(57)【要約】  免疫調節ポリヌクレオチドが開示される。該免疫調節ポリヌクレオチドは、5-修飾ウリジン、5-修飾シチジン、合計6〜16のヌクレオチド、並びに/又は1以上の脱塩基スペーサー及び/もしくはヌクレオシド間ホスホトリエステルを含有し得る。また開示されるのは、標的化部分及び1以上の免疫調節ポリヌクレオチドを含有するコンジュゲートである。該免疫調節ポリヌクレオチド及びコンジュゲートは、1以上の補助部分をさらに含有し得る。また開示されるのは、1以上の立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートを含有する免疫調節ポリヌクレオチド又はコンジュゲートを含有する組成物である。さらに開示されるのは、該免疫調節ポリヌクレオチド又は該コンジュゲートを含有する医薬組成物及びその使用方法である。【選択図】図１
2020512843.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(A)のオリゴヌクレオチド:又はその立体異性体、2以上のジアステレオマーの混合物、互変異性体、もしくは2以上の互変異性体の混合物;或いはこれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、又は水和物;
X5'-(XN)b-YP-(XN)c-X3' (A)
(式中:
各々のXNは、独立に、ヌクレオチドであり;
X3'は、3'末端ヌクレオチドであり;
X5'は、5'末端ヌクレオチドであり;
YPは、ヌクレオシド間ホスホトリエステルであり;かつ
b及びcは、各々、約0〜約25の範囲の整数であり;ただし、その和は5以上であり;
ここで、該オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオ塩基を有するヌクレオチドを含む)。
【請求項２】
bが約1〜約15の範囲の整数である、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
bが、約3、約4、約11、又は約14の整数である、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
bが約3の整数である、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
bが約4の整数である、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
bが約11の整数である、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
bが約14の整数である、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
cが約0〜約10の範囲の整数である、請求項1〜7のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
cが約0又は約8の整数である、請求項1〜7のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
cが約0の整数である、請求項1〜7のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
cが約8の整数である、請求項1〜7のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
bとcの和が約5〜約20の範囲である、請求項1〜11のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
bとcの和が約5〜約15の範囲である、請求項1〜11のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
bとcの和が、約8、約9、約10、約11、約12、約13、又は約14である、請求項1〜11のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
bとcの和が約11又は約14である、請求項1〜11のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
bとcの和が約11である、請求項1〜11のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
bとcの和が約14である、請求項1〜11のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
各々のXNが、独立に、2'-デオキシリボヌクレオチドである、請求項1〜17のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
各々のXNが、独立に、2'-デオキシアデノシン、2'-デオキシグアノシン、2'-デオキシシチジン、5-ハロ-2'-デオキシシチジン、2'-デオキシチミジン、2'-デオキシウリジン、又は5-ハロ-2'-デオキシウリジンである、請求項1〜17のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
各々のXNが、独立に、2'-デオキシアデノシン、2'-デオキシグアノシン、2'-デオキシシチジン、2'-デオキシチミジン、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン、又は5-ヨード-2'-デオキシウリジンである、請求項1〜17のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
X3'が2'-デオキシリボヌクレオチドである、請求項1〜20のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
X3'が、2'-デオキシアデノシン、2'-デオキシグアノシン、2'-デオキシシチジン、5-ハロ-2'-デオキシシチジン、2'-デオキシチミジン、2'-デオキシウリジン、又は5-ハロ-2'-デオキシウリジンである、請求項1〜20のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
X3'が2'-デオキシチミジンである、請求項1〜20のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
X3'が2'-修飾リボヌクレオチドである、請求項1〜20のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
X3'が2'-メトキシリボヌクレオチド又は2'-エトキシメトキシリボヌクレオチドである、請求項1〜20のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
X5'が2'-デオキシリボヌクレオチドである、請求項1〜25のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
X5'が、2'-デオキシアデノシン、2'-デオキシグアノシン、2'-デオキシシチジン、5-ハロ-2'-デオキシシチジン、2'-デオキシチミジン、2'-デオキシウリジン、又は5-ハロ-2'-デオキシウリジンである、請求項1〜25のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
X5'が置換ピリミジン塩基を有する2'-デオキシリボヌクレオチドである、請求項1〜25のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
X5'が5-置換ピリミジン塩基を有する2'-デオキシリボヌクレオチドである、請求項1〜25のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
X5'が、2'-デオキシチミジン、5-ハロ-2'-デオキシシチジン、又は5-ハロ-2'-デオキシウリジンである、請求項1〜25のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
X5'が5-ハロ-2'-デオキシシチジンである、請求項1〜25のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
X5'が5-ハロ-2'-デオキシウリジンである、請求項1〜25のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
X5'が、2'-デオキシチミジン、5-ブロモ-2'-デオキシシチジン、5-ヨード-2'-デオキシシチジン、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン、又は5-ヨード-2'-デオキシウリジンである、請求項1〜25のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
X5'が、2'-デオキシチミジン、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン、又は5-ヨード-2'-デオキシウリジンである、請求項1〜25のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
X5'が3'-ホスホロチオエート基を有する、請求項1〜34のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
前記3'-ホスホロチオエートがキラルである、請求項35記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
前記3'-ホスホロチオエートがRpのキラリティーを有する、請求項35記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
前記3'-ホスホロチオエートがSpのキラリティーを有する、請求項35記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
X5'がRpのキラリティーを有する3'-ホスホロチオエート基を有し、かつX3'が2'-メトキシリボヌクレオチド又は2'-エトキシメトキシリボヌクレオチドである、請求項1〜34のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
X5'がSpのキラリティーを有する3'-ホスホロチオエート基を有し、かつX3'が2'-メトキシリボヌクレオチド又は2'-エトキシメトキシリボヌクレオチドである、請求項1〜34のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
YPが:
【化１】
2020512843.tif 000302
であり、ここで、ZがO又はSであり;かつdが約0〜約50の範囲の整数である、請求項1〜40のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
YPが:
【化２】
2020512843.tif 000303
であり、ここで、ZがO又はSであり;かつdが約0〜約50の範囲の整数である、請求項1〜40のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
ZがOである、請求項41又は42記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
ZがSである、請求項41又は42記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
dが約0〜約10の範囲の整数である、請求項41〜44のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４６】
dが約0〜約5の範囲の整数である、請求項45記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４７】
dが、約0、約1、又は約3の整数である、請求項45記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４８】
さらなるヌクレオシド間ホスホトリエステルを含む、請求項1〜47のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４９】
前記さらなるヌクレオシド間ホスホトリエステルがアルキルホスホトリエステルである、請求項48記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５０】
前記さらなるヌクレオシド間ホスホトリエステルがエチルホスホトリエステルである、請求項48記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５１】
1個の5-ハロ-2'-デオキシウリジンを含む、請求項1〜50のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５２】
前記5-ハロ-2'-デオキシウリジンが5-ブロモ-2'-デオキシウリジン又は5-ヨード-2'-デオキシウリジンである、請求項51記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５３】
3以上の2'-デオキシシチジンを含む、請求項1〜52のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５４】
3つの2'-デオキシシチジンを含む、請求項1〜53のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５５】
3以上の2'-デオキシグアノシンを含む、請求項1〜54のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５６】
4つの2'-デオキシグアノシンを含む、請求項1〜55のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５７】
3つの2'-デオキシシチジン及び3つの2'-デオキシグアノシンを含む、請求項1〜56のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５８】
3つの2'-デオキシシチジン及び4つの2'-デオキシグアノシンを含む、請求項1〜57のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５９】
3以上の2'-デオキシチミジンを含む、請求項1〜58のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６０】
3、4、5、6、7、又は8つの2'-デオキシチミジンを含む、請求項59記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６１】
3個、4個、5個、又は8つの2'-デオキシチミジンを含む、請求項59記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６２】
0個、1個、又は2つの2'-デオキシアデノシンを含む、請求項1〜61のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６３】
1以上のヌクレオシド間ホスホロチオエートを含む、請求項1〜62のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６４】
前記ヌクレオシド間ホスホロチオエートのうちの少なくとも1つがキラルである、請求項63記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６５】
式(B)の化合物:又は立体異性体、2以上のジアステレオマーの混合物、互変異性体、もしくは2以上の互変異性体の混合物;或いはこれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、又は水和物;
RX-LN-(Q)e      (B)
(式中:
Rxは、共役基であり;
LNは、リンカーであり;
各々のQは、独立に、ホスホトリエステルを含むオリゴヌクレオチドであり;かつ
eは、1、2、3、又は4の整数である)。
【請求項６６】
Rxが
【化３】
2020512843.tif 000304
である、請求項65記載の化合物。
【請求項６７】
Rxが-NH2である、請求項65記載の化合物。
【請求項６８】
式(C)の化合物:又はその立体異性体、2以上のジアステレオマーの混合物、互変異性体、もしくは2以上の互変異性体の混合物;或いはこれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、又は水和物;
【化４】
2020512843.tif 000305
(式中:
Abは、抗体であり;
各々のLNは、独立に、リンカーであり;
各々のQは、独立に、ホスホトリエステルを含むオリゴヌクレオチドであり;
各々のeは、独立に、1、2、3、又は4の整数であり;かつ
fは、1、2、3、又は4の整数である)。
【請求項６９】
fが1又は2の整数である、請求項68記載の化合物。
【請求項７０】
fが1の整数である、請求項68記載の化合物。
【請求項７１】
LNがポリエチレングリコールを含むリンカーである、請求項65〜70のいずれか一項記載の化合物。
【請求項７２】
LNが、
【化５】
2020512843.tif 000306
であり、ここで、dが約0〜約50の範囲の整数である、請求項65〜71のいずれか一項記載の化合物。
【請求項７３】
LNが、
【化６】
2020512843.tif 000307
であり、ここで、dが約0〜約50の範囲の整数である、請求項65〜71のいずれか一項記載の化合物。
【請求項７４】
dが約0〜約10の範囲の整数である、請求項72又は73記載の化合物。
【請求項７５】
dが約0〜約5の範囲の整数である、請求項74記載の化合物。
【請求項７６】
dが、約0、約1、又は約3の整数である、請求項74記載の化合物。
【請求項７７】
eが1の整数である、請求項65〜76のいずれか一項記載の化合物。
【請求項７８】
各々のQが、独立に、式(D)の構造を有する、請求項65〜77のいずれか一項記載の化合物:
【化７】
2020512843.tif 000308
(式中:
各々のXNは、独立に、ヌクレオチドであり;
X3'は、3'末端ヌクレオチドであり;
X5'は、5'末端ヌクレオチドであり;
YPは、ヌクレオシド間ホスホトリエステルの残基であり;かつ
b及びcは、各々、約0〜約25の範囲の整数であり;ただし、その和は5以上であり;
ここで、該オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオ塩基を有するヌクレオチドを含む)。
【請求項７９】
bが約1〜約15の範囲の整数である、請求項78記載の化合物。
【請求項８０】
bが、約3、約4、約11、又は約14の整数である、請求項78記載の化合物。
【請求項８１】
bが約3の整数である、請求項78記載の化合物。
【請求項８２】
bが約4の整数である、請求項78記載の化合物。
【請求項８３】
bが約11の整数である、請求項78記載の化合物。
【請求項８４】
bが約14の整数である、請求項78記載の化合物。
【請求項８５】
cが約0〜約10の範囲の整数である、請求項78〜84のいずれか一項記載の化合物。
【請求項８６】
cが約0又は約8の整数である、請求項78〜84のいずれか一項記載の化合物。
【請求項８７】
cが約0の整数である、請求項78〜84のいずれか一項記載の化合物。
【請求項８８】
cが約8の整数である、請求項78〜84のいずれか一項記載の化合物。
【請求項８９】
bとcの和が約5〜約20の範囲である、請求項78〜88のいずれか一項記載の化合物。
【請求項９０】
bとcの和が約5〜約15の範囲である、請求項78〜88のいずれか一項記載の化合物。
【請求項９１】
bとcの和が、約8、約9、約10、約11、約12、約13、又は約14である、請求項78〜88のいずれか一項記載の化合物。
【請求項９２】
各々のXNが、独立に、2'-デオキシリボヌクレオチドである、請求項78〜91のいずれか一項記載の化合物。
【請求項９３】
各々のXNが、独立に、2'-デオキシアデノシン、2'-デオキシグアノシン、2'-デオキシシチジン、5-ハロ-2'-デオキシシチジン、2'-デオキシチミジン、2'-デオキシウリジン、又は5-ハロ-2'-デオキシウリジンである、請求項78〜91のいずれか一項記載の化合物。
【請求項９４】
各々のXNが、独立に、2'-デオキシアデノシン、2'-デオキシグアノシン、2'-デオキシシチジン、2'-デオキシチミジン、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン、又は5-ヨード-2'-デオキシウリジンである、請求項78〜91のいずれか一項記載の化合物。
【請求項９５】
X3'が2'-デオキシリボヌクレオチドである、請求項78〜94のいずれか一項記載の化合物。
【請求項９６】
X3'が、2'-デオキシアデノシン、2'-デオキシグアノシン、2'-デオキシシチジン、5-ハロ-2'-デオキシシチジン、2'-デオキシチミジン、2'-デオキシウリジン、又は5-ハロ-2'-デオキシウリジンである、請求項78〜91のいずれか一項記載の化合物。
【請求項９７】
X3'が2'-デオキシチミジンである、請求項78〜91のいずれか一項記載の化合物。
【請求項９８】
X3'が2'-修飾リボヌクレオチドである、請求項78〜94のいずれか一項記載の化合物。
【請求項９９】
X3'が2'-メトキシリボヌクレオチド又は2'-エトキシメトキシリボヌクレオチドである、請求項78〜94のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１００】
X5'が2'-デオキシリボヌクレオチドである、請求項78〜99のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１０１】
X5'が、2'-デオキシアデノシン、2'-デオキシグアノシン、2'-デオキシシチジン、5-ハロ-2'-デオキシシチジン、2'-デオキシチミジン、2'-デオキシウリジン、又は5-ハロ-2'-デオキシウリジンである、請求項100記載の化合物。
【請求項１０２】
X5'が置換ピリミジン塩基を有する2'-デオキシリボヌクレオチドである、請求項100記載の化合物。
【請求項１０３】
X5'が5-置換ピリミジン塩基を有する2'-デオキシリボヌクレオチドである、請求項102記載の化合物。
【請求項１０４】
X5'が、2'-デオキシチミジン、5-ハロ-2'-デオキシシチジン、又は5-ハロ-2'-デオキシウリジンである、請求項102記載の化合物。
【請求項１０５】
X5'が、2'-デオキシチミジン、5-ブロモ-2'-デオキシシチジン、5-ヨード-2'-デオキシシチジン、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン、又は5-ヨード-2'-デオキシウリジンである、請求項102記載の化合物。
【請求項１０６】
X5'が、2'-デオキシチミジン、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン、又は5-ヨード-2'-デオキシウリジンである、請求項102記載の化合物。
【請求項１０７】
X5'が3'-ホスホロチオエート基を有する、請求項78〜106のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１０８】
前記3'-ホスホロチオエートがキラルである、請求項107記載の化合物。
【請求項１０９】
前記3'-ホスホロチオエートがRpのキラリティーを有する、請求項107記載の化合物。
【請求項１１０】
前記3'-ホスホロチオエートがSpのキラリティーを有する、請求項107記載の化合物。
【請求項１１１】
X5'がRpのキラリティーを有する3'-ホスホロチオエート基を有し、かつX3'が2'-メトキシリボヌクレオチド又は2'-エトキシメトキシリボヌクレオチドである、請求項78〜107のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１１２】
X5'がSpのキラリティーを有する3'-ホスホロチオエート基を有し、かつX3'が2'-メトキシリボヌクレオチド又は2'-エトキシメトキシリボヌクレオチドである、請求項78〜107のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１１３】
さらなるヌクレオシド間ホスホトリエステルを含む、請求項78〜112のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１１４】
前記さらなるヌクレオシド間ホスホトリエステルがアルキルホスホトリエステルである、請求項113記載の化合物。
【請求項１１５】
前記さらなるヌクレオシド間ホスホトリエステルがエチルホスホトリエステルである、請求項113記載の化合物。
【請求項１１６】
1個の5-ハロ-2'-デオキシウリジンを含む、請求項78〜115のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１１７】
前記5-ハロ-2'-デオキシウリジンが5-ブロモ-2'-デオキシウリジン又は5-ヨード-2'-デオキシウリジンである、請求項116記載の化合物。
【請求項１１８】
3以上の2'-デオキシシチジンを含む、請求項78〜117のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１１９】
3つの2'-デオキシシチジンを含む、請求項118記載の化合物。
【請求項１２０】
4以上の2'-デオキシグアノシンを含む、請求項78〜119のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１２１】
4つの2'-デオキシグアノシンを含む、請求項120記載の化合物。
【請求項１２２】
3つの2'-デオキシシチジン及び4つの2'-デオキシシチジンを含む、請求項78〜121のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１２３】
3以上の2'-デオキシチミジンを含む、請求項78〜122のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１２４】
3、4、5、6、7、又は8つの2'-デオキシチミジンを含む、請求項123記載の化合物。
【請求項１２５】
3個、4個、5個、又は8つの2'-デオキシチミジンを含む、請求項123記載の化合物。
【請求項１２６】
0個、1個、又は2つの2'-デオキシアデノシンを含む、請求項78〜125のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１２７】
1以上のヌクレオシド間ホスホロチオエートを含む、請求項74〜126のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１２８】
前記ヌクレオシド間ホスホロチオエートのうちの少なくとも1つがキラルである、請求項127記載の化合物。
【請求項１２９】
N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5Tという配列を有するオリゴヌクレオチド
(ここで:
xは、1〜4の範囲の整数であり;
N1は、非存在又は2'-デオキシチミジンであり;
N2は、修飾ヌクレオ塩基を有する2'-デオキシリボヌクレオチドであり;
N3は、3'-ホスホトリエステルを各々任意に含む、2'-デオキシアデノシン又は2'-デオキシチミジンであり;
N4は、2'-デオキシアデノシン又は2'-デオキシチミジンであり;かつ
N5は、3'-ホスホトリエステルを任意に含む2'-デオキシチミジンである)。
【請求項１３０】
xが1又は4の整数である、請求項129記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４０】
xが1の整数である、請求項129又は130記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４１】
N1が存在しない、請求項129〜140のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４２】
N1が2'-デオキシチミジンである、請求項129〜140のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４３】
N2が置換ピリミジン塩基を有する2'-デオキシリボヌクレオチドである、請求項129〜142のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４４】
N2が5-置換ピリミジン塩基を有する2'-デオキシリボヌクレオチドである、請求項143記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４５】
N2が5-ハロ-2'-デオキシシチジン又は5-ハロ-2'-デオキシウリジンである、請求項143記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４６】
N2が5-ブロモ-2'-デオキシウリジン又は5-ヨード-2'-デオキシウリジンである、請求項143記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４７】
N3が3'-ホスホトリエステルを含む2'-デオキシアデノシンである、請求項129〜146のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４８】
N3が2'-デオキシチミジンである、請求項129〜146のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４９】
N3が3'-ホスホトリエステルを含む2'-デオキシチミジンである、請求項129〜146のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５０】
N4が2'-デオキシアデノシンである、請求項129〜149のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５１】
N4が2'-デオキシチミジンである、請求項129〜149のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５２】
N5が2'-デオキシチミジンである、請求項129〜151のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５３】
N5が3'-ホスホトリエステルを含む2'-デオキシチミジンである、請求項129〜151のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５４】
1以上のヌクレオシド間ホスホロチオエートを含む、請求項129〜153のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５５】
前記ヌクレオシド間ホスホロチオエートのうちの少なくとも1つがキラルである、請求項154記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５６】
配列番号:p236、p238、p243、p246、p275、p276、p308、p313、p347、p361、p362、p425、p433、p434、p435、p436、p437、p438、p477、p478、p479、p480、p481、p482、p483、p484、p485、p486、p487、p488、又はp489の配列を有する、請求項129記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５７】
1以上の脱塩基スペーサー又はヌクレオシド間ホスホトリエステルを含む免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１５８】
前記免疫調節ポリヌクレオチドが5-ハロウリジンを含む、請求項157記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１５９】
前記5-ハロウリジンが2つの5'-末端ヌクレオシドのうちの少なくとも1つであるか又は前記免疫調節ポリヌクレオチド中の免疫刺激配列(ISS)に存在する、請求項158記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１６０】
前記5-ハロウリジンが5-ブロモウリジンである、請求項158又は159記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１６１】
前記5-ハロウリジンが5-ヨードウリジンである、請求項158又は159記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１６２】
前記5-ハロウリジンがヌクレオシド間ホスホジエステルホスフェートに結合した3'-位を含む、請求項158〜161のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１６３】
前記5-ハロウリジンがヌクレオシド間ホスホジエステルホスホロチオエートに結合した3'-位を含む、請求項158〜161のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１６４】
5'-末端5-ブロモウリジンを含む、免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１６５】
前記免疫調節ポリヌクレオチドが1以上のヌクレオシド間ホスホトリエステルを含む、請求項157〜164のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１６６】
前記1以上のヌクレオシド間ホスホトリエステルが1〜5つのヌクレオシド間ホスホトリエステルである、請求項165記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１６７】
前記ヌクレオシド間ホスホトリエステルのうちの少なくとも1つが共役基を含む、請求項165又は166記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１６８】
前記ヌクレオシド間ホスホトリエステルのうちの少なくとも1つが共役基を含むホスホチオトリエステルである、請求項165又は166記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１６９】
末端リン酸エステルをさらに含む、請求項157〜168のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１７０】
前記末端リン酸エステルが5'-末端リン酸エステルである、請求項169記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１７１】
前記末端リン酸エステルが3'-末端リン酸エステルである、請求項169記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１７２】
前記末端リン酸エステルが共役基を含む、請求項169〜171のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１７３】
前記末端リン酸エステルが共役基を含むホスホチオトリエステルである、請求項172記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１７４】
5'-キャップ又は3'-キャップを含む、請求項157〜173のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１７５】
前記免疫調節ポリヌクレオチドが5'-5'キャップである5'-キャップを含む、請求項174記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１７６】
前記5'-5'キャップが、ヌクレオシド間ホスフェート、ヌクレオシド間ホスホロチオエート、又はヌクレオシド間ホスホロジチオエートに共有結合した共役基を含む、請求項175記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１７７】
前記免疫調節ポリヌクレオチドが、ヌクレオシド間ホスフェート、ヌクレオシド間ホスホロチオエート、又はヌクレオシド間ホスホロジチオエートに共有結合した共役基を含む3'-キャップを含む、請求項174記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１７８】
前記免疫調節ポリヌクレオチドが5'-末端免疫刺激配列を含む、請求項157〜177のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１７９】
前記ヌクレオシド間ホスホトリエステルのうちの少なくとも1つが5'-末端免疫刺激配列に結合している5'-炭素原子を有するヌクレオシドの3'-炭素原子に結合している、請求項178記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１８０】
前記免疫調節ポリヌクレオチドが1以上の脱塩基スペーサーを含む、請求項157〜179のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１８１】
前記1以上の脱塩基スペーサーが1又は2つの脱塩基スペーサーである、請求項157〜180のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１８２】
前記脱塩基スペーサーの少なくとも1つがヌクレオシド間脱塩基スペーサーである、請求項157〜181のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１８３】
前記脱塩基スペーサーの少なくとも1つが3'-末端脱塩基スペーサーである、請求項157〜182のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１８４】
前記脱塩基スペーサーの少なくとも1つが共役基を含む、請求項157〜183のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１８５】
前記免疫調節ポリヌクレオチドが合計6〜16のヌクレオチドを含む、請求項157〜184のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１８６】
前記免疫調節ポリヌクレオチド中のヌクレオシド間架橋基の少なくとも50％がホスホロチオエートを含む、請求項157〜185のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１８７】
前記免疫調節ポリヌクレオチド中のヌクレオシド間架橋基の少なくとも80％がホスホロチオエートを含む、請求項186記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１８８】
前記免疫調節ポリヌクレオチド中のヌクレオ塩基に共有結合した共役基をさらに含む、請求項157〜187のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１８９】
前記免疫調節ポリヌクレオチドがシチジン及びグアノシンを2番目及び3番目のヌクレオシドとして含む、請求項157又は188記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１９０】
前記免疫調節ポリヌクレオチドがシチジン及びグアノシンを3番目及び4番目のヌクレオシドとして含む、請求項157又は189記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１９１】
1以上の補助部分をさらに含む、請求項157〜190のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１９２】
前記免疫調節ポリヌクレオチドがコンジュゲート部分を含み、かつ該コンジュゲート部分が前記補助部分のうちの少なくとも1つを含む、請求項191記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１９３】
前記1つの補助部分が100Da〜2,500Daの分子量を有するポリ(エチレングリコール)(PEG)を含む、請求項191又は192記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１９４】
各々のPEGが、独立に、合計少なくとも3のエチレングリコール反復単位を含む、請求項193記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１９５】
各々のPEGが、独立に、合計少なくとも20のエチレングリコール反復単位を含む、請求項193又は194記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１９６】
各々のPEGが、独立に、合計50以下のエチレングリコール反復単位を含む、請求項193〜195のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１９７】
前記免疫調節ポリヌクレオチドが1〜8つのPEGを含む、請求項191〜196のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１９８】
モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、補助部分、末端ホスホジエステル、末端ホスホトリエステル、5'-5'キャップ、及び基-OR'からなる群から選択される5'-キャッピング基を含み、ここで、R'が、生体可逆性基、非生体可逆性基、及びO-保護基からなる群から選択される、請求項157〜197のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項１９９】
前記5'-キャッピング基が、ホスフェート、ホスホロチオエート、又はホスホロジチオエートに結合した任意に置換されたC1-6アルキルを含むモノホスフェート又は末端ホスホジエステルである、請求項198記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項２００】
モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、補助部分、末端ホスホジエステル、末端ホスホトリエステル、及び基-OR'からなる群から選択される3'-キャッピング基を含み、ここで、R'が、生体可逆性基、非生体可逆性基、及びO-保護基からなる群から選択される、請求項157〜199のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項２０１】
前記3'-キャッピング基が、ホスフェート、ホスホロチオエート、又はホスホロジチオエートに結合した任意に置換されたC1-6アルキルを含むモノホスフェート又は末端ホスホジエステルである、請求項200記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項２０２】
コンジュゲート部分に結合したヌクレオ塩基を含む、請求項157〜201のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項２０３】
相補的ポリヌクレオチドにハイブリダイズした請求項157〜202のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチドを含む、ハイブリダイズした免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項２０４】
前記免疫調節ポリヌクレオチドが少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートを含む、請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項２０５】
少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートが前記免疫調節ポリヌクレオチド中の5'-末端ヌクレオシドと免疫刺激配列のCpGのシチジンとの間に配置されている、請求項204記載の組成物。
【請求項２０６】
前記立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートがS-ステレオジェニックである、請求項204又は205記載の組成物。
【請求項２０７】
前記立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートがR-ステレオジェニックである、請求項204又は205記載の組成物。
【請求項２０８】
少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートが前記免疫調節ポリヌクレオチド中の免疫刺激配列中のCpGのシチジンの5'-炭素原子に結合している、請求項204〜207のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２０９】
前記立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートがS-ステレオジェニックである、請求項208記載の組成物。
【請求項２１０】
前記立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートがR-ステレオジェニックである、請求項208記載の組成物。
【請求項２１１】
1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートが前記免疫調節ポリヌクレオチド中の1番目のヌクレオシドと2番目のヌクレオシドを接続する、請求項204〜210のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２１２】
前記立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートがS-ステレオジェニックである、請求項211記載の組成物。
【請求項２１３】
前記立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートがR-ステレオジェニックである、請求項211記載の組成物。
【請求項２１４】
1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートが前記免疫調節ポリヌクレオチド中の4番目のヌクレオシドと5番目のヌクレオシドを接続する、請求項204〜213のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２１５】
前記立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートがS-ステレオジェニックである、請求項214記載の組成物。
【請求項２１６】
前記立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートがR-ステレオジェニックである、請求項214記載の組成物。
【請求項２１７】
抗体又は抗体断片及び1以上の免疫調節ポリヌクレオチドを含むコンジュゲートであって、該抗体又は該抗体断片がal Q-タグを含み、かつ該免疫調節ポリヌクレオチドの各々が、独立に、該Q-タグに共有結合しているリンカーを含む、前記コンジュゲート。
【請求項２１８】
前記Q-タグがN-末端Q-タグである、請求項217記載のコンジュゲート。
【請求項２１９】
前記Q-タグがC-末端Q-タグである、請求項217記載のコンジュゲート。
【請求項２２０】
前記Q-タグが前記抗体又は前記抗体断片の重鎖中に配置される、請求項217〜219のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２２１】
前記Q-タグが前記抗体又は前記抗体断片の軽鎖中に配置される、請求項217〜219のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２２２】
前記免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つが5-修飾ウリジン又は5-修飾シチジンを含む、請求項217〜221のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２２３】
標的化部分及び1以上の免疫調節ポリヌクレオチドを含むコンジュゲートであって、該免疫調節ポリヌクレオチドの各々が、独立に、リンカーを含み、ここで、該標的化部分が該リンカーに共有結合しており、ここで、該免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つが5-修飾ウリジン又は5-修飾シチジンを含む、前記コンジュゲート。
【請求項２２４】
前記免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つが5-修飾ウリジンを含む、請求項222又は223記載のコンジュゲート。
【請求項２２５】
前記5-修飾ウリジンが、5-ハロウリジン、5-アルキニルウリジン、又は5-ヘテロシクリルウリジンである、請求項224記載のコンジュゲート。
【請求項２２６】
前記5-修飾ウリジンが5-ハロウリジンである、請求項225記載のコンジュゲート。
【請求項２２７】
前記5-ハロウリジンが5-ブロモウリジンである、請求項225又は226記載のコンジュゲート。
【請求項２２８】
前記5-ハロウリジンが5-ヨードウリジンである、請求項225又は226記載のコンジュゲート。
【請求項２２９】
前記5-修飾ウリジンが前記免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つの2つの5'-末端ヌクレオチドのうちの1つである、請求項222〜228のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２３０】
前記5-修飾ウリジンがヌクレオシド間リン酸エステルホスフェートに結合した3'-位を含む、請求項222〜229のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２３１】
前記5-修飾ウリジンがヌクレオシド間リン酸エステルホスホロチオエートに結合した3'-位を含む、請求項222〜229のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２３２】
前記免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つがシチジン及びグアノシンを2番目及び3番目のヌクレオシドとして含む、請求項217〜231のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２３３】
前記免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つがシチジン及びグアノシンを3番目及び4番目のヌクレオシドとして含む、請求項217〜231のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２３４】
前記免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つが合計6〜16のヌクレオチドを含む、請求項217〜233のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２３５】
標的化部分及び1以上の免疫調節ポリヌクレオチドを含むコンジュゲートであって、該免疫調節ポリヌクレオチドの各々が、独立に、リンカーを含み、ここで、該標的化部分が該リンカーに共有結合しており、該免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つが合計6〜16のヌクレオチドを含む、前記コンジュゲート。
【請求項２３６】
前記免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つが1以上の脱塩基スペーサー又はヌクレオシド間ホスホトリエステルを含む、請求項217〜235のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２３７】
標的化部分及び1以上の免疫調節ポリヌクレオチドを含むコンジュゲートであって、該免疫調節ポリヌクレオチドの各々が、独立に、リンカーを含み、ここで、該標的化部分が該リンカーに共有結合しており、該免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つが1以上の脱塩基スペーサー又はヌクレオシド間ホスホトリエステルを含む、前記コンジュゲート。
【請求項２３８】
少なくとも1つの脱塩基スペーサー又は少なくとも1つのホスホトリエステルが前記リンカーを含む、請求項237記載のコンジュゲート。
【請求項２３９】
前記免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つが1以上の脱塩基スペーサーを含む、請求項217〜238のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２４０】
前記1以上のヌクレオシド間脱塩基スペーサーが1又は2つの脱塩基スペーサーである、請求項239記載のコンジュゲート。
【請求項２４１】
前記脱塩基スペーサーの少なくとも1つがヌクレオシド間脱塩基スペーサーである、請求項235〜240のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２４２】
前記脱塩基スペーサーの少なくとも1つが3'-末端脱塩基スペーサーである、請求項235〜241のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２４３】
前記免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つが1以上のヌクレオシド間ホスホトリエステルを含む、請求項217〜242のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２４４】
前記1以上のヌクレオシド間ホスホトリエステルが1〜5つのヌクレオシド間ホスホトリエステルである、請求項243記載のコンジュゲート。
【請求項２４５】
前記コンジュゲートが前記リンカーに結合した1以上の補助部分をさらに含む、請求項217〜244のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２４６】
標的化部分、1以上の補助部分、及び1以上の免疫調節ポリヌクレオチドを含むコンジュゲートであって、該免疫調節ポリヌクレオチドの各々が、独立に、該標的化部分に結合したリンカーを含む、前記コンジュゲート。
【請求項２４７】
前記補助部分のうちの少なくとも1つが100Da〜2,500Daの分子量を有するポリ(エチレングリコール)(PEG)を含む、請求項245又は246記載のコンジュゲート。
【請求項２４８】
各々のPEGが、独立に、合計少なくとも3のエチレングリコール反復単位を含む、請求項247記載のコンジュゲート。
【請求項２４９】
各々のPEGが、独立に、合計少なくとも20のエチレングリコール反復単位を含む、請求項247又は248記載のコンジュゲート。
【請求項２５０】
各々のPEGが、独立に、合計50以下のエチレングリコール反復単位を含む、請求項247〜249のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２５１】
前記コンジュゲートが1〜8つのPEGを含む、請求項247〜250のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２５２】
前記標的化部分が、抗原結合部分、ポリペプチド、アプタマー、又は1以上の小分子を含む基である、請求項217〜251のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２５３】
前記標的化部分が抗原結合部分である、請求項252記載のコンジュゲート。
【請求項２５４】
前記標的化部分が抗体又はその抗原結合断片である、請求項252記載のコンジュゲート。
【請求項２５５】
前記免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つにおける5'-キャッピング基が、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、補助部分、末端ホスホジエステル、末端ホスホトリエステル、及び基-OR'からなる群から選択され、ここで、R'が、生体可逆性基、非生体可逆性基、及びO-保護基からなる群から選択される、請求項217〜254のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２５６】
前記5'-キャッピング基が、ホスフェート、ホスホロチオエート、又はホスホロジチオエートに結合した任意に置換されたC1-6アルキルを含むモノホスフェート又は末端ホスホジエステルである、請求項255記載のコンジュゲート。
【請求項２５７】
前記免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つにおける3'-キャッピング基が、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、補助部分、末端ホスホジエステル、末端ホスホトリエステル、及び基-OR'からなる群から選択され、ここで、R'が、生体可逆性基、非生体可逆性基、及びO-保護基からなる群から選択される、請求項217〜256のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２５８】
前記3'-キャッピング基が、ホスフェート、ホスホロチオエート、又はホスホロジチオエートに結合した任意に置換されたC1-6アルキルを含むモノホスフェート又は末端ホスホジエステルである、請求項257記載のコンジュゲート。
【請求項２５９】
免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つが前記リンカーに結合したヌクレオ塩基を含む、請求項217〜258のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２６０】
前記コンジュゲートが1〜6つの免疫調節ポリヌクレオチドを含む、請求項217〜259のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２６１】
前記コンジュゲートが1〜4つの免疫調節ポリヌクレオチドを含む、請求項260記載のコンジュゲート。
【請求項２６２】
前記コンジュゲートが免疫調節ポリヌクレオチドを1個しか含まない、請求項261記載のコンジュゲート。
【請求項２６３】
前記コンジュゲートが免疫調節ポリヌクレオチドを2個しか含まない、請求項262記載のコンジュゲート。
【請求項２６４】
前記コンジュゲートが1個の標的化部分を含む、請求項217〜263のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２６５】
前記免疫調節ポリヌクレオチドが5'-末端の4ヌクレオチド内のヒト免疫刺激配列を含む、請求項217〜261のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２６６】
前記免疫調節ポリヌクレオチドの前記5'-末端の4ヌクレオチド内のヒト免疫刺激配列がヌクレオシドと置換されたリン酸エステルに結合した5'-炭素原子を含むシチジンを含む、請求項265記載のコンジュゲート。
【請求項２６７】
前記免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つが5-修飾ウリジン又は5-修飾シチジンを含む、請求項217〜266のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２６８】
前記免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つがその相補体にハイブリダイズしている、請求項217〜267のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項２６９】
前記免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つが少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートを含む、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲートを含む組成物。
【請求項２７０】
標的化部分及び1以上の免疫調節ポリヌクレオチドを含むコンジュゲートを含む組成物であって、該免疫調節ポリヌクレオチドの各々が、独立に、リンカーを含み、ここで、該標的化部分が該リンカーに共有結合しており、該免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つが少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートを含む、前記組成物。
【請求項２７１】
少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートが前記免疫調節ポリヌクレオチド中の免疫刺激配列中の5'-末端ヌクレオシドとCpGのシチジンの間に配置されている、請求項269又は270記載の組成物。
【請求項２７２】
前記立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートがS-ステレオジェニックである、請求項269〜271のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２７３】
前記立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートがR-ステレオジェニックである、請求項269〜272のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２７４】
少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートが前記免疫調節ポリヌクレオチド中の免疫刺激配列中のCpGのシチジンの5'-炭素原子に結合している、請求項269〜273のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２７５】
前記立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートがS-ステレオジェニックである、請求項274記載の組成物。
【請求項２７６】
前記立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートがR-ステレオジェニックである、請求項274記載の組成物。
【請求項２７７】
少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートが前記免疫調節ポリヌクレオチド中の1番目のヌクレオシドと2番目のヌクレオシドを接続する、請求項269〜276のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２７８】
前記立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートがS-ステレオジェニックである、請求項277記載の組成物。
【請求項２７９】
前記立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートがR-ステレオジェニックである、請求項277記載の組成物。
【請求項２８０】
少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートが前記免疫調節ポリヌクレオチド中の4番目のヌクレオシドと5番目のヌクレオシドを接続する、請求項269〜279のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２８１】
前記立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートがS-ステレオジェニックである、請求項280記載の組成物。
【請求項２８２】
前記立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートがR-ステレオジェニックである、請求項280記載の組成物。
【請求項２８３】
医薬として許容し得る担体及び請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、又は請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物を含む、医薬組成物。
【請求項２８４】
エンドソーム性toll様受容体を該エンドソーム性toll様受容体を含む細胞で調節する方法であって、該細胞を、請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物と、該免疫調節ポリヌクレオチドが該細胞内に輸送されるのを可能にする条件下で接触させることを含み、ここで、該接触の後に、該エンドソーム性toll様受容体の活性が調節される、前記方法。
【請求項２８５】
前記免疫調節ポリヌクレオチドが免疫刺激ポリヌクレオチドであり、前記方法がエンドソーム性toll様受容体を刺激するためのものである、請求項284記載の方法。
【請求項２８６】
前記免疫調節ポリヌクレオチドが免疫抑制ポリヌクレオチドであり、前記方法がエンドソーム性toll様受容体を抑制するためのものである、請求項283記載の方法。
【請求項２８７】
1以上のサイトカインをエンドソーム性toll様受容体を含む抗原提示細胞で誘導する方法であって、該抗原提示細胞を、請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物と、該1以上の免疫調節ポリヌクレオチドが該細胞内に輸送されるのを可能にする条件下で接触させることを含み、ここで、該接触の後に、該細胞内の少なくとも1つのサイトカインのレベルが増大し、かつ前記標的化部分が該抗原提示細胞を標的とし、
ここで、該免疫調節ポリヌクレオチドが免疫刺激ポルヌクレオチド(polunucleotide)である、前記方法。
【請求項２８８】
前記抗原提示細胞がB細胞である、請求項287記載の方法。
【請求項２８９】
前記1以上のサイトカインのうちの少なくとも1つが炎症性サイトカインである、請求項287又は288記載の方法。
【請求項２９０】
前記抗原提示細胞が形質細胞様樹状細胞であり、ここで、前記標的化部分が該形質細胞様樹状細胞を認識する、請求項287記載の方法。
【請求項２９１】
前記抗原提示細胞がマクロファージである、請求項287記載の方法。
【請求項２９２】
前記サイトカインのうちの少なくとも1つがI型インターフェロンである、請求項287記載の方法。
【請求項２９３】
前記toll様受容体がTLR9である、請求項284〜292のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９４】
患者の液性腫瘍を治療する方法であって、該患者に、請求項1〜45のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項157〜203のいずれか一項記載の組成物、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物の有効量を投与することを含み、ここで、前記標的化部分がB細胞を標的とし、かつ該免疫調節ポリヌクレオチドがTLR9アゴニストである免疫刺激ポリヌクレオチドである、前記方法。
【請求項２９５】
前記液性腫瘍が血液学的腫瘍である、請求項294記載の方法。
【請求項２９６】
前記血液学的腫瘍がリンパ腫である、請求項295記載の方法。
【請求項２９７】
前記リンパ腫が非ホジキンB細胞リンパ腫である、請求項296記載の方法。
【請求項２９８】
前記リンパ腫が、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、又は多発性骨髄腫である、請求項297記載の方法。
【請求項２９９】
患者の固形腫瘍を治療する方法であって、該患者に、請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物を投与することを含み、ここで、該標的化部分が形質細胞様樹状細胞を標的とし、かつ該免疫調節ポリヌクレオチドがTLR9アゴニストである免疫刺激ポリヌクレオチドである、前記方法。
【請求項３００】
前記免疫調節ポリヌクレオチドが免疫刺激ポリヌクレオチドである、請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項３０１】
前記免疫調節ポリヌクレオチドが免疫刺激ポリヌクレオチドである、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項３０２】
前記免疫調節ポリヌクレオチドが免疫刺激ポリヌクレオチドである、請求項204〜216及び269〜282のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３０３】
前記免疫調節ポリヌクレオチドが免疫刺激ポリヌクレオチドである、請求項283記載の医薬組成物。
【請求項３０４】
前記免疫調節ポリヌクレオチドが免疫抑制ポリヌクレオチドである、請求項1〜45のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド。
【請求項３０５】
前記免疫調節ポリヌクレオチドが免疫抑制ポリヌクレオチドである、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート。
【請求項３０６】
前記免疫調節ポリヌクレオチドが免疫抑制ポリヌクレオチドである、請求項204〜216及び269〜282のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３０７】
前記免疫調節ポリヌクレオチドが免疫抑制ポリヌクレオチドである、請求項283記載の医薬組成物。
【請求項３０８】
癌を有する対象における癌を治療する方法であって、請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物の治療有効量を該対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項３０９】
前記癌が液性腫瘍である、請求項308記載の方法。
【請求項３１０】
前記液性腫瘍が血液学的腫瘍である、請求項309記載の方法。
【請求項３１１】
前記血液学的腫瘍がリンパ腫である、請求項310記載の方法。
【請求項３１２】
前記リンパ腫が、非ホジキンB細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、又は多発性骨髄腫である、請求項311記載の方法。
【請求項３１３】
前記癌が固形腫瘍である、請求項308記載の方法。
【請求項３１４】
前記固形腫瘍が、結腸癌、メラノーマ、又は頭頸部癌である、請求項313記載の方法。
【請求項３１５】
前記標的化部分が抗体又は抗体断片である、請求項308記載の方法。
【請求項３１６】
前記標的化部分が抗原提示細胞(APC)上の抗原に結合する、請求項308〜315のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１７】
前記APCが、B細胞、形質細胞様樹状細胞(pDC)、又はマクロファージである、請求項316記載の方法。
【請求項３１８】
前記抗原が、CD19、CD20、CD22、CD30、CD38、CD79もしくはCD79b、CD205、BDCA2、BDCA4、又はPD-L1である、請求項316記載の方法。
【請求項３１９】
前記コンジュゲートが全身投与される、請求項308〜318のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２０】
前記コンジュゲートが静脈内注射(i.v.)によって投与される、請求項319記載の方法。
【請求項３２１】
前記免疫調節ポリヌクレオチドがTLR9アゴニストである、請求項308〜320のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２２】
前記量が前記癌に対する適応免疫応答を惹起するのに有効である、請求項308〜321のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２３】
前記量が細胞性免疫を増大させるのに有効である、請求項322記載の方法。
【請求項３２４】
前記量が固形腫瘍におけるT細胞腫瘍浸潤を増大させるのに有効である、請求項322記載の方法。
【請求項３２５】
前記T細胞がCD4+又はCD8+ T細胞である、請求項324記載の方法。
【請求項３２６】
前記量が前記患者における持続的な抗腫瘍免疫を惹起するのに有効である、請求項322記載の方法。
【請求項３２７】
前記量が前記対象において腫瘍増殖を阻害するか又は腫瘍サイズを低下させるのに有効である、請求項308〜326のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２８】
前記コンジュゲートの投与がコンジュゲートされていない形態の前記免疫調節ポリヌクレオチドの投与と比べてより少ない前記対象における炎症性サイトカインの増加をもたらす、請求項308〜327のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２９】
前記炎症性サイトカインが、IL-6、IL-10、又はTNFγである、請求項328記載の方法。
【請求項３３０】
前記量が前記対象における補体経路を活性化するのに有効ではない、請求項308〜329のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３１】
前記量が前記対象における補体C3を活性化するのに有効ではない、請求項330記載の方法。
【請求項３３２】
前記癌がチェックポイントインヒビター再発性又は不応性癌である、請求項308〜331のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３３】
前記チェックポイントインヒビターが、PD-1インヒビター、PD-L1インヒビター、又はCTLA-4インヒビターである、請求項332記載の方法。
【請求項３３４】
チェックポイントインヒビターを前記対象に投与することを含む、請求項308〜333のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３５】
前記チェックポイントインヒビターが、PD-1インヒビター、PD-L1インヒビター、又はCTLA-4インヒビターである、請求項334記載の方法。
【請求項３３６】
前記チェックポイントインヒビターが、抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、又は抗CTLA-4抗体である、請求項334記載の方法。
【請求項３３７】
T細胞アゴニストを前記対象に投与することを含む、請求項308〜336のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３８】
前記T細胞アゴニストが、OX-40、ICOS、又は4-1 BBアゴニストである、請求項337記載の方法。
【請求項３３９】
癌を有する対象における非B細胞腫瘍を治療する方法であって、請求項1〜45のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項46〜58のいずれか一項記載の組成物、請求項157〜203のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物の治療有効量を該対象に投与することを含み、ここで、該標的化部分がB細胞抗原に結合する、前記方法。
【請求項３４０】
癌を有する対象における固形腫瘍を治療する方法であって、請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含み、ここで、該標的化部分がB細胞抗原に結合する、前記方法。
【請求項３４１】
癌を有する対象における液性腫瘍を治療する方法であって、請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物の治療有効量を該対象に投与することを含み、ここで、該標的化部分がAPC抗原に結合する、前記方法。
【請求項３４２】
前記APC抗原がpDC又はマクロファージ抗原である、請求項341記載の方法。
【請求項３４３】
癌を有する対象における癌を治療する方法であって、請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物の治療有効量及びチェックポイントインヒビターを該対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項３４４】
前記チェックポイントインヒビターが、PD-1インヒビター、PD-L1インヒビター、又はCTLA-4インヒビターである、請求項343記載の方法。
【請求項３４５】
前記チェックポイントインヒビターが、抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、又は抗CTLA-4抗体である、請求項344記載の方法。
【請求項３４６】
癌を有する対象における癌を治療する方法であって、請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物の治療有効量及びT細胞アゴニストを投与することを含む、前記方法。
【請求項３４７】
前記T細胞アゴニストが、OX-40、ICOS、又は4-1 BBアゴニストである、請求項346記載の方法。
【請求項３４８】
請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、もしくは請求項283記載の医薬組成物、又は請求項125記載の医薬組成物及びチェックポイントインヒビターを含む、医薬組成物。
【請求項３４９】
医薬として許容し得る賦形剤又は溶媒をさらに含む、請求項348記載の医薬組成物。
【請求項３５０】
請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物及びT細胞アゴニストを含む、医薬組成物。
【請求項３５１】
医薬として許容し得る賦形剤又は溶媒をさらに含む、請求項350記載の医薬組成物。
【請求項３５２】
前記標的化部分がAPC抗原に結合し、かつ前記コンジュゲートが対象における液性腫瘍又は固形腫瘍の増殖を抑制することができる、請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物。
【請求項３５３】
前記標的化部分がB細胞抗原に結合し、かつ前記コンジュゲートが対象におけるB細胞腫瘍の増殖を抑制することができる、請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物。
【請求項３５４】
前記標的化部分がB細胞抗原に結合し、かつ前記コンジュゲートが対象における非B細胞腫瘍の増殖を抑制することができる、請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物。
【請求項３５５】
前記標的化部分がB細胞抗原に結合し、かつ前記コンジュゲートが対象における固形腫瘍の増殖を抑制することができる、請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物。
【請求項３５６】
前記標的化部分がpDC又はマクロファージ抗原に結合し、かつ前記コンジュゲートが対象における液性腫瘍の増殖を抑制することができる、請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物。
【請求項３５７】
前記標的化部分がpDC又はマクロファージ抗原に結合し、かつ前記コンジュゲートが対象における固形腫瘍の増殖を抑制することができる、請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物。
【請求項３５８】
前記コンジュゲートが細胞性免疫を増大させることができる、請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物。
【請求項３５９】
前記コンジュゲートが対象におけるT細胞腫瘍浸潤を増大させることができる、請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物。
【請求項３６０】
前記T細胞がCD4+又はCD8+ T細胞である、請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物。
【請求項３６１】
前記コンジュゲートが対象における適応的抗腫瘍免疫を惹起することができる、請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物。
【請求項３６２】
前記コンジュゲートが対象におけるIFNγ分泌又は発現を刺激することができる、請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物。
【請求項３６３】
前記コンジュゲートが対象における補体経路を活性化しない、請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物。
【請求項３６４】
前記コンジュゲートが対象における補体C3を活性化しない、請求項157〜203のいずれか一項記載の免疫調節ポリヌクレオチド、請求項204〜216のいずれか一項記載の組成物、請求項217〜268のいずれか一項記載のコンジュゲート、請求項269〜282のいずれか一項記載の組成物、又は請求項283記載の医薬組成物。
【請求項３６５】
癌を有する対象における癌を治療する方法であって、CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を該対象に投与することを含み、ここで、該CpG-Ab免疫コンジュゲートが腫瘍関連抗原(TAA)に結合しない、前記方法。
【請求項３６６】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが少なくとも1つのtoll様受容体を発現する正常免疫細胞と関連する標的抗原に特異的に結合する、請求項365記載の方法。
【請求項３６７】
前記正常免疫細胞がTLR9を発現する、請求項366記載の方法。
【請求項３６８】
前記正常免疫細胞が抗原提示細胞(APC)である、請求項366又は367記載の方法。
【請求項３６９】
前記APCが、B細胞、樹状細胞、又はマクロファージである、請求項368記載の方法。
【請求項３７０】
前記標的抗原が、MHC分子、T細胞共刺激分子、免疫チェックポイント分子、B細胞特異的抗原、樹状細胞抗原特異的抗原、及びマクロファージ特異的抗原からなる群から選択される、請求項369記載の方法。
【請求項３７１】
前記MHC分子がMHCクラスI及びMHCクラスII分子から選択される、請求項370記載の方法。
【請求項３７２】
前記T細胞共刺激分子が、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1/CD11a/CD18、ICOS/CD278、4-1BB/CD137、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、及びCD83からなるリストから選択される、請求項370又は371記載の方法。
【請求項３７３】
前記免疫チェックポイント分子が、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、CLTA-4、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD47、CD160、2B4、CD172a、及びTGFRからなるリストから選択される、請求項370〜372のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７４】
前記標的抗原が、CD1、CD2、CD5、CD6、CD9、CD11、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD30、CD38、CD40、CD44、CD45R(B220)、CD49、CD52、CD56、CD74、CD79b、CD93、CD123、CD138、CD163、CD205、CD206、CD274、CD303、及びCD304からなる群から選択される、請求項370〜373のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７５】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが表2から選択される免疫刺激ポリヌクレオチドを含む、請求項365〜374のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７６】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが、p236、p238、p243、p246、p275、p276、p308、p313、p347、p361、p362、p425、p433、p434、p435、p436、p437、p438、p477、p478、p479、p480、p481、p482、p483、p484、p485、p486、p487、p488、及びp489からなる群から選択される免疫刺激ポリヌクレオチドを含む、請求項375記載の方法。
【請求項３７７】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートがT細胞エピトープにコンジュゲートされない、請求項365〜376のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７８】
前記T細胞エピトープがオボアルブミン(OVA)のエピトープである、請求項365〜376のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７９】
癌を有する対象における癌を治療する方法であって、CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を該対象に投与することを含み、ここで、該CpG-Ab免疫コンジュゲートが腫瘍関連抗原(TAA)に特異的に結合し、ここで、該TAAが、CD19、CD20、CD22、STAT3、エクスポーチン7、Her2、Src、EGFR、CD52、CXCR-4、Muc-1、及びDNAからなる群から選択される抗原ではない、前記方法。
【請求項３８０】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートと前記TAAとの結合が該TAAを発現する癌細胞内への該CpG-Ab免疫コンジュゲートの内在化を促進する、請求項379記載の方法。
【請求項３８１】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートと前記TAAとの結合が該TAAを発現する癌細胞のエンドソームへの該CpG-Ab免疫コンジュゲートの輸送を促進する、請求項379又は380記載の方法。
【請求項３８２】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートと前記TAAとの結合が該TAAを発現する癌細胞におけるTLR9シグナル伝達経路の活性化を促進する、請求項379〜381のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８３】
前記TAA及び前記TLR9が該TAAを発現する癌細胞の同じ細胞膜上に位置する、請求項382記載の方法。
【請求項３８４】
前記TAAと前記TLR9の両方が該TAAを発現する癌細胞の細胞膜上に位置する、請求項383記載の方法。
【請求項３８５】
前記TAAと前記TLR9の両方が該TAAを発現する癌細胞のエンドソーム膜上に位置する、請求項383記載の方法。
【請求項３８６】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートと前記TAAとの結合が該TAAを発現する癌細胞のアポトーシスを誘導する、請求項379〜385のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８７】
前記TAAが正常免疫細胞によって発現されない、請求項379〜386のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８８】
前記TAAが正常免疫細胞によって発現される、請求項379〜386のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８９】
前記正常免疫細胞が抗原提示細胞(APC)である、請求項388記載の方法。
【請求項３９０】
前記TAAが、CD8、CD11b、CD11c、CD14、CD33、CD40、CD123、CD157、CD168、CD169、CD172a、CD200、CD204、CD205、CD301、CD302、CD303、CD304、CD205、及びCD206からなる群から選択される、請求項379〜389のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９１】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが前記TAAにも前記癌細胞によって発現される任意の他のTAAにもコンジュゲートされない、請求項379〜390のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９２】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが表2から選択される免疫刺激ポリヌクレオチドを含む、請求項379〜392のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９３】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが、p236、p238、p243、p246、p275、p276、p308、p313、p347、p361、p362、p425、p433、p434、p435、p436、p437、p438、p477、p478、p479、p480、p481、p482、p483、p484、p485、p486、p487、p488、及びp489からなる群から選択される免疫刺激ポリヌクレオチドを含む、請求項392記載の方法。
【請求項３９４】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートがT細胞エピトープにコンジュゲートされない、請求項379〜393のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９５】
前記T細胞エピトープがオボアルブミン(OVA)である、請求項394記載の方法。
【請求項３９６】
免疫療法抵抗性又は不応性癌を有する対象における免疫療法抵抗性又は不応性癌を治療する方法であって、CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を該対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項３９７】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが腫瘍関連抗原に結合しない、請求項396記載の方法。
【請求項３９８】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが少なくとも1つのtoll様受容体を発現する正常免疫細胞と関連する標的抗原に特異的に結合する、請求項397記載の方法。
【請求項３９９】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが腫瘍関連抗原に特異的に結合する、請求項396記載の方法。
【請求項４００】
前記癌が免疫チェックポイントモジュレーターによる治療に抵抗性である、請求項396〜399のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０１】
前記対象に、前記免疫チェックポイントモジュレーターを共投与することをさらに含む、請求項400記載の方法。
【請求項４０２】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが表2から選択される免疫刺激ポリヌクレオチドを含む、請求項396〜401のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０３】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが、p236、p238、p243、p246、p275、p276、p308、p313、p347、p361、p362、p425、p433、p434、p435、p436、p437、p438、p477、p478、p479、p480、p481、p482、p483、p484、p485、p486、p487、p488、及びp489からなる群から選択される免疫刺激ポリヌクレオチドを含む、請求項402記載の方法。
【請求項４０４】
それを必要としている対象における癌を予防する方法であって、CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を該対象に投与することを含み、ここで、該CpG-Ab免疫コンジュゲートが少なくとも1つのtoll様受容体を発現する正常免疫細胞と関連する標的抗原に特異的に結合する、前記方法。
【請求項４０５】
腫瘍関連抗原を前記CpG-Ab免疫コンジュゲートと共投与することをさらに含む、請求項404記載の方法。
【請求項４０６】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが前記腫瘍関連抗原にコンジュゲートされない、請求項405記載の方法。
【請求項４０７】
前記正常免疫細胞がTLR9を発現する、請求項404〜406のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０８】
前記正常免疫細胞が抗原提示細胞(APC)である、請求項404又は407のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０９】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが表2から選択される免疫刺激ポリヌクレオチドを含む、請求項404〜408のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１０】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが、p236、p238、p243、p246、p275、p276、p308、p313、p347、p361、p362、p425、p433、p434、p435、p436、p437、p438、p477、p478、p479、p480、p481、p482、p483、p484、p485、p486、p487、p488、及びp489からなる群から選択される免疫刺激ポリヌクレオチドを含む、請求項409記載の方法。
【請求項４１１】
それを必要としている対象における癌を予防する方法であって、CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を癌ワクチンと共投与することを含み、ここで、該CpG-Ab免疫コンジュゲートが少なくとも1つのtoll様受容体を発現する正常免疫細胞と関連する標的抗原に特異的に結合する、前記方法。
【請求項４１２】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが前記癌ワクチンのアジュバントとして製剤化される、請求項411記載の方法。
【請求項４１３】
対象における適応免疫応答を誘導する方法であって、CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を該対象に投与することを含み、ここで、該CpG-Ab免疫コンジュゲートが少なくとも1つのtoll様受容体を発現する正常免疫細胞と関連する標的抗原に特異的に結合する、前記方法。
【請求項４１４】
前記対象が癌を有する、請求項413記載の方法。
【請求項４１５】
前記標的抗原がTAAではない、請求項414記載の方法。
【請求項４１６】
前記標的抗原が、CD19、CD20、CD22、STAT3、エクスポーチン7、Her2、Src、EGFR、CD52、CXCR-4、Muc-1、及びDNAからなる群から選択される抗原ではないTAAである、請求項414記載の方法。
【請求項４１７】
前記対象が感染性疾患を有する、請求項414記載の方法。
【請求項４１８】
前記正常免疫細胞がTLR9を発現する、請求項413〜417のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１９】
前記正常免疫細胞が抗原提示細胞(APC)である、請求項413〜418のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２０】
前記適応免疫応答がCD8+ T細胞依存性である、請求項413〜419のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２１】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが表2から選択される免疫刺激ポリヌクレオチドを含む、請求項413〜420のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２２】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが、p236、p238、p243、p246、p275、p276、p308、p313、p347、p361、p362、p425、p433、p434、p435、p436、p437、p438、p477、p478、p479、p480、p481、p482、p483、p484、p485、p486、p487、p488、及びp489からなる群から選択される免疫刺激ポリヌクレオチドを含む、請求項421記載の方法。
