(57)【要約】  本発明は、αｖβ６インテグリンに選択的に結合し、モチーフＸ１ＢｎＲＧＤＬＸ２Ｘ３Ｘ４ＺｍＸ５を含むアミノ酸配列を有するペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、任意のＤ−アミノ酸であり、Ｂｎは、任意のｎアミノ酸の配列であり、そのアミノ酸は、天然でも非天然でもよく、Ｄ−またはＬ−でもよく、同一でも異なっていてもよく、ｎは、１〜１０の数であり、Ｘ２およびＸ３は、任意のアミノ酸からそれぞれ独立に選択され、Ｘ４は、ＬｅｕまたはＩｌｅであり、Ｚｍは、任意のｍアミノ酸の配列であり、そのアミノ酸は、天然でも非天然でもよく、Ｄ−またはＬ−でもよく、同一でも異なっていてもよく、ｍは、１〜１０の数であり、Ｘ５は任意のＬ−またはＤ−アミノ酸である。前記ペプチドを含むコンジュゲート、前記ペプチドもしくは前記コンジュゲートを含む医薬組成物、ならびに例えば、哺乳動物対象におけるαｖβ６発現腫瘍の処置、画像化および／または診断における前記ペプチド、コンジュゲートもしくは組成物の使用も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
αｖβ６インテグリンに選択的に結合し、モチーフＸ１ＢｎＲＧＤＬＸ２Ｘ３Ｘ４ＺｍＸ５（配列番号３）を含むアミノ酸配列を有するペプチドであって、式中、Ｘ１は、任意のＤ−アミノ酸であり、Ｂｎは、任意のｎアミノ酸の配列であり、前記アミノ酸は、天然でも非天然でもよく、Ｄ−またはＬ−でもよく、同一でも異なっていてもよく、ｎは、１〜１０の数であり、Ｘ２およびＸ３は、任意のアミノ酸からそれぞれ独立に選択され、Ｘ４は、ＬｅｕまたはＩｌｅであり、Ｚｍは、任意のｍアミノ酸の配列であり、前記アミノ酸は、天然でも非天然でもよく、Ｄ−またはＬ−でもよく、同一でも異なっていてもよく、ｍは、１〜１０の数であり、Ｘ５は、任意のＬ−またはＤ−アミノ酸である、ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドの長さが、１７〜２５アミノ酸であり、任意選択で前記ペプチドの長さが２０アミノ酸である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
Ｘ１が、Ｄ−Ａｓｎである、請求項１または請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
Ｘ５が、Ｌ−ＴｈｒまたはＤ−Ｔｈｒである、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
Ｘ４が、Ｌｅｕである、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６】
ｎが５であり、および／またはｍが６である、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項７】
Ｂｎが、ＡＶＰＮＬ（配列番号４）、ＫＶＰＮＬ（配列番号５）またはＫ（ビオチン）ＶＰＮＬである、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項８】
Ｚｍが、ＡＱＫＶＡＲ（配列番号６）である、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドのアミノ酸配列が、
Ｈ２Ｎ−［Ｄ−Ａｓｎ］−ＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＣＯＯＨ（配列番号７）；
Ｈ２Ｎ−［Ｄ−Ａｓｎ］−ＫＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＣＯＯＨ（配列番号８）；
Ｈ２Ｎ−［Ｄ−Ａｓｎ］−Ｋ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＣＯＯＨ（配列番号８）；
Ｈ２Ｎ−［Ｄ−Ａｓｎ］−ＫＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲ［Ｄ−Ｔｈｒ］−ＣＯＯＨ（配列番号９）；
Ｈ２Ｎ−［Ｄ−Ａｓｎ］−Ｋ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲ［Ｄ−Ｔｈｒ］−ＣＯＯＨ（配列番号９）；および
Ｈ２Ｎ−［Ｄ−Ａｓｎ］−ＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲ［Ｄ−Ｔｈｒ］−ＣＯＯＨ（配列番号１０）
からなる群から選択される、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドが、Ｈ２Ｎ−［Ｄ−Ａｓｎ］−ＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＣＯＯＨ（配列番号７）である、請求項９に記載のペプチド。
【請求項１１】
前記ペプチドが、Ｎアセチル化および／またはＣアミド化されている、前記請求項のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１２】
治療的部分、ポリマー、ポリペプチドおよび／または検出可能な部分に直接もしくはリンカーを介してコンジュゲートした請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチドを含むコンジュゲート。
【請求項１３】
前記治療的部分が、抗がん剤を含む、請求項１２に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
前記抗がん剤が、オーリスタチン、マイタンシノイド、チューブリシン、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、アルファ−アマニチン、ピロロベンゾジアゼピン、イリノテカンおよびインドールカルボキサミド、またはその類似体、誘導体、プロドラッグもしくは活性代謝物からなる群から選択される、請求項１３に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
前記抗がん剤が、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、メルタンシン（ＤＭ１）、ラブタンシン（ＤＭ４）またはセンタナマイシンを含む、請求項１４に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
前記治療的部分が、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２５Ａｃ、２２３Ｒａ、４４Ｓｃ、６７Ｇａ、１３１Ｉ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅおよび６７Ｃｕからなる群から選択される放射性同位元素を含む、請求項１２から１５のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
前記検出可能な部分が、核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）、単光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）または光学的画像化によって検出可能である、請求項１２から１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
前記検出可能な部分が、フルオロフォア、放射性核種またはスピン標識を含む、請求項１７に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
前記検出可能な部分が、６８Ｇａ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、８９Ｚｒ、１２４Ｉ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ、１８Ｆ、８６Ｙ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、６７Ｇａまたは９９ｍＴｃを含む、請求項１８に記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
前記検出可能な部分が、キレート化剤を含むリンカーを介してペプチドとカップリングされた１１１Ｉｎを含み、任意選択で前記キレート化剤が、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、テトラアザシクロドデカン（ｔｅｔｒａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ）−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む、請求項１２から１９のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
前記ポリマーが、１つもしくは複数（例えば１つまたは２つ）のエチレングリコール基または１つもしくは複数（例えば１つまたは２つ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含む、請求項１２から２０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
前記１つまたは複数（例えば１つまたは２つ）のＰＥＧ鎖が、長さ１〜５０個のエチレングリコール単位である、請求項２１に記載のコンジュゲート。
【請求項２３】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチドまたは請求項１２から２２のいずれか一項に記載のコンジュゲート；および
薬学的に許容可能な担体
を含む医薬組成物。
【請求項２４】
医学に使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチド、請求項１２から２２のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
哺乳動物対象においてαｖβ６発現腫瘍の処置の方法に使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチド、請求項１２から２２のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記腫瘍が、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍である、請求項２５に記載の使用のためのペプチド、コンジュゲートまたは組成物。
【請求項２７】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチド、請求項１２から２２のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは請求項２３に記載の医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、αｖβ６発現腫瘍を有する哺乳動物対象を処置する方法。
【請求項２８】
前記腫瘍が、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
哺乳動物対象のαｖβ６発現腫瘍を処置するための医薬の調製における請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチド、請求項１２から２２のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは請求項２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３０】
前記腫瘍が、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍である、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記腫瘍がある対象に請求項１７から２２のいずれか一項に記載のコンジュゲートを投与する工程と、前記検出可能な部分を検出し、それにより前記腫瘍の画像を形成する工程とを含む、哺乳動物対象のαｖβ６発現腫瘍を画像化する方法。
【請求項３２】
前記腫瘍が、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象にコンジュゲートを投与する工程と、前記検出可能な部分を検出し、それにより前記対象におけるαｖβ６発現腫瘍の存在を診断する工程とを含む、哺乳動物対象におけるがんの診断のｉｎ  ｖｉｖｏ方法に使用するための請求項１７から２２のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項３４】
αｖβ６発現腫瘍を有すると疑われる哺乳動物対象に請求項１７から２２のいずれか一項に記載のコンジュゲートを投与する工程と、前記検出可能な部分を検出し、それにより対象におけるαｖβ６発現腫瘍の存在を診断する工程とを含む、がん診断の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドバリアント、コンジュゲートおよびその医薬組成物、ならびにがんの処置および腫瘍の画像化を含めた医学におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インテグリンは、細胞接着、浸潤、増殖およびアポトーシスを含めたいくつかの鍵となる工程に関係する細胞表面受容体の大きなファミリーを包含するαβヘテロ二量体分子である［２３］。ヒトでは８クラス２４個のメンバーが存在し、高度に保存されているトリペプチドモチーフＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐによってフィブロネクチンおよびビトロネクチンなどの細胞外リガンドに存在する基質を認識する［２７］。インテグリンαｖβ６は、口腔、頭頸部、膵、卵巣および乳がんなど数多くのがんで高レベルに発現され［４〜９］、インテグリンαｖβ６の発現レベルの増大は、腫瘍の進行と相関していた。インテグリンαｖβ６は、線維症［１１］および口蹄疫を含めた一部のウイルス感染症も促進し得る［２８］。したがって、インテグリンαｖβ６は、腫瘍学ならびにそれを超えた分野における画像化、診断および治療の主要な標的である［２９〜３０］。
【０００３】
Ａ２０ＦＭＤＶ２（Ｈ２Ｎ−１ＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲ２０Ｔ−ＯＨ）（配列番号１）は、口蹄疫ウイルスのウイルスタンパク質から得られる２０残基の直鎖ペプチドである［１〜３、１０］。このペプチドは、がん細胞において高度に発現されるインテグリン膜貫通型受容体であるαｖβ６に対して高い選択性および親和性を呈すると示されている［４〜９］。Ａ２０ＦＭＤＶ２は、７ＲＧＤＬＱＶ１３Ｌ（配列番号２）断片のＲＧＤトリペプチドを介してαｖβ６に結合し、ＲＧＤＬＱＶＬ断片に存在する２つのロイシン残基は、疎水的相互作用によって受容体へのペプチドの結合を増強し［１０］、その結合はＣ末端ペプチドモチーフ１０Ｌｅｕ〜２０Ｔｈｒから生成されるαらせんによっても安定化される［１］。加えて、放射性インジウム（１１１Ｉｎ）とカップリングした場合、Ａ２０ＦＭＤＶ２は、肺線維症においてαｖβ６に対する有効な造影剤である［２４］。［１８Ｆ］フルオロベンゾイル標識ペプチドである［１８Ｆ］ＦＢＡ−Ａ２０ＦＭＤＶ２は、ヒト臨床試験におけるＰＥＴ放射性トレーサーとしての使用が見出されている［２５］。
【０００４】
Ａ２０ＦＭＤＶ２は、４−［１８Ｆ］フルオロ安息香酸（ＦＢＡ）（または誘導体）にコンジュゲートすることによって［３２〜３４］、およびＤＯＴＡなどの金属キレート化剤を組み込んだＡ２０ＦＭＤＶ２ペプチドを使用する６４Ｃｕ標識によって［３５〜３７］画像診断用途の陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）に使用されてきた［３１］。近年、［１８Ｆ］−ＦＢＡ−Ａ２０ＦＭＤＶ２は、特発性肺線維症の処置レジメ［２４］において臨床の場へと歩みを進め［２５］、一方で１１１Ｉｎ標識Ａ２０ＦＭＤＶ２誘導体は、単光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）を使用するαｖβ６インテグリンを発現する乳がんの画像化で、特異性が高いことが示された［９］。これらの研究は、αｖβ６インテグリンを標的する進行中の診断用ツールに対するＡ２０ＦＭＤＶ２の重要性を概説し、αｖβ６を有効な治療標的として支持している。
【０００５】
ＷＯ２００７／０３９７２３は、αｖβ６ペプチドリガンド、その機能的バリアントおよびそれをコードしている核酸ならびにがんを含めたαｖβ６媒介性疾患の処置および画像化におけるそれらの使用について記述している。
【０００６】
残念なことに、マウス血漿研究において決定された通り、Ａ２０ＦＭＤＶ２の治療的価値は、エンドおよびエキソペプチダーゼなどの血清プロテアーゼに対する高い感受性に一部起因する短い血中半減期により限定されている［１３］。
【０００７】
感受性のペプチド（およびタンパク質）の半減期を改善するための報告されている一方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の導入である［３８］。Ｈａｕｓｎｅｒらは、Ｎ末端における１つもしくは２つのＰＥＧ２８部分［１３］またはＮおよびＣ終点両方における単一ＰＥＧ２８［３９］の配置によって４−［１８Ｆ］−ＦＢＡ−Ａ２０ＦＭＤＶ２のＰＥＧ化バージョンを調製し、２末端ＰＥＧ化Ａ２０ＦＭＤＶ２誘導体である［１８Ｆ］−ＦＢＡ−ＰＥＧ２８−Ａ２０ＦＭＤＶ２−ＰＥＧ２８が、最も好ましい薬物動態を呈すると結論付けた。
【０００８】
直鎖ペプチドのヘッドトゥテール環化も、エキソペプチダーゼによる分解を最小化する確立された方法であるが［４０］；重合またはラセミ化など望ましくない副反応を防止するために慎重な実験が必要とされる。
【０００９】
しかしながら、強力な結合活性、細胞取り込みおよび延長された血漿内半減期を持つ腫瘍標的化ペプチドに対する必要性は満たされていない。本発明は、これらのおよび他の必要性を解決する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
概して、本発明は、細胞研究においてＡ２０ＦＭＤＶ２ペプチドと比較して増強されたαｖβ６結合活性、一部の場合において（ｉｎ  ｓｏｍｅ  ｃａｓｅｓ）、増強された細胞取り込みを呈することが予想外に判明したＡ２０ＦＭＤＶ２ペプチドバリアントに関する。特に、本明細書のさらなる詳細に記載の通り、そのようなペプチドバリアントは、それぞれのペプチドの１１１Ｉｎ標識バージョンによって評価すると、対照Ａ２０ＦＭＤＶ２ペプチドと比較してαｖβ６発現異種移植腫瘍への増強された体内分布を呈する（αｖβ６発現を欠いている対照異種移植腫瘍と比較して）ことが判明した。したがって、そのようなペプチドバリアントは、腫瘍標的化化学療法送達薬剤および腫瘍造影剤としての潜在性が大きい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、第１の側面において、本発明は、αｖβ６インテグリンに選択的に結合し、モチーフＸ１ＢｎＲＧＤＬＸ２Ｘ３Ｘ４ＺｍＸ５（配列番号３）を含むアミノ酸配列を有するペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、任意のＤ−アミノ酸であり、Ｂｎは、任意のｎアミノ酸の配列であり、前記アミノ酸は、天然でも非天然でもよく、Ｄ−またはＬ−でもよく、同一でも異なっていてもよく、ｎは、１〜１０の数であり、Ｘ２およびＸ３は、任意のアミノ酸からそれぞれ独立に選択され、Ｘ４は、ＬｅｕまたはＩｌｅであり、Ｚｍは、任意のｍアミノ酸の配列であり、前記アミノ酸は、天然でも非天然でもよく、Ｄ−またはＬ−でもよく、同一でも異なっていてもよく、ｍは、１〜１０の数であり、Ｘ５は任意のＬ−またはＤ−アミノ酸である。
【００１２】
一部の態様において、ペプチドの長さは、少なくとも１７、１８、１９または２０アミノ酸である。一部の態様において、ペプチドの長さは、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１以下または２０アミノ酸以下である。特定の態様において、ペプチドの長さは、１７〜２５アミノ酸、例えば１９〜２１アミノ酸である。特定の態様において、ペプチドの長さは、２０アミノ酸である。
【００１３】
一部の態様において、Ｘ１は、Ｄ−Ａｓｎである。本明細書の表２および表３ならびに図３および図４に示されるように、Ｘ１がＤ−Ａｓｎである典型的なペプチド（ペプチド１９、２１、２５および２６）は、優れた相対的活性（表２）、αｖβ６発現腫瘍への高い体内分布（表３および図４）および優れた血漿安定性（図３）を呈した。
【００１４】
一部の場合において、Ｘ５は、Ｌ−ＴｈｒまたはＤ−Ｔｈｒである。
一部の場合において、Ｘ４は、Ｌ−Ｌｅｕである。
一部の場合において、ｎは、５である。一部の場合において、ｍは、６である。特定の場合において、ｎは、５であり、ｍは、６である。
【００１５】
一部の場合において、Ｂｎは、ＡＶＰＮＬ（配列番号４）、ＫＶＰＮＬ（配列番号５）またはＫ（ビオチン）ＶＰＮＬである。Ｂｍが、Ｋ（ビオチン）ＶＰＮＬである場合、ビオチンは、リジン側鎖に結合しているＤ−ビオチンでもよい。
【００１６】
一部の場合において、Ｚｍは、ＡＱＫＶＡＲ（配列番号６）である。
特定の場合において、ペプチドのアミノ酸配列は、
Ｈ２Ｎ−［Ｄ−Ａｓｎ］−ＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＣＯＯＨ（配列番号７）；
Ｈ２Ｎ−［Ｄ−Ａｓｎ］−ＫＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＣＯＯＨ（配列番号８）；
Ｈ２Ｎ−［Ｄ−Ａｓｎ］−Ｋ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＣＯＯＨ（配列番号８）；
Ｈ２Ｎ−［Ｄ−Ａｓｎ］−ＫＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲ［Ｄ−Ｔｈｒ］−ＣＯＯＨ（配列番号９）；
Ｈ２Ｎ−［Ｄ−Ａｓｎ］−Ｋ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲ［Ｄ−Ｔｈｒ］−ＣＯＯＨ（配列番号９）；および
Ｈ２Ｎ−［Ｄ−Ａｓｎ］−ＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲ［Ｄ−Ｔｈｒ］−ＣＯＯＨ（配列番号１０）
からなる群から選択される。
【００１７】
特に、ペプチドは、
Ｈ２Ｎ−［Ｄ−Ａｓｎ］−ＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＣＯＯＨ（配列番号７）あってもよい。
【００１８】
特定の場合において、ペプチドは、Ｎおよび／またはＣ末端で修飾されてもよい。例えば、ペプチドは、Ｎアセチル化および／またはＣアミド化されてもよい。
第２の側面において、本発明は、治療的部分、ポリマー、ポリペプチドおよび／または検出可能な部分に直接もしくはリンカーを介してコンジュゲートされた本発明の第１の側面のペプチドを含むコンジュゲートを提供する。
【００１９】
一部の態様において、ペプチドは、抗がん剤を含む治療的部分にコンジュゲートされる。
一部の態様において、抗がん剤は、オーリスタチン、マイタンシノイド、チューブリシン、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、アルファ−アマニチン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、イリノテカンおよびインドールカルボキサミド、またはその類似体、誘導体、プロドラッグもしくは活性代謝物からなる群から選択される。特に、抗がん剤は、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、メルタンシン（ＤＭ１）、ラブタンシン（ＤＭ４）またはセンタナマイシンを含んでもよい。
【００２０】
一部の場合において、治療的部分は、治療的同位元素を含んでもよい。例えば、治療的部分は、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２５Ａｃ、２２３Ｒａ、４４Ｓｃ、６７Ｇａ、１３１Ｉ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅおよび６７Ｃｕからなる群から選択される同位元素を含んでもよい。
【００２１】
一部の場合において、ペプチドは、核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）、単光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）または光学的画像化によって検出可能である検出可能な部分にコンジュゲートされる。特に、検出可能な部分は、フルオロフォア、放射性核種またはスピン標識を含んでもよい。特定の場合において、検出可能な部分は、６８Ｇａ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、８９Ｚｒ、１２４Ｉ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ、１８Ｆ、８６Ｙ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、６７Ｇａまたは９９ｍＴｃを含んでもよい。
【００２２】
特に、検出可能な部分は、キレートを含むリンカーを介してペプチドとカップリングされた１１１Ｉｎを含んでもよい。特に、キレートは、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、テトラアザシクロドデカン（ｔｅｔｒａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ）−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）からなる群から選択されてもよい。キレート（例えばＤＴＰＡ、ＤＯＴＡまたはＥＤＴＡ）は、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に連結されてもよい（例えば、キレートは、Ｎ末端でＤ−Ａｓｎに連結されてもよい）。
【００２３】
一部の場合において、ペプチドは、血漿内半減期および／または体内分布を増強するポリマーにコンジュゲートされる。特に、ペプチドは、１つまたは複数（例えば、Ｎ末端およびＣ末端のそれぞれなどで１つまたは２つ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基にコンジュゲートされてもよい。特定の場合において、ペプチドは、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−を含む部分にコンジュゲートされてもよく、式中、ｎ≧１である。特に、ｎは、１〜１００、１〜５０、１０〜４０または２０〜３０であってもよい。例えば、ｎは、１または２であってもよい。特定の場合において、ペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端に存在する２つのエチレングリコール基を有してもよい。
【００２４】
第３の側面において、本発明は、
本発明の第１の側面のペプチドまたは本発明の第２の側面のコンジュゲート；および
薬学的に許容可能な担体
を含む医薬組成物を提供する。
【００２５】
第４の側面において、本発明は、医学に使用するための、本発明の第１の側面のペプチド、本発明の第２の側面のコンジュゲートまたは本発明の第３の側面の医薬組成物を提供する。
【００２６】
第５の側面において、本発明は、哺乳動物対象におけるαｖβ６発現腫瘍の処置の方法に使用するための本発明の第１の側面のペプチド、本発明の第２の側面のコンジュゲートまたは本発明の第３の側面の医薬組成物を提供する。一部の態様において、腫瘍は、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍である。特定の場合において、コンジュゲートまたはその医薬組成物は、前記抗がん剤を１つまたは複数含むコンジュゲートである。特定の場合において、処置の方法は、哺乳動物対象の腫瘍がαｖβ６を発現しているかどうか決定する工程を含んでもよく、腫瘍が、αｖβ６を発現していると決定された場合、前記処置が投与される。
【００２７】
第６の側面において、本発明は、αｖβ６発現腫瘍を有する哺乳動物対象を処置する方法を提供し、本方法は、本発明の第１の側面のペプチド、本発明の第２の側面のコンジュゲートまたは本発明の第３の側面の医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与する工程を含む。一部の態様において、腫瘍は、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍である。特定の場合において、コンジュゲートまたはその医薬組成物は、前記抗がん剤を１つまたは複数含むコンジュゲートである。特定の場合において、処置の方法は、哺乳動物対象の腫瘍がαｖβ６を発現しているかどうか決定する工程を含んでもよく、腫瘍が、αｖβ６を発現していると決定された場合、前記処置が投与される。
【００２８】
第７の側面において、本発明は、哺乳動物対象のαｖβ６発現腫瘍を処置するための医薬の調製における本発明の第１の側面のペプチド、本発明の第２の側面のコンジュゲートまたは本発明の第３の側面の医薬組成物の使用を提供する。一部の態様において、腫瘍は、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍である。特定の場合において、コンジュゲートまたはその医薬組成物は、前記抗がん剤を１つまたは複数含むコンジュゲートである。特定の場合において、処置の方法は、哺乳動物対象の腫瘍がαｖβ６を発現しているかどうか決定する工程を含んでもよく、腫瘍が、αｖβ６を発現していると決定された場合、前記処置が投与される。
【００２９】
