(57)【要約】網膜神経節細胞生存の増加を必要とする対象における網膜神経節細胞生存を増加させるための方法が、本明細書に開示されている。このような方法は、網膜神経節細胞生存の増加を必要とする対象を選択するステップと、細胞外マトリックスに由来する単離されたナノベシクル（ＭＢＶ）の治療有効量を対象に投与するステップとを含む。このような方法は、網膜神経節細胞生存の増加を必要とする対象を選択するステップと、対象の眼に、細胞外マトリックスに由来する単離されたナノベシクルの治療有効量を局所的に投与するステップであって、ナノベシクルが、対象のマクロファージにおけるＦ４／８０およびＣＤ−１１ｂの発現を維持し、ナノベシクルが、リジルオキシダーゼを含み、ナノベシクルが、ａ）ＣＤ６３もＣＤ８１も発現しないか、またはｂ）ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏである、ステップとを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
網膜神経節細胞生存の増加を必要とする対象における網膜神経節細胞生存を増加させる方法であって、
網膜神経節細胞生存の増加を必要とする対象を選択するステップと、
前記対象の眼に、細胞外マトリックスに由来する単離されたナノベシクルの治療有効量を局所的に投与するステップであって、前記ナノベシクルが、前記対象のマクロファージにおけるＦ４／８０およびＣＤ−１１ｂの発現を維持し、前記ナノベシクルが、リジルオキシダーゼを含み、前記ナノベシクルが、ａ）ＣＤ６３もＣＤ８１も発現しないか、またはｂ）ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏである、ステップとを含み、
これにより、前記対象における網膜神経節細胞生存を増加させる、方法。
【請求項２】
前記細胞外マトリックスが、哺乳動物細胞外マトリックスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物細胞外マトリックスが、ヒト細胞外マトリックスである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞外マトリックスが、食道組織、膀胱、小腸粘膜下組織、真皮、臍帯、心膜、心組織、腫瘍組織または骨格筋に由来する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ナノベシクルが、ｍｉＲ−１４５および／またはｍｉＲ−１８１を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ナノベシクルが、前記対象の前記眼に局所的に投与される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ナノベシクルが、硝子体内または網膜下に投与される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ナノベシクルが、前記対象の前記眼に反復して投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ナノベシクルが、前記対象に毎週、隔月または毎月投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
網膜神経節細胞生存の増加を必要とする前記対象を選択するステップが、緑内障を有する対象を選択するステップを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象に眼内圧を低減する薬剤の治療有効量を投与するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
眼内圧を低減する前記薬剤（複数可）が、ａ）プロスタグランジンアナログ、ｂ）ベータ−アドレナリン作動性遮断薬、ｃ）アルファ−アドレナリン作動性アゴニストまたはｄ）コリン作動性アゴニストである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象が、傷害に起因する網膜神経節細胞変性を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象が、遺伝的障害に起因する網膜神経節細胞変性を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象が、圧力非依存性緑内障性視神経症、虚血性視神経症、炎症性視神経症、圧迫性視神経症、外傷性視神経症を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象が、動脈炎性虚血性視神経症、巨細胞動脈炎に関連した動脈炎性虚血性視神経症、非動脈炎性虚血性視神経症、浸潤性視神経症、サルコイドーシスに関連した浸潤性視神経症、感染性視神経症、梅毒に関連した感染性視神経症、ライム病に関連した感染性視神経症、トキソプラズマ症に関連した感染性視神経症、帯状疱疹に関連した感染性視神経症、脱髄性疾患による視神経炎、照射後視神経症、腸性肢端皮膚炎、遺伝性視神経症、優性視神経症に関連した遺伝性視神経症、圧迫性視神経症、眼窩偽腫瘍に関連した圧迫性視神経症、甲状腺眼疾患に関連した圧迫性視神経症、自己免疫性視神経症、またはループスに関連した自己免疫性視神経症を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＭＢＶが、マイクログリアおよび／またはアストロサイトからのサイトカインの分泌を減少させる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記サイトカインが、ＩＬ−１β、ＩＬ−６またはＴＮＦ−αである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
対象における網膜神経節細胞生存の増加における使用のための組成物であって、前記組成物が、細胞外マトリックスに由来する単離されたナノベシクルの治療有効量を含み、前記ナノベシクルが、Ｆ４／８０およびＣＤ−１１ｂを発現し、前記ナノベシクルが、ａ）ＣＤ６３もＣＤ８１も発現しないか、またはｂ）ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏであり、前記組成物が、前記対象の眼への局所的な投与のために製剤化されている、組成物。
【請求項２０】
前記細胞外マトリックスが、哺乳動物細胞外マトリックスである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記哺乳動物細胞外マトリックスが、ヒト細胞外マトリックスである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記細胞外マトリックスが、食道組織、膀胱、小腸粘膜下組織、真皮、臍帯、心膜、心組織、腫瘍組織または骨格筋に由来する、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ナノベシクルが、ｍｉＲ−１４５および／またはｍｉＲ−１８１を含む、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ナノベシクルが、前記対象の前記眼に局所的に投与される、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ナノベシクルが、硝子体内または網膜下に投与される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ナノベシクルが、前記対象の前記眼に反復して投与される、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ナノベシクルが、前記対象に毎週、隔月または毎月投与される、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
網膜神経節細胞生存の増加を必要とする前記対象を選択するステップが、緑内障を有する対象を選択するステップを含む、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記対象に眼内圧を低減する薬剤の治療有効量を投与するステップをさらに含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
眼内圧を低減する前記薬剤（複数可）が、ａ）プロスタグランジンアナログ、ｂ）ベータ−アドレナリン作動性遮断薬、ｃ）アルファ−アドレナリン作動性アゴニストまたはｄ）コリン作動性アゴニストである、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記対象が、傷害に起因する網膜神経節細胞変性を有する、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記対象が、遺伝的障害に起因する網膜神経節細胞変性を有する、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記対象が、圧力非依存性緑内障性視神経症、虚血性視神経症、炎症性視神経症、圧迫性視神経症、外傷性視神経症を有する、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記対象が、動脈炎性虚血性視神経症、巨細胞動脈炎に関連した動脈炎性虚血性視神経症、非動脈炎性虚血性視神経症、浸潤性視神経症、サルコイドーシスに関連した浸潤性視神経症、感染性視神経症、梅毒に関連した感染性視神経症、ライム病に関連した感染性視神経症、トキソプラズマ症に関連した感染性視神経症、帯状疱疹に関連した感染性視神経症、脱髄性疾患による視神経炎、照射後視神経症、腸性肢端皮膚炎、遺伝性視神経症、優性視神経症に関連した遺伝性視神経症、圧迫性視神経症、眼窩偽腫瘍に関連した圧迫性視神経症、甲状腺眼疾患に関連した圧迫性視神経症、自己免疫性視神経症、またはループスに関連した自己免疫性視神経症を有する、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
ＭＢＶが、マイクログリアおよび／またはアストロサイトからのサイトカインの分泌を減少させる、請求項１９〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記サイトカインが、ＩＬ−１β、ＩＬ−６またはＴＮＦ−αである、請求項３５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
この出願は、２０１７年５月５日に出願された米国仮特許出願第６２／５０２，２７１号に対する利益を主張し、これは、本明細書に参考として援用される。  
【０００２】
本発明は、眼科学の分野に関し、具体的には、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）生存を増加させるためのマトリックス結合ナノベシクル（ＭＢＶ）の使用、およびＲＧＣ生存の減少に関連する眼科疾患の処置に関する。
【０００３】
政府支援に対する謝辞
本発明は、米国陸軍／ＭＲＭＣから受けた助成番号Ｗ８１ＸＷＨ−１５−１−００２６により、政府支援で為された。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
ＲＧＣ死を暗示する眼性傷害および神経変性疾患後の神経修復を標的とする治療法の必要は大いに満たされていない。世界中でおよそ２億８５００万人が、眼に対する疾患または外傷により、様々な程度の生涯にわたる視力喪失を患う（ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｍｅｄｉａｃｅｎｔｒｅ／ｆａｃｔｓｈｅｅｔｓ／ｆｓ２８２／ｅｎ／にてオンライン利用できるＷＨＯ、「Ｖｉｓｕａｌ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ」、２０１４年８月）。米国単独では、２５０万症例の眼傷害が毎年発生し、そのうち５０，０００症例が、結果として生涯にわたる盲目となる（ＯｗｅｎｓおよびＭｕｔｔｅｒ、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｂｒｉｅｆ、＃１１２．Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｓｔ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  （ＨＣＵＰ）  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｂｒｉｅｆｓ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  （ＭＤ）２００６年）。ＲＧＣ軸索再生の失敗は依然として、軸索再生を抑制する種々の傷害誘導性因子による、眼の修復に対する障壁である。そのような因子は、不十分な内因性軸索成長能力（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｎｅｕｒｏｎ、３３巻（５号）：６８９〜７０２頁、２００２年）、失われた神経栄養性支持（Ｍａｎｓｏｕｒ−Ｒｏｂａｅｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、９１巻（５号）：１６３２〜１６３６頁、１９９４年）、グリアによって発現される阻害性分子（ＭｃＫｅｏｎら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１９巻（２４号）：１０７７８〜１０７８８頁、１９９９年）または細胞傷害の際に放出される阻害性分子（ＭｃＫｅｏｎら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１１巻（１１号）：３３９８〜３４１１頁、１９９１年）、および炎症性免疫応答（Ｄａｒｌｉｎｇｔｏｎら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ、６７巻（６号）：５９０〜５９９ｍ頁、２００８年）を含む。齧歯類モデルにおいて、分子的または遺伝的操作によってこれらの因子のうち１種または複数種を標的とする多因子性アプローチは、ニューロン生存および再生を改善することができる。しかし、現在利用できるモダリティを使用すると、再生が成功するニューロンの数は少なく（Ｔｒｏｐｅａら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２３巻（１８号）：７０３４〜７０４４頁、２００３年）、標的神経再支配は不十分であり、機能回復は全くないかそれに近い。よって、網膜神経節中等の軸索を再生させるための方法の必要が依然としてある。
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）技術を使用した再生医療戦略が、筋肉および結合組織における組織修復の促進において、前臨床および臨床で成功した。ＥＣＭは、細胞および組織同一性および機能の両方を規定する、特有のタンパク質および多糖微小環境である。ＥＣＭ技術は、健康組織の脱細胞化によって得られる異種間ＥＣＭ生体足場を使用する。正確な機構は不明であるが、ＥＣＭ生体足場は、マクロファージにおける抗炎症性Ｍ２様シグナル伝達を増加させ、部位適正な細胞動員および分化を誘導して、瘢痕を減少させ、身体がデフォルトで修復することができない組織における部位適正な組織修復を増加させることができる。近年、マトリックス結合ベシクル（ＭＢＶ）が、検査した全ての実験的および市販のＥＣＭ生体足場において見出され、予備データは、ＭＢＶが、親ＥＣＭのプラス効果の多くを再現することができることを示す。ＭＢＶのための新たな使用が、本明細書に開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、Ｎｅｕｒｏｎ、３３巻（５号）：６８９〜７０２頁、２００２年
【非特許文献２】Ｍａｎｓｏｕｒ−Ｒｏｂａｅｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、９１巻（５号）：１６３２〜１６３６頁、１９９４年
【非特許文献３】ＭｃＫｅｏｎら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１９巻（２４号）：１０７７８〜１０７８８頁、１９９９年
【非特許文献４】ＭｃＫｅｏｎら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１１巻（１１号）：３３９８〜３４１１頁、１９９１年
【非特許文献５】Ｄａｒｌｉｎｇｔｏｎら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ、６７巻（６号）：５９０〜５９９ｍ頁、２００８年
【非特許文献６】Ｔｒｏｐｅａら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２３巻（１８号）：７０３４〜７０４４頁、２００３年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
網膜神経節細胞生存の増加を必要とする対象における網膜神経節細胞生存を増加させる方法が本明細書に開示される。このような方法は、網膜神経節細胞生存の増加を必要とする対象を選択するステップと、対象の眼に、細胞外マトリックスに由来する単離されたナノベシクルの治療有効量を局所的に投与するステップであって、ナノベシクルが、対象のマクロファージにおけるＦ４／８０およびＣＤ−１１ｂの発現を維持し、ナノベシクルが、リジルオキシダーゼを含み、ナノベシクルが、ａ）ＣＤ６３もＣＤ８１も発現しないか、またはｂ）ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏである、ステップとを含む。
【０００７】
細胞外マトリックスに由来する単離されたナノベシクルの治療有効量を含む組成物の使用であって、ナノベシクルが、対象のマクロファージにおけるＦ４／８０およびＣＤ−１１ｂの発現を維持し、ナノベシクルが、リジルオキシダーゼを含み、ナノベシクルが、ａ）ＣＤ６３もＣＤ８１も発現しないか、またはｂ）ＣＤ６３ｌｏＣＤである、網膜神経節細胞生存（ｓｕｖｉｖａｌ）を増加させるための使用が、本明細書に開示されている。一部の実施形態では、このような組成物は、緑内障を有する対象の処置に役立つ。さらなる実施形態では、このような組成物は、傷害または遺伝的障害に起因する網膜神経節細胞変性を有する対象の処置に役立つ。さらなる実施形態では、このような組成物は、圧力非依存性緑内障性視神経症、虚血性視神経症、炎症性視神経症、圧迫性視神経症、または外傷性視神経症を有する対象の処置に役立つ。他の実施形態では、このような組成物は、動脈炎性虚血性視神経症、巨細胞動脈炎に関連した動脈炎性虚血性視神経症、非動脈炎性虚血性視神経症、浸潤性視神経症、サルコイドーシスに関連した浸潤性視神経症、感染性視神経症、梅毒に関連した感染性視神経症、ライム病に関連した感染性視神経症、トキソプラズマ症に関連した感染性視神経症、帯状疱疹に関連した感染性視神経症、脱髄性疾患による視神経炎、照射後視神経症、腸性肢端皮膚炎、遺伝性視神経症、優性視神経症に関連した遺伝性視神経症、圧迫性視神経症、眼窩偽腫瘍に関連した圧迫性視神経症、甲状腺眼疾患に関連した圧迫性視神経症、自己免疫性視神経症、またはループスに関連した自己免疫性視神経症を有する対象の処置に役立つ。
【０００８】
本発明の前述および他の目的、特色および利点は、添付の図面を参照しつつ続ける次の詳細な説明から、さらに明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１Ａ〜図１Ｂは、ＭＢＶが、ＲＧＣ神経突起成長を増加させることを示す。（Ａ）ＲＧＣ生存率は、ＵＢＭ−ＥＣＭまたはＭＢＶ（５〜８０μｇ／ｍｌ）のいずれによっても変化しなかった。データは、処置なし対照に対して正規化した。（Ｂ）総ＲＧＣ神経突起成長は、ＭＢＶ処置（５〜２０）μｇ／ｍｌにより増加し、５０〜８０μｇ／ｍｌのＭＢＶ用量により減少した。エラーバーは、ＳＥＭを示し、ｎ＝３。＊ｐ＜０．０１、培地と比較；＊＊ｐ＜０．００１、培地と比較。
【００１０】
【図２−１】図２Ａ〜図２Ｈは、ＭＢＶが、マイクログリアおよびアストロサイトの両方からの炎症促進性サイトカイン分泌を抑制することを示す。（Ａ〜Ｃ）刺激なしの（ｕｎｐｒｉｍｅｄ）マイクログリアにおいて、ＬＰＳ／ＩＦＮγは、炎症促進性サイトカインを増加させた。刺激ありのマイクログリアにおいて、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＮＦ−α分泌は、培地において上昇を維持したが、全３種のサイトカインの分泌は、ＵＢＭ−ＥＣＭおよびＭＢＶの両方によって有意に低下した。（Ｄ〜Ｆ）マイクログリアと同様に、ＬＰＳ／ＩＦＮγは、アストロサイトからの炎症促進性サイトカイン分泌（ｓｅｃｅｔｉｏｎ）を増加させ、これらの増加は、ＵＢＭ−ＥＣＭおよびＭＢＶの両方によって減少した。（Ｇ〜Ｈ）表は、刺激なしおよび刺激ありのマイクログリア（Ｇ）およびアストロサイト（Ｈ）の両方の実際のサイトカイン濃度を示す。エラーバーは、ＳＥＭを表し、データは、３回の独立した実験からの三連の（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）試料を表す。群間の一元配置ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５。
