(57)【要約】反復ヌクレオチドのホモポリマートラクトの配列を使用してデジタルデータをコードする核酸メモリ鎖は、従来のデジタルＤＮＡ記憶技術よりより安価でかつより迅速な代替え物を提供する。ホモポリマートラクトの使用は、より低い忠実度、ハイスループット配列決定技術（例えば、ナノポア配列決定法）が上記メモリ鎖においてコードされるデータを読み取ることを可能にする。専門的合成技術は、従来の単一ヌクレオチド配列と比較して、ホモポリマートラクトによって与えられる低減したデータ密度にも拘わらず、大容積のデータをコードし得る長いメモリ鎖の合成を可能にする。
2020522257.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸メモリ鎖を使用してデータを記録するための方法であって、該方法は、
データセットを表すビットのインシリコ配列を作製する工程；
規定された組成を有する複数のホモポリマートラクトまたはヘテロポリマートラクトを含む核酸メモリ鎖を合成する工程であって、各ホモポリマーまたはヘテロポリマートラクトは、該データセットを表すビットの該配列のビットに相当する工程、
を包含する方法。
【請求項２】
前記複数のホモポリマートラクトは、２〜１０の間の反復ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記データセットの各ユニットは、塩基２において表される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記データセットの各ユニットは、塩基３またはより多くにおいて表される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸メモリ鎖は、少なくとも約２００ヌクレオチド長〜約５，０００ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記合成する工程は、ｄＮＴＰ濃度を変動させることによって、トラクト長を制御することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記合成する工程は、反応時間を変動させることによって、トラクト長を制御することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記複数のトラクトは、２またはこれより多くの異なるヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記合成する工程は、ｄＮＴＰ比を変動させることによって、トラクト組成を制御する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸メモリ鎖の第１の末端を改変する工程であって、ナノポア配列決定法システムのナノポアを経る該第１の末端の通過を防止する工程；
該核酸メモリ鎖の第２の末端を、該ナノポアを経て通過させる工程；および
該核酸メモリ鎖の第２の末端を改変する工程であって、該ナノポアを通る該第２の末端の通過を防止し、それによって、該ナノポアに核酸メモリ鎖を捕捉する工程、
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記データセットは、テキストファイル、イメージファイル、およびオーディオファイルからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記合成する工程は、テンプレート非依存的合成を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を使用して、前記テンプレート非依存的合成を触媒する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ポリメラーゼθを使用して、前記テンプレート非依存的合成を触媒する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸メモリ鎖は、前記データセットへの該核酸メモリ鎖の変換を防止する共有結合した化学保護基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
核酸メモリ鎖からデータを読み取るための方法であって、該方法は、
規定された組成を有する複数のホモポリマートラクトまたはヘテロポリマートラクトを含む核酸メモリ鎖を配列決定する工程、
該核酸メモリ鎖配列をデジタル化データに変換する工程であって、ここで該複数のホモポリマーまたはヘテロポリマートラクトの各々は、データのユニットに相当するビットを表す工程；および
該デジタル化したデータ片を読み取り可能なフォーマットに変換する工程、
を包含する方法。
【請求項１７】
前記読み取り可能なフォーマットをディスプレイする工程をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記複数のホモポリマートラクトは、約２〜約１０の間のヌクレオチド反復を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記データのユニットは、塩基２において表される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記データのユニットは、塩基３において表される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記データのユニットは、塩基４において表される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸メモリ鎖は、少なくとも約２００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド長の間である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸メモリ鎖は、該核酸メモリ鎖を前記データセットに変換することを防止する共有結合した化学保護基を含み、前記方法は、該核酸メモリ鎖を配列決定する前に、該化学保護基のうちの１またはこれより多くを除去する工程をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国仮特許出願第６２／５１３，１１１号（２０１７年５月３１日出願）の利益および優先権を主張し、その内容は、その全体において本明細書に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ホモポリマートラクトを含む核酸メモリ鎖においてデータを記憶するための方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ＤＮＡデジタル記憶は、ＤＮＡの塩基配列を使用してデジタルデータを表し、そのデータをコードする塩基配列に相当するポリヌクレオチドのＤＮＡ合成を経てそのデータを記憶するというプロセスである。ＤＮＡデジタル記憶は、従来のデータ記憶方法を超えるいくつかの利点を提供し、何百億ドル単位の市場を標的にしている。フラッシュメモリを含み、磁気テープ上に記録することを含む従来のデータ記憶方法は、物理的空間要件、希少資源に対する信頼性、およびデータ完全性に関する問題を提示する。ＤＮＡデジタル記憶は、遙かにより大きなデータ記憶密度と顕著に低いエネルギー要件とを提供する。現行の方法は、ＤＮＡにおいてコードされるデータを正確に読み取るために、許容誤差がほとんどない高忠実度配列決定技術に依拠する。その要求される配列決定法は、忠実度要件を満たすには、比較的遅くかつ高価である。現行のＤＮＡデジタル記憶技術の例は、米国特許第９，３８４，３２０号（Ｃｈｕｒｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．）（本明細書に参考として援用される）に記載される。配列決定忠実度を増大するために、現行の方法（例えば、Ｃｈｕｒｃｈによって記載されるもの）は、読み取りおよび書き込みが困難である特徴（例えば、配列反復）を回避する配列を使用してデータをコードする。
現行のＤＮＡデジタル記憶技術の合成側は、速度の欠如、毒性副生成物の生成、および高コストによってその技術の採用をさらに限定する。大部分のデノボ核酸配列は、天然の（または非天然の）核酸塩基に相当するホスホロアミダイト試薬から構築される配列の連続的脱保護および合成を包含する固相ホスホロアミダイト技術技術を使用して合成される。アレイベースのフォーマット上でのインクジェット合成は、非常に低コストホスホロアミダイト合成が可能である一方で、作製される鎖は、１００〜２００塩基長に限定され、インデックス配列に長さのうちのいくらかを犠牲にしなければならず、その後のリードアウトのための十分な材料を提供するために、合成後増幅を要求するフェムトモル未満のスケールで作製される。従来の合成技術を使用すると、２００塩基対（ｂｐ）長より大きな核酸は、高い割合の破損および副反応を経験する。さらに、従来の合成技術は、毒性副生成物を生成し、この廃棄物の廃棄は、核酸合成機の利用可能性を制限し、オリゴ生成のコストを増大させる。合成に関するこれらの複雑性およびＤＮＡデジタル記憶におけるリードアウトは、他の点での有望な技術のための適用を制限している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第９，３８４，３２０号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
本発明は、デジタルデータをコードするホモポリマートラクトの配列を使用してデータを記憶するためのシステムおよび方法を提供する。反復塩基（例えば、２〜１０ヌクレオチド）のホモポリマートラクトを使用して上記データ配列において各ビットを表すと、よりハイスループットかつより安価な配列決定技術を使用することが可能になる。上記配列リードは、ホモポリマートラクト間の遷移を区別することにのみ依拠し、各個々のヌクレオチドの正確なリードを要求しないので、配列決定技術（例えば、ナノポア配列決定法、ゼロモード導波路（ＺＭＷ）単一分子配列決定（ｚｅｒｏ−ｍｏｄｅ  ｗａｖｅｇｕｉｄｅ  （ＺＭＷ）  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、および質量分析法）は、速度を増大しかつコストを低減するために使用され得る。
【０００６】
