(57)【要約】  本発明は、一般に、１以上のネオペプチドをコードする組換えポックスウイルスを含んでなる個別化癌ワクチン、またはこのような組換えポックスウイルスと薬学上許容可能なビヒクルとを含んでなる組成物、およびそれを必要とする癌対象を治療するための前記個別化癌ワクチンの使用に関する。特定の実施形態は、ａ）腫瘍サンプルおよび非腫瘍サンプルからＤＮＡを抽出すること、ｂ）標的領域、好ましくは、ゲノムの全コード領域（エクソーム）を選択すること、ｃ）前記抽出ＤＮＡから前記標的領域（例えば、エクソーム）を配列決定すること、ならびにｄ）前記腫瘍および非腫瘍サンプルから得られるＤＮＡ配列を比較することにより、１以上の腫瘍特異的突然変異を同定すること、を含んでなる同定工程を含んでなる、このようなワクチンまたは組成物を提供する方法に関する。実施形態はまた、このような個別化癌ワクチンの投与を含んでなる、癌を治療するまたはその再発を予防する方法を含む。本発明は、特にＴ細胞免疫応答を刺激するための個別化免疫療法の分野において非常に特別な関心が持たれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上のネオペプチドをコードする組換えポックスウイルスを含んでなる、個別化癌ワクチン。
【請求項２】
前記組換えポックスウイルスが、オルソポックスウイルス属に属し、好ましくは、ワクシニアウイルスである、請求項１に記載の個別化癌ワクチン。
【請求項３】
前記組換えポックスウイルスが、ＭＶＡなどの複製欠損ワクシニアウイルスである、請求項２に記載の個別化癌ワクチン。
【請求項４】
前記組換えポックスウイルスによりコードされる前記１以上のネオペプチドの各々が、１以上の腫瘍特異的突然変異を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の個別化癌ワクチン。
【請求項５】
前記ネオペプチドの少なくとも６０％が、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異を含んでなる、請求項４に記載の個別化癌ワクチン。
【請求項６】
前記ネオペプチドの少なくとも６０％が、ミスセンス突然変異を含んでなる、請求項５に記載の個別化癌ワクチン。
【請求項７】
前記１以上のネオペプチドが、１６〜９０アミノ酸残基、好ましくは、１７〜８５アミノ酸残基、より好ましくは、１８〜８０アミノ酸残基の長さを有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の個別化癌ワクチン。
【請求項８】
ミスセンス突然変異を含んでなる前記ネオペプチドが、１８〜２９残基の長さを有し、かつ、フレームシフト突然変異を含んでなる前記ネオペプチドが、３０〜８０アミノ酸残基の長さを有する、請求項５〜７のいずれか一項に記載の個別化癌ワクチン。
【請求項９】
少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％のミスセンス突然変異を有するネオペプチドが、中心の位置で置換アミノ酸を有する、請求項５〜８のいずれか一項に記載の個別化癌ワクチン。
【請求項１０】
いくつかのネオペプチド、好ましくは、全てのネオペプチドが、１以上の融合体、好ましくは、２〜１５個のネオペプチドの１以上の融合体の形態で、前記組換えポックスウイルスにより発現される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の個別化癌ワクチン。
【請求項１１】
前記融合体が、いずれのＴＭセグメントも含まない、請求項１０に記載の個別化癌ワクチン。
【請求項１２】
前記融合体が、疎水性に対して負のスコアをとる、請求項１０または１１に記載の個別化癌ワクチン。
【請求項１３】
前記融合体が、０．１以下のハイドロパシースコアを示す、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の個別化癌ワクチン。
【請求項１４】
前記組換えポックスウイルスが、２または３個の融合体をコードし、ここで、
各融合体が、５〜１０個のネオペプチドを含んでなり；
各融合体が、第１のネオペプチドのＮ末端に、および各ネオペプチドの間に、リンカー、好ましくは３アミノ酸長のリンカーを含んでなり；
各融合体が、前記融合体のＮ末端にシグナルペプチドを含んでなり；
かつ
各融合体が、場合により、前記融合体のＣ末端にタグを含んでなり；かつ
各融合体が、
負のグローバル疎水性スコアおよび／または０．１以下のグローバルハイドロパシースコアを示し、かつ
いずれの潜在的なＴＭセグメントも含まない、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の個別化癌ワクチン。
【請求項１５】
前記組換えウイルスが、１〜３個のカセットであって、各々が、ｐ１１ｋ７．５、ｐＨ５Ｒ、ｐ７．５Ｋ、およびｐＢ２Ｒからなる群から選択されるワクシニアプロモーターの転写制御下にある５〜１０個のネオペプチドの融合体の発現のためのカセットである前記１〜３個のカセットを含んでなる組換えＭＶＡである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の個別化癌ワクチン。
【請求項１６】
前記組換えポックスウイルスが、１以上の治療遺伝子、好ましくは、自殺遺伝子および免疫賦活遺伝子からなる群から選択される１以上の治療遺伝子をさらにコードする、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の個別化癌ワクチン。
【請求項１７】
組換えポックスウイルスによりコードされるのに好適な１以上のネオペプチドを同定する工程を含んでなる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の個別化癌ワクチンを調製する方法であって、前記１以上のネオペプチドが、１以上の腫瘍特異的突然変異を含んでなる、前記方法。
【請求項１８】
前記方法が、同定工程を含んでなり、
前記同定工程が、以下のサブ工程ａ）〜ｄ）：
ａ）腫瘍サンプルおよび非腫瘍サンプルからＤＮＡを抽出する工程、
ｂ）標的領域、好ましくは、ゲノムの全コード領域（エクソーム）を選択する工程、
ｃ）前記抽出ＤＮＡから前記標的領域（例えば、エクソーム）を配列決定する工程、ならびに
ｄ）前記腫瘍および非腫瘍サンプルから得られるＤＮＡ配列を比較することにより、１以上の腫瘍特異的突然変異を同定すること、
を含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍サンプルが、好ましくは、２０％超の腫瘍細胞を含んでなる腫瘍生検であり、かつ、前記非腫瘍サンプルが、生体液、細胞学的材料または生検である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記同定工程が、以下のさらなるサブ工程ｅ）〜ｉ）：
ｅ）ｍＲＮＡ転写レベル、またはタンパク質翻訳レベルのいずれかで、腫瘍中の発現レベル別に潜在的なネオペプチドをランク付けする工程；
ｆ）非自己発現腫瘍特異的突然変異を選択する工程；
ｇ）前記ネオペプチドに含まれるネオエピトープの免疫能を予測する工程；
ｈ）ネオエピトープ自体におけるおよび／またはいくつかのネオペプチドを含んでなるネオペプチド融合体における潜在的なＴＭセグメントの存在を予測する工程；
ｉ）疎水性の程度別に潜在的なネオペプチドおよび／またはネオペプチド融合体をランク付けする工程、ならびに、特に、ネオペプチドおよび／またはネオペプチド融合体が負のグローバル疎水性スコアおよび／または０．１以下のグローバルハイドロパシースコアを示すように、ネオペプチドおよび／またはネオペプチド融合体を選択する工程
の１以上をさらに含んでなる、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法が、前記組換えポックスウイルスを作製する工程をさらに含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記組換えポックスウイルスのゲノムに挿入される前記１以上のネオペプチドをコードする核酸分子が、対象における発現を可能にする好適な調節エレメントの制御下で１以上の発現カセット内に配置される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記１以上のネオペプチドをコードする前記核酸分子または発現カセットが、親ポックスウイルスのゲノムに挿入されて、前記組換えポックスウイルスが作製され、好ましくは、前記親ポックスウイルスが、ネオペプチドをコードする核酸分子または発現カセットのために選択される挿入部位においてクローン化された蛍光レポーター遺伝子を含んでなる、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記蛍光レポーターが、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ｅＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質）、ＡｍＣｙａｎ１蛍光タンパク質およびｍＣｈｅｒｒｙからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記組換えポックスウイルスを作製する前記工程が、前記蛍光レポーターのヌクレオチド配列において少なくとも１つの二本鎖切断を生じることができるエンドヌクレアーゼによる切断のさらなる工程であって、前記エンドヌクレアーゼが、前記ポックスウイルスのゲノムを切断しない前記さらなる工程を含んでなる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記エンドヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよび蛍光レポーター遺伝子内に独特な切断部位を有する制限酵素からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記組換えポックスウイルスを作製する前記工程が、２〜０．０５の間に含まれる組換え：親の比で、最大４週間、好ましくは、最大３週間で前記組換えポックスウイルスを作製することを可能とする、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法が、製造工程をさらに含んでなり、前記製造工程が、好適なプロデューサー細胞中で好適な規模まで増幅する工程、生産された組換えポックスウイルスを細胞培養物から回収する工程、および回収された組換えポックスウイルスを精製する任意選択の工程を含んでなる、請求項１７〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記プロデューサー細胞が、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
生産された組換えポックスウイルスを回収する前記工程が、前記プロデューサー細胞膜が破壊される、好ましくは高速ホモジナイザーを用いることにより破壊される溶解工程を含んでなる、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記精製工程が、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）工程を含んでなる、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記製造工程が、個別化癌ワクチンに関して、少なくとも１０９ｐｆｕ、望ましくは、少なくとも５×１０９ｐｆｕ、好ましくは、およそ１０１０ｐｆｕ以上の生産に達する、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記個別化癌ワクチンが、治療上有効な量の前記組換えポックスウイルスと薬学上許容可能なビヒクルとを含んでなる組成物である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の、または請求項１７〜３２のいずれか一項に記載の方法に従って得られる、個別化癌ワクチン。
【請求項３４】
個々の用量に対する前記治療上有効な量が、およそ５×１０７ｐｆｕ〜およそ１０９ｐｆｕである、請求項３３に記載の個別化癌ワクチン。 
【請求項３５】
対象において癌を治療するまたはその再発を予防するために、それを必要とする対象において使用するための、請求項３３または３４のいずれか一項に記載の個別化癌ワクチン。
【請求項３６】
前記癌が固形腫瘍である、請求項３５に記載の使用のための個別化癌ワクチン。 
【請求項３７】
前記癌が、脳癌、例えば、星状細胞腫、胚芽腫、生殖細胞腫瘍、中枢神経系非定型奇形／ラブドイド腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、神経膠腫および膠芽腫ならびに頭頸部癌である、請求項３６に記載の使用のための個別化癌ワクチン。 
【請求項３８】
前記癌が、肺癌、特にＮＳＣＬＣ、特に好ましくは腺癌、扁平上皮癌および大細胞癌である、請求項３６に記載の使用のための個別化癌ワクチン。 
【請求項３９】
前記癌が卵巣癌である、請求項３６に記載の使用のための個別化癌ワクチン。
【請求項４０】
前記個別化癌ワクチンが、静脈内、皮下、筋肉内または腫瘍内注射により患者に投与される、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の使用のための個別化癌ワクチン。
【請求項４１】
前記個別化癌ワクチンが、癌の治療において有用性を有する１以上のさらなる抗癌療法と併用して投与される、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の使用のための個別化癌ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、一般に、１以上のネオペプチドをコードする組換えポックスウイルスを含んでなる個別化癌ワクチン、またはこのような組換えポックスウイルスと薬学上許容可能なビヒクルとを含んでなる組成物、およびそれを必要とする癌対象を治療するための前記個別化癌ワクチンの使用に関する。特定の実施形態は、ａ）腫瘍サンプルおよび非腫瘍サンプルからＤＮＡを抽出すること、ｂ）標的領域、好ましくは、ゲノムの全コード領域（エクソーム）を選択すること、ｃ）前記抽出ＤＮＡから前記標的領域（例えば、エクソーム）を配列決定すること、ならびにｄ）前記腫瘍および非腫瘍サンプルから得られるＤＮＡ配列を比較することにより、１以上の腫瘍特異的突然変異を同定すること、を含んでなる同定工程を含んでなる、このようなワクチンまたは組成物を提供する方法に関する。実施形態はまた、このような個別化癌ワクチンの投与を含んでなる、癌を治療するまたはその再発を予防する方法を含む。本発明は、特にＴ細胞免疫応答を刺激するための個別化免疫療法の分野において非常に特別な関心が持たれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
ここ数十年間で、腫瘍抗原を発現する多数の治療ワクチンが、腫瘍抗原に対する自然免疫応答および特異的免疫応答を刺激することを目的として、作製されている。しかしながら、最も一般的に同定される腫瘍関連抗原（例えば、ＭＵＣ−１、ＷＴ１、ＰＳＡ、ＣＥＡ）は、腫瘍において選択的に過剰発現するが、非腫瘍細胞において残存発現を有することがある。よって、この伝統的なアプローチの有効性は、このような「自己」抗原に対する自己寛容によって制限されることが予想される。
【０００３】
さらに、同一セットの癌抗原を集団内の全員に送達するための伝統的なパラダイムは、疾患リスクおよび免疫応答の個々の変動性を無視している。重要なことに、ヒトはワクチンに対して様々に反応し、宿主の免疫応答は集団内で大幅に異なるということは、無視することができない(Relman, 2008, J Infect Dis. 198(1):4-5; Plotkin, 2008, Clin Infect Dis.47(3):401-9)。クリニックにおいて免疫チェックポイント遮断薬が最近導入されたとともに、ある治療は一部の患者には有効であるが、他の患者には有効でないということが医療従事者にとって実際に明らかとなってきている。
【０００４】
免疫学、遺伝学、分子生物学およびバイオインフォマティクスの進歩が、より個別化されたアプローチへの道を開いている。ゲノムシークエンシング（例えば、次世代シークエンシング（ＮＧＳ））の分野における技術的なブレークスルーにより、今では、腫瘍の全ゲノムまたはエクソーム（ゲノムのコード領域）を、前例のないスピードおよびコストで配列決定することが可能となっている。腫瘍の分子キャラクタリゼーションにより、癌細胞の発癌および増殖の過程中、高速の増殖、修復機序の欠陥およびクローン選択の結果として突然変異が生じることが実証された。腫瘍ゲノムの突然変異の蓄積は、一般に、癌組織に特異的な異常型タンパク質種の発現をもたらす。それらはネオ抗原と呼ばれる。最も一般的な腫瘍関連抗原とは対照的に、腫瘍ネオ抗原は、腫瘍細胞にのみ存在し、正常細胞には存在せず、胸腺における抗原特異的Ｔ細胞の欠失を誘導しない。よって、それらは、自己タンパク質に対する自己寛容および自己免疫反応のリスクを負うことなく、強力な免疫応答を誘導することが予想される。従って、腫瘍ネオ抗原は、慣例的なケアにおけるそれらの採用は、多数の科学的および技術的な課題を克服することを必要とするが、腫瘍に特異的に適合された治療ワクチンの設計のための理想的な標的となり得る。特に、ほとんどの癌突然変異は、確率的現象の結果であり、各患者に特異的なものである。
【０００５】
適当なワクチンプラットフォームの選択は、臨床現場においてそれが成功するための主要因子である。いくつかの技術プラットフォームが、ネオ抗原指向性ワクチンの開発のために現在想定されており、その例としては、細菌（例えば、Ａｄｖａｘｉｓにより開発されたリステリアに基づくＡＤＸＳ−Ｎｅｏワクチン；ＷＯ２０１６／２０７８５９；ＷＯ２０１６／１９１５４５）、ウイルスベクター（例えば、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎのレンチウイルス系ＺＶｅｘ）、核酸ワクチン（例えば、Ｂｉｏｎｔｅｃｈにより開発されたナノ粒子に内包された酸ｍＲＮＡに基づくワクチン；Kreiter et al., 2015, Nature 520 692-6；ＷＯ２０１２／１５９７５４、Ｖａｃｃｉｂｏｄｙにより開発されたワクチン複合体をコードするＤＮＡ）およびアジュバント添加ペプチド（ＷＯ２０１６／１８７５０８）が含まれる。ペプチドワクチンの代表的な例としては、例えば、ニボルマブとの併用で膀胱癌、膠芽腫および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を対象とした、ＮＥＯＮ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓにより現在開発中のポリＩＣＬＣ（ポリイノシン・ポリシチジル酸）安定化ペプチド；Ａｇｅｎｕｓにより開発されたｇｐ９６（９６ｋＤａ熱ショックタンパク質）アジュバント添加腫瘍ネオ抗原；およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅのリポソーム内包ペプチド）が含まれる。別の最近の代替は、患者に投与する前に抗原にｉｎ  ｖｉｔｒｏ曝露した後のベクターとしての樹状細胞（ＤＣ）の使用である。ＤＣは、ペプチドまたは腫瘍ライセートでパルスされる（例えば、Ｄｅｎｄｒｅｏｎにより市販されている活性化ＤＣワクチンシプリューセル−Ｔ、Ｅｘｏｃｙｔｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓにより開発された患者腫瘍エクソームを負荷したＤＣ；ＯｎｃｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｌｌａ  Ｉｎｃにより開発されたＤＣワクチン）。
【０００６】
しかしながら、この分野において最も主導権があるものは、その見込みを達成する前に、主な課題に対応しなければならない。他のトピックの中でも、橋渡しの成功は、腫瘍突然変異の同定、このような突然変異を組み込んだネオペプチドの設計、個別化ワクチンの製造および検査は疾患進行に不随することから、ベッドサイドの患者に臨床的に十分な量を迅速に送達することを保証するための有効な製造方法の達成に従属する。
【０００７】
よって、各患者の腫瘍に対するネオ抗原の同定、および薬物の製造のために確立された標準を用いた対応する個別化療法の製造を可能とする合理化された時間集約的な方法を開発する必要がある。
【０００８】
癌ワクチンを開発する以前の試みにおいて、組換えＭＶＡ（改変ウイルスアンカラ）が、有効なベクターとしての役割を果たしている(Acres and Bonnefoy, 2008, Expert Review of Vaccines 7, 889-93)。ワクシニアに基づくワクチンは、単剤療法として、または化学療法、放射線療法もしくは免疫チェックポイント阻害剤との併用として投与された場合、結果を出している(Farsaci et al., 2011, In Cancer Vaccines: From Research to Clinical Practice, Ed Bot; CRC Press, pp56-77; WO2015/175340; WO2015/175334)。例えば、ＭＵＣ１腫瘍関連抗原およびヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）をコードするＭＶＡに基づく癌ワクチンであるＴＧ４０１０（またはその研究名ＭＶＡＴＧ９９３１）は、進行性転移性ＮＳＣＬＣにおける第一選択標準治療の化学療法との併用で有効性を示した(Quoix et al., 2011, The Lancet Oncology 12(12): 1125-33)。予防ＲＭＡ−ＭＵＣ１モデルにおけるＭＶＡＴＧ９９３１による抗原特異的腫瘍制御は、ＭＵＣ１ならびにＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の一過性のデノボ発現に明らかに依存する。他のポックスウイルス、特に、ワクシニアウイルスおよび鶏痘ウイルスも、抗癌ベクターとして使用されている(Gulley et al., 2008, Clin Cancer Res 14(10): 3060-9)。
【０００９】
しかしながら、癌ネオ抗原に対する強力な免疫応答を誘導するＭＶＡまたは他のポックスウイルスの能力は、試験されておらず、依然として確立されていない。加えて、組換えＭＶＡを生産する既知の方法は相同組換えに頼っており、これは効率が低く、従って、非常に時間がかかる。
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、組換えＭＶＡは実際にいくつかの癌ネオ抗原に対する免疫応答を誘導することができること、およびいくつかのネオペプチドをコードする個別化ＭＶＡが迅速に作製され得ることを見出した。
【００１１】
本開示は、抗腫瘍ネオペプチドの融合体を発現するＭＶＡに基づく癌ワクチン、ならびに組換えＭＶＡの作製を最大限にし、規模拡大性および方法の完了までの時間を改善するように特別に設計されている製造方法を提供することにより、前述のニーズを満たしている。
【００１２】
この技術的課題は、特許請求の範囲に定義される実施形態の提供により解決される。
【００１３】
本発明の他のおよびさらなる側面、特徴および利点は、本発明の現在好ましい実施形態の以下の記載から明らかであろう。これらの実施形態は、開示の目的のために示される。
【００１４】
発明の概要
本発明は、一般に、１以上のネオペプチドをコードする組換えポックスウイルスを含んでなる個別化癌ワクチンに関する。
【００１５】
一側面では、組換えポックスウイルスは、ワクシニアウイルス、好ましくは、ＭＶＡなどの複製欠損ワクシニアウイルスである。
【００１６】
別の側面では、組換えポックスウイルスによりコードされる前記１以上のネオペプチドの各々は、１以上の腫瘍特異的突然変異を含んでなり、好ましくは、前記ネオペプチドの少なくとも６０％が、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異を含んでなる。望ましくは、１以上のネオペプチドが、１６〜９０アミノ酸残基、好ましくは、１７〜８５アミノ酸残基、より好ましくは、１８〜８０アミノ酸残基の長さを有する。好ましい実施形態では、ミスセンス突然変異を含んでなるネオペプチドは、１８〜２９残基の長さを有し、フレームシフト突然変異を含んでなるネオペプチドは、３０〜アミノ酸残基の長さを有する。ミスセンス突然変異を有するネオペプチドの少なくとも８０％が、中心の位置で置換アミノ酸を有する。好ましい実施形態では、いくつかのネオペプチド、好ましくは全てのネオペプチドが、１以上の融合体の形態で組換えポックスウイルスにより発現される。組換えポックスウイルスは、好ましくは、自殺遺伝子および免疫賦活遺伝子からなる群から選択される１以上の治療遺伝子をさらにコードし得る。
【００１７】
さらなる側面では、本発明はまた、個別化癌ワクチンによりコードされるために好適な１以上のネオペプチドを同定する工程であって、前記１以上のネオペプチドが、１以上の腫瘍特異的突然変異を含んでなる工程を含んでなる、前記個別化癌ワクチン(personalized cancer)を調製する方法を提供する。好ましい方法は、以下のサブ工程ａ）〜ｄ）：ａ）腫瘍サンプルおよび非腫瘍サンプルからＤＮＡを抽出すること、ｂ）標的領域、好ましくは、ゲノムの全コード領域（エクソーム）を選択すること、ｃ）前記抽出ＤＮＡから前記標的領域（例えば、エクソーム）を配列決定すること、ならびにｄ）前記腫瘍および非腫瘍サンプルから得られるＤＮＡ配列を比較することにより、１以上の腫瘍特異的突然変異を同定すること、を含んでなる同定工程を含んでなる。このような方法は、以下のさらなるサブ工程ｅ）〜ｇ）：ｅ）ｍＲＮＡ転写レベル、またはタンパク質翻訳レベルのいずれかで、腫瘍中の発現レベル別に潜在的なネオペプチドをランク付けすること；ｆ）非自己発現腫瘍特異的突然変異を選択すること；ｇ）前記ネオペプチドに含まれるネオエピトープの免疫能を予測すること；の１以上をさらに含んでなってもよい。
【００１８】
同定工程に加えて、前記方法はまた、前記組換えポックスウイルスを作製する工程を含んでなってもよい。好ましくは、組換えポックスウイルスのゲノムに挿入される前記ネオペプチドをコードする核酸分子が、対象における発現を可能にする好適な調節エレメントの制御下で１以上の発現カセット内に配置される。好ましくは、組換えポックスウイルスを作製する前記工程は、ネオペプチドをコードする核酸分子または発現カセットのために選択される挿入部位においてクローン化された蛍光レポーター遺伝子を含んでなる親ポックスウイルスを使用する。好ましい実施形態では、前記組換えポックスウイルスを作製する前記工程は、前記蛍光レポーターのヌクレオチド配列において１以上の二本鎖切断を生じることができるエンドヌクレアーゼによる切断の工程であって、前記エンドヌクレアーゼがポックスウイルスゲノムを切断しない工程を含んでなる。前記方法はまた、製造工程を含んでなってもよく、ここで、前記製造工程は、好適なプロデューサー細胞中で好適な規模まで増幅する工程、生産された組換えポックスウイルスを細胞培養物から回収する工程、および回収された組換えポックスウイルスを精製する任意選択の工程を含んでなる。
