(57)【要約】  肺癌を治療するための改善された方法が提供される。患者から得られた腫瘍サンプルは、（ｉ）ＨＥＲ２変異の存在を検出するためのＤＮＡシークエンシング、および（ｉｉ）ＨＥＲ２タンパク質が腫瘍細胞中で発現しているかどうかを決定するための質量分析プロテオミクス解析により、分析される。ＨＥＲ２変異を有する患者の腫瘍細胞において特有のＨＥＲ２タンパク質断片が検出される場合、患者は、トラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）または同等の抗体薬物複合体による療法に反応を示す。逆に、腫瘍細胞がＨＥＲ２変異を含むが、特有のタンパク質断片が検出されない場合、患者はＴ−ＤＭ１療法に反応を示さない。腫瘍細胞中のＨＥＲ３の検出は、治療に対する反応の陽性の予測因子である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌に罹患している患者の治療方法であって、
ａ．  患者から得られた腫瘍細胞中のＨＥＲ２タンパク質のレベルを検出および定量化すること、ここで、前記腫瘍サンプルは、ＨＥＲ２遺伝子において１以上の変異を含んでなる；
ｂ．  ＨＥＲ２タンパク質が検出されない場合、有効量の治療薬トラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）を含んでなる第１の治療レジメンで患者を治療すること、ここで、前記ＨＥＲ２タンパク質は、ＡＳＣＯガイドラインの下で過剰発現していない、または
ｃ．  ＨＥＲ２が検出されない場合、有効量のＴ−ＤＭ１を含まない第２の治療レジメンで患者を治療すること、
を含んでなる、方法。
【請求項２】
ＨＥＲ２の発現が検出される場合、患者が、有効量の治療薬トラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）を含んでなる前記第１の治療レジメンで治療され、ここで、ＨＥＲ２は、Ｈｅｒ３が検出される場合にＡＳＣＯガイドラインの下で過剰発現していない、Ｈｅｒ３タンパク質の発現の検出をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
腫瘍細胞のタンパク質消化物において質量分析によりＨＥＲ２断片ペプチドを検出することにより、ＨＥＲ２タンパク質が検出される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
腫瘍細胞のタンパク質消化物において質量分析によりＨｅｒ３断片ペプチドを検出することにより、ＨＥＲ３タンパク質が検出される、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含んでなる、請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質消化物がトリプシン消化物を含んでなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
質量分析が、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、ハイブリッドイオントラップ／四重極質量分析および／または飛行時間型質量分析を含んでなる、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
使用する質量分析のモードが、選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、並列反応モニタリング（ＰＲＭ）、インテリジェント選択的反応モニタリング（ｉＳＲＭ）、および／または多重選択的反応モニタリング（ｍＳＲＭ）であり得る、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
腫瘍細胞が固形組織に由来する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
固形組織がホルマリン固定固形組織である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
