(57)【要約】  本発明は、新規マーカーの使用による、対象の血液中で制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を検出するための方法に関する。本方法は、マーカーＢＴＮＬ８の検出と組み合わせた、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する少なくとも１つの一般に知られているマーカーの検出を含む。本方法により、免疫抑制および免疫寛容の維持などの重要な免疫学的機能に関与する様々なＴｒｅｇ集団の信頼できる検出および定量が可能になる。本発明は、新規マーカーを使用する免疫学的疾患または症状に罹患している対象の処置をモニタリングするための方法も提供する。本発明は、Ｔｒｅｇを検出するためのＢＴＮＬ８の特異的な検出を可能にする手段の使用にも関する。ＢＴＮＬ８とともにＴｒｅｇの一般に知られているマーカーを検出するための検出手段を含むキットも提供される。
2020531853.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を検出するための方法であって、該対象から得られた試料において：
（ａ）Ｔｒｅｇと関連することが知られている少なくとも１つのマーカー；
（ｂ）ＢＴＮＬ８
を検出することを含む、方法。
【請求項２】
Ｔｒｅｇと関連することが知られている前記マーカーが、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰおよびＦｏｘＰ３の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
次のマーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＴＩＧＩＴおよびＨＥＬＩＯＳのうち１つ以上の検出をさらに含む、請求項１〜２の何れかに記載の方法。
【請求項４】
以下のマーカー：
（ａ）ＣＤ４、ＧＡＲＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｂ）ＣＤ４、ＬＡＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｃ）ＣＤ４、ＧＡＲＰ、ＬＡＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｄ）ＣＤ４、ＣＤ２５、ＧＡＲＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｅ）ＣＤ４、ＣＤ２５、ＬＡＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｆ）ＣＤ４、ＣＤ２５、ＧＡＲＰ、ＬＡＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｇ）ＣＤ４、ＣＤ１２７、ＧＡＲＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｈ）ＣＤ４、ＣＤ１２７、ＬＡＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｉ）ＣＤ４、ＣＤ１２７、ＧＡＲＰ、ＬＡＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｊ）ＣＤ４、ＣＤ１２１ａ、ＧＡＲＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｋ）ＣＤ４、ＣＤ１２１ａ、ＬＡＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｌ）ＣＤ４、ＣＤ１２１ａ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｍ）ＣＤ４、ＣＤ１２１ｂ、ＧＡＲＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｎ）ＣＤ４、ＣＤ１２１ｂ、ＬＡＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｏ）ＣＤ４、ＣＤ１２１ｂ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰおよびＢＴＮＬ８
の検出を含む、請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
該Ｔｒｅｇが定量されるステップをさらに含む、請求項１〜４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
前記試料が、前記活性化Ｔｒｅｇを検出する前に細胞ベースプロダクトが投与された対象に由来し、前記細胞ベースプロダクトが好ましくは制御性マクロファージ（Ｍｒｅｇ）を含んだものである、請求項１〜５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）および（ｂ）における検出が、以下の技術：フローサイトメトリー、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲおよびＥＬＩＳＡのうち１つ以上を使用する、請求項１〜６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
前記試料が血液試料または血液由来試料である、請求項１〜７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
非Ｔｒｅｇが陰性対照として使用される、請求項１〜７の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
対象における免疫学的疾患または症状の処置をモニタリングまたは評価するための方法であって、
（ａ）前記免疫学的疾患または症状の処置が開始された後に前記対象から得られた試料を提供し；
（ｂ）請求項１〜９に記載の方法を実行し；
（ｃ）ＢＴＮＬ８発現Ｔｒｅｇを定量すること
を含み；
処置開始後のＢＴＮＬ８発現Ｔｒｅｇの数の増加が、該処置が有効であることを示す、
方法。
【請求項１１】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を単離する方法であって、
（ａ）Ｔｒｅｇを含有するまたは含有すると思われる試料を提供し；
（ｂ）ＢＴＮＬ８およびＴｒｅｇと関連することが知られている少なくとも１つのマーカーの発現により、該試料中に含有される他の細胞からＴｒｅｇを分離することを含み、前記マーカーが好ましくは、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰおよびＦｏｘＰ３の群から選択される、
方法。
【請求項１２】
Ｔｒｅｇを検出、濃縮、単離および／または定量するための、ＢＴＮＬ８タンパク質に特異的な親和性を有する化合物の使用。
【請求項１３】
前記化合物が、ＢＴＮＬ８に対する抗体または抗体断片である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
（ａ）Ｔｒｅｇと関連することが知られている少なくとも１つのマーカー、好ましくはＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰまたはＦｏｘＰ３の検出のための手段；および
（ｂ）ＢＴＮＬ８の検出のための手段
を含むキット。
【請求項１５】
前記手段が、（ｉ）ＢＴＮＬ８に対する抗体または抗体断片、および／または（ｉｉ）ＢＴＮＬ８遺伝子に対するポリヌクレオチドプライマーまたはプローブを含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
Ｔ細胞のプール中で制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を検出するための方法であって、対象から得られた試料において：
（ａ）Ｔｒｅｇと関連することが知られている少なくとも１つのマーカー；
（ｂ）ＢＴＮＬ８
を検出することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規Ｔｒｅｇマーカーの使用によって、対象の血液中の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を検出するための方法に関する。本方法は、細胞表面マーカーＢＴＮＬ８の検出と組み合わせた、制御性Ｔ細胞に対する少なくとも１つの一般に知られているマーカーの検出を含む。本方法により、免疫抑制および免疫寛容の維持などの重要な免疫学的機能に関与するＴｒｅｇ集団の信頼できる検出および定量が可能になる。本発明は、新規マーカーを使用する免疫学的疾患または症状に罹患している対象の処置をモニタリングするための方法も提供する。本発明は、Ｔｒｅｇを検出するためのＢＴＮＬ８の特異的な検出を可能にする手段の使用にも関する。ＢＴＮＬ８とともに広く一般に知られているＴｒｅｇのマーカーを検出するための手段を含むキットも提供される。
