(57)【要約】  本発明は、肺における炎症をもたらす病態を患う哺乳動物の肺における炎症を低減させるための組成物及び方法を提供する。本明細書に記載の組成物及び方法は、単独で、又は細胞外ベシクル取り込み阻害剤との組合せで使用される、哺乳動物におけるインフラマソームシグナリングを阻害する薬剤、例えば、インフラマソーム構成成分に対して指向される抗体を含む。
2020503345.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺における炎症の治療を、それを必要とする患者において行う方法であって、インフラマソームシグナリングを阻害する薬剤を含む組成物を前記患者に投与し、それにより前記患者の前記肺における前記炎症を治療することを含む方法。
【請求項２】
前記肺における前記炎症が、中枢神経系（ＣＮＳ）損傷、神経変性疾患、自己免疫疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、間質性肺疾患及び急性呼吸窮迫症候群から選択される病態により引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＮＳ損傷が、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中及び脊髄損傷（ＳＣＩ）からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記神経変性疾患が、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）及びパーキンソン病（ＰＤ）からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物の前記投与が、前記患者の肺細胞におけるインフラマソーム活性化の阻害をもたらす、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物の前記投与が、対照と比較して前記患者の肺細胞におけるカスパーゼ−１、ヌクレオチド結合ロイシンリッチリピートピリンドメイン含有タンパク質１（ＮＬＲＰ１）、ヌクレオチド結合ロイシンリッチリピートピリンドメイン含有タンパク質２（ＮＬＲＰ２）、ヌクレオチド結合ロイシンリッチリピートピリンドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）、ＮＬＲファミリーＣＡＲＤドメイン含有タンパク質４（ＮＬＲＣ４）、カスパーゼ−１１、Ｘ連鎖アポトーシス阻害タンパク質（ＸＩＡＰ）、パンネキシン−１、カスパーゼ活性化リクルートメントドメイン含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ＡＳＣ）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、ハイモビリティーグループボックス１（ＨＭＧＢ１）又はアブセントインメラノーマ２（ＡＩＭ２）レベルの低減をもたらし、前記対照は、非処理患者である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記肺細胞が、ＩＩ型肺胞細胞である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物の前記投与が、対照と比較して急性肺損傷（ＡＬＩ）の低減をもたらし、前記対照は、非処理患者である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＡＬＩの前記低減が、肺胞及び／又は間質腔中への好中球浸潤の低減、肺胞中隔肥厚の低減若しくは不存在又はそれらの組合せにより証明される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記薬剤が、細胞外ベシクル（ＥＶ）取り込み阻害剤、インフラマソーム構成成分に結合する抗体又はそれらの組合せである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＥＶ取り込み阻害剤が、化合物又は抗体であり、前記抗体は、表１から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記薬剤が、インフラマソーム構成成分に結合する抗体との組合せのＥＶ取り込み阻害剤である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＥＶ取り込み阻害剤が、ヘパリンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヘパリンが、エノキサパリンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
インフラマソーム構成成分に結合する前記抗体が、哺乳動物ＡＩＭ２、ＮＬＲＰ１、ＮＬＲＰ２、ＮＬＲＰ３又はＮＬＲＣ４インフラマソームの構成成分に特異的に結合する抗体である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記インフラマソーム構成成分が、カスパーゼ−１、ＡＳＣ又はＡＩＭ２である、請求項１０又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記インフラマソーム構成成分が、ＡＳＣである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体が、前記ＡＳＣタンパク質のＮ末端ＰＹＲＩＮ−ＰＡＡＤ−ＤＡＰＩＮドメイン（ＰＹＤ）、Ｃ末端カスパーゼリクルートメントドメイン（ＣＡＲＤ）ドメイン又は前記ＰＹＤ若しくはＣＡＲＤドメインに由来するエピトープに結合する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体が、配列番号１及び配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸に結合する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体が、前記患者の前記肺におけるＡＳＣ活性を阻害する、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物が、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤と配合される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物を、脳室内、腹腔内、静脈内投与するか、又は吸入により投与する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
中枢神経系（ＣＮＳ）損傷を受けた患者の肺における炎症を治療する方法であって、インフラマソームシグナリングを阻害する薬剤を含む組成物を前記患者に投与し、それにより前記患者の前記肺における前記炎症を治療することを含む方法。
【請求項２４】
前記ＣＮＳ損傷が、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中及び脊髄損傷（ＳＣＩ）からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物の前記投与が、前記患者の肺細胞におけるインフラマソーム活性化の阻害をもたらす、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物の前記投与が、対照と比較して前記患者の肺細胞におけるカスパーゼ−１、ＮＬＲＰ１、ＮＬＲＰ２、ＮＬＲＰ３、ＮＬＲＣ４、カスパーゼ−１１、ＸＩＡＰ、パンネキシン−１、カスパーゼ活性化リクルートメントドメインを含有するアポトーシス関連スペック様タンパク質（ＡＳＣ）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、ハイモビリティーグループボックス１（ＨＭＧＢ１）又はアブセントインメラノーマ２（ＡＩＭ２）レベルの低減をもたらし、前記対照は、非処理患者である、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記肺細胞が、ＩＩ型肺胞細胞である、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物の前記投与が、対照と比較して急性肺損傷（ＡＬＩ）の低減をもたらし、前記対照は、非処理患者である、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ＡＬＩの前記低減が、肺胞及び／又は間質腔中への好中球浸潤の低減、肺胞中隔肥厚の低減若しくは不存在又はそれらの組合せにより証明される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記薬剤が、細胞外ベシクル（ＥＶ）取り込み阻害剤、インフラマソーム構成成分に結合する抗体又はそれらの組合せである、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＥＶ取り込み阻害剤が、化合物又は抗体であり、前記抗体は、表１から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記薬剤が、インフラマソーム構成成分に結合する抗体との組合せのＥＶ取り込み阻害剤である、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＥＶ取り込み阻害剤が、ヘパリンである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ヘパリンが、エノキサパリンである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
インフラマソーム構成成分に結合する前記抗体が、哺乳動物ＡＩＭ２、ＮＬＲＰ１、ＮＬＲＰ２、ＮＬＲＰ３又はＮＬＲＣ４インフラマソームの構成成分に特異的に結合する抗体である、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記インフラマソーム構成成分が、カスパーゼ−１、ＡＳＣ又はＡＩＭ２である、請求項３０又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記インフラマソーム構成成分が、ＡＳＣである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体が、前記ＡＳＣタンパク質のＰＹＤ、ＣＡＲＤドメイン又は前記ＰＹＤ若しくはＣＡＲＤドメインに由来のエピトープに結合する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗体が、配列番号１及び配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸に結合する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体が、前記患者の前記肺におけるＡＳＣ活性を阻害する、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記組成物が、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤と配合される、請求項２３〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記組成物を、脳室内、腹腔内、静脈内投与するか、又は吸入により投与する、請求項２３〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]  本出願は、全ての目的のために参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１６年１２月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／４４０，１８０号からの優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記述
[0002]  本発明は、米国政府の支援を受けてNational Institute of Neurological Disorders and Stroke（ＮＩＮＤＳ）により授与された助成金番号４Ｒ４２ＢＳ０８６２７４−０２のもとなされた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
電子的に提出されたテキストファイルの説明
[0003]  本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ読取可能フォーマットコピー（ファイル名：ＵＮＭＩ＿０１０＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１７年１２月２８日、ファイルサイズ２キロバイト）。
【０００４】
分野
[0004]  本発明は、一般に、免疫学及び医学の分野に関する。より特定すると、本発明は、肺における炎症を産生する病態に応答して炎症を低減させるための治療として哺乳動物の肺におけるＡＳＣ（カスパーゼ活性化リクルートメントドメイン（ＣＡＲＤ）含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（Apoptosis-associated Speck-like protein containing a Caspase Activating Recruitment Domain(CARD)））活性及びアブセントインメラノーマ２（Absent in Melanoma 2）（ＡＩＭ２）インフラマソーム活性をモジュレートするための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
背景
[0005]  重度外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は広範な公衆衛生上の問題であり、世界中にわたる死亡及び罹患の主因である（３）。脳への直接的損傷の他、ＴＢＩは、他の器官、例えば、肺における合併症をもたらし得る。急性肺損傷（ＡＬＩ；２）は、一般的な外傷後の心肺障害であり、４０％超の院内死亡率を伴う（４）。ＴＢＩ患者は、特に、ＡＬＩを発症しやすく、一部の研究は３０％ほども高い発生率を報告している（５）。近年の研究は、全身性炎症因子がＴＢＩ後の肺機能不全及び肺損傷をもたらし得ることを示しているが（６）、ＴＢＩ誘導肺損傷の基礎となる正確な分子機序の定義は不十分のままである。
【０００６】
[0006]  損傷細胞から放出される大量の分泌炎症性メディエーター、例として、サイトカイン、ケモカイン、及び損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）は、脳炎症に寄与し、遠位器官、例えば、肺を冒す（５）。最も広く研究されているＤＡＭＰの１つは、種々の病原性状態、例として、ＴＢＩにおける炎症の早期メディエーターとして機能し得るハイモビリティーグループボックス−１（high mobility group box-1）（ＨＭＧＢ１）である（７）。より近年の研究は、ＨＭＧＢ１がＴＢＩ誘導肺機能不全の機序に関与し得ることを示している（８）。ＨＭＧＢ１放出は、ＴＢＩ後のカスパーゼ−１の活性化並びにＩＬ−１β及びＩＬ−１８のプロセシングに関与する多タンパク質複合体のインフラマソーム（９）により調節され得る（１０）。
