(57)【要約】本開示は、最適に製造されたストラドマーと呼ばれる生物学的に活性なタンパク質の生成のための最適化方法に関する。本開示は、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染性疾患を含む、疾患および状態の治療において有用な組成物および方法をさらに提供する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物であって、前記ＧＬ−２０４５組成物のホモ二量体画分が、前記組成物全体の２０％未満を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物。
【請求項２】
組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物であって、前記ＧＬ−２０４５組成物の最高次の多量体画分が、前記組成物全体の少なくとも約３０％を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物。
【請求項３】
前記ホモ二量体の二量体画分が、前記組成物全体の約７％〜約１２％を構成する、請求項１または２に記載の組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物。
【請求項４】
前記ホモ二量体の三量体画分が、前記組成物全体の約６％〜約１１％を構成する、請求項１または２に記載の組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物。
【請求項５】
前記ホモ二量体の四量体画分が、前記組成物全体の約１０％〜約１５％を構成する、請求項１または２に記載の組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物。
【請求項６】
前記ホモ二量体の五量体画分が、前記組成物全体の約６％〜約１０％を構成する、請求項１または２に記載の組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物。
【請求項７】
前記ホモ二量体の六量体画分が、前記組成物全体の約１０％〜約１４％を構成する、請求項１または２に記載の組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物。
【請求項８】
前記ホモ二量体〜６マーの二量体画分が、前記組成物全体の合計約４０〜６０％を構成する、請求項１または２に記載の組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物。
【請求項９】
組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物であって、
ａ）ホモ二量体画分が、前記組成物全体の約２０％未満を構成し、
ｂ）最高次の多量体画分が、前記組成物全体の少なくとも約３０％を構成し、
ｃ）前記ホモ二量体の二量体画分が、前記組成物全体の約７％〜約１１％を構成し、
ｄ）前記ホモ二量体の三量体画分が、前記組成物全体の約６％〜約１１％を構成し、
ｅ）前記ホモ二量体の四量体画分が、前記組成物全体の１０％〜約１５％を構成し、
ｆ）前記ホモ二量体の五量体画分が、前記組成物全体の約６％〜約１０％を構成し、
ｇ）前記ホモ二量体の六量体画分が、前記組成物全体の約１０％〜約１４％を構成し、
ｈ）前記ホモ二量体の前記二量体〜前記ホモ二量体の前記六量体画分が、前記組成物全体の約４０％〜約６０％を構成し、
ｉ）前記ホモ二量体の前記三量体〜前記ホモ二量体の前記六量体画分が、前記組成物全体の約３２％〜約５０％を構成し、
ｊ）前記ホモ二量体の前記四量体〜前記ホモ二量体の前記六量体画分が、約２６％〜約３９％を構成し、
ｋ）前記ホモ二量体の前記五量体〜前記ホモ二量体の前記六量体画分が、前記組成物全体の約１８％〜約２３％を構成し、または
ｌ）（ａ）〜（ｋ）の任意の組み合わせである、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物。
【請求項１０】
組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物であって、
ａ）ホモ二量体画分が、前記組成物全体の約２０％未満を構成し、
ｂ）最高次の多量体画分が、前記組成物全体の少なくとも約３０％を構成し、
ｃ）前記ホモ二量体の二量体画分が、前記組成物全体の約７％〜約１１％を構成し、
ｄ）前記ホモ二量体の三量体画分が、前記組成物全体の約６％〜約１１％を構成し、
ｅ）前記ホモ二量体の四量体画分が、前記組成物全体の１０％〜約１５％を構成し、
ｆ）前記ホモ二量体の五量体画分が、前記組成物全体の約６％〜約１０％を構成し、
ｇ）前記ホモ二量体の六量体画分が、前記組成物全体の約１０％〜約１４％を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物。
【請求項１１】
組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物であって、
ａ）ホモ二量体画分が、前記組成物全体の約２０％未満を構成し、
ｂ）最高次の多量体画分が、前記組成物全体の少なくとも約３０％を構成し、
ｈ）前記ホモ二量体の前記二量体〜前記ホモ二量体の前記六量体画分が、前記組成物全体の約４０％〜約６０％を構成し、
ｉ）前記ホモ二量体の前記三量体〜前記ホモ二量体の前記六量体画分が、前記組成物全体の約３２％〜約５０％を構成し、
ｊ）前記ホモ二量体の四量体〜前記ホモ二量体の前記六量体画分が、前記組成物全体の約２６％〜約３９％を構成し、
ｋ）前記ホモ二量体の五量体〜前記ホモ二量体の前記六量体画分が、前記組成物全体の約１８％〜約２３％を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の前記組み換え生成された精製ＧＬ−２０４５を用いて、治療または予防が必要な対象における炎症性、自己免疫、または感染性疾患または障害を治療または予防する方法。
【請求項１３】
前記疾患または障害が、特発性血小板減少性紫斑病、慢性炎症性多発ニューロパシー、多巣性運動ニューロパシー、重症筋無力症、臓器移植、およびリウマチ性関節炎から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＧＬ−２０４５が、静脈内に、皮下に、経口で、腹腔内に、舌下に、口腔内に、経皮的に、皮下移植を介して、または筋肉内に投与される、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
ＧＬ−２０４５を生成するための方法であって、
（ａ）ＧＬ−２０４５をコードする発現ベクターで安定的にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、前記ＣＨＯ細胞が約５００万〜約３０００万細胞／ｍＬの細胞密度に到達するまで、３７℃±１℃で培養することと、
（ｂ）成長温度を３７℃±１℃から３２．５℃±１℃にシフトさせることと、
（ｃ）前記培地からＧＬ−２０４５を採取することと、を含む、方法。
【請求項１６】
前記細胞が、前記成長温度のシフト前に、約１０００万〜約２５００万細胞／ｍＬの密度まで成長される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、前記成長温度のシフト前に、約１０００万〜約１５００万細胞／ｍＬの密度まで成長される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、前記成長温度のシフト前に、約１５００万〜約２０００万細胞／ｍＬの密度まで成長される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記培養が、ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ基礎培地中で行われる、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＣＨＯ細胞が、培養中に、ＡｃｔｉＣＨＯ餌料ＡおよびＡｃｔｉＣＨＯ餌料Ｂを給餌される、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＨＯ細胞が、１日おきに給餌される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＧＬ−２０４５をコードする発現ベクターが、配列番号１のリーダーペプチドを含む、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＧＬ−２０４５をコードする発現ベクターが、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース認識配列をさらに含み、かつｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするベクターでトランスフェクトされる、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＧＬ−２０４５をコードする発現ベクターが、２０個未満のゲノム挿入を生じる、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の方法によって作製された、組み換え生成されたＧＬ−２０４５。
【請求項２６】
ＧＬ−２０４５発現カセットを含む、ＧＬ−２０４５をコードする発現ベクターであって、前記ＧＬ−２０４５発現カセットが、隣接したｐｉｇｇｙＢａｃ最小逆方向反復要素である、ＧＬ−２０４５をコードする発現ベクター。
【請求項２７】
ＧＬ−２０４５を生成するための方法であって、
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を請求項２６に記載の発現ベクターでトランスフェクトすることと、
（ｂ）３７℃±１°の成長温度で、ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ培地を用いて生物反応器中で（ａ）からの前記ＣＨＯ細胞を培養することと、
（ｃ）前記培養物が約１０００万〜約１５００万細胞／ｍＬの細胞密度に到達するまで、３７℃±１℃の成長温度で、Ａｃｔｉ  ＣＨＯ餌料ＡおよびＡｃｔｉ  ＣＨＯ餌料Ｂを（ｂ）からの培養物に毎日給餌することと、
（ｄ）前記成長温度を３７℃±１℃から３２．５℃±１℃にシフトさせることと、
（ｅ）前記培地からＧＬ−２０４５を採取することと、を含み、前記方法が、２１日目に＞８０％の細胞生存率、および＞９，０００ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質力価であって、そのうちＧＬ−２０４５の＞７０％が多量体として存在する、最終タンパク質力価を生じ、前記多量体の＞３０％がさらに高次の多量体ＧＬ−２０４５である、方法。
【請求項２８】
前記細胞生存率が、培養の１８日目に９５％を超える、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
多量体の割合が、８０％を超える、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法によって生成されたＧＬ−２０４５を精製する方法であって、
（ａ）親和性クロマトグラフィによって前記培養上清からＧＬ−２０４５を精製することと、
（ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、および疎水性相互作用クロマトグラフィのうちの１つ以上によってＧＬ−２０４５を研磨することと、を含む、方法。
【請求項３１】
前記親和性クロマトグラフィが、タンパク質Ａカラムを使用する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記タンパク質Ａカラムが、ＮａＯＨ耐性カラムである、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記タンパク質Ａカラムが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｕｅ樹脂である、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
親和性クロマトグラフィによる精製が、３つの異なる洗浄緩衝液のうちの１つを利用して、精製状態を最適化することを含む、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
親和性クロマトグラフィによる精製が、前記親和性クロマトグラフィカラムからＧＬ−２０４５を溶出させることを含む、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ＧＬ−２０４５の溶出が、ｐＨ勾配を有する溶出を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＧＬ−２０４５の溶出が、ｐＨ勾配を有しない溶出を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記親和性クロマトグラフィカラムが再生されて、結合されたＧＬ−２０４５を除去する、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記親和性クロマトグラフィカラムが、製造業者によって示唆されるよりも頻繁に再生される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記親和性クロマトグラフィカラムが、各精製周期の前に再生される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記親和性クロマトグラフィカラムが、０．５ＭのＮａＯＨ緩衝液を用いて再生される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
ＧＬ−２０４５の研磨が、クロマトグラフィを通した陰イオン交換流を含む、請求項３０〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
クロマトグラフィを通した陰イオン交換流が、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ速流カラムを使用することを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＧＬ−２０４５の研磨が、陽イオン交換クロマトグラフィを含む、請求項３０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
陽イオン交換クロマトグラフィが、ＰＯＲＯＳ  ＸＳカラムを使用することを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
陽イオン交換クロマトグラフィが、酢酸ナトリウム溶出緩衝液を使用することを含む、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記溶出緩衝液が、３６．５〜３８．５％の１ＭのＮａＣｌ緩衝液をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＧＬ−２０４５の研磨が、疎水性相互作用クロマトグラフィを含む、請求項３０〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
疎水性相互作用クロマトグラフィが、ブチルＦＦ樹脂を使用することを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
疎水性相互作用クロマトグラフィが、フェニルＨＰ樹脂を使用することを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記カラムが、前記ＧＬ−２０４５ホモ二量体の単離を生じる、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５２】
疎水性相互作用クロマトグラフィが、オクチルＦＦ樹脂を使用することを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記カラムが、ＧＬ−２０４５の非秩序凝集体の除去を生じる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ＧＬ−２０４５を精製するための方法であって、
（ａ）タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィによって培養上清からＧＬ−２０４５を精製することを含み、前記タンパク質Ａカラムが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ培地などの耐アルカリ性培地を使用し、前記精製が少なくとも２つの洗浄周期で行われ、定置洗浄（ＣＩＰ）手順が、０．５ＭのＮａＯＨ緩衝液などの高ＮａＯＨ再生工程を用いた各精製ランの後に行われる、ＧＬ−２０４５を精製するための方法。
【請求項５５】
ＧＬ−２０４５を研磨するための方法であって、
（ａ）陽イオン交換クロマトグラフィによってＧＬ−２０４５を研磨することであって、前記陽イオン交換カラムが、ＰＯＲＯＳ  ＸＳなどの高能力の高解像度樹脂を含有し、前記溶出緩衝液が、３６．５〜３８．５％の１ＭのＮａＣｌ緩衝液から構成される酢酸ナトリウム緩衝液である、陽イオン交換クロマトグラフィによってＧＬ−２０４５を研磨することと、
（ｂ）陰イオン交換クロマトグラフィによってＧＬ−２０４５を研磨することであって、前記陰イオン交換カラムが、高い化学的安定性を有し、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ速流培地のような定置洗浄および衛生プロトコルを可能にする、強陰イオン交換培地を含有する、陰イオン交換クロマトグラフィによってＧＬ−２０４５を研磨することと、
（ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィによってＧＬ−２０４５を研磨することであって、前記疎水性相互作用培地が、ブチルＦＦ、フェニルＨＰ、またはオクチルＦＦ樹脂であり、かつ研磨に加えて、ＧＬ−２０４５の特定の画分を単離または除去するために選択される、疎水性相互作用クロマトグラフィによってＧＬ−２０４５を研磨することと、を含む、ＧＬ−２０４５を研磨するための方法。
【請求項５６】
前記ＧＬ−２０４５の最終タンパク質力価が、＞４ｇ／Ｌである、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＧＬ−２０４５の最終タンパク質組成物が、＞７０％の多量体である、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記多量体が、さらに高次の多量体である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法によって作製された、組み換え生成された精製ＧＬ−２０４５。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１６年１２月９日に出願された、米国仮特許出願第６２／４３２，４０２号に対する優先権を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
電子的に提出されるテキストファイルの記載
ここで電子的に提出されるテキストファイルの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。コンピュータ読み取り可能なフォーマットコピーの配列一覧（ファイル名：ＧＬＩＫ＿０１７＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ；記録日：２０１７年１２月８日；ファイルサイズ、１５ｋｂ）。
【０００３】
本発明は、概して、免疫学、自己免疫、炎症、および腫瘍免疫学の分野に関する。より具体的には、本発明は、ＧＬ−２０４５を製造する最適化方法に関する。本発明はまた、そのように最適に製造されたＧＬ−２０４５を含む新規組成物、ならびにＧＬ−２０４５組成物を使用する方法に関する。本発明はさらに、自己免疫疾患および炎症性疾患などの病的状態の治療または予防に関する。
【背景技術】
【０００４】
プールヒト静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）は、１９５０年代前半以降の免疫不全症の治療に、その後の数十年では自己免疫疾患および炎症性疾患の治療に使用されている。ＩＶＩＧは、補体Ｃ１ｑおよびＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）へのＩＶＩＧ凝集体の結合、ならびにＮＫ細胞（例えば、ＦｃγＲＩＩＩａ）、マクロファージ（例えば、ＦｃγＲＩＩａ）、Ｂ細胞（例えば、ＦｃγＲＩＩｂ）、単球、および樹状細胞を含む単球由来細胞などの免疫細胞に対するこれらの受容体の架橋を含む、いくつかの機構を介して、寛容原性免疫効果を媒介する。ＩＶＩＧは、少量かつ不定量の多量体免疫グロブリン、ＩｇＡまたはＩｇＭを含む、典型的には９０％超の未変性ＩｇＧを含有するプールヒト血漿から製造される、無菌状態の精製免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）生成物の製剤である（Ｒｕｔｔｅｒ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ａｃａｄ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，２００１，Ｊｕｎｅ；４４（６）：１０１０−１０２４）。
【０００５】
実質的な公開データは、ｈＩＶＩＧの小さな凝集ＩｇＧ画分、具体的にはこれらの凝集体のＦｃ部分が、病的免疫複合体によって媒介された特定の疾患の治療において過度に効果的であることを示唆している。微量（１〜５％）のＩｇＧが、ＩＶＩＧ内に多量体の形態として存在し、ＩｇＧ二量体が、ｈＩＶＩＧの５〜１５％を構成し得ることが観察されている。ＩＶＩＧ凝集体に類似する、Ｆｃ受容体および補体成分Ｃ１ｑを貪欲に結合させる組み換え生成されたＦｃ多量体を使用するＩＶＩＧ療法に対する代替案が記載されている（米国特許出願公開第２０１０／０２３９６３３号、同第２０１３／０１５６７６５号、同第２０１５／０２１８２３６号、および国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／１３２３６４号を参照のこと）。
【０００６】
１つのそのようなＦｃ多量体、ＧＬ−２０４５は、以前に開示されている（米国特許出願公開第２０１３／０１５６７６５号）。ＧＬ−２０４５は、ＩＶＩＧの組み換え模倣薬である多量体化汎用ストラドマーである。ＧＬ−２０４５は、免疫グロブリンＩｇＧ１  Ｆｃが結合するリガンドのうちの大部分または全てを結合させる。さらに、ＧＬ−２０４５は、全ての標準受容体に、かつ補体Ｃ１ｑに、高い親和性および結合力で結合し、ＩＶＩＧと比較して、１０〜１，０００倍大きいインビトロ効能を有する。加えて、ＧＬ−２０４５、またはそのマウス等価物は、コラーゲン誘導関節炎、実験的自己免疫性神経障害、特発性血小板減少性紫斑病、および実験的自己免疫性重症筋無力症を含む、自己免疫疾患の多数の動物モデルにおいて効果的である。このように、ＧＬ−２０４５はまた、特発性血小板減少性紫斑病、慢性炎症性多発ニューロパシー、多巣性運動ニューロパシー、重症筋無力症、臓器移植、およびリウマチ性関節炎を含むがこれらに限定されない、広範囲の自己免疫疾患の治療において潜在的な臨床有用性を有する。
【０００７】
ＧＬ−２０４５の効力および効能においてＩＶＩＧを上回る利点に加えて、ＧＬ−２０４５は、製造プロセスにおけるいくつかの利点を実証している。ＩＶＩＧは、プールヒト血液製剤であり、これは、数万人のドナーの血液から得られ、次にそれらの血清を一緒に混合し、続いて精製して、ウィルスおよび他の感染体、ならびに凝集ＩｇＧを除去することを意味する。このように、入手および供給が制限されており、かつ生成費用が高い。加えて、大量のＩＶＩＧ間に有意な程度のばらつきがある。反対に、ＧＬ−２０４５は、組み換え生成されるため、供給および生成費用の困難をなくすと同時に、製造プロセスにわたってより良好な制御を提供する。
【０００８】
ＧＬ−２０４５ホモ二量体は、Ｆｃガンマ受容体および補体Ｃ１ｑを含むＦｃリガンドに対して、親和性を有し、かつ実質的な結合力を有さずに結合する。ＧＬ−２０４５ホモ二量体はまた、結合力により標準受容体に結合することができるさらに高次の多量体を天然に形成する。ＧＬ−２０４５ホモ二量体は、ＩＶＩＧの多量体画分の増強された効能を模倣するＧＬ−２０４５のこれらのさらに高次の多量体である。しかしながら、標準的な細胞培養条件は、可変的な細胞生存率のレベル、多量体されたタンパク質の程度、およびタンパク質力価を生み出す。したがって、定義された多量体パターンを生じるＧＬ−２０４５、および特に、細胞生存率およびタンパク質力価を最適化しながら、さらに高次の多量体の百分率の増加を生じるＧＬ−２０４５を製造する方法が当該技術分野において必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／０２３９６３３号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１３／０１５６７６５号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１５／０２１８２３６号明細書
【特許文献４】国際公開第２０１５／１３２３６４号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｒｕｔｔｅｒ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ａｃａｄ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，２００１，Ｊｕｎｅ；４４（６）：１０１０−１０２４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、標準的な製造技術に対して、細胞生存率の改善、高タンパク質力価の改善、およびさらに高次の多量体の百分率の驚くべき実質的な増加の３つ全てを提供する。したがって、この最適化された製造方法は、非最適に製造されたＧＬ−２０４５組成物と比較して、炎症性疾患を治療するための増強された効能を有する最適に製造されたＧＬ−２０４５組成物を提供する。ＧＬ−２０４５の最適化された製造は、最適化された上流製造方法を含み、およびいくつかの実施形態では、最適化された下流方法を含む。最適化された上流製造方法は、ａ）高タンパク質力価を発生させ、ｂ）高細胞生存率を維持して細胞片残屑を最小にし、かつｃ）ＧＬ−２０４５の機能性に必須であるホモ二量体の高秩序多量体、および所望に応じて、ホモ二量体の両方を保持する。最適化された下流製造方法は、具体的にはＧＬ−２０４５の選択された多量体プロファイルを維持するために用いられる様々な精製技術を含む。したがって、いくつかの実施形態では、定義された多量体プロファイルを有するＧＬ−２０４５組成物を本明細書に提供する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５をコードする発現ベクターで安定的にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、ＣＨＯ細胞が約５００万〜約３０００万細胞／ｍＬの細胞密度に到達するまで、３７℃±１℃で培養することと、成長温度を３７℃±１℃〜３２．５℃±１℃にシフトさせることと、培地からＧＬ−２０４５を採取することと、を含む、ＧＬ−２０４５を生成するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、成長温度のシフト前に、約１０００万〜約２５００万細胞／ｍＬの密度まで成長される。いくつかの実施形態では、細胞は、成長温度のシフト前に、約１０００万〜約１５００万細胞／ｍＬの密度まで成長される。いくつかの実施形態では、細胞は、成長温度のシフト前に、約１５００万〜約２０００万細胞／ｍＬの密度まで成長される。いくつかの実施形態では、生物反応器培養の約３日目の３７℃±１℃〜３４℃±１℃へのシフトと、約７日目の３４℃±１℃〜３１℃±１℃への第２の温度シフトとを伴う、二重温度シフトを用いる。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞は、ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ基礎培地中に培養される。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞は、培養中に、ＡｃｔｉＣＨＯ餌料ＡおよびＡｃｔｉＣＨＯ餌料Ｂを給餌される。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞は、１日おきに給餌される。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５をコードする発現ベクターは、配列番号１のリーダーペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５をコードする発現ベクターは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース認識配列をさらに含み、かつｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするベクターでトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５をコードする発現ベクターは、２０個未満のゲノム挿入を生じる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって作製された組み換え生成されたＧＬ−２０４５を提供する。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５発現カセットを含む、ＧＬ−２０４５をコードする発現ベクターであって、ＧＬ−２０４５発現カセットが、ｐｉｇｇｙＢａｃ最小逆方向反復要素によって隣接されている、発現ベクターを提供する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５を生成するための方法であって、ＣＨＯ細胞を本明細書に記載される発現ベクターでトランスフェクトすることと、３７℃±１°の成長温度で、ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ培地を用いて生物反応器中でＣＨＯ細胞を培養することと、培養物が約１０００万〜約１５００万細胞／ｍＬの細胞密度に到達するまで、３７℃±１℃の成長温度で、Ａｃｔｉ  ＣＨＯ餌料ＡおよびＡｃｔｉ  ＣＨＯ餌料ＢをＣＨＯ細胞の培養物に毎日給餌することと、３７℃±１℃〜３２．５℃±１℃まで成長温度をシフトさせることと、培地からＧＬ−２０４５を採取することと、を含み、本方法が、２１日目に＞８０％の細胞生存率、および＞９，０００ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質力価であって、そのうちＧＬ−２０４５の＞７０％が多量体として存在する、最終タンパク質力価を生じ、多量体の＞３０％がさらに高次の多量体ＧＬ−２０４５である、方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞生存率は、培養の１８日目に９５％を超える。いくつかの実施形態では、多量体の割合は、８０％を超える。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって生成されたＧＬ−２０４５を精製する方法であって、親和性クロマトグラフィによって培養上清からＧＬ−２０４５を精製することと、陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、および疎水性相互作用クロマトグラフィのうちの１つ以上によってＧＬ−２０４５を研磨することと、を含む、方法を提供する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、親和性クロマトグラフィの前に、深層濾過を用いる。いくつかの実施形態では、深層フィルタは、Ｘ０ＨＣ（ミリポア）である。いくつかの実施形態では、深層濾過ユニットは、高百分率のＤＮＡを上清から除去する。いくつかの実施形態では、深層濾過ユニットは、Ｅｍｐｈａｚｅ（商標）ＡＥＸハイブリッド精製器（３Ｍ）である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、親和性クロマトグラフィは、タンパク質Ａカラムを使用する。