組織がパラフィン包埋組織である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＨＥＲ２タンパク質からの特有の断片ペプチドまたは複数の特有の断片ペプチドの検出が、既知量の添加内部標準ペプチドと比較することにより、前記サンプル中のＨＥＲ２タンパク質からの特有の断片ペプチドもしくは複数の特有の断片ペプチドの定量レベルを検出および／または決定することを含んでなり、ここで、生体サンプル中の天然ペプチドおよび内部標準ペプチドの両方が、ＨＥＲ２タンパク質からの特有の断片ペプチドまたは複数の特有の断片ペプチドの同じアミノ酸配列に対応する、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
内部標準ペプチドまたは複数の内部標準ペプチドが、同位体標識ペプチドである、請求項３〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
同位体標識された内部標準ペプチドまたは複数の内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈまたはその組合せから選択される１以上の重安定同位体を含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
どの薬剤を治療に使用するかに関する治療の決定が、その生体サンプル中の他のペプチド／タンパク質と組み合わせたＨＥＲ２タンパク質からの特有の断片ペプチドまたは複数の特有の断片ペプチドの検出および／または定量化に基づくように、ＨＥＲ２タンパク質からの特有の断片ペプチドまたは複数の特有の断片ペプチドの検出および定量化を、他のタンパク質からの他のペプチドの検出および定量化と多重的に組み合わせることができる、請求項３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
標準核酸シークエンシング、次世代核酸シークエンシング、ポリメラーゼ連鎖反応、制限断片多型分析、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、およびその組合せからなる群から選択される１以上の方法を用いて、１つの変異または複数の変異が、患者から得られた腫瘍細胞から調製された生体サンプル中のＨＥＲ２遺伝子内で検出される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍細胞内のＨＥＲ２遺伝子における前記ＤＮＡ変異が、単一ヌクレオチド変化、挿入、欠失、再配列、重複、個々のヌクレオチドの重複／欠失、複数のヌクレオチドの重複／欠失、一塩基対多型、トランジション、トランスバージョン、逆位、コピー数多型、長いひと続きの核酸の重複／欠失、およびその組合せからなる群から選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
序文
患者から外科的に切除された腫瘍組織をアッセイすること、ならびに、トラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）および他の抗Ｈｅｒ−２抗体薬物複合体などのＨＥＲ２標的治療薬による治療に最も反応を示す可能性が高い患者を同定することにより、癌患者、特に肺癌患者を治療するための方法が提供される。少なくとも１つのＨＥＲ２変異に対して陽性である腫瘍では、腫瘍が検出可能な量のＨＥＲ２タンパク質発現を発現している場合、患者はＴ−ＤＭ１または同等の抗体薬物複合体（「ＡＤＣ」）で治療される。この治療は、ＨＥＲ２発現がＨＥＲ２陽性と従来みなされるレベルを下回る場合、および／またはＨＥＲ２遺伝子が増幅されていない場合ですら、有効である。ＨＥＲ３タンパク質の検出可能な発現は、Ｔ−ＤＭ１または同等のＡＤＣに対する反応の可能性の予測因子でもある。
【０００２】
ヒト表皮成長因子受容体２、受容体チロシンプロテインキナーゼｅｒｂＢ−２、ＣＤ３４０（分化抗原群３４０）、および癌原遺伝子Ｎｅｕとしても知られるＨＥＲ２タンパク質（以下、「ＨＥＲ２」）は、ヒトにおいてＥＲＢＢ２遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＨＥＲ２は、ヒト表皮成長因子受容体（ＨＥＲ／ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ）ファミリーのメンバーである。この癌遺伝子の増幅または過剰発現は、特定の侵襲性型の乳癌の発生および進行に重要な役割を果たすことが示されている。近年、このタンパク質は、乳癌患者のおよそ３０％に対して、重要なバイオマーカーおよび療法の標的となっている。
【０００３】
