(57)【要約】免疫細胞標的化部分とサイトカイン分子とを含む免疫刺激性融合分子をコードするポリヌクレオチド、その医薬および製剤、ならびにそれを使用および作製する方法が、開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ｍＲＮＡを含む１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドであって、標的免疫細胞における細胞表面抗原に対する完全または部分的な結合部位を含む免疫細胞標的化部分にペプチドリンカーによって作動可能に連結した、サイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントを含む、融合タンパク質をコードする、１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドと、
（ｂ）前記標的免疫細胞と
を含む、組成物。
【請求項２】
前記１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、シグナルペプチドをコードする配列をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ｍＲＮＡが、修飾されたｍＲＮＡである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドが、非組込みＲＮＡを含む、請求項１に記載の操作されたポリヌクレオチド分子。
【請求項５】
免疫細胞において一過的な遺伝子発現を誘導する方法であって、標的免疫細胞を、有効量の、ｍＲＮＡを含む１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドを含む第１の組成物と、前記ポリヌクレオチドを前記免疫細胞に導入するのに好適な条件下において接触させるステップを含み、前記１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドが、前記標的免疫細胞における細胞表面抗原に対する完全または部分的な結合部位を含む免疫細胞標的化部分にペプチドリンカーによって作動可能に連結した、サイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントを含む、融合タンパク質をコードする、方法。
【請求項６】
前記免疫細胞が、その表面上に発現されるかまたはそれ以外の方法で表される前記細胞表面抗原を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドが、リポフェクションによって、電気穿孔によって、ヌクレオポレーションによって、流体力学的ショックによって、またはナノ粒子において、前記免疫細胞に導入される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
サイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントを、免疫細胞において発現させる方法であって、標的免疫細胞を、ｍＲＮＡを含む１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドと、操作されたポリヌクレオチドを前記免疫細胞に導入するのに好適な条件下において接触させるステップを含み、前記１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドが、前記標的免疫細胞における細胞表面抗原に対する完全または部分的な結合部位を含む免疫細胞標的化部分にペプチドリンカーによって作動可能に連結した、サイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントを含む、融合タンパク質をコードする、方法。
【請求項９】
前記接触させるステップが、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行われる、請求項５または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫細胞を、有効量の、１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドを含む第２の組成物と、前記第２の組成物中の前記１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドを前記免疫細胞に導入するのに好適な条件下において接触させるステップをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の組成物が、サイトカイン分子、成長因子分子、共刺激性分子、および前述のもののいずれかのバリアントのうちの１つまたは複数を一緒にコードする、１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
第１の組成物中の前記１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドおよび前記第２の組成物中の前記１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドが、免疫細胞にコトランスフェクトされる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドが免疫細胞の中にトランスフェクトされている、該免疫細胞を含む、修飾された免疫細胞であって、
前記１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡを含み、前記１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドが、サイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントをコードし、
必要に応じて、前記サイトカインもしくは成長因子分子が、免疫細胞によって発現されるかまたはそれ以外の方法で免疫細胞上に表される細胞表面抗原に対する完全または部分的な結合部位を有する免疫細胞標的化部分に作動可能に連結した融合分子として提供される、修飾された免疫細胞。
【請求項１４】
前記免疫細胞が、健康なおよび／または非悪性の免疫細胞、リンパ球、またはＴ細胞である、請求項１３に記載の修飾された免疫細胞。
【請求項１５】
前記サイトカイン分子が、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、またはＩＬ−２７のうちの１つまたは複数から選択される、請求項１３に記載の修飾された免疫細胞。
【請求項１６】
前記サイトカイン分子が、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−１５である、請求項１５に記載の修飾された免疫細胞。
【請求項１７】
前記免疫細胞標的化部分が、免疫細胞表面受容体に結合する、抗体もしくはその抗原結合性断片、非抗体スキャフォールド、またはリガンドから選択され、前記免疫細胞表面受容体が、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１９７、ＣＤ３８、ＣＤ２７、ＣＤ１９６、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＤ８４、ＣＤ２２９、ＣＣＲ１、ＣＣＲ５、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＣＲ１０、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、またはＧＩＴＲのうちの１つまたは複数から選択される、請求項１３に記載の修飾された免疫細胞。
【請求項１８】
前記免疫細胞標的化部分が、ＣＤ４５に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む、請求項１７に記載の修飾された免疫細胞。
【請求項１９】
前記融合分子が、前記免疫細胞標的化部分および前記サイトカイン分子を作動可能に連結させるためのリンカーをさらに含む、請求項１３に記載の修飾された免疫細胞。
【請求項２０】
前記免疫細胞が、前記免疫細胞の表面上に結合した融合分子であって、前記免疫細胞によって発現されるかまたはそれ以外の方法で前記免疫細胞上に表される細胞表面抗原との親和性を有する免疫細胞標的化部分に作動可能に連結した、サイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントを含む、融合分子をさらに含む、請求項１３に記載の修飾された免疫細胞。
【請求項２１】
前記１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドによってコードされる前記サイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントが、前記免疫細胞の表面上に結合した前記融合分子の前記サイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントとは異なる、請求項２０に記載の修飾された免疫細胞。
【請求項２２】
前記１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドによってコードされる前記サイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントが、前記免疫細胞の表面上に結合した前記融合分子の前記サイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントと同じである、請求項２０に記載の修飾された免疫細胞。
【請求項２３】
前記１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドによってコードされる免疫細胞標的化部分が、前記免疫細胞の表面上に結合した前記融合分子の前記免疫細胞標的化部分とは異なる、請求項２０に記載の修飾された免疫細胞。
【請求項２４】
前記１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドによってコードされる免疫細胞標的化部分が、前記免疫細胞の表面上に結合した前記融合分子の前記免疫細胞標的化部分と同じである、請求項２０に記載の修飾された免疫細胞。
【請求項２５】
前記１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドを、前記免疫細胞にトランスフェクトするステップを含む、請求項１３から２４のいずれか１項に記載の修飾された免疫細胞を調製するための方法。
【請求項２６】
細胞療法を提供する方法であって、請求項１３から２４のいずれか１項に記載の複数の修飾された免疫細胞を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項２７】
対象におけるがんの処置のための方法であって、ヒト対象に、請求項１に記載の１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドを含む組成物を、Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクション、およびそれに続く前記１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドによってコードされる前記サイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントの発現に好適な形式および条件下において投与するステップを含み、前記１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドによって発現される前記サイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントが、前記対象における前記トランスフェクトされたＴ細胞および／または他の免疫細胞において、ｉｎ  ｖｉｖｏで、前記がんに対する免疫応答を刺激するように作用する、方法。
【請求項２８】
前記サイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントの前記発現が、一過的に発現される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記投与が、静脈内に、または腫瘍内注射によって行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
対象におけるがんの処置のための方法であって、
（ａ）ヒト対象に、細胞治療用組成物を投与するステップであって、前記組成物が、がん細胞またはがん細胞が存在する組織にホーミングするＴ細胞の集団を含み、前記Ｔ細胞が、複数の免疫刺激性融合分子であって、それぞれの融合分子が（ｉ）免疫刺激性サイトカインまたは成長因子分子、および（ｉｉ）前記Ｔ細胞における細胞表面抗原に対する親和性を有する免疫細胞標的化部分を含む、複数の免疫刺激性融合分子によって修飾されており、前記複数の免疫刺激性融合分子が、前記Ｔ細胞の表面に結合している、ステップと、
（ｂ）前記ヒト対象に、請求項１に記載の１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドを含む組成物を、ステップ（ａ）において投与される修飾されたＴ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクション、およびそれに続く前記１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドによってコードされる前記サイトカインまたは成長因子分子の発現に好適な形式および条件下において投与するステップと
を含み、
ステップ（ａ）において投与される前記細胞治療用組成物中の、および／またはステップ（ｂ）において投与される前記１つもしくは複数の操作されたポリヌクレオチドによって発現される、前記サイトカインおよび／または成長因子分子が、前記対象におけるＴ細胞の前記集団および／または他の免疫細胞において、ｉｎ  ｖｉｖｏで、前記がんに対する免疫応答を刺激するように作用する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年７月３日に出願された米国仮出願第６２／５２８，４１１号、２０１７年１２月１３日に出願された同第６２／５９８，４３３号、２０１８年１月２２日に出願された同第６２／６２０，４１８号、２０１８年１月２２日に出願された同第６２／６２０，１０７号、および２０１８年４月１３日に出願された同第６２／６５７，４５５号に対する優先権およびその利益を主張し、これらのそれぞれの全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
【０００２】
ＥＦＳ−Ｗｅｂを通じて本出願とともに提出された、２０１８年７月３日に作成され、サイズが２３１，５２９バイトである「１７４２８５＿０１０９００＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔ」と題されるＡＳＣＩＩテキストファイルは、これにより参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
分野
【０００３】
本開示は、概して、免疫刺激部分および免疫細胞標的化部分を含むように操作された免疫刺激性融合分子をコードするポリヌクレオチドに関する。それを作製および使用するための方法もまた、提供される。
【背景技術】
【０００４】
背景
サイトカインは、免疫系の調節に関与する。がん療法において使用される場合、サイトカインは、抗腫瘍効果を有し、一部の種類の腫瘍に対する免疫応答を増加させることができる、免疫調節剤として作用し得る。しかしながら、急速な血液クリアランスおよび腫瘍特異性の欠如のため、腫瘍部位および他の関連組織（例えば、リンパ節および脾臓）において免疫応答を活性化するかまたは抗腫瘍効果を有するのに十分なサイトカイン濃度を達成するためには、高用量のサイトカインの全身投与が必要である。これらの高レベルの全身サイトカインは、重度の毒性および有害反応を引き起こし得る。
【０００５】
したがって、改善された特性、例えば、より高い治療的有効性を有することならびにこれらの製品の副作用（例えば、とりわけ、毒性、非腫瘍細胞の破壊）の数および重症度の低減を有するサイトカイン組成物に対する必要性が、依然として存在している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
本開示は、とりわけ、免疫刺激部分と免疫細胞標的化部分とを含む免疫刺激性融合分子（ＩＦＭ、「テザー融合体」と互換可能に使用される）をコードする、１つまたは複数のポリヌクレオチドを提供する。
【０００７】
一態様では、（ａ）ｍＲＮＡを含む１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドであって、標的免疫細胞における細胞表面抗原に対する完全または部分的な結合部位を含む免疫細胞標的化部分にペプチドリンカーによって作動可能に連結した、サイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントを含む、融合タンパク質をコードする、１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドと、（ｂ）標的免疫細胞とを含む組成物が、本明細書において提供される。
【０００８】
一部の実施形態では、１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、シグナルペプチドをコードする配列をさらにさらに含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、修飾されたｍＲＮＡである。一部の実施形態では、１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドは、非組込みＲＮＡを含む。
【０００９】
さらなる態様は、免疫細胞において一過的な遺伝子発現を誘導する方法であって、標的免疫細胞を、有効量の、ｍＲＮＡを含む１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドを含む第１の組成物と、ポリヌクレオチドを免疫細胞に導入するのに好適な条件下において接触させるステップを含み、１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドが、標的免疫細胞における細胞表面抗原に対する完全または部分的な結合部位を含む免疫細胞標的化部分にペプチドリンカーによって作動可能に連結した、サイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントを含む、融合タンパク質をコードする、方法に関する。一部の実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。
【００１０】
一部の実施形態では、免疫細胞は、その表面上に発現されるかまたはそれ以外の方法で提示される（displayed）、細胞表面抗原を有する。一部の実施形態では、１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドは、リポフェクションによって、電気穿孔によって、ヌクレオポレーションによって、流体力学的ショックによって、またはナノ粒子において、免疫細胞に導入される。
【００１１】
サイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントを、免疫細胞において発現させる方法であって、標的免疫細胞を、ｍＲＮＡを含む１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドと、操作されたポリヌクレオチドを免疫細胞に導入するのに好適な条件下において接触させるステップを含み、１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドが、標的免疫細胞における細胞表面抗原に対する完全または部分的な結合部位を含む免疫細胞標的化部分にペプチドリンカーによって作動可能に連結した、サイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントを含む、融合タンパク質をコードする、方法もまた、本明細書において提供される。一部の実施形態では、接触させるステップは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。
【００１２】
一部の実施形態では、方法は、免疫細胞を、有効量の、１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドを含む第２の組成物と、第２の組成物中の１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドを免疫細胞に導入するのに好適な条件下において接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、第２の組成物は、サイトカイン分子、成長因子分子、共刺激性分子、および前述のもののいずれかのバリアントのうちの１つまたは複数を一緒にコードする、１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第１の組成物中の１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドおよび第２の組成物中の１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドは、免疫細胞にコトランスフェクトされる。
【００１３】
別の態様は、
１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドが免疫細胞の中にトランスフェクトされている、その免疫細胞を含む修飾された免疫細胞であって、
１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡを含み、１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドが、サイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントをコードし、
必要に応じて、サイトカインもしくは成長因子分子が、免疫細胞によって発現されるかまたはそれ以外の方法で免疫細胞に提示される細胞表面抗原に対する完全または部分的な結合部位を有する免疫細胞標的化部分に作動可能に連結した融合分子として提供される、修飾された免疫細胞に関する。
【００１４】
一部の実施形態では、免疫細胞は、健康なおよび／または非悪性の免疫細胞、リンパ球、またはＴ細胞である。一部の実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、またはＩＬ−２７のうちの１つまたは複数から選択される。一部の実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−１５である。一部の実施形態では、免疫細胞標的化部分は、免疫細胞表面受容体に結合する、抗体もしくはその抗原結合性断片、非抗体スキャフォールド、またはリガンドから選択され、免疫細胞表面受容体は、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１９７、ＣＤ３８、ＣＤ２７、ＣＤ１９６、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＤ８４、ＣＤ２２９、ＣＣＲ１、ＣＣＲ５、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＣＲ１０、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、またはＧＩＴＲのうちの１つまたは複数から選択される。一部の実施形態では、免疫細胞標的化部分は、ＣＤ４５に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、融合分子は、免疫細胞標的化部分およびサイトカイン分子を作動可能に連結させるためのリンカーをさらに含む。一部の実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞の表面上に結合した融合分子であって、免疫細胞によって発現されるかまたはそれ以外の方法で免疫細胞に提示される細胞表面抗原との親和性を有する免疫細胞標的化部分に作動可能に連結した、サイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントを含む、融合分子をさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドによってコードされるサイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントは、免疫細胞の表面上に結合した融合分子のサイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントとは異なる。一部の実施形態では、１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドによってコードされるサイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントは、免疫細胞の表面上に結合した融合分子のサイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントと同じである。一部の実施形態では、１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドによってコードされる免疫細胞標的化部分は、免疫細胞の表面上に結合した融合分子の免疫細胞標的化部分とは異なる。一部の実施形態では、１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドによってコードされる免疫細胞標的化部分は、免疫細胞の表面上に結合した融合分子の免疫細胞標的化部分と同じである。
【００１５】
本明細書に開示される修飾された免疫細胞を調製するための方法であって、１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドを、免疫細胞にトランスフェクトするステップを含む、方法もまた、本明細書において提供される。
【００１６】
細胞療法を提供する方法であって、本明細書に開示される複数の修飾された免疫細胞を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法もまた、本明細書において提供される。細胞療法を提供するための修飾された免疫細胞の使用もまた、本明細書に開示される。
【００１７】
さらなる態様は、対象におけるがんの処置のための方法であって、ヒト対象に、本明細書に開示される１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドを含む組成物を、Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクション、およびそれに続く１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドによってコードされるサイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントの発現に好適な形式および条件下において投与するステップを含み、１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドによって発現されるサイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアント（variant  there）が、対象におけるトランスフェクトされたＴ細胞および／または他の免疫細胞において、ｉｎ  ｖｉｖｏで、がんに対する免疫応答を刺激するように作用する、方法に関する。
【００１８】
一部の実施形態では、サイトカインもしくは成長因子分子、またはそのバリアントの発現は、一過的に発現される。一部の実施形態では、投与は、静脈内に、または腫瘍内注射によって行われる。
【００１９】
別の態様は、対象におけるがんの処置のための方法であって、
（ａ）ヒト対象に、細胞治療用組成物を投与するステップであって、組成物が、がん細胞またはがん細胞が存在する組織にホーミングするＴ細胞の集団を含み、Ｔ細胞が、複数の免疫刺激性融合分子であって、それぞれの融合分子が（ｉ）免疫刺激性サイトカインまたは成長因子分子、および（ｉｉ）Ｔ細胞における細胞表面抗原に対する親和性を有する免疫細胞標的化部分を含む、複数の免疫刺激性融合分子によって修飾されており、複数の免疫刺激性融合分子が、Ｔ細胞の表面に結合している、ステップと、
（ｂ）ヒト対象に、請求項１に記載の１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドを含む組成物を、ステップ（ａ）において投与される修飾されたＴ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクション、およびそれに続く１つまたは複数の操作されたポリヌクレオチドによってコードされるサイトカインまたは成長因子分子の発現に好適な形式および条件下において投与するステップと
を含み、
ステップ（ａ）において投与される細胞治療用組成物中の、および／またはステップ（ｂ）において投与される１つもしくは複数の操作されたポリヌクレオチドによって発現される、サイトカインおよび／または成長因子分子が、対象におけるＴ細胞の集団および／または他の免疫細胞において、ｉｎ  ｖｉｖｏで、がんに対する免疫応答を刺激するように作用する、方法に関する。
【００２０】
がんの処置のための組成物（例えば、操作されたポリヌクレオチドおよび／または修飾された免疫細胞）の使用もまた、本明細書において提供される。
【００２１】
別の態様では、
（ａ）免疫刺激性サイトカイン分子と、
（ｂ）標的免疫細胞の表面上の抗原に対する親和性を有する抗体の抗原結合性断片を含む、免疫細胞標的化部分と
を含む免疫刺激性融合分子であって、
免疫刺激性サイトカイン分子が、抗原結合性断片に作動可能に連結している、免疫刺激性融合分子が、提供される。
【００２２】
別の態様では、
（ａ）免疫刺激性サイトカイン分子と、
（ｂ）標的免疫細胞の表面上の抗原に特異的な抗原結合性部位を有する抗体を含む、免疫細胞標的化部分であって、抗体が、Ｃ末端およびＮ末端を有する軽鎖と、Ｃ末端およびＮ末端を有する重鎖とを含み、軽鎖が、ジスルフィド結合によって重鎖に連結されている、免疫細胞標的化部分と
を含む免疫刺激性融合分子であって、
免疫刺激性サイトカイン分子が、軽鎖のＣ末端、軽鎖のＮ末端、または重鎖部分のＮ末端において、抗体に作動可能に連結している、免疫刺激性融合分子が、提供される。
【００２３】
別の態様では、
（ａ）ＩＬ−１２分子と、
（ｂ）ＣＤ４５細胞表面受容体に特異的な抗原結合性部位を有するＦａｂ断片を含む、Ｔ細胞標的化部分と
を含む免疫刺激性融合分子であって、
Ｆａｂ断片およびＩＬ−１２分子が、融合分子として一緒に作動可能に連結している、免疫刺激性融合分子が、提供される。
【００２４】
一部の実施形態では、免疫細胞標的化部分は、エフェクターＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＣＴＬから選択される、Ｔ細胞を標的とする。一部の実施形態では、抗原は、Ｔ細胞の細胞表面上に発現されるＣＤ４５受容体である。一部の実施形態では、免疫細胞標的化部分は、抗ＣＤ４５抗体ＢＣ８、４Ｂ２、ＧＡＰ８．３、もしくは９．４のＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、または前述のもののいずれかのヒト化バージョンを含む。一部の実施形態では、免疫刺激性サイトカイン分子は、ＩＬ−１２、一本鎖ＩＬ−１２、ＩＬ−１２のサブユニット、または前述のもののいずれかのバリアント形態を含む。免疫刺激性融合分子は、標的免疫細胞の表面上の抗原に対する親和性を有する一本鎖Ｆｖをさらに含んでもよく、必要に応じて、一本鎖Ｆｖは、抗原結合性断片と同じ抗原に対する親和性を有する。一部の実施形態では、一本鎖Ｆｖは、抗原結合性断片とは異なる抗原に対する親和性を有する。一部の実施形態では、抗原結合性断片は、Ｆａｂ断片であり、これは、軽鎖および重鎖断片が必要に応じてジスルフィド結合によって連結されたものを必要に応じて含み、免疫刺激性サイトカイン分子は、軽鎖のＣ末端、軽鎖のＮ末端、重鎖断片のＣ末端、または重鎖断片のＮ末端において、Ｆａｂ断片に作動可能に連結している。
【００２５】
一部の実施形態では、免疫刺激性サイトカイン分子は、リンカーによって抗原結合性断片に作動可能に連結している。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカー、非切断性リンカー、ペプチドリンカー、可動性リンカー、剛性リンカー、ヘリカルリンカー、および非ヘリカルリンカー、例えば、ＧｌｙおよびＳｅｒを含むペプチドリンカーから選択される。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、（ＧＧＧＳ）Ｎ（配列番号１２４）または（ＧＧＧＧＳ）Ｎ（配列番号１２５）リンカーであり、Ｎは、モチーフの反復回数を示し、１〜１０から選択される整数である。
【００２６】
一部の実施形態では、抗原結合性断片は、ＣＤ４５受容体に対する親和性を有し、
（ａ）配列番号８２に示されるアミノ酸配列の抗体部分の可変ドメイン、または配列番号８２の可変ドメインに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくはそれよりも高い同一性のアミノ酸配列に対応する、軽鎖可変アミノ酸配列、および／あるいは
（ｂ）配列番号７９に示されるアミノ酸配列の可変ドメイン、または配列番号７９の可変ドメインに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくはそれよりも高い同一性のアミノ酸配列に対応する、重鎖可変アミノ酸配列を含む。
【００２７】
一部の実施形態では、サイトカイン分子は、配列番号５０に示されるアミノ酸配列、または配列番号５０のサイトカイン部分に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくはそれよりも高い同一性のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する、ＩＬ−１２分子を含む。
【００２８】
一部の実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−１２Ａサブユニットが、配列番号７０に示されるアミノ酸配列、または配列番号７０のサイトカイン部分に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくはそれよりも高い同一性のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するリンカーを通じて、ＩＬ−１２Ｂサブユニットに連結された、一本鎖ＩＬ−１２分子を含む。
【００２９】
一部の実施形態では、リンカーは、配列番号３６のアミノ酸配列、または配列番号３６のサイトカイン部分に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくはそれよりも高い同一性のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する、ペプチドリンカーを含む。
【００３０】
一部の実施形態では、一本鎖Ｆｖは、配列番号８０のＦｖ部分、または配列番号８０のＦｖ部分に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくはそれよりも高い同一性のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する。
【００３１】
一部の実施形態では、Ｆａｂ断片は、可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を有する軽鎖、ならびに可変ドメイン（ＶＨ）および定常ドメイン（ＣＨ１）を有する重鎖断片を含み、軽鎖および重鎖断片は、必要に応じて、ジスルフィド結合によって連結されており、軽鎖および重鎖断片は、それぞれが、Ｃ末端およびＮ末端を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１２分子は、軽鎖または重鎖断片のＣ末端またはＮ末端に作動可能に連結している。
【００３２】
一部の実施形態では、免疫刺激性融合分子は、ＩＬ−１２分子に融合された第１の末端を有するペプチドリンカーをさらに含み、第２の末端は、Ｆａｂ断片に融合されており、それによって、ＩＬ−１２分子およびＦａｂ断片を作動可能に連結させている。
【００３３】
本明細書に開示される免疫刺激性融合分子のうちのいずれか１つをコードする、単離された核酸分子もまた、本明細書において提供される。
【００３４】
配列番号３６、５０、７０、７９、８０、もしくは８２のアミノ酸配列、または配列番号３６、５０、７０、７９、８０、もしくは８２に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくはそれよりも高い同一性のアミノ酸配列に対応するポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸を含む、ベクターもまた、本明細書において提供される。
【００３５】
本明細書に開示される核酸分子またはベクターを含む、宿主細胞もまた、本明細書において提供される。
【００３６】
さらなる態様は、
（ａ）（ｉ）免疫刺激性サイトカイン分子、および
（ｉｉ）細胞表面抗原に対する親和性を有する免疫細胞標的化部分を含む、免疫刺激性融合分子と、
（ｂ）細胞表面抗原を発現するかまたはそれ以外の方法で提示する、標的免疫細胞と
を含む、修飾された免疫細胞であって、
免疫刺激性融合分子が、細胞表面抗原との相互作用を通じて、免疫細胞の表面に結合している、修飾された免疫細胞に関する。
【００３７】
別の態様は、健康なおよび／または非悪性の免疫細胞と、そこに結合した本明細書に開示される免疫刺激性融合分子とを含む、修飾された免疫細胞に関する。
【００３８】
別の態様は、修飾された免疫細胞を調製する方法であって、
（ａ）免疫細胞の集団を提供するステップと、
（ｂ）本明細書に開示される免疫刺激性融合分子を、免疫細胞の集団とともにインキュベートして、そこへの免疫刺激性融合分子の標的化結合を可能にし、それによって、細胞表面上に結合した免疫刺激性融合分子を有する免疫細胞の集団を産生するステップと
を含む、方法に関する。
【００３９】
別の態様は、免疫細胞療法において使用するための組成物であって、
（ａ）複数の免疫刺激性融合分子であって、それぞれの融合分子が、
（ｉ）免疫刺激性サイトカイン分子、および
（ｉｉ）Ｔ細胞の細胞表面抗原に対する親和性を有する免疫細胞標的化部分を含む、複数の免疫刺激性融合分子と、
（ｂ）細胞表面抗原を発現するかまたはそれ以外の方法で提示する、Ｔ細胞の集団であって、複数の免疫刺激性融合分子が、細胞表面抗原との相互作用を通じて、Ｔ細胞の表面に結合している、Ｔ細胞の集団と、
（ｃ）薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と
を含む、組成物に関する。
【００４０】
別の態様は、本明細書に開示される免疫刺激性融合分子と、薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤とを含む、医薬組成物に関する。
【００４１】
ヒト対象におけるがんの処置のための方法であって、ヒト対象に、細胞治療用組成物を投与するステップを含み、組成物が、
（ａ）複数の免疫刺激性融合分子であって、それぞれの融合分子が、
（ｉ）免疫刺激性サイトカイン分子、および
（ｉｉ）Ｔ細胞の細胞表面抗原に対する親和性を有する免疫細胞標的化部分を含む、複数の免疫刺激性融合分子と、
（ｂ）がん細胞またはがん細胞が存在する組織にホーミングするＴ細胞の集団であって、Ｔ細胞が、細胞表面抗原を発現する、Ｔ細胞の集団と
を含み、
複数の免疫刺激性融合分子が、Ｔ細胞の表面に結合しており、サイトカイン分子が、ヒト対象におけるＴ細胞の集団および／または他の免疫細胞において、ｉｎ  ｖｉｖｏで、がんに対する免疫応答を刺激するように作用する、方法もまた、本明細書において提供される。
【００４２】
一部の実施形態では、Ｔ細胞の集団は、初代Ｔ細胞、増やした初代Ｔ細胞、ＰＢＭＣ細胞に由来するＴ細胞、臍帯血細胞に由来するＴ細胞、ヒト対象に対して自家であるＴ細胞、ヒト対象に対して同種であるＴ細胞、遺伝子操作されたＴ細胞、ＣＡＲ−Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞、活性化Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、および／またはＣＴＬを含む。一部の実施形態では、細胞治療用組成物は、養子細胞療法、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、操作ＴＣＲ  Ｔ細胞療法、抗原訓練Ｔ細胞療法（ａｎｔｉｇｅｎ−ｔｒａｉｎｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ）、または富化抗原特異的Ｔ細胞療法から選択される細胞療法過程において、ヒト対象に投与される。
【００４３】
一部の実施形態では、本明細書に開示される免疫刺激性融合分子は、ナノ粒子、リポソーム、および／または生体分解性ポリマーをさらに含み得る。一部の実施形態では、ナノ粒子は、タンパク質ナノゲル、ヌクレオチドナノゲル、ポリマーナノ粒子、または固体ナノ粒子を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、タンパク質ナノゲルを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、必要に応じて、ナノ粒子表面上に、少なくとも１つのポリマー、カチオン性ポリマー、またはカチオン性ブロックコポリマーを含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、酸化還元（ジスルフィド）またはｐＨ（加水分解性基）または酵素（プロテアーゼ）に感受性である可逆性リンカーによって架橋された、ナノゲルを含む。
【００４４】
ある態様では、
（ａ）（ｉ）免疫刺激性サイトカイン分子、および
（ｉｉ）細胞表面抗原に対する親和性を有する免疫細胞標的化部分を含む、免疫刺激性融合分子と、
（ｂ）細胞表面抗原を発現するかまたはそれ以外の方法で提示する、標的免疫細胞であって、
免疫刺激性融合分子が、細胞表面抗原との相互作用を通じて、免疫細胞の表面に結合している、標的免疫細胞と、
（ｃ）ナノ粒子、ナノゲル、またはリポソームと
を含む、組成物が提供される。
【００４５】
別の態様では、
（ｉ）ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、またはＩＬ−２７を含め、これらのうちの１つまたは複数から選択されるサイトカイン分子と、
（ｉｉ）免疫細胞における免疫細胞表面受容体との親和性を有する、免疫細胞標的化部分であって、免疫細胞標的化部分が、免疫細胞表面受容体に結合する、抗体もしくはその抗原結合性断片、非抗体スキャフォールド、またはリガンドから選択され、免疫細胞表面受容体が、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１９７、ＣＤ３８、ＣＤ２７、ＣＤ１９６、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＤ８４、ＣＤ２２９、ＣＣＲ１、ＣＣＲ５、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＣＲ１０、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、またはＧＩＴＲのうちの１つまたは複数から選択される、免疫細胞標的化部分と
を含む免疫刺激性融合分子（ＩＦＭ）であって、
サイトカイン分子および免疫細胞標的化部分が、融合分子として一緒に作動可能に連結している、免疫刺激性融合分子が、提供される。
【００４６】
一部の実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−１２を含み得る。免疫細胞標的化部分は、ＣＤ４５に結合する抗体またはリガンドを含み得る。
【００４７】
別の態様では、
（ｉ）ＩＬ−１２および／もしくはＩＬ−１５、またはそのバリアント形態から選択される、サイトカイン分子と、
（ｉｉ）免疫細胞における免疫細胞表面受容体との親和性を有する、免疫細胞標的化部分であって、免疫細胞標的化部分が、免疫細胞表面受容体に結合する、抗体もしくはその抗原結合性断片、非抗体スキャフォールド、またはリガンドから選択され、免疫細胞表面受容体が、ＣＤ４５である、免疫細胞標的化部分と
を含む免疫刺激性融合分子（ＩＦＭ）であって、
サイトカイン分子および免疫細胞標的化部分が、融合分子として一緒に作動可能に連結している、免疫刺激性融合分子が、提供される。
【００４８】
一部の実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−１２および／またはＩＬ−１５である。免疫細胞標的化部分は、ＣＤ４５に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含み得る。
【００４９】
一部の実施形態では、免疫細胞は、健康なおよび／または非悪性の免疫細胞である。様々な実施形態では、ＩＦＭは、標的化部分およびサイトカイン分子を作動可能に連結させるためのリンカーをさらに含み得る。例えば、リンカーは、切断可能なリンカー、非切断性リンカー、ペプチドリンカー、可動性リンカー、剛性リンカー、ヘリカルリンカー、または非ヘリカルリンカー、好ましくは必要に応じてＧｌｙおよびＳｅｒを含むペプチドリンカーから選択され得、好ましくは、ペプチドリンカーは、（ＧＧＧＳ）Ｎまたは（ＧＧＧＧＳ）Ｎリンカーであり、Ｎは、モチーフの反復回数を示し、１〜１０から選択される整数である。
【００５０】
本明細書に開示されるＩＦＭと、薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤とを含む、医薬組成物もまた、本明細書において提供される。
【００５１】
別の態様は、健康なおよび／または非悪性の免疫細胞と、そこに結合したまたはそれを標的とする本明細書に開示されるＩＦＭとを含む、修飾された免疫細胞に関する。
【００５２】
さらなる態様は、修飾された免疫細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ調製の方法であって、
複数の健康なおよび／または非悪性の免疫細胞を提供するステップと、
本明細書に開示されるＩＦＭを、複数の健康なおよび／または非悪性の免疫細胞とともにインキュベートして、そこへのＩＦＭの標的化結合を可能にし、それによって、複数の修飾された免疫細胞を産生するステップと
を含む、方法に関する。
【００５３】
別の態様は、細胞療法を提供する方法であって、
複数の健康なおよび／または非悪性の免疫細胞を提供するステップと、
本明細書に開示されるＩＦＭを、複数の健康なおよび／または非悪性の免疫細胞とともにインキュベートして、そこへのＩＦＭの標的化結合を可能にし、それによって、複数の修飾された免疫細胞を産生するステップと、
複数の修飾された免疫細胞を、それを必要とする対象に投与するステップと
を含み、
好ましくは、細胞療法が、対象のプレコンディショニングの非存在下において投与され、前記プレコンディショニングが、ＣＰＸ（シクロホスファミド）または他のlymphodepletion  conditioning  chemotherapy（リンパ枯渇コンディショニング化学療法）を含む、方法に関する。
【００５４】
一部の実施形態では、細胞療法は、がん、好ましくは、固形腫瘍がんまたは血液がんを処置するために使用され得る。固形腫瘍がんは、卵巣がん、直腸がん、胃がん、精巣がん、肛門領域のがん、子宮がん、結腸がん、直腸がん、腎細胞癌、肝臓がん、肺の非小細胞癌、小腸のがん、食道のがん、黒色腫、カポジ肉腫、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚もしくは眼内の悪性黒色腫、子宮がん、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、類表皮がん、子宮頸部の癌、扁平上皮細胞がん、卵管の癌、子宮内膜の癌、膣の癌、軟組織の肉腫、尿道のがん、外陰部の癌、陰茎のがん、膀胱のがん、腎臓もしくは尿管のがん、腎盂の癌、脊髄軸腫瘍、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、前記がんの転移病変、またはこれらの組合せのうちの１つまたは複数であり得る。血液がんは、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ヘアリー細胞白血病、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、または大顆粒リンパ球性白血病）、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫または結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫）、菌状息肉症、非ホジキンリンパ腫（例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、またはマントル細胞リンパ腫）、またはＴ細胞非ホジキンリンパ腫（菌状息肉症、未分化大細胞型リンパ腫、または前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫））、中枢神経系原発リンパ腫、セザリー症候群、ワルデンストレームマクログロブリン血症）、慢性骨髄増殖性新生物、ランゲルハンス細胞組織球症、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、または骨髄異形成／骨髄増殖性新生物のうちの１つまたは複数であり得る。
【００５５】
様々な実施形態では、細胞療法は、養子細胞療法、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、操作ＴＣＲ  Ｔ細胞療法、腫瘍浸潤リンパ球療法、抗原訓練Ｔ細胞療法、富化抗原特異的Ｔ細胞療法、またはＮＫ細胞療法から選択され得る。ある特定の実施形態では、複数の健康なおよび／または非悪性の免疫細胞は、対象にとって自家である。
【００５６】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＩＦＭを含む粒子、例えば、ナノ粒子、例えば、タンパク質を含むナノ粒子（例えば、タンパク質ナノゲル）を提供する。一実施形態では、粒子は、同じＩＦＭを含む。他の実施形態では、粒子は、１つまたは複数の異なる種類のＩＦＭを含む。ナノ粒子および作製方法は、２０１７年６月１３日に出願されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３７２４９号において、例えば、５７〜７９ページに開示されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、そのようなナノ粒子は、例えば、米国公開第２０１７／００８０１０４号、米国特許第９，６０３，９４４号、米国公開第２０１４／００８１０１２号、およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３７２４９号に開示されるバックパック技術との併用で使用することができ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５７】
一部の実施形態では、免疫刺激部分は、サイトカイン分子、共刺激性分子のアゴニスト、または負の免疫調節因子の阻害剤、例えば、チェックポイントインヒビターの阻害剤から選択される。
【００５８】
一部の実施形態では、免疫刺激部分は、サイトカイン分子である。ある特定の実施形態では、サイトカイン分子は、サイトカインを含み、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、またはＩＬ−２７のうちの１つまたは複数から選択されるサイトカインを、それらのバリアント形態（例えば、サイトカイン誘導体、サイトカイン分子をポリペプチドとともに含む複合体、例えば、サイトカイン受容体複合体、およびそれらの他のアゴニスト形態）を含めて含む。一実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−１５分子である。
【００５９】
他の実施形態では、免疫刺激部分は、共刺激性分子、例えば、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、抗ＣＤ４０、またはＣＤ３から選択される共刺激性分子のアゴニストである。一部の実施形態では、免疫刺激性分子のアゴニストは、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３、またはＣＤ２８に対するアゴニスト抗体分子、またはそれらのアゴニストリガンドである。
【００６０】
なおも他の実施形態では、免疫刺激部分は、負の免疫調節因子の阻害剤、例えば、チェックポイントインヒビター、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、またはＣＴＬＡ−４から選択されるチェックポイントインヒビターの、阻害剤である。一部の実施形態では、負の免疫調節因子の阻害剤は、抗体分子またはリガンドである。例えば、チェックポイントインヒビターの阻害剤、例えば、抗体分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、またはＣＴＬＡ−４に結合し、かつ／またはそれを阻害する。
【００６１】
一部の実施形態では、免疫細胞標的化部分は、免疫細胞表面標的に結合し、それによって、免疫刺激部分を免疫細胞、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、リンパ球）へと標的化することができる。理論によって束縛されることを望むものではないが、免疫細胞標的化部分の、免疫細胞表面標的への結合は、免疫細胞の表面上における、免疫刺激部分、例えば、サイトカイン分子と、その対応する受容体、例えば、サイトカイン受容体との濃度、例えば、経時的な濃度を、例えば、遊離サイトカイン分子とそのサイトカイン受容体との会合と比べて、増加させると考えられている。一部の実施形態では、免疫細胞表面標的は、免疫細胞の表面上に豊富に存在する（例えば、免疫細胞表面上に存在するサイトカイン分子の受容体の数を数で勝る）。一部の実施形態では、免疫細胞標的化部分は、免疫細胞表面標的、例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ４５から選択される標的に結合する抗体分子またはリガンド分子から選択され得る。一実施形態では、免疫細胞標的化部分は、ＣＤ４５に結合する抗体分子またはリガンド分子を含む。他の実施形態では、免疫細胞標的化部分は、免疫チェックポイントインヒビター、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、またはＣＴＬＡ−４に結合する。免疫チェックポイントインヒビターが標的とされるいくつかの実施形態では、免疫細胞標的化部分は、免疫チェックポイントインヒビターに結合し得るか、またはそれに結合し、かつそれを阻害し得る。いくつかの実施形態では、標的化部分は、サイトカイン分子を、免疫細胞の表面に特異的に送達し、かつ／またはサイトカイン分子の濃度を増加させ、それによって、サイトカイン分子の増加した局在化、分布、および／または細胞表面利用可能性の増強のうちの１つまたは複数がもたらされると考えられている。いくつかの実施形態では、ＩＦＭは、サイトカイン分子のシグナル伝達機能を実質的に妨害しない。そのような標的化効果は、免疫細胞の増殖および活性化の限局性および長期の刺激をもたらし、したがって、免疫応答の制御された増大（expansion）および活性化を誘導する。
【００６２】
したがって、とりわけ、前述の部分を含むＩＦＭ、その医薬組成物、および製剤、例えば、ＩＦＭを含むナノ粒子（例えば、本明細書に記載されるタンパク質ナノゲル）、それをコードする核酸、前述の分子を産生する方法、ならびに前述のＩＦＭおよびその組成物を使用して、障害、例えば、がん、感染障害、または自己免疫障害を処置する方法が、本明細書において提供される。
【００６３】
したがって、一態様では、本開示は、免疫刺激部分（例えば、サイトカイン分子、共刺激性分子のアゴニスト、または負の免疫調節因子の阻害剤）と、免疫細胞標的化部分とを含む、免疫刺激性融合分子（ＩＦＭ）を提供する。
【００６４】
一部の実施形態では、免疫刺激部分、例えば、サイトカイン分子は、免疫細胞標的化部分に（例えば、直接的または間接的に、例えば、ペプチドリンカーを介して）、接続されている、例えば、共有結合により連結されている。一部の実施形態では、ＩＦＭの免疫細胞標的化部分は、免疫細胞、例えば、免疫エフェクター細胞における表面標的、例えば、表面受容体に結合する。いくつかの実施形態では、ＩＦＭは、免疫刺激部分、例えば、サイトカイン分子、および免疫細胞標的化部分を、免疫細胞、例えば、エフェクター免疫細胞に会合させる、例えば、一緒に連結させる。一部の実施形態では、ＩＦＭは、免疫細胞の表面上におけるＩＦＭのサイトカイン分子の濃度（例えば、ＩＦＭのサイトカイン分子の経時的な、例えば、指定された期間の濃度）を増加させる。いくつかの実施形態では、免疫細胞の表面上におけるＩＦＭのサイトカイン分子の濃度の増加は、次のうちの１つまたは複数をもたらす：（ｉ）ＩＦＭのサイトカイン分子の、免疫細胞表面への局在化（例えば、レベル）の、例えば、遊離サイトカイン分子と比べた増加、（ｉｉ）ＩＦＭのサイトカイン分子の細胞表面利用可能性（例えば、濃度（例えば、レベルまたは量）および／または曝露期間）の、遊離サイトカイン分子と比べた増強、（ｉｉｉ）標的とされる免疫細胞の集団、例えば、事前に選択された表面標的、例えば、本明細書に記載される表面標的を発現する細胞の集団における、サイトカインシグナル伝達の、例えば、遊離サイトカイン分子と比べた増加、（ｉｖ）標的とされる細胞集団におけるサイトカインシグナル伝達を、例えば、遊離サイトカイン分子と比べて、延長すること（例えば、サイトカインシグナル伝達の持続時間を少なくとも８時間、例えば、２４時間増加させること）、（ｖ）免疫刺激をもたらすこと、（ｖｉ）例えば、標的とされる免疫細胞の集団の、免疫細胞活性化および／もしくは増大を増加させること、または（ｖｉｉ）遊離サイトカイン分子と比較して、低下した副作用、例えば、低い全身毒性を示すこと。一部の実施形態では、ＩＦＭは、（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうちのいずれかを、遊離サイトカイン分子よりも高い程度に、例えば、少なくとも８時間、例えば、２４時間、変化させる、例えば、増加させる。一実施形態では、サイトカイン分子は、本明細書に記載されるＩＬ−１５分子であり、免疫細胞標的化部分は、抗ＣＤ４５抗体分子、例えば、本明細書に記載されるＣＤ４５に結合する抗体または抗体断片である。
【００６５】
関連する態様では、本開示は、免疫細胞標的化部分にカップリングした、例えば、融合された、サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５分子を含む、組成物、例えば、ＩＦＭを提供する。いくつかの実施形態では、免疫細胞標的化部分は、免疫細胞における標的または受容体に結合する。いくつかの実施形態では、免疫細胞標的化部分は、細胞、例えば、免疫細胞（例えば、免疫エフェクター細胞、例えば、リンパ球）上のＣＤ４５受容体に結合する、抗体分子、例えば、抗体または抗体断片、例えば、抗ＣＤ４５抗体分子（例えば、ＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ）を含むか、またはそれらである。いくつかの実施形態では、組成物、例えば、ＩＦＭは、サイトカイン分子および免疫細胞標的化部分を、免疫細胞、例えば、エフェクター免疫細胞に会合させる、例えば、一緒に連結させる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ４５抗体を細胞に結合させることで、ＩＬ−１５分子と細胞との会合が増加し、ＩＬ−１５シグナル伝達、免疫刺激のうちの１つまたは複数が、例えば、遊離ＩＬ−１５分子（組成物で見出されないＩＬ−１５分子）と比べて、経時的に、改善される。いくつかの実施形態では、シグナル伝達および／または免疫刺激は、ある期間、例えば、数分間、数時間、数日間にわたって、例えば、少なくとも８時間、例えば、２４時間、生じる。
【００６６】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＩＦＭを含む粒子、例えば、ナノ粒子、例えば、タンパク質を含むナノ粒子（例えば、本明細書に記載されるタンパク質ナノゲル）を提供する。一実施形態では、粒子は、同じＩＦＭを含む。他の実施形態では、粒子は、１つまたは複数の異なる種類のＩＦＭを含む。
【００６７】
本明細書に開示されるＩＦＭおよび／または粒子を含む、組成物、例えば、医薬組成物もまた、開示される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤をさらに含む。
【００６８】
なおも別の態様では、本開示は、本明細書に開示されるＩＦＭをコードするヌクレオチド配列を含むか、またはそれに実質的に同一である（例えば、それに少なくとも９５％同一である）ヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子、ならびに本明細書に開示される核酸分子を含むベクター、例えば、発現ベクター、および宿主細胞を提供する。
【００６９】
例えば、本明細書に開示されるＩＦＭを作製する、例えば、産生する方法もまた、開示される。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に開示される核酸分子を含む宿主細胞を、好適な成長条件下において培養するステップを含む。
【００７０】
なおも別の態様では、本開示は、対象、例えば、ヒトにおける障害または状態を処置する方法を提供する。方法は、処置を必要とする対象に、本明細書に記載される組成物、例えば、ＩＦＭまたは粒子を、障害または状態を処置するのに有効な量で投与するステップを含む。一部の実施形態では、障害は、がん、例えば、固形腫瘍または血液がんである。他の実施形態では、障害は、感染、例えば、ウイルス、細菌、または酵母感染である。なおも他の実施形態では、障害は、自己免疫障害である。本明細書に開示される組成物は、単独で使用することができるか、または限定されないが、細胞療法と組み合わせて、および化学療法もしくは放射線療法との組合せとして、使用することができる。一部の実施形態では、細胞療法は、養子細胞療法、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、操作ＴＣＲ  Ｔ細胞療法、腫瘍浸潤リンパ球療法、抗原訓練Ｔ細胞療法、または富化抗原特異的Ｔ細胞療法から選択される。
【００７１】
関連する態様では、本開示は、医薬において使用するための、例えば、対象、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）における障害または状態を処置するのに使用するための、本明細書に開示される組成物、例えば、ＩＦＭおよび／または粒子を提供する。代替として、対象、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）における障害または状態を処置するための医薬の製造における、組成物、例えば、ＩＦＭの使用が、開示される。一部の実施形態では、障害は、がん、例えば、固形腫瘍または血液がんである。他の実施形態では、障害は、感染、例えば、ウイルス（例えば、ＨＩＶ）、細菌、または酵母感染である。なおも他の実施形態では、障害は、自己免疫障害である。本明細書に開示される組成物は、単独で使用することができるか、または限定されないが、細胞療法と組み合わせて、および化学療法もしくは放射線療法との組合せとして、使用することができる。一部の実施形態では、細胞療法は、養子細胞療法、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、操作ＴＣＲ  Ｔ細胞療法、腫瘍浸潤リンパ球療法、抗原訓練Ｔ細胞療法、または富化抗原特異的Ｔ細胞療法から選択される。
【００７２】
別の態様では、本開示は、サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５分子を、対象、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）における免疫細胞に選択的に送達する方法を提供する。方法は、本明細書に記載されるＩＦＭを対象に投与するステップを含み、サイトカイン分子は、免疫細胞に選択的に送達される。
【００７３】
本明細書に開示される治療および送達の方法の実施形態では、本明細書における対象は、細胞に基づく療法、例えば、免疫細胞療法を必要としている。例えば、対象は、養子細胞療法、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、操作ＴＣＲ  Ｔ細胞療法、腫瘍浸潤リンパ球療法、抗原訓練Ｔ細胞療法、または富化抗原特異的Ｔ細胞療法から選択される、細胞療法を必要としている。一部の実施形態では、対象は、患者、例えば、ヒト患者である。一部の実施形態では、対象は、がん、糖尿病、自己免疫疾患、アレルギーもしくはアレルギー性状態、喘息、または心臓血管疾患から選択される疾患を有する。ある実施形態では、対象は、移植を必要としている。
【００７４】
本明細書に記載されるＩＦＭは、処置しようとする障害（例えば、がん）を罹患している対象に、例えば、静脈内または皮下投与によって、直接的に投与され得る。一部の実施形態では、ＩＦＭの免疫細胞標的化部分は、サイトカイン分子を、免疫細胞の表面に送達し、それによって、免疫細胞の表面におけるサイトカイン分子の濃度を増加させる。いくつかの実施形態では、ＩＦＭは、次のうちの１つまたは複数をもたらす：サイトカイン分子の分布を局在化させ、および／またはその細胞表面利用可能性を増強させ、それによって、免疫細胞を活性化および／または刺激すること。
【００７５】
他の実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかで、免疫細胞療法を活性化および／または刺激するために、免疫細胞療法と組み合わせて投与され得る。例えば、本明細書に記載されるＩＦＭは、処置しようとする障害（例えば、がん）を罹患している対象に、例えば、静脈内または皮下投与によって、細胞に基づく療法と共投与され得る。他の実施形態では、細胞療法は、投与の前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、本明細書に記載されるＩＦＭでパルスされる。一部の実施形態では、細胞療法は、養子細胞療法、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、操作ＴＣＲ  Ｔ細胞療法、腫瘍浸潤リンパ球療法、抗原訓練Ｔ細胞療法、または富化抗原特異的Ｔ細胞療法から選択される。
【００７６】
本明細書に開示されるＩＦＭ、組成物、ナノ粒子、方法、使用、核酸、ベクター、および宿主細胞のいずれかの追加の特性および実施形態には、以下のうちの１つまたは複数が含まれる。
【００７７】
一部の実施形態では、ＩＦＭは、二機能性または二特異性分子であり、例えば、これは、例えば、異なる機能および／または結合特異性を有する、少なくとも２つの異なる種類のメンバーを有する。例えば、ＩＦＭは、免疫刺激部分、例えば、サイトカイン分子と、免疫細胞標的化部分とを含むかまたはそれらからなり、免疫刺激部分および免疫細胞標的部分は、同じかまたは異なる細胞、例えば、１つまたは複数の免疫細胞における２つの異なる細胞表面標的または受容体に結合する。いくつかの実施形態では、免疫刺激部分および免疫細胞標的部分は、同じ免疫細胞、例えば、同じ免疫エフェクター細胞における２つの異なる標的に結合する。二機能性または二特異性分子は、追加の部分、例えば、さらなる結合性および／または機能性部分をさらに含んでもよい。例えば、ＩＦＭは、多機能性または多特異性分子であり得、例えば、これは、三機能性もしくは三特異性、または四機能性もしくは四特異性の融合分子である。
【００７８】
ある特定の実施形態では、ＩＦＭは、Ｎ末端からＣ末端の方向で、以下の式で表すことができ：Ｒ１−（必要に応じてＬ１）−Ｒ２またはＲ２−（必要に応じてＬ１）−Ｒ１、式中、Ｒ１は、免疫細胞標的化部分を含み、Ｌ１は、リンカー（例えば、本明細書に記載されるペプチドリンカー）を含み、Ｒ２は、免疫刺激部分、例えば、サイトカイン分子を含む。
【００７９】
一部の実施形態では、免疫刺激部分、例えば、サイトカイン分子は、免疫細胞標的化部分に、機能的に連結されている、例えば、共有結合により連結されている（例えば、化学的カップリング、遺伝子もしくはタンパク質融合、非共有結合的会合、またはその他の方法で）。例えば、免疫刺激部分は、免疫細胞標的化部分に、例えば、リンカーを介して、間接的に共有結合によりカップリングされていてもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカー、非切断性リンカー、ペプチドリンカー、可動性リンカー、剛性リンカー、ヘリカルリンカー、または非ヘリカルリンカーから選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。ペプチドリンカーは、５〜２０、８〜１８、１０〜１５、または約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５〜２０、２０〜２５、もしくは２５〜３０アミノ酸長であり得る。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、３０アミノ酸であるかまたはそれよりも長くてもよく、例えば、３０〜３５、３５〜４０、４０〜５０、５０〜６０アミノ酸長であってもよい。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒを含み、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ３−Ｓｅｒ）ｎまたは（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎを含むリンカーであり、式中、ｎは、モチーフの反復回数を示し、例えば、ｎ＝１、２、３、４、または５である（例えば、（Ｇｌｙ３−Ｓｅｒ）２、または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２、または（Ｇｌｙ３−Ｓｅｒ）３、または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカー）。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号３６、３７、３８、もしくは３９のアミノ酸配列、またはそれに実質的に同一である（例えば、１個、２個、３個、４個、もしくは５個のアミノ酸置換を有する）アミノ酸配列を含む。一実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３７）を含む。別の実施形態では、リンカーは、抗体ヒンジ領域に由来するアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧＭ、またはＩｇＧＡ抗体のヒンジ領域に由来するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＩｇＧヒンジ領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４ヒンジ領域に由来するアミノ酸を含む。例えば、リンカーは、ＩｇＧヒンジに由来するバリアントアミノ酸配列、例えば、１つまたは複数のシステインが、例えば、セリンで置き換えられたバリアントを含む。一部の実施形態では、リンカーは、一方または両方のシステインが、別のアミノ酸、例えば、セリンで置き換えられた、ＤＫＴＨＴＣＰＰＳＣＡＰＥ（配列番号１２６）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、アミノ酸ＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰ（配列番号３８）、ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰＥ（配列番号１２７）、またはそれらの誘導体を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＩｇＧ２ヒンジ領域に由来するアミノ酸、例えば、アミノ酸ＳＶＥＳＰＰＳＰ（配列番号１２８）、ＥＲＫＳＳＶＥＳＰＰＳＰ（配列番号１２９）、またはそれらの誘導体を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＩｇＧ４ヒンジ領域に由来するアミノ酸、例えば、アミノ酸ＰＰＳＰＳＳＰ（配列番号１３０）、ＥＳＫＹＧＰＰＳＰＳＳＰ（配列番号１３１）、またはそれらの誘導体を含む。
【００８０】
他の実施形
態では、リンカーは、非ペプチドの化学的リンカーである。例えば、免疫刺激部分は、架橋によって、免疫細胞標的化部分に共有結合によりカップリングされる（covalently  coupled）。好適な架橋剤としては、適切なスペーサーによって分離された２つの異なる反応基を有するヘテロ二官能性のもの（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、またはホモ二官能性のもの（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）が挙げられる。なおも他の実施形態では、免疫刺激部分は、リンカーなしで、免疫細胞標的化部分に直接的に共有結合によりカップリングされる。なおも他の実施形態では、ＩＦＭの免疫刺激部分および免疫細胞標的化部分は、共有結合により連結されず、例えば、非共有結合により会合される。
【００８１】
他の実施形態では、リンカーは、タンパク質またはその断片もしくは誘導体、例えば、ヒトアルブミンもしくはＦｃドメイン、またはその断片もしくは誘導体であってもよい。一部の実施形態では、免疫細胞標的化部分は、Ｎ末端に連結され、免疫刺激部分は、Ｃ末端に連結される。
【００８２】
他の実施形態では、リンカーは、免疫細胞標的化部分を、免疫刺激部分に、非共有結合により会合させる。例えば、リンカーは、二量体化ドメイン、例えば、コイルドコイルまたはロイシンジッパーを含む。
【００８３】
例えば、２つの他のタンパク質をつなぐＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ相互作用の高い親和性を使用した、他の非共有結合的相互作用に基づく融合体もまた、使用することができる。
免疫細胞
【００８４】
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、有核細胞、例えば、本明細書において以下に記載される有核細胞である。
【００８５】
一部の実施形態では、免疫細胞は、免疫エフェクター細胞の集団、例えば、次のうちの１つまたは複数から選択される免疫エフェクター細胞の集団である：Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、アルファＴ細胞、ベータＴ細胞、ガンマＴ細胞、およびデルタＴ細胞；Ｂ細胞；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞；ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞；または樹状細胞。いくつかの実施形態では、免疫細胞、例えば、免疫エフェクター細胞は、免疫細胞標的化部分に結合する細胞表面受容体を提示する。
【００８６】
より特定の実施形態では、免疫細胞、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、リンパ球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはナチュラルキラー細胞から選択される免疫細胞）、または造血幹細胞）。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、リンパ球を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｂ細胞を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、造血幹細胞を含む。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えば、がん抗原に結合するＣＡＲを含む、例えば、それを発現する、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）である。他の実施形態では、免疫細胞は、外因性高親和性Ｆｃ受容体を発現する。一部の実施形態では、免疫細胞は、操作されたＴ細胞受容体を含む、例えば、それを発現する。一部の実施形態では、免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球である。一部の実施形態では、免疫細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８  Ｔ細胞）である。一部の実施形態では、免疫細胞は、調節性Ｔ細胞（「Ｔｒｅｇ」）である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、患者、例えば、患者の血液から得られた、免疫細胞、例えば、ＮＫ細胞である。他の実施形態では、免疫細胞は、健康なドナーから得られた免疫細胞、例えば、ＮＫ細胞である。一部の実施形態では、ＮＫ細胞集団は、患者に注入する前に、Ｔ細胞、例えば、同種Ｔ細胞が精製されている、例えば、枯渇されている。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、胚性幹細胞および／またはｉＰＳＣ細胞に由来する免疫細胞、例えば、ＮＫ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞は、細胞系、例えば、安定または不死化細胞系（例えば、ＮＫ細胞不死化細胞系）である。一部の実施形態では、免疫細胞は、患者、例えば、血液がん、例えば、白血病またはリンパ腫を有する患者から得られる。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるKlingemann,  H.  ら  (2016)  Frontiers  in  Immunology  Vol.  7(Art.  91):  1-7に記載されるように、ＮＫ細胞系、例えば、ＮＫ−９２（例えば、ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−２４０７）、ＮＫ−ＹＳ、ＫＨＹＧ−１、ＮＫＬ、ＮＫＧ、ＳＮＫ−６、ＩＭＣ−１から選択される、ＮＫ細胞系である。一実施形態では、免疫細胞は、ＮＫ９２細胞系、例えば、高親和性Ｆｃ受容体を発現するバリアントＮＫ９２細胞、例えば、ＦｃガンマＲＩＩＩａを発現する細胞（例えば、１５８Ｖ）である。他の実施形態では、ＮＫ９２細胞系は、例えば、これもKlingemannら（上記）に記載されるように、がん抗原に結合するＣＡＲを含む。
サイトカイン分子
【００８８】
一部の実施形態では、ＩＦＭのサイトカイン分子としては、免疫調節性サイトカイン、例えば、炎症促進性サイトカインまたは抗炎症性サイトカインが挙げられる。一部の実施形態では、サイトカインは、サイトカインの一般的なγ鎖（γｃ）ファミリーのメンバーである。一部の実施形態では、サイトカイン分子は、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１、例えば、インターロイキン−１アルファ（ＩＬ−１α）もしくはインターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１β）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、インターロイキン−２３（ＩＬ−２３）、インターロイキン−２７（ＩＬ−２７）、インターロイキン−３５（ＩＬ−３５）、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＧＣＳＦに、それらのバリアント形態（例えば、サイトカイン誘導体、サイトカイン分子とポリペプチドとを含む複合体、例えば、サイトカイン受容体複合体、およびそれの他のアゴニスト形態）を含めたもののうちの１つまたは複数から選択される、サイトカインを含む。一部の実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、またはＩＬ−２７サイトカイン分子から選択される炎症促進性サイトカイン分子である。一部の実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−３５サイトカイン分子から選択される抗炎症性サイトカイン分子である。一部の実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、またはＩＬ−２７に、それらのバリアント形態（例えば、サイトカイン誘導体、サイトカイン分子とポリペプチドとを含む複合体、例えば、サイトカイン受容体複合体、およびそれの他のアゴニスト形態、例えば、非中和抗サイトカイン抗体分子）を含めたものから選択される。一部の実施形態では、サイトカイン分子は、例えば、本明細書に記載されるスーパーアゴニスト（ＳＡ）である。例えば、スーパーアゴニストは、天然に存在するサイトカインと比較して、例えば、少なくとも１０％、２０％、または３０％増加したサイトカイン活性を有し得る。一部の実施形態では、サイトカイン分子は、単量体または二量体である。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、受容体またはその断片、例えば、サイトカイン受容体ドメインをさらに含む。
【００８９】
一実施形態では、サイトカイン分子は、野生型サイトカイン、例えば、野生型、例えば、ヒトアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、サイトカイン分子は、野生型サイトカイン配列、例えば、ヒトサイトカイン配列に実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、サイトカイン分子は、野生型サイトカイン配列、例えば、ヒトサイトカイン配列と比べて、少なくとも９５％〜１００％同一であるか、あるいは少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、野生型サイトカイン配列、例えば、ヒトサイトカイン配列と比べて、５個以下、１０個以下、または１５個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