【０００７】
[0007]  ＴＢＩ後の肺合併症の病理学的機序を説明するための種々の説明、例として、タンパク質性破片の毛細血管漏出及び浸潤をもたらす血管浸透性の増加が記載されている（１１）。細胞外ベシクル（ＥＶ）は、細胞間コミュニケーションにおける役割を担う膜含有ベシクルであり（１２）、ＬＰＳ誘導ネズミモデルにおけるＡＬＩの発症における役割を担うことに関与するとされている。さらに、ＥＶは生物活性サイトカイン、ＩＬ−１β及びインフラマソームタンパク質を担持し得（１３）（１４）、その積み荷を介して免疫応答をトリガーし、隣接及び周囲細胞に炎症を増幅させ得ることが示されている。しかしながら、ＥＶ媒介インフラマソームシグナリングがＴＢＩ誘導ＡＬＩの病理学的機序に寄与し得るか否かは不明である。さらに、ＴＢＩ誘導ＡＬＩの病理学的機序が、肺炎症を産生する他の病態により共有されるか否かも不明である。さらに、肺炎症を治療するためのFederal Drug Administration（ＦＤＡ）承認薬物は不足している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
[0008]  したがって、ＴＢＩ及び他の病態により引き起こされる肺炎症の病理学的機序の解明だけでなく、肺炎症を治療及び／又は予防するための治療組成物及びその使用の開発が速やかに必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
概要
[0009]  一態様において、本明細書において、肺における炎症の治療を、それを必要とする患者において行う方法であって、インフラマソームシグナリングを阻害する薬剤を含む組成物を患者に投与し、それにより患者の肺における炎症を治療することを含む方法が提供される。一部の例において、肺における炎症は、中枢神経系（ＣＮＳ）損傷、神経変性疾患、自己免疫疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、間質性肺疾患及び急性呼吸窮迫症候群から選択される病態により引き起こされる。一部の例において、ＣＮＳ損傷は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中及び脊髄損傷（ＳＣＩ）からなる群から選択される。一部の例において、神経変性疾患は、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）及びパーキンソン病（ＰＤ）からなる群から選択される。一部の例において、組成物の投与は、患者の肺細胞におけるインフラマソーム活性の阻害をもたらす。一部の例において、組成物の投与は、対照と比較して患者の肺細胞におけるカスパーゼ−１、ヌクレオチド結合ロイシンリッチリピートピリンドメイン含有タンパク質１（nucleotide-binding leucine-rich repeat pyrin domain containing protein 1）（ＮＬＲＰ１）、ヌクレオチド結合ロイシンリッチリピートピリンドメイン含有タンパク質２（ＮＬＲＰ２）、ヌクレオチド結合ロイシンリッチリピートピリンドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）、ＮＬＲファミリーＣＡＲＤドメイン含有タンパク質４（ＮＬＲＣ４）、カスパーゼ−１１、Ｘ連鎖アポトーシス阻害タンパク質（ＸＩＡＰ）、パンネキシン−１、カスパーゼ活性化リクルートメントドメイン含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ＡＳＣ）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、ハイモビリティーグループボックス１（ＨＭＧＢ１）又はアブセントインメラノーマ２（ＡＩＭ２）レベルの低減をもたらし、対照は、非処理患者である。一部の例において、肺細胞は、ＩＩ型肺胞細胞である。一部の例において、組成物の投与は、対照と比較して急性肺損傷（ＡＬＩ）の低減をもたらし、対照は、非処理患者である。一部の例において、ＡＬＩの低減は、肺胞及び／又は間質腔中への好中球浸潤の低減、肺胞中隔肥厚の低減若しくは不存在又はそれらの組合せにより証明される。一部の例において、薬剤は、細胞外ベシクル（ＥＶ）取り込み阻害剤、インフラマソーム構成成分に結合する抗体又はそれらの組合せである。一部の例において、ＥＶ取り込み阻害剤は、化合物又は抗体であり、抗体は、表１から選択される。一部の例において、薬剤は、インフラマソーム構成成分に結合する抗体との組合せのＥＶ取り込み阻害剤である。一部の例において、ＥＶ取り込み阻害剤は、ヘパリンである。一部の例において、ヘパリンは、エノキサパリンである。一部の例において、インフラマソーム構成成分に結合する抗体は、哺乳動物ＡＩＭ２、ＮＬＲＰ１、ＮＬＲＰ２、ＮＬＲＰ３又はＮＬＲＣ４インフラマソームの構成成分に特異的に結合する抗体である。一部の例において、インフラマソーム構成成分は、カスパーゼ−１、ＡＳＣ又はＡＩＭ２である。一部の例において、インフラマソーム構成成分は、ＡＳＣである。一部の例において、抗体は、ＡＳＣタンパク質のＮ末端ＰＹＲＩＮ−ＰＡＡＤ−���ＡＰＩＮドメイン（ＰＹＤ）、Ｃ末端カスパーゼリクルートメントドメイン（ＣＡＲＤ）ドメイン又はＰＹＤ若しくはＣＡＲＤドメインに由来するエピトープに結合する。一部の例において、抗体は、配列番号１及び配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するタンパク質に結合する。一部の例において、抗体は、患者の肺におけるＡＳＣ活性を阻害する。一部の例において、組成物は、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤と配合される。一部の例において、組成物は、脳室内、腹腔内、静脈内投与するか、又は吸入により投与する。
【００１０】
[0010]  別の態様において、本明細書において、中枢神経系（ＣＮＳ）損傷を受けた患者の肺における炎症を治療する方法であって、インフラマソームシグナリングを阻害する薬剤を含む組成物を患者に投与し、それにより患者の肺における炎症を治療することを含む方法が提供される。一部の例において、ＣＮＳ損傷は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中及び脊髄損傷（ＳＣＩ）からなる群から選択される。一部の例において、組成物の投与は、患者の肺細胞におけるインフラマソーム活性化の阻害をもたらす。一部の例において、組成物の投与は、対照と比較して患者の肺細胞におけるカスパーゼ−１、ＮＬＲＰ１、ＮＬＲＰ２、ＮＬＲＰ３、ＮＬＲＣ４、カスパーゼ−１１、ＸＩＡＰ、パンネキシン−１、カスパーゼ活性化リクルートメントドメイン含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ＡＳＣ）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、ハイモビリティーグループボックス１（ＨＭＧＢ１）又はアブセントインメラノーマ２（ＡＩＭ２）レベルの低減をもたらし、対照は、非処理患者である。一部の例において、肺細胞は、ＩＩ型肺胞細胞である。一部の例において、組成物の投与は、対照と比較して急性肺損傷（ＡＬＩ）の低減をもたらし、対照は、非処理患者である。一部の例において、ＡＬＩの低減は、肺胞及び／又は間質腔中への好中球浸潤の低減、肺胞中隔肥厚の低減若しくは不存在又はそれらの組合せにより証明される。一部の例において、薬剤は、細胞外ベシクル（ＥＶ）取り込み阻害剤、インフラマソーム構成成分に結合する抗体又はそれらの組合せである。一部の例において、ＥＶ取り込み阻害剤は、化合物又は抗体であり、抗体は、表１から選択される。一部の例において、薬剤は、インフラマソーム構成成分に結合する抗体との組合せのＥＶ取り込み阻害剤である。一部の例において、ＥＶ取り込み阻害剤は、ヘパリンである。一部の例において、ヘパリンは、エノキサパリンである。一部の例において、インフラマソーム構成成分に結合する抗体は、哺乳動物ＡＩＭ２、ＮＬＲＰ１、ＮＬＲＰ２、ＮＬＲＰ３又はＮＬＲＣ４インフラマソームの構成成分に特異的に結合する抗体である。一部の例において、インフラマソーム構成成分は、カスパーゼ−１、ＡＳＣ又はＡＩＭ２である。一部の例において、インフラマソーム構成成分は、ＡＳＣである。一部の例において、抗体は、ＡＳＣタンパク質のＰＹＤ、ＣＡＲＤドメイン又はＰＹＤ若しくはＣＡＲＤドメインに由来するエピトープに結合する。一部の例において、抗体は、配列番号１及び配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するタンパク質に結合する。一部の例において、抗体は、患者の肺におけるＡＳＣ活性を阻害する。一部の例において、組成物は、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤と配合される。一部の例において、組成物は、脳室内、腹腔内、静脈内投与するか、又は吸入により投与する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
図面の簡単な説明
【図１Ａ】[0011]ＴＢＩ後のＣ５７／ＢＬ６マウス皮質及び肺組織におけるインフラマソーム活性化を説明する。図１Ａは、ＴＢＩ後の活性カスパーゼ−１、ＡＳＣ、ＩＬ−１８、ＩＬ−β、ＨＭＧＢ１、及びＡＩＭ２の代表的なイムノブロットを示す。
【図１Ｂ】[0011]活性カスパーゼ−１（図１Ｂ）は、皮質組織中でＴＢＩの４及び２４時間後において有意に上昇する。データは、平均＋／−ＳＥＭ；疑似と比較して****ｐ＜０．００１、***ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５として提示した。１群当たりＮ＝４〜５。
【図１Ｃ】[0011]ＡＳＣ（図１Ｃ）は、皮質組織中でＴＢＩの４及び２４時間後において有意に上昇する。データは、平均＋／−ＳＥＭ；疑似と比較して****ｐ＜０．００１、***ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５として提示した。１群当たりＮ＝４〜５。
【図１Ｄ】[0011]ＩＬ−１８（図１Ｄ）は、皮質組織中でＴＢＩの４及び２４時間後において有意に上昇する。データは、平均＋／−ＳＥＭ；疑似と比較して****ｐ＜０．００１、***ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５として提示した。１群当たりＮ＝４〜５。
【図１Ｅ】[0011]ＨＭＧＢ１（図１Ｅ）は、皮質組織中でＴＢＩの４及び２４時間後において有意に上昇する。データは、平均＋／−ＳＥＭ；疑似と比較して****ｐ＜０．００１、***ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５として提示した。１群当たりＮ＝４〜５。
【図１Ｆ】[0011]ＡＩＭ２（図１Ｆ）は、皮質組織中でＴＢＩの４及び２４時間後において有意に上昇する。データは、平均＋／−ＳＥＭ；疑似と比較して****ｐ＜０．００１、***ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５として提示した。１群当たりＮ＝４〜５。
【図１Ｇ】[0011]ＩＬ−β（図１Ｇ）は、皮質組織中でＴＢＩの４及び２４時間後において有意に上昇する。データは、平均＋／−ＳＥＭ；疑似と比較して****ｐ＜０．００１、***ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５として提示した。１群当たりＮ＝４〜５。
【図１Ｈ】[0011]図１Ｈは、肺組織における活性カスパーゼ−１、ＡＳＣ、ＩＬ−１８、ＩＬ−β、ＨＭＧＢ１、及びＡＩＭ２の代表的なイムノブロットを示す。
【図１Ｉ】[0011]活性カスパーゼ−１（図１Ｉ）は、肺組織中でＴＢＩの４及び２４時間後に有意に上昇する。データは、平均＋／−ＳＥＭとして提示した。１群当たりＮ＝４〜５、疑似と比較して**ｐ＜０．０１．、*ｐ＜０．０５。
【図１Ｊ】[0011]ＡＳＣ（図１Ｊ）は、肺組織中でＴＢＩの４及び２４時間後に有意に上昇する。データは、平均＋／−ＳＥＭとして提示した。１群当たりＮ＝４〜５、疑似と比較して**ｐ＜０．０１．、*ｐ＜０．０５。
【図１Ｋ】[0011]ＩＬ−１８（図１Ｋ）は、肺組織中でＴＢＩの４及び２４時間後に有意に上昇する。データは、平均＋／−ＳＥＭとして提示した。１群当たりＮ＝４〜５、疑似と比較して**ｐ＜０．０１．、*ｐ＜０．０５。
【図１Ｌ】[0011]ＨＭＧＢ１（図１Ｌ）は、肺組織中でＴＢＩの４及び２４時間後に有意に上昇する。データは、平均＋／−ＳＥＭとして提示した。１群当たりＮ＝４〜５、疑似と比較して**ｐ＜０．０１．、*ｐ＜０．０５。
【図１Ｍ】[0011]ＡＩＭ２（図１Ｍ）は、肺組織中でＴＢＩの４及び２４時間後に有意に上昇する。データは、平均＋／−ＳＥＭとして提示した。１群当たりＮ＝４〜５、疑似と比較して**ｐ＜０．０１．、*ｐ＜０．０５。
【図１Ｎ】[0011]ＩＬ−β（図１Ｎ）は、肺組織中でＴＢＩの４及び２４時間後に有意に上昇する。データは、平均＋／−ＳＥＭとして提示した。１群当たりＮ＝４〜５、疑似と比較して**ｐ＜０．０１．、*ｐ＜０．０５。
【図２Ａ】[0012]ＩＩ型肺胞上皮細胞におけるインフラマソームタンパク質の発現を説明する。図２ＡはＡＩＭ２を示す。
【図２Ｂ】[0012]図２Ｂは活性カスパーゼ−１を示す。
【図２Ｃ】[0012]図２ＣはＡＳＣ免疫反応性がマウスと比較してＣＣＩ後（４、２４時間）に肺組織において増加することを示す。ＡＩＭ２、カスパーゼ−１、及びＡＳＣ（緑色）及びＩＩ型上皮細胞（サーファクタントプロテインＣ、赤色）の共焦点画像。
【図３Ａ】[0013]ＴＢＩがマウス肺における核及び細胞質ＨＭＧＢ１発現を増加させることを説明する。図３Ａは、ＴＢＩ後の核ＨＭＧＢ１の代表的なイムノブロットを示す。
【図３Ｂ】[0013]図３Ｂは、核ＨＭＧＢ１が、疑似と比較して４時間の損傷動物において有意に上昇することを示す。データは、平均＋／−ＳＥＭとして提示した；疑似と比較して****ｐ＜０．００１、***ｐ＜０．０１、*ｐ＜０．０５。１群当たりＮ＝４〜５。
【図３Ｃ】[0013]図３Ｃは、ＴＢＩ後の細胞質ＨＭＧＢ１の代表的なイムノブロットを示す。
【図３Ｄ】[0013]図３Ｄは、細胞質ＨＭＧＢ１が、疑似と比較して４時間の損傷動物において有意に上昇することを示す。データは、平均＋／−ＳＥＭとして提示した；疑似と比較して****ｐ＜０．００１、***ｐ＜０．０１、*ｐ＜０．０５。１群当たりＮ＝４〜５。
【図３Ｅ】[0013]図３Ｅは、ＨＭＧＢ１免疫反応性が疑似マウスと比較してＣＣＩ後に肺組織において増加したことを示す。ＨＭＧＢ１及びＩＩ型上皮細胞（サーファクタントプロテインＣ、赤色）の共焦点画像。
【図４Ａ】[0014]ＴＢＩの４時間後のマウス肺におけるピロプトソーム形成を説明する。図４Ａは、ＴＢＩが肺組織におけるＡＳＣのラダリングを誘導することを示し、カスパーゼ−１の活性化及びピロトーシスをもたらすＡＳＣ二量体のオリゴマー化であるピロプトソームの形成を示す。
【図４Ｂ】[0014]図４Ｂはガスダーミンの代表的なイムノブロットを示す。
【図４Ｃ】[0014]図４Ｃはガスダーミンの定量を示す。ガスダーミン−Ｄは、ＴＢＩ後に肺組織において有意に上昇する。データは、平均＋／−ＳＥＭとして提示した。１群当たりＮ＝４〜５、疑似と比較して**ｐ＜０．０１．、*ｐ＜０．０５。