いくつかの実施形態では、タンパク質Ａカラムは、ＮａＯＨ耐性樹脂を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質Ａ樹脂は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ樹脂である。いくつかの実施形態では、親和性クロマトグラフィによる精製は、３つの異なる洗浄緩衝液のうちの１つを利用して精製状態を最適化することを含む。いくつかの実施形態では、親和性クロマトグラフィによる精製は、親和性クロマトグラフィカラムからＧＬ−２０４５を溶出させることを含む。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５の溶出は、ｐＨ勾配を用いた溶出を含む。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５の溶出は、ｐＨ勾配を用いない溶出を含む。一実施形態では、溶出は、グリシン緩衝液を使用して行われる。別の実施形態では、溶出は、酢酸緩衝液を使用して行われる。いくつかの実施形態では、親和性クロマトグラフィカラムは、結合されたＧＬ−２０４５を除去するために再生される。いくつかの実施形態では、親和性クロマトグラフィカラムは、製造業者によって示唆されるよりも頻繁に再生される。いくつかの実施形態では、親和性クロマトグラフィカラムは、各精製周期の前に再生される。いくつかの実施形態では、親和性クロマトグラフィカラムは、０．５ＭのＮａＯＨ緩衝液を用いて再生される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５の研磨は、クロマトグラフィを通した陰イオン交換流を含む。いくつかの実施形態では、クロマトグラフィを通した陰イオン交換流は、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ速流カラムを使用することを含む。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５の研磨は、陽イオン交換クロマトグラフィを含む。いくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィは、ＰＯＲＯＳ  ＸＳカラムを使用することを含む。いくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィは、酢酸ナトリウム溶出緩衝液を使用することを含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、３６．５〜３９．０％の１ＭのＮａＣｌ緩衝液をさらに含む。一実施形態では、溶出方法は、段階溶出であり、別の実施形態では、溶出は、勾配溶出である。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５の研磨は、疎水性相互作用クロマトグラフィを含む。いくつかの実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィは、ブチルＦＦ樹脂を使用することを含む。いくつかの実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィは、フェニルＨＰ樹脂を使用することを含む。いくつかの実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィ（「ＨＩＣ」）は、フェニルセファロース６速流高サブ樹脂を使用することを含む。一実施形態では、ＨＩＣ方法は、フロースルーモードにあり、別の実施形態では、ＨＩＣ方法は、結合モードにある。いくつかの実施形態では、ＨＩＣ樹脂は、ＧＬ−２０４５ホモ二量体の単離を生じる。いくつかの実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィは、オクチルＦＦ樹脂を使用することを含む。いくつかの実施形態では、カラムは、ＧＬ−２０４５の非秩序凝集体の除去を生じる。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５を精製するための方法であって、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィによって培養上清からＧＬ−２０４５を精製することを含み、タンパク質Ａカラムが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ培地などの耐アルカリ性培地を使用し、精製が少なくとも２つの洗浄周期で行われ、定置洗浄（ＣＩＰ）手順が、０．５ＭのＮａＯＨ緩衝液などの高ＮａＯＨ再生工程を用いた各精製ランの後に行われる、ＧＬ−２０４５を精製するための方法を提供する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５を精製するための方法であって、陽イオン交換クロマトグラフィによってＧＬ−２０４５を研磨することを含み、陽イオン交換カラムが、ＰＯＲＯＳ  ＸＳなどの高能力の高解像度樹脂を含有し、溶出緩衝液が、３６．５〜３９．０％の１ＭのＮａＣｌ緩衝液から構成される酢酸ナトリウム緩衝液である、ＧＬ−２０４５を精製するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５を精製するための方法は、陰イオン交換クロマトグラフィによってＧＬ−２０４５を研磨することをさらに含み、陰イオン交換カラムは、高い化学的安定性を有し、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ速流培地のような定置洗浄および衛生プロトコルを可能にする、強陰イオン交換培地を含有する。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５を精製するための方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィによってＧＬ−２０４５を研磨することをさらに含み、疎水性相互作用培地は、ブチルＦＦ、フェニルＨＰ、またはオクチルＦＦ樹脂であり、かつ研磨に加えて、ＧＬ−２０４５の特定の画分を単離または除去するために選択される。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５を精製および／または研磨するための方法は、全ての濾過およびクロマトグラフィ工程の後に（すなわち、最終医薬物質）、＞４ｇ／ＬのＧＬ−２０４５の最終タンパク質力価を生じる。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５の最終タンパク質組成物は、＞７０％の多量体を含む。いくつかの実施形態では、多量体の＞２８％は、分析的ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析されるようなさらに高次の多量体である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって作製された精製ＧＬ−２０４５を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって作製された精製ＧＬ−２０４５は、ホモ二量体の百分率および／もしくはホモ二量体の二量体を最小にするか、または別様に、ホモ二量体、より低次の多量体、さらに高次の多量体、および最高次の多量体の百分率を均衡させる、定義された多量体パターンを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組み換え生成された精製ＧＬ−２０４５を用いて治療または予防が必要な対象における炎症性、自己免疫、または感染性疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、特発性血小板減少性紫斑病、慢性炎症性多発ニューロパシー、多巣性運動ニューロパシー、重症筋無力症、臓器移植、およびリウマチ性関節炎から選択される。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５は、静脈内に、皮下に、経口で、腹腔内に、舌下に、口腔内に、経皮的に、皮下移植を介して、または筋肉内に投与される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物であって、ＧＬ−２０４５組成物のホモ二量体画分が、組成物全体の約２０％未満を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ホモ二量体画分は、組成物全体の１２〜１９％を構成する。他の実施形態では、ホモ二量体画分は、組成物全体の１４〜１９％を構成する。いくつかの実施形態では、ホモ二量体画分は、組成物全体の１５．５〜１７．５％を構成する。別の実施形態では、ホモ二量体画分は、組成物全体の約１６．２％を構成する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物であって、ＧＬ−２０４５組成物のホモ二量体の二量体画分が、組成物全体の約７％〜約１２％を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ホモ二量体の二量体画分は、組成物全体の約９％〜約１１％を構成する。他の実施形態では、ホモ二量体の二量体画分は、組成物全体の約１０％を構成する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物であって、ＧＬ−２０４５組成物のホモ二量体の三量体画分が、組成物全体の約５．５％〜約１１％を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ホモ二量体の三量体画分は、組成物全体の約６．５％〜約８％を構成する。他の実施形態では、ホモ二量体の三量体画分は、組成物全体の約７％を構成する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物であって、ＧＬ−２０４５組成物のホモ二量体の四量体画分が、組成物全体の約１０％〜約１６％を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ホモ二量体の四量体画分は、組成物全体の約１３％〜約１５％を構成する。他の実施形態では、ホモ二量体の四量体画分は、組成物全体の約１４％を構成する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物であって、ＧＬ−２０４５組成物のホモ二量体の五量体画分が、組成物全体の約６％〜約９％を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ホモ二量体の五量体画分は、組成物全体の約７％〜約８％を構成する。他の実施形態では、ホモ二量体の五量体画分は、組成物全体の約７％を構成する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物であって、ＧＬ−２０４５組成物のホモ二量体の六量体画分が、組成物全体の約１０％〜約１４％を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物を含む。いくつかの実施形態では、ホモ二量体の六量体画分は、組成物全体の約１２％〜約１３％を構成する。他の実施形態では、ホモ二量体の六量体画分は、組成物全体の約１２．７％を構成する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物であって、最高次の多量体（すなわち、ホモ二量体の７マー以上の画分中のもの）が、組成物全体の少なくとも約２８％を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物を提供する。いくつかの実施形態では、最高次の多量体は、組成物全体のわずか３５％を構成する。いくつかの実施形態では、最高次の多量体画分は、組成物全体の約３０％〜約３４％を構成する。他の実施形態では、最高次の多量体画分は、組成物全体の約３１．４％を構成する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物であって、
（ａ）ホモ二量体画分が、組成物全体の約２０％未満を構成し、
（ｂ）最高次の多量体画分が、組成物全体の少なくとも約２８％を構成し、
（ｃ）ホモ二量体の二量体画分が、組成物全体の約７％〜約１２．５％を構成し、
（ｄ）ホモ二量体の三量体画分が、組成物全体の約５．５％〜約１１％を構成し、
（ｅ）ホモ二量体の四量体画分が、組成物全体の約１０％〜約１６％を構成し、
（ｆ）ホモ二量体の五量体画分が、組成物全体の約６％〜約１０％を構成し、
（ｇ）ホモ二量体の六量体画分が、画分全体の約１０％〜約１４％を構成し、
（ｈ）ホモ二量体の二量体〜ホモ二量体の六量体画分が、組成物全体の約４０％〜約６０％を構成し、
（ｉ）ホモ二量体の三量体〜ホモ二量体の六量体画分が、組成物全体の約３２％〜約５０％を構成し、
（ｊ）ホモ二量体の四量体〜ホモ二量体の六量体画分が、組成物全体の約２６％〜約３９％を構成し、
（ｋ）ホモ二量体の五量体〜ホモ二量体の六量体画分が、組成物全体の約１８％〜約２３％を構成し、または
（ｌ）（ａ）〜（ｋ）の任意の組み合わせである、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物を提供する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物であって、組成物全体のおよそ８０％が、さらに高次の多量体を含み、これは、ホモ二量体の二量体以上（すなわち、２バンド以上）を意味する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物全体のおよそ６０〜８０％は、ホモ二量体の三量体以上（すなわち、３バンド以上）を含む。いくつかの実施形態では、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物の全体の約５４〜７２％は、四量体以上（すなわち、４バンド以上）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５であって、組成物全体のおよそ４４〜５７％が、五量体以上（すなわち、５バンド以上）を含む、ＧＬ−２０４５を提供する。いくつかの実施形態では、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物の全体の約３８〜５１％は、六量体以上（すなわち、６バンド以上）を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、組み換え生成されたＧＬ−２０４５であって、組成物の２〜６バンド（すなわち、ホモ二量体の二量体〜ホモ二量体の六量体）が、組成物の約３９〜６１％を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５を提供する。いくつかの実施形態では、組み換え生成されたＧＬ−２０４５であって、組成物の３〜６バンド（すなわち、ホモ二量体の三量体〜ホモ二量体の六量体）が、組成物の約３２〜５０％を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５を提供する。いくつかの実施形態では、組み換え生成されたＧＬ−２０４５であって、組成物の４〜６バンド（すなわち、ホモ二量体の四量体〜ホモ二量体の六量体）が、組成物の約２６〜３９％を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５を提供する。いくつかの実施形態では、組み換え生成されたＧＬ−２０４５であって、組成物の５〜６バンド（すなわち、ホモ二量体の五量体〜ホモ二量体の六量体）が、組成物の約１６〜２３％を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】サイズ排除クロマトグラフィによるＧＬ−２０４５分画（図１Ａ）および非還元ゲルによる結果として生じる画分の分析（図１Ｂ）を例示する。
【図１Ｂ】サイズ排除クロマトグラフィによるＧＬ−２０４５分画（図１Ａ）および非還元ゲルによる結果として生じる画分の分析（図１Ｂ）を例示する。
【図２】ＧＬ−２０４５画分の生体層干渉法分析を例示する。
【図３Ａ】ＧＬ−２０４５についてのゲル分析（図３Ａ）およびサイズ排除分画結果（図３Ｂ）を例示する。
【図３Ｂ】ＧＬ−２０４５についてのゲル分析（図３Ａ）およびサイズ排除分画結果（図３Ｂ）を例示する。
【図４Ａ】補体依存性細胞致死アッセイにおけるＧＬ−２０４５画分の効果を例示する。
【図４Ｂ】補体依存性細胞致死アッセイにおけるＧＬ−２０４５画分の効果を例示する。
【図４Ｃ】補体依存性細胞致死アッセイにおけるＧＬ−２０４５画分の効果を例示する。
【図４Ｄ】補体依存性細胞致死アッセイにおけるＧＬ−２０４５画分の効果を例示する。
【図５Ａ】溶出クロマトグラム（図５Ａ）およびＦｃγＲＩＩＩａ結合アッセイにおいて使用するためのＧＬ−２０４５のＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析（図５Ｂおよび５Ｃ）を例示する。
【図５Ｂ】溶出クロマトグラム（図５Ａ）およびＦｃγＲＩＩＩａ結合アッセイにおいて使用するためのＧＬ−２０４５のＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析（図５Ｂおよび５Ｃ）を例示する。
【図５Ｃ】溶出クロマトグラム（図５Ａ）およびＦｃγＲＩＩＩａ結合アッセイにおいて使用するためのＧＬ−２０４５のＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析（図５Ｂおよび５Ｃ）を例示する。
【図６Ａ】図５に示される溶出された画分のＦｃγＲＩＩＩａへの結合（図６Ａ）および最良適合曲線（図６Ｂ）を例示する。
【図６Ｂ】図５に示される溶出された画分のＦｃγＲＩＩＩａへの結合（図６Ａ）および最良適合曲線（図６Ｂ）を例示する。
【図７】陰イオン交換画分のＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析を例示する：ＧＬ−ＧＬＭ−０１＝組み換え、非分画Ｆｃ（Ｇ００１）、ＧＬ−ＧＬＭ−０２＝非分画ＧＬ−２０４５、ＧＬ−ＧＬＭ−０５＝ｐＨ６．０での分画ＧＬ−２０４５、ＧＬ−ＧＬＭ−０６＝ｐＨ６．５での分画ＧＬ−２０４５、ＧＬ−ＧＬＭ−０７＝ｐＨ７．０での分画ＧＬ−２０４５、ＧＬ−ＧＬＭ−０８＝ｐＨ７．５での分画ＧＬ−２０４５。
【図８】分画ＧＬ−２０４５の非分画の存在下での化学誘引物質としてＣ５ａを用いた好中球走化性アッセイの結果を例示する：ＧＬ−ＧＬＭ−０１＝組み換え、非分画Ｆｃ（Ｇ００１）、ＧＬ−ＧＬＭ−０２＝非分画ＧＬ−２０４５、ＧＬ−ＧＬＭ−０５＝ｐＨ６．０での分画ＧＬ−２０４５、ＧＬ−ＧＬＭ−０６＝ｐＨ６．５での分画ＧＬ−２０４５、ＧＬ−ＧＬＭ−０７＝ｐＨ７．０での分画ＧＬ−２０４５、ＧＬ−ＧＬＭ−０８＝ｐＨ７．５での分画ＧＬ−２０４５。
【図９】培養の４、８、および１０日目の、異なる培地のパネルにおいて成長されたＣＨＯ細胞の細胞密度（１００万／ｍＬ単位で）を例示する。
【図１０】培養の４、８、および１０日目の、異なる培地のパネルにおいて成長されたＣＨＯ細胞の細胞生存率（％）を例示する。
【図１１】培養の１０日目の、異なる培地のパネルにおいて成長されたＣＨＯ細胞のタンパク質力価（ｍｇ／ｍＬ）を例示する。
【図１２Ａ】図９〜１１に例示される培地のパネル中に成長されたＣＨＯ細胞から生成されたＧＬ−２０４５タンパク質のゲル分析を例示する。
【図１２Ｂ】図９〜１１に例示される培地のパネル中に成長されたＣＨＯ細胞から生成されたＧＬ−２０４５タンパク質のゲル分析を例示する。
【図１３Ａ】ＰｏｗｅｒＣＨＯ３  ＣＤ、ＡＤＣＦ−Ｍａｂ  Ｈｙｃｌｏｎｅ、およびＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ培地についての給餌スケジュール（図１３Ａ）、ならびにＣｅｌｌｖｅｎｔｏ、ＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ、ＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ  Ｌｉｆｅ、およびＣＤ４ＭＣＨＯ  Ｈｙｃｌｏｎｅ培地（図１３Ｂ）についての給餌スケジュールを例示する。
【図１３Ｂ】ＰｏｗｅｒＣＨＯ３  ＣＤ、ＡＤＣＦ−Ｍａｂ  Ｈｙｃｌｏｎｅ、およびＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ培地についての給餌スケジュール（図１３Ａ）、ならびにＣｅｌｌｖｅｎｔｏ、ＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ、ＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ  Ｌｉｆｅ、およびＣＤ４ＭＣＨＯ  Ｈｙｃｌｏｎｅ培地（図１３Ｂ）についての給餌スケジュールを例示する。
【図１４】培養の０〜１１日目の、異なる培地＋給餌の組み合わせのパネルにおいて成長されたＣＨＯ細胞の細胞密度（ｅ６細胞／ｍＬ）を例示する。
【図１５】培養の０〜１１日目の、異なる培地＋給餌の組み合わせのパネルにおいて成長されたＣＨＯ細胞の細胞生存率（％）を例示する。
【図１６】培養の０〜１１日目の、異なる培地＋給餌の組み合わせのパネルにおいて成長されたＣＨＯ細胞からのＧＬ−２０４５のタンパク質力価（ｍｇ／ｍＬ）を例示する。
【図１７】ＧＬ−２０４５多量体化に関する図１３Ａ〜１３Ｂに例示される培地＋給餌の組み合わせおよびスケジュールの効果のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を例示する。
【図１８Ａ】細胞密度（図１８Ａ）、細胞生存率（図１８Ｂ）、培養物ｐＨ（図１８Ｃ）、およびＧＬ−２０４５タンパク質力価（図１８Ｄ）に関する、毎日のＡｃｔｉＣＨＯ−Ｐ培地＋給餌（赤色）、ならびに１日おきのＡｃｔｉＣＨＯ−Ｐ培地＋給餌（青色）の効果を例示する。
【図１８Ｂ】細胞密度（図１８Ａ）、細胞生存率（図１８Ｂ）、培養物ｐＨ（図１８Ｃ）、およびＧＬ−２０４５タンパク質力価（図１８Ｄ）に関する、毎日のＡｃｔｉＣＨＯ−Ｐ培地＋給餌（赤色）、ならびに１日おきのＡｃｔｉＣＨＯ−Ｐ培地＋給餌（青色）の効果を例示する。
【図１８Ｃ】細胞密度（図１８Ａ）、細胞生存率（図１８Ｂ）、培養物ｐＨ（図１８Ｃ）、およびＧＬ−２０４５タンパク質力価（図１８Ｄ）に関する、毎日のＡｃｔｉＣＨＯ−Ｐ培地＋給餌（赤色）、ならびに１日おきのＡｃｔｉＣＨＯ−Ｐ培地＋給餌（青色）の効果を例示する。
【図１８Ｄ】細胞密度（図１８Ａ）、細胞生存率（図１８Ｂ）、培養物ｐＨ（図１８Ｃ）、およびＧＬ−２０４５タンパク質力価（図１８Ｄ）に関する、毎日のＡｃｔｉＣＨＯ−Ｐ培地＋給餌（赤色）、ならびに１日おきのＡｃｔｉＣＨＯ−Ｐ培地＋給餌（青色）の効果を例示する。
【図１９】ＧＬ−２０４５タンパク質力価に関する、毎日のＡｃｔｉＣＨＯ−Ｐ培地＋給餌（赤色）、および３日おきのＡｃｔｉＣＨＯ−Ｐ培地＋給餌（青色）の効果を例示する。
【図２０Ａ】ＡｃｔｉＣＨＯ−Ｐ基礎培地を用いたＡｃｔｉＣＨＯ餌料Ａ（青色）の使用と比較した、細胞生存率（図２０Ａ）およびＧＬ−２０４５タンパク質力価（図２０Ｂ）に関してＰｏｗｅｒＣＨＯ２（赤色）基礎培地とＡｃｔｉＣＨＯ餌料Ａを組み合わせる効果を例示する。
【図２０Ｂ】ＡｃｔｉＣＨＯ−Ｐ基礎培地を用いたＡｃｔｉＣＨＯ餌料Ａ（青色）の使用と比較した、細胞生存率（図２０Ａ）およびＧＬ−２０４５タンパク質力価（図２０Ｂ）に関してＰｏｗｅｒＣＨＯ２（赤色）基礎培地とＡｃｔｉＣＨＯ餌料Ａを組み合わせる効果を例示する。
【図２１Ａ】細胞密度（図２１Ａ）、細胞生存率（図２１Ｂ）、およびＧＬ−２０４５タンパク質力価（図２１Ｃ）に関する最適化された振とうフラスコ状態の効果を例示する。
【図２１Ｂ】細胞密度（図２１Ａ）、細胞生存率（図２１Ｂ）、およびＧＬ−２０４５タンパク質力価（図２１Ｃ）に関する最適化された振とうフラスコ状態の効果を例示する。
【図２１Ｃ】細胞密度（図２１Ａ）、細胞生存率（図２１Ｂ）、およびＧＬ−２０４５タンパク質力価（図２１Ｃ）に関する最適化された振とうフラスコ状態の効果を例示する。
【図２２】タンパク質Ａ精製ＧＬ−２０４５のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を例示する。
【図２３Ａ】ｐＨ勾配溶出によるＧＬ−２０４５の溶出後のタンパク質Ａカラムからの溶出プロファイル（図２３Ａ）および単離された画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図２３Ｂ）を例示する。
【図２３Ｂ】ｐＨ勾配溶出によるＧＬ−２０４５の溶出後のタンパク質Ａカラムからの溶出プロファイル（図２３Ａ）および単離された画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図２３Ｂ）を例示する。
【図２４】溶出クロマトグラムおよび非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を例示する。
【図２５】溶出クロマトグラムおよび非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を例示する。
【図２６】ランＣ１〜Ｃ３の溶出クロマトグラフを例示する。
【図２７】ランＣ１〜Ｃ３からの溶出ピーク３８％〜３９％の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を例示する。
【図２８】イオンクロマトグラフィ精製ＧＬ−２０４５の濃度測定法分析を例示する。
【図２９Ａ】ＨＩＣカラムの溶出プロファイル（上パネル）ならびに溶出およびフロースルー画分（ＦＴ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（下パネル）を例示する。
【図２９Ｂ】ＨＩＣカラムの溶出プロファイル（上パネル）ならびに溶出およびフロースルー画分（ＦＴ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（下パネル）を例示する。
【図３０】Ｍ０４５のＨＩＣカラム研磨からの溶出プロファイル（右パネル）およびＮｕ−ＰＡＧＥ分析（右パネル）を例示する。
【図３１】Ｍ０４５のＨＩＣカラム研磨からの溶出プロファイルを例示する。
【図３２】Ｍ０４５のＨＩＣカラム研磨からの溶出プロファイルおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を例示する。
【図３３】最適に製造されたＧＬ−２０４５組成物の定義された多量体パターンを例示する。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本明細書に記載される最適化された組み換えＧＬ−２０４５の生成に対する手法は、細胞生存率およびタンパク質力価を最適化しながら、ＧＬ−２０４５多量体化の増強を生じる最適化された上流製造方法を含む。いくつかの実施形態では、最適化された下流製造によって、医薬物質に対する最適化された状態が遂行される。さらに、定義された多量体パターンを有するＧＬ−２０４５を含む組成物を本明細書に提供する。本明細書に提供される組成物は、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー、抗体媒介疾患、および補体媒介疾患を治療するのに有用性を有する。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「医薬物質」は、製造業者によって販売されるようなＧＬ−２０４５の最終剤形を指す。
【００３６】
本明細書で使用される場合、特許請求の範囲および／もしくは明細書における「備える」という用語と併せて使用される場合の「１つ（ａ）」もしくは「１つ（ａｎ）」という単語の使用は、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは１つ超」の意味とも一致する。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「生体模倣薬」、「生体模倣薬分子」、「生体模倣薬化合物」という用語、および関連する用語は、プールヒト静脈内免疫グロブリン（「ｈＩＶＩＧ」）、モノクローナル抗体、または抗体のＦｃフラグメントなどの別の化合物の機能を模倣する人工化合物を指す。「生物学的に活性な」生体模倣薬とは、それらの天然に発生する対応物と同一または類似の生物活性を持つ化合物のことである。「天然に発生する」とは、生物中に通常に見られる分子またはその部分を意味する。天然に発生するとはまた、実質的に天然に発生することも意味する。「免疫学的に活性な」生体模倣薬とは、抗体、サイトカイン、インターロイキン、および他の当該技術分野で知られている免疫学的な分子などの天然に発生する免疫学的に活性な分子と同一または類似の免疫学的活性を呈する生体模倣薬のことである。好ましい実施形態では、本発明の生体模倣薬は、本明細書で定義されるように、（例えば、最適に製造されたＧＬ−２０４５）最適化された多量体化ストラドマーである。
【００３８】
「直接連結される」とは、介在もしくは外来配列を有せずに互いに接続される２つの配列、例えば、ＤＮＡもしくはクローニングフラグメント中への制限酵素認識部位の挿入から得られるアミノ酸配列を意味する。当業者であれば、「直接連結される」が、多量体化能力が実質的に影響を受けない限り、アミノ酸の添加または除去を包含することを理解するであろう。
【００３９】
「相同な」とは、所与の核酸またはアミノ酸配列の配列全体にわたる同一性を意味する。例えば、「８０％相同な」とは、所与の配列が、特許請求される配列と約８０％の同一性を共有し、かつ挿入、欠損、置換、およびフレームシフトを含み得ることを意味する。当業者であれば、配列整列を行って、挿入および欠損を考慮し、配列の長さ全体にわたる同一性を判定することができることを理解するであろう。
【００４０】
ｈＩＶＩＧが、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合し、かつこれを完全に飽和させること、およびＦｃＲｎのそのような競合抑制が、ｈＩＶＩＧの生物活性において重要な役割を果たし得ることは記載されている（例えば、Ｆ．Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００５，６６（４）４０３−４１０）。Ｆｃγ受容体に強力に結合する免疫グロブリンは、少なくともある程度までＦｃＲｎにも結合するため、当業者であれば、１つ超のＦｃγ受容体に結合することができるストラドマーが、ＦｃＲｎにも結合し、かつこれを完全に飽和させ得ることを認識するであろう。
【００４１】
ＤＥＬ多形体およびＥＥＭ多形体と呼ばれる、ＩｇＧ１の２つのヒト多形体がある。ＤＥＬ多形体は、位置３５６ではＤを有し、位置３５８ではＬを有し、ＥＥＭ多形体は、位置３５６でＥを有し、位置３５８でＭを有する（Ｋａｂａｔ番号付け、配列番号２および３、それぞれ、ＥＥＭ多形体およびＤＥＬ多形体）。本明細書で提供されるストラドマーは、ＤＥＬ多形体またはＥＥＭＩｇＧ１多形体のいずれかを含み得る。したがって、特定の変異体についての文章がＤＥＬ多型の文脈で明示的に生成されている場合であっても、当業者であれば、ＥＥＭ多形体に対して同じ変異を行って、同じ結果を生じ得ることを理解するであろう。
【００４２】
ＵＳ２０１０／０２３９６３３は、連結された免疫グロブリンＦｃドメインを使用して、自己免疫疾患および他の炎症状態を含む病的状態の治療のために、ストラドマーの個々の構成要素間の制限部位および親和性標識を含む短い配列を含む、ｈＩＶＩＧの秩序正しく多量体化された免疫グロブリンＦｃ生体模倣薬（ストラドマーとして知られる生物学的に活性な秩序多量体）を創成することを開示している。その全体が参照により組み込まれる、ＵＳ２０１０／０２３９６３３を参照されたい。ＵＳ２０１３／０１５６７６５は、個々の構成要素が、制限部位または親和性標識によって分離されるのではなく、直接連結されるストラドマーを開示している。ＵＳ２０１３／０１５６７６５はまた、Ｎ末端連結された構築物に対して多量体化および補体結合の改善を呈する（例えば、ＵＳ２０１０／０２３９６３３に記載されたＧＬ−２０１９）、そのＣ末端に直接連結されたＩｇＧ２ヒンジ多量体化ドメインを有するＩｇＧ１Ｆｃドメインを含む多量体化ストラドマー（ＧＬ−２０４５）を特に開示している。その全体が参照により組み込まれる、ＵＳ２０１３／０１５６７６５を参照されたい。ＧＬ−２０４５の構造は、ＩｇＧ１ヒンジ−ＩｇＧ１ＣＨ２  ＩｇＧ１  ＣＨ３−ＩｇＧ２ヒンジおよびＧＬ−２０４５を、配列番号４および５（それぞれ、ＥＥＭ多形体およびＤＥＬ多形体）として提供する。