【背景技術】
【０００２】
寛容性を確立する手段としての免疫学的に寛容なドナーから非寛容個体への免疫制御細胞の移動が現在真剣に注目されている［１］。免疫制御細胞のいくつかのクラス［２］は、現在、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および抑制性骨髄細胞の様々な種を含め、実質臓器移植での使用のための補助的免疫抑制剤として開発されている［３−５］。
【０００３】
Ｔｒｅｇは、その免疫抑制効果のためにこの点で特に有用であることが証明されている制御性細胞の１タイプである。Ｔｒｅｇは、免疫反応を抑制し、同種ドナーからの細胞または臓器に対する免疫寛容性を促進する能力を有するＴ細胞のサブグループである。近年、様々な生理学的および病理学的免疫反応を制御する際のＴｒｅｇの役割が明らかになってきており、自己免疫疾患、実質臓器移植および造血幹細胞移植の処置のためのＴｒｅｇの使用が示唆されている。ドナーからＴｒｅｇを単離し、これらの細胞をエクスビボで増量させ、処置する患者にそれらを注入し、それらが移植の免疫学的拒絶を抑制するという、いくつかの試験が現在進行中である。このようなアプローチにおいて、患者に注入された抑制性Ｔｒｅｇのモニタリングは、処置効率を予測するために重要である。したがって、患者へのＴｒｅｇ投与後、Ｔｒｅｇの検出およびモニタリングを可能にするマーカーが必要とされる。
【０００４】
このようなマーカーは、単離Ｔｒｅｇの投与に依存する処置に有用であるだけでなく、患者においてＴｒｅｇを誘導する能力を有する他のタイプの免疫制御細胞に基づく治療アプローチに対しても有用である。例えば、ヒト制御性マクロファージ（Ｍｒｅｇ）は、細胞ベース医薬品としてのその開発において既に非常に進展している細胞タイプである［６］。早くも２００８年に、免疫抑制薬処置への生体ドナー腎臓移植レシピエントの長期依存を短縮することを意図して、生体ドナー腎移植レシピエントを粗製Ｍｒｅｇ調製物で術前に処置した［７］。Ｍｒｅｇはマクロファージ分化の特有の状態を反映しており、それらの誘導方式、比較的安定な表現型および強力なサプレッサー機能により、他の活性化状態においてマクロファージとは区別される［８−９］。ヒトＭｒｅｇは、プラスチック面との接触、血清免疫グロブリンによるＣＤ１６のライゲーションおよび他の血清因子への曝露を必要とする時間依存的過程を通じて高濃度のヒト血清［１０］とともに培養されたＭ−ＣＳＦ刺激ＣＤ１４＋末梢血単球から発生する［１１］。これらの培養条件下で、ヒトＭｒｅｇは徐々にそれらの特徴的な伸展形態および細胞表面表現型を獲得する。ヒトＭｒｅｇは、ＩＦＮ−γ誘導性インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）活性を通じてインビトロでのマイトジェン刺激型同種Ｔ細胞増殖を妨げ、同時に活性化された同種Ｔ細胞の接触依存的な除去に介在する［１２］。Ｍｒｅｇ産生およびそれらの安定的な抑制活性の単純性により、それらは、免疫抑制療法での使用のための細胞ベース治療製品として適切となる。異所性マウス心臓移植モデルにおける前臨床実験から、ｉ．ｖ．注射により投与されるドナー系列Ｍｒｅｇが免疫適格性の、完全にミスマッチのレシピエントにおける同種移植片生存を延長させる能力が明らかになった［１３］。マウスへのｉ．ｖ．注射後、同種Ｍｒｅｇが肺、肝臓および脾臓に急速に蓄積したが、リンパ節には蓄積せず、それらは最長４週間にわたり持続した。Ｍｒｅｇは、それらの生涯期間を超えて耐える移植片保護効果を発揮し、この効果には、レシピエントにおいて誘導されるＴｒｅｇが介在する。したがって、免疫抑制性ＴｒｅｇはＭｒｅｇ誘導性免疫応答にも重要な役割を果たすと思われるので、それらの特異的な検出および定量はＭｒｅｇ療法の有効性を評価するために重要である。
【０００５】
免疫抑制性Ｔｒｅｇに対して特徴的であるマーカーパターンは、当技術分野で記載されており、ＣＤ３+、ＣＤ４+、ＣＤ２５+、ＣＤ１２７low、ＬＡＰ+、ＧＡＲＰ+およびＦＯＸＰ３+を含む。しかし、上記のマーカーによるＴｒｅｇの検出には問題があることが多く、曖昧な結果につながる。例えば、マーカーＬＡＰおよびＧＡＲＰは低レベルで発現されるが、これはつまり、弱陽性細胞と陰性細胞との区別が困難である場合があるということである。結果として、免疫抑制性Ｔｒｅｇのかなりの部分が、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）または磁気ビーズに基づく分離などの細胞ソーティング法から漏れることが分かった。
【０００６】
上記マーカーパターンの別の欠点は、マーカーＦＯＸＰ３が細胞内転写因子であることであり、これはつまり、抗体が細胞に浸透し、このマーカーが発現される核に侵入することを可能にするためにＴ細胞が死滅させられざるを得ないということである［１４］。したがって、ＦＯＸＰ３では、ＦＡＣＳまたは磁気ビーズに基づくソーティングによる生存可能なＴｒｅｇ細胞のソーティングが可能とならない。さらに、エフェクターＴ細胞は、それらの活性化時にＦＯＸＰ３を上方制御させる［１５］。同様に、マーカーＣＤ３+、ＣＤ４+、ＣＤ２５+およびＣＤ１２７lowは、制御性Ｔｒｅｇに特異的ではないが、ヒトＴ細胞の他の型と共通である。
【０００７】
多くの疾患および障害の処置のためのＴｒｅｇの根本的な関連性ゆえに、免疫抑制性Ｔｒｅｇを検出し、モニタリングするのに有用である特異的なマーカーをさらに同定することが必要である。今回、本発明の過程で、免疫抑制性Ｔｒｅｇがそれらの表面または細胞内貯蔵内で、エフェクターＴ細胞または他の型のＴ細胞よりも高いレベルのブチロフィリン様タンパク質８（ＢＴＮＬ８）を発現すると思われることが分かった。したがって、ＢＴＮＬ８は、免疫抑制性Ｔｒｅｇの特異的な同定、検出、単離、定量、モニタリングおよび／または濃縮に使用され得る。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、ＢＴＮＬ８が免疫抑制性Ｔｒｅｇの表面上に存在するという洞察に基づく。したがって第１の態様において、本発明は、対象において免疫抑制性Ｔｒｅｇを検出するための方法を提供し、この方法は、対象から得られた細胞試料において、
（ａ）Ｔｒｅｇと関連することが知られている少なくとも１つのマーカー；
（ｂ）マーカーＢＴＮＬ８
を検出することを含む。
【０００９】
本発明の方法は、活性化免疫抑制性Ｔｒｅｇにより発現されることが知られ、ある程度までこれらの細胞に特異的である少なくとも１つの広く一般に知られるマーカーと組み合わせた、新規マーカーＢＴＮＬ８の検出に依存する。
【００１０】
ＢＴＮＬ８は、ブチロフィリンファミリーに密接に関連するヒトにおける４員ブチロフィリン様遺伝子ファミリーに属する、あまり研究されていない細胞表面受容体であり、これらの両ファミリーは構造的および機能的にＢ７−同時刺激分子と関連がある。ＢＴＮＬ８は、ＩｇＶおよびＩｇＣドメインを含む細胞外領域があるＩ型膜タンパク質である［１６］。これは、Ｔ細胞により発現される、現在のところ特徴が分かっていない受容体に対する同時刺激または同時阻害リガンドとして働く細胞表面受容体である。ＢＴＮＬ８は、２つの異なる変異体の形態：５７ｋＤａのＢＴＮ様変異体および約３７ｋＤａのＢ７様変異体で発現される。５７ｋＤａのＢＴＮ様変異体は、３７ｋＤアイソフォームから欠失している細胞内Ｂ３０．２ドメインを組み込む。両ＢＴＮＬ８  ｍＲＮＡスプライシング変異体の発現は、好中球および好酸球［１７］ならびに腸細胞において以前に報告されたが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞または単球におけるＢＴＮＬ８発現は以前には報告されていない。以下の例で報告される一連の実験において、３７ｋＤａのＢ７様変異体は、Ｍｒｅｇ細胞とともにそれらを共培養することによって活性化されている誘導型Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）により高度に上方制御されることが分かった。したがって、本願においてＢＴＮＬ８に言及する場合、約３７ｋＤａの分子量を有するＢＴＮＬ８のＢ７様変異体を意味する。ＢＴＮＬ８のＢ７様スプライシング変異体のヌクレオチド配列は本明細書中の配列番号１で示す。ＢＴＮＬ８のアミノ酸配列は配列番号２で示す。
