(57)【要約】経路上および／または経路から外れた遺伝子発現を制御する、すなわち、増加させるかまたは減少させるために使用され得る、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍから単離されたポリヌクレオチドを含む天然プロモーターおよびそれらに由来する変異プロモーターが提供される。プロモーター活性が徐々に増加している複数のプロモーターを含むプロモーターラダーもまた提供される。プロモーターを含む宿主細胞および組換えベクター、ならびに宿主細胞を使用して、目的の補助遺伝子を発現させ、生体分子を産生する方法もまた提供される。
2020524492.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの異種の補助標的遺伝子に機能的に連結している配列番号１〜８からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
【請求項２】
ａ．少なくとも１つの第１の異種の標的遺伝子に機能的に連結している第１のプロモーターポリヌクレオチド配列であって、前記少なくとも１つの第１の異種の標的遺伝子が、標的生体分子を産生するための生合成経路の構成成分であり、前記標的生体分子がアミノ酸、有機酸、タンパク質、およびポリマーからなる群から選択される、第１のプロモーターポリヌクレオチド配列；ならびに
ｂ．少なくとも１つの第２の異種の標的遺伝子に機能的に連結している配列番号１〜８からなる群から選択される第２のプロモーターポリヌクレオチド配列であって、前記少なくとも１つの第２の異種の標的遺伝子が補助標的遺伝子である、第２のプロモーターポリヌクレオチド配列
を含む、宿主細胞。
【請求項３】
前記第２のプロモーターポリヌクレオチド配列が配列番号１、５、および７からなる群から選択される、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項４】
前記補助標的遺伝子が、ＧＯｓｌｉｍターム  ＧＯ：０００３６７４；ＧＯ：０００３６７７；ＧＯ：０００８１５０；ＧＯ：００３４６４１；またはＧＯ：０００９０５８の下に分類される遺伝子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項５】
前記補助標的遺伝子が、以下のＧＯｓｌｉｍターム：ＧＯ：０００３６７４；ＧＯ：０００３６７７；ＧＯ：０００８１５０；ＧＯ：００３４６４１；およびＧＯ：０００９０５８の下に、またはそれらのうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、もしくは５つの下に分類される遺伝子である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
単離されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記補助標的遺伝子が、以下のＫＥＧＧエントリー：Ｍ０００１６；Ｍ００５２５；Ｍ００５２６；Ｍ００５２７；Ｍ０００３０；Ｍ００４３３  Ｍ０００３１；Ｍ０００２０；Ｍ０００１８；Ｍ０００２１；Ｍ００３３８；Ｍ００６０９；Ｍ０００１７；Ｍ０００１９；Ｍ００５３５；Ｍ００５７０；Ｍ００４３２；Ｍ０００１５；Ｍ０００２８；Ｍ００７６３；Ｍ０００２６；Ｍ０００２２；Ｍ０００２３；Ｍ０００２４；Ｍ０００２５；およびＭ０００４０の１つもしくは複数、または全部の遺伝子を含む生合成経路の構成成分ではない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記補助標的遺伝子が、前記宿主細胞におけるａｓｄでも、ａｓｋでも、ａｓｐＢでも、ｃｇ０９３１でも、ｄａｐＡでも、ｄａｐＢでも、ｄａｐＤでも、ｄａｐＥでも、ｄａｐＦでも、ｄｄｈでも、ｆｂｐでも、ｈｏｍでも、ｉｃｄでも、ｌｙｓＡでも、ｌｙｓＥでも、ｏｄｘでも、ｐｃｋでも、ｐｇｉでも、ｐｐｃでも、ｐｔｓＧでも、ｐｙｃでも、ｔｋｔでも、ｚｗｆでもなく、それらの内因性機能的オルソログでもない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記補助標的遺伝子が、以下のＫＥＧＧエントリー：Ｍ０００１０、Ｍ００００２、Ｍ００００７、Ｍ００５８０、またはＭ００００５の１つもしくは複数、または全部の遺伝子から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの第１の異種の標的遺伝子が、アミノ酸生合成経路の構成成分である遺伝子である、請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記アミノ酸生合成経路が、
Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）のエントリーＭ０００１６の遺伝子を含むリシン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００５２５の遺伝子を含むリシン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００５２６の遺伝子を含むリシン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００５２７の遺伝子を含むリシン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ０００３０の遺伝子を含むリシン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００４３３の遺伝子を含むリシン生合成経路；および
ＫＥＧＧエントリーＭ０００３１の遺伝子を含むリシン生合成経路
からなる群から選択される、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
前記アミノ酸生合成経路が、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２０の遺伝子を含むセリン生合成経路からなる群から選択される、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記アミノ酸生合成経路が、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１８の遺伝子を含むスレオニン生合成経路からなる群から選択される、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記アミノ酸生合成経路が、
ＫＥＧＧエントリーＭ０００２１の遺伝子を含むシステイン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００３３８の遺伝子を含むシステイン生合成経路；および／または
ＫＥＧＧエントリーＭ００６０９の遺伝子を含むシステイン生合成経路
からなる群から選択される、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記アミノ酸生合成経路が、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１７の遺伝子を含むメチオニン生合成経路からなる群から選択される、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記アミノ酸生合成経路が、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１９の遺伝子を含むバリン／イソロイシン生合成経路からなる群から選択される、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
前記アミノ酸生合成経路が、
ＫＥＧＧエントリーＭ００５３５の遺伝子を含むイソロイシン生合成経路；および／または
ＫＥＧＧエントリーＭ００５７０の遺伝子を含むイソロイシン生合成経路
からなる群から選択される、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
前記アミノ酸生合成経路が、ＫＥＧＧエントリーＭ００４３２の遺伝子を含むロイシン生合成経路からなる群から選択される、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
前記アミノ酸生合成経路が、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１５の遺伝子を含むプロリン生合成経路からなる群から選択される、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
前記アミノ酸生合成経路が、
ＫＥＧＧエントリーＭ０００２８の遺伝子を含むオルニチン生合成経路；および
ＫＥＧＧエントリーＭ００７６３の遺伝子を含むオルニチン生合成経路
からなる群から選択される、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
前記アミノ酸生合成経路が、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２６の遺伝子を含むヒスチジン生合成経路からなる群から選択される、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記アミノ酸生合成経路が、
ＫＥＧＧエントリーＭ０００２２の遺伝子を含むシキミ酸生合成経路；
エントリーＭ０００２３の遺伝子を含むトリプトファン生合成経路；  
ＫＥＧＧエントリーＭ０００２４の遺伝子を含むフェニルアラニン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ０００２５の遺伝子を含むチロシン生合成経路；および
ＫＥＧＧエントリーＭ０００４０の遺伝子を含むチロシン生合成経路
からなる群から選択される、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
配列番号１〜８からなる群から選択される１つまたは複数の追加の第２のプロモーターポリヌクレオチド配列をさらに含み、それぞれの追加の第２のプロモーターポリヌクレオチド配列が、少なくとも１つの追加の第２の異種の標的遺伝子に機能的に連結し、前記少なくとも１つの追加の第２の異種の標的遺伝子が補助標的遺伝子である、請求項２〜２２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの第２の異種の標的遺伝子および前記少なくとも１つの追加の第２の異種の標的遺伝子が、同じ代謝経路の要素である、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの第２の異種の標的遺伝子および前記少なくとも１つの追加の第２の異種の標的遺伝子が、同じ代謝経路の要素ではない、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
配列番号１〜８からなる群から選択される１つまたは複数の追加の第１のプロモーターポリヌクレオチド配列をさらに含み、それぞれの追加の第１のプロモーターポリヌクレオチド配列が、少なくとも１つの追加の第１の異種の標的遺伝子に機能的に連結し、前記少なくとも１つの第１の異種の標的遺伝子および前記少なくとも１つの追加の第１の異種の標的遺伝子が同じ代謝経路内にある、請求項２〜２２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、請求項２７に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
前記補助標的遺伝子が、配列番号１４８〜２８６から選択されるアミノ酸配列をコードする、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
前記補助標的遺伝子が、配列番号９〜１４７から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
標的生体分子を産生する方法であって、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の宿主細胞を、前記生体分子を産生するのに適した条件下で培養するステップを含む、方法。
【請求項３２】
前記生体分子がＬ−アミノ酸である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リシンである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ａ．プロモーター活性のレベルが徐々に増加している複数のプロモーターを含むプロモーターの群から選択される第１のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む第１の宿主細胞であって、前記第１のプロモーターポリヌクレオチドが異種の標的遺伝子に作動可能に連結しており、前記異種の標的遺伝子が、標的生体分子の産生のための経路内の遺伝子、および前記標的生体分子の産生のための前記経路から外れている異種の補助標的遺伝子から選択される、第１の宿主細胞；
ｂ．プロモーター活性のレベルが徐々に増加している前記複数のプロモーターを含む前記プロモーターの群から選択される第２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む第２の宿主細胞であって、前記第２のプロモーターポリヌクレオチドが、異種の補助標的遺伝子に機能的に連結しており、前記第１および第２のプロモーターポリヌクレオチドが異なる、第２の宿主細胞
を含む複数の宿主細胞。
【請求項３５】
前記複数の宿主細胞が少なくとも１×１０６個の細胞を含む、請求項３４に記載の複数の宿主細胞。
【請求項３６】
プロモーター活性のレベルが徐々に増加している前記複数のプロモーターを含む前記プロモーターの群が構成的プロモーターである、請求項３４または３５に記載の複数の宿主細胞。
【請求項３７】
プロモーター活性のレベルが徐々に増加している前記複数のプロモーターを含む前記プロモーターの群が誘導性プロモーターである、請求項３４または３５に記載の複数の宿主細胞。
【請求項３８】
前記第２のプロモーターポリヌクレオチドに作動可能に連結した前記異種の補助標的遺伝子が、シェル３もしくはシェル４の標的遺伝子であり、および／または前記第１のプロモーターポリヌクレオチドがシェル３もしくは４の異種の補助標的遺伝子に作動可能に連結している、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の複数の宿主細胞。
【請求項３９】
前記第１および／または第２のプロモーターポリヌクレオチドに作動可能に連結した前記異種の補助標的遺伝子が、以下のＫＥＧＧエントリー：Ｍ０００１６；Ｍ００５２５；Ｍ００５２６；Ｍ００５２７；Ｍ０００３０；Ｍ００４３３  Ｍ０００３１；Ｍ０００２０；Ｍ０００１８；Ｍ０００２１；Ｍ００３３８；Ｍ００６０９；Ｍ０００１７；Ｍ０００１９；Ｍ００５３５；Ｍ００５７０；Ｍ００４３２；Ｍ０００１５；Ｍ０００２８；Ｍ００７６３；Ｍ０００２６；Ｍ０００２２；Ｍ０００２３；Ｍ０００２４；Ｍ０００２５；およびＭ０００４０の１つもしくは複数、または全部の遺伝子を含む生合成経路の構成成分ではない、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の複数の宿主細胞。
【請求項４０】
前記第１および／または第２のプロモーターポリヌクレオチドに作動可能に連結した前記異種の補助標的遺伝子が、前記宿主細胞におけるａｓｄでも、ａｓｋでも、ａｓｐＢでも、ｃｇ０９３１でも、ｄａｐＡでも、ｄａｐＢでも、ｄａｐＤでも、ｄａｐＥでも、ｄａｐＦでも、ｄｄｈでも、ｆｂｐでも、ｈｏｍでも、ｉｃｄでも、ｌｙｓＡでも、ｌｙｓＥでも、ｏｄｘでも、ｐｃｋでも、ｐｇｉでも、ｐｐｃでも、ｐｔｓＧでも、ｐｙｃでも、ｔｋｔでも、ｚｗｆでもなく、それらの内因性機能的オルソログでもない、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の複数の宿主細胞。
【請求項４１】
前記第１および／または第２のプロモーターポリヌクレオチドに作動可能に連結した前記異種の補助標的遺伝子が、以下のＫＥＧＧエントリー：Ｍ０００１０、Ｍ００００２、Ｍ００００７、Ｍ００５８０、またはＭ００００５の１つもしくは複数、または全部の遺伝子から選択される、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の複数の宿主細胞。
【請求項４２】
前記第１および／または第２のプロモーターポリヌクレオチドに作動可能に連結した前記異種の補助標的遺伝子が、ＧＯｓｌｉｍターム  ＧＯ：０００３６７４；ＧＯ：００３６７７；ＧＯ：０００８１５０；ＧＯ：００３４６４１；またはＧＯ：００９０５８の下に分類される遺伝子である、請求項３４〜４１のいずれか一項に記載の複数の宿主細胞。
【請求項４３】
前記第１および／または第２のプロモーターポリヌクレオチドに作動可能に連結した前記異種の補助標的遺伝子が、以下のＧＯｓｌｉｍターム：ＧＯ：０００３６７４；ＧＯ：００３６７７；ＧＯ：０００８１５０；ＧＯ：００３４６４１；ＧＯ：００９０５８の下に、またはそれらの少なくとも２つ、３つ、４つ、もしくは５つの下に分類される遺伝子である、請求項４２に記載の複数の宿主細胞。
【請求項４４】
前記第１のプロモーターポリヌクレオチドが、標的生体分子の産生のための経路上の異種の標的遺伝子、例えば、前記標的生体分子の産生のための生合成経路のシェル１における異種の標的遺伝子に作動可能に連結している、請求項３４〜３７に記載の複数の宿主細胞。
【請求項４５】
前記第１のプロモーターポリヌクレオチドが、異種のシェル２標的遺伝子に作動可能に連結している、請求項３４〜３７に記載の複数の宿主細胞。
【請求項４６】
標的生体分子の産生のための前記経路がアミノ酸生合成経路である、請求項３４〜４５のいずれか一項に記載の複数の宿主細胞。
【請求項４７】
前記アミノ酸生合成経路が、
Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）のエントリーＭ０００１６の遺伝子を含むリシン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００５２５の遺伝子を含むリシン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００５２６の遺伝子を含むリシン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００５２７の遺伝子を含むリシン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ０００３０の遺伝子を含むリシン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００４３３の遺伝子を含むリシン生合成経路；および
ＫＥＧＧエントリーＭ０００３１の遺伝子を含むリシン生合成経路
からなる群から選択される、請求項４６に記載の複数の宿主細胞。
【請求項４８】
前記アミノ酸生合成経路が、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２０の遺伝子を含むセリン生合成経路からなる群から選択される、請求項４６に記載の複数の宿主細胞。
【請求項４９】
前記アミノ酸生合成経路が、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１８の遺伝子を含むスレオニン生合成経路からなる群から選択される、請求項４６に記載の複数の宿主細胞。
【請求項５０】
前記アミノ酸生合成経路が、
ＫＥＧＧエントリーＭ０００２１の遺伝子を含むシステイン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ００３３８の遺伝子を含むシステイン生合成経路；および／またはＫＥＧＧエントリーＭ００６０９の遺伝子を含むシステイン生合成経路
からなる群から選択される、請求項４６に記載の複数の宿主細胞。
【請求項５１】
前記アミノ酸生合成経路が、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１７の遺伝子を含むメチオニン生合成経路からなる群から選択される、請求項４６に記載の複数の宿主細胞。
【請求項５２】
前記アミノ酸生合成経路が、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１９の遺伝子を含むバリン／イソロイシン生合成経路からなる群から選択される、請求項４６に記載の複数の宿主細胞。
【請求項５３】
前記アミノ酸生合成経路が、
ａ．ＫＥＧＧエントリーＭ００５３５の遺伝子を含むイソロイシン生合成経路；および／または
ｂ．ＫＥＧＧエントリーＭ００５７０の遺伝子を含むイソロイシン生合成経路
からなる群から選択される、請求項４６に記載の複数の宿主細胞。
【請求項５４】
前記アミノ酸生合成経路が、ＫＥＧＧエントリーＭ００４３２の遺伝子を含むロイシン生合成経路からなる群から選択される、請求項４６に記載の複数の宿主細胞。
【請求項５５】
前記アミノ酸生合成経路が、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１５の遺伝子を含むプロリン生合成経路からなる群から選択される、請求項４６に記載の複数の宿主細胞。
【請求項５６】
前記アミノ酸生合成経路が、
ａ．ＫＥＧＧエントリーＭ０００２８の遺伝子を含むオルニチン生合成経路；および
ｂ．ＫＥＧＧエントリーＭ００７６３の遺伝子を含むオルニチン生合成経路
からなる群から選択される、請求項４６に記載の複数の宿主細胞。
【請求項５７】
前記アミノ酸生合成経路が、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２６の遺伝子を含むヒスチジン生合成経路からなる群から選択される、請求項４６に記載の複数の宿主細胞。
【請求項５８】
前記アミノ酸生合成経路が、
ＫＥＧＧエントリーＭ０００２２の遺伝子を含むシキミ酸生合成経路；
エントリーＭ０００２３の遺伝子を含むトリプトファン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ０００２４の遺伝子を含むフェニルアラニン生合成経路；
ＫＥＧＧエントリーＭ０００２５の遺伝子を含むチロシン生合成経路；および
ＫＥＧＧエントリーＭ０００４０の遺伝子を含むチロシン生合成経路
からなる群から選択される、請求項４６に記載の複数の宿主細胞。
【請求項５９】
前記第１のプロモーターポリヌクレオチドおよび前記第２のプロモーターポリヌクレオチドが、同じ異種の補助標的遺伝子配列に作動可能に連結している、請求項３４〜５８のいずれか一項に記載の複数の宿主細胞。
【請求項６０】
プロモーター活性のレベルが徐々に増加している前記複数のプロモーターを含む前記プロモーターの群から選択される第３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む第３の宿主細胞をさらに含み、前記第３のプロモーターが、異種の標的遺伝子に機能的に連結しており、前記第１、第２、および第３のプロモーターが異なる、請求項３４〜５９のいずれか一項に記載の複数の宿主細胞。
【請求項６１】
前記第１、第２、および第３のプロモーターが、同じ異種の補助標的遺伝子に作動可能に連結している、請求項６０に記載の複数の宿主細胞。
【請求項６２】
プロモーター活性のレベルが徐々に増加している前記複数のプロモーターを含む前記プロモーターの群から選択される第４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む第４の宿主細胞をさらに含み、前記第４のプロモーターが、異種の標的遺伝子に機能的に連結しており、前記第１、第２、第３、および第４のプロモーターが異なる、請求項６０または６１に記載の複数の宿主細胞。
【請求項６３】
前記第１、第２、第３、および第４のプロモーターが、同じ異種の補助標的遺伝子に作動可能に連結している、請求項６２に記載の複数の宿主細胞。
【請求項６４】
プロモーター活性のレベルが徐々に増加している前記複数のプロモーターを含む前記プロモーターの群から選択される第５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む第５の宿主細胞をさらに含み、前記第５のプロモーターが、異種の標的遺伝子に機能的に連結しており、前記第１、第２、第３、第４、および第５のプロモーターが異なる、請求項６２または６３に記載の複数の宿主細胞。
【請求項６５】
前記第１、第２、第３、第４、および第５のプロモーターが、同じ異種の補助標的遺伝子に作動可能に連結している、請求項６４に記載の複数の宿主細胞。
【請求項６６】
プロモーター活性のレベルが徐々に増加している前記複数のプロモーターを含む前記プロモーターの群から選択される第６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む第６の宿主細胞をさらに含み、前記第６のプロモーターが、異種の標的遺伝子に機能的に連結しており、前記第１、第２、第３、第４、第５、および第６のプロモーターが異なる、請求項６４または６５に記載の複数の宿主細胞。
【請求項６７】
前記第１、第２、第３、第４、第５、第６、および第７のプロモーターが、同じ異種の補助標的遺伝子に作動可能に連結している、請求項６６に記載の複数の宿主細胞。
【請求項６８】
プロモーター活性のレベルが徐々に増加している前記複数のプロモーターを含む前記プロモーターの群から選択される第８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む第８の宿主細胞をさらに含み、前記第８のプロモーターが、異種の標的遺伝子に機能的に連結しており、前記第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、および第８のプロモーターが異なる、請求項６６または６７に記載の複数の宿主細胞。
【請求項６９】
前記第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、および第８のプロモーターが、同じ異種の補助標的遺伝子に作動可能に連結している、請求項６８に記載の複数の宿主細胞。
【請求項７０】
前記宿主細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主細胞である、請求項３４〜７０のいずれか一項に記載の複数の宿主細胞。
【請求項７１】
前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主細胞がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である、請求項７１に記載の複数の宿主細胞。
【請求項７２】
標的分子の産生のための選択された代謝経路に直接的に関与する異種の標的遺伝子に作動可能に連結したプロモーターポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３４〜７１のいずれか一項に記載の複数の宿主細胞。
【請求項７３】
請求項３４〜７２のいずれか一項に記載の複数の宿主細胞を培養するステップを含む方法。
【請求項７４】
少なくとも１つの異種の補助標的遺伝子に機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチドの組合せを含む複数の形質転換宿主細胞であって、前記プロモーターポリヌクレオチドの組合せが、プロモーター活性のレベルが徐々に増加している複数のプロモーターを含む、複数の形質転換宿主細胞。
【請求項７５】
前記プロモーターポリヌクレオチドの組合せが、配列番号１、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択される配列を含む少なくとも１つの第１のプロモーターポリヌクレオチド、ならびに配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、および配列番号８からなる群から選択される配列を含む少なくとも１つの第２のプロモーターポリヌクレオチドを含む、請求項７４に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項７６】
各プロモーターポリヌクレオチドが、異なる異種の標的遺伝子に機能的に連結している、請求項７４または７５に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項７７】
各プロモーターポリヌクレオチドが、同じ異種の補助標的遺伝子に機能的に連結している、請求項７４または７５に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項７８】
請求項７４〜７７のいずれか一項に記載の複数の宿主細胞を培養するステップを含む方法。
【請求項７９】
標的生体分子の産生を増加させるための方法であって、
ａ．複数の宿主細胞を提供するステップであって、前記複数の宿主細胞が、プロモーター活性のレベルが徐々に増加している複数の異種のプロモーターを含み、前記複数の前記プロモーターがそれぞれ、異種の標的遺伝子に作動可能に連結しており、前記複数のプロモーターの少なくとも１つのプロモーターが、異種の補助標的遺伝子に作動可能に連結している、ステップ；
ｂ．前記複数の宿主細胞を、前記標的生体分子を産生するのに適した条件下で培養するステップ；および
ｃ．対照細胞と比較して、標的生体分子の産生の増加を示す宿主細胞を前記複数の宿主細胞から同定するステップ
を含む、方法。
【請求項８０】
前記同定された宿主細胞を、前記複数の他の宿主細胞から単離するステップをさらに含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記単離された宿主細胞を保存するステップを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記単離された宿主細胞を増やすステップを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記複数の宿主細胞が、少なくとも第１および第２の宿主細胞を含み、前記第１および第２の宿主細胞が、プロモーター活性のレベルが徐々に増加している前記複数の異種のプロモーターから選択される異なるプロモーターで形質転換されており、前記異なるプロモーターが、同じ異種の補助標的遺伝子に作動可能に連結している、請求項７９〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記複数の宿主細胞が第３の宿主細胞をさらに含み、前記第１、第２、および第３の宿主細胞がそれぞれ、プロモーター活性のレベルが徐々に増加している前記複数の異種のプロモーターから選択される異なるプロモーターで形質転換されており、前記異なるプロモーターが同じ異種の補助標的遺伝子に作動可能に連結している、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記複数の宿主細胞が第４の宿主細胞をさらに含み、前記第１、第２、第３、および第４の宿主細胞がそれぞれ、プロモーター活性のレベルが徐々に増加している前記複数の異種のプロモーターから選択される異なるプロモーターで形質転換されており、前記異なるプロモーターが同じ異種の補助標的遺伝子に作動可能に連結している、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記複数の宿主細胞が第５の宿主細胞をさらに含み、前記第１、第２、第３、第４、および第５の宿主細胞がそれぞれ、プロモーター活性のレベルが徐々に増加している前記複数の異種のプロモーターから選択される異なるプロモーターで形質転換されており、前記異なるプロモーターが同じ異種の補助標的遺伝子に作動可能に連結している、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記複数の宿主細胞が第６の宿主細胞をさらに含み、前記第１、第２、第３、第４、第５、および第６の宿主細胞がそれぞれ、プロモーター活性のレベルが徐々に増加している前記複数の異種のプロモーターから選択される異なるプロモーターで形質転換されており、前記異なるプロモーターが同じ異種の補助標的遺伝子に作動可能に連結している、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記複数の宿主細胞が第７の宿主細胞をさらに含み、前記第１、第２、第３、第４、第５、第６、および第７の宿主細胞がそれぞれ、プロモーター活性のレベルが徐々に増加している前記複数の異種のプロモーターから選択される異なるプロモーターで形質転換されており、前記異なるプロモーターが同じ異種の補助標的遺伝子に作動可能に連結している、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記複数の宿主細胞が第８の宿主細胞をさらに含み、前記第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、および第８の宿主細胞がそれぞれ、プロモーター活性のレベルが徐々に増加している前記複数の異種のプロモーターから選択される異なるプロモーターで形質転換されており、前記異なるプロモーターが同じ異種の補助標的遺伝子に作動可能に連結している、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記異種の補助標的遺伝子がシェル３および／またはシェル４の標的遺伝子である、請求項７９〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記提供するステップが、前記異種の標的遺伝子に作動可能に連結した、プロモーター活性のレベルが徐々に増加している前記複数のプロモーターを含む組換えベクターライブラリーで複数の宿主細胞を形質転換することを含む、請求項７９〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１７年６月７日に出願された、「PROMOTERS  FROM  CORYNEBACTERIUM  GLUTAMICUM  AND  USES  THEREOF  IN  REGULATING  ANCILLARY  GENE  EXPRESSION」と題する米国仮特許出願第６２／５１６，６０９号のＳｅｃｔｉｏｎ  １１９（ｅ）による優先権の利益を主張し、その開示は、全体として、かつ全ての目的のために参照により本明細書に組み入れられている。