ヒト表皮成長因子受容体３、および受容体チロシンプロテインキナーゼｅｒｂＢ−３としても知られるＨｅｒ３タンパク質（以下、「Ｈｅｒ３」）は、ヒトにおいてＥＲＢＢ３遺伝子によりコードされるタンパク質である。Ｈｅｒ３も、ヒト表皮成長因子受容体（ＨＥＲ／ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ）ファミリーのメンバーである。他のＥＲＢＢファミリーメンバーと同様に、Ｈｅｒ３は、ＥＲＢＢファミリーの他のメンバーとホモ二量体化またはヘテロ二量体化し得る。ＨＥＲ２−Ｈｅｒ３ヘテロ二量体は、考え得る二量体のうちで最も活性が高く、リガンド活性化ヘテロ二量体は、ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ、およびＰＬＣγ経路を含む複数の経路を活性化する。
【０００４】
本明細書ではＴ−ＤＭ１といい、アドトラスツズマブエムタンシンおよびＴ−ＤＭ１としても知られるトラスツズマブエムタンシンは、ＨＥＲ２タンパク質を特異的に標的とし、結合する治療薬である。Ｔ−ＤＭ１は、商品名カドサイラで販売されており、モノクローナル抗体トラスツズマブ（ハーセプチン）が細胞傷害性剤エムタンシン（ＤＭ１）と結合している抗体薬物複合体である。トラスツズマブは、単独で、ＨＥＲ２タンパク質と結合することにより癌細胞の成長を停止し、複合化したＤＭ１が細胞に侵入するのを可能とし、チューブリンと結合することにより細胞を破壊する。ＨＥＲ２と結合するトラスツズマブは、受容体のホモ二量体化またはヘテロ二量体化（ＨＥＲ２／Ｈｅｒ３）を防止し、最終的に、ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ細胞シグナル伝達経路の活性化を阻害する。モノクローナル抗体はＨＥＲ２を標的とし、ＨＥＲ２は癌細胞においてのみ過剰発現するため、複合体は、腫瘍細胞に優先的に毒素を送達する。他の抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体は、現在開発中であり、本明細書に記載の方法に使用してもよい。本明細書におけるＴ−ＤＭ１の使用への参照は、特に断りのない限り、他の抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体の使用を含むと理解されるであろう。
【０００５】
トラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）または他の抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体による治療に最も反応を示す可能性が高い癌患者、特に肺癌患者の同定方法は、腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を発現するだけでなく、ＨＥＲ２遺伝子において変異も有する患者を同定する。癌患者から得られた腫瘍細胞は、ＨＥＲ２発現および少なくとも１つのＨＥＲ２変異の存在に関して分析される。両方が認められる場合は、患者はＴ−ＤＭ１で治療される。さらに、腫瘍においてＨｅｒ３発現が検出されれば、患者はＴ−ＤＭ１による治療から利益を得られることがさらに示される。
【発明の概要】
【０００６】
癌に罹患している患者の治療方法であって、前記方法の工程は、（ａ）患者から得られた腫瘍細胞中のＨＥＲ２タンパク質のレベルを検出および定量化すること、ここで、前記腫瘍サンプルは、ＨＥＲ２遺伝子において１以上の変異を含んでなる；（ｂ）ＨＥＲ２タンパク質が検出されない場合、有効量の治療薬トラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）もしくは同等の抗ＨＥＲ２抗体薬物複合体を含んでなる第１の治療レジメンで患者を治療すること、ここで、前記ＨＥＲ２タンパク質は、ＡＳＣＯガイドラインの下で過剰発現していない、または（ｃ）ＨＥＲ２が検出されない場合、有効量のＴ−ＤＭ１を含まない第２の治療レジメンで患者を治療すること、を含んでなる、方法が提供される。場合により、腫瘍細胞は、ＨＥＲ３タンパク質の発現に関して検査されてもよく、ここで、ＨＥＲ２の発現が検出される場合、患者は、有効量の治療薬トラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）を含んでなる前記第１の治療レジメンで治療され、ここで、ＨＥＲ２は、ＡＳＣＯガイドラインの下でおよびＨＥＲ３が検出される場合に過剰発現していない。腫瘍細胞のタンパク質消化物において質量分析によりＨＥＲ２断片ペプチドを検出することにより、ＨＥＲ２タンパク質は検出されてもよく、腫瘍細胞のタンパク質消化物において質量分析によりＨＥＲ３断片ペプチドを検出することにより、ＨＥＲ３タンパク質は検出されてもよい。
