(57)【要約】  本明細書で提供される実施態様は、対象動物の免疫系の調節および、例えば癌の治療に用いることができるキメラタンパク質に関する組成物および方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含むタンパク質：
PD-1の細胞外ドメイン；
4-1BBトランスメンブレンドメイン、CD28トランスメンブレンドメイン、CD27トランスメンブレンドメイン、およびICOSトランスメンブレンドメインから成る群から選択されるトランスメンブレンドメイン；並びに
4-1BB細胞内シグナリングドメイン、CD28細胞内シグナリングドメイン、CD27細胞内シグナリングドメイン、およびICOS細胞内シグナリングドメイン、並びにそれらの任意の組合せから成る群から選択される細胞内シグナリングドメイン。
【請求項２】
トランスメンブレンドメインが4-1BBトランスメンブレンドメインである、請求項1に記載のタンパク質。
【請求項３】
細胞内シグナリングドメインが、4-1BB細胞内シグナリングドメイン、CD28細胞内シグナリングドメイン、CD27細胞内シグナリングドメイン、およびICOS細胞内シグナリングドメインから成る群から選択される、請求項2に記載のタンパク質。
【請求項４】
細胞内シグナリングドメインが、4-1BBの細胞内ドメイン、並びに、CD28細胞内シグナリングドメイン、CD27細胞内シグナリングドメインおよびICOS細胞内シグナリングドメインから成る群から選択される細胞内ドメイン、である、請求項2に記載のタンパク質。
【請求項５】
トランスメンブレンドメインがCD28トランスメンブレンドメインである、請求項1に記載のタンパク質。
【請求項６】
細胞内シグナリングドメインが、4-1BBトランスメンブレンドメイン、CD28トランスメンブレンドメイン、CD27トランスメンブレンドメイン、およびICOSトランスメンブレンドメインから成る群から選択される、請求項5に記載のタンパク質。
【請求項７】
細胞内シグナリングドメインが、4-1BBの細胞内ドメイン並びにCD28細胞内シグナリングドメイン、CD27細胞内シグナリングドメイン、およびICOS細胞内シグナリングドメインから成る群から選択される細胞内ドメインである、請求項5に記載のタンパク質。
【請求項８】
トランスメンブレンドメインがCD27トランスメンブレンドメインである、請求項1に記載のタンパク質。
【請求項９】
細胞内シグナリングドメインが、4-1BB細胞内シグナリングドメイン、CD28細胞内シグナリングドメイン、CD27細胞内シグナリングドメイン、およびICOS細胞内シグナリングドメインから成る群から選択される、請求項8に記載のタンパク質。
【請求項１０】
細胞内シグナリングドメインが、4-1BBの細胞内ドメイン、並びに、CD28細胞内シグナリングドメイン、CD27細胞内シグナリングドメインおよびICOS細胞内シグナリングドメインから成る群から選択される細胞内ドメイン、である、請求項8に記載のタンパク質。
【請求項１１】
トランスメンブレンドメインがICOSトランスメンブレンドメインである、請求項1に記載のタンパク質。
【請求項１２】
細胞内シグナリングドメインが、4-1BB細胞内シグナリングドメイン、CD28細胞内シグナリングドメイン、CD27細胞内シグナリングドメイン、およびICOS細胞内シグナリングドメインから成る群から選択される、請求項11に記載のタンパク質。
【請求項１３】
細胞内シグナリングドメインが、4-1BBの細胞内ドメイン、並びに、CD28細胞内シグナリングドメイン、CD27細胞内シグナリングドメインおよびICOS細胞内シグナリングドメインから成る群から選択される細胞内ドメインである、請求項11に記載のタンパク質。
【請求項１４】
配列番号:21、23、25、27、29または31の配列を含む、請求項1に記載のタンパク質。
【請求項１５】
リーダー配列を含む、請求項1−14のいずれか1項に記載のタンパク質。
【請求項１６】
CD8リーダー配列を含む、請求項15に記載のタンパク質。
【請求項１７】
CD8リーダー配列が配列番号:1を含む、請求項16に記載のタンパク質。
【請求項１８】
請求項1から17のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１９】
配列番号:22、24、26、28、30または32の配列を含む、核酸分子。
【請求項２０】
さらに配列番号:2によってコードされるリーダー配列を含む、請求項19に記載の核酸分子。
【請求項２１】
請求項19または20に記載の核酸分子を含む、組換え細胞。
【請求項２２】
請求項18に記載の核酸分子を含む、組換え細胞。
【請求項２３】
請求項1−17のいずれか1項に記載のタンパク質を含む、組換え細胞。
【請求項２４】
リンパ球またはT細胞である、請求項21または22に記載の細胞。
【請求項２５】
腫瘍浸潤リンパ球（“TIL”）である、請求項21または22に記載の細胞。
【請求項２６】
髄浸潤リンパ球（“MIL”）である、請求項21または22に記載の細胞。
【請求項２７】
MILが低酸素MILである、請求項26に記載の細胞。
【請求項２８】
請求項1−17のいずれか1項に記載のタンパク質をコードする核酸分子を細胞にトランスフェクトまたは感染させる工程を含む、組換え細胞を作製する方法。
【請求項２９】
細胞がMILである、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
タンパク質をコードする核酸分子をMILにトランスフェクトまたは感染させる前に、低酸素条件下で当該細胞をインキュベートする工程を更に含む、請求項28または29に記載の方法。
【請求項３１】
低酸素条件が約0.5％から約5％の酸素ガスを含む、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
低酸素条件が約1％から約2％の酸素ガスを含む、請求項30に記載の方法。
【請求項３３】
低酸素インキュベーション後に正常酸素条件下で細胞をインキュベートする工程を更に含む、請求項30−32のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３４】
細胞を抗CD3/抗CD28ビーズに接触させる工程を更に含む、請求項28−33のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３５】
免疫応答を対象動物で増強する方法であって、請求項21−27のいずれか1項に記載の組換え細胞を当該対象動物に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項３６】
組換え細胞を作製する工程を含み、当該組換え細胞を作製する工程が当該タンパク質をコードする核酸を細胞にトランスフェクトする工程を更に含む、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
対象動物から細胞を単離する工程を更に含む、請求項35に記載の方法。
【請求項３８】
対象動物が新生物を有する、請求項35に記載の方法。
【請求項３９】
新生物が白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫である、請求項35に記載の方法。
【請求項４０】
対象動物が人間である、請求項35に記載の方法。
【請求項４１】
対象動物で新生物を治療する方法であって、請求項21−27のいずれか1項に記載の組換え細胞を当該対象動物に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項４２】
組換え細胞を作製する工程を更に含み、当該組換え細胞を作製する工程がキメラトランスメンブレンタンパク質をコードする核酸を細胞にトランスフェクトする工程を含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
対象動物から細胞を単離する工程を更に含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４４】
対象動物が新生物を有する、請求項41に記載の方法。
【請求項４５】
新生物が多発性骨髄腫、白血病またはリンパ腫である、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
対象動物が人間である、請求項41に記載の方法。
【請求項４７】
対象動物に細胞を投与する前に以下の工程を更に含む、請求項41に記載の方法:
当該細胞を抗CD3/抗CD28ビーズに接触させる工程；
当該細胞を低酸素条件下でインキュベートする工程；および
当該細胞を正常酸素条件下でインキュベートする工程。
【請求項４８】
細胞を低酸素条件下で約0.5から約4日間インキュベートする、請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