【０００２】
配列表の参照による組み入れ
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、全体として参照により本明細書に組み入れられている配列表を含有する。２０１８年６月５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＺＭＧ−００４＿ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズが６４５，６９５バイトである。
【０００３】
背景
分野
本開示は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍから単離されたポリヌクレオチドを含む天然プロモーターおよびそれらに由来する変異プロモーター、プロモーターを含む宿主細胞および組換えベクター、ならびに宿主細胞を培養するステップを含む、補助標的遺伝子（ancillary  target  gene）の発現を改変し、および生体分子を産生する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
関連技術の説明
工業的に重要な細菌の菌株は、生体分子の産生において重要な役割を果たす。例えば、コリネ型細菌、特にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍは、培養されて、アミノ酸、有機酸、ビタミン、ヌクレオシド、およびヌクレオチドなどの生体分子を産生することができる。産生プロセスを向上させるためにたゆまぬ努力が続けられている。前記プロセスは、例えば、撹拌および酸素供給、または例えば発酵中の糖濃度などの栄養培地の組成、栄養分供給スケジュール、ｐＨバランス、代謝物除去、または例えば、イオン交換クロマトグラフィーによる製品形態への仕上げ、または微生物自体の内因性パフォーマンス特性などの発酵関連手段に関して向上され得る。
【０００５】
パフォーマンス特性には、例えば、収量、力価、生産性、副産物排除、プロセスの一過的逸脱に対する許容度、最適な増殖温度および増殖速度を挙げることができる。微生物株のパフォーマンスを向上させるための一つの方法は、代謝物の産生を調節する遺伝子の発現を増加させることである。遺伝子の発現を増加させることは、その遺伝子によりコードされる酵素の活性を増加させることができる。酵素活性を増加させることは、その酵素が属する経路により生成される代謝産物の合成の速度を増加させることができる。場合によっては、代謝物の産生の速度を増加させることは、他の細胞プロセスを不均衡にさせて、微生物培養物の増殖を阻害し得る。時々、活性を下方制御することが、菌株のパフォーマンスを向上させるのに重要であることがある。例えば、流束の方向を副産物から離すように変えることで、収量を向上させることができる。したがって、代謝経路内で同時の様々な構成成分の発現レベルの微調整が必要である場合が多い。
【０００６】
プロモーターは、遺伝子が転写される速度を制御し、様々な仕方で転写に影響を及ぼし得る。例えば、構成的プロモーターは、内部細胞条件にも外部細胞条件にも無関係に、それらの関連した遺伝子の転写を一定の速度で命令し、一方、制御可能なプロモーターは、内部および／または外部細胞条件、例えば、増殖速度、温度、特定の環境化学物質に対する応答などに応じて、遺伝子が転写される速度を増加または減少させる。プロモーターを、それらの正常な細胞状況から単離することができ、事実上いかなる遺伝子の発現も制御するように操作して、細胞増殖、産物収量、および／または他の目的の表現型の効果的な改変を可能にすることができる。
【０００７】
標的生体分子の産生について、プロモーターは、典型的には、宿主細胞において標的生体分子を生成する生合成経路の構成成分である異種の標的遺伝子に機能的に連結している。例えば、リシンの産生について、リシン生合成経路の構成成分（例えば、Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ  （ＫＥＧＧ）経路Ｍ０００３０において定義されているような）は、異種のプロモーターに機能的に連結することができる。そのような経路上の構成成分の領域は、有限であり、十分探索されており、標的生体分子産生を最適化するために経路上標的遺伝子の発現または活性をモジュレートすることによるさらなる最適化の可能性は限られている。しかしながら、工業的に重要な宿主株において、異種のプロモーターを１つまたは複数の補助標的遺伝子に作動可能に連結し、それにより、そのような標的遺伝子の発現をモジュレートすることにより与えられる、そのような生体分子の生産性および収量への潜在的影響は、ほとんど探索されていない。したがって、発現または活性を増加または減少させて、それにより標的生体分子産生を向上させるようにモジュレートされ得る補助標的遺伝子をスクリーニングし、同定し、使用するための方法および組成物についての必要性が当技術分野において依然としてある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
簡単な概要
本開示は、当技術分野におけるこれらを始めとする必要性に取り組む。簡単に述べれば、本開示は、少なくとも１つの異種の補助標的遺伝子に機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチド配列を含有する宿主細胞であって、前記補助標的遺伝子が標的生体分子を産生するための生合成経路の構成成分ではない、宿主細胞を対象とする。本開示は、標的生体分子の産生を向上させるために異種の補助標的遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターポリヌクレオチドをスクリーニングし、同定し、使用するための方法を提供する。
【０００９】
好ましい実施形態では、プロモーターポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８から選択される配列を含む。一部の実施形態では、プロモーターポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号５、または配列番号７から選択される配列からなる。
【００１０】
一部の実施形態では、補助標的遺伝子は、ＧＯｓｌｉｍターム、ＧＯ：０００３６７４；ＧＯ：０００３６７７；ＧＯ：０００８１５０；ＧＯ：００３４６４１；またはＧＯ：０００９０５８の下に分類される遺伝子である。好ましくは、補助標的遺伝子は、以下のＧＯｓｌｉｍターム、ＧＯ：０００３６７４；ＧＯ：０００３６７７；ＧＯ：０００８１５０；ＧＯ：００３４６４１；もしくはＧＯ：０００９０５８の下に、またはそれらの少なくとも２つ、３つ、４つ、もしくは５つの下に分類される遺伝子である。一部の実施形態では、補助標的遺伝子は、以下のＫＥＧＧエントリー：Ｍ０００１０、Ｍ００００２、Ｍ００００７、Ｍ００５８０、またはＭ００００５の１つもしくは複数、または全部の遺伝子から選択される。
【００１１】
一部の実施形態では、補助標的遺伝子は、以下のＫＥＧＧエントリー：Ｍ０００１６；Ｍ００５２５；Ｍ００５２６；Ｍ００５２７；Ｍ０００３０；Ｍ００４３３  Ｍ０００３１；Ｍ０００２０；Ｍ０００１８；Ｍ０００２１；Ｍ００３３８；Ｍ００６０９；Ｍ０００１７；Ｍ０００１９；Ｍ００５３５；Ｍ００５７０；Ｍ００４３２；Ｍ０００１５；Ｍ０００２８；Ｍ００７６３；Ｍ０００２６；Ｍ０００２２；Ｍ０００２３；Ｍ０００２４；Ｍ０００２５；およびＭ０００４０の１つもしくは複数、または全部の遺伝子を含む生合成経路の構成成分ではない。
【００１２】
一実施形態では、本開示は、少なくとも第１および第２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含有する宿主細胞であって、第１のプロモーターが、第１の異種の標的遺伝子に機能的に連結しており、第１の異種の標的遺伝子が標的生体分子を産生するための生合成経路の構成成分であり、かつ第２のプロモーターが、標的生体分子を産生するための生合成経路の構成成分ではない第２の異種の補助標的遺伝子に機能的に連結している、宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、第１のプロモーターは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍから単離されたポリヌクレオチドを含む天然プロモーターおよび／またはそれに由来する変異プロモーターであり得、それぞれ、短いＤＮＡ配列、理想的には１００塩基対未満によりコードされ得、一方、第２のプロモーターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８から選択される配列を含む。一部の実施形態では、第１および第２のプロモーターの両方が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８から選択される配列を含む。一部の実施形態では、プロモーターポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号５、または配列番号７から選択される配列からなる。
【００１３】
本開示の一実施形態は、本明細書に記載された第１および／または第２のプロモーターポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。本開示の一実施形態は、本明細書に記載された第１のプロモーターポリヌクレオチドおよび／または第２のプロモーターポリヌクレオチドを含む組換えベクターに関する。一部の実施形態では、第１のプロモーターポリヌクレオチドは、第１の経路上標的遺伝子に機能的に連結している。一部の実施形態では、第２のプロモーターポリヌクレオチドは、第１または第２の補助標的遺伝子に機能的に連結している。本開示の一実施形態は、本明細書に記載されたプロモーターポリヌクレオチドの組合せを含む宿主細胞に関する。本開示の一実施形態は、本明細書に記載されたプロモーターポリヌクレオチドの組合せを含む組換えベクターに関する。一部の実施形態では、各プロモーターポリヌクレオチドは、異なる標的遺伝子に機能的に連結している。好ましくは、本明細書でより詳細に記載および実証されているように、標的遺伝子は、同じ代謝経路の要素ではない。一部の実施形態では、第１のセットの標的遺伝子は、同じ代謝経路の要素であり、第２のセットの標的遺伝子は、異なる経路の要素である。本開示の一実施形態は、本明細書に記載された組換えベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【００１４】
本開示の一実施形態は、補助標的遺伝子に機能的に連結した少なくとも１つのプロモーターポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、プロモーターポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８から選択される配列を含み、プロモーターポリヌクレオチドが配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、または配列番号８から選択される配列を含む場合、標的遺伝子がプロモーターポリヌクレオチドの内因性遺伝子以外である、宿主細胞に関する。一部の実施形態では、宿主細胞は、少なくとも２つのプロモーターポリヌクレオチドを含み、各プロモーターポリヌクレオチドが異なる標的遺伝子に機能的に連結している。本開示の一実施形態は、補助標的遺伝子に機能的に連結した少なくとも１つのプロモーターポリヌクレオチドを含む組換えベクターであって、プロモーターポリヌクレオチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８から選択される配列を含み、プロモーターポリヌクレオチドが配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、または配列番号８から選択される配列を含む場合、標的遺伝子がプロモーターポリヌクレオチドの内因性遺伝子以外である、組換えベクターに関する。
【００１５】
一部の実施形態では、組換えベクターは、少なくとも２つのプロモーターポリヌクレオチドを含み、各プロモーターポリヌクレオチドが、異なる標的遺伝子に機能的に連結している。好ましくは、本明細書に、より完全に記載および実証されているように、標的遺伝子は、同じ代謝経路の要素ではない。例えば、１つの標的遺伝子は、標的生体分子の産生のための経路上標的遺伝子であり得、第２の標的遺伝子は補助標的遺伝子であり得る。
【００１６】
本開示の一実施形態は、本明細書に記載された組換えベクターで形質転換された宿主細胞に関する。一部の場合には、形質転換された宿主細胞は、異種の補助標的遺伝子または少なくとも１つの異種の補助標的遺伝子に機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチドの組合せを含み、前記プロモーターポリヌクレオチドの組合せが、プロモーターラダーを含む。個々のプロモーターポリヌクレオチドは、異なる形質転換宿主細胞内にあり得、かつ同じ異種の補助標的遺伝子配列に作動可能に連結し得る。一部の実施形態では、前記プロモーターポリヌクレオチドの組合せは、少なくとも１つの第１のプロモーターポリヌクレオチドおよび少なくとも１つの第２のプロモーターポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第１のプロモーターポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号５、および配列番号７からなる群から選択され、第２のプロモーターポリヌクレオチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、および配列番号８からなる群から選択される。一部の実施形態では、前記第１および第２のプロモーターポリヌクレオチドは、複数の宿主細胞の異なる宿主細胞内にあり、かつ同じ異種の補助標的遺伝子配列に作動可能に連結している。一部の場合には、形質転換宿主細胞は、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、および／または８つの異なるプロモーターポリヌクレオチドのプロモーターラダーを含むプロモーターポリヌクレオチドの組合せを含む。一部の場合には、前記第１、第２、第３、第４、第５、第６、および／または第７のプロモーターポリヌクレオチドは、複数の形質転換宿主細胞の異なる宿主細胞内にあり、かつ同じ異種の補助標的遺伝子配列に作動可能に連結している。
【００１７】
一部の場合には、異種の補助標的遺伝子または少なくとも１つの異種の補助標的遺伝子に機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチドの組合せを含む形質転換宿主細胞であって、前記プロモーターポリヌクレオチドの組合せがプロモーターラダーを含む、形質転換宿主細胞が、経路上のシェル１および／またはシェル２異種の標的遺伝子に作動可能に連結したプロモーターポリヌクレオチドをさらに含む。一部の場合には、形質転換宿主細胞のそれぞれ、形質転換宿主細胞の実質的に全部、または形質転換宿主細胞の大部分が、経路上のシェル１および／またはシェル２の異種の標的遺伝子に作動可能に連結したプロモーターポリヌクレオチドを含む。
【００１８】
本開示の一実施形態は、１つまたは複数の補助標的遺伝子の発現を改変する方法であって、本明細書に記載された宿主細胞を培養するステップを含み、各補助標的遺伝子の改変が上方制御および下方制御から独立して選択される、方法に関する。好ましくは、補助標的遺伝子は、アミノ酸、有機酸、核酸、タンパク質、またはポリマーなどの生体分子の生合成経路の１つまたは複数のポリペプチドまたはタンパク質をコードしない。例えば、一部の実施形態では、補助標的遺伝子は、転写因子、シグナル伝達分子、クエン酸回路の構成成分、または解糖系の構成成分の生合成経路の１つまたは複数のポリペプチドまたはタンパク質をコードし得る。
【００１９】
本開示の別の実施形態は、生体分子を産生する方法であって、生体分子を産生するのに適した条件下で、本明細書に記載された宿主細胞を培養するステップを含む方法に関する。一部の実施形態では、補助標的遺伝子は、アミノ酸、有機酸、香味料および芳香剤、バイオ燃料、タンパク質および酵素、ポリマー／モノマーおよび他のバイオマテリアル、脂質、核酸、小分子治療薬、タンパク質またはペプチド治療薬、ファインケミカル、ならびに栄養補助食品から選択される生体分子の生合成を直接的に、または間接的に増強する。好ましい実施形態では、生体分子はＬ−アミノ酸である。特定の実施形態では、Ｌ−アミノ酸はリシンである。
【００２０】
一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する。一部の実施形態では、宿主細胞はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、アミノ酸Ｌ−リシンの生合成のための遺伝学的および生化学的経路の図を示す。生合成経路において中間体を転用する遺伝子（例えば、ｐｃｋ、ｏｄｘ、ｉｃｄ、およびｈｏｍ）は下線が引かれている。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
詳細な説明
以下の説明において、ある特定の具体的な詳細は、本開示の様々な実施形態の完全な理解を提供するために示されている。しかしながら、当業者は、本開示がこれらの詳細なしに実施され得ることを理解しているだろう。
【００２３】
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、本明細書および特許請求の範囲を通じて、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変形は、オープンの包括的な意味で、すなわち、「含むが、それらに限定されない」と解釈されるべきである。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「組換え核酸分子」は、組換えＤＮＡ分子または組換えＲＮＡ分子を指す。組換え核酸分子は、異なる本源由来で、かつ天然では一緒に付着していない、連結された核酸分子を含有する任意の核酸分子である。組換えＲＮＡ分子は、組換えＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ分子を含む。特に、組換え核酸分子は、異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１〜８のプロモーターを含む核酸分子を含む。
【００２５】
本明細書に使用される場合、用語「異種の標的遺伝子」は、特定のゲノムにおいてそれが作動可能に連結しているプロモーターによってそれの天然状態（例えば、遺伝子改変されていない細胞内）では調節されていない任意の遺伝子またはコード配列を指す。本明細書で提供される場合、天然に存在しないプロモーターに機能的に連結した全ての標的遺伝子は、「異種の標的遺伝子」とみなされる。より具体的には、配列番号１、５、および７のプロモーターポリヌクレオチド配列は天然で存在しないため、全ての機能的に連結した標的遺伝子配列は、「異種の標的遺伝子」配列である。同様に、宿主細胞における全ての、例えば、天然に存在する標的遺伝子であって、宿主細胞において天然に存在するが、野生型生物体において通常、前記標的遺伝子に機能的に連結していないプロモーターに機能的に連結している、標的遺伝子は、「異種の標的遺伝子」である。本明細書で使用される場合、異種の標的遺伝子は、オペロンの一部分である１つまたは複数の標的遺伝子を含むことができる。すなわち、オペロンの内因性プロモーターは、配列番号１〜８の核酸配列を有するプロモーターポリヌクレオチド配列に置き換えられる。本明細書で使用される場合、用語「プロモーターポリヌクレオチド配列」は、関連した配列番号に列挙されているような配列を有する核酸を指す。
【００２６】
「代謝経路」または「生合成経路」は、各反応が遺伝子産物（例えば、酵素）により触媒される、一連の基質から生成物への変換反応であり、１つの変換反応の生成物が、次の変換反応のための基質として働き、原料から標的生体分子への変換反応が挙げられる。一部の実施形態では、代謝経路は、Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ  ＫＥＧＧデータベースに定義されているような経路モジュールである。本明細書で使用される場合、ＫＥＧＧデータベース（その中のマップおよび経路モジュールを含む）への言及は、本出願の優先日に公的に利用可能である場合のそのデータベースを指す。
【００２７】
「経路上」異種の標的遺伝子は、標的生体分子が、それが存在する生物体において産生される代謝経路内にある、遺伝子産物（例えば、酵素、または多酵素複合体の構成成分）をコードする異種の標的遺伝子である。通常、改変の標的とされる遺伝子は、「経路上」にあると判断される遺伝子、すなわち、目的の分子についての生合成経路の要素、またはその生合成経路への分岐、もしくはそれからの分岐であることが公知の代謝酵素の遺伝子である（Keasling,  JD.  「Manufacturing  molecules  through  metabolic  engineering.」  Science、２０１０年）。そのような遺伝子の発見を自動化し得る、流束均衡分析（「ＦＢＡ」）などの方法（Segreら、「Analysis  of  optimality  in  natural  and  perturbed  metabolic  networks.」  PNAS、２００２年）が知られている。
【００２８】
「補助」または「経路から外れた」異種の標的遺伝子、または「標的分子の産生のための生合成経路の構成成分ではない」異種の標的遺伝子などは、標的生体分子が、それが存在する生物体において産生される代謝経路内にある遺伝子産物（例えば、酵素、または多酵素複合体の構成成分）をコードしない異種の標的遺伝子である。
【００２９】
例えば、標的生体分子Ｌ−リシンの産生のための補助なまたは経路から外れた異種の標的遺伝子は、ＫＥＧＧ経路モジュールＭ０００１６、Ｍ０００３０、Ｍ０００３１、Ｍ００４３３、Ｍ００５２５、Ｍ００５２６、もしくはＭ００５２７、または好ましくはそれらの全部において開示されていない遺伝子である。別の例として、標的生体分子セリンの産生のための補助なまたは経路から外れた異種の標的遺伝子は、ＫＥＧＧ経路モジュールＭ０００２０に開示されていない遺伝子である。別の例として、標的生体分子スレオニンの産生のための補助なまたは経路から外れた異種の標的遺伝子は、ＫＥＧＧ経路モジュールＭ０００１８に開示されていない遺伝子である。別の例として、標的生体分子システインの産生のための補助なまたは経路から外れた異種の標的遺伝子は、ＫＥＧＧ経路モジュールＭ０００２１、Ｍ００３３８、もしくはＭ００６０９、または好ましくはそれらの全部において開示されていない遺伝子である。
【００３０】
さらに別の例として、標的生体分子バリンおよび／またはイソロイシンの産生のための補助なまたは経路から外れた異種の標的遺伝子は、ＫＥＧＧ経路モジュールＭ０００１９に開示されていない遺伝子である。さらに別の例として、標的生体分子イソロイシンの産生のための補助な、経路から外れた異種の標的遺伝子は、ＫＥＧＧ経路モジュールＭ００５３５もしくはＭ００５７０、または好ましくはそれらの全部において開示されていない遺伝子である。さらに別の例として、標的生体分子ロイシンの産生のための補助なまたは経路から外れた異種の標的遺伝子は、ＫＥＧＧ経路モジュールＭ００４３２に開示されていない遺伝子である。
【００３１】
さらに別の例として、標的生体分子プロリンの産生のための補助なまたは経路から外れた異種の標的遺伝子は、ＫＥＧＧ経路モジュールＭ０００１５に開示されていない遺伝子である。さらに別の例として、標的生体分子オルニチンの産生のための補助なまたは経路から外れた異種の標的遺伝子は、ＫＥＧＧ経路モジュールＭ０００２８、Ｍ００７６３、または好ましくはそれらの全部において開示されていない遺伝子である。さらに別の例として、標的生体分子ヒスチジンの産生のための補助なまたは経路から外れた異種の標的遺伝子は、ＫＥＧＧ経路モジュールＭ０００２６に開示されていない遺伝子である。
【００３２】
さらに別の例として、トリプトファン、チロシン、およびフェニルアラニンなどの芳香族アミノ酸は、シキミ酸経路を介して産生される。したがって、標的生体分子シキミ酸、またはシキミ酸経路の生合成産物であるアミノ酸（例えば、標的生体分子、トリプトファン、チロシン、またはフェニルアラニンの１つまたは複数）の産生のための補助なまたは経路から外れた異種の標的遺伝子は、ＫＥＧＧ経路モジュールＭ０００２２に開示されていない遺伝子である。さらに別の例として、標的生体分子トリプトファンの産生のための補助なまたは経路から外れた異種の標的遺伝子は、ＫＥＧＧ経路モジュールＭ０００２２に開示されていない遺伝子である。さらに別の例として、標的生体分子フェニルアラニンの産生のための補助なまたは経路から外れた異種の標的遺伝子は、ＫＥＧＧ経路モジュールＭ０００２４に開示されていない遺伝子である。さらに別の例として、標的生体分子チロシンの産生のための補助なまたは経路から外れた異種の標的遺伝子は、ＫＥＧＧ経路モジュールＭ０００２５、Ｍ０００４０、またはそれらの組合せにおいて開示されていない遺伝子である。
【００３３】
さらに別の例として、一部の実施形態では、Ｌ−リシン標的生体分子を産生することの関連において、Ｌ−リシンを産生する生合成経路の構成成分である異種の標的遺伝子は、以下の遺伝子の１つ、またはそれが存在する生物体におけるその内因性機能的オルソログである：ａｓｄ、ａｓｋ、ａｓｐＢ、ｃｇ０９３１、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｄｄｈ、ｆｂｐ、ｈｏｍ、ｉｃｄ、ｌｙｓＡ、ｌｙｓＥ、ｏｄｘ、ｐｃｋ、ｐｇｉ、ｐｐｃ、ｐｔｓＧ、ｐｙｃ、ｔｋｔ、またはｚｗｆ。したがって、Ｌ−リシン標的生体分子を産生することの関連において、補助なまたは経路から外れた異種の標的遺伝子は、以下の遺伝子の１つでも、それが存在する生物体におけるその内因性機能的オルソログでもない遺伝子である：ａｓｄ、ａｓｋ、ａｓｐＢ、ｃｇ０９３１、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｄｄｈ、ｆｂｐ、ｈｏｍ、ｉｃｄ、ｌｙｓＡ、ｌｙｓＥ、ｏｄｘ、ｐｃｋ、ｐｇｉ、ｐｐｃ、ｐｔｓＧ、ｐｙｃ、ｔｋｔ、またはｚｗｆ。
【００３４】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、「シェル」と呼ばれる優先レベルに分けられ、プロモーターポリヌクレオチドは、シェルの１つまたは複数の異種の標的遺伝子に作動可能に連結し、シェルは、標的分子産生に間接的に関与する遺伝子で構成されている。本明細書で使用される場合、「シェル１」遺伝子は、選択された代謝経路に直接的に関与する生合成酵素をコードする遺伝子である。「シェル２」遺伝子は、生成物転用またはフィードバックシグナル伝達を担う生合成経路内のシェル１ではない酵素または他のタンパク質をコードする遺伝子を含む。「シェル３」遺伝子は、生合成経路の発現をモジュレートすること、または宿主細胞内の炭素流束を制御することを担う制御遺伝子を含む。「シェル４」遺伝子は、シェル１〜３のいずれの１つにも割り当てられていない標的生物体の遺伝子である。実施例５は、リシン産生の系統的ゲノムワイドな摂動についてのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおける遺伝子のシェルへの割当を記載する。
【００３５】
一部の場合には、補助異種の標的遺伝子は、標的分子の産生のための「シェル２」、「シェル３」、および／または「シェル４」異種の標的遺伝子である。一部の場合には、補助異種の標的遺伝子は、標的分子の産生のための「シェル３」および／または「シェル４」異種の標的遺伝子である。一部の場合には、補助異種の標的遺伝子は、標的分子の産生のための「シェル３」異種の標的遺伝子である。一部の場合には、補助異種の標的遺伝子は、標的分子の産生のための「シェル４」異種の標的遺伝子である。一部の場合には、補助異種の標的遺伝子は、標的分子の産生のための「シェル２」異種の標的遺伝子である。
【００３６】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるリシン産生の関連における例示的な標的遺伝子およびそれらのシェル指定は、下記の表１０に提供されている。
【００３７】
「一実施形態」または「ある実施形態」へのこの明細書を通しての言及は、その実施形態に関して記載された特定の特徴、構造、または特性が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、この明細書を通して様々な箇所での句「一実施形態では」または「ある実施形態では」の出現は、必ずしも全部が同じ実施形態を指しているとは限らない。明確にするために、別々の実施形態に関連して記載されている本発明のある特定の特徴がまた、単一の実施形態において組み合わせて提供され得ることは認識されている。逆に、簡潔さのために、単一の実施形態に関連して記載されている本発明の様々な特徴はまた、別々に、または任意の適切な部分的組合せで提供され得る。
【００３８】
プロモーター活性を有するポリヌクレオチド
以下の判定基準の両方を満たす天然のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍプロモーターを同定した：１）構成的プロモーターのラダー、すなわち、プロモーター活性のレベルが徐々に増加している複数のプロモーターを表す；および２）短いＤＮＡ配列、理想的には１００塩基対未満によりコードされている。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２における全体的な遺伝子発現レベルを記載する公表されたデータセット（Leeら、Biotechnol  Lett  （２０１３年）３５巻：７０９〜７１７頁）を調べて、異なる増殖条件に渡って構成的に発現する遺伝子を同定した。発現レベルが２つの増殖条件、すなわち、過酸化水素の添加の有りおよび無しでの最少培地におけるケモスタット増殖に渡って一定（０．３３から３の間の発現比率として定義される）のままである遺伝子が第１の判定基準を満たした。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２トランスクリプトームを記載する公表されたデータセット（Pfeifer-Sancarら、BMC  Genomics  ２０１３年、１４巻：８８８頁）を調べて、小型プロモーター、すなわち、６０塩基対のコアプロモーター領域、および長さが２６から４０塩基対の間の５’非翻訳領域からなるプロモーターに関する遺伝子を見出した。その２つのデータセットを、相互参照して、両方の判断基準を満たすプロモーターを同定した。以下の５つの野生型プロモーターが同定された（表１）。
