(57)【要約】本開示は、例えばがんの診断のプロセスにおいて、メチル化の状態および／またはプロファイルの解析のために特定のDNAを濃縮する方法に関する態様に関する。特定の態様において、本方法は、DNAの供給源としてゲノムDNAの代わりにセルフリーDNAを利用し、2つ以上の酵素消化部位を有しかつ少なくとも1つのCpG部位を含有する断片の集中的な濃縮を可能にする。2020527340.tif 000003
2020527340.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)(i)アダプターとカップリングすることができない末端または
(ii)複数のセルフリーデオキシリボ核酸(DNA)の残りからの分離のために構成されている末端
を有する複数のセルフリーDNA(cfDNA)分子を、1つまたは複数のCpG部位を含有する断片を生成するために該セルフリーDNA分子の少なくともサブセットを断片化するのに十分な条件へ供し、複数のDNA断片を提供する工程；
(b)該複数のDNA断片の末端へアダプターをカップリングし、非メチル化核酸塩基から区別可能であるメチル化核酸塩基を有する複数のタグ付加DNA断片を提供する工程；
(c)該複数のタグ付加DNA断片またはその誘導体を核酸シーケンシングへ供し、複数の配列リードを生じさせる工程；ならびに
(d)該複数の配列リードを処理し、(i)該複数の配列リードの両末端での該アダプターからの配列を同定し、そして(ii)該配列を同定すると、該複数のセルフリーDNA分子からのセルフリーDNA分子を1つまたは複数のCpG部位を有すると同定する工程
を含む、対象の複数のcfDNA分子を処理または解析するための方法。
【請求項２】
前記複数のDNA断片の少なくともサブセットが、メチル化核酸塩基を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
セルフリーDNA分子を1つまたは複数のCpG部位を有すると同定する工程が、セルフリーDNA分子を2つ以上のCpG部位を有すると同定することを含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
(b)の前または後に、前記末端を有する前記cfDNA分子の断片を前記複数のDNA断片から分離する工程をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記断片を磁気ビーズへ結合し、磁気分離を使用して該断片を分離する、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
(b)の前または後に、前記複数のcfDNA分子、前記複数のDNA断片、またはその誘導体を、メチル化核酸塩基が非メチル化核酸塩基から区別されることを可能にするために十分な条件へ供する工程をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記複数のcfDNA分子、前記複数のDNA断片、またはその誘導体を前記条件へ供する工程が、該複数のDNA断片に対してバイサルファイト変換を行うことを含む、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記複数のタグ付加DNA断片またはその誘導体を、メチル化塩基が非メチル化核酸塩基から区別されることを可能にするために十分な条件へ供する工程をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記複数のタグ付加DNA断片またはその誘導体を前記条件へ供する工程が、該複数のタグ付加DNA断片に対してバイサルファイト変換を行うことを含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
(a)における前記条件が、修飾されたcfDNA分子の少なくとも前記サブセットを断片化して複数のCpG部位を含有する断片を生成するために十分である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
(a)が、前記複数のcfDNA分子に対して制限酵素消化を行い、該複数のcfDNA分子の少なくとも前記サブセットを断片化して1つまたは複数のCpG部位を含有する断片を生成することをさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
制限酵素消化が、CpG部位を有する前記複数のcfDNA分子からのDNA断片を濃縮する1つまたは複数の制限酵素を使用して行われる、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記1つまたは複数の制限酵素が、MspI、HpaII、および／またはTaqIを含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記アダプターの各々が、核酸シーケンサーのフローセルへ結合するように構成されている機能的配列を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
(b)におけるアダプターのカップリングが、アダプターを前記複数のDNA断片の末端へライゲーションすることを含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ライゲーション前に、前記複数のDNA断片の末端修復または核酸塩基テーリングを行う工程をさらに含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
ライゲーション前に、前記複数のDNA断片の末端修復および核酸塩基テーリングを行う工程をさらに含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記アダプターが、核酸分子へカップリングされてシーケンシング用のライブラリーを提供するように構成されている、請求項15に記載の方法。
【請求項１９】
前記アダプターが、前記核酸分子へライゲーションされるように構成されている、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記アダプターが少なくとも1つのステムループ領域を含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸分子へ前記アダプターをカップリングする工程、および該核酸分子へカップリングされた該アダプターの前記ステムループ領域を線形化する工程をさらに含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記線形化が、エンドヌクレアーゼ、ウラシルグリコシラーゼもしくはその機能的類似体、またはその組み合わせを使用して行われる、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記エンドヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼVIIIまたはその機能的類似体である、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記ウラシルグリコシラーゼがウラシルデオキシリボ核酸(DNA)グリコシラーゼである、請求項22に記載の方法。
【請求項２５】
前記アダプターがY形状である、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記アダプターが平滑末端化されている、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記アダプターが既知の配列を含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記アダプターが、前記複数のタグ付加DNA断片またはその誘導体のユニーク分子同定を可能にするユニーク配列を含む、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記アダプターの前記核酸塩基がメチル化されていない、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記アダプターの前記核酸塩基がメチル化されている、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記複数のDNA断片または前記複数のタグ付加DNA断片を増幅へ供する工程をさらに含む、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記増幅がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記複数のDNA断片または前記複数のタグ付加DNA断片のサイズ選択を行い、サイズ選択された複数のDNA断片を提供する工程をさらに含む、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記サイズ選択された複数のDNA断片が、約130〜約400核酸塩基の長さを有する、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
前記サイズ選択された複数のDNA断片が、約30〜約250核酸塩基の長さを有する、請求項33に記載の方法。
【請求項３６】
前記複数のDNA断片または前記複数のタグ付加DNA断片の少なくとも一部分のメチル化状態を測定し、該サイズ選択された複数のDNA断片または該複数のタグ付加DNA断片の少なくとも該一部分のメチル化プロファイルを提供する工程をさらに含む、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記サイズ選択された複数のDNA断片の少なくとも一部分のメチル化状態を測定し、該サイズ選択された複数のDNA断片の少なくとも該一部分のメチル化プロファイルを提供する工程をさらに含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３８】
前記メチル化プロファイルを参照に対して処理する工程をさらに含む、請求項36または37に記載の方法。
【請求項３９】
前記参照が、1つまたは複数のさらなる対象のcfDNA分子の参照メチル化プロファイルを含む、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記複数のcfDNA分子が、前記対象の身体試料から得られる、請求項1〜39のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記身体試料が、血漿、血清、骨髄、脳脊髄液、胸腔内液、唾液、糞便、および尿からなる群より選択される、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
1つまたは複数のCpG部位を有する複数のcfDNA分子からの前記cfDNA分子を処理し、該複数のcfDNA分子についてのメチル化プロファイルを作成する工程をさらに含む、請求項1〜41のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記メチル化プロファイルを処理し、疾患もしくは障害を有するまたは有する疑いがあるという前記対象の尤度を求める工程をさらに含む、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
前記疾患または障害が、がん、多発性硬化症、外傷性または虚血性脳損傷、糖尿病、膵炎、アルツハイマー病、胎児異常、および異常な組織特異的細胞死を伴う任意の障害からなる群より選択される、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
前記疾患または障害が、膵臓がん、肝臓がん、肺がん、結腸直腸がん、白血病、膀胱がん、骨がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、黒色腫、卵巣がん、精巣がん、腎臓がん、肉腫、胆管がん、および前立腺がんからなる群より選択されるがんである、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