本発明の第４、第５、第６または第７の側面によると、ペプチド、コンジュゲートまたは医薬組成物は、投与されてもよくまたは別の抗がん剤および／もしくは放射線療法もしくは手術と同時に投与するためのものであってもよい。特に、第２の化学療法薬（同時、逐次的、別々または並行的）および／もしくは放射線療法ならびに／または手術前もしくは手術後の併用療法が特に考えられる。どんな特定の理論に束縛されることを望むものでもないが、本発明者らは、本発明のαｖβ６標的化ペプチドまたはコンジュゲートに基づく治療と１つまたは複数の受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の遮断とを組み合わせることにより、単独療法と比較して抗がん治療有効性を増強し得ると信じている。予備抗体研究は、αｖβ６が、ＲＴＫシグナル伝達を調節し、さらに増強する可能性があることを示す。そのうえ、腫瘍モデルにおいて抗αｖβ６抗体と組み合わせてＲＴＫ［例えば上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）またはｅｒｂＢ−２（別名ヒト上皮成長因子受容体２またはＨＥＲ２／ｎｅｕ）］を標的することにより、単独療法よりも治療が増強される。したがって、本発明のαｖβ６標的化ペプチドまたはコンジュゲートに基づく治療は、特に、トラスツズマブ［ハーセプチン（登録商標）］、ゲフィチニブ［イレッサ（登録商標）］、エルロチニブ［タルセバ（登録商標）］、ラパチニブ［タイケルブ（登録商標）］、セツキシマブ［アービタックス（登録商標）］およびパニツムマブ［ベクティビックス（登録商標）］のうち１つまたは複数と組み合わせられてもよいことが本明細書において特に考えられる。
【００３０】
第８の側面において、本発明は、腫瘍がある対象に本発明の第２の側面のコンジュゲート（前記検出可能な部分を含む前記コンジュゲート）またはその組成物を投与する工程と、前記検出可能な部分を検出し、それにより前記腫瘍の画像を形成する工程とを含む、哺乳動物対象のαｖβ６発現腫瘍を画像化する方法を提供する。一般に、画像は、ディスプレイ（例えばデジタルディスプレイスクリーン）上に形成されることになるが、対象の身体上または内における直接画像化が、本明細書において特に考えられる。一部の態様において、腫瘍は、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍である。
【００３１】
第９の側面において、本発明は、哺乳動物対象においてがんを診断するｉｎ  ｖｉｖｏ方法に使用するための本発明の第２の側面のコンジュゲート（前記検出可能な部分を含む前記コンジュゲート）またはその組成物を提供し、その方法は、対象に前記コンジュゲートまたはその前記組成物を投与する工程と、前記検出可能な部分を検出し、それにより対象におけるαｖβ６発現腫瘍の存在を診断する工程とを含む。一部の場合において、前記検出可能な部分の検出は、前記検出可能な部分の量、濃度、レベル、強度および／もしくは場所を測定する工程と、測定値を関連付けまたは解釈して（参照レベル、バックグラウンドまたは対照と測定値を比較することによるなど）、測定値が対象および／もしくは対象の身体内の特定の場所におけるαｖβ６発現腫瘍の存在を示すか否か決定する工程とを含む。一部の態様において、腫瘍は、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍である。
【００３２】
第１０の側面において、本発明は、αｖβ６発現腫瘍を有すると疑われる哺乳動物対象に本発明の第２の側面のコンジュゲート（前記検出可能な部分を含む前記コンジュゲート）またはその組成物を投与する工程と、前記検出可能な部分を検出し、それにより対象におけるαｖβ６発現腫瘍の存在を診断する工程とを含む、がんを診断する方法を提供する。一部の場合において、前記検出可能な部分の検出は、前記検出可能な部分の量、濃度、レベル、強度および／もしくは場所を測定する工程と、測定値を関連付けまたは解釈して（参照レベル、バックグラウンドまたは対照と測定値を比較することによるなど）、測定値が対象および／もしくは対象の身体内の特定の場所におけるαｖβ６発現腫瘍の存在を示すか否か決定する工程とを含む。一部の態様において、腫瘍は、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍である。
【００３３】
本発明によると、対象は、ヒト、コンパニオンアニマル（例えばイヌまたはネコ）、実験動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタまたはヒト以外の霊長類）、家畜または農用動物（例えばブタ、ウシ、ウマまたはヒツジ）であってもよい。好ましくは、対象はヒトである。対象は、特定の場合において、αｖβ６発現腫瘍を患っている、それと診断されたまたは有すると疑われたヒトでもよい。
【００３４】
本発明は、記述されている側面および好ましい特色の組合せが明らかに容認できないまたは明白に避けるべきと述べられている場合を除き、その組合せを含む。本発明のこれらのおよびさらなる側面および態様は、以下のさらなる詳細ならびに付随する例および図を参照して記述される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ペプチド２〜１５の合成に使用される非タンパク新生アミノ酸の構造を示す図である。
【図２Ａ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるペプチド２２〜ペプチド２５試験の比較を示す図である。全てのＡ２０ＦＭＤＶ２バリアントが、特異性、活性および内部移行に関してスクリーニングされた。Ａ）特異性は、１０００ｎＭにおいてＡ３７５Ｐｕｒｏへの結合に存在せず（上のヒストグラム）、Ａ３７５Ｐβ６への結合にのみ存在し（下のヒストグラム）、ヒストグラムの推移は、Ａｉ）ペプチド２２（左手のヒストグラム）およびＡｉｉ）ペプチド２５（右手のヒストグラム）によって示される同じ１００ｎＭ濃度でのフローサイトメトリーによる平均蛍光強度（ＭＦＩ）の幾何平均（ＧＭ）を示す。Ｂ）親和性が、フローサイトメトリーにより０．１、１、１０、１００および１０００ｎＭでＡ３７５Ｐβ６に結合するレベルを測定することによって決定された。結果は、商業的に供給されている対照ビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２と比較してペプチドの結合を示す。一回の代表的な実験からのデータは、Ｂｉｉ）ペプチド２５（右手のグラフ）が、Ｂｉ）ペプチド２２（左手のグラフ）と比較して同程度の濃度でＡ３７５Ｐβ６によりよく結合することを示す。Ｃ）内部移行は、Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍ（登録商標）を使用してＡ３７５Ｐβ６細胞によるαｖβ６依存的内部移行を示す。データは、０分および４５分後の細胞の表面におけるペプチドを示す（各パネルにおいて緑色、右側の画像）、Ｃｉ）ペプチド２２およびＣｉｉ）ペプチド２５は内部に取り込まれ、その内部移行の速度は同程度である（画像の下のグラフを参照のこと；ペプチド２２左手のグラフ、ペプチド２５右手のグラフ）。
【図２Ｂ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるペプチド２２〜ペプチド２５試験の比較を示す図である。全てのＡ２０ＦＭＤＶ２バリアントが、特異性、活性および内部移行に関してスクリーニングされた。Ａ）特異性は、１０００ｎＭにおいてＡ３７５Ｐｕｒｏへの結合に存在せず（上のヒストグラム）、Ａ３７５Ｐβ６への結合にのみ存在し（下のヒストグラム）、ヒストグラムの推移は、Ａｉ）ペプチド２２（左手のヒストグラム）およびＡｉｉ）ペプチド２５（右手のヒストグラム）によって示される同じ１００ｎＭ濃度でのフローサイトメトリーによる平均蛍光強度（ＭＦＩ）の幾何平均（ＧＭ）を示す。Ｂ）親和性が、フローサイトメトリーにより０．１、１、１０、１００および１０００ｎＭでＡ３７５Ｐβ６に結合するレベルを測定することによって決定された。結果は、商業的に供給されている対照ビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２と比較してペプチドの結合を示す。一回の代表的な実験からのデータは、Ｂｉｉ）ペプチド２５（右手のグラフ）が、Ｂｉ）ペプチド２２（左手のグラフ）と比較して同程度の濃度でＡ３７５Ｐβ６によりよく結合することを示す。Ｃ）内部移行は、Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍ（登録商標）を使用してＡ３７５Ｐβ６細胞によるαｖβ６依存的内部移行を示す。データは、０分および４５分後の細胞の表面におけるペプチドを示す（各パネルにおいて緑色、右側の画像）、Ｃｉ）ペプチド２２およびＣｉｉ）ペプチド２５は内部に取り込まれ、その内部移行の速度は同程度である（画像の下のグラフを参照のこと；ペプチド２２左手のグラフ、ペプチド２５右手のグラフ）。
【図２Ｃ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるペプチド２２〜ペプチド２５試験の比較を示す図である。全てのＡ２０ＦＭＤＶ２バリアントが、特異性、活性および内部移行に関してスクリーニングされた。Ａ）特異性は、１０００ｎＭにおいてＡ３７５Ｐｕｒｏへの結合に存在せず（上のヒストグラム）、Ａ３７５Ｐβ６への結合にのみ存在し（下のヒストグラム）、ヒストグラムの推移は、Ａｉ）ペプチド２２（左手のヒストグラム）およびＡｉｉ）ペプチド２５（右手のヒストグラム）によって示される同じ１００ｎＭ濃度でのフローサイトメトリーによる平均蛍光強度（ＭＦＩ）の幾何平均（ＧＭ）を示す。Ｂ）親和性が、フローサイトメトリーにより０．１、１、１０、１００および１０００ｎＭでＡ３７５Ｐβ６に結合するレベルを測定することによって決定された。結果は、商業的に供給されている対照ビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２と比較してペプチドの結合を示す。一回の代表的な実験からのデータは、Ｂｉｉ）ペプチド２５（右手のグラフ）が、Ｂｉ）ペプチド２２（左手のグラフ）と比較して同程度の濃度でＡ３７５Ｐβ６によりよく結合することを示す。Ｃ）内部移行は、Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍ（登録商標）を使用してＡ３７５Ｐβ６細胞によるαｖβ６依存的内部移行を示す。データは、０分および４５分後の細胞の表面におけるペプチドを示す（各パネルにおいて緑色、右側の画像）、Ｃｉ）ペプチド２２およびＣｉｉ）ペプチド２５は内部に取り込まれ、その内部移行の速度は同程度である（画像の下のグラフを参照のこと；ペプチド２２左手のグラフ、ペプチド２５右手のグラフ）。
【図３】２４時間後のヒト血漿（ｎ＝２）およびＰＢＳ（対照）中のペプチドの安定性を示す図である。血漿中で５０％未満安定であるペプチド２３および２４と比較して、ペプチド２２、２５および２６は、７５％以上安定である。ペプチドレベルは、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を使用して定量化された。２４時間後にヒト血漿（標識「血液」、各ペプチドについて右手のバー）およびＰＢＳ（各ペプチドについて左手のバー）中のペプチドの安定性を決定した。この実験において、ＰＢＳは対照として使用された。
【図４】陽性αｖβ６発現腫瘍および陰性対照腫瘍（Ａ３７５Ｐｕｒｏ）における１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡカップリングしたペプチドの取り込みを示す図である。ペプチドは、陰性腫瘍（赤色；各ペプチドについて左手のバー）と比較してαｖβ６発現腫瘍（青色；各ペプチドについて右手のバー）に特異的に取り入れられる。相対的取り込みは、Ａ３７５Ｐｕｒｏ：Ａ３７５β６比によって示される。データは、２５が、陰性腫瘍と比較してαｖβ６発現腫瘍に対してほぼ１０倍より特異的であることを示す。データは、ペプチド２２〜２６それぞれについて組織１グラム当たりの平均注入用量（ＩＤ）±平均の標準誤差（ＳＥＭ）としてプロットされる。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明について記述するにあたり、以下の用語を利用することとし、以下に示す通り定義されるものとする。
ペプチドバリアントおよび非天然アミノ酸
本明細書において定義される通り、本発明のペプチドは、親Ａ２０ＦＭＤＶ２ペプチドのバリアントであり、ペプチドが請求項に定義される通りであれば、１つまたは複数の非天然のアミノ酸を含んでもよい。適切な非天然のアミノ酸には、例えば、Ｄ−アミノ酸、オルニチン、ジアミノ酪酸オルニチン、ノルロイシンオルニチン、ピリジルアラニン（pyriylalanine）、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、フェニルグリシン、アルファおよびアルファ二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、トリフルオロチロシン、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン、ｐ−Ｉ−フェニルアラニンなどの天然のアミノ酸のハロゲン化誘導体、Ｌ−アリルグリシン、ｂ−アラニン、Ｌ−ａ−アミノ酪酸、Ｌ−ｇ−アミノ酪酸、Ｌ−ａ−アミノイソ酪酸、Ｌ−ｅ−アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、Ｌ−メチオニンスルホン、Ｌ−ノルロイシン、Ｌ−ノルバリン、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−チオプロリン、１−メチル−Ｐｈｅ、ペンタメチル−Ｐｈｅなどフェニルアラニンのメチル誘導体、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシル酸）、Ｌ−ジアミノプロピオン酸ならびにＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）がある。ペプチドは、さらに修飾されてもよい。例えば、１つまたは複数のアミド結合が、エステルまたはアルキル骨格結合によって置き換えられてもよい。ＮもしくはＣアルキル置換基、側鎖修飾またはジスルフィド架橋、側鎖アミドもしくはエステル結合などの制約があってもよい。
【００３７】
本発明のペプチドは、修飾ペプチドおよび合成ペプチド類似体の両方を含んでもよい。例えば、ペプチドを修飾して、製剤および貯蔵特性を改善し、または非ペプチド性構造を組み込むことによって、不安定なペプチド結合を保護してもよい。
【００３８】
本発明のペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端修飾を含んでもよい。例えば、Ｎ末端アセチル化および／またはＣ末端アミド化。
本発明のペプチドは、当業者に公知の方法を使用して調製されてもよい。例えば、ペプチドは、化学合成（例えば固相技術および自動化ペプチド合成装置）によって、または組換え手段（本明細書に記述される核酸などを使用する）によって産生されてもよい。例えば、ペプチドは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学を使用する自動化された複数ペプチド合成装置（Ａｂｉｍｅｄ  ＡＭＳ  ４２２）で固相戦略を使用して合成されてもよい。ペプチドは、次いで逆相−ＨＰＬＣによって精製され、凍結乾燥され得る。本発明のペプチドを作る特定の合成方法は、以下の実施例に記述される。
【００３９】
一部の場合において、Ｘ２およびＸ３は、らせん促進残基である。一部の場合において、Ｚｍアミノ酸は、らせん促進残基である。本明細書で使用される、らせん促進残基は、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、ＰｈｅおよびＡｓｐからなる群からそれぞれ独立に選択され得る。らせん促進残基は、１つまたは複数の人工または修飾アミノ酸を含んでもよい。
検出可能な部分
本明細書で使用される、本発明のペプチドは、検出可能な部分にコンジュゲートされてもよい。用語「検出可能な部分」は、患者に本発明のコンジュゲートを投与した後に標的部位に位置する場合に、身体の外側および標的が位置する部位から一般に非侵襲的に検出され得る部分に関する。したがって、本発明のこの態様のコンジュゲートは、画像化および診断に有用である。容易に検出可能な部分は、核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）、単光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）および陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）などの画像化技術ならびに光学的画像化によって検出可能な実体である。好ましくは、画像化部分は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ条件下でその特性を保持する安定かつ非毒性な実体である。そのような部分の例には、それだけには限らないが放射性部分、例えば放射性同位元素がある。適切な放射性原子には、シンチグラフィー研究用のインジウム１１１、テクネチウム９９ｍまたはヨウ素１２３がある。他の容易に検出可能な部分には、例えば、ヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素１８、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄などＭＲＩ用のスピン標識ならびにＣｙ５．５およびカンタムドットを含む光学的部分がある。検出可能な部分のさらなる例には、６８Ｇａ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、８９Ｚｒ、１２４Ｉ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ、１８Ｆ、８６Ｙ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、６７Ｇａおよび９９ｍＴｃがある。
【００４０】
用語「治療的部分」は、有益な、予防的および／または治療的特性を有する部分を包含する。
細胞傷害性化学療法薬は、当業者に周知であり：メクロレタミン（ＨＮ２）、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）およびクロラムブシルなどの窒素マスタードを含めたアルキル化剤；１０個のエチレンイミンおよびヘキサメチルメラミンなどのメチルメラミン、チオテパ；ブスルファンなどのアルキルスルホナート；カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＬＪ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮ−Ｕ）およびストレプトゾエイン（streptozoein）（ストレプトゾトシン）などのニトロソ尿素；ならびにダカルバジン（ＤＴＩＣ；ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド）などのトリアゼン；メトトレキサート（アメトプテリン）などの葉酸類似体を含めた代謝拮抗物質；フルオロウラシル（５−フルオロウラシル；５−ＦＵ）、フロキシウリジン（フルオロデオキシウリジン；ＦＵｄＲ）およびシタラビン（シトシンアラビノシド）などのピリミジン類似体；ならびにプリン類似体およびメルカプトプリン（６−メルカプトプリン；６−ＭＰ）、チオグアニン（６−チオグアニン；ＴＧ）およびペントスタチン（２’−デオキシコホルマイシン）などの関連阻害剤などの抗がん剤がある。天然物には、ビンブラスチン（ＶＬＢ）およびビンクリスチンなどのビンカアルカロイド；エトポシドおよびテニポシドなどのエピポドフィロトキシン；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびマイトマイシン（マイトマイシンＱなどの抗生物質；Ｌ−アスパラギナーゼなどの酵素；ならびにインターフェロンアルフェノーム（alphenomes）などの生物学的応答調節物質がある。その他の薬剤には、シスプラチン（ｃｉｓ−ＤＤＰ）およびカルボプラチンなどのプラチナ配位錯体；ミトキサントロンおよびアントラサイクリン（antbracycline）などのアントラセンジオン；水酸化尿素などの置換尿素；プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン、ＭＩＨ）などのメチルヒドラジン誘導体；ならびにミトタン（ｏ、ｐ’−ＤＤＤ）およびアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制剤；タキソールおよび類似体／誘導体；ならびにフルタミドおよびタモキシフェンなどのホルモンアゴニスト／アンタゴニストがある。
【００４１】
特に、本発明のペプチドは、オーリスタチン、マイタンシノイド、チューブリシン、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、アルファ−アマニチン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、イリノテカンおよびインドールカルボキサミド、またはその類似体、誘導体、プロドラッグもしくは活性代謝物から選択される抗がん剤にコンジュゲートされてもよい。特定の例は、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、メルタンシン（ＤＭ１）、ラブタンシン（ＤＭ４）およびセンタナマイシンを含む。
【００４２】
特定の場合において、抗がん剤は、細胞死をもたらす任意の部分を含む細胞傷害性ペプチドまたはポリペプチド部分であってもよい。
細胞傷害性ペプチドおよびポリペプチド部分は、当業者に周知であり、例えば、リシン、アブリン、シュードモナス外毒素、組織因子、等がある。
【００４３】
細胞毒性物質としてのリシンの使用は、Ｂｕｒｒｏｗｓ  ＆  Ｔｈｏｒｐｅ、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ  ９０：８９９６〜９０００頁、１９９３年に記述されており、参照により本明細書に組み込む、腫瘍の限局性血液凝固および梗塞をもたらす組織因子の使用は、Ｒａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４６４６〜４６５３頁、１９９８年およびＨｕａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：２５  ５４７〜５５０頁、１９９７年に記述されている。Ｔｓａｉら、Ｄｉｓ．Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ  ３８：１０６７〜１０７４頁、１９９５年は、モノクローナル抗体にコンジュゲートされたアブリンＡ鎖について記述しており、参照により本明細書に組み込む。他のリボソーム不活性化タンパク質が、ＷＯ９６／０６６４１において細胞毒性物質として記述されている。シュードモナス外毒素が、細胞傷害性ポリペプチド部分として使用されてもよい（例えば、Ａｉｅｌｌｏら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ  ９２：１０４５７〜１０４６１頁、１９９５年を参照のこと）。
【００４４】
特定の放射性原子も、充分な用量で送達される場合、細胞傷害性であり得る。したがって、抗がん剤は、使用時に、細胞傷害性となるのに充分な量の放射活性を標的部位に送達する放射性原子を含んでもよい。適切な放射性原子には、リン３２、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、レニウム１８６、レニウム１８８、アスタチン２１１もしくはイットリウム９０または隣接する細胞、細胞小器官もしくは核酸を破壊するのに十分なエネルギーを放射する他の任意の同位元素がある。特に、治療的放射性同位元素は、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２５Ａｃ、２２３Ｒａ、４４Ｓｃ、６７Ｇａ、１３１Ｉ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅおよび６７Ｃｕからなる群から選択され得る。好ましくは、本発明の化合物中の同位元素および放射性原子の密度は、４０００ｃＧｙより高く、より好ましくは少なくとも６０００、８０００または１００００ｃＧｙのような用量であり、その化合物は標的部位、好ましくは標的部位にある細胞およびその細胞の細胞小器官、特に核へ送達される。放射性原子は、公知の方法で結合部分に結合されてもよい。例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡまたは別のキレート化剤が本発明のペプチドに結合され、上記の通り１１１Ｉｎ、６８Ｇａ、９０Ｙを含めた金属放射性核種または放射性原子を結合するために使用されてもよい。チロシン残基が、本発明のペプチドに導入されてもよく、１２５Ｉまたは１３１Ｉで標識され得る。
【００４５】
治療的薬剤にペプチドをコンジュゲートする方法は、当業者に周知である。これらは、リンカー、例えば切断可能なリンカーの使用を含み得る。
用語「薬学的に許容可能な担体」は、ペプチドまたはそのコンジュゲートと適合し、レシピエントに対して有害でない成分を一般に含む。一般に、担体は、無菌であり発熱物質を含まないことになる水または生理食塩水になるが；他の許容できる担体が使用されてもよい。一般に、本発明の医薬組成物または製剤は、非経口投与用、より具体的には静脈内投与用である。
【００４６】
当業技術者に公知であろう通り、上で定義した本発明の医薬または医薬組成物は、他の医薬も投与される患者に有用に投与され得る。例えば、がんの場合、本発明の医薬または医薬組成物は、他の抗腫瘍剤の投与前、後もしくは最中、例えば化学療法の前、後もしくは最中に患者に投与されてもよい。化学療法後のペプチドによる処置は、腫瘍の再発または転移を減少もしくは防止するのに特に有用であり得る。例えば、抗腫瘍剤が、本発明のペプチドに直接または間接的に共有結合的に連結され得る。
【００４７】
αｖβ６発現の決定
当業者は、サンプル（腫瘍サンプルなど）がインテグリンαｖβ６を発現するかどうか決定する数多くの技術を承知していよう。特定の態様において、処置されるべき対象は、インテグリンαｖβ６を発現する細胞を１つまたは複数有する腫瘍を有してもよい。特定の場合において、腫瘍がインテグリンαｖβ６を発現する（すなわちαｖβ６陽性がんである）という所見は、前もって実施されてもよく、またはがんの型から推測されてもよい。例えば、いくつかの腫瘍型は、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍を含め、インテグリンαｖβ６を発現することが公知である。どんな特定の理論に束縛されることを望むものでもないが、本発明者らは、胃腸（ＧＩ）管のがんおよび多くの上皮組織から発達する癌腫が、本発明のペプチドまたはコンジュゲートを使用するαｖβ６標的化治療から恩恵を受け得ると信じている。さらなる研究努力によってαｖβ６を発現すると判明したがんの範囲が拡大するにつれて、その結果、本発明のペプチドまたはコンジュゲートを使用するαｖβ６標的化治療から治療的恩恵を呈し得るがんの範囲は広がると期待される。
【００４８】
さらにまたは別法として、特定の場合において、処置は、腫瘍がインテグリンαｖβ６を発現するかどうか決定する活性工程を含んでもよい。そのような工程を、例えば、本発明のαｖβ６標的化ペプチドまたはコンジュゲートによる処置を開始する前に実施して、本発明のαｖβ６標的化ペプチドまたはコンジュゲートを使用する治療に対する対象の適合見込みを予測してもよい。αｖβ６発現の決定は、免疫組織化学を使用する腫瘍サンプルにおけるタンパク質発現および／もしくはレベルの測定、ＥＬＩＳＡもしくはウェスタンブロッティングによる細胞溶解物中のタンパク質レベルの測定、ならびに／またはαｖβ６もしくはその断片もしくはサブユニットに特異的に結合できる結合剤の使用を含んでもよい。
【００４９】
特定の態様において、対象がαｖβ６陽性がんを有するかどうかの決定は、がん、血液中を循環しているがん細胞のサンプル、および／または血液もしくは血漿中を循環している腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）から得られる細胞のサンプルから抽出される核酸で実行されてもよい。
【００５０】
特定の場合において、αｖβ６の発現の決定は、がん細胞のサンプルからＲＮＡを抽出する工程と、リアルタイムＰＣＲおよび／またはαｖβ６もしくはその断片をコードしているＲＮＡにハイブリダイズすることができるプローブを使用することによって発現を測定する工程とを含む。αｖβ６インテグリンの存在または量は、抗体または本発明のペプチドもしくはコンジュゲートなど、αｖβ６もしくはその断片に特異的に結合する能力がある結合剤を使用して直接決定されてもよい。結合剤は、標識されているもしくは例えばＥＬＩＳＡ型アッセイにおいて検出可能な結果を生じることができる二次抗体を例えば使用して、１つまたは複数のさらなる種との反応後に検出され得るまたは検出でき得るように標識されてもよい。
【００５１】
サンプル
本明細書で使用される「試験サンプル」は、細胞または組織サンプル（例えば生検）、生体液、抽出物（例えば、対象から得られるタンパク質またはＤＮＡ抽出物）でもよい。特に、サンプルは、腫瘍サンプル、血液サンプル（血漿または血清サンプルを含む）、脳脊髄液サンプルまたは非腫瘍組織サンプルでもよい。サンプルは、対象から新たに得られたものでもよくまたは決定を行う前に処理および／もしくは貯蔵された（例えば凍結、固定または１つもしくは複数の精製、富化もしくは抽出工程に供された）ものでもよい。循環腫瘍ＤＮＡのために血液または血漿サンプルを富化する技術（例えば断片サイズに基づく）が、記述されている。さらに、ｃｔＤＮＡ内のがん関連突然変異を同定する配列決定技術が、記述されている（例えばデジタルＰＣＲ、標的ディープシーケンシング、ネステッドリアルタイムＰＣＲ、等に基づく）。
【００５２】
本明細書において使用される「および／または」は、他の有無にかかわらず２つの指示された特色または成分のそれぞれについての特定の開示と見なすべきである。例えば「Ａおよび／またはＢ」は、まさにそれぞれが本明細書において個別に提示されるかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれについての特定の開示と見なすべきである。
