(57)【要約】  本出願は、対象の試料からの免疫グロブリン遊離軽鎖（ＦＬＣ）を、抗ＦＬＣ特異性抗体又はその断片で精製すること、及び該精製された試料を質量分析技術に供して、該試料中の１種又は複数の単クローン性ＦＬＣに対応する１つ又は複数のピークの存在を同定すること、を含む形質細胞関連疾患を同定又はモニタリングする方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の試料からの免疫グロブリン遊離軽鎖（ＦＬＣ）を、抗ＦＬＣ特異性抗体又はその断片で精製すること、及び前記精製された試料を質量分析技術に供して、前記試料中の１種又は複数の単クローン性ＦＬＣに対応する１つ又は複数のピークの存在を同定すること、を含む形質細胞関連疾患を同定又はモニタリングする方法。
【請求項２】
前記抗ＦＬＣ特異性抗体が、抗カッパＦＬＣ特異性抗体又はその断片と、抗ラムダＦＬＣ特異性抗体又はその断片との混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗ＦＬＣ特異性抗体又はその断片が、ポリクローナルである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体の断片が、Ｆ（ａｂ’）２断片である、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗ＦＬＣ特異性抗体又は断片が、前記抗体又はその断片の少なくとも１つの重鎖（又はその断片）と少なくとも１つの軽鎖（又はその断片）の間に１つ又は複数の非ジスルフィドクロスリンクを含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記質量分析技術が、オービトラップ型質量分析計、イオン捕捉型質量分析計、飛行時間型質量分析計、トリプル四重極質量分析計、又は四重極質量分析計である、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記質量分析技術が、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
総カッパ及び総ラムダ軽鎖を抗総カッパ及び抗総ラムダ抗体又はその断片で精製すること、及び前記精製された試料を質量分析法に供して、１つ又は複数の単クローン性免疫グロブリンに対応する１つ又は複数のピークを同定すること、をさらに含む、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記総ラムダ及び総カッパ軽鎖が、抗総カッパ抗体と抗総ラムダ抗体との混合物を用いて共精製される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記形質細胞関連疾患が、インタクト免疫グロブリン、多発性骨髄腫、軽鎖多発性骨髄腫、非分泌性多発性骨髄腫、ＡＬアミロイドーシス、軽鎖沈着症（ＬＣＤＤ）、くすぶり型多発性骨髄腫、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、マクログロブリン血症、ＰＯＥＭＳ（多発神経障害、臓器腫大、内分泌疾患、単クローン性ガンマグロブリン血症及び皮膚変化）症候群及びＬＣＤＤから選択される、請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が、涙液、血漿、血清、唾液、尿、血液又は脳脊髄液である、請求項１〜１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
抗カッパ遊離軽鎖抗体、その断片；その抗ラムダ遊離軽鎖抗体；及び質量分析法のターゲットを含むキット。
【請求項１３】
前記抗体が、前記質量分析法のターゲットで固定化される、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
請求項１３に記載の質量分析法のターゲットを含む質量分析計。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象からの遊離軽鎖（ＦＬＣ）を精製すること、及び質量分析法を利用してそれらを検出すること、により形質細胞関連疾患を同定又はモニタリングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体分子（免疫グロブリンとしても知られる）は、二回転対称を有し、典型的には同一重鎖２つ及び同一軽鎖２つで構成され、各鎖が可変及び定常ドメインを含む。重鎖及び軽鎖の可変ドメインが一緒になって、抗原結合部位を形成し、それにより両方の鎖が抗体分子の抗原結合特異性に寄与する。抗体の基本的四量体構造は、ジスルフィド結合により共有結合で連結された２つの重鎖を含む。各重鎖は順次、同様にジスルフィド結合を介して、軽鎖に付着する。これにより、実質的に「Ｙ」形の分子が生成される。
【０００３】
重鎖は、抗体中で見出される２つの型の鎖のより大きな方であり、典型的な分子量２２，０００〜２５，０００Ｄａのより小さな軽鎖に比較して、典型的な分子量５０，０００〜７７，０００Ｄａを有する。
【０００４】
それぞれＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥのための重鎖の構成要素であるＧ、Ａ、Ｍ、Ｄ及びＥである重鎖の５種の主要クラス（複数又は単一）が存在する。ＩｇＧは、正常なヒト血清の主要な免疫グロブリンであり、全免疫グロブリンプールの７０〜７５％を占める。これは、二次免疫応答の主要な抗体である。それは、２つの重鎖＋２つの軽鎖の単一四量体を形成する。
【０００５】
ＩｇＭは、免疫グロブリンプールのおよそ１０％を占める。該分子は、Ｊ鎖と一緒になって、基本の四鎖構造が５個の五量体を形成する。個々の重鎖は、およそ６５，０００Ｄａの分子量を有し、分子全体は、約９７０，０００Ｄａの分子量を有する。ＩｇＭは、大部分が静脈内プールに限定され、優勢な早期抗体である。
【０００６】
ＩｇＡは、ヒト血清免疫グロブリンプールの１５〜２０％に相当する。８０％を超えるＩｇＡが、モノマーとして生じる。しかしＩｇＡの一部（分泌性ＩｇＡ）は、二量体形態で存在する。
【０００７】
ＩｇＤは、全血漿免疫グロブリンの１％未満を占める。ＩｇＤは、成熟したＢ細胞の表面膜上に見出される。
【０００８】
ＩｇＥは、正常な血清中には稀であるが、好塩基球及び肥満細胞の表面膜上に見出される。それは、喘息及び枯草熱などのアレルギー疾患に関連する。
【０００９】
５種の主要クラス（単一又は複数）に加え、ＩｇＧのサブクラス４つ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）が存在する。加えて、ＩｇＡのサブクラス２つ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）が存在する。
【００１０】
