(57)【要約】本開示は、CD19に特異的に結合するモノクローナル抗体およびその抗原結合断片、変異型、多量体型、または二重特異性抗体、ならびに、様々な治療的、診断的、および予防的な適応においてこれらの抗CD19抗体およびその抗原結合断片を作製および使用する方法に関する。2020503256.tif 000012
2020503256.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD19に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、SEQ ID NO：23または29のアミノ酸配列を含む可変重鎖相補性決定領域1（CDRH1）、SEQ ID NO：24または30のアミノ酸配列を含む可変重鎖相補性決定領域2（CDRH2）、SEQ ID NO：25、26、27、28、または31のアミノ酸配列を含む可変重鎖相補性決定領域3（CDRH3）を含む可変重鎖、SEQ ID NO：32、37、41、または44のアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域1（CDRL1）、SEQ ID NO：33、38、43、または45のアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域2（CDRL2）、およびSEQ ID NO：34、35、36、40、43、または46から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域3（CDRL3）の組み合わせを含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
SEQ ID NO：2、6、12、16、または20のアミノ酸配列を含む可変重鎖とSEQ ID NO：4、8、10、14、18、または22のアミノ酸配列を含む可変軽鎖との組み合わせをさらに含む、請求項1に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
以下からなる群より選択される可変重鎖配列と可変軽鎖配列の組み合わせをさらに含む、請求項1に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片：
（a）SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含む可変重鎖とSEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む可変軽鎖；
（b）SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む可変重鎖とSEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含む可変軽鎖；
（c）SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む可変重鎖とSEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含む可変軽鎖；
（d）SEQ ID NO：12のアミノ酸配列を含む可変重鎖とSEQ ID NO：14のアミノ酸配列を含む可変軽鎖；
（e）SEQ ID NO：16のアミノ酸配列を含む可変重鎖とSEQ ID NO：18のアミノ酸配列を含む可変軽鎖；および
（f）SEQ ID NO：20のアミノ酸配列を含む可変重鎖とSEQ ID NO：22のアミノ酸配列を含む可変軽鎖。
【請求項４】
CD19がヒトCD19である、請求項1に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
モノクローナル抗体、ドメイン抗体（dAb）、一本鎖抗体（scAb）、Fab断片、F(ab’)2断片、一本鎖可変断片（scFv）、scFv-Fc断片、シングルドメイン重鎖抗体、シングルドメイン軽鎖抗体、変異型抗体、多量体型抗体、または二重特異性抗体である、請求項1に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
ウサギ、マウス、キメラ、ヒト化、または完全ヒト型のモノクローナル抗体である、請求項1に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
IgGアイソタイプである、請求項1に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
IgG1アイソタイプである、請求項1に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
ヒトCD19に対する特異的結合について、請求項1に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片と競合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
作用物質にコンジュゲートされている、請求項1に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
作用物質が毒素である、請求項10に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
毒素が、ドラスタチンまたはその誘導体、アウリスタチンまたはその誘導体、マイタンシノイドまたはその誘導体、デュオカルマイシンまたはその誘導体、カリチアマイシンまたはその誘導体、およびピロロベンゾジアゼピンまたはその誘導体からなる群より選択される、請求項11に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
毒素が、リンカーを介して抗体またはその抗原結合断片にコンジュゲートされている、請求項11に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
リンカーが、切断可能なリンカーである、請求項13に記載の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
CD19に結合する第一のアミノ酸配列を含む第一のアームと、CD19には結合しない第二のアミノ酸配列を含む第二のアームとを含む、単離された二重特異性抗体。
【請求項１６】
CD19に結合し、かつ
SEQ ID NO：23または29のアミノ酸配列を含む可変重鎖相補性決定領域1（CDRH1）、SEQ ID NO：24または30のアミノ酸配列を含む可変重鎖相補性決定領域2（CDRH2）、SEQ ID NO：25、26、27、28、または31のアミノ酸配列を含む可変重鎖相補性決定領域3（CDRH3）を含む可変重鎖と、SEQ ID NO：32、37、41、または44のアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域1（CDRL1）、SEQ ID NO：33、38、43、または45のアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域2（CDRL2）、およびSEQ ID NO：34、35、36、40、43、または46から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域3（CDRL3）を含む可変軽鎖との組み合わせを含む
第一のアームを少なくとも含む、請求項15に記載の単離された二重特異性抗体。
【請求項１７】
CD19に結合する第一のアームが、SEQ ID NO：2、6、12、16、または20のアミノ酸配列を含む可変重鎖とSEQ ID NO：4、8、10、14、18、または22のアミノ酸配列を含む可変軽鎖との組み合わせをさらに含む、請求項16に記載の単離された二重特異性抗体。
【請求項１８】
CD19に結合する第一のアームが、以下からなる群より選択される可変重鎖配列と可変軽鎖配列との組み合わせをさらに含む、請求項16に記載の単離された二重特異性抗体：
（a）SEQ ID NO：2のアミノ酸配列を含む可変重鎖とSEQ ID NO：4のアミノ酸配列を含む可変軽鎖；
（b）SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む可変重鎖とSEQ ID NO：8のアミノ酸配列を含む可変軽鎖；
（c）SEQ ID NO：6のアミノ酸配列を含む可変重鎖とSEQ ID NO：10のアミノ酸配列を含む可変軽鎖；
（d）SEQ ID NO：12のアミノ酸配列を含む可変重鎖とSEQ ID NO：14のアミノ酸配列を含む可変軽鎖；
（e）SEQ ID NO：16のアミノ酸配列を含む可変重鎖とSEQ ID NO：18のアミノ酸配列を含む可変軽鎖；および
（f）SEQ ID NO：20のアミノ酸配列を含む可変重鎖とSEQ ID NO：22のアミノ酸配列を含む可変軽鎖。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる、2016年11月4日に出願された米国特許仮出願第62/417,380号の恩典を主張する。
【０００２】
発明の分野
本開示は、CD19に特異的に結合するモノクローナル抗体およびその抗原結合断片、変異型、多量体型、または二重特異性抗体、ならびに様々な治療的、診断的、および予防的な適応においてこれらの抗CD19抗体およびその抗原結合断片を作製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
B細胞はその分化および増殖の過程において多様な細胞表面分子を発現する。例としてはCD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD74、CD75、CD77、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、およびCD86白血球表面マーカーが含まれる。これらのマーカーは一般に、例えばB細胞悪性腫瘍、自己免疫疾患、および移植片拒絶のようなB細胞異常症またはB細胞疾患の治療のための治療標的として提案されてきた。
【０００４】
CD19はB細胞上、および、多くのB細胞リンパ腫のようなB細胞に由来するある種のがん細胞上に認められる表面タンパク質である。抗CD19モノクローナル抗体はマウスにおいて作製されている。しかし、マウスに由来する抗体は一般にヒトにおいては免疫原性であり、ヒト化抗体もヒトにおいて免疫原性となり得る。
【０００５】
したがって、CD19を標的とする治療法で使用するための完全ヒト型モノクローナル抗体およびその抗原結合配列が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本開示では、CD19に結合するモノクローナル抗体およびその抗原結合断片または任意の断片、変異型、多量体型、もしくは二重特異性抗体が提供される。本明細書においては、これらの抗体およびその抗原結合断片または任意の断片、変異型、多量体型、もしくは二重特異性抗体はまとめて抗CD19モノクローナル抗体または抗CD19 mAb、またはその抗原結合断片もしくは任意の断片、変異型、多量体型あるいは二重特異性抗体と呼ばれる。好ましくは、モノクローナル抗体およびその抗原結合断片または任意の断片、変異型、多量体型、もしくは二重特異性抗体は、少なくともヒトCD19に対して特異的である。ある態様において、ヒトCD19を認識するモノクローナル抗体およびその抗原結合断片または任意の断片、変異型、多量体型、もしくは二重特異性抗体は、非限定的な例として非ヒト霊長類CD19、例えばカニクイザルCD19、および／または齧歯類CD19のような、少なくとも1種類の他の非ヒトCD19タンパク質に対して交差反応性でもある。
【０００７】
ある態様において、抗CD19モノクローナル抗体またはその抗原結合断片もしくは任意の断片、変異型、多量体型、あるいは二重特異性抗体は、SEQ ID NO:2、6、12、16、および20から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一である可変重鎖アミノ酸配列を含む。ある態様において、抗CD19モノクローナル抗体またはその抗原結合断片もしくは任意の断片、変異型、多量体型、あるいは二重特異性抗体は、SEQ ID NO:4、8、10、14、18、および22から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一である可変軽鎖アミノ酸配列を含む。ある態様において、抗CD19モノクローナル抗体またはその抗原結合断片もしくは任意の断片、変異型、多量体型、あるいは二重特異性抗体は、SEQ ID NO:2、6、12、16、および20から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一である可変重鎖アミノ酸配列、ならびにSEQ ID NO:4、8、10、14、18、および22から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上同一である可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【０００８】
ある態様において、抗CD19モノクローナル抗体またはその抗原結合断片もしくは任意の断片、変異型、多量体型、あるいは二重特異性抗体は、SEQ ID NO:2、6、12、16、および20から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖アミノ酸配列を含む。ある態様において、抗CD19モノクローナル抗体またはその抗原結合断片もしくは任意の断片、変異型、多量体型、あるいは二重特異性抗体は、SEQ ID NO:4、8、10、14、18、および22から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む。ある態様において、抗CD19モノクローナル抗体またはその抗原結合断片もしくは任意の断片、変異型、多量体型、あるいは二重特異性抗体は、SEQ ID NO:2、6、12、16、および20から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖アミノ酸配列、ならびにSEQ ID NO:4、8、10、14、18、および22から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【０００９】
ある態様において、抗CD19モノクローナル抗体またはその抗原結合断片もしくは任意の断片、変異型、多量体型、あるいは二重特異性抗体は、SEQ ID NO:23または29のアミノ酸配列を含む可変重鎖相補性決定領域1（CDRH1）、SEQ ID NO:24または30のアミノ酸配列を含む可変重鎖相補性決定領域2（CDRH2）、およびSEQ ID NO:25、26、27、28、または31のアミノ酸配列を含む可変重鎖相補性決定領域3（CDRH3）を含む。
【００１０】
ある態様において、抗CD19モノクローナル抗体またはその抗原結合断片もしくは任意の断片、変異型、多量体型、あるいは二重特異性抗体は、SEQ ID NO:32、37、41、または44のアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域1（CDRL1）、SEQ ID NO:33、38、43、または45から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域2（CDRL2）、およびSEQ ID NO:34、35、36、40、43、または46のアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域3（CDRL3）を含む。
【００１１】
ある態様において、抗CD19モノクローナル抗体またはその抗原結合断片もしくは任意の断片、変異型、多量体型、あるいは二重特異性抗体は、SEQ ID NO:23または29のアミノ酸配列を含む可変重鎖相補性決定領域1（CDRH1）、SEQ ID NO:24または30のアミノ酸配列を含む可変重鎖相補性決定領域2（CDRH2）、SEQ ID NO:25、26、27、28、または31のアミノ酸配列を含む可変重鎖相補性決定領域3（CDRH3）、SEQ ID NO:32、37、41、または44のアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域1（CDRL1）、SEQ ID NO:33、38、43、または45から選択されるアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域2（CDRL2）、およびSEQ ID NO:34、35、36、40、43、または46のアミノ酸配列を含む可変軽鎖相補性決定領域3（CDRL3）を含む。
【００１２】
本開示ではCD19に結合する一価抗体またはその抗原結合断片も提供される。本明細書においてこれらの抗体またはその抗原結合断片はまとめて抗CD19一価抗体または抗CD19 monov mAbと呼ばれる。本開示の一価抗体またはその抗原結合断片は、CD19を特異的に認識する1つのアームと、本明細書においてはダミーアームと呼ばれる第二のアームとを含む。ダミーアームはヒトタンパク質と結合しない、またはさもなければ交差反応しないアミノ酸配列を含む。ある態様において、ダミーアームは、全血中において認められるヒトタンパク質と結合しない、またはさもなければ交差反応しないアミノ酸配列を含む。ある態様において、ダミーアームは、固形組織において認められるヒトタンパク質と結合しない、またはさもなければ交差反応しないアミノ酸配列を含む。好ましくは、一価抗体またはその抗原結合断片は少なくともヒトCD19に対して特異的である。ある態様において、ヒトCD19を認識する一価抗体またはその抗原結合断片は、非限定的な例として非ヒト霊長類CD19、例えばカニクイザルCD19、および／または齧歯類CD19のような、少なくとも1種類の他の非ヒトCD19タンパク質に対して交差反応性でもある。抗CD19一価抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に記載される抗CD19結合配列のいずれかを含み得る。ある態様において、抗CD19一価抗体またはその抗原結合断片は、本明細書に記載される5F5抗体、7F11抗体、9G8抗体、F6抗体、7F1抗体、および10D8抗体またはその任意の抗原結合断片におけるアミノ酸配列から由来する、または誘導されるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