【００１１】
Ｔｒｅｇに対する特異性を達成するために、マーカーＢＴＮＬ８の検出を、免疫抑制性Ｔｒｅｇにより発現されることが知られる少なくとも１つのマーカーの同時または連続的検出と組み合わせる。免疫抑制性Ｔｒｅｇに特徴的であるマーカーは、当技術分野で公知であり、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂおよびＦｏｘＰ３が挙げられるが限定されない。これらのマーカーのうち１つ以上を新規ＢＴＮＬ８マーカーと組み合わせることによって、試料中での免疫抑制性Ｔｒｅｇの非常に特異的な検出が実現可能となる。ＦｏｘＰ３とは異なり、新規マーカーＢＴＮＬ８は免疫抑制性Ｔｒｅｇの表面で発現され、したがってこれは、ＦｏｘＰ３に対する代用マーカーとして多くの設定で使用され得る。
【００１２】
本発明の方法の一実施形態において、ＢＴＮＬ８がＣＤ２５と組み合わせて使用される。本明細書中で使用される場合、ＣＤ２５は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）受容体α鎖を指し、ＩＬ２ＲＡ遺伝子によりヒトにおいて含まれるタンパク質である［１８］。ＩＬ２受容体α（ＩＬ２ＲＡ）鎖は、ＩＬ２受容体β（ＩＬ２ＲＢ）鎖およびＩＬ２受容体γ鎖（ＩＬ２ＲＧ）と一緒に、高親和性のＩＬ−２受容体を形成する。ＣＤ２５は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、一部の胸腺細胞、骨髄前駆細胞およびオリゴデンドロサイト上で提示されるＩ型受容体タンパク質である。このような実施形態において、免疫抑制性Ｔｒｅｇは、マーカープロファイルＢＴＮＬ８+ＣＤ２５+により同定され得る。
【００１３】
本発明の方法の別の実施形態において、ＢＴＮＬ８がＣＤ１２７と組み合わせて使用される。本発明に関連して、ＣＤ１２７はインターロイキン−７受容体のαサブユニットを指す［１９−２０］。ヘテロ二量体インターロイキン−７受容体は、２本の個別のタンパク質鎖、すなわちインターロイキン−７受容体−α（ＣＤ１２７）および共通γ鎖受容体（ＣＤ１３２）からなる。ＣＤ１２７がインターロイキン−７受容体に特有である一方で、共通γ鎖受容体は、インターロイキン−２、−４、−９および−１５を含め、様々なサイトカインと共有される。ＣＤ１２７は、ナイーブおよびメモリーＴ細胞を含め、様々な細胞型で発現される。重要なこととして、Ｔｒｅｇは、従来のＴ細胞で観察されるものと比較してＣＤ１２７発現が顕著により低いことを特徴とする。このような実施形態において、免疫抑制性Ｔｒｅｇは、マーカープロファイルＢＴＮＬ８+ＣＤ１２７lowにより同定され得る。
【００１４】
本発明の方法のまた別の実施形態において、ＢＴＮＬ８がマーカー反復優位糖タンパク質Ａ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎｓ  ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ）（ＧＡＲＰ）と組み合わせて使用される。この８０ｋＤａ膜貫通タンパク質は、６６２アミノ酸からなり、主に２０ロイシンリッチ反復から構成される細胞外領域を有する［２１−２２］。ＧＡＲＰは、細胞発生において重要な役割を果たすことが示唆されているが、その実際の機能は未知である。ＧＡＲＰは免疫抑制性Ｔｒｅｇの表面上で発現されることが示されている。このような実施形態において、免疫抑制性ＴｒｅｇはマーカープロファイルＢＴＮＬ８+ＧＡＲＰ+により同定され得る。
【００１５】
本発明の方法のまた別の実施形態において、ＢＴＮＬ８は、マーカーとして潜伏期関連ペプチド（ＬＡＰ）と組み合わせて使用される。ＬＡＰは、一般的にＴＧＦ−β不活性を維持するためにＴＧＦ−βと会合するタンパク質である。ＴＧＦ−βは、それが２つのポリペプチド［２３−２４］、すなわち潜在型ＴＧＦ−ベータ結合タンパク質（ＬＴＢＰ）および潜伏期関連ペプチド（ＬＡＰ）と複合体化する潜在型形態で、多くの細胞型により分泌される。その分泌後、血清プロテイナーゼが複合体からの活性ＴＧＦ−βの放出を触媒する。ＴＧＦ−βは、Ｔ細胞制御および分化の両方においても重要な役割を果たす。このような実施形態において、免疫抑制性ＴｒｅｇはマーカープロファイルＢＴＮＬ８+ＬＡＰ+により同定され得る。
【００１６】
本発明の方法のまた別の実施形態において、ＢＴＮＬ８がＣＤ１２１ａと組み合わせて使用される。本明細書中で使用される場合、ＣＤ１２１ａは、インターロイキン１受容体（ＩＬ１Ｒ）ファミリーに属するインターロイキン１受容体Ｉ型、シングルパス、Ｉ型膜貫通糖タンパク質を指す。ＣＤ１２１ａは、ＩＬ−１介在性炎症の誘発に関与することが分かっている［２５］。このような実施形態において、免疫抑制性Ｔｒｅｇは、マーカープロファイルＢＴＮＬ８+ＣＤ１２１ａ+により同定され得る。
【００１７】
本発明の方法のまた別の実施形態において、ＢＴＮＬ８がＣＤ１２１ｂと組み合わせて使用される。本明細書中で使用される場合、ＣＤ１２１ｂは、同様にインターロイキン１容体（ＩＬ１Ｒ）ファミリーに属するインターロイキン１受容体ＩＩ型を指す。ＣＤ１２１ｂは、インターロイキン−１α、インターロイキン−１βおよびインターロイキン１受容体アンタゴニストに対するデコイ受容体であり、それにより、それらがその通常の受容体と結合し、そのシグナル伝達を阻害することが妨げられる。このような実施形態において、免疫抑制性Ｔｒｅｇは、マーカープロファイルＢＴＮＬ８+ＣＤ１２１ｂ+により同定され得る。
【００１８】
一般的には、マーカーの検出は、Ｔヘルパー細胞など、Ｔ細胞またはＴ細胞サブ集団上に存在することが一般に知られているマーカーも含む。したがって、Ｔｒｅｇの検出は、Ｔ細胞マーカーＣＤ３およびＣＤ４も含むことが特に好ましい。マーカーＣＤ３およびＣＤ４は、Ｔ細胞の検出およびソーティングのために広く使用される周知のマーカーである。ＣＤ３が全てのＴ細胞の表面上に存在する一方で、ＣＤ４は、（Ｔｒｅｇが属する）Ｔヘルパー細胞により発現される。したがって、ＣＤ３およびＣＤ４の陽性検出によって、両方の表面マーカーを有する細胞がＴヘルパー細胞であるという結論が可能となる。
【００１９】
発明者らは、ＩＤＯ依存性機序を通じて共培養Ｔ細胞においてＭｒｅｇがＴＩＧＩＴ発現を強く誘導したことを発見した。したがって、別の実施形態において、本発明の方法は、少なくとも１つの既知のＴｒｅｇマーカーおよびＢＴＮＬ８の検出の他に、ＴＩＧＩＴの検出も含む。さらに別の実施形態において、本発明の方法は、少なくとも１つの既知のＴｒｅｇマーカーおよびＢＴＮＬ８の検出の他に、マーカーＨＥＬＩＯＳの検出も含む。
【００２０】
本開示に基づき、当業者は、Ｔｒｅｇを確実に同定し、検出する様々なマーカーパターンを容易に設計可能である。原則として、新しいマーカーＢＴＮＬ８を１つのさらなるＴｒｅｇマーカーと組み合わせることが十分なものである一方で、検出の特異性を向上させるために、２つを超えるマーカーを同時に使用することが好ましい。特に、検出された細胞がＴヘルパー細胞の群に属することを確実にするためにさらなるマーカーとしてＣＤ４を使用することが好ましい。本発明の実施に際した使用のための好ましいマーカーパターンは、次のマーカーの検出を含む：
（ａ）ＣＤ４、ＧＡＲＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｂ）ＣＤ４、ＬＡＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｃ）ＣＤ４、ＧＡＲＰ、ＬＡＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｄ）ＣＤ４、ＣＤ２５、ＧＡＲＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｅ）ＣＤ４、ＣＤ２５、ＬＡＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｆ）ＣＤ４、ＣＤ２５、ＧＡＲＰ、ＬＡＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｇ）ＣＤ４、ＣＤ１２７、ＧＡＲＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｈ）ＣＤ４、ＣＤ１２７、ＬＡＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｉ）ＣＤ４、ＣＤ１２７、ＧＡＲＰ、ＬＡＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｊ）ＣＤ４、ＣＤ１２１ａ、ＧＡＲＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｋ）ＣＤ４、ＣＤ１２１ａ、ＬＡＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｌ）ＣＤ４、ＣＤ１２１ａ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｍ）ＣＤ４、ＣＤ１２１ｂ、ＧＡＲＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｎ）ＣＤ４、ＣＤ１２１ｂ、ＬＡＰおよびＢＴＮＬ８、