【００３９】
【表１】
2020524492.tif 000003
【００４０】
野生型プロモーターＰｃｇ１８６０およびＰｃｇ３１２１は文献に記載されていない。野生型プロモーターＰｃｇ０００７−ｇｙｒＢも文献に記載されていないが、NeumannおよびQuinones（J  Basic  Microbiol.  １９９７年；３７巻（１号）：５３〜６９頁）は、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｇｙｒＢ遺伝子発現の制御を記載している。野生型プロモーターＰｃｇ０７５５は、メチオニン生合成経路の公知の要素である（Sudaら、Appl  Microbiol  Biotechnol  （２００８年）８１巻：５０５〜５１３頁；およびReyら、Journal  of  Biotechnology  １０３巻（２００３年）５１〜６５頁）。野生型プロモーターＰｃｇ３３８１はｔａｔＡホモログである。ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおけるｔａｔＡ経路は、Kikuchiら、Applied  and  Environmental  Microbiology、２００６年１１月、７１８３〜７１９２頁により記載されている。強い構成的プロモーターＰｃｇ０００７を変異誘発のために選択した。Ｐｃｇ０００７の予測された−１０エレメントにおける６個の位置（ＴＡＡＧＡＴ）のうちの４個がランダム化されて、より強いプロモーターバリアントと減弱したプロモーターバリアントの両方（配列番号１、５、および７）を生じた。
【００４１】
配列番号１〜８を含むプロモーターの同定後、本発明者らは、１つまたは複数のそのようなプロモーターが、生合成経路の１つまたは複数の異種の標的遺伝子に機能的に連結して、宿主細胞においてその生合成経路により産生される標的生体分子の産生を増加させ得ることを決定した。配列番号１〜８のプロモーターの同定および特徴付け、ならびに標的生体分子を産生するための１つまたは複数の経路上異種の標的遺伝子の発現を上方制御および／または下方制御することにおけるそれらの使用は、２０１６年１２月７日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６５４６４号にさらに記載されており、その内容は、全体として、かつ配列番号１〜８のプロモーター、異種の標的遺伝子に作動可能に連結していようが、していまいが、前記プロモーターを含むベクター、発現カセット、および宿主細胞、ならびに標的生体分子の産生（例えば、配列番号１〜８のプロモーターを使用する）のための方法および組成物を含むが、これらに限定されない全ての目的のために、参照により本明細書に組み入れられている。
【００４２】
追加として、本発明者らは、驚くべきことに、１つまたは複数のそのようなプロモーターを１つまたは複数の補助なまたは経路から外れた異種の標的遺伝子に機能的に連結することが、標的生体分子の産生を増加させ、または標的生体分子の産生をさらに増加させるために使用され得ることを発見した。
【００４３】
例えば、一部の実施形態では、１つまたは複数のそのようなプロモーターを１つまたは複数の補助異種の標的遺伝子に機能的に連結することは、標的生体分子を産生する生合成経路の構成成分である異種の標的遺伝子に機能的に連結したプロモーターを有しない菌株バックグラウンドにおいて標的生体分子の産生を増加させるために使用することができる。追加として、一部の実施形態では、１つまたは複数のそのようなプロモーターを１つまたは複数の補助異種の標的遺伝子に機能的に連結することは、標的生体分子を産生する生合成経路の構成成分である１つまたは複数の異種の標的遺伝子に機能的に連結した１つまたは複数のプロモーターも含む菌株バックグラウンドにおいて標的生体分子の産生を増加させるために使用することができる。
【００４４】
一部の場合には、標的生体分子の産生のための生合成経路の構成成分である１つまたは複数の異種の標的遺伝子に機能的に連結した１つまたは複数のプロモーターは、配列番号１〜８、配列番号１、５、および７、ならびに当技術分野において公知の他のプロモーターから選択することができる。同様に、一部の場合には、標的生体分子の産生のための生合成経路の構成成分ではない１つまたは複数の補助異種の標的遺伝子に機能的に連結した１つまたは複数のプロモーターは、配列番号１〜８、配列番号１、５、および７、ならびに当技術分野において公知の他のプロモーターから選択することができる。
【００４５】
したがって、本開示の一実施形態は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍから単離されたポリヌクレオチドを含む天然プロモーター、およびプロモーター活性が徐々に増加している構成的プロモーターのラダーを合わせて表現する、それらに由来する変異プロモーターに関し、プロモーターのラダーの１つまたは複数は、標的生体分子の産生のための異種の補助標的遺伝子に機能的に連結している。一部の実施形態では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍプロモーターは、短いＤＮＡ配列によりコードされ得る。一部の実施形態では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍプロモーターは、１００塩基対未満のＤＮＡ配列によりコードされ得る。プロモーターは、標的生体分子の産生のための生合成経路内にある異種の標的遺伝子に機能的に連結したプロモーターも含む菌株を含む、任意の菌株バックグラウンドにおいて使用することができる。
【００４６】
本開示の一実施形態は、配列番号１（Ｐｃｇ０００７＿ｌｉｂ＿３９）、配列番号２（Ｐｃｇ１８６０）、配列番号３（Ｐｃｇ０００７）、配列番号４（Ｐｃｇ０７５５）、配列番号５（Ｐｃｇ０００７＿ｌｉｂ＿２６５）、配列番号６（Ｐｃｇ３３８１）、配列番号７（Ｐｃｇ０００７＿ｌｉｂ＿１１９）、または配列番号８（Ｐｃｇ３１２１）から選択される配列を含むプロモーターポリヌクレオチドに関する。別の実施形態では、本明細書は、少なくとも１つの異種の補助標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１を含むプロモーターポリヌクレオチドを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、少なくとも１つの異種の補助標的遺伝子に機能的に連結した配列番号２のプロモーターポリヌクレオチドを提供し、含む。別の実施形態では、本明細書は、少なくとも１つの異種の補助標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチドを提供し、含む。別の実施形態では、本明細書は、少なくとも１つの異種の補助標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチドを提供し、含む。別の実施形態では、本明細書は、少なくとも１つの異種の補助標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチドを提供し、含む。別の実施形態では、本明細書は、少なくとも１つの異種の補助標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチドを提供し、含む。別の実施形態では、本明細書は、少なくとも１つの異種の補助標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチドを提供し、含む。別の実施形態では、本明細書は、少なくとも１つの異種の補助標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチドを提供し、含む。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「プロモーターカセット」は、少なくとも１つの異種の補助標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列を指す。本開示のある特定の実施形態では、「プロモーターカセット」は、リンカーポリヌクレオチド、補助標的遺伝子に続く転写ターミネーター、補助標的遺伝子の開始コドンの上流のリボソーム結合部位、およびそれぞれの組合せの１つまたは複数をさらに含み得る。
【００４８】
本開示の一実施形態は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８から選択される配列からなるプロモーターポリヌクレオチドに関する。ある実施形態では、本明細書は、配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を提供し、含む。本明細書で使用される場合、プロモーターカセットは、プロモーター名、続いて、そのプロモーターに機能的に連結している異種の標的遺伝子の名前を参照して記載され得る。例えば、経路から外れたグルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ遺伝子をコードする遺伝子ｚｗｆに機能的に連結した、Ｐｃｇ１８６０と名付けられた配列番号２のプロモーターは、Ｐｃｇ１８６０−ｚｗｆと呼ばれる。同様に、Ｐｃｇ０００７＿３９−ｌｙｓＡは、ポリペプチドジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコードする標的遺伝子ｌｙｓＡに機能的に連結した配列番号１の０００７＿３９プロモーターである。
【００４９】
本開示の一実施形態は、本明細書に記載されたプロモーターポリヌクレオチドの組合せに関する。この関連において、用語「プロモーターポリヌクレオチドの組合せ」は、別々の単離された配列として、別々のポリヌクレオチド分子の構成成分として、または同じポリヌクレオチド分子の構成成分として、およびそれらの組合せとして存在し得る２つまたはそれより多いポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチド分子の例には、染色体およびプラスミドが挙げられる。
【００５０】
本開示はまた、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８に示されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドから本質的になる、単離されたプロモーターポリヌクレオチドに関する。ある実施形態では、本明細書は、配列番号１の単離されたプロモーターポリヌクレオチドを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、配列番号５の単離されたプロモーターポリヌクレオチドを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、配列番号７の単離されたプロモーターポリヌクレオチドを提供し、含む。
【００５１】
この関連における用語「本質的に」は、１，０００ヌクレオチド長以下、８００ヌクレオチド長以下、７００ヌクレオチド長以下、６００ヌクレオチド長以下、５００ヌクレオチド長以下、または４００ヌクレオチド長以下のポリヌクレオチド；および１５，０００ヌクレオチド長以下、１０，０００ヌクレオチド長以下、７，５００ヌクレオチド長以下、５，０００ヌクレオチド長以下、２，５００ヌクレオチド長以下、１，０００ヌクレオチド長以下、８００ヌクレオチド長以下、７００ヌクレオチド長以下、６００ヌクレオチド長以下、５００ヌクレオチド長以下、または４００ヌクレオチド長以下のポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８のポリヌクレオチドの５’末端および３’末端、それぞれに、付加されていることを意味する。
【００５２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８のポリヌクレオチドの５’末端および３’末端、それぞれに、付加されたポリヌクレオチドの前述の２つのリストからの特徴の任意の有用な組合せは本明細書における本発明に従う。「有用な組合せ」とは、例えば、結果として効率的な組換えが実行される特徴の組合せを意味する。置き換えられ得るＤＮＡ領域に隣接する同じ長さの付加物の使用が、実験手順における相同組換えによるその領域の転移を促進する。相対的に長い隣接する相同領域は、環状ＤＮＡ分子間の効率的な組換えに有利であるが、置換ベクターのクローニングは、その隣接部分の長さの増加と共により困難になる（Wangら、Molecular  Biotechnology、４３２巻：４３〜５３頁（２００６年））。本明細書は、標的遺伝子配列の相同組換えおよび置換を命令する、少なくとも１つの異種の補助標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列（例えば、「プロモーターカセット」）に隣接する相同領域を提供し、含む。ある実施形態では、相同領域は、直列反復領域である。ある実施形態では、相同領域は、プロモーターカセットに隣接する標的遺伝子配列の５００塩基対（ｂｐ）から５０００ｂｐの間をそれぞれ含む。ある実施形態では、相同領域は、プロモーターカセットに隣接する標的遺伝子配列の少なくとも５００ｂｐをそれぞれ含む。ある実施形態では、相同領域は、プロモーターカセットに隣接する標的遺伝子配列の少なくとも１０００ｂｐ（１Ｋｂ）をそれぞれ含む。ある実施形態では、相同領域は、プロモーターカセットに隣接する標的遺伝子配列の少なくとも２Ｋｂをそれぞれ含む。ある実施形態では、相同領域は、プロモーターカセットに隣接する標的遺伝子配列の少なくとも５Ｋｂをそれぞれ含む。
【００５３】
本開示はさらに、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８に示されたヌクレオチド配列からなる、単離されたプロモーターポリヌクレオチドに関する。ある実施形態では、単離されたプロモーターポリヌクレオチドは、配列番号１のポリヌクレオチド配列からなる。ある実施形態では、単離されたプロモーターポリヌクレオチドは、配列番号５のポリヌクレオチド配列からなる。ある実施形態では、単離されたプロモーターポリヌクレオチドは、配列番号７のポリヌクレオチド配列からなる。
【００５４】
微生物などの生きている物に存在するようなポリヌクレオチドの生化学および化学構造に関する詳細は、例えば、とりわけ、Bergらによる教科書「Biochemie」［Biochemistry］（Spektrum  Akademischer  Verlag  Heidelberg  Berlin、Germany、２００３年；ＩＳＢＮ  ３−８２７４−１３０３−６）に見出すことができる。
【００５５】
核酸塩基または塩基アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）を含有するデオキシリボヌクレオチドモノマーからなるポリヌクレオチドは、デオキシリボ−ポリヌクレオチドまたはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）と呼ばれる。核酸塩基または塩基アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含有するリボヌクレオチドモノマーからなるポリヌクレオチドは、リボポリヌクレオチドまたはリボ核酸（ＲＮＡ）と呼ばれる。前記ポリヌクレオチドにおけるモノマーは、３’，５’−ホスホジエステル結合により互いに共有結合により連結している。
【００５６】
「プロモーターポリヌクレオチド」または「プロモーター」または「プロモーター活性を有するポリヌクレオチド」は、転写されることになっているポリヌクレオチドに機能的に連結している時、コードポリヌクレオチドの転写の開始の点および頻度を決定し、それにより、調節されるポリヌクレオチドの発現の強度に影響を及ぼすことを可能にする、ポリヌクレオチド、好ましくはデオキシリボポリヌクレオチド、または核酸、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を意味する。本明細書で使用される用語「プロモーターラダー」は、プロモーター活性のレベルが徐々に増加している、複数のプロモーターを指す。本明細書で使用される用語「プロモーター活性」は、プロモーターが、ポリヌクレオチド配列のｍＲＮＡへの転写を開始する能力を指す。プロモーター活性を評価する方法は、当業者に周知であり、その方法には、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１６／６５４６４の実施例２に記載された方法が挙げられる。本明細書で使用される用語「構成的プロモーター」は、内部細胞条件にも外部細胞条件にも無関係に、その関連した遺伝子の一定の速度での転写を命令するプロモーターを指す。一部の場合には、プロモーターラダーのプロモーターは、刺激に応答して（例えば、化学物質、熱、冷却、ストレス、リン酸飢餓などによる誘導に応答して）様々なプロモーター強度を示す。一部の場合には、プロモーターラダーのプロモーターは、様々な構成的プロモーター強度を示す。
【００５７】
ＤＮＡの二本鎖構造のために、配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８における鎖に相補的な鎖は、同様に、本発明の対象である。
【００５８】
キット
本開示の一実施形態は、配列番号１、配列番号５、および配列番号７から選択される配列を含む第１のプロモーターポリヌクレオチド、ならびにポリヌクレオチドについての適切な保存手段を含むキットに関する。一部の実施形態では、第１のプロモーターポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号５、および配列番号７から選択される配列からなる。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載された少なくとも２つの第１のプロモーターポリヌクレオチドを含むプロモーターポリヌクレオチドの組合せを含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載された少なくとも１つの第１のプロモーターポリヌクレオチド、ならびに配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、および配列番号８から選択される配列を含む少なくとも１つの第２のプロモーターポリヌクレオチドを含む、プロモーターポリヌクレオチドの組合せを含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載された少なくとも１つの第１のプロモーターポリヌクレオチド、ならびに配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、および配列番号８から選択される配列からなる少なくとも１つの第２のプロモーターポリヌクレオチドを含む、プロモーターポリヌクレオチドの組合せを含む。
【００５９】
標的遺伝子
本開示の一実施形態は、本明細書に記載されているようなプロモーターポリヌクレオチドを含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を培養するステップを含む、異種の標的遺伝子の発現をモジュレートする方法に関する。異種の標的遺伝子は、本明細書に記載されたプロモーターにより発現が調節されるポリヌクレオチドである。異種の標的遺伝子は、１つもしくは複数のポリペプチドをコードするコードポリヌクレオチド、または非コードＲＮＡなどの非コードポリヌクレオチドであり得る。タンパク質／ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＡＴＧ、ＧＴＧ、およびＴＴＧからなる群から選択される開始コドン、好ましくはＡＴＧまたはＧＴＧ、特に好ましくはＡＴＧ、タンパク質コード配列、ならびにＴＡＡ、ＴＡＧ、およびＴＧＡからなる群から選択される１つまたは複数の停止コドンから本質的になる。異種の標的遺伝子は、「経路上」もしくは「経路から外れて」、またはそれらの組合せであり得る。
【００６０】
「転写」は、ＤＮＡ鋳型から始まって、相補ＲＮＡ分子が産生されるプロセスを意味する。このプロセスは、ＲＮＡポリメラーゼ、「シグマ因子」、および転写制御タンパク質などのタンパク質を含む。標的遺伝子がコードポリヌクレオチドである場合、合成されたＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ、ｍＲＮＡ）は次いで、続いてポリペプチドまたはタンパク質を生じる翻訳のプロセスにおいて、鋳型としての役割を果たす。
【００６１】
「機能的に連結した」とは、この関連において、本開示によるプロモーターポリヌクレオチドのさらなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの連続的配置を意味し、結果として、前記さらなるポリヌクレオチドが転写されて、センスＲＮＡ転写産物を生じる。
【００６２】
さらなるポリヌクレオチドが、ポリペプチド／タンパク質をコードする標的遺伝子であり、かつ開始コドンから始まって、停止コドンを含み、適切な場合、転写終結配列を含む、ポリペプチドについてのコード領域からなる場合には、「機能的に連結した」は、本発明によるプロモーターポリヌクレオチドの標的遺伝子との連続的配置を意味し、結果として、前記標的遺伝子の転写および合成ＲＮＡの翻訳を生じる。
【００６３】
標的遺伝子が複数のタンパク質／ポリペプチドをコードする場合には、各遺伝子の前にリボソーム結合部位があり得る。適切な場合、終結配列は、最後の遺伝子の下流に位置する。
【００６４】
好ましくは、標的遺伝子は、好ましくは、タンパク質を構成するアミノ酸、タンパク質を構成しないアミノ酸、ビタミン、ヌクレオシド、ヌクレオチド、および有機酸の群から選択される生体分子の生合成経路の１つまたは複数のポリペプチドまたはタンパク質をコードする。標的遺伝子は、好ましくは、参照により本明細書に組み入れられているＥＰ１１０８７９０Ａ２の表１に列挙された経路上のおよび／または経路から外れた標的遺伝子の１つまたは複数からなる。
【００６５】
本明細書は、代謝経路および生合成経路に関与する遺伝子のような、Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）において同定可能な異種の標的遺伝子のいずれか１つに機能的に連結した配列番号１〜８からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を提供し、含む。ＫＥＧＧデータベースは、インターネット上で、genome.jp/keggにおいて利用可能である。
【００６６】
好ましい実施形態では、標的生体分子は、アミノ酸、タンパク質、炭水化物ポリマーであり、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列の１つまたは複数は、クエン酸回路の１つまたは複数の補助標的遺伝子に機能的に連結している。一部の場合には、補助標的遺伝子は、ＫＥＧＧ経路Ｍ０００１０における遺伝子から選択される。一実施形態では、標的生体分子は、アミノ酸、タンパク質、または炭水化物ポリマーであり、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列の１つまたは複数は、解糖経路の１つまたは複数の補助標的遺伝子に機能的に連結している。一部の場合には、補助標的遺伝子は、ＫＥＧＧ経路Ｍ００００２における遺伝子から選択される。一実施形態では、標的生体分子は、アミノ酸、タンパク質、または炭水化物ポリマーであり、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列の１つまたは複数は、ペントースリン酸経路の１つまたは複数の補助標的遺伝子に機能的に連結している。一部の場合には、補助標的遺伝子は、ＫＥＧＧ経路Ｍ００００７もしくはＭ００５８０、またはそれらの組合せにおける遺伝子から選択される。
【００６７】
一実施形態では、標的生体分子は、アミノ酸、タンパク質、または炭水化物ポリマーであり、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列の１つまたは複数は、ＰＲＰＰ生合成経路の１つまたは複数の補助標的遺伝子に機能的に連結している。一部の場合には、補助標的遺伝子は、ＫＥＧＧ経路Ｍ００００５における遺伝子から選択される。一部の場合には、標的生体分子は、特定のアミノ酸または１セットのアミノ酸であり、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列の１つまたは複数は、異なるアミノ酸または１セットのアミノ酸の産生のための代謝経路から選択される１つまたは複数の補助標的遺伝子に機能的に連結している。
【００６８】
ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧマップ番号００３００に表されているようなリシン生合成経路の１つまたは複数の経路上標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、１つまたは複数の経路上標的遺伝子は、リシンスクシニル−ＤＡＰ生合成経路、Ｍ０００１６から選択される。ある実施形態では、１つまたは複数の経路上標的遺伝子は、リシンアセチル−ＤＡＰ生合成経路、Ｍ００５２５から選択される。ある実施形態では、１つまたは複数の経路上標的遺伝子は、リシンＤＡＰデヒドロゲナーゼ生合成経路、Ｍ００５２６から選択される。ある実施形態では、１つまたは複数の経路上標的遺伝子は、リシンＤＡＰアミノトランスフェラーゼ生合成経路、Ｍ００５２７から選択される。ある実施形態では、１つまたは複数の経路上標的遺伝子は、ＡＡＡ経路生合成経路、Ｍ０００３０から選択される。ある実施形態では、１つまたは複数の経路上標的遺伝子は、２−オキソグルタレートからのリシン生合成経路、Ｍ００４３３、またはＬｙｓＷにより媒介されるリシン生合成経路、Ｍ０００３１から選択される。
【００６９】
本開示は、エントリーＭ０００２０の遺伝子を含むセリン生合成経路の１つまたは複数の経路上標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列を提供し、含む。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１８の遺伝子を含むスレオニン生合成経路の１つまたは複数の経路上標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２１の遺伝子を含むシステイン生合成経路の１つまたは複数の経路上標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００３３８の遺伝子を含むシステイン生合成経路の１つまたは複数の経路上標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００６０９の遺伝子を含むシステイン生合成経路の１つまたは複数の経路上標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１７の遺伝子を含むメチオニン生合成経路の１つまたは複数の経路上標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１９の遺伝子を含むバリン／イソロイシン生合成経路の１つまたは複数の経路上標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００５３５の遺伝子を含むイソロイシン生合成経路の１つまたは複数の経路上標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００５７０の遺伝子を含むイソロイシン生合成経路の１つまたは複数の経路上標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００４３２の遺伝子を含むロイシン生合成経路の１つまたは複数の経路上標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１５の遺伝子を含むプロリン生合成経路の１つまたは複数の経路上標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２８の遺伝子を含むオルニチン生合成経路の１つまたは複数の経路上標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００７６３の遺伝子を含むオルニチン生合成経路の１つまたは複数の経路上標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２６の遺伝子を含むヒスチジン生合成経路の１つまたは複数の経路上標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２２の遺伝子を含むシキミ酸生合成経路の１つまたは複数の経路上標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、エントリーＭ０００２３の遺伝子を含むトリプトファン生合成経路の１つまたは複数の経路上標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２４の遺伝子を含むフェニルアラニン生合成経路の１つまたは複数の経路上標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２５の遺伝子を含むチロシン生合成経路の１つまたは複数の経路上標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００４０の遺伝子を含むチロシン生合成経路の１つまたは複数の経路上標的遺伝子に機能的に連結している。
【００７０】
好ましい実施形態では、例えば、宿主細胞、宿主細胞のゲノム、発現カセット、および／またはポリヌクレオチドベクターにおいて、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列のうちの１つまたは複数は、本明細書に記載された１つまたは複数の経路上標的遺伝子に機能的に連結しており、かつ配列番号１〜８の１つまたは複数のプロモーターポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載された１つまたは複数の補助標的遺伝子に機能的に連結している。別の実施形態では、例えば、宿主細胞、宿主細胞のゲノム、発現カセット、および／またはポリヌクレオチドベクターにおいて、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列のうちの１つまたは複数は、本明細書に記載された１つまたは複数の経路上標的遺伝子に機能的に連結しており、かつ１つまたは複数の他のプロモーターポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載された１つまたは複数の補助標的遺伝子に機能的に連結している。さらに別の実施形態では、例えば、宿主細胞、宿主細胞のゲノム、発現カセット、および／またはポリヌクレオチドベクターにおいて、配列番号１〜８のプロモーターポリヌクレオチド配列のうちの１つまたは複数は、本明細書に記載された１つまたは複数の補助標的遺伝子に機能的に連結しており、かつ１つまたは複数の他のプロモーターポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載された１つまたは複数の経路上標的遺伝子に機能的に連結している。
【００７１】