【請求項４２３】
癌を有する対象における癌を治療する方法であって、該対象に、表6-A及び6-Bから選択されるCpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項４２４】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが腫瘍関連抗原(TAA)に結合する、請求項423記載の方法。
【請求項４２５】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが前記TAA以外の標的抗原に結合する、請求項423又は424記載の方法。
【請求項４２６】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートがTLR受容体を発現する正常免疫細胞と関連する標的抗原に結合する、請求項423〜425のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２７】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが、p236、p238、p243、p246、p275、p276、p308、p313、p347、p361、p362、p425、p433、p434、p435、p436、p437、p438、p477、p478、p479、p480、p481、p482、p483、p484、p485、p486、p487、p488、及びp489を含むCpG-Ab免疫コンジュゲートからなる群から選択される、請求項423〜426のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２８】
少なくとも1つのさらなる癌療法剤の治療有効量を共投与することをさらに含む、請求項365〜427のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２９】
前記少なくとも1つのさらなる癌療法剤が、第二のTAA、T細胞共刺激分子、及び免疫チェックポイントモジュレーターから選択される、請求項428記載の方法。
【請求項４３０】
前記第二のTAAが前記TAAと同じである、請求項429記載の方法。
【請求項４３１】
前記第二のTAAが前記TAAと異なる、請求項429記載の方法。
【請求項４３２】
前記T細胞共刺激分子が、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1/CD11a/CD18、ICOS/CD278、4-1BB/CD137、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、及びCD83、又はこれらのリガンドからなるリストから選択される、請求項429〜431のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３３】
前記T細胞共刺激分子が、抗OX40抗体、抗ICOS/CD278抗体、もしくは抗4-1BB/CD137抗体、又はこれらの抗原結合断片である、請求項432記載の方法。
【請求項４３４】
前記免疫チェックポイントモジュレーターが、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、CLTA-4、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD47、CD160、2B4、CD172a、及びTGFRからなるリストから選択される免疫チェックポイント分子のインヒビターである、請求項429〜433のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３５】
前記免疫チェックポイントモジュレーターが、抗CD47抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、又はこれらの抗原結合断片である、請求項434記載の方法。
【請求項４３６】
前記癌が固形腫瘍である、請求項365〜435のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３７】
前記癌が液性腫瘍である、請求項365〜435のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３８】
前記癌が再発癌である、請求項365〜437のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３９】
前記投与又は共投与が全身投与によるものである、請求項365〜438のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４０】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量が前記対象における補体経路を活性化するのに有効ではない、請求項365〜439のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４１】
前記量が前記対象における補体C3を活性化するのに有効ではない、請求項440記載の方法。
【請求項４４２】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが請求項68の化合物である、請求項365〜441のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４３】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが請求項1記載のオリゴヌクレオチドを含む、請求項365〜442のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４４】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが請求項65記載の化合物を含む、請求項365〜443のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４５】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが請求項78記載の化合物を含む、請求項365〜444のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４６】
前記CpG-Ab免疫コンジュゲートが、SB-342、SB-343、SB-341、SB-340、SB-179、SB-181、SB-186、SB-189、SB-228、SB-229、SB-242、SB-263、SB-337、SB-267、SB-284、SB-312、SB-313、SB-347、SB-373、SB-382、SB-388、SB-389、SB-408、SB-416、SB-419、SB-421、SB-423、SB-426、SB-427、SB-428、SB-429、及びSB-430から選択される、請求項365〜445のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願の相互参照)
本出願は、それぞれ、2017年4月14日及び7月27日に出願された、米国仮出願第62/485,748号及び第62/537,925号の恩典を主張するものであり;その各々の開示は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
(発明の分野)
本発明は、免疫系応答を調節する組成物及び方法に関する。本明細書に提供されるのは、免疫調節ポリヌクレオチドである。また本明細書に提供されるのは、5-修飾ウリジン又は5-修飾シチジンを含み、かつ約6〜約16ヌクレオチドの範囲の長さを有する免疫調節ポリヌクレオチドである。さらに本明細書に提供されるのは、標的化部分及び1以上の免疫調節ポリヌクレオチドを含むコンジュゲートである。本明細書に提供されるのは、免疫調節ポリヌクレオチド又は標的化部分及び1以上の免疫調節ポリヌクレオチドを含むコンジュゲートを含む医薬組成物である。本明細書に提供されるのは、癌などの疾患を治療するためのそれらの使用方法である。
【背景技術】
【０００３】
(背景)
病原体関連分子パターン(PAMP)は、様々な病原体と関連する分子であり、toll様受容体(TLR)及び自然免疫応答を活性化する他のパターン認識受容体(PRR)によって認識される。病原体の非存在下で免疫系を動員するPAMPの能力は、細胞破壊を伴う種々の疾患を自然免疫系応答の使用を介して治療するための戦略(例えば、抗癌療法)を提供する。種々の治療応用について検討されているPAMPの1つのクラスは、CpG ODN(例えば、アガトリモド)などの免疫刺激ポリヌクレオチドである。CpG ODNは、免疫細胞(例えば、B細胞、単球、及び形質細胞様樹状細胞(pDC))におけるTLR9二量体化を媒介して、サイトカイン(例えば、I型インターフェロン及びインターロイキン)を上方調節し、それにより、ナチュラルキラー細胞を活性化すると考えられる。
【０００４】
CpG ODNは、通常、3つのクラス:クラスA、クラスB、及びクラスCに分類される。クラスAのCpG ODNは、通常、ホスホロチオエート骨格を有する3'-及び5'-末端のポリ-Gテール並びにホスフェート骨格を含む中央のパリンドローム配列を含有する。クラスAのCpG ODNは、通常、中央のパリンドローム配列中に、CpGを含有する。クラスBのCpG ODNは、通常、完全ホスホロチオエート骨格を含み、クラスBのCpG ODNの5'末端の配列は、多くの場合、TLR9活性化に極めて重要である。クラスCのCpG ODNは、二重鎖の形成を可能にする3'-末端配列を有する完全ホスホロチオエート骨格を含む。CpG ODNは、多くの場合、血清中での分解を起こしやすい。したがって、CpG ODNの薬物動態は、治療薬としてのその開発における限定要因の1つとなり得る。さらに、CpG ODNは、インビボで不均一な組織分布を示すことが多く、主要な蓄積部位は、肝臓、腎臓、及び脾臓内である。そのような分布は、PAMPと関連するオフターゲット活性及び局所毒性を誘発することがある。したがって、CpG ODNの治療応用は、本明細書に記載される薬物動態的/薬力学的課題に対処することにより促進することができる。
【０００５】
したがって、新規の免疫調節ポリヌクレオチドが必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
(発明の概要)
一般に、本発明は、免疫調節(例えば、免疫刺激)ポリヌクレオチド、並びに標的化部分及び1以上の免疫調節(例えば、免疫刺激)ポリヌクレオチドを含有するコンジュゲートに関する。
【０００７】
一態様において、開示されるのは、免疫調節ポリヌクレオチドである。該免疫調節ポリヌクレオチドは、免疫刺激ポリヌクレオチドであり得る。或いは、該免疫調節ポリヌクレオチドは、免疫抑制ポリヌクレオチドであり得る。
【０００８】
いくつかの実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドは、1以上(例えば、1又は2つ)の脱塩基スペーサー又はホスホトリエステルを含有する。特定の実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドは、1以上(例えば、1〜5つ)のヌクレオシド間ホスホトリエステルを含有する。さらなる実施態様において、該ヌクレオシド間ホスホトリエステルのうちの少なくとも1つは、共役基を含有する。またさらなる実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドは、末端リン酸エステル(例えば、5'-末端リン酸エステル又は3'-末端リン酸エステル)をさらに含有する。またさらなる実施態様において、該末端リン酸エステルは、共役基を含有する。他の実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドは、5'-キャップ又は3'-キャップを含む。さらに他の実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドは、5'-5'キャップである5'-キャップを含有する。さらに他の実施態様において、該5'-5'キャップは、ヌクレオシド間ホスフェート、ヌクレオシド間ホスホロチオエート、又はヌクレオシド間ホスホロジチオエートに共有結合した共役基を含有する。いくつかの実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドは、ヌクレオシド間ホスフェート、ヌクレオシド間ホスホロチオエート、又はヌクレオシド間ホスホロジチオエートに共有結合した共役基を含有する3'-キャップを含む。
【０００９】
さらなる実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドは、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、補助部分、末端ホスホジエステル、末端ホスホトリエステル、5'-5'キャップ、又は基-OR'(ここで、R'は、生体可逆性基、非生体可逆性基、又はO-保護基である)である5'-キャッピング基を含有する。またさらなる実施態様において、該5'-キャッピング基は、ホスフェート、ホスホロチオエート、又はホスホロジチオエートに結合した任意に置換されたC1-6アルキルを含むモノホスフェート又は末端ホスホジエステルである。またさらなる実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドは、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、補助部分、末端ホスホジエステル、末端ホスホトリエステル、及び基-OR'(ここで、R'は、生体可逆性基、非生体可逆性基、又はO-保護基である)である3'-キャッピング基を含有する。いくつかの実施態様において、該3'-キャッピング基は、ホスフェート、ホスホロチオエート、又はホスホロジチオエートに結合した任意に置換されたC1-6アルキルを含むモノホスフェート又は末端ホスホジエステルである。
【００１０】
特定の実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドは、1以上(例えば、1又は2つ)の脱塩基スペーサーを含有する。さらなる実施態様において、該脱塩基スペーサーの少なくとも1つは、ヌクレオシド間脱塩基スペーサーである。またさらなる実施態様において、該脱塩基スペーサーの少なくとも1つは、3'-末端脱塩基スペーサーである。またさらなる実施態様において、該脱塩基スペーサーの少なくとも1つは、共役基を含む。
【００１１】
ある実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドは、5-修飾ウリジン(例えば、5-ハロウリジン(例えば、5-ブロモウリジンもしくは5-ヨードウリジン)又は5-修飾シチジン)を含有する。さらなる実施態様において、該5-修飾ウリジン(例えば、5-ハロウリジン(例えば、5-ブロモウリジン又は5-ヨードウリジン))は、2つの5'-末端ヌクレオシドのうちの少なくとも1つであるか、又は該免疫調節ポリヌクレオチド中の免疫刺激配列(ISS)中に存在する。またさらなる実施態様において、該5-修飾ウリジン(例えば、5-ハロウリジン)は、ヌクレオシド間ホスホジエステルホスフェートに結合した3'-位を含む。ある実施態様において、該5-修飾ウリジン(例えば、5-ハロウリジン)は、ヌクレオシド間ホスホジエステルホスホロチオエートに結合した3'-位を含む。またさらなる実施態様において、該5-修飾ウリジン(例えば、5-ハロウリジン)は、5'-末端のものである。いくつかの実施態様において、該5-修飾ウリジンは、5-ブロモウリジンである。特定の実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドは、シチジン及びグアノシンを2番目及び3番目のヌクレオシドとして又は3番目及び4番目のヌクレオシドとして含有する。
【００１２】
特定の実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドは、5'-末端免疫刺激配列を含有する。ある実施態様において、該ヌクレオシド間ホスホトリエステルのうちの少なくとも1つは、5'-末端免疫刺激配列に結合している5'-炭素原子を有するヌクレオシドの3'-炭素原子に結合している。
【００１３】
さらなる実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドは、合計6〜16(例えば、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、又は16)のヌクレオチドを含む。またさらなる実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチド中のヌクレオシド間架橋基の少なくとも10％(例えば、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、又は少なくとも90％)は、ホスホロチオエートを含有する。またさらなる実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチド中のヌクレオシド間架橋基の少なくとも50％は、ホスホロチオエートを含有する。
【００１４】
いくつかの実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドは、該免疫調節ポリヌクレオチド中のヌクレオ塩基に共有結合した共役基を含む。
【００１５】
ある実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドは、1以上の補助部分を含む。特定の実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドは、該補助部分のうちの少なくとも1つを含有するコンジュゲート部分を含む。いくつかの実施態様において、該補助部分のうちの少なくとも1つは、100Da〜2,500Daの分子量を有するポリ(エチレングリコール)(PEG)を含有する。さらなる実施態様において、各々のPEGは、独立に、合計少なくとも3つのエチレングリコール反復単位を含有する。またさらなる実施態様において、各々のPEGは、独立に、合計少なくとも20のエチレングリコール反復単位を含有する。またさらなる実施態様において、各々のPEGは、独立に、合計50以下のエチレングリコール反復単位を含有する。他の実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドは、1〜8つのPEGを含有する。
【００１６】
特定の実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドは、本明細書に(例えば、表2に)開示されるポリヌクレオチドである。
【００１７】
別の態様において、開示されるのは、相補的ポリヌクレオチドにハイブリダイズした免疫調節ポリヌクレオチドを含有するハイブリダイズした免疫調節ポリヌクレオチドである。
【００１８】
また別の態様において、開示されるのは、免疫調節ポリヌクレオチドを含有する組成物であり、ここで、該免疫調節ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートを含有する。
【００１９】
いくつかの実施態様において、少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートは、該免疫調節ポリヌクレオチド中の免疫刺激配列中の5'-末端ヌクレオシドとCpGのシチジンの間に配置されている。さらなる実施態様において、1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートは、該免疫調節ポリヌクレオチド中の1番目のヌクレオシドと2番目のヌクレオシドを接続する。またさらなる実施態様において、1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートは、該免疫調節ポリヌクレオチド中の免疫刺激配列中のCpGのシチジンの5'-炭素原子に結合している。またさらなる実施態様において、1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートは、該免疫調節ポリヌクレオチド中の4番目のヌクレオシドと5番目のヌクレオシドを接続する。ある実施態様において、該立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートは、S-ステレオジェニックである。特定の実施態様において、該立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートは、R-ステレオジェニックである。
【００２０】
また別の態様において、開示されるのは、標的化部分及び1以上の免疫調節ポリヌクレオチドを含有するコンジュゲートである。
【００２１】
いくつかの実施態様において、該標的化部分は、抗原結合部分、ポリペプチド、アプタマー、又は1以上の小分子を含む基である。ある実施態様において、該標的化部分は、抗原結合部分(例えば、抗体又はその抗原結合断片)である。さらなる実施態様において、該抗体又は該抗体断片は、N-末端又はC-末端Q-タグを含み、ここで、該免疫調節ポリヌクレオチドは、独立に、該N-末端又はC-末端Q-タグに共有結合している。またさらなる実施態様において、該Q-タグは、該抗体又は該抗体断片の重鎖又は軽鎖中に配置されている。
【００２２】
特定の実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドは、他の態様において開示されている通りである。
【００２３】
ある実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つは、5-修飾ウリジン又は5-修飾シチジンを含有する。さらなる実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つは、5-ハロウリジン、5-アルキニルウリジン、又は5-ヘテロシクリルウリジンである5-修飾ウリジンを含む。またさらなる実施態様において、該5-修飾ウリジンは、5-ハロウリジン(例えば、5-ブロモウリジン又は5-ヨードウリジン)である。いくつかの実施態様において、該5-修飾ウリジンは、該免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つの2つの5'-末端ヌクレオチドのうちの1つである。他の実施態様において、該5-修飾ウリジンは、ヌクレオシド間リン酸エステルホスフェートに結合した3'-位を含む。さらに他の実施態様において、該5-修飾ウリジンは、ヌクレオシド間リン酸エステルホスホロチオエートに結合した3'-位を含む。さらに他の実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つは、シチジン及びグアノシンを2番目及び3番目のヌクレオシドとして含有する。特定の実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つは、シチジン及びグアノシンを3番目及び4番目のヌクレオシドとして含有する。
【００２４】
いくつかの実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つは、合計6〜16(例えば、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、又は16)のヌクレオチドを含有する。
【００２５】
さらなる実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つは、1以上の脱塩基スペーサー又はヌクレオシド間ホスホトリエステルを含有する。またさらなる実施態様において、少なくとも1つの脱塩基スペーサー又は少なくとも1つのホスホトリエステルは、リンカーを含有する。
【００２６】
特定の実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つは、1以上(例えば、1又は2つ)の脱塩基スペーサーを含有する。他の実施態様において、該脱塩基スペーサーの少なくとも1つは、ヌクレオシド間脱塩基スペーサーである。さらに他の実施態様において、該脱塩基スペーサーの少なくとも1つは、3'-末端脱塩基スペーサーである。
【００２７】
ある実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つは、1以上(例えば、1〜5つ)のヌクレオシド間ホスホトリエステルを含有する。
【００２８】
いくつかの実施態様において、該コンジュゲートは、リンカーに結合した1以上の補助部分をさらに含有する。さらなる実施態様において、該補助部分の少なくとも1つは、100Da〜2,500Daの分子量を有するポリ(エチレングリコール)(PEG)を含有する。またさらなる実施態様において、各々のPEGは、独立に、合計少なくとも3つ(例えば、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16、少なくとも18、又は少なくとも20)のエチレングリコール反復単位を含有する。またさらなる実施態様において、各々のPEGは、独立に、合計50以下の(例えば、45以下、40以下、35以下、又は30以下)のエチレングリコール反復単位を含有する。ある実施態様において、該コンジュゲートは、1〜8つのPEGを含有する。
【００２９】
特定の実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つにおける5'-キャッピング基は、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、補助部分、末端ホスホジエステル、末端ホスホトリエステル、又は基-OR'(ここで、R'は、生体可逆性基、非生体可逆性基、もしくはO-保護基である)である。さらなる実施態様において、該5'-キャッピング基は、モノホスフェート又はホスフェート、ホスホロチオエート、もしくはホスホロジチオエートに結合した任意に置換されたC1-6アルキルを含有する末端ホスホジエステルである。またさらなる実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つにおける3'-キャッピング基は、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、補助部分、末端ホスホジエステル、末端ホスホトリエステル、又は基-OR'(ここで、R'は、生体可逆性基、非生体可逆性基、もしくはO-保護基である)である。他の実施態様において、該3'-キャッピング基は、モノホスフェート又はホスフェート、ホスホロチオエート、もしくはホスホロジチオエートに結合した任意に置換されたC1-6アルキルを含有する末端ホスホジエステルである。
【００３０】
ある実施態様において、免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つは、リンカーに結合したヌクレオ塩基を含有する。
【００３１】
さらなる実施態様において、該コンジュゲートは、1〜6つ(例えば、1〜4つ)の免疫調節ポリヌクレオチドを含有する。またさらなる実施態様において、該コンジュゲートは、ただ1つの免疫調節ポリヌクレオチドを含有する。またさらなる実施態様において、該コンジュゲートは、ただ2つの免疫調節ポリヌクレオチドを含有する。他の実施態様において、該コンジュゲートは、1つの標的化部分を含有する。
【００３２】
いくつかの実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドは、5'-末端の4ヌクレオチド以内にヒト免疫刺激配列を含有する。ある実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドの5'-末端の4ヌクレオチド以内のヒト免疫刺激配列は、ヌクレオシドと置換されたリン酸エステルに結合した5'-炭素原子を含有するシチジンを含む。
【００３３】
特定の実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つは、5-修飾ウリジン又は5-修飾シチジンを含有する。
【００３４】
ある実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つは、その相補体にハイブリダイズしている。
【００３５】
さらなる実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つは、少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートを含有する。
【００３６】
さらなる態様において、開示されるのは、標的化部分及び1以上の免疫調節ポリヌクレオチドを含むコンジュゲートを含有する組成物であって、該免疫調節ポリヌクレオチドの各々が、独立に、リンカーを含み、ここで、該標的化部分が該リンカーに共有結合しており、かつ該免疫調節ポリヌクレオチドの少なくとも1つが少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートを含有する、組成物である。
【００３７】
いくつかの実施態様において、少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートは、該免疫調節ポリヌクレオチド中の免疫刺激配列中の5'-末端ヌクレオシドとCpGのシチジンの間に配置されている。ある実施態様において、少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートは、該免疫調節ポリヌクレオチド中の免疫刺激配列中のCpGのシチジンの5'-炭素原子に結合している。特定の実施態様において、少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートは、該免疫調節ポリヌクレオチド中の1番目のヌクレオシドと2番目のヌクレオシドを接続する。さらなる実施態様において、少なくとも1つの立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートは、該免疫調節ポリヌクレオチド中の4番目のヌクレオシドと5番目のヌクレオシドを接続する。またさらなる実施態様において、該立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートは、S-ステレオジェニックである。またさらなる実施態様において、該立体化学的に濃縮されたヌクレオシド間ホスホロチオエートは、R-ステレオジェニックである。
【００３８】
またさらなる態様において、開示されるのは、医薬として許容し得る担体及び本発明の免疫調節ポリヌクレオチド、本発明の立体化学的に濃縮された組成物、又は本発明のコンジュゲートを含有する医薬組成物である。
【００３９】
またさらなる態様において、開示されるのは、エンドソーム性toll様受容体を含む細胞を、本発明の免疫調節ポリヌクレオチド、本発明の組成物、本発明のコンジュゲート、又は本発明の医薬組成物と、該免疫調節ポリヌクレオチドが該細胞に輸送されることを可能にする条件下で接触させることにより、該エンドソーム性toll様受容体を含む細胞でエンドソーム性toll様受容体を調節する方法であって、該接触の後、該エンドソーム性toll様受容体の活性が調節される、方法である。
【００４０】
いくつかの実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドは、免疫刺激ポリヌクレオチドであり、該方法は、エンドソーム性toll様受容体を刺激するためのものである。
【００４１】
特定の実施態様において、該免疫調節ポリヌクレオチドは、免疫抑制ポリヌクレオチドであり、該方法は、エンドソーム性toll様受容体を抑制するためのものである。
【００４２】
別の態様において、開示されるのは、エンドソーム性toll様受容体を含有する抗原提示細胞を、本発明の免疫調節ポリヌクレオチド、本発明の組成物、本発明のコンジュゲート、又は本発明の医薬組成物と、該1以上の免疫調節ポリヌクレオチドが該細胞内に輸送されるのを可能にする条件下で接触させることにより、該抗原提示細胞において1以上のサイトカインを誘導する方法であって、該接触の後、該細胞内の少なくとも1つのサイトカインのレベルが増大し、該標的化部分が該抗原提示細胞を標的とし、かつ該免疫調節ポリヌクレオチドが免疫刺激ポリヌクレオチドである、方法である。
【００４３】
いくつかの実施態様において、該抗原提示細胞は、B細胞である。ある実施態様において、該1以上のサイトカインのうちの少なくとも1つは、炎症性サイトカインである。特定の実施態様において、該抗原提示細胞は、形質細胞様樹状細胞であり、ここで、該標的化部分は、該形質細胞様樹状細胞を標的とする。ある実施態様において、該抗原提示細胞は、マクロファージである。さらなる実施態様において、該サイトカインのうちの少なくとも1つは、I型インターフェロンである。またさらなる実施態様において、該toll様受容体は、TLR9である。
【００４４】
また別の態様において、開示されるのは、患者に、本発明の免疫調節ポリヌクレオチド、本発明の組成物、本発明のコンジュゲート、又は本発明の医薬組成物の有効量を投与することにより、該患者における液性腫瘍を治療する方法であって、該標的化部分がB細胞を標的とし、かつ該免疫調節ポリヌクレオチドがTLR9アゴニストである免疫刺激ポリヌクレオチドである、方法である。
【００４５】
ある実施態様において、該液性腫瘍は、血液学的腫瘍である(例えば、該血液学的腫瘍は、リンパ腫である)。特定の実施態様において、該リンパ腫は、非ホジキンB細胞リンパ腫である。さらなる実施態様において、該リンパ腫は、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、又は多発性骨髄腫である。
【００４６】
また別の態様において、開示されるのは、患者に、本発明の免疫調節ポリヌクレオチド、本発明の組成物、本発明のコンジュゲート、又は本発明の医薬組成物を投与することにより、患者における固形腫瘍を治療する方法であって、該標的化部分が形質細胞様樹状細胞を標的とし、かつ該免疫調節ポリヌクレオチドがTLR9アゴニストである免疫刺激ポリヌクレオチドである、方法である。いくつかの実施態様において、患者における固形腫瘍を治療する方法は、該患者に、本明細書に開示される免疫調節ポリヌクレオチドを投与することを含み、ここで、該免疫調節ポリヌクレオチドは、該患者におけるB細胞を標的とする。
【００４７】
本発明は、本明細書に記載される目的のための(例えば、患者における液性又は固形腫瘍を治療するための)製品(例えば、医薬品)の製造における本発明の免疫調節ポリヌクレオチド、本発明のコンジュゲート、本発明の組成物、又は本発明の医薬組成物の使用を提供することが理解されるべきである。本発明は、本明細書に記載される目的のための(例えば、患者における液性又は固形腫瘍を治療するための)本発明の免疫調節ポリヌクレオチド、本発明のコンジュゲート、本発明の組成物、又は本発明の医薬組成物の使用も提供することも理解されるべきである。さらに、本発明は、本明細書に記載される目的による使用のための(例えば、患者における液性又は固形腫瘍を治療するための)本発明の免疫調節ポリヌクレオチド、本発明のコンジュゲート、本発明の組成物、又は本発明の医薬組成物を提供することが理解されるべきである。
【００４８】
本発明の任意の態様において、リンカーは、本明細書に開示されている通りである(例えば、式(II)、(V)、及び(VI)〜(XV)のいずれか1つによるものである)ことができる。本発明の任意の態様において、該共役基は、本明細書に開示されている通りであることができる。
【００４９】
本明細書に提供されるのは、式(A)のオリゴヌクレオチド:又はその立体異性体、2以上のジアステレオマーの混合物、互変異性体、もしくは2以上の互変異性体の混合物;或いはこれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、又は水和物である;
X5'-(XN)b-YP-(XN)c-X3'      (A)
(式中:
各々のXNは、独立に、ヌクレオチドであり;
X3'は、3'末端ヌクレオチドであり;
X5'は、5'末端ヌクレオチドであり;
YPは、ヌクレオシド間ホスホトリエステルであり;かつ
b及びcは、各々、約0〜約25の範囲の整数であり;ただし、その和は5以上であり;
ここで、該オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオ塩基を有するヌクレオチドを含む)。
【００５０】
また本明細書に提供されるのは、N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5Tという配列を有するオリゴヌクレオチド、又はその立体異性体、2以上のジアステレオマーの混合物、互変異性体、もしくは2以上の互変異性体の混合物;或いはこれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、又は水和物である;
(ここで:
xは、1〜4の範囲の整数であり;
N1は、非存在又は2'-デオキシチミジンであり;
N2は、修飾ヌクレオ塩基を有する2'-デオキシリボヌクレオチドであり;
N3は、3'-ホスホトリエステルを各々任意に含む、2'-デオキシアデノシン又は2'-デオキシチミジンであり;
N4は、2'-デオキシアデノシン又は2'-デオキシチミジンであり;かつ
N5は、3'-ホスホトリエステルを任意に含む2'-デオキシチミジンである)。
【００５１】
さらに本明細書に提供されるのは、式(B)の化合物:又はその立体異性体、2以上のジアステレオマーの混合物、互変異性体、もしくは2以上の互変異性体の混合物;或いはこれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、又は水和物である;
RX-LN-(Q)e      (B)
(式中:
Rxは、共役基であり;
LNは、リンカーであり;
各々のQは、独立に、ホスホトリエステルを含むオリゴヌクレオチドであり;かつ
eは、1、2、3、又は4の整数である)。
【００５２】
さらに本明細書に提供されるのは、式(C)の化合物:又はその立体異性体、2以上のジアステレオマーの混合物、互変異性体、もしくは2以上の互変異性体の混合物;或いはこれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、又は水和物である;
【化１】
2020512843.tif 000003
(式中:
Abは、抗体であり;
各々のLNは、独立に、リンカーであり;
各々のQは、独立に、ホスホトリエステルを含むオリゴヌクレオチドであり;
各々のeは、独立に、1、2、3、又は4の整数であり;かつ
fは、1、2、3、又は4の整数である)。
【００５３】
一態様において、本明細書に提供されるのは、癌を有する対象における癌を治療する方法であって、CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を該対象に投与することを含み、ここで、該CpG-Ab免疫コンジュゲートが腫瘍関連抗原(TAA)に結合しない、方法である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、少なくとも1つのtoll様受容体を発現する正常免疫細胞と関連する標的抗原に特異的に結合する。いくつかの実施態様において、該正常免疫細胞は、TLR9を発現する。いくつかの実施態様において、該正常免疫細胞は、抗原提示細胞(APC)である。いくつかの実施態様において、該APCは、B細胞、樹状細胞、又はマクロファージである。いくつかの実施態様において、該標的抗原は、MHC分子、T細胞共刺激分子、免疫チェックポイント分子、B細胞特異的抗原、樹状細胞特異的抗原、及びマクロファージ特異的抗原からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、該MHC分子は、MHCクラスI及びMHCクラスII分子から選択される。いくつかの実施態様において、該T細胞共刺激分子は、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1/CD11a/CD18、ICOS/CD278、4-1BB/CD137、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、及びCD83からなるリストから選択される。いくつかの実施態様において、該免疫チェックポイント分子は、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-1、TIM-3、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、CLTA-4、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD47、CD160、2B4、CD172a、及びTGFRからなるリストから選択される。いくつかの実施態様において、標的抗原は、CD1、CD2、CD3、CD5、CD6、CD9、CD11、CD14、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD30、CD32、CD37、CD38、CD39、CD40、CD44、CD45R(B220)、CD49、CD52、CD55、CD56、CD64、CD66(癌胎児性抗原、CEA)、CD68、CD70、CD74、CD79b、CD80、CD93、CD115、CD123、CD126、CD127、CD137、CD138、CD163、CD196、CD197、CD200R、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、CD267、CD269、CD274、CD300a、CD301、CD303、CD304、CD319、CD336、CLEC5a、CLEC6、CLEC9a、CXCL16、CX3CR1、及びDC-STAMPからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、表2から選択される免疫刺激ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、p236、p238、p243、p246、p275、p276、p308、p313、p347、p361、p362、p425、p433、p434、p435、p436、p437、p438、p477、p478、p479、p480、p481、p482、p483、p484、p485、p486、p487、p488、及びp489からなる群から選択される免疫刺激ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、T細胞エピトープにコンジュゲートされていない。いくつかの実施態様において、該T細胞エピトープは、オボアルブミン(OVA)のエピトープである。いくつかの実施態様において、該癌は、固形腫瘍である。いくつかの実施態様において、該癌は、液性腫瘍である。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該癌は、再発癌である。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該投与又は共投与は、全身投与によるものである。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量は、対象における補体経路を活性化するのに有効ではない。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該量は、対象における補体C3を活性化するのに有効ではない。
【００５４】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、癌を有する対象における癌を治療する方法であって、CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を該対象に投与することを含み、ここで、該CpG-Ab免疫コンジュゲートが腫瘍関連抗原(TAA)に特異的に結合し、ここで、該TAAが、CD19、CD20、CD22、エクスポーチン7、Her2、Src、EGFR、CD52、CXCR-4、Muc-1、及びDNAからなる群から選択される抗原ではない、方法である。いくつかの実施態様において、CpG-Ab免疫コンジュゲートとTAAとの結合は、該TAAを発現する癌細胞内への該CpG-Ab免疫コンジュゲートの内在化を促進する。いくつかの実施態様において、CpG-Ab免疫コンジュゲートとTAAとの結合は、該TAAを発現する癌細胞のエンドソームへの該CpG-Ab免疫コンジュゲートの輸送を促進する。いくつかの実施態様において、CpG-Ab免疫コンジュゲートとTAAとの結合は、該TAAを発現する癌細胞におけるTLR9シグナル伝達経路の活性化を促進する。いくつかの実施態様において、TAAとTLR9は、該TAAを発現する癌細胞の同じ細胞膜上に位置する。いくつかの実施態様において、TAAとTLR9はどちらも、該TAAを発現する癌細胞の細胞膜上に位置する。いくつかの実施態様において、TAAとTLR9はどちらも、該TAAを発現する癌細胞のエンドソーム膜上に位置する。いくつかの実施態様において、CpG-Ab免疫コンジュゲートとTAAとの結合は、該TAAを発現する癌細胞のアポトーシスを誘導する。いくつかの実施態様において、該TAAは、正常免疫細胞によって発現されない。いくつかの実施態様において、該TAAは、正常免疫細胞によって発現される。いくつかの実施態様において、該正常免疫細胞は、抗原提示細胞(APC)である。いくつかの実施態様において、該TAAは、CD8、CD11b、CD11c、CD14、CD33、CD40、CD123、CD157、CD168、CD169、CD172a、CD200、CD204、CD205、CD301、CD302、CD303、CD304、及びCD206からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、TAA又は該癌によって発現される任意の他のTAAにコンジュゲートされない。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、表2から選択される免疫刺激ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、p236、p238、p243、p246、p275、p276、p308、p313、p347、p361、p362、p425、p433、p434、p435、p436、p437、p438、p477、p478、p479、p480、p481、p482、p483、p484、p485、p486、p487、p488、及びp489からなる群から選択される免疫刺激ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、T細胞エピトープにコンジュゲートされていない。いくつかの実施態様において、該T細胞エピトープは、オボアルブミン(OVA)である。いくつかの実施態様において、該癌は、固形腫瘍である。いくつかの実施態様において、該癌は、液性腫瘍である。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該癌は、再発癌である。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該投与又は共投与は、全身投与によるものである。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量は、対象における補体経路を活性化するのに有効ではない。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該量は、対象における補体C3を活性化するのに有効ではない。
【００５５】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、免疫療法抵抗性又は不応性癌を有する対象における免疫療法抵抗性又は不応性癌を治療する方法であって、CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を該対象に投与することを含む、方法である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、腫瘍関連抗原に結合しない。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、少なくとも1つのtoll様受容体を発現する正常免疫細胞と関連する標的抗原に特異的に結合する。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、腫瘍関連抗原に特異的に結合する。いくつかの実施態様において、該癌は、免疫チェックポイントモジュレーターによる治療に抵抗性である。いくつかの実施態様において、該方法は、該対象に、免疫チェックポイントモジュレーターを共投与することをさらに含む。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、表2から選択される免疫刺激ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、表2に示されるp236、p238、p243、p246、p275、p276、p308、p313、p347、p361、p362、p425、p433、p434、p435、p436、p437、p438、p477、p478、p479、p480、p481、p482、p483、p484、p485、p486、p487、p488、及びp489からなる群から選択される免疫刺激ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、該癌は、固形腫瘍である。いくつかの実施態様において、該癌は、液性腫瘍である。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該癌は、再発癌である。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該投与又は共投与は、全身投与によるものである。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量は、対象における補体経路を活性化するのに有効ではない。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該量は、対象における補体C3を活性化するのに有効ではない。
【００５６】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、それを必要としている対象における癌を予防する方法であって、CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を該対象に投与することを含み、ここで、該CpG-Ab免疫コンジュゲートが少なくとも1つのtoll様受容体を発現する正常免疫細胞と関連する標的抗原に特異的に結合する、方法である。いくつかの実施態様において、そのような方法は、腫瘍関連抗原を該CpG-Ab免疫コンジュゲートと共投与することをさらに含む。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、該腫瘍関連抗原にコンジュゲートされていない。いくつかの実施態様において、該正常免疫細胞は、TLR9を発現する。いくつかの実施態様において、該正常免疫細胞は、抗原提示細胞(APC)である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、表2から選択される免疫刺激ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、表2に示されるp236、p238、p243、p246、p275、p276、p308、p313、p347、p361、p362、p425、p433、p434、p435、p436、p437、p438、p477、p478、p479、p480、p481、p482、p483、p484、p485、p486、p487、p488、及びp489からなる群から選択される免疫刺激ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、該癌は、固形腫瘍である。いくつかの実施態様において、該癌は、液性腫瘍である。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該癌は、再発癌である。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該投与又は共投与は、全身投与によるものである。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量は、対象における補体経路を活性化するのに有効ではない。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該量は、対象における補体C3を活性化するのに有効ではない。
【００５７】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、それを必要としている対象における癌を予防する方法であって、CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を癌ワクチンと共投与することを含み、ここで、該CpG-Ab免疫コンジュゲートが少なくとも1つのtoll様受容体を発現する正常免疫細胞と関連する標的抗原に特異的に結合する方法である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、癌ワクチンのアジュバントとして製剤化される。いくつかの実施態様において、該癌は、固形腫瘍である。いくつかの実施態様において、該癌は、液性腫瘍である。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該癌は、再発癌である。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該投与又は共投与は、全身投与によるものである。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量は、対象における補体経路を活性化するのに有効ではない。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該量は、対象における補体C3を活性化するのに有効ではない。
【００５８】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象における適応免疫応答を誘導する方法であって、CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を該対象に投与することを含み、ここで、該CpG-Ab免疫コンジュゲートが少なくとも1つのtoll様受容体を発現する正常免疫細胞と関連する標的抗原に特異的に結合する、方法である。いくつかの実施態様において、該対象は、癌を有する。いくつかの実施態様において、該標的抗原は、TAAではない。いくつかの実施態様において、該標的抗原は、CD19、CD20、CD22、STAT3、エクスポーチン7、Her2、Src、EGFR、CD52、CXCR-4、Muc-1、及びDNAからなる群から選択される抗原ではないTAAである。いくつかの実施態様において、該対象は、感染性疾患を有する。いくつかの実施態様において、該正常免疫細胞は、TLR9を発現する。いくつかの実施態様において、該正常免疫細胞は、抗原提示細胞(APC)である。いくつかの実施態様において、該適応免疫応答は、CD8+ T細胞依存性である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、表2から選択される免疫刺激ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、表2に示されるp236、p238、p243、p246、p275、p276、p308、p313、p347、p361、p362、p425、p433、p434、p435、p436、p437、p438、p477、p478、p479、p480、p481、p482、p483、p484、p485、p486、p487、p488、及びp489からなる群から選択される免疫刺激ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様において、該癌は、固形腫瘍である。いくつかの実施態様において、該癌は、液性腫瘍である。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該癌は、再発癌である。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該投与又は共投与は、全身投与によるものである。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量は、対象における補体経路を活性化するのに有効ではない。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該量は、対象における補体C3を活性化するのに有効ではない。
【００５９】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、癌を有する対象における癌を治療する方法であって、該対象に、表6から選択されるCpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を投与することを含む、方法である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、腫瘍関連抗原(TAA)に結合する。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、TAA以外の標的抗原に結合する。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、TLR受容体を発現する正常免疫細胞と関連する標的抗原に結合する。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、表2に示されるp236、p238、p243、p246、p275、p276、p308、p313、p347、p361、p362、p425、p433、p434、p435、p436、p437、p438、p477、p478、p479、p480、p481、p482、p483、p484、p485、p486、p487、p488、及びp489を含むCpG-Ab免疫コンジュゲートからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、少なくとも1つのさらなる癌療法剤の治療有効量を共投与することをさらに含む。いくつかの実施態様において、少なくとも1つのさらなる癌療法剤は、第二のTAA、T細胞共刺激分子、及び免疫チェックポイントモジュレーターから選択される。いくつかの実施態様において、第二のTAAは、該TAAと同じである。いくつかの実施態様において、第二のTAAは、該TAAと異なっている。いくつかの実施態様において、該T細胞共刺激分子は、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1/CD11a/CD18、ICOS/CD278、4-1BB/CD137、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、及びCD83、又はこれらのリガンドからなるリストから選択される。いくつかの実施態様において、該T細胞共刺激分子は、抗OX40抗体、抗ICOS/CD278抗体、もしくは抗4-1BB/CD137抗体、又はこれらの抗原結合断片である。いくつかの実施態様において、ここで、該免疫チェックポイントモジュレーターは、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、CLTA-4、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD47、CD160、2B4、CD172a、及びTGFRからなるリストから選択される免疫チェックポイント分子のインヒビターである。いくつかの実施態様において、該免疫チェックポイントモジュレーターは、抗CD47抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、又はこれらの抗原結合断片である。いくつかの実施態様において、該癌は、固形腫瘍である。いくつかの実施態様において、該癌は、液性腫瘍である。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該癌は、再発癌である。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該投与又は共投与は、全身投与によるものである。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量は、対象における補体経路を活性化するのに有効ではない。本明細書に提供される方法のいくつかの実施態様において、該量は、対象における補体C3を活性化するのに有効ではない。
【００６０】
本明細書に提供される方法のいずれかのいくつかの実施態様において、ここで、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、上で定義されている式(A)のオリゴヌクレオチドを含む。本明細書に提供される方法のいずれかのいくつかの実施態様において、ここで、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、上で定義されている式(B)の化合物を含む。本明細書に提供される方法のいずれかのいくつかの実施態様において、ここで、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、上で定義されている式(C)の化合物である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
(図面の簡単な説明)
本出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも1つの図面を含む。カラー図面を伴う特許又は特許出願のコピーは、要求及び必要な料金の支払いの後、特許庁により提供される。
【００６２】
【図１】図1Aは、対応する構造を有する略語を示す一連の構造である。これらの略語は、表2で使用されている略語である。
【００６３】
図1Bは、対応する構造を有する略語を示す一連の構造である。これらの略語は、表2で使用されている略語である。
【００６４】
【図２】図2は、一本鎖CpG ODN(レーンA(p145)及びD(p88))並びにアニールした二本鎖CpG ODN(レーンB(p88/p144)及びC(p88/p145))の臭化エチジウム染色変性ゲルの画像である。
【００６５】
【図３】図3Aは、それぞれ、レーンB、C、D、E、F、G、及びHに対応するポリヌクレオチド(p76、p77、p78、p79、p80、p81、及びp82とのマウストランスグルタミナーゼ媒介性コンジュゲーションの前(レーンA)及び後のQ-タグ化抗CD38抗体の臭化エチジウム染色還元ゲルの画像である。HC+1は、ポリヌクレオチドにコンジュートされたQ-タグ化抗CD38抗体重鎖のバンドを示している。HCは、Q-タグ化抗CD38抗体重鎖のバンドを示している。LCは、抗CD38抗体軽鎖を示している。
【００６６】
図3Bは、それぞれ、レーンB、C、D、E、F、及びGに対応するポリヌクレオチドp83、p84、p85、p86、p87、及びp88との微生物トランスグルタミナーゼ媒介性コンジュゲーションの前(レーンA)及び後のQ-タグ化抗CD38抗体の臭化エチジウム染色還元ゲルの画像である。HC+1は、ポリヌクレオチドにコンジュートされたQ-タグ化抗CD38抗体重鎖のバンドを示している。HCは、Q-タグ化抗CD38抗体重鎖のバンドを示している。LCは、抗CD38抗体軽鎖を示している。
【００６７】
【図４】図4Aは、双極子付加環化を介する一本鎖ポリヌクレオチドとのコンジュゲーション(レーンB、p88とのDar1コンジュゲート)又は二本鎖ポリヌクレオチドとのコンジュゲーション(レーンC、D、E、及びF)の前(レーンA)及び後のアジドリンカーにコンジュゲートされたQ-タグ化抗CD38の臭化エチジウム染色変性ゲルの画像である。レーンCは、無金属型1,3-双極子付加環化によって連結されたQ-タグ化抗CD38抗体とp88/p145二本鎖CpGとのコンジュゲートの分離された第一のAEXピークに対応する。レーンDは、無金属型1,3-双極子付加環化によって連結されたQ-タグ化抗CD38抗体とp88/p145二本鎖CpGとのコンジュゲートの分離された第二のAEXピークに対応する。レーンEは、無金属型1,3-双極子付加環化によって連結されたQ-タグ化抗CD38抗体とp88/p144二本鎖CpGとのコンジュゲートの分離された第一のAEXピークに対応する。レーンFは、無金属型1,3-双極子付加環化によって連結されたQ-タグ化抗CD38抗体とp88/p144二本鎖CpGとのコンジュゲートの分離された第二のAEXピークに対応する。
【００６８】
図4Bは、280nm及び260nmでの吸光度に基づくシグナルを示すリツキシマブ-p19コンジュゲートを含有する粗混合物のAEX-HPLCトレースを示すグラフである。リツキシマブ-p19コンジュゲートに対応する3つのピークが存在している。
【００６９】
図4Cは、図4Bで列挙されている、粗混合物、p19、及びリツキシマブ-p19 AEXピーク1、2、及び3:のAEX-HPLCトレースの合成を示すグラフである。
【００７０】
図4Dは、リツキシマブ-PEG24-N3(レーンA)と粗コンジュゲーション反応混合物(レーンB)と分離されたリツキシマブ-p19 AEXピーク1(レーンC)、2(レーンD)、及び3(レーンE)を比較した、変性SDS PAGE 6％トリス-グリシンゲルの画像である。
【００７１】
【図５】図5は、マウス脾臓細胞でIL-6を用量依存的に誘導するマウス免疫刺激ポリヌクレオチドの効力を示すグラフである。図示されたデータは、p18というマウス免疫刺激ポリヌクレオチド配列について、少なくとも15種のホスホロチオエートが免疫刺激活性を獲得するのに好ましいことを示している。コンジュゲートされた標的化部分の非存在下において、ホスホロチオエート骨格は、IL-6を誘導する免疫刺激ポリヌクレオチドの効力を制御する重要な特徴である。
【００７２】
【図６】図6は、処置から5.5時間後のアルカリホスファターゼのレベルによって測定される、Ramos Blue細胞でのNFκBの用量依存的な活性化における本発明の免疫コンジュゲート及びCpG 7909の効力を示すグラフである。x-軸は、対数目盛での該コンジュゲートの濃度(nM)を提供している。
【００７３】
【図７】図7は、処置から24時間及びQBインキュベーションから2.5時間後のアルカリホスファターゼのレベルによって測定される、Ramos Blue細胞でのNFκBの用量依存的な活性化における免疫コンジュゲート及びCpG 7909の効力を示すグラフである。x軸は、線形目盛での該コンジュゲートの濃度(M)の対数を提供している。
【００７４】
【図８】図8は、処置から48時間及びQBインキュベーションから2.5時間後のアルカリホスファターゼのレベルによって測定される、Ramos Blue細胞でのNFκBの用量依存的な活性化における免疫コンジュゲートの効力を示すグラフである。x軸は、線形目盛での該コンジュゲートの濃度(M)の対数を提供している。
【００７５】
【図９】図9は、アルカリホスファターゼのレベルによって測定される、Ramos Blue細胞でのNFκBの用量依存的な活性化におけるp1ポリヌクレオチドとp6ポリヌクレオチドの効力を比較したグラフである。
【００７６】
【図１０】図10は、アルカリホスファターゼのレベルによって測定される、Ramos Blue細胞でのNFκBの用量依存的な活性化における免疫コンジュゲートの効力を示すグラフである。
【００７７】
【図１１】図11は、アルカリホスファターゼのレベルによって測定される、Ramos Blue細胞でのNFκBの用量依存的な活性化における免疫コンジュゲートの効力を示すグラフである。
【００７８】
【図１２】図12は、アルカリホスファターゼのレベルによって測定される、Ramos Blue細胞でのNFκBの用量依存的な活性化における免疫コンジュゲートの効力を示すグラフである。
【００７９】
【図１３】図13は、アルカリホスファターゼのレベルによって測定される、Ramos Blue細胞でのNFκBの用量依存的な活性化における免疫コンジュゲートの効力を示すグラフである。
【００８０】
【図１４】図14は、アルカリホスファターゼのレベルによって測定される、Ramos Blue細胞でのNFκBの用量依存的な活性化における免疫コンジュゲートの効力を示すグラフである。
【００８１】
【図１５】図15は、DB細胞でのIL-6の用量依存的誘導における免疫コンジュゲートの効力を示すグラフである。y-軸は、PPIBレベルに対して正規化されたIL6分泌の増加の乗数を示している。
【００８２】
【図１６】図16は、Ramos Blue細胞でのNFκBの用量依存的誘導における免疫コンジュゲートの効力を示すグラフである。この図は、NFκBを活性化する1つのポリヌクレオチド(Dar1)又は2つのポリヌクレオチド(Dar2)を有するコンジュゲートを比較している。
【００８３】
【図１７】図17は、DB細胞でのIL-6の用量依存的誘導における免疫コンジュゲートの効力を示すグラフである。この図は、IL6を誘導する1つのポリヌクレオチド(Dar1)又は2つのポリヌクレオチド(Dar2)を有するコンジュゲートを比較している。y-軸は、PPIBレベルに対して正規化されたIL6分泌の増加の乗数を示している。
【００８４】
【図１８】図18は、アルカリホスファターゼ読み出しによって測定される、Ramos-Blue細胞でのNFκBの活性化における様々な長さの免疫刺激ポリヌクレオチドを含有する免疫コンジュゲートの効力を示すグラフである。
【００８５】
【図１９】図19は、アルカリホスファターゼ読み出しによって測定される、Ramos-Blue細胞でのNFκBの活性化における様々な長さの免疫刺激ポリヌクレオチドを含有する免疫コンジュゲートの効力を示すグラフである。
【００８６】
【図２０】図20は、ヌクレオシド間ホスホジエステルホスフェートに結合している5'-末端5-ヨード-2-デオキシウリジンを有するポリヌクレオチドを含有するコンジュゲートの免疫刺激活性とヌクレオシド間ホスホジエステルホスホロチオエートに結合している5'-末端5-ヨード-2-デオキシウリジンを有するポリヌクレオチドを含有するコンジュゲートの免疫刺激活性との比較を示すグラフである。該免疫刺激活性は、アルカリホスファターゼ読み出しによって測定される、Ramos-Blue細胞でのNFκB活性化の測定により評価した。
【００８７】
【図２１】図21は、ヌクレオシド間ホスホジエステルホスフェートに結合している5'-末端5-ヨード-2-デオキシウリジンを有するポリヌクレオチドを含有するコンジュゲートの免疫刺激活性とヌクレオシド間ホスホジエステルホスホロチオエートに結合している5'-末端5-ヨード-2-デオキシウリジンを有するポリヌクレオチドを含有するコンジュゲートの免疫刺激活性との比較を示すグラフである。該免疫刺激活性は、アルカリホスファターゼ読み出しによって測定される、Ramos-Blue細胞でのNFκB活性化の測定により評価した。
【００８８】
【図２２】図22は、1以上の5-ヨード-2-デオキシウリジンを含有するコンジュゲートの免疫刺激活性の比較を示すグラフである。該免疫刺激活性は、アルカリホスファターゼ読み出しによって測定される、Ramos-Blue細胞でのNFκB活性化の測定により評価した。
【００８９】
【図２３】図23は、5-ヨード-2-デオキシウリジンを含有又は欠如するコンジュゲートの免疫刺激活性の比較を示すグラフである。該免疫刺激活性は、アルカリホスファターゼ読み出しによって測定される、Ramos-Blue細胞でのNFκB活性化の測定により評価した。
【００９０】
【図２４】図24は、ホスフェートベース又はホスホロチオエートベースであるヌクレオシド間ホスホトリエステルを含有するコンジュゲートの免疫刺激活性の比較を示すグラフである。該免疫刺激活性は、アルカリホスファターゼ読み出しによって測定される、Ramos-Blue細胞でのNFκB活性化の測定により評価した。
【００９１】
【図２５】図25は、ホスフェートベース又はホスホロチオエートベースであるヌクレオシド間ホスホトリエステルを含有するコンジュゲートの免疫刺激活性の比較を示すグラフである。該免疫刺激活性は、アルカリホスファターゼ読み出しによって測定される、Ramos-Blue細胞でのNFκB活性化の測定により評価した。
【００９２】
【図２６】図26Aは、1以上のホスホロチオエートベースのヌクレオシド間ホスホトリエステルを含有するコンジュゲートの免疫刺激活性の比較を示すグラフである。該免疫刺激活性は、アルカリホスファターゼ読み出しによって測定される、Ramos-Blue細胞でのNFκB活性化の測定により評価した。
【００９３】
図26Bは、1以上のホスホロチオエートベースのヌクレオシド間ホスホトリエステルを含有するコンジュゲートの免疫刺激活性の比較を示すグラフである。該免疫刺激活性は、アルカリホスファターゼ読み出しによって測定される、Ramos-Blue細胞でのNFκB活性化の測定により評価した。
【００９４】
【図２７】図27は、抗体及び1以上の免疫刺激ポリヌクレオチドを含有するコンジュゲートの免疫刺激活性の比較を示すグラフである。該免疫刺激活性は、アルカリホスファターゼ読み出しによって測定される、Ramos-Blue細胞でのNFκB活性化の測定により評価した。
【００９５】
【図２８】図28は、抗体中の重鎖Q-タグ又は軽鎖Q-タグを介してコンジュゲートされた免疫刺激ポリヌクレオチドの細胞依存性細胞傷害性(CDC)の比較を示すグラフである。CDCアッセイは、ヒト血清中でコンジュゲートとともにインキュベートされたDaudi細胞で実施し、細胞傷害性は、蛍光により測定した。
【００９６】
【図２９】図29は、補助部分を有するコンジュゲートの免疫刺激活性の比較を示すグラフである。該免疫刺激活性は、アルカリホスファターゼ読み出しによって測定される、Ramos-Blue細胞でのNFκB活性化の測定により評価した。括弧内の参照名は、該コンジュゲートで使用されるリンカー/補助部分構造を示し、AMなしは、コンジュゲートSB-189が補助部分を含有しないことを示している。
【００９７】
【図３０】図30は、補助部分を有するコンジュゲートのCDC活性の比較を示すグラフである。CDCアッセイは、ヒト血清中でコンジュゲートとともにインキュベートされたDaudi細胞で実施し、細胞傷害性は、蛍光により測定した。
【００９８】
【図３１】図31は、Q-タグを介してマウス抗CD22抗体に連結された切断型マウス交差反応性ヒト免疫刺激ポリヌクレオチド(p275)を含有するコンジュゲートを用いたA20マウスB細胞リンパ腫細胞でのIL6の誘導を示すグラフである。
【００９９】
【図３２】図32は、Q-タグを介してマウス抗CD22抗体に連結された切断型マウス交差反応性ヒト免疫刺激ポリヌクレオチド(p275)を含有するコンジュゲートを用いたA20マウスB細胞リンパ腫細胞でのIL6の誘導を示すグラフである。
【０１００】
【図３３】図33Aは、免疫刺激ポリヌクレオチドを含有するコンジュゲート又はコンジュゲートされていない免疫刺激ポリヌクレオチドを用いたA20マウスB細胞リンパ腫細胞でのIL6の誘導を示すグラフである。
【０１０１】
図33Bは、様々な濃度の遊離の抗マウスCD22抗体の存在下での抗マウスCD22抗体及び免疫刺激ポリヌクレオチドを含有するコンジュゲートによるA20マウスB細胞リンパ腫細胞でのIL6の誘導を示すグラフである。
【０１０２】
【図３４】図34Aは、クラスAのCpG ODNのCpG-2336によるヒトPBMCにおけるインターフェロン-αの誘導を示すグラフである。
【０１０３】
図34Bは、コンジュゲートSB-340を用いたヒトPBMCにおけるインターフェロン-αの誘導を示すグラフである。抗BDCA2抗体のSB-341とp246とを本実験の対照として使用した。Y-軸は、450nmの波長での任意単位の光学密度を提供している。
【０１０４】
図34Cは、コンジュゲートSB-342を用いた純化された形質細胞様細胞でのインターフェロン-αの誘導を示すグラフである。抗BDCA2抗体、抗BDCA4抗体、及び抗SB-343を本実験の対照として使用した。
【０１０５】
【図３５】図35は、様々な5'-末端修飾及びヌクレオシド間トリエステルを有するポリヌクレオチドの免疫刺激活性の比較を示すグラフである。
【０１０６】
【図３６】図36は、様々な5'-末端修飾及びヌクレオシド間トリエステルを有するポリヌクレオチドの免疫刺激活性の比較を示すグラフである。
【０１０７】
【図３７】図37Aは、マウスへのA20マウスB細胞リンパ腫細胞の接種並びにその後の3回のビヒクル(生理食塩水)又は本発明の免疫刺激ポリヌクレオチド(p326)及び対照(p18)の腫瘍内投与後の腫瘍体積増加の進行を示すグラフである。投与時間は、X-軸上の矢印で示されている。
【０１０８】
図37Bは、マウスへのA20マウスB細胞リンパ腫細胞の接種及びその後の3回のビヒクル(生理食塩水)、免疫刺激ポリヌクレオチド(p3)、抗CD22抗体(CD22)、又はコンジュゲートSB-338、SB-339、もしくはSB-344の静脈内投与後の腫瘍体積増加の進行を示すグラフである。投与時間は、X-軸上の矢印で示されている。
【０１０９】
【図３８】図38Aは、マウスへのA20マウスB細胞リンパ腫細胞の接種及びその後の3回のビヒクル(生理食塩水)又は免疫刺激ポリヌクレオチドの腫瘍内投与後の腫瘍体積増加の進行を示すグラフである。
【０１１０】
図38Bは、マウスへのA20マウスB細胞リンパ腫細胞の接種及びその後の3回のビヒクル(生理食塩水)又は免疫刺激ポリヌクレオチドの腫瘍内投与から20日目の腫瘍体積値を示すグラフである。
【０１１１】
【図３９】図39Aは、マウスへのA20マウスB細胞リンパ腫細胞の接種及び(i)その後の1回の本発明のコンジュゲート(SB-337)の静脈内投与、又は(ii)その後の3回のビヒクル(生理食塩水)もしくは免疫刺激ポリヌクレオチドの腫瘍内投与後の腫瘍体積増加の進行を示すグラフである。
【０１１２】
図39Bは、マウスへのA20マウスB細胞リンパ腫細胞の接種及び(i)その後の1回の本発明のコンジュゲート(SB-337)の静脈内投与、又は(ii)その後の3回のビヒクル(生理食塩水)もしくは免疫刺激ポリヌクレオチドの腫瘍内投与後20日目の腫瘍体積値を示すグラフである。
【０１１３】
【図４０】図40は、A20マウスリンパ腫細胞が接種され、その後、生理食塩水、遊離抗体、抗体-免疫刺激ポリヌクレオチドコンジュゲート、又は遊離の免疫刺激ポリヌクレオチドで処置されたBalb/cマウスの生存率(％)を示すグラフである。対照群は、接種されていない未処置のBalb/cマウスである。CD22-10及びCD22-3として特定される線は、治療レジメン:それぞれ、10mg/kgの遊離の抗マウスCD22抗体及び3mg/kgの遊離の抗マウスCD22抗体に対するマウス生存率(％)を提供している。SB-337-10及びSB-337-3として特定される線は、治療レジメン:それぞれ、10mg/kgのSB-337及び3mg/kgのSB-337に対するマウス生存率(％)を提供している。
【０１１４】
【図４１】図41Aは、マウス血清中、37℃で最大24時間インキュベートされたポリヌクレオチドの試料の変性ゲルの画像である。
【０１１５】
図41Bは、マウス血清中、37℃で最大24時間インキュベートされたポリヌクレオチドの試料の変性ゲルの画像である。
【０１１６】
図41Cは、ラット血清中、37℃で最大24時間インキュベートされたポリヌクレオチドの試料の変性ゲルの画像である。
【０１１７】
図41Dは、サル血清中、37℃で最大24時間インキュベートされたポリヌクレオチドの試料の変性ゲルの画像である。
【０１１８】
図41Eは、ヒト血清中、37℃で最大24時間インキュベートされたポリヌクレオチドの試料の変性ゲルの画像である。
【０１１９】
【図４２】図42は、80％マウス血清中でのポリヌクレオチドの安定性に対する免疫刺激ポリヌクレオチドの5'-末端のホスフェートベース及びホスホロチオエートベースのヌクレオシド間ホスホジエステルの効果を示すグラフである。
【０１２０】
【図４３】図43は、80％マウス血清中での劣化実験における分解されたp246及びインタクトなp246の割合を示すグラフである。
【０１２１】
【図４４】図44は、80％マウス血清中でのポリヌクレオチドの安定性に対する5'-末端ヌクレオチド構造の効果を示すグラフである。
【０１２２】
【図４５】図45は、80％マウス血清、80％非ヒト霊長類(NHP)血清、及び80％ヒト血清中でのポリヌクレオチドの安定性に対する5'-末端ヌクレオチド構造の効果を示すグラフである。マウス血清のデータは別々の実験で得られたため、これらのデータには、アステリスクで印が付けられている。
【０１２３】
【図４６】図46Aは、実施例6に記載されている実験スキームを示している。この実験スキームでは、播種性B細胞リンパ腫を有するマウスに、CpG-Ab(マウス抗CD22 mAbにコンジュゲートされたCpG ODN)の静脈内投与が与えられた。
【０１２４】
図46Bは、1、3、及び5日目に、(i)3mg/kgのCpG(p313)-mAb(CD22)コンジュゲート(黒塗りの菱形);(ii)10mg/kgのCpG-mAb(CD22)(黒塗りの三角);(iii)裸のCpG ODN(白抜きの三角);(iv)10mg/kgのCD22 mAb(黒塗りの四角);(v)10mg/kgのGpC-mAb対照コンジュゲート(白抜きの四角);又は(vi)生理食塩水溶液(黒塗りの丸)で処置された播種性B細胞リンパ腫を有するマウスの生存率を示している。
【０１２５】
図46Cは、1回目の腫瘍移植から生き残り、その後、47日目に2回目の腫瘍移植を受けたマウスの生存率を示している。2回目の腫瘍移植後の生き残りには処置を与えなかった。1、3、及び5日目に10mg/kgのCpG-mAb(CD22)で処置された生き残り(下向きの三角); 1、3、及び5日目に3mg/kgのCpG-mAb(CD22)で処置された生き残り(菱形); 47日目に腫瘍細胞が移植され、生理食塩水溶液で処置された第二の対照群(上向きの三角)。
【０１２６】
図46Dは、1回目及び2回目の腫瘍移植からの生き残りに、その後、90日目に、3回目の腫瘍移植を受けさせた実験を示している。2回目又は3回目の腫瘍移植後の生き残りには処置を与えなかった。第三の対照群に、90日目に腫瘍細胞を移植し、生理食塩水溶液で処置した。生き残り(四角)及び対照群(丸)の腫瘍体積を、90日目〜120日目までモニタリングした。
【０１２７】
【図４７】図47Aは、実施例7に記載されている実験スキームを示している。この実験スキームでは、固形B細胞リンパ腫を有するマウスに、CpG-Ab(マウス抗CD22 mAbにコンジュゲートされたCpG ODN)の静脈内投与が与えられた。
【０１２８】
図47Bは、9、12、及び14日目に、(i)3mg/kgのCpG-mAb(CD22)(白抜きの菱形);(ii)10mg/kgのCpG-mAb(CD22)(大きい黒塗りの三角);(iii)裸のCpG ODN(白抜きの三角);(iv)10mg/kgのCD22 mAb(黒塗りの四角);(v)10mg/kgのGpC-mAb対照コンジュゲート(小さい黒塗りの四角)、又は(vi)生理食塩水溶液(黒塗りの丸)で処置された固形B細胞リンパ腫を有するマウスの腫瘍体積を示している。
【０１２９】
図47Cは、対照(生理食塩水及びSB-339)と比較した、10mg/kgのSB-337 DAR1又は10mg/kgのSB-337 DAR2で処置された固形B細胞リンパ腫を有するマウスの腫瘍体積を示している。
【０１３０】
図47Dは、対照(生理食塩水及びSB-339)と比較した、10mg/kgのSB-337 PEG24Bis DAR1又は10mg/kgのSB-337 PEG24Bis DAR2で処置された固形B細胞リンパ腫を有するマウスの腫瘍体積を示している。
【０１３１】
図47Eは、生理食塩水対照と比較した、10mg/kgのPD-1、10mg/kgのPD-1＋3mg/kgのSB-337 DAR1;又は10mg/kgのPD-1＋3mg/kgのSB-337 DAR2で処置された固形B細胞リンパ腫を有するマウスの腫瘍体積を示している。
【０１３２】
図47Fは、対照(生理食塩水及びmCD22)と比較した、マウスの体重に対するp347、SB-337 DAR1、及びSB-337 DAR2の効果を示している。
【０１３３】
【図４８】図48Aは、実施例8に記載されている実験スキームを示している。この実験スキームでは、固形結腸癌を有するマウスに、単独の又は抗PD-1抗体と組み合わせた、B細胞を標的とするCpG-Ab(マウス抗CD22 mAbにコンジュゲートされたCpG ODN)の静脈内投与が与えられた。
【０１３４】
図48Bは、(i)3mg/kgのCpG-mAb(CD22)(上向きの三角);(ii)抗PD-1抗体(黒塗りの四角);(iii)抗PD-1抗体と組み合わせた3mg/kgのCpG-mAb(CD22)(下向きの三角);及び(iv)生理食塩水溶液(黒塗りの丸)を受容した後の固形B細胞リンパ腫モデルを有するマウスの腫瘍体積を示している。
【０１３５】
【図４９】図49Aは、(i)10mg/kgのCpG-mAb(CD22)(三角)又は生理食塩水溶液(丸)を受容した後の固形B細胞リンパ腫を有する免疫適格Balb/Cマウスにおける腫瘍体積を示している。
【０１３６】
図49Bは、(i)10mg/kgのCpG-mAb(CD22)(四角)、(ii)裸のCpG ODN(三角)、又は(iii)生理食塩水溶液(丸)を受容した後の固形B細胞リンパ腫を有する免疫不全Nu/Nuマウスにおける腫瘍体積を示している。
【０１３７】
図49Cは、(i)10mg/kgのCpG-mAb(CD22)(四角)、(ii)裸のCpG ODN(三角)、又は(iii)生理食塩水溶液(丸)を受容した後の固形B細胞リンパ腫を有する免疫不全SCIDマウスにおける腫瘍体積を示している。
【０１３８】
【図５０】図50Aは、(i)CpG-mAb(CD22)のみ(白抜きの丸);(ii)CpG-mAb(CD22)及びCD4+ T細胞除去処置(白抜きの四角);(iii)CD4+ T細胞除去処置(黒塗りの四角);又は(iv)生理食塩水溶液(黒塗りの丸)を受容した後の可溶性B細胞リンパ腫を有するマウスの生存率を示している。
【０１３９】
図50Bは、(i)CpG-mAb(CD22)のみ(白抜きの丸);(ii)CpG-mAb(CD22)及びナチュラル(nature)キラー(NK)細胞除去処置(白抜きの四角);(iii)NK細胞除去処置(黒塗りの四角);又は(iv)生理食塩水溶液(黒塗りの丸)を受容した後の可溶性B細胞リンパ腫を有するマウスの生存率を示している。
【０１４０】
図50Cは、(i)CpG-mAb(CD22)のみ(白抜きの丸);(ii)CpG-mAb(CD22)及びCD8+ T細胞除去処置(白抜きの四角);(iii)CD8+ T細胞除去処置(黒塗りの四角);又は(iv)生理食塩水溶液(黒塗りの丸)を受容した後の可溶性B細胞リンパ腫を有するマウスの生存率を示している。
【０１４１】
【図５１】図51Aは、CpG-mAb(CD22)(四角)又は生理食塩水溶液(丸)を受容した後の固形B細胞リンパ腫を有するマウスにおける腫瘍体積を示している。消化のために17日目に、マウスを屠殺し、腫瘍を採取した。
【０１４２】
図51Bは、(i)CpG-Ab(四角)又は(ii)生理食塩水溶液(丸)で処置された固形B細胞リンパ腫を有するマウスから採取された腫瘍におけるCD4+又はCD8+生存ゲート細胞のパーセンテージを示している。
【０１４３】
図51Cは、(i)CpG-Ab(四角)又は(ii)生理食塩水溶液(丸)で処置されたマウスにおけるCD8+腫瘍細胞のパーセンテージと腫瘍体積の相関を示している。
【０１４４】
【図５２】図52Aは、(i)CpG-mAb(CD22)のみ(白抜きの丸);(ii)抗PD-1抗体のみ(黒塗りの四角);(iii)抗PD-1抗体と組み合わせたCpG-mAb(CD22)(白抜きの四角);又は(iv)生理食塩水溶液(黒塗りの丸)を受容した後の固形B細胞リンパ腫を有するマウスにおける腫瘍体積を示している。
【０１４５】
図52Bは、(i)CpG-mAb(CD22)のみ(白抜きの丸);(ii)抗PD-L1抗体のみ(黒塗りの三角);(iii)抗PD-L1抗体と組み合わせたCpG-mAb(CD22)(白抜きの三角);又は(iv)生理食塩水溶液(黒塗りの丸)を受容した後の固形B細胞リンパ腫を有するマウスにおける腫瘍体積を示している。
【０１４６】
図52Cは、(i)CpG-mAb(CD22)のみ(白抜きの丸);(ii)抗PD-1抗体のみ(黒塗りの四角);(iii)抗PD-1抗体と組み合わせたCpG-mAb(CD22)(白抜きの四角);(iv)抗PD-1抗体と組み合わせたCpG-mAb(CD22)及びCD8+ T細胞除去処置;又は(v)生理食塩水溶液(黒塗りの丸)を受容した後の固形B細胞リンパ腫を有するマウスにおける腫瘍体積を示している。
【０１４７】
【図５３】図53Aは、(i)抗PD-1抗体のみ(四角);(ii)抗PD-1抗体と組み合わせたCpG-mAb(CD22)(菱形);又は(iii)生理食塩水溶液(丸)を受容した後の固形B細胞リンパ腫を有するマウスにおける平均腫瘍体積を示している。
【０１４８】
図53Bは、抗PD-1抗体のみを受容した後の固形B細胞リンパ腫を有する個々のマウスにおける腫瘍体積を示している。
【０１４９】
図53Cは、CpG-mAb(CD22)/抗PD-1抗体組合せ処置を受容した後の固形B細胞リンパ腫を有する個々のマウスにおける腫瘍体積を示している。
【０１５０】
図53Dは、2回目の腫瘍移植後の1回目の腫瘍移植からの生き残り(上向きの三角)及び未処置の対照群(下向きの三角)の腫瘍体積を示している。
【０１５１】
【図５４】図54Aは、(i)(i)抗OX40抗体のみ(三角);(ii)抗OX40抗体と組み合わせたCpG-mAb(CD22)(菱形);又は(iii)生理食塩水溶液(丸)を受容した後の固形B細胞リンパ腫を有するマウスにおける腫瘍体積を示している。
【０１５２】
図54Bは、(i)(i)抗ICOS抗体のみ(四角);(ii)抗ICOS抗体と組み合わせたCpG-mAb(CD22)(三角);又は(iii)生理食塩水溶液(丸)を受容した後の固形B細胞リンパ腫を有するマウスにおける腫瘍体積を示している。
【０１５３】
図54Cは、(i)抗4-1BB抗体のみ(菱形);(ii)抗4-1BB抗体と組み合わせたCpG-mAb(CD22)(三角);又は(iii)生理食塩水溶液(丸)を受容した後の固形B細胞リンパ腫を有するマウスにおける腫瘍体積を示している。
【０１５４】
【図５５】図55Aは、(i)10mg/kgのCpG-mAb(CD22)又は(i)生理食塩水溶液を10、13、及び16日目の各々に受容した後の結腸癌を有するマウスにおける腫瘍体積を示している。
【０１５５】
図55Bは、(i)CpG-mAb(CD22)又は(i)生理食塩水溶液で処置されたマウスから単離された106個の脾臓細胞をAH1抗原で刺激する前又は刺激した後の、該細胞におけるIFN-γ分泌細胞の数を示している。
【０１５６】
【図５６】図56Aは、(i)10mg/kgのCpG-Ab(PD-L1)(菱形);(i)10mg/kgのCpG-Ab(CD205)(三角);又は(iii)生理食塩水溶液の静脈内投与を10、12、及び14日目の各々に受容した後の固形B細胞リンパ腫を有するマウスにおける平均腫瘍体積を示している。
【０１５７】
図56Bは、10、12、及び14日目に10mg/kgのCpG-Ab(CD205)の静脈内投与を受容した後のB細胞リンパ腫を有する個々のマウスにおける腫瘍体積を示している。
【０１５８】
図56Cは、10、12、及び14日目に10mg/kgのCpG-Ab(PD-L1)の静脈内投与を受容した後のB細胞リンパ腫を有する個々のマウスにおける腫瘍体積を示している。
【０１５９】
図56Dは、38日目に与えられた2回目の腫瘍移植の後の、CpG-Ab(CD205)で処置された1回目の腫瘍移植からの生き残り(四角)又はCpG-Ab(PD-L1)で処置された1回目の腫瘍投与からの生き残り(三角)及び未処置の対照群(丸)の腫瘍体積を示している。
【０１６０】
【図５７】図57Aは、(i)10mg/kgのCpG-Ab(CD205)(三角);(ii)10mg/kgの抗CD205抗体(四角);(iii)10mg/kgのマウスIgG(白抜きの丸);又は(iv)生理食塩水溶液(黒塗りの丸)の静脈内投与を10、12、及び14日目の各々に受容した後の固形B細胞リンパ腫を有するマウスにおける平均腫瘍体積を示している。
【０１６１】
図57Bは、10mg/kgの抗CD205抗体の静脈内投与を10、12、及び14日目の各々に受容した後の固形B細胞リンパ腫を有する個々のマウスにおける腫瘍体積を示している。
【０１６２】
図57Cは、10mg/kgのCpG-Ab(CD205)の静脈内投与を10、12、及び14日目の各々に受容した後の固形B細胞リンパ腫を有する個々のマウスにおける腫瘍体積を示している。
【０１６３】
図57Dは、10mg/kgのラットIgG2a抗体の静脈内投与を10、12、及び14日目の各々に受容した後の固形B細胞リンパ腫を有する個々のマウスにおける腫瘍体積を示している。
【０１６４】
【図５８】図58は、p246にコンジュゲートされた抗CD38抗体(黒塗りの四角)、p4にコンジュゲートされた抗CD38抗体(黒塗りの丸)、コンジュゲートされていないp246(白抜きの四角)、又はコンジュゲートされていないp4(白抜きの丸)で処置した後のヒトRamos細胞でのNFκB活性化を示している。
【０１６５】
【図５９】図59は、サル血清をザイモサン(逆向きの三角;陽性対照)、p1(黒塗りの丸)、又は本明細書に提供される2つのCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチド(黒塗りの四角及び黒塗りの三角)とともにインキュベートした後の(C3放出によって測定される)補体活性化を示している。
【０１６６】
【図６０】図60Aは、(i)生理食塩水溶液(黒塗りの丸);(ii)3mg/kgのCpG-Ab(4523-CD22; SB-337)(四角);(iii)3mg/kgのCD19-mAb(黒塗りの下向きの三角);(iv)3mg/kgのCpG-Ab(4523-CD19; SB-388)(黒塗りの菱形);(v)1.9μg/マウスの裸のCpG(P347)(上向きの三角);(vi)19μg/マウスの裸のCpG(p347)(白抜きの下向きの三角);(vii)190μg/マウスの裸のCpG(P347)(白抜きの菱形)を; 10、12、及び14日目の各々に静脈内投与した後のA20マウスB細胞リンパ腫細胞異種移植片を有するマウスの平均腫瘍体積増加の進行を示している。
【０１６７】
図60Bは、(i)生理食塩水溶液(実線);(ii)3mg/kgのCpG-Ab(SB-337)(チェック柄);(iii)3mg/kgのCD19-mAb(水平);(iv)3mg/kgのCpG-Ab(SB-388)(垂直);(v)1.9μg/マウスの裸のCpG(P347)(下向きの斜線)を; 10、12、及び14日目の各々に静脈内投与した後のA20マウスB細胞リンパ腫細胞異種移植片を有するマウスの20日目の平均腫瘍体積を示している。
【０１６８】
図60Cは、(i)生理食塩水溶液(黒);(ii)3mg/kgのCpG-Ab(SB-337)(チェック柄);(iii)3mg/kgのCD19-mAb(水平);(iv)3mg/kgのCpG-Ab(SB-388)(垂直);(v)1.9μg/マウスの裸のCpG(P347)(下向きの斜線);(vi)19μg/マウスの裸のCpG(P347)(格子);(vii)190μg/マウスの裸のCpG(P347)(上向きの斜線)を; 10、12、及び14日目の各々に静脈内投与した後のA20マウスB細胞リンパ腫細胞異種移植片を有するマウスの腫瘍重量変化を除外した20日目の平均体重変化を示している。
【０１６９】
【図６１】図61Aは、(i)生理食塩水溶液(黒塗りの丸);又は(ii)p347(黒塗りの四角)を; 7、9、11、及び13日目の各々に腫瘍内投与した後のB16F10メラノーマ再移植及び14日目の再移植の後のマウスの平均腫瘍体積増加の進行を示している。
【０１７０】
図61Bは、生理食塩水溶液(上のパネル)又はp347(下のパネル)を; 7、9、11、及び13日目の各々に腫瘍内投与した後のB16F10メラノーマ再移植及び14日目の再移植の後のマウスからの肺転移を示している。
【０１７１】
図61Cは、(i)生理食塩水溶液(上向きの三角);又は(ii)p347(下向きの三角)を; 7、10、12、及び14日目の各々に腫瘍内投与した後のCT26結腸直腸異種移植片を接種したマウスの平均腫瘍体積増加の進行を示している。
【０１７２】
【図６２】図62Aは、(i)生理食塩水溶液(丸);又は(ii)10mg/kgのCpG-mAb(SB-337)(四角)を; 10、12、及び14日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いた遺伝的B細胞欠損マウスの平均腫瘍体積増加の進行を示している。
【０１７３】
図62Bは、(i)生理食塩水溶液(丸);又は(ii)10mg/kgのCpG-mAb(SB-337)(四角)を; 10、12、及び14日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いた抗CD20 mAbでB細胞を除去したマウスの平均腫瘍体積増加の進行を示している。
【０１７４】
【図６３】図63Aは、(i)生理食塩水溶液(丸);(ii)10mg/kgの抗CD22(上向きの三角);(iii)10mg/kgの抗PD-L1(下向きの三角);(iv)10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(四角);又は(v)10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)＋10mg/kgの抗PD-L1(菱形)を投与した後のMC38直腸結腸同系モデルを用いたマウスの平均腫瘍体積増加の進行を示している。抗CD22及びCD22-CpGを10、12、及び14日目に静脈内投与し;抗PD-L1を10、13、及び17日目に腹腔内投与した。*p＝0.01; **p＝0.001。
【０１７５】
図63Bは、生理食塩水を10、12、及び14日目に静脈内投与した後のMC38直腸結腸同系モデルを用いた各々のマウスの腫瘍体積増加の進行を示している。
【０１７６】
図63Cは、10mg/kgの抗CD22 mAbを10、12、及び14日目に静脈内投与した後のMC38直腸結腸同系モデルを用いた各々のマウスの腫瘍体積増加の進行を示している。