【図２−２】同上。
【図２−３】同上。
【００１１】
【図３】図３は、ＭＢＶが、炎症促進性アストロサイトからの馴化培地におけるＲＧＣ生存を増加させることを示す。ＲＧＣは、刺激ありまたは刺激なしのマイクログリアのいずれかによって馴化した上清で培養したアストロサイトからの培地で処置した。３日後に、ＬＰＳ／ＩＦＮγ−刺激なしおよび培地−刺激ありの培地で処置したＲＧＣは、１００％ＲＧＣ死を示した。刺激ありのＭＢＶ培地または刺激ありのＵＢＭ−ＥＣＭ培地で処置したＲＧＣは、生存の増加を示した。データは、非馴化培地に対して正規化した。エラーバーは、ＳＥＭを表し、実験は、３回の独立した実験から解析されたｎ＞３００個のニューロンを表す。＃ｐ＜０．０１、非馴化培地と比較。
【００１２】
【図４】図４は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＭＢＶ毒性を示す。健康な未傷害ラット眼に、０、２および７日目に、５、１０および２０ｕｇ／ｍｌのＭＢＶを硝子体内注射した。未注射対照と比較して、ＲＧＣ生存率は、ＰＢＳまたは５ｕｇ／ｍｌのＭＢＶのいずれによっても影響を受けなかったが、ＲＧＣ生存率は、１０および２０ｕｇ／ｍｌのＭＢＶによって、網膜中心において低下したが、網膜周辺では低下しなかった。１群あたりＮ＝５匹の動物、網膜１個につき１２箇所の位置が解析された。＊ｐ＜０．０５、未注射対照と比較。データは、ｉｎ  ｖｉｖｏで網膜中心または網膜周辺のいずれかにおいて、ＲＧＣ生存率に影響を与えることなく、５ｕｇ／ｍｌのＭＢＶ濃度を使用することができることを示す。
【００１３】
【図５−１】図５Ａ〜図５Ｃは、ＭＢＶが、ＩＯＰ傷害後のＲＧＣ生存の増加を促進することを示す。（Ａ）無処置ＩＯＰ上昇（ＩＯＰ）、ＰＢＳ処置ＩＯＰ上昇、およびＭＢＶ処置（ＩＯＰ＋ＭＢＶ）後の、未傷害対照眼（対照）の網膜中心および網膜周辺におけるＲＢＰＭＳおよびＢｒｎ３Ａで共標識されたＲＧＣ細胞体を示す代表的画像。（Ｂ〜Ｃ）無処置およびＰＢＳ処置眼と比較して、定量的解析は、ＭＢＶが、網膜中心（Ｂ）および網膜周辺（Ｃ）の両方においてＲＧＣ生存率を増加させたことを示した。エラーバーは、ＳＥＭを表し、１群あたりｎ＝５匹の動物、網膜１個につき１２枚の網膜画像、１群あたり総計６０枚の画像。有意性は、群間の事後チューキー検定による一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した；＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、培地と比較；＊ｐ＜０．０５、群間。
【図５−２】図５Ａ〜図５Ｃは、ＭＢＶが、ＩＯＰ傷害後のＲＧＣ生存の増加を促進することを示す。（Ａ）無処置ＩＯＰ上昇（ＩＯＰ）、ＰＢＳ処置ＩＯＰ上昇、およびＭＢＶ処置（ＩＯＰ＋ＭＢＶ）後の、未傷害対照眼（対照）の網膜中心および網膜周辺におけるＲＢＰＭＳおよびＢｒｎ３Ａで共標識されたＲＧＣ細胞体を示す代表的画像。（Ｂ〜Ｃ）無処置およびＰＢＳ処置眼と比較して、定量的解析は、ＭＢＶが、網膜中心（Ｂ）および網膜周辺（Ｃ）の両方においてＲＧＣ生存率を増加させたことを示した。エラーバーは、ＳＥＭを表し、１群あたりｎ＝５匹の動物、網膜１個につき１２枚の網膜画像、１群あたり総計６０枚の画像。有意性は、群間の事後チューキー検定による一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した；＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、培地と比較；＊ｐ＜０．０５、群間。
【００１４】
【図６−１】図６Ａ〜図６Ｃは、ＭＢＶが、ＲＧＣ軸索変性を抑制することを示す。（Ａ）未傷害対照眼（対照）、無処置ＩＯＰ眼（ＩＯＰ）、ＰＢＳ処置ＩＯＰ眼およびＭＢＶ処置ＩＯＰ眼の網膜中心および網膜周辺における、ＣｔｘＢで標識されたＲＧＣ軸索を示す代表的画像。（Ｂ）未傷害対照眼（対照）、無処置ＩＯＰ眼（ＩＯＰ）、ＰＢＳ処置ＩＯＰ眼およびＭＢＶ処置ＩＯＰ眼の視神経におけるＣｔｘＢで標識されたＲＧＣ軸索を示す代表的画像。（Ｃ）ＣｔｘＢ発現の定量的解析は、ＭＢＶが、ＲＧＣ軸索喪失を低下させたことを示した。エラーバーは、ＳＥＭを表し、１群あたりｎ＝５匹の動物、視神経１つにつき１５枚の画像、１群あたり総計７５枚の画像。有意性は、群間の事後チューキー検定による一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した；＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、培地と比較；＊ｐ＜０．０５、群間。
【図６−２】図６Ａ〜図６Ｃは、ＭＢＶが、ＲＧＣ軸索変性を抑制することを示す。（Ａ）未傷害対照眼（対照）、無処置ＩＯＰ眼（ＩＯＰ）、ＰＢＳ処置ＩＯＰ眼およびＭＢＶ処置ＩＯＰ眼の網膜中心および網膜周辺における、ＣｔｘＢで標識されたＲＧＣ軸索を示す代表的画像。（Ｂ）未傷害対照眼（対照）、無処置ＩＯＰ眼（ＩＯＰ）、ＰＢＳ処置ＩＯＰ眼およびＭＢＶ処置ＩＯＰ眼の視神経におけるＣｔｘＢで標識されたＲＧＣ軸索を示す代表的画像。（Ｃ）ＣｔｘＢ発現の定量的解析は、ＭＢＶが、ＲＧＣ軸索喪失を低下させたことを示した。エラーバーは、ＳＥＭを表し、１群あたりｎ＝５匹の動物、視神経１つにつき１５枚の画像、１群あたり総計７５枚の画像。有意性は、群間の事後チューキー検定による一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した；＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１、培地と比較；＊ｐ＜０．０５、群間。
【００１５】
【図７−１】図７Ａ〜図７Ｂは、ＭＢＶが、視神経におけるＩＯＰ誘導性グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）発現を減少させることを示す。（Ａ）未傷害対照眼（対照）、無処置ＩＯＰ眼（ＩＯＰ）、ＰＢＳ処置ＩＯＰ眼およびＭＢＶ処置ＩＯＰ眼の視神経におけるＧＦＡＰ発現を示す代表的画像。（Ｂ）ＧＦＡＰ免疫反応性の定量的解析は、硝子体内ＭＢＶ注射が、視神経におけるＧＦＡＰ発現を低下させることを示した。エラーバーは、ＳＥＭを表し、１群あたりｎ＝５匹の動物、視神経１つにつき１５枚の画像、１群あたり総計７５枚の画像が解析された。有意性は、群間の事後チューキー検定による一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した；＃ｐ＜０．００１、培地と比較；＊ｐ＜０．００１、群間。
【図７−２】図７Ａ〜図７Ｂは、ＭＢＶが、視神経におけるＩＯＰ誘導性グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）発現を減少させることを示す。（Ａ）未傷害対照眼（対照）、無処置ＩＯＰ眼（ＩＯＰ）、ＰＢＳ処置ＩＯＰ眼およびＭＢＶ処置ＩＯＰ眼の視神経におけるＧＦＡＰ発現を示す代表的画像。（Ｂ）ＧＦＡＰ免疫反応性の定量的解析は、硝子体内ＭＢＶ注射が、視神経におけるＧＦＡＰ発現を低下させることを示した。エラーバーは、ＳＥＭを表し、１群あたりｎ＝５匹の動物、視神経１つにつき１５枚の画像、１群あたり総計７５枚の画像が解析された。有意性は、群間の事後チューキー検定による一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した；＃ｐ＜０．００１、培地と比較；＊ｐ＜０．００１、群間。
【００１６】
【図８−１】図８Ａ〜図８Ｂは、ＭＢＶが、視神経におけるＧＡＰ−４３発現を増加させることを示す。（Ａ）未傷害対照眼（対照）、無処置ＩＯＰ眼（ＩＯＰ）、ＰＢＳ処置ＩＯＰ眼およびＭＢＶ処置ＩＯＰ眼の視神経におけるＧＡＰ−４３発現を示す代表的画像。（Ｂ）ＧＡＰ−４３免疫反応性の定量的解析は、硝子体内ＭＢＶ注射が、視神経におけるＧＡＰ−４３発現を増加させることを示した。エラーバーは、ＳＥＭを表し、実験は、１群あたりｎ＝５匹の動物、動物１匹あたり視神経１つにつき１５枚の画像、１群あたり総計７５枚の画像が解析されたことを表す。有意性は、群間の事後チューキー検定による一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した；＃ｐ＜０．０５、培地と比較；＊ｐ＜０．０５、群間。
【図８−２】図８Ａ〜図８Ｂは、ＭＢＶが、視神経におけるＧＡＰ−４３発現を増加させることを示す。（Ａ）未傷害対照眼（対照）、無処置ＩＯＰ眼（ＩＯＰ）、ＰＢＳ処置ＩＯＰ眼およびＭＢＶ処置ＩＯＰ眼の視神経におけるＧＡＰ−４３発現を示す代表的画像。（Ｂ）ＧＡＰ−４３免疫反応性の定量的解析は、硝子体内ＭＢＶ注射が、視神経におけるＧＡＰ−４３発現を増加させることを示した。エラーバーは、ＳＥＭを表し、実験は、１群あたりｎ＝５匹の動物、動物１匹あたり視神経１つにつき１５枚の画像、１群あたり総計７５枚の画像が解析されたことを表す。有意性は、群間の事後チューキー検定による一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した；＃ｐ＜０．０５、培地と比較；＊ｐ＜０．０５、群間。
【００１７】
【図９】図９Ａ〜図９Ｄは、虚血性傷害後のＭＢＶ注射が、明順応陰性応答（ＰｈＮＲ）振幅を増加させ、潜伏時間を短縮することを示す。（Ａ）ＩＯＰ上昇１４日後の、未傷害網膜（青色の線）またはＩＯＰ傷害網膜（赤色の線）における網膜電図検査（ＥＲＧ）応答の比較。（Ｂ）ＩＯＰ上昇１４日後の、未傷害網膜（青色の線）、またはＩＯＰ傷害後のＭＢＶ処置眼の網膜（赤色の線）におけるＥＲＧ応答の比較。（Ｃ）定量的には、ＰＢＳ注射ありおよびなしのＩＯＰ上昇は、未傷害対照と比較して、明順応陰性応答（ＰｈＮＲ）振幅を減少させた。ＭＢＶ処置は、無処置群と比較してＰｈＮＲ振幅を増加させ、未傷害群およびＭＢＶ処置群の間にＰｈＮＲ振幅の差はなかった。（Ｄ）ＩＯＰ上昇は、ＰｈＮＲの潜伏時間を減少させ、ＭＢＶ処置によるＩＯＰ上昇と比較して有意に増加した。Ｃ、Ｄ。エラーバーは、ＳＥＭを表し、１群あたりｎ＝５匹の動物、動物１匹あたり３回のＥＲＧ記録。有意性は、群間の事後チューキー検定による一元配置ＡＮＯＶＡによって決定した；＃ｐ＜０．０５、培地と比較；＊ｐ＜０．０５、群間。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
配列表
添付の配列表に収載されている核酸およびアミノ酸配列は、連邦規則法典第３７巻１．８２２条（３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．  １．８２２）に定義されている通り、ヌクレオチド塩基に対しては標準文字省略を、アミノ酸に対しては３文字コードを使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、表示されている鎖のいずれかの参照によって相補鎖が含まれているものと理解される。配列表は、参照により本明細書に組み込む、ＡＳＣＩＩテキストファイル［２０１８年５月４日、１，１２１バイト］として提出される。
【００１９】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）で構成された生物学的足場は、外科用メッシュ材料として開発されており、腹側ヘルニア修復（Ａｌｉｃｕｂａｎら、Ｈｅｒｎｉａ．２０１４年；１８巻（５号）：７０５〜７１２頁）、筋骨格再建（Ｍａｓｅら、Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ．２０１０年；３３巻（７号）：５１１頁）、食道再建（Ｂａｄｙｌａｋら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ．２０１１年；１７巻（１１〜１２号）：１６４３〜５０頁）、硬膜置換（Ｂｅｊｊａｎｉら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．２００７年；１０６巻（６号）：１０２８〜１０３３頁）、腱修復（Ｌｏｎｇｏら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｔ．２０１２年；２０１２巻：５１７１６５頁）、乳房再建（Ｓａｌｚｂｅｒ、Ａｎｎ  Ｐｌａｓｔ  Ｓｕｒｇ．２００６年；５７巻（１号）：１〜５頁）をとりわけ含む臨床適用において使用される（Ｂａｄｙｌａｋら、Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ．２００９年；５巻（１号）：１〜１３頁）。
【００２０】
マトリックス結合ナノベシクル（ＭＢＶ）が、ＥＣＭの線維ネットワーク内に包埋されることが開示されている。このようなマトリックス結合ナノ粒子は、ＥＣＭ足場製造過程においてそのカーゴを分解および変性から遮蔽する。エキソソームは、これまでに体液および細胞培養上清においてはほぼ例外なく同定されるマイクロベシクルである。ＭＢＶとエキソソームとは異なることが実証されている。ＭＢＶは、例えば、洗剤および／または酵素による消化に対して抵抗性であり、一群の異なるマイクロＲＮＡを含有し、ｍｉＲ−１４５が富化されていることから、他のマイクロベシクルとは異なる。ＭＢＶは、他のマイクロベシクルに見出される特徴的表面タンパク質を持たない。本明細書に開示されている通り、ＭＢＶは、細胞生存に影響を与え、治癒応答をモジュレートして、神経学的機能を保存または回復する。ＭＢＶが、ＲＧＣ生存、軸索成長および組織リモデリングを差次的に調節することが開示されている。
【００２１】
用語
用語および方法に関する次の説明は、本開示をより良く記載し、本開示の実施において当業者をガイドするために提供されている。単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈がそれ以外を明らかに指示しない限り、１つまたは２つ以上を指す。例えば、用語「１つの細胞を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａ  ｃｅｌｌ）」は、単一または複数の細胞を含み、語句「少なくとも１つの細胞を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｃｅｌｌ）」と等価であると考慮される。用語「または（ｏｒ）」は、文脈がそれ以外を明らかに示さない限り、記述されている代替要素のうち単一の要素、または２つもしくはそれよりも多い要素の組合せを指す。本明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」を意味する。よって、「ＡまたはＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ａ  ｏｒ  Ｂ）」は、追加的な要素を除外することのない、「Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ａ，Ｂ，ｏｒ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ）」を意味する。本明細書に参照されているＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号の日付は、少なくとも２０１５年９月１６日もの早さで利用できる配列である。本明細書に引用されているあらゆる参考文献、特許出願および公報、ならびにＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号は、参照により本明細書に組み込む。本開示の様々な実施形態の概説を容易にするために、特定の用語に関する次の説明を提供する：
【００２２】
動物：例えば、哺乳動物および鳥類を含むカテゴリーである、生きている多細胞脊椎動物の生物。哺乳動物という用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方を含む。同様に、用語「対象」は、ヒトおよび獣医学対象の両方を含む。
【００２３】
生体適合性：哺乳動物被験体に植え込まれたときに、被験体における有害応答を誘発しない、いずれかの材料。生体適合性材料は、個体に導入されたときに、その意図される機能を発揮することができ、該個体にとって有毒または傷害性でなく、その被験体におけるその材料の免疫学的拒絶を誘導することもない。
【００２４】
富化される：混合物中にあるナノベシクル等の目的の構成成分が、富化過程前と比較して、富化過程後に、該混合物中の他の望まれない構成成分の量に対する該構成成分の量の増加した比を有する過程。
【００２５】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）：組織内の細胞を囲みこれを支持する、構造タンパク質、特殊化タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンおよび成長因子が挙げられるがこれらに限定されない、構造的かつ機能的生体分子および／または生体高分子の複合混合物であり、他に断りがなければ、無細胞である。ＥＣＭ調製物は、本明細書に記載されている本技術分野で公知のプロセスにより供給源組織から細胞が除去されたことを意味する、「脱細胞化された」または「無細胞である」とみなすことができる。「ＥＣＭ由来（ｄｅｒｉｖｉｅｄ）ナノベシクル」、「マトリックス結合ナノベシクル」、「ＭＢＶ」または「ＥＣＭに由来するナノベシクル」等、「ＥＣＭ由来材料」とは、天然ＥＣＭまたは培養細胞によってＥＣＭが産生されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ供給源から調製される、ナノベシクルである。ＥＣＭ由来ナノベシクルについては、下に定義する。
【００２６】
緑内障：網膜神経節細胞死、視神経乳頭の陥凹、および視野の漸進的喪失によって特徴付けられる眼障害。異常に高い眼内圧は一般的に、眼にとって有害であることが公知であり、緑内障における主要リスク因子の１つである。緑内障患者において、高い眼内圧は、網膜に変性的変化をもたらし得る。「高眼圧症」は、視野または視神経乳頭の欠損のいかなる徴候も伴わない、異常に高い眼内圧を有する個体における臨床状況を指す。高眼圧症を有する個体は、緑内障への変換のリスクを保有し、このリスクは、より高い眼内圧測定値に相関する。
【００２７】
緑内障は、開放隅角型および閉塞隅角型に分けることができ、急性型および慢性型へとさらに分類することができる。正常眼圧緑内障も存在する。緑内障は、原発性または続発性緑内障でありえる。全緑内障症例の８０％超が、原発性開放隅角緑内障とも呼ばれる慢性開放隅角緑内障（ＣＯＡＧ）である。本明細書に開示されている方法を使用して、緑内障のこれらの型のいずれかを処置することができる。
【００２８】
「原発性閉塞隅角性緑内障」は、虹彩、線維柱帯網および周辺角膜の間の接触に起因し、次いでこれにより、眼からの房水の流出が閉塞される。虹彩および線維柱帯網（ＴＭ）の間のこのような接触は、房水産生と同じペースを維持することができなくなり圧力が上がるまで、網目構造の機能を漸進的に損傷し得る。全症例の半数超において、虹彩およびＴＭの間の接触延長は、癒着（事実上「瘢痕」）の形成を引き起こす。これらは、房水流出の永続的閉塞を引き起こす。一部の症例では、眼における圧力が急速に増加し、疼痛および発赤を引き起こし得る（症候性またはいわゆる「急性」閉塞隅角性（ａｎｇｌｅ  ｃｌｏｓｕｒｅ））。この状況では、視覚がぼやけるようになる場合があり、明るい光の周囲に光ぼけ（ｈａｌｏ）が見える場合がある。付随する症状は、頭痛および嘔吐を含む場合がある。身体的徴候および症状から診断を行うことができる：瞳孔の中程度の散大（ｍｉｄ−ｄｉｌａｔｅｄ）および光に対する無応答性、角膜浮腫性（曇った）、視力低下、発赤ならびに疼痛。しかし、症例の大部分は無症候性である。非常に重症な視力喪失に先立ち、これらの症例は、一般に、アイケア専門家による検査によってのみ同定することができる。
【００２９】
視神経損傷が、進行性視野喪失をもたらす場合、「原発性開放隅角緑内障」が発生する。原発性開放隅角緑内障の人全員が、正常を上回って上昇する眼圧を有するとは限らない。圧力増加は、房水流出経路の遮断に起因する。微細な通路が遮断されるため、眼における圧力が増大し、感知できない非常に漸進的な視力喪失を引き起こす。周辺視野が先ず影響を受けるが、最終的に、処置しなければ全体的視野が失われる。視神経の陥凹を探し、視野を測定することにより、診断を行うことができる。プロスタグランジンアゴニストは、ぶどう膜強膜路を開放することにより機能する。
【００３０】
緑内障の他の型は、ぶどう膜炎、虹彩毛様体炎、眼内出血、外傷または眼内腫瘍の後に発生し得る、発育性緑内障および続発性緑内障である。本明細書に開示されている方法を使用して、緑内障のいずれかの型を処置することができる。
【００３１】
緑内障において網膜神経節細胞死が発生する。網膜神経節細胞の生存を増加させるための方法が、本明細書に開示されている。
【００３２】
眼内投与：例えば、硝子体または前房の中に送達することにより、眼の中に直接的に薬剤を投与すること。間接的眼内送達（例えば、角膜を通った拡散による）は、眼の中への直接的投与ではない。
【００３３】