２つの型の軽鎖：ラムダ（λ）及びカッパ（κ）が存在する。ヒトの体内で生成されるλ分子のおよそ２倍の数のκが存在するが、これは幾つかの哺乳動物では全く異なる。各鎖は、単一ポリペプチド鎖の中におよそ２２０のアミノ酸を含み、そのポリペプチド鎖は、１つの定常ドメインと１つの可変ドメインに折り畳まれている。形質細胞は、κ又はλ分子のいずれかと一緒になって、５つの重鎖型のうちの１つを生成する。正常には、重鎖合成の間におよそ４０％過剰の遊離軽鎖生成が行われる。軽鎖分子が、重鎖分子に結合していない場合、それらは、「遊離軽鎖分子」として知られる。κ軽鎖は通常、単量体として見出される。λ軽鎖は、二量体を形成する傾向がある。
【００１１】
抗体生成細胞に関連する増殖性疾患が複数存在する。
【００１２】
多くのそのような増殖性疾患において、形質細胞は、増殖して同一の形質細胞の単クローン性腫瘍を形成する。これにより、多量の同一免疫グロブリンが生成され、それは単クローン性ガンマグロブリン血症として知られる。
【００１３】
黒色腫及び原発性全身性アミロイドーシス（ＡＬアミロイドーシス）などの疾患は、それぞれ英国における癌死亡のおよそ１．５％及び０．３％を占める。多発性骨髄腫は、非ホジキンリンパ腫に続く、２番目に一般的な悪性血液病の形態である。コーカサス人では、発生数は、年間で１００万人あたりおよそ４０人である。従来、多発性骨髄腫の診断は、骨髄中の過剰な単クローン性形質細胞、血清又は尿中の単クローン性免疫グロブリン、及び高カルシウム血症、腎不全、貧血又は骨病変などの関連の臓器又は組織障害の存在に基づく。骨髄の正常な形質細胞量は、有核細胞の約１％であるが、多発性骨髄腫では、その量は、典型的には１０％を超え、多くの場合３０％を超えるが、９０％を超える場合がある。
【００１４】
ＡＬアミロイドーシスは、アミロイド沈着としての単クローン性遊離軽鎖断片の蓄積を特徴とするタンパク質高次構造障害である。典型的にはこれらの患者は、心不全又は腎不全を示すが、末梢神経及び他の臓器が、巻き込まれる場合もある。
【００１５】
患者の血流内、それどころか尿中に、単クローン性免疫グロブリンの存在により同定され得る他の疾患が複数存在する。これらには、骨髄の外部で生じて任意の臓器内に存在し得る形質細胞腫瘍である形質細胞腫及び骨髄外形質細胞腫が挙げられる。単クローン性タンパク質は、存在する場合には、典型的にはＩｇＡである。多発性の孤立性形質細胞腫（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｏｌｉｔａｒｙ  ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｍａｓ）が、多発性骨髄腫のエビデンスを伴って、又は伴わずに生じる場合がある。ワルデンシュトレームマクログロブリン血症は、単クローン性ＩｇＭの生成に関連する低グレードのリンパ増殖障害である。米国には１年あたりおよそ１５００の、英国には３００の新しい症例が存在する。血清ＩｇＭの定量は、診断及びモニタリングの両方にとって重要である。Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫は、英国の全癌死亡のおよそ２．６％を生じ、単クローン性免疫グロブリンは、標準的電気泳動法を利用して患者の約１０〜１５％の血清中で同定されている。初期の報告では、単クローン性遊離軽鎖が、患者の６０〜７０％の尿中で検出され得ることが示されている。Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病において、単クローン性タンパク質は、遊離軽鎖免疫アッセイにより同定されている。
【００１６】
加えて、いわゆるＭＧＵＳ状態が存在する。これらは、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症である。この用語は、多発性骨髄腫、ＡＬアミロイドーシス、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症などのエビデンスを有さない個体の単クローン性インタクト免疫グロブリンの予想外の存在を表す。ＭＧＵＳは、５０歳を超える人口の１％、７０歳を超える人口の３％、８０歳を超える人口では最大１０％に見出され得る。これらのほとんどは、ＩｇＧ又はＩｇＭ関連であるが、より希少なＩｇＡ関連又は二クローン性がある。ＭＧＵＳの人々のほとんどは、無関係の疾患で死亡するが、ＭＧＵＳは、悪性の単クローン性ガンマグロブリン血症に転換する場合がある。
【００１７】
先に強調された疾患についての少なくとも幾つかの症例では、該疾患は、異常な濃度の単クローン性免疫グロブリン又は遊離軽鎖を示す。疾患が、形質細胞の異常な複製を生じる場合、これは多くの場合、「単クローン」が増幅して血中に出現するために、その細胞型によってより多くの免疫グロブリンを生成する。
【００１８】
免疫固定電気泳動は、免疫グロブリン分子に対する沈降抗体を使用する。該電気泳動は、テストの感度を改善するが、沈降抗体の存在により、それを用いて単クローン性免疫グロブリンを定量することができない。免疫固定電気泳動はまた、どちらかと言えば実施が面倒で、解釈が困難になる場合がある。キャピラリーゾーン電気泳動は、血清タンパク質分離のために多くの臨床検査室で用いられ、ほとんどの単クローン性免疫グロブリンを検出することができる。しかし、キャピラリーゾーン電気泳動は、免疫固定と比較すると、試料の５％の単クローン性タンパク質を検出することができない。これらのいわゆる「偽陰性」結果には、低濃度単クローン性タンパク質が包含される。
【００１９】
総κ及びλアッセイが、生成された。しかし総κ及び総λアッセイは、単クローン性免疫グロブリン又は遊離軽鎖の検出には感受性が低すぎる。これは、そのようなアッセイと干渉する多クローン性結合軽鎖のバックグランド濃度が高いためである。
【００２０】
より近年になり、遊離κ軽鎖と、別個に遊離λ軽鎖と、を検出し得る感度の高いアッセイが開発された。この方法は、遊離κ又は遊離λ軽鎖のいずれかに対するポリクローナル抗体を利用する。そのような抗体を上昇させる可能性は、国際公開第９７／１７３７２号パンフレットでは、複数の異なる可能な特異性のうちの１つと考察された。この文書には、動物を寛容化して、先行技術が生成し得るよりも特異性がある所望の抗体を生成し得る方法が開示される。該遊離軽鎖アッセイは、遊離λ又は遊離κ軽鎖に結合する抗体を利用する。遊離軽鎖の濃度は、ネフェロメトリー又はタービメトリーにより計測される。これは、反応容器又はキュベット内の適当な抗体を含有する溶液へのテスト試料の添加を必要とする。光線をキュベットに透過させて、抗原−抗体反応が進行すると、不溶性免疫複合体が形成するにつれ、キュベットを透過した光が次第に散乱する。ネフェロメトリーでは、入射光から離れる角度で光の強度を測定することにより光散乱をモニタリングするが、タービメトリーでは、入射光線の強度の低下を測定することにより、光散乱をモニタリングする。既知の抗原（即ち、遊離κ又は遊離Ｉ）濃度の一連のキャリブレーターを最初にアッセイして、抗原濃度に対して測定された光散乱の検量線を作成する。