本明細書で記載されるとおりのホモポリマートラクトを使用するデータの記録は、長鎖（例えば、５〜１０ｋｂ）の核酸を使用して最も効率的に達成される。旧来の合成技術は、長さが制限されている一方で、例えば、ヌクレオチドトランスフェラーゼを使用するテンプレート非依存的ポリヌクレオチド合成は、低減したコストにおいておよびより低い廃棄物生成で、長鎖を合成し得る。酵素合成されるｓｓＤＮＡメモリ鎖は、従来のホスホロアミダイトアプローチと比較して、上記ＤＮＡ合成のうちの５０％を要求し得るに過ぎない。なぜなら、約１００〜２００ヌクレオチド長より長いｓｓＤＮＡ鎖は、複雑かつコストのかかるライゲーションまたはＰＣＲ技術を要求し、ｓｓＤＮＡをｄｓＤＮＡ中間体から生成し得るに過ぎないからである。米国特許第８，８０８，９８９号（Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．（本明細書に参考として援用される））を参照のこと。データコード化は、標準的ヌクレオチドを使用して数字で表される塩基２、３、４にあり得るか、またはデータ密度は、塩基８、１０、１２、またはより多くのコード化スキームを生成するために、改変されたヌクレオチドアナログの任意の数を使用して増大され得る。
【０００７】
改変されたヌクレオチドアナログに対する制限は、それらが選択された合成技術（例えば、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ））を使用して組み込まれ得ること、および選択された配列決定分析を使用して互いから区別され得ることのみである。いくつかの実施形態において、合成は、Ｍｎ２＋の存在下でポリメラーゼθを使用して達成され得る。
【０００８】
一貫したホモポリマートラクト長は、本発明のシステムおよびに本質的ではない。なぜならそれは、認識される必要のある個々のトラクトの間での遷移に過ぎないからである。上記トラクト長が変動することが許容され得るとしても、本発明の合成技術は、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）  対  合成中のオリゴヌクレオチドメモリ鎖の比率を調節し、発生中のメモリ鎖への上記ｄＮＴＰの曝露時間を制御することによって、平均ホモポリマートラクト長を効果的に制御し得る。上記ホモポリマートラクトの長さは、上記リードアウト技術に最適化され得る；最高のデータ記憶密度は、単一ヌクレオチドリードアウト分解能で達成されるが、最高のリードアウト速度および精度は、所定の配列決定技術に関して、上記ヌクレオチドビットのサイズを最小限の検出可能な長さ（例えば、２〜１０ヌクレオチド）へと拡げることによって達成可能である。
【０００９】
ナノポア配列決定法を使用する本発明のシステムおよび方法は、上記鎖のうちの一方または両方の末端上に含まれる専門的メモリ鎖構築物（例えば、ストッパー（例えば、ヘアピンまたは高分子付加物））を使用し得る。他のナノポアベースの方法では、上記メモリ鎖は環化され得、隣接するナノポアの間に通され得る。
【００１０】
本発明のある種の局面は、核酸メモリ鎖を使用してデータを記録するための方法を包含する。上記方法の工程は、データセットを表すインシリコオリゴヌクレオチド配列を作製する工程を包含し得、ここで上記オリゴヌクレオチド配列の各ヌクレオチドは、上記データセットのユニットに相当する。次いで、複数のホモポリマートラクトを含む核酸メモリ鎖が合成され得、ここで各ホモポリマートラクトは、上記オリゴヌクレオチド配列のヌクレオチドに相当する。上記複数のホモポリマートラクトは、３〜１０の間の反復ヌクレオチドを含み得る。上記データセットの各ユニットは、特定の適用に関して所望されるとおりの塩基２、塩基３、塩基４、またはより多くにおいて表され得る。
【００１１】
ある種の実施形態において、上記核酸メモリ鎖は、少なくとも約２００ヌクレオチド長〜約５，０００ヌクレオチド長であり得る。上記合成する工程は、ｄＮＴＰ濃度を変動させることによって、ホモポリマー長を制御する工程を包含し得る。上記方法の工程は、上記核酸メモリ鎖の第１の末端を改変して、ナノポア配列決定法システムのナノポアを通る上記第１の末端の通過を防止する工程；上記核酸メモリ鎖の第２の末端を上記ナノポアを通って通過させる工程；および上記核酸メモリ鎖の第２の末端を改変して、上記ナノポアを経る上記第２の末端の通過を防止する工程を包含し得る。
【００１２】
他の実施形態は、規定された化学量論または組成のヘテロポリマートラクトから構成されるメモリ鎖を利用して、ヌクレオチドアナログの設定数のコード化能力をさらに増大させ得る。さらなる実施形態は、構造において類似であるが、種々の条件（例えば、紫外線もしくは可視光、酸化剤もしくは還元剤、アルカリ性もしくは酸性のｐＨ、または配列特異的ヌクレアーゼ）の下で除去され得るリンカーを使用するヌクレオチドアナログを使用し、それによって、適用可能なプロセスの知識がない者に上記データを偽装することによって、メモリ鎖においてコードされたデータを保護するように努められ得る。
【００１３】
上記データセットは、テキストファイル、イメージファイル、およびオーディオファイルからなる群より選択され得る。上記合成する工程は、テンプレート非依存的合成を含み得る。ある種の実施形態において、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素は、上記テンプレート非依存的合成を触媒するために使用され得る。ポリメラーゼθは、いくつかの実施形態において上記テンプレート非依存的合成を触媒するために使用され得る。
【００１４】
本発明の局面は、核酸メモリ鎖からデータを読み取るための方法を包含し得る。上記方法の工程は、複数のホモポリマートラクトを含む核酸メモリ鎖を配列決定する工程；上記核酸メモリ鎖配列をデジタル化データに変換する工程であって、ここで上記複数のホモポリマートラクトの各々は、データのユニットに相当するヌクレオチドを表す工程；および上記デジタル化データ片を読み取り可能なフォーマットに変換する工程を包含し得る。上記方法の工程は、上記読み取り可能なフォーマットをディスプレイする工程を包含し得る。上記複数のホモポリマートラクトは、約２〜約１０の間のヌクレオチド反復を含み得る。上記核酸メモリ鎖は、少なくとも約２００ヌクレオチド〜約５，０００ヌクレオチド長の間であり得る。
【００１５】
種々の実施形態において、上記配列決定する工程は、ナノポア配列決定法、一塩基合成法、または質量分析法を含み得る。上記配列決定する工程、翻訳する工程、および変換する工程は、上記核酸メモリ鎖上で１またはこれより多くの回数、反復され得る。
【００１６】
本発明の他の局面は、以下の図面および詳細な説明を考慮すれば、当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ホモポリマートラクトを形成するために使用される酵素による合成サイクルを示す。
【００１８】
【図２】図２は、ホモポリマートラクトで核酸メモリ鎖を合成する方法を示す。
【００１９】
【図３】図３は、ホモポリマートラクトを有する核酸メモリ鎖からデータを読み取る方法を示す。
【００２０】
【図４】図４は、ホモポリマー長および鎖長に対する鎖／ＧＢの関係を示す。
【００２１】
【図５】図５は、メモリ鎖における区別可能なヌクレオチドアナログの数の関数として、５００のポリマートラクトから構成されるＤＮＡ鎖においてコードされ得るデータを示す。
【００２２】
【図６】図６は、本発明のナノポアに捕捉された核酸メモリ鎖を示す。
【００２３】
【図７】図７は、処理条件に応じてホモポリマートラクトの鎖内にコード化されるデータを変化させるためのスキームを示す。
【００２４】
【図８】図８は、ホモポリマートラクトで核酸メモリ鎖を合成するためのシステムを示す。
【００２５】
【図９】図９は、ナノウェルのアレイ上でホモポリマートラクトで核酸メモリ鎖を並行して合成するためのシステムを示す。
【００２６】
【図１０】図１０は、システム内に出現し得る構成要素のより詳細な模式図を与える。
【００２７】
【図１１】図１１は、２つの異なる塩基組成ホモポリマートラクトの酵素により媒介される合成の分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
本発明は、デジタルデータのユニットに相当するホモポリマートラクトを有する核酸からのデータを書き込み、データを読み取るためのシステムおよび方法を提供する。そのデータコード化配列における各ヌクレオチドを（例えば、３〜１０回）反復することによって、ホモポリマートラクトとの間の遷移のみが、核酸データ記憶におけるより安価な実行を生じ得るより低い忠実度、よりハイスループットの配列決定技術を可能にする配列決定リードにおいて観察されるために必要である。核酸ホモポリマートラクトメモリ鎖を合成することの利点は、以下である：１）非常に長い（５〜１０ｋｂ）鎖を作製する能力があり、これは、ハイスループット、リードアウトのための長リードＤＮＡ配列決定技術の使用を可能にすること、２）配列決定リードアウト技術におけるエラーを許容できること、および３）従来の化学的合成法のものより遙かに少ないコストで核酸メモリ鎖を作製できること。ホモポリマー核酸メモリ鎖の使用は、テンプレート非依存的ＴｄＴ酵素またはポリメラーゼθを使用して効率的に生成され得る長い（例えば、５〜１０ｋｂ）鎖において最良に実現され、ここでホモポリマートラクト長は、曝露時間およびｄＮＴＰ  対  ポリヌクレオチドメモリ鎖比を質変化させることによって制御され得る。
【００２９】
酵素により媒介されるアプローチによってデータをコードするためのホモポリマーの合成は、ターミネーターではない、天然のまたは改変されたヌクレオチドトリホスフェートを使用することによって容易に達成され、可能なＤＮＡ合成の最も単純でかつ最も迅速な方法を生じる。１つの天然のまたは改変されたヌクレオチドトリホスフェートは、反応ゼロへとヌクレオチジルトランスフェラーゼで送達され、反応させられ、次いで、緩衝液で洗浄することによって除去され、このようにして、図１で図示されるとおりのデータ記憶の１つの「書き込み（ｗｒｉｔｅ）」サイクルを完了させる。そのデータ鎖合成は、毒性または有害な化学物質がない完全に水性の環境で起こり、従って、大規模データ記憶センターに適した実際的なデバイスを可能にする。
【００３０】