【図５Ａ】[0015]ＴＢＩがマウスにおいて肺胞形態変化及び急性肺損傷を誘導することを説明する。図５Ａは、４時間及び２４時間における疑似及び損傷動物からの肺切片のＨ及びＥ染色を示す。切片は、好中球浸潤（矢印頭部）、肺胞毛細血管膜の形態の変化（アスタリスク、*）、間質浮腫（短矢印）の証拠、並びに間質及び肺胞中隔の肥厚（ポンド、＃）の証拠を示す。
【図５Ｂ】[0015]図５Ｂは、急性肺損傷スコアリングが４時間及び２４時間において疑似と比較して損傷動物において有意に増加することを示す。データは、平均＋／−ＳＥＭとして提示した。１群当たりＮ＝４〜５、疑似と比較して**ｐ＜０．０１．、*ｐ＜０．０５。
【図６】[0016]対照及びＴＢＩ損傷マウスからの血清由来ＥＶにおけるＣＤ８１の発現を説明する。疑似対照及びＴＢＩ損傷マウスからの血清由来ＥＶにおけるＣＤ８１の代表的なイムノブロット。
【図７Ａ】[0017]ＴＢＩ動物からのＥＶの養子移植が非損傷マウスの肺においてカスパーゼ−１及びＡＳＣを誘導することを説明する。図７Ａは、カスパーゼ−１（図７Ｂ）、ＡＳＣ（図７Ｃ）、ＩＬ−１８（図７Ｄ）、ＡＩＭ２（図７Ｅ）、ＨＭＧＢ１（図７Ｆ）が、疑似動物からのＥＶと比較してＴＢＩマウスから単離されたＥＶを受容した動物の肺において上昇することを示す代表的なイムノブロットを説明する。
【図７Ｂ】[0017]カスパーゼ−１（図７Ｂ）が、疑似動物からのＥＶと比較してＴＢＩマウスから単離されたＥＶを受容した動物の肺において上昇することを示す。データを、＋平均／−ＳＥＭとして提示した；疑似と比較して*ｐ＜．０．０５。１群当たりＮ＝３。
【図７Ｃ】[0017]ＡＳＣ（図７Ｃ）が、疑似動物からのＥＶと比較してＴＢＩマウスから単離されたＥＶを受容した動物の肺において上昇することを示す。データを、＋平均／−ＳＥＭとして提示した；疑似と比較して*ｐ＜．０．０５。１群当たりＮ＝３。
【図７Ｄ】[0017]ＩＬ−１８（図７Ｄ）が、疑似動物からのＥＶと比較してＴＢＩマウスから単離されたＥＶを受容した動物の肺において上昇することを示す。データを、＋平均／−ＳＥＭとして提示した；疑似と比較して*ｐ＜．０．０５。１群当たりＮ＝３。
【図７Ｅ】[0017]ＡＩＭ２（図７Ｅ）が、疑似動物からのＥＶと比較してＴＢＩマウスから単離されたＥＶを受容した動物の肺において上昇することを示す。データを、＋平均／−ＳＥＭとして提示した；疑似と比較して*ｐ＜．０．０５。１群当たりＮ＝３。
【図７Ｆ】[0017]ＨＭＧＢ１（図７Ｆ）が、疑似動物からのＥＶと比較してＴＢＩマウスから単離されたＥＶを受容した動物の肺において上昇することを示す。データを、＋平均／−ＳＥＭとして提示した；疑似と比較して*ｐ＜．０．０５。１群当たりＮ＝３。
【図７Ｇ】[0017]ＴＢＩマウスからのＥＶは、Ｈ及びＥ染色により決定されたとおり、肺胞形態変化（肺胞サイズの減少）及び炎症性細胞の浸潤を誘導した（図７Ｇ）。
【図７Ｈ】[0017]ＡＬＩスコアは、非損傷マウスと比較して損傷マウスから送達されたＥＶにおいて有意に増加する（図７Ｈ）。データは、平均＋／−ＳＥＭとして提示した；非損傷群と比較して*ｐ＜．０．０５。
【図８Ａ】[0018]エノキサパリン（３ｍｇ／ｋｇ）及びＩＣ１００（５ｍｇ／ｋｇ）による処理が、損傷マウスからのＥＶが送達された動物の肺におけるインフラマソーム発現を低減させることを説明する。図８Ａは、カスパーゼ−１（図８Ｂ）、ＡＳＣ（図８Ｃ）、ＩＬ−１β（図８Ｄ）、ＡＩＭ２（図８Ｅ）、ＨＭＧＢ１（図８Ｆ）が、非処理陽性対照動物と比較してエノキサパリン及びＩＣ１００により処理された動物の肺において低減することを示す代表的なイムノブロットを説明する。
【図８Ｂ】[0018]カスパーゼ−１（図８Ｂ）が、非処理陽性対照動物と比較してエノキサパリン及びＩＣ１００により処理された動物の肺において低減することを示す。データは、平均＋／−ＳＥＭとして提示した；疑似と比較して*ｐ＜．０．０５。１群当たりＮ＝４。
【図８Ｃ】[0018]ＡＳＣ（図８Ｃ）が、非処理陽性対照動物と比較してエノキサパリン及びＩＣ１００により処理された動物の肺において低減することを示す。データは、平均＋／−ＳＥＭとして提示した；疑似と比較して*ｐ＜．０．０５。１群当たりＮ＝４。
【図８Ｄ】[0018]ＩＬ−１β（図８Ｄ）が、非処理陽性対照動物と比較してエノキサパリン及びＩＣ１００により処理された動物の肺において低減することを示す。データは、平均＋／−ＳＥＭとして提示した；疑似と比較して*ｐ＜．０．０５。１群当たりＮ＝４。
【図８Ｅ】[0018]ＡＩＭ２（図８Ｅ）が、非処理陽性対照動物と比較してエノキサパリン及びＩＣ１００により処理された動物の肺において低減することを示す。データは、平均＋／−ＳＥＭとして提示した；疑似と比較して*ｐ＜．０．０５。１群当たりＮ＝４。
【図８Ｆ】[0018]ＨＭＧＢ１（図８Ｆ）が、非処理陽性対照動物と比較してエノキサパリン及びＩＣ１００により処理された動物の肺において低減することを示す。データは、平均＋／−ＳＥＭとして提示した；疑似と比較して*ｐ＜．０．０５。１群当たりＮ＝４。
【図９Ａ】[0019]エノキサパリン（３ｍｇ／ｋｇ）及びＩＣ１００（５ｍｇ／ｋｇ）による処理が、損傷マウスからのＥＶが送達された動物の肺におけるＡＬＩスコアを低減させることを説明する。図９Ａは、生理食塩水（図９Ａ）処理の損傷マウスからのＥＶが送達されたマウス肺からの肺切片のＨ及びＥ染色を説明する。切片は、好中球浸潤の証拠、肺胞毛細血管膜の形態の変化、間質浮腫、並びに間質及び肺胞中隔の肥厚の証拠を示す。
【図９Ｂ】[0019]図９Ｂは、非処理（図９Ｂ）の損傷マウスからのＥＶが送達されたマウス肺からの肺切片のＨ及びＥ染色を説明する。
【図９Ｃ】[0019]図９Ｃは、エノキサパリン（図９Ｃ）処理の損傷マウスからのＥＶが送達されたマウス肺からの肺切片のＨ及びＥ染色を説明する。
【図９Ｄ】[0019]図９Ｄは、ＩＣ１００（抗ＡＳＣ；図９Ｄ）処理の損傷マウスからのＥＶが送達されたマウス肺からの肺切片のＨ及びＥ染色を説明する。
【図９Ｅ】[0019]図９Ｅは、急性肺損傷スコアリングが、非処理動物と比較してエノキサパリン、ＩＣ１００により処理された動物において有意に減少することを説明する。データを、平均＋／−ＳＥＭとして提示した。１群当たりＮ＝４、**ｐ＜０．０１．、*ｐ＜０．０５。
【図１０Ａ】[0020]ＴＢＩ患者からの血清由来ＥＶの送達が、肺内皮細胞におけるインフラマソームタンパク質発現を増加させることを説明する。図１０Ａは、ＴＢＩ−ＥＶ及び対照ＥＶとの４時間のインキュベーション後のＰＭＶＥＣにおけるカスパーゼ−１、ＡＳＣ、ＡＩＭ２、ＨＭＧＢ１のウエスタンブロット表示を示す。
【図１０Ｂ】[0020]図１０Ｂは、ウエスタンブロットの定量を示す、１群当たりｎ＝３つのフィルター、ｎ＝６人の患者、ｔ検定、ｐ＜０．０５。
【図１０Ｃ】[0020]図１０Ｃは、ウエスタンブロットの定量を示す、１群当たりｎ＝３つのフィルター、ｎ＝６人の患者、ｔ検定、ｐ＜０．０５。
【図１０Ｄ】[0020]図１０Ｄは、ウエスタンブロットの定量を示す、１群当たりｎ＝３つのフィルター、ｎ＝６人の患者、ｔ検定、ｐ＜０．０５。
【図１０Ｅ】[0020]図１０Ｅは、ウエスタンブロットの定量を示す、１群当たりｎ＝３つのフィルター、ｎ＝６人の患者、ｔ検定、ｐ＜０．０５。
【図１０Ｆ】[0020]図１０Ｆは、Ellaシンプルプレックスアッセイを使用したＩＬ−１β発現の有意な増加の免疫アッセイ結果を示す。１群当たりｎ＝３つのフィルター、ｎ＝６人の患者、ｔ検定、ｐ＜０．０５。
【図１１Ａ】[0021]肺内皮細胞へのＴＢＩ−ＥＶの送達が、活性カスパーゼ−１の免疫反応性及び細胞死を増加させることを説明する。図１１Ａは、カスパーゼ−１FLICA及びＰＩ染色の同時局在化並びにＴＢＩ−ＥＶと４時間インキュベートされたＰＭＶＥＣを示す。
【図１１Ｂ】[0021]図１１Ｂは、対照ＥＶと４時間インキュベートされたＰＭＶＥＣにおけるカスパーゼ−１FLICA及びＰＩ染色を示す。
【図１１Ｃ】[0021]図１１Ｃは、ＴＢＩ及び対照ＥＶと４時間インキュベートされたＰＭＶＥＣの蛍光プレートリーダー分析を示す。ｎ＝６、ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
定義
[0022]  特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。
【００１３】
[0023]  本明細書において使用される「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、長さにも翻訳後修飾にも、例えば、グリコシル化にもリン酸化にも関係なくアミノ酸の任意のペプチド結合鎖を意味するために同義的に使用される。
【００１４】
[0024]  本明細書において使用される用語「抗体」は、一般に、及び広く、免疫グロブリン、モノクローナル抗体、及びポリクローナル抗体、並びにそれらの活性断片を指す。断片は、それがコグネイト抗原（例えば、ＡＳＣ、ＮＬＲＰ１、ＡＩＭ２など）に結合するという点で活性であり得、又はそれは、それが生物学的に機能的であるという点で活性であり得る。本明細書における使用のための抗体は、当技術分野において公知の技術を使用するキメラ、ヒト化、又はヒト抗体であり得る。
【００１５】
[0025]  本明細書において使用される用語「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体の最小部分が他のヒト抗体中に導入されている抗体を指す。
【００１６】
[0026]  本明細書において使用される用語「ヒト抗体」は、軽微な配列変化又はバリエーションを有する、タンパク質の実質的に全ての部分がヒトにおいて実質的に非免疫原性である抗体を指す。
【００１７】
[0027]  抗原結合部位は、一般に、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）免疫グロブリンドメインにより形成され得、抗原結合界面は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される６つの表面ポリペプチドループにより形成される。フレームワーク領域（ＦＲ）と一緒にＶＨ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）及びＶＬ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）においてそれぞれ３つのＣＤＲが存在する。
【００１８】
[0028]  用語「ＣＤＲ領域」又は「ＣＤＲ」は、Kabat et al.,1991(Kabat,E.A.et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Edition.US Department of Health and Human Services,Public Service,NIH,Washington）、及び後版により定義されるとおり、免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖の超可変領域を意味し得る。抗体は、典型的には、３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含有する。
【００１９】
[0029]  全抗体の断片も抗原に結合し得ることが示されている。結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片（Ward,E.S.et al.,(1989)Nature 341,544-546）；（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片（McCafferty et al.,(1990)Nature,348,552-554）；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片（Holt et al.,(2003)Trends in Biotechnology 21,484-490）；（ｉｖ）ＶＨ又はＶＬドメインからなるｄＡｂ断片（Ward,E.S.et al.,Nature 341,544-546(1989）、McCafferty et al.,(1990)Nature,348,552-554、Holt et al.,(2003)Trends in Biotechnology 21,484-490］；（ｖ）単離ＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの結合Ｆａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）2断片（ｖｉｉ）ＶＨドメイン及びＶＬドメインが、その２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成することを可能とするペプチドリンカーにより結合している単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、（Bird et al.,(1988)Science,242,423-426、Huston et al.,(1988)PNAS USA,85,5879-5883）；（ｖｉｉｉ）二重特異的単鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ第９２１０９９６５号）及び（ｉｘ）遺伝子融合により構築された多価又は多重特異的断片である「ダイアボディ」（国際公開第９４／１３８０４号；Holliger,P.(1993)et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448）が挙げられる。
【００２０】
[0030]  Ｆｖ、ｓｃＦｖ又はダイアボディ分子は、ＶＨ及びＶＬドメインを結合するジスルフィド架橋の取り込みにより安定化することができる（Reiter,Y.et al.,Nature Biotech,14,1239-1245,1996）。ＣＨ３ドメインに結合しているｓｃＦｖを含むミニボディを作製することもできる（Hu,S.et al.,(1996)Cancer Res.,56,3055-3061）。結合断片の他の例は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における数残基、例として、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインの付加だけＦａｂ断片と異なるＦａｂ’、及び定常ドメインのシステイン残基がフリーチオール基を担持するＦａｂ’断片であるＦａｂ’−ＳＨであり得る。
【００２１】
[0031]  「Ｆｖ」は、本明細書において使用される場合、抗原認識部位及び抗原結合部位の両方を保持する抗体の最小断片を指し得る。「Ｆａｂ」は、本明細書において使用される場合、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖のＣＨ１ドメインを含む抗体の断片を指し得る。用語「ｍＡｂ」は、モノクローナル抗体を指す。
【００２２】
[0032]  用語「カスパーゼ活性化リクルートメントドメイン（ＣＡＲＤ）含有アポトーシス関連スペック様タンパク質」及び「ＡＳＣ」は、ＡＳＣ遺伝子の発現産物若しくはそのアイソフォーム、又はＡＳＣ（例えば、ヒトにおけるＮＰ＿０３７３９０（Ｑ９ＵＬＺ３−１）、ＮＰ＿６６０１８３（Ｑ９ＵＬＺ３−２）又はＱ９ＵＬＺ３−３、マウスにおけるＮＰ＿０７５７４７又はラットにおけるＮＰ＿７５８８２５（ＢＡＣ４３７５４））と少なくとも６５％（しかし好ましくは、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％）のアミノ酸配列同一性を共有し、ＡＳＣの機能的活性を呈するタンパク質を意味する。タンパク質の「機能的活性」は、タンパク質の生理学的機能に関連する任意の活性である。ＡＳＣの機能的活性としては、例えば、カスパーゼ−１の活性化及び細胞死の開始のためのタンパク質のリクルートメントが挙げられる。