【０００７】
これらの方法において、タンパク質消化物は、トリプシン消化物などのプロテアーゼ消化物を含み得る。質量分析は、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、ハイブリッドイオントラップ／四重極質量分析および／または飛行時間型質量分析を含み得、使用する質量分析のモードは、選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、並列反応モニタリング（ＰＲＭ）、インテリジェント選択的反応モニタリング(intelligent Selected Reaction Monitoring)（ｉＳＲＭ）、および／または多重選択的反応モニタリング（ｍＳＲＭ）であり得る。
【０００８】
腫瘍細胞は、固形組織からのものであり得、固形組織は、ホルマリン固定固形組織でもよく、パラフィン包埋であってもよい。ＨＥＲ２タンパク質からの特有の断片ペプチドまたは複数の特有の断片ペプチドの検出は、既知量の添加内部標準ペプチドと比較することにより、前記サンプル中の特有の断片ＨＥＲ２ペプチドもしくは複数の特有のＨＥＲ２断片ペプチドの定量レベルを検出および／または決定することを含んでなり、ここで、生体サンプル中の天然ペプチドおよび内部標準ペプチドの両方は、ＨＥＲ２タンパク質からの特有の断片ペプチドまたは複数の特有の断片ペプチドの同じアミノ酸配列に対応する。一つの内部標準ペプチドまたは複数の内部標準ペプチド(The internal standard peptide, or multiple internal standard peptides)は、同位体標識ペプチドであり得る。また、１８Ｏ、１７Ｏ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈまたはその組合せから選択される１以上の重安定同位体を含み得る。
【０００９】
どの薬剤を治療に使用するかに関する治療の決定が、その生体サンプル中の他のペプチド／タンパク質と組み合わせたＨＥＲ２タンパク質からの特有の断片ペプチドまたは複数の特有の断片ペプチドの検出および／または定量化に基づくように、ＨＥＲ２タンパク質からの特有の断片ペプチドまたは複数の特有の断片ペプチドを検出および定量化するこれらの方法は、他のタンパク質からの他のペプチドの検出および定量化と多重的に(in multiplex)組み合わせることができる。
【００１０】
標準核酸シークエンシング、次世代核酸シークエンシング、ポリメラーゼ連鎖反応、制限断片多型分析、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、およびこれらの組合せなどの１以上の方法を用いて、１つの変異または複数の変異は、患者から得られた腫瘍細胞から調製された生体サンプル中のＨＥＲ２遺伝子内で検出され得る。前記腫瘍細胞内のＨＥＲ２遺伝子における前記ＤＮＡ変異は、例えば、単一ヌクレオチド変化、挿入、欠失、再配列、重複、個々のヌクレオチドの重複／欠失、複数のヌクレオチドの重複／欠失、一塩基対多型、トランジション、トランスバージョン、逆位、コピー数多型、長いひと続きの核酸の重複／欠失、およびこれらの組合せの１以上であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】表１は、肺癌患者の成績データ、およびＨＥＲ２遺伝子において変異も有する患者腫瘍組織から得られた腫瘍細胞中のＨＥＲ２発現の検出を記載する。全患者腫瘍がＨＥＲ２変異を有していたが、腫瘍がいずれかの定量レベルでＨＥＲ２タンパク質からの特有の断片ペプチドの発現を示す患者の６／８例が、Ｔ−ＤＭ１による治療に対して治療反応を示した。腫瘍がＨＥＲ２変異を有するが、ＨＥＲ２タンパク質からの特有の断片ペプチドは検出されなかった２例の患者は、Ｔ−ＤＭ１による治療に反応を示さなかった。
【発明の具体的説明】
【００１２】