(a)複数のセルフリーデオキシリボ核酸(cfDNA)分子またはその誘導体の少なくとも一部分の各々の片末端または両末端を修飾し、
(i)アダプターとカップリングすることができない末端または
(ii)該複数のcfDNAの残りからの分離のために構成されている末端
を有する複数の修飾されたセルフリーDNA分子を提供する工程；
(b)該複数の修飾されたセルフリーDNA分子を、1つまたは複数のCpG部位を含有する断片を生成するために該修飾されたセルフリーDNA分子の少なくともサブセットの各々を断片化するのに十分な条件へ供し、複数のDNA断片を提供する工程；ならびに
(c)該アダプターを該複数のDNA断片の末端へカップリングし、非メチル化核酸塩基から区別可能であるメチル化核酸塩基を有する複数のタグ付加DNA断片を提供する工程
を含む、対象の複数のセルフリーDNA分子から複数のDNA断片を濃縮するための方法。
【請求項４７】
前記複数のDNA断片の少なくともサブセットが、メチル化核酸塩基を有する、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
(c)の前または後に、前記末端を有する前記cfDNA分子の断片を前記複数のDNA断片から分離する工程をさらに含む、請求項46または47に記載の方法。
【請求項４９】
前記断片を磁気ビーズへ結合し、磁気分離を使用して該断片を分離する、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
(a)において、前記修飾されたセルフリーDNA分子の末端が、ライゲーションまたはプライマー伸長を受けることができない、請求項46〜49のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
(c)の前または後に、前記複数のDNA断片を、メチル化核酸塩基が非メチル化核酸塩基から区別されることを可能にするために十分な条件へ供する工程をさらに含む、請求項46〜49のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記複数のDNA断片を、メチル化核酸塩基が非メチル化核酸塩基から区別されることを可能にするために十分な条件へ供する工程が、該複数のDNA断片に対してバイサルファイト変換を行うことを含む、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
(c)の後に、前記複数のタグ付加DNA断片を、メチル化核酸塩基が非メチル化核酸塩基から区別されることを可能にするために十分な条件へ供し、それによってさらなる複数のタグ付加DNA断片を生じさせる工程をさらに含む、請求項46〜52のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記複数のタグ付加DNA断片を、メチル化核酸塩基が非メチル化核酸塩基から区別されることを可能にするために十分な条件へ供する工程が、該複数のタグ付加DNA断片に対してバイサルファイト変換を行うことを含む、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
(b)における前記条件が、前記修飾されたセルフリーDNA分子の少なくとも前記サブセットの各々を断片化して、1つまたは複数のCpG部位を含有する断片を生成するために十分である、請求項46〜54のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記修飾が、前記複数のcfDNA分子の少なくとも前記一部分の各々の3’末端を、該3’末端をジデオキシヌクレオチド(ddNTP)部分またはその機能的類似体で修飾するために十分な条件へ供することを含む、請求項46〜55のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記修飾が、前記複数のcfDNA分子の少なくとも前記一部分の各々の5’末端を、該5’末端を脱リン酸化するために十分な条件へ供することを含む、請求項46〜56のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記修飾が、前記複数のcfDNA分子の少なくとも一部分の各々の前記片末端または両末端に1つまたは複数のブロッカーオリゴヌクレオチドを組み込むことを含む、請求項46〜57のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
(b)が、前記複数の修飾されたセルフリーDNA分子の制限酵素消化を行い、該修飾されたセルフリーDNA分子の少なくとも前記サブセットの各々を断片化し、1つまたは複数のCpG部位を含有する断片を生成することをさらに含む、請求項46〜58のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記制限酵素消化が、CpG部位を有する断片を濃縮する1つまたは複数の制限酵素を使用して行われる、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
前記1つまたは複数の制限酵素が、MspI、HpaII、および／またはTaqIを含む、請求項60に記載の方法。
【請求項６２】
前記アダプターの各々が、核酸シーケンサーのフローセルへ結合するように構成されている機能的配列を含む、請求項46〜61のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
(c)における前記アダプターのカップリングが、該アダプターを複数のDNA断片の前記末端へライゲーションすることを含む、請求項46〜62のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
ライゲーション前に、前記複数のDNA断片の末端修復または核酸塩基テーリングを行う工程をさらに含む、請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
ライゲーション前に、前記複数のDNA断片の末端修復および核酸塩基テーリングを行う工程をさらに含む、請求項64に記載の方法。
【請求項６６】
前記アダプターが、核酸分子へカップリングされてシーケンシング用のライブラリーを提供するように構成されている、請求項46に記載の方法。
【請求項６７】
前記アダプターが、前記核酸分子へライゲーションされるように構成されている、請求項66に記載の方法。
【請求項６８】
前記アダプターが少なくとも1つのステムループ領域を含む、請求項65に記載の方法。
【請求項６９】
前記核酸分子へ前記アダプターをカップリングする工程、および該核酸分子へカップリングされた該アダプターの前記ステムループ領域を線形化する工程をさらに含む、請求項68に記載の方法。
【請求項７０】
前記線形化が、エンドヌクレアーゼ、ウラシルグリコシラーゼもしくはその機能的類似体、またはその組み合わせを使用して行われる、請求項69に記載の方法。
【請求項７１】
前記エンドヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼVIIIまたはその機能的類似体である、請求項70に記載の方法。
【請求項７２】
前記ウラシルグリコシラーゼがウラシルデオキシリボ核酸(DNA)グリコシラーゼである、請求項70に記載の方法。
【請求項７３】
前記アダプターがY形状である、請求項46〜72のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記アダプターが平滑末端化されている、請求項46〜73のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記アダプターが既知の配列を含む、請求項46〜74のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記アダプターが、前記複数のタグ付加DNA断片またはその誘導体のユニーク分子同定を可能にするユニーク配列を含む、請求項46〜75のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記アダプターの前記核酸塩基がメチル化されていない、請求項46〜76のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記アダプターの前記核酸塩基がメチル化されている、請求項46〜77のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記複数のDNA断片または前記複数のタグ付加DNA断片を増幅へ供する工程をさらに含む、請求項46〜78のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記増幅がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む、請求項79に記載の方法。
【請求項８１】
前記複数のDNA断片または前記複数のタグ付加DNA断片のサイズ選択を行い、サイズ選択された複数のDNA断片を提供する工程をさらに含む、請求項46〜80のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記サイズ選択された複数のDNA断片が、約130〜約400核酸塩基の長さを有する、請求項81に記載の方法。
【請求項８３】
前記サイズ選択された複数のDNA断片が、約30〜約250核酸塩基の長さを有する、請求項81に記載の方法。
【請求項８４】
前記複数のDNA断片または前記複数のタグ付加DNA断片の少なくとも一部分のメチル化状態を測定し、該サイズ選択された複数のDNA断片または該複数のタグ付加DNA断片の少なくとも該一部分のメチル化プロファイルを提供する工程をさらに含む、請求項46〜83のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記サイズ選択された複数のDNA断片の少なくとも一部分のメチル化状態を測定し、該サイズ選択された複数のDNA断片の少なくとも該一部分のメチル化プロファイルを提供する工程をさらに含む、請求項81に記載の方法。
【請求項８６】
前記メチル化プロファイルを参照に対して処理する工程をさらに含む、請求項84または85に記載の方法。
【請求項８７】
前記サイズ選択された複数のDNA断片またはその誘導体の少なくとも一部分を、核酸シーケンシングへ供し、複数の配列リードを生じさせる工程をさらに含む、請求項81に記載の方法。
【請求項８８】
前記参照が、1つまたは複数のさらなる対象のcfDNA分子の参照メチル化プロファイルを含む、請求項86に記載の方法。
【請求項８９】
前記複数のcfDNA分子が、前記対象の身体試料から得られる、請求項46〜88のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記身体試料が、血漿、血清、骨髄、脳脊髄液、胸腔内液、唾液、糞便、および尿からなる群より選択される、請求項89に記載の方法。
【請求項９１】
(a)シーケンサーによって作成された複数の配列リードを検索する工程であって、ここで、該複数の配列リードの少なくともサブセットが、
(i)複数のセルフリーデオキシリボ核酸(DNA)分子由来の配列および
(ii)個々の配列リードの各々の両末端でのアダプター配列
を含む個々の配列リードを含み、
該アダプター配列が該複数のセルフリーDNA分子に由来しない、工程；
(b)該複数の配列リードを処理し、(i)両末端に該アダプター配列を有する該複数の配列リードからの1つまたは複数の配列リードを同定し、そして(ii)該1つまたは複数の配列リードを、該複数のセルフリーDNA分子の1つまたは複数のCpG部位に関連すると同定する工程；ならびに
(c)(b)において同定された該1つまたは複数のCpG部位を使用し、該複数のセルフリーDNA分子についてのメチル化プロファイルを作成する工程
を含む、複数のセルフリーDNA分子を処理または解析するための方法。
【請求項９２】
前記1つまたは複数のCpG部位が2つ以上のCpG部位を含む、請求項91に記載の方法。
【請求項９３】
前記メチル化プロファイルを示すレポートを電子的に出力する工程をさらに含む、請求項91または92に記載の方法。