【００４３】
ストラドマー単位単量体
本明細書で使用される場合、「ストラドマー単位単量体」という用語は、少なくとも第２のストラドマー単位単量体と関連付けられたとき、少なくとも１つのＦｃドメインを含み、かつＧＬ−２０４５およびＩｇＧ２ヒンジ多量体化ドメインの場合の、ホモ二量体「ストラドマー単位」を形成する、単一の隣接するペプチド分子を指す。好ましい実施形態では、ＧＬ−２０４５のストラドマー単位は、２つの関連付けられたストラドマー単位単量体から構成される。しかしながら、ＧＬ−２０４５ストラドマーはまた、３つ以上のストラドマー単位単量体も含有し得る。
【００４４】
本発明の最適に製造されたストラドマー（最適に製造されたＧＬ−２０４５）は、ＩｇＧ１  Ｆｃ単量体のＮ末端およびリーダーペプチド（配列番号１）のＣ末端と、ＩｇＧ１  ＦｃのＣ末端および多量体化ドメインＩｇＧ２ヒンジ（配列番号６）のＮ末端との間の直接連結を含有する。
【００４５】
明確にさせるために、当業者であれば、本発明の最適に製造されたストラドマー分子は、Ｆｃドメイン単量体および多量体化領域をコードするポリヌクレオチド分子を調製することによって構築され得ることを理解するであろう。そのようなポリヌクレオチド分子は、発現ベクター内に挿入され得、これを使用して、細菌の集団を形質変換するか、または哺乳動物の細胞の集団にトランスフェクトすることができる。次に、形質変換された細菌またはトランスフェクトされた哺乳動物の細胞を適切な培養条件下で培養することによって、ストラドマー単位単量体を生成することができる。例えば、ジェネテシン／Ｇ４１８を用いて細胞を選択することによって、安定的にトランスフェクトされた細胞のプールを継続するクローナル細胞株を達成することができる。代替的に、細胞は、ＣＭＶ促進剤の制御下で、本発明の最適に製造されたストラドマーをコードするＤＮＡ（例えば、配列番号４または５によるストラドマーをコードするＤＮＡ）を一時的にトランスフェクトされ得る。次に、発現されたストラドマー単位単量体は、ストラドマー単量体の相互連結を使用した、ストラドマー単量体もしくは単位の自己集合またはストラドマー単量体の会合のいずれかの際に機能的ストラドマー単位およびストラドマーを形成することができる。次に、発現されたストラドマーは、本明細書に記載される下流製造方法（例えば、親和性クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、および／または疎水性相互作用クロマトグラフィ）によって細胞培地から精製され得る。当業者であれば、核酸構築物に含まれるリーダーペプチドは、ストラドマー単位単量体ペプチドの生成のみを促進するために使用され、かつ成熟タンパク質の発現時に開裂されることを理解するであろう。したがって、本発明の生物学的に活性な生体模倣薬は、リーダーペプチドを含まない。
【００４６】
クラスターストラドマー
一実施形態では、本開示に従って作製された最適に製造されたＧＬ−２０４５は、クラスターストラドマーである。「クラスターストラドマー」は、中心部分「頭部」および２つ以上の「脚部」を含むラジアル形態を有する生体模倣薬であり、各脚部は、少なくとも１つのＦｃガンマ受容体および／または補体を結合させることができる１つ以上のＦｃドメインを含む。クラスターストラドマーはまた、ストラドマーの多量体化を生じる多量体化ドメインの存在により、「多量体化ストラドマー」としても知られている。したがって、１つのストラドマー単量体分子上に複数のＦｃドメインを含有するシリアルストラドマーは、分子がまた、少なくとも１つの多量体化ドメインを含有する限り、依然としてクラスターストラドマーまたは多量体化ストラドマーとして分類され得る。各クラスターストラドマーは、各々が「クラスターストラドマー単位」と呼ばれる１つ超のホモ二量体タンパク質から構成される。各クラスターストラドマー単位は、少なくとも１つの機能的Ｆｃドメインを多量体化する少なくとも１つの領域、および少なくとも１つの機能的Ｆｃドメインを含む「脚部」領域から構成される。多量体化領域は、いったん別のクラスターストラドマー単位に多量体化されると、クラスターストラドマーの「頭部」を創成する。脚部領域は、各脚部領域中にＦｃドメインがあるのと同じぐらい多くの補体分子を結合させることができ得る。例えば、脚部領域は、各脚部領域中にＦｃドメインがあるのと同じぐらい多くのＣ１ｑ分子を結合させることができる。したがって、クラスターストラドマーは、２つ以上のＣ１ｑ分子を結合させることができる生体模倣薬化合物であり、したがって補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）としても知られている補体媒介溶解を防止する。
【００４７】
本発明の最適に製造されたストラドマー内に含有された多量体化領域は、ＩｇＧ２ヒンジ領域である。当該技術分野で知られているように、ヒトＩｇＧ２のヒンジ領域は、共有結合二量体を形成し得る（Ｙｏｏ、Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０，３１３４−３１３８（２００３），Ｓａｌｆｅｌｄ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５，１３６９−１３７２（２００７））。ＩｇＧ２の二量体形成は、潜在的に、Ｃ−Ｃ結合によるＩｇＧ２ヒンジ構造を通して媒介され（Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ  ２００３）、これは、ヒンジ構造単独で二量体形成を媒介し得ることを示唆する。しかしながら、ヒト血清中に見られるＩｇＧ２二量体の量は限定されている。ホモ二量体の二量体として存在するＩｇＧ２の量は、ＩｇＧ２全体の１０％未満であると推測される（Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。さらに、ホモ二量体の二量体を超えるＩｇＧ２の多量体化の量的証拠はない。（Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。すなわち、天然のＩｇＧ２が、ヒト血清中にさらに高次の多量体を形成することは見出されていない。ＩｇＧ２ヒンジ含有ストラドマー（例えば、最適に製造されたＧＬ−２０４５）は、さらに高次の多量体として存在しており、ＩｇＧ２ヒンジ相互作用が可変かつ動的であるヒト血清中の天然のＩｇＧ２とは違って、ＧＬ−２０４５は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、分析的超遠心、および３７℃で１００％の湿度での３ヶ月の安定性研究に関して証明される高度に安定的な多量体を形成することが実証された。さらに、ＩｇＧ２ヒンジ含有ストラドマー調剤薬物中の多量体の量は、ヒト血清中のＩｇＧ２について観察される、二量体のおよそ１０％を有意に上回り、多量体は含まれないことも驚くべきことである。例えば、ホモ二量体の二量体、三量体、四量体、およびさらに高次の多量体を含む多量体であるストラドマーの割合は、２０％を超え、かつ３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはさらには９０％を超える場合がある。特に好ましい実施形態では、ホモ二量体として存在するＧＬ−２０４５の割合は、１０〜２０％であり、ホモ二量体の高秩序多量体として存在するＧＬ−２０４５の対応する割合は、７０％を上回る。
【００４８】
アミノ酸配列ＧＬ−２０４５は、配列番号４および５に記載されている。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「単離された」ポリペプチドもしくはペプチドという用語は、天然に発生する対応物を有しないか、または例えば、膵臓、肝臓、脾臓、卵巣、精巣、筋肉、関節組織、神経組織、胃腸組織、または乳房組織もしくは腫瘍組織（例えば、乳癌組織）などの組織、あるいは血液、血清、または尿などの体液中に、それを天然に伴う構成要素から分離または精製されたかのいずれかの、ポリペプチドもしくはペプチドを指す。典型的には、ポリペプチドまたはペプチドは、天然に関連付けられるタンパク質および他の天然に発生する有機分子を含まない、乾燥重量当たり、少なくとも７０％であるときに「単離された」とみなされる。好ましくは、本発明のポリペプチド（またはペプチド）の調製物は、本発明のポリペプチド（ペプチド）の乾燥重量当たり、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９９％である。化学的に合成されたポリペプチドまたはペプチドは、それを天然に伴う構成要素から本質的に分離されるので、合成ポリペプチドまたはペプチドは、「単離され」る。
【００５０】
本発明の単離されたポリペプチド（もしくはペプチド）は、例えば、ポリペプチドもしくはペプチドをコードする組み換え核酸の発現によって、または化学合成によって得られ得る。それが天然に起こる供給源とは異なる細胞系中に生成されたポリペプチドまたはペプチドは、それを天然に伴う構成要素を必ずしも含まないため、「単離され」る。好ましい実施形態では、本発明の単離されたポリペプチドは、ＩｇＧ１  Ｆｃ単量体およびＩｇＧ２ヒンジ多量体化ドメインに対応する配列（配列番号６）のみを含み、タンパク質のクローニングまたは精製（例えば、導入された制限酵素認識部位または精製標識）の助けとなり得るさらなる配列を含まない。単離もしくは純度の程度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析によって測定することができる。
【００５１】
製造方法
ＧＬ−２０４５は、ホモ二量体の秩序多量体を形成し、かつホモ二量体および多量体画分のうちの全てにおいて活性である。製造プロセスが最適化された多量体プロファイルを生じることは、ＧＬ−２０４５機能に不可欠である。本明細書で使用される場合、「最適化された多量体プロファイル」または「最適化された多量体化プロファイル」とは、ＩＶＩＧ模倣薬としてのＧＬ−２０４５に対する所望の生物学的成果（例えば理論に縛られないが、Ｃ３／Ｃ３ｂのレベルでの、例えば、補体系の最初の活性化、および／または補体活性化のその後の抑制、ならびにＣＤＣの防止によるＣ１ｑへの結合の改善）を生じる、ＧＬ−２０４５のホモ二量体と高秩序多量体との組み合わせを指す。当業者であれば、他の治療目的用を含めて、単独または他の要素と組み合わせてのいずれかで、別個の生成物として最適に製造されたＧＬ−２０４５から様々な多量体画分を単離させることが有益であり得ることを認識するであろう。例えば、実施例に提供されるように、ＧＬ−２０４５のより大きい多量体画分は、Ｃ１ｑへの結合、下流補体媒介エフェクター機能の調節、および低親和性ＦｃγＲの結合において、より小さい多量体画分よりも活性である。したがって、本発明の方法は、最適化された多量体プロファイルを含むＧＬ−２０４５組成物のみならず、所望のエフェクター機能に基づいて多量体を選択することのみを含むＧＬ−２０４５組成物も対象とする。そのような実施形態では、１つの所望の生物学的成果を生じるＧＬ−２０４５の最適化された多量体プロファイルは、別の所望の生物学的成果を生じる最適化された多量体プロファイルとは異なり得る。
【００５２】
理論に縛られないが、ホモ二量体は、非凝集ＩｇＧ１と類似の受容体およびリガンド緩衝液として機能すると考えられる。さらに高次の多量体は、低親和性Ｆｃγ受容体および補体因子（例えば、六量体であるＣ１ｑ）への増加した結合力で結合し、本明細書に記載されるように、ホモ二量体またはより低次の多量体（例えば、ＧＬ−２０４５ホモ二量体の二量体、三量体、および／または四量体）と比較すると、生物学的効能の増強を実証する。したがって、多量体化の程度は、臨床的に有効なＧＬ−２０４５の生成において不可欠な上流および下流製造の検討事項である。このように、最適化された上流製造方法を通して、最適な細胞生存率、高タンパク質力価、およびＧＬ−２０４５の最適な多量体化プロファイルを維持することが望まれるのみならず、最適化された下流製造方法を通して、ＧＬ−２０４５の最適な多量体化プロファイルを維持および／または改善することも望まれる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される最適化された製造方法は、ＧＬ−２０４５の少なくとも７０％または少なくとも８０％が、非ホモ二量体（例えば、ホモ二量体の二量体、ホモ二量体の三量体など）として存在する、ＧＬ−２０４５タンパク質組成物を生じる。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５の７０％超または８０％超は、非ホモ二量体として存在する。例えば、最適化された製造方法は、ＧＬ−２０４５の８０％、８５％、９０％、９５％以上が非ホモ二量体として存在する、ＧＬ−２０４５タンパク質組成物を生じ得る。いくつかの実施形態では、タンパク質組成物は、最高次の多量体（すなわち、ホモ二量体の７マー以上）として存在するＧＬ−２０４５の少なくとも２８％または少なくとも３０％を構成する。いくつかの実施形態では、タンパク質組成物は、最高次の多量体として存在するＧＬ−２０４５のわずか３５％を構成する。いくつかの実施形態では、タンパク質組成物は、四量体、五量体、六量体、および７マーとして存在するＧＬ−２０４５の少なくとも約３５％から構成される（すなわち、ＧＬ−２０４５組成物全体の少なくとも３５％が、４〜６画分から構成される）。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５の少なくとも約３５％は、ホモ二量体の三量体以上として存在する（すなわち、ＧＬ−２０４５組成物全体の少なくとも３５％は、３画分以上から構成される）。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５の少なくとも約３５％は、ホモ二量体の三量体、四量体、五量体、または六量体として存在する（すなわち、ＧＬ−２０４５組成物全体の少なくとも３５％は、３〜６画分から構成される）。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５の少なくとも約３５％は、ホモ二量体以上の四量体として存在する（すなわち、ＧＬ−２０４５組成物全体の少なくとも３５％は、４画分以上から構成される）。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５の少なくとも約３５％は、ホモ二量体の四量体および五量体として存在する（すなわち、ＧＬ−２０４５組成物全体の少なくとも３５％は、４および５画分から構成される）。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５の少なくとも約３５％は、ホモ二量体の五量体以上として存在する（すなわち、ＧＬ−２０４５組成物全体の少なくとも３５％は、５画分以上から構成される）。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５の少なくとも約３５％は、ホモ二量体の五量体および六量体として存在する（すなわち、ＧＬ−２０４５組成物全体の少なくとも３５％は、５および６画分から構成される）。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５の少なくとも約３５％は、ホモ二量体の六量体以上として存在する（すなわち、ＧＬ−２０４５組成物全体の少なくとも３５％は、６画分以上から構成される）。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５の少なくとも約３５％は、ホモ二量体の７マー以上として存在する（すなわち、ＧＬ−２０４５組成物全体の少なくとも３５％は、７画分以上から構成される）。例えば、本明細書に記載される最適化された製造方法は、ＧＬ−２０４５の４０％、４５％、５０％、５５％以上がホモ二量体の五量体以上として存在する、ＧＬ−２０４５タンパク質組成物を生じ得る。Ｆｃ含有治療法についての現在の製造方法（例えば、モノクローナル抗体）は、下流濾過工程を通した、タンパク質力価の増加および収率の増加に焦点を当てていた。これらの方法は、概して、Ｆｃ含有タンパク質の多量体化に対する製造プロセスの効果を検討しておらず、本明細書に記載される方法とは全く対照的に、タンパク質の集合および多量体化を最小にすることを目指している。驚くべきことに、ＧＬ−２０４５の最高タンパク質収率を生じる培養条件は、多量体として存在するＧＬ−２０４５の最高百分率を必ずしも生じない。このように、本明細書に記載されるデータは、タンパク質力価全体に影響を与える製造変数が、少なくとも部分的に、多量体化プロファイルに影響を与える変数から独立していることを実証している。したがって、当業者は、上流製造条件が当該技術分野の現在の状態に基づいてＧＬ−２０４５多量体化に影響を与えることを予測することができないであろう。
【００５４】
例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いた組み換えタンパク質の生成のために構築されたプロトコルは、培養の特定日目の３７℃〜３１℃への温度シフトを提供する（Ｏｕｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５２（３），ｐｐ．１９９−２０７，（２００６）；Ｍａｓｔｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｍａｌｅｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，２（１）、ｐｐ．４９−６１，（２０１４））。しかしながら、本発明者らは、Ｏｕｇｕｃｈｉらに記載されたものとは対照的に、３７℃〜３２．５℃への温度シフトが、タンパク質力価について最適化しながら、細胞密度および高細胞生存率の維持を生じることを見出した。さらに、本発明者らは、以前に記載されているような培養の所与日目に基づくよりもむしろ、細胞密度に基づいて温度をシフトさせることが、ほぼ１０ｇ／ＬのＧＬ−２０４５タンパク質力価の増強を生じることを見出した。
【００５５】
さらに、本発明者らは、最適化された上流製造方法から生じる最適化された多量体化プロファイルの維持が、最適化された下流製造方法（例えば、親和性クロマトグラフィおよび／またはイオン交換クロマトグラフィ）に部分的に依存していることを発見した。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびＦｃ融合タンパク質の濾過および精製技術は、広く記載されており、かつ一般的に使用されている。しかしながら、ＧＬ−２０４５に適用された場合、これらの技術は、ＧＬ−２０４５多量体化プロファイルの予測不能な変性を生じる。例えば、本発明者らは、驚くべきことに、大部分のタンパク質Ａカラムが、実施例８に実証されるように、ｍＡｂおよびＦｃ融合タンパク質の精製におけるそれらのルーチン使用にもかかわらず、ＧＬ−２０４５の精製に好適でないことを発見した。タンパク質Ａは、非常に高価な試薬であり、単一の薬物の適正製造基準（ＧＭＰ）の精製に従って使用するためには数百万ドルの費用がかかり、かつ経済的に実行可能であるためには１００回以上も多くの再使用がなされる必要がある。ｍＡｂおよびＦｃ融合タンパク質と同様に、ＧＬ−２０４５は、タンパク質Ａに結合するが、ｍＡｂおよびＦｃ融合タンパク質とは違って、ＧＬ−２０４５は、タンパク質ＡへのＧＬ−２０４５の貪欲な結合のために、通常の溶出工程ではタンパク質Ａから完全には解離しない。本発明者らは、最適な多量体化プロファイルが維持される、ＧＬ−２０４５の精製のためのタンパク質Ａカラムの利用が、より頻繁なカラム清掃スケジュールを必要とすることを思いがけず発見した。
【００５６】
本発明者らは、当該技術分野で一般的に使用されるタンパク質Ａカラム定置洗浄（ＣＩＰ）手順が、思いがけず、ＧＬ−２０４５多量体化プロファイルの変化を生じることをさらに発見した。通常のＣＩＰ手順は、カラムを通過するタンパク質上清の多数の周期を伴い得る、精製ランの終了時のカラム清掃を必然的に伴う。しかしながら、本発明者らは、ＧＬ−２０４５の高い結合力により、タンパク質ＡからのＧＬ−２０４５の解離が欠落することを発見した。その結果として、タンパク質Ａの結合部位は、占有されたままであり、その後の周期におけるＧＬ−２０４５の結合を防止し、ホモ二量体の損失を生じる。したがって、本発明者らは、ｍＡｂもしくはＦｃ融合タンパク質と共に利用されるプロトコルとは対照的に、ＧＬ−２０４５を用いた、タンパク質ＡカラムのＣＩＰ清掃を、モノクローナル抗体もしくはＦｃ融合タンパク質を用いたもの、および０．５ＭのＮａＯＨなどの高度に厳密な再生緩衝液を用いたものよりも頻繁に行わなければならないことを思いがけず発見した。
【００５７】
ｐＨ溶出勾配は、精製中のタンパク質収率を最適化するために、タンパク質Ａカラムと共に一般的に使用される。本発明者らは、驚くべきことに、モノクローナル抗体もしくはＦｃ融合タンパク質のタンパク質Ａカラム収率を最適化するために当該技術分野で使用されるｐＨ溶出勾配が、ＧＬ−２０４５のホモ二量体もしくはさらに高次の多量体構成要素の所望の損失を引き起こし、したがってＧＬ−２０４５の多量体化プロファイル（実施例１０に実証される）を変化させる可能性があることを発見した。このように、本発明者らはまた、ＧＬ−２０４５の収率と多量体化との組み合わせを最適化するために溶出勾配技術を使用する手段を決定した。加えて、本発明者らは、驚くべきことに、新規の目的のために、すなわち、別個の最大高秩序ＧＬ−２０４５多量体をホモ二量体凝集体（実施例１１に実証されるような）から分離させるために、ｐＨ溶出勾配をタンパク質Ａカラムに適用することができることを発見した。
【００５８】
本発明者らはまた、陰イオン交換および陽イオン交換などのモノクローナル抗体およびＦｃ融合タンパク質を精製するために当該技術分野で一般的に使用されているイオン交換カラムを使用する場合に、ｐＨおよび／または塩の変化が、実施例１２に実証されるように、ＧＬ−２０４５の多量体化プロファイルを変化させ得ることを発見した。これは、塩もしくはｐＨの変化が、少量のタンパク質の損失を生じ得るが、薬物の組成物には変化をもたらさない、モノクローナル抗体もしくはＦｃ融合タンパク質とは全く対照的である。加えて、本発明者らは、驚くべきことに、塩および／またはｐＨの調整を、新規の目的のために、最大高秩序ＧＬ−２０４５多量体を同様の分子質量からなり得るホモ二量体の凝集体から分離するために、使用することができることを発見した。実施例１３に実証されるように、本発明者らは、最高次の多量体画分からの無秩序凝集体の除去が、より高い効力およびより高度に精製されたＧＬ−２０４５生成物と関連付けられることを証明するために、機能的アッセイを使用する。
【００５９】
疎水性相互作用（ＨＩＣ）カラムは、高収率捕捉、モノクローナル抗体の研磨、全長形態からの長さの小さい種の除去、不活性形態からの活性形態の分離、およびウィルスの一掃を含む、様々な機構を通してモノクローナル抗体およびＦｃ融合タンパク質を精製するために、当該技術分野で一般的に使用されている。しかしながら、ＧＬ−２０４５の文脈で使用される場合、本発明者らは、標準的なＨＩＣカラムが予測不能であることを見出した。実施例１４に実証されるように、異なるマトリックスから構成される７ＨＩＣカラムは、同じ上清および同じ緩衝液が全てのカラムと共に使用されているにもかかわらず、１６％〜６２％の範囲の大きく異なった捕捉率に関連付けられる。
【００６０】
さらに、本発明者らは、緩衝液の変化が、ＧＬ−２０４５の多量体化プロファイルを変化させ得ることを予測する。これは、緩衝液の変化が、少量のタンパク質の損失またはより不完全な研磨を生じるが、薬物の根本的な組成物には変化をもたらさないであろう、モノクローナル抗体もしくはＦｃ融合タンパク質とは全く対照的である。
【００６１】
さらに、本発明者らは、ＧＬ−２０４５ホモ二量体は、高秩序多量体を形成させるＩｇＧ１  Ｆｃおよび多量体化ドメインから構成されるため、ＧＬ−２０４５は、天然のＩｇＧ１  Ｆｃホモ二量体への結合力を有さずに結合する、全てのまたはほぼ全ての多くのリガンドおよび標的に貪欲に結合することを発見した。これは、驚くべきことに、全ての低親和性Ｆｃ受容体および補体Ｃ１ｑ、ならびに精製カラムにおいて一般的に使用されるタンパク質Ａおよびタンパク質Ｇを含む。しかしながら、この貪欲な結合はまた、より望ましくない潜在的な標的結合、例えば、エンドトキシンも生じる。この理由のために、本発明者らは、タンパク質ＡによるＧＬ−２０４５の精製、ならびに少なくとも１つ以上の陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換フロースルー、および疎水性相互作用カラムによるタンパク質Ａ精製ＧＬ−２０４５の研磨を含む、複数の工程の精製プロセスが望ましいと判定した。好ましい実施形態では、タンパク質ＡによるＧＬ−２０４５の精製、ならびに結合モードにおける陽イオン交換クロマトグラフィ、フロースルーモードにおける陰イオン交換、および結合モードもしくはフロースルーモードのいずれかにおける疎水性相互作用カラムの３つ全てによるタンパク質Ａ精製ＧＬ−２０４５の研磨を含む、４工程の精製プロセスが望ましい。この４工程の精製プロセスは、実施例１５に概説されている。当業者であれば、ＧＬ−２０４５組成物をさらに精製するための実施例１５に記載されるプロセスの前、中、または後の任意の時点で、深層濾過および超濾過工程を含む追加の濾過工程を追加することができることを容易に理解するであろう。
【００６２】
上流製造
一般的に言えば、上流製造方法は、特定の型のタンパク質生物学的生成物（例えば、ＧＬ−２０４５）を製造するために、制御された条件下で、生物学的材料を接種し、培養物中に成長させる方法である。本明細書で使用される場合、「上流製造方法」とは、具体的には、下流製造方法として一般的に分類されるその後の精製および濾過工程を参照しない、タンパク質の組み換え生成のための方法を指す。特定のタンパク質の特性の最適化（例えば、多量体化の効率）を目的とする変更または変化を有する上流製造方法は、本明細書で「最適化された上流製造方法」と呼ばれる。特定の特性を有する最終タンパク質生成物を生じるために、上流タンパク質製造のいくつかの態様は、最適化され得る（例えば、所望の結果を達成するために変化または変更される）。最適化され得る上流組み換えタンパク質生成の態様は、タンパク質をコードする発現ベクターの組成物、細胞型、基礎培地、給餌を含む培地添加剤、給餌スケジュール、継代スケジュール、培養温度、温度シフト、湿度、通気の程度、ｐＨ、播種細胞密度、ＣＯ２レベル、および／または酸素レベルを含み得るがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される最適化された上流製造方法は、最適化されていない上流製造方法によって生成されたＧＬ−２０４５と比較して、さらに高次の多量体の百分率の増加を有する高力価のＧＬ−２０４５の生成を生じる。
【００６３】
本発明のいくつかの態様では、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、ＧＬ−２０４５をコードする発現ベクターでトランスフェクトされる。いくつかの態様では、ゲノムへのＧＬ−２０４５発現カセットの挿入は、ＧＬ−２０４５発現カセットがｐｉｇｇｙＢａｃ最小逆方向反復要素によって隣接される、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンによって媒介される。このＧＬ−２０４５発現ベクターの、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースをコードするベクターとの共発現は、積極的に転写されるゲノムの領域内への遺伝子組み込みを媒介し、標準的なトランスフェクト方法（参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１０／０３１１１１６およびＭａｔａｓｃｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．Ｖ．１０８，ｐｐ  ２１４１−２１４０，（２０１１）を参照のこと）と比較して、安定的かつ増強された遺伝子発現を有する細胞株の発生を生じる。ピギーバックシステムは、通常、少なくとも部分的に多数の統合された導入遺伝子のために、タンパク質の生成を増加させる。しかしながら、本発明者らは、導入遺伝子の挿入率が比較的低い（例えば、ＵＶ分光光度法によって判定された、および１１コピー）高力価、高生存率のクローナル細胞株を選択したが、当業者であれば、選択的な抗菌圧力の使用がまた、約５０個超の挿入コピーまたは約１００個超の挿入コピーの導入遺伝子挿入率の使用も可能にすることを理解するであろう。いくつかの態様では、発現ベクターは、リーダーペプチド（例えば配列番号１）をコードする核酸を含む。いくつかの態様では、発現ベクターは、成功裏にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択を可能にするための抗菌耐性遺伝子をさらに含む。本発明のある態様では、成功裏にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、抗菌選択の不在下で発生される（ＵＳ２０１０／０３１１１１６を参照のこと）。いくつかの態様では、発現ベクターは、ＧＬ−２０４５の高レベルの発現を促進するための転写促進剤（例えば、ＣＭＶ促進剤）をさらに含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５発現ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、生物反応器中で培養する。いくつかの実施形態では、転写的に活性な部位で優先的に挿入を引き起こす技術を使用してＧＬ−２０４５発現ベクターで１度安定的にトランスフェクトされるように、多くの変異体があるＣＨＯ細胞株を慎重に選択する。いくつかの実施形態では、当該トランスフェクトされた選択ＣＨＯ細胞株に適用された培養条件は、培養プロトコルが、細胞生存率に悪影響を与えることなく、標準的な製造方法によるよりも長く継続することを可能にする。標準的な製造方法は、生物反応器中の１２日間を平均化することができ、その時点で、培養物中に存在する細胞片の増加のために、細胞生存率の減少がある。細胞生存率の損失と関連付けられることに加えて、細胞片は、濾過および精製と関連付けられる課題を劇的に増加させる。本発明のいくつかの実施形態では、細胞を、所定の細胞密度で生物反応器中に播種し、＞１２日間培養する。いくつかの実施形態では、細胞を、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１日以上の間、許容可能な生存細胞密度を有する生物反応器中に培養する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐを、最適に製造されたＧＬ−２０４５の最適化された上流製造のための基礎培地として使用する。本明細書で相互変換可能に使用されるような「ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ」および「最適化された培地」という用語は、市販のＡｃｔｉＣＨＯ（登録商標）基礎培地（「ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ」ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、その任意の実質的なコピー、またはＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐと実質的に同じ分量中に実質的に同じ構成物質を含む培地を指す。ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐはまた、ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐとほぼ同一の生成物であり、これらの開示の目的のための等価的試薬である、ハイクローン「ＡｃｔｉＰｒｏ」としても、最近ＧＥによって販売されている。いくつかの実施形態では、ＡｃｔｉＣＨＯ（登録商標）餌料Ａおよび餌料Ｂ（ＡｃｔｉＣＨＯ（登録商標）餌料Ａおよび餌料Ｂと同一の生成物であり、この開示の目的のための等価的試薬である、ハイクローン「Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ａ」およびハイクローン「Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ７ｂ」としても、最近ＧＥによって販売されている）を、基礎培地に加えて使用する。本明細書で相互変換可能に使用されるような「ＡｃｔｉＣＨＯ餌料Ａ」もしくは「最適化された餌料Ａ」、および本明細書で相互変換可能に使用されるような「ＡｃｔｉＣＨＯ餌料Ｂ」もしくは「最適化された餌料Ｂ」という用語は、市販のＡｃｔｉＣＨＯ（登録商標）給餌（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、その実質的なコピー、またはＡｃｔｉＣＨＯ餌料Ａおよび／もしくはＡｃｔｉＣＨＯ餌料Ｂと実質的に同じ分量中に実質的に同じ構成物質を含む給餌を指す。本発明のいくつかの態様では、ＧＬ−２０４５発現ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に、ＡｃｔｉＣＨＯ餌料Ａおよび餌料Ｂを毎日給餌する。本発明のいくつかの態様では、ＧＬ−２０４５発現ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に、ＡｃｔｉＣＨＯ餌料Ａおよび餌料Ｂを１日おきに給餌する。本発明のいくつかの態様では、ＧＬ−２０４５発現ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に、ＡｃｔｉＣＨＯ餌料Ａおよび餌料Ｂを連続的な給餌を介して給餌する。