【００５３】
特定の形態においてまたは開示されている機能を実行する手段に関して表される前述の説明もしくは以下の請求項もしくは添付の図面に開示されている特色、または開示されている結果を得る方法もしくは工程は、必要に応じて、別々にまたはそのような特色の任意の組合せで、その多様な形態の本発明を理解するために利用され得る。
【００５４】
本発明は、上述した典型的な態様と組み合わせて記述されているが、本開示を与えられた場合、多くの同等の修飾および変形が、当業技術者にとって明らかであろう。したがって、上に記載の本発明の典型的な態様は、例示的なものであり、制限するものではないと見なされる。記述されている態様に対する様々な変更が、本発明の精神と範囲から逸脱することなく行われてもよい。いかなる誤解も避けるために、本明細書に提供されるあらゆる理論的な説明は、読者の理解を改善する目的で提供される。本発明者らは、これらの理論的な説明のいずれによっても束縛されないことを望む。
【００５５】
本明細書に使用されるどんな見出しも、単なる構成の目的であり、記述されている主題を限定するものと解釈されるべきでない。
この明細書の全体を通じて、続く請求項を含めて、文脈上別段の解釈を要する場合を除き、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形は、述べられる整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を内包するが、他の任意の整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を除外しないことを意味すると理解されよう。明細書および添付の請求項に使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈に別段の明確な指図がない限り複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。範囲は、「約」ある特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして本明細書に表現されてもよい。そのような範囲が表現される場合、別の態様は、ある特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、先の「約」の使用によって値が近似値として表現される場合、特定の値が別の態様を形成することが理解されよう。数値に関する用語「約」は、随意であり、例えば＋／−１０％を意味する。
【００５６】
以下は、例として示されるものであり、本請求項の範囲に対する制限と解釈されるべきでない。
【実施例】
【００５７】
フローサイトメトリーによってαｖβ６インテグリンに対する結合活性が測定可能になるように、全てのペプチドを、天然のＡｌａの代わりに２Ｌｙｓ（Ｄ−ビオチン）残基を組み込んで合成した（すなわち、ＷＯ２００７／０３９７２８に開示されている通り、Ａ２０ＦＭＤＶ２は２位にＡｌａを有する）。比較のために、自身でＳＰＰＳ合成したペプチドを商業的に合成されたビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２（下の表２においてビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２−Ａと呼ぶ）と比較した。活性研究後に、強力な結合活性を呈したビオチン化ペプチドを次いで選択し、金属キレート化剤ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）［１７］を組み込んで、血漿安定性研究およびｉｎ  ｖｉｖｏ体内分布研究のための１１１Ｉｎのカップリングを容易にした。ビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２、その非タンパク新生誘導体ならびにビオチン化およびＤＰＴＡ組み込み類似体の合成、結合研究および血漿安定性について、以下で詳細に記述する。
【００５８】
実験
全般的な情報
全ての試薬を試薬品質で購入し、それ以上精製することなく使用した。ＨＰＬＣ溶媒をＨＰＬＣ品質で購入し、それ以上精製することなく使用した。ＦｍｏｃＮＨ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｏ−ＣＨ２−ｐｈｉ−ＯＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈを、ＰｏｌｙＰｅｐｔｉｄｅ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、Ｒｉｎｋアミド、４−（ヒドロキシメチル）フェノキシ酢酸（ＨＭＰ）、Ｂｏｃ無水物およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を、ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）から購入した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（ＡＲ品質）およびアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）（ＨＰＬＣ品質）を、Ｓｃｈａｒｌａｕ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）から購入した。ジイソプロピルエチルアミン（ｉＰｒ２ＮＥｔ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ピペリジン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、コリジン、１，８−ジアザビシクロウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、２−メルカプトエタノール、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）および３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール（ＤＯＤＴ）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。２−ニトロベンゼンスルホニルクロリド（２−ＮＢＳ−Ｃｌ）および硫酸ジメチル（ＤＭＳ）を、ＡＫ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から入手した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を、Ｏａｋｗｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｒｉｖｅｒ  Ｅｄｇｅ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から購入した。アミノメチルポリスチレン樹脂およびＤＴＰＡを、公開されている手順にしたがって合成した［２１、２２］。以下の側鎖保護を持つＦｍｏｃ−アミノ酸を、ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍから購入した：Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（Ｐｂｆ＝２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｔｒｔ＝トリフェニルメチル）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−ＯＨ（ｔＢｕ＝ｔ−ブチル）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ。
【００５９】
エレクトロスプレーイオン化質量スペクトル（ＥＳＩ−ＭＳ）を、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）１１００ＭＳＤ分光計に直列に接続したＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）１１２０  Ｃｏｍｐａｃｔ  ＬＣで記録した。サンプルを、０．１％ギ酸／Ｈ２Ｏおよび０．１％ギ酸／ＣＨ３ＣＮ（１：１、容積／容積）を使用して、ポジティブモードで、ＥＳＩ供給源に０．２ｍＬ／分で直接フローインジェクションを使用して導入した。主要なおよび著しい断片が、形態ｘ  ｍ／ｚ（電荷に対する質量比）で提示された。分析ＲＰ−ＨＰＬＣを、流速１ｍＬ／分でＷａｔｅｒｓ  ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８カラム（５μｍ、４．６×１５０ｍｍ）を使用してＵｌｔｉｍａｔｅ  ３０００システムで実行した。０．１％  ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（溶媒Ａ）および０．１％  ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ（溶媒Ｂ）の直線勾配を、２１０ｎｍの検出で使用した。分取ＲＰ−ＨＰＬＣを、流速１０ｍＬ／分でＷａｔｅｒｓ  ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｐｒｅｐ  ＭＳ  Ｃ１８カラム（１０μｍ、１９×３００ｍｍ）を使用してＷａｔｅｒｓ  ２４８７二波長吸光度検出器を備えたＷａｔｅｒｓ６００システムで実行した。勾配システムを、溶出プロファイルおよび分析ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムから得られるピークプロファイルにしたがって調整した。
【００６０】
全般的なペプチド合成手順
固相ペプチド合成（０．１ｍｍｏｌ規模）を、Ｆｍｏｃ化学戦略に基づいてアミノメチルポリスチレン樹脂（０．８ｍｍｏｌ／ｇ）上で実行した。ＦｍｏｃＮＨ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｏ−ＣＨ２−ｐｈｉ−ＯＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈを、全般的な方法Ａ（下記参照）を使用して樹脂に結合させ、Ｒｉｎｋアミドを、全般的な方法Ｂを使用して樹脂に結合させ、ＨＭＰを、全般的な方法Ｃを使用して樹脂にカップリングした［２０］。Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨのカップリングを、全般的な方法Ｄを使用して達成した。所望のペプチド配列を、手作業でまたは全般的な方法Ｅを使用してＴｒｉｂｕｔｅ（商標）（Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）ペプチド合成装置で合成し、ペプチド結合Ｎ−メチル化を、全般的な方法Ｆを使用して実施し［１９］、Ｎメチル化リジンへのＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨのカップリングを、全般的な方法Ｇを使用して実施した。Ｎ末端アセチル化を、全般的な方法Ｈを使用して実施し、ｔ−ブチル保護されたＤＴＰＡを、全般的な方法Ｉを使用してペプチドにカップリングした。Ｄ−ビオチンを、全般的な方法Ｊを使用してペプチドに結合させた。直鎖ペプチドを、全般的な方法Ｋを使用して樹脂から切断し、粗産物を、全般的な方法Ｌにしたがって精製した。
【００６１】
全般的な方法Ａ：アミノメチルポリスチレン樹脂へのＦｍｏｃＮＨ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｏ−ＣＨ２−ｐｈｉ−ＯＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈの結合
アミノメチルポリスチレン樹脂（０．１ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２／ＤＭＦ（１：１、容積／容積）中で２０分間膨潤させ、溶媒を濾過によって除去した。樹脂に、１０％  ＤＭＦ／ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ、容積／容積）中のＦｍｏｃＮＨ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｏ−ＣＨ２−ｐｈｉ−ＯＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ（２当量）溶液、その後ＤＩＣ（２当量）を添加し、反応混合物を室温で３時間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）、ＣＨ２Ｃｌ２（３×５ｍＬ）で洗浄し、風乾して１６を得た。陰性カイザー試験［４１］は、完全な反応を示した。
【００６２】
全般的な方法Ｂ：アミノメチルポリスチレン樹脂へのＲｉｎｋアミドの結合
アミノメチルポリスチレン樹脂（０．１ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２／ＤＭＦ（１：１、容積／容積）中で２０分間膨潤させ、溶媒を濾過によって除去した。樹脂に、１０％  ＤＭＦ／ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ、容積／容積）中のＲｉｎｋアミド（２当量）溶液、その後ＤＩＣ（２当量）を添加し、反応混合物を室温で３時間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）、ＣＨ２Ｃｌ２（３×５ｍＬ）で洗浄し、風乾した。陰性カイザー試験は、完全な反応を示した。
【００６３】
全般的な方法Ｃ：アミノメチルポリスチレン樹脂への４−（ヒドロキシメチル）フェノキシ酢酸（ＨＭＰ）の結合（樹脂２７の合成）
アミノメチルポリスチレン樹脂（０．１ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２／ＤＭＦ（１：１、容積／容積）中で２０分間膨潤させ、溶媒を濾過によって除去した。樹脂に、１０％  ＤＭＦ／ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ、容積／容積）中のＨＭＰ（２当量）溶液、その後ＤＩＣ（２当量）を添加し、反応混合物を室温で３時間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）、ＣＨ２Ｃｌ２（３×５ｍＬ）で洗浄し、風乾して２７を得た。陰性カイザー試験は、完全な反応を示した。
【００６４】
全般的な方法Ｄ：ＨＭＰ樹脂２７へのＦｍｏｃ−Ｄ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨの結合
樹脂にＤＭＦ（１ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｄ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（２当量）溶液およびＤＩＣ（２当量）を添加し、その後ＤＭＦ（１００μＬ）中のＤＭＡＰ（１０％当量）を滴下した。反応混合物を室温で２時間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した後、エステル化をさらなる２時間繰り返した。樹脂に２０％酢酸無水物／ＤＭＦ（１ｍＬ）を添加し、ＤＭＦ（１００μＬ）中のＤＭＡＰ（１０％当量）溶液を滴下し、反応混合物を室温で１時間撹拌し、その後溶液を排液し、樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した。
【００６５】
全般的な方法Ｅ：手作業および自動化されたＦｍｏｃ  ＳＰＰＳ
ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＦｍｏｃ保護されたアミノ酸（５当量）溶液にＨＢＴＵ（４．７５当量）およびｉＰｒ２ＮＥｔ（１０当量）を添加し、溶液を樹脂に添加した。混合物を室温で３０分間撹拌した後、溶液を排液し、樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ保護基を、室温で５分間次いで１０分間の２０％ピペリジン／ＤＭＦ（５ｍＬ、容積／容積）による処理によって除去した。
【００６６】
全般的な方法Ｆ：ペプチド結合Ｎ−メチル化
ＮＢＳ保護：ＮＭＰ（１ｍＬ）中の２−ＮＢＳ−Ｃｌ（４当量）溶液にコリジン（１０当量）を添加し、溶液を樹脂に添加し、反応混合物を室温で１５分間攪拌した。溶液を排液し、樹脂をＮＭＰ（３×５ｍＬ）で洗浄した後、反応をさらなる１０分間繰り返した。Ｎ−メチル化：樹脂にＮＭＰ（１ｍＬ）中のＤＢＵ（３当量）溶液を添加し、反応混合物を室温で３分間撹拌した。ＮＭＰ（１ｍＬ）中のＤＭＳ（１０当量）溶液を反応混合物に次いで添加し、反応混合物を室温で２分間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をＮＭＰ（３×５ｍＬ）で洗浄した後、反応をさらなる２分間繰り返した。ＮＢＳ脱保護：樹脂にＮＭＰ（２ｍＬ）中の２−メルカプトエタノール（１０当量）およびＤＢＵ（５当量）溶液を添加し、反応混合物を室温で５分間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をＮＭＰ（３×５ｍＬ）で洗浄した後、反応をさらなる５分間繰り返した。
【００６７】
全般的な方法Ｇ：Ｎメチル化ＬｙｓへのＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨのカップリング
ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（５当量）溶液にＨＡＴＵ（４．７５当量）およびｉＰｒ２ＮＥｔ（１０当量）を添加し、溶液を樹脂に添加し、反応混合物を室温で３時間攪拌した。溶液を排液し、樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した後、反応をさらなる３時間繰り返した。
【００６８】
全般的な方法Ｈ：Ｎ末端アセチル化
樹脂に２０％酢酸無水物／ＤＭＦ（１ｍＬ）溶液を添加し、その後ＤＭＦ（１００μＬ）中のＤＭＡＰ（１０％当量）溶液を滴下した。反応混合物を室温で３０分間撹拌した後、溶液を排液し、樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した。
【００６９】
全般的な方法Ｉ：ｔ−ブチル保護ＤＴＰＡの結合
ＤＭＦ（１ｍＬ）中の４２（５当量）溶液にＨＢＴＵ（４．７５当量）およびｉＰｒ２ＮＥｔ（１０当量）を添加し、溶液を樹脂に添加した。混合物を室温で３０分間撹拌した後、溶液を排液し、樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した。
【００７０】
全般的な方法Ｊ：Ｄ−ビオチンの結合
ペプチド１〜１５およびペプチド１７、１９、２０および２１の合成のために、Ｎ末端Ｆｍｏｃ基を、室温で５分間次いで１０分間の２０％ピペリジン／ＤＭＦ（５ｍＬ、容積／容積）による処理によって除去した。ＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した後、ＤＭＦ（１ｍＬ）中の（Ｂｏｃ）２Ｏ（５当量）溶液を樹脂に添加し、反応混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで、ＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した。Ｄｄｅ基を、２％ヒドラジン／ＤＭＦ（５ｍＬ、容積／容積）を室温で５分間使用することによって除去し、新鮮な試薬で１０分間繰り返した。ＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した後、ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＤ−ビオチン（５当量）、ＨＢＴＵ（４．７５当量）およびｉＰｒ２ＮＥｔ（１０当量）溶液を樹脂に添加し、反応混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで、ＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した。
【００７１】
ペプチド１６および１８およびペプチド２２〜２６の合成のために、Ｄｄｅ基を、２％ヒドラジン／ＤＭＦ（５ｍＬ、容積／容積）を室温で５分間使用することによって除去し、新鮮な試薬で１０分間繰り返した。ＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した後、ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＤ−ビオチン（５当量）、ＨＢＴＵ（４．７５当量）およびｉＰｒ２ＮＥｔ（１０当量）溶液を樹脂に添加し、反応混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで、ＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した。
【００７２】
全般的な方法Ｋ：樹脂からのペプチドの切断
所望の直鎖ペプチドを含有する樹脂を、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＤＯＤＴ／ＴＩＰＳ（９４：２．５：２．５：１．０、５ｍＬ、容積／容積／容積／容積）の混合物中で３時間撹拌した。濾液に冷ジエチルエーテル（３０ｍＬ）を添加し、上清を廃棄する前に産物混合物を１０分間遠心分離した。この手順を２回繰り返した。得られた固体を、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ＋０．１％ＴＦＡ溶液（１５ｍＬ）に溶解し、凍結乾燥した。
【００７３】
全般的な方法Ｌ：精製
粗ペプチドを、Ｈ２Ｏ／０．１％  ＴＦＡ溶液に溶解し、流速１０ｍＬ／分で、０．５％Ｂ／分で５〜２０％Ｂ、次いで３５％Ｂまで０．２％Ｂ／分の勾配を使用してＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８カラムで分取逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣによって精製した。ペプチドの純度を、フローインジェクション（ＥＳＩ＋、１００Ｖ）および分析ＲＰ−ＨＰＬＣ［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８カラム、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１ｍＬ／分］によって決定した。
【００７４】
生物学研究
ペプチドの調製
比較ために、商業的に供給されているビオチン化ＤＯＴＡ−Ａ２０ＦＭＤＶ２ペプチド（純度９５％）を、ＰＰＲ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）から購入した点に注意されたい。ペプチドを０．１％  ＴＦＡ（水に希釈した）に再懸濁して濃度１ｍＭの保存溶液を調製し、分注し、−２０℃で貯蔵した。
【００７５】
細胞株
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで使用した細胞株は、形質導入した黒色腫株Ａ３７５Ｐｐｕｒｏ、およびＡ３７５Ｐβ６である［ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）／１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で培養した］［９］。
【００７６】
ペプチドの結合の特異性およびレベル−フローサイトメトリー方法
細胞をトリプシン処理し、ＤＭＥＭ／０．１％（質量／容積）アジ化ナトリウム／０．１％（質量／容積）ＢＳＡ（フロー培地）に再懸濁して、４×１０６個細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。この時点から全てを氷上に保ち、細胞懸濁液５０μＬを、各フローチューブ（ファルコン２０５４−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に分注した。ペプチドを、２×濃度でフロー培地中に段階的に希釈した。したがって各濃度５０μＬを細胞５０μＬに添加した場合、終濃度１０００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭおよび０ｎＭを得た。Ａ３７５Ｐｐｕｒｏ細胞の場合、最高濃度の１０００ｎＭだけを細胞に添加した。次いでペプチドを、氷上に１５分間放置した。次いで、細胞をフロー培地に再懸濁し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離することにより２回洗浄した。
【００７７】
マウス抗ビオチン［１：２００で５０μＬ；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（２００−００２−２１１）］を各サンプルに１５分間添加し、次いで洗浄工程を繰り返した。Ａｌｅｘａ  ４８８にコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（１：２５０）を、各サンプルに添加し（５０μＬ）、暗所で氷上に１５分間放置した。洗浄工程を繰り返し、細胞をフロー培地３８０μＬに再懸濁した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ血球計算器（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、データを取得し；幾何平均蛍光強度を各サンプルについて記録した。
【００７８】
内部移行アッセイ方法−Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍおよびフローサイトメトリー
細胞をトリプシン処理し、ＤＭＥＭ（無血清培地）に再懸濁して４×１０６個細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。この時点から全てを氷上に保った。細胞懸濁液５０μＬを、各フローチューブに分注した。ペプチドを氷冷無血清培地中に２００ｎＭになるよう希釈し、細胞サンプルに５０μＬを添加した後に終濃度１００ｎＭを得た。ペプチドを氷上に１５分間放置し、次いでフロー培地で２回洗浄し、各洗浄工程の間に１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。マウス抗ビオチン（１：２００で５０μＬ）を各サンプルに１５分間添加し、次いで洗浄工程を繰り返した。０時点を除いて、時点サンプルのそれぞれを、３７℃で１５、３０および４５分間インキュベーター内に置き、細胞を、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳで再度洗浄する前に０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００界面活性剤を５分間添加した。ＡｌｅｘａＦＬＵＯＲ  ４８８にコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（１：２５０）を、各サンプルに添加し（５０μＬ）、暗所で氷上に１５分間放置した。サンプルを上記のように洗浄し、３０μＬになるように再懸濁した。サンプルを、Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍ  Ｘ  Ｍａｒｋ  ＩＩ（Ａｍｎｉｓ、Ｍｅｒｃｋ）で検査し、Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍ画像を、搭載されているソフトウェアを使用して０分のサンプルと比較して内部移行について評価した。
【００７９】
内部移行アッセイ方法−フローサイトメトリー
細胞を、抗体でビオチンを検出する前に界面活性剤を添加しなかったことを除いて上記の通り調製した。サンプルを、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）血球計算器で分析した。経時的に測定した蛍光シグナルの減少は、Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍを使用して視覚的に確認したように、結合しているペプチドの内部移行と関連付けられた（データ不掲載）。
【００８０】
血漿安定性
ＤＴＰＡコンジュゲートしたペプチド１５μｇにインジウム１１１（Ｃｏｖｉｄｉｅｎ−Ｐｅｔｔｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）１５ＭＢｑを添加し（最終容積２０μＬ）、その後酢酸アンモニウム（１Ｍ）５μＬを添加した。サンプルを混合し、室温で３０分間放置した。この混合物２μＬを蒸留水１００μＬに添加し、次いで混合物を勾配逆相−ＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ）に注射した。サンプルを、蒸留水中の０．１％  ＴＦＡ中でＡｇｉｌｅｎｔ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８カラムに流した。これは、一般に＞９５％である放射標識の効率を確認するためであった。ヒト血液を、ナトリウムヘパリン管に採取し、２０００ｇで１０分間遠心分離した。血漿（３００μＬ）を、７．５ＭＢｑのバリアントペプチドとインキュベートし、直ちに１５０μＬを除去し、３７℃に置き、残りの１５０μＬを、時間０分サンプルとして使用した。これに、氷冷アセトニトリル等容積を添加し（１：１）、サンプルを混合し、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を採集し、１０分間吸引乾燥してアセトニトリルを除去した。残滓を、０．２２μｍフィルターによって濾過し（微粒子を除去するため）、１００μＬを放射ＨＰＬＣ機械に注射した。２４時間サンプルを同様に処理した。対照サンプルをＰＢＳとインキュベートした。（注意：ＰＢＳ対照は、濾過のこの工程またはアセトニトリルの添加を必要としなかった）。サンプルを複製して実行し、類似の結果であった。
【００８１】
体内分布