【請求項９４】
前記メチル化プロファイルを処理し、疾患もしくは障害を有するまたは有する疑いがあるという前記対象の尤度を求める工程をさらに含む、請求項91〜93のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記疾患または障害が、がん、多発性硬化症、外傷性または虚血性脳損傷、糖尿病、膵炎、アルツハイマー病、および胎児異常、ならびに異常な組織特異的細胞死を伴う任意の障害からなる群より選択される、請求項94に記載の方法。
【請求項９６】
前記疾患または障害が、膵臓がん、肝臓がん、肺がん、結腸直腸がん、白血病、膀胱がん、骨がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、黒色腫、卵巣がん、精巣がん、腎臓がん、肉腫、胆管がん、および前立腺がんからなる群より選択されるがんである、請求項95に記載の方法。
【請求項９７】
以下を含む、複数のセルフリーデオキシリボ核酸(DNA)分子を処理または解析するためのシステム：
複数の配列リードを保存するデータベースであって、該複数の配列リードの少なくともサブセットが、
(i)複数のセルフリーDNA分子由来の配列および
(ii)個々の配列リードの各々の両末端でのアダプター配列
を含む個々の配列リードを含み、
該アダプター配列が該複数のセルフリーDNA分子に由来しない、データベース；ならびに
該データベースへ動作可能に接続された1つまたは複数のコンピュータプロセッサであって、
(1)該データベースから該複数の配列リードを検索する；
(2)該複数の配列リードを処理し、(i)両末端に該アダプター配列を有する該複数の配列リードからの1つまたは複数の配列リードを同定し、そして(ii)該1つまたは複数の配列リードを、該複数のセルフリーDNA分子の1つまたは複数のCpG部位に関連すると同定する；かつ
(3)(2)において同定された該1つまたは複数のCpG部位を使用し、該複数のセルフリーDNA分子についてのメチル化プロファイルを作成する
ように、個々にまたはまとめてプログラミングされている、1つまたは複数のコンピュータプロセッサ。
【請求項９８】
前記1つまたは複数のCpG部位が2つ以上のCpG部位を含む、請求項97に記載のシステム。
【請求項９９】
前記1つまたは複数のコンピュータプロセッサが、前記メチル化プロファイルを示すレポートを電子的に出力するように個々にまたはまとめてプログラミングされている、請求項97に記載のシステム。
【請求項１００】
前記1つまたは複数のコンピュータプロセッサが、前記メチル化プロファイルを処理し、疾患もしくは障害を有するまたは有する疑いがあるという前記対象の尤度を求めるように、個々にまたはまとめてプログラミングされている、請求項97に記載のシステム。
【請求項１０１】
前記疾患または障害が、がん、多発性硬化症、外傷性または虚血性脳損傷、糖尿病、膵炎、アルツハイマー病、および胎児異常、ならびに異常な組織特異的細胞死を伴う任意の障害からなる群より選択される、請求項100に記載のシステム。
【請求項１０２】
前記疾患または障害が、膵臓がん、肝臓がん、肺がん、結腸直腸がん、白血病、膀胱がん、骨がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、黒色腫、卵巣がん、精巣がん、腎臓がん、肉腫、胆管がん、および前立腺がんからなる群より選択されるがんである、請求項101に記載のシステム。
【請求項１０３】
1つまたは複数のコンピュータプロセッサによる実行時に、以下の工程を含む複数のセルフリーデオキシリボ核酸(DNA)分子を処理または解析するための方法を実施する、機械実行可能コードを含む、非一時的コンピュータ可読媒体：
(a)シーケンサーによって作成された複数の配列リードを検索する工程であって、ここで、該複数の配列リードの少なくともサブセットが、
(i)複数のセルフリーDNA分子由来の配列および
(ii)個々の配列リードの各々の両末端でのアダプター配列
を含む個々の配列リードを含み、
該アダプター配列が該複数のセルフリーDNA分子に由来しない、工程；
(b)該複数の配列リードを処理し、(i)両末端に該アダプター配列を有する該複数の配列リードからの1つまたは複数の配列リードを同定し、そして(ii)該1つまたは複数の配列リードを、該複数のセルフリーDNA分子の1つまたは複数のCpG部位に関連すると同定する工程；ならびに
(c)(b)において同定された該1つまたは複数のCpG部位を使用し、該複数のセルフリーDNA分子についてのメチル化プロファイルを作成する工程。
【請求項１０４】
以下の工程を含む、セルフリーDNA(cfDNA)からCpGリッチ配列の集合を濃縮する方法：
cfDNA分子の末端を標識する工程であって、標識されたcfDNA分子の末端がライゲーション不能である標識されたcfDNA分子を生成する、工程；
該標識されたcfDNA分子を、メチル化形態、非メチル化形態、または両方のC^CGG部位を認識する1つまたは複数の制限酵素で消化し、両末端においてライゲーション可能である消化cfDNA分子を生成し、かつ、片末端においてのみライゲーション可能である消化cfDNA分子を生成する工程；
消化cfDNA分子のライゲーション可能末端へメチル化アダプターをライゲーションする工程であって、それによってアダプター連結cfDNA分子を生成する、工程；
アダプター連結cfDNA分子をバイサルファイト変換へ供し、バイサルファイト変換されたアダプター連結cfDNA分子を生成する工程；ならびに
分子の両末端にアダプターを含むバイサルファイト変換されたアダプター連結cfDNA分子を増幅する工程。
【請求項１０５】
増幅されバイサルファイト変換されたアダプター連結cfDNA分子をサイズ選択する工程をさらに含む、請求項104に記載の方法。
【請求項１０６】
サイズ選択され、増幅され、バイサルファイト変換されたアダプター連結cfDNA分子が、約150〜約400ヌクレオチドの長さを有する、請求項105に記載の方法。
【請求項１０７】
標識する工程が、標識の前または後に、cfDNA分子の5’末端の脱リン酸化を含む、請求項104〜106のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
標識する工程が、cfDNA分子の3’末端へddNTPを付加することを含む、請求項104〜107のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
標識が検出可能である、請求項108に記載の方法。
【請求項１１０】
標識が、蛍光性であるか、比色性であるか、ビオチン化されているか、放射性であるか、またはその組み合わせである、ddNTPを含む、請求項108に記載の方法。
【請求項１１１】
ライゲーション工程前に、消化cfDNA分子の末端修復およびヌクレオチドテーリングの工程をさらに含む、請求項104〜110のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記制限酵素が、MspIであるか、HpaIIであるか、またはMspIおよび／もしくはHpaIIを含む混合物である、請求項104〜111のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記アダプターが少なくとも1つのステムループ領域を含む、請求項104〜112のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
アダプター連結cfDNA分子上のアダプターの前記ステムループ領域を線形化する工程をさらに含む、請求項113に記載の方法。
【請求項１１５】
前記線形化が、少なくとも1つのウラシルDNAグリコシラーゼによって行われるか、制限酵素によって行われるか、または両方によって行われる、請求項114に記載の方法。
【請求項１１６】
前記線形化が、ウラシルDNAグリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼVIIIの混合物によって行われる、請求項113または114に記載の方法。
【請求項１１７】
前記アダプターがフォーク形状である、請求項104〜116のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記増幅工程がポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項104〜117のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記アダプターが1つまたは複数の既知の配列を含む、請求項104〜118のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記アダプターが1つまたは複数のユニーク配列を含む、請求項104〜119のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
血液または血漿からcfDNAを得る工程をさらに含む、請求項104〜120のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記サイズ選択された増幅cfDNA分子の一部または全部を解析する、請求項105〜121のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記サイズ選択された増幅cfDNA分子の一部または全部を、部分的にまたは完全に配列決定する、請求項105〜122のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記サイズ選択された増幅cfDNA分子の一部または全部を、メチル化プロファイルについて解析する、請求項105〜123のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記サイズ選択された増幅cfDNA分子の一部または全部のメチル化プロファイルを、参照と比較する、請求項105〜124のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
cfDNAを個体の血液または血漿から得る、請求項104〜125のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
第1の個体からのcfDNA由来のサイズ選択された増幅cfDNA分子の一部または全部のメチル化プロファイルを、第2のまたはそれ以上の個体のDNA中の1つまたは複数のメチル化プロファイルと比較する、請求項105〜126のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2017年6月30日に出願された米国仮特許出願第62/527,236号、および2018年6月29日に出願された米国仮特許出願第62/691,815号に対する優先権を主張し、これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本開示の分野の態様は、少なくとも細胞生物学、分子生物学、DNA解析、ライブラリー調製、診断学および／または医学を含む。
【背景技術】
【０００３】
背景
がん細胞は異常なDNAメチル化パターンをしばしば示す。高メチル化および／または低メチル化腫瘍DNA断片は、細胞アポトーシスまたは壊死を介して血流中へ放出され得、ここで、それらは、血漿または尿のような体液中の循環セルフリーDNA(cfDNA)の一部となり得る。従って、cfDNAメチル化プロファイリングは、がんスクリーニングについての有望な戦略である。全ゲノムバイサルファイトシーケンシングはDNAメチロームの包括的な視点を提供するが、全ゲノムをディープシーケンシングするのは高価であり得る。リデューストリプリゼンテーションバイサルファイトシーケンシング（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）（RRBS）は、高CpG含有量を有するゲノム領域のメチル化プロファイリングのための費用効果の高い技術である（DNAメチル化の大部分はCpG部位で生じる）。RRBSにおいて、ゲノムDNAは、先ず、制限エンドヌクレアーゼ（通常はMspI）で消化され、次いで、サイズ選択され、CpG密集領域について濃縮する。これらの領域はゲノムの約3%のみを構成するが、ゲノムについての包括的なDNAメチル化情報を提供する。しかし、cfDNAは、自然において既に断片化されており、166 bpの周りに特徴的なピークを示す。典型的なRRBS手順に従って40〜220 bpの断片を選択すると、cfDNAの集団全体を選択するようなものであろう。従って、ゲノムDNAから生成されて典型的なRRBSライブラリー中に存在するほぼ全ての断片は、MspIによって2回切断されているが、これはcfDNAについては当てはまらない。従って、cfDNAに対して典型的なRRBSを行うことは、cfDNAについて、例えば臨床診断適用の目的についてメチル化プロファイリングを行うために有利であろう、CpG濃縮を欠く。