眼内圧：眼の内側の房水産生の速度、および眼から前房隅角を通ってシュレム管に向かって出る際の房水流出に対する抵抗性の間の相互関係によって決定される、眼球を満たす流体、房水の圧力。ヒトの眼において、房水形成の速度は２．５４／分であるが、ウサギの眼におけるその速度は、およそ３〜４μＬ／分である。ヒトの眼における正常ＩＯＰ測定値は、広く許容される共通認識によると、１０〜２０ｍｍ水銀柱の間に及ぶ範囲であり、平均は１５．５ｍｍである。
【００３４】
硝子体内投与：硝子体腔の中に薬剤を投与すること。硝子体腔は、その前縁として水晶体およびその支持系（小体）、ならびに周辺縁として網膜およびそのコーティングを有する眼のコアの容量の大部分を占有する間隙である。硝子体内投与は、注射、ポンピングまたはインプラントによって達成することができる。
【００３５】
単離された：「単離された」生物学的構成成分（核酸、タンパク質、細胞またはナノベシクル等）は、構成成分が天然に発生する場合の、生物の細胞における他の生物学的構成成分またはＥＣＭから離れて実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質は、標準精製方法によって精製された核酸およびタンパク質を含む。単離されたナノベシクルは、ＥＣＭの線維性材料から除去される。この用語は、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質ならびに化学合成された核酸も包含する。
【００３６】
リジルオキシダーゼ（Ｌｏｘ）：コラーゲンおよびエラスチン前駆体におけるリシン残基からアルデヒドの形成を触媒する銅依存性酵素。このようなアルデヒドは、高度に反応性であり、他のリジルオキシダーゼ由来アルデヒド残基と、または無修飾リシン残基と自発性化学反応を行う。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、その結果、コラーゲンおよびエラスチンの架橋が生じ、これは、コラーゲン原線維の安定化における、ならびに成熟エラスチンの完全性および弾性のための役割を果たす。複雑な架橋が、コラーゲン（３個のリシン残基に由来するピリジノリン）およびエラスチン（４個のリシン残基に由来するデスモシン）において形成され、これらは、構造が異なる。Ｌｏｘ酵素をコードする遺伝子は、種々の生物からクローニングされている（Ｈａｍａｌａｉｎｅｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１１巻：５０８頁、１９９１年；Ｔｒａｃｋｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９巻：４８６３頁、１９９０年；参照により本明細書に組み込む）。ヒトリジルオキシダーゼの配列の残基１５３〜４１７および残基２０１〜４１７は、触媒機能に重要であることが示された。ＬｏｘＬ１、ＬｏｘＬ２、ＬｏｘＬ３およびＬｏｘＬ４と呼ばれる４種のＬｏｘ様アイソフォームが存在する。
【００３７】
マクロファージ：細胞デブリ、異物、微生物およびがん細胞を貪食および分解する白血球細胞の１種。貪食におけるその役割に加えて、この細胞は、発生、組織維持および修復における、ならびにリンパ球等の免疫細胞を含む他の細胞を動員し影響を与えるという点から自然免疫および適応免疫の両方における重要な役割を果たす。マクロファージは、Ｍ１およびＭ２と称されてきた表現型を含む、多くの表現型で存在し得る。主に炎症促進性の機能を果たすマクロファージは、Ｍ１マクロファージ（ＣＤ８６＋／ＣＤ６８＋）と呼ばれる一方、炎症を減少させ、組織修復を助長および調節するマクロファージは、Ｍ２マクロファージ（ＣＤ２０６＋／ＣＤ６８＋）と呼ばれる。マクロファージの様々な表現型を同定するマーカーは、種の間で異なる。マクロファージ表現型が、Ｍ１の端からＭ２の端に及ぶスペクトルによって表されることに留意されたい。Ｆ４／８０（接着Ｇタンパク質共役受容体Ｅ１（ＡＤＧＲＥ１）遺伝子によってコードされる）は、マクロファージマーカーであり、両者共に参照により本明細書に組み込む、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＮＰ＿００１２４３１８１．１、２０１８年４月６日およびＮＰ＿００１９６５、２０１８年３月５日を参照されたい。
【００３８】
マイクロＲＮＡ：典型的には、標的ｍＲＮＡ翻訳を抑圧することにより遺伝子発現を転写後調節する、約１７〜約２５ヌクレオチド塩基の長さの小分子非コードＲＮＡ。より大量の特異的ｍｉＲＮＡが、より低レベルの標的遺伝子発現と相関することになるように、ｍｉＲＮＡは、負の調節因子として機能することができる。３つの型のｍｉＲＮＡ、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）、未熟ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）および成熟ｍｉＲＮＡが存在する。一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）は、約数百塩基〜１ｋｂ超のステムループ構造の転写物として発現される。ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ転写物は、ステムループの基部付近のステムの両方の鎖を切断するドローシャと呼ばれるＲＮａｓｅ  ＩＩエンドヌクレアーゼによって、核内で切断される。ドローシャは、ずらした（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）カットでＲＮＡ二重鎖を切断し、５’リン酸および３’端における２ヌクレオチドオーバーハングを残す。切断産物である、未熟ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）は、折り返し（ｆｏｌｄ−ｂａｃｋ）様式で形成されたヘアピン構造を有する、約６０〜約１１０ヌクレオチド長である。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、Ｒａｎ−ＧＴＰおよびエキスポーチン−５によって核から細胞質へと輸送される。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、ダイサーと呼ばれる別のＲＮａｓｅ  ＩＩエンドヌクレアーゼによって、細胞質においてさらにプロセシングされる。ダイサーは、５’リン酸および３’オーバーハングを認識し、ステムループジャンクションにおいてループを切断除去して、ｍｉＲＮＡ二重鎖を形成する。ｍｉＲＮＡ二重鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合し、そこで、アンチセンス鎖が優先的に分解され、センス鎖成熟ｍｉＲＮＡが、その標的部位へとＲＩＳＣを方向づける。生物学的に活性型のｍｉＲＮＡは成熟ｍｉＲＮＡであり、これは約１７〜約２５ヌクレオチドの長さである。
【００３９】
ナノベシクル：直径約１０〜約１，０００ｎｍのナノ粒子である細胞外小胞。ナノベシクルは、他の分子の中でも生物学的に活性なシグナル伝達分子（例えば、マイクロＲＮＡ、タンパク質）を保有する脂質膜結合した粒子である。一般に、ナノベシクルは、脂質二重層によって境界を定められ、生物学的分子が、二重層に封入されるおよび／または包埋され得る。よって、ナノベシクルは、原形質膜によって囲まれた内腔を含む。異なる種類の小胞は、直径、細胞下起源、密度、形状、沈降速度、脂質組成、タンパク質マーカー、核酸含量および細胞外マトリックス由来または分泌された等の起源に基づき区別することができる。ナノベシクルは、ＥＣＭ由来のマトリックス結合ナノベシクル（上述を参照）等、その起源、タンパク質含量および／またはｍｉＲ含量により同定することができる。
【００４０】
「エキソソーム」は、細胞によって分泌される膜性小胞であり、直径は１０〜１５０ｎｍに及ぶ。一般に、後期エンドソームまたは多小胞体は、内向きの出芽および限定されたエンドソーム膜からこのような封入されたベシクルへの小胞の切断によって形成された内腔内（ｉｎｔｒａｌｕｍｅｎａｌ）小胞を含有する。続いて、このような内腔内小胞は、原形質膜との融合後のエキソサイトーシスにおいて、多小胞体内腔から細胞外環境、典型的には血液、脳脊髄液または唾液等の体液へと放出される。エキソソームは、膜のセグメントが陥入し、形質膜陥入されると、細胞内で作製される。より小型の小胞へと破壊され、最終的に細胞から排出される、内部移行されたセグメントは、タンパク質、ならびにｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ等のＲＮＡ分子を含有する。血漿由来エキソソームの大部分は、リボソームＲＮＡを欠如する。細胞外マトリックス由来エキソソームは、特異的ｍｉＲＮＡおよびタンパク質構成成分を含み、血液、尿、唾液、精液および脳脊髄液等、実質的に全ての体液に存在することが示されてきた。エキソソームは、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ６３を発現することができ、よって、ＣＤ１１ｃ＋およびＣＤ６３＋でありえる。エキソソームは、その表面に高レベルのリジル（ｌｙｓｌ）オキシダーゼを持たない。
【００４１】
「ＥＣＭに由来するナノベシクル」、「マトリックス結合ナノベシクル」、「ＭＢＶ」または「ＥＣＭ由来ナノベシクル」は全て、細胞挙動に影響するタンパク質、脂質、核酸、成長因子およびサイトカイン等、生物学的に活性なシグナル伝達分子を含有する、細胞外マトリックスに存在する、サイズが１０ｎｍ〜１０００ｎｍに及ぶ同じ膜結合した粒子を指す。これらの用語は互換的であり、同じ小胞を指す。このようなＭＢＶは、ＥＣＭ内に包埋され、これに結合されており、表面に単に付着させている訳ではない。このようなＭＢＶは、凍結融解、ならびにペプシン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、プロテイナーゼＫおよびコラゲナーゼ等のプロテアーゼによる消化、ならびに洗剤による消化等、厳しい単離条件に対して抵抗性である。一般に、このようなＭＢＶは、ｍｉＲ−１４５ならびに任意選択でｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−１４３およびｍｉＲ−１２５がとりわけ富化されている。このようなＭＢＶは、ＣＤ６３もしくはＣＤ８１を発現しないか、またはかろうじて検出可能なレベルのこれらのマーカーを発現する（ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏ）。ＭＢＶは、表面にリシルｌｙｓｌオキシダーゼ（Ｌｏｘ）を含む。ＥＣＭは、組織由来のＥＣＭであってよく、培養下の細胞から産生することができる、または商業的供給源から購入することができる。ＭＢＶは、エキソソームと異なる。
【００４２】
薬学的に許容されるキャリア：本発明において有用な薬学的に許容されるキャリアは従来のキャリアである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ著、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ、第１５版（１９７５年）は、本明細書に開示された融合タンパク質の医薬品送達に適した組成物および製剤について記載する。
【００４３】
一般に、キャリアの性質は、用いられる特定の投与機序に依存する。例えば、非経口的製剤は通常、ビヒクルとして水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロール等、薬学的にかつ生理学的に許容される流体などを含む注射用流体を含む。固体組成物（例えば、粉剤・散剤（ｐｏｗｄｅｒ）、丸剤、錠剤またはカプセル剤の形態）のため、従来の無毒固体キャリアは、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムを含むことができる。生物学的に中性のキャリアに加えて、投与されるべき医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存料およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタン等、少量の無毒性補助物質を含有することができる。
【００４４】
医薬剤：対象または細胞に適切に投与されると、所望の治療的または予防的効果を誘導することができる化学化合物または組成物。「インキュベートすること」は、薬物が、細胞と相互作用するのに十分な量の時間を含む。「接触すること」は、固体または液体形態における、エキソソーム、ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡをコードする核酸等の薬剤と細胞とをインキュベートすることを含む。
【００４５】
光毒性：光によって誘導される細胞に対する損傷。
【００４６】
ポリヌクレオチド：いずれかの長さの核酸配列（線形配列等）。したがって、ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド、および同様に、染色体に見出される遺伝子配列を含む。「オリゴヌクレオチド」は、ネイティブホスホジエステル結合によって連結した複数の連結ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、６〜３００ヌクレオチドの間の長さのポリヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドアナログは、オリゴヌクレオチドと同様に機能するが、非天然起源の部分を有する部分を指す。例えば、オリゴヌクレオチドアナログは、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド等、変更された糖部分または糖間連結等、非天然起源の部分を含有することができる。天然起源のポリヌクレオチドの機能的アナログは、ＲＮＡまたはＤＮＡに結合することができ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子を含む。
【００４７】
精製された：用語「精製された」は、絶対的純度を要求しない；むしろ、相対的な用語として意図される。よって、例えば、精製された核酸分子調製物は、参照されている核酸が、細胞内のその天然環境における核酸よりも純粋である調製物である。例えば、核酸の調製物は、核酸が、調製物の総タンパク質含量の少なくとも５０％を表すように精製される。同様に、精製されたエキソソーム調製物は、エキソソームが、マイクロベシクルおよびエキソソームが存在する細胞を含む環境中よりも純粋である調製物である。核酸またはエキソソームの精製された集団は、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％を超えて純粋である、またはそれぞれ他の核酸もしくは細胞構成成分を含まない。
【００４８】
疾患の防止または処置：疾患の「防止」は、例えば、緑内障等の疾患の素因を有することが既知である人における、疾患の発症の阻害を指す。既知の素因を有する人の例は、家族に疾患の病歴を有する、またはある状態に被験体を罹り易くする因子に曝露された人物である。「処置」は、発症し始めた後の疾患または病理学的状態の徴候または症状を寛解する治療介入を指す。
【００４９】
網膜：光に対する光受容体（錐体および杆体）を含有する、眼の光（光子）感受性部分。杆体および錐体は、光感受性色素の使用により光覚を行う。光感受性色素は、オプシンと呼ばれるタンパク質およびビタミンＡのバリアントであるレチネン（ｒｅｔｉｎｅｎｅ）と呼ばれる発色団でできている。杆体は、ロドプシンを含有する一方、錐体は、ヨードプシンを含有する。杆体および錐体は、連続的ニューロンを経てシグナルを伝達し、これは、網膜の出力細胞および神経節細胞における神経（ｎｅｕｒａｌ）発火を誘発する。視覚シグナルは、外側膝状体へと視神経によって運搬され、そこから、視覚シグナルが視覚野（後頭葉）へと通過され、視覚刺激として登録される。
【００５０】
対象：非ヒト霊長類、マウス、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類および爬虫類等、哺乳動物および非哺乳動物等、あらゆる脊椎動物を含む、ヒトおよび非ヒト動物。記載されている方法の多くの実施形態では、対象は、ヒトである。
【００５１】
治療有効量：処置されている被験体における所望の効果の達成に十分な、ＭＢＶ等の特異的物質の含量。被験体に投与される場合、所望のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果を達成することが示された標的組織濃度（例えば、骨における）を達成する投薬量が一般に使用される。
【００５２】
移植：それを必要とする被験体へのＭＢＶ等の生体適合性基材の配置。
【００５３】
処置すること、処置、および治療法：症状の軽減、軽快、縮小、もしくは患者にとって状態をより耐えられるものとすること、変性もしくは減退の速度を遅くすること、変性の最終ポイントの衰弱性を低くすること、対象の身体的もしくは精神的福祉を改善すること、または視力を改善すること等、いずれかの客観的または主観的パラメータを含む、傷害、病理または状態の減弱または寛解におけるいずれかの成功または成功の兆候。処置は、客観的または主観的パラメータによって評価することができる；これは、身体検査、神経学的検査または精神医学的評定の結果を含む。
【００５４】
他に説明がなければ、本明細書に使用されているあらゆる技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。単数形の用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「それ（ｔｈｅ）」は、文脈がそれ以外を明らかに示すのでなければ、複数形の指示対象を含む。同様に、語「または」は、文脈がそれ以外を明らかに示すのでなければ、「および」を含むことが意図される。したがって、「ＡまたはＢを含む」は、Ａ、またはＢ、あるいはＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドに示されているあらゆる塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびあらゆる分子量または分子質量の値が、近似値であり、説明のために提示されていることをさらに理解されたい。本開示の実施または検査において、本明細書に記載されているものと同様のまたは均等な方法および材料を使用することができるが、適した方法および材料について下に記載する。本明細書に言及されているあらゆる刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体を参照により本明細書に組み込む。矛盾がある場合、用語の説明を含め本明細書が優先される。加えて、材料、方法および実施例は単なる例証であり、限定を意図するものではない。
【００５５】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に由来するナノベシクル
ＥＣＭに由来するナノベシクル（マトリックス結合ナノベシクル、ＭＢＶとも呼ばれる）は、参照により本明細書に組み込む、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１７／１５１８６２に開示されている。ナノベシクルが、細胞外マトリックスに包埋されていることが開示されている。このようなＭＢＶは単離することができ、生物学的に活性である。よって、このようなＭＢＶは、単独でまたは別のＥＣＭと共に、治療目的で使用することができる。このようなＭＢＶは、単独でまたは別のＥＣＭと共に、生物学的足場において使用することができる。
【００５６】
細胞外マトリックスは、哺乳動物組織内の細胞を囲みこれを支持する、また、他に断りがなければ、無細胞である、構造タンパク質、特殊化タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンおよび成長因子が挙げられるがこれらに限定されない、構造および機能的な生体分子および／または生体高分子の複合混合物である。一般に、開示されているＭＢＶは、いずれかの種類の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に包埋されており、この位置から単離され得る。よって、ＭＢＶは、ＥＣＭの表面に脱離可能に存在している訳ではなく、エキソソームではない。
【００５７】
細胞外マトリックスは、例えばであって限定するものではないが、これらそれぞれの全体を参照により組み込まれる、米国特許第４，９０２，５０８号；同第４，９５６，１７８号；同第５，２８１，４２２号；同第５，３５２，４６３号；同第５，３７２，８２１号；同第５，５５４，３８９号；同第５，５７３，７８４号；同第５，６４５，８６０号；同第５，７７１，９６９号；同第５，７５３，２６７号；同第５，７６２，９６６号；同第５，８６６，４１４号；同第６，０９９，５６７号；同第６，４８５，７２３号；同第６，５７６，２６５号；同第６，５７９，５３８号；同第６，６９６，２７０号；同第６，７８３，７７６号；同第６，７９３，９３９号；同第６，８４９，２７３号；同第６，８５２，３３９号；同第６，８６１，０７４号；同第６，８８７，４９５号；同第６，８９０，５６２号；同第６，８９０，５６３号；同第６，８９０，５６４号；および同第６，８９３，６６６号に開示されている。しかし、ＥＣＭは、いずれかの組織から、または培養細胞によってＥＣＭが産生されるいずれかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ供給源から産生することができ、ネイティブＥＣＭの１種または複数種のポリマー構成成分（構成物）を含む。ＥＣＭ調製物は、供給源組織または培養物から細胞が除去されたことを意味する、「脱細胞化された」または「無細胞である」とみなすことができる。