本開示は、エントリーＭ０００２０の遺伝子を含むセリン生合成経路の１つまたは複数の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１、５、または７のプロモーターポリヌクレオチド配列を提供し、含む。ある実施形態では、配列番号１、５、または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１８の遺伝子を含むスレオニン生合成経路の１つまたは複数の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５、または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２１の遺伝子を含むシステイン生合成経路の１つまたは複数の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５、または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００３３８の遺伝子を含むシステイン生合成経路の１つまたは複数の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５、または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００６０９の遺伝子を含むシステイン生合成経路の１つまたは複数の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５、または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１７の遺伝子を含むメチオニン生合成経路の１つまたは複数の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５、または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１９の遺伝子を含むバリン／イソロイシン生合成経路の１つまたは複数の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５、または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００５３５の遺伝子を含むイソロイシン生合成経路の１つまたは複数の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５、または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００５７０の遺伝子を含むイソロイシン生合成経路の１つまたは複数の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５、または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００４３２の遺伝子を含むロイシン生合成経路の１つまたは複数の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５、または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００１５の遺伝子を含むプロリン生合成経路の１つまたは複数の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５、または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２８の遺伝子を含むオルニチン生合成経路の１つまたは複数の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５、または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ００７６３の遺伝子を含むオルニチン生合成経路の１つまたは複数の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５、または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２６の遺伝子を含むヒスチジン生合成経路の１つまたは複数の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５、または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２２の遺伝子を含むシキミ酸生合成経路の１つまたは複数の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５、または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、エントリーＭ０００２３の遺伝子を含むトリプトファン生合成経路の１つまたは複数の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５、または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２４の遺伝子を含むフェニルアラニン生合成経路の１つまたは複数の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５、または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００２５の遺伝子を含むチロシン生合成経路の１つまたは複数の標的遺伝子に機能的に連結している。ある実施形態では、配列番号１、５、または７のプロモーターポリヌクレオチド配列は、ＫＥＧＧエントリーＭ０００４０の遺伝子を含むチロシン生合成経路の１つまたは複数の標的遺伝子に機能的に連結している。
【００７２】
本明細書は、表２に提供されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２またはその任意のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ等価物由来の異種の経路上のまたは経路から外れた標的遺伝子のいずれか１つに機能的に連結した配列番号１〜８からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を提供し、含む。配列開始および終了位置は、ゲノムヌクレオチド受託番号ＮＣ＿００３４５０．３に対応する。対応する遺伝子が、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの他の菌株に存在し、表２から容易に同定され得ることは、当業者により理解されているだろう。ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を提供し、含む。
【００７３】
【表２−１】
2020524492.tif 000004
【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【００７４】
ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された経路上のまたは経路から外れた異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。
【００７５】
ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された経路上のまたは経路から外れた異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表２に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。
【００７６】
ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された経路上のまたは経路から外れた異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。
【００７７】
【表３−１】
2020524492.tif 000010
【表３−２】
2020524492.tif 000011
【００７８】
ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された経路上のまたは経路から外れた異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。
【００７９】
ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された経路上のまたは経路から外れた異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表３に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。
【００８０】
本明細書は、表４に提供されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２またはそのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ等価物由来の経路上のまたは経路から外れた異種の標的遺伝子のいずれか１つに機能的に連結した配列番号１〜８からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。配列開始および終了位置は、ゲノムヌクレオチド受託番号ＮＣ＿００３４５０．３に対応する。対応する遺伝子が、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの他の菌株に存在し、表４から容易に同定され得ることは、当業者により理解されているだろう。ある実施形態では、本明細書は、表４に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。
【００８１】
【表４】
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【００８２】
ある実施形態では、本明細書は、表４に列挙された経路上のまたは経路から外れた異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。
【００８３】
ある実施形態では、本明細書は、表４に列挙された経路上のまたは経路から外れた異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表４に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。
【００８４】
本明細書は、表５に提供されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ  １３０３２またはそのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ等価物由来の経路から外れた異種の標的遺伝子のいずれか１つに機能的に連結した配列番号１〜８からなる群から選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。配列開始および終了位置は、ゲノムヌクレオチド受託番号ＮＣ＿００３４５０．３に対応する。対応する遺伝子が、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの他の菌株に存在し、表５から容易に同定され得ることは、当業者により理解されているだろう。ある実施形態では、本明細書は、表５に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表５に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表５に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表５に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表５に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表５に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表５に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表５に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。
【００８５】
【表５−１】
2020524492.tif 000013
【表５−２】
2020524492.tif 000014
【００８６】
ある実施形態では、本明細書は、表５に列挙された経路から外れた異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表５に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表５に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表５に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表５に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表５に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。
【００８７】
ある実施形態では、本明細書は、表５に列挙された経路から外れた異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表５に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表５に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表５に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表５に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表５に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表５に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表５に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。
【００８８】
ある実施形態では、本明細書は、表１０に列挙された経路から外れた異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表１０に列挙された経路から外れた異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表１０に列挙された経路から外れた異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。
【００８９】
本明細書は、プロモーターラダーを含む複数のプロモーターポリヌクレオチドから選択されるプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。一部の場合には、宿主細胞は、プロモーターラダーを含む複数の形質転換宿主細胞の構成成分であり、例えば、その複数の各細胞は、プロモーターラダーの異なるプロモーターポリヌクレオチドを含む。一部の場合には、その複数の同じまたは異なる形質転換宿主細胞における、プロモーターラダーのプロモーターポリヌクレオチドは、同じ異種の、例えば、補助な、標的遺伝子に作動可能に連結している。一部の場合には、異種の標的遺伝子は、シェル２、シェル３、および／またはシェル４の異種の標的遺伝子である。一部の場合には、異種の標的遺伝子は、シェル３および／またはシェル４の異種の標的遺伝子である。一部の場合には、異種の標的遺伝子は、シェル４の異種の標的遺伝子である。一部の場合には、異種の標的遺伝子は、シェル２の異種の標的遺伝子である。一部の場合には、異種の標的遺伝子は、シェル３の異種の標的遺伝子である。一部の場合には、異種の標的遺伝子は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来の異種の標的遺伝子、例えば、表１０、または必要に応じて、本明細書に記載された表のいずれか１つに提供された異種の標的遺伝子である。表１０における配列開始および終了位置は、ゲノムヌクレオチド受託番号ＮＣ＿００３４５０．３に対応する。対応する遺伝子は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの他の菌株に存在し、本開示から容易に同定され得ることは、当業者により理解されているだろう。
【００９０】
一部の場合には、プロモーターラダーを含むプロモーターポリヌクレオチドは、経路から外れた異種の標的遺伝子、例えば、シェル２、シェル３、および／もしくはシェル４の異種の標的遺伝子、表１０に提供された経路から外れた異種の標的遺伝子、または、必要に応じて、本明細書に記載された表のいずれか１つにおける経路から外れた標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１〜８からなる群から選択される。一部の場合には、異種の標的遺伝子は、シェル４の異種の標的遺伝子である。
【００９１】
ある実施形態では、本明細書は、シェル２、シェル３、および／またはシェル４の異種の標的遺伝子、例えば、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。一部の場合には、異種の標的遺伝子は、シェル４の異種の標的遺伝子である。ある実施形態では、本明細書は、シェル２、シェル３、および／またはシェル４の異種の標的遺伝子、例えば、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。一部の場合には、異種の標的遺伝子は、シェル４の異種の標的遺伝子である。ある実施形態では、本明細書は、シェル２、シェル３、および／またはシェル４の異種の標的遺伝子、例えば、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。一部の場合には、異種の標的遺伝子は、シェル４の異種の標的遺伝子である。ある実施形態では、本明細書は、シェル２、シェル３、および／またはシェル４の異種の標的遺伝子、例えば、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。一部の場合には、異種の標的遺伝子は、シェル４の異種の標的遺伝子である。
【００９２】
ある実施形態では、本明細書は、シェル２、シェル３、および／またはシェル４の異種の標的遺伝子、例えば、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。一部の場合には、異種の標的遺伝子は、シェル４の異種の標的遺伝子である。ある実施形態では、本明細書は、シェル２、シェル３、および／またはシェル４の異種の標的遺伝子、例えば、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。一部の場合には、異種の標的遺伝子は、シェル４の異種の標的遺伝子である。
【００９３】
ある実施形態では、本明細書は、シェル２、シェル３、および／またはシェル４の異種の標的遺伝子、例えば、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。一部の場合には、異種の標的遺伝子は、シェル２の異種の標的遺伝子である。ある実施形態では、本明細書は、シェル２、シェル３、および／またはシェル４の異種の標的遺伝子、例えば、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。一部の場合には、異種の標的遺伝子は、シェル４の異種の標的遺伝子である。
【００９４】
ある実施形態では、本明細書は、表１０に列挙された経路から外れた異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターを提供し、含む。
【００９５】
ある実施形態では、本明細書は、表１０に列挙された経路から外れた異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号３のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号４のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号５のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号６のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号７のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、本明細書は、表１０に列挙された異種の標的遺伝子に機能的に連結した配列番号８のプロモーターポリヌクレオチド配列を含む組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、含む。
【００９６】
本明細書で使用される場合、宿主細胞は、プロモーターカセットの１個または複数個で形質転換されている、下記の「発現」と題するセクションに記載された生物体を指す。当業者にとって明らかなように、宿主細胞は、本明細書に記載されているような１個または複数個のプロモーターカセットを含み得る。
【００９７】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、アミノ酸、有機酸、香味料および芳香剤、バイオ燃料、タンパク質および酵素、ポリマー／モノマーおよび他のバイオマテリアル、脂質、核酸、小分子治療薬、タンパク質治療薬、ファインケミカル、ならびに栄養補助食品から選択される生体分子を産生する生合成経路と関連している。
【００９８】
一部の実施形態では、標的遺伝子は、抗生物質、アルカロイド、テルペノイド、およびポリケタイドから選択される二次代謝物を産生する生合成経路と関連している。一部の実施形態では、標的遺伝子は、アルコール、アミノ酸、ヌクレオチド、抗酸化剤、有機酸、ポリオール、ビタミン、および脂質／脂肪酸から選択される一次代謝物を産生する代謝経路と関連している。一部の実施形態では、標的遺伝子は、タンパク質、核酸、およびポリマーから選択される高分子を産生する生合成経路と関連している。
【００９９】
加えて、それぞれの生合成経路、解糖系、アナプレロシス、クエン酸回路、ペントースリン酸回路、アミノ酸搬出の１つまたは複数の酵素、および必要に応じて、制御タンパク質を増強し、特に過剰発現させることは、Ｌ−アミノ酸の産生にとって有利であり得る。
【０１００】
したがって、例えば、Ｌ−アミノ酸の産生について、以下の群から選択される１つまたは複数の遺伝子が増強され、特に、過剰発現することは有利であり得る：ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする遺伝子ｄａｐＡ（ＥＰ−Ｂ０１９７３３５）；エノラーゼをコードする遺伝子ｅｎｏ（ＤＥ：１９９４７７９１．４）；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｇａｐ（Eikmanns（１９９２年）、Journal  of  Bacteriology  １７４巻：６０７６〜６０８６頁）；トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子ｔｐｉ（Eikmanns（１９９２年）、Journal  of  Bacteriology  １７４巻：６０７６〜６０８６頁）；３−ホスホグリセリン酸キナーゼをコードする遺伝子ｐｇｋ（Eikmanns（１９９２年）、Journal  of  Bacteriology  １７４巻：６０７６〜６０８６頁）；グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｚｗｆ（ＪＰ−Ａ−０９２２４６６１）；ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子ｐｙｃ（ＤＥ−Ａ−１９８３１６０９；Eikmanns（１９９２年）、Journal  of  Bacteriology  １７４巻：６０７６〜６０８６頁）；リンゴ酸−キノンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子ｍｑｏ（Molenaarら、European  Journal  of  Biochemistry  ２５４巻、３９５〜４０３頁（１９９８年））；フィードバック抵抗性アスパラギン酸キナーゼをコードする遺伝子ｌｙｓＣ（受託番号Ｐ２６５１２）；リシン搬出をコードする遺伝子ｌｙｓＥ（ＤＥ−Ａ−１９５４８２２２）；ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｈｏｍ（ＥＰ−Ａ０１３１１７１）；スレオニンデヒドラターゼをコードする遺伝子ｉｌｖＡ（Moeckelら、Journal  of  Bacteriology（１９９２年）８０６５〜８０７２頁））またはフィードバック抵抗性スレオニンデヒドラターゼをコードする対立遺伝子ｉｌｖＡ（Ｆｂｒ）（Moeckelら、（１９９４年）Molecular  Microbiology  １３巻：８３３〜８４２頁）；アセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする遺伝子ｉｌｖＢＮ（ＥＰ−Ｂ０３５６７３９）；ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードする遺伝子ｉｌｖＤ（SahmおよびEggeling（１９９９年）  Applied  and  Environmental  Microbiology  ６５巻：１９７３〜１９７９頁）；およびＺｗａ１タンパク質をコードする遺伝子ｚｗａ１（ＤＥ：１９９５９３２８．０、ＤＳＭ１３１１５）。
【０１０１】
さらに、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子ｐｃｋ（ＤＥ１９９５０４０９．１；ＤＳＭ１３０４７）；グルコース−６−リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子ｐｇｉ（米国特許第６，５８６，２１４号；ＤＳＭ１２９６９）；ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子ｐｏｘＢ（ＤＥ：１９９５１９７５．７；ＤＳＭ１３１１４）；およびＺｗａ２タンパク質をコードする遺伝子ｚｗａ２（ＤＥ：１９９５９３２７．２、ＤＳＭ１３１１３）の群から選択される１つまたは複数の遺伝子の発現を減弱させ、特に、低下させることもまた、Ｌ−アミノ酸の産生に有利であり得る。
【０１０２】
加えて、望ましくない副反応を排除することはさらに、アミノ酸、特に、Ｌ−リシンの産生に有利であり得る（Nakayama：「Breeding  of  Amino  Acid  Producing  Micro-organisms」、Overproduction  of  Microbial  Products、Krumphanzl、Sikyta、Vanek（編）、Academic  Press、London、UK、１９８２年）。
【０１０３】
したがって、本開示によるプロモーターは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて標的遺伝子を過剰発現または過小発現させるいずれの場合にも使用することができる。
【０１０４】
標的生体分子の産生を最適化するための補助標的遺伝子を同定する方法
標的生体分子産生を向上させるための発現および／または活性のモジュレーションのための補助標的遺伝子をスクリーニングおよび／または同定するための方法が本明細書に記載されている。一部の場合には、異種の補助標的遺伝子は、シェル２、シェル３、および／またはシェル４の標的遺伝子である。一部の場合には、異種の補助標的遺伝子は、シェル３および／またはシェル４の標的遺伝子である。一部の場合には、異種の補助標的遺伝子は、シェル４の標的遺伝子である。典型的には、方法は、形質転換宿主細胞のライブラリーをスクリーニングするステップであって、ライブラリーの個々の形質転換宿主細胞が、ライブラリーの他の形質転換細胞と比較して異なる［プロモーターポリヌクレオチド：作動可能に連結した異種の補助標的遺伝子］組合せを含む、ステップを含む。次いで、そのような組合せは、標的生体分子産生を向上させるライブラリーから同定され、かつ標的生体分子の製造に用いられ、またはさらに最適化され得る。
【０１０５】
したがって、方法は、そのようなライブラリーを提供するステップ、および／またはそのようなライブラリーをスクリーニングするステップ、および／または標的分子産生の向上を示す形質転換体を同定するステップ、および／またはそのような向上した形質転換体を単離するステップ、および／またはそのような向上した形質転換体を保存し、もしくは増やすステップの１つまたは複数のステップを含み得る。一部の実施形態では、プロモーターポリヌクレオチドはプロモーターラダーを含む。
【０１０６】
一般的に、ライブラリーの形質転換宿主細胞は、経路上の改変をさらに含む。一部の場合には、経路上の改変は、ライブラリーの形質転換細胞の全部、本質的に全部、実質的に全部、または大部分で同じである。例えば、リシン産生について、ライブラリーの形質転換細胞の全部、本質的に全部、実質的に全部、または大部分が、経路上異種の標的遺伝子ｌｙｓＡに作動可能に連結したプロモーターポリヌクレオチド、および／または経路上異種の標的遺伝子に作動可能に連結した１つもしくは複数の他のプロモーターポリヌクレオチドを含み得る。一部の場合には、形質転換宿主細胞は、内因性経路上標的遺伝子がそれらの対応する内因性プロモーターに作動可能に連結しているような野生型株バックグラウンドを含む。
【０１０７】
形質転換細胞のライブラリーは、プロモーターラダーを含み得、プロモーターラダーの個々のプロモーターポリヌクレオチドはライブラリーの異なる細胞内にある。一般的に、プロモーターラダーの異なるプロモーターポリヌクレオチドは、異なる形質転換細胞における同じ異種の補助標的遺伝子に作動可能に連結している。例として、８つの異なるプロモーターポリヌクレオチドを有するプロモーターラダーを含み、かつ単一の異種の補助標的遺伝子を問い合わせるライブラリーについて、最小ライブラリーサイズは、１個の細胞が各可能な［プロモーターポリヌクレオチド：作動可能に連結した異種の補助標的遺伝子］組合せを含有する、８個の細胞、または１個の細胞がプロモーターラダーのプロモーターポリヌクレオチドを含まない対照細胞である、９個の細胞である。形質転換宿主細胞のライブラリーが、ライブラリーまたはそのサブセットの最小細胞セットの複数（例えば、＞１０個；＞１００個；＞１，０００個；１０〜１，０００個；１０〜１０，０００個；または１００〜１００，０００個）の重複コピーを含有し得ることを、当業者は認識できる。ライブラリーは、それぞれの問い合わされる異種の補助標的遺伝子が、異なる細胞におけるプロモーターラダーの異なるプロモーターポリヌクレオチドのそれぞれに作動可能に連結しているように、それぞれの問い合わされる異種の補助標的遺伝子についての追加の細胞セットをさらに含み得る。これは、ライブラリーにおける各細胞が、異なる［プロモーターポリヌクレオチド：作動可能に連結した異種の補助標的遺伝子］組合せを問い合わせる実験である、細胞セットを提供する。
【０１０８】
ライブラリーは、当業者に利用可能ないくつかの技術によって提供され得る。例えば、選択されたバックグラウンド（例えば、ｌｙｓＡ過剰発現のために改変された）を有する複数の宿主細胞は、実質的に全部の形質転換体が、単一の［異種の補助標的遺伝子に作動可能に連結したプロモーターポリヌクレオチド］組合せを含有するように一つずつ改変されるような条件下で、組換えベクターのライブラリーで形質転換され得る。組換えベクターは、組込みベクターであり得、それゆえに、その提供は、宿主細胞のゲノムを操作することを含む。形質転換体は、標的分子産生のために単離され、保存され、および／または増殖され、必要に応じて、アッセイされ得る。例示的な単離方法は、非限定的に、限界希釈、プレーティング、画線、および／またはコロニー採取を含む。例示的な保存方法には、非限定的に、凍結保存または胞子形成が挙げられる。例えば、形質転換体を単離し、適切な凍結保護物質（例えば、グリセロール）と混合し、氷晶形成を制限するのに適した条件下で極低温で凍結し、保存することができる。
【０１０９】