【０１７７】
図63Dは、10mg/kgの抗PD-L1を10、13、及び17日目に腹腔内投与した後のMC38直腸結腸同系モデルを用いた各々のマウスの腫瘍体積増加の進行を示している。
【０１７８】
図63Eは、10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)を10、12、及び14日目に静脈内投与した後のMC38直腸結腸同系モデルを用いた各々のマウスの腫瘍体積増加の進行を示している。
【０１７９】
図63Fは、10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)を10、12、及び14日目に静脈内投与し、さらに、10mg/kgの抗PD-L1を10、13、及び17日目に腹腔内投与した後のMC38直腸結腸同系モデルを用いた各々のマウスの腫瘍体積増加の進行を示している。
【０１８０】
【図６４】図64Aは、(i)生理食塩水溶液(丸);(ii)10mg/kgの抗CD22(四角);(iii)10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(三角);又は(iv)10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)＋10mg/kgの抗PD-L1(菱形)を10、12、及び14日目に投与した後のB16F10メラノーマモデルを用いたマウスの平均腫瘍体積増加の進行を示している。抗CD22及びCD22-CpGを静脈内投与し;抗PD-L1を腹腔内投与した。**p＝0.08; ***p＝0.03。
【０１８１】
図64Bは、(i)生理食塩水溶液(丸);(ii)10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(丸);(iii)10mg/kgの抗PD1(四角);(iv)10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)＋10mg/kgの抗PD1(上向きの三角)(v)10mg/kgの抗PD-L1(下向きの三角);(vi)10mg/kgのCD22-CpG＋10mg/kgの抗PD-L1(菱形)を投与した後のLLC1ルイス肺癌モデルを用いたマウスの平均腫瘍体積増加の進行を示している。抗CD22及びCD22-CpGを7、10、及び13日目に静脈内投与し;抗PD-L1及び抗PD1を7、10、及び14日目に腹腔内投与した。**p＝0.023。
【０１８２】
【図６５】図65Aは、(i)生理食塩水溶液(丸);(ii)10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(三角);又は(iii)10mg/kgのDEC205-CpG(SB-3096)を12、17、20、及び24日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウスの平均腫瘍体積増加の進行を示している。
【０１８３】
図65Bは、生理食塩水を12、17、20、及び24日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いた各々のマウスの腫瘍体積増加の進行を示している。
【０１８４】
図65Cは、10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)を12、17、20、及び24日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いた各々のマウスの腫瘍体積増加の進行を示している。
【０１８５】
図65Dは、10mg/kgのDEC205-CpG(SB-3096)を12、17、20、及び24日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いた各々のマウスの腫瘍体積増加の進行を示している。
【０１８６】
【図６６】図66Aは、(i)生理食塩水溶液(小さい丸);(ii)CD4除去(大きい丸);(iii)3mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(四角);又は(iv)CD4除去＋3mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(菱形)を投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウスの平均腫瘍体積増加の進行を示している。CD22-CpGを10、13;及び15日目に静脈内投与した。CD4除去は、抗CD4を用いて実施した。
【０１８７】
図66Bは、(i)生理食塩水溶液(丸);(ii)CD4除去(上向きの三角);(iii)3mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(四角);又は(iv)CD4除去＋3mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(下向きの三角)を投与した後のA20リンパ腫モデルを用いたマウスの平均腫瘍体積増加の進行を示している。CD22-CpGを10、12;及び14日目に静脈内投与した。CD4除去は、抗CD4を用いて実施した。
【０１８８】
【図６７】図67Aは、1nM CD22 Ab(チェック柄); 1nM CpG(SB-4715)(水平線);又は1nM CpG-Ab(SB-337)(垂直線)とのインビトロインキュベーション後のCD19+/B220+ B細胞上のCD40、CD70、CD80、CD86、MHC-I、MHC II、及び4-1 BBL表面発現の平均蛍光強度(MFI)を示している。
【０１８９】
図67Bは、生理食塩水(実線); 10mg/kgのCD22 Ab(チェック柄); 10mg/kgのCpG(SB-4715)(水平線);又は10mg/kgのCpG-Ab(SB-337)(垂直線)のインビボ投与後のCD19+/B220+ B細胞上のCD40、CD80、CD86、及びMHC II表面発現の平均蛍光強度(MFI)を示している。
【０１９０】
【図６８】図68Aは、(i)生理食塩水(実線);(ii)Ab(抗CD22)(チェック柄);(iii)CpG-Ab(SB-337)(水平);又は(iv)CpG(SB-4715)(垂直)で処置されたマウスにおける全T細胞(CD3+)集団に対する活性化T細胞(CD71+、CD3+)のパーセントを示している。
【０１９１】
図68Bは、(i)生理食塩水(実線);(ii)Ab(抗CD22)(チェック柄);(iii)CpG-Ab(SB-337)(水平);又は(iv)CpG(SB-4715)(垂直)で処置されたマウスにおける全T細胞(CD3+)集団に対する活性化T細胞(Ki67+、CD3+)のパーセントを示している。
【０１９２】
【図６９】図69Aは、(i)生理食塩水溶液(丸);(ii)10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(四角);(iii)10mg/kgのCD22(上向きの三角);又は(iv)遊離CpG(P347)(下向きの三角)を10、12、14日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウスの平均腫瘍体積増加の進行を示している。
【０１９３】
図69Bは、(i)生理食塩水溶液(小さい丸);(ii)10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(小さい四角);(iii)10mg/kgのCD22(小さい上向きの三角)で処置されたマウス由来の流入領域リンパ節細胞;もしくは(iv)遊離CpG(P347)(小さい下向きの三角);又は(v)生理食塩水溶液(菱形);(vi)10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(大きい丸);(vii)10mg/kgのCD22(大きい四角);もしくは(viii)遊離CpG(P347)(大きい上向きの三角)で処置されたマウス由来の非流入領域リンパ節細胞を養子移植した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウスの平均腫瘍体積増加の進行を示している。
【０１９４】
図69Cは、(i)生理食塩水溶液(上向きの狭い斜線);(ii)10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(下向きの狭い斜線);(iii)10mg/kgのCD22(grid);もしくは(iv)遊離CpG(P347)(下向きの幅広い斜線)で処置されたマウス由来の流入領域リンパ節細胞;又は(v)生理食塩水溶液(実線);(vi)10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(チェック柄);(vii)10mg/kgのCD22(水平);もしくは(viii)遊離CpG(P347)(empty)で処置されたマウス由来の非流入領域リンパ節細胞の養子移植後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウスの24日目の平均腫瘍体積を示している。
【０１９５】
【図７０】図70Aは、(i)生理食塩水(実線);(ii)10mg/kgのAb(CD22)(チェック柄);(iii)5.7ug/用量の遊離CpG(p347)(水平);又は(iv)10mg/kgのCpG-mAb(SB-337)(垂直)で静脈内処置された未処置のマウスにおけるIL-6の血漿濃度を示している。
【０１９６】
図70Bは、(i)生理食塩水(実線);(ii)10mg/kgのAb(CD22)(チェック柄);(iii)5.7ug/用量の遊離CpG(p347)(水平);又は(iv)10mg/kgのCpG-mAb(SB-337)(垂直)で静脈内処置された未処置のマウスにおけるIL-1βの血漿濃度を示している。
【０１９７】
図70Cは、(i)生理食塩水(実線);(ii)10mg/kgのAb(CD22)(チェック柄);(iii)5.7ug/用量の遊離CpG(p347)(水平);又は(iv)10mg/kgのCpG-mAb(SB-337)(垂直)で静脈内処置された未処置のマウスにおけるIL-10の血漿濃度を示している。
【０１９８】
図70Dは、(i)生理食塩水(実線);(ii)10mg/kgのAb(CD22)(チェック柄);(iii)5.7ug/用量の遊離CpG(Sp347)(水平);又は(iv)10mg/kgのCpG-mAb(SB-337)(垂直)で静脈内処置された未処置のマウスにおけるIL-12p70の血漿濃度を示している。
【０１９９】
図70Eは、(i)生理食塩水(実線);(ii)10mg/kgのAb(CD22)(チェック柄);(iii)5.7ug/用量の遊離CpG(p347)(水平);又は(iv)10mg/kgのCpG-mAb(SB-337)(垂直)で静脈内処置された未処置のマウスにおけるIFNγの血漿濃度を示している。
【０２００】
図70Fは、(i)生理食塩水(実線);(ii)10mg/kgのAb(CD22)(チェック柄);(iii)5.7ug/用量の遊離CpG(p347)(水平);又は(iv)10mg/kgのCpG-mAb(SB-337)(垂直)で静脈内処置された未処置のマウスにおけるTNFαの血漿濃度を示している。
【０２０１】
【図７１】図71Aは、(i)生理食塩水(丸);又は(ii)10mg/kgのCpG-mAb(SB-337)(四角)を10、13、及び17日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウス由来の脾臓の全細胞に対するB細胞(B220+)のパーセンテージを示している。*p＜0.05
【０２０２】
図71Bは、(i)生理食塩水(丸);又は(ii)10mg/kgのCpG-mAb(SB-337)(四角)を10、13、及び17日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウス由来の脾臓の全細胞に対する胚中心(GC)細胞(B220+、IgDlo、Fas+)のパーセンテージを示している。*p＜0.05
【０２０３】
図71Cは、(i)生理食塩水(丸);又は(ii)10mg/kgのCpG-mAb(SB-337)(四角)を10、13、及び17日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウス由来の脾臓の全細胞に対するT濾胞ヘルパー(Tfh)細胞(CD4+、CXCR5+、PD-1+)のパーセンテージを示している。*p＜0.05
【０２０４】
図71Dは、(i)生理食塩水;又は(ii)10mg/kgのCpG-mAb(SB-337)を10、13、及び17日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウス由来のIL-21の相対変化倍率を示している。*p＜0.05
【０２０５】
図71Eは、(i)生理食塩水;又は(ii)10mg/kgのCpG-mAb(SB-337)を10、13、及び17日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウス由来のBcl-6の相対変化倍率を示している。*p＜0.05
【０２０６】
図71Fは、(i)生理食塩水;又は(ii)10mg/kgのCpG-mAb(SB-337)を10、13、及び17日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウス由来のIRF-4の相対変化倍率を示している。*p＜0.05
【０２０７】
【図７２】図72Aは、(i)生理食塩水;又は(ii)3mg/kgのCpG-mAb(SB-337)を10、13、及び17日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウス由来の脾臓におけるIL-6の相対変化倍率を示している。
【０２０８】
図72Bは、(i)生理食塩水;又は(ii)3mg/kgのCpG-mAb(SB-337)を10、13、及び17日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウス由来の脾臓におけるIL-10の相対変化倍率を示している。
【０２０９】
図72Cは、(i)生理食塩水;又は(ii)3mg/kgのCpG-mAb(SB-337)を10、13、及び17日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウス由来の脾臓におけるIL-1βの相対変化倍率を示している。
【０２１０】
図72Dは、(i)生理食塩水;又は(ii)3mg/kgのCpG-mAb(SB-337)を10、13、及び17日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウス由来の脾臓におけるTNFαの相対変化倍率を示している。
【０２１１】
【図７３】図73Aは、(i)生理食塩水;又は(ii)3mg/kgのCpG-mAb(SB-337)を10、13、及び17日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウス由来の流入領域リンパ節におけるIL-6の相対変化倍率を示している。
【０２１２】
図73Bは、(i)生理食塩水;又は(ii)3mg/kgのCpG-mAb(SB-337)を10、13、及び17日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウス由来の流入領域リンパ節におけるIL-10の相対変化倍率を示している。
【０２１３】
図73Cは、(i)生理食塩水;又は(ii)3mg/kgのCpG-mAb(SB-337)を10、13、及び17日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウス由来の流入領域リンパ節におけるIL-1βの相対変化倍率を示している。
【０２１４】
図73Dは、(i)生理食塩水;又は(ii)3mg/kgのCpG-mAb(SB-337)を10、13、及び17日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウス由来の流入領域リンパ節におけるTNFαの相対変化倍率を示している。
【０２１５】
【図７４】図74Aは、(i)生理食塩水;又は(ii)3mg/kgのCpG-mAb(SB-337)を10、13、及び16日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウスにおけるIgMの濃度を示している。*p＜0.05。
【０２１６】
図74Bは、(i)生理食塩水;又は(ii)3mg/kgのCpG-mAb(SB-337)を10、13、及び16日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウスにおけるIgG2aの濃度を示している。*p＜0.05
【０２１７】
図74Cは、(i)生理食塩水;又は(ii)3mg/kgのCpG-mAb(SB-337)を10、13、及び16日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウスにおけるIgGの濃度を示している。*p＜0.05
【０２１８】
【図７５】図75は、市販の二次抗マウスIgG2a-HRP抗体である二次Ab1を用いて測定された生理食塩水(丸)もしくは3mg/kgのCpG-mAb(SB-337)(四角)で静脈内処置されたマウス由来の血清中のマウス抗AH1 IgG2aのスキーム及び定量;又は第二の市販の二次抗マウスIgG2a-HRP抗体である二次Ab2を用いた生理食塩水(下向きの三角)もしくは3mg/kgのCpG-mAb(SB-337)(菱形)による処置の測定を示している。
【０２１９】
【図７６】図76Aは、(i)生理食塩水(丸);又は(ii)10mg/kgのCpG-mAb(SB-337)(四角)を毎週静脈内投与した後のマウス由来の脾臓の全B細胞(B220+)に対する調節性B細胞(Breg; CD19+、B220+、CD1dhi)のパーセンテージを示している。*p＜0.001
【０２２０】
図76Bは、(i)生理食塩水(丸);又は(ii)10mg/kgのCpG-mAb(SB-337)(四角)を毎週静脈内投与した後のマウス由来の脾臓の全細胞に対する調節性B細胞(Breg; CD19+、B220+、CD1dhi)のパーセンテージを示している。*p＜0.001
【０２２１】
【図７７】図77Aは、(i)生理食塩水(丸);(ii)10mg/kgのCpG-mAb(SB-337)(四角);又は(iii)10mg/kgのCpG;(三角)で14、17、及び30日目の各々に静脈内処置されたCT26結腸直腸モデルを用いたマウス由来の脾臓リンパ節の全細胞に対する脾臓骨髄樹状細胞(mDC; B220-、CD11C+; DEC205hi)のパーセンテージを示している。*p＝0.0002、&p＝0.003、#p＝0.002。
【０２２２】
図77Bは、(i)生理食塩水(丸);(ii)10mg/kgのCpG-mAb(SB-337)(四角);又は(iii)10mg/kgのCpG(三角)で; 14、17、及び30日目の各々に静脈内処理されたCT26結腸直腸モデルを用いたマウス由来の全細胞に対するプールされたリンパ節(LN)骨髄樹状細胞(mDC; B220-、CD11C+; CD8+)のパーセンテージを示している。試料は、流入領域リンパ節(dLN)及び非流入領域リンパ節(ndLN)から採取した。
【０２２３】
【図７８】図78Aは、(i)生理食塩水溶液(丸);(ii)形質細胞様樹状細胞(pDC)除去(下向きの三角);(iii)3mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(四角);又は(iv)pDC除去＋3mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(上向きの三角)で10、13、及び15日目の各々に処置した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウスの平均腫瘍体積増加の進行を示している。
【０２２４】
図78Bは、(i)生理食塩水溶液(小さい丸);(ii)形質細胞様樹状細胞(pDC)除去(菱形);(iii)3mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(四角);又は(iv)pDC除去＋3mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(大きい丸)で10、12、及び14日目の各々に処置した後のA20リンパ腫モデルを用いたマウスの平均腫瘍体積増加の進行を示している。
【０２２５】
【図７９】図79Aは、(i)生理食塩水(実線);又は(ii)3mg/kgのCpG-mAb(SB-337)(チェック柄)を10、12、及び14日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウス由来のT細胞遺伝子の遺伝子発現の相対変化倍率を示している。
【０２２６】
図79Bは、(i)生理食塩水(実線);又は(ii)3mg/kgのCpG-mAb(SB-337)(水平)を10、12、及び14日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウス由来のマクロファージ遺伝子の遺伝子発現の相対変化倍率を示している。
【０２２７】
図79Cは、(i)生理食塩水(実線);又は(ii)3mg/kgのCpG-mAb(SB-337)(垂直)を10、12、及び14日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウス由来のサイトカイン遺伝子の遺伝子発現の相対変化倍率を示している。
【０２２８】
図79Dは、(i)生理食塩水(実線);(ii)3mg/kgのCpG-mAb(SB-337)(上向きの斜線);(iii)抗PD-L1(下向きの斜線);(iv)3mg/kgのCpG-mAb＋抗PD-L1(SB-337)(格子)を10、12、及び14日目の各々に静脈内投与した後のCT26結腸直腸モデルを用いたマウス由来のアポトーシス酵素遺伝子の遺伝子発現の相対変化倍率を示している。
【０２２９】
【図８０】図80Aは、24〜72時間の(i)CpG(p425)(四角);(ii)CpG-Ab(SB-430)(三角);又は(iii)Ab(菱形)によるインビトロ処置に応答したヒト初代B細胞由来のIL-6の濃度についての用量応答曲線を示している。
【０２３０】
図80Bは、24〜72時間の(i)CpG(p425)(三角);又は(ii)CpG-Ab(SB-430)(丸)によるインビトロ処置に応答したヒト初代B細胞上でのMHC II発現の平均蛍光強度(MFI)についての用量応答曲線を示している。
【０２３１】
図80Cは、24〜72時間の(i)CpG(p425)(三角);又は(ii)CpG-Ab(SB-430)(丸)によるインビトロ処置に応答したヒト初代B細胞上でのCD86発現の平均蛍光強度(MFI)についての用量応答曲線を示している。
【０２３２】
図80Dは、24〜72時間の(i)CpG(p425)(三角);又は(ii)CpG-Ab(SB-430)(丸)によるインビトロ処置に応答したヒト初代B細胞上でのCD70発現の平均蛍光強度(MFI)についての用量応答曲線を示している。
【０２３３】
図80Eは、24〜72時間の(i)CpG(p425)(三角);又は(ii)CpG-Ab(SB-430)(丸)によるインビトロ処置に応答したヒト初代B細胞上でのCD20発現の平均蛍光強度(MFI)についての用量応答曲線を示している。
【０２３４】
【図８１】図81は、24時間の(i)hCD22-hCpG(SB-430)(四角);(ii)遊離のヒトCpG 7909(下向きの三角);又は(iii)遊離のヒトCpG Solstice(p425)(下向きの矢印)によるインビトロ処置に応答した初代ヒト脾臓細胞由来のIL-6の濃度についての用量応答曲線を示している。
【０２３５】
【図８２】図82Aは、Daudiバーキットリンパ腫細胞の皮下移植並びに12、14、及び16日目の各々での静脈内(IV)処置の前に腹腔内(IP)注射される新鮮ヒト末梢血単核細胞(hPBMC)を用いたヒト化マウスモデル実験のスキームを示している。
【０２３６】
図82Bは、Daudiバーキットリンパ腫細胞の皮下移植並びに12、14、及び16日目の各々での(i)生理食塩水(丸);(ii)5mg/kgのhCD22 Ab(四角);(iii)5.7μg/用量のCpG(p425)(白抜きの三角);又は(iv)5mg/kgのhCD22-CpG(SB-430)(黒塗りの三角)による静脈内(IV)処置の前に新鮮ヒト末梢血単核細胞が腹腔内注射されたヒト化マウスモデルにおける平均腫瘍体積増加の進行を示している。
【０２３７】
【図８３】図83は、静脈内又は皮下投与されたマウスにおけるCpG-抗体コンジュゲートSB-337 DAR1の薬物動態プロファイルを示している。
【０２３８】
【図８４】図84は、静脈内投与されたマウスにおけるCpG-抗体コンジュゲートSB-337 DAR1の薬物動態プロファイルを示している。
【０２３９】
【図８５】図85は、静脈内投与されたマウスにおけるCpG-抗体コンジュゲートSB-337 DAR1の薬物動態プロファイルを示している。
【０２４０】
【図８６】図86は、静脈内投与されたマウスにおけるCpG-抗体コンジュゲートSB-337 DAR1及びSB-337 DAR2の薬物動態プロファイルを示している。
【０２４１】
【図８７】図87A及び87Bは、静脈内投与されたマウスにおけるCpG-抗体コンジュゲートの薬物動態プロファイルを示している。
【発明を実施するための形態】
【０２４２】
(詳細な説明)
(定義)
本明細書で使用される「脱塩基スペーサー」という用語は、以下の構造の二価基を表す:
R1-L1-[-L2-(L1)n1-]n2-R2, (I)
(ここで:
n1は、0又は1であり、
n2は、1〜6の整数であり、
R1は、免疫調節ポリヌクレオチド中のヌクレオシドとの結合であり、
R2は、免疫調節ポリヌクレオチド中のヌクレオシドとの結合又はキャッピング基との結合であり、
各々のL1は、独立に、ホスホジエステル又はホスホトリエステルであり、かつ
各々のL2は、糖類似体であり、
ただし、
該脱塩基スペーサーがヌクレオシド間脱塩基スペーサーである場合、各々のn1は1であり、R2は、ヌクレオシドとの結合であり、かつ
該脱塩基スペーサーが末端脱塩基スペーサーである場合、各々のn1は、独立に、0又は1であり、R2は、キャッピング基との結合である)。
【０２４３】
本明細書で使用される「約」という用語は、列挙された値の±10％である値を表す。
【０２４４】
本明細書で使用される「アルカン-テトライル」という用語は、別途指定されない限り、1〜16個の炭素を有する、四価非環式の直鎖又は分岐鎖飽和炭化水素基を表す。アルカン-テトライルは、アルキルについて記載されている通りに任意に置換されていてもよい。
【０２４５】
本明細書で使用される「アルカン-トリイル」という用語は、別途指定されない限り、1〜16個の炭素を有する、三価非環式の直鎖又は分岐鎖飽和炭化水素基を表す。アルカン-トリイルは、アルキルについて記載されている通りに任意に置換されていてもよい。
【０２４６】
本明細書で使用される「アルカノイル」という用語は、カルボニル基を介して親分子基に結合している水素又はアルキル基を表し、かつホルミル(すなわち、カルボキシアルデヒド基)、アセチル、プロピオニル、ブチリル、及びイソ-ブチリルによって例示される。非置換アルカノイル基は、1〜7個の炭素を含有する。該アルカノイル基は、置換されていなくてもよく、又はアルキル基について本明細書に記載されている通りに置換されていてもよい(例えば、任意に置換されたC1-7アルカノイル)。「-オイル」という末尾を、本明細書で定義されている別の基、例えば、アリール、シクロアルキル、及びヘテロシクリル、に付加して、「アリーロイル」、「シクロアルカノイル」、及び「(ヘテロシクリル)オイル」を定義してもよい。これらの基は、それぞれ、アリール、シクロアルキル、又はヘテロシクリルに結合したカルボニル基を表す。「アリーロイル」、「シクロアルカノイル」、及び「(ヘテロシクリル)オイル」の各々は、それぞれ、「アリール」、「シクロアルキル」、又は「ヘテロシクリル」について定義されている通りに任意に置換されていてもよい。
【０２４７】
本明細書で使用される「アルケニル」という用語は、1、2、又は3つの炭素-炭素二重結合を含有する非環式の一価直鎖又は分岐鎖炭化水素基を表す。該アルケニル基の非限定的な例としては、エテニル、プロパ-1-エニル、プロパ-2-エニル、1-メチルエテニル、ブタ-1-エニル、ブタ-2-エニル、ブタ-3-エニル、1-メチルプロパ-1-エニル、2-メチルプロパ-1-エニル、及び1-メチルプロパ-2-エニルが挙げられる。アルケニル基は、アルキルについて本明細書で定義されている通りに任意に置換されていてもよい。
【０２４８】
本明細書で使用される「アルケニレン」という用語は、水素が1個除去され、それにより、この基が二価になっている、直鎖又は分岐鎖アルケニル基を指す。該アルケニレン基の非限定的な例としては、エテン-1,1-ジイル;エテン-1,2-ジイル;プロパ-1-エン-1,1-ジイル、プロパ-2-エン-1,1-ジイル;プロパ-1-エン-1,2-ジイル、プロパ-1-エン-1,3-ジイル;プロパ-2-エン-1,1-ジイル;プロパ-2-エン-1,2-ジイル;ブタ-1-エン-1,1-ジイル;ブタ-1-エン-1,2-ジイル;ブタ-1-エン-1,3-ジイル;ブタ-1-エン-1,4-ジイル;ブタ-2-エン-1,1-ジイル;ブタ-2-エン-1,2-ジイル;ブタ-2-エン-1,3-ジイル;ブタ-2-エン-1,4-ジイル;ブタ-2-エン-2,3-ジイル;ブタ-3-エン-1,1-ジイル;ブタ-3-エン-1,2-ジイル;ブタ-3-エン-1,3-ジイル;ブタ-3-エン-2,3-ジイル;ブタ-1,2-ジエン-1,1-ジイル;ブタ-1,2-ジエン-1,3-ジイル;ブタ-1,2-ジエン-1,4-ジイル;ブタ-1,3-ジエン-1,1-ジイル;ブタ-1,3-ジエン-1,2-ジイル;ブタ-1,3-ジエン-1,3-ジイル;ブタ-1,3-ジエン-1,4-ジイル;ブタ-1,3-ジエン-2,3-ジイル;ブタ-2,3-ジエン-1,1-ジイル;及びブタ-2,3-ジエン-1,2-ジイルが挙げられる。該アルケニレン基は、置換されていなくてもよく、又はアルキルについて記載されている通りに置換されていてもよい(例えば、任意に置換されたアルケニレン)。
【０２４９】
本明細書で使用される「アルコキシ」という用語は、式-ORの化学置換基を表し、式中、Rは、別途指定されない限り、C1-6アルキル基である。いくつかの実施態様において、該アルキル基は、本明細書で定義されている通りにさらに置換されていてもよい。「アルコキシ」という用語を、本明細書で定義されている他の用語、例えば、アリール、シクロアルキル、又はヘテロシクリルと組み合わせて、「アリールアルコキシ」、「シクロアルキルアルコキシ」、及び「(ヘテロシクリル)アルコキシ」基を定義することができる。これらの基は、それぞれ、アリール、シクロアルキル、又はヘテロシクリルによって置換されているアルコキシを表す。「アリールアルコキシ」、「シクロアルキルアルコキシ」、及び「(ヘテロシクリル)アルコキシ」の各々は、各々の個々の部分について本明細書で定義されている通りに任意に置換されていてもよい。
【０２５０】
本明細書で使用される「アルキル」という用語は、置換されていない場合、別途指定されない限り、1〜12個の炭素を有する、非環式の直鎖又は分岐鎖飽和炭化水素基を指す。ある好ましい実施態様において、非置換アルキルは、1〜6つの炭素を有する。アルキル基は、メチル;エチル; n-プロピル及びイソ-プロピル; n-ブチル、sec-ブチル、イソ-ブチル、及びtert-ブチル;ネオペンチルなどによって例示され、原子価が許容すれば、アミノ;アリール;アリールオキシ;アジド;シクロアルキル;シクロアルコキシ;シクロアルケニル;シクロアルキニル;ハロ;ヘテロシクリル;(ヘテロシクリル)オキシ;ヒドロキシ;ニトロ;チオール;シリル;シアノ; =O; =S; =NR'(ここで、R'は、H、アルキル、アリール、又はヘテロシクリルである):からなる群から独立に選択される、1、2、3個、又は炭素が2以上のアルキル基の場合、4以上の置換基で任意に置換されていてもよい。該置換基の各々は、それ自体、置換されていなくてもよく、又は原子価が許容すれば、各々のそれぞれの基について本明細書で定義されている通りに非置換置換基で置換されていてもよい。
【０２５１】
本明細書で使用される「アルキルアミノ」という用語は、式-N(RN1)2又は-NHRN1(式中、RN1は、本明細書で定義されているアルキルである)を有する基を指す。アルキルアミノのアルキル部分は、アルキルについて定義されている通りに任意に置換されていてもよい。置換アルキルアミノ上の各々の任意の置換基は、それ自体、置換されていなくてもよく、又は原子価が許容すれば、各々のそれぞれの基について本明細書で定義されている非置換置換基で置換されていてもよい。
【０２５２】
本明細書で使用される「アルキルシクロアルキレン」という用語は、2つの原子価が2個の水素原子を置換している、アルキルシクロアルカンである飽和二価炭化水素基を指す。好ましくは、該2つの原子価のうちの少なくとも1つは、シクロアルカン部分に存在する。該アルカン及びシクロアルカン部分は、本明細書に記載されている通りに個々の基として任意に置換されていてもよい。
【０２５３】
本明細書で使用される「アルキレン」という用語は、2つの原子価が2個の水素原子を置換している、直鎖又は分岐鎖飽和炭化水素である飽和二価炭化水素基を指す。本明細書で定義されているアルキレンの原子価は、任意の置換基を含まない。該アルキレン基の非限定的な例としては、メチレン、エタン-1,2-ジイル、エタン-1,1-ジイル、プロパン-1,3-ジイル、プロパン-1,2-ジイル、プロパン-1,1-ジイル、プロパン-2,2-ジイル、ブタン-1,4-ジイル、ブタン-1,3-ジイル、ブタン-1,2-ジイル、ブタン-1,1-ジイル、及びブタン-2,2-ジイル、ブタン-2,3-ジイルが挙げられる。「Cx-yアルキレン」という用語は、x〜y個の炭素を有するアルキレン基を表す。xの例示的な値は、1、2、3、4、5、及び6であり、yの例示的な値は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、及び12である。アルキレンは、アルキルについて本明細書に記載されている通りに任意に置換されていてもよい。
【０２５４】
本明細書で使用される「アルキルスルフェニル」という用語は、式-S-(アルキル)の基を表す。アルキルスルフェニルは、アルキルについて定義されている通りに任意に置換されていてもよい。
【０２５５】
本明細書で使用される「アルキルスルフィニル」という用語は、式-S(O)-(アルキル)の基を表す。アルキルスルフィニルは、アルキルについて定義されている通りに任意に置換されていてもよい。
【０２５６】
本明細書で使用される「アルキルスルホニル」」という用語は、式-S(O)2-(アルキル)の基を表す。アルキルスルホニルは、アルキルについて定義されている通りに任意に置換されていてもよい。
【０２５７】
本明細書で使用される「アルキニル」という用語は、少なくとも1つの炭素-炭素三重結合を含有する2〜6個の炭素原子の一価の直鎖又は分岐鎖炭化水素基を表し、エチニル、1-プロピニルなどによって例示される。該アルキニル基は、置換されていなくてもよく、又はアルキルについて定義されている通りに置換されていてもよい(例えば、任意に置換されたアルキニル)。
【０２５８】
本明細書で使用される「5-アルキニルウリジン」という用語は、ヌクレオ塩基が、以下の構造の5-アルキニルウラシルであるヌクレオシドを表す:
【化２】
2020512843.tif 000004
(ここで、Rは、該ヌクレオシドのペンタフラノースのアノマー炭素との結合であり、かつXは、アルキニルである)。いくつかの実施態様において、Xは、エチニル又はプロピニルである(例えば、Xは、エチニルである)。
【０２５９】
本明細書で使用される「アルキニレン」という用語は、1又は2つの炭素-炭素三重結合を含み、かつ置換されていない場合、C及びHのみを含有する、直鎖又は分岐鎖の二価置換基を指す。該アルキニレン基の非限定的な例としては、エチン-1,2-ジイル;プロパ-1-イン-1,3-ジイル;プロパ-2-イン-1,1-ジイル;ブタ-1-イン-1,3-ジイル;ブタ-1-イン-1,4-ジイル;ブタ-2-イン-1,1-ジイル;ブタ-2-イン-1,4-ジイル;ブタ-3-イン-1,1-ジイル;ブタ-3-イン-1,2-ジイル;ブタ-3-イン-2,2-ジイル;及びブタ-1,3-ジイン-1,4-ジイルが挙げられる。該アルキニレン基は、置換されていなくてもよく、又はアルキニル基について記載されている通りに置換されていてもよい(例えば、任意に置換されたアルキニレン)。
【０２６０】
本明細書で使用される「アミノ」という用語は、-N(RN1)2を表し、ここで、アミノが置換されていない場合、両方のRN1はHであるか;又はアミノが置換されている場合、各々のRN1は、独立に、H、-OH、-NO2、-N(RN2)2、-SO2ORN2、-SO2RN2、-SORN2、-COORN2、N-保護基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、アリールアルキル、アリールオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、もしくはヘテロシクリルであり、ただし、少なくとも1つのRN1はHではなく、かつ各々のRN2は、独立に、H、アルキル、もしくはアリールである。該置換基の各々は、それ自体、置換されていなくてもよく、又は各々のそれぞれの基について本明細書で定義されている非置換置換基で置換されていてもよい。いくつかの実施態様において、アミノは、非置換アミノ(すなわち、-NH2)又は置換アミノ(例えば、-NHRN1)であり、ここで、RN1は、独立に、-OH、-SO2ORN2、-SO2RN2、-SORN2、-COORN2、任意に置換されたアルキル、又は任意に置換されたアリールであり、かつ各々のRN2は、任意に置換されたアルキル又は任意に置換されたアリールであることができる。いくつかの実施態様において、置換アミノは、アルキルアミノであってもよく、ここで、アルキル基は、アルキルについて本明細書に記載されている通りに任意に置換されている。ある実施態様において、アミノ基は、RN1が任意に置換されたアルキルである-NHRN1である。RN1が任意に置換されたアルキルである-NHRN1の非限定的な例としては:任意に置換されたアルキルアミノ、タンパク質を構成するアミノ酸、タンパク質を構成しないアミノ酸、タンパク質を構成するアミノ酸のC1-6アルキルエステル、及びタンパク質を構成しないアミノ酸C1-6アルキルエステルが挙げられる。
【０２６１】
本明細書で使用される「アミノアルキル」という用語は、本明細書で定義されている、1、2、又は3つのアミノ基で置換されたアルキルを表す。アミノアルキルは、アルキル基について記載されている通りにさらに任意に置換されていてもよい。
【０２６２】
本明細書で使用される「アレン-テトライル」という用語は、3個の水素原子が原子価と置き換えられているアリール基である四価基を表す。アレン-テトライルは、アリールについて本明細書に記載されている通りに任意に置換されていてもよい。
【０２６３】
本明細書で使用される「アリール」という用語は、1又は2つの芳香環を有する単環式、二環式、又は多環式炭素環式環系を表す。アリール基は、6〜10個の炭素原子を含んでいてもよい。非置換炭素環式アリール基内の原子は全て、炭素原子である。炭素環式アリール基の非限定的な例としては、フェニル、ナフチル、1,2-ジヒドロナフチル、1,2,3,4-テトラヒドロナフチル、フルオレニル、インダニル、インデニルなどが挙げられる。該アリール基は、置換されていなくてもよく、又はアルキル;アルケニル;アルキニル;アルコキシ;アルキルスルフィニル;アルキルスルフェニル;アルキルスルホニル;アミノ;アリール;アリールオキシ;アジド;シクロアルキル;シクロアルコキシ;シクロアルケニル;シクロアルキニル;ハロ;ヘテロアルキル;ヘテロシクリル;(ヘテロシクリル)オキシ;ヒドロキシ;ニトロ;チオール;シリル;及びシアノからなる群から独立に選択される1、2、3、4、もしくは5個の置換基で置換されていてもよい。該置換基の各々は、それ自体、置換されていなくてもよく、又は各々のそれぞれの基について本明細書で定義されている非置換置換基で置換されていてもよい。
【０２６４】
本明細書で使用される「アリールアルキル」という用語は、アリール基で置換されたアルキル基を表す。該アリール及びアルキル部分は、本明細書に記載されている通りに個々の基として任意に置換されていてもよい。
【０２６５】
本明細書で使用される「アリールアルキレン」という用語は、1個の水素原子が原子価と置き換えられているアリールアルキル基を表す。アリールアルキレンは、アリールアルキルについて本明細書に記載されている通りに任意に置換されていてもよい。
【０２６６】
本明細書で使用される「アリーレン」という用語は、1個の水素原子が原子価と置き換えられているアリール基を表す。アリーレンは、アリールについて本明細書に記載されている通りに任意に置換されていてもよい。
【０２６７】
本明細書で使用される「アリールオキシ」という用語は、式-ORの化学置換基を表し、式中、Rは、別途指定されない限り、アリール基である。任意に置換されたアリールオキシにおいて、該アリール基は、アリールについて本明細書に記載されている通りに任意に置換されている。
【０２６８】
本明細書で使用される「補助部分」という用語は、親水性ポリマー、正電荷を有するポリマー、又は糖アルコールを含有する一価基を表す。
【０２６９】
本明細書で使用される「任意に置換されたN」という用語は、二価-N(RN1)-基又は三価-N=基を表す。アザ基は、RN1がHであるかもしくは存在しない場合、置換されていなくてもよく、又はRN1がHでない場合を除いて、RN1が「アミノ」について定義されている通りである場合、置換されていてもよい。2つのアザ基は、「ジアザ」を形成するように接続されていてもよい。
【０２７０】
本明細書で使用される「任意に置換されたN-保護アミノ」という用語は、本明細書で定義されている置換アミノを表し、ここで、少なくとも1つの置換基はN-保護基であり、他の置換基は、N-保護アミノが置換されていない場合、Hであり、又はN-保護アミノが置換されている場合、H以外の置換基である。
【０２７１】
本明細書で使用される「アジド」という用語は、-N3基を表す。
【０２７２】
本明細書で使用される「嵩高い基」という用語は、本明細書で定義されている任意の置換基又は置換基の群を表し、ここで、ジスルフィドと結合しているラジカルは、該ラジカルがsp3混成炭素である場合、1以下の水素原子を保有し、又は該ラジカルがsp2混成炭素である場合、水素原子を保有していない、炭素原子である。該ラジカルは、sp混成炭素ではない。嵩高い基は、炭素原子を介してのみジスルフィドと結合している。
【０２７３】
本明細書で使用される「5'-5'キャップ」という用語は、式R'-Nuc1-O-(LP)n-の基を表し、式中、R'は、ホスフェート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、ホスホジエステル、ヒドロキシル、又は水素であり; Nuc1は、ヌクレオシドであり;各々のLPは、独立に、-P(=XE1)(-XE2-RE2A)-O-であり;かつnは、1、2、又は3であり;
ここで、各々のXE1及び各々のXE2は、独立に、O又はSであり、かつ各々のRE2Aは、独立に、水素、生体可逆性基、非生体可逆性基、補助部分、共役基、標的化部分に結合したリンカー、又は標的化部分及び1以上(例えば、1〜6つ)の補助部分に結合したリンカーであり;かつ
式中、R'は、該ヌクレオシドの3'-炭素に結合し、かつ-O-は、該ヌクレオシドの5'-炭素に結合している。
【０２７４】
本明細書で使用される「キャッピング基」という用語は、ポリヌクレオチドの5'-又は3'-末端に位置する一価又は二価基を表す。該キャッピング基は、末端リン酸エステル;ジホスフェート;トリホスフェート;補助部分;生体可逆性基;非生体可逆性基; 5'キャップ(例えば、5'-5'キャップ);固体支持体;標的化部分及び任意に1以上(例えば、1〜6つ)の補助部分に結合したリンカー;又は基-OR'(ここで、R'は、水素、生体可逆性基、非生体可逆性基、固体支持体、及びO-保護基からなる群から選択される)である。基-OR'、ジホスフェート、トリホスフェート、生体可逆性基、非生体可逆性基、固体支持体、及び補助部分は、一価キャッピング基の例である。末端リン酸エステルは、一価(末端リン酸エステルが標的化部分に対するリンカーを含まない場合)、又は二価(末端リン酸エステルが標的化部分に対するリンカーを含む場合)のいずれかであり得るキャッピング基の例である。標的化部分に結合したリンカー(補助部分を有する又は有さない)は、二価キャッピング基の例である。
【０２７５】
本明細書で使用される「炭素環式」という用語は、任意に置換されたC3-16単環式、二環式、又は三環式構造を表し、ここで、芳香族又は非芳香族であり得る、該環は、炭素原子によって形成される。炭素環式構造としては、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、及び特定のアリール基が挙げられる。
【０２７６】
本明細書で使用される「カルボニル」という用語は、-C(O)-基を表す。
【０２７７】
本明細書で使用される「Cx-y」という表現は、その名前がこの表現のすぐ後に続く基が、置換されていない場合、合計x〜y個の炭素原子を含有することを示す。該基が合成基(例えば、アリールアルキル)である場合、Cx-yは、その名前がこの表現のすぐ後に続く部分が、置換されていない場合、合計x〜y個の炭素原子を含有することを示す。例えば、(C6-10-アリール)-C1-6-アルキルは、該アリール部分が、置換されていない場合、合計6〜10個の炭素原子を含有し、かつ該アルキル部分が、置換されていない場合、合計6〜10個の炭素原子を含有する基である。
【０２７８】
本明細書で使用される「シアノ」という用語は、-CN基を表す。
【０２７９】
本明細書で使用される「付加環化反応」という用語は、活性化なし、化学触媒による活性化、又は熱エネルギーを用いる活性化のいずれかが存在し、かつnが、1、2、又は3であるとき、合計[4n+2]個のπ電子が結合形成に関与する2つの構成要素の反応を表す。付加環化反応は、光化学活性化が存在し、かつnが、1、2、又は3であるとき、[4n]個のπ電子が関与する2つの構成要素の反応でもある。望ましくは、[4n+2]個のπ電子が結合形成に関与し、n＝1である。代表的な付加環化反応としては、アルケンと1,3-ジエンとの反応(ディールス・アルダー反応)、アルケンとα,β-非置換カルボニルとの反応(ヘテロディールス・アルダー反応)、及びアルキンとアジド化合物との反応(例えば、ヒュスゲン付加環化)が挙げられる。
【０２８０】
本明細書で使用される「シクロアルケニル」という用語は、別途指定されない限り、環中の少なくとも1つの二重結合と3〜10個の炭素とを有する非芳香族炭素環式基(例えば、C3-C10シクロアルケニル)を指す。シクロアルケニルの非限定的な例としては、シクロプロパ-1-エニル、シクロプロパ-2-エニル、シクロブタ-1-エニル、シクロブタ-1-エニル、シクロブタ-2-エニル、シクロペンタ-1-エニル、シクロペンタ-2-エニル、シクロペンタ-3-エニル、ノルボルネン-1-イル、ノルボルネン-2-イル、ノルボルネン-5-イル、及びノルボルネン-7-イルが挙げられる。該シクロアルケニル基は、置換されていなくても、又はシクロアルキルについて記載されている通りに置換されていてもよい(例えば、任意に置換されたシクロアルケニル)。
【０２８１】
本明細書で使用される「シクロアルケニルアルキル」という用語は、各々本明細書で定義されている、シクロアルケニル基で置換されたアルキル基を表す。該シクロアルケニル及びアルキル部分は、本明細書で定義されている個々の基として置換されていてもよい。
【０２８２】
本明細書で使用される「シクロアルケニレン」という用語は、1個の水素原子が原子価と置き換えられているシクロアルケニル基である二価基を表す。シクロアルケニレンは、シクロアルキルについて本明細書に記載されている通りに任意に置換されていてもよい。シクロアルケニレンの非限定的な例は、シクロアルケン-1,3-ジイルである。
【０２８３】
本明細書で使用される「シクロアルコキシ」という用語は、式-ORの化学置換基を表し、式中、Rは、別途指定されない限り、シクロアルキル基である。いくつかの実施態様において、該シクロアルキル基は、本明細書で定義されている通りにさらに置換されていてもよい。
【０２８４】
本明細書で使用される「シクロアルキル」という用語は、別途指定されない限り、3〜10個の炭素を有する環状アルキル基(例えば、C3-C10シクロアルキル)を指す。シクロアルキル基は、単環式又は二環式であってもよい。二環式シクロアルキル基は、ビシクロ[p.q.0]アルキル型のものであってもよく、ここで、p及びqの各々は、独立に、1、2、3、4、5、6、又は7であり、ただし、pとqの和は、2、3、4、5、6、7、又は8である。或いは、二環式シクロアルキル基は、架橋シクロアルキル構造、例えば、ビシクロ[p.q.r]アルキルを含んでいてもよく、ここで、rは、1、2、又は3であり、p及びqの各々は、独立に、1、2、3、4、5、又は6であり、ただし、pとqとrの和は、3、4、5、6、7、又は8である。該シクロアルキル基は、スピロ環式基、例えば、スピロ[p.q]アルキルであってもよく、ここで、p及びqの各々は、独立に、2、3、4、5、6、又は7であり、ただし、pとqの和は、4、5、6、7、8、又は9である。シクロアルキルの非限定的な例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、1-ビシクロ[2.2.1.]ヘプチル、2-ビシクロ[2.2.1.]ヘプチル、5-ビシクロ[2.2.1.]ヘプチル、7-ビシクロ[2.2.1.]ヘプチル、及びデカリニルが挙げられる。該シクロアルキル基は、置換されていなくてもよく、又はアルキル;アルケニル;アルキニル;アルコキシ;アルキルスルフィニル;アルキルスルフェニル;アルキルスルホニル;アミノ;アリール;アリールオキシ;アジド;シクロアルキル;シクロアルコキシ;シクロアルケニル;シクロアルキニル;ハロ;ヘテロアルキル;ヘテロシクリル;(ヘテロシクリル)オキシ;ヒドロキシ;ニトロ;チオール;シリル;シアノ;=O;=S;=NR'(R'は、H、アルキル、アリール、もしくはヘテロシクリルである):からなる群から独立に選択される1、2、3、4、もしくは5個の置換基で置換されていてもよい(例えば、任意に置換されたシクロアルキル)。該置換基の各々は、それ自体、置換されていなくてもよく、又は各々のそれぞれの基について本明細書で定義されている非置換置換基で置換されていてもよい。
【０２８５】
本明細書で使用される「シクロアルキルアルキル」という用語は、各々本明細書で定義されている、シクロアルキル基で置換されたアルキル基を表す。該シクロアルキル及びアルキル部分は、本明細書に記載されている個々の基として任意に置換されていてもよい。
【０２８６】
本明細書で使用される「シクロアルキレン」という用語は、1個の水素原子が原子価と置き換えられているシクロアルキル基である二価基を表す。シクロアルキレンの非限定的な例は、シクロアルカン-1,3-ジイルである。シクロアルキレンは、シクロアルキルについて本明細書に記載されている通りに任意に置換されていてもよい。
【０２８７】
本明細書で使用される「シクロアルキニル」という用語は、別途指定されない限り、1又は2つの炭素-炭素三重結合を有し、かつ8〜12個の炭素を有する一価炭素環式基を指す。シクロアルキニルは、1つの渡環結合又は架橋を含んでいてもよい。シクロアルキニルの非限定的な例としては、シクロオクチニル、シクロノニニル、シクロデシニル、及びシクロデカジイニルが挙げられる。該シクロアルキニル基は、置換されていなくてもよく、又はシクロアルキルについて定義されている通りに置換されていてもよい(例えば、任意に置換されたシクロアルキニル)。
【０２８８】
本明細書で使用される「ジヒドロピリダジン基」という用語は、1,2,4,5-テトラジン基と歪みシクロアルケニルの間の付加環化を介して得られる二価基を表す。
【０２８９】
本明細書で使用される「ハロ」という用語は、臭素、塩素、ヨウ素、及びフッ素から選択されるハロゲンを表す。
【０２９０】
本明細書で使用される「5-ハロウリジン」という用語は、ヌクレオ塩基が、以下の構造の5-ハロウラシルであるヌクレオシドを表す:
【化３】
2020512843.tif 000005
(ここで、Rは、該ヌクレオシドのペンタフラノースのアノマー炭素との結合であり、かつXは、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨードである)。いくつかの実施態様において、Xは、ブロモ又はヨードである。
【０２９１】
本明細書で使用される「ヘテロアルカン-テトライル」という用語は、1個のヘテロ原子によって1回; 1個のヘテロ原子によって、毎回独立に、2回; 1個のヘテロ原子によって、毎回独立に、3回;又は1個のヘテロ原子によって、毎回独立に、4回中断されているアルカン-テトライル基を指す。各々のヘテロ原子は、独立に、O、N、又はSである。いくつかの実施態様において、該ヘテロ原子は、O又はNである。非置換CX-Yヘテロアルカン-テトライルは、X〜Y個の炭素原子及び本明細書で定義されているヘテロ原子を含有する。該ヘテロアルカン-テトライル基は、置換されていなくてもよく、又はヘテロアルキルについて記載されているように置換されていてもよい(例えば、任意に置換されたヘテロアルカン-テトライル)。
【０２９２】
本明細書で使用される「ヘテロアルカン-トリイル」という用語は、1個のヘテロ原子によって1回; 1個のヘテロ原子によって、毎回独立に、2回; 1個のヘテロ原子によって、毎回独立に、3回;又は1個のヘテロ原子によって、毎回独立に、4回中断されているアルカン-トリイル基を指す。各々のヘテロ原子は、独立に、O、N、又はSである。いくつかの実施態様において、該ヘテロ原子は、O又はNである。非置換CX-Yヘテロアルカン-トリイルは、X〜Y個の炭素原子及び本明細書で定義されているヘテロ原子を含有する。該ヘテロアルカン-トリイル基は、置換されていなくてもよく、又はヘテロアルキルについて記載されているように置換されていてもよい(例えば、任意に置換されたヘテロアルカン-トリイル)。
【０２９３】
本明細書で使用される「ヘテロアルキル」という用語は、1もしくは2個のヘテロ原子によって1回; 1もしくは2個のヘテロ原子によって、毎回独立に、2回; 1もしくは2個のヘテロ原子によって、毎回独立に、3回;又は1もしくは2個のヘテロ原子によって、毎回独立に、4回中断されているアルキル、アルケニル、又はアルキニル基を指す。各々のヘテロ原子は、独立に、O、N、又はSである。いくつかの実施態様において、該ヘテロ原子は、O又はNである。該ヘテロアルキル基はいずれも、2つの隣接する酸素又は硫黄原子を含まない。該ヘテロアルキル基は、置換されていなくてもよく、又は置換されていてもよい(例えば、任意に置換されたヘテロアルキル)。ヘテロアルキルが置換されており、かつ置換基がヘテロ原子に結合している場合、該置換基は、該ヘテロ原子の性質及び原子価によって選択される。したがって、ヘテロ原子に結合している置換基は、原子価が許容すれば、=O、-N(RN2)2、-SO2ORN3、-SO2RN2、-SORN3、-COORN3、N-保護基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、又はシアノからなる群から選択され、ここで、各々のRN2は、独立に、H、アルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、又はヘテロシクリルであり、かつ各々のRN3は、独立に、アルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、又はヘテロシクリルである。これらの置換基の各々は、それ自体、置換されていなくてもよく、又は各々のそれぞれの基について本明細書で定義されている非置換置換基で置換されていてもよい。ヘテロアルキルが置換されており、かつ置換基が炭素に結合している場合、該置換基は、アルキルについて記載されているものから選択され、ただし、ヘテロ原子に結合している炭素原子上の置換基は、ClでもBrでもIでもない。炭素原子は、ヘテロアルキル基の末端に見られるということが理解される。
【０２９４】
本明細書で使用される「ヘテロアリールオキシ」という用語は、Rがヘテロアリールである構造-ORを指す。ヘテロアリールオキシは、ヘテロシクリルについて定義されている通りに任意に置換されていてもよい。
【０２９５】
本明細書で使用される「ヘテロシクリル」という用語は、別途指定されない限り、縮合又は架橋5、6、7、又は8員環を有し、窒素、酸素、及び硫黄からなる群から独立に選択される1、2、3、又は4個のヘテロ原子を含有する、単環式、二環式、三環式、又は四環式環系を表す。ヘテロシクリルは、芳香族又は非芳香族であることができる。非芳香族5員ヘテロシクリルは、0又は1つの二重結合を有し、非芳香族6員及び7員ヘテロシクリル基は、0〜2つの二重結合を有し、非芳香族8員ヘテロシクリル基は、0〜2つの二重結合及び/又は0もしくは1つの炭素-炭素三重結合を有する。ヘテロシクリル基は、別途指定されない限り、1〜16個の炭素原子を含む。特定のヘテロシクリル基は、最大9個の炭素原子を含み得る。非芳香族ヘテロシクリル基としては、ピロリニル、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ホモピペリジニル、ピペラジニル、ピリダジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロインドリル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、ピラニル、ジヒドロピラニル、ジチアゾリルなどが挙げられる。ヘテロ環式環系が少なくとも1つの芳香族共鳴構造又は少なくとも1つの芳香族互変異性体を有する場合、そのような構造は、芳香族ヘテロシクリル(すなわち、ヘテロアリール)である。ヘテロアリール基の非限定的な例としては、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチエニル、ベンゾオキサゾリル、フリル、イミダゾリル、インドリル、イソインダゾリル、イソキノリニル、イソチアゾリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、プリニル、ピロリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、クナゾリニル(qunazolinyl)、キノリニル、チアジアゾリル(例えば、1,3,4-チアジアゾール)、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、テトラゾリルなどが挙げられる。「ヘテロシクリル」という用語は、1以上の炭素及び/又はヘテロ原子が単環式環の2つの近接していない員を架橋している架橋多環式構造を有するヘテロ環式化合物、例えば、キヌクリジン、トロパン、又はジアザ-ビシクロ[2.2.2]オクタンも表す。「ヘテロシクリル」という用語は、上記のヘテロ環式環のいずれかが、1、2、又は3つの炭素環式環、例えば、アリール環、シクロヘキサン環、シクロヘキセン環、シクロペンタン環、シクロペンテン環、又は別の単環式ヘテロ環式環に縮合している二環式、三環式、及び四環式基を含む。縮合ヘテロシクリルの例としては、1,2,3,5,8,8a-ヘキサヒドロインドリジン; 2,3-ジヒドロベンゾフラン; 2,3-ジヒドロインドール;及び2,3-ジヒドロベンゾチオフェンが挙げられる。該ヘテロシクリル基は、置換されていなくてもよく、又はアルキル;アルケニル;アルキニル;アルコキシ;アルキルスルフィニル;アルキルスルフェニル;アルキルスルホニル;アミノ;アリール;アリールオキシ;アジド;シクロアルキル;シクロアルコキシ;シクロアルケニル;シクロアルキニル;ハロ;ヘテロアルキル;ヘテロシクリル;(ヘテロシクリル)オ��シ;ヒドロキシ;ニトロ;チオール;シリル;シアノ; =O; =S; =NR'(ここで、R'は、H、アルキル、アリール、もしくはヘテロシクリルである):からなる群から独立に選択される1、2、3、4、もしくは5個の置換基で置換されていてもよい。該置換基の各々は、それ自体、置換されていなくてもよく、又は各々のそれぞれの基について本明細書で定義されている非置換置換基で置換されていてもよい。
【０２９６】
本明細書で使用される「ヘテロシクリルアルキル」という用語は、各々本明細書で定義されている、ヘテロシクリル基で置換されたアルキル基を表す。該ヘテロシクリル及びアルキル部分は、本明細書に記載されている個々の基として任意に置換されていてもよい。
【０２９７】
本明細書で使用される「(ヘテロシクリル)アザ」という用語は、式-N(RN1)(RN2)の化学置換基を表し、式中、RN1は、ヘテロシクリル基であり、かつRN2は、H、-OH、-NO2、-N(RN2)2、-SO2ORN2、-SO2RN2、-SORN2、-COORN2、N-保護基、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アリール、アリールアルキル、アリールオキシ、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアルキル、又はヘテロシクリルである。好ましくは、RN2は、Hである。
【０２９８】
本明細書で使用される「ヘテロシクリレン」という用語は、1個の水素原子が原子価と置き換えられているヘテロシクリル基を表す。該ヘテロシクリレンは、ヘテロシクリルについて記載されているように任意に置換されていてもよい。ヘテロシクリレンの非限定的な例は、ヘテロ環-1,3-ジイルである。
【０２９９】
本明細書で使用される「(ヘテロシクリル)オキシ」という用語は、式-ORの化学置換基を表し、式中、Rは、別途指定されない限り、ヘテロシクリル基である。(ヘテロシクリル)オキシは、ヘテロシクリルについて記載されているように任意に置換されていてもよい。
【０３００】
本明細書で互換的に使用される「ヒドロキシル」及び「ヒドロキシ」という用語は、-OH基を表す。
【０３０１】
本明細書で使用される「免疫調節ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシド間リン酸エステル及び任意にヌクレオシド間脱塩基スペーサーからなる群から独立に選択されるヌクレオシド間架橋基によって共有結合的に結合されている合計6〜50の連続するヌクレオシドを含有するポリヌクレオチドコンストラクトを表す。該免疫調節ポリヌクレオチドは、それぞれ、5'-及び3'-キャッピング基により、5'-及び3'-末端でキャッピングされている。該免疫調節ポリヌクレオチドは、例えば、免疫調節ポリヌクレオチドが送達された抗原提示細胞における(例えば、免疫調節ポリヌクレオチドが送達されなかった別の抗原提示細胞と比較した)NFκBの活性化の変化又は少なくとも1つの炎症性サイトカインもしくは少なくとも1つのI型インターフェロンの分泌の変化によって決定されるような、自然免疫応答の調節が可能である。該免疫調節ポリヌクレオチドは、共役基、又は該免疫調節ポリヌクレオチドがコンジュゲートの部分である場合、標的化部分及び任意に1以上(例えば、1〜6つ)の補助部分(例えば、ポリエチレングリコール)に結合しているリンカーを含有し得る。該共役基又は該リンカーは、ホスホトリエステル又は末端キャッピング基の部分であり得る。
【０３０２】
本明細書で使用される「免疫刺激ポリヌクレオチド」という用語は、例えば、免疫刺激ポリヌクレオチドが送達された抗原提示細胞における(例えば、免疫刺激ポリヌクレオチドが送達されなかった別の抗原提示細胞と比較した)NFκBの活性化の増大又は少なくとも1つの炎症性サイトカインもしくは少なくとも1つのI型インターフェロンの分泌の増大によって決定されるような、自然免疫応答の活性化が可能である免疫調節ポリヌクレオチドを表す。いくつかの実施態様において、該免疫刺激ポリヌクレオチドは、少なくとも1つのシチジン-p-グアノシン(CpG)配列(ここで、pは、ヌクレオシド間ホスホジエステル(例えば、ホスフェートもしくはホスホロチオエート)又はヌクレオシド間ホスホトリエステルもしくはホスホチオトリエステルである)を含有する。本明細書で使用される場合、CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、細菌もしくはウイルス起源のCpG ODNなどの天然に存在するもの、又は合成されたものであることができる。例えば、いくつかの実施態様において、該免疫刺激ポリヌクレオチド中のCpG配列は、2'-デオキシリボースを含有する。いくつかの実施態様において、該免疫刺激ポリヌクレオチド中のCpG配列は、メチル化されていない。いくつかの実施態様において、該免疫刺激ポリヌクレオチドは、本明細書に提供される式(A)のオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施態様において、該免疫刺激ポリヌクレオチドは、本明細書に提供される式(B)のオリゴヌクレオチドである。
【０３０３】
本明細書で使用される「免疫抑制ポリヌクレオチド」という用語は、例えば、免疫抑制ポリヌクレオチドが送達された抗原提示細胞における(例えば、免疫抑制ポリヌクレオチドが送達されなかった別の抗原提示細胞と比較した)NFκBの活性化の低下又は少なくとも1つの炎症性サイトカインもしくは少なくとも1つのI型インターフェロンの分泌の低下によって決定されるような、自然免疫応答の抑制が可能である免疫調節ポリヌクレオチドを表す。
【０３０４】
本明細書で使用される「ヌクレオシド間架橋基」という用語は、ヌクレオシド間リン酸エステル又はヌクレオシド間脱塩基スペーサーを表す。
【０３０５】
本明細書で使用される「5-修飾シチジン」という用語は、ヌクレオ塩基が、以下の構造のものであるヌクレオシドを表す:
【化４】
2020512843.tif 000006
(ここで、Rは、該ヌクレオシドのペンタフラノースのアノマー炭素との結合であり、かつXは、ハロゲン、アルキニル、アルケニル、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、又はアリールである)。いくつかの実施態様において、5-修飾シチジンは、5-ハロシチジン(例えば、5-ヨードシチジン又は5-ブロモシチジン)である。他の実施態様において、5-修飾シチジンは、5-アルキニルシチジンである。
【０３０６】
本明細書で使用される「5-修飾ウリジン」という用語は、ヌクレオ塩基が、以下の構造のものであるヌクレオシドを表す:
【化５】
2020512843.tif 000007
(ここで、Rは、該ヌクレオシドのペンタフラノースのアノマー炭素との結合であり、かつXは、ハロゲン、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、又はアリールであり、ただし、該5-修飾ウリジンは、チミジンではない)。いくつかの実施態様において、5-修飾ウリジンは、5-ハロウリジン(例えば、5-ヨードウリジン又は5-ブロモウリジン)である。他の実施態様において、5-修飾ウリジンは、5-アルキニルウリジンである。いくつかの実施態様において、5-修飾ウリジンは、2-デオキシリボースを含有するヌクレオシドである。
【０３０７】
本明細書で使用される「ニトロ」という用語は、-NO2基を表す。
【０３０８】
本明細書で使用される「非生体可逆性」という用語は、エンドソームの内部に存在する条件下で分解に抵抗性である化学基を指す。非生体可逆性基は、チオエステル及び/又はジスルフィドを含有しない。
【０３０９】
本明細書で使用される「ヌクレオ塩基」という用語は、ヌクレオチド又はヌクレオシドの糖部分の1'位に結合した窒素含有ヘテロ環式環を表す。ヌクレオ塩基は、修飾されていなくても、修飾されていてもよい。本明細書で使用される場合、「未修飾」又は「天然」ヌクレオ塩基には、プリン塩基のアデニン(A)及びグアニン(G)、並びにピリミジン塩基のチミン(T)、シトシン(C)、及びウラシル(U)が含まれる。修飾ヌクレオ塩基には、他の合成及び天然ヌクレオ塩基、例えば、5-メチルシトシン(5-me-C又はm5c)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6-メチル及びその他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2-プロピル及びその他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミン、及び2-チオシトシン、5-ハロウラシル及びシトシン、5-プロピニルウラシル及びシトシン、6-アゾウラシル、シトシン、及びチミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル及びその他の8-置換アデニン及びグアニン、5-ハロ、特に、5-ヨード、5-ブロモ、5-トリフルオロメチル及びその他の5-置換ウラシル及びシトシン、5-アルキニル(例えば、5-エチニル)ウラシル、5-アセトアミド-ウラシル、7-メチルグアニン、及び7-メチルアデニン、8-アザグアニン及び8-アザアデニン、7-デアザグアニン及び7-デアザアデニン、並びに3-デアザグアニン及び3-デアザアデニンが含まれる。さらなるヌクレオ塩基には、米国特許第3,687,808号に開示されているもの;ポリマー科学及び工学のコンサイス百科事典(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering)、858〜859ページ、 Kroschwitz, J. I.編、John Wiley & Sons, 1990に開示されているもの; Englischらの文献、Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に開示されているもの;及びSanghvi, Y. S.の文献、第15章、アンチセンス研究及び応用(Antisense Research and Applications)、289〜302ページ(Crookeら編、CRC Press, 1993)に開示されているものが含まれる。5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、並びに2-アミノプロピニルアデニンを含むN-2、N-6、及びO-6置換プリン、5-プロピニルウラシル、並びに5-プロピニルシトシンを含む、特定のヌクレオ塩基は、本発明のハイブリダイズしたポリヌクレオチドの結合親和性を増大させるのに特に有用である。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を0.6〜1.2℃増大させることが示されている(Sanghviら編、アンチセンス研究及び応用(Antisense Research and Applications)、1993, CRC Press, Boca Raton、276〜278ページ)。これらは、特定の実施態様において、2'-O-メトキシエチル糖修飾と組み合わせることができる。これらの修飾ヌクレオ塩基及び他の修飾ヌクレオ塩基のうちのいくつかの調製を教示する米国特許としては、上記の米国特許第3,687,808号;第4,845,205号;第5,130,302号;第5,134,066号;第5,175,273号;第5,367,066号;第5,432,272号;第5,457,187号;第5,459,255号;第5,484,908号;第5,502,177号;第5,525,711号;第5,552,540号;第5,587,469号;第5,594,121号;第5,596,091号;第5,614,617号;及び第5,681,941号が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の目的のために、本明細書で使用される「修飾ヌクレオ塩基」はさらに、本明細書に記載される1以上の保護基を含む天然又は非天然のヌクレオ塩基を表す。
【０３１０】
本明細書で使用される「ヌクレオシド」という用語は、ペンタフラノース-ヌクレオ塩基の組合せを表す。該ペンタフラノースは、2位が、OR、R、ハロ(例えば、F)、SH、SR、NH2、NHR、NR2、又はCNで置換されており、ここで、Rが、任意に置換されたC1-6アルキル(例えば、C1-6アルキルもしくは(C1-6アルコキシ)-C1-6-アルキル)又は任意に置換された(C6-14アリール)-C1-4-アルキルである、2-デオキシリボース又はその修飾型である。ある実施態様において、2位は、OR又はFで置換されており、ここで、Rは、C1-6アルキル又は(C1-6-アルコキシ)-C1-6-アルキルである。該ペンタフラノースは、アノマー炭素でヌクレオ塩基に結合している。いくつかの実施態様において、「ヌクレオシド」という用語は、以下の構造を有する二価基を指す:
【化６】
2020512843.tif 000008
（ここで、B1は、ヌクレオ塩基であり; Yは、H、ハロゲン(例えば、F)、ヒドロキシル、任意に置換されたC1-6アルコキシ(例えば、メトキシもしくはメトキシエトキシ)、又は保護されたヒドロキシル基であり; Y1は、H又はC1-6アルキル(例えば、メチル)であり;かつ3'及び5'の各々は、別の基との結合の位置を示す)。
【０３１１】
本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語は、ホスフェート、ホスホロチオエート、又はホスホロジチオエートに結合しているヌクレオシドを指す。
【０３１２】
本明細書で使用される「オキソ」という用語は、二価酸素原子を表す(例えば、オキソの構造は、=Oとして示されてもよい)。
【０３１３】
本明細書で使用される「患者」という用語は、ヒト又は非ヒト動物(例えば、哺乳動物)を表す。いくつかの実施態様において、対象は、患者由来の試料の当技術分野で公知の臨床検査によるか又はそれなしで、有資格専門家(例えば、医師又はナース・プラクティショナー)によって決定されるような、腫瘍(例えば、液性腫瘍又は固形腫瘍)に罹患していてもよい。
【０３１４】
本明細書で使用される「Ph」という用語は、フェニルを表す。
【０３１５】
本明細書で使用される「リン酸エステル」という用語は、少なくとも1つの原子価が非水素置換基に共有結合しており、ただし、少なくとも1つの非水素置換基が少なくとも1つのヌクレオシドを含有する基である、ホスフェート、ホスホロチオエート、又はホスホロジチオエートを含有する基を表す。ただ1つの原子価がヌクレオシドを含有する基に共有結合しているリン酸エステルは、末端リン酸エステルである。2つの原子価がヌクレオシド含有基に共有結合しているリン酸エステルは、ヌクレオシド間リン酸エステルである。リン酸エステルは、以下の構造の基であってもよい:
【化７】
2020512843.tif 000009
(ここで、
XE1及びXE2の各々は、独立に、O又はSであり;
RE1及びRE3の各々は、独立に、水素もしくはヌクレオシドとの結合;脱塩基スペーサーの糖類似体;生体可逆性基;非生体可逆性基;補助部分;共役基;標的化部分に結合しているリンカー;標的化部分及び1以上(例えば、1〜6つ)の補助部分に結合しているリンカー;又は式-P(=XE1)(-XE2-RE2A)-O-の基の中のリン原子であり、
ここで、RE2Aは、水素、生体可逆性基、非生体可逆性基、補助部分、共役基、標的化部分に結合しているリンカー、又は標的化部分及び1以上(例えば、1〜6つ)の補助部分に結合しているリンカーであり;かつ
RE2は、水素、生体可逆性基、非生体可逆性基、補助部分、共役基、標的化部分に結合しているリンカー、又は標的化部分及び1以上(例えば、1〜6つ)の補助部分に結合しているリンカーであり;
ただし、RE1及びRE3のうちの少なくとも1つは、少なくとも1つのヌクレオシドを含有する基との結合である)。
RE1及びRE3の各々が、独立に、少なくとも1つのヌクレオシドを含有する基との結合である場合、リン酸エステルは、ヌクレオシド間リン酸エステルである。RE1及びRE3のうちの1つがヌクレオシドを含有しない基との結合である場合、リン酸エステルは、末端リン酸エステルである。
【０３１６】
本明細書で使用される「ホスホジエステル」という用語は、3つの原子価のうちの2つが非水素置換基と置換されている一方、残りの原子価が水素と置換されているリン酸エステルを指す。ホスホジエステルは、ホスフェート、ホスホロチオエート、又はホスホロジチオエート;ヌクレオシド、脱塩基スペーサー、及び/又はホスホリル基との1又は2つの結合;並びに該ホスホジエステルが、ヌクレオシド、脱塩基スペーサー、又はホスホリル基とのただ1つの結合を含有する場合、生体可逆性基;非生体可逆性基;補助部分;共役基;標的化部分に結合しているリンカー;並びに標的化部分及び1以上(例えば、1〜6つ)の補助部分に結合しているリンカーからなる群から独立に選択される1つの基からなる。末端ホスホジエステルは、ヌクレオシドを含有する基、並びに生体可逆性基;非生体可逆性基;補助部分;共役基;ホスホリル基;並びに標的化部分及び任意に1以上(例えば、1〜6つ)の補助部分に結合しているリンカーからなる群から選択される1つの基との1つの結合を含む。ヌクレオシド間ホスホジエステルは、ヌクレオシド含有基との2つの結合を含む。ホスホジエステルは、以下の構造の基であってもよい:
【化８】
2020512843.tif 000010
(ここで、
XE1及びXE2の各々は、独立に、O又はSであり;
RE1及びRE3の各々は、独立に、水素もしくはヌクレオシドとの結合;脱塩基スペーサーの糖類似体;生体可逆性基;非生体可逆性基;補助部分;共役基;標的化部分に結合しているリンカー;標的化部分及び1以上(例えば、1〜6つ)の補助部分に結合しているリンカー;又は式-P(=XE1)(-XE2-RE2A)-O-の基の中のリン原子であり、
ここで、RE2Aは、水素、生体可逆性基、非生体可逆性基、補助部分、共役基、標的化部分に結合しているリンカー、又は標的化部分及び1以上(例えば、1〜6つ)の補助部分に結合しているリンカーであり;かつ
RE2は、水素、生体可逆性基、非生体可逆性基、補助部分、共役基、標的化部分に結合しているリンカー、又は標的化部分及び1以上(例えば、1〜6つ)の補助部分に結合しているリンカーであり;
ただし、RE1、RE2、及びRE3のうちのただ1つが水素であり;かつ
ただし、RE1及びRE3のうちの少なくとも1つは、少なくとも1つのヌクレオシドを含有する基との結合である）。
【０３１７】
RE1とRE3の両方が少なくとも1つのヌクレオシドを含有する基との結合である場合、ホスホジエステルは、ヌクレオシド間ホスホジエステルである。RE1及びRE3のうちのただ1つがヌクレオシドを含有する基との結合である場合、ホスホジエステルは、末端ホスホジエステルである。
【０３１８】
本明細書で使用される「ホスホリル」という用語は、式-P(=XE1)(-XE2-RE2A)-O-RE3Aの置換基を指し、
ここで、
XE1及びXE2の各々は、独立に、O又はSであり;
RE2Aは、水素、生体可逆性基、非生体可逆性基、補助部分、共役基、標的化部分に結合しているリンカー、又は標的化部分及び1以上(例えば、1〜6つ)の補助部分に結合しているリンカーであり;かつ
RE3Aは、水素又は空いた原子価である。
【０３１９】
基がホスホリルに結合していると特定されるとき、該基は、該ホスホリルのリン原子に結合している。
【０３２０】
本明細書で使用される「ホスホトリエステル」という用語は、3つ全ての原子価が非水素置換基と置換されているリン酸エステルを指す。該ホスホトリエステルは、ホスフェート、ホスホロチオエート、又はホスホロジチオエート;ヌクレオシドもしくは脱塩基スペーサーとの1つもしくは2つの結合、及び/又はホスホリル基;並びに生体可逆性基;非生体可逆性基;補助部分;共役基;並びに標的化部分及び任意に1以上(例えば、1〜6つ)の補助部分に結合しているリンカーからなる群から独立に選択される1又は2つの基からなる。末端ホスホトリエステルは、ヌクレオシドを含有する基、並びに生体可逆性基;非生体可逆性基;補助部分;共役基;ホスホリル基;並びに標的化部分及び任意に1以上(例えば、1〜6つ)の補助部分に結合しているリンカーからなる群から独立に選択される2つの基との1つの結合を含む。いくつかの実施態様において、末端ホスホトリエステルは、標的化部分及び任意に1以上(例えば、1〜6つ)の補助部分に結合している1又は0個のリンカーを含有する。ヌクレオシド間ホスホトリエステルは、ヌクレオシド含有基との2つの結合を含む。ホスホトリエステルは、以下の構造の基であってもよい:
【化９】
2020512843.tif 000011
(ここで、
XE1及びXE2の各々は、独立に、O又はSであり;
RE1及びRE3の各々は、独立に、ヌクレオシド;脱塩基スペーサーの糖類似体;生体可逆性基;非生体可逆性基;補助部分;共役基;標的化部分に結合しているリンカー;標的化部分及び1以上(例えば、1〜6つ)の補助部分に結合しているリンカー;又は式-P(=XE1)(-XE2-RE2A)-O-の基の中のリン原子との結合であり、
ここで、RE2Aは、水素;生体可逆性基;非生体可逆性基;補助部分;共役基;標的化部分に結合しているリンカー;又は標的化部分及び1以上(例えば、1〜6つ)の補助部分に結合しているリンカーであり;かつ
RE2は、生体可逆性基;非生体可逆性基;補助部分;共役基;標的化部分に結合しているリンカー;又は標的化部分及び1以上(例えば、1〜6つ)の補助部分に結合しているリンカーであり;
ただし、RE1及びRE3のうちの少なくとも1つは、少なくとも1つのヌクレオシドを含有する基との結合である)。
RE1とRE3の両方が少なくとも1つのヌクレオシドを含有する基との結合である場合、ホスホトリエステルは、ヌクレオシド間ホスホトリエステルである。RE1及びRE3のうちのただ1つがヌクレオシドを含有する基との結合である場合、ホスホトリエステルは、末端ホスホトリエステルである。
【０３２１】
本明細書で使用される「生理的条件」という用語は、生きた哺乳動物のプロフェッショナル抗原提示細胞の内部に存在し得る条件を指す。該生理的条件には、約35℃〜約42℃の温度及び約6〜約8の水性pHが含まれる。
【０３２２】
本明細書で使用される「保護基」という用語は、ヒドロキシ、アミノ、又はカルボニルを化学合成時の1以上の望ましくない反応への関与から保護することが意図される基を表す。本明細書で使用される「O-保護基」という用語は、ヒドロキシ又はカルボニル基を化学合成時の1以上の望ましくない反応への関与から保護することが意図される基を表す。本明細書で使用される「N-保護基」という用語は、窒素含有(例えば、アミノ又はヒドラジン)基を化学合成時の1以上の望ましくない反応への関与から保護することが意図される基を表す。一般に使用されるO-及びN-保護基は、引用により本明細書中に組み込まれる、Greeneの文献、「有機合成における保護基(Protective Groups in Organic Synthesis)」、第3版(John Wiley & Sons, New York, 1999)に開示されている。例示的なO-及びN-保護基としては、アルカノイル、アリーロイル、又はカルバミル基、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、t-ブチルアセチル、2-クロロアセチル、2-ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、o-ニトロフェノキシアセチル、α-クロロブチリル、ベンゾイル、4-クロロベンゾイル、4-ブロモベンゾイル、t-ブチルジメチルシリル、トリ-イソ-プロピルシリルオキシメチル、4,4'-ジメトキシトリチル、イソブチリル、フェノキシアセチル、4-イソプロピルペヘノキシアセチル(pehenoxyacetyl)、ジメチルホルムアミジノ、及び4-ニトロベンゾイルが挙げられる。
【０３２３】
カルボニル含有基を保護するための例示的なO-保護基としては:アセタール、アシラール、1,3-ジチアン、1,3-ジオキサン、1,3-ジオキソラン、及び1,3-ジチオランが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２４】
他のO-保護基としては:置換アルキル、アリール、及びアリール-アルキルエーテル(例えば、トリチル;メチルチオメチル;メトキシメチル;ベンジルオキシメチル;シロキシメチル; 2,2,2,-トリクロロエトキシメチル;テトラヒドロピラニル;テトラヒドロフラニル;エトキシエチル; 1-[2-(トリメチルシリル)エトキシ]エチル; 2-トリメチルシリルエチル; t-ブチルエーテル; p-クロロフェニル、p-メトキシフェニル、p-ニトロフェニル、ベンジル、p-メトキシベンジル、及びニトロベンジル);シリルエーテル(例えば、トリメチルシリル;トリエチルシリル;トリイソプロピルシリル;ジメチルイソプロピルシリル; t-ブチルジメチルシリル; t-ブチルジフェニルシリル;トリベンジルシリル;トリフェニルシリル;及びジフェニルメチルシリル);カルボネート(例えば、メチル、メトキシメチル、9-フルオレニルメチル;エチル; 2,2,2-トリクロロエチル; 2-(トリメチルシリル)エチル;ビニル、アリル、ニトロフェニル;ベンジル;メトキシベンジル; 3,4-ジメトキシベンジル;及びニトロベンジル)が挙げられるが、これらに限定されない
【０３２５】
他のN-保護基としては、不斉補助剤、例えば、保護された又は保護されていないD、L、又はD、L-アミノ酸、例えば、アラニン、ロイシン、フェニルアラニンなど;スルホニル含有基、例えば、ベンゼンスルホニル、p-トルエンスルホニルなど;カルバメート形成基、例えば、ベンジルオキシカルボニル、p-クロロベンジルオキシカルボニル、p-メトキシベンジルオキシカルボニル、p-ニトロベンジルオキシカルボニル、2-ニトロベンジルオキシカルボニル、p-ブロモベンジルオキシカルボニル、3,4-ジメトキシベンジルオキシカルボニル、3,5-ジメトキシベンジルオキシカルボニル、2,4-ジメトキシベンジルオキシカルボニル、4-メトキシベンジルオキシカルボニル、2-ニトロ-4,5-ジメトキシベンジルオキシカルボニル、3,4,5-トリメトキシベンジルオキシカルボニル、1-(p-ビフェニリル)-1-メチルエトキシカルボニル、α,α-ジメチル-3,5-ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、t-ブチルオキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、2,2,2,-トリクロロエトキシカルボニル、フェノキシカルボニル、4-ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル-9-メトキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニルなど、アリール-アルキル基、例えば、ベンジル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチルなど、及びシリル基、例えば、トリメチルシリルなどが挙げられるが、これらに限定されない。有用なN-保護基は、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、ピバロイル、t-ブチルアセチル、アラニル、フェニルスルホニル、ベンジル、t-ブチルオキシカルボニル(Boc)、及びベンジルオキシカルボニル(Cbz)である。
【０３２６】
本明細書で使用される「ピリド-2-イルヒドラゾン」という用語は、以下の構造の基を表す:
【化１０】
2020512843.tif 000012
(ここで、各々のR'は、独立に、H又は任意に置換されたC1-6アルキルである)。ピリド-2-イルヒドラゾンは、置換されていなくてもよい(すなわち、各々のR'は、Hである)。
【０３２７】
本明細書で使用される「立体化学的に濃縮された」という用語は、列挙された基のある立体異性体配置の同じ基の反対の立体異性体配置に対する局所的な立体化学的優先性を指す。したがって、立体化学的に濃縮されたホスホロチオエートを含有するポリヌクレオチドは、所定の立体化学のホスホロチオエートが反対の立体化学のホスホロチオエートに優先して存在する鎖である。この優先性は、所定の立体化学のホスホロチオエートについてのジアステレオマー比を用いて数値的に表すことができる。所定の立体化学のホスホロチオエートについてのジアステレオマー比は、所定の立体化学を有する特定されたホスホロチオエートを有するジアステレオマーの、反対の立体化学を有する特定されたホスホロチオエートを有するジアステレオマーに対するモル比である。所定の立体化学のホスホロチオエートについてのジアステレオマー比は、1.1以上(例えば、4以上、9以上、19以上、又は39以上)であり得る。
【０３２８】
本明細書で使用される「Q-タグ」という用語は、-NH2アミンを含有する化合物とのトランスグルタミナーゼ媒介反応時にポリペプチドの部分を含有するコンジュゲートを提供するグルタミン残基を含有するポリペプチドの部分を指し、ここで、該グルタミン残基は、該化合物に結合したアミドを含むように修飾された側鎖を含む。Q-タグは、当技術分野で公知である。Q-タグの非限定的な例は、LLQGG及びGGGLLQGGである
【０３２９】
本明細書で使用される「歪みシクロアルケニル」という用語は、空いた原子価がHと置換されたときに、少なくとも16kcal/molの環歪みエネルギーを有するシクロアルケニル基を指す。
【０３３０】
本明細書で使用される「糖類似体」という用語は、2つのヒドロキシル基をホスフェート、ホスホロチオエート、もしくはホスホロジチオエート中の酸素原子、又はキャッピング基との結合と置き換えるように修飾されているC3-6単糖又はC3-6アルジトール(例えば、グリセロール)である二価又は三価基を表す。糖類似体は、相補鎖中のヌクレオ塩基との水素結合に関与することができるヌクレオ塩基を含有しない。糖類似体は、環状又は非環状である。糖類似体に含まれるさらなる任意の修飾は:残りのヒドロキシル基又は炭素結合水素原子のうちの1つ、2つ、又は3つとH;任意に置換されたC1-6アルキル;本明細書で定義されている-リンクA(-T)p;共役基;-(CH2)t1-ORZ(ここで、t1は、1〜6の整数であり、かつRZは、任意に置換されたC1-6アルキル、任意に置換されたC2-6アルケニル、任意に置換されたC2-6アルキニル、任意に置換されたC6-14アリール、任意に置換されたC3-8シクロアルキル、任意に置換された(C1-9ヘテロシクリル)-C1-6-アルキル、任意に置換された(C6-10アリール)-C1-6-アルキル、又は任意に置換された(C3-8シクロアルキル)-C1-6-アルキルである)との置換; 1又は2つの不飽和(例えば、1又は2つの二重結合)の導入;及び1つ、2つ、又は3つ水素又はヒドロキシル基とアルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、又はヘテロシクリルについて定義されている置換基との置換である。糖類似体の非限定的な例は、任意に置換されたC2-6アルキレン、任意に置換されたC2-6アルケニレン、任意に置換されたC5シクロアルカン-1,3-ジイル、任意に置換されたC5シクロアルケン-1,3-ジイル、任意に置換されたヘテロ環-1,3-ジイル(例えば、任意に置換されたピロリジン-2,5-ジイル、任意に置換されたテトラヒドロフラン-2,5-ジイル、又は任意に置換されたテトラヒドロチオフェン-2,5-ジイル)、又は任意に置換された(C1-4アルキル)-(C3-8シクロアルキレン)(例えば、任意に置換された(C1アルキル)-(C3シクロアルキレン))である。
【０３３１】
本明細書で使用される「スルフィド」という用語は、二価-S-又は=S基を表す。ジスルフィドは、-S-S-である。
【０３３２】
本明細書で使用される「標的化部分」という用語は、所与の標的細胞集団(例えば、抗原提示細胞(APC;例えば、プロフェッショナルAPC(例えば、B細胞、pDC、もしくはマクロファージ)))と関連する受容体又は他の受容部分に特異的に結合するか、又はそれと反応性に会合するか、又はそれと複合体を形成する部分(例えば、小分子、例えば、炭水化物)を表す。本発明のコンジュゲートは、標的化部分を含有する。該標的化部分は、抗体もしくは抗原結合断片又はこれらの改変された誘導体(例えば、Fcabもしくは融合タンパク質(例えば、scFv))であることができる。該標的化部分は、ポリペプチドであることができる。或いは、該標的化部分は、小分子(例えば、マンノース)又は小分子のクラスター(例えば、マンノースのクラスター)であることができる。標的化部分を含む本発明のコンジュゲートは、該標的化部分が結合する標的に対して100nM未満のKdを示し得る。Kdは、当技術分野で公知の方法を用いて、例えば、表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて、例えば、BIACORE(商標)システム(GE Healthcare, Little Chalfont, the United Kingdom)を用いて測定される。
【０３３３】
本明細書で使用される「1,2,4,5-テトラジン基」という用語は、以下の式の基を表す。
【化１１】
2020512843.tif 000013
(式中、R'は、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロシクリルであり;かつR''は、任意に置換されたアルキレン、任意に置換されたヘテロアルキレン、任意に置換されたアリーレン、任意に置換されたシクロアルキレン、任意に置換されたヘテロシクリレン、又は基-Ra-Rb-(ここで、Ra及びRbの各々は、独立に、任意に置換されたアルキレン、任意に置換されたヘテロアルキレン、任意に置換されたアリーレン、任意に置換されたシクロアルキレン、もしくは任意に置換されたヘテロシクリレンである)である)。
【０３３４】
「治療効果」という用語は、薬理活性物質によって引き起こされる、対象、特に、哺乳動物、より特には、ヒトにおける局所又は全身効果を指す。したがって、この用語は、疾患の診断、治癒、緩和、治療、もしくは予防における、又は動物もしくはヒトでの望ましい心身の発達及び状態の増進における使用が意図される任意の物質を意味する。本明細書で使用される「治療有効量」又は「治療有効用量」という用語は、治療されるべき疾患の症状を改善するか、治療するか、又は少なくとも部分的に停止させるのに必要な免疫調節ポリヌクレオチド又はコンジュゲートの量を表す。この用途に有効な量は、疾患の重症度並びに対象の体重及び全身状態によって決まる。通常、インビトロで使用される投薬量は、医薬組成物のインビボ投与に有用な量に関する有用な指針を提供することができ、動物モデルは、特定疾患の治療のための有効投薬量を決定するために使用することができる。
【０３３５】
本明細書で使用される「チオカルボニル」という用語は、C(=S)基を表す。
【０３３６】
本明細書で使用される「チオヘテロシクリレン」という用語は、基-S-R-を表し、ここで、Rは、ヘテロシクリレンである。チオヘテロシクリレンは、ヘテロシクリルについて記載されているように任意に置換されていてもよい。
【０３３７】
本明細書で使用される「チオール」という用語は、-SH基を表す。
【０３３８】
患者における疾患又は状態との関連において使用される「治療する」という用語は、本発明のポリヌクレオチド又はコンジュゲートを患者に投与することにより、患者において、有益な又は望ましい結果、例えば、臨床結果を得ることを指すことが意図される。有益な又は望ましい結果としては、疾患又は状態の1以上の症状の軽減又は改善;疾患又は状態の程度の縮小;疾患又は状態の安定化(すなわち、悪化しないこと);疾患又は状態の拡大の予防;疾患又は状態の進行の遅延又は減速;疾患又は状態の緩和;及び寛解(部分的であるか、全体的であるかを問わない)を挙げることができる。疾患又は状態を「緩和する」とは、本発明のポリヌクレオチド又はコンジュゲートによる治療の非存在下での程度又は時間経過と比較して、該疾患又は状態の程度及び/もしくは望ましくない臨床症状が軽減されること並びに/又は進行の時間経過が遅くなることを意味する。
【０３３９】
本明細書で使用される「トリアゾロシクロアルケニレン」という用語は、その環内原子の全てが炭素原子であり、かつ橋頭原子がsp2混成炭素原子である8員環に縮合した1,2,3-トリアゾール環を含有するヘテロシクリレンを指す。トリアゾシクロアルケニレンは、ヘテロシクリルについて記載されているように任意に置換されていてもよい。
【０３４０】
本明細書で使用される「トリアゾロヘテロシクリレン」という用語は、少なくとも1つのヘテロ原子を含有する8員環に縮合した1,2,3-トリアゾール環を含有するヘテロシクリレンを指す。トリアゾロヘテロシクリレン中の橋頭原子は、炭素原子である。トリアゾロヘテロシクリレンは、ヘテロシクリルについて記載されているように任意に置換されていてもよい。
【０３４１】
「免疫調節ポリヌクレオチド」、「免疫刺激ポリヌクレオチド」、「免疫抑制ポリヌクレオチド」、及び「コンジュゲート」という用語は、それぞれ、免疫調節ポリヌクレオチド、免疫刺激ポリヌクレオチド、免疫抑制ポリヌクレオチド、及びコンジュゲートの塩を包含することが理解されるべきである。例えば、「免疫調節ポリヌクレオチド」、「免疫刺激ポリヌクレオチド」、「免疫抑制ポリヌクレオチド」、及び「コンジュゲート」という用語は、ホスフェート、ホスホロチオエート、又はホスホロジチオエートのプロトン化された中性形態(P-XH部分、ここで、Xは、O又はSである)とホスフェート、ホスホロチオエート、又はホスホロジチオエートの脱プロトン化されたイオン形態(P-X-部分、ここで、Xは、O又はSである)の両方を包含する。したがって、RE1、RE2、及びRE3のうちの1つ又は複数を水素として有すると記載されるホスホエステル及びホスホジエステルは、ホスフェート、ホスホロチオエート、又はホスホロジチオエートは脱プロトン化されたイオン形態で存在する塩を包含することが理解されるべきである。
【０３４２】
「自然免疫応答」及び「自然免疫」という用語は、当技術分野で認識されており、病原体関連分子パターンを認識したときに身体の免疫系が開始する非特異的防御機構を指し、これは、様々な経路を介するサイトカイン産生及び細胞死を含む、様々な形態の細胞活動を伴う。本明細書で使用される場合、自然免疫応答は、toll様受容体9(TLR9)によって媒介されるCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドに対する細胞応答を含み、これには、限定されないが、炎症性サイトカインの産生(例えば、I型インターフェロン又はIL-10の産生)の増大、NFκB経路の活性化、免疫細胞の増殖、成熟、分化、及び/又は生存の増大、並びに場合によっては、細胞アポトーシスの誘導が含まれる。自然免疫の活性化は、当技術分野で公知の方法、例えば、(NF)-κB活性化の測定を用いて検出することができる。
【０３４３】