CD19に結合する本開示の抗体およびその断片は、CD19の機能活性を調節する、ブロックする、阻害する、低減する、アンタゴナイズする、中和する、またはさもなければ妨げる役割を担う。CD19の機能活性は非限定的な例として、CD21および／もしくはCD81とB細胞コレセプターとして機能すること、活性化されたリン酸化状態において1つもしくは複数のSrcファミリーキナーゼと結合すること、ならびに／またはPI-3キナーゼを動員することを含む。本明細書に記載される抗体の存在下におけるCD19の機能活性レベルが、該抗体との結合がない場合におけるCD19の機能活性レベルと比べて少なくとも95％、例えば96％、97％、98％、99％、または100％低下した場合、該抗体がCD19の少なくとも1つの機能活性を完全に調節する、ブロックする、阻害する、低減する、アンタゴナイズする、中和する、またはさもなければ妨げると考えられる。本明細書に記載される抗体の存在下におけるCD19の機能活性レベルが、該抗体との結合がない場合のCD19の機能活性レベルと比較して95％未満、例えば10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、または90％未満低下した場合、該抗体がCD19の少なくとも1つの機能活性を部分的に調節する、ブロックする、阻害する、低減する、アンタゴナイズする、中和する、またはさもなければ妨げると考えられる。
【００１４】
本開示は、CD19と第二の標的とを認識する二重特異性抗体をも提供する。ある態様において、第二の標的は、非限定的な例として全身性エリテマトーデス（SLE）、関節リウマチ（RA）、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、ワルデンシュトレーム高ガンマグロブリン血症、シェーグレン症候群、多発性硬化症（MS）、および／またはループス腎炎を含む、例えばB細胞の介する自己免疫疾患および／または炎症性疾患のような自己免疫疾患および／または炎症性疾患と関連する、またはさもなければ関与することが知られている抗原である。
【００１５】
本開示は、CD19と第二の標的とを認識する二重特異性抗体を提供する。標準的な抗体と配列が識別不能であり、一方の結合部位がCD19に対して特異的であり、第二の結合部位が別の標的、例えば腫瘍関連抗原（TAA）に対して特異的であるような二重特異性抗体の同定、作製、および精製が本開示によって可能になる。ある態様において、TAAはがん細胞の細胞表面上に発現される抗原である。ある態様において、がん細胞は、肺がん細胞、気管支がん細胞、前立腺がん細胞、乳がん細胞、大腸がん細胞、膵臓がん細胞、卵巣がん細胞、白血病がん細胞、リンパ腫がん細胞、食道がん細胞、肝臓がん細胞、泌尿器がんおよび／もしくは膀胱がん細胞、腎臓がん細胞、口腔がん細胞、咽頭がん細胞、子宮がん細胞、ならびに／またはメラノーマ細胞から選択される。ある態様において、好適な第二の標的は、非限定的な例としてCD47、CD20、CD22、CD40、BAFFR、CD5、CD32b、ICOSL、IL6R、および／またはIL21Rを含む。
【００１６】
CD19と第二の標的とを認識する本開示の二重特異性抗体およびその抗原結合断片は、非限定的な例として、PCT公報WO 2012/023053号に記載されるκλボディ完全ヒト型二重特異性抗体フォーマット、架橋断片、クアドローマ、ならびに／または非限定的な例として連結型抗体断片、強制ヘテロ二量体および／もしくはシングルドメインに基づく組換えフォーマットのような様々な組換えフォーマットのいずれかの使用のような、当技術分野において公知の任意の方法を用いて作製される。二重特異性フォーマットの例は非限定的に、Fabアーム交換に基づく二重特異性IgG（Gramer et al., 2013 MAbs. 5(6)）；CrossMabフォーマット（Klein C et al., 2012 MAbs 4(6)）；SEED技術（Davis JH et al., 2010 Protein Eng Des Sel. 23(4):195-202）、エレクトロスタティック・ステアリング（electrostatic steering）（Gunasekaran K et al., J Biol Chem. 2010 285(25):19637-46）またはノブ・イントゥ・ホール（knob-into-hole）（Ridgway JB et al., Protein Eng. 1996 9(7):617-21）またはホモ二量体形成を妨げる他の置換変異のセット（Von Kreudenstein TS et al., 2013 MAbs. 5(5):646-54）のような強制ヘテロ二量体化アプローチに基づく複数のフォーマット；タンデムscFv（例えばBiTE）のような断片に基づく二重特異性フォーマット（Wolf E et al., 2005 Drug Discov. Today 10(18):1237-44）；二重特異性四価抗体（Portner LM et al., 2012 Cancer Immunol Immunother. 61(10):1869-75）；二重親和性再ターゲティング分子（Moore PA et al., 2011 Blood. 117(17):4542-51）、ダイアボディ（Kontermann RE et al., Nat Biotechnol. 1997 15(7):629-31）を含む。
【００１７】
本開示の二重特異性抗体は非限定的な例として架橋断片、クアドローマ、および／または非限定的な例として連結型抗体断片、強制ヘテロ二量体のような様々な組換えフォーマット、および／またはシングルドメインに基づく組換えフォーマットの任意のものの使用のような、当技術分野において公知の任意の方法を用いて作製される。
【００１８】
本開示のモノクローナル、一価および／または二重特異性抗体は、治療的介入のために、または研究もしくは診断のための試薬として使用することができる。例えば、本開示のモノクローナル、一価および／または二重特異性抗体は、そのような治療または予防が望ましい対象に本開示の抗体を投与することによって異常なCD19の発現および／または活性に関連する病態の進行を治療、予防、および／もしくは遅延させる方法に、または、そのような病態に関連する症状を緩和する方法に有用である。治療される対象は例えばヒトである。モノクローナル、一価および／または二重特異性抗体は、病態の進行を治療、予防、遅延させるために、または病態と関連する症状を緩和するために十分な量で投与される。
【００１９】
ある態様において、本明細書に記載されるモノクローナル、一価および／または二重特異性抗体は、1つもしくは複数の付加的な作用物質と共に、または付加的な作用物質と組み合わせて使用される。好適な付加的作用物質は、例えばがん、炎症および／または自己免疫疾患のような、意図された適用のための現行の薬物療法および／または外科的治療を含む。ある態様において、モノクローナル、一価および／または二重特異性抗体は、リツキシマブと共に使用することができる。
【００２０】
ある態様において、モノクローナル、一価および／または二重特異性抗体ならびに付加的な作用物質は、単一の治療用組成物に製剤化され、モノクローナル、一価および／または二重特異性抗体ならびに付加的な作用物質が同時に投与される。または、モノクローナル、一価および／もしくは二重特異性抗体ならびに付加的な作用物質は互いに分けられ、例えば各々が別々の治療用組成物に製剤化され、モノクローナル、一価および／もしくは二重特異性抗体ならびに付加的な作用物質が同時に投与される、または、モノクローナル、一価および／もしくは二重特異性抗体ならびに付加的な作用物質が治療計画における異なる時点で投与される。例えばモノクローナル、一価および／もしくは二重特異性抗体が付加的な作用物質の投与以前に投与される、モノクローナル、一価および／もしくは二重特異性抗体が付加的な作用物質の投与に続いて投与される、または、モノクローナル、一価および／もしくは二重特異性抗体ならびに付加的な作用物質が交互に投与される。本明細書に記載されるように、モノクローナル、一価および／または二重特異性抗体ならびに付加的な作用物質は、単回投与または複数回投与で投与される。
【００２１】
本開示の抗体を用いて治療および／または予防される病態は、例えばがんまたは異常なCD19の発現および／もしくは活性に関連する任意の他の疾患もしくは障害を含む。
【００２２】
本開示に従った薬学的組成物は、本開示の抗体および担体を含み得る。これらの薬学的組成物は、例えば診断キットのようなキットに含めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】図1A〜1Fは、FACS解析によって決定された本開示の様々な抗CD19抗体の、6つの異なるBリンパ球細胞株（Raji, Ramos, Nalm6, SU-DHL6, SU-DHL4, Mec2）、CD19発現抑制（CD19-silenced）細胞株（Raji siRNA）、および負の対照細胞株（Jurkat）に結合する能力を表す一連のグラフである。
【図１Ｂ】図1A〜1Fは、FACS解析によって決定された本開示の様々な抗CD19抗体の、6つの異なるBリンパ球細胞株（Raji, Ramos, Nalm6, SU-DHL6, SU-DHL4, Mec2）、CD19発現抑制細胞株（Raji siRNA）、および負の対照細胞株（Jurkat）に結合する能力を表す一連のグラフである。
【図１Ｃ】図1A〜1Fは、FACS解析によって決定された本開示の様々な抗CD19抗体の、6つの異なるBリンパ球細胞株（Raji, Ramos, Nalm6, SU-DHL6, SU-DHL4, Mec2）、CD19発現抑制細胞株（Raji siRNA）、および負の対照細胞株（Jurkat）に結合する能力を表す一連のグラフである。
【図１Ｄ】図1A〜1Fは、FACS解析によって決定された本開示の様々な抗CD19抗体の、6つの異なるBリンパ球細胞株（Raji, Ramos, Nalm6, SU-DHL6, SU-DHL4, Mec2）、CD19発現抑制細胞株（Raji siRNA）、および負の対照細胞株（Jurkat）に結合する能力を表す一連のグラフである。
【図１Ｅ】図1A〜1Fは、FACS解析によって決定された本開示の様々な抗CD19抗体の、6つの異なるBリンパ球細胞株（Raji, Ramos, Nalm6, SU-DHL6, SU-DHL4, Mec2）、CD19発現抑制細胞株（Raji siRNA）、および負の対照細胞株（Jurkat）に結合する能力を表す一連のグラフである。
【図１Ｆ】図1A〜1Fは、FACS解析によって決定された本開示の様々な抗CD19抗体の、6つの異なるBリンパ球細胞株（Raji, Ramos, Nalm6, SU-DHL6, SU-DHL4, Mec2）、CD19発現抑制細胞株（Raji siRNA）、および負の対照細胞株（Jurkat）に結合する能力を表す一連のグラフである。
【図２】FACS解析によって決定された本開示の様々な抗CD19抗体の、トランスフェクトCHO細胞または負の対照細胞株（CHO）によって発現されたカニクイザルCD19に結合する能力を表す一連のグラフである。
【図３】図3Aおよび3Bは、30μg/mLまたは3μg/mLの濃度での本開示の様々な抗CD19抗体の、ヒトBリンパ球に結合する能力を表す一連のグラフである。図3Cおよび3Dは、30μg/mLまたは3μg/mLの濃度での本開示の様々な抗CD19抗体の、カニクイザルBリンパ球に結合する能力を表す一連のグラフである。図3Eおよび3Fは、30μg/mLまたは3μg/mLの濃度での本開示の様々な抗CD19抗体の、ヒトTリンパ球および単球に結合する能力を表す一連のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
詳細な説明
本開示はCD19に結合するモノクローナル抗体を提供する。本明細書においてこれらの抗体はまとめて抗CD19モノクローナル抗体または抗CD19 mAbと呼ばれる。好ましくは、モノクローナル抗体は少なくともヒトCD19に対して特異的である。ある態様において、ヒトCD19を認識するモノクローナル抗体は、非限定的な例として非ヒト霊長類CD19、例えばカニクイザルCD19、および／または齧歯類CD19のような、少なくとも1種類の他の非ヒトCD19タンパク質に対して交差反応性でもある。本開示はまた、本明細書において開示される抗CD19モノクローナル抗体と同じエピトープに結合する抗体をも含む。
【００２５】
本開示は、CD19に対して特異的な第一のアームを少なくとも含む一価抗体および／または二重特異性抗体をも提供する。好ましくは、一価抗体および／または二重特異性抗体は、少なくともヒトCD19に対して特異的である。ある態様において、ヒトCD19を認識する一価抗体および／または二重特異性抗体はまた、非限定的な例として非ヒト霊長類CD19、例えばカニクイザルCD19、および／または齧歯類CD19のような、少なくとも1種類の他の非ヒトCD19タンパク質に対して交差反応性でもある。本開示は、本明細書において開示される抗CD19一価抗体および／または抗CD19二重特異性抗体と同じエピトープに結合する抗体をも提供する。
【００２６】
本開示の二重特異性抗体によって、2つの抗体アームの、細胞表面上の2つの抗原との同時の結合（同時結合(co-engagement)と称される）が可能になり、その結果、結合活性（アビディティ）メカニズムによる親和性の相加的または相乗的な増大がもたらされる。結果として、同時結合により単一の抗原のみを発現する細胞と比べて双方の抗原を発現する細胞に対して選択性が高くなる。さらに、二重特異性抗体の2つのアームのその各々の標的に対する親和性は、標的細胞との結合が抗体アームのうち一方によって主になされるような仕方で調整し得る。ある態様において、二重特異性抗体は、CD19に結合する第一のアームと、CD19ではない第二の標的に結合する第二のアームとを含む。ある態様において、二重特異性抗体は、CD19に結合する第一のアームと、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第二のアームとを含む。ある態様において、二重特異性抗体は、CD19に結合する第一のアームと、腫瘍関連抗原（TAA）に結合する第二のアームとを含み、第一のアームはCD19に高い親和性で結合し、第二のアームはTAAに低い親和性で結合する。ある態様において、TAAはがん細胞の細胞表面上に発現される抗原である。ある態様において、がん細胞は、肺がん細胞、気管支がん細胞、前立腺がん細胞、乳がん細胞、大腸がん細胞、膵臓がん細胞、卵巣がん細胞、白血病がん細胞、リンパ腫がん細胞、食道がん細胞、肝臓がん細胞、泌尿器がんおよび／もしくは膀胱がん細胞、腎臓がん細胞、口腔がん細胞、咽頭がん細胞、子宮がん細胞、ならびに／またはメラノーマ細胞から選択される。ある態様において、好適な第二の標的は、非限定的な例としてCD47、CD20、CD22、CD40、BAFFR、CD5、CD32b、ICOSL、IL6R、および／またはIL21Rを含む。
【００２７】
ある態様において、二重特異性抗体は、完全ヒト型二重特異性IgGフォーマット、例えば、その内容の全体が参照により本明細書に組み入れられるPCT公報WO 2012/023053号に記載されるκλボディフォーマットである。
【００２８】
本開示の例示的な抗CD19モノクローナル抗体およびその抗原結合断片は、例えば、5F5抗体、7F11抗体、9G8抗体、F6抗体、7F1抗体、および10D8抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００２９】
少なくとも1つの結合部位がCD19に対して特異的である、本開示の例示的な抗CD19二重特異性抗体は、例えば、5F5抗体、7F11抗体、9G8抗体、F6抗体、7F1抗体、および10D8抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００３０】
ある態様において、本開示の例示的な抗CD19モノクローナル抗体およびその抗原結合断片は、表1に示されるCDR配列から選択される重鎖相補性決定領域（CDR）と表2に示されるCDR配列から選択される軽鎖CDRとの組み合わせを含む。表1および表2に示されるCDRはIMGT命名法に従って定義付けられる。
【００３１】
ある態様において、本開示の例示的な抗CD19モノクローナル抗体、単一特異性抗CD19抗体、抗CD19一価抗体、および／または二重特異性抗体は、表1に示されるCDR配列から選択される重鎖相補性決定領域（CDR）と表2に示されるCDR配列から選択される軽鎖CDRとの組み合わせを含む。表1および表2に示されるCDRはIMGT命名法に従って定義付けられる。
【００３２】
（表１）抗CD19重鎖CDR
2020503256.tif 000003
【００３３】
（表２）抗CD19軽鎖CDR
2020503256.tif 000004
【００３４】
抗CD19抗体
例示的な抗CD19抗体は、本明細書において5F5、7F11、9G8、F6、7F1、および10D8と呼ばれる抗体、またはその任意の断片、変異型、多量体型、もしくは二重特異性抗体を含む。または、抗CD19抗体は、5F5、7F11、9G8、F6、7F1、および10D8と同じエピトープに結合する抗体もしくはその任意の断片、変異型、多量体型、あるいは二重特異性抗体である。これらの抗体またはその任意の断片、変異型、多量体型、もしくは二重特異性抗体は本明細書において各々「huCD19」抗体と呼ばれる。本開示のhuCD19抗体は、完全ヒト型モノクローナル抗体、ならびにヒト化モノクローナル抗体、およびキメラ抗体、またはその任意の断片、変異型、多量体型、もしくは二重特異性抗体を含む。これらの抗体はヒトCD19に対する特異性を示し、CD19の少なくとも1つの生物学的機能または活性を調節する、例えばブロックする、阻害する、低減する、アンタゴナイズする、中和する、またはさもなければ妨げることが示されている。
【００３５】