さらに、問い合わされる異種の補助標的遺伝子は、複数の（例えば、２つまたはそれより多い）異なる経路上改変バックグラウンドでアッセイすることができる。異なる経路上バックグラウンドのアッセイは、同時に、例えば並行して、または連続的に、実施することができる。例えば、リシンの産生を増加させるための形質転換宿主細胞のライブラリーは、ｌｙｓＡ過剰発現改変を有し、かつ複数の［異種の標的遺伝子に作動可能に連結したプロモーターポリヌクレオチド］組合せを問い合わせる形質転換宿主細胞の第１のサブライブラリー、および異なる、または追加の経路上改変を有することによって第１のサブライブラリーとは異なる第２のサブライブラリーを含み得る。同様に、ライブラリーは、経路から外れた改変バックグラウンドを含み得、またはさらに含み、複数の［異種の標的遺伝子に作動可能に連結したプロモーターポリヌクレオチド］組合せを問い合わせ、および／または複数の［異種の補助標的遺伝子に作動可能に連結したプロモーターポリヌクレオチド］組合せを問い合わせる。例として、リシンの産生を増加させるための形質転換宿主細胞のライブラリーは、経路上ｌｙｓＡ過剰発現改変；経路から外れたｐｇｉ過剰発現改変；および様々な［異種の補助標的遺伝子に作動可能に連結したプロモーターポリヌクレオチド］組合せを含むバックグラウンドを有する形質転換宿主細胞を含み得る。
【０１１０】
一部の実施形態では、方法は、複数の宿主細胞から、標的生体分子の産生の増加を示す宿主細胞を同定するステップを含む。一部の場合には、同定するステップは、宿主細胞を同定するための再現性フィルター、および標的生体分子の産生の増加を再現性よく示す、根底にある［異種の補助標的遺伝子に作動可能に連結したプロモーターポリヌクレオチド］組合せを含む。例えば、同定するステップは、各［異種の補助標的遺伝子に作動可能に連結したプロモーターポリヌクレオチド］組合せの重複コピーをアッセイし、重複コピーの全部、実質的に全部、または大部分において標的生体分子産生の向上を再現性よく示す組合せを同定することができる。別の例として、統計的フィルターは、選択されたレベルの統計的有意性（例えば、ｐ＜０．０５、０．０１、０．００５、または０．００１）を満たさない組合せを排除するために適用することができる。
【０１１１】
一部の実施形態では、方法は、ライブラリーを提供する反復法を含み得る。例えば、ライブラリーが提供され、培養され得、標的生体分子の産生の増加を示す１つまたは複数の宿主細胞が、ライブラリー作製およびスクリーニングの第２ラウンドのためのバックグラウンド菌株を含み得る。したがって、一部の実施形態では、後続の反復は、先行する宿主細胞ライブラリーの少なくとも２個の個々の宿主細胞の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せである固有の遺伝的バリエーションを有する個々の宿主細胞を含む新しい宿主細胞ライブラリーを生じる。生じた宿主細胞が、選択されたレベルの標的生体分子産生向上を獲得するまで；ライブラリーを提供し、かつスクリーニングするさらなるラウンドが向上の減少を示すまで；または向上プラトーまで、反復は、複数回、実施され得る。ある実施形態では、少なくとも１ラウンドが、異種の補助標的遺伝子を問い合わせる。追加として、または代替として、経路上遺伝子が、ライブラリー作製およびスクリーニングの早い方の、または後の方のラウンドにおいて、必要に応じて、異種の補助標的遺伝子のさらなる問い合わせと組み合わせて、問い合わされ得る。
【０１１２】
リンカー
標的遺伝子は、本発明によるプロモーターポリヌクレオチドの下流に、すなわち、その３’末端に、両方のポリヌクレオチドが、互いに、直接的にまたはリンカーオリゴヌクレオチドもしくはリンカーポリヌクレオチドによって機能的に連結するように、位置する。プロモーターと標的遺伝子が互いにリンカーオリゴヌクレオチドまたはリンカーポリヌクレオチドによって機能的に連結することが優先される。前記リンカーオリゴヌクレオチドまたはリンカーポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドからなる。
【０１１３】
この関連において、語句「互いに直接的に、機能的に連結した」とは、プロモーターポリヌクレオチド、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の３’末端におけるヌクレオチドが、標的遺伝子の開始コドンの最初のヌクレオチドに直接的に連結していることを意味する。これは、結果として、５’末端ＡＵＧ開始コドンからすぐに開始し、したがって、いかなる他の翻訳開始シグナルも有しない、「リーダーのない」ｍＲＮＡを生じる。
【０１１４】
この関連において、語句「互いにリンカーオリゴヌクレオチドによって機能的に連結した」とは、プロモーターポリヌクレオチド、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の３’末端におけるヌクレオチドが、標的遺伝子の開始コドンの最初のヌクレオチドに、１ヌクレオチド長、２ヌクレオチド長、３ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、または５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドによって連結していることを意味する。
【０１１５】
この関連において、語句「互いにリンカーポリヌクレオチドによって機能的に連結した」とは、プロモーターポリヌクレオチド、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の３’末端におけるヌクレオチドが、標的遺伝子の開始コドンの最初のヌクレオチドへ、６ヌクレオチド長から６００ヌクレオチド長以下のポリヌクレオチドによって連結していることを意味する。
【０１１６】
この関連において、語句「互いに機能的に連結した」とは、標的遺伝子が、本発明によるプロモーターポリヌクレオチドに、標的遺伝子の転写および合成されたＲＮＡの翻訳が保証されるように結合していることを意味する。
【０１１７】
技術的要求に応じて、リンカーポリヌクレオチドは、
６〜６００、６〜５００、６〜４００、６〜３００、６〜２００、６〜１８０、６〜１６０、６〜１４０、６〜１２０、６〜１００、６〜８０、６〜６０、６〜５０、６〜４０、６〜３０、６〜２８、６〜２７、６〜２６、もしくは６〜２５；または
８〜６００、８〜５００、８〜４００、８〜３００、８〜２００、８〜１８０、８〜１６０、８〜１４０、８〜１２０、８〜１００、８〜８０、８〜６０、８〜５０、８〜４０、８〜３０、８〜２８、８〜２７、８〜２６、もしくは８〜２５；または
１０〜６００、１０〜５００、１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００、１０〜１８０、１０〜１６０、１０〜１４０、１０〜１２０、１０〜１００、１０〜８０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２８、１０〜２７、１０〜２６、もしくは１０〜２５；または
１２〜６００、１２〜５００、１２〜４００、１２〜３００、１２〜２００、１２〜１８０、１２〜１６０、１２〜１４０、１２〜１２０、１２〜１００、１２〜８０、１２〜６０、１２〜５０、１２〜４０、１２〜３０、１２〜２８、１２〜２７、１２〜２６、もしくは１２〜２５；または
１４〜６００、１４〜５００、１４〜４００、１４〜３００、１４〜２００、１４〜１８０、１４〜１６０、１４〜１４０、１４〜１２０、１４〜１００、１４〜８０、１４〜６０、１４〜５０、１４〜４０、１４〜３０、１４〜２８、１４〜２７、１４〜２６、もしくは１４〜２０；または
１６〜６００、１６〜５００、１６〜４００、１６〜３００、１６〜２００、１６〜１８０、１６〜１６０、１６〜１４０、１６〜１２０、１６〜１００、１６〜８０、１６〜６０、１６〜５０、１６〜４０、１６〜３０、１６〜２８、１６〜２７、１６〜２６、もしくは１６〜２５；または
１８〜６００、１８〜５００、１８〜４００、１８〜３００、１８〜２００、１８〜１８０、１８〜１６０、１８〜１４０、１８〜１２０、１８〜１００、１８〜８０、１８〜６０、１８〜５０、１８〜４０、１８〜３０、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、もしくは１８〜２５；または
２０〜６００、２０〜５００、２０〜４００、２０〜３００、２０〜２００、２０〜１８０、２０〜１６０、２０〜１４０、２０〜１２０、２０〜１００、２０〜８０、２０〜６０、２０〜５０、２０〜４０、２０〜３０、２０〜２８、２０〜２７、２０〜２６、もしくは２０〜２５ヌクレオチド長である。
【０１１８】
特に好ましい実施形態では、リンカーポリヌクレオチドは、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長であり、これが、好ましいことに機能的な構築物を生じるからである。
【０１１９】
したがって、本開示はさらに、５’末端にＡＴＧまたはＧＴＧ開始コドンを含有し、かつ１つまたは複数の経路から外れたポリペプチドをコードする標的遺伝子に、直接的に、またはＲＮＡの翻訳を保証するリンカーポリヌクレオチドによって３’末端におけるヌクレオチドを介して機能的に連結している、プロモーターポリヌクレオチド、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８から本質的になる、単離されたプロモーターポリヌクレオチドに関する。プロモーターと標的遺伝子が互いにリンカーポリヌクレオチドによって機能的に連結していることが優先される。
【０１２０】
本開示はさらにまた、３’末端におけるヌクレオチドを介して、リンカーオリゴヌクレオチドに機能的に連結している、プロモーターポリヌクレオチド、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８から本質的になる単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０１２１】
加えて、本開示はさらに、３’末端におけるヌクレオチドを介して、ＲＮＡの翻訳を保証するリンカーポリヌクレオチドに機能的に連結している、プロモーターポリヌクレオチド、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８から本質的になる単離されたポリヌクレオチドに関する。
【０１２２】
この関連において、用語「本質的に」とは、１，０００ヌクレオチド長以下、８００ヌクレオチド長以下、７００ヌクレオチド長以下、６００ヌクレオチド長以下、５００ヌクレオチド長以下、または４００ヌクレオチド長以下のポリヌクレオチドが、プロモーターポリヌクレオチド、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の５’末端に付加しており、かつ１，０００ヌクレオチド長以下、８００ヌクレオチド長以下、７００ヌクレオチド長以下、６００ヌクレオチド長以下、５００ヌクレオチド長以下、もしくは４００ヌクレオチド長以下のポリヌクレオチドが、標的遺伝子の３’末端に付加しており、または１５，０００ヌクレオチド長以下、１０，０００ヌクレオチド長以下、７，５００ヌクレオチド長以下、５，０００ヌクレオチド長以下、２，５００ヌクレオチド長以下、１，０００ヌクレオチド長以下、８００ヌクレオチド長以下、７００ヌクレオチド長以下、６００ヌクレオチド長以下、５００ヌクレオチド長以下、もしくは４００ヌクレオチド長以下のポリヌクレオチドが、リンカーオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの３’末端に付加していることを意味する。
【０１２３】
ポリヌクレオチドの前述の３つのリストからの特徴のいかなる有用な組合せも、本明細書において本発明に従う。「有用な組合せ」とは、例えば、結果として効率的な組換えが実行される特徴の組合せを意味する。置き換えられるＤＮＡ領域に隣接する同じ長さの付加物の使用は、実験手順における相同組換えによるその領域の転移を促進する。相対的に長い隣接する相同領域は、環状ＤＮＡ分子間の効率的な組換えに有利であるが、置換ベクターのクローニングは、その隣接部分の長さの増加と共により困難になる（Wangら、Molecular  Biotechnology、３２巻：４３〜５３頁（２００６年））。
【０１２４】
加えて、リンカーオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの３’末端における隣接部分は、その３’末端が、５’末端にＡＴＧまたはＧＴＧ開始コドンを含有し、かつ１つまたは複数のポリペプチドをコードする標的遺伝子に機能的に連結している場合、長さが１５，０００ヌクレオチド以下まで増加する。
【０１２５】
リンカーポリヌクレオチドのこれらの特に好ましい実施形態は、ＲＮＡの翻訳を有利に保証する。
【０１２６】
プロモーターポリヌクレオチド、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８と、ＲＮＡの翻訳を保証するリンカーポリヌクレオチドと、５’末端にＡＴＧまたはＧＴＧ開始コドンを有する、１つまたは複数のポリペプチドをコードする標的遺伝子との間の化学的連結を促進するために、クローニングに必要とされる機能的ヌクレオチド配列が、前記ポリヌクレオチドへそれらの５’および３’末端に組み込まれ得、前記クローニング後さえも少なくとも部分的に保持される。
【０１２７】
本明細書における用語「クローニングに必要とされる機能的ヌクレオチド配列」は、配列が通常４から８ヌクレオチドまでからなる、存在する任意のＲＥＩＩ（ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ）切断部位を表す。
【０１２８】
加えて、制限エンドヌクレアーゼについての切断部位を除去するためのヌクレオチド配列の変異誘発プライマーまたは新規遺伝子合成（例えば、ＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）による）による部位特異的変異誘発は、前記切断部位がその後のクローニングステップに有利に使用されることを可能にするために、その配列へサイレント変異を導入し得ることは、言及しておきたい。
【０１２９】
本発明によるプロモーターが、ＲＮＡの翻訳を保証するリンカーポリヌクレオチドに機能的に連結していることから生じるポリヌクレオチドはまた、本明細書において下記で、発現ユニットとも呼ばれている。
【０１３０】
発現
本開示はさらに、微生物において標的遺伝子またはポリヌクレオチドを発現させるための、本発明によるプロモーターまたは本発明による発現ユニットの使用に関する。本発明によるプロモーターまたは本発明による発現ユニットは、転写、および合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を保証する。本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」は、微生物の形質転換細胞を指す。
【０１３１】
本開示は、上記で詳細に記載された組換え核酸および組換えベクターを含む形質転換宿主細胞を提供し、含む。本開示はさらに、２つの組換え核酸で形質転換された宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、宿主細胞は、３つの組換え核酸で形質転換されている。上記で提供されているように、核酸は、所望の産物の収量への全体的効果に基づいて、生合成経路から選択され得る。本明細書の宿主細胞へ組み込まれ得る組換え核酸の数の実際的な限界はない。発現は、好ましくは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の微生物において実行される。以下の種に基づいているＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属内の菌株が優先される：Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ（寄託された基準株はＤＳＭ４４５４９である）；Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（寄託された基準株はＡＴＣＣ１３０３２である）；およびＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ（寄託された基準株はＡＴＣＣ６８７１である）。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ種が極めて特に優先される。このように、対応する宿主においては存在せず、検出もできない性質、好ましくは酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させることは可能である。したがって、例えば、Yukawaらは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  Ｒにおける構成的Ｐｔｒｃプロモーターの調節下での、Ｄ−キシロースを利用するためのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ遺伝子の発現を記載する（Applied  Microbiology  and  Biotechnology  ８１巻、６９１〜６９９頁（２００８年））。
【０１３２】
本明細書は、上記のプロモーターポリヌクレオチド配列の調節下での生合成経路の２つまたはそれより多い遺伝子を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどの宿主細胞を提供し、含む。様々な実施形態では、１つまたは複数の標的遺伝子（例えば、補助標的遺伝子、ならびに／またはシェル２、および／もしくはシェル３、および／もしくはシェル４の標的遺伝子）は、上記のような配列番号１〜８の配列を有するプロモーターポリヌクレオチド配列の調節下に置かれる。他の実施形態では、１つまたは複数の標的遺伝子は、上記のような配列番号１、５、または７の配列を有するプロモーターポリヌクレオチド配列の調節下に置かれる。
【０１３３】
本明細書によるある特定の実施形態では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞は、配列番号１〜８の配列を有するプロモーターの調節下での２つの標的遺伝子を有する。本明細書によるある特定の他の実施形態では、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞は、配列番号１、５、または７の配列を有するプロモーターの調節下での２つの標的遺伝子を有する。相同組換えを使用して、異種の遺伝子に機能的に連結したプロモーターを調製するように、本開示のプロモーターが、内因性プロモーターおよび内因性配列に取って代わる。その組換えが、遺伝子をその天然遺伝子座に保持しながら、内因性プロモーターの置き換えをもたらすことを当業者は認識しているだろう。特定の非限定的例は下記の表８に示されている。複数のプロモーター−異種の標的ペア（例えば、プロモーターカセット）は、宿主細胞のゲノムへ容易に組み込まれ得る。ある実施形態では、プロモーターカセットは、連続的に、宿主細胞へ組み込まれ得る。ある特定の実施形態では、本開示の組換えベクターは、単一の構築物における２個またはそれより多い異なるプロモーターカセットを提供する。本明細書は、記載された方法を使用して開発することができるプロモーター置き換えの数の実際的な限界を設けない。
【０１３４】
プロモーターラダーを含む複数の宿主細胞であって、複数の宿主細胞のうちの１個の細胞が、異種の標的遺伝子、例えば、補助標的遺伝子、シェル２標的遺伝子、シェル３標的遺伝子、またはシェル４標的遺伝子に作動可能に連結した第１のプロモーターポリヌクレオチドを含み、複数の宿主細胞のうちの第２の細胞が、同じ異種の標的遺伝子に作動可能に連結した第２のプロモーターポリヌクレオチドを含み、第１および第２のプロモーターポリヌクレオチドがプロモーターラダーの異なるプロモーターポリヌクレオチドである、複数の宿主細胞もまた本明細書に記載されている。
【０１３５】
一部の場合には、複数の宿主細胞は、同じ異種の標的遺伝子に作動可能に連結した第３のプロモーターポリヌクレオチドを含む、複数の宿主細胞のうちの第３の細胞をさらに含み、第３のプロモーターポリヌクレオチドは、第１および第２のプロモーターポリヌクレオチドとは異なる、プロモーターラダーのプロモーターポリヌクレオチドである。一部の場合には、複数の宿主細胞は、同じ異種の標的遺伝子に作動可能に連結した第４のプロモーターポリヌクレオチドを含む、複数の宿主細胞のうちの第４の細胞をさらに含み、第４のプロモーターポリヌクレオチドは、第１、第２、および第３のプロモーターポリヌクレオチドとは異なる、プロモーターラダーのプロモーターポリヌクレオチドである。一部の場合には、複数の宿主細胞は、同じ異種の標的遺伝子に作動可能に連結した第５のプロモーターポリヌクレオチドを含む、複数の宿主細胞のうちの第５の細胞をさらに含み、第５のプロモーターポリヌクレオチドは、第１、第２、第３、および第４のプロモーターポリヌクレオチドとは異なる、プロモーターラダーのプロモーターポリヌクレオチドである。一部の場合には、複数の宿主細胞は、同じ異種の標的遺伝子に作動可能に連結した第６のプロモーターポリヌクレオチドを含む、複数の宿主細胞のうちの第６の細胞をさらに含み、第６のプロモーターポリヌクレオチドは、第１、第２、第３、第４、および第５のプロモーターポリヌクレオチドとは異なる、プロモーターラダーのプロモーターポリヌクレオチドである。一部の場合には、複数の宿主細胞は、同じ異種の標的遺伝子に作動可能に連結した第７のプロモーターポリヌクレオチドを含む、複数の宿主細胞のうちの第７の細胞をさらに含み、第７のプロモーターポリヌクレオチドは、第１、第２、第３、第４、第５、および第６のプロモーターポリヌクレオチドとは異なる、プロモーターラダーのプロモーターポリヌクレオチドである。一部の場合には、複数の宿主細胞は、同じ異種の標的遺伝子に作動可能に連結した第８のプロモーターポリヌクレオチドを含む、複数の宿主細胞のうちの第８の細胞をさらに含み、第８のプロモーターポリヌクレオチドは、第１、第２、第３、第４、第５、第６、および第７のプロモーターポリヌクレオチドとは異なる、プロモーターラダーのプロモーターポリヌクレオチドである。
【０１３６】
一部の場合には、プロモーターラダーの第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、および／または第８のプロモーターポリヌクレオチドのそれぞれは、配列番号１〜８から選択される。一部の場合には、プロモーターラダーのプロモーターポリヌクレオチドは、配列番号１、５、および７から選択される。複数の宿主細胞における細胞の数は、少なくとも約１×１０５個、１×１０６個、または１×１０７個の細胞を含み得る。
【０１３７】
ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０００７−ｌｙｓＡおよびＰｃｇ３１２１−ｐｇｉを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ１８６０−ｐｙｃおよびＰｃｇ０００７−ｚｗｆを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０００７−ｌｙｓＡおよびＰｃｇ０００７−ｚｗｆを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ３１２１−ｐｃｋおよびＰｃｇ０００７−ｚｗｆを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０００７＿３９−ｐｐｃおよびＰｃｇ０００７−ｚｗｆを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ３１２１−ｐｃｋおよびＰｃｇ３１２１−ｐｇｉを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ３３８１−ｄｄｈおよびＰｃｇ０００７−ｚｗｆを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＢおよびＰｃｇ０００７−ｚｗｆを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０００７−ｚｗｆおよびＰｃｇ３１２１−ｐｇｉを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ３３８１−ｄｄｈおよびＰｃｇ３１２１−ｐｇｉを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ３１２１−ｐｇｉおよびＰｃｇ１８６０−ｐｙｃを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ１８６０−ｐｙｃおよびＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＢを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ１８６０−ｐｙｃおよびＰｃｇ０００７−ｌｙｓＡを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ１８６０−ａｓｄおよびＰｃｇ０００７−ｚｗｆを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＢおよびＰｃｇ３１２１−ｐｇｉを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ１８６０−ｐｙｃおよびＰｃｇ１８６０−ａｓｄを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ３３８１−ａｓｐＢおよびＰｃｇ１８６０−ｐｙｃを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ３３８１−ｆｂｐおよびＰｃｇ１８６０−ｐｙｃを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ３３８１−ｄｄｈおよびＰｃｇ３３８１−ｆｂｐを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０７５５−ｐｔｓＧおよびＰｃｇ３１２１−ｐｇｉを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ１８６０−ｐｙｃおよびＰｃｇ３１２１−ｐｃｋを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ１８６０−ａｓｄおよびＰｃｇ３１２１−ｐｇｉを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ１８６０−ａｓｄおよびＰｃｇ３３８１−ｆｂｐを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０００７＿３９−ｌｙｓＥおよびＰｃｇ３３８１−ｆｂｐを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ３３８１−ｆｂｐおよびＰｃｇ０００７−ｌｙｓＡを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０００７＿３９−ｌｙｓＥおよびＰｃｇ１８６０−ｐｙｃを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ３１２１−ｐｇｉおよびＰｃｇ３３８１−ｆｂｐを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ３１２１−ｐｃｋおよびＰｃｇ０００７−ｌｙｓＡを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０００７−ｌｙｓＡおよびＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＢを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＢおよびＰｃｇ１８６０−ａｓｄを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ３１２１−ｐｇｉおよびＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＤを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０００７−ｌｙｓＡおよびＰｃｇ３３８１−ｄｄｈを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ３１２１−ｐｃｋおよびＰｃｇ１８６０−ａｓｄを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０００７−ｌｙｓＡおよびＰｃｇ１８６０−ａｓｄを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ３１２１−ｐｃｋおよびＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＢを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ３３８１−ｄｄｈおよびＰｃｇ１８６０−ａｓｄを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０００７＿３９−ｐｐｃおよびＰｃｇ１８６０−ａｓｄを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０００７＿３９−ｐｐｃおよびＰｃｇ０００７−ｌｙｓＡを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ３３８１−ｄｄｈおよびＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＢを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＢおよびＰｃｇ３３８１−ｆｂｐを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０００７＿３９−ｐｐｃおよびＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＢを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ３３８１−ａｓｐＢおよびＰｃｇ３１２１−ｐｃｋを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＢおよびＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＤを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０００７＿３９−ｌｙｓＥおよびＰｃｇ３３８１−ａｓｐＢを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０００７＿３９−ｌｙｓＥおよびＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＤを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ３３８１−ａｓｐＢおよびＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＢを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ１８６０−ａｓｄおよびＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＤを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ３３８１−ａｓｐＢおよびＰｃｇ０００７−ｌｙｓＡを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ３３８１−ａｓｐＢおよびＰｃｇ３３８１−ｄｄｈを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０７５５−ｐｔｓＧおよびＰｃｇ１８６０−ｐｙｃを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０７５５−ｐｔｓＧおよびＰｃｇ３３８１−ｆｂｐを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０００７−ｚｗｆおよびＰｃｇ３３８１−ｆｂｐを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は、プロモーターカセットＰｃｇ０７５５−ｐｔｓＧおよびＰｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＤを含むトランスジェニックＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。
