(57)【要約】  本開示は、一般に、末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドを含む金属有機構造体ナノ粒子、その製造方法、およびその使用方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチド官能化金属有機構造体（ＭＯＦ）ナノ粒子であって、前記オリゴヌクレオチドが末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドであり、前記リン酸がＭＯＦナノ粒子の金属イオンと金属リン酸結合を形成する、ナノ粒子。
【請求項２】
前記ＭＯＦナノ粒子が、ジルコニウム（Ｚｒ）、クロム（Ｃｒ）、鉄（Ｆｅ）、および／またはアルミニウム（Ａｌ）を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記ＭＯＦが、ＵｉＯ−６６、ＵｉＯ−６７−ｂｐｙ、ＵｉＯ６８−Ｎ３／ＰＣＮ−５８、ＰＣＮ−２２２／ＭＯＦ−５４５、ＰＣＮ−２２３、ＰＣＮ−２２４、ＭＩＬ−１０１（Ａｌ）、ＭＩＬ−１０１（Ｆｅ）、またはＭＩＬ−１０１（Ｃｒ）を含む、請求項２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドが、その３’末端にリン酸基を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドが、その５’末端にリン酸基を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項６】
ペプチド、タンパク質、ナノ粒子、抗体、小分子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される薬剤をさらに含み、前記薬剤が前記ナノ粒子にカプセル化されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドが、（ＧＧＴ）ｎヌクレオチド配列を含み、配列中、ｎが２〜２０である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記ＭＯＦナノ粒子の表面上の末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドの密度が、約２ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜約２４ｐｍｏｌ／ｃｍ２である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記ＭＯＦナノ粒子が、その表面上に複数の末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドを含み、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが、遺伝子発現を調節する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項９に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
前記末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドがＲＮＡである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
前記ＲＮＡが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１１に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド官能化ＭＯＦナノ粒子を作製する方法であって、
（ａ）ＭＯＦナノ粒子を形成するように金属イオンと多座配位子を混合することと、
（ｂ）前記末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドのリン酸基が、金属−リン酸結合による前記ＭＯＦナノ粒子表面上の配位不飽和金属部位（ＣＵＳ）と会合するように、前記ＭＯＦナノ粒子を複数の前記末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドと接触させ、それにより前記オリゴヌクレオチド官能化ＭＯＦナノ粒子を生成することと、を含む、方法。
【請求項１４】
前記多座配位子が、２、３、または４つの配位官能基を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記多座配位子が二座配位子である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記多座配位子が三座配位子である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記多座配位子が、少なくとも１つのカルボキシレート官能基を含む、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記多座配位子が、少なくとも１つの環窒素を有する少なくとも１つの複素環基を含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記多座配位子が、ギ酸、酢酸、シュウ酸、プロパン酸、ブタン二酸、（Ｅ）−ブテン二酸、ベンゼン−１，４−ジカルボン酸、ベンゼン−１，３−ジカルボン酸、ベンゼン−１，３，５−トリカルボン酸、２−アミノ−１，４−ベンゼンジカルボン酸、２−ブロモ−１，４−ベンゼンジカルボン酸、ビフェニル−４，４’−ジカルボン酸、ビフェニル−３，３’，５，５’−テトラカルボン酸、ビフェニル−３，４’，５−トリカルボン酸、２，５−ジヒドロキシ−１，４−ベンゼンジカルボン酸、１，３，５−トリス（４−カルボキシフェニル）ベンゼン、（２Ｅ，４Ｅ）−ヘキサ−２，４−ジエン二酸、１，４−ナフタレンジカルボン酸、ピレン−２，７−ジカルボン酸、４，５，９，１０−テトラヒドロピレン−２，７−ジカルボン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、アデニン、４，４’−ビピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリジン−４−カルボン酸、ピリジン−３−カルボン酸、イミダゾール、１Ｈ−ベンズイミダゾール、２−メチル−１Ｈ−イミダゾール、またはそれらの混合物を含む、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記多座配位子が、テレフタル酸（Ｈ２ＢＤＣ）、２，２’−ビピリジン−５，５’−ジカルボン酸（Ｈ２ＢＰＹ）、２’，５’−ビス（アジドメチル）−［１，１’：４’，１’’−テルフェニル］−４，４’’−ジカルボン酸、（Ｈ２ＴＰＤＣ−Ｎ３）、４，４’，４’’，４’’’−ポルフィリンテトラ安息香酸（Ｈ２ＴＣＰＰ）、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記金属イオンが、１２接続Ｚｒ３クラスター、６接続Ｚｒ３クラスター、８接続Ｚｒ３クラスター、Ｃｒ３クラスター、Ｆｅ３クラスター、Ａｌ３クラスター、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｂ）の前に、前記ＭＯＦナノ粒子を前記薬剤と接触させ、それにより前記薬剤を前記ナノ粒子にカプセル化するステップをさらに含む、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｄ）：塩溶液を前記オリゴヌクレオチド官能化ＭＯＦナノ粒子に添加するステップをさらに含み、ステップ（ｄ）がステップ（ｃ）の後である、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記塩溶液が、０．５Ｍの最終濃度まで添加される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｅ）：前記オリゴヌクレオチド官能化ＭＯＦナノ粒子を１つ以上のナノ粒子と接触させるステップをさらに含み、前記１つ以上のナノ粒子のそれぞれが、前記オリゴヌクレオチド官能化ＭＯＦナノ粒子の表面上の前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするのに十分に相補的なオリゴヌクレオチドを含み、ステップ（ｅ）がステップ（ｄ）の後である、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
遺伝子の発現を阻害する方法であって、前記遺伝子をコードする標的ポリヌクレオチドを、前記標的ポリヌクレオチドの全部または一部に相補的な１つ以上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることを含み、前記オリゴヌクレオチドが、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のナノ粒子の末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドであり、前記標的ポリヌクレオチドと前記末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイズが、前記遺伝子産物の発現を阻害するのに十分な程度の相補性で前記標的ポリヌクレオチドの長さにわたって生じる、方法。
【請求項２７】
前記遺伝子産物の発現がインビボで阻害される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記遺伝子産物の発現がインビトロで阻害される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の活性を上方調節する方法であって、ＴＬＲを有する細胞を請求項１〜１２のいずれか１項に記載のナノ粒子と接触させることを含む、方法。
【請求項３０】
前記末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドが、ＴＬＲアゴニストを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＴＬＲが、ｔｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）、ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）、ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）、ｔｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）、ｔｏｌｌ様受容体６（ＴＬＲ６）、ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）、ｔｏｌｌ様受容体８（ＴＬＲ８）、ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）、ｔｏｌｌ様受容体１０（ＴＬＲ１０）、ｔｏｌｌ様受容体１１（ＴＬＲ１１）、ｔｏｌｌ様受容体１２（ＴＬＲ１２）、およびｔｏｌｌ様受容体１３（ＴＬＲ１３）からなる群から選択される、請求項２９または請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
インビトロで実施される、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
インビボで実施される、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に、末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドを含む金属有機構造体ナノ粒子、その製造方法、およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
政府支援に関する記述
本発明は、空軍科学研究局により授与されたＦＡ９５５０−１４−１−０２７４、陸軍研究局により授与されたＷ９１１ＮＦ−１５−１−０１５１、国立科学財団によって授与されたＤＭＲ１１２１２６２、および国立衛生研究所によって授与されたＵ５４  ＣＡ１９９０９１の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明におけるある特定の権利を有する。
【０００３】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
この出願には、本開示の別の部分として、コンピュータ読み取り可能な形式の配列表（ファイル名：２０１７−１２８＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；サイズ：４，９２３バイト；作成日：２０１８年７月１２日）が含まれる。
【０００４】
発明の背景
ＤＮＡは、そのプログラム可能で配列特異的な相互作用により、ナノ材料を修飾するための汎用性があり強力な配位子であることが知られている。１〜３例えば、球状ナノ粒子（ＮＰ）上にＤＮＡを高密度に官能化することによって、オリゴヌクレオチドを配向し（３’−５’または５’−３’）、球状核酸−ナノ粒子コンジュゲート（ＳＮＡ）を生成することができ、４これは研究および医学におけるさまざまな用途を可能にした珍しい生物学的特性を呈する。実際、多くの生物診断システムおよび遺伝子調節のための治療用リード化合物は現在、ＳＮＡに基づいている。５、６さらに、それらはＤＮＡプログラム可能なアセンブリの概念に基づいた結晶工学アプローチの中心的なビルディングブロックとなった。７〜９これまで、貴金属１、２、１０、酸化物１１、量子ドットナノ粒子をＤＮＡで修飾するためのいくつかのアプローチが開発されてきた。１２しかしながら、優先的にエンドオン様式でＭＯＦナノ粒子をオリゴヌクレオチドで直接修飾する一般的な方法はない。実際、以前のすべてのアプローチでは、静電吸着およびファンデルワールス相互作用などの非特異的相互作用を利用した１３、１４か、またはＤＮＡで官能化する前に粒子表面上に固定化する必要のあるカップリング剤を必要とした１５、１６かのいずれかであり、制御および一般性をあまり付与しない。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本明細書では、高密度のオリゴヌクレオチドでＭＯＦナノ粒子を官能化するための一般的な戦略が提供される。末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドを使用して、ＭＯＦナノ粒子表面上の高密度の配位不飽和金属部位（ＣＵＳ）を化学的に対応させることができる。１７〜２１固体核磁気共鳴（ＳＳＮＭＲ）分光法および粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）により、ＭＯＦのＤＮＡ官能化が金属−リン酸配位によって生じ、ＭＯＦアーキテクチャの構造的完全性および多孔性が修飾後も維持されることが確認されている（図１）。一般性の概念実証として、このアプローチは、４つの金属ノード（Ｚｒ、Ｆｅ、Ｃｒ、Ａｌ）および４つの異なる有機リンカーを特徴とする一連の９つの異なるＭＯＦに拡張された。
【０００６】
したがって、いくつかの態様では、本開示は、オリゴヌクレオチド官能化金属有機構造体（ＭＯＦ）ナノ粒子を提供し、オリゴヌクレオチドは末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドであり、リン酸はＭＯＦナノ粒子の金属イオンと金属リン酸結合を形成する。いくつかの実施形態では、ＭＯＦナノ粒子は、ジルコニウム（Ｚｒ）、クロム（Ｃｒ）、鉄（Ｆｅ）、および／またはアルミニウム（Ａｌ）を含む。さらなる実施形態では、ＭＯＦは、ＵｉＯ−６６、ＵｉＯ−６７−ｂｐｙ、ＵｉＯ６８−Ｎ３／ＰＣＮ−５８、ＰＣＮ−２２２／ＭＯＦ−５４５、ＰＣＮ−２２３、ＰＣＮ−２２４、ＭＩＬ−１０１（Ａｌ）、ＭＩＬ−１０１（Ｆｅ）、またはＭＩＬ−１０１（Ｃｒ）を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドは、その３’末端にリン酸基を有する。さらなる実施形態では、末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドは、その５’末端にリン酸基を有する。いくつかの実施形態では、本開示のナノ粒子は、ペプチド、タンパク質、ナノ粒子、抗体、小分子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される薬剤をさらに含み、薬剤はナノ粒子にカプセル化される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドは、（ＧＧＴ）ｎヌクレオチド配列を含み、配列中、ｎは２〜２０である。さらなる実施形態では、ＭＯＦナノ粒子の表面上の末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドの密度は、約２ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜約２４ｐｍｏｌ／ｃｍ２である。いくつかの実施形態では、ＭＯＦナノ粒子は、その表面上に複数の末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドを含み、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは遺伝子発現を調節する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらなる実施形態では、末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドはＲＮＡである。なおさらなる実施形態では、ＲＮＡは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。
【０００９】
いくつかの態様では、本開示は、（ａ）金属イオンと多座配位子を混合してＭＯＦナノ粒子を形成することと、（ｂ）末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドのリン酸基が、金属−リン酸結合によるＭＯＦナノ粒子表面上の配位不飽和金属部位（ＣＵＳ）と会合するように、ＭＯＦナノ粒子を複数の末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドと接触させ、それによりオリゴヌクレオチド官能化ＭＯＦナノ粒子を生成することと、を含む、本開示のオリゴヌクレオチド官能化ＭＯＦナノ粒子を作製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、多座配位子は、２、３、または４つの配位官能基を含む。さらなる実施形態では、多座配位子は二座配位子である。なおさらなる実施形態では、多座配位子は三座配位子である。いくつかの実施形態では、多座配位子は、少なくとも１つのカルボキシレート官能基を含む。いくつかの実施形態では、多座配位子は、少なくとも１つの環窒素を有する少なくとも１つの複素環基を含む。さらなる実施形態では、多座配位子は、ギ酸、酢酸、シュウ酸、プロパン酸、ブタン二酸、（Ｅ）−ブテン二酸、ベンゼン−１，４−ジカルボン酸、ベンゼン−１，３−ジカルボン酸、ベンゼン−１，３，５−トリカルボン酸、２−アミノ−１，４−ベンゼンジカルボン酸、２−ブロモ−１，４−ベンゼンジカルボン酸、ビフェニル−４，４’−ジカルボン酸、ビフェニル−３，３‘，５，５’−テトラカルボン酸、ビフェニル−３，４’，５−トリカルボン酸、２，５−ジヒドロキシ−１，４−ベンゼンジカルボン酸、１，３，５−トリス（４−カルボキシフェニル）ベンゼン、（２Ｅ，４Ｅ）−ヘキサ−２，４−ジエン二酸、１，４−ナフタレンジカルボン酸、ピレン−２，７−ジカルボン酸、４，５，９，１０−テトラヒドロピレン−２，７−ジカルボン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、アデニン、４，４’−ビピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリジン−４−カルボン酸、ピリジン−３−カルボン酸、イミダゾール、１Ｈ−ベンズイミダゾール、２−メチル−１Ｈ−イミダゾール、またはそれらの混合物を含む。いくつかの実施形態では、多座配位子は、テレフタル酸（Ｈ２ＢＤＣ）、２，２’−ビピリジン−５，５’−ジカルボン酸（Ｈ２ＢＰＹ）、２’，５’−ビス（アジドメチル）−［１，１’：４’，１’’−テルフェニル］−４，４’’−ジカルボン酸、（Ｈ２ＴＰＤＣ−Ｎ３）、４，４’ ，４’ ’ ，４’’’−ポルフィリンテトラ安息香酸（Ｈ２ＴＣＰＰ）、またはそれらの組み合わせを含む。さらなる実施形態では、金属イオンは、１２接続Ｚｒ３クラスター、６接続Ｚｒ３クラスター、８接続Ｚｒ３クラスター、Ｃｒ３クラスター、Ｆｅ３クラスター、Ａｌ３クラスター、またはそれらの組み合わせを含む。なおさらなる実施形態では、本方法は、ステップ（ｂ）の前に、ＭＯＦナノ粒子を薬剤と接触させ、それにより薬剤をナノ粒子にカプセル化するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ステップ（ｄ）：塩溶液をオリゴヌクレオチド官能化ＭＯＦナノ粒子に添加することをさらに含み、ステップ（ｄ）はステップ（ｃ）の後である。いくつかの実施形態では、塩溶液は、０．５Ｍの最終濃度まで添加される。またさらなる実施形態では、本方法は、ステップ（ｅ）：オリゴヌクレオチド官能化ＭＯＦナノ粒子を１つ以上のナノ粒子と接触させるステップをさらに含み、１つ以上のナノ粒子のそれぞれは、オリゴヌクレオチド官能化ＭＯＦナノ粒子の表面上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするのに十分に相補的なオリゴヌクレオチドを含み、ステップ（ｅ）はステップ（ｄ）の後である。
【００１０】
いくつかの態様では、遺伝子をコードする標的ポリヌクレオチドを、標的ポリヌクレオチドの全部または一部に相補的な１つ以上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることを含む、遺伝子の発現を阻害する方法が提供され、オリゴヌクレオチドは、本開示のナノ粒子の末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドであり、標的ポリヌクレオチドと末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイズは、遺伝子産物の発現を阻害するのに十分な程度の相補性で標的ポリヌクレオチドの長さにわたって生じる。いくつかの実施形態では、遺伝子産物の発現はインビボで阻害される。いくつかの実施形態では、遺伝子産物の発現はインビトロで阻害される。
【００１１】