【００６６】
最適化された上流製造方法のいくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５発現ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、温度シフト前に、特定の細胞密度まで成長させる。いくつかの態様では、ＣＨＯ細胞を、温度シフト前に、約５００万〜３０００万細胞／ｍＬの密度まで成長させる。いくつかの態様では、細胞を、温度シフト前に、約６００万、７００万、８００万、９００万、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、または約３０００万細胞／ｍＬの密度まで成長させる。いくつかの態様では、ＣＨＯ細胞を、温度シフト前に、約１０００万〜２５００万細胞／ｍＬの密度まで成長させる。最適化された製造方法のいくつかの態様では、ＣＨＯ細胞を、温度シフト前に、約１０００万〜１５００万細胞／ｍＬの密度まで成長させる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５発現ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、所定の細胞密度に到達するまで、３７℃±１℃で培養する。いくつかの態様では、温度を、細胞が所定の細胞密度に到達した後に、３２．５℃±１℃にシフトさせる。この態様は、細胞を所定の日数の間３７℃で培養し、その後、温度を３１℃にシフトさせることが多い、以前に記載されている組み換えタンパク質の生成のための培養方法（Ｏｕｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５２（３），ｐｐ．１９９−２０７，（２００６）；Ｍａｓｔｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｍａｌｅｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，２（１），ｐｐ．４９−６１，（２０１４））とは対照的である。本発明者らは、培養時間ではなく細胞密度に基づく、３７℃±１℃〜３２．５℃±１℃への温度シフトは、思いがけず、標準的な上流製造方法に対する、生存率の増加、細胞密度の改善、タンパク質力価の実質的な増加の組み合わせを提供することを判定した。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５発現ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、二重温度シフトに供する。一実施形態では、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、３７℃±１℃で培養し、ピーク生存細胞密度に到達する前に、３４℃±１℃にシフトさせる。好ましい実施形態では、この温度シフトは、ＣＨＯ細胞がログ成長段階で維持される間に起こる。特に好ましい実施形態では、最初の温度シフトは、培養の３日目または４日目に起こる。別の実施形態では、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、所定の細胞密度に到達するまで、３７℃±１℃で培養し、その時間に、温度は、３４℃±１℃にシフトされる。好ましい実施形態では、細胞密度は、第１の温度シフトで、５００万〜２０００万細胞／ｍｌである。特に好ましい実施形態では、細胞密度は、第１の温度シフトで、８００万〜１５００万細胞／ｍｌである。いくつかの実施形態では、第２の温度シフトは、７±１日目に起こる。いくつかの実施形態では、次に、温度が、３１℃にさらにシフトされる。いくつかの実施形態では、この第２の温度シフトは、最初の温度シフトの約４日後に行われる。
【００６８】
下流製造方法
いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５の採取は、下流製造方法によって達成される。いくつかの実施形態では、下流製造方法を、本明細書に記載される最適化された上流製造方法と組み合わせて用いて、特定のタンパク質画分を除去または単離（例えば、ホモ二量体ＧＬ−２０４５の無秩序高分子量凝集体の除去）する。本明細書で使用される場合、「下流製造方法」は、所望の純度および／または濃度のタンパク質組成物を発生させるためのタンパク質上清に対して行われるタンパク質精製および濾過工程である。いくつかの実施形態では、下流製造方法は、本明細書で「最適化された下流製造方法」と呼ばれる、ＧＬ−２０４５の特定の多量体化プロファイルを生じ、かつ／または維持するために、ＧＬ−２０４５の精製および濾過のために最適化されている。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５は、親和性クロマトグラフィによって精製される。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５は、タンパク質Ａカラムを使用して精製される。以上に記載されたように、タンパク質Ａカラムは、非常に高価であり、経済的に実行可能であるために、かなりの回数再使用される。タンパク質Ａカラムの再使用は、タンパク質結合能を維持するために、タンパク質Ａカラムの「再生」を必然的に伴う。本明細書で使用される場合「再生」または「再生させる」とは、溶出プロセス中に除去されなかったタンパク質Ａカラムからの結合されたタンパク質の除去を指す。いくつかの実施形態では、タンパク質Ａカラムは、ＧＬ−２０４５精製中に、製造業者の指示において示されるよりも頻繁に、またはモノクローナル抗体もしくはＦｃ融合タンパク質を精製するための当該技術分野における通常よりも頻繁に、再生されなければならない。いくつかの実施形態では、タンパク質Ａカラムは、製造業者によって推奨されるよりも少なくとも２倍頻繁に再生されなければならない。さらなる実施形態では、タンパク質Ａカラムは、カラムにわたるＧＬ−２０４５上清の通過の各成功裏のラウンド間に再生されなければならない。そのような実施形態では、タンパク質Ａ親和性カラムを用いたＧＬ−２０４５の精製は、貪欲に結合されたＧＬ−２０４５多量体をタンパク質Ａカラムから除去し、タンパク質Ａカラムの完全な結合能を再生させるために、高度に厳密な再生緩衝液の使用を必然的に伴う。好ましい実施形態では、高度に厳密な再生緩衝液は、タンパク質Ａカラムの劣化を引き起こさないか、またはカラムの劣化がほとんどないことに関連付けられる。いくつかの実施形態では、高度に厳密な再生緩衝液は、可溶性塩基を含む。いくつかの実施形態では、塩基は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）である。いくつかの実施形態では、再生緩衝液は、０．３ＭのＮａＯＨよりも大きいＮａＯＨ濃度を有する。例えば、高度に厳密な再生緩衝液は、０．３５Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１．０Ｍ以上を上回るＮａＯＨであり得る。特定の実施形態では、再生緩衝液中のＮａＯＨの濃度は、０．５ＭのＮａＯＨである。
【００７０】
いくつかの実施形態では、タンパク質Ａ親和性カラムからのＧＬ−２０４５の溶出は、医薬物質からのＧＬ−２０４５の高分子量無秩序凝集体の量を除去または減少させるように最適化される。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５は、溶出勾配（例えば、ｐＨ溶出勾配）によってタンパク質Ａカラムから溶出される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５の最適化された下流製造方法は、親和性クロマトグラフィ（例えば、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィ）による精製、ならびに陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、および疎水性相互作用カラムから選択される少なくとも１つ以上の研磨工程を含む、複数の工程の精製プロセスを含む。好ましい実施形態では、親和性クロマトグラフィ（例えば、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィ）による精製、ならびに陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、および疎水性相互作用カラムの各々による研磨を含む、当該技術分野で一般的に実践される２つまたは３つの工程の精製プロセスの代わりに、ＧＬ−２０４５に対する４工程の精製プロセスが使用される。「研磨」という用語は、古典的に、凝集体、エンドトキシン、ＤＮＡ、および／またはウィルスを含む、残りの不純物のタンパク質Ａ精製後の除去を指す。加えて、ＧＬ−２０４５に関しては、「研磨」とは、さらに、これらの同じクロマトグラフィ技術の使用を通してなど、ホモ二量体および特定のさらに高次の多量体の割合を制御することを意味する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５は、イオン交換クロマトグラフィ（例えば、陽イオンまたは陰イオン交換）によって研磨される。いくつかの実施形態では、イオン交換クロマトグラフィによるＧＬ−２０４５の研磨は、タンパク質Ａ精製後のプロセス中に保持されるＧＬ−２０４５ホモ二量体の無秩序高分子量凝集体の量を低減および／または最小にする溶出緩衝液を用いて行われる。いくつかの実施形態では、タンパク質ＡカラムからＧＬ−２０４５を溶出させるために、段階溶出が行われる。いくつかの実施形態では、タンパク質ＡカラムからＧＬ−２０４５を溶出させるために、勾配溶出が行われる。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、酢酸ナトリウム緩衝液である。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液中の酢酸ナトリウムの濃度は、少なくとも２５ｍＭである。例えば、溶出緩衝液中の酢酸ナトリウムの濃度は、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、１００ｍＭ以上の酢酸ナトリウムであり得る。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、５０ｍＭの酢酸ナトリウムである。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、可変量の追加の塩緩衝液（例えば、ＮａＣｌ緩衝液）の添加を含む５０ｍＭの酢酸ナトリウムである。いくつかの実施形態では、追加の緩衝液は、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５の緩衝液（「緩衝液ｂ」）である。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、少なくとも３０％の緩衝液Ｂを含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、３０％〜４０％の緩衝液Ｂを含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、３５％〜４０％の緩衝液Ｂを含む。またさらなる実施形態では、溶出緩衝液は、３７％〜３９％の緩衝液Ｂを含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、３８％＋／−０．５％の緩衝液ｂを含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５は、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）を使用して研磨される。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５の高分子量無秩序凝集体を除去するために、ＨＩＣカラム（例えば、オクチルＦＦ  ＨＩＣカラム）が選択される。ＨＩＣカラムを用いてＧＬ−２０４５を精製するために、フロースルーモードまたは結合モードのいずれかを行うことができる。当業者は、ｐＨ条件および塩条件などの変数を調製することで、ＧＬ−２０４５がＨＩＣ樹脂に結合するか、またはカラムを通して流動するかが判定されるであろうと理解している。いくつかの実施形態では、ホモ二量体および／またはさらに高次の多量体（例えば、ブチルＨＰおよび／またはフェニルＨＰカラム）などのＧＬ−２０４５の特定の画分を精製するために、ＨＩＣカラムが選択される。いくつかの実施形態では、特定の疾患の兆候の治療のために、ＧＬ−２０４５の特定の画分を単離することが望ましい場合がある。例えば、特定のＧＬ−２０４５画分から構成される医薬物質（例えば、主にＧＬ−２０４５ホモ二量体から構成される医薬物質、主にホモ二量体の二量体から構成される医薬物質、ＧＬ−２０４５のより高秩序の多量体から構成される医薬物質など）を発生させるために、ＨＩＣカラムを使用し得る。ＧＬ−２０４５画分の、別個の生成物への分離は、特定の疾患の兆候に対して有益であり得る。例えば、ＧＬ−２０４５ホモ二量体は、ＦｃγＲＩに結合するが、実質的には、他のＦｃＲに結合する。このように、ＧＬ−２０４５ホモ二量体は、少なくとも部分的に、腹膜炎（Ｈｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖ．１６２，１９９２）または急性肺損傷（Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖ  １８８，２０１２）などを信号伝達するＦｃγＲＩによって媒介される疾患の治療に特に有用であり得る。同様に、ＧＬ−２０４５の三量体、潜在的に、二量体および四量体は、自己免疫疾患を治療するために特に有用であり得る（ＷＯ２０１５／１６８６４３を参照のこと）。Ｃ１ｑは六量体であるので、五量体、六量体、および七量体は、補体媒介疾患の治療に特に有用であり得る。当業者であれば、これらは、ＧＬ−２０４５画分が特定の疾患を治療するのに有益であり得る方法のうちの単なるいくつかであることを認識するであろう。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される最適化された下流製造方法は、個々の精製および／または濾過技術の組み合わせであり得る。例えば、いくつかの実施形態では、最適化された下流方法は、親和性クロマトグラフィによるＧＬ−２０４５の精製（例えば、タンパク質Ａカラムについての最適化方法による精製）、引き続きイオン交換クロマトグラフィ方法による追加の研磨（例えば、最適化された陽イオン交換方法による研磨）、および／または疎水性相互作用カラムを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される最適化された下流方法は、タンパク質Ａ、陽イオン交換、陰イオン交換フロースルー、および疎水性相互作用カラムによる精製を含む、４工程の精製プロセスを含む。いくつかの実施形態では、追加の深層濾過および／または超濾過工程も、使用され得る。
【００７５】
したがって、本明細書で相互変換可能に使用される「最適な製造方法」または「最適化された製造方法」という用語は、最適化された上流および／または最適化された下流製造方法を指し得る。いくつかの実施形態では、最適化された製造方法は、最適化された上流方法および下流方法の両方を含む。このように、本明細書で使用される場合、「最適に製造されたストラドマー」または「最適に製造されたＧＬ−２０４５」という用語は、最適化された上流製造条件および／または最適化された下流製造方法に従って作製された高力価で高次の多量体優性ＧＬ−２０４５組成物を指す。本明細書に記載されるＧＬ−２０４５組成物は、最適に生成されたＧＬ−２０４５（すなわち、本明細書に記載される方法によって作製されたＧＬ−２０４５）であり得るが、当業者であれば、本明細書に記載される定義された多量体パターン内に該当するＧＬ−２０４５組成物を、他の手段によって達成することができることを理解するであろう。したがって、「ＧＬ−２０４５組成物」または「組み換えＧＬ−２０４５組成物」または「精製ＧＬ−２０４５組成物」とは、組成物が最適な製造方法を介して作製されたか否かにかかわらず、ＧＬ−２０４５医薬物質を含む、ＧＬ−２０４５を含む組成物を指す。本明細書では、「多量体パターン」もしくは「バンドパターン」という用語または任意の類似の用語は、相互変換可能に使用され、かつＧＬ−２０４５組成物の分析的アッセイにおいて観察される多量体のパターンを指す。例示的多量体パターンを図３３に示す。。
【００７６】
いくつかの実施形態では、定義された多量体パターンを用いて組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物を本明細書に提供する。本明細書で使用される場合、「定義された多量体パターン」または「定義された多量体化パターン」または「定義されたバンドパターン」という用語は、再生可能であり、かつホモ二量体、さらに高次の多量体、および／または最高次の多量体として存在するＧＬ−２０４５組成物全体の百分率の観点から記載され得るＧＬ−２０４５多量体化のパターンを指す。当業者であれば、ホモ二量体および／または多量体の百分率の絶対値が使用される分析的方法に基づいて変化し得ることを理解するであろう。例としては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデジタルソフトウエア分析であれば、同一の組成物の分析的ＳＥＣ−ＨＰＬＣと比較して、いくらか異なる多量体の百分率を生じるであろう。本明細書で別段明記されない限り、本明細書に記載されるＧＬ−２０４５組成物のホモ二量体および多量体の百分率は、分析的ＳＥＣ−ＨＰＬＣ方法によって測定される百分率として発現される。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５の少なくとも８０％が、非ホモ二量体または「多量体」（例えば、ホモ二量体の二量体、ホモ二量体の三量体など）として存在する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５を提供する。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５の８０％超が、多量体として存在する。例えば、本明細書に記載されるようなものなどの最適化された製造方法は、ＧＬ−２０４５の８０％、８５％、９０％、９５％以上が多量体として存在する、ＧＬ−２０４５タンパク質組成物を生じ得る。いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５の少なくとも３０％は、ホモ二量体の７マー以上として本明細書に定義される「最高次の多量体」として存在する。いくつかの実施形態では、組み換え生成されたＧＬ−２０４５のわずか４０％は、最高秩序多量体として存在する。当業者であれば、「バンド」または「画分」について話す場合、別段明記されない限り、バンドの数が、画分中に存在するホモ二量体の数を内包することを理解するであろう。したがって、例えば、２バンドは、ホモ二量体の二量体を含み、３バンドは、ホモ二量体の三量体を含む。したがって、例えば、２バンドは、ホモ二量体の二量体を含み、３バンドは、ホモ二量体の三量体を含み、４バンドは、ホモ二量体の四量体を含むなどである。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「さらに高次の多量体」とは、ホモ二量体の三量体以上（すなわち、３画分以上に存在する多量体）を指す。本明細書で使用される場合、「最高次の多量体」という用語は、７画分以上における多量体、またはホモ二量体の７マー以上を含む画分を指す。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ホモ二量体画分が組成物全体の約２０％未満を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ホモ二量体画分は、タンパク質組成物全体の約１２％〜約１９％、約１４％〜約１９％、約１５．５％〜約１７．５％、または約１４％〜約１８．５％を構成する。いくつかの実施形態では、ホモ二量体画分は、タンパク質組成物全体の約１５．９％または約１６．２％を構成する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ホモ二量体の二量体画分が、組成物全体の約７％〜約１３％、約７％〜約１２．５％、約７％〜約１２％、約９％〜約１１％、または約９．１％〜約１１．７％を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ホモ二量体の二量体画分は、タンパク質組成物全体の約１０％または約１０．６％を構成する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、ホモ二量体の三量体画分が、組成物全体の約５．５％〜約１１％、約５．５％〜約１０％、または約６．５％〜約８％を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ホモ二量体の三量体画分は、タンパク質組成物全体の約７％または約７．３％を構成する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ホモ二量体の四量体画分が、組成物全体の約１０％〜約１６％、約１１％〜約１６％、約１３％〜約１５％、または約１２．４％〜約１５．１％を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ホモ二量体の四量体画分は、タンパク質組成物全体の約１４％または約１４．３％を構成する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、ホモ二量体の五量体画分が、組成物全体の約６％〜約９％、約７％〜約８％、または約７．１％〜約８．２％を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物を提供する。いくつかの実施形態では、五量体画分の二量体は、タンパク質組成物全体の約７％または約７．５％を構成する。
【００８３】
いくつかの実施形態では、ホモ二量体の六量体画分が、組成物全体の約１０％〜約１４％、約１２％〜約１３％、または約１２．１％〜約１３．２％を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ホモ二量体の六量体画分は、タンパク質組成物全体の約１２．７％または約１２．６％を構成する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、最高次の多量体画分が、組成物全体の少なくとも約２８％を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物を提供する。いくつかの実施形態では、最高次の多量体画分は、タンパク質組成物全体のわずか約３５％を構成する。いくつかの実施形態では、最高次の多量体画分は、タンパク質組成物全体の約３０％〜約３４％、または約２８．６％〜約３５．１％を構成する。いくつかの実施形態では、最高次の多量体画分は、タンパク質組成物全体の約３１．４％または約３１．９％を構成する。いくつかの実施形態では、ホモ二量体画分が組成物全体の約２０％未満を構成し、最高次の多量体画分が組成物全体の少なくとも約２８％を構成し、ホモ二量体の二量体画分が組成物全体の約７％〜約１３％を構成し、ホモ二量体の三量体画分が組成物全体の約５％〜約１１％を構成し、ホモ二量体の四量体画分が組成物全体の約１０％〜約１６％を構成し、ホモ二量体の五量体画分が組成物全体の約６％〜約１０％を構成し、ホモ二量体の六量体画分が画分全体の約１０％〜約１４％を構成し、ホモ二量体の二量体〜ホモ二量体の六量体画分が組成物全体の約４０％〜約６０％を構成し、ホモ二量体の三量体〜ホモ二量体の六量体画分が組成物全体の約３２％〜約５０％を構成し、ホモ二量体の四量体〜ホモ二量体の六量体画分が組成物全体の約３０％〜約３７％を構成し、ホモ二量体の五量体〜ホモ二量体の六量体画分が組成物全体の約１８％〜約２３％を構成し、または前述の任意の組み合わせである、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物を提供する。
【００８５】
いくつかの実施形態では、ＧＬ−２０４５組成物全体のおよそ８０％がホモ二量体の二量体以上（すなわち、２バンド以上）を含む、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物全体のおよそ６０〜８０％、６２〜８０％、または６０〜７８％は、ホモ二量体の三量体以上（すなわち、バンド３以上）を含む。いくつかの実施形態では、組み換え生成されたＧＬ−２０４５組成物全体の約５４〜７６％、約５４〜７２％、約５６〜７６％、または約５４〜６７％は、四量体以上（すなわち、バンド４以上）を含む。いくつかの実施形態では、組成物全体のおよそ４４〜６０％、４４〜５７％、または４４〜５１％が五量体以上（すなわち、バンド５以上）を含む、ＧＬ−２０４５組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物全体のおよそ３８〜５１％が六量体以上（すなわち、バンド６以上）を含む、ＧＬ−２０４５組成物を提供する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、組成物の２〜６バンド（すなわち、ホモ二量体の二量体〜ホモ二量体の六量体）が組成物の約３９〜６１％または約４４〜６０％を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５を提供する。いくつかの実施形態では、組成物の３〜６バンド（すなわち、ホモ二量体の三量体〜ホモ二量体の六量体）が組成物の約３２〜５０％または約３５〜４８％を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５を提供する。いくつかの実施形態では、組成物の４〜６バンド（すなわち、ホモ二量体の四量体〜ホモ二量体の六量体）が組成物の約２６〜３９％または約３０〜３９％を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５を提供する。いくつかの実施形態では、組成物の５〜６バンド（すなわち、ホモ二量体の五量体〜ホモ二量体の六量体）が組成物の約１６〜２３％または約１８〜２３％を構成する、組み換え生成されたＧＬ−２０４５を提供する。
【００８７】
理論に縛られないが、低親和性Ｆｃ受容体およびＣ１ｑへの結合におけるＧＬ−２０４５の少なくとも活性構成要素は、ホモ二量体およびホモ二量体の二量体である。当業者であれば、本明細書に記載される最適化されたクロマトグラフィ方法、または同様の精製技術を使用して、最終生成物中のホモ二量体またはホモ二量体および二量体の量を低減させることができると容易に理解するであろう。したがって、当業者であれば、そうすることで、本明細書に記載される多量体の百分率を変更すると知っているであろう。例示の方法によって、かつ前述の一般性を制限することなく、当業者が精製プロセスにおいてホモ二量体またはホモ二量体および二量体の５０％を除去する場合、各残りの多量体（すなわち、三量体、四量体、五量体、六量体、７マーなど）の百分率は、それに応じて増加するであろう。ホモ二量体の９０％および二量体の５０％を除去すれば、最終生成物中に存在するタンパク質全体をおよそ２０％＋／−５％を減少させ、したがって、タンパク質全体の割合として表される、三量体、四量体、五量体、六量体、および７マーの百分率を増加させるであろう。
【００８８】
その上、当業者であれば、現在のクロマトグラフィ技術は、一般に、ある程度まで六量体などの隣接するバンドを、かつ比較的低い程度まで五量体を、同時に除去しなければ、最高次の多量体などの単一の多量体バンドの除去または低減を可能にしないことをさらに認識しているであろう。したがって、当業者であれば、最高次の多量体の除去または低減の結果としてのホモ二量体の任意の所与の多量体の百分率における観察される代償性増加が、除去されるＧＬ−２０４５の画分由来の所与の多量体よりも大きい程度増加することを知っているであろう（例えば、ホモ二量体の百分率は、最高次の多量体が除去または低減されたときに六量体について観察される百分率の増加よりも大きい程度増加するであろう）。いずれの場合でも、残りの多量体の多量体百分率の累積増加は、分析的方法に起因する何らかのばらつきに依存して、除去された画分についての多量体の割合に等しいべきである。
【００８９】
医薬組成物
本明細書に記載されるＧＬ−２０４５組成物の投与は、任意の一般的な経路を介して、経口で、非経口で、または局所になされるであろう。例示的経路は、縫合などの移植可能デバイス上に、または移植可能ポリマー、硬膜内、皮質内、または皮膚などの移植可能デバイス内に統合された、経口、経鼻、口腔、直腸、膣、眼、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、動脈内、腫瘍内、脊椎、髄腔内、関節内、動脈内、くも膜下、舌下、口腔粘膜、気管支、リンパ管、子宮内、皮下、腫瘍内を含むがこれらに限定されない。そのような組成物は、通常、本明細書に記載されるような薬学的に許容可能な組成物として投与されるであろう。好ましい実施形態では、単離された最適に製造されたストラドマーを、静脈内に、または皮下に投与する。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、任意および全ての溶剤、分散培地、被覆、抗菌性および抗真菌性薬剤、等張および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような培地および薬剤の使用は、当該技術分野でよく知られている。任意の従来の培地または薬剤は、本発明のベクターまたは細胞と互換性がない場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が考えられる。補助的活性成分を、組成物中に組み込むこともできる。
【００９１】
本発明のＧＬ−２０４５組成物を、中性形態または塩形態で製剤化してもよい。薬学的に許容可能な塩は、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石、マンデルなどの有機酸と共に形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と共に形成される）を含む。遊離カルボキシル基と共に形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基からも得ることができる。
【００９２】
無菌注射可能な溶液は、上記に列挙される様々な他の成分を含む適切な溶剤中に必要とされる量で最適に製造されたＧＬ−２０４５を組み込み、必要に応じて、その後濾過殺菌することによって調製される。いくつかの実施形態では、筋肉内、皮下、または静脈内投与のために、無菌注射可能な溶液を製剤化する。概して、分散液は、基礎分散培地および上記に列挙されるものからの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクル内に様々な殺菌された活性成分を組み込むことによって調製される。無菌注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末＋その以前に無菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分を産出する真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【００９３】