「適応免疫応答」及び「適応免疫」という用語は、当技術分野で認識されており、特異的抗原を認識したときに身体の免疫系が開始する抗原特異的防御機構を指し、これには、液性応答と細胞性応答の両方が含まれる。本明細書で使用される場合、適応免疫応答には、CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドによって誘発及び/又は強化される細胞応答が含まれる。いくつかの実施態様において、該免疫刺激ポリヌクレオチド又はその部分は、抗原特異的適応免疫応答の抗原標的である。他の実施態様において、該免疫刺激ポリヌクレオチドは、抗原特異的適応免疫応答の抗原標的ではないが、それにもかかわらず、該適応免疫応答を強化する。適応免疫応答の活性化は、当技術分野で公知の方法、例えば、抗原特異的抗体産生、又は抗原特異的細胞によって媒介される細胞傷害性のレベルの測定を用いて検出することができる。
【０３４４】
「Toll様受容体」(又は「TLR」)」という用語は、当技術分野で認識されており、当初は微生物病原体を認識する自然免疫系のセンサーとして同定されたパターン認識受容体のファミリーを指す。TLRは、「PAMP」(病原体関連分子パターン)と呼ばれることが多い、微生物内の独特の構造を認識する。リガンドのTLRに対する結合は、自然免疫応答及び/又は適応免疫応答を誘導する細胞内シグナル伝達経路のカスケードを起動する。本明細書で使用される場合、「toll様受容体」又は「TLR」という用語は、細胞によって発現されるtoll様受容体タンパク質の機能性断片も指す。ヒトでは、TLR-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7/8、及び-9を含む、10種のTLRが同定されている。その内容が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、D'Arpa及びLeungの文献、Adv. Wound Care, 6:330-343(2017)。TLRをコードするヒト遺伝子は公知である。
【０３４５】
CD289(分化抗原群289)とも表記されるToll様受容体9(TLR9)は、toll様受容体(TLR)ファミリーのメンバーである。その内容が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Duらの文献、Eur. Cytokine Netw., 11:362-371(2000)。TLR9は、樹状細胞(DC)、Bリンパ球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、及び他の抗原提示細胞を含む免疫系細胞で発現される重要な受容体である。TLR9活性化は、自然免疫と適応免疫の橋渡しをするシグナル伝達カスケードを誘発する。Martinez-Camposらの文献、Viral Immunol., 30:98-105(2016); Notleyらの文献、Sci. Rep., 7:42204(2017);これらの各々の内容は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる。天然のTLR-9アゴニストとしては、非メチル化シトシン-グアニンジヌクレオチド(CpG)含有オリゴデオキシヌクレオチド(CpG ODN)が挙げられる。本開示において使用が見出されるTLR-9リガンドとしては、天然に存在するか又は合成されたCpG ODN、並びに本明細書に提供される他のCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチド及び/又は免疫コンジュゲートが挙げられるが、これらに限定されない。TLR9シグナル伝達経路の活性化は、当技術分野で公知の方法、例えば、骨髄分化抗原88(MyD88)の動員、核因子(NF)-κB、c-Jun N-末端キナーゼ(JNK)、及びp38マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)シグナル伝達経路の活性化、インターフェロン調節因子-7の活性化、サイトカイン、例えば、I型インターフェロン(IFN)、インターロイキン(IL)-6、IL-10、及びIL-12のうちの1つ又は複数の発現レベル、1以上の免疫細胞集団、例えば、NK細胞、ナチュラルキラーT細胞、単球の活性化、並びに細胞傷害性リンパ球(CTL)及びTヘルパー-1(Th1)応答のレベル、及び免疫グロブリン分泌のレベルの測定を用いて検出することができる。
【０３４６】
本明細書で使用される「TLR発現細胞」という用語は、toll様受容体を発現し、かつtoll様受容体がアゴニストに結合したときに、toll様受容体シグナル伝達経路を活性化させることができる細胞を指す。該toll様受容体は、細胞表面に、及び/又は細胞の1以上の細胞内コンパートメント、例えば、エンドソームもしくはファゴソームの膜に発現され得る。TLR発現細胞は、toll様受容体以外の1以上の細胞表面抗原をさらに発現し得る。特定の免疫細胞はTLRを発現し、該免疫細胞におけるTLRシグナル伝達経路の活性化は、自然免疫応答及び/又は適応免疫応答を誘発する。TLRシグナル伝達経路によって活性化される免疫細胞は、他の疾患細胞を身体から排除するのを助けることができる。特定の疾患細胞(例えば、癌細胞又はウイルス感染細胞)はTLRを発現し、該疾患細胞におけるTLRシグナル伝達経路の活性化は、例えば、アポトーシスの誘導を介する、該疾患細胞の死をもたらすことができる。TLR9発現細胞の例としては、樹状細胞(DC)、B細胞、T細胞、ランゲルハンス細胞、ケラチノサイト、肥満細胞、内皮細胞、筋線維芽細胞、及び初代線維芽細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細胞が何らかのtoll様受容体(例えば、TLR9)を発現するかどうかの決定は、当技術分野で公知の方法、例えば、細胞内でのtoll様受容体のmRNAの検出を用いて実施することができる。
【０３４７】
「免疫細胞」という用語は、当技術分野で認識されており、本明細書で使用される場合、宿主防御機構に関与する任意の細胞、例えば、炎症促進性サイトカインを産生する細胞、並びに組織損傷及び/又は疾患発病に関与する細胞を指す。免疫細胞の例としては、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、肥満細胞、マクロファージ、抗原提示細胞(APC)、好塩基球、及び好酸球が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４８】
「抗原提示細胞」又は「APC」という用語は、当技術分野で認識されており、特定のリンパ球、例えば、T細胞による認識のための抗原をプロセシングし、それを提示することにより、細胞性免疫応答を媒介する不均質な免疫細胞集団を指す。例示的なタイプの抗原提示細胞としては、例えば、B細胞、単球、樹状細胞、及びランゲルハンス細胞を含む、プロフェッショナル抗原提示細胞、並びに例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、アストロサイト、線維芽細胞、及びオリゴデンドロサイトを含む、他の抗原提示細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「抗原提示細胞」という用語は、インビボで見られる抗原提示細胞及びインビボ細胞に由来するインビトロ細胞培養物で見られる抗原提示細胞を含む。本明細書で使用される場合、抗原提示細胞には、人為的に修飾されている、例えば、toll様受容体(例えば、TLR9)を発現するように又はtoll様受容体(例えば、TLR9)の発現レベルを調節するように遺伝子修飾されているAPCも含まれる。
【０３４９】
「樹状細胞」又は「DC」という用語は、当技術分野で認識されており、特殊化した抗原感知細胞及び抗原提示細胞(APC)の不均質な集団を指す。ヒトDCは、3つの主要なサブセット:形質細胞様DC(pDC)、骨髄DC(mDC)、及び単球由来DC(MDDC)に分類される。Schramlらの文献、Curr. Opin. Immunol., 32:13-20(2015);その内容は、引用により完全に本明細書中に組み込まれる。DCのサブセットは、独特のTLR発現パターンに基づいて特定することができる。例として、DCの骨髄性又は「従来的」サブセット(mDC)は、刺激されたとき、TLR 1〜8を発現し、一連の活性化マーカー(例えば、CD80、CD86、MHCクラスI及びII、CCR7)、炎症促進性サイトカイン、並びにケモカインが産生される。この刺激及び結果として生じる発現の結果は、抗原特異的CD4+及びCD8+ T細胞のプライミングである。これらのDCは、抗原を取り込み、それを適切な形でT細胞に提示する増強された能力を獲得する。DCの形質細胞様サブセット(pDC)は、活性化したときにTLR7及びTLR9を発現し、結果としてNK細胞及びT細胞の活性化をもたらす。
【０３５０】
本明細書で使用される「抗原」という用語は、自然免疫応答と適応免疫応答の両方を含む免疫応答を誘発することができる分子又はその抗原性断片を指す。本明細書で使用される場合、抗原は、タンパク質、ペプチド、多糖、脂質、核酸、特に、RNA及びDNA、ヌクレオチド、並びに他の生物学的又は生化学的物質であることができる。「免疫応答を誘発する」という用語は、抗原などの刺激に応答したインビボでの免疫細胞の刺激を指す。該免疫応答は、細胞性免疫応答、例えば、T細胞及びマクロファージ刺激と液性免疫応答、例えば、B細胞及び補体刺激並びに抗体産生の両方からなる。免疫応答は、限定されないが、抗体免疫アッセイ、増殖アッセイ、及びその他を含む、当技術分野で周知の技法を用いて測定することができる。
【０３５１】
「抗原性断片」及び「抗原結合断片」という用語は、本明細書で互換的に使用される。本明細書で使用される抗原性断片は、抗原結合分子、例えば、抗体と、特異的反応で複合体を形成することができる。本明細書で言及される特異的反応は、抗原又は抗原性断片が、高度に選択的な様式で、その対応する抗体と反応し、かつ他の抗原によって誘発され得る多数の他の抗体と反応しないことを示す。そのような反応の特異性は、抗原中の1以上のエピトープ(免疫原性決定基)の存在によって決定される。本明細書で使用される場合、抗原又はその抗原性断片は、1つのエピトープを有していてもよく、又は複数のエピトープを有していてもよい。
【０３５２】
本明細書で使用される「T細胞エピトープ」という用語は、T細胞によって産生される抗原の任意のエピトープを指す。
【０３５３】
本明細書で使用される「腫瘍関連抗原」又は「TAA」という用語は、癌細胞によって又は本明細書に提供される治療もしくは予防的ケアを受けている(例えば、治療的用量の免疫刺激ポリヌクレオチドもしくはCpG-Ab免疫コンジュゲートを受容している)癌患者の固形腫瘍の間質において発現される抗原を指す。TAAは、本明細書に提供される治療もしくは予防的ケアで標的とされても標的とされなくてもよい。TAAは、癌細胞上で過剰発現されているか、突然変異しているか、又は誤調節されている必要はなく、TAAであれば正常細胞で有しているであろうものと同じ特徴を有することができる。いくつかの実施態様において、TAAは、癌細胞で過剰発現されているか、突然変異しているか、又は誤調節されていることがある。TAAは、タンパク質、核酸、脂質、又は他の抗原であることができる。TAAは、細胞表面に発現されるTAA、細胞内TAA、又は核内TAAであることができる。固形腫瘍との関連において、TAAは、固形腫瘍塊の間質で発現されることができる。本明細書で使用される「間質」という用語は、癌細胞以外の固形腫瘍塊中の成分を指す。例えば、間質としては、線維芽細胞、上皮細胞、他の血管成分、又は細胞外マトリックス成分を挙げることができる。本明細書で使用される場合、「間質」という用語は、免疫系の成分、例えば、免疫細胞(例えば、B細胞、T細胞、樹状細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞など))を含まない。様々なTAAが当技術分野で公知である。TAAの特定は、当技術分野で公知の、例えば、Zhangらの文献、Methods Mol. Biol., 520:1-10(2009)に開示されている方法を用いて実施することができ;この文献の内容は、引用により本明細書中に入れられる。
【０３５４】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、対応する抗原と、非共有結合的に、可逆的に、かつ特異的な様式で結合することができる、免疫グロブリンファミリーのポリペプチドを指す。例えば、天然のIgG抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも2つの重(H)鎖及び2つの軽(L)鎖を含む四量体である。各々の重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではVHと略記される)及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、3つのドメインCH1、CH2、及びCH3から構成される。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではVLと略記される)及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメインCLから構成される。VH領域及びVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる、より保存されている領域とともに散在する、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。各々のVH及びVLは、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順序で配置された3つのCDR及び4つのFR: FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、及びFR4から構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞)及び古典的補体系の第一成分(Clq)を含む、宿主組織又は因子との結合を媒介し得る。
【０３５５】
本明細書で使用される場合、抗体には、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ科動物抗体、キメラ抗体、及び抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体を含む)が含まれるが、これらに限定されない。該抗体は、任意のアイソタイプ/クラスのもの(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、及びIgY)、又はサブクラスのもの(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)であることができる。
【０３５６】
軽鎖と重鎖は両方とも、構造的及び機能的に相同な領域に分類される。「定常」及び「可変」という用語は、機能面で使用される。これに関して、軽鎖(VL)部分と重鎖(VH)部分の両方の可変ドメインは抗原認識及び特異性を決定することが理解されるであろう。逆に、軽鎖の定常ドメイン(CL)及び重鎖の定常ドメイン(CH1、CH2、又はCH3)は、例えば、分泌、経胎盤移動、Fc受容体結合、補体結合などの重要な生物学的性質を付与する。慣例により、定常領域ドメインの付番は、該ドメインが抗体の抗原結合部位又はアミノ末端からより遠くなるにつれて増加する。N-末端は可変領域であり、C-末端には定常領域があり; CH3ドメイン及びCLドメインは、実際、それぞれ、重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端ドメインを含む。
【０３５７】
本明細書で使用される場合、文脈に応じて、「抗体」という用語は、抗体分子の抗原結合断片を指すこともできる。本明細書で使用される「抗原結合断片」という用語は、(例えば、結合、立体障害、安定化/不安定化、空間的分布によって)抗原のエピトープと特異的に相互作用する能力を保持する抗体の1以上の部分を指す。結合断片の例としては、単鎖Fv(scFv)、ジスルフィド連結Fv(sdFv)、Fab断片、F(ab')断片、VL、VH、CL、及びCH1ドメインからなる一価断片; F(ab)2断片、ジスルフィド架橋によってヒンジ領域で連結された2つのFab断片を含む二価断片; VH及びCH1ドメインからなるFd断片;抗体の単腕のVL及びVHドメインからなるFv断片; VH又はVLドメインからなるdAb断片(Wardらの文献、Nature、341:544-546(1989));単一ドメイン抗体(VHH)、並びに単離された相補性決定領域(CDR)、又は抗体の他のエピトープ結合断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５８】
「特異的に結合する」、「選択的に結合する」という用語、又は同様の用語は、2つの分子、化合物、細胞、及び/又は粒子間の化学的相互作用を指し、ここで、第一の実体は、それが非標的である第三の実体に結合するよりも大きい特異性及び親和性で第二の標的実体に結合する。いくつかの実施態様において、「特異的結合」は、第三の非標的実体に対する親和性よりも少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍、又はそれを上回る、第一の実体の第二の標的実体に対する親和性を指すことができる。いくつかの実施態様において、「特異的結合」は、抗原(又はその抗原性断片)と抗体(又はその抗原結合断片)の間の相互作用を説明する文脈で使用される。特定の実施態様において、「特異的結合」は、解離定数(KD)が10-5M以下、10-6M以下、もしくは10-7M以下である抗体と所定の抗原との結合、又はKDが所定の抗原以外の非特異的抗原との結合についてのそのKDよりも少なくとも2倍小さい抗体と所定の抗原との結合を指す。いくつかの実施態様において、特異的結合を用いて、不均質なタンパク質集団及び他の生物製剤中の、例えば、生体試料、例えば、血液、血清、血漿、又は組織試料中の所定の抗原の存在を決定することができる。したがって、ある指定の免疫アッセイ条件下において、特定の結合特異性を有する抗体又は結合剤は、特定の抗原とバックグラウンドの少なくとも2倍結合し、試料中に存在する他の抗原と相当な量でそれほど結合しない。一実施態様において、指定の免疫アッセイ条件下において、特定の結合特異性を有する抗体又は結合剤は、特定の抗原とバックグラウンドの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、又は10倍結合し、試料中に存在する他の抗原と相当な量でそれほど結合しない。そのような条件下における抗体又は結合剤との特異的結合は、該抗体又は薬剤が特定のタンパク質に対するその特異性について選択されたものであることを必要とし得る。望ましいか又は適切な場合、この選択は、他の種(例えば、マウスもしくはラット)由来の分子と交差反応する抗体又は他のサブタイプを取り去ることにより達成することができる。或いは、いくつかの実施態様において、ある特定の所望の分子と交差反応する抗体又は抗体断片が選択される。
【０３５９】
「癌」又は「腫瘍」という用語は、無制御な増殖、不死性、転移能、急速な成長及び増殖速度、並びにある特徴的な形態学的特徴などの、癌を生じる細胞に典型的な特徴を保有する細胞の存在を指す。いくつかの実施態様において、そのような細胞は、PD-1、PD-L1、及び/又はCTLA-4などの免疫チェックポイントインヒビターの発現及び活性に起因して、一部又は完全にそのような特徴を示す。癌細胞は、例えば、CATスキャン、MRイメージング、X線、超音波、もしくは触診などの手段によって、腫瘍塊に基づいて検出可能であり、かつ/又は患者から得られる試料における1以上の癌特異的抗原の発現のために検出可能である固形腫瘍の形態であることが多い。いくつかの実施態様において、固形腫瘍は、測定可能な寸法を有する必要はない。癌細胞はまた、液性腫瘍の形態であってもよく、その癌細胞は、動物内に単独で又は播種性に存在し得る。本明細書で使用される場合、「播種性腫瘍」及び「液性腫瘍」という用語は、互換的に使用されており、限定されないが、白血病及びリンパ腫並びに他の血液細胞癌を含む。
【０３６０】
「白血病」という用語は、「芽球」と呼ばれる未成熟な白血球の異常増加を特徴とする血液又は骨髄の癌のタイプを指す。白血病は、多種多様な疾患に及ぶ幅広い用語である。さらに、これは、全て血液学的新生物として知られている、血液、骨髄、及びリンパ系に影響を及ぼすより幅広い疾患群の一部である。白血病は、急性リンパ球性(又はリンパ芽球性)白血病(ALL)、急性骨髄性(又は骨髄もしくは非リンパ性)白血病(AML)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、及び慢性骨髄性白血病(CML)という4つの大きな分類に分けることができる。さらなるタイプの白血病には、有毛細胞白血病(HCL)、T細胞前リンパ球性白血病(T-PLL)、大型顆粒リンパ球性白血病、及び成人T細胞白血病が含まれる。
【０３６１】
「リンパ腫」という用語は、リンパ系細胞から発生する血液細胞腫瘍群を指す。リンパ腫の2つの主要なカテゴリーは、ホジキンリンパ腫(HL)と非ホジキンリンパ腫NHL)である。リンパ腫には、リンパ組織の任意の新生物が含まれる。主要なクラスは、リンパと血液の両方に属し、その両方に広がる白血球の一種である、リンパ球の癌である。
【０３６２】
本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、前悪性癌及び悪性癌を含み、原発性腫瘍(例えば、その細胞がもとの腫瘍の部位以外の対象の身体の部位に転移していない腫瘍)及び二次性腫瘍(例えば、もとの腫瘍の部位とは異なる二次的な部位への腫瘍細胞の遊走である転移から生じる腫瘍)、再発癌、並びに不応性癌も含む。
【０３６３】
「癌再発(recurrence)」及び「癌再発(relapse)」という用語は、互換的に使用されており、寛解後の徴候、症状、又は疾患の逆戻りを指す。再発性(recurrent)癌細胞は、原発性腫瘍の同じ部位で、又は別の場所で、例えば、二次癌で再出現し得る。癌細胞は、原発性癌と同じ疾患形態又は異なる疾患形態で再発し得る。例えば、いくつかの実施態様において、原発性癌は固形腫瘍であり、再発癌は液性腫瘍である。他の実施態様において、原発性癌は液性腫瘍であり、再発癌は固形腫瘍である。さらに他の実施態様において、原発性癌と再発癌はどちらも固形腫瘍であるか、又はどちらも液性腫瘍である。いくつかの実施態様において、再発性腫瘍は、原発性腫瘍によっても発現される少なくとも1つの腫瘍関連抗原を発現する。
【０３６４】
本明細書で使用される「不応性癌」という用語は、治療に応答しない癌、例えば、治療(例えば、免疫療法による治療)の開始時に抵抗性である癌又は治療の間に抵抗性になり得る癌を指す。「応答する」、「応答」、又は「応答性」という用語は、例えば、腫瘍サイズの低下又は腫瘍増殖の阻害という意味での抗癌応答を指す。これらの用語は、例えば、第一のイベントとしての第二の原発性癌のために打ち切りが生じる1回目の再発までの期間である再発もしくは再発が認められない死亡までの時間の増加、又は治療から何らかの原因による死亡までの期間である全生存の増加に反映される予後の改善を指すこともできる。応答する又は応答を有するとは、刺激に曝露されたときに達成される有益なエンドポイントがあることを意味する。或いは、負の又は有害な症状は、刺激に曝露されたときに、最小限に抑えられるか、和らげられるか、又は弱められる。腫瘍又は対象が望ましい応答を示す可能性を評価することは、腫瘍又は対象が望ましい応答を示さない(すなわち、応答の欠如を示すか又は非応答性である)可能性を評価することと等価であることが理解されるであろう。
【０３６５】
本明細書で使用される場合、癌としては、B細胞癌、例えば、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、例えば、アルファ鎖病、ガンマ鎖病、及びミュー鎖病などの重鎖病、良性の単クローン性ガンマグロブリン血症、及び免疫球性アミロイドーシス、メラノーマ、乳癌、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳又は中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸癌、子宮又は子宮内膜癌、口腔又は咽頭の癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸又は虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織の癌などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明によって包含される方法に適当可能な癌のタイプの他の非限定的な例としては、ヒト肉腫及び癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、肝臓癌、絨毛腫、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、骨癌、脳腫瘍、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、網膜芽腫;白血病、例えば、急性リンパ球性白血病並びに急性骨髄球性白血病(骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、及び赤白血病);慢性白血病(慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病及び慢性リンパ球性白血病);並びに真性多血症、リンパ腫(ホジキン病及び非ホジキン病)、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、並びに重鎖病が挙げられる。いくつかの実施態様において、癌は、上皮性であり、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、婦人科癌、腎臓癌、喉頭癌、肺癌、口腔癌、頭頸部癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、又は皮膚癌を含むが、これらに限定されない。他の実施態様において、癌は、乳癌、前立腺癌、肺癌、又は結腸癌である。さらに他の実施態様において、上皮癌は、非小細胞肺癌、非乳頭型腎細胞癌、子宮頸癌、卵巣癌(例えば、漿液性卵巣癌)、又は乳癌である。上皮癌は、限定されないが、漿液性、子宮内膜性、粘液性、明細胞性、ブレンナー型、又は未分化型を含む、様々な他の様式で特徴付けることができる。
【０３６６】
本明細書で使用される「癌療法」又は「癌療法剤」という用語は、抗腫瘍効果を発揮するか又は抗腫瘍活性を有することができる療法又は薬剤を指す。そのような抗腫瘍効果又は抗腫瘍活性は、腫瘍細胞増殖の速度、生存能力、又は転移活性の低下として示されることができる。抗腫瘍活性を示す考えられる方法は、治療中に生じる異常細胞の増殖速度の低下又は腫瘍サイズの安定もしくは低下を示すことである。そのような活性は、限定されないが、異種移植モデル、同種移植モデル、MMTVモデル、及び抗腫瘍活性を検討するための当技術分野で知られている他の公知のモデルを含む、一般に認められているインビトロ又はインビボ腫瘍モデルを用いて評価することができる。
【０３６７】
本明細書で使用される場合、任意の疾患又は障害を「予防する」、「予防すること」、又は「予防」という用語は、本明細書に記載される疾患もしくは障害、又はその症状の発症、再発、又は拡大の全体的又は部分的な予防を意味する。
【０３６８】
本明細書で使用される場合、対象が、生物学的に、医学的に、又は生活の質の点で、治療から恩恵を受けるのであれば、そのような対象は、そのような治療「を必要として」いる。
【０３６９】
「治療剤」という用語は、当技術分野で認識されており、それを必要としている対象に投与されたとき、生物学的に、生理学的に、又は薬理学的に活性があり、かつ局所又は全身に作用して、該対象に対する有益な治療効果を発揮する、任意の物質を指す。
【０３７０】
本明細書で使用される「免疫コンジュゲート」又は「抗体-薬物-コンジュゲート(ADC)」という用語は、抗原結合部分(例えば、抗体又はその抗原結合断片)と本明細書に記載される免疫調節ポリヌクレオチドとの連結を指す。該連結は、共有結合又は非共有結合的相互作用であることができ、キレート化を含むことができる。当技術分野で公知の又は本明細書に提供される様々なリンカーを、免疫コンジュゲートを形成させるために利用することができる。いくつかの実施態様において、免疫コンジュゲートは、本明細書に提供される式(C)のコンジュゲートである。
【０３７１】
本明細書で使用される「抗原結合部分」という用語は、抗原に特異的に結合することができる部分を指し、抗体及び抗原結合断片を含むが、これらに限定されない。
【０３７２】
本明細書で使用される「CpG-Ab免疫コンジュゲート」又は「CpG-Ab」という用語は、抗体(Ab)又はその抗原結合断片と本明細書に記載されるCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドとの連結を指す。
【０３７３】
本明細書で使用される「T細胞アゴニスト」という用語は、混合された出発細胞集団由来のT細胞の増殖、分化、及び/又は生存を選択的に刺激する任意の薬剤を指す。したがって、得られる細胞集団は、該出発細胞集団と比較したT細胞数の増加を伴って濃縮される。本開示で使用を見出すT細胞アゴニストとしては、T細胞受容体(TCR)に特異的に結合する抗原分子、及びT細胞共刺激分子が挙げられるが、これらに限定されない。T細胞共刺激分子の例としては、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、及びCD83リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様において、該T細胞アゴニストは、T細胞共刺激分子に対する抗体である。特定の実施態様において、該T細胞アゴニストは、腫瘍関連抗原(TAA)である。特定の実施態様において、該T細胞アゴニストは、病原性抗原である。
【０３７４】
本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント」又は「免疫チェックポイント分子」は、シグナルを調節する免疫系の分子である。免疫チェックポイント分子は、刺激性チェックポイント分子である、すなわち、シグナルを高めるか、又は阻害性チェックポイント分子である、すなわち、シグナルを弱めることができる。具体的な実施態様において、免疫チェックポイントは、T細胞又は抗原提示細胞(APC)のいずれかによって発現されるタンパク質である。特定のタイプの癌細胞は、免疫クリアランスを回避するために、免疫チェックポイントタンパク質を発現する。癌細胞によって発現される免疫チェックポイントタンパク質とT細胞によって発現される免疫チェックポイントタンパク質との間の相互作用を阻害するための免疫チェックポイントモジュレーターの使用は、特定の癌治療で有効であることが証明されている。
【０３７５】
本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイントモジュレーター」は、対象における免疫チェックポイントの活性を変化させることができる薬剤である。ある実施態様において、免疫チェックポイントモジュレーターは、限定されないが、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、CD47、2B4、及びTGFRを含む、1以上の免疫チェックポイント分子の機能を変化させる。該免疫チェックポイントモジュレーターは、免疫チェックポイントのアゴニスト又はアンタゴニストであり得る。いくつかの実施態様において、該免疫チェックポイントモジュレーターは、免疫チェックポイント結合タンパク質(例えば、抗体、抗体Fab断片、二価抗体、抗体薬物コンジュゲート、scFv、融合タンパク質、二価抗体、又は四価抗体)である。他の実施態様において、該免疫チェックポイントモジュレーターは、小分子である。特定の実施態様において、該免疫チェックポイントモジュレーターは、抗PDl又は抗PD-Ll抗体である。
【０３７６】
本明細書で使用される「標的送達」という用語又は「標的とする」という動詞形は、他のどの器官、組織、細胞、又は細胞内コンパートメント(非標的位置と呼ばれる)をも上回る、特定の器官、組織、細胞、及び/又は細胞内コンパートメント(標的位置と呼ばれる)への被送達薬剤(例えば、免疫刺激ポリヌクレオチド)の到達を促進するプロセスを指す。標的送達は、当技術分野で公知の方法を用いて、例えば、全身投与の後、標的細胞集団における被送達薬剤の濃度を非標的細胞集団における被送達薬剤の濃度と比較することにより検出することができる。本明細書で提供されているように、標的送達は、非標的位置と比較して標的位置で少なくとも2倍高い濃度を生じる。標的送達は、標的化部分と、標的細胞と関連する受容部分との特異的結合によって達成され得る。本明細書で使用される場合、標的細胞と関連する受容部分は、標的細胞の表面又は細胞質ゾル内に位置し得る。いくつかの実施態様において、該受容部分は、標的細胞と関連する抗原である。
【０３７７】
生物、組織、細胞、又はこれらの構成要素との関連において使用される場合の「異常な」という用語は、少なくとも1つの観察可能な又は検出可能な特徴(例えば、年齢、処置、時刻など)が「正常な」(予想される)それぞれの特徴を示す生物、組織、細胞、又はこれらの構成要素と異なる生物、組織、細胞、又はこれらの構成要素を指す。ある細胞もしくは組織型にとって正常であるか又はある細胞もしくは組織型に対して予想される特徴が、異なる細胞又は組織型にとって異常である場合もある。いくつかの実施態様において、異常な細胞は、癌細胞である。
【０３７８】
「組合せ療法」という用語は、本開示に記載される状態又は障害(例えば、癌)を治療するための2以上の治療剤の投与を指す。そのような投与は、実質的に同時の様式でのこれらの治療剤の共投与、例えば、固定比の治療剤を有する単一製剤を投与すること、又は各々の治療剤について別々の製剤(例えば、カプセル剤及び/もしくは静脈内製剤)で投与することを包含する。さらに、そのような投与は、逐次様式又は別々の様式での、ほぼ同時にか又は異なる時点でかのいずれかでの、各々のタイプの治療剤の使用も包含する。そのような投与は、異なる時点で及び/又は異なる投与経路を通じて投与することができる別々の製剤として各々の成分が製剤化されることも包含する。いずれにせよ、組合せ療法の治療レジメンは、本明細書に記載される状態又は障害を治療する際に有益な治療効果を提供する。
【０３７９】
本明細書で使用される場合、「共投与すること」又は「共投与」という用語及び同様の用語は、2以上の治療剤(例えば、免疫コンジュゲート及び免疫チェックポイントモジュレーター)、化合物、療法などを同時に又はほぼ同時に投与する行為を指す。共投与することは、本開示の様々な治療剤、例えば、免疫コンジュゲート、T細胞アゴニスト、免疫チェックポイントモジュレーター、又は他の化学療法薬が同じ製剤へと組み合わされるか又は対象への同時投与のために別々に製剤化され得る同時投与を指すことができる。共投与することは、逐次投与を指すこともできる。本発明の様々な治療剤、例えば、免疫コンジュゲート、T細胞アゴニスト、免疫チェックポイントモジュレーター、又は他の化学療法薬を投与する順番又は順序は、様々であってもよく、任意の特定の順序に限定されない。共投与することは、2以上の薬剤が異なる身体領域に又は異なる送達スキームによって投与される状況、例えば、第一の薬剤が全身投与され、第二の薬剤が腫瘍内に投与される状況、又は第一の薬剤が腫瘍内に投与され、第二の薬剤が血液中もしくは腫瘍近位へと全身投与される状況を指すこともできる。共投与することは、例えば、第一の薬剤が腫瘍内に投与され、第二の薬剤が腫瘍内に投与される同一の送達スキームによって投与される、2以上の薬剤を指すこともできる。
【０３８０】
「腫瘍内注射」は、本明細書に提供される薬剤の腫瘍細胞塊及び/又は腫瘍微小環境への直接的な投与を指す。本明細書で使用される場合、腫瘍微小環境には、新生物過程が生存し、拡張し、又は拡大するための構造的及び/又は機能的環境を生み出す新生物形成環境が含まれる。腫瘍微小環境は、腫瘍を形成する1以上の新生物細胞を取り囲み、それに栄養を与える、細胞、分子、線維芽細胞、細胞外マトリックス、及び血管によって構成される。腫瘍微小環境内の細胞又は組織の例としては、腫瘍血管系、腫瘍浸潤リンパ球、線維芽細胞細網細胞、内皮前駆細胞(EPC)、癌関連線維芽細胞、周皮細胞、他の間質細胞、細胞外マトリックス(ECM)の構成要素、樹状細胞、抗原提示細胞、T細胞、調節性T細胞、マクロファージ、好中球、及び腫瘍の近くに位置する他の免疫細胞が挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍微小環境に影響を及ぼす細胞機能の例としては、サイトカイン及び/又はケモカインの産生、サイトカインに対する応答、ペプチド抗原の抗原プロセシング及び提示、白血球走化性及び遊走の調節、遺伝子発現の調節、補体活性化、シグナル伝達経路の調節、細胞性細胞傷害性、細胞性免疫、液性免疫応答、並びに他の自然又は適応免疫応答が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞機能を調節する効果を測定すること。
【０３８１】
「対象」、「患者」、「個体」という用語及び同様の用語は、本明細書で互換的に使用されており、インビトロのものであるか、インビボのものであるかを問わず、本明細書に提供される方法に適した、任意の動物又はその細胞を指す。ある非限定的な実施態様において、患者、対象、又は個体は、哺乳動物、例えば、ヒト、又は他の動物、例えば、野生動物(例えば、サギ、コウノトリ、ツルなど)、家畜(例えば、カモ、ガチョウなど)、もしくは実験動物(例えば、オランウータン、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、マーモット、ジリスなど)である。
【０３８２】
癌との関連において使用される「生存」という用語は、以下のいずれかを含む:全生存としても知られる死亡までの生存(ここで、該死亡は、関連する原因又は腫瘍に関係なくてもよい);「無再発生存」(ここで、再発という用語は、局所再発と遠隔再発の両方を含むものとする);無転移生存;無疾患生存(ここで、疾患という用語は、癌及びそれに付随する疾患を含むものとする)。該生存の長さは、定義された始点(例えば、診断時又は治療開始時)及び終点(例えば、死亡、再発、又は転移)を参照して計算することができる。さらに、治療の効力の基準は、化学療法に対する応答、生存の確率、所与の期間内の転移の確率、及び腫瘍再発の確率を含むように拡大することができる。
【０３８３】
本発明は、標的化部分及び1以上の免疫調節(例えば、免疫刺激)ポリヌクレオチドを含有する免疫調節(例えば、免疫刺激)ポリヌクレオチド及びコンジュゲートを提供する。該免疫調節ポリヌクレオチドは、5-修飾ウリジン又は5-修飾シチジンを含有し得る。該免疫調節ポリヌクレオチドの5'-末端での(例えば、2つの5'-末端ヌクレオシド間での)5-修飾ウリジン(例えば、5-エチニル-ウリジン)の包含は、該ポリヌクレオチドの免疫調節特性を増強し得る。該免疫調節ポリヌクレオチドは、長さが18〜28ヌクレオチドである典型的なCpG ODNよりも短くてもよい(例えば、合計6〜16のヌクレオチド又は12〜14個のヌクレオチドを含有する)。本発明のより短い免疫調節ポリヌクレオチド(例えば、合計6〜16のヌクレオチド又は12〜14個のヌクレオチドを含有するもの)は、より長い典型的なCpG ODNの免疫調節活性を保持し得、かつより長いCpG ODNと比較して、より高い免疫調節活性(例えば、NFκB活性化によるか又は少なくとも1つのサイトカイン(例えば、IL-6又はIL-10)の発現レベルの変化によって測定される)を示し得る。有利なことに、より短い免疫調節ポリヌクレオチドは、その合成が完全長の典型的なCpG ODNの合成よりも少ないポリヌクレオチド合成工程を伴うので、調製するのが簡単でかつ経済的である。該免疫調節ポリヌクレオチドは、1以上の脱塩基スペーサー及び/又はヌクレオシド間ホスホトリエステルを含有し得る。
【０３８４】
本発明の免疫調節ポリヌクレオチドは、その免疫刺激活性を実質的に犠牲にすることなく、大部分はヌクレオシド間ホスフェート(例えば、50％を上回るヌクレオシド間ホスフェート)を含有するCpG ODNの安定性よりも優れている安定性(例えば、ヌクレアーゼに対する安定性)を示し得る。この効果は、例えば、少なくとも50％(例えば、少なくとも70％)のヌクレオシド間ホスホロチオエートもしくはホスホロジチオエートを組み入れることによるか、又はヌクレオシド間ホスホトリエステル及び/もしくはヌクレオシド間脱塩基スペーサーの包含によって達成することができる。ホスホトリエステル及び脱塩基スペーサーは、標的化部分とのコンジュゲーションにも好都合である。ホスフェートベースのホスホトリエステル及び脱塩基スペーサーは、完全なホスホロチオエート骨格を有するポリヌクレオチドと比べた、オフターゲット活性の低下のためにも使用し得る。理論によって束縛されることを望むものではないが、この効果は、標的化部分によって媒介される標的細胞への送達を妨害することなく、自己送達を低下させることにより達成され得る。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、15以下の連続するヌクレオシド間ホスホロチオエート(例えば、14以下、13以下、12以下、11以下、又は10以下の連続するヌクレオシド間ホスホロチオエート)を含むことができる。例えば、合計12〜16のヌクレオシドを含有する免疫刺激ポリヌクレオチドは、10以下の連続するヌクレオシド間ホスホロチオエートを含有し得る。
【０３８５】
本発明の免疫刺激ポリヌクレオチドは、合計50以下のヌクレオシド(例えば、30以下、28以下、又は16以下のヌクレオシド)を含有することができる。本発明の免疫刺激ポリヌクレオチドは、合計少なくとも6つのヌクレオシド(例えば、10以上又は12以上のヌクレオシド)を含有することができる。例えば、本発明の免疫刺激ポリヌクレオチドは、合計6〜30のヌクレオシド(例えば、合計6〜28のヌクレオシド、合計6〜20のヌクレオシド、合計6〜16のヌクレオシド、合計10〜20のヌクレオシド、合計10〜16のヌクレオシド、合計12〜28個のヌクレオシド、合計12〜20のヌクレオシド、又は合計12〜16のヌクレオシド)を含有することができる。
【０３８６】
本発明の免疫刺激ポリヌクレオチドは、1以上のホスホトリエステル(例えば、ヌクレオシド間ホスホトリエステル)及び/又はホスホロチオエート(例えば、1〜6つ又は1〜4つ)を、例えば、一方の末端又は両方の末端に(例えば、5'-末端の6ヌクレオシド又は3'-末端の6ヌクレオシド以内に)含むことができる。1以上のヌクレオシド間ホスホトリエステル及び/又はホスホロチオエートの包含は、エキソヌクレアーゼ媒介性分解の割合を低下させることにより、ポリヌクレオチドの安定性を増強することができる。
【０３８７】
ある実施態様において、本発明の免疫刺激ポリヌクレオチドは、ホスホトリエステル又は末端ホスホジエステルを含有し、ここで、該ホスホトリエステル又は該末端ホスホジエステルは、標的化部分又は共役基に及び任意に1以上(例えば、1〜6つ)の補助部分に結合しているリンカーを含む。特定の実施態様において、該免疫刺激ポリヌクレオチドは、ただ1つのリンカーを含有する。いくつかの実施態様において、該免疫刺激ポリヌクレオチドは、ただ1つの共役基を含有する。
【０３８８】
本発明のポリヌクレオチド(例えば、免疫刺激ポリヌクレオチド)は、鎖及びその部分的又は全体的な相補体を含むハイブリダイズしたポリヌクレオチドであることができる。該ハイブリダイズしたポリヌクレオチドは、少なくとも6つ(例えば、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、又は23)の相補的塩基対合を、包含されるより短い鎖に存在するヌクレオチドの総数まで有することができる。例えば、該ハイブリダイズしたポリヌクレオチドのハイブリダイズした部分は、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、又は23の塩基対を含有し得る。
【０３８９】
本発明のコンジュゲートは、標的化部分及び1以上の免疫調節(例えば、免疫刺激)ポリヌクレオチド(例えば、1〜6つ又は1〜4つ(例えば、1又は2つ)の免疫調節(例えば、免疫刺激)ポリヌクレオチド)を含有する。該コンジュゲートにおいて、該免疫調節ポリヌクレオチドの各々は、独立に、リンカーを含む。標的化部分は、該リンカーに共有結合している。該リンカーは、免疫調節ポリヌクレオチド中のヌクレオ塩基、脱塩基スペーサー、ホスフェート、ホスホロチオエート、又はホスホロジチオエートに結合していてもよい。本発明のコンジュゲートによって標的とされる細胞は、プロフェッショナルAPC(例えば、B細胞、pDC、又はマクロファージ)である。該標的化部分は、抗原結合部分(例えば、抗体もしくはその抗原結合断片)、ポリペプチド、アプタマー、又は1以上の小分子(例えば、マンノース)を含む基であることができる。本発明のコンジュゲートにおいて、標的化部分は、抗体又は抗体断片であり得る。本発明のコンジュゲートは、抗体又は抗体断片及び該抗体又は該抗体断片中のQ-タグに共有結合している1以上の免疫調節ポリヌクレオチドを含有することができる。該Q-タグは、N-末端又はC-末端にあり得る。該Q-タグは、該抗体又は該抗体断片の重鎖又は軽鎖に配置され得る。特異的に標的とされる組織及び細胞への標的化部分に基づく本発明の免疫調節ポリヌクレオチドの送達の使用は、インビボでの免疫調節ポリヌクレオチドの通常は不均一な分布という欠点を克服し得る。さらに、標的化部分に基づく本発明の免疫調節ポリヌクレオチドの送達は、免疫調節ポリヌクレオチドの全身投与又は標的組織への投与にとって有利であり得るが、それは、全身投与及び標的組織への投与が、インビボでの血液循環を通じて、該免疫調節ポリヌクレオチドの望ましくない分布をもたらし得るのに対し、本発明のコンジュゲートは、全身投与された場合でも、主に標的組織又は細胞で細胞内送達を経ることができるからである。分布に関連する利点は、短い免疫調節ポリヌクレオチド(例えば、合計6〜16のヌクレオシド(例えば、合計10〜16個又は12〜16個のヌクレオシド)を含有する免疫調節ポリヌクレオチド)を含有するコンジュゲートで特に顕著であり得る。
【０３９０】
本発明のコンジュゲートは、1以上(例えば、1〜6つ)の補助部分(例えば、ポリエチレングリコール(PEG))をさらに含有し得る。該補助部分は、キャッピング基、生体可逆性基、又は非生体可逆性基の部分であり得る。該補助部分は、リンカーに(例えば、免疫調節(例えば、免疫刺激)ポリヌクレオチド中のホスフェート、ホスホロチオエート、又はホスホロジチオエートに結合しているリンカーに)結合していてもよい。本発明のコンジュゲートにおける補助部分(例えば、PEG)の包含は、そのような補助部分を欠く参照コンジュゲートと比べて、該コンジュゲートの薬物動態及び/又は生体分布特性を改善し得る。
【０３９１】
本発明の免疫調節ポリヌクレオチドのうちの1つ又は複数を、抗原提示細胞(APC;例えば、プロフェッショナルAPC(例えば、B細胞、pDC、又はマクロファージ))を標的とする標的化部分(例えば、抗原結合部分)にコンジュゲートすることができる。エンドソーム性toll様受容体(例えば、TLR9)を含有する細胞(例えば、抗原提示細胞(APC;例えば、プロフェッショナルAPC(例えば、B細胞、pDC、又はマクロファージ)))への本発明の免疫調節ポリヌクレオチド又は本発明のコンジュゲートの送達を用いて、細胞内のエンドソーム性toll様受容体を刺激すること(免疫刺激ポリヌクレオチドの場合)又は抑制すること(免疫抑制ポリヌクレオチドの場合)ができる。理論によって束縛されるものではないが、エンドソーム性toll様受容体の活性化は、炎症促進性サイトカイン(例えば、IL-6、IL-10、及び/又はI型インターフェロン)を誘導することができ;この活性は、様々な腫瘍(例えば、患者の固形腫瘍及び液性腫瘍)の治療に有用であると考えられる。
【０３９２】
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、式(A)のオリゴヌクレオチド:又はその立体異性体、2以上のジアステレオマーの混合物、互変異性体、もしくは2以上の互変異性体の混合物;或いはこれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、又は水和物である;
X5'-(XN)b-YP-(XN)c-X3' (A)
(式中:
各々のXNは、独立に、ヌクレオチドであり;
X3'は、3'末端ヌクレオチドであり;
X5'は、5'末端ヌクレオチドであり;
YPは、ヌクレオシド間ホスホトリエステルであり;かつ
b及びcは、各々、約0〜約25の範囲の整数であり;ただし、その和は5以上であり;
ここで、該オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオ塩基を有するヌクレオチドを含む)。
【０３９３】
ある実施態様において、bは、約1〜約15の範囲の整数である。ある実施態様において、bは、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、又は約15の整数である。ある実施態様において、bは、約3、約4、約11、又は約14の整数である。ある実施態様において、bは、約3の整数である。ある実施態様において、bは、約4の整数である。ある実施態様において、bは、約11の整数である。ある実施態様において、bは、約14の整数である。
【０３９４】
ある実施態様において、cは、約0〜約10の範囲の整数である。ある実施態様において、cは、約0、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、又は約10の整数である。ある実施態様において、cは、約0又は約8の整数である。ある実施態様において、cは、約0の整数である。ある実施態様において、cは、約8の整数である。
【０３９５】
ある実施態様において、bは、約3の整数であり、cは、約8の整数である。ある実施態様において、bは、約4の整数であり、cは、約8の整数である。ある実施態様において、bは、約11の整数であり、cは、約0の整数である。ある実施態様において、bは、約14の整数であり、cは、約0の整数である。
【０３９６】
ある実施態様において、bとcの和は、約5〜約20の範囲である。ある実施態様において、bとcの和は、約5〜約15の範囲である。ある実施態様において、bとcの和は、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、又は約15である。ある実施態様において、bとcの和は、約8、約9、約10、約11、約12、約13、又は約14である。ある実施態様において、bとcの和は、約11である。ある実施態様において、bとcの和は、約12である。ある実施態様において、bとcの和は、約14である。
【０３９７】
ある実施態様において、各々のXNは、独立に、2'-デオキシリボヌクレオチド又は2'-修飾リボヌクレオチドである。ある実施態様において、各々のXNは、独立に、2'-デオキシアデノシン(A)、2'-デオキシグアノシン(G)、2'-デオキシシチジン(C)、5-ハロ-2'-デオキシシチジン、2'-デオキシチミジン(T)、2'-デオキシウリジン(U)、5-ハロ-2'-デオキシウリジン、2'-フルオロリボヌクレオチド、2'-メトキシリボヌクレオチド、又は2'-(2-メトキシエトキシ)リボヌクレオチドである。ある実施態様において、各々のXNは、独立に、2'-デオキシリボヌクレオチドである。ある実施態様において、各々のXNは、独立に、2'-デオキシアデノシン、2'-デオキシグアノシン、2'-デオキシシチジン、5-ハロ-2'-デオキシシチジン、2'-デオキシチミジン、2'-デオキシウリジン、又は5-ハロ-2'-デオキシウリジンである。ある実施態様において、各々のXNは、独立に、2'-デオキシアデノシン、2'-デオキシグアノシン、2'-デオキシシチジン、2'-デオキシチミジン、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン、又は5-ヨード-2'-デオキシウリジンである。
【０３９８】
ある実施態様において、X3'は、2'-デオキシリボヌクレオチド又は2'-修飾リボヌクレオチドである。ある実施態様において、X3'は、2'-デオキシリボヌクレオチドである。ある実施態様において、X3'は、2'-デオキシアデノシン、2'-デオキシグアノシン、2'-デオキシシチジン、5-ハロ-2'-デオキシシチジン、2'-デオキシチミジン、2'-デオキシウリジン、5-ハロ-2'-デオキシウリジン、2'-フルオロリボヌクレオチド、2'-メトキシリボヌクレオチド、又は2'-(2-メトキシエトキシ)リボヌクレオチドである。ある実施態様において、X3'は、2'-デオキシアデノシン、2'-デオキシグアノシン、2'-デオキシシチジン、5-ハロ-2'-デオキシシチジン、2'-デオキシチミジン、2'-デオキシウリジン、又は5-ハロ-2'-デオキシウリジンである。ある実施態様において、X3'は、2'-デオキシチミジンである。ある実施態様において、X3'は、置換ピリミジン塩基を有する2'-デオキシリボヌクレオチドである。ある実施態様において、X3'は、5-置換ピリミジン塩基を有する2'-デオキシリボヌクレオチドである。ある実施態様において、X3'は、2'-デオキシチミジン、5-ハロ-2'-デオキシシチジン、又は5-ハロ-2'-デオキシウリジンである。ある実施態様において、X3'は、2'-デオキシチミジン、5-ブロモ-2'-デオキシシチジン、5-ヨード-2'-デオキシシチジン、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン、又は5-ヨード-2'-デオキシウリジンである。ある実施態様において、X3'は、2'-デオキシチミジン、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン、又は5-ヨード-2'-デオキシウリジンである。ある実施態様において、X3'は、3'キャッピング基を含む末端ヌクレオチドである。ある実施態様において、該3'キャッピング基は、末端リン酸エステルである。ある実施態様において、該3'キャッピング基は、3-ヒドロキシル-プロピルホスホリル(すなわち、-P(O2)-CH2CH2CH2OH)である。
【０３９９】
ある実施態様において、X5'は、2'-デオキシリボヌクレオチド又は2'-修飾リボヌクレオチドである。ある実施態様において、X5'は、2'-デオキシリボヌクレオチドである。ある実施態様において、X5'は、2'-デオキシアデノシン、2'-デオキシグアノシン、2'-デオキシシチジン、5-ハロ-2'-デオキシシチジン、2'-デオキシチミジン、2'-デオキシウリジン、5-ハロ-2'-デオキシウリジン、2'-フルオロリボヌクレオチド、2'-メトキシリボヌクレオチド、又は2'-(2-メトキシエトキシ)リボヌクレオチドである。ある実施態様において、X5'は、2'-デオキシアデノシン、2'-デオキシグアノシン、2'-デオキシシチジン、5-ハロ-2'-デオキシシチジン、2'-デオキシチミジン、2'-デオキシウリジン、又は5-ハロ-2'-デオキシウリジンである。ある実施態様において、X5'は、置換ピリミジン塩基を有する2'-デオキシリボヌクレオチドである。ある実施態様において、X5'は、5-置換ピリミジン塩基を有する2'-デオキシリボヌクレオチドである。ある実施態様において、X5'は、2'-デオキシチミジン、5-ハロ-2'-デオキシシチジン、又は5-ハロ-2'-デオキシウリジンである。ある実施態様において、X5'は、5-ハロ-2'-デオキシシチジンである。ある実施態様において、X5'は、5-ハロ-2'-デオキシウリジンである。ある実施態様において、X5'は、2'-デオキシチミジン、5-ブロモ-2'-デオキシシチジン、5-ヨード-2'-デオキシシチジン、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン、又は5-ヨード-2'-デオキシウリジンである。ある実施態様において、X5'は、2'-デオキシチミジン、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン、又は5-ヨード-2'-デオキシウリジンである。ある実施態様において、X5'は、5-ブロモ-2'-デオキシウリジンである。ある実施態様において、X5'は、5-ヨード-2'-デオキシウリジンである。ある実施態様において、X5'は、3'-ホスホロソエート(phosphorothoate)基を有する。ある実施態様において、X5'は、Rpのキラリティーを有する3'-ホスホロソエート基を有する。ある実施態様において、X5'は、Spのキラリティーを有する3'-ホスホロソエート基を有する。
【０４００】
ある実施態様において、YPは、ヌクレオシド間ホスホチオトリエステルである。
【０４０１】
ある実施態様において、YPは:
【化１２】
2020512843.tif 000014
であり、ここで、Zは、O又はSであり;かつdは、約0〜約50の範囲の整数である。ある実施態様において、ZはOである。ある実施態様において、ZはSである。ある実施態様において、dは、約0〜約10の範囲の整数である。ある実施態様において、dは、約0〜約5の範囲の整数である。ある実施態様において、dは、約0、約1、約2、約3、約4、又は約5の整数である。ある実施態様において、dは、約0、約1、又は約3の整数である。
【０４０２】
ある実施態様において、YPは:
【化１３】
2020512843.tif 000015
であり、ここで、Zは、O又はSであり;かつdは、約0〜約50の範囲の整数である。ある態様において、ZはOである。ある態様において、ZはSである。ある態様において、dは、約0〜約10の範囲の整数である。ある態様において、dは、約0〜約5の範囲の整数である。ある態様において、dは、約0、約1、約2、約3、約4、又は約5の整数である。ある実施態様において、dは、約0、約1、又は約3の整数である。
【０４０３】
ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチドは、1つのさらなるヌクレオシド間ホスホトリエステルを含む。一実施態様において、さらなるヌクレオシド間ホスホトリエステルは、C1-6アルキルホスホトリエステルである。別の実施態様において、さらなるヌクレオシド間ホスホトリエステルは、エチルホスホトリエステルである。
【０４０４】
ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチドは、1つの5-ハロ-2'-デオキシウリジンを含む。一実施態様において、5-ハロ-2'-デオキシウリジンは、5-フルオロ-2'-デオキシウリジン、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン、又は5-ヨード-2'-デオキシウリジンである。別の実施態様において、5-ハロ-2'-デオキシウリジンは、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン又は5-ヨード-2'-デオキシウリジンである。さらに別の実施態様において、5-ハロ-2'-デオキシウリジンは、5-フルオロ-2'-デオキシウリジンである。さらに別の実施態様において、5-ハロ-2'-デオキシウリジンは、5-ブロモ-2'-デオキシウリジンである。さらに別の実施態様において、5-ハロ-2'-デオキシウリジンは、5-ヨード-2'-デオキシウリジンである。
【０４０５】
ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチドは、3以上の2'-デオキシシチジンを含む。ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチドは、3つの2'-デオキシシチジンを含む。
【０４０６】
ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチドは、4以上の2'-デオキシグアノシンを含む。ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチドは、4つの2'-デオキシグアノシンを含む。
【０４０７】
ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチドは、3つの2'-デオキシシチジン及び4つの2'-デオキシグアノシンを含む。ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチドは、1、2、又は3つのCGジヌクレオチドを含む。ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチドは、3個のCGジヌクレオチドを含む。
【０４０８】
ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチドは、3以上の2'-デオキシチミジンを含む。ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチドは、3、4、5、6、7、又は8つの2'-デオキシチミジンを含む。ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチドは、3個、4個、5個、又は8つの2'-デオキシチミジンを含む。
【０４０９】
ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチドは、2'-デオキシアデノシンを含まない。ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチドは、1又は2つの2'-デオキシアデノシンを含む。
【０４１０】
ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチドは、約5〜約20又は約6〜約15ヌクレオチドの範囲の長さを有する。ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチドは、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、又は約15の長さを有する。ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチドは、約10、約11、約12、約13、約14、又は約15の長さを有する。
【０４１１】
ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチドは、1以上のヌクレオシド間ホスホロチオエートを含む。ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチド中のヌクレオシド間ホスホエステルは全て、ヌクレオシド間ホスホロチオエートである。ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチドは、1以上のキラルヌクレオシド間ホスホロチオエートを含む。
【０４１２】
ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチドは、p275、p276、p313、又はp347である。ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチドは、p236、p238、p243、p246、p308、p361、p362、又はp425である。ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチドは、p236、p238、p243、p246、p275、p276、p308、p313、p347、p361、p362、p425、p433、p434、p435、p436、p437、p438、p477、p478、p479、p480、p481、p482、p483、p484、p485、p486、p487、p488、又はp489である。
【０４１３】
ある実施態様において、式(A)のオリゴヌクレオチドは、免疫調節オリゴヌクレオチドである。
【０４１４】
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5Tという配列を有するオリゴヌクレオチド、又はその立体異性体、2以上のジアステレオマーの混合物、互変異性体、もしくは2以上の互変異性体の混合物;或いはこれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、又は水和物であり;
ここで:
xは、1〜4の範囲の整数であり;
N1は、非存在又は2'-デオキシチミジンであり;
N2は、修飾ヌクレオ塩基を有する2'-デオキシリボヌクレオチドであり;
N3は、3'-ホスホトリエステルを各々任意に含む、2'-デオキシアデノシン又は2'-デオキシチミジンであり;
N4は、2'-デオキシアデノシン又は2'-デオキシチミジンであり;
N5は、任意に3'-ホスホトリエステルを含む2'-デオキシチミジンであり;かつ
Cは2'-デオキシシチジンであり、かつGは2'-デオキシグアノシンである。
【０４１５】
ある実施態様において、N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中、xは、1、2、3、又は4の整数である。ある実施態様において、N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中、xは、1の整数である。ある実施態様において、N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中、xは、4の整数である。
【０４１６】
ある実施態様において、N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中、N1は存在しない。ある実施態様において、N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中、N1は、2'-デオキシチミジンである。
【０４１７】
ある実施態様において、N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中、N2は、置換ピリミジン塩基を有する2'-デオキシリボヌクレオチドである。ある態様において、N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中、N2は、5-置換ピリミジン塩基を有する2'-デオキシリボヌクレオチドである。ある態様において、N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中、N2は、5-ハロ-2'-デオキシシチジン又は5-ハロ-2'-デオキシウリジンである。ある態様において、N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中、N2は、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン又は5-ヨード-2'-デオキシウリジンである.
【０４１８】
ある実施態様において、N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中、N3は、3'-ホスホトリエステルを含む2'-デオキシアデノシンである。ある態様において、N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中、N3は、2'-デオキシチミジンである。ある態様において、N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中、N3は、3'-ホスホトリエステルを含む2'-デオキシチミジンである。
【０４１９】
ある実施態様において、N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中、N4は、2'-デオキシアデノシンである。ある態様において、N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中、N4は、2'-デオキシチミジンである。
【０４２０】
ある実施態様において、N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中、N5は、2'-デオキシチミジンである。ある態様において、N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5T中、N5は、3'-ホスホトリエステルを含む2'-デオキシチミジンである。
【０４２１】
ある実施態様において、N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5Tのオリゴヌクレオチドは、1以上のヌクレオシド間ホスホロチオエートを含む。ある実施態様において、N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5Tのオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのキラルヌクレオシド間ホスホロチオエートを含む。
【０４２２】
ある実施態様において、N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5Tのオリゴヌクレオチドは、p275、p276、又はp313である。ある実施態様において、N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5Tのオリゴヌクレオチドは、p236、p238、p243、p246、p308、p361、p362、又はp425である。ある実施態様において、N1N2CGN3CG(T)xGN4CGN5Tのオリゴヌクレオチドは、p236、p238、p243、p246、p275、p276、p308、p313、p347、p361、p362、p425、p433、p434、p435、p436、p437、p438、p477、p478、p479、p480、p481、p482、p483、p484、p485、p486、p487、p488、又はp489である。
【０４２３】
(免疫刺激ポリヌクレオチド)
本発明の免疫刺激ポリヌクレオチドは、PAMPとして機能することができ、かつ自然免疫応答を活性化するか又はTLR9シグナル伝達を(例えば、TLR9アゴニストとして)誘発することにより適応免疫応答を刺激することができる。本発明の免疫刺激ポリヌクレオチドにおいて使用し得る配列は、クラスBのCpGポリヌクレオチドについて当技術分野で公知のもの、又は5-ハロウリジンもしくは5-アルキニルウリジンを含むその修飾体、又はこれらの切断バージョン(例えば、合計6〜16のヌクレオシドを含有するもの)である。本発明の切断型免疫刺激ポリヌクレオチド(例えば、合計6〜16のヌクレオシドを含有するもの)は、切断型のクラスBのCpGポリヌクレオチド配列(例えば、1以上の3'-末端ヌクレオチドが除去されているか又は1以上の該配列内ヌクレオチドが切除されているクラスBのCpGポリヌクレオチド配列)を含有し得る。
【０４２４】
本発明の免疫刺激ポリヌクレオチドは、少なくとも1つの免疫刺激配列(ISS)を含有する。例えば、本発明の免疫刺激ポリヌクレオチドは、1、2、3、又は4つのISSを含有することができる。免疫刺激ポリヌクレオチド中のISSは、標的生物によって決まる。本発明の免疫刺激ポリヌクレオチドにおいて使用されるISSの一般的な特徴は、シチジン-p-グアノシン配列であり、ここで、pは、ヌクレオシド間ホスホジエステル(例えば、ホスフェートもしくはホスホロチオエート)又はヌクレオシド間ホスホトリエステルである。好ましくは、ISS中のシチジン及びグアノシンは、2'-デオキシリボースを含有する。いくつかの実施態様において、本発明の免疫刺激ポリヌクレオチドは、1、2、又は3つのヒトISSを含有する。例えば、ヒトISSは、CG又はNCGであることができ、ここで、Nは、ウリジン、シチジン、もしくはチミジン、又は本明細書に開示される、ウリジンもしくはシチジンの修飾バージョン(例えば、5-ハロウリジン(例えば、5-ヨードウリジンもしくは5-ブロモウリジン)、5-アルキニルウリジン(例えば、5-エチニルウリジンもしくは5-プロピニルウリジン)、5-ヘテロアリールウリジン、もしくは5-ハロシチジン)であり;かつGは、グアノシン又は本明細書に開示されるその修飾バージョン(例えば、7-デアザグアノシン)である。好ましくは、ヒトISSは、NCGである(例えば、ここで、Nは、5-ハロウリジンである)。いくつかの実施態様において、ヒトISSは、UCGである(例えば、ここで、Uは、5-アルキニルウリジン(例えば、5-エチニルウリジン)である)。好ましくは、ヒトを標的とする本発明の免疫刺激ポリヌクレオチドは、5'-末端ヌクレオチドを含む4つの隣接するヌクレオチド内にISSを含有する(例えば、本発明の免疫刺激ポリヌクレオチドは、5'-末端ISSを含有する)。マウスISSは、六量体ヌクレオチド配列: Pu-Pu-CG-Py-Pyであり、ここで、各々のPuは、独立に、プリンヌクレオチドであり、かつ各々のPyは、独立に、ピリミジンヌクレオチドである。
【０４２５】
いくつかの実施態様において、本発明の免疫刺激ポリヌクレオチド中のCpGに対する5'-隣接ヌクレオチドは、2'-アルコキシリボースを含有しない。好ましくは、本発明の免疫刺激ポリヌクレオチド中のCpGに対する5'-隣接ヌクレオチドは、2'-デオキシリボースのみを糖として含有する。
【０４２６】
本発明の免疫刺激ポリヌクレオチドの構造的特徴としては:(1)高含量のホスホロチオエート(例えば、ヌクレオシドの少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、又は少なくとも80％がホスホロチオエートによって連結され得る)、(2)ポリ-Gテールの欠如、(3)該免疫刺激ポリヌクレオチド中のヌクレオシドが、2'-デオキシリボース又は2'-修飾リボース(例えば、2'-ハロ(例えば、2'-フルオロ)もしくは任意に置換された2'-アルコキシ(例えば、2'-メトキシ))を含有し得る、及び/或いは(4)NCGである5'-末端ISSの包含(ここで、Nは、ウリジン、シチジン、又はチミジン、或いは本明細書に開示される、ウリジン又はシチジンの修飾バージョン(例えば、5-ハロウリジン(例えば、5-ヨードウリジンもしくは5-ブロモウリジン)、5-アルキニルウリジン(例えば、5-エチニルウリジンもしくは5-プロピニルウリジン)、5-ヘテロアリールウリジン、又は5-ハロシチジン)であり;かつGは、グアノシン又は本明細書に開示されるその修飾バージョン(例えば、7-デアザグアノシン)である)を挙げることができる。
【０４２７】
いくつかの実施態様において、該コンジュゲートは、1つの標的化部分(例えば、抗体又はその抗原結合断片)及び該標的化部分に共有結合している1つの免疫調節ポリヌクレオチドを含有する。
【０４２８】
(免疫抑制ポリヌクレオチド)
本発明のポリヌクレオチドは、TLR9シグナル伝達の活性化を(例えば、TLR9抑制作用を介して)低下させることにより、適応免疫応答を抑制することができる。いくつかの実施態様において、本発明の免疫抑制ポリヌクレオチドは、以下の式: N1-N2-CG(式中、N1及びN2の各々は、独立に、2'-アルコキシリボース(例えば、2'-メトキシリボース)を含有するヌクレオチドである)によって記述される、CpGに対して5'に隣接している少なくとも2つの2'-アルコキシヌクレオチドを含む。
【０４２９】
(ポリヌクレオチドの構造的特徴)
(脱塩基スペーサー)
本明細書に開示される免疫調節ポリヌクレオチドは、1以上(例えば、1又は2つ)の脱塩基スペーサー(例えば、ヌクレオシド間脱塩基スペーサー及び/又は末端脱塩基スペーサー)を含み得る。該免疫調節ポリヌクレオチドが2以上の脱塩基スペーサーを含む場合、該脱塩基スペーサーの構造は、同じであっても異なっていてもよい。
【０４３０】
脱塩基スペーサーは、式(I)のものである:
R1-L1-[-L2-(L1)n1-]n2-R2 ,(I) 
(式中、
n1は、0又は1であり、
n2は、1〜6の整数であり、
R1は、免疫調節ポリヌクレオチド中のヌクレオシドとの結合であり、
R2は、免疫調節ポリヌクレオチド中のヌクレオシドとの結合又はキャッピング基との結合であり、
各々のL1は、独立に、ホスホジエステル又はホスホトリエステルであり、かつ
各々のL2は、糖類似体である)。
【０４３１】
特定の実施態様において、脱塩基スペーサーがヌクレオシド間の脱塩基スペーサーである場合、n1は1であり、かつR2はヌクレオシドとの結合であり、脱塩基スペーサーが末端の脱塩基スペーサーである場合、n1は0又は1であり、かつR2はキャッピング基との結合である。
【０４３２】
いくつかの実施態様において、脱塩基スペーサーは、ヌクレオシド間の脱塩基スペーサー又は3'-末端の脱塩基スペーサーである。ある実施態様において、各々の2つの隣接するL2基は、L1基によって隔てられている(例えば、2つの隣接するL2基の間に配置されているL1の場合、n1は1である)。
【０４３３】
ある実施態様において、免疫刺激ポリヌクレオチドは、該免疫刺激ポリヌクレオチドの5'-末端ヌクレオチドを含む4つの連続するヌクレオチド内に配置されたISSを含有し、
ここで、該ISSはNCGであり、ここで、Nは、ウリジン、シチジン、又はチミジン、或いは本明細書に開示される、ウリジン又はシチジンの修飾バージョン(例えば、5-ハロウリジン(例えば、5-ヨードウリジンもしくは5-ブロモウリジン)、5-アルキニルウリジン(例えば、5-エチニルウリジンもしくは5-プロピニルウリジン)、5-ヘテロアリールウリジン、又は5-ハロシチジン)であり、かつ
N及びCは、ホスホジエステル又はホスホトリエステルを介して互いに連結されている。
【０４３４】
(糖類似体)
糖類似体は、2つのヒドロキシル基を(i)1つのリン酸エステル中の酸素原子との結合及び(ii)もう一つのリン酸エステル中の酸素原子とのもしくはキャッピング基との結合と置換するように修飾されているC3-6単糖又はC3-6アルジトール(例えば、グリセロール)である二価又は三価の基である。糖類似体は、環状又は非環状である。類似体に含まれるさらなる任意の修飾は:残りのヒドロキシル基又は炭素結合水素原子のうちの1つ、2つ、又は3つとH;任意に置換されたC1-6アルキル;本明細書で定義されている-リンクA(-T)p;共役基;-(CH2)t1-ORZ(ここで、t1は、1〜6の整数であり、かつRZは、任意に置換されたC1-6アルキル、任意に置換されたC2-6アルケニル、任意に置換されたC2-6アルキニル、任意に置換されたC6-14アリール、任意に置換されたC3-8シクロアルキル、任意に置換された(C1-9ヘテロシクリル)-C1-6-アルキル、任意に置換された(C6-10アリール)-C1-6-アルキル、又は任意に置換された(C3-8シクロアルキル)-C1-6-アルキルである)との置換; 1又は2つの不飽和(例えば、1又は2つの二重結合)の導入;及び1、2、又は3つの水素又はヒドロキシル基と、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、又はヘテロシクリルについて定義されている置換基との置換である。いくつかの実施態様において、RZは、任意に置換されたC1-6アミノアルキル(例えば、-NH2を含有する任意に置換されたC1-6アミノアルキル)である。
【０４３５】
糖類似体の非限定的な例は、任意に置換されたC2-6アルキレン、任意に置換されたC2-6アルケニレン、任意に置換されたC5シクロアルカン-1,3-ジイル、任意に置換されたC5シクロアルケン-1,3-ジイル、任意に置換されたヘテロ環-1,3-ジイル(例えば、任意に置換されたピロリジン-2,5-ジイル、任意に置換されたテトラヒドロフラン-2,5-ジイル、又は任意に置換されたテトラヒドロチオフェン-2,5-ジイル)、又は任意に置換された(C1-4アルキル)-(C3-8シクロアルキレン)(例えば、任意に置換された(C1アルキル)-(C3シクロアルキレン))である。糖類似体の非限定的な例は:
【化１４】
2020512843.tif 000016
(ここで、
R1及びR2の各々は、独立に、リン酸エステル中の酸素原子との結合であり;
R3及びR4の各々は、独立に、H;任意に置換されたC1-6アルキル;-(CH2)t1-ORZ;又は-リンクA-RTであり;
ここで、t1は、1〜6の整数であり;
RZは、任意に置換されたC1-6アルキル、任意に置換されたC2-6アルケニル、任意に置換されたC2-6アルキニル、任意に置換されたC6-14アリール、任意に置換されたC3-8シクロアルキル、任意に置換された(C1-9ヘテロシクリル)-C1-6-アルキル、任意に置換された(C6-10アリール)-C1-6-アルキル、任意に置換された(C3-8シクロアルキル)-C1-6-アルキルであり;
リンクAは、リンカーであり;かつ
RTは、標的化部分;コンジュゲーション部分;任意に置換されたC1-6アルキル、任意に置換されたC2-6アルケニル、任意に置換されたC2-6アルキニル、任意に置換されたC6-14アリール、任意に置換されたC3-8シクロアルキル、任意に置換された(C1-9ヘテロシクリル)-C1-6-アルキル、任意に置換された(C6-10アリール)-C1-6-アルキル、又は任意に置換された(C3-8シクロアルキル)-C1-6-アルキルとの結合である)である。
【０４３６】
ある実施態様において、RZは、任意に置換されたC1-6アミノアルキル(例えば、-NH2を含有する任意に置換されたC1-6アミノアルキル)である。
【０４３７】
(ホスホエステル)
本発明の免疫調節ポリヌクレオチドは、1以上のヌクレオシド間ホスホトリエステル並びに/又は1もしくは2つの末端ホスホジエステル及び/もしくはホスホトリエステルを含有し得る。ホスホトリエステルは、1又は2つの原子価がヌクレオシド及び/又は脱塩基スペーサーと置換されており、かつ残りの原子価が生体可逆性基、非生体可逆性基、標的化部分に結合しているリンカー、又は共役基に結合している、ホスフェート、ホスホロチオエート、又はホスホロジチオエートを含有し得る。ヌクレオシド間ホスホトリエステルは、2つのヌクレオシド及び/又は脱塩基スペーサーに結合しており、かつ残りの原子価は、生体可逆性基、非生体可逆性基、標的化部分に結合しているリンカー、又は共役基に結合している。ヌクレオシド間ホスホジエステルは、2つのヌクレオシド及び/又は脱塩基スペーサーに結合している。末端ホスホジエステルは、免疫調節ポリヌクレオチドの5'-又は3'-末端にホスフェート、ホスホロチオエート、又はホスホロジチオエートを含有し、ここで、残りの2つの原子価のうちの1つは、生体可逆性基、非生体可逆性基、標的化部分に結合しているリンカー、又は共役基に結合している。
【０４３８】
(リンカー及びコンジュゲーション部分)
本発明の免疫調節ポリヌクレオチドは、標的化部分及び任意に1以上の補助部分に結合しているリンカーを含有し得る。該リンカーは、43Da〜10kDa(例えば、100Da〜8kDa、100Da〜7kDa、又は100Da〜3kDa)の分子量を有する。該リンカーは、本明細書において、リンクAと表示され得る。該リンカーは、第一の原子価が、ヌクレオシド間もしくは末端ホスフェート、ヌクレオシド間もしくは末端ホスホロチオエート、ヌクレオシド間もしくは末端ホスホロジチオエート、脱塩基スペーサー、キャッピング基、又はヌクレオ塩基に結合しており、かつ第二の原子価が標的化部分に結合している、多価基であってもよい。該リンカーは、その各々が、独立に、補助部分に結合している、1以上の原子価をさらに含み得る。いくつかの実施態様において(例えば、標的化部分が小分子である場合)、免疫調節ポリヌクレオチドは、複数の標的化部分に対する複数のリンカーを含有する。他の実施態様において(例えば、標的化部分が抗体又はその抗原結合断片である場合)、免疫調節ポリヌクレオチドは、標的化部分に対する1つのリンカーを含有し得る。
【０４３９】
本明細書に開示される免疫調節ポリヌクレオチドは、共役基を含み得る。共役基は、コンジュゲーション反応(例えば、付加環化反応(例えば、双極子付加環化)、アミド化反応、もしくは芳香族求核置換)を受けることができる官能基であるか、又は該官能基が脱保護されたとき、コンジュゲーション反応を受けることができるようになる少なくとも1つのコンジュゲート部分を含む。相補的反応基との反応によって、該共役基は、本発明の免疫調節ポリヌクレオチド中にリンカーを生じる。
【０４４０】
特定の実施態様において、標的化部分に結合しているリンカーは、ヌクレオシド間ホスホトリエステルの部分である。ある実施態様において、標的化部分に結合しているリンカーは、脱塩基スペーサーの部分である。
【０４４１】
いくつかの実施態様において、リンカー(例えば、リンクA)又は共役基は、式(II)のものである:
-Z1-QA1-Z2-(-QA2-Z3-)k-RT, (II)
(式中、
Z1は、二価基、三価基、四価基、又は五価基であり、ここで、原子価のうちの1つは、QA1に結合しており、第二の原子価は、空いているか、又は式(II)がリンカーに関するものである場合、RTに結合しており、かつ残りの原子価の各々は、存在する場合、独立に、補助部分に結合しており;
Z2は、非存在、二価基、三価基、四価基、又は五価基であり、ここで、原子価のうちの1つは、QA1に結合しており、第二の原子価は、QA2又はRTに結合しており、かつ残りの原子価の各々は、存在する場合、独立に、補助部分に結合しており;
Z3は、非存在、二価基、三価基、四価基、又は五価基であり、ここで、原子価のうちの1つは、QA2に結合しており、第二の原子価は、RTに結合しており、かつ残りの原子価の各々は、存在する場合、独立に、補助部分に結合しており;
RTは、非存在、又は標的化部分との結合であり;
kは、0又は1である)。
【０４４２】
式(II)がリンカーに関するものである場合、
QA1及びQA2は、独立に、非存在、任意に置換されたC2-12ヘテロアルキレン(例えば、-C(O)-N(H)-、-N(H)-C(O)-、-S(O)2-N(H)-、もしくは-N(H)-S(O)2-を含有するヘテロアルキレン)、任意に置換されたC1-12チオヘテロシクリレン(例えば、
【化１５】
2020512843.tif 000017
)、任意に置換されたC1-12ヘテロシクリレン(例えば、1,2,3-トリアゾール-1,4-ジイルもしくは
【化１６】
2020512843.tif 000018
)、シクロブタ-3-エン-1,2-ジオン-3,4-ジイル、ピリド-2-イルヒドラゾン、任意に置換されたC6-16トリアゾロヘテロシクリレン(例えば、
【化１７】
2020512843.tif 000019
)、任意に置換されたC8-16トリアゾロシクロアルケニレン(例えば、
【化１８】
2020512843.tif 000020
)、又はジヒドロピリダジン基(例えば、
【化１９】
2020512843.tif 000021
)であり;かつ
RTは、標的化部分との結合であり;
ただし、QA1及びQA2のうちの少なくとも1つは存在する。
【０４４３】
式(II)が共役基に関するものである場合、
(i)QA2は存在せず、かつQA1は、コンジュゲーション部分、例えば、任意に置換されたC2-12アルキニル、任意に置換されたN-保護アミノ、アジド、N-マレイミド、S-保護チオール、
【化２０】
2020512843.tif 000022
もしくはこれらのN-保護バージョン、
【化２１】
2020512843.tif 000023
、環内炭素-炭素三重結合を含有する任意に置換されたC6-16ヘテロシクリル(例えば、
【化２２】
2020512843.tif 000024
)、1,2,4,5-テトラジン基(例えば、
【化２３】
2020512843.tif 000025
)、又は任意に置換されたC8-16シクロアルキニル(例えば、
【化２４】
2020512843.tif 000026
)、-NHRN1、任意に置換されたC4-8歪みシクロアルケニル(例えば、trans-シクロオクテニルもしくはノルボルネニル)、又は-COOR12もしくは-CHOを含有する任意に置換されたC1-16アルキルであり;かつ
kは0であるか;
或いは
(ii)QA1は、リンカーについて定義されている通りであり、かつQA2は、コンジュゲーション部分、例えば、任意に置換されたC2-12アルキニル、任意に置換されたN-保護アミノ、アジド、N-マレイミド、S-保護チオール、
【化２５】
2020512843.tif 000027
もしくはこれらのN-保護バージョン、
【化２６】
2020512843.tif 000028
、環内炭素-炭素三重結合を含有する任意に置換されたC6-16ヘテロシクリル(例えば、
【化２７】
2020512843.tif 000029
)、1,2,4,5-テトラジン基(例えば、
【化２８】
2020512843.tif 000030
)、又は任意に置換されたC8-16シクロアルキニル(例えば、
【化２９】
2020512843.tif 000031
)、-NHRN1、任意に置換されたC4-8歪みシクロアルケニル(例えば、trans-シクロオクテニルもしくはノルボルネニル)、又は-COOR12もしくは-CHOを含有する任意に置換されたC1-16アルキルであり;かつ
kは1であり;
ここで、
RN1は、H、N-保護基、又は任意に置換されたC1-6アルキルであり;
各々のR12は、独立に、H又は任意に置換されたC1-6アルキルであり;
R13は、ハロゲン(例えば、F)であり;
Z3及びRTは、存在しない。
【０４４４】
ある実施態様において、Z1は、分岐基及び2つの二価セグメントを有し、ここで、該分岐基は、該2つの二価セグメントの各々に結合しており、
ここで、
該二価セグメントのうちの1つは、ヌクレオシド間もしくは末端ホスフェート、ヌクレオシド間もしくは末端ホスホロチオエート、ヌクレオシド間もしくは末端ホスホロジチオエート、脱塩基スペーサー、又はヌクレオ塩基に結合しており、かつ残りの二価セグメントはQA1に結合しており;
該分岐基は、任意に置換されたC1-12アルカン-トリイル又は任意に置換されたC2-12ヘテロアルカン-トリイルであり、ここで、2つの原子価は、該二価セグメントと置換されており、かつ残りの原子価は、
【化３０】
2020512843.tif 000032
と置換されており、
ここで、
p1は、1、2、又は3であり;
各々のs2は、独立に、0〜10の整数であり;
各々のQB及び各々のQDは、独立に、非存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-、又は-OCH2-であり;かつ
各々のQCは、独立に、非存在、任意に置換されたC1-12アルキレン、任意に置換されたC2-12アルケニレン、任意に置換されたC2-12アルキニレン、任意に置換されたC2-12ヘテロアルキレン、任意に置換されたC1-9ヘテロシクリレン、又は-P(Z)(OH)-であり、ここで、Zは、O又はSであり;
各々のQGは、独立に、任意に置換されたC1-6アルカン-トリイル、任意に置換されたC1-6アルカン-テトライル、任意に置換されたC2-6ヘテロアルカン-トリイル、又は任意に置換されたC2-6ヘテロアルカン-テトライルであり;かつ
各々のQHは、独立に、RM1又は-QG[(-QB-QC-QD)s2-RM1]p1であり、ここで、各々のRM1は、独立に、補助部分との結合である。
【０４４５】
ある実施態様において、Z2は、分岐基及び2つの二価セグメントを有し、ここで、該分岐基は、該2つの二価セグメントの各々に結合しており、
ここで、
該二価セグメントのうちの1つは、標的化部分又はQA2に結合しており、かつ残りの二価セグメントはQA1に結合しており;
該分岐基は、任意に置換されたC1-12アルカン-トリイル又は任意に置換されたC2-12ヘテロアルカン-トリイルであり、ここで、2つの原子価は、該二価セグメントと置換されており、かつ残りの原子価は、
【化３１】
2020512843.tif 000033
と置換されており、
ここで、
p1は、1、2、又は3であり;
各々のs2は、独立に、0〜10の整数であり;
各々のQB及び各々のQDは、独立に、非存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-、又は-OCH2-であり;かつ
各々のQCは、独立に、非存在、任意に置換されたC1-12アルキレン、任意に置換されたC2-12アルケニレン、任意に置換されたC2-12アルキニレン、任意に置換されたC2-12ヘテロアルキレン、任意に置換されたC1-9ヘテロシクリレン、又は-P(Z)(OH)-であり、ここで、Zは、O又はSであり;
各々のQGは、独立に、任意に置換されたC1-6アルカン-トリイル、任意に置換されたC1-6アルカン-テトライル、任意に置換されたC2-6ヘテロアルカン-トリイル、又は任意に置換されたC2-6ヘテロアルカン-テトライルであり;かつ
各々のQHは、独立に、RM1又は-QG[(-QB-QC-QD)s2-RM1]p1であり、ここで、各々のRM1は、独立に、補助部分との結合である。
【０４４６】
ある実施態様において、Z3は、分岐基及び2つの二価セグメントを有し、ここで、該分岐基は、該2つの二価セグメントの各々に結合しており、
ここで、
該二価セグメントのうちの1つは、標的化部分に結合しており、かつ残りの二価セグメントはQA2に結合しており;
該分岐基は、任意に置換されたC1-12アルカン-トリイル又は任意に置換されたC2-12ヘテロアルカン-トリイルであり、ここで、2つの原子価は、該二価セグメントと置換されており、かつ残りの原子価は、
【化３２】
2020512843.tif 000034
と置換されており、
ここで、
p1は、1、2、又は3であり;
各々のs2は、独立に、0〜10の整数であり;
各々のQB及び各々のQDは、独立に、非存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-、又は-OCH2-であり;かつ
各々のQCは、独立に、非存在、任意に置換されたC1-12アルキレン、任意に置換されたC2-12アルケニレン、任意に置換されたC2-12アルキニレン、任意に置換されたC2-12ヘテロアルキレン、任意に置換されたC1-9ヘテロシクリレン、又は-P(Z)(OH)-であり、ここで、Zは、O又はSであり;
各々のQGは、独立に、任意に置換されたC1-6アルカン-トリイル、任意に置換されたC1-6アルカン-テトライル、任意に置換されたC2-6ヘテロアルカン-トリイル、又は任意に置換されたC2-6ヘテロアルカン-テトライルであり;かつ
各々のQHは、独立に、RM1又は-QG[(-QB-QC-QD)s2-RM1]p1であり、ここで、各々のRM1は、独立に、補助部分との結合である。
【０４４７】
Z1、Z2、又はZ3中の二価セグメントは、-(-QB-QC-QD-)s1-であってもよく、
ここで、
各々のs1は、独立に、1〜50(例えば、1〜30)の整数であり;
各々のQB及び各々のQDは、独立に、非存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-、又は-OCH2-であり;かつ
各々のQCは、独立に、非存在、任意に置換されたC1-12アルキレン、任意に置換されたC2-12アルケニレン、任意に置換されたC2-12アルキニレン、任意に置換されたC2-12ヘテロアルキレン、又は任意に置換されたC1-9ヘテロシクリレンであり;
ただし、QB、QC、及びQDのうちの少なくとも1つは存在する。
【０４４８】
ある実施態様において、少なくとも1つのQCは、二価セグメント中に存在する。特定の実施態様において、QCは、二価セグメントの各々のモノマー単位中に存在する。いくつかの実施態様において、Z1は、存在するQCを介して結合している。さらなる実施態様において、QB及びQDのうちの少なくとも1つは、Z1の各々のモノマー単位中に存在する。またさらなる実施態様において、QB及びQDのうちの少なくとも1つは、Z2の各々のモノマー単位中に存在する。特定の実施態様において、存在する場合、Z1、Z2、及びZ3のうちの1つだけが、分岐基を含有する。
【０４４９】
またさらなる実施態様において、Z1、Z2、及びZ3のうちの1つ、2つ、又は3つは、独立に、
-(-QB-QC-QD-)s1-QE-(-QB-QC-QD-)s1-, (III)
であり、ここで、
各々のs1は、独立に、1〜50(例えば、1〜30)の整数であり;
各々のQB及び各々のQDは、独立に、非存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-、又は-OCH2-であり;かつ
各々のQCは、独立に、非存在、任意に置換されたC1-12アルキレン、任意に置換されたC2-12アルケニレン、任意に置換されたC2-12アルキニレン、任意に置換されたC2-12ヘテロアルキレン、任意に置換されたC1-9ヘテロシクリレン、又は-P(Z)(OH)-であり、ここで、Zは、O又はSであり;かつ
QEは、非存在又は式(IV)の分岐基であり:
【化３３】
2020512843.tif 000035
式中、
p1は、1、2、又は3であり;
各々のs2は、独立に、0〜10の整数であり;
QFは、任意に置換されたC1-12アルカン-トリイル又は任意に置換されたC2-12ヘテロアルカン-トリイルであり;かつ
各々のQGは、独立に、任意に置換されたC1-6アルカン-トリイル、任意に置換されたC1-6アルカン-テトライル、任意に置換されたC2-6ヘテロアルカン-トリイル、又は任意に置換されたC2-6ヘテロアルカン-テトライルであり;かつ
各々のQHは、独立に、RM1 or -QG[(-QB-QC-QD)s2-RM1]p1であり、ここで、各々のRM1は、独立に、補助部分との結合である。
【０４５０】
式(IV)において、p1が1である場合、QGは存在せず; p1が2又は3である場合、少なくとも1つのQGは存在する。
【０４５１】
特定の実施態様において、Z1は、存在するQCを介して、ヌクレオシド間又は末端ホスフェート、ヌクレオシド間又は末端ホスホロチオエート、ヌクレオシド間又は末端ホスホロジチオエート、脱塩基スペーサー、キャッピング基、又はヌクレオ塩基に結合している。
【０４５２】
特定の実施態様において、QB、QC、QD、及びQEのうちの少なくとも1つが二価セグメント中に存在する(例えば、少なくとも1つのQCが存在するか、QEが存在するか、又はQEが存在しない)。ある実施態様において、各々のQB及び各々のQDは、独立に、非存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-,-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-、又は-OCH2-である。
【０４５３】
いくつかの実施態様において、-(-QB-QC-QD-)s1-が組み合わさって、基:
-QB-(CH2)g1-(CH2OCH2)g2-(CH2)g3-QD-
を形成し、
ここで、
(i)g2は1〜50の整数であり;
(ii)g1は1であり、QBは、-NHCO-、-CONH-、もしくは-O-であるか;又はg1は0であり、QDは-NHCO-であり;かつ
(iii)g3は1であり、QBは、-NHCO-、-CONH-、もしくは-O-であり;又はg3は0であり、QDは-CONH-である。
【０４５４】