いくつかの態様では、本開示は、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を有する細胞を本開示のナノ粒子と接触させることを含む、ＴＬＲの活性を上方調節する方法を提供する。いくつかの実施形態では、末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲアゴニストを含む。さらなる実施形態では、ＴＬＲは、ｔｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）、ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）、ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）、ｔｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）、ｔｏｌｌ様受容体６（ＴＬＲ６）、ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）、ｔｏｌｌ様受容体８（ＴＬＲ８）、ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）、ｔｏｌｌ様受容体１０（ＴＬＲ１０）、ｔｏｌｌ様受容体１１（ＴＬＲ１１）、ｔｏｌｌ様受容体１２（ＴＬＲ１２）、およびｔｏｌｌ様受容体１３（ＴＬＲ１３）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本方法はインビトロで実施される。いくつかの実施形態では、本方法はインビボで実施される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】（ａ）ＵｉＯ−６６  ＭＯＦナノ粒子の溶媒熱合成の模式図ａ、（ｂ）末端リン酸修飾ＤＮＡおよびその後のＭＯＦ−ＮＰコアサテライトハイブリッドアーキテクチャの配列特異的アセンブリを利用した、ＭＯＦのＤＮＡ修飾を示す。
【図２】ＤＮＡ官能化ＭＯＦナノ粒子の特性評価を示す：（ａ）ＵｉＯ−６６のＳＥＭおよび（ｂ）ＤＮＡ官能化ＵｉＯ６６のＴＥＭ画像。（ｃ）リン酸官能化オリゴヌクレオチドの３１Ｐ｛１Ｈ｝ＳＳＮＭＲスペクトル。挿入図：非結合ホスホジエステル（青）、サイドオンＺｒ結合ホスホジエステル（灰色）、およびＺｒ結合末端リン酸（赤）に対応する３つのリン共鳴。（ｄ）シミュレートされたＵｉＯ−６６のＰＸＲＤ（黒）、ＤＮＡ官能化前（赤）および官能化後（青）の２２５ｎｍのＵｉＯ−６６。（ｅ）相補的なＤＮＡで組み立てられたＭＯＦおよび５０ｎｍの金ナノ粒子凝集体の融解転移。スケールバー＝パネルａでは５００ｎｍ、パネルｂでは２μｍ。
【図３】合成され、さらにＤＮＡで官能化された９つのＭＯＦのライブラリを示す。ＤＮＡ表面被覆に影響する要因を体系的に調査するために、（ａ）有機リンカーの長さ、（ｂ）金属ノードの接続性、ならびに（ｃ）金属クラスターのタイプを独立して意図的に変化させ、ＤＮＡ表面被覆を表面ＳＢＵ密度、ＳＢＵ配位数、およびＭ−Ｏ結合解離エネルギーに対してプロットした。スケールバー＝２００ｎｍ。
【図４】ＵｉＯ−６６、ＵｉＯ−６７−ｂｐｙ、およびＵｉＯ−６８−Ｎ３のＰＸＲＤスペクトルを示す。
【図５】ＰＣＮ−２２２、ＰＣＮ−２２３、およびＰＣＮ−２２４のＰＸＲＤスペクトルを示す。
【図６】ＭＩＬ−１０１（Ｃｒ）、ＭＩＬ−１０１（Ｆｅ）、およびＭＩＬ−１０１（Ａｌ）のＰＸＲＤスペクトルを示す。
【図７】（ａ）ＵｉＯ−６６（２２５±３５ｎｍ）、（ｂ）ＵｉＯ−６７−ｂｐｙ（１７３±１９ｎｍ）、および（ｃ）ＵｉＯ−６８−Ｎ３／ＰＣＮ−５８（１４８±３９ｎｍ）のＳＥＭおよびＴＥＭ画像を示す。
【図８】（ａ）ＰＣＮ−２２２（１９５×４８ｎｍ）、（ｂ）ＰＣＮ−２２３（５３８×４８ｎｍ）、および（ｃ）ＰＣＮ−２２４（１１０±２４ｎｍ）のＳＥＭおよびＴＥＭ画像を示す。
【図９】（ａ）ＭＩＬ−１０１（Ｃｒ）（７８±１６ｎｍ）、（ｂ）ＭＩＬ−１０１（Ｆｅ）（４７０±５７ｎｍ）、および（ｃ）ＭＩＬ−１０１（Ａｌ）（４３４±８６ｎｍ）のＳＥＭおよびＴＥＭ画像を示す。
【図１０】ＤＮＡ相互接続ＭＯＦ  ＮＰ−Ａｕ  ＮＰアセンブリのＴＥＭおよびＥＤＸ特性評価を示す。（ａ）相補的な２２５ｎｍのＤＮＡ−ＵｉＯ−６６  ＭＯＦ  ＮＰおよび２０ｎｍのＤＮＡ−Ａｕ  ＮＰから形成されたナノクラスターの代表的なＨＡＡＤＦ画像。挿入図：ＭＯＦ  ＮＰ−ＡｕＮＰクラスターおよび単一のナノクラスターの模式図。（ｂ）ＭＯＦ  ＮＰおよびＡｕＮＰのプログラム可能なＤＮＡ配位子が、アセンブリの構造的構成（Ａｕ  ＮＰサイズおよびＭＯＦ対Ａｕ  ＮＰ化学量論）を制御する方法を実証するナノクラスターアセンブリのＴＥＭ画像。すべてのスケールバーは１００ｎｍであるが、パネルａは１μｍである。
【図１１】さまざまな形状の相補的なＤＮＡ修飾ＡｕＮＰで組み立てられた２２５ｎｍのＤＮＡ修飾ＭＯＦ  ＮＰコアのＴＥＭ画像を示す：（ａ）球状ＡｕＮＰ（挿入図）、（ｂ）Ａｕナノキューブ（挿入図）、（ｃ）八面体ＡｕＮＰ（挿入図）、（ｄ）Ａｕナノプリズム（挿入図）。すべてのスケールバーは１００ｎｍである。
【図１２】ＤＮＡ修飾金属ＮＰ（ＡｇＮＰ、ＡｕＮＳ、Ｆｅ３Ｏ４）のアセンブリの探索を示す。相補的なＤＮＡ−ＵｉＯ−６６  ＭＯＦ  ＮＰの周りに組み立てられたＤＮＡ修飾銀ナノ粒子（ａ）、相補的なＤＮＡ−ＵｉＯ−６６  ＭＯＦ  ＮＰの周りに組み立てられたＤＮＡ修飾金ナノスター（ｂ）、および相補的なＤＮＡ−ＵｉＯ−６６  ＭＯＦ  ＮＰの周りに組み立てられたＤＮＡ修飾酸化鉄ナノ粒子（ｃ）を示すＥＤＳ元素マッピング。すべてのスケールバーは１００ｎｍである。
【図１３】ＭＯＦ−ＮＰナノクラスターが、一本鎖ＤＮＡと比較して、細胞取り込み能力が高いことを示す。それぞれ８時間および２４時間、異なる形態の核酸とインキュベートしたＳＫ−ＯＶ−３細胞の蛍光顕微鏡写真：（１）２２５ｎｍのＵｉＯ−６６（Ｔａｍｒａ−ＤＮＡで標識）および２０ｎｍのＡｕＮＰで合成したハイブリダイズしたナノクラスター、ならびに（２）合計ＤＮＡ濃度１×１０−６Ｍの色素標識一本鎖ＤＮＡ。スケールバー＝１０μｍ。
【図１４】ＭＯＦ−ＮＰナノクラスターによって引き起こされる無視できる細胞毒性または抗増殖効果を確認するＭＴＴアッセイの結果を示す。
【図１５】フルオレセインカプセル化Ｃｙ５−ＤＮＡ−ＵｉＯ−６６の共焦点顕微鏡画像（ａ）Ｃｙ５チャネル、（ｂ）フルオレセインチャネル、（ｃ）統合画像を示す。
【図１６】溶液中のＭＯＦ−ＡｕＮＰナノクラスターの形成を確認するｃｒｙｏ−ＴＥＭ画像を示す。
【図１７】溶液中のＭＯＦ−ＡｕＮＰナノクラスターの形成を確認するｃｒｙｏ−ＴＥＭ画像を示す。
【図１８】ＵＶ−ｖｉｓ分光法を使用して、遊離コロイドナノ粒子の消光と組み立てられたＭＯＦナノ粒子凝集体を比較した実験結果を示す。
【図１９】ハイブリダイズしたナノクラスターの共焦点Ｚスタック画像を示し、細胞取り込みを確認する。
【図２０】ＮＵ−１０００（左）およびＰＣＮ−２２２（右）ＮＰのサイズ分析を示す。
【図２１】ＮＵ−１０００およびＰＣＮ−２２２  Ｎｐの合成時、インスリンカプセル化、およびＤＮＡ−ＭＯＦコンジュゲートのＰＸＲＤスペクトルを示す。
【図２２】ＤＮＡ−ＮＵ−１０００（左）およびＤＮＡ−ＰＣＮ−２２２（右）ＮＰの形態がＤＮＡ官能化後に維持されていることを確認するＳＥＭ画像を示す。
【図２３】Ｔａｍｒａ−ＤＮＡ−ＮＵ−１０００  ＮＰ（赤）およびＮＵ−１０００  ＮＰ（黒）の典型的なＵＶ−ｖｉｓスペクトルを示す。
【図２４】インスリンのカプセル化およびＤＮＡの官能化後、表面積が大幅に低減していることを明らかにするＮ２の吸脱着等温線を示す。
【図２５】インスリンがメソ細孔およびミクロ細孔の両方を占めることを示唆するＮＵ−１０００およびＰＣＮ−２２２のＤＦＴ孔径分布を示す。
【図２６】（ａ）ＭＯＦ  ＮＰのメソ細孔チャネルへのインスリンのカプセル化、それに続く末端リン酸修飾ＤＮＡを使用した表面官能化の概略図を示す。（ｂ）２つのメソ細孔Ｚｒ  ＭＯＦ：ＮＵ−１０００およびＰＣＮ−２２２／ＭＯＦ−５４５の結晶構造、ならびにそれらのそれぞれの有機リンカー。（ｃ）使用した末端リン酸修飾核酸（３’または５’）。
【図２７】（ａ）合成時のＮＵ−１０００  ＮＰの走査型電子顕微鏡画像（左）および透過型電子顕微鏡（右）画像を示す。（ｂ）合成時のＰＣＮ−２２２  ＮＰのＳＥＭ（左）およびＴＥＭ（右）画像。（ｃ）合成時のＮＰ（上）およびＤＮＡ官能化ＮＰ（下）についてＤＬＳにより測定された、細胞培地中のＮＵ−１０００およびＰＣＮ−２２２のコロイド安定性。（ｄ）ＮＵ−１０００およびＰＣＮ−２２２  ＭＯＦ  ＮＰのＤＮＡ担持およびインスリンカプセル化密度。
【図２８】（ａ）１０μｍのインスリン＠ＤＮＡ−ＮＵ−１０００粒子の代表的な共焦点蛍光顕微鏡写真が、インスリン（ＡＦ６４７チャネル）およびＤＮＡ（ＴＡＭＲＡチャネル）の共局在を確認したことを示す。（ｂ）単一の１０μｍのインスリン＠ＤＮＡ−ＮＵ−１０００結晶のＺスタック画像。（ｃ）４００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で細胞外培地（９０％ＤＭＥＭ培地＋１０％血清）とインキュベートしたＤＮＡ−ＮＵ−１０００  ＮＰおよびＤＮＡ−ＰＣＮ−２２２  ＮＰの分解プロファイル。（ｄ）４００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で、シミュレートした細胞内培地（１×ＰＢＳ、ｐＨ＝７．０）でインキュベートしたＤＮＡ−ＮＵ−１０００ＮＰおよびＤＮＡ−ＰＣＮ−２２２ＮＰの分解プロファイル。（ｅ）天然インスリン（赤）、インスリン＠ＭＯＦ  ＮＰ（ＮＵ−１０００はオレンジ、ＰＣＮ−２２２はピンク）、およびインスリン＠ＤＮＡ−ＭＯＦ  ＮＰ（ＮＵ−−１０００は茶色、ＰＣＮ−２２２は紫）についてＥＬＩＳＡ  により測定した、インスリン活性アッセイ。
【図２９】（ａ〜ｃ）遊離インスリン＋ＤＮＡ（ａ）、インスリン＠ＤＮＡ−ＮＵ−１０００（ｂ）、およびインスリン＠ＤＮＡ−ＰＣＮ−２２２（ｃ）で６時間処理した後のＳＫ−ＯＶ細胞のフローサイトメトリープロットおよび共焦点蛍光顕微鏡写真を示す。（ｄ）フローサイトメトリーによって決定される、異なる構築物において送達されたインスリンの細胞取り込み。さまざまなインキュベーション時間（０．５時間および２時間）でインスリンで処理した後、ＳＫ−ＯＶ細胞において６４７ｎｍでの蛍光を測定した。（ｅ）ＭＴＴアッセイは、インスリン＠ＤＮＡ−ＰＣＮ−２２２およびインスリン＠ＤＮＡ−ＮＵ−１０００  ＮＰによって引き起こされる認識できる細胞毒性がないことを確認する。スケールバー＝１０μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
金属有機構造体（ＭＯＦ）は、化学カーゴの保管および輸送に有望なモジュール式、結晶質、および多孔質の材料のクラスである。ＭＯＦはバルク形態で研究されてきたが、ＭＯＦナノ粒子の外部表面官能性を意図的に操作する方法はあまり開発されていない。それらの表面を修飾する一般化可能なアプローチにより、バルクＭＯＦ構造に依存しない化学官能性を粒子表面上に付与することができる。さらに、オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）などの化学的にプログラム可能な配位子を使用すると、粒子間相互作用の操作が可能になる。本明細書では、末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドによるＭＯＦナノ粒子の外部金属ノードの表面官能化のための配位化学に基づく戦略が提供される。４つの異なる金属種（Ｚｒ、Ｃｒ、Ｆｅ、およびＡｌ）を含む９つの別個の原型ＭＯＦ粒子の外部表面は、この戦略の一般性を示すオリゴヌクレオチドで良好に官能化された。オリゴヌクレオチドのプログラム可能で特異的な相互作用を利用することにより、１１の別個のＭＯＦ粒子−無機粒子コア−サテライトダスターを合成した。これらのハイブリッドナノクラスターでは、ビルディングブロックの相対的な化学量論、サイズ、形状、および組成をすべて独立して制御することができる。本開示は、プログラム可能な材料ビルディングブロックとして、および細胞内プロセスを測定および操作するためのプローブとして有用なオリゴヌクレオチド−ナノ粒子コンジュゲートの新しいセットへのアクセスを提供する。
【００１４】
細胞内送達を介して機能性タンパク質を直接補充することは、それらの本来の環境、それらの大きいサイズ、および帯電した表面の外側のそれらの固有の不安定性のため、いまだ課題である。タンパク質の効果的な細胞内送達のためのオリゴヌクレオチド−ＭＯＦナノ粒子（ＭＯＦ  ＮＰ）コンジュゲートの合成も本明細書で提供される。このような送達ビヒクルの簡単な２段階の調製は、２つの水安定性ジルコニウムＭＯＦ  ＮＰ、ＮＵ−１０００、およびＰＣＮ−２２２／ＭＯＦ−５４５のメソ細孔チャネル内にタンパク質をカプセル化し、続いてリン酸末端オリゴヌクレオチド表面官能化を行うことによって実現した。インスリンは、このシステムのモデルタンパク質として選択された。天然のタンパク質自体と比較して、この戦略を使用することにより、高いタンパク質担持（およそ４０重量％）および１０倍の細胞取り込みの増強が達成された。３Ｄオリゴヌクレオチドシェルは、コロイド内のＭＯＦ  ＮＰを安定化するだけでなく、認識できる細胞毒性なしにそれらの細胞内在化を増強した。このアプローチは、生物学的プローブまたは潜在的な治療薬としてのさまざまなタンパク質の送達を容易にするために一般化することができる。
【００１５】
タンパク質は多くの生命プロセスにおいて重要な役割を果たす。活性タンパク質の細胞内送達は、代謝経路の評価４８、細胞プロセスの調節３、およびタンパク質欠乏疾患の治療薬５０〜５２を含む多くの潜在的な生物医学的用途４７にとって魅力的である。過去数十年の間に、トランスフェクション剤、ナノキャリア５３〜５５、および広範なタンパク質表面修飾５６〜５９の使用など、生細胞によるタンパク質の内在化を容易にする一連の技術が開発された。各戦略には独自のメリットがあるが、多くは顕著な細胞毒性、タンパク質活性の低下、または低い送達ペイロードに悩まされ、化学的安定性と送達効率が制限される。６０最近、ＭＯＦは、それらのメソ細孔および安定した構造体構造により、機能性タンパク質の固定化および保存のための有望な材料のクラスとして現れ、高いタンパク質担持容量、ならびに効率的な酵素触媒の大幅に改善された熱および化学安定性を含む有意な特性をもたらす。６１〜６７比較的に、ＭＯＦ  ＮＰによるタンパク質の細胞内送達は、一部には、それらのコロイド安定性が不十分であり表面が正に帯電していることが多く７１〜７２、細胞取り込み効率を制限し、生物学的利用能を低下させるため６８〜７０、あまり研究されていない。７３〜７６したがって、ＭＯＦ  ＮＰ凝集を低減し、正電荷によって引き起こされる細胞毒性を最小限に抑え、その細胞内送達を容易にする効果的なアプローチの開発が非常に望まれている。７７〜７８
【００１６】
複数のオリゴヌクレオチドで高密度に官能化されたＮＰから合成される球状核酸（ＳＮＡ）−ＮＰコンジュゲート７９は、カチオンまたはウイルスのトランスフェクションを使用せずに細胞に効果的に侵入する独自の能力を呈する。８０高密度に詰められたオリゴヌクレオチドは、細胞表面スカベンジャー受容体によって認識され、カベオリン媒介エンドサイトーシスによるナノ粒子の取り込みを容易にする。８１〜８２重要なことに、さまざまなＳＮＡ−ＮＰコンジュゲートは、細胞内診断８６、遺伝子調節８７、および免疫調節戦略８８に有利な特性を呈する異なるコア組成物により合成されてきた。５９、７７、８３〜８５本明細書では、タンパク質の細胞内送達のためのオリゴヌクレオチド−ＭＯＦ  ＮＰコンジュゲートを合成する簡単な戦略が提供される（図２６ａ）。
【００１７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、ここでは、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうでないと示さない限り複数の指示対象が含まれることに留意されたい。
【００１８】
本明細書で使用される「約」という用語は、およそを意味すると理解されることにも留意されたい。
【００１９】
核酸−金属有機構造体（ＭＯＦ）ナノ粒子コンジュゲート
有機金属構造体（ＭＯＦ）は、有機配位子に配位した金属／金属イオンを含む１、２、または３次元の微孔性材料である。本明細書で使用される、ＭＯＦは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０２１１４４５号に開示されるＩＣＰを含むがこれに限定されない無限配位ポリマー（ＩＣＰ）を含む。
【００２０】
本開示は、ＭＯＦと、金属有機構造体の表面に付着した複数のオリゴヌクレオチドとを含むナノ粒子を提供する。ＭＯＦは、（１）金属および（２）多座配位子を含む。いくつかの実施形態では、配位子は有機リガンドである。多座配位子は、それぞれ異なる金属原子に配位してＭＯＦを形成する少なくとも２つの官能基を有する。ＭＯＦは、複数の同じ多座配位子、または２つ以上の多座配位子の組み合わせ／混合物を含み得る。多座配位子は、カルボキシレート官能基（ＣＯＯＨまたはＣＯＯ−）、または少なくとも１つの環窒素を有する複素環基（例えば、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル、イミダゾリル）などの２つ以上（例えば、２、３、４つ）の配位官能基を含み得る。場合によっては、多座配位子は、２、３、または４つのカルボキシレート官能基を含む。場合によっては、多座配位子は、少なくとも１つのカルボキシレート官能基と、少なくとも１つの複素環基、例えば、ピラゾレート、イミダゾレート、またはテトラゾレートとを含む。多座配位子の例には、ギ酸、酢酸、シュウ酸、プロパン酸、ブタン二酸、（Ｅ）−ブテン二酸、ベンゼン−１，４−ジカルボン酸、ベンゼン−１，３−ジカルボン酸、ベンゼン−１，３，５−トリカルボン酸、２−アミノ−１，４−ベンゼンジカルボン酸、２−ブロモ−１，４−ベンゼンジカルボン酸、ビフェニル−４，４’−ジカルボン酸、ビフェニル−３，３‘，５，５’−テトラカルボン酸、ビフェニル−３，４’，５−トリカルボン酸、２，５−ジヒドロキシ−１，４−ベンゼンジカルボン酸、１，３，５−トリス（４−カルボキシフェニル）ベンゼン、（２Ｅ，４Ｅ）−ヘキサ−２，４−ジエン二酸、１，４−ナフタレンジカルボン酸、ピレン−２，７−ジカルボン酸、４，５，９，１０−テトラヒドロピレン−２，７−ジカルボン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、アデニン、４，４’−ビピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリジン−４−カルボン酸、ピリジン−３−カルボン酸、イミダゾール、１Ｈ−ベンズイミダゾール、および２−メチル−１Ｈ−イミダゾールが含まれる。場合によっては、多座配位子は、テレフタル酸（Ｈ２ＢＤＣ）、２，２’−ビピリジン−５，５’−ジカルボン酸（Ｈ２ＢＰＹ）、２’，５’−ビス（アジドメチル）−［１，１’：４’，１’’−テルフェニル］−４，４’’−ジカルボン酸（Ｈ２ＴＰＤＣ−Ｎ３）、または４，４‘，４’‘，４’’’−ポルフィリンテトラ安息香酸（Ｈ２ＴＣＰＰ）を含む。場合によっては、多座配位子は、テレフタル酸（Ｈ２ＢＤＣ）、２，２’−ビピリジン−５，５’−ジカルボン酸（Ｈ２ＢＰＹ）、２‘，５’−ビス（アジドメチル）−［１，１’：４’，１’’−テルフェニル］−４，４’’−ジカルボン酸、（Ｈ２ＴＰＤＣ−Ｎ３）、４，４’，４’’，４’’’−ポルフィリンテトラ安息香酸（Ｈ２ＴＣＰＰ）、１，２，４，５−テトラキス（４−カルボキシフェニル）ベンゼン、１，３，５−トリス（４’−カルボキシ［１，１’−ビフェニル］−４−イル）ベンゼン、１，３，５−トリス（４−カルボキシフェニル）ベンゼン、２，５−ジヒドロキシテレフタル酸、２，６−ナフタレンジカルボン酸、２−ヒドロキシテレフタル酸、２−メチルイミダゾール、３，３’，５，５’−テトラカルボキシジフェニルメタン、４  ４’，４’’−ｓ−トリアジン−２，４，６−トリイル−トリ安息香酸、９，１０−アントラセンジカルボン酸、ビフェニル−３，３’，５，５’−テトラカルボン酸、ビフェニル−３，４’，５−トリカルボン酸、イミダゾール、テレフタル酸（すなわち、１，４−ベンゼンジカルボン酸）、トリメシン酸、［１，１’：４’，１’’］テルフェニル−３，３’，５，５’−テトラカルボン酸、またはそれらの組み合わせである。
【００２１】
さまざまな実施形態では、ＭＯＦはナノ粒子コアを形成し、オリゴヌクレオチドはコアの外表面に付着する層を形成する。さまざまな実施形態では、金属有機構造体は３次元構造を有する。さまざまな実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの末端で金属有機構造体に付着している。さまざまな実施形態では、オリゴヌクレオチドの一方の末端は、金属有機構造体の表面に付着し、オリゴヌクレオチドの他方の末端は、金属有機構造体の表面から離れて（または遠位に）配向される。さまざまな実施形態では、連結基は、金属有機構造体およびオリゴヌクレオチドの両方に共有結合している。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ＭＯＦナノ粒子の金属は複数の金属イオンを含む。場合によっては、ＭＯＦは複数の同じ金属イオンを含み、他の場合には、ＭＯＦは異なる金属イオンの組み合わせ／混合物を含む。想定される金属イオンには、ジルコニウム（Ｚｒ）、クロム（Ｃｒ）、鉄（Ｆｅ）、アルミニウム（Ａｌ）、およびそれらの混合物が含まれる。いくつかの実施形態では、ＭＯＦは、ＵｉＯ−６６、ＵｉＯ−６７−ｂｐｙ、ＵｉＯ６８−Ｎ３／ＰＣＮ−５８、ＰＣＮ−２２２／ＭＯＦ−５４５、ＰＣＮ−２２３、ＰＣＮ−２２４、ＭＩＬ−１０１（Ａｌ）、ＭＩＬ−１０１（Ｆｅ）、またはＭＩＬ−１０１（Ｃｒ）を含む。適切な金属イオンには、１２接続Ｚｒ３クラスター、６接続Ｚｒ３クラスター、８接続Ｚｒ３クラスター、Ｃｒ３クラスター、Ｆｅ３クラスター、Ａｌ３クラスター、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００２３】
さまざまな態様では、本開示は、標的オリゴヌクレオチドを、遺伝子産物の発現を阻害するのに十分な条件下で本明細書に記載のナノ粒子と接触させることを含む、標的オリゴヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物の発現を阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子産物の発現はインビボで阻害される。いくつかの実施形態では、遺伝子産物の発現はインビトロで阻害される。さまざまな実施形態では、遺伝子産物の発現は、標的オリゴヌクレオチドをナノ粒子と接触させない場合の遺伝子産物の発現に対して少なくとも約５％、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、および／または少なくとも約９５％阻害される。さまざまな態様では、本開示はまた、標的分子を本明細書に記載のナノ粒子と接触させることを含む標的分子を検出する方法を提供し、標的分子とナノ粒子との接触は検出可能な変化をもたらす。いくつかの実施形態では、検出はインビトロである。いくつかの実施形態では、検出はインビボである。
【００２４】
オリゴヌクレオチド
本開示で想定されるオリゴヌクレオチドには、本明細書で定義されるＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの修飾形態、および組み合わせが含まれる。したがって、オリゴヌクレオチドはＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは二本鎖であり、さらなる実施形態では、ＤＮＡは一本鎖である。さらなる態様では、オリゴヌクレオチドはＲＮＡを含み、またさらなる態様では、オリゴヌクレオチドは二本鎖ＲＮＡを含み、特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。「ＲＮＡ」という用語には、２本の別々の鎖の二重鎖、および一本鎖構造が含まれる。一本鎖ＲＮＡには、二次構造を有するＲＮＡも含まれる。いくつかの態様では、ヘアピンループを有するＲＮＡが想定される。
【００２５】