図２は、ある種の実施形態に従うホモポリマートラクトで核酸メモリ鎖を合成する方法１０１を示す。その方法１０１は、データセットを表すインシリコオリゴヌクレオチド配列を作製する工程１０３を包含する。そのデータセットは、テキスト、イメージ、ビデオ、オーディオ、またはデジタル化され得るいずれかの他の情報片を表し得るデジタル化データを含み得る。そのオリゴヌクレオチド配列は、天然もしくは改変されたヌクレオチドまたはそのアナログの任意の数を含み得、そのメモリ鎖において使用される特有のヌクレオチドもしくはアナログの数に依存して、塩基２、塩基３、塩基４、またはより多くのスキームを使用してそのデータセットをコードし得る。単純な実施形態において、上記コード化スキームは、従来から、１またはこれより多くのヌクレオチドまたはアナログが０ｓに相当し得、１またはこれより多くの他のヌクレオチドが１ｓに相当し得る一連の０ｓおよび１ｓによって表されるバイナリデータスキームに相当し得る。次いで、インシリコオリゴヌクレオチド配列において、順に、一連のホモポリマートラクト（各々、１ヌクレオチドに相当する）を含む核酸メモリ鎖（例えば、ＲＮＡ、１本鎖または２本鎖のＤＮＡ）は、合成され得る１０５。ある種の実施形態において、さらなる工程は、上記メモリ鎖の一方の末端を改変する工程１０７、上記メモリ鎖を、ナノポアを通って通す工程１０９および上記鎖の他方の末端を改変して、上記末端が上記ナノポアを通って通過しないように防止する工程１１１を包含する。
【００３１】
図３は、ホモポリマートラクトを有する核酸メモリ鎖からデータを読み取る方法２０３を示す。上記方法２０３の工程は、核酸メモリ鎖における一連のホモポリマートラクトを配列決定する工程２０３、上記配列をデータセットに変換する工程２０５、上記データセットを読み取り可能なフォーマット（例えば、イメージ、ビデオ、オーディオクリップ、またはテキスト片）に変換する工程、および必要に応じて、そのデータの読み取り可能なフォーマットを（例えば、モニター上に、またはプリンターもしくは他の入力／出力デバイスを使用して）ディスプレイする工程２０９を包含する。
【００３２】
好ましくは、本発明のシステムおよび方法は、１本鎖または２本鎖のいずれかでありかつ天然に存在し得るかまたは化学合成もしくは酵素による合成によって生成され得る、長いＤＮＡ鎖（５〜１０ｋｂ）を使用する。ある種の実施形態において、その核酸メモリ鎖は、２〜１０、３〜１０、４〜１０ヌクレオチドまたはこれより長くてもよい一連のホモポリマートラクトを作製するために、ＴｄＴを使用して酵素により生成され得る。そのホモポリマートラクトは各々、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、またはチミン（Ｔ）からなり得る。交互になっているホモポリマートラクトの配列は、そのメモリ鎖において記憶されるべきであるデータをコードするために使用され得る。
【００３３】
各ヌクレオチドホモポリマートラクトは、使用される塩基の数に依存して、種々の量のデータを表し得る。１バイトを作製するために要求されるビット数（十進法の２５６）は、以下の関係によって規定される：  ＃ビット／バイト＝８／（ｌｏｇ２（ｎ））（ここでｎ＝数字で表される使用される塩基）。各トラクトは、２個の塩基コード化が使用される場合に１ビットに相当し得るか、または４個の塩基コード化が使用される場合に、１バイトの１／４に相当し得る。ある種の実施形態において、ＤＮＡデータ鎖は、２〜１０個のヌクレオチドホモポリマートラクトから（塩基２データセット提示を使用して）構成され得、これは、３３３ビット〜１００ビットが、９９９塩基長〜１０００塩基長との間のメモリ鎖において表されることを可能にする。好ましい実施形態において、データの核酸塩基コード化は、１種のヌクレオチドの単一ホモポリマートラクトが異なるヌクレオチドのホモポリマートラクトに常に隣接しているようにされ得る。例えば、コード化は、アデニンのホモポリマートラクトは直前にないか、または別のアデニンホモポリマートラクトが続かないようにされ得る。２つの隣接するホモポリマートラクトが同じヌクレオチドを含む場合には、そのコード化データ配列中の単一のヌクレオチドを表す平均ホモポリマートラクトより測定可能に長いホモポリマートラクトが合成され得る。それらのより長いトラクトは、例えば、反応におけるｄＮＴＰの濃度を増大させるかまたは反応時間を増大させることによって、以下で記載される合成反応の操作を通じて作製され得る。２つの隣接する同一のホモポリマートラクトの正確な長さは、リードアウトデバイス（すなわち、ナノポア配列決定機）を使用して単一ホモポリマートラクトから一義的に区別されるために十分長い必要があるに過ぎない。ある種の実施形態において、非ヌクレオチドホモポリマースペーサーは、隣接する同じヌクレオチドホモポリマートラクトを互いから明確に区別するために、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴのホモポリマートラクトの間に付加され得る。Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴのホモポリマートラクトの使用は、２つのヌクレオチド（バイナリコードにおける０ｓおよび１ｓに類似）を単に使用するよりむしろ、１つの連続鎖において記憶され得るデータの密度を増大させる４ビットコード化空間の作製を可能にする。例えば、４つの連続するホモポリマートラクトは、Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴが塩基４スキームにおいて使用される場合、２５６ディジット（すなわち、１バイト）をコードし得る。このような実施形態において、３ヌクレオチド長のホモポリマートラクトまたは１０ヌクレオチド長のホモポリマートラクトがそれぞれ使用されるとすれば、８３バイトまたは２５バイトは、９９６ヌクレオチド長または１０００ヌクレオチド長の核酸メモリ鎖において表され得る。
【００３４】
種々の実施形態において、塩基８またはさらに塩基１２コード化スキームは、特有に改変されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドアナログのホモポリマートラクトのメモリ鎖への組み込みを通じて使用され得る。それらの改変されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドアナログは、特有のデジタルシグナルを、ナノポア配列決定機または一分子ＺＭＷ配列決定機のようなリードアウトデバイスで生成するはずである。ＴｄＴ（以下で考察されるとおり）は、ナノポアのようなリードアウトデバイスによって提供されるシグナルを増強し得る、広い範囲の改変されたｄＮＴＰアナログを組み込み得、従って、それらの中にコードされたデータを有する核酸メモリ鎖を生成するために使用され得る。改変されたヌクレオチド（例えば、Ａ＊、Ｇ＊、Ｃ＊およびＴ＊またはＡ＊＊、Ｇ＊＊、Ｃ＊＊およびＴ＊＊）のホモポリマーは、８ビットまたはさらに１２ビットのコード化スキームを生成するために、ＴｄＴおよび４種の塩基の各々の改変されたｄＮＴＰアナログ（例えば、ｄＡ＊ＴＰまたはｄＡ＊＊ＴＰ）を使用して合成され得る。より多くの塩基（ｎ）コード化は、データ圧縮を可能にし、所定の情報量をコードするために要求されるＤＮＡ鎖の数の低減を生じる。ホモポリマートラクトの長さの関数としてデータ１ＧＢあたりのＤＮＡ鎖の数、数字で表される塩基（ｎ）、および合成される鎖長を決定する関係性は、以下によって規定される：  ＃鎖／ＧＢ＝（８／（ｌｏｇ２（ｎ））＊１０９＊ホモポリマー長＊１／鎖長（図４に図示されるとおり）
【００３５】
特有のホモポリマートラクトの数は、リードアウト技術（すなわち、ナノポアまたはＺＭＷ一分子配列決定）が１つのホモポリマートラクトを別のものから決定する能力によってのみ制限され得る。ナノポアを経て位置を変える間のイオン流の変化を検出することによる、改変されていないヌクレオチドから構成されるホモポリマーの検出が、文献においていくつか報告されている（Ｖｅｎｔａ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１３；  Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１５）。ナノポアにおけるＤＮＡの滞留時間を変化させる改変は、区別可能なかつ特徴的なイオン流シグナルを生成する。Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０およびＭｏｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１６は、５または１０ｋＤａ  ＰＥＧで官能化した非共有結合的ｂｉｓＰＮＡまたはγＰＮＡを使用して、ナノポアによる検出を増強する。Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ  ２０１５は、アダマンチル８−オキソＧアナログを選択的に作製して、その滞留時間を改変しかつ特有のシグナルを生成した。ＴｄＴがｄＡＴＰのＮ６での、ｄＣＴＰのＮ４での、ｄＧＴＰのＮ２もしくはＯ６での、およびｄＴＴＰのＯ４もしくはＮ３でのかさ高い改変の組み込みを許容するとすれば、それらの位置でのアシルもしくはアルキル改変は、ナノポアまたはＺＭＷ一分子配列決定技術の検出モダリティーを増強するようにスクリーニングおよび選択され得る。検出は、ナノポアにおける鑑別的な電流遮断を増強するかまたはＺＭＷ一分子アプローチにおけるＤＮＡポリメラーゼの活性部位における改変されたヌクレオチドの滞留時間を増強する改変されたヌクレオチドを通じて改善され得る。他の天然のおよび非天然のプリンおよびピリミジンヌクレオチドアナログは、これらが、ナノポア配列決定機または一分子ＺＭＷ配列決定機のようなリードアウトデバイスで特有のデジタルシグナルを生成する場合に使用され得る。ピリミジンおよびプリンのそれぞれＣ５またはＣ７における改変は、これらがナノポア配列決定機または一分子ＺＭＷ配列決定機のようなリードアウトデバイスで特有のデジタルシグナルを生成する場合に使用され得る。適切な改変されたヌクレオチドトリホスフェートは、酵素による伸長工程の間に迅速に組み込まれ、置換特異的滞留時間を検出工程の間に可能な限り短いホモポリマーに提供するように選択される。ビットコード化空間を拡大するために適したＡ、Ｇ、Ｃ、およびＴの塩基に対する改変の例としては、Ｎ６−ベンゾイルｄＡ、Ｎ６−ベンジルｄＡ、Ｎ６−アルキルｄＡ、Ｎ６−アシルｄＡ、Ｎ６−置換されたアルキルｄＡ、Ｎ６−置換されたアシルｄＡ、Ｎ６−アリールアシルｄＡ、Ｎ６−置換されたアリールアシルｄＡ、Ｎ２−アルキル−ｄＧ、Ｎ２−アシルｄＧ、Ｎ２−アリールアシルｄＧ、Ｎ２−置換されたアルキルｄＧ、Ｎ２−置換されたアシルｄＧ、Ｎ２−置換されたアリールアシルｄＧ、Ｏ６アルキルｄＧ、Ｏ４アルキルｄＴ、Ｎ３アルキルｄＴ、Ｎ３アシルｄＴ、Ｏ６置換されたアルキルｄＧ、Ｏ４置換されたアルキルｄＴ、Ｃ５−プロパルギルアミンｄＴ、Ｃ５−プロパルギルアミンｄＣ、Ｃ７−プロパルギルアミンｄＡ、Ｃ７−プロパルギルアミンｄＧ、置換されたＣ５−プロパルギルアミンｄＴ、置換されたＣ５−プロパルギルアミンｄＣ、置換されたＣ７−プロパルギルアミンｄＡ、置換されたＣ７−プロパルギルアミンｄＧが挙げられ得るが、これらに限定されない。