【００２３】
[0033]  用語「ＡＳＣ遺伝子」、又は「ＡＳＣ核酸」は、天然ＡＳＣコード核酸配列、ＡＳＣ  ｃＤＮＡが転写され得るゲノム配列、及び／又は上記のもののアレルバリアント及びホモログを意味する。この用語は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、及びＲＮＡを包含する。
【００２４】
[0034]  本明細書において使用される用語「インフラマソーム」は、カスパーゼ−１を活性化させる多タンパク質（例えば、少なくとも２つのタンパク質）複合体を意味する。さらに、用語「インフラマソーム」は、次いでＩＬ−１β、ＩＬ−１８及びＩＬ−３３プロセシング及び活性化を調節するカスパーゼ−１活性を活性化させる多タンパク質複合体を指し得る。それぞれ参照により全体として本明細書に組み込まれるArend et al.2008;Li et al.2008;及びMartinon et al. 2002参照。用語「ＮＬＲＰ１インフラマソーム」、「ＮＡＬＰ１インフラマソーム」、「ＮＬＲＰ２インフラマソーム」、「ＮＡＬＰ２インフラマソーム」、「ＮＬＲＰ３インフラマソーム」、「ＮＡＬＰ３インフラマソーム」、「ＮＬＲＣ４インフラマソーム」、「ＩＰＡＦインフラマソーム」又は「ＡＩＭ２インフラマソーム」は、少なくともカスパーゼ−１及び１つのアダプタータンパク質、例えば、ＡＳＣのタンパク質複合体を意味する。例えば、用語「ＮＬＲＰ１インフラマソーム」及び「ＮＡＬＰ１インフラマソーム」は、ＮＬＲＰ１、ＡＳＣ、カスパーゼ−１、カスパーゼ−１の活性化及びインターロイキン−１β、インターロイキン−１８及びインターロイキン−３３のプロセシングのためのカスパーゼ−１１、ＸＩＡＰ、並びにパンネキシン−１を含有する多タンパク質複合体を意味し得る。用語「ＮＬＲＰ２インフラマソーム」及び「ＮＡＬＰ２インフラマソーム」は、ＮＬＲＰ２（ａｋａ  ＮＡＬＰ２）、ＡＳＣ及びカスパーゼ−１を含有する多タンパク質複合体を意味し得る一方、用語「ＮＬＲＰ３インフラマソーム」及び「ＮＡＬＰ３インフラマソーム」は、ＮＬＲＰ３（ａｋａ  ＮＡＬＰ３）、ＡＳＣを含有する多タンパク質複合体を意味し得、用語「ＮＬＲＣ４インフラマソーム」及び「ＩＰＡＦインフラマソーム」は、ＮＬＲＣ４（ａｋａ  ＩＰＡＦ）、ＡＳＣ及びカスパーゼ−１を含有する多タンパク質複合体を意味し得る。さらに、用語「ＡＩＭ２インフラマソーム」は、ＡＩＭ２、ＡＳＣ及びカスパーゼ−１を含む多タンパク質複合体を意味し得る。
【００２５】
[0035]  本明細書において使用される語句「配列同一性」は、２つの配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列）をアラインしてサブユニットマッチングを最大化する、すなわち、ギャップ及び挿入を考慮する場合のその２つの配列中の対応位置における同一サブユニットの割合を意味する。配列同一性は、配列分析ソフトウェア（例えば、Accelrys CGC,San Diego,CAからのSequence Analysis Software Package）を使用して計測することができる。
【００２６】
[0036]  語句「治療有効量」及び「有効投与量」は、治療的に（例えば、臨床的に）望ましい結果を産生するために十分な量を意味し；結果の正確な性質は、治療される障害の性質に応じて変動する。例えば、治療すべき障害がＳＣＩである場合、結果は、運動技能及びロコモーター機能の改善、脊髄病変の減少などであり得る。本明細書に記載の組成物は、１日１回以上〜週１回以上投与することができる。当業者は、ある因子、例として、限定されるものではないが、疾患又は障害の重症度、前治療、対象の全身健康状態及び／又は年齢、並びに存在する他の疾患が対象を有効に治療するために要求される投与量及びタイミングに影響し得ることを認識する。さらに、治療有効量の本発明の組成物による対象の治療は、単一治療又は一連の治療を含み得る。
【００２７】
[0037]  本明細書において使用される用語「治療」は、疾患、疾患の症状又は疾患を罹患しやすい傾向を治癒し、回復させ、緩和し、軽減し、変更し、救助し、好転させ、改善し、又はそれに影響を与える目的での、患者への本明細書に記載の、若しくは本明細書に記載の方法により同定される治療剤の適用若しくは投与、又は疾患、疾患の症状若しくは疾患を罹患しやすい傾向を有する患者からの単離組織若しくは細胞系への治療剤の適用若しくは投与として定義される。
【００２８】
[0038]  用語「患者」「対象」及び「個体」は、本明細書において互換的に使用され、治療すべき哺乳動物対象を意味し、ヒト患者が好ましい。一部の例において、本発明の方法は、実験動物において、獣医学的用途において、及び疾患についての動物モデル、例として、限定されるものではないが、げっ歯類、例として、マウス、ラット、及びハムスター、並びに霊長類の発生において使用される。
【００２９】
[0039]  本明細書において互換的に使用される「アブセントインメラノーマ２」及び「ＡＩＭ２」は、ＡＩＭ２遺伝子の発現産物若しくはアイソフォーム；又はＡＩＭ２（例えば、アクセッション番号ＮＸ＿０１４８６２、ＮＰ００４８２４、ＸＰ０１６８５８３３７、ＸＰ００５２４５６７３、ＡＡＢ８１６１３、ＢＡＦ８４７３１、ＡＡＨ１０９４０）と少なくとも６５％（しかし好ましくは、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％）のアミノ酸配列同一性を共有し、ＡＩＭ２の機能的活性を呈するタンパク質を意味し得る。
【００３０】
[0040]  本明細書において互換的に使用される「ＮＡＬＰ１」及び「ＮＬＲＰ１」は、ＮＡＬＰ１若しくはＮＬＲＰ１遺伝子の発現産物若しくはアイソフォーム；又はＮＡＬＰ１（例えば、アクセッション番号ＡＡＨ５１７８７、ＮＰ＿００１０２８２２５、ＮＰ＿１２７５００、ＮＰ＿１２７４９９、ＮＰ＿１２７４９７、ＮＰ０５５７３７）と少なくとも６５％（しかし好ましくは、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％）のアミノ酸配列同一性を共有し、ＮＡＬＰ１の機能的活性を呈するタンパク質を意味する。
【００３１】
[0041]  本明細書において互換的に使用される「ＮＡＬＰ２」及び「ＮＬＲＰ２」は、ＮＡＬＰ２若しくはＮＬＲＰ２遺伝子の発現産物若しくはアイソフォーム；又はＮＡＬＰ２（例えば、アクセッション番号ＮＰ＿００１１６７５５２、ＮＰ＿００１１６７５５３、ＮＰ＿００１１６７５５４又はＮＰ＿０６０３２２）と少なくとも６５％（しかし好ましくは、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％）のアミノ酸配列同一性を共有し、ＮＡＬＰ２の機能的活性を呈するタンパク質を意味する。
【００３２】
[0042]  本明細書において互換的に使用される「ＮＡＬＰ３」及び「ＮＬＲＰ３」は、ＮＡＬＰ３若しくはＮＬＲＰ３遺伝子の発現産物若しくはアイソフォーム；又はＮＡＬＰ３（例えば、アクセッション番号ＮＰ＿００１０７３２８９、ＮＰ＿００１１２０９３３、ＮＰ＿００１１２０９３４、ＮＰ＿００１２３００６２、ＮＰ＿００４８８６、ＮＰ＿８９９６３２、ＸＰ＿０１１５４２３５０、ＸＰ＿０１６８５５６７０、ＸＰ＿０１６８５５６７１、ＸＰ＿０１６８５５６７２又はＸＰ＿０１６８５５６７３）と少なくとも６５％（しかし好ましくは、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％）のアミノ酸配列同一性を共有し、ＮＡＬＰ３の機能的活性を呈するタンパク質を意味する。
【００３３】
[0043]  本明細書において互換的に使用される「ＮＬＲＣ４」及び「ＩＰＡＦ」は、ＮＬＲＣ４若しくはＩＰＡＦ遺伝子の発現産物若しくはアイソフォーム；又はＮＬＲＣ４（例えば、アクセッション番号ＮＰ＿００１１８６０６７、ＮＰ００１１８６０６８、ＮＰ＿００１２８９４３３又はＮＰ＿０６７０３２）と少なくとも６５％（しかし好ましくは、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％）のアミノ酸配列同一性を共有し、ＮＬＲＣ４の機能的活性を呈するタンパク質を意味する。
【００３４】
[0044]  用語「脳卒中」及び「虚血性脳卒中」は、血流が中断されている脳又は脊髄の一部を意味する。
【００３５】
[0045]  「ＣＮＳの外傷性損傷」は、ＣＮＳ機能の永久的又は一時的損害をもたらす可能性がある外部の機械的力からのＣＮＳの任意の傷害を意味する。
【００３６】
[0046]  用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、ヒト化抗体、可溶性又は結合形態で標識することができる抗体に対する抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び任意の公知の技術、例えば、限定されるものではないが、酵素的開裂、ペプチド合成又は組換え技術により提供されるそれらの断片、領域又は誘導体を含むことを意味する。このような本発明の抗ＡＳＣ及び抗ＮＬＲＰ１抗体は、それぞれカスパーゼ−１活性化を妨害するＡＳＣ及びＮＬＲＰ１の一部に結合し得る。
【００３７】
[0047]  慣用の分子生物学的技術を含む方法は、本明細書に記載される。このような技術は、一般に当技術分野において公知であり、方法論の論文、例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,vol.1-3,ed.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001；及びCurrent Protocols in Molecular Biology,ed.Ausubel et al.,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York,1992（定期的更新あり）に詳述されている。免疫学的技術は、一般に当技術分野において公知であり、方法論の論文、例えば、Advances in Immunology,volume 93,ed.Frederick W.Alt,Academic Press,Burlington,MA,2007;Making and Using Antibodies:A Practical Handbook,eds.Gary C.Howard and Matthew R.Kaser,CRC Press,Boca Raton,FL,2006;Medical Immunology,6thed.,edited by Gabriel Virella,Informa Healthcare Press,London,England,2007；及びHarlow and Lane ANTIBODIES:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1988に詳述されている。
【００３８】
[0048]  本明細書に記載のものと同様又は同等の組成物及び方法を本発明の実施又は試験において使用することができるが、好適な組成物及び方法が以下に記載される。本明細書に挙げられる全ての刊行物、特許出願、及び特許は、参照により全体として組み込まれる。矛盾する場合、本明細書が定義を含め優先される。以下に考察される特定の実施形態は、説明のためのものにすぎず、限定的なものではない。
【００３９】
概要
[0049]  本明細書において、肺炎症をもたらすか、又は引き起こす病態を受けた、又はそれを患う哺乳動物の肺における炎症を低減させるための組成物及び方法が提供される。本明細書に記載の組成物及び方法は、細胞外ベシクル（ＥＶ）取り込みをモジュレートし（例えば、阻害するか、又は低減させ）、哺乳動物における肺炎症のための治療として使用される、哺乳動物インフラマソーム及び／又は化合物の少なくとも１つの構成成分（例えば、ＡＳＣ）に特異的に結合する本明細書に提供される抗体又はその活性断片を含み得る。
【００４０】
[0050]  本明細書において、肺における炎症応答をもたらし、及び／又は引き起こす病態を有する哺乳動物の肺における炎症を低減させる方法が記載される。一実施形態において、哺乳動物の肺における炎症を治療する方法は、インフラマソームシグナリングを阻害する薬剤を含む組成物を哺乳動物に投与することを含む。哺乳動物は、本明細書に提供される患者又は対象であり得る。肺における炎症をもたらし得る病態の例としては、中枢神経系（ＣＮＳ）損傷（例えば、脊髄損傷（ＳＣＩ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）又は脳卒中）、神経変性疾患、自己免疫疾患、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、嚢胞性線維症、間質性肺疾患又は急性呼吸窮迫症候群が挙げられる。組成物は、治療有効量で投与することができる。治療有効量は、本明細書に提供される用量であり得る。薬剤は、細胞外ベシクル（ＥＶ）取り込み阻害剤、インフラマソームの構成成分に結合する本明細書に提供される抗体若しくはその活性断片又はそれらの組合せであり得る。組成物は、任意の好適な経路により、例えば、吸入により投与し、静脈内、腹腔内、又は脳室内投与することができる。組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体又は希釈剤をさらに含み得る。
【００４１】
[0051]  一実施形態において、薬剤の投与は、対象の肺における哺乳動物インフラマソームの構成成分の活性及び／又は発現レベルの低減をもたらし得る。低減は、肺の細胞、例えば、ＩＩ型肺胞細胞などにおけるものであり得る。低減は、対照と比較したものであり得る。対照は、薬剤の投与前の対象であり得る。対照は、薬剤が投与されなかった対象におけるインフラマソーム構成成分の活性及び／又は発現レベルであり得る。一実施形態において、薬剤の投与は、対象の少なくとも肺又は肺細胞におけるカスパーゼ−１活性化の低減をもたらす。一実施形態において、薬剤の投与は、対象の少なくとも肺又は肺細胞における１つ以上のインフラマソーム構成成分（例えば、ＡＳＣ、ＡＩＭ２、ＮＡＬＰ１、ＮＡＬＰ２、ＮＡＬＰ２、ＮＡＬＰ３又はＮＬＲＣ４）の発現レベルの低減をもたらす。
【００４２】
[0052]  別の実施形態において、薬剤の投与は、急性肺損傷（ＡＬＩ）の低減又は排除をもたらし得る。一実施形態において、ＡＬＩの低減は、肺胞及び／又は間質腔中への好中球浸潤の低減、肺胞中隔肥厚の低減若しくは不存在又はそれらの組合せにより証明される。低減は、対照と比較したものであり得る。対照は、薬剤の投与前の対象におけるＡＬＩであり得る。対照は、薬剤が投与されなかったＡＬＩを罹患する対象におけるＡＬＩであり得る。
【００４３】
[0053]  さらなる別の実施形態において、薬剤の投与は、対象の肺におけるピロトーシスの低減又は排除をもたらし得る。ピロトーシスは、カスパーゼ−１の活性化を含む細胞死の炎症促進形態である。ピロトーシスは、ガスダーミンＤ（ＧＳＤＭＤ）のカスパーゼ−１媒介開裂によりトリガーされ得る。一実施形態において、ピロトーシスの低減は、対象の肺又は肺細胞（例えば、ＩＩ型肺胞細胞）におけるＧＳＤＭＤの開裂の低減又は欠落により証明される。ピロトーシスの低減又は排除は、対照と比較したものであり得る。ＧＳＤＭＤの開裂の低減又は欠落は、対照と比較したものであり得る。対照は、薬剤の投与前の対象におけるピロトーシスのレベルであり得る。対照は、薬剤が投与されなかったピロトーシスを罹患する対象におけるピロトーシスのレベルであり得る。