本明細書に開示されるＭＯＦで使用されるオリゴヌクレオチドは、リン酸がＭＯＦナノ粒子の金属イオンと金属−リン酸結合を形成するような末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドは、その３’末端にリン酸基を有する。いくつかの実施形態では、末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドは、その５’末端にリン酸基を有する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドは、（ＧＧＴ）ｎヌクレオチド配列を含み、配列中、ｎは２〜２０である。さらなる実施形態では、ｎは、２もしくは少なくとも２であるか、３もしくは少なくとも３であるか、４もしくは少なくとも４であるか、５もしくは少なくとも５であるか、６もしくは少なくとも６であるか、７もしくは少なくとも７であるか、８もしくは少なくとも８であるか、９もしくは少なくとも９であるか、１０もしくは少なくとも１０であるか、１１もしくは少なくとも１１であるか、１２もしくは少なくとも１２であるか、１３もしくは少なくとも１３であるか、１４もしくは少なくとも１４であるか、１５もしくは少なくとも１５であるか、１６もしくは少なくとも１６であるか、１７もしくは少なくとも１７であるか、１８かもしくは少なくとも１８であるか、１９もしくは少なくとも１９であるか、または２０である。さらなる実施形態では、ｎは、３未満、４未満、５未満、６未満、７未満、８未満、９未満、１０未満、１１未満、１２未満、１３未満、１４未満、１５未満、１６未満、１７未満、１８未満、１９未満、または２０未満である。
【００２７】
いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、ＭＯＦの一部であるオリゴヌクレオチドと標的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが起こるようなオリゴヌクレオチドの標的配列に十分に相補的な配列から構成される。さまざまな態様におけるオリゴヌクレオチドは、二本鎖分子が標的オリゴヌクレオチドの一本鎖配列にハイブリダイズする一本鎖配列も含む限り、一本鎖または二本鎖である。いくつかの態様では、ＭＯＦの一部であるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、二本鎖標的オリゴヌクレオチドと三重構造を形成し得る。別の態様では、三重鎖構造は、ＭＯＦの一部である二本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖標的オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって形成され得る。三重鎖オリゴヌクレオチド複合体のさらなる説明は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２００６／４０１２４に見られる。
【００２８】
「オリゴヌクレオチド」は、個々に重合されたヌクレオチドサブユニットを含むと当技術分野で理解されている。本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語またはその複数形は、本明細書で論じられ、さもなければ当技術分野で知られている変形形態と交換可能である。ある特定の例では、当技術分野では、天然に存在するヌクレオチド、および修飾ヌクレオチドを含む天然に存在しないヌクレオチドを包含する「核酸塩基」という用語を使用する。したがって、ヌクレオチドまたは核酸塩基とは、天然に存在する核酸塩基であるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）を意味する。天然に存在しない核酸塩基には、例えばおよび限定されないが、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ’，Ｎ’−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニル−シトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、プソイドイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、ならびにＢｅｎｎｅｒらの米国特許第５，４３２，２７２号およびＳｕｓａｎ  Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２５：ｐｐ  ４４２９−４４４３に記載の「天然に存在しない」核酸塩基が含まれる。「核酸塩基」という用語には、既知のプリンおよびピリミジン複素環だけでなく、その複素環類似体および互変異性体も含まれる。さらに、天然に存在するおよび天然に存在しない核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号（Ｍｅｒｉｇａｎら）、Ｃｈａｐｔｅｒ  １５  ｂｙ  Ｓａｎｇｈｖｉ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｅｄ．Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｂ．Ｌｅｂｌｅｕ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３−７２２（特に６２２および６２３ページ、ならびにＣｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｃｏｏｋ，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １９９１，６，５８５−６０７を参照されたい、これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されるものが含まれる。さまざまな態様では、オリゴヌクレオチドは、最も古典的な意味でのヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基として機能する、ある特定の「普遍的な塩基」を含む核酸塩基のように機能し得る複素環式化合物などの化合物を含む天然に存在しないヌクレオチドのカテゴリーである１つ以上の「ヌクレオシド塩基」または「塩基単位」も含む。普遍的な塩基には、３−ニトロピロール、任意選択で置換されたインドール（例えば、５−ニトロインドール）、���よび任意選択で置換されたヒポキサンチンが含まれる。他の望ましい普遍的な塩基には、ピロール、ジアゾール、またはトリアゾール誘導体が含まれ、当技術分野で知られている普遍的な塩基が含まれる。
【００２９】
修飾ヌクレオチドは、ＥＰ１０７２６７９およびＷＯ９７／１２８９６に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。修飾ヌクレオチドには、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルおよびアデニンとグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルおよびアデニンとグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが含まれるが、これらに限定されない。さらなる修飾塩基には、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換フェノキサジンシチジンなどのＧクランプ（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキ−サジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）などの三環系ピリミジンが含まれる。修飾塩基には、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドンで置き換えられたものも含まれ得る。追加の核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３に開示されているもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されているものが含まれる。これらの塩基のいくつかは、結合親和性を高めるのに有用であり、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリ���を含み、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃上昇させることが示されており、ある特定の態様では、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされる。米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６４５，９８５号、同第５，８３０，６５３号、同第５，７６３，５８８号、同第６，００５，０９６号、同第５，７５０，６９２号、および同第５，６８１，９４１号を参照されたく、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３０】
所定の配列のオリゴヌクレオチドを作製する方法は周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．１９８９）およびＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，１ｓｔ  Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）を参照されたい。固相合成法は、ポリリボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドの両方に適している（ＤＮＡ合成の周知の方法は、ＲＮＡ合成にも有用である）。ポリリボヌクレオチドは酵素的に調製することもできる。天然に存在しない核酸塩基もオリゴヌクレオチドに組み込むことができる。例えば、米国特許第７，２２３，８３３号、Ｋａｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７４：２２３８（１９５１）、Ｙａｍａｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８３：２５９９（１９６１）、Ｋｏｓｔｕｒｋｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：３９４９（１９７４）、Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７６：６０３２（１９５４）、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７：７４−７５（２００５）、およびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４：１３６８４−１３６８５（２００２）を参照されたい。
【００３１】
本明細書に開示されるＭＯＦは、一般に、長さが約５ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを含む。より具体的には、本明細書に開示されるＭＯＦは、長さが約５〜約９０ヌクレオチド、長さが約５〜約８０ヌクレオチド、長さが約５〜約７０ヌクレオチド、長さが約５〜約６０ヌクレオチド、長さが約５〜約５０ヌクレオチド、長さが約５〜約４５ヌクレオチド、長さが約５〜約４０ヌクレオチド、長さが約５〜約３５ヌクレオチド、長さが約５〜約３０ヌクレオチド、長さが約５〜約２５ヌクレオチド、長さが約５〜約２０ヌクレオチド、長さが約５〜約１５ヌクレオチド、長さが約５〜約１０ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドが所望の結果を達成できる程度に具体的に開示されたサイズの長さの中間のすべてのオリゴヌクレオチドを含む。したがって、長さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００以上のヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが想定される。
【００３２】
本明細書で定義されるオリゴヌクレオチドには、アプタマーも含まれる。アプタマーの生成および使用は、当業者に既知である。一般に、アプタマーは、標的配位子に強く結合し、それを識別して区別することができる核酸またはペプチド結合種である（Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ．６（３）３１６−３２０（２００９）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。アプタマーは、いくつかの実施形態では、指数関数的濃縮（ＳＥＬＥＸ）プロセスによる配位子の体系的進化と呼ばれる技術によって取得することができる（Ｔｕｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：５０５−１０（１９９０）、米国特許第５，２７０，１６３号および米国特許第５，６３７，４５９号、それらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。核酸アプタマーの一般的な議論は、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｐｔａｍｅｒｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｍａｙｅｒ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００９）およびＣｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２（１）：７２−７９（２００３）に見られるが、これらに限定されない。ＲＮＡアプタマーの選択、ＤＮＡアプタマーの選択、標的タンパク質に共有結合することができるアプタマーの選択、修飾アプタマーライブラリの使用、ならびに診断薬および治療薬としてのアプタマーの使用を含むが、これらに限定されないアプタマーの追加の議論は、Ｍｏｌｅｋｕｌｙａｒｎａｙａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｙａ，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．６，２０００，ｐｐ．１０９７−１１１３から翻訳されたＫｏｐｙｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３４（６）：９４０−９５４（２０００）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に提供されている。さまざまな態様では、アプタマーは長さが１０〜１００ヌクレオチドである。
【００３３】
さまざまな態様では、本方法は、標的オリゴヌクレオチドに１００％相補的である、すなわち完全に一致するオリゴヌクレオチドの使用を含むが、他の態様では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さにわたって標的オリゴヌクレオチドに少なくとも（以上を意味する）約９５％相補的、オリゴヌクレオチドが標的遺伝子産物の所望の阻害を達成できる程度にオリゴヌクレオチドの長さにわたって標的オリゴヌクレオチドに少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０  ％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％相補的である。ハイブリダイゼーションの程度は、得られた標的オリゴヌクレオチドの検出、または遺伝子産物発現の阻害の程度よりも有意ではないことは、当業者によって理解されるであろう。
【００３４】
オリゴヌクレオチド密度
本明細書で提供されるＭＯＦは、ＭＯＦの表面上にオリゴヌクレオチドの密度を有する。いくつかの態様では、細胞によるＭＯＦの分解および／または取り込みに対するオリゴヌクレオチドの耐性は、ＭＯＦ表面に関連するオリゴヌクレオチドの密度によって影響を受ける。ＰＣＴ／ＵＳ２００８／６５３６６（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように、オリゴヌクレオチド官能化ナノ粒子の表面上のオリゴヌクレオチドの高密度は、細胞によるナノ粒子の取り込みの増加に関連する。
【００３５】
ＭＯＦを安定させるのに十分な表面密度、およびＭＯＦとオリゴヌクレオチドとの所望の組み合わせに対してそれを得るのに必要な条件は、経験的に決定することができる。概して、使用されるオリゴヌクレオチドが小さければ小さいほど、そのオリゴヌクレオチドの表面密度は高くなり得る。一般に、少なくとも１ｐｍｏｌ／ｃｍ２の表面密度が、安定したＭＯＦ組成物を提供するのに適切である。いくつかの態様では、表面密度は少なくとも１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２である。オリゴヌクレオチドが、少なくとも２ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも３ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも４ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも６ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも７ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも８ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも９ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１７５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２以上の表面密度でＭＯＦに存在する方法も提供される。オリゴヌクレオチドが、２ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、３ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、４ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、６ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、７ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、８ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、９ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約２０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約３０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約３５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約４０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約４５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約５５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約６０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約６５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約７０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約７５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約８０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約８５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約９０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約９５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約１２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約１５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約１７５ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約２５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約３００ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約３５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約４００ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約４５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約５００ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約５５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約６００ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約６５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約７００ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約７５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約８００ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約８５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約９００ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約９５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満、約１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２未満の表面密度でＭＯＦに存在する方法も提供される。
【００３６】