【００５８】
一部の実施形態では、ＥＣＭは、脊椎動物から、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ等が挙げられるがこれらに限定されない、哺乳動物の脊椎動物から単離される。ＥＣＭは、膀胱、腸、肝臓、心臓、食道、脾臓、胃および真皮を限定することなく含む、いずれかの臓器または組織に由来することができる。特異的で非限定的な例では、細胞外マトリックスは、食道組織、膀胱、小腸粘膜下組織、真皮、臍帯、心膜、心組織または骨格筋から単離される。ＥＣＭは、例えばであって限定するものではないが、粘膜下、上皮基底膜、固有層等を含む、臓器から得られるいずれかの部分または組織を含むことができる。非限定的な一実施形態では、ＥＣＭは、膀胱から単離される。
【００５９】
ＥＣＭは、基底膜を含んでも含まなくてもよい。別の非限定的な実施形態では、ＥＣＭは、基底膜の少なくとも部分を含む。ＥＣＭ材料は、毛細血管内皮細胞または線維細胞等、元の組織を構成していた細胞エレメントの一部を保持しても保持しなくてもよい。一部の実施形態では、ＥＣＭは、基底膜表面および非基底膜表面の両方を含有する。
【００６０】
非限定的な一実施形態では、ＥＣＭは、ブタ膀胱（膀胱マトリックスまたはＵＢＭとしても公知）から収集される。簡潔に説明すると、ＥＣＭは、ブタ等の哺乳動物から膀胱組織を除去し、脂肪組織を含む残存外部結合組織をトリミングすることにより調製される。水道水による反復洗浄によって残尿は全て除去される。組織は、先ず組織を脱上皮化溶液、例えばであって限定するものではないが、高張性食塩水（例えば、１．０Ｎ食塩水）に１０分間〜４時間に及ぶ期間浸漬することにより離層される。高張性食塩水溶液への曝露は、基礎をなす基底膜から上皮細胞を除去する。任意選択で、カルシウムキレート剤を食塩水溶液に添加することができる。初期離層手順後に残っている組織は、上皮基底膜および上皮基底膜の反内腔側（ａｂｌｕｍｉｎａｌ）の組織層を含む。相対的に脆弱な上皮基底膜は、内腔表面における何らかの機械的擦過によって必ず損傷され、除去される。この組織は次に、反内腔側組織の大部分を除去するが、上皮基底膜および固有層を維持するためのさらなる処置に付される。外側漿膜、外膜、粘膜筋層（ｔｕｎｉｃａ  ｍｕｓｃｕｌａｒｉｓ  ｍｕｃｏｓａ）、粘膜下層（ｔｕｎｉｃａ  ｓｕｂｍｕｃｏｓａ）および大部分の粘膜筋板は、機械的擦過によってまたは酵素処置の組合せ（例えば、トリプシンまたはコラゲナーゼを使用）と続く水和および擦過によって、残っている脱上皮化組織から除去される。これらの組織の機械的除去は、例えばであって限定するものではないが、Ａｄｓｏｎ−Ｂｒｏｗｎ鉗子およびＭｅｔｚｅｎｂａｕｍハサミによる腸間膜組織の除去と、湿らせたガーゼに包まれたメスの柄または他の強固な物体による長軸方向の拭き取り動作を使用した、筋層および粘膜下層の拭き取りによって達成される。切刃、レーザーおよび他の組織分離方法が関与する自動ロボット手順も企図される。これらの組織が除去された後に、その結果得られたＥＣＭは、上皮基底膜および下位の固有層から主になる。
【００６１】
別の実施形態では、ＥＣＭは、ブタ膀胱組織を擦過して、メスの柄および湿らせたガーゼによる長軸方向の拭き取り動作を使用して漿膜および筋層の両方を含む外層を除去することにより調製される。組織セグメントの外転後に、同拭き取り動作を使用して、基礎をなす組織から粘膜の内腔部分が離層される。粘膜下の穿孔を防止するように注意を払う。これらの組織が除去された後に、その結果得られたＥＣＭは、粘膜下層から主になる（参照により本明細書に組み込む米国特許第９，２７７，９９９号の図２を参照）。
【００６２】
ＥＣＭは、粉末として調製することもできる。かかる粉末は、その全体を参照により本明細書に組み込む、Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２６巻（２００５年）１４３１〜１４３５頁の方法に従って作製することができる。例えば、ＵＢＭシートを凍結乾燥し、次いで液体窒素中に浸すために、切り刻んで小型のシートにすることができる。次に、急速凍結した材料を細かく砕き、粒子をロータリーナイフミル内に置くのに十分なほど小さくして、そのミル内で、ＥＣＭを粉末化する。同様に、ＥＣＭ組織内のＮａＣｌを沈殿させることにより、材料を均一なサイズの粒子へと破砕し、これを急速凍結し、凍結乾燥し、粉末化することができる。
【００６３】
非限定的な一実施形態では、ＥＣＭは、小腸粘膜下組織またはＳＩＳに由来する。市販の調製物として、ＳＵＲＧＩＳＩＳ（商標）、ＳＵＲＧＩＳＩＳ−ＥＳ（商標）、ＳＴＲＡＴＡＳＩＳ（商標）およびＳＴＲＡＴＡＳＩＳ−ＥＳ（商標）（Ｃｏｏｋ  Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）ならびにＧＲＡＦＴＰＡＴＣＨ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．；Ｃａｎｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）が挙げられるがこれらに限定されない。別の非限定的な実施形態では、ＥＣＭは、真皮に由来する。市販の調製物として、ＰＥＬＶＩＣＯＬ（商標）（欧州ではＰＥＲＭＡＣＯＬ（商標）として売られる；Ｂａｒｄ、Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ、Ｇａ．）、ＲＥＰＬＩＦＯＲＭ（商標）（Ｍｉｃｒｏｖａｓｉｖｅ；Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）およびＡＬＬＯＤＥＲＭ（商標）（ＬｉｆｅＣｅｌｌ；Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が挙げられるがこれらに限定されない。別の実施形態では、ＥＣＭは、膀胱に由来する。市販の調製物として、ＵＢＭ（ＡＣｅｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｊｅｓｓｕｐ、Ｍｄ．）が挙げられるがこれに限定されない。
【００６４】
ＭＢＶは、下に開示されている方法を使用して、細胞外マトリックスから得る（これから放出させる）ことができる。一部の実施形態では、ＥＣＭは、ペプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼまたはプロテイナーゼＫ等、酵素で消化され、ＭＢＶが単離される。他の実施形態では、グリシンＨＣＬ、クエン酸、水酸化アンモニウム等の溶液のｐＨを変化させることにより、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等が挙げられるがこれらに限定されない、キレート剤の使用により、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、ヨウ化ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム等が挙げられるがこれらに限定されない、塩の使用によるイオン強度および／もしくはカオトロピック効果により、またはグアニジンＨＣｌもしくは尿素のような変性条件にＥＣＭを曝露することにより、ＭＢＶを、ＥＣＭから放出させ、かつ分離する。
【００６５】
特定の例では、ＭＢＶは、ペプシン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｎｏｒｎｉｄａｓｅ）、プロテイナーゼＫ、塩溶液またはコラゲナーゼ等、酵素によるＥＣＭの消化後に調製される。ＥＣＭを凍結融解することができる、または機械的分解に付すことができる。
【００６６】
一部の実施形態では、ＭＢＶにおいてＣＤ６３および／またはＣＤ８１の発現を検出することができない。よって、ＭＢＶは、ＣＤ６３および／またはＣＤ８１を発現しない。具体例では、ナノベシクルにおいてＣＤ６３およびＣＤ８１の両方を検出することができない。他の実施形態では、ＭＢＶは、ウエスタンブロットによって検出可能なもの等、かろうじて検出可能レベルのＣＤ６３およびＣＤ８１を有する。このようなＭＢＶは、ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏである。当業者であれば、例えば、ＣＤ６３およびＣＤ８１に特異的に結合する抗体を使用して、ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏであるＭＢＶを容易に同定することができる。低レベルのこれらのマーカーは、少量および多量のＣＤ６３およびＣＤ８１についての閾値を決定するための蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）等の手順および蛍光標識された抗体を使用して確立することができる。開示されているＭＢＶは、生体液におけるその存在のため、ＥＣＭの表面に一過的に付着することができるエキソソームなどのナノベシクルとは異なる。
【００６７】
ＭＢＶは、リジルオキシダーゼ（ｌｙｓｌｏｘｉｄａｓｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）（Ｌｏｘ）を含む。一般に、ＥＣＭに由来するナノベシクルは、エキソソームよりも高いＬｏｘ含量を有する。Ｌｏｘは、ＭＢＶの表面に発現される。Ｎａｎｏ−ＬＣ  ＭＳ／ＭＳプロテオミクス解析を使用して、Ｌｏｘタンパク質を検出することができる。Ｌｏｘの定量は、以前に記載された通りに行うことができる（Ｈｉｌｌ  ＲＣら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２０１５年；１４巻（４号）：９６１〜７３頁）。
【００６８】
ある特定の実施形態では、ＭＢＶは、１種または複数種のｍｉＲＮＡを含む。具体的で非限定的な例では、ＭＢＶは、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−１８１のうちの１つ、２つまたは３つ全てを含む。ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−１８１は、本技術分野で公知である。
【００６９】
ｍｉＲ−１４５核酸配列は、参照により本明細書に組み込むＭｉＲｂａｓｅ受託番号ＭＩ００００４６１に提示されている。ｍｉＲ−１４５核酸配列は、ＣＡＣＣＵＵＧＵＣＣＵＣＡＣＧＧＵＣＣＡＧＵＵＵＵＣＣＣＡＧＧＡＡＵＣＣＣＵＵＡＧＡＵＧＣＵＡＡＧＡＵＧＧＧＧＡＵＵＣＣＵＧＧＡＡＡＵＡＣＵＧＵＵＣＵＵＧＡＧＧＵＣＡＵＧＧＵＵ（配列番号１）である。ｍｉＲ−１８１核酸配列は、参照により本明細書に組み込むｍｉＲｂａｓｅ受託番号ＭＩ００００２６９に提示されている。ｍｉＲ−１８１核酸配列は：ＡＧＡＡＧＧＧＣＵＡＵＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＵＵＣＡＧＡＧＧＡＣＵＣＣＡＡＧＧＡＡＣＡＵＵＣＡＡＣＧＣＵＧＵＣＧＧＵＧＡＧＵＵＵＧＧＧＡＵＵＵＧＡＡＡＡＡＡＣＣＡＣＵＧＡＣＣＧＵＵＧＡＣＵＧＵＡＣＣＵＵＧＧＧＧＵＣＣＵＵＡ（配列番号２）である。ｍｉＲ−１４３核酸配列は、参照により本明細書に組み込む、ＮＣＢＩ受託番号ＮＲ＿０２９６８４．１、２０１８年３月３０日に提示されている。ｍｉＲ−１４３核酸配列をコードするＤＮＡは次の通りである：ＧＣＧＣＡＧＣＧＣＣ  ＣＴＧＴＣＴＣＣＣＡ  ＧＣＣＴＧＡＧＧＴＧ  ＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡ  ＴＣＴＣＴＧＧＴＣＡ  ＧＴＴＧＧＧＡＧＴＣ  ＴＧＡＧＡＴＧＡＡＧ  ＣＡＣＴＧＴＡＧＣＴ  ＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡ  ＧＡＡＧＴＴＧＴＴＣ  ＴＧＣＡＧＣ（配列番号３）。
【００７０】
投与後に、ＭＢＶは、対象におけるマクロファージ上のＦ４／８０（マクロファージマーカー）およびＣＤ−１１ｂの発現を維持する。ナノベシクル処置されたマクロファージは、優勢に、Ｍ２表現型を示すＦ４／８０＋Ｆｉｚｚ１＋である。
【００７１】
本明細書に開示されているＭＢＶは、医薬品送達のための組成物へと製剤化し、生体足場およびデバイスにおいて使用することができる。ＭＢＶは、参照により本明細書に組み込む、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１７／１５１８６２において開示されている。
【００７２】
ＥＣＭからのＭＢＶの単離
ＭＢＶを産生するために、ＥＣＭは、目的のいずれかの細胞によって産生することができる、または商業的供給源から利用することができる、上記参照。ＭＢＶは、処置されている対象と同じ種から、またはそれとは異なる種から産生することができる。一部の実施形態では、これらの方法は、ＥＣＭを酵素で消化して、消化されたＥＣＭを産生するステップを含む。具体的な実施形態では、ＥＣＭは、ペプシン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ、メタロプロテイナーゼおよび／またはプロテイナーゼＫのうち１種または複数種で消化される。具体的で非限定的な例では、ＥＣＭは、エラスターゼおよび／またはメタロプロテイナーゼのみで消化される。別の非限定的な例では、ＥＣＭは、コラゲナーゼおよび／またはトリプシンおよび／またはプロテイナーゼＫで消化されない。さらなる実施形態では、この方法は、酵素の使用を含まない。具体的で非限定的な例では、この方法は、塩化カリウム等、塩等、カオトロピック剤またはイオン強度を利用して、ＭＢＶを単離する。追加的な実施形態では、ＥＣＭを操作して、ＭＢＶ単離に先立ちＭＢＶ含量を増加させることができる。
【００７３】
一部の実施形態では、ＥＣＭは、酵素で消化される。ＥＣＭは、約１２〜約３６時間等、約１２〜約４８時間、酵素で消化することができる。ＥＣＭは、約１２、約２４、約３６または約４８時間、酵素で消化することができる。具体的で非限定的な一例では、ＥＣＭは、室温にて酵素で消化される。しかし、消化は、約４℃で、または約４℃〜２５℃の間のいずれかの温度で行うことができる。一般に、ＥＣＭは、コラーゲン原線維を除去するのに十分な、いずれかの長さの時間、およびいずれかの温度にて、酵素で消化される。消化過程は、組織供給源に応じて変動し得る。任意選択で、ＥＣＭは、酵素による消化の前または後のいずれかで、凍結および融解することにより処理される。ＥＣＭは、イオン性洗剤および／または非イオン性洗剤を含む洗剤で処理することができる。
【００７４】
次に、消化されたＥＣＭは、遠心分離等により処理されて、原線維不含上清を単離する。一部の実施形態では、消化されたＥＣＭは、例えば、第１のステップの場合、約３００〜約１０００ｇで遠心分離される。よって、消化されたＥＣＭは、約４００ｇ、約４５０ｇ、約５００ｇまたは約６００ｇ等、約４００ｇ〜約７５０ｇで遠心分離することができる。この遠心分離は、約１０、約１１、約１２、約１４、約１４または約１５分間等、約１０〜約１２分間等、約１０〜約１５分間、行うことができる。消化されたＥＣＭを含む上清が採取される。
【００７５】
ＭＢＶは、Ｌｏｘを含む。一部の実施形態では、斯かるＭＢＶを単離するための方法は、細胞外マトリックスをエラスターゼおよび／またはメタロプロテイナーゼで消化して、消化された細胞外マトリックスを産生するステップと、消化された細胞外マトリックスを遠心分離して、コラーゲン原線維レムナントを除去し、これにより、原線維を含まない上清を産生するステップと、原線維を含まない上清を遠心分離して、固体材料を単離するステップと、担体に固体材料を懸濁するステップとを含む。
【００７６】
一部の実施形態では、消化されたＥＣＭは、第２のステップの場合、約２０００ｇ〜約３０００ｇで遠心分離することもできる。よって、消化されたＥＣＭは、約２，０００ｇ、２，５００ｇ、２，７５０ｇまたは３，０００ｇ等、約２，５００ｇ〜約３，０００ｇで遠心分離することができる。この遠心分離は、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９または約３０分間等、約２０〜約２５分間等、約２０〜約３０分間、行うことができる。消化されたＥＣＭを含む上清が採取される。
【００７７】
追加的な実施形態では、消化されたＥＣＭは、第３のステップの場合、約１０，０００〜約１５，０００ｇで遠心分離することができる。よって、消化されたＥＣＭは、約１０，０００ｇ、１１，０００ｇまたは１２，０００ｇ等、約１０，０００ｇ〜約１２，５００ｇで遠心分離することができる。この遠心分離は、約２５〜約３０分間、例えば、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９または約４０分間等、約２５〜約４０分間、行うことができる。消化されたＥＣＭを含む上清が採取される。
【００７８】
これらの遠心分離ステップのうち１、２または全３種は、独立的に利用することができる。一部の実施形態では、全３種の遠心分離ステップが利用される。遠心分離ステップは、２、３、４または５回等、反復することができる。一実施形態では、全３種の遠心分離ステップは、３回反復される。
【００７９】
一部の実施形態では、消化されたＥＣＭは、約５００ｇで約１０分間、遠心分離される、約２，５００ｇで約２０分間、遠心分離される、および／または約１０，０００ｇで約３０分間、遠心分離される。全３種のステップ等、これらのステップ（複数可）は、３回等、２、３、４または５回反復される。よって、非限定的な一例では、消化されたＥＣＭは、約５００ｇで約１０分間、遠心分離される、約２，５００ｇで約２０分間、遠心分離される、および約１０，０００ｇで約３０分間、遠心分離される。これら３種のステップは、３回反復される。これにより、原線維不含上清が産出される。
【００８０】
次に、原線維不含上清を遠心分離して、ＭＢＶを単離する。一部の実施形態では、原線維不含上清は、約１００，０００ｇ〜約１５０，０００ｇで遠心分離される。よって、原線維不含上清は、約１００，０００ｇ、約１０５，０００ｇ、約１１０，０００ｇ、約１１５，０００ｇまたは約１２０，０００ｇ等、約１００，０００ｇ〜約１２５，０００ｇで遠心分離される。この遠心分離は、約７０〜約８０分間、例えば、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５または約９０分間等、約６０〜約９０分間、行うことができる。非限定的な一例では、線維不含上清は、約１００，０００ｇで約７０分間、遠心分離される。ＭＢＶである固体材料が採取される。次に、このようなＭＢＶは、バッファー等が挙げられるがこれらに限定されない、いずれかの目的のキャリアに再懸濁させることができる。
【００８１】
さらなる実施形態では、ＥＣＭは、酵素で消化されない。このような方法では、ＥＣＭは、リン酸緩衝食塩水等、等張性食塩水溶液に懸濁される。続いて、塩の最終濃度が約０．１Ｍを超えるように、懸濁液に塩が添加される。濃度は、例えば、最大約３Ｍ、例えば、約０．１Ｍ塩〜約３Ｍまたは約０．１Ｍ〜約２Ｍであってよい。塩は、例えば、約０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．７Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１．０Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、１．５Ｍ、１．６Ｍ、１．７Ｍ、１．８Ｍ、１．９Ｍまたは２Ｍであってよい。一部の非限定的な例では、塩は、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたは塩化マグネシウムである。他の実施形態では、塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、ヨウ化ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、ナトリウム塩、リチウム塩、セシウム塩またはカルシウム塩である。
【００８２】
一部の実施形態では、ＥＣＭは、約１５分間〜約１時間、約３０分間〜約１時間または約４５分間〜約１時間等、約１０分間〜約２時間、塩溶液に懸濁される。ＥＣＭは、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５または１２０分間、塩溶液に懸濁させることができる。ＥＣＭは、約４℃〜約２５℃または約４℃〜約３７℃等が挙げられるがこれらに限定されない、４℃〜約５０℃の温度で塩溶液に懸濁させることができる。具体的で非限定的な例では、ＥＣＭは、約４℃で塩溶液に懸濁される。他の具体的で非限定的な例では、ＥＣＭは、約２２℃または約２５℃（室温）で塩溶液に懸濁される。さらなる非限定的な例では、ＥＣＭは、約３７℃で塩溶液に懸濁される。
【００８３】
一部の実施形態では、方法は、約０．４Ｍ超の塩濃度で細胞外マトリックスをインキュベートするステップと；消化された細胞外マトリックスを遠心分離して、コラーゲン原線維レムナントを除去し、上清を単離するステップと；上清を遠心分離して、固体材料を単離するステップと；固体材料をキャリアに懸濁させ、これにより、細胞外マトリックスからＭＢＶを単離するステップとを含む。