【００２１】
このアッセイ形式は、遊離軽鎖濃度の検出に成功することが見出されている。さらに、この技術の感度は、非常に高い。
【００２２】
遊離軽鎖（ＦＬＣ）、重鎖若しくはサブクラス、又は重鎖クラス若しくはサブクラスに結合した軽鎖型の量又は型の特徴づけは、多発性骨髄腫などのＢ細胞疾患及び腎症などの他の免疫介在性疾患をはじめとする広範囲の疾患において重要である。
【００２３】
全体として本明細書に援用される国際公開第２０１５／１５４０５２号パンフレット（Ｍａｙｏ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）には、質量分析法（ＭＳ）を用いて免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、又はそれらの混合物を検出する方法が開示されている。免疫グロブリン軽鎖、重鎖、又はそれらの混合物を含む試料を免疫精製し、還元して、軽鎖と重鎖を分離し、質量分析法に供して試料のマススペクトルを得る。これは、患者からの試料中の単クローン性タンパク質を検出するのに用いることができる。それはまた、モノクローナル抗体中のジスルフィド結合及びグリコシル化などの翻訳後修飾をフィンガープリンティング、アイソタイピング及び同定するために用いることができる。
【００２４】
国際公開第２０１５／１３１１６９号パンフレット（Ｈ．Ｌｅｅ  Ｍｏｆｆｉｔｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｒｅ）には、異常な抗体生成に関連する状態をモニタリングする方法が記載されている。これは、標的免疫グロブリンの酵素切断と、定量質量分析法による１種又は複数の可変ドメインペプチド断片の測定と、を利用する。該方法は、疾患に関連する特異的標的免疫グロブリンに特有の可変ドメインペプチド断片の同定に依存するため複雑であり、長々しい酵素切断を必要とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明の出願者は、遊離軽鎖（ＦＬＣ）の特異的抗体及び質量分析法（ＭＳ）が、形質細胞関連疾患を同定する選択的な迅速アッセイに用いられ得ることを認識した。予想に反してそれらは、この技術が正常な患者におけるＦＬＣを検出するのに充分、感受性があることを見出した（遊離カッパ軽鎖の９５％正常参照範囲は、３．３〜１９．４ｍｇ／Ｌであり、遊離ラムダ軽鎖の場合、５．７〜２６．３ｍｇ／Ｌである）。先行技術は、かなり高レベルのＩｇＧなどの免疫グロブリンを検査している（成人の正常レベルは、典型的には６〜１６ｇ／Ｌである）。
【００２６】
抗ＦＬＣ抗体が、試料からＦＬＣを精製してアッセイにおける汚染物質を減少させるのに用いられる。正常な試料から精製されたＦＬＣが、ＭＳにより分析された場合、異なるサイズ及び電荷のＦＬＣの曲線が作成されることを、本出願者は認識している。図１は、抗遊離ラムダについて、図２は、抗遊離カッパについて、図３及び４は、正常なカッパ及びラムダ生成のためのサイズのオーバーラッピング及び組み合わせた曲線についての典型的な結果を示す。該曲線は、健常対象の正常な抗体生成細胞により生成されたＦＬＣの多くの異なる個々のピークで構成される。本出願者は、単クローン性疾患において、クローン（複数可）の増殖により生成された多量のＦＬＣ（複数可）が存在する。これは、バックグランドの正常なＦＬＣ生成をかなり上回るＦＬＣ量に上る。これは、鋭い強度ピークとして見ることができる（図５参照）。それはまた、先行技術の系に比較してアッセイの感度を上昇させる。
【００２７】
従来は、カッパとラムダの比率を測定して、異常なＦＬＣ生成を同定する。これは、該比率を生成するためにカッパ及びラムダＦＬＣの別個の測定及び正確な定量を必要とする。これはまた、例えば複数のクローンが存在して比率を歪める場合に、カッパ及びラムダの一方の量を他方の鎖の型に対して上昇させ、他の上昇させないこと、に依存する。
【００２８】
本発明は、別個のカッパ及びラムダＦＬＣを定量する必要がない。それは代わりに、バックグランドＦＬＣ生成に比較して上昇したピークの単一検出に依存する。これにより、例えば大きな感度が実現されて、非分泌性多発性骨髄腫及びＡＬアミロイドーシスを同定することができる。それはまた、インタクト免疫グロブリンを還元して重鎖に結合された軽鎖を放出することなく、ＦＬＣを計測することができる。
【００２９】
ＦＬＣは、成人ではインタクト免疫グロブリン（典型的には６〜１６ｇ／Ｌ）に比較してかなり低濃度で、例えば約２６ｍｇ／Ｌなどの４０ｍｇ／Ｌ未満で存在する。遊離カッパ軽鎖の９５％正常参照範囲は、３．３〜１９．４ｍｇ／Ｌであり、遊離ラムダ軽鎖の場合、５．７〜２６．３ｍｇ／Ｌである。それゆえ、正常な患者であってもＦＬＣを同定すること、及びＭＧＵＳ患者における単クローン性ＦＬＣの存在を同定することができるというのは、驚くべきことである。
【００３０】
本発明は、対象の試料からの免疫グロブリン遊離軽鎖（ＦＬＣ）を、抗ＦＬＣ特異性抗体又はその断片で精製すること、及び該精製された試料を質量分析技術に供して、該試料中の１種又は複数の単クローン性ＦＬＣに対応する１つ又は複数のピークの存在を同定すること、を含む形質細胞関連疾患を同定又はモニタリングする方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
即ち、質量分析アッセイは、典型的には、質量分析法に供されると電荷及び質量のおかげで遊離軽鎖を分離する。これは、典型的には異なる分子量を有するＦＬＣの正常な分布を生成して、生殖系列の軽鎖アミノ酸配列の分子量と、それらの配列の体細胞高頻度突然変異と、を正常なＦＬＣを有する対象において反映させる。先に議論された通り、単クローン性ＦＬＣの存在が、形質細胞関連疾患により生成された多量の単クローン性ＦＬＣのから得られたピークを生成する。その単クローン性ＦＬＣは、サイズ及び電荷を有し、存在するバックグランドの正常なＦＬＣに比較して多量（大きなピーク）であることにより同定される。
【００３２】
本明細書で用いられる質量分析法（ＭＳ）としては、例えば液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）、四重極飛行時間型質量分析法と結び付けたマイクロフロー液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化（ｍｉｃｒｏ  ＬＣ−ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ）が挙げられる。これには、例えば陽イオンモードの使用が含まれてもよい。オービトラップ型質量分析計、イオン捕捉型質量分析計、飛行時間型質量分析計、トリプル四重極質量分析計、又は四重極質量分析計が、用いられてもよい。