【０００４】
本開示は、メチル化プロファイリングのための血液由来または血漿由来または尿由来（またはその組み合わせ）のcfDNAからのライブラリーの調製を容易にすることを含む、RRBSをcfDNAへ適用することについての当技術分野における改善に関する。
【発明の概要】
【０００５】
概要
がん細胞は、腫瘍抑制遺伝子のプロモータ領域の高メチル化および遺伝子間領域の広範囲にわたる低メチル化のような、異常なDNAメチル化パターンをしばしば示し得る。従って、患者のDNAメチル化プロファイルは、臨床実務におけるがん評価についての標的であり得る。高メチル化および／または低メチル化腫瘍DNA断片は、細胞アポトーシスまたは壊死のようなプロセスを介して血流中へ放出され得、ここで、これらの循環腫瘍DNA(ctDNA)は、血漿中の循環セルフリーDNA(cfDNA)の一部となる。cfDNAメチル化プロファイリングの非侵襲性の性質は、少なくとも一般的ながんスクリーニングを含む、1つまたは複数の疾患または障害のスクリーニングについての有効な戦略であり得る。本開示の態様は、メチル化プロファイリングについて情報を与える領域（例えば、CpG島）についてcfDNAを濃縮するための方法を提供し、メチル化プロファイリングについて解析される核酸は、そのような濃縮手段がない場合と比べて、より有効である。特定の局面において、個体は、がんを有するか、またはがんを有する疑いがあるか、またはがんを有するリスクがあり、cfDNA分子の解析は、個体が、がんを有するか、またはがんを有する疑いがあるか、またはがんを有するリスクがあるかどうかを決定することを助ける。cfDNAは、二本鎖、一本鎖、またはその混合物であり得る。
【０００６】
本開示の態様は、メチル化量および／または分子中の場所の解析のための分子の調製に関する方法、システム、および組成物に関する。特定の態様において、分子はcfDNAを含み、特定の局面において、cfDNAは個体（例えば、個体由来の血液または血漿または尿（またはその組み合わせ）試料）に由来する。特定の態様において、本開示は、cfDNA分子のCpGリッチ領域中のような、cfDNA分子中のDNAメチル化を評価するための方法およびシステムを提供する。そのような方法およびシステムは、CpGリッチ領域についてセルフリーDNA分子を濃縮し得、方法の特定の態様において、有利なことに、臨床診断適用へ向けてのような、メチル化プロファイリングを可能にする。本開示は、メチル化プロファイリングのためのcfDNAからのライブラリーの調製を容易にすることを含む、CpGリッチ領域についてセルフリーDNA分子を濃縮するための改善された方法、システム、および組成物を提供する。cfDNAの供給源は、例えば、血液由来または血漿由来または尿由来（またはその組み合わせ）であり得る。
【０００７】
がんに関する本開示の態様について、好適な試料中のcfDNAの検出および特徴付けは、腫瘍組織起源を同定することを含む、非侵襲性がんスクリーニングのための有効な方法であり得る。液体生検（これは流体生検または液相生検とも呼ばれ得る）、例えば、採血は、伝統的な組織生検とは異なり、様々な異なる悪性腫瘍を診断するために有用であり、本開示に包含される方法において利用され得る。
【０００８】
本開示は、メチル化プロファイリングがメチル化情報を提供するために特に有効であるように、cfDNA中のCpG島を濃縮する態様に関する。特定の態様は、cfDNAのCpGリッチ領域中のDNAメチル化を評価する方法を含む。
【０００９】
具体的な態様において、本方法は、ゲノムDNAについて利用されないが、代わりに、cfDNAについて利用される。そのような区別は、ゲノムDNAについてCpG島を濃縮するのに適している方法と、cfDNAについてCpG島を濃縮することについて機能しないであろう方法とを区別する。本開示は、ゲノムDNAのメチル化解析のための方法を適応させ、ゲノムDNAとのユニークな差異を有するcfDNAのメチル化解析のための方法に適用する。
【００１０】
具体的な態様において、本方法は、高度に分解されたゲノムDNA、例えば、古代のDNA、またはホルマリン固定パラフィン包埋組織標本由来のDNAについて利用される。
【００１１】
本開示の態様は、単一ヌクレオチドレベルでゲノムワイドメチル化プロファイルを解析するために使用される効率的なハイスループット技術である、リデューストリプリゼンテーションバイサルファイトシーケンシング(RRBS)の改善および／または適応を含む。この技術は、高CpG含有量を有するゲノムの領域を濃縮するために制限酵素およびバイサルファイトシーケンシングを組み合わせ、少なくともいくつかの場合において、この方法は、配列決定される必要があるヌクレオチドの量を低減する。標準RRBSは、cfDNAまたは高度に分解されたゲノムDNAについて利用することができないため、本開示は、しかし、cfDNAまたは高度に分解されたゲノムDNAについてのRRBSの適応を提供する。
【００１２】
本開示は、これはcfRRBSと呼ばれ得る方法であるが、cfDNAまたは高度に分解されたゲノムDNAの費用効果の高いメチル化プロファイリングのためのRRBSアナログアプローチを含む。典型的なRRBSとは異なり、具体的な態様において、本明細書に開示されるcfRRBS手順は、cfDNAまたは高度に分解されたゲノムDNAのジデオキシヌクレオチド(ddNTP)標識付加、続いて、MspI消化およびライブラリー構築を含む。ライブラリーは、次いで、少なくとも特定の態様において、150〜400 bpのサイズ選択へ供される。開示される手順の態様では、MspI認識可能配列を含まないかまたは1つだけ含むDNA断片は廃棄され、2つ以上のMspI認識可能配列を含む断片のみが濃縮される。具体的な態様において、これは、各分子が少なくとも1つのCpG部位を含むことを保証し、診断ツールの幅広い臨床応用を容易にする費用効果の高いシーケンシングをもたらす。
【００１３】
一局面において、本開示は、以下の工程を含む、対象の複数のセルフリーデオキシリボ核酸(DNA)分子を処理または解析するための方法を提供する：(a)(i)アダプターとカップリングすることができない末端または(ii)複数のcfDNAの残りからの分離のために構成されている末端を有する複数のセルフリーDNA(cfDNA)分子を、1つまたは複数のCpG部位で該セルフリーDNA分子の少なくともサブセットを断片化するために十分な条件へ供し、複数のDNA断片を提供する工程；複数のDNA断片の末端へアダプターをカップリングし、非メチル化核酸塩基から区別可能であるメチル化核酸塩基を有する複数のタグ付加DNA断片を提供する工程；任意で、(b)該複数のタグ付加DNA断片またはその誘導体を核酸シーケンシングへ供し、複数の配列リードを生じさせる工程；ならびに、任意で、(c)該複数の配列リードを処理し、(i)該複数の配列リードの両末端での該アダプターからの配列を同定し、そして(ii)該配列を同定すると、該複数のセルフリーDNA分子からのセルフリーDNA分子を1つまたは複数のCpG部位を有すると同定する工程。
【００１４】
いくつかの態様において、前記複数のDNA断片の少なくともサブセットは、メチル化核酸塩基を有する。いくつかの態様において、セルフリーDNA分子を1つまたは複数のCpG部位を有すると同定する工程が、セルフリーDNA分子を2つまたは3つまたは4つまたはそれ以上のCpG部位を有すると同定することを含む。いくつかの態様において、方法は、前記複数のDNA断片の末端へ前記アダプターをカップリングする工程の前または後に、前記末端を有する前記cfDNA分子の断片を前記複数のDNA断片から分離する工程をさらに含む。いくつかの態様において、前記断片を磁気ビーズへ結合し、磁気分離を使用して該断片を分離する。いくつかの態様において、方法は、前記複数のDNA断片の末端へ前記アダプターをカップリングする工程の前または後に、前記複数のcfDNA分子、前記複数のDNA断片、またはその誘導体を、メチル化核酸塩基が非メチル化核酸塩基から区別されることを可能にするために十分な条件へ供する工程をさらに含む。いくつかの態様において、前記複数のcfDNA分子、前記複数のDNA断片、またはその誘導体を前記条件へ供する工程は、該複数のDNA断片に対してバイサルファイト変換を行うことを含む。
【００１５】
いくつかの態様において、方法は、前記複数のタグ付加DNA断片またはその誘導体を、メチル化塩基が非メチル化核酸塩基から区別されることを可能にするために十分な条件へ供する工程をさらに含む。いくつかの態様において、前記複数のタグ付加DNA断片またはその誘導体を前記条件へ供する工程は、該複数のタグ付加DNA断片に対してバイサルファイト変換を行うことを含む。いくつかの態様において、(a)における前記条件は、修飾されたcfDNA分子の少なくとも前記サブセットを複数のCpG部位で断片化するために十分である。
【００１６】
いくつかの態様において、(a)の工程は、前記複数のcfDNA分子に対して制限酵素消化を行い、前記1つまたは複数のCpG部位で該複数のcfDNA分子の少なくとも前記サブセットを断片化する工程をさらに含む。いくつかの態様において、前記制限酵素消化は、CpG部位を有する前記複数のcfDNA分子からのDNA断片を濃縮する1つまたは複数の制限酵素を使用して行われる。いくつかの態様において、前記1つまたは複数の制限酵素は、MspI、HpaII、および／またはTaqIを含む。ある局面において、MspIのみが利用され、一方、他の局面において、HpaIIがMspIと共に利用されまたはTaqIがMspIと共に利用され、またはHpaIIおよびTaqIの両方がMspIと共に利用される。いくつかの場合において、HpaIIのみが利用され、他の場合においてTaqIのみが利用される。いくつかの局面において、MspIは消化のために用いられない。複数の酵素が方法において利用される場合、それらは、実質的に同時にまたは任意の順序で連続して、複数のcfDNA分子へ曝露され得る。
【００１７】
いくつかの態様において、アダプターは、例えば、試料の性質、方法の目的、方法についての意図される適用などに依存して最も有効であるように、特に構成されている。ある態様において、前記アダプターの各々は、核酸シーケンサーのフローセルへ結合するように構成されている少なくとも1つの機能的配列（任意の好適なサイズまたは配列のものであり得る）を含む。いくつかの態様において、(b)における前記アダプターのカップリングは、該アダプターを前記複数のDNA断片の前記末端へライゲーションすることを含む。いくつかの態様において、方法は、ライゲーション前に、複数のDNA断片の末端修復または核酸塩基テーリングを行う工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、ライゲーション前に、複数のDNA断片の末端修復および核酸塩基テーリングを行う工程をさらに含む。
【００１８】
いくつかの態様において、前記アダプターは、核酸分子へカップリングされてシーケンシング用のライブラリーを提供するように構成されている。いくつかの態様において、前記アダプターは、前記核酸分子へライゲーションされるように構成されている。いくつかの態様において、前記アダプターは少なくとも1つのステムループ領域を含む。いくつかの態様において、方法は、前記核酸分子へ前記アダプターをカップリングする工程、および該核酸分子へカップリングされた該アダプターの前記ステムループ領域を線形化する工程をさらに含む。いくつかの態様において、前記線形化は、エンドヌクレアーゼ、ウラシルグリコシラーゼもしくはその機能的類似体、またはその組み合わせを使用して行われる。いくつかの態様において、前記エンドヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼVIIIまたはその機能的類似体である。いくつかの態様において、前記ウラシルグリコシラーゼはウラシルデオキシリボ核酸(DNA)グリコシラーゼである。