【００８４】
塩溶液におけるインキュベーションの後に、ＥＣＭを遠心分離して、コラーゲン原線維を除去する。一部の実施形態では、消化されたＥＣＭは、約２０００ｇ〜約５０００ｇで遠心分離することもできる。よって、消化されたＥＣＭは、約２，５００ｇ、約３，０００ｇ、３，５００、約４，０００ｇまたは約４，５００ｇ等、約２，５００ｇ〜約４，５００ｇで遠心分離することができる。具体的で非限定的な一例では、遠心分離は、約３，５００ｇにおいてである。この遠心分離は、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０分間、約３１、約３２、約３３、約３４または約３５分間等、約２５〜約３５分間等、約２０〜約４０分間、行うことができる。次に上清が採取される。
【００８５】
追加的な実施形態では、次に、上清は、第３のステップの場合、約１００，０００〜約１５０，０００ｇで遠心分離することができる。よって、消化されたＥＣＭは、約１００，０００ｇ、１１０，０００ｇまたは１２０，０００ｇ等、約１００，０００ｇ〜約１２５，０００ｇで遠心分離することができる。この遠心分離は、約１時間〜約３時間、例えば、約３０分間、約４５分間、約６０分間、約９０分間または約１２０分間（２時間）等、約３０分間〜約２．５時間、行うことができる。固体材料が採取され、緩衝食塩水等の溶液に懸濁され、これにより、ＭＢＶが単離される。
【００８６】
さらに他の実施形態では、ＥＣＭは、リン酸緩衝食塩水等が挙げられるがこれに限定されない、等張性緩衝塩溶液に懸濁される。遠心分離または他の方法を使用して、大きい粒子を除去することができる（以下を参照）。次に、限外濾過を利用して、ＥＣＭからＭＢＶを単離し、粒子は、約１０ｎｍ〜約３００ｎｎの間等、約１０〜約１，０００ｎｍの間等、約１０ｎｍ〜約１０，０００ｎｍの間である。
【００８７】
具体的で非限定的な例では、等張性緩衝食塩水溶液は、約０．１６４ｍＭの総塩濃度および約７．２〜約７．４のｐＨを有する。一部の実施形態では、等張性緩衝食塩水溶液は、約０．００２７Ｍ  ＫＣｌ等、０．００２Ｍ  ＫＣｌ〜約０．１６４Ｍ  ＫＣＬを含む（リン酸緩衝食塩水におけるＫＣＬの濃度）。次に、この懸濁液が超遠心分離によって処理される。
【００８８】
等張性緩衝塩溶液におけるインキュベーション後に、ＥＣＭを遠心分離して、コラーゲン原線維を除去する。一部の実施形態では、消化されたＥＣＭは、約２０００ｇ〜約５０００ｇで遠心分離することもできる。よって、消化されたＥＣＭは、約２，５００ｇ、約３，０００ｇ、３，５００、約４，０００ｇまたは約４，５００ｇ等、約２，５００ｇ〜約４，５００ｇで遠心分離することができる。具体的で非限定的な一例では、遠心分離は、約３，５００ｇにおいてである。この遠心分離は、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０分間、約３１、約３２、約３３、約３４または約３５分間等、約２５〜約３５分間等、約２０〜約４０分間、行うことができる。
【００８９】
微量濾過および遠心分離を使用および組み合わせて、懸濁液から大きい分子量の材料を除去することができる。一実施形態では、２００ｎｍ超等、大きいサイズの分子材料は、微量濾過を使用して除去される。別の実施形態では、大きいサイズの材料は、遠心分離の使用により除去される。第３の実施形態では、微量濾過および超遠心分離の両方を使用して、大きい分子量の材料を除去する。約１０，０００ｎｍ超、約１，０００ｎｍ超、約５００ｎｍ超または約３００ｎｍ超の材料等、大きい分子量の材料が、懸濁されたＥＣＭから除去される。
【００９０】
次に、微量濾過の流出液または上清は、限外濾過に付される。よって、約１０，０００ｎｍ未満、約１，０００ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満または約３００ｎｍ未満の粒子を含む流出液が採取および利用される。次に、この流出液は、３，０００〜１００，０００の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜による限外濾過に付される。本実施例において１００，０００ＭＷＣＯが使用された。
【００９１】
網膜神経節細胞生存を増加させるための方法
網膜神経節細胞生存の増加を必要とする対象における網膜神経節細胞生存を増加させるための方法が、本明細書に開示されている。対象は、獣医学対象またはヒトでありえる。対象は、哺乳動物でありえる。対象は、トリまたはネコ、イヌもしくはウサギ等の飼育ペットでありえる。対象は、ブタ、反芻動物、ウマおよび家禽を含む、非ヒト、霊長類または家畜でありえる。本方法は、網膜神経節細胞生存を増加させるための処置を必要とする対象を選択するステップと、治療有効量のＭＢＶを対象に投与するステップとを含む。ＭＢＶは、網膜神経節細胞生存の増加を必要とする対象と同じまたは異なる種に由来することができる。
【００９２】
一部の実施形態では、対象は、緑内障を有する。対象は、開放隅角緑内障、閉塞隅角緑内障または正常眼圧緑内障を有し得る。緑内障は、原発性緑内障または続発性緑内障でありえる。これらの対象のいずれかを、処置のために選択することができる。眼内の流体圧力である眼内圧（ＩＯＰ）は、ミリメートル水銀柱（ｍｍＨｇ）またはキロパスカル（ｋＰａ）の単位で測定することができる。正常眼内圧は典型的に、１０ｍｍＨｇ〜２０ｍｍＨｇの間であると考慮される。眼内圧の平均値は、約２．７５〜３．５０ｍｍＨｇの変動がある１５．５ｍｍＨｇである。上昇した眼内圧（２１ｍｍＨｇまたは２．８ｋＰａを上回る）は、緑内障の最も重要で、唯一修正可能なリスク因子である。一部の実施形態では、上昇した眼内圧を有する対象が選択される。他の実施形態では、上昇した眼内圧未満であるが、緑内障性損傷の証拠を有する対象が選択される。例えば、対象は、視神経円板の陥凹、および増加したまたは増加しつつある陥凹乳頭径比（例えば、０．３、０．５または０．７を超える）を有し得る。他の実施形態では、対象は、緑内障性視神経損傷（陥凹乳頭径比における進行等）の存在下でわずかに上昇したＩＯＰを有し得る。
【００９３】
緑内障の検査は、眼圧測定の使用等、眼内圧の測定、前房隅角検査または隅角鏡検査、および損傷を同定するための視神経の検査、陥凹乳頭径比の変化、縁出現、および血管変化の検出を含むことができる。視野検査を行うことができる。網膜神経線維層は、光干渉断層撮影、走査レーザー旋光分析および／または走査レーザー検眼鏡検査（ハイデルベルク網膜断層像）等、イメージング技法により評価することができる。追加的な検査は、眼圧測定、眼底検査、視野測定、隅角鏡検査、角膜厚測定および神経線維解析を含む。これらの方法は、本明細書に開示されている方法に従った処置のための対象を選択するために行うことができる。
【００９４】
他の実施形態では、対象は、傷害に起因する網膜神経節細胞変性を有する。さらなる実施形態では、対象は、遺伝的障害に起因する網膜神経節細胞変性を有する。一部の非限定的な例では、対象は、圧力非依存性緑内障性視神経症、虚血性視神経症、炎症性視神経症、圧迫性視神経症、外傷性視神経症を有する。他の非限定的な例では、対象は、動脈炎性虚血性視神経症、巨細胞動脈炎に関連した動脈炎性虚血性視神経症、非動脈炎性虚血性視神経症、浸潤性視神経症、サルコイドーシスに関連した浸潤性視神経症、感染性視神経症、梅毒に関連した感染性視神経症、ライム病に関連した感染性視神経症、トキソプラズマ症に関連した感染性視神経症、帯状疱疹に関連した感染性視神経症、脱髄性疾患による視神経炎、照射後視神経症（ｐｏｓｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｏｐｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、腸性肢端皮膚炎、遺伝性視神経症、優性視神経症に関連した遺伝性視神経症、圧迫性視神経症、眼窩偽腫瘍に関連した圧迫性視神経症、甲状腺眼疾患に関連した圧迫性視神経症、自己免疫性視神経症、またはループスに関連した自己免疫性視神経症を有する。
【００９５】
対象は、眼性光毒性、特に、光黄斑症とも呼ばれる光網膜症を有し得る。一部の実施形態では、光網膜症は、太陽への曝露に起因する。他の実施形態では、光網膜症は、人工光への曝露に起因する。対象は、光黄斑症としても公知の光網膜症のリスクを有し得る。例えば、対象は、眼にレーザー手技を受けていてよい、または溶接工でありえる。
【００９６】
対象は、爆破デバイスへの曝露等、外傷に起因する網膜変性を有し得る。対象は、網膜レーザー手技を受けていてよい。さらなる実施形態では、対象は、ニューロン（すなわち、非光受容体）変性が発生する疾患を有する。そのようなものとして、緑内障、網膜動脈閉塞および網膜静脈閉塞が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９７】
一部の実施形態では、投与は、全身性であってよい。例示的な投与経路として、静脈内、腹腔内または皮下投与が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９８】
一部の実施形態では、投与は、硝子体内または網膜下投与の使用等、眼への局所であってよい。投与は、眼の前房に行うこともできる。他の実施形態では、投与は、眼の硝子体に行うことができる。一部の実施形態では、眼の硝子体の投与は、硝子体内注射、ポンプまたはインプラントを使用して達成される。
【００９９】
投薬処置は、上に指定された量を最終的に送達するための、単一用量スケジュールまたは複数用量スケジュールとすることができる。用量は、間欠的であってよい。さらに、対象には、適正な数の用量を投与することができる。
【０１００】
個々の用量は典型的に、対象における測定可能な効果の産生に要求される量以上であり、主題の組成物またはその副産物の吸収、分布、代謝および排泄（「ＡＤＭＥ」）に関する薬物動態および薬理学に基づき、よって、対象内における組成物の配置（ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）に基づき決定することができる。これは、投与経路、ならびに局所的および全身性（例えば、静脈内）適用に対して調整することができる投薬量についての検討事項を含む。用量および／または用量レジメンの有効量は、前臨床アッセイから、安全性および用量漸増および用量範囲の治験、個々の臨床医−患者関係性、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイから経験的に容易に決定することができる。一般に、これらのアッセイは、網膜神経節細胞、またはこの細胞の変性に影響を与える生物学的構成成分（サイトカイン、特異的炎症性細胞、マイクログリア等）の発現を評価する。
【０１０１】
治療有効量のＭＢＶは、薬学的に許容される担体、例えば、約３．０〜約８．０のｐＨ、好ましくは、約３．５〜約７．４、３．５〜６．０または３．５〜約５．０のｐＨの等張性緩衝溶液に懸濁することができる。有用な緩衝液は、クエン酸ナトリウム−クエン酸およびリン酸ナトリウム−リン酸および酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液を含む。保存料および抗細菌剤等、他の剤を組成物に添加することができる。このような組成物は、硝子体内に（ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅｏｕｓｌｙ）または網膜下に等、眼に局所的に投与することができる。
【０１０２】
局所的投与機序は、例として、眼内、眼窩内、結膜下、テノン嚢下、網膜下または経強膜的経路を含む。投与は、眼の前房に行うこともできる。ある実施形態では、有意により少ない量の構成成分（全身性アプローチと比較して）が、全身性に（例えば、静脈内）投与された場合と比較して、局所的に（例えば、硝子体内）投与された場合に効果を発揮することができる。
【０１０３】
網膜下注射は、黄斑中に直接的に為すことができる、例えば、黄斑下注射である。例示的な方法は、眼内注射（例えば、球後、網膜下、黄斑下、硝子体内および脈絡膜内（ｉｎｔｒａｃｈｏｒｉｄａｌ））、イオントフォレーシス、点眼および眼内植え込み（例えば、硝子体内、テノン嚢下および結膜下）を含む。
【０１０４】
一部の実施形態では、治療有効量のＭＢＶは、硝子体内注射によって投与される。硝子体内注射のための一般方法は、次の簡潔な概略によって説明することができる。この例は、方法のある特定の特色を説明することを単に意図し、決して、限定を意図するものではない。硝子体内注射のための手技は、本技術分野で公知である（例えば、Ｐｅｙｍａｎら（２００９年）Ｒｅｔｉｎａ、２９巻（７号）：８７５〜９１２頁ならびにＦａｇａｎおよびＡｌ−Ｑｕｒｅｓｈｉ、（２０１３年）Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．４１巻（５号）：５００〜７頁を参照）。他の眼内投与方法が本技術分野で公知であり、網膜下投与を含む。
【０１０５】
簡潔に説明すると、硝子体内注射のための研究対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）は、瞳孔散大による手技、眼の滅菌および麻酔薬の投与のために調製することができる。本技術分野で公知のいずれか適した散瞳剤を瞳孔散大のために使用することができる。適切な瞳孔散大は、処置前に確認することができる。滅菌は、滅菌アイトリートメント、例えば、ポビドン−ヨウ素（ＢＥＴＡＤＩＮＥ（登録商標））等のヨウ化物含有溶液を適用することにより達成することができる。同様の溶液を使用して、眼瞼、睫毛および他のいずれかの近傍組織（例えば、皮膚）を浄化することもできる。リドカインまたはプロパラカイン等、いずれか適した麻酔薬をいずれか適した濃度で使用することができる。麻酔薬は、麻酔薬の局所滴剤、ゲルまたはゼリーおよび結膜下（ｓｕｂｃｏｎｊｕｃｔｉｖａｌ）適用を限定することなく含む、本技術分野で公知のいずれかの方法によって投与することができる。
【０１０６】
注射に先立ち、滅菌された開瞼器を使用して、区域から睫毛を除くことができる。注射部位は、シリンジでマークすることができる。注射部位は、患者の水晶体に基づき選択することができる。例えば、注射部位は、偽水晶体患者または無水晶体患者においては縁（ｌｉｍｕｓ）から３〜３．５ｍｍ、有水晶体患者においては縁から３．５〜４ｍｍでありえる。患者は、注射部位と反対の方向で見ることができる。注射の間、針は、強膜と垂直に挿入し、眼の中心を指すことができる。針は、先端が網膜下間隙ではなく硝子体で終わるように挿入することができる。注射のための本技術分野で公知のいずれか適した容量を使用することができる。注射後に、眼は、抗生物質等の滅菌剤で処置することができる。眼をリンスして、過剰な滅菌剤を除去することもできる。
【０１０７】
治療有効量のＭＢＶの硝子体内注射（またはいずれか他の投与経路による投与）は、１回行うことができる、または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０回等、反復して行うことができる。投与は、隔週に、毎週に、１週間おきに、毎月に、または２、３、４、５もしくは６カ月毎に行うことができる。
【０１０８】
治療有効量のＭＢＶを含む医薬組成物は、正確な投薬量の個々の投与に適した単位剤形で製剤化することができる。投与される活性化合物（複数可）の量は、処置されている被験体、苦痛の重症度および投与様式に依存し、最良には処方する臨床医の判断に委ねられる。このような制約内で、投与されるべき製剤は、処置されている被験体における所望の効果の達成に有効な量の活性構成成分（複数可）の数量を含有する。一部の実施形態では、開示されている方法は、対象の眼に投与されると、網膜神経節細胞の生存を増加させる。
【０１０９】
対象には、同じ組成物または異なる組成物において、追加的な治療剤を投与することができる。そのような治療剤として、眼内圧を低減する薬剤が挙げられるがこれらに限定されない。薬剤は、ａ）プロスタグランジンアナログ、ｂ）ベータ−アドレナリン作動性遮断薬、ｃ）アルファ−アドレナリン作動性アゴニスト、またはｄ）コリン作動性アゴニストであってよい。例示的な薬剤は、ラタノプロスト、ビマトプロスト（ｂｉｍａｔｏｒｐｏｓｔ）、トラボプロスト、チモロール、ベタキソロール、ブリモニジン、ピロカルピン、ドルゾラミド、ブリンゾラミドおよびアセタゾラミドを含む。一部の具体的で非限定的な例では、薬剤は、ａ）ラタノプロスト、ｂ）チモロール、ｃ）ブリモニジンまたはｄ）ピロカルピンである。対象には、リパスジルまたはネタルスジル（ｎｅｔａｒｓｕｄｉｌ）等が挙げられるがこれらに限定されない、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を投与することができる。
【０１１０】
対象に投与することができる追加的な薬剤は、感染および炎症のリスクを低下させるための、抗細菌および抗真菌抗生物質、ならびに非ステロイド性抗炎症剤を含む。追加的な薬剤は、いずれかの経路によって投与することができる。追加的な薬剤は、ＭＢＶと別々に、またはそれと同じ組成物において製剤化することができる。
【０１１１】
役立つ薬剤は、アミノグリコシド（ｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）（例えば、アミカシン、アプラマイシン、アルベカシン、バンベルマイシン、ブチロシン、ジベカシン、ジヒドロストレプトマイシン、フォーチミシン（複数可）、ゲンタマイシン、イセパマイシン、カナマイシン、ミクロノマイシン、ネオマイシン、ネオマイシンウンデシレン酸塩、ネチルマイシン、パロモマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、トロスペクトマイシン（ｔｒｏｓｐｅｃｔｏｍｙｃｉｎ））、アンフェニコール（ａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）（例えば、アジダムフェニコール、クロラムフェニコール、フロルフェニコール、チアンフェニコール）、アンサマイシン（例えば、リファミド、リファンピン、リファマイシンｓｖ、リファペンチン、リファキシミン）、β−ラクタム（例えば、カルバセフェム（ｃａｒｂａｃｅｐｈｅｍ）（例えば、ロラカルベフ）、カルバペネム（例えば、ビアペネム、イミペネム、メロペネム、パニペネム）、セファロスポリン（例えば、セファクロル、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セファゾリン、セフカペンピボキシル、セフクリジン（ｃｅｆｃｌｉｄｉｎ）、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフェタメト、セフィキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォラニド、セフォタキシム、セフォチアム、セフォゾプラン、セフピミゾール、セフピラミド、セフピロム、セフポドキシムプロキセチル、セフプロジル、セフロキサジン、セフスロジン、セフタジジム、セフテラム、セフテゾール、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セフゾナム、セファセトリルナトリウム、セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロスポリン、セファロチン、セファピリンナトリウム、セフラジン、ピブセファレキシン（ｐｉｖｃｅｆａｌｅｘｉｎ））、セファマイシン（例えば、セフブペラゾン、セフメタゾール、セフィニノクス（ｃｅｆｉｎｉｎｏｘ）、セフォテタン、セフォキシチン）、モノバクタム（例えば、アズトレオナム、カルモナム、チゲモナム（ｔｉｇｅｍｏｎａｍ））、オキサセフェム（ｏｘａｃｅｐｈｅｍ）、フロモキセフ、モキサラクタム）、ペニシリン（例えば、アムジノシリン、アムジノシリンピボキシル、アモキシシリン、アンピシリン、アパルシリン（ａｐａｌｃｉｌｌｉｎ）、アスポキシシリン、アジドシリン、アズロシリン、バカンピシリン、ベンジルペニシリン酸（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ベンジルペニシリンナトリウム、カルベニシリン、カリンダシリン、クロメトシリン、クロキサシリン、シクラシリン、ジクロキサシリン、エピシリン、フェンベニシリン（ｆｅｎｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、フロキサシリン、ヘタシリン、レナンピシリン、メタンピシリン、メチシリンナトリウム、メズロシリン、ナフシリンナトリウム、オキサシリン、ペナメシリン、ペネタメートヨウ化水素酸塩（ｐｅｎｅｔｈａｍａｔｅ  ｈｙｄｒｉｏｄｉｄｅ）、ペニシリンＧベネタミン（ｂｅｎｅｔｈａｍｉｎｅ）、ペニシリンｇベンザチン、ペニシリンｇベンズヒドリルアミン、ペニシリンＧカルシウム、ペニシリンＧヒドラバミン（ｈｙｄｒａｂａｍｉｎｅ）、ペニシリンＧカリウム、ペニシリンＧプロカイン、ペニシリンＮ、ペニシリンＯ、ペニシリンＶ、ペニシリンＶベンザチン、ペニシリンＶヒドラバミン、ペニメピサイクリン、フェネチシリンカリウム、ピペラシリン、ピバンピシリン、プロピシリン、キナシリン（ｑｕｉｎａｃｉｌｌｉｎ）、スルベニシリン、スルタミシリン、タランピシリン、テモシリン、チカルシリン）、その他（例えば、リチペネム（ｒｉｔｉｐｅｎｅｍ））、リンコサミド（例えば、クリンダマイシン、リンコマイシン）、マクロライド（例えば、アジスロマイシン、カルボマイシン（ｃａｒｂｏｍｙｃｉｎ）、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、エリスロマイシンアシストレート（ａｃｉｓｔｒａｔｅ）、エリスロマイシンエストレート、エリスロマイシングルコヘプトン酸塩、エリスロマイシンラクトビオン酸塩、エリスロマイシンプロピオン酸塩、エリスロマイシンステアリン酸塩、ジョサマイシン、ロイコマイシン、ミデカマイシン、ミオカマイシン（ｍｉｏｋａｍｙｃｉｎ）、オレアンドマイシン、プリマイシン（ｐｒｉｍｙｃｉｎ）、ロキタマイシン、ロサラマイシン（ｒｏｓａｒａｍｉｃｉｎ）、ロキシスロマイシン、スピラマイシン、トロレアンドマイシン）、ポリペプチド（例えば、アンホマイシン、バシトラシン、カプレオマイシン、コリスチン、エンデュラシジン（ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ）、エンビオマイシン、フサファンギン、グラミシジンｓ、グラミシジン（複数可）、ミカマイシン、ポリミキシン、プリスチナマイシン、リストセチン、テイコプラニン、チオストレプトン、ツベルアクチノマイシン（ｔｕｂｅｒａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、チロシジン、チロスリシン、バンコマイシン、バイオマイシン、ヴァージニアマイシン、亜鉛バシトラシン）、テトラサイクリン（例えば、アピサイクリン（ａｐｉｃｙｃｌｉｎｅ）、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、グアメサイクリン（ｇｕａｍｅｃｙｃｌｉｎｅ）、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、ペニメピサイクリン、ピパサイクリン（ｐｉｐａｃｙｃｌｉｎｅ）、ロリテトラサイクリン、サンサイクリン（ｓａｎｃｙｃｌｉｎｅ）、テトラサイクリン）、およびその他（例えば、サイクロセリン、ムピロシン、ツベリン）を含む。