さらに、一実施形態は、経口投与に好適なＧＬ−２０４５組成物であり、不活性希釈剤を含むか、または含まない薬学的に許容可能な担体中に提供される。担体は、同化可能であるか、または食用であるべきであり、かつ液体、半固体（例えば、ペースト）、または固体担体を含む。任意の従来の培地、薬剤、希釈剤、または担体が、内部に含有される最適に製造されたストラドマー調剤薬の受容性または治療有効性にとって有害である場合を除いて、本発明の方法の実践において使用するための経口で投与可能な最適に製造されたストラドマー組成物におけるその使用が適切である。担体もしくは希釈剤の例には、脂肪、油、水、生理食塩水、脂質、リポソーム、樹脂、バインダー、充填剤など、またはそれらの組み合わせが含まれる。本明細書で使用される場合、「経口投与」という用語は、経口、口腔、経腸、または経胃投与を含む。
【００９４】
一実施形態では、ＧＬ−２０４５組成物は、任意の従来の実践的な方法における、すなわち、溶液、懸濁、乳化、混和、カプセル化、マイクロカプセル化、吸収などによる、担体と組み合わされる。そのような手順は、当業者にとってはルーチンである。
【００９５】
特定の実施形態では、粉末形態でのＧＬ−２０４５組成物は、半固体または固体担体と完全に組み合わされる、または混合される。混合は、粉砕などの任意の従来の方法で実行され得る。治療活性の欠落（例えば、胃の変性を通して）から組成物を保護するために、混合プロセスにおいて安定剤を添加することもできる。経口で投与可能な組成物において使用するための安定剤の例には、緩衝液、胃酸の分泌物に対する拮抗薬、グリシンおよびリジンなどのアミノ酸、ブドウ糖、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトールなどの炭水化物、タンパク質分解酵素抑制剤などが含まれる。より好ましくは、経口で投与された組成物について、安定剤は、胃酸の分泌物に対する拮抗薬を含むこともできる。
【００９６】
さらに、半固体または固体担体と組み合わせられた経口投与のためのＧＬ−２０４５組成物を、硬質もしくは軟質シェルゼラチンカプセル、タブレット、またはピルへとさらに製剤化することができる。より好ましくは、ゼラチンカプセル、タブレット、またはピルを、経腸的に被覆する。腸溶性被覆は、ｐＨが酸性である胃または上部腸内の組成物の変性を防止する。米国特許第５，６２９，００１号を参照されたい。小腸に到達した際、内部の基礎ｐＨが被覆を溶解させ、組成物を放出して腸管細胞、例えば、パイエル板Ｍ細胞と相互作用することを可能にする。
【００９７】
別の実施形態では、粉末形体でのＧＬ−２０４５組成物は、免疫学的に活性な生体模倣薬をカプセル化するナノ粒子を創成するか、または免疫学的に活性な生体模倣薬が付着される材料と完全に組み合わされるか、または混合される。各ナノ粒子は、１００ミクロン以下のサイズを有するであろう。ナノ粒子は、別様に、経口で生物利用ができないであろう、免疫学的に活性な生体模倣薬の胃腸吸収を可能にする粘膜接着特性を有し得る。
【００９８】
別の実施形態では、粉末状組成物を、安定剤を含むか、もしくは含まない、水もしくは生理食塩水などの液体担体と組み合わせる。
【００９９】
使用され得る特定のＧＬ−２０４５製剤は、緩衝液の組成物が以下の通り：６ｍＭのリン酸ナトリウム一塩基一水和物、９ｍＭのリン酸ナトリウム二塩基七水和物、ｐＨ７．０＋／−０．１の５０ｍＭの塩化ナトリウム、カリウムを含まない低張リン酸塩ベースの緩衝液中の免疫学的に活性な生体模倣薬タンパク質の溶液である。低張緩衝液中の免疫学的に活性な生体模倣薬タンパク質の濃度は、１０μｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。この製剤は、任意の投与経路、例えば、限定されないが、静脈内投与を介して投与され得る。
【０１００】
さらに、半固体担体と組み合された局所投与のためのＧＬ−２０４５組成物を、クリームまたはゲル軟骨へとさらに製剤化することができる。ゲル軟骨の形成のために好ましい担体は、ゲルポリマーである。本発明のゲル組成物を製造するのに使用される好ましいポリマーは、カルボポール、カルボキシメチルセルロース、およびプルロニックポリマーを含むがこれらに限定されない。具体的には、粉末状Ｆｃ多量体組成物を、皮膚の上または真下の疾患の治療のための皮膚への適用のために、０．５重量％〜５重量％／体積の強度でカルボポール９８０などのポリマー化剤を含有する水性ゲルと組み合わせる。本明細書で使用される場合、「局所投与」という用語は、皮膚、表皮性、皮下、または粘膜表面への適用を含む。
【０１０１】
さらに、ＧＬ−２０４５組成物を、皮下または皮下移植のためにポリマーへと製剤化することができる。移植可能な薬物注入ポリマーのために好ましい製剤は、一般に安全とみなされる薬剤であり、例えば、交差結合デキシトランを含み得る（Ｓａｍａｎｔｈａ  Ｈａｒｔ，Ｍａｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｈｅｓｉｓ，“Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｄｅｘｔｒａｎ  Ｇｅｌ：Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ“Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｕｎｅ  ８，２００９）ｄｅｘｔｒａｎ−ｔｙｒａｍｉｎｅ（Ｊｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．Ｐａｒｔ  Ａ．１６（８）：２４２９−４０），ｄｅｘｔｒａｎ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ（Ｊｕｋｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．Ｐａｒｔ  Ａ．，１６（２）：５６５−７３），ｏｒ  ｄｅｘｔｒａｎ−ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ（Ｂｒｏｎｄｓｔｅｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，５３：７−１３）。当業者であれば、ポリマーまたはヒドロゲル内に固着されたストラドマーを組み込み、かつ細孔径を所望の直径に制御する、多くの同様のポリマーおよびヒドロゲルを形成することができることを知るであろう。
【０１０２】
製剤に対して、投与製剤と互換性のある方法で、かつ症状の改善または修復をもたらすのに治療的に効果的である量で、溶液を投与する。製剤は、摂取可能な溶液、薬物放出カプセルなどの様々な剤形で容易に投与される。治療される対象の状態に応じて、投与の何らかの変形が生じ得る。投与に対して責任を負う人は、いかなる場合も、個々の対象に適切な用量を判定することができる。さらに、ヒトへの投与について、製剤は、必要に応じて、ＦＤＡ生物学的製剤評価研究センター標準規格による、無菌状態、一般的安全性、および純度標準規格を満たす。
【０１０３】
投与の経路は、治療される疾患の場所および性質により必然的に変化し、かつ例えば、皮内、経皮的、皮下、非経口、経鼻、静脈内、筋肉内、鼻腔内、皮下、経皮、気管内、腹腔内、腫瘍内、かん流、洗浄、直接注入、直腸内、および経口投与を含み得る。
【０１０４】
一実施形態では、ＧＬ−２０４５組成物は、静脈内に、皮下に、経口で、腹腔内に、舌下に、口腔的に、経皮的に、直腸的に、皮下移植によって、または筋肉内に投与される。特定の実施形態では、最適に製造されたストラドマーは、静脈内に、皮下に、または筋肉内に投与される。一実施形態では、最適に製造されたストラドマーは、約０．００５ｍｇ／Ｋｇ〜約１０００ｍｇ／Ｋｇの用量で投与される。さらなる実施形態では、最適に製造されたストラドマーは、約０．０１ｍｇ／Ｋｇ〜約１００ｍｇ／Ｋｇで投与される。またさらなる実施形態では、最適に製造されたストラドマーは、約０．１ｍｇ／Ｋｇ〜約２０ｍｇ／Ｋｇで投与される。またさらなる実施形態では、最適に製造されたストラドマーは、約１ｍｇ／Ｋｇ〜約１０ｍｇ／Ｋｇで投与される。またさらなる実施形態では、最適に製造されたストラドマーは、約２ｍｇ／Ｋｇ〜約５ｍｇ／Ｋｇで投与される。最適に製造されたストラドマーは、少なくとも毎日、毎週、隔週、毎月、または時にはより長い間隔で投与され得る。第１の投与段階が第２の投与段階の約０．１％〜約３００％を構成する、二相性投与計画を使用してもよい。
【０１０５】
さらなる実施形態では、ＧＬ−２０４５組成物は、１つ以上の追加の医療品および／もしくは治療薬の投与前、中、または後に投与される。さらなる実施形態では、追加の薬学的に活性な薬剤は、ステロイド；モノクローナル抗体、融合タンパク質、または抗サイトカインなどの生物学的抗自己免疫薬物；非生物学的抗自己免疫薬物；免疫抑制剤；抗菌；および抗ウィルス薬；サイトカイン；または別様に、免疫調節薬として作用することができる薬剤を含む。またさらなる実施形態では、ステロイドは、プレドニゾン、プレドニゾロン、コルチゾン、デキサメタゾン、モメタゾンテストテロン、エストロゲン、オキサンドロロン、フルチカゾン、ブデソニド、ベクロメタゾン、アルブテロール、またはレブアルブテロールである。またさらなる実施形態では、モノクローナル抗体は、エクリズマブ、オクレリズマブ、インフリキシマブ、アダリムマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、ゴリムマブ、オファツムマブ、ＬＹ２１２７３９９、ベリムマブ、ベルツズマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、ジヌツキシマブ、セクキヌマブ、エボロクマブ、ブリナツモマブ、ペムブロリズマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、シルツキシマブ、オビヌツズマブ、アドトラスツズマブ、ラキシバクマブ、ペルツズマブ、ブレンツキシマブ、イピルムマブ、デノスマブ、カナキヌマブ、ウステキヌマブ、カツマキソマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、ナタリズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、オマリズマブ、トイツモマブ−Ｉ１３１、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、トラスツズマブ、パリビズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、アブシキマブ、ムロノノマブ、ベドチン、イブリツモマブチウキセタン、モタビツマブ、またはセルトリズマブである。またさらなる実施形態では、融合タンパク質は、エタネルセプトまたはアバタセプトである。またさらなる実施形態では、抗サイトカイン生物製剤は、アナキンラである。またさらなる実施形態では、抗リウマチ非生物学的薬物は、シクロホスファミド、メトトレキサート、アザチオプリン、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、ミノサイクリン、有機金化合物、フォスタマチニブ、トファシチニブ、エトリコキシブ、またはスルファサラジンである。またさらなる実施形態では、免疫抑制剤は、シクロスポリンＡ、タクロリムス、シロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、エベロリムス、ＯＫＴ３、抗胸腺細胞グロブリン、バシリキシマブ、ダクリズマブ、またはアレムツズマブである。またさらなる実施形態では、最適に製造されたストラドマーは、化学療法薬の投与前、中、または後に投与される。またさらなる実施形態では、最適に製造されたストラドマーおよび追加の治療薬は、一緒に投与されたときに、治療的相乗効果を示す。一実施形態では、最適に製造されたストラドマーは、追加の治療薬の投与前に投与される。別の実施形態では、最適に製造されたストラドマーは、追加の治療薬の投与と同時に投与される。また別の実施形態では、最適に製造されたストラドマーは、追加の治療薬と共に投与後に投与される。
【０１０６】
一実施形態では、ＧＬ−２０４５組成物は、移植可能デバイスに共有結合的に固着された状態で投与される。一実施形態では、最適に製造されたストラドマーは、縫合に固着される。別の実施形態では、最適に製造されたストラドマーは、移植片またはステントに固着される。別の実施形態では、最適に製造されたストラドマーは、心臓弁、整形外科関節置換、または移植された電子リードに固着される。別の実施形態では、最適に製造されたストラドマーは、移植可能マトリックスに固着され、かつ移植可能マトリックス内に埋め込まれる。好ましい実施形態では、最適に製造されたストラドマーは、移植可能ヒドロゲルに固着され、かつ移植可能ヒドロゲル内に埋め込まれる。一実施形態では、ヒドロゲルは、デキストラン、ポリビニルアルコール、ナトリウムポリアクリレート、またはアクリレートポリマーから構成される。さらなる実施形態では、最適に製造されたストラドマーは、免疫細胞の入口が固着されたストラドマーと相互作用し、次に血液循環に戻ることを可能にするのに十分大きい細孔径を有するヒドロゲル内に固着された状態で投与される。さらなる実施形態では、ヒドロゲルの細孔径は、５〜５０ミクロンである。好ましい実施形態では、ヒドロゲルの細孔径は、２５〜３０ミクロンである。
【０１０７】
別の実施形態では、ＧＬ−２０４５組成物は、種特異的またはキメラストラドマー分子を有する、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル、ヒヒ、およびチンパンジー）、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタ、ウサギ、ヤギ、シカ、ヒツジ、フェレット、アレチネズミ、モルモット、ハムスター、コウモリ、トリ（例えば、ニワトリ、七面鳥、およびダック）、魚、および爬虫類を治療するために投与される。別の実施形態では、ヒトは、大人または子供である。また別の実施形態では、最適に製造されたストラドマーは、補体媒介疾患を予防するために投与される。さらなる実施形態では、ストラドマーは、コンパニオン動物および家畜におけるワクチン関連自己免疫状態を予防するために投与される。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「非経口投与」という用語は、腸を介した吸収を伴わずに、化合物が対象内に吸収される任意の投与形態を含む。本発明で使用される例示的非経口投与は、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、腫瘍内、眼球内、経鼻、または関節内投与を含むがこれらに限定されない。
【０１０９】
加えて、本発明のＧＬ−２０４５組成物は、任意選択的に、別の医薬品の前、中、または後に投与され得る。
【０１１０】
以下は、特定の例示的疾患について、示されるように、様々な医薬製剤の分類および投与の好ましい経路についての特定の例である：
【０１１１】
口腔または舌下で溶解可能なタブレット：アンギナ、結節性多発動脈炎。
【０１１２】
静脈内、筋肉内、または皮下：重症筋無力症、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、非定型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、膜性腎症、視神経脊髄炎、同種移植の抗体媒介拒否、ループス腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、特発性血小板減少性紫斑病、封入体筋炎、パラプロテイン血症性ＩｇＭ脱髄性多発性ニューロパシー、壊疽性筋膜炎、天疱瘡、壊疽、皮膚筋炎、肉芽腫、リンパ腫、肺血症、再生不良性貧血、多系統臓器不全、多発性骨髄腫、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症、慢性炎症性脱髄性多発根神経、炎症性筋疾患、血栓性血小板減少性紫斑病、筋炎、貧血症、新生組織形成、溶血性貧血症、脳炎、脊髄炎、ヒトｔ細胞白血病ウィルス１型と特に関連付けられる脊髄症、白血病、多発性硬化症および視神経炎、ぜんそく、表皮壊死症、Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｅａｔｏｎ筋無力症候群、神経障害、ブドウ膜炎、ギラン・バレー症候群、移植片対宿主病、スティフマン症候群、抗Ｙｏ抗体を有する傍腫瘍性小脳変性、抗Ｈｕ抗体を有する腫瘍随伴性脳脊髄症および感覚性神経障害、全身性血管炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫糖尿病性神経障害、急性突発性自律神経障害、フォークト・小柳・原田症候群、多巣性運動ニューロパシー、抗／ＧＭ１と関連付けられる下位運動ニューロン症候群、脱髄、膜性増殖性糸球体腎炎、心筋症、川崎病、リウマチ性関節炎、およびエバンス症候群、ＣＩＤＰ、ＭＳ、皮膚筋炎、筋ジストロフィー。本明細書で使用される場合、「静脈内投与」という用語は、静脈内注入もしくは点滴を介して体循環へと送達するための全ての技術を含む。
【０１１３】
皮膚ゲル、ローション、クリーム、またはパッチ：白斑、帯状疱疹、にきび、口唇炎。
【０１１４】
肛門坐薬、ゲル、または点滴：潰瘍性結腸炎、痔炎症。
【０１１５】
ピル、トローチ、被嚢性として、または腸溶性被覆による口腔：クローン病、セリアック病、過敏性腸症候群、炎症性肝臓疾患、バレット食道。
【０１１６】
皮質内：てんかん、アルツハイマー病、多発性硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病。
【０１１７】
腹腔内点滴または移植：子宮内膜症。
【０１１８】
医療デバイス：冠動脈ステント、人工関節上で被覆される。
【０１１９】
最適に製造されたＧＬ−２０４５の治療用途
一実施形態では、自己免疫疾患、炎症性疾患、または補体媒介疾患もしくは状態などの疾患もしくは状態を治療または予防するための方法を提供する。
【０１２０】
合理的設計ならびにインビトロおよびインビボ検証に基づいて、本発明の最適に製造されたＧＬ−２０４５は、炎症性疾患および障害を治療するための、ならびにアレルギー、癌、自己免疫疾患、感染性疾患、および炎症性疾患に対する生物免疫療法などの様々な他の状況において免疫機能を変更するための重要な生物医薬品として機能するであろう。本明細書に開示される免疫学的に活性な最適に製造されたＧＬ−２０４５を用いた治療に好適な医学的状態は、増加されたもしくは不適切な補体活性を含む、補体活性化もしくは補体媒介エフェクター機能により引き起こされるか、またはこれと関連付けられる任意の疾患を含む。そのような医学的状態は、エクリズマブなどの補体結合薬物を用いて現在治療されているか、または以前に治療された医学的状態を含む。エクリズマブは、補体タンパク質Ｃ５（古典的補体経路におけるＣ１およびＣ１ｑの下流である補体タンパク質）に結合し、その開裂およびその後の補体媒介細胞溶解を抑制する。本発明の生体模倣薬は、当該技術分野で知られている他の補体結合薬物に対する安全かつ効果的な代替品を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の生体模倣薬は、古典的補体経路のＣ１複合体における第１のサブ単位である、Ｃ１ｑを結合させる。免疫学的に活性な最適に製造されたストラドマーを用いた治療に好適な医学的状態は、重症筋無力症、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、非定型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、膜性腎症、視神経脊髄炎、拒同種移植の抗体媒介拒否、ループス腎炎、黄斑変性症、鎌状赤血球病、および膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）を含むがこれらに限定されない。本明細書に記載される免疫学的に活性な最適に製造されたＧＬ−２０４５の治療に好適な追加の医学的状態は、自己免疫血球減少症、慢性炎症脱髄性多発性ニューロパシー、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、抗因子ＶＩＩＩ自己免疫疾患、皮膚筋炎、血管炎、およびブドウ膜炎などのｈＩＶＩＧが臨床的に有用であると見出された、広範囲の免疫抑制療法を用いて現在ルーチン的に治療されているもの（Ｆ．Ｇ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２６，１１２３（１９９２）；Ｐ．Ｇａｊｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｌａｎｃｅｔ  ｉ，４０６（１９８４）；Ｙ．Ｓｕｌｔａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｌａｎｃｅｔ  ｉｉ，７６５（１９８４）；Ｍ．Ｃ．Ｄａｌａｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２９，１９９３（１９９３）；Ｄ．Ｒ．Ｊａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３３７，１１３７（１９９１）；Ｐ．ＬｅＨｏａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｃｕｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｆｌａｍｍ．８，４９（２０００）を参照のこと）、ならびにモノクローナル抗体が使用され得るか、またはすでに臨床使用されているこうした癌もしくは炎症性疾患状態を含む。この発明の対称である化合物によって効果的に治療され得るものの中に含まれる状態は、サイトカインネットワークに不均衡を有する炎症性疾患、病原性自己抗体もしくは自己攻撃的Ｔ細胞によって媒介される自己免疫疾患、または急性もしくは慢性期の慢性再発性自己免疫、炎症、あるいは感染性疾患もしくはプロセスを含む。
【０１２１】
加えて、補体を伴う炎症性成分を有する他の医学的状態は、ぜんそく、エリテマトーデス、糸球体腎炎、糸球体腎症、関節炎、自己免疫溶血性貧血症および自己免疫心臓疾患を含む自己抗体媒介疾患、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、炎症性腸疾患、発作性夜間ヘモグロビン尿症、非定型溶血性尿毒症症候群、例として、心筋梗塞、脊髄損傷、および脳卒中を含む虚血再かん流傷害、移植された器官もしくは血液の拒否、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト免疫不全ウィルス関連炎症、副腎脳白質ジストロフィー、ならびにてんかん性障害、特にラスムッセン症候群、ウェスト症候群、およびレノックスガストー症候群を含むウィルス感染後脳炎と関連付けられると考えられるものなどのＧＬ−２０４５組成物を用いた治療から有益を受けるであろう。
【０１２２】
本明細書に記載されるＧＬ−２０４５組成物を使用した治療に対する一般的な手法は、疾患または状態を有する対象に、治療に影響を与えるための治療的に効果的な量のＧＬ−２０４５組成物を投与することである。いくつかの実施形態では、疾患もしくは状態は、サイトカインネットワークにおける不均衡を有する炎症性疾患、病原性自己抗体もしくは自己攻撃的Ｔ細胞によって媒介される自己免疫障害、または急性期もしくは慢性期の慢性再発性疾患もしくはプロセスとして広く分類され得る。
【０１２３】
本明細書に使用される場合、「治療する」および「治療」という用語は、対象が疾患もしくは状態、または疾患もしくは状態の症状の改善を有するように、本発明の最適に製造されたストラドマーの治療的に効果的な量を対象に投与することを指す。改善は、疾患もしくは状態、または疾患もしくは状態の症状の任意の改善もしくは修復である。改善は、観察可能なもしくは測定可能な改善であるか、または対象の健全性の一般的な感覚の改善であり得る。したがって、当業者は、治療は疾患状態を改善させ得るが、疾患についての完全な治癒ではない場合があることを理解している。具体的には、対象の改善は、炎症の減少；Ｃ反応性タンパク質などの炎症性実験室マーカーの減少；自己抗体などの自己免疫マーカーまたは血小板数、白血球数、もしくは赤血球数の改善、発疹もしくは紫斑の減少、脱力、無感覚、もしくはヒリヒリ感の減少、高血糖を有する患者のグルコースレベルの増加、関節痛、炎症、腫れ、もしくは劣化の減少、筋けいれんおよび下痢頻度および体積の減少、アンギナの減少、組織炎症の減少、または発作頻度の減少のうちの１つ以上によって証明されるような自己免疫の低下；癌腫瘍量の減少、腫瘍進行時間の増加、癌疼痛の減少、延命の増加もしくは生活の質の改善；あるいは骨粗しょう症の進行の遅延もしくは改善のうちの１つ以上を含み得る。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「治療的に効果的な量」という用語は、疾患または状態の症状の改善または修復をもたらす量を指す。当業者であれば、本明細書で生成されるＧＬ−２０４５の治療的に効果的な量は最終医薬物質に応じて変化し得ることを理解するであろう。したがって、例えば、全てのより低次の多量体を取り除く必要がある場合、結果として生じるさらに高次の多量体の低減された用量が必要とされ得ると考えられる。このように、ＧＬ−２０４５の１つ超の「治療的に効果的な用量」がある。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「予防」とは、疾患の症状の完全な予防、疾患の症状の発現の遅延、または続いて発症された疾患の症状の重症度の緩和を意味し得る。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本明細書の最適に製造されたストラドマーが本明細書に記載される方法に従って投与される、任意の哺乳動物の対象という意味で捉えられる。特定の実施形態では、本開示の方法は、ヒト対象を治療するために用いられる。本開示の方法はまた、種特異的またはキメラストラドマー分子を生成するために、非ヒト霊長類（例えば、サル、ヒヒ、およびチンパンジー）、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ブタ、ウサギ、ヤギ、シカ、ヒツジ、フェレット、アレチネズミ、モルモット、ハムスター、コウモリ、トリ（例えば、ニワトリ、七面鳥、およびダック）、魚、ならびに爬虫類を治療するために用いられ得る。
【０１２７】
補体抑制は、抗体媒介疾患を低減することが実証されている（Ｓｔｅｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２０１１  Ｎｏｖ；１１（１）：２４０５−２４１３−Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｓｅｐｔ  ２２を参照のこと）。本発明の最適に製造されたストラドマーはまた、抗体媒介である疾患または状態を治療するために使用され得る。自己抗体は、多くの既知の自己免疫疾患を媒介し、多数の他の自己免疫疾患において役割を果たす可能性が高い。本発明の最適に製造されたストラドマーが使用され得る認識された抗体媒介疾患は、グッドバスチャー病を含む抗糸球体基底膜抗体媒介腎炎；固体臓器移植における抗ドナー抗体（ドナー特異的同種抗体）；視神経脊髄炎における抗アクアポリン４抗体；神経筋緊張症における抗ＶＧＫＣ抗体、辺縁系脳炎、およびマルファン症候群；重症筋無力症における抗ニコチン性アセチルコリン受容体および抗ＭｕＳＫ抗体；Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｅａｔｏｎ筋無力症候群における抗ＶＧＣＣ抗体；腫瘍と関連付けられることが多い辺縁系脳炎における抗ＡＭＰＡＲおよび抗ＧＡＢＡ（Ｂ）Ｒ抗体；全身硬直症候群もしくは過剰驚愕症における抗ＧｌｙＲ抗体；反復自然流産、ヒューズ症候群、および全身性エリテマトーデスにおける抗リン脂質、抗カルジオリピン、および抗β２糖タンパク質Ｉ抗体；全身硬直症候群、自己免疫小脳性運動失調症、もしくは辺縁系脳炎における反グルタミン酸脱炭酸酵素抗体；卵巣奇形種と関連付けられることが多いが非腫瘍随伴性であり得る若年成人および子供に多い顕著な運動障害を伴う辺縁系特徴および皮質下特徴の両方を含む、新たに記載される症候群における抗ＮＭＤＡ受容体抗体；抗二重鎖ＤＮＡ、全身性エリテマトーデスにおける抗一本鎖ＤＮＡ、抗ＲＮＡ、抗ＳＭ、および抗Ｃ１ｑ抗体；強皮症、シェーグレン症候群、および抗Ｒｏ、抗Ｌａ、抗Ｓｃｌ７０、抗Ｊｏ−１を含むポリ筋炎を含む結合組織疾患における抗核および抗核小体抗体；リウマチ性関節炎における抗リウマチ因子抗体；結節性多発動脈炎における抗Ｂ型肝炎表面抗原抗体；ＣＲＥＳＴ症候群における抗セントロメア抗体；心内膜炎における、または心内膜炎のリスクとしての抗連鎖球菌抗体；橋本甲状腺炎における抗サイログロブリン、抗甲状腺ペルオキシダーゼ、および抗ＴＳＨ受容体抗体；混合性結合組織疾患および全身性エリテマトーデスにおける抗Ｕ１  ＲＮＰ抗体；ならびに天疱瘡における抗デスモグレインおよび抗ケラチン生成細胞抗体を含むがこれらに限定されない。
【０１２８】
本発明のＧＬ−２０４５組成物は、鬱血性心不全（ＣＨＦ）、血管炎、酒さ、にきび、湿疹、心筋炎および心筋の他の状態、全身性エリテマトーデス、糖尿病、脊椎症、髄液線維芽細胞、ならびに骨髄基質；骨粗しょう；パジェット病、骨巨細胞腫；多発性骨髄腫；乳癌；不使用骨粗しょう症；栄養失調、歯周病、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、脊髄損傷、急性肺血症性関節炎、骨軟化症、クッシング症候群、単骨性線維性骨異形成症、多発性線維性骨形成異常、歯周再構築、および骨折；サルコイドーシス；溶骨性骨癌、肺癌、腎臓癌、および直腸癌；骨転移、骨疼痛管理、および体液性悪性高カルシウム血症、強直性脊椎炎および他の脊椎関節症；移植拒絶反応、ウィルス感染、血液学的新生組織形成および腫瘍様状態、例えば、ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ球性白血病、菌状息肉腫、外套細胞リンパ腫、小胞リンパ腫、びまん性大細胞型ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、毛様細胞白血病、およびリンパ形質細胞性白血病）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫、およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫を含むリンパ球前駆細胞の腫瘍、胸腺腫、末梢Ｔ細胞白血病、大人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫および大型顆粒リンパ球性白血病、ランゲルハンス細胞肉芽腫症を含む成熟ＴおよびＮＫ細胞の腫瘍、成熟したＡＭＬ、分化していないＡＭＬ、急性前骨髄球白血病、急性骨髄単球性白血病、および急性単球性白血病を含む急性骨髄性白血病などの骨髄新生組織形成、骨髄異形成症候群、および慢性骨髄性白血病を含む慢性骨髄増殖性障害、中枢神経系の腫瘍、例えば、脳腫瘍（グリオーマ、神経芽細胞腫、星状細胞腫、髄芽腫、上衣腫、および網膜芽腫）、固体腫瘍（鼻咽頭癌、基底細胞癌、膵臓癌、胆管癌、カポジ肉腫、精巣癌、子宮、膣もしくは頸部癌、卵巣癌、原発性肝臓癌もしくは子宮内膜癌、血管系の腫瘍（血管肉腫および血管周囲細胞腫））、または他の癌を含むがこれらに限定されたに状態を治療するために使用され得る。
【０１２９】
本発明のＧＬ−２０４５組成物を使用して、自己免疫疾患を治療することができる。本明細書に使用される場合、「自己免疫疾患」という用語は、８０個超の疾患および状態の多様な群を指す。これらの疾患および状態のうちの全てにおいて、根本的な問題は、体の免疫系が体自体を攻撃することである。自己免疫疾患は、結合組織、神経、筋肉、内分泌系、皮膚、血液、ならびに呼吸器系および消化器系を含む全ての主な体組織に影響を与える。自己免疫疾患には、例えば、慢性炎症脱髄性多発性ニューロパシー、多巣性運動ニューロパシー、全身性エリテマトーデス、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、重症筋無力症、および１型糖尿病が含まれる。
【０１３０】
本発明の組成物および方法を使用して治療可能な疾患もしくは状態は、鎌状赤血球病、特発性血小板減少性紫斑病、同種免疫／自己免疫血小板減少症、後天性免疫血小板減少症、自己免疫好中球減少症、自己免疫溶血性貧血症、パルボウィルスＢ１９関連赤血球形成不全、後天性抗因子ＶＩＩＩ自己免疫、後天性ウォン・ヴィレブランド疾患、多発性骨髄腫および意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症、肺血症、再生不良性貧血、赤芽球形成不全、ダイアモンド・ブラックファン貧血症、新生児の溶血性疾患、免疫媒介好中球減少症、血小板輸血に対する治療抵抗性、新生児の輸血後紫斑、溶血性尿毒症症候群、全身性血管炎、血栓性血小板減少性紫斑病、またはエバンス症候群を含むがこれらに限定されない血液免疫学的なプロセスであり得る。