【００４４】
[0054]  一実施形態において、投与すべき薬剤は、ＥＶ取り込み阻害剤である。ＥＶ取り込み阻害剤は、化合物、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ペプチド、本明細書に提供される抗体若しくはその活性断片又はそれらの組合せであり得る。化合物又はペプチドは、ヘパリン、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）、エノキサパリン、アシアロフェツイン、ヒト受容体関連タンパク質（ＲＡＰ）、ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）ペプチド、サイトカラシンＤ、サイトカラシンＢ、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ラトランクリンＡ、ラトランクリンＢ、ＮＳＣ２３７６６、ダイナソア、クロルプロマジン、５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピル）アミロリド（ＥＩＰＡ）、アミロリド、バフィロマイシンＡ、モネンシン及びクロロキン、アネキシン−Ｖ、ワートマンニン、ＬＹ２９４００２、メチル−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）、フィリピン、シンバスタチン、フモニシンＢ１及びＮ−ブチルデオキシノジリマイシン塩酸塩、Ｕ０１２６又はプロトンポンプ阻害剤から選択される１つ以上の化合物であり得る。ＥＶ取り込み阻害剤、本明細書に提供される抗体又はその活性断片は、表１に列記されるタンパク質標的に対して指向される１つ以上の抗体又はその活性断片であり得る。ＥＶ取り込み阻害剤を使用して哺乳動物の肺における炎症を治療し、及び／又は低減させるための組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体又は希釈剤をさらに含み得る。
【００４５】
【表１】
2020503345.tif 000003
【００４６】
【表２】
2020503345.tif 000004
【００４７】
【表３】
2020503345.tif 000005
【００４８】
【表４】
2020503345.tif 000006
【００４９】
【表５】
2020503345.tif 000007
【００５０】
[0056]  一実施形態において、投与すべき薬剤は、哺乳動物インフラマソームの構成成分又はそれに由来する抗原若しくはエピトープに対して指向される本明細書に提供される抗体又はその活性断片である。別の実施形態において、投与すべき薬剤は、哺乳動物インフラマソームの構成成分に対して指向されるアンチセンスＲＮＡ又はｓｉＲＮＡである。インフラマソーム構成成分は、当技術分野において公知の任意のインフラマソーム、例えば、ＮＡＰＬ１、ＮＡＬＰ２、ＮＡＬＰ３、ＮＬＲＣ４又はＡＩＭ２インフラマソームなどの構成成分であり得る。典型的な実施形態において、抗体は、ＡＳＣ又はそれに由来する抗原若しくはエピトープに特異的に結合する。しかしながら、哺乳動物インフラマソーム（例えば、ＮＡＬＰ１、ＮＡＬＰ２、ＮＡＬＰ３、ＮＬＲＣ４又はＡＩＭ２インフラマソーム）の任意の他の構成成分に対する抗体を使用することができる。
【００５１】
[0057]  本明細書に記載の抗体は、モノクローナル若しくはポリクローナル抗体又はそれらの活性断片であり得る。前記抗体又は活性断片は、本明細書に記載のキメラ、ヒト又はヒト化のものであり得る。
【００５２】
[0058]  ＡＳＣに特異的に結合する本明細書に提供される任意の好適な抗体又はその活性断片、例えば、対象の肺細胞（例えば、ＩＩ型肺胞細胞）におけるＡＳＣ活性を阻害する抗体を使用することができる。典型的な実施形態において、抗体は、アミノ酸配列の配列番号１又は配列番号２と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列に特異的に結合する。同様に、別の実施形態において、インフラマソームは、ＮＡＬＰ１インフラマソームであり、少なくとも１つの構成成分は、ＮＡＬＰ１（すなわち、ＮＬＲＰ１）である。この実施形態において、本明細書に提供される抗体又はその活性断片は、アミノ酸配列の配列番号３又は配列番号４と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列に特異的に結合する。
【００５３】
[0059]  さらに別の実施形態において、薬剤は、インフラマソームの構成成分に結合する本明細書に提供される１つ以上の抗体又はその活性断片との組合せの１つ以上のＥＶ取り込み阻害剤である。ＥＶ取り込み阻害剤は、本明細書に提供される任意のＥＶ取り込み阻害剤であり得る。インフラマソームの構成成分に結合する抗体は、本明細書に提供される任意のインフラマソーム構成成分に結合する任意の抗体であり得る。一実施形態において、肺炎症を罹患する対象に投与される薬剤は、ＡＩＭ２インフラマソームの構成成分（例えば、ＡＳＣ）に結合する抗体との組合せのヘパリン（例えば、エノキサパリン）を含む。
【００５４】
[0060]  一実施形態において、本方法は、哺乳動物インフラマソーム（例えば、ＡＩＭ２インフラマソーム）の少なくとも１つの構成成分（例えば、ＡＳＣ）に特異的に結合する本明細書に提供される抗体又はその活性断片を含む治療有効量の組成物を提供すること；及び組成物を肺炎症を罹患する哺乳動物に投与することを含み、哺乳動物への組成物の投与は、哺乳動物の肺におけるカスパーゼ−１活性化の低減をもたらす。別の実施形態において、本方法は、哺乳動物インフラマソーム（例えば、ＡＩＭ２インフラマソーム）の少なくとも１つの構成成分（例えば、ＡＳＣ）に特異的に結合する抗体を含む治療有効量の組成物を提供すること；及び組成物を肺炎症を罹患する哺乳動物に投与することを含み、哺乳動物への組成物の投与は、１つ以上のインフラマソーム構成成分（例えば、ＡＳＣ）のレベルの低減をもたらす。さらに別の実施形態において、本方法は、哺乳動物インフラマソーム（例えば、ＡＩＭ２インフラマソーム）の少なくとも１つの構成成分（例えば、ＡＳＣ）に特異的に結合する抗体を含む治療有効量の組成物を提供すること；及び組成物を肺炎症を罹患する哺乳動物に投与することを含み、哺乳動物への組成物の投与は、ＡＬＩの低減をもたらす。肺炎症は、炎症性構成成分によるＣＮＳ損傷（例えば、ＳＣＩ又はＴＢＩ）、喘息、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）、神経変性疾患、又は自己免疫疾患の結果であり得る。一実施形態において、肺炎症は、ＣＮＳ損傷、例えば、ＴＢＩ又はＳＣＩにより引き起こされる。
【００５５】
[0061]  一実施形態において、本明細書に提供される方法は、肺炎症を罹患すると疑われる対象からの試料における哺乳動物インフラマソームの１つ以上の構成成分のレベル又は活性を検出することをさらに含む。レベル又は活性を検出する方法は、対象から得られた試料における少なくとも１つのインフラマソームタンパク質（例えば、ＡＳＣ又はＡＩＭ２）のレベルを計測すること；前記少なくとも１つのインフラマソームタンパク質（例えば、ＡＳＣ又はＡＩＭ２）のレベル又は活性の上昇の存在又は不存在を決定することを含む。前記少なくとも１つのインフラマソームタンパク質のレベル又は活性は、対照試料における前記少なくとも１つのインフラマソームタンパク質のレベルに対して向上し得る。タンパク質シグネチャーにおける前記少なくとも１つのインフラマソームタンパク質のレベル又は活性は、予め決定された参照値又は参照値の範囲に対して向上し得る。少なくとも１つのインフラマソームタンパク質は、ヌクレオチド結合ロイシンリッチリピートピリンドメイン含有タンパク質１（ＮＬＲＰ１）、ＮＬＲＰ２、ＮＬＲＰ３、ＮＬＲＣ４、ＡＩＭ２、カスパーゼリクルートメントドメイン含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ＡＳＣ）、カスパーゼ−１、又はそれらの組合せであり得る。試料は、脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液、血液、血清、血漿、尿又は肺吸引液であり得る。
【００５６】
哺乳動物インフラマソームの少なくとも１つの構成成分に特異的に結合する抗体
[0062]  哺乳動物の肺における炎症を低減させる本明細書に記載の方法は、哺乳動物インフラマソーム（例えば、ＡＩＭ２インフラマソーム）の少なくとも１つの構成成分（例えば、ＡＳＣ、ＡＩＭ２）に特異的に結合する本明細書に提供される抗体又はその活性断片を含む組成物を含む。哺乳動物の肺における炎症を治療し、及び／又は低減させるための組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体又は希釈剤をさらに含み得る。本明細書の方法における使用のための哺乳動物インフラマソームの構成成分に対して指向される例示的な抗体は、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第８６８５４００号に見出されるものであり得る。
【００５７】
[0063]  一実施形態において、哺乳動物の肺における炎症を治療し、及び／又は低減させるための組成物は、哺乳動物ＡＳＣタンパク質、例えば、ヒト、マウス又はラットＡＳＣタンパク質などのドメイン又はその一部に特異的に結合する本明細書に提供される抗体又はその活性断片を含む。任意の好適な抗ＡＳＣ抗体を使用することができ、いくつかは市販されている。本明細書の方法における使用のための抗ＡＳＣ抗体の例は、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第８６８５４００号に見出されるものであり得る。本明細書に提供される方法における使用のための市販の抗ＡＳＣ抗体の例としては、限定されるものではないが、０４−１４７抗ＡＳＣ、MilliporeSigmaからのクローン２ＥＩ−７マウスモノクローナル抗体、Millipore SigmaからのＡＢ３６０７−抗ＡＳＣ抗体、Biorbytからのｏｒｂ１９４０２１抗ＡＳＣ、LifeSpan BiosciencesからのＬＳ−Ｃ３３１３１８−５０抗ＡＳＣ、R&D SystemsからのＡＦ３８０５抗ＡＳＣ、Novus BiologicalsからのＮＢＰ１−７８９７７抗ＡＳＣ、Rockland Immunochemicalsからの６００−４０１−Ｙ６７抗ＡＳＣ、MBL InternationalからのＤ０８６−３抗ＡＳＣ、AdipogenからのＡＬ１７７抗ＡＳＣ、モノクローナル抗ＡＳＣ（クローンｏ９３Ｅ９）抗体、Santa Cruz Biotechnologyから抗ＡＳＣ抗体（Ｆ−９）、Santa Cruz Biotechnologyからの抗ＡＳＣ抗体（Ｂ−３）、Enzo Life SciencesからのＡＳＣポリクローナル抗体−ＡＤＩ−９０５−１７３、又はＡ１６１抗ヒトＡＳＣ−Leinco Technologiesが挙げられる。ヒトＡＳＣタンパク質は、アクセッション番号ＮＰ＿０３７３９０．２（Ｑ９ＵＬＺ３−１）、ＮＰ＿６６０１８３（Ｑ９ＵＬＺ３−２）又はＱ９ＵＬＺ３−３であり得る。ラットＡＳＣタンパク質は、アクセッション番号ＮＰ＿７５８８２５（ＢＡＣ４３７５４）であり得る。マウスＡＳＣタンパク質は、アクセッション番号ＮＰ＿０７５７４７．３であり得る。一実施形態において、抗体は、哺乳動物ＡＳＣタンパク質（例えば、ヒト、マウス又はラットＡＳＣ）のＰＹＲＩＮ−ＰＡＡＤ−ＤＡＰＩＮドメイン（ＰＹＤ）又はその一部若しくは断片に結合する。この実施形態において、本明細書に記載の抗体は、ヒト、マウス又はラットＡＳＣのＰＹＤドメイン又はその断片と少なくとも６５％（例えば、６５、７０、７５、８０、８５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列に特異的に結合する。一実施形態において、抗体は、哺乳動物ＡＳＣタンパク質（例えば、ヒト、マウス又はラットＡＳＣ）のＣ末端カスパーゼリクルートメントドメイン（ＣＡＲＤ）又はその一部若しくは断片に結合する。この実施形態において、本明細書に記載の抗体は、ヒト、マウス又はラットＡＳＣのＣＡＲＤドメイン又はその断片と少なくとも６５％（例えば、６５、７０、７５、８０、８５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列に特異的に結合する。さらに別の実施形態において、抗体は、ＰＹＤ及びＣＡＲＤドメイン間に局在する哺乳動物ＡＳＣタンパク質配列（例えば、ヒト、マウス又はラットＡＳＣ）の一部又はその断片に結合する。別の実施形態において、哺乳動物の肺における炎症を治療し、及び／又は低減させるための組成物は、ラットＡＳＣの一領域、例えば、アミノ酸配列ＡＬＲＱＴＱＰＹＬＶＴＤＬ��ＱＳ（配列番号１）（すなわち、ラットＡＳＣ、アクセッション番号ＢＡＣ４３７５４の残基１７８〜１９３）に特異的に結合する抗体を含む。この実施形態において、本明細書に記載の抗体は、ラットＡＳＣのアミノ酸配列ＡＬＲＱＴＱＰＹＬＶＴＤＬＥＱＳ（配列番号１）と少なくとも６５％（例えば、６５、７０、７５、８０、８５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列に特異的に結合する。別の実施形態において、哺乳動物のＣＮＳにおける炎症を治療し、及び／又は低減させるための組成物は、ヒトＡＳＣの一領域、例えば、アミノ酸配列ＲＥＳＱＳＹＬＶＥＤＬＥＲＳ（配列番号２）に特異的に結合する抗体を含む。一実施形態において、本明細書に記載のＡＳＣドメイン又はその断片に結合する抗体は、哺乳動物の肺細胞、例えば、ＩＩ型肺胞細胞におけるＡＳＣ活性を阻害する。
【００５８】