【００３３】
或いは該ＭＳ技術としては、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）が挙げられる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦが用いられる場合、それは典型的には帯電したイオンの陽性モード、好ましくは１＋、２＋及び／又は３＋イオン、最も好ましくは２＋イオンで用いられる。
【００３４】
典型的にはＦＬＣの酵素切断は、実行されない。
【００３５】
該抗ＦＬＣ特異性抗体又はその断片は、モノクローナル若しくはポリクローナル抗体、又はその断片であってもよい。該抗体は、合成抗体であってもよく、合成抗体としては、組換え抗体、核酸アプタマー、及び非免疫グロブリン足場タンパク質が挙げられる。
【００３６】
該抗体は、抗ヒト又は抗ウマ又は抗ヒツジ又は抗ブタなどの種特異性であってもよい。該抗体は、軟骨性の魚、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ、ウシ、ラマなどのラクダ科、ウサギ又はマウスなどで増加されてもよい。該抗体又は断片は、遊離軽鎖に特異的に結合することが可能である。
【００３７】
該抗体の断片は、例えばＦ（ａｂ’）２断片であってもよい。
【００３８】
該抗ＦＬＣ特異性抗体又は断片は、抗カッパＦＬＣ特異性又は抗ラムダＦＬＣ特異性であってもよい。即ち該ラムダＦＬＣ及びカッパＦＬＣは、試料から別個に分離されてもよい。例えばその後、２つの別のアッセイが、質量分析法で実行される。その後、図１及び２に示されたものなどの別のラムダＦＬＣ記録及び別のカッパＦＬＣ記録が生成される。
【００３９】
或いは、又はより典型的には、抗カッパＦＬＣ特異性抗体又は断片と、抗ラムダ特異性抗体又は断片との混合物が、用いられる。これは、ラムダ及びカッパ遊離軽鎖の両方を共精製して、例えば正常な健常患者について図４に示された読み出しを生成する。単クローン性ピークは、依然として組み合わせたバックグランドＦＬＣより上で同定される。
【００４０】
抗ＦＬＣ特異性抗体又はその断片は、抗体又はその断片の少なくとも１つの重鎖（又はその断片）と少なくとも１つの軽鎖（又はその断片）の間に１つ又は複数の非ジスルフィドクロスリンクを含んでいてもよい。
【００４１】
該クロスリンクは、典型的にはチオエーテル結合を含む。別のクロスリンクが、用いられてもよい。
【００４２】
チオエーテルクロスリンクは、チオエーテル結合を含む。これは、抗体の残基間の連結であり、該連結は、ジスルフィド結合よりむしろ硫黄１つの結合を有する。即ち、チオエーテルクロスリンクは、当業者に熟知されたジスルフィド架橋など、もう１つの硫黄原子を含む連結を含まない。代わりにチオエーテルクロスリンクは、高分子の残基を架橋する硫黄１つの結合を含む。１つ又は複数のさらなる非硫黄原子が、追加的に連結を形成してもよい。
【００４３】
チオエーテルクロスリンクにより連結された残基は、天然残基又は非天然残基であり得る。当業者に認識される通り、チオエーテルクロスリンクの形成が、残基から原子を損失し得る。例えば２つのシステイン残基の側鎖間のチオエーテルクロスリンクの形成が、残基からの硫黄原子及び水素原子の損失をもたらし得るが、それでも得られたチオエーテルクロスリンクは、当業者によりシステイン残基を連結すると認識されよう。
【００４４】
チオエーテルクロスリンクは、抗体の任意の２つの残基を連結することができる。残基の１つ又は複数が、例えばシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、メチオニン及びチロシン、から選択されてもよい。残基の２つが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、メチオニン及びチロシンからなる群から選択されてもよい。より典型的には該残基の２つが、システイン残基である。典型的には唯一のチオエーテルクロスリンクが、重鎖と軽鎖の間にある。或いは２つ、３つ又はより多くのチオエーテルクロスリンクが、用いられてもよい。抗体の該重鎖対、又はその断片は、チオエーテル結合などの１つ又は複数の非ジスルフィドクロスリンクにより連結されていてもよい。
【００４５】
チオエーテルクロスリンクは、例えば、参照により本明細書に援用される、国際公開第２００６／０９９４８１号パンフレット、並びにＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  （２０１３）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ｖｏｌ  ２８８（２３），  １６３７１−８及びＺｈａｎｇ  ＆  Ｆｌｙｎｎ  （２０１３）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ，  ｖｏｌ  ２８８（４３），  ３４３２５−３５に記載される。
【００４６】
ホスフィン及びホスファイトが、用いられてもよい。本明細書の「ホスフィン」は、一般式Ｒ３Ｐ（ここでＰ＝リン、及びＲ＝任意の他の原子）で示される少なくとも１つの機能的単位を含む任意の化合物を指す。ホスファイトにおいて、該Ｒの位置は、特異的に酸素原子が占める。Ｒ３Ｐ含有化合物は、ジスルフィド結合を攻撃し得る強力な求核試薬として作用する。これは、ジスルフィドの還元をもたらし得るが、幾つかの条件下では、チオエーテル結合の形成をもたらす場合もある。
【００４７】
化合物としては、
トリス（ジメチルアミノ）ホスフィン（ＣＡＳ番号１６０８−２６−０）
トリス（ジエチルアミノ）ホスフィン（ＣＡＳ番号２２８３−１１−６）
トリメチルホスファイト（ＣＡＳ番号１２１−４５−９）
トリブチルホスフィン（ＣＡＳ番号９９８−４０−３）
が挙げられる。
参考資料：
参照により本明細書に援用される、
Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．，  ｖｏｌ  ４７，  ２２４４−２２４７。
クロスリンクはまた、遊離チオールと反応して抗体分子の鎖にクロスリンクするマレイミドクロスリンカーなどのクロスリンカーを含んでいてもよい。これは、国際公開第ＷＯ００／４４７８８号パンフレットに記載される通り、チオール基の一方の側と、追加的にリシンカルボキシル基などのもう一方の部分と、で結合するように作製することができる。
【００４８】
リンカー、特にフレキシブルリンカーにより互いに連結された２つの反応性部分を含む二官能性クロスリンカーを用いてもよい。該リンカーは、鎖、例えば置換又は非置換アルキルの中で互いに共有結合された１つ又は複数の炭素を含んでいてもよい。該リンカーは、特にＣ１〜Ｃ１０、最も典型的にはＣ２〜Ｃ６又はＣ３〜Ｃ６リンカー。本出願者らは、クロスリンクされたタンパク質の相対的に高レベルの回収を有するため特に有用である、ａ，ａ’−ジブロモ−ｍ−キシレン、ＢＭＯＥ（ビスマレイミドエタン）又はＢＭＢ（ビスマレイミドブタン）などのＣ２〜Ｃ６含有クロスリンカーを見出した。