１００μＬ中に２×１０６個の細胞を、雌ＣＤ１  Ｎｕ／Ｎｕマウスの肩に皮下注射した。腫瘍を、左肩（Ａ３７５Ｐｕｒｏ）および右肩（Ａ３７５β６）で２週間にわたり皮下成長させた。腫瘍が、直径およそ５ｍｍに成長したら、ペプチドをインジウム１１１で放射性標識し、放射ＨＰＬＣによって分析して標識効率を決定した。標識されたペプチドを無菌ＰＢＳ／ＢＳＡに希釈し、動物１匹当たり０．３ＭＢｑを与えるように投薬した。次いでマウスに放射性標識ペプチドを静脈内（尾静脈）注射し、１時間後に殺処分した。血液、器官および腫瘍を摘出し、計量し、その翌日残留活性をガンマカウンター（ＬＫＢ  Ｃｏｍｐｕｇａｍｍａ）で測定した。データを、％注射用量／ｇ組織（％ＩＤ／ｇ）として表した。
【００８２】
ペプチド特徴付けデータ
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（１）（配列番号１１）
ペプチド（１）（９７．１ｍｇ、５０％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１３．２分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２２４．３；Ｆｏｕｎｄ  １２２３．６。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱｋＶＡＲＴ−ＯＨ（２）（配列番号１２）
ペプチド（２）（５４．３ｍｇ、２２％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１１．９分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２２４．３；Ｆｏｕｎｄ  １２２３．７。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱ［オルニチン］ＶＡＲＴ−ＯＨ（３）（配列番号１３）
ペプチド（３）（６３．５ｍｇ、２６％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．７分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２１７．３；Ｆｏｕｎｄ  １２１６．７。
ペプチドＮ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱ［ジアミノ酪酸］ＶＡＲＴ−ＯＨ（４）（配列番号１４）
ペプチド（４）（７０．３ｍｇ、２９％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．７分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２１０．３；Ｆｏｕｎｄ  １２０９．８。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱ［ジアミノプロピオン酸］ＶＡＲＴ−ＯＨ（５）（配列番号１５）
ペプチド（５）（５９．９ｍｇ、２５％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．９分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２０３．２；Ｆｏｕｎｄ  １２０３．１。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱ−Ｎ−ＭｅＫＶＡＲＴ−ＯＨ（６）（配列番号１６）
ペプチド（６）（７２．７ｍｇ、３０％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１１．５分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２３１．３；Ｆｏｕｎｄ  １２３０．７。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶ［アミノイソ酪酸］ＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（７）（配列番号１７）
ペプチド（７）（１６．６ｍｇ、７％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１１．９分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２０９．７；Ｆｏｕｎｄ  １２１０．２。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶ［ノルバリン］ＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（８）（配列番号１８）
ペプチド（８）（１９．５ｍｇ、８％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．２分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２１６．８；Ｆｏｕｎｄ  １２１７．２。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶ［ノルロイシン］ＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（９）（配列番号１９）
ペプチド（９）（１８．７ｍｇ、８％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．７分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２２３．８；Ｆｏｕｎｄ  １２２４．７。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶ［アリルグリシン］ＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（１０）（配列番号２０）
ペプチド（１０）（５．５ｍｇ、２％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１１．７分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２１５．７；Ｆｏｕｎｄ  １２１５．８。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶ［ｔ−ブチル−アラニン］ＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（１１）（配列番号２１）
ペプチド（１１）（７．５ｍｇ、３％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．９分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２３０．８；Ｆｏｕｎｄ  １２３０．７。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶ［ホモロイシン］ＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（１２）（配列番号２２）
ペプチド（１２）（２６．１ｍｇ、１１％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１３．１分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２３０．８；Ｆｏｕｎｄ  １２３１．２。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶ［２−アミノ−３−エチルペンタン酸］ＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（１３）（配列番号２３）
ペプチド（１３）（１０．１ｍｇ、４％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．９分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２３０．８；Ｆｏｕｎｄ  １２３０．８。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶ［シクロヘキシルアラニン］ＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（１４）（配列番号２４）
ペプチド（１４）（６．２ｍｇ、２％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１３．４分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２４３．８；Ｆｏｕｎｄ  １２４４．２。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶ［アダマンチルグリシン］ＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（１５）（配列番号２５）
ペプチド（１５）（２２．４ｍｇ、９％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１３．７分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２６２．８；Ｆｏｕｎｄ  １２６３．３。
【００８３】
ペプチド（１６）
ペプチドＡｃＨＮ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（１６）（配列番号１１）（Ｎ末端アセチル化）（３０．１ｍｇ、１２％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１３．９分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２４４．８；Ｆｏｕｎｄ  １２４５．２。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＮＨ２（１７）（配列番号１１）（Ｃ末端アミド化）
ペプチド（１７）（１３．４ｍｇ、５％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９５％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１３．５分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２２３．８；Ｆｏｕｎｄ  １２２３．３。
【００８４】
ペプチド（１８）
ペプチドＡｃＨＮ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＮＨ２（１８）（配列番号１１）（Ｎ末端アセチル化およびＣ末端アミド化）（１２．５ｍｇ、５％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９５％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１３．９分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２４４．３；Ｆｏｕｎｄ  １２４４．６。
ペプチドＨ２Ｎ−ｎＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（１９）（配列番号８）
ペプチド（１９）（４７．７ｍｇ、１９％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９５％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．６分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２２３．８；Ｆｏｕｎｄ  １２２４．１。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲｔ−ＯＨ（２０）（配列番号２６）
ペプチド（２０）（４５．３ｍｇ、１９％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９５％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１３．０分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２２３．８；Ｆｏｕｎｄ  １２２４．２。
ペプチドＨ２Ｎ−ｎＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲｔ−ＯＨ（２１）（配列番号９）
ペプチド（２１）（３６．４ｍｇ、１５％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９５％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．９分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２２３．８；Ｆｏｕｎｄ  １２２４．４。
ペプチドＤＴＰＡ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（２２）（配列番号１１）（Ｎ末端ＤＴＰＡ）
ペプチド（２２）（５３．７ｍｇ、２４％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１３．３分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１４１１．９；Ｆｏｕｎｄ  １４１１．６。
ペプチドＤＴＰＡ−ｎＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（２５）（配列番号８）（Ｎ末端ＤＴＰＡ）
ペプチド（２５）（３７．５ｍｇ、１３％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９５％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．６分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１４１１．３；Ｆｏｕｎｄ  １４１０．６。
ペプチドＤＴＰＡ−ｎＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲｔ−ＯＨ（２６）（配列番号９）（Ｎ末端ＤＴＰＡ）
ペプチド（２６）（１２．５ｍｇ、４％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９５％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．９分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１４１１．３；Ｆｏｕｎｄ  １４１０．６。
ペプチドＤＴＰＡ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＮＨ２（２４）（配列番号１１）（Ｎ末端ＤＴＰＡおよびＣ末端アミド化）
ペプチド（２４）（１２．１ｍｇ、４％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９５％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１３．０分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１４１０．８；Ｆｏｕｎｄ  １４１０．１。
ペプチドＤＴＰＡ−ＧＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（２３）（配列番号２７）（Ｎ末端ＤＴＰＡ）
ペプチド（２３）（４１．９ｍｇ、１５％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９５％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．６分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１４３９．９；Ｆｏｕｎｄ  １４３９．２。
【００８５】
実施例１−ビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２  １、Ｌｙｓ１６またはＬｅｕ１３修飾およびビオチン化ペプチド２〜１５、Ｎ−および／またはＣ末端修飾およびビオチン化ペプチド１６〜２１ならびに（ＤＴＰＡ）含有ペプチド２２〜２６の合成。
【００８６】
Ａ２０ＦＭＤＶ２結合活性に対する非タンパク新生アミノ酸（図１に挙げる）の導入の調査を可能にするために、ペプチド６を除くビオチン化ペプチド１〜１５（表１を参照のこと）を、スキーム１に図示される条件を使用してＣ末端カルボン酸を送達する酸不安定性ヒドロキシメチルフェノキシプロピオン酸リンカー（ＨＭＰＰ）上で標準的なＦｍｏｃ  ＳＰＰＳによって合成した。所望のペプチド配列を、２０％ピペリジン／ＤＭＦを使用して取り付けて、Ｆｍｏｃ保護基およびカップリング試薬であるＯ−（ベンゾトリアゾール（benzotriazol）−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸（ＨＢＴＵ）／ＤＩＰＥＡを除去した。
【００８７】
αｖβ６インテグリンに対する特異的結合をフローサイトメトリーによって研究するので、Ａ２０ＦＭＤＶ２（１）の第２残基である天然のアラニンおよびその全ての類似体を、ビオチン化リジン残基で置換した。この置換は、よい耐性を示すことがこれまでに示されている［２４、２５］。側鎖Ｎε−アミノ基上の１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキス−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）［１９］基を選択的に脱保護し、その後ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡを使用してＤ−ビオチンと縮合することによってＤ−ビオチン部分を組み込むことを選択した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ２Ｏ／３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール（ＤＯＤＴ）／トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）（９４：２．５：２．５：１．０、容積／容積／容積／容積）は、対応するペプチジル樹脂からの合成ペプチドの切断をもたらした。ペプチド１〜１５を、２％〜５０％の範囲の優れた収量および９９％を超える純度で得た（ペプチド特徴付けデータを参照のこと）。
【００８８】
Ｎ−Ｌ−メチルリジン修飾を含有するペプチド６を合成するために、ＴＦＡ媒介ペプチド切断およびＲＰ−ＨＰＬＣ精製後に優れた収量（３０％）でペプチド６を与える樹脂上でのＮ−メチル化プロトコール［２２］を利用した。
【００８９】
全て天然に存在するアミノ酸を含有するリードペプチド、Ａ２０ＦＭＤＶ２は、アミノおよびカルボキシ末端に作用するエキソペプチダーゼによる分解の影響を受けやすいはずである。これを軽減するために、６個のＮおよび／またはＣ末端修飾ならびにビオチン化Ａ２０ＦＤＭＶ２模倣体を調製し、アミノおよびカルボキシ端（ペプチド１６〜１８）ならびにＮ末端およびＣ末端アミノ酸（それぞれＡｓｎ１およびＴｈｒ２０、ペプチド１９〜２１）を系統的に修飾した。Ｎ末端／Ｃ末端修飾したペプチド１６〜１８を、Ｎ末端を無水酢酸でキャッピングする（１６）もしくはＲｉｎｋアミドリンカーを利用してＣ末端カルボキサミドを与える（１７）または両方を組合せる（ペプチド１８）ことによって得た。
【００９０】
ビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２（１）のＮ末端で天然のＡｓｎ１の場所に非天然のＤ−Ａｓｎ１を有するペプチド１９を、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ構成単位をＮ末端残基として合成に組み込んだことを除いてスキーム１に概説されている合成経路を使用して得た。Ｃ末端で非天然のＤ−Ｔｈｒを含有するペプチド２０および２１を調製するために、ＨＭＰを固定している樹脂２７（スキーム１、ＨＭＰ＝ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸を参照のこと）を、ＤＩＣ／ＤＭＡＰを使用してＦｍｏｃ−Ｄ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨで最初にエステル化し、次いで配列をＦｍｏｃ  ＳＰＰＳによって伸長させた。
【００９１】
【表１】
2020518656.tif 000002
【００９２】
【化１】
2020518656.tif 000003
【００９３】
スキーム１．ビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２ペプチドバリアントの調製の合成プロトコール。
結合アッセイから得られた結果（表２、後を参照のこと）は、１のＮおよびＣ末端の修飾（それぞれペプチド１６および１７）、またはＡ２０ＦＭＤＶ２（１）の天然のＡｓｎ１およびＡｓｎ１とＴｈｒ２０両方の残基の、Ｄ対応物への置換（それぞれペプチド１９および２１）が、１と比較して生物学的活性の改善を呈するペプチドをもたらすことを示した。したがって、ヒト血漿における細胞内部移行研究および分解アッセイを実施できるように、その４つのＮおよびＣ終点修飾類似体（１６、１８、１９および２１）を、ＤＴＰＡキレート化剤を組み込むために選択した。含ＤＴＰＡビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２ペプチド（２２）も対照として調製した［２５］。
【００９４】
スキーム１に図示した通り、含ＤＴＰＡビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２ペプチド２２および類似体２３〜２５を、Ｆｍｏｃ  ＳＰＰＳ条件（Ｆｍｏｃ保護基除去のために２０％ピペリジン／ＤＭＦおよびカップリング試薬としてＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ）を使用して合成した。Ａ２０ＦＭＤＶ２のＮ末端でＤＴＰＡ、Ｌｙｓ２の側鎖でＤ−ビオチンを結合させるために、Ｎ末端Ｆｍｏｃ保護基を２０％ピペリジン／ＤＭＦを使用して最初に除去し、ｔ−ブチル保護ＤＴＰＡ［２１］を、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡを使用して、得られたＮα−アミノ基にカップリングした。ＤＴＰＡの４つのカルボン酸が、酸不安定性ｔ−ブチルエステルとして保護されたので、Ｄｄｅ保護基を２％ヒドラジン／ＤＭＦを使用して選択的に除去し、Ｄ−ビオチンをＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡを使用して側鎖アミノリジルにカップリングすることができる。ＤＴＰＡリガンドの組み込みを可能にするためのペプチド２３および２４の場合、グリシンスペーサーを利用してペプチド１６および１８のアセチル基を模倣し、それによりアミド結合形成を介するＤＴＰＡの容易な結合を可能にした。
【００９５】
実施例２−ペプチドバリアントの生物学的活性
元のＡ２０ＦＭＤＶ２より優れているペプチドバリアントがあるとすると、それはどのペプチドバリアントか試験するために、Ａ３７５Ｐβ６細胞株におけるインテグリンαｖβ６の発現［９］を除いて遺伝的に同一である２つの細胞株（Ａ３７５ＰｐｕｒｏおよびＡ３７５Ｐβ６）を使用して一連の試験を設計した。Ａ３７５Ｐｐｕｒｏは、そのリガンド内のＲＧＤモチーフに結合するさらに４つのインテグリン（αｖβ３、αｖβ５、αｖβ８およびα５β１）を発現するので、これら２つの細胞株における結合活性を比較することは、非常に厳しいアッセイであると考えられる。
【００９６】
修飾ペプチド１〜１５、１６〜２１および２２〜２５の挙動を特徴付けるために使用したアッセイの例として、図２はペプチド２２〜２５の比較を示す。Ａ２０ＦＭＤＶ２は、他のインテグリンより＞１０００倍選択的にαｖβ６に結合する［９］。修飾ペプチドが特異性を保持していることを確認するために、Ａ３７５Ｐβ６細胞と対比してどれくらいのペプチドがＡ３７５Ｐｐｕｒｏに結合するかについてフローサイトメトリーを使用して決定した。図２Ａは、１０００ｎＭでペプチド２２（Ａｉ）もペプチド２５（Ａｉｉ）もＡ３７５Ｐｐｕｒｏに結合しなかったことを示す（赤色ヒストグラム；上パネル）。それに対して、両方のペプチドが、１００ｎＭでＡ３７５Ｐβ６によく結合した（青色ヒストグラム；下パネル）。これらのデータは、αｖβ６結合特異性が、これらのペプチドバリアントにおいて保持されていることを示す。さらに、あらゆるペプチドバリアントが、１０００ｎＭでＡ３７５Ｐｐｕｒｏに結合できなかった（データ不掲載）ことは、全てのペプチドが特異性を保持していることを示した。
【００９７】
修飾ペプチドが、１００ｎＭで親ビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２ペプチドと同様にまたはよりよく結合するかどうか決定するために、０、０．１、１、１０、１００および１０００ｎＭでＡ３７５Ｐβ６に対するバリアントの結合活性を試験した。
【００９８】
例として、図２Ｂは、１００ｎＭでペプチド２２が、商業的に得られるビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２より１６％高く結合するのでより優れていることを示す。同様に、１００ｎＭでの結合が、商業的に得られるビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２の１５０％なので、ペプチド２５はさらにより優れている。これらのデータは、一回の実験のものであった。表２は、研究した全てのペプチドの最大４回の実験の平均を示し、全体としてペプチド２２が、親（すなわち商業的に得られたビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２）より平均して５％高い活性を有し、ペプチド２５が、親より３６％高かったことを示す。
【００９９】
３７℃で細胞によって内部に取り込まれる能力（したがって治療法のための潜在的ベクター）を評価するために、Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍ（登録商標）細胞数測定およびフローサイトメトリーを使用した。Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍ（登録商標）は、細胞内区画と対比して表面上の蛍光の画像分析を可能にする各細胞の蛍光画像（図２Ｃ）を撮像する。図２Ｃのヒストグラムは、０分時点と比較した内部移行をプロットする。フローサイトメトリーの場合、ペプチドが内部に取り込まれるのにつれる表面発現の消失を監視した。
【０１００】
表２は、商業的に供給されたビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２と比較して本研究において使用される全てのペプチドの活性および内部移行データを要約する［本研究において合成したビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２（１）は、ペプチド（１）が、Ｄ−ビオチンをカップリングするために活用されるＡｌａ２Ｌｙｓ突然変異を含むという点で商業的に得られたビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２と異なった］。
【０１０１】
表２はまた、結合親和性値を内部取り込み量と乗算して相対的活性値を得ることによって、細胞内薬物送達に対する各ペプチドの潜在性の任意値（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｖａｌｕｅ）を提供する。ペプチド（７）および（９）を除いて；大部分の１６Ｌｙｓおよび１３Ｌｅｕ修飾は相対的活性を減少させ、相対的活性が対照ビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２より低かったことが分かる。それに対し、ＮおよびＣ末端修飾ペプチドのほとんど（１６〜１９および２１）は、ビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２（１）と比較してより優れた結合親和性を有し、相対的活性が改善された。例えば、非タンパク新生Ｄ−Ａｓｎアミノ酸Ｎ末端修飾を有するペプチド１９は、細胞αｖβ６に対し親化合物よりも平均で４３％良好に結合した（表２）。１．０の値を有する非修飾Ａ２０ＦＭＤＶと比較して、ペプチド１６（Ｎアセチル化）、１７（Ｃアミド化）、１８（Ｎアセチル化およびＣアミド化）、１９（Ｄ−Ａｓｎ置換）および２１（Ｄ−ＡｓｎおよびＤ−Ｔｈｒ置換両方）は、対照ペプチド１より５５％、３１％、９％、２７％、および３７％高い相対的活性値を有する。
【０１０２】
【表２】
2020518656.tif 000004
【０１０３】
有望なことに、リードペプチド（１６、１７、１９、２１）にＤＴＰＡをコンジュゲーションして、ペプチド２３〜２６をそれぞれ作製することは、結合親和性または内部移行にほとんど効果がなく、したがって相対的活性の増大が維持された。
実施例３−血漿安定性および体内分布研究
図３は、３７℃でのＰＢＳ（黒色バー；各ペプチドについて左手のバー）と対比した血漿（赤色バー；各ペプチドについて右手のバー）中のＤＴＰＡコンジュゲートペプチド（２２〜２６）の安定性を、０分時点と比較して示す。データは、ＰＢＳ中で３７℃、２４時間後にペプチドの約１０％しか分解されなかったことを示す。それに対し、ペプチド（２２、２５、２６）は、２４時間後に血漿中で類似レベルの残存（７７％〜８０％）を示すが、ペプチド（２３）（６０％残存）およびペプチド（２４）（５２％残存）は大きく分解される。したがって、ペプチド２４および２３（それぞれＣ末端アミド化およびＮ末端アセチル化）の修飾は、対照親ペプチド（１）と比較して血漿分解に対する感受性を増大させた。Ｄアミノ酸（Ｄ−Ａｓｎ、化合物２５、およびＤ−Ａｓｎ／Ｄ−Ｔｈｒ化合物２６）を使用する化学操作によるペプチド修飾が、ヒト血漿プロテアーゼに対する感受性を改善するのに最適であった。