（ｏ）ＣＤ４、ＣＤ１２１ｂ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰおよびＢＴＮＬ８。
【００２１】
本発明によれば、Ｔｒｅｇの検出は定性または定量ベースで行われ得る。いくつかの適用に対して、所望のマーカーパターンを有するある特定の細胞の存在を検出することは十分である。しかし、殆どの適用に対して、標的細胞を定量的に評価することが好ましい。したがって、上記方法は、Ｔｒｅｇが定量されるさらなるステップを含み得る。細胞の定量は、特異的な検出方法に主に依存する様々な手段により達成され得る。例えばＲＴ−ＰＣＲまたはフローサイトメトリーによる検出の定量は当技術分野で周知である。
【００２２】
本発明の方法で使用される細胞試料は、免疫抑制性Ｔｒｅｇを含有するかまたはそれを含有すると思わわれる何らかの試料であり得る。例えば、細胞試料は、例えばコアニードルバイオプシー、穿刺吸引などによって、試験する対象から得られている組織試料であり得る。本発明の方法で使用する前に、例えば細胞溶解および続くＲＮＡ精製によって、適切な緩衝液での希釈によって、または例えば蛍光標識抗体で細胞を染色することによって、試料をマーカー分析に適したものとするために、試料を処理し得る。特に好ましい実施形態において、対象から得られた細胞試料は、血液試料または血液試料由来である試料、例えば血清または血漿試料などである。
【００２３】
特に好ましい本発明の実施形態において、本方法は、必要とする対象へのＭｒｅｇの投与により誘導されているＴｒｅｇの検出を目的とする。その場合、試料は、そのＴｒｅｇ検出前に細胞ベースプロダクト（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）が投与された対象由来であり、この細胞ベースプロダクトは好ましくはＭｒｅｇを含んだものである。
【００２４】
特に好ましい実施形態において、ステップ（ａ）および（ｂ）におけるマーカーの検出は、ＢＴＮＬ８および／または転写レベルでＴｒｅｇと関連することが知られている上記で論じたマーカーのうち少なくとも１つを測定することを含む。転写レベルでＢＴＮＬ８遺伝子の発現をモニタリングするための適切な方法としては、好ましくは、ｍＲＮＡレベルの定量的または半定量的検出を可能にするもの、例えば定量的ＲＴ−ＰＣＲ（例えばＴａｑＭａｎ（商標）ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット分析または例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（ｅｄｓ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に一般的に記載される他の方法が挙げられる。
【００２５】
転写レベルでの発現レベルの検出は、通常、第１ステップとして対象の細胞試料からの、例えば血液試料からの、ｍＲＮＡの単離を必要とする。ｍＲＮＡなどのＲＮＡを単離するための方法は、当技術分野で周知であり、文献で詳細に論じられている（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  ＹｏｒｋおよびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９４），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。このような方法は、通常は試験する対象から得られる細胞または組織の溶解を含む。細胞溶解は細胞の形質膜を破壊可能である界面活性剤の使用によって行われ得る。例えば、グアニジンチオシアン酸塩および／またはＳＤＳを含有する緩衝液を細胞溶解のために使用し得る。本方法は、発現レベルのモニタリングなど、さらなる下流の適用を妨害し得るＤＮＡの痕跡のない純粋なＲＮＡを得るために細胞のＤＮＡを酵素により消化するステップを含み得る。ＲＮＡの分解につながる酵素の阻害剤も溶解緩衝液に添加され得る。高度精製ＲＮＡを調製するためのキットは、Ｑｉａｇｅｎ、Ａｍｂｉｏｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａなど、いくつかの製造者から入手可能である。
【００２６】
市販キットの使用により細胞または組織試料から単離されるＲＮＡは通常、様々なタイプのＲＮＡを含む。好ましくは、組織試料から得られたＲＮＡは、ｍＲＮＡ、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を含むトータルＲＮＡである。本発明の方法については、ｍＲＮＡ分画を他の細胞性ＲＮＡの分画に対して濃縮することが望ましい。好ましくは、ｍＲＮＡを他のＲＮＡ分子から分離する。ｍＲＮＡを濃縮するかまたは精製するための方法は当技術分野で公知である。例えば、ｍＲＮＡがそれらの３’末端でポリ（Ａ）テールを含有するので、セルロースもしくはＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）マトリクスなどの固体マトリクスにカップリングされるオリゴ（ｄＴ）またポリ（Ｕ）を使用するアフィニティークロマトグラフィーが行われ得る（例えばＡｕｓｕｂｅｌら（１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。アフィニティーマトリクスに結合されているポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡは、２ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．１％ＳＤＳを使用して溶出され得る。
【００２７】
転写レベルで発現を検出するための通常使用される１つの方法はＲＴ−ＰＣＲである。この方法において、逆転写（ＲＴ）反応によりｍＲＮＡ鋳型がｃＤＮＡに移される。ＲＮＡ鋳型の逆転写は逆転写酵素により触媒され、特異的なオリゴヌクレオチドプライマーにより、または代わりにオリゴ−ｄＴプライマーにより反応が刺激され得る。次に、続くＰＣＲ反応のための鋳型としてｃＤＮＡを使用する。続くＰＣＲステップにおいて、特異的なオリゴヌクレオチドプライマーおよびポリメラーゼ酵素、例えばＴａｑポリメラーゼの使用によりｃＤＮＡを増幅させる。好ましい実施形態において、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲとしてＲＴ−ＰＣＲ反応が行われるが、これにより、リアルタイムで増幅ＤＮＡの検出および同時定量が可能になる。絶対コピー数として、またはさらなる遺伝子発現産物の使用により正規化された相対量としての何れかで定量が行われる。
【００２８】