【００９０】
例示的なサイトカインアミノ酸配列は、本明細書に開示されており、例えば、ＩＬ−１５のアミノ酸は、例えば、配列番号１０および配列番号４０として提供されており、ＩＬ−７のアミノ酸は、例えば、配列番号４２および配列番号４３として提供されており、ＩＬ−２１のアミノ酸は、例えば、配列番号４４および配列番号４５として提供されており、ＩＬ−１２Ａのアミノ酸は、例えば、配列番号４６および配列番号４７として提供されており、ＩＬ−１２Ｂのアミノ酸は、例えば、配列番号４８および配列番号４９として提供されており、例示的なＩＬ−１２ＡおよびＩＬ−１２Ｂの融合体は、例えば、配列番号５０および配列番号５１として開示されている。本明細書に開示されるサイトカイン配列および実質的に同一である配列（例えば、少なくとも９０％、９５％、またはそれよりも高い配列同一性）のうちのいずれかを、本明細書に開示されるＩＦＭにおいて使用することができる。
【００９１】
一実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−１５分子である。一実施形態では、ＩＬ−１５分子（例えば、ＩＬ−１５ポリペプチド分子）は、野生型ＩＬ−１５アミノ酸配列、例えば、ヒトＩＬ−１５アミノ酸配列を含み、例えば、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−１５分子、例えば、ＩＬ−１５活性を保持するＩＬ−１５、例えば、ヒトＩＬ−１５の全長、断片、またはバリアントである。他の実施形態では、ＩＬ−１５分子は、例えば、ヒトＩＬ−１５アミノ酸配列に対して、１個または複数のアミノ酸変更、例えば、置換を有する、ヒトＩＬ−５のバリアントである。一部の実施形態では、ＩＬ−１５バリアントは、例えば、ＵＳ２０１６／０１８４３９９に記載されるように、４５位、５１位、５２位、または７２位における変異を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５バリアントは、Ｎ、Ｓ、またはＬからＤ、Ｅ、Ａ、Ｙ、またはＰのうちの１つへの置換を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、変異は、Ｌ４５Ｄ、Ｌ４５Ｅ、Ｓ５１Ｄ、Ｌ５２Ｄ、Ｎ７２Ｄ、Ｎ７２Ｅ、Ｎ７２Ａ、Ｎ７２Ｓ、Ｎ７２Ｙ、またはＮ７２Ｐから選択される（ヒトＩＬ−１５の配列、配列番号１１に関して）。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５分子は、ＩＬ−１５バリアント、例えば、１個または複数のアミノ酸置換を有するヒトＩＬ−１５ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５分子は、７２位において、置換、例えば、ＮからＤへの置換を含む。一実施形態では、ＩＬ−１５分子は、配列番号１１、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列の、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄポリペプチドであり、これは、ＩＬ−１５Ｒａ結合活性を有する。
【００９３】
他の実施形態では、ＩＬ−１５分子は、ＩＬ−１５（例えば、ＩＬ−１５野生型またはバリアント配列）と、ＩＬ−１５受容体のＩＬ−１５結合性断片、例えば、ＩＬ−１５受容体アルファまたはそのＩＬ−１５結合性断片との複合体を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５分子は、ＩＬ−１５とＩＬ−１５受容体断片、例えば、ＩＬ−１５受容体の細胞外ドメインまたはその断片との複合体を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５分子およびＩＬ−１５受容体のＩＬ−１５結合性断片は、共有結合により連結されず、例えば、非共有結合により会合される。
【００９４】
一実施形態では、ＩＬ−１５受容体断片は、配列番号９もしくは配列番号５２のアミノ酸配列、またはその断片、またはそれに実質的に同一である（例えば、それに少なくとも９５％同一であるか、あるいは配列番号９もしくは配列番号５２のアミノ酸配列、またはその断片に対して少なくとも１個、２個、３個、４個、５個のアミノ酸変更を有するが、１０個以下、１５個以下、２０個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有し、かつＩＬ−１５結合活性を有する、アミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００９５】
一部の実施形態では、ＩＬ−１５分子は、ＩＬ−１５と、ＩＬ−１５受容体断片、例えば、ｓｕｓｈｉドメイン（例えば、本明細書に記載される）との複合体を含む。一部の実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類に由来する。一実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは、ヒト配列、またはそれに実質的に同一である（例えば、それに少なくとも９５％同一である）ものを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１５受容体アルファの細胞外ドメインは、本明細書において「ｓｕｓｈｉドメイン」と称される、ＩＬ−１５に結合するドメインを含む。いくつかの実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは、本明細書において「最小ドメイン」（例えば、配列番号５２のアミノ酸配列を有する）と称される６２アミノ酸として、もしくは６５アミノ酸の拡張ドメイン（例えば、配列番号９のアミノ酸配列を有する）として提供されるか、または、アミノ酸３１〜１０７もしくは配列番号６３を含む、例えば、それからなる、７７アミノ酸のドメインを含む。
【００９６】
一部の実施形態では、ＩＬ−１５受容体断片は、野生型配列を有する。他の実施形態では、ＩＬ−１５受容体断片は、変異した配列、例えば、７７位における置換、例えば、Ｌ７７Ｉ置換（番号付けは、配列番号４の野生型ＩＬ−１５Ｒａを参照している）を有する。一部の実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号９、配列番号５２、配列番号６５、もしくは配列番号６６のアミノ酸配列、またはそれに実質的に同一である（例えば、それに少なくとも９５％同一であるか、または配列番号９、配列番号５２、配列番号６５、もしくは配列番号６６のアミノ酸配列に対して少なくとも１個、２個、３個、４個、５個のアミノ酸変更を有するが、１０個以下もしくは１５個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有し、かつＩＬ−１５結合活性を有する、アミノ酸配列を含む。
【００９７】
一部の実施形態では、ＩＬ−１５受容体アルファ細胞外ドメインは、配列番号６３の６２〜１７１アミノ酸、またはそれに実質的に同一である（例えば、それに少なくとも９５％同一である、それに対して９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性であるか、またはそれに対して最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、もしくは１５個の変更（例えば、置換）を有し、かつＩＬ−１５結合活性を有する）アミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５受容体アルファ細胞外ドメインは、配列番号６３の６５〜１７１アミノ酸、またはそれに実質的に同一である（例えば、それに少なくとも９５％同一である、それに対して９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性であるか、またはそれに対して最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、もしくは１５個の変更（例えば、置換）を有し、かつＩＬ−１５結合活性を有する）アミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５受容体アルファ細胞外ドメインは、配列番号６３の最大１７１アミノ酸、またはそれに実質的に同一である（例えば、それに少なくとも９５％同一である、それに対して９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性であるか、またはそれに対して最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、もしくは１５個の変更（例えば、置換）を有し、かつＩＬ−１５結合活性を有する）アミノ酸配列からなる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５受容体アルファ細胞外ドメインは、配列番号６３の６２〜１７１、６２〜１６０、６２〜１５０、６２〜１４０、６２〜１３０、６２〜１２０、６２〜１１０、６２〜１００、６２〜９０、６２〜８０、６２〜７０、６５〜１７１、６５〜１６０、６５〜１５０、６５〜１４０、６５〜１３０、６５〜１２０、６５〜１１０、６５〜１００、６５〜９０、６５〜８０、６５〜７０、もしくは６５〜７７アミノ酸、またはそれに対して少なくとも９５％の同一性、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を有するか、またはそれに対して最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、もしくは１５個の変更（例えば、置換）を有し、かつＩＬ−１５結合活性を有する、配列からなる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５受容体アルファ細胞外ドメインは、配列番号６３の６２〜１７１、６２〜１６０、６２〜１５０、６２〜１４０、６２〜１３０、６２〜１２０、６２〜１１０、６２〜１００、６２〜９０、６２〜８０、６２〜７０、６５〜１７１、６５〜１６０、６５〜１５０、６５〜１４０、６５〜１３０、６５〜１２０、６５〜１１０、６５〜１００、６５〜９０、６５〜８０、６５〜７０、または６５〜７７アミノ酸からなる。
【００９８】
一部の実施形態では、ＩＬ−１５分子を含有するＩＦＭは、ポリペプチド、例えば、サイトカイン受容体、例えば、サイトカイン受容体ドメイン、および第２の異種ドメインをさらに含み得る。一実施形態では、異種ドメインは、免疫グロブリンＦｃ領域である。他の実施形態では、異種ドメインは、抗体分子、例えば、Ｆａｂ断片、ＦＡＢ２断片、ｓｃＦｖ断片、またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えば、ｓｄＡｂ（ナノボディ）断片、重鎖抗体断片である。一部の実施形態では、ポリペプチドはまた、第３の異種ドメインも含む。一部の実施形態では、サイトカイン受容体ドメインは、第２のドメインのＮ末端にあり、他の実施形態では、サイトカイン受容体ドメインは、第２のドメインのＣ末端にある。
【００９９】
一部の実施形態では、サイトカイン分子は、サイトカインおよび抗サイトカイン抗体分子の複合体を含む。例えば、サイトカインは、ＩＬ−２であり得、抗サイトカイン抗体は、非中和抗ＩＬ−２抗体分子であり得る（例えば、Spangler,  J.B.,  ら  (2015)  www.dx.doi.org/10.1016/j.immuni.2015.04.015；Letourneau,  S.  ら  (2010)  PNAS  Vol  107(5):  2171-2176、Boyman,  O.  ら(2006)  Science  311,  1924）；およびSpangler,  J.B.  (2015)  Annu  Rev  Immunol  33:139-167を参照されたく、これらの内容は、参照により全体が組み込まれる）。
免疫細胞標的化部分
【０１００】
一部の実施形態では、ＩＦＭの免疫細胞標的化部分は、免疫細胞表面標的、例えば、免疫細胞表面受容体に選択的に結合する、抗体分子またはリガンドを含む。一部の実施形態では、免疫細胞表面標的または受容体は、以下の特性のうちの１つ、２つ、３つ、またはそれよりも多くを有し得る：（ｉ）免疫細胞の表面上に豊富に存在すること（例えば、免疫細胞表面上に存在するサイトカイン分子の受容体の数を数で勝る）、（ｉｉ）例えば、ＩＦＭのサイトカインによって活性化される受容体と比べて、緩徐な下方調節、内部移行、および／または細胞表面代謝回転を示すこと、（ｉｉｉ）例えば、ＩＦＭのサイトカインによって活性化される受容体と比べて、長い期間、免疫細胞の表面上に存在すること、または（ｉｖ）内部移行すると、実質的にリサイクルされて細胞表面に戻ること、例えば、免疫細胞表面標的のうちの少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれよりも多くが、リサイクルされて細胞表面に戻る。
【０１０１】
一部の実施形態では、ＩＦＭの免疫細胞標的化部分は、リサイクリング細胞表面受容体に結合する。理論によって束縛されるものではないが、リサイクリング細胞表面受容体への結合は、受容体およびＩＦＭの内部移行を媒介すると考えられている。例えば、受容体とともに内部移行されたＩＦＭは、初期エンドソーム内に隔離され、続いて、後続の分解（例えば、クラスリンに媒介されるエンドサイトーシスおよびクラスリン非依存的エンドサイトーシスのいずれかによる）へと進むのではなく、リサイクルされて細胞表面に戻り得る。ＩＦＭ／受容体が細胞表面に戻ることは、ＩＦＭのサイトカイン分子を細胞表面に回復させることによってサイトカインシグナル伝達を改善することができ、それによって、サイトカイン分子がそれ自体の細胞表面受容体に結合する時間および利用可能性を増加させることができる。加えて、表面膜において本開示の融合タンパク質の結合によって開始されるシグナル伝達事象は、エンドソーム区画から継続され得る。
【０１０２】
一部の実施形態では、免疫細胞表面標的または受容体は、免疫細胞の表面上に存在するが、がんまたは腫瘍細胞、例えば、固形腫瘍または血液がん細胞上には存在しない。一部の実施形態では、免疫細胞表面標的または受容体は、がんまたは腫瘍細胞上におけるその存在と比較して、免疫細胞の表面上に主に存在し、例えば、免疫細胞上では、がんまたは腫瘍細胞に対して、少なくとも５：１、１０：１、１５：１、２０：１の高い比で存在する。
【０１０３】
一部の実施形態では、ＩＦＭの免疫細胞標的化部分は、細胞（例えば、免疫細胞）、例えば、細胞の表面膜上に発現される受容体に結合し、さらに、この細胞はまた、サイトカイン受容体（例えば、ＩＦＭのサイトカイン分子に対する受容体）も発現する。
【０１０４】
一部の実施形態では、ＩＦＭの免疫細胞標的化部分は、免疫細胞表面標的、例えば、ＣＤ１６、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ５６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１９７、ＣＤ３８、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ５６、ＣＤ１９６、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＤ８４、ＣＤ２２９、ＣＣＲ１、ＣＣＲ５、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、またはＣＣＲ１０から選択される標的に結合する、抗体分子またはリガンド分子から選択され得る。一部の実施形態では、免疫細胞標的化部分は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ５６、またはＣＤ４５に結合する。他の実施形態では、免疫細胞表面標的は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ２２から選択される。一実施形態では、免疫細胞標的化部分は、ＣＤ４５（本明細書において、「ＣＤ４５受容体」または「ＣＤ４５Ｒ」とも互換可能に称される）に結合する抗体分子またはリガンド分子を含む。一部の実施形態では、標的は、ＣＤ４５（例えば、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、またはＣＤ４５ＲＯから選択されるＣＤ４５アイソフォーム）である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４５は、主として、Ｔ細胞上に発現される。例えば、ＣＤ４５ＲＡは、主として、ナイーブＴ細胞上に発現され、ＣＤ４５ＲＯは、主として、活性化Ｔ細胞およびメモリーＴ細胞上に発現される。
【０１０５】
一部の実施形態では、ＩＦＭの免疫細胞標的化部分（例えば、抗体分子）は、チェックポイントインヒビター、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、またはＣＴＬＡ−４に結合する。いくつかの実施形態では、チェックポイントインヒビターは、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞上に存在する。
【０１０６】
他の実施形態では、ＩＦＭの免疫細胞標的化部分は、免疫細胞標的または受容体に結合する、抗体分子（例えば、抗原結合性ドメイン）、受容体分子（例えば、受容体、受容体断片、またはその機能性バリアント）、またはリガンド分子（例えば、リガンド、リガンド断片、またはその機能性バリアント）、またはこれらの組合せを含む。
【０１０７】
一部の実施形態では、ＩＦＭの免疫細胞標的化部分の抗体分子は、免疫細胞標的または受容体に結合する、全長抗体（例えば、少なくとも１つ、好ましくは２つの、完全重鎖と、少なくとも１つ、好ましくは２つの完全軽鎖とを含む、抗体）、または抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ（ｄＡｂ）、二価抗体、または二特異性抗体もしくはその断片、それらの単一ドメインバリアント、またはラクダ抗体））を含む。
【０１０８】
抗体分子の重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４、またはそれらの断片から、より典型的には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４から、選択され得る。一部の実施形態では、重鎖のＦｃ領域は、以下のうちの１つまたは複数を増加または減少させるための、１個または複数の変更、例えば、置換を含み得る：Ｆｃ受容体結合、新生児型Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、補体機能、または抗体形成の安定化（例えば、ＩｇＧ４の安定化）。例えば、ＩｇＧ４、例えば、ヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域は、２２８位における置換（例えば、ＳｅｒからＰｒｏへの置換）を含み得る（例えば、Angal,  S,  King,  DJ,  ら  (1993)  Mol  Immunol  30:105-108（当初は、異なる番号付けシステムを使用して、Ｓ２４１Ｐと記載されていた）、Owens,  R,  Ball,  E,  ら  (1997)  Immunotechnology  3:107-116を参照されたい）。
【０１０９】
抗体分子の軽鎖定常領域は、カッパもしくはラムダの軽鎖定常領域またはその断片から選択され得る。
【０１１０】
ＩＦＭの免疫細胞標的化部分の抗体分子は、約１００ｎＭを下回る、５０ｎＭを下回る、２５ｎＭを下回る、１０ｎＭを下回る、例えば、１ｎＭを下回る（例えば、約１０〜１００ｐＭ）の解離定数で、標的抗原に結合することができる。いくつかの実施形態では、抗体分子は、抗原上の立体構造エピトープまたは線形エピトープに結合する。ある特定の実施形態では、免疫細胞標的化部分の抗体分子が結合する抗原は、免疫細胞の表面上に安定に発現される。いくつかの実施形態では、抗原は、細胞表面上のＩＦＭのサイトカイン分子の受容体と比べて、細胞表面上により豊富にある、細胞表面受容体である。
【０１１１】
一部の実施形態では、免疫細胞標的化部分は、免疫細胞表面標的またはリガンドに結合する、抗体分子（例えば、全長抗体（例えば、少なくとも１つ、好ましくは２つの、完全重鎖と、少なくとも１つ、好ましくは２つの完全軽鎖とを含む、抗体）、または抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ（ｄＡｂ）、二価抗体、または二特異性もしくは多特異性抗体またはその断片、それらの単一ドメインバリアント、またはラクダ抗体））、または非抗体スキャフォールド、またはリガンドから選択される。一部の実施形態では、免疫細胞標的化部分は、ＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１（例えば、ＣＤ１１ａ（インテグリンアルファ−Ｌ）、ＣＤ１１ｂ、またはＣＤ１１ｃ）、ＣＤ１８（インテグリンベータ−２）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、もしくはＣＤ２５、またはこれらの組合せに結合する抗体分子またはリガンド、例えば、前述の標的のうちの２つまたはそれよりも多くに結合する二特異性抗体である。
【０１１２】
一部の実施形態では、抗体分子（例えば、単一特異性または二特異性抗体）は、ＣＤ４５、ＣＤ８、ＣＤ１８、またはＣＤ１１ａのうちの１つまたは複数に結合し、例えば、それは、ＣＤ４５、ＣＤ８、ＣＤ１８、またはＣＤ１１ａに結合するＩｇＧ、例えば、ヒトＩｇＧ４または抗原結合性ドメイン、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖである。一部の実施形態では、抗体分子は、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体分子は、組換え抗体である。
【０１１３】
一部の実施形態では、抗ＣＤ４５抗体は、ヒト抗ＣＤ４５抗体、ヒト化抗ＣＤ４５抗体、またはキメラ抗ＣＤ４５抗体である。一部の実施形態では、抗ＣＤ４５抗体は、抗ＣＤ４５モノクローナル抗体である。例示的な抗ＣＤ４５抗体としては、抗体ＢＣ８、４Ｂ２、ＧＡＰ８．３、または９．４が挙げられる。他の免疫細胞表面標的に対する抗体、例えば、抗ＣＤ８抗体、例えば、ＯＫＴ８モノクローナル抗体、抗ＣＤ１８抗体、例えば、１Ｂ４モノクローナル抗体、および抗ＣＤ１１ａ抗体、例えば、ＭＨＭ２４抗体もまた、開示されている。
【０１１４】
本明細書に開示されるアミノ酸配列、またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列）を有する抗体分子、それをコードする核酸分子、核酸分子を含む宿主細胞およびベクターもまた、本開示により包含される。
【０１１５】
一実施形態では、ＣＤ４５に結合する抗体分子は、１つのＣＤ４５アイソフォームに特異的であるか、または１つを上回る（more  than  on）ＣＤ４５アイソフォームに結合し、例えば、パンＣＤ４５抗体である。一部の実施形態では、抗ＣＤ４５抗体分子は、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯに結合する。一実施形態では、抗ＣＤ４５抗体分子は、ＢＣ８抗体である。一部の実施形態では、ＢＣ８抗体は、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯに結合する。他の実施形態では、抗ＣＤ４５抗体分子は、ＣＤ４５ＲＯ特異的であるか、またはパンＣＤ４５抗体分子であり、例えば、これは、活性化Ｔ細胞およびメモリーＴ細胞に結合する。抗ＣＤ４５抗体分子のさらなる例としては、ＧＡＰ８．３、４Ｂ２、および９．４が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
一実施形態では、抗ＣＤ４５抗体分子は、ＢＣ８抗体、例えば、キメラまたはヒト化ＢＣ８抗体である。一部の実施形態では、キメラＢＣ８抗体は、
（ｉ）配列番号１、２、３、４、７、２１、もしくは２２に示されるアミノ酸配列の抗体部分、またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号１、２、３、４、７、２１、または２２の抗体部分に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）に対応する軽鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、カッパ軽鎖配列をさらに含む）、および／あるいは
（ｉｉ）それぞれ、配列番号５、６、もしくは８に示されるアミノ酸配列、またはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、それぞれ、配列番号５、６、または８に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）の重鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、ヒトＩｇＧ１重鎖配列またはＳ２２８Ｐ置換を有するヒトＩｇＧ４配列をさらに含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣ８抗体は、例えば、Ｋａｂａｔの定義による、ＢＣ８抗体の軽鎖可変領域および／もしくは重鎖可変領域の１つ、２つ、もしくは３つすべてのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３を含むか、または緊密に関連するＣＤＲ、例えば、配列番号１〜４、７、２１、もしくは２２、もしくは５〜６、もしくは８のＣＤＲ配列からの少なくとも１個のアミノ酸変更を有するが、２個以下、３個以下、もしくは４個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
【０１１７】
他の実施形態では、配列番号１〜４のアミノ酸、またはそれに実質的に同一であるアミノ酸（例えば、配列番号１〜４に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）（必要に応じて、カッパ軽鎖配列をさらに含む）は、必要に応じてリンカーを介して、本明細書に記載されるＩＬ−１５サイトカインまたは受容体、例えば、ｓｕｓｈｉドメイン（例えば、配列番号９またはそれに実質的に同一であるアミノ酸（例えば、配列番号９に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）を含む。一実施形態では、ＩＬ−１５サイトカインまたは受容体は、配列番号１〜４のＢＣ８抗体の軽鎖のＮ末端にカップリングされる。他の実施形態では、ＩＬ−１５サイトカインまたは受容体は、配列番号１〜４のＢＣ８抗体の軽鎖のＣ末端にカップリングされる。一実施形態では、リンカーは、配列番号３７または３８を含むか、またはそれからなる。
【０１１８】
他の実施形態では、配列番号２１もしくは２２のアミノ酸、またはそれに実質的に同一であるアミノ酸（例えば、配列番号２１または２２に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）（必要に応じて、カッパ軽鎖配列をさらに含む）は、必要に応じてリンカーを介して、本明細書に記載されるＩＬ−１５サイトカインまたは受容体、例えば、ｓｕｓｈｉドメイン（例えば、配列番号９またはそれに実質的に同一であるアミノ酸（例えば、配列番号９に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）を含む。一実施形態では、ＩＬ−１５サイトカインまたは受容体は、配列番号３７または３８のリンカーを介して、配列番号２１または２２のＢｃ８抗体の軽鎖のＮ末端にカップリングされる。他の実施形態では、ＩＬ−１５サイトカインまたは受容体は、配列番号３７または３８のリンカーを介して、配列番号２１または２２のＢｃ８抗体の軽鎖のＣ末端にカップリングされる。
【０１１９】
一部の実施形態では、配列番号６もしくは８のアミノ酸、またはそれに実質的に同一であるアミノ酸（例えば、配列番号６または８に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）は、重鎖定常領域を含む。一部の実施形態では、配列番号６もしくは８のアミノ酸、またはそれに実質的に同一であるアミノ酸（例えば、配列番号６または８に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）は、本明細書に記載されるＩＬ−１５サイトカインまたは受容体、例えば、ｓｕｓｈｉドメイン（例えば、配列番号９、またはそれに実質的に同一であるアミノ酸（例えば、配列番号９に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）を含む。一実施形態では、ＩＬ−１５サイトカインまたは受容体は、配列番号６または８のＢｃ８抗体の軽鎖のＮ末端にカップリングされる。他の実施形態では、ＩＬ−１５サイトカインまたは受容体は、配列番号６または８のＢｃ８抗体の軽鎖のＣ末端にカップリングされる。
【０１２０】
他の実施形態では、ヒト化ＢＣ８抗体は、
（ｉ）配列番号１９に示されるアミノ酸配列の抗体部分またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号１９の抗体部分に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）に対応する軽鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、カッパ軽鎖配列をさらに含む）、および／または
（ｉｉ）配列番号１８に示されるアミノ酸配列またはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号１８に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）の重鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、ヒトＩｇＧ１重鎖配列をさらに含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣ８抗体は、例えば、Ｋａｂａｔの定義による、ＢＣ８抗体の軽鎖可変領域および／もしくは重鎖可変領域の１つ、２つ、もしくは３つすべてのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３を含むか、または緊密に関連するＣＤＲ、例えば、配列番号１８もしくは１９のＣＤＲ配列からの少なくとも１個のアミノ酸変更を有するが、２個以下、３個以下、もしくは４個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
【０１２１】
一部の実施形態では、配列番号１９のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号１９に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）は、必要に応じてリンカー（例えば、配列番号３６〜３９のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号３６〜３９に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）を含むリンカーを介して、配列番号１９のＮ末端またはＣ末端にカップリングされた、ＩＬ−１５サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５サイトカインを含む。
【０１２２】
代替としてまたは組合せで、配列番号１８のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号１８に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）は、必要に応じてリンカー（例えば、配列番号３６〜３９のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号３６〜３９に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）を含むリンカーを介して、配列番号１８のＮ末端またはＣ末端にカップリングされた、ＩＬ−１５サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５サイトカインを含む。
【０１２３】
他の実施形態では、ＣＤ４５に結合する抗体分子は、９．４抗体、例えば、キメラまたはヒト化９．４抗体である。一部の実施形態では、キメラ９．４抗体は、
（ｉ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列の抗体部分またはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号１５の抗体部分に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）に対応する軽鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、カッパ軽鎖配列をさらに含む）、および／または
（ｉｉ）それぞれ、配列番号１４に示されるアミノ酸配列またはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、それぞれ、配列番号１４に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）の重鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、ヒトＩｇＧ１重鎖配列をさらに含む）を含む。いくつかの実施形態では、９．４抗体は、例えば、Ｋａｂａｔの定義による、９．４抗体の軽鎖可変領域および／もしくは重鎖可変領域の１つ、２つ、もしくは３つすべてのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３を含むか、または緊密に関連するＣＤＲ、例えば、配列番号１４もしくは１５のＣＤＲ配列からの少なくとも１個のアミノ酸変更を有するが、２個以下、３個以下、もしくは４個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
【０１２４】
一部の実施形態では、配列番号１５のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号１５に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）は、必要に応じてリンカー（例えば、配列番号３６〜３９のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号３６〜３９に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）を含むリンカーを介して、配列番号１５のＮ末端またはＣ末端にカップリングされた、ＩＬ−１５サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５サイトカインを含む。
【０１２５】
代替としてまたは組合せで、配列番号１４のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号１４に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）は、必要に応じてリンカー（例えば、配列番号３６〜３９のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号３６〜３９に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）を含むリンカーを介して、配列番号１４のＮ末端またはＣ末端にカップリングされた、ＩＬ−１５サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５サイトカインを含む。
【０１２６】
他の実施形態では、ＣＤ４５に結合する抗体分子は、４Ｂ２抗体、例えば、キメラまたはヒト化４Ｂ２抗体である。一部の実施形態では、キメラ４Ｂ２抗体は、
（ｉ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列の抗体部分、またはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号１７の抗体部分に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）に対応する軽鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、カッパ軽鎖配列をさらに含む）、および／または
（ｉｉ）それぞれ、配列番号１６に示されるアミノ酸配列またはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、それぞれ、配列番号１６に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）の重鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、ヒトＩｇＧ１重鎖配列をさらに含む）を含む。いくつかの実施形態では、４Ｂ２抗体は、例えば、Ｋａｂａｔの定義による、４Ｂ２抗体の軽鎖可変領域および／もしくは重鎖可変領域の１つ、２つ、もしくは３つすべてのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３を含むか、または緊密に関連するＣＤＲ、例えば、配列番号１６もしくは１７のＣＤＲ配列からの少なくとも１個のアミノ酸変更を有するが、２個以下、３個以下、もしくは４個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
【０１２７】
一部の実施形態では、配列番号１７のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号１７に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）は、必要に応じてリンカー（例えば、配列番号３６〜３９のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号３６〜３９に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）を含むリンカーを介して、配列番号１７のＮ末端またはＣ末端にカップリングされた、ＩＬ−１５サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５サイトカインを含む。
【０１２８】
代替としてまたは組合せで、配列番号１６のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号１６に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）は、必要に応じてリンカー（例えば、配列番号３６〜３９のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号３６〜３９に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）を含むリンカーを介して、配列番号１６のＮ末端またはＣ末端にカップリングされた、ＩＬ−１５サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５サイトカインを含む。
【０１２９】
別の実施形態では、ＣＤ８に結合する抗体分子は、ＯＫＴ８抗体、例えば、キメラまたはヒト化ＯＫＴ８抗体である。一部の実施形態では、キメラＯＫＴ８抗体は、
（ｉ）配列番号３１に示されるアミノ酸配列の抗体部分またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号３１の抗体部分に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）に対応する軽鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、カッパ軽鎖配列をさらに含む）、および／または
（ｉｉ）配列番号３０に示されるアミノ酸配列またはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号３０に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）の重鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、ヒトＩｇＧ１重鎖配列をさらに含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＯＫＴ８抗体は、例えば、Ｋａｂａｔの定義による、ＯＫＴ８抗体の軽鎖可変領域および／もしくは重鎖可変領域の１つ、２つ、もしくは３つすべてのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３を含むか、または緊密に関連するＣＤＲ、例えば、配列番号３０もしくは３１のＣＤＲ配列からの少なくとも１個のアミノ酸変更を有するが、２個以下、３個以下、もしくは４個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
【０１３０】
一部の実施形態では、配列番号３１のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号３１に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）は、必要に応じてリンカー（例えば、配列番号３６〜３９のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号３６〜３９に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）を含むリンカーを介して、配列番号３１のＮ末端またはＣ末端にカップリングされた、ＩＬ−１５サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５サイトカインを含む。
【０１３１】
代替としてまたは組合せで、配列番号３０のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号３０に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）は、必要に応じてリンカー（例えば、配列番号３６〜３９のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号３６〜３９に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）を含むリンカーを介して、配列番号３０のＮ末端またはＣ末端にカップリングされた、ＩＬ−１５サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５サイトカインを含む。
【０１３２】
別の実施形態では、ＣＤ１８に結合する抗体分子は、１Ｂ４抗体、例えば、キメラまたはヒト化１Ｂ４抗体である。一部の実施形態では、キメラ１Ｂ４抗体は、
（ｉ）配列番号２９に示されるアミノ酸配列の抗体部分またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号３１の抗体部分に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）に対応する軽鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、カッパ軽鎖配列をさらに含む）、および／または
（ｉｉ）配列番号２８に示されるアミノ酸配列またはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号２８に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）の重鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、ヒトＩｇＧ１重鎖配列をさらに含む）を含む。いくつかの実施形態では、１Ｂ４抗体は、例えば、Ｋａｂａｔの定義による、１Ｂ４抗体の軽鎖可変領域および／もしくは重鎖可変領域の１つ、２つ、もしくは３つすべてのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３を含むか、または緊密に関連するＣＤＲ、例えば、配列番号２８もしくは２９のＣＤＲ配列からの少なくとも１個のアミノ酸変更を有するが、２個以下、３個以下、もしくは４個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
【０１３３】
一部の実施形態では、配列番号２９のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号２９に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）は、必要に応じてリンカー（例えば、配列番号３６〜３９のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号３６〜３９に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）を含むリンカーを介して、配列番号２９のＮ末端またはＣ末端にカップリングされた、ＩＬ−１５サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５サイトカインを含む。
【０１３４】
代替としてまたは組合せで、配列番号２８のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号２８に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）は、必要に応じてリンカー（例えば、配列番号３６〜３９のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号３６〜３９に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）を含むリンカーを介して、配列番号２８のＮ末端またはＣ末端にカップリングされた、ＩＬ−１５サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５サイトカインを含む。
【０１３５】
なおも別の実施形態では、ＣＤ１１ａに結合する抗体分子は、ＭＨＭ２４抗体、例えば、キメラまたはヒト化ＭＨＭ２４抗体である。一部の実施形態では、キメラＭＨＭ２４抗体は、
（ｉ）配列番号２７に示されるアミノ酸配列の抗体部分またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号２７の抗体部分に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）に対応する軽鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、カッパ軽鎖配列をさらに含む）、および／または
（ｉｉ）配列番号２６に示されるアミノ酸配列またはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号２６に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）の重鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、ヒトＩｇＧ１重鎖配列をさらに含む）を含む。いくつかの実施形態では、ＭＨＭ２４抗体は、例えば、Ｋａｂａｔの定義による、ＭＨＭ２４抗体の軽鎖可変領域および／もしくは重鎖可変領域の１つ、２つ、もしくは３つすべてのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３を含むか、または緊密に関連するＣＤＲ、例えば、配列番号２６もしくは２７のＣＤＲ配列からの少なくとも１個のアミノ酸変更を有するが、２個以下、３個以下、もしくは４個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
【０１３６】
一部の実施形態では、配列番号２７のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号２７に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）は、必要に応じてリンカー（例えば、配列番号３６〜３９のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号３６〜３９に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）を含むリンカーを介して、配列番号２７のＮ末端またはＣ末端にカップリングされた、ＩＬ−１５サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５サイトカインを含む。
【０１３７】
代替としてまたは組合せで、配列番号２６のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号２６に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）は、必要に応じてリンカー（例えば、配列番号３６〜３９のアミノ酸配列またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号３６〜３９に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）を含むリンカーを介して、配列番号２６のＮ末端またはＣ末端にカップリングされた、ＩＬ−１５サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５サイトカインを含む。
例示的なＩＦＭ形式
【０１３８】
ＩＦＭの例示的な形式には、免疫細胞表面標的に結合する抗体分子（例えば、免疫グロブリン部分（Ｉｇ）、例えば、抗体（例えば、全長抗体、ＩｇＧ）または抗体断片（Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、半抗体、または単一ドメイン抗体など）にカップリングされた、サイトカイン分子（例えば、１つまたは複数のサイトカイン分子）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＩＦＭは、抗体分子のアミノ末端（Ｎ末端）またはカルボキシ末端（Ｃ末端）、典型的にはＣ末端への融合体を含む。サイトカイン分子は、必要に応じてリンカーを介して、抗体分子にカップリングされ得る。一部の実施形態では、サイトカインまたはサイトカイン受容体、例えば、受容体断片（例えば、ｓｕｓｈｉドメイン）は、抗体分子のＮ末端またはＣ末端にカップリングされる。いくつかの実施形態では、サイトカインまたはサイトカイン受容体、例えば、受容体断片（例えば、ｓｕｓｈｉドメイン）は、抗体分子（例えば、全長抗体またはその断片、例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、もしくは半抗体）の軽鎖のＮ末端またはＣ末端にカップリングされる。代替としてまたは組合せで、サイトカインまたはサイトカイン受容体、例えば、受容体断片（例えば、ｓｕｓｈｉドメイン）は、抗体分子（例えば、全長抗体またはその断片、例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、半抗体、もしくは単一ドメイン抗体（ＶＨ））の重鎖のＮ末端またはＣ末端にカップリングされる。形式（format）の例は、例えば、図１、図２Ａ、図３Ａ〜３Ｄ、図６Ａ、図１１Ａ、および図１２Ａに提供されている。
【０１３９】
一部の実施形態では、ＩＦＭは、軽鎖または重鎖のＮ末端領域またはＣ末端領域のいずれかで、サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−２７、またはサイトカイン受容体、例えば、ＩＬ−１５Ｒアルファｓｕｓｈｉドメインにカップリングされた、例えば、共有結合により連結された、抗免疫細胞標的化抗体分子、例えば、抗ＣＤ４５（例えば、ＢＣ８抗体）、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１８、または抗ＣＤ１１ａの軽鎖を含む（例えば、図１、図２Ａ、図３Ａ〜３Ｄ、図６Ａ、図１１Ａ、および図１２Ａに示されるように。任意の組合せの方向の軽鎖または重鎖−サイトカイン分子が、ＩＦＭに存在し得る。
【０１４０】
例えば、ＩＦＭは、軽鎖のＮ末端領域で、サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉドメインにカップリングされた、例えば、共有結合により連結された、全長抗体、または２つの同一な半抗体、例えば、それぞれが抗免疫細胞標的化抗体分子、例えば、抗ＣＤ４５（例えば、ＢＣ８抗体）、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１８、もしくは抗ＣＤ１１ａの軽鎖および重鎖を有する第１および第２の抗体の四量体を含み得る（例えば、図３Ａおよび図３Ｃに示されるように）。
【０１４１】
他の実施形態では、ＩＦＭは、軽鎖のＣ末端領域で、サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉドメインにカップリングされた、例えば、共有結合により連結された、全長抗体、または２つの同一な半抗体、例えば、それぞれが抗免疫細胞標的化抗体分子、例えば、抗ＣＤ４５（例えば、ＢＣ８抗体）、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１８、もしくは抗ＣＤ１１ａの軽鎖および重鎖を有する第１および第２の抗体の四量体を含み得る（例えば、図２Ａ、図３Ａ、図３Ｃ、および図６Ａに示されるように）。
【０１４２】
代替として、または前述の形式との組合せで、ＩＦＭは、重鎖のＣ末端領域で、サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉドメインにカップリングされた、例えば、共有結合により連結された、全長抗体、または２つの同一な半抗体、例えば、それぞれが抗免疫細胞標的化抗体分子、例えば、抗ＣＤ４５（例えば、ＢＣ８抗体）、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１８、もしくは抗ＣＤ１１ａの軽鎖および重鎖を有する第１および第２の抗体の四量体を含み得る（例えば、図６Ａに示されるように）。
【０１４３】
代替として、または前述の形式との組合せで、ＩＦＭは、重鎖のＮ末端領域で、サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉドメインにカップリングされた、例えば、共有結合により連結された、全長抗体、または２つの同一な半抗体、例えば、それぞれが抗免疫細胞標的化抗体分子、例えば、抗ＣＤ４５（例えば、ＢＣ８抗体）、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１８、もしくは抗ＣＤ１１ａの軽鎖および重鎖を有する第１および第２の抗体の四量体を含み得る。
【０１４４】
代替として、または前述の形式との組合せで、ＩＦＭは、重鎖可変ドメインのＮ末端領域またはＣ末端領域で、サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉドメインにカップリングされた、例えば、共有結合により連結された、抗免疫細胞標的化抗体分子、例えば、抗ＣＤ４５（例えば、ＢＣ８抗体）、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１８、または抗ＣＤ１１ａの軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを有する抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）を含み得る（例えば、図２Ａ、図３Ｂ、図３Ｄ、図１１Ａ、および図１２Ａに示されるように）。
【０１４５】
代替として、または前述の形式との組合せで、ＩＦＭは、軽鎖可変ドメインのＮ末端領域またはＣ末端領域で、サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉドメインにカップリングされた、例えば、共有結合により連結された、抗免疫細胞標的化抗体分子、例えば、抗ＣＤ４５（例えば、ＢＣ８抗体）、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１８、または抗ＣＤ１１ａの軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを有する抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）を含み得る。
【０１４６】
代替として、ＩＦＭは、２つの異なる半抗体、例えば、第１および第２の抗体の四量体を含み、第１の抗体は、軽鎖のＮ末端領域で、サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉドメインにカップリングされた、例えば、共有結合により連結された、抗免疫細胞標的化抗体分子、例えば、抗ＣＤ４５（例えば、ＢＣ８抗体）、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１８、または抗ＣＤ１１ａの軽鎖および重鎖（またはその断片、例えば、ｓｃＦｖもしくはＦａｂ）を有し、第２の抗体は、軽鎖または重鎖のＣ末端領域で、サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉドメインにカップリングされた、例えば、共有結合により連結された、抗免疫細胞標的化抗体分子、例えば、抗ＣＤ４５（例えば、ＢＣ８抗体）、抗ＣＤ８、抗ＣＤ１８、または抗ＣＤ１１ａの軽鎖および重鎖（またはその断片、例えば、ｓｃＦｖもしくはＦａｂ）を有する。同じかまたは異なる標的に対する抗体の任意のペアリング、例えば、ＣＤ４５：ＣＤ８、ＣＤ４５：ＣＤ１８、ＣＤ４５：ＣＤ１１ａ、ＣＤ８：ＣＤ１８、ＣＤ８：ＣＤ１１ａ、またはＣＤ１８：ＣＤ１１ａを使用することができる。
【０１４７】
他の実施形態では、ＩＦＭは、重鎖のＮ末端領域またはＣ末端領域のいずれかで、サイトカイン分子、例えば、ＩＬ−１５またはＩＬ−１５  ｓｕｓｈｉドメインにカップリングされた、例えば、共有結合により連結された、抗免疫細胞標的化抗体分子、例えば、抗ＣＤ４５（例えば、ＢＣ８抗体）または抗ＣＤ８の重鎖、および対応する軽鎖を含む（例えば、図６Ａに示されるように）。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、重鎖のＣ末端に、共有結合により連結される。
【０１４８】
他の実施形態では、ＩＦＭは、非サイトカイン免疫刺激性分子、例えば、免疫刺激性分子のアゴニストにカップリングされた、例えば、共有結合により連結された、抗免疫細胞標的化抗体分子、例えば、抗ＣＤ４５（例えば、ＢＣ８抗体）または抗ＣＤ８の重鎖を含む。一部の実施形態では、免疫刺激性分子は、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３、またはＣＤ２８のアゴニストである。一部の実施形態では、免疫刺激性分子のアゴニストは、抗体分子またはリガンドである。例えば、免疫刺激性分子のアゴニストは、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３、またはＣＤ２８に対するアゴニスト抗体分子である。一部の実施形態では、免疫刺激性分子は、重鎖および対応する軽鎖のＮ末端領域またはＣ末端領域のいずれかで、連結される。いくつかの実施形態では、免疫刺激性分子は、重鎖のＣ末端に、共有結合により連結される。
【０１４９】
なおも他の実施形態では、ＩＦＭは、負の免疫調節因子の阻害剤、例えば、チェックポイントインヒビターの阻害剤にカップリングされた、例えば、共有結合により連結された、抗免疫細胞標的化抗体分子、例えば、抗ＣＤ４５（例えば、ＢＣ８抗体）または抗ＣＤ８の重鎖を含む。一部の実施形態では、負の免疫調節因子の阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、またはＣＴＬＡ−４から選択される、チェックポイントインヒビターの阻害剤である。一部の実施形態では、免疫刺激性分子のアゴニストは、抗体分子またはリガンドである。例えば、チェックポイントインヒビターの阻害剤、例えば、抗体分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、またはＣＴＬＡ−４に結合し、かつ／またはそれを阻害する。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭ（ＬＣ−ｃｈＢＣ８−ｓｕｓｈｉ、ｓｕｓｈｉ−ＬＣ−ｃｈＢＣ８、ＬＣ−ｃｈＢＣ８−Ｌ１−ＩＬ１５、ＩＬ１５−ＬＣ−ｃｈＢＣ８、およびＨＣ−ｃｈＢＣ８−Ｆａｂ、ＨＣ−ｃｈＢＣ８−ＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ）は、
（ｉ）配列番号１、２、３、もしくは４から選択される軽鎖のアミノ酸配列、またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号１に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性のアミノ酸配列、あるいは配列番号１、２、３、または４と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＦＭは、配列番号１、２、３、または４と比べて、５個以下、１０個以下、または１５個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）、および
（ｉｉ）配列番号５もしくは６から選択される重鎖のアミノ酸配列、またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号５または６に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性のアミノ酸配列、あるいは配列番号５または６と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＦＭは、配列番号５または６と比べて、５個以下、１０個以下、または１５個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
【０１５１】
他の実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭ（例えば、ＨＣ−ｃｈＢＣ８−ＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ−ＩＬ１５およびＬＣ−ｃｈＢＣ８）は、
（ｉ）配列番号７に示される軽鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、ヒトカッパに由来する定常ドメイン配列をさらに含む）、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号７に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号７と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列、および
（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列、またはそれの実質的に同一なアミノ酸配列（例えば、配列番号８に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い同一性のアミノ酸配列、あるいは配列番号８と比べて、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＦＭは、配列番号７または８と比べて、５個以下、１０個以下、または１５個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
【０１５２】
なおも他の実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭ（例えば、ＨＣ−ｃｈ９．４−ＦａｂおよびＬＣ−ｃｈ９．４−ＩＬ１５）は、
（ｉ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号１５の抗体部分に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号１５と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列、および
（ｉｉ）それぞれ、配列番号１４に示されるアミノ酸配列、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、それぞれ、配列番号１４に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号１５と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＦＭは、配列番号１４または１５と比べて、５個以下、１０個以下、または１５個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
【０１５３】
なおも他の実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭ（例えば、ＨＣ−ｃｈ４Ｂ２−ＦａｂおよびＬＣ−ｃｈ４Ｂ２−ＩＬ１５）は、
（ｉ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号１６の抗体部分に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号１６と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列、および
（ｉｉ）それぞれ、配列番号１７に示されるアミノ酸配列、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、それぞれ、配列番号１７に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号１７と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＦＭは、配列番号１６または１７と比べて、５個以下、１０個以下、または１５個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
【０１５４】
他の実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭ（例えば、ＨＣ−ｈＢＣ８（２３）−ＦａｂおよびＬＣ−ｈＢＣ８（２３）−ＩＬ１５）は、
（ｉ）配列番号１８に示されるアミノ酸配列、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号１８の抗体部分に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号１８と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列、および
（ｉｉ）それぞれ、配列番号１９に示されるアミノ酸配列、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、それぞれ、配列番号１９に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号１９と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＦＭは、配列番号１８または１９と比べて、５個以下、１０個以下、または１５個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
【０１５５】
他の実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭ（例えば、ＨＣ−ｃｈＢＣ８−ＦａｂおよびＬＣ−ｃｈＢＣ８−Ｌ２−ＩＬ１５）は、
（ｉ）配列番号５に示されるアミノ酸配列、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号５の抗体部分に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号５と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列、および
（ｉｉ）それぞれ、配列番号２１に示されるアミノ酸配列、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、それぞれ、配列番号２１に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号２１と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＦＭは、配列番号２１または５と比べて、５個以下、１０個以下、または１５個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
【０１５６】
他の実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭ（例えば、ＨＣ−ｃｈＢＣ８−ＦａｂおよびＬＣ−ｃｈＢＣ８−Ｌ３−ＩＬ１５）は、
（ｉ）配列番号５に示されるアミノ酸配列、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号５の抗体部分に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号５と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列、および
（ｉｉ）それぞれ、配列番号２２に示されるアミノ酸配列、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、それぞれ、配列番号２２に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号２２と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＦＭは、配列番号２２または５と比べて、５個以下、１０個以下、または１５個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
【０１５７】
他の実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭ（例えば、ＨＣ−ｃｈＭＨＭ２４−ＦａｂおよびＬＣ−ｃｈＭＨＭ２４−ＩＬ１５）は、
（ｉ）配列番号２６に示されるアミノ酸配列、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号２６の抗体部分に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号２６と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列、および
（ｉｉ）それぞれ、配列番号２７に示されるアミノ酸配列、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、それぞれ、配列番号２７に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号２７と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＦＭは、配列番号２６または２７と比べて、５個以下、１０個以下、または１５個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
【０１５８】
他の実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭ（例えば、ＨＣ−ｃｈＭＨＭ２４−ＦａｂおよびＬＣ−ｃｈＭＨＭ２４−ｓｃＩＬ１２ｐ７０）は、
（ｉ）配列番号２６に示されるアミノ酸配列、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号２６の抗体部分に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号２６と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列、および
（ｉｉ）それぞれ、配列番号５０または５１に示されるアミノ酸配列、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、それぞれ、配列番号５０または５１に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号５０または５１と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＦＭは、配列番号５０または５１または２６と比べて、５個以下、１０個以下、または１５個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
【０１５９】
他の実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭ（例えば、ＨＣ−ｃｈＭＨＭ２４−ＦａｂおよびＬＣ−ｃｈＭＨＭ２４−ＩＬ７）は、
（ｉ）配列番号２６に示されるアミノ酸配列、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号２６の抗体部分に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号２６と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列、および
（ｉｉ）それぞれ、配列番号４２または４３に示されるアミノ酸配列、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、それぞれ、配列番号４２または４３に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号４２または４３と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＦＭは、配列番号４２または４３または２６と比べて、５個以下、１０個以下、または１５個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
【０１６０】
他の実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭ（例えば、ＨＣ−ｃｈＭＨＭ２４−ＦａｂおよびＬＣ−ＭＨＭ２４−ＩＬ１５）は、
（ｉ）配列番号２６に示されるアミノ酸配列、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号２６の抗体部分に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号２６と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列、および
（ｉｉ）それぞれ、配列番号２７に示されるアミノ酸配列、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、それぞれ、配列番号２７に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号２７と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＦＭは、配列番号２７または２６と比べて、５個以下、１０個以下、または１５個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
【０１６１】
他の実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭ（例えば、ＨＣ−ｃｈ１Ｂ４−ＦａｂおよびＬＣ−ｃｈ１Ｂ４−ＩＬ１５）は、
（ｉ）配列番号２８に示されるアミノ酸配列、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号２８の抗体部分に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号２８と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列、および
（ｉｉ）それぞれ、配列番号２９に示されるアミノ酸配列、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、それぞれ、配列番号２９に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号２９と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＦＭは、配列番号２８または２９と比べて、５個以下、１０個以下、または１５個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
【０１６２】
他の実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭ（例えば、ＨＣ−ｃｈＯＫＴ８−ＦａｂおよびＬＣ−ｃｈＯＫＴ８−ＩＬ１５）は、
（ｉ）配列番号３０に示されるアミノ酸配列、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号３０の抗体部分に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号３０と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列、および
（ｉｉ）それぞれ、配列番号３１に示されるアミノ酸配列、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、それぞれ、配列番号３１に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号３１と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＦＭは、配列番号３０または３１と比べて、５個以下、１０個以下、または１５個以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
【０１６３】
他の実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭ（例えば、ＢＣ８ｓｃＦｖ−ＩＬ１５）は、配列番号３２に示されるアミノ酸配列、あるいはそれに実質的に同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号３２の抗体部分に少なくとも８５％、９０％、９５％、またはそれを上回って同一であるアミノ酸配列）、あるいは配列番号３２と比べて少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個、またはそれを上回るアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１６４】
他の実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭ（例えば、四価ＣＤ１３７アゴニスト）は、抗ＣＤ１３７アゴニスト一本鎖可変断片抗体のＣ末端に共有結合により融合された、抗ＣＤ４５ヒト化ＩｇＧ４（例えば、ヒト化ＢＣ８）を含み得る。一部の実施形態では、ＩＦＭは、ＩｇＧ４のＣ末端に、追加の抗ＣＤ１３７  ｓｃＦｖをさらに含み、例えば、それによって、ＣＤ４５に関して二価であり、ＣＤ１３７に関して四価である、分子が得られる。他の実施形態では、ＩＦＭは、ｓｃＦｖ抗ＣＤ１３７アゴニストがＩｇＧのＣ末端にのみ融合した、上で明記された通りの抗ＣＤ４５  ＩｇＧ４も含み得、それによって、ＣＤ４５に関して二価であり、ＣＤ１３７に関して二価である、分子が得られる。
【０１６５】
他の実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭ（例えば、二価ＣＤ１３７アゴニスト）は、Ｆａｂの重鎖および軽鎖のＣ末端を介して抗ＣＤ１３７アゴニスト一本鎖可変断片抗体のＮ末端に共有結合により融合された、抗ＣＤ４５ヒト化ＩｇＧ１  Ｆａｂ（例えば、ヒト化ＢＣ８）を含み得、それによって、ＣＤ４５に関して一価であり、ＣＤ１３７に関して二価である、分子が得られる。
【０１６６】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＩＦＭを含む、ポリマースキャフォールド、例えば、ポリマーヒドロゲル、例えば、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、例えば、ＩＦＭを含むヒドロゲルを提供する。ポリマーはまた、ポリペプチド、キトサン、ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、またはブロックコポリマーであり得る。一部の実施形態では、ポリマースキャフォールドは、複数の異なるポリペプチドまたはポリマーを含む。一実施形態では、ポリマースキャフォールドは、１つのＩＦＭを含む。他の実施形態では、ポリマースキャフォールドは、１つまたは複数の異なるＩＦＭを含む。一部の実施形態では、ポリマースキャフォールドは、生体分解性である。いくつかの実施形態では、ポリマースキャフォールドは、受動的拡散を通じて、および／またはポリマースキャフォールドの分解を通じて、時間とともに、ＩＦＭを放出し得る。
【０１６７】
一部の実施形態では、ポリマースキャフォールドは、少なくとも部分的に、化学的架橋によって、例えば、限定されないが、本明細書に開示されるリンカーを使用して、形成される。ポリマーは、ポリマー鎖間で共有結合架橋剤または非共有結合による相互作用（例えば、Ｈ結合、静電相互作用、またはファンデルワールス相互作用）を使用して架橋したポリマーネットワークを含み得る。一部の実施形態では、架橋剤は、例えば、限定されないが、変更された酸化還元状態または変更された環境ｐＨによって、例えば、ジスルフィド結合または酸不安定性エステル基を含めることによって、可逆性である。他の酸不安定性リンカーは、例えば、シス−アコニット酸リンカー、アセタール、ケタール、活性化アミド、例えば、２，３ジメチルマレアミド酸、ビニルエーテル、他の活性化エーテルおよびエステル、例えば、エノールまたはシリルエーテルまたはエステル、イミン、イミニウム、エナミン、カルバメート、ヒドラゾン、ならびに当該技術分野において公知の他の結合（linkage）であり得る。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＩＦＭを含むポリマースキャフォールドは、それを必要とする対象に投与される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＩＦＭを含むポリマースキャフォールドは、局所的に（例えば、腫瘍内に）投与される。いくつかの実施形態では、ポリマースキャフォールドは、体内に注射するかまたは埋め込むと、例えば、１０００ｃＰまたはそれを上回る粘度の増加により固化する、液体である。