ＭＯＦにおけるオリゴヌクレオチドの密度が、表面上のオリゴヌクレオチドおよび／またはＭＯＦ自体との特定の生体分子および／または非生体分子相互作用を調節することが想定される。さまざまな条件下で、一部のポリペプチドは、オリゴヌクレオチドの密度によって引き起こされる立体障害に基づいて、ＭＯＦの一部であるオリゴヌクレオチドとの相互作用を禁止される場合がある。立体障害によってさもなければ排除される生体分子および／または非生体分子とのオリゴヌクレオチドの相互作用が望ましい態様では、生体分子および／または非生体分子がオリゴヌクレオチドと相互作用できるようにＭＯＦにおけるオリゴヌクレオチドの密度が低下する。
【００３７】
オリゴヌクレオチドの表面密度が、ＭＯＦに関連するオリゴヌクレオチドの安定性を調節することも想定される。したがって、一実施形態では、オリゴヌクレオチドを含むＭＯＦが提供され、オリゴヌクレオチドは、ＭＯＦの一部ではない同一のオリゴヌクレオチドの半減期と少なくとも実質的に同じ半減期を有する。他の実施形態では、ＭＯＦに関連するオリゴヌクレオチドは、ＭＯＦの一部ではない同一のオリゴヌクレオチドの半減期よりも約５％大きい〜約１，０００，０００倍以上大きい半減期を有する。
【００３８】
標的オリゴヌクレオチドを検出する方法
本開示は、標的分子を本明細書に記載の組成物と接触させることを含む、標的分子を検出する方法を提供する。接触は、さまざまな態様では、本開示により提供される遺伝子発現の調節をもたらす。別の態様では、接触は検出可能な変化をもたらし、検出可能な変化は標的分子の検出を示す。検出可能な標識の検出は、本明細書に記載の方法のいずれかによって実施され、検出可能な標識は、ＭＯＦの一部である分子上に存在し得るか、標的分子上に存在し得る。
【００３９】
遺伝子発現を阻害する方法
本開示により提供される追加の方法は、標的オリゴヌクレオチドを本明細書に記載の組成物と接触させることを含む、標的オリゴヌクレオチドから発現される遺伝子産物の発現を阻害する方法を含み、接触は遺伝子産物の発現を阻害するのに十分である。遺伝子産物の阻害は、標的オリゴヌクレオチドと本開示の組成物とのハイブリダイゼーションから生じる。
【００４０】
当技術分野では、標的オリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするために、ＭＯＦの一部であるオリゴヌクレオチドの配列は、その標的オリゴヌクレオチドの配列と１００％相補的である必要はないことが理解される。さらに、ＭＯＦの一部であるオリゴヌクレオチドは、介在または隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように、１つ以上のセグメント上で標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする可能性がある（例えばおよび限定されることなく、ループ構造またはヘアピン構造）。相補性パーセントは、ＭＯＦの一部であるオリゴヌクレオチドの長さにわたって決定される。例えば、オリゴヌクレオチドの２０ヌクレオチドのうち１８ヌクレオチドが全長１００ヌクレオチドの標的オリゴヌクレオチドの２０ヌクレオチド領域に相補的であるオリゴヌクレオチドを含むＭＯＦを考えると、ＭＯＦの一部であるオリゴヌクレオチドは９０パーセント相補的であろう。この例では、残りの非相補的ヌクレオチドは、クラスター化されるかまたは相補的ヌクレオチドが散在していてもよく、互いにまたは相補的ヌクレオチドに隣接する必要はない。ＭＯＦの一部であるオリゴヌクレオチドの標的オリゴヌクレオチドの領域との相補性パーセントは、当技術分野で知られているＢＬＡＳＴプログラム（基本的なローカルアライメント検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０、Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９−６５６）を使用して日常的に決定することができる。
【００４１】
遺伝子産物の発現を阻害する方法には、標的遺伝子産物の発現が、オリゴヌクレオチドを含むＭＯＦの不在下での遺伝子産物の発現と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％阻害されるものが含まれる。言い換えれば、提供される方法は、本質的に標的遺伝子産物の発現のあらゆる程度の阻害をもたらすものを包含する。
【００４２】
阻害の程度は、体液サンプルもしくは生検サンプルから、または当技術分野で周知の画像化技術により、インビボで決定される。あるいは、阻害の程度は、一般に、本明細書に記載の組成物の使用から生じるインビボで予想され得る阻害の程度の予測可能な尺度として、細胞培養アッセイにおいてインビトロで決定される。本開示により、標的オリゴヌクレオチドの阻害を使用して、所与の細胞に対する阻害の効果を評価することが想定される。非限定的な例として、遺伝子産物がシグナル伝達経路の一部である遺伝子産物の阻害の効果を研究することができる。あるいは、遺伝子産物がアポトーシス経路に関与していると仮定される遺伝子産物の阻害を研究することができる。
【００４３】
本明細書に記載の方法のいずれかを組み合わせて使用して、所望の結果を達成することができることが理解されるであろう。例えばおよび限定されることなく、本明細書に記載の方法を組み合わせて、標的オリゴヌクレオチドの検出およびその発現の調節の両方を可能にすることができる。いくつかの実施形態では、この組み合わせを使用して、インビトロまたはインビボのいずれかでの経時的な標的オリゴヌクレオチド発現の阻害を定量化することができる。一態様では、特定の時点で培養物から細胞を除去し、各時点で標的オリゴヌクレオチドの発現の相対レベルを評価することにより、経時的な定量が達成される。一態様では、検出可能な標識の視覚化を通じて経時的に評価される標的オリゴヌクレオチドの量の減少は、標的オリゴヌクレオチドの阻害率を示す。
【００４４】
したがって、標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしてその発現を阻害する所与のオリゴヌクレオチドの有効性を決定すること、ならびに細胞に対する所与のオリゴヌクレオチドの阻害の効果を決定することは、想定される態様である。
【００４５】
薬剤
いくつかの態様では、本開示は、薬剤をさらに含むオリゴヌクレオチド官能化ＭＯＦナノ粒子を想定している。さまざまな実施形態では、薬剤は、ペプチド、タンパク質、ナノ粒子（例えばおよび限定されることなく、貴金属、金属酸化物、または量子ドット）、抗体、小分子、またはそれらの組み合わせである。本開示の実施形態のいずれにおいても、薬剤はナノ粒子にカプセル化される。ナノ粒子内に薬剤をカプセル化する方法は一般に当技術分野９４〜９５で既知であり、本明細書に記載されている（例えば、実施例２を参照されたい）。
【００４６】
本明細書で使用される「薬剤」は、治療または診断の目的に有用な任意の化合物を意味する。本明細書で使用される用語は、状態の治療または診断のために患者に投与される任意の化合物を含むと理解される。
【００４７】
タンパク質治療薬には、ペプチド、酵素、構造タンパク質、受容体および他の細胞または循環タンパク質、ならびにそれらの断片および誘導体が含まれ、これらの異常発現は１つ以上の障害を引き起こす。特定の一実施形態として、治療薬には、化学療法薬も含まれる。さまざまな実施形態では、治療薬には、放射性物質も含まれる。
【００４８】
さまざまな態様では、タンパク質治療薬には、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−アルファ）、コンセンサスインターフェロン、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、アンジオポエチン、例えば、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２、Ａｎｇ−４、Ａｎｇ−Ｙ、ヒトアンジオポエチン様ポリペプチド、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、アンギオゲニン、骨形成タンパク質−１、骨形成タンパク質−２、骨形成タンパク質−３、骨形成タンパク質−４、骨形成タンパク質−５、骨形成タンパク質−６、骨形成タンパク質−７、骨形成タンパク質−８、骨形成タンパク質−９、骨形成タンパク質−１０、骨形成タンパク質−１１、骨形成タンパク質−１２、骨形成タンパク質−１３、骨形成タンパク質−１４、骨形成タンパク質−１５、骨形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形成タンパク質受容体ＩＢ、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子受容体、サイトカイン誘導性好中球走化性因子１、サイトカイン誘導性好中球、走化性因子２α、サイトカイン誘導性好中球走化性因子２β、β内皮細胞成長因子、エンドセリン１、表皮成長因子、上皮由来好中球誘引物質、線維芽細胞成長因子４、線維芽細胞成長因子５、線維芽細胞成長因子６、線維芽細胞成長因子７、線維芽細胞成長因子８、線維芽細胞成長因子８ｂ、線維芽細胞成長因子８ｃ、線維芽細胞成長因子９、線維芽細胞成長因子１０、酸性の線維芽細胞成長因子、塩基性の線維芽細胞成長因子、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α１、グリア細胞株誘導性神経栄養因子受容体α２、成長関連タンパク質、成長関連タンパク質α、成長関連タンパク質β、成長関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮成長因子、肝細胞成長因子、肝細胞成長因子受容体、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子受容体、インスリン様成長因子ＩＩ、インスリン様成長因子結合タンパク質、ケラチノサイト成長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経成長因子神経成長因子受容体、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、胎盤成長因子、胎盤成長因子２、血小板由来内皮細胞成長因子、血小板由来成長因子、血小板由来成長因子Ａ鎖、血小板由来成長因子ＡＡ、血小板由来成長因子ＡＢ、血小板由来成長因子Ｂ鎖、血小板由来成長因子ＢＢ、血小板由来成長因子受容体α、血小板由来成長因子受容体β、プレＢ細胞成長刺激因子、幹細胞因子受容体、ＴＮＦ（ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２を含む）、形質転換成長因子α、形質転換成長因子β、形質転換成長因子β１、形質転換成長因子β１．２、形質転換成長因子β２、形質転換成長因子β３、形質転換成長因子β５、潜在性形質転換成長因子β１、形質転換成長因子β結合タンパク質Ｉ、形質転換成長因子β結合タンパク質ＩＩ、形質転換成長因子β結合タンパク質ＩＩＩ、腫瘍壊���因子受容体Ｉ型、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ型、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体、血管内皮成長因子、ならびにキメラタンパク質およびその生物学的または免疫学的に活性な断片を含むがこれらに限定されないサイトカインまたは造血因子が含まれる。生物学的薬剤の例には、サイトカインなどの免疫調節タンパク質、腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体、腫瘍抑制遺伝子、およびがんワクチンが含まれるが、これらに限定されない。本発明の組成物および方法と併用して使用することができるインターロイキンの例には、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）が含まれるが、これらに限定されない。サイトカイン以外の他の免疫調節剤には、ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ、レバミゾール、およびオクトレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
さまざまな実施形態では、米国特許第７，６６７，００４号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の治療薬は、本明細書に開示される組成物および方法での使用が想定され、アルキル化剤、抗生物質薬剤、代謝拮抗剤、ホルモン剤、植物由来の薬剤、および生物学的薬剤を含むが、これらに限定されない。
【００５０】
アルキル化剤の例には、ビスクロロエチルアミン（ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、ウラシルマスタード）、アジリジン（例えば、チオテパ）、アルキルアルコンスルホネート（例えば、ブスルファン）、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン）、非古典的アルキル化剤（アルトレタミン、ダカルバジン、およびプロカルバジン）、白金化合物（例えば、カルボプラスチン、シスプラチン、および白金（ＩＶ）（Ｐｔ（ＩＶ）））が含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
抗生物質薬剤の例には、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、およびアントラセンジオン）、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、プリカトマイシンが含まれるが、これらに限定されない。追加の抗生物質薬剤は、以下で詳しく説明される。
【００５２】
代謝拮抗剤の例には、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート、ロイコボリン、ヒドロキシ尿素、チオグアニン（６−ＴＧ）、メルカプトプリン（６−ＭＰ）、シタラビン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、クラドリビン（２−ＣＤＡ）、アスパラギナーゼ、メシル酸イマチニブ（またはＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））、およびゲムシタビンが含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
ホルモン剤の例には、合成エストロゲン（例えば、ジエチルスチベストロール）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、フルオキシメステロール、およびラロキシフェン）、抗アンドロゲン（ビカルタミド、ニルタミド、フルタミド）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アミノグルテチミド、アナストロゾール、およびテトラゾール）、ケトコナゾール、酢酸ゴセレリン、ロイプロリド、酢酸メゲストロール、およびミフェプリストンが含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
植物由来の薬剤の例には、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビンゾリジン、およびビノレルビン）、ポドフィロトキシン（例えば、エトポシド（ＶＰ−１６）およびテニポシド（ＶＭ−２６））、カンプトテシン化合物（例えば、２０（Ｓ）カンプトテシン、トポテカン、ルビテカン、およびイリノテカン）、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
使用が想定される化学療法薬には、次のものが含まれるが、これらに限定されない：以下を含むアルキル化剤；ナイトロジェンマスタード、例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、およびクロラムブシル；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、およびセムスチン（メチルＣＣＮＵ）；エチレンイミン／メチルメラミン、例えば、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホルアミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミン）；アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン；トリアジン、例えば、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）；葉酸類似体、例えば、メトトレキサートおよびトリメトレキサート、ピリミジン類似体、例えば、５−フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２’−ジフルオロデオキシシチジン、プリン類似体、例えば、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２’−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリトロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、および２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ）を含む代謝拮抗剤；有糸分裂阻害剤を含む天然物、例えば、パクリタキセル、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、およびビノレルビンを含む）、タキソテール、エストラムスチン、およびリン酸エストラムスチン；エピポドフィロトキシン、例えば、エトポシドおよびテニポシド；抗生物質、例えば、アクチモマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ、およびアクチノマイシン；酵素、例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ；生物学的応答修飾物質、例えば、インターフェロン−アルファ、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ；白金配位錯体（シスプラチン、Ｐｔ（ＩＶ）、カルボプラチンなど）、アントラセンジオン（ミトキサントロンなど）、置換尿素（ヒドロキシ尿素など）、メチルヒドラジン誘導体（Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）およびプロカルバジンを含む）、副腎皮質抑制剤（ミトタン（ｏ，ｐ´−ＤＤＤ）およびアミノグルテチミドなど）を含む種々の薬剤；副腎皮質ステロイド拮抗薬（プレドニゾンおよび同等物、デキサメタゾンおよびアミノグルテチミドなど）を含むホルモンおよび拮抗薬；プロゲスチン、例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール；エストロゲン、例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール等価物；抗エストロゲン剤、例えば、タモキシフェン；アンドロゲン（プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン／等価物を含む）；抗アンドロゲン剤、例えば、フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体、およびロイプロリド；ならびに非ステロイド系抗アンドロゲン剤、例えば、フルタミド。
【００５６】
化学療法薬には、抗ＰＤ−１抗体、アルキル化剤、血管新生阻害剤、抗体、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤、抗増殖剤、抗ウイルス剤、オーロラキナーゼ阻害剤、アポトーシス促進剤（例えば、Ｂｃｌ−２ファミリー阻害剤）、細胞死受容体経路（ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐａｔｈｗａｙ）の活性化因子、Ｂｃｒ−Ａｂｌキナーゼ阻害剤、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）抗体、抗体薬物コンジュゲート、生物学的応答修飾物質、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、細胞周期阻害剤、シクロオキシゲナーゼ−２阻害剤、ＤＶＤ、白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ（ＥｒｂＢ２）受容体阻害剤、成長因子阻害剤、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）−９０阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、ホルモン療法、免疫学的製剤、アポトーシスタンパク質阻害剤（ＩＡＰ）の阻害剤、挿入抗生物質、キナーゼ阻害剤、キネシン阻害剤、Ｊａｋ２阻害剤、哺乳類ラパマイシン標的阻害剤、マイクロＲＮＡ、マイトジェン活性化細胞外シグナル調節キナーゼ阻害薬、多価結合タンパク質、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ポリＡＤＰ（アデノシン二リン酸）リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害薬、白金化学療法薬（例えば、シスプラチン）、ポロ様キナーゼ（Ｐｌｋ）阻害剤、ホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤、プロテアソーム阻害剤、プリン類似体、ピリミジン類似体、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、レチノイド／デルトイド植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ユビキチンリガーゼ阻害剤など、およびこれらの薬剤の１つ以上の組み合わせも含まれるが、これらに限定されない。追加の化学療法薬は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８／００７２８１０号に開示されている。
【００５７】
いくつかの実施形態では、薬剤には小分子が含まれる。本明細書で使用される「小分子」という用語は、化学化合物、例えば、任意選択で誘導体化され得るペプチド模倣物、または天然もしくは合成のいずれかの任意の他の低分子量有機化合物を指す。そのような小分子は、治療的に送達可能な物質であり得るか、または送達を容易にするためにさらに誘導体化され得る。
【００５８】
「低分子量」とは、１０００ダルトン未満、典型的には３００〜７００ダルトンの分子量を有する化合物を意味する。さまざまな態様では、低分子量化合物は、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、約７００、約７５０、約８００、約８５０、約９００、または約１０００ダルトンである。
【００５９】
免疫調節