【０１０４】
反対側の肩にＡ３７５ＰｐｕｒｏおよびＡ３７５Ｐβ６腫瘍を保有する免疫不全状態のマウス（ｎ＝３〜５）に３００Ｂｑの放射性標識ペプチド２２〜２６を静脈（ｉｖ）注射で与え、次いで１時間後に殺した。主要な器官および血液を直ちに採集し、計量し、放射活性を決定した。表３のデータは、試験した５つのＤＴＰＡコンジュゲートペプチドの挙動を示す；データは、平均％注射用量／ｇ組織で表される。
【０１０５】
【表３】
2020518656.tif 000005
【０１０６】
これまでの本発明者らの研究と同様に、著しい残留が、消化管（胃および腸）および肺にも存在する［９、２４］。αｖβ６とは独立であると本発明者らが報告した腎臓残留は［９］、最少の残留を示すペプチド２５および２６ならびに親ビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２であるペプチド２２よりはるかに大きな残留を示すペプチド２３および２４を含めた５つのペプチドで大きく変動する。αｖβ６陰性対照腫瘍と比較して、αｖβ６陽性腫瘍による各ペプチドの強力な選択的取り込みが存在する。図４は、ヒストグラムでこれらの差異を強調する。ＤＴＰＡ標識親ペプチド２２に対してペプチド２３〜２６に統計的な取り込みの増大はないが、全てのバリアントは、対照ペプチド２２と比較してαｖβ６陽性腫瘍対αｖβ６陰性腫瘍の残留の平均比がわずかに高い。対照ペプチド２２と比較して、αｖβ６陰性腫瘍に対するαｖβ６陽性腫瘍おける最も高い残留比はペプチド２５で見られた。
【０１０７】
考察
２０残基直鎖ペプチドＡ２０ＦＭＤＶ２は、腫瘍関連αｖβ６インテグリンに対する高い特異性および親和性を呈し、細胞へのαｖβ６依存的内部移行も呈する。したがってＡ２０ＦＭＤＶ２は、αｖβ６発現がん細胞に治療用担持物（例えば化学療法ペイロード）を送達するのに見込みがあるリード化合物と考えられる。上記の実施例において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ挙動、血漿安定性およびｉｎ  ｖｉｖｏ体内分布に対するＡ２０ＦＭＤＶ２の天然のアミノ酸残基の非タンパク新生置換物の影響について調査した。
【０１０８】
本明細書に記述されるペプチドの全ては、Ｆｍｏｃ  ＳＰＰＳによって優れた収量および卓越した純度で合成された。αｖβ６インテグリンに対する結合研究は、Ａ２０ＦＭＤＶ２類似体の全てがＡ３７５Ｐβ６細胞にだけ結合し、Ａ３７５Ｐｐｕｒｏ細胞に結合しないことを示し、特異性が修飾の影響を受けないことを示した。さらに、アセチル化Ｎ末端ならびにアミド化Ｃ末端または天然の１Ａｓｎおよび２０Ｔｈｒ残基の非天然のＤ−バージョンを組み込んだペプチドは、親ペプチド（Ａ２０ＦＭＤＶ２）より強力なαｖβ６結合活性を呈し、さらに天然の１６Ｌｙｓおよび１３Ｌｅｕ残基の非タンパク新生置換物を含有する大部分のペプチドより強力だった。例えば、非タンパク新生Ｄ−Ａｓｎアミノ酸Ｎ末端修飾を有するペプチド１９は、細胞αｖβ６に対し親化合物よりも平均で４３％良好に結合した（表２）。
【０１０９】
ヒト血漿における安定性を評価し、ペプチドが、マウス血清でのこれまでの研究よりずっと長く完全なままであることが示され、このことは、ヒト血漿がこれらのペプチドに対してマウス血清より分解性でないことを示唆している。全ての放射性標識ペプチドの９０％以上は、ＰＢＳ中で、３７℃で２４時間後に完全なままであり、一方でＤアミノ酸を含有するＡ２０ＦＭＤＶ２である２５および２６だけが、ヒト血漿中で、３７℃で２４時間後に大部分が完全なままであった（７６〜８０％）。
【０１１０】
修飾は、αｖβ６発現細胞への内部移行の程度に対して中程度の効果しかなかった。したがって、表２は、試験した全てのペプチドについて内部移行が、市販のビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２と比較して０．７８〜１．１１倍変動したことを示す。細胞内細胞毒の送達については、ペプチドの結合親和性と内部移行の両方を考える必要があるので、表２は、各ペプチドの相対的活性の任意値も示す。対照ペプチドは１．０の値を有し、ペプチド１６、１９、１７、１８および２１は、対照ペプチドよりそれぞれ５５％、２７％、３１％、９％および３７％高い相対的活性値を有する。
【０１１１】
治療法を送達するためのαｖβ６標的化ペプチドの場合、それらペプチドは、αｖβ６発現腫瘍に選択的に保持されなければならない。体内分布研究において試験した５つのリードペプチド（２２〜２６）の全てが、αｖβ６陰性腫瘍より少なくとも６〜１０倍高いレベルでαｖβ６陽性腫瘍に選択的に保持されることを見出した。全ての修飾ペプチドがＤＴＰＡ標識およびビオチン化ペプチド２２よりわずかに優れていたことは、有望である。本結果は、Ａ２０ＦＭＤＶ２の化学修飾により、αｖβ６発現がんに選択的に位置する能力が改善されたことを示す。
【０１１２】
参照文献
本発明および本発明が関係する最新技術についてより完全に記述し、開示するためにいくつかの刊行物を上に引用している。これらの参照の完全な引用が、以下で提供される。これら参照のそれぞれの全体を、本明細書に組み込む。
【０１１３】
【表４−１】
2020518656.tif 000006
【０１１４】
【表４−２】
2020518656.tif 000007
【０１１５】
【表４−３】
2020518656.tif 000008
【０１１６】
各個々の刊行物または特許または特許出願を、その全体を参照により組み込むように具体的かつ個別に示すがごとく、本明細書に引用される全ての参照を、その全体を参照によりおよび同じ範囲に対する全ての目的のために本明細書に組み込む。
【０１１７】
本明細書に記述される特定の態様は、例として提示されるものであり、制限として提示されるものではない。本明細書におけるどんな副題も、利便性のためだけに含まれ、決して開示を限定するものと解釈されるべきでない。
【図１】
2020518656.tif 000009
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月24日(2019.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年４月２４日出願のＧＢ１７０６４７２．６の優先権を主張し、その内容および要素をあらゆる目的のために参照により本明細書に組み込む。
本発明は、ペプチドバリアント、コンジュゲートおよびその医薬組成物、ならびにがんの処置および腫瘍の画像化を含めた医学におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インテグリンは、細胞接着、浸潤、増殖およびアポトーシスを含めたいくつかの鍵となる工程に関係する細胞表面受容体の大きなファミリーを包含するαβヘテロ二量体分子である［２３］。ヒトでは８クラス２４個のメンバーが存在し、高度に保存されているトリペプチドモチーフＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐによってフィブロネクチンおよびビトロネクチンなどの細胞外リガンドに存在する基質を認識する［２７］。インテグリンαｖβ６は、口腔、頭頸部、膵、卵巣および乳がんなど数多くのがんで高レベルに発現され［４〜９］、インテグリンαｖβ６の発現レベルの増大は、腫瘍の進行と相関していた。インテグリンαｖβ６は、線維症［１１］および口蹄疫を含めた一部のウイルス感染症も促進し得る［２８］。したがって、インテグリンαｖβ６は、腫瘍学ならびにそれを超えた分野における画像化、診断および治療の主要な標的である［２９〜３０］。
【０００３】
Ａ２０ＦＭＤＶ２（Ｈ２Ｎ−１ＮＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲ２０Ｔ−ＯＨ）（配列番号１）は、口蹄疫ウイルスのウイルスタンパク質から得られる２０残基の直鎖ペプチドである［１〜３、１０］。このペプチドは、がん細胞において高度に発現されるインテグリン膜貫通型受容体であるαｖβ６に対して高い選択性および親和性を呈すると示されている［４〜９］。Ａ２０ＦＭＤＶ２は、７ＲＧＤＬＱＶ１３Ｌ（配列番号２）断片のＲＧＤトリペプチドを介してαｖβ６に結合し、ＲＧＤＬＱＶＬ断片に存在する２つのロイシン残基は、疎水的相互作用によって受容体へのペプチドの結合を増強し［１０］、その結合はＣ末端ペプチドモチーフ１０Ｌｅｕ〜２０Ｔｈｒから生成されるαらせんによっても安定化される［１］。加えて、放射性インジウム（１１１Ｉｎ）とカップリングした場合、Ａ２０ＦＭＤＶ２は、肺線維症においてαｖβ６に対する有効な造影剤である［２４］。［１８Ｆ］フルオロベンゾイル標識ペプチドである［１８Ｆ］ＦＢＡ−Ａ２０ＦＭＤＶ２は、ヒト臨床試験におけるＰＥＴ放射性トレーサーとしての使用が見出されている［２５］。
【０００４】
Ａ２０ＦＭＤＶ２は、４−［１８Ｆ］フルオロ安息香酸（ＦＢＡ）（または誘導体）にコンジュゲートすることによって［３２〜３４］、およびＤＯＴＡなどの金属キレート化剤を組み込んだＡ２０ＦＭＤＶ２ペプチドを使用する６４Ｃｕ標識によって［３５〜３７］画像診断用途の陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）に使用されてきた［３１］。近年、［１８Ｆ］−ＦＢＡ−Ａ２０ＦＭＤＶ２は、特発性肺線維症の処置レジメ［２４］において臨床の場へと歩みを進め［２５］、一方で１１１Ｉｎ標識Ａ２０ＦＭＤＶ２誘導体は、単光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）を使用するαｖβ６インテグリンを発現する乳がんの画像化で、特異性が高いことが示された［９］。これらの研究は、αｖβ６インテグリンを標的する進行中の診断用ツールに対するＡ２０ＦＭＤＶ２の重要性を概説し、αｖβ６を有効な治療標的として支持している。
【０００５】
ＷＯ２００７／０３９７２３は、αｖβ６ペプチドリガンド、その機能的バリアントおよびそれをコードしている核酸ならびにがんを含めたαｖβ６媒介性疾患の処置および画像化におけるそれらの使用について記述している。
【０００６】
残念なことに、マウス血漿研究において決定された通り、Ａ２０ＦＭＤＶ２の治療的価値は、エンドおよびエキソペプチダーゼなどの血清プロテアーゼに対する高い感受性に一部起因する短い血中半減期により限定されている［１３］。
【０００７】
感受性のペプチド（およびタンパク質）の半減期を改善するための報告されている一方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の導入である［３８］。Ｈａｕｓｎｅｒらは、Ｎ末端における１つもしくは２つのＰＥＧ２８部分［１３］またはＮおよびＣ終点両方における単一ＰＥＧ２８［３９］の配置によって４−［１８Ｆ］−ＦＢＡ−Ａ２０ＦＭＤＶ２のＰＥＧ化バージョンを調製し、２末端ＰＥＧ化Ａ２０ＦＭＤＶ２誘導体である［１８Ｆ］−ＦＢＡ−ＰＥＧ２８−Ａ２０ＦＭＤＶ２−ＰＥＧ２８が、最も好ましい薬物動態を呈すると結論付けた。
【０００８】
直鎖ペプチドのヘッドトゥテール環化も、エキソペプチダーゼによる分解を最小化する確立された方法であるが［４０］；重合またはラセミ化など望ましくない副反応を防止するために慎重な実験が必要とされる。
【０００９】
しかしながら、強力な結合活性、細胞取り込みおよび延長された血漿内半減期を持つ腫瘍標的化ペプチドに対する必要性は満たされていない。本発明は、これらのおよび他の必要性を解決する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
概して、本発明は、細胞研究においてＡ２０ＦＭＤＶ２ペプチドと比較して増強されたαｖβ６結合活性、一部の場合において（ｉｎ  ｓｏｍｅ  ｃａｓｅｓ）、増強された細胞取り込みを呈することが予想外に判明したＡ２０ＦＭＤＶ２ペプチドバリアントに関する。特に、本明細書のさらなる詳細に記載の通り、そのようなペプチドバリアントは、それぞれのペプチドの１１１Ｉｎ標識バージョンによって評価すると、対照Ａ２０ＦＭＤＶ２ペプチドと比較してαｖβ６発現異種移植腫瘍への増強された体内分布を呈する（αｖβ６発現を欠いている対照異種移植腫瘍と比較して）ことが判明した。したがって、そのようなペプチドバリアントは、腫瘍標的化化学療法送達薬剤および腫瘍造影剤としての潜在性が大きい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、第１の側面において、本発明は、αｖβ６インテグリンに選択的に結合し、モチーフＸ１ＢｎＲＧＤＬＸ２Ｘ３Ｘ４ＺｍＸ５（配列番号３）を含むアミノ酸配列を有するペプチドを提供し、式中、Ｘ１は、任意のＤ−アミノ酸であり、Ｂｎは、任意のｎアミノ酸の配列であり、前記アミノ酸は、天然でも非天然でもよく、Ｄ−またはＬ−でもよく、同一でも異なっていてもよく、ｎは、１〜１０の数であり、Ｘ２およびＸ３は、任意のアミノ酸からそれぞれ独立に選択され、Ｘ４は、ＬｅｕまたはＩｌｅであり、Ｚｍは、任意のｍアミノ酸の配列であり、前記アミノ酸は、天然でも非天然でもよく、Ｄ−またはＬ−でもよく、同一でも異なっていてもよく、ｍは、１〜１０の数であり、Ｘ５は任意のＬ−またはＤ−アミノ酸である。
【００１２】
一部の態様において、ペプチドの長さは、少なくとも１７、１８、１９または２０アミノ酸である。一部の態様において、ペプチドの長さは、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１以下または２０アミノ酸以下である。特定の態様において、ペプチドの長さは、１７〜２５アミノ酸、例えば１９〜２１アミノ酸である。特定の態様において、ペプチドの長さは、２０アミノ酸である。
【００１３】
一部の態様において、Ｘ１は、Ｄ−Ａｓｎである。本明細書の表２および表３ならびに
図３および図４に示されるように、Ｘ１がＤ−Ａｓｎである典型的なペプチド（ペプチド１９、２１、２５および２６）は、優れた相対的活性（表２）、αｖβ６発現腫瘍への高い体内分布（表３および図４）および優れた血漿安定性（図３）を呈した。
【００１４】
一部の場合において、Ｘ５は、Ｌ−ＴｈｒまたはＤ−Ｔｈｒである。
一部の場合において、Ｘ４は、Ｌ−Ｌｅｕである。
一部の場合において、ｎは、５である。一部の場合において、ｍは、６である。特定の場合において、ｎは、５であり、ｍは、６である。
【００１５】
一部の場合において、Ｂｎは、ＡＶＰＮＬ（配列番号４）、ＫＶＰＮＬ（配列番号５）またはＫ（ビオチン）ＶＰＮＬである。Ｂｍが、Ｋ（ビオチン）ＶＰＮＬである場合、ビオチンは、リジン側鎖に結合しているＤ−ビオチンでもよい。
【００１６】
一部の場合において、Ｚｍは、ＡＱＫＶＡＲ（配列番号６）である。
特定の場合において、ペプチドのアミノ酸配列は、
Ｈ２Ｎ−［Ｄ−Ａｓｎ］−ＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＣＯＯＨ（配列番号７）；
Ｈ２Ｎ−［Ｄ−Ａｓｎ］−ＫＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＣＯＯＨ（配列番号８）；
Ｈ２Ｎ−［Ｄ−Ａｓｎ］−Ｋ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＣＯＯＨ（配列番号８）；
Ｈ２Ｎ−［Ｄ−Ａｓｎ］−ＫＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲ［Ｄ−Ｔｈｒ］−ＣＯＯＨ（配列番号９）；
Ｈ２Ｎ−［Ｄ−Ａｓｎ］−Ｋ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲ［Ｄ−Ｔｈｒ］−ＣＯＯＨ（配列番号９）；および
Ｈ２Ｎ−［Ｄ−Ａｓｎ］−ＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲ［Ｄ−Ｔｈｒ］−ＣＯＯＨ（配列番号１０）
からなる群から選択される。
【００１７】
特に、ペプチドは、
Ｈ２Ｎ−［Ｄ−Ａｓｎ］−ＡＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＣＯＯＨ（配列番号７）あってもよい。
【００１８】
特定の場合において、ペプチドは、Ｎおよび／またはＣ末端で修飾されてもよい。例えば、ペプチドは、Ｎアセチル化および／またはＣアミド化されてもよい。
第２の側面において、本発明は、治療的部分、ポリマー、ポリペプチドおよび／または検出可能な部分に直接もしくはリンカーを介してコンジュゲートされた本発明の第１の側面のペプチドを含むコンジュゲートを提供する。
【００１９】
一部の態様において、ペプチドは、抗がん剤を含む治療的部分にコンジュゲートされる。
一部の態様において、抗がん剤は、オーリスタチン、マイタンシノイド、チューブリシン、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、アルファ−アマニチン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、イリノテカンおよびインドールカルボキサミド、またはその類似体、誘導体、プロドラッグもしくは活性代謝物からなる群から選択される。特に、抗がん剤は、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、メルタンシン（ＤＭ１）、ラブタンシン（ＤＭ４）またはセンタナマイシンを含んでもよい。
【００２０】
一部の場合において、治療的部分は、治療的同位元素を含んでもよい。例えば、治療的部分は、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２５Ａｃ、２２
３Ｒａ、４４Ｓｃ、６７Ｇａ、１３１Ｉ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅおよび６７Ｃｕからなる群から選択される同位元素を含んでもよい。
【００２１】
一部の場合において、ペプチドは、核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）、単光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）または光学的画像化によって検出可能である検出可能な部分にコンジュゲートされる。特に、検出可能な部分は、フルオロフォア、放射性核種またはスピン標識を含んでもよい。特定の場合において、検出可能な部分は、６８Ｇａ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、８９Ｚｒ、１２４Ｉ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ、１８Ｆ、８６Ｙ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、６７Ｇａまたは９９ｍＴｃを含んでもよい。
【００２２】
特に、検出可能な部分は、キレートを含むリンカーを介してペプチドとカップリングされた１１１Ｉｎを含んでもよい。特に、キレートは、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、テトラアザシクロドデカン（ｔｅｔｒａｚａｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ）−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）からなる群から選択されてもよい。キレート（例えばＤＴＰＡ、ＤＯＴＡまたはＥＤＴＡ）は、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に連結されてもよい（例えば、キレートは、Ｎ末端でＤ−Ａｓｎに連結されてもよい）。
【００２３】
一部の場合において、ペプチドは、血漿内半減期および／または体内分布を増強するポリマーにコンジュゲートされる。特に、ペプチドは、１つまたは複数（例えば、Ｎ末端およびＣ末端のそれぞれなどで１つまたは２つ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基にコンジュゲートされてもよい。特定の場合において、ペプチドは、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−を含む部分にコンジュゲートされてもよく、式中、ｎ≧１である。特に、ｎは、１〜１００、１〜５０、１０〜４０または２０〜３０であってもよい。例えば、ｎは、１または２であってもよい。特定の場合において、ペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端に存在する２つのエチレングリコール基を有してもよい。
【００２４】
第３の側面において、本発明は、
本発明の第１の側面のペプチドまたは本発明の第２の側面のコンジュゲート；および
薬学的に許容可能な担体
を含む医薬組成物を提供する。
【００２５】
第４の側面において、本発明は、医学に使用するための、本発明の第１の側面のペプチド、本発明の第２の側面のコンジュゲートまたは本発明の第３の側面の医薬組成物を提供する。
【００２６】
第５の側面において、本発明は、哺乳動物対象におけるαｖβ６発現腫瘍の処置の方法に使用するための本発明の第１の側面のペプチド、本発明の第２の側面のコンジュゲートまたは本発明の第３の側面の医薬組成物を提供する。一部の態様において、腫瘍は、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍である。特定の場合において、コンジュゲートまたはその医薬組成物は、前記抗がん剤を１つまたは複数含むコンジュゲートである。特定の場合において、処置の方法は、哺乳動物対象の腫瘍がαｖβ６を発現しているかどうか決定する工程を含んでもよく、腫瘍が、αｖβ６を発現していると決定された場合、前記処置が投与される。
【００２７】
第６の側面において、本発明は、αｖβ６発現腫瘍を有する哺乳動物対象を処置する方法を提供し、本方法は、本発明の第１の側面のペプチド、本発明の第２の側面のコンジュゲートまたは本発明の第３の側面の医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に
投与する工程を含む。一部の態様において、腫瘍は、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍である。特定の場合において、コンジュゲートまたはその医薬組成物は、前記抗がん剤を１つまたは複数含むコンジュゲートである。特定の場合において、処置の方法は、哺乳動物対象の腫瘍がαｖβ６を発現しているかどうか決定する工程を含んでもよく、腫瘍が、αｖβ６を発現していると決定された場合、前記処置が投与される。
【００２８】
第７の側面において、本発明は、哺乳動物対象のαｖβ６発現腫瘍を処置するための医薬の調製における本発明の第１の側面のペプチド、本発明の第２の側面のコンジュゲートまたは本発明の第３の側面の医薬組成物の使用を提供する。一部の態様において、腫瘍は、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍である。特定の場合において、コンジュゲートまたはその医薬組成物は、前記抗がん剤を１つまたは複数含むコンジュゲートである。特定の場合において、処置の方法は、哺乳動物対象の腫瘍がαｖβ６を発現しているかどうか決定する工程を含んでもよく、腫瘍が、αｖβ６を発現していると決定された場合、前記処置が投与される。
【００２９】
本発明の第４、第５、第６または第７の側面によると、ペプチド、コンジュゲートまたは医薬組成物は、投与されてもよくまたは別の抗がん剤および／もしくは放射線療法もしくは手術と同時に投与するためのものであってもよい。特に、第２の化学療法薬（同時、逐次的、別々または並行的）および／もしくは放射線療法ならびに／または手術前もしくは手術後の併用療法が特に考えられる。どんな特定の理論に束縛されることを望むものでもないが、本発明者らは、本発明のαｖβ６標的化ペプチドまたはコンジュゲートに基づく治療と１つまたは複数の受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の遮断とを組み合わせることにより、単独療法と比較して抗がん治療有効性を増強し得ると信じている。予備抗体研究は、αｖβ６が、ＲＴＫシグナル伝達を調節し、さらに増強する可能性があることを示す。そのうえ、腫瘍モデルにおいて抗αｖβ６抗体と組み合わせてＲＴＫ［例えば上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）またはｅｒｂＢ−２（別名ヒト上皮成長因子受容体２またはＨＥＲ２／ｎｅｕ）］を標的することにより、単独療法よりも治療が増強される。したがって、本発明のαｖβ６標的化ペプチドまたはコンジュゲートに基づく治療は、特に、トラスツズマブ［ハーセプチン（登録商標）］、ゲフィチニブ［イレッサ（登録商標）］、エルロチニブ［タルセバ（登録商標）］、ラパチニブ［タイケルブ（登録商標）］、セツキシマブ［アービタックス（登録商標）］およびパニツムマブ［ベクティビックス（登録商標）］のうち１つまたは複数と組み合わせられてもよいことが本明細書において特に考えられる。
【００３０】
第８の側面において、本発明は、腫瘍がある対象に本発明の第２の側面のコンジュゲート（前記検出可能な部分を含む前記コンジュゲート）またはその組成物を投与する工程と、前記検出可能な部分を検出し、それにより前記腫瘍の画像を形成する工程とを含む、哺乳動物対象のαｖβ６発現腫瘍を画像化する方法を提供する。一般に、画像は、ディスプレイ（例えばデジタルディスプレイスクリーン）上に形成されることになるが、対象の身体上または内における直接画像化が、本明細書において特に考えられる。一部の態様において、腫瘍は、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍である。
【００３１】
第９の側面において、本発明は、哺乳動物対象においてがんを診断するｉｎ  ｖｉｖｏ方法に使用するための本発明の第２の側面のコンジュゲート（前記検出可能な部分を含む前記コンジュゲート）またはその組成物を提供し、その方法は、対象に前記コンジュゲートまたはその前記組成物を投与する工程と、前記検出可能な部分を検出し、それにより対象におけるαｖβ６発現腫瘍の存在を診断する工程とを含む。一部の場合において、前記検出可能な部分の検出は、前記検出可能な部分の量、濃度、レベル、強度および／もしく
は場所を測定する工程と、測定値を関連付けまたは解釈して（参照レベル、バックグラウンドまたは対照と測定値を比較することによるなど）、測定値が対象および／もしくは対象の身体内の特定の場所におけるαｖβ６発現腫瘍の存在を示すか否か決定する工程とを含む。一部の態様において、腫瘍は、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍である。
【００３２】
第１０の側面において、本発明は、αｖβ６発現腫瘍を有すると疑われる哺乳動物対象に本発明の第２の側面のコンジュゲート（前記検出可能な部分を含む前記コンジュゲート）またはその組成物を投与する工程と、前記検出可能な部分を検出し、それにより対象におけるαｖβ６発現腫瘍の存在を診断する工程とを含む、がんを診断する方法を提供する。一部の場合において、前記検出可能な部分の検出は、前記検出可能な部分の量、濃度、レベル、強度および／もしくは場所を測定する工程と、測定値を関連付けまたは解釈して（参照レベル、バックグラウンドまたは対照と測定値を比較することによるなど）、測定値が対象および／もしくは対象の身体内の特定の場所におけるαｖβ６発現腫瘍の存在を示すか否か決定する工程とを含む。一部の態様において、腫瘍は、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍である。
【００３３】
本発明によると、対象は、ヒト、コンパニオンアニマル（例えばイヌまたはネコ）、実験動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタまたはヒト以外の霊長類）、家畜または農用動物（例えばブタ、ウシ、ウマまたはヒツジ）であってもよい。好ましくは、対象はヒトである。対象は、特定の場合において、αｖβ６発現腫瘍を患っている、それと診断されたまたは有すると疑われたヒトでもよい。
【００３４】
本発明は、記述されている側面および好ましい特色の組合せが明らかに容認できないまたは明白に避けるべきと述べられている場合を除き、その組合せを含む。本発明のこれらのおよびさらなる側面および態様は、以下のさらなる詳細ならびに付随する例および図を参照して記述される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ペプチド２〜１５の合成に使用される非タンパク新生アミノ酸の構造を示す図である。
【図２Ａ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるペプチド２２〜ペプチド２５試験の比較を示す図である。全てのＡ２０ＦＭＤＶ２バリアントが、特異性、活性および内部移行に関してスクリーニングされた。Ａ）特異性は、１０００ｎＭにおいてＡ３７５Ｐｕｒｏへの結合に存在せず（上のヒストグラム）、Ａ３７５Ｐβ６への結合にのみ存在し（下のヒストグラム）、ヒストグラムの推移は、Ａｉ）ペプチド２２（左手のヒストグラム）およびＡｉｉ）ペプチド２５（右手のヒストグラム）によって示される同じ１００ｎＭ濃度でのフローサイトメトリーによる平均蛍光強度（ＭＦＩ）の幾何平均（ＧＭ）を示す。Ｂ）親和性が、フローサイトメトリーにより０．１、１、１０、１００および１０００ｎＭでＡ３７５Ｐβ６に結合するレベルを測定することによって決定された。結果は、商業的に供給されている対照ビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２と比較してペプチドの結合を示す。一回の代表的な実験からのデータは、Ｂｉｉ）ペプチド２５（右手のグラフ）が、Ｂｉ）ペプチド２２（左手のグラフ）と比較して同程度の濃度でＡ３７５Ｐβ６によりよく結合することを示す。Ｃ）内部移行は、Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍ（登録商標）を使用してＡ３７５Ｐβ６細胞によるαｖβ６依存的内部移行を示す。データは、０分および４５分後の細胞の表面におけるペプチドを示す（各パネルにおいて緑色、右側の画像）、Ｃｉ）ペプチド２２およびＣｉｉ）ペプチド２５は内部に取り込まれ、その内部移行の速度は同程度である（画像の下のグラフを参照のこと；ペプチド２２左手のグラフ、ペプチド２５右手のグラフ）。