CD19の生物学的機能または活性は、非限定的な例として、CD21および／もしくはCD81とB細胞コレセプターとして機能すること、活性化されたリン酸化状態において1つもしくは複数のSrcファミリーキナーゼと結合すること；ならびに／またはPI-3キナーゼを動員することを含む。本明細書に記載される抗体の存在下におけるCD19の機能活性レベルが、該抗体との結合がない場合におけるCD19の機能活性レベルと比較して少なくとも95％、例えば96％、97％、98％、99％、または100％低下する場合に、該抗体はCD19の少なくとも1つの機能活性を完全に調節する、ブロックする、阻害する、低減する、アンタゴナイズする、中和する、またはさもなければ妨げると考えられる。本明細書に記載される抗体の存在下におけるCD19の機能活性レベルが、該抗体との結合がない場合のCD19の機能活性レベルと比較して95％未満、例えば10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、または90％低下する場合に、該抗体はCD19の少なくとも1つの機能活性を部分的に調節する、ブロックする、阻害する、低減する、アンタゴナイズする、中和する、またはさもなければ妨げると考えられる。
【００３６】
本明細書に記載されるhuCD19モノクローナル抗体またはその任意の断片、変異型、多量体型、もしくは二重特異性抗体の各々は、下記に挙げられるアミノ酸配列および相当する核酸配列に示されるように、重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）を含む。下記のVH配列およびVL配列の各々に、IMGTに従ったCDR配列が含まれる。
【００３７】
5F5抗体は、SEQ ID NO:1に示される核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（VH）（SEQ ID NO:2）と、SEQ ID NO:3に示される核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（VL）（SEQ ID NO:4）とを含む。
2020503256.tif 000005
【００３８】
7F11抗体は、SEQ ID NO:5に示される核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（VH）（SEQ ID NO:6）と、SEQ ID NO:7に示される核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（VL）（SEQ ID NO:8）とを含む。
2020503256.tif 000006
【００３９】
9G8抗体は、SEQ ID NO:105に示される核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（VH）（SEQ ID NO:6）と、SEQ ID NO:9に示される核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（VL）（SEQ ID NO:10）とを含む。
2020503256.tif 000007
【００４０】
F6抗体は、SEQ ID NO:11に示される核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（VH）（SEQ ID NO:12）と、SEQ ID NO:13に示される核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（VL）（SEQ ID NO:14）とを含む。
2020503256.tif 000008
2020503256.tif 000009
【００４１】
7F1抗体は、SEQ ID NO:15に示される核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（VH）（SEQ ID NO:16）と、SEQ ID NO:17に示される核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（VL）（SEQ ID NO:18）とを含む。
2020503256.tif 000010
【００４２】
10D8抗体は、SEQ ID NO:19に示される核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（VH）（SEQ ID NO:20）と、SEQ ID NO:21に示される核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（VL）（SEQ ID NO:22）とを含む。
2020503256.tif 000011
【００４３】
ある態様において、本明細書に提示される抗CD19抗体配列またはその抗原結合断片は、一価抗体を作製するために使用される。本開示の一価抗体は、共通の重鎖配列、CD19を特異的に認識する1つのアーム、および本明細書においてダミーアームと呼ばれる第二のアームを含む。ダミーアームは、ヒトタンパク質と結合しないかまたはさもなければ交差反応しないアミノ酸配列を含む。ある態様において、ダミーアームは、全血中に認められるヒトタンパク質と結合しないかまたはさもなければ交差反応しないアミノ酸配列を含む。ある態様において、ダミーアームは、固形組織中に認められるヒトタンパク質と結合しないかまたはさもなければ交差反応しないアミノ酸配列を含む。好ましくは、一価抗体は少なくともヒトCD19に対して特異的である。ある態様において、ヒトCD19を認識する一価抗体は、少なくとも1種類の他の非ヒトCD19タンパク質、例えば非限定的な例として非ヒト霊長類CD19、例えばカニクイザルCD19、および／または齧歯類CD19に対して交差反応性でもある。
【００４４】
ある態様において、抗CD19抗体配列またはその抗原結合断片は、CD19以外の標的に結合する第二の抗体配列またはその抗原結合断片と共に使用され、本明細書において「抗CD19二重特異性抗体」と呼ばれる二重特異性抗体が作製される。
【００４５】
本明細書においては例として下記の抗体配列が提供されるが、当技術分野において認識される様々な技術の任意のものを用いて二重特異性抗体を作製するためにこれらの配列を使用できることを理解されるべきである。二重特異性フォーマットの例は、非限定的に、共通の重鎖、κ型軽鎖、およびλ型軽鎖を含む完全ヒト型二重特異性抗体（PCT公報WO 2012/023053号）、Fabアーム交換に基づく二重特異性IgG（Gramer et al., 2013 MAbs. 5(6)）；CrossMabフォーマット(Klein C et al., 2012 MAbs 4(6))；SEED技術（Davis JH et al., 2010 Protein Eng Des Sel. 23(4):195-202）、エレクトロスタティック・ステアリング（Gunasekaran K et al., J Biol Chem. 2010 285(25):19637-46）またはノブ・イントゥ・ホール（Ridgway JB et al., Protein Eng. 1996 9(7):617-21）またはホモ二量体形成を妨げる他の置換変異のセット（Von Kreudenstein TS et al., 2013 MAbs. 5(5):646-54）のような強制ヘテロ二量体化アプローチに基づく複数のフォーマット；タンデムscFv（例えばBiTE）（Wolf E et al., 2005 Drug Discov. Today 10(18):1237-44）のような、断片に基づく二重特異性フォーマット；二重特異性四価抗体（Portner LM et al., 2012 Cancer Immunol Immunother. 61(10):1869-75）；二重親和性再ターゲティング分子（Moore PA et al., 2011 Blood. 117(17):4542-51）、ダイアボディ（Kontermann RE et al., Nat Biotechnol. 1997 15(7):629-31）を含む。
【００４６】
定義
別様に定義されている場合を除き、本開示に関連して用いられる科学技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、本文がそれ以外であることを必要としている場合を除き、単数形は複数形を含み、複数形は単数形を含む。一般的に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションに関連して用いられる名称、およびそれらの技術は、当技術分野において周知であり、一般的に用いられる。組み換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換に関して、標準的な技術が用いられる（例えば、電気穿孔、リポフェクチン）。酵素反応および精製技術は、製造元の仕様書に従って、または当技術分野において一般的に行われるように、または本明細書に記載されるように行われる。前述の技術および技法は一般的に、当技術分野において周知の通常の方法に従っておよび本明細書を通して引用および考察される様々な一般的なおよびより特異的な参考文献に記述されるように行われる。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))を参照されたい。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医化学および薬化学に関連して用いられる名称、ならびにそれらの実験技法および技術は、当技術分野において周知であり、一般的に用いられる技法および技術である。化学合成、化学分析、薬剤調製、調合、ならびに患者への送達および処置に関して、標準的な技術が用いられる。
【００４７】
本開示に従って用いられるように、以下の用語は、それ以外であることを示している場合を除き、以下の意味を有すると理解される。
【００４８】
本明細書において用いられる「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ig）分子の免疫活性部分、すなわち抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を意味する。「と特異的に結合する」、または「と免疫反応する」、または「免疫特異的に結合する」とは、抗体が所望の抗原の1つまたは複数の抗原性決定基と反応するが、他のポリペプチドとは反応しないか、またはかなり低い親和性（Kd＞10-6）で結合することを意味する。抗体としては、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、dAb（ドメイン抗体）、一本鎖、Fab、Fab'、およびF(ab')2断片、scFv、ならびにFab発現ライブラリを含む、任意の断片、バリアント、多量体型、またはその二特異性体が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００４９】
抗体の基本構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は、各々の対が1つの「軽」鎖（約25 kDa）と1つの「重」鎖（約50〜70 kDa）とを有する、ポリペプチド鎖の2つの同一の対で構成される。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約100個から110個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を定義する。一般的に、ヒトから得られる抗体分子は、分子に存在する重鎖の性質が互いに異なるIgG、IgM、IgA、IgE、およびIgDのクラスのいずれかに関連する。あるクラスは、IgG1、IgG2、およびその他などのサブクラスも同様に有する。さらに、ヒトでは、軽鎖はカッパ鎖またはラムダ鎖でありうる。
【００５０】
本明細書において用いられる「モノクローナル抗体」（MAb）、または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、独自の軽鎖遺伝子産物と独自の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の1つの分子種のみを含む抗体分子集団を意味する。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（CDR）は、その集団の全ての分子において同一である。MAbは、抗原に対する独自の結合親和性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含む。
【００５１】
「抗原結合部位」または「結合部分」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を意味する。抗原結合部位は、重鎖（「H」）と軽鎖（「L」）のN-末端可変（「V」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と呼ばれる、重鎖と軽鎖のV領域内の3つの高度に多様な伸長部が、「フレームワーク領域」または「FR」として知られるより保存された隣接伸長部のあいだに挿入される。このように、「FR」という用語は、免疫グロブリンの超可変領域のあいだに、超可変領域に隣接して天然に見いだされるアミノ酸配列を意味する。抗体分子において、軽鎖の3つの超可変領域および重鎖の3つの超可変領域は、三次元空間で互いに関連して配置されて抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面と相補的であり、重鎖および軽鎖の各々の3つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」と呼ばれる。各ドメインに対するアミノ酸の割付は、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))、またはChothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)）の定義に従う。
【００５２】
本明細書において用いられる「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン、scFv、またはT細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面官能基からなり、通常、特異的三次元構造特徴ならびに特異的電荷特徴を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのN-末端またはC-末端ペプチドに対して作製されうる。抗体は、解離定数が≦1μM、例えば≦100 nM、好ましくは≦10 nM、および最も好ましくは≦1 nMである場合に、抗原に特異的に結合すると言われる。
【００５３】
本明細書において用いられる「免疫学的に結合する」および「免疫学的結合特性」という用語は、免疫グロブリン分子と、それに対して免疫グロブリン分子が特異的である抗原とのあいだに起こるタイプの非共有的相互作用を意味する。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Kd）に関して表記することができ、Kdが小さいほど、親和性が大きいことを表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野において周知の方法を用いて定量することができる。そのような1つの方法は、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離速度を測定する段階を伴い、それらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響を及ぼす幾何学的パラメータに依存する。このように、濃度ならびに実際の結合速度および解離速度を計算することによって、「オン速度定数」（Kon）および「オフ速度定数」（Koff）の両方を決定することができる（Nature 361 : 186-87 (1993)を参照されたい）。Koff/Konの比率は、親和性に関連しない全てのパラメータの削除を可能にして、解離定数Kdに等しい（一般的に、Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473を参照されたい）。本開示の抗体は、放射リガンド結合アッセイまたは当業者に公知の類似のアッセイなどのアッセイによって測定した場合に、平衡結合定数（Kd）が≦1μM、例えば≦100 nM、好ましくは≦10 nM、およびより好ましくは≦1 nMであれば、標的に特異的に結合すると言われる。
【００５４】
本明細書において用いられる「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、ゲノム、cDNA、もしくは合成起源のポリヌクレオチド、またはそのいくつかの組み合わせを意味し、その起源のために、「単離されたポリヌクレオチド」は、（1）「単離されたポリヌクレオチド」が天然において見いだされるポリヌクレオチドの全てまたは一部に会合していない、（2）天然において結合していないポリヌクレオチドに機能的に結合している、または（3）より大きい配列の一部として天然において存在しない。本開示に従うポリヌクレオチドは、本明細書に記載される重鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子および軽鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を含む。
【００５５】
「単離されたタンパク質」という用語は、cDNA、組み換え型RNA、もしくは合成起源のタンパク質、またはそのいくつかの組み合わせを意味し、その起源または由来源のために、「単離されたタンパク質」は、（1）天然において見いだされるタンパク質に会合していない、（2）同じ起源の他のタンパク質を含まない、例えば海洋タンパク質を含まない、（3）異なる種からの細胞によって発現される、または（4）天然において存在しない。
【００５６】
「ポリペプチド」という用語は、本明細書においてポリペプチド配列の本来のタンパク質、断片、またはアナログを意味するために、一般的な用語として用いられる。ゆえに、本来のタンパク質断片およびアナログは、ポリペプチドに属する種である。本開示に従うポリペプチドは、本明細書に記載される重鎖免疫グロブリン分子および軽鎖免疫グロブリン分子を含むとともに、重鎖免疫グロブリン分子にカッパ軽鎖免疫グロブリン分子などの軽鎖免疫グロブリン分子を組み合わせた、およびその逆によって形成される抗体分子、ならびにその断片およびアナログを含む。
【００５７】
本明細書において物体に適用される場合に用いられる「天然に存在する」という用語は、物体を天然において見いだすことができるという事実を意味する。例えば、天然の起源から単離することができる生物（ウイルスを含む）に存在して、研究室において人為的にまたはそれ以外の方法で意図的に改変されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００５８】