さらなる好ましい実施形態において、ＢＴＮＬ８遺伝子および／または他のＴｒｅｇマーカー遺伝子の発現レベルを決定するためにＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲが使用される。ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲは、ＰＣＲ中の特異的な増幅産物の蓄積を検出するフルオロフォアに基づくＲＴ−ＰＣＲ法である。ＴａｑＭａｎ  ＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＲＮＡが最初に逆転写酵素によってｃＤＮＡに転写される。続くＰＣＲ反応において、ＤＮＡ鋳型内であり、２つのＰＣＲプライマーの間にある１０〜６０ヌクレオチドのセグメントに相補的である１本鎖オリゴヌクレオチドプローブを添加する。フルオロフォアおよびクエンチャー色素をそれぞれプローブの５’および３’末端に共有結合させる。あるいは、クエンチャー色素を内部ヌクレオチドに結合させることもでき、一方でフルオロフォアをプローブの５’または３’末端に結合させるか、またはその逆を行う。フルオロフォアとプローブに結合されたクエンチャー色素との間の近接近により、そのフルオロフォアが選択的に励起されたとき、フルオロフォアからの蛍光発光が阻害される。ＰＣＲにおけるＤＮＡ合成中、Ｔａｑポリメラーゼの５’エクソヌクレアーゼ活性によって、鋳型ＤＮＡとハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプローブが切断され、それによりフルオロフォアおよびクエンチャー色素が空間的に分離される。ＰＣＲサイクリング中に蛍光を検出するが；これは放出されるフルオロフォアおよびＰＣＲ中に存在するＤＮＡ鋳型の量に正比例する。当技術分野で公知である全てのフルオロフォア−クエンチャー対を本発明の方法において使用し得る。適切なフルオロフォアの例は、ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレシン）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレシン）またはＶＩＣである。適切なクエンチャー色素はＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）である。ＴａｑＭａｎアプローチにおいてプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドの構築および標識は、文献において非常に詳細に記載されている。例えばＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ，ＵＳＡ）またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒシステム（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＴａｑＭａｎアプローチＲＴ−ＰＣＲ反応を行い得る。
【００２９】
マイクロアレイは、発現プロファイリングにおいて別の一般的に使用されるツールである。マイクロアレイは、基質上の空間的に分離されるプローブ、例えば核酸プローブ、の整然とした配列を指す。このようなアレイは、関心のある遺伝子、例えばＢＴＮＬ８遺伝子および／または他のＴｒｅｇマーカー遺伝子と相補的であり、したがって個々の遺伝子配列またはその転写産物とハイブリッド形成する、少なくとも１つ、および好ましくは複数のオリゴヌクレオチドを含有し得る。基質は、好ましくは、表面の異なる既知の位置（スポット）に複数のプローブが結合している固体基質である。マイクロアレイ上のスポットは、通常、マイクロアレイ上に印刷されるかまたはフォトリソグラフィーもしくはインクジェット印刷により合成されるかの何れかである。一般的なマイクロアレイ上には数千個のスポットがあり得、各スポットが核酸断片またはオリゴヌクレオチドなどの多数の同一プローブを含有し得る。このようなマイクロアレイは一般的には少なくとも１００オリゴヌクレオチドまたは断片／ｃｍ2の密度を有する。ある一定の実施形態において、アレイは、およそ、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１０5、少なくとも１０6、少なくとも１０7オリゴヌクレオチドまたは断片／ｃｍ2の密度を有し得る。支持体は、ガラスまたはプラスチックスライドまたは固定された位置またはスポットにプローブが結合している表面上の膜であり得る。
【００３０】
本明細書中で言及されるＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ反応で使用されるプライマーまたはプローブは、特異的なハイブリッド形成および個々のＴｒｅｇマーカー遺伝子、ＢＴＮＬ８遺伝子内の標的配列の連続増幅が可能になるように設計される。本開示に基づき、熟練者は、個々のＴｒｅｇマーカー遺伝子の発現を検出するために使用し得るオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブを容易に設計可能である。ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲのための配列特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを設計するための方法は、科学文献、例えばＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈおよびＤｖｅｋｓｌｅｒ，“ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ”，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００３で非常に詳細に論じられている。ＰＣＲプライマーを設計する際に考慮すべきパラメーターとしては、例えば、ヌクレオチド数、プライマーのＧ／Ｃ含量、融解温度、二次構造につながり得る相補的ヌクレオチドの存在などが挙げられる。本発明の方法での使用のためのオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０ヌクレオチドの長さを有する。当技術分野で公知である何らかの適切な技術によって、オリゴヌクレオチドプライマーを調製し得る。例えば、それらは、合成由来、例えばホスホアミダイト法によるものであり得る。天然のヌクレオチド塩基アデニン、チミン（ウリジン）、シトシンまたはグアニンを含有するオリゴマーまたはポリマーだけでなく、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、修飾された塩基、例えば５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシンなども含み得る。
【００３１】
ＢＴＮＬ８の検出のためのプローブおよびプライマーは、ヒトＢＴＮＬ８遺伝子のコード配列、すなわちｍＲＮＡのスプライシング後に得られる配列、である配列番号１で示されるＢＴＮＬ８配列に基づき通常の方法に従い設計され得る。好ましくは、発現レベルの検出を対象とする本発明の方法は、配列番号１で示されるヒトＤＮＡ配列に対応するｍＲＮＡ配列を利用する。例えば天然の多型の結果から、ヒトＢＴＮＬ８遺伝子のポリヌクレオチド配列は、限定数の配列の逸脱を示し得ることが認識される。したがって、結果として配列番号１の配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはより高い配列同一性を示すｍＲＮＡ分子を生じさせるポリヌクレオチドもＢＴＮＬ８遺伝子という用語により包含される。例えばＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８においてヌクレオチド配列間の同一性の度合いを決定するためのコンピュータプログラムは入手可能であり（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡから入手可能）、例えばプログラムＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰを含み、これらはＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムに基づく。製造者により推奨されるとおり、標準的なパラメーターとともにこれらのプログラムを使用し得る。
【００３２】
Ｔ細胞においてＢＴＮＬ８  ｍＲＮＡが高レベルに検出される場合、この細胞がＴｒｅｇ細胞であることが想定され得る。エフェクターＴ細胞などの非Ｔｒｅｇ細胞もある程度までＢＴＮＬ８を発現する可能性がある一方で、このような発現は比較的低い。本発明によれば、それゆえに、非Ｔｒｅｇ細胞による、特にエフェクターＴ細胞によるＢＴＮＬ８（または何らかの他のＴｒｅｇマーカー）の発現が陰性対照として使用されることが好ましい。陰性対照における、すなわち例えばエフェクターＴ細胞などの非Ｔｒｅｇ細胞における個々の量よりも、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５５０％、少なくとも約６００％、少なくとも約７５０％または少なくとも約１０００％高いＲＮＡレベルでＢＴＮＬ８発現を測定することにより、試験した細胞が免疫抑制性Ｔｒｅｇ細胞であることが明らかに示される。