【０１３１】
疾患もしくは状態はまた、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発根神経、パラプロテイン血症性ＩｇＭ脱髄性多発性ニューロパシー、Ｌａｍｂｅｒｔ−Ｅａｔｏｎ筋無力症候群、重症筋無力症、多巣性運動ニューロパシー、抗ＧＭ１と関連付けられる下位運動ニューロン症候群、脱髄、多発性硬化症および視神経炎、スティフマン症候群、抗Ｙｏ抗体を有する傍腫瘍性小脳変性、腫瘍随伴性脳脊髄症、抗Ｈｕ抗体を有する感覚性神経障害、てんかん、脳炎、脊髄炎、ヒトＴ細胞リンパ向性ウィルス１と特に関連付けられる脊髄症、自己免疫糖尿病性神経障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、または急性突発性自律神経障害を含むがこれらに限定されない神経免疫学的なプロセスであり得る。
【０１３２】
疾患もしくは状態はまた、聴力損失もしくは失明と関連付けられる炎症もしくは自己免疫であり得る。例えば、疾患もしくは状態は、騒音性聴力損失もしくは加齢に伴う聴力損失などの自己免疫関連の聴力損失であり得るか、または聴覚デバイスなどのデバイスの移植（例えば、蝸牛移植）と関連付けられ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される組成物は、デバイスの移植前、同時に、または後に対象に投与され得る。
【０１３３】
疾患もしくは状態はまた、川崎病、リウマチ性関節炎、フェルティ症候群、ＡＮＣＡ陽性血管炎、自発性ポリ筋炎、皮膚筋炎、抗リン脂質症候群、反復自然流産、全身性エリテマトーデス、若年性特発性関節炎、レイノー病、クレスト症候群、またはブドウ膜炎を含むがこれらに限定されないリウマチ疾患プロセスであり得る。
【０１３４】
疾患もしくは状態はまた、中毒性表皮壊死症、壊疽、肉芽腫、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、落葉状天疱瘡、白斑を含む自己免疫皮膚水疱形成疾患、連鎖球菌毒素性ショック症候群、強皮症、広範性および極限性皮膚全身性硬化症を含む全身性硬化症、またはアトピー性皮膚炎（特に、ステロイド剤依存性）を含むがこれらに限定されない皮膚免疫学的な疾患プロセスであり得る。
【０１３５】
疾患もしくは状態はまた、封入体筋炎、壊疽性筋膜炎、炎症性筋疾患、筋炎、抗デコリン（ＢＪ抗原）ミオパシー、腫瘍随伴性壊死ミオパシー、Ｘ連結性空胞化ミオパシー、ペニシラミン誘導性ポリ筋炎、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、または心筋症を含むがこれらに限定されない筋骨格免疫学的な疾患プロセスであり得る。
【０１３６】
疾患もしくは状態はまた、悪性貧血症、自己免疫慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、セリアック病、疱疹状皮膚炎、特発性肝硬変、反応性関節炎、クローン病、ウィップル病、潰瘍性結腸炎、または硬化性胆管炎を含むがこれらに限定されない胃腸免疫学的な疾患プロセスであり得る。
【０１３７】
疾患もしくは状態はまた、移植片対宿主病、抗体媒介移植片の拒絶、骨髄移植後拒絶、感染性後疾患炎症、リンパ腫、白血病、新生組織形成、ぜんそく、抗ベータ細胞抗体を有する１型糖尿病、シェーグレン症候群、混合性結合組織疾患、アジソン疾患、フォークト・小柳・原田症候群、膜性増殖性糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、橋本甲状腺炎、ウェゲナー肉芽腫症、矯小多脳回症、チャーグ・ストラウス症候群、結節性多発動脈炎、または多系統臓器不全であり得る。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「アレルギー」とは、ＩｇＥによって媒介される全ての免疫反応、ならびにＩｇＥ媒介反応を模倣するこうした反応を含む。アレルギーは、ＩｇＥまたはＩｇＥ様免疫反応をトリガするタンパク質、ペプチド、炭水化物、およびそれらの組み合わせを含むアレルギーによって誘導される。例示的アレルギーは、ナッツアレルギー、花粉アレルギー、および虫刺されアレルギーを含む。例示的アレルギーは、ツタウルシおよびオーク中のウルシオール；ハウスダスト抗原；カバノキ花粉成分Ｂｅｔ  ｖ  １およびＢｅｔ  ｖ  ２；セロリ中の１５ｋＤ抗原；リンゴ抗原Ｍａｌ  ｄ  １；モモ中のＰｒｕ  ｐ３；オオアワガエリ花粉アレルギーＰｈｌ  ｐ  １；ホソムギ中のＬｏｌ  ｐ  ３、Ｌｏｌ  ｐ  １、またはＬｏｌ  ｐ  Ｖ；ギョウギシバ中のＣｙｎ  ｄ  １；イエダニアレルギーのイエダニＤｅｒ  ｐ１、Ｄｅｒ  ｐ２、またはＤｅｒ  ｆ１；グルテン中のα−グリアジンおよびγ−グリアジンエピトープ；ハチ毒ホスホリパーゼＡ２；ピーナッツ中のＡｒａ  ｈ  １、Ａｒａ  ｈ  ２、およびＡｒａ  ｈ  ３エピトープを含む。
【０１３９】
別の実施形態では、本明細書に記載されるＧＬ−２０４５組成物は、血液が患者から引き出され、患者内に導入し戻す前に約１時間半〜約３時間の一定時間、最適に製造されたストラドマー（複数可）と一時的に接触される、プライミング系において利用され得るであろう。細胞療法のこの形態では、患者自身のエフェクター細胞は、最適に製造されたストラドマーへのエフェクター細胞の曝露を通してエフェクター細胞を調節するために、エクスビボでマトリックス上に固着された最適に製造されたストラドマーに曝露される。次に、調節されたエフェクター細胞を含む血液を、患者内に注入し戻す。そのようなプライミング系は、多数の臨床および治療用途を有し得るであろう。
【０１４０】
本明細書に記載されるＧＬ−２０４５組成物はまた、免疫反応プロファイルの特定の変化に影響を与えるための様々な文脈で免疫系反応を変更するために容易に適用され得る。対象における免疫反応の変更または調節は、免疫反応の増加、減少、または割合もしくは成分の変化を指す。例えば、サイトカイン生成もしくは分泌レベルは、補体に結合し、かつこれらの受容体と相互作用するように設計されたストラドマーとのＦｃＲｓの適切な組み合わせと共に補体を標的とすることによって所望に応じて増加または減少され得る。抗体生成はまた、増加もしくは増加され得；２つ以上のサイトカインもしくは免疫細胞受容体の割合が変化され得；または追加の型のサイトカインもしくは抗体が生成され得る。
【０１４１】
好ましい実施形態では、自己免疫または炎症性疾患を有する対象は、本明細書に記載されるＧＬ−２０４５組成物の治療的に効果的な量を対象に投与する工程を含む、変更されたそれらの免疫反応を有し、ＧＬ−２０４５組成物の治療的に効果的な量は、対象における免疫反応を変更する。理想的には、この発明は、対象における疾患もしくは状態を治療する。変更された免疫反応は、増加または減少された反応で有り得、かつＩＬ−１ＲＡおよび他のＩＬ−１ファミリーメンバー、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−２３、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１受容体、ＴＮＦ−α、他のＴＮＦファミリーメンバーおよびＴＮＦ受容体、ＩＦＮ−α、他のインターフェロンファミリーメンバーおよびインターフェロン受容体のうちのいずれかのレベルを含む変更されたサイトカインレベル、またはＣＣＬ、ＣＸＣ、ＸＣ、およびＦＡＭ１９ケモカインファミリーメンバーのうちのいずれかのレベルを含むケモカインレベルを伴い得る。好ましい実施形態では、ＩＬ−６またはＩＬ−８は、治療に対する反応において低減される。特に好ましい実施形態では、ＩＬ−６およびＩＬ−８は、治療に対する反応において低減され、かつ／またはＩＬ−１０もしくはＩＬ−１ＲＡは、治療に対する反応において増加される。しかしながら、本発明は、記載される生体模倣薬の作用の任意の特定の機構によって限定されない。変更された免疫反応は、対象における変更された自己抗体レベルであり得る。変更された免疫反応は、対象における変更された自己攻撃的Ｔ細胞レベルであり得る。
【０１４２】
例えば、自己免疫疾患におけるＴＮＦアルファ生成の低減量は、治療効果を有し得る。この実用的な用途は、抗ＴＮＦアルファ抗体療法（例えば、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））であり、これは、尋常性乾癬、リウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、クローン病、潰瘍性結腸炎、および強直性脊椎炎を治療することが臨床的に証明されている。これらの自己免疫疾患は、異なる病因を有するが、炎症および免疫細胞活性に関連する疾患プロセスの重要な免疫学的成分を共有している。ＴＮＦアルファ生成を減少させるように設計されたストラドマーは、これらおよび多くの他の自己免疫疾患において同様に効果的であろう。変更された免疫反応プロファイルはまた、抗体生成、例えば、対象自身の組織を標的とする自己抗体、または対象における変更された自己侵攻性Ｔ細胞レベルの減少に影響を与えるための直接的もしくはは間接的調節であり得る。例えば、多発性硬化症は、インターフェロンベータ療法によって治療され得る自己反応性Ｔ細胞を伴う自己免疫障害である。例えば、Ｚａｆｒａｎｓｋａｙａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００７  Ｍａｙ；１２１（ｌ）：２９−３９−Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｄｅｃ  １８を参照されたい。自己反応性Ｔ細胞レベルを減少させるように設計された最適に製造されたストラドマーは、多発性硬化症において同様に効果的であり、かつ自己反応性Ｔ細胞を伴う他の自己免疫疾患であり得る。
【０１４３】
本明細書に記載されるＧＬ−２０４５組成物は、樹状細胞、マクロファージ、破骨細胞、単球、もしくはＮＫ細胞を含む免疫細胞からの共刺激分子の発現を調節するために、またはこれらの同じ免疫細胞の分化、成熟、もしくはインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）を含むサイトカイン分泌の抑制のために、あるいはインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、もしくはＩＬ１−ＲＡを含むサイトカイン分泌を増加させるために、使用され得る。当業者はまた、最適化された免疫学的に活性な生体模倣薬に免疫細胞を曝露することによって、かつ免疫細胞が樹状細胞、マクロファージ、破骨細胞、または単球である免疫細胞機能の調節を測定することによって、最適化された免疫学的に活性な生体模倣薬の効能を検証し得る。一実施形態では、免疫細胞は、最適化された免疫学的に活性な生体模倣薬にインビトロで曝露され、細胞表面受容体の量もしくはサイトカイン生成の量を判定する工程をさらに含み、細胞表面受容体もしくはサイトカイン生成の量の変化は、免疫細胞機能の調節を示す。別の実施形態では、免疫細胞は、自己免疫疾患のためのモデル動物において最適化された免疫学的に活性な生体模倣薬にインビボで曝露され、自己免疫疾患の改善の程度を評価する工程をさらに含む。
【０１４４】
本明細書に記載されるＧＬ−２０４５組成物はまた、デバイスの構成要素として使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＧＬ−２０４５は、医療用インプラントなどのデバイス上で被覆され得る。例えば、最適に製造されたストラドマーは、例えば、ブドウ膜炎もしくは黄斑変性症における眼内使用のために、浸透を改善し、かつ薬物放出を長引かせるために、冠状動脈ステント上で、またはナノ粒子療法の一部として被覆され得る。本明細書に記載される最適に製造されたストラドマーはまた、診断の一成分として使用され得る。いくつかの実施形態では、当業者は、どの患者において、ストラドマーの使用が特に有益であり得るかを判定することによって、治療を個人化することができる。例えば、当業者は、患者の免疫細胞を免疫学的に活性な生体模倣薬に曝露して、高反応者を識別するために、フローサイトメトリーもしくはサイトカインプロファイルによって免疫細胞の活性化もしくは成熟の調節を測定し得る。
【０１４５】
本明細書で引用される全ての参照は、それらの全体が参照により組み込まれる。
【実施例】
【０１４６】
高タンパク質力価、付随低細胞片を含む長い生存率、およびＧＬ−２０４５のさらに高次の多量体の生成の組み合わせを最適化するために、製造プロセスにおいて様々な手法をとった。具体的には、多量体化の増加の特性を有するＧＬ−２０４５生成物のための最適な条件：基礎培地、給餌の型、給餌のタイミング、温度シフト、通気、および振とうフラスコ条件を判定するための以下の上流製造プロセスの態様は、様々であった。各例では、最適な条件を識別するために、細胞密度、生存率、タンパク質力価、および多量体化を分析した。さらに、ＧＬ−２０４５の最適な多量体化プロファイルが維持されたＧＬ−２０４５の精製および濾過のための最適な条件を判定するための緩衝液、洗浄プロトコル、およびカラム選択を含む下流製造プロセスの態様は、様々であった。以下の例は、例示のみの方法によって、かつ限定の方法によらずに提供される。
【０１４７】
実施例１−ＧＬ−２０４５の分画および生体層干渉法分析
０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ＋０．１５ＭのＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中にＧＥ  Ｈｉ−Ｌｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇカラム（ＧＥ、＃１７−１０７１−０１）を使用して、ＧＬ−２０４５の溶液を分画した。３．２ｍＬのＧＬ−２０４５溶液を、２．６ｍＬ／分の流量で装填した。６つの画分（１〜６）を、２．０ｍＬの体積で回収し、２８０ｎｍのＵＶ測定によって、タンパク質濃度を判定した（図１Ａ）。ＧＬ−２０４５画分の各々についての多量体化を評価した。簡潔に言うと、画分１〜６の各々の試料を、４〜１２％の非還元Ｎｕ−Ｐａｇｅ  ＢＴゲル（インビトロゲン、＃ＮＰ０３２２ＢＯＸ）に装填した。試料を、１５０ボルトでおよそ３時間実験した。結果は、図１Ｂに提供され、かつ画分１〜６のＧＬ−２０４５のさらに高次の多量体の存在下で、明白な差を実証している。画分１〜３は、より低次の多量体（例えば、バンド１〜４）から構成される。画分１は、ほぼ包括的に、５５ＫＤの明白なＭＷを有するホモ二量体から構成される（バンド１、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥからＭＷ推測）。画分２は、１１０ＫＤのＭＷを有するホモ二量体のおよそ９７％の二量体から構成される（バンド２）。画分３は、主に、それぞれ、より少ない量のバンド２、５（ＭＷ＝２７５ＫＤ）、６（ＭＷ＝３３０ＫＤ）、および７（ＭＷ＝３８５ＫＤ）と共に、１６５ＫＤおよび２２０ＫＤのＭＷを有するバンド３および４から構成される。画分４は、主に、より少ない量のバンド３、７、８（ＭＷ＝４４０ＫＤ）およびさらに高次のバンドと共に、バンド４、５、および６から構成される。しかしながら、画分５および６は、主に、さらに高次の多量体（バンド５＋）から構成される。
【０１４８】
生体層干渉法運動結合分析を使用して、ＦｃγＲＩＩＩＡ受容体への結合について、ＧＬ−２０４５の画分を分析した。生体層干渉法は、バイオセンサチップ表面上に固体化されたリガンドと溶液中の分析との間の結合を検出する。結合が起こると、波長シフトを生じる（「ＲＵ」の反応単位として検出される）、バイオセンサチップでの光学的厚さの増加を生成する。最大結合レベル（ＲＵ  ｍａｘ）は、センサ表面上のリガンドの量を飽和させる平衡での試料結合の最大可能量である。
【０１４９】
Ｈｉｓ標識付き受容体タンパク質（５μｇ／ｍＬ）を、３００秒間、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（Ｃａｔ．＃１８−１０９２）から１Ｘ運動分析緩衝液中の抗Ｈｉｓセンサチップ（抗Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ  ＨＩＳ１Ｋ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｃａｔ．＃１８−５１２１）に結合させた。装填されたセンサを、６０秒間基線測定値を得るために、ラベル化された受容体またはリガンドを含まない１Ｘ運動緩衝液中に移送した。基線を得た後、受容体／タンパク質のオン比を、５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、および１２．５μｇ／ｍＬの濃度で６０秒間選択される精製ストラドマーを含有する１ｘ運動緩衝液にセンサチップを移送することによって測定した。オフ比を、センサチップを１Ｘ運動緩衝液に移送することによって３００秒間測定し、ＲＵ値、オン比値、解離比、およびＫｄ値を、ＦｏｒｔｅＢｉｏソフトウエアを使用して計算した。
【０１５０】
結合曲線結果を、図２に示し、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔソフトウエアによって計算される運動結合データを、表２に提供する。これらの結合曲線は、より低い分子量画分（例えば、画分１および２）について観察されるものよりも高い分子量のＧＬ−２０４５（例えば、画分３、４、５、および６）を含有する画分について、ますますより低いオフ比を有する、より高い結合力を実証しており、ＧＬ−２０４５の高分子量画分は、より低い分子量画分よりも貪欲に結合することを示している。
【表２】
2020503855.tif 000003
【０１５１】
実施例２−ＧＬ−２０４５画分を用いた補体依存性細胞（ＣＤＣ）致死アッセイ
補体活性化を抑制するためのＧＬ−２０４５画分の能力を評価した。ＧＬ−２０４５を、サイズ排除クロマトグラフィによって６画分に分画し（図３Ａ）、各々を、非還元ゲルについての多量体化について分析した（図３Ｂ）。補体活性化に対する各画分の効果を判定するために、ＣＤ２０発現ウィル２細胞を、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を用いて２０分間培養し、その後、細胞を遠心分離し、新たな培地中に再懸濁した。次に、細胞を、本明細書に記載される画分１〜６の各々、ならびに６つの濃度：１００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、または１μｇ／ｍＬのうちの１つでの比較としての非分画ＧＬ−２０４５を含有する培地の９６ウェルプレート中に培養した。補体依存性細胞溶解を開始するために、血清を細胞懸濁液に添加し、プレートを、３７℃で３時間培養した。細胞死を、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｙｔｏｔｏｘ  Ｇｌｏアッセイを用いて定量化した。Ｃｙｔｏｔｏｘアッセイ試薬を、プレートの各ウェルに添加し、プレートを、室温で１５分間暗所で培養した。１５分後の発光を、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＧｌｏＭａｘ照度計上で読み取り、細胞死を、この読み取りから計算した。結果は、図４Ａ〜４Ｄに示され、かつ画分５および６（バンド５〜１３中により高い分子量の多量体を含有する）が、画分１〜４中に存在する、より低い分子量の多量体よりもＣＤＣのより顕著な抑制を示すことを実証している。４バンド以上を含む画分のみが、六量体Ｃ１ｑへのさらに高次の多量体の多価Ｆｃ結合と一致する、ＣＤＣの効果的な抑制を実証していることも留意される。
【０１５２】
実施例３−ＦｃγＲＩＩＩａへのＧＬ−２０４５画分の結合
ＦｃγＲＩＩＩａへのＧＬ−２０４５画分の結合を判定した。ＧＬ−２０４５の上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２の０．１５ＭのＮａＣｌの結合緩衝液を用いたタンパク質Ａ  ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ（ＧＥ＃１１−００３４−９５）を有する親和性クロマトグラフィによって精製し、ｐＨ２．７の０．１Ｍのグリシンを用いて溶出した（図５Ａ）。親和性クロマトグラフィ−精製ＧＬ−２０４５を、ｐＨ７．２の１Ｘ  ＰＢＳ（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ  ＃１１９−０６９−１０１）中に保存した。精製ＧＬ−２０４５のプールを、ｐＨ５．０の５０ｍＭの酢酸ナトリウムに対してさらに透析し、かつｐＨ５．０の５０ｍＭの酢酸ナトリウムの結合緩衝液を用いたＰＯＲＯＳ  ＣＩＥＸカラム（１．２ｃｍＤ×１０ｃｍＬのＧＯＰＵＲＥカラム、Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃４４４８８８５）に対する陽イオン交換クロマトグラフィ、および５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０の１ＭのＮａＣｌを用いた溶出勾配（０〜１００％の溶出緩衝液）によって研磨した。この研磨工程を、最終画分から最高次の多量体および／または非秩序凝集体を取り除くことなく行った。最終工程として、ＣＩＥＸ研磨されたＧＬ−２０４５を、≦５ｍＬの体積まで濃縮し、緩衝液を、ゲル濾過ランニング緩衝液に対して交換し、かつ０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ＋ｐＨ７．５の０．１５ＭのＮａＣｌを実験緩衝液（Ｔｒｉｓ  ＨＣＬ、ｐＨ７．５  Ｔｅｋｎｏｖａ  ＃Ｔ１０７５）として使用して、ゲル濾過カラム（Ｈｉｌｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ（ＧＥ  ＃１７−１０７１−０１））中に注入した。次に、ゲル分析によって、多量体化について画分を分析した（図５Ｂおよび図５Ｃ）。
【０１５３】
ＦｃγＲＩＩＩａへの分画されたＧＬ−２０４５の結合を、ＦｃγＲＩＩＩａ  ＥＬＩＳＡ結合アッセイを使用して判定した。簡潔に言うと、９６プレートを、組み換えＦｃγＲＩＩＩａで被覆し、ＧＬ−２０４５と反応させた。洗浄後、ＦｃγＲＩＩＩａ結合材料の量を、ＥＬＩＳＡベースのアッセイにおけるＦｃ検出ｍＡｂを使用して判定した（図６Ａおよび図６Ｂ）。各画分についてのＥＣ５０値を表３に示す。これらの結果は、さらに高次の多量体（画分１Ｃ４、１Ｃ５、１Ｃ６、１Ｃ７、１Ｃ８、１Ｃ９、１Ｃ１０、および１Ｃ１１）が、より低次の多量体（画分１Ｄ９、１Ｅ４、および１Ｆ７）よりもＦｃγＲＩＩＩａに対して低ＥＣ５０よって留意される、より貪欲な結合を実証し、かつ驚くべきことに、最高分子量の多量体（画分１Ｃ３、１Ｃ２、１Ｃ１、１Ｂ１２、１Ｂ１１よりも貪欲な結合を実証することを実証している。高度に機能的な最高次の多量体（例えば、画分１Ｂ１１、１Ｂ１２、１Ｃ１、１Ｃ２、および１Ｃ３）と共に、特定のより低い効力の高分子量凝集化画分を含むために、まさに最高分子量画分を前提とする。これらの結果は、非常に驚くべきことに、ＧＬ−２０４５の全ての高分子量画分が、高秩序高分子量の多量体の形成とは対照的に、ホモ二量体の非秩序集合の効果による可能性が高い、ＦｃγＲへの結合の増加を実証するわけではないことを示している。これらのデータは、高分子量のさらに高次の多量体の生成および保持、ならびに結合標的の低親和性受容体にはより効果的でない（表３の１Ｂ１１および１Ｂ１２についてのＥＣ５０値を参照のこと）非秩序の高分子量凝集体（例えば、１Ｂ１１および１Ｂ１２）の取り除きを生じるように、最適な上流製造方法と組み合わせた、最適化された下流製造方法（タンパク質Ａ精製、イオン交換クロマトグラフィ、および疎水性相互作用クロマトグラフィについての最適化された条件を含む）の必要性を示している。
【表３】
2020503855.tif 000004
【０１５４】
実施例４−ＧＬ−２０４５画分のＣ５ａ誘導走化性分析
ＧＬ−２０４５細胞培養物を、Ｌグルタミン（Ｌｏｎｚａ、＃１７−６０５Ｅ）およびＨＴ補完剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃１１０６７−０３０）を用いてＰｏｗｅｒＣＨＯ２培地（Ｌｏｎｚａ、＃Ｕ２１−０７０）中に成長させた。ＧＬ−２０４５の上清を、タンパク質Ａ  ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ（ＧＥ、＃１１−００３４−９５）を用いて親和性クロマトグラフィによって精製し、次に、低分子バンドを高分子バンドに分離させるための異なるｐＨ条件を使用して、ＡＩＥＸ  ＨｉＳｃｒｅｅｎ  Ｑ  ＦＦ（ＧＥ、＃２８−９５０５−１０）で分画した。結果を図７に示す（ＧＬ−ＧＬＭ−０１＝組み換え、非分画Ｆｃ（Ｇ００１）、ＧＬ−ＧＬＭ−０２＝非分画ＧＬ−２０４５、ＧＬ−ＧＬＭ−０５＝ｐＨ６．０での分画ＧＬ−２０４５、ＧＬ−ＧＬＭ−０６＝ｐＨ６．５での分画ＧＬ−２０４５、ＧＬ−ＧＬＭ−０７＝ｐＨ７．０での分画ＧＬ−２０４５、ＧＬ−ＧＬＭ−０８＝ｐＨ７．５での分画ＧＬ−２０４５）。最後に、異なる画分を濃縮し、ＨＢＳＳ（Ｌｏｎｚａ、＃１０−５２７Ｆ）に対して透析した。
【０１５５】
ＧＬ−２０４５の上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２の０．１５ＭのＮａＣｌの結合緩衝液を用いて、タンパク質Ａ（ｐＡ）ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ（ＧＥ、＃１１−００３４−９５）を有する親和性クロマトグラフィによって精製した。結合緩衝液を用いた第１の洗浄、および１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、２Ｍの尿素、ｐＨ７．０の５０ｍＭのリン酸塩を含む緩衝液を用いた第２の洗浄後、ｐＡに結合されたタンパク質を、ｐＨ２．７の０．１Ｍのグリシンで溶出した。
【０１５６】
親和性クロマトグラフィ精製ＧＬ−２０４５を、ｐＨ７．０の１Ｘ  ＰＢＳ（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ  ＃１１９−０６９−１０１）中に保存した。４バッチの精製ＧＬ−２０４５を、ｐＨ６．０、６．５、７．０、または７．５の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬでさらに希釈し（６Ｘ）、ｐＨ６．０、６．５、７．０、または７．５の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬの結合緩衝液を用いてＨｉＳｃｒｅｅｎ  Ｑ  ＦＦカラムに対する陰イオン交換クロマトグラフィによって精製し、かつｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ＋１ＭのＮａＣｌを用いて勾配溶出（０〜１００％の溶出緩衝液）によって溶出した。
【０１５７】
これらの精製画分を利用して、好中球走化性に対するＧＬ−２０４５画分の効果を判定した。簡潔に言うと、補体Ｃ５ａを、１ｎＭの濃度でのより低いウェルのボイデンチャンバに対する化学誘引物質として添加した。ボイデンチャンバへの添加前に、好中球（ＰＢＭＣからの血液全体から精製された、最終濃度２．２５×１０６細胞／ｍＬ）を、示されたＧＬ−２０４５画分（０．０２〜１０μｇ／ｍＬの最終濃度μｇ／ｍＬ）または組み換えＦｃ対照（ＧＬＭ−００１、Ｇ００１）を用いて３０分間、予め培養した。次に、細胞懸濁液を、ボイデンチャンバの上ウェルに添加し、２５分間培養した。培養期間後、移動された集団を、各状態についてより低いチャンバ内の細胞の数を計測することによって評価し、各状態についての割合走化性を判定した（図８）。ＧＬ−ＧＬＭ−００１について、走化性は観察されなかった（組み換えＦｃ対照、Ｇ００１）。より高次の多量体（バンド５〜１３を含む、画分ＧＬ−ＧＬＭ−００２、ＧＬ−ＧＬＭ−００５、ＧＬ−ＧＬＭ−００６、およびＧＬ−ＧＬＭ−００７）は、より低次の多量体（バンド１〜４を含む、画分ＧＬ−ＧＬＭ−００８）よりもＣ５ａ誘導走化性のより貪欲な抑制を実証した。
【０１５８】
実施例１〜４に提供されたデータは、ＧＬ−２０４５に対するさらに高次の多量体の増強された効能を実証している。上記のデータに基づいて、最大生物学的効能を達成するためのＧＬ−２０４５のさらに高次の多量体（例えば、図１、３、５、および７のバンド５＋）の特定の生成のために最適な条件を判定するために、上流製造プロトコルを試験した。
【０１５９】
実施例５−ＧＬ−２０４５生成における基礎培地のスクリーニング
この実験の目的は、ＧＬ−２０４５のタンパク質力価、細胞生存率、細胞密度、およびＧＬ−２０４５の多量体化に対する基礎培地のパネルの効果を試験することであった。
【０１６０】
３７Ｃおよび５％ＣＯ２でのシェーカー培養器中で、Ｌグルタミン（Ｌｏｎｚａ  ＃１７−６０５Ｅ）およびヒポキサンチンナトリウムおよびチミジン（ＨＴ、Ｇｉｂｃｏ  ＃１１０６７−０３０）を含む、ＰｒｏＣＨＯ５培地（Ｌｏｎｚａ  ＃１２−７６６Ｑ）中に、ＧＬ−２０４５を成長させた。継代後、細胞を洗浄し、５０ｍＬのチューブスピン内に選択された培地（表４に示される）中の０．５×１０６細胞／ｍＬで重複して接種した。各チューブは、１０ｍＬの培養物を含有し、かつ３７℃、５％ＣＯ２、８０％湿度、および１８０ｒｐｍ回転速度のキューナー商標磁気浮上シェーカー培養器中に置かれた。４、８、および１０日目に、細胞密度、細胞生存率、およびグルコースレベルを測定するために、各培養物から試料の１ミリリットルを取り出した。試料を遠心分離し、上清を＋４℃で保存した。４ｍＭのＬグルタミンならびに１Ｘヒポキサンチンナトリウムおよびチミジンを列挙しなかった選択された培地に、成分としてＬグルタミンおよびＨＴを補完した。選択される培地についての成長条件を表４に示す。
【表４】
2020503855.tif 000005
【０１６１】
選択された培地中に成長されたＧＬ−２０４５細胞培養物を、細胞密度、細胞生存率、タンパク質力価、およびさらに高次の多量体の割合について評価した。細胞をトリパンブルーと混合することによって、細胞密度および細胞生存率の評価を行った。手動の細胞計数器を使用して、生存細胞および死細胞を計数した。細胞密度（図９、表５）および細胞生存率（図１０、表６）について、培養の４日目および８日目についてのデータを示す。試験された１９個の培地のうち、ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ、ＣＨＯＭＡＣＳ  ＣＤ、およびＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯによる、４日目の最大細胞密度を観察した。８日目では、細胞密度の傾向は、４日目と比較して、ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ、ＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ、ＥｘｐｉＣＨＯ、Ｃｅｌｌ  Ｖｅｎｔｏ  ＣＨＯ  ２１０、およびＣｅｌｌ  Ｖｅｎｔｏ  ＣＨＯ  ２１０を除いた全ての培地について陰性であった。１９個の培地のうち、ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ、続いてＥｘｐｉＣＨＯ、Ｃｅｌｌ  Ｖｅｎｔｏ  ＣＨＯ  １１０、およびＨＹＱ  ＳＦＸ−ＣＨＯ  ＬＭによる、試験された８日目の最大細胞生存率を観察した。１９個の培地のうち、４日目〜８日目の細胞生存率において肯定的な傾向を有する唯一の培地は、ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐであった。したがって、４日目に高細胞密度を生成し、かつ８日目に細胞密度について陰性傾向を有しない唯一の培地は、ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐである。
【表５】
2020503855.tif 000006
【表６】
2020503855.tif 000007
【０１６２】