【０１６９】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるＩＦＭを含む粒子、例えば、ナノ粒子、例えば、タンパク質を含むナノ粒子（例えば、本明細書に記載されるタンパク質ナノゲル）を提供する。一実施形態では、粒子は、同じＩＦＭを含む。他の実施形態では、粒子は、１つまたは複数の異なる種類のＩＦＭを含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本明細書における組成物は、粒子、例えば、ナノ粒子もしくはマイクロ粒子、またはナノ粒子およびマイクロ粒子の両方を含む。いくつかの実施形態では、粒子、例えば、ナノ粒子は、３０ｎｍ〜１２００ｎｍの間、４０ｎｍ〜１，１００ｎｍの間、５０ｎｍ〜１，０００ｎｍの間、例えば、５０〜５００ｎｍの間、より典型的には７０〜４００ｎｍの間の平均流体力学的直径（例えば、動的光散乱法によって測定される）を有する。
【０１７１】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、リポソーム、タンパク質ナノゲル、ヌクレオチドナノゲル、ポリマーナノ粒子、または固体ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態では、粒子は、必要に応じて、粒子表面上に、少なくとも１つのポリマー、カチオン性ポリマー、またはカチオン性ブロックコポリマーを含む。他の実施形態では、ナノ粒子は、酸化還元（ジスルフィド）またはｐＨ（加水分解性基）または酵素（プロテアーゼ）に感受性である可逆性リンカーによって架橋された、ナノゲルを含む。
【０１７２】
一部の実施形態では、本明細書に開示される１つまたは複数のＩＦＭは、本明細書に提供されるように、互いに架橋していてもよい。他の実施形態では、１つまたは複数のＩＦＭは、タンパク質−親水性ポリマーコンジュゲート（例えば、ＰＥＧで可逆的に修飾されている）、タンパク質−疎水性ポリマーコンジュゲート（例えば、可逆的に修飾されたＰＬＡまたはＰＬＧＡ）、バルク架橋タンパク質ヒドロゲル、架橋タンパク質ナノゲル粒子、異なるシェル材料（例えば、脂質、ポリマー、またはシリカ）を用いたタンパク質ナノカプセル、タンパク質コンジュゲートナノ粒子（例えば、ミセル、ポリマーナノ粒子、無機ナノ粒子）、およびリポソームを含むがこれらに限定されない、様々なナノ構造に形成することができるか、または自己アセンブリし得る。同様に、本明細書に提供されるように、互いに架橋したタンパク質は、一部の実施形態では、タンパク質ナノ構造に形成することができるか、または自己アセンブリし得る。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、必要に応じて、ＩＦＭは、例えば、必要に応じて分解性リンカー（例えば、ジスルフィドリンカー）を介して、ナノ粒子のタンパク質−親水性ポリマーに共有結合によりカップリングされ、例えば、架橋され、生物学的に活性なままである、例えば、その機能を維持する。したがって、本明細書に開示される組成物および方法は、細胞療法、例えば、免疫療法にとって重要な利益を提供することができる。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、ＩＦＭを含む粒子は、有核細胞、例えば、免疫細胞をさらに含む（本明細書において、「有核細胞−ナノ粒子複合体」とも称される）。
【０１７５】
したがって、本開示は、ＩＦＭおよび粒子、例えば、ナノ粒子を含む、組成物を提供する。一部の態様では、本開示は、有核細胞と、本明細書に記載される少なくとも１つのＩＦＭおよび／または粒子とを含む、組成物を提供する。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、粒子は、有核細胞への静電引力によって、細胞表面と会合している。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、少なくとも１つのリガンドを含み、リガンドは、有核細胞の表面上のタンパク質、炭水化物、または脂質に対する親和性を有する。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、粒子は、例えば、有核細胞、例えば免疫細胞の表面に、共有結合によりコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、有核細胞に共有結合によりコンジュゲートされていない。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、粒子は、１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを上回る）治療用タンパク質、例えば、サイトカイン分子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−４、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−５、ＩＦＮガンマ、ＴＮＦアルファ（ＴＮＦａ）、ＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、またはＧＣＳＦに、それらのバリアント形態、例えば、変異体；サイトカイン分子とポリペプチドとを含む複合体、例えば、サイトカイン受容体複合体；それらの融合体またはアゴニスト形態を含めたもの）；成長因子；および他の分子、例えば、例としてＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、抗ＣＤ４０、またはＣＤ３から選択される、共刺激性分子に対する抗体分子またはアゴニストリガンドから選択される、１つまたは複数の追加の治療用タンパク質をさらに含み得る。
【０１７９】
他の態様では、本開示は、前述の粒子を作製する方法を提供する。
【０１８０】
本開示の他の特性、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【０１８１】
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似であるかまたはそれと同等である方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が、以下に記載されている。本明細書に記載されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。加えて、材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】図１は、細胞表面標的化および刺激のためのサイトカインおよび免疫グロブリン部分を併せ持つ、本開示の例示的融合タンパク質を表す。
【０１８３】
【図２−１】図２Ａ〜２Ｃは、様々な抗体形式を含むＩＦＭを表す。図２Ａは、様々な抗体形式を含むＩＬ−１５  ＩＦＭの概略図を表す。図２Ｂおよび２Ｃは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅ（図２Ｂ）またはフローサイトメトリーカウントビーズ（図２Ｃ）を使用するパルスアッセイにおけるＣＤ８  Ｔ細胞増大に関するＩＦＭの評価を表す。
【図２−２】同上。
【図２−３】同上。
【０１８４】
【図３−１】図３Ａ〜３Ｄは、ＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ複合体と抗ＣＤ４５抗体間の様々な融合戦略の概略図を表す。図３Ａおよび３Ｂは、ｃｈＢＣ８  ＩｇＧ（図３Ａ）またはｃｈＢＣ８  Ｆａｂ（図３Ｂ）軽鎖のＮ末端またはＣ末端へのＩＬ−１５の融合についての概略図を表す。抗体融合体は、ＩＬ−１５との高親和性相互作用によるＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉとの複合体を含む。図３Ｃおよび３Ｄは、ｃｈＢＣ８  ＩｇＧ（図３Ｃ）またはｃｈＢＣ８Ｆａｂ（図３Ｄ）軽鎖のＮ末端またはＣ末端へのＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉの融合についての概略図を表す。抗体融合体は、ＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉとの高親和性相互作用によるＩＬ−１５Ｎ７２Ｄとの複合体を含む。
【図３−２】同上。
【図３−３】同上。
【図３−４】同上。
【０１８５】
【図４−１】図４Ａ〜４Ｂは、様々な融合戦略を含むＩＦＭの、ＣＤ８  Ｔ細胞増大に対する効果を表す。（図４Ａおよび４Ｂ）ＩＬ−１５Ｎ７２ＤとｃｈＢＣ８  Ｆａｂ（図４Ａ）またはｃｈＢＣ８  ＩｇＧ（図４Ｂ）とを含むＩＦＭをパルスバイオアッセイでＴ細胞増大について評価した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅを使用してＣＤ８  Ｔ細胞増殖を分析した；ＩＬ１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉＬ７７Ｉ−Ｆｃおよび非刺激Ｔ細胞（陰性対照）を比較のために含めた。
【図４−２】同上。
【０１８６】
【図５−１】図５Ａ〜５Ｄは、野生型または変異ＩＬ−１５を含むＩＦＭの生物活性、およびＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ複合体の抗ＣＤ４５抗体との様々な融合戦略を表す。図５Ａおよび５Ｂは、ＩＦＭとのパルスインキュベーションの３日後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅを使用してパルスアッセイでＣＤ８  Ｔ細胞増大について評価した、野生型ＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｎ７２ＤとｃｈＢＣ８  Ｆａｂ（図５Ａ）またはｃｈＢＣ８  ＩｇＧ（図５Ｂ）とを含むＩＦＭを表す。図５Ｃおよび５Ｄは、ＩＦＭとの３日間のインキュベーション後にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅを使用する一定の曝露、例えば静的、アッセイ形式での、ＣＤ８  Ｔ細胞増大に関するｃｈＢＣ８  Ｆａｂ（図５Ｃ）またはｃｈＢＣ８  ＩｇＧ（図５Ｄ）を含むＩＦＭの評価を表す。
【図５−２】同上。
【図５−３】同上。
【図５−４】同上。
【０１８７】
【図６−１】図６Ａ〜６Ｂは、ｃｈＢＣ８  ＩｇＧ軽鎖または重鎖へのＣ末端融合を含む、ＩＦＭを表す。図６Ａは、ｃｈＢＣ８  ＩｇＧ軽鎖または重鎖のＣ末端に融合されたＩＬ−１５、およびＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ間の非共有結合性複合体を含む、ＩＦＭの概略図を表す。図６Ｂは、パルスバイオアッセイにおけるＣＤ８  Ｔ細胞増大に対するＩＦＭの効果を表す。
【図６−２】同上。
【０１８８】
【図７−１】図７Ａ〜７Ｃは、ＩＦＭが、活性向上のために抗体断片の機能的結合を必要とすることを表す。図７Ａおよび７Ｂは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅを使用してパルスアッセイでＣＤ８  Ｔ細胞の増大について評価した、可溶性ＢＣ８  ＩｇＧ競合因子の存在または非存在下でのｃｈＢＣ８  Ｆａｂ（図７Ａ）またはｃｈＢＣ８  ＩｇＧ（図７Ｂ）を含むＩＬ−１５  ＩＦＭを表す。図７Ｃは、ヒト化ＢＣ８  Ｆａｂ断片を含む、またはＣＤ４５への結合を除去する変異ＣＤＲ−Ｈ３を含有するヒト化ＢＣ８  Ｆａｂ断片を含む、ＩＬ−１５  ＩＦＭのＣＤ８  Ｔ細胞増大についてのパルスバイオアッセイでの評価を表す。
【図７−２】同上。
【図７−３】同上。
【０１８９】
【図８−１】図８Ａ〜８Ｃは、ＩＦＭの細胞表面負荷および残留性を表す。図８Ａは、蛍光標識抗ＩＬ１５または抗ＩｇＧ抗体での染色により検出された、ＩＦＭのパルス後のＭＦＩを示す、フローサイトメトリーヒストグラムを表す。図８Ｂは、ＩＬ−１５の細胞表面染色の持続を経時的に表す。図８Ｃは、フローサイトメトリーカウントビーズを使用して測定された細胞密度を経時的に表す。
【図８−２】同上。
【図８−３】同上。
【０１９０】
【図９−１】図９Ａ〜９Ｂは、ＩＬ−１５とｃｈＢＣ８間に様々なリンカー組成を含むＩＦＭの評価を表す。図９Ａは、ｃｈＢＣ８  Ｆａｂ軽鎖のＣ末端へのＩＬ−１５の融合のための３つの異なるリンカーのアミノ酸配列を表す。図９Ｂは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅを使用するパルスバイオアッセイでの、異なるリンカー組成を含むＦＭのＣＤ８  Ｔ細胞増大についての評価を表す。
【図９−２】同上。
【０１９１】
【図１０−１】図１０Ａ〜１０Ｂは、代替ＣＤ４５抗体クローンを含むＩＦＭの評価を表す。図１０Ａは、Ｔ細胞上に発現されたＣＤ４５に対する様々なＣＤ４５抗体クローンの結合親和性を表す。図１０Ｂは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅを使用するパルスバイオアッセイでの、異なる抗ＣＤ４５抗体クローンを含むＩＬ−１５  ＩＦＭの評価を表す。
【図１０−２】同上。
【０１９２】
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｂは、ＣＤ８、ＣＤ１１ａまたはＣＤ１８を標的とする抗体を含むＩＦＭを表す。図１１Ａは、代替細胞表面受容体を標的とするＦａｂ抗体断片の軽鎖Ｃ末端へのＩＬ−１５の融合を含む、ＩＬ−１５  ＩＦＭの概略図を表し、ＩＦＭは、ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ間の非共有結合性会合を含む。図１１Ｂは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅを使用するパルスバイオアッセイでの、ＩＬ−１５  ＩＦＭのＣＤ８  Ｔ細胞増大についての評価を表す。
【図１１−２】同上。
【０１９３】
【図１２−１】図１２Ａ〜１２Ｂは、ＣＤ４  Ｔ細胞またはＣＤ８  Ｔ細胞に対する、抗ＣＤ８を含むＩＦＭの効力の評価を表す。図１２Ａは、抗ＣＤ８  Ｆａｂ軽鎖のＣ末端へのＩＬ−１５の融合、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉとの非共有結合性会合を含む、ＩＬ−１５  ＩＦＭの概略図を表す。図１２Ｂは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅを使用するパルスバイオアッセイでの、精製ＣＤ４  Ｔ細胞またはＣＤ８  Ｔ細胞に対する抗ＣＤ８  ＩＦＭの効力の評価を表す。ＣＤ４  Ｔ細胞またはＣＤ８  Ｔ細胞は、磁気ビーズ選別を使用して（ＣＤ４  Ｔ細胞とＣＤ８  Ｔ細胞の混合物を天然に含む）全Ｔ細胞から精製した。
【図１２−２】同上。
【０１９４】
【図１３−１】図１３Ａ〜１３Ｃは、ＩＬ−１５  ＩＦＭを含むナノ粒子がＴ細胞増大を支持することを示すグラフを表す。図１３Ａおよび１３Ｂは、サイズ排除クロマトグラフィーにより分析したタンパク質ナノゲルへのＩＦＭの架橋を表し（図１３Ａ）、ＩＬ１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉＬ７７Ｉ−Ｆｃを含むタンパク質ナノゲルが比較として示されている（図１３Ｂ）。ＩＬ−１５  ＩＦＭまたはＩＬ１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉＬ７７Ｉ−Ｆｃを含むバックパックを、パルスバイオアッセイでＣＤ８  Ｔ細胞増大について評価した（図１３Ｃ）。フローサイトメトリーカウントビーズを使用して細胞密度を分析した。データが増大倍率として表されている。
【図１３−２】同上。
【図１３−３】同上。
【０１９５】
【図１４−１】図１４Ａ〜１４Ｂは、プライミングがＡＣＴ有効性を向上させることができることを示す。
【図１４−２】同上。
【０１９６】
【図１５】図１５は、プラットフォームの多用途性を例証する、免疫標的とする（immunotargeted）表面受容体およびサイトカインの例を示す。
【０１９７】
【図１６−１】図１６Ａ〜１６Ｅは、ＩＬ−１５テザー融合体（tethered  fusion）が、固形腫瘍モデルにおける腫瘍特異的Ｔ細胞療法を向上させることを示す。
【図１６−２】同上。
【図１６−３】同上。
【図１６−４】同上。
【図１６−５】同上。
【０１９８】
【図１７−１】図１７Ａ〜１７Ｇは、テザー融合プラットフォームが、ＣＤ８標的化ＩＦＭとのパルスインキュベーションにより活性化全ＣＤ３ヒトＴ細胞の培養物におけるＣＤ８  Ｔ細胞の選択的細胞標的化および増大向上を可能にすることを示す。
【図１７−２】同上。
【図１７−３】同上。
【図１７−４】同上。
【図１７−５】同上。
【図１７−６】同上。
【図１７−７】同上。
【０１９９】
【図１８−１】図１８Ａ〜１８Ｅは、様々な変異型のＩＬ−１５の細胞活性、およびＩＬ−１５変異体を含むＩＦＭの表面残留性を示す。
【図１８−２】同上。
【図１８−３】同上。
【図１８−４】同上。
【図１８−５】同上。
【図１８−６】同上。
【図１８−７】同上。
【０２００】
【図１９−１】図１９Ａ〜１９Ｃは、野生型または変異ＩＬ−１５を含む、ＣＤ８標的化ＩＦＭによる、選択的細胞標的化およびＣＤ８  Ｔ細胞増大を示す。
【図１９−２】同上。
【図１９−３】同上。
【０２０１】
【図２０−１】図２０は、野生型または変異ＩＬ−１５を含む、ＣＤ４５標的化ＩＦＭの細胞残留性を示す。
【図２０−２】同上。
【０２０２】
【図２１】図２１は、ＩＬ−１５テザー融合体が、ＩＬ−１５受容体の下流の持続的シグナル伝達を支持することを示す。
【０２０３】
【図２２−１】図２２Ａ〜２２Ｄは、抗ＣＤ４５抗体およびＩＬ−１２（「抗ＣＤ４５−ＩＬ１２−ＴＦ」または「αＣＤ４５−ＩＬ１２−ＴＦ」または「ＩＬ１２−ＴＦ」とも呼ばれる）を含む４つの例示的構築物を図示する。
【図２２−２】同上。
【０２０４】
【図２３】図２３は、抗ＣＤ４５−ＩＬ１２−ＴＦが、ＩＬ−１２の強い細胞負荷、および強い表面残留性を支持することを示す。
【０２０５】
【図２４】図２４は、ＩＬ−１２テザー融合体が、持続的ＳＴＡＴ４リン酸化を誘導すること、およびＳＴＡＴ４リン酸化が、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５テザー融合体での組合せ処置によって増強されることを示す。
【０２０６】
【図２５】図２５は、ＩＬ−１５  ＩＦＭとＩＬ−２１  ＩＦＭとの組合せの表面負荷および残留性残留性（persistence  persistence）を示す。
【０２０７】
【図２６】図２６は、ＣＤ４５標的化ＩＬ−１５  ＩＦＭとＣＤ８標的化ＩＬ−２１  ＩＦＭとの組合せの表面負荷を示す。
【０２０８】
【図２７−１】図２７Ａ〜２７Ｂは、ＩＬ−１５  ＩＦＭとＩＬ−２１  ＩＦＭとの組合せからのＳＴＡＴ５リン酸化を示す。
【図２７−２】同上。
【０２０９】
【図２８】図２８は、ＩＬ−１２  ＩＦＭとＩＬ−１５  ＩＦＭとの組合せからの表面負荷を示す。
【０２１０】
【図２９】図２９は、ＩＬ−１２  ＩＦＭとＩＬ−１５  ＩＦＭとの組合せからのＳＴＡＴ４リン酸化を示す。
【０２１１】
【図３０−１】図３０は、ＣＤ４５テザーＩＬ−１５−Ｄ６１Ｈ  ＩＦＭとＣＤ１８テザー野生型ＩＬ−１５  ＩＦＭとの組合せによるＴ細胞増大を示す。
【図３０−２】同上。
【０２１２】
【図３１−１】図３１は、ＣＤ４５、ＣＤ１１ａまたはＣＤ１８を標的とする様々なヒト化抗体を使用するＩＬ−１２またはＩＬ−１５の表面負荷を示す。
【図３１−２】同上。
【０２１３】
【図３２】図３２は、マウスＴ細胞テザーＩＬ−１２の表面残留性を示す。
【０２１４】
【図３３−１】図３３は、マウスＴ細胞テザーＩＬ−１２の定量を示す。
【図３３−２】同上。
【図３３−３】同上。
【０２１５】
【図３４−１】図３４Ａ〜３４Ｂは、テザー融合体が、標的細胞にシスで、トランスで、および転送によりシグナル伝達することができることを表す概略図を示し、ならびにＩＬ−１２テザー融合体による負荷（「シス」）非負荷（「トランス」および「転送された」）標的細胞におけるＳＴＡＴ４リン酸化の活性化を示す。
【図３４−２】同上。
【０２１６】
【図３５−１】図３５Ａは、腫瘍成長、マウス体重変化、生存（ＡＣＴ後１００日目まで）を示す。
【図３５−２】同上。
【図３５−３】同上。
【０２１７】
【図３５−４】図３５Ｂは、サロゲートＩＬ１２−ＴＦリード候補を有するＰｍｅｌ細胞が、移入および内在性免疫細胞の一過性リンパ球減少を誘導することを示す。
【図３５−５】同上。
【図３５−６】同上。
【０２１８】
【図３５−７】図３５Ｃ〜３５Ｄは、循環内在性ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖を（ＫＩ６７陽性によって）示す。
【図３５−８】同上。
【０２１９】
【図３５−９】図３５Ｅは、内在性ＮＫ細胞の増殖を（Ｋｉ６７陽性によって）および活性化を（ＣＤ６９陽性によって）示す。
【図３５−１０】同上。
【０２２０】
【図３６−１】図３６は、ＩＬ１２−ＴＦが、養子移入Ｔ細胞に前負荷された場合または溶解させて（solubly）共投与された場合のどちらかの場合に、腫瘍特異的Ｔ細胞療法を増強することを示す。
【図３６−２】同上。
【０２２１】
【図３７−１】図３７Ａは、ＩＬ１２−ＴＦを有する腫瘍特異的Ｔ細胞の単一または複数用量後の腫瘍成長曲線を示す。
【０２２２】
【図３７−２】図３７Ｂは、ＩＬ１２−ＴＦを有する腫瘍特異的Ｔ細胞の単一または複数用量からの生存率を示す。
【０２２３】
【図３７−３】図３７Ｃは、ＩＬ１２−ＴＦが、腫瘍特異的Ｔ細胞増大および生着をｉｎ  ｖｉｖｏで増進することを示す。
【０２２４】
【図３７−４】図３７Ｄは、ＩＬ１２−ＴＦを有する腫瘍特異的Ｔ細胞の１または２用量での処置後の体重変化を示す。
【０２２５】
【図３８】図３８は、２つのＩＬ１２−ＴＦの一方を有するＰｍｅｌでのＡＣＴ後のＩＦＮ−γ血漿レベルを示す。
【０２２６】
【図３９】図３９は、２つのＩＬ１２−ＴＦの一方を有するＰｍｅｌでのＡＣＴ後のＣＸＣＬ１０血漿レベルを示す。
【０２２７】
【図４０−１】図４０Ａ〜４０Ｄは、野生型または変異ＩＬ−１５を含む、ＣＤ８標的化ＩＦＭのｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＤ８  Ｔ細胞への特異的結合、ならびにＣＤ８標的化ＩＦＭの循環ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞およびＮＫ細胞に対する活性を示す。
【図４０−２】同上。
【図４０−３】同上。
【図４０−４】同上。
【０２２８】
【図４１−１】図４１Ａ〜４１Ｃは、野生型または変異ＩＬ−１５バリアントを含む、ＣＤ８標的化ＩＦＭの安全性と比較した、漸増用量（increasing  dose）または投薬スケジュール後のＩＬ−１５の毒性を示す。＊は、２回目の投薬後を示す。
【図４１−２】同上。
【図４１−３】同上。
【図４１−４】同上。
【図４１−５】同上。
【図４１−６】同上。
【図４１−７】同上。
【０２２９】
【図４２−１】図４２Ａ〜４２Ｂは、ＩＬ−１２、ＣＤ８標的化ＩＬ−１２  ＩＦＭ、または２つの異なるＣＤ４５標的化ＩＬ−１２  ＩＦＭでの用量漸増（dose  escalation）からの、抗腫瘍有効性および体重変化を示す。
【図４２−２】同上。
【図４２−３】同上。
【図４２−４】同上。
【図４２−５】同上。
【図４２−６】同上。
【図４２−７】同上。
【図４２−８】同上。
【発明を実施するための形態】
【０２３０】
本開示は、とりわけ、免疫刺激性融合分子（ＩＦＭ）またはテザー融合体（ＴＦ）の組成物、ならびに関連するその作製および使用の方法を提供する。本明細書に記載される「ＩＦＭ」または「ＴＦ」は、免疫刺激部分、例えば、サイトカイン分子（例えば、生物学的に活性なサイトカイン）と、免疫細胞、例えば、免疫エフェクター細胞に結合することができる免疫細胞標的化部分、例えば、抗体分子（例えば、抗体または抗体断片）とを含む。いくつかの実施形態では、免疫刺激部分および免疫細胞標的化部分は、機能的に連結されている（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合、またはその他の方法によって）。一部の実施形態では、免疫細胞標的化部分は、免疫細胞表面標的に結合し、それによって、免疫刺激部分、例えば、サイトカイン分子を免疫細胞、例えば、免疫エフェクター細胞（例えば、リンパ球）へと標的化することができる。
【０２３１】
一部の実施形態では、テザー融合体は、免疫細胞に、テザー融合体をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトすることによって得ることができる。これは、少なくともいくつかの理由のため、有利であり得る。第１に、これにより、免疫細胞にローディングする前にテザー融合体を発現させる追加のステップが省略される。第２に、トランスフェクトした免疫細胞は、細胞療法として患者に投与されると、ポリヌクレオチドからテザー融合体を継続的に発現することができ、それによって、テザー融合体のレベルのより長い持続をもたらすことができる。第３に、トランスフェクトした免疫細胞は、テザー融合体を分泌することができ、これが、ひいては、トランスフェクトした免疫細胞自体に結合（自己分泌シグナル伝達）、および／または隣接する免疫細胞に結合（パラ分泌シグナル伝達）して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて自己分泌およびパラ分泌の二重活性を達成することができる。
【０２３２】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、免疫細胞標的化部分ありまたはなしで、サイトカイン分子を発現および分泌するように設計することができる。サイトカイン分子の分泌のためのシグナルペプチドを選択し、ポリヌクレオチド上に操作することができ、いくつかの好適なシグナルペプチドが、当該技術分野において十分に説明されている（例えば、Sternら,  Improving  mammalian  cell  factories:  The  selection  of  signal  peptide  has  a  major  impact  on  recombinant  protein  synthesis  and  secretion  in  mammalian  cells.  Trends  Cell  Mol  Biol.  2007;2:1-7を参照されたく、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２３３】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、サイトカインを発現するための配列（例えば、遺伝子）を含み得る、プラスミド、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡを含む。好適なプラスミドとしては、遺伝子を免疫細胞に移入するために使用することができる標準的なプラスミドベクターおよびミニサークルプラスミドが挙げられる。ポリヌクレオチド（例えば、プラスミドまたはミニサークルプラスミド）は、遺伝子材料（例えば、抗原に対する受容体をコードする配列）を、免疫細胞に移入させること、および／または免疫細胞において遺伝子材料を発現させることを容易にするための任意の追加の配列情報をさらに含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、プロモーター、例えば、汎用プロモーター、組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーター、および／または核もしくは細胞質に特異的なプロモーターを含み得る。一部の実施形態では、細胞特異的プロモーターは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６、ＮＫ１．１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、またはＣＤ１１ｃの生来のプロモーターから選択される。プロモーターは、構成的プロモーターであってもよく、または誘導性（正または負の）プロモーターであってもよい。一部の実施形態では、プロモーターは、テザー融合体の発現をＴ細胞活性化と結びつけるための、Ｔ細胞活性化と関連するプロモーターであってもよい。一部の実施形態では、プロモーターは、ＰＤ−１、ＣＤ２５、ＣＤ１３７、ＣＤ６９、ＣＤ４５ＲＯの生来のプロモーター、またはＴ細胞活性化により上方調節される他の遺伝子のプロモーターから選択される。他の実施形態では、プロモーターは、ＣＤ２７、ＣＤ６２Ｌ、またはＣＣＲ７のプロモーターから選択される。他の実施形態では、プロモーターは、負の調節性シグナルをテザー融合体の発現へと変換するために、Ｔ細胞の負の共刺激と関連していてもよい。プロモーターおよびプラスミド（例えば、ミニサークルプラスミド）は、一般に、当該技術分野において周知であり、従来的な技法を使用して調製することができる。
【０２３４】
様々な実施形態では、ポリヌクレオチドを使用して、免疫細胞をトランスフェクトすることができる。別途示されない限り、トランスフェクトする、トランスフェクトされた、またはトランスフェクトすることという用語を使用して、免疫細胞、例えば、リンパ球における外因性ポリヌクレオチドまたはそれから発現されたポリペプチドの存在を示し得る。当該技術分野において公知のように、いくつかの方法およびベクターが、ポリヌクレオチドのリンパ球への移入を媒介することができる。例としては、ウイルスベクター（例えば、Zhangら  MicroRNA-31  negatively  regulates  peripherally  derived  regulatory  T-cell  generation  by  repressing  retinoic  acid-inducible  protein  3.  Nat.  Commun.  6,  7639  (2015)；Cribbsら,  Simplified  production  and  concentration  of  lentiviral  vectors  to  achieve  high  transduction  in  primary  human  T  cells.  BMC  Biotechnol.  13,  98  (2013)を参照されたい）、電気穿孔（例えば、Van  Driesscheら,  Messenger  RNA  electroporation:  an  efficient  tool  in  immunotherapy  and  stem  cell  research.  FOLIA  HISTOCHEMICA  ET  CYTOBIOLOGICA  Vol.  43,  No.  4,  2005,  pp.  213-216を参照されたい）、ならびにナノ粒子（例えば、Moffettら  Hit-and-run  programming  of  therapeutic  cytoreagents  using  mRNA  nanocarriers.  NATURE  COMMUNICATIONS.  8:  389  (2017)；米国公開第２０１７０２９６６７６号および同第２０１８００３０１５３号を参照されたい）の使用が挙げられる。
【０２３５】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、合成、例えば、当該技術分野において公知の方法を使用して設計され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成され得る、合成ｍＲＮＡであり得る。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡ配列は、特定の必要性に適合させ、安定性および翻訳効率を改善することができる。これは、ｍＲＮＡにおけるシス作用構造エレメントによって制御または最適化することができ、５’−キャップ（例えば、メチル化ｍ７ＧｐｐｐＮキャップ）、ポリ（Ａ）テール（既定の長さであり、３’末端「マスキング」配列がない可能性がある）、非翻訳領域、およびコーディング領域の配列は、細胞バックグラウンドおよび安定性の増加、例えば、細胞におけるより長い半減期に関して、最適化することができる（例えば、Kuhnら  mRNA  as  a  versatile  tool  for  exogenous  protein  expression.  Curr  Gene  Ther,  12  (2012),  pp.  347-361；Petschら  Protective  efficacy  of  in  vitro  synthesized,  specific  mRNA  vaccines  against  influenza  A  virus  infection.  Nat  Biotechnol,  30  (2012),  pp.  1210-1216；Dikenら  Antitumor  vaccination  with  synthetic  mRNA:  strategies  for  itro  and  ivo  preclinical  studies.  Methods  Mol  Biol,  969  (2013),  pp.  235-246；およびGrudzien-Nogalskaら  Synthetic  mRNAs  with  superior  translation  and  stability  properties.  Methods  Mol  Biol,  969  (2013),  pp.  55-72を参照されたい）。一部の実施形態では、ヌクレオチド修飾が、ｍＲＮＡに挿入されてもよい（Warrenら  Highly  efficient  reprogramming  to  pluripotency  and  directed  differentiation  of  human  cells  with  synthetic  modified  mRNA.  Cell  Stem  Cell,  7  (2010),  pp.  618-630を参照されたい）。
【０２３６】
様々な実施形態では、ｍＲＮＡは、例えば、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼを使用して、ｃＤＮＡ鋳型、例えば、プラスミドＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって合成することができる。設計、合成、精製、安定化、および送達の追加の態様は、Tolmachovら  (November  26th  2015)  Methods  of  Transfection  with  Messenger  RNA  Gene  Vectors,  Gene  Therapy  Doaa  Hashad,  IntechOpen,  DOI:  10.5772/61688；Van  der  Jeughtら  (2015)  Intratumoral  delivery  of  mRNA:  Overcoming  obstacles  for  effective  immunotherapy,  OncoImmunology,  4:5,  e1005504,  DOI:  10.1080/2162402X.2015.1005504；Schlakeら  (2012)  Developing  mRNA-vaccine  technologies,  RNA  Biology,  9:11,  1319-1330,  DOI:  10.4161/rna.22269；およびQuabiusら  Synthetic  mRNAs  for  manipulating  cellular  phenotypes:  an  overview.  New  Biotechnology  Volume  32,  Issue  1,  25  January  2015,  Pages  229-235において見出すことができ、これらはすべてが参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３７】
理論によって束縛されることを望むものではないが、免疫細胞標的化部分の、免疫細胞表面標的への結合は、免疫細胞におけるその対応する受容体、例えば、サイトカイン受容体とともに、免疫刺激部分、例えば、サイトカイン分子の表面における濃度、例えば経時的な濃度を、例えば、遊離サイトカイン分子とそのサイトカイン受容体との会合と比べて、増加させると考えられている。これは、ＩＦＭが結合した免疫細胞自体に対する免疫効果（自己分泌シグナル伝達）、および／またはまたは（and/or  or）別の（例えば、隣接する）免疫細胞に対する免疫効果（パラ分泌シグナル伝達）をもたらし得る。有利なことには、他の治療薬、例えば、可溶性サイトカイン、武装化（ａｒｍｏｒｅｄ）ＣＡＲ−Ｔ（サイトカインを有する）、およびナノゲルバックパック（免疫細胞上）と比較して、本開示のテザー融合体は、バランスのとれた自己分泌およびパラ分泌の二重の活性をもたらし、十分に高い活性および低い毒性の両方の利点を組み合わせることができる。対照的に、全身活性を提供しながらの可溶性サイトカインの送達は、その高い毒性が公知である。武装化ＣＡＲ−Ｔは、パラ分泌および全身活性、ならびに全身毒性をもたらすサイトカインを局所的に分泌させ得る。ナノゲルバックパック、例えば、米国公開第２０１７／００８０１０４号、米国特許第９，６０３，９４４号、米国公開第２０１４／００８１０１２号、およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３７２４９号（それぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるものなどは、高度に局在化された自己分泌活性を提供することができ、これは、ある特定のサイトカイン（例えば、ＩＬ−１５）については望ましいものであり得る。しかしながら、パラ分泌活性が必要とされるサイトカイン（例えば、ＩＬ−１２）については、本明細書に開示されるテザー融合体が、バランスのとれた自己分泌およびパラ分泌活性のためのスイートスポットであり得る。図３４Ａに示されるように、テザー融合体は、免疫細胞にテザー（またはロード）されるとシスでシグナル伝達を行うことができ、隣接する標的免疫細胞にはトランスでシグナル伝達を行うことができ、もともとのバックパックロード細胞に対して近接していない標的免疫細胞へは転送によってシグナル伝達を行うことができる。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、免疫細胞標的化部分は、次のうちの１つまたは複数の増加をもたらす：例えば、指定された期間にわたる、免疫細胞における免疫刺激部分の結合、利用可能性、活性化、および／またはシグナル伝達。いくつかの実施形態では、ＩＦＭは、サイトカイン分子のシグナル伝達機能を実質的に妨害しない。そのような標的化効果は、免疫細胞の増殖および活性化の限局性および長期の刺激をもたらし、したがって、免疫応答の制御された増大および活性化を誘導する。本明細書に開示されるＩＦＭは、サイトカイン分子の免疫刺激性生物活性（例えば、シグナル伝達活性および／または効力）を保持しながら、副作用の低減、例えば、より低い全身毒性を含め、当該技術分野において公知のサイトカインに優る複数の利点を提供する。
【０２３９】
以前の開示のイムノサイトカイン−抗体−サイトカイン融合タンパク質は、典型的に、サイトカイン成分を通じてエフェクター機能を強化するために、抗体成分を介して疾患抗原（例えば、腫瘍関連抗原、例えば、細胞膜抗原および細胞外マトリックス成分）を標的とするように設計されている。（Clin.  Pharmacol.  2013;  5(Suppl  1):  29-45.  Thomas  List  and  Dario  Neri.  Published  online  2013  Aug  20.  doi:  10.2147/CPAA.S49231  PMCID:  PMC3753206）。サイトカインの治療的使用に対する例示的な障害は、それらの血清半減期が短いことおよびバイオアベイラビリティが限定されることに関連している。高用量のサイトカインであればこれらの障害を克服することができるが、用量制限毒性をもたらす。結果として、ほとんどのサイトカインは、毒性を低減させ、半減期を増加させるために、タンパク質操作アプローチを必要とする。具体的な戦略としては、ＰＥＧ化、抗体複合体および融合タンパク質の形式、ならびに変異誘発が挙げられる。（Antibodies  2013,  2,  426-451;  doi:10.3390/antib2030426  Rodrigo  Vazquez-Lombardi  Brendan  Roome  and  Daniel  Christ）。
【０２４０】
本開示は、とりわけ、サイトカインと、融合タンパク質を受容体の特定の組成を有する免疫細胞（例えば、健康および／または非悪性）に向けるように機能する標的化部分との共有結合によるコンジュゲートとしての、融合タンパク質を提供する。炎症促進性サイトカインを、標的化部分、好ましくは、抗体または抗体断片（例えば、一本鎖Ｆｖ、Ｆａｂ、ＩｇＧ）に融合することにより、融合タンパク質を目的の細胞へと方向付け、サイトカインの細胞表面利用可能性を増強させる。目的の細胞としては、とりわけ、免疫細胞、特に、リンパ球、および好ましくはＴ細胞（例えば、全ＣＤ３  Ｔ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、またはＣＤ８  Ｔ細胞）が挙げられ、また他の細胞型を挙げることができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＣＤ８  Ｔ細胞のサブセットを活性化し得る。免疫細胞を含め、目的の細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、対象内）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ  ｖｉｖｏ（例えば、細胞に基づく療法）であってもよい。
【０２４１】
一部の実施形態では、免疫細胞表面標的は、免疫細胞の表面上に豊富に存在する（例えば、免疫細胞表面上に存在するサイトカイン分子の受容体の数を数で勝る）。一部の実施形態では、免疫細胞標的化部分は、免疫細胞表面標的、例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ４５から選択される標的に結合する抗体分子またはリガンド分子から選択され得る。一実施形態では、免疫細胞標的化部分は、ＣＤ４５に結合する抗体分子またはリガンド分子を含む。
【０２４２】
ＣＤ４５は、豊富な受容体の例である。ＣＤ４５はまた、白血球共通抗原としても公知であり、赤血球以外の造血細胞に存在し、細胞活性化を補助するＩ型膜貫通タンパク質である（例えば、Altin,  JG,  Immunol  Cell  Biol.  1997  Oct;75(5):430-45を参照されたい）。ＩＦＭの標的化部分の他の受容体は、細胞表面上に維持され、細胞による内部移行に耐性であることが理想的である（例えば、持続性受容体）。豊富かつ持続性の受容体の例は、ＣＤ４５である。代替として、標的化部分の受容体は、構成的に代謝回転され得、例えば、細胞によって内部移行され、リサイクルされて表面に戻り、それによって、その動的な内部移行にもかかわらず、融合タンパク質の有意な結合の機会を可能にする（リサイクリング受容体）。ＣＤ２２は、リサイクリング受容体の例である。
【０２４３】
サイトカイン受容体の発現レベルは、（ｉ）細胞型、および（ｉｉ）細胞の活性化状態を含む、様々な要因に基づいて変動し得る。いくつかの実施形態では、発現レベルは、サイトカインシグナル伝達、シグナル強度、および持続期間のうちの１つまたは複数に影響を及ぼし得る。一実施形態では、免疫細胞表面上に発現される受容体は、細胞表面上で、標的化部分に対する受容体の数が、サイトカイン成分に対する受容体の数を上回る、有効な比で存在する。そのような有効な比は、標的化部分受容体が持続性である場合に実現されるか、または代替として、それらの細胞表面密度が、受容体を細胞の表面に回復させるリサイクリング機序によって効果的に維持され、結果として、サイトカイン成分を上回る標的化成分の結合の機会が可能となる場合に、実現される。リサイクルされる（例えば、内部移行され、細胞表面に戻る）受容体の場合には、抗体受容体は、標的化部分の結合の機会が、タンパク質のサイトカイン成分の結合の機会を上回るのを可能にするに有効な比で、存在する。そのような有効な比は、細胞表面へのサイトカインの局在化を可能にし、結果として、サイトカインがそれ自体の細胞表面受容体に結合するための時間および利用可能性を増加させる（標的化受容体の動的存在、内部移行、および表面に戻ることにかかわらず）。
【０２４４】
一部の事例では、形質膜受容体によって開始されるシグナル伝達の調節は、エンドサイトーシスに結びつけられている。活性化された受容体の内部移行は、シグナルの減弱化の手段であるが、また、受容体シグナル伝達の持続期間およびシグナル伝達出力特異性も調節する（Barbieri,  P.P.  Di  Fiore,  S.  Sigismund.  Endocytic  control  of  signaling  at  the  plasma  membrane  Curr.  Opin.  Cell  Biol.,  39  (2016),  pp.  21-27において考察されている）。エンドソームは、多重タンパク質シグナル伝達アセンブリの形成を促進し、結果として、空間および時間において効率的なシグナル伝達を可能にする、移動性シグナル伝達プラットフォームとして機能し得る。形質膜において開始される一部のシグナル伝達事象、例えば、サイトカインシグナル伝達事象は、エンドソーム区画から継続し得る。
【０２４５】
本開示のＩＦＭは、一般に、アゴニスト性サイトカイン、ならびに特にＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、およびＩＬ−１２ｐ７０の生物活性の改善を付与し得る。他のアゴニスト性サイトカインとしては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、およびＩＬ−２７が挙げられる。一部の実施形態では、サイトカイン分子は、炎症促進性サイトカインを含み、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、またはＩＬ−２７のうちの１つまたは複数から選択されるサイトカインを、それらのバリアント形態（例えば、サイトカイン誘導体、サイトカイン分子をポリペプチドとともに含む複合体、例えば、サイトカイン受容体複合体、およびそれらの他のアゴニスト形態）を含めて含む。一実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−１２を含む（１つのＩＦＭまたは２つのＩＦＭに）。
【０２４６】
１つの例示的な実施形態では、ＩＦＭの免疫細胞標的化部分は、抗ＣＤ４５抗体分子に由来し、サイトカイン分子は、必要に応じてＩＬ−１５受容体アルファサブユニットのｓｕｓｈｉドメインと複合体形成したインターロイキン−１５である（αＣＤ４５−ＩＬ１５およびαＣＤ４５−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ）。別の例示的な実施形態では、ＩＦＭの免疫細胞標的化部分は、抗ＣＤ４５抗体分子に由来し、サイトカイン分子は、インターロイキン−１２である（αＣＤ４５−ＩＬ１２）。αＣＤ４５−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  ＩＦＭおよびαＣＤ４５−ＩＬ１２  ＩＦＭは、例えば、併用療法において、一緒に使用することができる。
【０２４７】
別の実施形態では、ＩＦＭ、例えば、免疫細胞標的化部分が、ＣＤ４５以外の豊富または持続性細胞表面受容体、例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、またはＣＤ２０から選択される標的を標的とする抗体に由来するＩＦＭは、異なる細胞表面分子にテザーされ得る。ＩＦＭは、サイトカイン、例えば、必要に応じてＩＬ−１５受容体アルファサブユニットのｓｕｓｈｉドメインと複合体形成したインターロイキン−１５、および／またはインターロイキン−１２を含有し得る。ＩＦＭは、例えば、αＣＤ４５−ＩＬ１５、αＣＤ４５−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ、またはαＣＤ４５−ＩＬ１２との併用療法において、一緒に使用することができる。
【０２４８】
別の実施形態では、同じかまたは異なる細胞表面受容体にテザーされた追加のサイトカインを含むＩＦＭは、例えば、併用療法において、一緒に使用される。免疫細胞標的化部分は、免疫細胞表面標的、例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはＣＤ４５、および炎症促進性サイトカインから選択される標的に結合する、抗体分子またはリガンド分子から選択され得、例えば、そのバリアント形態を含め、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、またはＩＬ−２７うちの１つまたは複数から選択されるサイトカインを含む。一部の実施形態では、２つの異なるＩＦＭの組合せが、使用される。他の実施形態では、３つの異なるＩＦＭの組合せが、使用される。他の実施形態では、３つを上回るＩＦＭの組合せが、使用される。
【０２４９】
本開示の融合タンパク質の治療的使用は、とりわけ、（１）受容体に媒介される、特定の細胞に固有の受容体（例えば、ＣＤ４またはＣＤ８）の結合を介した、治療用タンパク質の特異的送達のための薬剤として、（２）例えば、ＡＣＴ（養子細胞移入）を含むＴ細胞療法において、および例えば、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫ細胞、抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作されたＴ細胞もしくはＣＡＲ−Ｔ細胞、腫瘍抗原に特異的なＴ細胞受容体を発現するように遺伝子操作されたＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、および／または抗原訓練Ｔ細胞（例えば、目的の抗原、例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を表面に表す抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって「訓練」されているＴ細胞）を含む、他の重要な免疫細胞型もともに、患者に再導入する前の単離された自家および同種細胞の活性化および増大を誘導するためのｅｘ  ｖｉｖｏ薬剤として、ならびに（３）ＡＣＴを含む、細胞療法において使用される細胞の増大を補助するために使用されるサイトカインを送達するために投与するためのｉｎ  ｖｉｖｏ薬剤としてのものを含む。
【０２５０】
このため、本開示のＩＦＭと、薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤とを含む、医薬組成物を使用して、治療用タンパク質を、それを必要とする対象に送達することができる。健康なおよび／または非悪性の免疫細胞と、そこに結合したまたはそれを標的とする本開示のＩＦＭとを含む、修飾された免疫細胞もまた、提供される。そのような修飾された免疫細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで調製することができる。
【０２５１】
本開示はまた、修飾された免疫細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ調製の方法であって、複数の健康なおよび／または非悪性の免疫細胞を提供するステップと、本開示のＩＦＭを、複数の健康なおよび／または非悪性の免疫細胞とともにインキュベートして、そこへのＩＦＭの標的化結合を可能にし、それによって、複数の修飾された免疫細胞を産生するステップとを含む、方法もまた、提供する。
【０２５２】
また、細胞療法を提供する方法であって、複数の健康なおよび／または非悪性の免疫細胞を提供するステップと、本開示のＩＦＭを、複数の健康なおよび／または非悪性の免疫細胞とともにインキュベートして、そこへのＩＦＭの標的化結合を可能にし、それによって、複数の修飾された免疫細胞を産生するステップと、複数の修飾された免疫細胞を、それを必要とする対象に投与するステップとを含む、方法も、本明細書において提供される。一部の実施形態では、細胞療法は、対象のプレコンディショニングの非存在下において投与され、前記プレコンディショニングは、ＣＰＸ（シクロホスファミド）または他のリンパ枯渇コンディショニング化学療法を含む。プレコンディショニングの排除は、化学療法剤によるプレコンディショニングが、健康な細胞を含め、すべての細胞に対して全身的な高い毒性を引き起こし、免疫系を減弱させ、多数の望ましくない副作用を誘導し得ることが周知であるため、有利である。
定義
【０２５３】
ある特定の用語が、本明細書において以下に定義される。追加の定義は、本出願を通じて提供されている。
【０２５４】
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という冠詞は、１つまたは１つを上回る、例えば、少なくとも１つの、その冠詞の文法上の目的物を指す。本明細書において「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語とともに使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という単語の使用は、「１つ」を意味し得るが、これはまた、「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは１つを上回る」という意味とも一致する。
【０２５５】
本明細書で使用される場合、「約」および「およそ」とは、概して、測定の性質または正確さを考慮した、測定された量の許容可能な誤差の程度を意味する。例示的な誤差の程度は、所与の値の範囲の２０パーセント（％）以内であり、典型的には１０％以内であり、より典型的には５％以内である。「実質的に」という用語は、５０％を上回ることを意味し、好ましくは８０％を上回ることを意味し、最も好ましくは９０％または９５％を上回ることを意味する。
【０２５６】
本明細書で使用される場合、「含むこと」または「含む」という用語は、所与の実施形態に存在する組成物、方法、およびそのそれぞれの構成要素（複数可）に関して使用されるが、指定されていないエレメントを含むことも周知である。
【０２５７】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態にそれらのエレメントが必要とされることを指す。この用語は、本開示のその実施形態の基本的かつ新規なまたは機能的な特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさない追加のエレメントの存在を許容する。
【０２５８】
「からなる」という用語は、実施形態のその説明において列挙されていないあらゆるエレメントを除外した、本明細書に記載される組成物、方法、およびそのそれぞれの構成要素を指す。
【０２５９】
本明細書で使用される場合、別途言及されない限り、「転写」という用語は、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を指し、「翻訳」という用語は、ｍＲＮＡ鋳型からのポリペプチドの合成を指す。一般に翻訳は、ｍＲＮＡ転写物の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）の配列および構造によって調節される。１つの調節性配列は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）であり、これは、ｍＲＮＡの効率的かつ正確な翻訳を促進する。原核生物のＲＢＳは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ（３０Ｓリボソーム小サブユニット内に位置する）の３’末端のＵＣＣＵコア配列に相補的な５’−ＵＴＲのプリンリッチ配列であるシャイン・ダルガーノ配列である。様々なシャイン・ダルガーノ配列が、原核生物のｍＲＮＡにおいて見出されており、一般に、ＡＵＧ開始コドンの約１０ヌクレオチド上流に位置している。ＲＢＳの活性は、ＲＢＳと開始因子（または開始コドン）ＡＵＧとを引き離しているスペーサーの長さおよびヌクレオチド組成によって影響を受け得る。真核生物においては、リボソームの動員は、５’キャップｍＲＮＡによって媒介される。内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）もまた、真核生物におけるリボソームの動員を媒介し得る。これらは、ｍＲＮＡ翻訳のために様々なウイルスによって使用され、当業者であれば、真核生物宿主における異種タンパク質発現を促進する際にそれらを使用することを熟知しているであろう。さらに、真核生物においては、コザック配列が、短い５’非翻訳領域内に位置しており、ｍＲＮＡの翻訳を指示する。コザックコンセンサス配列が欠如しているｍＲＮＡはまた、安定な二次構造が欠如した中等度に長い５’−ＵＴＲを有する場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系において効率的に翻訳され得る。Ｅ．ｃｏｌｉリボソームは、シャイン・ダルガーノ配列を優先的に認識する一方、真核生物のリボソーム（例えば、網状赤血球ライセートにおいて見出されるもの）は、シャイン・ダルガーノまたはコザックリボソーム結合部位のいずれかを効率的に使用することができる。
【０２６０】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」、「プロモーターエレメント」、または「プロモーター配列」という用語は、目的のヌクレオチド配列にライゲーションされると、目的のヌクレオチド配列のｍＲＮＡへの転写を制御することができる、ＤＮＡ配列を指す。プロモーターは、典型的には、それがｍＲＮＡへの転写を制御する、目的のヌクレオチド配列の５’（すなわち、上流）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写開始のための他の転写因子による特異的結合のための部位を提供するが、必ずしもそうとは限らない。プロモーターは、構成的に活性であってもよく（「構成的プロモーター」）または他の因子、例えば、化学物質、熱、もしくは光によって制御されてもよい。「誘導性プロモーター」の活性は、生物的因子または非生物的因子の存在または非存在によって誘導される。広く使用される構成的プロモーターとしては、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、ヒトベータアクチン、ＣＡＧ、Ａｃ５、ポリへドリン、ＴＥＦ１、ＧＤＳ、ＡＤＨ１（エタノールによって抑制される）、ＣａＭＶ３５Ｓ、Ｕｂｉ、Ｈ１、Ｕ６、Ｔ７（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを必要とする）、およびＳＰ６（ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを必要とする）が挙げられる。一般的な誘導性プロモーターとしては、ＴＲＥ（テトラサイクリンまたはその誘導体によって誘導可能であり、ＴｅｔＲリプレッサーによって抑制可能である）、ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０（ガラクトースにより誘導可能であり、グルコースによって抑制可能である）、ｌａｃ（ｌａｃリプレッサー（ＬａｃＩ）の非存在下では構成的であり、ＩＰＴＧまたはラクトースによって誘導可能である）、Ｔ７ｌａｃ（Ｔ７およびｌａｃのハイブリッドであり、ｌａｃオペレーターによっても制御されるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを必要とし、ＩＰＴＧまたはラクトースによって誘導可能である）、ａｒａＢＡＤ（リプレッサーＡｒａＣに結合するアラビノースによって誘導可能であり、転写を活性化するようにそれを切り替える；グルコースの存在下において、ＣＡＰ結合部位を介して、または抗誘導因子であるフコースの競合的結合によって、異化代謝産物抑制を抑制する）、ｔｒｐ（ＴｒｐＲリプレッサーと結合すると、トリプトファンによって抑制可能である）、ｔａｃ（ｌａｃおよびｔｒｐのハイブリッドであり、ｌａｃプロモーターのように調節される；例えば、ｔａｃＩおよびｔａｃＩＩ）、ならびにｐＬ（温度によって調節される）が挙げられる。プロモーターは、宿主に応じて、原核生物プロモーターであってもよく、または真核生物プロモーターであってもよい。真核生物において、プロモーターは、さらに、細胞特異的であっても組織特異的プロモーターであってもよく、または上流の細胞内シグナル伝達分子による活性化に依存し得る。当業者であれば、目的のタンパク質の選択的な転写を駆動させるための細胞特異的、組織特異的、または活性化依存性プロモーターを熟知しているであろう。一般的なプロモーターおよびそれらの配列は、当該技術分野において周知である。
【０２６１】
プロモーターが、モジュラーアーキテクチャを有すること、およびモジュラーアーキテクチャが、変更され得ることを、理解されたい。細菌性プロモーターは、典型的に、コアプロモーターエレメントおよび追加のプロモーターエレメントを含む。コアプロモーターは、転写を開始するために必要とされる、プロモーターの最小限の部分を指す。コアプロモーターには、転写開始部位、ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、および一般的な転写因子結合部位が含まれる。「転写開始部位」は、転写される最初のヌクレオチドを指し、＋１と表記される。開始部位の下流のヌクレオチドは、＋１、＋２などと番号付けされ、開始部位の上流のヌクレオチドは、−１、−２などと番号付けされる。追加のプロモーターエレメントは、コアプロモーターの５’（すなわち、典型的に、開始部位の３０〜２５０ｂｐ上流）に位置し、転写の頻度を調節する。近位プロモーターエレメントおよび遠位プロモーターエレメントは、特異的転写因子部位を構成する。原核生物において、コアプロモーターは、通常、−１０配列または−３５配列の２つのコンセンサス配列を含み、これらは、シグマ因子によって認識される。−１０配列（最初に転写されるヌクレオチドから１０ｂｐ上流）は、典型的に、長さが約６ヌクレオチドであり、典型的に、アデノシンおよびチミジンのヌクレオチドから構成されている（プリブノーボックスとしても公知である）。このボックスの存在は、転写の開始に必須である。コアプロモーターの−３５配列は、典型的に、長さが約６ヌクレオチドである。−３５配列のヌクレオチド配列は、典型的に、４つのヌクレオシドのそれぞれから構成されている。この配列の存在は、非常に高い転写速度を可能にする。一部の実施形態では、−１０配列および−３５配列は、約１７ヌクレオチド離間している。真核生物プロモーターは、原核生物プロモーターよりも多様性が高く、転写開始部位の数キロ塩基上流に位置していてもよい。一部の真核生物プロモーターは、ＴＡＴＡボックスを含有しており、これは、典型的に、転写開始部位の４０〜１２０塩基以内に位置している。特定の結合性タンパク質によって認識される、１つまたは複数の上流活性化配列（ＵＡＳ）は、転写の活性化因子として作用し得る。これらのＵＡＳ配列は、典型的に、転写開始部位の上流に見出される。ＵＡＳ配列とＴＡＴＡボックスとの間の距離は、高度に可変性であり、最大１ｋｂであり得る。
【０２６２】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、適切な制御エレメントと会合すると、複製することができ、遺伝子配列を細胞内または細胞間に移入することができる、任意の遺伝子エレメント、例えば、プラスミド（マイクロプラスミドおよびミニプラスミドを含む）、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、エピソーム、ウイルス、ビリオンなどを指す。遺伝子配列は、通常、１つまたは複数の調節性配列、例えば、プロモーター、活性化因子／リプレッサー結合部位、終止因子、エンハンサーなどに作動可能に連結している。プロモーター配列は、構成的、誘導性、および／または抑制性であり得る。
【０２６３】
「自家」という用語は、同じ個体に由来する任意の材料を指し、この材料が、後に、この個体に再導入される。「同種」という用語は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の材料を指す。
【０２６４】
「抗体」または「抗体分子」とは、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、タンパク質、例えば、免疫グロブリン鎖またはその断片を指す。抗体分子は、抗体（例えば、全長抗体）および抗体断片を包含する。ある実施形態では、抗体分子は、全長抗体または全長免疫グロブリン鎖の抗原結合性断片または機能性断片を含む。例えば、全長抗体は、天然に存在するか、または通常の免疫グロブリン遺伝子断片組換えプロセスによって形成された、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子（例えば、ＩｇＧ）である）。いくつかの実施形態では、抗体分子は、免疫グロブリン分子、例えば、抗体断片の免疫学的に活性な抗原結合性部分を指す。抗体断片、例えば、機能性断片は、抗体の一部分、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、可変断片（Ｆｖ）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、または一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。機能性抗体断片は、インタクトな（例えば、全長）抗体によって認識されるものと同じ抗原に結合する。「抗体断片」または「機能性断片」という用語はまた、可変領域からなる単離された断片、例えば、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片、または軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって接続された組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）も含む。一部の実施形態では、抗体断片は、抗原結合活性を有さない抗体の部分、例えば、Ｆｃ断片または単一アミノ酸残基を含まない。例示的な抗体分子としては、全長抗体および抗体断片、例えば、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、一本鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片、ならびに一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が挙げられる。「Ｆａｂ」および「Ｆａｂ断片」という用語は、互換可能に使用され、抗体のそれぞれの重鎖および軽鎖に由来する１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメイン、すなわち、ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、およびＣＨ１を含む、領域を指す。
【０２６５】
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン可変ドメイン配列」は、免疫グロブリン可変ドメインの構造を形成することができるアミノ酸配列を指す。例えば、この配列には、天然に存在する可変ドメインのアミノ酸配列のすべてまたは一部が含まれ得る。例えば、この配列は、１つ、２つ、もしくはそれを上回るＮ末端もしくはＣ末端アミノ酸を含んでも含まなくてもよく、またはタンパク質構造の形成と適合性のある他の変更を含んでもよい。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、抗体分子は、単一特異性であり、例えば、これは、単一のエピトープに対する結合特異性を含む。一部の実施形態では、抗体分子は、多特異性であり、例えば、これは、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対する結合特異性を有し、第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対する結合特異性を有する。一部の実施形態では、抗体分子は、二特異性抗体分子である。「二特異性抗体分子」は、本明細書で使用される場合、１つを上回る（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれを上回る）エピトープおよび／または抗原に対する特異性を有する抗体分子を指す。
【０２６７】
「抗原」（Ａｇ）は、本明細書で使用される場合、すべてのタンパク質またはペプチドを含む、巨大分子を指す。一部の実施形態では、抗原は、免疫応答を誘起することができる、例えば、ある特定の免疫細胞の活性化および／または抗体の生成に関与する、分子である。抗原は、抗体生成に関与するだけではない。Ｔ細胞受容体はまた、抗原を認識した（ペプチドまたはペプチド断片が、ＭＨＣ分子と複合体形成した抗原ではあるとしても）。ほぼすべてのタンパク質またはペプチドを含む、任意の巨大分子が、抗原となり得る。抗原はまた、ゲノム組換え体またはＤＮＡに由来し得る。例えば、免疫応答を誘起することができるタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡは、「抗原」をコードする。いくつかの実施形態では、抗原は、遺伝子の全長ヌクレオチド配列だけによってコードされる必要はなく、また、抗原は、遺伝子によってコードされる必要もまったくない。いくつかの実施形態では、抗原は、合成することができるか、または生体試料、例えば、組織試料、腫瘍試料、細胞、または他の生物学的成分を有する流体に由来し得る。本明細書で使用される場合、「腫瘍抗原」または互換可能に「がん抗原」には、免疫応答を誘起することができる、がん、例えば、がん細胞または腫瘍微小環境に存在するか、またはそれと関連する、任意の分子が含まれる。本明細書で使用される場合、「免疫細胞抗原」には、免疫応答を誘起することができる、免疫細胞に存在するか、または免疫細胞と関連する、任意の分子が含まれる。
【０２６８】
抗体分子の「抗原結合性部位」または「抗原結合性断片」または「抗原結合性部分」（本明細書において互換可能に使用される）は、抗原結合に関与する、抗体分子、例えば、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、例えば、ＩｇＧの一部を指す。一部の実施形態では、抗原結合性部位は、重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）の可変（Ｖ）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖の可変領域内の３つの高度に多様なストレッチは、超可変領域と称されており、より保存されている「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる隣接するストレッチの間に配置される。ＦＲは、天然には、免疫グロブリンにおける超可変領域の間に、それに隣接して見出される、アミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間において、互いに対して、結合される抗原の三次元表面に対して相補性となる抗原結合性表面を形成するように配置されている。重鎖および軽鎖のそれぞれの３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。フレームワーク領域およびＣＤＲは、例えば、Kabat,  E.A.,  ら  (1991)  Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,  Fifth  Edition,  U.S.  Department  of  Health  and  Human  Services,  NIH  Publication  No.  91-3242およびChothia,  C.  ら(1987)  J.  Mol.  Biol.  196:901-917において定義および説明されている。それぞれの可変鎖（例えば、可変重鎖および可変軽鎖）は、典型的に、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成されており、アミノ末端からカルボキシ末端へのアミノ酸の順で、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４と配置されている。可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲは、一般に、２７〜３２位（ＣＤＲ１）、５０〜５６位（ＣＤＲ２）、および９１〜９７位（ＣＤＲ３）の残基を含むと定義される。可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲは、一般に、２７〜３３位（ＣＤＲ１）、５２〜５６位（ＣＤＲ２）、および９５〜１０２位（ＣＤＲ３）の残基を含むと定義される。当業者であれば、ループが、抗体にわたって異なる長さのものであってもよく、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｉａなどの番号付けシステムは、フレームワークが抗体にわたって一貫した番号付けを有するように制御することを理解するであろう。
【０２６９】
一部の実施形態では、抗体の抗原結合性断片（例えば、本開示の融合分子の一部として含まれる場合）は、全長Ｆｃドメインが欠如していてもよく、またはそれを含まなくてもよい。ある特定の実施形態では、抗体結合性断片は、全長ＩｇＧまたは全長Ｆｃを含まないが、軽鎖および／または重鎖に由来する１つまたは複数の定常領域（またはその断片）を含んでもよい。一部の実施形態では、抗原結合性断片は、あらゆるＦｃドメインを完全に含まなくてもよい。一部の実施形態では、抗原結合性断片は、全長Ｆｃドメインを実質的に含まなくてもよい。一部の実施形態では、抗原結合性断片は、全長Ｆｃドメインの一部分（例えば、ＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメイン、またはその一部分）を含んでもよい。一部の実施形態では、抗原結合性断片は、全長Ｆｃドメインを含んでもよい。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。
【０２７０】
本明細書で使用される場合、「サイトカイン分子」は、天然に存在する野生型サイトカインの全長、断片、またはバリアント（天然に存在するサイトカイン分子の活性の少なくとも１０％を有する、その断片および機能性バリアントを含む）を指す。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、天然に存在する分子の活性、例えば、免疫調節活性の少なくとも３０、５０、または８０％を有する。いくつかの実施形態では、サイトカイン分子は、必要に応じて免疫グロブリンＦｃ領域にカップリングされた、受容体ドメイン、例えば、サイトカイン受容体ドメインをさらに含む。他の実施形態では、サイトカイン分子は、免疫グロブリンＦｃ領域にカップリングされている。他の実施形態では、サイトカイン分子は、抗体分子（例えば、免疫グロブリンＦａｂもしくはｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片、ＦＡＢ２断片、またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えば、ｓｄＡｂ（ナノボディ）断片、重鎖抗体断片、単一ドメイン抗体、二特異性もしくは多特異性抗体）、または非抗体スキャフォールドおよび抗体模倣体（例えば、リポカリン（例えば、アンチカリン）、アフィボディ、フィブロネクチン（例えば、モノボディもしくはアドネクチン）、ノッチン、アンキリンリピート（例えば、ＤＡＲＰｉｎ）、およびＡドメイン（例えば、アビマー））にカップリングされている。
【０２７１】
「がん」は、本明細書で使用される場合、あらゆる種類の発がん性プロセスおよび／またはがん性成長を包含し得る。いくつかの実施形態では、がんは、原発性腫瘍、ならびに転移性組織または悪性形質転換細胞、組織、もしくは臓器を含む。いくつかの実施形態では、がんは、すべての組織病理およびステージ、例えば、侵襲性／重症度のステージのがんを包含する。いくつかの実施形態では、がんは、再発がんおよび／または耐性がんを含む。「がん」および「腫瘍」という用語は、互換可能に使用することができる。例えば、いずれの用語も、固形腫瘍および液性腫瘍を包含する。本明細書で使用される場合、「がん」または「腫瘍」という用語は、前悪性ならびに悪性のがんおよび腫瘍を含む。
【０２７２】
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」は、免疫系において、例えば、感染因子および外来物に対して保護するように機能する、様々な細胞のうちのいずれかを指す。いくつかの実施形態では、この用語は、白血球、例えば、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、および単球を含む。「免疫細胞」という用語には、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞が含まれる。「免疫細胞」はまた、免疫応答に関与する細胞の修飾されたバージョン、例えば、例としてKlingemannら（上記）に記載されるような、ＮＫ細胞系ＮＫ−９２（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−２４０７）、ｈａＮＫ（高親和性Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｖ）を発現するＮＫ−９２バリアント）、およびｔａＮＫ（所与の腫瘍抗原に対するＣＡＲを発現する遺伝子をトランスフェクトした、標的化ＮＫ−９２細胞）を含む、修飾されたＮＫ細胞も指す。
【０２７３】
「免疫エフェクター細胞」は、この用語が本明細書で使用されるとき、免疫応答に関与する、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する、細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例としては、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、アルファＴ細胞、ベータＴ細胞、ガンマＴ細胞、およびデルタＴ細胞；Ｂ細胞；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞；ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞；樹状細胞；ならびにマスト細胞が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えば、がん抗原に結合するＣＡＲを含む、例えば、それを発現する、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）である。他の実施形態では、免疫細胞は、外因性高親和性Ｆｃ受容体を発現する。一部の実施形態では、免疫細胞は、操作されたＴ細胞受容体を含む、例えば、それを発現する。一部の実施形態では、免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球である。一部の実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞の集団を含み、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する特異性が富化された、例えば、目的のＴＡＡ、例えば、ＭＡＲＴ−１を表面に表すＭＨＣに対する特異性を有するＴ細胞に関して選別することによって富化された、Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞の集団を含み、目的のＴＡＡペプチドを表面に表す抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、樹状細胞によって、ＴＡＡに対する特異性を有するように「訓練」されている、Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ２、サバイビンなどのうちの１つまたは複数から選択されるＴＡＡに対して、訓練されている。一部の実施形態では、免疫細胞は、目的の複数のＴＡＡペプチドを表面に表すＡＰＣ、例えば、樹状細胞によって、複数のＴＡＡに対する特異性を有するように「訓練」されている、Ｔ細胞の集団を含む。一部の実施形態では、免疫細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８  Ｔ細胞）である。一部の実施形態では、免疫細胞は、ヘルパーＴ細胞、例えば、ＣＤ４  Ｔ細胞である。
【０２７４】
「エフェクター機能」または「エフェクター応答」という用語は、細胞の特化した機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。
【０２７５】
「細胞傷害性Ｔリンパ球」（ＣＴＬ）は、本明細書で使用される場合、標的細胞を殺滅する能力を有するＴ細胞を指す。ＣＴＬ活性化は、次の２つのステップが生じたときに発生し得る：１）標的細胞における抗原結合ＭＨＣ分子と、ＣＴＬ上のＴ細胞受容体との間の相互作用がなされること、および２）Ｔ細胞における共刺激性分子と標的細胞との会合（engagement）により、共刺激性シグナルが生じること。ＣＴＬは、次いで、標的細胞における特定の抗原を認識し、例えば、細胞溶解によって、これらの標的細胞の破壊を誘導する。一部の実施形態では、ＣＴＬは、ＣＡＲを発現する。一部の実施形態では、ＣＴＬは、操作されたＴ細胞受容体を発現する。
【０２７６】
「対象」という用語は、免疫応答が誘起され得る生物（例えば、哺乳動物、ヒト）を含む。一実施形態では、対象は、患者、例えば、免疫細胞療法を必要とする患者である。別の実施形態では、対象は、例えば、同種移植が意図される、免疫細胞のドナー、例えば、同種ドナーである。
【０２７７】