【００３３】
また別の特に好ましい実施形態において、ステップ（ａ）および（ｂ）におけるＴｒｅｇマーカーの検出は、翻訳レベルでのＴｒｅｇマーカー遺伝子発現の検出を含む。これは、ＢＴＮＬ８などの個々のＴｒｅｇマーカーのタンパク質レベルが決定されることを意味する。Ｔｒｅｇタンパク質レベルは、生体試料中でＢＴＮＬ８タンパク質を特異的に検出することが可能な何らかの適切な方法により決定され得る。このタンパク質の検出は、このタンパク質に特異的に結合する分子に基づき得るか、またはこれは、このタンパク質を試料中に存在する他のタンパク質から分離することに基づき得る。Ｔｒｅｇマーカータンパク質に特異的に結合する分子としては、ＢＴＮＬ８などのＴｒｅｇマーカーに対して結合活性を有する抗体および抗体断片が挙げられる。ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、ＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂおよびＦｏｘＰ３のようなＴｒｅｇマーカータンパク質を対象とする多くの抗体が調製されており、商業的に購入し得る。このような抗体またはその断片は、ウエスタンブロット、定量的ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、極性化分析、（定量的）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）において、または定量的電子顕微鏡法を含め、免疫組織化学的方法において、Ｔｒｅｇマーカータンパク質の検出のために使用され得る。本発明の特に好ましい実施形態において、上記方法のステップ（ａ）および（ｂ）での検出はＥＬＩＳＡを使用する。特異的な結合を検出することが可能な他の方法としては、例えば蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が挙げられる。生体試料中でそのタンパク質を他の構成要素から分離することによるＴｒｅｇマーカータンパク質の定量的検出を可能とする方法としては、定量的質量分析法、電気泳動法、例えば二次元ゲル電気泳動など、およびクロマトグラフィー法、例えばサイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィー、などが挙げられる。
【００３４】
上記のように、エフェクターＴ細胞もＢＴＮＬ８を少量産生し得る可能性がある。したがって、陰性対照を提供するためにエフェクターＴ細胞などの非Ｔｒｅｇ細胞のタンパク質レベルも測定すべきである。試験した細胞に対するタンパク質レベルから、ＢＴＮＬ８発現が陰性対照よりも高いことが明らかになる場合、これによって、試験した細胞がＴｒｅｇであると結論付けることが可能となる。具体的に、陰性対照における、すなわちエフェクターＴ細胞などの非Ｔｒｅｇ細胞における個々の量よりも少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５５０％、少なくとも約６００％、少なくとも約７５０％または少なくとも約１０００％高いタンパク質レベルでＢＴＮＬ８発現を測定することにより、試験した細胞が免疫抑制性Ｔｒｅｇ細胞であることが明らかに示される。
【００３５】
本発明のさらにより好ましい実施形態において、本発明の方法のステップ（ａ）および（ｂ）におけるＴｒｅｇマーカーの検出は、フローサイトメトリーを含む。フローサイトメトリーは、細胞表面マーカーおよび細胞内分子の発現を分析するために広く使用される方法である。これは、細胞カウント、細胞ソーティングおよびバイオマーカープロファイリングのような適用に日常的に使用される。特にこれは不均質な細胞集団中で異なる細胞型を定めるために使用され得る。フローサイトメトリーは主に、細胞表面上のマーカーを検出する蛍光標識抗体により生成される蛍光強度を測定するために使用される。これは細胞内マーカーの検出にも使用され得るものの、抗体が細胞に浸透しなければならならず、細胞を殺してしまうので、このような検出はあまり望ましくない。これにより、生存可能な均質細胞集団の提供を目的とする細胞ソーティング適用のための細胞内マーカーの検出が妨げられる。
【００３６】
Ｔｒｅｇの表面上でＢＴＮＬ８が発現されるという洞察から、Ｔｒｅｇの誘導を目的とする免疫疾患の処置をモニタリングする機会がもたらされる。したがって、本発明の第２の態様において、対象において免疫疾患または症状の処置をモニタリングまたは評価するための方法が提供され、この方法は、
（ａ）前記の免疫疾患または症状の処置が開始された後に対象から得られた試料を提供し；
（ｂ）上記の検出方法を行い；
（ｃ）ＢＴＮＬ８発現Ｔｒｅｇを定量すること；
を含み、処置開始後のＢＴＮＬ８発現Ｔｒｅｇ数の増加は処置が有効であることを示す。
【００３７】
この方法により、このようなＴｒｅｇの検出および定量が特異的に可能になるので、患者におけるＴｒｅｇ数の増加を求める免疫疾患または障害の処置が有効か否かを決定することが可能になる。前記方法の第１ステップにおいて、試料は免疫学的疾患または症状に罹患している対象から提供される。好ましくは、この試料は、血漿または血清試料などの血液または血液由来試料である。対象における免疫学的疾患または症状の処置は既に始まっている。例えば、対象は、試料回収の６時間、１２時間、２４時間または４８時間前に免疫学的疾患または症状の処置に対する投薬を受けているものであり得る。試料は、本明細書中の他所で論じられるような従来の方法により対象から得られ得る。続くステップにおいて、ＢＴＮＬ８発現Ｔｒｅｇを検出するために、本発明の第１の態様による検出方法が行われる。次に、ＢＴＮＬ８発現Ｔｒｅｇを定量し、場合によっては陰性対照と比較する。適切な陰性対照は、処置の開始前の同じ対象、すなわち投薬を全く受けていない対象からの試料であり得る。ＢＴＮＬ８発現Ｔｒｅｇ数の増加は、投与される医薬品、例えばＭｒｅｇベース組成物（Ｍｒｅｇ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）などが有効であり、Ｔｒｅｇを誘導することを示す。
【００３８】
処置は、特に、上記方法により定量されるＢＴＮＬ８発現Ｔｒｅｇ数が、未処置対象、すなわち処置が開始される前の対象におけるＢＴＮＬ８発現Ｔｒｅｇ数と比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも７５倍、少なくとも１００倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍または少なくとも１０００高い場合、有効である。
【００３９】
免疫学的疾患または障害の処置は、Ｔｒｅｇの投与または、代わりにＴｒｅｇを誘導可能な化合物または細胞の投与を含み得る。処置は、好ましくは細胞ベース組成物（ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）の投与を含む。細胞ベース組成物は、例えば抑制性骨髄細胞またはＭｒｅｇを含み得る。Ｔｒｅｇの誘導または投与により処置され得るかまたは緩和され得る免疫学的疾患または障害は、器官、組織または細胞移植片など、移植を受けた対象において移植片拒絶を抑制するかまたは移植片生存を延長させることを求める処置を含む。移植する器官は例えば腎臓、肝臓、心臓、肺または膵臓であり得る。レシピエントに移植する器官がヒト器官であることが特に好ましい。移植片は組織移植片でもあり得る。移植される組織は、好ましくはヒト組織、例えば腸、角膜、皮膚、複合組織、骨髄または膵臓の膵島組織などである。移植片が細胞移植片である場合、移植する細胞の性質は一般に制限されないが、移植される細胞が、成人幹細胞移植片、単離肝細胞移植片、造血幹細胞（ＨＳＣ）移植片または白血球細胞移植片からなる群から選択されることが好ましい。移植片は通常、同種移植片、すなわち遺伝学的に異なるがレシピエントと同種に属するドナー由来の移植片である。
【００４０】
レシピエントにおける移植片拒絶の抑制および同種器官、組織または細胞移植片の受容の誘導は、Ｍｒｅｇの投与により誘導され得る。細胞は、注射または点滴により静脈内投与され得る。注射または点滴は術前または術後の何れかに与えられ得る。細胞が術前に投与される場合、それらは、術前に少なくとも１回、好ましくは２回、より好ましくは３回レシピエントに投与される。
【００４１】