ＨＥＲ２標的治療薬トラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）（または、上記のように、同等の薬剤）により患者を治療する方法が提供される。癌患者、例えば肺癌患者の腫瘍組織が、患者がＴ−ＤＭ１に対して好ましい様式で臨床的に反応を示すかどうかを判定するために、分析される。具体的には、患者から得られた腫瘍細胞の分析が、ＨＥＲ２タンパク質の発現およびＨＥＲ２遺伝子において少なくとも１つの変異の存在を検出する場合、患者はＴ−ＤＭ１で治療される。従来のＴ−ＤＭ１治療による状況とは異なり（Wolff et al., (Arch Pathol Lab Med.138:241-256 (2014)参照、ＨＥＲ２変異が存在するならば、Ｔ−ＤＭ１治療が有効となるために、ＨＥＲ２遺伝子は増幅される必要はなく、ＨＥＲ２は過剰発現している必要はない。実際に、ＨＥＲ２発現が検出限界で検出可能であるならば、この方法は有効である。さらに、腫瘍組織中のＨｅｒ３発現の検出は、Ｔ−ＤＭ１による治療が有効となることを示すさらなる指標として使用することができる。ＨＥＲ２と同様に、Ｈｅｒ３発現のレベルは、Ｔ−ＤＭ１による治療が有効となるために、検出限界以上であれば十分である。
【００１３】
サンプルは、有利には、ホルマリン固定である。質量分析計を用いて、１以上の特有の特定のペプチド断片を検出および定量化し、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織に由来する細胞中のＨＥＲ２タンパク質からのペプチドに関する特定の特徴を決定する。特有のＨＥＲ２特異的ペプチド断片は、全長ＨＥＲ２タンパク質に由来する。意外にも、ＨＥＲ２特異的ペプチドは、腫瘍組織のＦＦＰＥサンプルから調製された消化物において確実に検出され、かつ同時に定量化され得ることが見出されている。米国特許第９，７６５，３８０号を参照。その全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。同じサンプル中のＨｅｒ３発現の検出も、例えば、米国特許第９，１２８，１０２号（その全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる）に記載の類似の方法を用いて、達成され得る。ＨＥＲ２遺伝子における変異の存在は、以下でさらに説明するように、当技術分野で公知の方法により、決定され得る。
【００１４】
ホルマリン固定癌患者組織などの患者組織サンプルから得られた細胞から調製された複雑なタンパク質ライセートサンプルにおいて、特有のＨＥＲ２特異的ペプチド、場合により、Ｈｅｒ３特異的ペプチドを直接検出および測定することは、質量分析を用いて実施される。ホルマリン固定組織からのタンパク質サンプルの調製方法は、米国特許第７，４７３，５３２号に記載されており、その全内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。米国特許第７，４７３，５３２号に記載の方法は、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（ロックビル、メリーランド州）から入手可能な液体組織試薬およびプロトコールを用いて、好都合に実施され得る。
【００１５】
癌患者からの組織、および癌組織の最も広くかつ有利に入手可能な形態は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織である。外科的に切除された組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、世界中ではるかに最も一般的な癌組織サンプルの保存方法であり、標準的な病理学の実践において認められている慣習である。ホルムアルデヒドの水溶液は、ホルマリンと呼ばれる。「１００％」ホルマリンは、水中ホルムアルデヒド（約４０容量％または３７質量％）の飽和溶液からなり、酸化および重合度を制限するために、少量の安定剤、通常メタノールが含まれる。組織を保存する最も一般的な方法は、全組織を長時間（８時間〜４８時間）、通常１０％中性緩衝ホルマリンと呼ばれる含水ホルムアルデヒドに浸漬した後、固定全組織をパラフィンろうに室温にて長時間保存で包埋することである。よって、ホルマリン固定癌組織を分析するための分子分析方法が、癌患者組織の分析のための最も受け入れられ、頻繁に利用されている方法であろう。
【００１６】
質量分析、特にＳＲＭ／ＭＲＭ質量分析の方法を用いた結果は、肺癌組織を含む、組織が回収および保存された患者の特定の癌内でのＨＥＲ２タンパク質、および場合によりＨｅｒ３タンパク質の正確かつ精密な定量レベルを相関させるために用いられ得る。これは、癌に関する診断／予後情報を提供するだけでなく、医師または他の医療従事者が患者に対する適当な療法を決定することも可能にする。この場合は、ＨＥＲ２タンパク質および場合によりＨｅｒ３タンパク質に対する質量分析アッセイを利用すれば、癌組織中のＨＥＲ２（およびＨｅｒ３）タンパク質発現の特定のレベルに関する情報を提供でき、また、癌組織を得た患者が、治療薬Ｔ−ＤＭ１に対して好ましい様式で反応を示すかどうかを決定するための本明細書に記載の方法の一部として、このアッセイを用いることができる。