【０１３８】
本開示は、上記のような３個またはそれより多いプロモーターカセットを有する宿主細胞を提供し、含む。ある実施形態では、宿主細胞は、Ｐｃｇ０００７＿３９−ｚｗｆ、Ｐｃｇ０００７＿３９−ｌｙｓＡ、およびＰｃｇ１８６０−ｐｙｃプロモーターカセットを含む。ある実施形態では、宿主細胞はＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞である。
【０１３９】
ある実施形態では、宿主細胞は、前述のプロモーターカセットのいずれか１個を含み、および／あるいはｐｃｇ０００７＿３９−ｄｎａｋ；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ００７４；ｐｃｇ３１２１−ｃｇ００７４；ｐｃｇ１８６０−ｒｈｌｅ＿６０９；ｐｃｇ３１２１−ｃｇ１１４４；ｐｃｇ１８６０−ｒｈｌｅ＿６０９；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２８９９＿２１９４；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ１４８６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｍｋ；ｐｃｇ０００７＿３９−ｒｐｏｂ＿３８３；ｐｃｇ０００７＿３９−ｄｄｌ；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ００２７；ｐｃｇ０００７＿３９−ｄｄｌ；ｐｃｇ０００７＿３９−ｒｐｏｂ＿３８３；ｐｃｇ０００７＿３９−ｒｐｏｂ＿３８３；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ００２７；ｐｃｇ１８６０−ｃｇ１１４４；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ０７２５；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ００２７；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ１５２７；ｐｃｇ０００７＿３９−ｄｄｌ；ｐｃｇ０００７＿３９−ｒｐｏｂ＿３８３；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ０７２５；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ０７２５；ｐｃｇ０００７＿３９−ｄｄｌ；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ０７２５；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ０７２５；ｐｃｇ０００７＿３９−ｈｓｐｒ；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ３３５２；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２８９９＿２１９４；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２９６５；ｐｃｇ０００７＿３９−ｒｐｏｂ＿３８３；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２８９９＿２１９４；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ００７４；ｐｃｇ３１２１−ｃｇ００７４；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６；ｐｃｇ３１２１−ｃｇ１１４４；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２８９９；ｐｃｇ０００７＿３９−ｒｈｏ；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ０７２５；ｐｃｇ１８６０−ｃｇ１１４４；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６  ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｕｒｅｒ；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｕｓｇ；ｐｃｇ３１２１−ｍｕｔｍ２＿２５２２；ｐｃｇ０００７＿３９−ｄｄｌ；ｐｃｇ１８６０−ｃｇ１１４４；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２８９９；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２９６５；ｐｃｇ０００７＿３９−ｄｄｌ；ｐｃｇ３１２１−ｍｕｔｍ２＿２５２２；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｔｙｒａ；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ１４８６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２８９９；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ００２７；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ１５１１；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ１２６２；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃ���３４１９；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ１４８６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ３２１０；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ１４８６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ１４８６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ１４８６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ１４８６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ０７６７；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ２４８１；ｐｃｇ０００７＿３９−ｔｙｒａ；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ１４８６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ１５１１；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ０８２７；ｐｃｇ０００７＿３９−ｔｙｒａ；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ１４８６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ１２６２；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ１４８６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ１２６２；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ１２６２；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ０７６７；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ０３０４；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ１５１１；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ０７６７；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ１２６２；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ１５１１；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ０７６７；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ０７６７；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ１２６２；ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ１４８６；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ１２６２；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ０３０４；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ１２６２；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ０７６７；ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ１２６２、またはそれらの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、もしくは全部の組合せを含む。
【０１４０】
本発明によるプロモーターまたは本発明による発現ユニットはさらに、微生物のパフォーマンス特性を向上させるために使用され、そのパフォーマンス特性には、例えば、収量、力価、生産性、副産物排除、プロセスの一過的逸脱に対する許容度、最適な増殖温度および増殖速度を挙げることができる。一部の実施形態では、本発明によるプロモーターまたは本発明による発現ユニットは、微生物において標的遺伝子を上方制御する（過剰発現）ために使用される。過剰発現は、一般的に、出発株（親株）、または野生株（野生株が出発株ならば）と比較して、リボ核酸、タンパク質（ポリペプチド）、または酵素の細胞内濃度または活性の増加を意味する。一部の実施形態では、本発明によるプロモーターまたは本発明による発現ユニットは、微生物において標的遺伝子を下方制御する（過小発現）ために使用される。過小発現は、一般的に、出発株（親株）、または野生株（野生株が出発株ならば）と比較して、リボ核酸、タンパク質（ポリペプチド）、または酵素の細胞内濃度または活性の減少を意味する。一部の実施形態では、本発明によるプロモーターおよび／または発現ユニットの組合せは、微生物において１つより多い標的遺伝子の発現を制御するために使用され、各標的遺伝子は、上方制御されるかまたは下方制御される。一部の実施形態では、プロモーターおよび／または発現ユニットの組合せにより上方制御または下方制御される標的遺伝子は、同じ代謝経路の要素である。一部の実施形態では、プロモーターおよび／または発現ユニットの組合せにより上方制御または下方制御される標的遺伝子は、同じ代謝経路の要素ではない。
【０１４１】
本明細書に記載されたプロモーターは、対応するＤＮＡによりコードされる微生物における１つまたは複数の酵素（タンパク質）の細胞内活性を、例えば、弱いプロモーターを使用すること、または低活性を有する対応する酵素をコードし、もしくは対応する遺伝子もしくは酵素（タンパク質）を不活性化する遺伝子もしくは対立遺伝子を使用すること、および必要に応じて、これらの手段を組み合わせることにより、減弱する（低下させ、または排除する）ための当技術分野において非常によく知られた他の方法と組み合わせて、使用することができる。
【０１４２】
遺伝子発現の低下は、適切な培養により、または遺伝子発現のシグナル構造の遺伝的改変（変異）により起こり得る。遺伝子発現のシグナル構造は、例えば、リプレッサー遺伝子、アクチベーター遺伝子、オペレーター、プロモーター、アテニュエーター、リボソーム結合部位、開始コドン、およびターミネーターである。専門家は、例えば、特許出願ＷＯ９６／１５２４６、BoydおよびMurphy（Journal  of  Bacteriology  １７０巻：５９４９頁（１９８８年））、VoskuilおよびChambliss（Nucleic  Acids  Research  ２６巻：３５４８頁（１９９８年）、JensenおよびHammer（Biotechnology  and  Bioengineering  ５８巻：１９１頁（１９９８年））、Patekら（Microbiology  １４２巻：１２９７頁（１９９６年））、Vasicovaら（Journal  of  Bacteriology  １８１巻：６１８８頁（１９９９年））、ならびに遺伝学および分子生物学の公知の教科書、例えば、Knippersによる教科書（「Molekulare  Genetik  [Molecular  Genetics]」、第６版、Georg  Thieme  Verlag、Stuttgart、Germany、１９９５年）またはWinnackerによる教科書（「Gene  und  Klone  [Genes  and  Clones]」、VCH  Verlagsgesellschaft、Weinheim、Germany、１９９０年）において、これらに関する情報を見出すことができる。
【０１４３】
酵素タンパク質の触媒性質の変化または低下をもたらす変異は、先行技術から公知である；挙げられ得る例は、QiuおよびGoodman（Journal  of  Biological  Chemistry  ２７２巻：８６１１〜８６１７頁（１９９７年））、Sugimotoら（Bioscience  Biotechnology  and  Biochemistry  ６１巻：１７６０〜１７６２頁（１９９７年））ならびにMoeckel  （「Die  Threonindehydratase  aus  Corynebacterium  glutamicum:  Aufhebung  der  allosterischen  Regulation  und  Struktur  des  Enzyms  [Threonine  dehydratase  from  Corynebacterium  glutamicum:  Cancelling  the  allosteric  regulation  and  structure  of  the  enzyme]」、  Reports  from  the  Juelich  Research  Centre、Juel-2906、ISSN09442952、Juelich、Germany、１９９４年）による研究である。包括的記述は、遺伝学および分子生物学の公知の教科書、例えば、Hagemann（「Allgemeine  Genetik  [General  Genetics]」、  Gustav  Fischer  Verlag、Stuttgart、１９８６年）による教科書に見出すことができる。
【０１４４】
可能な変異は、移行、トランスバージョン、挿入、および欠失である。アミノ酸交換の酵素活性への効果に応じて、ミスセンス変異またはナンセンス変異が言及される。遺伝子における少なくとも１つの塩基対の挿入または欠失は、フレームシフト変異をもたらし、その結果として、間違ったアミノ酸が組み込まれ、または翻訳が早まって中断される。いくつかのコドンの欠失は、典型的には、酵素活性の完全な喪失をもたらす。そのような変異の発生に関する教示は、先行技術であり、遺伝学および分子生物学の公知の教科書、例えば、Knippers（「Molekulare  Genetik  [Molecular  Genetics]」、第６版、Georg  Thieme  Verlag、Stuttgart、Germany、１９９５年）による教科書、Winnacker（「Gene  und  Klone  [Genes  and  Clones]」、VCH  Verlagsgesellschaft、Weinheim、Germany、１９９０年）による教科書、またはHagemann（「Allgemeine  Genetik  [General  Genetics]」、Gustav  Fischer  Verlag、Stuttgart、１９８６年）による教科書に見出すことができる。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの遺伝子を変異させる一般的な方法は、SchwarzerおよびPuehler（Bio/Technology  ９巻、８４〜８７頁（１９９１年））により記載された遺伝子破壊および遺伝子置換の方法である。
【０１４５】
遺伝子破壊の方法において、目的の遺伝子のコード領域の中心的部分が、宿主（典型的にはＥ．ｃｏｌｉ）において複製し得るが、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいては複製し得ないプラスミドベクターにクローニングされる。可能なベクターは、例えば、ｐＳＵＰ３０１（Simonら、Bio/Technology  １巻、７８４〜７９１頁（１９８３年））、ｐＫ１８ｍｏｂもしくはｐＫ１９ｍｏｂ（Schaeferら、Gene  １４５巻、６９〜７３頁（１９９４年））、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢもしくはｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ（Jaegerら、Journal  of  Bacteriology  １７４巻：５４６２〜６５頁（１９９２年））、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡ）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Shuman（１９９４年）、Journal  of  Biological  Chemistry  ２６９巻：３２６７８〜８４頁；米国特許第５，４８７，９９３号）、ｐＣＲ（登録商標）Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｈｏｌｌａｎｄ；Bernardら、Journal  of  Molecular  Biology、２３４巻：５３４〜５４１頁（１９９３年））またはｐＥＭ１（Schrumpfら、１９９１年、Journal  of  Bacteriology  １７３巻：４５１０〜４５１６頁）である。遺伝子のコード領域の中心的部分を含有するプラスミドベクターは、次いで、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの望ましい菌株へ接合または形質転換により移入される。接合の方法は、例えば、Schaeferら（Applied  and  Environmental  Microbiology  ６０巻、７５６〜７５９頁（１９９４年））により記載されている。形質転換の方法は、例えば、Thierbachら（Applied  Microbiology  and  Biotechnology  ２９巻、３５６〜３６２頁（１９８８年））、DunicanおよびShivnan（Bio/Technology  ７巻、１０６７〜１０７０頁（１９８９年））ならびにTauchら（FEMS  Microbiological  Letters  １２３巻、３４３〜３４７頁（１９９４年））により記載されている。「クロスオーバー」事象による相同組換え後、問題の遺伝子のコード領域は、ベクター配列により中断され、２つの不完全な対立遺伝子が得られ、１つが、３’末端を欠損し、１つが５’末端を欠損している。この方法は、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｒｅｃＡ遺伝子を排除するためにFitzpatrickら（Applied  Microbiology  and  Biotechnology  ４２巻、５７５〜５８０頁（１９９４年））により使用されている。
【０１４６】
遺伝子置換の方法において、変異、例えば、欠失、挿入、または塩基交換は、目的の遺伝子においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで確立される。次に、調製された対立遺伝子は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍについて複製的ではないベクターにおいてクローニングされ、次いで、これは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの望ましい宿主へ形質転換または接合により移入される。組込みをもたらす第１の「クロスオーバー」事象、および標的遺伝子または標的配列において切除をもたらす適切な第２の「クロスオーバー」事象による相同組換え後、変異または対立遺伝子の取り込みが達成される。この方法は、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｐｙｃ遺伝子を欠失により排除するためにPeters-Wendisch（Microbiology  １４４巻、９１５〜９２７頁（１９９８年））により使用された。
【０１４７】
本明細書に記載されたプロモーターは、対応するＤＮＡによりコードされる微生物における１つまたは複数の酵素の細胞内活性を、例えば、その遺伝子（複数可）のコピー数を増加させること、強いプロモーターを使用すること、または高活性を有する対応する酵素をコードする遺伝子を使用すること、および必要に応じて、これらの手段を組み合わせることにより、上昇させる（増強する）ための当技術分野において非常によく知られた他の方法と組み合わせて、使用することができる。
【０１４８】
過剰発現を達成するために、対応する遺伝子のコピー数を増加させることができ、または代替として、構造遺伝子の上流に位置する、プロモーターおよび制御領域、またはリボソーム結合部位を変異させることができる。構造遺伝子の上流に組み込まれる発現カセットは同じように働く。誘導性プロモーターによって、酵素アミノ酸産生の過程において発現を増加させることはさらに可能である。発現は、ｍＲＮＡの寿命を延長することを目的とした手段によって同様に向上する。さらに、酵素活性はまた、酵素タンパク質の分解を防止することにより増強される。遺伝子または遺伝子構築物は、異なるコピー数を有するプラスミドに存在し得るか、または染色体に組み込まれて、増幅され得る。あるいは、関連遺伝子の過剰発現はさらに、培地の組成および培養条件を変化させることにより達成され得る。
【０１４９】
当業者は、とりわけ、Martinら（Bio/Technology  ５巻、１３７〜１４６頁（１９８７年））、Guerreroら（Gene  １３８巻、３５〜４１頁（１９９４年））、TsuchiyaおよびMorinaga（Bio/Technology  ６巻、４２８〜４３０頁（１９８８年））、Eikmannsら（Gene  １０２巻、９３〜９８頁（１９９１年））、欧州特許明細書０４７２８６９、米国特許第４，６０１，８９３号、SchwarzerおよびPuehler（Bio/Technology  ９巻、８４〜８７頁（１９９１年）、Reinscheidら（Applied  and  Environmental  Microbiology  ６０巻、１２６〜１３２頁（１９９４年））、LaBarreら（Journal  of  Bacteriology  １７５巻、１００１〜１００７頁（１９９３年））、特許出願ＷＯ９６／１５２４６、Malumbresら（Gene  １３４巻、１５〜２４頁（１９９３年））、日本特許公開明細書ＪＰ−Ａ−１０−２２９８９１、JensenおよびHammer（Biotechnology  and  Bioengineering  ５８巻、１９１〜１９５頁（１９９８年））、Makrides（Microbiological  Reviews  ６０巻：５１２〜５３８頁（１９９６年））、ならびに遺伝学および分子生物学の公知の教科書に、上記に関する詳細を見出すことができる。
【０１５０】
遺伝子は、例えば、エピソームプラスミドによって、過剰発現し得る。適切なプラスミドは、コリネ型細菌において複製されるプラスミドである。多数の公知のプラスミドベクター、例えば、ｐＺ１（Menkelら、Applied  and  Environmental  Microbiology（１９８９年）６４巻：５４９〜５５４頁）、ｐＥＫＥｘ１（Eikmannsら、Gene  １０２巻：９３〜９８頁（１９９１年））、またはｐＨＳ２−１（Sonnenら、Gene  １０７巻：６９〜７４頁（１９９１年））は潜在性プラスミドｐＨＭ１５１９、ｐＢＬ１、またはｐＧＡ１に基づいている。他のプラスミドベクター、例えば、ｐＣＧ４（米国特許第４，４８９，１６０号）、またはｐＮＧ２（Serwold-Davisら、FEMS  Microbiology  Letters  ６６巻、１１９〜１２４頁（１９９０年））、またはｐＡＧ１（米国特許第５，１５８，８９１号）に基づいたプラスミドベクターが同様に使用され得る。
【０１５１】
さらに、例えば、ｈｏｍ−ｔｈｒＢオペロンの複製および増幅についてReinscheidら（Applied  and  Environmental  Microbiology  ６０巻、１２６〜１３２頁（１９９４年））により記載されているような、染色体における組込みによる遺伝子増幅のプロセスが用いられ得ることの助けとなるプラスミドベクターもまた適している。この方法において、完全な遺伝子が、宿主（典型的にはＥ．ｃｏｌｉ）において複製し得るが、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて複製し得ないプラスミドベクターへクローニングされる。適切なベクターは、例えば、ｐＳＵＰ３０１（Simonら、Bio/Technology  １巻、７８４〜７９１頁（１９８３年））、ｐＫ１８ｍｏｂもしくはｐＫ１９  ｍｏｂ（Schaeferら、Gene  １４５巻、６９〜７３頁（１９９４年））、ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、ＵＳＡ）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Shuman（１９９４年）  Journal  of  Biological  Chemistry、２６９巻：３２６７８〜８４頁；米国特許第５，４８７，９９３号）、ｐＣＲ（登録商標）Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；Bernardら、Journal  of  Molecular  Biology、２３４巻：５３４〜５４１頁（１９９３年））、ｐＥＭ１（Schrumpfら、１９９１年、Journal  of  Bacteriology  １７３巻：４５１０〜４５１６頁）、またはｐＢＧＳ８（Sprattら、１９８６年、Gene  ４１巻：３３７〜３４２頁）である。次いで、増幅される遺伝子を含有するプラスミドベクターは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの望ましい菌株へ接合または形質転換により移入される。接合の方法は、例えば、Schaeferら（Applied  and  Environmental  Microbiology  ６０巻、７５６〜７５９頁（１９９４年））により記載されている。形質転換の方法は、例えば、Thierbachら（Applied  Microbiology  and  Biotechnology  ２９巻、３５６〜３６２頁（１９８８年））、DunicanおよびShivnan（Bio/Technology  ７巻、１０６７〜１０７０頁（１９８９年））ならびにTauchら（FEMS  Microbiological  Letters  １２３巻、３４３〜３４７頁（１９９４年））において記載されている。クロスオーバー事象による相同組換え後、生じた菌株は、関連遺伝子の少なくとも２つのコピーを含有する。
【０１５２】
遺伝子発現を制御する、すなわち、増加させるかまたは減少させる方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで提供されたＤＮＡ分子を使用して微生物が作製される組換え方法が挙げられる。そのようなＤＮＡ分子は、例えば、プロモーター、発現カセット、遺伝子、対立遺伝子、コード領域などを含む。それらは、形質転換、接合、形質導入の方法、または類似した方法により望ましい微生物へ導入される。
【０１５３】
本開示の場合、プロモーターは、好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８のポリヌクレオチドであり、発現カセットは、好ましくは、３’末端におけるヌクレオチドを介して、ＲＮＡの翻訳を保証するリンカーポリヌクレオチドに機能的に連結している配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８のポリヌクレオチドである。
【０１５４】
本発明によるプロモーターまたは本発明による発現ユニットを使用する過剰発現の手段は、対応するポリペプチドの活性または濃度を、過剰発現を生じる手段の前の菌株における前記ポリペプチドの活性または濃度に基づいて、通常、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、または５００％、好ましくは、１，０００％以下、２，０００％以下、４，０００％以下、１０，０００％以下、または２０，０００％以下、増加させる。
【０１５５】
発現または過剰発現の程度は、その遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量を測定することにより、ポリペプチドの量を決定することにより、および酵素活性を決定することにより、確立され得る。
【０１５６】
ｍＲＮＡの量は、とりわけ、「ノーザンブロッティング」の方法および定量ＲＴ−ＰＣＲの方法を使用することにより決定され得る。定量ＲＴ−ＰＣＲは、ポリメラーゼ連鎖反応に先行する逆転写を含む。これについて、例えば、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）製のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍが、Jungwirthら（FEMS  Microbiology  Letters  ２８１巻、１９０〜１９７頁（２００８年））に記載されているように、使用され得る。タンパク質の濃度は、１次元および２次元タンパク質ゲル分画、ならびにその後、適切な評価ソフトウェアを使用するゲルにおけるタンパク質濃度の光学的同定によって、決定され得る。コリネ型細菌についてのタンパク質ゲルを調製する通例の方法、および前記タンパク質を同定する通例の方法は、Hermannら（Electrophoresis、２２巻：１７１２〜２３頁（２００１年））により記載された手順である。タンパク質濃度は、同様に、検出されるタンパク質に特異的な抗体を使用するウェスタンブロットハイブリダイゼーション（Sambrookら、Molecular  cloning:  a  laboratory  manual．第２版  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、N.Y.、１９８９年）、およびその後、濃度決定のための適切なソフトウェアを使用する光学的評価（LohausおよびMeyer（１９９８年）Biospektrum  ５巻：３２〜３９頁；Lottspeich、Angewandte  Chemie  ３２１巻：２６３０〜２６４７頁（１９９９年））により決定され得る。収集されたデータの統計的有意性は、Ｔ検定によって決定される（Gosset、Biometrika  ６巻（１号）：１〜２５頁（１９０８年））。