ＭｒｅｇがＴｒｅｇの誘導のために使用される場合、手術の１週間前より早くない時期に、例えば手術の６日、５日、４日、３日、２日または１日前に、レシピエントにＭｒｅｇが投与されることが好ましい。Ｍｒｅｇ細胞が術後に投与される場合、最初の投与は、好ましくは術後２４時間以内、より好ましくは術後３６時間、４８時間、６０時間または７２時間以内に与えられる。あるいは安定に免疫抑制された移植片レシピエントにおいて、移植後の何れかの時点でＭｒｅｇ治療薬を投与し得る。あるいは、急性または慢性移植片拒絶を起こしている移植片レシピエントにＭｒｅｇを投与し得る。そして、Ｍｒｅｇは、移植片に対するレシピエントの免疫系のＴ細胞反応を忌避すること、およびレシピエントに対して長期移植片受容を付与するための十分な長期間にわたりレシピエントの身体（特に脾臓、肝臓、肺および骨髄）において持続させることが可能である。
【００４２】
Ｔｒｅｇにより処置され得る免疫学的疾患としては、免疫状態の制御解除または過剰な炎症反応、特に慢性炎症疾患を特徴とする疾患または障害がさらに挙げられる。このような疾患または障害としては、例えば、自己免疫疾患、炎症疾患および過敏症反応が挙げられる。疾患は、局所または全身自己免疫状態であり得る。処置する自己免疫疾患のタイプとしては、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、強皮症、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎および他の全身性自己免疫状態；関節リウマチ（ＲＡ）、若年性関節リウマチおよび他の炎症性関節炎；潰瘍性大腸炎、クローン病および他の炎症性腸疾患；自己免疫肝炎、原発性胆汁性肝硬変および他の自己免疫肝臓疾患；皮膚小血管脈管炎、多発性血管炎を伴う肉芽腫症、多発性血管炎を伴う好酸球性肉芽腫症、ベーチェット病、閉塞性血栓血管炎、川崎病および自己免疫病因の他の大、中または小血管血管炎；多発性硬化症（ＭＳ）および神経免疫学的障害；Ｉ型糖尿病、自己免疫甲状腺機能不全、自己免疫下垂体機能不全および他の自己免疫内分泌障害；溶血性貧血、血小板減少性紫斑病および血液および骨髄の他の自己免疫障害；乾癬、尋常性天疱瘡、類天疱瘡および皮膚に関連する他の自己免疫状態が挙げられる。
【００４３】
処置は急性または慢性炎症疾患または病態生理学的に重要な炎症性要因を伴う疾患も対象とし得る。処置する炎症疾患は局所または全身性であり得る。Ｔｒｅｇが有効である炎症疾患または症状のタイプは限定されず、動脈閉塞疾患、例えば末梢動脈閉塞疾患（ｐＡＯＤ）、重症虚血肢、動脈硬化症、大脳梗塞、心筋梗塞、腎臓梗塞、腸閉塞、狭心症および動脈硬化または狭窄により引き起こされる他の症状；心臓シンドロームＸとしても知られる微小血管アンギナ；ＩＩ型糖尿病および肥満関連メタボリックシンドロームを含む、炎症を付随する全身性代謝性疾患；または湿疹を含む皮膚疾患が挙げられるが限定されない。好ましくは、処置する炎症疾患は、動脈壁の内膜の慢性炎症、例えば心筋梗塞、卒中発作、重症虚血肢血管炎およびｐＡＯＤを特徴とする。処置は、好ましくは喘息、湿疹、アレルギー性鼻炎、血管浮腫、薬物過敏症および肥満細胞症の群から選択される過敏性反応も対象とし得る。
【００４４】
第３の態様において、本発明は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を濃縮、単離またはソーティングするための方法に関し、この方法は、
（ａ）Ｔｒｅｇを含有する、または含有すると思われる試料を提供し；
（ｂ）ＢＴＮＬ８およびＴｒｅｇと関連することが知られている少なくとも１つのマーカーの発現により、試料中に含有される他の細胞からＴｒｅｇを分離することを含み、該マーカーは好ましくはＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰおよびＦｏｘＰ３の群から選択される。
【００４５】
好ましくはＢＴＮＬ８に対して親和性を有する化合物、より好ましくは以下に記載のような抗体または抗体断片の使用によって調製ステップ（ｂ）を行う。一実施形態において、本方法は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）など、フローサイトメトリーに基づく細胞ソーティング法であり得る。この方法において、ＴｒｅｇをＢＴＮＬ８に対する蛍光標識抗体または抗体断片、および、別のＴｒｅｇマーカー、好ましくはＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰおよびＦｏｘＰ３の群からのマーカーに対する少なくとも１つのさらなる抗体または抗体断片と接触させる。電気的検出装置を通じて流体ストリーム（ｆｌｕｉｄ  ｓｔｒｅａｍ）中にＢＴＮＬ８発現Ｔｒｅｇを送る。流体ストリーム（ｆｌｕｉｄ  ｓｔｒｅａｍ）は、各液滴が１個以下の細胞を含むことを確保するサイズを持つ液滴に分割される。ストリームが分割されて液滴になる直前に、細胞の蛍光シグナルを測定する蛍光測定装置を通じて流体ストリーム（ｆｌｕｉｄ  ｓｔｒｅａｍ）を送る。検出されるシグナルに基づき、細胞を異なる容器に導いて、異なって標識される細胞の分離を達成する。別の好ましい実施形態において、本方法は磁気ビーズ細胞分離を含み得る。この方法は、細胞にタグ付加するためにサイズが約１００ｎｍである超常磁性ナノ粒子を使用する。次にナノ粒子に対して親和性を有するカラムにおいて細胞を捕捉する。
【００４６】
第４の態様において、本発明は、Ｔｒｅｇを検出、濃縮、単離および／または定量するためにＢＴＮＬ８タンパク質に対して親和性を有する化合物の使用に関する。親和性化合物は、細胞の表面上でＢＴＮＬ８に結合する化合物として広く理解される。親和性化合物は、好ましくはタンパク質分子、例えば受容体、リガンドまたは抗体などである。特定の好ましい実施形態において、この親和性化合物は、ＢＴＮＬ８に対する抗体または抗体断片である。Ｔｒｅｇ表面上でＢＴＮＬ８が発現されるという洞察により、血液試料などの不均質組成物においてＢＴＮＬ８発現Ｔｒｅｇを検出、濃縮、単離および定量する可能性がもたらされる。ＢＴＮＬ８に対する抗体は、当技術分野で記載されており、異なる製造者からも市販されている。本発明の関連で、「抗体」という用語は、それらが所望の免疫学的活性を呈する、すなわちＢＴＮＬ８に特異的に結合する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体、例えば二特異性抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体を含むことを広く理解しなければならない。特に、この用語は、グラフト技術などにより調製されたあらゆる種類の人工抗体分子を含むものとして理解すべきである。本方法での使用のための抗体は、何らかのアイソタイプクラス、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤならびにそれらのサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２などであり得る。
【００４７】
全抗体の他、抗体のＢＴＮＬ８結合断片も使用し得る。本明細書中で使用される場合、抗体のＢＴＮＬ８結合断片は、ＢＴＮＬ８に対する特異的な結合活性の少なくとも一部を保持する断片である。特に本発明のＢＴＮＬ８結合断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２断片を含み得る。「ＢＴＮＬ８結合断片」という用語によりさらに含まれるのは、（本明細書中で「ｓｃＦｖ抗体とも呼ばれる）１本鎖Ｆｖ抗体断片およびジスルフィド結合Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）である。抗体断片の組み換え産生のための方法は先行技術において記載されており、それには、例えばファージディスプレイまたはリボソームディスプレイなどの技術が含まれる。これらの方法により産生される組み換え抗体断片は、精製され、結合親和性およびＢＴＮＬ８に対する特異性について試験され得る。
【００４８】
第５の態様において、本発明は、本明細書中の他所で論じられる検出方法を行うためのキットに関する。本キットは次の要素を含む：
（ａ）Ｔｒｅｇと関連することが知られている少なくとも１つのマーカー、好ましくはＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰまたはＦｏｘＰ３の検出のための手段；および
（ｂ）ＢＴＮＬ８の検出のための手段。