本開示の組成物および方法は、指定される配列またはそれに実質的に同一もしくは類似である配列、例えば、指定される配列に少なくとも８５％、９０％、９５％、もしくはそれを上回って同一である配列を有する、ポリペプチドおよび核酸を包含する。アミノ酸配列の文脈において、「実質的に同一である」という用語は、第１および第２のアミノ酸配列が、共通の構造ドメインおよび／または共通の機能的活性を有し得るように、第１のアミノ酸が、第２のアミノ酸配列におけるアラインしたアミノ酸残基に、ｉ）同一であるか、またはｉｉ）そのアミノ酸残基の保存的置換である、十分な数または最小限の数のアミノ酸残基を含有することを指して、本明細書で使用される。例えば、参照配列、例えば、本明細書に提供される配列に対して、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する共通の構造ドメインを含有するアミノ酸配列。
【０２７８】
ヌクレオチド配列の文脈において、「実質的に同一である」という用語は、第１および第２のヌクレオチド配列が、共通の機能的活性を有するポリペプチドをコードするか、または共通の構造ポリペプチドドメインもしくは共通の機能的ポリペプチド活性をコードするように、第１の核酸配列が、第２の核酸配列におけるアラインしたヌクレオチドに同一である十分な数または最小限の数のヌクレオチドを含有することを指して、本明細書で使用される。例えば、参照配列、例えば、本明細書に提供される配列に対して、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列。
【０２７９】
配列間の相同性または配列同一性（これらの用語は、本明細書において互換可能に使用される）の計算は、以下のように行われる。
【０２８０】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列を、最適な比較の目的でアラインする（例えば、最適なアライメントのために、ギャップが、第１および第２のアミノ酸または核酸配列のうちの一方または両方に導入されてもよく、非相同配列は、比較目的で、無視してもよい）。好ましい実施形態では、比較目的でアラインされる参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを、次いで、比較する。第１の配列における位置が、第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、分子は、その位置において同一である（本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同等である）。
【０２８１】
２つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列が共有している同一な位置の数の関数であり、２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要のあるギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮する。
【０２８２】
２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（www.gcg.comで入手可能）におけるＧＡＰプログラムに組み込まれている、NeedlemanおよびWunsch（(1970)  J.  Mol.  Biol.  48:444-453）のアルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ加重および１、２、３、４、５、または６の長さ加重を使用して、決定される。なおも別の好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）におけるＧＡＰプログラムを使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ加重および１、２、３、４、５、または６の長さ加重を使用して、決定される。特に好ましいパラメーターセット（および別途示されない限り使用すべきもの）は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティでのＢｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリングマトリックスである。
【０２８３】
２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているE.  MeyersおよびW.  Miller（(1989)  CABIOS,  4:11-17）のアルゴリズムを使用し、ＰＡＭ１２０加重残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを使用して、決定することができる。
【０２８４】
本明細書に記載される核酸およびタンパク質配列は、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連する配列を同定するために公開データベースに対する検索を実施するための「クエリー配列」として使用することができる。そのような検索は、Altschul,  ら  (1990)  J.  Mol.  Biol.  215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して行うことができる。本開示の核酸（例えば、配列番号１）分子と相同であるヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行うことができる。本開示のタンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことができる。比較目的でギャップ付きアライメントを得るために、Altschulら,  (1997)  Nucleic  Acids  Res.  25:3389-3402に記載されるようなギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合には、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。本開示の分子は、それらの機能に実質的な作用を有さない、追加の保存的または非必須アミノ酸置換を有し得ることが、理解される。
【０２８５】
「アミノ酸」という用語は、天然か合成かに関係なく、アミノ官能性および酸官能性の両方を含み、天然に存在するアミノ酸のポリマーに含めることができる、すべての分子を包含することが意図される。例示的なアミノ酸としては、天然に存在するアミノ酸；そのアナログ、誘導体、および同類；バリアント側鎖を有するアミノ酸アナログ；ならびに前述のもののいずれかの任意のもののすべての立体異性体が挙げられる。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語には、ＤまたはＬ光学異性体およびペプチド模倣体の両方が含まれる。
【０２８６】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。
【０２８７】
ポリペプチドの文脈における「機能性バリアント」または「バリアント」または「バリアント形態」という用語は、天然に存在する配列の１つまたは複数の活性の少なくとも１０％を有することができる、ポリペプチドを指す。一部の実施形態では、機能性バリアントは、天然に存在する配列に対する実質的なアミノ酸配列同一性を有するか、または実質的に同一なヌクレオチド配列によってコードされ、結果として、機能性バリアントは、天然に存在する配列の１つまたは複数の活性を有する。
【０２８８】
「分子」という用語は、本明細書で使用される場合、文脈によって示されるように、ポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸を指し得る。この用語には、天然に存在する野生型のポリペプチドまたはそれをコードする核酸の全長、断片、またはバリアント、例えば、その機能性バリアントが含まれる。一部の実施形態では、バリアントは、野生型ポリペプチドまたはそれをコードする核酸の誘導体、例えば、変異体である。
【０２８９】
「単離された」という用語は、本明細書で使用される場合、そのもともとのまたは生来の環境（例えば、それが天然に存在する場合には天然の環境）から取り出された材料を指す。例えば、生きている動物に存在している天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、ヒトの介入により、天然系にともに存在する材料のうちのいくつかまたはすべてから分離されたものは、単離されている。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であってもよく、かつ／またはそのようなポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、組成物の一部であってもよく、そのようなベクターまたは組成物が本来見出される環境の一部ではないという点で、依然として単離されていると言える。
【０２９０】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」（一本鎖の場合）という用語は、本明細書において、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指して互換可能に使用される。ポリマーは、直鎖であっても分枝鎖であってもよく、これは、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。これらの用語はまた、修飾されているアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作、例えば、標識化成分とのコンジュゲーションも包含する。ポリペプチドは、天然の源から単離することができるか、組換え技法によって、真核生物もしくは原核生物宿主から産生することができるか、または合成手順の産物であり得る。
【０２９１】
「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、または「ポリヌクレオチド配列」、および「ポリヌクレオチド」という用語は、互換可能に使用される。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかであるヌクレオチドの任意の長さのポリマー形態、またはそれらのアナログを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、一本鎖の場合には、コーディング鎖であっても非コーディング（アンチセンス）鎖であってもよい。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、重合の後に、例えば、標識化成分とのコンジュゲーションによって、さらに修飾されてもよい。核酸は、組換えポリヌクレオチド、または天然に存在しないかもしくは非天然の配置で別のポリヌクレオチドに連結されたかのいずれかである、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、もしくは合成起源のポリヌクレオチドであってもよい。
【０２９２】
「親ポリペプチド」という用語は、野生型ポリペプチドを指し、野生型ポリペプチドのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、公的にアクセス可能なタンパク質データベース（例えば、ＥＭＢＬヌクレオチド配列データベース、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ、ＥｘＰａｓｙ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋなど）の一部である。
【０２９３】
「変異体ポリペプチド」または「ポリペプチドバリアント」または「ムテイン」という用語は、そのアミノ酸配列が、その対応する野生型（親）形態、天然に存在する形態、または任意の他の親形態のアミノ酸配列とは異なる、ポリペプチドの形態を指す。変異体ポリペプチドは、１つまたは複数の変異、例えば、変異体ポリペプチドをもたらす置換え、挿入、欠失などを含有し得る。
【０２９４】
「親ポリペプチドに対応する」という用語（またはこの用語の文法上の変形形態）は、ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくともアミノ酸の変形形態の存在のみにより、対応する親ポリペプチドのアミノ酸配列とは異なっている、本開示のポリペプチドを記載して使用される。典型的には、バリアントポリペプチドおよび親ポリペプチドのアミノ酸配列は、高い同一性のパーセンテージを呈する。１つの例では、「親ポリペプチド（polypetide）に対応する」とは、バリアントポリペプチドのアミノ酸配列が、親ポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の同一性を有することを意味する。別の例では、バリアントポリペプチドをコードする核酸配列は、親ポリペプチドをコードする核酸配列に対して少なくとも約５０％の同一性、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の同一性を有する。
【０２９５】
「親ポリペプチドに変形形態を導入すること（または付加するなど）」（またはその文法上の変形形態）または変形形態を含むように「親ポリペプチドを修飾する」（またはその文法上の変形形態）という用語は、必ずしも、親ポリペプチドが、そのような変換のための物理的な出発材料であることを意味するわけではなく、むしろ、親ポリペプチドが、バリアントポリペプチドを作製するためのガイドとなるアミノ酸配列を提供することを意味する。１つの例では、「親ポリペプチドにバリアントを導入すること」とは、親ポリペプチドの遺伝子が、バリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を作製するように、適切な変異を通じて修飾されていることを意味する。別の例では、「親ポリペプチドにバリアントを導入すること」とは、結果として得られるポリペプチドが、理論上、親ポリペプチド配列をガイドとして使用して設計されることを意味する。設計されたポリペプチドは、次いで、化学的手段または他の手段によって生成することができる。
【０２９６】
本開示の様々な態様を、以下にさらに詳細に記載する。追加の定義は、本明細書全体にわたって記載されている。
サイトカイン分子
【０２９７】
サイトカインは、免疫応答の媒介因子である、タンパク質性シグナル伝達化合物である。サイトカインは、増殖、分化および細胞生存／アポトーシスを含む、多くの異なる細胞機能を制御し、サイトカインはまた、ウイルス感染症および自己免疫疾患を含む、いくつかの病態生理学的過程に関与する。サイトカインは、自然免疫系の細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞）と養子免疫系の細胞（ＴおよびＢ細胞）の両方を含む様々な細胞による様々な刺激下で合成される。サイトカインは、炎症促進性および抗炎症性である２群に分類することができる。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αを含む、炎症促進性サイトカインは、主として、自然免疫細胞およびＴｈ１細胞に由来する。ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＬ−５を含む、抗炎症性サイトカインは、Ｔｈ２免疫細胞から合成される。
【０２９８】
本開示は、１つまたは複数のサイトカイン分子、例えば、免疫調節性（例えば、炎症促進性）サイトカインおよびそれらのバリアント、例えば機能性バリアントを含む、例えば、それらを含有するように操作されている、ＩＦＭ（例えば、ＩＦＭポリペプチド）を、なかんずく、提供する。したがって、一部の実施形態では、サイトカイン分子は、インターロイキンまたはそのバリアント、例えば機能性バリアントである。一部の実施形態において、インターロイキンは、炎症促進性インターロイキンである。
【０２９９】
実施形態では、サイトカイン分子は、サイトカインの完全長、断片またはバリアント、例えば、１つまたは複数の変異を含むサイトカインである。一部の実施形態では、サイトカイン分子は、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１アルファ（ＩＬ−１アルファ）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１ベータ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、インターロイキン−２３（ＩＬ−２３）、インターフェロン（ＩＦＮ）α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、腫瘍壊死因子アルファ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＣＳＦ、またはそれらの断片もしくはバリアント、または前述のサイトカインのいずれかについての組合せから選択される、サイトカインを含む。他の実施形態では、サイトカイン分子は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、もしくはインターフェロンガンマ、またはそれらの断片もしくはバリアント、または前述のサイトカインのいずれかについての組合せから選択される。サイトカイン分子は、単量体であることもあり、または二量体であることもある。実施形態では、サイトカイン分子は、受容体ドメイン、例えば、サイトカイン受容体ドメインをさらに含む。
【０３００】
一部の実施形態では、サイトカインまたは成長因子分子は、Ｉｆｎ−γ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７またはＴＮＦ−αのうちの１つまたは複数から選択されるＴｒｅｇ阻害性分子であることができる。Ｉｆｎ−γは、Ｔｒｅｇ脆弱性を促進し、腫瘍微小環境における抑制を低減し得る。ＩＬ−１およびＩＬ−６、ＩＬ−２１およびＩＬ−２３は、炎症促進性ＩＬ−１７を産生するようにＴｒｅｇを誘導することおよび／またはＴｒｅｇをＴｈ１７  Ｔ細胞サブセットに変換することができる。ＩＬ−１２は、ＴｒｅｇにおけるＩｆｎ−γ産生を促進して、Ｔｒｅｇ脆弱性および全般の免疫原性促進性環境をもたらす。ＴＮＦ−αは、Ｔｒｅｇ発生を害し、なおかつ、既存のＴｒｅｇの機能を低下させる。したがって、これらのサイトカインは、Ｔｒｅｇ発生を害すること、Ｔｒｅｇ機能を低下させること、または免疫活性化細胞へのＴｒｅｇ分化転換を誘導することができる。
【０３０１】
Ｔｒｅｇ活性を低下させることが望ましいがんに関しては、Ｔｒｅｇ阻害性サイトカインの１つまたは複数をＴｒｅｇ特異的ＩＦＭによって全身送達して、Ｔｒｅｇ抑制を全体的に低下させることができる。二重特異性標的化（例えば、ＣＤ４：ＣＤ２５、ＣＤ４：ＮＲＰ１、ＣＤ４：ＣＤ３９）を使用して、全身注射されたＩＦＭをｉｎ  ｖｉｖｏでＴｒｅｇ細胞に方向付けることができる。特異的細胞集団に標的化するこの概念は、実施例で記載される。これらのＩＦＭは、そうすると、Ｔｒｅｇ数を低減させ、および／またはＴｒｅｇ機能を低下させ、Ｔｒｅｇを炎症促進性または免疫原性状態にさせる。
【０３０２】
加えて、Ｔｒｅｇ特異的ＩＦＭを、抗腫瘍免疫細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで負荷し、トランスまたはパラ分泌シグナル伝達によってＴｒｅｇに送達することができる。この場合、抗腫瘍細胞は、Ｔｒｅｇ阻害性サイトカインの局所濃度を増加させることにより局所的抗抑制環境を生じさせる。これは、全体的なＴｒｅｇ機能不全とは対照的に局所的なＴｒｅｇ機能不全を促進することができる。
ＩＬ−１５分子
【０３０３】
一部の実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−１５分子、例えば、ＩＬ−１５、例えばヒトＩＬ−１５、の完全長、断片またはバリアントである。実施形態では、ＩＬ−１５分子は、例えば配列番号１０のアミノ酸配列を有する、野生型、ヒトＩＬ−５である。他の実施形態では、ＩＬ−１５分子は、例えば１つまたは複数のアミノ酸修飾を有する、ヒトＩＬ−５のバリアントである。
【０３０４】
一部の実施形態では、ＩＬ−１５バリアントは、例えば米国特許出願公開第２０１６／０１８４３９９号に記載されているように、４５、５１、５２または７２位に変異を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５バリアントは、Ｎ、ＳまたはＬからＤ、Ｅ、Ａ、ＹまたはＰのうちの１つへの置換を含むか、またはそれからなる。一部の実施形態では、変異は、Ｌ４５Ｄ、Ｌ４５Ｅ、Ｓ５１Ｄ、Ｌ５２Ｄ、Ｎ７２Ｄ、Ｎ７２Ｅ、Ｎ７２Ａ、Ｎ７２Ｓ、Ｎ７２Ｙ、またはＮ７２Ｐ（ヒトＩＬ−１５、配列番号１１、の配列に関して）から選択される。当業者には明確に理解されるが、位置のいずれの組合せが変異されていてもよい。一部の実施形態では、ＩＬ−１５バリアントは、２つまたはそれより多くの変異を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５バリアントは、３つまたはそれより多くの変異を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５バリアントは、４つ、５つ、または６つまたはそれより多くの変異を含む。
【０３０５】
一部の実施形態では、ＩＬ−１５分子は、変異、例えば、本明細書において配列番号１１で示されるようなＮ７２Ｄ点変異を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５分子は、配列番号１１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列であって、野生型ヒトＩＬ−１５と比べてＮ７２Ｄ変異を含み、かつＩＬ−１５Ｒα結合活性を有する、配列を含む。
【０３０６】
一部の実施形態では、ＩＬ−１５バリアントは、アミノ酸８、１０、６１、６４、６５、７２、１０１または１０８位（ヒトＩＬ−１５、配列番号１１、の配列に関して）に１つもしくは複数の変異を含むか、またはそれらからなる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５バリアントは、野生型ＩＬ−１５と比較して増加された活性を有する。一部の実施形態では、ＩＬ−１５バリアントは、野生型ＩＬ−１５と比較して減少された活性を有する。一部の実施形態では、ＩＬ−１５バリアントは、野生型ＩＬ−１５と比較しておおよそ２分の１、４分の１、１０分の１、２０分の１、４０分の１、６０分の１、１００分の１、または１００分の１未満に減少された活性を有する。一部の実施形態では、変異は、Ｄ８Ｎ、Ｋ１０Ｑ、Ｄ６１Ｎ、Ｄ６１Ｈ、Ｅ６４Ｈ、Ｎ６５Ｈ、Ｎ７２Ａ、Ｎ７２Ｈ、Ｑ１０１Ｎ、Ｑ１０８Ｎ、またはＱ１０８Ｈ（ヒトＩＬ−１５、配列番号１１、の配列に関して）から選択される。当業者には分かるであろうが、位置のいずれの組合せが変異されていてもよい。一部の実施形態では、ＩＬ−１５バリアントは、２つまたはそれより多くの変異を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５バリアントは、３つまたはそれより多くの変異を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５バリアントは、４つ、５つ、または６つまたはそれより多くの変異を含む。一部の実施形態では、ＩＬ−１５バリアントは、６１および６４位に変異を含む。一部の実施形態では、６１および６４位における変異は、Ｄ６１ＮまたはＤ６１Ｈ、およびＥ６４ＱまたはＥ６４Ｈである。一部の実施形態では、ＩＬ−１５バリアントは、６１および１０８位に変異を含む。一部の実施形態では、６１および１０８位における変異は、Ｄ６１ＮまたはＤ６１Ｈ、およびＱ１０８ＮまたはＱ１０８Ｈである。
【０３０７】
実施形態では、サイトカイン分子は、受容体ドメイン、例えば、サイトカイン受容体ドメインをさらに含む。一実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−１５受容体、または本明細書に記載されるようなその断片（例えば、ＩＬ−１５受容体アルファのＩＬ−１５結合ドメイン）を含む。一部の実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−１５分子、例えば、ＩＬ−１５または本明細書に記載されるようなＩＬ−１５スーパーアゴニストである。本明細書で使用される場合、サイトカイン分子の「スーパーアゴニスト」形態は、天然に存在するサイトカインと比較して、例えば少なくとも１０％、２０％、３０％、増加された活性を示す。例示的スーパーアゴニストは、ＩＬ−１５  ＳＡである。一部の実施形態では、ＩＬ−１５  ＳＡは、ＩＬ−１５と、ＩＬ−１５受容体、例えばＩＬ−１５受容体アルファのＩＬ−１５結合断片との、または例えば本明細書に記載されているような、そのＩＬ−１５結合断片との複合体を含む。他の実施形態では、サイトカイン分子は、免疫グロブリンＦｃまたは抗体分子と必要に応じてカップリングされている、受容体ドメイン、例えば、ＩＬ−１５Ｒアルファの細胞外ドメインを、さらに含む。実施形態では、サイトカイン分子は、ＷＯ２０１０／０５９２５３に記載されているような、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＩＬ−１５ＳＡ）である。一部の実施形態では、サイトカイン分子は、ＩＬ−１５と、例えば、Rubinsteinら  PNAS  103:24  p.  9166-9171  (2006)に記載されているような、Ｆｃに融合された可溶性ＩＬ−１５受容体アルファドメイン（例えば、ｓＩＬ−１５Ｒａ−Ｆｃ融合タンパク質）とを含む。
【０３０８】
ＩＬ−１５分子は、ポリペプチド、例えば、サイトカイン受容体、例えばサイトカイン受容体ドメイン、および第２の異種ドメインをさらに含むことができる。一実施形態では、異種ドメインは、免疫グロブリンＦｃ領域である。他の実施形態では、異種ドメインは、抗体分子、例えば、Ｆａｂ断片、ＦＡＢ２断片、ｓｃＦｖ断片、またはアフィボディ断片もしくは誘導体、例えばｓｄＡｂ（ナノボディ）断片、重鎖抗体断片である。一部の実施形態では、ポリペプチドは、第３の異種ドメインも含む。一部の実施形態では、サイトカイン受容体ドメインは、第２のドメインのＮ末端にあり、他の実施形態では、サイトカイン受容体ドメインは、第２のドメインのＣ末端にある。
【０３０９】
野生型ＩＬ−１５受容体アルファ配列ならびにこの配列の断片およびバリアントが下に示される。
【０３１０】
野生型ＩＬ−１５受容体アルファ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＩ２１１４１．１）：配列番号４１。
【０３１１】
野生型ＩＬ−１５受容体アルファ細胞外ドメイン（受託番号Ｑ１３２６１の一部分）：配列番号６３。
【０３１２】
アイソフォームＣＲＡ＿ｄ  ＩＬ−１５受容体アルファ細胞外ドメイン（受託番号ＥＡＷ８６４１８の一部分）：配列番号６４。
【０３１３】
野生型ＩＬ−１５受容体アルファ配列は、配列番号４１として上で提供されたものである。ＩＬ−１５受容体アルファは、細胞外ドメイン、２３アミノ酸膜貫通セグメント、および３９アミノ酸細胞質テールを含有する。ＩＬ−１５受容体アルファの細胞外ドメインは、配列番号６３として提供されたものである。
【０３１４】
他の実施形態では、ＩＬ−１５アゴニストを使用することができる。例えば、天然に存在するサイトカインの少なくとも１つの活性を惹起する、ＩＬ−１５受容体のアゴニスト、例えば、ＩＬ−１５受容体に対する抗体分子（例えば、アゴニスト抗体）。実施形態では、ＩＬ−１５受容体またはその断片は、ヒト、または非ヒト動物、例えば哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、からのものである。
ＩＬ−１５受容体アルファｓｕｓｈｉドメイン
【０３１５】
野生型ＩＬ−１５受容体アルファ配列は、配列番号６４として上で提供されたものである。ＩＬ−１５受容体アルファは、細胞外ドメイン、２３アミノ酸膜貫通セグメント、および３９アミノ酸細胞質テールを含有する。ｓｕｓｈｉドメインは、例えば、Bergamaschiら(2008),  JBC  VOL.  283,  NO.  7,  pp.  4189-4199;  Weiら(2001),  Journal  of  Immunology  167:277-282;  Schlunsら(2004)  PNAS  Vol  110  (15)  5616-5621、米国特許出願公開第２０１６／０１８４３９９号（これらの各々についての内容は、参照により本明細書に組み込まれる）を含む、文献に記載されている。
【０３１６】
ＩＬ−１５受容体アルファの細胞外ドメインは、配列番号６３として提供されたものである。ＩＬ−１５受容体アルファの細胞外ドメインは、ＩＬ−１５に結合する、ｓｕｓｈｉドメインと呼ばれるドメインを含む。補体制御タンパク質（ＣＣＰ）モジュールまたはショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）とも呼ばれる、一般的ｓｕｓｈｉドメインは、補体系の複数のメンバーを含む、いくつかのタンパク質に見られる、タンパク質ドメインである。ｓｕｓｈｉドメインは、おおよそ６０アミノ酸の配列ストレッチを構成する４個の高度に保存されたシステイン残基の第１および第４のシステインにより結合されている、ベータサンドイッチフォールドを採る（Norman,  Barlow,  ら  J  Mol  Biol.  1991  Jun  20;219(4):717-25）。ＩＬ−１５Ｒアルファにおけるｓｕｓｈｉドメインの第１および第４のシステインにより結合されているアミノ酸残基は、６２アミノ酸ポリペプチドを構成し、このポリペプチドを本発明者らは最小ドメイン（配列番号５２）と呼ぶ。最小ｓｕｓｈｉドメインのＮ末端およびＣ末端にＩＬ−１５Ｒアルファの追加のアミノ酸を含めること、例えば、Ｎ末端ＩｌｅおよびＴｈｒならびにＣ末端ＩｌｅおよびＡｒｇ残基の含有によって、結果として６５ｓｕｓｈｉアミノ酸ドメイン（配列番号９）が得られる。
【０３１７】
本明細書に記載のｓｕｓｈｉドメインは、野生型ｓｕｓｈｉドメインと比べて１つまたは複数の変異を含み得る。例えば、ＩＬ−１５Ｒａの残基７７は、野生型遺伝子ではロイシンである（および配列番号４１中に下線が引かれている）が、これをイソロイシンに変異（Ｌ７７Ｉ）させることができる。したがって、Ｌ７７Ｉ（配列番号４１の野生型ＩＬ−１５Ｒａを参照する番号付けで）を含む最小ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号６５として提供される。Ｌ７７Ｉ（配列番号４１の野生型ＩＬ−１５Ｒａを参照する番号付けで）を含む伸長ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号６６として提供される。
最小ｓｕｓｈｉドメイン、野生型：
ＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣ（配列番号５２）
伸長ｓｕｓｈｉドメイン、野生型：
ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲ（配列番号９）
最小ｓｕｓｈｉドメイン、Ｌ７７Ｉ：
ＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＩＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩ（配列番号６５）
伸長ｓｕｓｈｉドメイン、Ｌ７７Ｉ：
ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＩＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲ（配列番号６６）
【０３１８】
一部の実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号６３の６２〜１７１アミノ酸からなるか、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列であって、ＩＬ−１５結合活性を有する配列からなる。一部の実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号６３の６５〜１７１アミノ酸からなるか、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列であって、ＩＬ−１５結合活性を有する配列からなる。一部の実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号６３の最大１７１アミノ酸からなるか、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列であって、ＩＬ−１５結合活性を有する配列からなる。一部の実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号６３の６２〜１７１、６２〜１６０、６２〜１５０、６２〜１４０、６２〜１３０、６２〜１２０、６２〜１１０、６２〜１００、６２〜９０、６２〜８０、６２〜７０、６５〜１７１、６５〜１６０、６５〜１５０、６５〜１４０、６５〜１３０、６５〜１２０、６５〜１１０、６５〜１００、６５〜９０、６５〜８０、もしくは６５〜７０アミノ酸からなるか、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列であって、ＩＬ−１５結合活性を有する配列からなる。一部の実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号６３の６２〜１７１、６２〜１６０、６２〜１５０、６２〜１４０、６２〜１３０、６２〜１２０、６２〜１１０、６２〜１００、６２〜９０、６２〜８０、６２〜７０、６５〜１７１、６５〜１６０、６５〜１５０、６５〜１４０、６５〜１３０、６５〜１２０、６５〜１１０、６５〜１００、６５〜９０、６５〜８０、もしくは６５〜７０アミノ酸からなる。一部の実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号９もしくは配列番号５２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【０３１９】
一部の実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号６３の６２〜１７１アミノ酸からなるか、またはそれと比べて最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個もしくは４０個の修飾（例えば、置換）を有する配列であって、ＩＬ−１５結合活性を有する配列からなる。一部の実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号５の最大１７１アミノ酸からなるか、またはそれと比べて最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個もしくは４０個の修飾（例えば、置換）を有する配列であって、ＩＬ−１５結合活性を有する配列からなる。一部の実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号６３の６２〜１７１、６２〜１６０、６２〜１５０、６２〜１４０、６２〜１３０、６２〜１２０、６２〜１１０、６２〜１００、６２〜９０、６２〜８０、６２〜７０、６５〜１７１、６５〜１６０、６５〜１５０、６５〜１４０、６５〜１３０、６５〜１２０、６５〜１１０、６５〜１００、６５〜９０、６５〜８０、もしくは６５〜７０アミノ酸からなるか、またはそれと比べて最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個もしくは４０個の修飾（例えば、置換）を有する配列であって、ＩＬ−１５結合活性を有する配列からなる。
【０３２０】
一部の実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号６３の少なくとも６２アミノ酸を含むか、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列であって、野生型ＩＬ−１５Ｒａと比べてＬ７７Ｉ変異を含み、かつＩＬ−１５結合活性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号６３の少なくとも６５アミノ酸を含むか、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列であって、野生型ＩＬ−１５Ｒａと比べてＬ７７Ｉ変異を含み、かつＩＬ−１５結合活性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号６３の一部分を含むか、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列であって、野生型ＩＬ−１５Ｒａと比べてＬ７７Ｉ変異を含み、かつＩＬ−１５結合活性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号９または配列番号５２のアミノ酸配列を含む。
【０３２１】
一部の実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号６３の少なくとも６２アミノ酸を含むか、またはそれと比べて最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個もしくは４０個の修飾（例えば、置換）を有する配列であって、野生型ＩＬ−１５Ｒａと比べてＬ７７Ｉ変異を含み、かつＩＬ−１５結合活性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号６６の一部分を含むか、またはそれと比べて最大１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個もしくは４０個の修飾（例えば、置換）を有する配列であって、野生型ＩＬ−１５Ｒａと比べてＬ７７Ｉ変異を含み、かつＩＬ−１５結合活性を有する配列を含む。
【０３２２】
実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号６３の少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、６２、６５、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０もしくは１６０の連続するアミノ酸を含むか、またはそれと比べてＬ７７Ｉ変異を有する配列を含む。実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは、配列番号６３の１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、１５０〜１６０、もしくは１６０〜１７０の連続するアミノ酸からなるか、またはそれと比べてＬ７７Ｉ変異を有する配列からなる。
【０３２３】
実施形態では、ｓｕｓｈｉドメインは、ヒトまたは非ヒト動物、例えば哺乳動物、例えば非ヒト霊長類からのｓｕｓｈｉドメインである。
【０３２４】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、第２の、異種ドメイン、例えば、ＦｃドメインまたはＦａｂドメインを有することができる。
【０３２５】
一部の実施形態では、ＩＬ−１５受容体を含むポリペプチドまたはその断片は、Ｆｃドメインを含む。実施形態では、Ｆｃドメインは、エフェクター減弱Ｆｃドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ２  Ｆｃドメイン、例えば、配列番号５４のヒトＩｇＧ２  Ｆｃドメインまたはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【０３２６】
実施形態では、エフェクター減弱Ｆｃドメインは、例えば、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、例えば、配列番号６７の野生型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、低下されたエフェクター活性を有する。一部の実施形態では、エフェクター活性は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を含む。実施形態では、エフェクター活性は、ＡＤＣＣアッセイにおいて、例えば、配列番号６７の野生型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％低下される。一部の実施形態では、エフェクター活性は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を含む。実施形態では、エフェクター活性は、ＣＤＣアッセイ、例えば、Armourら,  "Recombinant  human  IgG  molecules  lacking  Fc  gamma  receptor  I  binding  and  monocyte  triggering  activities."  Eur  J  Immunol  (1999)  29:2613-24"に記載されているＣＤＣアッセイにおいて、例えば、配列番号６７の野生型ＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％低下される。
【０３２７】
一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号６７のＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含むか、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０３２８】
一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号６８のＩｇＧ２定常領域もしくはその断片を含むか、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０３２９】
一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号５５のＩｇＧ２Ｄａ  Ｆｃドメインを含むか、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムを使用して、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ変異の一方または両方を含む。実施形態では、Ｆｃドメインは、Armourら  "Recombinant  human  IgG  molecules  lacking  Fc  gamma  receptor  I  binding  and  monocyte  triggering  activities."  Eur  J  Immunol  (1999)  29:2613-24に記載されているものである。
【０３３０】
一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、二量体化活性を有する。
【０３３１】
一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧドメイン、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。
【０３３２】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、配列番号５６の配列（ｓｕｓｈｉ−ＩｇＧ２Ｄａ−Ｆｃ）、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、タンパク質を含む。
【０３３３】
一部の実施形態では、本明細書に（例えば、配列番号９で）記載されるｓｕｓｈｉドメインと、本明細書に記載されるＦｃドメイン、例えばＩｇＧ２  Ｆｃドメイン（例えば、配列番号５４、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列）とを含む、ＩＦＭ。一部の実施形態では、ＩＦＭは、配列番号９のｓｕｓｈｉドメインと、本明細書に記載されるＦｃドメイン、例えばＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、例えば、配列番号６７のＦｃドメイン、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列とを含む。一部の実施形態では、ＩＦＭは、配列番号９のｓｕｓｈｉドメインと、ＩｇＧ２  Ｆｃドメイン、例えば、配列番号５４のＦｃドメイン、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列とを含む。一部の実施形態では、ＩＦＭは、配列番号９のｓｕｓｈｉドメインと、ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン、例えば、配列番号６７のＦｃドメイン、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列とを含む。
【０３３４】
一部の実施形態では、ＩＦＭは、配列番号９のｓｕｓｈｉドメインと、配列番号５６のＩｇＧ２Ｄａ  Ｆｃドメイン、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列とを含む。一部の実施形態では、ＩＦＭは、配列番号９のｓｕｓｈｉドメインと、配列番号５６のＩｇＧ２Ｄａ  Ｆｃドメイン、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列とを含む。一部の実施形態では、ＩＦＭは、配列番号５６の配列、またはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、ｓｕｓｈｉ−ＩｇＧ２Ｄａ−Ｆｃタンパク質を含む。
【０３３５】
実施形態では、ＩＬ−１５分子は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際出願公開番号ＷＯ２０１７／０２７８４３に記載されている分子である。
ＩＬ−１２分子
【０３３６】
インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、２つの別々の遺伝子であるＩＬ−１２ＡとＩＬ−１２Ｂによってそれぞれコードされるｐ３５およびｐ４０サブユニットで構成されている、ヘテロ二量体サイトカインである。ＩＬ−１２は、ナイーブＴ細胞のＴｈ１細胞への分化に関与する。ＩＬ−１２は、Ｔ細胞の成長および機能を刺激することができるＴ細胞刺激因子として公知である。ＩＬ−１２は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からのインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）の産生を刺激し、ＩＦＮ−γのＩＬ−４媒介抑制を低減させる。ＩＬ−１２を産生するＴ細胞は、ＩＬ−１２活性に関連する共受容体であるＣＤ３０を有する。
【０３３７】
ＩＬ−１２は、ＮＫ細胞およびＴリンパ球の活性に重要な役割を果たす。ＩＬ−１２は、ＮＫ細胞およびＣＤ８細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞傷害活性の増強を媒介する。ＮＫ細胞におけるＩＬ−２とＩＬ−１２のシグナル伝達の間にも関連性があるようである。ＩＬ−２は、ＮＫ細胞におけるＩＬ−１２シグナル伝達に関与する非常に重要なタンパク質の発現を維持する２つのＩＬ−１２受容体であるＩＬ−１２Ｒ−β１およびＩＬ−１２Ｒ−β２の発現を刺激する。機能的応答の増強は、ＩＦＮ−γ産生、および標的細胞の殺滅により実証される。
【０３３８】
ＩＬ−１２は、抗血管新生活性も有し、これは、ＩＬ−１２が、新たな血管の形成を阻止することができることを意味する。ＩＬ−１２は、インターフェロンガンマの産生を増加させることによってこれを行い、その結果として、誘導性タンパク質−１０（ＩＰ−１０またはＣＸＣＬ１０）と呼ばれるケモカインの産生を増加させる。次いで、ＩＰ−１０がこの抗血管新生効果を媒介する。免疫応答を誘導するその能力およびその抗血管新生活性のため、可能性のある抗がん薬としてＩＬ−１２を試験することに関心がもたれている。ＩＬ−１２と乾癬および炎症性腸疾患といった疾患との間には関連性があり、この関連性は、処置に有用でありうる。
【０３３９】
ＩＬ−１２は、ＩＬ−１２Ｒ−β１およびＩＬ−１２Ｒ−β２により形成されたヘテロ二量体受容体である、ＩＬ−１２受容体と結合する。ＩＬ−１２Ｒ−β２は、活性化Ｔ細胞上に見出され、Ｔｈ１細胞発生を促進するサイトカインにより刺激され、Ｔｈ２細胞発生を促進するサイトカインにより阻害されるので、ＩＬ−１２機能に主要な役割を果たすと考えられる。結合すると、ＩＬ−１２Ｒ−β２は、チロシンリン酸化され、キナーゼであるＴｙｋ２およびＪａｋ２のための結合部位を提供する。これらのキナーゼは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞におけるＩＬ−１２シグナル伝達に関与するＳＴＡＴ４などの非常に重要な転写因子タンパク質を活性化するのに重要である。
【０３４０】
ＩＬ−１２は、固形腫瘍における抗炎症環境を再形成する可能性がある、強力なサイトカインである。しかし、その臨床的有用性は、可溶性投与（soluble  administration）からの、またはＩＬ−１２を分泌するように操作された養子移入Ｔ細胞からの、両方からの、重度の毒性により制限されてきた。本明細書で開示されるテザー融合体（ＴＦ）は、サイトカイン用量および生体内分布の制御の向上を可能にする。ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル系では、ＩＬ１２−ＴＦサイトカインは、Ｔ細胞の表面へのＩＬ−１２の持続的負荷、ならびに継続的なＴ細胞の活性化およびＩＬ−１２受容体の下流へのシグナル伝達をもたらす。その結果として、これは、自然免疫および適応免疫を活性化することができる。
【０３４１】
テザー融合体におけるＩＬ−１２は、ＩＬ−１２ＡサブユニットとＩＬ−１２Ｂサブユニットの両方を含有する一本鎖の形態であってよい。一部の実施形態では、ＩＬ−１２は、非一本鎖として（すなわち、ＩＬ−１２の天然形態である、ＩＬ−１２ＡとＩＬ−１２Ｂのヘテロ二量体として）存在し得る。例えば、ＴＦは、３つのタンパク質サブユニット（Ｆａｂ重鎖、ＩＬ−１２Ａ（またはＩＬ−１２Ｂ）を有するＦａｂ軽鎖、およびＩＬ−１２Ｂ（またはＩＬ−１２Ａ））の共発現によって作製されうる。
免疫細胞標的化部分
【０３４２】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される免疫刺激性融合分子は、免疫細胞標的化部分を含む。免疫細胞標的化部分は、抗体分子（例えば、本明細書に記載の抗原結合性ドメイン）、受容体もしくは受容体断片、またはリガンドもしくはリガンド断片、またはこれらの組合せから選択することができる。一部の実施形態では、免疫細胞標的化部分は、免疫細胞（例えば、免疫細胞の表面に存在する分子、例えば抗原）と会合する、例えば、結合する。ある特定の実施形態では、免疫細胞標的化部分は、本明細書で開示される免疫刺激性融合分子を標的とする、例えば、それを免疫（例えば、リンパ球、例えばＴ細胞）に誘導する。
【０３４３】
一部の実施形態では、免疫細胞標的化部分は、抗体分子（例えば、完全抗体（例えば、少なくとも１つ、好ましくは２つ、の完全重鎖と、少なくとも１つ、好ましくは２つ、の完全軽鎖とを含む抗体）、または抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ（ｄＡｂ）、二価抗体、または二重特異性抗体もしくはその断片、その単一ドメインバリアント、またはラクダ抗体））、非抗体スキャフォールド、またはＣＤ４５受容体と結合するリガンドから選択される。
【０３４４】
一部の実施形態では、免疫細胞標的化部分は、免疫細胞の表面上に発現される、残留性の、存在量が多い、および／またはリサイクリング細胞表面受容体および分子に、ＩＦＭを向かわせる。これらの受容体／分子は、例えば、ＣＤ４５（例えば、ＢＣ８（ＡＣＣＴ：ＨＢ−１０５０７）、９．４（ＡＴＴＣ：ＨＢ−１０５０８）、ＧＡＰ８．３（ＡＴＴＣ：ＨＢ−１２）、モノクローナル抗体を介して）、ＣＤ８（ＯＫＴ８モノクローナル抗体を介して）、膜貫通型インテグリン分子ＣＤ１１ａ（ＭＨＭ２４モノクローナル抗体を介して）またはＣＤ１８（キメラ１Ｂ４モノクローナル抗体を介して）を含む。他の好ましい実施形態では、標的化部分は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２からなる群から選択されるマーカーに向けられる。一部の実施形態では、免疫細胞標的化部分は、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１９７、ＣＤ３８、ＣＤ２７、ＣＤ１９６、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＤ８４、ＣＤ２２９、ＣＣＲ１、ＣＣＲ５、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８またはＣＣＲ１０と結合する抗体分子、例えば、抗原結合性ドメイン、非抗体スキャフォールド、またはリガンドから選択される。
【０３４５】
白血球共通抗原としても公知の「ＣＤ４５」は、ヒトＣＤ４５タンパク質および種、アイソフォーム、およびそれらの他の配列バリアントを指す。したがって、ＣＤ４５は、ネイティブ、完全長タンパク質であることもあり、またはネイティブタンパク質の少なくとも１つの生物活性を保持する、短縮化断片もしくは配列バリアント（例えば、天然に存在するアイソフォームもしくは組換えバリアント）であることもある。ＣＤ４５は、受容体連結型タンパク質チロシンホスファターゼであり、これは、白血球に発現され、これらの細胞の機能に重要な役割を果たす（参照により本明細書に組み込まれる、Altin,  JG  (1997)  Immunol  Cell  Biol.75(5):430-45において概説されている）。例えば、ＣＤ４５の細胞外ドメインは、Ｔ細胞上にいくつかの異なるアイソフォームで発現され、発現される特定のアイソフォーム（複数可）は、細胞の特定の亜集団、それらの成熟状態、および抗原露出に依存する。ＣＤ４５の発現は、ＴＣＲによるＴ細胞の活性化に重要であり、異なるＣＤ４５アイソフォームはＴ細胞活性化に対する異なる支持能力を表す。
【０３４６】
「ＣＤ４」は、Ｔヘルパー細胞、単球、マクロファージおよび樹状細胞などの、免疫細胞の表面に見出される、ＭＨＣクラスＩＩの（ＴＣＲ、Ｔ細胞受容体、との）共受容体である。ＣＤ４  Ｔ細胞は、病原体への調節された有効な免疫応答を達成するのに極めて重要である。ナイーブＣＤ４  Ｔ細胞は、抗原−ＭＨＣ複合体との相互作用後に活性化され、主として微小環境のサイトカイン環境に依存して、特異的サブタイプに分化する。古典的Ｔヘルパー１およびＴヘルパー２に加えて、他のサブセットが同定されており、そのようなサブセットとしては、Ｔヘルパー１７、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、濾胞性ヘルパーＴ細胞、およびＴヘルパー９が挙げられ、これらの各々が特有のサイトカインプロファイルを有する。ＣＤ４  Ｔ細胞は、自然免疫系の細胞、Ｂリンパ球、細胞傷害性Ｔ細胞はもちろん、非免疫細胞の活性化に及ぶ、複数の機能を実行し、免疫反応の抑制にも非常に重要な役割を果たす。例えば、Rishi  Vishalら  "CD4+  T  Cells:  Differentiation  and  Functions,"  Clinical  and  Developmental  Immunology,  vol.  2012,  Article  ID  925135,  12  pages,  2012.  doi:10.1155/2012/925135を参照されたい。
【０３４７】
「ＣＤ８」は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の共受容体としての機能を果たす、膜貫通糖タンパク質である。ＴＣＲと同様に、ＣＤ８は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と結合するが、クラスＩのＭＨＣタンパク質に特異的である。このタンパク質には、アルファとベータという２つのアイソフォームがあり、これらの各々が異なる遺伝子によりコードされる。ヒトの場合、両方の遺伝子は、２ｐ１２位の２番染色体上に位置する。ＣＤ８共受容体は、主として、細胞傷害性Ｔ細胞の表面上に発現されるが、ナチュラルキラー細胞、皮質胸腺細胞、および樹状細胞上にも見出され得る。ＣＤ８は、Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫および低色素性菌状息肉症に発現される。機能するために、ＣＤ８は、１対のＣＤ８鎖からなる二量体を形成する。ＣＤ８の最も一般的な形態は、ＣＤ８−αおよびＣＤ８−β鎖で構成されており、これら両方は、細いストークと細胞内テールとによって膜に接続されている免疫グロブリン可変（ＩｇＶ）様細胞外ドメインを有する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ８−α鎖のあまり一般的でないホモ二量体も、一部の細胞上に発現される。ＣＤ８−αの細胞外ＩｇＶ様ドメインは、クラスＩのＭＨＣ分子のα３部分と相互作用する。この親和性により、細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞受容体と標的細胞は、抗原特異的活性化の間に密接に結合された状態で保たれる。ＣＤ８表面タンパク質を有する細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＤ８  Ｔ細胞と呼ばれる。例えば、Leahy  DJら  (March  1992).  "Crystal  structure  of  a  soluble  form  of  the  human  T  cell  coreceptor  CD8  at  2.6  A  resolution".  Cell.68  (6):  1145-62;  Gao  Gら(2000).  "Molecular  interactions  of  coreceptor  CD8  and  MHC  class  I:  the  molecular  basis  for  functional  coordination  with  the  T-cell  receptor".  Immunol  Today.  21  (12):  630-6；およびDevine  Lら(1999)."Orientation  of  the  Ig  domains  of  CD8  alpha  beta  relative  to  MHC  class  I".J  Immunol.162  (2):  846-51を参照されたい。
【０３４８】
「インテグリンアルファＬ（ＩＴＧＡＬ）」および「ＬＦＡ−１のアルファサブユニット」としても公知の、「ＣＤ１１ａ」は、ＩＣＡＭ−１との相互作用により細胞間接着をもたらす膜糖タンパク質である。遺伝子ＩＴＧＡＬは、インテグリンアルファＬ鎖をコードする。インテグリンは、アルファ鎖およびベータ鎖で構成されているヘテロ二量体内在性膜タンパク質である。このＩドメイン含有アルファインテグリンは、ベータ２鎖（ＩＴＧＢ２）と結びついて、インテグリンリンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）を形成し、これは、すべての白血球上に発現される。ＬＦＡ−１は、そのリガンドであるＩＣＡＭ  １〜３（細胞間接着分子１〜３）との相互作用によって白血球細胞間接着に重要な役割（importantrole）を果たし、リンパ球共刺激シグナル伝達においても機能する。異なるアイソフォームをコードする２つの転写物バリアントが、この遺伝子について見出されている。例えば、Cornwell  RDら  Description  of  the  leukocyte  function-associated  antigen  1  (LFA-1  or  CD11a)  promoter.  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America.  1993;90(9):4221-4225；およびBose  TOら  CD11a  Regulates  Effector  CD8  T  Cell  Differentiation  and  Central  Memory  Development  in  Response  to  Infection  with  Listeria  monocytogenes.  Flynn  JL,  ed.  Infection  and  Immunity.  2013;81(4):1140-1151.  doi:10.1128/IAI.00749-12を参照されたい。
【０３４９】
インテグリンベータ２鎖（ＩＴＧＢ２）としても公知の「ＣＤ１８」は、４つの異なる構造：ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａと対合される）；マクロファージ−１抗原（ＣＤ１１ｂと対合される）；インテグリンアルファＸベータ２（ＣＤ１１ｃと対合される）、およびインテグリンアルファＤベータ２（ＣＤ１１ｄと対合される）、のベータサブユニットである。ＣＤ１８が欠けているｎヒトは、血液から組織への白血球血管外遊出の欠如により定義される疾患である、白血球接着不全症を引き起こす。ベータ２インテグリンは、可溶性形態でも見つかっている。可溶性ベータ２インテグリンは、リガンド結合性であり、血漿レベルは、自己免疫疾患の脊椎関節炎では疾患活動性と逆相関する。例えば、Mazzone  A1  ら  Leukocyte  CD11/CD18  integrins:  biological  and  clinical  relevance.  Haematologica.1995  Mar-Apr;80(2):161-75；およびGjelstrupら(8  September  2010).  "Shedding  of  Large  Functionally  Active  CD11/CD18  Integrin  Complexes  from  Leukocyte  Membranes  during  Synovial  Inflammation  Distinguishes  Three  Types  of  Arthritis  through  Differential  Epitope  Exposure".  The  Journal  of  Immunology.  185  (7):  4154-4168を参照されたい。
【０３５０】
「ＣＤ２０」は、細胞膜内にカルシウムチャネルを形成して細胞活性化に必要なカルシウムの流入を可能にする、Ｂ細胞上に見出されるＩＩＩ型膜貫通タンパク質であって、Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、およびＢ細胞慢性リンパ球性白血病において発現されるＩＩＩ型膜貫通タンパク質である。これらの疾患の治療に重要な、ＣＤ２０に対する抗体として、例えば、リツキシマブおよびオファツムマブが存在し、さらにいくつかが開発中である。同様に、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であるオクレリズマブは、多発性硬化症について治験中である。例えば、Cragg  MSら  (2005)."The  biology  of  CD20  and  its  potential  as  a  target  for  mAb  therapy".  Current  Directions  in  Autoimmunity.  Current  Directions  in  Autoimmunity.  8:  140-74；およびKuijpers  TWら  (January  2010).  "CD20  deficiency  in  humans  results  in  impaired  T  cell-independent  antibody  responses".  The  Journal  of  Clinical  Investigation.  120  (1):  214-22を参照されたい。
チェックポイントインヒビターを標的とする部分  
【０３５１】
一部の実施形態では、免疫刺激性部分または標的化部分（例えば、抗体分子）は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／０１８４３９９号に記載されているように、免疫抑制因子の阻害剤、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、阻害性ＫＩＲ、ＣＤ２７６、ＶＴＣＮ１、ＢＴＬＡ／ＨＶＥＭ、ＨＡＶＣＲ２およびＡＤＯＲＡ２Ａなどのチェックポイントインヒビターの阻害剤に結合する。実施形態では、チェックポイントインヒビターは、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞上に存在する。
【０３５２】
一部の実施形態では、免疫刺激性部分または標的化部分は、ＰＤ−１に結合する。例えば、ピディリズマブおよび他の抗ＰＤ−１抗体は、Rosenblatt,  J.  ら  (2011)  J  Immunotherapy  34(5):  409-18、米国特許第７，６９５，７１５号、米国特許第７，３３２，５８２号、および米国特許第８，６８６，１１９号において開示されており、それらの全体が参照により組み込まれる。ＭＥＤＩ０６８０および他の抗ＰＤ−１抗体は、米国特許第９，２０５，１４８号およびＷＯ２０１２／１４５４９３に開示されており、それらの全体が参照により組み込まれる。さらなる抗ＰＤ−１抗体としては、例えば、ＷＯ２０１０／０２７８２７、ＷＯ２０１１／０６６３４２、ＷＯ２０１５／１１２８００、ＷＯ２０１６／０９２４１９、ＷＯ２０１５／０８５８４７、ＷＯ２０１４／１７９６６４、ＷＯ２０１４／１９４３０２、ＷＯ２０１４／２０９８０４、ＷＯ２０１５／２００１１９、米国特許第８，７３５，５５３号、米国特許第７，４８８，８０２号、米国特許第８，９２７，６９７号、米国特許第８，９９３，７３１号、および米国特許第９，１０２，７２７号に記載されているものが挙げられ、それらの全体が参照により組み込まれる。
【０３５３】
一部の実施形態では、免疫刺激性部分または標的化部分は、ＰＤ−Ｌ１に結合する。例えば、アテゾリズマブおよび他の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、その全体が参照により組み込まれる米国特許第８，２１７，１４９号において開示されている。アベルマブおよび他の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、その全体が参照により組み込まれるＷＯ２０１３／０７９１７４において開示されている。デュルバルマブおよび他の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、その全体が参照により組み込まれる米国特許第８，７７９，１０８号において開示されている。ＢＭＳ−９３６５５９および他の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号およびＷＯ２０１５／０８１１５８に開示されており、それらの全体が参照により組み込まれる。さらなる抗ＰＤ−Ｌ１抗体としては、例えば、ＷＯ２０１５／１８１３４２、ＷＯ２０１４／１０００７９、ＷＯ２０１６／０００６１９、ＷＯ２０１４／０２２７５８、ＷＯ２０１４／０５５８９７、ＷＯ２０１５／０６１６６８、ＷＯ２０１３／０７９１７４、ＷＯ２０１２／１４５４９３、ＷＯ２０１５／１１２８０５、ＷＯ２０１５／１０９１２４、ＷＯ２０１５／１９５１６３、米国特許第８，１６８，１７９号、米国特許第８，５５２，１５４号、米国特許第８，４６０，９２７号、および米国特許第９，１７５，０８２号に記載されているものが挙げられ、それらの全体が参照により組み込まれる。
【０３５４】
一部の実施形態では、免疫刺激性部分または標的化部分は、ＬＡＧ−３に結合する。ＬＡＧ−３抗体、例えば、ＢＭＳ−９８６０１６（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ＴＳＲ−０３３（Ｔｅｓａｒｏ）、ＭＫ−４２８０（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ）、またはＲＥＧＮ３７６７（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）は、当技術分野において報告されている。ＩＭＰ７３１および他の抗ＬＡＧ−３抗体は、ＷＯ２００８／１３２６０１および米国特許第９，２４４，０５９号において開示されており、それらの全体が参照により組み込まれる。さらなる抗ＬＡＧ−３抗体としては、例えば、ＷＯ２００８／１３２６０１、ＷＯ２０１０／０１９５７０、ＷＯ２０１４／１４０１８０、ＷＯ２０１５／１１６５３９、ＷＯ２０１５／２００１１９、ＷＯ２０１６／０２８６７２、米国特許第９，２４４，０５９号、米国特許第９，５０５，８３９号に記載されているものが挙げられ、それらの全体が参照により組み込まれる。
【０３５５】
一部の実施形態では、免疫刺激性部分または標的化部分は、ＴＩＭ−３に結合する。一部の実施形態では、ＴＩＭ−３標的化部分は、ＴＳＲ−０２２（Ｔｅｓａｒｏ）、またはＬＹ３３２１３６７（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）から選択される。ＡＰＥ５１３７、ＡＰＥ５１２１、および他の抗ＴＩＭ−３抗体は、ＷＯ２０１６／１６１２７０において開示されており、その全体が参照により組み込まれる。さらなる抗ＴＩＭ−３抗体としては、例えば、ＷＯ２０１６／１１１９４７、ＷＯ２０１６／０７１４４８、ＷＯ２０１６／１４４８０３、米国特許第８，５５２，１５６号、米国特許第８，８４１，４１８号および米国特許第９，１６３，０８７号に記載されているものが挙げられ、それらの全体が参照により組み込まれる。
【０３５６】
一部の実施形態では、免疫刺激性部分または標的化部分は、ＣＴＬＡ−４に結合する。抗体イピリムマブおよび他の抗ＣＴＬＡ−４抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，９８４，７２０号において開示されている。抗体トレメリムマブおよび他の抗ＣＴＬＡ−４抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４１１，０５７号において開示されている。
抗体分子
【０３５７】
本明細書に記載される免疫刺激性融合分子は、１つまたは複数の抗体分子を含むことができる。例えば、免疫細胞エンゲージャーは、抗体分子を含むことができる。一実施形態では、抗体分子は、がん抗原、例えば、腫瘍抗原または間質抗原と結合する。一部の実施形態では、がん抗原は、例えば、哺乳動物、例えばヒト、がん抗原である。他の実施形態では、抗体分子は、免疫細胞抗原、例えば、哺乳動物、例えばヒト、免疫細胞抗原と結合する。例えば、抗体分子は、がん抗原または免疫細胞抗原上のエピトープ、例えば、線状または立体構造エピトープ、と特異的に結合する。
【０３５８】
ある実施形態では、抗体分子は、単一特異性抗体分子であり、単一のエピトープに結合する。例えば、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を有し、これらの各々が同じエピトープに結合する、単一特異性抗体。
【０３５９】
別の実施形態では、抗体分子は、多重特異性抗体分子であり、例えば、それは、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、この複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列の第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対する結合特異性を有し、この複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列の第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対する結合特異性を有する。ある実施形態では、第１および第２のエピトープは、同じ抗原上、例えば、同じタンパク質（または多量体タンパク質のサブユニット）上にある。ある実施形態では、第１および第２のエピトープは、重複する。ある実施形態では、第１および第２のエピトープは、重複しない。実施形態では、第１および第２のエピトープは、異なる抗原上、例えば、異なるタンパク質（または多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。ある実施形態では、多重特異性抗体分子は、第３、第４または第５の免疫グロブリン可変ドメインを含む。ある実施形態では、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子、三重特異性抗体分子、または四重特異性抗体分子である。
【０３６０】
ある実施形態では、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、２つ以下の抗原に対する特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列、および第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列を、特徴とする。ある実施形態では、第１および第２のエピトープは、同じ抗原上、例えば、同じタンパク質（または多量体タンパク質のサブユニット）上にある。ある実施形態では、第１および第２のエピトープは、重複する。ある実施形態では、第１および第２のエピトープは、重複しない。ある実施形態では、第１および第２のエピトープは、異なる抗原上、例えば、異なるタンパク質（または多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。ある実施形態では、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する、重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列と、第２のエピトープに対する結合特異性を有する、重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列とを含む。ある実施形態では、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有するハーフ抗体と、第２のエピトープに対する結合特異性を有するハーフ抗体とを含む。ある実施形態では、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有するハーフ抗体またはその断片と、第２のエピトープに対する結合特異性を有するハーフ抗体またはその断片とを含む。ある実施形態では、二重特異性抗体分子は、第１のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖもしくはＦａｂまたはその断片と、第２のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖもしくはＦａｂまたはその断片とを含む。
【０３６１】
ある実施形態では、抗体分子は、ダイアボディ、および一本鎖分子、ならびに抗体の抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）を含む。例えば、抗体分子は、重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列（本明細書ではＶＨと略記される）、および軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列（本明細書ではＶＬと略記される）を含むことができる。ある実施形態では、抗体分子は、重鎖および軽鎖を含むか、またはそれらからなる（本明細書では、ハーフ抗体と呼ばれる）。別の例では、抗体分子は、２つの重（Ｈ）鎖可変ドメイン配列および２つの軽（Ｌ）鎖可変ドメイン配列を含み、それによって２つの抗原結合性部位を形成し、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆｖ、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、単一可変ドメイン抗体、ダイアボディ（Ｄａｂ）（二価および単一または二重特異性）、トリアボディ（三価および単一または多重特異性）、および全抗体の修飾により産生されうるキメラ抗体もしくはヒト化抗体、または組換えＤＮＡ技術を使用して新規に合成されたものを含む。これらの機能性抗体断片は、それらのそれぞれの抗原または受容体と選択的に結合する能力を保持する。抗体および抗体断片は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥを含むがこれらに限定されない、抗体のいずれのクラスからのものであってもよく、抗体のいずれのサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）からのものであってもよい。抗体分子の調製物は、モノクローナルであってもよく、またはポリクローナルであってもよい。抗体分子はまた、ヒト抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲグラフト抗体、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成された抗体であってもよい。抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から選択される、重鎖定常領域を有することができる。抗体は、例えば、カッパまたはラムダから選択される、軽鎖を有することもできる。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書では用語「抗体」と交換可能に使用される。
【０３６２】
抗体分子の抗原結合性断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなる、ダイアボディ（ｄＡｂ）断片；（ｖｉ）ラクダまたはラクダ化可変ドメイン；（ｖｉｉ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、Birdら(1988)  Science  242:423-426；およびHuston  ら(1988)  Proc.Natl.Acad.Sci.USA  85:5879-5883を参照されたい）；（ｖｉｉｉ）単一ドメイン抗体が挙げられる。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技法を使用して得られ、断片は、インタクト抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
【０３６３】
抗体分子は、インタクト分子はもちろん、それらの機能性断片も含む。抗体分子の定常領域を、抗体の特性を修飾するために（例えば、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基数、エフェクター細胞機能または補体機能のうちの１つまたは複数を増加または減少させるために）、変更すること、例えば、変異させることができる。
【０３６４】
抗体分子は、単一ドメイン抗体であってよい。単一ドメイン抗体は、その相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体を含むことができる。例としては、重鎖抗体、天然に軽鎖を欠く抗体、従来の４鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、操作された抗体、および抗体に由来するもの以外の単一ドメインスキャフォールドが挙げられるが、これらに限定されない。単一ドメイン抗体は、当技術の単一ドメイン抗体のいずれであってもよく、またはいずれの将来の単一ドメイン抗体であってもよい。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギおよびウシを含むがこれらに限定されない、いずれの種に由来してもよい。本開示の別の態様によれば、単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠く重鎖抗体として公知の、天然に存在する単一ドメイン抗体である。そのような単一ドメイン抗体は、例えば、ＷＯ９４０４６７８において開示されている。明確にするために、軽鎖を天然に欠く重鎖抗体に由来するこの可変ドメインは、４鎖免疫グロブリンの従来のＶＨと区別するために、本明細書ではＶＨＨまたはナノボディとして知られる。そのようなＶＨＨ分子は、Ｃａｍｅｌｉｄａｅ種において、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコにおいて産生される抗体に由来しうる。Ｃａｍｅｌｉｄａｅ以外の他の種が、天然に軽鎖を欠く重鎖抗体を産生し得、そのようなＶＨＨは、本開示の範囲内である。
【０３６５】
抗体分子は、非抗体スキャフォールドおよび抗体模倣物を含むことができる。例示的非抗体スキャフォールドとしては、リポカリン（例えば、アンチカリン）、アフィボディ、フィブロネクチン（例えば、モノボディまたはアドネクチン）、ノッチン、アンキリンリピート（例えば、ＤＡＲＰｉｎ）、およびＡドメイン（例えば、アビマー）が挙げられる。
【０３６６】
ＶＨおよびＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲまたはＦＷ）と呼ばれる、より保存されている領域が散在している、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に、細分することができる。
【０３６７】
フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、いくつかの方法によって正確に定義されている（Kabat,  E.  A.,  ら(1991)  Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,  Fifth  Edition,  U.S.  Department  of  Health  and  Human  Services,  NIH  Publication  No.  91-3242;  Chothia,  C.  ら(1987)  J.  Mol.Biol.196:901-917；およびＯｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用されているＡｂＭ定義を参照されたい）。一般に、例えば、Protein  Sequence  and  Structure  Analysis  of  Antibody  Variable  Domains.In:  Antibody  Engineering  Lab  Manual  (Ed.:  Duebel,  S.  and  Kontermann,  R.,  Springer-Verlag,  Heidelberg)を参照されたい。