【００１９】
なおさらなる側面では、個別化癌ワクチンは、対象において癌を治療するまたはその再発を予防するために、それを必要とする対象において使用するためのものである。前記癌は、好ましくは固形腫瘍、特に脳癌または肺癌である。好ましい実施形態では、個別化癌ワクチンは、癌の治療において有用性を有する１以上のさらなる抗癌療法と併用して投与される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＭＶＡＴＧ１９０２２およびＭＶＡＴＧ１９０２３によりコードされる発現カセットの設計を例示する。「ＧＳ」は１０アミノ酸リンカーを表し、「Ｆｌａｇ」はＦｌａｇタグを表し、「ＳＲ」は、狂犬病糖タンパク質から得られるシグナルペプチドの頭字語である。ＦＣＵ１、ｂ−Ｇａｌ、Ｅ１６ＨＰＶ１６、Ｅ７６ＨＰＶ１６およびＭＣＵ１は、これらの抗原から得られる２７アミノ酸長ペプチドを表す。
【図２Ａ−２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、全抗原、それぞれＭＵＣ１（ＭＶＡ−ＭＵＣ１）、ＦＣＵ１（ＭＶＡ−ＦＣＵ１）、ｂ−ガラクトシダーゼ（ＭＶＡ−ｂＧａｌ）、ＨＰＶ−１６  Ｅ７（ＭＶＡ−Ｅ７ＨＰＶ１６）およびＨＰＶ−１６  Ｅ１（ＭＶＡ−Ｅ１ＨＰＶ１６）をコードするＭＶＡベクターと比較した、ペプチドをコードするＭＶＡＴＧ１９０２２およびＭＶＡＴＧ１９０２３ベクターでＣ５７ｂｌ／６マウス（５匹／群）を免疫化した後のＥＬＩＳｐｏｔを例示する。刺激は、各発現抗原／ペプチド（それぞれＦＣＵ１特異的ＥＧ１５（Ａ）、ＭＵＣ１特異的Ｌ１５Ｌ３（Ｂ）、Ｅ７特異的Ｒ９Ｆ（Ｃ）、Ｅ１特異的Ｉ８Ｌ（Ｄ）およびｂ−Ｇａｌ特異的Ｉ８Ｖ  ５Ｅ））に対して特異的なペプチドまたは無関係のペプチド（「ＣＴＲＬ」（対照））のいずれかで行った。
【図２Ｄ−２Ｅ】図２Ｄ〜２Ｅは、全抗原、それぞれＭＵＣ１（ＭＶＡ−ＭＵＣ１）、ＦＣＵ１（ＭＶＡ−ＦＣＵ１）、ｂ−ガラクトシダーゼ（ＭＶＡ−ｂＧａｌ）、ＨＰＶ−１６  Ｅ７（ＭＶＡ−Ｅ７ＨＰＶ１６）およびＨＰＶ−１６  Ｅ１（ＭＶＡ−Ｅ１ＨＰＶ１６）をコードするＭＶＡベクターと比較した、ペプチドをコードするＭＶＡＴＧ１９０２２およびＭＶＡＴＧ１９０２３ベクターでＣ５７ｂｌ／６マウス（５匹／群）を免疫化した後のＥＬＩＳｐｏｔを例示する。刺激は、各発現抗原／ペプチド（それぞれＦＣＵ１特異的ＥＧ１５（Ａ）、ＭＵＣ１特異的Ｌ１５Ｌ３（Ｂ）、Ｅ７特異的Ｒ９Ｆ（Ｃ）、Ｅ１特異的Ｉ８Ｌ（Ｄ）およびｂ−Ｇａｌ特異的Ｉ８Ｖ  ５Ｅ））に対して特異的なペプチドまたは無関係のペプチド（「ＣＴＲＬ」（対照））のいずれかで行った。
【図３】図３は、ＭＶＡＴＧ１９０３０により発現された第１および第２のＣＴ２６ペンタトープ(pentatope)融合体のアミノ酸配列を例示する。
【図４】図４は、ＭＶＡＴＧ１９０３０およびＭＶＡＴＧ１９０３８ベクターでＢａｌｂ／ｃマウス（５匹／群）を免疫化した後のＥＬＩＳｐｏｔを例示する。ＣＴ２６−ＭＵＣ１細胞のプライミングを行った場合と行わなかった場合での、１０個の変異ＣＴ２６ペプチドのプールまたはＣＴ２６野生型ペプチドのプール（すなわち、腫瘍特異的突然変異を含まない）のいずれかで刺激した後、ＩＦＮγ応答を評価した。
【図５】図５は、ＣＴ２６−ＭＵＣ１細胞でプライミングしたマウスモデルとしなかったマウスモデルの両方において、ＭＶＡＴＧ１９０３０およびＭＶＡＴＧ１９０３８（または陰性対照としてのウイルス処方緩衝液Ｓ０８）でＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化した後のＣＴ２６変異ペプチド（ＥＨ２７ｍ）および非変異ＣＴ２６ペプチド（ＰＥ２７ｗｔ）に対した生じたＩＦＮγ応答を例示する。培養培地での刺激を陰性対照として行う。
【図６】図６は、ＣＴ２６−ＭＵＣ１細胞でプライミングしたマウスモデルとしなかったマウスモデルの両方において、ＭＶＡＴＧ１９０３０およびＭＶＡＴＧ１９０３８（または陰性対照としてのウイルス処方緩衝液Ｓ０８）でＢａｌｂ／ｃマウスを免疫化した後のＣＴ２６変異ペプチド（ＥＨ２７ｍ）および非変異ＣＴ２６ペプチド（ＰＥ２７ｗｔ）に対した生じたＩＦＮγ応答を例示する。ＩＦＮγ応答は、抗マウスＭＨＣＩＩ抗体の存在下（＋抗ＭＨＣＩＩ）および非存在下で評価する。培養培地での刺激を陰性対照として行う。
【図７】図７は、ＧＳＧ、ＧＴＳまたはＧＡＳリンカーをコードする９個のヌクレオチドの変性ヌクレオチド配列を例示する。
【図８】図８は、前記構築物が有する融合体カセットの数（１、２または３）、各融合体に含まれるネオペプチドの数（Ｎｂ  ｎｅｏ）、ＴＭセグメントの存在または非存在（ＴＭ）、各融合体に対して算出されたハイドロパシー（hydropathy）スコア（Ｈｙｄｒｏ）ならびに各構築物に対するリンカーの存在および長さに従って示されたプラスミド別の、回収された白色プラークのパーセンテージ、およびＣＥＦ細胞のトランスフェクション後のＰＣＲにより同定された組換え（ｍＣｈｅｒｒｙ陰性およびｍＣｈｅｒｒｙ陽性）または親（すなわち、非組換え）ウイルスを例示する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
一般的な定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が関係する当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。
【００２２】
用語「ａ」および「ａｎ」は、文脈上別段の明確な指示がない限り、その冠詞の文法的目的語が「１」または「２以上」（すなわち、２、３、４、５などを含む１以上）であることを指す。
【００２３】
用語「および／または」は、本明細書で使用する場合は常に、「および」、「または」および「前記用語により接続される要素の全部または任意の他の組合せ」の意味を含む。
【００２４】
用語「など」、「例えば」は、本明細書で使用する場合、例示的目的のためのものであり、従って、限定するものではない。
【００２５】
用語「約」または「およそ」は、本明細書に示される値または範囲は決定的なものではなく、デバイスまたはこのような値もしくは範囲を決定するために用いられる方法の誤差の固有の変動、または試験対象間に存在する変動を含むように、所与の値または範囲の１０％以内、好ましくは８％以内、より好ましくは５％以内で変動し得ることを示すために、本明細書において使用される。
【００２６】
本明細書で使用する場合、製品、組成物および方法の定義に使用する場合、用語「を含んでなる(comprising)」（ならびに「を含んでなる(comprise)」および「を含んでなる(comprises)」などの「を含んでなる(comprising)」の任意の形態）、「を有する(having)」（ならびに「を有する(have)」および「を有する(has)」などの「を有する(having)」の任意の形態）、「を含む(including)」（ならびに「を含む(includes)」および「を含む(include)」などの「を含む(including)の任意の形態）または「を含有する(containing)」（ならびに「を含有する(contains)」および「を含有する(contain)」などの「を含有する(containing)」の任意の形態）は、非限定的であり、追加の列挙されていない要素または方法の工程を排除するものではない。「から実質的になる」は、いずれかの本質的な意義のある他の成分または工程を排除することを意味する。「からなる」は、他の成分または工程の痕跡量より多い要素を排除することを意味する。
【００２７】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合により共有結合した少なくとも９個のアミノ酸を含んでなるアミノ酸残基のポリマーを指すために、互換的に使用される。ポリマーは、直鎖、分岐または環状であり得、天然に存在するおよび／またはアミノ酸の類似体を含んでなってもよく、非アミノ酸により割り込まれてもよい。ポリペプチドに含まれるアミノ酸の最大数は、限定されない。一般的な指示として、この用語は、短いポリマー（当技術分野では、一般にペプチドと呼ばれる）およびより長いポリマー（当技術分野では、一般にポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる）の両方を指す。この用語は、とりわけ、天然ポリペプチド、修飾ポリペプチド（誘導体、類似体、バリアントまたは突然変異体とも呼ばれる）、ポリペプチド断片、ポリペプチド多量体（例えば、二量体）、組換えポリペプチド、融合ポリペプチドを包含する。
【００２８】
本発明の文脈内では、用語「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」および「ヌクレオチド配列」は、互換的に使用され、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）または混合ポリリボ−ポリデオキシリボヌクレオチドのいずれかにおける少なくとも９個のヌクレオチド残基のポリマーを定義する。これらの用語は、それらの一本鎖または二本鎖、直鎖または環状、天然または合成、未修飾または修飾バージョン（例えば、遺伝子改変ポリヌクレオチド；最適化ポリヌクレオチド）、センスまたはアンチセンスポリヌクレオチド、キメラ混合物（例えば、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド）を包含する。例示的なＤＮＡ核酸としては、限定されるものではないが、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ベクター、ウイルスＤＮＡ（例えば、ウイルスゲノム、ウイルスベクター）、オリゴヌクレオチド、プローブ、プライマー、コーディングＤＮＡ、非コーディングＤＮＡ、またはそれらのいずれかの断片などが含まれる。例示的なＲＮＡ核酸としては、限定されるものではないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、前駆体メッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、コーディングＲＮＡ、非コーディングＲＮＡなどが含まれる。本明細書に記載の核酸配列は、当技術分野で公知の標準的な方法、例えば、自動ＤＮＡ合成装置（例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されているものなど）の使用により合成してもよいし、または、天然に存在する資源（例えば、ゲノム、ｃＤＮＡなど）もしくは当技術分野で周知の分子生物学技術（例えば、クローニング、ＰＣＲなど）を用いた人工資源（例えば、市販のライブラリー、プラスミドなど）から得てもよい。
【００２９】
本発明の文脈内では、同一性パーセントは、比較される配列の最適なグローバルアラインメント、すなわち、Needleman and Wunsch (1970)のアルゴリズムなど、当業者に周知のいずれかのアルゴリズムを用いて、それらの長さ全体にわたりそれらの全体においてとられる配列の最適なアラインメントに基づき、決定される。この配列比較は、当業者に周知のいずれかのソフトウエア、例えば、「ギャップオープン」パラメーター＝１０．０、「ギャップ伸長」パラメーター＝０．５、「Ｂｌｏｓｕｍ  ６２」マトリックス、「エンドギャップペナルティー」パラメーター＝偽、「エンドギャップオープン」パラメーター＝１０、および「エンドギャップ伸長」パラメーター＝０．５を用いて、Ｎｅｅｄｌｅソフトウエアを用いて実施してよい。Ｎｅｅｄｌｅソフトウエアは、例えば、https://www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_needle/にて入手可能である。
【００３０】
用語「ウイルス」、「ウイルス粒子」、「ウイルスベクター」および「ビリオン」は、互換的に使用され、ウイルス粒子に封入され得る野生型ウイルスゲノムの１以上のエレメントを含んでなるビヒクルを意味するものと広く理解される。この用語は、ウイルスゲノムおよびウイルス粒子を包含する。
【００３１】
用語「から得られる」、「由来する(originating)」または「由来する(originate)」は、成分の起源（例えば、ネオエピトープ、ネオペプチド、ネオ抗原、核酸分子、ウイルスなど）またはサンプルの起源（例えば、対象または対象の群）を同定するために使用されるが、成分／サンプルが得られる方法（これは例えば、化学合成または組換えの手段によりなされ得る）を限定することを意味しない。
【００３２】
本明細書で使用する場合、用語「単離された」は、その自然環境から除去される（すなわち、それが自然に関連しているまたは自然において認められる１以上の他の成分から分離される）成分（例えば、ポリペプチド、核酸分子、ベクターなど）を指す。より具体的には、それは、（部分的にまたは実質的に）精製される成分を指す。例えば、核酸分子は、自然においてそれと通常関連する配列から分離される（例えば、染色体またはゲノムから解離される）場合に単離されるが、異種配列（例えば、組換えベクター内）と関連し得る。合成成分は、本質的に単離されている。
【００３３】
用語「対象」は、一般に、本明細書に開示される製品または方法のいずれかが必要である、または有益であり得る脊椎動物生物体を指す。一般に、生物体は、哺乳動物、特に、家畜、農用動物、競技動物、および霊長類（ヒトおよび非ヒト）からなる群から選択される哺乳動物である。用語「対象」および「患者」は、ヒト生物体を指す場合、互換的に使用され得、男性および女性、ならびに胎児、新生児、乳児、若年成人、成人および高齢者を網羅する。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語「腫瘍」は、用語「癌」、「悪性腫瘍」、「新生物」のいずれかと互換的に使用され得、制御されない細胞の成長および伸展からもたらされるいずれかの疾患または病状を包含する。これらの用語は、いずれの種類の組織、器官または細胞、いずれのステージの悪性腫瘍（例えば、前病変〜ステージＩＶ）も含むことを意味する。一般に、腫瘍、特に悪性腫瘍は、正常組織と比較して構造組織および機能的調和の部分的または完全な欠如を示し、一般に、周囲の組織に浸潤し（伸展）、かつ／または離れた部位へ転移する傾向を示す。本発明は、好ましくは、本明細書に記載の固形腫瘍の治療のために設計される。
【００３５】
「新生細胞」、「癌細胞」または「腫瘍細胞」は、異常な（すなわち、増大した）速度で分裂する細胞を指すために互換的に使用され得る。
【００３６】
用語「治療」（ならびに「治療する(treating)」、「治療する(treat)」などの「治療」の任意の形態）は、本明細書で使用する場合、予防および／または療法を指す。一般に、「予防」は、例えば、１以上の臨床症状または生化学的症状（腫瘍のサイズ、関連バイオマーカーの発現レベル、ステージの進行…）の初発または再発の発症を防ぎ、遅延させる、またはその重症度を低減させるための予防を指し、一方、療法は、本発明に従って治療される対象における、標的とする病状、その症状、または病状に続発する状態の進行を減速または制御するために、１以上の臨床症状または生化学的症状（腫瘍のサイズ、関連バイオマーカーの発現レベル…）を改善することを目的とした病状を指す。
【００３７】
用語「投与する」（または「投与された」などの「投与」の任意の形態）は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載の様式に従って、成分（例えば、少なくとも、ネオペプチドをコードするポックスウイルス）を対象に送達することを指す。
【００３８】
個別化癌ワクチン
第１の側面では、本発明は、１以上のネオペプチドをコードする組換えポックスウイルスを含んでなる個別化癌ワクチンに関する。
【００３９】
「個別化」は、本発明の癌ワクチンを特徴付けるために本明細書で適用される場合、個人レベル（特定の対象）または部分集団レベル（例えば、特定の疾患、特定の表現型の特徴を有する、もしくは同じ薬物を服用する、もしくは例えば、免疫系における同じ欠損を示すといった共通の特徴を共有する人の小グループ）のいずれかを指す。
【００４０】
ポックスウイルス
本明細書で使用する場合、用語「ポックスウイルス」は、ポックスウイルス科ファミリー、好ましくは、オルソポックスウイルス、カプリポックスウイルス、アビポックスウイルス、パラポックスウイルス、レポリポックスウイルスおよびスイポックスウイルスなどのいくつかの属を含む脊椎動物宿主を対象とするコードポックスウイルス亜科サブファミリーに属するウイルスを指す。本発明の文脈では、オルソポックスウイルスが好ましく、ならびに、カナリアポックスウイルス（例えば、ＡＬＶＡＣ）および鶏痘ウイルス（例えば、ＦＰ９ベクター）を含むアビポックスウイルスが好ましい。好ましい実施形態では、癌ワクチンは、オルソポックスウイルス属、さらにより好ましくは、ワクシニアウイルス（ＶＶ）種に属するポックスウイルスベクターを含んでなる。いずれのワクシニアウイルス株も本発明の文脈で使用することができ、その例としては、限定されるものではないが、ウエスタンリザーブ（ＷＲ）、コペンハーゲン（Ｃｏｐ）、リスター、ＬＩＶＰ、ワイス、タシケント、Ｔｉａｎ  Ｔａｎ、ブライトン、アンカラ、ＭＶＡ（改変ワクシニアウイルスアンカラ）、ＬＣ１６Ｍ８、ＬＣ１６Ｍ０株などが含まれ、特に好ましくは、ＷＲ、コペンハーゲン、ワイスおよびＭＶＡワクシニアウイルスである。種々のポックスウイルス科のゲノムの配列が、ジェンバンクなどの専門データバンクにおいて当技術分野で入手可能である（例えば、受託番号ＮＣ＿００６９９８、Ｍ３５０２７、ＮＣ＿００５３０９、Ｕ９４８４８は、ＷＲ、コペンハーゲン、カナリアポックスウイルスおよびＭＶＡゲノムの配列を提供する）。
【００４１】
別の適当な実施形態は、パラポックスウイルス属に属するポックスウイルスベクターを含んでなる癌ワクチンに関する。ポックスウイルス科ファミリーの他のメンバーと同様、パラポックスウイルスは、広い選択範囲の哺乳動物およびヒトを含む脊椎動物を感染し得る卵形の形状を有する比較的大きなエンベロープ二本鎖ＤＮＡウイルスである。パラポックスウイルスは、他のポックスウイルスと区別する独特ならせん状の被膜を有する。このような属は、パラポックスウイルスオビス（ＯＲＦＶ）、偽牛痘ウイルス（ＰＣＰＶ）およびウシ丘疹性口内炎ウイルスを含む一連の異なる種、ならびに互いに形態的、構造的および／または遺伝子的な差を有し得るそれらの異なる株（例えば、ＯＲＦＶ０１７０１、ＮＺ２、ＮＺ７およびＯＶ−ＳＡ００株ならびにウシ丘疹性(popular)口内炎ウイルスＢＶ−ＡＲ０２株）を包含する。本発明の文脈では、ＰＣＰＶ種が好ましい。ＰＣＰＶは、一般に１３０〜１５０キロベースの、ＤＮＡの直鎖および二本鎖セグメントであるゲノムを有する。
【００４２】
本発明の文脈では、野生型株およびその任意の誘導体（すなわち、例えば、ウイルスゲノム内で隣接しているまたはしていない１以上のヌクレオチドのトランケーション、欠失、置換、および／または挿入により、野生型株と比較して改変されているポックスウイルス）のいずれかを使用してもよい。改変は、内在性ウイルス遺伝子（例えば、コード配列および／もしくは調節配列）ならびに／または遺伝子間領域内であり得る。さらに、改変は、サイレントであってもなくても（例えば、改変ウイルス遺伝子産物をもたらす）よい。改変は、従来の分子生物学技術を用いて、当業者に公知の多数の方法で行うことができる。本発明は、腫瘍溶解性（例えば、腫瘍細胞中でよりよくまたは選択的に複製するように設計された）および複製欠損ポックスウイルスを含む。
【００４３】
好ましくは、本発明により包含される改変は、このような改変をされていないウイルスと比較して、例えば、そのウイルスのビルレンス、毒性、病原性または複製に影響を及ぼす。ウイルス遺伝子を変化させることを目的とした例示的な改変は、好ましくは、ＤＮＡ代謝、宿主ビルレンスまたはＩＦＮ経路に関与する（例えば、Guse et al., 2011, Expert Opinion Biol. Ther.11(5):595-608参照）。特に好適な破壊される遺伝子は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする遺伝子（座位Ｊ２Ｒ；ジェンバンク受託番号ＡＡＡ４８０８２）である。ＴＫ酵素は、デオキシリボヌクレオチドの合成に関与する。正常細胞は一般に低濃度のヌクレオチドを有するため、ＴＫは、正常細胞におけるウイルス複製に必要であるが、高ヌクレオチド濃度を含有する分裂細胞においては不要である。さらに、ＴＫ遺伝子の不活性化は、腫瘍細胞に対する選択性を増大させることで知られる。代わりにまたは組み合わせて、本明細書における使用のためのポックスウイルスは、ウイルスリボヌクレオチドレダクターゼをコードする１以上の遺伝子または両方の遺伝子を変化させることにより、改変してもよい。ウイルス酵素は、哺乳動物酵素とサブユニット構造が類似しており、Ｉ４ＬおよびＦ４Ｌ座位によりそれぞれコードされるＲ１およびＲ２と呼ばれる(designed)、２つの異種サブユニットから構成されている。Ｉ４ＬおよびＦ４Ｌ遺伝子の配列ならびに種々のポックスウイルスのゲノムにおけるそれらの位置は、公開データベースにおいて入手可能である。他の好適な改変としては、デオキシウリジントリホスファターゼ（Ｆ２Ｌ）、ウイルス血球凝集素（Ａ５６Ｒ）；セリンプロテアーゼ阻害剤（Ｂ１３Ｒ／Ｂ１４Ｒ）および補体４ｂ結合タンパク質（Ｃ３Ｌ）を変化させるものが含まれる。本明細書で使用する遺伝子命名法は、コペンハーゲンワクシニア株のものである。これは、本明細書において、特に断りのない限り、他のポックスウイルス科の相同遺伝子に対しても使用され、コペンハーゲンと他のワクシニア株との対応関係は、当業者には入手可能である。例示的目的のために、ＴＫ、ＴＫ−およびＦ２ＬならびにＴＫ−およびＩ４Ｌを欠くワクシニアウイルス（ＶＶ）は、文献に記載されている（例えば、ＷＯ２００９／０６５５４７およびＷＯ２００９／０６５５４６参照）。
【００４４】
好ましい実施形態では、本発明の癌ワクチンに含まれるポックスウイルスは、複製欠損ポックスウイルス、好ましくは、複製欠損ワクシニアウイルスであり、このことは、これはヒト細胞においてかなりの程度まで複製できないことを意味する。ポックスウイルスベクターは、ウイルス複製に不可欠な領域の部分的もしくは完全な欠失または不活性化により複製欠損にされ得、複製機能の障害または欠陥は、従来の手段、例えば、非許容性細胞におけるＤＮＡ合成および／またはウイルス力価を測定することによって、評価することができる。
【００４５】
本発明の文脈において使用するための特に適当なポックスウイルスベクターは、その高度に弱毒化された表現型のために(Mayr et al., 1975, Infection 3: 6-14; Sutter and Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10847-51)、また、非弱毒ポックスウイルスと比較して、感染時に生じるより明白なＩＦＮ１型の応答のために、ＭＶＡである。例示的目的のために、ＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞における連続継代を通じて作製されている。そのゲノムの配列解析は、それは、そのゲノムの変化を通じて、その親ウイルスである漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラの病原性を失っていることを示した（Antoine et al., 1998, Virol. 244: 365-96およびジェンバンク受託番号Ｕ９４８４８）。ＭＶＡは、１０万名を超える人における天然痘ワクチン接種に安全かつ有効に使用されている。ヒト細胞におけるこのウイルスの複製能は、これもまた欠損しているが、ニワトリ胚細胞においては欠損していない。特に、卵に基づく製造方法において、大量のウイルスを生産するために、種々の細胞系が当技術分野で入手可能である（例えば、ＷＯ２００７／１４７５２８）。
【００４６】
用語「組換え」は、以下に記載するように、そのゲノムに挿入された１以上の外因性核酸分子（例えば、ネオペプチドをコードする１以上の核酸分子）を含んでなるポックスウイルスを指す。
【００４７】
ネオペプチドの種類および数
明確にする目的で、「抗原」は、一般に、ＣＤ４＋（例えば、Ｔｈ１、Ｔｈ２および／もしくはＴｈ１７）ならびに／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞応答（例えば、ＣＴＬ応答）を含む、その抗原に対する液性または特異的Ｔ細胞応答（または両方）を生じさせることができる物質（例えば、ポリペプチド）を指す。本明細書に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏ（動物もしくはヒト）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、生体サンプル）のいずれかで抗原の免疫原性の性質を評価するために、非常に多様な直接的または間接的生物学的アッセイが、当技術分野で利用可能である。
【００４８】
免疫系により検出可能になるために、抗原は処理され、このプロセシングは、ペプチドへの抗原の断片化、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体；ヒトにおけるＨＬＡ「ヒト白血球抗原」）とのペプチドの会合、および、それらがＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介したＴ細胞により認識され得る細胞表面でのペプチド−ＭＨＣ複合体の提示を必要とする。これらの抗原由来ペプチドは、最小の免疫決定因子（すなわち、エピトープ）を含む。ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩという２種類が存在する。ＭＨＣクラスＩ分子は、哺乳動物対象の全ての有核細胞の表面に存在し、ペプチド／ＭＨＣクラスＩ複合体は、ＣＤ８＋  ＣＴＬ活性化を誘発する。対照的に、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、通常、特殊化した抗原提示細胞、例えば、樹状細胞、単核食細胞、一部の内皮細胞、胸腺上皮細胞、およびＢ細胞の表面にのみ存在し、ＭＨＣクラスＩＩ分子を介したペプチド提示は、一般に、ＣＤ４＋  Ｔ細胞応答を駆動する。ＭＨＣクラスＩ分子を介した提示のためのエピトープは、一般に、少なくとも８アミノ酸長、好ましくは、８、９または１０アミノ酸であるが、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、通常、それより長い（例えば、少なくとも１３アミノ酸残基）(Rock et al., 2010, J. Immunol. 184(1): 9-15)。ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ結合のインシリコ予測に関しては、多数の予測アルゴリズムが当技術分野に存在する（例えば、Nielsen et al., 2010, Immunology 130(3): 319-28参照）。例示的目的のために、ＳＶＭＨＣ、ＮｅｔＭＨＣＩＩ、Ｔｅｐｉｔｏｐｅ／ｐｒｏｐｐｅｄ、ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ、Ｅｐｉｔｏｌｌｋｉｔなどを挙げることができる。