役立つ薬剤は、また、２，４−ジアミノピリミジン（例えば、ブロジモプリム、テトロキソプリム（ｔｅｔｒｏｘｏｐｒｉｍ）、トリメトプリム）、ニトロフラン（例えば、フラルタドン（ｆｕｒａｌｔａｄｏｎｅ）、塩化フラゾリウム（ｆｕｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ニフラデン（ｎｉｆｕｒａｄｅｎｅ）、ニフラテル、ニフルフォリン（ｎｉｆｕｒｆｏｌｉｎｅ）、ニフルピリノール（ｎｉｆｕｒｐｉｒｉｎｏｌ）、ニフルプラジン（ｎｉｆｕｒｐｒａｚｉｎｅ）、ニフルトイノール、ニトロフラントイン）、キノロンおよびアナログ（例えば、シノキサシン、シプロフロキサシン、クリナフロキサシン、ジフロキサシン（ｄｉｆｌｏｘａｃｉｎ）、エノキサシン、フレロキサシン、フルメキン���グレパフロキサシン、ロメフロキサシン、ミロキサシン（ｍｉｌｏｘａｃｉｎ）、ナジフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オキソリニン酸、パズフロキサシン、ペフロキサシン、ピペミド酸、ピロミド酸、ロソクサシン、ルフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、トロバフロキサシン）、スルホンアミド（例えば、アセチルスルファメトキシピラジン、ベンジルスルファミド、クロラミン−ｂ、クロラミン−ｔ、ジクロラミンｔ、マフェニド、４’−（メチルスルファモイル）スルファニルアニリド、ノプリルスルファミド（ｎｏｐｒｙｌｓｕｌｆａｍｉｄｅ）、フタリルスルファセタミド、フタリルスルファチアゾール、サラゾスルファジミジン、サクシニルスルファチアゾール、スルファベンズアミド、スルファセタミド、スルファクロルピリダジン、スルファクリソイジン（ｓｕｌｆａｃｈｒｙｓｏｉｄｉｎｅ）、スルファシチン（ｓｕｌｆａｃｙｔｉｎｅ）、スルファジアジン、スルファジクラミド、スルファジメトキシン、スルファドキシン、スルファエチドール（ｓｕｌｆａｅｔｈｉｄｏｌｅ）、スルファグアニジン、スルファグアノール（ｓｕｌｆａｇｕａｎｏｌ）、スルファレン、スルファロクス酸（ｓｕｌｆａｌｏｘｉｃ  ａｃｉｄ）、スルファメラジン、スルファメータ、スルファメタジン、スルファメチゾール、スルファメトミジン、スルファメトキサゾール、スルファメトキシピリダジン、スルファメトロール（ｓｕｌｆａｍｅｔｒｏｌｅ）、スルファミドクリソイジン（ｓｕｌｆａｍｉｄｏｃｃｈｒｙｓｏｉｄｉｎｅ）、スルファモキソール、スルファニルアミド、スルファニリルウレア（ｓｕｌｆａｎｉｌｙｌｕｒｅａ）、ｎ−スルファニルイル−３，４−キシルアミド、スルファニトラン（ｓｕｌｆａｎｉｔｒａｎ）、スルファペリン、スルファフェナゾール、スルファプロキシリン（ｓｕｌｆａｐｒｏｘｙｌｉｎｅ）、スルファピラジン、スルファピリジン、スルファソミゾール（ｓｕｌｆａｓｏｍｉｚｏｌｅ）、スルファシマジン（ｓｕｌｆａｓｙｍａｚｉｎｅ）、スルファチアゾール、スルファチオウレア、スルファトラミド、スルフイソミジン、スルフイソキサゾール）、スルホン（例えば、アセダプソン、アセジアスルホン（ａｃｅｄｉａｓｕｌｆｏｎｅ）、アセトスルホンナトリウム、ダプソン、ジアチモスルホン（ｄｉａｔｈｙｍｏｓｕｌｆｏｎｅ）、グルコスルホンナトリウム、ソラスルホン（ｓｏｌａｓｕｌｆｏｎｅ）、サクシスルホン、スルファニル酸、ｐ−スルファニリルベンジルアミン、スルホキソンナトリウム、チアゾールスルホン）、ならびにその他（例えば、クロホクトール、ヘキセジン、メテナミン、メテナミンアンヒドロメチレン−クエン酸塩、メテナミン馬尿酸塩、メテナミンマンデル酸塩、メテナミンスルホサリチル酸塩、ニトロキソリン、タウロリジン、キシボルノール）等の合成抗細菌薬を含む。
【０１１２】
追加的な役立つ薬剤は、ポリエン（例えば、アンホテリシンＢ、カンジシジン、デンノスタチン（ｄｅｎｎｏｓｔａｔｉｎ）、フィリピン、フンジクロミン（ｆｕｎｇｉｃｈｒｏｍｉｎ）、ハチマイシン、ハマイシン（ｈａｍｙｃｉｎ）、ルセンソマイシン、メパルトリシン、ナタマイシン、ニスタチン、ペチロシン、ペリマイシン（ｐｅｒｉｍｙｃｉｎ））、その他（例えば、アザセリン、グリセオフルビン、オリゴマイシン、ネオマイシンウンデシレン酸塩、ピロールニトリン、シッカニン、ツベルシジン、ビリジン（ｖｉｒｉｄｉｎ））、アリルアミン（例えば、ブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィン）、イミダゾール（例えば、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロルダントイン（ｃｈｌｏｒｄａｎｔｏｉｎ）、クロルミダゾール（ｃｈｌｏｒｍｉｉｄａｚｏｌｅ）、クロコナゾール（ｃｌｏｃｏｎａｚｏｌｅ）、クロトリマゾール、エコナゾール、エニルコナゾール（ｅｎｉｌｃｏｎａｚｏｌｅ）、フェンチコナゾール、フルトリマゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ラノコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール硝酸塩、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール）、チオカルバメート（例えば、トルシクラート、トリンデート（ｔｏｌｉｎｄａｔｅ）、トルナフテート）、トリアゾール（例えば、フルコナゾール、イトラコナゾール、サペルコナゾール（ｓａｐｅｒｃｏｎａｚｏｌｅ）、テルコナゾール）、その他（例えば、アクリソルシン（ａｃｒｉｓｏｒｃｉｎ）、アモロルフィン、ビフェナミン（ｂｉｐｈｅｎａｍｉｎｅ）、ブロモサリチルクロルアニリド（ｂｒｏｍｏｓａｌｉｃｙｌｃｈｌｏｒａｎｉｌｉｄｅ）、ブクロサミド（ｂｕｃｌｏｓａｍｉｄｅ）、プロピオン酸カルシウム、クロルフェネシン、シクロピロクス、クロキシキン（ｃｌｏｘｙｑｕｉｎ）、コパラフィネート（ｃｏｐａｒａｆｆｉｎａｔｅ）、ジアムタゾール二塩酸塩、エキサラミド、フルシトシン、ハレタゾール（ｈａｌｅｔｈａｚｏｌｅ）、ヘキセチジン、ロフルカルバン（ｌｏｆｌｕｃａｒｂａｎ）、ニフラテル、ヨウ化カリウム、プロピオン酸、ピリチオン、サリチルアニリド、プロピオン酸ナトリウム、スルベンチン、テノニトロゾール、トリアセチン、ウジョチオン（ｕｊｏｔｈｉｏｎ）、ウンデシレン酸（ｕｎｄｅｃｙｌｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、プロピオン酸亜鉛）等、抗真菌抗生物質を含む。（１）抗生物質およびアナログ（例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルビシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、メノガリル、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｅ）、ペプロマイシン、ピラルビシン、プリカマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ジノスタチン、ゾルビシン）、（２）葉酸アナログ（例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、���ダトレキセート、メトトレキセート、ピリトレキシム、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート）等、代謝拮抗薬、（３）プリンアナログ（例えば、クラドリビン、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン）、（４）ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ドキシフルリジン、エミテフル（ｅｍｉｔｅｆｕｒ）、エノシタビン、フロクスウリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、テガフール（ｔａｇａｆｕｒ））を含む、抗新生物剤が役立つ場合もある。
【０１１３】
２１−アセトキシプレグネノロン、アルクロメタゾン、アルゲストン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、クロロプレドニゾン、クロベタゾール、クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、シクロスポリン、デフラザコート、デソニド、デスオキシメタゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、エノキソロン、フルアザコルト（ｆｌｕａｚａｃｏｒｔ）、フルクロロニド（ｆｌｕｃｌｏｒｏｎｉｄｅ）、フルメタゾン、フルニソリド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、フルオロメトロン、フルペロロン酢酸塩、フルプレドニデン酢酸塩、フルプレドニゾロン、フルランドレノリド、フルチカゾンプロピオン酸塩、ホルモコータル、ハルシノニド、ハロベタゾールプロピオン酸塩、ハロメタゾン、ハロプレドン酢酸塩、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、ロテプレドノールエタボン酸エステル、マジプレドン（ｍａｚｉｐｒｅｄｏｎｅ）、メドリゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、モメタゾンフロ酸エステル、パラメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、プレドニゾロン２５−ジエチルアミノ−酢酸塩、プレドニゾロンリン酸ナトリウム、プレドニゾン、プレドニバル（ｐｒｅｄｎｉｖａｌ）、プレドニリデン、リメキソロン、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンベネトニド（ｂｅｎｅｔｏｎｉｄｅ）およびトリアムシノロンヘキサセトニド等、ステロイド性抗炎症剤を使用することもできる。
【０１１４】
加えて、非ステロイド性抗炎症剤を使用することができる。これは、アミノアリールカルボン酸誘導体（例えば、エンフェナム酸（ｅｎｆｅｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、エトフェナメート、フルフェナム酸、イソニキシン（ｉｓｏｎｉｘｉｎ）、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ニフルミン酸、タルニフルメート、テロフェナメート（ｔｅｒｏｆｅｎａｍａｔｅ）、トルフェナム酸）、アリール酢酸誘導体（例えば、アセクロフェナク、アセメタシン、アルクロフェナク、アンフェナク、アムトルメチングアシル（ａｍｔｏｌｍｅｔｉｎ  ｇｕａｃｉｌ）、ブロムフェナク、ブフェキサマク、シンメタシン（ｃｉｎｍｅｔａｃｉｎ）、クロピラク、ジクロフェナクナトリウム、エトドラク、フェルビナク、フェンクロジン酸（ｆｅｎｃｌｏｚｉｃ  ａｃｉｄ）、フェンチアザク、グルカメタシン（ｇｌｕｃａｍｅｔａｃｉｎ）、イブフェナク、インドメタシン、イソフェゾラク（ｉｓｏｆｅｚｏｌａｃ）、イソキセパク（ｉｓｏｘｅｐａｃ）、ロナゾラク、メチアジン酸、モフェゾラク、オキサメタシン（ｏｘａｍｅｔａｃｉｎｅ）、ピラゾラク（ｐｉｒａｚｏｌａｃ）、プログルメタシン、スリンダク、チアラミド、トルメチン、トロペシン（ｔｒｏｐｅｓｉｎ）、ゾメピラク）、アリール酪酸誘導体（例えば、ブマジゾン、ブチブフェン（ｂｕｔｉｂｕｆｅｎ）、フェンブフェン、キセンブシン（ｘｅｎｂｕｃｉｎ））、アリールカルボン酸（例えば、クリダナク、ケトロラク、チノリジン）、アリールプロピオン酸誘導体（例えば、アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ベルモプロフェン（ｂｅｒｍｏｐｒｏｆｅｎ）、ブクロクス酸（ｂｕｃｌｏｘｉｃ  ａｃｉｄ）、カルプロフェン、フェノプロフェン、フルノキサプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、イブプロキサム、インドプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピケトプロレン（ｐｉｋｅｔｏｐｒｏｌｅｎ）、ピルプロフェン、プラノプロフェン、プロチジン酸、スプロフェン、チアプロフェン酸、キシモプロフェン（ｘｉｍｏｐｒｏｆｅｎ）、ザルトプロフェン）、ピラゾール（例えば、ジフェナミゾール（ｄｉｆｅｎａｍｉｚｏｌｅ）、エピリゾール）、ピラゾロン（例えば、アパゾン、ベンズピペリロン（ｂｅｎｚｐｉｐｅｒｙｌｏｎ）、フェプラゾン、モフェブタゾン、モラゾン（ｍｏｒａｚｏｎｅ）、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピペブゾン（ｐｉｐｅｂｕｚｏｎｅ）、プロピフェナゾン、ラミフェナゾン（ｒａｍｉｆｅｎａｚｏｎｅ）、スキシブゾン、チアゾリノブタゾン（ｔｈｉａｚｏｌｉｎｏｂｕｔａｚｏｎｅ））、サリチル酸誘導体（例えば、アセタミノサロール（ａｃｅｔａｍｉｎｏｓａｌｏｌ）、アスピリン、ベノリレート（ｂｅｎｏｒｙｌａｔｅ）、ブロモサリゲニン（ｂｒｏｍｏｓａｌｉｇｅｎｉｎ）、アセチルサリチル酸カルシウム、ジフルニサル、エテルサレート（ｅｔｅｒｓａｌａｔｅ）、フェンドサル（ｆｅｎｄｏｓａｌ）、ゲンチジン酸（ｇｅｎｔｉｓｉｃ  ａｃｉｄ）、サリチル酸グリコール、サリチル酸イミダゾール、アセチルサリチル酸リシン、メサラミン、サリチル酸モルホリン、サリチル酸１−ナフチル、オルサラジン、パルサルミド（ｐ��ｒｓａｌｍｉｄｅ）、アセチルサリチル酸フェニル、サリチル酸フェニル、サラセタミド（ｓａｌａｃｅｔａｍｉｄｅ）、サリチルアミドｏ−酢酸、サリチル硫酸、サルサレート、スルファサラジン）、チアジンカルボキサミド（例えば、アンピロキシカム、ドロキシカム、イソキシカム（ｉｓｏｘｉｃａｍ）、ロルノキシカム、ピロキシカム、テノキシカム）、ε−アセトアミドカプロン酸、ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉｎｅ）、ベンダザック、ベンジダミン、α−ビサボロール、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモルファゾン、フェプラジノール（ｆｅｐｒａｄｉｎｏｌ）、グアイアズレン（ｇｕａｉａｚｕｌｅｎｅ）、ナブメトン、ニメスリド、オキサセプロール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ペリソキサール、プロカゾン、スーパーオキシドジスムターゼ、テニダップおよびジロートンを含む。
【０１１５】
インプラントも、本明細書に開示されている方法に役立つ。インプラントは、強膜（例えば、２〜３ｍｍ切開）または他の適した部位に切開を入れた後の、鉗子またはトロカールによる留置を含む、種々の方法によって眼に挿入することができる。一部の事例では、インプラントは、別々の切開を入れることなくトロカールによって置くことができるが、その代わりに、トロカールで眼に直接的に孔を形成することによる。留置の方法は、放出動態に影響し得る。例えば、トロカールで硝子体または後眼房にデバイスを植え込むことは、硝子体内における、鉗子による留置よりも深いデバイスの留置をもたらし得、このことは、硝子体の縁により近いインプラントをもたらし得る。植え込まれたデバイスの位置は、デバイスを囲む治療剤の濃度勾配に影響し得、よって、放出速度に影響し得る（例えば、硝子体の縁のより近くに置かれたデバイスは、より遅い放出速度をもたらし得、米国特許第５，８６９，０７９号および米国特許第６，６９９，４９３号を参照）。一実施形態では、インプラントは、生体分解可能な（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）ポリマーマトリックスと共に製剤化されている。
【０１１６】
一般に、インプラントが使用される場合、ＭＢＶは、ポリマーマトリックスにおける免疫抑制剤の不均等分布のせいで放出速度における有害なゆらぎが発生しないよう、十分に均等に分布されるように、ポリマーマトリックスに均一に分布される。用いられるべきポリマー組成物の選択は、所望の放出動態、インプラントの位置、患者寛容性、およびインプラント手技の性質により変動する。ポリマーは、インプラントの少なくとも約１０重量パーセントとして含まれることができる。一例では、ポリマーは、インプラントの少なくとも約２０重量パーセントとして含まれる。別の実施形態では、インプラントは、２種以上のポリマーを含む。これらの因子は、米国特許第６，６９９，４９３号に詳細に記載されている。ポリマーの特徴は一般に、植え込み部位における生分解性、目的の薬剤との適合性、被包の容易さ、および水不溶性をとりわけ含む。一般に、ポリマーマトリックスは、薬物負荷が放出されるまでに完全に分解されるとは限らない。適したポリマーの化学組成は、本技術分野で公知である（例えば、米国特許第６，６９９，４９３号を参照）。
【０１１７】
投与は、単一投与、定期的ボーラスまたは持続注入として提供することができる。一部の実施形態では、投与は、内部リザーバー（例えば、眼内または眼外位置に配置されたインプラント（米国特許第５，４４３，５０５号および同第５，７６６，２４２号を参照））または外部リザーバー（例えば、静脈内バッグ）から為される。構成成分は、眼の内壁に固定化された持続放出薬物送達デバイスからの特異的な期間における継続的放出によって、または脈絡膜への標的化経強膜的制御放出により投与することができる（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ００／００２０７、ＰＣＴ／ＵＳ０２／１４２７９、Ａｍｂａｔｉら、Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．４１巻：１１８１〜１１８５頁、２０００年、およびＡｍｂａｔｉら、Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．４１巻：１１８６〜１１９１頁、２０００年を参照）。眼の内側へと局所的に構成成分を投与するのに適した種々のデバイスは、本技術分野で公知である。例えば、米国特許第６，２５１，０９０号、米国特許第６，２９９，８９５号、米国特許第６，４１６，７７７号、米国特許第６，４１３，５４０号およびＰＣＴ公開番号ＰＣＴ／ＵＳ００／２８１８７を参照されたい。
【０１１８】
一部の実施形態では、本方法は、治療利益が達成されたことを検出するステップを含む。治療有効性の尺度は、修飾されている特定の疾患に適用可能となり、治療有効性の測定に使用するための適正な検出方法を認識する。対象は、本技術分野で公知のいずれかの方法を使用して、応答に関して評価され得る。そのようなものとして、眼底検査（ｏｐｈｔｈａｌｏｍｏｓｃｃｏｐｙ）、視野測定、隅角鏡検査、角膜厚測定または神経線維解析が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、網膜神経節細胞数および／または生存率を評価することができる。当業者であれば、開示されている方法が有効であることを容易に決定することができる。例えば、これは、陥凹乳頭径比が安定化したかどうかによって決定することができる。走査レーザー旋光分析または光干渉断層撮影を使用して、例えば、網膜神経線維層解析を行うことができる。視野検査を使用して、緑内障の進行をモニターすることができる。開示されている方法のいずれかに対して、視力欠損の処置における治療有効性は、個体の視力の変更として評価することができる。