【０３６８】
用語「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」は、本明細書で使用される場合、抗原特異性および結合親和性を付与する、抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。一般に、各重鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）があり、各軽鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）がある。
【０３６９】
所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列境界は、いくつかの公知スキームのいずれかを使用して決定することができ、そのようなスキームには、Kabatら(1991),  "Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,"  5th  Ed.Public  Health  Service,  National  Institutes  of  Health,  Bethesda,  MDにより記載されたもの（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Al-Lazikaniら,  (1997)  JMB  273,927-948により記載されたもの（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム（numbering  scheme））が含まれる。本明細書で使用される場合、「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム（number  scheme）に従って定義されるＣＤＲは、「超可変ループ」と呼ばれることもある。
【０３７０】
例えば、Ｋａｂａｔの下では、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）におけるＣＤＲアミノ酸残基は、３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）におけるＣＤＲアミノ酸残基は、２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）と番号付けされる。Ｃｈｏｔｈｉａの下では、ＶＨにおけるＣＤＲアミノ酸は、２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５６（ＨＣＤＲ２）および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ、ＶＬにおけるアミノ酸残基は、２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）と番号付けされる。
【０３７１】
各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを通常は含み、これらは、アミノ末端からカルボキシ末端へ次の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【０３７２】
抗体分子は、ポリクローナル抗体であってもよく、またはモノクローナル抗体であってもよい。
【０３７３】
用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書で使用される場合、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一結合特異性および親和性を表す。モノクローナル抗体を、ハイブリドーマ技術により生じさせることができ、またはハイブリドーマ技術を使用しない方法（例えば、組換え法）により生じさせることができる。
【０３７４】
抗体を、組換えにより産生することができ、例えば、ファージディスプレイによりまたはコンビナトリアル法により産生することができる。
【０３７５】
抗体を生成するためのファージディスプレイおよびコンビナトリアル法は、当技術分野において（例えば、Ｌａｄｎｅｒら米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇら国際公開番号ＷＯ９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒら国際公開番号ＷＯ９１／１７２７１；Ｗｉｎｔｅｒら国際公開番号ＷＯ９２／２０７９１；Ｍａｒｋｌａｎｄら国際公開番号ＷＯ９２／１５６７９；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら国際公開番号ＷＯ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら国際公開番号ＷＯ９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄら国際公開番号ＷＯ９２／０９６９０；Ｌａｄｎｅｒら国際公開番号ＷＯ９０／０２８０９；Fuchsら  (1991)  Bio/Technology  9:1370-1372;  Hayら(1992)  Hum  Antibod  Hybridomas  3:81-85;  Huseら  (1989)  Science  246:1275-1281;  Griffthsら(1993)  EMBO  J  12:725-734;  Hawkinsら(1992)  J  Mol  Biol  226:889-896;  Clacksonら  (1991)  Nature  352:624-628;  Gramら(1992)  PNAS  89:3576-3580;  Garradら  (1991)  Bio/Technology  9:1373-1377;  Hoogenboomら  (1991)  Nuc  Acid  Res  19:4133-4137;およびBarbasら  (1991)  PNAS  88:7978-7982（これらのすべてについての内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように）公知である。
【０３７６】
一実施形態では、抗体は、完全ヒト抗体（例えば、ヒト免疫グロブリン配列から抗体を産生するように遺伝子操作されたマウスにおいて作製された抗体）であるか、または非ヒト抗体、例えば、齧歯動物（マウスもしくはラット）、ヤギ、霊長類（例えば、サル）、ラクダ抗体である。好ましくは、非ヒト抗体は、齧歯動物（マウスまたはラット抗体）である。齧歯動物抗体の産生方法は、当技術分野において公知である。
【０３７７】
ヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなく、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスを使用して、生成することができる。目的の抗原で免疫されたこれらのトランスジェニックマウスからの脾細胞は、ヒトタンパク質からのエピトープに対して特異的親和性を有するヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマを産生するために使用される（例えば、Ｗｏｏｄら国際出願ＷＯ９１／００９０６、ＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらＰＣＴ公開ＷＯ９１／１０７４１；Ｌｏｎｂｅｒｇら国際出願ＷＯ９２／０３９１８；Ｋａｙら国際出願９２／０３９１７；Lonberg,  N.  ら1994  Nature  368:856-859;  Green,  L.L.  ら  1994  Nature  Genet.  7:13-21;  Morrison,  S.L.  ら  1994  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.USA  81:6851-6855;  Bruggemanら  1993  Year  Immunol  7:33-40;  Tuaillonら  1993  PNAS  90:3720-3724;  Bruggemanら  1991  Eur  J  Immunol  21:1323-1326を参照されたい）。
【０３７８】
抗体分子は、可変領域、またはその一部分、例えばＣＤＲが、非ヒト生物、例えば、ラットまたはマウスにおいて生成されるものであってよい。キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、およびヒト化抗体は、本開示の範囲内である。非ヒト生物、例えば、ラットまたはマウスにおいて生成され、その後、例えば可変フレームワークまたは定常領域において、ヒトにおける抗原性を低下させるように修飾された、抗体分子は、本開示の範囲内である。例えば、本明細書で開示されるテザー融合体を作製するために、当技術分野において公知の技法を使用して９．４、４Ｂ２およびＢＣ８などの抗ヒトＣＤ４５抗体をヒト化することができる。
【０３７９】
「事実上ヒトの」タンパク質は、中和抗体応答、例えば、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を実質的に誘発しないタンパク質である。ＨＡＭＡは、いくつかの状況で、例えば、抗体分子が、例えば慢性または再発性の病状の処置の際に、反復投与される場合、問題のあるものでありうる。ＨＡＭＡ応答は、血清からの抗体排除増加のため（例えば、Salehら,  Cancer  Immunol.Immunother.,  32:180-190  (1990)を参照されたい）、およびまた潜在的アレルギー反応のため（例えば、LoBuglioら,  Hybridoma,  5:5117-5123  (1986)を参照されたい）、反復抗体投与を無効にする可能性がありうる。
【０３８０】
キメラ抗体（例えば、マウス可変ドメインとヒト定常ドメインとを含有する抗体）は、当技術分野において公知の組換えＤＮＡ技法により産生することができる（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Ａｋｉｒａら、欧州特許出願第１８４，１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．、欧州特許出願第１７１，４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願第１７３，４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、国際出願ＷＯ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙら米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願第１２５，０２３号；Betterら(1988  Science  240:1041-1043);  Liuら(1987)  PNAS  84:3439-3443;  Liuら,  1987,  J.  Immunol.139:3521-3526;  Sunら(1987)  PNAS  84:214-218;  Nishimuraら,  1987,  Canc.Res.47:999-1005;  Woodら(1985)  Nature  314:446-449；およびShaw  ら,  1988,  J.  Natl  Cancer  Inst.80:1553-1559を参照されたい）。
【０３８１】
ヒト化またはＣＤＲグラフト抗体は、ドナーＣＤＲで置き換えられた（免疫グロブリン重鎖およびまたは軽鎖の）少なくとも１つまたは２つ、しかし一般には３つすべてのレシピエントＣＤＲを有する。抗体は、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部分で置き換えられていることもあり、またはＣＤＲの一部のみが、非ヒトＣＤＲで置き換えられていることもある。置き換える必要があるのは、抗原への結合に必要とされる数のＣＤＲのみである。好ましくは、ドナーは、齧歯動物抗体、例えば、ラットまたはマウス抗体であり、レシピエントは、ヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークである。概して、ＣＤＲを提供する免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供する免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。一実施形態では、ドナー免疫グロブリンは、非ヒト（例えば、齧歯動物）である。アクセプターフレームワークは、天然に存在する（例えば、ヒト）フレームワークもしくはコンセンサスフレームワークであるか、またはそれと約８５％もしくはそれより高度に、好ましくは９０％、９５％、９９％もしくはそれより高度に同一の配列である。
【０３８２】
本明細書で使用される場合、用語「コンセンサス配列」は、関連のある配列のファミリーにおいて出現頻度が最も高いアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列を指す（例えば、Winnaker,  From  Genes  to  Clones  (Verlagsgesellschaft,  Weinheim,  Germany  1987)を参照されたい）。タンパク質のファミリー内のコンセンサス配列中の各位置は、ファミリー内でその位置における出現頻度が最も高いアミノ酸によって占有される。２つのアミノ酸が、同頻度で出現する場合、どちらかがコンセンサス配列に含まれていてもよい。「コンセンサスフレームワーク」は、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域を指す。
【０３８３】
抗体分子は、当技術分野において公知の方法によりヒト化することができる（例えば、Morrison,  S.  L.,  1985,  Science  229:1202-1207、Oiらによる1986,  BioTechniques  4:214、ならびにＱｕｅｅｎらによる米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号および米国特許第５，６９３，７６２号を参照されたく、これらのすべてについての内容は、これにより参照により組み込まれる）。
【０３８４】
ヒト化またはＣＤＲグラフト抗体分子は、免疫グロブリン鎖の１つ、２つまたはすべてのＣＤＲを置き換えることができる、ＣＤＲグラフティングまたはＣＤＲ置換によって、産生することができる。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；Jonesら  1986  Nature  321:552-525;  Verhoeyanら  1988  Science  239:1534;  Beidlerら  1988  J.  Immunol.  141:4053-4060；Ｗｉｎｔｅｒ米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたく、これらのすべてについての内容は、これにより参照により明示的に組み込まれる。Ｗｉｎｔｅｒは、本開示のヒト化抗体を調製するために使用することができるＣＤＲグラフティング方法を記載している（１９８７年３月２６日に出願された英国特許出願公開第２１８８６３８Ａ号、Ｗｉｎｔｅｒ米国特許第５，２２５，５３９号）。これらの内容は、参照により明示的に組み込まれる。
【０３８５】
特定のアミノ酸が置換、欠失または付加されたヒト化抗体分子も、本開示の範囲内である。ドナーからのアミノ酸を選択する基準は、米国特許第５，５８５，０８９号、例えば、米国特許第５，５８５，０８９号の第１２〜１６欄、例えば、米国特許第５，５８５，０８９号の第１２〜１６欄に記載されており、その内容は、これにより参照により組み込まれる。抗体をヒト化するための他の技法は、１９９２年１２月２３日に発行されたＰａｄｌａｎら欧州特許第５１９５９６号Ａ１に記載されている。
【０３８６】
抗体分子は、一本鎖抗体であることもある。一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を操作してもよい（例えば、Colcher,  D.  ら(1999)  Ann  N  Y  Acad  Sci  880:263-80;およびReiter,  Y.  (1996)  Clin  Cancer  Res  2:245-52を参照されたい）。一本鎖抗体を二量体化または多量体化して、同じ標的タンパク質の異なるエピトープに対する特異性を有する多価抗体を生成することができる。
【０３８７】
さらに他の実施形態では、抗体分子は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥの重鎖定常領域から選択される、特に、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の（例えばヒト）重鎖定常領域から選択される、重鎖定常領域を有する。別の実施形態では、抗体分子は、例えば、カッパまたはラムダの（例えばヒト）軽鎖定常領域から選択される、軽鎖定常領域を有する。定常領域を、抗体の特性を修飾するために（例えば、Ｆｃ受容体結合、抗体グリコシル化、システイン残基数、エフェクター細胞機能および／または補体機能のうちの１つまたは複数を増加または減少させるために）、変更すること、例えば、変異させることができる。一実施形態では、抗体は、エフェクター機能を有し、補体を固定することができる。他の実施形態では、抗体は、エフェクター細胞の動員も、補体の固定もしない。別の実施形態では、抗体は、Ｆｃ受容体に結合する能力が低下している、またはそのような能力がない。例えば、抗体は、Ｆｃ受容体への結合を支持しない、アイソタイプまたはサブタイプ、断片または他の変異体であり、例えば、変異誘発されたまたは欠失されたＦｃ受容体結合領域を有する。
【０３８８】
抗体定常領域を変更する方法は、当技術分野において公知である。機能が変更された、例えば、細胞におけるＦｃＲ、または補体のＣ１成分などの、エフェクターリガンドに対する親和性が変更された抗体を、抗体の定常部分における少なくとも１つのアミノ酸残基を異なる残基で置き換えることにより、産生することができる（例えば、欧州特許第３８８，１５１号Ａ１、米国特許第５，６２４，８２１号および米国特許第５，６４８，２６０号を参照されたく、これらのすべてについての内容は、これにより参照により本明細書に組み込まれる）。ネズミまたは他の種の免疫グロブリンに適用された場合にこれらの機能を低下または消失させる、同様のタイプの変更を記載することができる。
【０３８９】
抗体分子を誘導体化することができ、または別の機能性分子（例えば、本明細書に記載のサイトカイン分子、または他の化学基もしくはタンパク質性の基）に連結させることができる。本明細書で使用される場合、「誘導体化された」抗体分子は、修飾されたものである。誘導体化の方法としては、蛍光部分、放射性核種、毒素、酵素、または親和性リガンド、例えばビオチン、の付加が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本開示の抗体分子は、免疫接着分子を含む、本明細書に記載される抗体の誘導体化された形態および別様に修飾された形態を含むように意図されている。例えば、抗体分子を１つまたは複数の他の分子実体、例えば、サイトカイン分子、別の抗体（例えば、二重特異性抗体もしくはダイアボディ）、検出可能な薬剤、細胞傷害剤、医薬剤、および／または抗体もしくは抗体部分と別の分子との会合を媒介することができるタンパク質もしくはペプチド（例えば、ストレプトアビジンコア領域もしくはポリヒスチジンタグ）に、機能的に（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合により、または別様に）連結させることができる。
【０３９０】
１つのタイプの誘導体化抗体分子は、抗体分子を、１つまたは複数のタンパク質、例えば、サイトカイン分子、別の抗体分子（同じタイプのもの、もしくは例えば二重特異性抗体を生じさせるために、異なるタイプのもの）に架橋させることにより、産生される。好適な架橋剤は、適切なスペーサーによって隔てられている２つの他と異なって反応性の基を有するヘテロ二官能性であるもの（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、またはホモ二官能性であるもの（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）を含む。そのようなリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌから入手可能である。
例示的な免疫刺激性融合分子およびリンカー
【０３９１】
ある特定の実施形態では、ＩＦＭを、Ｎ末端からＣ末端への配向で、次の式を用いて表すことができる：Ｒ１−（必要に応じてＬ１）−Ｒ２、またはＲ２−（必要に応じてＬ１）−Ｒ１（式中、Ｒ１は、免疫細胞標的化部分を含み、Ｌ１は、リンカー（例えば、本明細書に記載されるペプチドリンカー）を含み、Ｒ２は、免疫刺激部分、例えば、サイトカイン分子を含む）。
【０３９２】
一部の実施形態では、免疫刺激部分、例えば、サイトカイン分子は、免疫細胞標的化部分に接続されている、例えば、それに共有結合的に連結されている。
【０３９３】
一部の実施形態では、免疫刺激部分、例えば、サイトカイン分子は、免疫細胞標的化部分に（例えば、化学的カップリング、融合、共有結合性会合により、または別様に）機能的に連結されている、例えば、共有結合的に連結されている。例えば、免疫刺激部分は、免疫細胞標的化部分に間接的に、例えばリンカーを介して、共有結合的にカップリングされていることもある。
【０３９４】
実施形態では、リンカーは、切断性リンカー、非切断性リンカー、ペプチドリンカー、可動性リンカー、剛性リンカー、ヘリカルリンカー、または非ヘリカルリンカーから選択される。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。ペプチドリンカーは、５〜２０、８〜１８、１０〜１５、または約８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５アミノ酸長であることができる。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒを含み、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）ｎ（ここで、ｎは、モチーフの反復の数を示す、例えば、ｎ＝１、２、３、４または５）を含むリンカー（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカー）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号３６、３７、３８もしくは３９のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一の（例えば、１、２、３、４もしくは５つのアミノ酸置換を有する）アミノ酸配列を含む。一実施形態では、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３７）を含む。別の実施形態では、リンカーは、ＩｇＧ４ヒンジ領域からのアミノ酸、例えば、アミノ酸ＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰ（配列番号３８）を含む。
【０３９５】
他の実施形態では、リンカーは、非ペプチド、化学的リンカーである。例えば、免疫刺激部分は、免疫細胞標的化部分に架橋によって共有結合的にカップリングされている。好適な架橋剤は、適切なスペーサーによって隔てられている２つの他と異なって反応性の基を有するヘテロ二官能性であるもの（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、またはホモ二官能性であるもの（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）を含む。
【０３９６】
一部の実施形態では、リンカーは、生分解性または切断性リンカーであってよい。切断性リンカーは、ＩＦＭの切断を可能にし、その結果、免疫刺激部分、例えば、サイトカイン分子を、免疫標的化部分から放出することができる。リンカーの切断を、関連組織内での生物学的活性化により、または代替的に、例えば電磁照射、例えばＵＶ照射などの、外部刺激により、引き起こすことができる。
【０３９７】
一実施形態では、切断性リンカーは、細胞の外側での切断のために、例えば、細胞または組織の損傷または疾患に関連する状態で切断されるように、構成される。そのような状態は、例えば、アシドーシス；壊死性状態（例えば、壊死細胞から溢出するカルパインもしくは他のプロテアーゼにより切断される）を含む、細胞内酵素の存在（細胞内に通常は限局される）；低酸素状態、例えば還元環境；血栓症（例えば、リンカーが、トロンビンにより、もしくは血液凝固カスケードに関連する別の酵素により、切断されうる）；免疫系活性化（例えば、リンカーは、活性化された補体タンパク質の作用により切断可能でありうる）；または疾患もしくは傷害に関連する他の状態を含む。
【０３９８】
一実施形態では、切断性リンカーは、Ｓ−Ｓ連結（ジスルフィド結合）を含むこともあり、または金属が還元されるとバラバラになる遷移金属錯体を含むこともある。Ｓ−Ｓリンカーの一実施形態は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，６０３，９４４号において開示されたような、次の構造を有しうる：
【化１】
2020530440.tif 000002
【０３９９】
別の例は、酸（または塩基）不安定性部分、例えば、酸不安定性エステル基などの加水分解を促進するｐＨの変化の際に、例えば低ｐＨで、切断されるｐＨ感受性リンカー。そのような状態は、罹患した、アポトーシス性のもしくは壊死性の細胞および組織などの、処置すべき状態を有する細胞の表面に見出されるもしくはそのような細胞の付近に放出されるプロテアーゼまたは他の酵素による、または他の状態もしくは因子による、がん性細胞および組織の付近に見出されることがある酸性状態などの、細胞外環境で、または低酸素もしくは虚血細胞および組織の付近に見出され得るような還元環境で見出され得る。酸不安定性リンカーは、例えば、シス−アコニット酸リンカーでありうる。ｐＨ感受性結合の他の例としては、アセタール、ケタール、活性化アミド、例えば、２，３ジメチルマレアミド酸のアミド、ビニルエーテル、他の活性化エーテルおよびエステル、例えば、エノールもしくはシリルエーテルもしくはエステル、イミン、イミニウム、オルトエステル、エナミン、カルバメート、ヒドラゾン、ならびに当技術分野において公知の他の結合（linkage）が挙げられる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開番号２０１２／１５５９２０およびFranco  ら  AIMS  Materials  Science,  3(1):  289-323を参照されい）。２０１７年９月５日に出願された米国特許仮出願第６２／５５４，０６７号、および２０１８年１月１１日に出願された同第６２／６１６，２２１号において開示されたリンカーも、使用することができ、参照により本明細書に組み込まれる。「ｐＨ感受性」という表現は、問題の切断性リンカーが、酸性ｐＨ（例えば、６．０未満の、例えば４．０〜６．０の範囲のｐＨ）で実質的に切断されるという事実を指す。
【０４００】
さらに別の実施形態では、切断性リンカーは、プロテアーゼ（例えば、ペプシン、トリプシン、サーモリシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭ；例えば、ＡＤＡＭ−１０もしくはＡＤＡＭ−１７））、グリコシダーゼ（例えば、α−、β−、γ−アミラーゼ、α−、β−グルコシダーゼもしくはラクターゼ）またはエステラーゼ（例えば、アセチルコリンエステラーゼ、プソイドコリンエステラーゼもしくはアセチルエステラーゼ）などの、酵素による切断のために構成される。切断性リンカーを切断することができる他の酵素としては、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、グランザイムＡ、グランザイムＢ、リソソーム酵素、カテプシン、前立腺特異的抗原、単純ヘルペスウイルスプロテアーゼ、サイトメガロウイルスプロテアーゼ、トロンビン、カスパーゼ、およびインターロイキン１ベータ変換酵素が挙げられる。
【０４０１】
さらに別の例は、目的の組織における、酵素、例えば、プロテアーゼ（例えば、ペプシン、トリプシン）の過剰発現であり、それによって、目的の組織に到達すると特別に設計されたペプチドリンカーが切断される。この点について好適なリンカーの例証的な例は、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号１０５）、Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（配列番号１０６）、Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（配列番号１０７）、Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ（配列番号１０８）、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ（配列番号１０９）である。
【０４０２】
さらに別の例では、目的の組織における、酵素、例えば、グリコシダーゼ（例えば、α−アミラーゼ）の過剰発現により、目的の組織に到達すると特別に設計された炭水化物リンカーの切断が引き起こされる。この点について好適なリンカーの例証的な例は、−（α−１−４−Ｄ−グルコース）ｎ−（式中、ｎ≧４）である。
【０４０３】
さらに別の例では、切断性リンカーは、電磁照射、例えばＵＶ照射、による切断のために構成される。リンカーＢの切断をもたらす、目的の組織のＵＶ曝露は、薬物放出を促進することができ、または所望の組織におけるナノ粒子取込みを促進することができる。
【０４０４】
切断性リンカーは、合計で２〜６０個の原子、例えば、２〜２０個の原子を含むことができる。切断性リンカーは、アミノ酸残基を含むことができ、例えば、アミノ酸残基１〜３０個、または２〜１０個の、ペプチド結合であってよい。１つのバリアントでは、切断性リンカーＢは、１〜３０個、例えば、２〜１０個、または２〜８個、または３〜９個、または４〜１０個のアミノ酸からなる。ｐＨ感受性リンカーについては、原子の数は、通常は２〜５０、例えば、２〜３０である。
【０４０５】
本発明の一部の実施形態では、リンカーは、アミノカプロン酸（アミノヘキサン酸とも呼ばれる）結合、または１〜３０個または２〜１０個の炭水化物残基で構成されている結合を含む。
【０４０６】
一実施形態では、リンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼの基質としての機能を果たすことができるペプチドを含む。マトリックスメタロプロテイナーゼとして、例えば、ＭＭＰ−１（間質コラゲナーゼ）、ＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）などが公知であり、前述のものの中からの１種類または複数の種類のマトリックスメタロプロテイナーゼの基質としての機能を果たすことができる基質ペプチドを使用することができる。マトリックスメタロプロテイナーゼについては、例えば、１９９３年に出版された、"Molecular  mechanism  of  cancer  metastasis",  Ed.  by  Tsuruo  T.,  pp.  92-107,  Medical  View  Co.,  Ltd.を参照されたい。マトリックスメタロプロテイナーゼの基質としての機能を果たすことができる基質ペプチドに関しては、例えば、特定のタイプのマトリックスメタロプロテイナーゼ、およびそれによって特異的に認識される基質ペプチドが、Nature  Biotechnology,  19,  pp.  661-667,  2001において説明されている。したがって、この刊行物を参照することにより、特定のタイプのマトリックスメタロプロテイナーゼによって特異的に切断される基質ペプチドを選択することができる。例えば、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号１１０）は、ＭＭＰ−９の特異的基質として公知であり、前述のオクタペプチドを、ＭＭＰ−９の基質としての機能を果たすことができる基質ペプチドとして使用することが好ましい。マトリックスメタロプロテイナーゼの基質としての機能を果たすことができる基質ペプチドの例証的な例としては、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（配列番号１１１）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１１２）、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（配列番号１１３）、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ（配列番号１１４）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ（配列番号１１５）、Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ（配列番号１１６）、Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（配列番号１１７）、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ（配列番号１１８）、Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ（配列番号１１９）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号１２０）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号１２１）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号１２２）などが挙げられる。
【０４０７】
別の実施形態では、リンカーは、ディスインテグラーゼおよびメタロプロテアーゼ（metalloproteas）（ＡＤＡＭ）、ＭＭＰ、またはグランザイムの基質としての機能を果たすことができるペプチドを含む。例えば、限定ではないが、リンカーは、ＡＤＡＭ−８、ＡＤＡＭ−１０、ＡＤＡＭ−１２、ＡＤＡＭ−１７、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１３、グランザイムＡまたはグランザイムＢのペプチド基質を含むことができる。ＡＤＡＭ、ＭＭＰおよびグランザイムの基質は、十分に（例えば、Miller,  MA,  らIntegrative  Biology  (2011)  3:422-438、Van  Damme  らBiol  Chem  (2010)  391:983-997、およびCasciola-Rosen,  L,  らJ  Biol  Chem  (2007)  282:4545-4552）に記載されており、当業者は、そのようなペプチドまたはそれらのバリアントを目的のリンカーに容易に組み込むことができるはずである。
【０４０８】
リンカーは、基質ペプチドに加えて、治療用タンパク質との結合（単数または複数）に関与するコネクターを含有することができる。そのようなコネクターは、各々が、１個のアミノ酸残基からなることもあり、または２〜１０個、例えば、３〜９個、もしくは４〜８個、もしくは２〜８個のアミノ酸残基を含有するオリゴペプチドからなることもある。コネクターとしてのアミノ酸残基またはオリゴペプチドは、存在する場合、基質ペプチドの両方の末端と結合していることもあり、または構造のうちの１つを示すために基質ペプチドの一方の末端とだけ結合していることもある。コネクター（複数可）として使用可能な１つのアミノ酸のタイプ、およびコネクター（複数可）として使用可能なオリゴペプチドを構成するアミノ酸残基のタイプは、特に限定されず、任意のタイプの１つのアミノ酸残基、または例えば任意のタイプの２〜８個の同じまたは異なるアミノ酸残基を含有する、任意のオリゴペプチドを、使用することができる。コネクター（複数可）として使用可能なオリゴペプチドの例としては、例えば、Ｇｌｙアミノ酸を多く含むコネクターが挙げられる。他の有機部分もコネクターとして使用することができる。
【０４０９】
さらに他の実施形態では、免疫刺激部分は、リンカーなしで、免疫細胞標的化部分に共有結合的に直接カップリングされている。
【０４１０】
さらに他の実施形態では、ＩＦＭの免疫刺激部分および免疫細胞標的化部分は、共有結合的に連結されていない、例えば、非共有結合的に会合されている。
【０４１１】
サイトカイン分子の、抗体分子、例えば、免疫グロブリン部分（Ｉｇ）、例えば、抗体（ＩｇＧ）または抗体断片（Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）への融合の例示的形式としては、抗体分子のアミノ末端（Ｎ末端）またはカルボキシ末端（Ｃ末端）、通常は、抗体分子のＣ末端への融合を挙げることができる。一実施形態では、サイトカインポリペプチド、Ｉｇポリペプチドにつながれているサイトカイン−受容体複合体もしくはサイトカイン−受容体Ｆｃ複合体、サイトカインポリペプチド鎖とＩｇポリペプチド鎖との間の好適な接合部を含むサイトカイン−Ｉｇ部分融合分子は、直接ポリペプチド結合、２つの鎖間にポリペプチドリンカーを有する接合部、および鎖間の化学的結合を含有する。典型的な接合部は、小さいＧｌｙ４Ｓｅｒリンカー（ＧＧＧＧＳ）Ｎ（ここで、Ｎは、モチーフの反復の数を示す）で構成されている可動性リンカーである。（ＧＧＧＧＳ）２および（ＧＧＧＧＳ）３は、本開示の融合構築物における使用のためのリンカーの好ましい実施形態である。
【０４１２】
本明細書に記載される例示的免疫刺激性融合分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４から選択されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、前述のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれより高度に同一性のアミノ酸配列）を含むことができる。
【０４１３】
本開示の例示的免疫刺激性融合分子（またはその一部分）が、本明細書に記載される。ある特定のｓｃＦｖにおける配置は、ＶＨ−リンカー−ＶＬであることに、留意されたい。しかし、ＶＬ−リンカー−ＶＨ配置も、機能性に影響することなしに、使用することができる。加えて、特定のリンカー（リンカー−１、リンカー−２など）を様々な構築物において使用したが、本明細書で開示される他のリンカーも交換可能に使用することができる。
配列番号１
名称：ＬＣ−ｃｈＢＣ８−ｓｕｓｈｉ
キメラＢＣ８抗ＣＤ４５抗体の軽鎖；親ＢＣ８マウスモノクローナル抗体からの可変ドメインと、ヒト定常カッパドメインとを含有する；可動性リンカーを使用して抗体軽鎖Ｃ末端に遺伝子的に融合された野生型ＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉドメインを含有する。
【化２】
2020530440.tif 000003
【０４１４】
Ｎ末端からＣ末端へ、キメラＢＣ８  Ｆａｂの軽鎖部分が、ペプチドリンカーを介してＩＬ−１５結合ｓｕｓｈｉドメインに融合されて示されている。軽鎖の配列は、通常のフォントで示されており；ペプチドリンカーの位置は、イタリック体および一重下線により示されており；ｓｕｓｈｉドメインは、二重下線により示されている。カッパ定常領域は、配列番号７４として示される。
【０４１５】
一部の実施形態では、キメラＢＣ８抗体は、配列番号１で示される軽鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、カッパ軽鎖配列をさらに含む）、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号１と少なくとも９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）を含む。実施形態では、キメラＢＣ８抗体は、ＢＣ８抗体の軽鎖可変領域の、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号１のＣＤＲ配列のいずれかからの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
【０４１６】
実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭは、配列番号１またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高度に同一性の、あるいは配列番号１と比べて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれより多くのアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、アミノ酸配列）から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。実施形態では、ＩＦＭは、配列番号１と比べて５、１０または１５以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
配列番号２
名称：ｓｕｓｈｉ−ＬＣ−ｃｈＢＣ８
【０４１７】
キメラＢＣ８抗ＣＤ４５抗体の軽鎖；親ＢＣ８マウスモノクローナル抗体からの可変ドメインと、ヒト定常カッパドメインとを含有する；可動性リンカーを使用して抗体軽鎖Ｎ末端に遺伝子的に融合された野生型ＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉドメインを含有する。
【化３】
2020530440.tif 000004
【０４１８】
Ｎ末端からＣ末端へ、ペプチドリンカーを介してキメラＢＣ８  Ｆａｂの軽鎖部分に融合されているＩＬ−１５結合野生型ｓｕｓｈｉドメインが示されている。軽鎖の配列は、通常のフォントで示されており；ペプチドリンカーの位置は、イタリック体および一重下線により示されており；ｓｕｓｈｉドメインは、二重下線により示されている。カッパ定常領域は、配列番号７４として示される。
【０４１９】
一部の実施形態では、キメラＢＣ８抗体は、配列番号２で示される軽鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、カッパ軽鎖配列をさらに含む）、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）を含む。実施形態では、ＢＣ８抗体は、ＢＣ８抗体の軽鎖可変領域の、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号２のＣＤＲ配列のいずれかからの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
【０４２０】
実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭは、配列番号２またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高度に同一性の、あるいは配列番号２と比べて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれより多くのアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、アミノ酸配列）から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。実施形態では、ＩＦＭは、配列番号２と比べて５、１０または１５以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
配列番号３
名称：ＬＣ−ｃｈＢＣ８−ＩＬ１５（ＬＣ−ｃｈＢＣ８−Ｌ１−ＩＬ１５とも呼ばれる）
【０４２１】
キメラＢＣ８抗ＣＤ４５抗体の軽鎖；親マウスモノクローナル抗体からの可変ドメインと、ヒト定常カッパドメインとを含有する；可動性リンカーを使用して抗体軽鎖Ｃ末端に遺伝子的に融合された野生型ＩＬ−１５を含有する。
【化４】
2020530440.tif 000005
【０４２２】
Ｎ末端からＣ末端へ、キメラＢＣ８  Ｆａｂの軽鎖部分が、ペプチドリンカーを介してＩＬ−１５サイトカインに融合されて示されている。軽鎖の配列は、通常のフォントで示されており；ペプチドリンカーの位置は、イタリック体および一重下線により示されており；サイトカイン分子は、二重下線により示されている。カッパ定常領域は、配列番号７４として示される。
【０４２３】
一部の実施形態では、キメラＢＣ８抗体は、配列番号３で示される軽鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、カッパ軽鎖配列をさらに含む）、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号３と少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）を含む。実施形態では、ＢＣ８抗体は、ＢＣ８抗体の軽鎖可変ドメインの、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号３のＣＤＲ配列のいずれかからの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
【０４２４】
実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭは、配列番号３またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号３と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高度に同一性の、あるいは配列番号３と比べて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれより多くのアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、アミノ酸配列）から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。実施形態では、ＩＦＭは、配列番号３と比べて５、１０または１５以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
配列番号４
名称：ＩＬ１５−ＬＣ−ｃｈＢＣ８
【０４２５】
キメラＢＣ８抗ＣＤ４５抗体の軽鎖；親マウスモノクローナル抗体からの可変ドメインと、ヒト定常カッパドメインとを含有する；可動性リンカーを使用して抗体軽鎖Ｎ末端に遺伝子的に融合された野生型ＩＬ−１５を含有する。
【化５】
2020530440.tif 000006
【０４２６】
Ｎ末端からＣ末端へ、ペプチドリンカーを介してキメラＢＣ８  Ｆａｂの軽鎖部分に融合されたＩＬ−１５サイトカインが示されている。軽鎖の配列は、通常のフォントで示されており；ペプチドリンカーの位置は、イタリック体および下線により示されており；サイトカイン分子は、二重下線により示されている。カッパ定常領域は、配列番号７４として示される。
【０４２７】
一部の実施形態では、キメラＢＣ８抗体は、配列番号４で示される軽鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、カッパ軽鎖配列をさらに含む）、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号４と少なくとも９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）を含む。実施形態では、ＢＣ８抗体は、ＢＣ８抗体の軽鎖可変ドメインの、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号４のＣＤＲ配列のいずれかからの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
【０４２８】
実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭは、配列番号４またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高度に同一性の、あるいは配列番号４と比べて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれより多くのアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、アミノ酸配列）から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。実施形態では、ＩＦＭは、配列番号４と比べて５、１０または１５以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
【０４２９】
キメラＢＣ８抗体分子の例示的な対応する重鎖、例えば、ＦａｂまたはＩｇＧが、下にそれぞれ配列番号５または配列番号６として示される。
配列番号５
名称：ＨＣ−ｃｈＢＣ８−Ｆａｂ
【０４３０】
キメラＢＣ８抗ＣＤ４５抗体のＦａｂ重鎖；親ＢＣ８マウスモノクローナル抗体からの可変ドメインと、ヒトＩｇＧ１からのＣＨ１ドメインとを含有する。
【０４３１】
一部の実施形態では、キメラＢＣ８抗体は、配列番号５で示される重鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、ヒトＩｇＧ１からのＣＨ１ドメイン配列をさらに含む）、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号５と少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）を含む。実施形態では、ＢＣ８抗体は、ＢＣ８抗体の重鎖可変ドメインの、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号５のＣＤＲ配列からの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
配列番号６
名称：ＨＣ−ｃｈＢＣ８−ＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ
【０４３２】
キメラＢＣ８抗ＣＤ４５抗体の重鎖；親ＢＣ８マウスモノクローナル抗体からの可変ドメインと、Ｓ２２８Ｐ変異を含有するヒトＩｇＧ４（ＩｇＧ４−Ｓ２２８Ｐ）からの定常領域とを含有する。
【０４３３】
一部の実施形態では、キメラＢＣ８抗体は、配列番号６で示される重鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、Ｓ２２８Ｐ変異を含有するヒトＩｇＧ４（ＩｇＧ４−Ｓ２２８Ｐ）からの定常ドメイン配列をさらに含む）、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号６と少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）を含む。実施形態では、キメラＢＣ８抗体は、ＢＣ８抗体の重鎖可変ドメインの、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号６のＣＤＲ配列のいずれかからの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
配列番号７
名称：ＬＣ−ｃｈＢＣ８
【０４３４】
キメラＢＣ８抗ＣＤ４５抗体の軽鎖；親ＢＣ８マウスモノクローナル抗体からの可変ドメインと、ヒト定常カッパドメインとを含有する。
【０４３５】
一部の実施形態では、ＢＣ８抗体は、配列番号７で示される軽鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、ヒトカッパからの定常ドメイン配列をさらに含む）、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号７と少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）を含む。実施形態では、ＢＣ８抗体は、ＢＣ８抗体の軽鎖可変ドメインの、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号７のＣＤＲ配列のいずれかからの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
配列番号８
名称：ＨＣ−ｃｈＢＣ８−ＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ−ＩＬ１５
【０４３６】
キメラＢＣ８抗ＣＤ４５抗体の重鎖；親ＢＣ８マウスモノクローナル抗体からの可変ドメインと、Ｓ２２８Ｐ変異を含有するヒトＩｇＧ４（ＩｇＧ４−Ｓ２２８Ｐ）からの定常領域とを含有する；可動性リンカーを使用して抗体重鎖Ｃ末端に遺伝子的に融合された野生型ＩＬ−１５を含有する。
【化６】
2020530440.tif 000007
【０４３７】
Ｎ末端からＣ末端へ、ペプチドリンカーを介して融合したＩＬ−１５サイトカインに融合されたキメラＢＣ８  ＩｇＧ４の重鎖部分が示されている。重鎖の配列は、通常のフォントで示されており；ペプチドリンカーの位置は、イタリック体および下線により示されており；サイトカイン分子は、二重下線により示されている。
【０４３８】
一部の実施形態では、ＢＣ８抗体は、配列番号８で示される重鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、ヒトＩｇＧ４定常配列をさらに含む）、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号８と少なくとも９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）を含む。実施形態では、ＢＣ８抗体は、ＢＣ８抗体の重鎖可変ドメインの、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号８のＣＤＲ配列のいずれかからの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
【０４３９】
実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭは、配列番号８のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高度に同一性の、あるいは配列番号８と比べて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれより多くのアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、アミノ酸配列）を含むことができる。実施形態では、ＩＦＭは、配列番号８と比べて５、１０または１５以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
配列番号１４
名称：ＨＣ−ｃｈ９．４−Ｆａｂ
【０４４０】
キメラ９．４抗ＣＤ４５抗体のＦａｂ重鎖；親９．４マウスモノクローナル抗体からの可変ドメインと、ヒトＩｇＧ１からのＣＨ１ドメインとを含有する。
【０４４１】
一部の実施形態では、キメラ９．４抗体は、配列番号１４で示される重鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、ヒトＩｇＧ１重鎖配列をさらに含む）、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号１４と少なくとも９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）を含む。実施形態では、９．４抗体は、９．４抗体の重鎖可変ドメインの、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号１４のＣＤＲ配列のいずれかからの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
配列番号１５
名称：ＬＣ−ｃｈ９．４−ＩＬ１５
【０４４２】
キメラ９．４抗ＣＤ４５抗体の軽鎖；親９．４マウスモノクローナル抗体からの可変ドメインと、ヒト定常カッパドメインとを含有する；可動性リンカーを使用して抗体軽鎖Ｃ末端に遺伝子的に融合された野生型ＩＬ−１５を含有する。
【化７】
2020530440.tif 000008
【０４４３】
Ｎ末端からＣ末端へ、ペプチドリンカーを介して融合されたＩＬ−１５サイトカインに融合されたキメラ９．４  ＩｇＧ１の軽鎖部分が示されている。軽鎖の配列は、通常のフォントで示されており；ペプチドリンカーの位置は、イタリック体および下線により示されており；サイトカイン分子は、二重下線により示されている。カッパ定常領域は、配列番号７４として示される。
【０４４４】
一部の実施形態では、配列番号１５で示されるアミノ酸配列の抗体部分またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号１５の抗体部分と少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）に対応する、キメラ９．４抗体の軽鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、カッパ軽鎖配列をさらに含む）。実施形態では、９．４抗体は、ＢＣ８抗体の、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号１５のＣＤＲ配列のいずれかからの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
【０４４５】
実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭは、配列番号１５のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号１５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高度に同一性の、あるいは配列番号１５と比べて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれより多くのアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、アミノ酸配列）を含むことができる。実施形態では、ＩＦＭは、配列番号１５と比べて５、１０または１５以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
配列番号１６
名称：ＨＣ−ｃｈ４Ｂ２−Ｆａｂ
【０４４６】
キメラ４Ｂ２抗ＣＤ４５抗体のＦａｂ重鎖；親４Ｂ２マウスモノクローナル抗体からの可変ドメインと、ヒトＩｇＧ１からのＣＨ１ドメインとを含有する。
【０４４７】
一部の実施形態では、キメラ４Ｂ２抗体は、配列番号１６で示される重鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、ヒトＩｇＧ１重鎖配列をさらに含む）、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号１６と少なくとも９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）を含む。実施形態では、４Ｂ２抗体は、４Ｂ２抗体の重鎖可変ドメインの、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号１６のＣＤＲ配列のいずれかからの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
配列番号１７
名称：ＬＣ−ｃｈ４Ｂ２−ＩＬ１５
【０４４８】
キメラ４Ｂ２抗ＣＤ４５抗体の軽鎖；親４Ｂ２マウスモノクローナル抗体からの可変ドメインと、ヒト定常カッパドメインとを含有する；可動性リンカーを使用して抗体軽鎖Ｃ末端に遺伝子的に融合された野生型ＩＬ−１５を含有する。
【化８】
2020530440.tif 000009
【０４４９】
Ｎ末端からＣ末端へ、ペプチドリンカーを介してＩＬ−１５サイトカインに融合されたキメラ４Ｂ２  ＩｇＧ１の軽鎖部分が示されている。軽鎖の配列は、通常のフォントで示されており；ペプチドリンカーの位置は、イタリック体および下線により示されており；サイトカイン分子は、二重下線により示されている。カッパ定常領域は、配列番号７４として示される。
【０４５０】
一部の実施形態では、配列番号１７で示されるアミノ酸配列の抗体部分またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号１７の抗体部分と少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）に対応する、キメラ４Ｂ２抗体の軽鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、カッパ軽鎖配列をさらに含む）。実施形態では、４Ｂ２抗体は、４Ｂ２抗体の、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号１７のＣＤＲ配列のいずれかからの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
【０４５１】
実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭは、配列番号１７のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号１７と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高度に同一性の、あるいは配列番号１７と比べて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれより多くのアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、アミノ酸配列）を含むことができる。実施形態では、ＩＦＭは、配列番号１７と比べて５、１０または１５以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
配列番号１８
名称：ＨＣ−ｈＢＣ８（２３）−Ｆａｂ
【０４５２】
ヒト化ＢＣ８抗ＣＤ４５抗体のＦａｂ重鎖；ヒト化可変ドメインと、ヒトＩｇＧ１からのＣＨ１ドメインとを含有する。
【０４５３】
一部の実施形態では、ヒト化ＢＣ８抗体の重鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、ヒトＩｇＧ１からのＣＨ１ドメイン配列をさらに含む）は、配列番号１８で示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号１８の抗体部分と少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）を有する。実施形態では、ＢＣ８抗体は、ＢＣ８抗体の重鎖可変ドメインの、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号１８のＣＤＲ配列のいずれかからの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
配列番号１９
名称：ＬＣ−ｈＢＣ８（２３）−ＩＬ１５
【０４５４】
ヒト化ＢＣ８抗ＣＤ４５抗体の軽鎖；ヒト化可変ドメインと、ヒト定常カッパドメインとを含有する；可動性リンカーを使用して抗体軽鎖Ｃ末端に遺伝子的に融合された野生型ＩＬ−１５を含有する。
【化９】
2020530440.tif 000010
【０４５５】
Ｎ末端からＣ末端へ、ペプチドリンカーを介してＩＬ−１５サイトカインに融合されたヒト化ＢＣ８  ＩｇＧ１の軽鎖部分が示されている。軽鎖の配列は、通常のフォントで示されており；ペプチドリンカーの位置は、イタリック体および下線により示されており；サイトカイン分子は、二重下線により示されている。カッパ定常領域は、配列番号７４として示される。
【０４５６】
一部の実施形態では、配列番号１９で示されるアミノ酸配列の抗体部分またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号１９の抗体部分と少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）に対応する、ヒト化ＢＣ８抗体の軽鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、カッパ軽鎖配列をさらに含む）。実施形態では、ＢＣ８抗体は、ＢＣ８抗体の軽鎖可変ドメインの、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号１９のＣＤＲ配列のいずれかからの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
【０４５７】
実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭは、配列番号１９のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号１９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高度に同一性の、あるいは配列番号１９と比べて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれより多くのアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、アミノ酸配列）を含むことができる。実施形態では、ＩＦＭは、配列番号１９と比べて５、１０または１５以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
配列番号２０
名称：ＨＣ−ｈＢＣ８（２３）−ヌル−Ｆａｂ
【０４５８】
ヒト化ＢＣ８抗ＣＤ４５抗体のＦａｂ重鎖；ヒト化可変ドメインと、ＣＤＲ−Ｈ３におけるＳＧＧＧＳ（配列番号１２３）置換と、ヒトＩｇＧ１からのＣＨ１ドメインとを含有する。
配列番号２１
名称：ＬＣ−ｃｈＢＣ８−Ｌ２−ＩＬ１５
【０４５９】
キメラＢＣ８抗ＣＤ４５抗体の軽鎖；親マウスモノクローナル抗体からの可変ドメインと、ヒト定常カッパドメインとを含有する；配列ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３７）を有する可動性リンカーを使用して抗体軽鎖Ｃ末端に遺伝子的に融合された野生型ＩＬ−１５を含有する。
【化１０】
2020530440.tif 000011
【０４６０】
Ｎ末端からＣ末端へ、ペプチドリンカー（Ｌ２）を介してＩＬ−１５サイトカインに融合されたキメラＢＣ８  ＩｇＧ１の軽鎖部分が示されている。軽鎖の配列は、通常のフォントで示されており；ペプチドリンカーの位置は、イタリック体および下線により示されており；サイトカイン分子は、二重下線により示されている。カッパ定常領域は、配列番号７４として示される。
【０４６１】
一部の実施形態では、配列番号２１で示されるアミノ酸配列の抗体部分またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号２１の抗体部分と少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）に対応する、キメラＢＣ８抗体の軽鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、カッパ軽鎖配列をさらに含む）。実施形態では、ＢＣ８抗体は、ＢＣ８抗体の軽鎖可変ドメインの、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号２１のＣＤＲ配列のいずれかからの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
【０４６２】
実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭは、配列番号２１のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号２１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高度に同一性の、あるいは配列番号２１と比べて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれより多くのアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、アミノ酸配列）を含むことができる。実施形態では、ＩＦＭは、配列番号２１と比べて５、１０または１５以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
配列番号２２
名称：ＬＣ−ｃｈＢＣ８−Ｌ３−ＩＬ１５
【０４６３】
キメラＢＣ８抗ＣＤ４５抗体の軽鎖；親マウスモノクローナル抗体からの可変ドメインと、ヒト定常カッパドメインとを含有する；ヒトＩｇＧ１ヒンジに関連するリンカー（配列番号３８）を使用して抗体軽鎖Ｃ末端に遺伝子的に融合された野生型ＩＬ−１５を含有する。
【化１１】
2020530440.tif 000012
【０４６４】
Ｎ末端からＣ末端へ、ペプチドリンカー（Ｌ３）を介してＩＬ−１５サイトカインに融合されたキメラＢＣ８  ＩｇＧ１の軽鎖部分が示されている。軽鎖の配列は、通常のフォントで示されており；ペプチドリンカーの位置は、イタリック体および下線により示されており；サイトカイン分子は、二重下線により示されている。カッパ定常領域は、配列番号７４として示される。
【０４６５】
一部の実施形態では、配列番号２２で示されるアミノ酸配列の抗体部分またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号２２の抗体部分と少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）に対応する、キメラＢＣ８抗体の軽鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、カッパ軽鎖配列をさらに含む）。実施形態では、ＢＣ８抗体は、ＢＣ８抗体の軽鎖可変ドメインの、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号２２のＣＤＲ配列のいずれかからの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
【０４６６】
実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭは、配列番号２２のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号２２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高度に同一性の、あるいは配列番号２２と比べて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれより多くのアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、アミノ酸配列）を含むことができる。実施形態では、ＩＦＭは、配列番号２２と比べて５、１０または１５以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
配列番号２５
名称：ｈＢＣ８（２３）−ヌル重鎖可変ドメイン
【０４６７】
ヒト化ＢＣ８抗ＣＤ４５抗体の重鎖可変ドメイン；ＣＤＲ−Ｈ３にＳＧＧＧＳ置換を含有する。
【０４６８】
実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭは、配列番号２５のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号２５と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高度に同一性の、あるいは配列番号２５と比べて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれより多くのアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、アミノ酸配列）を含むことができる。実施形態では、ＩＦＭは、配列番号２５と比べて５、１０または１５以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
配列番号２６
名称：ＨＣ−ｃｈＭＨＭ２４−Ｆａｂ
【０４６９】
キメラＭＨＭ２４抗ＣＤ１１ａ抗体のＦａｂ重鎖；親マウスモノクローナル抗体からの可変ドメインと、ヒトＩｇＧ１からのＣＨ１ドメインとを含有する。
【０４７０】
一部の実施形態では、キメラＭＨＭ２４抗体の重鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、ヒトＩｇＧ１からのＣＨ１ドメイン配列をさらに含む）は、配列番号２６で示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号２６の抗体部分と少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）を有する。実施形態では、ＭＨＭ２４抗体は、ＭＨＭ２４抗体の重鎖可変ドメインの、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号２６のＣＤＲ配列のいずれかからの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
配列番号６９
名称：ＨＣ−ｈＭＨＭ２４−Ｆａｂ
【０４７１】
ヒト化ＭＨＭ２４抗ＣＤ１１ａ抗体のＦａｂ重鎖；ヒト化ＭＨＭ２４重鎖可変ドメインからの可変ドメインと、ヒトＩｇＧ１からのＣＨ１ドメインとを含有する。
【０４７２】
一部の実施形態では、ヒト化ＭＨＭ２４抗体の重鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、ヒトＩｇＧ１からのＣＨ１ドメイン配列をさらに含む）は、配列番号２７で示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号２７の抗体部分と少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）を有する。実施形態では、ＭＨＭ２４抗体は、ＭＨＭ２４抗体の重鎖可変ドメインの、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号２７のＣＤＲ配列のいずれかからの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
配列番号２７
名称：ＬＣ−ｃｈＭＨＭ２４−ＩＬ１５
【０４７３】
キメラＭＨＭ２４抗ＣＤ１１ａ抗体の軽鎖；親マウスモノクローナル抗体からの可変ドメインと、ヒト定常カッパドメインとを含有する；可動性リンカーを使用して抗体軽鎖Ｃ末端に遺伝子的に融合された野生型ＩＬ−１５を含有する。
【化１２】
2020530440.tif 000013
【０４７４】
Ｎ末端からＣ末端へ、ペプチドリンカーを介してＩＬ−１５サイトカインに融合されたキメラＭＨＭ２４  ＩｇＧ１の軽鎖部分が示されている。軽鎖の配列は、通常のフォントで示されており；ペプチドリンカーの位置は、イタリック体および下線により示されており；サイトカイン分子は、二重下線により示されている。カッパ定常領域は、配列番号７４として示される。
【０４７５】
一部の実施形態では、配列番号２７で示されるアミノ酸配列の抗体部分またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号２７の抗体部分と少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）に対応する、キメラＭＨＭ２４抗体の軽鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、カッパ軽鎖配列をさらに含む）。実施形態では、キメラＭＨＭ２４抗体は、抗体の軽鎖可変ドメインの、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号２７のＣＤＲ配列のいずれかからの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
【０４７６】
実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭは、配列番号２７のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号２７と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高度に同一性の、あるいは配列番号２７と比べて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれより多くのアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、アミノ酸配列）を含むことができる。実施形態では、ＩＦＭは、配列番号２７と比べて５、１０または１５以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
配列番号２８
名称：ＨＣ−ｃｈ１Ｂ４−Ｆａｂ
【０４７７】
キメラ１Ｂ４抗ＣＤ１８抗体のＦａｂ重鎖；親マウスモノクローナル抗体からの可変ドメインと、ヒトＩｇＧ１からのＣＨ１ドメインとを含有する。
【０４７８】
一部の実施形態では、キメラ１Ｂ４抗体の重鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、ヒトＩｇＧ１からのＣＨ１ドメイン配列をさらに含む）は、配列番号２８で示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号２８の抗体部分と少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）を有する。実施形態では、キメラ１Ｂ４抗体は、１Ｂ４抗体の重鎖可変ドメインの、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号２８のＣＤＲ配列のいずれかからの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
配列番号２９
名称：ＬＣ−ｃｈ１Ｂ４−ＩＬ１５
【０４７９】
キメラ１Ｂ４抗ＣＤ１８抗体の軽鎖；親マウスモノクローナル抗体からの可変ドメインと、ヒト定常カッパドメインとを含有する；可動性リンカーを使用して抗体軽鎖Ｃ末端に遺伝子的に融合された野生型ＩＬ−１５を含有する。
【化１３−１】
2020530440.tif 000014
【化１３−２】
2020530440.tif 000015
【０４８０】
Ｎ末端からＣ末端へ、ペプチドリンカーを介してＩＬ−１５サイトカインに融合されたキメラ１Ｂ４  ＩｇＧ１の軽鎖部分が示されている。軽鎖の配列は、通常のフォントで示されており；ペプチドリンカーの位置は、イタリック体および下線により示されており；サイトカイン分子は、二重下線により示されている。カッパ定常領域は、配列番号７４として示される。
【０４８１】
一部の実施形態では、配列番号２９で示されるアミノ酸配列の抗体部分またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号２９の抗体部分と少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）に対応する、キメラ１Ｂ４抗体の軽鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、カッパ軽鎖配列をさらに含む）。実施形態では、キメラ１Ｂ４抗体は、抗体の軽鎖可変ドメインの、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号２９のＣＤＲ配列のいずれかからの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
【０４８２】
実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭは、配列番号２９のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号２９と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高度に同一性の、あるいは配列番号２９と比べて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれより多くのアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、アミノ酸配列）を含むことができる。実施形態では、ＩＦＭは、配列番号２９と比べて５、１０または１５以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
配列番号３０
名称：ＨＣ−ｃｈＯＫＴ８−Ｆａｂ
【０４８３】
キメラＯＫＴ８抗ＣＤ８抗体のＦａｂ重鎖；親マウスモノクローナル抗体からの可変ドメインと、ヒトＩｇＧ１からのＣＨ１ドメインとを含有する。
【０４８４】
一部の実施形態では、キメラＯＫＴ８抗ＣＤ８抗体の重鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、ヒトＩｇＧ１からのＣＨ１ドメイン配列をさらに含む）は、配列番号３０で示されるアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号３０の抗体部分と少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）を有する。実施形態では、キメラＯＫＴ８抗ＣＤ８抗体は、ＯＫＴ８抗ＣＤ８抗体の重鎖可変ドメインの、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号３０のＣＤＲ配列からの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
配列番号３１
名称：ＬＣ−ｃｈＯＫＴ８−ＩＬ１５
【０４８５】
キメラＯＫＴ８抗ＣＤ８抗体の軽鎖；親マウスモノクローナル抗体からの可変ドメインと、ヒト定常カッパドメインとを含有する；可動性リンカーを使用して抗体軽鎖Ｃ末端に遺伝子的に融合された野生型ＩＬ−１５を含有する。