本明細書において用いられる「機能的に連結した」という用語は、そのように記述された成分の位置がその意図される様式でそれらを機能させる関係にあることを意味する。コード配列に「機能的に連結された」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列と適合性の条件下で達成されるようにライゲーションされる。
【００５９】
本明細書において用いられる「制御配列」という用語は、それらがライゲーションされるコード配列の発現およびプロセシングを行うために必要であるポリヌクレオチド配列を意味する。そのような制御配列の性質は、原核細胞中の宿主生物に応じて異なり、そのような制御配列は一般的に、真核細胞においてプロモーター、リボソーム結合部位、および転写終止配列を含み、一般的に、そのような制御配列はプロモーターおよび転写終止配列を含む。「制御配列」という用語は、少なくとも、その存在が発現およびプロセシングにとって必須である全ての成分を含むことを意図し、同様にその存在が有利である追加の成分、例えばリーダー配列、および融合パートナー配列を含むことができる。本明細書において言及される「ポリヌクレオチド」という用語は、長さが少なくとも10塩基のリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれかであるヌクレオチドのポリマーホウ素、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾型を意味する。この用語は、DNAの一本鎖および二本鎖型を含む。
【００６０】
本明細書において用いられる、20種類の通常アミノ酸およびその略語は、慣例的用法に従う。Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991))を参照されたい。20種類の通常アミノ酸の立体異性体（例えば、D-アミノ酸）、α-、α-二置換アミノ酸などの非天然アミノ酸、N-アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非通常アミノ酸も同様に、本開示のポリペプチドにとって適した成分でありうる。非通常アミノ酸の例には、4-ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、ε-N,N,N-トリメチルリジン、ε-N-アセチルリジン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリジン、σ-N-メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、4-ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書において用いられるポリペプチドの表記において、標準的な用法および慣例に従って、左手方向はアミノ末端方向であり、右手方向はカルボキシ末端方向である。
【００６１】
ポリペプチドに適用される場合、「実質的な同一性」という用語は、2つのペプチド配列が、プログラムGAPまたはBESTFITなどによって、デフォルトのギャップの重みを用いて最適に整列させた場合に、少なくとも80％の配列同一性、好ましくは少なくとも90％の配列同一性、より好ましくは少なくとも95％の配列同一性、および最も好ましくは少なくとも99％の配列同一性を共有することを意味する。
【００６２】
好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
【００６３】
保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の相互交換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり、ならびにイオウ含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタミン酸-アスパラギン酸、およびアスパラギン-グルタミンである。
【００６４】
本明細書において考察されるように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列における軽微な変化は、アミノ酸配列の変化が、少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、90％、95％、および最も好ましくは99％を維持する限り、本開示に包含されると企図される。特に、保存的アミノ酸交換が企図される。保存的交換は、その側鎖が関連するアミノ酸のファミリー内で起こる交換である。遺伝子コードアミノ酸は一般的に、ファミリーに分けられる：（1）酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸であり；（2）塩基性アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジンであり；（3）非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり、および（4）非荷電極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸には、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、およびトレオニンが挙げられる。疎水性アミノ酸には、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンが挙げられる。他のアミノ酸ファミリーには、（i）脂肪族ヒドロキシファミリーであるセリンおよびトレオニン；（ii）アミド含有ファミリーであるアスパラギンおよびグルタミン；（iii）脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；ならびに（iv）芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが挙げられる。例えば、ロイシンをイソロイシンまたはバリンに、アスパラギン酸をグルタミン酸に、トレオニンをセリンに単発的に交換しても、またはアミノ酸を構造的に関連するアミノ酸に類似の交換を行っても、特に交換がフレームワーク部位内でのアミノ酸を伴わない場合、得られた分子の結合または特性に対して主要な効果を有しないことは妥当に予想される。アミノ酸の変化によって、機能的ペプチドが得られるか否かは、ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることによって容易に決定することができる。アッセイは、本明細書において詳細に記述される。抗体または免疫グロブリン分子の断片またはアナログは、当業者によって容易に調製することができる。断片またはアナログの好ましいアミノおよびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界付近に存在する。構造および機能的ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを公共または固有の配列データベースと比較することによって同定することができる。好ましくは、コンピューター化比較法を用いて、公知の構造および／または機能の他のタンパク質に存在する配列モチーフまたは予想されるタンパク質コンフォメーションドメインを同定する。公知の三次元構造に折り畳まれるタンパク質配列を同定する方法は公知である。Bowie et al. Science 253: 164 (1991)。このように、前述の例は、当業者が、本開示に従って構造および機能的ドメインを定義するために用いられうる配列モチーフおよび構造コンフォメーションを認識できることを証明する。
【００６５】
好ましいアミノ酸置換は、（1）タンパク質分解に対する感受性を低減させる、（2）酸化に対する感受性を低減させる、（3）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる、（4）結合親和性を変化させる、および（4）そのようなアナログの他の物理化学的または機能的特性を付与または改変する置換である。アナログは、天然に存在するペプチド配列以外の配列の様々なムテインを含むことができる。例えば、1つまたは複数のアミノ酸置換（好ましくは、保存的アミノ酸置換）を、天然に存在する配列（好ましくは分子間接触を形成するドメイン外のポリペプチドの部分において）に行ってもよい。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させてはならない（例えば、交換アミノ酸は、親配列に存在するらせんを切断するまたは親配列を特徴付けする他のタイプの二次構造を崩壊させる傾向があってはらなない）。当技術分野において認識されるポリペプチドの二次および三次構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); and Thornton et at. Nature 354: 105 (1991)において記述される。
【００６６】
本明細書において用いられる、「標識」または「標識された」という用語は、例えば、印をつけたアビジン（例えば、光学または熱量測定法によって検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出することができる、ビオチニル部分のポリペプチドに、放射標識アミノ酸または連結部分を組み入れることによって検出可能なマーカーを組み入れることを意味する。ある状況において、標識またはマーカーはまた、治療的でありうる。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野において公知であり、用いられうる。ポリペプチドの標識の例には、以下が挙げられるがこれらに限定されるわけではない：放射性同位元素または放射性核種（例えば、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I）、蛍光標識（例えば、FITC、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、p-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光物質、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される既定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの態様において、標識は、可能性がある立体妨害を低減させるために、様々な長さのスペーサーアームによって結合される。本明細書において用いられる「薬剤または薬物」という用語は、患者に適切に投与した場合に、所望の治療効果を誘導することができる化学化合物または組成物を意味する。
【００６７】
本明細書における他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))によって例証されるように、当技術分野における慣例的用法に従って用いられる。
【００６８】
本明細書において用いられる「実質的に純粋な」とは、目的種が、存在する優勢な種であり（すなわち、モルに基づいて、組成物中の他の任意の個々の種より豊富に存在する）、好ましくは実質的に精製された分画は、目的種が、存在する全ての高分子種の少なくとも約50％（モルに基づいて）を含む組成物である。
【００６９】
一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物に存在する全ての高分子種が約80％を超えて、より好ましくは約85％、90％、95％、および99％を超えて含むであろう。最も好ましくは、目的種は、組成物が本質的に1つの高分子種からなる、本質的に均一になるまで精製される（通常の検出法によって組成物中に汚染種を検出することができない）。
【００７０】
患者という用語は、ヒトおよび獣医学的対象を含む。
【００７１】
抗体
当技術分野において公知の様々な技法を、例えば、CD19、腫瘍関連抗原、もしくは他の標的などの所定の標的に対する、またはその誘導体、断片、アナログ、ホモログ、もしくはオルトログに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を産生するために用いてもよい（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照されたい）。
【００７２】
抗体は、免疫血清の主にIgG分画を提供するプロテインAまたはプロテインGを用いるアフィニティクロマトグラフィーなどの周知の技術によって精製される。次に、または代わりに、求める免疫グロブリンの標的である特異的抗原またはそのエピトープを、免疫アフィニティクロマトグラフィーによって免疫特異的抗体を精製するためにカラム上に固定してもよい。免疫グロブリンの精製は、例えばD. Wilkinson（The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28）によって考察される。
【００７３】
一部の態様において、本開示の抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、例えば本明細書において提供される実施例に記載される技法を用いることによって生成される。抗体はまた、例えばその表面上の所定の標的の高レベルを発現する細胞トランスフェクタントの組み合わせによってBALB/cマウスを免疫感作することによっても作製される。次に、骨髄腫/B細胞融合体から生じるハイブリドーマを、選択された標的に対する反応性に関してスクリーニングする。
【００７４】
モノクローナル抗体は、例えばKohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)に記述される方法などのハイブリドーマ法を用いて調製される。ハイブリドーマ法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を典型的に、免疫物質に特異的に結合する抗体を産生するまたは産生することができるリンパ球を誘発するために、免疫物質によって免疫感作する。または、リンパ球をインビトロで免疫感作することができる。
【００７５】
免疫物質は典型的に、タンパク質抗原、その断片、またはその融合タンパク質を含む。一般的に、ヒト起源の細胞が望ましい場合、末梢血リンパ球が用いられ、または非ヒト哺乳動物起源が望ましい場合には脾細胞もしくはリンパ節細胞が用いられる。リンパ球を、ポリエチレングリコールなどの適した融合物質を用いて不死化細胞株に融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103）。不死化細胞株は通常、形質転換された哺乳動物細胞であり、詳しくは齧歯類、ウシ、およびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウス骨髄腫細胞株が用いられる。融合していない不死化細胞の生育または生存を阻害する1つまたは複数の物質を好ましくは含む適した培養培地において、ハイブリドーマ細胞を培養することができる。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRTまたはHPRT）を欠如する場合、ハイブリドーマの培養培地は典型的に、HGPRT欠損細胞の生育を防止する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む（「HAT培地」）であろう。
【００７６】
好ましい不死化細胞株は、効率よく融合して、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル発現を支持し、HAT培地などの培地に対して感受性である細胞株である。より好ましい不死化細胞株は、例としてSalk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Californiaおよびthe American Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから得ることができるマウス骨髄腫細胞株である。ヒト骨髄腫およびマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も同様にモノクローナル抗体を産生するために記述されている（Kozbor, J. Immunol, 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63)を参照されたい）。
【００７７】
ハイブリドーマ細胞を培養した培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の存在に関してアッセイすることができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降またはラジオイムノアッセイ（RIA）もしくは酵素免疫測定法（ELISA）などのインビトロ結合アッセイによって決定する。そのような技術およびアッセイは当技術分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のScatchard分析によって決定することができる。その上、モノクローナル抗体の治療応用では、標的抗原に対して高い程度の特異性および高い結合親和性を有する抗体を同定することが重要である。
【００７８】
所望のハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈技法によってサブクローニングして、標準的な方法によって生育させることができる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103を参照されたい）。この目的のための適した培養培地は、例えばダルベッコ改変イーグル培地およびRPMI 1640培地を含む。または、ハイブリドーマ細胞を、インビボで哺乳動物の腹水として生育させることができる。
【００７９】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体を、例えばプロテインA-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィーなどの通常の免疫グロブリン精製技法によって培養培地または腹水から単離または精製することができる。