細胞を正常酸素条件下で約0.5から約4日間インキュベートする、請求項47に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互引用）本出願は、米国仮特許出願62/438106（2016年12月22日出願）（参照によってその全体が本明細書に含まれる）に関し優先権を主張する。
（技術分野）
本発明は、対象動物の免疫系の調節、例えば癌の治療に用いることができるキメラタンパク質に関する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌を治療するために免疫系を操作する多くの組成物および方法が存在する。しかしながら、癌の治療には改善された組成物および方法がなお希求される。ここに開示する内容は、これらの希求および当業者には疑問の余地のない他の希求も充足させる。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書に開示する実施態様は、PD-1の細胞外ドメイン；4-1BBトランスメンブレンドメイン、CD28トランスメンブレンドメイン、CD27トランスメンブレンドメイン、およびICOSトランスメンブレンドメインから成る群から選択されるトランスメンブレンドメイン；並びに4-1BB細胞内シグナリングドメイン、CD28細胞内シグナリングドメイン、CD27細胞内シグナリングドメイン、およびICOS細胞内シグナリングドメインから成る群から選択される細胞内シグナリングドメイン、並びにそれらの任意の組合せを含むタンパク質を提供する。
本明細書に開示する実施態様はまた、本明細書で提供するタンパク質をコードする核酸分子を提供する。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載するタンパク質または核酸分子を含む組換え細胞が提供される。
いくつかの実施態様では、当該組換え細胞を作製する方法が提供される。
免疫応答増強または新生物治療のための実施態様もまた提供される。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
本明細書で用いられるように、用語、例えば“a”、“an”、および“the”は、文脈が特段に指示しないかぎり単数および複数の指示対象を含む。
本書類で用いられるように、“comprise（含む）”、“have（有する）”、“has（有する）”および“include（含む）”という用語並びにそれらの活用形は、本明細書で用いられるように、“〜を含むが、ただしそれらに限定されない”ということを意味する。多様な組成物および方法は多様な成分または工程を“含む”（“〜を含むが、ただしそれらに限定されない”ということを意味すると解される）という観点で記述されているが、一方、当該組成物、方法および装置はまた、多様な成分および工程から“本質的に成る”かまたはそれらから“成る”ことも可能であり、そのような用語法では本質的に指定されたメンバーのみのグループに限定されると解するべきである。
本明細書で用いられるように、“treat（治療する）”、“treated”または“treating”という用語はともに治療的処置を意味し、ここで対象は、望ましくない生理学的状態、異常または疾患を減速させるか（軽減させるか）、または有利な若しくは望ましい臨床結果を得ることができる。本明細書に記載する実施態様の目的のためには、有利なまたは望ましい臨床結果には以下が含まれる（ただしそれらに限定されない）：症状の緩和；症状、異常または疾患の規模の減弱；症状、異常または疾患の安定化（すなわち悪化しない）状態；症状、異常若しくは疾患の開始の遅延またはその進行の減速；検出可能であれ検出不能であれ、症状、異常若しくは病的状態の改善または寛解（部分的であれ完全であれ）；少なくとも1つの測定可能な身体的パラメーターの改善（必ずしも患者が認識できるとは限らない）；または症状、異常若しくは疾患の改良または改善。したがって、“癌の治療”または“癌を治療する”とは、癌または本明細書に記載する任意の他の状態に関連する一次性事象または二次性症状のいずれかを緩和または改善する活性を意味する。いくつかの実施態様では、治療されている癌は本明細書に列挙する癌の1つである。
【０００５】
本明細書において、“自己の”という用語は、同じ個体に由来する任意の物質であって、後に当該個体に再導入される物質を指すために用いられる。
“同種異系の”とは同じ種の異なる動物に由来する移植片を指す。
“異種の”とは異なる種の動物に由来する移植片を指す。
本明細書で用いられる“癌”という用語は、異常細胞の急速かつ無制御増殖を特徴とする疾患と定義される。癌細胞は、局所的にまたは血流およびリンパ系を介して身体の他の部分へ拡散することができる。多様な癌の例には、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓に関する癌（renal cancer）、肝臓癌、脳の癌、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、肺癌などが含まれるが、ただしこれらに限定されない。癌の例にはまた、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病またはリンパ性悪性疾患が含まれるが、ただしこれらに限定されない。そのような癌のより多くの例には以下が含まれる：腎臓癌若しくは腎臓に関する癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む）、扁平細胞癌（例えば扁平上皮細胞癌）、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃に関する癌若しくは胃癌（胃腸管癌、胃腸管間質性腫瘍（GIST）を含む）、膵臓癌、頭頸部癌、神経膠芽細胞腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、卵胞膜細胞腫、男性胚細胞腫、ヘパトーマ、血液学系悪性疾患（非ホジキンリンパ腫（NHL）、多発性骨髄腫、および急性血液学系悪性疾患を含む）、子宮内膜または子宮の癌腫、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛癌腫、唾液腺の癌腫、外陰部癌、甲状腺癌、食道の癌腫、肝臓に関する癌腫、肛門の癌腫、陰茎の癌腫、鼻咽頭の癌腫、喉頭の癌腫、カポジ肉腫、黒色腫、皮膚の癌腫、神経鞘腫、希突起神経膠細胞腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、尿路の癌腫、甲状腺癌腫、ウィルムス腫瘍、前記の他にB細胞リンパ腫（低悪性度/濾胞性非ホジキンリンパ腫（NHL）、小リンパ球性（SL）NHL、中間悪性度/濾胞性NHL、中間悪性度びまん性NHL、高悪性度免疫芽細胞性NHL、高悪性度リンパ芽球性NHL、高悪性度の小非切れ込み細胞（small non-cleaved cell）NHL、腫瘤（bulky disease）NHL、マントル細胞リンパ腫、エイズ関連リンパ腫およびワルデンストロームマクログロブリン血症を含む）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽細胞性白血病、および移植後リンパ増殖異常（PTLD）、前記の他に、母斑症、浮腫（例えば脳腫瘍に随伴するもの）およびメーグス症候群に随伴する異常な血管増殖。
本明細書で用いられる“腫瘍”は、全ての新形成細胞の増殖および分裂（悪性または良性を問わない）、並びに全ての前癌性および癌性細胞および組織を指す。
【０００６】
“有効量”または“治療的に有効な量”は本明細書では互換的に用いられ、個別の生物学的な結果を達成するために有効な、本明細書に記載の化合物、処方物、物質または組成物の量を指す。そのような結果には、当該業界で適切な任意の手段によって決定されるウイルス感染の阻害が含まれ得るが、ただし前記に限定されない。
“発現ベクター”は、発現されるべきヌクレオチド配列に作動するように連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは発現のために十分なcis-作動性エレメントを含むことができる。発現のための他のエレメントは宿主細胞によってまたはin vitro発現系で供給され得る。発現ベクターには当業界で公知の全てのものが含まれ、例えば、組換えポリヌクレオチドを取り込むコスミド、プラスミド（例えば裸の状態またはリポソームに収納される）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス）が含まれる。