【００４９】
ビスマレイミドはホモ二官能性スルフヒドリル反応性クロスリンカーである
これは、炭化水素又は他のリンカーによりつなげられた２つのマレイミド基を含有する充分に特徴づけられたクラスのクロスリンカーである。該マレイミド基は、ジスルフィドの還元により露出した遊離スルフヒドリル基と自然に反応して、各スルフヒドリルで非還元性チオエーテル結合を形成し、それにより２つの残留するシステインを共有結合でクロスリンクする。
【００５０】
化合物としては
ビス（マレイミド）エタン（ＣＡＳ番号５１３２−３０−９）
１，４−ビス（マレイミド）ブタン（ＣＡＳ番号２８５３７−７０−４）
が挙げられる。
【００５１】
参考資料：
参照により本明細書に援用される、
Ａｕｃｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  （ＳＯＤｌ），  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｓｔ  ｃｏｍｍｏｎ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  ｖｏｌ  １０７（５０）  −  ｐａｇｅｓ  ２１３９４−９
Ｇｅｕｌａ  ａｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＶＤＡＣ１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ：  ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｓｉｔｅｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ｖｏｌ  ２８７（３），  ４７５−８５
Ｋｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｔｗｏ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ａ  ｎａｓｃｅｎｔ  ｃｈａｉｎ  ｓｐａｎ  ｔｈｅ  ＥＲ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｓｐａｎｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏｐｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  ｖｏｌ  １７１（７）  ｐａｇｅｓ  １４４１−１４５２。
【００５２】
α，α’−ジブロモ−ｍ−キシレンは同じく用いられ得るホモ二官能性スルフヒドリル反応性クロスリンカーである
ジブロモ−ｍ−キシレン（ＣＡＳ番号６２６−１５−３）は、ハロゲン化ジアルキルクラスの化合物のメンバーであり、遊離スルフヒドリル基と反応するホモ二官能性クロスリンカーとして作用する。
【００５３】
参考資料：
参照により本明細書に援用される、
Ｊｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ−Ｈｅｌｉｃａｌ  Ｃａｌｐａｉｎ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｂｙ  Ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  ａ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，  ｃｏｌ  １３４（４２）  −  ｐａｇｅｓ  １７７０４−１３。
【００５４】
安定したチオエーテル結合を形成する別のスルフヒドリル反応性クロスリンキング化合物
遊離スルフヒドリルと反応して非還元性の共有結合でクロスリンクされた生成物をもたらすことが知られている試薬には少なくとも６つのクラスが存在する。スルフヒドリル基へのこれらの化合物の特異的反応性は様々であり、幾つかは、特定条件下で水、アミン及びカルボキシル基と反応するであろう。加えて、これらの化合物の多くは、嵩高のリンカー基を有し、制限された空間的環境でクロスリンクする能力を限定してもよい。以下の列挙は、各クラスからの２、３例を与えているが、より包括的列挙及び参考資料は、
【００５５】
参照により本明細書に援用される、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，  Ｗｏｎｇ，  Ｓ：  ＩＳＢＮ  ０−８４９３−５８８６−８に与えられる。
【００５６】
ビスマレイミド
ビス（マレイミド）ヘキサン；Ｎ−Ｎ’−メチレンビスマレイミド；ビス（Ｎ−マレイミドメチル）エーテル；Ｎ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）−ビスマレイミド；ビス（Ｎ−マレイミド）−４，４’−ビベンジル；ナフタレン−１，５−ジマレイミド
【００５７】
ハロアセチル誘導体
１，３−ジブロモアセトン；Ｎ，Ｎ’−ビス（ヨードアセチル）ポリメチレンジアミン；Ν，Ν’−ジ（ブロモアセチル）フェニルヒドラジン；１，２−ジ（ブロモアセチル）アミノ−３−フェニルヒドラジン；γ−（２，４−ジニトロフェニル）−α−ブロモアセチル−Ｌ−ジアミノ酪酸ブロモアセチル−ヒドラジド
【００５８】
ハロゲン化ジアルキル
α，α’−ジブロモ−ｐ−キシレンスルホン酸；α，α’−ジヨード−ｐ−キシレンスルホン酸；ジ（２−クロロエチル）スルフィド；トリ（２−クロロエチル）アミン；Ｎ，Ｎ−ビス（ｐ−ブロモエチル）ベンジルアミン
【００５９】
２．４  ｓ−トリアジン
ジクロロ−６−メトキシ−ｓ−トリアジン；２，４，６−トリクロロ−ｓ−トリアジン（シアヌル酸）；２，４−ジクロロ−６−（３’−メチル−４−アミノアニリノ）−ｓ−トリアジン；２，４−ジクロロ−６−アミノ−ｓ−トリアジン
【００６０】
アジリジン
２，４，６−トリ（エチレンイミド）−ｓ−トリアジン；Ｎ，Ｎ’−エチレンイミノイル−１，６−ジアミノヘキサン；トリ［１−（２−メチルアジリデニル）］−ホスフィン  オキシド
【００６１】
ビスエポキシド
１，２：３，４−ジエポキシブタン；１，２：５，６−ジエポキシヘキサン；ビス（２，−エポキシプロピル）エーテル；１，４−ブタジオールジグリシドキシエーテル
該クロスリンクは、１つ又は複数の天然由来ジスルフィド結合を置き換えてもよく、或いはジスルフィド結合に加えて生成されてもよい。
【００６２】
他のクロスリンキング化学もまた、含まれる可能性がある。別のクロスリンキングとしては、以下のものを挙げることができる：
【００６３】
カルボキシルから第一級アミンへ