【００８０】
モノクローナル抗体はまた、米国特許第4,816,567号に記述される方法などの組み換えDNA法によっても作製することができる。本開示のモノクローナル抗体をコードするDNAは、通常の技法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離およびシークエンシングすることができる。本開示のハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAの好ましい起源として役立つ。単離した後、DNAを発現ベクターの中に入れることができ、次に発現ベクターをサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、またはそれ以外では免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組み換え型宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得る。DNAはまた、例えばヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を相同なマウス配列の代わりに置換することによって（米国特許第4,816,567号；Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)を参照されたい）、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てまたは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって、改変することができる。そのような非免疫グロブリンポリペプチドを、本開示の抗体の定常ドメインの代わりに置換することができ、または本開示の抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換して、キメラ二価抗体を作製することができる。
【００８１】
本開示のモノクローナル抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体を含む。これらの抗体は、投与される免疫グロブリンに対してヒトが免疫応答を生じることがなく、ヒトに投与するために適している。抗体のヒト化型は、ヒト免疫グロブリンの配列で主に構成され、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む、キメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖または断片（Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、または抗体の他の抗原結合小配列など）である。ヒト化は、例えばWinterと共同研究者（Jones et al, Nature, 321 :522-525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239: 1534-1536 (1988)）の方法に従うことによって、齧歯類CDRまたはCDR配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに置換することによって行われる。（同様に、米国特許第5,225,539号も参照されたい）。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基を、対応する非ヒト残基に交換する。ヒト化抗体はまた、例えばレシピエント抗体またはインポートされたCDRもしくはフレームワーク配列のいずれにおいても見いだされない残基を含む。一般的に、ヒト化抗体は、全てまたは実質的に全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンの領域に対応し、およびフレームワーク領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の領域に対応する、少なくとも1つ、典型的に2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は最適には、免疫グロブリン定常領域、典型的にヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部（Fc）を含む（Jones et al., 1986; Riechmann et al, 1988; and Presta, Curr. Op. Struct. Biol, 2:593-596 (1992)）。
【００８２】
完全ヒト型抗体は、CDRを含む軽鎖および重鎖の両方の全配列がヒト遺伝子から生じる抗体分子である。そのような抗体は、本明細書において「ヒト抗体」または「完全ヒト型抗体」と呼ばれる。モノクローナル抗体は、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor, et al, 1983 Immunol Today 4: 72を参照されたい）、およびモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術（Cole, et al, 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照されたい）を用いることによって調製することができる。モノクローナル抗体は、ヒトハイブリドーマを用いることによって（Cote, et al, 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030を参照されたい）、またはエプスタイン-バーウイルスによってインビトロでヒトB細胞を形質転換することによって（Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照されたい）利用および産生されうる。
【００８３】
加えて、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリを含むさらなる技術を用いて産生することもできる。（Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)を参照されたい）。同様に、ヒト抗体は、トランスジェニック動物、例えば内因性の免疫グロブリン座が部分的または完全に不活化されているマウスにヒト免疫グロブリン座を導入することによって作製されうる。チャレンジすると、遺伝子再配列、アセンブリ、および抗体レパートリーを含む全ての局面においてヒトにおいて認められるものと類似するヒト抗体産生が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号、およびMarks et al, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); and Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)において記述される。
【００８４】
加えて、ヒト抗体は、抗原によるチャレンジに応答して動物の内因性の抗体ではなく完全ヒト型抗体を産生するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物を用いて産生されうる（PCT公報WO 94/02602を参照されたい）。非ヒト宿主における重鎖および軽鎖免疫グロブリン鎖をコードする内因性の遺伝子を、無能力化して、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする活性な座を宿主ゲノムに挿入する。ヒト遺伝子を、例えば、必須のヒトDNAセグメントを含む酵母人工染色体を用いて組み入れる。次に、完全ではない修飾の相補物を含む中間のトランスジェニック動物を交雑することによって、所望の修飾の全てを提供する動物が子孫として得られる。そのような非ヒト動物の例は、PCT公報WO 96/33735およびWO 96/34096において開示されるXenomouse（商標）と呼ばれるマウスである。この動物は、完全ヒト型免疫グロブリンを分泌するB細胞を産生する。抗体を、動物から、関心対象の免疫原による免疫感作後に、例えばポリクローナル抗体調製物として、直接得ることができ、またはモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマなどの動物に由来する不死化B細胞から得ることができる。加えて、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子を回収して発現させて、抗体を直接得ることができ、またはさらに改変して、例えば一本鎖Fv（scFv）分子などの抗体のアナログを得ることができる。
【００８５】
マウスがその例である、内因性の免疫グロブリン重鎖の発現を欠如する非ヒト宿主を産生する方法の例は、米国特許第5,939,598号に開示される。これは、座の再配列を防止するためにおよび再配列した免疫グロブリン重鎖座の転写物の形成を防止するために、胚幹細胞における少なくとも1つの内因性の重鎖座からJセグメント遺伝子を欠失させる段階であって、欠失が選択可能マーカーをコードする遺伝子を含むターゲティングベクターによって行われる段階、ならびにその体細胞および生殖細胞が選択可能マーカーをコードする遺伝子を含むトランスジェニックマウスを胚幹細胞から産生する段階を含む方法によって得ることができる。
【００８６】
ヒト抗体などの関心対象の抗体を産生する1つの方法は、米国特許第5,916,771号に開示される。この方法は、ある培養哺乳動物宿主細胞に、重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを導入する段階、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、別の哺乳動物宿主細胞に導入する段階、およびこれら2種類の細胞を融合させてハイブリッド細胞を形成する段階を含む。このハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。
【００８７】
この技法をさらに改善するために、免疫原における臨床的に関連するエピトープを同定する方法、および関連するエピトープに高い親和性で特異的に結合する抗体を選択する相関法が、PCT公報WO 99/53049に開示される。
【００８８】
抗体は、上記の一本鎖抗体をコードするDNAセグメントを含むベクターによって発現されうる。
【００８９】
これらは、ベクター、リポソーム、裸のDNA、アジュバント補助DNA、遺伝子銃、カテーテル等を含みうる。ベクターは、WO 93/64701に記述されるコンジュゲートなどの、ターゲティング部分（例えば、細胞表面受容体に対するリガンド）と核酸結合部分（例えば、ポリリジン）とを有する化学コンジュゲート、ウイルスベクター（例えば、DNAまたはRNAウイルスベクター）、標的部分（例えば、標的細胞に対して特異的な抗体）と核酸結合部分（例えば、プロタミン）とを含む融合タンパク質であるPCT/US 95/02140（WO 95/22618）に記述されるタンパク質などの融合タンパク質、プラスミド、ファージ等を含む。ベクターは、染色体、非染色体、または合成ベクターでありうる。
【００９０】
好ましいベクターは、ウイルスベクター、融合タンパク質、および化学コンジュゲートを含む。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスを含む。DNAウイルスベクターが好ましい。これらのベクターは、オルトポックスまたはアビポックスベクターなどのポックスベクター、I型単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクターなどのヘルペスウイルスベクター（Geller, A. I. et al, J. Neurochem, 64:487 (1995); Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A. I. et al, Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993); Geller, A. I., et al, Proc Natl. Acad. Sci USA 87: 1149 (1990)を参照されたい）、アデノウイルスベクター（LeGal LaSalle et al, Science, 259:988 (1993); Davidson, et al, Nat. Genet 3:219 (1993); Yang, et al, J. Virol. 69:2004 (1995)を参照されたい）、およびアデノ随伴ウイルスベクター（Kaplitt, M. G. et al, Nat. Genet. 8: 148 (1994)を参照されたい）を含む。
【００９１】
ポックスウイルスベクターは、細胞質に遺伝子を導入する。アビポックスウイルスベクターによって、核酸のごく短期間の発現が起こる。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクターは、神経細胞に核酸を導入するために好ましい。アデノウイルスベクターでは、核酸の発現は、アデノ随伴ウイルス（約4ヶ月間）より短期間（約2ヶ月間）であるが、アデノ随伴ウイルスでの発現は、HSVベクターより短期間である。選択される特定のベクターは、標的細胞および処置される状態に依存するであろう。導入は、標準的な技術によって、例えば、感染、トランスフェクション、形質導入、または形質転換によって行われうる。遺伝子移入様式の例には、例えば裸のDNA、CaPO4沈殿、DEAEデキストラン、電気穿孔、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクション、およびウイルスベクターが挙げられる。
【００９２】
ベクターは、本質的に任意の所望の標的細胞を標的とするために用いることができる。例えば、定位注射を用いてベクター（例えば、アデノウイルス、HSV）を所望の位置に向けることができる。加えて、SynchroMed Infusionシステムなどのミニポンプ注入システムを用いて脳室内（icv）注入によって、粒子を送達することができる。対流と呼ばれるバルクフローに基づく方法はまた、脳の広い領域に大きい分子を送達するために有効であることが証明されており、標的細胞にベクターを送達するために有用でありうる（Bobo et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :2076-2080 (1994); Morrison et al, Am. J. Physiol. 266:292-305 (1994)を参照されたい）。用いることができる他の方法は、カテーテル、静脈内、非経口、腹腔内および皮下注射、ならびに経口または他の公知の投与経路を含む。
【００９３】
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有する抗体である。本件の例において、結合特異性の1つは、CD19またはその任意の断片などの標的に対するものである。第二の結合標的は、任意の他の抗原であり、都合よくは、細胞表面タンパク質または受容体もしくは受容体サブユニットである。
【００９４】
二重特異性抗体を作製する方法は当技術分野において公知である。従来、二重特異性抗体の組み換えによる産生は、2つの重鎖が異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づいている（Milstein and Cuello, Nature, 305 :537-539 (1983)）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖が無作為に組み合わさるために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、そのうちの1つのみが正しい二重特異性構造を有する10個の異なる抗体分子の可能性がある混合物を生じる。正しい分子の精製は通常、アフィニティクロマトグラフィー段階によって行われる。類似の技法は、1993年5月13日に公表されたWO 93/08829、およびTraunecker et al, EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示される。
【００９５】
本開示の二重特異性および／または一価抗体は、これによってその内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる2011年8月16日に出願された同時係属中の出願、PCT公報WO 2012/023053号において開示されるものを含む、本技術分野において認識される様々な技術のうち任意のものを用いて作製することができる。PCT公報WO 2012/023053号に記載される方法によって、構造においてはヒト免疫グロブリンと同一の二重特異性抗体が作製される。このタイプの分子はユニークな重鎖ポリペプチドの2つのコピー、定常κドメインに融合された第一の軽鎖可変領域、および定常λドメインに融合された第二の軽鎖可変領域からなる。各々の結合部位は重鎖および軽鎖の両方が寄与する異なる抗原特異性を表す。軽鎖可変領域はλファミリーまたはκファミリーのものであってよく、好ましくはλ定常ドメインおよびκ定常ドメインにそれぞれ融合される。これは、非天然型の接合ポリペプチドの生成を避けるために好ましい。しかし、第一の特異性のためにκ軽鎖可変ドメインを定常λドメインに融合し、第二の特異性のためにλ軽鎖可変ドメインを定常κドメインに融合することによって本開示の二重特異性抗体を得ることも可能である。PCT公報WO 2012/023053号に記載される二重特異性抗体は、IgGκλ抗体または「κλボディ」と呼ばれ、新規の完全ヒト型二重特異性IgGフォーマットである。このκλボディフォーマットにより、標準のモノクローナル抗体と識別不能な特徴を有する標準のIgG分子から識別不能な二重特異性抗体の親和性精製が可能になるため、本フォーマットは以前のフォーマットと比べて好都合である。
【００９６】