特段に指定されなければ、“アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列”は、同じアミノ酸配列をコードし互いに縮退バージョンである全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはRNAをコードするヌクレオチド配列という語句はまた、当該タンパク質をコードするヌクレオチド配列が何らかのバージョンではイントロンを含み得るという点でイントロンを含むことができる。いくつかの実施態様では、ヌクレオチド配列はイントロンを含まず、コード配列のみを含む。
【０００７】
本明細書で用いられる“レンチウイルス”は、レンチウイルス科の一属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染できるという点においてレトロウイルスの中では唯一のものである。レンチウイルスは宿主細胞のDNAに顕著な量の遺伝情報をデリバリーすることができ、したがってそれらは遺伝子デリバリーベクターの最も効率的な方法である。HIV、SIVおよびFIVはいずれもレンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターはin vivoで顕著なレベルの遺伝子導入を達成することができる。
“作動できるように連結される”という用語は、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結を指し、前記連結は後者の発現をもたらす。例えば、第一の核酸配列が第二の核酸配列と機能的関係に置かれるとき、第一の核酸配列は第二の核酸配列に作動できるように連結されている。例えば、あるプロモーターがあるコード配列の転写または発現に影響を与える場合、当該プロモーターは当該コード配列に作動できるように連結されている。いくつかの実施態様では、作動できるように連結されるDNA配列は連続性であり、必要な場合には2つのタンパク質コード領域は同じリーディングフレームで結合される。
本明細書で用いられる“ポリヌクレオチド”という用語は、ヌクレオチドの鎖と定義される。さらにまた、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で用いられる核酸およびポリヌクレオチドは互換性である。当業者は、核酸はポリヌクレオチドであり、加水分解されてモノマー“ヌクレオチド”を形成し得るという普遍的知識を有する。モノマーヌクレオチドは加水分解されてヌクレオシドを形成し得る。本明細書で用いられるポリヌクレオチドには、以下を含む当業界で利用可能な任意の手段によって入手できる全ての核酸が含まれる（ただしそれらに限定されない）。当該手段には、組換え手段（すなわち組換えライブラリーまたは細胞ゲノムから通常のクローニング技術及びPCRTMなどによる核酸配列のクローニング）および合成手段が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【０００８】
本明細書で用いられるように、“ペプチド”、“ポリペプチド”および“タンパク質”という用語は互換的に用いられ、ペプチド結合によって共有結合されるアミノ酸残基で構成された化合物を指す。タンパク質またはペプチドは少なくとも2つのアミノ酸を含まなければならず、タンパク質配列またはアミノ酸配列を構成できるアミノ酸の最大数には制限はない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合によって連結される2つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で用いられるように、当該用語は、短い鎖および長い鎖の両方を指し、当業界では一般的に短い鎖は例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称され、長い鎖は当業界では一般的にタンパク質と称され、それらには多くのタイプが存在する。“ポリペプチド”にはとりわけ、例えば生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチド変種、改変ポリペプチド、誘導体、アナローグ、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには天然のポリペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、または前記の組合せが含まれる。
本明細書で用いられる“プロモーター”という用語は、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識される、ポリヌクレオチド配列の特異的な転写を開始するために必要なDNA配列と定義される。
本明細書で用いられる“プロモーター/調節配列”という用語は、当該プロモーター/調節配列に作動できるように連結された遺伝子生成物の発現に必要な核酸配列を意味する。いくつかの事例ではこの配列はコアプロモーター配列であり得るが、他の事例では、この配列はまたエンハンサー配列および遺伝子生成物の発現に必要な他の調節エレメントを含むことができる。プロモーター/調節配列は、例えば組織特異的態様で遺伝子生成物を発現する配列であり得る。
【０００９】
“構成的”プロモーターは、ある遺伝子生成物をコードまたは指定するポリヌクレオチドと作動できるように連結されるとき、ある細胞の大半のまたは全ての生理学的条件下で当該遺伝子生成物を当該細胞で生成させるヌクレオチド配列である。
“誘導性”プロモーターは、ある遺伝子生成物をコードまたは指定するポリヌクレオチドと作動できるように連結されるとき、当該プロモーターに対応する誘導物質がある細胞に実質的に存在するときにのみ当該遺伝子生成物を当該細胞で生成させるヌクレオチド配列である。
“組織特異的”プロモーターは、ある遺伝子をコードするまたはある遺伝子によって指定されるポリヌクレオチドと作動できるように連結されるとき、当該細胞が実質的に当該プロモーターに対応する組織タイプの細胞である場合にのみ当該遺伝子生成物を当該細胞で生成させるヌクレオチド配列である。
本明細書で用いられるように、“実質的に精製された”細胞は、本質的に他の細胞を含まない細胞である。実質的に精製された細胞はまた、当該細胞が天然に存在する状態では当該細胞に通常的に随伴している他の細胞タイプから分離されている細胞を指す。いくつかの事例では、実質的に精製された細胞の集団は均一細胞集団と称される。他の事例では、この用語は、単に、細胞の天然の状態ではそれらの細胞に通常的に随伴する細胞から分離された細胞を指す。いくつかの実施態様では、細胞はin vitroで培養される。他の実施態様では、細胞はin vitroで培養されない。
本明細書で用いられる“トランスフェクトされた”または“形質転換された”または“形質導入された”という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移転または導入されるプロセスを指す。“トランスフェクトされた”または“形質転換された”または“形質導入された”細胞は、外因性核酸をトランスフェクト、形質転換または形質導入された細胞である。当該細胞には初代対象細胞およびその子孫が含まれる。
【００１０】
本明細書で用いられる“転写制御下で”または“作動するように連結され”という語句は、プロモーターが、RNAポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するために当該ポリヌクレオチドに関して正しい配置および方向で存在することを意味する。
“ベクター”は単離核酸を含む物であり、これを用いて細胞の内部に当該単離核酸をデリバリーすることができる。多数のベクターが当業界で公知であり、ベクターには、線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物結合ポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスが含まれるが、ただしこれらに限定されない。したがって、“ベクター”という用語には自律的に複製するプラスミドまたはウイルスが含まれる。当該用語はまた、核酸の細胞への移転を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物（例えばポリリジン化合物、リポソームなど）を含むと解されるべきである。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
範囲：本開示を通して、多様な実施態様がある範囲の形式で提示され得る。範囲をもった書式の記述は単に便宜および簡潔さのためであり、本発明の趣旨における融通の利かない制限と解されるべきではない。したがって、範囲的記述は、具体的に開示された全ての可能な部分範囲とともに当該範囲内の個々の数値を含むと解されるべきである。例えば、1から6という範囲の記述は、具体的に開示された部分範囲（例えば1から3、1から4、1から5、2から4、2から6、3から6など）とともに、当該範囲内の個々の数（例えば1、2、2.7、3、4、5、5.3および6）を含むと解されるべきである。このことは、範囲の幅に関係なく適用される。