【００４９】
用語「ネオ抗原」は、本明細書で使用する場合、癌細胞における発癌過程中に出現している抗原を指す。好ましい実施形態では、ネオ抗原は、対応する野生型抗原に関して、アミノ酸残基の１以上の非サイレント突然変異を含んでなる。一般に、非サイレント突然変異は、ヌクレオチドレベルで生じ、アミノ酸レベルでの変化に変わる。別の好ましい実施形態では、ネオ抗原は、患者から得た癌細胞または組織において認められるが、患者または健常者から得た正常細胞または組織のサンプルには認められない。
【００５０】
用語「ネオペプチド」は、ネオエピトープと、ネオエピトープの片側または両側のフランキング配列とを含んでなるネオ抗原の断片を指す。フランキング配列は、ネオエピトープが由来するネオ抗原のものである。従って、ネオペプチドは、ＭＨＣ分子により提示されるネオエピトープ自身より長いネオ抗原の断片に対応する。ネオペプチドでは、従ってネオエピトープが存在し、その通常環境において天然に存在するフランキング配列により（片側または両側で）囲まれている。ネオペプチドが別の自己タンパク質においても存在するまれなケースを除き、ネオペプチドは、ほとんどのケースで、非自己の性質となる（およびそうなるように選択され得る。下記参照）。この非自己の性質のために、このようなネオペプチドは腫瘍特異的Ｔリンパ球により認識されることが予想される。
【００５１】
用語「ネオエピトープ」は、本明細書で使用する場合、ＭＨＣ依存性Ｔ細胞認識に寄与する（または、対象の細胞の表面でＭＨＣ分子により提示される）ネオ抗原の、ならびに、本明細書に記載の様式に従って前記ネオ抗原において同定される非サイレント突然変異の１以上を含んでなる最小の免疫決定因子を指す。
【００５２】
用語「突然変異」は、試験配列と参照配列との間の１以上の配列差に関する。
【００５３】
一実施形態では、組換えポックスウイルスによりコードされる１以上のネオペプチドの各々は、患者の腫瘍に対して特異的であり、本明細書に記載の突然変異のセットからの１以上の腫瘍特異的突然変異を含んでなる。本発明の文脈では、「腫瘍特異的突然変異」は、癌細胞の腫瘍性形質転換および／または進行とともに生じる突然変異に関する。一般に、腫瘍特異的突然変異は、好ましくは、癌細胞（例えば、腫瘍サンプル）に含まれるＤＮＡに存在するが、非癌性細胞（例えば、非腫瘍サンプル）に含まれるＤＮＡには存在しない。ヌクレオチドレベルで生じるものの、本発明の文脈では、腫瘍特異的突然変異は非サイレントであり、アミノ酸レベルでの変化に変わる。
【００５４】
ミスセンス突然変異、欠失、挿入、フレームシフト突然変異、およびスプライシング部位における突然変異を含む、いくつかの種類の腫瘍特異的突然変異が本発明により包含される。「ミスセンス」突然変異は、コードされたアミノ酸配列に影響を及ぼす特定のコドン内での１つのヌクレオチドの別のヌクレオチドとの置換により生じ、従って、１つのアミノ酸変化をもたらす。タンパク質配列に影響を及ぼす別の方法は、核酸分子内のヌクレオチドの数を変化させる、１以上のヌクレオチド（例えば、ＤＮＡの小片）の挿入または欠失である。挿入および欠失突然変異は、読み枠の変化（いわゆるフレームシフト突然変異）をもたらすことがあるが、必ずしもそうなるわけではない（例えば、３個のヌクレオチドの挿入または欠失は、コドンの付加または抑制をもたらす）。突然変異がヌクレオチド配列において早期に生じた場合、ほぼ全てのポリペプチドが変化する場合がある。フレームシフト突然変異は、終止シグナルに翻訳される終止コドンの生成ももたらし得、次に、得られたタンパク質が切断される（デノボで生成した終止コドンの下流のその部分の欠失）。ミスセンス突然変異は、ｍＲＮＡのスプライシング部位に位置することもあり、異常なスプライシングをもたらし、従って、異常なタンパク質配列をもたらし得る。用語「スプライシング」は、新生前駆体メッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）転写物の編集に関する。スプライシング後、イントロンが除去され、エクソンが互いに連結される（ライゲートされる）。用語「スプライシング部位」は、イントロンの認識およびスプライシング反応の正確性にとって非常に重要なイントロンの末端に位置する短い保存配列に関連する。
【００５５】
本発明は、酵素、受容体、転写因子など、全てのタンパク質クラスに由来するネオペプチドを包含する。いずれの種類の突然変異も存在し得るが、しかしながら、腫瘍特異的突然変異は、好ましくは、ミスセンスまたはフレームシフトである。有利には、本明細書における使用のためのネオペプチドの少なくとも６０％、望ましくは、少なくとも６５％、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも７５％、少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％など）、少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％など）、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％でさえも）、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％でさえもが、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異を含んでなる。ミスセンスおよびフレームシフト突然変異のうち、ミスセンス突然変異がより頻度が高い。特定の実施形態では、本明細書における使用のためのネオペプチドの少なくとも６０％、望ましくは、少なくとも６５％、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも７５％およびさらにより好ましくは、少なくとも８０％（例えば、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％など）、少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％など）、少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％でさえも）、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％でさえもが、ミスセンス突然変異を含んでなる。しかしながら、フレームシフト突然変異が同定される場合、組換えポックスウイルスによりコードされるネオペプチドの１以上が、フレームシフト突然変異を含んでなることも好ましい。例えば、組換えポックスウイルスによりコードされる１０個のネオペプチドに関しては、好ましくは、そのネオペプチドの少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個または１０個でさえもが、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異であり、より好ましくは、そのネオペプチドの少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個または１０個でさえもが、ミスセンス突然変異である。同様に、組換えポックスウイルスによりコードされる３０個のネオペプチドに関しては、好ましくは、そのネオペプチドの少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個または３０個でさえもが、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異であり、より好ましくは、そのネオペプチドの少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個または３０個でさえもが、ミスセンス突然変異である。当業者ならば、他の数のネオペプチドをコードするポックスウイルスに対してこれらの例を容易に適合するであろう。
【００５６】
組換えポックスウイルスによりコードされるネオペプチドの長さは、一般に、１３アミノ酸残基〜約１５１アミノ酸残基の間に含まれるが、当然のことながら、長さはネオペプチドによって変わり得る。有利には、本明細書における使用のためのネオペプチドの各々は、１５〜１０１アミノ酸残基。望ましくは、１６〜９０アミノ酸残基、好ましくは、１７〜８５アミノ酸残基、より好ましくは、１８〜８０アミノ酸残基の長さを有する。有利には、本明細書における使用のためのネオペプチドの少なくとも７０％が奇数のアミノ酸を有するが、その理由は、単一のミスセンス突然変異の場合、これにより、同じ数のフランキングアミノ酸が変異アミノ酸の片側にある状態で、ネオペプチドの中心にそれを挿入することが可能となるからである。当然のことながら、ネオペプチドの長さは、突然変異の種類に依存することもある。例示的であるが限定的ではない目的のために、ミスセンス突然変異を含んでなるネオペプチドは、好ましくは、１８〜２９残基の長さを有し、一方、フレームシフト突然変異を含んでなるネオペプチドは、好ましくは、３０〜８０アミノ酸残基の長さを有する。本発明の文脈では、本発明のポックスウイルス癌ワクチンによりコードされるネオペプチドの少なくとも６０％、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％でさえもが、好ましくは、１８〜２９残基の長さを有する。１９、２１、２６、２７または２９残基の個々のネオペプチドが、特に好ましい。特に好ましい実施形態では、本発明のポックスウイルス癌ワクチンによりコードされるネオペプチドの少なくとも６０％、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％でさえもが、ミスセンス突然変異を含んでなり、１８〜２９残基、特に、１９、２１、２６、２７または２９残基の長さを有する。
【００５７】
突然変異の位置に関しては、本発明は、ネオペプチド内の任意の位置を企図する。しかしながら、中心の位置が、ミスセンス突然変異に対しては特に好ましい。「中心の位置」とは、変異アミノ酸が、ネオペプチドの長さに応じて、ネオペプチドの中央（ネオペプチドが奇数のアミノ酸を有する場合）もしくは２つの中心の位置の一方（ネオペプチドが偶数のアミノ酸を有する場合）、または正確に中心の位置の片側の２〜５個のアミノ酸のいずれかに正確に位置することを意味する。望ましくは、ミスセンス突然変異を有するネオペプチドの少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％でさえもが、上記で定義される中心の位置において置換アミノ酸を有する。具体的には、正確に中心の位置（例えば、１９ｍｅｒネオペプチドに関しては位置１０、２１ｍｅｒネオペプチドに関しては位置１１、２７ｍｅｒネオペプチドに関しては位置１４および２９ｍｅｒネオペプチドに関しては位置１５）においてミスセンス突然変異を有する１９、２１、２７または２９個のアミノ酸（さらにより好ましくは、２７または２９個のアミノ酸）のネオペプチドが好ましい。
【００５８】
しかしながら、特に、フレームシフト突然変異に関して、またはミスセンス突然変異がネオ抗原のＮもしくはＣ末端でもしくはその近くで生じる場合、突然変異は、少なくとも一部のネオペプチドにおいて、Ｎ末端もしくはＣ末端の近くに位置することがある。
【００５９】
いくつかの実施形態はまた、１以上の融合体の形態での組換えポックスウイルスによるネオペプチドの発現を企図する。用語「融合体」は、本明細書で使用する場合、単一のポリペプチド鎖における２以上のネオペプチドの組合せを指す。融合体は、直接的（すなわち、間に追加のアミノ酸残基がない）またはネオペプチドの到達性を向上させるためにリンカーを介したものであり得る。個々に発現される一連の独特なネオペプチドに加えて、従って本発明はまた、個々に融合体およびいくつかの他のものの形態でいくつかのネオペプチドを発現する組換えポックスウイルスを包含する。あるいは、ポックスウイルスベクターにより発現される全てのネオペプチドは、１以上の融合体にクラスター化される。
【００６０】
特定の実施形態は、ＥＲ（小胞体）を介したプロセシングおよび／または分泌を亢進するための、コードされたネオエピトープ（またはその融合体）のＮ末端でのシグナルペプチドの存在を企図する。簡単に述べれば、シグナルペプチドは、通常、１５〜３５個の基本的に疎水性のアミノ酸を含んでなり、翻訳の開始のためのコドンの下流にあるポリペプチドのＮ末端で挿入され、次に、特定のＥＲに位置するエンドペプチダーゼにより除去され、成熟ポリペプチドを生じる。さらに膜アンカー配列を組み込むことにより、コードされたネオペプチド（またはその融合体）のＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ提示を向上させるために、膜固定も使用され得る。膜貫通ペプチドは、本質的に高疎水性であり、細胞膜内のポリペプチドを固定する役割を果たす。それらは、好ましくは、ポリペプチドのＣ末端部内、好ましくは、終止コドンのすぐ上流に挿入される。適当な膜貫通および／またはシグナルペプチドは、当技術分野で公知である。それらは、免疫グロブリン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、インスリン、狂犬病糖タンパク質、ＨＩＶウイルスエンベロープ糖タンパク質または麻疹ウイルスＦタンパク質のものなど、細胞またはウイルスポリペプチドから得てもよいし、合成であってもよい。好ましいシグナルペプチドおよび膜アンカー配列は、ＷＯ２００８／１３８６４９に記載されており、狂犬病または麻疹Ｆ糖タンパク質に由来するものが好ましい。２個以上のシグナルペプチドおよび／または膜貫通配列が組換えポックスウイルスに使用される場合、異なる起源のものを選択してもよいし、生産過程を悪化させ得る相同組換え事象を制限するために、高度の配列同一性（例えば、７５％超）を示す相同配列を変性させてもよい。
【００６１】
先の実施形態の代わりにまたはそれと組み合わせて、本発明は、特にネオペプチド融合体における、１以上のリンカー（スペーサーとも呼ばれる）の存在を企図する。一般に、リンカーは、グリシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、アラニンおよび／またはプロリンなどのアミノ酸残基から構成される１〜３０アミノ酸長のペプチドである。本発明の文脈における好ましいリンカーは、２〜１５個のアミノ酸、好ましくは、３、５、または１０個のアミノ酸、主にグリシンおよびセリン（例えば、ＧＳＧ、ＧＳＧＳＧ（配列番号６６）、ＳＧＳＧＳ（配列番号６７）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号６８））またはグリシン、セリンおよびトレオニン（例えば、ＧＳＴＳＧ（配列番号６９）、ＳＧＴＧＳ（配列番号７０））またはグリシン、セリン、ならびにトレオニンおよび／もしくはアラニン（例えば、ＧＡＳ、ＧＴＳ）を含んでなる。３個のアミノ酸の好ましいリンカーとしては、特に、配列ＧＳＧ、ＧＡＳ、およびＧＴＳのリンカーが含まれる。２個の融合ネオペプチドの間にリンカーを含める必要があるか否かを評価するのは、当業者の手の届く範囲内である。
【００６２】
好ましい実施形態では、ネオペプチドは、リンカーが各ネオペプチドの間（例えば、ネオペプチド１とネオペプチド２の間、ネオペプチド２とネオペプチド３の間など）、ならびに場合により、第１のネオペプチドのＮ末端および／または最後のネオペプチドのＣ末端にある融合体に配置される。１つの構築物内にいくつかのリンカーが使用される場合、アミノ酸配列またはコドン核酸配列(nucleic sequence)を変えて、核酸レベル(nucleic level)での同一性のパーセンテージを減少させ（例えば、７７％未満の同一性、望ましくは７５％未満、７０％未満、好ましくは、６０％未満、５０％未満、さらにより好ましくは、特に１０個のアミノ酸のリンカーに関しては３５％未満まで）、従って、生産過程中の組換え事象を制限してもよい。好ましい実施形態では、１つの組換えポックスウイルスに含まれるリンカー核酸配列(nucleic sequence)は、リンカーのいずれか２つの間で同一な核酸配列(nucleic sequence)の部分が、最大８個の隣接ヌクレオチド（例えば、好ましくは、最大７個、より好ましくは、最大６個の隣接ヌクレオチド）まで減少するように、（アミノ酸配列またはコドン核酸配列(nucleic sequence)を変化させることにより）設計され、従って、上記のような核酸配列(nucleic sequence)の同一性の減少に寄与し、従って、生産過程中の望ましくない組換え事象の制限に寄与する。実施例の項で説明するように、特に組換えポックスウイルスが１０個以上のネオペプチドをコードする場合、２〜５アミノ酸残基（例えば、２、３、４または５個のアミノ酸）の短いリンカーが有利である。ＧＳＧ、ＧＡＳおよび／またはＧＴＳなどの３個のアミノ酸リンカーが、互いからネオペプチドを分離するために、本発明の文脈において特に好ましい。個々にまたは本明細書に記載のネオペプチド融合体と組み合わせて使用されるための、３個のアミノ酸リンカーをコードする例示的なヌクレオチド配列を図７に示す。例示的目的のために、同一のまたは類似の配列のひと続きの間に生じ得る組換えポックスウイルスにおける相同組換えのリスクを低減するために、コドン縮重（Ｇに対しては４個のコドンが考えられ、Ｓに対しては６個が考えられる）を利用することにより、１５個のＧＳＧをコードするヌクレオチド配列が作製および変性されている。同様に、それぞれＧＴＳおよびＧＡＳリンカーをコードする１０および５個の変性ヌクレオチド配列を図７に示す。
【００６３】
本発明の特定の実施形態は、ネオペプチド（もしくはその融合体）の発現またはこのようなネオペプチドもしくは融合体を発現する感染宿主細胞の検出を促進するために、タグの存在を企図する。タグペプチドは、抗タグ抗体を用いた免疫検出アッセイにより検出することができる。非常に多様なタグペプチドが本発明の文脈において使用することができ、その例としては、限定されるものではないが、ＰＫタグ、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＫ；配列番号６）、ＭＹＣタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ配列番号１１）、ポリヒスチジンタグ（通常、５〜１０ヒスチジン残基のひと続き；）、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号１８）、ＨＳＶタグ（ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ；配列番号１９）およびＶＳＶタグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ；配列番号２０）が含まれる。タグペプチドは、ネオペプチドもしくはその融合体（タグ−ポリペプチド）のＮ末端あるいはそのＣ末端（ポリペプチド−タグ）あるいは内部に独立に位置してよい。
【００６４】
組換えポックスウイルスによりコードされ得るネオペプチドの数は、選択される発現の種類（個別発現、以下に記載する短いまたは大きな融合体における発現）およびポックスウイルスの種類に応じて限定されない。例示的目的のために、１〜５０個のネオペプチドが組換えポックスウイルスにより発現され得、より好ましくは、５〜４５個、さらにより好ましくは、６〜３５個であり、１０〜３０個のネオペプチドが最も好ましい。
【００６５】
好ましい実施形態では、いくつかのネオペプチド、好ましくは全てのネオペプチドが、１以上の融合体の形態で組換えポックスウイルスにより発現される。好ましくは、本発明の個別化癌ワクチンに含まれるポックスウイルスは、２個以上のネオペプチドの１〜５個の融合体、好ましくは、２個以上のネオペプチドの１〜４個の融合体、より好ましくは、２個以上のネオペプチドの１〜３個の融合体、特に好ましくは、２個以上のネオペプチドの２または３個の融合体をコードする。より好ましくは、各融合体は、２〜１５個のネオペプチド、好ましくは、３〜１２個のネオペプチド、より好ましくは、４〜１１個のネオペプチド、さらにより好ましくは、５〜１０個のネオペプチド（例えば、５、６、７、８、９または１０個）を含んでなる。ネオペプチドの数は、組換えポックスウイルスによりコードされる融合体によって変わり得る。しかしながら、特に好ましい実施形態では、本発明の個別化癌ワクチンに含まれるポックスウイルスは、５〜１０個のネオペプチドの２または３個の融合体をコードする。
【００６６】
本発明の文脈では、各融合体は、他と異なって設計され得、ペプチドシグナル、リンカー、タグなどのエレメントの存在および／または配列および／または数および／または位置によって互いに区別し得る。好ましい実施形態によれば、しかしながら、各融合体は、ａ）そのＮ末端におけるシグナルペプチド、ｂ）第１のネオペプチドのＮ末端、各ネオペプチドの間、および最後のネオペプチドのＣ末端におけるリンカー、ならびにｃ）そのＣ末端におけるタグを含んでなる。
【００６７】
ネオペプチドおよびその融合体におけるＴＭ（膜貫通）セグメントの存在の予測
一実施形態では、組換えポックスウイルスによりコードされる１以上のネオエピトープまたはその融合体のアミノ酸配列は、いずれの潜在的な膜貫通セグメントも含まない。ＴＭセグメントは、およそ２０残基（例えば、１８〜３０残基、好ましくは、１９〜２１残基）の短い疎水性のαヘリックスとして定義され得る。所与の配列（例えば、特定のネオペプチドまたはネオペプチドの融合体）がＴＭセグメントを含んでなるか否かという確率を予測するために、いくつかの予測ツールを使用することができ、例えば、ＴＭＨＭＭ（膜貫通隠れマルコフモデル；Krogh et al., 2001, J. Mol. Biol. 305: 567-80）およびＤＡＳ（Ｄｅｎｓｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ）が挙げられる。例えば、ＤＡＳ−ＴＭ選別アルゴリズムは、潜在的な膜貫通セグメントの位置を得ることができるクエリーに対して、高精度の疎水性プロファイルを提供する。
【００６８】
好ましい実施形態では、本発明の個別化癌ワクチンに含まれるポックスウイルスによりコードされるネオペプチドの少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％および１００％でさえも）が、潜在的なＴＭセグメント（ペプチド内ＴＭ）を含まない。この文脈では、ＴＭセグメント(seqment)を含んでなると予測されるネオペプチドは、好ましくは、選択されない。
【００６９】
さらにより好ましくは、ＴＭセグメントの存在の予測は、各ネオペプチド融合体にも適用される。ＴＭセグメントは２個の特定のネオペプチドの接合部（ペプチド間ＴＭ）により生じ得ることが、実際に観察されている。この場合、融合体におけるネオペプチドの順序を改変することは、ＴＭの存在を排除するための選択肢である。例えば、ＴＭセグメントがネオペプチド２のＮ末端でのネオペプチド１の融合体から生じる場合、ネオペプチドを反転させること（ネオペプチド１のＮ末端でのネオペプチド２の融合体）が、ＴＭセグメントを有するリスクを排除し得る。別の選択肢は、２個の融合ネオペプチドの間に適当なリンカーを付加することであり得る。
【００７０】
ネオペプチドおよびその融合体の疎水性スコアおよびハイドロパシースコア（hydropathy score）の予測
一実施形態では、組換えポックスウイルスによりコードされる１以上のネオエピトープまたはその融合体のアミノ酸配列は、本質的に親水性である。所与の配列の親水性または疎水性の性質は、当技術分野で利用可能な多数の方法およびアルゴリズムにより容易に決定することができる。特定の配列の疎水性スコアおよび／またはハイドロパシースコアを算出することは、当業者の手の届く範囲内である。例えば、これらのスコアは、カイト−ドゥーリトル法(Kyte and Doolittle, 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-32)またはいずれかの他の好適な方法（例えば、とりわけ、Rose et al., 1993, Ann. Rev. Biomol. Struc. 22: 381-415; Kallol et al., 2003, J. Chromat. 1000: 637-55; Sweet et al., 1983, J. Mol. Biol. 171: 479-88）もしくはアルゴリズム（例えば、ＥｘＰＡｓｙ  Ｐｒｏｔ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；コロラド州またはＷｏｒｌｄ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓにより開発されたＰｒｏｔｅｉｎ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ  Ｐｌｏｔｓなど）を用いて決定することができる。一般的な方法において、所与の配列の疎水性スコアは、下表１に要約される各アミノ酸残基の疎水性／親水性値の和により決定される。
【００７１】
【表１】
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【００７２】
表１に例示されるように、Ｉ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｃ、ＭおよびＡのアミノ酸は、これらの残基の疎水性の性質と相関する正の疎水性スコア（例えば、Ｉに関しては４．５）を示し、一方、Ｇ、Ｔ、Ｓ、Ｗ、Ｙ、Ｐ、Ｈ、Ｅ、Ｑ、Ｄ、Ｎ、ＫおよびＲは、それらの親水性の性質と相関する負の疎水性スコア（例えば、Ｒに関しては−４．５）を示す。
【００７３】
所与のネオペプチドの疎水性スコアは、前記ネオペプチドに含まれる各アミノ酸残基の疎水性／親水性値の和により決定され、ハイドロパシースコアは、前記ネオペプチドに対して決定された疎水性スコアをこのペプチドに存在する残基の数で割ることにより算出される。所与のネオペプチド融合体の疎水性スコアは、前記融合体に含まれる各ネオペプチドに対して決定された疎水性スコアの和に対応する。所与のネオペプチド融合体のハイドロパシースコアは、前記ネオペプチド融合体に対して決定された疎水性スコアをこのネオペプチド融合体に存在する残基の数で割ることにより算出される。
【００７４】