【００１９】
いくつかの態様において、前記アダプターはY形状である。いくつかの態様において、前記アダプターは平滑末端化されている。いくつかの態様において、前記アダプターは既知の配列を含む。いくつかの態様において、前記アダプターは、前記複数のタグ付加DNA断片またはその誘導体のユニーク分子同定を可能にするユニーク配列を含む。
【００２０】
いくつかの態様において、前記アダプターの前記核酸塩基はメチル化されていない。いくつかの態様において、前記アダプターの前記核酸塩基はメチル化されている。いくつかの態様において、方法は、前記複数のDNA断片または前記複数のタグ付加DNA断片を増幅へ供する工程をさらに含む。いくつかの態様において、前記増幅はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む。
【００２１】
いくつかの態様において、方法は、前記複数のDNA断片または前記複数のタグ付加DNA断片のサイズ選択を行い、サイズ選択された複数のDNA断片を提供する工程をさらに含む。いくつかの態様において、前記サイズ選択された複数のタグ付加DNA断片は、約150〜約400核酸塩基、約150〜約300核酸塩基、約150〜約200核酸塩基、約200〜約400核酸塩基、約200〜約300核酸塩基、約300〜約400核酸塩基などを含む、少なくとも約130〜約400核酸塩基またはそれ未満の長さを有する。いくつかの態様において、前記サイズ選択された複数のDNA断片は、少なくとも約30〜約250核酸塩基、約30〜約200核酸塩基、約30〜約100核酸塩基、約75〜約250核酸塩基、約75〜約200核酸塩基、約75〜約150核酸塩基、約75〜約125核酸塩基、約100〜約250核酸塩基、約100〜約200核酸塩基、約100〜約150核酸塩基、約175〜約250核酸塩基、約175〜約225核酸塩基、約200〜約250核酸塩基またはそれ未満などの長さを有する。
【００２２】
いくつかの態様において、方法は、前記複数のDNA断片の少なくとも一部分または前記複数のタグ付加DNA断片の少なくとも一部分のメチル化状態を測定し、該複数のDNA断片または該サイズ選択された複数のタグ付加DNA断片の該少なくとも該一部分のメチル化プロファイルを提供する工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、前記サイズ選択された複数のDNA断片の少なくとも一部分または前記複数のタグ付加DNA断片の少なくとも一部分のメチル化状態を測定し、該サイズ選択された複数のDNA断片または該複数のタグ付加DNA断片の該少なくとも該一部分のメチル化プロファイルを提供する工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、前記メチル化プロファイルを1つまたは複数の参照に対して処理する工程をさらに含む。メチル化プロファイルは、任意の数のCpG部位、CpGリッチ配列、および／またはCpG島の情報（あるメチル化部位の存在および／または非存在を含む）を含み得る。いくつかの態様において、前記参照は、1つまたは複数のさらなる対象のcfDNA分子の参照メチル化プロファイルを含む。cfDNAの参照メチル化プロファイルが得られる対象は、例えば、健康であってもよく、がんがなくてもよく、がんを有してもよく、またはがんを有するリスクが高くてもよい。
【００２３】
いくつかの態様において、前記複数のcfDNA分子は、前記対象の身体試料から得られる。いくつかの態様において、前記身体試料は、血漿、血清、骨髄、脳脊髄液、胸腔内液、唾液、糞便、痰、乳頭吸引液、生検材料、頬擦過標本、尿およびその組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様において、方法は、1つまたは複数のCpG部位を有する前記複数のcfDNA分子からの前記cfDNA分子を処理し、該複数のcfDNA分子についてのメチル化プロファイルを作成する工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、前記メチル化プロファイルを処理し、疾患もしくは障害を有するまたは有する疑いがあるという前記対象の尤度を求める工程をさらに含む。個体由来の試料からのメチル化プロファイルが1つまたは複数の参照と比較される場合、1つまたは複数の参照の試料の供給源は、個体の試料と同じ供給源であってもなくてもよい。
【００２４】
いくつかの態様において、前記疾患または障害は、がん、多発性硬化症、外傷性または虚血性脳損傷、糖尿病、膵炎、アルツハイマー病、および胎児異常からなる群より選択される。いくつかの態様において、前記疾患または障害は、膵臓がん、肝臓がん、肺がん、結腸直腸がん、白血病、膀胱がん、骨がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、黒色腫、卵巣がん、精巣がん、腎臓がん、肉腫、胆管がん、甲状腺がん、胆嚢がん、脾臓がん、および前立腺がんからなる群より選択されるがんである。
【００２５】
いくつかの態様において、前記対象の身体試料から得られた、cfDNA分子のメチル化パターンは、異常な組織特異的細胞死をモニタリングするために使用することができる。
【００２６】
別の局面において、本開示は、以下の工程を含む、対象の複数のセルフリーDNA(cfDNA)分子から複数のデオキシリボ核酸(DNA)断片を濃縮するための方法を提供する：(a)複数のセルフリーDNA分子またはその誘導体の少なくとも一部分の各々の片末端または両末端を修飾し、(i)アダプターとカップリングすることができない末端または(ii)該複数のcfDNAの残りからの分離のために構成されている末端を有する複数の修飾されたセルフリーDNA分子を提供する工程；(b)該複数の修飾されたセルフリーDNA分子を、1つまたは複数のCpG部位で該修飾されたセルフリーDNA分子の少なくともサブセットの各々を断片化するために十分な条件へ供し、複数のDNA断片を提供する工程であって、ここで、該複数のDNA断片の少なくともサブセットはメチル化核酸塩基を有する、工程；ならびに(c)該アダプターを該複数のDNA断片の末端へカップリングし、非メチル化核酸塩基から区別可能であるメチル化核酸塩基を有する複数のタグ付加DNA断片を提供する工程。
【００２７】
いくつかの態様において、前記複数のDNA断片の少なくともサブセットは、メチル化核酸塩基を有する。いくつかの態様において、方法は、(c)の前または後に、前記末端を有する前記cfDNA分子の断片を前記複数のDNA断片から分離する工程をさらに含む。いくつかの態様において、前記断片を磁気ビーズへ結合し、磁気分離を使用して該断片を分離する。いくつかの態様において、(a)において、前記修飾されたセルフリーDNA分子の末端は、ライゲーションまたはプライマー伸長を受けることができない。いくつかの態様において、方法は、(c)の前または後に、前記複数のDNA断片を、メチル化核酸塩基が非メチル化核酸塩基から区別されることを可能にするために十分な条件へ供する工程をさらに含む。いくつかの態様において、前記複数のDNA断片を、メチル化核酸塩基が非メチル化核酸塩基から区別されることを可能にするために十分な条件へ供する工程は、該複数のDNA断片に対してバイサルファイト変換を行うことを含む。
【００２８】
いくつかの態様において、方法は、(c)の後に、前記複数のタグ付加DNA断片を、メチル化核酸塩基が非メチル化核酸塩基から区別されることを可能にするために十分な条件へ供し、それによってさらなる複数のタグ付加DNA断片を生じさせる工程をさらに含む。いくつかの態様において、前記複数のタグ付加DNA断片を、メチル化核酸塩基が非メチル化核酸塩基から区別されることを可能にするために十分な前記条件へ供する工程は、該複数のタグ付加DNA断片に対してバイサルファイト変換を行うことを含む。
【００２９】
いくつかの態様において、(b)における前記条件は、複数のCpG部位で前記修飾されたセルフリーDNA分子の少なくとも前記サブセットの各々を断片化するために十分である。いくつかの態様において、前記修飾は、前記複数のcfDNA分子の前記少なくとも前記一部分の各々の3’末端を、該3’末端をジデオキシヌクレオチド(ddNTP)部分またはその機能的類似体で修飾するために十分な条件へ供することを含む。いくつかの態様において、前記修飾は、前記複数のcfDNA分子の前記少なくとも前記一部分の各々の5’末端を、該5’末端を脱リン酸化するために十分な条件へ供することを含む。脱リン酸化は、例として、仔ウシ腸アルカリホスファターゼのようなデホスホリラーゼを利用することを含む、任意の好適な手段によって生じ得る。
【００３０】
いくつかの態様において、前記修飾は、前記複数のcfDNA分子の少なくとも一部分の各々の前記片末端または両末端に1つまたは複数のブロッカーオリゴヌクレオチドを組み込むことを含む。いくつかの態様において、(b)は、前記複数の修飾されたセルフリーDNA分子の制限酵素消化を行い、前記1つまたは複数のCpG部位で該修飾されたセルフリーDNA分子の少なくとも前記サブセットの各々を断片化する工程をさらに含む。いくつかの態様において、前記制限酵素消化は、CpG部位を有する断片を濃縮する1つまたは複数の制限酵素を使用して行われる。いくつかの態様において、前記1つまたは複数の制限酵素は、MspI、HpaII、および／またはTaqIを含む。
【００３１】
いくつかの態様において、前記アダプターの各々は、核酸シーケンサーのフローセルへ結合するように構成されている機能的配列を含む。いくつかの態様において、(c)における前記アダプターのカップリングは、該アダプターを前記複数のDNA断片の前記末端へライゲーションすることを含む。いくつかの態様において、方法は、ライゲーション前に、前記複数のDNA断片の末端修復または核酸塩基テーリングを行う工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、ライゲーション前に、前記複数のDNA断片の末端修復および核酸塩基テーリングを行う工程をさらに含む。ある態様において、アダプターは標識される。
【００３２】
いくつかの態様において、前記アダプターは、核酸分子へカップリングされてシーケンシング用のライブラリーを提供するように構成されている。いくつかの態様において、前記アダプターは、前記核酸分子へライゲーションされるように構成されている。いくつかの態様において、前記アダプターは少なくとも1つのステムループ領域を含む。いくつかの態様において、方法は、前記核酸分子へ前記アダプターをカップリングする工程、および該核酸分子へカップリングされた該アダプターの前記ステムループ領域を線形化する工程をさらに含む。いくつかの態様において、前記線形化は、エンドヌクレアーゼ、ウラシルグリコシラーゼもしくはその機能的類似体、またはその組み合わせを使用して行われる。いくつかの態様において、前記エンドヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼVIIIまたはその機能的類似体である。いくつかの態様において、前記ウラシルグリコシラーゼはウラシルデオキシリボ核酸(DNA)グリコシラーゼである。
【００３３】
いくつかの態様において、前記アダプターはY形状である。いくつかの態様において、前記アダプターは平滑末端化されている。いくつかの態様において、前記アダプターは既知の配列を含む。いくつかの態様において、前記アダプターは、前記複数のタグ付加DNA断片またはその誘導体のユニーク分子同定を可能にするユニーク配列を含む。
【００３４】
いくつかの態様において、前記アダプターの前記核酸塩基はメチル化されていない。いくつかの態様において、前記アダプターの前記核酸塩基がメチル化されている。いくつかの態様において、方法は、前記複数のDNA断片または前記複数のタグ付加DNA断片を増幅へ供する工程をさらに含む。いくつかの態様において、前記増幅はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む。