置換の好ましい実施形態としては、反応種のｐＨ、温度および濃度の最も極端な化学条件下を除いて、除去に対して完全に安定である共有結合的付着が挙げられるが、これらに限定されない。特有の電流遮断に影響を及ぼし得る置換としては、アルキル、ヘテロ原子置換されたアルキル、芳香族炭化水素、アルキル置換された芳香族炭化水素、ヘテロ原子置換されたアルキル置換された芳香族炭化水素、ヘテロ原子置換された芳香族炭化水素、ベンジル、置換されたベンジルまたはこのようなものの組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、その置換は、２〜４５０のモノマー単位から構成されるポリエチレングリコールであり得る。いくつかの実施形態において、ペプチドまたはペプトイドから構成される置換は、特異的かつ識別可能な様式で、ホモポリマーの滞留時間を増大させるために適切であり得る。ＴｄＴのようなテンプレート非依存的ポリメラーゼによる改変されたヌクレオチドの組み込みの効率は、種々の金属イオン補因子（例えば、Ｃｏ＋＋、Ｚｎ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｍｎ＋＋、または２もしくはこれより多くの異なる金属イオンの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）の使用によって調節され得る。各改変されたヌクレオチドは、酵素によるホモポリマー合成の間の最適な性能のために、種々の金属イオンを要求し得る。
【００３６】
ＤＮＡデータ鎖の長期安定性は必須であることから、非プリンベースのホモポリマーを使用することには別個の利点が存在する。なぜならそれらは、低ｐＨでの脱プリンを受けやすいからである。いくつかの実施形態において、そのホモポリマービットは、特有の電流遮断を各々生じる、ホモポリマートラクトを生じる２個、３個、４個またはこれより多くの異なる化学基で改変される単一のヌクレオチドタイプ（すなわち、チミン）のみから構成され得る。従って、４個の特有の改変物質（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）で標識された１個のヌクレオチドは、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔの存在に代わって使用され得る。２個、３個、４個またはこれより多くの異なる化学基を有する他の３個のヌクレオチドのうちの１つのみを使用する他の実施形態は、可能である。
【００３７】
上記改変されたヌクレオチドアナログが、ナノポアを経る単一ヌクレオチドの通過のための特有の滞留時間を引き起こすために十分である場合、別の実施形態は、ホモポリマービットの代わりに単一ヌクレオチドビットを使用する。単一の改変されたヌクレオチドビットは、ＤＮＡ鎖ごとに最大の情報密度を可能にし、従って、ＤＮＡベースのデータ記憶のコストを低減することにおいて有利である。
【００３８】
ホモポリマートラクトの正確な長さは、そのリードアウトに使用される配列決定技術が、１つのホモポリマートラクトの開始および停止を別のものから明らかに区別し得る限りにおいて重大ではない。使用される特有のヌクレオチドまたは塩基（改変されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドアナログを含む）の数の増大、および従って、データの設定量を捕捉するために必要な長さを低減することに対する別個の合成および記憶密度の利点が存在するが、ＤＮＡデータ記憶合成あたりの最低コストは、酵素による合成の間に４種の天然のヌクレオチドｄＮＴＰモノマーを使用することによって達成され得る。なぜならそれら試薬は、分子生物学および配列決定分野において広く使用されており、最低の製造コストで非常に大きなバッチで生成されるからである。特有のホモポリマートラクトの数を増大させるｄＮＴＰアナログの生成コストは、ＤＮＡデータ記憶の使用が増大しかつアナログの製造スケールも増大されるにつれて、低減され得る。
【００３９】
ホモポリマートラクトセグメントを合成する任意の方法は、本発明のシステムおよび方法とともに使用され得るが、好ましい実施形態は、テンプレート非依存的酵素ＴｄＴを使用する。ＴｄＴは、ポワソン分布でそのホモポリマーを迅速にかつ安価に生成する限りにおいて、ある種の利益を提供し、ここでは、ホモポリマーの平均サイズが［ｄＮＴＰ］  対  発生中のオリゴヌクレオチドメモリ鎖の比率によって厳密に制御され得る。いくつかの実施形態において、Ｍｎ２＋の存在下でのポリメラーゼθは、ホモポリマートラクト核酸メモリ鎖を合成するためにテンプレート非依存的ポリメラーゼとして使用され得る。別の実施形態において、そのホモポリマートラクトセグメントの長さは、過剰なｄＮＴＰを反応ゾーンに送達し、次いで、その反応物を、注意深く制御された時間間隔の後に除去することによって制御され得る。
【００４０】
ＴｄＴは、ｄＮＴＰ濃度  対  改変することが所望される核酸鎖の３末端の濃度の比を制御することによって、かなり規定された長さのホモポリマートラクトを合成する能力を示した。アレイベースのフォーマット上でのインクジェット合成は、非常に低コストのホスホロアミダイト合成が可能であるが、作製される鎖は、１００〜２００塩基長に制限され、インデックス配列に長さのうちのいくらかを犠牲にしなければならず、その後のリードアウトのために十分な材料を提供するために合成後増幅を要求するフェムトモル未満のスケールで作製され、そして大抵は、比較的不十分なショートリード配列決定リードアウト技術に適している。
【００４１】
本発明のプロセスに従って合成される１本鎖ＤＮＡの鎖は、合成の間またはリードアウトの間のいずれかに、ヘアピンまたはｄｓＤＮＡの防止から利益を得ることができる。ヘアピン形成は、塩基対合に必要な水素結合を防止するために、Ａ：ＴまたはＧ：Ｃ塩基対のうちの一方のメンバーの環外アミンを改変することによって防止され得る。いくつかの実施形態において、その環外アミンは、アシル化またはアルキル化によって改変され得る。塩基対合を防止する、Ａ、ＧまたはＣの環外アミンの任意の単純かつ安定な改変は、ヘアピン形成を防止するために使用され得る。ある種の実施形態において、デオキシアデノシンのＮ６およびデオキシグアノシンのＮ２は、塩基対合を防止するアセチル基でアセチル化され得る。いくつかの実施形態において、デオキシアデノシンのＮ６およびデオキシシチジンのＮ４は、塩基対合およびヘアピン形成を防止するために改変され得る。いくつかの実施形態において、デオキシグアノシンのＯ６またはデオキシチミジンのＯ６は、塩基対合およびヘアピン形成を防止するために改変され得る。いくつかの実施形態において、デオキシチミジンのＯ４またはデオキシチミジンのＮ３は、塩基対合およびヘアピン形成を防止するために改変され得る。いくつかの実施形態において、より多くの塩基コード化スキームを生成するＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴへの改変はまた、塩基対合およびヘアピン形成を防止するという目的を果たす。いくつかの実施形態において、ホモポリマービットは、特有の電流遮断を生じかつ鎖内または鎖間２本鎖領域の形成を防止する２個、３個、４個またはこれより多くの異なる化学基で改変される単一ヌクレオチドタイプ（すなわち、チミン）のみから構成され得る。別の実施形態において、ＴｄＴまたは別のテンプレート非依存的ヌクレオチジルトランスフェラーゼの熱安定バージョンは、高温での鎖合成を行う、従って、鎖内または鎖間２本鎖領域の形成を防止するために使用され得る。
【００４２】
ホモポリマートラクト長の制御は、２〜１０ヌクレオチド長のホモポリマートラクト長の再現可能な範囲を作製するために、ｄＮＴＰアナログの組み込み速度の決定および較正後に、上記で記載されるとおりの任意のアナログに関して最適化され得る。Ａ＊、Ｇ＊、Ｃ＊、およびＴ＊ならびにＡ＊＊、Ｇ＊＊、Ｃ＊＊およびＴ＊＊ホモポリマートラクトの使用は、８ビットまたは１２ビットコード化の作製を可能にし、「０」および「１」をコードするために２つのヌクレオチドを単純に使用することよりむしろ、１つの連続する鎖において記憶され得るデータの密度を増大する。３つの連続するホモポリマートラクトは、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ａ＊、Ｇ＊、Ｃ＊、およびＴ＊が使用される場合に、２５６ディジット（すなわち、１バイト）をコードし得る。このような実施形態において、３ヌクレオチド長のホモポリマートラクトまたは１０ヌクレオチド長のホモポリマートラクトがそれぞれ使用される場合には、９９９または９９０ヌクレオチド長の核酸メモリ鎖において１１１バイトまたは３３バイトとなる。２つの連続するホモポリマートラクトは、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ａ＊、Ｇ＊、Ｃ＊、Ｔ＊、Ａ＊＊、Ｇ＊＊、Ｃ＊＊、およびＴ＊＊が使用される場合には、２５６ディジット（すなわち、１バイト）をコードし得る。それらの実施形態において、３ヌクレオチド長のホモポリマートラクトまたは１０ヌクレオチド長のホモポリマートラクトがそれぞれ使用される場合、９９６または１０００ヌクレオチド長の核酸メモリ鎖において１６６バイトまたは５０バイトとなる。
【００４３】
ある種の実施形態において、データはまた、より高レベルのデータ圧縮を達成するために、無作為配列および規定された組成のメモリ鎖ヘテロポリマートラクトにおいてコードされ得る。そのヘテロポリマーストレッチは、種々のｄＮＴＰの混合物（ここでそのｄＮＴＰ化学量論は、そのヘテロポリマートラクトの組成を制御するために使用される）を使用する酵素による反応で生成され得る。ヘテロポリマートラクトの数およびタイプは、ｄＮＴＰアナログの組み合わせおよびその検出モダリティーがその異なるトラクトの組成を区別する能力によってのみ制限される。ｍ個のｄＮＴＰアナログに関して、ヘテロポリマー形成に関して（ｍ２−ｍ）／２バイナリ組み合わせが存在する。各バイナリ組み合わせのトラクト組成の２つの異なるレベル（例えば、アナログＡおよびＢが、それぞれおよそ２：１比で存在するトラクトならびにそれらが１：２比で存在するトラクト）を区別し得る検出モダリティーは、データが塩基ｍ２の速度でｍ個のアナログのセットからコード化されることを可能にし、そのメモリ鎖のコード化能力を効果的に倍加する。図５は、ホモポリマーおよび２つのレベルのトラクト組成でのバイナリヘテロポリマーベースのコード化スキームのいずれかを使用して、入手可能なｄＮＴＰアナログの数の関数としてメモリ鎖において記憶され得るデータを図示する。