【図２Ｂ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるペプチド２２〜ペプチド２５試験の比較を示す図である。全てのＡ２０ＦＭＤＶ２バリアントが、特異性、活性および内部移行に関してスクリーニングされた。Ａ）特異性は、１０００ｎＭにおいてＡ３７５Ｐｕｒｏへの結合に存在せず（上のヒストグラム）、Ａ３７５Ｐβ６への結合にのみ存在し（下のヒストグラム）、ヒストグラムの推移は、Ａｉ）ペプチド２２（左手のヒストグラム）およびＡｉｉ）ペプチド２５（右手のヒストグラム）によって示される同じ１００ｎＭ濃度でのフローサイトメトリーによる平均蛍光強度（ＭＦＩ）の幾何平均（ＧＭ）を示す。Ｂ）親和性が、フローサイトメトリーにより０．１、１、１０、１００および１０００ｎＭでＡ３７５Ｐβ６に結合するレベルを測定することによって決定された。結果は、商業的に供給されている対照ビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２と比較してペプチドの結合を示す。一回の代表的な実験からのデータは、Ｂｉｉ）ペプチド２５（右手のグラフ）が、Ｂｉ）ペプチド２２（左手のグラフ）と比較して同程度の濃度でＡ３７５Ｐβ６によりよく結合することを示す。Ｃ）内部移行は、Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍ（登録商標）を使用してＡ３７５Ｐβ６細胞によるαｖβ６依存的内部移行を示す。データは、０分および４５分後の細胞の表面におけるペプチドを示す（各パネルにおいて緑色、右側の画像）、Ｃｉ）ペプチド２２およびＣｉｉ）ペプチド２５は内部に取り込まれ、その内部移行の速度は同程度である（画像の下のグラフを参照のこと；ペプチド２２左手のグラフ、ペプチド２５右手のグラフ）。
【図２Ｃ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるペプチド２２〜ペプチド２５試験の比較を示す図である。全てのＡ２０ＦＭＤＶ２バリアントが、特異性、活性および内部移行に関してスクリーニングされた。Ａ）特異性は、１０００ｎＭにおいてＡ３７５Ｐｕｒｏへの結合に存在せず（上のヒストグラム）、Ａ３７５Ｐβ６への結合にのみ存在し（下のヒストグラム）、ヒストグラムの推移は、Ａｉ）ペプチド２２（左手のヒストグラム）およびＡｉｉ）ペプチド２５（右手のヒストグラム）によって示される同じ１００ｎＭ濃度でのフローサイトメトリーによる平均蛍光強度（ＭＦＩ）の幾何平均（ＧＭ）を示す。Ｂ）親和性が、フローサイトメトリーにより０．１、１、１０、１００および１０００ｎＭでＡ３７５Ｐβ６に結合するレベルを測定することによって決定された。結果は、商業的に供給されている対照ビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２と比較してペプチドの結合を示す。一回の代表的な実験からのデータは、Ｂｉｉ）ペプチド２５（右手のグラフ）が、Ｂｉ）ペプチド２２（左手のグラフ）と比較して同程度の濃度でＡ３７５Ｐβ６によりよく結合することを示す。Ｃ）内部移行は、Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍ（登録商標）を使用してＡ３７５Ｐβ６細胞によるαｖβ６依存的内部移行を示す。データは、０分および４５分後の細胞の表面におけるペプチドを示す（各パネルにおいて緑色、右側の画像）、Ｃｉ）ペプチド２２およびＣｉｉ）ペプチド２５は内部に取り込まれ、その内部移行の速度は同程度である（画像の下のグラフを参照のこと；ペプチド２２左手のグラフ、ペプチド２５右手のグラフ）。
【図３】２４時間後のヒト血漿（ｎ＝２）およびＰＢＳ（対照）中のペプチドの安定性を示す図である。血漿中で５０％未満安定であるペプチド２３および２４と比較して、ペプチド２２、２５および２６は、７５％以上安定である。ペプチドレベルは、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を使用して定量化された。２４時間後にヒト血漿（標識「血液」、各ペプチドについて右手のバー）およびＰＢＳ（各ペプチドについて左手のバー）中のペプチドの安定性を決定した。この実験において、ＰＢＳは対照として使用された。
【図４】陽性αｖβ６発現腫瘍および陰性対照腫瘍（Ａ３７５Ｐｕｒｏ）における１１１Ｉｎ−ＤＴＰＡカップリングしたペプチドの取り込みを示す図である。ペプチドは、陰性腫瘍（赤色；各ペプチドについて左手のバー）と比較してαｖβ６発現腫瘍（青色；各ペプチドについて右手のバー）に特異的に取り入れられる。相対的取り込みは、Ａ３７５Ｐｕｒｏ：Ａ３７５β６比によって示される。データは、２５が、陰性腫瘍と比較してαｖβ６発現腫瘍に対してほぼ１０倍より特異的であることを示す。データは、ペプチド２２〜２６それぞれについて組織１グラム当たりの平均注入用量（ＩＤ）±平均の標準誤差（ＳＥＭ）としてプロットされる。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明について記述するにあたり、以下の用語を利用することとし、以下に示す通り定義されるものとする。
ペプチドバリアントおよび非天然アミノ酸
本明細書において定義される通り、本発明のペプチドは、親Ａ２０ＦＭＤＶ２ペプチドのバリアントであり、ペプチドが請求項に定義される通りであれば、１つまたは複数の非天然のアミノ酸を含んでもよい。適切な非天然のアミノ酸には、例えば、Ｄ−アミノ酸、オルニチン、ジアミノ酪酸オルニチン、ノルロイシンオルニチン、ピリジルアラニン（pyriylalanine）、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、フェニルグリシン、アルファお
よびアルファ二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、トリフルオロチロシン、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン、ｐ−Ｉ−フェニルアラニンなどの天然のアミノ酸のハロゲン化誘導体、Ｌ−アリルグリシン、ｂ−アラニン、Ｌ−ａ−アミノ酪酸、Ｌ−ｇ−アミノ酪酸、Ｌ−ａ−アミノイソ酪酸、Ｌ−ｅ−アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、Ｌ−メチオニンスルホン、Ｌ−ノルロイシン、Ｌ−ノルバリン、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒドロキシプロリン、Ｌ−チオプロリン、１−メチル−Ｐｈｅ、ペンタメチル−Ｐｈｅなどフェニルアラニンのメチル誘導体、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシル酸）、Ｌ−ジアミノプロピオン酸ならびにＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）がある。ペプチドは、さらに修飾されてもよい。例えば、１つまたは複数のアミド結合が、エステルまたはアルキル骨格結合によって置き換えられてもよい。ＮもしくはＣアルキル置換基、側鎖修飾またはジスルフィド架橋、側鎖アミドもしくはエステル結合などの制約があってもよい。
【００３７】
本発明のペプチドは、修飾ペプチドおよび合成ペプチド類似体の両方を含んでもよい。例えば、ペプチドを修飾して、製剤および貯蔵特性を改善し、または非ペプチド性構造を組み込むことによって、不安定なペプチド結合を保護してもよい。
【００３８】
本発明のペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端修飾を含んでもよい。例えば、Ｎ末端アセチル化および／またはＣ末端アミド化。
本発明のペプチドは、当業者に公知の方法を使用して調製されてもよい。例えば、ペプチドは、化学合成（例えば固相技術および自動化ペプチド合成装置）によって、または組換え手段（本明細書に記述される核酸などを使用する）によって産生されてもよい。例えば、ペプチドは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学を使用する自動化された複数ペプチド合成装置（Ａｂｉｍｅｄ  ＡＭＳ  ４２２）で固相戦略を使用して合成されてもよい。ペプチドは、次いで逆相−ＨＰＬＣによって精製され、凍結乾燥され得る。本発明のペプチドを作る特定の合成方法は、以下の実施例に記述される。
【００３９】
一部の場合において、Ｘ２およびＸ３は、らせん促進残基である。一部の場合において、Ｚｍアミノ酸は、らせん促進残基である。本明細書で使用される、らせん促進残基は、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、ＰｈｅおよびＡｓｐからなる群からそれぞれ独立に選択され得る。らせん促進残基は、１つまたは複数の人工または修飾アミノ酸を含んでもよい。
検出可能な部分
本明細書で使用される、本発明のペプチドは、検出可能な部分にコンジュゲートされてもよい。用語「検出可能な部分」は、患者に本発明のコンジュゲートを投与した後に標的部位に位置する場合に、身体の外側および標的が位置する部位から一般に非侵襲的に検出され得る部分に関する。したがって、本発明のこの態様のコンジュゲートは、画像化および診断に有用である。容易に検出可能な部分は、核磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）、単光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）および陽電子放射
断層撮影法（ＰＥＴ）などの画像化技術ならびに光学的画像化によって検出可能な実体である。好ましくは、画像化部分は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ条件下でその特性を保持する安定かつ非毒性な実体である。そのような部分の例には、それだけには限らないが放射性部分、例えば放射性同位元素がある。適切な放射性原子には、シンチグラフィー研究用のインジウム１１１、テクネチウム９９ｍまたはヨウ素１２３がある。他の容易に検出可能な部分には、例えば、ヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素１８、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄などＭＲＩ用のスピン標識ならびにＣｙ５．５およびカンタムドットを含む光学的部分がある。検出可能な部分のさらなる例には、６８Ｇａ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、８９Ｚｒ、１２４Ｉ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ、１８Ｆ、８６Ｙ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、６７Ｇａおよび９９ｍＴｃがある。
【００４０】
用語「治療的部分」は、有益な、予防的および／または治療的特性を有する部分を包含する。
細胞傷害性化学療法薬は、当業者に周知であり：メクロレタミン（ＨＮ２）、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）およびクロラムブシルなどの窒素マスタードを含めたアルキル化剤；１０個のエチレンイミンおよびヘキサメチルメラミンなどのメチルメラミン、チオテパ；ブスルファンなどのアルキルスルホナート；カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＬＪ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮ−Ｕ）およびストレプトゾエイン（streptozoein）（ストレプトゾトシン）などのニトロソ尿素；ならびにダカルバジン（ＤＴＩＣ；ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド）などのトリアゼン；メトトレキサート（アメトプテリン）などの葉酸類似体を含めた代謝拮抗物質；フルオロウラシル（５−フルオロウラシル；５−ＦＵ）、フロキシウリジン（フルオロデオキシウリジン；ＦＵｄＲ）およびシタラビン（シトシンアラビノシド）などのピリミジン類似体；ならびにプリン類似体およびメルカプトプリン（６−メルカプトプリン；６−ＭＰ）、チオグアニン（６−チオグアニン；ＴＧ）およびペントスタチン（２’−デオキシコホルマイシン）などの関連阻害剤などの抗がん剤がある。天然物には、ビンブラスチン（ＶＬＢ）およびビンクリスチンなどのビンカアルカロイド；エトポシドおよびテニポシドなどのエピポドフィロトキシン；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびマイトマイシン（マイトマイシンＱなどの抗生物質；Ｌ−アスパラギナーゼなどの酵素；ならびにインターフェロンアルフェノーム（alphenomes）などの生物学的応答調節物質がある。その他の薬剤には、シスプラチン（ｃｉｓ−ＤＤＰ）およびカルボプラチンなどのプラチナ配位錯体；ミトキサントロンおよびアントラサイクリン（antbracycline）などのアントラセンジオン；水酸化尿
素などの置換尿素；プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン、ＭＩＨ）などのメチルヒドラジン誘導体；ならびにミトタン（ｏ、ｐ’−ＤＤＤ）およびアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制剤；タキソールおよび類似体／誘導体；ならびにフルタミドおよびタモキシフェンなどのホルモンアゴニスト／アンタゴニストがある。
【００４１】
特に、本発明のペプチドは、オーリスタチン、マイタンシノイド、チューブリシン、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、アルファ−アマニチン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、イリノテカンおよびインドールカルボキサミド、またはその類似体、誘導体、プロドラッグもしくは活性代謝物から選択される抗がん剤にコンジュゲートされてもよい。特定の例は、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、メルタンシン（ＤＭ１）、ラブタンシン（ＤＭ４）およびセンタナマイシンを含む。
【００４２】
特定の場合において、抗がん剤は、細胞死をもたらす任意の部分を含む細胞傷害性ペプチドまたはポリペプチド部分であってもよい。
細胞傷害性ペプチドおよびポリペプチド部分は、当業者に周知であり、例えば、リシン、アブリン、シュードモナス外毒素、組織因子、等がある。
【００４３】
細胞毒性物質としてのリシンの使用は、Ｂｕｒｒｏｗｓ  ＆  Ｔｈｏｒｐｅ、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ  ９０：８９９６〜９０００頁、１９９３年に記述されており、参照により本明細書に組み込む、腫瘍の限局性血液凝固および梗塞をもたらす組織因子の使用は、Ｒａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４６４６〜４６５３頁、１９９８年およびＨｕａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：２５  ５４７〜５５０頁、１９９７年に記述されている。Ｔｓａｉら、Ｄｉｓ．Ｃｏｌｏｎ  Ｒｅｃｔｕｍ  ３８：１０６７〜１０７４頁、１９９５年は、モノクローナル抗体にコンジュゲートされたアブリンＡ鎖について記述しており、参照により本明細書に組み込む。他のリボソーム不活性化タンパク質が、ＷＯ９６／０６６４１において細胞毒性物質として記述されている。シュードモナス外毒素が、細胞傷害性ポリペプチド部分として使用されてもよい（例えば、Ａｉｅｌｌｏら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ  ９２：１０４５７〜１０４６１頁、１９９５年を参照のこと）。
【００４４】
特定の放射性原子も、充分な用量で送達される場合、細胞傷害性であり得る。したがって、抗がん剤は、使用時に、細胞傷害性となるのに充分な量の放射活性を標的部位に送達する放射性原子を含んでもよい。適切な放射性原子には、リン３２、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、レニウム１８６、レニウム１８８、アスタチン２１１もしくはイットリウム９０または隣接する細胞、細胞小器官もしくは核酸を破壊するのに十分なエネルギーを放射する他の任意の同位元素がある。特に、治療的放射性同位元素は、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２５Ａｃ、２２３Ｒａ、４４Ｓｃ、６７Ｇａ、１３１Ｉ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅおよび６７Ｃｕからなる群から選択され得る。好ましくは、本発明の化合物中の同位元素および放射性原子の密度は、４０００ｃＧｙより高く、より好ましくは少なくとも６０００、８０００または１００００ｃＧｙのような用量であり、その化合物は標的部位、好ましくは標的部位にある細胞およびその細胞の細胞小器官、特に核へ送達される。放射性原子は、公知の方法で結合部分に結合されてもよい。例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡまたは別のキレート化剤が本発明のペプチドに結合され、上記の通り１１１Ｉｎ、６８Ｇａ、９０Ｙを含めた金属放射性核種または放射性原子を結合するために使用されてもよい。チロシン残基が、本発明のペプチドに導入されてもよく、１２５Ｉまたは１３１Ｉで標識され得る。
【００４５】
治療的薬剤にペプチドをコンジュゲートする方法は、当業者に周知である。これらは、リンカー、例えば切断可能なリンカーの使用を含み得る。
用語「薬学的に許容可能な担体」は、ペプチドまたはそのコンジュゲートと適合し、レシピエントに対して有害でない成分を一般に含む。一般に、担体は、無菌であり発熱物質を含まないことになる水または生理食塩水になるが；他の許容できる担体が使用されてもよい。一般に、本発明の医薬組成物または製剤は、非経口投与用、より具体的には静脈内投与用である。
【００４６】
当業技術者に公知であろう通り、上で定義した本発明の医薬または医薬組成物は、他の医薬も投与される患者に有用に投与され得る。例えば、がんの場合、本発明の医薬または医薬組成物は、他の抗腫瘍剤の投与前、後もしくは最中、例えば化学療法の前、後もしくは最中に患者に投与されてもよい。化学療法後のペプチドによる処置は、腫瘍の再発または転移を減少もしくは防止するのに特に有用であり得る。例えば、抗腫瘍剤が、本発明のペプチドに直接または間接的に共有結合的に連結され得る。
【００４７】
αｖβ６発現の決定
当業者は、サンプル（腫瘍サンプルなど）がインテグリンαｖβ６を発現するかどうか決定する数多くの技術を承知していよう。特定の態様において、処置されるべき対象は、
インテグリンαｖβ６を発現する細胞を１つまたは複数有する腫瘍を有してもよい。特定の場合において、腫瘍がインテグリンαｖβ６を発現する（すなわちαｖβ６陽性がんである）という所見は、前もって実施されてもよく、またはがんの型から推測されてもよい。例えば、いくつかの腫瘍型は、頸部腫瘍、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、皮膚腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍または膵腫瘍を含め、インテグリンαｖβ６を発現することが公知である。どんな特定の理論に束縛されることを望むものでもないが、本発明者らは、胃腸（ＧＩ）管のがんおよび多くの上皮組織から発達する癌腫が、本発明のペプチドまたはコンジュゲートを使用するαｖβ６標的化治療から恩恵を受け得ると信じている。さらなる研究努力によってαｖβ６を発現すると判明したがんの範囲が拡大するにつれて、その結果、本発明のペプチドまたはコンジュゲートを使用するαｖβ６標的化治療から治療的恩恵を呈し得るがんの範囲は広がると期待される。
【００４８】
さらにまたは別法として、特定の場合において、処置は、腫瘍がインテグリンαｖβ６を発現するかどうか決定する活性工程を含んでもよい。そのような工程を、例えば、本発明のαｖβ６標的化ペプチドまたはコンジュゲートによる処置を開始する前に実施して、本発明のαｖβ６標的化ペプチドまたはコンジュゲートを使用する治療に対する対象の適合見込みを予測してもよい。αｖβ６発現の決定は、免疫組織化学を使用する腫瘍サンプルにおけるタンパク質発現および／もしくはレベルの測定、ＥＬＩＳＡもしくはウェスタンブロッティングによる細胞溶解物中のタンパク質レベルの測定、ならびに／またはαｖβ６もしくはその断片もしくはサブユニットに特異的に結合できる結合剤の使用を含んでもよい。
【００４９】
特定の態様において、対象がαｖβ６陽性がんを有するかどうかの決定は、がん、血液中を循環しているがん細胞のサンプル、および／または血液もしくは血漿中を循環している腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）から得られる細胞のサンプルから抽出される核酸で実行されてもよい。
【００５０】
特定の場合において、αｖβ６の発現の決定は、がん細胞のサンプルからＲＮＡを抽出する工程と、リアルタイムＰＣＲおよび／またはαｖβ６もしくはその断片をコードしているＲＮＡにハイブリダイズすることができるプローブを使用することによって発現を測定する工程とを含む。αｖβ６インテグリンの存在または量は、抗体または本発明のペプチドもしくはコンジュゲートなど、αｖβ６もしくはその断片に特異的に結合する能力がある結合剤を使用して直接決定されてもよい。結合剤は、標識されているもしくは例えばＥＬＩＳＡ型アッセイにおいて検出可能な結果を生じることができる二次抗体を例えば使用して、１つまたは複数のさらなる種との反応後に検出され得るまたは検出でき得るように標識されてもよい。
【００５１】
サンプル
本明細書で使用される「試験サンプル」は、細胞または組織サンプル（例えば生検）、生体液、抽出物（例えば、対象から得られるタンパク質またはＤＮＡ抽出物）でもよい。特に、サンプルは、腫瘍サンプル、血液サンプル（血漿または血清サンプルを含む）、脳脊髄液サンプルまたは非腫瘍組織サンプルでもよい。サンプルは、対象から新たに得られたものでもよくまたは決定を行う前に処理および／もしくは貯蔵された（例えば凍結、固定または１つもしくは複数の精製、富化もしくは抽出工程に供された）ものでもよい。循環腫瘍ＤＮＡのために血液または血漿サンプルを富化する技術（例えば断片サイズに基づく）が、記述されている。さらに、ｃｔＤＮＡ内のがん関連突然変異を同定する配列決定技術が、記述されている（例えばデジタルＰＣＲ、標的ディープシーケンシング、ネステッドリアルタイムＰＣＲ、等に基づく）。
【００５２】
本明細書において使用される「および／または」は、他の有無にかかわらず２つの指示
された特色または成分のそれぞれについての特定の開示と見なすべきである。例えば「Ａおよび／またはＢ」は、まさにそれぞれが本明細書において個別に提示されるかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢのそれぞれについての特定の開示と見なすべきである。
【００５３】
特定の形態においてまたは開示されている機能を実行する手段に関して表される前述の説明もしくは以下の請求項もしくは添付の図面に開示されている特色、または開示されている結果を得る方法もしくは工程は、必要に応じて、別々にまたはそのような特色の任意の組合せで、その多様な形態の本発明を理解するために利用され得る。
【００５４】
本発明は、上述した典型的な態様と組み合わせて記述されているが、本開示を与えられた場合、多くの同等の修飾および変形が、当業技術者にとって明らかであろう。したがって、上に記載の本発明の典型的な態様は、例示的なものであり、制限するものではないと見なされる。記述されている態様に対する様々な変更が、本発明の精神と範囲から逸脱することなく行われてもよい。いかなる誤解も避けるために、本明細書に提供されるあらゆる理論的な説明は、読者の理解を改善する目的で提供される。本発明者らは、これらの理論的な説明のいずれによっても束縛されないことを望む。
【００５５】
本明細書に使用されるどんな見出しも、単なる構成の目的であり、記述されている主題を限定するものと解釈されるべきでない。
この明細書の全体を通じて、続く請求項を含めて、文脈上別段の解釈を要する場合を除き、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形は、述べられる整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を内包するが、他の任意の整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を除外しないことを意味すると理解されよう。明細書および添付の請求項に使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈に別段の明確な指図がない限り複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。範囲は、「約」ある特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして本明細書に表現されてもよい。そのような範囲が表現される場合、別の態様は、ある特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、先の「約」の使用によって値が近似値として表現される場合、特定の値が別の態様を形成することが理解されよう。数値に関する用語「約」は、随意であり、例えば＋／−１０％を意味する。
【００５６】
以下は、例として示されるものであり、本請求項の範囲に対する制限と解釈されるべきでない。
【実施例】
【００５７】
フローサイトメトリーによってαｖβ６インテグリンに対する結合活性が測定可能になるように、全てのペプチドを、天然のＡｌａの代わりに２Ｌｙｓ（Ｄ−ビオチン）残基を組み込んで合成した（すなわち、ＷＯ２００７／０３９７２８に開示されている通り、Ａ２０ＦＭＤＶ２は２位にＡｌａを有する）。比較のために、自身でＳＰＰＳ合成したペプチドを商業的に合成されたビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２（下の表２においてビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２−Ａと呼ぶ）と比較した。活性研究後に、強力な結合活性を呈したビオチン化ペプチドを次いで選択し、金属キレート化剤ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）［１７］を組み込んで、血漿安定性研究およびｉｎ  ｖｉｖｏ体内分布研究のための１１１Ｉｎのカップリングを容易にした。ビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２、その非タンパク新生誘導体ならびにビオチン化およびＤＰＴＡ組み込み類似体の合成、結合研究および血漿安定性について、以下で詳細に記述する。
【００５８】
実験
全般的な情報
全ての試薬を試薬品質で購入し、それ以上精製することなく使用した。ＨＰＬＣ溶媒をＨＰＬＣ品質で購入し、それ以上精製することなく使用した。ＦｍｏｃＮＨ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｏ−ＣＨ２−ｐｈｉ−ＯＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈを、ＰｏｌｙＰｅｐｔｉｄｅ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、Ｒｉｎｋアミド、４−（ヒドロキシメチル）フェノキシ酢酸（ＨＭＰ）、Ｂｏｃ無水物およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を、ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）から購入した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（ＡＲ品質）およびアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）（ＨＰＬＣ品質）を、Ｓｃｈａｒｌａｕ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）から購入した。ジイソプロピルエチルアミン（ｉＰｒ２ＮＥｔ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、ピペリジン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、コリジン、１，８−ジアザビシクロウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、２−メルカプトエタノール、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）および３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール（ＤＯＤＴ）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。２−ニトロベンゼンスルホニルクロリド（２−ＮＢＳ−Ｃｌ）および硫酸ジメチル（ＤＭＳ）を、ＡＫ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から入手した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を、Ｏａｋｗｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｒｉｖｅｒ  Ｅｄｇｅ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から購入した。アミノメチルポリスチレン樹脂およびＤＴＰＡを、公開されている手順にしたがって合成した［２１、２２］。以下の側鎖保護を持つＦｍｏｃ−アミノ酸を、ＧＬ  Ｂｉｏｃｈｅｍから購入した：Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（Ｐｂｆ＝２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｔｒｔ＝トリフェニルメチル）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−ＯＨ（ｔＢｕ＝ｔ−ブチル）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ。