（ａ）カルボジイミド活性化：Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドＨＣｌ（ＥＤＣ；ＣＡＳ  Ｎｒ  ２５９５２−５３−８
（ｂ）カルボジイミド活性化：Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ｓＮＨＳ；ＣＡＳ  Ｎｒ  １０６６２７−５４−７）で安定化されたＥＤＣ
（ｃ）４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウム（ＤＭＴＭＭ；ＣＡＳ  Ｎｒ  ３９４５−６９−５）
・上記のもののいずれかで活性化されたら、カルボキシラートが第一級アミン（リシン、Ｎ−末端）と反応して、アミド共有結合を形成するであろう。
・注：幾つかの条件下では、ＥＤＣ／ｓＮＨＳ活性化は、活性化カルボキシル基（アスパラギン酸、グルタミン酸、Ｃ−末端の）とヒドロキシル基（即ち、セリン、トレオニン及びチロシン）の間のエステル共有結合を形成させ得る。
【００６４】
カルボキシルからカルボキシルへ
（ａ）カルボキシルをＥＤＣ、ＥＤＣ／ｓＮＨＳ又はＤＭＴＭＭで活性化し、その後、アミン誘導体化ポリエチレングリコール、例えばアミン−ＰＥＧｎ−アミン（ここでｎ＝ＰＥＧ単位の反復数）でクロスリンクする
（ｂ）カルボキシルをＤＭＴＭＭで活性化し、ホモ二官能性ヒドラジド、例えば、アジピン酸二塩酸塩（ＡＤＨ；ＣＡＳ  Ｎｒ  １０７１−９３−８）でクロスリンクする
【００６５】
カルボキシルからスルフヒドリルへ
ジスルフィドが存在する場合、還元剤、例えばトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ；ＣＡＳ  Ｎｒ  ５１８０５−４５−９）で−ＳＨに還元する。カルボキシルをカルボジイミド（ＥＤＣ）で活性化して、
（ａ）３−（４−（４−（アミノメチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）フェニル）プロピオロニトリル塩酸塩（ＡＰＮ；ＣＡＳ  Ｎｒ  １６４３８４１−８８−６）
（ｂ）アミン−（ＰＥＧ）ｎ−マレイミド（ここでｎ＝ＰＥＧ単位の反復数）（ＭＡＬ−ＰＥＧ−ＮＨ２）
でクロスリンクする。
【００６６】
アミンからアミンへ
（ａ）ＰＥＧ化ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート）、例えばＢＳ（ＰＥＧ）５（ここで５＝ＰＥＧ単位の反復数）
（ｂ）ジメチルピメルイミダート（ＤＭＰ；ＣＡＳ  Ｎｒ  ５８５３７−９４−３）
（ｃ）ｐ−フェニレンジイソチオシアナート（ＰＤＩＴＣ；ＣＡＳ  Ｎｒ  ４０４４−６５−９）
（ｄ）スベリン酸ビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＤＳＳ；ＣＡＳ  Ｎｒ  ６８５２８−８０−３）
（ｅ）エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシナート）（スルホ−ＥＧＳ；ＣＡＳ  Ｎｒ  １６７４１０−９２−６）
【００６７】
アミンからスルフヒドリルへ
（ａ）マレイミド−ＰＥＧ８−スクシンイミジルエステル（ＣＡＳ  Ｎｒ  ７５６５２５−９３−６）
（ｂ）４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ；ＣＡＳ  Ｎｒ  ６４９８７−８５−５）
（ｃ）３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ；ＣＡＳ  Ｎｒ  ６８１８１−１７−９）
（ｄ）３−（４−ホルミルフェニル）プロピオロニトリル（ＡＰＮ−ＣＨＯ）
（ｅ）ヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＩＡＡ−ＮＨＳ；ＣＡＳ  Ｎｒ  ３９０２８−２７−８）
【００６８】
ヒドロキシルからスルフヒドリルへ
（ａ）４−（マレインイミド）フェニルイソシアナート（ＰＭＰＩ；ＣＡＳ  Ｎｒ  １２３４５７−８３−０）
【００６９】
他の化学
（ａ）ｐ−アジドフェニルグリオキサール（ＡＰＧ；ＣＡＳ  Ｎｒ  １１９６１５１−４９−１）
・アルギニンと、そしてより少ない程度にシスチン（ジスルフィド結合）及びヒスチジンと反応させる。光活性化により、二重結合、Ｃ−Ｈ及びＮ−Ｈで、又は環拡大機序を介して第一級アミンで、付加反応を開始する。
（ｂ）１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ；ＣＡＳ  Ｎｒ  ２４２５−７９−８）
・ヒドロキシル、アミン及びスルフヒドリル基と反応させる
（ｃ）４−（４−ジアゾニオフェニル）ベンゼンジアゾニウム（ＣＡＳ  Ｎｒ  ５９５７−０３−９
・チロシン及びヒスチジンと反応させる
（ｄ）ベンゾフェノン−４−ヨードアセトアミド（ＣＡＳ  Ｎｒ  ７６８０９−６３−７）
・スルフヒドリルと反応させて、光活性化により、活性Ｃ−Ｈ及びＮ−Ｈ結合と反応させて、共有結合を形成させる
（ｅ）スクシンイミジル  ２−［（４，４’−アジペンタンアミド）エチル］−１，３’−ジチオプロピオナート）（ＳＤＡＤ；ＣＡＳ  Ｎｒ  １２５３２０２−３８−８
・ＮＨＳエステル基は、第一級アミンと反応し；ジアジリン基は、光活性化により任意のアミノ酸側鎖又はペプチド骨格と効率的に反応する
【００７０】
典型的には抗体の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％が、クロスリンクされる。７０％〜８０％のクロスリンキング効率が、例えばビスマレイミド、を用いて観察された。例えば還元剤を添加して残りの非クロスリンク抗体のジスルフィド結合を破壊すること、及び例えばゲル電気泳動を利用して、分離すること、により、該クロスリンクされた抗体はさらに精製されて、より高レベルのクロスリンキングを生成してもよい。
【００７１】
クロスリンクされた抗体を利用する利点は、それが、例えば精製抗体から放出された遊離軽鎖により、試料の汚染を減少させることである。これは、この系の感度及び正確度を上昇させる。
【００７２】
該方法は、総カッパ及び総ラムダ軽鎖を抗総カッパ及び抗総ラムダ抗体又はその断片で精製するステップと、該精製された試料を質量分析法に供して、単クローン性軽鎖生成に対応する１つ又は複数のピークの存在を同定するステップと、をさらに含んでいてもよい。即ち、抗ＦＬＣ特異性抗体は、実質的に遊離軽鎖のみに結合するが、総カッパ及び／又は総ラムダ軽鎖は、遊離軽鎖と、重鎖に結合された軽鎖との両方に結合する。それゆえこれは、遊離軽鎖ではなく試料中の任意の軽鎖を検出する。この追加のステップは、例えば単クローン性のインタクト免疫グロブリンが生成されるＭＧＵＳの同定を支援する。
【００７３】