【００４４】
本発明のデータコード化鎖は、正確に規定されたホモポリマー長を必ずしも要求しないことがある。なぜならそれらは、ハイスループットＤＮＡ配列決定技術によってホモポリマートラクトセグメント間での遷移の一義的な区別を可能にするために十分長い（約２〜１０ヌクレオチド）必要があるに過ぎないからである。既存の次世代の一塩基合成（ＳＢＳ）システムは、２つの隣接するホモポリマートラクト間の遷移を容易に決定し得る。繰り返すと、ホモポリマートラクトの正確な長さは、ホモポリマービットの正確な検出にとって重要ではない。同じヌクレオチドのトラクトの使用は、現行のＳＢＳプラットフォームにおける最も頻繁なエラー：挿入および欠失を克服するにあたって利点を提供する。＞２ｎｔのホモポリマートラクトにおける１ヌクレオチドの検出は、本当のホモポリマーとしてなお解釈される。同様に、ホモポリマートラクトにおける単一ヌクレオチドの挿入は、２つの隣接するホモポリマーとして誤って解釈されない。なぜならＳＢＳの間の１より多くのヌクレオチドの挿入は、起こりそうにない事象だからである。この配列決定エラー許容誤差は、ＤＮＡデータ鎖によって記憶される情報の正確なデコードを担保するために要求される配列決定深度を減少させるという利点を提供する。既存のナノポアシステムは、それらの鑑別的電流遮断に基づいて、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴのホモポリマートラクトを互いから容易に区別し得る。ある種の実施形態において、一分子ＺＭＷ配列決定法は、直線状の鎖上のホモポリマートラクトの線形順序を決定するために使用され得る。いずれかの配列決定技術の使用は、ＤＮＡイニシエーターが、一分子ＺＭＷ配列決定のためのプライマーを提供するために、合成された１本鎖メモリ鎖の５’末端において自己相補性ヘアピンのような、配列決定リードアウト技術と適合性である特性を有することを要求し得る。ナノポア配列決定技術はまた、「スタート」データマークを提供するために、鎖の５’末端において自己相補性ヘアピンを要求し得る。種々の実施形態において、上記リードアウト技術は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）によって提供されるもののような任意の次世代配列決定法であり得る。いくつかの実施形態において、そのリードアウトまたは配列決定技術は、質量分析法ベースであり得る。そのリードアウト技術の技術特異的なエラー率は、２つの異なるホモポリマートラクト間の遷移を一義的に検出し得るおよび／または１つのホモポリマートラクト長と２つの同一のホモポリマートラクトが互いに隣接している場合に１つの２×長との間の差異を一義的に検出し得る限りにおいて、重要ではない。
【００４５】
ある種のリードアウト技術は、本発明の具体的適用に基づく他のものより好ましいこともある。ナノポア配列決定法のような技術は、非破壊的であり得、その核酸メモリ鎖を無傷のまま残し得、多数のリードアウトサイクルに適切であり得る。ＺＭＷ一分子などのような一塩基合成法（ＳＢＳ）に依存するリードアウト技術は、オリジナルのテンプレート鎖のコピーを生成し得、その相補鎖を分離して、そのオリジナルの核酸メモリ鎖を、その後のリードアウトサイクルの準備ができたその初期状態へと戻すために、リードアウト後操作（すなわち、融解による鎖分離）を要求し得る。質量分析法のような他のリードアウト技術は、破壊的であり、サンプリングおよびリードアウトの反復サイクル後に、核酸メモリ鎖のプールを使い尽くす。
【００４６】
種々の実施形態において、核酸メモリ鎖は、「ストッパー（ｓｔｏｐｐｅｒ）」を含み得る。「ストッパー」は、ナノポアを経る１本鎖または２本鎖の核酸の通過を防止する高分子構築物であり得る（Ｍａｎｒａｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  Ｒｅａｄｉｎｇ  ＤＮＡ  ａｔ  ｓｙｎｇｌｅ−  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｕｔａｎｔ  ＭｓｐＡ  ｎａｎｏｐｏｒｅ  ａｎｄ  ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０，  ３４９−３５３（本明細書で参考として援用される））。ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼのようなタンパク質は、タンパク質のナノポアのシス側にある大きい方のポア（約６．３ｎｍ）を通して引っ張られないために十分大きい。その小さい方の側のポア直径は、約１．２ｎｍ幅であると概算される。ストッパーは、本発明の核酸メモリ鎖の５末端または３’末端いずれの上でも使用され得る。いくつかの適用では、核酸分子の３’末端または５’末端の両方にストッパーを有することが望ましい場合がある。ストッパーは、突出する５’オーバーハングまたは３’オーバーハング（これに、情報コード化核酸が共有結合的に付着される）のいずれかを有するヘアピン（ステム−ループ）構造からなり得る。そのストッパーがヘアピンからなる場合、そのｄｓステムの長さは、そのメモリ鎖をそのナノポアを経て位置を変えるために使用される電場によって、そのステムに対して発揮される任意の融解力に耐えるために十分長いことがある。ある種の実施形態において、２本鎖ステム領域の１つの塩基は、そのヘアピンの２本鎖ステム部分がナノポアを経てその分子の残りの位置を変える電場によってその分子に対して発揮される力の影響下で融解し得ないように、その塩基対合を形成するその同族塩基へと架橋され得る。ある種の実施形態に従うＴｄＴ媒介性核酸メモリ合成のためにヘアピンストッパーを利用するために、そのストッパーは、テンプレート非依存的合成のためにＴｄＴの結合を可能にする十分な長さ（すなわち、＞１０ヌクレオチド）の３’オーバーハングを有し得る。
【００４７】
ストッパーは、核酸分子の３’末端または５’末端のいずれかに付加され得る非ヌクレオチド高分子構築物からなり得る。その構築物は、ポリメラーゼまたはＴｄＴのようなトランスフェラーゼによる、核酸の３’末端上への高分子種の直接的結合体化によって（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｒｇｅ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｏ  ＤＮＡ，  ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，  ７（９）：８０９８−８１０４（本明細書で参考として援用される））、または官能性を介して核酸の特定の改変を可能にするその官能化したヌクレオチドの組み込みによって（Ｗｉｎｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４３（１７）：ｅ１１０（本明細書で参考として援用される））、合成され得る。５’末端ストッパーは、ヘアピンの直接合成を介するか、または３’から５’へのオリゴヌクレオチド合成の最終工程として導入される機能性ハンドルの二次改変を介するかのいずれかで、オリゴヌクレオチドアダプターの化学合成のときに容易に導入され得、イニシエーターとして使用され得る。あるいは、５’末端ストッパーは、オリゴヌクレオチドイニシエーターを、その５’末端を介して、磁性ビーズもしくは非磁性ビーズまたは粒子もしくはナノ粒子に付着させ、メモリ鎖を含むホモポリマートラクトを酵素により合成し、次いで、その磁性ビーズもしくは非磁性ビーズまたは粒子もしくはナノ粒子に付着されたメモリ鎖を残すことによって、構築され得る。
【００４８】
ストッパーは、分子の残りからのそのストッパーの切断を可能にして、その核酸鎖がそのナノポアから受動的に拡散するかまたは電圧の適用を通じて、そのナノポアから位置を変えるかのいずれかを可能にし、このようにして、鎖が回復されることを可能にするようにさらに改変され得る。
【００４９】
ある種の実施形態において、テンプレート非依存的ポリメラーゼまたはトランスフェラーゼは、「１回書き込み多数回再生（Ｗｒｉｔｅ  Ｏｎｃｅ，  Ｒｅａｄ  Ｍａｎｙ）」タイプのメモリデバイスとして、ナノポアデバイスの使用を可能にするために、核酸の合成前の鎖を改変するために使用され得る。ＤＮＡ配列決定機としてのナノポアデバイスの使用と関連する本質的論点の一部は、そのデバイスがナノポアの不十分な区別が原因で生じさせる高いエラー率である。これは、そのポアを経て位置を変える速度、またはナノポアのおよその深さが８ｎｍであり、多数の塩基が同時にそのポアに存在することを可能にするという事実に起因し得る。本発明のホモポリマーメモリ鎖は、ホモポリマー反復の使用を通じてこの論点に対処し、厳密な配列決定精度の必要性を減少させる。ある種の実施形態において、ナノポア配列決定法の欠点は、位置を変えて塩基を呼び出すプロセスの間に、ＤＮＡメモリ鎖の各センスが読み取られ得、その結果、個々の塩基およびその相補鎖の読み取りが、核塩基を一度のみ読み取ることのエラー率を保証し得るように、ヘアピンアダプターを２本鎖ＤＮＡメモリ鎖の一方の末端に与えることによって対処され得る。ある種の実施形態において、ナノポア配列決定法の忠実度は、ポアを横断して位置を変えないかさ高い付加物（例えば、タンパク質または固体状態）を有する１本鎖または２本鎖の核酸分子の各末端（５’末端および３’末端）の適切な改変によって増大され得る。次いで、その分子は、ポア内で捕捉され得、何度も前後に位置を変えられて、同じポアにおける同じ分子の多数のリードを可能にし得、従って、その配列決定エラー率を、リードの数の平方の平方によって低減し得る（配列決定リードエラーが確率的起源に起因する場合）。
【００５０】