好ましい実施形態では、本発明の個別化癌ワクチンに含まれる組換えポックスウイルスによりコードされるネオペプチドの少なくとも６０％は、負の疎水性スコアおよび／または０．１以下のハイドロパシースコア（例えば、０．１、０．０９、０．０８など、または負のスコアでさえも、例えば、−０．０１９、−１．５など）を示す。同様に、本明細書における使用のための組換えポックスウイルスによりコードされる各融合体は、好ましくは、疎水性に関しては負の、および／またはハイドロパシーに関しては０．１以下のスコアを示す。「少なくとも６０％」は、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％および１００％でさえも包含する。
【００７５】
例示的目的のために、配列ＧＱＳＬＰＭＴＨＳＬＫＬＳＫＴＮＲＴＬＦＬＬＧＶＴＫＹ（配列番号５８）のネオペプチドは、−３，６の負の疎水性スコア（加えて、Ｇに関しては−０．４、Ｑに関しては−３．５、Ｓに関しては−０．８、Ｌに関しては＋３．８など）および−０．１３（−３．６／２９）のハイドロパシースコアを有する。従って、このペプチドは、本発明の個別化癌ワクチンに含まれる組換えポックスウイルスにより発現されるのに好適となる。対照的に、ネオペプチドＧＬＭＧＩＶＶＧＴＶＦＩＩＲＧＬＲＳＶＧＡＳＲＨＱＧＬ（配列番号５９）は、疎水性に関しては正のスコアを有し（２３．３）、０．８６のハイドロパシースコアを有する。従って、融合体に含まれる他のネオペプチドが、融合体のグローバルスコア（global score）を本明細書に記載の適当な閾値まで下げることを可能にすることを補わない限り、このペプチドは、本発明の個別化癌ワクチンに含まれる組換えポックスウイルスにより発現されるのに適当ではない。
【００７６】
特に好ましい実施形態では、本発明の個別化癌ワクチンに含まれる組換えポックスウイルスは、２または３個の融合体をコードし、ここで、
各融合体は、５〜１０個のネオペプチドを含んでなり；前記融合体の第１のネオペプチドのＮ末端において、および各ネオペプチドの間に、好ましくは３アミノ酸長のリンカーを有し（例えば、図７に示されるものの１以上）； 
各融合体は、前記融合体のＮ末端においてシグナルペプチドを含んでなり；
各融合体は、場合により、前記融合体のＣ末端においてタグ配列を含んでなり；かつ
各融合体は、
負のグローバル疎水性スコア（global negative hydrophobicity score）および／または０．１以下のグローバルハイドロパシースコア（global hydropathy score）を示し、かつ
いずれの潜在的なＴＭセグメントも含まない。
【００７７】
個別化癌ワクチンによりコードされるネオ抗原およびネオペプチドの同定
個別化癌ワクチンの開発は、患者毎のネオペプチドの同定および選択を必要とする。
【００７８】
従って、本発明は、組換えポックスウイルスによりコードされるために好適な１以上のネオペプチドを同定する工程であって、ここで、前記ネオペプチドの各々は、１以上の腫瘍特異的突然変異を含んでなる工程を含んでなる個別化癌ワクチンを調製する方法に関する。
【００７９】
この目的のために、治療される対象から、腫瘍生体サンプルおよび非腫瘍生体サンプルを得る。用語「生体サンプル」は、本明細書で使用する場合、ｉｎ  ｖｉｖｏで採取または回収され得る対象から得られるサンプルを指す。本発明の文脈では、対象から採取または回収される生体サンプルは、ＤＮＡを含有し、かつ好ましくは、ｍＲＮＡまたはタンパク質も含有する。
【００８０】
一実施形態では、生体サンプルは、体液または組織サンプルから得られる。例示的な体液サンプルとしては、限定されるものではないが、血液、血清、血漿、尿、糞便、脳脊髄液および気管支液体ならびにそれらの誘導体（例えば、部分精製血液、ＰＢＭＣ）が含まれる。組織サンプルは、限定されるものではないが、いずれかの起源または細胞型の哺乳動物から単離された器官、組織、画分および細胞であり得る（例えば、口腔、消化管、皮膚、肺、頭部などの組織を含んでなるサンプル）。例示的な組織サンプルとしては、例えば、細胞ライセート、細胞培養物、組織、新鮮凍結組織、細胞学的材料（例えば、子宮頸部スメア、膣スワブ、気管支擦過物、胸膜液、結腸鏡検査など）、外科的腫瘍除去後に得られる組織ならびに組織生検が含まれる。本発明の文脈では、生体サンプルは、懸濁液もしくは溶液に入っていてもよく、または、固体支持体（例えば、スライド、ビーズ、チップもしくはナノ粒子）に付いたままでもよい。本発明はまた、「精製された」または半「精製された」生体サンプル、例えば、単離ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、単離タンパク質などを包含する。
【００８１】
好ましい一実施形態では、腫瘍サンプルは、好ましくは、２０％超の腫瘍細胞を含んでなる腫瘍生検である。これはいずれの様式で調製してもよく、その例としては、限定されるものではないが、細針吸引物もしくは新鮮固形腫瘍（酵素的に消化され得る）などの解離組織標本、または生検のミクロトーム切片が含まれる。別の実施形態では、腫瘍サンプルは細胞学的材料（例えば、子宮頸部または膣スワブ）である。
【００８２】
さらに別の実施形態では、非腫瘍サンプルは、生体液（例えば、ＰＢＭＣ単離の有無を問わない血液）、細胞学的材料（例えば、頬スワブ）、生検（例えば、健常組織の生検）または非腫瘍細胞を含んでなる外科的切除の小片から得られる。非腫瘍サンプルは、同じ患者または参照健常対象または対象の群から採取または回収することができる。
【００８３】
腫瘍および非腫瘍サンプルが同じサンプリングに由来する場合、当業者ならば、非腫瘍細胞から腫瘍細胞を認識および分離する方法（例えば、免疫組織学による）を知っている。
【００８４】
一実施形態では、同定工程は、 
ａ）前記腫瘍サンプルおよび前記非腫瘍サンプルからＤＮＡを抽出すること、
ｂ）標的領域、好ましくは、ゲノムの全コード領域（エクソーム）を選択すること、
ｃ）前記抽出ＤＮＡから前記標的領域（例えば、エクソーム）を配列決定すること、ならびに
ｄ）前記腫瘍および非腫瘍サンプルから得られるＤＮＡ配列を比較することにより、１以上の腫瘍特異的突然変異を同定すること、
を含んでなる。
【００８５】
用語「エクソーム」は、エクソンにより形成されるゲノムの部分（すなわち、転写される際、ＲＮＡスプライシングによるイントロン除去後にｍＲＮＡ内に残存する配列）を指す。例示的目的のために、ヒトゲノムのエクソームは、全ゲノムの約１％に相当する約１８０，０００個のエクソンからなる。エクソームシークエンシングのための技術は、当技術分野で周知である(Anderson and Schrijver, 2010, Genes 1(1): 38-69)。一般に、方法は、以下の２段階アプローチが関与する。第１に、アレイに基づくハイブリダイゼーション（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販されている）または液体に基づくハイブリダイゼーション（ＲｏｃｈｅからＮｉｍｂｌｅＧｅｎとして市販されている；Bainbridge et al., 2010, Genome Biol.11:R62）を用いたコード配列の標的捕獲であり、この捕獲段階に次いで、シークエンシング工程が続く(Ng S.B. et al, 2009, Nature 461: 272-6)。ＤＮＡ配列のシークエンシングのために多数の技術的アプローチが市販されており、とりわけ、ピロシークエンシング（Ｒｏｃｈｅ４５４として市販されている）、色素シークエンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａを介して市販されている）、デジタルシークエンシング（ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇとして市販されている）が挙げられる。
【００８６】
腫瘍特異的突然変異を同定する工程は必須であるが、個別化組換えポックスウイルスによりコードされる最適なネオペプチドを選択するため、および／または好適なネオペプチド融合体においてそれらを組み合わせるために、さらなる任意選択の選別を用いてもよい。実際に、多くの腫瘍特異的突然変異が、形質転換および癌進行中に蓄積することがあり、一部は、自身の癌に対して治療される対象の免疫系を刺激する大きな可能性を有し得る。追加の選別を用いる場合、同定工程は、好ましくは、上記のサブ工程ａ）〜ｄ）に加えて、以下のさらなるサブ工程ｅ）〜ｉ）のうち１以上を含んでなる：
ｅ）ｍＲＮＡ転写レベル、またはタンパク質翻訳レベルのいずれかで、腫瘍中の発現レベル（または対応するネオ抗原の発現レベル）別に潜在的なネオペプチドをランク付けすること；
ｆ）非自己発現腫瘍特異的突然変異を選択すること；
ｇ）インシリコ予測または免疫原性生物学的試験のいずれかにより、ネオペプチドに含まれるネオエピトープの免疫能を予測すること；
ｈ）ネオエピトープ自体（ペプチド内ＴＭ）および／またはいくつかのネオペプチドを含んでなるネオペプチド融合体（融合体領域におけるペプチド間ＴＭ、すなわち、第１のネオペプチドのＣ末端および第２のネオペプチドＮ末端を網羅する領域、ならびに場合により、第１と第２のネオペプチドの間のリンカー）における潜在的なＴＭセグメントの存在を予測すること；
ｉ）疎水性の程度別に潜在的なネオペプチドおよび／またはネオペプチド融合体をランク付けすること、ならびに、特に、ネオペプチドおよび／またはネオペプチド融合体が負のグローバル疎水性スコアおよび／または０．１以下のグローバルハイドロパシースコアを示すように、ネオペプチドおよび／またはネオペプチド融合体を選択すること。
【００８７】
前述のように、さらなるサブ工程ｅ）〜ｉ）のうち１以上が、同定工程に存在してもよい。さらなるサブ工程ｅ）〜ｉ）のいくつかが存在してもよい。特に、好ましい実施形態では、同定工程は、上記のサブ工程ａ）〜ｄ）に加えて、上記のサブ工程ｅ）およびｆ）（これらのサブ工程は、以下でより詳細に説明する）、ならびに場合により、
サブ工程ｇ）（これも以下でより詳細に説明する）、
サブ工程ｈ）（これも以下でより詳細に説明する）、
サブ工程ｉ）（これも以下でより詳細に説明する）、または
サブ工程ｇ）、ｈ）およびｉ）の任意の組合せ（例えば、サブ工程ｇ）とｈ）、サブ工程ｇ）とｉ）、サブ工程ｈ）とｉ）、もしくはサブ工程ｇ）、ｈ）およびｉ））
もさらに含んでなる。
【００８８】
サブ工程ｅ）：ネオ抗原を腫瘍中の発現レベル別でランク付けすることにより、さらなる選別を加えることができる。従って、好ましい実施形態では、同定工程は、腫瘍中で少なくとも発現されている、好ましくは、高度に発現されているネオペプチドを選択するサブ工程ｅ）をさらに含んでなる。発現は、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルで検出または定量化され得る。一実施形態では、ネオペプチドは、それらが腫瘍中で少なくとも転写されている、好ましくは、高度に転写されているという検出、すなわち、ＲＮＡ腫瘍サンプル中で認められ、ＯＲＦ（翻訳される場合）中で生じる発現腫瘍特異的突然変異；（ＲｅｆＳｅｑ転写物またはジェンバンク）に基づき選択され得る。例示的目的のために、前記発現腫瘍特異的突然変異は、一般に、患者から得た前記腫瘍生体サンプルから抽出されたＲＮＡ、すなわちトランスクリプトームから生じた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を配列決定することにより、同定される。本明細書で使用する場合、トランスクリプトームは、生物体により発現されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の全範囲を指す。トランスクリプトームシークエンシングのための技術は、当技術分野で周知である（例えば、Chu and Corey, 2012, Nucleic Acid Ther. 22: 271-4; Wang et al., 2009, Nat Rev Genet. 10(1): 57-63）。好ましくは、変異ネオ抗原をコードするｍＲＮＡは、腫瘍サンプルから抽出されたＲＮＡにおいて豊富に発現している。ネオペプチドの選択のための発現の好ましい絶対値を与えることは不可能であるが、選択はむしろ相対的であり、潜在的なネオペプチド発現は、優先順位別に検出／定量化およびランク付けされる。当業者ならば、治療される対象の腫瘍中の種々の候補ネオペプチドの発現レベルを比較する方法を知っており、それらを発現レベルの大きい順にランク付けし、高度に発現しているネオペプチドを第１にランク付けし、非発現ネオペプチドがリストの最後になるようにランク付けする。
【００８９】
ｍＲＮＡ発現の代わりにまたはそれと組み合わせて、ウエスタンブロット、イムノアッセイ、質量分析などのよく記載されているプロテオミクス技術を用いて、腫瘍特異的突然変異から生じるペプチドの発現レベルに基づき、ネオペプチドの選択を実施してもよい。ここでまた、選択はむしろ相対的であり、潜在的なネオペプチド発現は、優先順位別に検出／定量化およびランク付けされる。これも当業者には容易である。
【００９０】
サブ工程ｆ）：サブ工程ｅ）の代わりにまたはそれと組み合わせて、対象のプロテオームにおいてそのようなものとして存在しないネオペプチドを意味する非自己ネオペプチドを選択する工程を含めることにより、さらなる選別を加えることもできる。実際に、腫瘍特異的突然変異の存在は、同じペプチドが、対象の正常細胞において発現している対応する野生型タンパク質中に存在しないことを保証するものであるが、サブ工程ｆ）は、同じペプチドが、対象の正常細胞において発現している別のタンパク質の一部ではないことを確認することを目的とする。例示的目的のために、変異していると同定されるポリペプチドは、複数の最小の免疫決定因子（例えば、１個のアミノ酸で９ｍｅｒの重複）に切断され、宿主において発現しているタンパク質に対応する宿主のプロテオーム（例えば、ヒト対象ではヒトプロテオーム）に対して、ｂｌａｓｔｐで整列される(Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215(3):403-10)。次に、宿主タンパク質と共有されない変異エピトープが選択される。他の点において、自己エピトープ（すなわち、プロテオームに存在する）は、自己免疫問題および免疫応答を減少させ得る自己ペプチドに対する免疫寛容のリスクを避けるために、排除される。上記のように、サブ工程ｆ）は、好ましくは、サブ工程ｅ）と組み合わせてよく、従って、（高度）発現非自己ネオペプチドの選択がもたらされる。
【００９１】
サブ工程ｇ）：サブ工程ｅ）、サブ工程ｆ）およびサブ工程ｅ）とｆ）の組合せの代わりにまたはそれらと組み合わせて、選択されたネオペプチドの免疫能を予測することにより、さらなる選別をさらに加えてもよい。免疫能に基づくこのような選択は、インシリコ予測および／または生物分析アプローチ（例えば免疫原性生物学的試験）のいずれかにより行ってもよい。インシリコ予測因子は、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）またはサポートベクターマシン（ＳＶＭ）などの機械学習アルゴリズムを用いて構築され、高免疫原性配列を同定するよう訓練される。次に、このアルゴリズムは、潜在的な提示の指標としてのＨＬＡクラスＩおよび／またはクラスＩＩタンパク質に対する親和性に関してエピトープを分類するために使用される。例示的目的のために、このさらなるおよび任意選択の工程は、ＨＬＡタイピング、ならびにｓｅｑ２ＨＬＡ(Boegel et al., 2015, Methods Mol Biol 1310: 247-51)、ＮｅｔＭＨＣＩＩｐａｎ(Andreatta et al., 2015, Immunogenetics 67(11-12): 641-50)およびＩＥＤＢコンセンサス結合予測などの訓練アルゴリズムを用いた、ＭＨＣクラスＩＩ結合の予測（変異抗原を複数のペプチド／エピトープに切断する（通常、１個のアミノ酸で、クラスＩ結合では８〜１０ｍｅｒおよびクラスＩＩ結合では１０〜２０ｍｅｒの重複）の工程を含み得る。例示的目的のために、低スコアを有する変異ペプチドが、好ましく選択される。他の点において、このようなペプチドは、より高いＭＨＣクラス結合スコア、従って、Ｔ細胞応答を生じるより高い確率を有すると予測される。
【００９２】
免疫能のインシリコ予測の代わりにまたはそれに加えて、免疫原性ネオペプチドは、質量分析、サイトカイン放出アッセイ（例えば、適当な動物モデルにおけるＩＦＮγ  ＥＬＩｓｐｏｔ）、ＭＨＣ制限突然変異を同定するためのＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ結合アッセイ、フローサイトメトリー、免疫蛍光染色、組織化学などの当技術分野で周知の適当な生物分析試験により同定してもよい。
【００９３】
前述のように、サブ工程ｇ）は、好ましくは、サブ工程ｅ）、サブ工程ｆ）またはサブ工程ｅ）とｆ）の両方と、より好ましくは、サブ工程ｅ）とｆ）の両方と組み合わせてよく、従って、（高度）発現非自己および免疫原性ネオペプチドの選択がもたらされる。
【００９４】
サブ工程ｈ）：サブ工程ｅ）、サブ工程ｆ）、もしくはサブ工程ｇ）またはそれらの任意の組合せ（例えば、サブ工程ｅ）とｆ）もしくはサブ工程ｆ）とｇ）もしくはサブ工程ｅ）とｇ）、もしくはサブ工程ｅ）、ｆ）およびｇ））の代わりにまたはそれらと組み合わせて、選択されたネオペプチド（ペプチド内ＴＭ）または得られたネオペプチド融合体（ペプチド間ＴＭ）における潜在的なＴＭセグメントの存在を予測することにより、さらなる選別をさらに加えてもよい。上記のように、選択されたネオペプチドおよび得られたネオペプチド融合体は、組換えポックスウイルスの作製および免疫系に対するネオエピトープの適当な提示を促進するために、ＴＭセグメントを含まないことが好ましい。前述のように、ＴＭＨＭＭ(Krogh et al., 2001, J. Mol. Biol. 305: 567-80)およびＤＡＳ（Ｄｅｎｓｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ）など、所与のペプチドにおけるＴＭセグメントの存在を予測するために、いくつかの予測ツールを使用することができる。２個のネオペプチドの接合部におけるペプチド間ＴＭの予測の場合は、ネオペプチドを反転させることが、ＴＭの存在を排除するための選択肢であり得る。別の選択肢は、２個のネオペプチドの間に適当なリンカーを付加することであり得る。
【００９５】
サブ工程ｉ）：サブ工程ｅ）、サブ工程ｆ）、サブ工程ｇ）もしくはサブ工程ｈ）またはそれらの任意の組合せ（例えば、サブ工程ｅ）とｆ）もしくはサブ工程ｆ）とｇ）もしくはサブ工程ｅ）とｇ）、サブ工程ｇ）とｈ）もしくはサブ工程ｅ）、ｆ）およびｇ）もしくはサブ工程ｅ）、ｆ）、ｇ）およびｈ））の代わりにまたはそれらと組み合わせて、疎水性または親水性の程度に従ってネオペプチドおよび／またはネオペプチド融合体をランク付けすることにより、さらなる選別をさらに加えてもよい。実際に、ネオペプチド融合体は、疎水性アミノ酸残基の１以上の短いひと続きの存在を許容し得るが、得られたネオペプチド融合体が負のグローバル疎水性スコアおよび／または０．１未満のグローバルハイドロパシースコアを有することを保証するために、選択されたネオペプチドの少なくとも６０％が、上記のように本質的に親水性であることが好ましい。このような予測は、上記のような当技術分野で公知の従来の方法およびアルゴリズムにより行ってもよい（例えば、Kyte and Doolittle, 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-32またはＥｘＰＡｓｙ  Ｐｒｏｔ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎアルゴリズム）。
【００９６】
組換えポックスウイルスの作製
同定工程に加えて、本発明による個別化癌ワクチンを調製する方法は、組換えポックスウイルスを作製する工程を含んでなってもよい。一般に、このような工程は、本明細書に記載の選択されたネオペプチド（例えば、場合により、ペプチドシグナル、リンカー、タグなどを有する１以上の融合体における配置）をコードする合成核酸の作製、ネオペプチドを発現する組換えポックスウイルスの作製、および前記組換えポックスウイルスの製造を含んでなる。
【００９７】
合成核酸分子の作製
核酸分子は、選択されたネオペプチド、好ましくは、場合により、本明細書に記載のリンカー、タグおよびペプチドシグナルを有する、１以上の融合体における配置をコードするように設計される。これは、好ましくは、自動化方法における化学合成（例えば、重複合成オリゴヌクレオチドからの組立てまたは合成遺伝子の直接合成）により作製される。
【００９８】
特定の実施形態では、特定の対象において高レベルの発現を提供するために、核酸配列を最適化することが有利であり得る。簡単に述べれば、核酸分子は、コドン最適化を介した発現、所与の宿主生物体に対する非最適コドンの非選択および／または発現に負に影響を及ぼすことが予想されるＡＴもしくはＧＣリッチ配列のひと続きの排除を向上させる目的で設計され得る。配列ＴＴＴＴＴＮＴは、ポックスウイルス初期転写終結シグナルであるため、これも回避される。
【００９９】
合成核酸分子の発現
本発明においては、組換えポックスウイルスのゲノムに挿入されるネオペプチドをコードする核酸分子は、好適な調節エレメントと動作可能に連結される。本発明の文脈では、ネオペプチドをコードする核酸分子は、１以上の発現カセット内に配置され得る。一般に、「発現カセット」は、対象における発現を可能にする好適な調節エレメントの制御下で１以上のネオペプチドをコードする核酸分子を含んでなる。
【０１００】
本明細書で使用する場合、用語「調節エレメント」は、複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、安定性および／または輸送過程を含む、ネオペプチドの発現を可能にする、それに寄与する、またはそれを調節するいずれかのエレメントを指す。本明細書で使用する場合、「動作可能に連結された」は、連結されるエレメントが、それらの意図する目的のために一斉に機能するように配置されることを意味する。
【０１０１】
調節エレメントの選択は、ネオペプチド自体、ポックスウイルス自体、治療される対象、所望の発現レベルなどの因子に依存し得ることが、当業者により認識されるであろう。プロモーターは特に重要である。本発明の文脈では、これは、多くの種類の細胞における構成的指向性発現であり得、または、特定の細胞もしくは細胞の種類に対して特異的であり得（例えば、腫瘍特異的調節配列）、または、特定の事象もしくは外因性因子（例えば、温度、栄養素添加物、ホルモンなど）に応答してあるいはウイルスサイクルの相（例えば、後期もしくは初期）に従って調節され得る。ウイルスの生産を最適化するため、および発現ポリペプチドの潜在的な毒性を回避するために、特定の事象または外因性因子に応答して生産工程中に抑制されるプロモーターを使用してもよい。当業者ならば、プロモーターに加えて、調節エレメントは、転写の適切な開始、調節および／または終結（例えば、ポリＡ転写終結配列）、ｍＲＮＡの輸送、プロセシングおよび安定性、翻訳（例えば、イニシエーターＭｅｔ、三分節リーダー配列、ＩＲＥＳリボソーム結合部位、シグナルペプチドなど）のためのさらなるエレメントをさらに含んでなってもよいことを認識するであろう。
【０１０２】
ワクシニアウイルスプロモーターが、組換えポックスウイルスにおける発現のために特に適合される。代表的な例としては、限定されるものではないが、ワクシニア７．５Ｋ、Ｈ５Ｒ、１１Ｋ７．５(Erbs et al., 2008, Cancer Gene Ther. 15(1): 18-28)、ＴＫ、ｐ２８、ｐ１１、Ｂ２Ｒ、Ａ３５ＲおよびＫ１Ｌプロモーター、Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら(1997, Biotechniques 23: 1094-7; Hammond et al, 1997, J. Virol 方法s 66: 135-8; and Kumar and Boyle, 1990, Virology 179: 151-8)に記載のものなどの合成プロモーター、ならびに初期／後期キメラプロモーターが含まれる。
【０１０３】
組換えポックスウイルスが、１以上のネオペプチドをコードするいくつかの発現カセットを含んでなる場合、発現は、同じまたは異なる調節エレメント（例えば、プロモーター）により制御され得る。好ましくは、組換えポックスウイルスは、１〜５個の発現カセットを含んでなり、より好ましくは、各々が、本明細書に記載のネオペプチド融合体の発現のためのものである。特に好ましい実施形態は、各々が、ｐ１１ｋ７．５、ｐＨ５ＲおよびｐＢ２Ｒからなる群から選択されるワクシニアプロモーターの転写制御下にある５〜１０個のネオペプチドの融合体の発現のための１〜３個のカセットを含んでなる組換えＭＶＡに関する。
【０１０４】
代替実施形態では、発現カセットの数が組換えポックスウイルスの構築を複雑にする場合（例えば３超）、２個以上の独特な組換えポックスウイルスを含んでなる系を介して進めてもよく、このことは、個別化癌ワクチンが、ネオペプチドを発現する２個以上の組換えポックスウイルス（例えば、２または３）を含んでなることを意味する。
【０１０５】
組換えポックスウイルスのネオペプチドをコードする核酸分子の挿入
本明細書における使用のための１以上のネオペプチドをコードする核酸分子または発現カセットは、前記組換えポックスウイルスを作製するために、親ポックスウイルスのゲノムに挿入される。ネオペプチドをコードする核酸配列／発現カセットは、ポックスウイルスゲノム内の任意の位置、例えば、ウイルス遺伝子内、遺伝子間領域内、非必須遺伝子もしくは領域内またはウイルス配列の代わりに挿入してよい。非必須座位におけるポックスウイルスゲノム内の挿入が好ましい。チミジンキナーゼ遺伝子が、コペンハーゲンおよびウエスタンリザーブワクシニアウイルスへの挿入に特に適当であり、欠失ＩＩまたはＩＩＩが、ＭＶＡベクターへの挿入に特に適当である(WO97/02355; Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72: 1031-8)。好ましくは、ポックスウイルスがＭＶＡである場合、ネオペプチドをコードする核酸分子または発現カセットの挿入は、ＭＶＡの欠失ＩＩＩ内に行われる。組換えポックスウイルスが上記のいくつかのカセットを含んでなる場合、それらは、同じまたは異なる位置でウイルスゲノムに挿入してよい。同じ位置での全ての発現カセットの挿入が好ましく、特に、組換えワクシニアウイルスに関してはＴＫ座位、組換えＭＶＡに関しては欠失ＩＩＩへの挿入が好ましい。
【０１０６】