【００１１】
腫瘍免疫学における主要な障害は、多くの細胞系アプローチにおいて本来の抗腫瘍有効性を制限する腫瘍特異的耐性の誘導である。最近の研究では、チェックポイント阻害物質を標的とすることによって顕著な臨床的有効性が示され、転移性黒色腫に対し抗CTLA-4および抗PD-1の承認に至った。いくつかの特徴では、実施態様はキメラ受容体に関し、前記キメラ受容体は、免疫系の脱活性化を妨げることができるタンパク質のドメインの細胞外ドメイン発現および細胞内活性化ドメインを含む。これは耐性発生メカニズムを乗っ取り活性化シグナルにするという利点を有する。このアプローチは、T細胞アネルギーが疾患の病理発生の主要な特徴であり、抗原特異性が内因性T細胞レパートリーによって供給される全臨床状況で用いることができる。
いくつかの特徴では、実施態様はキメラトランスメンブレンタンパク質に関し、前記タンパク質は、阻害性受容体の細胞外ドメイン、トランスメンブレンドメイン、および細胞内シグナリングドメインを含む。いくつかの実施態様では、細胞内シグナリングドメインは免疫応答を活性化することができる。細胞内シグナリングドメインは細胞内シグナリングタンパク質の一部分を含むことができる。いくつかの実施態様では、細胞内ドメインを用いて細胞（例えばT細胞）の活性化を維持することができる。
いくつかの実施態様では、細胞外ドメインはシグナルを細胞内シグナリングドメインに伝達することができる。例えば、細胞外ドメインは、自然のまま（native）の阻害性受容体のアゴニストとの結合時にシグナルを細胞内シグナリングドメインに伝達することができる。
シグナルトランスダクションはタンパク質のオリゴマー化を含むことができる。オリゴマー化はホモオリゴマー化またはヘテロオリゴマー化を含むことができる。オリゴマー化は、タンパク質のダイマー化、すなわち第二のキメラトランスメンブレンタンパク質とのホモダイマー化または異なるタンパク質とのヘテロダイマー化を含むことができる。
【００１２】
シグナルトランスダクションはリン酸化を含むことができる。例えば、細胞内シグナリングドメインはキナーゼ活性および/またはリン酸化部位を含むことができる。
シグナルトランスダクションは自己リン酸化、例えば細胞内シグナリングドメインの自己リン酸化を含むことができる。
いくつかの実施態様では、受容体（“スイッチ受容体”とも称されることがある）は本明細書に記載するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様では、当該受容体は本明細書に記載する核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施態様では、受容体は、CD8リーダーペプチド、PD-1細胞外ドメイン、4-1BBトランスメンブレンドメイン、および4-1BB細胞内ドメインを含む。いくつかの実施態様では、リーダーペプチドは細胞内のタンパク質プロセッシング中に切断されて、PD-1細胞外ドメイン、4-1BBトランスメンブレンドメイン、および4-1BB細胞内ドメインを含む受容体をもたらす。いくつかの実施態様では、当該ドメインは本明細書および下記に記載するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様では、受容体は、CD8リーダーペプチド、PD-1細胞外ドメイン、CD28トランスメンブレンドメイン、およびCD28細胞内ドメインを含む。いくつかの実施態様では、リーダーペプチドは細胞内のタンパク質プロセッシング中に切断されて、PD-1細胞外ドメイン、CD28トランスメンブレンドメイン、およびCD28細胞内ドメインを含む受容体をもたらす。いくつかの実施態様では、当該ドメインは本明細書および下記に記載するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様では、受容体は、CD8リーダーペプチド、PD-1細胞外ドメイン、CD28トランスメンブレンドメイン、CD28細胞内ドメイン、および4-1BB細胞内ドメインを含む。いくつかの実施態様では、リーダーペプチドは細胞内のタンパク質プロセッシング中に切断されて、PD-1細胞外ドメイン、CD28トランスメンブレンドメイン、CD28細胞内ドメイン、および4-1BB細胞内ドメインを含む受容体をもたらす。いくつかの実施態様では、当該ドメインは本明細書および下記に記載するアミノ酸配列を含む。
【００１３】
いくつかの実施態様では、受容体は、CD8リーダーペプチド、PD-1細胞外ドメイン、CD27トランスメンブレンドメイン、およびCD27細胞内ドメインを含む。いくつかの実施態様では、リーダーペプチドは細胞内のタンパク質プロセッシング中に切断されて、PD-1細胞外ドメイン、CD27トランスメンブレンドメイン、およびCD27細胞内ドメインを含む受容体をもたらす。いくつかの実施態様では、当該ドメインは本明細書および下記に記載するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様では、受容体は、CD8リーダーペプチド、PD-1細胞外ドメイン、CD27トランスメンブレンドメイン、CD27細胞内ドメイン、および4-1BB細胞内ドメインを含む。いくつかの実施態様では、リーダーペプチドは細胞内のタンパク質プロセッシング中に切断されて、PD-1細胞外ドメイン、CD27トランスメンブレンドメイン、CD27細胞内ドメイン、および4-1BB細胞内ドメインを含む受容体をもたらす。いくつかの実施態様では、当該ドメインは本明細書および下記に記載するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様では、受容体は、CD8リーダーペプチド、PD-1細胞外ドメイン、ICOSトランスメンブレンドメイン、およびICOS細胞内ドメインを含む。いくつかの実施態様では、リーダーペプチドは細胞内のタンパク質プロセッシング中に切断されて、PD-1細胞外ドメイン、ICOSトランスメンブレンドメイン、およびICOS細胞内ドメインを含む受容体をもたらす。いくつかの実施態様では、当該ドメインは本明細書および下記に記載するアミノ酸配列を含む。
【００１４】
いくつかの実施態様では、細胞外ドメインは阻害性受容体の細胞外ドメインである。いくつかの実施態様では、細胞外ドメインは、リガンド結合ドメイン、例えば阻害性受容体のアゴニスト結合ドメインを含む。いくつかの実施態様では、細胞外ドメインは、リガンド結合に応答して膜を横断しシグナルを伝達するために十分な構造を含む。いかなる特定の理論にも拘束されないが、多価リガンド媒介オリゴマー化によってシグナルを伝達する阻害性受容体にとって、リガンド結合ドメインが単に存在することが、リガンド結合に応答して膜を横断しシグナルを伝達するために十分な構造であり得る。いかなる特定の理論にも拘束されないが、細胞膜に対するトランスメンブレンドメインの向きを変化させることによってシグナルを伝達する阻害性受容体にとって、細胞外ドメインは、リガンド結合に応答して膜を横断しシグナルを伝達するためにリガンド結合ドメインとトランスメンブレンドメインとの間の自然のままの構造を要求することができる。例えば、細胞外ドメインは、阻害性受容体のリガンド結合ドメインからトランスメンブレンドメインまで当該受容体の自然のままの配列を含むことができる。
自然のままの阻害性受容体はヒト阻害性受容体またはマウス阻害性受容体であり得る。したがって、細胞外ドメインはヒトまたはマウスのアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施態様では、自然のままの阻害性受容体の供給源は、例えば当該キメラトランスメンブレンタンパク質に対する免疫応答を回避するために、治療されている対象動物の種に適合するように選択される。それにもかかわらず、自然のままの阻害性受容体は、例えば便宜のために異なる種から選択することができる。したがって、キメラタンパク質は、当該タンパク質が発現される細胞の種に対してまたは当該タンパク質が投与される対象動物に対して異種由来であることもそうでないこともある。
【００１５】
いくつかの実施態様では、自然のままの阻害性受容体は、自然のままのアゴニストとの結合時に免疫活性を低下させるタンパク質から選択される。例えば、自然のままの阻害性受容体は、自然のままのアゴニストとの結合時にT細胞分裂、T細胞生存、サイトカイン分泌、または免疫細胞溶解活性を低下させることができる。自然のままの阻害性受容体は、リンパ球阻害性受容体であり得る（すなわち、阻害性受容体はリンパ球（例えばT細胞）上で発現され得る）。例えば、自然のままの阻害性受容体はT細胞上で発現され、アゴニストと自然のままの阻害性受容体との結合は、T細胞分裂、T細胞生存、サイトカイン分泌、または免疫細胞溶解活性に不利な細胞シグナリングを引き起こすことができる。