[0064]  別の実施形態において、哺乳動物の肺における炎症を低減させるための組成物は、ＮＬＲＰ１又はそのドメインに特異的に結合する本明細書に提供される抗体（例えば、抗ＮＬＲＰ１ニワトリ抗体）又はその活性断片を含む。任意の好適な抗ＮＬＲＰ１抗体を使用することができ、いくつかは市販されている。本明細書に記載の方法における使用のための抗ＮＬＲＰ１抗体の例は、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第８６８５４００号に見出されるものであり得る。本明細書に提供される方法における使用のための市販の抗ＮＬＲＰ１抗体の例としては、限定されるものではないが、R&D SystemsからのヒトＮＬＲＰ１ポリクローナル抗体ＡＦ６７８８、EMD Milliporeウサギポリクローナル抗ＮＬＲＰ１  ＡＢＦ２２、Novus Biologicalsウサギポリクローナル抗ＮＬＲＰ１  ＮＢ１００−５６１４８、Sigma-Aldrichマウスポリクローナル抗ＮＬＲＰ１  ＳＡＢ１４０７１５１、Abcamウサギポリクローナル抗ＮＬＲＰ１  ａｂ３６８３、Biorbytウサギポリクローナル抗ＮＬＲＰ１  ｏｒｂ３２５９２２  mybiosourceウサギポリクローナル抗ＮＬＲＰ１  ＭＢＳ７００１２２５、R&D systemsヒツジポリクローナルＡＦ６７８８、Aviva Systemsマウスモノクローナル抗ＮＬＲＰ１  ｏａｅｄ００３４４、Aviva Systemsウサギポリクローナル抗ＮＬＲＰ１  ＡＲＯ５４４７８＿Ｐ０５０、Origeneウサギポリクローナル抗ＮＬＲＰ１  ＡＰＯ７７７５ＰＵ−Ｎ、Antibodies onlineウサギポリクローナル抗ＮＬＲＰ１  ＡＢＩＮ７６８９８３、Prosciウサギポリクローナル抗ＮＬＲＰ１  ３０３７、Proteintechウサギポリクローナル抗ＮＬＲＰ１  １２２５６−１−ＡＰ、Enzoマウスモノクローナル抗ＮＬＲＰ１  ＡＬＸ−８０４−８０３−Ｃ１００、Invitrogenマウスモノクローナル抗ＮＬＲＰ１  ＭＡ１−２５８４２、GeneTexマウスモノクローナル抗ＮＬＲＰ１  ＧＴＸ１６０９１、Rocklandウサギポリクローナル抗ＮＬＲＰ１  ２００−４０１−ＣＸ５、又はCell Signaling Technologyウサギポリクローナル抗ＮＬＲＰ１  ４９９０が挙げられる。ヒトＮＬＲＰ１タンパク質は、アクセッション番号ＡＡＨ５１７８７、ＮＰ＿００１０２８２２５、ＮＰ＿０５５７３７、ＮＰ＿１２７４９７、ＮＰ＿１２７４９９、又はＮＰ＿１２７５００であり得る。一実施形態において、抗体は、哺乳動物ＮＬＲＰ１タンパク質（例えば、ヒトＮＬＲＰ１）のＰｙｒｉｎ、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲ１−６、ＦＩＩＮＤ又はＣＡＲＤドメイン又はその一部若しくは断片に結合する。この実施形態において、本明細書に記載の抗体は、ヒトＮＬＲＰ１の規定のドメイン（例えば、Ｐｙｒｉｎ、ＮＡＣＨＴ、ＬＲＲ１−６、ＦＩＩＮＤ又はＣＡＲＤ）又はその断片と少なくとも６５％（例えば、６５、７０、７５、８０、８５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列に特異的に結合する。一実施形態において、Ayes Laboratoriesによりカスタム設計され、産生されたニワトリ抗ＮＬＲＰ１ポリクローナルが肺炎症の低減に使用される。この抗体は、ヒトＮＬＲＰ１中の以下のアミノ酸配列ＣＥＹＹＴＥＩＲＥＲＥＲＥＫＳＥＫＧＲ（配列番号３）に対して指向され得る。一実施形態において、本明細書に記載のＮＬＲＰ１ドメイン又はその断片に結合する抗体は、哺乳動物の肺細胞、例えば、ＩＩ型肺胞細胞におけるＮＬＲＰ１活性を阻害する。
【００５９】
[0065]  さらに別の実施形態において、哺乳動物の肺における炎症を低減させるための組成物は、ＡＩＭ２又はそのドメインに特異的に結合する本明細書に提供される抗体又はその活性断片を含む。任意の好適な抗ＡＩＭ２抗体を使用することができ、いくつかは市販されている。本明細書に提供される方法における使用のための市販の抗ＡＩＭ２抗体の例としては、限定されるものではないが、Proteintechからのウサギポリクローナル抗ＡＩＭ２カタログ番号２０５９０−１−ＡＰ、Abcam抗ＡＩＭＳ抗体（ａｂ１１９７９１）、ECM biosciencesからのウサギポリクローナル抗ＡＩＭ２（Ｎ末端領域）カタログ番号ＡＰ３８５１、Elabsciencesからのウサギポリクローナル抗ＡＳＣカタログ番号Ｅ−ＡＢ−３０４４９、Santa Cruz BiotechnologyからのＡＩＭ２抗体（３Ｃ４Ｇ１１）と呼ばれる抗ＡＩＭ２マウスモノクローナル抗体、カタログ番号ｓｃ−２９３１７４、OrigeneからのマウスモノクローナルＡＩＭ２抗体、カタログ番号ＴＡ３２４９７２、Thermofisher ScientificからのＡＩＭ２モノクローナル抗体（１０Ｍ２Ｂ３）、Antibodies-onlineからのＡＩＭ２ウサギポリクローナル抗体ＡＢＩＮ９２８３７２又はＡＢＩＮ７６０７６６、Biomatixコート抗ＡＩＭ２ポリクローナル抗体、カタログ番号ＣＡＥ０２１５３、Aviva Systems Biologyからの抗ＡＩＭ２ポリクローナル抗体（ＯＡＢＦ０１６３２）、LSBio-C354127からのウサギポリクローナル抗ＡＩＭ２抗体ＬＳ−Ｃ３５４１２７、Cell Signaling Technologyからのウサギモノクローナル抗ＡＩＭ２抗体、カタログ番号ＭＡ５−１６２５９、Fab Gennix International Incorporatedからのウサギポリクローナル抗ＡＩＭ２  モノクローナル抗体、カタログ番号ＡＩＭ２  ２０１ＡＰ、MyBiosourceウサギポリクローナル抗ＡＩＭ２カタログ番号ＭＢＳ８５５３２０、Signalwayウサギポリクローナル抗ＡＩＭ２カタログ番号３６２５３、Novus Biologicalウサギポリクローナル抗ＡＩＭ２カタログ番号４３９００００２、GeneTexウサギポリクローナル抗ＡＩＭ２  ＧＴＸ５４９１０、Prosci、ウサギポリクローナル抗ＡＩＭ２  ２６−５４０、Biorbytマウスモノクローナル抗ＡＩＭ２  ｏｒｂ３３３９０２、Abcamウサギポリクローナル抗ＡＩＭ２  ａｂ９３０１５）、Abcamウサギポリクローナル抗ＡＩＭ２  ａｂ７６４２３、Signma Aldrichマウスポリクローナル抗ＡＩＭ２  ＳＡＢ１４０６８２７、又はBiolegend抗ＡＩＭ２  ３Ｂ１０が挙げられる。ヒトＡＩＭ２タンパク質は、アクセッション番号ＮＸ＿０１４８６２、ＮＰ００４８２４、ＸＰ０１６８５８３３７、ＸＰ００５２４５６７３、ＡＡＢ８１６１３、ＢＡＦ８４７３１又はＡＡＨ１０９４０であり得る。一実施形態において、抗体は、哺乳動物ＡＩＭ２タンパク質（例えば、ヒトＡＩＭ２）のＰｙｒｉｎ又はＨＩＮ−２００ドメイン又はそれらの一部若しくは断片に結合する。この実施形態において、本明細書に記載の抗体は、ヒトＡＩＭ２の規定のドメイン（例えば、Ｐｙｒｉｎ又はＨＩＮ−２００）又はその断片と少なくとも６５％（例えば、６５、７０、７５、８０、８５％）の配列同一性を有するアミノ酸配列に特異的に結合する。一実施形態において、本明細書に記載のＡＩＭ２ドメイン又はその断片に結合する抗体は、哺乳動物の肺細胞、例えば、ＩＩ型肺胞細胞におけるＡＩＭ２活性を阻害する。
【００６０】
[0066]  本明細書に記載の抗インフラマソーム（例えば、抗ＡＳＣ、抗ＮＬＲＰ１又は抗ＡＩＭ２）抗体としては、哺乳動物インフラマソーム（例えば、ＡＩＭ２インフラマソーム）の構成成分、例えば、ＡＳＣ又はＡＩＭ２などに特異的に結合する免疫グロブリン可変領域の少なくとも１つの抗原結合領域を有するポリクローナル及びモノクローナルげっ歯類抗体、ポリクローナル及びモノクローナルヒト抗体、又はそれらの任意の一部が挙げられる。一部の例において、抗体がポリペプチドのエピトープに対して産生され、天然又は組換えタンパク質の少なくとも一部に結合する場合に抗体がＡＳＣに特異的であるように、抗体はＡＳＣに特異的である。
【００６１】
[0067]  競合阻害によりモノクローナル抗体特異性及び親和性を決定する方法は、参照により全体として本明細書に組み込まれるHarlow,et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988,Colligan et al.,eds.,Current Protocols in Immunology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1992,1993)、及びMuller,Meth.Enzymol.92:589-601,1983に見出すことができる。
【００６２】
[0068]  本発明の抗インフラマソーム（例えば、抗ＡＳＣ及び抗ＡＩＭ２）抗体は、限定されるものではないが、ポリペプチド若しくは抗原性断片による適切な動物の接種、リンパ球集団のインビトロ刺激、合成法、ハイブリドーマ、及び／又はそのような抗ＡＳＣ若しくは抗ＮＬＲ１抗体をコードする核酸を発現する組換え細胞のような方法により定型的に作製することができる。精製組換えＡＳＣ又はそのペプチド断片、例えば、ラットＡＳＣ（例えば、アクセッション番号ＢＡＣ４３７５４）の残基１７８〜１９３（配列番号１）又はヒトＡＳＣの配列番号２を使用する動物の免疫化は、抗ＡＳＣ抗体を調製する方法の一例である。同様に、精製組換えＮＬＲＰ１又はそのペプチド断片、例えば、ラットＮＡＬＰ１の残基ＭＥＥ  ＳＱＳ  ＫＥＥ  ＳＮＴ  ＥＧ−ｃｙｓ（配列番号４）又はヒトＮＡＬＰ１の配列番号３を使用する動物の免疫化は、抗ＮＬＲＰ１抗体を調製する方法の一例である。
【００６３】
[0069]  ＡＳＣ又はＮＬＲＰ１に特異的に結合するモノクローナル抗体は、当業者に公知の方法により得ることができる。例えば、内容が参照により全体として本明細書に組み込まれるKohler and Milstein,Nature 256:495-497,1975；米国特許第４，３７６，１１０号；Ausubel et al.,eds.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1987,1992)；Harlow and Lane ANTIBODIES:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1988；Colligan et al.,eds.,Current Protocols in Immunology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1992,1993)参照。このような抗体は、任意の免疫グロブリンクラス、例として、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤ及びそれらの任意のサブクラスのものであり得る。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、インビトロ、インサイチュー又はインビボで培養することができる。
【００６４】
組成物の投与
[0070]  本発明の組成物は、任意の好適な配合物で哺乳動物（例えば、げっ歯類、ヒト）に投与することができる。例えば、抗ＡＳＣ抗体は、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤、例えば、生理食塩水又は緩衝塩溶液中で配合することができる。好適な担体及び希釈剤は、投与方式及び経路並びに標準的な医薬実務に基づき選択することができる。例示的な薬学的に許容可能な担体及び希釈剤、並びに医薬配合物の説明は、本分野における標準的教本のRemington's Pharmaceutical Sciences、及びＵＳＰ／ＮＦに見出すことができる。他の物質を組成物に添加して組成物を安定化し、及び／又は保存することができる。
【００６５】
[0071]  本発明の組成物は、任意の慣用の技術により哺乳動物に投与することができる。典型的には、このような投与は、吸入によるもの、又は非経口（例えば、静脈内、皮下、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、又は髄腔内導入）であり得る。組成物は、例えば、内部若しくは外部標的部位への手術送達により、又は血管によりアクセス可能な部位へのカテーテルにより標的部位に直接投与することもできる。組成物は、単一ボーラス、複数回注射で、又は連続注入（例えば、静脈内、腹膜透析によるもの、ポンプ注入）により投与することができる。非経口投与のため、組成物は、好ましくは、無菌パイロジェンフリー形態で配合される。
【００６６】
有効用量
[0072]  上記の組成物は、好ましくは、有効量、すなわち、治療される哺乳動物における所望の結果を産生し得る（例えば、ＣＮＳの外傷性損傷若しくは脳卒中を受け、又は自己免疫若しくはＣＮＳ疾患を有する哺乳動物のＣＮＳにおける炎症を低減させ得る）量で哺乳動物（例えば、ラット、ヒト）に投与される。このような治療有効量は、下記のとおり決定することができる。
【００６７】
[0073]  本発明の方法において利用される組成物の毒性及び治療効力は、培養物中の細胞又は実験動物のいずれかを使用する標準的医薬手順により決定してＬＤ50（集団の５０％の致死用量）を決定することができる。毒性効果及び治療効果間の用量比は治療指数であり、それは比ＬＤ50／ＥＤ50として表現することができる。大きな治療指数を示すそれらの組成物が好ましい。毒性副作用を示すものを使用することができる一方、そのような副作用の潜在的な損傷を最小化する送達系を設計するように留意すべきである。好ましい組成物の投与量は、好ましくは、毒性をほとんど有さず、又は有さないＥＤ50を含む範囲内である。投与量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。
【００６８】
[0074]  医学及び獣医学分野において周知のとおり、任意の１つの対象についての投与量は、多くの因子、例として、対象のサイズ、体表面積、年齢、投与すべき特定の組成物、投与の時間及び経路、全身健康状態、並びに同時投与される他の薬物に依存する。
【実施例】
【００６９】
実施例
[0075]  本発明を以下の具体的な実施例によりさらに説明する。実施例は、説明のため提供するにすぎず、決して本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでない。
【００７０】
実施例１
ＴＢＩ後のＡＬＩにおけるＥＶ媒介インフラマソームシグナリングの役割及びその中和の効果
[0076]  肺機能不全は、重度外傷性脳損傷の合併症として見つかることが多い（１）。ＴＢＩ対象の約２０〜２５パーセントが急性肺損傷（ＡＬＩ）を発症する（２）が、ＴＢＩ誘導ＡＬＩの病変を媒介する機序の定義は不十分のままである。従来の文献は、ＴＢＩ後の肺機能不全が、心肺機能不全をもたらす頭蓋内圧の増加に対する交感神経応答に起因するという考えを支持している（４２）。しかしながら、より近年の研究は、全身炎症応答もＴＢＩ誘導肺損傷における重要な役割を担うことを示している（４３）。具体的には、ＨＭＧＢ１−ＲＡＧＥリガンド受容体経路がＴＢＩ後の肺機能不全についての中枢伝達機序として機能する（８）。さらに、ＨＭＧＢ１は、ＡＩＭ２インフラマソーム活性化を誘導する（３７）。さらなる従来の文献は、病原体がＤＡＭＰ、例えば、ＨＭＧＢ１を担持するＥＶを分泌し、炎症をトリガーすることを明らかにしている（Buzas et al.,2014）。種々の研究は、血液脳関門（ＢＢＢ）が損傷後３〜６時間ほど早くＴＢＩ後に浸透性になり、脳及び血管内コンパートメント間の保護障壁への損傷をもたらし、タンパク質及び体液の漏出をもたらすことを示している（４４）。損傷後のＢＢＢの破壊は、炎症性メディエーター、例えば、ＤＡＭＰの分泌をもたらし、それが脳炎症を促進し、遠位器官を損傷し得る（５）。いくつかの炎症性メディエーターは、明確な脳損傷のマーカーとして作用し得るが、それらの妥当性は広く認められているわけではない（４５）。さらに現在、ＴＢＩ誘導ＡＬＩについての臨床的に承認された治療もバイオマーカーも存在しない。近年、ＥＶは、いくつかの異なるタイプの疾患、例として、肺損傷（４６）及びＴＢＩ（４７）についてのバイオマーカー研究の関心領域になっている。ＴＢＩを有する患者の脳脊髄液から単離されたＥＶにおいて、対照試料と比較してインフラマソームタンパク質が増加することが既に示されている（１４）。本実施例において、ＴＢＩ誘導ＡＬＩの病因におけるＥＶ媒介インフラマソームシグナリングの寄与を試験した。
【００７１】
材料及び方法
動物及び外傷性脳損傷