培養物を、１０日目に沈降させ、０．２μｍで濾過し、かつタンパク質Ａ親和性カラムを使用して精製するまで４℃に保った。精製について、上清培養物を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２の０．１５ＭのＮａＣｌの結合緩衝液を含む、１ｍＬのタンパク質ＡカラムのＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ、＃１１−００３４−９３）を有する親和性クロマトグラフィによって精製した。カラム−結合されタンパク質を、結合緩衝液を用いて洗浄し、続いて１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、２Ｍの尿素、ｐＨ７．０の５０ｍＭのリン酸塩による第２の洗浄を行った。カラムに結合されたＧＬ−２０４５を、ｐＨ２．７の０．１Ｍのグリシンで溶出し、かつＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ、＃１７−５０８７−０１）を通してｐＨ７．０の１Ｘ  ＰＢＳ中で脱塩した。精製された全ての試料を４℃で保存した。生体層干渉法（Ｏｃｔｅｔ）によって、タンパク質力価の測定を行った（図１１および表７）。試験された１９個の基礎培地のうち、Ｃｅｌｌ  Ｖｅｎｔｏ  ＣＨＯ  １１０による、続いてＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ培地、ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ、およびＥｘｐｉＣＨＯによる、１０日目の最大タンパク質力価を観察した。力価の有意な低下が他の培地と共に起こった。
【表７】
2020503855.tif 000008
【０１６３】
さらに高次の多量体の割合を判定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮｕＰａｇｅ３〜８％トリスアセテートゲル、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃ＥＡ０３７５２ＢＯＸ）に対して、各精製培養物を実験した（非低減形態で）。２μｇのタンパク質を、３μＬの試料緩衝液（ＮｕＰａｇｅ、ＬＤＳ（４Ｘ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃ＮＰ０００７）、２０μＭのヨードアセトアミド（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  ＃１６３−２１０９）、および脱イオン（ＤＩ）水中で、１０μＬの最終体積まで希釈した。試料を、８０℃で１０分間加熱し、ゲルに装填し、かつランニング緩衝液（トリスアセテートＳＤＳ（２０Ｘ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃ＬＡ００４１））を使用して、１５０Ｖで１時間２５分間実験した。ゲルをＤＩ水中で洗浄し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃ＬＣ６０６０）で染色し、かつＤＩ水で脱染した。完全な脱染後、Ｓｙｎｇｅｎｅ製のＧ：ＢＯＸシステムを使用して画像を切り取り、かつＳｙｎｇｅｎｅソフトウエアのＧｅｎｅＴｏｏｌを用いた濃度測定法によって、バンドパターンを分析した。各レーンの各個々のバンドの強度を測定した（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。
【０１６４】
思いがけず、ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ、続いてＥＸ−ＣＥＬＬ  ＣＤ  ＣＨＯおよびＣＨ−Ｓ  ＳＦＭ２による、試験された１９個の培地のうちの４バンドを超えるさらに高次の多量体の最大割合を観察した（表８）。これらのデータは、さらに高次の多量体の百分率の増加が、制御されるべき独立変数であり、かつ総タンパク質力価の増加と単に相関性がないことを示す。ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐは、第３の最高タンパク質力価および最大レベルの多量体化（バンド５＋中に存在するタンパク質の４５．９％）を生じ、Ｃｅｌｌ  Ｖｅｎｔｏ  ＣＨＯ  １１０は、最大タンパク質力価であるが、実質的により低いレベルの多量体化（バンド５＋中に存在するタンパク質の３２．６％）を生じた。
【表８】
2020503855.tif 000009
【０１６５】
実施例６−給餌によるＧＬ−２０４５の培地のスクリーニング
推奨される給餌スケジュール
実施例５の実験の結果に基づいて、最高ＧＬ−２０４５タンパク質力価と関連付けられる４つの基礎培地および最低ＧＬ−２０４５タンパク質力価を関連付けられる３つの基礎培地を、市販の給餌を培養中に提供する反復実験に供した。高力価を生成したＣｅｌｌ  Ｖｅｎｔｏ  １１０およびＥｘｐｉＣＨＯは、製造業者が推奨する給餌が識別されなかったため、給餌実験のために選択されなかった。Ｃｅｌｌ  Ｖｅｎｔｏ  ＣＨＯ  １１０は、給餌を伴わない細胞順応のために使用されるべき完全培地であり、Ｃｅｌｌ  Ｖｅｎｔｏ  ２１０は、給餌との組み合わせで培養のために使用される。この実験で使用される培地および給餌の組み合わせを表９に詳述する。
【表９】
2020503855.tif 000010
【０１６６】
ＧＬ−２０４５クローン５８を、３７Ｃおよび５％ＣＯ２でのシェーカー培養器中のＬグルタミン（Ｌｏｎｚａ  ＃１７−６０５Ｅ）ならびにヒポキサンチンナトリウムおよびチミジン（ＨＴ、Ｇｉｂｃｏ  ＃１１０６７−０３０）を有する「ＰｒｏＣＨＯ５」培地（Ｌｏｎｚａ  ＃１２−７６６Ｑ）中に培養した。継代後、細胞を洗浄し、０．５×１０６細胞／ｍｌで接種し、次に、密度が１×１０６〜３×１０６細胞／ｍＬおよび≧８０％の生存率に到達したときにサブ培養した。ＧＬ−２０４５クローン５８を、表１０に詳述される選択された培地へと直接順応させた。少なくとも２〜３継代にわたって安定的な倍加時間（２０〜３０時間）および≧９０％の生存細胞密度（ＶＣＤ）を得たときに、順応が完了すると思われた。細胞を、選択された培地（ｄ０）中に０．５×１０６細胞／ｍＬで播種し、３７Ｃ、５％ＣＯ２、および高湿度で１５０ｒｐｍで設定された培養器における標準的な振とうプラットフォーム中に培養した。ＰｏｗｅｒＣＨＯ３  ＣＤを除く全ての培養について、給餌は、３日目に始めた（ｄ３）。ＰｏｗｅｒＣＨＯ３  ＣＤ培地についての給餌は、１日目に始めた。総培養物体積は、１２０ｍＬであった。生存率が５０％まで低下したときに、培養物を採取した。推奨されるプロトコルに従って、製造業者が推奨する給餌と共に、７つの培地の各々中に、ＧＬ−２０４５安定細胞株を成長させた。試験された培地の各々についての給餌戦略およびスケジュールを図１３Ａおよび図１３Ｂに概説する。
【０１６７】
細胞密度、細胞生存率、およびＧＬ−２０４５タンパク質力価の測定を、研究全体にわたって行った。タンパク質力価について、試料を、ペレット細胞に遠心分離し、細胞上清中のタンパク質の測定を、実施例６に記載されるような細胞上清の生体層干渉法（Ｏｃｔｅｔ）によって行った。ＧＬ−２０４５多量体化を、実施例５に記載されるようなタンパク質Ａ精製後の研究の各アームの終端で評価した。培養物を、１４日目または生存率が５０％未満に低下するまで継続した。
【０１６８】
驚くべきことに、製造業者が推奨する給餌によりＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ中に成長されたＧＬ−２０４５は、製造業者が推奨する給餌による他の培地のうちのいずれかにおいて成長されたＧＬ−２０４５よりもはるかに高いピーク細胞密度を達成した。この優れた細胞密度は、驚くべきことに、Ｃｅｌｌ  Ｖｅｎｔｏ  ２１０を除く、試験された全ての他の培地／給餌の組み合わせと比較して、３倍以上であった（図１４）。
【０１６９】
さらに、製造業者が推奨する給餌によりＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ、ＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ、またはＡＤＣＦ  ＭＡＢ中に成長されたＧＬ−２０４５は、製造業者が推奨する給餌により試験された他の培地中に成長されたＧＬ−２０４５よりも、１０日目にはるかに良好な（２〜３倍）細胞生存率を達成した。これは、これらの３つの培地が、試験されたいくつかの他の培地／給餌の組み合わせと比較して、優れた細胞生存率を生じることを実証する（図１５）。
【０１７０】
加えて、製造業者が推奨するＡｃｔｉＣＨＯ餌料ＡおよびＡｃｔｉＣＨＯ餌料ＢによりＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ培地中に成長されたＧＬ−２０４５  ＣＨＯ安定細胞株は、試験された任意の他の培地および製造業者が推奨する給餌よりも実質的に高い力価を発生させた（図１６）。ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ培養物から生成された力価は、試験された他の培地のうちのいずれから生成された力価よりも少なくとも４倍高く、１２日目のＣｅｌｌ  Ｖｅｎｔｏ  ＣＨＯ−２１０−についての５００ｍｇ／Ｌ未満および他の培地についてはさらにそれ未満と比較して、振とうフラスコ中で１０日目に２ｇ／Ｌに到達した。
【０１７１】
異なる培養条件によるバンド５以上（５＋）における割合多量体によって測定されるようなＧＬ−２０４５の多量体化を、実施例５に記載されるように判定した（図１７、表１０）。製造業者推奨基礎培地および給餌を使用したＧＬ−２０４５多量体化の最高割合は、ＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ、続いてＡｃｔｉＣＨＯおよびＰｏｗｅｒＣＨＯ３であった。ＡＤＣＦ−ＭａｂおよびＢａｌａｎＣＤは、他の培養条件と比較して、有意に悪いＧＬ−２０４５多量体化を実証した。
【表１０】
2020503855.tif 000011
【０１７２】
要約では、ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ培地は、細胞密度、生存率、およびタンパク質力価に関して試験される他の培地よりも有意に良好である。濃度測定法分析は、ＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ培地＋ＣＤ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  給餌Ｃが、３５．７％で最高割合の最大活性多量体（表１０、バンド５＋）を有することを示している。しかしながら、ＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ培地＋ＣＤ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  給餌Ｃは、４．７％のゲル中に移動しない最高割合の高分子材料を有し（図１７のゲルの上部に見られるように）、これは、この培地がまた、ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐよりも低い高秩序およびより機能的な多量体を有する凝集された非秩序多量体のより大きい画分も発生させることを示唆している。ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ＋餌料ＡおよびＢは、ゲル中に移動しない、無視できる量の非特異的に凝集された高分子量の材料を有する３０．１％の４バンドを上回る第２の最高割合のさらに高次の多量体バンドを有する。したがって、ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐは、完全に機能的なさらに高次の多量体バンドの最高割合を有する可能性が高い。これらのデータは、上流製造条件が細胞生存率、密度、および総タンパク質力価に影響を与えるのみならず、ＧＬ−２０４５の臨床的に有効なさらに高次の多量体の生成にも影響を与えることをさらに示している。実施例３に実証されるように、最高分子量画分は、ＦｃＲγＩＩＩａに対する結合の減少を呈し、これは、最高分子量画分（例えば、無秩序ＧＬ−２０４５凝集体）がＧＬ−２０４５の高秩序多量体よりも生物学的に活性でないことを示唆している。本明細書に示されるように、非常に驚くべきことに、試験される全ての基礎培地のうち、ＡｃｔｉＣＨＯ−Ｐのみが、高い総ＧＬ−２０４５タンパク質力価、高多量体化、ならびに最小量の無秩序高分子量のＧＬ−２０４５凝集体を実証した。
【０１７３】
変更された給餌プロトコル
ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ培地＋給餌が最適なタンパク質力価およびさらに高次の多量体の生成を生じると判定した後、変更された給餌スケジュールを試験して、１日おきに給餌することによって、同様のまたは最適化された結果を得ることができるかどうかを判定した。図１８に実証されるように、１日おきに給餌することは（青色）、毎日の給餌と比較して、細胞密度（図１８Ａ）、細胞生存率（図１８Ｂ）、培養物ｐＨ（図１８Ｃ）、またはタンパク質力価（図１８Ｄ）に著しい影響を与えなかった。これらの結果は、驚くべきことに、１日おきの給餌により、同様の結果を得ることができることを示しており、かつ無菌状態を維持し、製造費用を最小にするために好ましい場合がある。しかしながら、３日おきに給餌する同様の実験は、生存率およびタンパク質生成が、２日おきよりも頻繁でない給餌により減少し始め得ることを示唆した（図１９）。
【０１７４】
同様の結果を達成するためにＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ給餌を他の非ＡｃｔｉＣＨＯ基礎培地と共に使用することができるかどうかを判定するために、追加の実験を行った。簡潔に言うと、ＧＬ−２０４５クローン５８を、Ｐｏｗｅｒ  ＣＨＯ−２  ＣＤ（Ｌｏｎｚａ、＃１２−７７１Ｑ）＋４ｍＭのＬグルタミン（Ｌｏｎｚａ、＃１７−６０５Ｅ）＋１Ｘ  ＨＴ補完剤（Ｇｉｂｃｏ、＃１１０６７−０３０）中に培養した。継代後、細胞を洗浄し、かつＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ完全培地ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ＋６ｍＭのＬグルタミン（Ｌｏｎｚａ、＃１７−６０５Ｅ）またはＰｏｗｅｒ  ＣＨＯ−２  ＣＤ完全培地中に０．３×１０６細胞／ｍｌで接種され、温度シフトなしに培養した。＋１ｍＬのＡｃｔｉＣＨＯ給餌Ａ（ＰＡＡ、＃Ｕ１５−０７２）＋０．１ｍＬの給餌Ｂ（ＰＡＡ、＃Ｕ０５−０３４）によるＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ  ＰｏｗｅｒＣＨＯ培養物を毎日給餌した。９日目に、培養全体を通して実施例５に記載されるように、細胞生存率およびタンパク質力価を判定した（図２０）。結果は、製造業者の推奨に従ってＡｃｔｉＣＨＯ給餌ＡおよびＢと共に使用された場合、ＰｏｗｅｒＣＨＯ２およびＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐの両方が、同じ細胞生存率およびＧＬ−２０４５タンパク質収率を発生させることを示している。したがって、多量体組成物がＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ＋Ａ＋Ｂに対して無変化のままである場合、ＡｃｔｉＣＨＯ給餌ＡおよびＢを、他の選択的高実行基礎培地と共に使用することができ得る。
【０１７５】
実施例７−ＧＬ−２０４５生成のための温度シフトの最適タイミングおよび延長
この実験の目的は、温度シフトの最適なタイミングおよび延長を評価することであった。多数の研究員は、組み換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株の細胞周期、アポトーシス、および代謝に対する温度シフトの効果を検討した。しかしながら、検討事項は、概して、生存細胞密度に対する温度シフトの効果に対して与えられるが、最適な温度シフトの結果について必要とされる最小細胞密度には、あるとしてもほとんど注意が払われていない。さらに、多量体化ストラドマーにおける温度シフトを成功裏に行うために必要な最小細胞密度は、検討されていない。
【０１７６】
本発明の研究員は、驚くべきことに、最適なＧＬ−２０４５発現および最大力価のためには、温度シフトの時間に１０００万細胞／ｍＬの最小生存細胞密度が必要とされることを見出した。さらに、この要件は、温度シフトが起こる培養日よりも重要である。温度シフトのタイミングは、驚くべきことに、生存細胞密度が対数成長段階にあるとき、概して、生存細胞密度が１０００万〜１５００万細胞／ｍＬであるときに最も成功する。これは、概して、最初の播種密度に応じて、生物反応器の培養の４〜５日目に対応する。
【０１７７】
さらに、当該技術分野で記載されるものから逸脱すると、高力価のＧＬ−２０４５を製造するための最適な上流条件について、３７セ氏温度（３７℃）＋／−１．０Ｃ〜３２．５Ｃ＋／−１．０Ｃの温度シフトが、３１℃＋／−０．５Ｃへの温度シフトに対して好ましい。ＧＬ−２０４５の上清の２つの別個のプールを、温度シフトの性質を除いて、同一の条件を使用した安定ＣＨＯクローンから発生させた。ＣＨＯ細胞を、５日目に７．１〜７．０のｐＨシフトを有する１０Ｌ  ＸＤＲ−１０単一使用生物反応器システムの生物反応器（Ｘｃｅｌｌｅｒｅｘ、ＧＥ）中に培養した。ＡｃｔｉＣＨＯ−Ｐ  ＣＤ（ｃａｔ＃Ｕ２１−０５１）７リットルを、２８０ｍｌのＰＡＡ餌料Ａ（ｃａｔ＃Ｕ１５−０５３）を毎日および２８ｍｌのＰＡＡ餌料Ｂ（ｃａｔ＃Ｕ１５−０５４）を毎日と共に生成のために使用した。ＰＡＡ餌料ＡおよびＢは、ＡｃｔｉＣＨＯ餌料Ａおよび餌料Ｂと等価である。３２．５度（Ａ）への温度シフトおよび３１．０度への温度シフト（Ｂ）は各々、５日目に起こった。結果を表１１に示す。
【表１１】
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【０１７８】
実施例８−ＧＬ−２０４５のタンパク質Ａカラム精製は、より頻繁なＣＩＰ手順を必要とする
ＧＬ−２０４５を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２の０．１５ＭのＮａＣｌの結合緩衝液を含むタンパク質Ａ  ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（ＧＥ＃１１−００３４−９５）を有する親和性クロマトグラフィ（ＡＣ）により精製し、かつｐＨ２．７の０．１Ｍのグリシンにより溶出した。ＡＣ精製ＧＬ−２０４５を、ｐＨ７．０の１Ｘ  ＰＢＳ中に保存した（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．＃１１９−０６９−１０１）。各実験の終了時に、ＡＣ  ＧＬ−２０４５精製を、カラム適所清掃（ＣＩＰ）手順によらずに処理した。ＣＩＰ手順は、典型的には、タンパク質Ａ樹脂を消毒しながら沈殿物を加水分解するために精製周期間にカラムを通して希釈された水酸化ナトリウム（０．１〜０．５ＭのＮａＯＨ）を流動させ、よってタンパク質Ａカラムの結合能を再生させることを伴う（Ｂｏｕｌｅｔ−Ａｕｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌ．６、２０１６）。ＧＬ−２０４５を、４つの別個のタンパク質Ａ親和性カラム（カラム１〜４、ラン１１．２７．１２）上で精製した。次に、同じタンパク質Ａ親和性カラムを、１００％溶出緩衝液によりカラムを溶出した後、第２の親和性精製ラン（ラン１１．２８．１２）のために使用した。同じカラムを使用した２回のＧＬ２０４５の精製は、第２の精製ラン後、低減量のより低い分子量の種、ホモ二量体およびホモ二量体の二量体の両方を示した（図２２）。表１２に示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの濃度測定法分析は、ホモ二量体および二量体バンドの有意な損失を実証し、これは、より低い分子量バンドが、溶出緩衝液による溶出によってタンパク質Ａカラムから完全には除去されない、残存するタンパク質Ａに高度に貪欲なＧＬ−２０４５タンパク質によるタンパク質Ａ親和性カラムへの結合において上回ることを示している。
【表１２】
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【０１７９】
より低い分子量バンドの損失は、複数のタンパク質Ａ結合部位を含む高分子量の多量体ＧＬ−２０４５が、低分子量の種を上回り、これが、より低い分子量の種の損失を引き起こし、かつ薬物の組成物を効果的に変更させる、親和性カラムに対する結合力ベースの結合があることを示している。これらのデータは、より頻繁なＣＩＰ手順、およびよって、より頻繁なタンパク質Ａカラムの再生が、複数の精製ランについてタンパク質Ａカラムを使用したときに、ＧＬ−２０４５の最適な精製のために必要であることを示唆している。これらの結果は、以上に記載されたように、再生が、典型的には、当該技術分野で最も一般的に使用されるタンパク質Ａカラムを劣化させるであろうＮａＯＨの使用を必要とするため、予期されなかった。したがって、そのような緩衝液のより頻繁な使用は、タンパク質Ａカラムのより急速な劣化を生じるであろう。このように、０．５ＭのＮａＯＨなどの高強度ＮａＯＨ緩衝液による頻繁なＣＩＰ手順に耐えることができるタンパク質Ａカラムは、無傷のＧＬ−２０４５薬物の最適プロファイルを維持するために、ＧＬ−２０４５の精製において反復的に使用されるタンパク質Ａカラムの再生のために使用されなければならない。
【０１８０】
実施例９−ＧＬ−２０４５の反復的精製周期についてタンパク質Ａを再生するためのＣＩＰ手順は、０．５ＭのＮａＯＨを必要とする
実施例８に示されるような、ＣＩＰ手順の不在における低分子量の種の損失はまた、第１のカラムラン後にタンパク質Ａ親和性カラムへの結合を維持する高分子量の種があり、よって結合部位を占拠し、その後の精製ランにおけるより低い分子量の種の結合を防止することを示している。これらのデータは、追加のＣＩＰ手順が、タンパク質Ａ精製ＧＬ−２０４５の多量体プロファイルを維持するために用いられるべきであることを示した。
【０１８１】
本発明者らは、ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ  ＃２８−４０８２−５８）を使用した定期的な毎日の精製によって、およそ６〜７回の精製ラン後、精製ＧＬ−２０４５の組成物が、ホモ二量体および二量体画分のわずかな損失によって顕著な変化を生じることを発見した。例えば、モノクローナル抗体を精製する当業者であれば、６〜７回のタンパク質Ａ精製ラン後、精製された生成物の組成物中の変化を見出すことを予期しないであろう。この問題を解決するために、製造業者が推奨する０．１ＭのＮａＯＨによるＣＩＰ手順を、タンパク質Ａカラムの結合能を再生するために行った。これらのＣＩＰ手順を、各精製ラン後に行い、これは、当該技術分野において使用されるよりも頻繁である。頻繁なＣＩＰ手順を用いることで、何らかの改善が得られたが、より低い分子量の種の損失の問題は解決されなかった。したがって、本発明者らは、タンパク質ＡへのＧＬ−２０４５の貪欲な結合が、ホモ二量体および二量体の保持を促進するために、カラムの完全な再生のために当業者が通常使用するであろうよりも厳密なＣＩＰレジメンを必要とすると推論した。
【０１８２】
しかしながら、タンパク質Ａカラムにおいて一般的に使用される樹脂（例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ）は、ＮａＯＨ耐性ではなく、したがって、より厳密なＮａＯＨ緩衝液の使用により急速に劣化し、かつそのような再生は、減少した精製能力およびＧＬ−２０４５多量体組成物中の変化と関連付けられる。しかしながら、一般的にあまり使用されないタンパク質Ａ培地（例えば、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ＃１１−００３４−９５））は、０．５ＮａＯＨでの改善された清掃に耐えることができる。このように、本発明者らは、０．５ＭのＮａＯＨ緩衝液を使用した毎日のＣＩＰ手順によるＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラムを使用した。より頻繁かつより厳密なＣＩＰ手順の実行後、ホモ二量体または二量体の損失を伴わずに、かつＧＬ−２０４５の組成物中の変化を伴わずに、毎日のペースでＧＬ−２０４５のタンパク質Ａ精製を達成した。
【０１８３】
したがって、本発明者らは、ＧＬ−２０４５のタンパク質ＡカラムＣＩＰが、ホモ二量体および二量体、およびよって、無傷のＧＬ−２０４５薬物の最適プロファイルを保持するために、モノクローナル抗体またはＦｃ融合タンパク質を用いて作業する当業者によって通常用いられるであろう、より厳密かつより頻繁なＣＩＰ手順を必要とすることを発見した。
【０１８４】
実施例１０−タンパク質ＡカラムのｐＨ溶出勾配を使用して、高秩序多量体でないホモ二量体凝集体のＧＬ−２０４５を精製する
ｐＨ溶出勾配は、総タンパク質収率について最適化するためにタンパク質精製中にタンパク質Ａカラムと共に一般に使用されるが、典型的には、薬物の組成物を変化させるために使用されない。本発明者らは、タンパク質Ａカラム上でのそのようなｐＨ溶出勾配を、さらに高次の多量体からＧＬ−２０４５の無秩序凝集体を取り除くために使用することができることを発見した。ＧＬ−２０４５  ＣＨＯの上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２の０．１５ＭのＮａＣｌの混合緩衝液を含むタンパク質Ａ  ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ＃１１−００３４−９５）を有する親和性クロマトグラフィ（ＡＣ）によって精製し、続いて結合緩衝液による追加の洗浄を行った。タンパク質Ａに結合されたＧＬ−２０４５を、０％〜１００％のｐＨ２．７の０．１Ｍのグリシンを含む溶出緩衝液によって溶出し、それによってタンパク質Ａ親和性カラムからのＧＬ−２０４５の溶出のためのｐＨ勾配を創成した。溶出画分を、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ  ＃７８０２７１）内に回収し、かつｐＨ９．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌを各ウェル内に添加することによって、ｐＨ７．５に中和した。次に、画分の各々の等価のタンパク質量を、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４〜１２％ＮｕＰａｇｅ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、インビトロゲン  ＃ＮＰＯ３２２ＢＯＸ）上で実験した。
【０１８５】
ｐＨ溶出勾配によるタンパク質Ａカラムの溶出によって得られた画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、画分Ｄ６およびＤ７中に、非常に高い分子量の種が最後に溶出されたことを実証した（図２３Ａおよび図２３Ｂ）。驚くべきことに、まさに第１の画分（Ｄ１）がまた、高分子量の種を含有した。このように、これらの結果は、高分子量画分が、タンパク質Ａ親和性カラムのｐＨ勾配溶出によって、ＧＬ−２０４５の主な種（例えば、ホモ二量体、二量体、およびさらに高次の多量体）から分離され得ることを示している。実施例１〜３に示されるように、これらの画分は、減少したＦｃ受容体結合および減少したＣＤＣ抑制により実証される、より低い活性の種を表し得る。
【０１８６】
また、再生によって得られた非常に高い分子量の画分（０．５ＭのＮａＯＨによる、ＨＣｌによって中和されたＣＩＰ）が、ゲル（図２３Ｂ、右端のレーン）上に示されている。これらの結果は、溶出後のタンパク質Ａカラム上に存在する高分子量の種があることを示しており、これは、完全なカラム結合能を再生するためにＣＩＰ手順中の高度に厳密なＮａＯＨ緩衝液についての必要性を再び示している。
【０１８７】
したがって、この目的のためには通常使用されないが、ｐＨ溶出勾配を使用して、生物学的に活性なより低いおよびさらに高次の多量体からＧＬ−２０４５の高分子量無秩序凝集体を分離および除去することができる。そのような分離を用いて、精製ＧＬ−２０４５の多量体プロファイルをさらに最適化または維持することができる。代替的に、段階溶出勾配を使用して、最適化されたＧＬ−２０４５組成物に到達してもよい。
【０１８８】
実施例１１−イオン交換カラム塩およびｐＨ条件が、ＧＬ−２０４５多量体組成物を変性させる
ＧＬ−２０４５の精製のための重要な目標は、最終精製生成物の多量体組成物の厳格な制御である。イオン交換カラム（例えば、陽イオンと陰イオンとの交換）は、モノクローナル抗体およびＦｃ融合タンパク質の精製の研磨工程のためにルーチン的に使用される。本発明者らは、異なる濃度の塩を含む溶出緩衝液を用いて、陽イオン交換培地であるＰＯＲＯＳ  ＣＩＥＸ（インビトロゲン  ＧｏＰｕｒｅ  ＸＳ（１０ｍＬ）ｃａｔ＃４４４８８８５）を試験した。第１に、ＧＬ−２０４５を、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィによって精製し、次に、ＣＩＥＸカラムへの装填前に、ｐＨ５．０の５０ｍＭの酢酸ナトリウム中にプールおよび透析した。ｐＨ５の５０ｍＭの酢酸ナトリウムを、平衡および洗浄緩衝液として使用した。添加される可変量の緩衝液Ｂ（図２４に％として示されるｐＨ５の１ＭのＮａＣｌ）を含む５０ｍＭの酢酸ナトリウム溶出緩衝液を用いて、ＧＬ−２０４５の研磨に対する溶出緩衝液（ＥＢ）塩含有量の効果を試験した。ＡｋｔａＡｖａｎｔ上でクロマトグラフィランを行った。簡潔に言うと、Ａｖａｎｔ法は、１０カラム体積（ｃｖ）の総体積で、２ｍＬ／分で、ｐＨ５の５０ｍＭの酢酸ナトリウムを用いてＣＩＥＸカラムを平衡化することを含む。ｐＨ５の５０ｍＭの酢酸ナトリウム中に以前に透析された６５〜１００ｍｇのＧＬ−２０４５を、カラムに装填した。５ｃｖの結合緩衝液を用いて、２ｍＬ／分で、カラムを洗浄した。次に、多様な百分率のＮａＣｌ（例えば、３０〜５０％緩衝液Ｂから構成される溶出緩衝液）を含む９〜１５ｃｖの緩衝液を用いて、２ｍＬ／分で、ＧＬ−２０４５を溶出した。
【０１８９】
ＧＬ−２０４５の％回復を、３０％緩衝液ｂ、４０％緩衝液ｂ、および５０％緩衝液ｂ（それぞれ、３０％ＥＢ、４０％ＥＢ、および５０％ＥＢ）を含む溶出緩衝液により溶出されたＧＬ−２０４５について判定し、溶出緩衝液についての最適な範囲の塩濃度を判定した（図２４）。これらのデータは、溶出緩衝液中の塩含有量の変更が、ＧＬ−２０４５の多量体組成物を実質的に変性させ得ることを実証した。
【表１３】
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【０１９０】
実施例１１に示され、かつ表１３に定量化されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、３０％ＥＢ、４０％ＥＢ、または５０％ＥＢの溶出緩衝液により溶出された場合に、ＧＬ−２０４５分子量の種の分離における劇的な差を実証した。９１．７％の材料を、３０〜４０％緩衝液ｂを含む溶出緩衝液により溶出し、５０％緩衝液Ｂを含む溶出緩衝液により回復された材料は、高分子量の材料のみであった。これらのデータは、溶出緩衝液の変更が、ＧＬ−２０４５の多量体組成物を実質的に変性させ得ることを実証する。したがって、イオン交換のために選択された溶出緩衝液を使用して、この技術の新規使用であるＧＬ−２０４５の多量体組成物を変性させることができることは明白である。同時に、本発明者らは、ＧＬ−２０４５の組成物中の変化がイオン交換研磨工程において所望されない場合、精密のレベルは、当業者によって通常実践されない精密さのレベルが、イオン交換研磨工程において使用するための溶出緩衝液の塩濃度の選択において必要とされることを発見した。
【０１９１】
実施例１２−イオン交換クロマトグラフィを使用して、ホモ二量体またはホモ二量体の二量体を低減または取り除くことができる。
実施例１１のＧＬ−２０４５材料の９１．７％が、３０〜４０％緩衝液ｂを含む溶出緩衝液により溶出され、かつ５０％緩衝液Ｂを含む溶出緩衝液により回復された材料は、高分子量の材料のみであったため、３０〜４０％の緩衝液ｂの範囲を有する溶出緩衝液が、さらなる分析のために選択された。用いられた方法は、実施例１１に記載されるものと同様であった。