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、センチネル細胞で発現されるタンパク質のクラスであり、自然免疫系の調節に重要な役割を果たす。哺乳類の免疫系は、感染症と戦うために２つの一般的な戦略を使用する。病原体への曝露は、免疫刺激性サイトカイン、ケモカイン、および多反応性ＩｇＭ抗体の産生を特徴とする自然免疫応答を急速に引き起こす。自然免疫系は、多様な感染性微生物群によって発現される病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）への曝露によって活性化される。ＰＡＭＰの認識は、受容体のＴｏｌｌ様ファミリーのメンバーによって媒介される。特定のオリゴヌクレオチドに応答するＴＬＲ  ４、ＴＬＲ  ８、およびＴＬＲ  ９などのＴＬＲ受容体は、エンドソームと呼ばれる特別な細胞内区画内に存在する。ＴＬＲ  ４、ＴＬＲ  ８、およびＴＬＲ９受容体の調節機構は、ＤＮＡ−タンパク質相互作用に基づいている。
【００６０】
細菌ＤＮＡに見られるものと同様のＣｐＧモチーフを含む合成免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ受容体の同様の応答を刺激する。したがって、免疫調節オリゴヌクレオチドには、免疫不全およびがんの治療など、さまざまな潜在的な治療用途がある。
【００６１】
免疫系の下方調節は、Ｔｏｌｌ様受容体の発現に関与する遺伝子のノックダウンを伴う。このアンチセンスアプローチは、任意のＴｏｌｌ様タンパク質の発現をノックアウトするために特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列で官能化された金属有機構造体（ＭＯＦ）ナノ粒子の使用を伴う。
【００６２】
したがって、いくつかの実施形態では、ｔｏｌｌ様受容体を調節するために本開示のＭＯＦナノ粒子を利用する方法が開示される。本方法は、それぞれ、ＴＬＲアゴニストまたはＴＬＲアンタゴニストを使用してＴｏｌｌ様受容体を上方調節または下方調節するかのいずれかである。調節されるｔｏｌｌ様受容体には、ｔｏｌｌ様受容体１、ｔｏｌｌ様受容体２、ｔｏｌｌ様受容体３、ｔｏｌｌ様受容体４、ｔｏｌｌ様受容体５、ｔｏｌｌ様受容体６、ｔｏｌｌ様受容体７、ｔｏｌｌ様受容体８、ｔｏｌｌ様受容体９、ｔｏｌｌ様受容体１０、ｔｏｌｌ様受容体１１、ｔｏｌｌ様受容体１２、およびｔｏｌｌ様受容体１３が含まれる。いくつかの実施形態では、本方法は、ｔｏｌｌ様受容体を有する細胞をオリゴヌクレオチド官能化ＭＯＦナノ粒子と接触させることを含み、末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドはＴＬＲアゴニストを含む。さらなる実施形態では、ＴＬＲは、ｔｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）、ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）、ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）、ｔｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）、ｔｏｌｌ様受容体６（ＴＬＲ６）、ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）、ｔｏｌｌ様受容体８（ＴＬＲ８）、ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）、ｔｏｌｌ様受容体１０（ＴＬＲ１０）、ｔｏｌｌ様受容体１１（ＴＬＲ１１）、ｔｏｌｌ様受容体１２（ＴＬＲ１２）、およびｔｏｌｌ様受容体１３（ＴＬＲ１３）からなる群から選択される。さまざまな実施形態では、ＴＬＲはインビトロで調節される。いくつかの実施形態では、ＴＬＲはインビボで調節される。
【実施例】
【００６３】
ＭＯＦナノ粒子を合成し、ＤＭＦ（３回）および水（３回）で溶媒交換して、過剰な金属イオンおよび有機配位子を除去する。ＭＯＦナノ粒子の結晶化度および結晶サイズは、それぞれ、粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）および透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって決定される。次に、オリゴヌクレオチドの３’または５’末端のいずれかで化学修飾ホスホラミダイトを用いて、ＤＮＡ合成装置でリン酸修飾核酸を合成する。すべてのオリゴヌクレオチドは、製造業者が推奨する条件下で脱保護され、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製される。濃度の特性評価および決定は、それぞれ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析およびＵＶ−Ｖｉｓ分光法によって決定される。過剰のリン酸末端核酸（およそ１００ｎｍｏｌ）をＭＯＦ  Ｎｐコロイド（およそ２ｐｍｏｌ）に添加し、その後、シェーカー上に置いて一晩インキュベートした。次に、２Ｍ塩化ナトリウム溶液を反応混合物にゆっくり添加して０．５Ｍの最終濃度に到達させる塩熟成（ｓａｌｔ−ａｇｉｎｇ）手順を使用して、負に帯電したオリゴマーをスクリーニングし、高密度の表面固定化オリゴヌクレオチドを達成する。過剰のオリゴヌクレオチドを遠心分離（５×５０００ｒｐｍ、１０分間）により除去し、続いてＤＮＡ−ＭＯＦナノ粒子コンジュゲートを水に再懸濁した。ＭＯＦナノ粒子上のＤＮＡ表面被覆は、誘導結合プラズマ発光分光法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）およびＵＶ−可視分光法（ＵＶ−ＶＩＳ）によって決定される。第１に、ＭＯＦナノ粒子の表面積は、ＴＥＭから得られた幾何学的近似および半径／エッジ長さに基づいて計算することができる。第２に、粒子あたりの金属原子の数は、結晶学的情報に基づいて、所与のサイズのＭＯＦについて計算することができる。最後に、ＭＯＦナノ粒子サンプルのモル濃度は、ＭＯＦサンプルの金属含有量のＩＣＰ−ＡＥＳ分析によって得られる。
【００６４】
実施例１
材料
特に明記しない限り、すべての試薬は商業的供給源から入手し、さらに精製することなく使用した。この作業で使用されるすべてのオリゴヌクレオチドは、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入した試薬を用いて固体支持体ＭＭ１２合成装置で合成した。すべての実験で使用した水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｂｉｏｃｅｌ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手した超高純度脱イオン（ＤＩ）グレード（１８．２ＭΩ・ｃｍ抵抗率）であった。
【００６５】
方法
ＭＯＦナノ粒子の合成および特性評価
９つのＭＯＦナノ粒子の合成
ＵｉＯ−６６．ＵｉＯ−６６は、溶媒熱反応条件により合成した。１，４−ベンゼンジカルボン酸（５０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を１ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。別のバイアルで、塩化ジルコニル八水和物（２１ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）を３ｍＬのＤＭＦに溶解した。２つの溶液を１０ｍＬのシンチレーションバイアルで一緒に混合し、２．０ｍＬの酢酸を反応混合物に添加した。短時間の超音波処理の後、溶液を９０℃で１８時間加熱してＵｉＯ−６６ナノ粒子を得た。
【００６６】
ＵｉＯ−６７−ｂｐｙ。ＵｉＯ−６７−ｂｐｙは同様の方法により合成した。ビフェニル−４，４’−ジカルボン酸（１５０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのＤＭＦに添加し、白色の懸濁液を得た。別のバイアルで、塩化ジルコニル八水和物（１０５ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を３ｍＬのＤＭＦに溶解した。２つの画分を２５ｍＬのシンチレーションバイアルで一緒に混合し、２．５ｍＬの酢酸を反応混合物に添加した。短時間の超音波処理の後、懸濁液を９０℃で１８時間加熱してＵｉＯ−６７−ｂｐｙを得た。
【００６７】
ＵｉＯ−６８−アジド／ＰＣＮ−５８。２’，５’−ビス（アジドメチル）−［１，１’：４’，１’’−テルフェニル］−４，４’’−ジカルボン酸（ＴＰＤＣ−２ＣＨ２Ｎ３）は、文献で報告されている方法に従って合成された。３３１０ｍＬのシンチレーションバイアルで、ＴＰＤＣ−２ＣＨ２Ｎ３（１００ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）を１ｍＬのＤＭＦに添加した。別のバイアルで、塩化ジルコニル八水和物（２１ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）を３ｍＬのＤＭＦに溶解した。２つの画分を１０ｍＬのシンチレーションバイアルで一緒に混合し、２４０μＬの酢酸を反応混合物に添加した。懸濁液を９０℃で１８時間加熱した。
【００６８】
ＰＣＮ−２２２／ＭＯＦ−５４５。ＰＣＮ−２２２／ＭＯＦ−５４５ナノ結晶の合成は、若干の修正を加えて文献で報告されている方法に基づいた。３４塩化ジルコニル八水和物（３７．５ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ）およびテトラキス（４−カルボキシフェニル）−ポルフィリン（６．５ｍｇ、０．００８２ｍｍｏｌ）を、テフロン加工されたキャップ付きの２２ｍＬのホウケイ酸バイアル中のＤＭＦ（１６．２５ｍＬ）に溶解した。ジクロロ酢酸（０．２５ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を１３０℃で１８時間加熱して、暗紫色の棒状ナノ結晶および黄色の母液を得た。遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）によってナノ結晶を収集し、続いてＤＭＦで溶媒交換した。
【００６９】
ＰＣＮ−２２３。ＰＣＮ−２２３ナノ結晶の合成は、若干の修正を加えて文献で報告されている方法に基づいた。３４１０ｍＬのシンチレーションバイアルで、３ｍＬのＤＭＦ中の５，１０，１５，２０−テトラキス（４−カルボキシフェニル）ポルフィリン（Ｈ２ＴＣＰＰ、５．２ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）、塩化ジルコニル八水和物（９．８ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）、および酢酸（０．４ｍＬ）を超音波処理により溶解し、９０℃で１８時間加熱した。反応が完了した後、遠心分離によりＰＣＮ−２２３ナノ粒子を収集し、続いて新しいＤＭＦで３回洗浄した。
【００７０】
ＰＣＮ−２２４。ＰＣＮ−２２４ナノ結晶の合成は、若干の修正を加えて文献で報告されている方法に基づいた。３５２５ｍＬのシンチレーションバイアルで、１０ｍＬのＤＭＦ中の５，１０，１５，２０−テトラキス（４−カルボキシフェニル）ポルフィリン（１０ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）、塩化ジルコニル八水和物（３０ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）、および安息香酸（３００ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）を溶解し、混合物を９０℃（油浴）で５時間撹拌（３００ｒｐｍ）した。反応が終了した後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、３０分間）によりＰＣＮ−２２４ナノ粒子を収集し、続いて新しいＤＭＦで３回洗浄した。
【００７１】
ＭＩＬ−１０１−Ｃｒ。ＭＩＬ−１０１−Ｃｒナノ結晶の合成は、若干の修正を加えて文献で報告されている方法に基づいた。３６テレフタル酸（Ｈ２ＢＤＣ、５５ｍｇ  ０．３３ｍｍｏｌ）および硝酸クロム九水和物（Ｃｒ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ、１３２ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を１０ｍＬの水に溶解した。得られた懸濁液を室温で１時間撹拌し、その後、テフロン加工されたオートクレーブ中で１８０℃で８時間自生圧力下で加熱した。室温に冷却した後、混合物を濾過して、再結晶したテレフタル酸を除去した。７０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、生成物を濾液から緑色粉末として単離し、その後、エタノールで３回洗浄した。
【００７２】
ＭＩＬ−１０１−Ｆｅ。ＭＩＬ−１０１（Ｆｅ）Ｆｅ３Ｏ（Ｈ２Ｏ）２Ｃｌ（ＢＤＣ）３ナノ粒子は、以前に報告されたマイクロ波加熱法を使用して合成された。３７具体的には、５７．５ｍｇ（０．３４６ｍｍｏｌ）のテレフタル酸および９３．５ｍｇ（０．３４６ｍｍｏｌ）のＦｅＣｌ３・Ｈ２Ｏを１５ｍＬのＤＭＦに溶解した。この溶液をＨＰ５００マイクロ波容器に入れて密封した。次いで、反応物を急速に１５０℃に加熱し（３０秒以内）、この温度で１０分間保持した。室温に冷却した後、粒子を遠心分離により単離し、ＤＭＦおよびエタノールで洗浄した。室温に冷却した後、ナノ粒子を遠心分離によって単離し、ＤＭＦで洗浄して過剰な反応物を除去した。
【００７３】
ＭＩＬ−１０１−Ａｌ。ＭＩＬ−１０１（Ａｌ）ナノ結晶の合成では、４５ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）のテレフタル酸を５ｍＬのＤＭＦに溶解した。別のバイアルで、１２０ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）のＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏを５ｍＬのＤＭＦに添加し、それに５ｍＬのテレフタル酸ＤＭＦ溶液を添加した。短時間の超音波処理の後、懸濁液を室温で一晩放置して完全に溶解させた。５００μＬの酢酸を溶液に添加し、その後、従来のオーブンで１１０℃で１８時間加熱した。室温に冷却した後、粒子を遠心分離によって単離し、ＤＭＦおよびエタノールで洗浄して過剰な反応物を除去した。
【００７４】
粉末Ｘ線回折
合成したＭＯＦナノ粒子およびＤＮＡ官能化ＭＯＦナノ粒子コンジュゲートの結晶化度は、粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）によって確認された。粉末Ｘ線回折パターンは、４５ｋＶおよび１６０ｍＡで、２．５〜３０°の範囲にわたって２θ＝０．０５°の走査速度でＲｉｇａｋｕ  Ｓｍａｒｔｌａｂ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で収集された。
【００７５】
透過型電子顕微鏡および走査型電子顕微鏡
ＭＯＦナノ粒子は、２００ｋＶの加速電圧でＳＥまたはＴＥモードのいずれかで、Ｈｉｔａｃｈｉ  ＨＤ−２３００走査型透過電子顕微鏡を使用して分析された。サンプルは、ＭＯＦ結晶またはＭＯＦ−ＤＮＡコンジュゲートを含む希釈溶液をＴＥＭグリッド上に直接ドロップキャストすることによって、ＴＥＭグリッド上に分散した。各合成の平均結晶サイズは、類似の合成条件下で複数の合成から得られた１００を超える結晶のエッジ長さを測定することによって決定された。
【００７６】
オリゴヌクレオチドの合成
標準ＣＰＧ固相支持体でＭｅｒｍａｉｄ  ＭＭ１２  ＤＮＡ合成装置（Ｂｉｏ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）を使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。すべてのオリゴヌクレオチドは、製造業者が推奨する条件下で脱保護され、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製された。濃度の特性評価および決定は、それぞれ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析およびＵＶ−Ｖｉｓ分光法によって決定された。合成されたオリゴヌクレオチドの完全なリストは、表１に見られる。
【００７７】
【表１】
2020526558.tif 000003
【００７８】
ナノ粒子のＤＮＡ官能化
ＭＯＦナノ粒子のＤＮＡ官能化。典型的なＤＮＡ官能化実験では、過剰のリン酸末端核酸（およそ１００ｎｍｏｌ）をＭＯＦ  ＮＰコロイド（およそ２ｐｍｏｌ）に添加し、その後、シェーカー上に置いて一晩インキュベートした（本明細書に記載される）。次に、塩化ナトリウムを０．５Ｍの最終濃度まで溶液にゆっくりと添加し、これにより、負に帯電した隣接オリゴヌクレオチド鎖間の静電反発が低減され、ＤＮＡの高い表面密度が達成された。過剰なオリゴヌクレオチドを遠心分離（５×５０００ｒｐｍ、１０分間）により除去し、続いてＤＮＡ−ｎａｎｏＭＯＦコンジュゲートを水に再懸濁した。
【００７９】
銀および金のナノ粒子のＤＮＡ官能化。クエン酸でキャップされた球状の金および銀のナノ粒子（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ）は、さらに修飾することなく受け取ったままで使用した。異方性金ナノ粒子は、他の箇所で広範囲にわたって詳述されている手順に従って合成された。３８、３９チオール修飾オリゴヌクレオチドを用いたＡｕＮＰのＤＮＡ官能化は、他の箇所で広範囲にわたって詳述されている手順に従って実施された。４０簡単に説明すると、１００ｎｍｏｌのＡｕＮＰ結合アセンブリ鎖（配列１）を１００ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ、ｐＨ＝８）の溶液でおよそ１時間処理し、その後、Ｎａｐ−５サイズ排除カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製して、残りのＤＴＴを除去した。界面活性剤Ｔｗｅｅｎ−２０をＡｕＮＰの溶液に添加して、最終界面活性剤濃度を０．０１体積％にし、続いて精製したチオール化ＤＮＡ（ＡｕＮＰのＯ．Ｄ．あたり約４〜５ｎｍｏｌ）を添加した。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の５Ｍ溶液を、「塩熟成」プロセスでその後数時間かけてナノ粒子溶液にゆっくりと添加して、鎖間の静電反発を遮断することにより、粒子表面上のＤＮＡ密度を高めた。最終塩濃度を０．５Ｍ  ＮａＣｌにした後、粒子を一晩静置し、その後、遠心分離を３回（４０００〜１５０００ｒｐｍ；回数はナノ粒子のサイズに応じて１０〜６０分間で変化）行って精製し、上清を除去し、ナノ粒子ペレットをＮａｎｏｐｕｒｅ水（１８．２ＭΩ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に再懸濁して、任意の未反応ＤＮＡ、塩、および界面活性剤を除去した。最終回の遠心分離後に上清を除去した後、精製した粒子に塩を添加して、最終濃度をもう一度０．２Ｍ  ＮａＣｌにし、これは、その後のすべてのアセンブリ反応が起こる塩濃度である。
【００８０】
酸化鉄ナノ粒子のＤＮＡ官能化。クリックケミストリーによる酸化鉄およびセレン化カドミウムのナノ粒子のＤＮＡ官能化は、他の箇所で詳述されている手順に従って実施された。４１簡単に説明すると、疎水性ナノ粒子は、両親媒性ポリマーのコーティングの層で表面修飾することにより水相に移された第１の相であった。典型的なポリマーコーティングプロセスでは、０．２Ｍに等しいポリマーモノマー単位の初期濃度のクロロホルム中のアジド官能化ポリ無水マレイン酸−ａｌｔ−１−オクタデセン（Ｎ３−ＰＭＡＯ）の溶液を、およそ０．１μＭの濃度でクロロホルムに溶解したナノ結晶の溶液に添加した。ナノ結晶表面のｎｍ２あたりのポリマーモノマー単位の比率は、粒子を完全に被覆するために少なくともおよそ１００である必要があった。次に、混合物を穏やかに振盪しながらおよそ５０℃に２分間加熱した。室温まで冷却した後、溶媒を回転蒸発によりゆっくり蒸発させ、フラスコの底に薄いフィルムを得た。ホウ酸ナトリウム緩衝液（７５ｍＭ、ｐＨ＝９）を添加して、ナノ粒子を水溶液に移した。過剰なＮ３−ＰＭＡＯを除去するために、ショ糖勾配遠心分離を適用した。次に、精製したナノ粒子を、過剰の精製したＤＢＣＯ−ＤＮＡ（＃１２、ａｚｉｄｅＮＰ結合アセンブリ鎖）で官能化した。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の５Ｍ溶液を、「塩熟成」プロセスでその後数時間かけてナノ粒子溶液にゆっくりと添加して、鎖間の静電反発を遮断することにより、粒子表面上のＤＮＡ密度を高めた。
【００８１】
色素担持実験。５ｍＬのスクリューバイアルで、Ｃｙ５−ＤＮＡ（配列７）官能化ＵｉＯ−６６  ＮＰを、５０ｍＭフルオロセイン溶液（１ｍＬ）に浸し、２５℃で２４時間静置した。結晶を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、４０℃、５分間）により収集し、その後、水で洗浄し、このサイクルを１０回繰り返した。
【００８２】
共焦点蛍光顕微鏡法。Ｎｉｋｏｎ  Ａ１Ｒ＋共焦点レーザー顕微鏡システムで共焦点蛍光顕微鏡法を実施して、ＭＯＦナノ粒子の外部表面がＣｙ５標識ＤＮＡで官能化され、その後フルオレセインでカプセル化することができることを確認した。ナノ粒子のサイズが小さいため、光退色により、使用することができるレーザー励起の強度が大幅に制限される。その結果、断面画像は低輝度を呈する。しかしながら、Ｃｙ５およびフルオレセインの共局在化を明確に見ることができ（図１５）、ＭＯＦナノ粒子の内部細孔は依然としてＤＮＡ官能化後にアクセス可能であることを示唆する。
【００８３】
ＤＮＡ表面被覆の定量化
ＵＶ−Ｖｉｓ分光法（ＵＶ−Ｖｉｓ）。ＵＶ−Ｖｉｓ分光法は、温度ステージを備えたＣａｒｙ  ５０００（Ａｇｉｌｅｎｔ）ＵＶ−Ｖｉｓ分光計で実施した。測定には、１センチメートル（ｃｍ）の石英光学セルを利用した。ＭＯＦナノ粒子−ＤＮＡコンジュゲート上のＤＮＡの表面被覆は、色素標識ＤＮＡ配列＃６を利用して、ＵＶ−Ｖｉｓによって決定された。
【００８４】
誘導結合プラズマ発光分光法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）。各ＭＯＦのＤＮＡ被覆は、ナノ粒子の表面積およびＮＰモル濃度に基づいて定量化された。ＴＥＭから取得した各ＭＯＦ  ＮＰの半径／エッジ長さを用いて、各ナノ粒子の表面積を幾何学的近似に基づいて計算した：ＵｉＯ−６６、ＵｉＯ−６７−ｂｐｙ、ＵｉＯ−６８−Ｎ３、およびＭＩＬ−１０１（Ｆｅ）の八面体；  ＰＣＮ−２２４、ＭＩＬ−１０１（Ｃｒ）、およびＭＩＬ−１０１（Ａｌ）の球体；ＰＣＮ−２２２のロッド；  ＰＣＮ−２２３の楕円体）。各ＭＯＦ  ＮＰサンプルのモル濃度は、結晶学的情報に加えて、これらのＭＯＦサンプルの金属含有量のＩＣＰ−ＡＥＳ分析によって取得され、これに基づいて、所与のサイズのＭＯＦ  ＮＰについて粒子あたりの金属原子数を計算することができる。ＩＣＰ−ＡＥＳ分析は、自動サンプル交換装置を備えたＴｈｅｒｍｏ  ｉＣａｐ  ７６００  ＩＣＰ−ＯＥＳ機器で実施した。ＭＯＦサンプルをＤＭＦ（１ｍＬ）に分散し、１０μｌのＭＯＦサンプルをＨＮＯ３（９９０μｌ）に添加した。サンプルを６０℃で１５時間加熱して、ＭＯＦを完全に消化した。内部多元素標準を用いて未知のサンプルを調製し、生成された標準曲線と比較した。
【００８５】
３１Ｐ｛１Ｈ｝マジック角回転固体核磁気共鳴分光法。３１Ｐ｛１Ｈ｝マジック角回転（ＭＡＳ）ＮＭＲ分光法を、Ｖａｒｉａｎ  ４００ＭＨｚ  ＶＮＭＲＳシステム（５１２走査、５秒のリサイクル時間、１０，０００Ｈｚの回転速度）で実施して、ＤＮＡのリン酸部分と金属クラスターとの間の結合を直接調査した。