【０１１９】
治療有効性は、マイクログリアおよび／またはアストロサイトによって産生されたサイトカインを測定することにより評価することもできる。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１β、ＩＬ−６またはＴＮＦ−αである。サイトカインを測定するための方法は、本技術分野で公知であり、バイオアッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を限定することなく含む。例示的な方法を下に開示する。
【実施例】
【０１２０】
視動性およびマンガン増強ＭＲＩにより補完された（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔｅｄ）拡散テンソルＭＲＩは、視覚挙動の変化と相関する、長軸方向への軸索変性速度のわずかな変化を検出することができる。ＥＣＭ足場が、アストロサイトおよびマイクログリア活性化を減少させ、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）生存およびＲＧＣ発生遺伝子発現を増加させることにより、成体ラット中枢神経系（ＣＮＳ）におけるデフォルト治癒応答を変更することができることが本明細書に開示されている。
【０１２１】
ＥＣＭは、食道等の組織におけるデフォルト治癒応答をモジュレートすることが示されてきたが、効果の原因となる機構および生物活性因子は、完全に解明された訳ではない。ＭＢＶは、これが由来する親ＥＣＭと同様にｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞応答を誘発し、ＭＢＶが、細胞応答を調節するＥＣＭ内の重大な意味を持つ生物活性因子であることを示唆する。その上、ＭＢＶは、細胞の生存および成長を調節することが公知のｍｉＲＮＡが富化され、その表面にＬｏｘを有する。
【０１２２】
デフォルト治癒応答をモジュレートして、神経学的機能を保存または回復する治療法が本明細書に開示されている。組織特異的ＥＣＭ、特に、ＥＣＭから単離されたＭＢＶが、ＲＧＣ生存、軸索成長および組織リモデリングを差次的に調節することが開示されている。ＭＢＶは、ＲＧＣ生存および軸索再生を促進し、急性視神経虚血後に視神経における自然免疫応答を減少させることが示されている。
【０１２３】
（実施例１）
材料と方法
動物：スプラーグドーリーラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）によって提供された。動物管理およびプロトコールは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって発表されたＧｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓのガイドラインに従った。
【０１２４】
膀胱細胞外マトリックス脱細胞化およびハイドロゲル形成：成体出荷体重の豚由来のブタ膀胱は、地域の屠殺場によって提供された。膀胱を記載されている通りに脱細胞化した（Ｆａｕｓｔら、Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ａｐｐｌ、２０１７年．３１巻（９号）：１２７７〜１２９５頁）。Ｈ＆Ｅ染色およびゲル電気泳動による可視化を含む、ＤＮＡを定量するための確立された方法を使用して、脱細胞化を確認した（Ｆａｕｓｔら、Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ａｐｐｌ、２０１７年．３１巻（９号）：１２７７〜１２９５頁；Ｆｒｅｙｔｅｓら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００８年．２９巻（１１号）：１６３０〜７頁；Ｒｏｓａｒｉｏら、Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ、２００８年．３巻（２号）：１４５〜５６頁）。脱細胞化された膀胱細胞外マトリックス（ＵＢＭ−ＥＣＭ）を凍結し、凍結乾燥し、使用まで−２０℃で貯蔵した。１０ｍｇ／ｍｌのＵＢＭ−ＥＣＭハイドロゲルを以前に記載された通りに作製した（Ｆａｕｓｔら、Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ａｐｐｌ、２０１７年．３１巻（９号）：１２７７〜１２９５頁；Ｍｅｄｂｅｒｒｙら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０１３年．３４巻（４号）：１０３３〜４０頁）。簡潔に説明すると、凍結乾燥したＵＢＭ−ＥＣＭを粉砕して粉末にし、１０ｍｇ／ｍｌにおいて１ｍｇ／ｍｌペプシンで４８時間（ｈｒ）消化し、ｐＨを７．４に調整した。
【０１２５】
マトリックス結合ナノベシクル（ＭＢＶ）単離：凍結乾燥したＵＢＭ−ＥＣＭを、Ｔｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中Ｌｉｂｅｒａｓｅ  ＴＬ（５４０１０２０００１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で２４時間室温（ＲＴ）にてオービタルロッカー（ｏｒｂｉｔａｌ  ｒｏｃｋｅｒ）において消化した。消化されたＵＢＭ−ＥＣＭを（１０，０００ｇ、３０分間）で遠心分離した。ＭＢＶを４℃で２時間の超遠心分離（１００，０００ｇ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｏｐｔｉｍａ  Ｌ−９０Ｋ超遠心分離機）によってペレットにし、セファロースＣＬ−２Ｂ樹脂を使用してサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。精製されたＭＢＶを使用まで−８０℃で貯蔵した。全ＭＢＶ単離物を、記載されている通りに透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）によって形態学的に解析した（Ｈｕｌｅｉｈｅｌら、Ａｄｖ、２０１６年．２巻（６号）：ｅ１６００５０２頁）。ＴＥＭグリッドにおけるＭＢＶを、高分解能ＡＭＴデジタルカメラを備えたＪＥＯＬ  １２１０透過型電子顕微鏡により８０ｋＶで観察した。
【０１２６】
網膜神経節細胞（ＲＧＣ）単離：記載されている通りに出生後３日目のスプラーグドーリーラットの仔からＲＧＣを単離した（Ｂａｒｒｅｓら、Ｎｅｕｒｏｎ、１９８８年．１巻（９号）：７９１〜８０３頁）。精製されたＲＧＣを、ポリ−Ｄ−リシンで１時間ＲＴにて（７０ｋＤａ、１０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、ラミニンで一晩（３７℃、２μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．）コーティングされた９６ウェル培養プレート（０８７７２３Ｂ、Ｆａｌｃｏｎ）において、１ウェルあたり３，０００個のＲＧＣで神経基礎−ＳＡＴＯ（ｎｂ−ＳＡＴＯ）培地に播種した。ＭＢＶを滅菌ＰＢＳに再懸濁し、三連のウェルにおいて、５〜８０μｇ／ｍｌの範囲の濃度で、ＲＧＣ培養物に添加した。ＵＢＭ−ＥＣＭハイドロゲル（２５０μｇ／ｍｌ）およびｎｂ−ＳＡＴＯ培地を対照として使用した。ＲＧＣを３７℃、１０％ＣＯ２で３日間培養した。
【０１２７】
ＲＧＣ生存率：製造業者の指示（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒ３７６０１）に従ってカルセインおよびヨウ化プロピジウム生／死キットを使用して、ＲＧＣ生存率を解析した。簡潔に説明すると、カルセインおよびヨウ化プロピジウムを混合し、ＲＧＣと共に１５分間ＲＴでインキュベートした。１ウェルあたり５個のランダムな重複しない視野を、落射蛍光顕微鏡（ｅｐｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）フルオレセインおよびローダミンフィルターセット（Ｚｅｉｓｓ、Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ）を使用して２０×で撮像した。ＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して、生きているおよび死んだＲＧＣを定量した。データは、総計少なくとも４５個の視野に及ぶ、３回の独立した実験的反復からの３つ組み（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）を表す。
【０１２８】
ＲＧＣ神経突起成長定量：記載されている通りに神経突起成長を解析した（Ｓｔｅｋｅｔｅｅら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、２０１４年．５５巻（７号）：４３６９〜７７頁；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｒｗｅら、ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ、２０１７年．２６巻：４７〜５９頁）。簡潔に説明すると、ＲＧＣを、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、３０５２５−８９−４）で１５分間（分）固定し、次いでＰＢＳ（３×）で洗浄した。ＲＧＣを、ＰＢＳ中０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１５分間透過処理し、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１５分間ブロッキングし、ＰＢＳ中抗βＩＩＩチューブリン（１：３００、ＴＵＪ−１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と共に一晩４℃でインキュベートした。インキュベーション後に、ＲＧＣをＰＢＳ（３×）で洗浄し、ＦＩＴＣ−ウサギ抗ニワトリＩｇＹ  Ｈ＋Ｌ（１：１５０、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において３時間ＲＴでインキュベートし、ＰＢＳ（３×）で洗浄し、ＤＡＰＩ（１：３０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１５分間ＲＴで染色した。ＲＧＣをＰＢＳ（３×）で洗浄し、２０×（Ｚｅｉｓｓ、Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ）にて撮像した。ウェル毎に、総神経突起成長を、ＩｍａｇｅＪプラグインＮｅｕｒｏｎＪを使用して、別のＲＧＣに接触していないランダムに遭遇した最初の１０個のＲＧＣに対して測定した。データは、１群あたり総計少なくとも９０個のニューロンに及ぶ、３回の実験的反復における三連のウェルからの総ＲＧＣ神経突起成長を表す。
【０１２９】
マイクログリア培養：サプライヤーの推奨に従って９６ウェルプレートにおいて１ウェルあたり５０，０００個の細胞で、初代ラットマイクログリア（Ｌｏｎｚａ、Ｒ−Ｇ−５３５）を蒔いた。全実験に関して、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２でマイクログリアを最初にインキュベートして、接着を容易にした。２４時間後に、上清を除去し、新鮮マイクログリア培地で置きかえた。
【０１３０】
刺激なしのマイクログリア培養のため、次の試薬を三連のウェルに添加した：マイクログリア培地のみ、リポ多糖（ＬＰＳ、１００ｎｇ／ｍｌ）およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ、２０ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４、２０ｎｇ／ｍｌ）、ＵＢＭ−ＥＣＭハイドロゲル（２５０μｇ／ｍｌ）またはＭＢＶ（５μｇ／ｍｌ）。２４時間後に、ＥＬＩＳＡ解析のため、またはアストロサイトを処置するために培地を収集した。
【０１３１】
刺激ありのマイクログリア培養のため、マイクログリアをＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２０ｎｇ／ｍｌ）で６時間処置し、上清を除去し、マイクログリアをマイクログリア培地でリンスし、三連のウェルにおいて次のものでさらに２４時間処置した：マイクログリア培地、ＵＢＭ−ＥＣＭ（２５０μｇ／ｍｌ）またはＭＢＶ（５μｇ／ｍｌ）。さらに２４時間のインキュベーション後に、ＥＬＩＳＡアッセイのため、またはアストロサイトを処置するために上清を収集した。
【０１３２】
アストロサイト培養：サプライヤーの指示に従って９６ウェルプレートにおいて１ウェルあたり５，０００個の細胞で、初代ラットアストロサイト（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒ１８００）を蒔いた。２４時間、３７℃、５％ＣＯ２で、アストロサイトを接着させた。アストロサイトに対してマイクログリア極性化が有する効果を決定するために、マイクログリア馴化培地（「マイクログリア培養」セクションに記載されている群および収集）を三連のアストロサイトウェルに添加し、２４時間インキュベートした。マイクログリア馴化培地との最初の２４時間のインキュベーション後に、アストロサイトをアストロサイト培地でリンスし、新鮮アストロサイト培地と共にさらに２４時間インキュベートし、ＥＬＩＳＡアッセイのために上清を収集した。ＲＧＣ生存率に対するアストロサイト上清の効果を決定するために、トランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）プレートを使用した。サプライヤーの指示に従ってインサート１つあたり５，０００個の細胞で、アストロサイトをトランスウェルインサートに蒔き、底チャンバーをアストロサイト培地で満たした。アストロサイトを２４時間、３７℃、５％ＣＯ２で接着させた。最初の２４時間のインキュベーション後に、インサートにおけるアストロサイトにマイクログリア馴化培地を三連で添加し、２４時間インキュベートした。２４時間後に、アストロサイトをリンスし、培地を新鮮ｎｂ−ＳＡＴＯ培地でさらに２４時間置き換えた。インキュベーション後に、底ウェル中のｎｂ−ＳＡＴＯ培地をＲＧＣ培養のために収集した。
【０１３３】
ＥＬＩＳＡ解析：マイクログリアおよびアストロサイト上清を、製造業者の指示に従ってＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹ５０１）、ＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹ５０６）およびＴＮＦ−α（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ．＃４３８２０４）発現に関して解析した。３回の独立した実験的反復の二連の（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）試料を解析した。
【０１３４】
アストロサイト馴化培地に対する網膜神経節細胞応答：上に記載されている通りにＲＧＣを単離し、蒔き、２４時間、３７℃、１０％ＣＯ２で接着させた。ＲＧＣ生存に対するアストロサイト馴化培地の効果を決定するために、アストロサイト由来の上清を記載されている通りに収集し、三連のＲＧＣウェルに添加し、７２時間、３７℃、１０％ＣＯ２でインキュベートした。上のＲＧＣ生存率セクションに記載されている通りに、３回の独立した実験からのＲＧＣ生存率を解析した。
【０１３５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＭＢＶ用量応答：３用量のＭＢＶによりｉｎ  ｖｉｖｏでＲＧＣ生存を検査した：５、１０および２０μｇ／ｍｌ（１群あたりｎ＝５匹の動物）。イソフルラン吸入（３％導入、１．５％維持）により動物を麻酔した。１滴のプロパラカイン塩酸塩点眼液（Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）および１滴のトロピカミド点眼液（Ａｋｏｒｎ、Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ、ＩＬ）を、２０匹の動物の両眼に外用で適用して、それぞれ鎮痛および瞳孔散大を誘導した。１８ｇ針を使用して、縁のすぐ後ろの強膜に小孔を作製した。手術用顕微鏡下で、Ｈａｍｉｌｔｏｎマイクロシリンジを、強膜開口部を通して硝子体に挿入した。視神経乳頭の可能な限り近くに針先端を置き、網膜や水晶体に触れないように注意を払った。適正な濃度となるようにＭＢＶを滅菌ＰＢＳに希釈した。全注射容量は１μｌであり、ビヒクル対照（１群あたりｎ＝５）として滅菌ＰＢＳを使用した。１μｌのＭＢＶまたはＰＢＳを硝子体に注射し、針を適所に３０秒間保持して、ＭＢＶまたはＰＢＳを硝子体に拡散させた。針を除去し、針の除去の直後に、１滴のゲンタマイシン抗生物質軟膏（Ａｋｏｒｎ、Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ、ＩＬ）を外用で適用した。記載されている同じ技法を使用して、動物に、２および７日目に２回の追加的な注射を与えた。ＭＢＶ注射の１４日後に動物を屠殺し、ＲＧＣ定量のために網膜を除去した。
【０１３６】
ＭＢＶ処置による眼内圧上昇：以前に記載された通りに急性眼内圧（ＩＯＰ）上昇を誘導した。４５匹の動物は、食塩水前房灌流により右眼のみにＩＯＰ上昇を受け、左眼は、未傷害対照として働いた。７５：１０ｍｇ／ｋｇのケタミン／キシラジンカクテルの腹腔内注射で動物を麻酔し、足指ピンチ（ｔｏｅ  ｐｉｎｃｈ）反射により麻酔を確認した。それぞれ１滴のプロパラカインおよびトロピカミドを右眼に適用して、それぞれ鎮痛および瞳孔散大を誘導した。３０ｇ針を滅菌食塩水リザーバー（０．９％塩化ナトリウム；Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ）に接続し、針先端を前房に挿入した。手術用顕微鏡を使用して、虹彩と平行に針を挿入し、適所に確保した。食塩水リザーバーを上昇させて、ＩＯＰを１５ｍｍＨｇから１３０ｍｍＨｇに増加させ、適所に６０分間確保した。圧力トランスデューサー（ＢＩＯＰＡＣ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｏｌｅｔａ、ＣＡ、ＵＳＡ）および携帯式眼圧計を使用してＩＯＰを測定した。６０分後に、食塩水リザーバーを下げ、前房から針を除去した。針の除去直後に、１滴のゲンタマイシンを眼に適用した。１５匹の動物（組織学のためにｎ＝１０、ＥＲＧのためにｎ＝５）には、先のセクションに記載されている注射技法を使用して、ＩＯＰ上昇の直後にならびにＩＯＰ上昇後２および７日目に１μｌの５μｇ／ｍｌ  ＭＢＶ処置を受けさせた。１５匹の動物（組織学のためにｎ＝１０、ＥＲＧのためにｎ＝５）をビヒクル対照に使用し、ＩＯＰ上昇の直後にならびにＩＯＰ上昇後２および７日目に硝子体内注射した１μｌのＰＢＳを受けさせた。１５匹の動物（組織学のためにｎ＝１０、ＥＲＧのためにｎ＝５）は、いずれの注射もなしでＩＯＰ上昇を受けた。
【０１３７】
コレラ毒素サブユニットＢ注射：１群あたり５匹の動物は、１４日目における屠殺の３日前である１１日目に、コレラ毒素サブユニットＢ（ＣｔｘＢ）注射を受けた。コレラ毒素サブユニットＢ（組換え）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４コンジュゲート（ＬｉｆｅＴｅｃｈ、Ｃａｔ＃Ｃ３４７７）を滅菌ＰＢＳに再懸濁して、１％溶液を得た。イソフルラン吸入（３％導入、１．５％維持）により動物を麻酔した。先のセクションに記載されている通りに硝子体内注射技法を使用し、２μｌの１％ＣｔｘＢ溶液を硝子体に注射した。除去前にＨａｍｉｌｔｏｎシリンジ針を適所に３０秒間保持し、眼から針を除去した後に、１滴のゲンタマイシンを外用で適用した。
【０１３８】