組換えポックスウイルスを構築するための一般的な条件は、当技術分野で周知である（例えば、ＷＯ２００７／１４７５２８；ＷＯ２０１０／１３０７５３；ＷＯ０３／００８５３３；ＵＳ６，９９８，２５２；ＵＳ５，９７２，５９７およびＵＳ６，４４０，４２２参照）。一般に、挿入される核酸分子／発現カセットは、挿入部位の両側で親ゲノムに存在するものと相同な（例えば、９０〜１００％同一の）ポックスウイルス配列のひと続きに対応する、２個の組換えアームにより囲まれるトランスファープラスミドにおいてクローン化される。組換えアームの長さは、トランスファープラスミド内で変わり得る。望ましくは、組換えアームの各々は、少なくとも１５０ｂｐ、好ましくは、少なくとも２００ｂｐ、より好ましくは、少なくとも３００ｂｐ、さらにより好ましくは、３００〜６００ｂｐ、特に好ましくは、３５０〜５００ｂｐ（例えば、およそ３５０ｂｐもしくは５００ｂｐ）または３００〜４００ｂｐの相同ポックスウイルス配列を含んでなる。親ポックスウイルスは、用語「ポックスウイルス」に関連して上記したように、野生型ポックスウイルスでもよいし、改変されたもの（例えば、弱毒、腫瘍特異的など）でもよい。次に、親ゲノムおよび線状化トランスファープラスミドの両方に存在する相同配列のひと続きの間の相同組換えにより、挿入が行われ、これは、線状化トランスファープラスミドによる許容性細胞のトランスフェクションおよび親ポックスウイルスによる感染を必要とする。
【０１０７】
本発明の方法の特定の実施形態では、組換えポックスウイルスを作製する工程は、ネオペプチドをコードする核酸分子／発現カセットのために選択される挿入部位でクローン化された、レポーター遺伝子、特に蛍光レポーター遺伝子を含んでなる親ポックスウイルスの使用を包含する。好ましくは、レポーター遺伝子は、許容性細胞内でのその発現を可能にするプロモーター、例えば、ワクシニアプロモーターの転写制御下に置かれる。本実施形態は、親ポックスウイルスに関する組換えポックスウイルスの選択を促進する。本発明の文脈で使用され得る蛍光レポーターの代表的な例としては、限定されるものではないが、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ｅＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質）、ＡｍＣｙａｎ１蛍光タンパク質およびｍＣｈｅｒｒｙが含まれる。例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ（５８７ｎｍおよび６１０ｎｍでピーク吸収／発光を有するＤｉｓｃｏｓｏｍａ  ｍｕｓｈｒｏｏｍに由来する単量体蛍光タンパク質）に頼る場合、ｍＣｈｅｒｒｙをコードする配列の代わりにネオペプチドをコードする核酸分子または発現カセットが挿入された組換えウイルスは、白色プラークを生じるが、一方、ｍＣｈｅｒｒｙ発現カセットを有する親ウイルスは、赤色プラークを生じる。組換えポックスウイルスの選択は、直接可視化（白色プラーク）によるものでもよいし、または、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）タグ抗ワクシニアウイルス抗体で標識した後のＦＡＣＳなどの選別手段により促進してもよい。膨大な数の抗ワクシニア抗体が、商業的供給源から入手可能である。通常、５０〜１００個の親に対して１個の組換えが得られ、挿入工程から組換えポックスウイルスの作製までの全過程は、５〜６週間かかる。
【０１０８】
本発明の好ましい実施形態は、相同組換えの有効性を少なくとも１０倍増加させ、組換えポックスウイルスの作製に必要な時間を少なくとも１．５倍減少させることを可能にする組換えポックスウイルスを作製する工程に関する。上記の方法におけるように、ポックスウイルスゲノムに挿入される核酸または発現カセットは、組換えアームにより囲まれるトランスファープラスミド工程においてクローン化され、親ウイルスは、好適なプロモーターの制御下にある挿入部位でクローン化されたレポーター遺伝子（例えば、蛍光レポーター）を含んでなる。好ましくは、前記親ウイルスは、ポックスウイルスプロモーターの制御下で欠失ＩＩＩに挿入されたレポーター遺伝子（特に、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子）を含んでなるＭＶＡである。しかしながら、組換えポックスウイルスを作製する工程は、レポーター（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ）のヌクレオチド配列において１以上の二本鎖切断を生じることができるエンドヌクレアーゼによる切断のさらなる工程であって、しかし、前記エンドヌクレアーゼはポックスウイルスゲノムを切断しない工程を含んでなる。好適なエンドヌクレアーゼは、好ましくは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよび蛍光レポーター遺伝子内に独特な切断を有する制限酵素からなる群から選択される。ウイルス編集のためのＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９系の使用は、当技術分野で記載されており(Yuan et al., 2015, J. Virol 89, 5176-9; Yuan et al., 2016, Viruses 8, 72, doi:10.3390)、核局所化シグナルを有さないＣａｓ９をコードするプラスミドおよび好適なガイドＲＮＡの使用を必要とする。この考慮において、親ウイルスによる感染に加えて、許容性細胞は、トランスファープラスミド、Ｃａｓ９を発現するプラスミドおよびガイドＲＮＡ（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ標的ガイドＲＮＡ）をコードする１以上のプラスミドでトランスフェクトしてもよい。次に、組換えポックスウイルスの選択は、視覚的に（組換えに対応する白色プラークの直接単離、一方、有色プラークは親に対応し、色はレポーター遺伝子に依存する）または従来の選別手段（場合により、上記のような適当な抗体での標識工程後のＦＡＣＳ）を用いて行われる。この方法では、１〜１０個の親に対して１個の組換えが得られ、挿入工程から組換えポックスウイルスの作製までの全過程はおよそ３〜４週間かかる。好ましい実施形態では、組換えポックスウイルスを作製する工程は、最大４週間、好ましくは、最大３週間かかり、親に対する組換えの比は、２（１に対する２）〜０．１（１０に対する１）の間、好ましくは、２（１に対する２）〜０．０５（２０に対する１）の間に含まれる。特定の実施形態では、特に２個の組換えアームがおよそ３５０ｂｐ長である場合、組換え／親の比は１または１超である。
【０１０９】
特に好ましい実施形態は、各々が、ｐ１１ｋ７．５、ｐ７．５Ｋ、ｐＨ５ＲおよびｐＢ２Ｒからなる群、好ましくは、ｐ１１ｋ７．５、ｐＨ５ＲおよびｐＢ２Ｒからなる群から選択されるワクシニアプロモーターの転写制御下に置かれた５〜１０個のネオペプチドの融合体（好ましくは、各融合体は、異なるプロモーターの転写制御下にある）をコードする、ワクシニアＴＫ座位またはＭＶＡ欠失ＩＩＩ内に挿入された１〜３個の発現カセットを含んでなる組換えポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、より好ましくは、ＭＶＡ）の作製を可能にする方法に関する。本発明はまた、このような組換えポックスウイルスを含んでなる個別化癌ワクチンに関する。
【０１１０】
組換えポックスウイルスの製造
作製されたら、本明細書における使用のための組換えポックスウイルスは、従来の技術を用いて生産／増幅してよい。従って、本発明の方法は、前記組換えポックスウイルスを製造する工程をさらに含んでなってもよい。好ましい実施形態では、前記製造工程は、好適なプロデューサー細胞中で好適な規模まで増幅する工程、生産された組換えポックスウイルスを細胞培養物から回収する工程、および回収された組換えポックスウイルスを精製する任意選択の工程を含んでなる。
【０１１１】
増幅工程は、プロデューサー（例えば、許容性）宿主細胞の培養、培養されたプロデューサー宿主細胞の感染、および組換えポックスウイルス（例えば、感染性ウイルス粒子）の生産を可能にするために、好適な条件下での感染宿主細胞の培養を含む。
【０１１２】
プロデューサー細胞の選択は、増幅される組換えポックスウイルスの種類に依存する。ＭＶＡは、厳密に宿主制限されており、一般に、初代鳥類細胞（例えば、受精卵から得たニワトリ胚から調製されたニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ））または不死化鳥類細胞株のいずれかの鳥類細胞で増幅される。ＭＶＡ生産のための好適な鳥類細胞株の代表的な例としては、限定されるものではないが、アヒルＴＥＲＴ遺伝子で不死化されたノバリケン細胞株（例えば、ＷＯ２００７／０７７２５６、ＷＯ２００９／００４０１６、ＷＯ２０１０／１３０７５６およびＷＯ２０１２／００１０７５参照）；ウイルスおよび／または細胞遺伝子の組合せで不死化された鳥類細胞株（例えば、ＷＯ２００５／０４２７２８参照）；自然に不死化した細胞（例えば、ＵＳ５，８７９，９２４に開示されるニワトリＤＦ１細胞株）；または成長因子およびフィーダー層からの進行的な分離による胚細胞に由来する不死化細胞（例えば、Olivier et al., 2010, mAbs 2(4): 405-15に記載のＥｂ６６などのＷＯ２００５／００７８４０およびＷＯ２００８／１２９０５８に開示されるＥｂｘニワトリ細胞株）が含まれる。
【０１１３】
他のワクシニアウイルスまたは他のポックスウイルス株に関しては、鳥類初代細胞（ＣＥＦなど）および鳥類細胞株に加えて、多くの他の非鳥類細胞株が生産のために利用可能であり、その例としては、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ−ＣＲＭ−ＣＣＬ−２（商標）またはＡＴＣＣ−ＣＣＬ−２．２（商標））、ＭＲＣ−５、ＨＥＫ−２９３などのヒト細胞株；ＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）などのハムスター細胞株、およびベロ細胞が含まれる。好ましい実施形態では、非ＭＶＡワクシニアウイルスは、ＨｅＬａ細胞中で増幅される（例えば、ＷＯ２０１０／１３０７５３参照）。
【０１１４】
プロデューサー細胞は、好ましくは、動物またはヒト由来の製品を含まない合成培地を用いて、動物またはヒト由来製品を含まない培地で培養される。特に、成長因子は存在してもよいが、それらは好ましくは、組換えで生産されたものであり、動物材料から精製されたものではない。適当なアニマルフリー培地は、選択されるプロデューサー細胞に応じて、当業者により容易に選択され得る。このような培地は市販されている。特に、ＣＥＦがプロデューサー細胞として使用される場合、それらはＶＰ−ＳＦＭ細胞培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養され得る。プロデューサー細胞は、好ましくは、感染前に、３０℃〜３８℃の間に含まれる温度（より好ましくは、およそ３７℃）で、１〜８日間（好ましくは、ＣＥＦでは１〜５日間、不死化細胞では２〜７日間）培養される。必要に応じて、総細胞数を増加させるために、１〜８日のいくつかの継代を行ってもよい。例えば、白色プラークの単離後、組換えネオエピトープ発現ポックスウイルス（例えば、ＭＶＡ）の増幅を６〜１２ウェル細胞培養プラークにおいて実施した後、フラスコに移し、所望のウイルス量を得ることができる。
【０１１５】
組換えポックスウイルスによるプロデューサー細胞の感染は、プロデューサー細胞の増殖性感染を可能とするための適当な条件下で（特に、適当な感染多重度（ＭＯＩ）を用いて）行われる。ポックスウイルスの増幅に使用される好適なＭＯＩは、一般に、０．００１〜１の間（より好ましくは、約０．０５）である。感染工程もまた、好ましくは、動物またはヒト由来の製品を含まない合成培地を用いて、動物またはヒト由来製品を含まない培地（プロデューサー細胞の培養に使用した培地と同じでもよいし、異なっていてもよい）で行われる。感染工程は、通常、１〜６日間、より好ましくは、２〜４日間、最も好ましくは、約７２時間に及ぶ。
【０１１６】
次に、感染プロデューサー細胞は、後代ウイルスベクター（例えば、感染性ウイルス粒子）が産生されるまで、当業者に周知の適当な条件下で培養される。感染プロデューサー細胞の培養もまた、好ましくは、（動物またはヒト由来の製品を含まない合成培地を用いて）動物またはヒト由来製品を含まない培地（プロデューサー細胞の培養および感染工程に使用した培地と同じでもよいし、異なっていてもよい）で、３０℃〜３７℃の間の温度で１〜５日間行われる。
【０１１７】
ポックスウイルス粒子は、培養上清および／またはプロデューサー細胞から回収することができる。細胞培養上清およびプロデューサー細胞は、プールしてもよいし、または別々に回収してもよい。プロデューサー細胞からの（および場合により培養上清からも）回収は、ベクターの遊離を可能にするためのプロデューサー細胞膜の破壊を可能にする工程を必要とする場合がある。種々の技術が当業者に利用可能であり、その例としては、限定されるものではないが、凍結／解凍、低張溶解、超音波処理、顕微溶液化、または高速ホモジナイゼーションが含まれる。好ましい実施形態によれば、生産された組換えポックスウイルスを回収する工程は、プロデューサー細胞膜が好ましくは高速ホモジナイザーを用いることにより破壊される溶解工程を含んでなる。高速ホモジナイザーは、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ  Iｎｃ（イースト・ロングメドー、米国）またはＩｋａ−Ｌａｂｏｔｅｃｈｎｉｋ（シュタウフェン、ドイツ）から市販されている。特に好ましい実施形態によれば、前記高速ホモジナイザー(homogeneizer)は、ＳＩＬＶＥＲＳＯＮ  Ｌ４Ｒである。
【０１１８】
次に、ポックスウイルス粒子は、当技術分野で周知の精製工程を用いて、さらに精製され得る。種々の精製工程が想定され得、その例としては、清澄化、酵素処理（例えば、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼなど）、クロマトグラフィーおよび濾過工程が含まれる。適当な方法は、当技術分野で記載されている（例えば、ＷＯ２００７／１４７５２８；ＷＯ２００８／１３８５３３、ＷＯ２００９／１００５２１、ＷＯ２０１０／１３０７５３、ＷＯ２０１３／０２２７６４）。好ましい実施形態では、精製工程は、ウイルス懸濁液を濃縮および／または脱塩するために、他の生体分子からウイルスを分離するために使用され得るタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）工程を含んでなる。濾過する容量に応じて、種々のＴＦＦシステムおよびデバイスが当技術分野で利用可能であり、その例としては、限定されるものではないが、とりわけ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍｌａｂｓ、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ、ＰｅｎｄｏＴｅｃｈおよびＮｅｗ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎが含まれる。
【０１１９】
好ましい実施形態では、前記製造工程は、（腫瘍サンプルが由来する）患者の検査および治療のために好適な用量で分配される個別化癌ワクチンに関して、少なくとも１０９ｐｆｕ、望ましくは、少なくとも５×１０９ｐｆｕ、好ましくは、およそ１０１０ｐｆｕ以上の生産に達する。
【０１２０】
武装された組換えポックスウイルス
本発明の特定の実施形態はまた、ネオペプチドをコードする核酸分子に加えて、例えば、抗腫瘍応答を増強するために、ウイルスゲノムに挿入されたさらなる治療遺伝子を含んでなる組換えポックスウイルスを包含する。膨大な数の治療遺伝子が想定され得、特に、ウイルスの抗腫瘍有効性を増強するまたは宿主の免疫を強化することができるポリペプチドをコードするものが挙げられる。それらは、ヒト由来であってもよいし、ヒト由来でなくてもよく（例えば、細菌、酵母もしくはウイルス由来）、天然遺伝子、断片またはその機能的類似体（１以上のヌクレオチドの突然変異、欠失、置換および／または付加により後者から得られる）であり得る。このような類似体は、好ましくは、天然遺伝子の核酸配列と少なくとも７０％、有利には、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％の同一性の程度を有するヌクレオチド配列を有する。好ましい治療遺伝子は、自殺遺伝子および免疫賦活遺伝子からなる群から選択される。
【０１２１】
免疫賦活治療遺伝子
免疫賦活治療遺伝子は、特異的または非特異的な様式で、免疫系またはエフェクター細胞を刺激することができるポリペプチドをコードする。本発明の文脈における好適な免疫賦活タンパク質の例としては、限定されるものではないが、サイトカイン、特に好ましくは、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２４）、ケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１１）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮγ、ＩＦＮα）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ．．．）、ＡＰＣ（抗原提示細胞）曝露タンパク質（例えば、Ｂ７．１、Ｂ７．２など）、成長因子（トランスフォーミング成長因子ＴＧＦ、線維芽細胞成長因子ＦＧＦ、血管内皮成長因子ＶＥＧＦなど）、クラスＩまたはＩＩの主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）成分、アポトーシス誘導物質または阻害剤（例えば、Ｂａｘ、Ｂｃｌ２、ＢｃＩＸ．．．）、細胞増殖抑制剤、（ｐ２１、ｐ１６、Ｒｂ．．．）、免疫毒素、免疫チェックポイント阻害剤などの免疫エスケープ機序の遮断薬（前記阻害剤は、遮断ペプチド、抗体または単一ドメイン抗体もしくは抗体断片などの関連生物学的種）、ｃＧＡＳなどが含まれる。
【０１２２】
自殺遺伝子
用語「自殺遺伝子」は、薬物前駆体を細胞傷害性(cytoxic)薬物に変換できるタンパク質をコードする遺伝子を指す。好適な自殺遺伝子の代表的な例としては、限定されるものではないが、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、チミジル酸キナーゼ、シトシンデアミナーゼ（ＣＤａｓｅ）およびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＵＰＲＴａｓｅ）が含まれる。
【０１２３】
ＣＤａｓｅおよびＵＰＲＴａｓｅは、原核生物および下等真核生物に存在する（しかし、哺乳動物には存在しない）。ＣＤａｓｅは、外因性シトシンが加水分解的脱アミノ化の手段によってウラシルに変換されるピリミジン代謝経路に関与する。ＣＤａｓｅはまた、シトシンの類似体、すなわち、５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）プロドラッグを脱アミノ化し、それにより、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（ＵＰＲＴａｓｅにより５−フルオロ−ＵＭＰ（５−ＦＵＭＰ）に変換される際、高度の細胞傷害性である化合物）を形成する。遺伝子配列およびコードされる酵素は、例えば、専門データバンク（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ  ＥＭＢＬ、ジェンバンク、メドラインなど）において公的に入手可能である。特に好ましいのは、酵母ＵＰＲＴａｓｅおよびＣＤａｓｅ、特に、出芽酵母によりコードされるものである（ＦＵＲ１遺伝子；Kern et al., 1990, Gene 88: 149-57）。特に関心が持たれるのは、出芽酵母ＣＤａｓｅとその３５個の最初の残基が欠失した切断ＵＰＲＴａｓｅとの融合体（ＦＣＹ１：：ＦＵＲ１［Ｄｅｌｔａ］１０５融合体）をコードするＦＣＵ１自殺遺伝子であり、そのアミノ酸配列はＷＯ２００９／０６５５４６の配列識別子配列番号１に記載されている）。
【０１２４】
本明細書における使用のための治療遺伝子は、当業者が入手可能な配列データおよび本明細書に提供される配列情報を用いて、当業者に公知の多数の方法（例えば、クローニング、ＰＣＲ増幅、ＤＮＡシャフリング、化学合成）により、および入手可能な資源（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムライブラリー、ウイルスゲノムまたはそれを含むことで知られるいずれかの従来技術のベクターなど、当技術分野で記載されている生物学的材料）から独立に作製され得、次に、好適には、従来の分子生物学技術により、ネオエピトープをコードする核酸分子と同じ位置（例えば、ＭＶＡの欠失ＩＩＩ）または別の位置のいずれかで組換えポックスウイルスに挿入され得る。
【０１２５】
医薬組成物
一実施形態では、本発明の個別化癌ワクチンは、治療上有効な量の本明細書に記載の（または本明細書に記載の方法に従って得た）組換えポックスウイルスと薬学上許容可能なビヒクルとを含んでなる組成物の形態である。
【０１２６】
用語「薬学上許容可能なビヒクル」は、哺乳動物、特にヒト対象における投与に適合する、いずれかのおよび全ての担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント、分散媒、被覆剤、抗細菌剤および抗真菌剤、吸収剤などを含むものとする。
【０１２７】
「治療上有効な量」は、本発明に従って治療される対象において、以下に説明するものの１以上を含む臨床状態の観察可能な改善をもたらすのに必要な組換えポックスウイルスの量に相当する。
【０１２８】
このような治療上有効な量は、多様な因子、例えば、限定されるものではないが、ポックスウイルスの特徴（ウイルスの種類、バイオアベイラビリティおよび用量を含む）、疾患の重症度および経過（例えば、癌のグレード）、対象自体（年齢、性別、病歴、全身健康状態などを含む）、ウイルス処方中の薬学上許容可能な担体または賦形剤の性質、ならびに治療様式（投与経路、投与頻度、併用薬の種類など）に応じて変わり得る。ポックスウイルスの適当な用量は、関連状況を考慮して実務家により、例えば、ウイルスの投与に対する対象の反応をモニタリングすること、およびそれに従って用量を調整することによって、慣例的に決定および適合され得る（さらなるガイダンスについては、Remington, ; The Science and Practice of Pharmacy; Gennaro ed., Pharmaceutical Press, London, UK;例えば、第２２版以降を参照）。
【０１２９】
例示的目的のために、個々の用量に対する好適な治療上有効な量は、使用するポックスウイルスおよび定量化技術に応じて、およそ１０５〜およそ１０１３ｖｐ（ウイルス粒子）、ｉｕ（感染単位）またはｐｆｕ（プラーク形成単位）で変わり得る。一般的なガイダンスとして、およそ１０６ｐｆｕ〜およそ１０１１ｐｆｕの個々の用量が、本発明の文脈において特に適当であり、より好ましくは、およそ１０７ｐｆｕ〜およそ５×１０９ｐｆｕ；さらにより好ましくは、およそ５×１０７ｐｆｕ〜およそ１０９ｐｆｕ（例えば、５×１０７〜６×１０８、６×１０７〜５×１０８、７×１０７〜４×１０８、８×１０７〜３×１０８、９×１０７〜２×１０８ｐｆｕ）の用量が、ヒトへの使用に対して好都合であり、好ましくは、個々の用量は、およそ１０８の組換えポックスウイルスを含んでなる。個々の用量は、腫瘍内注射などの局所投与では２〜２０倍減量してよい。サンプル中に存在するウイルスの量は、慣例的な力価測定技術により、例えば、許容性細胞（例えば、ＢＨＫ−２１またはＣＥＦ）の感染後のプラークの数を数えることにより、免疫染色により（例えば、抗ウイルス抗体を用いた；Caroll et al., 1997, Virology 238: 198-211）、Ａ２６０吸光度（ｖｐ力価）を測定することにより、定量的免疫蛍光（ｉｕ力価）により、または特定のウイルスプライマーおよびプローブを用いたｑＰＣＲにより、決定することができる。
【０１３０】
種々の処方が本発明の文脈において想定され得、製造および凍結（例えば、−７０℃、−２０℃）、冷蔵（例えば、４℃）または周囲（例えば、２０〜２５℃）温度での長期保存（すなわち、少なくとも６ヵ月間）の条件下でのウイルス安定性を保証するためには、液体または凍結乾燥のいずれかである。組換えポックスウイルスは、有利には、ヒトまたは動物への使用に適当な希釈剤に入れられる。好適な希釈剤の代表的な例としては、滅菌水、生理食塩水（例えば、塩化ナトリウム）、リンゲル液、グルコース、トレハロースまたはサッカロース溶液、ハンクス液、および他の生理学的平衡塩水溶液が含まれる。
【０１３１】
望ましくは、個別化癌ワクチン組成物は、好適には、ヒトへの使用のために緩衝される。ＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン）、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン−ＨＣｌ）、ＨＥＰＥＳ（４−２−ヒドロキシエチル−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、リン酸緩衝液（例えば、ＰＢＳ；Ｎａ２ＨＰＯ４とＫＨ２ＰＯ４の混合物；Ｎａ２ＨＰＯ４とＮａＨ２ＰＯ４の混合物）、ＴＥＡ（トリエタノールアミン）、ＥＰＰＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−３−プロパンスルホン酸）、ＴＲＩＣＩＮＥ（Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）−メチル］−グリシン）および重炭酸緩衝液などの緩衝液が、生理的なまたはわずかに塩基性のｐＨ（例えば、およそｐＨ７〜およそｐＨ９）を維持するために特に適当である。緩衝液（例えば、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ）は、好ましくは、１０〜５０ｍＭの濃度で存在する。
【０１３２】
適当な浸透圧を保証するために、一価の塩を含めることも有益であり得る。前記一価の塩は、特に、ＮａＣｌおよびＫＣｌから選択され得、好ましくは、前記一価の塩は、特に１０〜５００ｍＭの濃度のＮａＣｌである。
【０１３３】
必要に応じて、癌ワクチン組成物は、低温での保存を促進するために、凍結防止剤を含んでもよい。好適な凍結防止剤としては、限定されるものではないが、例えば、０．５〜２０％（重量（ｇ）／容量（Ｌ）、ｗ／ｖという）、好ましくは、５〜１５％（ｗ／ｖ）で変動する濃度、好ましくは約１０％の、スクロース、トレハロース、マルトース、ラクトース、マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールが含まれる。デキストランまたはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの高分子量ポリマーの存在が、真空乾燥および凍結乾燥工程中に組換えポックスウイルスを保護するための凍結乾燥処方に特に適する（例えば、ＷＯ０３／０５３４６３；ＷＯ２００６／０８５００８２；ＷＯ２００７／０５６８４７；ＷＯ２００８／１１４０２１、ＷＯ２０１４／０５３５７１参照）。
【０１３４】
例示的目的のために、ＮａＣｌおよび／または糖を含む緩衝処方は、ポックスウイルスの保存に特に適合される（例えば、サッカロース５％（Ｗ／Ｖ）、グルタミン酸ナトリウム１０ｍＭ、およびＮａＣｌ  ５０ｍＭを含有するトリス１０ｍＭ  ｐＨ８；またはグリセロール（１０％）およびＮａＣｌを含有するリン酸緩衝食塩水）。