[0077]  全ての動物手順は、University of Miami Miller School of MedicineのInstitutional Animal Care and Use Committee（Animal Welfare Assurance A3224-01）により承認され、NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに従って行った。本試験を実施する場合、ＡＲＲＩＶＥ指針に従った。全てのＣ５７／ＢＬ６マウスは、８〜１２週齢及び２４〜３２グラムであった。マウスをＴＢＩについての実験群（疑似、４時間、２４）、養子移植及び処理についての実験群（ナイーブ、疑似生理食塩水、非処理、エノキサパリン、抗ＡＳＣ）にプロスペクティブにランダム化した。ＴＢＩ実験群について、疑似動物は外科手術を受けたが損傷されなかった。養子移植処理試験について、疑似生理食塩水群は外科手術を受け、ビヒクル処理として生理食塩水を受容した。ナイーブ動物は、外科手術を受けなかった。検出力分析（Ｇ*検出力分析、効果量Ｆ＝０．８５、α設定０．０５を使用）及び履歴データに基づきそれぞれの群について５〜６の試料サイズを使用した49,50。全てのマウスをUniversity of MiamiにおけるLois Pope Life Centerにおけるウイルス抗原不含（ＶＡＦ）動物施設において１２時間の明暗サイクルで飼育し、飼料及び水を自由摂餌として供給した。施設は、畜産的手順を週２回実施し、動物の状態を毎日確認した。動物を術後観察し、それらを加熱パッド上で保持し、体温を直腸プローブにより制御し、手術室内で体温を３７℃に維持し、次いで動物飼育室に移した。
【００７２】
[0078]  術前、動物をケタミン及びキシラジン（腹腔内、ｉ．ｐ．）により麻酔した。次いで、麻酔した動物を加熱パッド上に配置して３７℃の体温を確保した。制御式皮質衝撃（Controlled Cortical Impact）（ＣＣＩ）モデルを使用してＴＢＩを実施した。５ｍｍ開頭術を右皮質（ブレグマから−２．５ｍｍ後部、２．０ｍｍ側部）上で行った。ＥＣＣＩ−６．３装置（Custom Design & Fabrication,Richmond,VA,USA）を、６ｍ／ｓの速度、０．８ｍｍの深さ、及び１５０ｍｓの衝撃持続時間における３ｍｍのインパウンダー（impounder）で使用して損傷を誘導した（１５）。これらの手順後、動物をそれらのケージに戻し、飼料及び水を与えた。動物を記載のとおりＴＢＩの４時間及び２４時間後に屠殺した。疑似動物は麻酔し、損傷動物と同一の術前切開に供したが、開頭術も挫傷も受けなかった。
【００７３】
組織回収
[0079]  全ての動物を灌流前にケタミン及びキシラジンにより麻酔した。次いで、動物は気管灌流を受けた。気管カテーテルを２０ｃｍのＨ２Ｏにおいて使用して肺に４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を灌流させ、次いで４％のＰＦＡ中で４℃において一晩固定した。固定肺組織をパラフィン包埋し、５μｍ切片を加工した（１６）。タンパク質単離及び分子分析のために右肺組織を回収した。次いで、動物は骨頭切除術を受け、タンパク質単離及び分子分析のために右皮質組織を回収した。
【００７４】
ピロプトソーム単離アッセイ
[0080]  マウス肺組織溶解物を、５μｍの低結合ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Millipore）に通して濾過した。濾過後、上清を２，７００×ｇにおいて８分間遠心分離した。ペレットを４０μｌの３［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）緩衝液（２０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．５、５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２、０．５ｍｍｏｌ／ＬのＥＧＴＡ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌのフェニルメチルスルホニルフルオリド、プロテアーゼ阻害剤カクテル、及び０．１％のＣＨＡＰＳ）中で再懸濁させた。ピロプトソームを、２，７００×ｇにおける８分間の遠心分離によりペレット化した。次いで、２．２μｌのジスクシンイミジル基質（９）を有する２７．８μｌのＣＨＡＰＳ緩衝液中でペレットを再懸濁させ、室温において３０分間インキュベートしてＡＳＣ二量体を架橋させた。最後に、等量の２×Laemmli緩衝液を添加し、ＡＳＣ及びガスダーミン−Ｄ（ＧＳＤ）に対する市販の抗体を使用するイムノブロッティングによりタンパク質を分析した。
【００７５】
核及び細胞質抽出
[0081]  NE-PER核細胞質抽出試薬（Thermo Scientific）を製造業者の説明書に従って使用して核及び細胞質分画を抽出した。簡潔に述べると、マウス肺組織試料を、２０〜１００ｍｇの小片に切断し、５００×ｇにおいて５分間遠心分離した。組織片を細胞質抽出試薬によりホモジナイズし、１６，０００×ｇにおいて５分間遠心分離した。次いで、上清（細胞抽出物）を除去し、ペレットを核抽出試薬（Thermo Scientific）により１６，０００×ｇにおいて１０分間遠心分離した。この上清は核分画に対応し、それを取り出し、−８０℃において貯蔵した。
【００７６】
イムノブロッティング
[0082]  肺及び脳組織試料を液体窒素中でスナップ冷凍し、−８０℃において貯蔵した。プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Sigma,St Louis,MO,USA）を含有する抽出緩衝液中で右下肺及び右皮質組織の２ｍｍ切片をホモジナイズし、４〜２０％のトリス−TGX Criterionプレキャストゲル（Bio-Rad,Hercules,CA,USA）中で、de Rivero Vaccari et al.2015（１３）に記載のとおり、カスパーゼ−１（Novus Biologicals）、ＡＳＣ（Santa Cruz）、ＩＬ−１β（Cell Signaling）、ＩＬ−１８（Abcam）ＡＩＭ２（Santa Cruz）及びＨＭＧＢ１（Millipore）に対する抗体を使用して分解した。Image Labを使用してバンド密度の定量を実施し、全てのデータをβ−アクチンに対して正規化した。
【００７７】
免疫組織化学的検査
[0083]  組織切片をキシレン中で脱パラフィン化し、次いでエタノール及びトリス緩衝生理食塩水を使用して再水和した。次いで、免疫組織化学的手順を既に記載のとおり（１６）、二重染色について実施した。切片を、カスパーゼ−１及びＡＳＣ（Millipore）、ＡＩＭ２（Santa Cruz）、ＨＭＧＢ１（Millipore）及びＳＰＣ（Millipore）に対する抗体と４℃において一晩インキュベートした。疑似、４時間、及び２４時間マウスの免疫染色した肺切片を、Zeissレーザー走査共焦点顕微鏡（Zeiss,Inc.,Thornwood,NY,USA）により試験した。群盲検化した者により肺切片を分析した。
【００７８】
ＥＶ単離
[0084]  全エクソソーム抽出溶液を製造業者の説明書（Invitrogen）に従って使用してＴＢＩ損傷マウス及び損傷マウスからの血清からＥＶを単離した。簡潔に述べると、１００μｌのそれぞれの試料を２０００×ｇにおいて３０分間遠心分離した。次いで、上清を２０μｌの全エクソソーム抽出（ＴＥＩ）試薬と４℃において３０分間インキュベートし、次いで１０，０００×ｇにおいて室温において１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを１００μｌのＰＢＳ中で再懸濁させた。ＥＶをＣＤ８１の発現により、及びNanosightトラッキング分析により特徴づけした（図６）。
【００７９】
ＥＶの養子移植
[0085]  Ｃ５７ＢＬ−６ＴＢＩ及び疑似マウスからの血清由来ＥＶを、ナイーブＣ５７ＢＬ−６マウス中に頸静脈を介して体重１グラム当たり１．０×１０10個の粒子の用量において注射した48。粒子数をNanosightトラッキング分析により計測し、それに基づき試料を希釈した。術前、動物をケタミン及びキシレンにより麻酔した。１〜２ｃｍの切開部を顎及び鎖骨間に作製した。頸静脈を上昇させ、拘束し、次いでカテーテルを配置した。血清由来ＥＶを移植し、分析（ｎ＝５）のために注射の２４時間後に肺及び脳組織を回収した。
【００８０】
エノキサパリン及び抗ＡＳＣ処理
[0086]  ＴＢＩマウスからの血清由来ＥＶを、ナイーブＣ５７−ＢＬ６マウス中に頸静脈注射を介して注射した。１時間後、エノキサパリン（３ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝４）及び抗ＡＳＣ（５ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝４）をレシピエント動物に投与した。以下の群を使用した：１）ナイーブ群は、処理を受容せず、２）疑似生理食塩水群は、陰性対照として使用し、生理食塩水のみの頸静脈注射を受け、３）非処理群は、いかなる処理もせずにＴＢＩマウスからのＥＶを受容し、陽性対照として使用し、４）ＥＮＯＸ群は、ＴＢＩマウスからのＥＶ及びエノキサパリンを受容し、並びに５）抗ＡＳＣ群は、ＴＢＩマウスからのＥＶ及び抗ＡＳＣを受容した。処理順序はランダム化した。分析のため、注射の２４時間後に肺及び脳組織を回収した。処理実験において使用される抗ＡＳＣ抗体は、ＡＳＣに対するヒト化モノクローナル抗体であり、ネズミ、ヒト及びブタＡＳＣを認識することを留意すべきである。
【００８１】
組織学的検査及び肺損傷スコアリング
[0087]  組織学的検査、形態計測及びＡＬＩスコアリングのため、標準的なヘマトキシリン及びエオシン法により肺組織切片を染色した。American Thoracic Society Workshop Reportからの肺損傷スコアリングシステム（１７）を使用して盲検病理学者により肺切片をスコアリングした。スコアリングのために２０個のランダムな高倍率視野を選択した。ＡＬＩスコアリングについての基準は、肺胞腔、間質腔中の好中球の数、ヒアリン膜、空隙を満たすタンパク質性破片及び肺胞中隔肥厚に基づいた。これらの基準に基づき、０（損傷なし）〜１（重度損傷）間のスコアを付与した。
【００８２】
統計的分析
[0088]  ２つの群についてのスチューデントＴ検定及び２つ以上の群についての一元ＡＮＯＶＡとそれに続くテューキー多重比較検定（GraphPad Prismバージョン７．０）を使用してデータを分析した。ダゴスティーノ・パーソン検定を使用して正規性について検定した。データを平均＋／−ＳＥＭとして表現する。使用された有意性のＰ値は、*ｐ＜０．０５であった。
【００８３】
結果
重度ＴＢＩは、マウスの脳におけるＡＩＭ２インフラマソームタンパク質及びＨＭＧＢ１発現を増加させる
[0089]  炎症促進性サイトカインＩＬ−１β及びＩＬ−１８、並びにインフラマソームタンパク質の発現レベルは、流体パーカッション脳損傷後の二次損傷に関連する（１８）。重度ＣＣＩが炎症促進性サイトカインのプロセシング及びインフラマソームタンパク質レベルの変更を誘導したか否かを決定するため、皮質溶解物を分析したが、重度ＴＢＩにおけるインフラマソーム活性化に対する研究が制限された。本実施例において、重度ＣＣＩの後、皮質溶解物をカスパーゼ−１（図１Ａ、Ｂ）（ｐ＜．００１）、ＡＳＣ（図１Ａ、Ｃ）（ｐ＝．００３）、ＩＬ−１８（図１Ａ、Ｄ）（ｐ＝．００４２）、ＡＩＭ２（図１Ａ、Ｆ）（ｐ＝０．０１９７）及びＩＬ−１β（図１Ａ、Ｇ）（ｐ＝０．０１４１）のレベルについて損傷の４及び２４時間後において試験した。カスパーゼ−１、ＡＳＣ、ＡＩＭ２、及びＩＬ−Ｉβのレベルは、ＣＣＩの４時間後においてピークに達し、２４時間までに減少した。炎症性サイトカインの成熟の経時変化はわずかに異なったが、ＴＢＩの２４時間後までにピークに達した。他者らがＡＩＭ２インフラマソームを活性化させるインフラマソームＤＡＭＰ  ＨＭＧＢ１についての役割を示しているため、それらのタンパク質のレベルも皮質溶解物において決定した。図１Ａ、１Ｅに示されるとおり、ＣＣＩは、損傷の４及び２４時間後においてＨＭＧＢ１（図１Ａ、１Ｅ）（ｐ＝０．０１２１）のレベルの有意な増加を誘導した。これらのデータは、マウスにおける重度ＣＣＩの後、ＡＩＭ２インフラマソームタンパク質のレベルが損傷後の皮質において有意に上昇したことを示す。
【００８４】
重度ＴＢＩは、マウスの肺上のＡＩＭ２インフラマソームタンパク質及びＨＭＧＢ１発現を増加させる
[0090]  ＣＣＩが肺におけるインフラマソーム活性化を誘導したか否かを決定するため、肺溶解物のイムノブロット分析をカスパーゼ−１（図１Ｈ、Ｉ）（ｐ＝．００２６）、ＡＳＣ（図１Ｈ、Ｊ）（ｐ＝．０４２７）、ＩＬ−１８（図１Ｈ、Ｋ）（ｐ＝．００２５）、ＩＬ−１β（図１Ｈ、Ｎ）（ｐ＝．００１２）及びＡＩＭ２（図１Ｈ、Ｍ）（ｐ＜．００１）、及びＮＬＲＰ３（ｐ＝．００４７）（補足図１）について実施した。カスパーゼ−１、ＡＳＣ、ＩＬ−１８及びＡＩＭ２のレベル増加は、疑似対照と比較して損傷の４時間及び２４時間後において有意に増加した。しかしながら、タンパク質発現の増加の経時変化は、それらがＣＣＩの２４時間後においてピークに達した脳において観察されたものとわずかに異なった。ＨＭＧＢ１−ＲＡＧＥ軸がＴＢＩが肺機能不全を誘導する機序における役割を担うため（８）、肺溶解物をＨＭＧＢ１タンパク質発現のレベルについて分析した。図１Ｈ、１Ｌ（ｐ＝．０１５８）は、ＨＭＧＢ１発現がＴＢＩの４及び２４時間後において増加したことを示し、ＡＩＭ２インフラマソーム及びＨＭＧＢ１がＴＢＩ後の肺における炎症応答における役割を担うことを示す。
【００８５】
ＴＢＩは、マウスの肺においてピロトーシスを誘導する
[0091]  既に示されるとおり、皮質ニューロンにおけるＡＩＭ２インフラマソームの活性化は、ピロトーシス細胞死をもたらす（１９）。ＴＢＩがマウス肺組織においてピロトーシスをもたらすか否かを調査するため、肺組織中のピロプトソームをＴＢＩ後に単離した。損傷の４時間後において屠殺したＴＢＩ動物は、疑似動物と比較したＡＳＣオリゴマー化の証拠を示した（図４Ａ）。ＡＳＣ二量体、及び三量体がＴＢＩ動物において見られた（それぞれ、５０、７５ｋＤＡ）。これらの結果は、ピロプトソーム形成を示し、それはＡＳＣオリゴマーの超分子集合により特徴づけすることができる。さらに、カスパーゼ−１の活性化時に開裂され、ピロトーシス及びＩＬ−１βの放出をトリガーするガスダーミン−Ｄ（ＧＳＤＭＤ）（２０）は、疑似と比較してＴＢＩ動物の肺において有意に増加した（図４Ｂ及び４Ｃ）（ｐ＝０．０００１）。これらの知見は、ピロトーシスがＴＢＩ後の肺組織において細胞死に寄与することを示した。
【００８６】
ＴＢＩは、ＩＩ型肺胞上皮細胞におけるインフラマソームタンパク質の免疫反応性を増加させる
[0092]  ＴＢＩは、毛細血管漏出をもたらし、血管浸透性の増加及びＩＩ型肺細胞と呼ばれる特殊化肺胞上皮細胞の損傷をもたらし得る（５）。損傷後の肺におけるインフラマソーム発現に対するＴＢＩの細胞効果を試験するため、免疫組織化学的分析を、疑似、４時間、及び２４時間損傷動物の肺切片において実施した。ＩＩ型肺胞上皮細胞は、主なタイプのＡＬＩにおける損傷肺細胞であることが公知である（１７）。肺切片をＡＩＭ２、カスパーゼ−１、及びＡＳＣ（緑色）に対する抗体により染色し、ＩＩ型上皮細胞のマーカーであるプロ−サーファクタントプロテインＣ（Ｐｒｏ−ＳＰＣ、赤色）、及びＤＡＰＩ核染色（青色）により同時染色した。図２Ａ〜２Ｃに示されるとおり、活性カスパーゼ−１（図２Ａ）、ＡＳＣ（図２Ｂ）、及びＡＩＭ２（図２Ｃ）は、ＳＰＣ陽性細胞中に存在する（矢印）。これらのインフラマソームタンパク質の免疫反応性は、ＴＢＩ後に増加した。これらの知見は、インフラマソームタンパク質がＩＩ型肺胞上皮細胞中で発現されること及びＴＢＩがそれらの細胞における免疫反応性の増加をもたらすことを示す。