【化１４】
2020530440.tif 000016
【０４８６】
Ｎ末端からＣ末端へ、ペプチドリンカーを介してＩＬ−１５サイトカインに融合されたキメラＯＫＴ８  ＩｇＧ１の軽鎖部分が示されている。軽鎖の配列は、通常のフォントで示されており；ペプチドリンカーの位置は、イタリック体および下線により示されており；サイトカイン分子は、二重下線により示されている。カッパ定常領域は、配列番号７４として示される。
【０４８７】
一部の実施形態では、配列番号３１で示されるアミノ酸配列の抗体部分またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号３１の抗体部分と少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）に対応する、キメラＯＫＴ８抗体の軽鎖可変アミノ酸配列（必要に応じて、カッパ軽鎖配列をさらに含む）。実施形態では、キメラＯＫＴ８抗体は、抗体の軽鎖可変ドメインの、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号３１のＣＤＲ配列のいずれかからの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
【０４８８】
実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭは、配列番号３１のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号３１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高度に同一性の、あるいは配列番号３１と比べて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれより多くのアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、アミノ酸配列）を含むことができる。実施形態では、ＩＦＭは、配列番号３１と比べて５、１０または１５以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
配列番号３２
名称：ＢＣ８ｓｃＦｖ−ＩＬ１５
【０４８９】
短い可動性リンカーおよびヘキサヒスチジンタグを使用してＢＣ８−ｓｃＦｖのＣ末端に融合されたＩＬ−１５
【化１５】
2020530440.tif 000017
【０４９０】
Ｎ末端からＣ末端へ、ペプチドリンカーを介してＩＬ−１５サイトカインに融合されたＢＣ８  ｓｃＦｖの軽鎖部分が示されている。ｓｃＦｖ配列は、通常のフォントで示されており；ペプチドリンカーの位置は、イタリック体および下線により示されており；サイトカイン分子は、二重下線により示されている。
【０４９１】
一部の実施形態では、配列番号３１で示されるアミノ酸配列の抗体部分またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号３２の抗体部分と少なくとも８５％、９０％、９５％もしくはそれより高度に同一のアミノ酸配列）に対応する、ＢＣ８  ｓｃＦｖ抗体の軽鎖可変アミノ酸配列。実施形態では、ＢＣ８抗体は、抗体の軽鎖可変ドメインの、例えばＫａｂａｔの定義による、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を１つ、２つもしくは３つすべて含むか、または密接に関連しているＣＤＲ、例えば、配列番号３２内のＣＤＲ配列のいずれかからの少なくとも１つのアミノ酸変更、しかし２、３もしくは４つ以下の変更（例えば、置換、欠失もしくは挿入、例えば、保存的置換）を有する、ＣＤＲを含む。
【０４９２】
実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭは、配列番号３２のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号３２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高度に同一性の、あるいは配列番号３２と比べて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれより多くのアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、アミノ酸配列）を含むことができる。実施形態では、ＩＦＭは、配列番号３２と比べて５、１０または１５以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
【０４９３】
本開示のＩＦＭに含めることができる追加の配列が下の表１に示される。一部の実施形態では、ＩＦＭは、定常ラムダまたはラムダ領域を含む。例示的定常ラムダまたはラムダ領域としては、配列番号７４〜７８が挙げられる。様々な実施形態では、本明細書に記載されるＩＦＭは、配列番号１〜１０４のアミノ酸配列のうちの１つもしくは複数、またはそれと実質的に同一性のアミノ酸配列（例えば、配列番号１〜１０４のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高度に同一の、あるいは配列番号１〜１０４のいずれか１つと比べて少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０もしくはそれより多くのアミノ酸変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を有する、アミノ酸配列）を含むことができる。実施形態では、ＩＦＭは、配列番号１〜１０４のいずれか１つと比べて５、１０または１５以下の変更（例えば、置換、欠失、または挿入、例えば、保存的置換）を含む。
【表１−１】
2020530440.tif 000018
【表１−２】
2020530440.tif 000019
【表１−３】
2020530440.tif 000020
【表１−４】
2020530440.tif 000021
【表１−５】
2020530440.tif 000022
【表１−６】
2020530440.tif 000023
【表１−７】
2020530440.tif 000024
タンパク質バリアント
【０４９４】
完全長ポリペプチドおよびそのバリアントが、下に記載される。完全長ＩＬ−１５配列（配列番号４０）は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＡ６２６１６．１から得られる；成熟ＩＬ−１５は、シグナル配列を欠き、配列番号１０で定義される。完全長ＩＬ−１５Ｒα（配列番号４１）は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＩ２１１４１．１から得られる。ＩＬ−１５Ｒαのｓｕｓｈｉドメイン（ＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ）は、配列番号９によって与えられる。第１および第４のシステインと介在アミノ酸とを包含する最小ｓｕｓｈｉドメイン（配列番号５２）も他の箇所に記載されており、これは、妥当な代用物である。同様に、ネイティブＴｈｒもしくはＩｌｅ−Ｔｈｒを含む最小ｓｕｓｈｉドメインへの必要に応じたＮ末端付加、および／またはＩｌｅもしくはＩｌｅ−Ａｒｇを含む最小ｓｕｓｈｉドメインへの必要に応じたＣ末端付加も、妥当である。
【０４９５】
下に記載されるタンパク質バリアントは、タンパク質サブユニット名、および成熟タンパク質に対応する配列番号を指定する。発現する細胞からの分泌を促進するために、各タンパク質サブユニットをＮ末端シグナルペプチドと組換え発現させた。ｓｕｓｈｉ、ｓｕｓｈｉ−Ｌ７７Ｉ−Ｆｃ、およびｓｕｓｈｉ−Ｆｃには、ネイティブＩＬ−１５Ｒαシグナルペプチド（配列番号３５）を使用した。配列番号３３におけるリーダー配列を使用して、抗体軽鎖、ＩＬ−１５−ＷＴ、Ｎ末端ＩＬ−１５融合体、ＩＬ１５−Ｎ７２Ｄ、およびＦａｂ軽鎖へのｓｕｓｈｉのＮ末端融合体の分泌を支持した。抗体重鎖の分泌を支持するために、配列番号３４におけるリーダー配列を使用した。
【０４９６】
「重鎖」および「軽鎖」の命名法には、本発明者らは、抗体についての標準命名体系を使用する。例えば、抗体Ｆａｂ断片の場合、両方の鎖は、ほぼ同じ分子量を有するが、本発明者らは、完全長抗体における重鎖に対応する（例えば、可変重鎖およびＣＨ１ドメインを含有する）Ｆａｂ断片の鎖として、重鎖に言及する。さらに、Ｆａｂ断片の軽鎖とのサイトカイン融合体の場合、軽鎖は、サイトカイン融合体のため重鎖より大きい分子量を実際には有することになるが、一貫性を保つために、本発明者らは、可変軽鎖ドメインと定常カッパドメインとサイトカイン融合体が「軽鎖」を構成し、その一方で、可変重鎖ドメインとＣＨ１ドメインが「重鎖」を構成する、標準命名規則を維持する。
タンパク質名：ｃｈＢＣ８−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ（ｃｈＢＣ８−Ｌ１−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂとも呼ばれる）。
【０４９７】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈＢＣ８−Ｆａｂ（配列番号５）、ＬＣ−ｃｈＢＣ８−ＩＬ１５（配列番号３）、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ（配列番号９）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−Ｌ１（配列番号３６）を使用するキメラＢＣ８  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端への野生型ＩＬ−１５の融合、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉとの（ＩＬ−１５との相互作用による）非共有結合的会合を含む。キメラＢＣ８  Ｆａｂは、親マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）からの可変重鎖および可変軽鎖ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）と、ヒトからの定常ドメイン（ヒト定常カッパドメインおよびヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメイン）とを含む、抗ヒトＣＤ４５Ｒ抗体Ｆａｂ断片である。
タンパク質名：ＩＬ１５−ｃｈＢＣ８／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ
【０４９８】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈＢＣ８−Ｆａｂ（配列番号５）、ＩＬ１５−ＬＣ−ｃｈＢＣ８（配列番号４）、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ（配列番号９）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−Ｌ１（配列番号３６）を使用するキメラＢＣ８  Ｆａｂ断片軽鎖のＮ末端へのＩＬ−１５の融合、およびＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ間の非共有結合的会合を含む。
タンパク質名：ｃｈＢＣ８−ｓｕｓｈｉ／ＩＬ１５−Ｎ７２Ｄ  Ｆａｂ
【０４９９】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈＢＣ８−Ｆａｂ（配列番号５）、ＬＣ−ｃｈＢＣ８−ｓｕｓｈｉ（配列番号１）、およびＩＬ１５−Ｎ７２Ｄ（配列番号１１）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−Ｌ１（配列番号３６）を使用するキメラＢＣ８  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端へのＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉの融合、およびＩＬ１５−Ｎ７２ＤとＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ間の非共有結合的会合を含む。
タンパク質名：ｓｕｓｈｉ−ｃｈＢＣ８／ＩＬ１５−Ｎ７２Ｄ  Ｆａｂ
【０５００】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈＢＣ８−Ｆａｂ（配列番号５）、ｓｕｓｈｉ−ＬＣ−ｃｈＢＣ８（配列番号２）、およびＩＬ１５−Ｎ７２Ｄ（配列番号１１）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−Ｌ１（配列番号３６）を使用するキメラＢＣ８  Ｆａｂ断片軽鎖のＮ末端へのＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉの融合、およびＩＬ１５−Ｎ７２ＤとＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ間の非共有結合的会合を含む。
タンパク質名：ｃｈＢＣ８−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  ＩｇＧ
【０５０１】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈＢＣ８−ＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ（配列番号６）、ＬＣ−ｃｈＢＣ８−ＩＬ１５（配列番号３）、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ（配列番号９）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−Ｌ１（配列番号３６）を使用するキメラＢＣ８  ＩｇＧ−Ｓ２２８Ｐ軽鎖のＣ末端への野生型ＩＬ−１５の融合、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉとの（ＩＬ−１５との相互作用による）非共有結合的会合を含む。キメラＢＣ８  ＩｇＧ４−Ｓ２２８Ｐは、親マウスｍＡｂからの可変重鎖および可変軽鎖ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）と、ヒトからの定常ドメイン（ヒト定常カッパドメイン、およびＩｇＧ４のＦａｂアーム交換に対する感受性を低下させるＳ２２８Ｐ点変異を含有するヒトＩｇＧ４）とを含む、抗ヒトＣＤ４５Ｒ抗体である。
タンパク質名：ＩＬ１５−ｃｈＢＣ８／ｓｕｓｈｉ  ＩｇＧ
【０５０２】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈＢＣ８−ＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ（配列番号６）、ＩＬ１５−ＬＣ−ｃｈＢＣ８（配列番号４）、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ（配列番号９）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−Ｌ１（配列番号３６）を使用するキメラＢＣ８  ＩｇＧ４−Ｓ２２８Ｐ軽鎖のＮ末端への野生型のＩＬ−１５の融合、およびＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ間の非共有結合的会合を含む。
タンパク質名：ｃｈＢＣ８−ｓｕｓｈｉ／ＩＬ１５−Ｎ７２Ｄ  ＩｇＧ
【０５０３】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈＢＣ８−ＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ（配列番号６）、ＬＣ−ｃｈＢＣ８−ｓｕｓｈｉ（配列番号１）、およびＩＬ１５−Ｎ７２Ｄ（配列番号１１）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−Ｌ１（配列番号３６）を使用するキメラＢＣ８  ＩｇＧ４−Ｓ２２８Ｐ軽鎖のＣ末端へのＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉの融合、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉとＩＬ−１５間の非共有結合的会合を含む。
タンパク質名：ｓｕｓｈｉ−ｃｈＢＣ８／ＩＬ１５−Ｎ７２Ｄ  ＩｇＧ
【０５０４】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈＢＣ８−ＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ（配列番号６）、ｓｕｓｈｉ−ＬＣ−ｃｈＢＣ８（配列番号２）、およびＩＬ１５−Ｎ７２Ｄ（配列番号１１）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−Ｌ１（配列番号３６）を使用するキメラＢＣ８  ＩｇＧ４−Ｓ２２８Ｐ軽鎖のＮ末端へのＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉの融合、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉとＩＬ−１５間の非共有結合的会合を含む。
タンパク質名：ｃｈＢＣ８−（ＨＣ）−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  ＩｇＧ
【０５０５】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈＢＣ８−ＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ−ＩＬ１５（配列番号８）、ＬＣ−ｃｈＢＣ８（配列番号７）、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ（配列番号９）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−Ｌ１（配列番号３６）を使用するキメラＢＣ８  ＩｇＧ４−Ｓ２２８Ｐ重鎖のＣ末端へのＩＬ−１５の融合、およびＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ間の非共有結合的会合を含む。
タンパク質名：ｃｈＢＣ８−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  ｓｃＦｖ
【０５０６】
このタンパク質は、２つのサブユニット：ＢＣ８ｓｃＦｖ−ＩＬ１５（配列番号３２）およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ（配列番号９）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−Ｌ１（配列番号３６）を使用するＢＣ８−ｓｃＦｖのＣ末端へのＩＬ−１５の融合、およびＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ間の非共有結合的会合を含む。ＢＣ８−ｓｃＦｖは、可動性リンカーによりつながれた親マウスｍＡｂからの可変ドメインを含む。
タンパク質名：ＩＬ１５−Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉＬ７７１−Ｆｃ
【０５０７】
このタンパク質は、２つのサブユニット：ＩＬ１５−Ｎ７２Ｄ（配列番号１１）およびｓｕｓｈｉ−Ｌ７７Ｉ−Ｆｃ（配列番号１２）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ領域のＮ末端に融合された、Ｌ７７Ｉ変異を含有するＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ、およびＩＬ１５−Ｎ７２ＤとＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ間の非共有結合的会合を含む。
タンパク質名：ＩＬ１５−ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ
【０５０８】
このタンパク質は、２つのサブユニット：ＩＬ１５−ＷＴ（配列番号１０）およびｓｕｓｈｉ−Ｆｃ（配列番号１３）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ領域のＮ末端へのＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉの融合、およびＩＬ１５−ＷＴとＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ間の非共有結合的会合を含む。
タンパク質名：ＩＬ１５−ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−ＩｇＧ２Ｄａ−Ｆｃ
【０５０９】
このタンパク質は、２つのサブユニット：ＩＬ１５−ＷＴ（配列番号１０）およびｓｕｓｈｉ−ＩｇＧ２Ｄａ−Ｆｃ（配列番号５６）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、ヒトＩｇＧ２Ｄａ−Ｆｃ領域のＮ末端へのＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉの融合、およびＩＬ１５−ＷＴとの（ＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉとの相互作用による）非共有結合的会合を含む。
タンパク質名：ｃｈ９．４−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ
【０５１０】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈ９．４−Ｆａｂ（配列番号１４）、ＬＣ−ｃｈ９．４−ＩＬ１５（配列番号１５）、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ（配列番号９）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−Ｌ１（配列番号３６）を使用するキメラ９．４  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端への野生型ＩＬ−１５の融合、およびＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ間の非共有結合的会合を含む。キメラ９．４  Ｆａｂは、親マウスｍＡｂ（ＡＴＣＣハイブリドーマＨＢ−１０５０８に対応する）からの可変重鎖および可変軽鎖ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）と、ヒトからの定常ドメイン（ヒト定常カッパドメインおよびヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメイン）とを含む、抗ＣＤ４５Ｒ抗体Ｆａｂ断片である。
タンパク質名：ｃｈ４Ｂ２−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ
【０５１１】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈ４Ｂ２−ＩＬ１５（配列番号１６）、ＬＣ−ｃｈ４Ｂ２−ＩＬ１５（配列番号１７）、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ（配列番号９）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−Ｌ１（配列番号３６）を使用するキメラ４Ｂ２  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端への野生型ＩＬ−１５の融合、およびＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ間の非共有結合的会合を含む。キメラ４Ｂ２  Ｆａｂは、親マウスｍＡｂ（ＡＴＣＣハイブリドーマＨＢ−１１１８６に対応する）からの可変重鎖および可変軽鎖ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）と、ヒトからの定常ドメイン（ヒト定常カッパドメインおよびヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメイン）とを含む、抗ＣＤ４５Ｒ抗体Ｆａｂ断片である。
タンパク質名：ｈＢＣ８（２３）−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ
【０５１２】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｈＢＣ８（２３）−Ｆａｂ（配列番号１８）、ＬＣ−ｈＢＣ８（２３）−ＩＬ１５（配列番号１９）、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ（配列番号９）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−Ｌ１（配列番号３６）を使用するヒト化ＢＣ８  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端への野生型ＩＬ−１５の融合、およびＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ間の非共有結合的会合を含む。ヒト化ＢＣ８（２３）Ｆａｂは、親マウスｍＡｂからヒト化された可変重鎖および可変軽鎖ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）と、ヒトからの定常ドメイン（ヒト定常カッパドメインおよびヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメイン）とを含む、抗ＣＤ４５Ｒ抗体Ｆａｂ断片である。
タンパク質名：ｈＢＣ８−ヌル−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ
【０５１３】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈＢＣ８（２３）−ヌル−Ｆａｂ（配列番号２０）、ＬＣ−ｈＢＣ８（２３）−ＩＬ１５（配列番号１９）、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ（配列番号９）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−Ｌ１（配列番号３６）を使用するヒト化ＢＣ８  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端への野生型ＩＬ−１５の融合、およびＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ間の非共有結合的会合を含む。このタンパク質は、その重鎖が、ＣＤ４５Ｒに対する結合親和性が除去される結果となる（それ故に「ヌル」結合バリアントと表記）ＧＧＧＳ置換をＣＤＲ−Ｈ３ループ内に含有する点で、ｈＢＣ８（２３）−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂとは異なる。したがって、このＩＬ１５融合タンパク質は、ＣＤ４５Ｒ結合の効果の陰性対照として役立つ。
タンパク質名：ｃｈＢＣ８−Ｌ２−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ
【０５１４】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈＢＣ８−Ｆａｂ（配列番号５）、ＬＣ−ｃｈＢＣ８−Ｌ２−ＩＬ１５（配列番号２１）、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ（配列番号９）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−Ｌ２（配列番号３７）を使用するキメラＢＣ８  Ｆａｂ断片軽鎖のＮ末端へのＩＬ−１５の融合、およびＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ間の非共有結合的会合を含む。
タンパク質名：ｃｈＢＣ８−Ｌ３−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ
【０５１５】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈＢＣ８−Ｆａｂ（配列番号５）、ＬＣ−ｃｈＢＣ８−Ｌ３−ＩＬ１５（配列番号２２）、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ（配列番号９）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−Ｌ３（配列番号３８）を使用するキメラＢＣ８  Ｆａｂ断片軽鎖のＮ末端へのＩＬ−１５の融合、およびＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ間の非共有結合的会合を含む。
タンパク質名：ｃｈＭＨＭ２４−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ
【０５１６】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈＭＨＭ２４−Ｆａｂ（配列番号２６）、ＬＣ−ＭＨＭ２４−ＩＬ１５（配列番号２７）、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ（配列番号９）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−Ｌ１（配列番号３６）を使用するキメラＭＨＭ２４  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端への野生型ＩＬ−１５の融合、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉとの（ＩＬ−１５との相互作用による）非共有結合的会合を含む。キメラＭＨＭ２４  Ｆａｂは、親マウスｍＡｂからの可変重鎖および可変軽鎖ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）と、ヒトからの定常ドメイン（ヒト定常カッパドメインおよびヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメイン）とを含む、抗ヒトＣＤ１１ａ抗体Ｆａｂ断片である。
タンパク質名：ｃｈ１Ｂ４−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ
【０５１７】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈ１Ｂ４−Ｆａｂ（配列番号２８）、ＬＣ−ｃｈ１Ｂ４−ＩＬ１５（配列番号２９）、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ（配列番号９）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−Ｌ１（配列番号３６）を使用するキメラ１Ｂ４  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端への野生型ＩＬ−１５の融合、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉとの（ＩＬ−１５との相互作用による）非共有結合的会合を含む。キメラ１Ｂ４  Ｆａｂは、親マウスｍＡｂからの可変重鎖および可変軽鎖ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）と、ヒトからの定常ドメイン（ヒト定常カッパドメインおよびヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメイン）とを含む、抗ヒトＣＤ１８抗体Ｆａｂ断片である。
タンパク質名：ｃｈＯＫＴ８−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ
【０５１８】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈＯＫＴ８−Ｆａｂ（配列番号３０）、ＬＣ−ｃｈＯＫＴ８−ＩＬ１５（配列番号３１）、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ（配列番号９）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−Ｌ１（配列番号３６）を使用するキメラＯＫＴ８  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端への野生型ＩＬ−１５の融合、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉとの（ＩＬ−１５との相互作用による）非共有結合的会合を含む。キメラＯＫＴ８  Ｆａｂは、親マウスｍＡｂからの可変重鎖および可変軽鎖ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）と、ヒトからの定常ドメイン（ヒト定常カッパドメインおよびヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメイン）とを含む、抗ヒトＣＤ８抗体Ｆａｂ断片である。
タンパク質名：ｈ９．４Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０
【０５１９】
このタンパク質は、２つのサブユニット：ＨＣ−ｈ９．４Ｆａｂ（配列番号７９）およびＬＣ−ｈ９．４Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０（配列番号８２）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−１（配列番号３６）を使用するｈ９．４  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端への一本鎖ヒトＩＬ−１２ｐ７０の融合を含む。ｈ９．４  Ｆａｂは、ｈ９．４からの可変重鎖および可変軽鎖ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）と、ヒトからの定常ドメイン（ヒト定常カッパドメインおよびヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメイン）とを含む、抗ヒトＣＤ４５Ｒ抗体Ｆａｂ断片である。
タンパク質名：ｈ９．４Ｆａｂ−ｈ９．４ｓｃＦｖ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０
【０５２０】
このタンパク質は、２つのサブユニット：ＨＣ−ｈ９．４Ｆａｂ−ｈ９．４ｓｃＦｖ（配列番号８０）およびＬＣ−ｈ９．４Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０（配列番号８２）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−１（配列番号３６）を使用するｈ９．４  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端への一本鎖ヒトＩＬ−１２ｐ７０の融合、およびリンカー−１を使用するｈ９．４  Ｆａｂ断片重鎖へのｈ９．４  ｓｃＦｖの融合を含む。
タンパク質名：ｈ９．４Ｆａｂ−ｈＢＣ８ｓｃＦｖ−ｓｃＩＬ−１２−ｐ７０  
【０５２１】
このタンパク質は、２つのサブユニット：ＨＣ−ｈ９．４Ｆａｂ−ｈＢＣ８ｓｃＦｖ（配列番号８１）およびＬＣ−ｈ９．４Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０（配列番号８２）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−１（配列番号３６）を使用するｈ９．４  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端への一本鎖ヒトＩＬ−１２ｐ７０の融合、およびリンカー−１（配列番号３６）を使用するｈ９．４  Ｆａｂ断片重鎖へのｈＢＣ８  ｓｃＦｖの融合を含む。
タンパク質名：ｈ９．４Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０ＡＢ
【０５２２】
このタンパク質は、２つのサブユニット：ＨＣ−ｈ９．４Ｆａｂ（配列番号７９）およびＬＣ−ｈ９．４Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０ＡＢ（配列番号１０２）、の共発現によって作製する。結果として生じるタンパク質は、リンカー−１（配列番号３６）を使用するｈ９．４  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端への一本鎖ヒトＩＬ−１２ｐ７０の融合を含む。
タンパク質名：ｈ９．４Ｆａｂ−ｈ９．４ｓｃＦｖ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０ＡＢ
【０５２３】
このタンパク質は、２つのサブユニット：ＨＣ−ｈ９．４Ｆａｂ−ｈ９．４ｓｃＦｖ（配列番号８０）およびＬＣ−ｈ９．４Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０ＡＢ（配列番号１０２）、の共発現によって作製する。結果として生じるタンパク質は、リンカー−１（配列番号３６）を使用するｈ９．４  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端への一本鎖ヒトＩＬ−１２ｐ７０の融合、およびリンカー−１を使用するｈ９．４  Ｆａｂ断片重鎖へのｈ９．４  ｓｃＦｖの融合を含む。
タンパク質名：ｈ９．４Ｆａｂ−ｈＢＣ８ｓｃＦｖ−ｓｃＩＬ−１２−ｐ７０ＡＢ
【０５２４】
このタンパク質は、２つのサブユニット：ＨＣ−ｈ９．４Ｆａｂ−ｈＢＣ８ｓｃＦｖ（配列番号８１）およびＬＣ−ｈ９．４Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０ＡＢ（配列番号１０２）、の共発現によって作製する。結果として生じるタンパク質は、リンカー−１（配列番号３６）を使用するｈ９．４  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端への一本鎖ヒトＩＬ−１２ｐ７０の融合、およびリンカー−１（配列番号３６）を使用するｈ９．４  Ｆａｂ断片重鎖へのｈＢＣ８  ｓｃＦｖの融合を含む。
タンパク質名：ｈ９．４Ｆａｂ−ＩＬ−１２ｐ７０ＡＢ
【０５２５】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｈ９．４Ｆａｂ（配列番号７９）、ＬＣ−ｈ９．４Ｆａｂ−ＩＬ−１２Ａ（配列番号１０３）、およびＩＬ−１２Ｂ（配列番号４９）、の共発現によって作製する。結果として生じるタンパク質は、リンカー−１（配列番号３６）を使用するｈ９．４  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端へのヒトＩＬ−１２Ａの融合を含む。完全ＩＬ−１２ｐ７０は、ＩＬ−１２ＡとＩＬ−１２Ｂ間の会合により形成される。
タンパク質名：ｈ９．４Ｆａｂ−ｈ９．４ｓｃＦｖ−ＩＬ−１２ｐ７０ＡＢ
【０５２６】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｈ９．４Ｆａｂ−ｈ９．４ｓｃＦｖ（配列番号８０）、ＬＣ−ｈ９．４Ｆａｂ−ＩＬ−１２Ａ（配列番号１０３）、およびＩＬ−１２Ｂ（配列番号４９）、の共発現によって作製する。結果として生じるタンパク質は、リンカー−１（配列番号３６）を使用するｈ９．４  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端へのヒトＩＬ−１２Ａの融合、およびリンカー−１を使用するｈ９．４  Ｆａｂ断片重鎖へのｈ９．４  ｓｃＦｖの融合を含む。完全ＩＬ−１２ｐ７０は、ＩＬ−１２ＡとＩＬ−１２Ｂ間の会合により形成される。
タンパク質名：ｈ９．４Ｆａｂ−ｈＢＣ８ｓｃＦｖ−ＩＬ−１２−ｐ７０ＡＢ
【０５２７】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｈ９．４Ｆａｂ−ｈＢＣ８ｓｃＦｖ（配列番号８１）、ＬＣ−ｈ９．４Ｆａｂ−ＩＬ−１２Ａ（配列番号１０３）、およびＩＬ−１２Ｂ（配列番号４９）、の共発現によって作製する。結果として生じるタンパク質は、リンカー−１（配列番号３６）を使用するｈ９．４  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端へのヒトＩＬ−１２Ａの融合、およびリンカー−１（配列番号３６）を使用するｈ９．４  Ｆａｂ断片重鎖へのｈＢＣ８  ｓｃＦｖの融合を含む。完全ＩＬ−１２ｐ７０は、ＩＬ−１２ＡとＩＬ−１２Ｂ間の会合により形成される。
タンパク質名：ｈ９．４Ｆａｂ−ＩＬ−１２ｐ７０ＢＡ
【０５２８】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｈ９．４Ｆａｂ（配列番号７９）、ＬＣ−ｈ９．４Ｆａｂ−ＩＬ−１２Ｂ（配列番号１０４）、およびＩＬ−１２Ａ（配列番号４７）、の共発現によって作製する。結果として生じるタンパク質は、リンカー−１（配列番号３６）を使用するｈ９．４  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端へのヒトＩＬ−１２Ｂの融合を含む。完全ＩＬ−１２ｐ７０は、ＩＬ−１２ＢとＩＬ−１２Ａ間の会合により形成される。
タンパク質名：ｈ９．４Ｆａｂ−ｈ９．４ｓｃＦｖ−ＩＬ−１２ｐ７０ＢＡ
【０５２９】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｈ９．４Ｆａｂ−ｈ９．４ｓｃＦｖ（配列番号８０）、ＬＣ−ｈ９．４Ｆａｂ−ＩＬ−１２Ｂ（配列番号１０４）、およびＩＬ−１２Ａ（配列番号４７）、の共発現によって作製する。結果として生じるタンパク質は、リンカー−１（配列番号３６）を使用するｈ９．４  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端へのヒトＩＬ−１２Ｂの融合、およびリンカー−１を使用するｈ９．４  Ｆａｂ断片重鎖へのｈ９．４  ｓｃＦｖの融合を含む。完全ＩＬ−１２ｐ７０は、ＩＬ−１２ＢとＩＬ−１２Ａ間の会合により形成される。
タンパク質名：ｈ９．４Ｆａｂ−ｈＢＣ８ｓｃＦｖ−ＩＬ−１２−ｐ７０ＢＡ
【０５３０】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｈ９．４Ｆａｂ−ｈＢＣ８ｓｃＦｖ（配列番号８１）、ＬＣ−ｈ９．４Ｆａｂ−ＩＬ−１２Ｂ（配列番号１０４）、およびＩＬ−１２Ａ（配列番号４７）、の共発現によって作製する。結果として生じるタンパク質は、リンカー−１（配列番号３６）を使用するｈ９．４  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端へのヒトＩＬ−１２Ｂの融合、およびリンカー−１（配列番号３６）を使用するｈ９．４  Ｆａｂ断片重鎖へのｈＢＣ８  ｓｃＦｖの融合を含む。完全ＩＬ−１２ｐ７０は、ＩＬ−１２ＢとＩＬ−１２Ａ間の会合により形成される。
タンパク質名：ｃｈＭ１Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０
【０５３１】
このタンパク質は、２つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈＭ１Ｆａｂ（配列番号８３）およびＬＣ−ｃｈＭ１Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０（配列番号８４）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−１（配列番号３６）を使用するｃｈＭ１  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端への一本鎖マウスＩＬ−１２ｐ７０の融合を含む。
タンパク質名：ｃｈＭ１Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０
【０５３２】
このタンパク質は、２つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈＭ１Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ（配列番号８６）およびＬＣ−ｃｈＭ１Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０（配列番号８４）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−１（配列番号３６）を使用するｃｈＭ１  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端への一本鎖マウスＩＬ−１２ｐ７０の融合、およびリンカー−１（配列番号３６）を使用するｃｈＭ１  Ｆａｂ断片重鎖へのＭ１  ｓｃＦｖの融合を含む。
タンパク質名：ｃｈＭ１Ｆａｂ−ＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ
【０５３３】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈＭ１Ｆａｂ（配列番号８３）、ＬＣ−ｃｈＭ１Ｆａｂ−ＩＬ−１５（配列番号８５）、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ（配列番号９）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−１（配列番号３６）を使用するｃｈＭ１  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端への野生型ヒトＩＬ−１５の融合、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉとの（ＩＬ−１５との相互作用による）非共有結合的会合を含む。
タンパク質名：ｃｈＭ１Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ−ＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ
【０５３４】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈＭ１Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ（配列番号８６）およびＬＣ−ｃｈＭ１Ｆａｂ−ＩＬ−１５（配列番号８５）およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ（配列番号９）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−１（配列番号３６）を使用するｃｈＭ１  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端への野生型ヒトＩＬ−１５の融合、リンカー−１（配列番号３６）を使用するｃｈＭ１  Ｆａｂ断片重鎖へのＭ１  ｓｃＦｖの融合、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉとの（ＩＬ−１５との相互作用による）非共有結合的会合を含む。
タンパク質名：ｃｈＹ１６９Ｆａｂ−ＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ
【０５３５】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈＹ１６９Ｆａｂ（配列番号８７）、ＬＣ−ｃｈＹ１６９Ｆａｂ−ＩＬ−１５（配列番号８８）、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ（配列番号９）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−１（配列番号３６）を使用するキメラＹ１６９  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端への野生型ＩＬ−１５の融合、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉとの（ＩＬ−１５との相互作用による）非共有結合的会合を含む。
タンパク質名：ｃｈＹ１６９Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ−ＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ
【０５３６】
このタンパク質は、３つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈＹ１６９Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ（配列番号８９）、ＬＣ−ｃｈＹ１６９Ｆａｂ−ＩＬ−１５（配列番号８８）、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉ（配列番号９）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−１（配列番号３６）を使用するキメラＹ１６９  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端への野生型ＩＬ−１５の融合、リンカー−１（配列番号３６）を使用するｃｈＹ１６９  Ｆａｂ断片重鎖へのＭ１  ｓｃＦｖの融合、およびＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉとの（ＩＬ−１５との相互作用による）非共有結合的会合を含む。
タンパク質名：ｃｈＹ１６９Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０
【０５３７】
このタンパク質は、２つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈＹ１６９Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ（配列番号８９）およびＬＣ−ｃｈＹ１６９Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０（配列番号９０）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−１（配列番号３６）を使用するキメラＹ１６９  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端への一本鎖マウスＩＬ−１２ｐ７０の融合、およびリンカー−１（配列番号３６）を使用するｃｈＹ１６９  Ｆａｂ断片重鎖へのＭ１  ｓｃＦｖの融合を含む。
タンパク質名：ｃｈＹ１６９Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０
【０５３８】
このタンパク質は、２つのサブユニット：ＨＣ−ｃｈＹ１６９Ｆａｂ−（配列番号８７）およびＬＣ−ｃｈＹ１６９Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０（配列番号９０）、の共発現によって作製した。結果として生じるタンパク質は、リンカー−１（配列番号３６）を使用するキメラＹ１６９  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端への一本鎖マウスＩＬ−１２ｐ７０の融合を含む。
核酸／ベクター／細胞
【０５３９】
本開示はまた、本明細書に記載される免疫刺激性融合体分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を特徴とする。本明細書に記載されるＩＦＭおよび抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むベクターが、本明細書においてさらに提供される。一実施形態では、ベクターは、本明細書に記載されるＩＦＭおよび抗体分子をコードする、ヌクレオチドを含む。一実施形態では、ベクターは、本明細書に記載されるヌクレオチド配列を含む。ベクターは、ウイルス、プラスミド、コスミド、ラムダファージまたは酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含むが、これらに限定されない。非常に多くのベクター系を利用することができる。例えば、ベクターの１つのクラスは、例えば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ラウス肉腫ウイルス、ＭＭＴＶもしくはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルスなどの、動物ウイルスに由来する、ＤＮＡエレメントを利用する。ベクターの別のクラスは、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルスおよびフラビウイルスなどの、ＲＮＡウイルスに由来する、ＲＮＡエレメントを利用する。
【０５４０】
加えて、ＤＮＡが染色体に安定的に組み込まれている細胞を、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つまたは複数のマーカーを導入することにより、選択することができる。マーカーは、例えば、栄養要求性宿主に対する原栄養性（prototropy）、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）、または銅などの重金属に対する耐性などを提供することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現させるべきＤＮＡ配列に直接連結させることができるか、または共形質転換（cotransformation）により同じ細胞に導入することができるかのいずれかである。追加のエレメントが、ｍＲＮＡの最適な合成に必要とされることもある。これらのエレメントとしては、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルを挙げることができる。
【０５４１】
構築物を含有する発現ベクターまたはＤＮＡ配列を発現のために調製し終えたら、発現ベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクトまたは導入することができる。これを達成するために、例えば、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、電子穿孔、レトロウイルス形質導入、ウイルストランスフェクション、遺伝子銃、脂質ベースのトランスフェクションまたは他の従来の技法などの、様々な技法を利用することができる。プロトプラスト融合の場合、細胞は、培地で成長させられ、適切な活性についてスクリーニングされる。
【０５４２】
結果として生じるトランスフェクトされた細胞を培養するための、および産生された抗体分子を回収するための、方法および条件は、当業者に公知であり、本明細書に基づいて、利用される特定の発現ベクターおよび哺乳動物宿主細胞に依存して、そのような方法および条件を変えることまたは最適化することができる。
【０５４３】
別の態様では、本願は、本明細書に記載される核酸を含有する宿主細胞およびベクターを特徴とする。核酸は、単一のベクターの中に存在することもあり、または同じ宿主細胞もしくは別々の宿主細胞内に存在する別々のベクターの中に存在することもある。宿主細胞は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞であってもよく、または原核細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉであってもよい。例えば、哺乳動物細胞は、培養細胞であってもよく、または細胞株であってもよい。例示的哺乳動物細胞としては、リンパ球系の細胞株（例えば、ＮＳＯ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞、卵母細胞、およびトランスジェニック動物からの細胞、例えば乳腺上皮細胞が挙げられる。
【０５４４】
本開示は、本明細書に記載の抗体分子をコードする核酸を含む宿主細胞も提供する。一実施形態では、宿主細胞は、抗体分子をコードする核酸を含むように遺伝子操作される。一実施形態では、宿主細胞は、発現カセットを使用することにより遺伝子操作される。句「発現カセット」は、ヌクレオチド配列と適合性の宿主における遺伝子の発現に影響を与えることができる、ヌクレオチド配列を指す。そのようなカセットは、プロモーター、イントロンを有するまたは有さないオープンリーディングフレーム、および終結シグナルを含むことができる。発現を生じさせるのに必要なまたは役に立つ追加の因子、例えば、誘導性プロモーターなども、使用することができる。本開示は、本明細書に記載されるベクターを含む宿主細胞も提供する。細胞は、これらに限定されないが、真核細胞、細菌細胞、昆虫細胞、またはヒト細胞であることができる。好適な真核細胞としては、ベロ細胞、ヒーラ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞およびＭＤＣＫＩＩ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好適な昆虫細胞としては、Ｓｆ９細胞が挙げられるが、これに限定されない。
組成物
【０５４５】
免疫刺激性融合分子を含む、医薬組成物を含む、組成物が、本明細書において提供される。薬学的に許容される量で、薬学的に許容される組成で、組成物を製剤化することができる。用語「薬学的に許容される」は、活性成分（例えば、ナノ粒子の生物活性タンパク質）の生物活性の有効性に干渉しない非毒性の材料を意味する。そのような組成物は、一部の実施形態では、塩、緩衝剤、保存剤、および必要に応じて他の治療剤を含有することがある。医薬組成物は、一部の実施形態では、好適な保存剤を含有することもある。医薬組成物を、一部の実施形態では、単位剤形で提供することができ、薬学技術分野において周知の方法のいずれかにより調製することができる。非経口投与に好適な医薬組成物は、一部の実施形態では、ナノ粒子の滅菌水性または非水性調製物であって、一部の実施形態ではレシピエント対象の血液と等張性である、調製物を含む。この調製物は、公知の方法に従って製剤化することができる。滅菌注射用調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液であることもある。
【０５４６】
追加の組成物は、修飾された細胞、例えば、それらの細胞表面にテザーされた１つまたは複数の融合タンパク質をさらに含む修飾された免疫細胞を含む。これは、養子細胞療法、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、操作されたＴＣＲ  Ｔ細胞療法、腫瘍浸潤リンパ球療法、抗原訓練Ｔ細胞療法、富化抗原特異的Ｔ細胞療法、またはＮＫ細胞療法などの、細胞療法のｅｘ  ｖｉｖｏでの準備に有用でありうる。
【０５４７】
一部の実施形態では、本開示のＩＦＭは、例えばナノゲルまたはヒドロゲルまたはバイオゲルの形態で、治療用タンパク質の特異的送達のための薬剤として、特定の細胞に特有の受容体（例えば、ＣＤ４またはＣＤ８）の受容体媒介結合によって、それを必要とする患者に直接投与することができる。そのような直接投与は、全身投与（例えば、静脈内注射もしくは注入などの、非経口投与）である場合もあり、または局所投与（例えば、腫瘍内投与、例えば、腫瘍微小環境への注射）である場合もある。句「非経口投与」および「非経口投与される」は、本明細書で使用される場合、通常は注射または注入による、経腸（すなわち、消化管経由での）および局部投与以外の、投与方法を指し、限定ではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入を含む。
【０５４８】
一部の実施形態では、全身または局所投与による、患者への投与または再導入前に、単離された自己および同種異系細胞の活性化および増大を誘導するためのｅｘ  ｖｉｖｏ薬剤として、本開示のＩＦＭを使用することができる。例えば、増やした細胞を、ＡＣＴ（養子細胞移入）をはじめとするＴ細胞療法において、およびまた他の重要な免疫細胞型とともに、使用することができ、そのような免疫細胞型には、例えば、Ｂ細胞；腫瘍浸潤リンパ球；ＮＫ細胞；抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞；キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作されたＴ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞；腫瘍抗原、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）および／または抗原訓練Ｔ細胞（例えば、目的の抗原、例えば腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、を提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）により「訓練」されたＴ細胞）に特異的なＴ細胞受容体を発現するように遺伝子操作されたＴ細胞が含まれる。
治療的使用および方法
【０５４９】
免疫刺激性融合分子およびそれらを含有する組成物には、例えば、がんおよび感染性疾患の処置を含む、非常に多くの治療的有用性がある。本開示は、がんを有する対象を処置するための、がんを有する対象において免疫応答を誘導する方法を、なかんずく、提供する。例示的方法は、ＩＦＭが、サイトカインの細胞表面利用可能性を増加させるように、そして結果的にそのシグナル伝達を増強するように、選択および設計された、本明細書に記載される免疫刺激性融合分子のいずれかの治療有効量を、対象に投与することを含む。
【０５５０】
本明細書に記載される方法は、ＩＦＭ、例えば、本明細書に記載のＩＦＭまたはＩＦＭを含むナノ粒子を使用することにより、例えば、本明細書に記載される医薬組成物を使用することにより、対象におけるがんを処置することを含む。対象におけるがんの症状を軽減または改善する方法、ならびにがんの成長を阻害するおよび／または１つもしくは複数のがん細胞を死滅させる方法も、提供される。実施形態では、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載されるものまたは本明細書に記載される医薬組成物が投与された対象において、腫瘍のサイズを低下させ、および／またはがん細胞の数を減少させる。
【０５５１】
実施形態では、がんは、血液がんである。実施形態では、血液がんは、白血病またはリンパ腫である。本明細書で使用される場合、「血液がん」は、造血組織またはリンパ系組織の腫瘍、例えば、血液、骨髄またはリンパ節に影響を及ぼす腫瘍を指す。例示的な血液悪性疾患としては、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ヘアリー細胞白血病、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、もしくは大顆粒リンパ球性白血病）、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫もしくは結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫）、菌状息肉症、非ホジキンリンパ腫（例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、もしくはマントル細胞リンパ腫）もしくはＴ細胞非ホジキンリンパ腫（菌状息肉症、未分化大細胞型リンパ腫、もしくは前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫））、中枢神経系原発リンパ腫、セザリー症候群、ワルデンストレームマクログロブリン血症）、慢性骨髄増殖性新生物、ランゲルハンス細胞組織球症、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、または骨髄異形成／骨髄増殖性新生物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５５２】
実施形態では、がんは、固形がんである。例示的な固形がんとしては、卵巣がん、直腸がん、胃がん、精巣がん、肛門部のがん、子宮がん、結腸がん、直腸がん、腎細胞癌、肝臓がん、肺の非小細胞癌、小腸のがん、食道のがん、黒色腫、カポジ肉腫、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚もしくは眼内悪性黒色腫、子宮がん、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、類表皮がん、子宮頚部の癌、扁平上皮がん、卵管の癌、子宮内膜の癌、膣の癌、軟部組織の肉腫、尿道のがん、外陰部の癌、陰茎のがん、膀胱のがん、腎臓もしくは尿管のがん、腎盂の癌、脊髄軸腫瘍、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、前記がんの転移性病変、またはこれらの組合せが挙げれるが、それらに限定されない。
【０５５３】
実施形態では、免疫刺激性融合分子（または医薬組成物）は、処置または予防すべき疾患に適切な方法で投与される。投与の量および頻度は、患者の状態ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度といった因子によって決定される。適切な投薬量は、臨床試験によって決定されうる。例えば、「有効量」または「治療量」が示されている場合、投与される医薬組成物（または免疫刺激性融合分子）の正確な量は、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、対象の年齢、体重および状態の個体差を考慮して医師により決定されうる。実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物を、体重１ｋｇ当たり細胞１０４〜１０９個、例えば体重１ｋｇ当たり細胞１０５〜１０６個（これらの範囲内のすべての整数値を含む）の投薬量で、投与することができる。実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物を、これらの投薬量で複数回、投与することができる。実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物を、免疫療法に関して記載された注入技法（例えば、Rosenbergら,  New  Eng.  J.  of  Med.319:1676,  1988を参照されたい）を使用して投与することができる。
【０５５４】
実施形態では、免疫刺激性融合分子または医薬組成物は、対象に非経口投与される。実施形態では、細胞は、対象に静脈内、皮下、腫瘍内、結節内、筋肉内、皮内または腹腔内投与される。実施形態では、細胞は、直接、腫瘍またはリンパ節に投与、例えば、注射される。実施形態では、細胞は、輸液（例えば、Rosenbergら,  New  Eng.  J.  of  Med.319:1676,  1988に記載されているとおり）または静注内プッシュとして投与される。実施形態では、細胞は、注射用デポー製剤として投与される。
【０５５５】
実施形態では、対象は、哺乳動物である。実施形態では、対象は、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラットまたはマウスである。実施形態では、対象は、ヒトである。実施形態では、対象は、小児対象であり、例えば、１８歳未満、例えば、１７歳未満、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１歳またはそれ未満である。実施形態では、対象は、成体、例えば、少なくとも１８歳、例えば、少なくとも１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、または８０〜９０歳である。
併用療法
【０５５６】
本明細書において開示される免疫刺激性融合分子を、第２の治療剤または手順と組み合わせて使用することができる。
【０５５７】
一部の実施形態では、免疫刺激性融合分子は、放射線療法と組み合わせて投与される。
【０５５８】
一部の実施形態では、免疫刺激性融合分子は、細胞療法、例えば、養子細胞療法、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法、操作されたＴＣＲ  Ｔ細胞療法、腫瘍浸潤リンパ球療法、抗原訓練Ｔ細胞療法、または富化抗原特異的Ｔ細胞療法から選択される細胞療法と、併せて投与される。
【０５５９】
実施形態では、免疫刺激性融合分子および第２の治療剤または手順は、対象ががんと診断された後、例えば、がんが対象から排除されてしまう前に、投与／実行される。実施形態では、免疫刺激性融合分子および第２の治療剤または手順は、同時にまたは並行して投与／実行される。例えば、１つの処置の送達は、第２の送達が開始する時点で、まだ行われており、例えば、これらの処置の投与には重なりがある。他の実施形態では、免疫刺激性融合分子および第２の治療剤または手順は、逐次的に投与／実行される。例えば、一方の処置の送達が、他方の処置の送達が始まる前に終わる。
【０５６０】
実施形態では、併用療法は、どちらかの薬剤単独での単剤療法よりも効果がある処置をもたらすことができる。実施形態では、第１の処置と第２の処置の組合せは、単独での第１または第２の処置よりも効果がある（例えば、症状および／またはがん細胞のより大きな低減をもたらす）。実施形態では、併用療法は、単剤療法として投与されたときに同様の結果を達成するために通常必要とされる第１または第２の処置の用量と比較して低い第１または第２の処置の用量の使用を可能にする。実施形態では、併用療法には、部分的に相加的な効果、完全に相加的な効果、または相加効果より大きい効果を有する。
【０５６１】
一実施形態では、免疫刺激性融合分子は、療法、例えば、がん療法（例えば、抗がん剤、免疫療法、光線力学的療法（ＰＤＴ）、外科手術および／または放射線のうちの１つまたは複数）と組み合わせて投与される。用語「化学療法薬」、「化学療法剤」および「抗がん剤」は、本明細書では交換可能に使用される。免疫刺激性融合分子および療法、例えばがん療法の投与は、逐次的である（重なりがある、もしくはない）こともあり、同時的であることもある。免疫刺激性融合分子の投与は、療法（例えば、がん療法）の過程において継続的である場合もあり、または間欠的である場合もある。本明細書に記載される、ある特定の療法は、がんおよび非がん性疾患を処置するために使用することができる。例えば、本明細書に記載される方法および組成物を使用して、がん性および非がん性状態（例えば、結核）におけるＰＤＴ有効性を増強することができる（例えば、Agostinis,  P.  ら(2011)  CA  Cancer  J.  Clin.61:250-281において概説されている）。
抗がん療法
【０５６２】
他の実施形態では、免疫刺激性融合分子は、低または小分子量化学療法剤と組み合わせて投与される。例示的な低または小分子量化学療法剤としては、１３−シス−レチノイン酸（イソトレチノイン、ＡＣＣＵＴＡＮＥ（登録商標））、２−ＣｄＡ（２−クロロデオキシアデノシン、クラドリビン、ＬＥＵＳＴＡＴＩＮ（商標））、５−アザシチジン（アザシチジン、ＶＩＤＡＺＡ（登録商標））、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ、フルオロウラシル、ＡＤＲＵＣＩＬ（登録商標））、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ、メルカプトプリン、ＰＵＲＩＮＥＴＨＯＬ（登録商標））、６−ＴＧ（６−チオグアニン、チオグアニン、ＴＨＩＯＧＵＡＮＩＮＥ  ＴＡＢＬＯＩＤ（登録商標））、アブラキサン（パクリタキセルタンパク質結合型）、アクチノマイシン−Ｄ（ダクチノマイシン、ＣＯＳＭＥＧＥＮ（登録商標））、アリトレチノイン（ＰＡＮＲＥＴＩＮ（登録商標））、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ、トレチノイン、ＶＥＳＡＮＯＩＤ（登録商標））、アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン、ＨＭＭ、ＨＥＸＡＬＥＮ（登録商標））、アメトプテリン（メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、ＭＴＸ、ＴＲＥＸＡＬＬ（商標）、ＲＨＥＵＭＡＴＲＥＸ（登録商標））、アミフォスチン（ＥＴＨＹＯＬ（登録商標））、アラビノシルシトシン（Ａｒａ−Ｃ、シタラビン、ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ（登録商標））、三酸化ヒ素（ＴＲＩＳＥＮＯＸ（登録商標））、アスパラギナーゼ（Ｅｒｗｉｎｉａ  Ｌ−アスパラギナーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ＥＬＳＰＡＲ（登録商標）、ＫＩＤＲＯＬＡＳＥ（登録商標））、ＢＣＮＵ（カルムスチン、ＢｉＣＮＵ（登録商標））、ベンダムスチン（ＴＲＥＡＮＤＡ（登録商標））、ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））、ブレオマイシン（ＢＬＥＮＯＸＡＮＥ（登録商標））、ブスルファン（ＢＵＳＵＬＦＥＸ（登録商標）、ＭＹＬＥＲＡＮ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム（シトロボラム因子、フォリン酸、ロイコボリン）、カンプトテシン−１１（ＣＰＴ−１１、イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、カルボプラチン（ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（登録商標））、カルムスチンウエハー（カルムスチンインプラントを含むプロリフェプロスパン２０、ＧＬＩＡＤＥＬ（登録商標）ウェハー）、ＣＣＩ−７７９（テムシロリムス、ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標））、ＣＣＮＵ（ロムスチン、ＣｅｅＮＵ）、ＣＤＤＰ（シスプラチン、ＰＬＡＴＩＮＯＬ（登録商標）、ＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱ（登録商標））、クロラムブシル（ロイケラン）、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＩＣ、ＤＴＩＣ、イミダゾールカルボキサミド、ＤＴＩＣ−ＤＯＭＥ（登録商標））、ダウノマイシン（ダウノルビシン、ダウノルビシン塩酸塩、ルビドマイシン塩酸塩、ＣＥＲＵＢＩＤＩＮＥ（登録商標））、デシタビン（ＤＡＣＯＧＥＮ（登録商標））、デクスラゾキサン（ＺＩＮＥＣＡＲＤ（登録商標））、ＤＨＡＤ（ミトキサントロン、ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（登録商標））、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、ドキソル��シン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、ＲＵＢＥＸ（登録商標））、エピルビシン（ＥＬＬＥＮＣＥ（商標））、エストラムスチン（ＥＭＣＹＴ（登録商標））、エトポシド（ＶＰ−１６、エトポシドリン酸塩、ＴＯＰＯＳＡＲ（登録商標）、ＶＥＰＥＳＩＤ（登録商標）、ＥＴＯＰＯＰＨＯＳ（登録商標））、フロクスウリジン（ＦＵＤＲ（登録商標））、フルダラビン（ＦＬＵＤＡＲＡ（登録商標））、フルオロウラシル（クリーム）（ＣＡＲＡＣ（商標）、ＥＦＵＤＥＸ（登録商標）、ＦＬＵＯＲＯＰＬＥＸ（登録商標））、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、ヒドロキシ尿素（ＨＹＤＲＥＡ（登録商標）、ＤＲＯＸＩＡ（商標）、ＭＹＬＯＣＥＬ（商標））、イダルビシン（ＩＤＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イクサベピロン（ＩＸＥＭＰＲＡ（商標））、ＬＣＲ（ロイロクリスチン、ビンクリスチン、ＶＣＲ、ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標）、ＶＩＮＣＡＳＡＲ  ＰＦＳ（登録商標））、Ｌ−ＰＡＭ（Ｌ−サルコリシン、メルファラン、フェニルアラニンマスタード、ＡＬＫＥＲＡＮ（登録商標））、メクロレタミン（メクロレタミン塩酸塩、ムスチン、ナイトロジェンマスタード、ＭＵＳＴＡＲＧＥＮ（登録商標））、メスナ（ＭＥＳＮＥＸ（商標））、マイトマイシン（マイトマイシン−Ｃ、ＭＴＣ、ＭＵＴＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、ネララビン（ＡＲＲＡＮＯＮ（登録商標））、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ＯＮＸＡＬ（商標））、ペグアスパルガーゼ（ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、ＯＮＣＯＳＰＡＲ（登録商標））、ＰＥＭＥＴＲＥＸＥＤ（ＡＬＩＭＴＡ（登録商標））、ペントスタチン（ＮＩＰＥＮＴ（登録商標））、プロカルバジン（ＭＡＴＵＬＡＮＥ（登録商標））、ストレプトゾシン（ＺＡＮＯＳＡＲ（登録商標））、テモゾロミド（ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標））、テニポシド（ＶＭ−２６、ＶＵＭＯＮ（登録商標））、ＴＥＳＰＡ（チオホスホアミド、チオテパ、ＴＳＰＡ、ＴＨＩＯＰＬＥＸ（登録商標））、トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ビンブラスチン（ビンブラスチン硫酸塩、ビンカロイコブラスチン、ＶＬＢ、ＡＬＫＡＢＡＮ−ＡＱ（登録商標）、ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビノレルビン（ビノレルビン酒石酸塩、ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））、およびボリノスタット（ＺＯＬＩＮＺＡ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５６３】
別の実施形態では、免疫刺激性融合分子は、バイオ医薬品と併せて投与される。例示的バイオ医薬品としては、例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）；ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）（フルベストラント）；ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール）；Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標）（エキセメスタン）；ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール）；ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）（タモキシフェン）、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）（ベバシズマブ）；およびＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン）が挙げられる。
【実施例】
【０５６４】
（実施例１）
生物学的持続性が増加した抗体／ＩＬ−１５融合分子の構築
向上した特性を有するＩＦＭを生成する能力を実証するために、本発明者らは、複数の形式を含む一連のＩＦＭを構築した：（ｉ）ＩｇＧ、Ｆａｂ断片またはｓｃＦｖ断片を含む、ＩＦＭ、（ｉｉ）抗体または抗体断片のＮ末端またはＣ末端への融合；（ｉｉｉ）抗体または抗体断片へのＩＬ−１５またはＩＬ−１５Ｒα  ｓｕｓｈｉドメインどちらかの融合（例えば、図１および図２Ａ〜２Ｃ）；および（ｉｖ）抗体とサイトカインとの間に様々なリンカー組成を含むＩＦＭ。
Ａ．複数の異なる抗体形式を含むＩＬ−１５  ＩＦＭ
【０５６５】
ＩＬ−１５と免疫標的とする抗体との融合分子がＩＬ−１５生物活性を向上させる可能性（potential）を詳しく調査するために、本発明者らは、ＩＬ−１５と、免疫細胞の表面に大量に存在する受容体であるヒトＣＤ４５を標的とするｍＡｂクローンＢＣ８（Cysterら,  EMBO  Journal,  Vol  10,  no4,  893-902,  1991）とを含むＩＦＭを構築した。ＩＦＭは、３つの異なる抗体形式：ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、および完全長ＩｇＧ、を含んだ。手短に述べると、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号３６）からなるアミノ酸リンカーを使用してＦａｂまたはＩｇＧ軽鎖のＣ末端に、またはアミノ酸リンカーＲＳＧＳＧＧＧＧＳＬＱ（配列番号３９）を使用してｓｃＦｖのＣ末端に、野生型ＩＬ−１５を遺伝子的に融合させた。ＦａｂおよびＩｇＧ抗体形式は、ヒト定常領域と、マウスモノクローナル抗体ＢＣ８からの可変ドメインとを含んだ（例えば、ｃｈＢＣ８  ＦａｂまたはｃｈＢＣ８  ＩｇＧ）。ｓｃＦｖは、（ＧＧＧＧＳ）３リンカーに遺伝子的に融合されたＢＣ８重鎖および軽鎖可変ドメインを含んだ。ＩＬ−１５／抗体融合体をＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉと共発現させた。ＩＬ−１５とｓｕｓｈｉ間の高親和性相互作用は、ＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉとの非共有結合的会合を含む、ＩＬ−１５−抗体複合体をもたらした。まとめると、この結果として、次の３つのＩＦＭバリアントを得た：ｃｈＢＣ８−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  ｓｃＦｖ、ｃｈＢＣ８−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ、およびｃｈＢＣ８−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  ＩｇＧ（図２Ａ；さらなる詳細については、「タンパク質バリアント」セクションを参照されたい）。
【０５６６】