【０１５７】
本発明によるプロモーターを使用する標的遺伝子を過剰発現させる手段は、さらなる過剰発現手段と、適切な様式で組み合わせられ得る。過剰発現は、先行技術における利用可能な複数の方法によって達成される。これらには、遺伝子の発現を命令または調節するヌクレオチド配列を改変することに加えて、コピー数を増加させることが挙げられる。コピー数は、微生物の細胞質において複製するプラスミドによって増加され得る。この目的を達成するために、多数のプラスミドが先行技術において非常に様々な微生物群について記載されており、そのプラスミドは、遺伝子のコピー数の所望の増加を設定するために使用することができる。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に適したプラスミドは、例えば、Tauchら（Journal  of  Biotechnology  １０４巻（１〜３号）、２７〜４０頁、（２００３年））およびStansenら（Applied  and  Environmental  Microbiology  ７１巻、５９２０〜５９２８頁（２００５年））に記載されている。
【０１５８】
コピー数はさらに、微生物の染色体へさらなるコピーを導入することにより少なくとも１コピーだけ、増加され得る。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に適した方法は、例えば、特許ＷＯ０３／０１４３３０、ＷＯ０３／０４０３７３、およびＷＯ０４／０６９９９６に記載されている。
【０１５９】
遺伝子発現はさらに、標的遺伝子の上流に複数のプロモーターを位置づけ、またはそれらを、発現させる遺伝子に機能的に連結して、このようにして発現の増加を達成することにより、増加され得る。これの例は、特許ＷＯ２００６／０６９７１１に記載されている。
【０１６０】
遺伝子の転写は、適切な場合には、転写を抑制するタンパク質（リプレッサータンパク質）または促進するタンパク質（アクチベータータンパク質）により、調節される。したがって、過剰発現は、同様に、アクチベータータンパク質の発現を増加させ、またはリプレッサータンパク質の発現を低下させ、もしくはそのスイッチを切り、あるいは、リプレッサータンパク質の結合部位を排除することにより達成することができる。伸長の速度は、コドン使用頻度によって影響され、出発株において頻度が高い、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）についてのコドンを利用することにより、翻訳を増強することは可能である。さらに、開始コドンを、多くの微生物において最も頻度の高い（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて７７％）ＡＴＧコドンと置き換えることは、翻訳をかなり向上させ得、ＲＮＡレベルにおいて、ＡＵＧコドンは、例えばコドンＧＵＧおよびＵＵＧより２〜３倍、効果的であるためである（Khudyakovら、FEBS  Letters  ２３２巻（２号）：３６９〜７１頁（１９８８年）；Reddyら、Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  USA  ８２巻（１７号）：５６５６〜６０頁（１９８５年））。開始コドンと隣接領域の間の相乗効果は記載されているため、開始コドンを囲む配列を最適化することもまた可能である（Stenstroemら、Gene  ２７３巻（２号）：２５９〜６５頁（２００１年）；Huiら、EMBO  Journal  ３巻（３号）：６２３〜９頁（１９８４年））。
【０１６１】
ＤＮＡを操作すること、ＤＮＡの消化およびライゲーション、形質転換および形質転換体の選択についての教示は、とりわけ、Sambrookら、「Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual」、第２版（Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、１９８９年）による公知のマニュアルに見出すことができる。
【０１６２】
本開示はまた、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【０１６３】
KirchnerおよびTauch（Journal  of  Biotechnology  １０４巻：２８７〜２９９頁（２００３年））は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに使用されるベクターの選択を記載する。
【０１６４】
本発明によるベクターを使用する相同組換えは、染色体上のＤＮＡセグメントが、ベクターにより細胞へ輸送される本発明によるポリヌクレオチドに置き換えられることを可能にする。ベクターの環状ＤＮＡ分子と染色体上の標的ＤＮＡの間の効率的な組換えについて、本発明によるポリヌクレオチドに置き換えられるＤＮＡ領域は、その末端において、ベクターの組込みの部位およびＤＮＡの置換の部位を決定する、標的部位と相同なヌクレオチド配列と共に提供される。
【０１６５】
したがって、本発明によるプロモーターポリヌクレオチドは、１）染色体における標的遺伝子の天然遺伝子座における天然プロモーターと置き換えられ得、または２）染色体の天然遺伝子座における標的遺伝子と、もしくは別の遺伝子座における標的遺伝子と統合され得る。
【０１６６】
「標的遺伝子の天然遺伝子座における天然プロモーターの置き換え」とは、対応する野生型または対応する出発生物体においてそのヌクレオチド配列の形でその遺伝子座で単一コピーとして通常、天然で存在する遺伝子の天然に存在するプロモーターが置き換えられるという事実を意味する。
【０１６７】
「別の遺伝子座」とは、そのヌクレオチド配列が標的遺伝子の配列とは異なる遺伝子座を意味する。前記他の遺伝子座または前記他の遺伝子座におけるヌクレオチド配列は、好ましくは、染色体内に位置し、通常、増殖および所望の化合物の産生に必須ではない。染色体内の遺伝子間領域、すなわち、コーディング機能をもたないヌクレオチド配列を使用することはさらに可能である。
【０１６８】
発現または過剰発現は、好ましくは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の微生物において実行される。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属内では、以下の種に基づいた菌株が優先される：Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ（寄託された基準株はＤＳＭ４４５４９である）；Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（寄託された基準株はＡＴＣＣ１３０３２である）；およびＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ（寄託された基準株はＡＴＣＣ６８７１である）。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ種が極めて特に優先される。
【０１６９】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の、特にＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ種の適切な菌株は、特に、既知の野生型株：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１５８０６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ  ＡＴＣＣ１７９６５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ  ＡＴＣＣ１４０２０；ならびにそれらから調製されたＬ−アミノ酸産生変異体または菌株、例えば、Ｌ−リシン産生株：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７０９、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７０８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７１２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  ６４６３、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  ６４６４、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＭ５８−１、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＧ５２−５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＳＭ５７１４、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＳＭ１２８６６である。
【０１７０】
用語「Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ」もまた、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの代わりに使用されていた。Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ種の一部の代表は、例えば、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９株など、先行技術において、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓとも呼ばれていた。
【０１７１】
本発明による発現または過剰発現手段に用いられる微生物または菌株（出発株）は、好ましくは、所望のファインケミカルを周囲の栄養培地へ分泌し、かつそこに蓄積する能力をすでに有する。本明細書の下記において、語句「産生するための」もまた、このことについて使用される。より具体的には、過剰発現手段に用いられる菌株は、所望のファインケミカルを、細胞内、または栄養培地において、１２０時間以内、９６時間以内、４８時間以内、３６時間以内、２４時間以内、または１２時間以内に、少なくとも０．１０ｇ／Ｌ、少なくとも０．２５ｇ／Ｌ、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、少なくとも１．０ｇ／Ｌ、少なくとも１．５ｇ／Ｌ、少なくとも２．０ｇ／Ｌ、少なくとも４．０ｇ／Ｌ、または少なくとも１０．０ｇ／Ｌの濃度で蓄積する能力を有する。出発株は、好ましくは、変異誘発および選択により、組換えＤＮＡテクノロジーにより、または両方の方法の組合せにより調製された菌株である。
【０１７２】
本発明の手段に適した微生物がまた、野生株、例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ基準株ＡＴＣＣ  １３０３２またはＡＴＣＣ  １４０６７株において標的遺伝子の過剰発現または過小発現のために、本発明によるプロモーター、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８を最初に用い、次いで、先行技術に記載されたさらなる遺伝的手段によって、微生物に所望のファインケミカルを産生させることにより、獲得され得ることを、当業者は理解している。
【０１７３】
用語「生体分子」とは、本発明の手段に関して、アミノ酸、有機酸、ビタミン、ヌクレオシド、およびヌクレオチドを意味する。タンパク質を構成するアミノ酸、タンパク質を構成しないアミノ酸、高分子、および有機酸が特に優先される。
【０１７４】
「タンパク質を構成するアミノ酸」とは、天然タンパク質、すなわち、微生物、植物、動物、およびヒトのタンパク質に存在するアミノ酸を意味する。それらは、それらが互いにペプチド結合を介して連結しているタンパク質についての構造単位としての役割を果たす。
【０１７５】
Ｌ−アミノ酸またはアミノ酸が本明細書の下記で言及される場合、それらは、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタメート、Ｌ−グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン、Ｌ−バリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−トリプトファン、およびＬ−アルギニンの群から選択される、それらの塩を含む、１つまたは複数のアミノ酸を意味すると理解されるべきである。Ｌ−リシンは特に好ましい。Ｌ−アミノ酸、特にリシンは、ヒト医学および医薬産業、食品産業、ならびに極めて特に、動物栄養において使用される。したがって、アミノ酸、特にＬ−リシンの調製のための新しい向上したプロセスを提供することに一般的な関心が寄せられている。
【０１７６】
タンパク質およびポリペプチドという用語は交換可能である。
【０１７７】
本開示は、ファインケミカルを産生する微生物であって、プロモーターラダーのプロモーター、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８から選択されるプロモーターを使用することにより、特定の出発株と比較して、１つまたは複数の遺伝子の発現が増加している、微生物を提供する。
【０１７８】
発酵的調製
本開示は、
ａ）本開示による上記の微生物を適切な培地中で培養して、発酵ブロスを生じるステップ；ならびに
ｂ）ａ）の発酵ブロスにおいて、および／または微生物の細胞において、ファインケミカルを濃縮するステップ
を含む、ファインケミカルの発酵的調製のためのプロセスをさらに提供する。
【０１７９】
ここでファインケミカル含有発酵ブロスからファインケミカルまたは液体もしくは固体ファインケミカル含有生成物を得ることが優先される。作製された微生物は、所望の有機化合物を産生するために、例えば、ＷＯ０５／０２１７７２に記載されているように連続的に培養され、あるいはバッチプロセス（バッチ培養）で、またはフェドバッチもしくは反復フェドバッチプロセスで非連続的に培養され得る。公知の培養方法についての一般的な性質の概要は、Chmielによる教科書（Bioprozesstechnik.  １巻：Einfuehrung  in  die  Bioverfahrenstechnik（Gustav  Fischer  Verlag、Stuttgart、１９９１年））またはStorhasによる教科書（Bioreaktoren  and  periphere  Einrichtungen（Vieweg  Verlag、Braunschweig/Wiesbaden、１９９４年））において入手可能である。
【０１８０】
使用される培養培地または発酵培地は、適切な様式でそれぞれの菌株の要求を満たさなければならない。様々な微生物についての培養培地の記載は、「Manual  of  Methods  for  General  Bacteriology」、American  Society  for  Bacteriology（Washington  D.C.、USA、１９８１年）に載っている。用語培養培地および発酵培地は交換可能である。
【０１８１】
炭素源として、糖および炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、サトウダイコンまたはサトウキビ加工からのスクロース含有溶液、デンプン、デンプン加水分解物、およびセルロース；油脂、例えば、大豆油、ヒマワリ油、落花生油、およびココナッツ脂肪；脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、およびリノール酸；アルコール、例えば、グリセロール、メタノール、およびエタノール；ならびに有機酸、例えば、酢酸または乳酸を使用することが可能である。
【０１８２】
窒素源として、窒素含有有機化合物、例えば、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、トウモロコシ滲出液、大豆粉、および尿素；または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、および硝酸アンモニウムを使用することが可能である。窒素源は、個々に、または混合物として使用することができる。
【０１８３】
リン源として、リン酸、リン酸二水素カリウム、もしくはリン酸水素二カリウム、または対応するナトリウム含有塩を使用することが可能である。
【０１８４】
培養培地は、追加として、塩を、例えば、増殖に必要である金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、および鉄の塩化物または硫酸塩、例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄の形で含み得る。最後に、アミノ酸、例えば、ホモセリン、およびビタミン、例えば、チアミン、ビオチン、またはパントテン酸などの必須増殖因子が、上記の物質に加えて用いられ得る。
【０１８５】
前記出発材料は、単一バッチの形で培養へ加えられ、または適切な様式で培養中に供給され得る。
【０１８６】
培養のｐＨは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、もしくはアンモニア水などの塩基性化合物；またはリン酸もしくは硫酸などの酸性化合物を適切な様式で用いることにより調節することができる。ｐＨは、一般的に、６．０から８．５まで、好ましくは６．５〜８の値に調整される。発泡を調節するために、消泡剤、例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルを用いることが可能である。プラスミドの安定性を維持するために、適切な選択物質、例えば、抗生物質を培地に加えることは可能である。発酵は、好ましくは、好気性条件下で実行される。これらの条件を維持するために、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば、空気が培養へ導入される。過酸化水素に富む液体を使用することは同様に可能である。発酵は、適切な場合、高圧で、例えば、０．０３から０．２ＭＰａまでの高圧で、実行される。培養の温度は、通常、２０℃から４５℃まで、好ましくは、２５℃から４０℃まで、特に好ましくは、３０℃から３７℃までである。バッチまたはフェドバッチプロセスにおいて、培養は、好ましくは、回収されるのに十分な所望の有機化合物の量が形成されるまで継続される。この目的は、通常、１０時間〜１６０時間以内に達成される。連続プロセスにおいて、より長い培養時間が可能である。微生物の活動は、発酵培地において、および／または前記微生物の細胞において、有機化合物の濃縮（蓄積）を生じる。
【０１８７】
適切な発酵培地の例は、とりわけ、特許、ＵＳ５，７７０，４０９、ＵＳ５，９９０，３５０、ＵＳ５，２７５，９４０、ＷＯ２００７／０１２０７８、ＵＳ５，８２７，６９８、ＷＯ２００９／０４３８０３、ＵＳ５，７５６，３４５、およびＵＳ７，１３８，２６６に見出すことができる。
【０１８８】
発酵中に１回または複数回、濃度を決定するためのＬ−アミノ酸の分析は、Spackmanら（Analytical  Chemistry  ３０巻：１１９０〜１２０６頁（１９５８年））に記載されているように、イオン交換クロマトグラフィー、好ましくは陽イオン交換クロマトグラフィーによりＬ−アミノ酸を分離し、その後、ニンヒドリンを使用するポストカラム誘導体化によって、行われ得る。ポストカラム誘導体化についてニンヒドリンよりむしろオルト−フタルジアルデヒドを用いることも可能である。イオン交換クロマトグラフィーに関する概説論文は、Pickering（LC-GC  Magazine  of  Chromatographic  Science）７巻（６号）、４８４〜４８７頁（１９８９年））に見出すことができる。
【０１８９】
プレカラム誘導体化を、例えば、オルト−フタルジアルデヒドまたはフェニルイソチオシアネートを使用して実行すること、および生じたアミノ酸誘導体を、好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の形での逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーにより、分画することは同様に可能である。この型の方法は、例えば、Lindrothら（Analytical  Chemistry  ５１巻：１１６７〜１１７４頁（１９７９年））に記載されている。
【０１９０】
検出は、測光法で（吸収、蛍光）、行われる。
【０１９１】
アミノ酸分析に関する概要は、とりわけ、LottspeichおよびZorbasによる教科書「Bioanalytik」（Spektrum  Akademischer  Verlag、Heidelberg、Germany  １９９８年）に見出すことができる。
【０１９２】
発酵の過程における１つまたは複数の時点におけるα−ケト酸の濃度の決定は、イオン交換クロマトグラフィー、好ましくは、例えば０．０２５Ｍ硫酸によるＨ＋型のスルホン化スチレン−ジニビルベンゼンポリマーでの陽イオン交換クロマトグラフィーにより、ケト酸および他の分泌された生成物を分離し、その後、２１５ｎｍにおける（あるいはまた、２３０または２７５ｎｍにおける）ＵＶ検出により実行され得る。好ましくは、ＲＥＺＥＫ  ＲＦＱ−Ｆａｓｔ  Ｆｒｕｉｔ  Ｈ＋カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）が用いられ得るが、分離相について他の供給業者（例えば、ＢｉｏＲａｄ製のＡｍｉｎｅｘ）が可能である。同様の分離は、その供給業者による適用例に記載されている。
【０１９３】
濃度（単位体積あたりの形成された化合物）、収量（消費された単位炭素源あたりの形成された化合物）、形成（単位体積および時間あたりの形成された化合物）、および特定の形成（単位乾燥細胞物質もしくは乾燥バイオマスおよび時間あたりの形成された化合物、または単位細胞タンパク質および時間あたりの形成された化合物）、あるいは他のプロセスパラメータ、ならびにそれらの組合せの群から選択されるパラメータのうちの１つまたは複数に関する、本発明によるプロモーターバリアントを含有するプロセスまたは発酵プロセスのパフォーマンスは、本発明によるプロモーターバリアントを含有しない微生物を使用するプロセスまたは発酵プロセスに基づいて、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも１．５％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％、増加している。これは、大規模の工業プロセスに関して非常に価値があると考えられる。
【０１９４】
発酵手段は、所望のファインケミカル、好ましくは、アミノ酸、有機酸、ビタミン、ヌクレオシド、またはヌクレオチドを含有する発酵ブロスを生じる。
【０１９５】
ファインケミカルを含有する生成物は、次いで、液状または固形で提供され、または生産され、または回収される。
【０１９６】
発酵ブロスは、微生物が、ある特定の時間の間、およびある特定の温度で培養されている発酵培地または栄養培地を意味する。発酵培地または発酵中に用いられる培地は、所望の化合物の産生ならびに典型的には増殖および生存能を保証する全ての物質または構成成分を含む。
【０１９７】
発酵が完了した時、その結果、生じた発酵ブロスは、
ａ）微生物のバイオマス（細胞集団）であって、前記微生物の細胞の増殖により産生されたバイオマス；
ｂ）発酵中に形成された所望のファインケミカル
ｃ）発酵中におそらく形成された有機副産物；および
ｄ）発酵において消費されなかった、用いられた発酵培地の成分または出発材料の成分、例えば、ビオチンなどのビタミン、または硫酸マグネシウムなどの塩を含む。
【０１９８】
有機副産物は、特定の所望の化合物に加えて、発酵に用いられた微生物により産生され、必要に応じて、分泌される物質を含む。
【０１９９】
発酵ブロスは、培養容器または発酵タンクから取り出され、適切な場合には、収集され、ファインケミカルを含有する生成物を液状または固形で提供するために使用される。語句「ファインケミカル含有生成物を回収すること」もまた、このことについて使用される。最も単純な場合、発酵タンクから取り出されている、ファインケミカル含有発酵ブロス、それ自体が、その回収された生成物を構成する。
【０２００】
ａ）水分の部分的な（＞０％〜＜８０％）〜完全な（１００％）または事実上、完全な（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、または≧９９％）除去；
ｂ）バイオマスの部分的な（＞０％〜＜８０％）〜完全な（１００％）または事実上、完全な（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、または≧９９％）除去であって、バイオマスが、必要に応じて、除去前に不活化される；
【０２０１】
ｃ）発酵中に形成された有機副産物の部分的な（＞０％〜＜８０％）〜完全な（１００％）または事実上、完全な（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、≧９９．３％、または≧９９．７％）の除去；および
ｄ）発酵において消費されなかった、用いられた発酵培地の成分または出発材料の成分の発酵ブロスからの部分的な（＞０％）〜完全な（１００％）または事実上、完全な（≧８０％、≧９０％、≧９５％、≧９６％、≧９７％、≧９８％、≧９９％、≧９９．３％、または≧９９．７％）の除去
からなる群から選択される手段の１つまたは複数により、所望の有機化合物の濃縮または精製が達成される。前記化合物の所望の含有量を有する生成物がこのようにして単離される。
【０２０２】
水分の部分的な（＞０％〜＜８０％）〜完全な（１００％）または事実上、完全な（≧８０％〜＜１００％）除去（手段ａ））はまた乾燥とも呼ばれる。
【０２０３】
プロセスの１つの変形において、水分の、バイオマスの、有機副産物の、および用いられた発酵培地の消費されていない成分の、完全なまたは事実上、完全な除去は、所望の有機化合物の純粋な（≧８０重量％、≧９０重量％）、または高純度（≧９５重量％、≧９７重量％、または≧９９重量％）の生成物形態を生じる。手段ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）についての多数の技術的教示は、先行技術において入手できる。
【０２０４】
要求に応じて、バイオマスは、例えば遠心分離、濾過、デカンテーション、もしくはそれらの組合せなどの分離方法により発酵ブロスから全部、もしくは部分的に除去され得、またはそこに完全に残り得る。適切な場合、バイオマスまたはバイオマス含有発酵ブロスは、適切なプロセスステップ中に、例えば、熱処理（加熱）または酸の添加により、不活化される。
【０２０５】
一手順において、バイオマスは、調製された生成物に全くバイオマスが残存せず（０％）、または多くても３０％、多くても２０％、多くても１０％、多くても５％、多くても１％、もしくは多くても０．１％のバイオマスが残存するだけであるように、完全に、または事実上、完全に除去される。さらなる手順において、バイオマスは除去されず、あるいは、調製された生成物において全部（１００％）のまたは７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、もしくは９９．９％より多くのバイオマスが残存するように、わずかな割合だけ除去される。したがって、本発明による一プロセスにおいて、バイオマスは、≧０％〜≦１００％の割合で除去される。
【０２０６】
最後に、発酵後に得られる発酵ブロスは、バイオマスの完全なまたは部分的な除去の前または後に、酸性ｐＨに、無機酸、例えば、塩酸、硫酸、もしくはリン酸；または有機酸、例えば、プロピオン酸で調整して、最終生成物の操作性を向上させることができる（ＧＢ１，４３９，７２８またはＥＰ１３３１２２０）。バイオマスの全含有量を有する発酵ブロスを酸性化することは同様に可能である。最後に、ブロスは、亜硫酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３、ＧＢ１，４３９，７２８）または別の塩、例えば、亜硫酸のアンモニウム塩、アルカリ金属塩、またはアルカリ土類金属塩を添加することにより安定化させることもできる。
【０２０７】
バイオマスの除去中、発酵ブロスに存在するいかなる有機または無機固体も部分的に、または完全に除去される。発酵ブロス中に溶解した有機副産物、および発酵培地（出発材料）の溶解した消費されていない成分は、生成物中、少なくとも部分的に（＞０％）、好ましくは少なくとも２５％の程度まで、特に好ましくは少なくとも５０％の程度まで、非常に特に好ましくは、少なくとも７５％の程度まで、残存する。適切な場合、それらはまた、生成物において完全に（１００％）、または＞９５％もしくは＞９８％もしくは＞９９％を意味する事実上、完全に残存する。この意味における生成物が発酵ブロスの成分の少なくとも一部を含む場合には、これはまた、「発酵ブロスに基づいた生成物」という用語で記載される。
【０２０８】
その後、水分はブロスから除去され、または前記ブロスは、公知の方法により、例えば、ロータリーエバポレータ、薄膜エバポレータ、流下膜式エバポレータを使用して、逆浸透により、またはナノ濾過により、濃厚または濃縮される。この濃縮された発酵ブロスは、次いで、自由流動性生成物、特に、細かい粉末または好ましくは粗い顆粒にまで、凍結乾燥、噴霧乾燥、噴霧顆粒化の方法により、または例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００６６５５により記載されているように循環流動床においてなどの他のプロセスにより、生じさせることができる。所望の生成物は、適切な場合、生じた顆粒からスクリーニングまたは除塵により単離される。発酵ブロスを直接的に、すなわち、噴霧乾燥または噴霧顆粒化による前もっての濃縮なしに、乾燥させることは同様に可能である。
【０２０９】
「自由流動性」とは、異なるサイズのオリフィスを有する一連のガラスオリフィス容器から、少なくとも、５ｍｍオリフィスを有する容器から妨げられずに流れる粉末を意味する（Klein：Seifen,  Oele,  Fette,  Wachse  ９４巻、１２頁（１９６８年））。
【０２１０】
「細かい」とは、大部分（＞５０％）が２０から２００μｍまでの直径の粒子サイズを有する粉末を意味する。
【０２１１】
「粗い」とは、大部分（＞５０％）が２００から２０００μｍまでの直径の粒子サイズの生成物を意味する。
【０２１２】
粒子サイズ決定は、レーザー回折分光法の方法により行うことができる。対応する方法は、R.  H.  MuellerおよびR.  Schuhmannによる教科書「Teilchengroessenmessung  in  der  Laborpraxis」、Wissenschaftliche  Verlagsgesellschaft  Stuttgart（１９９６年）またはWiley  &  Sons（１９９８年）により出版されたM.  Rhodesによる教科書「Introduction  to  Particle  Technology」に記載されている。
【０２１３】
自由流動性の細かい粉末は、次に、適切な圧縮または顆粒化プロセスにより、粗く、非常に自由流動性が高く、保存可能で、実質的に無塵の生成物へ変換することができる。
【０２１４】
用語「無塵の」とは、生成物が、直径１００μｍ未満の粒子サイズをわずかな割合（＜５％）だけ、含むことを意味する。
【０２１５】
この発明の意味における「保存可能な」とは、乾燥した涼しい環境において、少なくとも１年間またはそれより長く、好ましくは少なくとも１．５年間またはそれより長く、特に好ましくは２年間またはそれより長く、それぞれの有機化合物のいかなる実質的な損失も生じることなく、保存され得る生成物を意味する。「実質的な損失」とは、＞５％の損失を意味する。