免疫組織化学試験：１群あたり１０匹の動物を免疫組織化学試験に使用した。動物を屠殺し、網膜および視神経を除去し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。網膜および視神経をＰＢＳで各回５分間３回リンスした。網膜を４等分し、ＩＨＣブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウム）において２時間、ＲＴで、６０ＲＰＭの振盪機において透過処理／ブロッキングした。ＣｔｘＢ注射を受けた動物由来の網膜を、ＩＨＣブロッキング緩衝液中１：２５０抗ＣｔｘＢ（マウス抗ＣｔｘＢ、Ａｂｃａｍ、ＡＢ６２４２９）で標識し、残っている網膜を、ＩＨＣブロッキング緩衝液中１：２５０抗（複数のスプライシングを伴う）ＲＮＡ結合タンパク質（ウサギ抗ＲＢＰＭＳ、Ｐｈｏｓｐｈｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、１８３０−ＲＢＰＭＳ）および１：２５０抗Ｂｒｎ３Ａ（マウス抗Ｂｒｎ３Ａ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＳＣ−８４２９）で４８時間、４℃で、６０ＲＰＭの振盪機において共標識した。網膜をＰＢＳ中０．３％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回リンスし、ＩＨＣブロッキング緩衝液中１：５００  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ロバ抗ウサギ（Ａｂｃａｍ、ＡＢ１５００７３）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５ヤギ抗マウス（Ａｂｃａｍ、ＡＢ１５０１１４）において２４時間、４℃で、６０ＲＰＭの振盪機においてインキュベートした。網膜をＰＢＳ中０．３％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回リンスし、ガラス顕微鏡スライド上にマウントし、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈ−１２００）でカバーグラスをかけ、落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ）により撮像した。以前の定量方法と同様に（Ｓｈａｗら、Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ、２０１７年．１５８巻：３３〜４２頁）、染色に先立ち網膜を４等分し、４分の１切片のそれぞれで網膜周辺および網膜中心（視神経乳頭の周囲）において３枚の画像を撮影し、これにより、網膜１個につき総計して網膜周辺における１２枚の画像および網膜中心における１２枚の画像を得た。以前の研究は、ＩＯＰ上昇が、網膜の周辺においてより高いＲＧＣ細胞死を引き起こすことを示しており（Ｃｈｅｎら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、２０１１年．５２巻（１号）：３６〜４４頁）、したがって、２箇所の位置におけるＲＧＣ生存を解析した。
【０１３９】
視神経をパラフィンに包埋し、１５μｍ切片となるようにクリオスタットにおいて切片作製した。ＩＨＣブロッキング緩衝液中、２時間、ＲＴで切片をブロッキング／透過処理し、ＰＢＳ中０．３％Ｔｗｅｅｎ−２０で２回リンスした。１：５００抗ＧＡＰ４３（ウサギ抗ＧＡＰ−４３、Ａｂｃａｍ、ＡＢ１６０５３）、１：５００抗ＧＦＡＰ（ウサギ抗ＧＦＡＰ、１：５００、Ａｂｃａｍ、ＡＢ７２６０）または１：２５０抗ＣｔｘＢ（マウス抗ＣｔｘＢ、Ａｂｃａｍ、ＡＢ６２４２９）で切片を２４時間、４℃で標識した。切片をＰＢＳ中０．３％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回リンスし、ＩＨＣブロッキング緩衝液中１：５００  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ロバ抗ウサギ（Ａｂｃａｍ、ＡＢ１５００７３）またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５ヤギ抗マウス（Ａｂｃａｍ、ＡＢ１５０１１４）において２４時間、４℃でインキュベートした。切片をＰＢＳ中０．３％Ｔｗｅｅｎ−２０で２回リンスし、ＩＨＣブロッキング緩衝液中４μｇ／ｍｌヘキスト染色（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈ６０２４）と共に１５分間、ＲＴでインキュベートした。切片をＰＢＳ中０．３％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回リンスし、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄでカバーグラスにマウントし、落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ）により撮像した。以前に記載された通りにＩｍａｇｅＪでシグナル強度を測定した（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｒｗｅら、ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ、２０１７年．２６巻：４７〜５９頁；ＭｃＣｌｏｙら、Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ、２０１４年．１３巻（９号）：１４００〜１２頁）。１５個の目的の領域（ＲＯＩ）が視神経に沿って均等に分布して描かれ、４個のＲＯＩが画像のバックグラウンドに描かれた。画像毎に面積、平均蛍光および積分された密度を測定し、次の等式に基づきシグナル強度を計算した：ＣＴＣＦ＝積分された密度−（面積×平均バックグラウンド蛍光）。
【０１４０】
網膜電図検査（ＥＲＧ）：確立されたプロトコールに従ってＥＲＧ機能解析を行った（Ａｌａｒｃｏｎ−Ｍａｒｔｉｎｅｚら、Ｍｏｌ  Ｖｉｓ、２００９年．１５巻：２３７３〜８３頁）。手短に言えば、７５：１０ｍｇ／ｋｇのケタミン／キシラジンカクテルの腹腔内注射により動物を麻酔し、足指ピンチ反射により麻酔を確認した。それぞれ１滴のプロパラカインおよびトロピカミドを各眼に適用して、それぞれ鎮痛および瞳孔散大を誘導し、記録の間はＧｏｎｉｏｖｉｓｃ  ２．５％（Ｓｉｇｍａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、品目＃９０５０）により眼の潤滑を維持した。２本の金ループ電極を角膜上に置き、参照電極を頬の内側に挿入し、接地リード電極（ｇｒｏｕｎｄ  ｌｅａｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）を四頭筋に挿入した。色−光ドームを使用して、試験（ｔｒｉａｌ）の間に両眼から同時に両側性ＥＲＧ読み取りを行った。一般に、１ステップの固定された強度の光を１ミリ秒間照射し、増加する照射の複数ステップにわたる掃引としてＥＲＧ応答を記録した。試験１回あたり５０個のＥＲＧ応答を記録し、光強度１ステップあたり総計３回の試験を行った。記録された異なる波の明順応陰性応答（ＰｈＮＲ）および暗黙時間を測定することにより、データを解析した。
【０１４１】
統計解析：盲検個体により全解析および測定が行われた。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）および事後チューキー検定を使用して、ｐ＜０．０５により群間の有意差を決定した。グラフは、平均を表し、エラーバーは、他に断りがなければ平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。
【０１４２】
（実施例２）
ＭＢＶは、ＲＧＣに対して非細胞傷害性であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＧＣ神経突起成長を増加させる
初代ニューロン培養におけるＭＢＶの効果を調査した以前の研究と一致して（Ｆａｕｓｔら、Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ａｐｐｌ、２０１７年．３１巻（９号）：１２７７〜１２９５頁）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は、ＵＢＭ−ＥＣＭに由来するＭＢＶが、非細胞傷害性であり、培地およびＵＢＭ−ＥＣＭハイドロゲルと比較してＲＧＣ神経突起成長を増加させることを示唆した（図１）。３日間の処置後に、５種のＭＢＶ濃度、ＵＢＭ−ＥＣＭまたは培地のいずれかで処置した群の間にＲＧＣ生存の差はなく、ＵＢＭ−ＥＣＭおよびＭＢＶが、検査した濃度において非細胞傷害性であることを示す（図１Ａ）。ＲＧＣ生存率研究とは対照的に、ＭＢＶは、３日後にＲＧＣ神経突起の長さを増加させた（図１Ｂ）。５、１０または２０μｇ／ｍｌのＭＢＶは、培地（２７５．２±１１．６μｍ）およびＵＢＭ−ＥＣＭ（３４８．３±１２．１μｍ）対照と比較して、それぞれ６２１．５±３５．２μｍ、６５２．４±２３．２μｍおよび５９６．０±３２．３μｍにＲＧＣ神経突起成長を有意に増加させた。５０および８０μｇ／ｍｌのＭＢＶは、それぞれ１９１．６±９．９μｍおよび７６．４±４．３μｍでありＲＧＣ神経突起成長を増加させなかった。
【０１４３】
（実施例３）
ＭＢＶは、マイクログリアおよびアストロサイトからの炎症促進性サイトカイン分泌を抑制する
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は、ＭＢＶが、マイクログリアおよびアストロサイトからの炎症促進性サイトカイン分泌を抑制することを示した（図２）。初代マイクログリアをＬＰＳ／ＩＦＮγで刺激して、炎症促進性Ｍ１様表現型を誘導し、その後、培地（対照）、ＵＢＭ−ＥＣＭ、またはＵＢＭ−ＥＣＭから単離されたＭＢＶで処置して、ＵＢＭ−ＥＣＭおよびＭＢＶが、炎症促進性サイトカイン分泌を抑制することができるか決定した（図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｇ）。ＬＰＳ／ＩＦＮγで２４時間処置されたマイクログリア（刺激なし）は、セクレトームにおけるＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの放出を増加させた。ＬＰＳ／ＩＦＮγで６時間刺激され、次いで培地で処置されたマイクログリアのセクレトームの解析は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの匹敵する放出増加をもたらし、上清を除去し、培地で置き換えた後に、マイクログリアが、炎症促進性サイトカインを放出し続けたことを示す。最後に、ＬＰＳ／ＩＦＮγで６時間刺激され、ＵＢＭ−ＥＣＭまたはＭＢＶで処置されたマイクログリアは、培地のみで２４時間処置されたマイクログリアと同様のＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＮＦ−α発現レベルを示し、ＬＰＳ／ＩＦＮγ刺激後の２４時間のＵＢＭ−ＥＣＭおよびＭＢＶ処置が、炎症促進性サイトカインの放出を抑制することを示す。アストロサイトセクレトームの解析は、マイクログリアの結果と匹敵する結果および傾向を示した（図２Ｄ、図２Ｅ、図２Ｆ、図２Ｈ）。ＬＰＳ／ＩＦＮγで処置された刺激なしのマイクログリア由来の上清で処置されたアストロサイトは、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの発現増加を示し、炎症促進性マイクログリア由来のセクレトームが、アストロサイトからの炎症促進性マーカーの放出を上方調節することを示す。培地で処置されたＬＰＳ／ＩＦＮγ刺激ありのマイクログリア由来のセクレトームは、アストロサイトからＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの同様の上方調節された発現を誘導した一方、ＬＰＳ／ＩＦＮγで刺激され、ＵＢＭ−ＥＣＭまたはＭＢＶで処置されたマイクログリア由来のセクレトームは、アストロサイトによる炎症促進性マーカーの発現を増加させなかった。これらの結果は、マイクログリア刺激後のＵＢＭ−ＥＣＭおよびＭＢＶ処置が、マイクログリアの炎症促進性サイトカイン分泌を下方調節し、アストロサイトによる炎症促進性サイトカインの分泌を防止することができることを示す。
【０１４４】
（実施例４）
ＭＢＶは、炎症促進性サイトカイン分泌を抑制し、これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＲＧＣ生存を増加させる
ＲＧＣをアストロサイト上清で処置したところ、結果は、ＬＰＳ／ＩＦＮγによるマイクログリアの処置、またはＬＰＳ／ＩＦＮγによる刺激、および培地によるその後の処置が、１００％ＲＧＣ細胞死をもたらした一方、マイクログリア刺激後のＵＢＭ−ＥＣＭまたはＭＢＶ処置は、ＲＧＣ生存率を増加させ、ＲＧＣ細胞死を防止したことを示した（図３）。これらの結果は、マイクログリアＭ１様極性化が、アストロサイトＡ１様極性化を介してＲＧＣ生存率に影響を与えることを示す以前の研究に対応し（Ｌｉｄｄｅｌｏｗら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１７年．５４１巻（７６３８号）：４８１〜４８７頁）、炎症促進性表現型よりも抗炎症性マイクログリア表現型を促進することが、傷害後にＲＧＣ生存を増加させることを示唆する。
【０１４５】
（実施例５）
ＭＢＶは、低濃度ではｉｎ  ｖｉｖｏで非細胞傷害性である
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究を行って、いずれの濃度のＭＢＶが、硝子体内注射後に非細胞傷害性であるか決定した。視神経乳頭（中心）周囲および網膜周辺（周辺）周囲のＲＧＣ生存率を定量し、未注射対照と比較したパーセンテージ生存可能ＲＧＣとして結果を示す（図４）。周辺周囲のＲＧＣ生存率は、未注射対照と比較して、ＭＢＶおよびＰＢＳ注射後に変化しなかった。中心領域におけるＲＧＣ生存率は、それぞれ１０μｇ／ｍｌおよび２０μｇ／ｍｌの注射後に、未注射対照眼の８２．８±１．９％および８０．７±４．４％に減少した一方、５μｇ／ｍｌのＭＢＶ（１０４．４±４．１％）およびＰＢＳ（９７．４±３．０％）の注射は、ＲＧＣ生存率に効果がなかった。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験でのＩＯＰ上昇について５μｇ／ｍｌのＭＢＶ濃度を選択した。
【０１４６】
（実施例６）
ＭＢＶは、ＩＯＰ上昇後にＲＧＣ生存を増加させる
ＩＯＰ上昇に続いて、ＩＯＰ上昇の直後に、ならびに２および７日目に５μｇ／ｍｌのＭＢＶを硝子体内注射したところ、ＲＧＣ生存率の有意な増加をもたらした（図５）。ＩＯＰ上昇１４日後にＲＧＣ生存率を解析したところ、ＩＯＰ上昇のみおよびＩＯＰ上昇とＰＢＳ注射は、網膜中心においてＲＧＣ生存率の有意な減少をもたらし、未傷害対照と比較して、４７．４±２．３％および４１．８±２．３％ＲＧＣ生存であった。ＭＢＶ処置は、２種の無処置群と比較して、網膜中心におけるＲＧＣ生存の有意な増加を引き起こし、７９．５±３．８％生存であった。同様に、網膜周辺において、ＩＯＰ上昇のみおよびＩＯＰ上昇とＰＢＳは、未傷害対照と比較してＲＧＣ生存率の有意な減少を引き起こし、それぞれ３６．３±３．６％および２６．４±２．８％のＲＧＣ生存であった。ＭＢＶ処置は、未傷害対照と比較して、７５．９±４．２％へＲＧＣ生存を有意に増加させた。
【０１４７】
（実施例７）
ＭＢＶは、ＩＯＰ上昇後にＲＧＣ軸索生存を増加させる
網膜におけるＣｔｘＢ標識は、健康対照群の網膜中心および網膜周辺におけるインタクトな軸索標識、ならびにＩＯＰ上昇群およびＩＯＰ上昇とＰＢＳ注射群における減少した軸索標識を示した（図６Ａ）。ＭＢＶで処置された動物は、健康対照群と同様に、インタクトな軸索標識を示し、ＭＢＶ処置が、網膜におけるＲＧＣ細胞体に加えて、ＲＧＣ軸索を保存することを示す。視神経において（図６Ｂ）、ＩＯＰ上昇群およびＩＯＰ上昇とＰＢＳ注射群は、それぞれ未傷害対照の３２．５±６．３％および２６．８±４．４％における有意に減少したＣｔｘＢ標識を示した（図６Ｃ）。ＭＢＶ処置視神経におけるＣｔｘＢ標識は、未傷害対照と比較して有意に減少し、対照に対して７８．６±６．１％であり、かつ、ＩＯＰ上昇群およびＩＯＰ上昇とＰＢＳ注射群の両方と比較して有意に増加した。
【０１４８】
（実施例８）
ＭＢＶは、ＩＯＰ上昇後にＧＦＡＰ発現を減少させる
ｉｎ  ｖｉｖｏでのアストロサイト活性化におけるＭＢＶの効果を解析するために、視神経の長さに沿ったＧＦＡＰ発現を解析した（図７Ａ）。未傷害対照神経と比較して、ＧＦＡＰ発現は、ＩＯＰ上昇群およびＩＯＰ上昇とＰＢＳ注射群において有意に増加し、これは、視神経傷害後の典型的なアストロサイト遊走および活性化と一致する。定量的には、ＩＯＰ上昇およびＩＯＰ上昇とＰＢＳは、未傷害対照と比較して、それぞれ３９３±２２．７％および４１３．７±２６．３％にＧＦＡＰ発現を有意に増加させた（図７Ｂ）。定性的および定量的には、ＩＯＰ上昇後にＭＢＶで処置された動物の視神経は、ＧＦＡＰ発現の減少を示し、未傷害対照視神経およびＭＢＶ処置視神経の間にＧＦＡＰ発現の有意差はなかった（１０７．７±６．４％増加）。
【０１４９】
（実施例９）
ＭＢＶは、ＩＯＰ上昇後にＧＡＰ４３発現を増加させる
ＭＢＶが、ｉｎ  ｖｉｖｏでＲＧＣ軸索成長を増加させることができるか決定するために、軸索成長マーカーＧＡＰ−４３の発現を解析した（図８Ａ）。未傷害対照神経と比較して、ＧＡＰ４３発現は、ＩＯＰ上昇群およびＩＯＰ上昇とＰＢＳ注射群において有意に減少し、それぞれ未傷害対照に対して７７．５±７．２％および７７．８±８．４％であった（図８Ｂ）。ＭＢＶで処置された動物の視神経は、ＧＡＰ４３発現の増加を示し、未傷害対照およびＭＢＶ処置視神経の間にＧＡＰ４３発現の差はなかった（１０８．６±６．１％）。
【０１５０】
（実施例１０）
ＭＢＶは、ＩＯＰ上昇後に網膜の電気的機能を改善する
網膜電図検査（ＥＲＧ）を使用して、明順応陰性応答（ＰｈＮＲ）振幅および潜伏時間を記録した（図９）。未傷害対照眼と比較して、ＩＯＰ上昇およびＩＯＰ上昇とＰＢＳ注射は、ＰｈＮＲ振幅を有意に３２．８±４．４％および４２．０±１６．８％減少させたが、未傷害対照およびＭＢＶ処置眼の間にＰｈＮＲ振幅の差はなかった（図９Ｃ）。潜伏時間解析は、未傷害対照群と比較して、ＩＯＰ上昇が、潜伏時間を有意に１６．６±４．０％増加させたことを示したが、ＩＯＰ上昇とＰＢＳ注射およびＭＢＶ処置は、潜伏時間に有意な作用がなかった（図９Ｄ）。
【０１５１】
（実施例１１）
ＭＢＶは、エキソソームとは別個のものである
エキソソームおよびマイクロベシクルの両方を含む細胞外ベシクル（ＥＶ）は、もっぱら細胞外液へと分泌され、そこで、細胞の間で自由に再配置され得ること、また、移動用の液体媒体として生体液を使用して遠隔部位に分泌されることが示されてきた（図１０）。実際に、ＥＶは、血液、尿、母乳、脳脊髄液および胸水を含む多くの種類の生体液から単離された。加えて、ＥＶは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の馴化培地に分泌される。体液または細胞培養上清から単離されたＥＶは、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９およびＨｓｐ７０を含む共通エキソソーム表面マーカーの発現によって容易に同定される。
【０１５２】
エキソソームとは対照的に、マトリックス結合ナノベシクル（ＭＢＶ）は、近年、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の複合的および機能的構成成分として報告された。ＭＢＶは、ＥＣＭ内でコラーゲン線維に密接に会合したベシクルの特異的亜集団である。ＥＣＭ−足場材料の酵素消化後のみにマトリックスからＭＢＶを分離することができることが示され、ＥＣＭ内に包埋されたＭＢＶが、創傷治癒および機械的ストレスのような正常な生理的過程においてまたは植え込まれたＥＣＭ生物学的足場に対する宿主応答によって惹起される分解において発生するもの等、マトリックスリモデリング事象における細胞取り込みのみに利用できることを示唆する（図１０）。マトリックス内におけるその別個の区画化の結果として、ＭＢＶは、マトリックスへの統合を可能にする、細胞表面マーカーの特有のセットを含有する。さらに、ＭＢＶは、エキソソームに典型的に関連付けられる古典的表面マーカーを発現しない（図１１）。身体内におけるそれらの位置の差（すなわち、流体ｖｓ  ＥＣＭ結合）およびそれらの差次的カーゴシグネチャーを考慮すると、ＭＢＶおよびエキソソームは、必然的に差次的機能を有する。これを実証するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養された幹細胞からＭＢＶおよびエキソソームを単離した（図１２）。次に、ＭＢＶおよびエキソソーム試料を使用して、マウス骨髄由来マクロファージを刺激した。結果は、エキソソームで刺激されたものと比較して、ＭＢＶに曝露されたマクロファージの特徴的表現型プロファイルを示す（図１３）。重要なことに、汎マクロファージマーカーＦ４／８０およびＣＤ−１１ｂの発現は、エキソソーム処置マクロファージにおいて有意に低下したが、ＭＢＶ処置マクロファージにおいては低下しなかった。結果は、ＥＶの亜集団の差次的生物学的活性を実証し、ＭＢＶがエキソソームとは別個であることを考証し、ＭＢＶが再生医療において潜在力を有することを実証する。ＭＢＶは、また、その表面にＬｏｘを含有した。
【０１５３】
開示された発明の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮して、図示された実施形態は本発明の好ましい実施例であるに過ぎず、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではないことが認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、これらの請求項の範囲および精神の範囲内にある全てを本発明者らの発明として請求する。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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