【００３５】
いくつかの態様において、方法は、前記複数のDNA断片または前記複数のタグ付加DNA断片のサイズ選択を行い、サイズ選択された複数のDNA断片を提供する工程をさらに含む。いくつかの態様において、前記サイズ選択された複数のDNA断片は、約130〜約400核酸塩基の長さを有する。いくつかの態様において、前記サイズ選択された複数のDNA断片は、約30〜約250核酸塩基の長さを有する。
【００３６】
いくつかの態様において、方法は、前記複数のDNA断片または前記複数のタグ付加DNA断片の少なくとも一部分のメチル化状態を測定し、該複数のDNA断片または該複数のタグ付加DNA断片の該少なくとも該一部分のメチル化プロファイルを提供する工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、前記サイズ選択された複数のDNA断片の少なくとも一部分のメチル化状態を測定し、該サイズ選択された複数のDNA断片またはサイズ選択された複数のタグ付加DNA断片の該少なくとも該一部分のメチル化プロファイルを提供する工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、前記メチル化プロファイルを1つまたは複数の参照に対して処理する工程をさらに含む。
【００３７】
いくつかの態様において、方法は、前記サイズ選択された複数のDNA断片もしくはサイズ選択された複数のタグ付加DNA断片またはその誘導体の少なくとも一部分を、核酸シーケンシングへ供し、複数の配列リードを生じさせる工程をさらに含む。いくつかの態様において、前記参照は、1つまたは複数のさらなる対象のcfDNA分子の参照メチル化プロファイルを含む。いくつかの態様において、前記複数のcfDNA分子は、前記対象の身体試料から得られる。いくつかの態様において、前記身体試料は、血漿、血清、骨髄、脳脊髄液、胸腔内液、唾液、糞便、痰、乳頭吸引液、生検材料、頬擦過標本および尿からなる群より選択される。
【００３８】
別の局面において、本開示は、以下の工程を含む、複数のセルフリーデオキシリボ核酸(DNA)分子を処理または解析するための方法を提供する：(a)シーケンサーによって作成された複数の配列リードを検索する工程であって、ここで、該複数の配列リードの少なくともサブセットが、(i)複数のセルフリーDNA分子由来の配列および(ii)個々の配列リードの各々の両末端でのアダプター配列を含む個々の配列リードを含み、該アダプター配列が該複数のセルフリーDNA分子に由来しない、工程；(b)該複数の配列リードを処理し、(i)両末端に該アダプター配列を有する該複数の配列リードからの1つまたは複数の配列リードを同定し、そして(ii)該1つまたは複数の配列リードを、該複数のセルフリーDNA分子の1つまたは複数のCpG部位に関連すると同定する工程；ならびに(c)(b)において同定された該1つまたは複数のCpG部位を使用し、該複数のセルフリーDNA分子についてのメチル化プロファイルを作成する工程る。特定の態様において、メチル化プロファイルは、個体についての、診断、予後、処置有効性、および／または処置レジメンについての臨床的アプローチにおいて利用される。
【００３９】
いくつかの態様において、前記1つまたは複数のCpG部位は、2つ以上、3つ以上、または4つ以上のCpG部位を含む。いくつかの態様において、方法は、前記メチル化プロファイルを示すレポートを電子的に出力するなど、レポートを作成する工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、前記メチル化プロファイルを処理し、少なくとも1つの疾患もしくは障害を有するまたは有する疑いがあるという前記対象の尤度またはリスクを求める工程をさらに含む。いくつかの態様において、前記疾患または障害は、がん、多発性硬化症、外傷性または虚血性脳損傷、糖尿病、膵炎、アルツハイマー病、および胎児異常からなる群より選択される。いくつかの態様において、前記疾患または障害は、膵臓がん、肝臓がん、肺がん、結腸直腸がん、白血病、膀胱がん、骨がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、黒色腫、卵巣がん、精巣がん、腎臓がん、肉腫、胆管がん、甲状腺がん、脾臓がん、胆嚢がん、および前立腺がんからなる群より選択されるがんである。
【００４０】
別の局面において、本開示は、以下を含む、複数のセルフリーデオキシリボ核酸(DNA)分子を処理または解析するためのシステムを提供する：複数の配列リードを保存するデータベースであって、ここで、該複数の配列リードの少なくともサブセットが、(i)複数のセルフリーDNA分子由来の配列および(ii)個々の配列リードの各々の両末端でのアダプター配列を含む個々の配列リードを含み、該アダプター配列が該複数のセルフリーDNA分子に由来しない、データベース；ならびに該データベースへ動作可能に接続された1つまたは複数のコンピュータプロセッサであって、(1)該データベースから該複数の配列リードを検索する；(2)該複数の配列リードを処理し、(i)両末端に該アダプター配列を有する該複数の配列リードからの1つまたは複数の配列リードを同定し、そして(ii)該1つまたは複数の配列リードを、該複数のセルフリーDNA分子の1つまたは複数のCpG部位に関連すると同定する；かつ(3)(2)において同定された該1つまたは複数のCpG部位を使用し、該複数のセルフリーDNA分子についてのメチル化プロファイルを作成するように、個々にまたはまとめてプログラミングされている、コンピュータプロセッサ。これに続いて、メチル化プロファイルは、配列リードに関連する個体が、例えば、がんを含む、特定の疾患または障害を有するか否かを示し得る。メチル化プロファイルは、個体が特定のタイプのがんを有するか否か、特定のステージのがんを有するか否か、1つまたは複数の特定の処置に対して十分に反応するか否か、個体の平均余命などを示し得る。
【００４１】
いくつかの態様において、前記1つまたは複数のCpG部位は2つ以上のCpG部位を含む。いくつかの態様において、前記1つまたは複数のコンピュータプロセッサは、前記メチル化プロファイルを示すレポートを電子的に出力するように個々にまたはまとめてプログラミングされている。いくつかの態様において、前記1つまたは複数のコンピュータプロセッサは、前記メチル化プロファイルを処理し、1つもしくは複数の疾患もしくは障害を有するまたは有する疑いがあるという前記対象の尤度またはリスクを求めるように、個々にまたはまとめてプログラミングされている。いくつかの態様において、前記疾患または障害は、がん、多発性硬化症、外傷性または虚血性脳損傷、糖尿病、膵炎、アルツハイマー病、および胎児異常からなる群より選択される。いくつかの態様において、前記疾患または障害は、膵臓がん、肝臓がん、肺がん、結腸直腸がん、白血病、膀胱がん、骨がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、黒色腫、卵巣がん、精巣がん、腎臓がん、肉腫、胆管がん、甲状腺がん、脾臓がん、胆嚢がん、および前立腺がんからなる群より選択されるがんである。
【００４２】
いくつかの態様において、前記対象の身体試料から得られた、cfDNA分子のメチル化パターンは、異常な組織特異的細胞死をモニタリングするために使用することができる。
【００４３】
別の局面において、本開示は、1つまたは複数のコンピュータプロセッサによる実行時に、以下の工程を含む複数のセルフリーデオキシリボ核酸(DNA)分子を処理または解析するための方法を実施する、機械実行可能コードを含む、非一時的コンピュータ可読媒体を提供する：(a)シーケンサーによって作成された複数の配列リードを検索する工程であって、ここで、該複数の配列リードの少なくともサブセットが、(i)複数のセルフリーDNA分子由来の配列および(ii)個々の配列リードの各々の両末端でのアダプター配列を含む個々の配列リードを含み、該アダプター配列が該複数のセルフリーDNA分子に由来しない、工程；(b)該複数の配列リードを処理し、(i)両末端に該アダプター配列を有する該複数の配列リードからの1つまたは複数の配列リードを同定し、そして(ii)該1つまたは複数の配列リードを、該複数のセルフリーDNA分子の1つまたは複数のCpG部位に関連すると同定する工程；ならびに(c)(b)において同定された該1つまたは複数のCpG部位を使用し、該複数のセルフリーDNA分子についてのメチル化プロファイルを作成する工程。
【００４４】
本開示のさらなる局面および利点は、本開示の単に例示的な態様が記載および説明される、下記の詳細な説明から当業者に容易に明らかとなるであろう。理解されるように、本開示は他のおよび異なる態様が可能であり、そのいくつかの詳細は、様々な明らかな点において改変が可能であり、全てが本開示から逸脱しない。従って、図面および説明は、例示的な性質のものであると見なされ、限定的であるとは見なされない。
【００４５】
いくつかの態様において、以下の工程を含む、cfDNA（血液または血漿または尿、またはその組み合わせから得られるものを含む）からCpGリッチ配列の集合を濃縮する方法がある：cfDNA分子の末端を標識または修飾する工程であって、標識されたcfDNA分子の末端がライゲーション不能である標識されたcfDNA分子を生成する、工程；標識されたcfDNA分子を、メチル化形態、非メチル化形態、または両方のC^CGG、T^CGA、または他の部位を認識する1つまたは複数の制限酵素（例えば、MspI、HpaII、TaqI、またはMspI、TaqI、および／もしくはHpaIIを含む混合物）で消化し、両末端においてライゲーション可能である消化cfDNA分子を生成し、かつ、片末端においてのみライゲーション可能である消化cfDNA分子を生成する工程；消化cfDNA分子のライゲーション可能末端へメチル化アダプターをライゲーションする工程であって、それによってアダプター連結cfDNA分子を生成する、工程；アダプター連結cfDNA分子をバイサルファイト変換へ供し、バイサルファイト変換されたアダプター連結cfDNA分子を生成する工程；ならびに、分子の両末端にアダプターを含むバイサルファイト変換されたアダプター連結cfDNA分子を（例えばポリメラーゼ連鎖反応によって）増幅する工程。具体的な態様において、アダプターは一本鎖DNAへライゲーションすることができ、バイサルファイト変換はアダプターライゲーション前に行うことができる。具体的な態様において、方法は、増幅されバイサルファイト変換されたアダプター連結cfDNA分子をサイズ選択する工程をさらに含む。サイズ選択され、増幅され、バイサルファイト変換されたアダプター連結cfDNA分子は、約150〜約400ヌクレオチドの長さを有し得る。いくつかの態様において、標識する工程は、標識の前または後に、cfDNA分子の5’末端の脱リン酸化を含む。標識する工程は、cfDNA分子の3’末端へddNTPを付加することを含み得、いくつかの場合において、標識は検出可能である。具体的な態様において、標識は、蛍光性であるか、比色性であるか、ビオチン化されているか、放射性であるか、またはその組み合わせである、ddNTPを含む。ある態様において、方法は、ライゲーション工程前に、消化cfDNA分子の末端修復およびヌクレオチドテーリングの工程をさらに含む。
【００４６】
特定の態様において、アダプターは少なくとも1つのステムループ領域を含む。そのような場合において、方法は、アダプター連結cfDNA分子上のアダプターのステムループ領域を線形化する工程をさらに含み得る。線形化は、少なくとも1つのウラシルDNAグリコシラーゼによって行われるか、制限酵素によって行われるか、または両方によって行われることができる。具体的な態様において、線形化は、ウラシルDNAグリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼVIIIの混合物によって行われる。いくつかの場合において、アダプターはフォーク形状である。アダプターは、1つまたは複数のユニーク配列を含む、1つまたは複数の既知の配列を含み得る。
【００４７】