コンジュゲーション部分は、補助部分がポリヌクレオチドにコンジュゲートされるまで保護されてもよい。例えば、保護されるコンジュゲーション部分としては、-COORPGO又は-NHRPGNを挙げることができ、ここで、RPGOはO-保護基(例えば、カルボキシル保護基)であり、かつRPGNはN-保護基である。
【０４５５】
さらなる実施態様において、リンクAは、
【化３４】
2020512843.tif 000036
であり、
ここで、
QA1及びQA2の各々は、非存在、独立に任意に置換されたC2-12ヘテロアルキレン(例えば、-C(O)-N(H)-、-N(H)-C(O)-、-S(O)2-N(H)-、もしくは-N(H)-S(O)2-を含有するヘテロアルキレン)、任意に置換されたC1-12チオヘテロシクリレン(例えば、
【化３５】
2020512843.tif 000037
)、任意に置換されたC1-12ヘテロシクリレン(例えば、1,2,3-トリアゾール-1,4-ジイルもしくは
【化３６】
2020512843.tif 000038
)、シクロブタ-3-エン-1,2-ジオン-3,4-ジイル、ピリド-2-イルヒドラゾン、任意に置換されたC6-16トリアゾロヘテロシクリレン(例えば、
【化３７】
2020512843.tif 000039
)、任意に置換されたC8-16トリアゾロシクロアルケニレン(例えば、
【化３８】
2020512843.tif 000040
)、又はジヒドロピリダジン基(例えば、
【化３９】
2020512843.tif 000041
)であり、ただし、QA1及びQA2のうちの少なくとも1は存在しており;
RTは、標的化部分との結合であり;
RPは、ヌクレオシド間架橋基、ヌクレオ塩基、キャッピング基、又は脱塩基スペーサーとの結合であり;
QTは、-CO-、-NH-、-NH-CH2-、又は-CO-CH2-であり;
各々のQSは、独立に、任意に置換されたC2-12アルキレン、任意に置換されたC2-12アルケニレン、任意に置換されたC2-12アルキニレン、又は任意に置換された(C6-10アリール)-C1-6-アルキレンであり;
各々のRMは、独立に、H、補助部分、-(CH2)q7-CO-N(RM1)2、又は-C[-CH2O-(CH2)q7-CO-N(RM1)2]3であり、ここで、各々のq7は、独立に、1〜5の整数であり、かつ各々のRM1は、独立に、H又は補助部分であり;
X1、X3、及びX5の各々は、独立に、非存在、-O-、-NH-、-CH2-NH-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-NH-C(O)-O-、-CH2-NH-C(O)-NH-、-CH2-O-C(O)-NH-、又は-CH2-NH-C(O)-O-であり;
X7は、非存在、-O-、-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-NH-、-CH2-NH-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-NH-C(O)-O-、-CH2-NH-C(O)-NH-、-CH2-O-C(O)-NH-、又は-CH2-NH-C(O)-O-であり;
X2、X4、及びX6の各々は、独立に、非存在、-O-、-NH-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、又は-NH-C(O)-O-であり;
x1及び各々のx5は、独立に、0又は1であり;
各々のx2は、独立に、0〜50(例えば、1〜40又は1〜30)の整数であり;
各々のx3は、独立に、1〜11の整数であり;
x4は、0、1、又は2であり;かつ
各々のx6は、独立に、0〜10(例えば、1〜6)の整数であり、ただし、両方のx6の和は12以下である。
【０４５６】
またさらなる実施態様において、リンクAは、
【化４０】
2020512843.tif 000042
であり、
ここで、
QA1は、任意に置換されたC2-12ヘテロアルキレン(例えば、-C(O)-N(H)-、-N(H)-C(O)-、-S(O)2-N(H)-、もしくは-N(H)-S(O)2-を含有するヘテロアルキレン)、任意に置換されたC1-12チオヘテロシクリレン(例えば、
【化４１】
2020512843.tif 000043
)、任意に置換されたC1-12ヘテロシクリレン(例えば、1,2,3-トリアゾール-1,4-ジイルもしくは
【化４２】
2020512843.tif 000044
)、シクロブタ-3-エン-1,2-ジオン-3,4-ジイルもしくはピリド-2-イルヒドラゾン)、任意に置換されたC6-16トリアゾロヘテロシクリレン(例えば、
【化４３】
2020512843.tif 000045
)、任意に置換されたC8-16トリアゾロシクロアルケニレン(例えば、
【化４４】
2020512843.tif 000046
)、又はジヒドロピリダジン基(例えば、
【化４５】
2020512843.tif 000047
)であり;
各々のRM1は、独立に、H又は補助部分であり;
RTは、標的化部分との結合であり;
RPは、ヌクレオシド間架橋基、ヌクレオ塩基、キャッピング基、又は脱塩基スペーサーとの結合であり;
QTは、-CO-、-NH-、-NH-CH2-、又は-CO-CH2-であり;
QPは、-C(O)-N(H)-、-N(H)-C(O)-、-S(O)2-N(H)-、又は-N(H)-S(O)2-であり;
各々のQSは、独立に、任意に置換されたC2-12アルキレン、任意に置換されたC2-12アルケニレン、任意に置換されたC2-12アルキニレン、又は任意に置換された(C6-10アリール)-C1-6-アルキレンであり;
q1、q3、及びq7の各々は、独立に、0又は1であり;
q2及びq8の各々は、0〜50(例えば、1〜40又は1〜30)の整数であり;
q4は、0〜10の整数であり;
q5及びq6の各々は、独立に、1〜10(例えば、1〜6)の整数であり;かつ
q9は、1〜10の整数である。
【０４５７】
またさらなる実施態様において、リンクAは、
【化４６】
2020512843.tif 000048
であり、
ここで、
各々の構造式において、一方の
【化４７】
2020512843.tif 000049
は、単結合を表し、もう一方の、
【化４８】
2020512843.tif 000050
は、二重結合を表し;
各々のRM1は、独立に、H又は補助部分であり;
RTは、標的化部分との結合であり;
RPは、ヌクレオシド間架橋基、ヌクレオ塩基、キャッピング基、又は脱塩基スペーサーとの結合であり;
QTは、-CO-、-CO-CH2-、-NH-、又は-NH-CH2-であり;
QPは、-C(O)-N(H)-、-N(H)-C(O)-、-S(O)2-N(H)-、又は-N(H)-S(O)2-であり;
各々のQSは、独立に、任意に置換されたC2-12アルキレン、任意に置換されたC2-12アルケニレン、任意に置換されたC2-12アルキニレン、又は任意に置換された(C6-10アリール)-C1-6-アルキレンであり;
q1、q3、及びq7の各々は、独立に、0又は1であり;
q2及びq8の各々は、0〜50(例えば、1〜40又は1〜30)の整数であり;
q4は、0〜10の整数であり;
q5及びq6の各々は、独立に、1〜10(例えば、1〜6)の整数であり;かつ
q9は、1〜10の整数である。
【０４５８】
いくつかの実施態様において、q5は0である。他の実施態様において、q5は、2〜6の整数である。
【０４５９】
特定の実施態様において、共役基は:
【化４９】
2020512843.tif 000051
であり、
ここで、
QA1は、独立に、任意に置換されたC2-12ヘテロアルキレン(例えば、-C(O)-N(H)-、-N(H)-C(O)-、-S(O)2-N(H)-、もしくは-N(H)-S(O)2-を含有するヘテロアルキレン)、任意に置換されたC1-12チオヘテロシクリレン(例えば、
【化５０】
2020512843.tif 000052
)、任意に置換されたC1-12ヘテロシクリレン(例えば、1,2,3-トリアゾール-1,4-ジイルもしくは
【化５１】
2020512843.tif 000053
)、シクロブタ-3-エン-1,2-ジオン-3,4-ジイル、ピリド-2-イルヒドラゾン、任意に置換されたC6-16トリアゾロヘテロシクリレン(例えば、
【化５２】
2020512843.tif 000054
)、任意に置換されたC8-16トリアゾロシクロアルケニレン(例えば、
【化５３】
2020512843.tif 000055
)、又はジヒドロピリダジン基(例えば、
【化５４】
2020512843.tif 000056
)であり;
QA2は、任意に置換されたC2-12アルキニル、任意に置換されたN-保護アミノ、アジド、N-マレイミド、S-保護チオール、
【化５５】
2020512843.tif 000057
もしくはこれらのN-保護バージョン、
【化５６】
2020512843.tif 000058
、環内炭素-炭素三重結合を含有する任意に置換されたC6-16ヘテロシクリル(例えば、
【化５７】
2020512843.tif 000059
)、1,2,4,5-テトラジン基(例えば、
【化５８】
2020512843.tif 000060
)、又は任意に置換されたC8-16シクロアルキニル(例えば、
【化５９】
2020512843.tif 000061
)、-NHRN1、任意に置換されたC4-8歪みシクロアルケニル(例えば、trans-シクロオクテニルもしくはノルボルネニル)、又は-COOR12もしくは-CHOを含有する任意に置換されたC1-16アルキルであり;
RN1は、H、N-保護基、又は任意に置換されたC1-6アルキルであり;
各々のR12は、独立に、H又は任意に置換されたC1-6アルキルであり;
R13は、ハロゲン(例えば、F)であり;
RPは、ヌクレオシド間架橋基、ヌクレオ塩基、キャッピング基、又は脱塩基スペーサーとの結合であり;
各々のQSは、独立に、任意に置換されたC2-12アルキレン、任意に置換されたC2-12アルケニレン、任意に置換されたC2-12アルキニレン、又は任意に置換された(C6-10アリール)-C1-6-アルキレンであり;
各々のRMは、独立に、H、補助部分、-(CH2)q7-CO-N(RM1)2、又は-C[-CH2O-(CH2)q7-CO-N(RM1)2]3であり、ここで、各々のq7は、独立に、1〜5の整数であり、かつ各々のRM1は、独立に、H又は補助部分であり;
X3及びX5の各々は、独立に、非存在、-O-、-NH-、-CH2-NH-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-NH-C(O)-O-、-CH2-NH-C(O)-NH-、-CH2-O-C(O)-NH-、又は-CH2-NH-C(O)-O-であり;
X7は、非存在、-O-、-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-NH-,-CH2-NH-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-NH-C(O)-O-、-CH2-NH-C(O)-NH-、-CH2-O-C(O)-NH-、又は-CH2-NH-C(O)-O-であり;
X2、X4、及びX6の各々は、独立に、非存在、-O-、-NH-、-O-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、又は-NH-C(O)-O-であり;
x1及び各々のx5は、独立に、0又は1であり;
各々のx2は、独立に、0〜50(例えば、1〜40又は1〜30)の整数であり;
各々のx3は、独立に、1〜11の整数であり;
x4は、0、1、又は2であり;かつ
各々のx6は、独立に、0〜10(例えば、1〜6)の整数であり、ただし、両方のx6の和は12以下である。
【０４６０】
いくつかの実施態様において、共役基は:
【化６０】
2020512843.tif 000062
であり、
ここで、
QA1は、任意に置換されたC2-12アルキニル、任意に置換されたN-保護アミノ、アジド、N-マレイミド、S-保護チオール、
【化６１】
2020512843.tif 000063
もしくはこれらのN-保護バージョン、
【化６２】
2020512843.tif 000064
、環内炭素-炭素三重結合を含有する任意に置換されたC6-16ヘテロシクリル(例えば、
【化６３】
2020512843.tif 000065
)、1,2,4,5-テトラジン基(例えば、
【化６４】
2020512843.tif 000066
)、又は任意に置換されたC8-16シクロアルキニル(例えば、
【化６５】
2020512843.tif 000067
)、-NHRN1、任意に置換されたC4-8歪みシクロアルケニル(例えば、trans-シクロオクテニルもしくはノルボルネニル)、又は-COOR12もしくは-CHOを含有する任意に置換されたC1-16アルキルであり;
RN1は、H、N-保護基、又は任意に置換されたC1-6アルキルであり;
各々のR12は、独立に、H又は任意に置換されたC1-6アルキルであり;
R13は、ハロゲン(例えば、F)であり;
RPは、ヌクレオシド間架橋基、ヌクレオ塩基、キャッピング基、又は脱塩基スペーサーとの結合であり;
各々のQSは、独立に、任意に置換されたC2-12アルキレン、任意に置換されたC2-12アルケニレン、任意に置換されたC2-12アルキニレン、又は任意に置換された(C6-10アリール)-C1-6-アルキレンであり;
X7は、非存在、-O-、-NH-、-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-CH2-NH-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-NH-C(O)-O-、-CH2-NH-C(O)-NH-、-CH2-O-C(O)-NH-、又は-CH2-NH-C(O)-O-であり;
X6は、非存在、-O-、-NH-、-O-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、又は-NH-C(O)-O-であり;
x1は、独立に、0又は1であり;
各々のx2は、独立に、0〜50(例えば、1〜40又は1〜30)の整数であり;
各々のx3は、独立に、1〜11の整数であり;かつ
x4は、0、1、又は2である。
【０４６１】
ある実施態様において、共役基は:
【化６６】
2020512843.tif 000068
であり、
ここで、
QA1は、任意に置換されたC2-12アルキニル、任意に置換されたN-保護アミノ、アジド、N-マレイミド、S-保護チオール、
【化６７】
2020512843.tif 000069
もしくはこれらのN-保護バージョン、
【化６８】
2020512843.tif 000070
、環内炭素-炭素三重結合を含有する任意に置換されたC6-16ヘテロシクリル(例えば、
【化６９】
2020512843.tif 000071
)、1,2,4,5-テトラジン基(例えば、
【化７０】
2020512843.tif 000072
)、又は任意に置換されたC8-16シクロアルキニル(例えば、
【化７１】
2020512843.tif 000073
)、-NHRN1、任意に置換されたC4-8歪みシクロアルケニル(例えば、trans-シクロオクテニルもしくはノルボルネニル)、又は-COOR12もしくは-CHOを含有する任意に置換されたC1-16アルキルであり;
RN1は、H、N-保護基、又は任意に置換されたC1-6アルキルであり;
各々のR12は、独立に、H又は任意に置換されたC1-6アルキルであり;
R13は、ハロゲン(例えば、F)であり;
RPは、ヌクレオシド間架橋基、ヌクレオ塩基、キャッピング基、又は脱塩基スペーサーとの結合であり;
QPは、-C(O)-N(H)-、-N(H)-C(O)-、-S(O)2-N(H)-、又は-N(H)-S(O)2-であり;
各々のQSは、独立に、任意に置換されたC2-12アルキレン、任意に置換されたC2-12アルケニレン、任意に置換されたC2-12アルキニレン、又は任意に置換された(C6-10アリール)-C1-6-アルキレンであり;
q1及びq3の各々は、独立に、0又は1であり;
q2は、0〜50(例えば、1〜40又は1〜30)の整数であり;
q4は、0〜10の整数であり;かつ
q5は、1〜10(例えば、1〜6)の整数である。
【０４６２】
またさらなる実施態様において、共役基は:
【化７２】
2020512843.tif 000074
であり、
ここで、
RPは、ヌクレオシド間架橋基、ヌクレオ塩基、キャッピング基、又は脱塩基スペーサーとの結合であり;
QPは、-C(O)-N(H)-、-N(H)-C(O)-、-S(O)2-N(H)-、又は-N(H)-S(O)2-であり;
各々のQSは、独立に、任意に置換されたC2-12アルキレン、任意に置換されたC2-12アルケニレン、任意に置換されたC2-12アルキニレン、又は任意に置換された(C6-10アリール)-C1-6-アルキレン;
q1及びq3の各々は、独立に、0又は1であり;
q2は、0〜50(例えば、1〜40又は1〜30)の整数であり;
q4は、0〜10の整数であり;かつ
q5は、1〜10(例えば、1〜6)の整数である。
【０４６３】
ある例示的な実施態様において、共役基は:
【化７３】
2020512843.tif 000075
2020512843.tif 000076
2020512843.tif 000077
2020512843.tif 000078
であり、
ここで、q2は、1〜50の整数(例えば、1〜24又は1〜8(例えば、2又は3)の整数)であり、q4は、0〜10(例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、又は8)の整数であり、q10は、0〜8(例えば、1、2、3、4、5、又は6)の整数であり、q11は0又は1であり、ZはO又はSであり、かつ各々のRMは、独立に、H、補助部分、-(CH2)q7-CO-N(RM1)2、又は-C[-CH2O-(CH2)q7-CO-N(RM1)2]3であり、ここで、各々のq7は、独立に、1〜5の整数であり、かつ各々のRM1は、独立に、H又は補助部分である。
【０４６４】
以下の例示的な共役基は、金属触媒付加環化を介する標的化部分とのコンジュゲーションに使用することができる:
【化７４】
2020512843.tif 000079
(ここで、q2は、1〜50の整数(例えば、1〜24又は1〜8(例えば、2又は3)の整数)であり、q4は、0〜10(例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、又は8)の整数であり、q10は、0〜8(例えば、1、2、3、4、5、又は6)の整数であり、q11は0又は1であり、かつZはO又はSである)。
【０４６５】
以下の例示的な共役基は、無金属付加環化を介する標的化部分とのコンジュゲーションに使用することができる:
【化７５】
2020512843.tif 000080
2020512843.tif 000081
2020512843.tif 000082
2020512843.tif 000083
(ここで、q2は、1〜50の整数(例えば、1〜24又は1〜8(例えば、2又は3)の整数)であり、q4は、0〜10(例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、又は8)の整数であり、q10は、0〜8(例えば、1、2、3、4、5、又は6)の整数であり、q11は0又は1であり、ZはO又はSであり、かつ各々のRMは、独立に、H、補助部分、-(CH2)q7-CO-N(RM1)2、又は-C[-CH2O-(CH2)q7-CO-N(RM1)2]3であり、ここで、各々のq7は、独立に、1〜5の整数であり、かつ各々のRM1は、独立に、H又は補助部分である)。
【０４６６】
以下の例示的な共役基は、アミド形成を介する標的化部分とのコンジュゲーションに使用することができる:
【化７６】
2020512843.tif 000084
(ここで、q2は、0〜50の整数(例えば、1〜8(例えば、2又は3)の整数)であり、かつq12は、1〜11の整数(例えば、1〜5(例えば、1、2、3、4、又は5の整数)である)。
【０４６７】
(生体可逆性基)
生体可逆性基は、135Da〜10kDa(例えば、135Da〜5kDa、200Da〜5kDa、又は200Da〜2kDa)の分子量を有し、かつジスルフィド(-S-S-)を含有する一価置換基である。生体可逆性基において、生体可逆性基のジスルフィドと原子価を共有結合する原子の最も短い鎖は、2〜10個の原子(例えば、2〜6個の原子又は4〜6個の原子(例えば、4又は5個の原子))である。生体可逆性基は、生理的条件下、細胞内で切断可能である。
【０４６８】
生体可逆性基をホスホエステルに含めて、例えば、本発明の免疫調節ポリヌクレオチドの全体的な負電荷を低下させ得る。免疫調節ポリヌクレオチドの全体的な負電荷の低下は、本発明の免疫調節ポリヌクレオチド及び/又はコンジュゲート細胞取込みを増強し得る。本発明の免疫調節ポリヌクレオチドは、ホスホエステル及び/又は脱塩基スペーサー中に1以上の生体可逆性基を含み得る。いくつかの実施態様において、本発明の免疫調節ポリヌクレオチドは、1〜6つの生体可逆性基(例えば、1〜4つの生体可逆性基(例えば、1、2、又は3つの生体可逆性基))を含み得る。
【０４６９】
生体可逆性基は、式(XXII)のものであることができる:
R5-S-S-(LinkB)-, (XXII)
(式中、
リンクBは、ホスフェート、ホスホロチオエート、もしくはホスホロジチオエートに結合したsp3混成炭素原子と-S-S-に結合した炭素原子とを含有する二価基であり、かつR5は、任意に置換されたC1-6アルキル、任意に置換されたC6-10アリール、もしくは-リンクC(-RM)rであるか、又はリンクBは、ホスフェート、ホスホロチオエート、もしくはホスホロジチオエートに結合したsp3混成炭素原子と-S-S-に結合した炭素原子とを含有する三価リンカーであり、ここで、リンクBの第三の原子価は、-S-S-及びR5と組み合わさって、任意に置換されたC3-9ヘテロシクリレンを形成し;
リンクCは、多価基であり;
各々のRMは、独立に、H、補助部分、又は-QG[(-QB-QC-QD)s2-RM1]p1であり、
ここで、
各々のRM1は、独立に、H又は補助部分であり、
各々のQB及び各々のQDは、独立に、非存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-、又は-OCH2-であり、
各々のQCは、独立に、非存在、任意に置換されたC1-12アルキレン、任意に置換されたC2-12アルケニレン、任意に置換されたC2-12アルキニレン、任意に置換されたC2-12ヘテロアルキレン、又は任意に置換されたC1-9ヘテロシクリレンであり、
各々のQGは、独立に、任意に置換されたC1-6アルカン-トリイル、任意に置換されたC1-6アルカン-テトライル、任意に置換されたC2-6ヘテロアルカン-トリイル、又は任意に置換されたC2-6ヘテロアルカン-テトライルであり、
各々のs2は、独立に、0〜10の整数であり、かつ
p1は、2又は3であり;
かつ
rは、1〜6(例えば、1、2、又は3)の整数である)。
【０４７０】
ある実施態様において、リンクB及び/又はR5は、-S-S-に結合した嵩高い基を含む。-S-S-に結合した嵩高い基の包含は、例えば、ポリヌクレオチド合成時の硫黄-硫黄結合の安定性を増強し得る。
【０４７１】
さらなる実施態様において、リンクBは、1、2、又は3つの基からなり、該基の各々は、独立に、任意に置換されたC1-12アルキレン、任意に置換されたC2-12アルケニレン、任意に置換されたC2-12アルキニレン、任意に置換されたC6-10アリーレン、任意に置換されたC2-12ヘテロアルキレン、及び任意に置換されたC1-9ヘテロシクリレンからなる群から選択される。
【０４７２】
特定の実施態様において、リンクB及び-S-S-は、組み合わさって:
【化７７】
2020512843.tif 000085
(ここで、
各々のR6は、独立に、C2-7アルカノイル; C1-6アルキル; C2-6アルケニル; C2-6アルキニル; C1-6アルキルスルフィニル; C6-10アリール;アミノ;(C6-10アリール)-C1-4-アルキル; C3-8シクロアルキル;(C3-8シクロアルキル)-C1-4-アルキル; C3-8シクロアルケニル;(C3-8シクロアルケニル)-C1-4-アルキル;ハロ; C1-9ヘテロシクリル; C1-9ヘテロアリール;(C1-9ヘテロシクリル)オキシ;(C1-9ヘテロシクリル)アザ;ヒドロキシ; C1-6チオアルコキシ; -(CH2)qCO2RA(ここで、qは、0〜4の整数であり、かつRAは、C1-6アルキル、C6-10アリール、及び(C6-10アリール)-C1-4-アルキルからなる群から選択される);-(CH2)qCONRBRC(ここで、qは、0〜4の整数であり、かつRB及びRCは、水素、C1-6アルキル、C6-10アリール、及び(C6-10アリール)-C1-4-アルキルからなる群から独立に選択される);-(CH2)qSO2RD(ここで、qは、0〜4の整数であり、かつRDは、C1-6アルキル、C6-10アリール、及び(C6-10アリール)-C1-4-アルキルからなる群から選択される);-(CH2)qSO2NRERF(ここで、qは、0〜4の整数であり、かつRE及びRFの各々は、独立に、水素、アルキル、アリール、及び(C6-10アリール)-C1-4-アルキルからなる群から選択される);チオール;アリールオキシ;シクロアルコキシ;アリールアルコキシ;(C1-9ヘテロシクリル)-C1-4-アルキル;(C1-9ヘテロアリール)-C1-4-アルキル; C3-12シリル;シアノ;もしくは-S(O)RH(ここで、RHは、水素、C1-C6アルキル、C6-10アリール、及び(C6-10アリール)-C1-4-アルキルからなる群から選択される)であるか;又は2つの隣接するR6基は、該R6基の各々が結合している原子と一緒に、組み合わさって、C6アリール、C2-5ヘテロシクリル、もしくはC2-5ヘテロアリールからなる群から選択される環状基を形成し、ここで、該環状基は、C2-7アルカノイル; C1-6アルキル; C2-6アルケニル; C2-6アルキニル; C1-6アルキルスルフィニル; C6-10アリール;アミノ;(C6-10アリール)-C1-4-アルキル; C3-8シクロアルキル;(C3-8シクロアルキル)-C1-4-アルキル; C3-8シクロアルケニル;(C3-8シクロアルケニル)-C1-4-アルキル;ハロ; C1-9ヘテロシクリル; C1-9ヘテロアリール;(C1-9ヘテロシクリル)オキシ;(C1-9ヘテロシクリル)アザ;ヒドロキシ; C1-6チオアルコキシ;-(CH2)qCO2RA(ここで、qは、0〜4の整数であり、かつRAは、C1-6アルキル、C6-10アリール、及び(C6-10アリール)-C1-4-アルキルからなる群から選択される);-(CH2)qCONRBRC(ここで、qは、0〜4の整数であり、かつRB及びRCは、水素、C1-6アルキル、C6-10アリール、及び(C6-10アリール)-C1-4-アルキルからなる群から独立に選択される);-(CH2)qSO2RD(ここで、qは、0〜4の整数であり、かつRDは、C1-6アルキル、C6-10アリール、及び(C6-10アリール)-C1-4-アルキルからなる群から選択される);-(CH2)qSO2NRERF(ここで、qは、0〜4の整数であり、かつRE及びRFの各々は、独立に、水素、アルキル、アリール、及び(C6-10アリール)-C1-4-アルキルからなる群から選択される);チオール;アリールオキシ;シクロアルコキシ;アリールアルコキシ;(C1-9ヘテロシクリル)-C1-4-アルキル;(C1-9ヘテロアリール)-C1-4-アルキル; C3-12シリル;シアノ;並びに-S(O)RH(ここで、RHは、水素、C1-C6アルキル、C6-10アリール、及び(C6-10アリール)-C1-4-アルキルからなる群から選択される)からなる群から選択される1、2、もしくは3個の置換基で任意に置換されており;
m1は、0、1、又は2であり;かつ
m2は、0、1、2、3、又は4である);
からなる群から選択される構造を形成するか、或いはリンクB、-S-S-、及びR5は、組み合わさって、
【化７８】
2020512843.tif 000086
を含有する基を形成する。
【０４７３】
またさらなる実施態様において、リンクCは、0〜3個の多価モノマー(例えば、任意に置換されたC1-6アルカン-トリイル、任意に置換されたC1-6アルカン-テトライル、又は三価窒素原子)及び1以上の二価モノマー(例えば、1〜40個)を含むことができ、ここで、各々の二価モノマーは、独立に、任意に置換されたC1-6アルキレン;任意に置換されたC2-6アルケニレン;任意に置換されたC2-6アルキニレン;任意に置換されたC3-8シクロアルキレン;任意に置換されたC3-8シクロアルケニレン;任意に置換されたC6-14アリーレン; N、O、及びSから選択される1〜4つのヘテロ原子を有する任意に置換されたC1-9ヘテロアリーレン; N、O、及びSから選択される1〜4つのヘテロ原子を有する任意に置換されたC1-9ヘテロシクリレン;イミノ;任意に置換されたN; O;又はS(O)m(ここで、mは、0、1、もしくは2である)である。いくつかの実施態様において、各々モノマーは、独立に、任意に置換されたC1-6アルキレン;任意に置換されたC3-8シクロアルキレン;任意に置換されたC3-8シクロアルケニレン;任意に置換されたC6-14アリーレン; N、O、及びSから選択される1〜4つのヘテロ原子を有する任意に置換されたC1-9ヘテロアリーレン; N、O、及びSから選択される1〜4つのヘテロ原子を有する任意に置換されたC1-9ヘテロシクリレン;イミノ;任意に置換されたN; O;又はS(O)m(ここで、mは、0、1、もしくは2(例えば、mは2である))である。ある実施態様において、各々モノマーは、独立に、任意に置換されたC1-6アルキレン;任意に置換されたC3-8シクロアルキレン;任意に置換されたC3-8シクロアルケニレン;任意に置換されたC6-14アリーレン; N、O、及びSから選択される1〜4つのヘテロ原子を有する任意に置換されたC1-9ヘテロアリーレン; N、O、及びSから選択される1〜4つのヘテロ原子を有する任意に置換されたC1-9ヘテロシクリレン;任意に置換されたN; O;又はS(O)m(ここで、mは、0、1、もしくは2である)である。補助部分をコンジュゲーション部分に又はその反応産物に接続する非生体可逆性リンカーは、2〜500個(例えば、2〜300個、2〜200個、2〜100個、又は2〜50個)のそのようなモノマーを含むことができる。リンクCは、1以上のポリエチレングリコールを含み得る(例えば、該ポリエチレングリコールは、88Da〜1kDa(例えば、88Da〜500Da)の分子量を含み得る。
【０４７４】
式(IIa)中の基-リンクC(-RM)rの調製において使用し得る化合物は、本明細書に及びWO 2015/188197号に記載されている。-リンクC(-RM)rの非限定的な例としては:
【化７９】
2020512843.tif 000087
が挙げられ、
ここで、
R14は、-S-S-との結合であり、
RMは、補助部分又は-QG[(-QB-QC-QD)s2-RM1]p1であり、
ここで、
各々のRM1は、独立に、H又は補助部分であり、
各々のQB及び各々のQDは、独立に、非存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-、又は-OCH2-であり、
各々のQCは、独立に、非存在、任意に置換されたC1-12アルキレン、任意に置換されたC2-12アルケニレン、任意に置換されたC2-12アルキニレン、任意に置換されたC2-12ヘテロアルキレン、又は任意に置換されたC1-9ヘテロシクリレンであり;
各々のQGは、独立に、任意に置換されたC1-6アルカン-トリイル、任意に置換されたC1-6アルカン-テトライル、任意に置換されたC2-6ヘテロアルカン-トリイル、又は任意に置換されたC2-6ヘテロアルカン-テトライルであり、
各々のs2は、独立に、0〜10の整数であり、かつ
p1は、2又は3であり;
各々のr4は、独立に、1〜6の整数であり;かつ
各々のr5は、独立に、0〜10の整数である。
【０４７５】
ある実施態様において、RMは、補助部分である。いくつかの実施態様において、少なくとも1つのRM1は、補助部分である。
【０４７６】
ある実施態様において、生体可逆性リンカー基は、
【化８０】
2020512843.tif 000088
であり、ここで、該基のうちの一方の末端は、ポリヌクレオチドに接続されており、もう一方の末端は、標的部分(一実施態様において、抗体)に接続されている。
【０４７７】
(非生体可逆性基)
非生体可逆性基は、生理的条件下、血清中又はエンドソーム内で切断可能な結合(例えば、エステル、チオエステル、又はジスルフィド)を含有しない一価置換基である。非生体可逆性基は、任意に置換されたC2-16アルキル;任意に置換されたC3-16アルケニル;任意に置換されたC3-16アルキニル;任意に置換されたC3-8シクロアルキル;任意に置換されたC3-8シクロアルケニル;任意に置換された(C3-8シクロアルキル)-C1-4-アルキル;任意に置換された(C3-8シクロアルケニル)-C1-4-アルキル;任意に置換されたC6-14アリール;任意に置換された(C6-14アリール)-C1-4-アルキル; N、O、及びSから選択される1〜4つのヘテロ原子を有する任意に置換されたC1-9ヘテロアリール; N、O、及びSから選択される1〜4つのヘテロ原子を有する任意に置換された(C1-9ヘテロアリール)-C1-4-アルキル; N、O、及びSから選択される1〜4つのヘテロ原子を有する任意に置換されたC2-9ヘテロシクリル(ここで、該ヘテロシクリルはS-S結合を含有しない); N、O、及びSから選択される1〜4つのヘテロ原子を有する任意に置換された(C2-9ヘテロシクリル)-C1-4-アルキル(ここで、該ヘテロシクリルはS-S結合を含有しない);又は式(XXIII)の基:
【化８１】
2020512843.tif 000089
であってもよく、
式中、
L3は、C2-6アルキレンであり;
R7は、任意に置換されたC2-6アルキル;任意に置換されたC6-14アリール;任意に置換された(C6-14アリール)-C1-4-アルキル;任意に置換されたC3-8シクロアルキル;任意に置換された(C3-8シクロアルキル)-C1-4-アルキル; N、O、及びSからなる群から選択される1〜4つのヘテロ原子を有する任意に置換されたC1-9ヘテロアリール; N、O、及びSからなる群から選択される1〜4つのヘテロ原子を有する任意に置換された(C1-9ヘテロアリール)-C1-4-アルキル; N、O、及びSからなる群から選択される1〜4つのヘテロ原子を有する任意に置換されたC2-9ヘテロシクリル(ここで、該ヘテロシクリルはS-S結合を含有しない); N、O、及びSから選択される1〜4つのヘテロ原子を有する任意に置換された(C2-9ヘテロシクリル)-C1-4-アルキル(ここで、該ヘテロシクリルはS-S結合を含有しない);並びに-OH、C1-6アルコキシ、又は-COOHで末端が終わるポリ(エチレングリコール)であり;かつ
R8は、H又はC1-6アルキルである。
【０４７８】
非生体可逆性ホスホトリエステルは、共役基、C2-16アルキル、
【化８２】
2020512843.tif 000090
又は
【化８３】
2020512843.tif 000091
とアジド含有基質との付加環化反応によって形成される基である置換基で置換されたホスフェート又はホスホロチオエートであってもよく、
ここで、
nは、1〜6の整数であり;
R9は、任意に置換されたC6アリール; 1もしくは2個の窒素原子を含有する6員環である任意に置換されたC4-5ヘテロアリール;又は1もしくは2個の窒素原子を含有する6員環である任意に置換されたC4-5ヘテロシクリルであり;
R10は、H又はC1-6アルキルであり;
R11は、ハロゲン、-COOR11A、又は-CON(R11B)2であり、ここで、R11A及びR11Bの各々は、独立に、H、任意に置換されたC1-6アルキル、任意に置換されたC6-14アリール、任意に置換されたC1-9ヘテロアリール、又は任意に置換されたC2-9ヘテロシクリルであり;かつ
アジド含有基質は、
【化８４】
2020512843.tif 000092
である。
【０４７９】
いくつかの実施態様において、非生体可逆性基は、-リンクD(-RM1)r1であり、ここで、リンクDは、多価リンカーであり、各々のRM1は、独立に、H又は補助部分であり、かつr1は、1〜6の整数である。
【０４８０】
場合により、-リンクD(-RM1)r1は、式(XXIV)のものである:
-QR-Q3([-Q4-Q5-Q6]r2-Q7-RM1)r1, (XXIV)
(式中、
r1は、1〜6の整数であり;
各々のr2は、独立に、0〜50(例えば、0〜30)の整数であり、ここで、反復単位は、同じであるか又は異なるものであり;
QRは、[-Q4-Q5-Q6]r2-QL-であり、ここで、QLは、任意に置換されたC2-12ヘテロアルキレン(例えば、-C(O)-N(H)-、-N(H)-C(O)-、-S(O)2-N(H)-、もしくは-N(H)-S(O)2-を含有するヘテロアルキレン)、任意に置換されたC1-12チオヘテロシクリレン(例えば、
【化８５】
2020512843.tif 000093
)、任意に置換されたC1-12ヘテロシクリレン(例えば、1,2,3-トリアゾール-1,4-ジイルもしくは
【化８６】
2020512843.tif 000094
)、シクロブタ-3-エン-1,2-ジオン-3,4-ジイル、ピリド-2-イルヒドラゾン、任意に置換されたC6-16トリアゾロヘテロシクリレン(例えば、
【化８７】
2020512843.tif 000095
)、任意に置換されたC8-16トリアゾロシクロアルケニレン(例えば、
【化８８】
2020512843.tif 000096
)、又はジヒドロピリダジン基(例えば、
【化８９】
2020512843.tif 000097
)であり;
Q3は、r1が1である場合、線状基(例えば、[-Q4-Q5-Q6]r2-)であり、又はr1が2〜6の整数である場合、分岐基(例えば、[-Q4-Q5-Q6]s-Q8([-Q4-Q5-Q6]r2-(Q8)r3)r4(ここで、r3は0もしくは1であり、r4は、0、1、2、もしくは3である)であり;各々のr2は、独立に、0〜50(例えば、0〜30)の整数であり、ここで、反復単位は、同じであるか又は異なるものであり;
各々のQ4及び各々のQ6は、独立に、非存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-、又は-OCH2-であり;
各々のQ5は、独立に、非存在、任意に置換されたC1-12アルキレン、任意に置換されたC2-12アルケニレン、任意に置換されたC2-12アルキニレン、任意に置換されたC2-12ヘテロアルキレン、又は任意に置換されたC1-9ヘテロシクリレンであり;
各々のQ7は、独立に、非存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-CH2-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NH-C(O)-、-NH-CH(Ra)-C(O)-、又は-C(O)-CH(Ra)-NH-であり;
各々のQ8は、独立に、任意に置換されたC1-6アルカン-トリイル、任意に置換されたC1-6アルカン-テトライル、任意に置換されたC2-6ヘテロアルカン-トリイル、又は任意に置換されたC2-6ヘテロアルカン-テトライルであり;かつ
各々のRaは、独立に、H又はアミノ酸側鎖であり;かつ
各々のRM1は、独立に、H又は補助部分である)。
【０４８１】
式(XXIV)中、Q4、Q5、及びQ6のうちの少なくとも1つが存在する。式(XXIV)中、リンクDは、各々のr3が0である場合、単一の分岐点を含み得、又は少なくとも1つのr3が1である場合、複数の分岐点を含み得る。式(XXIV)中、QRは、-Q5-Q4-QL-であり得、ここで、Q5は、任意に置換されたC2-12ヘテロアルキレン又は任意に置換されたC1-12アルキレンであり、かつQ4は、-CO-、-NH-、又は-O-である。式(XXIV)中、QLは:
【化９０】
2020512843.tif 000098
であり得る。
【０４８２】
式(XXIV)中、Q3は、式[-Q4-Q5-Q6]r2-の線状基であってもよく、ここで、Q4、Q5、及びQ6は、式(XXIV)について定義されている通りである。或いは、Q3は、分岐基[-Q4-Q5-Q6]r2-Q8([-Q4-Q5-Q6]r2-(Q8)r3)r4であってもよく、ここで、各々のQ8は、独立に、任意に置換されたC1-6アルカン-トリイル、任意に置換されたC1-6アルカン-テトライル、任意に置換されたC2-6ヘテロアルカン-トリイル、又は任意に置換されたC2-6ヘテロアルカン-テトライルであり;
ここで、
各々のr2は、独立に、0〜50(例えば、0〜30)の整数であり、ここで、反復単位は、同じあるか又は異なるものであり;
r3は、0又は1であり;
r4は、0、1、2、又は3であり;
ここで、
r3が0であるとき、リンクDは、三価又は四価基であり、かつ
r3が1であるとき、リンクDは、四価、五価、又は六価基である。
【０４８３】
ある実施態様において、r3は0である。
【０４８４】
いくつかの実施態様において、Q8は:
【化９１】
2020512843.tif 000099
である。
【０４８５】
式(I)中の基-リンクD(-RM1)pの調製において使用し得る化合物は、本明細書に及びWO 2015/188197号に記載されている。
【０４８６】
ある実施態様において、非生体可逆性リンカー基は、
【化９２】
2020512843.tif 000100
であり、ここで、該基のうちの一方の末端は、ポリヌクレオチドに接続されており、もう一方の末端は、標的部分(一実施態様において、抗体)に接続されている。
【０４８７】
(補助部分)
補助部分は、色素もしくは親水性基又はこれらの組合せ(例えば、親水性ポリマー(例えば、ポリ(エチレングリコール)(PEG))、正荷電ポリマー(例えば、ポリ(エチレンイミン))、もしくは糖アルコール(例えば、グルシトール))を含有する一価基である。補助部分は、100Da〜2.5kDa(例えば、350Da〜2.5kDa、100Da〜1,200Da、又は1kDa〜2.5kDa)の理論上の分子量を有し得る。
【０４８８】
色素は、(例えば、光退色後蛍回復法(FRAP)を用いた)細胞内への本発明のコンジュゲートの取込みの可視化又は移動のモニタリングのために、リン酸エステル基に含めることができる。当技術分野で公知の色素は、5'-もしくは3'-末端のホスフェートもしくはホスホロチオエートを介して又は2つの連続するヌクレオシドを結び付けるホスフェートもしくはホスホロチオエートを介して、ポリヌクレオチドに連結された補助部分として含めることができる。色素として使用することができる有用な構造の非限定的な例としては、FITC、RD1、アロフィコシアニン(APC)、aCFTM色素(Biotium, Hayward, CA)、BODIPY(Life TechnologiesのInvitrogen(商標) 10, Carlsbad, CA)、AlexaFluor(登録商標)(Life TechnologiesのInvitrogen(商標)、Carlsbad、CA)、DyLight Fluor(Thermo Scientific Pierce Protein Biology Products, Rockford, IL)、ATTO(ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany)、FluoProbe(Interchim SA, Motlucon, France)、及びAbberior Probes(Abberior GmbH, Gottingen, Germany)が挙げられる。
【０４８９】
本発明の免疫調節ポリヌクレオチド中の及び本発明のコンジュゲート中の補助部分として使用し得る親水性ポリマー及び正荷電ポリマーは、当技術分野で公知である。親水性ポリマーの非限定的な例は、ポリ(エチレングリコール)である。正荷電ポリマーの非限定的な例は、ポリ(エチレンイミン)である。
【０４９０】
糖アルコールベースの補助部分は、例えば、アミノ末端グルシトール又はグルシトールクラスターであり得る。アミノ末端グルシトール補助部分は:
【化９３】
2020512843.tif 000101
である。グルシトールクラスターの非限定的な例は:
【化９４】
2020512843.tif 000102
である。
【０４９１】
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、式(B)の化合物:又は立体異性体、2以上のジアステレオマーの混合物、互変異性体、もしくは2以上の互変異性体の混合物;或いはこれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、又は水和物である;
RX-LN-(Q)e       (B)
(式中:
Rxは、共役基であり;
LNは、リンカーであり;
各々のQは、独立に、ホスホトリエステルを含むオリゴヌクレオチドであり;かつ
eは、1、2、3、又は4の整数である)。
【０４９２】
ある実施態様において、式(B)中、Rxは、
【化９５】
2020512843.tif 000103
である。
【０４９３】
ある実施態様において、式(B)中、LNは、ポリエチレングリコールを含むリンカーである。
【０４９４】
ある実施態様において、式(B)中、LNは、
【化９６】
2020512843.tif 000104
であり、ここで、dは、約0〜約50の範囲の整数である。ある態様において、dは、約0〜約10の範囲の整数である。ある態様において、dは、約0〜約5の範囲の整数である。ある態様において、dは、約0、約1、又は約3の整数である。
【０４９５】
ある実施態様において、式(B)中、eは、1の整数である。
ある実施態様において、式(B)中、各々のQは、独立に、式(D)の構造を有する:
【化９７】
2020512843.tif 000105
。
【０４９６】
式中、XN、X3'、X5'、YP、b、及びcは、各々、本明細書で定義されている通りである。
【０４９７】
(標的化部分)
本発明のコンジュゲートにおいて使用される標的化部分を用いて、コンジュゲートされたペイロードポリヌクレオチドの標的送達のために体内の特異的細胞及び組織を標的とすることができる。本発明のコンジュゲートによって標的とされる細胞は、プロフェッショナルAPC(例えば、B細胞、pDC、又はマクロファージ)である。該標的化部分は、抗原結合部分(例えば、抗体もしくはその抗原結合断片)、ポリペプチド、アプタマー、又は1以上の小分子(例えば、マンノース)を含む基であることができる。本発明のコンジュゲート中の標的化部分は、インビボでの免疫調節ポリヌクレオチドの不均一な分布の問題に対処するのに有効であることができる。
【０４９８】
(抗原結合部分)
本発明のコンジュゲート中の抗原結合部分は、抗体又はその抗原結合断片(例えば、F(ab)2もしくはFab)或いはこれらの改変された誘導体(例えば、Fcab又は融合タンパク質(例えば、scFv))であることができる。ヒト又はキメラ(例えば、ヒト化)抗体は、本発明のコンジュゲート中の抗体として使用することができる。
【０４９９】
抗原結合部分は、該抗原結合部分によって認識される表面抗原を有する細胞を標的とする。特に、APCは、本発明のコンジュゲート中の抗原結合部分によって標的とされ得る。B細胞は、抗CD38、抗CD79b、抗CD30、抗CD22、もしくは抗CD20、抗CD19抗体、又はこれらの抗原結合断片、或いはこれらの改変された誘導体によって標的とされ得る。形質細胞様樹状細胞(pDC)は、抗DEC205、抗CD304、抗CD303、抗CD40、抗CD74、抗BDCA2、もしくは抗CD123抗体、又はこれらの抗原結合断片、或いはこれらの改変された誘導体によって標的とされ得る。マクロファージは、抗CD163、抗CD40、抗CD74、抗CD206、もしくは抗CD123抗体、又はこれらの抗原結合断片、或いはこれらの改変された誘導体によって標的とされ得る。
【０５００】
抗CD38抗体の非限定的な例は、ダラツムマブ、SAR650984、MOR202、又はWO 2012/092616号に開示されている抗体Ab79、Ab19、Ab43、Ab72、及びAb110のいずれか1つであり、これらの抗体の開示は、引用により組み込まれている。抗CD79b抗体の非限定的な例は、WO 2014/011521号に開示されているhuMA79b v28である。抗CD22抗体の非限定的な例は、US 2014/0127197号に開示されている10F4である。抗CD20抗体の非限定的な例は、リツキシマブである。抗DEC205抗体の非限定的な例は、その抗体が引用により本明細書中に組み込まれるUS 2010/0098704号に提供されている。抗CD40抗体の非限定的な例は、ルカツムマブ及びダセツズマブである。抗CD304抗体の非限定的な例は、ベセンクマブである。
【０５０１】
(ポリペプチド)
標的化部分は、細胞に対する親和性を有する(例えば、細胞型、例えば、形質細胞様細胞に対する親和性を有する)ポリペプチドであることができる。ポリペプチドの非限定的な例は、RGDペプチド、狂犬病ウイルス糖タンパク質(RVG)、及びDC3ペプチドである。
【０５０２】
(小分子)
標的化部分は、標的細胞の表面で発現される受容体を複合体化することができる小分子であることができる。本発明のコンジュゲート中の標的化部分として使用し得る小分子の非限定的な例は、葉酸、マンノース、PSMAリガンド、及びマンノースクラスターである。
【０５０３】
葉酸は、標的化部分として使用し得る。本発明のコンジュゲートにおいて、葉酸は、以下の構造のものであり得る:
【化９８】
2020512843.tif 000106
。
【０５０４】
マンノース又はマンノースクラスターを用いて、本発明のコンジュゲートを形質細胞様樹状細胞及びマクロファージに標的化することができるが、それは、これらの細胞が、その表面にマンノース受容体を発現するからである。
【０５０５】
マンノースクラスターは、当技術分野で公知である。マンノース補助部分(例えば、マンノースクラスター)は、式(XXV)のものであり得る:
-(-QM1-QM2-QM3-)s3-QM4[(-QM1-QM2-QM3-)s3-QM5]p3, (XXV)
(式中、
p3は、1、2、又は3であり;
各々のs3は、独立に、0〜50(例えば、0〜30)の整数であり;
各々のQM1及び各々のQM3は、独立に、非存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-、又は-OCH2-であり;かつ
各々のQM2は、独立に、非存在、任意に置換されたC1-12アルキレン、任意に置換されたC2-12アルケニレン、任意に置換されたC2-12アルキニレン、任意に置換されたC2-12ヘテロアルキレン、又は任意に置換されたC1-9ヘテロシクリレンであり;
QM4は、非存在(p3が1である場合)、任意に置換されたC1-6アルカン-トリイル(p3が2である場合)、任意に置換されたC1-6アルカン-テトライル(p3が3である場合)、任意に置換されたC2-6ヘテロアルカン-トリイル(p3が2である場合)、又は任意に置換されたC2-6ヘテロアルカン-テトライル(p3が3である場合)であり;
各々のQM5は、独立に、マンノース又は-QM6[(-QM1-QM2-QM3)s2-RM2]p1であり、ここで、各々のRM2は、独立に、マンノースであり;かつ
各々のQM6は、存在する場合、独立に、任意に置換されたC1-6アルカン-トリイル、任意に置換されたC1-6アルカン-テトライル、任意に置換されたC2-6ヘテロアルカン-トリイル、又は任意に置換されたC2-6ヘテロアルカン-テトライルである)。
【０５０６】
マンノースクラスターの非限定的な例は:
【化９９】
2020512843.tif 000107
2020512843.tif 000108
であり、ここで、各々のaは、独立に、0〜10の整数である。
【０５０７】
(コンジュゲート)
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、式(C)のコンジュゲート:又はその立体異性体、2以上のジアステレオマーの混合物、互変異性体、もしくは2以上の互変異性体の混合物;或いはこれらの医薬として許容し得る塩、溶媒和物、又は水和物である;
【化１００】
2020512843.tif 000109
(式中、Abは、標的化部分であり; fは、1、2、3、又は4の整数であり;かつLN、Q、及びeは、各々、本明細書で定義されている通りである)。
【０５０８】
ある実施態様において、式(C)中、Abは、抗体である。ある実施態様において、式(C)中、Abは、モノクローナル抗体である。
【０５０９】
ある実施態様において、式(C)中、fは、1又は2の整数である。ある態様において、式(C)中、fは、1の整数である。
【０５１０】
ある実施態様において、式(C)中、eとfはどちらも、各々、1の整数である。
本明細書で使用される「DAR」という用語は、CpG抗体コンジュゲートの薬物-抗体比、より具体的には、ポリヌクレオチド-抗体比を指す。一実施態様において、CpG抗体コンジュゲートは、約1〜約20、約1〜約10、約1〜約8、約1〜約4、又は約1〜約2の範囲のDARを有する。別の実施態様において、CpG抗体コンジュゲートは、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、又は約8のDARを有する。
【０５１１】
(コンジュゲートの調製)
(コンジュゲーション)
標的化部分を1以上の免疫調節ポリヌクレオチドにコンジュゲートするのに有用な反応は本明細書に記載されており、かつ当技術分野で公知である(例えば、バイオオルソゴナルな反応)。この結合を形成させるために使用することができる例示的な反応としては、トリアゾール部分を形成させるためのアジドとアルキン系共役基(例えば、環内炭素-炭素三重結合を含有する任意に置換されたC6-16ヘテロシクリレン又は任意に置換されたC8-16シクロアルキニル)との間のヒュスゲン付加環化(金属触媒型もしくは無金属型);ジエノフィルとジエン/ヘテロ-ジエンとの間のディールス・アルダー反応;他のペリ環状反応、例えば、エン反応による結合形成;アミド又はチオアミド結合形成;スルホンアミド結合形成(例えば、アジド化合物によるもの);アルコール又はフェノールアルキル化(例えば、ウィリアムソンアルキル化)、オキシム、ヒドラゾン、又はセミカルバジド基を形成させるための縮合反応;求核試薬(例えば、アミン及びチオール)による共役付加反応;ジスルフィド結合形成;並びにカルボニル(例えば、活性化カルボン酸及びエステル、例えば、ペンタフルオロフェニル(PFP)エステルもしくはテトラフルオロフェニル(TFP)エステル)における又は求電子性アレン(例えば、オリゴフッ素化アレン、フルオロベンゾニトリル基、もしくはフルオロニトロベンゼン基におけるSNAr)における求核置換(例えば、アミン、チオール、又はヒドロキシル求核試薬によるもの)が挙げられる。いくつかの実施態様において、コンジュゲーション反応は双極子付加環化であり、かつコンジュゲーション部分は、アジド、環内炭素-炭素三重結合を含有する任意に置換されたC6-16ヘテロシクリレン、又は任意に置換されたC8-16シクロアルキニルを含む。相補的反応基及び共役基は、その相互相補性について選択される。例えば、アジドを共役基及び相補的反応基のうちの一方で使用することができ、同時に、アルキンを共役基及び相補的反応基のうちのもう一方で使用することができる。
【０５１２】
(求核/求電子反応)
求核試薬及び求電子試薬は、限定されないが、求電子試薬によるC-H結合への挿入、求電子試薬によるO-H結合への挿入、求電子試薬によるN-H結合への挿入、アルケンを横切る求電子試薬の付加、アルキンを横切る求電子試薬の付加、求電子性カルボニル中心への付加、求電子性カルボニル中心における置換、ケテンへの付加、イソシアネートへの求核付加、イソチオシアネートへの求核付加、求電子性シリル基における求核置換、アルキルハライド又はシュードハライドにおける脱離基(例えば、ハライド又はシュードハライド)の求核置換;活性化カルボン酸エステル(例えば、PFPエステルもしくはTFPエステル)、チオエステル、無水物、又はアシルハライドのカルボニルにおける求核付加/除去;α,β-不飽和カルボニル基への求核試薬の1,4-共役付加、エポキシドの求核開環、電子不足芳香族化合物の芳香族求核置換、活性化リン中心への求核付加、活性化リン中心における求核置換、活性化硫黄中心への求核付加、及び活性化硫黄中心における求核置換から選択される結合形成反応に関与することができる。
【０５１３】
求核性共役基は、任意に置換されたアルケン、任意に置換されたアルキン、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロシクリル、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、アニリド、又はチオであることができる。
【０５１４】
求電子性共役基は、アジド、活性化カルボニル(例えば、活性化カルボン酸エステル(例えば、スクシンイミジルエステルもしくはスルホスクシンイミジルエステル)、チオエステル、無水物、又はアシルハライド)、イソシアネート、チオイソシアネート、マイケル受容体(例えば、マレイミド)、アルキルハライド又はシュードハライド、エポキシド、エピスルフィド、アジリジン、或いは電子不足アリールであることができる。
【０５１５】
例えば、コンジュゲーションは、縮合反応を介して生じて、ヒドラゾン結合である連結を形成することができる。
【０５１６】
コンジュゲーションは、例えば、カルボキシル系共役基(例えば、カルボン酸、エステル、又は-CONH2)の活性化、及びその後の共役基中の一級アミンとの反応によるアミド結合の形成を伴い得る。活性化剤は、様々なカルボジイミド様のもの: EDC(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩)、EDAC(1-エチル-3(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩)、DCC(ジシクロヘキシルカルボジイミド)、CMC(1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリノエチル)カルボジイミド)、DIC(ジイソプロピルカルボジイミド)、又はウッドワード試薬K(N-エチル-3-フェニルイソキサゾリウム-3'-スルホネート)であることができる。-CONH2であるカルボキシル系共役基の活性化は、トランスグルタミナーゼを用いて達成することができる。活性化NHS-エステル系共役基と一級アミン系共役基との反応も、アミド結合の形成をもたらす。
【０５１７】
ポリヌクレオチドは、カルボニル系共役基を含有し得る。二級アミンの同時形成を伴うコンジュゲーションは、還元アミノ化により(すなわち、アミン系共役基をアルデヒド系共役基と反応させ、その後、ヒドリド供与体(例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウム又は水素化トリアセトキシホウ素ナトリウム)で還元することにより)達成することができる。
【０５１８】
エーテル形成を用いて、標的化部分を1以上のポリヌクレオチドにコンジュゲートし、本発明のコンジュゲートを形成させることができる。エーテル連結形成は、エポキシド系共役基とヒドロキシ系共役基との反応を伴い得る。
【０５１９】
チオールを共役基として使用することもできる。例えば、ジスルフィド結合の形成によるコンジュゲーションは、ピリジルジスルフィド媒介性のチオール-ジスルフィド交換によって達成することができる。スルフヒドリル系共役基の導入は、例えば、トラウト試薬(2-イミノチオラン)、SATA(N-スクシンイミジル S-アセチルチオアセテート、SATP(スクシンイミジルアセチルチオプロピオネート)、SPDP(N-スクシンイミジル 3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート、SMPT(スクシニミジルオキシカルボニル-α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)トルエン)、N-アセチルホモシステインチオラクトン、SAMSA(S-アセチルメルカプトコハク酸無水物)、AMBH(2-アセドアミド(Acedamido)-4-メルカプト酪酸ヒドラジド)、及びシスタミン(2,2'-ジチオビス(エチルアミン)によって媒介される。
【０５２０】
チオエーテル連結形成は、スルフヒドリル系共役基をマレイミドもしくはヨードアセチル系共役基と反応させるか又はエポキシド系共役基と反応させることにより行うことができる。
【０５２１】
マレイミド系共役基は、SMCC(スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート)、スルホ-SMCC(スルホスクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレート)、MBS(m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)、スルホ-MBS(m-マレイミドベンゾイル-N-スルホヒドロキシスクシンイミドエステル)、SMPB(スクシンイミジル-4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート)、スルホ-SMPB(スルホスクシンイミジル 4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート)、GMBS(N-α-マレイミドブツリル(buturyl)-オキシスクシンイミドエステル)、スルホGMBS(N-α-マレイミドブツリル(buturyl)-オキシスルホスクシンイミドエステル)によって導入することができる。
【０５２２】
カルバメート連結の形成によるコンジュゲーションは、ヒドロキシ系共役基とCDI(N,N'-カルボニルジイミダゾール)又はDSC(N,N'-ジスクシンイミジルカルボネート)又はN-ヒドロキシスクシンイミジルクロロホルメートとの反応及びその後のアミン系共役基との反応により行うことができる。
【０５２３】
(付加環化反応)
付加環化反応を用いて、所望の共有結合を形成させることができる。代表的な付加環化反応としては、アルケン系共役基と1,3-ジエン系共役基との反応(ディールス・アルダー反応)、アルケン系共役基とα,β-不飽和カルボニル系共役基との反応(ヘテロディールス・アルダー反応)、並びにトリアゾール部分を得るためのアルキン系共役基とアジド系共役基との反応(その金属触媒型及び無金属型変形を含む、ヒュスゲン付加環化)が挙げられるが、これらに限定されない。付加環化反応用の反応物質を含む、共役基の選択された非限定的な例は:アルケン、アルキン、1,3-ジエン、α,β-不飽和カルボニル、及びアジドである。例えば、アジドとアルキンの間のヒュスゲン付加環化(クリック反応)は、多様な生物学的実体の官能化に使用されている。
【０５２４】
歪みアルキン系共役基は、1つの環内炭素-炭素三重結合を含む炭素環式又はヘテロ環式環系(例えば、環内炭素-炭素三重結合を含有する任意に置換されたC6-16ヘテロシクリレン又は任意に置換されたC8-16シクロアルキニル)である。歪みアルキン系共役基は、アジド共役基との無金属型双極子付加環化を介して、標的化部分をポリヌクレオチドにコンジュゲートするのに有用であり得る。
【０５２５】
(カップリング反応)
共役基としては、ヒドロシリル化、オレフィンクロスメタセシス、共役付加、スティルカップリング、鈴木カップリング、薗頭カップリング、檜山カップリング、及びヘック反応用の反応物質を挙げることができるが、これらに限定されない。これらの反応のコンジュゲーション部分としては、ヒドリドシラン、アルケン(例えば、活性化アルケン、例えば、エノン又はエノエート)、アルキン、アリールハライド、アリールシュードハライド(例えば、トリフレート又はノナフレート)、ハロゲン化アルキル、並びにアルキルシュードハライド(例えば、トリフレート、ノナフレート、及びホスフェート)が挙げられる。クロスカップリング反応用の触媒は、当技術分野で周知である。そのような触媒は、有機金属錯体又は金属塩(例えば、Pd(0)、Pd(II)、Pt(0)、Pt(II)、Pt(IV)、Cu(I)、もしくはRu(II))であり得る。添加剤、例えば、配位子(例えば、PPh3、PCy3、BINAP、dppe、dppf、SIMes、又はSIPr)及び金属塩(例えば、LiCl)を添加して、クロスカップリング反応を促進してもよい。
【０５２６】
(免疫調節ポリヌクレオチドの調製)
免疫調節ポリヌクレオチドは、例えば、ヌクレオシドホスホロアミダイトからポリヌクレオチドを化学合成する当技術分野で公知の方法に従って調製することができる。ヌクレオシドホスホロアミダイト及び免疫調節ポリヌクレオチドの合成の非限定的な例は、実施例において提供されている。ホスホロアミダイトは、ホスホロアミダイトのP原子に共有結合した共役基を含むことができる。
【０５２７】
(標的化部分の調製)
標的化部分は、免疫調節ポリヌクレオチド中の共役基と該標的化部分に結合した相補的反応基との結合を形成させることにより、1以上のポリヌクレオチドにコンジュゲートすることができる。該標的化部分は、もともと、相補的反応基(例えば、抗体もしくは抗原結合断片又はこれらの改変された誘導体中のQ-タグ(例えば、LLQGG、GGGLLQGG、もしくは当技術分野で公知の別のQ-タグ配列)を保有していてもよく、或いはそれは、相補的反応基をQ-タグに結合させることによって相補的反応基を含むように修飾されていてもよい。そのような相補的反応基を標的化部分に導入する方法は、当技術分野で公知である。
【０５２８】
相補的反応基としては、任意に置換されたC2-12アルキニル、任意に置換されたN-保護アミノ、アジド、N-マレイミド、S-保護チオール、
【化１０１】
2020512843.tif 000110
もしくはこれらのN-保護バージョン、
【化１０２】
2020512843.tif 000111
、環内炭素-炭素三重結合を含有する任意に置換されたC6-16ヘテロシクリル(例えば、
【化１０３】
2020512843.tif 000112
)、1,2,4,5-テトラジン基(例えば、
【化１０４】
2020512843.tif 000113
)、任意に置換されたC8-16シクロアルキニル(例えば、
【化１０５】
2020512843.tif 000114
)、-NHRN1、任意に置換されたC4-8歪みシクロアルケニル(例えば、trans-シクロオクテニルもしくはノルボルネニル)、又は-COOR12もしくは-CHOを含有する任意に置換されたC1-16アルキルを挙げることができ;
ここで、
RN1は、H、N-保護基、又は任意に置換されたC1-6アルキルであり;
各々のR12は、独立に、H、任意に置換されたC1-6アルキル、又はO-保護基(例えば、カルボキシル保護基)であり;かつ
R13は、ハロゲン(例えば、F)である。
【０５２９】
相補的反応基は、コンジュゲーション反応まで保護されていてもよい。例えば、保護される相補的反応基としては、-COORPGO又は-NHRPGNを挙げることができ、ここで、RPGOはO-保護基(例えば、カルボキシル保護基)であり、RPGNはN-保護基である。
【０５３０】
いくつかの実施態様において、相補的反応基は、基-Z3-QA3であり、
ここで、
Z3は、二価、三価、四価、又は五価基であり、ここで、該原子価のうちの1つはQA3で置換されており、該原子価のうちの1つは空いており、かつ残りの原子価の各々は、存在する場合、独立に、補助部分で置換されており;
QA3は、任意に置換されたC2-12アルキニル、任意に置換されたN-保護アミノ、アジド、N-マレイミド、S-保護チオール、
【化１０６】
2020512843.tif 000115
もしくはこれらのN-保護バージョン、
【化１０７】
2020512843.tif 000116
、環内炭素-炭素三重結合を含有する任意に置換されたC6-16ヘテロシクリル(例えば、
【化１０８】
2020512843.tif 000117
)、1,2,4,5-テトラジン基(例えば、
【化１０９】
2020512843.tif 000118
)、任意に置換されたC8-16シクロアルキニル(例えば、
【化１１０】
2020512843.tif 000119
)、-NHRN1、任意に置換されたC4-8歪みシクロアルケニル(例えば、trans-シクロオクテニルもしくはノルボルネニル)、又は-COOR12もしくは-CHOを含有する任意に置換されたC1-16アルキルであり;
ここで、
RN1は、H、N-保護基、又は任意に置換されたC1-6アルキルであり;
各々のR12は、独立に、H、任意に置換されたC1-6アルキル、又はO-保護基(例えば、カルボキシル保護基)であり;かつ
R13は、ハロゲン(例えば、F)である。
【０５３１】
ある実施態様において、Z3は、分岐基及び2つの二価セグメントからなり、ここで、該分岐基は、該2つの二価セグメントの各々に結合しており、
ここで、
該二価セグメントのうちの1つは、空いた原子価を有し、残りの二価セグメントは、QA3に結合しており;かつ
該分岐基は、任意に置換されたC1-12アルカン-トリイル、任意に置換されたC1-12アルカン-テトライル、任意に置換されたC2-12ヘテロアルカン-トリイル、及び任意に置換されたC2-12ヘテロアルカン-テトライルからなる群から独立に選択される1又は2つのモノマーからなり、ここで、該分岐基の2つの原子価は、該2つの二価セグメントに結合しており、残りの原子価の各々は、独立に、補助部分で置換されている。
【０５３２】
Z3中の二価セグメントは、-(-QB-QC-QD-)s1-であってもよく、
ここで、
各々のs1は、独立に、1〜50(例えば、1〜30)の整数であり;
各々のQB及び各々のQDは、独立に、非存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-、又は-OCH2-であり;かつ
各々のQCは、独立に、非存在、任意に置換されたC1-12アルキレン、任意に置換されたC2-12アルケニレン、任意に置換されたC2-12アルキニレン、任意に置換されたC2-12ヘテロアルキレン、又は任意に置換されたC1-9ヘテロシクリレンである。
【０５３３】
さらなる実施態様において、QB及びQDのうちの少なくとも1つは、Z3の各々のモノマー単位中に存在する。
【０５３４】
またさらなる実施態様において、-Z3-QA3は、
-(-QB-QC-QD-)s1-QE-(-QB-QC-QD-)s1-QA3, (Vb)
であり、
ここで、
各々のs1は、独立に、1〜50(例えば、1〜30)の整数であり;
QA3は、本明細書に記載されている通りであり;
各々のQB及び各々のQDは、独立に、非存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-OC(O)-、-COO-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-、又は-OCH2-であり;かつ
各々のQCは、独立に、非存在、任意に置換されたC1-12アルキレン、任意に置換されたC2-12アルケニレン、任意に置換されたC2-12アルキニレン、任意に置換されたC2-12ヘテロアルキレン、又は任意に置換されたC1-9ヘテロシクリレンであり;かつ
QEは、非存在又は本明細書に記載されている式(IV)の分岐基である。
【０５３５】
ある実施態様において、各々のQB及び各々のQDは、独立に、非存在、-CO-、-NH-、-O-、-S-、-SO2-、-NHC(O)-、-C(O)NH-、-CH2-、-CH2NH-、-NHCH2-、-CH2O-、又は-OCH2-である。
【０５３６】
いくつかの実施態様において、-(-QB-QC-QD-)s1-が組み合わさって、基:
-QB-(CH2)g1-(CH2OCH2)g2-(CH2)g3-QD-
を形成し、
ここで、
(i)g2は、1〜50(例えば、1〜40又は1〜30)の整数であり;
(ii)g1は1であり、かつQBは、-NHCO-、-CONH-、もしくは-O-であるか;又はg1は0であり、かつQDは-NHCO-であり;かつ
(iii)g3は1であり、かつQBは、-NHCO-、-CONH-、もしくは-O-であるか;又はg3は0であり、かつQDは-CONH-である。
【０５３７】
さらなる実施態様において、相補的反応基は:
【化１１１】
2020512843.tif 000120
であり、
ここで、
QA2は、非存在、独立に任意に置換されたC2-12ヘテロアルキレン(例えば、-C(O)-N(H)-、-N(H)-C(O)-、-S(O)2-N(H)-、もしくは-N(H)-S(O)2-)を含有するヘテロアルキレン、任意に置換されたC1-12チオヘテロシクリレン(例えば、
【化１１２】
2020512843.tif 000121
)、任意に置換されたC1-12ヘテロシクリレン(例えば、1,2,3-トリアゾール-1,4-ジイルもしくは
【化１１３】
2020512843.tif 000122
)、シクロブタ-3-エン-1,2-ジオン-3,4-ジイル、ピリド-2-イルヒドラゾン、任意に置換されたC6-16トリアゾロヘテロシクリレン(例えば、
【化１１４】
2020512843.tif 000123
)、任意に置換されたC8-16トリアゾロシクロアルケニレン(例えば、
【化１１５】
2020512843.tif 000124
)、又はジヒドロピリダジン基(例えば、
【化１１６】
2020512843.tif 000125
)であり;
QA3は、任意に置換されたC2-12アルキニル、任意に置換されたN-保護アミノ、アジド、N-マレイミド、S-保護チオール、
【化１１７】
2020512843.tif 000126
もしくはこれらのN-保護バージョン、
【化１１８】
2020512843.tif 000127
、環内炭素-炭素三重結合を含有する任意に置換されたC6-16ヘテロシクリル(例えば、
【化１１９】
2020512843.tif 000128
)、1,2,4,5-テトラジン基(例えば、
【化１２０】
2020512843.tif 000129
)、又は任意に置換されたC8-16シクロアルキニル(例えば、
【化１２１】
2020512843.tif 000130
)、-NHRN1、任意に置換されたC4-8歪みシクロアルケニル(例えば、trans-シクロオクテニルもしくはノルボルネニル)、又は-COOR12もしくは-CHOを含有する任意に置換されたC1-16アルキルであり;
RN1は、H、N-保護基、又は任意に置換されたC1-6アルキルであり;
各々のR12は、独立に、H又は任意に置換されたC1-6アルキルであり;
R13は、ハロゲン(例えば、F)であり;
RTは、標的化部分との結合であり;
QTは、-CO-、-NH-、-NH-CH2-、又は-CO-CH2-であり;
X1、X3、及びX5の各々は、独立に、非存在、-O-、-NH-、-CH2-NH-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-NH-C(O)-O-、-CH2-NH-C(O)-NH-、-CH2-O-C(O)-NH-、又は-CH2-NH-C(O)-O-であり;
X2及びX4の各々は、独立に、非存在、-O-、-NH-、-C(O)-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、又は-NH-C(O)-O-であり;
x2は、0〜50(例えば、1〜40又は1〜30)の整数であり;
x3は、1〜11の整数であり;かつ
各々のx5は、独立に、0又は1であり;かつ
各々のx6は、独立に、0〜10(例えば、1〜6)の整数であり、ただし、両方のx6の和は、12以下である。
【０５３８】
またさらなる実施態様において、該相補的反応基は:
【化１２２】
2020512843.tif 000131
2020512843.tif 000132
であり、
ここで、
QA3は、任意に置換されたC2-12アルキニル、任意に置換されたN-保護アミノ、アジド、N-マレイミド、S-保護チオール、
【化１２３】
2020512843.tif 000133
もしくはこれらのN-保護バージョン、
【化１２４】
2020512843.tif 000134
、環内炭素-炭素三重結合を含有する任意に置換されたC6-16ヘテロシクリル(例えば、
【化１２５】
2020512843.tif 000135
)、1,2,4,5-テトラジン基(例えば、
【化１２６】
2020512843.tif 000136
)、又は任意に置換されたC8-16シクロアルキニル(例えば、
【化１２７】
2020512843.tif 000137
)、-NHRN1、任意に置換されたC4-8歪みシクロアルケニル(例えば、trans-シクロオクテニルもしくはノルボルネニル)、又は-COOR12もしくは-CHOを含有する任意に置換されたC1-16アルキルであり;
各々のRM1は、独立に、H又は補助部分であり;
RN1は、H、N-保護基、又は任意に置換されたC1-6アルキルであり;
各々のR12は、H又は任意に置換されたC1-6アルキルであり;
R13は、ハロゲン(例えば、F)であり;
QTは、-CO-、-NH-、-NH-CH2-、又は-CO-CH2-であり;
RTは、標的化部分との結合であり;
q5及びq6の各々は、独立に、1〜10(例えば、1〜6)の整数であり;
q7は、0又は1であり;
q8は、0〜50(例えば、1〜40又は1〜30)の整数であり;かつ
q9は、1〜10の整数である。
【０５３９】
またさらなる実施態様において、該相補的反応基は:
【化１２８】
2020512843.tif 000138
2020512843.tif 000139
であり、
ここで、
各々のRM1は、独立に、H又は補助部分であり;
QTは、-CO-、-NH-、-NH-CH2-、又は-CO-CH2-であり;
RTは、標的化部分との結合であり;
q5及びq6の各々は、独立に、1〜10(例えば、1〜6)の整数であり;
q7は、0又は1であり;
q8は、0〜50(例えば、1〜40又は1〜30)の整数であり;かつ
q9は、1〜10の整数である。
【０５４０】
(固体支持体)
本明細書に開示される免疫調節ポリヌクレオチドは、固体支持体に結合していてもよい。該ポリヌクレオチドとともに使用し得る切断可能な固体支持体は、当技術分野で公知である。該固体支持体の非限定的な例としては、例えば、当技術分野で公知の切断可能なリンカー(例えば、スクシネート系リンカー)(例えば、UNYLINKER(商標))を介して鎖に結合している制御された多孔質ガラス又はマクロ多孔質ポリスチレンが挙げられる。
【０５４１】
(方法)
本発明のコンジュゲートは、APCタイプの表面受容体を認識する標的化部分を使用することにより、プロフェッショナルAPC(例えば、B細胞、pDC、又はマクロファージ)への免疫調節ポリヌクレオチドの選択的送達に使用することもできる。理論によって束縛されるものではないが、本発明のコンジュゲートを(例えば、能動輸送によって)1以上のエンドソーム性toll様受容体(例えば、TLR9)を発現するプロフェッショナルAPC(例えば、B細胞、pDC、又はマクロファージ)のエンドソームに輸送することができると考えられている。したがって、エンドソームに送達される免疫刺激ポリヌクレオチドは、エンドソーム性toll様受容体(例えば、TLR9)を刺激することができる。同様に、エンドソームに送達される免疫抑制ポリヌクレオチドは、エンドソーム性toll様受容体(例えば、TLR9)を抑制することができる。
【０５４２】
(サイトカイン誘導)
エンドソーム性toll様受容体は、本発明の免疫刺激ポリヌクレオチド(例えば、本発明のコンジュゲート中に提供されるもの)を用いて刺激して、APCでサイトカインを誘導することができる。例えば、B細胞でTLR9を刺激すると、炎症性サイトカイン(例えば、IL-6及びIL-10)のNFκB媒介性分泌の活性化がもたらすことができるのに対し、pDC又はマクロファージでTLR9を刺激すると、I型インターフェロン(例えば、IFNα又はIFNβ)を誘導することができる。APCでのサイトカインの誘導は、当技術分野で公知の方法を用いて決定することができる。例えば、APCで誘導されたサイトカインのレベルは、該細胞を本発明の免疫刺激ポリヌクレオチド又はコンジュゲートと接触させた後よりも(例えば、参照細胞、例えば、本発明の免疫刺激ポリヌクレオチド又はコンジュゲートが参照細胞に送達されなかったという点で被験細胞とは異なる参照細胞と比較した場合)高い(例えば、少なくとも1％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、又は少なくとも50％高い)ものであることができる。
【０５４３】
(液性(血液)及び固形腫瘍の治療)
本発明の免疫刺激ポリヌクレオチド及び/又はコンジュゲートは、液性(例えば、血液)又は固形腫瘍を治療する方法において使用し得る。理論によって束縛されることを望むものではないが、本明細書に記載されている通りに、TLR9を刺激し、サイトカインを誘導すると、液性又は固形腫瘍に対する自然又は適応免疫応答を刺激し得ると考えられている。通常、TLR9を刺激することは、健常なB細胞に対する増殖促進効果を有する。対照的に、TLR9アゴニストである免疫刺激ポリヌクレオチドは、Bリンパ腫細胞に対する抗増殖効果を示す。TLR9アゴニストである免疫刺激ポリヌクレオチドの抗増殖効果は、Bリンパ腫細胞への送達を必要としない。それよりも、Bリンパ腫細胞に対する抗増殖効果は、免疫刺激ポリヌクレオチドを別のAPC(例えば、健常なAPC)に送達することにより誘導することができる。理論によって束縛されることを望むものではないが、本発明の免疫刺激ポリヌクレオチドは、APC(例えば、健常なAPC)で1以上のサイトカインを誘導することができ、1種以上の誘導されたサイトカインはBリンパ腫細胞に輸送されて、抗増殖効果を誘導することができると考えられている。したがって、B細胞を標的とする本発明のコンジュゲート及び本発明の免疫刺激ポリヌクレオチドは、液性腫瘍、例えば、非ホジキンB細胞リンパ腫の治療において有用であり得る。本発明の免疫刺激ポリヌクレオチド及びそのコンジュゲートを用いて治療し得るリンパ腫の非限定的な例は、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、及び多発性骨髄腫である。pDC及びマクロファージでTLR9を刺激すると、I型インターフェロン(例えば、IFNα又はIFNβ)を誘導し、かつNK細胞を活性化することができ、これにより、腫瘍細胞(例えば、固形腫瘍細胞)を死滅させることができる。したがって、本発明の免疫刺激ポリヌクレオチド又はコンジュゲートによって刺激される自然免疫応答は、腫瘍細胞の分解をもたらすことができる。その後、腫瘍細胞分解産物、すなわち、腫瘍関連抗原は、pDCによって動員されて、残存する腫瘍細胞に対するCD8+ T細胞をプライミングし、それにより、固形腫瘍に対する適応免疫応答を刺激することができる。
【０５４４】
本発明のコンジュゲートは、インビボでの免疫刺激ポリヌクレオチドの不均一な組織分布の問題に対処することができる。したがって、本発明のコンジュゲートは、患者に、全身性に又は標的とされる作用部位から離れている部位で投与することができる。
【０５４５】
Toll様受容体(TLR)シグナル伝達は、自然免疫と適応免疫を橋渡しするものとして作用する。Toll様受容体アゴニストは、疾患細胞(例えば、癌細胞又は病原体感染細胞)に対する免疫応答を誘導することができ、したがって、そのような疾患を予防又は治療するための治療剤としての役割を果たすことができる。したがって、ある態様において、本明細書に提供されるのは、toll様受容体(TLR)アゴニストを用いて、疾患を予防又は治療する方法である。そのような方法は、それを必要としている対象に、TLRを活性化することができる治療剤を投与することを含み、ここで、TLRアゴニストを投与したとき、治療されている疾患に対する免疫応答が該対象において誘導される。ある実施態様において、該疾患は、癌などの腫瘍性疾患及びウイルス感染などの感染性疾患から選択される。
【０５４６】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、癌を有する対象における癌を治療する方法であって、該対象に、TLRアゴニストの治療有効量を投与することを含む、方法である。本明細書に記載されているように、様々な実施態様において、本方法で治療するのに成功し得る癌の種類としては、原発性癌、二次性癌、再発癌、及び不応性癌が挙げられる。さらに本明細書に記載されているように、様々な実施態様において、本方法で治療するのに成功し得る癌の種類としては、固形腫瘍及び液性腫瘍が挙げられる。癌の治療の成功は、例えば、癌の生存、癌の退縮(例えば、腫瘍サイズの縮小)、治療によって生じる癌のない表現型(すなわち、患者において癌細胞が検出されないこと)を含む、癌の部分寛解又は完全寛解によって示される臨床基準に基づいて、責任ある医師によって決定されることができる。
【０５４７】
したがって、いくつかの実施態様において、癌を予防又は治療する方法は、それを必要としている対象に、TLR1アゴニスト、TLR2アゴニスト、TLR3アゴニスト、TLR4アゴニスト、TLR5アゴニスト、TLR6アゴニスト、TLR7アゴニスト、TLR8アゴニスト、TLR9アゴニスト、及びTLR10アゴニストから選択される1種以上のTLRアゴニストの治療有効量を投与することを含む。本開示で使用されているTLRアゴニストの非限定的な例としては、TLR1/2アゴニストであるPam3Cys; TLR2アゴニストであるCFA; TLR2アゴニストであるMALP2; TLR2アゴニストであるPam2Cys; TLR-2アゴニストであるFSL-I; TLR-2アゴニストであるHib-OMPC; TLR3アゴニストであるポリリボシン酸(polyribosinic):ポリリボシチジン酸(polyribocytidic)(ポリl:C); TLR3アゴニストであるポリアデノシン-ポリウリジル酸(ポリAU); TLR3アゴニストである、ポリ-L-リジン及びカルボキシメチルセルロースで安定化されたポリイノシン酸-ポリシチジン酸(Hiltonol); TLR4アゴニストである細菌LPS、TLR5アゴニストである細菌フラジェリン; TLR7アゴニストであるイミキモド; TLR7/8アゴニストであるレシキモド; TLR7/8アゴニストであるロキソリビン;並びにTLR9アゴニストである非メチル化CpG ODNが挙げられるが、これらに限定されない。当技術分野で公知の及び本開示で使用されているさらなるTLRアゴニストとしてはさらに、免疫された動物でサイトカイン産生を刺激し、マクロファージを活性化し、自然免疫応答を促進し、かつ抗体産生を強化するためのワクチンアジュバント及び免疫刺激剤として有用であることが知られている、TLR4受容体に結合するアミノアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５４８】
当技術分野で公知の及び本開示で使用されているさらなるTLRアゴニストとしてはさらに、他の病原体関連分子パターン(PAMP)及び損傷関連分子パターン(DAMP)が挙げられる(P. D'Arpa及びK. Leungの文献、上記)。PAMPの例としては、リポタンパク質、リポポリペプチド、ペプチドグリカン、ザイモサン、リポ多糖、ナイセリアのポーリン、フラジェリン、プロフィリン、ガラクトセラミド、ムラミルジペプチドが挙げられる。ペプチドグリカン、リポタンパク質、及びリポタイコ酸は、グラム陽性菌の細胞壁成分である。リポ多糖は、ほとんどの細菌によって発現され、MPLが1つの例である。フラジェリンは、病原性細菌及び片利共生細菌によって分泌される細菌鞭毛の構造的成分を指す。rt.-ガラクトシルセラミド(rt.-GalCer)は、ナチュラルキラーT(NKT)細胞のアクチベーターである。ムラミルジペプチドは、全ての細菌に共通の生体活性ペプチドグリカンモチーフである。DAMPの例としては、分泌型リソソームを含む非古典的分泌機構を通じて分泌されるタンパク質、例えば、高移動度群ボックス(HMGB)1及びガレクチン-3;並びにネクローシスを起こした細胞によって放出される分子、例えば、S100タンパク質、HMGB1、IL-1a、ガレクチン-3、HSP60、HSP70、HSP72、ヒストン、及び核酸;並びに細胞外マトリックス分子、例えば、ヒアルロナン、ヘパリン(heparin)硫酸、フィブロネクチン、及び分解されたマトリックス構成成分が挙げられる。
【０５４９】
CpGを含有するオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)は、TLR9のアゴニストであり、かつ腫瘍に対する自然免疫と適応免疫の両方を活性化する。本明細書に記載されているように、天然に存在するCpG ODNと合成されたCpG含有ポリヌクレオチドの両方を含む、免疫刺激ポリヌクレオチドは、癌を予防又は治療するための治療剤として想定される。
【０５５０】
したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、癌を有する対象における癌を治療するための方法であって、CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドの治療有効量を該対象に投与することを含む、方法である。いくつかの実施態様において、癌を治療するための上記の方法において投与されるCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、投与したときに、TLR媒介性シグナル伝達経路を活性化することができる。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、天然に存在する。天然に存在するCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドの例としては、限定されないが、細菌又はウイルス起源のCpG ODNが挙げられる。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、人工的に合成されている。いくつかの実施態様において、合成されたCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、その天然の対応物と同じ配列を有する。いくつかの実施態様において、合成されたCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドの配列は、天然に存在するCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドと異なっている。いくつかの実施態様において、CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、通常は核酸に見られない1以上の化学的実体を含有するように化学的に修飾されている。
【０５５１】
いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、本開示の表2に掲載されている免疫刺激ポリペプチドのうちの1つである。いくつかの実施態様において、該CpG含有ポリヌクレオチドは、p236、p238、p243、p246、p275、p276、p308、p313、p347、p361、p362、p425、p433、p434、p435、p436、p437、p438、p477、p478、p479、p480、p481、p482、p483、p484、p485、p486、p487、p488、及びp489から選択される。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp236である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp238である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp238である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp243である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp246である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp275である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp276である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp308である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは313である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp347である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp361である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp362である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp425である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp433である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp434である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp435である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp436である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp437である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp438である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp477である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp478である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp479である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp480である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp481である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp482である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp483である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp484である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp485である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp486である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp487である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp488である。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドはp489である。
【０５５２】
本明細書に提供されているように、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、自立型であるか、又はより大きい分子もしくは複合体の一部を形成することができる。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、共有結合的に又は非共有結合的に、抗原又はその抗原性断片にコンジュゲートされていない。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、正常免疫細胞によってコードされ、発現される抗原又はその抗原性断片にコンジュゲートされていない。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、T細胞抗原又はそのエピトープにコンジュゲートされていない。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、オボアルブミン(OVA)又はそのエピトープにコンジュゲートされていない。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、日本スギ花粉アレルゲンCryj2のT細胞エピトープペプチドにコンジュゲートされていない。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、腫瘍関連抗原にコンジュゲートされていない。
【０５５３】
特定の実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、対象に投与したときの特定の器官、組織、細胞、及び/又は細胞コンパートメントへの標的送達のための標的化部分にコンジュゲートされている。いくつかの実施態様において、該標的化部分は、抗体又はその抗原結合断片である。いくつかの実施態様において、該標的化部分は、本明細書に記載される化学的部分を含む。
【０５５４】
いくつかの実施態様において、該標的化部分は、他の非標的細胞よりも標的細胞又は標的細胞集団への該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドの到達を特異的に促進する。該標的送達は、当技術分野で公知の方法を用いて、例えば、標的細胞又は標的細胞集団における該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドの細胞濃度を測定し、それを非標的細胞又は標的細胞集団における該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドの細胞濃度と比較して検出することができる。例えば、細胞マーカーを用いて、特定の細胞集団を同定し、純化することができる。該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドの標的送達を検出し、測定するための他の方法は当業者に公知であり、本開示の範囲内に含まれる。
【０５５５】