サイトカインを細胞とともに一定の時間インキュベートし、その後、未結合サイトカインを洗浄により除去する、パルスバイオアッセイを使用して、ＣＤ８  Ｔ細胞増大に対するＩＦＭの効果を評価した。サイトカインを洗浄除去しない「静的」刺激アッセイと比較して、パルスバイオアッセイのほうが、生物学的効果の持続性のよりよい特徴付けが得られる。パルスバイオアッセイは、高親和性受容体／リガンド相互作用の定量分析についての、十分に認識されている課題である、リガンド枯渇に関連する交絡因子（Hulme,  Tevethick,  Ligand  binding  assays  at  equilibrium:  validation  and  interpretation  Br  J  Pharm  2010,  161:1219-1237）にも適応する。同じ原理が、細胞受容体への結合によってそれらの効果が媒介されるサイトカインおよび成長因子についての、定量的な細胞に基づくアッセイにも当てはまる。本発明者らは、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃドメインに融合された保存的Ｌ７７Ｉ変異を含有するｓｕｓｈｉドメインを含むＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃタンパク質に対するＩＦＭの効果と、Ｎ７２Ｄ変異を含有するＩＬ−１５バリアントと（ｓｕｓｈｉドメインとの相互作用によって）非共有結合的に会合している、ヒトＩｇＧ１−Ｆｃドメインに融合された保存的Ｌ７７Ｉ変異を含有するｓｕｓｈｉドメインを含むＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃタンパク質であるＩＬ１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉＬ７７Ｉ−Ｆｃに対するＩＦＭの効果とを比較した。Ｎ７２Ｄ変異は、ＩＬ−１５のアゴニスト特性を向上させると言われている（Zhu,  Marcus,  Xu,  Lee,  ら    Novel  Human  Interleukin-15  Agonists.Journal  of  Immunology  2009）。陰性対照として、本発明者らは、単独での（ＩＬ−１５への融合を含まない）ｃｈＢＣ８を評価した。ＩＦＭおよび対照をＣＤ８  Ｔ細胞とともに１時間、３７℃でインキュベートし、その後、３回洗浄して未結合タンパク質を除去した。次いで、細胞を完全培地にまき、３日間成長させ、次いで、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅ（図２Ｂ）とフローサイトメトリーカウントビーズ（図２Ｃ）の両方を使用して増殖について評定した。これらの両方の方法は、一貫した結果をもたらし、３つすべての抗体形式が、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉＬ７７Ｉ−Ｆｃタンパク質より長い持続性を有するＩＦＭを産生することができることを実証した。ｓｃＦｖ、ＦａｂまたはＩｇＧを含有するＩＦＭの効力の増加には傾向があった（すなわち、効力：ＩｇＧ  ＩＦＭ＞Ｆａｂ  ＩＦＭ＞ｓｃＦｖ  ＩＦＭ）。ｃｈＢＣ８抗体単独の陰性対照は、Ｔ細胞増大を誘導しなかった。これは、ＩＬ−１５の存在がＩＦＭの増殖効果に必要であることを示す。前述は、ＩＬ−１５の生物学的持続性を向上させる、抗ＣＤ４５抗体または抗体断片へのＩＬ−１５の融合の非限定的な例を提供する。例えば本明細書に記載の、複数の抗体形式は、向上した効力を有するそのようなＩＦＭを産生することができる。
Ｂ．抗ＣＤ４５へのＩＬ−１５の様々な融合戦略を含むＩＦＭ  
【０５６７】
サイトカインとＩＦＭの抗体間の代替融合戦略を詳しく調査するために、本発明者らは、キメラＢＣ８  ＦａｂまたはＩｇＧ抗体のＮ末端またはＣ末端へのＩＬ−１５の融合を含む、６つの追加のＩＦＭを構築した。最初の２つのＩＦＭは、ＩＬ−１５をｃｈＢＣ８  ＦａｂまたはｃｈＢＣ８  ＩｇＧ軽鎖のＮ末端に遺伝子的に融合させることにより構築し、抗体融合体をＩＬ−１５Ｒαと共発現させて次のＩＦＭを得た：ＩＬ１５−ｃｈＢＣ８／ｓｕｓｈｉ  ＦａｂおよびＩＬ１５−ｃｈＢＣ８／ｓｕｓｈｉ  ＩｇＧ（図３Ａ〜３Ｂ；さらなる詳細については「タンパク質バリアント」セクションを参照されたい）。本発明者らは、上記実施例１ＡにおけるｃｈＢＣ８−ＩＬ１５の命名規則を使用し、ＩＬ１５−ｃｈＢＣ８は、ここでは、ＩＬ−１５の抗体ＣまたはＮ末端それぞれへの融合を指す。４つの追加のＩＦＭを、野生型ＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉをｃｈＢＣ８  ＦａｂまたはＩｇＧ軽鎖のＮ末端またはＣ末端に融合させることにより構築し、これらの抗体融合体をＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ（図３Ｃ〜３Ｄ）と共発現させた：ｃｈＢＣ８−ｓｕｓｈｉ／ＩＬ１５Ｎ７２ＤＦａｂ、ｓｕｓｈｉ−ｃｈＢＣ８／ＩＬ１５Ｎ７２Ｄ  Ｆａｂ、ｃｈＢＣ８−ｓｕｓｈｉ／ＩＬ１５Ｎ７２ＤＩｇＧ、ｓｕｓｈｉ−ｃｈＢＣ８／ＩＬ１５Ｎ７２ＤＩｇＧ（さらなる詳細についてはタンパク質バリアントセクションを参照されたい）。実施例１Ａにおける２つのＦａｂおよびＩｇＧ  ＩＦＭ（ｃｈＢＣ８−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  ＦａｂおよびｃｈＢＣ８−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  ＩｇＧ）とともに、これらの８つのＩＦＭにより、本発明者らは、様々な抗体融合戦略、免疫標的化部分へのＩＬ−１５の遺伝子融合対ｓｕｓｈｉの遺伝子融合、および野生型または変異ＩＬ−１５バリアントのどちらかを含むＩＦＭを試験することができた。
【０５６８】
第１の実験では、本発明者らは、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄを含むＩＦＭをパルスバイオアッセイ形式で評価し、Ｆａｂ融合体とＩｇＧ融合体の両方、ならびにＮ末端およびＣ末端融合体について、ＩＦＭが、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄとｓｕｓｈｉ−Ｆｃバリアントとの間の複合体を含むＩＬ−１５形式と比較して向上した活性を示すことを見いだした（図４Ａ〜４Ｂ）。８つすべてのＩＦＭバリアントを比較する追加実験で、本発明者らは、抗体へのＩＬ−１５またはｓｕｓｈｉどちらかの融合について同様の効力を観察し、ならびにまた、野生型ＩＬ−１５およびＩＬ１５−Ｎ７２Ｄを含有するタンパク質バリアントについて同様の効力を観察した（図５Ａ〜５Ｂ）。本発明者らは、ＩＬ−１５またはｓｕｓｈｉの、ｃｈＢＣ８  ＩｇＧまたはＦａｂのＣ末端への融合が、抗体Ｎ末端への融合より大きいＣＤ８  Ｔ細胞増大をもたらす傾向を観察した（図４Ａ〜４Ｂおよび図５Ａ〜５Ｂ）。しかし、ＩＦＭバリアント（ＩｇＧまたはＦａｂへのＮ末端（N-  -terminal）融合を含む）の各々は、ＣＤ４５受容体結合機能性（functionality）を含有しない対照タンパク質であるＩＬ１５−Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉＬ７７Ｉ−Ｆｃより大きい効力を提示した（図３Ｃ〜３Ｄおよび図４Ａ〜４Ｂ）。対照として、単独でのキメラＢＣ８または親ＢＣ８マウスｍＡｂ抗体は、上記の本発明者らの観察と一致して、Ｔ細胞増大を誘導しなかった（図４Ａ〜４Ｂおよび図５Ａ〜５Ｂ）。本発明者らは、ＣＤ８  Ｔ細胞増殖に関して８つのＩＦＭを「静的」アッセイ形式でも評価した。３日のインキュベーション（洗浄なし）後、ＩＦＭの各々は、ＩＬ１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉＬ７７Ｉ−Ｆｃと同様の活性を生じさせる結果となったが、但し、Ｆａｂ断片へのＩＬ−１５のＮ末端融合（ＩＬ１５−ｃｈＢＣ８／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ）を含むＩＦＭは例外であり、このアッセイ形式でわずかに低い効力を生じさせる結果となった（図５Ｃ〜５Ｄ）。ＩｇＧ融合は、ＩＬ−１５  Ｆａｂ融合と同様の効力を提示した（図３Ｂ）。本発明者らは、ＣＤ４５受容体を標的とする抗体とのＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ複合体の複数の融合戦略（multiple  fusions  strategies）が、生物学的持続性が増加したＩＦＭを生じさせる結果となり、またＩＦＭ融合戦略が、ＩＬ−１５の野生型形態と変異形態の両方の活性を向上させると、結論付ける。
Ｃ．抗体重鎖または軽鎖のＣ末端に融合されたＩＬ−１５を含むＩＦＭ  
【０５６９】
本発明者らは、追加のｃｈＢＣ８−サイトカイン融合体を構築して、サイトカインを抗体重鎖または軽鎖Ｃ末端に融合させる能力を評価した。野生型ＩＬ−１５をｃｈＢＣ８重鎖（ＨＣ）のＣ末端に遺伝子的に融合させ、この構築物をＩＬ１５Ｒα−ｓｕｓｈｉと共発現させて、ＩＦＭバリアントｃｈＢＣ８（ＨＣ）−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  ＩｇＧを生じさせた（図６Ａ）。本発明者らは、ｃｈＢＣ８（ＨＣ）−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  ＩｇＧを、軽鎖Ｃ末端に融合されたＩＬ−１５を含む、前の実施例に記載したｃｈＢＣ８−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  ＩｇＧと比較した。明確にするために、本発明者らは、ここではこの後者のタンパク質を、重鎖Ｃ末端への融合を含むＩＦＭと区別するために、ｃｈＢＣ８（ＬＣ）−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  ＩｇＧと呼ぶ。活性化ヒトＣＤ８  Ｔ細胞を、１時間、３７℃で、ｃｈＢＣ８（ＨＣ）−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  ＩｇＧまたはｃｈＢＣ８−ＩＬ１５（ＬＣ）／ｓｕｓｈｉ  ＩｇＧの４００ｎＭ〜２５．６ｐＭにわたる７つの５倍段階希釈物（seven  serial  five-fold  dilutions）でパルスし、次いで完全培地で３回洗浄し、細胞５００，０００個／ｍＬで蒔いた。培地のみ、親ＢＣ８抗体（ＩＬ−１５との融合を含有しない）、またはＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ（免疫標的化機能を欠く）の段階希釈物を、対照として使用した。５日の培養後、本発明者らは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅを使用してＣＤ８  Ｔ細胞増大を測定した。ｃｈＢＣ８（ＨＣ）−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  ＩｇＧおよびｃｈＢＣ８−ＩＬ１５（ＬＣ）／ｓｕｓｈｉ  ＩｇＧ  ＩＦＭは、各々、Ｔ細胞増大を誘導し、同様の用量応答特性を示したが、ＩＬ１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃも、親ＢＣ８抗体も、Ｔ細胞増大を誘導せず、同様の用量応答特性を示さなかった（図６Ｂ）。本発明者らは、抗体軽鎖または重鎖のＣ末端へのＩＬ−１５の融合各々により、持続性が増加したＩＦＭを産生することが可能であると結論付ける。
Ｄ．機能性抗体結合はＩＦＭの効力向上に必要である
【０５７０】
本発明者らは、単独でのＣＤ４５と（例えば、ＩＬ−１５との融合を含まないＢＣ８抗体と）の結合が、ＩＦＭの活性増加を説明しないことを上で実証した（図３Ｃ〜３Ｄ、図４Ａ〜４Ｂ、および図５Ａ〜５Ｄ）。これは、ＩＦＭの効力へのサイトカインの必要性を支持する。本発明者らは、抗体のそのコグネイト細胞表面受容体への結合の機能的必要性を実証するために２つの追加の対照実験を行った。第１の実験で、本発明者らは、ＣＤ４５細胞表面受容体への可溶性競合因子としての１μＭ  ＢＣ８の存在または非存在下で、実施例１Ａに記載した８つのＩＦＭの各々についての活性化初代ヒトＣＤ８  Ｔ細胞に対するパルスアッセイを行った。３７℃での１時間のパルスインキュベーション後、細胞を３回洗浄し、次いで、完全ＲＰＭＩ培地に細胞３００，０００個／ｍＬの密度で蒔いた。３７℃で５日後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅを使用して細胞増大を測定した。ＢＣ８競合因子の存在は、パルスバイオアッセイにおいて８つすべてのＩＦＭの活性を除去した（図７Ａ〜７Ｂ）。
【０５７１】
第２の実験で、本発明者らは、機能性ＢＣ８結合領域または非機能性ＢＣ８結合領域のどちらかを含む２つのＩＦＭを生成した。機能性ＢＣ８領域を有するＩＦＭは、親ＢＣ８抗体からのＣＤＲをヒト可変ドメインにグラフトしたヒト化ＢＣ８可変ドメインを有するＦａｂ抗体断片と、ヒト化ＢＣ８  Ｆａｂ軽鎖へのＩＬ−１５ＷＴの融合とを含んだ。この複合体をＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉと共発現させて、ＩＦＭバリアントｈＢＣ８（２３）−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ（さらなる詳細については「タンパク質バリアント」セクションを参照されたい）を生じさせた。ヒト化ＢＣ８抗体（ｈＢＣ８（２３））は、キメラＢＣ８抗体と同様の結合親和性を有する（図１０Ａ）。非機能性ＢＣ８領域（ｈＢＣ８−ヌル−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ）を有するＩＦＭは、残基ＳＧＧＧＳで置き換えられた、抗体重鎖におけるＣＤＲ３の５つのアミノ酸を除いて、同じＦａｂ断片を含んだ。これらのアミノ酸置換は、試験した濃度について細胞ＣＤ４５との検出可能な結合を示さない、ヒト化ＢＣ８抗体を生じさせた（図１０Ａ）。これらのタンパク質の各々（４００ｎＭ〜２５．６ｐＭの濃度範囲にわたる７つの５倍段階希釈物）を活性化ヒトＣＤ８  Ｔ細胞とともにパルスし、次いで、細胞を洗浄し、９６ウェルプレートに細胞５００，０００個／ｍＬで蒔いた。３７℃で３日後、ｈＢＣ８（２３）−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂは、ＣＤ８  Ｔ細胞増大を支持したが、ｈＢＣ８−ヌル−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂは支持しなかった（図７Ｃ）。まとめると、これらのデータは、機能性細胞表面受容体結合がＩＦＭの効力の向上に必要であることを実証する。
Ｅ．抗ＣＤ４５への融合はＩＬ−１５の負荷および細胞表面残留性を増加させる
【０５７２】
ＩＦＭの生物学的持続性の向上が、ＩＬ−１５の細胞への負荷および残留性の増加と相関するかどうかを詳しく調査するために、本発明者らは、細胞表面ＩＦＭレベルを経時的に分析した。細胞５×１０７個／ｍＬの密度のＣＤ８  Ｔ細胞を、ＰＢＳとＨＢＳＳの１：１混合物中の０．７５ｍｇ／ｍＬ  ｈＢＣ８（２３）−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ、ＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａ、またはＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉＬ７７Ｉ−Ｆｃとともに１時間パルスし、次いで、完全培地で３回洗浄した。ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａは、野生型ＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉの、ヒトＩｇＧ２−Ｆｃドメインのバリアントへの融合体である。細胞をＰＢＳとＨＢＳＳの１：１混合物中でインキュベートする偽パルス対照を、陰性対照として使用した。次いで、蛍光標識抗ＩＬ−１５抗体を使用してＩＬ−１５について、またはヒトＩｇＧ軽鎖および重鎖を認識する蛍光標識ポリクローナル抗体を使用してＩｇＧドメイン（ＦａｂまたはＦｃ断片）について、細胞を染色した。これらの抗体は、Ｔ細胞表面の、ＩＬ−１５、または会合しているＦａｂもしくはＦｃ断片、両方の検出をもたらした。ｈＢＣ８（２３）−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂタンパク質は、ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２ＤａまたはＩＬ１５−Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉＬ７７Ｉ−Ｆｃタンパク質より実質的に高レベルのＩＬ−１５染色を生じさせた。これは、細胞表面におけるＩＬ−１５のより大きい存在量を示す（図８Ａ）。本発明者らは、ＩＦＭがＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ構築物より高レベルの染色を生じさせる、ＩｇＧ染色についての一貫した結果を観察した（図８Ａ）。ＩＬ−１５の増殖効果の陽性対照として、本発明者らは、おおよそ１０ｎＭのＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ２Ｄａを偽パルス対照に添加した（「偽、次いで飽和」条件）。これは、ＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ含有バリアントについてのＥＣ９０より高い濃度に対応し（図３Ａ〜３Ｄを参照されたい）、したがって、ＩＬ−１５による最大増殖効果の陽性対照として役立つ。細胞を培養で繁殖させ、パルスインキュベーション後３日間、ＩＬ−１５表面レベルをモニターした。ＩＬ−１５検出は、ｈＢＣ８（２３）−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂについてはバックグラウンドより高いままであったが、両方のＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃバリアントは、パルスインキュベーションの一日後にはバックグラウンドと区別できなかった（図８Ｂ）。ｈＢＣ８（２３）−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂのパルスは、さらに、ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃバリアントの飽和量と同様の細胞増大を生じさせた（図８Ｃ）。
【０５７３】
本発明者らは、本発明者らが使用したＩＬ−１５抗体（クローン番号３４５５９、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）が、ＩＬ−１５Ｒβと少なくとも部分的に重複する、ＩＬ−１５上のエピトープと結合する可能性があり、したがって、ＩＬ−１５シグナル伝達受容体とまだ生産的に結合していないＩＬ−１５を検出することができると推論する。この抗体は、いくつかのグループにより遮断／中和抗体として記載されている（例えば、Neely,  GG,  Robbins,  Amankwah,  ら(2001)  J  Imm  167:5011-5017；Krutzik,  Hewison,  Liu,  Robles,  ら(2008)  J  Imm  181:7115-7120;  Schlaepfer,  Speck  (2008)  PLoS  ONE  3:e1999；およびCorreia,  Cardoso,  Pereira,  Neves,  ら,J  Imm  (2009)  182:  6149-6159を参照されたい）。しかし、それがＩＬ−１５Ｒαとの競合的ＩＬ−１５結合によってその中和効果を媒介するようではない。ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５Ｒαとのその相互作用によって樹状細胞表面に提示され、この抗体は、樹状細胞上でのＩＬ−１５のそのような提示を検出するために以前に使用されている（Ferlazzo,  Pack,  Thomas,  Paludan,  ら  PNAS  2004）。これらの観察と一致して、本発明者らは、この抗体を使用してＴ細胞表面のｈＢＣ８（２３）−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  ＦａｂおよびＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃバリアントを検出することができる（図８Ａ〜８Ｂ；各タンパク質バリアントは、ＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉとＩＬ−１５間の会合を含む）。したがって、抗体の中和活性は、ＩＬ−１５、ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβまたは共通γ鎖についての他の２つの細胞表面受容体のうちの１つとの競合的結合に由来しうる。それ故に、この抗体でのＩＬ−１５の検出は、その細胞表面受容体、例えば、ＩＬ−２／ＩＬ−１５Ｒβまたは共通γ鎖を飽和させるレベルを超える、Ｔ細胞表面へのＩＬ−１５の過剰負荷を反映しうる。これは、ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ融合体との会合の結果として生じる二量体ＩＬ−１５が、サイトカインのわずかに多い存在量を生じさせ得るとはいえ、ＩＬ−１５受容体を介してＴ細胞と専ら相互作用するＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ構築物について検出される低レベルの細胞表面ＩＬ−１５（図８Ａ〜８Ｂ）も説明しうる。全体的に見て、本発明者らは、ＩＦＭが、Ｔ細胞表面へのＩＬ−１５のより大きい初期負荷を促進もし、経時的な細胞表面の生物学的に利用可能なＩＬ−１５レベル上昇を支持もすると結論付ける。
Ｆ．複数のリンカー組成がＩＦＭ効力の増強を支持する
【０５７４】
ＩＦＭのＩＬ−１５と抗体間の結合（linkage）の周囲の可動性を評価するために、本発明者らは、複数の異なるポリペプチドリンカー組成を詳しく調査した。実施例１で詳しく調査したＩＦＭ各々は、（ＧＧＧＧＳ）３の３つのタンデムリピートからなる可動性１５アミノ酸リンカー（リンカー−１、配列番号３６）をＩＬ−１５またはｓｕｓｈｉと抗体の間に含んだ。ここで、本発明者らは、可動性８アミノ酸リンカー（（ＧＧＧＳ）２；リンカー−２、配列番号３７）と、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域に由来する適度に可動性の１２アミノ酸リンカー（ＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰ；リンカー３、配列番号３８、下線付きの位置は、このリンカーについてシステインからセリンへ変異させたＩｇＧ１ヒンジ領域の残基を示す）とを含む、２つの追加のリンカー組成を詳しく調査した。リンカー−２またはリンカー−３を使用してｃｈＢＣ８  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端にＩＬ−１５ＷＴを融合させ、ＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉと共発現させて、ｃｈＢＣ８−Ｌ２−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  ＦａｂおよびｃｈＢＣ８−Ｌ３−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂをそれぞれ生成した（図９Ａ）。本発明者らは、前に実施例１においてｃｈＢＣ８−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂを記載した。このＩＦＭバリアントは、ＩＬ−１５とｃｈＢＣ８軽鎖の間に（ＧＧＧＧＳ）３リンカー（リンカー−１、配列番号３６）を含む。一貫性を保つために、本発明者らは、この構築物をここではｃｈＢＣ８−Ｌ１−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂと呼ぶ（図９Ａ）。これらのタンパク質構築物を、実施例１に記載したようにＣＤ８  Ｔ細胞とのパルスバイオアッセイで評価した。培地のみを含む偽段階希釈物とのインキュベーション、またはＣＤ４５に対する親和性を除去するように変異させたＢＣ８結合ドメインを含むｈＢＣ８−ヌル−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ（図１０Ａ）とのインキュベーションを、陰性対照として使用した。パルスインキュベーションの３日後、本発明者らは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅを使用して細胞増殖を分析し、３つすべてのリンカー組成が、Ｔ細胞増大を誘導することができることを見いだした（図９Ｂ）。本発明者らは、サイトカインと抗体との間の複数のリンカー組成により、向上した効力を有するＩＦＭを生成することが可能であると結論付ける。
方法
【０５７５】
タンパク質発現。タンパク質を無血清培地における懸濁に適応したＨＥＫ２９３細胞から産生した。例外は、親マウスモノクローナル抗体ＢＣ８であり、これは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＨＢ−１０５０７）から入手したＢＣ８ハイブリドーマ培養物から精製した。次いで、タンパク質を、適宜、プロテインＡ樹脂（Ｆｃ融合体および完全長（ＩｇＧ）抗体について）、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；抗体Ｆａｂ断片への融合体について）、またはヒスチジン親和性樹脂（例えば、ニッケル−ニトリロ三酢酸、Ｎｉ−ＮＴＡ；６ヒスチジンタグ付きｓｃＦｖ融合体について）のいずれかによって精製した。精製したタンパク質を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に緩衝液交換した。適切な分子量を、還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥならびに凝集により確認し、多量体状態をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定した。凝集または多量体状態に基づいて、タンパク質を、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅクロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｒｅｐ−ｇｒａｄｅカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＳＥＣにより、必要に応じて精製した。
【０５７６】
静的バイオアッセイ。ヒト血液から単離されたＣＤ８  Ｔ細胞（Ｂｉｏｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｏｒｐ．からのもの）を、製造業者の指示に従ってＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  カタログ番号１１１３２Ｄ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を用いて、製造業者の指示に従って１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−２（カタログ番号２０２−ＩＬ−０５０／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下で活性化し、６ウェル９．５ｃｍ２プレート内の、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ−ＨＩ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）と、ペニシリン／ストレプトマイシンと、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（カタログ番号３５０５０−０６１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）とを補充した、ＲＰＭＩ  １６４０を含有する完全ＲＰＭＩ培地（カタログ番号３０−２００１、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）にまき、３７℃および５％ＣＯ２で培養した。３日の刺激後、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを除去し、細胞を完全ＲＰＭＩ培地中で２４時間、静置しておいた。次いで、Ｔ細胞を細胞０．５×１０６個／ｍＬで、別段の指示がない限り２０ｎＭ〜４．９ｐＭの範囲の濃度に渡るＩＦＭもしくは対照タンパク質の６つの４倍段階希釈物の存在下で、または陰性対照として培地のみとともに、９６ウェルプレートに播種した。３７℃および５％ＣＯ２で３日後、細胞増大をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（カタログ番号Ｇ８０８１、Ｐｒｏｍｅｇａ）によって分析した。
【０５７７】
パルスバイオアッセイ。ヒトＣＤ８  Ｔ細胞（Ｂｉｏｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｏｒｐ．からのもの）を、静的バイオアッセイについて記載したように、１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−２の存在下、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）で刺激した。３日の刺激後、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを除去し、細胞を完全ＲＰＭＩ培地中で２４時間、静置しておいた。別段の指示がない限り、活性化Ｔ細胞を、細胞５００，０００個／ｍＬの細胞密度で、別段の指示がない限り８０ｎＭ〜５ｎＭの濃度範囲のＩＦＭもしくは対照タンパク質（３つの４倍段階希釈物）とともに、または陰性対照として培地のみ（０ｎＭ）とともに、インキュベートした。３７℃および５％ＣＯ２で１時間後、細胞を完全ＲＰＭＩ培地で３回洗浄して未結合サイトカインを除去し、次いで、別段の指示がない限り９６ウェルプレート内の完全ＲＰＭＩ培地に（追加のサイトカインの非存在下で）細胞０．５×１０６個／ｍＬで蒔いた。追加の対照は、親ＢＣ８抗体またはｃｈＢＣ８  ＩｇＧ抗体のどちらかを必要に応じて含んだ。３７℃および５％ＣＯ２で３日後、Ｔ細胞増大をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅまたはフローサイトメトリーによって分析した。フローサイトメトリーについては、７−ＡＡＤ（カタログ番号Ａ９４００−５ＭＧ、Ｓｉｇｍａ）を使用して染色し（そしてその後、分析中に死細胞を排除し）、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ  Ａｂｓｏｌｕｔｅカウントビーズ（カタログ番号Ｃ３６９５０、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を製造業者の指示に従って使用して生存細胞密度を定量した。
【０５７８】
細胞表面のＩＦＭの測定。パルスインキュベーションおよび洗浄後、培養下で０、１および３日後に、細胞を免疫蛍光染色により分析して細胞表面ＩＦＭを検出した。手短に述べると、細胞を、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含有する１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳ／ＢＳＡ）で洗浄し、次いで、ＰＢＳ／ＢＳＡ中のＰＥコンジュゲート抗ＩＬ−１５抗体（クローン番号３４５５９；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号ＩＣ２４７１Ｐ）の１：１００希釈物およびＤｙＬｉｇｈｔ６５０コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＋Ｌポリクローナル抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  カタログ番号Ｓａ５−１０１２９）の１：１００希釈物で染色した。４℃で２０〜３０分インキュベーション後、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡで１回洗浄し、次いで、Ｄｉｖａソフトウェアを使用するＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での分析のためにＰＢＳ／ＢＳＡに再懸濁させた。Ｃｙｔｏｂａｎｋ（Ｃｙｔｏｂａｎｋ，Ｉｎｃ）およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を使用して、データを解析した。
（実施例２）
代替抗ＣＤ４５抗体へのＩＬ１５の融合
【０５７９】
ＢＣ８以外の抗ＣＤ４５抗体が、向上した効力を有するＩＦＭを生成することができるかどうかを評価するために、本発明者らは、２つの追加の抗ＣＤ４５モノクローナル抗体（ｍＡｂクローン９．４および４Ｂ２）を評価した。本発明者らは、先ず、活性化ＣＤ８  Ｔ細胞の表面上に発現されたＣＤ４５に対する、キメラＩｇＧ形態のこれらの抗体の、結合親和性を評価した。キメラ抗体各々は、マウス可変ドメインおよびヒト定常領域（ヒト定常カッパドメイン、およびＩｇＧ４ヒンジ領域を安定させるためのＳ２２８Ｐ変異を含有するヒトＩｇＧ４）を含む。以前の結果との比較のために、本発明者らは、これらの抗体を、ｃｈＢＣ８、ｈＢＣ８（２３）、および非結合バリアントｈＢＣ８−ヌルと並行して評価した。ヒト化ＢＣ８抗体は、ＢＣ８からグラフトされたＣＤＲ領域を含有する可変ドメインからなり、ｈＢＣ８−ヌルバリアントは、ＣＤ４５への結合を除去するＳＧＧＧＳ置換を重鎖ＣＤＲ３に含有する（図１０Ａ）。ｃｈ４Ｂ２およびｃｈ９．４抗体は、それぞれ、０．４４および０．８４ｎＭの見かけの解離定数（ＫＤ，ａｐｐ）で、細胞ＣＤ４５に対する最高の親和性を示したが、ｃｈＢＣ８およびｈＢＣ８（２３）抗体は、それぞれ、６．６８および７．８ｎＭのＫＤ，ａｐｐを示した（図１０Ａ）。ｈＢＣ８−ヌル抗体は、調査した最高濃度（５００ｎＭ；図１０Ａ）で有意な結合を示さなかった。本発明者らは、見かけの解離定数（ＫＤ，ａｐｐ）という用語を、真の平衡解離定数と区別するために使用する：ＩｇＧ抗体の二価の性質は、これらのタイプのアッセイについての真の平衡解離定数の計算を複雑にするアビディティー効果をもたらす。とは言うものの、ＫＤ，ａｐｐは、その固有の状況での抗体の細胞受容体への相対親和性のスコアリングに有用な測定基準である。
【０５８０】
本発明者らは、次に、これらの抗体の各々を含むＩＦＭの効力を評価した。手短に述べると、ＩＬ−１５をｃｈ９．４またはｃｈ４Ｂ２  Ｆａｂ断片軽鎖のＣ末端に融合させ、ＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉと共発現させて、ｃｈ９．４−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂおよびｃｈ４Ｂ２−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂをそれぞれ生成した。ｃｈＢＣ８−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ、ｈＢＣ８（２３）−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ、およびｈＢＣ８−ヌル−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂの構築は、実施例１に記載した。本発明者らは、パルスバイオアッセイでこれらのＩＦＭの効力を比較し、次の一連の陰性対照を含めた：ｈＢＣ８−ヌル−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ（ＣＤ４５結合が除去されたＩＦＭ）、ＩＬ−１５ＷＴ／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ、ＢＣ８抗体、および培地のみ。ＩＦＭの各々は、パルスインキュベーションの３日後に測定して陰性対照より大きいＴ細胞増大を誘導した（図１０Ｂ）。４Ｂ２または９．４を含むＩＦＭは、ｃｈＢＣ８またはｈＢＣ８（２３）を含むＩＦＭと比較して増加した効力を有した。これは、４Ｂ２および９．４のｃｈＢＣ８およびｈＢＣ８（２３）と比較して増加した親和性と一致し、細胞表面受容体に対する抗体の親和性増加がＩＦＭの効力の増加をもたらすという考えと合致する。全体的に見て、本発明者らは、向上した生物学的持続性を有するＩＦＭの生成がＢＣ８抗体に限定されず、細胞表面受容体に対する親和性増加がＩＦＭの効力を向上させうると結論付ける。
方法
【０５８１】
細胞結合アッセイ。初代ヒトＣＤ８  Ｔ細胞を、実施例１に記載したようにＣＤ３／ＣＤ２８ビーズおよび１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２で活性化した。活性化および完全ＲＰＭＩ培地中での一晩の静置（実施例１の方法を参照されたい）後、Ｔ細胞を、５００ｎＭ〜６．４ｐＭにわたる抗体の７つの５倍段階希釈物とともに、または培地のみの対照とともに、４℃で１時間インキュベートした。細胞をＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％ＦＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で３回洗浄し、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号ＨＰ６０１７）を使用して、２０分間、４℃で抗体結合を検出した。細胞をＭＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色剤（７−ＡＡＤ）を含有するＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。ＰＥシグナル中の（７−ＡＡＤ排除によって）生細胞集団の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を使用して、抗体結合を定量した。平均蛍光単位を抗体濃度に対してプロットすることにより曲線を生成し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して４変数ロジスティック方程式を使用して非線形回帰によって見かけの解離定数（ＫＤ，ａｐｐ）を決定した。
【０５８２】
パルスバイオアッセイ。実施例１に記載したとおりにパルスバイオアッセイを行った。
【０５８３】
タンパク質発現。実施例１に記載したとおりにタンパク質を産生した。
（実施例３）
追加の細胞表面受容体を標的とするＩＦＭは効力および特異性の向上を促進する
Ａ．ＣＤ４５以外の追加の細胞表面受容体はサイトカイン効力の向上を促進する。
【０５８４】
ＣＤ４５以外の細胞表面受容体を標的とするＩＦＭが、生物学的効力の増加をもたらすことができるかどうかを詳しく調査するために、本発明者らは、追加の細胞表面受容体を標的とする抗体を含むＩＦＭを構築した。代替受容体は、細胞表面に大量に存在する受容体でありうるか、またはタンパク質レベルで残留性を示す（例えば、緩徐な受容体内在化を表す、もしくは受容体内在化に際し細胞表面に戻る強力なリサイクリングを表す）ことができる。理想的には、受容体は、存在量が多くもあり、残留性でもある。これらの考察に基づいて、本発明者らは、ＣＤ８、ＣＤ１１ａまたはＣＤ１８を標的とするＩＦＭを評価のために選択した。ＣＤ８は、細胞傷害性Ｔ細胞上に発現されるＴ細胞受容体の共受容体である。ＣＤ８は、皮質胸腺細胞、樹状細胞およびナチュラルキラー細胞においても発現されうる。細胞傷害性Ｔ細胞では、ＣＤ８は、活性化Ｔ細胞受容体／ＭＨＣ複合体を細胞表面に維持するのに役立ち（Wooldridge,  van  den  berg,  Glick,  らJBC  2005）、Ｔ細胞受容体が内在化すると、ＣＤ８共受容体が、Ｔ細胞受容体と比較して優先的に細胞表面に維持される（1989  J  Imm  Boyer,  Auphan,  Gabert,  Schmitt-Verhulstら  Comparison  of  phosphorylation  and  internalization  of  the  antigen  receptor/CD3  complex,  CD8,  and  Class  I  MHC-encoded  proteins  on  T  cells）。リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）は、インテグリンアルファ−Ｌ（ＣＤ１１ａ）とインテグリンベータ−２（ＣＤ１８）とで構成されているヘテロ二量体細胞表面受容体であり、細胞間接着およびリンパ球共刺激に関与する。インテグリンは、一般に、タンパク質レベルで残留性を表す：それらは、通常は、細胞表面からの緩徐な内在化を示し、または内在化に際しリサイクルされて細胞表面に戻る（2012  J  Cell  Sci  Integrins  at  a  Glanceおよび1989  EMBO  J  Endocytosis  and  recycling  of  the  Fn  receptor  in  CHO）。ＬＦＡ−１は、いくつかの異なるタイプの白血球上に高レベルで存在し、単球Ｕ９３７細胞、前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ−６０およびリンパ芽球様細胞株ＪＹをはじめとする複数の異なる細胞型において緩徐な内在化を示すことが証明されている（1992  EMBO  J  Circulating  Integrins  Bretscher）。加えて、ＣＤ１１ａ抗体エファリズマブの前臨床研究により、ＣＤ１１ａは、血液から単離されたヒトおよびマウスＴ細胞においてタンパク質レベルで残留性を示すことが実証されたが、エファリズマブは、二次架橋抗体の存在下で受容体内在化および分解を誘導しうる（2004  Coffey,  Pippigら  J  Pharm  Exp  Ther）。
【０５８５】
本発明者らは、ＣＤ８（抗体クローンＯＫＴ８）、ＣＤ１１ａ（抗体クローンＭＨＭ２４）またはＣＤ１８（抗体クローン１Ｂ４）を標的とするＩＦＭを、ＩＬ−１５をそれぞれの抗体断片軽鎖のＣ末端に遺伝子的に融合させることによって構築した。ＩＬ−１５−抗体融合体をＩＬ−１５Ｒα−ｓｕｓｈｉと共発現させて、次の３つのＩＦＭを生成した：ｃｈＭＨＭ２４−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ、ｃｈ１Ｂ４−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ、およびｃｈＯＫＴ８−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ（図１１Ａ）。各Ｆａｂ断片は、マウス可変領域およびヒト定常ドメイン（カッパおよびＣＨ１）を有する、キメラヒトおよびマウス領域で構成されていた。ＣＤ８  Ｔ細胞に対するＩＦＭの効力を、実施例１に記載したようにパルスバイオアッセイで分析し、パルスインキュベーション後の培養３日後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅを使用して細胞を増殖について分析した。３つのＩＦＭ各々は、ｃｈＢＣ８−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂのものと同様のレベルのＴ細胞増殖を支持した（図１１Ｂ）。本発明者らは、免疫標的化機能性を有さないＩＬ−１５の形態が、パルスバイオアッセイにおいて最小限の効果を示すことを実証した（図２Ａ〜２Ｃ、４Ａ〜４Ｂ、５Ａ〜５Ｄ、６Ａ〜６Ｂ、および８Ａ〜８Ｃ）。まとめると、これは、追加の細胞表面受容体により、向上した生物学的持続性を有するＩＦＭを生成することが可能であることを実証する。
Ｂ．ＣＤ８  Ｔ細胞に対する効力の向上を促進するＩＦＭ
【０５８６】
細胞表面受容体標的化が、個々の細胞型に対する効力の向上を促進することができるかどうかを評価するために、本発明者らは、ＣＤ８標的化ＩＦＭのＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞に対する効力を比較した。ＣＤ４またはＣＤ８細胞をパルスバイオアッセイ形式でｃｈＯＫＴ８−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂで処理し、パルスインキュベーションの３日後に細胞増殖を測定した。ＣＤ８標的化ＩＦＭは、ＣＤ４  Ｔ細胞と比較してＣＤ８  Ｔ細胞をより強く刺激した（図１２Ａ〜１２Ｂ）。これは、ＩＦＭの抗体に基づく特定の細胞を標的とする能力を支持する。
方法
【０５８７】
ＣＤ４  Ｔ細胞またはＣＤ８  Ｔ細胞に関するパルスバイオアッセイ。ＣＤ４、ＣＤ８、またはＣＤ４およびＣＤ８共受容体を発現する細胞の混合物を含有する、初代ヒトＣＤ３  Ｔ細胞を、実施例１に記載したようにＣＤ３／ＣＤ２８活性化ビーズを使用して１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２の存在下で活性化した。３日の活性化後、ビーズを除去し、細胞を完全ＲＰＭＩ培地中で一晩、静置した。次いで、本発明者らは、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）使用（カタログ番号１３０−０４５−１０１、および番号１３０−０４５−２０１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．）を製造業者のプロトコールに従って使用して、ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞の集団を個々に精製した。次いで、ＣＤ４  Ｔ細胞またはＣＤ８  Ｔ細胞を、実施例１に記載したようにパルスバイオアッセイで分析した。
（実施例４）
ＩＬ−１５  ＩＦＭを含むタンパク質ナノゲルは長期細胞増大を支持する
【０５８８】
薬物負荷ナノ粒子（本明細書では「バックパック」とも呼ぶ）は、細胞生存性および機能を支持する可能性を保持する。それ故、本発明者らは、ＩＦＭを含むナノ粒子を形成する能力、ならびにＴ細胞生存性および増大に対するこれらのナノ粒子の効果を詳しく調査した。本発明者らは、可逆的、アミン反応性、ホモ二官能性架橋剤を使用して、ｈＢＣ８（２３）−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂを架橋させてタンパク質ナノゲルにした。ＩＬ１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉＬ７７Ｉ−Ｆｃを含むタンパク質ナノゲルをコンパレーターとして使用した。これら両方のタンパク質は、効率的に架橋してタンパク質ナノゲルになった：ＳＥＣ分析により、これらのタンパク質ナノゲルは、より大きい種と一致して、遊離タンパク質より速い溶出時間で移動した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。タンパク質ナノゲルと遊離（非架橋）タンパク質のＨＰＬＣトレースの比較（図１３Ａ〜１３Ｂ）により、最小限の量の遊離タンパク質が架橋ナノゲル中に残存していることが明らかになった。これは、タンパク質のナノゲルへの高度の変換を示唆する。タンパク質ナノゲルをポリエチレングリコールとポリリシンのブロックコポリマーでコーティングし、ＣＤ８  Ｔ細胞とともにインキュベートした。両方のタンパク質ナノゲルは、非架橋タンパク質および非刺激対照と比較して長期の細胞増大を支持した（図１３Ｃ）。
方法
【０５８９】
タンパク質ナノゲル合成。架橋タンパク質ナノ粒子を含むタンパク質ナノゲルを次のように形成した。ｃｈＢＣ８−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ  Ｆａｂ融合タンパク質は、４００ダルトンの平均分子量を有する最終濃度２．５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ−４００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｆｇ．Ｃｏｒｐ．）および１０％のグリセロール（Ｓｉｇｍａ）の存在下で、１７ｍｇ／ｍＬの濃度のこのタンパク質を、２７倍モル過剰の分解性架橋剤（式Ｉ）とともにインキュベートすることにより、架橋させてタンパク質ナノゲルにした。ＩＬ１５Ｎ７２Ｄ／ｓｕｓｈｉＬ７７Ｉ−Ｆｃタンパク質は、１７ｍｇ／ｍＬの濃度のこのタンパク質を２７倍モル過剰の分解性架橋剤（式Ｉ）とともにインキュベートすることにより、架橋させてタンパク質ナノゲルにした。この研究に使用した架橋剤であるビス［２−（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニルオキシ）エチル］ジスルフィドは、式Ｉに示すように、可動性ジスルフィド含有リンカーにより互いにつながれている２つのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基を含有する。
式Ｉ：
【化１６】
2020530440.tif 000025
【０５９０】
室温で３０分のインキュベーション後、反応物をダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）で希釈して、１．５ｍｇ／ｍＬの最終サイトカイン濃度にした。次いで、Ｚｅｂａカラム（カットオフ４０，０００ＭＷ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）を使用するＤＰＢＳへの緩衝液交換により、リンカー脱離基（架橋反応の一部として除去されるリンカーの分子断片を含む）および未反応リンカーから、タンパク質ナノゲルを精製した。Ｚｅｂａカラムは製造業者の指示に従って使用した。そこには、緩衝液交換を促進するためにＤＰＢＳでの３回の連続洗浄によりＤＰＢＳ中でカラムを平衡させ、その後、反応生成物を適用することを含んだ。緩衝液交換したタンパク質ナノゲルを、フォトダイオードアレイを備えたＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣシステム（株式会社島津製作所（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｃｏｒｐ．））において溶離剤としてＰＢＳ（ｐＨ７．２）（流速０．５ｍＬ／分）を用いてＢｉｏＳｅｐＴＭ  ＳＥＣ−ｓ４０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｉｎｃ．）を使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、分析した。
【０５９１】
おおよそ１〜１．５ｍｇ／ｍＬのサイトカイン濃度のタンパク質ナノゲルを、ポリエチレングリコール−ポリリシン（ＰＥＧ−ポリＫ）ブロックコポリマー［平均分子量５キロダルトン（ｋＤ）のポリエチレングリコールポリマーと３０アミノ酸ポリリシンポリマー（ポリリシン３０またはポリＫ３０）とを含むブロックコポリマーである、ＰＥＧ５ｋ−ポリＫ３０（Ａｌａｍａｎｄａ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  カタログ番号０５０−ＫＣ０３０）］と、コンジュゲートした。ＰＥＧ５ｋ−ポリＫ３０をＤＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬに再構成し、１〜１．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質ナノゲルに５０μｇ／ｍＬの最終ブロックコポリマー濃度で添加し、室温で３０分間インキュベートした。
【０５９２】
Ｔ細胞増大分析。１〜１．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度でＰＥＧ５ｋ−ポリＫ３０を含むタンパク質ナノゲルを、細胞１００×１０６個／ｍＬの細胞濃度のＨＢＳＳ中のＣＤ８  Ｔ細胞１×１０６個と、同体積で混合し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびＧｌｕｔａｍａｘ（すべて、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．からのもの）を含有するＲＰＭＩ培地でＴ細胞を３回洗浄し、おおよそ細胞１×１０６個／ｍＬの細胞密度で播種し、９日間、２４ウェル組織培養プレートで培養した。バックパックの細胞付着の３日後に細胞を新鮮培地に１：５の比率で分割した。０、１、２、３、６および９日目にフローサイトメトリーにより生細胞／死細胞染色（７−ＡＡＤ）およびカウントビーズ（ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ  Ａｂｓｏｌｕｔｅカウントビーズ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）によって、細胞増殖を測定した。
（実施例５）
免疫調節因子への融合を含む例示的ＩＦＭ
【０５９３】
サイトカインへの融合に加えて、免疫細胞標的化抗体を、非サイトカイン免疫調節因子、例えば、共刺激分子またはチェックポイントインヒビターに対する抗体またはリガンドにカップリングさせることができる。
【０５９４】
一実施形態では、ｃｈＢＣ８抗ＣＤ４５  ＦａｂまたはＩｇＧを含む構築物を、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）などの共刺激性受容体を標的とする抗体分子、例えばＦａｂまたはｓｃＦｖにカップリングさせることができる。一部の実施形態では、ＣＤ１３７に対する抗体分子は、アゴニスト抗体である。一部の実施形態では、ＣＤ１３７に対する抗体分子は、ｓｃＦｖ、ＦａｂまたはＩｇＧから選択される。実施形態では、融合体は、融合体の抗ＣＤ４５（またはＣＤ１１、ＣＤ８、ＣＤ４など）部分のＮ末端またはＣ末端ドメインに融合された共刺激性受容体に対する抗体分子を含む。簡単に言うと、上におよび図に記載した融合体のすべてを、サイトカインが４−１ＢＢに対するＦａｂまたはｓｃＦｖアゴニスト（または任意の他の細胞表面受容体のアゴニスト）によって置き換えられるように、修飾することができた。
【０５９５】
他の実施形態では、ｃｈＢＣ８抗ＣＤ４５  ＦａｂまたはＩｇＧを含む構築物を、負の免疫調節因子、例えば、チェックポイントインヒビターの阻害剤、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３またはＣＴＬＡ−４から選択されるチェックポイントインヒビターの阻害剤、を標的とする抗体分子、例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖと、カップリングさせることができる。例えば、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１に対するＩｇＧ、ＦａｂまたはｓｃＦｖ抗体などの、アンタゴニストで、ＣＤ４５、ＣＤ１１などとの融合体の相互作用によって細胞表面受容体の拮抗作用の持続をもたらすサイトカインに代えて、用いることができる。
（実施例６）
プライミングはＡＣＴ有効性を向上させることができる
【０５９６】
一部の実施形態では、細胞治療薬、腫瘍微小環境および／または宿主のプライミング（またはプレコンディショニング）は、養子細胞療法（ＡＣＴ）に広範な恩恵をもたらすことができることを示した。ある特定の実施形態では、短い（例えば、約１〜３日、約１日、または１日未満）プライミングイベントであっても、驚くべきことに、細胞療法の有効性に対して劇的な効果を有することができる。
【０５９７】
図１４Ａに示すように、宿主および腫瘍微小環境の、例えば、ＣＰＸ（シクロホスファミド）または他のリンパ球枯渇コンディショニング化学療法でのプライミングは、腫瘍成長を有意に抑制したので、ＡＣＴ有効性を向上させる。Ｐｍｅｌトランスジェニックマウス株は、Finkelsteinら,  J  Leukoc  Biol.  2004  Aug;  76(2):  333-337からのものであった。
【０５９８】
一部の実施形態では、細胞治療薬（例えば、Ｔ細胞ＡＣＴ）も、Ｔ細胞活性化を向上または最適化するためにプライミングすることができる。図１４Ｂに示すように、ＩＬ−２１の前処理は、ＩＬ−２／ＩＬ−７およびＩＬ−７がその後に続く、ＡＣＴ有効性の最大の向上を示した。
【０５９９】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示する免疫刺激性融合分子を使用して、そのようなプライミングをｉｎ  ｖｉｖｏ環境に拡大することができる。
（実施例７）
免疫標的とする表面受容体の多用途性
【０６００】
図１５は、免疫標的化部分（例えば、様々な細胞表面受容体に対する抗体）とサイトカイン分子との様々な組合せを図示する。複数の受容体が、サイトカイン免疫標的化を促進することができる。例えば、テザー融合体（tethered  fusion）は、複数の細胞型上に存在しうる「存在量の多い」細胞表面受容体、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ４５および／またはＣＤ２に対する抗体にテザーされた様々なサイトカインを用いて作製することができる。サイトカインを、細胞型特異的表面受容体、例えばＣＤ４、ＣＤ８またはＣＤ５６を介して、特定の細胞に免疫標的化することもできる。
（実施例８）
ＩＬ−１５テザー融合体は、固形腫瘍におけるＴ細胞療法を向上させる
【０６０１】
本発明者らは、２つの異なる腫瘍特異的細胞療法モデルを使用して、抗がん療法の有効性を増強するＩＬ−１５  ＩＦＭの能力を評価した。まとめると、これらの研究は、ヒトまたはマウスＴ細胞、ＣＡＲ−Ｔ細胞または腫瘍特異的ＴＣＲ、および免疫不全または免疫応答性動物モデルを含む、腫瘍モデルにわたって、腫瘍特異的細胞療法を増強するＩＬ−１５  ＩＦＭの能力を実証する。腫瘍特異的Ｔ細胞上への免疫標的とするＩＬ−１５の前負荷は、図１６Ａ〜１６Ｃ（Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍を担持している、免疫応答性のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス）および図１６Ｄ〜１６Ｅ（異種腫瘍モデル、Ｈ１２９９腫瘍を担持しているＮＳＧマウス）に示すように、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を支持し、ＩＬ−１５テザー融合体は、腫瘍特異的細胞療法の有効性を経時的に増強する。
【０６０２】
ＩＬ−１５  ＩＦＭを、先ず、Ｐｍｅｌ／Ｂ１６−Ｆ１０モデルにおいて調査した。このモデルについては、黒色腫抗原（ｇｐ１００）に特異的なＣＤ８  Ｔ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで増やし、次いで、ｇｐ１００発現Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍細胞株を有する同系マウスに注射する。ＡＣＴの９日前に、Ｂ１６−Ｆ１０マウス黒色腫細胞２００，０００個を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右側腹部に皮内注射した。黒色腫抗原ｇｐ１００特異的マウスＣＤ８  Ｔ細胞をＰｍｅｌマウスから単離し、プレートにコーティングした、マウスＣＤ３およびＣＤ２８受容体に対する抗体を使用して、２日間、活性化し、次いで、ＩＬ−２１の存在下で２日間、増やした。ｅｘ  ｖｉｖｏでの増大後、細胞に、０．７５ｍｇ／ｍＬの濃度のｃｈＭ１Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉを負荷した。細胞をＨＢＳＳで３回洗浄して過剰なサイトカインを除去し、次いで、細胞６．０×１０６個／マウスの単一用量として注射した。追加の群は、ビヒクル単独（細胞なし）、およびＩＬ−１５  ＩＦＭの非存在下でＨＢＳＳを偽負荷した細胞６．０×１０６個の単一用量（Ｐｍｅｌ単独）を含んだ。すべての動物に、ＡＣＴの一日前にシクロホスファミドリンパ球枯渇（４ｍｇ／マウス）も施した。
【０６０３】
図１６Ａ〜１６Ｃは、上記研究からの腫瘍成長曲線、マウス生存曲線およびＰｍｅｌ増大曲線を示す。Ｐｍｅｌ細胞単独は、研究過程にわたって腫瘍体積を低減させ、この効果は、細胞へのｃｈＭ１Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉの前負荷によって増強された（図１６Ａ）。４００ｍｍ３の腫瘍体積になるまで測定して、この腫瘍体積の低減は、生存転帰の向上と言えた（図１６Ｂ）。ビヒクル対照マウスは、１３日の生存中央値を有したが、Ｐｍｅｌ細胞単独での処置は、この生存中央値を３４日に増加させた。ｃｈＭ１Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉを前負荷したＰｍｅｌは、生存時間中央値を４３日に延長し、２匹の完全寛解（２８．６％）をもたらした。ビヒクル対照にも、Ｐｍｅｌ単独群にも、３９日を過ぎて生存しているマウスが一切いなかった。この腫瘍制御のおよび生存の増加は、循環Ｐｍｅｌ細胞数の増加と相関した（図１６Ｃ）。ピーク増大時に、ｃｈＭ１Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ負荷Ｐｍｅｌは、Ｐｍｅｌ単独より２．６倍高い血中濃度を有し、この濃度増加は、ピーク増大後も長く維持された：ｃｈＭ１Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ負荷群については、ＡＣＴ後４２日ほども経過して血液１μｌ当たり２００個より多いＰｍｅｌ細胞がなお存在し、これは、偽負荷Ｐｍｅｌ群よりかなり多かった（図１６Ｃ）。本発明者らは、腫瘍標的化Ｔ細胞でのＩＬ−１５テザー融合分子の前負荷が、同系宿主における細胞増大を増進させ、より良好な腫瘍制御および全生存をもたらすと結論付ける。
【０６０４】
ヒト異種移植腫瘍を含む追加のマウスモデルおよびキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞療法を使用して、腫瘍特異的細胞療法を増進するＩＬ−１５  ＩＦＭの能力を試験した。手短に述べると、臨床ＣＡＲ−Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増大に使用されるものと同様のプロトコールに従って、ＣＡＲ−Ｔ細胞を生成した。ＥＧＦＲ標的化ＣＡＲ構築物（腫瘍細胞上に発現されるＥＧＦＲを認識する）でのＣＤ３ヒトＴ細胞の形質導入および増大後、ヒトＣＤ４５標的化ＩＬ−１５  ＩＦＭ（ｈ９．４Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ）をそれらの細胞に負荷し、腫瘍異種移植片担持マウスに注射し、ｉｎ  ｖｉｖｏ増大および治療有効性について評定した。この研究では、Ｈ１２９９ヒト肺がん細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から獲得し、ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウス（ＮＳＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）の剪毛した右側腹部に腫瘍細胞１．０×１０７個を皮下（ＳＣ）注射した。ヒトＣＤ３  Ｔ細胞を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒビーズを用いて、１：１のビーズ：細胞比、および細胞１×１０６個／ｍＬの細胞密度で活性化した。Ｔ細胞培地（ＴＣＭ、１０％ウシ胎仔血清と２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液と２ｍＭ  Ｌ−グルタミンとを補充したＲＰＭＩ  １６４０）に、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−２１（１００ｎｇ／ｍＬ）を補充し、５％ＣＯ２を用いて３７℃で細胞を培養した。２日の培養後、ビーズを磁石によって培養物から除去し、細胞を培地で洗浄した。Ｔ細胞を新鮮培地に細胞２．０×１０７個／ｍＬで再懸濁させ、感染多重度５のＣＡＲ−Ｔ発現レンチウイルスベクターと１０ｎｇ／ｍＬの硫酸プロタミンを用いて、３０分間、５００ｇ遠心分離下で、Ｔ細胞に形質導入した。３０分の遠心分離後、ＩＬ−７およびＩＬ−２１をそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬおよび１００ｎｇ／ｍＬの濃度でさらに補充した新鮮ＴＣＭで細胞を希釈して、細胞５．０×１０６個／ｍＬにした。５％ＣＯ２を用いて３７℃でさらに１２時間、細胞に形質導入した。１２時間の形質導入後、細胞をペレット化してウイルス含有培地を除去し、ＩＬ−１５（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−２１（１００ｎｇ／ｍＬ）を補充した新鮮Ｔ細胞培地に細胞１．０×１０６個／ｍＬで再懸濁させた。５％ＣＯ２を用いて３７℃でさらに３日間、細胞を培養し、その後、細胞に０．７５ｍｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−１５  ＩＦＭを負荷した。細胞をＨＢＳＳで３回洗浄して過剰なサイトカインを除去し、次いで、Ｈ１２９９腫瘍担持マウスにＣＡＲ−Ｔ細胞５．０×１０６個／マウスを単一用量として注射した。他の群は、ビヒクル単独（細胞なし）、およびＨＢＳＳを偽負荷した細胞５．０×１０６個の単一用量（ＣＡＲ−Ｔ単独）を含んだ。ＣＡＲ−Ｔ生成を（同じヒトドナーを使用して）繰り返し、ＣＡＲ−Ｔ細胞５×１０６個の第２の用量（ＩＬ−１５  ＩＦＭを含有するまたは含有しない）を３７日目に注射した。
【０６０５】
図１６Ｄは、上記研究からの腫瘍成長曲線を示す。ＣＡＲ−Ｔ細胞単独は、研究過程にわたって、対照群（ＨＢＳＳ：Ｔ細胞なし；ＷＴ：活性化し、増やしたが、ＣＡＲ形質導入を行っていないＴ細胞）と比較して腫瘍体積を低減させ、この効果は、細胞へのｈ９．４Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉでの前負荷によって増強された。ＩＬ−１５  ＩＦＭ負荷ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置したマウスのみが、継続的腫瘍退縮（continue  dtumor  regression）を示した。ｈ９．４Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉテザー融合分子は、ＣＡＲ−Ｔ抗腫瘍活性を増強する。ＡＣＴ後８週間の後、腫瘍を収集し、計量した。図１６Ｅは、ＩＬ−１５  ＩＦＭがＣＡＲ−Ｔ細胞単独と比較して腫瘍重量を減少させたこと、およびまた、結果として７匹のうちの３匹のマウスが完全寛解（腫瘍なし）となったことを示す。
（実施例９）
テザー融合プラットフォームは選択的細胞標的化を可能にする
【０６０６】
ＣＤ８標的化ＩＬ−７は、ＣＤ８  Ｔ細胞に対する選択的負荷およびＣＤ８  Ｔ細胞の選択的増大をもたらす。図１７Ａ〜１７Ｂは、ＣＤ８標的化ＩＬ−７が、ＣＤ８  Ｔ細胞を選択的に標的とする、細胞特異的標的化を示す。図１７Ｃは、ＣＤ８標的化ＩＬ−７とのパルスインキュベーションによる活性化全ＣＤ３ヒトＴ細胞の培養物における、ＣＤ４  Ｔ細胞ではなく、ＣＤ８  Ｔ細胞の選択的増大を示す。手短に述べると、ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ）を製造業者の指示に従って使用して、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７および１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２１の存在下で（in  the  presence  of  in  the  presence  of）、３日間、全ＣＤ３ヒトＴ細胞（ＣＤ４  Ｔ細胞とＣＤ８  Ｔ細胞の両方を含む）を刺激することにより、活性化ヒトＴ細胞を準備した。次いで、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを除去し、細胞を完全培地（１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０）中で一晩、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７および１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２１の存在下、３７Ｃおよび５％ＣＯ２でインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、５００ｎＭの、ＣＤ８標的化ＩＬ−７構築物（ｃｈＯＫＴ８Ｆａｂ−ＩＬ７）とともにインキュベートした。３７Ｃで１時間後、細胞を完全培地で２回洗浄し、細胞２００，０００個／ｍＬの密度でまき、３７Ｃおよび５％ＣＯ２でインキュベートした。別途、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６５０コンジュゲート抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  カタログ番号ＳＡ５−１０１２９；ＤｙＬｉｇｈｔ  ６５０フルオロフォアを、フローサイトメトリー用のＡＰＣチャネルで読み取ることができる、図１７Ｂを参照されたい）、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  カタログ番号３４４６０４）およびＡＰＣ／Ｃｙ７コンジュゲート抗ＣＤ８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  カタログ番号３４４７１５）で、Ｔ細胞を染色することにより、ＣＤ８  Ｔ細胞およびＣＤ４  Ｔ細胞への負荷について細胞を分析した。抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体は、ＣＤ８標的化ＩＦＭのＦａｂ領域を検出する。抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ８抗体は、ＣＤ４  Ｔ細胞集団とＣＤ８  Ｔ細胞集団を区別することができる（図１７Ａ）。図１７Ｂは、ＣＤ４  Ｔ細胞とＣＤ８  Ｔ細胞の混合集団とともにインキュベートされたときに、ＣＤ８標的化ＩＬ−７構築物が選択的にＣＤ８  Ｔ細胞上により高レベルで負荷されることを示す。図１７Ｃは、ＣＤ８標的化ＩＬ−７構築物によるＣＤ８  Ｔ細胞の選択的増大を示す。
【０６０７】
異なる抗体クローンおよび抗体配置による選択的細胞負荷をさらに詳しく調査するために、本発明者らは、２つの異なる抗ＣＤ８モノクローナル抗体によるＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞への負荷を比較した。手短に述べると、本発明者らは、Ｆａｂ断片としての抗ヒトＣＤ８抗体クローンＯＫＴ８および５１．１（ｃｈＯＫＴ８Ｆａｂおよびｃｈ５１．１Ｆａｂ）を組換えにより産生した。本発明者らは、次の２つのＩＬ−１５  ＩＦＭをさらに構築した：ｃｈＯＫＴ８Ｆａｂを含むもの（ｃｈＯＫＴ８Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ）、およびｃｈＯＫＴ８Ｆａｂと抗ＣＤ４５  ｓｃＦｖとを含む第２のもの（ｃｈＯＫＴ８Ｆａｂ−ＢＣ８ｓｃＦｖ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ）。この後者の構築物は、２つの異なる細胞表面受容体であるＣＤ８およびＣＤ４５に対する抗体断片を含有し、本発明者らは、それが、アビディティー効果によってＣＤ８  Ｔ細胞のより強い細胞負荷をもたらすことができると推論した。本発明者らは、ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞に負荷するこれら４つの抗体およびＩＦＭ構築物の能力を、全ＣＤ３  Ｔ細胞（ＣＤ４  Ｔ細胞とＣＤ８  Ｔ細胞の混合物を含む）を使用して評価した。図１７Ｄは、各構築物についてのＣＤ８  Ｔ細胞への強い選択的負荷を示す。図１７Ｅにおいて、同様に、本発明者らは、抗ＩＬ−１５染色を使用してＣＤ８  Ｔ細胞へのＩＬ−１５の選択的負荷を示す（ＩＬ−１５を含有しないＦａｂ構築物であるｃｈＯＫＴ８Ｆａｂおよびｃｈ５１．１Ｆａｂは、もちろん、このアッセイでは陰性である）。
【０６０８】
ＣＤ８  Ｔ細胞に対する相対親和性を比較するために、本発明者らは、図１７ＤからのＣＤ８  Ｔ細胞に対する結合力価測定を図１７Ｆにおける単一プロットにまとめた。ｃｈＯＫＴ８Ｆａｂ−ＢＣ８ｓｃＦｖ抗体配置（antibody  configuration）は、ＣＤ８  Ｔ細胞への最も密接な結合をもたらした。このＩＦＭは、より高濃度で使用したときにはＣＤ４  Ｔ細胞への負荷ももたらした（図１７Ｄおよび図１７Ｅ）。本発明者らは、これは、ＣＤ４  Ｔ細胞上とＣＤ８  Ｔ細胞上の両方に存在するＣＤ４５受容体と結合するＢＣ８ｓｃＦｖに起因すると推論する。図１７Ｄに見られるＣＤ４  Ｔ細胞に対するｃｈＯＫＴ８Ｆａｂ−ＢＣ８ｓｃＦｖ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉの相対親和性は、Ｔ細胞に対する単量体ＢＣ８ｓｃＦｖの親和性（図１７Ｇ、ヘキサヒスチジンタグを使用してＢＣ８ｓｃＦｖを構築し、ここではこのタグをフローサイトメトリーによる検出のためのハンドルとして使用する）に類似しており、ｃｈＯＫＴ８ＦａｂおよびｃｈＯＫＴ８Ｆａｂ−Ｉｌ１５／ｓｕｓｈｉのＣＤ４  Ｔ細胞への最小限の結合と合わせて、本発明者らは、ｃｈＯＫＴ８Ｆａｂ−ＢＣ８ｓｃＦｖ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉのＣＤ４  Ｔ細胞への結合が、ＢＣ８ｓｃＦｖにより駆動されると結論付ける。二量体形態のＢＣ８ｓｃＦｖは、Ｔ細胞に対してより高い親和性をもたらし、これは、二価結合からのアビディティー効果（affect）に起因する可能性がある。本発明者らは、ＣＤ４  Ｔ細胞と対比してＣＤ８  Ｔ細胞に対するｃｈＯＫＴ８Ｆａｂ−ＢＣ８ｓｃＦｖ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉのより高い結合親和性−ならびに一価ｃｈＯＫＴ８Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉと比較してＣＤ８  Ｔ細胞へのより高い結合性−は、同様に、ＣＤ８  Ｔ細胞への二価結合の結果として生じるアビディティー効果（effect）に起因すると、さらに推論する。したがって、本発明者らは、異なる細胞表面受容体に特異的である抗体クローンを使用してＩＦＭを構築して、細胞の親和性および負荷を向上させることができると結論付ける。さらに、細胞選択的負荷をなお保持しつつ親和性向上を可能にするためには、選択された抗体の１つまたは複数は特定の細胞型に特異的でありうる。そのような方法を使用して、本発明者らは、異なる細胞型への様々な負荷効率（例えば、この場合、ＣＤ８  Ｔ細胞へのより強い負荷およびＣＤ４  Ｔ細胞へのより弱い−しかしゼロでない−負荷）を有する異種特異性抗体を構築することがさらに実行可能であることを示す。
（実施例１０）
サイトカイン操作はテザー融合効力を向上させる
【０６０９】
本発明者らは、生物活性がモジュレートされたサイトカイン変異体の操作により、ＩＦＭ効力をさらに増強する能力を評価した。ＩＬ−１５とその細胞シグナル伝達受容体間の相互作用についての構造−機能の理解（ChirifuらNat  Immunol.  2007  Sep;8(9):1001-7;  Ringら  Nat  Immunol.2012  Dec;13(12):1187-95）に基づいて、本発明者らは、ＩＬ−１５／ＩＬ−２受容体ベータと相互作用すると考えられているアミノ酸側鎖への変異を含む３つのＩＬ−１５バリアント（具体的には、ＩＬ−１５−Ｄ８Ｎ、ＩＬ−１５−Ｄ６１Ｎ、およびＩＬ−１５Ｎ７２Ａ）、ならびにガンマ鎖と相互作用すると考えられているアミノ酸側鎖への変異を含む３つの追加のＩＬ−１５バリアント（ＩＬ−１５−Ｋ１０Ｑ、ＩＬ−１５−Ｑ１０１Ｎ、およびＩＬ−１５−Ｑ１０８Ｎ）を構築した。本発明者らは、ｃｈＢＣ８Ｆａｂ抗体断片との融合体としてＩＬ−１５変異体を構築し、ヒトＴ細胞に対するそれらの結合および活性を評価した。手短に述べると、初代ヒトＴ細胞を、実施例１に記載したように活性化し、次いで、ＩＬ−１５バリアントを含むＩＦＭの５倍段階希釈物とともにインキュベートした（ＩＦＭインキュベーション後に洗浄を伴わない、例えば、「連続（constant）」インキュベーションアッセイ形式）。野生型ＩＬ−１５および（an）ＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ構築物を含むＩＦＭを、比較のための対照として使用した。３７Ｃおよび５％ＣＯ２での３日間のＩＬ−１５構築物とのインキュベーション後、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ  Ａｂｓｏｌｕｔｅカウントビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してフローサイトメトリーにより製造業者の指示に従って細胞密度を分析した。野生型ＩＬ−１５を含有するＩＦＭ（ｃｈＢＣ８Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ）は、ＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ構築物と同様の細胞効力を示した（図１８Ａおよび図１８Ｂ）。加えて、図１８Ａおよび図１８Ｂは、３つの異なるＩＬ−１５バリアント（ＩＬ−１５−Ｋ１０Ｑ、ＩＬ−１５−Ｑ１０１Ｎ、およびＩＬ−１５−Ｎ７２Ａ）が野生型ＩＬ−１５より強い細胞効力をもたらすこと、２つのＩＬ−１５バリアント（ＩＬ−１５−Ｄ６１ＮおよびＩＬ−１５−Ｑ１０８Ｎ）が細胞効力の低下をもたらしたこと、および単一ＩＬ−１５バリアント（ＩＬ−１５−Ｄ８Ｎ）は、評価した濃度範囲のもとで細胞活性を表さなかったことを示す。別の実験で、本発明者らは、２つの減弱されたＩＬ−１５バリアント（ＩＬ−１５−Ｄ６１ＮおよびＩＬ−１５−Ｑ１０８Ｎ）の表面残留性を、実施例１に記載のパルスアッセイ形式で評価した。本発明者らは、減弱されたバリアントを含むＩＦＭが細胞表面でのより強い残留性を示すことを見いだした（図１８Ｃ）。成長因子およびサイトカインシグナル伝達受容体の活性化は、細胞内の負の調節フィードバック機構を誘導する。１つのそのような機構は、活性化サイトカインおよび成長因子受容体の内部移行および分解を含む（JonesらTrends  Biotechnol.2008  Sep;26(9):498-505において概説されている）。理論により拘束されることを望まないが、本発明者らは、減弱された活性を有するサイトカインバリアントからの表面残留性上昇は、細胞内のそのような負の調節フィードバック機構のより弱い誘導に起因しうると推論する。
【０６１０】
サイトカイン活性とＩＦＭ表面残留性および効力との間の関係をさらに詳しく調査するために、本発明者らは、ＩＬ−１５およびそのＩＬ−１５／ＩＬ−２受容体ベータとの境界部に変異を含む４つの追加のＩＬ−１５バリアントを設計した。詳細には、本発明者らは、ＩＬ−１５バリアントであるＩＬ−１５−Ｄ６１Ｈ、ＩＬ−１５Ｅ６４Ｈ、ＩＬ−１５−Ｄ６５ＨまたはＩＬ−１５−Ｎ７２Ｈを含む、ＣＤ８標的化ＩＦＭを構築した。ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ）を製造業者の指示に従って使用して、３日間、ＣＤ３ヒトＴ細胞を刺激することにより、活性化ヒトＴ細胞を準備し、次いで、ビーズを除去し、細胞を完全培地（１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０）中で一晩、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７および１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２１の存在下、３７Ｃおよび５％ＣＯ２でインキュベートした。次いで、１０〜０．００３２ｎＭの濃度範囲にわたるＩＦＭの５倍段階希釈物とともに活性化Ｔ細胞をインキュベートし、細胞２００，０００個／ｍＬの密度で９６ウェルプレートに蒔いた（ＩＦＭインキュベーション後に洗浄を伴わない、例えば、「連続」インキュベーションアッセイ形式）。３７Ｃおよび５％ＣＯ２で３日後、細胞を収集し、細胞増大およびＩＦＭ表面レベルについて評価した。ＩＦＭ表面レベルの分析のために、細胞を、ＢＶ４２１コンジュゲート抗ＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  カタログ番号３４４６３２）、ＢＶ７８６コンジュゲート抗ＣＤ８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  カタログ番号３４４７４０）、およびＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−６４７コンジュゲート抗ヒトカッパ（軽鎖）抗体で染色した。図１８Ｄは、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５構築物のＣＤ８  Ｔ細胞への高い負荷、およびＣＤ４  Ｔ細胞への最小限の負荷を実証する。ＣＤ８標的化ＩＦＭのＣＤ４  Ｔ細胞への限られた負荷は、細胞応答に対するＩＬ−１５変異の効果の制御された評価を可能にした。Ｄ６１Ｈ、Ｅ６４Ｈ、Ｎ６５ＨまたはＮ７２Ｈ点変異を含む、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５構築物とのインキュベーションに応答してのＣＤ４  Ｔ細胞の増大は、Ｄ６１Ｈ、Ｅ６４ＨおよびＮ６５Ｈ変異の活性減弱を裏づけた（図１８Ｅ）。
【０６１１】