【０１９２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、３５％、３６％、または３７％以上の緩衝液ｂ（それぞれ、３５％ＥＢ、３６％ＥＢ、３７％ＥＢなど）を含む溶出緩衝液により溶出された場合に、ＧＬ−２０４５ホモ二量体の分離において劇的な差を実証した。３５％ＥＢで明確に視認可能なホモ二量体およびホモ二量体の二量体は、対照的に、３６％ＥＢで大きく減少され、３７％ＥＢ以上で完全に取り除かれることに留意されたい（図２５）。同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、３５％ＥＢ、３６％ＥＢ、もしくは３７％ＥＢで溶出された場合、またはより高い緩衝液ｂの濃度を有する溶出緩衝液により溶出された場合に、ＧＬ−２０４５の最高次の多量体と大きい無秩序凝集体との分離における劇的な差を実証している。したがって、イオン交換について選択された溶出緩衝液を使用して、この技術の新規使用であるＧＬ−２０４５の多量体プロファイルを変性させることができることは明白である。この段階溶出からのデータは、所望のＧＬ−２０４５プロファイルを得るために、当業者が単一の工程または複数の段階溶出を選択するのに使用することができることも明白である。例えば、ＰＯＲＯＳ  ＣＩＥＸカラムおよび３６．５〜３８．５％緩衝液ｂを含む溶出緩衝液を使用したＧＬ−２０４５の研磨は、多量体１０を通して全てのホモ二量体、二量体、および多量体を保持し、かつ大きい無秩序凝集体および最高次の多量体を溶出するであろう。異なるカラムを使用する同様の例を実施例４に示す。
【０１９３】
実施例１３−イオン交換クロマトグラフィを使用して、大きいホモ二量体凝集体および最高次の多量体を減少または取り除くことができる
ＧＬ−２０４５の最適な組成物の製造は、最高次のＧＬ−２０４５多量体（例えば、明確に描写可能なバンド１０を上回るバンド、およそ６００ｋＤ）の量を最小にし、原子価の増加が免疫原性の理論的リスクの増加をもたらす、大きいホモ二量体凝集体および最高次の多量体の両方を除去するために、１０００ｋＤを上回る材料を取り除くことを必要とする。ＧＬ−２０４５を、異なる百分率の緩衝液ｂ（３８％ＥＢ（Ｃ１）、３９％ＥＢ（Ｃ２）、および４０％ＥＢ（Ｃ３））を含む溶出緩衝液により溶出した（図２６）。３８％（Ｃ１）、３９％（Ｃ２）、および４０％（Ｃ３）（図２６）で、続いて５０％および１００％緩衝液Ｂでのより小さい溶出ピークで、ＧＬ−２０４５についての主な溶出ピークを観察した。各溶出緩衝液についてのＧＬ−２０４５回復の％を判定し、表１４に表す。
【表１４】
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【０１９４】
溶出されたＧＬ−２０４５画分の多量体プロファイルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の目視検査によって判定した（図２７）。溶出された画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の目視検査は、溶出緩衝液の３８％が、残存する高分子量の材料の最小量を含むＧＬ−２０４５を回復することを示した。
【０１９５】
ＧＬ−２０４５のピークを、濃度測定法によって定量化した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドにおける割合強度として表１５に要約した、図２８）。ピーク１１は、最低分子量を有するホモ二量体を表し、ピーク１は、好ましくは、取り除かれる最高分子量の材料を含む材料を表す。
【表１５】
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【０１９６】
これらの結果は、ｐＨ５の３８％または３９％緩衝液Ｂを含むアセテート溶出緩衝液による段階溶出プロトコルが、ＧＬ−２０４５の好ましい画分のおよそ８５％を生じ、かつ６００ｋＤを上回る、より高い分子量の画分を低減したことを実証している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの目視検査は、高分子量の材料が３８％緩衝液ｂを含む溶出緩衝液を溶出した画分において最低であることを示したが、濃度測定分析は、３９％緩衝液ｂを含む溶出緩衝液により、最高分子量画分の最低百分率が得られることを示した。しかしながら、濃度測定分析は、ＣＩＥＸ精製タンパク質組成物の全てが親和性クロマトグラフィのみによって精製された材料と比較して、高分子量画分（バンド１）においてより少ない量を含有することを実証した。全体的に、溶出の分析は、大きい凝集体および最高次の多量体の量を、ＰＯＲＯＳ  ＣＩＥＸカラムを用いた制御された溶出条件を適用することによって制御することができることを示唆している。したがって、イオン交換のために選択された溶出緩衝液を使用して、この技術の新規使用であるＧＬ−２０４５の大きい凝集体および最大高秩序多量体組成物を変性させることができることは明白である。異なるカラムを使用する同様の例は実施例４にある。
【０１９７】
実施例１４−疎水性相互作用クロマトグラフィカラムを用いたＧＬ−２０４５多量体組成物の変性
ＧＬ−２０４５を、安定ＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞株から生成し、かつＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ  ＃３５０５０−０６１）およびＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ  ＃１０１３１−０２７）を有する２９３自由型培地（Ｇｉｂｃｏ  ＃１２３３８−０１８）中に成長させた。上清を、一週間に２回採取し、かつ０．２μｍで１Ｌのフィルタシステム（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＃４３１０９８）へと濾過した。次に、ＧＬ−２０４５の上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２の０．１５ＭのＮａＣｌの結合緩衝液を有するタンパク質Ａ  ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥ＃１１−００３４−９５）により精製し、３．０〜３．６のｐＨを有する０．１Ｍのクエン酸ナトリウム溶出緩衝液で溶出した。ＡＣ精製ＧＬ−２０４５を、ｐＨ７．０の１Ｘ  ＰＢＳ（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．＃１１９−０６９−１０１）中に保存した。
【０１９８】
次に、ＧＬ−２０４５を、ＨｉＴｒａｐ  ＨＩＣ選択キット（ＧＥ  ＃２８−４１１０−０７）を使用した、７つの異なる疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）上で精製した。このキットに含まれたカラムを表１６に記載する。
【表１６】
2020503855.tif 000017
【０１９９】
ＨＩＣカラムを、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０の１．０Ｍの硫酸アンモニウム（開始緩衝液）により平衡化し、かつ３．５ｍｇのＡＣ精製ＧＬ−２０４５（４体積の開始緩衝液中に希釈される）を、各カラムに装填した。開始緩衝液による洗浄後、ｐＨ７．０の０％〜１００％の５０ｍＭのリン酸ナトリウムを使用して、勾配溶出を行った。全ての分画ピークおよびフロースルーを、ＳＤＳページによって試験した。非低減試料を、１５％Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ＃１６１−１１５）内に装填した。銀染色キット形態であるインビトロゲン＃ＬＣ６１００を使用して、染色を行った。
【０２００】
７つの異なるＨＩＣカラムは、ＧＬ−２０４５の異なる多量体プロファイルを実証した。一例として、ブチルＨＰカラムは、ホモ二量体画分（画分Ａ１０）をＡ１２に見出される多量体分子量の種から分離した。フェニルＨＰカラム（画分Ｂ８と比較した画分Ｂ１１）で、同じ効果が見られた。オクチルＦＦカラムによる溶出画分中に、装填された材料の１６％のみが回復され、これは、それがＧＬ−２０４５のためのフロースルーモード研磨方法に良好に適合され得ることを示している。さらに、オクチルＦＦカラムから溶出された画分は、より高い分子量の種を含有し、これは、カラムが、より低い効力を有する非常に高い分子量のホモ二量体凝集体の種の除去にも良好に適合され得ることを示している。
【０２０１】
Ｍ０４５として知られるマウス版のＧＬ−２０４５上で、同様の実験を行い、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィによって、Ｍ０４５を精製し、次に、Ｈｉｌｏａｄ  ２６／１０フェニルセファロース高性能（ＧＥ  １７−１０８６−０１）を有するＨＩＣによって、ＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔ（ＧＥ）上でさらに精製した。ＨＩＣカラムを、０．１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０の１Ｍの硫酸アンモニウム（開始緩衝液）により平衡化し、Ｍ０４５をカラム上に装填し、続いて開始緩衝液による洗浄工程を行い、全ての非結合材料を除去した。次に、Ｍ０４５を、勾配溶出によるｐＨ７．０の０．１Ｍのリン酸ナトリウム溶出緩衝液により溶出した（図３０〜３１）。
【０２０２】
Ｍ０４５のＨＩＣ精製画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、Ｍ０４５多量体プロファイルに対するＨＩＣカラムの研磨の効果を判定した。これらの結果は、疎水性相互作用カラムを使用して、ホモ二量体、二量体、三量体、および多量体画分の明確な分離によって留意される、Ｍ０４５の多量体組成物を変性させることができることをさらに実証した（図３２）。
【０２０３】
実施例１５−最適に生成されたＧＬ−２０４５についての例示的なプロトコル
本明細書に記載されるデータは、（１）タンパク質力価、（２）培養全体を通した細胞生存率、および（３）ＧＬ−２０４５の多量体化、ならびに（４）最終ＧＬ−２０４５医薬物質中の多量体プロファイルの維持の最適化を生じる、ＧＬ−２０４５の上流および下流製造プロセスのいくつかの変数についての最適な条件を実証している。重要なことに、ＧＬ−２０４５の多量体化のレベルは、ストラドマーの臨床的効能にとって不可欠である（実施例１〜４を参照のこと）。現在の培養方法は、特定の画分の最適化された生成または特定の多量体化パターンの向上を必ずしも目的としていない。このように、多量体化に影響を与える上流培養試薬および条件ならびに下流精製培地および条件は、全て知られておらず、かつ当該技術分野の現在の状態に基づいて予測することができない。
【０２０４】
本明細書に記載されるデータは、最適に製造されたＧＬ−２０４５を発生させるための以下のプロトコル要素の発見をもたらした：
【０２０５】
（１）最適に製造されたＧＬ−２０４５を発生させるための最適ベースの培地は、ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐである。
本明細書に記載されるデータは、最適な基礎培地がＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐであったと実証している。ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ基礎培地中の生物反応器において培養されたＣＨＯ細胞は、試験された他の基礎培地と比較して、タンパク質力価の増加のために最適化されると同時に、高細胞密度および細胞生存率をもたらした。驚くべきことに、ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ培地は、培養プロトコルの終了時に存在するＧＬ−２０４５のさらに高次の多量体の百分率の増加をもたらした。
【０２０６】
（２）最適に製造されたＧＬ−２０４５を発生させるための最適な給餌は、ＡｃｔｉＣＨＯ  ＰおよびＡｃｔｉＣＨＯ餌料Ａおよび餌料Ｂである。
本明細書に記載されるデータは、最適な給餌が、毎日または１日おきに培養物に添加された、ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ餌料Ａおよび餌料Ｂであったとさらに実証している。ＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ餌料Ａおよび餌料Ｂは、試験された他の培地／給餌の組み合わせよりも４倍大きいタンパク質力価をもたらしながら、高細胞密度および高細胞生存率を維持した。重要なことに、かつ思いがけず、餌料Ａおよび餌料Ｂを有するＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ培地は、試験された他の培地／給餌の組み合わせと比較して、高レベルの高秩序多量体、および重要なことに、ＧＬ−２０４５の高分子量無秩序凝集体の百分率の減少をもたらした。これらのデータは、この特定の培地／給餌の組み合わせが、改善された臨床的効能を有するＧＬ−２０４５多量体のより大きい百分率（例えば、高秩序ＧＬ−２０４５多量体のより大きい百分率）の生成をもたらすことを示している。本発明者らは、驚くべきことに、餌料Ａおよび餌料Ｂの１日おきの添加について同様の結果を見出し、これは、この特定の培地／給餌の組み合わせを使用して、費用を低減し、かつ毎日の培養操作と関連付けられる汚染のリスクを軽減することができることを示している。
【０２０７】
さらに、餌料Ａおよび餌料Ｂを有するＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ培地は、ＧＬ−２０４５の非秩序の高分子量凝集体の百分率を最小にしながら、さらに高次の多量体として存在するＧＬ−２０４５の実質的な百分率の生成をもたらした。このように、この特定の培地／給餌の組み合わせは、驚くべきことに、高秩序多量体化されたＧＬ−２０４５の生物学的に機能的かつ臨床的に有効な画分について最適化し、したがって、さらに下流の精製工程における高次の凝集体を取り除く必要を低減しながら、ＧＬ−２０４５多量体プロファイルの保持を最適化した。
【０２０８】
（３）最適に製造されたＧＬ−２０４５を発生させるための最適な温度シフトは、細胞密度に基づく３７℃〜３２．５℃のシフトである。
本明細書に記載されるデータは、加えて、細胞密度に基づく３７℃〜３２．５℃の温度シフトが、最適な細胞密度、生存率、およびタンパク質力価をもたらすことを実証している。この温度シフトプロトコルは、単に培養日に基づく３７℃〜３１℃の温度シフトを記載する、構築されたプロトコル（Ｏｕｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５２（３）、ｐｐ．１９９−２０７、（２００６）；Ｍａｓｔｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｍａｌｅｓ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ、２（１）、ｐｐ．４９−６１、（２０１４））から逸脱している。本発明者らは、思いがけず、細胞が約１０〜１５×１０６細胞／ｍＬの密度に到達した後の３２．５℃への温度のシフトが、以前に構築されたプロトコルと比較して、高細胞密度および細胞生存率の維持のみならず、タンパク質力価の実質的な増加をもたらすことを見出した。
【０２０９】
本明細書で実証されたデータは、特定の下流精製プロトコルが、最適化された多量体化プロファイルを有するＧＬ−２０４５組成物をもたらすことを示している。これらの精製方法を実行する際に、カラム条件および緩衝液を制御することによって、ＧＬ−２０４５の所望の多量体プロファイルを維持するために、厳しい注意を払わなければならない。これは、収率の純度および保持が主な目標である、モノクローナル抗体、Ｆｃ融合タンパク質、または類似のＣＨＯ由来タンパク質とは全く対照的である。
【０２１０】
（４）ＧＬ−２０４５の最適化されたタンパク質Ａ精製は、頻繁かつ厳密なＣＩＰ方法を必要とする。
ＧＬ−２０４５は、タンパク質Ａに貪欲に結合する。この貪欲な結合は、ｍＡｂ精製のために通常用いられるＣＩＰ手順が使用されたときに、カラム中のタンパク質Ａ培地への結合を維持するＧＬ−２０４５をもたらした。結果として、タンパク質Ａカラムの使用の反復周期により、ＧＬ−２０４５のホモ二量体画分は、タンパク質Ａに結合し、かつカラムを通して流動することができなかった。これは、最終タンパク質Ａ精製ＧＬ−２０４５生成物の多量体プロファイルの実質的かつ機能的に重要な変化をもたらした。したがって、ＧＬ−２０４５の貪欲な結合は、当該技術分野で一般的に使用される（例えば、ｍＡｂまたはＦｃ−融合タンパク質精製中に）ものよりも頻繁かつ厳密な（例えば、０．５ＭのＮａＯＨ洗浄緩衝液を使用した）ＣＩＰ手順のための要件をもたらした。これらの結果は、最も一般的に使用されるタンパク質Ａカラムが、ＧＬ−２０４５多量体を除去し、かつタンパク質Ａカラムを完全に再生させるのに必要とされる厳密なＮａＯＨ洗浄に耐えることができないため、予期されなかった。したがって、一部だけのタンパク質Ａカラム、具体的にはＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅは、ＧＬ−２０４５の精製のために使用することができ、かつ所望のＧＬ−２０４５多量体プロファイルを維持するために、およそ０．５ＭのＮａＯＨによる頻繁なＣＩＰ手順を必要とするであろう。
【０２１１】
（５）。ｐＨ溶出勾配または段階溶出は、より低いかつさらに高次の多量体からＧＬ−２０４５の最高分子量画分の分離を促進する。
タンパク質Ａの精製によるｐＨ溶出勾配の使用は、第１および最後の溶出画分において溶出された最高分子量の成分をもたらした。これらのデータは、ｐＨ勾配を用いて、ＧＬ−２０４５の生物学的に活性な画分（例えば、ホモ二量体、二量体、およびさらに高次の多量体）を、生物活性を低減したと以前に示された、非秩序の高分子量凝集体から構成される画分から分離させることができることを示している。
【０２１２】
（６）イオン交換クロマトグラフィによるＧＬ−２０４５の研磨に最適な溶出緩衝液は、アセテート緩衝液＋３０〜４０％緩衝液ｂ、特に３７．５％〜３９％＋／０．５％である。
イオン交換クロマトグラフィは、一般に、ｍＡｂ生成中に不純物の薬物を研磨するために使用される。しかしながら、本発明者らは、最適な多量体化プロファイルが達成されるように、ＧＬ−２０４５の特定の画分（例えば、ホモ二量体の最高次の多量体および高分子量無秩序凝集体）を取り除くためにイオン交換クロマトグラフィを用いた。具体的には、本発明者らは、３０〜４０％緩衝液ｂの溶出緩衝液が、ＧＬ−２０４５の高分子量無秩序凝集体の量を低減することを見出した。さらにより具体的には、３８〜３９％緩衝液ｂの溶出緩衝液は、具体的には、低減量の無秩序凝集体についても最適化しながら、最終ＧＬ−２０４５生成物中に存在するホモ二量体の量を維持した。
【０２１３】
（７）疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）を用いて、特定のＧＬ−２０４５多量体化プロファイルを達成することができる。
本明細書のデータは、ＧＬ−２０４５を精製する研磨工程において、複数のＨＩＣを使用することができることを実証している。例えば、オクチルＦＦカラムからのフロースルーは、主に高分子量の種を含有し、これは、具体的にはＧＬ−２０４５の高分子量凝集体の除去のためにこのカラムを使用することができることを示している。代替的に、ブチルＨＰカラムを使用して、画分のうちの１つがより望ましい成果を達成し得る用途のための多量体画分から、ホモ二量体画分を分離させることができる。代替的に、結合モードにおいて、ＨＩＣカラムを使用することができる。
【０２１４】
ＧＬ−２０４５についての最適化された製造プロトコル
まとめると、上記に考察されたパラメータのうちの全てを組み込むと、以下のプロトコルは、多量体として全体的な集団の最高百分率を維持しながら、ＧＬ−２０４５の最高タンパク質収率をもたらした。
【０２１５】
ＥｘｃｅｌｌＧｅｎｅ  ＳＡ（Ｍｏｎｔｈｅｙ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース標的配列によって隣接されたＧＬ−２０４５発現カセットを含むＧＬ−２０４５発現ベクター、およびｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースを含む第２のベクターを使用して、ＣＨＯ細胞を２つのベクターでトランスフェクトした。ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンは、ゲノムの高度に転写された領域への優先的な挿入を有し、加えて、遺伝子抑制による絶縁を提供する、逆方向末端反復を含有する。トランスフェクトは、高度に転写されたゲノム領域への発現カセットの組み込みをもたらし、それによって導入遺伝子の２０個未満のゲノム挿入を有する安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞のバンクを構築する。次に、安定的にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、３７℃の成長温度でＡｃｔｉＣＨＯ  Ｐ培地による生物反応器中に培養した。この培養中に、培養物が約１０００万〜約１５００万細胞／ｍＬの細胞密度に到達するまで、３７℃の成長温度でＡｃｔｉＣＨＯ餌料Ａおよび餌料Ｂにより毎日細胞を給餌した。そのような密度に到達した後、成長温度を、３７℃±１℃〜３２．５℃±１℃にシフトし、かつ培地から最適に製造されたＧＬ−２０４５を、培養の最終日に培地から採取した。
【０２１６】
このプロトコルは、培養の１８日目に９５％超、および２１日目に８０％超の細胞生存率、ならびに９，０００ｍｇ／ｍＬ超の最終総タンパク質力価をもたらし、ＧＬ−２０４５の７０％超が、非ホモ二量体として存在し、３０％超が、第５の多量体を上回るさらに高次の多量体として存在した。
【０２１７】
最大高秩序多量体の継代を妨害せず、それによって上清のホモ二量体および多量体プロファイルを保持する、接線流動濾過システムにより培養上清から、ＧＬ−２０４５を採取した。次に、下流製造方法を用いて、ＧＬ−２０４５を単離し、不純物を除去し、かつＧＬ−２０４５の多量体プロファイルを制御するために特定の画分を単離した（例えば、非秩序高分子量凝集体の除去）。タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィによって、ＧＬ−２０４５を精製し、高アルカリ性再生に耐える能力のために、タンパク質Ａ培地を選択した。さらに、１つ超の洗浄緩衝液を使用して、精製プロセスにわたるさらなる制御を可能にした。加えて、ＣＩＰ手順は、最終ＧＬ−２０４５組成物中にホモ二量体を保持するのに必要とされるようなタンパク質Ａカラムの結合能を完全に再生させるために、通常よりも頻繁に行われ、かつカラムに貪欲に結合されたＧＬ−２０４５多量体を除去するために０．５ＭのＮａＯＨ緩衝液により行われた。ｐＨ溶出勾配を伴うか、または伴わずに、タンパク質Ａカラムから、ＧＬ−２０４５を溶出した。タンパク質Ａカラムの親和性クロマトグラフィによる精製後、追加の研磨工程を用いた。陽イオン交換クロマトグラフィを使用して、３７〜３９％＋／−０．５％緩衝液ｂを含む溶出緩衝液により、好ましくは、ＣＩＥＸ  ＰＯＲＯＳ  ＸＳ樹脂により、ＧＬ−２０４５の高分子量無秩序凝集体を除去した。いくつかの実施形態では、ＨＩＣカラムを使用して、ＧＬ−２０４５をさらに精製した。ＧＬ−２０４５の高分子量無秩序凝集体を除去するために、オクチルＦＦ樹脂を、追加の研磨工程として使用した。代替的に、ブチルＨＰ含有カラムを使用して、特定のＧＬ−２０４５画分を単離（例えば、さらに高次の多量体を単離）した。加えて、陰イオン交換カラム、具体的にはＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ速流カラムを、特にフロースルーモードにおける追加の研磨工程として使用した。
【０２１８】
これらの追加の精製工程は、個々に使用され得るが、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィによるＧＬ−２０４５の精製は、最終タンパク質力価が＞４ｇ／Ｌであり、ＧＬ−２０４５の＞７０％が多量体として存在し、多量体の＞３０％が五量体以上の多量体である、最終ＧＬ−２０４５医薬物質に到達するために、陰イオン交換、陽イオン交換、および疎水性相互作用クロマトグラフィの３つ全てと組み合わせて使用されることが好ましかった。
【０２１９】
実施例１６−最適に生成されたＧＬ−２０４５の分析
本明細書に記載される方法によって作製された最適に生成されたＧＬ−２０４５をさらに特徴付けするために、本明細書に記載されるＡｃｔｉＰｒｏ基礎培地、給餌、温度シフトを使用した本明細書に記載される上流方法に従って、生物反応器中にＧＬ−２０４５を生成した。次に、結果として生じるＧＬ−２０４５の上清を、ミリポアＸ０ＨＣ深層フィルタを通して送り、続いて０．２μｍのフィルタを通した濾過を行い、かつ複数の下流処理方法を使用して処理した。ＧＬ−２０４５組成物の多量体化プロファイルは、各処理工程後に評価され、図３３に示されている。濾過されたＧＬ−２０４５調製物の多量体化プロファイルを、図３３に赤い点によって示す。次に、濾過されたＧＬ−２０４５調製物を、タンパク質Ａ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ（ＧＥ．＃１１−００３４−９５）を有する親和性クロマトグラフィに供し（図３３に青い点によって示される多量体化プロファイル）、次に、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ速流カラムを使用したフロースルーモードにおけるＡＩＥＸを用いて精製した。次に、結果として生じたＧＬ−２０４５は、ｐＨ５．０±０．１０に調整されたｐＨであり、かつ０．２μｍのフィルタを通して濾過した（図３３に緑の点によって示される多量体化プロファイル）。次に、５０ｍＭのＮａアセテート＋ｐＨ５．０の３７５ｍＭのＮａＣｌを含む溶出緩衝液（図３３に黄色の点によって示される多量体化プロファイル）を含む溶出緩衝液、その後、疎水性相互作用クロマトグラフィ（図３３に橙色の点によって示される多量体化プロファイル）、および濾過（図３３に紫の点によって示される多量体化プロファイル）を使用して、最終医薬物質（図３３に黒の点として示される多量体化プロファイル）に到達するための段階溶出によって、結合モードにおけるＰｏｒｏｓ  ＸＳカラムを使用した陽イオン交換クロマトグラフィにより、ＧＬ−２０４５を精製した。図３３についての生データを以下の表１７に示す。
【表１７−１】
2020503855.tif 000018
【表１７−２】
2020503855.tif 000019
【表１７−３】
2020503855.tif 000020
【表１７−４】
2020503855.tif 000021
【０２２０】
分析的ＨＰＬＣの各工程の後に、ホモ二量体、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、および７＋マー画分の百分率を評価した。簡潔に言うと、本明細書に記載される上流方法に従って、ＧＬ−２０４５の安定的にトランスフェクトされたＣＨＯの上清を発生させた。次に、本明細書に記載される下流方法に従って、ＧＬ−２０４５を精製した。以下の成功裏の精製段階で、試料を得た：タンパク質Ａ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ負荷、タンパク質Ａ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅプール、陰イオン交換プール、陽イオン交換プール、ＨＩＣプール、ＵＦＤＦプール、および医薬物質。分析的ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって、試料を比較した。簡潔に言うと、高速液体クロマトグラフィシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステム）上で、２８０ｎｍのＵＶ検出を含む一連の２つのＳＥＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏ  ＳＥＣ（３００Å））を使用して、ＨＰＣＬによって、アイソクラチック分離を行った。クロマトグラフィは、６０分のラン時間、および０．５ｍＬ／分の流量で行われる。各ピークの相対面積割合を計算する。
【０２２１】
結果を図３３に示す。図３３において明白であるように、ＧＬ−２０４５の下流処理は、最小画分であるホモ二量体およびホモ二量体の二量体、ならびに最大画分である７マー＋を変更し、画分３〜６は、かなり安定的なままであった。より小さい多量体に関して、タンパク質Ａカラムの装填から最終医薬物質までの漸進的な下流製造工程は、ホモ二量体およびホモ二量体の二量体の回復の増加をもたらした。しかしながら、漸進的な下流処理工程は、最高次の多量体に対して反対の効果を有し、それらの関連する百分率の減少をもたらした。
【０２２２】
結果として生じるＧＬ−２０４５薬物生成物は、組成物全体の百分率として、ホモ二量体の約２０％未満、および７マー以上の約２８％超を構成する、定義された多量体パターンを有した。組成物はまた、約７〜１２％のホモ二量体の二量体、約６〜１１％のホモ二量体の三量体、約１０〜１６％のホモ二量体の四量体、約６〜９％のホモ二量体の五量体、および約１０〜１４％のホモ二量体の六量体を含んだ。
【図１Ａ】
2020503855.tif 000022
【図１Ｂ】
2020503855.tif 000023
【図２】
2020503855.tif 000024
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2020503855.tif 000026
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2020503855.tif 000028
【図４Ｃ】
2020503855.tif 000029
【図４Ｄ】
2020503855.tif 000030
【図５Ａ】
2020503855.tif 000031
【図５Ｂ】
2020503855.tif 000032
【図５Ｃ】
2020503855.tif 000033
【図６Ａ】
2020503855.tif 000034
【図６Ｂ】
2020503855.tif 000035
【図７】
2020503855.tif 000036
【図８】
2020503855.tif 000037
【図９】
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【図１０】
2020503855.tif 000039
【図１１】
2020503855.tif 000040
【図１２Ａ】
2020503855.tif 000041
【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
2020503855.tif 000045
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
2020503855.tif 000049
【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
2020503855.tif 000051
【図１８Ｄ】
2020503855.tif 000052
【図１９】
2020503855.tif 000053
【図２０Ａ】
2020503855.tif 000054
【図２０Ｂ】
2020503855.tif 000055
【図２１Ａ】
2020503855.tif 000056
【図２１Ｂ】
2020503855.tif 000057
【図２１Ｃ】
2020503855.tif 000058
【図２２】
2020503855.tif 000059
【図２３Ａ】
2020503855.tif 000060
【図２３Ｂ】
2020503855.tif 000061
【図２４】
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【図２５】
2020503855.tif 000063
【図２６】
2020503855.tif 000064
【図２７】
2020503855.tif 000065
【図２８】
2020503855.tif 000066
【図２９Ａ】
2020503855.tif 000067
【図２９Ｂ】
2020503855.tif 000068
【図３０】
2020503855.tif 000069
【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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