【００８６】
ＭＯＦ−ＮＰコアサテライトナノクラスターの特性評価
ＭＯＦ−ＮＰコアサテライトナノクラスターのシリカカプセル化。コロイド溶液から固体状態へのＭＯＦ−ＮＰコアサテライトナノクラスターの固定化は、シリカカプセル化によって達成された。４２簡単に説明すると、Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＳＰＡ）（２μＬ、７．２μｍｏｌ）を、１ｍＬの０．２Ｍ  ＮａＣｌ溶液中のナノクラスターに大過剰で（ＤＮＡリン酸骨格の数に対して）添加し、混合物をおよそ３０分間攪拌した後、トリエトキシシラン（ＴＥＯＳ）（４μＬ、２１．７μｍｏｌ）を添加した。懸濁液を室温で２０分間激しく撹拌し、続いて３回の遠心分離および水中への再懸濁により精製して、過剰なシリカを除去した。ＴＥＭの場合、シリカでカプセル化したナノクラスターを水に再懸濁し、ＴＥＭグリッドにドロップキャストした。
【００８７】
ＭＯＦ−ＡｕＮＰナノクラスターの細胞培養、細胞取り込み、および細胞毒性の研究
細胞培養および取り込み実験。ＭＯＦ−ＮＰハイブリッドナノクラスターの細胞毒性および取り込み特性を評価した。具体的には、Ｔａｍｒａホスホラミダイト標識ＤＮＡを合成し、蛍光標識として２２５ｎｍのＵｉＯ−６６ナノ結晶上で官能化した後、２０ｎｍのＡｕＮＰとハイブリダイズしてＴａｍｒａ−ＭＯＦ−ＡｕＮＰナノクラスターを形成した。ＭｃＣｏｙの５Ａ培地中のヒト卵巣がん細胞（ＳＫ−ＯＶ−３）を異なる形態の核酸とインキュベートした：最初に、１００μＬのＭＯＦ−ＡｕＮＰナノクラスターの懸濁液；次に、１００μＬの同量の色素標識遊離Ｔａｍｒａ−ＤＮＡ鎖。細胞糸状アクチン（Ｆ−アクチン）は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ファロイジンで染色され、ＨＥＰＥＳ緩衝液の溶液で洗浄することにより、すべての吸収されなかった粒子が細胞から除去された。経時的な細胞小胞内のＭＯＦ−ＡｕＮＰナノクラスターの濃縮は、同量の単鎖色素標識ＤＮＡと比較して、細胞小胞内のナノクラスターの強い蓄積が観察された、共焦点レーザー走査顕微鏡によって実証された（図１３）。
【００８８】
ＭＴＴアッセイ。異なる量のＭＯＦ−ＡｕＮＰナノクラスターと２４時間インキュベートした後のＳＫ−ＯＶ−３細胞の細胞生存率は、ＭＴＴアッセイおよび細胞生存テストによって評価され、細胞に対してその無視できる細胞毒性または抗増殖効果を示した。簡単に説明すると、ＳＫ−ＯＶ−３細胞を、３７℃で２４時間、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および５％ＣＯ２とともに、ＭｃＣｏｙの５Ａ培地の９６ウェル細胞培養プレートに５×１０４細胞／ｍＬの密度で播種した。その後、培養培地を、異なる用量のカーボンドットを含む２００μＬのＭｃＣｏｙの５Ａ培地と交換し、さらに８時間または２４時間培養した。次に、１０μＬの５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ溶液を各細胞ウェルに添加した。細胞をさらに４時間インキュベートし、続いてＭＴＴを含む培養培地を除去し、その後、１００μＬのＤＭＳＯを添加した。得られた混合物を室温で１５分間振盪した。４９２ｎｍでのＭＴＴの吸光度を自動ＥＬＩＳＡ分析装置（ＳＰＲ−９６０）で測定した。各実験は５回行われ、平均データが示された。
【００８９】
結果／議論
最初の研究では、その高い安定性および広範囲にわたって特徴付けられている構造により、ＵｉＯ−６６が選択された。２２ＵｉＯ−６６を、結晶子サイズを調節するために酢酸を使用して培養熱条件下で合成し、２２５±３５ｎｍ（エッジ長さ）の八面体ナノ粒子を得た。ＵｉＯ−６６の結晶化度および結晶子サイズは、それぞれ、ＰＸＲＤおよび走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によって決定された（図２ａ、ｄ）。次に、オリゴヌクレオチドの３’または５’末端のいずれかで化学修飾ホスホラミダイトを用いてＤＮＡ合成装置で、リン酸修飾核酸を合成した。典型的なＤＮＡ−ＭＯＦ粒子の官能化実験では、過剰なオリゴヌクレオチドをＭＯＦナノ粒子のコロイド懸濁液に添加し、その後一晩インキュベートした（本明細書に記載される）。塩成熟手順を使用して、負に帯電したオリゴマーをスクリーニングし、高密度の表面固定化オリゴヌクレオチドを得た。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像およびＰＸＲＤにより、粒子の形状および結晶化度がＤＮＡ修飾後も維持されたことが確認された（図２ｂ、ｄ）。
【００９０】
ＭＯＦナノ粒子表面上への核酸の固定化を確認するために、３１Ｐ｛１Ｈ｝マジック角回転（ＭＡＳ）固体ＮＭＲ分光法を使用して、末端リン酸官能化ＤＮＡとＺｒベースのＳＢＵとの間の相互作用を調べた（図２ｃ）。化学リン酸化試薬（ＣＰＲ）を用いて合成された、１塩基（「ＣＰＲ−Ｔ１」）、２塩基（「ＣＰＲ−Ｔ２」）、および２０塩基（「ＣＰＲ−Ｔ２０」）の長さのオリゴ−Ｔ配列が合成され、ＭＯＦナノ粒子上に化学吸着された。図２ｃに示すように、−０．３ｐｐｍを中心とする狭いリン共鳴は、遊離核酸サンプルの非結合リン酸に対応する。ＣＰＲ−Ｔ１＠ＵｉＯ６６の場合、リン共鳴における−０．３から−５．１ｐｐｍへの４．８ｐｐｍの高磁場シフトにより、Ｚｒ−リン酸結合の形成が確認された。２３ＣＰＲ−Ｔ２＠ＵｉＯ−６６の場合、３つの共鳴が観察され、非結合ホスホジエステルのＰ原子（−０．２ｐｐｍ）、Ｚｒ−Ｏ−Ｐ（ホスホジエステル、−２．８ｐｐｍ）、および−５．９ｐｐｍでＺｒ−Ｏ−Ｐ（末端リン酸）の共鳴に割り当てられた（図２ｃ挿入図）。データは、固定化が２つの方法：両方のリン酸がＺｒ豊富な表面と結合することができるエンドオンおよび／またはサイドオンで生じる可能性があることを示唆した。２つのＺｒ−Ｏ−Ｐモード間の有意なピーク強度の違い（末端リン酸対ホスホジエステル）は、内部ホスホジエステルと比較して、Ｚｒ中心に対する末端リン酸の親和性の増加によるものであり、この違いは主に、内部ホスホジエステルが受ける立体障害の増加によるものであり、Ｚｒ−リン酸相互作用を研究した以前の報告と一致するが、ＭＯＦの文脈では異なる。２４ＣＰＲｄＴ２０＠ＵｉＯ−６６の場合、表面の官能化による化学シフトの大幅な広がりが観察される。この変化は、骨格と末端リン酸との比率の増加、各骨格リン酸に対する別個の化学環境、およびより長いオリゴヌクレオチド鎖にアクセス可能な自由度の大きさに起因した。総合して、これらのデータは、ＤＮＡの末端リン酸部分が、ＭＯＦナノ粒子の外部表面上の以前に溶媒結合したＺｒ部位に配位するという結論を支持した。
【００９１】
ＭＯＦ表面上のＤＮＡ被覆の程度は、誘導結合プラズマ発光分光法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）およびＵＶ−可視分光法（ＵＶ−ＶＩＳ）によって決定された。ＵｉＯ−６６の粒子あたりの表面積およびＺｒ原子は、結晶子のサイズ、形状、および構造の幾何学的近似（本明細書に記載される）に基づいて計算された。ＤＮＡ表面被覆を定量化するために、Ｔａｍｒａ色素標識ＤＮＡを使用して、ＵｉＯ−６６粒子を修飾した。５５６ｎｍでのＴａｍｒａの吸収を測定して、ＵｉＯ−６６の平均ＤＮＡ担持は１７±６ｐｍｏｌ／ｃｍ２であると決定され、これはＩＣＰ−ＡＥＳによって測定された（本明細書に記載される）リンおよびＺｒの濃度と相関する。この研究で実現されたＤＮＡ表面被覆は、配位子ストラット修飾アプローチを使用した報告よりも約２倍高い。１５高いＤＮＡ表面被覆は、高いＤＮＡ表面被覆を有する粒子に特有の特性である相補的なＤＮＡを有する、ＤＮＡ官能化ＵｉＯ−６６ナノ粒子および金ＮＰ（直径＝５０ｎｍ）から形成される凝集体の熱融解分析によっても確認された。１
【００９２】
このアプローチの一般性を評価するために、４つの別個の金属ノード、４つの別個の有機リンカー、および５つの異なるトポロジーを表すＵｉＯ−６６、ＵｉＯ−６７−ｂｐｙ（２，２’−ビピリジン−５’，５’−ジカルボン酸）、ＵｉＯ−６８−Ｎ３／ＰＣＮ−５８、ＰＣＮ−２２２／ＭＯＦ−５４５、ＰＣＮ−２２３、ＰＣＮ−２２４、ＭＩＬ−１０１（Ａｌ）、ＭＩＬ−１０１（Ｆｅ）、およびＭＩＬ１０１（Ｃｒ）を含む、異なる金属および有機リンカーを含む９つの別個のＭＯＦアーキテクチャを選択した（図３）。それらの高い化学的安定性に加えて、これらのＭＯＦはナノ医療において有望である。２５、２６ＭＯＦナノ粒子の合成、特性評価、ならびに表面の官能化および定量化は、文献報告に従って、記載のもの（図４〜９）と類似して行われた。これらの異なるＭＯＦを比較する際に、ＳＢＵ密度、ＳＢＵ配位数、および金属−酸素結合解離エネルギーが表面の官能化にどのように影響するかをテストした。
【００９３】
ＤＮＡ表面の被覆は、ナノ粒子表面上に存在するＳＢＵの密度と相関するだろうと仮定された。これをテストするために、ＵｉＯ−６６、ＵｉＯ−６７−ｂｐｙ、およびＵｉＯ−６８−Ｎ３という、基礎トポロジーが同じである３つの等細網状のＺｒベースの構造体を合成した。このファミリー内では、表面金属ノードの密度は有機リンカー長さの増加の関数として減少し、Ｚｒ酸化物クラスターＳＢＵ表面密度（（１００）ファセットが露出していると仮定する）は、ＵｉＯ−６６、ＵｉＯ−６７−ｂｐｙ、およびＵｉＯ−６８−Ｎ３について、それぞれ、０．２７、０．１６、および０．１１ｎｍ−２と推定される。図３ａに示すように、各ＭＯＦ表面上のＺｒ  ＳＢＵ密度の関数としてＤＮＡ表面被覆をプロットすることにより、ＤＮＡとＺｒ  ＳＢＵとの比率が本質的に一定である（より大きい表面を有する構造はより多くのＤＮＡを有する）線形関係が観察された。これは、異なるＭＯＦでのＤＮＡ官能化と表面ＳＢＵ密度との間の定量的相関の最初の実証であり、意図する用途に適したＤＮＡ表面担持でＭＯＦ構造を選択する方法を提供する。高いＤＮＡ担持密度は、ナノ材料のコロイド安定性、および高いＤＮＡ担持が粒子プローブ性能と相関するある特定の生物学的用途に大きな影響を与える可能性がある。
【００９４】
高いＳＢＵ配位数を有するＭＯＦがより高いＤＮＡ官能化密度をもたらす（ナノ粒子表面上のより多くの溶媒結合ＣＵＳにより）ことをテストするために、３つのＺｒベースのポルフィリンＭＯＦ、ＰＣＮ−２２２、ＰＣＮ−２２３、およびＰＣＮ−２２４を、同一のテトラカルボキシフェニルポルフィリンリンカー（Ｈ２ＴＣＰＰ）から合成した。これにより、ＳＢＵ接続が異なるため、異なるネットトポロジーを共有する構造が得られた（図３ｂ）。具体的には、８−、１２−、および６−の配位数を有する３つの異なる八面体Ｚｒ６  ＳＢＵがこれらの構造体をそれぞれ定義し、それぞれ、０．２８、０．２５、および０．２８ｎｍ−２の同等の表面ＳＢＵ密度をもたらす。図３ｂに示すように、同等の表面ＳＢＵ密度を有する３つのＭＯＦのＳＢＵ配位数とともにＤＮＡ表面被覆が増加する傾向が見られた。これは、高度に配位された金属クラスターが、その後のリン酸−ＤＮＡ吸着に有利に働く配位不飽和により高度の表面欠陥を曝すためであった２７。
【００９５】
次に、より強い金属−リン酸結合の形成がより大規模なＤＮＡ吸着を容易にするかどうかをテストした（図３Ｃ）。ＭＩＬ−１０１（Ｃｒ）、ＭＩＬ−１０１（Ｆｅ）、およびＭＩＬ−１０１（Ａｌ）の３つの等構造ＭＩＬ−１０１構造体を合成した。３つすべてのＭＯＦで同一の構造が見つかったため、ＤＮＡ表面被覆の決定におけるリン酸−金属結合強度（吸着後）の重要性を評価することができた。金属。Ｆｅ−Ｏ、Ｃｒ−Ｏ、およびＡｌ−Ｏの結合について、それぞれ、４０９、４７７、および５１２ｋＪ／ｍｏｌの酸素結合解離エネルギー（ＢＤＥ）が報告されている。２８ＢＤＥの関数としてのＤＮＡ表面被覆の増加が観察された（図３Ｃ）。
【００９６】
最後に、ＤＮＡ−ＭＯＦナノ粒子コンジュゲート表面におけるオリゴヌクレオチドの安定性および密度を理解して、異なるＤＮＡ−ＮＰサイズ、形状、および組成を有するそのような構造のハイブリダイゼーションおよびアセンブリ特性を研究した。特に、ＤＮＡ−ＭＯＦナノ粒子および原型無機金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）ＳＮＡコンジュゲートを使用して、ハイブリッドコアサテライトナノクラスターを合成した。典型的な実験では、異なるサイズのＡｕＮＰがＭＯＦナノ粒子上のＤＮＡ配列と相補的なＤＮＡ配列で官能化されてアセンブリを容易にし、補体が混合され、塩熟成され、得られたコアサテライトハイブリッドアーキテクチャが低速遠心分離によって単離された。組み立てられたナノクラスターの形態を確認するために、図１０ａに示すように、ＤＮＡ−ナノ粒子アセンブリを安定化するために開発されたシリカカプセル化プロトコルを使用した。２９重要なことに、非相補的なＤＮＡ官能化粒子を混合しても、ＭＯＦ−ＡｕＮＰナノクラスターは形成されない。
【００９７】
ＤＮＡを介したハイブリダイゼーション反応の化学量論を修正することにより（ＭＯＦ  ＮＰ：ＡｕＮＰ比を１：２０から１：２０００に変化させることにより）、中心のＭＯＦ粒子への金属ＮＰの担持を制御することができた（図１０ｂ）。ＭＯＦ−ＮＰナノクラスターサテライト構造の形成は、高いＡｕＮＰ：ＭＯＦ比でポリマー構造よりも好まれ、それらが形成されると、クラスター間ハイブリダイゼーションによる拡張ネットワークの形成を阻害したナノクラスター抹消の同一の非相補的ＤＮＡのみを露出した。このＤＮＡを介したアプローチの一般性をさらに調査するために、金ナノスター、立方体、八面体、および三角柱、銀球、ならびにＦｅ３Ｏ４球を含むさまざまなＤＮＡ官能化ＮＰビルディングブロックを有するＭＯＦ粒子コアでサテライト構造を体系的に組み立てた。得られた構造のＴＥＭおよびエネルギー分散型Ｘ線分光法（ＥＤＸ）マッピングは、それらのきれいな形成を示す（図１１および１２）。ＭＯＦ−ＮＰハイブリッドナノクラスターの細胞毒性および取り込み特性も評価した。経時的な細胞小胞内のＭＯＦ−ＡｕＮＰナノクラスターの濃縮は、共焦点レーザー走査顕微鏡によって実証され（図１３および１９）、同量の単鎖色素標識ＤＮＡと比較して、細胞小胞内のナノクラスターの強い蓄積が観察され、認識できる細胞毒性はなかった（図１４）。総合して、実現された構造は、プログラム可能なアセンブリのためのおよびデザイナーオリゴヌクレオチド相互作用が関連する用途で、これらの新しいＤＮＡ修飾ＭＯＦ  ＮＰの汎用性および潜在的な有用性を示す。
【００９８】
低温透過型電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ−ＴＥＭ）画像により、溶液中のＭＯＦ−ＡｕＮＰナノクラスターの形成が確認された（図１６および１７）。また、ＭＯＦ−ＮＰコアサテライトナノクラスターの光学特性を決定して、遊離コロイドナノ粒子と組み立てられたＭＯＦナノ粒子凝集体の消光を比較した。すべての場合で、最大消光は、遊離粒子ＬＳＰＲから約２０ｎｍだけ赤方偏移し、これは、プラズモンナノ粒子の組み立てによる周知の効果である（図１８）。
【００９９】
この実施例は、本明細書に開示された技術に対するいくつかの利点を示した。第１に、有機リンカーの選択とは無関係に、およびさまざまな金属クラスターに広く適用可能な、ＤＮＡ修飾ＭＯＦの合成へのアプローチを提供する。第２に、実現した構造は安定しており、元のＭＯＦの特徴の多くを有し、相補的なＤＮＡ修飾ＮＰビルディングブロックでプログラム可能に組み立てることができる。第３に、ＤＮＡでＭＯＦ  ＮＰを修飾するためのデザインルールがこの作業を通じて浮上している。最も注目すべきは、ＤＮＡ表面被覆がＭＯＦナノ粒子表面のＳＢＵ密度、配位数、および金属−リン酸結合強度と直接相関することが本明細書で示された。最後に、本明細書に記載の実験は、生物学において有用である特性３０、触媒３１、および光学３２を有するデザイナー材料を調製するために使用することができる調整可能な特性を有するＮＰビルディングブロックの広いクラスへの経路を提供する。
【０１００】
実施例２
材料
特に明記しない限り、すべての試薬は商業的供給源から入手し、さらに精製することなく使用した。ヒト組換えインスリン（分子式：Ｃ２５７Ｈ３８３Ｎ６５Ｏ７７Ｓ６、分子量：５８０７．５７、カタログ番号：９１０７７Ｃ−１００ＭＧ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡから購入した。インスリン、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７標識インスリン（ヒト）は、ＮａｎｏＣＳ，ＵＳＡから購入した。ＥＬＩＳＡキットはＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡから購入した。この作業で使用されるすべてのオリゴヌクレオチドは、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入した試薬を用いて固体支持体ＭＭ１２合成装置で合成した。すべての実験で使用した水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｂｉｏｃｅｌ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手した超高純度脱イオン（ＤＩ）グレード（１８．２ＭΩ・ｃｍ抵抗率）であった。
【０１０１】
ＭＯＦ  ＮＰ合成
１５０ｎｍのＮＵ−１０００  ＭＯＦ  ＮＰの合成。８ｍｇ（３４．３ｎｍｏｌ）の塩化ジルコニウムおよび２ｍｇ（３ｎｍｏｌ）の１，３，６，８−テトラキス（ｐ−安息香酸）ピレン（Ｈ４ＴＢＡＰｙ）配位子を２．０ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、０．４ｍｌの酢酸および０．２ｍｌのＤＩ水も混合溶液に添加し、半透明の黄色溶液を得た。１０のサンプルバイアルを同じ条件下で一度に調製し、９０℃のオーブンに３０分間入れ、その間に淡黄色の懸濁液が形成された。室温に冷却した後、１０のバイアルを組み合わせ、ナノ結晶を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３０分間）により収集し、続いてＤＭＦおよびアセトンで３回溶媒交換し、その後ＨＣｌで活性化した。
【０１０２】
１０μｍのＮＵ−１０００  ＭＯＦ粒子の合成。１０μｍのＮＵ−１０００粒子の合成は、文献で報告されている方法に基づいた。４３簡単に説明すると、７０ｍｇのＺｒＣｌ４（０．３０ｍｍｏｌ）および２７００ｍｇ（２２ｍｍｏｌ）の安息香酸を８ｍＬのＮ，Ｎ−ジエチルホルムアミド（ＤＥＦ）（６ドラムバイアル中）に混合し、超音波処理により溶解した。透明な溶液を８０℃のオーブンで１時間インキュベートした。室温まで冷却した後、４０ｍｇ（０．０６ｍｍｏｌ）のＨ４ＴＢＡＰｙをこの溶液に添加し、混合物を２０分間超音波処理した。黄色の懸濁液を１２０℃のオーブンで４８時間加熱した。室温まで冷却した後、黄色の単結晶がバイアルの壁に存在した。サンプルをＤＭＦおよびアセトンで洗浄し、その後ＨＣｌで活性化した。
【０１０３】
ＰＣＮ−２２２  ＭＯＦ  ＮＰの合成。２００ｎｍのＰＣＮ−２２２／ＭＯＦ−５４５ナノ結晶の合成は、若干の修正を加えて文献で報告されている方法に基づいた。４４塩化ジルコニル八水和物（３７．５ｍｇ、０．１１６ｍｍｏｌ）およびテトラキス（４−カルボキシフェニル）−ポルフィリン（６．５ｍｇ、０．００８２ｍｍｏｌ）を、テフロン加工されたキャップ付きの２２ｍＬのホウケイ酸バイアル中のＤＭＦ（１６．２５ｍＬ）に溶解した。ジクロロ酢酸（０．２５ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を１３０℃で１８時間加熱して、暗紫色の棒状ナノ結晶および黄色の母液を得た。遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）によってナノ結晶を収集し、続いてＤＭＦで溶媒交換した。得られたナノ粒子のサイズ分析を実施した（図２０）。
【０１０４】
粉末Ｘ線回折。ＭＯＦナノ粒子（合成時、インスリンカプセル化、およびインスリンカプセル化ＤＮＡ−ＭＯＦコンジュゲート）の結晶化度は、粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）によって確認された。粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）データ（図２１）は、Ｃｕ回転陽極Ｘ線源を備えたＲｉｇａｋｕモデルＡＴＸ−Ｇ回折計で収集された。
【０１０５】
インスリンのカプセル化。活性化されたＭＯＦナノ粒子（３ｍｇ）を、室温で１時間、インスリン溶液（ＤＩ水中、０．４ｍｇ／ｍＬ）で処理し、インスリンをカプセル化した。インスリンの担持は、文献で報告されている方法に基づいて、誘導結合プラズマ発光分光法（ＩＣＰ−ＯＥＳ）および熱重量分析（ＴＧＡ）によって測定された。４５ＭＯＦ  ＮＰの表面に付着したインスリンを除去するために、上清をデカントし、その後固体サンプルをＤＩ水で３回洗浄して、結晶の表面に付着したインスリン分子を除去した。
【０１０６】
ＤＮＡの合成および官能化
オリゴヌクレオチドの合成。標準ＣＰＧ固相支持体でＭｅｒｍａｉｄ  ＭＭ１２  ＤＮＡ合成装置（Ｂｉｏ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）を使用して、オリゴヌクレオチド（表２）を合成した。すべてのオリゴヌクレオチドは、製造業者が推奨する条件下で脱保護され、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製された。濃度の特性評価および決定は、それぞれ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析およびＵＶ−Ｖｉｓ分光法によって決定された。
【０１０７】
【表２】
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【０１０８】
ＤＮＡ官能化。ＭＯＦ  ＮＰのＤＮＡ官能化は、若干の修正を加えて以前に報告された方法に基づいて行われた。４６典型的なＤＮＡ官能化実験では、過剰のリン酸末端核酸（およそ１００ｎｍｏｌ）をＭＯＦ  ＮＰコロイド（およそ２ｍｇ）に添加し、その後、シェーカー上に置いて４時間インキュベートした。過剰のオリゴヌクレオチドを遠心分離（３×１００００ｒｐｍ、１５分間）により除去し、続いて水に再懸濁した。ＳＥＭ画像により、ＤＮＡ−ＮＵ−１０００およびＤＮＡ−ＰＣＮ−２２２ナノ粒子（ＮＰ）の形態がＤＮＡ官能化後も維持されたことが確認された（図２２）。Ｔａｍｒａ−ＤＮＡ−ＮＵ−１０００  ＮＰおよびＮＵ−１０００  ＮＰのＵＶ−ｖｉｓスペクトルも取得した（図２３）。
【０１０９】
ＤＮＡ−ＮＵ−１０００およびＤＮＡ−ＰＣＮ−２２２の分解プロファイル
シミュレートされた細胞外マトリックスの分解プロファイル。血管内および間質液をシミュレートするために、ＭＯＦ  ＮＰを、穏やかに振盪（４００ｒｐｍ）しながら、３７℃でＤＭＥＭ緩衝液＋血清（ｐＨ＝７．０）とインキュベートした。具体的には、およそ５０μｇのＤＮＡ−ＮＵ−１０００およびＤＮＡ−ＰＣＮ−２２２を最初に２００μＬの水に分散させ、ストック溶液（０．２５ｍｇ／ｍＬ）を形成した。次に、２０μＬのストック溶液および９８０μＬ（ＤＭＥＭ緩衝液＋血清溶液）（ｐＨ＝７．０）を含む７つの同一サンプルを調製し、サーモシェーカーで、それぞれ、０．５、１．５、６、１２、２４、４８、および７２時間インキュベートした。各時点で、１つのサンプルを収集し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１５分間）して、残りのＭＯＦ  ＮＰを除去した。上清のＵＶ−ｖｉｓ吸光度を測定し、経時的なリンカー放出の割合を標準曲線に基づいて計算した。