【０２１６】
顆粒化または圧縮中、食品もしくは飼料の加工に結合剤、ゲル化剤、もしくは増粘剤として通常使用されるような、通常の有機もしくは無機補助剤もしくは担体、例えば、デンプン、ゼラチン、セルロース誘導体、もしくは類似した物質、またはさらなる物質、例えば、シリカ、シリケート（ＥＰ０７４３０１６Ａ）、およびステアレートを用いることは有利である。
【０２１７】
ＷＯ０４／０５４３８１に記載されているように、生じた顆粒の表面を油脂で処理することはさらに有利である。使用することができる油は、鉱油、植物油、または植物油の混合物である。そのような油の例は、大豆油、オリーブ油、大豆油／レシチン混合物である。同じように、シリコーン油、ポリエチレングリコール、またはヒドロキシエチルセルロースもまた適している。顆粒の表面の前記油での処理は、その生成物の耐摩耗性の増加および粉塵含有量の低下を達成する。生成物における油含有量は、飼料用添加物の総量に対して、０．０２〜２．０重量％、好ましくは０．０２〜１．０重量％、非常に特に好ましくは０．２〜１．０重量％である。
【０２１８】
好ましい生成物は、≧９７重量％の割合が１００〜１８００μｍまでの粒子サイズを有し、または≧９５重量％の割合が直径３００〜１８００μｍの粒子サイズを有する。塵、すなわち、粒子サイズ＜１００ｐｍを有する粒子の割合は、好ましくは、＞０〜１重量％であり、特に好ましくは０．５重量％を超えない。
【０２１９】
しかしながら、代替として、生成物はまた、飼料の加工における公知かつ通例の有機もしくは無機担体、例えば、シリカ、シリケート、粗挽き粉、ふすま、穀粉、デンプン、糖などに吸収され、ならびに／または通例の増粘剤もしくは結合剤と混合され、それで安定化され得る。それについての使用およびプロセスの例は、文献（Die  Muehle  +  Mischfuttertechnik  １３２巻（１９９５年）４９号、８１７頁）に記載されている。
【０２２０】
以下の実施例は、例証を目的として提供され、限定を目的とするものではない。
【実施例】
【０２２１】
（実施例１）
候補プロモーターのＬ−リシン生合成経路への適用
本開示のプロモーターは、宿主細胞における生体分子の産生のためのプロセスの向上に有用である。本開示のプロモーターの適用および使用の例は、アミノ酸Ｌ−リシンの産生を対象とする。
【０２２２】
図１は、Ｌ−リシンの産生のための生合成経路を提示し、全体的なＬ−リシン収量の低下をもたらす、経路由来の中間体を転用する遺伝子ｐｃｋ、ｏｄｘ、ｉｃｄ、およびｈｏｍ（例えば、ホモセリン／スレオニンシンターゼ経路）を含む。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ株ＡＴＣＣ  １３０３２におけるシンボル、遺伝子名、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ番号（ＥＣ番号）、およびマップ位置は表３に提供されている。
【０２２３】
表３に提供されているような標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１〜８のプロモーターを含む組換えベクターを、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍクローニングベクターへ酵母相同組換えクローニング技術を使用して、各プロモーターが直列反復領域に隣接したベクターを構築して、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおいて標的遺伝子座で相同組換えを提供するように、クローニングする。組換えにより、内因性プロモーターは、内因性Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ遺伝子座におけるそれぞれの標的遺伝子に機能的に連結した配列番号１〜８のプロモーターにより置き換えられる。そのプロモーターおよび機能的に連結した標的遺伝子を含む様々なターゲティングベクターは、０．５Ｋｂ、１Ｋｂ、２Ｋｂ、および５Ｋｂの範囲の様々な相同直列反復アーム長を含んだ。各ＤＮＡ挿入断片を、商業的に供給されたオリゴおよび鋳型として上記の宿主株ゲノムＤＮＡを使用して相同領域のＰＣＲ増幅により作製した。ゲノムへ導入されるプロモーターは、オリゴテールにコードされた。ＰＣＲ断片を、酵母における相同組換えを使用するベクターバックボーンへと構築した。
【０２２４】
ベクターを、最初、標準熱ショック形質転換技術を使用してＥ．ｃｏｌｉへ形質転換し、正しく構築されたクローンを同定および検証する。形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ細菌を、構築成功について試験する。各Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換プレートからの４個のコロニーを培養し、正しい構築についてＰＣＲにより試験する。ベクターを、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換のためのベクターＤＮＡを提供するためにＥ．ｃｏｌｉ宿主において増幅する。
【０２２５】
検証されたクローンを、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ宿主細胞へエレクトロポレーションによって形質転換する。各形質転換について、ＤＮＡの１μｇあたりコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数は、挿入断片サイズの関数として決定される。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍゲノム組込みは、相同アーム長の関数として分析される。より短いアームは効率がより低い。
【０２２６】
挿入カセットの組込みに成功していると同定されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍの培養は、ｓａｃｂ選択遺伝子のループアウトについて対抗選択するために５％スクロースを含有する培地で培養される。様々な相同直列反復アームについてのスクロース抵抗性頻度は、アーム長によって有意に変化することはない。これらの結果は、ループアウト効率が０．５ｋｂ〜５ｋｂの相同アーム長に渡って一定に保たれることを示唆している。
【０２２７】
ループアウト事象をさらに検証するために、スクロース抵抗性を示すコロニーを培養し、シーケンシングにより分析する。挿入ゲノム領域のシーケンシングの結果は、下記の表６に要約されている。
【０２２８】
【表６】
2020524492.tif 000015
【０２２９】
シーケンシング結果は、ループアウトにおける１０〜２０％効率を示す。いかなる特定の理論にも制限されるつもりはないが、ループアウトは挿入配列に依存する可能性がある。たとえ正しいとしても、１０〜２０個のスクロース抵抗性コロニーを採取することは、高い成功率をもたらす。
【０２３０】
組込みにより、組換えベクターは、内因性プロモーター配列を、Ｐｃｇ１８６０（配列番号２）、Ｐｃｇ０００７（配列番号３）、Ｐｃｇ０７５５（配列番号４）、Ｐｃｇ０００７＿ｌｉｂ＿２６５（配列番号５）、Ｐｃｇ３３８１（配列番号６）、Ｐｃｇ００７＿ｌｉｂ＿１１９（配列番号７）、およびＰｃｇ３１２１（配列番号８）からなる群から選択されるプロモーターに置き換える。生じた組換え株は以下のリストに提供されている：
【０２３１】
Ｐｃｇ１８６０−ａｓｄ；Ｐｃｇ０７５５−ａｓｄ；Ｐｃｇ０００７＿１１９−ａｓｄ；Ｐｃｇ３１２１−ａｓｄ；Ｐｃｇ０００７＿２６５−ａｓｄ；Ｐｃｇ３３８１−ａｓｄ；Ｐｃｇ１８６０−ａｓｋ；Ｐｃｇ０７５５−ａｓｋ；Ｐｃｇ３１２１−ａｓｋ；Ｐｃｇ０００７＿１１９−ａｓｋ；Ｐｃｇ０００７＿２６５−ａｓｋ；Ｐｃｇ３３８１−ａｓｋ；Ｐｃｇ３３８１−ａｓｐＢ；Ｐｃｇ０００７＿１１９−ａｓｐＢ；Ｐｃｇ０００７＿１１９−ｃｇ０９３１；Ｐｃｇ１８６０−ｃｇ０９３１；Ｐｃｇ０００７＿２６５−ｃｇ０９３１；Ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ０９３１；Ｐｃｇ０７５５−ｃｇ０９３１；Ｐｃｇ０００７−ｃｇ０９３１；Ｐｃｇ０００７−ｄａｐＡ；Ｐｃｇ３３８１−ｄａｐＡ；Ｐｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＡ；Ｐｃｇ０００７＿１１９−ｄａｐＡ；Ｐｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＢ；Ｐｃｇ０７５５−ｄａｐＢ；Ｐｃｇ０００７−ｄａｐＢ；Ｐｃｇ３３８１−ｄａｐＢ；Ｐｃｇ１８６０−ｄａｐＢ  Ｐｃｇ３１２１−ｄａｐＢ；Ｐｃｇ０００７＿１１９−ｄａｐＢ；Ｐｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＤ；Ｐｃｇ０００７＿１１９−ｄａｐＤ；Ｐｃｇ３３８１−ｄａｐＤ；Ｐｃｇ０００７＿３９−ｄａｐＤ；Ｐｃｇ３１２１−ｄａｐＤ；Ｐｃｇ０００７−ｄａｐＤ；Ｐｃｇ１８６０−ｄａｐＤ；Ｐｃｇ０７５５−ｄａｐＤ；Ｐｃｇ３３８１−ｄａｐＥ；Ｐｃｇ３１２１−ｄａｐＥ；Ｐｃｇ０７５５−ｄａｐＥ；Ｐｃｇ０００７＿１１９−ｄａｐＥ；Ｐｃｇ１８６０−ｄａｐＥ；Ｐｃｇ０００７＿３９−ｄａｐＥ；Ｐｃｇ０００７＿２６５−ｄａｐＦ；Ｐｃｇ３３８１−ｄａｐＦ；Ｐｃｇ０００７＿１１９−ｄａｐＦ；Ｐｃｇ０００７−ｄａｐＦ；Ｐｃｇ１８６０−ｄａｐＦ；Ｐｃｇ０００７＿３９−ｄａｐＦ；Ｐｃｇ３３８１−ｄｄｈ；Ｐｃｇ３１２１−ｄｄｈ；Ｐｃｇ０００７＿１１９−ｄｄｈ；Ｐｃｇ０００７＿３９−ｄｄｈ；Ｐｃｇ１８６０−ｄｄｈ；Ｐｃｇ０００７＿２６５−ｄｄｈ；Ｐｃｇ０７５５−ｄｄｈ；Ｐｃｇ０００７−ｄｄｈ；Ｐｃｇ３３８１−ｆｂｐ；Ｐｃｇ０００７＿１１９−ｆｂｐ；Ｐｃｇ１８６０−ｆｂｐ；Ｐｃｇ０００７−ｆｂｐ；Ｐｃｇ３１２１−ｆｂｐ；Ｐｃｇ０７５５−ｆｂｐ；Ｐｃｇ０７５５−ｈｏｍ；Ｐｃｇ３３８１−ｈｏｍ；Ｐｃｇ１８６０−ｈｏｍ；Ｐｃｇ３１２１−ｈｏｍ；Ｐｃｇ０００７＿１１９−ｉｃｄ；Ｐｃｇ３１２１−ｉｃｄ；Ｐｃｇ３３８１−ｉｃｄ；Ｐｃｇ１８６０−ｉｃｄ；Ｐｃｇ０００７＿３９−ｉｃｄ；Ｐｃｇ０００７−ｉｃｄ；Ｐｃｇ０００７＿２６５−ｉｃｄ；Ｐｃｇ０００７−ｌｙｓＡ；Ｐｃｇ０００７＿３９−ｌｙｓＡ；Ｐｃｇ３１２１−ｌｙｓＡ；Ｐｃｇ０００７＿２６５−ｌｙｓＡ；Ｐｃｇ０００７＿１１９−ｌｙｓＡ；Ｐｃｇ３３８１−ｌｙｓＡ；Ｐｃｇ０００７＿３９−ｌｙｓＥ；Ｐｃｇ０００７−ｌｙｓＥ；Ｐｃｇ０００７＿２６５−ｌｙｓＥ；Ｐｃｇ３１２１−ｌｙｓＥ；Ｐｃｇ３３８１−ｌｙｓＥ；Ｐｃｇ０００７＿１１９−ｌｙｓＥ；Ｐｃｇ３３８１−ｏｄｘ；Ｐｃｇ０００７＿２６５−ｏｄｘ；Ｐｃｇ０７５５−ｏｄｘ；Ｐｃｇ０００７−ｏｄｘ；Ｐｃｇ１８６０−ｏｄｘ；Ｐｃｇ０００７＿３９−ｏｄｘ；Ｐｃｇ０００７＿１１９−ｏｄｘ；Ｐｃｇ３１２１−ｏｄｘ；Ｐｃｇ３１２１−ｐｃｋ；Ｐｃｇ���３８１−ｐｃｋ；Ｐｃｇ０００７＿１１９−ｐｃｋ；Ｐｃｇ０００７＿２６５−ｐｃｋ；Ｐｃｇ０７５５−ｐｃｋ；Ｐｃｇ０００７＿３９−ｐｃｋ；Ｐｃｇ０００７−ｐｃｋ；Ｐｃｇ１８６０−ｐｃｋ；Ｐｃｇ３１２１−ｐｇｉ；Ｐｃｇ０００７＿１１９−ｐｇｉ；Ｐｃｇ３３８１−ｐｇｉ；Ｐｃｇ０００７＿２６５−ｐｇｉ；Ｐｃｇ１８６０−ｐｇｉ；Ｐｃｇ０００７−ｐｇｉ；Ｐｃｇ０００７＿３９−ｐｐｃ；Ｐｃｇ０００７＿２６５−ｐｐｃ；Ｐｃｇ０７５５−ｐｐｃ；Ｐｃｇ３３８１−ｐｐｃ；Ｐｃｇ０００７＿１１９−ｐｐｃ；Ｐｃｇ１８６０−ｐｐｃ；Ｐｃｇ３１２１−ｐｐｃ；Ｐｃｇ０７５５−ｐｔｓＧ；Ｐｃｇ１８６０−ｐｔｓＧ；Ｐｃｇ０００７＿３９−ｐｔｓＧ；Ｐｃｇ３３８１−ｐｔｓＧ；Ｐｃｇ０００７＿１１９−ｐｔｓＧ；Ｐｃｇ３１２１−ｐｔｓＧ；Ｐｃｇ１８６０−ｐｙｃ；Ｐｃｇ０７５５−ｐｙｃ；Ｐｃｇ０００７＿３９−ｐｙｃ；Ｐｃｇ０００７＿２６５−ｐｙｃ；Ｐｃｇ０００７−ｐｙｃ；Ｐｃｇ３３８１−ｐｙｃ；Ｐｃｇ０００７＿１１９−ｐｙｃ；Ｐｃｇ３１２１−ｐｙｃ；Ｐｃｇ３１２１−ｔｋｔ；Ｐｃｇ０００７＿１１９−ｔｋｔ；Ｐｃｇ０７５５−ｔｋｔ；Ｐｃｇ０００７−ｔｋｔ；Ｐｃｇ３３８１−ｔｋｔ；Ｐｃｇ０００７＿２６５−ｔｋｔ；Ｐｃｇ０００７−ｚｗｆ；Ｐｃｇ０７５５−ｚｗｆ；Ｐｃｇ０００７＿２６５−ｚｗｆ；およびＰｃｇ１８６０−ｚｗｆ；Ｐｃｇ３１２１−ｚｗｆ。
【０２３２】
複数個の単一コロニーを採取し、接種し、小規模培養として増殖させる。試験プロモーターを含むそれぞれの新しく生成された株を、生成物力価パフォーマンスを評価するように設計された小規模培養においてリシン収量について試験する。小規模培養は、工業規模培養からの培地を使用して行われる。生成物力価は、標準比色アッセイで、炭素消耗（すなわち、単一バッチ収量を表す）について光学的に測定される。簡単に述べれば、濃縮されたアッセイ混合物を調製し、試薬の最終濃度が１６０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、０．２ｍＭ  Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ、０．２Ｕ／ｍＬ西洋ワサビペルオキシダーゼ、および０．００５Ｕ／ｍＬのリシンオキシダーゼであるように発酵試料に加える。反応は完了へと進み、光学密度が、Ｔｅｃａｎ  Ｍ１０００プレート分光光度計を使用して、５６０ｎｍ波長において測定される。
【０２３３】
一部の場合には、Ｌ−リシンの収量は、操作されていない株に対して２４％より多く（例えば、組換え株７０００００７８４０）、増加している。他の実施形態では、Ｌ−リシンの収量は、９０％近く（例えば、組換え株７０００００７７３）、減少している。ｐｇｉおよびｚｗｆについてのプロモーターの置き換えは、Ｌ−リシン産生に１０％より高い向上を生じる。
【０２３４】
注目すべきことには、Ｌ−リシンの産生は、単に、最も活性の高いプロモーターを組み込むことに依存するものではない。リシン収量は、相対的に弱いプロモーター（例えば、１、７×、もしくは４８×の相対的プロモーター発現を有するｐｇｉ、または７×の相対的プロモーター強度におけるｄａｐＢ）により最大化され、または中間体発現（例えば、４５４×の相対的プロモーター発現を有するｌｙｓＡ）により最大化される。ある特定の場合には、発現は、相対的プロモーター強度が最大化された時に最大である（例えば、ｐｐｃ）。遺伝学的経路における遺伝子の位置は、Ｌ−リシン収量の相対的増加もしくは減少または最適なプロモーター強度を確実に予測するものではない。例えば、ｃｇ０９３１の高レベル発現は、結果として収量の向上を生じ、一方、ｄａｐＤのより高いレベルは、結果として、収量の向上なし、または減少を生じる。
【０２３５】
（実施例２）
Ｌ−リシン生合成経路の操作
Ｌ−リシンの収量は、標的遺伝子についてプロモーターのペアを交換することにより改変される。実施例１の構築物は、以下のような組換え生物体を調製するために使用される。
【０２３６】
Ｐｃｇ０００７−ｌｙｓＡおよびＰｃｇ３１２１−ｐｇｉの組合せは、Ｌ−リシンの最高収量を提供する。
【０２３７】
【表７−１】
2020524492.tif 000016
【表７−２】
2020524492.tif 000017
【表７−３】
2020524492.tif 000018
【０２３８】
（実施例３）
経路から外れた遺伝子に作動可能に連結したプロモーターを用いたＬ−リシン生合成経路の操作
Ｌ−リシンの収量は、経路から外れた第２の異種の標的遺伝子に機能的に連結した第２のプロモーターポリヌクレオチド配列を含むことにより、改変される。異種の標的遺伝子は、ｎｃｇｌ０００９、ｎｃｇｌ００１９、ｎｃｇｌ００５４、ｎｃｇｌ００８２、ｎｃｇｌ０１４２、ｎｃｇｌ０２２３、ｎｃｇｌ０２４１、ｎｃｇｌ０２４２、ｎｃｇｌ０３０４、ｎｃｇｌ０３０６、ｎｃｇｌ０３５６、ｎｃｇｌ０３９８、ｎｃｇｌ０４０８、ｎｃｇｌ０４２４、ｎｃｇｌ０４２５、ｎｃｇｌ０４２７、ｎｃｇｌ０４３９、ｎｃｇｌ０４５８、ｎｃｇｌ０４７１、ｎｃｇｌ０５３１、ｎｃｇｌ０５４６、ｎｃｇｌ０５６４、ｎｃｇｌ０５７３、ｎｃｇｌ０５７８、ｎｃｇｌ０５８１、ｎｃｇｌ０５９８、ｎｃｇｌ０６００、ｎｃｇｌ０６０１、ｎｃｇｌ０６４１、ｎｃｇｌ０６６３、ｎｃｇｌ０６６８、ｎｃｇｌ０７３７、ｎｃｇｌ０７６７、ｎｃｇｌ０８１３、ｎｃｇｌ０８２３、ｎｃｇｌ０８２７、ｎｃｇｌ０８５３、ｎｃｇｌ０８７４、ｎｃｇｌ０８７７、ｎｃｇｌ０９０５、ｎｃｇｌ０９１６、ｎｃｇｌ０９６６、ｎｃｇｌ１０６５、ｎｃｇｌ１１２４、ｎｃｇｌ１１３７、ｎｃｇｌ１１５２、ｎｃｇｌ１１８７、ｎｃｇｌ１１９６、ｎｃｇｌ１２０２、ｎｃｇｌ１２０３、ｎｃｇｌ１２０８、ｎｃｇｌ１２６１、ｎｃｇｌ１２６２、ｎｃｇｌ１２６７、ｎｃｇｌ１３０１、ｎｃｇｌ１３２０、ｎｃｇｌ１３２２、ｎｃｇｌ１３６４、ｎｃｇｌ１３６６、ｎｃｇｌ１３７１、ｎｃｇｌ１３７２、ｎｃｇｌ１４５７、ｎｃｇｌ１４８４、ｎｃｇｌ１５００、ｎｃｇｌ１５０３、ｎｃｇｌ１５０８、ｎｃｇｌ１５１１、ｎｃｇｌ１５４５、ｎｃｇｌ１５５０、ｎｃｇｌ１５８３、ｎｃｇｌ１６０７、ｎｃｇｌ１８５５、ｎｃｇｌ１８５８、ｎｃｇｌ１８８０、ｎｃｇｌ１８８６、ｎｃｇｌ１９００、ｎｃｇｌ１９０５、ｎｃｇｌ１９１１、ｎｃｇｌ１９２８、ｎｃｇｌ１９４８、ｎｃｇｌ１９６１、ｎｃｇｌ２００１、ｎｃｇｌ２００２、ｎｃｇｌ２０１９、ｎｃｇｌ２０４８、ｎｃｇｌ２０７７、ｎｃｇｌ２１０４、ｎｃｇｌ２１４７、ｎｃｇｌ２１５３、ｎｃｇｌ２１９０、ｎｃｇｌ２２０４、ｎｃｇｌ２２１０、ｎｃｇｌ２２１１、ｎｃｇｌ２２４７、ｎｃｇｌ２２５０、ｎｃｇｌ２２７４、ｎｃｇｌ２２８６、ｎｃｇｌ２２８７、ｎｃｇｌ２２９８、ｎｃｇｌ２３２７、ｎｃｇｌ２３９９、ｎｃｇｌ２４２５、ｎｃｇｌ２４４０、ｎｃｇｌ２４４１、ｎｃｇｌ２４４６、ｎｃｇｌ２４４９、ｎｃｇｌ２４７２、ｎｃｇｌ２４７３、ｎｃｇｌ２４８１、ｎｃｇｌ２４９１、ｎｃｇｌ２５０５、ｎｃｇｌ２５２７、ｎｃｇｌ２５３５、ｎｃｇｌ２５３８、ｎｃｇｌ２５５９、ｎｃｇｌ２５６７、ｎｃｇｌ２５６９、ｎｃｇｌ２５７６、ｎｃｇｌ２５８７、ｎｃｇｌ２６１４、ｎｃｇｌ２６６９、ｎｃｇｌ２６８４、ｎｃｇｌ２６９９、ｎｃｇｌ２７０２、ｎｃｇｌ２７５５、ｎｃｇｌ２７８９、ｎｃｇｌ２７９０、ｎｃｇｌ２８０２、ｎｃｇｌ２８２７、ｎｃｇｌ２８８６、ｎｃｇｌ２８９８、ｎｃｇｌ２９０１、ｎｃｇｌ２９０５、ｎｃｇｌ２９２１、ｎｃｇｌ２９２９、ｎｃｇｌ２９３０、ｎｃｇｌ２９３１、ｎｃｇｌ２９８２、およびｎｃｇｌ２９８４から選択される。
【０２３９】
上記で同定された経路から外れた異種の遺伝子の一部分と相同的な配列に連結した、本明細書で同定されたプロモーターを含有する構築物は、表８および９に提供されているような組換え宿主細胞生物体を調製するために使用される。組込みにより、組換えベクターは、内因性プロモーター配列を、Ｐｃｇ１８６０（配列番号２）、Ｐｃｇ０００７（配列番号３）、Ｐｃｇ０７５５（配列番号４）、Ｐｃｇ０００７＿ｌｉｂ＿２６５（配列番号５）、Ｐｃｇ３３８１（配列番号６）、Ｐｃｇ００７＿ｌｉｂ＿１１９（配列番号７）、およびＰｃｇ３１２１（配列番号８）からなる群から選択されるプロモーターに置き換える。生じた組換え株のリストは下記の表８に提供されている。
【０２４０】
複数個の単一コロニー（表８におけるＮ）を採取し、接種し、小規模培養として増殖させる。試験プロモーターを含むそれぞれの新しく生成された株を、生成物力価パフォーマンスを評価するように設計された小規模培養においてリシン収量について試験する。小規模培養は、工業規模培養からの培地を使用して行われる。生成物力価は、標準比色アッセイで、炭素消耗（すなわち、単一バッチ収量を表す）について光学的に測定される。簡単に述べれば、濃縮されたアッセイ混合物を調製し、試薬の最終濃度が１６０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、０．２ｍＭ  Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ、０．２Ｕ／ｍＬ西洋ワサビペルオキシダーゼ、および０．００５Ｕ／ｍＬのリシンオキシダーゼであるように発酵試料に加える。反応は完了へと進み、光学密度が、Ｔｅｃａｎ  Ｍ１０００プレート分光光度計を使用して、５６０ｎｍ波長において測定される。
【０２４１】
表８に示されているように、Ｌ−リシンの収量は、経路から外れた標的遺伝子に機能的に連結した異種のプロモーターを含有しない親株に対して１４％より多く（例えば、組換え株７０００１５２４５１）、増加している。表９における少なくとも３つの異なる株に適用されたそれらのプロモーター置き換えの中で、全体的に最も良いパフォーマンスを示した改変は、ｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ０７２５（６株における平均６．５％収量変化）、ｐｃｇ０００７＿３９−ｎｃｇｌ１２６２（９株における平均６．３％収量変化）、およびｐｃｇ０００７＿３９−ｃｇ２７６６（２３株における平均５．１％収量変化）である。
【０２４２】
注目すべきことには、Ｌ−リシンの産生は、単に、最も活性の高いプロモーターを組み込むことに依存するものではない。ｐｃｇ３１２１−ｍｕｔｍ２＿２５２２改変は、弱いプロモーターを含むが、４株において平均５％、収量を向上させた。
【０２４３】
【表８−１】
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【表８−２】
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【表８−３】
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【表８−４】
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【表８−５】
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【０２４４】
表９に示されているように、異種のプロモーターに作動可能に連結している場合、リシン産生の有意な増加を示す、経路から外れた標的遺伝子は、ある特定のＧＯＳｌｉｍタームの過剰出現を示す。
【０２４５】
【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【表９−５】
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【表９−６】
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【表９−７】
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【表９−８】
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【表９−９】
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【表９−１０】
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【表９−１１】
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【表９−１２】
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【表９−１３】
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【表９−１４】
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【０２４６】
（実施例４）
異なるシェルに属する遺伝子によるＬ−リシン生合成モジュレーションの評価
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノムにわたる遺伝子座を、その遺伝子の発現を制御する天然プロモーターが、配列番号１〜８から選択されるプロモーターで置換された菌株を作製することによるリシン産生への潜在的影響について試験した。各遺伝子座の影響を、配列番号１〜８により定義されるプロモーターからの１つまたは複数のプロモーターで天然プロモーターを個々に置換することにより試験した。
【０２４７】
菌株を、複数回の実験においてリシン産生について試験し、全実験にわたる各株の平均パフォーマンスを計算し、プロモーター改変を欠く対照株と比較した。単一の遺伝子変化によって異なる全ての株ペアを計算し、変化を有する株と変化を有しない株との間での９６時間目におけるリシン産生の差を計算した。変化は、このパフォーマンス差が、この変化によって異なる全ての株ペアにわたって（ｐ＝０．０１において）０より有意に大きい場合には、ヒットと定義される。
【０２４８】
表１０は、試験された各遺伝子座／プロモーター改変の組合せ、およびそのパフォーマンスを提供する。各遺伝子座は、本明細書に定義されているようなシェル名称と共に提供されている。表１０は、各改変された遺伝子座の遺伝子座ｉｄ、発現を改変するために使用されたプロモーター、改変を含有する任意の株が株パフォーマンスの有意な差を有したかどうか、および特定の遺伝子座に関連した遺伝子のシェル割当を提供する。表１０に示されているように、複数の異なるプロモーターを使用して同じ遺伝子座を試験することにより、出願人らは、株パフォーマンスに影響する遺伝子をコードする遺伝子座を同定することができ、それには、リシン産生についての株パフォーマンスとの既知の関係が以前には同定されていなかったシェル４の遺伝子が含まれた（例えば、４９〜５４行目参照）。
【０２４９】
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【表１０−４】
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【表１０−５】
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【表１０−６】
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【表１０−７】
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【表１０−８】
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【表１０−９】
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【表１０−１０】
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【表１０−１１】
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【表１０−１２】
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【表１０−１３】
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【表１０−１４】
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【表１０−１５】
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【表１０−１６】
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【表１０−１７】
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【表１０−１８】
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【表１０−１９】
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【表１０−２０】
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【表１０−２１】
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【表１０−２２】
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【表１０−２３】
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【表１０−２４】
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【表１０−２５】
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【表１０−２６】
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【０２５０】
（実施例５）
系統的ゲノムワイドな摂動についてのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノムにおける遺伝子の様々なシェルへの割当
遺伝子の同定
同定された遺伝子を、それらのリシン産生への影響の関連性に基づいて４つのシェル（１〜４）へ分けた。
【０２５１】
シェル１および２について、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノムにおける遺伝子は、基準株ＡＴＣＣ  １３０３２の配列との相同性によりアノテートされた。シェル１および２における各遺伝子の機能は、ＫＥＧＧ経路データベースを使用することにより決定された。シェル３について、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのゲノムにおける遺伝子は、ＲＡＳＴサーバーを使用してアノテートされた。シェル３における各遺伝子の機能は、各遺伝子のアノテートされた記載における自然言語検索タームを使用して決定された。これらの検索タームは、目的の代謝区域の名前から引き出された文字列であった。
【０２５２】
各シェルへの割当
同定された遺伝子は、もしそれらが、基質グルコースと生成物リシンとの間の直接代謝中間体の変換に関与するならば、シェル１へ割り当てられた。これは、グルコースの細胞の中への輸送、リシンの細胞から外への輸送、および最終的にリシンへ変換される各中間体への、グルコースに最初に含有された炭素の変換に関与する酵素を含んだ。
【０２５３】
同定された遺伝子は、もしそれらが、窒素代謝、ＴＣＡ回路、またはＲＮＡデグラドソーム（degradasome）ＫＥＧＧ経路マップの要素であると同定されるならば、シェル２へ割り当てられた。これらの代謝区域は、以下のそれらのリシン産生との関係性に基づいて選択された：リシンは、バイオマスと比較してかなりの窒素を含有すること、ＴＣＡ回路は、リシンおよびバイオマスの合成のためのエネルギーを発生させること、ならびにＲＮＡデグラドソームは、工業発酵中、十分な産生のために最大にするのに重要であるタンパク質発現を調節すること。
【０２５４】
同定された遺伝子は、もしそれらが、細胞膜輸送、転写、ペプチドグリカン生合成、脂肪酸生合成、およびビオチン代謝の要素であると同定されるならば、シェル３へ割り当てられた。これらの代謝区域は、工業発酵におけるリシンの産生に関係しているが、シェル２において同定された区域ほどではない。輸送は、各細胞の生産性を増加させるのに重要である；転写に関係した遺伝子を変化させることは、細胞全体にわたる遺伝子の系統的改変を可能にする；ペプチドグリカンおよび脂肪酸の合成は、細胞壁生合成に関与し、その細胞壁生合成は、リシンの中間体のうちの１つの終点である；ビオチンは、リシン代謝経路内にある酵素についての重要な補助因子である。
【０２５５】
同定された遺伝子は、それらが、シェル１〜３のいずれにも分類されないならば、シェル４へ割り当てられた。
【０２５６】
この明細書で言及された米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許の刊行物の全ては、本記載と相反しない程度で、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【０２５７】
本明細書に記載された特定の実施形態は、例証のために本明細書に記載されているが、本明細書に記載された精神および範囲から逸脱することなく、様々な改変がなされ得ることは、前述から認識されているだろう。したがって、本開示は、添付の特許請求の範囲による場合を除き、限定されない。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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