【００１７】
ＨＥＲ２標的治療薬Ｔ−ＤＭ１による乳癌患者の治療は、癌の成長を防止し、そして癌患者の生命を延長するのに非常に有効である。ＨＥＲ２タンパク質は、細胞の外側から成長促進シグナルを受容し、それらの成長促進シグナルを腫瘍細胞の内側に送達して、腫瘍細胞が成長および分裂するように刺激するよう機能する膜結合タンパク質である。治療薬Ｔ−ＤＭ１は、ＨＥＲ２タンパク質の細胞外ドメイン領域に結合する際、腫瘍細胞の成長を阻害し、最終的に腫瘍細胞を死滅させるための３つの機能をもたらすＨＥＲ２特異的抗体薬物複合体（トラスツズマブ＋エムタンシン）である。第１の機能は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合して、ＨＥＲ２タンパク質に成長促進シグナルを与える成長タンパク質の結合を阻害し、それにより、通常、受容したシグナルを内側に送達するそのシグナル変換機能を阻害することである。第２は、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘発することである。Ｔ−ＤＭ１は抗体であるため、Ｔ−ＤＭ１は、腫瘍細胞を異物として印を付けて、免疫応答を開始および／または維持し得る。第３の機能は、Ｔ−ＤＭ１の抗体領域に複合化している毒性薬剤エムタンシンを腫瘍細胞に送達することであり、ここで、Ｔ−ＤＭ１により結合されているＨＥＲ２タンパク質は、内部移行し、エムタンシンを細胞の内側に送達して、腫瘍細胞死を引き起こし得る。
【００１８】
ＨＥＲ２タンパク質は、Ｔ−ＤＭ１が任意の効果を有するためには、腫瘍細胞中で発現しなければならず、よって、推定上の患者から得られた腫瘍細胞中のＨＥＲ２の発現を検出および／または定量化する必要がある。現在、癌患者組織、特にＦＦＰＥ組織中のタンパク質の存在を判定するための最も広く使用され、適用されている方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）である。ＩＨＣ法は、目的のタンパク質を検出するために抗体を利用する。ＩＨＣ検査の結果は、病理学者または組織技師によって解釈されることが最も多い。この解釈は、主観的なものであり、ＨＥＲ２を標的とする治療薬Ｔ−ＤＭ１に対する感受性を予測し得る定量的データを提供しない。
【００１９】
ＨＥＲ２  ＩＨＣ検査からの研究では、この検査および他のこのような検査から得られた結果は誤っている、または誤解を招くものである可能性があることを示唆している。これはおそらく、異なる検査室が、陽性および陰性のＩＨＣの状態を分類するための異なるルールを使用していることが原因である。検査を実施する各病理学者も、結果が陽性または陰性であるかどうかを決定するために異なる基準を使用する場合がある。ほとんどの場合、これは、検査結果がボーダーラインにある場合、すなわち、結果が強陽性または強陰性のいずれでもない場合に生じる。他の場合では、癌組織のある領域からの組織は、検査が陽性となり得、一方、癌の異なる領域からの組織は、検査が陰性となる。不正確なＩＨＣ検査結果は、癌と診断された患者が考え得る最良のケアを受けないことを意味し得る。癌の全部または一部が特定の標的腫瘍性タンパク質に陽性であるが、検査結果がそれを陰性と分類する場合、医師は正確な治療を推奨する可能性は低いが、患者はそれらの剤から利益を得られる可能性がある。癌が腫瘍性タンパク質標的陰性であるが、検査結果がそれを陽性と分類する場合、医師は特定の治療を推奨し得るが、患者は、何らかの利益を得る可能性は低く、剤の二次的なリスクに曝露する。
【００２０】
よって、患者が最適な治療を受ける最大の機会を得るように、腫瘍、例えば肺腫瘍中のＨＥＲ２タンパク質の定量レベルを正確に検出および評価できる能力には、大きな臨床的価値がある。
【００２１】