【００８７】
ＴＢＩは、核及び細胞質ＨＭＧＢ１発現を増加させる
[0093]  ＴＢＩ後の肺細胞におけるＨＭＧＢ１の細胞分布を決定するため、肺ホモジネートからの核及び細胞質分画を単離した（図３Ａ、３Ｃ）（ｐ＝．０３３７）。イムノブロッティングは、両方の分画がＴＢＩの４時間後におけるＨＭＧＢ１発現の有意な増加を有したことを示した（図３Ｂ、３Ｄ）（ｐ＝．０３４５）。ＨＭＧＢ１の免疫組織化学的分析も実施してＴＢＩ後の肺切片における免疫反応性の変化を決定した。切片をＨＭＧＢ１（緑色）及びＳＰＣ（赤色）及びＤＡＰＩ核染色（青色）について同時染色した。ＨＭＧＢ１の免疫反応性は、疑似と比較して４時間及び２４時間において増加した。ＨＭＧＢ１の弱い免疫反応性がＳＰＣ陽性細胞において観察され（矢印）（図３Ｅ）；したがって、損傷肺組織におけるＨＭＧＢ１変化が細胞質であり得ることを示唆する。
【００８８】
ＴＢＩは、肺形態の変化を誘導し、ＡＬＩを誘導する
[0094]  ＡＬＩは、肺胞及び間質浮腫並びに肺胞腔中への炎症性細胞の浸潤をもたらす炎症プロセスにより特徴づけすることができる（２３）。肺組織の組織病理学的分析（図５Ａ）は、重度ＴＢＩが損傷の４及び２４時間後における肺構造及び形態のかなりの変化を引き起こすことを示す。疑似動物は、正常な肺胞形態を示した一方、損傷動物は、肺胞浮腫の急激な変化を示したが、損傷の２４時間後までにわずかに減少した（長矢印）。さらに、両方の時点において好中球浸潤（矢印頭部）及び肺胞毛細血管膜の形態の変化（*）の証拠が存在した。損傷動物は、間質浮腫の徴候を示し、それは損傷の４時間後においてより顕著であったが、損傷の２４時間後においても依然として明らかであった（短矢印）。最後に、損傷動物は、間質区域及び肺胞中隔の肥厚の証拠も示した（ポンド、＃）。
【００８９】
[0095]  重度損傷がＡＬＩを誘導することを裏付けるため、American Thoracic Society（１７）により定義されたＡＬＩスコアリング体系を使用して組織学的切片を分析した。この体系は、肺胞及び間質腔中への好中球浸潤の証拠、ヒアリン膜形成、空隙を満たすタンパク質性破片、並びに肺胞中隔肥厚に基づく（１７）。これらの特徴は、損傷動物において有意に上昇し、ＡＬＩスコアは、疑似と比較してＴＢＩ動物において全体的に高かった（図５Ｂ）（ｐ＝０．００１７）。
【００９０】
エノキサパリン及び抗ＡＳＣ抗体処理は、ＴＢＩマウスからのＥＶの養子移植後のインフラマソーム発現及びＡＬＩを有意に低減させる
[0096]  ＴＢＩ後に循環中に放出され得るＥＶ及びそれらの積み荷が肺においてインフラマソーム活性化を誘導し得る証拠を提供するため、重度ＣＣＩマウスからの血清由来ＥＶを使用して古典的養子移植実験を実施した。ＥＶマーカーＣＤ８１についてのウエスタンブロットを使用してＥＶ調製物をバリデートした（図６）。対照は、疑似及びナイーブ動物から単離されたＥＶを受容した。図７Ａ〜７Ｆに示されるとおり、活性カスパーゼ−１（図７Ａ、７Ｂ）、ＡＳＣ（図７Ａ、７Ｃ）、ＩＬ−１８（図７Ａ、７Ｄ）、ＡＩＭ２（図７Ａ、７Ｅ）及びＨＭＧＢ１（図７Ａ、７Ｆ）は、非損傷又はナイーブマウス又はナイーブマウスからのＥＶを受容する動物の肺と比較してＴＢＩ損傷動物からのＥＶを受容した動物の肺において有意に上昇した。さらに、炎症性細胞の浸潤（矢印）は、ＴＢＩマウスからのＥＶにより処理された肺において明らかであった（図７Ｇ）。最後に、ＡＬＩスコアも、損傷マウスからのＥＶを受容した動物において有意に高かった（図７Ｈ）。これらの試験は、ＴＢＩ後に循環中に放出されるＥＶが、ＡＬＩの病変に寄与する肺標的細胞におけるインフラマソームを活性化させる神経−呼吸器−インフラマソーム軸（neural-respiratory-inflammasome axis）についての証拠を提供した。
【００９１】
[0097]  次に、損傷マウスからナイーブマウスへのＥＶの養子移植後のエノキサパリン又はＡＳＣに対するモノクローナル抗体のいずれかによる処理によりエクソソーム取り込み遮断を試みた。陰性対照動物は、生理食塩水を受容し、陽性対照動物は、処理を受容しなかった。図８Ａ〜８Ｆに示されるとおり、カスパーゼ−１（図８Ａ、８Ｂ）、ＡＳＣ（図８Ａ、８Ｃ）、ＩＬ−１β（図８Ａ、８Ｄ）、ＡＩＭ２（図８Ａ、８Ｅ）及びＨＭＧＢ１（図８Ａ、８Ｆ）は、エノキサパリン又はヒト化モノクローナル抗ＡＳＣ抗体（例えば、ＩＣ１００抗体）による処理後に、非処理（陽性対照）群と比較して有意に低減した（ｐ＝＜．０００１）。さらに、Ｈ及びＥ染色された肺切片は、肺胞及び間質腔中への有意に少ない好中球浸潤を示し、中隔肥厚の徴候を示さなかった（図９Ａ〜Ｄ）。エノキサパリン及び抗ＡＳＣ抗体（ＩＣ１００）により処理された動物についてのＡＬＩスコアは、非処理群と比較して有意に低かった（図９Ｅ）（ｐ＝＜．０００１）。したがって、ＴＢＩ後に循環中に放出されるＥＶは、ＡＬＩをもたらす肺細胞におけるインフラマソーム活性化における役割を担う。
【００９２】
結論
[0098]  ＴＢＩは、より高い割合のある医学的合併症、特に肺及び中枢神経系機能不全に関連し得る。本実施例において、重度ＴＢＩは、皮質及び肺組織中でＨＭＧＢ１及びインフラマソーム発現（例えば、ＡＩＭ２、カスパーゼ−１及びＡＳＣ発現）を増加させ、ＡＬＩと一致する肺形態の変化（例えば、肺胞及び間質腔中への好中球の浸潤、肺胞中隔肥厚、並びに肺胞浮腫及び出血）を誘導することが示され、神経細胞呼吸器炎症軸（Neural Respiratory Inflammatory Axis）の考えを導入する。重要なことに、ＴＢＩは、肺組織における（例えば、ＧＳＤＭＤ開裂の存在下で）ピロトーシスをもたらし、ＩＩ型肺胞上皮細胞におけるインフラマソームタンパク質の発現を増加させた。さらに、ＴＢＩマウスからのＥＶの養子移植は、インフラマソームを活性化させ、ＡＬＩを誘導し、そのことは脳損傷がインフラマソームタンパク質の積み荷を含有するＥＶの放出を誘導し、次いでそれがＡＬＩをもたらすことを示した。さらに、ＥＶ取り込み（エノキサパリン）及びインフラマソーム活性化（抗ＡＳＣ抗体（ＩＣ１００）処理）の両方の阻害により、インフラマソームタンパク質発現及びＡＬＩの発生が低減することが示された。
【００９３】
[0099]  まとめると、本実施例は、ＡＩＭ２インフラマソームシグナリングがＴＢＩ後の肺損傷の病理学的機序における中心的役割を担うことを示し、ＥＶ媒介インフラマソームシグナリングを含むＴＢＩ誘導ＡＬＩの機序を実証する。これらのデータは、ＥＶ媒介インフラマソームシグナリングが神経細胞−呼吸器−炎症軸（Neuronal-Respiratory-Inflammatory Axis）を含む中心的役割を担い得る証拠を提供した。したがって、インフラマソームタンパク質に対する抗体又はＥＶ取り込みを遮断する薬物によるこの軸の標的化は、救命医療の全ての領域における神経外傷誘導ＡＬＩにおける治療アプローチを提供し得る。これらの結果に照らして、開示される治療方針は、一般に肺の炎症性疾患の治療に有用であり得る。
【００９４】
参照による組み込み
[00100]  以下の参照文献は、全ての目的のために参照により全体として組み込まれる。
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【００９５】
実施例２
ヒト患者におけるＴＢＩ後のＡＬＩにおけるＥＶ媒介インフラマソームシグナリングの役割
[0151]  実施例１におけるマウスに対する実験へのフォローアップとして、ヒト肺内皮細胞におけるインフラマソームシグナリングに対するヒトＴＢＩ患者から単離されたＥＶの役割を試験した。
【００９６】
[0152]  第１の実験において、全エクソソーム抽出キット（Thermofisher）を使用して血清由来ＥＶをＴＢＩ及び対照患者から単離した。肺ヒト細小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−Lonza）を培養し、１２ウェルプレート上でプレーティングした。コンフルエンシーに達した後、ＴＢＩ及び対照患者からの単離ＥＶを４時間のインキュベーション期間、細胞に送達した（１．９４×１０８個の粒子／ｍｌ）。インキュベーション後、細胞を２００ｕｌの溶解緩衝液により回収し、細胞溶解物をウエスタンブロット分析に使用した。
【００９７】
[0153]  第２の実験において、全エクソソーム抽出キット（Thermofisher）を使用して血清由来ＥＶをＴＢＩ及び対照患者から単離した。肺ヒト細小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−Lonza）を培養し、９６ウェルプレート上でプレーティングした。コンフルエンシーに達した後、ＴＢＩ及び対照患者からの単離ＥＶを３時間のインキュベーション期間、細胞に送達し（１．９４×１０８個の粒子／ｍｌ）、次いでカスパーゼ−１FAM FLICA（Immunohistochemistry Technologies）と１：３０の容量／容量比でさらに１時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を除去し、細胞をアポトーシス洗浄緩衝液（Immunohistochemistry Technologies）により３回洗浄した。次いで、細胞を核染色についてのヘキスト及び細胞死についてのヨウ化プロピジウムにより同時染色した。EVOS顕微鏡を使用して画像を撮影し、次いで蛍光プレートリーダー下で４９２ｎｍの励起波長及び５２０ｎｍの発光波長において細胞を読み取った。
【００９８】
結果
[0154]  図１０Ａ〜１０Ｆに示されるとおり、ＴＢＩ患者からの血清由来ＥＶの送達は、肺内皮細胞におけるインフラマソームタンパク質発現を増加させた。図１０Ａ〜１０Ｅは、カスパーゼ−１、ＡＳＣ、ＡＩＭ２、及びＨＭＧＢ１が、対照ＥＶと４時間インキュベートされたＰＭＶＥＣと比較してＴＢＩ−ＥＶと４時間インキュベートされたＰＭＶＥＣにおいて上昇することを示した。免疫アッセイ結果は、Ellaシンプルプレックスアッセイを使用してＩＬ−１ベータ発現の有意な増加を示した（図１０Ｆ）。
【００９９】
[0155]  図１１Ａ〜１１Ｃにおいて示されるとおり、肺内皮細胞へのＴＢＩ−ＥＶの送達は、カスパーゼ−１の免疫反応性及び細胞死を増加させた。
【０１００】
結論
[0156]  これらの試験は、ＴＢＩ後に循環中に放出されるＥＶがＡＬＩの病変に寄与する肺標的細胞におけるインフラマソームを活性化させる神経細胞−呼吸器−インフラマソーム軸についてのさらなる証拠を提供した。
【０１０１】
[0157]  上記の種々の実施形態を組み合わせてさらなる実施形態を提供することができる。本明細書に言及される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許刊行物の全ては、参照により全体として本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、別のさらなる実施形態を提供するために種々の特許、出願及び刊行物の概念を用いることが必要な場合、改変することができる。
【０１０２】
[0158]  これらの及び他の変化は、上記の詳細な説明に照らして実施形態に対して行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を本明細書及び特許請求の範囲に開示される具体的な実施形態に限定するものと解釈すべきでないが、そのような特許請求の範囲が与えられる均等物の完全な範囲とともに全ての考えられる実施形態を含むと解釈すべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示により限定されるものではない。
【図１Ａ】
2020503345.tif 000008
【図１Ｂ】
2020503345.tif 000009
【図１Ｃ】
2020503345.tif 000010
【図１Ｄ】
2020503345.tif 000011
【図１Ｅ】
2020503345.tif 000012
【図１Ｆ】
2020503345.tif 000013
【図１Ｇ】
2020503345.tif 000014
【図１Ｈ】
2020503345.tif 000015
【図１Ｉ】
2020503345.tif 000016
【図１Ｊ】
2020503345.tif 000017
【図１Ｋ】
2020503345.tif 000018
【図１Ｌ】
2020503345.tif 000019
【図１Ｍ】
2020503345.tif 000020
【図１Ｎ】
2020503345.tif 000021
【図２Ａ】
2020503345.tif 000022
【図２Ｂ】
2020503345.tif 000023
【図２Ｃ】
2020503345.tif 000024
【図３Ａ】
2020503345.tif 000025
【図３Ｂ】
2020503345.tif 000026
【図３Ｃ】
2020503345.tif 000027
【図３Ｄ】
2020503345.tif 000028
【図３Ｅ】
2020503345.tif 000029
【図４Ａ】
2020503345.tif 000030
【図４Ｂ】
2020503345.tif 000031
【図４Ｃ】
2020503345.tif 000032
【図５Ａ】
2020503345.tif 000033
【図５Ｂ】
2020503345.tif 000034
【図６】
2020503345.tif 000035
【図７Ａ】
2020503345.tif 000036
【図７Ｂ】
2020503345.tif 000037
【図７Ｃ】
2020503345.tif 000038
【図７Ｄ】
2020503345.tif 000039
【図７Ｅ】
2020503345.tif 000040
【図７Ｆ】
2020503345.tif 000041
【図７Ｇ】
2020503345.tif 000042
【図７Ｈ】
2020503345.tif 000043
【図８Ａ】
2020503345.tif 000044
【図８Ｂ】
2020503345.tif 000045
【図８Ｃ】
2020503345.tif 000046
【図８Ｄ】
2020503345.tif 000047
【図８Ｅ】
2020503345.tif 000048
【図８Ｆ】
2020503345.tif 000049
【図９Ａ】
2020503345.tif 000050
【図９Ｂ】
2020503345.tif 000051
【図９Ｃ】
2020503345.tif 000052
【図９Ｄ】
2020503345.tif 000053
【図９Ｅ】
2020503345.tif 000054
【図１０Ａ】
2020503345.tif 000055
【図１０Ｂ】
2020503345.tif 000056
【図１０Ｃ】
2020503345.tif 000057
【図１０Ｄ】
2020503345.tif 000058
【図１０Ｅ】
2020503345.tif 000059
【図１０Ｆ】
2020503345.tif 000060
【図１１Ａ】
2020503345.tif 000061
【図１１Ｂ】
2020503345.tif 000062
【図１１Ｃ】
2020503345.tif 000063
【配列表】
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【国際調査報告】
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