ＴｄＴのようなトランスフェラーゼは、ＤＮＡ分子の３’末端に大きくかつかさ高い改変ヌクレオチドアナログを付加するために使用され得る。ある種の実施形態において、ＷＯＲＭナノポアメモリデバイスは、以下の工程を使用して生成され得る：（１）上記で考察されるとおりの任意の高密度コード化スキームにおいて特定の情報をコードする一分子のＤＮＡを生成し、その５’末端を、ナノポアを経るそのＤＮＡ分子の完全に位置を変えることを防止するかさ高い分子構築物で共有結合的に改変する工程；（２）その５’改変された末端がそのナノポアと接触状態になりかつそれ以上位置を変えられなくなるまで、そのＤＮＡ分子をそのナノポアを経て通す工程；（３）ＴｄＴおよび改変されたヌクレオチドを使用して、１個（またはこれより多くの）かさ高いヌクレオチドアナログ（「ストッパー」）をそのＤＮＡ分子の３’末端に共有結合的に付加して、そのナノポアの円環（ｔｏｒｕｓ）内にその分子を効果的に捕捉する工程；（４）そのナノポアへの電流の極性を逆にして、３’改変されないいかなるＤＮＡ分子をも取り除き、従って、「捕捉された」（５’改変および３’改変された）核酸鎖の純粋な集団を作製する工程；（５）洗浄もしくは他の手段を通じて、任意の捕捉されていない核酸をそのナノポアの近傍から除去する工程；（６）適用された電圧を使用して、その「捕捉された」ＤＮＡ鎖をいずれかの方向または両方向において読み取る工程（潜在的には、そのエラー率を受容可能なレベルへと低減するために何度も読み取る工程）。種々の実施形態において、工程６は、一方向における電圧誘導性「リード」、ナノポアを経てデータコード化核酸を「巻き戻す」ために反対方向において迅速に位置を変えること、続いて、元の方向における別の電圧誘導性「リード」からなり得る。「リード」−「巻き戻し」−「リード」のこのサイクルは、所望であるだけ何度でも反復され得る。
【００５１】
いくつかの実施形態において、その捕捉された核酸鎖は、いずれかの方向において位置を変える間に読み取られ得る。いくつかの実施形態において、その捕捉された鎖は、その分子の一方の末端（５’末端または３’末端のいずれか）に位置を変えられ得、反対の方向において読み取られ得る。なぜなら読み取りのこのような極性は、より精度の高い読み取りを提供し得るからである。
【００５２】
ある種の実施形態において、環化された核酸メモリ鎖は、上記の合成法、続いて環化を使用して生成され得る。その環化された鎖は、かさ高い高分子または特定のホモポリマー配列を含み得、ここでその合成された鎖の末端は、データ読み取りのための開始点および停止点を指定するために連結された。開始および停止のホモポリマー配列はまた、直線状の核酸鎖において使用され得る。環化された鎖３０５は、その環状鎖３０５が、図６に示されるように、単一の膜３０３上に配置された２つのナノポア（３０６および３０９）の間に物理的に捕捉されるように、２つの隣接するナノポア（３０６および３０９）の間に通されていてもよい。その環化されたメモリ鎖は、単一ヌクレオチドの配列、ホモポリマートラクト配列、改変されたヌクレオチドアナログの配列、またはこれらのいくつかの組み合わせのいずれかとして、デジタル情報をコードし得る。一方のナノポア３０９は、その情報がコードされたメモリ鎖がそのポアを経て位置を変えるにつれて電気シグナルを生成するために使用され得る一方で、他方のナノポア３０７は、そのＤＮＡ分子が、膜３０３のシス側および第１のナノポア３０９に戻ることを可能にするための発端として単に作用し得る。このスキームの１つの利点は、その情報コード鎖が、反復読み取りのためにリサイクルされ得、何度も読み取られて、そのようにして任意の考えられるリードアウトエラーを低減し得ることである。
【００５３】
他の実施形態は、メモリ鎖が特定のセットの条件下でのみアクセスされ得るように、そのメモリ鎖においてデータをコードし得る。このような場合、そのメモリ鎖は、少なくとも部分的に、切断可能なリンカーで付着された改変を含むヌクレオチドから構成される。改変（例えば、化学保護基）およびリンカーは、ポリマートラクトが正確な処理なしにナノポアを経て位置を変える場合に、電流遮断がそのデータをコードする配列とは異なるように選択され得る。図７は、ｄＧヌクレオチドへのジスルフィド連結およびアミド連結された改変を使用するスキームを概説し、電流遮断およびそのメモリ鎖においてコードされるデータが、処理条件に応じてどのように変化し得るかを図示する。Ｇ＊およびＧ＊＊は、サイズおよび融通性において構造的に類似であり、ナノポアプラットフォーム上で類似の電流遮断を生じ得るが、異なる条件下で除去される。Ｇ＊およびＧ＊＊＊は、構造的に異なるが、その改変は、同じ除去条件を共有する。他の実施形態は、異なる処理（例えば、特定の波長の光、酸性もしくはアルカリ性のｐＨ、酸化的条件もしくは還元的条件、または配列特異的ヌクレアーゼ）で切断可能である他の改変またはリンカーを使用し得る。いくつかの実施形態は、暗号化のためのメモリ鎖改変の存在もしくは非存在を、またはデータへの以前のアクセスまたは質変化の化学的マーカーとして使用し得る。大部分のリンカー切断反応は、効果的に不可逆性であるので、このアプローチは、１回書き込み多数回再生システムに最もよく適合される。ここのシステムでは、単一分子は、冗長性なしにデータをコードするために十分であり得る。
【００５４】
本発明のリードアウトスキームとともに有用である多くの考えられる情報コード化スキームは、可能であり、本開示に基づいて当業者に明らかであり得る。
【００５５】
合成は、プレートのウェル（例えば、各々１．５μｌの１５３６ウェルプレート）への滴の音波送達（ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）を使用して達成され得る。種々の実施形態において、核酸メモリ鎖は、ビーズもしくは磁性ビーズまたは表面上で合成され得、いずれも、全長合成が完了したか、または適用に依存して合成支持体から除去された後に、そのビーズもしくは磁性ビーズまたは表面上に残され得る。
【００５６】
ある種の実施形態において、長い（５〜１０ｋｂ）データ鎖の合成のためのシステムは、ウェルのアレイ（例えば、多数のナノリットル容積のウェル）へのインクジェット送達を使用し得る。他の実施形態において、多数の空気圧制御されるアクチュエーターは、アレイの各位置に試薬を同時に送達するために、各ウェルの上に配置され得る。各アクチュエーターは、そのＤＮＡデータ鎖のビットを特定するために使用されるテンプレート非依存的ポリメラーゼとともに製剤化される２またはこれより多くのヌクレオチドまたは改変されたヌクレオチドの各々の間を選択するセレクターバルブによって供給され得る。１またはこれより多くのさらなるセレクターバルブポートは、必要であれば、１またはこれより多くの洗浄試薬に専念させられる。ナノリットル容積のウェルのアレイは、そのウェルの直径が、送達された液体が開放端部にされたウェルの長さの中に毛細管作用によって捕捉されるようにされている限りにおいて、両方の末端において開き得る。ヌクレオチド−酵素製剤の各ラウンドが、その開放端部にされたウェルに送達された後、すすぎ試薬または酵素反応停止試薬が、各ウェルから反応混合物がすすがれ、そのようにして、酵素による合成の次のサイクルのためにそのアレイを準備するように、ウェルのアレイの下側の開放部を横切ってかつ経て流され得る。他の実施形態において、真空源は、１つの試薬を、次の試薬の送達の前にキャピラリーナノウェルから迅速に除去するために使用される。
【００５７】
ある種の実施形態は、バルブ制御された試薬送達を有する高度並行ナノ流体チャンバを使用し得る。例示的な微小流体核酸メモリ鎖合成デバイスは、例示目的でスケールどおりではないが図８に示される。微小流体チャネル２５５（レギュレーター２５７を含む）は、レザバ２５３を反応チャンバ２５１および出口チャネル２５９（レギュレーター２５７を含む）に連結して、その反応チャンバ２５１から廃棄物を排出する。核酸メモリ鎖合成のための微小流体デバイスは、例えば、チャネル２５５、レザバ２５３、および／またはレギュレーター２５７を含み得る。核酸メモリ鎖合成は、反応チャンバの内側表面に繋留または結合され、必要に応じて、ポリヌクレオチドイニシエーターを放出可能に結合し得るビーズまたは他の基材を含み得る、多くの繋留され合成されたヌクレオチドイニシエーターを含み得る微小流体反応チャンバ２５１において起こり得る。その反応チャンバ２５１は、試薬がその反応チャンバ２５４に添加および除去され得るように、少なくとも１つの取り入れ口および１つの出口チャネル２５９を含み得る。その反応チャンバ２５１は、最適なかつ再現可能な酵素による合成条件を維持するために温度制御されるべきである。その微小流体デバイスは、メモリ鎖コード化スキームにおいて使用されるべき各それぞれのｄＮＴＰまたはアナログのためのレザバ２５３を含み得る。これらのレザバ２５３の各々はまた、ＴｄＴまたはＤＮＡ鎖もしくはＲＮＡ鎖をテンプレート非依存的様式で伸長する任意の他の酵素の適切な量を含み得る。さらなるレザバ２５３は、洗浄または他の仕事のための試薬を含み得る。
【００５８】
レザバ２５３は、反応チャンバ２５４へと別個のチャネル２５５を介して連結され得、各チャネル２５５を経る反応チャンバ２５４への試薬の流れは、ゲート、バルブ、圧力レギュレーター、または他の手段の使用を通じて個々に調節され得る。反応チャンバ２５４から出口チャネル２５９を経る流れは、同様に調節され得る。レザバ２５３は、既知の濃度の流体中に懸濁されたｄＮＴＰ、改変されたｄＮＴＰまたは上記で記載されるこれらの任意のアナログを保持し得、その結果、試薬の濃度は、反応チャンバ２５４へと流れるようにされた試薬の容積に基づいて厳密に制御され得る。よって、各ホモポリマートラクトの長さは、試薬濃度の制御を通じて管理され得る。
【００５９】
ある種の場合には、試薬はリサイクルされ得る（特に、ｄＮＴＰおよび酵素試薬）。試薬は、反応チャンバ２５４から、同じチャネル２５５（これを経てそれらはゲート、バルブ、真空ポンプ、圧力レギュレーターまたは他のレギュレーター２５７を使用して逆流を誘導することによって入る）を介して、それらそれぞれのレザバ２５３へと引き戻され得る。あるいは、試薬は、反応チャンバ２５４からそれらそれぞれのレザバ２５３へと、独立した戻りチャネルを介して戻され得る。その微小流体デバイスは、ゲート、バルブ、圧力、または上記の他のレギュレーター２５７を作動し得るコントローラーを含み得る。
【００６０】
例示的な微小流体核酸メモリ鎖合成反応は、ＮＴＰ試薬を反応チャンバ２５４から出口チャネル２５９または戻りチャネル（示さず）を介して除去する前に、所望のｄＮＴＰ（本発明の核酸メモリ鎖においてデータをコードするために使用される任意の構成要素分子をいうために全体を通じて使用される）試薬を反応チャンバ２５４へと、所定の濃度でかつ所定の時間量（所望のホモポリマー長を生じるように計算される）にわたって流す工程；洗浄試薬を反応チャンバ２５４へと流す工程；洗浄試薬を反応チャンバ２５４から出口チャネル２５９を経て除去する工程；所望のメモリ鎖配列において次のＮＴＰ試薬を、所望のホモポリマートラクト比を達成するために計算された条件下で流す工程；および所望の核酸メモリ鎖が合成されるまで反復する工程を包含し得る。所望の核酸メモリ鎖が合成された後、それは、反応チャンバ繋留または基材から放出され得、出口チャネル２５９または他の手段を介して集められ得る。