【００５９】
エレクトロスプレーイオン化質量スペクトル（ＥＳＩ−ＭＳ）を、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）１１００ＭＳＤ分光計に直列に接続したＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）１１２０  Ｃｏｍｐａｃｔ  ＬＣで記録した。サンプルを、０．１％ギ酸／Ｈ２Ｏおよび０．１％ギ酸／ＣＨ３ＣＮ（１：１、容積／容積）を使用して、ポジティブモードで、ＥＳＩ供給源に０．２ｍＬ／分で直接フローインジェクションを使用して導入した。主要なおよび著しい断片が、形態ｘ  ｍ／ｚ（電荷に対する質量比）で提示された。分析ＲＰ−ＨＰＬＣを、流速１ｍＬ／分でＷａｔｅｒｓ  ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８カラム（５μｍ、４．６×１５０ｍｍ）を使用してＵｌｔｉｍａｔｅ  ３０００システムで実行した。０．１％
ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（溶媒Ａ）および０．１％  ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ（溶媒Ｂ）の直線勾配を、２１０ｎｍの検出で使用した。分取ＲＰ−ＨＰＬＣを、流速１０ｍＬ／分でＷａｔｅｒｓ  ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｐｒｅｐ  ＭＳ  Ｃ１８カラム（１０μｍ、１９×３００ｍｍ）を使用してＷａｔｅｒｓ  ２４８７二波長吸光度検出器を備えたＷａｔｅｒｓ６００システムで実行した。勾配システムを、溶出プロファイルおよび分析ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムから得られるピークプロファイルにしたがって調整した。
【００６０】
全般的なペプチド合成手順
固相ペプチド合成（０．１ｍｍｏｌ規模）を、Ｆｍｏｃ化学戦略に基づいてアミノメチ
ルポリスチレン樹脂（０．８ｍｍｏｌ／ｇ）上で実行した。ＦｍｏｃＮＨ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｏ−ＣＨ２−ｐｈｉ−ＯＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈを、全般的な方法Ａ（下記参照）を使用して樹脂に結合させ、Ｒｉｎｋアミドを、全般的な方法Ｂを使用して樹脂に結合させ、ＨＭＰを、全般的な方法Ｃを使用して樹脂にカップリングした［２０］。Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨのカップリングを、全般的な方法Ｄを使用して達成した。所望のペプチド配列を、手作業でまたは全般的な方法Ｅを使用してＴｒｉｂｕｔｅ（商標）（Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）ペプチド合成装置で合成し、ペプチド結合Ｎ−メチル化を、全般的な方法Ｆを使用して実施し［１９］、Ｎメチル化リジンへのＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨのカップリングを、全般的な方法Ｇを使用して実施した。Ｎ末端アセチル化を、全般的な方法Ｈを使用して実施し、ｔ−ブチル保護されたＤＴＰＡを、全般的な方法Ｉを使用してペプチドにカップリングした。Ｄ−ビオチンを、全般的な方法Ｊを使用してペプチドに結合させた。直鎖ペプチドを、全般的な方法Ｋを使用して樹脂から切断し、粗産物を、全般的な方法Ｌにしたがって精製した。
【００６１】
全般的な方法Ａ：アミノメチルポリスチレン樹脂へのＦｍｏｃＮＨ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｏ−ＣＨ２−ｐｈｉ−ＯＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈの結合
アミノメチルポリスチレン樹脂（０．１ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２／ＤＭＦ（１：１、容積／容積）中で２０分間膨潤させ、溶媒を濾過によって除去した。樹脂に、１０％  ＤＭＦ／ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ、容積／容積）中のＦｍｏｃＮＨ−Ｌ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｏ−ＣＨ２−ｐｈｉ−ＯＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ（２当量）溶液、その後ＤＩＣ（２当量）を添加し、反応混合物を室温で３時間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）、ＣＨ２Ｃｌ２（３×５ｍＬ）で洗浄し、風乾して１６を得た。陰性カイザー試験［４１］は、完全な反応を示した。
【００６２】
全般的な方法Ｂ：アミノメチルポリスチレン樹脂へのＲｉｎｋアミドの結合
アミノメチルポリスチレン樹脂（０．１ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２／ＤＭＦ（１：１、容積／容積）中で２０分間膨潤させ、溶媒を濾過によって除去した。樹脂に、１０％  ＤＭＦ／ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ、容積／容積）中のＲｉｎｋアミド（２当量）溶液、その後ＤＩＣ（２当量）を添加し、反応混合物を室温で３時間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）、ＣＨ２Ｃｌ２（３×５ｍＬ）で洗浄し、風乾した。陰性カイザー試験は、完全な反応を示した。
【００６３】
全般的な方法Ｃ：アミノメチルポリスチレン樹脂への４−（ヒドロキシメチル）フェノキシ酢酸（ＨＭＰ）の結合（樹脂２７の合成）
アミノメチルポリスチレン樹脂（０．１ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２／ＤＭＦ（１：１、容積／容積）中で２０分間膨潤させ、溶媒を濾過によって除去した。樹脂に、１０％  ＤＭＦ／ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ、容積／容積）中のＨＭＰ（２当量）溶液、その後ＤＩＣ（２当量）を添加し、反応混合物を室温で３時間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）、ＣＨ２Ｃｌ２（３×５ｍＬ）で洗浄し、風乾して２７を得た。陰性カイザー試験は、完全な反応を示した。
【００６４】
全般的な方法Ｄ：ＨＭＰ樹脂２７へのＦｍｏｃ−Ｄ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨの結合
樹脂にＤＭＦ（１ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｄ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（２当量）溶液およびＤＩＣ（２当量）を添加し、その後ＤＭＦ（１００μＬ）中のＤＭＡＰ（１０％当量）を滴下した。反応混合物を室温で２時間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した後、エステル化をさらなる２時間繰り返した。樹脂に２０％酢酸無水物／ＤＭＦ（１ｍＬ）を添加し、ＤＭＦ（１００μＬ）中のＤＭＡＰ（１０％当量）溶液を滴下し、反応混合物を室温で１時間撹拌し、その後溶液を排液し、樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した。
【００６５】
全般的な方法Ｅ：手作業および自動化されたＦｍｏｃ  ＳＰＰＳ
ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＦｍｏｃ保護されたアミノ酸（５当量）溶液にＨＢＴＵ（４．７５当量）およびｉＰｒ２ＮＥｔ（１０当量）を添加し、溶液を樹脂に添加した。混合物を室温で３０分間撹拌した後、溶液を排液し、樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した。Ｆｍｏｃ保護基を、室温で５分間次いで１０分間の２０％ピペリジン／ＤＭＦ（５ｍＬ、容積／容積）による処理によって除去した。
【００６６】
全般的な方法Ｆ：ペプチド結合Ｎ−メチル化
ＮＢＳ保護：ＮＭＰ（１ｍＬ）中の２−ＮＢＳ−Ｃｌ（４当量）溶液にコリジン（１０当量）を添加し、溶液を樹脂に添加し、反応混合物を室温で１５分間攪拌した。溶液を排液し、樹脂をＮＭＰ（３×５ｍＬ）で洗浄した後、反応をさらなる１０分間繰り返した。Ｎ−メチル化：樹脂にＮＭＰ（１ｍＬ）中のＤＢＵ（３当量）溶液を添加し、反応混合物を室温で３分間撹拌した。ＮＭＰ（１ｍＬ）中のＤＭＳ（１０当量）溶液を反応混合物に次いで添加し、反応混合物を室温で２分間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をＮＭＰ（３×５ｍＬ）で洗浄した後、反応をさらなる２分間繰り返した。ＮＢＳ脱保護：樹脂にＮＭＰ（２ｍＬ）中の２−メルカプトエタノール（１０当量）およびＤＢＵ（５当量）溶液を添加し、反応混合物を室温で５分間撹拌した。溶液を排液し、樹脂をＮＭＰ（３×５ｍＬ）で洗浄した後、反応をさらなる５分間繰り返した。
【００６７】
全般的な方法Ｇ：Ｎメチル化ＬｙｓへのＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨのカップリング
ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＦｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（５当量）溶液にＨＡＴＵ（４．７５当量）およびｉＰｒ２ＮＥｔ（１０当量）を添加し、溶液を樹脂に添加し、反応混合物を室温で３時間攪拌した。溶液を排液し、樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した後、反応をさらなる３時間繰り返した。
【００６８】
全般的な方法Ｈ：Ｎ末端アセチル化
樹脂に２０％酢酸無水物／ＤＭＦ（１ｍＬ）溶液を添加し、その後ＤＭＦ（１００μＬ）中のＤＭＡＰ（１０％当量）溶液を滴下した。反応混合物を室温で３０分間撹拌した後、溶液を排液し、樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した。
【００６９】
全般的な方法Ｉ：ｔ−ブチル保護ＤＴＰＡの結合
ＤＭＦ（１ｍＬ）中の４２（５当量）溶液にＨＢＴＵ（４．７５当量）およびｉＰｒ２ＮＥｔ（１０当量）を添加し、溶液を樹脂に添加した。混合物を室温で３０分間撹拌した後、溶液を排液し、樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した。
【００７０】
全般的な方法Ｊ：Ｄ−ビオチンの結合
ペプチド１〜１５およびペプチド１７、１９、２０および２１の合成のために、Ｎ末端Ｆｍｏｃ基を、室温で５分間次いで１０分間の２０％ピペリジン／ＤＭＦ（５ｍＬ、容積／容積）による処理によって除去した。ＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した後、ＤＭＦ（１ｍＬ）中の（Ｂｏｃ）２Ｏ（５当量）溶液を樹脂に添加し、反応混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで、ＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した。Ｄｄｅ基を、２％ヒドラジン／ＤＭＦ（５ｍＬ、容積／容積）を室温で５分間使用することによって除去し、新鮮な試薬で１０分間繰り返した。ＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した後、ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＤ−ビオチン（５当量）、ＨＢＴＵ（４．７５当量）およびｉＰｒ２ＮＥｔ（１０当量）溶液を樹脂に添加し、反応混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで、ＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した。
【００７１】
ペプチド１６および１８およびペプチド２２〜２６の合成のために、Ｄｄｅ基を、２％ヒドラジン／ＤＭＦ（５ｍＬ、容積／容積）を室温で５分間使用することによって除去し
、新鮮な試薬で１０分間繰り返した。ＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した後、ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＤ−ビオチン（５当量）、ＨＢＴＵ（４．７５当量）およびｉＰｒ２ＮＥｔ（１０当量）溶液を樹脂に添加し、反応混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで、ＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄した。
【００７２】
全般的な方法Ｋ：樹脂からのペプチドの切断
所望の直鎖ペプチドを含有する樹脂を、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＤＯＤＴ／ＴＩＰＳ（９４：２．５：２．５：１．０、５ｍＬ、容積／容積／容積／容積）の混合物中で３時間撹拌した。濾液に冷ジエチルエーテル（３０ｍＬ）を添加し、上清を廃棄する前に産物混合物を１０分間遠心分離した。この手順を２回繰り返した。得られた固体を、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ＋０．１％ＴＦＡ溶液（１５ｍＬ）に溶解し、凍結乾燥した。
【００７３】
全般的な方法Ｌ：精製
粗ペプチドを、Ｈ２Ｏ／０．１％  ＴＦＡ溶液に溶解し、流速１０ｍＬ／分で、０．５％Ｂ／分で５〜２０％Ｂ、次いで３５％Ｂまで０．２％Ｂ／分の勾配を使用してＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８カラムで分取逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣによって精製した。ペプチドの純度を、フローインジェクション（ＥＳＩ＋、１００Ｖ）および分析ＲＰ−ＨＰＬＣ［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８カラム、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１ｍＬ／分］によって決定した。
【００７４】
生物学研究
ペプチドの調製
比較ために、商業的に供給されているビオチン化ＤＯＴＡ−Ａ２０ＦＭＤＶ２ペプチド（純度９５％）を、ＰＰＲ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）から購入した点に注意されたい。ペプチドを０．１％  ＴＦＡ（水に希釈した）に再懸濁して濃度１ｍＭの保存溶液を調製し、分注し、−２０℃で貯蔵した。
【００７５】
細胞株
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで使用した細胞株は、形質導入した黒色腫株Ａ３７５Ｐｐｕｒｏ、およびＡ３７５Ｐβ６である［ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）／１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で培養した］［９］。
【００７６】
ペプチドの結合の特異性およびレベル−フローサイトメトリー方法
細胞をトリプシン処理し、ＤＭＥＭ／０．１％（質量／容積）アジ化ナトリウム／０．１％（質量／容積）ＢＳＡ（フロー培地）に再懸濁して、４×１０６個細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。この時点から全てを氷上に保ち、細胞懸濁液５０μＬを、各フローチューブ（ファルコン２０５４−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に分注した。ペプチドを、２×濃度でフロー培地中に段階的に希釈した。したがって各濃度５０μＬを細胞５０μＬに添加した場合、終濃度１０００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭおよび０ｎＭを得た。Ａ３７５Ｐｐｕｒｏ細胞の場合、最高濃度の１０００ｎＭだけを細胞に添加した。次いでペプチドを、氷上に１５分間放置した。次いで、細胞をフロー培地に再懸濁し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離することにより２回洗浄した。
【００７７】
マウス抗ビオチン［１：２００で５０μＬ；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（２００−００２−２１１）］を各サンプルに１５分間添加し、次いで洗浄工程を繰り返した。Ａｌｅｘａ  ４８８にコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（１：２５０）を、各サンプルに添加し（５０μＬ）、暗所で氷上に１５分間放置した。洗浄工程を繰り返し、細胞をフロー培地３８０μＬに再懸濁した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ血球計算器（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、データを取得し；幾何平均蛍光強度を各サンプルについて記録した。
【００７８】
内部移行アッセイ方法−Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍおよびフローサイトメトリー
細胞をトリプシン処理し、ＤＭＥＭ（無血清培地）に再懸濁して４×１０６個細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。この時点から全てを氷上に保った。細胞懸濁液５０μＬを、各フローチューブに分注した。ペプチドを氷冷無血清培地中に２００ｎＭになるよう希釈し、細胞サンプルに５０μＬを添加した後に終濃度１００ｎＭを得た。ペプチドを氷上に１５分間放置し、次いでフロー培地で２回洗浄し、各洗浄工程の間に１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。マウス抗ビオチン（１：２００で５０μＬ）を各サンプルに１５分間添加し、次いで洗浄工程を繰り返した。０時点を除いて、時点サンプルのそれぞれを、３７℃で１５、３０および４５分間インキュベーター内に置き、細胞を、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで１０分間固定し、ＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳで再度洗浄する前に０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００界面活性剤を５分間添加した。ＡｌｅｘａＦＬＵＯＲ  ４８８にコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（１：２５０）を、各サンプルに添加し（５０μＬ）、暗所で氷上に１５分間放置した。サンプルを上記のように洗浄し、３０μＬになるように再懸濁した。サンプルを、Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍ  Ｘ  Ｍａｒｋ  ＩＩ（Ａｍｎｉｓ、Ｍｅｒｃｋ）で検査し、Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍ画像を、搭載されているソフトウェアを使用して０分のサンプルと比較して内部移行について評価した。
【００７９】
内部移行アッセイ方法−フローサイトメトリー
細胞を、抗体でビオチンを検出する前に界面活性剤を添加しなかったことを除いて上記の通り調製した。サンプルを、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）血球計算器で分析した。経時的に測定した蛍光シグナルの減少は、Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍを使用して視覚的に確認したように、結合しているペプチドの内部移行と関連付けられた（データ不掲載）。
【００８０】
血漿安定性
ＤＴＰＡコンジュゲートしたペプチド１５μｇにインジウム１１１（Ｃｏｖｉｄｉｅｎ−Ｐｅｔｔｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）１５ＭＢｑを添加し（最終容積２０μＬ）、その後酢酸アンモニウム（１Ｍ）５μＬを添加した。サンプルを混合し、室温で３０分間放置した。この混合物２μＬを蒸留水１００μＬに添加し、次いで混合物を勾配逆相−ＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ）に注射した。サンプルを、蒸留水中の０．１％  ＴＦＡ中でＡｇｉｌｅｎｔ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８カラムに流した。これは、一般に＞９５％である放射標識の効率を確認するためであった。ヒト血液を、ナトリウムヘパリン管に採取し、２０００ｇで１０分間遠心分離した。血漿（３００μＬ）を、７．５ＭＢｑのバリアントペプチドとインキュベートし、直ちに１５０μＬを除去し、３７℃に置き、残りの１５０μＬを、時間０分サンプルとして使用した。これに、氷冷アセトニトリル等容積を添加し（１：１）、サンプルを混合し、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を採集し、１０分間吸引乾燥してアセトニトリルを除去した。残滓を、０．２２μｍフィルターによって濾過し（微粒子を除去するため）、１００μＬを放射ＨＰＬＣ機械に注射した。２４時間サンプルを同様に処理した。対照サンプルをＰＢＳとインキュベートした。（注意：ＰＢＳ対照は、濾過のこの工程またはアセトニトリルの添加を必要としなかった）。サンプルを複製して実行し、類似の結果であった。
【００８１】
体内分布
１００μＬ中に２×１０６個の細胞を、雌ＣＤ１  Ｎｕ／Ｎｕマウスの肩に皮下注射した。腫瘍を、左肩（Ａ３７５Ｐｕｒｏ）および右肩（Ａ３７５β６）で２週間にわたり皮下成長させた。腫瘍が、直径およそ５ｍｍに成長したら、ペプチドをインジウム１１１で放射性標識し、放射ＨＰＬＣによって分析して標識効率を決定した。標識されたペプチドを無菌ＰＢＳ／ＢＳＡに希釈し、動物１匹当たり０．３ＭＢｑを与えるように投薬した。次いでマウスに放射性標識ペプチドを静脈内（尾静脈）注射し、１時間後に殺処分した。
血液、器官および腫瘍を摘出し、計量し、その翌日残留活性をガンマカウンター（ＬＫＢ
Ｃｏｍｐｕｇａｍｍａ）で測定した。データを、％注射用量／ｇ組織（％ＩＤ／ｇ）として表した。
【００８２】
ペプチド特徴付けデータ
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（１）（配列番号１１）
ペプチド（１）（９７．１ｍｇ、５０％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１３．２分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２２４．３；Ｆｏｕｎｄ  １２２３．６。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱｋＶＡＲＴ−ＯＨ（２）（配列番号１２）
ペプチド（２）（５４．３ｍｇ、２２％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１１．９分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２２４．３；Ｆｏｕｎｄ  １２２３．７。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱ［オルニチン］ＶＡＲＴ−ＯＨ（３）（配列番号１３）
ペプチド（３）（６３．５ｍｇ、２６％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．７分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２１７．３；Ｆｏｕｎｄ  １２１６．７。
ペプチドＮ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱ［ジアミノ酪酸］ＶＡＲＴ−ＯＨ（４）（配列番号１４）
ペプチド（４）（７０．３ｍｇ、２９％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．７分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２１０．３；Ｆｏｕｎｄ  １２０９．８。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱ［ジアミノプロピオン酸］ＶＡＲＴ−ＯＨ（５）（配列番号１５）
ペプチド（５）（５９．９ｍｇ、２５％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．９分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２０３．２；Ｆｏｕｎｄ  １２０３．１。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱ−Ｎ−ＭｅＫＶＡＲＴ−ＯＨ（６）（配列番号１６）
ペプチド（６）（７２．７ｍｇ、３０％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１１．５分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２３１．３；Ｆｏｕｎｄ  １２３０．７。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶ［アミノイソ酪酸］ＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（７）（配列番号１７）
ペプチド（７）（１６．６ｍｇ、７％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１１．９分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２０９．７；Ｆｏｕｎｄ  １２１０．２。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶ［ノルバリン］ＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（８）（配列番号１８）
ペプチド（８）（１９．５ｍｇ、８％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％
の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．２分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２１６．８；Ｆｏｕｎｄ  １２１７．２。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶ［ノルロイシン］ＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（９）（配列番号１９）
ペプチド（９）（１８．７ｍｇ、８％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．７分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２２３．８；Ｆｏｕｎｄ  １２２４．７。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶ［アリルグリシン］ＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（１０）（配列番号２０）
ペプチド（１０）（５．５ｍｇ、２％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１１．７分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２１５．７；Ｆｏｕｎｄ  １２１５．８。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶ［ｔ−ブチル−アラニン］ＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（１１）（配列番号２１）