いくつかの実施態様では、自然のままの阻害性受容体は、CTLA-4（細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4；CD152）、PD-1（プログラム細胞死タンパク質1；CD279）、LAG-3（リンパ球活性化遺伝子3；CD223）、またはTim-3（T細胞免疫グロブリンムチン-3）であり得る。したがって、いくつかの実施態様では、細胞外ドメインはCTLA-4、PD-1、LAG-3、またはTim-3の細胞外ドメインであり得る。阻害性受容体はPD-1であり得る。いくつかの実施態様では、トランスメンブレンタンパク質はPD-1の細胞外ドメインを含む。いくつかの実施態様では、細胞外ドメインの配列は本明細書に記載するPD-1ドメインを含む。
【００１６】
いくつかの実施態様では、細胞内シグナリングドメインは細胞内シグナリングタンパク質のシグナリングドメインである。いくつかの実施態様では、細胞内シグナリングドメインはキナーゼ活性またはリン酸化部位を含むことができる。いくつかの実施態様では、細胞内シグナリングドメインは、例えば細胞膜を横断するシグナルトランスダクションに続いて、シグナリング分子（例えばキナーゼまたはホスホリラーゼ）を活性化することができる。細胞内シグナリングドメインは下流のキナーゼまたはホスホリラーゼを介してシグナルを発することができる。
細胞内シグナリングタンパク質はヒトタンパク質またはマウスタンパク質であり得る。したがって、細胞内シグナリングドメインはヒトまたはマウスアミノ酸配列を含むことができる。いくつかの実施態様では、細胞内シグナリングタンパク質は、治療のために用いられている対象動物および細胞の種に適合するように選択され、したがって、例えばシグナリングドメインは当該細胞の細胞質機構を利用して下流のシグナリング分子を活性化することができる。それにもかかわらず、細胞内シグナリングタンパク質は、例えば便宜のために異なる種（例えば上記に記載のもの）から選択することができる。
いくつかの実施態様では、細胞内シグナリングタンパク質は免疫活性を増加させる。したがって、キメラトランスメンブレンタンパク質を介するシグナルトランスダクションは、免疫活性を増加させるシグナルカスケードを生じることができ、この場合、細胞内シグナリングドメインは細胞内シグナリングカスケードを媒介する。いくつかの実施態様では、細胞内シグナリングタンパク質は、T細胞分裂、T細胞生存、サイトカイン分泌、または免疫細胞溶解活性を強化することができる。いくつかの実施態様では、細胞内シグナリングタンパク質はトランスメンブレンタンパク質であるか、または細胞内シグナリングタンパク質は自然のままのトランスメンブレンタンパク質と結合することができる。細胞内シグナリングタンパク質はリンパ球タンパク質であり得る（すなわち、細胞内シグナリングタンパク質はリンパ球（例えばT細胞）上で発現され得る）。
【００１７】
いくつかの実施態様では、細胞内シグナリングタンパク質は、CD3ζ（T細胞表面糖タンパク質CD3ゼータ鎖；CD247）、4-1BB（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー9；CD137）、またはCD28（T細胞特異的表面糖タンパク質CD28；Tp44）である。細胞内シグナリングタンパク質は4-1BBであり得る。したがって、細胞内シグナリングタンパク質は4-1BBのシグナリングドメインを含むことができる。いくつかの実施態様では、細胞内ドメインは本明細書に記載する細胞内ドメインを含む。
いくつかの実施態様では、キメラトランスメンブレンタンパク質は自殺ドメインを含み、すなわち当該タンパク質を含む組換え細胞を殺滅する。自殺ドメインはチミジンキナーゼ活性またはカスパーゼ活性を含むことができる。例えば、自殺ドメインはチミジンキナーゼまたはカスパーゼであり得る。いくつかの実施態様では、自殺ドメインはHSVチミジンキナーゼ（“HSV-TK”）のチミジンキナーゼドメインであるか、または自殺ドメインはカスパーゼ9の一部分を含む。
【００１８】
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【００１９】
いくつかの実施態様では、スイッチ受容体は下記の表で提供される配列を含む：
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【００２０】
いくつかの実施態様では、上記の表で提供される受容体はN-末端CD8リーダペプチド配列を含む。いくつかの実施態様では、リーダー配列はMALPVTALLLPLALLLHAARP（配列番号:1）である。受容体がリーダー配列を含む場合、リーダー配列は表の配列のN-末端に付加され、連続した配列を形成できる。リーダー配列は、例えば配列番号:2のヌクレオチド配列によってコードされ得る。本明細書で提供する細胞内ドメインはまた細胞内シグナリングドメインと称され得る。
したがって、いくつかの実施態様では、受容体は下記の表で提供される配列を含む：
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【００２１】
いくつかの特徴では、実施態様は、本明細書に記載するキメラトランスメンブレンタンパク質をコードする核酸分子に関する。当該核酸分子はプロモーターを含んでもよく、ここで当該プロモーターは、例えば組換え細胞でのキメラタンパク質の発現のために、キメラトランスメンブレンタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動できるように連結される。いくつかの実施態様では、プロモーターは構成的プロモーターである。いくつかの実施態様では、プロモーターは細胞特異的プロモーターである。いくつかの実施態様では、プロモーターは組織特異的プロモーターである。
核酸分子は上記に示す配列を含むことができる。核酸分子は、本明細書に示すヌクレオチド配列と少なくとも約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％配列相同性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。遺伝暗号は縮重性であるので、核酸配列の変動はコードされるアミノ酸配列を変化させないことがある。したがって、縮重性変化は本開示に包含されることが意図される。いくつかの実施態様では、核酸分子は、本明細書に示すヌクレオチド配列中の連続する少なくとも約100、200、300、500、600または700ヌクレオチドと少なくとも約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％配列相同性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、核酸分子は、本明細書に示すヌクレオチド配列中の連続する少なくとも約100ヌクレオチドと少なくとも95％配列相同性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。既定の設定を用いてNCBIウェブサイトでBlastnまたはBlastPを実行し、2つの配列を比較またはアラインメントするために相同性を用いることができる。
いくつかの実施態様では、核酸分子は本明細書に記載するアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施態様では、核酸分子は、本明細書に示すアミノ酸配列の1つ以上を含むアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施態様では、核酸分子は、本明細書に示すアミノ酸配列と少なくとも約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％配列相同性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。相同性はタンパク質との関係において同一性または類似性であり得る。既定の設定を用いて日常的ツール（例えばExpasy、BLASTp、Clustalなど）を利用することによって相同性を用いることができる。
【００２２】