本発明者らは、ＣＤ８  Ｔ細胞およびＣＤ４  Ｔ細胞に対するこれらの構築物の活性をパルスアッセイ形式でさらに評価した。手短に述べると、活性化全ＣＤ３ヒトＴ細胞を、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５バリアントとともに１時間、３７Ｃでインキュベートし、洗浄して未結合ＩＦＭを除去し、細胞２００，０００個／ｍＬの密度でまき、３７Ｃおよび５％ＣＯ２でインキュベートした。各々がＴ細胞生存または増大をさらに支持しうる、誘導されたサイトカイン分泌またはテザー融合体解離および再結合の効果を制御するために、本発明者らは、パルスインキュベーションの１および３日後に細胞培養培地をリフレッシュし、さらなる細胞増大を可能にするために、パルスインキュベーションの３日後、５倍希釈比を使用して新鮮培地に細胞をさらに分割した。各ＣＤ８標的化構築物は、ＣＤ４  Ｔ細胞と比較してより高度にＣＤ８  Ｔ細胞に選択的に負荷した（図１９Ａ）。加えて、減弱された細胞活性を有するヒスチジン変異体（Ｄ６１Ｈ、Ｅ６４ＨおよびＮ６５Ｈ）の各々は、パルスインキュベーションの一日後、混合ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞上へのより高い表面残留を示した（図１９Ａ）。ＣＤ８標的化構築物の、ＣＤ４  Ｔ細胞と対比してＣＤ８  Ｔ細胞を選択的に増やす能力を評価するために、本発明者らは、それらの活性を、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５  ＩＦＭと同じ抗体配置を用いて構築された、非選択的に負荷される、ＣＤ４５標的化ＩＬ−１５  ＩＦＭ（ＣＤ８標的化構築物についての抗体形式と一致するＦａｂ−ｓｃＦｖ形式を有する、ｈ９．４Ｆａｂ−ＢＣ８ｓｃＦｖ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ）と、比較した。ＣＤ８標的化ＩＬ−１５構築物各々は、ＣＤ８  Ｔ細胞の選択的増大をもたらし、Ｄ６１ＨおよびＥ６４Ｈ変異を含む、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５構築物は、野生型ＩＬ−１５を含む、ＣＤ８標的化構築物より大きいＣＤ８  Ｔ細胞増大を支持した（図１９Ｂ）。注目すべきことに、このパルスアッセイ形式では、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５構築物の各々は、ＣＤ４  Ｔ細胞を弱くしか増やさなかった（図１９Ｂ）。これは、ＣＤ８特異性のためのそれらのデザインと合致し、ＣＤ８  Ｔ細胞への負荷に対するそれらの特異性と合致した。比較のために、野生型ＩＬ−１５、ＩＬ−１５−Ｄ６１Ｈ、またはＩＬ−１５−Ｅ６４Ｈを含む、ＣＤ８標的化構築物についての全増大時間経過を示す（図１９Ｃ）。
【０６１２】
本発明者らは、ＣＤ４５標的化ＩＦＭの文脈の範囲内で減弱ＩＬ−１５バリアントＩＬ−１５−Ｄ６１Ｈ（ｈ９．４Ｆａｂ−ＢＣ８ｓｃＦｖ−ＩＬ１５−Ｄ６１Ｈ）をさらに評価した。ＣＤ８標的化ＩＬ−１５−Ｄ６１Ｈ  ＩＦＭについて観察されたデータと一致して、ＣＤ４５テザー構築物は、一価および二価両方のＣＤ４５テザーＩＬ−１５  ＩＦＭと比較して強い細胞表面残留性をもたらした（図２０）。まとめると、本発明者らは、減弱ＩＬ−１５バリアントを含むＩＦＭが、より高い細胞表面残留性をもたらすことができ、より強い細胞増殖を経時的に誘導することができると結論付ける。
（実施例１１）
ＩＬ−１５テザー融合体は、ＩＬ−１５受容体の下流の持続的シグナル伝達を支持する
【０６１３】
本発明者らは、細胞内シグナル伝達の活性化を支持するＩＬ−１５テザー融合体の能力を、テザー融合体とのパルスインキュベーションの一日後に評価した。手短に述べると、ヒトＴ細胞を、３日間、ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓで、製造業者の指示に記載されているように活性化した。ビーズを除去し、細胞をＩＬ−２とともに１日間インキュベートした後、ＩＬ−１５構築物とのパルスまたは連続インキュベーションに付した。細胞を生物学的二重反復でＰＢＳ（偽条件）、およびＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ構築物、またはｈＢＣ８Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉとともに１時間、３７℃でインキュベートし、次いで、完全培地（１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０）で（will）３回洗浄した。次いで、細胞を完全培地に、おおよそ細胞４００，０００個／ｍＬの細胞密度でまき、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。「連続」インキュベーション条件については、示したＩＬ−１５構築物をおおよそ１μｇ／ｍＬの濃度で細胞に補充した。翌日、細胞を回収し、おおよそ１．５％のパラホルムアルデヒドで１０分間、室温で固定し、１００％メタノールで１０分間、４℃で透過処理した。次いで、リン酸化ＳＴＡＴ５（ＩＬ−１５受容体から下流のシグナル伝達分子により活性化された転写因子）に特異的な抗体を使用して細胞を免疫染色し、Ｄｉｖａソフトウェアを使用してＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａで分析し、Ｃｙｔｏｂａｎｋを使用してデータを解析した。両方のＩＬ−１５構築物が、「連続」形式でＴ細胞とともにインキュベートしたとき、ＳＴＡＴ５のリン酸化を誘導したが、テザー融合体のみが、パルスインキュベーションの一日後にＳＴＡＴ５リン酸化を維持していた（図２１）。
（実施例１２ａ）
ＩＬ−１２を含む例示的な免疫刺激性融合タンパク質
【０６１４】
ＩＬ−１２を含むテザー融合体（ＩＦＭとも呼ぶ）は、ＩＬ−１５について記載したものと同様の方法で構築することができる。例示的ＩＬ−１２テザー融合体（ＩＬ１２−ＴＦ）を図２２Ａ〜２２Ｄに図示する。ヒトまたはマウス細胞両方に対する使用のためのＩＬ１２−ＴＦは、ヒトまたはマウスＩＬ−１２のどちらか、およびヒトまたはマウスＣＤ４５のどちらかに特異的な抗体断片を使用して、構築した。ＩＬ１２−ＴＦ  ｃｈＭ１Ｆａｂ−ｓｃ−ＩＬ１２ｐ７０は、マウス一本鎖ＩＬ−１２ｐ７０に融合された抗マウスＣＤ４５  Ｆａｂ断片を含む（図２２Ａ）。マウス一本鎖ＩＬ−１２ｐ７０は、マウスＩＬ−１２ＡとＩＬ−１２Ｂ間の遺伝子融合を含む。マウス細胞における使用のためのもう１つのＩＬ１２−ＴＦであるｃｈＭ１Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０は、抗マウスＣＤ４５  ＦａｂおよびｓｃＦｖ抗体断片のＦａｂ−ｓｃＦｖ融合体とマウス一本鎖ＩＬ−１２ｐ７０とを含む（図２２Ｂ）。ヒト細胞との使用のための対応するＩＬ１２−ＴＦも構築した：ｈ９．４Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０（図２２Ｃ）およびｈ９．４Ｆａｂ−ｈ９．４ｓｃＦｖ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０（図２２Ｄ）は、ヒトＣＤ４５に特異的なＦａｂまたはＦａｂ−ｓｃＦｖ融合体と、一本鎖ヒトＩＬ−１２ｐ７０とを含む。４つすべての構築物についての、それぞれのＩＬ−１２ｐ７０サブユニットであるＩＬ−１２ＡおよびＩＬ−１２Ｂは、配向ＩＬ−１２Ｂ−ＩＬ−１２Ａを有する一本鎖分子として発現されるが、逆の発現配向（例えば、ＩＬ−１２Ａ−ＩＬ−１２Ｂ）も可能である。ＩＬ−１２ＡサブユニットとＩＬ−１２Ｂサブユニットをつなぐ複数の異なる可動性リンカーが可能である。ＩＬ−１２ｐ７０を、タンパク質の天然形態である、ＩＬ−１２ＡとＩＬ−１２Ｂのヘテロ二量体として、発現させることもできる。本明細書で開示する様々なリンカーを使用して、抗ＣＤ４５抗体とＩＬ−１２を作動可能に連結させることができ、このリンカーは、これらの間に空間を加えるように働く。
（実施例１２ｂ）
ＩＬ−１２のＣＤ４５への抗体媒介テザリングは、ＩＬ−１２の細胞負荷および長期表面残留を支持する
【０６１５】
本発明者らは、Ｔ細胞へのＩＬ−１２の負荷を支持するＩＬ−１２−ＴＦの能力を評価した。手短に述べると、ヒト全ＣＤ３  Ｔ細胞を、３日間、ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓで活性化した。ビーズを除去し、細胞をＩＬ−２とともに１日間インキュベートした後、完全培地（１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０）で希釈したｈ９．４Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０とのパルスインキュベーションに付した。細胞を生物学的二重反復で完全培地（偽条件）、またはｈ９．４Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０とともに１時間、３７℃でインキュベートし、次いで、完全培地（１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０）で（will）３回洗浄して未結合ＩＬ１２−ＴＦを除去した。次いで、細胞を完全培地に、おおよそ細胞２００，０００個／ｍＬの細胞密度でまき、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。フローサイトメトリーを使用して、ポリクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体での免疫染色により、表面テザーＩＬ−１２を検出した。ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ  Ａｂｓｏｌｕｔｅフローサイトメトリーカウントビーズを使用して、細胞を計数した。いずれの場合も、Ｄｉｖａソフトウェアを使用してＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａで細胞を分析し、Ｃｙｔｏｂａｎｋを使用してデータを解析した。
【０６１６】
図２３に示すように、抗ＣＤ４５抗体に融合されたＩＬ−１２のパルスインキュベーションは、ＩＬ−１２のＴ細胞表面への有意な負荷および長期残留ばかりでなく、有意なＴ細胞増大も支持する。
（実施例１３）
ＩＬ−１２テザー融合体は、持続的ＳＴＡＴ４リン酸化を誘導する
【０６１７】
ヒト全ＣＤ３  Ｔ細胞を、３日間、ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓで活性化した。ビーズを除去し、細胞をＩＬ−２とともに１日間インキュベートした後、完全培地（１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０）で希釈したＩＬ−１２およびＩＬ−１５テザー融合構築物とのパルスインキュベーションに付した。細胞を、生物学的二重反復で、完全培地（偽条件）、ＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ、ｈ９．４Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０、ｈ９．４Ｆａｂ−ＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ、またはｈ９．４Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０構築物とｈ９．４Ｆａｂ−ＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ構築物の組合せ（各々５００ｎＭで）とともに、１時間、３７℃でインキュベートし、次いで、完全培地で２回洗浄した。次いで、細胞を完全培地に、おおよそ細胞２００，０００個／ｍＬの細胞密度でまき、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。連続ＩＬ−１５インキュベーションの対照条件については、細胞にＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ構築物をおおよそ２５ｎＭの濃度で補充した。翌日、細胞を回収し、おおよそ２％のパラホルムアルデヒドで１０分間、室温で固定し、１００％メタノールで１０分間、４℃で透過処理した。次いで、リン酸化ＳＴＡＴ４またはリン酸化ＳＴＡＴ５に特異的な抗体を使用して細胞を免疫染色し、Ｄｉｖａソフトウェアを使用してＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａで分析し、Ｃｙｔｏｂａｎｋを使用してデータを解析した。
【０６１８】
図２４に示すように、ＩＬ−１５テザー融合体のパルスインキュベーションは、２５ｎＭ  ＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃとの連続インキュベーションと同様のレベルまでのＳＴＡＴ５リン酸化を誘導するが、ＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃとのパルスインキュベーションは、バックグラウンドレベルより高いＳＴＡＴ５リン酸化を誘導しない。ＩＬ−１２テザー融合体は、ＳＴＡＴ４のリン酸化を誘導する。この活性は、ＩＬ−１５テザー融合体との組み合わせたパルスインキュベーションにより増強される。本発明者らは、テザー融合体が、個々に使用されたときも、組み合わせて使用されたときもどちらも継続的細胞内シグナル伝達活性を誘導することができ、ＩＦＭと異なるサイトカインとの組合せが、単一ＩＦＭにより観察されるものを超える活性増加をもたらすことができると結論づける。
（実施例１４）
免疫細胞表面への複数のサイトカインのテザリング
【０６１９】
免疫細胞は、複数の異なる入力からのシグナルを感知し、統合することが多い。実際、当技術分野における多くの例が、複数のサイトカインは個々のサイトカイン単独よりも広範なまたは強力な免疫応答を惹起できることを裏づけている。それ故、本発明者らは、ＩＦＭプラットフォームを使用して免疫細胞表面に複数のサイトカインを同時にテザーする能力を評価した。本発明者らは、この可能性を、サイトカインの複数の異なる組合せを使用して調査し、複数の異なる細胞表面受容体からの刺激の拘束（tethering  stimuli）によっても調査した。
【０６２０】
本発明者らは、先ず、単一の細胞表面受容体からＩＬ−１５およびＩＬ−２１をテザーすることにより、免疫細胞表面に２つのサイトカインを同時にテザーする能力を実証した。手短に述べると、全ＣＤ３ヒトＴ細胞を、実施例１３に記載したようにＣＤ３／ＣＤ２８刺激を使用して活性化した。次いで、細胞を、様々なモル比でのＣＤ４５テザーＩＬ−１５およびＩＬ−２１（ｈ９．４Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉおよびｈ９．４Ｆａｂ−ＩＬ２１）とともにインキュベートして、細胞表面サイトカイン負荷に対する相対濃度の効果を調査した。ＩＬ−１５  ＴＦとＩＬ−２１  ＴＦを、それぞれ、５００ｎＭ：０ｎＭ、１５００ｎＭ：５００ｎＭ、５００ｎＭ：１５００ｎＭ、および５００ｎＭ：１５００ｎＭの濃度で混合することにより、１：０、３：１、１：１、および１：３のＩＬ−１５：ＩＬ−２１テザー融合体（ＴＦ）比を評価した。３７℃で１時間インキュベーション後、細胞を完全培地で２回洗浄し、その後、ＰＥコンジュゲート抗ＩＬ−１５およびＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−６４７コンジュゲート抗ＩＬ−２１抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号ＩＣ２４７１Ｐ、およびＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  カタログ番号５１３００６）で染色した。ＤｉＶａソフトウェアを使用してＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーターで細胞を分析し、Ｃｙｔｏｂａｎｋを使用してデータを解析した。図２５は、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１両方を、ＣＤ４５受容体へのテザリングによってＴ細胞表面に同時に負荷することができることを実証する。しかし、本発明者らは、ＩＬ−２１：ＩＬ−１５  ＴＦのモル比を増加させると、ＩＬ−１５の量が減少する代わりに、細胞表面上のＩＬ−２１の増加をもたらすことを、さらに観察した。図２５は、この効果が、負荷当日（０日目）にも、パルスインキュベーションの一日後（１日目）にも観察されたことを示す。これは、負荷量の最初の相違が、経時的に観察される表面レベルに影響を与えることを示す。
【０６２１】
次に、本発明者らは、細胞表面に複数のサイトカインを、それらを異なる細胞表面受容体にテザーすることにより、「相加的に」負荷する能力を評価した。本発明者らは、ＣＤ８標的化ＩＬ−２１構築物を使用することによって細胞選択的サイトカイン負荷をＴＦ組合せとカップリングする可能性をさらに評価した。ＩＬ−２１は、ＣＤ８  Ｔ細胞に望ましい幹細胞記憶表現型を付与するが、不必要に、ＣＤ４  Ｔ細胞のＩＦＮｇ産生性Ｔｈ１表現型への分化を抑制する一方で、ＣＤ４  Ｔ細胞のＴｈ２ヘルパー表現型への分化を促進すると報告されている（Tianら  Trends  Immunol.  2016  Aug;  37(8):  557-568）。それ故、ＣＤ８  Ｔ細胞に特異的なＩＬ−２１テザー融合体は、抗がん療法に望ましいはずである。手短に述べると、全ヒトＣＤ３  Ｔ細胞を、実施例１３に記載したように活性化した。次いで、細胞を、各々５００ｎＭの濃度の、ＣＤ４５テザーＩＬ−１５（ｈ９．４Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ）またはＣＤ８テザーＩＬ−２１（ｃｈＯＫＴ８Ｆａｂ−ＢＣ８ｓｃＦｖ−ＩＬ２１）の組合せとともに、インキュベートした。３７Ｃでの１時間のインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、次いで、ＰＥコンジュゲート抗ＩＬ−１５およびＡｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ−６４７コンジュゲート抗ＩＬ−２１抗体で染色した。ＣＤ４  Ｔ細胞またはＣＤ８  Ｔ細胞へのサイトカイン負荷の独立した定量を可能にするために、ＰＥ／Ｃｙ７コンジュゲート抗ＣＤ４およびＢＶ７８５コンジュゲート抗ＣＤ８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  カタログ番号３４４６１２および３４４７４０）でさらに染色した。ＤｉＶａソフトウェアを使用してＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーターで細胞を分析し、Ｃｙｔｏｂａｎｋを使用してデータを解析した。図２６は、ＣＤ４５テザーＩＬ−１５がＣＤ４  Ｔ細胞とＣＤ８  Ｔ細胞の両方に同様に高レベルに負荷したことを実証する。比較して、ＣＤ８標的化ＩＬ−２１は、ＣＤ８  Ｔ細胞に選択的に高レベルに負荷した。重要なこととして、ＣＤ８標的化ＩＬ−２１の追加は、ＣＤ４５標的化ＩＬ−１５のレベルを低下させなかった（図２６）。これは、異なる細胞表面受容体からのテザーによる相加的サイトカイン負荷を裏づける。
【０６２２】
生物活性を増強するＩＦＭ組合せの能力を詳しく調査するために、本発明者らは、ＩＬ−１５シグナル伝達受容体とＩＬ−２１シグナル伝達受容体両方の下流の転写因子であるＳＴＡＴ５の、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１  ＴＦとのパルスインキュベーション後の活性化を（リン酸化によって）評価した。手短に述べると、上に記載したパルスインキュベーションおよび洗浄の後、細胞を、細胞おおよそ２００，０００個／ｍＬの密度で完全培地にまき、３７Ｃおよび５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。細胞内シグナル伝達は、シグナルが細胞内の負の調節フィードバック機構により経時的に低減される、動的プロセスである。それ故、本発明者らは、ＳＴＡＴ５シグナル伝達活性の上限を反映するために飽和量（２５ｎＭ）のＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ構築物との連続インキュベーションを含む対照条件を含めた。加えて、本発明者らは、ＣＤ４５テザーＩＬ−１５とＣＤ４５テザーＩＬ−２１の組合せ、またはＣＤ４５テザーＩＬ−１５とＣＤ８テザーＩＬ−２１の組合せ（各ＴＦを５００ｎＭでインキュベートした）を評価した。３７Ｃおよび５％ＣＯ２で１または３日のインキュベーション後、実施例１１に記載したように、ウェルを固定し、透過処理し、ＳＴＡＴ５リン酸化について免疫染色した。注目すべきことに、パルスインキュベーションの一日後、ＣＤ４５標的化ＩＬ−１５は、ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃとの連続インキュベーションのものに近い（approaching）レベルにＳＴＡＴ５リン酸化を誘導した（図２７Ａ）。ＩＬ−１５テザー融合体とＩＬ−２１テザー融合体の組合せ−各サイトカインを同じ受容体にテザーすることによるもの、またはサイトカインを別々の受容体にテザーすることによるもの、の両方−は、ＩＬ−１５  ＴＦ単独と比較してＳＴＡＴ５リン酸化のさらなる増加をもたらした。そして連続ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ対照条件と同様のレベルに達する（図２７Ａ）。相加的に負荷されたテザー融合体−すなわち、ＣＤ４５標的化ＩＬ−１５とＣＤ８標的化ＩＬ−２１との組合せ−は、３日目の時点で飽和ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ条件と同様のレベルへＳＴＡＴ５リン酸化をさらに維持した（図２７Ｂ）。本発明者らは、同じ受容体へのまたは異なる受容体へのテザリング、の両方による、細胞表面への複数のサイトカインのテザリングは、細胞応答を増強することができると結論付ける。異なる細胞表面受容体からのテザリングは、相加的サイトカイン負荷をさらに可能にすることができ、向上した細胞活性をさらにもたらすことができる。
【０６２３】
ＩＦＭ組合せについてのサイトカインおよび細胞表面受容体のモジュール性をさらに詳しく調査するために、本発明者らは、ＩＬ−１５およびＩＬ−１２を含むＩＦＭの組合せからの細胞表面負荷および細胞応答を調査した。ＩＬ−１５とＩＬ−１２の組合せからの向上した抗腫瘍活性は、当技術分野において十分に記載されている（Di  CarloらJ  Immunol.  2000  Sep  15;165(6):3111-8;  Lasekら  Eur  Cytokine  Netw.  1999  Sep;10(3):345-56）。これは、ＩＬ−１５により誘導されるＩＬ−１２受容体発現レベル上昇に少なくとも一部は起因する可能性がある（Wuら  Eur  J  Immunol.  1997  Jan;27(1):147-54）。それ故、ＩＬ−１５およびＩＬ−１２を含むＩＦＭの組合せは、向上した治療活性をさらにもたらしうる。本発明者らは、ＩＬ−１５およびＩＬ−１２が両方ともＣＤ４５受容体からテザーされている、ＩＦＭ組合せ、ならびにＩＬ−１２がＣＤ４５からテザーされており、その一方でＩＬ−１５がＣＤ１８からテザーされている、組合せを、評価した。手短に述べると、全ＣＤ３ヒトＴ細胞を、実施例１３に記載したように活性化した。次いで、細胞を、ＣＤ４５テザーＩＬ−１５もしくはＩＬ−１２の組合せ（ｈ９．４Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉおよびｈ９．４Ｆａｂ−ｓｃＩＬ１２ｐ７０）、またはＣＤ４５テザーＩＬ−１２とＣＤ１８テザーＩＬ−１５の組合せ（ｃｈ１Ｂ４Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ）とともに、インキュベートした。両方の組合せを、各ＩＦＭについて２５、１００および４００ｎＭの濃度で評価した。３７Ｃで１時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、次いで、完全培地に細胞２００，０００個／ｍＬの密度でまき、３７Ｃおよび５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。ＩＬ−１２の細胞表面レベルを（Ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ−６４７コンジュゲート抗ＩＬ−１２抗体、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  カタログ番号５０１８１８を使用して）０および１日目に評価し、ＩＬ−１２受容体の下流の転写因子であるＳＴＡＴ４の活性化を（ＰＥコンジュゲート抗ｐ−ＳＴＡＴ４抗体、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  カタログ番号５５８２４９を使用して）１日目に分析した。細胞表面サイトカインについての染色および細胞内シグナル伝達は、上記のとおりに行った。組合せＩＬ−１５およびＩＬ−２１負荷についての上で観察されたデータと一致して、本発明者らは、ＣＤ４５標的化ＩＬ−１２について、ＣＤ４５標的化ＩＬ−１５と組み合わせたときに、より低い全般的負荷を観察した（ｈ９．４Ｆａｂ−ｓｃＩＬ１２ｐ７０とｈ９．４Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉの組合せ；図２８）。しかし、ＣＤ４５標的化ＩＬ−１２と、ＣＤ１８標的化ＩＬ−１５の組合せは、細胞表面のＩＬ−１２のレベルを低下させなかった（ｈ９．４Ｆａｂ−ｓｃＩＬ１２ｐ７０とｃｈ１Ｂ４Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉの組合せ、図２８）。ＩＬ−１２テザー融合体は、ＳＴＡＴ４リン酸化を誘導したが、ＩＬ−１５テザー融合体も、２０ｎＭ  ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃとの連続インキュベーションも、ＳＴＡＴ４リン酸化を誘導しなかった（図２９）。これは、ＩＬ−１５およびＩＬ−１２による細胞内シグナル伝達についての理解と合致しており、ＩＦＭからのパルスインキュベーションが、通常はネイティブサイトカインの���続インキュベーションによってしか観察されないサイトカイン活性をもたらすことができることを、示唆する。注目すべきことに、ＩＬ−１５  ＴＦは、そのままではＳＴＡＴ４活性を誘導しなかったにもかかわらず、ＩＬ−１２  ＴＦとＩＬ−１５  ＴＦの組合せにより、ＳＴＡＴ４リン酸化が増強された（図２９）。本発明者らは、ＩＬ−１５を含むＩＦＭとＩＬ−１２を含むＩＦＭを組み合わせることで、シグナル伝達を、単独でのＩＬ−１２により誘導されるものを超えてさらに増強することができると結論付ける。これは、ＩＬ−１５によるＩＬ−１２受容体発現の誘導の結果として生じうる。加えて、ＩＬ−２およびＩＬ−７は、ＩＬ−１２受容体発現を上昇させると記載されており（Wuら,  Eur  J  Immunol.1997  Jan;27(1):147-54）、ＩＬ−２またはＩＬ−７を含むＩＦＭの、ＩＬ−１２  ＩＦＭとの組合せも、ＩＬ−１２またはＩＬ−１２  ＩＦＭ活性を増強する可能性があるだろう。
【０６２４】
本発明者らは、複数の異なる細胞表面受容体から単一のサイトカインをテザーすることによるＩＦＭ組合せについての可能性を、さらに詳しく調査した。特に、本発明者らは、向上した細胞表面残留性をもたらす、ＣＤ４５標的化ＩＬ−１５点変異体を、ＣＤ１８標的化野生型ＩＬ−１５と組み合わせることの、Ｔ細胞増大および生存性に対する効果を評価した。手短に述べると、全ＣＤ３ヒトＴ細胞を、実施例１３に記載したように活性化した。次いで、細胞を、Ｄ６１Ｈ変異を有する２５もしくは１００ｎＭ  ＣＤ４５テザーＩＬ−１５（ｈ９．４Ｆａｂ−ＢＣ８ｓｃＦｖ−ＩＬ１５−Ｄ６１Ｈ／ｓｕｓｈｉ）、１００ｎＭ  ＣＤ１８テザー野生型ＩＬ−１５（ｃｈ１Ｂ４Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ）、またはこれら２つのＩＦＭの組合せとともに、インキュベートした。３７Ｃで１時間後、細胞を完全培地で２回洗浄し、１ｍＬ当たり細胞２００，０００個の細胞密度でまき、３７Ｃおよび５％ＣＯ２でインキュベートした。ＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーターでＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ  Ａｂｓｏｌｕｔｅフローサイトメトリーカウントビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ＤｉＶａソフトウェアを使用して生存細胞密度を経時的にモニターし、Ｃｙｔｏｂａｎｋを使用してデータを解析した。ｈ９．４Ｆａｂ−ＢＣ８ｓｃＦｖ−ＩＬ１５−Ｄ６１Ｈ／ｓｕｓｈｉとｃｈ１Ｂ４Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉの組合せは、単一のテザーサイトカインより大きいＴ細胞増殖をもたらした（図３０）。本発明者らは、個々のサイトカインまたはサイトカインバリアントを複数の細胞表面受容体からテザーして生物学的効力を向上させることができると結論付ける。
【０６２５】
本発明者らは、サイトカインを、単一の受容体から（例えば、ＣＤ４５受容体からテザーされる両方のサイトカイン）、または異なる受容体の組合せから、の両方とも細胞表面にテザーすることができることをここで示した。これらの研究は、ＣＤ８、ＣＤ１８またはＣＤ４５受容体を標的とする抗体を使用する組合せサイトカイン負荷を調査したが、細胞表面受容体の他の組合せ（必要に応じて、例えば、ＣＤ４、ＣＤ１１ａおよび／またはＣＤ２を含む）が可能である。単一の細胞への３つまたはそれより多くのサイトカインをテザーすることも可能であり、さらなる利益を追加することになる（単一の免疫細胞への、例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１の組合せ負荷は、ここでの本発明者らの観察に基づいて、ＳＴＡＴ４シグナル伝達とＳＴＡＴ５シグナル伝達の両方を増強することができた）。加えて、本発明者らは、異なる受容体からのサイトカインのテザーにより、第２のサイトカインが第１のサイトカインレベルを低下させることなくＴ細胞表面に負荷される「相加的」サイトカイン負荷が可能になることを、実証した。理論により拘束されるものではないが、本発明者らは、異なる受容体からの負荷のときに観察される相加性が、単一細胞表面受容体への負荷について競合する必要がないＩＦＭの抗体成分の結果であると推論する。本発明者らは、相加的負荷を細胞特異的標的化と組み合わせることができることをさらに実証した。本発明者らは、ＩＬ−１５とＩＬ−２１を組み合わせることができることを示し、例えば、ＩＬ−２１をＣＤ８  Ｔ細胞に選択的に負荷させ、その一方で、ＩＬ−１５をＣＤ４  Ｔ細胞とＣＤ８  Ｔ細胞の両方に負荷させた。これは、有利である。なぜなら、ＩＬ−２１は、ＣＤ４  Ｔ細胞のＴｈ２表現型への分化を促進する一方で、ＣＤ４  Ｔ細胞のＩＦＮｇ産生性Ｔｈ１表現型への分化を阻害することが示されているからである（Tianら,  Trends  Immunol.2016  Aug;  37(8):  557-568）。したがって、ＣＤ４  Ｔ細胞から離れた方向にＩＬ−２１を方向付けし直すことは、抗がん療法に望ましいはずである。Ｔｈ１  ＣＤ４  Ｔ細胞は、より増殖性が高い抗がんＣＤ４  Ｔ細胞サブセットと考えられるからである。最後に、本発明者らは、個々のサイトカインおよび／またはサイトカインバリアントを複数の異なる受容体に負荷して生物活性のさらなる向上を促進することができることを実証した。具体的には、本発明者らは、ＩＬ−１５を含む、ＣＤ１８におよびＣＤ４５標的化テザー融合体と、ＩＬ−１５変異体を含む、活性が強化されたテザー融合体とを組み合わせることによる、細胞増大の向上を示した。全体的に見て、これらのデータは、免疫細胞表面の非遺伝子操作により免疫刺激活性をもたらすためのテザー融合体プラットフォームの幅広い多用途性を支持する。
（実施例１５）
ＣＤ１１ａまたはＣＤ１８受容体からのＩＬ−１５またはＩＬ−１２のテザリング
【０６２６】
実施例３において、本発明者らは、複数の異なる、存在量が多いまたは残留性の細胞表面受容体が、向上した生物学的活性および残留性を有するＩＦＭ（テザー融合体とも呼ぶ）を生成することができることを実証した。ここでは、本発明者らは、選択された受容体を標的化する抗体のヒト化形態についてのＩＬ−１５およびＩＬ−１２の高い細胞表面負荷を支持する能力を評価した。手短に述べると、ＣＤ３ヒトＴ細胞を、実施例１に記載したように活性化した。活性化されたＣＤ３  Ｔ細胞を、ヒト化ＭＨＭ２４可変ドメインを含む、ＣＤ１１ａ標的化ＩＬ−１２  ＩＦＭ（ｈＭＨＭ２４Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０）５００ｎＭとともにインキュベートし、比較のために、ＣＤ４５標的化ＩＬ−１２  ＩＦＭ（ｈ９．４Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０およびｈ９．４Ｆａｂ−ＢＣ８ｓｃＦｖ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０；各々５００ｎＭで）を含めた。３７Ｃで１時間後、細胞を完全培地で２回洗浄し、次いで、フローサイトメトリー分析のためにＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−６４７コンジュゲート抗ヒトＩＬ−１２抗体で染色した。図３１Ａは、ヒト化抗体を含むテザー流合体とのパルスインキュベーションが、細胞表面へのＩＬ−１２の負荷を支持したことを示す。
【０６２７】
別の実験で、本発明者らは、ＣＤ４５、ＣＤ１１ａまたはＣＤ１８受容体のいずれかを標的化するヒト化抗体へのＩＬ−１５テザー融合体の細胞表面負荷を評定した。手短に述べると、ＣＤ３ヒトＴ細胞を、実施例１に記載したように活性化し、次いで、抗ＣＤ４５  Ｆａｂ断片（ｈ９．４Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ）、抗ＣＤ１１ａ  Ｆａｂ断片（ｈＨＭＨ２４Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ）または抗ＣＤ１８  Ｆａｂ断片（ｈ１Ｂ４Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ）である、様々なヒト化抗体の軽鎖のＣ末端に融合されたＩＬ−１５を含むＩＦＭの、５倍段階希釈物とともにインキュベートした。３７Ｃで１時間後、細胞を完全培地で２回洗浄し、次いで、フローサイトメトリー分析のために、表面ＩＦＭレベルを検出するためのＰＥコンジュゲート抗ヒトＩＬ−１５抗体で染色した。図３１Ｂは、様々なヒト化抗体を含むテザー融合体とのパルスインキュベーションが、細胞表面へのＩＬ−１５の用量依存性負荷を支持したことを示す。
（実施例１６）
マウスＴ細胞テザーＩＬ−１２の表面残留性および定量  
【０６２８】
本発明者らは、マウスＣＤ４５およびマウスｓｃＩＬ−１２ｐ７０サイトカインに特異的な抗体を含むテザー融合体についての、マウスＴ細胞の表面へのＩＬ−１２の負荷および残留性を促進する能力を評価した。マウスＩＬ−１２  ＴＦとのインキュベーションの前に、マウスＣＤ８  Ｔ細胞をＰｍｅｌマウスから単離し、マウスＣＤ３およびＣＤ２８受容体に対する抗体を使用して、２日間、活性化し、次いで、ＩＬ−２１の存在下で２日間、増やした。手短に述べると、マウスＣＤ３およびＣＤ２８受容体に対する抗体を事前にコーティングした（ＣＤ３およびＣＤ２８抗体をそれぞれ０．５μｇ／ｍＬおよび５μｇ／ｍＬの濃度でコーティングした）Ｎｕｎｃ  ＨｉｇｈＢｉｎｄプレートにおいて、完全培地（ＲＰＭＩ  １６４０、１０％  ＦＢＳ、インスリン−トランスフェリン−セレニウム、ペニシリン／ストレプトマイシン、および５０μＭベータ−メルカプトエタノールを含有する）中で、単離されたＣＤ８  Ｔ細胞をインキュベートした。抗体コーティングプレート上でのおおよそ２４時間のインキュベーション後、ＩＬ−２およびＩＬ−７を、それぞれ、２０ｎｇ／ｍＬおよび０．５ｎｇ／ｍＬの最終濃度まで添加した。インキュベーションの２日目後、細胞を抗体コーティングプレートから回収し、２０ｎｇ／ｍＬの最終濃度でＩＬ−２１を含有する培地でおおよそ細胞２００，０００個／ｍＬの密度に希釈した。ＩＬ−２１中で１日増やした後、細胞を、２０ｎｇ／ｍＬの最終濃度でＩＬ−２１を含有する培地でおおよそ細胞２００，００個／ｍＬの密度に再び希釈した。次いで、細胞を回収し、洗浄し、１２５ｎＭの濃度のＩＬ−１２テザー融合体（ｃｈＭ１Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０またはｃｈＭ１Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０）とともに１時間、３７Ｃでインキュベートし、その後、完全培地で３回洗浄した。細胞を２４ウェルディッシュにおいて完全培地に細胞５００，０００個／ｍＬの密度で蒔いた。パルスインキュベーション後０、１、３および５日目に、マウスＩＬ−１２に特異的な抗体を使用して細胞を免疫染色し、Ｄｉｖａソフトウェアを使用してＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａで分析し、ＦｌｏｗＪｏを使用してデータを解析した。図３２に示すように、ＩＬ−１２テザー融合体は、マウスＴ細胞へのＩＬ−１２の高レベルでの負荷を支持する。５日の実験期間中に偽条件のバックグラウンドより高いＩＬ−１２が検出可能である。
【０６２９】
別の実験で、本発明者らは、パルスインキュベーション後にマウスＴ細胞にテザーされたＩＬ−１２の量を定量した。手短に述べると、マウスＣＤ８  Ｔ細胞を、段階希釈したｃｈＭ１Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０とともに１時間、３７Ｃでパルスインキュベートし、未結合のテザー融合体を洗浄により除去した。細胞表面に結合されているＩＬ−１２レベルを、ＰＥコンジュゲートモノクローナル抗ＩＬ−１２抗体およびＱＵＡＮＴＢｒｉｔｅ（商標）ＰＥ定量キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、フローサイトメトリー分析により定量した。図３３に示すように、パルスしたＩＬ−１２テザー融合体の飽和濃度で、おおよそ３６００のＩＬ−１２テザー融合体分子が、マウスＴ細胞の表面に結合された。これは、細胞１×１０６個当たりおおよそ６５０ｐｇのｃｈＭ１Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０、および細胞１，０００，０００個当たりおおよそ４３０ｐｇのＩＬ−１２  ｐ７０に相当する。
（実施例１７）
ＩＬ−１２テザー融合体による非負荷標的細胞におけるＳＴＡＴ４リン酸化の活性化
【０６３０】
テザー融合体は、負荷細胞と非負荷標的細胞の両方を活性化することができる（図３４Ａ）。それ故、本発明者らは、ＩＬ−１２テザー融合体を、シス／自己分泌、トランス、およびパラ分泌様式でのヒトＴ細胞における活性を支持するその能力について評価した。手短に述べると、ＳＴＡＴ４リン酸化を、ＩＬ−１２テザー融合体（ｈ９．４Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０）とのパルスインキュベーションの一日後に、３つの別々のアッセイで測定して、シス、トランスおよびパラ分泌活性を探索した。全ＣＤ３Ｔ細胞を、実施例１３に記載したように活性化した。活性化されたヒトＴ細胞を、ＩＬ１２−ＴＦ（ｈ９．４Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０）とともに１時間、３７℃でインキュベートし、未結合のテザー融合体を洗浄により除去し、細胞を、細胞４×１０５個／ｍＬの密度で播種し、一晩、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。非負荷細胞を、完全培地中、サイトカインの非存在下でもう１日繁殖させ、翌日、トランスおよびパラ分泌アッセイのための「標的」細胞として使用した。シス提示／自己分泌活性については、上記のとおり、細胞を固定し、透過処理し、ＳＴＡＴ４リン酸化について免疫染色した。トランス提示評価については、非ＩＬ１２−ＴＦ負荷標的細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識して、フローサイトメトリーを使用してＩＬ１２−ＴＦ負荷細胞と区別できるようにした。ＩＬ１２−ＴＦ負荷細胞を、蛍光標識された非負荷細胞と混合し、ペレット化し、一緒に３０分間インキュベートした。次いで細胞を固定し、透過処理し、ＳＴＡＴ４リン酸化について免疫染色した。転送／パラ分泌については、パルスインキュベーションの一日後にＩＬ１２−ＴＦ負荷細胞から順化培地を回収し、非負荷細胞に移し、３０分間インキュベートし、次いで、固定化し、透過処理し、ＳＴＡＴ４リン酸化について免疫染色した。すべてのアッセイにおいて、ＤｉＶａソフトウェアを使用してＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａフローサイトメーターで細胞を分析し、Ｃｙｔｏｂａｎｋを使用してデータを解析した。すべてのアッセイについて、ＩＬ１２−ＴＦは、テザー融合体を含有しない培地でパルスした「偽」パルス細胞のバックグラウンドより高いＳＴＡＴ４リン酸化を誘導する（図３４Ｂ）。ＩＬ−１５は、ＩＬ−１２の活性を増強すると報告されており、本発明者らは、ＩＬ−１５テザー融合体とＩＬ−１２テザー融合体の組合せがＳＴＡＴ４リン酸化を増強することができることを上に示す。それ故、本発明者らは、ここに記載する３つのアッセイで、ＩＬ−１２（ｈ９．４Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０）テザー融合体およびＩＬ−１５（ｈ９．４Ｆａｂ−ＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ）テザー融合体との組合せパルスインキュベーションについてのＳＴＡＴ４リン酸化も評価した。図３４Ｂに示すように、シスおよび転送アッセイにおいて、ＩＬ−１５テザー融合体は、そのままでは強いＳＴＡＴ４リン酸化を誘導しなかったが、ＩＬ−１２テザー融合体とＩＬ−１５テザー融合体の組合せによってＳＴＡＴ４リン酸化が増強された。
（実施例１８）
腫瘍特異的Ｔ細胞療法におけるＩＬ１２−ＴＦの効果
【０６３１】
表面テザーＩＬ−１２を、養子細胞療法（ＡＣＴ）の前に細胞に前負荷したときにがんに対する腫瘍特異的細胞療法を増強する能力について評価した。手短に述べると、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞４００，０００個を皮内接種した。別途、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞におけるマウスｇｐ１００抗原に特異的なＴ細胞受容体を発現するＰｍｅｌ−１マウスから、ＣＤ８  Ｔ細胞を単離した。細胞を、実施例１６に記載したように、活性化し、増やした。マウスＩＬ１２−ＴＦ（ｃｈＭ１Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０）を、活性化ＣＤ８  Ｐｍｅｌ  Ｔ細胞に、５０ｎＭの濃度で細胞とインキュベートすることにより負荷し、未結合サイトカインを洗浄により除去し、細胞をＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液）に再懸濁させた。本発明者らは、単独（２５０ｎＭの濃度で）またはＩＬ−１２テザー融合体との組合せ（５０ｎＭの濃度で）のどちらかで、ＩＬ１５−ＴＦ（ｃｈＹ１６９Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ）も評価した。テザー融合体との３７℃で１時間のインキュベーション後、細胞を完全培地で２回洗浄し、ＨＢＳＳに再懸濁させ、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍担持マウスに尾静脈注射により養子移入（細胞５×１０６個／マウス）した。対照として、マウスをＨＢＳＳまたはＰｍｅｌ  Ｔ細胞単独でも処置した。骨髄破壊的リンパ球枯渇は、抗腫瘍Ｔ細胞療法によく使用されるが、この研究におけるすべての処置条件を骨髄破壊的リンパ球枯渇の非存在下で行った。
【０６３２】
図３５Ａは、腫瘍成長、マウス体重変化、および生存期間（ＡＣＴ後１００日目まで）を示す。ＩＬ−１２含有レジメン（ＩＬ１２−ＴＦおよびＩＬ１２／１５  ＴＦ）は、抗腫瘍成長の点でも、長期生存の点でも、最高の抗腫瘍活性を示した。ＩＬ１２−ＴＦを（単独またはＩＬ１５−ＴＦとの組合せのどちらかで）有するＰｍｅｌで処置した群からの７匹のうちの４匹（５７％）のマウスは、完全寛解を示した。注目すべきことに、ＩＬ１５−ＴＦ含有群では、１匹が長期生存している。すべての処置群は、５％未満のピーク体重減少を示し、この減少は、ＨＢＳＳ処置群に見られた体重減少と一致した。これは、ここで試験した処置戦略についての顕性毒性の非存在を示す。
【０６３３】
マウスＩＬ１２−ＴＦを有するＰｍｅｌ細胞は、内在性免疫系に対する活性の徴候を示す。それらは、ＣＤ８  Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む、移入および内在性免疫細胞の、一過性リンパ球減少を誘導する（図３５Ｂ）。これに続いて、内在性ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖（Ｋｉ６７陽性により定義されるとおり）および分化が生じる（図３５Ｃ）。内在性ＣＤ８  Ｔ細胞のさらなる細分化は、増殖性細胞が、抗原経験内在性ＣＤ８  Ｔ細胞集団（フローサイトメトリーにより、集団は、コンジェニックＰｍｅｌ  Ｔ細胞マーカーＣＤ９０．１について陰性でもあり、ＣＤ８およびＣＤ４４について二重陽性でもある）内にほぼ排他的に含まれることを明らかにし、これは、ＩＬ１２−ＴＦの存在が、内在性免疫系の特異的区画を活性化していることを示唆する（図３５Ｄ）。図３５Ｂに示す内在性ＮＫ細胞の一過性リンパ球減少の後は、図３５Ｅに示すようにそれらの増殖増加（Ｋｉ６７陽性によって）および活性化（ＣＤ６９陽性によって）である。本発明者らは、ＩＬ１２−ＴＦを有する腫瘍特異的Ｔ細胞には、がんに対するＡＣＴも増強し、内在性免疫系をプライミングもする可能性を保持すると結論付ける。
（実施例１９）
ＩＬ１２−ＴＦは、養子移入Ｔ細胞に前負荷された場合または溶解させて共投与された場合のどちらかの場合に腫瘍特異的Ｔ細胞療法を増強する
【０６３４】
表面テザーＩＬ−１２を、がんに対する養子細胞療法（ＡＣＴ）を増強する能力について評価した。手短に述べると、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞４００，０００個を皮内接種した（innoculated）。腫瘍特異的Ｔ細胞での養子細胞療法の一日前（Ｂ１６−Ｆ１０細胞の接種の９日後）に、腫瘍担持マウスを４ｍｇのシクロホスファミドで処置した。別途、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞におけるｇｐ１００抗原に特異的なＴ細胞受容体を発現するＰｍｅｌ−１マウスからＣＤ８  Ｔ細胞を単離し、実施例１６でＴ細胞について記載したように、活性化し、増やした。次いで、細胞をＡＣＴのために収集し、１２５ｎＭの濃度のＩＬ−１２テザー融合体（ｃｈＭ１Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０）とともにインキュベートした。未結合のテザー融合体を洗浄により除去し、細胞をＨＢＳＳに再懸濁させ、次いで、ＣＤ８  Ｐｍｅｌ  Ｔ細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）注射によりＢ１６−Ｆ１０腫瘍担持マウスに養子移入（細胞３×１０６個／マウス）した。対照として、マウスをまた、ＨＢＳＳで、ＣＤ８  Ｐｍｅｌ  Ｔ細胞単独で、またはＣＤ８  Ｐｍｅｌ  Ｔ細胞に続いて可溶性ＩＬ−１２ｐ７０（０．１４３、０．７１５および３．５７５ピコモルのＩＬ−１２ｐ７０に対応する、１０、５０もしくは２５０ｎｇの用量レベルで）の単一用量で、または可溶性ＩＬ−１２テザー融合体（０．１４３、０．７１５もしくは３．５７５ピコモルのテザー融合体）で処置し、すべての条件について静脈内投与した。理論により拘束されることを望まないが、実施例１６での予備的計算に基づき、これまでに試験した最高用量は、表面テザーＩＬ−１２用量の１００倍を超える量に相当する。
【０６３５】
図３６に示したように、前負荷したまたは溶解させて共投与したＩＬ−１２テザー融合体は、両方とも、腫瘍成長を有意に阻害し、長期生存を支持した。いずれの場合も、テザー融合体は、遊離ＩＬ−１２の共投与より強く腫瘍成長を阻害し、生存を延長した。体重減少の形での最小限の顕性毒性が観察された。明確にするためにデータを２つの別々の図にプロットし、図の第２のセットに、比較のためにＨＢＳＳ群、Ｐｍｅｌのみの群、およびＩＬ１２−ＴＦを有するＰｍｅｌ群を再プロットする。ＡＣＴ後の最初の３５日間の、または所与の群内の２匹のマウスが死亡するまでの、腫瘍成長動態を示す。
（実施例２０）
ＩＬ１２−ＴＦ候補は複数細胞用量でさらに向上した腫瘍制御を可能にする
【０６３６】
ほとんどの細胞療法は、強固な抗腫瘍応答のために、ＡＣＴの前に骨髄破壊的化学療法を含むプレコンディショニングレジメンを必要とする。しかし、このアプローチには、連続的プレコンディショニング化学療法の繰り返しによって前に投与した細胞の活性を枯渇させるリスクのため複数細胞用量を投与することができないことを含む、制限がある。実施例１８において、本発明者らは、ＩＬ１２−ＴＦが固形腫瘍モデルにおいてプレコンディショニングの非存在下で腫瘍特異的Ｔ細胞療法を増強する可能性を実証した。これらの効果を踏まえて、本発明者らは、ＩＬ１２−ＴＦについて、複数細胞用量の使用によって抗腫瘍制御をさらに増強する能力を評価した。手短に述べると、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞４００，０００個を皮内接種した。別途、ＰｍｅｌマウスからＣＤ８  Ｔ細胞を単離し、活性化し、増やし、実施例１８に記載したようにＩＬ１２−ＴＦ（ｃｈＭ１Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０）を負荷した。腫瘍接種の９日後に、マウスをＣＤ８  Ｐｍｅｌ  Ｔ細胞でｉ．ｖ．注射により処置した。シクロホスファミドでのリンパ球枯渇を、初回細胞用量の一日前に使用し、２回目の細胞用量を、初回用量の１４日後に追加のリンパ球枯渇の非存在下で投与した。加えて、本発明者らは、単一用量の腫瘍特異的細胞療法の有効性を増強するＩＬ１２−ＴＦの代替配置（ｃｈＭ１Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０）の能力を評価した。両方のＩＬ１２−ＴＦ（ｃｈＭ１Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０およびｃｈＭ１Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０）は、テザー融合体をｅｘ  ｖｉｖｏで負荷した単一細胞用量で、腫瘍成長阻害および生存期間を向上させた（図３７Ａ）。ｃｈＭ１Ｆａｂ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０をｅｘ  ｖｉｖｏで負荷した腫瘍特異的Ｔ細胞の複数用量は、抗腫瘍生存をさらに増強したが、腫瘍特異的Ｔ細胞単独の複数用量は、増強しなかった（図３７Ｂ）。
【０６３７】
ＩＬ１２−ＴＦは、循環Ｐｍｅｌ  Ｔ細胞のピーク増大とそれらの長期残留性の両方を増加させた（図３７Ｃ）。本発明者らは、体重減少の形での顕性毒性の徴候を観察しなかった（図３７Ｄ）。観察されたいずれの体重減少も、シクロホスファミドでのリンパ球枯渇により主として駆動されるようであった：各処置群におけるマウスは、体重がおおよそ１０％減少した（図３７Ｄ）が、リンパ球枯渇の非存在下で行った実施例１８で、本発明者らは、すべての処置群にわたって５％未満の体重減少を観察した（図３５Ａ）。加えて、本発明者らは、ＩＬ１２−ＴＦを有するＰｍｅｌでのＡＣＴの一日後に血漿中の中等度のレベルの全身性ＩＦＮ−γ（図３８）およびＣＸＣＬ１０（図３９）を観察し、循環レベルは、養子細胞移入から４日以内にベースラインに戻った（図３８〜３９）。
【０６３８】
要約すれば、本発明者らは、複数の配置の抗体媒介サイトカインテザリングが、Ｔ細胞表面へのＩＬ−１２の強い負荷および残留性を可能にすることを、前臨床研究で実証した。さらに、表面テザーＩＬ−１２は、侵襲性固形腫瘍モデルにおいて養子移入された腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を実質的に向上させ、この向上は、１００倍を超えてモル過剰の全身投与したＩＬ−１２より良好な腫瘍制御および生存期間を含む。リンパ球枯渇の非存在下でのＩＬ１２−ＴＦを負荷した腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性は、複数細胞用量の投与による有効性のさらなる向上を可能にした。
【０６３９】
表面テザーＩＬ−１２はまた、体重減少の形での顕性毒性および継続的全身サイトカイン放出の非存在を伴う−抗原経験ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖増加を含む−内在性免疫系の活性化を支持する。
【０６４０】
本発明者らは、細胞表面テザー免疫刺激性サイトカインが、固形腫瘍を含むがんに対する細胞療法の有効性を増強する強力なアプローチであると結論付ける。このアプローチは、遺伝子操作を必要とせず、ＣＡＲ−Ｔ、ＴＣＲ−Ｔ、腫瘍関連抗原特異的Ｔ細胞、およびＮＫ細胞などの、現在臨床調査中である細胞療法に、容易に組み込むことができる。
（実施例２１）
テザー融合プラットフォームはｉｎ  ｖｉｖｏでの特異的細胞標的化を可能にする
【０６４１】
ＣＤ８標的化ＩＬ−７またはＩＬ−１５テザー融合体を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏでの選択的ＣＤ８  Ｔ細胞負荷のための能力を確立した（実施例９を参照されたい）ので、本発明者らは、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５  ＩＦＭを使用してｉｎ  ｖｉｖｏでＣＤ８  Ｔ細胞の選択的標的化を試験した。二価Ｆａｂ−ｓｃＦｖ構築物を使用して（using  using）ＣＤ８親和性の向上を実証するヒトＴ細胞における本発明者らの以前の観察（図１７Ｄ〜図１７Ｆ）を踏まえて、本発明者らは、類似のＦａｂ−ｓｃＦｖ抗体配置を含む、ＣＤ８標的化マウスＩＬ−１５バリアント（ｃｈＹ１６９Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ）を生成した。ＣＤ４５標的化ｓｃＦｖは、標的細胞上での残留を向上させるが、ＣＤ８標的化Ｆａｂを特異性をもたらすように設計する。
【０６４２】
本実施例に記載する最初の実験で、本発明者らは、静脈内投与したテザー融合体が、ｉｎ  ｖｉｖｏで特異的にマウスＣＤ８  Ｔ細胞上の標的になりうるかどうかを試験した。２匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス／群に、ｃｈＹ１６９Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ（２μｇ／マウス）、ｃｈＭ１Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ（ＣＤ４５標的化ＩＦＭ、２μｇ／マウス）、またはＰＢＳビヒクル対照を注射した。注射の１時間後、採血し、テザー融合体細胞表面結合をフローサイトメトリーにより評定した。赤血球を溶解し、テザー融合体を検出するためにカッパおよびＩＬ−１５に対する蛍光コンジュゲート抗体で残存細胞を染色した。マウスＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ１．１およびＣＤ４５に特異的な抗体を、免疫細胞サブセット分析を可能にするために、さらに含めた。テザー融合体表面結合を、カッパとＩＬ−１５の両方に対する陽性により定義した。ビヒクル対照処置動物とｃｈＭ１Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ処置動物は、両方とも、最小限の陽性染色細胞を有した（３．５〜３．９／μｌ）一方で、ｃｈＹ１６９Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ処置動物は、１０倍を超える、より高濃度の循環テザー融合体陽性細胞を有した（図４０Ａ）。図４０Ａにおけるヒストグラムプロットは、ｃｈＭ１Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ処置動物についての蛍光の大量シフトを示す。しかし、明瞭なＴＦ陽性集団はなかった。ＣＤ４５は、すべての免疫細胞上に見出されるため、特異的結合が存在した可能性があるが、テザー融合体シグナルは、はるかに多い数の細胞にわたって広がっていた。ＣＤ８標的化ＩＬ−１５（ｃｈＹ１６９Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ）で処置したマウスについては、全細胞のわずかなパーセンテージ（１．７３％）しか、テザー融合体について陽性でなかったが、ＣＤ８  Ｔ細胞の大部分は陽性であった（図４０Ｂ）。さらに、分析した他のサブセット（ＣＤ４  Ｔ細胞、ＮＫ細胞）のいずれも、ＴＦ染色を示さなかった。まとめると、これらのデータは、ｃｈＹ１６９Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉテザー融合体によるＣＤ８細胞の特異的な高レベルの標的化、およびＣＤ４５特異的ｃｈＭ１Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉテザー融合体による非特異的な低レベルの標的化を示す。
【０６４３】
第２の実験で、本発明者らは、循環免疫細胞に対する、ＣＤ４５またはＣＤ８標的化ＩＬ−１５  ＩＦＭの単一用量（２または１０μｇ）の効果を評価した。加えて、本発明者らは、標的化されていないＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ構築物と、Ｄ６１ＨおよびＥ６４Ｈ変異を含む、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５バリアント（ｃｈＹ１６９Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ−ＩＬ１５−ＤＨＥＨ／ｓｕｓｈｉ；これらの変異のさらなる記載については実施例９を参照されたい）を含めた。注射後３日目に採血し、赤血球を溶解し、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８およびＮＫ１．１に対する蛍光コンジュゲート抗体で残存細胞を染色した。注射後３日目まで、いずれのテザー融合体形式または濃度についてもＣＤ４  Ｔ細胞数の変化はほとんどなかった（図４０Ｃ）。対照的に、ＣＤ８数は、テザー融合体形式および濃度のすべてにより増加し、３．４〜１３．６倍の範囲であった。ＣＤ４５標的化およびＣＤ８標的化されたテザー融合体の効果は、ＣＤ８細胞に対して同様であり、標的化されていないＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃと比べて増加した。その低下した生物活性と一致して、ＤＨＥＨ変異体は、野生型ＩＬ−１５  ＩＦＭより少ないＣＤ８増大を推進した（drove）。ＣＤ４５と比べてＣＤ８標的化テザー融合体についてＣＤ８  Ｔ細胞増大の増強はなかったが、ＮＫ細胞に対するオフターゲット効果の低下が（循環におけるＮＫ１．１＋細胞の定量により測定して）あった。ＮＫ細胞は、ＩＬ−１５に対して高感受性でもあり、それらの数は、ＩＬ−１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃおよび汎ＣＤ４５標的化ｃｈＭ１Ｆａｂ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉテザー融合体により劇的に増加した（ＨＢＳＳ処置群と比べて６〜１３倍増大）。対照的に、ＣＤ８標的化ｃｈＹ１６９Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉは、ＮＫ細胞数のほんのわずかな増加（３〜５倍）をもたらした。ＮＫ細胞に対するＤＨＥＨ変異体オフターゲット効果は、よりいっそう減弱され、ビヒクル対照と比べてほんの１．５〜３倍の増大であった。これらの効果は、ＣＤ８  Ｔ細胞のＮＫ細胞に対する比を比較することによって最も明確に分かる（図４０Ｄ）。標的化されていないＩＬ１５／ｓｕｓｈｉは、ＣＤ８  Ｔ細胞のＮＫ細胞に対する比を実際に低下させ、これは、標的化がないと、ＮＫ特異的活性が優性されることを示唆する。汎ＣＤ４５標的化テザー融合体は、ＣＤ８  Ｔ細胞数を有意に増加させたが、それは、ＮＫ細胞数に対して匹敵する効果を有し、ＣＤ８：ＮＫ比は、ビヒクル処置マウスと変わらない。野生型ＣＤ８標的化テザー融合体は、ＣＤ８：ＮＫ比の実質的増加を推進し、２μｇおよび１０μｇ用量について、それぞれ、９．２倍および４．４倍増加した。ＤＨＥＨ変異体は、ＣＤ８  Ｔ細胞に対して劇的な効果を有さず、ＮＫ細胞に対するオフターゲット効果も低下させ、この構築物で処置したマウスは、野生型ＣＤ８標的化テザー融合体と同様のＣＤ８：ＮＫ比を有した。本発明者らは、ＩＦＭ標的化が、ＩＬ−１５のＣＤ８およびＮＫ細胞効果の大きさおよび選択性をモジュレートすることができ、特に、ＩＬ−１５の標的化（ＣＤ８対ＣＤ４５対非標的化型）、用量、および活性を（ＩＬ−１５変異を減弱することによって）制御することによりＩＬ−１５活性をＣＤ８細胞の方に偏らせることができると結論付ける。
【０６４４】
まとめると、これらの実験は、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５バリアントの全身投与によって、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＤ８  Ｔ細胞にＩＬ−１５を負荷することができること、これらの細胞の方にＩＬ−１５活性を偏らせることができること、およびさらに、ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃなどの、当技術分野において説明されているＩＬ−１５構築物での処置により達成可能なものを超えてＣＤ８  Ｔ細胞の循環レベルを上昇させることができることを示す。
（実施例２２）
ＣＤ８標的化ＩＬ−１５の全身投与は毒性の低下を示す
【０６４５】
本発明者らは、全身毒性に対するＩＬ−１５のＣＤ８  Ｔ細胞への再標的化の効果を評価した。手短に述べると、１群当たりｎ＝５のマウスの、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、半減期延長形態のＩＬ−１５であるＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ構築物、またはＤ６１Ｈ（ＤＨ）もしくはＤ６１ＨおよびＥ６４Ｈ（ＤＨＥＨ）変異を含有する、２つの異なるＣＤ８標的化ＩＬ−１５バリアント（ｃｈＹ１６９Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ−ＩＬ１５−ＤＨ／ｓｕｓｈｉおよびｃｈＹ１６９Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ−ＩＬ１５−ＤＨＥＨ／ｓｕｓｈｉ）を、１０、３０または９０μｇの静脈内注射により１週間に１回投与される２用量を与えた。加えて、本発明者らは、野生型ＩＬ−１５を含有する、ＣＤ８標的化ＩＦＭである、ｃｈＹ１６９Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ−ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉを９０μｇの用量レベルで評価した。上の実施例２１で、本発明者らは、ＣＤ８標的化構築物が、ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ、またはＣＤ４５標的化構築物と比較して、ＣＤ８  Ｔ細胞の方にＩＬ−１５の負荷および活性を偏らせること、および１０μｇ用量で、ＣＤ８標的化構築物が、１０μｇ  ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃと同様にまたはそれより良好に循環ＣＤ８  Ｔ細胞の増大を誘導するが、循環ＮＫ細胞のより小さい増大を誘導することを実証した。本発明者らは、固定用量レベルで１週間当たりの用量数を増加させることも評価し、詳細には、本発明者らは、１０μｇの、ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ、またはＣＤ８標的化ＩＬ−１５  ＩＦＭの、週に２または３用量を、２週間にわたって調査した（１群当たりマウスｎ＝３）。図４１Ａは、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５バリアントの用量漸増について体重減少の形の顕性毒性がないことを経時的に示す。しかし、ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃ構築物は、ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃについては１週間当たり１０μｇの最大耐用量を有し、３０および９０μｇ用量は、有意な毒性を誘導し、注射の４日後に死亡をもたらした（図４１Ａ、図の凡例中のカッコ内の数は、実験終了時の生存マウスの割合を示す）。さらに、本発明者らは、死亡マウスから脾臓を採取し、３０および９０μｇのＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃで処置したマウスにおいて脾腫大を認めた（図４１Ｂ）。比較して、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５バリアントのそれぞれは、全２週間研究を完了することができ、ここで調査した全２週間投薬レジメン後、最小限の体重減少をもたらし（図４１Ａ）、死亡した動物がいない、および１０μｇのＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃと比較して脾臓腫大が小さかった（図４１Ｂ）。さらに、ＩＬ１５／ｓｕｓｈｉ−Ｆｃは、週１回、１０μｇの用量で耐容され、この投薬を週当たり２または３用量に増加させると、２回目の注射後に有意な毒性および死亡がもたらされた（図４１Ｃ、図の凡例中のカッコ内の数は、実験終了時の生存マウスの割合を示す）。死亡したマウスも脾腫を示した（図４１Ｂ）。比較して、ＣＤ８標的化ＩＬ−１５バリアントの週に２または３回、１０μｇの用量での投薬は、全２週間投薬レジメンの過程で、有意な体重減少も、動物死亡（図４１Ｃ）も、実質的な脾臓腫大（図４１Ｂ）も、もたらさなかった。本発明者らは、ＣＤ８  Ｔ細胞へのＩＬ−１５の再標的化がｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＬ−１５のより低い毒性およびより多い投薬を可能にすると結論付ける。ＩＬ−１５によるＮＫ細胞の増大はｉｎ  ｖｉｖｏでＩＬ−１５毒性に強く寄与することが示されている（Guoら,  J  Immunol.2015  Sep  1;195(5):2353-64）。理論により拘束されることを望まないが、ｉｎ  ｖｉｖｏでＩＬ−１５の活性をＮＫ細胞から離れた方向に偏らせることは、毒性を低下させることができ、ＣＤ８  Ｔ細胞に対するより強い投薬を可能にすると推論される。これは、ＩＬ−１５の抗腫瘍有効性がＣＤ８  Ｔ細胞により媒介されうること（Xuら,  Cancer  Res.  2013  May  15;73(10):3075-86;  Chengら,  J  Hepatol.  2014  Dec;61(6):1297-303）を考えると、治療的に有利かつ有意である。
（実施例２３）
ＩＬ−１２のＣＤ８を標的とする全身投与からの抗がん有効性
【０６４６】
ＩＬ−１２は、マウス腫瘍モデルにおいて強い抗腫瘍活性を誘導する強力なサイトカインであるが、ヒト臨床試験では高い毒性に難儀した。ＩＬ−１２は、ＣＤ４  Ｔ細胞のＴｈ１表現型への分化を支持し、ＣＤ８  Ｔ細胞の細胞傷害性を増加させ、ＮＫ細胞を活性化する。しかし、がん療法についてのＩＬ−１２の臨床試験により、ヒト患者におけるＩＬ−１２の効果がＮＫ細胞に対して最も顕著であることが判明した（Robertsonら,  Clin  Cancer  Res.  1999  Jan;5(1):9-16;  Bekaii-Saabら,  Mol  Cancer  Ther.  2009  Nov;  8(11):  2983-2991）。ＩＬ−１２のＮＫ細胞に対する優性活性は、ＮＫ細胞を活性化することに関連する毒性と相まって、ＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞にＩＬ−１２の生物学的効果を有効にもたらす能力を制限する可能性がある。この仮説を検証するために、本発明者らは、マウスＣＤ８  Ｔ細胞標的化マウスＩＬ−１２  ＩＦＭ（ｃｈＹ１６９Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ−ｓｃＩＬ−１２ｐ７０）を構築し、マウス黒色腫腫瘍モデルにおいてその安全性および抗腫瘍有効性を評価した。
【０６４７】
手短に述べると、Ｂ６Ｄ２Ｆ１／Ｊマウスに、Ｂ１６−Ｆ１０黒色腫細胞４００，０００個を皮内注射により接種した。１０日後、腫瘍担持マウスを無作為化し、０．０５、０．２５、１または５μｇの、組換えＩＬ−１２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＣＤ４５標的化ＩＬ−１２（ｃｈＭ１Ｆａｂ−Ｍ１ｓｃＦｖ−ｓｃＩＬ１２ｐ７０およびｃｈＭ１Ｆａｂ−ｓｃＩＬ１２ｐ７０）、またはＣＤ８標的化ＩＬ−１２の２用量（毎週１回投薬）を用いて静脈内注射により処置した（１群当たりマウスｎ＝５）。図４２Ａは、ＣＤ４５標的化ＩＬ−１２  ＩＦＭまたはＣＤ８標的化ＩＬ−１２  ＩＦＭの毎週の注射各々が、ＩＬ−１２の毎週の注射より強い抗腫瘍有効性をもたらしたことを実証する。加えて、ＣＤ８標的化ＩＬ−１２は、ＣＤ４５標的化ＩＬ−１２と同様の腫瘍成長阻害をもたらした（図４２Ａ）。注目すべきことに、ＣＤ４５標的化ＩＬ−１２  Ｆａｂ−ｓｃＦｖ構築物で処置したマウスは、１および５μｇ用量レベルで体重減少の形の毒性を被ったが、ＣＤ８標的化ＩＬ−１２  Ｆａｂ−ｓｃＦｖ構築物で処置したマウスは、同様の毒性を示さなかった（図４２Ｂ）。本発明者らは、ＩＬ−１２を含むＩＦＭが、ＩＬ−１２単独と比較して向上した抗腫瘍有効性をもたらすことができ、細胞特異的に標的化されたＩＬ−１２が、全身毒性を低下させることができると結論付ける。
（実施例２４）
テザー融合体をコードするｍＲＮＡのトランスフェクション
【０６４８】
ｍＲＮＡ合成。修飾リボヌクレオチドであるプソイドウリジン（Ψ）および５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）で完全に置換され、ＡＲＣＡでキャップされた、ｅＧＦＰまたは本明細書で開示されるテザー融合体（例えば、ＩＬ−１５もしくはＩＬ−１２融合体）のコドン最適化ｍＲＮＡを、産生することができる。Ψおよびｍ５Ｃで修飾されたｅＧＦＰ  ｍＲＮＡを、ｃｙ５（これもＴｒｉＬｉｎｋからのもの）とコンジュゲートさせて、これらの転写物の送達を追跡することができる。
【０６４９】
Ｔ細胞のｍＲＮＡトランスフェクション。正常ドナーからの凍結保存ＰＢＭＣを温ＴＣＭの滴下添加により解凍し、その後、遠心分離（１０分間４５０×ｇ）することができる。ＣＤ８  Ｔ細胞を負の選択（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）により単離することができる。細胞をＴＣＭ＋ＩＬ−２中で細胞１０６個／ｍｌで培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１：１のビーズ：細胞比で用いて刺激することができる。αＣＤ３標的化トランスフェクションを含む実験については、これらのビーズをＮＰ添加の２４時間前に除去することができる。
【０６５０】
ナノ粒子（ＮＰ）媒介トランスフェクションについては、例えば実施例４の方法（methof）を使用して、ＮＰを調製することができ、Ｔ細胞を、ＸＦＳＦＭに、２×１０６／ｍｌの濃度になるように再懸濁させることができる。細胞１０６個当たり２．５μｇのｍＲＮＡを含有する、抗体を標的とするＮＰを、３７℃で２時間の曝露のためにこの懸濁液中に混合し、その後、それを、５０ＩＵのＩＬ−２／ｍｌを補充したＴ細胞培地の添加により、４倍に希釈することができる。対照ＮＰはｅＧＦＰ  ｍＲＮＡを含有する。
【０６５１】
電子穿孔のために、Ｔ細胞２×１０６個を、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで２回洗浄し、３μｇのｅＧＦＰ  ｍＲＮＡを含有する１００μｌのＴ細胞電子穿孔用培地（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁させ、電子穿孔用キュベットに移し、プログラムＴ−２０を使用してＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）装置で処理することができる。電子穿孔された細胞を、抗生物質を含まない２ｍｌ  ＴＣＭ＋ＩＬ−２を含有するプレートに移すことができる。
【０６５２】
ＣＤ３４＋細胞のナノ粒子トランスフェクション。正常ドナーから事前に集められた末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）からＣＤ３４＋細胞を精製することができる。解凍後、細胞を計数し、次いで、５０ｎｇ／ｍｌのヒト幹細胞因子（Ｓｃｆ）と、５０ｎｇ／ｍｌのマウスＦｌｔ３／Ｆｌｋ−２リガンドと、２５ｎｇ／ｍｌのヒトトロンボポエチン（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とを補充した、ＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭＩＩ無血清培地である、ＨＳＣ培地中で、一晩、１０６／ｍｌの濃度で培養することができる。翌日、細胞を収集し、計数し、９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）において、細胞２．５×１０４個／ウェルで、サイトカインを含まない１００μｌのＨＳＣに再懸濁させることができる。１ウェルにつき１μｇのｅＧＦＰまたはＭｕｓａｓｈｉ−２  ｍＲＮＡを含有する、ＣＤ１０５標的化ＮＰまたは対照ＮＰで１時間、細胞を処理し、次いで、サイトカインを含まない１ｍｌのＨＳＣ培地で２回洗浄することができる。次いで、洗浄された細胞を、２４ウェル組織培養プレート内の５００μｌの完全ＨＳＣ培地に移すことができる。４８時間後、細胞を、フローサイトメトリーによる分析のためにＣＤ３４、ＣＤ１３３およびＣＤ１０５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）について標識した。
【０６５３】
細胞表面上および上清中のＩＦＭの測定。トランスフェクション後、培養中の、０、１および３日後に、細胞を免疫蛍光染色により分析して、細胞表面ＩＦＭおよび上清中のＩＦＭを検出することができる。手短に述べると、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含有する１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳ／ＢＳＡ）で細胞を洗浄し、次いで、ＰＢＳ／ＢＳＡ中の、ＰＥコンジュゲート抗ＩＬ１５抗体（クローン番号３４５５９；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号ＩＣ２４７１Ｐ）の１：１００希釈物、およびＤｙＬｉｇｈｔ６５０コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＋Ｌポリクローナル抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  カタログ番号Ｓａ５−１０１２９）の１：１００希釈物で染色することができる。４℃で２０〜３０分インキュベーション後、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡで１回洗浄し、次いで、Ｄｉｖａソフトウェアを使用するＦＡＣＳＣｅｌｅｓｔａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での分析のためにＰＢＳ／ＢＳＡに再懸濁させることができる。Ｃｙｔｏｂａｎｋ（Ｃｙｔｏｂａｎｋ，Ｉｎｃ）およびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を使用して、データを解析することができる。その一方で、上清を回収し、ウェスタンブロットに供することができる。
【０６５４】
本開示の範囲および趣旨から逸脱しない、本開示の記載した方法および組成物の修飾形態および変形形態は、当業者には明らかである。特定の実施形態に関連して本開示を説明したが、特許請求された本開示をそのような特定の実施形態に不当に限定すべきでないことは理解すべきである。実際、本開示を実施するための記載した方法の様々な修飾形態が意図されており、そのような修飾形態が、後続の特許請求の範囲によって示される本開示の範囲内であることは、本開示が属する関連分野の当業者には理解される。
参照による組込み
【０６５５】
本明細書中で言及するすべての特許および刊行物は、各々の独立した特許および刊行物が参照により組み込まれていると具体的かつ個々に示されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。２０１８年７月３日に出願された、「ＩＭＭＵＮＯＳＴＩＭＵＬＡＴＯＲＹ  ＦＵＳＩＯＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ」という名称の、代理人整理番号１７４２８５−０１０８００／ＰＣＴを有するＰＣＴ国際出願、および２０１８年７月３日に出願された、「ＦＵＳＩＯＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＥＳ  ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＩＭＭＵＮＥ  ＲＥＧＵＬＡＴＯＲＹ  ＣＥＬＬＳ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ」という名称の、代理人整理番号１７４２８５−０１１０００／ＰＣＴを有するＰＣＴ国際出願は、両方とも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2020530440.tif 000026
【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１７−５】
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【図１７−６】
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【図１７−７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【図１８−６】
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【図１８−７】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３３−３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３５−３】
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【図３５−４】
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【図３５−５】
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【図３５−６】
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【図３５−７】
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【図３５−８】
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【図３５−９】
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【図３５−１０】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３７−３】
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【図３７−４】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４０−３】
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【図４０−４】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４１−３】
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【図４１−４】
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【図４１−５】
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【図４１−６】
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【図４１−７】
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【図４２−１】
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【図４２−２】
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【図４２−３】
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【図４２−４】
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【図４２−５】
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【図４２−６】
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【図４２−７】
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【図４２−８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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