ペプチドの検出および特定のＨＥＲ２断片ペプチドの定量レベルの決定は、質量分析計において実施され、ＳＲＭ／ＭＲＭ法を用いて実施され得、それにより、液体組織ライセートに存在する複雑なペプチド混合物内で、各ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積が決定される（上記の米国特許第７，４７３，５３２号参照）。次に、ＨＥＲ２タンパク質、および上記のＨｅｒ３を含む他のタンパク質の定量レベルは、ＳＲＭ／ＭＲＭ法により決定され、それにより、１つの生体サンプル中のＨＥＲ２タンパク質からの個々の特定のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積が、個々の特定のＨＥＲ２断片ペプチドの各々に対する既知量の「添加(spiked)」内部標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積と比較される。一実施態様では、内部標準は、合成ペプチドが１以上の重同位体で標識された１以上のアミノ酸残基を含有する、同一の正確なＨＥＲ２断片ペプチドの合成バージョンである。このような同位体標識内部標準は、質量分析が、天然ＨＥＲ２断片ペプチドクロマトグラフィーシグネチャーピークとは異なり、かつ、比較ピーク(a comparator peak)として使用され得る、予測可能な一貫したＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピークを生じさせるように合成される。よって、内部標準が、生体サンプルからのタンパク質またはペプチド調製物に既知量で添加され、質量分析により分析される場合、天然ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積は、内部標準ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピーク面積と比較され、この数値比較は、生体サンプルからの最初のタンパク質調製物に存在する天然ペプチドの絶対モル濃度および／または絶対重量のいずれかを示す。断片ペプチドに関する定量的データは、１サンプルあたりに分析されたタンパク質の量に従って示される。
【００２２】
ＨＥＲ２（およびＨｅｒ３断片ペプチド）に対するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するために、ペプチド配列を単に超えた追加の情報が、質量分析計により利用され得る。その追加の情報は、質量分析計（例えば、三連四重極質量分析計）に対して、特定の断片ペプチドの正確かつ集中した分析を実施するように指示および命令するのに使用される。三連四重極質量分析計は、現在、１細胞内に含まれる全タンパク質からの数十万〜数百万の個々のペプチドからなり得る非常に複雑なタンパク質ライセート内の単一の単離された標的ペプチドを分析するための最も好適な機器である。追加の情報は、三連四重極質量分析計に対して、１細胞内に含まれる全タンパク質からの数十万〜数百万の個々のペプチドからなり得る非常に複雑なタンパク質ライセート内の単一の単離された標的ペプチドの分析を可能とするための正確な指示を提供する。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、イオントラップ／四重極ハイブリッド、または三連四重極を含むいずれの種類の質量分析計で開発および実施され得るが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイのための現在最も有利な機器プラットフォームは、三連四重極機器プラットフォームであるとみなされることが多い。
【００２３】
患者腫瘍組織中のＨＥＲ２タンパク質の発現の検出は、ＳＲＭ／ＭＲＭ法を用いない質量分析によっても実施され得る。単一の生体サンプル、この場合では、ホルマリン固定患者腫瘍組織から調製されたタンパク質ライセート中の可能な限り多くのペプチドの存在を同定することにより、「グローバル」なプロファイルを実施するために、三連四重極以外の他の質量分析機器が用いられる。この目的のための１つの有利な質量分析機器（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）は、イオントラップまたはイオントラップ／四重極ハイブリッドである。
【００２４】
ＨＥＲ２の発現を検出するため、また、ＨＥＲ２の定量化のための適当な参照レベルを決定するため、癌、この場合は肺癌に罹患している患者のコホートから腫瘍サンプルを得る。肺癌腫瘍サンプルは、標準的な方法を用いてホルマリン固定され、サンプル中のＨＥＲ２のレベルは、上記の方法を用いて測定される。組織サンプルは、当技術分野で周知の方法を用いて、ＩＨＣおよびＦＩＳＨを用いて調べてもよい。コホート内の患者は、ＨＥＲ２遺伝子の少なくとも１つの変異を有し、Ｔ−ＤＭ１により治療されていると決定される。患者の反応は、当技術分野で周知の方法を用いて、例えば、治療後の時間間隔での患者の全生存を記録することにより、測定される。好適な参照レベルは、当技術分野で周知の統計的方法を用いて、例えば、ログランク検定の最低ｐ値を決定することにより、決定され得る。参照レベルが決定されたら、それを用いて、患者がＴ−ＤＭ１による治療から利益を得られる可能性が高いことを示すＨＥＲ２タンパク質発現レベルを有する患者を同定することができる。患者の腫瘍サンプル中のＨＥＲ２タンパク質のレベルは、一般にａｍｏｌ／μｇで表されるが、他の単位も使用することができる。当業者ならば、参照レベルは、およそ中心値の範囲、例えば、＋／−２５０、１５０、１００、５０または２５ａｍｏｌ／μｇとして表され得ることを認識するであろう。