この方法において必須の段階は、同じ重鎖可変ドメインを共有し異なる抗原特異性を有する2つの抗体Fv領域（各々が可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインとからなる）を同定することである。モノクローナル抗体およびその断片の作製については数多の方法が記載されている（例えば、参照により本明細書に組み入れられるAntibodies:A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照のこと）。完全ヒト型抗体は、CDR1およびCDR2を含む軽鎖および重鎖の両方の配列がヒト遺伝子から生じるような抗体分子である。CDR3領域はヒト由来のものであってもよく、または、合成法によって設計されてもよい。本明細書においてそのような抗体は「ヒト抗体」または「完全ヒト型抗体」と称される。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技術；ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4:72を参照のこと）；およびヒトモノクローナル抗体を作製するEBVハイブリドーマ技術（Cole, et al., 1985 In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96 を参照のこと）を用いて調製することができる。ヒトモノクローナル抗体は、ヒトハイブリドーマを用いることによって（Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80:2026-2030を参照のこと）、またはインビトロにおいてエプスタイン・バーウイルスを用いてヒトB細胞を形質転換することによって（Cole, et al., 1985 In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96 を参照のこと）、利用することができ、作製することができる。
【００９７】
モノクローナル抗体は、例えば、標的抗原、またはその免疫原性断片、誘導体、もしくは変異体を用いて動物個体を免疫感作することによって作製される。あるいは、標的抗原をコードする核酸分子を含有するベクターでトランスフェクトした細胞を用いることによって、トランスフェクトされた細胞の表面で標的抗原が発現され結合されるようにして、動物個体を免疫感作する。当技術分野においては異種（xenogenic）非ヒト動物を作製するための様々な技術が周知である。例えば、これによってその全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,075,181号および第6,150,584号を参照のこと。
【００９８】
あるいは、抗体は、抗体配列もしくは抗原結合ドメイン配列を含有するライブラリを、標的抗原との結合についてスクリーニングすることによって得られる。このライブラリは、例えばバクテリオファージにおいて、構築されたファージ粒子の表面上において発現されるバクテリオファージコートタンパク質とのタンパク質またはペプチド融合体、およびファージ粒子内に含有されるコードDNA配列として（即ち「ファージディスプレイライブラリ」として）調製される。
【００９９】
次いで、ミエローマ/B細胞融合の結果生じたハイブリドーマを、標的抗原に対する反応性についてスクリーニングする。モノクローナル抗体は、例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495(1975)によって記載されるようなハイブリドーマ法を用いて調製される。ハイブリドーマ法においては、免疫感作剤に特異的に結合する抗体を産生する、または産生できるリンパ球を誘発するために、典型的には、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を免疫感作剤を用いて免疫感作する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫感作することができる。
【０１００】
厳密には不可能ではないが、同じ重鎖可変ドメインを有するが異なる抗原に対して指向する異なる抗体が偶然に同定される可能性は非常に低い。実際、ほとんどの場合において、重鎖は抗原結合表面に大きく寄与しているとともに、配列が最も変わりやすい。特に、重鎖上のCDR3は、配列、長さ、および構造の最も多様なCDRである。したがって、異なる抗原に対して特異的な2つの抗体はほぼ常に、異なる重鎖可変ドメインを有する。
【０１０１】
同時係属中の出願、PCT公報WO 2012/023053号において開示される方法は、この制限を克服するものであり、全てのライブラリメンバーについて重鎖可変ドメインが同じであり、それゆえに多様性が軽鎖可変ドメインに限定されるような抗体ライブラリを使用することによって、同じ重鎖可変ドメインを有する抗体の単離を大いに促進する。そのようなライブラリは、例えば、これによってその各々の全体が参照により本明細書に組み入れられる同時係属中の出願、PCT公報WO 2010/135558号およびPCT公報WO 2011/084255号に記載されている。しかし、重鎖可変ドメインと共に軽鎖可変ドメインが発現されるため、双方のドメインが抗原との結合に寄与し得る。過程をさらに容易にするため、異なる抗原に対する抗体のインビトロにおける選択のために、同じ重鎖可変ドメインおよび多様なλ可変軽鎖またはκ可変軽鎖のいずれかを含有する抗体ライブラリを並行して使用することができる。このアプローチでは、本開示の完全免疫グロブリンフォーマットにおいて二重特異性抗体を作製するための構成要素として使用できる、共通の重鎖を有するが、一方がλ軽鎖可変ドメインを有し、他方がκ軽鎖可変ドメインを有する2つの抗体の同定が可能になる。本開示の二重特異性抗体は、異なるアイソタイプのものであってよく、異なるFcレセプターへの結合特性を変えるために、ならびにこのような方法で抗体のエフェクター機能および薬物動態学的特性を改変するために、それらのFc部分は改変されてよい。Fc部分を改変するための数多の方法が記載されており、本開示の抗体に適用可能である（例えば、Strohl, WR Curr Opin Biotechnol 2009 (6):685-91；米国特許第6,528,624号；2009年1月9日に出願されたPCT/US2009/0191199を参照のこと）。本開示の方法は、Fc部分を欠くF(ab’)2 フォーマットでの二重特異性抗体および抗体混合物を作製するために使用することもできる。
【０１０２】
共通の重鎖および2つの異なる軽鎖を単一の細胞において共発現させて、本開示の二重特異性抗体を構築する。全てのポリペプチドが同じレベルで発現され、免疫グロブリン分子を形成するのに十分に同等に構築された場合、単一特異性（同じ軽鎖）および二重特異性（2つの異なる軽鎖）の比率は50％となるはずである。しかし、異なる軽鎖が異なるレベルで発現される、および／または同じ効率では構築されない可能性がある。したがって、その固有の発現特性または異なる性質を補って共通の重鎖と構築させるために、異なるポリペプチドの相対的発現を調節する手段が用いられる。この調節は、プロモーターの強度によって、異なる効率を特徴とする配列内リボソーム進入部位（IRES）の使用、または、転写もしくは翻訳レベルにおいて作用できる、およびmRNA安定性に対して作用する他のタイプの調節エレメントの使用によって成すことができる。異なる強度の異なるプロモーターは、CMV（最初期サイトメガロウイルス・ウイルスプロモーター）；EF1-1α（ヒト伸長因子1α-サブユニットプロモーター）；Ubc（ヒトユビキチンCプロモーター）；SV40（サルウイルス40プロモーター）を含み得る。哺乳動物起源およびウイルス起源の異なるIRESについても記述されている（例えば、Hellen CU and Sarnow P. Genes Dev 2001 15:1593-612を参照のこと）。これらのIRESはその長さおよびリボソーム動員効率において大きく異なる。さらに、IRESの複数のコピーを導入することによって活性をさらに調整することが可能である（Stephen et al.2000 Proc Natl Acad Sci USA 97:1536-1541）。発現の調節は細胞の複数の連続的なトランスフェクションを行ってどれか1つの軽鎖を発現する個々の遺伝子のコピー数を増加させ、それによりそれらの相対的な発現を改変することによって成すこともできる。本明細書において提供される例から、異なる鎖の相対的発現の調節が二重特異性抗体の構築および全収量を最大化するために重要であることが示される。
【０１０３】
重鎖と2種類の軽鎖の共発現から、細胞培養上清中に3種類の異なる抗体の混合物が生じる：2種類の単一特異性二価抗体および1種類の二重特異性二価抗体である。後者は、混合物から精製して関心対象の分子を得なければならない。本明細書に記載される方法では、CaptureSelect Fab Kappa and CaptureSelect Fab Lambdaアフィニティマトリクス（BAC BV, Holland）のようなκまたはλ軽鎖定常ドメインと特異的に相互作用するアフィニティクロマトグラフィー媒体を使用することによって、この精製工程が大いに促進される。この多段階アフィニティクロマトグラフィー精製アプローチは効率的であり、本開示の抗体に一般に適用可能である。これは抗体混合物を発現するクアドローマまたは他の細胞株に由来する各々の二重特異性抗体について開発しなければならない、および最適化しなければならない特異的精製法とは著しく対照的である。実際に、混合物中の異なる抗体の生化学的特徴が類似している場合、イオン交換クロマトグラフィーのような標準のクロマトグラフィー技術を用いたそれらの分離は難しいか、または全く不可能であり得る。
【０１０４】
他の好適な精製法には、これによってその内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる、2012年10月19日に出願され、PCT公報WO 2013/088259号として公開された同時係属中の出願PCT/IB2012/003028において開示されるものが含まれる。
【０１０５】
二重特異性抗体製造の他の態様において、所望の結合特異性（抗体-抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させることができる。融合は好ましくは、ヒンジ、CH2、およびCH3領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのあいだで行う。融合体の少なくとも1つに存在する軽鎖結合にとって必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（CHI）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、および望ましければ免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを、異なる発現ベクターに挿入して、適した宿主生物に同時トランスフェクトする。二重特異性抗体を作製するさらなる詳細に関しては、例えば、Suresh et al, Methods in Enzymology, 121 :210 (1986)を参照されたい。
【０１０６】
WO 96/27011に記述される別のアプローチに従って、抗体分子対のあいだの界面を、組み換え型細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大限にするように操作することができる。好ましい界面は、抗体定常ドメインのCH3領域の少なくとも一部を含む。この方法において、第一の抗体分子の界面からの1つまたは複数の小さいアミノ酸側鎖を、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）に交換する。大きいアミノ酸側鎖をより小さい側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）に交換することによって、大きい側鎖と同一または類似のサイズの代償的「腔」が、第二の抗体分子の界面上に作製される。これは、ホモ二量体などの他の望ましくない最終産物に対してヘテロ二量体の収率を増加させる機序を提供する。
【０１０７】
抗体断片から二重特異性抗体を作製する技術は、文献において記述されている。例えば、二重特異性抗体は、化学的連結を用いて調製することができる。産生された二重特異性抗体を、酵素の選択的固定のための物質として用いることができる。
【０１０８】
組み換え型細胞培養から二重特異性抗体断片を直接作製および単離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて産生されている。Kostelny et al, J. Immunol. 148(5): 1547- 1553 (1992)。FosおよびJunタンパク質のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって異なる2つの抗体のFab'部分に連結させた。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、その後再度酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法はまた、抗体ホモ二量体を産生するためにも利用することができる。Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)によって記述される「ディアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代わりの機序を提供している。断片は、同じ鎖の2つのドメイン間で対を形成するには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（VL）に接続された重鎖可変ドメイン（VH）を含む。したがって、1つの断片のVHおよびVLドメインを、別の断片の相補的VLおよびVHドメインと対を形成させて、それによって2つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Fv（sFv）二量体を用いることによって二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略も同様に報告されている。Gruber et al, J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
【０１０９】
2価を超える抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)。
【０１１０】
例示的な二重特異性抗体は、異なる2つのエピトープに結合することができ、その少なくとも1つは、本開示のタンパク質抗原を起源とする。または、特定の抗原を発現する細胞に細胞防御機構を集中させるために、免疫グロブリン分子の抗抗原性アームを、T細胞受容体分子（例えば、CD2、CD3、CD28、またはB7）、またはFcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、およびFcγRIII（CD16）などのIgGのFc受容体（FcγR）などの白血球上のトリガー分子に結合するアームと組み合わせることができる。二重特異性抗体を用いて、特定の抗原を発現する細胞に細胞傷害性物質を向けることもできる。これらの抗体は、抗原結合アームと、細胞傷害剤、またはEOTUBE、DPTA、DOTA、もしくはTETAなどの放射性核種キレート剤に結合するアームとを有する。別の関心対象の二重特異性抗体は、本明細書に記載されるタンパク質抗原に結合して、組織因子（TF）にさらに結合する。
【０１１１】
ヘテロコンジュゲート抗体も同様に、本開示の範囲内である。ヘテロコンジュゲート抗体は、2つの共有結合抗体で構成される。そのような抗体は、例えば、免疫系の細胞を望ましくない細胞に向けるために（米国特許第4,676,980号を参照されたい）およびHIV感染症を処置するために（WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089を参照されたい）提唱されている。抗体は、架橋剤を含む化学を含む合成タンパク質化学における公知の方法を用いてインビトロで調製することができると企図される。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を構築することができる。この目的のための適した試薬の例には、イミノチオラートおよびメチル-4-メルカプトブチルイミダート、ならびに例えば米国特許第4,676,980号に開示される試薬が挙げられる。
【０１１２】
がんならびに／または異常なCD19発現および／もしくは活性に関連する疾患および障害の処置において、例えば抗体の有効性を増強するために、エフェクター機能に関して本開示の抗体を修飾することが望ましい場合がある。例えば、システイン残基をFc領域に導入して、それによってこの領域において鎖間ジスルフィド結合を形成させることができる。このように作製されたホモ二量体抗体は、改善されたインターナリゼーション能および／または増加した補体依存性細胞傷害性および抗体依存性細胞傷害性（ADCC）を有しうる。（Caron et al, J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照されたい）。または、二重のFc領域を有し、それによって増強された補体溶解およびADCC能を有しうる抗体を工学操作することができる。（Stevenson et al, Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)を参照されたい）。
【０１１３】
コンジュゲートされた抗体
本開示はまた、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素またはその断片）または放射活性同位元素（すなわち、ラジオコンジュゲート）などの細胞傷害剤にコンジュゲートされた抗体またはその抗原結合断片を含む、コンジュゲートされた抗体（本明細書においてイムノコンジュゲートとも称する）にも関する。
【０１１４】
ある態様において、毒素は、微小管阻害剤またはその誘導体である。ある態様において、毒素は、ドラスタチンまたはその誘導体である。ある態様において、毒素は、アウリスタチンE、AFP、MMAF、MMAE、MMAD、DMAF、またはDMAEである。ある態様において、毒素は、マイタンシノイドまたはマイタンシノイド誘導体である。ある態様において、毒素は、DM1またはDM4である。ある態様において、毒素は核酸損傷毒素である。ある態様において、毒素は、デュオカルマイシンまたはその誘導体である。ある態様において、毒素は、カリチアマイシンまたはその誘導体である。ある態様において、作用物質は、ピロロベンゾジアゼピンまたはその誘導体である。