いくつかの態様において、方法は、血液または血漿からcfDNAを得る工程をさらに含む。サイズ選択された増幅cfDNA分子の一部または全部を、解析することができ、例えば、部分的にまたは完全に配列決定することができる。いくつかの場合において、サイズ選択された増幅cfDNA分子の一部または全部を、メチル化パターンについて解析し、サイズ選択された増幅cfDNA分子の一部または全部のメチル化パターンを、参照と比較しても比較しなくてもよい。第1の個体からのcfDNA由来のサイズ選択された増幅cfDNA分子の一部または全部のメチル化パターンを、第2のまたはそれ以上の個体のDNA中の1つまたは複数のメチル化パターンと比較することができる。
【００４８】
本開示の方法は、セルフリーDNA(cfDNA)からCpGリッチ配列の集合を濃縮するための方法であって、cfDNA分子の末端を修飾し、標識されたcfDNA分子の末端がライゲーション不能であるcfDNA分子を生成する工程を含む、方法を含む。ライゲーションを防ぐための末端への修飾は、末端への1つまたは複数の修飾において達成され得る。例えば、DNAの5’末端および／または3’末端が修飾され得る。いくつかの場合において、5’末端は脱リン酸化され、これに加えてまたはこれの代わりに、3’末端は、例えばddNTPを用いての、DNAの3’末端への薬剤の付加によって修飾される。
【００４９】
参照による組み入れ
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み入れられるように具体的かつ個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み入れらる。参照により組み入れられる刊行物および特許または特許出願が、本明細書中に含まれる開示に矛盾する程度まで、本明細書は、いかなるそのような矛盾する材料にも取って代わりかつ／または優先するように意図される。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において特に記載される。本発明の特徴および利点のよりよい理解は、本発明の原理を利用する、例示的な態様を記載する下記の詳細な説明、ならびに添付の図面（本明細書においてまた「図（Figure）」および「図（FIG.）」）を参照することによって、得られるだろう。
【００５１】
【図１】セルフリーDNA(cfDNA)のメチル化プロファイリングを行うフローチャートを図示する。
【図２】Y形状アダプターでセルフリーRRBS(cfRRBS)を使用するcfDNAのメチル化プロファイリングを図示する。
【図３】ステムループアダプターでセルフリーRRBS(cfRRBS)を使用するcfDNAのメチル化プロファイリングを図示する。
【図４】一本鎖ライゲーションアダプターでセルフリーRRBS(cfRRBS)を使用するcfDNAのメチル化プロファイリングを図示する。
【図５】ストレプトアビジン磁気ビーズによる除去を伴ってセルフリーRRBS(cfRRBS)を使用するcfDNAのメチル化プロファイリングを図示する。
【図６】図6Aは、切断型Y形状アダプターを図示し、図6Bは、末端にバーコードを有する切断型Y形状アダプターを図示し、図6Cは、末端にバーコードと酵素消化によって残された核酸塩基とを有する切断型Y形状アダプターを図示する。
【図７】図7Aは、ステムループアダプターを図示し、図7Bは、末端にバーコードを有するステムループアダプターを図示し、図7Cは、末端にバーコードと酵素消化によって残された核酸塩基とを有するステムループアダプターを図示する。
【図８】種々の一本鎖ライゲーションアダプターの例を図示する。
【図９】RRBSアッセイからの生成物のゲル電気泳動とcfRRBSアッセイからのものとの比較を図示する。
【図１０】本明細書に提供される方法を実行するようにプログラムされているかまたはそうでなければ構成されているコンピュータシステムを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
詳細な説明
本発明の様々な態様が本明細書において記載および説明されているが、そのような態様は例示のためにのみ提供されることが、当業者に明らかであろう。多数の変形、変更、および置換が、本発明を逸脱することなく、当業者に想到され得る。本明細書に記載される本発明の態様の様々な代替物が用いられ得ることが、理解されるべきである。
【００５３】
長年の特許法の慣習に従って、「1つの（a）」および「1つの（a）」という単語は、特許請求の範囲を含む、本明細書において「含む」という単語と合わせて使用される場合、「1つまたは複数の」を意味する。本開示のいくつかの態様は、本開示の1つまたは複数の構成要素、方法工程、および／または方法からなり得るかまたはこれらから本質的になり得る。本明細書に記載される任意の方法、システム、または組成物が、本明細書に記載される任意の他の方法または組成物に関して実施され得ることが意図される。
【００５４】
I．定義の例
本発明の様々な局面は範囲の形式で示され得る。範囲の形式での記載は、単に利便性および簡潔さのためであり、本開示の範囲に対する変更できない限定として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。従って、範囲の記載は、あたかも明示的に記載しているかのように、その範囲内の全ての可能な部分範囲ならびに個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、1〜6のような範囲の記載は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などのような部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数値、例えば、1、2、3、4、5、および6を具体的に開示しているとみなされるべきである。これは範囲の幅にかかわらず当てはまる。範囲が存在する場合、範囲は範囲の終点を含み得る。
【００５５】
用語「対象」は、本明細書において使用される場合、一般に、処理または解析を受ける生体試料を有する個体を指す。対象は動物または植物であり得る。対象は、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ブタまたはげっ歯動物であり得る。対象は、患者であり得、例えば、1つまたは複数のがん（例えば、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、肝胆道がん、白血病、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、皮膚がん、尿路がん、精巣がん、腎臓がん、肉腫、胆管がん、甲状腺がん、胆嚢がん、脾臓がん、または前立腺がん；がんは固形腫瘍を含んでも含まなくてもよい）、1つまたは複数の感染症、1つまたは複数の遺伝性障害、または1つまたは複数の腫瘍、あるいはその任意の組み合わせのような、疾患を有し得るかまたは疾患を有する疑いがあり得るか疾患を有するリスクがあり得る。1つまたは複数の腫瘍を有するか有する疑いがある対象について、腫瘍は、1つまたは複数のタイプのものであり得る。対象は、疾患を有し得るかまたは疾患を有する疑いがあり得る。対象は無症候性であり得る。
【００５６】
用語「試料」は、本明細書において使用される場合、一般に、生体試料を指す。試料は、組織および／もしくは細胞からまたは組織および／もしくは細胞の環境から採取され得る。いくつかの例において、試料は、組織生検材料、血液（例えば、全血）、血漿、細胞外液、乾燥血液スポット、培養細胞、培養培地、廃棄組織、植物物質、合成タンパク質、細菌および／もしくはウイルス試料、真菌組織、古細菌、または原生動物を含み得るか、またはこれらから誘導され得る。試料は収集前に供給源から単離されている場合がある。試料は法医学的証拠を含み得る。非限定的な例としては、収集前に最初の供給源から単離された、指紋、唾液、尿、血液、糞便、精液、または他の体液が挙げられる。いくつかの例において、試料は、試料調製中にその最初の供給源（細胞、組織、体液、例えば血液、環境試料など）から単離される。試料は、化石に由来する試料を含むがこれに限定されない絶滅種に由来し得る。試料は、その最初の供給源から精製またはそうでなければ濃縮されてもされなくてもよい。いくつかの場合において、最初の供給源は、さらなる処理前にホモジナイズされる。試料は、バフィーコート、脂質、または粒子状物質を除去するために濾過または遠心分離され得る。試料はまた、核酸について精製もしくは濃縮され得、またはRNアーゼもしくはDNアーゼで処理され得る。試料は、無傷であるか、断片化されているか、または部分的に分解されている、組織および／または細胞を含有し得る。
【００５７】
試料は、疾患または障害を有する対象から得られてもよく、対象は、疾患または障害の診断を受けていても受けていなくてもよい。対象はセカンドオピニオンを必要としていてもよい。疾患または障害は、感染症、免疫障害もしくは疾患、がん、遺伝性疾患、変性疾患、生活習慣病、または損傷であり得る。感染症は、細菌、ウイルス、真菌、および／または寄生生物によって引き起こされ得る。がんの非限定的な例としては、膵臓がん、肝臓がん、肺がん、結腸直腸がん、白血病、膀胱がん、骨がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、黒色腫、卵巣がん、甲状腺がん、胆嚢がん、脾臓がん、および前立腺がんが挙げられる。遺伝性疾患または障害のいくつかの例としては、嚢胞性線維症、シャルコー・マリー・トゥース病、ハンチントン病、ポイツ・ジェガーズ症候群、ダウン症候群、関節リウマチ、およびティ・サックス病が挙げられるが、これらに限定されない。生活習慣病の非限定的な例としては、肥満症、糖尿病、動脈硬化症、心疾患、脳卒中、高血圧、肝硬変、腎炎、がん、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、聴覚問題、および慢性背部痛が挙げられる。損傷のいくつかの例としては、擦過傷、脳損傷、打撲傷、熱傷、振盪、うっ血性心不全、建設損傷、脱臼、動揺胸郭、骨折、血胸、椎間板ヘルニア、ヒップポインター、低体温症、裂傷、圧迫神経症（pinched nerve）、気胸、肋骨骨折、坐骨神経痛、脊髄損傷、腱靭帯筋膜損傷、外傷性脳損傷、およびむちうち症が挙げられるが、これらに限定されない。試料は、疾患または障害を有する対象の処置の前および／または後に採取され得る。試料は、疾患または障害についての対象の処置の前および／または後に採取され得る。試料は、処置または処置レジメン中に採取され得る。複数の試料が、処置の開始前から始めることを含めて、経時的に処置の効果をモニタリングするために対象から採取され得る。試料は、感染症を有することが分かっているかまたはその疑いがある対象から採取され得、感染症についての診断用抗体が入手可能であってもなくてもよい。
【００５８】
試料は、疾患または障害を有する疑いがある対象から採取され得る。試料は、疲労、悪心、体重減少、痛み、疼痛、衰弱、または記憶喪失のような、説明のつかない症状を経験している対象から採取され得る。試料は、説明される症状を有する対象から採取され得る。試料は、家族歴および／もしくは既往歴、年齢、環境曝露、生活習慣危険因子、他の公知の危険因子の存在、またはその組み合わせのような1つまたは複数の要因に起因して、疾患または障害を発症するリスクがある対象から採取され得る。
【００５９】
試料は、健康な個体から採取され得る。いくつかの場合において、試料は、同じ個体から縦断的に採取され得る。いくつかの場合において、縦断的に得られた試料は、個体の健康のモニタリングおよび健康問題の早期発見（例えば、がんの早期診断）を目的として解析され得る。いくつかの態様において、試料は、在宅環境でまたはポイント・オブ・ケア環境で収集され得、その後、解析前に、郵便配達、クーリエ配達、または他の輸送方法によって輸送され得る。例えば、ホームユーザーは、指を刺すことによって血液スポット試料を収集し得、血液スポット試料は乾燥され、その後、郵便配達によって輸送されて解析され得る。いくつかの場合において、縦断的に得られた試料は、健康、運動能力または認知能力に影響を与えると予想される刺激に対する反応をモニタリングするために使用され得る。非限定的な例としては、薬剤、食事療法および／または運動レジメンに対する反応が挙げられる。いくつかの場合において、個々の試料は、多目的であり、臨床的に関連する情報を得るためにメチル化プロファイリングを可能にし、また、個体の個人または家族の祖先についての情報のためにも使用される。