ペプチド（１１）（７．５ｍｇ、３％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．９分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２３０．８；Ｆｏｕｎｄ  １２３０．７。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶ［ホモロイシン］ＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（１２）（配列番号２２）
ペプチド（１２）（２６．１ｍｇ、１１％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１３．１分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２３０．８；Ｆｏｕｎｄ  １２３１．２。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶ［２−アミノ−３−エチルペンタン酸］ＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（１３）（配列番号２３）
ペプチド（１３）（１０．１ｍｇ、４％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．９分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２３０．８；Ｆｏｕｎｄ  １２３０．８。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶ［シクロヘキシルアラニン］ＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（１４）（配列番号２４）
ペプチド（１４）（６．２ｍｇ、２％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１３．４分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２４３．８；Ｆｏｕｎｄ  １２４４．２。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶ［アダマンチルグリシン］ＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（１５）（配列番号２５）
ペプチド（１５）（２２．４ｍｇ、９％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１３．７分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２６２．８；Ｆｏｕｎｄ  １２６３．３。
【００８３】
ペプチド（１６）
ペプチドＡｃＨＮ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（１６）（配列番号１１）（Ｎ末端アセチル化）（３０．１ｍｇ、１２％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１３．９分［ＸＴｅｒｒａ
（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２４４．８；Ｆｏｕｎｄ  １２４５．２。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＮＨ２（１７）（配列番号１１）（Ｃ末端アミド化）
ペプチド（１７）（１３．４ｍｇ、５％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９５％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１３．５分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２２３．８；Ｆｏｕｎｄ  １２２３．３。
【００８４】
ペプチド（１８）
ペプチドＡｃＨＮ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＮＨ２（１８）（配列番号１１）（Ｎ末端アセチル化およびＣ末端アミド化）（１２．５ｍｇ、５％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９５％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１３．９分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２４４．３；Ｆｏｕｎｄ  １２４４．６。
ペプチドＨ２Ｎ−ｎＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（１９）（配列番号８）
ペプチド（１９）（４７．７ｍｇ、１９％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９５％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．６分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２２３．８；Ｆｏｕｎｄ  １２２４．１。
ペプチドＨ２Ｎ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲｔ−ＯＨ（２０）（配列番号２６）
ペプチド（２０）（４５．３ｍｇ、１９％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９５％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１３．０分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２２３．８；Ｆｏｕｎｄ  １２２４．２。
ペプチドＨ２Ｎ−ｎＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲｔ−ＯＨ（２１）（配列番号９）
ペプチド（２１）（３６．４ｍｇ、１５％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９５％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．９分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１２２３．８；Ｆｏｕｎｄ  １２２４．４。
ペプチドＤＴＰＡ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（２２）（配列番号１１）（Ｎ末端ＤＴＰＡ）
ペプチド（２２）（５３．７ｍｇ、２４％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９９％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１３．３分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１４１１．９；Ｆｏｕｎｄ  １４１１．６。
ペプチドＤＴＰＡ−ｎＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（２５）（配列番号８）（Ｎ末端ＤＴＰＡ）
ペプチド（２５）（３７．５ｍｇ、１３％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９５％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．６分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１４１１．３；Ｆｏｕｎｄ  １４１０．６。
ペプチドＤＴＰＡ−ｎＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲｔ−ＯＨ（２６）（配列番号９）（Ｎ末端ＤＴＰＡ）
ペプチド（２６）（１２．５ｍｇ、４％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９５％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．９分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９
５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１４１１．３；Ｆｏｕｎｄ  １４１０．６。
ペプチドＤＴＰＡ−ＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＮＨ２（２４）（配列番号１１）（Ｎ末端ＤＴＰＡおよびＣ末端アミド化）
ペプチド（２４）（１２．１ｍｇ、４％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９５％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１３．０分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１４１０．８；Ｆｏｕｎｄ  １４１０．１。
ペプチドＤＴＰＡ−ＧＮＫ（ビオチン）ＶＰＮＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴ−ＯＨ（２３）（配列番号２７）（Ｎ末端ＤＴＰＡ）
ペプチド（２３）（４１．９ｍｇ、１５％）を、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度＞９５％の白色固体として得た。Ｒｔ＝１２．６分［ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ１８、５〜９５％Ｂ、３％Ｂ／分、１．０ｍＬ／分］；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ＋２Ｈ］２＋Ｃａｌｃ．１４３９．９；Ｆｏｕｎｄ  １４３９．２。
【００８５】
実施例１−ビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２  １、Ｌｙｓ１６またはＬｅｕ１３修飾およびビオチン化ペプチド２〜１５、Ｎ−および／またはＣ末端修飾およびビオチン化ペプチド１６〜２１ならびに（ＤＴＰＡ）含有ペプチド２２〜２６の合成。
【００８６】
Ａ２０ＦＭＤＶ２結合活性に対する非タンパク新生アミノ酸（図１に挙げる）の導入の調査を可能にするために、ペプチド６を除くビオチン化ペプチド１〜１５（表１を参照のこと）を、スキーム１に図示される条件を使用してＣ末端カルボン酸を送達する酸不安定性ヒドロキシメチルフェノキシプロピオン酸リンカー（ＨＭＰＰ）上で標準的なＦｍｏｃ
ＳＰＰＳによって合成した。所望のペプチド配列を、２０％ピペリジン／ＤＭＦを使用して取り付けて、Ｆｍｏｃ保護基およびカップリング試薬であるＯ−（ベンゾトリアゾール（benzotriazol）−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸（ＨＢＴＵ）／ＤＩＰＥＡを除去した。
【００８７】
αｖβ６インテグリンに対する特異的結合をフローサイトメトリーによって研究するので、Ａ２０ＦＭＤＶ２（１）の第２残基である天然のアラニンおよびその全ての類似体を、ビオチン化リジン残基で置換した。この置換は、よい耐性を示すことがこれまでに示されている［２４、２５］。側鎖Ｎε−アミノ基上の１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキス−１−イリデン）エチル（Ｄｄｅ）［１９］基を選択的に脱保護し、その後ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡを使用してＤ−ビオチンと縮合することによってＤ−ビオチン部分を組み込むことを選択した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ２Ｏ／３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール（ＤＯＤＴ）／トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）（９４：２．５：２．５：１．０、容積／容積／容積／容積）は、対応するペプチジル樹脂からの合成ペプチドの切断をもたらした。ペプチド１〜１５を、２％〜５０％の範囲の優れた収量および９９％を超える純度で得た（ペプチド特徴付けデータを参照のこと）。
【００８８】
Ｎ−Ｌ−メチルリジン修飾を含有するペプチド６を合成するために、ＴＦＡ媒介ペプチド切断およびＲＰ−ＨＰＬＣ精製後に優れた収量（３０％）でペプチド６を与える樹脂上でのＮ−メチル化プロトコール［２２］を利用した。
【００８９】
全て天然に存在するアミノ酸を含有するリードペプチド、Ａ２０ＦＭＤＶ２は、アミノおよびカルボキシ末端に作用するエキソペプチダーゼによる分解の影響を受けやすいはずである。これを軽減するために、６個のＮおよび／またはＣ末端修飾ならびにビオチン化Ａ２０ＦＤＭＶ２模倣体を調製し、アミノおよびカルボキシ端（ペプチド１６〜１８）ならびにＮ末端およびＣ末端アミノ酸（それぞれＡｓｎ１およびＴｈｒ２０、ペプチド１９〜２１）を系統的に修飾した。Ｎ末端／Ｃ末端修飾したペプチド１６〜１８を、Ｎ末端を
無水酢酸でキャッピングする（１６）もしくはＲｉｎｋアミドリンカーを利用してＣ末端カルボキサミドを与える（１７）または両方を組合せる（ペプチド１８）ことによって得た。
【００９０】
ビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２（１）のＮ末端で天然のＡｓｎ１の場所に非天然のＤ−Ａｓｎ１を有するペプチド１９を、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ構成単位をＮ末端残基として合成に組み込んだことを除いてスキーム１に概説されている合成経路を使用して得た。Ｃ末端で非天然のＤ−Ｔｈｒを含有するペプチド２０および２１を調製するために、ＨＭＰを固定している樹脂２７（スキーム１、ＨＭＰ＝ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸を参照のこと）を、ＤＩＣ／ＤＭＡＰを使用してＦｍｏｃ−Ｄ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨで最初にエステル化し、次いで配列をＦｍｏｃ  ＳＰＰＳによって伸長させた。
【００９１】
【表１】
2020518656.tif 000015
【００９２】
【化１】
2020518656.tif 000016
【００９３】
スキーム１．ビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２ペプチドバリアントの調製の合成プロトコール。
結合アッセイから得られた結果（表２、後を参照のこと）は、１のＮおよびＣ末端の修飾（それぞれペプチド１６および１７）、またはＡ２０ＦＭＤＶ２（１）の天然のＡｓｎ１およびＡｓｎ１とＴｈｒ２０両方の残基の、Ｄ対応物への置換（それぞれペプチド１９および２１）が、１と比較して生物学的活性の改善を呈するペプチドをもたらすことを示した。したがって、ヒト血漿における細胞内部移行研究および分解アッセイを実施できるように、その４つのＮおよびＣ終点修飾類似体（１６、１８、１９および２１）を、ＤＴＰＡキレート化剤を組み込むために選択した。含ＤＴＰＡビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２ペプチド（２２）も対照として調製した［２５］。
【００９４】
スキーム１に図示した通り、含ＤＴＰＡビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２ペプチド２２および類似体２３〜２５を、Ｆｍｏｃ  ＳＰＰＳ条件（Ｆｍｏｃ保護基除去のために２０％ピペリジン／ＤＭＦおよびカップリング試薬としてＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ）を使用して合成した。Ａ２０ＦＭＤＶ２のＮ末端でＤＴＰＡ、Ｌｙｓ２の側鎖でＤ−ビオチンを結合させるために、Ｎ末端Ｆｍｏｃ保護基を２０％ピペリジン／ＤＭＦを使用して最初に除去し、ｔ−ブチル保護ＤＴＰＡ［２１］を、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡを使用して、得られたＮα−アミノ基にカップリングした。ＤＴＰＡの４つのカルボン酸が、酸不安定性ｔ−ブチルエステルとして保護されたので、Ｄｄｅ保護基を２％ヒドラジン／ＤＭＦを使用して選択的に除去し、Ｄ−ビオチンをＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡを使用して側鎖アミノリジルにカップリングすることができる。ＤＴＰＡリガンドの組み込みを可能にするためのペプチド２３および２４の場合、グリシンスペーサーを利用してペプチド１６および１８のアセチル基を模倣し、それによりアミド結合形成を介するＤＴＰＡの容易な結合を可能にした。
【００９５】
実施例２−ペプチドバリアントの生物学的活性
元のＡ２０ＦＭＤＶ２より優れているペプチドバリアントがあるとすると、それはどのペプチドバリアントか試験するために、Ａ３７５Ｐβ６細胞株におけるインテグリンαｖβ６の発現［９］を除いて遺伝的に同一である２つの細胞株（Ａ３７５ＰｐｕｒｏおよびＡ３７５Ｐβ６）を使用して一連の試験を設計した。Ａ３７５Ｐｐｕｒｏは、そのリガンド内のＲＧＤモチーフに結合するさらに４つのインテグリン（αｖβ３、αｖβ５、αｖβ８およびα５β１）を発現するので、これら２つの細胞株における結合活性を比較することは、非常に厳しいアッセイであると考えられる。
【００９６】
修飾ペプチド１〜１５、１６〜２１および２２〜２５の挙動を特徴付けるために使用したアッセイの例として、図２はペプチド２２〜２５の比較を示す。Ａ２０ＦＭＤＶ２は、他のインテグリンより＞１０００倍選択的にαｖβ６に結合する［９］。修飾ペプチドが特異性を保持していることを確認するために、Ａ３７５Ｐβ６細胞と対比してどれくらいのペプチドがＡ３７５Ｐｐｕｒｏに結合するかについてフローサイトメトリーを使用して決定した。図２Ａは、１０００ｎＭでペプチド２２（Ａｉ）もペプチド２５（Ａｉｉ）もＡ３７５Ｐｐｕｒｏに結合しなかったことを示す（赤色ヒストグラム；上パネル）。それに対して、両方のペプチドが、１００ｎＭでＡ３７５Ｐβ６によく結合した（青色ヒストグラム；下パネル）。これらのデータは、αｖβ６結合特異性が、これらのペプチドバリアントにおいて保持されていることを示す。さらに、あらゆるペプチドバリアントが、１０００ｎＭでＡ３７５Ｐｐｕｒｏに結合できなかった（データ不掲載）ことは、全てのペプチドが特異性を保持していることを示した。
【００９７】
修飾ペプチドが、１００ｎＭで親ビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２ペプチドと同様にまたはよりよく結合するかどうか決定するために、０、０．１、１、１０、１００および１０００ｎＭでＡ３７５Ｐβ６に対するバリアントの結合活性を試験した。
【００９８】
例として、図２Ｂは、１００ｎＭでペプチド２２が、商業的に得られるビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２より１６％高く結合するのでより優れていることを示す。同様に、１００ｎＭでの結合が、商業的に得られるビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２の１５０％なので、ペプチド２５はさらにより優れている。これらのデータは、一回の実験のものであった。表２は、研究した全てのペプチドの最大４回の実験の平均を示し、全体としてペプチド２２が、親（すなわち商業的に得られたビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２）より平均して５％高い活性を有し、ペプチド２５が、親より３６％高かったことを示す。
【００９９】
３７℃で細胞によって内部に取り込まれる能力（したがって治療法のための潜在的ベクター）を評価するために、Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍ（登録商標）細胞数測定およびフローサイトメトリーを使用した。Ｉｍａｇｅｓｔｒｅａｍ（登録商標）は、細胞内区画と対比して表面上の蛍光の画像分析を可能にする各細胞の蛍光画像（図２Ｃ）を撮像する。図２Ｃのヒストグラムは、０分時点と比較した内部移行をプロットする。フローサイトメトリーの場合、ペプチドが内部に取り込まれるのにつれる表面発現の消失を監視した。
【０１００】
表２は、商業的に供給されたビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２と比較して本研究において使用される全てのペプチドの活性および内部移行データを要約する［本研究において合成したビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２（１）は、ペプチド（１）が、Ｄ−ビオチンをカップリングするために活用されるＡｌａ２Ｌｙｓ突然変異を含むという点で商業的に得られたビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２と異なった］。
【０１０１】
表２はまた、結合親和性値を内部取り込み量と乗算して相対的活性値を得ることによって、細胞内薬物送達に対する各ペプチドの潜在性の任意値（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｖａｌｕｅ）を提供する。ペプチド（７）および（９）を除いて；大部分の１６Ｌｙｓおよび１
３Ｌｅｕ修飾は相対的活性を減少させ、相対的活性が対照ビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２より低かったことが分かる。それに対し、ＮおよびＣ末端修飾ペプチドのほとんど（１６〜１９および２１）は、ビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２（１）と比較してより優れた結合親和性を有し、相対的活性が改善された。例えば、非タンパク新生Ｄ−Ａｓｎアミノ酸Ｎ末端修飾を有するペプチド１９は、細胞αｖβ６に対し親化合物よりも平均で４３％良好に結合した（表２）。１．０の値を有する非修飾Ａ２０ＦＭＤＶと比較して、ペプチド１６（Ｎアセチル化）、１７（Ｃアミド化）、１８（Ｎアセチル化およびＣアミド化）、１９（Ｄ−Ａｓｎ置換）および２１（Ｄ−ＡｓｎおよびＤ−Ｔｈｒ置換両方）は、対照ペプチド１より５５％、３１％、９％、２７％、および３７％高い相対的活性値を有する。
【０１０２】
【表２】
2020518656.tif 000017
【０１０３】
有望なことに、リードペプチド（１６、１７、１９、２１）にＤＴＰＡをコンジュゲーションして、ペプチド２３〜２６をそれぞれ作製することは、結合親和性または内部移行
にほとんど効果がなく、したがって相対的活性の増大が維持された。
実施例３−血漿安定性および体内分布研究
図３は、３７℃でのＰＢＳ（黒色バー；各ペプチドについて左手のバー）と対比した血漿（赤色バー；各ペプチドについて右手のバー）中のＤＴＰＡコンジュゲートペプチド（２２〜２６）の安定性を、０分時点と比較して示す。データは、ＰＢＳ中で３７℃、２４時間後にペプチドの約１０％しか分解されなかったことを示す。それに対し、ペプチド（２２、２５、２６）は、２４時間後に血漿中で類似レベルの残存（７７％〜８０％）を示すが、ペプチド（２３）（６０％残存）およびペプチド（２４）（５２％残存）は大きく分解される。したがって、ペプチド２４および２３（それぞれＣ末端アミド化およびＮ末端アセチル化）の修飾は、対照親ペプチド（１）と比較して血漿分解に対する感受性を増大させた。Ｄアミノ酸（Ｄ−Ａｓｎ、化合物２５、およびＤ−Ａｓｎ／Ｄ−Ｔｈｒ化合物２６）を使用する化学操作によるペプチド修飾が、ヒト血漿プロテアーゼに対する感受性を改善するのに最適であった。
【０１０４】
反対側の肩にＡ３７５ＰｐｕｒｏおよびＡ３７５Ｐβ６腫瘍を保有する免疫不全状態のマウス（ｎ＝３〜５）に３００Ｂｑの放射性標識ペプチド２２〜２６を静脈（ｉｖ）注射で与え、次いで１時間後に殺した。主要な器官および血液を直ちに採集し、計量し、放射活性を決定した。表３のデータは、試験した５つのＤＴＰＡコンジュゲートペプチドの挙動を示す；データは、平均％注射用量／ｇ組織で表される。
【０１０５】
【表３】
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【０１０６】
これまでの本発明者らの研究と同様に、著しい残留が、消化管（胃および腸）および肺にも存在する［９、２４］。αｖβ６とは独立であると本発明者らが報告した腎臓残留は［９］、最少の残留を示すペプチド２５および２６ならびに親ビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２であるペプチド２２よりはるかに大きな残留を示すペプチド２３および２４を含めた５つのペプチドで大きく変動する。αｖβ６陰性対照腫瘍と比較して、αｖβ６陽性腫瘍による各ペプチドの強力な選択的取り込みが存在する。図４は、ヒストグラムでこれらの差
異を強調する。ＤＴＰＡ標識親ペプチド２２に対してペプチド２３〜２６に統計的な取り込みの増大はないが、全てのバリアントは、対照ペプチド２２と比較してαｖβ６陽性腫瘍対αｖβ６陰性腫瘍の残留の平均比がわずかに高い。対照ペプチド２２と比較して、αｖβ６陰性腫瘍に対するαｖβ６陽性腫瘍おける最も高い残留比はペプチド２５で見られた。
【０１０７】
考察
２０残基直鎖ペプチドＡ２０ＦＭＤＶ２は、腫瘍関連αｖβ６インテグリンに対する高い特異性および親和性を呈し、細胞へのαｖβ６依存的内部移行も呈する。したがってＡ２０ＦＭＤＶ２は、αｖβ６発現がん細胞に治療用担持物（例えば化学療法ペイロード）を送達するのに見込みがあるリード化合物と考えられる。上記の実施例において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ挙動、血漿安定性およびｉｎ  ｖｉｖｏ体内分布に対するＡ２０ＦＭＤＶ２の天然のアミノ酸残基の非タンパク新生置換物の影響について調査した。
【０１０８】
本明細書に記述されるペプチドの全ては、Ｆｍｏｃ  ＳＰＰＳによって優れた収量および卓越した純度で合成された。αｖβ６インテグリンに対する結合研究は、Ａ２０ＦＭＤＶ２類似体の全てがＡ３７５Ｐβ６細胞にだけ結合し、Ａ３７５Ｐｐｕｒｏ細胞に結合しないことを示し、特異性が修飾の影響を受けないことを示した。さらに、アセチル化Ｎ末端ならびにアミド化Ｃ末端または天然の１Ａｓｎおよび２０Ｔｈｒ残基の非天然のＤ−バージョンを組み込んだペプチドは、親ペプチド（Ａ２０ＦＭＤＶ２）より強力なαｖβ６結合活性を呈し、さらに天然の１６Ｌｙｓおよび１３Ｌｅｕ残基の非タンパク新生置換物を含有する大部分のペプチドより強力だった。例えば、非タンパク新生Ｄ−Ａｓｎアミノ酸Ｎ末端修飾を有するペプチド１９は、細胞αｖβ６に対し親化合物よりも平均で４３％良好に結合した（表２）。
【０１０９】
ヒト血漿における安定性を評価し、ペプチドが、マウス血清でのこれまでの研究よりずっと長く完全なままであることが示され、このことは、ヒト血漿がこれらのペプチドに対してマウス血清より分解性でないことを示唆している。全ての放射性標識ペプチドの９０％以上は、ＰＢＳ中で、３７℃で２４時間後に完全なままであり、一方でＤアミノ酸を含有するＡ２０ＦＭＤＶ２である２５および２６だけが、ヒト血漿中で、３７℃で２４時間後に大部分が完全なままであった（７６〜８０％）。
【０１１０】
修飾は、αｖβ６発現細胞への内部移行の程度に対して中程度の効果しかなかった。したがって、表２は、試験した全てのペプチドについて内部移行が、市販のビオチン化Ａ２０ＦＭＤＶ２と比較して０．７８〜１．１１倍変動したことを示す。細胞内細胞毒の送達については、ペプチドの結合親和性と内部移行の両方を考える必要があるので、表２は、各ペプチドの相対的活性の任意値も示す。対照ペプチドは１．０の値を有し、ペプチド１６、１９、１７、１８および２１は、対照ペプチドよりそれぞれ５５％、２７％、３１％、９％および３７％高い相対的活性値を有する。
【０１１１】
治療法を送達するためのαｖβ６標的化ペプチドの場合、それらペプチドは、αｖβ６発現腫瘍に選択的に保持されなければならない。体内分布研究において試験した５つのリードペプチド（２２〜２６）の全てが、αｖβ６陰性腫瘍より少なくとも６〜１０倍高いレベルでαｖβ６陽性腫瘍に選択的に保持されることを見出した。全ての修飾ペプチドがＤＴＰＡ標識およびビオチン化ペプチド２２よりわずかに優れていたことは、有望である。本結果は、Ａ２０ＦＭＤＶ２の化学修飾により、αｖβ６発現がんに選択的に位置する能力が改善されたことを示す。
【０１１２】
参照文献
本発明および本発明が関係する最新技術についてより完全に記述し、開示するためにい
くつかの刊行物を上に引用している。これらの参照の完全な引用が、以下で提供される。これら参照のそれぞれの全体を、本明細書に組み込む。
【０１１３】
【表４−１】
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【０１１４】
【表４−２】
2020518656.tif 000020
【０１１５】
【表４−３】
2020518656.tif 000021
【０１１６】
各個々の刊行物または特許または特許出願を、その全体を参照により組み込むように具体的かつ個別に示すがごとく、本明細書に引用される全ての参照を、その全体を参照によりおよび同じ範囲に対する全ての目的のために本明細書に組み込む。
【０１１７】
本明細書に記述される特定の態様は、例として提示されるものであり、制限として提示されるものではない。本明細書におけるどんな副題も、利便性のためだけに含まれ、決して開示を限定するものと解釈されるべきでない。
【国際調査報告】
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