いくつかの実施態様では、キメラトランスメンブレンタンパク質は、本明細書および上記で示す1つ以上のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様では、キメラトランスメンブレンタンパク質は、本明細書に示すアミノ酸配列の1つと少なくとも約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載するアミノ酸配列の変種は種々の実施態様に含まれ得る。“変種”という用語は、あるタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、1つ以上（例えば1、2、3、4など）のアミノ酸置換、欠失および/または挿入が存在するタンパク質またはポリペプチドを指し、さらに当該用語は、あるタンパク質またはポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変種およびまた別のスプライス変種を含む。“変種”という用語は、アミノ酸配列の1つ以上のアミノ酸の類似若しくは相同アミノ酸または非類似アミノ酸による置換を含む。いくつかの変種は、アミノ酸配列の1つ以上のアミノ酸の位置におけるアラニン置換を含む。他の置換には、タンパク質の全体の正味荷電、極性または疎水性に対してほとんどまたは全く影響がない保存的置換が含まれる。保存的置換は、キメラトランスメンブレンタンパク質の機能に重要ではない影響を有することがある。いくつかの実施態様では、当該機能は、リンパ球（例えば髄浸潤リンパ球（MIL））で発現されるときタンパク質の特異性であることができる。当業者は、本明細書で提供する配列と比較することによって、置換がキメラトランスメンブレンタンパク質の機能に影響を及ぼすか否かを決定することができる。非限定的な保存置換の例は下記の表に示される。いくつかの実施態様にしたがえば、キメラトランスメンブレンタンパク質は、本明細書に記載するアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％配列同一性を有する。
【００２３】
保存的アミノ酸置換
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下記の表は保存的アミノ酸置換の別の構図を示す。
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【００２４】
したがって、いくつかの実施態様では、本明細書に開示するアミノ酸配列の1、2、3、4、5、6、7、8、9または10アミノ酸残基は保存的置換により改変される。いくつかの実施態様では、1、2、3、4または5アミノ酸残基のみが保存的置換により置換される。
いくつかの実施態様では、キメラトランスメンブレンタンパク質は、本明細書に記載する配列（配列番号:1−44）またはその変種を含む。いくつかの実施態様では、当該タンパク質がCD8のリーダー配列（配列番号:1）を含む場合、当該リーダー配列は、キメラトランスメンブレンタンパク質の細胞外膜への輸送を補助することができる別のシグナルペプチドまたはリーダー配列で置き換えられる。
いくつかの特徴では、実施態様は本明細書に開示する核酸を含む組換え細胞に関する。いくつかの実施態様では、当該実施態様は本明細書に記載するキメラトランスメンブレンタンパク質を含む組換え細胞に関する。いくつかの実施態様では、この細胞は、本明細書に示すアミノ酸配列またはその変種を含むキメラタンパク質を含む。いくつかの実施態様では、この細胞はリンパ球である。この細胞はT細胞であり得る。いくつかの実施態様では、この細胞は腫瘍浸潤リンパ球（“TIL”）または髄浸潤リンパ球（“MIL”）であり得る。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載するキメラトランスメンブレンタンパク質を含む細胞は、対象動物に投与されたとき、キメラトランスメンブレンタンパク質が存在しない細胞と比較して当該対象動物でより長期間存続する。
【００２５】
いくつかの特徴では、実施態様は組換え細胞を作製する方法に関し、前記方法は、本明細書に記載する核酸分子を細胞にトランスフェクトする工程を含む。いくつかの特徴では、実施態様は組換え細胞を作製する方法に関し、前記方法は、本明細書に記載するアミノ酸配列をコードする核酸分子を細胞にトランスフェクトする工程を含む。当該核酸分子はプラスミドであり得る。細胞に本明細書に記載するヌクレオチド配列の1つ以上を含むプラスミドをトランスフェクトすることができる。細胞にはまた当該核酸分子を含むウイルスまたはウイルス様粒子を感染させることができる。いくつかの実施態様では、ウイルスはレンチウイルス、アデノウイルスまたはアデノ関連ウイルス（“AAV”）である。いくつかの実施態様では、細胞はTILまたはMILである。いくつかの実施態様では、MILは活性化されたMILである。MILは、例えばそれらを抗CD3/抗CD28ビーズおよび適切なサイトカインとともに、例えば低酸素条件下でインキュベートすることによって活性化することができる。低酸素条件下でのMILの増殖の例は、WO2016037054（参照によってその全体が本明細書に含まれる）で見出すことができる。いくつかの実施態様では、核酸分子は、細胞を本明細書に記載する低酸素環境でインキュベートした後で当該細胞にトランスフェクトされる。いくつかの実施態様では、核酸分子は、、細胞を本明細書に記載する低酸素環境で約1、2、3、4または5日間インキュベートした後で当該細胞にトランスフェクトされる。いくつかの実施態様では、細胞は続いて正常酸素条件下で約1、2、3、4または5日間インキュベートされる。
【００２６】
いくつかの実施態様では、キメラトランスメンブレンタンパク質を含むMILは、WO2016037054（参照によってその全体が本明細書に含まれる）に記載された方法にしたがって調製される。いくつかの実施態様では、当該方法は、対象動物から骨髄の細胞、リンパ球、および/または髄浸潤リンパ球（“MIL”）を取り出す工程；当該細胞を低酸素環境でインキュベートし、それによって活性化MILを生じる工程；および当該活性化MILを対象動物に投与する工程を含むことができる。細胞はまた、本明細書に記載する抗CD3/抗CD28抗体およびサイトカインの存在下で活性化させることができる。MILを低酸素環境でインキュベートする前にまたは後で、キメラトランスメンブレンタンパク質をコードする核酸分子（例えば本明細書に記載するものの1つ）を細胞にトランスフェクトまたは感染させることができる。
低酸素環境は、約21％未満の酸素、例えば約20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％未満、または約3％未満の酸素を含むことができる。例えば、低酸素環境は約0％の酸素から約20％の酸素、例えば約0％の酸素から約19％の酸素、約0％の酸素から約18％の酸素、約0％の酸素から約17％の酸素、約0％の酸素から約16％の酸素、約0％の酸素から約15％の酸素、約0％の酸素から約14％の酸素、約0％の酸素から約13％の酸素、約0％の酸素から約12％の酸素、約0％の酸素から約11％の酸素、約0％の酸素から約10％の酸素、約0％の酸素から約9％の酸素、約0％の酸素から約8％の酸素、約0％の酸素から約7％の酸素、約0％の酸素から約6％の酸素、約0％の酸素から約5％の酸素、約0％の酸素から約4％の酸素、または約0％の酸素から約3％の酸素を含むことができる。いくつかの実施態様では、低酸素環境は約1％から約7％の酸素を含む。いくつかの実施態様では、低酸素環境は約1％から約2％の酸素である。いくつかの実施態様では、低酸素環境は約0.5％から約1.5％の酸素である。いくつかの実施態様では、低酸素環境は約0.5％から約2％の酸素である。低酸素環境は、約20％、約19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、または約0％の酸素を含むことができる。いくつかの実施態様では、低酸素環境は約7％、6％、5％、4％、3％、2％、または1％の酸素を含む。
【００２７】
低酸素環境でのMILのインキュベーションは、例えば組織培養液で少なくとも約1時間（例えば少なくとも約12時間、18時間、24時間、30時間、36時間、42時間、48時間、60時間、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、または少なくとも約14日間も）MILをインキュベートする工程を含むことができる。インキュベーションは、MILを約1時間から約30日間（例えば約1日から約20日、約1日から約14日、または約1日から約12日間）インキュベートする工程を含むことができる。いくつかの実施態様では、低酸素環境でのMILのインキュベーションは、MILを低酸素環境で約2日から約5日間インキュベートする工程を含む。当該方法は、低酸素環境でMILを約1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、または14日間インキュベートする工程を含む。いくつかの実施態様では、当該方法は低酸素環境でMILを約3日間インキュベートする工程を含む。いくつかの実施態様では、当該方法は、低酸素環境でMILを約2日から約4日間インキュベートする工程を含む。いくつかの実施態様では、当該方法は、低酸素環境でMILを約3日から4日間インキュベートする工程を含む。