いくつかの実施態様において、該標的化部分は、非標的細胞又は標的細胞集団よりも少なくとも2倍多くのCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドを標的細胞又は標的細胞集団に送達する。いくつかの実施態様において、該標的化部分は、非標的細胞又は標的細胞集団に対してよりも少なくとも5倍多くのCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドを標的細胞又は標的細胞集団に対して送達する。いくつかの実施態様において、該標的化部分は、非標的細胞又は標的細胞集団に対してよりも少なくとも10倍多くのCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドを標的細胞又は標的細胞集団に対して送達する。いくつかの実施態様において、該標的化部分は、非標的細胞又は標的細胞集団に対してよりも少なくとも20倍多くのCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドを標的細胞又は標的細胞集団に対して送達する。いくつかの実施態様において、該標的化部分は、非標的細胞又は標的細胞集団に対してよりも少なくとも30倍多くのCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドを標的細胞又は標的細胞集団に対して送達する。いくつかの実施態様において、該標的化部分は、非標的細胞又は標的細胞集団に対してよりも少なくとも40倍多くのCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドを標的細胞又は標的細胞集団に対して送達する。いくつかの実施態様において、該標的化部分は、非標的細胞又は標的細胞集団に対してよりも少なくとも50倍多くのCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドを標的細胞又は標的細胞集団に対して送達する。いくつかの実施態様において、該標的化部分は、非標的細胞又は標的細胞集団に対してよりも少なくとも100倍多くのCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドを標的細胞又は標的細胞集団に対して送達する。いくつかの実施態様において、該標的化部分は、非標的細胞又は標的細胞集団に対してよりも100倍を超えて多くのCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドを標的細胞又は標的細胞集団に対して送達する。
【０５５６】
いくつかの実施態様において、該標的化部分は、標的細胞の付近、表面、及び/又は内部に位置する受容部分に特異的に結合することにより、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。いくつかの実施態様において、該標的化部分は、抗体又はその抗原結合断片であり、該受容部分は、標的細胞によって産生される抗原又はその抗原断片である。いくつかの実施態様において、該受容部分は、細胞表面抗原である。いくつかの実施態様において、該受容部分は、該標的細胞の細胞質ゾル内に位置する。いくつかの実施態様において、該受容部分は、該標的細胞細胞内小器官、例えば、エンドソーム又はファゴソームと関連している。いくつかの実施態様において、該標的化部分に結合すると、該標的細胞は、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドを内在化する。いくつかの実施態様において、該受容部分は、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドの内在化を促進する。いくつかの実施態様において、該標的細胞は、内在化されたCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドを、細胞内コンパートメント、例えば、エンドソーム又はファゴソームにさらに輸送する。いくつかの実施態様において、該受容部分は、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドの輸送を促進する。
【０５５７】
癌を治療する方法のいくつかの実施態様において、該標的細胞は、少なくとも1つのtoll様受容体、例えば、TLR7及び/又はTLR9を発現する。いくつかの実施態様において、該標的細胞は、正常免疫細胞、例えば、抗原提示細胞(APC)である。いくつかの実施態様において、該標的細胞は、癌細胞、例えば、B細胞リンパ腫細胞である。いくつかの実施態様において、該受容部分は、toll様受容体と同じ細胞膜上に位置する。いくつかの実施態様において、該受容部分とtoll様受容体は両方とも該標的細胞の細胞膜上に位置する。いくつかの実施態様において、該受容部分とtoll様受容体は両方とも、該標的細胞のエンドソーム膜又はファゴソーム膜上に位置する。いくつかの実施態様において、該標的化部分と該受容部分との結合は、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドと該標的細胞によって発現されるTLR9受容体との結合を促進する。
【０５５８】
いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、CpG-Ab免疫コンジュゲートを形成するように、抗体又はその抗原結合断片にコンジュゲートされている。いくつかの実施態様において、該コンジュゲーションは、共有結合的連結を介するもの、例えば、本明細書に提供される化学的リンカー分子を介するものである。他の実施態様において、該コンジュゲーションは、非共有結合的連結を介するもの、例えば、リガンドとその受容体の結合相互作用を介するものである。本開示に関して使用することができる非共有結合的連結の他の例としては、静電気的相互作用(例えば、TAT又はスペルミン又はプロタミン複合体)及びビオチン-アビジン/ストレプトアビジン相互作用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５５９】
いくつかの実施態様において、該抗体は、抗CD20抗体、抗CD22抗体、抗CD30抗体、抗CD37抗体、抗CD38抗体、抗CD40抗体、抗CD74抗体、抗CD79b抗体、抗CD205抗体、抗CD274抗体、抗CD303抗体、抗CD304抗体、抗CD19抗体、抗CD1抗体、抗CD2抗体、抗CD3抗体、抗CD5抗体、抗CD6抗体、抗CD9抗体、抗CD11抗体、抗CD18抗体、抗CD21抗体、抗CD23抗体、抗CD24抗体、抗CD25抗体、抗CD26抗体、抗CD44抗体、抗CD45R抗体、抗CD49抗体、抗CD66(癌胎児性抗原、CEA)抗体、抗CD93抗体、抗CD52抗体、抗CD56抗体、抗CD123抗体、抗CD138抗体、抗CD163抗体、抗CD206抗体から選択される。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD20抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD22抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD30抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD38抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD40抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD74抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD76b抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD205抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD274抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD303抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD304抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD19抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD1抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD2抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD3抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD5抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD6抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD9抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD11抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD18抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD21抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD23抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD24抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD25抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD26抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗304抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD44抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD45R抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD49抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD66(癌胎児性抗原、CEA)抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD93抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD52抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD56抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD123抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD138抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD163抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は抗CD206抗体である。
いくつかの実施態様において、該抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は、ヒト抗体である。いくつかの実施態様において、該抗体は、ヒト化抗体である。
【０５６０】
いくつかの実施態様において、該CpG-Abコンジュゲートは、本開示の表6-A又は6-Bに掲載されている免疫コンジュゲートのうちの1つである。いくつかの実施態様において、該CpG-Abコンジュゲートは、表6-A及び6-Bに示されているSB-342、SB-343、SB-341、SB-340、SB-179、SB-181、SB-186、SB-189、SB-228、SB-229、SB-242、SB-263、SB-337、SB-267、SB-284、SB-312、SB-313、SB-347、SB-373、SB-382、SB-388、SB-389、SB-408、SB-416、SB-419、SB-421、SB-423、SB-426、SB-427、SB-428、SB-429、及びSB-430から選択される。
【０５６１】
該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、1以上のCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチド及び1以上の抗体又はその抗原結合断片を含むことができる。該免疫コンジュゲート中の抗体又はその抗原結合断片とCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドの分子比(Ab:CpG比)は、1:1〜1:100の範囲に及ぶことができる。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートのAb:CpG比は、1:1である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートのAb:CpG比は、1:2である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートのAb:CpG比は、1:3である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートのAb:CpG比は、1:4である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートのAb:CpG比は、1:5である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートのAb:CpG比は、1:6である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートのAb:CpG比は、1:7である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートのAb:CpG比は、1:8である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートのAb:CpG比は、1:9である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートのAb:CpG比は、1:10である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートのAb:CpG比は、1:15である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートのAb:CpG比は、1:20である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートのAb:CpG比は、1:30である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートのAb:CpG比は、1:40である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートのAb:CpG比は、1:50である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートのAb:CpG比は、1:60である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートのAb:CpG比は、1:70である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートのAb:CpG比は、1:80である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートのAb:CpG比は、1:90である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートのAb:CpG比は、1:100である。
【０５６２】
いくつかの実施態様において、癌を治療する方法は、癌を有する対象に、CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を投与することを含み、ここで、該対象に投与したとき、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、正常免疫細胞を標的とする。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、肥満細胞、マクロファージ、抗原提示細胞(APC)、好塩基球、及び好酸球から選択される1以上のタイプの正常細胞を標的とする。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、正常APCを標的とする。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、B細胞、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、アストロサイト、線維芽細胞、及びオリゴデンドロサイトから選択される1以上のタイプの正常APCを標的とする。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、正常B細胞を標的とする。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、正常樹状細胞を標的とする。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、正常マクロファージを標的とする。いくつかの実施態様において、1以上のタイプの正常細胞を標的とするCpG-Ab免疫コンジュゲートは、異常細胞、例えば、癌細胞を標的としない。
【０５６３】
いくつかの実施態様において、癌を治療する方法は、癌を有する対象に、CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を投与することを含み、ここで、該対象に投与したとき、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、少なくとも1つのtoll様受容体を発現する細胞を標的とする。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、TLR9を発現する細胞を標的とする。いくつかの実施態様において、該CpG-免疫コンジュゲートは、TLR7を発現する細胞を標的とする。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、樹状細胞(DC)、B細胞、T細胞、ランゲルハンス細胞、ケラチノサイト、肥満細胞、内皮細胞、筋線維芽細胞、及び初代線維芽細胞から選択されるTLR発現細胞を標的とする。
【０５６４】
いくつかの実施態様において、癌を治療する方法は、癌を有する対象に、CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を投与することを含み、ここで、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、治療されている癌の異常細胞を標的とする。いくつかの実施態様において、そのような異常細胞は、癌細胞である。いくつかの実施態様において、そのような異常細胞は、治療されている腫瘍の間質細胞である。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、B細胞癌、例えば、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、例えば、アルファ鎖病、ガンマ鎖病、及びミュー鎖病などの重鎖病、単クローン性ガンマグロブリン血症、及び免疫球性アミロイドーシス、メラノーマ、乳癌、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳又は中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸癌、子宮又は子宮内膜癌、口腔又は咽頭の癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸又は虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織の癌などから選択される1以上のタイプの癌細胞を標的とする。本発明によって包含される方法に適当可能な癌のタイプの他の非限定的な例としては、ヒト肉腫及び癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、肝臓癌、絨毛腫、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、骨癌、脳腫瘍、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、網膜芽腫;白血病、例えば、急性リンパ球性白血病並びに急性骨髄球性白血病(骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、及び赤白血病);慢性白血病(慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病及び慢性リンパ球性白血病);並びに真性多血症、リンパ腫(ホジキン病及び非ホジキン病)、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、並びに重鎖病が挙げられる。いくつかの実施態様において、癌は、上皮性であり、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、婦人科癌、腎臓癌、喉頭癌、肺癌、口腔癌、頭頸部癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、又は皮膚癌を含むが、これらに限定されない。他の実施態様において、癌は、乳癌、前立腺癌、肺癌、又は結腸癌である。さらに他の実施態様において、上皮癌は、非小細胞肺癌、非乳頭型腎細胞癌、子宮頸癌、卵巣癌(例えば、漿液性卵巣癌)、又は乳癌である。上皮癌は、限定されないが、漿液性、子宮内膜性、粘液性、明細胞性、ブレンナー型、又は未分化型を含む、様々な他の様式で特徴付けることができる。
【０５６５】
いくつかの実施態様において、癌を治療する方法は、癌を有する対象に、CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を投与することを含み、ここで、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、治療されている癌の異常細胞を標的とし、かつT細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、肥満細胞、マクロファージ、抗原提示細胞(APC)、好塩基球、及び好酸球から選択される正常免疫細胞も標的とする。いくつかの実施態様において、治療されている癌の異常細胞を標的とするCpG-Ab免疫コンジュゲートは、B細胞、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、アストロサイト、線維芽細胞、及びオリゴデンドロサイトから選択される正常APCも標的とする。いくつかの実施態様において、治療されている癌の異常細胞を標的とするCpG-Ab免疫コンジュゲートは、樹状細胞(DC)、B細胞、T細胞、ランゲルハンス細胞、ケラチノサイト、肥満細胞、内皮細胞、筋線維芽細胞、及び初代線維芽細胞から選択されるTLR受容体を発現する細胞も標的とする。特定の実施態様において、そのような異常細胞は、癌性免疫細胞である。特定の実施態様において、そのような異常細胞は、リンパ腫細胞又は白血病細胞である。特定の実施態様において、そのような異常細胞は、B細胞リンパ腫細胞であり、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、対象のB細胞リンパ腫細胞と正常B細胞の両方を標的とする。
【０５６６】
いくつかの実施態様において、癌を治療する方法は、癌を有する対象に、CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を投与することを含み、ここで、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、標的細胞に到達したときに、TLR9媒介性シグナル伝達経路を活性化する。そのような活性化は、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドと、該標的細胞の表面又は細胞質ゾル内に発現されるTLR9受容体との結合を介するものであることができる。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートによって標的とされる細胞は、該CpG-Ab免疫コンジュゲートを内在化することができる。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートによって標的とされる細胞は、該免疫コンジュゲートの該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチド部分を内在化することができる。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートによって標的とされる細胞は、内在化されたCpG-Ab免疫コンジュゲート又はそのCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチド部分を、TLR受容体を発現した細胞内小器官に輸送することができる。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートによって標的とされる細胞は、内在化されたCpG-Ab免疫コンジュゲート又はそのCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチド部分を細胞のエンドソーム又はファゴソームに輸送することができる。
【０５６７】
いくつかの実施態様において、癌を治療する方法は、癌を有する対象に、CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を投与することを含み、ここで、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、標的細胞と関連する抗原に特異的に結合することができる。本明細書に記載されているように、標的細胞と関連する抗原は、標的細胞の表面及び/又は細胞質ゾル内に見出すことができる。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、標的細胞の表面に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施態様において、CpG-Ab免疫コンジュゲートは、標的細胞の細胞質ゾル内に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施態様において、CpG-Ab免疫コンジュゲートは、標的細胞の細胞内コンパートメント又は細胞内小器官の膜に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施態様において、CpG-Ab免疫コンジュゲートは、標的細胞のエンドソーム膜又はファゴソーム膜に存在する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートによる結合により、該標的抗原は、標的細胞への該CpG-Ab免疫コンジュゲート又は該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドの内在化を促進する。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートによる結合により、該標的抗原は、標的細胞のエンドソームへの該CpG-Ab免疫コンジュゲート又は該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドの輸送を促進する。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートによる結合により、該標的抗原は、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドと標的細胞によって発現されるTLR9との結合を促進する。
【０５６８】
いくつかの実施態様において、標的細胞と関連する抗原は、該標的細胞によってコードされ、発現されるタンパク質である。それらの実施態様において、該タンパク質抗原は、標的細胞の内在性遺伝子によってコードされる(例えば、標的細胞ゲノムによってコードされる)か、又は外因性遺伝子によってコードされる(例えば、標的細胞に人為的に導入された遺伝子によってコードされる)ことができる。他の実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートの標的抗原は、標的細胞によってコードされることも発現されることもない。いくつかの実施態様において、標的細胞と関連する抗原は、該標的細胞によって取り込まれる外因性抗原(例えば、APCによってエンドサイトーシスされ、プロセシングされる抗原)である。
【０５６９】
非限定的な例として、いくつかの実施態様において、正常免疫細胞を標的とするために、該CpG-Ab免疫コンジュゲートの標的抗原は、正常免疫細胞によってコードされ、発現される(例えば、B細胞抗原)。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートの標的抗原は、正常免疫細胞の内在性遺伝子によってコードされる。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートの標的抗原は、正常免疫細胞に導入される外因性遺伝子(例えば、レポーター遺伝子)によってコードされる。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートの標的抗原は、免疫細胞によって取り込まれ、プロセシングされる疾患抗原(例えば、腫瘍関連抗原又はウイルス抗原)である。
【０５７０】
非限定的な例として、いくつかの実施態様において、異常細胞(例えば、癌細胞又は病原体感染細胞)を標的とするために、該CpG-Ab免疫コンジュゲートの標的抗原は、異常細胞の内在性遺伝子によってコードされるタンパク質であり得る。様々な実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートの標的抗原は、標的細胞で過剰発現されているか、突然変異しているか、又は誤調節されている。他の実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートの標的抗原は、該抗原が正常細胞で有するのと同じ特徴を有する。他の実施態様において、該CpG-免疫コンジュゲートの標的抗原は、(例えば、病原体感染を通じて)異常細胞に導入された外因性遺伝子によってコードされる。
【０５７１】
いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、肥満細胞、マクロファージ、抗原提示細胞(APC)、好塩基球、及び好酸球から選択される正常免疫細胞によってコードされ、発現される抗原に特異的に結合する。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、B細胞、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、アストロサイト、線維芽細胞、及びオリゴデンドロサイトから選択される正常抗原提示細胞(APC)によってコードされ、発現される抗原に特異的に結合する。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、正常B細胞によってコードされ、発現される抗原に特異的に結合する。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、正常樹状細胞によってコードされ、発現される抗原に特異的に結合する。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、マクロファージ細胞によってコードされ、発現される抗原に特異的に結合する。
【０５７２】
いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、免疫チェックポイント分子、T細胞共刺激分子、MHCタンパク質(MHCクラスI及びII分子を含む)、並びに他の免疫細胞特異的抗原から選択される、正常免疫細胞によってコードされ、発現される抗原に特異的に結合する。
【０５７３】
特定の実施態様において、本開示で使用されている免疫チェックポイント分子としては、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、CLTA-4、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD47、CD160、2B4、及びTGFRが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５７４】
特定の実施態様において、本開示で使用されているT細胞共刺激分子としては、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1/CD11a/CD18、ICOS/CD278、4-1BB/CD137、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、及びCD83が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５７５】
特定の実施態様において、本開示で使用されているB細胞特異的抗原としては、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、BCMA/TNFRSF17、BLIMP1/PRDM1、C1q R1/CD93、CD117/c-kit、CD11b/インテグリンαM、CD19、CD1c/BDCA-1、CD1d、CD20、CD21、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2Rα、CD27/TNFRSF7、CD34、CD37、CD38、CD40/TNFRSF5、CD43、CD5、CD69、CD72、CD83、CXCR4、CXCR5、DEP-1/CD148、EMMPRIN/CD147、FCRL3/FcRH3、Flt-3/Flk-2、HLA-DR、IgM、IL-10、IL-12Rβ2、IL-12/IL-35 p35、IL-21、IL-21R、IL-27Rα/WSX-1/TCCR、IL-27/IL-35 EBI3サブユニット、IL-3Rα/CD123、IL-4Rα、IL-7Rα/CD127、IRF4、MHCクラスII(I-A/I-E)、ネプリライシン/CD10、Pax5/BSAP、Sca-1/Ly6、シグレック-2/CD22、STAT1、STAT3、Synデカン-1/CD138、TACI/TNFRSF13B、TGF-β、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TLR4が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様において、B細胞特異的抗原は、CD1、CD2、CD5、CD9、CD11、CD17、CD18、CD19、CD20、CD21/CD35、CD22、CD23、CD24、CD25、CD27、CD30、CD38、CD40、CD45R/B220、CD69、CD70、CD78、CD79a(Igα)、CD79b(Igβ)、CD80、CD86、CD93(C1Rqp)、CD137/4-1BB、CD138、CD252/OX40L、CD267、CD268/BAFF-R、CD279/PD1、CD319、PDL-2、Pax-5、IgD、IgM、Notch 2、及びTLR4から選択される。
【０５７６】
特定の実施態様において、本開示で使用されている樹状細胞特異的抗原としては、B220/CD45R、BATF3、BST-2/テザリン、CD11b/インテグリンαM、CD11c、CD14、CD163、CD19、CD1c/BDCA-1、CD1d1、CD20、CD3、CD4、CD8、CLEC9a、CX3CR1、DC-SIGN/CD209、DEC-205/CD205、DLEC/CLEC4C/BDCA-2、E-カドヘリン、EpCAM/TROP1、F4/80、FcεRIα、FcγRI/CD64、FcγRIA/CD64、FcγRIB/CD64、FcγRIII(CD16)、FcγRIIIA/CD16a、FcγRIIIB/CD16b、GFI-1、HLA-DR、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IGSF4A/SynCAM1、Ikaros、IL-1β/IL-1F2、IL-10、IL-12、IL-2、IL-23、IL-3Rα/CD123、IL-6、iNOS、インテグリンαE/CD103、IRF4、IRF8、ランゲリン/CD207、Ly-6G(Gr-1)、Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)、MHCクラスII(I-A/I-E)、MMR/CD206、NCAM-1/CD56、ニューロピリン-1、NFIL3/E4BP4、一酸化窒素、PU.1/Spi-1、SIRPα/CD172a、Spi-B、トロンボモジュリン/BDCA-3、TLR7、TLR9、TNF-α、及びXCR1が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる樹状細胞抗原及び樹状細胞抗原に特異的に結合する抗体は、当技術分野で公知であり、例えば、各々の内容が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Rafael Nunezの文献、Current Protocols in Cytometry(2001) 9.17.1-9.17.15; Hockらの文献、Immunology 83:573-581; Jiang, W.らの文献、Nature 375:151-155;及びBenderらの文献、J. Immunol. Methods 196:121-135;及びM. Colliらの文献、Immunology. 2013 Sep; 140(1): 22-30に記載されているものなどがある。特定の実施態様において、樹状細胞特異的抗原は、CD1a、CD1b/c、CD4、CD8、CD11b、CD11c、CD40、CD45R/B220、CD49d、CD80、CD83、CD85a、CD85f、CD85g/ILT7、CD85i、CD85j、CD86、CD123、CD197/CCR7、CD205、CD206、CD207、CD208、CD209、CD273/B7-DC/PD-L2、CD303/BDCA-2、CD304/ニューロピリン-1、DCマーカー/33D1、F4/80、MHCクラスI、ファシン、HLA-DR、及びシグレックHから選択される。特定の実施態様において、樹状細胞特異的抗原は、CD1a、CD1b、CD1c、CD4、CD8、CD11b、CD11c、CD40、CD45R/B220、CD49d、CD80、CD83、CD85g/ILT7、CD86、CD123、CD197(CCR7)、CD273(B7-DC、PD-L2)、CD303(BDCA-2)、CD304(ニューロピリン-1)、DCマーカー(33D1)、F4/80、HLA-DR、MHCクラスII、シグレックHから選択される形質細胞様樹状細胞抗原である。
【０５７７】
特定の実施態様において、本開示で使用されているマクロファージ表面抗原としては、アクチビンA、AIF-1/Iba1、アルギナーゼ1/ARG1、B7-1/CD80、B7-2/CD86、カルシトニンR、CCL1/I-309/TCA-3、CCL11/エオタキシン、CCL14/HCC-1/HCC-3、CCL15/MIP-1δ、CCL16/HCC-4、CCL17/TARC、CCL18/PARC、CCL19/MIP-3β、CCL2/JE/MCP-1、CCL20/MIP-3α、CCL22/MDC、CCL23/Ckβ8-1、CCL23/MPIF-1、CCL24/エオタキシン-2/MPIF-2、CCL26/エオタキシン-3、CCL3/CCL4、CCL3/MIP-1α、CCL4/MIP-1β、CCL5/RANTES、CCL8/MCP-2、CCR2、CCR5、CD11b/インテグリンαM、CD11c、CD15/ルイスX、CD163、CD200R1、CD200R1L、CD36/SR-B3、CD43、CD45、CD68/SR-D1、CLEC10A/CD301、COX-2、CX3CL1/フラクタルカイン、CX3CR1、CXCL1/GROα/KC/CINC-1、CXCL10/IP-10/CRG-2、CXCL11/I-TAC、CXCL13/BLC/BCA-1、CXCL16、CXCL2/GROβ/MIP-2/CINC-3、CXCL3/GROγ/CINC-2/DCIP-1、CXCL5/ENA-70、CXCL5/ENA-74、CXCL5/ENA-78、CXCL9/MIG、CXCR1/IL-8RA、CXCR2/IL-8 RB、DC-SIGN/CD209、DEC-205/CD205、デクチン-1/CLEC7A、デクチン-2/CLEC6A、EMR1、F4/80、FcεRIα、FcγRI/CD64、FcγRIA/CD64、FcγRIB/CD64、FcγRII/CD32、FcγRIII(CD16)、FIZZ1/RELMα、ガレクチン-3、GATA-6、G-CSF、GITRリガンド/TNFSF18、GM-CSF、HLA-DR、ID2、IFN-γ、IFN-γR1/CD119、IL-1β/IL-1F2、IL-1RII、IL-10、IL-15、IL-17/IL-17A、IL-18/IL-1F4、IL-1ra/IL-1F3、IL-23、IL-4Rα、IL-6、IL-8/CXCL8、iNOS、インテグリンαL/CD11a、IRF4、IRF5、LAMP-2/CD107b、ランゲリン/CD207、LILRB4/CD85k/ILT3、L-セレクチン/CD62L、LXRα/NR1H3、Ly-6G(Gr-1)、Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)、MARCO、M-CSF R/CD115、Mer、MFG-E8、MHCクラスII(I-A/I-E)、MMR/CD206、NFATC1、NGFI-Bα/Nur77/NR4A1、PPARδ/NR1C2、PPARγ/NR1C3、RANK/TNFRSF11A、RUNX3/CBFA3、シグレック-1/CD169、シグレック-3/CD33、シグレック-F、SIGNR1/CD209b、SIRPα/CD172a、SLAM/CD150、SOCS-3、スフィンゴシンキナーゼ1/SPHK1、スフィンゴシンキナーゼ2/SPHK2、SR-AI/MSR、SR-BI、STAT1、STAT6、TGF-β、TIM-4、TLR1、TLR2、TLR4、TLR8、TNF-α、TRACP/PAP/ACP5、VCAM-1/CD106、VEGF、及びYM1/キチナーゼ3-様3が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様において、マクロファージ特異的抗原は、CD11a、CD11b、CD11c、CD14、CD15(SSEA-1)、CD16/32、CD33、CD64、CD68、CD80、CD85k(ILT3)、CD86、CD105(エンドグリン)、CD107b、CD115、CD163、CD195(CCR5)、CD282(TLR2)、CD284(TLR4)、F4/80、GITRL、HLA-DR、Mac-2(ガレクチン-3)、MHCクラスIIから選択される。
【０５７８】
特定の実施態様において、本開示で使用されているT細胞特異的抗原としては、CD3、CD4、CD8、CD25、CD127、及びCD196/CCR6、CD197/CCR7、CD62L、CD69、並びにCD45ROが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５７９】
特定の実施態様において、本開示で使用されているT濾胞ヘルパー細胞特異的抗原としては、BCL-6、Stat-3、CD3、CD4、CD84、CD126/IL-6Rα、CD150/SLAM)、CD154/CD40L、CD185/CXCR5、CD252/OX40L、CD278/ICOS、CD279/PD1、及びTCRα/βが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様において、本開示で使用されているTh1細胞特異的抗原としては、GM-CSF、IFN-γ、IL-2、T-bet、細胞外マーカー、CD4、CD26、CD94、CD119、CD183、CD191(CCR1)、CD195(CCR5)、CD254(TRANCE、RANKL)、CD366(Tim-3)、IL-18R、リンホトキシンβ受容体(LTβR)、TNF-α、及びTNF-βが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様において、本開示で使用されているTh2細胞特異的抗原としては、c-MAF、GATA3、GM-CSF、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、細胞外マーカー、CCR8、CD4、CD184(CXCR4)、CD193(CCR3)、CD194(CCR4)、CD197(CCR7)、CD278(ICOS)、CD294(CRTH2)、CD365(Tim-1)、及びIL-1Rが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様において、本開示で使用されているTh9細胞特異的抗原としては、GATA3、IRF4、Stat-6、CD3、CD4、及びTCRα/βが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様において、本開示で使用されているTh17細胞特異的抗原としては、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、RORα、RORγt、Stat-3、CD3、CD4、CD38、CD161/NK-1.1、CD194/CCR4、CD196/CCR6、IL-1R、及びTGF-βが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様において、本開示で使用されているTh22細胞特異的抗原としては、AHR、CCR10、CD3、CD$、CD194/CCR4、CD196/CCR6、及びTCRα/βが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様において、本開示で使用されているTreg細胞特異的抗原としては、FOXP3、Helios、細胞外マーカー、CD4、CD25、CD39、CD62L、CD73、CD103、CD134、CD152/CTLA-4、CD194/CCR4、CD223、FR4、GARP、GITR、及びTGF-βが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５８０】
特定の実施態様において、本開示で使用されているナチュラルキラー細胞特異的抗原としては、CD11b、CD11c、CD16/32、CD49b、CD56(NCAM)、CD57、CD69、CD94、CD122、CD158(Kir)、CD161(NK-1.1)、CD244(2B4)、CD314(NKG2D)、CD319(CRACC)、CD328(シグレック-7)、CD335(NKp46)、Ly49、Ly108、Vα24-Jα18 TCR(iNKT)、グラニュライシン、グランザイム、及びパーフォリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５８１】
特定の実施態様において、本開示で使用されている内皮細胞特異的抗原としては、CD31、CD34、CD54、CD61、CD62E/E-セレクチン、CD105/エンドグリン、CD106/VCAM-1、CD144/VE-カドヘリン、CD146/MUC18、Mel-CAM、CD201/EPCR、CD202b/Tie2/Tek、CD309/VEGFR2-Flk-1、ポドプラニン、及びVEGFR3が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様において、本開示で使用されている好塩基球細胞特異的抗原としては、プロ主要塩基性タンパク質1、CD13、CD44、CD54、CD63、CD69、CD107a、CD123、CD193/CCR3、CD203c、FcεRIα、IgE、及びTLR4が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様において、本開示で使用されているアストロサイト細胞特異的抗原としては、S100B、CD40、CD80、CD86、CD88、及びGFAPが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様において、本開示で使用されている好酸球細胞特異的抗原としては、C3AR、CD15(SSEA-1)、CD23、CD49d、CD52、CD53、CD88、CD129、CD183、CD191、CD193、CD244(2B4)、CD294、CD305、FcεRIα、ガレクチン-9、MRP-14、シグレック-8、及びシグレック-10が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様において、本開示で使用されている肥満細胞特異的抗原としては、CD117/C-kit、CD203c、及びFcεRIαが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様において、本開示で使用されている線維芽細胞特異的抗原としては、CD10、CD29、CD47、CD81、CD91、CD121aが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５８２】
特定の実施態様において、CD19、CD20、CD22、CD30、CD38、CD40、CD74、CD79b、CD205、CD274、CD303、及びCD304から選択される正常免疫細胞と関連する標的抗原に特異的に結合するCpG-Ab免疫コンジュゲート。特定の実施態様において、CD19、CD20、CD22、CD30、CD38、CD40、CD74、CD79b、CD205、CD274、CD303、及びCD304から選択される標的抗原に特異的に結合するCpG-Ab免疫コンジュゲート。
【０５８３】
いくつかの実施態様において、正常免疫細胞(例えば、APC)と関連する抗原に特異的に結合するCpG-Ab免疫コンジュゲートは、異常細胞を標的としない。いくつかの実施態様において、正常免疫細胞(例えば、APC)と関連する抗原に特異的に結合するCpG-Ab免疫コンジュゲートは、異常細胞と関連する抗原に結合しない。いくつかの実施態様において、正常免疫細胞(例えば、APC)と関連する抗原に特異的に結合するCpG-Ab免疫コンジュゲートは、本明細書に提供される方法で治療されている癌の腫瘍関連抗原に結合しない。
【０５８４】
いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、ケラチノサイト、ランゲルハンス細胞、T細胞、B細胞、肥満細胞、内皮細胞、筋線維芽細胞、及び初代線維芽細胞から選択されるTLR発現細胞と関連する抗原に特異的に結合する。いくつかの実施態様において、TLR発現細胞と関連する抗原に特異的に結合するCpG-Ab免疫コンジュゲートは、異常細胞を標的としない。いくつかの実施態様において、TLR発現細胞と関連する抗原に特異的に結合するCpG-Ab免疫コンジュゲートは、異常細胞と関連する抗原に結合しない。いくつかの実施態様において、TLR発現細胞と関連する抗原に特異的に結合するCpG-Ab免疫コンジュゲートは、本明細書に提供される方法で治療されている癌の腫瘍関連抗原に結合しない。
【０５８５】
いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、本方法によって治療されている癌の腫瘍関連抗原に特異的に結合する。本開示のCpG-Ab免疫コンジュゲートによって標的とされ得る腫瘍関連抗原(TAA)の例としては、EGFR、EGFRvIII、gp100又はPmel17、HER2/neu、メソテリン、CEA、MART-1/メラン-A、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MUC-1、GPNMB、HMW-MAA、TIM1、ROR1、CD19、gp100、ジペプチジルペプチダーゼIV(DPPIV)、アデノシンデアミナーゼ-結合タンパク質(ADAbp)、サイクロフィリンb、結腸直腸関連抗原(CRC)-C017-1A/GA733、癌胎児性抗原(CEA)並びにその免疫原性エピトープCAP-1及びCAP-2、etv6、aml1、前立腺特異的抗原(PSA)並びにその免疫原性エピトープPSA-1、PSA-2、及びPSA-3、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、T細胞受容体/CD3-ζ鎖、MAGEファミリーの腫瘍抗原(例えば、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-05)、GAGEファミリーの腫瘍抗原(例えば、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、チロシナーゼ、p53、MUCファミリー(例えば、MUC1、MUC16など;例えば、米国特許第6,054,438号; WO98/04727号;又はWO98/37095号を参照)、p21ras、RCAS1、α-フェトタンパク質、E-カドヘリン、α-カテニン、β-カテニン、及びγ-カテニン、p120ctn、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、大腸腺腫様ポリポーシスタンパク質(APC)、フォドリン、コネクシン37、Ig-イディオタイプ、p15、gp75、GM2及びGD2ガングリオシド、Smadファミリーの腫瘍抗原脳グリコーゲンホスホリラーゼ、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1、及びCT-7、並びにc-erbB-2及びウイルス抗原、例えば、HPV-16及びHPV-18のE6及びE7抗原並びにEBVによってコードされる核抗原(EBNA)-1、並びにマーカー(β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ...)、βhCG、WT1、TRP-2、NY-BR-1、NY-CO-58、MN(gp250)、テロメラーゼ、並びに生殖細胞由来腫瘍抗原の配列の全て又は一部を含む配列が挙げられるが、これらに限定されない。腫瘍関連抗原には、血液型抗原、例えば、Lea、Leb、LeX、LeY、H-2、B-1、B-2抗原も含まれる。腫瘍関連抗原は、当技術分野で公知の、例えば、Zhangらの文献、上記に開示されている方法を用いて同定することができる。
【０５８６】
特に、いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、CD19、CD20、CD22、CD25、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44、CD45R(B220)、CD49、CD52、CD56、CD70、CD74、CD79a、CD79b、CD93、CD123、CD138、CD163、CD205、CD206、CD274、CD303、及びCD304、葉酸受容体α、葉酸受容体β、メソテリン、PSMA、Her-2、EGFR、トランスフェリン受容体、インテグリン、クリプト、EphA2、AGS-5、AGS-16、CanAg、EpCAM、IL4受容体、IL2受容体、ルイスY、GPNMBから選択される腫瘍関連抗原に特異的に結合する。
【０５８７】
他の実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、CD19、CD20、CD22portin 7、Her2、Src、EGFR、CD52、CXCR-4、Muc-1、及びDNAから選択される腫瘍関連抗原に結合しない。
【０５８８】
いくつかの実施態様において、該腫瘍関連抗原は、1以上の正常免疫細胞と関連している。いくつかの実施態様において、該腫瘍関連抗原は、1以上のTLR発現細胞とも関連している。特定の実施態様において、該腫瘍関連抗原は、正常免疫細胞によってコードされ、発現されるタンパク質である。特定の実施態様において、該正常免疫細胞は、該腫瘍関連抗原を含有又は発現するように人為的に改変されている。特定の実施態様において、該腫瘍関連抗原は、APCによって取り込まれ、プロセシングされる外因性抗原である。特定の実施態様において、該癌は免疫細胞癌であり、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、該腫瘍関連抗原に特異的に結合することにより、癌性免疫細胞と正常免疫細胞の両方を標的とする。特定の実施態様において、該癌は、リンパ腫又は白血病である。特定の実施態様において、該癌は、B細胞リンパ腫である。
【０５８９】
本明細書に記載される癌を治療する方法のいくつかの実施態様において、本明細書に開示される方法で治療されている癌は、固形腫瘍である。いくつかの実施態様において、本明細書に開示される方法で治療されている癌は、液性腫瘍である。特定の実施態様において、本明細書に開示される方法で治療されている癌は、リンパ腫又は白血病である。特定の実施態様において、本明細書に開示される方法で治療されている癌は、マントル細胞リンパ腫(MCL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、バーキットリンパ腫、多発性メラノーマ(MM)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、急性骨髄性白血病(AML)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、有毛細胞白血病(HCL)、リンパ形質細胞性リンパ腫(LPL)、骨格筋リンパ腫(SML)、脾臓辺縁帯リンパ腫(SMZL)、濾胞中心リンパ腫(FCL)、結腸直腸癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭頸部癌、乳癌、膵癌、膠芽腫(GBM)、前立腺癌、食道癌、腎細胞癌、肝癌、膀胱癌、及び胃癌からなるリストから選択される。
【０５９０】
いくつかの実施態様において、本明細書に開示される方法で治療されている癌は、少なくとも1つの免疫療法に抵抗性である。いくつかの実施態様において、癌を治療する方法は、癌を有する対象に、(i)該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチド又は該CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量;及び(ii)治療されている癌を免疫療法剤のみで治療したとき、該癌が抵抗するか又は応答しないことを示す免疫療法剤を共投与することを含む。
【０５９１】
特定の実施態様において、本明細書に提供される方法で治療されている癌は、免疫チェックポイントモジュレーターによる治療に応答しないことが示されている。特定の実施態様において、該免疫チェックポイントモジュレーターは、PD-1のインヒビターである。特定の実施態様において、該免疫チェックポイントモジュレーターは、PD-L1のインヒビターである。いくつかの実施態様において、癌を治療する方法は、癌を有する対象に、(i)該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチド又は該CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量;及び(ii)PD-1のインヒビターの治療有効量を共投与することを含む。いくつかの実施態様において、癌を治療する方法は、癌を有する対象に、(i)該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチド又は該CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量;及び(ii)PD-L1のインヒビターの治療有効量を共投与することを含む。特に、いくつかの実施態様において、該PD-1のインヒビターは、抗PD-1抗体又はその抗原結合断片である。いくつかの実施態様において、該PD-L1のインヒビターは、抗PD-L1抗体又はその抗原結合断片である。
【０５９２】
ある態様において、本明細書に提供されるのは、癌を発症しやすい対象における癌を予防する方法であって、該対象に、本明細書に記載されるTLRアゴニストの治療有効量を投与することを含む、方法である。いくつかの実施態様において、該対象に、本明細書に記載されるCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチド又はCpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を投与することを含む方法。特定の実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、本明細書に記載される正常免疫細胞を標的とする。特定の実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、本明細書に記載されるTLR発現細胞を標的とする。特定の実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、本明細書に記載される正常免疫細胞と関連する抗原に特異的に結合する。特定の実施態様において、本明細書に記載される正常免疫細胞と関連する抗原に特異的に結合するCpG-Ab免疫コンジュゲートは、予防されている癌の腫瘍関連抗原に結合しない。特定の実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、本明細書に記載されるTLR発現細胞と関連する抗原に特異的に結合する。特定の実施態様において、本明細書に記載されるTLR発現細胞と関連する抗原に特異的に結合するCpG-Ab免疫コンジュゲートは、予防されている癌の腫瘍関連抗原に結合しない。特定の実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、本明細書に記載されるように予防されている癌の腫瘍関連抗原に特異的に結合する。特定の実施態様において、予防されている癌の腫瘍関連抗原は、正常免疫細胞又はTLR発現細胞とも関連する。特定の実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、CD19、CD20、CD22、STAT3、エクスポーチン7、Her2、Src、EGFR、CD52、CXCR-4、Muc-1、及びDNAから選択される抗原に特異的には結合しない。
【０５９３】
いくつかの実施態様において、癌を予防する方法は、癌を発症しやすい対象に、(i)CpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量及び(ii)予防されている癌の腫瘍関連抗原を投与することをさらに含む。いくつかの実施態様において、該腫瘍関連抗原は、該CpG-Ab免疫コンジュゲートにコンジュゲートされていない。特定の実施態様において、該腫瘍関連抗原は、癌ワクチンとして製剤化される。特定の実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、癌ワクチンのアジュバントとして製剤化される。
【０５９４】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法を用いて予防又は治療されている癌は、以前の癌の部分寛解又は完全寛解期にある対象における癌再発のエピソードである。特定の実施態様において、該以前の癌は液性癌であり、予防又は治療されている再発癌は液性癌である。特定の実施態様において、該以前の癌は固形癌であり、予防又は治療されている再発癌は固形癌である。特定の実施態様において、該以前の癌は液性癌であり、予防又は治療されている再発癌は固形癌である。特定の実施態様において、該以前の癌は固形癌であり、予防又は治療されている再発癌は液性癌である。
【０５９５】
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法を用いて予防又は治療されている癌は、対象が部分寛解又は完全寛解を示した後の該対象における癌再発の1回目のエピソードである。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法を用いて予防又は治療されている癌は、対象が部分寛解又は完全寛解を示した後の該対象における癌再発の2回目のエピソードである。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法を用いて予防又は治療されている癌は、対象が部分寛解又は完全寛解を示した後の該対象における癌再発の3回目のエピソードである。いくつかの実施態様において、本明細書に提供される方法を用いて予防又は治療されている癌は、対象が部分寛解又は完全寛解を示した後の該対象における癌再発の3回目のエピソードの後の癌再発のエピソードである。
【０５９６】
ある態様において、本明細書に提供されるのは、それを必要としている対象における適応免疫応答を誘導する方法であって、該対象に、本明細書に記載されるTLRアゴニストの治療有効量を投与することを含む、方法である。特定の実施態様において、適応免疫応答を誘導する方法は、それを必要としている対象に、本明細書に記載されるCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチド又はCpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を投与することを含む。特定の実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、本明細書に記載される正常免疫細胞を標的とする。特定の実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、本明細書に記載されるTLR発現細胞を標的とする。特定の実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、癌細胞又は病原体感染細胞から選択される疾患細胞を標的とする。特定の実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、本明細書に記載される正常免疫細胞と関連する抗原に特異的に結合する。特定の実施態様において、正常免疫細胞と関連する抗原に特異的に結合するCpG-Ab免疫コンジュゲートは、疾患抗原に結合しない。特定の実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、本明細書に記載されるTLR発現細胞と関連する抗原に特異的に結合する。特定の実施態様において、TLR発現細胞と関連する抗原に特異的に結合するCpG-Ab免疫コンジュゲートは、疾患抗原に結合しない。特定の実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、本明細書に記載される疾患抗原に特異的に結合する。特定の実施態様において、該疾患抗原は、正常免疫細胞又はTLR発現細胞とも関連する。特定の実施態様において、該疾患抗原は、腫瘍関連抗原又は病原性抗原である。特定の実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、CD19、CD20、CD22、STAT3、エクスポーチン7、Her2、Src、EGFR、CD52、CXCR-4、Muc-1、及びDNAから選択される抗原に特異的には結合しない。
【０５９７】
本明細書に記載される方法及び使用のいくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、それを必要としている対象に、該対象におけるTLR9媒介性シグナル伝達経路を活性化するのに十分である投薬量で投与される。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、それを必要としている対象に、該CpG-Ab免疫コンジュゲートによって標的とされる細胞集団でTLR9媒介性シグナル伝達経路を活性化するのに十分である投薬量で投与される。本明細書に記載されているように、いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートによって標的とされる細胞集団は、TLR9を発現する。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートによって標的とされる細胞集団は、標的細胞の細胞表面上で、標的細胞のエンドソーム膜上で、標的細胞の細胞表面上とエンドソーム膜上の両方でTLR9を発現することができる。
【０５９８】
特に、本明細書に記載される方法及び使用のいくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、それを必要としている対象に、(a)標的細胞上の該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドによるTLR9受容体との特異的結合;(b)標的細胞による該CpG-Ab免疫コンジュゲート又はその該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチド部分の効率的な内在化;(c)標的細胞における1以上のシグナル伝達経路の活性化;(d)標的細胞による1以上の炎症性サイトカインの分泌の誘導;(e)標的細胞による1以上の炎症性サイトカイン分泌の抑制;(f)標的細胞の1以上の遺伝子の発現の上方調節;(g)標的細胞の1以上の遺伝子の発現の抑制;(h)標的とされる正常免疫細胞の活性化、及び(i)標的とされる癌細胞のアポトーシスの誘導、(j)標的とされる癌細胞の壊死の誘導から選択される効果のうちの1つ又は複数を誘導するのに有効である投薬量で投与される。
【０５９９】
特に、本明細書に記載される方法及び使用のいくつかの実施態様において、CpG-Ab免疫コンジュゲートを投与したとき、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、標的細胞のTLR9受容体に特異的に結合する。特に、いくつかの実施態様において、CpG-Ab免疫コンジュゲートと標的細胞と関連する抗原との結合は、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドとTLR9受容体との特異的結合を促進する。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートの標的抗原は、TLR9受容体の近くに位置する。特定の実施態様において、標的抗原とTLR9受容体は両方とも、標的細胞の細胞膜上に位置する。特定の実施態様において、標的抗原とTLR9受容体は両方とも、標的細胞の細胞内膜上に位置する。特定の実施態様において、標的抗原とTLR9受容体は両方とも、標的細胞のエンドソーム膜又はファゴソーム膜上に位置する。いくつかの実施態様において、標的抗原は細胞膜上に位置し、CpG-Ab免疫コンジュゲートに結合したときに、該CpG-Ab免疫コンジュゲートの細胞質ゾルへの内在化を促進する。
【０６００】
特に、本明細書に記載される方法及び使用のいくつかの実施態様において、該方法は、それを必要としている対象に、正常免疫細胞を標的とするCpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を投与することを含み、ここで、該CpG-Ab免疫コンジュゲートを投与したとき、標的細胞内の1以上の免疫原性シグナル伝達経路が活性化される。特定の実施態様において、活性化されるシグナル伝達経路は、核因子(NF)-κBシグナル伝達経路、c-Jun N-末端キナーゼ(JNK)シグナル伝達経路、AP1シグナル伝達経路、IRF3/7経路、及びp38マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)シグナル伝達経路から選択される1つ又は複数のものである。細胞シグナル伝達経路の活性化は、当技術分野で公知の方法、例えば、限定されないが、その発現が対象となるシグナル伝達経路の活性化によって特異的に誘導される分子マーカーの存在の検出を用いて検出することができる。
【０６０１】
特に、本明細書に記載される方法及び使用のいくつかの実施態様において、該方法は、それを必要としている対象に、正常免疫細胞を標的とするCpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を投与することを含み、ここで、該CpG-Ab免疫コンジュゲートを投与したとき、1以上の炎症性サイトカインの分泌が誘導される。特定の実施態様において、該1以上の炎症性サイトカインは、I型インターフェロン(IFN)、インターロイキン(IL)-6、IL10、IL-12、IL-18、及び腫瘍壊死因子(TNF)から選択される。
【０６０２】
特に、本明細書に記載される方法及び使用のいくつかの実施態様において、該方法は、それを必要としている対象に、正常免疫細胞を標的とするCpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を投与することを含み、ここで、該CpG-Ab免疫コンジュゲートを投与したとき、1以上のさらなるタンパク質の発現が上方調節される。特定の実施態様において、上方調節されるタンパク質は、抗原提示分子(例えば、MHCクラスI及びII)、サイトカイン受容体(例えば、IL-6受容体、IL-10受容体、IL-12受容体、TNF-α受容体、TNF-β受容体、IFN-α受容体、IFN-β受容体、IFN-γ)、ケモカイン受容体(例えば、ケモカイン受容体7)、T細胞共刺激分子(例えば、CD3、CD28、CD27、CD30、CD40、CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD134/OX-40、OX-40L、CD137/4-1BB、4-1BBL、CD278/ICOS、B7-H3、B7h/B7RP-1、LIGHTなど)、並びにT細胞成熟調節タンパク質(例えば、インドールアミン 2,3-ジオキシゲナーゼ)から選択される1つ又は複数のものである。
【０６０３】
特に、本明細書に記載される方法及び使用のいくつかの実施態様において、該方法は、それを必要としている対象に、正常免疫細胞を標的とするCpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を投与することを含み、ここで、該CpG-Ab免疫コンジュゲートを投与したとき、1以上の正常免疫細胞集団の増殖、分化、成熟、及び/又は生存が増大する。特定の実施態様において、1以上の増大した正常免疫細胞集団は、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、ナチュラルキラー細胞、Tヘルパー細胞、B細胞、及びAPC(mDCを含む)から選択される。本明細書に記載される方法及び使用のいくつかの実施態様において、該方法は、それを必要としている対象に、正常免疫細胞を標的とするCpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を投与することを含み、ここで、該CpG-Ab免疫コンジュゲートを投与したとき、1以上の正常免疫細胞集団の増殖、分化、成熟、及び/又は生存が低下する。特定の実施態様において、1以上の低下した正常免疫細胞集団は、B-reg細胞及びT-reg細胞から選択される。
【０６０４】
特定の実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートを投与したとき、抗原提示活性は、対象のAPCで増大する。いくつかの実施態様において、該APCは、B細胞、単球、樹状細胞、及びランゲルハンス細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、アストロサイト、線維芽細胞、並びにオリゴデンドロサイトから選択される。特定の実施態様において、該APCは、B細胞である。特定の実施態様において、該APCは、樹状細胞である。特定の実施態様において、該APCは、マクロファージである。いくつかの実施態様において、該樹状細胞は、pDCである。特定の実施態様において、増大した抗原提示活性は、活性化されたAPCによる腫瘍関連抗原のより効率的な提示をもたらす。
【０６０５】
特定の実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートを投与したとき、治療又は予防されている癌の1以上の腫瘍関連抗原に対する抗原特異的CD4+ T細胞性免疫が増大する。特定の実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートを投与したとき、CD4+ T細胞による腫瘍浸潤が増大する。特定の実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートを投与したとき、治療又は予防されている癌の1以上の腫瘍関連抗原に対する抗原特異的CD8+ T細胞性免疫が増大する。特定の実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートを投与したとき、CD8+ T細胞による腫瘍浸潤が増大する。特定の実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートを投与したとき、治療又は予防されている癌の1以上の腫瘍関連抗原に特異的に対するB細胞の免疫グロブリン分泌が増大する。
【０６０６】
特に、本明細書に記載される方法及び使用のいくつかの実施態様において、該方法は、それを必要としている対象に、疾患細胞を標的とするCpG-Ab免疫コンジュゲートの治療有効量を投与することを含み、ここで、該CpG-Ab免疫コンジュゲートを投与したとき、1以上のアポトーシスシグナル伝達経路が誘導されて、標的とされる疾患細胞のアポトーシスを誘発する。いくつかの実施態様において、該疾患細胞は、癌細胞である。
【０６０７】
本明細書に記載される方法及び使用のいくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、それを必要としている対象に、該対象の補体系を活性化するのに有効ではない量で投与される。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、それを必要としている対象に、該対象の補体C1を活性化するのに有効ではない量で投与される。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、それを必要としている対象に、該対象の補体C3を活性化するのに有効ではない量で投与される。補体活性化は、当技術分野で公知の方法を用いて検出することができる。いくつかの実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、それを必要としている対象に、該CpG-Ab免疫コンジュゲートの抗体部分が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性を誘導するのに有効ではない量で投与される。
【０６０８】
本明細書に記載されているように、CpG含有ポリヌクレオチドを含む治療剤、コンジュゲート、又は組成物は、癌を予防又は治療するための少なくとも1つのさらなる治療剤と組み合わせて使用することができる。いくつかの実施態様において、そのような組合せ療法は、どちらかの治療剤のみの個別の効果よりも良好である相乗的な治療効果を示す。いくつかの実施態様において、そのような組合せ療法は、該治療剤のみの個別の効果の総和よりも良好である相乗的な治療効果を示す。
【０６０９】
したがって、ある態様において、本明細書に提供されるのは、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドを少なくとも1つのさらなる癌療法剤と組み合わせて用いて、癌を予防又は治療する方法である。そのような方法は、それを必要としている対象に、(i)該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドの治療有効量、及び(ii)少なくとも1つのさらなる癌療法剤の治療有効量を投与することを含む。特定の実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、自立型ポリヌクレオチドとして投与される。特定の実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、CpG-Ab免疫コンジュゲートとして投与される。特定の実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチド及びさらなる治療剤は、同じ組成物中に製剤化される。他の実施態様において、CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチド及びさらなる治療剤は、別々の組成物中に製剤化される。
【０６１０】
いくつかの実施態様において、該少なくとも1つのさらなる癌療法剤は、T細胞アゴニスト、免疫チェックポイントモジュレーター、STINGアゴニスト、RIG-Iアゴニスト、他のtoll様受容体アゴニストから選択される。
【０６１１】
いくつかの実施態様において、該さらなる癌療法剤は、T細胞共刺激分子である。いくつかの実施態様において、該T細胞共刺激分子は、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1/CD11a/CD18、ICOS/CD278、4-1BB/CD137、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、及びCD83、又はこれらのリガンドから選択される。いくつかの実施態様において、共刺激分子のリガンドは、共刺激分子に特異的に結合する抗体である。特定の実施態様において、該さらなる癌療法剤は、抗OX40抗体、抗OX40L抗体、抗ICOS抗体、抗CTLA4抗体、抗CD40L抗体、抗CD28抗体、抗LFA1抗体、抗TIM1/TIM3抗体、抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗CD27抗体、及び抗4-1BB抗体から選択される。
【０６１２】
いくつかの実施態様において、該さらなる癌療法剤は、本方法で予防又は治療されている癌によって産生される腫瘍関連抗原である。いくつかの実施態様において、予防又は治療されている癌は、白血病、リンパ腫、メラノーマ、結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、膵臓癌、頭頸部癌、皮膚癌、及び脳腫瘍、肺癌であり、腫瘍関連抗原は、CD19、CD20、CD22、CD38、CD138、CD30、CD52、CD56、CD79、CD123、CD206、CD303、CD304、EGFR、葉酸受容体α、葉酸受容体β、メソテリン、Her2、トランスフェリン受容体、及びPSMAから選択される。いくつかの実施態様において、該さらなる癌療法剤は、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、LAG-3、CEACAM-1、CEACAM-5、CLTA-4、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD47、CD160、2B4、CD172a、及びTGFRのインヒビターから選択される免疫チェックポイントモジュレーターである。特定の実施態様において、該さらなる癌療法剤は、PD-1インヒビターである。特定の実施態様において、該さらなる癌療法剤は、PD-L1インヒビターである。特定の実施態様において、該さらなる癌療法剤は、CD47インヒビターである。いくつかの実施態様において、該さらなる癌療法剤は、免疫チェックポイントモジュレーターに特異的に結合する抗体である。いくつかの実施態様において、特定の実施態様において、該さらなる癌療法剤は、抗PD-1抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、該さらなる癌療法剤は、抗PD-L1抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、該さらなる癌療法剤は、抗CD47抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、該さらなる癌療法剤は、抗CD172a抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、該さらなる癌療法剤は、抗OX40抗体又はその抗原結合断片、特定の実施態様において、該さらなる癌療法剤は、抗TIM3抗体又はその抗原結合断片である。特定の実施態様において、該さらなる癌療法剤は、抗LAG3抗体又はその抗原結合断片である。抗PD-1及び抗PD-L1抗体並びにそれらの使用は、例えば、US20180030137号、US9815898号、US20170313776号、US20170313774号、US20170267762号、WO2017019846号、WO2018013017号、US20180022809号、US20180002423号、WO2017220990号、WO2017218435号、WO2017215590号、US9828434号、及びWO2017196867号に記載されている。抗CD47抗体及びその使用は、例えば、US9663575号、US9803016号、US20170283498号、US20170369572号、WO2017215585号、WO2017196793号、及びWO2017049251号に記載されている。
【０６１３】
いくつかの実施態様において、該さらなる癌療法剤は、STING経路アゴニストである。STING(TMEM173、MITA、ERIS、及びMPYSとしても知られる、インターフェロン遺伝子の刺激因子)は、環状ジヌクレオチド(CDN)の直接結合に応答して立体構造変化を受け、TBK1活性化、IRF-3リン酸化、並びにIFN-β及び他のサイトカインの産生を含む下流のシグナル伝達カスケードを生じる、ERに局在する膜貫通タンパク質である。腫瘍に存在する宿主抗原提示細胞内のSTING経路は、腫瘍関連抗原に対する自然発生的なCD8+ T細胞応答の誘導に関与する。この経路の活性化及びその後のIFN-βの産生も、抗腫瘍効果に寄与する。いくつかの実施態様において、STING経路アゴニストは、ADU-S100である。さらなるSTINGアゴニスト及びその使用は、例えば、US20180028553号、US20170319680号、US20170298139号、US20060040887号、US20080286296号、US20120041057号、US20140205653号、WO2014179335号、WO 2014179760号、US20150056224号、WO 2016096174号、WO 2017011444号、WO 2017027645号、及びWO 2017027646号に記載されている。
【０６１４】
いくつかの実施態様において、該さらなる癌療法剤は、RIG-I経路アゴニストである。RIG-I(レチノイン酸誘導性遺伝子-I)は、宿主の自然免疫系を起動して、感染初期段階に病原性微生物から防御するパターン認識受容体のメンバーである。(RIG-I)様受容体ファミリーの3つのメンバー: RIG-I、MDA5(メラノーマ分化因子5)、及びLGP2(遺伝学及び生理学の研究室2)が存在し、これらは、ほどんどの細胞及び組織型で発現される。RIG-Iは、種々のRNAウイルスの認識及びその後の下流のシグナル伝達の活性化の細胞質センサーとして機能して、I型IFN産生及び抗ウイルス遺伝子発現を駆動する。活性化されたRIG-Iは、CARD-CARD媒介性相互作用を介して、その下流のアダプター分子MAVS(別名、IPS-1、CARDIF、及びVISA)を動員する。オリゴマーRIG-I CARDの会合とMAVSのポリマー形成が一緒になって、シグナル伝達の2つの枝への分岐を媒介するタンパク質複合体のシグナル伝達プラットフォームとしての役割を果たす。一方の枝は、腫瘍壊死因子受容体関連因子(TRAF)-2/6及び受容体相互作用タンパク質1を動員して、その後、IKK複合体を活性化し、NF-κB活性化をもたらす。もう一方の枝は、TRAF3を介してシグナルを伝達し、TANK/IKKγ/IKKε/TBK1複合体を活性化し、インターフェロンレギュレーター因子(IRF)-3及び-7のリン酸化及び二量体化をもたらす。Liuらの文献、Front Immunol. 2017, 7:662。この経路の活性化は、抗腫瘍効果に寄与する。いくつかの実施態様において、RIG-I経路アゴニストは、RGT100である。RIG-Iアゴニスト及びその使用は、例えば、US20170057978号、US20170258897号、US9381208号、US9738680号、US9650427号、WO2017173427号、及びWO2017011622号に記載されている。
【０６１５】
いくつかの実施態様において、該さらなる癌療法剤は、TLR1アゴニスト、TLR2アゴニスト、TLR3アゴニスト、TLR4アゴニスト、TLR5アゴニスト、TLR6アゴニスト、TLR7アゴニスト、TLR8アゴニスト、及びTLR10アゴニストから選択されるtoll様受容体アゴニストである。
【０６１６】
さらなる実施態様において、癌を治療する方法に関して、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、(自立型形態で又はCpG-Ab免疫コンジュゲートとして)、1以上のさらなる治療剤又は処置と組み合わせて投与され、例えば、ここで、該さらなる治療剤又は処置は、化学療法、標的抗癌療法、腫瘍溶解薬、細胞毒性剤、免疫に基づく療法、サイトカイン、外科的処置、放射線処置、共刺激分子のアクチベーター、阻害分子のインヒビター、ワクチン、細胞免疫療法、及び腫瘍溶解性ウイルス療法からなる群から選択される。
【０６１７】
本明細書に提供されているように、該CpG含有ポリヌクレオチド(自立型形態のもの又はCpG-Ab免疫コンジュゲートとしてのもののいずれか)は、例えば、非非経口又は非経口投与によって投与することができる。非経口投与は、筋肉内、静脈内、動脈内、頭蓋内、皮下、眼窩内、脳室内、脊髄内、髄腔内、腹腔内、直腸、及び局所の投与経路を含むことができる。局所の投与経路は、経皮、皮内、口腔内、及び舌下の投与経路を含むことができる。医薬組成物は、選択された投与経路に従って製剤化される。非経口投与は、選択された期間にわたる連続注入によるものであってもよい。特定の実施態様において、該投与は、皮下、筋肉内、皮内、粘膜、膣内、子宮頸部、腫瘍周辺、腫瘍内へのもの、又は直接的に腫瘍流入領域リンパ節内へものである。該ポリヌクレオチド及び/又はコンジュゲートは、望ましくは、医薬として許容し得る担体とともに投与される。本明細書に記載される障害の治療のために製剤化される本明細書に記載されるポリヌクレオチド及び/又はコンジュゲートの医薬製剤も、本発明の一部である。
【０６１８】
対象に投与されるCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチド(自立型形態のもの又はCpG-Ab免疫コンジュゲートとしてのもののいずれか)の実際の投薬量は、体重、状態の重症度、治療されている疾患のタイプ、以前の又は同時並行の治療的介入、患者の突発性疾患、及び投与経路などの物理的及び生理的因子によって決定されることができる。CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチド(自立型形態のもの又はCpG-Ab免疫コンジュゲートとしてのもののいずれか)の実際の投薬量は、単一用量で又は一連の逐次投与で投与することができる。投薬量及び投与経路に応じて、好ましい投薬量及び/又は有効量の投与回数は、対象の応答によって様々であり得る。投与に責任のある医師は、いずれにしても、個々の対象について、組成物中の活性成分の濃度、適切な用量、及びスケジュールを決定することになる。
【０６１９】
ある実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、自立型形態で、端点を含む、0.01ミリグラム/kg体重〜1000ミリグラム/kg体重の範囲に及ぶ投薬量で投与される。他の非限定的な例において、用量は、約0.01ミリグラム/kg体重〜約0.05ミリグラム/kg体重も含み得る。他の非限定的な例において、用量は、投与1回当たり、約0.01ミリグラム/kg体重、約0.05ミリグラム/kg体重、約0.1ミリグラム/kg体重、約0.2ミリグラム/kg体重、約0.3ミリグラム/kg体重、約0.4ミリグラム/kg体重、約0.5ミリグラム/kg体重、約0.6ミリグラム/kg体重、約0.7ミリグラム/kg体重、約0.8ミリグラム/kg体重、約0.9ミリグラム/kg体重、約1ミリグラム/kg体重、約2ミリグラム/kg体重、約3ミリグラム/kg体重、約4ミリグラム/kg体重、約5ミリグラム/kg体重、約6ミリグラム/kg体重、約7ミリグラム/kg体重、約8ミリグラム/kg体重、約9ミリグラム/kg体重、約10ミリグラム/kg体重、約20ミリグラム/kg体重、約30ミリグラム/kg体重、約40ミリグラム/kg体重、約50ミリグラム/kg体重、約60ミリグラム/kg体重、約70ミリグラム/kg体重、約80ミリグラム/kg体重、約90ミリグラム/kg体重、約100ミリグラム/kg体重、約200ミリグラム/kg体重、約300ミリグラム/kg体重、約400ミリグラム/kg体重、約500ミリグラム/kg体重、約600ミリグラム/kg体重、約700ミリグラム/kg体重、約800ミリグラム/kg体重、約900ミリグラム/kg体重、約1000ミリグラム/kg体重、又はそれより多く、及びこれらの中の導出可能な任意の範囲も含み得る。
【０６２０】
ある実施態様において、該CpG-Ab免疫コンジュゲートは、端点を含む、約1マイクログラム/kg体重〜約500ミリグラム/kg体重の範囲に及ぶ投薬量で投与される。他の非限定的な例において、用量は、投与1回当たり、約1マイクログラムkg体重、約5マイクログラム/kg体重、約10マイクログラム/kg体重、約50マイクログラム/kg体重、約100マイクログラム/kg体重、約200マイクログラム/kg体重、約350マイクログラム/kg体重、約500マイクログラム/kg体重、約1ミリグラム/kg体重、約5ミリグラム/kg体重、約10ミリグラム/kg体重、約50ミリグラム/kg体重、約100ミリグラム/kg体重、約200ミリグラム/kg体重、約350ミリグラム/kg体重、約500ミリグラム/kg体重、約1000mg/kg体重、又はそれより多く、及びこれらの中の導出可能な任意の範囲も含み得る。本明細書に掲載されている数から導出可能な範囲の非限定的な例において、約5mg/kg/体重〜約100mg/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重〜約500ミリグラム/kg/体重などの範囲を、上記の数に基づいて投与することができる。
【０６２１】
特定の実施態様において、該CpG-Abコンジュゲートは、投与1回当たり、約3ミリグラム/kg/体重の各々の用量の3回の逐次投与で投与される。特定の実施態様において、該CpG-Abコンジュゲートは、投与1回当たり、約10ミリグラム/kg/体重の各々の用量の3回の逐次投与で投与される。特定の実施態様において、該逐次投与は、48時間の間隔で実施される。
【０６２２】
本明細書に提供されているように、組合せ療法は、2以上の治療剤の投与を含む。そのような投与は、各々の治療剤について、実質的に同時の様式での、例えば、固定比の活性成分を有する単一の製剤中での又は別々の製剤(例えば、カプセル剤及び/もしくは静脈内製剤)中でのこれらの治療剤の共投与を包含する。さらに、そのような投与は、同時的又は逐次的な各々のタイプの治療剤の投与も包含する。そのような投与は、各々の成分が異なる位置で又は異なる投与経路を介して(例えば、腫瘍内に及び/もしくは全身に)投与することができる別々の製剤として製剤化されることも包含する。どの場合も、組合せ療法の治療レジメンは、本明細書に記載される状態又は障害を治療する際に有益な効果を提供することが責任のある医師によって決定されることができる。
【０６２３】
ある実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチド又はCpG-Ab免疫コンジュゲートは、少なくとも1つのさらなる癌療法剤の投与とほぼ同時に投与される。非限定的な例として、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチド又はCpG-Ab免疫コンジュゲート及び該少なくとも1つのさらなる癌療法剤の投与は、同時、例えば、互いに30分以内、互いに25分以内、互いに20分以内、互いに15分以内、互いに10分以内、互いに5分以内、又は互いに1分以内であることができる。
【０６２４】
ある実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチド又はCpG-Ab免疫コンジュゲートは、該少なくとも1つのさらなる癌療法剤とともに逐次投与される。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチド又はCpG-Ab免疫コンジュゲートは、該少なくとも1つのさらなる癌療法剤の投与の前に投与される。いくつかの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチド又はCpG-Ab免疫コンジュゲートは、少なくとも1つのさらなる癌療法剤の投与の後に投与される。非限定的な例として、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチド又はCpG-Ab免疫コンジュゲート及び該少なくとも1つのさらなる癌療法剤の投与は、互いに少なくとも30分間、互いに少なくとも1時間、互いに少なくとも6時間、互いに少なくとも12時間、互いに少なくとも24時間、互いに少なくとも36時間、互いに少なくとも48時間、互いに少なくとも3日間、互いに少なくとも1週間、互いに少なくとも2週間、又は互いに少なくとも1カ月間空けることができる。
【０６２５】