同じく、別個の総カッパ軽鎖特異性抗体及び総ラムダ軽鎖特異性抗体が、用いられてもよく、或いは該２種の抗体の互いの混合物が、用いられてもよい。該抗体及び断片は、先に定義された通りであってもよく、又は先に記載された通り修飾されてもよい。典型的にはそれらは、１つ又は複数の非ジスルフィドクロスリンクでクロスリンクされる。
【００７４】
総カッパ及び／又はラムダ抗体を用いたアッセイの代わり又は追加として用いられ得る別の方法は、例えば還元剤を用いて、試料の一部を還元条件に供する。これは、重鎖から結合された軽鎖を放出する。放出された軽鎖はその後、抗総カッパ及び／若しくはラムダ軽鎖を用いて、又は抗カッパ及び／若しくはラムダＦＬＣ抗体を用いて、濃縮又は精製されてもよい。
【００７５】
濃縮ステップで用いられる抗体が、検出抗体の軽鎖と重鎖の間の１つ又は複数の非ジスルフィドクロスリンクの存在により修飾される場合、それらは、依然として還元条件下で用いられて、図９及び１０に示される通り試料中の放出された軽鎖を検出してもよい。
【００７６】
該試料は、例えば涙液、血漿、血清、血液、尿、唾液又は脳脊髄液をはじめとする適切な体液であってもよい。
【００７７】
形質細胞関連疾患は、１つ又は複数の単クローン性軽鎖を生成する任意のものであってもよい。これらには、例えばインタクト免疫グロブリン、多発性骨髄腫、軽鎖多発性骨髄腫、非分泌性多発性骨髄腫、ＡＬアミロイドーシス、軽鎖沈着症（ＬＣＤＤ）、くすぶり型多発性骨髄腫、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、マクログロブリン血症、ＰＯＥＭＳ（多発神経障害、臓器腫大、内分泌疾患、単クローン性ガンマグロブリン血症及び皮膚変化）症候群が挙げられる。
【００７８】
ＦＬＣ又は総軽鎖を精製するために本発明で用いられる抗体又は断片が、例えば当該技術分野で概ね知られる型の適切な免疫精製カラムで提供されてもよい。或いは該抗体は、例えば「ＤｙｎａＢｅａｄｓ（商標）」として知られる型の、磁気ビーズに付着されてもよい。これにより抗体を試料と混合させて、試料中のＦＬＣ又は総軽鎖に結合させる。その後、ＦＬＣ又は軽鎖に付着された抗体が、抗体又は断片を引き付ける磁気の援助により試料から除去される。
【００７９】
その後、ＦＬＣ又は軽鎖は、抗体から溶出されて、例えば質量分析法のターゲット上に配置させることにより、質量分析計で用いられてもよい。
【００８０】
或いは該抗体又は断片は、例えば質量分析法のターゲット上で、固定化されてもよい。該試料は、該抗体を含むターゲットと接触させ、該ターゲットを洗浄して結合された材料を除去し、その後、結合されたＦＬＣ又は軽鎖を含有する（断片の抗体を介して）質量分析法のターゲットを質量分析法に供して、結合された遊離軽鎖又は複数の軽鎖の存在を検出する。
【００８１】
したがって本発明のさらなる態様は、抗カッパＦＬＣ抗体又はその断片、抗ラムダＦＬＣ抗体又はその断片、及び少なくとも１つの質量分析法のターゲットを提供する。典型的には該抗体は、質量分析法のターゲット上で固定化される。典型的には抗カッパＦＬＣ抗体と抗ラムダＦＬＣ抗体の混合物が、該ターゲット上で固定化される。
【００８２】
先に定義された質量分析法のターゲットを含む質量分析計も、提供される。
【００８３】
本発明の方法は、１種又は複数のさらなるアッセイと組み合わせて使用して、対象が有する任意の病気をさらに特徴づけてもよい。例えば：
血清血漿（Ｓｅｒｕｍ  ｐｌａｓｍａ）電気泳動又は免疫固定電気泳動を実施して、該病気をさらに特徴づけてもよい。
【００８４】
総タンパク質アルブミン又はベータ−２−マイクログロブリンが、ＭＳ又は当該技術分野で知られた従来のアッセイにより検出されてもよい。
【００８５】
クレアチニン及びシスタチンなどの腎機能マーカーが、アッセイされてもよい。トロポニン、ＮＴ−ｐｒｏ−ＢＮＰなどの心臓マーカーも、アッセイされてもよい。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）及びリン酸塩（Ｐｈ）と同様に、高カルシウム血症のための骨プロファイル／ターンオーバーがアッセイされてもよい。
【００８６】
したがって、本明細書で請求される発明は、インタクト免疫グロブリン、多発性骨髄腫、軽鎖多発性骨髄腫、非分泌性多発性骨髄腫、ＡＬアミロイドーシス、軽鎖沈着症、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞腫及びＭＧＵＳをはじめとする種々の異なる形質細胞関連疾患を検出すると予測される。ＭＧＵＳは、正常なＦＬＣクローンが存在する場合に検出されるであろう。
【００８７】
以下の表は、本発明の予測される感度に比較して、最も適切な症候性単クローン性ガンマグロブリン血症スクリーニングパネルの感度を示している。ＳＰＥは、血清血漿電気泳動であり、ｓＦＬＣは、血清遊離軽鎖であり、ＭＳ  ＦＬＣは、本発明である。
【表１】
2020522683.tif 000003
【００８８】
ここに本発明を、以下の図を参照しながら、例として記載する。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】抗遊離ラムダ抗体での精製後の、形質細胞関連疾患の非存在下での正常試料の一価イオン範囲２２．５〜２３．５ｋＤａに及ぶ陽イオンモードでの質量分析法の実行を示す。
【００９０】
【図２】抗遊離カッパ抗体での精製後の、正常試料の一価イオン範囲２２．５〜２３．５ｋＤａに及ぶ陽イオンモードでの質量分析法の実行を示す。
【００９１】
【図３】図１及び２の印字出力のオーバーレイを示す。
【００９２】
【図４】正常試料に及ぼす抗遊離ラムダ及び抗遊離カッパ抗体での共精製の影響を示す。
【００９３】
【図５】抗遊離ラムダでの精製後の異常な試料での質量分析の実行を示す。これは、異常な単クローン性タンパク質の存在を示した異常なピークを示す。
【００９４】
【図６】抗遊離カッパでの精製後の、遊離ラムダの異常なクローン性生成が存在する異常な試料の質量分析法の実行を示す。
【００９５】
【図７】図５及び６に示された印字出力のオーバーレイを示す。
【００９６】
【図８】抗遊離ラムダ及び抗遊離カッパでの共精製後の、遊離ラムダの異常なクローン性生成を含む異常な試料の質量分析法の実行を示す。
【００９７】
【図９】還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により示されたＢＳ（ＰＥＧ）５によるヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体のクロスリンキング。Ｌ１＝遊離免疫グロブリン軽鎖、Ｈ１＝遊離免疫グロブリン重鎖、Ｈ１Ｌ１及びＨ２Ｌ２＝クロスリンクされた重鎖及び軽鎖分子。
【００９８】
【図１０】ＢＳ（ＰＥＧ）５でクロスリンクされた抗体は、生物活性を保持する。ヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体を上昇濃度のＢＳ（ＰＥＧ）５でクロスリンクして、ＥＬＩＳＡによりそれらのＩｇＧ結合活性を分析した。