【００６１】
使用可能なデータ量をコードするために要求されるホモポリマーコード化ＤＮＡ鎖の顕著な数が原因で、ＤＮＡ合成の高度並行法が要求される。一実施形態において、図９に示されるように、ウェルのアレイを含むフローセル（９−１）は、疎水性材料の水平および垂直のストライプ（９−２）をパターン形成して、疎水性領域の境界に面した複数の親水性ウェル（？）を形成することによって、適切な基材上に形成される。その親水性ウェルの代表的な寸法は、３００×３００ｎｍ〜１０００×１０００ｎｍであり得る。この親水性アレイは、フローセルのフロアを、そのフロアと光学的に透明なカバーとの間で適切な寸法のギャップとともに形成する。冷たい（すなわち、至適酵素特異的温度未満の）ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、天然もしくは改変されたヌクレオチドトリホスフェートのうちの一方および任意の必要な補因子の溶液は、流体の流れを中止した際に、その酵素−ヌクレオチドトリホスフェート溶液が、各親水性領域の上に配置された空間的に規定された液滴（９−４）へと滴にされるように、入り口（９−３）を経てそのフローセルへと流される。成形レンズ（９−６）を経たＩＲ源（９−５）は、ＤＬＰ（デジタルライト投射）デバイス（９−８）（このデバイスは、添加される特定のヌクレオチドを有するように選択される、疎水性により拘束された液滴（９−４）の各々にＩＲビーム（９−９）を同時に向けるために使用される）上にビーム（９−７）を投射し、ポリメラーゼ伸長反応製剤の、所望の長さのホモポリマーを合成するように規定された期間にわたって最大酵素活性のための温度への迅速な加熱を生じる。ある適切に規定された反応時間の後に、そのＩＲ源は停止され、冷たいすすぎ緩衝液が、そのフローセルの中へと迅速に注入され、出口（９−１０）を経て排出され、そのようにして、反応をクエンチし、１回の「書き込み」サイクルを終了する。この一連の工程は、各発生中のデータ鎖が、全長ホモポリマーデータ鎖が完成されるまで、その空間的位置および添加されるべき選択されたヌクレオチドに従ってランダムにアクセスされるように、各「書き込み」サイクルにつき何度も反復される。いくつかの実施形態において、１９２０×１０８０の操縦可能ミラーを有するＤＬＰデバイスは、合成フローセルにおいて〜２Ｍ合成位置に同時にランダムにアクセスするために使用され得る。いくつかの実施形態において、その使用されるテンプレート非依存的ポリメラーゼは、室温を十分に上回る至適反応温度を伴う好熱性であり、その結果、酵素活性は、ＩＲ源による液滴の迅速な加熱の前に、疎水性により拘束された液滴において最小限にされる。いくつかの実施形態において、そのフローセルの底面（疎水性により規定された親水性ウェルを有する）は、低温でその疎水性ウェルの中に液滴を維持して、温度がＩＲ源によって上昇されるまで酵素活性を妨げる冷却デバイスに隣接される。
【００６２】
別の実施形態において、フローセルは、疎水性領域の境界に面した複数の親水性スポットを形成する疎水性材料の水平および垂直ストライプのパターン形成によって、適切な基材上に形成されるウェルのアレイから構成される。その親水性スポットの代表的寸法は、３００×３００ｎｍ〜１０００×１０００ｎｍであり得る。各親水性スポットは、個々にアドレス指定可能なＣＭＯＳヒーターの上に配置される。この親水性−ＣＭＯＳヒーターアレイは、フローセルのフロアを、そのフロアと光学的に透明なカバーとの間に適切な寸法のギャップとともに形成する。冷たい（すなわち、至適酵素特異的温度未満の）ヌクレオチジルトランスフェラーゼおよび天然もしくは改変されたヌクレオチドトリホスフェートのうちの一方の溶液は、流体の流れを中止した際に、そのポリメラーゼ伸長反応溶液ビーズが、関連付けられたＣＭＯＳヒーターとともに各親水性領域の上に配置された空間的に規定された液滴へと滴にされるように、そのフローセルへと流される。添加される特定のヌクレオチドを有するように選択される、疎水性により拘束された液滴の各々は、所望の長さのホモポリマーを合成するように規定された期間にわたって最大酵素活性のための温度へと迅速に加熱される。ある適切に規定された反応時間の後に、そのヒーターは停止され、冷たいすすぎ緩衝液が、そのフローセルの中へと迅速に注入され、そのようにして、反応をクエンチし、１回の「書き込み」サイクルを終了する。この一連の工程は、各発生中のデータ鎖が、全長ホモポリマーデータ鎖が完成するまでその空間的位置および添加されるべき選択されたヌクレオチドに従ってランダムにアクセスされるように、各「書き込み」サイクルに関して何度も反復される。いくつかの実施形態において、使用される酵素は、そのＣＭＯＳヒーターによる液滴の迅速な加熱の前に、疎水性により拘束された滴に望ましくないヌクレオチドが添加される確率が低いように、室温を十分上回る至適温度に伴って好熱性である。
【００６３】
当業者は、本発明のシステムおよび方法に必要または最も適していると認識するので、本発明のシステムおよび方法は、プロセッサ３０９（例えば、中央演算処理装置（ＣＰＵ）、グラフィック処理装置（ＧＰＵ）など）、コンピューター読み取り可能な記憶デバイス３０７（例えば、メインメモリ、スタティックメモリなど）、またはバスを介して互いと連絡するこれらの組み合わせのうちの１つまたはこれより多くを含み得る、図１０に示されるとおりのコンピューティングデバイスを含み得る。コンピューティングデバイスは、モバイルデバイス１０１（例えば、携帯電話）、パーソナルコンピューター９０１、およびサーバーコンピューター５１１を含み得る。種々の実施形態において、コンピューティングデバイスは、ネットワーク５１７を介して互いと連絡するように構成され得る。
【００６４】
コンピューティングデバイスは、本明細書で記載される工程の中でもとりわけ、メモリ鎖の合成、配列決定されたメモリ鎖の読み取り、ならびにヒトまたは機械読み取り可能なフォーマットと、デジタル化データ、核酸配列との間のデータのコンパイルおよび翻訳を制御するために使用され得る。コンピューティングデバイスは、データの読み取り可能なフォーマットをディスプレイするために使用され得る。
【００６５】
プロセッサ３０９は、当該分野で公知の任意の適切なプロセッサ（例えば、Ｉｎｔｅｌ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）によって商品名ＸＥＯＮ  Ｅ７の下で販売されるプロセッサまたはＡＭＤ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，  ＣＡ）によって商品名ＯＰＴＥＲＯＮ  ６２００の下で販売されるプロセッサ）を含み得る。
【００６６】
メモリ３０７は好ましくは、以下を記憶し得る少なくとも１つの有形の一時的でない媒体を含む：システムに本明細書で記載される機能を実施させることが実行可能である指示の１またはこれより多くのセット（例えば、本明細書で見出される任意の方法論または機能を具現化するソフトウェア）；データ（例えば、メモリ鎖においてコードされるデータ）；または両方。コンピューター読み取り可能な記憶デバイスは、例示的実施形態において、単一の媒体であり得る一方で、用語「コンピューター読み取り可能な記憶デバイス（ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ｒｅａｄａｂｌｅ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｄｅｖｉｃｅ）」とは、その指示またはデータを記憶する単一の媒体または複数の媒体（例えば、集中データベースもしくは分散データベース、および／または関連付けられたキャッシュおよびサーバー）を含むと理解されるべきである。用語「コンピューター読み取り可能な記憶デバイス」は、応じて、ソリッドステートメモリ（例えば、加入者識別モジュール（ＳＩＭ）カード、セキュアデジタルカード（ＳＤカード）、マイクロＳＤカード、またはソリッドステートドライブ（ＳＳＤ））、光学および磁気媒体、ハードドライブ、ディスクドライブ、ならびに任意の他の有形記憶媒体が挙げられるが、これらに限定されないと理解されるものとする。
【００６７】
任意の適切なサービスが、記憶装置５２７のために使用され得る（例えば、Ａｍａｚｏｎ  Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、サーバー５１１のメモリ３０７、クラウド記憶装置、別のサーバー、または他のコンピューター読み取り可能な記憶装置のような）。クラウド記憶装置は、データが論理プール中に記憶され、物理的記憶装置が多数のサーバーおよび多数の位置にまたがり得るデータ記憶スキームをいい得る。記憶装置５２７は、ホスティングコンピューターによって所有されかつ管理され得る。好ましくは、記憶装置５２７は、本明細書で記載されるオペレーションを実施および指示するために必要な場合、記録３９９を記憶するために使用される。
【００６８】
本発明に従う入力／出力デバイス３０５は、ビデオディスプレイ装置（例えば、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）またはブラウン管（ＣＲＴ）モニター）、英数字入力デバイス（例えば、キーボード）、カーソル制御デバイス（例えば、マウスまたはトラックパッド）、ディスクドライブ装置、シグナル生成デバイス（例えば、スピーカー）、タッチスクリーン、ボタン、加速度計、マイクロフォン、携帯高周波アンテナ、ネットワークインターフェースデバイスのうちの１またはこれより多くを含み得、これらは、例えば、ネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）、Ｗｉ−Ｆｉカード、もしくは携帯モデム、またはこれらの任意の組み合わせであり得る。
【００６９】
当業者は、任意の適切な開発環境またはプログラミング言語が、本発明の種々のシステムおよび方法に関して本明細書で記載される操作性を可能にするために使用され得ることを認識する。例えば、本明細書のシステムおよび方法は、Ｐｅｒｌ、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｊａｖａ（登録商標）、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ、Ｒｕｂｙ  ｏｎ  Ｒａｉｌｓ、ＧｒｏｏｖｙおよびＧｒａｉｌｓ、または任意の他の適切なツールを使用して実行され得る。コンピューティングデバイス１０１に関して、本来のｘＣｏｄｅまたはＡｎｄｒｏｉｄ  Ｊａｖａ（登録商標）を使用することは好ましいことであり得る。
【００７０】