ある実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、該免疫チェックポイントモジュレーターの投与の前に投与される。そのような方法において、該免疫チェックポイントモジュレーターは、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドの投与から48時間以内に、例えば、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドの投与から少なくとも又は少なくとも約又は約又は5分、15分、30分、1時間、2時間、3時間、4時間、6時間、8時間、12時間、16時間、18時間、20時間、22時間、24時間、30時間、36時間、40時間、又は48時間以内に投与することができる。いくつかの方法及び使用において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、該免疫チェックポイントモジュレーターの投与の6時間〜30時間又は12時間〜24時間(各々を含む)前に投与される。ある実施態様において、該免疫チェックポイントモジュレーターは、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドの投与から3日、4日、5日、7日、2週間、3週間、又は4週間以内に投与することができる。投与のタイミング及び順序は、必要であれば、特定の免疫チェックポイントモジュレーターについて、実験的に決定することができる。これらの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、自立型形態で又はCpG-Ab免疫コンジュゲートとして投与することができる。
【０６２６】
ある実施態様において、CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドと免疫チェックポイントモジュレーターはどちらも一連の逐次投与によって投与される。特定の実施態様において、第一の用量のCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドと第一の用量の免疫チェックポイントモジュレーターは同時投与され、後続の用量のCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドと後続の用量の免疫チェックポイントモジュレーターは逐次投与される。これらの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、自立型形態で又はCpG-Ab免疫コンジュゲートとして投与することができる。
【０６２７】
ある実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、T細胞アゴニストの投与の前に投与される。そのような方法において、該T細胞アゴニストは、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドの投与から48時間以内に、例えば、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドの投与から少なくとも又は少なくとも約又は約5分、15分、30分、1時間、2時間、3時間、4時間、6時間、8時間、12時間、16時間、18時間、20時間、22時間、24時間、30時間、36時間、40時間、又は48時間以内に投与することができる。いくつかの方法及び使用において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、T細胞アゴニストの投与の6時間〜30時間又は12時間〜24時間(各々を含む)前に投与される。ある実施態様において、T細胞アゴニストは、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドの投与から3日、4日、5日、7日、2週間、3週間、又は4週間以内に投与することができる。投与のタイミング及び順序は、必要であれば、特定のT細胞アゴニストについて、実験的に決定することができる。これらの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、自立型形態で又はCpG-Ab免疫コンジュゲートとして投与することができる。
【０６２８】
ある実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドと該T細胞アゴニストはどちらも、一連の逐次投与によって投与される。特定の実施態様において、第一の用量のCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドと第一の用量のT細胞アゴニストは同時投与され、後続の用量のCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドと後続の用量T細胞アゴニストは逐次投与される。これらの実施態様において、該CpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、自立型形態で又はCpG-Ab免疫コンジュゲートとして投与することができる。
【０６２９】
(自己免疫疾患の治療)
TLR9を抑制することにより、炎症促進性サイトカインの分泌の低下を助けることができる。したがって、本発明の免疫抑制ポリヌクレオチド及びそのコンジュゲートは、炎症促進性サイトカインの過剰発現を特徴とする疾患(例えば、自己免疫疾患)の治療において有用であり得る。自己免疫疾患の非限定的な例は:乾癬、関節リウマチ、狼瘡、ギラン・バレー症候群、血管炎、重症筋無力症、強直性脊椎炎、溶血性貧血、結節性多発動脈炎、特発性血小板減少性紫斑病、抗リン脂質抗体症候群、原発性胆汁性肝硬変、クローン病、潰瘍性大腸炎、自己免疫性肝炎、強皮症、皮膚筋炎、及び円形脱毛症である。
【０６３０】
(医薬組成物)
免疫調節ポリヌクレオチドの送達は、当業者に公知の種々の方法を用いて、細胞を該免疫調節ポリヌクレオチド又は該コンジュゲートと接触させることにより達成することができる。特定の実施態様において、本発明の免疫調節ポリヌクレオチド又はコンジュゲートは、医薬として許容し得る賦形剤及び/又は医薬として許容し得る担体を含む医薬組成物として製剤化することができる。該医薬組成物は、液体又は固体(例えば、凍結乾燥)形態のものであることができる。
【０６３１】
ヒト使用のために、本発明の免疫調節ポリヌクレオチド又はコンジュゲートは、単独で又は意図される投与経路及び標準的な薬学的慣行に関して選択される医薬担体と混合して投与することができる。したがって、本発明に従って使用するために医薬組成物は、本発明のコンジュゲートを医薬として使用し得る調製物へとプロセシングするのを促進する1以上の生理的に許容し得る担体、賦形剤、及び補助剤を用いて、従来の方法で製剤化することができる。
【０６３２】
頻繁に使用される担体又は賦形剤としては、糖(例えば、ラクトース、マンニトール)、乳タンパク質、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロース及びその誘導体、ポリ(エチレングリコール)、並びに溶媒、例えば、滅菌水、アルコール、グリセロール、及び多価アルコールが挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体及び栄養素補液を挙げることができる。他の医薬として許容し得る担体としては、例えば、レミントン:薬学の科学及び実践(Remington: The Science and Practice of Pharmacy)、第21版、Gennaro編、Lippencott Williams & Wilkins(2005)、及び2013年に刊行された米国薬局方:国民医薬品集(The United States Pharmacopeia: The National Formulary)(USP 36 NF31)に記載されている、水性溶液、塩を含む無毒な賦形剤、防腐剤、緩衝剤などが挙げられる。医薬組成物の様々な成分のpH及び正確な濃度は、当技術分野における通常の慣行に従って調整することができる。Goodman及びGilmanの文献、治療薬の薬理学的基礎(Pharmacological Basis for Therapeutics)を参照されたい。
【０６３３】
本発明の医薬組成物の作製において、活性成分は、通常、賦形剤(例えば、凍結乾燥製剤中のもの)と混合されるか又は賦形剤によって希釈される。賦形剤が希釈剤としての役割を果たす場合、それは、固体、半固体、又は液体材料(例えば、リン酸緩衝生理食塩水)であることができ、これらは、活性成分のためのビヒクル、担体、又は媒体として作用する。したがって、該組成物は、錠剤、散剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、及びシロップ剤の形態であることができる。当技術分野で公知であるように、希釈剤の種類は、意図される投与経路によって異なり得る。結果として得られる組成物は、さらなる薬剤、例えば、防腐剤を含むことができる。製剤は:滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱油;湿潤剤;乳化剤及び懸濁化剤;防腐剤、例えば、メチル-及びプロピルヒドロキシ-ベンゾエート;甘味剤;並びに着香剤をさらに含むことができる。他の例示的な賦形剤は、医薬賦形剤のハンドブック(Handbook of Pharmaceutical Excipients)、第6版、Roweら編、Pharmaceutical Press(2009)に記載されている。防腐剤としては、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスを挙げることができる。
【０６３４】
これらの医薬組成物は、従来の方法で、例えば、従来の混合、溶解、造粒、ドラジェ製造、粉末化、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥プロセスによって製造することができる。製剤を製造するための当技術分野で周知の方法は、例えば、レミントン:薬学の科学及び実践(Remington: The Science and Practice of Pharmacy)、第21版、Gennaro編、Lippencott Williams & Wilkins(2005)、及び製薬工学百科事典(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology)、J. Swarbrick及びJ. C. Boylan編、1988-1999, Marcel Dekker, New Yorkに見られる。適切な製剤は、選択される投与経路によって決まる。そのような組成物の製剤化及び調製は、医薬製剤の分野の当業者に周知である。製剤の調製において、ポリヌクレオチド又はコンジュゲートを粉砕して、他の成分と組み合わせる前に適当な粒径を提供することができる。
【０６３５】
(投与経路)
本発明の医薬組成物は、局所又は全身投与することができる。治療有効量は、対象における疾患進行の程度、個体の年齢、性別、及び体重などの要因によって異なる。投薬レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整することができる。例えば、数回の分割した用量を毎日投与することができ、又は治療状況の緊急性による適応通りに、用量を比例的に低下させることができる。
【０６３６】
当業者によって理解されるように、本発明の医薬組成物は、選択された投与経路に応じて、種々の形態で患者に投与することができる。本明細書に記載される方法において使用されるポリヌクレオチド及び/又はコンジュゲートは、例えば、非経口投与によって投与することができる。非経口投与は、筋肉内、静脈内、動脈内、頭蓋内、皮下、眼窩内、脳室内、脊髄内、髄腔内、腹腔内、直腸、及び局所の投与経路を含むことができる。局所の投与経路は、経皮、皮内、口腔内、及び舌下の投与経路を含むことができる。医薬組成物は、選択された投与経路に従って製剤化される。非経口投与は、選択された期間にわたる連続注入によるものであってもよい。該ポリヌクレオチド及び/又はコンジュゲートは、望ましくは、医薬として許容し得る担体とともに投与される。本明細書に記載される障害の治療のために製剤化される本明細書に記載されるポリヌクレオチド及び/又はコンジュゲートの医薬製剤も、本発明の一部である。
【０６３７】
(非経口投与のための製剤)
本明細書に記載される本発明の免疫調節(例えば、免疫刺激)ポリヌクレオチド及び/又はコンジュゲートは、それを必要としている患者に、本明細書に記載される医薬として許容し得る非経口(例えば、静脈内、筋肉内、又は皮下)製剤として投与することができる。医薬製剤は、従来の無毒な医薬として許容し得る担体及びアジュバントを含有する剤形又は製剤として、非経口(例えば、静脈内、筋肉内、又は皮下)投与することもできる。特に、非経口投与に好適な製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、及び製剤を患者の血液と等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性の滅菌注射溶液;並びに懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。例えば、そのような組成物を調製するために、本発明の免疫調節ポリヌクレオチド又はコンジュゲートは、非経口的に許容し得る液体ビヒクルに溶解又は懸濁させることができる。利用することができる許容し得るビヒクル及び溶媒には、水、適量の塩酸、水酸化ナトリウム、又は好適な緩衝剤の添加により好適なpHに調整された水(例えば、リン酸緩衝生理食塩水)、1,3-ブタンジオール、リンガー溶液、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。水性製剤は、1以上の防腐剤、例えば、メチル、エチル、又はn-プロピル p-ヒドロキシベンゾエートを含有することもできる。非経口製剤に関するさらなる情報は、例えば、引用により本明細書中に組み込まれる、米国薬局方(United States Pharmacopeia)−国民医薬品集(National Formulary)(USP-NF)に見出すことができる。
【０６３８】
本発明のコンジュゲートの非経口製剤は、USP-NFによって非経口投与に好適であると確認された4つの一般的なタイプの調製物のうちのいずれか1つであることができる:
(1)「注射用薬物」:薬物注射液として非経口投与用の適当な滅菌ビヒクルと組み合わされる乾燥(例えば、凍結乾燥)固体としての原薬(例えば、本発明のコンジュゲート);
(2)「薬物注射用乳剤」:好適なエマルジョン媒体に溶解又は分散している原薬(例えば、本発明のコンジュゲート)の液体調製物;
(3)「薬物注射用懸濁液」:好適な液体媒体に懸濁している原薬(例えば、本発明のコンジュゲート)の液体調製物;及び
(4)「注射懸濁液用薬物」:薬物注射用懸濁液として非経口投与用の適当な滅菌ビヒクルと組み合わされる乾燥固体としての原薬(例えば、本発明のコンジュゲート)。
【０６３９】
非経口投与用の例示的な製剤としては、界面活性剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースと好適に混合された水中で調製されたポリヌクレオチド及び/又はコンジュゲートの溶液が挙げられる。分散剤は、グリセロール、液体ポリ(エチレングリコール)、DMSO、及びアルコールを含む又は含まないこれらの混合物中で、並びに油中で調製することもできる。通常の貯蔵及び使用条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含有し得る。好適な製剤の選択及び調製のための従来の手順及び成分は、例えば、レミントン:薬学の科学及び実践(Remington: The Science and Practice of Pharmacy)、第21版、Gennaro編、Lippencott Williams & Wilkins(2005)及び2013年に刊行された米国薬局方:国民医薬品集(The United States Pharmacopeia: The National Formulary)(USP 36 NF31)に記載されている
【０６４０】
生体適合性で生分解性のラクチドポリマー、ラクチド/グリコリドコポリマー、又はポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンコポリマーを用いて、該ポリヌクレオチド及び/又はコンジュゲートの放出を制御することができる。ポリヌクレオチド及び/又はコンジュゲートのための他の潜在的に有用な非経口送達系としては、エチレン-酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、又は移植可能な注入システムが挙げられる。非経口製剤は、該ポリヌクレオチド及び/又はコンジュゲートの迅速な放出のために又は持続性/延長放出のために製剤化することができる。ポリヌクレオチド又はコンジュゲートの非経口放出のための例示的な製剤としては:水性溶液、再構成用の粉末、共溶媒溶液、油/水乳剤、懸濁液、マイクロスフェア、及びポリマーゲルが挙げられる。
【０６４１】
以下の実施例は、本発明を例示することを意図している。これらは、本発明を限定することを決して意図していない。
【実施例】
【０６４２】
(実施例)
(実施例1.ヌクレオチド及びポリヌクレオチドの合成及び精製)
免疫調節ポリヌクレオチド及びそのための前駆体の例示的な合成は、以下で記載されている。
【０６４３】
(前駆体)
本発明のポリヌクレオチドの調製において有用な前駆体は、WO 2015/188197号に提供されている(例えば、PEG鎖を含有するホスホロアミダイト、標的化部分、及び生体可逆性基)。
【０６４４】
(ホスホロアミダイト及び他のモノマー)
本発明のポリヌクレオチドの合成において有用なヌクレオシド含有中間体は、WO 2015/188197号に開示されている(例えば、WO 2015/188197号における化合物U1-U54、A1-A15、C1-9、及びG1-G12)。
【０６４５】
市販のホスホロアミダイトは、Glen Research(Sterling, VA)又はChemGenes(Wilmington, MA)から購入した。必要な場合、他のホスホロアミダイトは、本明細書中の別所に記載されている標準的な反応条件を用いて、適切に保護されたヌクレオシドから調製した。
【０６４６】
(化合物S61B)
【化１２９】
2020512843.tif 000140
S61(0.48g、2.0mmol)のDCM(5.0mL)溶液に、S61A(0.60g、2.0mmol)及びETT(アセトニトリル中0.25M、4.8mL、1.2mmol)を添加した。混合物を2時間撹拌した。揮発性物質の蒸発により残渣が得られ、これを、酢酸エチル/ヘキサン(Combi Flash Rf装置で0〜30％勾配)を用いるフラッシュシリカゲルカラム精製に供すると、化合物S61Bが無色の油状物(0.49g、55％)として得られた。
【化１３０】
2020512843.tif 000141
【０６４７】
(化合物S108)
【化１３１】
2020512843.tif 000142
ジオキサン(100mL)中の2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エタノール(S108A、25.0g、167mmol)とN-メチルモルホリン(21.0mL、191mmol)の撹拌混合物に、Fmoc-OSu(62.2g、184mmol)のジオキサン(50mL)溶液を滴加した。一晩撹拌した後、反応液を真空中で濃縮すると、薄黄色の油状物が得られた。粗製物をEtOAcに再溶解させ、飽和NaHCO3(水性)及びブラインで洗浄した。有機層を真空中で除去すると、油状物が得られ、これをSiO2クロマトグラフィーにより精製すると、FmocNH-PEG2-OH(S108、55g、88％収率)が得られた。ESI+ m/z  計算値371.4、実測値372.2[M+H]+。
【０６４８】
(X1及びX2脱塩基スペーサー合成−一般的なスキーム:)
【化１３２】
2020512843.tif 000143
(化合物S110)
【化１３３】
2020512843.tif 000144
0℃、アルゴン下のNaH(13.2g、鉱油中60％、230.0mmol)のTHF(40mL)懸濁液に、ジオール(S109、4.92g、22.0mmol)のTHF(20mL)を滴加し;得られた混合物を室温に温め、1時間撹拌した。反応混合物を0℃に冷却し、臭化プロパルギル(18.6g、158.4mmol)のTHF(25mL)溶液をゆっくりと添加し、得られた混合物を室温に温め、40℃で一晩撹拌した。TLCにより観察して、生成物が消費された後、反応液を水の滴加により0℃でクエンチし、得られた混合物をジクロロメタン(50mL×2)で抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、蒸発させると、残渣が得られ、これを、ISCOコンパニオン(ヘキサン/酢酸エチル、0〜30％)を用いるフラッシュシリカゲルカラムにより精製すると、5.92g(89.5％)の化合物S110が油状物として得られた。
【化１３４】
2020512843.tif 000145
C18H20O4のESI MS  計算値300.34、観測値[M+H]+ 301.3。
【０６４９】
(化合物S111)
【化１３５】
2020512843.tif 000146
ビス-プロパルギル化合物S110(5.9g、19.64mmol)を酢酸/水混合物(60mL、75:25)に溶解させ、反応を50℃で2時間継続した。反応の終了後、溶液を蒸発させ、トルエン(2×20mL)とともに共蒸発させた。残渣を、ISCOコンパニオン(ヘキサン/酢酸エチル、20〜80％)を用いるフラッシュシリカゲルカラムを用いて、後処理なしでそのまま精製すると、3.02g(72.5％)の化合物S111が油状物として得られた。
【化１３６】
2020512843.tif 000147
C11H16O4のESI MS  計算値212.24、観測値[M+H]+ 213.2。
【０６５０】
(化合物S112)
【化１３７】
2020512843.tif 000148
0℃のジオールS111(3.0g、14.2mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(3.15mL、17.0mmol)、及びDMAP(0.36g、2.83mmol)のジクロロメタン(25mL)溶液に、塩化ジメトキシトリチル(4.8g、14.2mmol)のジクロロメタン(40mL)溶液を滴加し、反応を室温で一晩継続した。混合物をジクロロメタンで希釈し、水、その後、ブラインで洗浄し、有機層を無水Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた残渣を、ISCOコンパニオン(ヘキサン/酢酸エチル、0〜40％)を用いるフラッシュシリカゲルカラムにより精製すると、5.29g(73％)のモノDMT保護化合物S112が白色の固体として得られた。
【化１３８】
2020512843.tif 000149
C32H34O6のESI MS  計算値514.6、観測値[M+Na]+ 537.4。
【０６５１】
(化合物S113)
【化１３９】
2020512843.tif 000150
DMT保護化合物S112(0.5g、0.98mmol)のジクロロメタン(4mL)溶液に、2'-シアノエチル-N,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロアミダイト(0.58g、1.95mmol)のジクロロメタン(3mL)溶液を室温で滴加し、その後、5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(BTT; 0.25Mアセトニトリル溶液、0.78mL、0.18mmol)をアルゴン雰囲気下で滴加した。出発材料が消失するまで(2時間)、反応を継続し、粗混合物を20mLのジクロロメタンで希釈し、飽和NaHCO3溶液(10mL)及びブライン(10mL)で順次洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させた。溶媒を真空中で蒸発させ、粗混合物を、共溶媒としての3％トリエチルアミンを有する酢酸エチル/ヘキサン(Combi Flash Rf装置で0〜30％勾配)を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製すると、0.53gの化合物S113(75％)が油状物として得られた。C41H51N2O7PのESI MS  計算値714.82、観測値715.6[M+H]+;
【化１４０】
2020512843.tif 000151
【０６５２】
(化合物S114)
【化１４１】
2020512843.tif 000152
アルゴン雰囲気下、8.0mLの無水ジクロロメタン中の-78℃のDMT保護化合物S112(0.98g、1.9mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.39mL、2.09mmol)の溶液に、ビス-(N,N-ジイソプロピルアミノ)-クロロホスフィン(0.56g、2.09mmol)のジクロロメタン(4.0mL)溶液を滴加した。撹拌を1時間持続しながら、反応混合物を室温に温めておいた。2.0mLの無水ジクロロメタン中の3-ブチン-1-オール(0.14g、1.9mmol)の溶液を室温で添加し;得られた混合物を10分間撹拌し、その時点で、0.25M ETTのアセトニトリル(4.6mL、1.15mmol)溶液を添加し、さらに3時間撹拌し続けた。TLCによる出発材料の消失によって観察される反応の終了後、粗混合物を20mLのジクロロメタンで希釈し、飽和NaHCO3溶液(10mL)及びブライン(10mL)で順次洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させた。揮発性物質を真空中で蒸発し、粗混合物を、溶媒系としての3％トリエチルアミンを含む酢酸エチル/ヘキサン(Combi Flash Rf装置で0〜40％勾配)を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製すると、0.33gの化合物S114(25％)が油状物として得られた。C42H52NO7PのESI MS  計算値713.83、観測値714.7[M+H]+;
【化１４２】
2020512843.tif 000153
【０６５３】
(X3及びX4脱塩基スペーサー合成−一般的なスキーム:)
【化１４３】
2020512843.tif 000154
(化合物S116)
【化１４４】
2020512843.tif 000155
化合物S116を、化合物S110について記載されているプロトコルを用いて、91％収率で油状物として調製した。
【化１４５】
2020512843.tif 000156
C13H14O3のESI MS  計算値218.24、観測値[M+H]+ 219.2。
【０６５４】
(化合物S117)
【化１４６】
2020512843.tif 000157
化合物S117を、化合物S111について記載されているプロトコルを用いて、91％収率で油状物として調製した。
【化１４７】
2020512843.tif 000158
C6H10O3のESI MS  計算値130.14、観測値[M+Na]+ 153.0。
【０６５５】
(化合物S118)
【化１４８】
2020512843.tif 000159
化合物S118を、化合物S112について記載されているプロトコルを用いて、54％収率で白色の固体として調製した。
【化１４９】
2020512843.tif 000160
C27H28O5のESI MS  計算値432.50、観測値[M+Na]+ 455.4。
【０６５６】
(化合物S119)
【化１５０】
2020512843.tif 000161
化合物S119を、化合物S113について記載されているプロトコルを用いて、86％収率で油状物として調製した。C36H45N2O6PのESI MS  計算値432.72、観測値433.5[M+H]+;
【化１５１】
2020512843.tif 000162
【０６５７】
(化合物S120)
【化１５２】
2020512843.tif 000163
化合物S120を、化合物S114について記載されているプロトコルを用いて、47％収率で油状物として調製した。C37H46NO6PのESI MS  計算値431.73、観測値432.5[M+H]+;
【化１５３】
2020512843.tif 000164
【０６５８】
(X5及びX6脱塩基スペーサー合成−一般的なスキーム:)
【化１５４】
2020512843.tif 000165
(化合物S121)
【化１５５】
2020512843.tif 000166
S116(4.0g、22.2mmol)のジオキサン(25mL)溶液に、最小量の水に溶解したKOH(0.12g、2.2mmol)の溶液を添加し、得られた混合物を室温で少なくとも30分間撹拌した。該混合物を0℃に冷却し、アクリロニトリル(2.35g、44.4mmol)のジオキサン(15mL)溶液を滴加し、得られた混合物を室温で一晩反応させておいた。揮発性物質を真空中で蒸発し、残渣を水で希釈し、pHを中性付近に調整した。粗生成物を酢酸エチル(2×50mL)で抽出し、合わせた有機層をブラインで洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、蒸発させると、残渣が得られ、これを、ISCOコンパニオン(ジクロロメタン/メタノール、0〜5％)を用いるフラッシュシリカゲルカラムにより精製すると、3.1g(60％)の化合物S121が白色の固体として得られた。
【化１５６】
2020512843.tif 000167
C13H15NO3のESI MS  計算値233.2、観測値[M+Na]+ 256.3。
【０６５９】
(化合物S122)
【化１５７】
2020512843.tif 000168
0℃の水素化アルミニウムリチウム(0.83g、4.0mmol)のTHF(10mL)懸濁液に、化合物S121(1.28g、5.5mmol)のTHF(15mL)溶液を滴加し、得られた混合物を室温に温め、3時間撹拌し続けた。反応の終了後、反応混合物を0℃に冷却し、必要な場合、水の滴加によりクエンチした(約2〜3mL)。追加の約8mLの水を添加し、粗生成物を酢酸エチル(2×25mL)中に抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、蒸発させると、化合物S122が得られ、これを、それ以上精製することなく、次の工程で使用した。
【化１５８】
2020512843.tif 000169
C13H19NO3のESI MS  計算値237.2、観測値[M+H]+ 238.2。
【０６６０】
(化合物S123)
【化１５９】
2020512843.tif 000170
0℃のジクロロメタン(8mL)中の化合物S122(1.0g、4.2mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(2.3mL、12.6mmol)に、Fmoc-OSu(1.7g、5.0mmol)の溶液を滴加し、得られた混合物を室温で3時間反応させておいた。終了後、反応混合物をジクロロメタン(10mL)で希釈し、水、その後、ブラインで洗浄した。有機層を分離し、無水Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、蒸発させると、残渣が得られた。該残渣を、ISCOコンパニオン(ヘキサン/酢酸エチル、0〜50％)を用いるフラッシュシリカゲルカラムにより精製すると、0.65g(35％)の化合物S123が白色の固体として得られた。
【化１６０】
2020512843.tif 000171
C28H29NO5のESI MS  計算値459.5、観測値[M+Na]+ 482.5。
【０６６１】
(化合物S124)
【化１６１】
2020512843.tif 000172
化合物S124を、化合物S111について記載されているプロトコルを用いて、定量的収率で油状物として調製した。
【化１６２】
2020512843.tif 000173
C21H25NO5のESI MS  計算値371.4、観測値[M+Na]+ 394.3。
【０６６２】
(化合物S125)
【化１６３】
2020512843.tif 000174
化合物S125を、化合物S112について記載されているプロトコルを用いて、48％の生成物(S125)収率で白色の固体として調製した。
【化１６４】
2020512843.tif 000175
C42H43NO7のESI MS  計算値673.7、観測値[M+Na]+ 696.7。
【０６６３】
(化合物S126)
【化１６５】
2020512843.tif 000176
化合物S126を、化合物S113について記載されているプロトコルを用いて、78％の生成物(S126)収率で油状物として調製した。C51H60N3O8PのESI MS  計算値874.0、観測値896.9[M+Na]+、913.0[M+K]+;
【化１６６】
2020512843.tif 000177
【０６６４】
(脱塩基スペーサーS131の合成−一般的なスキーム:)
【化１６７】
2020512843.tif 000178
(化合物S127)
【化１６８】
2020512843.tif 000179
アルゴン下のS109(2.56g、11.4mmol)のジクロロメタン(50mL)溶液に、ブロモアセトニトリル(3.01g、25.1mmol)、酸化銀(I)(5.28g、22.8mmol)、及びヨウ化テトラブチルアンモニウム(0.84g、2.28mmol)を添加し、得られた混合物を一晩撹拌した。該混合物をセライト(登録商標)上で濾過し、濾液を蒸発させると、黒色の残渣が得られ、これを、ISCOコンパニオン(ヘキサン/酢酸エチル、15〜90％)でのフラッシュシリカゲルカラム精製に供すると、1.34g(39％)の所望の化合物S127が粘性のある油状物として得られた。C16H18N2O4のESI MS  計算値302.3、観測値[M+H]+ 303.3。
【０６６５】
(化合物S128)
【化１６９】
2020512843.tif 000180
化合物S127(1.34g、4.43mmol)のTHF(30mL)溶液に、LiAlH4のTHF(2M、8.9mL、17.7mmol)溶液をアルゴン下で添加し、混合物を55℃まで4時間加熱した。THF(2M、4mL、8.0mmol)中のLiAlH4の別の部分を添加し、4時間撹拌し続けた。反応の終了後、混合物を室温に冷却し、Na2SO4.10H2Oでクエンチした。固体を濾過除去し、酢酸エチルで洗浄した。濾液を無水Na2SO4上で乾燥させた。混合物を濾過し、蒸発させると、残渣が得られ、これをジクロロメタン(20mL)に溶解させた。この溶液に、Fmoc-OSu(1.5g、4.43mmol)及びDIEA(0.87mL、5.0mmol)を添加した。混合物を1時間撹拌し、その後、蒸発させると、残渣が得られ、これをISCOコンパニオン(ヘキサン/酢酸エチル、20〜90％)でのフラッシュシリカゲルカラム精製に供すると、1.04g(31％)の化合物S128が白色の泡状物として得られた。
【化１７０】
2020512843.tif 000181
C46H46N2O8のESI MS  計算値754.9、観測値[M+H]+ 755.3。
【０６６６】
(化合物S129)
【化１７１】
2020512843.tif 000182
化合物S128(1.1g、1.51mmol)をAcOH/H2O混合物(10mL、3:1)に溶解させ、反応を55℃で5時間継続した。反応の終了後、揮発性物質を蒸発させ、トルエン(2×20mL)とともに共蒸発させ、残渣をISCOコンパニオン(ヘキサン/酢酸エチル、30〜100％)でのフラッシュシリカゲルカラム精製に供すると、0.54g(54％)の化合物S129が白色の泡状物として得られた。
【化１７２】
2020512843.tif 000183
C39H42N2O8のESI MS  計算値666.7、観測値[M+H]+ 667.3。
【０６６７】
(化合物S130)
【化１７３】
2020512843.tif 000184
0℃のジオールS129(0.73g、1.1mmol)、DIPEA(0.19mL、1.1mmol)、及びDMAP(0.013g、0.11mmol)のジクロロメタン(6mL)溶液に、DMTrCl(0.34g、0.99mmol)のジクロロメタン(1mL)溶液を滴加した。得られた混合物を室温に温め、一晩撹拌した。混合物を蒸発させると、残渣が得られ、これをISCO(ヘキサン/酢酸エチル、20〜100％)でのフラッシュシリカゲルカラム精製に供すると、0.47g(44％)のモノジメトキシトリチル保護化合物S130が白色の泡状物として得られた。
【化１７４】
2020512843.tif 000185
C60H60N2O10のESI MS  計算値969.1、観測値[M+Na]+ 991.3。
【０６６８】
(化合物S131)
【化１７５】
2020512843.tif 000186
ビス-(N,N-ジシオプロピルアミノ(disiopropylamino))-クロロホスフィン(0.085g、0.32mmol)の無水CH2Cl2(1.0mL)溶液を3-Fmoc-アミノ-プロパン-1-オール(0.090g、0.30mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.18mL、1.05mmol)の無水CH2Cl2(3.0mL)に-78℃で滴加した。反応混合物を室温に温め、1.5時間撹拌した。1.0mLの無水CH2Cl2中の化合物S130(0.30g、0.30mmol)の溶液を添加し、得られた混合物を10分間撹拌した。ETT(0.72mL、アセトニトリル中0.25M、0.18mmol)の溶液を反応混合物に添加し、得られた混合物を3時間撹拌した。該混合物をCH2Cl2(20mL)で希釈し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液(20mL)及びブライン(20mL)で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾液を真空中で蒸発させると、残渣が得られ、これを、共溶媒系としての3％トリエチルアミンを含む酢酸エチル/ヘキサン(0〜30％勾配)用いるISCOコンパニオン上でのフラッシュシリカゲルカラム精製に供すると、0.12gの生成物S131(32％)が白色の泡状物として得られた。C84H91N4O13PのESI MS  計算値1395.6、観測値1395.7[M]+;
【化１７６】
2020512843.tif 000187
【０６６９】
(化合物dT4)
【化１７７】
2020512843.tif 000188
(FmocNH-PEG2-ヒドロキシル-ジイソプロピルアミノ-dT(5'-DMT)ホスホロアミダイト(dT4)の合成)
5'-DMT-デオキシチミジン(4.30g、7.89mmol)及びDIEA(1.51mL、8.68mmol)のCH2Cl2(40mL)撹拌懸濁液をアルゴン下で-78℃に冷却した。ビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン(2.32g、8.68mmol)のCH2Cl2(10mL)溶液を滴加した。混合物を冷却浴から取り出し、1時間撹拌した。CH2Cl2(15mL)中のFmocNH-Peg2-OH(S108、2.93g、7.89mmol)を、反応混合物に添加し、その後、ETT(アセトニトリル中0.25M、18.9mL)の溶液に添加した。一晩撹拌した後、混合物を真空中で濃縮し、EtOAcに再溶解させ、飽和NaHCO3(水性)及びブラインで洗浄した。有機層を真空中で除去すると、白色の泡状物が得られた。この粗材料をSiO2クロマトグラフィーにより精製すると、表題ホスホロアミダイト(dT4、4.1g、50％収率)が得られた。
【０６７０】
上記の合成プロトコルを様々なトリエステルの他のホスホロアミダイト前駆体の合成に使用した。
【０６７１】
(化合物dU6)
【化１７８】
2020512843.tif 000189
Ar(g)下、室温のdU1(3.3g、5.0mmol)、1-メチルイミダゾール(1.2mL、15.0mmol)、及びヨウ素(1.9g、15.0mmol)のTHF(10mL)溶液に、塩化tert-ブチルジメチルシリル(0.8g、5.5mmol)のTHF(5mL)を撹拌しながら滴加した。反応液を室温で1時間撹拌した。TLCにより、反応の終了が確認された。溶媒を真空中で除去し、粗製物を酢酸エチルに溶解させ、水性Na2S2O3(濃縮)で洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、液体を蒸発させた。粗製物を、ISCOコンパニオン(ヘキサン/酢酸エチル、0〜50％)を用いるフラッシュシリカゲルカラムにより精製すると、dU2が固体として定量的収率で得られた。NMRは、発表されたものと一致している。Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 9, 3962-3971。
【０６７２】
トリイソプロピルシラン(1.0mL、5.0mmol)を含む80％水性酢酸溶液(40mL)に溶解したdU2(3.9g、5.0mmol)の溶液を室温で1時間撹拌した。TLCにより、反応の終了が確認された。溶媒を真空中で除去した。粗製物を、ISCOコンパニオン(ヘキサン/酢酸エチル、0〜60％)を用いるフラッシュシリカゲルカラムにより精製すると、1g(43％)の所望の化合物dU3が固体として得られた。C15H25IN2O5SiのESI MS  計算値468.4、観測値[M+Na]+ 491.0。
【０６７３】
Ar(g)下、氷水浴中で0℃に冷却されたdU3(1.0g、2.2mmol)のTHF(20mL)溶液に、水素化ナトリウム(60％分散、0.2g、4.7mmol)を添加した。反応液を0℃で30分間撹拌した。ヨードメタン(0.7mL、10.8mmol)を滴加し、反応液を0℃で3時間撹拌した。RP-HPLC/MSにより、反応の終了が確認された。反応液を20mLのメタノールで0℃でクエンチし、室温に温めた。水性NaHCO3(飽和)を添加し、混合物をCH2Cl2で抽出した。有機相をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、液体を真空中で濃縮した。シリカゲルカラムクロマトログラフィー(ヘキサン/酢酸エチル、0〜50％)による精製により、固体dU4(0.6g、58％収率)が得られた。C16H27IN2O5SiのESI MS  計算値482.4、観測値[M+H]+ 483.1。
【０６７４】
フッ化tert-ブチルアンモニウム(1M THF、3mL、3.0mmol)を滴加した。
【０６７５】
【０６７６】
【０６７７】
((5-アジドバレリル)- ε-N-Bocリジン(PP1)の調製)
ε-N-Bocリジン(9.46g、38.4mmol)及びK2CO3(2.67g、19.3mmol)を1:1のTHF:H2O(60mL)に溶解させた。THF(10mL)中のペンタフルオロフェニル-5-アジドバレレート(10.8g、34.9mmol)を添加し、反応液を室温で一晩撹拌した。所望の生成物をRP-HPLC-MSにより観測した。394.2[M+Na]。反応液を1N HCl(水性)による滴定によりpH 5に酸性化し、生成物をEtOAc(3×100mL)で抽出した。有機層をH2O(50mL)及びブライン(50mL)で順次洗浄した。有機層をMgSO4上で乾燥させ、真空中で濃縮すると、濃いシロップが得られた。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製すると、所望の生成物PP2が白色の針状物(8.1g、62％収率)として得られた。ESI MS+ C16H29N5O5の質量計算値: 371.4、実測値: 394.2[M+Na]+。
【０６７８】
(PP1のペグ化の一般的なプロトコル:(5-アジドバレリル)-ε-N-(NH-Boc PEG24)リジン(PP4)の調製)
PP1(0.74g、2.0mmol)をHCl(2mL、ジオキサン中4N)で4時間処理した。HPLC-MSにより、完全な脱保護が示された。272.2[M+H]+。反応液を1:1のH2O:アセトニトリル(10mL)で希釈し、凍結させ、一晩凍結乾燥させると、PP2が白色の固体として定量的収率で得られた。DMF(3mL)中のNHBoc-PEG24酸(1.1g、0.88mmol)を、HATU(0.34g、0.88mmol)、HOBt(0.14g、0.88mmol)、及びDIEA(0.7mL、4.0mmol)で活性化し、その後、PP2(0.24g、0.8mmol)で2時間処理した。RP-HPLCMSにより、所望のPP4の形成が示された。粗製物をRP-HPLCにより精製すると、PP4が白色の固体(0.55g、46％収率)として得られた。ESI MS+ C67H130N6O30の質量計算値: 1499.77、実測値: 1499.9[M+H]+、1400.8[M-Boc]+。
【０６７９】
【化１７９】
2020512843.tif 000190
ビスPegX-NH2及びトリスPegX-NH2(ここで、X＝様々なPEG長)を、WO2015/188197号に記載されている手順を用いて、市販の出発材料から調製した。
【０６８０】
(PP2、PP3、及びPP4のペグ化の一般的なプロトコル:)
DMF(1mL)に溶解したリジンPP1(38mg、0.1mmol)を、HATU(37mg、0.1mmol)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(49mL、0.3mmol)、及びmPEG48-NH2(200mg、0.09mmol)で処理した。RP-HPLC-MSにより、PP1への完全なPEG48付加が示された。粗製物をRP-HPLCにより精製すると、NHBoc PP7が白色の固体(97mg、42％収率)として得られた。ESI MS+ C113H224N6O52の質量計算値: 2499.03、実測値: 833.7[M+3H]3+、625.6[M+4H]4+。PP7をHCl(2mL、ジオキサン中4N)で4時間脱保護した。HPLC-MSにより、出発材料の質量を有するピークの消失によって観測される、完全な脱保護が示された。反応液を1:1のH2O:アセトニトリル(10mL)で希釈し、凍結させ、一晩凍結乾燥させると、白色の固体PP8が定量的に得られた。ESI MS+ C108H216N6O50の質量計算値: 2398.88、実測値: 1199.8[M+2H]2+、800.3[M+3H]3+、600.5[M+4H]4+、480.6[M+5H]5+。
【０６８１】
【化１８０】
2020512843.tif 000191
このスキームにおいて、条件は:
A)6-メチテトラジン(methytetrazine)-OSu、HATU、ヒューニッヒ塩基、DMF;及び
B)DBCO-CpG、アセトニトリル/H2O;
であり、ここで、6-メチルテトラジン-OSuは、以下の式:
【化１８１】
2020512843.tif 000192
のものであり、
DBCO-CpGは、以下の式:
【化１８２】
2020512843.tif 000193
のものである。
【０６８２】
(ポリヌクレオチド(PP28及びPP30)がロードされたリンカーの調製のための一般的なプロトコル)
(PP12及びPP16のテトラジン-コンジュゲーション処理:)
PP12(43mg、0.12mmol)をDMF(0.5mL)に溶解させ、HATU(4.6mg、0.12mmol)、DIEA(12.7μL、0.73mmol)、及び5分後に、6-メチル-テトラジン-OSu(19.9mg、0.61mmol)で処理した。粗反応液を室温で30分間撹拌した。RP-HPLCMSにより、6-メチル-テトラジンカルボキシレートとPP12との完全なカップリングが示された。粗製物をRP-HPLCにより精製し、プール画分を凍結乾燥させると、PP27が紫色の固体(39mg、85％収率)として得られた。ESI MS+質量計算値C170H325N11O76: 3739.47、実測値: 833.7[M+3H]3+、625.6[M+4H]4。純粋なPP27を、DBCO-CpGを含むアセトニトリル:水(1:1)中で処理し、37℃で1〜2時間、及び室温でさらに1時間インキュベートすると、PP28が得られた。PP28を分取AEX(20mMリン酸塩及び20mMリン酸塩-1M臭化ナトリウム)により精製した。
【０６８３】
(CpGがロードされたリンカーPP28及びPP30への代替ワンポット経路)
PP12(400nmol)をDBCO-CpG(420nmol)を含むアセトニトリル:水(1:1)中で処理し、37℃で1〜2時間、その後、室温でさらに1時間インキュベートする。DMSOストック溶液中のテトラジン-OSu(4000nmol)を粗PP12-DBCO-CpG溶液に添加し、紫色の溶液を室温で3時間又は1〜2時間反応させると、PP28が得られる。粗PP28を分取RP-HPLC(水及び10％アセトニトリル:水中の50mM TEAA)又は分取AEX(20mMリン酸塩及び20mMリン酸塩-1M臭化ナトリウム)により精製した。
【０６８４】
【化１８３】
2020512843.tif 000194
(テトラジン-PEG24-OPFP(PP32)の調製)
Ar(g)下のアミノ-PEG24-カルボン酸(1.0g、0.9mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(0.8mL、4.4mmol)のDMF/水(1:1、12mL)溶液に、DMF(3mL)中のメチルテトラジンフェニルアセチルスクシンイミジルエステル(370mg、1.1mmol)を撹拌しながら滴加した。反応液を室温で2時間撹拌した。RP-HPLC/MSにより、生成物の形成が示された。溶媒を真空中で除去し、粗製物をRP-HPLC(TFA調節剤)により精製すると、1.1g(80％)のPP31が得られた。C62H111N5O27のESI MS  計算値1358.56、観測値[M+H]+ 1358.8。Ar(g)下のPP31(109mg、0.08mmol)のジクロロメタン(3mL)溶液に、無水ピリジン(32mg、0.4mmol)及びペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート(67mg、0.24mmol)を添加した。反応液を室温で一晩撹拌した。溶媒を真空中で除去した。粗生成物をEtOAcに再溶解させ、水性NaHCO3(5％w/v)(3回)及びブライン(1回)で洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮すると、PP32が定量的に得られた。それ以上精製することなく、次の工程で使用した。C68H110F5N5O27のESI MS  計算値1524.61、観測値[M+2H]2+ 763.0。
【０６８５】
【化１８４】
2020512843.tif 000195
(PP34の調製)
Ar(g)下のmPEG48-アミン(2.15g、1.00mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(0.87mL、5.00mmol)のDMF/水(1:1、10mL)溶液に、DMF(5mL)中のNα-Cbz-Nε-Boc-L-リジンスクシンイミジルエステル(570mg、1.2mmol)を撹拌しながら滴加した。反応混合物を室温で2時間撹拌した。RP-HPLC/MSにより、生成物PP33の形成が示された。反応混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー(CH2Cl2:MeOH 0〜10％)により精製した。回収されたPP33を次の反応でそのまま使用した。C116H223N3O53のESI MS  計算値2508.0、観測値[M+3H]3+ 836.7,[M+4H]4+ 627.9。PP33(1.00mmol)のMeOH溶液を窒素(g)でフラッシュし、パラジウム/活性炭(10％wt、触媒)を添加した。この溶液に、真空引きと水素(g)によるパージを交互に行った(3回)。2時間後のRP-HPLC/MSにより、PP34の形成が示された。不均一な混合物をセライト床に通して濾過し、大量のメタノールで洗浄した。真空中での溶媒の除去により、PP34(2工程かけて、2.0g、84％収率)が得られた。C108H217N3O51のESI MSの計算値2373.87、観測値[M+3H]3+ 792.0。
【０６８６】
【化１８５】
2020512843.tif 000196
(PP37の調製)
Ar(g)下のPP32(124mg、0.08mmol)及びジイソプロピルエチルアミン(31mg、0.24mmol)のDMF/水(1:1、10mL)溶液に、DMF/水(1:1、10mL)中のPP34(230mg、0.1mmol)を撹拌しながら滴加した。反応液を室温で2時間撹拌し、RP-HPLC/MSにより、生成物PP35の形成が示された。溶媒を真空中で除去し、PP35を、それ以上精製することなく、次の工程で使用した。C170H326N8O77のESI MS  計算値3714.4、観測値[M+4H]4+ 929.5、[M+5H]5+ 743.8。粗PP35(0.08mmol)を、Ar(g)下、HCl(ジオキサン中4N、5mL)で処理した。反応液を室温で2時間撹拌し、RP-HPLC/MSにより、Boc保護基の完全な除去が示された。溶媒を真空中で除去し、アミンをDMF(5mL)及びジイソプロピルエチルアミン(140uL、0.8mmol)中のビス-Peg3-PFPエステル(230mg、0.4mmol)の溶液でアシル化した。2時間後、RP-HPLC/MSにより、生成物PP37の形成が示された。溶媒を真空中で除去し、粗製物をRP-HPLC(TFA調節剤)により精製すると、PP37が31mgのテトラTFA塩として8.7％収率で得られた。C181H333F5N8O81のESI MSの計算値4012.56、観測値[M+3H]3+ 1338.3、[M+4H]4+ 1004.0、[M+5H]5+ 803.4、[M+6H]6+ 669。
(補助部分を含有するリンカーのリスト:)
【化１８６】
2020512843.tif 000197
【表１】
2020512843.tif 000198
【０６８７】
上の表において、Y又はZとして特定される基は、以下の構造を有する:
【化１８７】
2020512843.tif 000199
。
【０６８８】
上の表において、「p313＋N3-バレルアミド」として特定される基Zは、p313とZとしてのN3-バレルアミドを有するリンカーとの間の付加環化反応の生成物を指す。
【０６８９】
表1に示されるホスホロアミダイトモノマーは、本明細書に及びWO 2015/188197号に記載されている標準的な合成手順を用いて合成された。
【０６９０】
キラルホスホロチオエートオリゴヌクレオチド合成で使用される二環式オキサアザホスホリジンモノマーは、Wadaの文献、J. Am. Chem. Soc. 130:16031-16037, 2008によって報告されている文献プロトコルを用いて調製された。
(表1)
【表２】
2020512843.tif 000200
2020512843.tif 000201
2020512843.tif 000202
2020512843.tif 000203
2020512843.tif 000204
2020512843.tif 000205
2020512843.tif 000206
2020512843.tif 000207
2020512843.tif 000208
(キラル脱塩基スペーサー−化合物X7、X8、X9、及びX10:)
【化１８８】
2020512843.tif 000209
(X7及びX8の合成:)
【化１８９】
2020512843.tif 000210
(X9及びX10の合成:)
【化１９０】
2020512843.tif 000211
【０６９１】
以下のものは、当技術分野で公知の方法及び本明細書に記載される方法を用いて調製することができるさらなる親水性ヌクレオシドホスホロアミダイトである:
【化１９１】
2020512843.tif 000212
(ここで、Rは、OH、任意に置換されたアミノ、又は-CO2R1(R1は、Hもしくは対イオンである)であり、nは、1〜4の整数である);
【化１９２】
2020512843.tif 000213
(ここで、Rは、OH、OAc、OMe、任意に置換されたアミノ、又はCO2R1(R1は、Hもしくは対イオンである)であり、nは、1〜51の整数である)。
【０６９２】
以下のものは、当技術分野で公知の方法及び本明細書に記載される方法を用いて調製することができるさらなる置換ヌクレオシドホスホロアミダイトである:
【化１９３】
2020512843.tif 000214
(ここで、R及びR1の各々は、独立に、H又は任意に置換されたC1-6アルキル(例えば、Me、Et、i-Pr、もしくはn-Bu)である)。
【０６９３】
以下のホスホロアミダイトは、Glen Research(Sterling, VA)もしくはChemGenes(Wilmington, MA)から購入されるか、又は本明細書に記載される標準的なプロトコルを用いて調製される:
【化１９４】
2020512843.tif 000215
。
【０６９４】
これらの中間体は、本発明のポリヌクレオチド(例えば、5'-末端修飾ヌクレオシドを含有するポリヌクレオチド)の調製において使用することができる。5'-末端修飾ヌクレオシドの非限定的な例は、5-ハロウリジン、5-アルキニルウリジン、5-ヘテロアリールウリジン、及び5-ハロシチジンである。
5'-キャッピング：
a)5'-5'-キャッピング:
【化１９５】
2020512843.tif 000216
b)5'-ホスフェート又はホスホロチオエートキャッピング:
【化１９６】
2020512843.tif 000217
【０６９５】
(小分子ベースの標的化部分の合成)
小分子ベースの標的化部分の調製に有用な例示的化合物は、WO 2015/188197号に記載されている(例えば、WO 2015/188197号に記載されている化合物M1〜M30)。
【０６９６】
(グルシトール補助部分の合成)
グルシトールベースの補助部分の調製に有用な例示的化合物は、WO 2015/188197号に記載されている(例えば、WO 2015/188197号に記載されている化合物POH1〜POH10)。
(一般的なポリヌクレオチド合成:)
(一般的なスキーム:)
【化１９７】
2020512843.tif 000218
【０６９７】
(実験の詳細:)
自動ポリヌクレオチド合成(1μmolスケール)を、以下の試薬及び溶媒を用いて、MerMade 6又は12で実施した:
酸化剤−THF/ピリジン/H2O中、0.02M I2(1サイクル当たり60秒の酸化)、
浸硫試薬II−ジチアゾール誘導体/ピリジン/アセトニトリル(6:4のピリジン:アセトニトリル中、0.05M)(1サイクル当たり60秒)
ブロック解除−3％トリクロロ酢酸(1サイクル当たり2×40秒のブロック解除)、
キャップ混合物A−THF/2,6-ルチジン/Ac2O(1サイクル当たり60秒のキャッピング)、及び
キャップ混合物B−THF中の16％メチルイミダゾール(1サイクル当たり60秒のキャッピング)
【０６９８】
標準的なポリヌクレオチド合成条件の例外は、次の通りであった:
−Uny-リンカーと呼ばれる非ヌクレオシドリンカーを有するCPG支持体を使用した。
−修飾された2'-デオキシ-ホスホロアミダイトの一部を、出発材料の溶解度に応じて、100mMまでTHF/アセトニトリル混合物(1:4)に溶解させることを除き、合成前に全ての2'-デオキシリボース-ホスホロアミダイトを100mMまで100％無水アセトニトリルに再懸濁させた。
−ホスホロアミダイト活性化を2.5倍モル濃度過剰の5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(BTT)を用いて行った。活性化された2'-デオキシリボース-ホスホロアミダイトを挿入1回当たり2×1分間のカップリングでカップリングさせ、修飾されたホスホロアミダイトを挿入1回当たり2×3分間のカップリングでカップリングさせた。
【０６９９】
【０７００】
【０７０１】
【０７０２】
【０７０３】
【０７０４】
80μLの酢酸を添加し、試料を室温で1時間静置し続け、凍結させ、凍結乾燥させた。乾燥した試料を20％アセトニトリルに再溶解させ、NAP 10(Sephadex(商標)-G25 DNA等級)カラムに通して脱塩した。最終生成物のために、回収された純粋な画分を凍結させ、凍結乾燥させた。
【０７０５】
(脱塩基スペーサーを用いる一般的なコンジュゲーションスキーム:)
(クリック反応−一般的なスキーム:)
【化１９８】
2020512843.tif 000219
(ここで、
各々のqは、0又は1であり;
各々のmは、0〜5の整数であり;
Zは、O又はSであり;
ROは、ポリヌクレオチド中のヌクレオシドとの結合であり;
Rは、H、ポリヌクレオチド中のヌクレオシド、固体支持体、又はキャッピング基(例えば、-(CH2)3-OH)との結合であり;
各々のR'は、独立に、H、-Q1-QA1、生体可逆性基、又は非生体可逆性基であり;
各々のR''は、独立に、H、-Q1-QA-Q2-T、生体可逆性基、又は非生体可逆性基であり;
各々のRAは、独立に、H又は-ORCであり、ここで、RCは、-Q1-QA1、生体可逆性基、非生体可逆性基、又は固体支持体との結合であり;
各々のRBは、独立に、H又は-ORDであり、ここで、RDは、-Q1-QA-Q2-T、生体可逆性基、又は非生体可逆性基であり;
ここで、
各々のQ1は、独立に、二価、三価、四価、又は五価基であり、ここで、1つの原子価は、QA又はQA1に結合しており;第二の原子価は空いており、残りの原子価の各々は、存在する場合、独立に、補助部分に結合しており;
各々のQ2は、独立に、二価、三価、四価、又は五価基であり、ここで、1つの原子価はQAに結合しており;第二の原子価はTに結合しており、残りの原子価の各々は、存在する場合、独立に、補助部分に結合しており;
QAは、1,2,3-トリアゾール-1,4-ジイル、任意に置換されたC6-16トリアゾロヘテロシクリレン(例えば、
【化１９９】
2020512843.tif 000220
)、任意に置換されたC8-16トリアゾロシクロアルケニレン(例えば、
【化２００】
2020512843.tif 000221
)、又はジヒドロピリダジン基(例えば、
【化２０１】
2020512843.tif 000222
)であり;
QA1は、任意に置換されたC2-12アルキニル、環内炭素-炭素三重結合を含有する任意に置換されたC6-16ヘテロシクリル(例えば、
【化２０２】
2020512843.tif 000223
)、任意に置換されたC8-16シクロアルキニル(例えば、
【化２０３】
2020512843.tif 000224
)、又は任意に置換されたC4-8歪みシクロアルケニル(例えば、trans-シクロオクテニル)であり;かつ
Tは、標的化部分であり、
ただし、出発材料は、少なくとも1つの-Q1-QA1を含有し、生成物は、-Q1-QA-Q2-Tを含有し;かつ
ただし、出発材料及び生成物は、固体支持体との0個又は1個の結合を含有する)。
【０７０６】
(コンジュゲーション法)
(Cu触媒型クリック反応)
(銅THPTA錯体調製)
硫酸銅五水和物(CuSO4-5H2O)の5mM水性溶液とトリス(3-ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル)アミン(THPTA)の10mM水性溶液を1:1(v/v)(1:2のモル比)で混合し、室温で1時間静置しておいた。この錯体を用いて、例えば、下記の一般的なコンジュゲーションスキームに示されている通りに、ヒュスゲン付加環化を触媒した。
【０７０７】
(一般的な手順(100nMスケール):)
1.7mLエッペンドルフチューブ中の710μLの水及び100μLのtert-ブタノール(10％の最終容量)の溶液に、60μLの銅-THPTA錯体、次いで、50μLの2mMオリゴ溶液、60μLの20mM水性アスコルビン酸ナトリウム溶液、及び20μLの10mM標的化部分-アジド溶液を添加した。完全に混合した後、この溶液を室温で1時間静置しておいた。反応の終了をゲル解析により確認した。反応混合物を5〜10倍モル濃度過剰のSiliaMetS(登録商標) TAAcONa(樹脂結合EDTAナトリウム塩)を含有するスクリューキャップバイアルに添加する。混合物を1時間撹拌する。その後、この混合物をillustra(商標)Nap(商標)-10カラムSephadex(商標)に通して溶出させる。得られた溶液を凍結させ、一晩凍結乾燥させる。
【０７０８】
(アミド連結を介したコンジュゲーション:)
アミド化によるコンジュゲーションを当技術分野で公知のアミド化反応条件下で実施することができる。例えば、Aaronsonらの文献、Bioconjugate Chem. 22:1723-1728, 2011を参照されたい。
【化２０４】
2020512843.tif 000225
(ここで、
各々のqは、0又は1であり;
各々のmは、0〜5の整数であり;
Zは、O又はSであり;
ROは、ポリヌクレオチド中のヌクレオシドとの結合であり;
Rは、H、ポリヌクレオチド中のヌクレオシド、固体支持体、又はキャッピング基(例えば、-(CH2)3-OH)との結合であり;
各々のR'は、独立に、H、-Q1-QA1、生体可逆性基、又は非生体可逆性基であり;
各々のR''は、独立に、H、-Q1-QA-Q1-T、生体可逆性基、又は非生体可逆性基であり;
各々のRAは、独立に、H又は-ORC、ここで、RCは、-Q1-QA1、生体可逆性基、又は非生体可逆性基であり;
各々のRBは、独立に、H又は-ORD、ここで、RDは、-Q1-QA-Q2-T、生体可逆性基、又は非生体可逆性基であり;
ここで、
各々のQ1は、独立に、二価、三価、四価、又は五価基であり、ここで、1つの原子価は、QA又はQA1に結合しており、第二の原子価は空いており、残りの原子価の各々は、存在する場合、独立に、補助部分に結合しており;
各々のQ2は、独立に、二価、三価、四価、又は五価基であり、ここで、1つの原子価はQAに結合しており、第二の原子価はTに結合しており、残りの原子価の各々は、存在する場合、独立に、補助部分に結合しており;
QAは、-C(O)-N(H)-又は-N(H)-C(O)-を含有する任意に置換されたC2-12ヘテロアルキレンであり;
QA1は、-NHRN1又は-COOR12であり、ここで、RN1は、H、N-保護基、又は任意に置換されたC1-6アルキルであり、R12は、H、任意に置換されたC1-6アルキル、又はO-保護基であり;かつ
Tは、標的化部分であり、
ただし、出発材料は、少なくとも1つの-Q1-QA1を含有し、生成物は、-Q1-QA-Q2-Tを含有する)。
【０７０９】
(溶液相コンジュゲーション:)
【化２０５】
2020512843.tif 000226
(ここで、
mは、0〜5の整数であり;
Zは、O又はSであり;
ROは、ポリヌクレオチド中のヌクレオシドとの結合であり;
Rは、H、ポリヌクレオチド中のヌクレオシド、又はキャッピング基との結合であり;
各々のR'は、独立に、H、-Q1-NH2、生体可逆性基、又は非生体可逆性基であり;
各々のR''は、独立に、H、-Q1-NH-CO-Q2-T、生体可逆性基、又は非生体可逆性基であり;
各々のRAは、独立に、H又は-ORC、ここで、RCは、-Q1-NH2、生体可逆性基、又は非生体可逆性基であり;
各々のRBは、独立に、H又は-ORD、ここで、RDは、-Q1-NH-CO-Q2-T、生体可逆性基、又は非生体可逆性基であり;
ここで、
各々のQ1は、独立に、二価、三価、四価、又は五価基であり、ここで、1つの原子価は-NH-CO-又は-NH2に結合しており、第二の原子価は空いており、残りの原子価の各々は、存在する場合、独立に、補助部分に結合しており;
各々のQ2は、独立に、二価、三価、四価、又は五価基であり、ここで、1つの原子価は-NH-CO-に結合しており、第二の原子価はTに結合しており、残りの原子価の各々は、存在する場合、独立に、補助部分に結合しており;かつ
Tは、標的化部分であり、
ただし、出発材料は、-Q1-NH2を含有し、生成物は、-Q1-NH-CO-Q2-Tを含有する。)
【０７１０】
(支持体上でのコンジュゲーション:)
【化２０６】
2020512843.tif 000227
(ここで、
Zは、O又はSであり;
ROは、ポリヌクレオチド中のヌクレオシドとの結合であり;
各々のQ2は、独立に、二価、三価、四価、又は五価基であり、ここで、1つの原子価は-NH-CO-に結合しており、第二の原子価はTに結合しており、残りの原子価の各々は、存在する場合、独立に、補助部分に結合しており;かつ
Tは、標的化部分である。)
【化２０７】
2020512843.tif 000228
(ここで、
nは、1〜8の整数であり;
Aは、O又は-CH2-であり;
Zは、O又はSであり;
ROは、ポリヌクレオチド中のヌクレオシドとの結合であり;
各々のQ2は、独立に、二価、三価、四価、又は五価基であり;ここで、1つの原子価は、アジド又はトリアゾールに結合しており、第二の原子価はTに結合しており、残りの原子価の各々は、存在する場合、独立に、補助部分に結合しており;かつ
Tは、標的化部分である。)
【化２０８】
2020512843.tif 000229
(ここで、
nは、1〜8の整数であり;
Aは、O又は-CH2-であり;
Zは、O又はSであり;
ROは、ポリヌクレオチド中のヌクレオシドとの結合であり;
各々のQ2は、独立に、二価、三価、四価、又は五価基であり;ここで、1つの原子価は、アジド又はトリアゾールに結合しており、第二の原子価はTに結合しており、残りの原子価の各々は、存在する場合、独立に、補助部分に結合しており;かつ
Tは、標的化部分である。)
【化２０９】
2020512843.tif 000230
(ここで、
nは、1〜8の整数であり;
Aは、O又は-CH2-であり;
Zは、O又はSであり;
ROは、ポリヌクレオチド中のヌクレオシドとの結合であり;
各々のQ2は、独立に、二価、三価、四価、又は五価基であり;ここで、1つの原子価は、アジド又はトリアゾールに結合しており、第二の原子価はTに結合しており、残りの原子価の各々は、存在する場合、独立に、補助部分に結合しており;かつ
各々のTは、独立に、標的化部分である。)
【０７１１】
(ホスホトリエステルのFmoc脱保護の代表的な実施例:)
Fmoc保護アミンを有するホスホトリエステルを含むポリヌクレオチドを脱保護条件に供すると、ホスホトリエステルからホスホジエステルへの観察可能な変換なしでFmoc脱保護が生じた。
【化２１０】
2020512843.tif 000231
【０７１２】
(p68とのDBCO-NHSコンジュゲーション−代表的な実施例:)
ホスホトリエステル中のアミノ基とのDBCO-NHSコンジュゲーションは、マススペクトロメトリー分析から明らかなように、室温で10分で終了した。
【化２１１】
2020512843.tif 000232
【０７１３】
DBCO共役基を含有するp68のRP-HPLC精製(表2参照)を、以下の条件を用いて実施した:
−バッファーA＝水中の50mM TEAA;
−バッファーB＝90％アセトントリル(Acetontrile);及び
−流量＝1mL/分;
−勾配:
・0〜2分(100％バッファーA/0％バッファーB)、
・2〜22分(0％〜100％バッファーB)、及び
・22〜25分(100％バッファーB)。
【０７１４】
同様の手順を用いて、例えば、2'-修飾ヌクレオシドホスホロアミダイト、例えば、本明細書に記載されているものを用いて、ポリヌクレオチドを調製することができる。そのような手順は、国際特許出願PCT/US2015/034749号に提供されており; PCT/US2015/034749号におけるジスルフィドホスホトリエステルオリゴヌクレオチド合成の開示は、引用により本明細書中に組み込まれる。
【０７１５】
本明細書に記載される一般的な手順に従って、表2に掲載されている免疫調節ポリヌクレオチドを調製した。
(表2)
【表３】
2020512843.tif 000233
2020512843.tif 000234
2020512843.tif 000235
2020512843.tif 000236
2020512843.tif 000237
2020512843.tif 000238
2020512843.tif 000239
2020512843.tif 000240
2020512843.tif 000241
2020512843.tif 000242
2020512843.tif 000243
2020512843.tif 000244
2020512843.tif 000245
表2において、列Aは、DB細胞におけるIL-6発現(EC50、nM)を提供し;列Bは、DB細胞におけるIL-10発現(EC50、nM)を提供し;列Cは、Ramos blue細胞におけるNFκB活性化(EC50、nM)を提供し;列Dは、Hela-hTLR9-NFκB-luc細胞におけるNFκB活性化(EC50、nM)を提供し;列Eは、Hela-mTLR9-NFκB-luc細胞におけるNFκB活性化(EC50、nM)を提供し;列Fは、マウス脾臓細胞におけるIL-6分泌(EC50、nM)を提供し;列Gは、95％マウス血漿中で24時間プレインキュベーションした後のマウス脾臓細胞におけるIL-6分泌(EC50、nM)を提供し;列Hは、マウス骨髄DC分化におけるIL-6分泌(EC50、nM)を提供し;列Iは、RNAiMaxで2時間トランスフェクションした後のマウスHEK-Blue細胞におけるNFκB活性化(EC50、nM)を提供し;かつ列Jは、RNAiMaxで2時間トランスフェクションした後のヒトHEK-Blue細胞におけるNFκB活性化(EC50、nM)を提供する。
本明細書に含まれる表の全体を通じて提供される配列の重要な記述子は、次の通りである:小文字＝ヌクレオシド-3'-ホスホロチオエート;大文字＝ヌクレオシド-3'-ホスフェート;イタリック体の小文字＝3' tBuDS-Ph(オルト)トリエステル(PS)を有するヌクレオシド;イタリック体の大文字＝3' tBuDS-Ph(オルト)トリエステル(PO)を有するヌクレオシド; dt＝dT(DBCO);太字の二重下線のt＝DBCO-C6-dT;太字の小文字＝3' n-ブチルトリエステル(PS)を有するヌクレオシド;太字の大文字＝3' n-ブチルトリエステル(PO)を有するヌクレオシド;イタリック体の太字の小文字＝3'ホモプロパルギルトリエステル(hPro)(PS)を有するヌクレオシド;イタリック体の下線の小文字＝3' DBCO-NH-PEG2トリエステル(N1)(PS)を有するヌクレオシド;イタリック体の下線の大文字＝3' DBCO-NH-PEG2トリエステル(N1)(PO)を有するヌクレオシド;二重下線のt＝dT PEG2-NH2トリエステル(PS);二重下線のT＝dT PEG2-NH2トリエステル(PO);イタリック体の二重下線の小文字＝3' PEG2-NH2トリエステル(N1)(PS)を有するヌクレオシド;イタリック体の二重下線の大文字＝3' PEG2-NH2トリエステル(N1)(PO)を有するヌクレオシド;太字のイタリック体の下線の大文字U＝5-ヨード-2'-デオキシウリジン(PO);太字のイタリック体の下線の小文字u＝5-ヨード-2'-デオキシウリジン(PS);太字の下線＝2'-フルオロヌクレオチド(PO);アポストロフは、アポストロフの左側にある文字によって特定されるヌクレオチドが2'-OMe修飾リボースを含有することを示す;下線のng＝7-デアザ-2'-デオキシグアノシン(PS);下線のpT＝PEG4 dTトリエステル(PO);下線のpt＝PEG4 dTトリエステル(PS); fT＝5-トリフルオロメチル-チミジン(PO); fU＝5-フルオロ-2'-デオキシウリジン(PO); bU＝5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(PO); ft＝5-トリフルオロメチル-チミジン(PS); fu＝5-フルオロ-2'-デオキシウリジン(PS); bu＝5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(PS); C3＝C3スペーサー(-(CH2)3-OH)(PO); c3＝C3スペーサー(-(CH2)3-OH)(PS); C6＝ヘキサン-1,6-ジイル; NH2C6＝6-アミノヘキサ-1-イル; Te＝3'エチルトリエステル(PO)を有するチミジン; Ge＝3'エチルトリエステル(PO)を有するグアノシン; Ce＝3'エチルトリエステル(PO)を有するシチジン; Ue＝3'エチルトリエステル(PO)を有する5-ヨードウリジン; ue＝3'エチルトリエステル(PS)を有する5-ヨードウリジン; iu＝5-ヨード-2'-デオキシウリジン(PS)に基づく5'-5'キャップ; iU＝5-ヨード-2'-デオキシウリジン(PO)に基づく5'-5'キャップ; X5＝X5-DBCO(PO); x5＝x5-DBCO(PS); X3＝X3脱塩基スペーサー(PO);及びIR700は色素である。ここで、記述子(PO)は、3'-ホスフェートを表し;かつ(PS)は、3'-ホスホロチオエートを表し; od＝5'-オルトジスルフィドホスホジエステル; o＝5'-ホスフェート(PO); ods＝5'-オルトジスルフィドホスホロチオエート; s＝5'-ホスホロチオエート(PS);上付き文字「r」＝Rp PS;上付き文字「s」＝Sp PS; Af＝2'-フルオロ-アデノシン(PO) ; Csi＝dC O-シリルトリエステル(PO); Tsi＝dT O-シリルトリエステル(PO); tm＝2'-OMeチミジン(PS); t(m)＝2'-OMOEチミジン(PS)である。構造は、図1A及び1Bに示されている。
【０７１６】
(二本鎖CpG:)
(アニーリング及びゲル解析:)
ポリヌクレオチドp88(1mL、5mMストック)をDPBS(24.7mL)とともにp144(3.3mL、2mMストック)に添加した。ポリヌクレオチドp88を同様の方法でp145で処理した。混合物を65℃まで10分間加熱した。TBEウレアゲルによる解析により、p88の完全なアニーリングが示された(図2参照)。1μLの各々の試料を取り出し、5μLのホルムアミドローディングバッファーに添加し、ウェル毎に15％TBE-ウレアゲル上にローディングし、200ボルトの電圧を40分間かけ、その後、臭化エチジウム(EtBr)染色した。p88、p144、及びp145の構造については、表2を参照されたい。
【０７１７】
p88/p144を用いた二本鎖CpG−代表的な実施例(1):
【化２１２】
2020512843.tif 000246
【０７１８】
p88/p145を用いた二本鎖CpG−代表的な実施例(2):
【化２１３】
2020512843.tif 000247
【０７１９】
(実施例2:本発明の例示的なコンジュゲートの調製)
下記の調製では、以下の抗体が使用されている:抗CD38抗体は、WO 2012/092616号に開示されているAb79であり、この抗体の開示は、引用により完全に本明細書中に組み込まれており;抗CD79b抗体は、WO 2014/011521号に開示されているhuMA79bv28であり、この抗体の開示は、引用により完全に本明細書中に組み込まれており;抗CD30抗体は、ブレンツキシマブであり;抗CD22抗体は、US 20140127197号に開示されている10F4であり、この抗体の開示は、引用により完全に本明細書中に組み込まれており;かつ抗CD20抗体は、リツキシマブである。
【０７２０】
他の抗体を本明細書に記載されるコンジュゲート中に組み入れてもよく、例えば、抗DEC205抗体は、US 2010/0098704号に開示されている抗体(例えば、以下の配列:
【化２１４】
2020512843.tif 000248
を有する軽鎖;及び以下の配列:
【化２１５】
2020512843.tif 000249
を有する重鎖であることができ;抗CD303抗体は、軽鎖配列
【化２１６】
2020512843.tif 000250
及び重鎖配列:
【化２１７】
2020512843.tif 000251
を有することができ;抗CD40抗体は、ルカツムマブ又はダセツズマブであることができ;抗CD74抗体は、ミラツズマブであることができ;抗CD304抗体は、ベセンクマブであることができ;かつ抗CD38抗体は、ダラツムマブ、SAR650984(Sanofi-Immunogen)、又はMOR202(Morphosys-Celgene)であることができる。これらの抗体は、Q-タグ(例えば、重鎖内の
【化２１８】
2020512843.tif 000252
又は軽鎖内の
【化２１９】
2020512843.tif 000253
)を含むことができる。
【０７２１】
他の抗体を本明細書に記載されるコンジュゲートに組み入れることができ、例えば:抗PD-L1抗体は、以下の配列:
【化２２０】
2020512843.tif 000254
を有する軽鎖、及び重鎖配列:
【化２２１】
2020512843.tif 000255
を有する、mAbs(2016), 8, 593及びUS8217149号に記載されている抗体であることができる。
【０７２２】
(A.微生物トランスグルタミナーゼ(mTG)によって媒介されるQ-タグ化抗体とのコンジュゲーションの一般的な手順)
(表3.トランスグルタミナーゼ媒介性コンジュゲーションの例示的な設定)
【表４】
2020512843.tif 000256
酵素的コンジュゲーションの一般的な条件:
最終抗体濃度＝50μM
抗体:トランスグルタミナーゼ(mTG)比: 10:1
リンカー:Ab比: 100:1
mTG MW＝38kDa、100mU/mg、ε280＝71850M-1 cm-1
2％w/v＝20mg/mL＝トリスバッファー中、5μM
トリスバッファー: 25mMトリス、150mM NaCl、pH 8.5
トリスバッファー又はDMSO中のリンカー溶液
DMSO≦5％v/vの最終容量
(一般的なプロトコル:)
トリスバッファー中のQ-タグ化抗体(例えば、それぞれ、CD22-Q及びCD38-Qと表記される、Q-タグ化抗CD22抗体又はQ-タグ化抗CD38抗体)の溶液に、アジドアミノリンカー及びmTGを順次添加した。混合物を37℃に2時間温め、この時点で、DPBSを溶離液として用いてAmicon 30kDスピン濃縮器に通して、懸垂アジド-リンカー(Ab-N3)を有する抗体をバッファー交換することにより、余分なリンカー及びmTGを除去した。その後、Ab-N3の試料を還元し、下記の通りに、RP-HPLCにより、リンカーコンジュゲーションの程度について特徴付けた。その後のAb-N3中のアジドによるCpGポリヌクレオチドのホスホトリエステル中のアルキンのヒュスゲン付加環化により、本発明の例示的なコンジュゲートが供給された(図3A及び3B参照)。
【０７２３】
(B.活性化カルボン酸エステル(例えば、TFP又はPFP)の使用を介する抗体とのコンジュゲーションのための一般的なプロトコル)
表4.抗原結合部分(例えば、抗体)とTFP-エステル又はPFP-エステルでキャッピングされたアジド-PEGとのコンジュゲーションのための例示的な設定
【表５】
2020512843.tif 000257
(一般的なプロトコル:)
DPBSバッファー中の抗体の溶液に、アジド-PEG24-PFPを添加し、得られた混合物を室温で一晩放置し、この時点で、DPBSを溶離液として用いてAmicon 30kDスピン濃縮器に通して、生成されたAb-N3をバッファー交換することにより、余分なアジド-PEG24-PFPを除去した。その後、Ab-N3の試料を還元し、下記の通りに、RP-HPLCにより、リンカーコンジュゲーションの程度について特徴付けた。その後のAb-N3中のアジドによるCpGポリヌクレオチドのホスホトリエステル中のアルキンのヒュスゲン付加環化により、本発明の例示的なコンジュゲートが供給された。
【０７２４】
(抗体/二本鎖免疫調節ポリヌクレオチドコンジュゲーションプロトコル)
完全にアニーリングされた二本鎖CpGポリヌクレオチド(p88/p144及びp88/p145)を抗CD38Q-N3抗体(39mL、40mM)に添加した。混合物を37℃まで2時間加熱し、陰イオン交換樹脂(AEX)上でのクロマトグラフィーにより精製した。2つの主要なピークを収集し、Amicon 30kD濃縮器に通して濃縮し、トリ-グリシン変性ゲルにより解析し、200ボルトの電圧を1時間かけ、その後、臭化エチジウム染色した(図4A参照)。
【０７２５】
(抗CD20抗体免疫調節ポリヌクレオチドコンジュゲート)
TFP-PEG24-N3リンカーを介して免疫刺激ポリヌクレオチド(p19)にコンジュゲートされたリツキシマブを含有するコンジュゲート(ここで、TFP部分は、リツキシマブに連結されており、アジドは、免疫刺激ポリヌクレオチドに連結されている)。該コンジュゲートの粗混合物を以下の条件下でAEX-HPLCにより精製した:
バッファーA: 20mMリン酸ナトリウム、15％iPrOH(水性)
バッファーB: 20mMリン酸ナトリウム、1M臭化ナトリウム、15％iPrOH(水性)
カラム: Thermo Scientific Dionex DNASwift、5×150mm
10〜95％バッファーBで10分、その後、洗浄し、再平衡化させる
勾配: 10〜95％Bで10分、洗浄、95％Bで5分間
【０７２６】
粗混合物のAEX-HPLCトレースが図4Bに示されている(ピーク1、2、及び3のピーク面積は、それぞれ、ピーク1、2、及び3の総面積の28％、40％、及び32％である)。図4Cは、粗混合物の合わせたHPLCトレース並びに図4Bの番号1、2、及び3によって特定される分離されたピークを示している。図4Dは、リツキシマブ-PEG24-N3と粗反応混合物と分離されたピーク1、2、及び3の比較を提供している。リツキシマブ-p19-DAR1(薬物-抗体比＝1、すなわち、1つの抗体が1つのp19ポリヌクレオチドコンジュゲートにされている)をその分子量(MW＝155400)により特定した。
【０７２７】
本明細書に記載されるコンジュゲーション手順は、表6に掲載されている例示的な本発明のコンジュゲートを調製するために使用されている。
【０７２８】
(RP-HPLCによるコンジュゲートされていない重鎖及びコンジュゲートされた重鎖の定量)
ヒュスゲン付加環化の前にAb-N3試料を分析して、アジドリンカーのコンジュゲーション効率を評価した。まず、DTT(20mMDTT)及び5Mグアニジン-HClによるAb-N3(5μM)の還元を65℃で30分間実施した。得られたタンパク質性生成物を、RP-HPLCにより、以下の条件下で分析した:
・カラム: Pursuit Diphenyl 5、4.6×250mm、5μm
・カラム温度: 60℃
・MPA:水中の0.1％TFA、MPB:アセトニトリル中の0.1％TFA
・勾配: 35〜50％MPBで17分
・280nmでの検出
【０７２９】
コンジュゲートされていない重鎖とコンジュゲートされた重鎖(HC-N3)のパーセンテージは、表5に提供されており、コンジュゲートされていない重鎖とコンジュゲートされた重鎖のピーク面積の合計のパーセンテージに基づいている。
(表5.抗体HCのコンジュゲーションの程度の定量)
【表６】
2020512843.tif 000258
【０７３０】
(ポリヌクレオチドホスフェート骨格を有するコンジュゲートはホスホロチオエート骨格を有するコンジュゲートよりも速く陰イオン交換カラムから溶出することができる)
CpGポリヌクレオチドにコンジュゲートされたQ-タグ化抗CD38抗体を含有するコンジュゲートを本明細書に記載されている通りに調製した。この実験において、合成に使用されたCpGポリヌクレオチドは、p19、p21、及びp88であった。単離されたコンジュゲートを以下の条件下でAEX-HPLC分析に供した:
方法A: 10〜95％Bで10分、その後、洗浄及び再平衡化
方法B: 10〜50％Bで10分、その後、洗浄及び再平衡化
カラム: Thermo Scientific Dionex DNASwift、分析用  5×150mm
バッファーA: 20mMリン酸ナトリウム、15％iPrOH(水性)
バッファーB: 20mMリン酸ナトリウム、1M臭化ナトリウム、15％i-PrOH(水性)
【０７３１】
AEX-HPLCトレース中のSB-037(抗CD38Q-p19)コンジュゲートに対応するピークの保持時間は、SB-038(抗CD38Q-p21)に対応するピークの保持時間よりも大きかった。
(表6-A)
【表７】
2020512843.tif 000259
2020512843.tif 000260
2020512843.tif 000261
2020512843.tif 000262
2020512843.tif 000263
2020512843.tif 000264
2020512843.tif 000265
2020512843.tif 000266
2020512843.tif 000267
2020512843.tif 000268
表6-Aにおいて、列Aは、DB細胞におけるIL-6発現(EC50、nM)を提供し;列Bは、DB細胞におけるIL-10発現(EC50、nM)を提供し;列Cは、Ramos blue細胞におけるNFκB活性化(EC50、nM)を提供し;列Dは、マウス血清中で24時間プレインキュベーションした後のRamos blue細胞におけるNFκB活性化(EC50、nM)を提供し;列Eは、マウスA20リンパ腫細胞におけるqPCRによるIL-6誘導(EC50、nM)を提供し;かつ列Fは、マウスA20-hCD20リンパ腫細胞におけるIL-6誘導(EC50、nM)を提供する。DBCO/アジドコンジュゲーションは全て、無金属型1,3-双極子付加環化反応条件下で実施し; DAR1は、1というポリヌクレオチド/抗体比を示し; DAR2は、2というポリヌクレオチド/抗体比を示し;かつn/aは、活性化なしを表す。表6-Aにおいて、*は、準最適な活性化を示す。表6-Aにおいて、CD38は、抗CD38抗体を表し; CD22は、抗CD22抗体を表し; CD79bは、抗CD79b抗体を表し;マウスCD22は、抗マウスCD22抗体を表し; BDCA2は、抗BDCA2抗体を表し;かつBDCA4は、抗BDCA4抗体を表す。表6-Aにおいて、TCOは、標的化部分に結合したtrans-シクロオクテニルに基づく基である。TCOは、図1Bに示されている構造を有する。
(表6-B)
【表８】
2020512843.tif 000269
2020512843.tif 000270
表6-2において、列Aは、Ramos blue細胞におけるNFκB活性化(EC50、nM)を提供し;列Bは、マウス脾臓細胞におけるIL-6分泌、DAR1(EC50、nm)を提供し;列Cは、マウス脾臓細胞におけるIL-6分泌、DAR2(EC50、nm)を提供し;列Dは、Daudi-NFκB-Luc細胞におけるNFκB活性化、DAR1(EC50、nm)を提供し;列Eは、Daudi-NFκB-Luc細胞におけるNFκB活性化、DAR2(EC50、nm)を提供する。表6-2において、CD38は、抗CD38抗体を表し; CD22は、抗CD22抗体を表し;マウスCD22は、抗マウスCD22抗体を表し; DAR1は、1というポリヌクレオチド/抗体比を示し; DAR2は、2というポリヌクレオチド/抗体比を示す。
【０７３２】
(実施例3.本発明の例示的なコンジュゲートのインビトロ及びインビボプロファイリング)
細胞:ヒトDB、Daudi、Raji、Ramos、SUDHL10、及びNCI-H929、並びにマウスA20細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(ATCC)から購入し、10％FBSを含有するRPMI中で培養した。Ramos-blue及びHEK-Blue-hTLR9細胞をInvivogenから購入し、供給元の推奨に従って維持した。全ての細胞のTLR9発現をqPCRにより確認した。
【０７３３】
フローサイトメトリー:対象となる受容体の細胞表面発現を、CyFlow MLフローサイトメーター(Partec)及び市販の抗体(Biolegend, BD Biosciences, San Diego)を用いるFACS解析により測定した。
【０７３４】
(免疫刺激ポリヌクレオチド又はそのコンジュゲートのインビトロプロファイリング:)
いくつかの実験において、免疫刺激ポリヌクレオチド又はそのコンジュゲートの活性を、ヒト又はマウスリンパ腫細胞を用いて評価した。これらの実験では、試験化合物を96ウェルプレート中の細胞(1〜4×105個/ウェル)に添加し、37℃、5％CO2で24〜72時間インキュベートした。インキュベーション期間の最後に、培養培地を除去し、これを用いて、サイトカイン分泌(DB細胞)又はNFkB活性化の尺度としてのアルカリホスファターゼ分泌(Ramos-blue、HEK-Blue-hTLR9細胞)を評価した。分泌されたサイトカインは、市販のELISAキットによって測定した。残りの細胞を溶解させ、全RNAを精製し、サイトカイン遺伝子発現(IL-6及びIL-10)をqPCRにより定量し、ハウスキーピング遺伝子(B2M、GAPDH、又はPPIB)に対して正規化した。他のサイトカイン(例えば、IL-8、IL-12a、及びIL-12b)の遺伝子発現も、当技術分野で公知の方法、例えば、qPCRを用いて決定することができる。
【０７３５】
いくつかの実験において、免疫刺激ポリヌクレオチドを、ヒト又はマウスTLR-9及びNFkB-ルシフェラーゼレポータープラスミドを安定に発現するHeLa細胞でプロファイリングした。細胞内ルシフェラーゼ活性をルシフェリン(Britelite, Perkin Elmer)の添加により定量し、発光シグナルをVictor2ルミノメーター(Perkin Elmer)を用いて捕捉した。
【０７３６】
いくつかの実験において、免疫刺激ポリヌクレオチドの活性を、新たに単離されたマウス脾臓細胞を用いて評価した。C57Bl6マウス由来の脾臓を採取し、氷冷PBSを用いて滅菌70μmフィルターに通してさいの目状にした。その後、細胞をPBSで洗浄し、市販のRBC溶解バッファーを用いて赤血球を溶解させた。細胞を4℃のPBSで再び洗浄し、10％FBSを含有するRPMIに再懸濁させ、96ウェルプレートに播種し(2×105細胞/ウェル)、37℃、5％CO2で2〜4時間インキュベートした。その後、試験化合物を添加し、37℃、5％CO2でさらに24〜72時間インキュベートした。上清を慎重に除去し、サイトカインレベルをELISAにより定量した。細胞を溶解させ、全RNAを精製し、遺伝子発現を標準的な方法を用いるqPCRにより測定した。
【０７３７】
いくつかの実験において、試験化合物を、マウス骨髄分化樹状細胞(DC)とともにインキュベーションしたときのサイトカイン分泌について評価した。これらの実験では、マウス初代骨髄前駆細胞を、公表されているプロトコルに従って、C57Bl6マウスの大腿骨及び脛骨から単離した。細胞を4℃のPBSですぐに洗浄し、市販の溶解バッファーを用いて赤血球を溶解させた。細胞を10％胎仔ウシ血清を含有するRPMIに1.2×106細胞/mlで懸濁させ、96ウェルプレート中に播種し、組換えマウスGM-CSF(100ng/ml)及びマウスTNFα(10ng/ml)によるか又は7日間のFLT3Lの添加によるかのいずれかでDCに分化させた。試験化合物を添加し、24〜72時間インキュベートした。サイトカイン分泌をELISAにより培養上清中で測定し、細胞を溶解させ、これを用いて、標準的な方法を用いるqPCRにより遺伝子発現を評価した。
【０７３８】
いくつかの実験において、試験化合物を、マウス、ラット、サル、又は健常ヒト由来の95％血漿中でインキュベートして、安定性を評価した。これらの実験では、血液(EDTA)を少なくとも3個体から回収し;血漿を遠心分離により単離し、プールした。試験化合物を密封管中の血漿にスパイクし、37℃で1〜72時間インキュベートし、その後、該化合物をRPMI＋10％FBSに適当な濃度まで希釈し、上で概説した試験系で機能的活性について評価した。
【０７３９】
いくつかの実験において、1×105細胞/ウェルで1、2、4、又は7日間インキュベートした後、当技術分野で公知の方法を用いて、例えば、Cell Titer Gloキット(Promega)を用いて、リンパ球増殖に対する試験化合物の効果を評価することができる。
【０７４０】
いくつかの実験において、当技術分野で公知の方法を用いて、例えば、CyFlow MLフローサイトメーター(Partec)を用いるFACSによるアネキシン-V細胞表面発現によって、細胞のアポトーシスに対する試験化合物の効果を評価することができる。
【０７４１】
本発明のコンジュゲートの細胞依存性細胞傷害性(CDC)活性を次の通りに評価した。Daudi細胞を10％FBS及びPen/Strepが補充されたRPMI1640 GlutaMAX中で培養した。細胞を遠心分離し、培地を除去し、10％ヒト血清(SIGMA cat#S1764, LOT#SLBQ0752V, 46CH50)が補充されたOPTIMEMに0.8×106細胞/mLの濃度及び50μL/ウェルの容量で再懸濁させることにより、Daudi細胞を96ウェルフォーマットでプレーティングした。化合物希釈液プレートをOPTIMEM中に2倍の濃度で調製し、1ウェル当たり50μLの化合物希釈液を添加して、5％の最終濃度のヒト血清を得た。プレーティングされた培養物を、5％CO2下、37℃で2時間インキュベートした。Alamar Blue生死判定試薬(10μL/ウェル)を添加し、得られた培養物を、5％CO2下、37℃で3〜18時間インキュベートした。蛍光(EX560及びEM590)を用いて、結果をプレートリーダーで読み取った。
【０７４２】
ヒト末梢血単核細胞(hPBMC)における本発明のコンジュゲートのサイトカイン誘導を次の通りに評価した。ヒトPBMCをサンディエゴ血液バンク(San Diego Blood Bank)から入手したLRSから単離した。形質細胞様樹状細胞をMACsキット(Miltenyi Biotec)でhPBMCから単離し、96ウェルフォーマット(5×104細胞/ウェルの密度)でComplete RPMI中にすぐにプレーティングした。化合物を2時間後に添加し、5％CO2下、37℃で20時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を回収し、サイトカインレベルをELISA(BioLegend)によって決定した。
【０７４３】
インビトロプロファイリング実験の結果は、表2及び6〜23及び図5〜33にまとめられている。
【０７４４】
図5は、抗体にコンジュゲートされていないCpGポリヌクレオチドが、IL-6の発現のレベルによって決定されるようなサイトカインの誘導にホスホロチオエート骨格を必要とすることを示している。
【０７４５】
図6〜8は、本発明の例示的なコンジュゲートとホスホロチオエート骨格を有するコンジュゲートされていないCpGポリヌクレオチドのTLR9アゴニスト活性の比較を提供している。
【０７４６】
図9〜15は、(1)ホスホロチオエートがコンジュゲートされた標的化部分の非存在下での免疫刺激ポリヌクレオチドのTLR9アゴニスト活性の活性に重要であること、及び(2)標的化部分とCpGポリヌクレオチドの5'-末端ヌクレオシドに結合したホスフェートとのコンジュゲーションがそのTLR9アゴニスト活性を低下させることを示している。
【０７４７】
図16及び17は、2つのポリヌクレオチドを含む本発明のコンジュゲートが、1つのポリヌクレオチドを含む本発明のコンジュゲートと比べてより高い、NFκB活性化によって示されるような免疫刺激活性を示すことができることを示している。
【０７４８】
表7は、5'-末端5-ヨードウリジンの包含が免疫刺激ポリヌクレオチドの活性を増強することを示している。
(表7)
【表９】