【０１３５】
治療的使用および治療方法
本発明の個別化癌ワクチンおよび方法は、癌、特に、転移性癌および再発の高リスクにあるものの治療に特に適する。従って、本発明はまた、対象において癌を治療するまたはその再発を予防するための使用のための個別化癌ワクチン（例えば、ポックスウイルス組成物）、ならびにこのような治療目的のための個別化癌ワクチンの使用を提供する。本発明はまた、癌を治療するまたはその再発を予防するための薬剤の製造のための本明細書に記載の個別化癌ワクチンまたはその組成物に関する。
【０１３６】
別の側面では、本発明はまた、それを必要とする対象において癌を治療するまたはその再発を予防するのに十分な量で、前記対象において個別化癌ワクチン組成物を投与することを含んでなる治療の方法に関する。
【０１３７】
本発明の文脈において治療され得る癌の代表的な例としては、骨癌、肝臓癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、食道癌、中咽頭癌、肺癌、頭部または頸部の癌、皮膚癌、黒色腫、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、乳癌、直腸癌、肛門部の癌、前立腺癌、リンパ腫、内分泌系の癌、甲状腺癌、軟組織肉腫、慢性または急性白血病、膀胱癌、腎臓癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、神経膠腫などが含まれる。本発明は、固形腫瘍の治療に特に適当である。これはまた、転移性固形癌または再発の高リスクに関連する癌を含む、進行癌の治療に特に有用である。本明細書に記載の様式に従って治療されるための好ましい癌としては、脳癌、例えば、星状細胞腫、胚芽腫、生殖細胞腫瘍、中枢神経系非定型奇形／ラブドイド腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、神経膠腫および膠芽腫ならびに頭頸部癌が含まれる。本明細書に記載の様式に従って治療されるための他の種類の癌は、肺癌、特にＮＳＣＬＣ、特に好ましくは腺癌、扁平上皮癌および大細胞癌である。本発明の個別化癌ワクチンで治療される別の好適な癌は、卵巣癌である。
【０１３８】
本発明の個別化癌ワクチンの使用またはそれを用いた方法により提供される有益な効果は、ベースライン状態または本明細書に記載の様式に従って治療されない場合に予想される状態を上回る臨床状態の観察可能な改善により、証明され得る。臨床状態の改善は、一般に医師または他の熟練の医療従事者により用いられるいずれかの関連する臨床測定により、容易に評価され得る。本発明の文脈では、治療的利益は、一過性（投与休止後１ヵ月間または数ヵ月間）または持続的（数ヵ月間または数年間）であり得る。臨床状態の自然経過は対象毎にかなり変わり得るため、治療的利益は、治療される各対象において認められる必要はないが、かなりの数の対象において認められる必要がある（例えば、２群間の統計的有意差は、当技術分野で公知のいずれかの統計的検定、例えば、チューキーパラメトリック検定、クラスカル・ウォリス検定およびマン・ホイットニーによるＵ検定、スチューデントのｔ検定、ウィルコクソン検定などにより決定することができる）。
【０１３９】
特定の実施形態では、このような治療的利益は、以下の１以上と相関し得る：本発明に従って治療される対象における、腫瘍成長の阻害もしくは緩徐化、増殖および転移、腫瘍浸潤（隣接組織への腫瘍細胞の伸展）の予防もしくは遅延、腫瘍病変数の減少；腫瘍のサイズの減少、転移の数または程度の減少、全生存率（ＯＳ）の延長、無増悪生存期間（ＰＦＳ）の増加、寛解の長さの増加、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患の再発の予防、別の治療、特に別の免疫療法に対する良好な反応の提供、生活の質の改善ならびに／または抗腫瘍応答（例えば、非特異的（先天性の）および／または細胞傷害性Ｔ細胞応答などの特異的）の誘発。
【０１４０】
血液検査、生体液および生検の分析ならびに医用画像技術などの適当な測定が、臨床的利益を評価するために利用可能な医学検査室および病院において慣例的に行われ、多数のキットが市販されている。それらは、投与前（ベースライン）、治療中および治療休止後の様々な時点で行われ得る。
【０１４１】
個別化癌ワクチンまたはその組成物の投与
いずれの従来の投与経路も適用可能であり、好ましくは、非経口経路である。非経口経路は、注射または注入としての投与を対象とし、全身経路および局所経路を包含する。特に好適な投与経路としては、限定されるものではないが、静脈内（静脈へ）、血管内（血管へ）、動脈内（動脈へ）、皮内（真皮へ）、皮下（皮膚の下）、筋肉内（筋肉へ）、腹腔内（腹膜へ）、脳内（脳へ）および腫瘍内（腫瘍またはその近傍へ）経路ならびに乱切が含まれる。注入は、一般に、静脈内経路または腫瘍内（大きな腫瘍内）により行われる。粘膜投与も本発明により企図され、その例としては、限定されるものではないが、経口／食事、鼻腔内、気管内、鼻咽頭、肺内、膣内または直腸内経路が含まれる。局所投与は、皮膚または組織の表面（例えば、点眼薬；点耳薬など）に直接適用する。特に、治療される腫瘍が気道および肺にある場合、吸入も想定され得る。個別化癌ワクチンまたはその組成物は、好ましくは、静脈内、皮下、筋肉内または腫瘍内注射により患者に投与される。
【０１４２】
投与は、標準的な針およびシリンジまたは送達を促進もしくは改善できる当技術分野で利用可能ないずれかのデバイス、例えば、カテーテル、電気シリンジ、Ｑｕａｄｒａｆｕｓｅ注射針、無針注射デバイス（例えば、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（商標）デバイス）、注入ポンプ、スプレーなどを使用してよい。電気穿孔も、筋肉内投与を促進するために実施してよい。局所投与は、経皮的な手段（例えば、パッチ、顕微針など）を用いて行うこともできる。
【０１４３】
個別化癌ワクチンは、単一の用量で、またはより望ましくは、長期間にわたり複数の用量で投与することができる。本発明の文脈では、休薬期間後に繰り返される投与の逐次サイクルを介して進めることが可能である。各ウイルス投与間の間隔は、数時間〜６ヵ月（例えば、２４時間、４８時間、７２時間、１週間、２週間、３週間、１ヵ月、２ヵ月など）であり得る。間隔は、規則的でもよいし、そうでなくてもよい。用量は、上記の範囲内で、各投与で変えてもよい。例示的目的のために、好ましい治療スキームは、臨床的利益が認められるまではおよそ１または２週間の間隔で、認められた後は１〜６ヵ月毎に、１０７〜５×１０９ｐｆｕの組換えＭＶＡの１〜１０回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回）の投与が関与する。
【０１４４】
併用療法
本明細書に記載の方法および治療的使用のさらなる実施形態では、個別化癌ワクチンは、前述の癌の治療において有用性を有する１以上のさらなる抗癌療法と併用して投与され得る。特に、さらなる抗癌療法は、手術、放射線療法、化学療法、寒冷療法、ホルモン療法、毒素療法、免疫療法およびサイトカイン療法からなる群から選択される。このようなさらなる抗癌療法は、本発明の個別化癌ワクチンの前、後、基本的に同時に、または間欠的な様式で、標準的技法に従って対象に投与される。
【０１４５】
特定の実施形態では、本発明による方法または使用は、手術と併用して行われ得る。例えば、個別化癌ワクチンは、腫瘍の部分的または完全な外科的切除後に投与され得る（例えば、切除領域内の局所適用により）。
【０１４６】
他の実施形態では、本発明による方法は、放射線療法と関連して使用され得る。当業者ならば、適当な放射線療法のプロトコールおよびパラメーターを容易に処方することができる（例えば、Perez and Brady, 1992, Principles and Practice of Radiation Oncology, 第2版. JB Lippincott Coを参照；当業者に容易に明らかな適当な改変および修飾を用いて）。癌治療に使用され得る放射線の種類は、当技術分野で周知であり、直線加速器またはコバルトもしくはセシウム、プロトン、および中性子などの放射能源からの電子線、高エネルギー光子が含まれる。放射性同位体の線量範囲は広く異なり、同位体の半減期、放射される放射線の強さおよび種類、ならびに新生細胞による取り込みに依存する。長期間（３〜６週間）の通常のＸ線線量、または高単一線量が、本発明により企図される。
【０１４７】
本発明の特定の実施形態では、個別化癌ワクチンは、癌の治療のために現在利用可能な化学療法と併用して使用され得る。好適な化学療法剤の代表的な例としては、限定されるものではないが、アルキル化剤、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、白金誘導体、チロシンキナーゼ受容体の阻害剤、シクロホスファミド、代謝拮抗剤、ＤＮＡ損傷剤および有糸分裂阻害剤が含まれる。
【０１４８】
さらなる実施形態では、個別化癌ワクチンは、抗新生物抗体ならびにｓｉＲＮＡおよびアンチセンスポリヌクレオチドなどの免疫療法と併用して使用され得る。代表的な例としては、とりわけ、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＬＡＧ３などの特定の免疫チェックポイントを遮断するモノクローナル抗体（例えば、イピリムマブ、トレメリムマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、ＡＭＰ−２２４ＭＥＤＩ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＭＳ−９３６５５９など）、上皮成長因子受容体を遮断するモノクローナル抗体（特に、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、トラスツズマブ（ハーセプチン（商標））など）および血管内皮成長因子を遮断するモノクローナル抗体（特に、ベバシズマブおよびラニビズマブ）が含まれる。
【０１４９】
さらなる実施形態では、個別化癌ワクチンは、アジュバントと併用して使用され得る。好適なアジュバントの代表的な例としては、限定されるものではないが、ＴＬＲ３リガンド(Claudepierre et al., 2014, J. Virol. 88(10): 5242-55)、ＴＬＲ９リガンド（例えば、ＯＤＮ１８２６(Fend et al., 2014, Cancer Immunol. Res. 2, 1163-74)およびＬｉｔｅｎｉｍｏｄ（Ｌｉ２８）(Carpentier et al., 2003, Frontiers in Bioscience 8, e115-127; Carpentier et al., 2006, Neuro-Oncology 8(1): 60-6;ＥＰ１１６２９８２；ＵＳ７，７００，５６９およびＵＳ７，１０８，８４４)などのＣｐＧｓならびにシルデナフィルなどのＰＤＥ５阻害剤（ＵＳ５，２５０，５３４、ＵＳ６，４６９，０１２およびＥＰ４６３７５６）が含まれる。
【０１５０】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、未治療の対象と比較して、治療された対象における生存期間を例えば少なくとも３ヵ月増加させる。あるいは、本発明の方法は、前記腫瘍に対するＴ細胞応答（ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞応答）を生じさせる。
【０１５１】
個別化癌ワクチンおよび１以上のさらなる抗癌療法の投与は、分〜週にわたる間隔を空けてもよい。例えば、対象に対して、組換えポックスウイルスおよびさらなる抗癌療法を逐次的または間欠的に与えてもよいが、同じ期間内での両療法の同時投与も企図される。治療の過程は、実務家により慣例的に決定され得るが、種々のプロトコールが本発明により包含される。例えば、個別化癌ワクチンの１〜１０回の投与が、手術および化学(chimio)／放射線療法の後に行われ得る。さらに、治療の過程の後、治療サイクルの反復前に抗癌治療を投与しない期間が存在することが企図される。
【０１５２】
上記で引用した特許の開示、刊行物およびデータベースエントリーは全て、具体的に引用することによりそれらの全内容が本明細書の一部とされる。本発明の他の特徴、目的、および利点は、明細書および図面ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために組み込まれる。しかしながら、本開示を踏まえ、当業者は、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態に変更を行えることを認識するはずである。
【実施例】
【０１５３】
材料と方法
以下に記載する構築は、Ｍａｎｉａｔｉｓら（1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NYまたは以降の版）に詳述される一般的な遺伝子工学および分子クローニング技術に従って、または市販のキットを使用する場合は製造業者の推奨に従って行われる。ＰＣＲ増幅技術は、当業者に公知である（例えば、PCR protocols -A guide to methods and applications, 1990, Innis, Gelfand, Sninsky and White, Academic Press発行）。
【０１５４】
組換えＭＶＡの作製
ワクシニアプロモーターおよびネオエピトープの異なる融合体をコードする合成遺伝子が、Ｇｅｎｅａｒｔ（レーゲンスブルク、ドイツ）により合成された。配列をヒトコドン使用頻度に対して最適化し、コザック配列（ＡＣＣ）をＡＴＧ開始コドンの前に付加した。さらに、以下の一部のモチーフを除外した：ポックスウイルスベクターにおける発現に有害であるＴＴＴＴＴＮＴ、ＧＧＧＧＧ、ＣＣＣＣＣ。
【０１５５】
マルチエピトープ構築物：ＭＶＡＴＧ１９０２２およびＭＶＡＴＧ１９０２３の作製
ＭＶＡＴＧ１９０２２は、５個の異なる抗原：ＦＣＵ１、ｂ−ｇａｌ、ＭＵＣ１、ＨＰＶ−１６  Ｅ７およびＨＰＶ−１６  Ｅ１に由来する５個のペプチドの融合体をコードする発現カセットを含有する。全てのペプチドは、Ｃ５７ｂｌ／６  Ｔ細胞エピトープを含んでなる２７ｍｅｒである。より具体的には、ペンタトープ(pentatope)融合体は、５’〜３’にかけて、ＦＣＵ１ペプチド（配列番号１）、ｂ−Ｇａｌペプチド（配列番号２）、ＨＰＶ−１６  Ｅ１ペプチド（配列番号３）、ＨＰＶ−１６  Ｅ７ペプチド（配列番号４）およびＭＵＣ１ペプチド（配列番号５）を含んでなり、融合ポリペプチドの最適なプロセシングおよびエピトープ提示のために、融合体のＮ末端、ペプチドの間、および最後のペプチドの後に１０ｍｅｒのＧＳリンカーが存在する。検出を促進するために、融合体のＣ末端にタグ配列、Ｆｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号６）を付加した。ペンタトープ(pentatope)融合体（配列番号７）を、ｐ１１Ｋ７．５プロモーター（配列番号８）の制御下に置いた。
【０１５６】
ＭＶＡＴＧ１９０２３は、狂犬病糖タンパク質から得られたシグナルペプチド（配列番号９）がＮ末端に付加された同じペンタトープ(pentatope)融合体をコードする発現カセットを含有する。改変ペンタトープ(pentatope)融合体（配列番号１０）を、ｐ１１Ｋ７．５プロモーター（配列番号８）の制御下に置いた。
【０１５７】
ペンタトープ(pentatope)融合体の各々に対応する、およびワクシニアトランスファープラスミドと相同なおよそ３０ｂｐの配列により囲まれるＤＮＡ断片を、合成方法により作製した。ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｓｔｒｉｎｇｓ（商標）ＤＮＡ断片を、ＮｏｔＩおよびＢｇｌＩＩＩにより消化されたワクシニアトランスファープラスミドｐＴＧ１８６２６にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング（Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤクローニングキット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により挿入し、それぞれｐＴＧ１９０２２およびｐＴＧ１９０２３を得た。
【０１５８】
ＭＶＡトランスファープラスミド、ｐＴＧ１８６２６は、ＭＶＡゲノムの欠失ＩＩＩへの相同組換えにより導入されるヌクレオチド配列の挿入を可能にするように設計される。これは、ＭＶＡ欠失ＩＩＩを囲むフランキング配列（ＢＲＧ３およびＢＲＤ３）がクローン化されたプラスミドｐＵＣ１８に由来する(Sutter and Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10847)。
【０１５９】
相同組換えは、その欠失ＩＩＩ内にｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含有する親ＭＶＡ（ＭＶＡ  ｍＣｈｅｒｒｙ）を用いて、行った。ＭＶＡ  ｍＣｈｅｒｒｙの利点は、最初の開始ＭＶＡ  ｍＣｈｅｒｒｙウイルス（親ウイルス）により感染されるものからの発現カセットを組み込むことに成功している組換えウイルスにより感染される細胞を区別することである。実際に、欠失ＩＩＩ内での発現カセットの組換えが成功している場合は、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子は除去され、ウイルスプラークは白色として出現する。
【０１６０】
組換えは比較的頻繁な事象であるが、ワクシニアウイルスでは、組換えプラークの１〜５％のみが挿入ＤＮＡを含有する。従って、相同組換えの有効性を高めるために、エンドヌクレアーゼによる切断のさらなる工程を追加した。例えば、ＭＶＡにおけるｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の二本鎖切断を特異的に生じさせ、従って、組換えＭＶＡの選択の効率を高める（例えば、通常、ウイルスプラークの１０〜５０％が発現カセットを含有する）ために、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９系を使用してもよい。ＭＶＡは細胞質において複製することを考慮すると、ｍＣｈｅｒｒｙ配列に特異的なｇＲＮＡを含有するｐｇＲＮＡとともに、Ｙｕａｎら(2015, J. Virol. doi:10.1128)に記載の通りにＮＬＳ（核局所化シグナル）を有さないＣａｓ９酵素（ｐＣａｓ９プラスミド）を提供することが推奨される。
【０１６１】
ＭＶＡＴＧ１９０２２の作製は、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）における相同組換えにより行った。ＣＥＦを、１１〜１２日齢の胚形成ＳＰＦ卵（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）から単離し、グルタミン４ｍＭを添加した、終濃度４０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンを含有する培養培地で培養した。ＣＥＦを、ＭＶＡ感染前に、３７℃、５％ＣＯ２で２４または４８時間培養した。１０８個のＣＥＦ細胞を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを添加した、終濃度４０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンを含有する別の培養培地で、親ｍＣｈｅｒｒｙをコードするＭＶＡにＭＯＩ０．０２で２時間感染させた。感染細胞をトリプシン処理し、１０７個の細胞を、２μｇのｐＴＧ１９０２２（Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｅｌｏｆｅｃｔｏｒ技術に従って）ならびに必要に応じて、ｐＣＡＳ９およびｐｇＲＮＡでのｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎによりトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を６ウェルプレートに移し、３７℃で２日間インキュベートした。感染およびトランスフェクトした細胞を回収し、プラーク単離に用いた。段階希釈を用いて、ＣＥＦ単層を室温で３０分間感染させた。６０ｍｍ培養ディッシュに播種した２×１０７個の細胞ＣＥＦを、各希釈液５００μＬで感染させた。３０分後、１％アガロースを含有する培養培地５ｍＬの層を、単層細胞に重ねた。培養ディッシュを５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃にて９６時間引き続きインキュベートした。１％アガロースおよび０．００８％ニュートラルレッドを含有する培養培地の新たな層（５ｍＬ）を重ねることにより、顕微鏡検査によるプラークの検出を促進した。選択した白色プラークを取り、５００μＬのＰＢＳに入れ、−２０℃で凍結させた。凍結プラークを用いて、ＣＥＦ単層細胞を６ウェル細胞培養プレート中で室温にて３０分間感染させることにより、ウイルス増幅を行った。３０分後、培養培地２ｍｌを加え、感染細胞を５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃にてインキュベートした。７２時間後、ディッシュの全内容物を回収した（増幅物１）。場合により、増幅の第２の工程をＦ１７５フラスコで行ってもよい。この場合、増幅したプラーク１００μＬを１０ｍＬのＰＢＳで希釈し、これを用いて、２つの培養フラスコ（約７×１０７個を含有するＦ１７５）中で、室温にて３０分間新鮮ＣＥＦを感染させた。培養培地２０ｍｌを加え、感染細胞を５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃にて７２時間インキュベートした。次に、増幅物２を回収した。発現カセットの存在および親ＭＶＡによる汚染の非存在を、ＰＣＲにより確認した。全てのこの過程は、わずか３週間で行うことができた。
【０１６２】
ＭＶＡＴＧ１９０２２は、いくつかのＦ５００フラスコを用いた前臨床実験のためにより大規模に生産してもよい。ＣＥＦを最初に、グルタミン４ｍＭを添加した、終濃度４０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンを含有する好適な培地で培養し、３７℃および５％ＣＯ２にて、感染前に４８時間インキュベートした。次に、細胞を上記の増幅物２バルクで感染させた。ウイルス増幅を、３７℃以下（例えば、３４〜３５℃）および５％ＣＯ２にて７２時間〜９６時間行った。次に、感染細胞および培地をペレット状にし、凍結させた。粗回収物を高速ホモジナイザー(homogeneizer)（ＳＩＬＶＥＲＳＯＮ  Ｌ４Ｒ）を用いて破壊し、精製過程（例えば、Ｗ０２００７／１４７５２８に記載の）に送った。簡単に述べれば、溶解ウイルス調製物は、濾過により清澄化し、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）工程により精製することができる。精製したウイルスを、好適なウイルス処方緩衝液（例えば、５％（ｗ／ｖ）サッカロース、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、１０ｍＭグルタミン酸ナトリウム、ｐＨ８）に再懸濁させた。
【０１６３】
ＭＶＡＴＧ１９０２３ウイルスの作製は、相同組換えによりＣＥＦにおいて行い、上記のように生産した。
【０１６４】
ＣＴ２６ネオペプチド構築物：ＭＶＡＴＧ１９０３０およびＭＶＡＴＧ１９０３８の作製
ＭＶＡＴＧ１９０３０は、配列がＫｒｅｉｔｅｒら(2015, Nature, 520: 692-6)に記載されている５個のＣＴ２６ネオペプチド（ペンタトープ(pentatope)）の融合体の各々をコードする２個の発現カセットを含有する。ペンタトープ(pentatope)の検出を促進するために、各ペンタトープ(pentatope)のＣ末端に、タグ配列、すなわち、それぞれペンタトープ(pentatope)１に対してはＦｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号６）およびペンタトープ(pentatope)２に対してはｃ−ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号１１）を付加した。タグ付きペンタトープ(pentatope)１（配列番号１２）は、ｐ１１Ｋ７．５プロモーター（配列番号８）の制御下に置き、一方、タグ付きペンタトープ(pentatope)２（配列番号１３）は、ｐＨ５Ｒプロモーター（配列番号１４）の制御下に置いた。
【０１６５】
ＭＶＡＴＧ１９０３８は、狂犬病糖タンパク質のシグナルペプチド（配列番号９）がペンタトープ(pentatope)１のＮ末端に付加され、麻疹Ｆ糖タンパク質のシグナルペプチド（配列番号１５）がペンタトープ(pentatope)２のＮ末端に付加された同じペンタトープ(pentatope)融合体をコードする２個の発現カセットを含有する。改変ペンタトープ(pentatope)１（配列番号１６）は、ｐ１１Ｋ７．５プロモーター（配列番号８）の制御下に置き、一方、改変ペンタトープ(pentatope)２（配列番号１７）は、ｐＨ５Ｒプロモーター（配列番号１４）の制御下に置いた。
【０１６６】
好適な制限部位により分離された２個の発現カセットに対応する、およびワクシニアトランスファープラスミドと相同なおよそ３０ｂｐの配列により囲まれるＤＮＡ断片を、合成方法により作製した。ＳｎａＢ１による制限後、断片を、ＮｏｔＩおよびＢｇｌＩＩにより消化されたワクシニアトランスファープラスミドｐＴＧ１８６２６にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング（Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤクローニングキット、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により挿入し、それぞれｐＴＧ１９０３０およびｐＴＧ１９０３８を得た。
【０１６７】
ＭＶＡＴＧ１９０３０およびＭＶＡＴＧ１９０３８ウイルスの作製は、上記のように相同組換えによりＣＥＦにおいて行った。
【０１６８】
ヒトネオペプチド構築物：ＭＶＡＴＧ１９１１１の作製