【００２５】
意外にも、ＨＥＲ２遺伝子に変異が存在する場合、腫瘍組織中での任意の検出可能なレベルでのＨＥＲ２の発現は、Ｔ−ＤＭ１に対する反応を予測するものであることが見出されている。従って、Ｔ−ＤＭ１療法が有効となるためには、ＨＥＲ２タンパク質は過剰発現している必要はなく、ＨＥＲ２遺伝子は増幅される必要はない。さらに、Ｈｅｒ３発現の同時検出は、Ｔ−ＤＭ１に対する反応のさらなる指標（独立した指標ではない）であることが見出されている。ＨＥＲ２と同様に、Ｈｅｒ３の発現は、検出限界超であれば十分である。
【００２６】
トラスツズマブまたはＴ−ＤＭ１による従来の治療方法では、患者から得られた腫瘍組織は、一般に、治療の適格性を決定するために、ＨＥＲ２の発現に関して評価される。これらの測定に関する臨床ガイドラインは、当技術分野で周知であり、例えば、ＡＳＣＯガイドラインがある（例えば、Wolff et al., “Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J. Clin. Oncol. 31: 3997-4013 (2013)およびArch Pathol Lab Med. 138:241-256 (2014)参照。ＨＥＲ２の発現の決定方法は、上記のように、一般にＩＨＣが関与する。これらの従来の治療方法では、ＨＥＲ２タンパク質が過剰発現していると判明している場合、患者はＴ−ＤＭ１のみで治療される。本明細書に記載の方法の文脈において、ＨＥＲ２発現のレベルが、ＡＳＣＯガイドラインの下での治療に関して推奨される発現レベル未満である場合、または、患者が、これらのガイドラインの下での治療にそれ以外で適格ではない場合、ＨＥＲ２は過剰発現していないとみなされる。
【００２７】
患者腫瘍組織からの患者腫瘍細胞に存在するＨＥＲ２遺伝子におけるＤＮＡ変異の検出は、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術を用いて回収された患者腫瘍細胞からの核酸配列における正常からの変化および／または変異体を検出することにより実施され得、それにより、ＮＧＳ技術を利用して、全ゲノムの配列決定（全ゲノムシークエンシング［ＷＧＳ］）、１つのゲノムに存在する全遺伝子からの全エクソンの全コレクションの配列決定（全エクソームシークエンシング［ＷＥＳ］）、または１つのゲノムに存在する全遺伝子からのエクソンの全コレクションの所定のサブセットの配列決定（エクソームシークエンシング［ＥＳ］）を行う。ＨＥＲ２遺伝子の配列決定および変異の存在の同定のための方法は、当技術分野で公知である。
【００２８】
核酸およびタンパク質の両方が、同じ液体組織生体分子調製物から分析され得るため、タンパク質が分析された同じサンプル中の核酸から、疾患の診断および薬物治療の決定に関する追加の情報を生成することが可能である。例えば、ＨＥＲ２タンパク質が高レベルで特定の細胞により発現している場合、ＳＲＭによりアッセイされる際、データは、細胞の状態およびそれらの制御されない成長の可能性に関する情報を提供し得る。同時に、遺伝子における変異状態に関する情報を、同じ液体組織生体分子調製物に存在する核酸から得ることができる。核酸は、ＨＥＲ２タンパク質を含むタンパク質のＳＲＭ分析と同時に評価され得る。一実施態様では、ＨＥＲ２タンパク質発現に関する情報は、ＨＥＲ２遺伝子の配列に関する情報、およびＨＥＲ２遺伝子に少なくとも１つの変異があるかどうかに関する情報と組み合わせることができる。さらに、核酸は、例えば、シークエンシング法、ポリメラーゼ連鎖反応法、制限断片多型分析、欠失、挿入の同定、および／もしくは限定されるものではないが、一塩基対多型、トランジション、トランスバージョンを含む変異の存在の判定のうち１以上、２以上、もしくは３以上、またはその組合せにより調べられ得る。
【図１】
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【国際調査報告】
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