2020512843.tif 000271
【０７４９】
表8及び9は、免疫刺激ポリヌクレオチド配列の3'-切断及びISS間のより短い間隔が有害ではない可能性があり、かつ免疫刺激ポリヌクレオチドの免疫刺激活性を改善する可能性すらあることを示している。これらの表は、わずか2つのISSが免疫刺激に十分であり得ることも示している。
(表8)
【表１０】
2020512843.tif 000272
(表9)
【表１１】
2020512843.tif 000273
【０７５０】
図18は、ホスホロチオエートに基づく全てのヌクレオシド間ホスホエステルを有する免疫刺激ポリヌクレオチドを含有するコンジュゲートが遊離のp1の活性と同程度である活性を示すこと、及び短い免疫刺激ポリヌクレオチドを含有するコンジュゲートが完全長の免疫刺激ポリヌクレオチドを含有するコンジュゲートの活性と同程度である活性を示すことを示している。図18に示されているデータは、表10に掲載されている。
(表10)
【表１２】
2020512843.tif 000274
【０７５１】
図19は、ホスホロチオエートに基づく全てのヌクレオシド間ホスホエステルを有するより短い免疫刺激ポリヌクレオチドを含有するコンジュゲートがホスホロチオエートに基づく全てのヌクレオシド間ホスホエステルを有するより長い免疫刺激ポリヌクレオチドを含有するコンジュゲートの活性よりも優れている活性を示すことを示している。図19に示されているデータは、表11にまとめられている。
(表11)
【表１３】
2020512843.tif 000275
【０７５２】
図20及び21は、5'-末端ISS内にホスフェートに基づくヌクレオシド間リン酸エステルを有する免疫刺激ポリヌクレオチドが5'-末端ISS内にホスホロチオエートに基づくヌクレオシド間リン酸エステルを有する免疫刺激ポリヌクレオチドよりも大きい免疫刺激活性を示すことを示している。図20及び21に示されているデータは、表12にまとめられている。
(表12)
【表１４】
2020512843.tif 000276
【０７５３】
図22は、5'-末端ヒトISS配列がUCGであることが好ましいことを示している。図22に示されているデータは、表13にまとめられている。
(表13)
【表１５】
2020512843.tif 000277
【０７５４】
図23は、5'-末端ISS中の5-ヨードウリジンの包含が免疫刺激ポリヌクレオチドの免疫刺激活性に対するより強い増強効果を有することを示している。図23に示されているデータは、表14にまとめられている。
(表14)
【表１６】
2020512843.tif 000278
【０７５５】
図24及び25は、ホスフェートに基づくヌクレオシド間ホスホトリエステルを含有するポリヌクレオチドの免疫刺激活性がホスホロチオエートに基づくヌクレオシド間ホスホトリエステルを含有する対応するポリヌクレオチドの免疫刺激活性よりも大きいものであり得ることを示している。図24及び25に示されているデータは、表15にまとめられている。
(表15)
【表１７】
2020512843.tif 000279
【０７５６】
表16は、ホスホトリエステル挿入が免疫刺激ポリヌクレオチド中で許容されることを示している。
(表16)
【表１８】
2020512843.tif 000280
【０７５７】
表17及び18は、脱塩基スペーサー挿入が免疫刺激ポリヌクレオチド中で許容されることを示している。
(表17)
【表１９】
2020512843.tif 000281
(表18)
【表２０】
2020512843.tif 000282
*準最適な活性化
【０７５８】
図26A及び26Bは、より高い含有量のホスホロチオエートに基づくヌクレオシド間ホスホトリエステルが免疫刺激ポリヌクレオチドの免疫刺激活性に影響を及ぼすことを示している。この効果は、3'-末端からより遠くに配置されたホスホロチオエートに基づくヌクレオシド間ホスホトリエステルを有する免疫刺激ポリヌクレオチドにおいて特に顕著である。図26A及び26Bに示されているデータは、表19にまとめられている。
(表19)
【表２１】
2020512843.tif 000283
*準最適な活性化
**不活性
【０７５９】
表20は、標的化部分と免疫刺激ポリヌクレオチドとを連結するより長いリンカーがより短いリンカーを有するコンジュゲートと比べてコンジュゲートの免疫刺激活性を増強し得ることを示している。
(表20)
【表２２】
2020512843.tif 000284
*(PEGx)は、抗体に結合した相補的反応基中のエチレングリコール単位の数を示している。
【０７６０】
図27は、Q-タグを介する抗体重鎖とのコンジュゲーションが、PFP化学反応を使用することによる抗体軽鎖とのコンジュゲーションと比べて優れた免疫刺激活性を示すコンジュゲートを提供することができることを示している。図27に示されているデータは、表21にまとめられている。
(表21)
【表２３】
2020512843.tif 000285
*DARは、ポリヌクレオチド/抗体比を表す。
【０７６１】
図28は、抗体重鎖コンジュゲートが抗体軽鎖コンジュゲートと比べて優れた免疫刺激活性を示すことができることを示している。図28に示されているデータは、表22にまとめられている。
(表22)
【表２４】
2020512843.tif 000286
*(PEGx)は、NH2-PEGx-N3から形成される抗体に結合した相補的反応基中のエチレングリコール単位の数を示している。
【０７６２】
図29は、補助部分(例えば、ポリ(エチレングリコール))の包含が本発明のコンジュゲートの免疫刺激活性を増強することができることを示している。図29に示されているデータは、表23にまとめられている。
(表23)
【表２５】
2020512843.tif 000287
*(PEGx)は、コンジュゲート中で使用された相補的反応基を示す。
【０７６３】
表24は、PEG補助部分の包含が標的化部分にコンジュゲートされていない免疫刺激ポリヌクレオチドの自己送達にそれほど大きな影響を及ぼさなかったことを示している。表24のデータは、A20細胞と免疫刺激ポリヌクレオチドとのインキュベーションから20時間後の、ELISAによって測定された、該細胞におけるIL6分泌についてのものである。
(表24)
【表２６】
2020512843.tif 000288
*(PEGx)は、コンジュゲート中で使用された相補的反応基を示す。
【０７６４】
図30は、補助部分がコンジュゲートの細胞依存性細胞傷害性に影響を及ぼすことができることを示している。図30に示されているデータは、表25にまとめられている。
(表25)
【表２７】
2020512843.tif 000289
*(PEGx)は、コンジュゲート中で使用された相補的反応基を示す。
【０７６５】
図31及び32は、切断型免疫刺激ポリヌクレオチドを含有するコンジュゲートを用いたマウスA20細胞におけるIL6の誘導を示している。これらのアッセイで利用された抗体は、マウス抗CD20抗体又はマウス抗CD22抗体であった。Q-タグは、該ポリヌクレオチドと該抗体とのコンジュゲーションに使用された。図31及び32に示されているデータは、表26にまとめられている。
(表26)
【表２８】
2020512843.tif 000290
*(PEGx)は、コンジュゲート中で使用された相補的反応基を示す。
*は、準最適な活性化を示す。
【０７６６】
図33Aは、例示的なコンジュゲート及び免疫刺激ポリヌクレオチドを用いたマウスA20細胞におけるIL6の誘導を示している。これらのアッセイで利用された抗体は、マウス抗CD22抗体であった。Q-タグは、該ポリヌクレオチドと該抗体とのコンジュゲーションに使用された。図33Aに示されているデータは、表27にまとめられている。
(表27)
【表２９】
2020512843.tif 000291
*(PEGx)は、コンジュゲート中で使用された相補的反応基を示す。PEG23は、NH2-PEG23-N3から形成された相補的反応基である。
【０７６７】
図33Bは、免疫刺激コンジュゲートの活性が免疫刺激コンジュゲートに含まれる抗体によって標的とされる受容体と同じ受容体を標的とする過剰な(0〜10倍の)遊離抗体の存在によって抑制されることを示している。IL6分泌を用いて、該コンジュゲート及びコンジュゲートされていないポリヌクレオチドの免疫刺激効率を評価した。これらのデータは、(1)該標的化部分が本発明のポリヌクレオチドの免疫刺激活性を改善し、かつ(2)本発明のコンジュゲート中の免疫刺激ポリヌクレオチドの細胞内送達が細胞表面受容体媒介性である可能性が高いことを示している。したがって、該コンジュゲートされていないポリヌクレオチドと比べた該コンジュゲートにおける免疫刺激活性の増強は、該免疫刺激ポリヌクレオチドの細胞内送達の改善によるものである可能性が高い。
【０７６８】
図34Aは、クラスAのCpG ODNであるCpG-2336によるヒトPBMCにおけるインターフェロン-αの誘導を示している。図34Bは、コンジュゲートSB-340を用いたヒトPBMCにおけるインターフェロン-αの誘導を示している。抗BDCA2抗体のSB-341とp246とを、この実験における対照として使用した。図34Cは、純化された形質細胞様細胞におけるインターフェロン-αの誘導を示している。抗BCDA4抗体及びそのコンジュゲート(SB-343)を対照として使用した。
【０７６９】
図35及び36は、QuantiBlueを用いるNFκB活性化によって測定される、様々な5'-修飾及びヌクレオシド間トリエステルを有するポリヌクレオチドの24時間での免疫刺激活性を示している。
(固形腫瘍モデルにおけるインビボプロファイリング)
A20マウスB細胞リンパ腫細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection(ATCC))から購入し、10％FBSを含有するRPMI培地中で培養した。実験当日、該細胞を採取し、HBSSに再懸濁させ、6〜8週齢の雌Balb/cマウス(Charles River)に皮下接種した(マウス1匹当たり5×106細胞)。10日後、マウスを無作為に割り付け、8〜10匹のマウスを有する各々の群に、腫瘍内(I.T.、25μL)注射又は静脈内(I.V.、100μL)注射のいずれかによって、3用量の試験品(免疫刺激ポリヌクレオチド又はコンジュゲート)を1日おきに(Q2D)投与した。腫瘍体積を用いて、処置の有効性を評価した。腫瘍体積は、式: V＝(L×W2)/2(式中、Vは腫瘍体積であり、Lは腫瘍の長さであり、Wは腫瘍の幅である)を用いて、週2回計算した。
【０７７０】
図37A及び37Bは、本発明の免疫刺激ポリヌクレオチドによる腫瘍の処置が腫瘍増殖を停止させ、逆転させることすらできることを示している。これらの実験では、本発明の免疫刺激ポリヌクレオチドを、図表のX軸に沿った矢印で特定される時点で腫瘍内又は静脈内投与した。これらのデータは、コンジュゲートが該コンジュゲートの遊離の個々の成分と比べてその抗腫瘍活性の点で優れていることも示している。図37Bに示されたインビボプロファイリング試験の詳細は、表28に提供されている。
(表28)
【表３０】
2020512843.tif 000292
*(PEGx)は、コンジュゲート中で使用された相補的反応基を示す。
【０７７１】
図38Aは、本発明の免疫刺激ポリヌクレオチドによる腫瘍の処置が、未修飾の免疫刺激ポリヌクレオチド又は5'-末端ISSを欠く免疫刺激ポリヌクレオチドと比較して、腫瘍増殖を低下させることができることを示している。これらの実験では、本発明の免疫刺激ポリヌクレオチドは腫瘍内に投与された。
【０７７２】
図38Bは、被験マウスへのA20マウスB細胞リンパ腫細胞の皮下接種及びその後の、上記のような、3用量の生理食塩水、本発明の免疫刺激ポリヌクレオチド、又は未修飾免疫刺激ポリヌクレオチドの腫瘍内投与から20日目の腫瘍体積を示している。これらの実験では、本発明の免疫刺激ポリヌクレオチドを腫瘍内投与した。
【０７７３】
図39Aは、本発明のコンジュゲートの静脈内投与が本発明のコンジュゲートされていない免疫刺激ポリヌクレオチドの直接的な腫瘍内投与と同じくらい腫瘍の治療に有効であり得ることを示している。生理食塩水及びコンジュゲートされていない免疫刺激ポリヌクレオチドを腫瘍内投与し、SB-337を静脈内投与した。
【０７７４】
図39Bは、被験マウスへのA20マウスB細胞リンパ腫細胞の皮下接種及びその後の、上記のような、3用量の生理食塩水、免疫刺激ポリヌクレオチド、又はコンジュゲートの投与から20日目の腫瘍体積を示している。生理食塩水及び免疫刺激ポリヌクレオチドを3用量で腫瘍内に投与し、SB-337を1回静脈内投与した。
【０７７５】
(液性腫瘍モデルでのインビボプロファイリング)
A20マウスB細胞リンパ腫細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection(ATCC))から購入し、10％FBSを含有するRPMI培地中で培養した。実験当日、該細胞を採取し、HBSSに再懸濁させ、6〜8週齢の雌Balb/cマウス(Charles River)に静脈内接種した(マウス1匹当たり5×106細胞)。翌日から、8〜10匹のマウス/群に、静脈内(I.V.、100μL)注射によって、3用量の試験品(免疫刺激ポリヌクレオチド又はコンジュゲート)を1日おきに(Q2D)投与した。47日目に、生き残りに(マウス1匹当たり5×106個のA20細胞)を再移植した。年齢及びサイズがマッチしている新しい対照群を追加し、A20マウス腫瘍細胞を接種した。未接種で未処置の同腹子を対照として含めた。生存率(％)をモニタリングして、処置効率を評価した。
【０７７６】
図40は、生理食塩水、本発明のコンジュゲート、又は免疫刺激ポリヌクレオチドによる処置を受けているマウス集団の生存率を示している。図40に示されたインビボプロファイリング試験の詳細は、表29に提供されている。
(表29)
【表３１】
2020512843.tif 000293
**μg/用量
【０７７７】
(実施例4.免疫刺激ポリヌクレオチドの血清安定性)
(プロトコル:)
1μLの2mMストック溶液(ホスホトリエステルを有するCpGポリヌクレオチド)を19μLの新鮮なマウス血清中に入れた。20μLの試料をPCRプレート中に入れ、37℃のサーモサイクラーで加熱した。2μLの試料を表示された時点で取り出し、18μLのホルムアミドローディングバッファーに添加し、ゲル解析の前に凍結させた。2μLをウェル毎に15％TBE-ウレアゲルにローディングし、200ボルトの電圧を30分間かけ、その後、臭化エチジウム染色した(図41A及び41Bを参照)。ホスホトリエステルを含有するCpGポリヌクレオチドの安定性を、ラット血清、サル血清、及びヒト血清でも評価した(図41C、41D、及び41Eを参照)。
【０７７８】
(AEX HPLCによる免疫刺激ポリヌクレオチドの血清安定性解析:)
免疫刺激ポリヌクレオチド(水中40μM)を80％マウス血清中8μMの最終濃度まで希釈した。アリコートを指定された時点(典型的には、4時間、24時間、及び48時間)で採取し、1:1の10mM EDTAでクエンチした。試料を、移動相A: 20mMリン酸ナトリウムpH 8、15％v/vイソプロパノール及び移動相B: 20mMリン酸ナトリウムpH 8、1.5M臭化ナトリウム、15％v/vイソプロパノール; 10分で20〜98％移動相Bの勾配; 0.6mL/分の流量、260nmでの検出を用いて、60℃のDNAPac PA200、4×250mmのカラム上での陰イオン交換HPLCにより解析した。HPLCトレースにおいて、主要なピークを各々の時点について積分し、非劣化試料に対する％ピーク面積を計算した。同じ方法を用いて、ラット血清、サル血清、及びヒト血清中での免疫刺激ポリヌクレオチドの安定性を解析した。
【０７７９】
図42は、5'-末端ヌクレオシドに結合したヌクレオシド間ホスホロチオエートを含有する免疫刺激ポリヌクレオチドが5'-末端ヌクレオシドに結合したヌクレオシド間ホスフェートを含有する免疫刺激ポリヌクレオチドよりも大きい血清安定性を示すことを示している。表30に示されているように、5'-末端にヌクレオシド間ホスフェートを有する免疫刺激ポリヌンクレオチド(polynuncleotide)は、NFκB活性化によって測定したとき、5'-末端にヌクレオシド間ホスホロチオエートを有する免疫刺激ポリヌクレオチドと比べてより大きい免疫刺激活性を示すことができる。
(表30)
【表３２】
2020512843.tif 000294
【０７８０】
図43は、5-ヨードウリジン含有免疫刺激ポリヌクレオチドが、インタクトなp246の質量よりも127Da小さいm/zを有する物質に相当するHPLCピーク面積の増加の観察によって決定されるような、ヨウ素の損失による長期にわたる血清中での分解を受ける可能性があることを示している。
【０７８１】
図44は、5-ブロモウリジンが免疫刺激ポリヌクレオチドに血清安定性と免疫刺激活性の優れた組合せを提供することができることを示している。図44に示されたデータは、表31にまとめられている。
(表31)
【表３３】
2020512843.tif 000295
**は、準最適な活性化を示す。
ヨード-dUは5-ヨード-2'-デオキシウリジンであり、dTはチミジンであり、dUは2'-デオキシウリジンであり、CF3-dTは5-トリフルオロメチル-チミジンであり、フルオロ-dUは5-フルオロ-2'-デオキシウリジンであり、C3はC3スペーサー-(CH2)3-OHである。
【０７８２】
図45は、所定の時間間隔での残存するインタクトなポリヌクレオチドのパーセンテージによって測定されるような、血清(非ヒト霊長類(NHP)、ヒト、又はマウス)中でのポリヌクレオチドの安定性を示している。図43のデータは、表32にまとめられている。
(表32)
【表３４】
2020512843.tif 000296
この表に列挙されている値は、インキュベーションの開始後の所定の時間間隔で測定されたインタクトなポリヌクレオチドのパーセンテージである。
(ヒト免疫刺激コンジュゲートの代表例)
(表33)
【表３５】
2020512843.tif 000297
(マウス免疫刺激コンジュゲートの代表例)
(表34)
【表３６】
2020512843.tif 000298
*TCOは、標的化部分に結合したtrans-シクロオクテニルに基づく基である。TCOは、図1Bに例示されている構造を有する。
【０７８３】
(実施例5)
本実施例は、本明細書に提供される抗体にコンジュゲートされたCpGポリヌクレオチド(CpG-Ab)が様々な液性及び固形腫瘍の治療において有効であることを示している。具体的には、B細胞を標的とするCpG-Abは、癌を有する対象における自然免疫応答及び適応免疫応答に影響を及ぼすことができる。そのようなB細胞を標的とするCpG-Abは、CpG-Ab標的(例えば、CD22)を発現しない腫瘍及びCpG-Ab免疫調節ポリヌクレオチドの標的(例えば、TLR9アゴニスト)を発現しない腫瘍を含む、非B細胞腫瘍(例えば、結腸癌)の治療において有用であることができる。さらに、非B細胞抗原提示細胞(APC)、例えば、形質細胞様樹状細胞又はマクロファージを標的とするCpG-Abは、液性腫瘍(例えば、リンパ腫)の治療に有用である。CpG-Abの幅広い抗腫瘍効力は、対象へのその全身投与の後に観察された。B細胞を標的とするCpG-Abを含む、CpG-Abの抗腫瘍効果は、細胞性免疫を伴い、かつ宿主のT細胞機能、例えば、CD8+ T細胞機能に依存的であることが分かった。例えば、B細胞を標的とするCpG-Abを含む、CpG-Abは、固形腫瘍のCD4+及びCD8+ T細胞浸潤を増大させた。さらに、CpG-Abは、適応性がありかつ長続きする抗腫瘍免疫をもたらすことが分かった。チェックポイントインヒビター、例えば、抗PD1抗体及び抗PD-L1抗体との相乗効果が観察された。CpG-Abは、きれいな補体プロファイルを有するように、かつ例えば、補体C3を活性化しないように設計された。
【０７８４】
(実施例6. CpG-Abコンジュゲートを標的とするB細胞は播種性(液性)B細胞リンパ腫を治療するのに有効である)
播種性(液性)B細胞リンパ腫疾患モデルを免疫適格BALB/cマウス(8〜10匹のマウス/群)へのA20リンパ腫細胞(TLR9+/CD22+)の静脈内注射によって作出した。試験化合物を細胞注射から1、3、及び5日目に静脈内投与し、動物の生存を40日間モニタリングした。
【０７８５】
上の実施例1及び2に記載されている通りに、免疫刺激ポリヌクレオチドを合成し、マウス抗CD22モノクローナル抗体(mAb)にコンジュゲートした。このコンジュゲート(表6-Aに示されているSB-337)を、以下の実施例において、CpG-mAb(CD22)と呼ばれる。以下の実施例における対照コンジュゲート(SB-339)としての役割を果たすように、CpGジヌクレオチドをGpCジヌクレオチドと交換した合成ポリヌクレオチドを同様に作製し、抗CD22 mAbにコンジュゲートした。
【０７８６】
上記のように、0日目に、マウスに、A20リンパ腫細胞を注射した。その後、各々1、3、及び5日目に、マウスに、(i)3mg/kgのCpG-mAb(CD22);(ii)10mg/kgのCpG-mAb(CD22);(iii)コンジュゲートされていないCpG(表2に示されているp347);(iv)10mg/kgのCD22 mAb(CD22);又は(v)10mg/kgのGpC-mAb(対照コンジュゲート)の静脈内注射を投与した。さらに、陰性対照群は、1、3、及び5日目に、生理食塩水溶液のみを受容した。これらの群の生存率を40日間モニタリングした。
【０７８７】
図46Bに示されているように、CpG-mAbで処置されたマウスは、陰性対照群と比較して顕著により長い生存を有していた。この処置は投薬量依存的な効果を示した。特に、10mg/kgのCpG-mAb(CD22)を受容した群は、40日の観察域内で100％の生存率を持続し、90％の生存率を持続した、3mg/kgのCpG-mAb(CD22)を受容した群の結果よりもわずかに良好であった。
【０７８８】
さらに、裸のCpG ODN又は抗CD22 mAbのみによる処置も、生理食塩水溶液のみを受容した陰性対照群と比較して、群の生存を延長させたが、どちらの群も40日の観察域内で死に絶えた。GpC-mAb対照による処置も、陰性対照と比較して、群の生存を延長させ、この効果は、対照コンジュゲートの抗CD22 mAb成分に起因し得る。
【０７８９】
これらのデータは、CpG ODN及びCpG ODNを含有するCpG-Abコンジュゲート及び本明細書に提供されるB細胞表面抗原を標的とする抗体が播種性B細胞リンパ腫を治療するのに有効であることを示唆している。
【０７９０】
次に、1回目の腫瘍移植からの生き残りを47日目に2回目の腫瘍移植に供した。特に、第二の用量のA20リンパ腫細胞(5×106細胞)を、1、3、及び5日目に10mg/kg又は3mg/kgのCpG-mAb(CD22)で処置した生き残りマウスに静脈内注射した。未処置の対照群に、同じ用量のA20リンパ腫細胞を47日目に投与した。マウスの群の生存率を43日間(すなわち、1回目の腫瘍移植から合計90日)、モニタリングし続けた。
【０７９１】
図46Cに示されているように、1回目の腫瘍移植の結果と一致して、未処置の対照群も、47日目にA20細胞を受容してから40日以内に死に絶えた(すなわち、約85日で死に絶えた)。10mg/kg処置群と3mg/kg処置群はどちらも、対照群よりも顕著に良好な生存率を示した。特に、図46Cに示されているように、マウスが5日目の最後の用量のCpG-mAb(CD22)の後に処置を受けなかったにも関わらず、10mg/kg処置群は100％の生存率を維持し、3mg/kg処置群は90日の観察域の最後に60％の生存率を維持した。
【０７９２】
次に、1回目及び2回目の腫瘍移植からの生き残りを3回目の腫瘍移植に供した後、持続的な抗腫瘍効果をさらにモニタリングした。特に、90日目に5×106個のA20リンパ腫細胞(TLR9+/CD22+)をマウスの肩に皮下移植することにより、固形B細胞リンパ腫疾患モデルを生き残りマウスで作出した。未処置の対照群に、同じ用量のA20リンパ腫細胞を90日目に移植した。腫瘍生着のサイズを30日間(すなわち、90日目から120日目まで)、モニタリングした。
【０７９３】
特に、図46Dに示されているように、腫瘍体積は、対照群で急速に増加し、20日以内に3000mm3超のサイズに達した。対照的に、生き残りが5日目の最後の用量のCpG-mAb(CD22)の後に追加処置を受けなかったにも関わらず、生き残りの群は、30日の観察期間の全体を通じて、無腫瘍であり続けた。これらの実験は、可溶性腫瘍からの生き残りも固形腫瘍移植から生き残ったことを示している。これらの生き残りは、後に新たな腫瘍生着を強く阻害する抗腫瘍免疫を獲得した。
【０７９４】
まとめると、これらのデータは、本明細書に提供されるCpG-Abコンジュゲートが対象の腫瘍に対する持続的な適応免疫を誘導することができることを示唆している。
【０７９５】
(実施例7. B細胞を標的とするCpG-Abコンジュゲートは固形B細胞リンパ腫を治療するのに有効である)
固形B細胞リンパ腫疾患モデルを、5×106個のA20リンパ腫細胞(TLR9+/CD22+)を免疫適格BALB/cマウスに移植することにより作出した。該細胞をマウスの肩に皮下注射し、腫瘍増殖をモニタリングした。CpG-mAb(CD22)コンジュゲート及びGpC-mAb対照コンジュゲートを上記のように作製した。
【０７９６】
上記のように、0日目に、マウスに、A20リンパ腫細胞を移植した。その後、9、12、及び14日目の各々に、マウスに、(i)3mg/kgのCpG-mAb(CD22);(ii)10mg/kgのCpG-mAb(CD22);(iii)裸のCpG ODN;(iv)10mg/kgのCD22 mAb(黒塗りの四角);又は(v)10mg/kgのGpC-mAb(対照コンジュゲート)の静脈内注射を投与した。さらに、陰性対照群は、9、12、及び14日目に生理食塩水溶液のみを受容した。マウスの群の腫瘍体積を23日間モニタリングした。結果は、図47B〜47Eに示されている。
【０７９７】
図47Bに示されているように、CpG-mAb(CD22)で処置したマウスは、陰性対照群と比較して、有意により小さい体積を有していた。CpG-mAb(CD22)で処置された全てのマウスの腫瘍体積は、25日の期間の最後に、2000mm3未満であり続けた。この処置は、投薬量依存的な効果を示した。特に、10mg/kgのCpG-mAb(CD22)を受容した群は、3mg/kgのCpG-mAb(CD22)を受容した群と比較して、25日の期間の最後に、より小さい体積を有していた。さらに、裸のCpG ODNのみによる処置も、陰性対照群よりも有意に小さい腫瘍体積をもたらし、該腫瘍体積は、少なくとも20日間、2000mm3未満であり続けた。まとめると、これらのデータは、CpG ODN並びにCpG ODN及びB細胞表面抗原を標的とする抗体を含有するCpG-Abコンジュゲートが固形B細胞リンパ腫を治療するのに有効であることを示唆している。マウスの重量に対するCpG-mAb(CD22)コンジュゲートの効果も検討された。結果は、図47Fに示されている。
【０７９８】
(実施例8. B細胞を標的とするCpG-Abコンジュゲートは非B細胞癌を治療する際に有効である)
0.2×106個のCT26細胞(CD22-/PD-L1(low)/TLR9-)を免疫適格BALB/cマウスの脇腹に皮下移植することにより、結腸癌疾患モデルを作出した。CpG-mAb(CD22)コンジュゲートは、上記のように作製した。
【０７９９】
上記のように、0日目に、マウスに、CT26細胞を移植した。その後、このマウスに、(i)CpG-mAb(CD22)のみ;(ii)抗PD-1抗体のみ;(iii)抗PD-1抗体と組み合わせたCpG-mAb(CD22);又は(iv)生理食塩水溶液の静脈内注射を投与した。特に、3mg/kgのCpG-mAb(CD22)は、5日目に最初に注射し、8日目及び11日目に投与を反復した。10mg/kgの抗PD-1は、6日目に最初に注射し、9日目及び12日目に投与を反復した。マウスの群の腫瘍体積を18日間モニタリングした。
【０８００】
図48Bに示されているように、CpG-mAb(CD22)もしくは抗PD-1のみ、又はこれら2つの薬剤の組合せによる処置は全て、観察期間の最後に、対照群と比較して、腫瘍体積を有意に低下させた。組合せ処置の抗腫瘍効果は、抗PD-1のみによる処置よりも顕著であった。
【０８０１】
まとめると、これらのデータは全体で、固形腫瘍細胞自体がTLR9もCpG-mAb(CD22)コンジュゲートの抗原標的も発現していないとしても、B細胞を標的とするCpG-mAb(CD22)コンジュゲートの全身投与が固形腫瘍を治療するのに有効であることを示唆している。抗腫瘍効果は、B細胞を標的とするCpG-mAb(CD22)コンジュゲートを投与したときのB細胞活性化に起因し得る。さらに、抗PD-1抗体とB細胞を標的とするCpG-mAb(CD22)コンジュゲートの両方を使用する組合せ療法は、抗PD-1抗体のみによる処置と比較して、固形腫瘍を治療するのにより有効である。
【０８０２】
(実施例9.適格な免疫系におけるCpG-Abコンジュゲートの抗腫瘍効果)
次に、免疫適格系及び免疫不全系におけるCpG-Abコンジュゲートの抗腫瘍効果を評価するために、実験を行った。それぞれ、5×106個のA20リンパ腫細胞(TLR9+/CD22+)を免疫適格BALB/cマウス及び免疫不全Nu/Nuマウス及びSCIDマウス移植することにより、固形B細胞リンパ腫モデルを作出した。CpG-mAb(CD22)コンジュゲートは、上記のように作製した。
【表３７】
2020512843.tif 000299
【０８０３】
免疫適格群において、10mg/kgのCpG-mAb(CD22)を10、12、及び14日目に静脈内投与した。陰性対照群は、上記の日に生理食塩水溶液のみの静脈内注射を受容した。腫瘍体積を20日間モニタリングした。図49Aに示されているように、CpG-mAb(CD22)の静脈内投与は、免疫適格Balb/Cマウスにおいて無腫瘍表現型を生じさせたが、対照群の腫瘍体積は、観察期間中、増加し続けた。
【０８０４】
免疫不全群において、10mg/kgのCpG-mAb(CD22)又は裸のCpGを8及び11日目に静脈内投与した。陰性対照群は、上記の日に生理食塩水溶液のみのi.v.注射を受容した。腫瘍体積を15日間モニタリングした。図49B及び49Cに示されているように、裸のCpG ODN又はCpG-mAb(CD22)コンジュゲートのi.v.投与は、陰性対照群と比較して、免疫不全Nu/Nuマウス又はSCIDマウスにおける腫瘍増殖に影響を及ぼさなかった。
【０８０５】
まとめると、これらのデータは、CpG-Abコンジュゲートの抗腫瘍効果がT細胞免疫に依存的であることを示唆している。
【０８０６】
(実施例10. CpG-Abコンジュゲートの抗腫瘍効果はCD8+ T細胞依存性である)
次に、CpG-Abコンジュゲートの抗腫瘍効果に必要とされるリンパ球の活性を調べるために、実験を行った。特に、CpG-Abコンジュゲートの抗腫瘍効果を、それぞれ、抗CD4抗体(-2、-1、0、5、8、12日目に、500ug/マウス)、抗CD8抗体(-2、-1、0、5、8、12日目に、100ug/マウス)、又は抗アシアロGM1抗体(-2、-1、0、5、8、12日目に、25ug/マウス)の腹腔内注射によって獲得されるCD4+ T細胞除去マウス、CD8+ T細胞除去マウス、及びNK細胞除去マウスで評価した。細胞除去は、FACS解析により確認した。除去抗体は全て、Bioexcellから購入した。
【０８０７】
播種性B細胞リンパ腫モデルマウスは、上記のように作出した。CpG-mAb(CD22)コンジュゲートは、上記のように作製した。
【０８０８】
これらのリンパ球除去実験において、上記のように、0日目に、マウスに、A20リンパ腫細胞(5×106個)を注射した。その後、各々1、3、及び5日目に、マウスに、(i)3mg/kgのCpG-mAb(CD22)及びCD4+ T細胞を除去するための-2、-1、0、5、8、12日目の500ug/マウスの抗CD4除去抗体);(ii)3mg/kgのCpG-mAb(CD22)及びNK細胞を除去するための-2、-1、0、5、8、12日目の25ug/マウスの抗アシアロGM1抗体;並びに(iii)3mg/kgのCpG-mAb(CD22)及びCD8+ T細胞を除去するための-2、-1、0、5、8、12日目の100ug/マウスの抗CD8除去抗体の静脈内注射を投与した。さらに、陽性対照群は、3mg/kgのCpG-mAb(CD22)を、1、3、及び5日目に受容し、陰性対照群は、生理食塩水溶液のみを、1、3、及び5日目に受容した。これらの群の生存率を85日間モニタリングした。
【０８０９】
図50Aに示されているように、CpG-mAb(CD22)処置を受容したマウスは、CpG-mAb(CD22)で処置されていない群と比較して有意により良好な生存を示した。CD4+ T細胞除去は、生存に有意には影響を及ぼさなかった。特に、CpG-mAb(CD22)で処置された(T細胞除去処置あり及びなしの)2つのマウス群はどちらも、腫瘍細胞を移植した後、少なくとも85日間、50％生存率を維持したが、CpG-mAb(CD22)で処置されていない(T細胞除去処置あり及びなしの)2つのマウス群はどちらも、40日以内に死に絶えた。
【０８１０】
NK細胞又はCD8+細胞の除去はどちらも、CpG-mAb(CD22)で処置されたマウスにおいて、より悪い生存をもたらした。図50Bに示されているように、CpG-mAb(CD22)処置とNK細胞除去処置の両方を受容した群は、40日目に約90％の生存率及び85日目に約10％の生存を示した。より顕著なことに、図50Cに示されているように、90％超のCD8+ T細胞除去マウスは、CpG-mAb(CD22)処置の後でさえも、30日以内に死亡した。この結果は、対照群で観察された結果と似ていた(対照群では、全マウスが、約30日目に死亡した)。これらのデータは、CpG-Abの抗腫瘍効果が少なくともCD8+ T細胞依存性であることを示唆している。
【０８１１】
(実施例11. CpG-AbコンジュゲートはT細胞腫瘍浸潤を増大させる)
固形B細胞リンパ腫モデルマウスを上記のように作出した。CpG-mAb(CD22)コンジュゲートは、上記のように作製した。
【０８１２】
0日目にA20リンパ腫細胞を皮下移植してから10、12、及び14日後、マウスは、10mg/kgのCpG-mAb(CD22)コンジュゲートの静脈内投与を受容した。その後、17日目に採取された腫瘍を、HBSS中に1mg/mLのコラゲナーゼIV、100U/mLのDNアーゼIを含有する消化バッファー中、37℃で30分間のインキュベーションにより消化した。その後、消化された細胞を70umの篩に通して濾過し、洗浄し、氷上で抗CD4-PE又は抗CD8-PE抗体とともにインキュベートし、FACSにより解析した。
【０８１３】
図51Aに示されているように、腫瘍増殖は、対照群と比較して、CpG-mAb(CD22)で処置された群でより遅かった。CpG-mAb(CD22)処置されたマウスの17日目の腫瘍体積は、対照マウスよりも有意に小さかった。図51Bに示されているように、腫瘍組織内のCD4+細胞及びCD8+細胞のパーセンテージはどちらも、対照群よりも処置群で有意に高かった。さらに、図51Cに示されているように、腫瘍体積は、腫瘍内のCD8+細胞のパーセンテージと逆相関している。
【０８１４】
まとめると、これらのデータは、固形腫瘍を有するマウスへのCpG-Abコンジュゲートの全身投与が腫瘍内へのT細胞浸潤を有意に増大させることができることを示唆している。腫瘍及び/又は腫瘍微小環境内の免疫細胞、特に、CD8+ T細胞の数の増加は、腫瘍に対する免疫攻撃及び腫瘍増殖の阻害を促進する。
【０８１５】
(実施例12. CpG-Abコンジュゲートと免疫チェックポイントタンパク質の抗体の相乗効果)
CpG-Abコンジュゲートと免疫チェックポイントタンパク質抗体の両方を用いる組合せ療法の抗腫瘍効果を評価するために、実験を行った。
【０８１６】
固形B細胞リンパ腫モデルマウスは、上記のように作製した。CpG-mAb(CD22)コンジュゲートは、上記のように作製した。抗PD1抗体(クローンJ43)は、Bioxcellから購入し、抗PDL1抗体(アテゾリズマブ)は、自製した。
【０８１７】
上記のように、0日目に、マウスに、A20リンパ腫細胞を移植した。その後、このマウスに、(i)CpG-mAb(CD22);(ii)抗PD-1抗体もしくは抗PD-L1抗体の腹腔内注射;(iii)抗PD-1抗体と組み合わせたCpG-mAb(CD22)もしくは抗PD-L1抗体と組み合わせたCpG-mAb(CD22);又は(iv)生理食塩水溶液の静脈内注射を施した。特に、CpG-mAb(CD22)(単独又は免疫チェックポイントタンパク質抗体との組合せ)を受容した群について、第一の用量の3mg/kgのCpG-mAb(CD22)を10日目に最初に投与し、その後、12及び14日目に、同じ投与を反復した。さらに、免疫チェックポイントタンパク質抗体(単独又はCpG-mAb(CD22)との組合せ)を受容した群について、第一の用量の10mg/kgの免疫チェックポイントタンパク質抗体を10日目に最初に投与し、その後、13及び16日目に、同じ投与を反復した。マウスの群の腫瘍体積をモニタリングした。
【０８１８】
この実験から、CpG-mAb(CD22)と免疫チェックポイントタンパク質抗体が、これら2つの薬剤のいずれかによる個別的な処置と比較して、相乗的により強い腫瘍阻害効果を生じることが観察された。特に、図52A及び52Bに示されているように、該組合せ療法で処置されたマウスは、CpG-mAb(CD22)又は免疫チェックポイント抗体のみによる処置と比較して、有意により小さい腫瘍サイズを有していた。
【０８１９】
観察された相乗効果がCD8+ T細胞活性にも依存的であるかどうかを調べるために、さらなるマウスの群に、(i)10、12、及び14日目の各々に、10mg/kgのCpG-mAb(CD22)、(ii)10、13、及び16日目の各々に、10mg/kgの抗PD-1抗体、並びに(iii)抗CD8抗体(200ug/マウス、腹腔内、0日目に開始、CD8+ T細胞を除去するために、実験全体を通じて2回/週で投与)を投与した。図52Cに示されているように、生理食塩水処置対照群と同様、この実験群の腫瘍体積は急速に増加し、CpG-mAb(CD22)と免疫チェックポイントタンパク質抗体の両方を用いる組合せ療法の腫瘍増殖を阻害する際の相乗効果がCD8+ T細胞にも依存的であることが示唆された。
【０８２０】
さらに、CpG-mAb(CD22)と抗PD-1抗体の両方を用いる組合せ療法で処置され、1回目の腫瘍移植から生き延びたマウスを2回目の腫瘍移植に供した。特に、組合せ処置からの生き残りの群に、30日目に、第二の用量のA20細胞を肩に皮下投与した。生き残りの群は、2回目の腫瘍移植の後に追加の処置を受容しなかった。未処置対照群に、同じ用量の腫瘍細胞を投与した。腫瘍体積を25日間(すなわち、30日目から55日目まで)、さらにモニタリングした。
【０８２１】
図53A〜53Cに示されているように、対照群又は抗PD-1抗体のみで処置された群とは対照的に、CpG-Ab/抗PD-1の組合せは、観察期間の全体を通じて、全ての個体で腫瘍増殖を有意に阻害した。さらに、該組合せ処置は、約D18から2個体でステージング済みの腫瘍を退行させた。
組合せ処置からの生き残りの群を上記のように2回目の腫瘍移植に供した。図53Dに示されているように、2回目の腫瘍移植の後、未処置の対照群における腫瘍体積は急速に増加し、平均体積は20日以内に2000mm3超に達した。対照的に、生き残りの群は、25日間の観察域の全体を通じて無腫瘍であり続けた。これらの結果は、CpG-Abコンジュゲートと免疫チェックポイントタンパク質抗体を用いる組合せ療法が対象の腫瘍に対する持続的な適応免疫を誘導することができることを示唆している。
【０８２２】
(実施例13. CpG-AbコンジュゲートとT細胞アゴニストの相乗効果)
次に、CpG-AbコンジュゲートとT細胞アゴニストの両方を用いる組合せ療法の抗腫瘍効果を評価するために、実験を行った。
【０８２３】
固形B細胞リンパ腫モデルマウスは、上記のように作出した。CpG-mAb(CD22)コンジュゲートは、上記のように作製した。
【０８２４】
上記のように、0日目に、マウスに、A20リンパ腫細胞を移植した。その後、このマウスに、(i)CpG-mAb(CD22);(ii)抗OX-40抗体(クローンOX-86、10mg/kg、Bioxcell)、抗ICOS抗体(クローン7E.17G9、10mg/kg、Bioxcell)、もしくは抗4-1BB抗体(クローン3H3、1mg/kg、Bioxcell)の腹腔内注射;(iii)抗OX-40抗体と組み合わせたCpG-mAb(CD22)、抗ICOS抗体と組み合わせたCpG-mAb(CD22)、もしくは抗4-1BB抗体と組み合わせたCpG-mAb(CD22);又は(iv)生理食塩水溶液の静脈内注射を投与した。特に、CpG-mAb(CD22)(単独又はT細胞刺激抗体との組合せ)を受容した群については、第一の用量の3mg/kgのCpG-mAb(CD22)を10日目に最初に投与し、その後、12及び14日目に、同じ投与を反復した。さらに、T細胞刺激抗体(単独又はCpG-mAb(CD22)との組合せ)を受容した群については、第一の用量のT細胞刺激抗体を10日目に投与し、その後、13及び17日目に、同じ投与を反復した。マウスの群の腫瘍体積をモニタリングした。
【０８２５】
この実験から、CpG-mAb(CD22)及びT細胞刺激抗体が該T細胞刺激抗体のみによる処置では観察されない腫瘍阻害効果を相乗的にもたらすことが観察された。特に、図54A〜54Cに示されているように、該組合せ療法で処置されたマウスは、陰性対照群又はT細胞刺激抗体(抗OX-40、抗ICOS、もしくは抗4-1BB)のみで処置された群と比較して、有意により小さい腫瘍サイズを有していた。
【０８２６】
(実施例14. B細胞を標的とするCpG-Abは脾臓細胞における腫瘍抗原特異的細胞傷害性T細胞応答を誘発する)
結腸癌疾患モデルは、上記のように作出した。CpG-mAb(CD22)コンジュゲートは、上記のように作製した。
【０８２７】
上記のように、0日目に、マウスに、CT26細胞を移植した。その後、10、13、及び16日目に、このマウスに、10mg/kgのCpG-mAb(CD22)又は生理食塩水溶液の静脈内注射を投与した。マウスの群の腫瘍体積を17日間モニタリングした。図55Aに示されているように、CpG-mAb(CD22)による処置は、対照群と比較して、腫瘍増殖を有意に阻害した。
【０８２８】
17日目(最後の投与から24時間後)に、マウスを屠殺し、脾臓細胞を単離し、抗IFN-γ抗体でコーティングされたELISPOTプレートにプレーティングした(4×105細胞/ウェル)。該細胞に、CT26細胞表面抗原(AH1ペプチド)を100ug/mlで37℃で24時間投与し、IFN-γ分泌T細胞を計数した。図55Bに示されているように、IFN-γ分泌細胞の数は、対照と比較して、CpG-mAb(CD22)で処置された群で有意に増加した。これらのデータは、B細胞を標的とするCpG-Abコンジュゲートが、対象に投与されたときに、腫瘍抗原特異的細胞傷害性T細胞応答を誘発することができることを示唆している。
【０８２９】
(実施例15.樹状細胞を標的とするCpG-Abコンジュゲートは抗腫瘍適応免疫を誘発する)
固形B細胞リンパ腫疾患モデルは、上記のように作出した。配列番号:313の配列を有する免疫刺激ポリヌクレオチド(p313)を合成し、実施例1及び2に記載されている通りに、抗CD205抗体又は抗PD-L1抗体にコンジュゲートした。これらのコンジュゲートは、それぞれ、CpG-Ab(CD205)及びCpG-Ab(PD-L1)と呼ばれる。
【０８３０】
上記のように、0日目に、マウスに、A20細胞を移植した。その後、10、12、及び14日目に、このマウスに、(i)10mg/kgのCpG-Ab(CD205);(ii)10mg/kgのCpG-Ab(PD-L1);又は(iii)生理食塩水溶液の静脈内注射を施した。マウスの群の腫瘍体積を約41日間モニタリングした。
【０８３１】
図56Aに示されているように、CpG-Ab(CD205)による処置は、対照群と比較して、腫瘍増殖を有意に阻害した。図56Bにさらに示されているように、CpG-Ab(CD205)コンジュゲートは、この群の全8個体で腫瘍増殖を退行させ、全8個体のうち7個体で無腫瘍表現型を生じさせた。
【０８３２】
図56Cに示されているように、CpG-Ab(PD-L1)による処置は、全8個体のうち3個体で腫瘍増殖を退行させ、無腫瘍表現型を生じさせた。
【０８３３】
さらに、CpG-Abコンジュゲートで処置された群からの生き残りを2回目の腫瘍移植に供した。特に、生き残りに、37日目に、5×106個のA20細胞を皮下投与し、それ以上処置しなかった。固形B細胞リンパ腫を有する未処置マウス群に、同じ用量のA20細胞を投与した。2回目の移植の後、マウスの群の腫瘍体積を17日間観察した。図56Dに示されているように、腫瘍体積は対照群で急速に増加し、その一方、CpG-Ab(PD-L1)処置群又はCpG-Ab(CD205)処置群の生き残りは、17日間の観察域の全体を通じて無腫瘍であり続けた。
【０８３４】
別の実験において、固形B細胞リンパ腫を有する4つのマウスの群(8個体/群)を、10、12、及び14日目の各々に、(i)10mg/kgのCpG-Ab(CD205)コンジュゲート;(ii)10mg/kgのマウス抗CD205モノクローナル抗体;(iii)10mg/kgのラットIgG、又は(iv)生理食塩水溶液の静脈内投与で処置した。マウスの群の腫瘍体積を27日間モニタリングした。
【０８３５】
図57A及び57Cに示されているように、CpG-Ab(CD205)コンジュゲートによる処置は、処置群の全8個体で、腫瘍増殖を退行させ、最終的に、無腫瘍表現型を生じさせた。また、腫瘍は、抗DEC205抗体及びラットIgG対照抗体で処置されたマウスで退行した。これは、おそらく、両抗体が、IgG2と同様、適度の抗腫瘍活性を生じる活性のあるFcエフェクター機能を保有していたという事実によるものであるが、これらのマウスはいずれも無腫瘍でなかった。したがって、抗DEC205抗体が抗腫瘍活性を示したという事実にもかかわらず、CpG-CD205コンジュゲートは、全てのマウスが無腫瘍であったため、有意により有効であった。
【０８３６】
まとめると、これらのデータは、樹状細胞を標的とするCpG-Abコンジュゲートが、対象に投与されたとき、腫瘍に対する持続的な適応免疫を誘発することができることを示唆している。
【０８３７】
(実施例16  CpG-CD19コンジュゲートは良好な効力を示す)
固形B細胞リンパ腫疾患モデルは、上記のように、4×106個のA20リンパ腫細胞をマウスに移植することにより作出した。簡潔に述べると、細胞を皮下注射し、キャリパーを用いて、腫瘍増殖を測定した。CpG-mAbコンジュゲート及び裸のCpGは、上記のように作製した。
【０８３８】
0日目にマウスに、A20リンパ腫細胞を移植した。マウスを10日間ステージングし、その後、10、12、及び14日目に処置し、20日目まで腫瘍増殖を測定した(図60A)。処置には、(i)3mg/kgのCpG-Ab(SB-337; CD22にコンジュゲートされたp313)(四角);(iii)3mg/kgの抗CD19(黒塗りの下向きの三角);(iv)3mg/kgのCpG-Ab(SB-388; CD19にコンジュゲートされたp313)(黒塗りの菱形);(v)1.9μg/マウスの遊離CpG(p347)(上向きの三角);(vi)19μg/マウスの遊離CpG(p347)(白抜きの下向きの三角);又は(vii)190μg/マウスの遊離CpG(p347)(白抜きの菱形)の静脈内注射が含まれた。さらに、陰性対照群は、生理食塩水溶液のみ(黒塗りの丸)を受容した。マウスの群の腫瘍体積をキャリパーを用いて10日目から測定し、20日目まで継続した(図60A)。20日目に、これらのマウスを屠殺し、腫瘍体積を測定した(図60B)。これらの結果から、CD19にコンジュゲートされたp313を含有するCpG-Abコンジュゲート(SB-388)が良好な効力を示し、この効力が同じCpG(p313)を含有するが、CD22にコンジュゲートされているCpG-Abコンジュゲート(SB-337)と類似していることが示された。
【０８３９】
さらに、腫瘍重量の変化を考慮に入れないマウスの体重変化を評価した(図60C)。予備的な安全性の結果から、CD19 CpG-Ab(SB-388)が、体重変化に基づいて、その同等の用量のCpGよりも毒性が低いことが示された。
【０８４０】
現在の及び以下の実施例において、CpG-4715は、表2に示されるp347に対応し; CpG-4523は、表2に示されるp313に対応する。SB-1490は、表6-Aに示されるSB-337に対応し;かつSB-3055は、図6-Bに示されるSB-388に対応する。
【０８４１】
(実施例17  固形腫瘍へのCpG4715の腫瘍内投与は有効である)
固形腫瘍へのCpGの腫瘍内投与を評価するために、アルビノのC57Bl/6マウス(n＝8/群)の脇腹に、1×106個のB16F10メラノーマ細胞を皮下接種した。該腫瘍を7日間増殖させておき、その後、7、9、11、及び13日目に、p347を腫瘍内注射した(50μLの生理食塩水中、30μg)。陰性対照として、50μLの生理食塩水を生理食塩水処置群に腫瘍内注射した。腫瘍体積を27日目までモニタリングした。これらの結果から、生理食塩水と比べた、p347で処置されたマウスにおけるより小さい腫瘍体積によって示されるように、p347が固形腫瘍型で有効であることが示された(図61A)。
【０８４２】
さらに、14日目に1×106個のB16F10メラノーマ細胞を尾静脈に静脈内注射することによって、B16F10メラノーマ細胞をマウスに再移植することにより、CpGの全身効果をモニタリングした。腫瘍体積を27日目までモニタリングし、その後すぐ、マウスを屠殺し、その肺を切除して、腫瘍転移を評価した。これらの結果から、未処置のメラノーマ細胞を尾静脈に注射することによりマウスに再移植すると、生理食塩水処置群と比較してp347処置群で肺転移がより少ないことが明らかになった(図61B)。まとめると、これらの結果から、CpGが全身効果をもたらし、免疫活性化からの持続的効果が肺への転移の総数を低下させることができることが示された。
【０８４３】
全身効果に関する作用機序をより慎重に決定するために、CT-26結腸直腸マウスモデルを上記のように使用した。簡潔に述べると、腫瘍を7日間増殖させておき、その後、7、10、12、及び14日目に、p347を腫瘍内注射した(50μLの生理食塩水中、10μg)。陰性対照として、50μLの生理食塩水を生理食塩水処置群に腫瘍内注射した。腫瘍体積を21日目までモニタリングした(図61C)。B16F10メラノーマモデルと一致して、CpG4715の腫瘍内投与は、CT26固形腫瘍で有効であった。重要なことに、これらの結果から、CT26細胞がTLR9-であるので、宿主TLR9がCpG処置の機能に十分であることが示された。
【０８４４】
(実施例18  CpG-Abコンジュゲートの抗腫瘍効果はB細胞依存性である)
CpGの活性に対するB細胞の役割を評価するために、実験を行った。この効果のために、CT26結腸直腸モデルを、上記のように、遺伝的にB細胞を欠損しているJhノックアウトマウス(Igh-Jtm1DhuN?+N2; Taconic Biosciences社)において使用した(図62A)。これらのマウスは、Ig重鎖遺伝子座に内在性マウスJセグメントの欠失を有しており、発生の進行と細胞量の両方が劇的に変化したB系譜の細胞を生じさせた。これらのマウスは、脾臓、骨髄、リンパ節、末梢血、又は腹膜に成熟した(免疫グロブリンを担持する)B-リンパ球を含有せず、かつこれらのマウスは、血清中に検出可能なIgM又はIgGを有さない。
【０８４５】
CT26異種移植片を上記のように作出した。腫瘍を7日間増殖させ、その後、10、12、及び14日目に、マウスを10mg/kgのCpG-mAb(CD22-CpG; SB-337)又は生理食塩水で静脈内処置した(図62A)。腫瘍体積を17日間モニタリングし、生理食塩水群とCpG-mAb群の間で有意差は認められなかった。これにより、B細胞がCpG活性に必要とされることが示された。
【０８４６】
これらの結果は、免疫適格マウスに抗CD20 mAbを投与することによりB細胞が除去されたマウスバックグラウンドでCT-26結腸直腸モデルを用いて、さらに裏付けられた(図62B)。腫瘍体積を27日間測定した。CpG-mAb処置群の抗腫瘍効果は、B細胞除去なしの処置と比較して有意に低下していた。この結果から、CpG活性がB細胞依存性であることがさらに裏付けられた。
【０８４７】
(実施例19  B細胞活性化は同系マウスモデルでCpG抗腫瘍活性を増強する)
結腸直腸癌の同系モデルをMC38結腸直腸癌細胞を用いて実施し、CpG抗腫瘍活性に対するB細胞活性化の効果を評価した。MC38結腸直腸癌細胞は、抗原/TLR9陰性である。簡潔に述べると、アルビノの雌C57Bl/6マウス(n＝8/群)の脇腹に、0.3×106個のMC38細胞を皮下接種した。異種移植片を10日間増殖させ、その後、試験化合物を、(i)生理食塩水溶液(丸);(ii)10mg/kgの抗CD22(上向きの三角);(iii)10mg/kgの抗PD-L1(下向きの三角);(iv)10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(四角);又は(v)10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)＋10mg/kgの抗PD-L1(菱形)とともに注射した。抗CD22及びCD22-CpGを10、12、及び14日目に静脈内投与し;抗PD-L1を10、13、及び17日目に腹腔内投与した(図63A)。腫瘍体積を17日目までモニタリングした(図63A)。
【０８４８】
これらの結果から、10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(四角)による処置が、生理食塩水処置と比べて、腫瘍体積を有意に低下させることが示された(図63A)。同様に、10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)＋10mg/kgの抗PD-L1(菱形)による処置は、生理食塩水処置マウスと比較して、腫瘍体積を有意に低下させた。これらの処置の各々についての個々のマウスの結果も示されている(図63B〜図63F)。
【０８４９】
さらに、B16F10メラノーマモデルを用いて、B細胞活性化の評価を行った。簡潔に述べると、1×106個のB16F10メラノーマ細胞をマウスの脇腹に皮下接種し、腫瘍を10日間増殖させておいた。その後、10、12、及び14日目に、マウスに、(i)生理食塩水溶液(丸);(ii)10mg/kgの抗CD22(四角);(iii)10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(三角);又は(iv)10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)＋10mg/kgの抗PD-L1(菱形)を投与した(図64A)。抗CD22及びCD22-CpGを静脈内投与し;抗PD-L1(アテゾリズマブ)を腹腔内投与した。これらの結果から、CD22-CpG処置が腫瘍体積を低下させることが示された(p＝0.08)。同様に、CD22-CpG＋抗PD-L1による処置は、腫瘍体積を有意に低下させた(p＝0.03)。
【０８５０】
結腸直腸モデル及びメラノーマモデルと一致して、LLC1ルイス肺癌細胞を接種したマウスは、同様の結果を示した。マウスにLLC1ルイス肺癌細胞を接種し、マウスの平均腫瘍体積増加の進行を追跡した。7日目から始めて、このマウスを、(i)生理食塩水溶液(丸);(ii)10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(丸);(iii)10mg/kgの抗PD1(四角);(iv)10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)＋10mg/kgの抗PD1(上向きの三角)(v)10mg/kgの抗PD-L1(下向きの三角);(vi)10mg/kgのCD22-CpG＋10mg/kgの抗PD-L1(菱形)で処置した(図64B)。抗CD22及びCD22-CpGを7、10、及び13日目に静脈内投与し;抗PD-L1及び抗PD1を7、10、及び14日目に腹腔内投与した。これらの結果から、単独の又は10mg/kgの抗PD1と組み合わせた(上向きの三角)又は10mg/kgの抗PD-L1と組み合わせた(菱形)、10mg/kgのCD22-CpGで処置されたマウスが腫瘍体積の有意な低下を示すことが示された(p＝0.023)。まとめると、これらの結果から、CD22-CpG処置がLLC1腫瘍体積を低下させることができることが示された。
【０８５１】
(実施例20  CpGをB細胞又は樹状細胞に標的とすることの有効性)
CpGを樹状細胞に標的とすることと比べた、CpGをB細胞に標的とすることの有効性を比較するために、実験を行った。上記のようなCT26結腸直腸モデルを用いて、マウスを、B細胞を標的とするためにCD22にコンジュゲートされたCpG(CD22-CpG; SB-337)、樹状細胞を標的とするためにDEC205にコンジュゲートされたCpG(DEC205-CpG; SB-419)、又は生理食塩水で静脈内処置した。12、17、20、及び24日目に、マウスを10mg/kgのCpG-Abで処置した。腫瘍体積を測定した。平均体積(図65A)及び各々のマウスの個々の腫瘍体積(図65B〜65D)が提示されている。これらの結果から、B細胞又は樹状細胞のいずれかをCpG-Abコンジュゲートで標的とすると、腫瘍体積を低下させることができることが示される。
【０８５２】
(実施例21  CpG-Ab活性はCT26結腸直腸モデルでCD4+ T細胞依存性であるが、A20リンパ腫モデルではCD4+ T細胞依存性でない)
CpGの作用機序におけるT細胞の役割を調べるために、2つのマウスモデルを利用した。第一のモデルでは、CT26結腸直腸癌細胞を使用した。簡潔に述べると、CT26マウスモデルを上記のように作出し、(i)生理食塩水溶液(小さい丸);(ii)CD4除去(大きい丸);(iii)3mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(四角);又は(iv)CD4除去＋3mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(菱形)を投与した後、マウスの平均腫瘍体積増加の進行を追跡した。CD22-CpGを10、13;及び15日目に静脈内投与した(図66A)。CD4除去は、10、13、及び17日目に腹腔内注射される抗CD4(クローンGK1.5、400ug/用量)を用いて実施した。この実験の結果から、CD4抗体を用いたCD4+ T細胞除去がCT26結腸直腸癌モデルにおいてCpG-Ab活性を阻害することが示された(図66A)。
【０８５３】
対照的に、CpG-Ab活性は、A20リンパ腫モデルでのCD4+ T細胞除去により阻害されなかった。簡潔に述べると、マウスに、(i)生理食塩水溶液(丸);(ii)CD4除去(上向きの三角);(iii)3mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(四角);又は(iv)CD4除去＋3mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(下向きの三角)を投与した後、A20リンパ腫モデルを用いたマウスの平均腫瘍体積増加の進行を追跡した(図66B)。CD22-CpGを10、12;及び14日目に静脈内投与した。CD4除去は、10、13、及び17日目に腹腔内注射される抗CD4(クローンGK1.5、400ug/用量)を用いて実施した。このモデルにおいて、CD22-CpGは、生理食塩水と比べて、腫瘍モデルを低下させた。しかしながら、CD4除去は、CpG-Ab活性に影響を及ぼさなかった。
【０８５４】
(実施例22  B細胞CpG-Abは表面T細胞共刺激因子を誘導する)
抗体、CpG(p347)、又はCpG-Ab(SB-337)で処置されたB細胞上での表面T細胞共刺激因子の発現を測定することにより、B細胞指向性CpG-Ab(SB-1490)におけるT細胞活性化の役割をアッセイした。マウス脾臓を採取し、70ミクロンの篩に通して、単一細胞懸濁液を作製した。室温で5分間のRBC溶解バッファーとのインキュベーションにより、赤血球(RBC)を溶解させ、その後、完全培地でクエンチした。マウスB細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を用いる陰性選択により、B細胞をさらに単離した。細胞を穏やかな遠心分離によって採取し、洗浄し、10％胎仔ウシ血清(FBS)及び1％ペニシリン/ストレプトマイシン(PS)を含有するRPMIに2×106細胞/mLの濃度で再懸濁させた。その後、細胞を96ウェルプレートに播種し、表示された濃度(1nM)の試験化合物で処理し、37℃で72時間インキュベートした。その後、細胞を穏やかな遠心分離によって採取し、FACSバッファーに再懸濁させた。再び遠心分離した後、次に、細胞を500μLのFACSバッファーに再懸濁させた。マウスFcRブロッカーを添加し、室温で10分間インキュベートした。細胞を氷に移し、適切に標識されたFACS抗体(下記の実施例を参照)を添加し、氷上で30分間インキュベートした。非特異的アイソタイプ対照を使用した。その後、細胞を、FACSバッファーを含むエッペンドルフチューブ中に回収した。細胞を遠心分離し、FACSバッファーで1回洗浄し、その後、再び遠心分離した。その後、細胞を再び、1mLのFACSバッファーに再懸濁させ、その後、CyFlow ML FACS装置による解析まで氷上で保持した。Flow Joソフトウェアを用いて、データを解析した。
【０８５５】
マウス脾臓B細胞と、抗体、遊離CpG(SB-4715)、又はCpG-Ab(SB-1490)コンジュゲートとのインビトロインキュベーションの結果から、B細胞指向性CpG-Abコンジュゲートが表面T細胞共刺激因子、例えば、CD40、CD70、CD80、CD86、MHC-I、MHC-II、及び4-1 BBLを誘導することが明らかになった(図67A)。
【０８５６】
同様の結果をインビボで処置されたマウスから得た。簡潔に述べると、マウスを10mg/kgで週3回処置し、最後の投与から3日後に、CD19+/B220+ B細胞を解析した。マウスの脾臓/リンパ節を採取し、PBSですすぎ、70ミクロンの篩に通して、単一細胞懸濁液を作製した。細胞を穏やかに遠心分離し、その後、FACSバッファーに再懸濁させた。FcRブロッカーを添加し(1:20希釈)、室温で10分間インキュベートした。細胞を氷に移し、適切に標識されたFACS抗体(又は非特異的アイソタイプ対照)を添加し、氷上で30分間インキュベートした。細胞を、FACSバッファーを含むエッペンドルフチューブ中に回収した。細胞を遠心分離し、その後、1mLのFACSバッファーで1回洗浄し、その後、再び遠心分離した。細胞を再び、1mLのFACSバッファーに再懸濁させ、その後、CyFlow ML FACS装置による解析まで氷上で保持した。Flow Joソフトウェアを用いて、データを解析した。CpG-Abによる処置は、生理食塩水と比べて、CD40、CD80、CD86、及びMHC-IIの表面発現の増大をもたらした(図67B)。
【表３８】
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【０８５７】
(実施例23  B細胞CpG-Abは二次リンパ組織内でのT細胞活性化を誘導する)
二次リンパ組織内でのT細胞の活性化をFACSにより測定して、B細胞を標的とするCpG-Abコンジュゲートの機能的効果を評価した。簡潔に述べると、Balb/cマウスを、(i)生理食塩水(実線);(ii)10mg/kgのAb(抗CD22)(チェック);(iii)10mg/kgのCpG-Ab(SB-SB-337)(水平);又は(iv)等用量のCpG(p347)(垂直)で週3回処置した。最後の投与から3日後に、マウスの脾臓及びリンパ節を採取し、CD3 T細胞をFACSにより解析した。マウスの脾臓/リンパ節を採取し、PBSですすぎ、70umの篩に通して、単一細胞懸濁液を作製した。細胞を穏やかに遠心分離し、その後、FACSバッファーに再懸濁させた。FcRブロッカーを添加し(1:20希釈)、室温で10分間インキュベートした。細胞を氷に移し、適切に標識されたFACS抗体(又は非特異的アイソタイプ対照)を添加し、氷上で30分間インキュベートした。細胞を、FACSバッファーを含むエッペンドルフチューブ中に回収した。細胞を遠心分離し、その後、1mLのFACSバッファーで1回洗浄し、その後、再び遠心分離した。細胞を再び、1mLのFACSバッファーに再懸濁させ、その後、CyFlow ML FACS装置による解析まで氷上で保持した。Flow Joソフトウェアを用いて、データを解析した。
【０８５８】
全T細胞集団(CD3+)に対するCD71+、CD3+細胞のパーセンテージを測定することにより、活性化T細胞を定量した(図68A)。また、全T細胞集団(CD3+)に対するKi67+、CD3+細胞の量を測定することにより、活性化T細胞を定量した(図68B)。FACSの結果から、B細胞を標的とするCpG-Abコンジュゲート、及び比較的程度は低いが、遊離CpGが、二次リンパ組織内の活性化T細胞のパーセンテージを増大させることが明らかになった。
【０８５９】
(実施例24  養子移入されたリンパ節細胞は腫瘍増殖を阻害する)
CT-26マウス結腸直腸癌モデルを用いて、B細胞を標的とするCpG-AbコンジュゲートにおけるT細胞活性化の役割をさらに解析する実験を行った。CT-26マウス結腸直腸モデルは、上記のように作出した。腫瘍を10日目にステージングし、10、12、14日目に、マウスに、(i)生理食塩水溶液(丸);(ii)10mg/kgのCD22-CpG(SB-337)(四角);(iii)10mg/kgのCD22(上向きの三角);又は(iv)遊離CpG(p347)(下向きの三角)を静脈内投与した(図69A)。腫瘍増殖を22日間(接種日から32日)モニタリングした(図69A)。上記の他の結果と一致して、CD22-CpGは、他の処置群と比べて、腫瘍体積の低下をもたらした。
【０８６０】
32日目に、マウスを屠殺し、リンパ節(流入領域及び非流入領域)を各々の処置群のマウスから単離し、プールした。このリンパ節を70mmの篩に通して、単一細胞懸濁液を作製した。細胞を氷冷PBSで2回洗浄し、計数した。1×107個の細胞(約70％のT細胞)を0.1×106個のCT-26細胞とHBSSバッファー中で混合し、混合物を、標準的なプロトコルに従って、未処置のBalbCマウスの脇腹に皮下接種した。腫瘍体積をこれらのマウスで24日間モニタリングした(図69B)。これらの結果から、養子移入されたリンパ節細胞が腫瘍増殖を阻害することが示された(図69C)。
【０８６１】
(実施例25  B細胞CpG-Abは自然免疫応答を誘導する)
未処置のマウスを、(i)生理食塩水(実線);(ii)10mg/kgのAb(CD22)(チェック);(iii)5.7ugのCpG(p347)(水平);又は(iv)10mg/kgのCpG-mAb(SB-337)で静脈内処置することにより、自然免疫応答に対するB細胞を標的とするCpG-Abコンジュゲートの効果を解析した。血液を表示された時点で尻尾から回収し、血清を遠心分離により単離した。血清サイトカインレベルをビーズに基づくマルチプレックス解析(LEGENDplex, Biolegend)により測定した。
【０８６２】
マウスを処置した後、自然免疫応答と関連する複数の血漿サイトカイン(すなわち、IL-6、IL-10、IL-1β、IL-12p70、IFNγ、及びTNFα)を処置の1時間、6時間、及び24時間後に測定した(図70A〜70F)。これらの結果から、B細胞を標的とするCpG-AbコンジュゲートがT細胞、樹状細胞(DC)、及びナチュラルキラー(NK)細胞の活性化のために有利なサイトカインプロファイルを誘導することが示された。特筆すべきことに、IL-1β(図70C)とIL-12p70(図70D)の濃度が6時間で極めて上昇していた。さらに、遊離CpGがTNFα(図70F)血漿濃度レベルを1時間で強く増大させたのに対し、この効果はCpG-mAbコンジュゲートでは観察されず、CpG-mAbが遊離CpGを上回る安全面での利点を有し得ることが示唆された。
【０８６３】
(実施例26  B細胞CpG-AbはB細胞分化及び胚中心形成を誘導する)
B細胞CpG-AbがB細胞分化及び胚中心形成を誘導するかどうかを評価するために、CT-26結腸直腸癌モデルを上記の方法に従って利用した。簡潔に述べると、マウスに、CT-26結腸直腸癌細胞を接種し、10日間増殖させておいた。その後、10、13、及び17日目に、マウスを生理食塩水又は10mg/kgのCpG-mAb(SB-1490)で静脈内処置し、最後の投与から24時間後に屠殺した。上述のように、脾臓を単離し、単一細胞調製物を調製し、脾臓の細胞の総数に対するB細胞(B220+;図71A)、GC細胞(B220+、IgDlo、Fas+;図71B)、及びT濾胞ヘルパー(Tfh)細胞(CD4+、CXCR5+、PD-1+;図71C)のパーセンテージを、FACS解析を用いて決定した。さらに、IL-21(図71D)、Bcl-6(図71E)、及びIRF-4(図71F)遺伝子発現の相対的な倍率変化を、標準的なqPCR法を用いて決定した。これらの結果から、CpG-mAbがB細胞、GC細胞、及びTfh細胞のパーセンテージを有意に増加させるだけでなく、IL-21、Bcl-6、及びIRF-4の発現レベルを有意に増大させることも示された。まとめると、これらの結果から、B細胞を標的とするCpG-AbコンジュゲートがB細胞分化及びGC形成を誘導することが示された。
【０８６４】
(実施例27  B細胞CpG-Abは自然免疫応答及び適応免疫応答を誘導する)
自然免疫応答及び適応免疫応答に対するB細胞CpG-Ab処置の効果を、CT-26結腸直腸癌モデルを用いて測定した。CT-26結腸直腸マウスモデルは、上記のように作出した。自然免疫応答を評価するために、腫瘍を皮下接種し、10日間増殖させた。10、13、及び17日目に、マウスを生理食塩水又は3mg/kgのCpG-mAb(SB-337)で静脈内処置し、最後の投与から24時間後に屠殺した。細胞を脾臓及びリンパ節から単離し、自然免疫応答と関連するいくつかの遺伝子(すなわち、IL-6、IL-10、IL-1β、及びTNFα)の遺伝子発現をqPCRにより測定した。これらの結果から、CpG-mAbによる処置が脾臓(図72A〜C)及び流入領域リンパ節(図73A〜C)におけるIL-6、IL-10、及びIL-1βの発現を増大させることが明らかになった。しかしながら、CpG-mAbは、脾臓(図72D)又は流入領域リンパ節(図73D)のいずれにおいてもTNFα発現を増大させなかった。まとめると、これらの結果から、B細胞を標的とするCpG-Abコンジュゲートが自然免疫応答を誘導することが示された。
【０８６５】
次に、適応免疫応答に対するB細胞CpG-Ab処置の効果を、CT-26固形腫瘍モデルを用いて測定した。CT-26結腸直腸マウスモデルは、上記のように作出した。適応免疫応答を評価するために、腫瘍を皮下接種し、10日間増殖させた。10、13、及び16日目に、マウスを生理食塩水又は3mg/kgのCpG-mAb(SB-337)で静脈内処置し、これらのマウスを24日目に屠殺し、血液を心穿刺により回収し、IgM、IgG、及びIgG2aの血清レベルをELISAにより測定した。血清をマウスから回収し、IgM、IgG、及びIgG2aのレベルを測定した。CpG-mAbで処置されたマウスについて、IgM(図74A)、IgG(図74B)、IgG2a(図74C)は、生理食塩水処置マウスと比べて、全て有意に増加した。
【０８６６】
CT-26腫瘍抗原AH1を基質としてる用いてELISAを行うことにより、腫瘍特異的抗体のレベルをさらに解析した。AH1ペプチドを96ウェルプレートに一晩コーティングし、その後、ウェルをELISA洗浄バッファーで3回洗浄して、余分なペプチドを除去した。マウス血清試料を添加し、室温で2時間インキュベートした。その後、ウェルを再び3回すすぎ、血清中のマウス抗AH1 IgG2aの量を、2つの異なる市販の二次抗マウスIgG2a-HRP抗体、二次Ab1及び二次Ab2を用いて測定した(図75)。ウェルを再び洗浄し、TMB基質溶液(100μL)を各々のウェルに添加した。プレートを室温で15〜30分間又は所望の色が現れるまでインキュベートした後、停止溶液(100μL)を各々のウェルに添加し、プレートを450nmで読み取った。マウスの血清中により多くのIgG2aが存在することと一致して、CpG-mAbによる処置は、血清中に有意により多い腫瘍特異的IgG2aを生じさせた。これらの結果から、B細胞CpG-Abが高親和性の腫瘍特異的抗体へのクラススイッチをもたらす適応応答を誘導することが示された。
【０８６７】
(実施例28  B細胞CpG-AbはB-reg集団を低下させる)
脾臓B-reg細胞に対するB細胞を標的とするCpG-Abコンジュゲートの効果を解析した。1、4、及び7日目に、Balb/Cマウス(n＝8)を生理食塩水又は10mg/kgのCpG-Ab(SB-337)で[[静脈内]]処置した。これらのマウスを最後の投与から14日後に屠殺した。B細胞(B220+)の数に対する脾臓Breg細胞(CD19+、B220+、CD1dhi)のパーセンテージを決定した(図76A)。さらに、細胞の総数に対する脾臓B-reg細胞(CD19+、B220+、CD1dhi)のパーセンテージを決定した(図76B)。両パラメータ下でのB-reg細胞のパーセンテージの定量により、CpG-mAb処置が、生理食塩水処置と比べて、マウスにおけるB-reg集団を有意に低下させることが明らかになった(図76A及び図76B)。これらの結果から、B細胞CpG-AbがB-reg集団を低下させることが示された。
【０８６８】
(実施例29  B細胞CpG-Abは二次リンパ組織内のDC集団を増殖させる)
二次リンパ組織内の樹状細胞集団に対するB細胞を標的とするCpG-Ab処置の効果を評価するために、CT-26固形腫瘍モデルを使用した。14、17、20日目に、マウスを、生理食塩水、5.7ug/用量のCpG(p347)、又は10mg/kgのCpG-mAb(SB-337)で静脈内処置した。脾臓由来の細胞を上記のように単離した。細胞の総数に対する脾臓骨髄樹状細胞(mDC; B220-、CD11C+、DEC205hi)のパーセンテージを計算した。脾臓mDCパーセンテージの定量により、遊離CpG処置とCpG-mAb処置の両方が、生理食塩水処置と比べて、mDC細胞のパーセンテージを有意に増加させることが明らかになった(それぞれ、p＝0.003; p＝0.0002)(図77A)。さらに、CpG-Ab処置後のmDC細胞のパーセンテージは、遊離CpGと比べて有意に増加していた(p＝0.002)(図77A)。まとめると、これらの結果から、CpG-Ab処置が脾臓内のmDC滞留を拡大したことが示された。
【０８６９】
さらに、プールしたリンパ節mDC細胞(B220-、CD11C+、CD8+)のパーセンテージを決定した。CpG-mAbによるマウスの処置は、流入領域リンパ節(dLN)と非流入領域リンパ節(ndLN)の両方におけるLN mDCのパーセンテージの増加をもたらした(図77B)。しかしながら、この効果は、遊離CpGで処置したときには観察されず(図77B)、これは、CpG-Abコンジュゲートと遊離CpGの間の示差効果を強調するものである。これらの結果から、B細胞を標的とするCpG-Abコンジュゲートが脾臓とリンパ節の両方における樹状細胞集団を拡大することができることが示された。
【０８７０】
(実施例30  pDCはCpG-Ab活性に寄与する)
CpG-Ab活性に対する形質細胞様樹状細胞(pDC)の寄与を決定するために、CT26結腸直腸癌モデル及びA20リンパ腫モデルを用いる実験を行った。CT-26結腸直腸モデルでは、腫瘍を10日間増殖させ、その後、10、13、及び15日目に、マウスを、生理食塩水又は3mg/kgのCD22-CpG(SB-337)で静脈内処置した。さらに、10、13、及び17日目に、一部のマウスに、PDCA1抗体、クローンBX444(マウス1匹当たり300μg)を、単独で又はCD22-CpG(SB-337)と組み合わせて腹腔内注射して、pDC細胞を除去した。腫瘍体積の発達を測定し、その結果から、pDC除去がCT-26結腸直腸モデルでCD22-CpGの効力を減少させることが示された(図78A)。
【０８７１】
A20リンパ腫モデルから、同様の結果が得られた。A20リンパ腫腫瘍を10日間増殖させ、その後、10、12、及び14日目に、マウスを、生理食塩水又は3mg/kgのCD22-CpG(SB-337)で静脈内処置した。さらに、10、13、及び17日目に、一部のマウスに、PDCA1抗体、クローンBX444(マウス1匹当たり300μg)を、単独で又はCD22-CpG(SB-337)と組み合わせて腹腔内注射して、pDC細胞を除去した。腫瘍体積の発達を測定し、その結果から、pDC除去がA20リンパ腫モデルにおいてCD22-CpGの効力を減少させることが示された(図78B)。まとめると、これらの結果から、pDCがCpG-Ab活性に寄与することが示された。
【０８７２】
(実施例31  CpG-mAbはT細胞腫瘍浸潤を増大させた)
T細胞浸潤に対するCpG-mAbコンジュゲートの効果をA20リンパ腫モデルを用いて決定した。簡潔に述べると、A20細胞をマウスに皮下接種し、10、13、及び17日目に、このマウスを生理食塩水又は3mg/kgのCpG-mAb(SB-337)で静脈内処置し、最後の投与から24時間後に、動物を屠殺した。いくつかの実験では、マウスを10mg/kgの抗PD-L1でも処置した(図79D)。これらのマウス由来の腫瘍を除去し、4℃でホモジナイズし、mRNAを標準的な方法により抽出し、遺伝子発現解析を、qPCRにより、T細胞遺伝子、例えば、CD3、CD4、CD8a、及びCD8b(図79A;マクロファージ遺伝子、例えば、CD38、GPR18、iNOS、FPR2、Egr2、Arg1、CD206、Adgre1、CD68、及びCd11b(図79B);サイトカイン遺伝子、例えば、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、IL-21、TNFα、IFNγ、及びTGFβ(図79C);並びにアポトーシス酵素遺伝子、例えば、グランザイムB及びパーフォリン(図79D)について実施した。ペプチジルプロリルイソメラーゼB(PPIB)と比べた遺伝子発現の解析を決定した。これらの結果から、CpG-mAbが、T細胞遺伝子(図79A)、マクロファージ遺伝子(図79B)、及び特定のサイトカイン遺伝子(図79C)の発現を増大させることが示された。さらに、CpG-mAbとCpG-mAb＋抗PD-L1はどちらも、アポトーシス酵素遺伝子の発現を増大させた(図79D)。まとめると、CpG-mAbで処置されたマウスの腫瘍遺伝子発現プロファイルは、免疫細胞の存在及び/又は活性化と一致していた。
【０８７３】
(実施例32  確認されたヒトCpG-Ab活性)
末梢血単核細胞(PBMC)を3人のドナーから回収し、プールすることにより、初代ヒトB細胞に対するCpG-Abコンジュゲートの効果を評価した。簡潔に述べると、白血球濃縮血液(LRSチャンバー)をサンディエゴ血液バンク(San Diego Blood Bank)から入手した。白血球を標準的なフィコール勾配遠心分離プロトコルにより単離した。B細胞をB細胞単離キット(Miltenyi)を用いる陰性選択によりさらに単離した。B細胞(＞95％純粋)を10％FBS及び1％PSを含有するRPMIに再懸濁させ、96ウェルプレート(1×105細胞/ウェル)に播種した。細胞を、表示されている通りに、様々な濃度のCpG(p425)、CpG-Ab(SB-430)、又はAb(hCD22)で処理し、37℃で48〜72時間インキュベートした。
【０８７４】
処理後、培養培地を除去し、分泌されたIL-6レベルをELISAにより測定した(図80A)。その後、細胞を採取し、MHC-II(図80B)、CD86(図80C)、CD70(図80D)、及びCD20(図80E)の細胞表面マーカーをFACSにより測定した。これらの結果から、分泌されたIL-6(図80A)、並びにMHC-II(図80B)、CD86(図80C)、CD70(図80D)、及びCD20(図80E)の表面マーカーの濃度によって決定したとき、ヒト初代B細胞がCpG-Ab処理に対してより感受性が高いことが示された。
【０８７５】
さらに、ヒト初代脾臓細胞をCpG-Abコンジュゲート及び遊離CpGによる処理に対する応答について解析した。初代ヒト脾臓細胞をBioreclamation IVTから購入した。細胞を、10％FBS及び1％PS(2×106細胞/ml)を含有するRPMIに再懸濁させ、96ウェルプレートに播種した。細胞を、表示された濃度のhCD22-hCpG(SB-430)、遊離ヒトCpG p1、又は遊離ヒトCpG(Solstice; p425)で処理し、37℃で24時間インキュベートした。培養培地を除去し、分泌されたIL-6をELISAにより測定した。hCD22-hCpGによる処理は、遊離CpG p1又は遊離ヒトCpG(solstice; p425)よりも少ない用量でIL-6の濃度を増大させることができた(図81)。EC50値は、それぞれ、0.51nM、818nM、及び338nMであり、これにより、hCpG-hAbがヒト脾臓細胞を活性化することができるというさらなる証拠が提供された。
【０８７６】
NCGマウスでヒト化マウスモデルを用いて、実験を行った。このモデルを、NOD/NjuマウスにおけるPrkdc遺伝子座とIl2rg遺伝子座の逐次的なCRISPR/Cas9編集によって作出し、NOD/Njuとコアイソジェニックなマウスを作製した。NOD/Njuは、外来の造血幹細胞の生着を可能にするSirpa(SIRPα)遺伝子の突然変異を保有している。Prkdcノックアウトは、適切なT細胞及びB細胞形成を欠くSCID様表現型を生成させる。Il2rg遺伝子のノックアウトは、SCID様表現型をさらに悪化させると同時に、NK細胞産生の減少をさらに生じさせる。このマウスをまず新鮮なヒトPBMCで腹腔内処置し、次に、2日後に、Daudi細胞(2.5×106個)の皮下注射を投与した(図82A)。12、14、及び16日目に、マウスを、生理食塩水、5mg/kgのhCD22抗体、5mg/kgのhCD22-CpG(SB-430)、又は5.7μg/用量の遊離CpG(p425)で処置した。平均腫瘍体積を32日間追跡した(図82B)。これらの結果から、hCD22-CpGで処置されたマウスが、他の処置群と比べて、より小さい腫瘍体積を有することが示された。まとめると、これらの結果から、CpG-Abコンジュゲートがヒト細胞で有効であることが示された。
【０８７７】
(実施例33)
天然に存在するCpG配列を有する本開示によるCpG含有ポリヌクレオチドの効力を証明し、比較するために、ヒトRamos細胞を、自立型形態又はコンジュゲートされた形態のいずれかの本CpG含有ポリヌクレオチド、及び自立型形態又はコンジュゲートされた形態のいずれかの天然に存在するクラスBのCpG配列とインキュベートした後に、該細胞におけるNFκB活性を測定した。図58Bに示されているように、本CpG-Abコンジュゲートは、自立型又はコンジュゲートされたクラスBのCpGと比較して、有意に改善された活性を有していた。
【０８７８】
(実施例34)
本開示によるCpG含有ポリヌクレオチドが補体経路を活性化するかどうかを評価するために、サル血清を、ザイモサン(陽性対照)、天然に存在するクラスBのCpG配列(p1)、又は本明細書に提供される2種のCpG含有ポリヌクレオチドとインキュベートすることにより、C3放出を評価した。図59に示されているように、本明細書に提供されるCpG含有免疫刺激ポリヌクレオチドは、該補体経路を活性化しなかった。
【０８７９】
(実施例35:マウス脾臓細胞アッセイを用いたCpG-抗体コンジュゲートの生物学的活性)
マウス(BALB/c)脾臓を採取し、70μmの篩に通して、単一細胞懸濁液を作製した。室温で5分間のRBC溶解バッファーとのインキュベーションにより、赤血球を溶解させ、その後、20:1の完全培地でクエンチした。細胞を穏やかな遠心分離により採取し、洗浄し、10％FBS及び1％PS(2×106細胞/mL)を含有するRPMIに再懸濁させ、9ウェルプレートに播種した。試験化合物を表示された濃度で添加し、37℃で24時間インキュベートした。培養培地を除去し、分泌されたIL-6をELISAにより測定した。結果は、下の表にまとめられている。
【表３９】
2020512843.tif 000301
【０８８０】
(実施例36: CpG-抗体コンジュゲートの薬物動態研究)
単回投与実験のために、試験化合物を10mg/kgで(BALB/c)マウスにIV又はSC投与した。血清試料を所定の時点で解析用に回収した。結果は、図83に示されている。
【０８８１】
反復投与実験のために、試験化合物を、1、7、及び14日目に、10mg/kgでマウスにIV投与した。血清試料を最後の注射から14日目に所定の時点で解析用に回収し、PKプロファイルを、単一用量の試験化合物しか受容しない別の組のマウスと比較した。結果は、図84に示されている。
【０８８２】
別の単回投与実験のために、CpG-抗体コンジュゲートを10mg/kgでマウスにIV投与した。血清試料を投与から0.08、1、6、24、48、及び120時間後に回収した。血清試料を抗体とインタクトなCpG-抗体コンジュゲートの両方によって解析した。結果は、図85に示されている。
【０８８３】
また別の単回投与実験のために、CpG-抗体コンジュゲートを10mg/kgでマウスにIV投与した。注射から0、0.08、1、6、及び24時間後に、マウスを屠殺した。血清、肝臓、及び脾臓試料を解析した。結果は、図86に示されている。
【０８８４】
また別の単回投与実験のために、CpG-抗体コンジュゲートを10mg/kgでマウスにIV投与した。血清試料を所定の時点で回収した。結果は、図87A及び87Bに示されている。
【０８８５】
上記の薬学的実験において、血清試料をELISAアッセイを用いて解析した。残存したインタクトなCpG-抗体コンジュゲートの量を決定するために、血清試料をELISAブロッキングバッファーを用いてビオチン化CpG相補配列で希釈し、その後、室温で30分間インキュベートした。希釈された血清試料を、ストレプトアビジンでプレコーティングされた96ウェルプレートのウェルに、各々100μLで添加した。プレートを、プレートシェーカー上で、室温で60分間インキュベートした後、ELISA洗浄バッファーで3回洗浄し、ELISAブロッキングバッファー中の最適化された希釈のヤギ抗マウスIgG-HRP抗体(100μL)を各々のウェルに添加した。プレートを、プレートシェーカー上で、室温で30分間インキュベートした後、ELISA洗浄バッファーで3回洗浄し、TMB基質溶液(100μL)を各々のウェルに添加した。プレートを室温で15〜30分間又は所望の色が現れるまでインキュベートし、その後、停止溶液(100μL)を各々のウェルに添加した。プレートを450nmで読み取った。50nMから始まる標準曲線を用いて、血清中のインタクトなCpG-抗体コンジュゲートの濃度を計算し、ELISAブロッキングバッファーに連続希釈した。同じプロトコルを用いて、組織をホモジナイズした後に、該組織中のCpG-抗体コンジュゲートも決定した。
【０８８６】
抗体又はCpG-抗体コンジュゲートの抗体部分を解析するために、96ウェルプレートを、PBSに希釈したマウスCD22細胞外ドメインでコーティングした。プレートを4℃で一晩インキュベートし、ELISA洗浄バッファーで3回洗浄し、ELISAブロッキングバッファーで、室温で少なくとも60分間ブロッキングした。ELISAブロッキングバッファーに最適化された希釈係数で血清試料を希釈した。希釈された血清試料を96ウェルプレートのウェルに各々100μLで添加した。プレートを、プレートシェーカー上で、室温で60分間インキュベートし、ELISA洗浄バッファーで3回洗浄した後、ELISAブロッキングバッファー中の最適化された希釈のヤギ抗マウスIgG-HRP抗体(100μL)を該プレートの各々のウェルに添加した。プレートを、プレートシェーカー上で、室温で30分間インキュベートし、ELISA洗浄バッファーで3回洗浄した後、TMB基質溶液(100μL)を各々のウェルに添加した。プレートを室温で15〜30分間又は所望の色が現れるまでインキュベートした後、停止溶液(100μL)を各々のウェルに添加した。プレートを450nmで読み取った。50nMから始まる標準曲線を用いて、血清中のCD22抗体濃度を計算し、ELISAブロッキングバッファーに連続希釈した。
【０８８７】
(その他の実施態様)
記載された発明の様々な修飾及びバリエーションが、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者に明らかであろう。本発明は、具体的な実施態様に関して記載されているが、特許請求されている本発明は、そのような具体的な実施態様に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、当業者に明白である本発明を実施するための記載された様式の様々な修飾は、本発明の範囲の範囲内であることが意図される。
【０８８８】
その他の実施態様は、特許請求の範囲内にある。
【０８８９】
(配列表)
本明細書は、配列表のコンピュータ可読形態(CRF)コピーとともに出願されている。2018年4月11日に作成された、116,262バイトのサイズの14465-001-228_SEQLIST.txtと題するCRFは、該配列表のハードコピーと同一であり、引用により完全に本明細書中に組み込まれる。
【図１Ａ】
2020512843.tif 000309
【図１Ｂ】
2020512843.tif 000310
【図２】
2020512843.tif 000311
【図３Ａ】
2020512843.tif 000312
【図３Ｂ】
2020512843.tif 000313
【図４Ａ】
2020512843.tif 000314
【図４Ｂ】
2020512843.tif 000315
【図４Ｃ−Ｄ】
2020512843.tif 000316
【図５】
2020512843.tif 000317
【図６】
2020512843.tif 000318
【図７】
2020512843.tif 000319
【図８】
2020512843.tif 000320
【図９】
2020512843.tif 000321
【図１０】
2020512843.tif 000322
【図１１】
2020512843.tif 000323
【図１２】
2020512843.tif 000324
【図１３】
2020512843.tif 000325
【図１４】
2020512843.tif 000326
【図１５】
2020512843.tif 000327
【図１６】
2020512843.tif 000328
【図１７】
2020512843.tif 000329
【図１８】
2020512843.tif 000330
【図１９】
2020512843.tif 000331
【図２０】
2020512843.tif 000332
【図２１】
2020512843.tif 000333
【図２２】
2020512843.tif 000334
【図２３】
2020512843.tif 000335
【図２４】
2020512843.tif 000336
【図２５】
2020512843.tif 000337
【図２６Ａ】
2020512843.tif 000338
【図２６Ｂ】
2020512843.tif 000339
【図２７】
2020512843.tif 000340
【図２８】
2020512843.tif 000341
【図２９】
2020512843.tif 000342
【図３０】
2020512843.tif 000343
【図３１】
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【図３２】
2020512843.tif 000345
【図３３】
2020512843.tif 000346
【図３４Ａ】
2020512843.tif 000347
【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
2020512843.tif 000349
【図３５】
2020512843.tif 000350
【図３６】
2020512843.tif 000351
【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
2020512843.tif 000354
【図４０】
2020512843.tif 000355
【図４１】
2020512843.tif 000356
【図４２】
2020512843.tif 000357
【図４３】
2020512843.tif 000358
【図４４】
2020512843.tif 000359
【図４５】
2020512843.tif 000360
【図４６Ａ−Ｂ】
2020512843.tif 000361
【図４６Ｃ】
2020512843.tif 000362
【図４６Ｄ】
2020512843.tif 000363
【図４７Ａ−Ｂ】
2020512843.tif 000364
【図４７Ｃ】
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【図４７Ｄ】
2020512843.tif 000366
【図４７Ｅ】
2020512843.tif 000367
【図４７Ｆ】
2020512843.tif 000368
【図４８】
2020512843.tif 000369
【図４９Ａ】
2020512843.tif 000370
【図４９Ｂ】
2020512843.tif 000371
【図４９Ｃ】
2020512843.tif 000372
【図５０Ａ】
2020512843.tif 000373
【図５０Ｂ】
2020512843.tif 000374
【図５０Ｃ】
2020512843.tif 000375
【図５１Ａ−Ｂ】
2020512843.tif 000376
【図５１Ｃ】
2020512843.tif 000377
【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
2020512843.tif 000379
【図５２Ｃ】
2020512843.tif 000380
【図５３Ａ】
2020512843.tif 000381
【図５３Ｂ−Ｃ】
2020512843.tif 000382
【図５３Ｄ】
2020512843.tif 000383
【図５４Ａ】
2020512843.tif 000384
【図５４Ｂ】
2020512843.tif 000385
【図５４Ｃ】
2020512843.tif 000386
【図５５Ａ】
2020512843.tif 000387
【図５５Ｂ】
2020512843.tif 000388
【図５６Ａ】
2020512843.tif 000389
【図５６Ｂ】
2020512843.tif 000390
【図５６Ｃ】
2020512843.tif 000391
【図５６Ｄ】
2020512843.tif 000392
【図５７Ａ】
2020512843.tif 000393
【図５７Ｂ】
2020512843.tif 000394
【図５７Ｃ】
2020512843.tif 000395
【図５７Ｄ】
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【図５８】
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【図５９】
2020512843.tif 000398
【図６０Ａ】
2020512843.tif 000399
【図６０Ｂ−Ｃ】
2020512843.tif 000400
【図６１】
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【図６２】
2020512843.tif 000402
【図６３Ａ−Ｂ】
2020512843.tif 000403
【図６３Ｃ−Ｆ】
2020512843.tif 000404
【図６４】
2020512843.tif 000405
【図６５Ａ−Ｂ】
2020512843.tif 000406
【図６５Ｃ−Ｄ】
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【図６６】
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【図６７Ａ】
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【図６７Ｂ】
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【図６８】
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【図６９Ａ】
2020512843.tif 000412
【図６９Ｂ−Ｃ】
2020512843.tif 000413
【図７０Ａ−Ｂ】
2020512843.tif 000414
【図７０Ｃ−Ｄ】
2020512843.tif 000415
【図７０Ｅ−Ｆ】
2020512843.tif 000416
【図７１Ａ−Ｃ】
2020512843.tif 000417
【図７１Ｄ−Ｆ】
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【図７２】
2020512843.tif 000419
【図７３】
2020512843.tif 000420
【図７４】
2020512843.tif 000421
【図７５】
2020512843.tif 000422
【図７６】
2020512843.tif 000423
【図７７】
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【図７８】
2020512843.tif 000425
【図７９Ａ−Ｂ】
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【図７９Ｃ−Ｄ】
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【図８０Ａ】
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【図８０Ｂ】
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【図８０Ｃ】
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【図８０Ｄ】
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【図８０Ｅ】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７Ａ】
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【図８７Ｂ】
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【国際調査報告】
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