ＭＶＡＴＧ１９１１１は、３個の融合体（第１の融合体は７個のネオペプチドを含有し（ヘプタトープ(heptatope)）、第２の融合体は６個のネオペプチドを含有し（ヘキサトープ(hexatope)）、および第３の融合体は５個のネオペプチドを含有する（ペンタトープ(pentatope)））に派遣された１８個のヒトネオペプチドを同時にコードする３個の発現カセットを含有する。１８個のコードされたネオペプチドのほとんどが、中心の位置に突然変異を有する２９個のアミノ酸から構成され、そのうち４個は例外で、それらはそれぞれ、そのＮ末端に位置する突然変異を有する１９個のアミノ酸のネオペプチド（ＮＰ１）、そのＣ末端に位置する突然変異を有する２１個のアミノ酸を含有するネオペプチド（ＮＰ１８）、本明細書に定義される中心の位置に突然変異を有するが、Ｃ末端フランキング配列に３個のアミノ酸欠失を有する２６個のアミノ酸を含有するネオペプチド（ＮＰ１０）およびフレームシフト突然変異から生じる７６個のアミノ酸のネオペプチド（ＮＰ１５）である。各融合体において、ネオペプチドは、融合ポリペプチドの最適なプロセシングおよびエピトープ提示のために、５アミノ酸リンカーにより分離された。以下の４個の異なるリンカー：ＧＳＧＳＧ、ＳＧＳＧＳ、ＧＳＴＳＧおよびＳＧＴＧＳを使用した。反復を避け、ポックスウイルス生産過程中の組換え事象を制限するために、リンカー配列コドンを変性させた。
【０１６９】
ペプチド融合体の検出を促進するために、各融合体のＣ末端に、タグ配列、すなわち、それぞれヘプタトープ(heptatope)に対してはＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号１８）、ヘキサトープ(hexatope)に対してはＨＳＶタグ（ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ；配列番号１９）およびペンタトープ(pentatope)に対してはＶＳＶタグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ；配列番号２０）を付加した。ＥＲを介したプロセシングを亢進するために、シグナルペプチドを各ネオペプチド融合体のＮ末端に付加した。狂犬病糖タンパク質（配列番号９）から得たシグナルペプチドを、ヘプタトープ(heptatope)およびペンタトープ(pentatope)のＮ末端に付加し、麻疹Ｆ糖タンパク質（配列番号１５）から得たシグナルペプチドを、ヘキサトープ(hexatope)のＮ末端に付加した。
【０１７０】
ネオペプチド融合体の発現を制御するために、種々のプロモーター、すなわち、それぞれヘプタトープ(heptatope)の発現を駆動するｐＨ５Ｒプロモーター（配列番号１４）、ヘキサトープ(hexatope)の発現に対するｐＢ２Ｒプロモーター（配列番号２１）およびペンタトープ(pentatope)に対するｐ１１Ｋ７．５プロモーター（配列番号８）を使用した。
【０１７１】
好適な制限部位により分離された３個の発現カセットに対応する、およびワクシニアトランスファープラスミドと相同なおよそ３５０ｂｐの配列により囲まれるＤＮＡ断片を、合成方法により作製し、ｐＴＧ１９１１１を得た。
【０１７２】
ＭＶＡＴＧ１９１１１ウイルスの作製は、上記のように相同組換えによりＣＥＦにおいて行った。
【０１７３】
ヒトネオペプチド構築物：ｐＴＧ１９２４７の作製
各々１０個のネオペプチドをコードする３個の発現カセットを含有するプラスミド構築物ｐＴＧ１９２４７を作製した。３０個のネオペプチドのプールを、公的に入手可能な患者データセット（試験ＰＲＪＥＢ３１３２、ヒト肺腺癌サンプルおよびそれらの正常対応物のエクソームシークエンシング）からのそれらの予測免疫原性に基づき、選択した。例示的目的のために、アミノ酸配列は、配列番号６０、６１および６２において与えられる。各カセットは、（狂犬病および麻疹Ｆ糖タンパク質から得た）シグナル配列を含んでなり、それぞれｐＨ５Ｒ、ｐＢ２Ｒおよびｐ１１ｋ７．５プロモーターの制御下に置かれる。融合体の構築を促進するため、選択されたネオペプチドの間にリンカーは含めなかった。対応するウイルスの作製は、上記に開示した方法に従って、相同組換えによりＣＥＦにおいて行った。しかしながら、５％未満の白色プラークの低い比が得られ、白色プラークのＰＣＲ分析は、ネオペプチド融合体を有する組換えＭＶＡの作製はないことを明らかにした（白色プラークは、おそらくｍＣｈｅｒｒｙ配列の突然変異の結果である）。
【０１７４】
ネオペプチドの発現およびウエスタンブロット解析
４×１０６個のＣＥＦ細胞を、６ウェルプレート中で、ネオペプチド融合体をコードする種々のＭＶＡにＭＯＩ０．２で感染させた。ＭＶＡＴＧＮ３３．１空ベクターを陰性対照として用いた。２４時間後、培地を廃棄し、細胞を、β−メルカプトエタノール（５％Ｖ：Ｖ）を含有するトリス−グリシン−ＳＤＳ２倍緩衝液（参照：ＬＣ２６７６；Ｎｏｖｅｘ）３００μＬ／ディッシュで溶解した。次に、ライセートを超音波処理し、９５℃で５分間加熱した。２０マイクロリットルの細胞ライセートを、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎプレキャストゲルシステム（Ｂｉｏｒａｄ）を用いた、プレキャストした４〜１５％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲル中での電気泳動に送った。電気泳動後、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｔｒａｎｓ−ｂｌｏｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（＃１７０−４１５５、Ｂｉｏｒａｄ））に移した。免疫検出をＨＲＰ−抗−ＴＡＧ抗体を用いて行った。以下の抗体：モノクローナル抗ＦＬＡＧ  Ｍ２、ＨＲＰ抗体（Ｓｉｇｍａ、Ａ８５９２）、ＨＡタグモノクローナル抗体、ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、２６１８３−ＨＲＰ）、ＶＳＶ−Ｇタグポリクローナル抗体、ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、ＰＡ１−２６５６４）、ヤギポリクローナル抗ＨＳＶタグ抗体、ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ、１９３９２）の各々の１／２０００希釈液を膜に適用し、一方、モノクローナル抗ｃＭｙｃ、ＨＲＰ抗体（Ｎｏｖｅｘ４６−０７０９）の１／５０００希釈液を使用した。免疫複合体を、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ  ｐｒｉｍｅウエスタンブロット試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＲＰＮ２２３６）を用いて明らかにし、ＢＩＯ−ＲＡＤからのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＣｈｅｍｉＤＯＣＴＭ  ＸＲＳを用いて分析した。
【０１７５】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
プレート調製
プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＳＩＰＳ４Ｗ１０）を、エタノール３５％（１５μｌ／ウェル）で１分間前処理し、滅菌水（２００μｌ／ウェル）で５回洗浄した。ウェルを１００μｌの１５μｇ／ｍｌ抗マウスＩＦＮγ抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ、ＡＮ１８、３３２１−３−１０００；ＰＢＳで希釈）でコートし、＋４℃で一晩または週末にかけてインキュベートした。実験の日に、プレートを滅菌ＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で５回洗浄し、完全培地（ＣＭ）２００μＬ／ウェルで３７℃にて少なくとも１時間飽和させた。
【０１７６】
サンプル調製
新鮮脾臓リンパ球を用いて生体外Ｅｌｉｓｐｏｔを行った。各実験において、各群の５匹の動物からの脾臓を回収し、プールした。脾臓を４ｍＬの完全培地（ＣＭ：ＲＰＭＩ  １０％ＦＣＳまたはマウスが腫瘍を有する場合はＸ−Ｖｉｖｏ）に回収し、次に、６ウェルプレート中で、７０μｍセルストレーナーを介したシリンジプランジャーで破砕した。得られた脾細胞懸濁液をＣＭで２倍希釈し、４ｍＬのＬｙｍｐｈｏｌｙｔｅ（登録商標）−Ｍ分離細胞培地（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、参照：ＣＬ５０３５）に置き、室温にて１５００ｇで２０分間遠心分離した。リンパ球を含有する界面相を回収し、１０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した（室温にて４００ｇで５分間遠心分離した）。リンパ球を２ｍＬのＲＢＣ溶解緩衝液（ＢＤ  ＰｈａｒｍＬｙｓｅ、ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、参照５５５８９９）に再懸濁し、室温にて５〜１５分間インキュベートし、赤血球（ＲＢＣ）を溶解した。ＣＭでの１回洗浄工程（室温での４００ｇでの５分間の遠心分離）の後、リンパ球を１ｍＬのＣＭに再懸濁し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒの「Ｚ２  Ｃｏｕｌｔｅｒ粒子数・サイズ分析器」を用いて計数した。ＣＭを用いて細胞濃度を１×１０７個／ｍＬに調整した。
【０１７７】
アッセイ
最初に、プレートを空にすることにより飽和培地を除去し、５０μＬ  ＣＭを全てのウェルに加えた。５０μＬのＣＭ中４μｇ／ｍＬ（すなわち、プールに関しては、各ペプチドの濃度は０．４μｇ／ｍＬ）の各ペプチド、もしくはペプチドのプール、または５０μＬのＣＭ（陰性対照）を、関連するウェルに加えた（以前に定義されたピペッティングスキームに従って；各条件は４回試験した）。陽性対照として、２０μｇ／ｍＬのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）５０μＬを加えた。第２に、１００μＬの各リンパ球懸濁液（１×１０６個）をウェルに加え（Ｔ８Ｖウェルは例外で、３×１０５個のみ加えた）、プレートを５％ＣＯ２中で３７℃にて１８時間〜２０時間インキュベートした。
【０１７８】
プレートを空にすることにより細胞を除去し、プレートをＰＢＳ（２００μＬ／ウェル）で５回洗浄し、１００μＬのビオチン化抗マウスＩＦＮγモノクローナル抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｒ４−６Ａ２、３３２１−６−１０００；ＰＢＳ０．５％ＦＣＳ中で１μｇ／ｍＬの終濃度）を全てのウェルに分配した。プレートを室温にて２時間インキュベートし、次に、ＰＢＳで５回洗浄し、Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ−アルカリホスファターゼ（ＳＩＧＭＡ、Ｅ２３６、ＰＢＳ０．５％ＦＣＳ中１／５０００ｅ）を各ウェル（１００μＬ／ウェル）に加えた。プレートを室温にて１時間インキュベートし、ＰＢＳで５回洗浄し、１００μｌのＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶液（ＢＣＩＰ／ＮＢＴタブレット、ＳＩＧＭＡ、Ｂ５６５５；０．４５μＭ濾過）を各ウェルに分配した。明瞭なスポットが陽性ウェルに認められるまで（約５〜１０分後）、プレートを暗所で室温にてインキュベートした。プレートを空にし、水道水で徹底的に洗浄することにより、発色を停止させた。乾燥するまで（少なくとも１時間）、プレートを蓋なしの暗所に室温で放置した。
【０１７９】
データ収集
スポットをＥＬＩＳｐｏｔリーダー（ＣＴＬ  Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔリーダー、Ｓ５ＵＶ）で数えた。ＥＬＩＳｐｏｔリーダーにより示された数が、像の現実と一致していることを保証するために、品質管理を各ウェルに対して行った。結果は、１×１０６個の脾臓リンパ球あたりのスポット形成単位（ｓｆｕ）の平均数として、４回の各試験に対して示した。陽性は、Ｍｏｏｄｉｅら(2006, J. Immunol Methods 315: 121-32)およびＭｏｏｄｉｅら(2010, Cancer Immunol Immunother doi 10.1007/s00262-010-0875-4)に記載の通りに決定した。
【０１８０】
実施例１：マルチペプチド構築物による免疫化
ベクターの構築および生産
図１に例示されるように、融合ポリペプチドの最適なプロセシングおよびエピトープ提示のために、１０アミノ酸ＧＳリンカーにより互いに分離された種々の抗原に由来する５個のペプチドの融合体の発現のために、２個のＭＶＡ構築物、ＭＶＡＴＧ１９０２２およびＭＶＡＴＧ１９０２３を作製した。各ペプチドは２７ｍｅｒであり、検証済みのＣ５７ｂｌ／６  Ｔ細胞エピトープを含んでなる。ペンタトープ(pentatope)をコードする配列は、ｐ１１ｋ７．５プロモーター（配列番号８）およびＭＶＡゲノムの欠失ＩＩＩに挿入されたカセットの制御下に置かれる。より具体的には、ペンタトープ(pentatope)融合体は、５’〜３’にかけて、ＦＣＵ１由来ペプチド（配列番号１）、ｂ−Ｇａｌ由来ペプチド（配列番号２）、ＨＰＶ−１６  Ｅ１由来ペプチド（配列番号３）、ＨＰＶ−１６  Ｅ７由来ペプチド（配列番号４）およびＭＵＣ１由来ペプチド（配列番号５）を含んでなり、ＦＣＵ１ペプチドの前、ペプチドの間、およびＭＵＣ１ペプチドの後に、１０ｍｅｒのＧＳリンカーを有する。発現の評価を促進するために、Ｆｌａｇタグ（配列番号６）がＣ末端に存在する。さらに、ＭＶＡＴＧ１９０２３は、そのＮ末端におけるシグナルペプチドの存在により、ＭＶＡＴＧ１９０２２と区別される。例示的目的のために、ペンタトープ（ｐｅｎｔａｔｏｐｅ）融合体は、ＭＶＡＴＧ１９０２２に対しては配列番号７で示される、また、ＭＶＡＴＧ１９０２３（シグナルペプチドを有する）に対しては配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含んでなる。
【０１８１】
ペプチドの発現の評価
ペプチド融合体の発現は、発現カセットに含まれるタグＦｌａｇペプチドに対する抗体を用いて、各ベクターに感染させたＣＥＦにおいて、ウエスタンブロットにより評価した。簡単に述べれば、ＣＥＦは、ＭＶＡＴＧ１９０２２もしくはＭＶＡＴＧ１９０２３または空（すなわち、非組換え）ＭＶＡ（陰性対照としてのＴＧＮ３３．１）に０．２のＭＯＩで感染させたまたは感染させなかった（偽対照）。細胞を２４時間後に回収し、細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。発現産物の免疫検出は、抗Ｆｌａｇ抗体で検出した。結果は、ＭＶＡＴＧ１９０２２（１９．７ｋＤａ）およびＭＶＡＴＧ１９０２３（２２．２ｋＤａ）により標的とされるペンタトープ(pentatope)融合体に関して予想されるサイズに対応するバンドが検出されたことを示す。予想されたように、空ＭＶＡに感染した細胞または偽緩衝液から得た細胞ライセート中には、バンドは検出されなかった。
【０１８２】
さらに、ＭＶＡＴＧ１９０２２に感染した細胞において検出されたものと比較して、ＭＶＡＴＧ１９０２３で得られたバンドの方が強かったことにより証明されたように、カセットがペプチドシグナルを備えている場合、より高い発現レベルが認められた。
【０１８３】
免疫原性の評価
これら２個のペンタトープ(pentatope)を発現するベクターがＴ細胞応答を生じる能力を、ＥＬＩｓｐｏｔ  ＩＦＮγによりＣ５７ｂｌ／６マウスにおいて試験し、全長抗原、それぞれＭＶＡＴＧ９９３１（ＭＵＣ−１）、ＭＶＡＴＧ１５６３７（ＦＣＵ−１）、ＭＶＡＴＧ１８１２４（β−ガラクトシダーゼ）、ＭＶＡＴＧ８０４２（ＨＰＶ−１６  Ｅ７）およびＭＶＡＴＧ１７４０９（ＨＰＶ−１６  Ｅ１）をコードするＭＶＡベクターにより生じる応答と比較した。
【０１８４】
より具体的には、ＭＶＡＴＧ９９３１（その臨床名ＴＧ４０１０）は、ＭＵＣ１腫瘍関連抗原およびヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）をコードする組換えＭＶＡである。ＴＧ４０１０は、進行性転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）における第一選択標準治療化学療法との併用で、２件の異なる無作為化対照第２ｂ相臨床試験において有効性を示した(Quoix et al., 2011, The Lancet Oncol 12(12): 1125-33)。ＭＶＡＴＧ１５６３７は、プロドラッグのフルオロシトシン（５−ＦＣ）をそれぞれ細胞傷害性５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）および５−フルオロウリジン−５′−一リン酸（５−ＦＵＭＰ）に変換する酵母ＣＤａｓｅおよびＵＰＲＴａｓｅ酵素を発現する、酵母由来ＦＣＵ１をコードする組換えＭＶＡである(Husseini et al., 2017, Ann Oncol 28(1): 169-74)。ＭＶＡＴＧ１８１２４は、ポックスウイルスプロモーターｐＨ５Ｒの制御下にあるβ−ガラクトシダーゼ抗原をコードする細菌ＬａｃＺ遺伝子を含有する。ＭＶＡＴＧ８０４２（その臨床名ＴＧ４００１）は、突然変異不活性化ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）１６  Ｅ６およびＥ７腫瘍性タンパク質ならびにヒトインターロイキン−２をコードする（ＷＯ９９／０３８８５）。ＭＶＡＴＧ１７４０９は、天然ポリペプチドの複製機能を消失するように改変されたＨＰＶ−１６  Ｅ１抗原をコードする（ＷＯ２００８／０９２８５４）。
【０１８５】
簡単に述べれば、１群あたり５匹のＣ５７ｂｌ／６マウスに対し、対応するＭＶＡを１週間間隔（０日目および７日目）で２回皮下注射した。各注射につき、２，５×１０７ｐｆｕのＭＶＡ（以下の緩衝液：トリス１０ｍＭ［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／ＨＣｌ］、サッカロース５％（Ｗ／Ｖ）、グルタミン酸ナトリウム１０ｍＭ、塩化ナトリウム５０ｍＭ、ｐＨ８中１００μＬ）を動物の側腹部に投与した。最後の注射から１週間後（１４日目）、全てのマウスを頸椎脱臼により屠殺した。脾臓をリンパ球単離のために回収し、ＩＦＮγ産生Ｔ細胞を材料と方法に記載の通りにＥｌｉｓｐｏｔ（サイトカイン特異的酵素結合免疫スポット）アッセイにより定量化した。各発現抗原／ペプチドに対して特異的な以下のペプチドを用いて、刺激を行った。
Ｉ８Ｌ（ＨＰＶ１６  Ｅ１）：ＩＡＹＫＹＡＱＬ（配列番号５０）
Ｉ８Ｖ（ｂ−ガラクトシダーゼ）： ＩＣＰＭＹＡＲＶ（配列番号５１）
Ｒ９Ｆ（Ｅ７  ＨＰＶ１６）： ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号５２）
Ｌ１５Ｌ−３（ＭＵＣ１）：ＬＳＹＴＮＰＡＶＡＡＴＳＡＮＬ（配列番号５３）、および
ＥＧ−１５（ＦＣＵ−１）：ＥＫＹＨＡＡＦＰＥＶＲＩＶＴＧ（配列番号５４）
ならびに対照として：
Ｔ８Ｖ（ＭＶＡに対して特異的）：ＴＳＹＫＦＥＳＶ（陽性対照）（配列番号５５）
Ｋ９ｉ−３（ＲＭＡ、無関係）：ＫＮＧＥＮＡＱＡＩ（配列番号５６）
Ｇ１５Ｈ（ＰｙＭＴ、無関係）：ＧＩＣＬＭＬＦＩＬＩＫＲＳＲＨ（配列番号５７）
【０１８６】
図２Ａ〜Ｅに例示されるように、ＭＶＡＴＧ１９０２２およびＭＶＡＴＧ１９０２３により発現された５個のエピトープのうち４個に関して、強い細胞応答が検出された（技術的バックグラウンドの問題がＭＵＣ−１応答の解釈を妨げている）。抗Ｅ１応答を除き、ＭＶＡＴＧ１９０２３は、ＭＶＡＴＧ１９０２２よりも良好な応答を示す傾向にある。小胞体に対するペプチド融合体のアドレッシングは、細胞プロテアソームによる分解から発現融合体を保護し、ＤＣなどの専門抗原提示細胞により貪食される感染細胞におけるその蓄積を促進する可能性が高いと予想することができる。
【０１８７】
重要なことに、ＭＶＡＴＧ１９０２３による免疫化後に誘導されたＩＦＮγ応答は、全長抗原によりもたらされるものと匹敵するレベルにあり、さらには抗Ｅ７応答に関して優れている（図２Ｃ）。従って、ＭＶＡバックボーンにおけるペプチドの近位は、これらの応答を短縮する免疫優性現象を観察することなく、多様な免疫応答の発生を可能にする。
【０１８８】
実施例２：ＣＴ２６ネオペプチド構築物による免疫化
ＣＴ２６ネオペプチド(neoepeptide)の選択
ＭＨＣクラスＩ結合に関する低スコア、ＣＤ８＋  Ｔ細胞エピトープの存在(Kreiter et al., 2015, Nature 520 (7549): 692-6)およびそれぞれのＣＴ２６腫瘍細胞株のゲノムにおける単一残基突然変異の存在など、当技術分野に記載の種々の基準に基づき、ＭＶＡ構築物（アミノ酸配列は配列番号２２〜３１において示される）における発現のためにＣＴ２６変異ネオペプチドを選択した。各ネオペプチドは、中心の位置（位置１４）で突然変異を含んでなる２７ｍｅｒであり、最適なプロセシングおよびエピトープ提示のために１０アミノ酸ＧＳリンカーにより以下から分離されている。
【０１８９】
ベクターの構築および生産
２個のＭＶＡ構築物、それぞれＭＶＡＴＧ１９０３０およびＭＶＡＴＧ１９０３８を、２個の融合体（ペンタトープ(pentatope)）に配置された上記のＣＴ２６ネオペプチドの発現のために作製した。第１のペンタトープ(pentatope)融合体は、ｐ１１Ｋ７．５プロモーター（配列番号８）の転写制御下に置かれ、第２はｐＨ５Ｒ制御（配列番号１４）下に置かれる。Ｆｌａｇタグ（配列番号６）が、第１のペンタトープ(pentatope)融合体のＣ末端に存在し、ｃ−ＭＹＣタグ（配列番号１１）が、第２の融合体の末端に存在する。ＭＶＡＴＧ１９０３８は、第１のペンタトープ(pentatope)融合体のＮ末端における狂犬病糖タンパク質（配列番号９）および第２のペンタトープ(pentatope)融合体のＮ末端における麻疹Ｆ糖タンパク質（配列番号１５）に由来するシグナルペプチドの存在により、ＭＶＡＴＧ１９０３０と区別される。２個のネオペプチド融合体カセットをＭＶＡゲノムの欠失ＩＩＩに挿入した。ＭＶＡＴＧ１９０３０では、第１および第２のペンタトープ(pentatope)融合体は、それぞれ、配列番号１２および配列番号１３に示される（図３にも例示される）アミノ酸配列を含んでなり、一方、ＭＶＡＴＧ１９０３８は、配列番号１６および配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含んでなる。
【０１９０】
ＣＴ２６ネオペプチドの発現の評価
ＣＴ２６ネオペプチド融合体の発現を、ＭＶＡＴＧ１９０３０およびＭＶＡＴＧ１９０３８に感染させたＣＥＦにおいて、ウエスタンブロットにより評価した。簡単に述べれば、ＣＥＦは、ＭＶＡＴＧ１９０３０もしくはＭＶＡＴＧ１９０３８または空（すなわち、非組換え）ＭＶＡ（陰性対照としてのＴＧＮ３３．１）に０．２のＭＯＩで感染させたまたは感染させなかった（偽対照）。細胞を２４時間後に回収し、細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。発現カセットに含まれるＦｌａｇおよびｃ−ＭＹＣタグに対する抗体を用いて、発現産物の免疫検出を検出した。非特異的バンドが抗ＭＹＣ抗体で強調されたが、陰性対照にも存在した。バックグラウンドが何であれ、ＭＶＡＴＧ１９０３０（両ペンタトープ(pentatope)とも２０．６ｋＤａ）およびＭＶＡＴＧ１９０３８（第１のペンタトープ(pentatope)は２３．１ｋＤａ、第２のペンタトープ(pentatope)は２３．５ｋＤａ）により標的とされるネオペプチド融合体に関して予想されるサイズに対応する両方の抗体で、ペンタトープ(pentatope)が検出された。予想されたように、空ＭＶＡに感染した細胞または偽緩衝液から得た細胞ライセート中には、特異的なバンドは検出されなかった（前述のように、抗ｃＭＹＣで処理したサンプル中には、バックグラウンドバンドが存在したが）。
【０１９１】
従って、本試験は、感染細胞における２個のネオペプチド融合体の発現を確認している。実施例１と同様に、ペプチドシグナルの存在は、発現に正の影響を及ぼし、また、ＭＶＡＴＧ１９０３０に感染した細胞において検出されたものと比較して、ＭＶＡＴＧ１９０３８で得られたバンドの方が強かったことにより証明されたように、ペプチドシグナルを備えたネオペプチド融合体には、より高いレベルが認められた。
【０１９２】
免疫原性の評価
ＭＶＡＴＧ１９０３０およびＭＶＡＴＧ１９０３８が、コードされたＣＴ２６ネオペプチドに対するＴ細胞応答を生じる能力を、Ｂａｌｂ／ｃマウスのＣＴ２６腫瘍モデルにおいてＥＬＩｓｐｏｔ  ＩＦＮγにより試験した。１群あたり５匹の動物を処置した。半分のＢａｌｂ／ｃマウスに対し、０日目に腫瘍ＣＴ−２６ＭＵＣ１細胞（１００μｌ中２×１０５個）を尾静脈に静脈内注射し（第１〜５群）、一方、残りの半分の動物（第６〜１１群）は未処置のままとした。１００μＬの前述のウイルス処方緩衝液中１×１０７ｐｆｕで、ＭＶＡ注射を静脈内経路により２および９日目に行った。マウスは、最後のＭＶＡ免疫化の１週後（１６日目）に屠殺した。脾臓をリンパ球単離のために回収し、材料と方法で定義された通りに処理した。変異ＣＴ２６ネオペプチド（配列番号２２〜３１）もしくはそれらの非変異ホモログ（配列番号３２〜４１に記載の野生型ペプチド）のいずれか、または変異（配列番号４２〜４５に記載）もしくは野生型（配列番号４６〜４９）のいずれかのＣＤ８＋  ＣＴ２６ペプチドを用いて、刺激を行った。野生型ＣＴ２６ペプチドは、扱うサンプル数を減らすためにプールし、一方、変異ＣＴ２６ペプチドは、個々にまたはペプチドプールにおいてのいずれかで使用した。
【０１９３】
図４に例示されるように、ＭＶＡＴＧ１９０３０およびＭＶＡＴＧ１９０３８ベクターによる免疫化後、ならびに１０個の変異ＣＴ２６ペプチドを集めたプールによる刺激後、注射したベクターおよび（ＣＴ２６−ＭＵＣ１細胞でプライミングしたまたはしなかった）動物モデルを問わず、高いＩＦＮγ応答が生じた。対照的に、１０個の野生型ＣＴ２６ペプチドのプールによる刺激は、いずれのＩＦＮγ産生も生じず、培地陰性対照でも同様である。
【０１９４】
図５は、両方ともＣＴ２６−ＭＵＣ１細胞でプライミングしたまたはしなかったマウスモデルにおける、ＭＶＡＴＧ１９０３０およびＭＶＡＴＧ１９０３８による免疫化後に変異ペプチドの１つ（ＥＨ２７ｍ；配列番号３０）に対して生じたＩＦＮγ応答を例示する。両方の場合（プライミング有り無し）において、３０〜６０スポットの範囲をとる応答が生じるが、対照的に、野生型ペプチド（ＰＥ２７ＷＴ配列番号３７）による刺激は、いずれのＩＦＮγ産生も生じない（５スポット未満）。シグナルペプチドを備えたＭＶＡベクター（ＭＶＡＴＧ１９０３８）により生じた応答は、融合体がいずれのシグナルペプチドも組み込んでいないＭＶＡＴＧ１９０３０で得られたものよりも、わずかに高いことに留意すべきである。ここでもまた、培地陰性対照では応答（５スポット未満）は検出されない。
【０１９５】
さらに、変異ペプチド（ＥＨ２７ｍ）に対する応答は、図６に示されるように、抗マウスＭＨＣＩＩ抗体による遮断後に阻害され、このことは、応答はＣＤ４＋型であることを示し得る。
【０１９６】
結論として、これらの結果は、ヒト抗癌療法のための個別化癌ワクチンの実現可能性を支持している。
【０１９７】
実施例３：ヒトネオペプチド構築物
ネオペプチドの同定および選択