いくつかの実施態様では、当該方法はさらにまた通常酸素環境でMILをインキュベートする工程、例えば低酸素環境でのMILのインキュベーション後に通常酸素環境でMILをインキュベートする工程を含む。
正常酸素環境は少なくとも約21％の酸素を含むことができる。正常酸素環境は、約5％の酸素から約30％の酸素、例えば約10％の酸素から約30％の酸素、約15％の酸素から約25％の酸素、約18％の酸素から約24％の酸素、約19％の酸素から約23％の酸素、または約20％の酸素から約22％の酸素を含むことができる。いくつかの実施態様では、正常酸素環境は約21％の酸素を含む。
正常酸素環境でのMILのインキュベーションは、例えば組織培養液で少なくとも約1時間（例えば少なくとも約12時間、18時間、24時間、30時間、36時間、42時間、48時間、60時間、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、または少なくとも約14日間も）MILをインキュベートする工程を含むことができる。インキュベーションは、MILを約1時間から約30日間（例えば約1日から約20日、約1日から約14日、または約1日から約12日間）インキュベートする工程を含むことができる。インキュベーションは、MILを約1時間から約30日間（例えば約1日から約20日、約1日から約14日、約1日から約12日、または約2日から約12日間）インキュベートする工程を含むことができる。
【００２８】
いくつかの実施態様では、本明細書に記載するキメラトランスメンブレンタンパク質をコードする核酸分子は、正常酸素環境に置かれた後でまたは正常環境に置かれる前に細胞にトランスフェクトまたは感染される。
いくつかの実施態様では、MILは、本明細書に記載するように対象動物の骨髄サンプルから抽出し、さらに培養/インキュベートすることによって入手される。いくつかの実施態様では、骨髄サンプルは遠心分離されて赤血球が除去される。いくつかの実施態様では、骨髄サンプルはアフェレーシスに付されない。いくつかの実施態様では、骨髄サンプルは末梢血リンパ球（“PBL”）を含まないか、または骨髄サンプルは実質的にPBLを含まない。これらの方法は、TILとして知られるようになった細胞と同じではない細胞を選別する。したがって、MILはTILではない。TILは当業者に公知の方法によって選別することができ、さらにTILが本明細書に記載するキメラトランスメンブレンタンパク質を発現できるように本明細書に記載する核酸分子をTILにトランスフェクトまたは感染させることができる。
【００２９】
いくつかの実施態様では、細胞はCD3およびCD28に対する抗体とともに培養することによっても活性化される。これは、例えば抗CD3/抗CD28ビーズとともに細胞をインキュベートすることによって実施できる（前記ビーズは市場で入手可能であるかまたは当業者によって作製され得る）。続いて細胞をプレート、フラスコまたはバッグに播くことができる。低酸素条件は、低酸素チャンバーまたは細胞培養バッグに95％窒素ガスおよび5％CO2ガス混合物を3分間フラッシュすることによって達成できる。前記操作は、容器中で1−2％未満のO2ガスをもたらすことができる。続いて、本明細書またはWO2016037054（参照によってその全体が本明細書に含まれる）の例の記載のように細胞を培養することができる。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載するキメラトランスメンブレンタンパク質を含む低酸素MILが提供される。いくつかの実施態様では、低酸素MILは約0.5％から約5％酸素ガスの環境にある。いくつかの実施態様では、低酸素MILは約1％から約2％酸素ガスの環境にある。いくつかの実施態様では、低酸素MILは約1％から約3％酸素ガスの環境にある。いくつかの実施態様では、低酸素MILは約1％から約4％酸素ガスの環境にある。低酸素MILとは、低酸素環境（例えば本明細書に記載する環境）において、ある期間インキュベートされたMILである。いずれの特定の理論にも拘束されないが、低酸素MILは、MILの抗腫瘍能力に影響を及ぼすタンパク質および/または遺伝子の発現に変化を受けるであろう。本明細書に記載するように、低酸素MILはまた、抗CD3/抗CD28ビーズまたは他の同様な活性化試薬の存在により活性化させることができる。したがって、低酸素MILはまた活性化低酸素MILであることができる。
【００３０】
いくつかの特徴において、実施態様は対象動物で免疫応答を増加させる方法に関し、前記方法は、本明細書に記載する組換え細胞を当該対象動物に投与する工程を含む。いくつかの実施態様では、実施態様は対象動物で新生物を治療する方法に関し、前記方法は、本明細書に記載する組換え細胞を当該対象動物に投与する工程を含む。新生物は、良性新生物、悪性新生物、または二次性新生物であり得る。新生物は癌であり得る。新生物は、リンパ腫または白血病（例えば慢性リンパ球性白血病（“CLL”）または急性リンパ芽球性白血病（“ALL”））であり得る。新生物は多発性骨髄腫とともに任意の固形腫瘍であり得る（例えば乳癌、前立腺癌、肺癌、食道癌、脳の癌、腎臓癌、膀胱癌、膵臓癌、骨肉腫など）。癌はまた本明細書に記載の癌であり得る。
当該方法は、本明細書に記載する組換え細胞の複数個を当該対象動物に投与する工程を含むことができる。当該方法は、本明細書に記載する組換え細胞の有効量を当該対象動物に投与する工程を含むことができる。いくつかの実施態様では、細胞は組換え細胞を受容する対象動物に対して自己の細胞である。いくつかの実施態様では、細胞は組換え細胞を受容する対象動物に対して同種異系の細胞である。いくつかの実施態様では、細胞は組換え細胞を受容する対象動物に対して異種の細胞である。
したがって、いくつかの実施態様では、細胞は対象動物から入手される細胞であり、本明細書で提供する受容体で改変され続いて当該対象動物に戻される。細胞は本明細書に記載のものであり得る。
いくつかの実施態様では、細胞は異なる動物から入手される細胞であり、本明細書で提供する受容体で改変され、続いて細胞の供給源と同じではない対象動物に戻される。細胞は本明細書に記載のものであり得る。
いくつかの実施態様では、細胞は異なる種（例えばブタ）から入手される細胞であり、本明細書で提供する受容体で改変され、続いて細胞の供給源と同じではない対象動物に戻される。細胞は本明細書に記載のものであり得る。
【００３１】
いくつかの実施態様では、細胞は対象動物から入手される。トランスフェクトまたは感染される細胞は当該対象動物から入手され得る。細胞は本明細書記載のように入手できる。例えば、投与される細胞は対象動物に対して自己由来であり得る。いくつかの実施態様では、投与される細胞は対象動物に対して同種異系である。細胞は対象動物から入手され、本明細書記載のキメラトランスメンブレンタンパク質をコードする核酸をトランスフェクトまたは感染させることができる。細胞は娘細胞でもよく、ここで当該娘細胞の親は当該対象動物から入手されたものである。組換え細胞は当該核酸をトランスフェクトまたは感染されてあるか、または組換え細胞の親が当該核酸をトランスフェクトまたは感染されてあったものであり得る。いくつかの実施態様では、トランスフェクトまたは感染された後の細胞は本明細書記載のアミノ酸配列の1つ以上を含むタンパク質を発現する。
当該方法はさらにまた組換え細胞を作製する工程を含むことができ、組換え細胞を作製する工程は、キメラトランスメンブレンタンパク質をコードする核酸（例えば本明細書に記載するもの）を細胞にトランスフェクトまたは感染させる工程を含む。いくつかの実施態様では、キメラトランスメンブレンタンパク質は、配列番号:5、6、7、8、9、10または11のいずれか1つに示すアミノ酸配列、またはその変種を含む。同様に、当該方法はさらにまた複数の組換え細胞を作製する工程を含み、ここで複数の組換え細胞を作製する工程は、キメラトランスメンブレンタンパク質をコードする核酸（例えば本明細書に記載するもの）を複数の細胞にトランスフェクトまたは感染させる工程を含む。当該方法はさらにまた親細胞を増殖させる工程を含むことができ、例えば組換え細胞は当該親細胞の娘細胞であり得る。当該方法は細胞の集団を拡張する工程を含むことができ、例えば当該方法は、本明細書に記載の組換え細胞の集団を対象動物に投与する工程を含むことができ、当該複数の組換え細胞の各細胞は親細胞の娘細胞であり得る。
当該方法はさらにまた当該対象動物から当該細胞または親細胞を単離する工程を含むことができる。
当該方法はさらにまた、例えば蛍光活性化細胞ソーティング（“FACS”）または磁気活性化細胞ソーティング（“MACS”）によって、細胞をソーティングする工程を含むことができる。
【００３２】