【０１１０】
シミュレートされた細胞内マトリックスの分解プロファイル。同様の手順に従って、１×ＰＢＳ溶液中のＤＮＡ−ＮＵ−１０００およびＤＮＡ−ＰＣＮ−２２２の分解プロファイルを測定し、細胞内マトリックス（ｐＨ＝７．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）でのそれらの分解をシミュレートした。
【０１１１】
窒素吸着等温線の測定。Ｎ２吸着等温線の測定は、７７ＫでＭｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ  Ｔｒｉｓｔａｒ  ＩＩ  ３０２０（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）で実施された。各測定には、２０〜３０ｍｇの材料が使用された。表面積は、Ｂｒｕｎａｕｅｒ−Ｅｍｍｅｔｔ−Ｔｅｌｌｅｒ（ＢＥＴ）方程式を適用することによって推定された。ｔ−プロット内部および外部表面積は、Ｎ２等温線（０．２６Ｐ／Ｐ０〜１．０Ｐ／Ｐ０）（図２４）の第２の直線領域においてハーキンズおよびジュラの式によって決定された。ＮＵ−１０００およびＰＣＮ−２２２のＤＦＴ孔径分布は、インスリンがメソ細孔およびミクロ細孔の両方を占めることを示唆した（図２５）。
【０１１２】
細胞取り込み実験および細胞毒性評価
細胞培養およびインキュベーション。ヒト卵巣がん細胞ＳＫ−ＯＶ−３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−７７（商標））およびマウス黒色腫細胞Ｂ１６−Ｆ１０（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−６４７５）を、３７℃で５％ＣＯ２のインキュベータでインキュベートした。これら２つの細胞株の培地は、代表的には１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％抗生物質を含むＭｃＣｏｙの５Ａ培地（ＡＴＣＣ（登録商標）３０−２００７（商標））およびＤｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＡＴＣＣ（登録商標）３０−２００２（商標））であった。許容されるコンフルエンスを得るために、細胞は２または３日ごとに継代された。
【０１１３】
共焦点蛍光顕微鏡による細胞の画像化。共焦点レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ８００）システムで共焦点蛍光顕微鏡法を実施し、インスリン＠ＤＮＡ−ＭＯＦ  ＮＰが細胞によって内在化されたことを確認した。ＳＫＯＶ−３細胞を、５×１０４コンフルエンスの繁茂で蒔いた。その後、インスリンカプセル化ＭＯＦおよび遊離インスリンを細胞とインキュベートした（表３）。６時間後、培地中の粒子を洗い流し、細胞を４％ホルムアルデヒドで固定した。細胞骨格アクチン（Ｆ−アクチン）を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８ファロイジン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ａ１２３７９）で染色した。
【０１１４】
【表３】
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【０１１５】
フローサイトメトリーによる細胞取り込み。ＬＳＲ−ＩＩフローサイトメトリー装置を使用して、オリゴヌクレオチドおよびインスリンの両方の細胞取り込みを特定する。Ｓｋｏｖ−３細胞を、５×１０５濃度でフローチューブで最初にインキュベートした。その後、インスリン＠ＤＮＡ−ＭＯＦ、および対照（遊離インスリン＋遊離ＤＮＡ）を細胞とインキュベートした（表３）。１５分または２時間後、粒子を洗い流し、細胞を４％ホルムアルデヒドで固定した。フローデータは、最初にＳＳＡおよびＦＳＡパラメーターによってゲーティングされ、各チャネルの陽性ゲーティングは陰性対照に基づく。
【０１１６】
ＭＴＴアッセイ。インスリン＠ＤＮＡ−ＭＯＦ構築物の抗増殖効果をＭＴＴアッセイにより評価した。具体的には、Ｂ１６−Ｆ１０細胞を、３７℃で２４時間、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および５％ＣＯ２とともに、ＤＭＥＭ培地の９６ウェル細胞培養プレートに５×１０４細胞／ｍＬの密度で播種した。次に、培養培地を異なる濃度のサンプル（非標識ＤＮＡおよびインスリンを含む）を含む２００μＬのＤＭＥＭ培地と交換し、７２時間培養した。次に、１０μＬの５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ溶液（１０％  ＳＤＳ）を各細胞ウェルに添加した。細胞をさらに４時間インキュベートし、続いてＭＴＴを含む培養培地を除去した。最後に、１００μＬの１０％ＳＤＳを添加し、３７℃で一晩インキュベートした。４９２ｎｍでのＭＴＴの吸光度を自動ＥＬＩＳＡ分析装置（ＳＰＲ−９６０）で測定し、基準吸光度は９７７ｎｍであった。各実験は３回行われ、平均データが示された。
【０１１７】
結果／議論
それらの水性安定性およびメソ細孔チャネル構造により、２つジルコニウムメソ細孔ＭＯＦ、ＮＵ−１０００、およびＰＣＮ−２２２／ＭＯＦ−５４５８９〜９１は、モデル酵素（図２６Ｂ）としてインスリンをカプセル化するためにナノ粒子として合成された。９２〜９３次に、これらのインスリン＠ＭＯＦ  ＮＰを末端リン酸修飾ＤＮＡで表面官能化して、３Ｄオリゴヌクレオチドシェルが立体および静電障壁を創出して、高誘電体媒質においてＭＯＦ  ＮＰを安定化し、細胞の侵入に関してそれらに官能性を付与するインスリン＠ＤＮＡ−ＭＯＦを得た（図２６ｃ）。７７  この戦略は、異なる孔径のＭＯＦに一般化することができ、高ペイロードで細胞膜を横断して機能酵素を輸送するための核酸ＭＯＦベースの送達ビヒクルのライブラリを創出する。
【０１１８】
文献の報告に従って、ＭＯＦ  ＮＰ合成およびインスリンカプセル化が実現された。９４〜９５簡単に説明すると、ＮＵ−１０００  ＭＯＦ  ＮＰ（１８０（２０）×７０（１０）ｎｍ）は、９０℃のＤＭＦ中の塩化ジルコニウム（ＺｒＣｌ４）、（４，４’，４’’，４’’’−（ポルフィン−５，１０，１５，２０−テトライル）テトラキス（安息香酸）（Ｈ４ＴＢＡＰｙ）、および酢酸の溶媒熱反応により合成された（図２７ａ）。ＰＣＮ−２２２  ＮＰ（２１０（３０）×５０（１０）ｎｍ）は、１３０℃のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の塩化ジルコニル八水和物（ＺｒＯＣｌ２・８Ｈ２Ｏ）、テトラキス（４−カルボキシフェニル）ポルフィリン（ＴＣＰＰ）、ジクロロ酢酸の溶媒熱反応により合成された（図２７ｂ）。次に、ＮＵ−１０００の活性化された結晶を、インスリンを含むビス−トリス−プロパン緩衝液（ＢＴＰ、ｐＨ＝７）の溶液で処理した。ＭＯＦ  Ｎｐによるインスリンのカプセル化効率は、誘導結合プラズマ発光分光法（ＩＣＰ−ＯＥＳ）によって決定され、３９および３４重量％の最大担持が、それぞれ、ＮＵ−１０００およびＰＣＮ−２２２  ＮＰについて決定された（図２７ｄ）。上清中の過剰なインスリンおよび粒子の外表面上に吸着したインスリンは、ＤＩ水およびトリプシン溶液で洗浄する連続ステップにより除去された。
【０１１９】
核酸でインスリン＠ＭＯＦ  ＮＰを官能化するために、末端リン酸修飾オリゴヌクレオチドを使用して、ＮＵ−１０００およびＰＣＮ−２２２  ＮＰ表面上に高密度の配位不飽和Ｚｒを化学的に対応させた。９６リン酸修飾核酸は、３’リン酸修飾ホスホラミダイトを用いて、ＤＮＡ合成装置で合成された。本明細書で使用される配列、５’（ｄＧＧＴ）１０−リン酸３’は、ポリｄＴシェルに対して、Ｇ豊富シェルを含むＳＮＡの細胞取り込みの増強を示した以前の研究に基づいて選択された。９７典型的なＤＮＡ官能化実験では、ＭＯＦ  ＮＰのコロイド分散液に過剰のオリゴヌクレオチドを添加し、４時間インキュベートした（本書に記載される）。両方のＭＯＦ  ＮＰのＤＮＡ被覆の定量化は、Ｐ対Ｚｒ比に基づいたＩＣＰ−ＯＥＳによって達成され、８±１ｎｍｏｌ／ｍｇおよび１０±１ｎｍｏｌ／ｍｇのＤＮＡ担持が、それぞれ、ＮＵ−１０００およびＰＣＮ−２２２  ＮＰについて測定された（図２７ｄ）。粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）および走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により、ＭＯＦ  ＮＰの結晶化度および形態がＤＮＡ官能化後も維持されたことが確認された（図２２）。重要なことに、動的光散乱（ＤＬＳ）により、ＤＮＡ表面の官能化が生体関連媒体のＭＯＦ  ＮＰコロイド安定性を大幅に増加することが確認された。図２７ｃに示すように、ＤＮＡ官能化ＮＵ−１０００およびＰＣＮ−２２２  ＮＰは、細胞培地（９０％ＤＭＥＭ緩衝液＋１０％ウシ胎児血清）において少なくとも２４時間コロイド安定性であるが、非官能化ＮＵ−１０００は、１時間未満で凝集し、それらのさらなるインビトロ用途を妨げる。
【０１２０】
コロイド安定性に加えて、細胞内タンパク質送達ビヒクルの別の望ましい設計上の考慮事項は、血清／細胞外マトリックスにおけるそれらの安定性およびタンパク質カーゴを放出する細胞内分解性である。生理学的条件下では、細胞内液は血清の濃度（およそ１ｍＭ）と比較して、著しく高い無機リン酸濃度（およそ１０ｍＭ）を呈する。９８〜９９したがって、インスリン＠ＤＮＡ−ＮＵ−１０００およびインスリン＠ＤＮＡ−ＰＣＮ−２２２の分解プロファイルは、細胞外条件と細胞内条件との両方をエミュレートするように設計された溶液にそれらを曝すことにより評価された。血清液をシミュレートするために、ＭＯＦ  ＮＰを、穏やかに振盪（４００ｒｐｍ）しながら、３７℃で９０％ＤＭＥＭ緩衝液＋１０％血清（ｐＨ＝７．０）とインキュベートし、両方のビヒクルについて１２時間以内に５％未満、および９６時間以内に２０％未満の分解が生じ、ＤＮＡ−ＭＯＦが循環に対して優れた安定性を呈することを示唆する（図２８ａ、ｂ）。対照的に、ＭＯＦ  ＮＰを、穏やかに振盪しながら、３７℃で細胞内培地模擬液（１×リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ＝７．０）においてインキュベートしたとき、ビヒクルは非常に速い速度で分解し始めた（図２８ｃ、ｄ）。興味深いことに、ＤＮＡ−ＰＣＮ−２２２はＤＮＡ−ＮＵ−１０００（半減期＝４０時間）と比較して非常に速い分解（半減期＝１時間）を呈し、有機リンカーの意図的な選択が構造体の安定性、したがってタンパク質の放出速度論に対して重大な影響がある可能性があることを示唆する。ＤＮＡ−ＭＯＦ  ＮＰは細胞外条件下で安定しており、調整可能な細胞内分解速度論を有するため、これらの結果は有望である。
【０１２１】
ＭＯＦ  ＮＰ表面上の核酸の固定化を直接視覚化するために、共焦点顕微鏡法を用いてインスリン＠ＤＮＡ−ＮＵ−１０００  ＭＯＦ  ＮＰを画像化した。共焦点顕微鏡の解像度の限界により、２．８μｍ×１０μｍのＮＵ−１０００粒子は、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７色素（ＡＦ６４７）標識インスリンでカプセル化され、前述のように、末端ＴＡＭＲＡ標識ＤＮＡでさらに官能化された。代表的な画像では、ＡＦ６４７およびＴＡＭＲＡの信号の共局在化により、インスリンのカプセル化の成功、それに続くＤＮＡの官能化が確認される（図２８ａ）。インスリンおよびＤＮＡの相対的な分布に関する詳細な情報を取得するために、単一のＭＯＦ粒子のＺスタック画像を撮影し、ＴＡＭＲＡシグナル（ＤＮＡ）が優先的に抹消を占めることが観察され、ＡＦ６４７（インスリン）は粒子全体に存在した（図２８ｂ）。粒子の両端で観測されたＡＦ６４７シグナルは、ＭＯＦの中心部と比較して増加し、タンパク質が１Ｄチャネルに沿って移動することを示し、これは以前に研究された拡散駆動機構である。９３ＭＯＦ細孔の直径が大きいため（ＮＵ−１０００の場合は３．２ｎｍ、ＰＣＮ−２２２の場合は３．７ｎｍ）９１、一本鎖ＤＮＡがＭＯＦ細孔を貫通し、内部表面を官能化して、粒子の内側の蛍光シグナルにつながることが予想される。Ｎ２吸着等温線によって確認されるように、両方のＭＯＦについてインスリンカプセル化後にＮ２取り込み能力の低下が観察され、ＤＮＡ官能化後に多孔性のさらなる損失が観察された（図２４および２５）。孔径分布分析により、インスリンがメソ細孔およびミクロ細孔の両方を占めたことが確認された。戦略の一般性に関する重要な質問は、インスリンがＭＯＦ  ＮＰ細孔から漏出したのか、またはＤＮＡ官能化プロセス中に触媒活性を失ったのかを決定することであった。この問題をテストするために、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、インスリン＠ＤＮＡ−ＮＵ−１０００およびインスリン＠ＤＮＡ−ＰＣＮ−２２２構築物のカプセル化の有効性を決定した。どちらの場合も、インスリン活性の喪失は観察されず、ＤＮＡの官能化はビヒクルからのタンパク質の浸出を引き起こさないことが示唆された（図２８ｅ）。
【０１２２】
前述のように、ＳＮＡ−ナノ粒子コンジュゲートの重要な特徴は、それらの細胞に効率的に侵入する能力である。したがって、インスリン＠ＤＮＡ−ＭＯＦが増強された細胞取り込みを実証するかどうかをテストした。具体的には、ＮＵ−１０００およびＰＣＮ−２２２  ＮＰをＡＦ６４７標識インスリンでカプセル化し、ＴＡＭＲＡ標識ＤＮＡで官能化し、ヒト卵巣腺癌細胞ＳＫＯＶ−３と０．５時間、２時間、６時間、２４時間インキュベートした（本明細書に記載される）。対照群として、遊離ＴＡＭＲＡ標識ＤＮＡおよびＡＦ−６４７標識インスリンの混合物を同じ濃度の細胞とインキュベートした。細胞小胞におけるインスリンの濃縮は、共焦点レーザー走査顕微鏡によって実証され、細胞小胞におけるＡＦ６４７色素およびＴＡＭＲＡシグナルの強い共局在化が観察された（図２９ａ〜ｃ）。Ｚスタック画像により、インスリン＠ＤＮＡ−ＭＯＦ  ＮＰが細胞膜に付着するのではなく、細胞によって内在化されたことが確認された。２時間の処理後、フローサイトメトリーを実施し、インスリン＠ＤＮＡ−ＭＯＦで処理した細胞では、遊離インスリン＋ＤＮＡ対照群で処理した細胞と比較して、蛍光が１０倍増加することが実証された（図２９ｄ）。インスリン＠ＤＮＡ−ＭＯＦは、ＳＮＡ−ＮＰコンジュゲートの従来の形態のものと比較して、細胞取り込みにおいて同様のレベルの増強を呈する。最後に、ＤＮＡ官能化ＭＯＦ  ＮＰがトランスフェクション試薬を必要とせずに細胞に効果的に侵入することを実証した後、両方のアーキテクチャのインビトロ細胞毒性がＭＴＴアッセイによって評価され、無視できる細胞毒性または抗増殖効果が観察された（図２９ｅ）。
【０１２３】
要約すると、タンパク質カプセル化核酸−ＭＯＦ  ＮＰコンジュゲートを調製するための合成戦略が本明細書に開示され、これらの構造を使用してタンパク質を細胞膜に高ペイロードおよび無視できる細胞毒性で効率的に送達することが実証されてきた。本明細書では、表面核酸官能化により、タンパク質カプセル化ＭＯＦ  ＮＰのコロイド安定性および細胞内送達効率が大幅に増強され、すべてタンパク質活性が保持されることを示す。これらの実施例は、これらの高度にモジュール化された材料を生物学的用途で有用にするためのＭＯＦ表面ナノ構造の重要な役割を強調する。本開示の組成物および方法は、ＭＯＦ孔径９３、１００〜１０１を調整することによりさまざまなタンパク質をカプセル化することを可能にし、また、インビボ画像化４８、遺伝子調節７８、治療法５１、および基本的な細胞プロセスの研究５０などの多様な目的に重要であるタンパク質および核酸標的の共送達を可能にすることも想定される。
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（１６）Ｋａｈｎ，Ｊ．Ｓ．；Ｆｒｅａｇｅ，Ｌ．；Ｅｎｋｉｎ，Ｎ．；Ｇａｒｃｉａ，Ｍ．Ａ．Ａ．；Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．２０１７，２９，１６０２７８２．
（１７）Ｈｗａｎｇ，Ｙ．Ｋ．；Ｈｏｎｇ，Ｄ．Ｙ．；Ｃｈａｎｇ，Ｊ．Ｓ．；Ｊｈｕｎｇ，Ｓ．Ｈ．；Ｓｅｏ，Ｙ．Ｋ．；Ｋｉｍ，Ｊ．；Ｖｉｍｏｎｔ，Ａ．；Ｄａｔｕｒｉ，Ｍ．；Ｓｅｒｒｅ，Ｃ．；Ｆｅｒｅｙ，Ｇ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００８，４７，４１４４．
（１８）Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｚ．；Ｍｏｒｒｉｓ，Ｗ．；Ｌｉｕ，Ｙ．Ｙ．；ＭｃＧｕｉｒｋ，Ｃ．Ｍ．；Ｚｈｏｕ，Ｙ．；Ｈｕｐｐ，Ｊ．Ｔ．；Ｆａｒｈａ，Ｏ．Ｋ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１５，５４，１４７３８．
（１９）Ｒｏｄｅｒ，Ｒ．；Ｐｒｅｉｓｓ，Ｔ．；Ｈｉｒｓｃｈｌｅ，Ｐ．；Ｓｔｅｉｎｂｏｒｎ，Ｂ．；Ｚｉｍｐｅｌ，Ａ．；Ｈｏｈｎ，Ｍ．；Ｒａｄｌｅｒ，Ｊ．Ｏ．；Ｂｅｉｎ，Ｔ．；Ｗａｇｎｅｒ，Ｅ．；Ｗｕｔｔｋｅ，Ｓ．；Ｌａｃｈｅｌｔ，Ｕ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１７，１３９，２３５９．
（２０）ＭｃＧｕｉｒｅ，Ｃ．Ｖ．；Ｆｏｒｇａｎ，Ｒ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５，５１，５１９９．
（２１）Ｄｏｏｎａｎ，Ｃ．；Ｒｉｃｃｏ，Ｒ．；Ｌｉａｎｇ，Ｋ．；Ｂｒａｄｓｈａｗ，Ｄ．；Ｆａｌｃａｒｏ，Ｐ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２０１７，５０，１４２３．
（２２）Ｃａｖｋａ，Ｊ．Ｈ．；Ｊａｋｏｂｓｅｎ，Ｓ．；Ｏｌｓｂｙｅ，Ｕ．；Ｇｕｉｌｌｏｕ，Ｎ．；Ｌａｍｂｅｒｔｉ，Ｃ．；Ｂｏｒｄｉｇａ，Ｓ．；Ｌｉｌｌｅｒｕｄ，Ｋ．Ｐ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０，１３８５０．
（２３）Ｎａｋａｙａｍａ，Ｈ．；Ｅｇｕｃｈｉ，Ｔ．；Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｎ．；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｓ．；Ｄａｎｊｙｏ，Ｍ．；Ｔｓｕｈａｋｏ，Ｍ．Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．１９９７，７，１０６３．
（２４）Ｎｏｎｇｌａｔｏｎ，Ｇ．；Ｂｅｎｉｔｅｚ，Ｉ．Ｏ．；Ｇｕｉｓｌｅ，Ｉ．；Ｐｉｐｅｌｉｅｒ，Ｍ．；Ｌｅｇｅｒ，Ｊ．；Ｄｕｂｒｅｕｉｌ，Ｄ．；Ｔｅｌｌｉｅｒ，Ｃ．；Ｔａｌｈａｍ，Ｄ．Ｒ．；Ｂｕｊｏｌｉ，Ｂ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６，１４９７．
（２５）Ｈｏｒｃａｊａｄａ，Ｐ．；Ｃｈａｌａｔｉ，Ｔ．；Ｓｅｒｒｅ，Ｃ．；Ｇｉｌｌｅｔ，Ｂ．；Ｓｅｂｒｉｅ，Ｃ．；Ｂａａｔｉ，Ｔ．；Ｅｕｂａｎｋ，Ｊ．Ｆ．；Ｈｅｕｒｔａｕｘ，Ｄ．；Ｃｌａｙｅｔｔｅ，Ｐ．；Ｋｒｅｕｚ，Ｃ．；Ｃｈａｎｇ，Ｊ．Ｓ．；Ｈｗａｎｇ，Ｙ．Ｋ．；Ｍａｒｓａｕｄ，Ｖ．；Ｂｏｒｉｅｓ，Ｐ．Ｎ．；Ｃｙｎｏｂｅｒ，Ｌ．；Ｇｉｌ，Ｓ．；Ｆｅｒｅｙ，Ｇ．；Ｃｏｕｖｒｅｕｒ，Ｐ．；Ｇｒｅｆ，Ｒ．Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２０１０，９，１７２．
（２６）Ｈｅ，Ｃ．Ｂ．；Ｌｉｕ，Ｄ．Ｍ．；Ｌｉｎ，Ｗ．Ｂ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１５，１１５，１１０７９．
（２７）Ｓｈｅａｒｅｒ，Ｇ．Ｃ．；Ｃｈａｖａｎ，Ｓ．；Ｂｏｒｄｉｇａ，Ｓ．；Ｓｖｅｌｌｅ，Ｓ．；Ｏｌｓｂｙｅ，Ｕ．；Ｌｉｌｌｅｒｕｄ，Ｋ．Ｐ．Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．２０１６，２８，３７４９．
（２８）Ｃｏｔｔｒｅｌｌ，Ｔ．Ｌ．Ｔｈｅ  ｓｔｒｅｎｇｔｈｓ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｏｎｄｓ；Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｌｏｎｄｏｎ，１９５４；ｐ３１０．
（２９）Ａｕｙｅｕｎｇ，Ｅ．；Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ，Ｒ．Ｊ．；Ｃｈｏｉ，Ｃ．Ｈ．Ｊ．；Ｃｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｉ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．２０１２，２４，５１８１．
（３０）Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ｄ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００４，４２８，４８７．
（３１）Ｂｒｏｄｉｎ，Ｊ．Ｄ．；Ａｕｙｅｕｎｇ，Ｅ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１５，１１２，４５６４．
（３２）Ｂｅｒｇｍａｎ，Ｄ．Ｊ．；Ｓｔｏｃｋｍａｎ，Ｍ．Ｉ．Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．２００３，９０，９０．
（３３）Ｊｉａｎｇ，Ｈ．Ｌ．；Ｆｅｎｇ，Ｄ．Ｗ．；Ｌｉｕ，Ｔ．Ｆ．；Ｌｉ，Ｊ．Ｒ．；Ｚｈｏｕ，Ｈ．Ｃ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２，１３４，１４６９０−１４６９３．
（３４）Ｋｅｌｔｙ，Ｍ．Ｌ．；Ｍｏｒｒｉｓ，Ｗ．；Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ａ．Ｔ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｋ．Ａ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．；Ｈａｒｒｉｓ，Ｔ．Ｄ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６，５２，７８５４−７８５７．
（３５）Ｐａｒｋ，Ｊ．；Ｊｉａｎｇ，Ｑ．；Ｆｅｎｇ，Ｄ．Ｗ．；Ｍａｏ，Ｌ．Ｑ．；Ｚｈｏｕ，Ｈ．Ｃ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１６，１３８，３５１８−３５２５．
（３６）Ｊｉａｎｇ，Ｄ．Ｍ．；Ｂｕｒｒｏｗｓ，Ａ．Ｄ．；Ｅｄｌｅｒ，Ｋ．Ｊ．Ｃｒｙｓｔｅｎｇｃｏｍｍ  ２０１１，１３，６９１６−６９１９．
（３７）Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｓｈｏｗ，Ｋ．Ｍ．Ｌ．；Ｄｅｌｌａ  Ｒｏｃｃａ，Ｊ．；Ｘｉｅ，Ｚ．Ｇ．；Ｔｒａｎ，Ｓ．；Ｌｉｎ，Ｗ．Ｂ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９，１３１，１４２６１−＋．
（３８）Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｍ．Ｎ．；Ｊｏｎｅｓ，Ｍ．Ｒ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｋ．Ａ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１４，１３６，７６０３−７６０６．