【０１１５】
用いることができる酵素的に活性な毒素およびその断片は、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素A鎖（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデッシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、アメリカヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（PAPI、PAPII、およびPAP-S）、ツルレイシ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンを含む。 ラジオコンジュゲート抗体を産生するために、多様な放射性核種を利用することができる。例には、212Bi、131I、131In、90Y、および186Reが挙げられる。
【０１１６】
抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオル)プロピオネート（SPDP）、イミノチオラン（IT）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルHCLなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビスアジド化合物（ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミンなど）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トリエン2,6-ジイソシアネートなど）、およびビス活性フッ素化合物（1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼンなど）などの多様な二官能タンパク質結合剤を用いて作製される。例えば、リシン免疫毒素を、Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)に記述されるように調製することができる。炭素-14標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸（MX-DTPA）は、放射性核種を抗体にコンジュゲートするための例示的なキレート剤である。（W094/11026を参照されたい）。
【０１１７】
当業者は、非常に多様な可能性がある部分を本開示の得られた抗体に結合させることができると認識するであろう。（例えば、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、"Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)を参照されたい）。
【０１１８】
結合は、抗体および他の部分がそのそれぞれの活性を保持する限り、2つの分子を結合させる任意の化学反応によって行われうる。この結合は、多くの化学的機序、例として共有結合、アフィニティ結合、インターカレーション、配位結合および錯体形成を含みうる。しかし、好ましい結合は共有結合である。共有結合は、既存の側鎖を直接縮合することによって、または外部架橋分子を組み入れることのいずれかによって行われうる。多くの二価または多価結合剤が本開示の抗体などのタンパク質分子を他の分子に結合させるために有用である。例えば、代表的な結合剤は、チオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン、およびヘキサメチレンジアミンなどの有機化合物を含みうる。この一覧は、当技術分野において公知の様々なクラスの結合剤を網羅したものではなく、むしろより一般的な結合剤の例であると意図される。（Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133: 1335-2549 (1984); Jansen et al, Immunological Reviews 62: 185-216 (1982); and Vitetta et al, Science 238: 1098 (1987)を参照されたい）。
【０１１９】
好適なリンカーは、文献に記述されている。（例えば、MBS（M-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用を記述する、Ramakrishnan, S. et al, Cancer Res. 44:201-208 (1984)を参照されたい）。同様に、オリゴペプチドリンカーによって抗体に結合させたハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用を記述する米国特許第5,030,719号も参照されたい。特に好ましいリンカーは、（i）EDC（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノ-プロピル)カルボジイミド塩酸塩）；（ii）SMPT（4-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチル-α-(2-ピリジル-ジチオ)-トルエン）（Pierce Chem. Co., Cat. (21558G)）；（iii）SPDP（スクシンイミジル-6 [3-(2-ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ヘキサノエート（Pierce Chem. Co., カタログ番号21651G）；（iv）スルホ-LC-SPDP（スルホスクシンイミジル6 [3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ヘキサノエート（Pierce Chem. Co.カタログ番号2165-G）；および（v）EDCにコンジュゲートしたスルホ-NHS (N-ヒドロキシスルホ-スクシンイミド：Pierce Chem. Co., カタログ番号24510）を含む。
【０１２０】
上記のリンカーは、異なる属性を有する成分を含み、このため、異なる物理化学特性を有するコンジュゲートが得られる。例えば、アルキルカルボキシラートのスルホ-NHSエステルは、芳香族カルボキシラートのスルホ-NHSエステルより安定である。NHSエステル含有リンカーは、スルホNHSエステルより溶解度が低い。さらに、リンカーSMPTは、立体的に妨害されるジスルフィド結合を含み、安定性が増加したコンジュゲートを形成することができる。ジスルフィド結合はインビトロで切断されることから、ジスルフィド結合は一般的に、他の結合より安定性が低く、それによってコンジュゲートはより利用できにくくなる。特に、スルホ-NHSは、カルボジイミド結合の安定性を増強しうる。カルボジイミド結合（EDCなど）をスルホ-NHSと共に用いると、カルボジイミド結合反応単独より加水分解に対してより抵抗性であるエステルを形成する。
【０１２１】
本明細書において開示される抗体はまた、イムノリポソームとして調合することができる。抗体を含むリポソームは、Epstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980);ならびに米国特許第4,485,045号および第4,544,545号において記述される方法などの当技術分野において公知の方法によって調製される。血液循環時間が改良されたリポソームは、米国特許第5,013,556号において開示される。
【０１２２】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成物による逆相蒸発法によって作製されうる。所望の直径を有するリポソームを生じるために、既定の孔サイズのフィルターの中にリポソームを押し出す。本開示の抗体のFab'断片を、Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)に記述されるように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームにコンジュゲートさせることができる。
【０１２３】
抗CD19抗体の使用
本開示に従う治療実体の投与は、移動、送達、認容性の改善、およびその他を提供するために製剤に組み入れられる、適した担体、賦形剤、および他の作用物質と共に投与されると認識されるであろう。多数の適当な製剤を、全ての製薬化学者に公知である処方集：Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975))、特にその中のBlaug, Seymourによる第87章において見いだすことができる。これらの製剤には、例えば、粉剤、パスタ剤、軟膏、ゼリー、ロウ、油、脂質、脂質（陽イオンまたは陰イオン性）含有小胞（Lipofectin（商標）など）、DNAコンジュゲート、無水吸収パスタ剤、水中油型および油中水型乳剤、乳剤カーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物が挙げられる。前述の混合物はいずれも、製剤中の活性成分が、製剤によって不活化されず、製剤が投与経路と生理学的に適合性で認容性である限り、本開示に従う処置および治療において適切であろう。同様に、製薬化学者にとって周知である製剤、賦形剤、および担体に関連する追加の情報に関して、Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2): 1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)、ならびにその中での引用を参照されたい。
【０１２４】
本開示の抗体を含む本開示の治療製剤は、非限定的な例として、白血病、リンパ腫、乳がん、結腸がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、神経膠腫、肺および気管支がん、大腸がん、膵臓がん、食道がん、肝臓がん、膀胱がん、腎臓および腎盂腎がん、口腔がんおよび咽頭がん、子宮体がん、ならびに／またはメラノーマのようながんに関連する症状を治療または緩和するために使用される。本開示はまた、がんに関連する症状を治療または緩和する方法をも提供する。治療計画は、例えばがんを患っている（または発症リスクのある）ヒト患者のような対象を、標準法を用いて同定することによって実施される。
【０１２５】
全身性エリテマトーデス（SLE）、関節リウマチ（RA）、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、ワルデンシュトレーム高ガンマグロブリン血症、シェーグレン症候群、多発性硬化症（MS）、および／またはループス腎炎を非限定的な例として含む、例えばB細胞仲介の自己免疫疾患および／または炎症性疾患のような、自己免疫疾患および／または炎症性疾患に関連する症状を治療または緩和するために、CD19および第二の標的を認識する本開示の二重特異性抗体を含む本開示の治療製剤が使用される。
【０１２６】
処置の有効性は、特定の免疫関連障害を診断または処置するための任意の公知の方法に関連して決定される。免疫関連障害の1つまたは複数の症状が軽減されれば、抗体が臨床上の恩典を付与することを示している。
【０１２７】
所望の特異性を有する抗体をスクリーニングする方法は、酵素免疫測定法（ELISA）および当技術分野において公知の他の免疫学媒介技術を含むがこれらに限定されるわけではない。
【０１２８】
CD19、腫瘍関連抗原、もしくは他の抗原（またはその断片）などの標的に対する抗体が、例えば適切な生理的試料中のこれらの標的のレベルを測定するために用いるために、診断法において用いるために、タンパク質のイメージングにおいて用いるために、およびその他のために、これらの標的の局在および／または定量に関連する当技術分野において公知の方法において用いられうる。所定の態様において、これらの標的のいずれかに対して特異的な抗体、または抗体由来抗原結合ドメインを含むその誘導体、断片、アナログ、もしくはホモログが、薬理活性化合物（本明細書において以降「治療物質」と呼ぶ）として利用される。
【０１２９】
本開示の抗体は、免疫アフィニティクロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準的な技術を用いて特定の標的を単離するために用いられうる。本開示の抗体（またはその断片）を診断的に用いて、臨床試験技法の一部として組織中のタンパク質レベルをモニターする、例えば所定の処置治療計画の効能を決定することができる。抗体を検出可能な物質に連結させる（すなわち、物理的に連結させる）ことによって、検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子群、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、および放射活性材料が挙げられる。適した酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適した補欠分子群の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適した蛍光材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリスリンが挙げらる；発光材料の例には、ルミノールが挙げられる；生物発光材料の例にはルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる；ならびに適した放射活性材料には125I、131I、35S、または3Hが挙げられる。
【０１３０】
ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、および完全ヒト型抗体を含む本開示の抗体は、治療物質として用いられうる。そのような物質は一般的に、対象における所定の標的の異常な発現または活性化に関連する疾患または病態を処置または予防するために用いられるであろう。抗体調製物、好ましくはその標的抗原に対して高い特異性および高い親和性を有する調製物を対象に投与すると、一般的に、標的とのその結合により効果を有するであろう。抗体を投与することにより、標的のシグナル伝達機能が排除、阻害、または妨害されうる。抗体を投与することにより、それが本来結合する内因性のリガンドと標的との結合が排除、または阻害、または妨害されうる。
【０１３１】
本開示の抗体の治療的有効量は一般的に、治療目的を達成するために必要な量に関する。先に述べたように、これは、ある例において、標的の機能を妨害する、抗体とその標的抗原との結合相互作用でありうる。投与するために必要な量は、さらにその特異的抗原に対する抗体の結合親和性に依存して、同様に、投与された抗体が、それが投与される対象の他の自由容量（free volume other subject）から枯渇する速度に依存するであろう。本開示の抗体または抗体断片の治療的に有効な投与の一般的範囲は、非制限的な例として、約0.1 mg/kg体重から約50 mg/kg体重でありうる。一般的な投与回数は、例えば1日2回から1週間に1回の範囲でありうる。
【０１３２】
本開示の抗体またはその断片は、薬学的組成物の形状で様々な疾患および障害の治療のために投与されうる。そのような組成物の調製に関係する原理および検討、ならびに成分の選択における指針は、例えばRemington : The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa. : 1995; Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; and Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New Yorkにおいて提供される。
【０１３３】
抗体断片を用いる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害性断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列の結合能を保持するペプチド分子を設計することができる。そのようなペプチドは、化学合成することができ、および／または組み換えDNA技術によって産生することができる（例えば、Marasco et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照されたい）。製剤はまた、処置される特定の適応にとって必要な1つより多くの活性化合物、好ましくは互いに有害な影響を及ぼさない補足的活性を有する化合物を含有することができる。またはもしくは加えて、組成物は、例えば細胞傷害物質、サイトカイン、化学療法剤、または増殖阻害剤などのその機能を増強する作用物質を含むことができる。そのような分子は、ふさわしくは、意図される目的にとって有効である量で併用して存在する。
【０１３４】
活性成分はまた、例えばコアセルベーション技術によってまたは界面重合化によって調製されたマイクロカプセル、例えばコロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）において、またはマクロエマルジョンにおいて、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに捕捉することができる。
【０１３５】
インビボ投与のために用いられる製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過メンブレンを通して濾過することによって容易に達成される。
【０１３６】
徐放性製剤を調製することができる。徐放性調製物の適した例には、マトリクスが、成型された製品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形状である、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが挙げられる。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号）、L-グルタミン酸とγエチル-L-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、LUPRON DEPOT（商標）などの分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー（乳酸-グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドで構成される注射可能なミクロスフェア）、およびポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン酢酸ビニルおよび乳酸-グリコール酸などのポリマーは、100日間のあいだ分子の放出を可能にするが、あるハイドロゲルは、タンパク質をより短い期間放出する。