図１１は、酵素による合成を介して作製された２つの異なる単一のホモポリマートラクトのポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。レーンＡは、全ての以下のレーンにおいて使用される出発２０マーオリゴヌクレオチドのサンプルである。レーンＢは、２０マーオリゴヌクレオチドおよび２１マーの形成を示す非可逆的ターミネーターｄｄＡＴＰを含むＴｄＴ反応からのサンプルである。レーンＣは、３７℃において１分後の、２０マーおよび天然のヌクレオチドｄＡＴＰを含むＴｄＴ反応からのサンプルである。レーンＤは、３７℃において５分後の、レーンＤにおける同じ反応混合物のサンプルである。レーンＥは、３７℃において１５分後の、レーンＣにおける同じ反応混合物のサンプルである。それら３つのレーンは、ＴｄＴ伸長反応の間の約５分間での投入ｄＡＴＰの消費および５分〜１５分の間にホモポリマー成長が観察されないことに起因する、ホモポリマー長制御を図示する。レーンＦは、３７℃において１分後の、２０マーオリゴヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログＮ６−ベンゾイル−ｄＡＴＰを含むＴｄＴ反応からのサンプルである。レーンＧは、３７℃において５分後の、レーンＦにおける反応混合物のサンプルである。レーンＨは、３７℃において１５分後の、レーンＦにおける同じ反応混合物のサンプルである。レーンＦ〜Ｈにおいて形成されるｄＡＢｚホモポリマーの長さの間に定性的差異はあるものの、同じ長さ制御が、Ｎ６−改変ｄＡＴＰアナログを用いてすら示される。
【実施例】
【００７１】
Ｎ６−ベンゾイル−デオキシアデノシントリホスフェートを、バイアルに、乾燥Ｎ２の下でＮ６−ベンゾイル−２’−デオキシアデノシン（０．０５５ｇ，  ０．１６ｍｍｏｌ）を装填し、トリメチルホスフェート（０．４３５ｍＬ）を添加することによって調製した。その得られた溶液に、トリブチルアミン（０．０７７ｍＬ，  ０．３２ｍｍｏｌ）を添加し、その反応混合物を、−５℃で保持されている間に乾燥Ｎ２で３０分間フラッシュした。このバイアルに、無水オキシ塩化リン（ａｎｈｙｄｒｏｕｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ  ｏｘｙｃｈｌｏｒｉｄｅ）（０．０１８ｍＬ，  ０．１９ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して添加し、その反応混合物を−５℃において３分間撹拌した。無水オキシ塩化リンの第２のアリコート（０．００９ｍＬ，  ０．１０ｍｍｏｌ）を、シリンジを介して添加し、その反応混合物を−５℃において８分間撹拌した。第２のバイアルに、トリブチルアミンピロホスフェート（０．０７５ｇ，  ０．１４ｍｍｏｌ）を装填し、乾燥Ｎ２でフラッシュし、無水アセトニトリルを添加し（０．６０９ｍＬ）、続いて、トリブチルアミン（０．２３１ｍＬ，  ０．９７ｍｍｏｌ）を添加した。その調製したトリブチルアミンピロホスフェート混合物を−２０℃へと冷却し、その反応混合物に添加し、１０分間反応させた。その反応を、Ｈ２Ｏ（４．３５ｍＬ）を滴下することによってクエンチした。そのフラスコの内容物を０．８７ｍＬのＨ２Ｏと合わせ、ジクロロメタンで抽出した（３×１５０ｍＬ）。その水相を濃ＮＨ４ＯＨでｐＨ６．５に調節し、１２時間、４℃において撹拌した。その混合物を、５０ｍＬの水を入れた２５０ｍＬ丸底フラスコに移し、減圧下で濃縮した。その残渣を、４０ｍＬ  水に溶解し、イオン交換クロマトグラフィー（ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣ，  Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＤＥＡＥ  ４８ｍＬカラム容積，  段階的勾配０→水中７０％  ＴＥＡＢ，  ｐＨ７．５）を介して精製した。その所望の生成物（Ａ２６０による吸光度）を含む画分をプールし、乾燥するまで、水からの反復濃縮（５×５０ｍＬ）を介して残留炭酸水素トリエチルアンモニウムを除去して減圧下で濃縮して、Ｎ６−ベンゾイル−２’−デオキシアデノシントリホスフェートを得た。
【００７２】
改変されたヌクレオチドから構成され、ヌクレオチジルトランスフェラーゼＴｄＴによるホモポリマートラクトの制御された合成を、以下の様式で行った。デオキシアデノシントリホスフェート（ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＮ６−ベンゾイル−デオキシアデノシントリホスフェート（各１ｍＭにおいて）のストック溶液を、Ｈ２Ｏ中に調製した。
【００７３】
種々のトリホスフェートの各々の０．５μｌ（５００ｐｍｏｌｅ）を、１．５μｌ（３０Ｕ）の市販のＴｄＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．５μｌ（５０ｐｍｏｌｅ）の５’−ＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴ−３’（ＩＤＴ）、２μｌの市販のＴｄＴ  Ｒｘｎ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  −  １Ｍ  カコジル酸カリウム、０．１２５Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．０５％（ｖ／ｖ）  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、５ｍＭ  ＣｏＣｌ２（２５℃においてｐＨ７．２））および４．５μｌのＨ２Ｏと別個に合わせた。その反応物を、３７℃においてインキュベートした。３０μｌ  アリコートを、１分間、５分間、および１５分間後に取り出し、各々、２０μｌ  ５ｍＭ  ＥＤＴＡでクエンチした。各サンプルを、真空下で乾燥させ、１００μｌ  Ｈ２Ｏ中に再構成した。各時点の１０μｌを、１０μｌの変性ロード緩衝液（１００％  ホルムアミドおよび０．１％  Ｏｒａｎｇｅ  Ｇ）と混合し、１ｍｍ×２０ｃｍ×１４ｃｍ  ２０％  ポリアクリルアミドゲルのウェルに適用した。４００Ｖにおいて３．５時間電気泳動した後、そのバンドをＳｙｂｒ  Ｇｏｌｄ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で可視化し、ＵＶ照明（ＵＶ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｗｒａｔｔｅｎ  ２Ａ  フィルタ４０５ｎｍカットオフ，  ＵＶＰ，  ＬＬＣ）下で撮影した。
【００７４】
多数のホモポリマートラクトの合成のために、イニシエーターオリゴヌクレオチドを、ビーズに付着させて、前の反応物および洗浄物の除去が点在した多数回の酵素による合成を可能にし得る。５’−ビオチン−ＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴ−３’（ＩＤＴ）を、ストレプトアビジン被覆磁性セファロースマイクロビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともにインキュベートし得る。オリゴヌクレオチドを装填したビーズを、ビーズスラリーのアリコートを取り出し、フィルタカップに移すことによって調製し得る。次いで、そのビーズを、１×ＰＢＳ（ビーズスラリーの２×容積を使用）ボルテックスおよびすすぎごとに遠心分離で５回洗浄した。次いで、１×ＰＢＳの１／２  ビーズスラリー容積を添加し得、ビオチン化オリゴヌクレオチドを、１／１０の公表されたビーズ結合能において添加した。その混合物を、３７℃において２時間、３０分ごとにボルテックスしてインキュベートした。２時間後、少量の上清を取り出し得、そのＡ２６０を任意の結合されていないオリゴヌクレオチドに関して測定した。そのＡ２６０が＜１０％  残留オリゴヌクレオチドを一旦示した後、そのビーズをＭＱ水で５回洗浄し得る。その洗浄したビーズを、ＭＱ水で所望の濃度にし得る。
【００７５】
ホモポリマー合成を、ビーズ結合オリゴヌクレオチドに対して２〜１０×モル当量の所望のｄＮＴＰを使用して、上記のように実施し得る。ビーズ、ｄＮＴＰ、ＴｄＴおよび緩衝液を含む反応混合物を、３７℃において１５分間インキュベートし得る。その反応を、１０μｌ  ＥＤＴＡで停止し得、水で３回すすぎ得る。新たなホモポリマー合成サイクルを、新鮮なＴｄＴ酵素、ｄＮＴＰ、緩衝液を添加することによって開始し得、３７℃において１５分間インキュベートし得る。その反応をＥＤＴＡで停止し、水で３回すすいだ後に；そのホモポリマー合成サイクルを、所望されるだけ何度も反復し得る。最後のＥＤＴＡクエンチおよび水での３回のすすぎの後に、支持体に結合した交互になっているホモポリマーを、固体支持体から、１００μｌ  濃アンモニウムを使用して切断し得、その上清をＧｅｎ−ｖａｃによって乾燥し得、次いで、上記のようにポリアクリルアミドゲルを使用して分析される準備ができるまで、−２０℃において貯蔵し得る。
【００７６】
援用
他の文書（例えば、特許、特許出願、特許公報、学術雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツ）への言及および引用は、本開示全体を通じて行われている。全てのこのような文書は、全ての目的のためにそれらの全体において本明細書で参考として援用される。
【００７７】
均等物
本発明の種々の改変およびその多くのさらなる実施形態が、本明細書で示されかつ記載されるものに加えて、本文書の全ての内容（本明細書で引用される科学文献および特許文献への言及を含む）から当業者に明らかになる。本明細書の主題は、その種々の実施形態およびその均等物において本発明の実施に適合され得る重要な情報、例示およびガイダンスを含む。
【図１】
2020522257.tif 000003
【図２】
2020522257.tif 000004
【図３】
2020522257.tif 000005
【図４】
2020522257.tif 000006
【図５】
2020522257.tif 000007
【図６】
2020522257.tif 000008
【図７】
2020522257.tif 000009
【図８】
2020522257.tif 000010
【図９】
2020522257.tif 000011
【図１０】
2020522257.tif 000012
【図１１】
2020522257.tif 000013
【国際調査報告】
2020522257.tif 000014
2020522257.tif 000015