ＮＳＣＬＣに罹患した患者の腫瘍および生殖細胞系サンプルの全エクソームシークエンシング（ＷＥＳ）を、ペアードエンドモード（２×１５０ｂｐ）で行い、腫瘍特異的体細胞突然変異を同定した。情報に関しては、シークエンシング施設が生データをＦＡＳＴＱという標準ファイル形式にした。各シークエンシングランは、ショートリード配列および塩基あたりの品質スコア、すなわちＰｈｒｅｄスコアを提供するＦＡＳＴＱファイルの生成をもたらす。これは、塩基呼び出し工程中の推定誤差確率に基づいている(Cock et al., 2010, Nucl. Acid Res. 38(6): 1767-71)。ペアードエンドシークエンシングでは、２個のＦＡＳＴＱファイルが生成され、各々、ライブラリー断片の末端に対応する。従って、得られたファイルは、品質選別工程中にペアのままでなければならず、すなわち、ペアの２個のリードが、選別を通過しなければならない。この選別工程中に評価される基準は、主に、特に配列の３’末端におけるＰｈｒｅｄスコアに基づくが、これはしばしば、バリアント呼び出し工程に関する正確な情報を維持するためのトリミングを必要とする(Edgar and Flyvbjerg, 2015, Bioinformatics 31(21): 3476-82)。
【０１９８】
次に、ショートリードは、参照ゲノムに対して整列される(Li et al., 2009, Bioinformatics 25(16): 2078-79)。このマッピング工程後、バリアント呼び出しアルゴリズムを使用して、単一ヌクレオチドバリアント（サイレントおよび非サイレントミスセンス突然変異を含むＳＮＶ）または参照ゲノムと患者配列との間の小さな挿入および欠失（インデル）などの様々な構造多様性を検出する(Danecek P. et al., 2011, Bioinformatics 27(15): 2156-58; Nielsen et al., 2011, Nature Reviews Genetics 12(6): 443-51)。腫瘍および対照組織からのサンプルは、腫瘍特異的突然変異を検出するために同時に処理される。
【０１９９】
次に、突然変異をタンパク質レベルで評価し、突然変異の位置に従って、可能な場合は１７ｍｅｒの突然変異が中心に位置するペプチドを設計する。これらの候補ペプチドは、次に、腫瘍トランスクリプトームからのデータを有する発現レベルで評価される(Hundal et al., 2016, Genome Medecine 8(1): 11)。腫瘍トランスクリプトームは、ネオ抗原の発現を評価するために、ペアードエンドモード（２×１５０ｂｐ）でＲＮＡ−Ｓｅｑにより測定した。ＲＮＡ−Ｓｅｑの感度のために、３倍超のリードカバレッジ深度が達成された場合、遺伝子は発現したとみなした。定量化工程は、マッピング後に、１００万あたりのマップされたリードの総数で、ライブラリーサイズにより調整された特定の転写物にマップされたリードの数を数えることにより、開始される(Wang et al., 2009, Nature Reviews Genetics 10(1): 57-63)。
【０２００】
従って、１以上の腫瘍特異的突然変異を有する計２０個の転写物（１８個の独特な遺伝子に対応）が同定されている。これに基づき、１８個の腫瘍特異的突然変異が選択されており、１８個のネオペプチドが設計されている。
【０２０１】
この１８個のネオペプチドは、以下の表２に記載の特徴を有する。
【０２０２】
【表２】
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【０２０３】
この１８個の選択されたネオペプチドのうち：
全てが１９〜７６のサイズを有する。
１７／１８（９４％）が、野生型ペプチドの１個のアミノ酸の変化をもたらすミスセンス突然変異に基づいており、１／１８（６％）が、フレームシフト突然変異を有する。
ミスセンスを有する変異ネオペプチドのうち：
それらは、１９〜２９アミノ酸のサイズを有し、
１５／１７（８８％）が、本明細書に定義される中心の突然変異を有し、かつ
１４／１７（８３％）が、２９アミノ酸のサイズおよび中心の突然変異を有する。
【０２０４】
ベクターの構築および生産
情報源としての対応する遺伝子のＵｎｉｐｒｏｔの記載を用いて、膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドの検索を、各ペプチドに対して行っている。いずれのネオペプチドも、それらの各タンパク質における膜貫通またはシグナルペプチドのいずれかの一部であるとは知られていなかった。Ｕｎｉｐｒｏｔを用いて、これらのペプチドに関連する既知の機能を検索した。ペプチドは、既知のドメインの範囲外か、または機能ドメインを形成するためには短すぎるのいずれかであった。７個のネオペプチド（ヘプタトープ(heptatope)）、６個のネオペプチド（ヘキサトープ(hexatope)）および５個のネオペプチド（ペンタトープ(pentatope)）を含有する３個の発現カセットを、以下のルールを用いて設計した：
ネオ抗原Ｎ末端に位置するミスセンス突然変異を含んでなる１９ｍｅｒのネオペプチドＮＰ１は、ヘプタトープ(heptatope)発現カセットのＮ末端に位置させた。
同様に、ネオ抗原Ｃ末端に天然に位置するネオペプチドＮＰ１８は、ペンタトープ(pentatope)をコードする発現カセットのＣ末端に位置させた。
ネオペプチドＮＰ１０は、ジスルフィド結合形成に関与する可能性のために、その最後の３残基を短縮し、いずれのフォールドも避けるためにヘキサトープ(hexatope)カセットの中央に置いた。
最後に、ネオペプチドＮＰ１３は、Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウエアによる潜在的な膜貫通ヘリックスを形成することが予測されたため、ヘキサトープ(hexatope)をコードするカセットの末端に置いた。
【０２０５】
ネオペプチドは、融合ポリペプチドの最適なプロセシングおよびエピトープ提示のために、５アミノ酸スペーサーにより分離された。以下の４個の異なるスペーサー：ＧＳＧＳＧ、ＳＧＳＧＳ、ＧＳＴＳＧおよびＳＧＴＧＳを使用した。異なるリンカー間のヌクレオチド同一性のパーセンテージを減少させて、この構築に用いた１７個のリンカー間の相同組換えのリスクを低減するために、アミノ酸配列およびコドン配列を変えた。ポリペプチドをＲＥに向かわせるために、シグナルペプチドをネオペプチドの各融合体のＮ末端に融合させた。狂犬病糖タンパク質から得たシグナルペプチドを、ヘプタトープ(heptatope)およびペンタトープ(pentatope)のＮ末端に付加し、一方、麻疹Ｆ糖タンパク質に由来するシグナルペプチドを、ヘキサトープ(hexatope)のＮ末端に付加した。
【０２０６】
これら３個のカセットの発現を検出するために、ウイルス由来のタグ（すなわち、ヘプタトープ(heptatope)、ヘキサトープ(hexatope)およびペンタトープ(pentatope)に対してそれぞれＨＡ（配列番号１８）、ＨＳＶ（配列番号１９）およびＶＳＶ（配列番号２０）タグ）を各構築物のＣ末端に付加した。
【０２０７】
３個のネオペプチド融合体カセットをＭＶＡゲノムの欠失ＩＩＩに挿入し、ＭＶＡＴＧ１９１１１を得た。より具体的には、第１のカセットは、２５５残基のヘプタトープ(heptatope)融合体をコードし、第２のカセットは、２３９残基のヘキサトープ(hexatope)融合体をコードし、第３のカセットは、２４３残基のペンタトープ(pentatope)融合体をコードした。ＭＶＡＴＧ１９１１１は、材料と方法に記載の方法に従って、ＣＥＦにおける相同組換えにより生産した。この最適化プロトコールは、組換えＭＶＡをわずか３週間で作製し、さらに１週間で精製バルクを生産することを可能にした。
【０２０８】
発現の評価
患者のネオペプチド融合体の発現を、ＭＶＡＴＧ１９１１１に感染させたＣＥＦにおいて、ウエスタンブロットにより評価した。簡単に述べれば、ＣＥＦは、ＭＶＡＴＧ１９１１１または空（すなわち、非組換え）ＭＶＡ（陰性対照としてのＴＧＮ３３．１）に０．２のＭＯＩで感染させたまたは感染させなかった（偽対照）。細胞を２４時間後に回収し、細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。発現カセットに含まれるＨＡ、ＨＳＶおよびＶＳＶタグに対する抗体を用いて、発現産物の免疫検出を検出した。結果は、ＭＶＡＴＧ１９１１１により標的とされる各ネオペプチド融合体に対して、特異的なバンドが検出されたことを示す。バンドの見かけのサイズは、各融合体に対して予想されたサイズよりわずかに高かった、すなわち、ヘプタトープ(heptatope)（予想サイズ：２８．２ｋＤａ）に対しては約３８ｋＤａ、ヘキサトープ(hexatope)（予想サイズ：２５．５ｋＤａ）に対しては約３０ｋＤａおよびペンタトープ(pentatope)（予想サイズ：２５．９ｋＤａ）に対しては約３６ｋＤａであった。この差は、翻訳後修飾に起因する可能性があった。予想されたように、空ＭＶＡに感染した細胞または偽緩衝液から得た細胞ライセート中には、特異的なバンドは検出されなかった。
【０２０９】
免疫原性の評価
設計により、ＭＶＡＴＧ１９１１１は、腫瘍特異的突然変異に由来するヒト抗原を標的とする。このワクチンの免疫原性を評価するために、従って、ヒト化マウスモデルを使用することが必要である。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ２．１トランスジェニックマウス（ＨＨＤ）マウスモデルは、ヒトＨＬＡ  Ａ０２＊０１ハプロタイプに特異的な免疫応答を生じる可能性を提供する(Firat et al. 1999, European Journal of Immunology 29(10): 3112-21)。さらに、マウスＨＬＡ分子の発現はこのマウスにおいて破壊され、マウス特異的免疫応答の発生を防ぐ。ＨＨＤマウスを使用して、ワクチンの免疫原性を評価した。マウスに対し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）２００μｌ中１．１０７ｐｆｕのＭＶＡＴＧ１９１１１ワクチンまたはＭＶＡ  ＴＧＮ３３．１を、１日目および７日目に静脈内注射により投与した。動物を１４日目に屠殺し、脾細胞を回収し、分析まで凍結させた。ＩＦＮ−ｙ産生細胞の数を、ＩＦＮ−ｙ  ＥＬＩＳｐｏｔにより決定した。
【０２１０】
簡単に述べれば、ＭＶＡＴＧ１９１１１または対照ウイルスＭＶＡＴＧＮ３３．１をワクチン接種したマウスの脾臓の単一細胞懸濁液を、異なる刺激条件下で、２００μｌ完全培地中５×１０５個／ウェルにてＥＬＩＳＰＯＴプレートで４８時間培養した。刺激条件には、陽性対照（ＭＶＡペプチドの混合）、陰性対照（５μｇ／ｍｌの無関係のペプチド）、個々のペプチド、またはワクチン（５μｇ／ｍｌの重複２０ｍｅｒペプチド）中に発現した抗原の１つと各々が関連した１８個のペプチドプールの１つ、または非変異ヒトタンパク質に対応する重複ペプチドが含まれた。インキュベーション後、プレートを洗浄し、比色法を用いてＩＦＮ−γ産生細胞を検出し、市販の自動ソフトウエアを用いてスポットを数えた。スポットの数が分析バックグラウンドと統計的に異なっていた場合、免疫応答は陽性であるとみなした。
【０２１１】
ＭＶＡＴＧ１９１１１ワクチンを投与した動物では、１８の条件のうち７つが、陽性の免疫応答をもたらした。より具体的には、４条件は高度に免疫原性であり、全動物において検出可能なＴ細胞応答を誘導したが、他の３条件は、一部の動物においてのみ免疫原性であった。免疫原性の差は、アッセイの感度または免疫表現型の変動性に関連している可能性がある。応答は変異タンパク質に制限されており、ワクチンは非変異タンパク質に対する免疫化を誘発しなかった。対照ウイルスＭＶＡＴＧＮ３３．１を投与した対照動物では、応答は認められなかった。
【０２１２】
さらに、反応するＴ細胞の表現型を特徴付けるために、抗クラスＩＩＭＨＣの存在下で、または以前の記載(Puliaev et al., 2004, J. Immunol. 173(2): 910-9)の通りに抗ＣＤ８枯渇ビーズを用いてＣＤ８細胞を枯渇させた後、高免疫原性ペプチドに対してＥＬＩＳＰＯＴを行った。ＣＤ８枯渇およびＭＨＣＩＩ遮断後の両方において応答が認められ、ＭＶＡＴＧ１９１１１はクラスＩ（ＣＤ８）およびクラスＩＩ（ＣＤ４）媒介応答の両方を誘導できたことが示された。
【０２１３】
生産および治療的使用
生産されたＭＶＡＴＧ１９１１１バルクは、腫瘍を得た患者に投与される前に、−８０または−２０℃で保存されるおよそ１０８ｐｆｕの個々の用量で分配され得る。
【０２１４】
実施例４：ネオエピトープ融合体におけるリンカーの役割
４．１  免疫原性に対するリンカーの影響
リンカーの長さおよび配列を変えることにより、実施例１に記載のＭＶＡＴＧ１９０２３ベクターから開始して、リンカーの影響を最初に試験した。ＭＶＡＴＧ１９０２３は、ＦＣＵ１、β−ガラクトシダーゼ、ＨＰＶ−１６  Ｅ１、ＨＰＶ−１６  Ｅ７およびＭＵＣ１（融合体のＮ末端からＣ末端にかけて）に由来する５個の抗原ペプチドの融合体をコードする。各ペプチドは、２７ｍｅｒの中心に位置する検証済みのＣ５７ｂｌ／６（ｂハプロタイプ）Ｔ細胞エピトープを含んでなる２７ｍｅｒであったが、Ｍｕｃ１は例外で、そのエピトープは抗原の最後の１５のＣ末端残基に対応する（表３参照）。１０残基長（５倍ＧＳ）リンカーが、各ペプチドのＮおよびＣ末端に存在し、同様に、狂犬病シグナルペプチドが融合体のＮ末端に、ＦｌａｇタグがそのＣ末端に存在した。融合体は、ｐ１１ｋ７．５プロモーターの制御下に置き、ＭＶＡの欠失ＩＩＩに挿入した。
【０２１５】
【表３】
2020530437.tif 000004
【０２１６】
ＭＶＡＴＧ１９０２３では、同じ１０残基リンカーが、各エピトープの前後に存在した。生じ得る、および部分的または完全なカセットの欠失に至り得る相同組換え事象を回避するために、遺伝暗号の縮重を利用して、各リンカーのＤＮＡ配列を変性させることが得策である。しかしながら、この配列の変性は、リンカーの数、性質および長さにより制限される。ベクター化されるエピトープの数が多い場合（例えば、１０以上）、遺伝暗号は、５倍ＧＳリンカーによる相同組換えを回避するのに十分なＤＮＡ多様性を生み出すことを可能にしない。従って、より小さなリンカー（ＧＳＧ）を使用する、セリン以外の残基（ＧＡＳまたはＧＴＳ）を使用する、および最終的に全くリンカーを使用しない可能性を検討した。ウイルスは、ＣＥＰで生産した。清澄化後、ウイルスをタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）により精製した。これにより、表４に例示されるＭＶＡＴＧ１９０１５８、ＭＶＡＴＧ１９０１５９およびＭＶＡＴＧ１９０１５７の作製がもたらされる。
【０２１７】
【表４】
2020530437.tif 000005
【０２１８】
これらの３構築物により誘導された免疫原性を、ＥＬＩＳＰＯＴにより評価し、前述と同じ免疫化条件下でＭＶＡＴＧ１９０２３によりもたらされたものと比較した。
【０２１９】
ＥＬＩＳＰＯＴの結果は、免疫応答は、５個中４個のエピトープ（Ｌ１５Ｌ３、Ｉ８Ｌ、Ｉ８ＶおよびＲ９Ｆ）に関して、ＭＶＡＴＧ１９０２３、ＭＶＡＴＧ１９１５８、ＭＶＡＴＧ１９１５９およびＭＶＡＴＧ１９１５７で大まかに類似していたが、ＥＧ１５に対する応答は、１０残基リンカーを含有するＭＶＡＴＧ１９０２３でわずかに高い傾向であったことを示す。
【０２２０】
これらの結果は、発現される種々の抗原ペプチドのＮおよびＣ末端でのリンカーの存在、性質、長さは、このようなペプチドの免疫原性に対して大きな影響を及ぼさないことを示す。
【０２２１】
４．２  組換えポックスウイルスの作製に対するリンカーの影響
（実施例３に記載の）ｐＴＧ１９１１１ベクターの文脈において組換えポックスウイルスを作製する構築物の能力に関して、リンカーの存在または非存在も試験した。ｐＴＧ１９１１１と同じネオペプチド融合体を含んでなるが、いずれのリンカーも含まないさらなるプラスミドを作製し、ｐＴＧ１９２６４を得た。組換えＭＶＡウイルスの獲得を、本明細書に記載のトランスフェクトされたＣＥＦ細胞におけるリンカーなし（ｐＴＧ１９２６４）と５ａａリンカー（ｐＴＧ１９１１１）の構築物との間で比較し、白色プラークは潜在的な組換えＭＶＡの裏付けとなり、赤色プラークは親（非組換え）ウイルスの裏付けとなる。
【０２２２】
表５に示されるように、両構築物とも白色プラークの獲得をもたらしたが、しかしながら、それらの割合は、リンカーを含有するｐＴＧ１９１１１ベクターの方が高かった。
【０２２３】
【表５】
2020530437.tif 000006
【０２２４】
まとめると、これらの結果は、リンカーの存在は、ＣＥＦ細胞において生じる白色プラークの数、従って組換えＭＶＡの作製を負に変えるものの、免疫原性に対する大きな影響は及ぼさないことを示す。従って、ベクター構築物の設計を促進するため、従って、特に、１０を超えるネオペプチドの発現が考えられるが、作製される組換えポックスウイルスの割合を減少させるリスクにある構築物において、有害な相同組換え事象のリスクを低減させるために、必要に応じて、リンカーを省略してもよい。
【０２２５】
実施例５：疎水性分析
５．１  ＴＭセグメントの予測
ペプチド内またはペプチド間ＴＭセグメントの存在を、ｐＴＧ１９２４７プラスミドの文脈において試験した。前述のように、ｐＴＧ１９２４７は、各融合体のＮ末端にシグナル配列を有する、ヒト肺腺癌（試験ＰＲＪＥＢ３１３２）に由来する１０個のネオペプチド（そのアミノ酸配列は配列番号６０、６１および６２に記載される）を各々がコードする３個の発現カセットを有する。構築を促進するため、選択されたネオペプチドの間にリンカーは含めなかった。対応するＭＶＡの作製を、上記に開示した方法に従って、相同組換えによりＣＥＦにおいてアッセイし、白色プラークと赤色プラークの数を数えた。５％未満の白色プラークの低い比が得られ、白色プラークのＰＣＲ分析は、ネオペプチド融合体を有する組換えＭＶＡはないことを明らかにした。
【０２２６】
各ネオペプチド融合体におけるＴＭ配列の予測を、ＴＭＨＭＭ予測アルゴリズムを用いて行った。融合体１においてはＴＭ配列を予測できなかった。しかしながら、２個の潜在的なペプチド間ＴＭセグメントが融合体２において同定され、それはそれぞれ、ネオペプチド１とネオペプチド２の接合部、およびネオペプチド７とネオペプチド８の接合部におけるものであった。他方、３個のペプチド内ＴＭセグメントが融合体３において同定され、より具体的には、ネオペプチド２、４および５の内部であった。
【０２２７】
次に、ｐＴＧ１９２５８と呼ばれる非ＴＭ構築物を作製し、これは、ｐＴＧ１９２４７と同じネオペプチド融合体１と、ネオペプチド１および２ならびにネオペプチド７および８が反転され、これらのペプチド間ＴＭセグメントの抑制を可能にしている、配列番号６３において例示される融合体２（この新規融合体２は、従って、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ネオペプチド２、ネオペプチド１、ネオペプチド３、ネオペプチド４、ネオペプチド６、ネオペプチド８、ネオペプチド７、ネオペプチド９およびネオペプチド１０を含んでなる）と、ネオペプチド２、４および５が排除された配列番号６４において例示される融合体３とを含んでなる。さらに、ｐＴＧ１９２４７における融合体３を駆動するために使用したプロモーターｐ１１Ｋ７．５を、ｐＴＧ１９２５８におけるｐ７．５Ｋプロモーターと置き換えた。ＣＥＦ細胞のトランスフェクション時に、より高いパーセンテージの白色プラークが得られた。しかしながら、２０個の白色プラークを単離および増幅した後、わずか６個の白色プラークのみが残り、ＰＣＲ分析により、全てがｍＣｈｅｒｒｙにおいて変異した親ウイルスに対応する（それらのいずれも組換えウイルスに対応していなかった）ことが明らかとされた。
【０２２８】
疎水性の影響は、各ネオペプチドおよび融合体に対する疎水性およびハイドロパシースコアを決定することにより、さらに検討した。
【０２２９】
５．２  疎水性分析
カイト−ドゥーリトル法を用いて、構築物ＭＶＡＴＧ１９１１１、ｐＴＧ１９２４７およびｐＴＧ１９２５８によりコードされる全てのネオペプチドの疎水性およびハイドロパシースコアを決定するために、疎水性分析を行った。ＭＶＡＴＧ１９１１１によりコードされる３個の融合体に関する結果を、以下の表６に報告する。 
【０２３０】
【表６】
2020530437.tif 000007
【０２３１】
これらの結果は、ＭＶＡＴＧ１９１１１によりコードされる１８個のネオペプチドのうち１７個が、良好な疎水性およびハイドロパシースコア（それぞれ、負の値および０．１未満）を示していることを示す。第２の融合体に含まれるネオペプチド１２のみが、この特定のペプチドの疎水性の性質を反映する正のスコアを示した。しかしながら、融合体２は、その負の疎水性（−７４）およびハイドロパシー（−０．４２）スコアに反映されるように、親水性を維持した。
【０２３２】
同じ予測試験を、ｐＴＧ１９２４７およびｐＴＧ１９２５８によりコードされるネオペプチドおよび融合体に対して行い、スコアをそれぞれ表７および８に報告する。
【０２３３】
【表７】
2020530437.tif 000008
【０２３４】
結果は、正の疎水性（１３３．５）およびハイドロパシー（０．４９４）スコアにより証明されるように、融合体３の高い疎水性の性質を強調している。
【０２３５】
上記のｐＴＧ１９２４７のＴＭ欠失バージョンに対応するｐＴＧ１９２５８の文脈において、同じ検討を行った。融合体１および２の疎水性およびハイドロパシースコアは、表７に報告されたものと同じである（両ベクターが有する同じ融合体、ならびに、ペプチド間ＴＭセグメントを排除するためにｐＴＧ１９２５８におけるネオペプチド１および２ならびに７および８の順序が反転した同じネオペプチドを含んでなる融合体２）。表８は、ｐＴＧ１９２５８の融合体３に関する疎水性およびハイドロパシースコアを示す（そのｐＴＧ１９２４７対応物に関して、ＴＭ含有ネオペプチド２、４および５を欠失した７個のネオペプチドの融合体）。
【０２３６】
【表８】
2020530437.tif 000009
【０２３７】
高疎水性およびＴＭ含有ネオペプチド２、４および５の排除にもかかわらず、ｐＴＧ１９２５８融合体３のグローバルスコアは、疎水性の性質になっている。
【０２３８】
従って、さらなる構築物を作製した。それはそれぞれ以下の通りであった。
融合体３を欠失したｐＴＧ１９２５８のバージョン（ｐＴＧ１９２８８という）
３個の融合体に含まれる、第１のネオペプチドのＮ末端において、および各ネオペプチドの間に、３アミノ酸リンカーを含むｐＴＧ１９２５８のバージョン（ｐＴＧ１９２６７）
ｐＴＧ１９２６７における第３の融合体の排除（ｐＴＧ１９２９３）
公開肺腺癌データバンクから選択され、親水性と予測され（負の疎水性スコア）、リンカーを有さない、他の１０個のネオペプチドを含有する別のものとの（ｐＴＧ１９２９０；配列番号６５）、または各ネオペプチドのＮおよびＣ末端における３アミノ酸リンカーとの（ｐＴＧ１９２９１）、ｐＴＧ１９２５８における第３の融合体の置換。
ｐＴＧ１９２９１における融合体１の排除（ｐＴＧ１９２９８）。
【０２３９】
組換えＭＶＡウイルスの獲得は、本明細書に記載のこれらの新規のプラスミド構築物により、トランスフェクトされたＣＥＦ細胞においてアッセイし、親プラスミドｐＴＧ１９２５８と比較した。赤色プラークは親（非組換え）ウイルスと相関し、一方、白色プラークは、潜在的な組換えＭＶＡの指標である。しかし、非組換え（すなわち、親）と組換えウイルス（ｍＣｈｅｒｒｙ陰性またはｍＣｈｅｒｒｙ陽性、後者は親による組換えプラークの汚染を反映する）とを区別するために、白色および赤色プラークのパネルに対してさらなるＰＣＲ分析が必要である。結果を図８に要約する。
【０２４０】
図８に示されるように、ｐＴＧ１９２５８は、いずれの組換えＭＶＡウイルスの作製ももたらさなかった。白色プラークが生じたものの、融合体を有するウイルスはＰＣＲ分析により検出できなかったが、この構築物においてＴＭセグメントは同定できなかった（しかしながら、融合体３は、その疎水性の性質を反映する正のスコアを示した）。白色プラークは、ｍＣｈｅｒｒｙマーカー遺伝子において変異した親ウイルスに起因していた。
【０２４１】
各融合体カセットにおけるネオペプチド間のリンカーの付加は、融合体３の疎水性の特徴を低減することを可能とした（ハイドロパシースコアは、０．１５１〜０．０８の０．１未満の値まで減少した）。この改変は、ＣＥＦ細胞において生じた高いパーセンテージの白色プラーク（１３．３％）をもたらし、７個の組換えウイルスが得られたことがＰＣＲ分析により確認された。
【０２４２】
ｐＴＧ１９２５８における疎水性融合体３を、１０個の親水性ネオペプチド（ハイドロパシースコア−０．５２）からなる別のものと置き換えることも、組換えＭＶＡウイルスの作製に有益であり、これは、ネオペプチド融合体におけるリンカーの存在（ｐＴＧ１９２９１）または非存在（ｐＴＧ１９２９０）を問わず、それぞれ７および６個の組換えウイルスが作製された。
【０２４３】
各々疎水性に関して負のスコアを示す１０個のネオペプチドのうち２個の融合体のみを残すような融合体の排除は、白色プラークのパーセンテージを１６％まで高め、組換えウイルスの回収を増加させた（１０および１１個の組換え体がＰＣＲにより同定された）。
【０２４４】
まとめると、これらの結果は、以下に要約されるように、ネオペプチド融合体の最適な設計を指摘する：
潜在的なＴＭセグメント（ペプチド内またはペプチド間）の排除；
ある程度親水性のネオペプチド（疎水性に関して負のスコア）の選択、または疎水性のネオペプチド（疎水性に関して負のスコア）の数を、例えば４０％未満に減少させる；
融合体におけるネオペプチドの配置；
各融合体のＮ末端におけるシグナルペプチドの存在が推奨される
ネオペプチド間および第１のネオペプチドのＮ末端における３アミノ酸リンカーの存在（例えば、図７に例示されるように、ＧＴＳ、ＧＳＧまたはＧＡＳ）
６〜１０個のネオペプチドの１〜３個の融合体のウイルスゲノムへの組み込み。
【０２４５】
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【図１】
2020530437.tif 000010
【図２Ａ−２Ｃ】
2020530437.tif 000011
【図２Ｄ−２Ｅ】
2020530437.tif 000012
【図３】
2020530437.tif 000013
【図４】
2020530437.tif 000014
【図５】
2020530437.tif 000015
【図６】
2020530437.tif 000016
【図７】
2020530437.tif 000017
【図８】
2020530437.tif 000018
【配列表】
2020530437000001.xml
【国際調査報告】
2020530437.tif 000048
2020530437.tif 000049
2020530437.tif 000050
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2020530437.tif 000052
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