【００９９】
【図１１Ａ】二価イオンの陽イオンモードでのＩｇＧカッパＭＧＵＳの対象からの試料についての質量分析法の実行を示す。
【０１００】
【図１１Ｂ】一価イオンの陽イオンモードでのＩｇＧカッパＭＧＵＳの対象からの試料についての質量分析法の実行を示す。
【０１０１】
【図１２Ａ】二価イオンの陽イオンモードでのＩｇＡラムダＭＧＵＳの対象からの試料についての質量分析法の実行を示す。
【０１０２】
【図１２Ｂ】一価イオンの陽イオンモードでのＩｇＡラムダＭＧＵＳの対象からの試料についての質量分析法の実行を示す。
【０１０３】
【図１３Ａ】二価イオンの陽イオンモードでのＩｇＡラムダＭＧＵＳの対象からの試料についての質量分析法の実行を示す。
【０１０４】
【図１３Ｂ】一価イオンの陽イオンモードでのＩｇＡラムダＭＧＵＳの対象からの試料についての質量分析法の実行を示す。
【０１０５】
【図１４Ａ】二価イオンの陽イオンモードでの正常対象からの質量分析法の実行を示す。
【０１０６】
【図１４Ｂ】一価イオンの陽イオンモードでの図１４Ａの正常試料の質量分析法の実行を示す。
【０１０７】
【図１５Ａ】二価イオンの陽イオンモードでの正常試料の質量分析法の実行を示す。
【０１０８】
【図１５Ｂ】一価イオンの陽イオンモードでの図１５Ａの正常対象の試料の質量分析法の実行を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１０９】
カッパＦＬＣ及びラムダＦＬＣを、抗カッパＦＬＣ抗体及び抗ラムダＦＬＣ抗体、又はそれらの混合物を用いて、別個に精製すること又は共精製することができる。
【０１１０】
精製されたＦＬＣを質量分析プレートにスポットして、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより分析する。
【０１１１】
図１〜８は、患者の血清中の単クローン性遊離軽鎖の存在が、どのようにしてバックグランドの正常な遊離軽鎖生成を超えるピークの存在により容易に同定され得るかを示す。このピークは、カッパピークとラムダピークのオーバーラップが存在するエリアでも同定され得る。
【０１１２】
抗ヒトＩｇＧ抗体は、ホモ二官能性クロスリンカーＢＳ（ＰＥＧ）５によりクロスリンクされ得る。
【０１１３】
該抗体を、上昇濃度のＢＳ（ＰＥＧ）５（０〜４０モル過剰）と共にインキュベートして、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分析した。図９に示された通り、ＢＳ（ＰＥＧ）５の非存在下で、還元剤（５０ｍＭ  ＤＴＴ）が、該抗体を重鎖及び軽鎖部分に解離する。対照的に、抗体と上昇濃度のＢＳ（ＰＥＧ）５（０〜４０モル過剰）とのインキュベーションで、重鎖及び軽鎖のクロスリンキングが同時に増加して、還元抵抗性重−軽鎖対を形成させる。
【０１１４】
ＢＳ（ＰＥＧ）５でクロスリンクされた抗体は、生物学的活性を保持する。
【０１１５】
精製されたヒトＩｇＧラムダを、３〜２０００ｎｇ／ｍＬでマイクロタイタープレートにコーティングした。０〜４０モル過剰のＢＳ（ＰＥＧ）５でクロスリンクした後、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体を適用した。結合された抗体の量を、西洋ワサビペルオキシダーゼレポーター酵素にコンジュゲートされたロバ抗ヒツジ抗体、及び３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン発色基質を用いて計測した。図１０に示された通り、４０×モル過剰までのＢＳ（ＰＥＧ）５の濃度では、クロスリンクされていない抗体に比較して、ヒトＩｇＧ結合への有意な影響は観察されなかった。
【０１１６】
ＭＧＵＳの対象からの試料及び正常試料のテスト
図１４〜１５のヒト血清試料（図１１〜１３（Ａ〜Ｃ）の３例のＩＰＥ陽性ＭＧＵＳ、及び２例の健常対照）を、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液（２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．０）で希釈して、抗体コーティング磁気ビーズと共にインキュベートして再懸濁させ、逐次ＰＢＳ−Ｔで３回、そして脱イオン水で２回洗浄した。ビーズを酸性緩衝液により室温で１５分間溶出した。溶離液の１つをマトリックス（ａ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、１０ｍｇ／ｇｌ）と混合し、その後、Ｍｏｓｑｕｉｔｏ  ＨＴＳスポッター（ＴＴＰ）を用いて磨いたスチールＭＡＬＤＩ標的プレートにスポットして、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｔｙｐｅｒ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（Ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ  ＬＴ／ＳＨ  Ｓｍａｒｔ）で分析した。マススペクトルを、一価（＋１、ｍ／ｚ  ２２〜２５ｋＤａ）及び二価（＝２、ｍ／ｚ  １０〜１４ｋＤａ）イオンを含む１０，０００〜３０，０００のｍ／ｚ範囲に及ぶ陽イオンモードで獲得した。データをＢｒｕｋｅｒ  Ｆｌｅｘ解析ソフトウエアで解析した。
【表２】
2020522683.tif 000004
【０１１７】
これは、質量分析法を用いると、正常な試料で正常に認められる遊離軽鎖レベルであっても単クローン性カッパ及びラムダ遊離軽鎖を検出し得ることを示している。
【０１１８】
予備的結果からも、二価イオンの陽性モードが異常な単クローン性ＦＬＣを一価陽性モードよりも良好に検出させることが示される。
【０１１９】
同定が困難であることの多いＭＧＵＳの対象であっても試料中の低レベルのＦＬＣの存在を迅速に同定する能力は、驚くべきことであり、ＭＧＵＳ及び他の単クローン性ガンマグロブリン血症の対象を同定することが可能となる新しいアプローチを開拓する。
【図１】
2020522683.tif 000005
【図２】
2020522683.tif 000006
【図３】
2020522683.tif 000007
【図４】
2020522683.tif 000008
【図５】
2020522683.tif 000009
【図６】
2020522683.tif 000010
【図７】
2020522683.tif 000011
【図８】
2020522683.tif 000012
【図９】
2020522683.tif 000013
【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【国際調査報告】
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