【０１３７】
本開示の抗体は、試料中の所与の標的（またはそのタンパク質断片）の存在を検出するための作用物質として用いることができる。いくつかの態様において、抗体は、検出可能な標識を含む。抗体は、ポリクローナル抗体であるか、またはより好ましくはモノクローナル抗体である。無傷の抗体またはその断片（例えば、Fab、scFv、またはF(ab)2）が用いられる。プローブまたは抗体に関して「標識された」という用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結させる）ことによるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接標識される別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識を包含すると意図される。間接的標識の例には、蛍光標識二次抗体を用いる一次抗体の検出、および蛍光標識ストレプトアビジンによって検出することができるようにビオチンによるDNAプローブの末端標識が挙げられる。「生物試料」という用語は、対象から単離された組織、細胞、および生体液、ならびに対象内に存在する組織、細胞、および液体を含むと意図される。それゆえ、血液、および血清、血漿、またはリンパを含む血液の分画または成分は「生物試料」という用語の用法内に含まれる。すなわち、本開示の検出法を用いて、インビトロならびにインビボで生物試料中の対象mRNA、タンパク質、またはゲノムDNAを検出することができる。例えば、分析対象mRNAを検出するためのインビトロ技術には、ノザンハイブリダイゼーションおよびインサイチューハイブリダイゼーションが挙げられる。分析対象タンパク質を検出するためのインビトロ技術には、酵素免疫測定法（ELISA）、ウェスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光が挙げられる。分析対象ゲノムDNAを検出するためのインビトロ技術にはサザンハイブリダイゼーションが挙げられる。イムノアッセイを行うための技法は、例えば"ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Immunoassay", E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; and "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985において記述される。さらに、分析対象タンパク質を検出するためのインビボ技術は、標識した抗分析対象タンパク質抗体を対象に導入する段階を含む。例えば、対象におけるその存在および位置を標準的な撮像技術によって検出することができる放射活性マーカーによって、抗体を標識することができる。
【０１３８】
薬学的組成物
本開示の抗体（本明細書において「活性化合物」と呼ばれる）、ならびにその誘導体、断片、アナログ、および相同体は、投与にとって適した薬学的組成物に組み入れることができる。そのような組成物は典型的に、抗体と、薬学的に許容される担体とを含む。本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与と適合性の任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、ならびにその他を含むと意図される。適した担体は、参照により本明細書に組み入れられる、当技術分野において標準的な参考テキストであるRemington's Pharmaceutical Sciences最新版に記述される。そのような担体または希釈剤の好ましい例には、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース液、および5％ヒト血清アルブミンが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。リポソームおよび固定油などの非水性媒体も同様に用いられうる。薬学的活性物質のためにそのような媒体および作用物質を用いることは、当技術分野において周知である。いかなる通常の媒体または作用物質も、活性化合物と不適合性である場合を除き、組成物におけるその使用が企図される。補助活性化合物も同様に、組成物に組み入れることができる。
【０１３９】
本開示の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように調合される。投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（例えば、表面）、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内、または皮下適用のために用いられる溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる：注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（EDTA）などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性調節剤。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基によって調節することができる。非経口調製物は、ガラスもしくはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または多用量バイアルに封入することができる。
【０１４０】
注射での使用にとって適した薬学的組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射可能溶液または分散液の即時調製用滅菌粉末を含む。静脈内投与の場合、適した担体には、生理食塩液、静菌水、Cremophor EL（商標）（BASF, Parsippany, N.J.）、またはリン酸緩衝生理食塩液（PBS）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、無菌的でなければならず、容易なシリンジ操作性が存在する程度に流動性であるべきである。組成物は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、およびその他）、およびその適した混合物を含む溶媒または分散媒体でありうる。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングを用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサル、およびその他によって達成することができる。多くの場合において、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましいであろう。注射可能な組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。
【０１４１】
滅菌注射用溶液は、活性化合物の必要量を、適切な溶媒において、先に列挙した成分の1つまたは組み合わせと共に組み入れて、必要に応じてその後濾過滅菌することによって調製することができる。一般的に、分散剤は、基本分散培地と、先に列挙した必要な他の成分とを含む滅菌媒体に活性化合物を組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製法は、予め濾過滅菌したその溶液から、活性成分と任意の追加の所望の成分とを含む粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１４２】
経口組成物は一般的に、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらを、ゼラチンカプセルに封入することができ、または錠剤に圧縮することができる。経口治療的投与の目的に関して、活性化合物を賦形剤と共に組み入れて、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の剤形で用いることができる。経口組成物はまた、液体担体中の化合物が、口に適用される、すすいで吐き出される、または飲み込まれる、マウスウォッシュとして用いるための液体担体を用いて調製することができる。薬学的に適合性の結合剤および／または補助材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤およびその他は、以下の成分または類似の性質の化合物のいずれかを含むことができる：血漿セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたは乳糖などの賦形剤；アルギン酸、Primogel、またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはSterotesなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの滑剤；蔗糖またはサッカリンなどの甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料などの香味料。
【０１４３】
吸入投与の場合、化合物は、適した促進剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからのエアロゾルスプレーの剤形で送達される。
【０１４４】
全身投与も、経粘膜または経皮手段によって行うことができる。経粘膜または経皮投与の場合、浸透される障壁にとって適切な浸透剤を製剤に用いる。そのような浸透剤は一般的に当技術分野において公知であり、例えば経粘膜投与の場合、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、点鼻スプレーまたは坐剤の使用を通して達成することができる。経皮投与の場合、活性化合物は、一般的に当技術分野において公知である軟膏、軟膏剤（salve）、ゲル、またはクリームに調合される。
【０１４５】
化合物はまた、直腸送達のために坐剤（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの通常の坐剤基剤と共に）または浣腸の剤形で調製することができる。
【０１４６】
1つの態様において、活性化合物は、インプラントおよび微小封入送達システムを含む、徐放性製剤などの、化合物が体から急速に消失しないよう保護する担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生体分解性で生体適合性のポリマーを用いることができる。そのような製剤を調製する方法は、当業者に明らかであろう。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.からの購入によっても得ることができる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体によって感染細胞を標的とするリポソームを含む）もまた、薬学的に許容される担体として用いることができる。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号に記述されるように当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【０１４７】
投与の容易さおよび用量の均一性のために、単位投与剤形で経口または非経口組成物を調合することが特に有利である。本明細書において用いられる単位投与剤形は、各単位が、必要な薬学的担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された既定量の活性化合物を含む、処置される対象にとって単位用量として適した物理的に個別の単位を意味する。本開示の単位投与剤形の仕様は、活性化合物の独自の特徴および達成される特定の治療効果、ならびに個体の処置のためにそのような活性化合物を作る技術分野における固有の制限によって左右され、それらに直接依存する。
【０１４８】
薬学的組成物は、投与に関する説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。
【０１４９】
本開示を、以下の実施例においてさらに説明するが、これらは特許請求の範囲に記述される本開示の範囲を制限しない。
【実施例】
【０１５０】
実施例1：抗CD19抗体のリンパ球結合解析
本開示の様々な抗CD19抗体の、様々なヒトBリンパ球細胞株に結合する能力を評価した。詳細には、ヒトIgG1 5F5、7F11、9G8、F6、7F1、および10D8抗CD19抗体を、（i）6種類のヒトBリンパ球細胞株Raji、Ramos、Nalm6、Su-DHL6、Su-DHL4、およびMec2、（ii）CD19発現抑制B細胞株Raji siRNA、ならびに負の対照細胞株（Jurkat）に結合するその能力について評価した。全てのインキュベーションを4℃のFACSバッファー（PBS、BSA 2％）において調製した。B細胞上のFcレセプターは10％マウス血清を用いてブロックした。4種類の用量のhIgG1について調べた：10、1、0.1、および0.01μg/mL。細胞表面の結合hIgG1はマウス抗ヒトIgG Fc-PE mAbを用いて検出した。本試験の結果を図1A〜1Fに示す。
【０１５１】
図1A〜1Fに示すように、試験した抗CD19抗体の全てが6種類の異なるBリンパ球の全てに結合するが、プロファイルおよび／または親和性は異なる。例えば、7F1および10D8はRaji細胞よりNalm6細胞によりよく結合する一方、他の抗体は反対の結合プロファイルを示す。試験した全ての抗体はCD19に対して明らかに特異的であり、CD19発現抑制細胞株Raji siRNAではCD19に対する結合能が消える。どの細胞株も負の対照細胞株には結合しなかった。
【０１５２】
実施例2：抗CD19抗体の交差反応性解析
抗CD19抗体の、ヒトCD19および／またはカニクイザルCD19に結合する能力を評価した。
【０１５３】
詳細には、ヒトIgG1 5F5、7F11、9G8、F6、7F1、および10D8抗CD19抗体を、カニクイザルCD19をトランスフェクトしたCHO細胞株および負の対照細胞株（CHO）に結合するその能力について評価した。全てのインキュベーションは4℃のFACSバッファー（PBS、BSA 2％）において調製した。B細胞上のFcレセプターは10％マウス血清を用いてブロックした。4種類の用量のhIgG1について調べた：10、1、0.1、および0.01μg/mL。本試験の結果を図2に示す。
【０１５４】
9G8抗CD19抗体は、明らかにカニクイザルCD19に対して交差反応性である。図2におけるFACSオーバーレイに認められるように、抗CD19抗体5F5、7F11、およびF6もまた、カニクイザルCD19に対してわずかに交差反応性である。抗CD19抗体7F1および10D8は、トランスフェクトされたCHO cynoCD19細胞には結合しなかった。
【０１５５】
実施例3：抗CD19抗体の末梢血単核細胞（PBMC）結合解析
本開示の様々な抗CD19抗体の様々な末梢血単核細胞（PBMC）に結合する能力。クエン酸バッファー中の凍結アリコートからのヒトおよびカニクイザルのPBMCについて調べた。以下のヒトIgG1抗CD19抗体を、30μg/mLおよび3μg/mLの2種類の用量で試験した：5F5、7F11、9G8、F6、10D8、7F1、正の対照としてMdx、および負の対照としてNI-0801と呼ばれる抗IP-10抗体。ヒトおよびカニクイザル種の両方に対して交差反応性の抗CD20-PEモノクローナル抗体（mAb）、抗CD14-FITC mAb、および抗CD3-PerCP mAbを用いてPBMCを標識した。マウス抗ヒトIgG Fc-APC mAbを用いて細胞表面に結合したhIgG1を検出した。抗CD20 mAbを用いてBリンパ球集団について、抗CD3を用いてTリンパ球集団について、および抗CD14を用いて単球集団についてのFACSゲーティングを行った。これらの試験の結果を図3A〜3Fに示す。
【０１５６】
図3Eに示すように、試験した抗CD19抗体のいずれも、30μg/mLという高用量ではヒトPBMC CD3+には結合しなかった。試験した抗体の全てが、単球に対して、細胞表面Fcレセプターによって結合する、負の対照NI-0801について認められるものと同じような結合レベルを示した。図3Aおよび3Bに示すように、試験した抗CD19抗体の全てが、ヒトPBMC CD20+に結合し、3μg/mLで親和性のわずかな差異が認められる。図3Cおよび3Dは、抗CD19抗体全ての交差反応性を示す。結合能はカニクイザルPBMCよりもヒトPBMCに対して10倍まで高く、正の対照Mdxについて認められるものと同程度である。
【０１５７】
他の態様
本発明をその詳細な説明と関連して説明したが、前述の説明は例証を意図するものであり、添付の請求項の範囲によって定義付けられる本発明の範囲を限定することを意図しない。他の局面、利点、および改変は以下の請求項の範囲内にある。
【図１Ａ】
2020503256.tif 000013
【図１Ｂ】
2020503256.tif 000014
【図１Ｃ】
2020503256.tif 000015
【図１Ｄ】
2020503256.tif 000016
【図１Ｅ】
2020503256.tif 000017
【図１Ｆ】
2020503256.tif 000018
【図２】
2020503256.tif 000019
【図３】
2020503256.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月18日(2019.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020503256000001.app
【国際調査報告】
2020503256.tif 000021
2020503256.tif 000022
2020503256.tif 000023