（３９）Ｋｕｍａｒ，Ｐ．Ｓ．；Ｐａｓｔｏｒｉｚａ−Ｓａｎｔｏｓ，Ｉ．；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｂ．；Ｇａｒｃｉａ  ｄｅ  Ａｂａｊｏ，Ｆ．Ｊ．；ＬｉｚＭａｒｚａｎ，Ｌ．Ｍ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００８，１９．
（４０）Ｈｕｒｓｔ，Ｓ．Ｊ．；Ｌｙｔｔｏｎ−Ｊｅａｎ，Ａ．Ｋ．Ｒ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６，７８，８３１３−８３１８．
（４１）Ｚｈａｎｇ，Ｃ．；Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ，Ｒ．Ｊ．；Ｙｏｕｎｇ，Ｋ．Ｌ．；Ｃｈｏｉ，Ｃ．Ｈ．Ｊ．；Ｈａｏ，Ｌ．Ｌ．；Ａｕｙｅｕｎｇ，Ｅ．；Ｌｉｕ，Ｇ．Ｌ．；Ｚｈｏｕ，Ｘ．Ｚ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．２０１３，１２，７４１−７４６．
（４２）Ａｕｙｅｕｎｇ，Ｅ．；Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ，Ｒ．Ｊ．；Ｃｈｏｉ，Ｃ．Ｈ．Ｊ．；Ｃｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｉ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．２０１２，２４，５１８１−５１８６．
（４３）Ｌｉ，Ｐ．；Ｋｌｅｔ，Ｒ．Ｃ．；Ｍｏｏｎ，Ｓ．Ｙ．；Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｃ．；Ｄｅｒｉａ，Ｐ．；Ｐｅｔｅｒｓ，Ａ．Ｗ．；Ｋｌａｈｒ，Ｂ．Ｍ．；Ｐａｒｋ，Ｈ．Ｊ．；Ａｌ−Ｊｕａｉｄ，Ｓ．Ｓ．；Ｈｕｐｐ，Ｊ．Ｔ．；Ｆａｒｈａ，Ｏ．Ｋ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５，５１，１０９２５．
（４４）Ｋｅｌｔｙ，Ｍ．Ｌ．；Ｍｏｒｒｉｓ，Ｗ．；Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ａ．Ｔ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｋ．Ａ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．；Ｈａｒｒｉｓ，Ｔ．Ｄ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６，５２，７８５４．
（４５）Ｃｈｅｎ，Ｙ．；Ｌｉ，Ｐ．；Ｍｏｄｉｃａ，Ｊ．Ａ．；Ｄｒｏｕｔ，Ｒ．Ｊ．；Ｆａｒｈａ，Ｏ．Ｋ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ２０１８，１４０，５６７８．
（４６）Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｚ．；ＭｃＧｕｉｒｋ，Ｃ．Ｍ．；Ｒｏｓｓ，Ｍ．Ｂ．；Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｙ．；Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｃ．；Ｘｉｎｇ，Ｈ．；Ｌｉｕ，Ｙ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１７，１３９，９８２７．
（４７）Ｄ’Ａｓｔｏｌｆｏ，Ｄ．Ｓ．；Ｐａｇｌｉｅｒｏ，Ｒ．Ｊ．；Ｐｒａｓ，Ａ．；Ｋａｒｔｈａｕｓ，Ｗ．Ｒ．；Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｈ．；Ｐｒａｓａｄ，Ｖ．；Ｌｅｂｂｉｎｋ，Ｒ．Ｊ．；Ｒｅｈｍａｎｎ，Ｈ．；Ｇｅｉｊｓｅｎ，Ｎ．Ｃｅｌｌ  ２０１５，１６１，６７４−６９０．
（４８）Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｍ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．２００２，３，５４６−５５６．
（４９）Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ：Ｔｅｃｈｎｏｌ．２００８，５，ｅ９５−ｅ１０３．
（５０）Ｄｅｓｎｉｃｋ，Ｒ．Ｊ．；Ｓｃｈｕｃｈｍａｎ，Ｅ．Ｈ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２００２，３，９５４−９６６．
（５１）Ｌｅａｄｅｒ，Ｂ．；Ｂａｃａ，Ｑ．Ｊ．；Ｇｏｌａｎ，Ｄ．Ｅ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２００８，７，２１−３９．
（５２）Ｐｅｔｒｏｓ，Ｒ．Ａ．；ＤｅＳｉｍｏｎｅ，Ｊ．Ｍ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２０１０，９，６１５−６２７．
（５３）Ｇｈｏｓｈ，Ｐ．；Ｙａｎｇ，Ｘ．Ｃ．；Ａｒｖｉｚｏ，Ｒ．；Ｚｈｕ，Ｚ．Ｊ．；Ａｇａｓｔｉ，Ｓ．Ｓ．；Ｍｏ，Ｚ．Ｈ．；Ｒｏｔｅｌｌｏ，Ｖ．Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１０，１３２，２６４２−２６４５．
（５４）Ｇｕ，Ｚ．；Ｂｉｓｗａｓ，Ａ．；Ｚｈａｏ，Ｍ．；Ｔａｎｇ，Ｙ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２０１１，４０，３６３８−３６５５．
（５５）Ｘｕ，Ｘ．Ｍ．；Ｃｏｓｔａ，Ａ．；Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｄ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０１２，２９，１９１９−１９３１．
（５６）Ｓｃｈｗａｒｚｅ，Ｓ．Ｒ．；Ｈｏ，Ａ．；Ｖｏｃｅｒｏ−Ａｋｂａｎｉ，Ａ．；Ｄｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９，２８５，１５６９−１５７２．
（５７）Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｍ．Ｓ．；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｋ．Ｊ．；Ｌｉｕ，Ｄ．Ｒ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７，１２９，１０１１０−＋．
（５８）Ｃｒｏｎｉｃａｎ，Ｊ．Ｊ．；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．；Ｂｅｉｅｒ，Ｋ．Ｔ．；ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ，Ｂ．Ｒ．；Ｃｅｐｋｏ，Ｃ．Ｌ．；Ｌｉｕ，Ｄ．Ｒ．ＡＣＳＣｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１０，５，７４７−７５２．
（５９）Ｂｒｏｄｉｎ，Ｊ．Ｄ．；Ｓｐｒａｎｇｅｒｓ，Ａ．Ｊ．；ＭｃＭｉｌｌａｎ，Ｊ．Ｒ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１５，１３７，１４８３８−１４８４１．
（６０）Ｆｕ，Ａ．Ｌ．；Ｔａｎｇ，Ｒ．；Ｈａｒｄｉｅ，Ｊ．；Ｆａｒｋａｓ，Ｍ．Ｅ．；Ｒｏｔｅｌｌｏ，Ｖ．Ｍ．ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．２０１４，２５，１６０２−１６０８．
（６１）Ｌｙｋｏｕｒｉｎｏｕ，Ｖ．；Ｃｈｅｎ，Ｙ．；Ｗａｎｇ，Ｘ．Ｓ．；Ｍｅｎｇ，Ｌ．；Ｈｏａｎｇ，Ｔ．；Ｍｉｎｇ，Ｌ．Ｊ．；Ｍｕｓｓｅｌｍａｎ，Ｒ．Ｌ．；Ｍａ，Ｓ．Ｑ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，１０３８２−１０３８５．
（６２）Ｓｈｉｈ，Ｙ．Ｈ．；Ｌｏ，Ｓ．Ｈ．；Ｙａｎｇ，Ｎ．Ｓ．；Ｓｉｎｇｃｏ，Ｂ．；Ｃｈｅｎｇ，Ｙ．Ｊ．；Ｗｕ，Ｃ．Ｙ．；Ｃｈａｎｇ，Ｉ．Ｈ．；Ｈｕａｎｇ，Ｈ．Ｙ．；Ｌｉｎ，Ｃ．Ｈ．Ｃｈｅｍｐｌｕｓｃｈｅｍ  ２０１２，７７，９８２−９８６．
（６３）Ｌｉａｎｇ，Ｋ．；Ｒｉｃｃｏ，Ｒ．；Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｃ．Ｍ．；Ｓｔｙｌｅｓ，Ｍ．Ｊ．；Ｂｅｌｌ，Ｓ．；Ｋｉｒｂｙ，Ｎ．；Ｍｕｄｉｅ，Ｓ．；Ｈａｙｌｏｃｋ，Ｄ．；Ｈｉｌｌ，Ａ．Ｊ．；Ｄｏｏｎａｎ，Ｃ．Ｊ．；Ｆａｌｃａｒｏ，Ｐ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５，６，７２４０．
（６４）Ｌｉ，Ｐ．；Ｍｏｏｎ，Ｓ．Ｙ．；Ｇｕｅｌｔａ，Ｍ．Ａ．；Ｈａｒｖｅｙ，Ｓ．Ｐ．；Ｈｕｐｐ，Ｊ．Ｔ．；Ｆａｒｈａ，Ｏ．Ｋ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１６，１３８，８０５２−８０５５．
（６５）Ｄｏｏｎａｎ，Ｃ．；Ｒｉｃｃｏ，Ｒ．；Ｌｉａｎｇ，Ｋ．；Ｂｒａｄｓｈａｗ，Ｄ．；Ｆａｌｃａｒｏ，Ｐ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２０１７，５０，１４２３−１４３２．
（６６）Ｌｉａｎ，Ｘ．Ｚ．；Ｆａｎｇ，Ｙ．；Ｊｏｓｅｐｈ，Ｅ．；Ｗａｎｇ，Ｑ．；Ｌｉ，Ｊ．Ｌ．；Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｓ．；Ｌｏｌｌａｒ，Ｃ．；Ｗａｎｇ，Ｘ．；Ｚｈｏｕ，Ｈ．Ｃ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２０１７，４６，３３８６−３４０１．
（６７）Ｇｋａｎｉａｔｓｏｕ，Ｅ．；Ｓｉｃａｒｄ，Ｃ．；Ｒｉｃｏｕｘ，Ｒ．；Ｍａｈｙ，Ｊ．Ｐ．；Ｓｔｅｕｎｏｕ，Ｎ．；Ｓｅｒｒｅ，Ｃ．Ｍａｔｅｒ．Ｈｏｒｉｚ．２０１７，４，５５−６３．
（６８）Ｌｉｕ，Ｗ．Ｌ．；Ｌｏ，Ｓ．Ｈ．；Ｓｉｎｇｃｏ，Ｂ．；Ｙａｎｇ，Ｃ．Ｃ．；Ｈｕａｎｇ，Ｈ．Ｙ．；Ｌｉｎ，Ｃ．Ｈ．Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂ  ２０１３，１，９２８−９３２．
（６９）Ｃａｏ，Ｙ．；Ｗｕ，Ｚ．Ｆ．；Ｗａｎｇ，Ｔ．；Ｘｉａｏ，Ｙ．；Ｈｕｏ，Ｑ．Ｓ．；Ｌｉｕ，Ｙ．Ｌ．Ｄａｌｔｏｎ  Ｔｒａｎｓ．２０１６，４５，６９９８−７００３．
（７０）Ｌｉａｎ，Ｘ．Ｚ．；Ｅｒａｚｏ−Ｏｌｉｖｅｒａｓ，Ａ．；Ｐｅｌｌｏｉｓ，Ｊ．Ｐ．；Ｚｈｏｕ，Ｈ．Ｃ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１７，８．
（７１）Ｓｉｎｄｏｒｏ，Ｍ．；Ｙａｎａｉ，Ｎ．；Ｊｅｅ，Ａ．Ｙ．；Ｇｒａｎｉｃｋ，Ｓ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２０１４，４７，４５９−４６９．
（７２）Ｍｏｒｒｉｓ，Ｗ．；Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｚ．；Ｃｈｏ，Ｄ．；Ａｕｙｅｕｎｇ，Ｅ．；Ｌｉ，Ｐ．；Ｆａｒｈａ，Ｏ．Ｋ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．ＡＣＳ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｅｒ．Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  ２０１７．
（７３）Ｆｒｏｈｌｉｃｈ，Ｅ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄ．２０１２，７，５５７７−５５９１．
（７４）Ｂａａｔｉ，Ｔ．；Ｎｊｉｍ，Ｌ．；Ｎｅｆｆａｔｉ，Ｆ．；Ｋｅｒｋｅｎｉ，Ａ．；Ｂｏｕｔｔｅｍｉ，Ｍ．；Ｇｒｅｆ，Ｒ．；Ｎａｊｊａｒ，Ｍ．Ｆ．；Ｚａｋｈａｍａ，Ａ．；Ｃｏｕｖｒｅｕｒ，Ｐ．；Ｓｅｒｒｅ，Ｃ．；Ｈｏｒｃａｊａｄａ，Ｐ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０１３，４，１５９７−１６０７．
（７５）Ｈｅ，Ｃ．Ｂ．；Ｌｉｕ，Ｄ．Ｍ．；Ｌｉｎ，Ｗ．Ｂ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１５，１１５，１１０７９−１１１０８．
（７６）Ｒｕｙｒａ，Ａ．；Ｙａｚｄｉ，Ａ．；Ｅｓｐｉｎ，Ｊ．；Ｃａｒｎｅ−Ｓａｎｃｈｅｚ，Ａ．；Ｒｏｈｅｒ，Ｎ．；Ｌｏｒｅｎｚｏ，Ｊ．；Ｉｍａｚ，Ｉ．；Ｍａｓｐｏｃｈ，Ｄ．Ｃｈｅｍ．−Ｅｕｒ．Ｊ．２０１５，２１，２５０８−２５１８．
（７７）Ｍｏｒｒｉｓ，Ｗ．；Ｂｒｉｌｅｙ，Ｗ．Ｅ．；Ａｕｙｅｕｎｇ，Ｅ．；Ｃａｂｅｚａｓ，Ｍ．Ｄ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１４，１３６，７２６１−７２６４．
（７８）Ｈｅ，Ｃ．Ｂ．；Ｌｕ，Ｋ．Ｄ．；Ｌｉｕ，Ｄ．Ｍ．；Ｌｉｎ，Ｗ．Ｂ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１４，１３６，５１８１−５１８４．
（７９）Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．；Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ｃ．；Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ  １９９６，３８２，６０７−６０９．
（８０）Ｃｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｉ．；Ａｕｙｅｕｎｇ，Ｅ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２，１３４，１３７６−１３９１．
（８１）Ｐａｔｅｌ，Ｐ．Ｃ．；Ｇｉｌｊｏｈａｎｎ，Ｄ．Ａ．；Ｄａｎｉｅｌ，Ｗ．Ｌ．；Ｚｈｅｎｇ，Ｄ．；Ｐｒｉｇｏｄｉｃｈ，Ａ．Ｅ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．２０１０，２１，２２５０−２２５６．
（８２）Ｃｈｏｉ，Ｃ．Ｈ．Ｊ．；Ｈａｏ，Ｌ．Ｌ．；Ｎａｒａｙａｎ，Ｓ．Ｐ．；Ａｕｙｅｕｎｇ，Ｅ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１３，１１０，７６２５−７６３０．
（８３）Ｙｏｕｎｇ，Ｋ．Ｌ．；Ｓｃｏｔｔ，Ａ．Ｗ．；Ｈａｏ，Ｌ．Ｌ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｓ．Ｅ．；Ｌｉｕ，Ｇ．Ｌ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２０１２，１２，３８６７−３８７１．
（８４）Ｂａｎｇａ，Ｒ．Ｊ．；Ｃｈｅｒｎｙａｋ，Ｎ．；Ｎａｒａｙａｎ，Ｓ．Ｐ．；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｓ．Ｔ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１４，１３６，９８６６−９８６９．
（８５）Ｃａｌａｂｒｅｓｅ，Ｃ．Ｍ．；Ｍｅｒｋｅｌ，Ｔ．Ｊ．；Ｂｒｉｌｅｙ，Ｗ．Ｅ．；Ｒａｎｄｅｒｉａ，Ｐ．Ｓ．；Ｎａｒａｙａｎ，Ｓ．Ｐ．；Ｒｏｕｇｅ，Ｊ．Ｌ．；Ｗａｌｋｅｒ，Ｄ．Ａ．；Ｓｃｏｔｔ，Ａ．Ｗ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１５，５４，４７６−４８０．
（８６）Ｒｏｓｉ，Ｎ．Ｌ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００５，１０５，１５４７−１５６２．
（８７）Ｒｏｓｉ，Ｎ．Ｌ．；Ｇｉｌｊｏｈａｎｎ，Ｄ．Ａ．；Ｔｈａｘｔｏｎ，Ｃ．Ｓ．；Ｌｙｔｔｏｎ−Ｊｅａｎ，Ａ．Ｋ．Ｒ．；Ｈａｎ，Ｍ．Ｓ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００６，３１２，１０２７−１０３０．
（８８）Ｒａｄｏｖｉｃ−Ｍｏｒｅｎｏ，Ａ．Ｆ．；Ｃｈｅｒｎｙａｋ，Ｎ．；Ｍａｄｅｒ，Ｃ．Ｃ．；Ｎａｌｌａｇａｔｌａ，Ｓ．；Ｋａｎｇ，Ｒ．Ｓ．；Ｈａｏ，Ｌ．Ｌ．；Ｗａｌｋｅｒ，Ｄ．Ａ．；Ｈａｌｏ，Ｔ．Ｌ．；Ｍｅｒｋｅｌ，Ｔ．Ｊ．；Ｒｉｓｃｈｅ，Ｃ．Ｈ．；Ａｎａｎｔａｔｍｕｌａ，Ｓ．；Ｂｕｒｋｈａｒｔ，Ｍ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．；Ｇｒｙａｚｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１５，１１２，３８９２−３８９７．
（８９）Ｍｏｎｄｌｏｃｈ，Ｊ．Ｅ．；Ｂｕｒｙ，Ｗ．；Ｆａｉｒｅｎ−Ｊｉｍｅｎｅｚ，Ｄ．；Ｋｗｏｎ，Ｓ．；ＤｅＭａｒｃｏ，Ｅ．Ｊ．；Ｗｅｓｔｏｎ，Ｍ．Ｈ．；Ｓａｒｊｅａｎｔ，Ａ．Ａ．；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｓ．Ｔ．；Ｓｔａｉｒ，Ｐ．Ｃ．；Ｓｎｕｒｒ，Ｒ．Ｑ．；Ｆａｒｈａ，Ｏ．Ｋ．；Ｈｕｐｐ，Ｊ．Ｔ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１３，１３５，１０２９４−１０２９７．
（９０）Ｍｏｒｒｉｓ，Ｗ．；Ｖｏｌｏｓｓｋｉｙ，Ｂ．；Ｄｅｍｉｒ，Ｓ．；Ｇａｎｄａｒａ，Ｆ．；ＭｃＧｒｉｅｒ，Ｐ．Ｌ．；Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｈ．；Ｃａｓｃｉｏ，Ｄ．；Ｓｔｏｄｄａｒｔ，Ｊ．Ｆ．；Ｙａｇｈｉ，Ｏ．Ｍ．Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１２，５１，６４４３−６４４５．
（９１）Ｆｅｎｇ，Ｄ．Ｗ．；Ｇｕ，Ｚ．Ｙ．；Ｌｉ，Ｊ．Ｒ．；Ｊｉａｎｇ，Ｈ．Ｌ．；Ｗｅｉ，Ｚ．Ｗ．；Ｚｈｏｕ，Ｈ．Ｃ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１，１０３０７−１０３１０．
（９２）Ｃｈｅｎ，Ｙ．；Ｌｉ，Ｐ．；Ｍｏｄｉｃａ，Ｊ．Ａ．；Ｄｒｏｕｔ，Ｒ．Ｊ．；Ｆａｒｈａ，Ｏ．Ｋ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１８，１４０，５６７８−５６８１．
（９３）Ｌｉ，Ｐ．；Ｍｏｄｉｃａ，Ｊ．Ａ．；Ｈｏｗａｒｔｈ，Ａ．Ｊ．；Ｖａｒｇａｓ，Ｅ．Ｌ．；Ｍｏｇｈａｄａｍ，Ｐ．Ｚ．；Ｓｎｕｒｒ，Ｒ．Ｑ．；Ｍｒｋｓｉｃｈ，Ｍ．；Ｈｕｐｐ，Ｊ．Ｔ．；Ｆａｒｈａ，Ｏ．Ｋ．Ｃｈｅｍ  ２０１６，１，１５４−１６９．
（９４）Ｌｉ，Ｐ．；Ｋｌｅｔ，Ｒ．Ｃ．；Ｍｏｏｎ，Ｓ．Ｙ．；Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｃ．；Ｄｅｒｉａ，Ｐ．；Ｐｅｔｅｒｓ，Ａ．Ｗ．；Ｋｌａｈｒ，Ｂ．Ｍ．；Ｐａｒｋ，Ｈ．Ｊ．；Ａｌ−Ｊｕａｉｄ，Ｓ．Ｓ．；Ｈｕｐｐ，Ｊ．Ｔ．；Ｆａｒｈａ，Ｏ．Ｋ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５，５１，１０９２５−１０９２８．
（９５）Ｋｅｌｔｙ，Ｍ．Ｌ．；Ｍｏｒｒｉｓ，Ｗ．；Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ａ．Ｔ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｋ．Ａ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．；Ｈａｒｒｉｓ，Ｔ．Ｄ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６，５２，７８５４−７８５７．
（９６）Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｚ．；ＭｃＧｕｉｒｋ，Ｃ．Ｍ．；Ｒｏｓｓ，Ｍ．Ｂ．；Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｙ．；Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｃ．；Ｘｉｎｇ，Ｈ．；Ｌｉｕ，Ｙ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１７，１３９，９８２７−９８３０．
（９７）Ｎａｒａｙａｎ，Ｓ．Ｐ．；Ｃｈｏｉ，Ｃ．Ｈ．Ｊ．；Ｈａｏ，Ｌ．Ｌ．；Ｃａｌａｂｒｅｓｅ，Ｃ．Ｍ．；Ａｕｙｅｕｎｇ，Ｅ．；Ｚｈａｎｇ，Ｃ．；Ｇｏｏｒ，Ｏ．Ｊ．Ｇ．Ｍ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｓｍａｌｌ  ２０１５，１１，４１７３−４１８２．
（９８）Ｌｉｂａｎａｔｉ，Ｃ．Ｍ．；Ｔａｎｄｌｅｒ，Ｃ．Ｊ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９６９，４２，７５４−７６５．
（９９）Ｂａｎｓａｌ，Ｖ．Ｋ．，Ｓｅｒｕｍ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ．Ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ  Ｈｉｓｔｏｒｙ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ，ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｓ，ｒｄ；Ｗａｌｋｅｒ，Ｈ．Ｋ．；Ｈａｌｌ，Ｗ．Ｄ．；Ｈｕｒｓｔ，Ｊ．Ｗ．，Ｅｄｓ．Ｂｏｓｔｏｎ，１９９０．
（１００）Ｆｅｎｇ，Ｄ．Ｗ．；Ｌｉｕ，Ｔ．Ｆ．；Ｓｕ，Ｊ．；Ｂｏｓｃｈ，Ｍ．；Ｗｅｉ，Ｚ．Ｗ．；Ｗａｎ，Ｗ．；Ｙｕａｎ，Ｄ．Ｑ．；Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｐ．；Ｗａｎｇ，Ｘ．；Ｗａｎｇ，Ｋ．Ｃ．；Ｌｉａｎ，Ｘ．Ｚ．；Ｇｕ，Ｚ．Ｙ．；Ｐａｒｋ，Ｊ．；Ｚｏｕ，Ｘ．Ｄ．；Ｚｈｏｕ，Ｈ．Ｃ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５，６．
（１０１）Ｌｉ，Ｐ．；Ｃｈｅｎ，Ｑ．；Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｃ．；Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ｎ．Ａ．；Ｍｅｈｄｉ，Ｂ．Ｌ．；Ｄｏｈｎａｌｋｏｖａ，Ａ．；Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，Ｎ．Ｄ．；Ｓｈｅｎ，Ｄ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．；Ｇｏｍｅｚ−Ｇｕａｌｄｒｏｎ，Ｄ．Ａ．；Ｃｅｔｉｎ，Ｆ．Ｍ．；Ｊａｇｉｅｌｌｏ，Ｊ．；Ａｓｉｒｉ，Ａ．Ｍ．；Ｓｔｏｄｄａｒｔ，Ｊ．Ｆ．；Ｆａｒｈａ，Ｏ．Ｋ．Ｃｈｅｍ  ２０１８，４，１０２２−１０３４．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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