細胞は、任意の適切な経路によって、例えば医薬的に許容できる組成物として対象動物に投与することができる。いくつかの実施態様では、この組成物は発熱物質を含まない。例えば、細胞の投与は当業界で公知の任意の方法を用いて実施できる。例えば、投与は非経口、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、点眼、心室内、関節内、脊髄内、嚢内、腹腔内、脳室内、または髄腔内であり得る。非経口投与のためには、細胞は、医薬的に許容できるビヒクルまたは担体との組成物で静脈内、皮下または筋肉内注射によって投与できる。細胞は、注射（例えばボーラス注射または連続輸液）による非経口投与のために処方することができる。組成物は、例えば懸濁物または油性若しくは水性ビヒクル中のエマルジョンの形状を採ることができ、処方薬剤（例えば懸濁剤、安定化剤および/または分散剤）を含むことができる。
注射で投与するために、無菌的水性ビヒクルである溶液中の細胞を用いることを所望できる。前記ビヒクルはまた、他の溶質（例えば緩衝剤または保存料とともに溶液を等張にさせるために十分な量の医薬的に許容できる塩またはグルコース）を含むことができる。いくつかの実施態様では、医薬組成物を医薬的に許容できる担体と一緒に処方して、注射投与が可能な無菌的溶液または懸濁物が提供され得る。特に、注射可能組成物は慣習的形状で、流動性溶液若しくは懸濁物としてまたはエマルジョンとして調製できる。適切な賦形剤は、例えば水、生理食塩水、デキストロース、マンニトール、ラクトース、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、システイン塩酸塩などである。加えて、所望される場合には、注射可能な医薬組成物は少量の無毒な補助物質、例えば湿潤剤、pH緩衝剤などを含むことができる。適切な医薬担体は以下に記載されている：“Remington's pharmaceutical Sciences”（E.W.Martin）。
【００３３】
対象動物は免疫細胞を含む任意の生物であり得る。例えば、対象動物は、げっ歯類、イヌ類、ネコ類、ブタ類、ヒツジ類、ウシ類、ウマ類、および霊長類から選択できる。対象動物はマウスまたはヒトであり得る。
いくつかの実施態様では、対象動物は新生物を有することができる。新生物は良性新生物、悪性新生物、または二次性新生物であり得る。新生物は癌であり得る。新生物は、リンパ腫または白血病（例えば慢性リンパ球性白血病（“CLL”）または急性リンパ芽球性白血病（“ALL”））であり得る。対象動物は、神経膠芽細胞腫、髄芽細胞腫、乳癌、頭頸部癌、腎臓癌、卵巣癌、カポジ肉腫、急性骨髄性白血病、およびB系列悪性疾患を有し得る。対象動物は多発性骨髄腫を有し得る。
いくつかの実施態様では、対象動物は“その必要がある”対象動物である。本明細書で用いられるように、“その必要がある”という語句は、当該対象動物が特定の方法または治療の必要があると確認されたかまたは疑われることを意味する。いくつかの実施態様では、確認は任意の診断手段によることができる。本明細書に記載する方法および治療のいずれにおいても、対象動物にはその必要があり得る。
本明細書で提供する受容体はまた、他のキメラ活性化受容体（“CAR”とも称され得る）とともに細胞内に配置され得る。
【００３４】
[実施例]
下記実施例は本明細書に記載する方法および組成物の例証であるが、前記方法および組成物を限定しない。治療方法で通常見いだされる種々の条件およびパラメーターにおける他の適切な改変および順化であって当業者に明白なものは、当該実施態様の趣旨および範囲内である。
【実施例１】
【００３５】
実施例1：レンチウイルス形質導入Jurkat白血病細胞株におけるPD-1スイッチ受容体の発現
レンチウイルス発現系を用いて本明細書に記載するように、下記に記載の受容体をJurkat細胞に形質導入した。簡単に記せば、緑色蛍光タンパク質（GFP）のみを保持する空ベクターコントロール（空ベクター）を保持するレンチウイルスまたはT2a切断可能ペプチドによってGFPに連結された6つのPD-1スイッチ受容体のそれぞれを保持するレンチウイルスがJurkat細胞に形質導入された。形質導入から4日して、細胞を抗PD-PECy7またはアイソタイプ適合コントロール抗体で標識し、ベックマンコールターガリオス（Beckman Coulter Galios）フローサイトメーターを用いて分析した。PD-1、PD-1スイッチ受容体またはGFPを発現しない非形質導入Jurkat細胞（非形質導入）を同じ方法で標識し、陰性コントロールとして用いた。受容体は細胞内で発現されることが見いだされた。
発現はまた、細胞をテトラマーヒトPDL1と結合させてFACSで分析することによって決定された（FACSはPD-1スイッチ受容体がPD-1リガンドPDL1と結合できることを示した）。前記は下記の手順を用いて決定された。簡単に記せば、緑色蛍光タンパク質（GFP）のみを保持する空ベクターコントロール（空ベクター）を保持するレンチウイルスまたはT2a切断可能ペプチドによってGFPに連結された6つのPD-1スイッチ受容体のそれぞれを保持するレンチウイルスがJurkat細胞に形質導入された。蛍光分子フィコエリトリン（PE）タグを付加したテトラマーヒトPDL1-Igで細胞を標識し、ベックマンコールターガリオスフローサイトメーターを用いて分析した。PD-1、PD-1スイッチ受容体またはGFPを発現しない非形質導入Jurkat細胞（非形質導入）を同じ方法で標識し、陰性コントロールとして用いた。
受容体はまたMILへの形質導入後に発現されることが見いだされた。簡単に記せば、3人の多発性骨髄腫患者（A）患者476−2312、B）患者1431、C）患者1943）の骨髄（BM）を用いて、低酸素条件下で活性化MILを生成した。3日目に、当該細胞に、GFPのみを保持する空ベクターコントロール（空ベクター）を保持するレンチウイルスまたはT2a切断可能ペプチドによってGFPに連結された6つのPD-1スイッチ受容体のそれぞれを保持するレンチウイルスを形質導入した。形質導入から3日して、細胞を抗CD3-APC、抗CD8-APCH7、ライブ-デッドイェロー（Live-dead Yellow）、および抗PD-PECy7またはアイソタイプ適合コントロール抗体で標識し、ベックマンコールターガリオスフローサイトメーターを用いて分析した。PD-1スイッチ受容体またはGFPを発現しない非形質導入MIL（非形質導入）を同じ方法で標識し、陰性コントロールとして用いた。発現はフローサイトメトリーによって測定した。空ベクターコントロールで形質導入されたMILと比較してGFP+PD-1スイッチ受容体を形質導入されたMILで観察されるPD-1発現の増加は、PD-1スイッチ受容体の発現と一致する。MILは低酸素条件下で活性化された。これらの結果は、当該受容体が異なる細胞タイプで発現することができたことを示している。受容体を発現する細胞は新生物（例えば本明細書に記載する癌）を治療するために用いることができる。
【実施例２】
【００３６】
実施例2：低酸素活性化MILは癌を治療する
対象動物から入手したMILを本明細書に記載するように活性化および増殖させる。簡単に記せば、対象動物から骨髄サンプルを入手後、WO2016037054（参照によってその全体が本明細書に含まれる）に記載するように、抗CD3/抗CD28ビーズおよびサイトカインの存在下で低酸素条件でインキュベートする。続いて、配列番号:21、23、25、27、29または31を含むキメラトランスメンブレンタンパク質をコードする核酸分子を含むウイルスをMILに感染させる。当該核酸分子はまたトランスフェクションまたはトランスダクションによって導入され得る。キメラ受容体はまた本明細書で提供するリーダー配列を含むことができる。続いて、細胞を正常酸素条件下で増殖させて拡張する。コントロールおよび感染MILを異なる細胞タイプと接触させる。MILの増殖も抗原を認識するMILの能力もキメラトランスメンブレンタンパク質の存在によって負の影響を受けない、MILへのキメラトランスメンブレンタンパク質の添加はその機能および増殖に有害ではない。癌（例えば多発性骨髄腫）を有する対象動物にMILが投与されて癌が治療され、当該対象動物は寛解状態にある。細胞はまた存続し、患者を寛解状態に維持し続けることが見いだされる。
要約すれば、本明細書で提供する実施態様および実施例は、本明細書で提供するキメラトランスメンブレンタンパク質を発現する細胞は、癌の治療および/または免疫応答の調節に効果的に用いることができることを示す。
本出願で引用されたおよび/またはアプリケーションデータシートに挙げられた米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物（CAS番号を含む）のいずれも参照によってその全体が本明細書に含まれる。
【配列表】
2020512284000001.app
【国際調査報告】
2020512284.tif 000016
2020512284.tif 000017
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