【００４９】
上記で論じられるように、転写または翻訳レベルでマーカー検出を行い得る。検出が転写レベルで行われる場合、本キットは、ＢＴＮＬ８遺伝子に対する少なくとも１つのポリヌクレオチドプライマーまたはプローブを含む。好ましくは、本キットは、ＢＴＮＬ８遺伝子に対する複数のポリヌクレオチドプライマーまたはプローブを含む。プライマーによって、ＢＴＮＬ８遺伝子の発現の検出が可能になる。本明細書中の他所で論じられるようにＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによって検出を行い得る。翻訳レベルで検出が行われる場合、本キットは、好ましくはこのような抗体または抗体断片の複数において、ＢＴＮＬ８に対する少なくとも１つの抗体または抗体断片を含む。本キットは、実行する検出方法に適切である緩衝液および試薬をさらに含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、ＭｒｅｇまたはＩＦＮ−ｙ  Ｍｃｐとともに共培養したＴ細胞、単独培養したＣＤ４＋Ｔ細胞および新鮮単離ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＢＴＮＬ８  ｍＲＮＡに対するｑＰＣＲの結果を示す（ｎ＝９；平均±ＳＥＭ）。
【図２】図２は、活性化および非活性化Ｔｒｅｇまたは従来のＴ細胞におけるＢＴＮＬ８  ｍＲＮＡ発現の分析の結果を示す。
【図３】図３は、同種ＭｒｅｇまたはＩＦＮ−ｙ  Ｍｃｐと共培養したＴ細胞および単独培養したＴ細胞から、ヤギ抗ＢＴＮＬ８  ｐＡｂを使用したＢＴＮＬ８に対するウエスタンブロットを示す。
【図４】図４は、抗ＢＴＮＬ８抗体で染色後、フローサイトメトリーによりＭｒｅｇ誘導性ＴｒｅｇにおいてＢＴＮＬ８発現が検出されたことを示す。
【実施例】
【００５１】
本発明の例示のために次の実施例を提供する。
【００５２】
実施例１：Ｍｒｅｇ誘導性Ｔｒｅｇと関連する新規マーカーの同定
【００５３】
Ｍｒｅｇ誘導性Ｔｒｅｇの表現型の特徴をより詳しく調べるために、マイクロアレイによる全ゲノム遺伝子発現プロファイリング研究を行った。５名のドナーからＭｒｅｇおよびＩＦＮ−ｙ−Ｍｃｐを作製した。ＨＬＡ−Ａ２が異なる５名の無関係のドナーから非分画ＣＤ３+Ｔ細胞を単離した。ＲＮＡ単離のために、新鮮単離ＣＤ３＋Ｔ細胞の試料をＣＤ４＋およびＣＤ８＋分画にフローソーティングした。１：１の比でのＭｒｅｇまたはＩＦＮ−ｙ−Ｍｃｐとの直接共培養に非分画Ｔ細胞をまた添加したか、または刺激なしで５日間にわたり単独培養した。培養５日後、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をＦＡＣＳソーティングし、トータルＲＮＡを抽出した。これらのＲＮＡ試料を使用して、単色ハイブリッド形成により作製される８種類の細胞型の３組の試料を含むマイクロアレイデータセットを作製した。ヒートマップから、比較物であるＴ細胞集団のうち何れか２つにおいて有意に（ｐ＜０．０１）および非常に差異的に（＞２０倍）制御された一元配置ＡＮＯＶＡによりリターンされたレポーターセットの階層的クラスタ分析が示された。対照状態と比較してＭｒｅｇ−共培養ＣＤ４＋Ｔ細胞において独特に上方制御される遺伝子を同定するために、判別遺伝子分析（ＤＧＡ）を行った。ＢＴＮＬ８が、ＩＦＮ−ｙ  Ｍｃｐ−共培養ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、同種Ｍｒｅｇ共培養ＣＤ４+Ｔ細胞において最もよく上方制御されるレポーターのうちの１つであることが分かった。
【００５４】
実施例２：Ｍｒｅｇと共培養されるＴ細胞におけるＢＴＮＬ８  ｍＲＮＡに対するｑＰＣＲ
【００５５】
ＢＴＮＬ８のＢＴＮ様およびＢ７様変異体両方を増幅させるプライマーを使用して、Ｔ細胞におけるＢＴＮＬ８  ｍＲＮＡに対するｑＰＣＲを行った。具体的には、Ｑｉａｇｅｎからの既に最適化されたプライマー対ＢＴＮＬ８＿２＿ＳＧを使用した（ｃａｔ．＃ＱＴ０１６７０９９１）。ＭｒｅｇまたはＩＦＮ−ｙ  ＭｃｐとともにＴ細胞を共培養し、ＣＤ４＋Ｔ細胞を単独培養し、ＣＤ４＋Ｔ細胞を新鮮単離した（ｎ＝９；平均±ＳＥＭ）。逆転写のためにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ−ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉキット（Ｒｏｃｈｅ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ）を使用してＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）リアルタイムＰＣＲシステムによりｑＰＣＲを行った。アンプリコンシーケンシングによって特異性を確認した（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ）。結果を図１で示す。アイソフォーム特異的なプライマーセットおよびアンプリコンのシーケンシングを使用して、Ｍｒｅｇ共培養Ｔ細胞がＢＴＮＬ８のＢ７−様、３７−ｋＤ変異体のみを発現すると判定された。さらに、Ｍｒｅｇとともに共培養したＴ細胞のみが大量のＢＴＮＬ８を発現することが分かり得る。
【００５６】
次に、フローソーティングによって、ヒト末梢血液から単離されたＣＤ４+ＣＤ２５+ＣＤ１２７intＴｒｅｇおよび従来のＣＤ４+Ｔ細胞においてＢＴＮＬ８  ｍＲＮＡの発現を定量した。この目的のために、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５+ＣＤ１２７int  ＴｒｅｇおよびＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５+ＣＤ１２７int非Ｔｒｅｇの分画のために、ヒト末梢血Ｔ細胞をフローソーティングした。図２で結果を示す。ＢＴＮＬ８  ｍＲＮＡ発現は、非活性化Ｔｒｅｇまたは従来のＴ細胞において検出されなかったが、５日間にわたるａＣＤ３／ａＣＤ２８ビーズでのポリクローナル活性化において誘導され得た。活性化された従来のＴ細胞におけるＢＴＮＬ８  ｍＲＮＡの発現は、活性化Ｔｒｅｇの場合と比較してかなり低かった。
【００５７】
実施例３：ウエスタンブロット分析
【００５８】
同種ＭｒｅｇまたはＩＦＮ−ｙ  Ｍｃｐと共培養したＴ細胞および単独培養したＴ細胞からヤギａ−ＢＴＮＬ８  ｐＡｂを使用してＢＴＮＬ８に対するウエスタンブロットを行った。プロテインＧ−Ｐｌｕｓセファロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、ＢＴＮＬ８の免疫沈降を行った。従来の方法に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティングを行った。
【００５９】
図３で結果を示す。ＢＴＮＬ８に対応する明瞭なバンドを３７ｋＤで検出した。３ドナーペアからの例を示す。ウエスタンブロッティングから、ＩＦＮ−ｙ−Ｍｃｐ共培養Ｔ細胞またはＴ細胞単独培養と比較して、Ｍｒｅｇ共培養Ｔ細胞におけるＢＴＮＬ８の３７ｋＤアイソフォームのより強い発現が明らかになった。
【００６０】
実施例４：フローサイトメトリーによるＴｒｅｇの検出
【００６１】
ＢＴＮＬ８のａａ１６１−２１０に対して生成させたウサギ抗体（ＬＳＢｉｏ＃Ｃ４５３０１８）での染色後、フローサイトメトリーによって、Ｍｒｅｇ共培養Ｔ細胞においてＢＴＮＬ８発現を検出した。ヒストグラムは、生存ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８’ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋単一事象でゲーティングする。
【００６２】
結果を図４で示す。抗ＢＴＮＬ８抗体での染色後、フローサイトメトリーによりＭｒｅｇ誘導性ＴｒｅｇにおいてＢＴＮＬ８発現を検出した。特異的なペプチド（ＬＳＢｉｏ＃Ｅ１８０２０）とウサギα−ＢＴＮＬ８  ｐＡｂを予め温置することによってＢＴＮＬ８の検出が阻止され、一方でＢＴＮＬ８のＮ末端に対応する非特異的ペプチド（ＬＳＢｉｏ＃Ｅ１８０１９）は効果がなく；したがって、フローサイトメトリーによるＢＴＮＬ８の検出は特異的である。
【００６３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020531853.tif 000008
2020531853.tif 000009