【００６０】
いくつかの態様において、生体試料は、1つまたは複数の核酸分子を含む核酸試料である。核酸分子は、セルフリーまたは実質的にセルフリーの核酸分子、例えば、セルフリーDNA(cfDNA)もしくはセルフリーRNA(cfRNA)またはその混合物であり得る。核酸分子は、ヒト、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、類人猿、サル、チンパンジー、爬虫類、両生類、または鳥類供給源を含む、様々な供給源に由来し得る。さらに、試料は、血液、血清、血漿、骨髄、硝子体、痰、糞便、尿、涙、汗、唾液、精液、粘膜分泌物、粘液、脳脊髄液、胸腔内液、羊水、およびリンパ液を含むがこれらに限定されない、セルフリー配列を含有する様々な動物体液から抽出され得る。試料は、胚、胎児、または妊婦から採取され得る。いくつかの例において、試料は母親の血漿から単離され得る。いくつかの例において、試料は、（妊娠している対象から得られる身体試料を介して）起源が胎児であるか、または対象自体の組織に由来する、セルフリー核酸（例えば、cfDNA）を含み得る。
【００６１】
試料の成分（核酸を含む）は、試料の多重化を可能にするために、例えば識別可能タグで、タグ付けされ得る。識別可能タグのいくつかの非限定的な例としては、フルオロフォア、磁気ナノ粒子、および核酸バーコードが挙げられる。フルオロフォアとしては、蛍光タンパク質、例えば、GFP、YFP、RFP、eGFP、mCherry、tdtomato、FITC、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 750、Pacific Blue、クマリン、BODIPY FL、Pacific Green、Oregon Green、Cy3、Cy5、Pacific Orange、TRITC、Texas Red、フィコエリトリン、アロフィコシアニン（Allophcocyanin）、または他のフルオロフォアが挙げられ得る。1つまたは複数のバーコードタグが、シーケンシング前に試料中のセルフリー核酸（例えば、cfDNA）へ（例えば、カップリングまたはライゲーションによって）結合され得る。バーコードは、試料中のcfDNA分子を一意的にタグ付けし得る。あるいは、バーコードは、試料中のcfDNA分子を非一意的にタグ付けし得る。バーコードは、試料中のcfDNA分子を非一意的にタグ付けし得、非一意的タグと組み合わされた、cfDNA分子（例えば、cfDNA分子の内在性配列の少なくとも一部分）から得られる追加情報が、試料中のcfDNA分子についての（例えば、他の分子に対して一意的に識別するための）一意的識別子として機能し得る。例えば、（例えば、所与のテンプレート分子由来の）一意的識別を有するcfDNA配列リードは、配列リードの片末端または両末端での1つまたは複数の連続塩基領域を含む配列情報、配列リードの長さ、および配列リードの片末端または両末端での結合されたバーコードの配列に基づいて検出され得る。DNA分子は、DNA（例えば、cfDNA）試料を、多く（例えば、少なくとも約50、少なくとも約100、少なくとも約500、少なくとも約1000、少なくとも約5000、少なくとも約10000、少なくとも約50000、または少なくとも約100000）の異なる不連続サブユニット（例えば、区画、ウェル、または小滴）へ増幅前に分割することによって、タグ付けすることなく一意的に識別され得、その結果、増幅されたDNA分子が、DNAのそれらのそれぞれの個々のインプット分子に由来すると一意的に決定および識別されることができる。
【００６２】
任意の数の試料が多重化され得る。例えば、多重解析は、少なくとも約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95、約100、またはそれ以上の試料を含有し得る。識別可能タグが、その起源について各試料をインテロゲートする方法を提供し得るか、または異なる試料を異なる領域もしくは固体支持体へ分離するように方向付け得る。
【００６３】
任意の数の試料がタグ付けまたは多重化無しで解析前に混合され得る。例えば、多重解析は、少なくとも約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95、約100、またはそれ以上の試料を含有し得る。試料は、コンビナトリアルプーリング設計を使用してタグ付け無しで多重化され得、コンビナトリアルプーリング設計において、試料は、コンピュータ・デマルチプレクシングを使用して、解析されるプールから個々の試料由来のシグナルが分割されるのを可能にする様式で、プール中へ混合される。
【００６４】
試料はシーケンシング前に濃縮され得る。例えば、cfDNA分子は、対象のゲノムまたはトランスクリプトーム由来の1つまたは複数の領域について選択的に濃縮されても非選択的に濃縮されてもよい。例えば、cfDNA分子は、標的配列捕捉（例えば、パネルの使用）、選択的増幅、または標的増幅によって、対象のゲノムまたはトランスクリプトーム由来の1つまたは複数の領域について選択的に濃縮され得る。別の例として、cfDNA分子は、ユニバーサル増幅によって、対象のゲノムまたはトランスクリプトーム由来の1つまたは複数の領域について非選択的に濃縮され得る。いくつかの態様において、増幅は、ユニバーサル増幅、全ゲノム増幅、または非選択的増幅を含む。cfDNA分子は、所定範囲内の長さを有する断片についてサイズ選択され得る。例えば、サイズ選択は、約40塩基対(bp)〜約250 bpの範囲内の長さについて、アダプターライゲーション前に、DNA断片に対して行われ得る。別の例として、サイズ選択は、約160 bp〜約400 bpの範囲内の長さについて、アダプターライゲーション後に、DNA断片に対して行われ得る。
【００６５】
いくつかの態様において、配列リードのサブセットが、解析のためにリードを処理する前に、さらなる解析から除去され得る。例えば、所定の閾値（例えば、90%、99%、99.9%、または99.99%）未満の品質スコアを有する配列リードのサブセットが、取り除かれ得る。所与のcfDNA試料由来の配列リードのセットは、バーコード配列、長さ、品質スコア、GC含有量、または個々の配列リードの他の特性を使用して、補正または正規化され得る。
【００６６】
用語「核酸」、または「ポリヌクレオチド」は、本明細書において使用される場合、一般に、1つまたは複数の核酸サブユニット、またはヌクレオチドを含む、分子を指す。核酸は、アデノシン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)、およびウラシル(U)、またはそれらのバリアントより選択される1つまたは複数のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドは、一般に、ヌクレオシドと、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上のリン酸(PO3)基とを含む。ヌクレオチドは、核酸塩基と、五炭糖（リボースまたはデオキシリボースのいずれか）と、1つまたは複数のリン酸基とを、個々にまたは組み合わせて含むことができる。
【００６７】
リボヌクレオチドは、糖がリボースであるヌクレオチドである。デオキシリボヌクレオチドは、糖がデオキシリボースであるヌクレオチドである。ヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸またはヌクレオシドポリリン酸であり得る。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシドポリリン酸、例えば、デオキシリボヌクレオシド三リン酸(dNTP)であり得、これは、デオキシアデノシン三リン酸(dATP)、デオキシシチジン三リン酸(dCTP)、デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)、ウリジン三リン酸(dUTP)およびデオキシチミジン三リン酸(dTTP) dNTPより選択され得、これらは、検出可能なタグ、例えば、発光タグまたはマーカー（例えば、フルオロフォア）を含む。ヌクレオチドは、成長している核酸鎖中へ組み込まれ得る任意のサブユニットを含み得る。そのようなサブユニットは、A、C、G、T、もしくはU、あるいは、1つもしくは複数の相補A、C、G、TもしくはUに特異的であるか、またはプリン（即ち、AもしくはG、もしくはそのバリアント）もしくはピリミジン（即ち、C、TもしくはU、もしくはそのバリアント）に相補的である、任意の他のサブユニットであり得る。いくつかの例において、核酸は、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)、またはそれらの誘導体もしくはバリアントである。核酸は一本鎖または二本鎖であり得る。核酸分子は、直線状、曲線状、もしくは環状、またはその任意の組み合わせであり得る。
【００６８】
用語「核酸分子」、「核酸配列」、「核酸断片」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において使用される場合、一般に、ポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド(DNA)もしくはリボヌクレオチド(RNA)、またはその類似体および／もしくは組み合わせ（例えば、DNAおよびRNAの混合物）を指す。核酸分子は様々な長さを有し得る。核酸分子は、少なくとも約5塩基、10塩基、20塩基、30塩基、40塩基、50塩基、60塩基、70塩基、80塩基、90、100塩基、110塩基、120塩基、130塩基、140塩基、150塩基、160塩基、170塩基、180塩基、190塩基、200塩基、300塩基、400塩基、500塩基、1キロベース(kb)、2 kb、3 kb、4 kb、5 kb、10 kb、または50 kbの長さを有することができるか、または、それは、前述の値の任意の2つの間の任意の数の塩基を有し得る。オリゴヌクレオチドは、典型的に、4つのヌクレオチド塩基の特定の配列から構成される：アデニン(A)；シトシン(C)；グアニン(G)；およびチミン(T)（ポリヌクレオチドがRNAである場合、チミン(T)の代わりにウラシル(U)）。従って、用語「核酸分子」、「核酸配列」、「核酸断片」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示であるように少なくとも部分的に意図される。あるいは、前記用語は、ポリヌクレオチド分子自体へ適用され得る。このアルファベット表示は、中央処理装置を有するコンピュータ中のデータベースへ入力され、かつ／または、機能ゲノミクスおよびホモロジー検索のようなバイオインフォマティクス適用のために使用され得る。オリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の非標準ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体および／または改変ヌクレオチドを含み得る。
【００６９】
用語「セルフリーDNA」または「cfDNA」は、本明細書において使用される場合、一般に、血流またはそこからの血漿のような体液中において自由に循環しているDNAを指す。本明細書において利用される方法の具体的な態様において、cfDNAは、細胞に関連しない血流中の腫瘍由来断片化DNAである循環腫瘍DNA(ctDNA)のような、特定のタイプのcfDNAを包含する。cfDNAは、二本鎖、一本鎖であり得るか、または両方の特徴を有し得る。
【００７０】
用語「CpG部位」は、本明細書において使用される場合、一般に、5’→3’方向に沿ってシトシン(C)をグアニン(G)に隣接して含む、核酸分子に沿う位置を指す。核酸分子は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、500、1000、10000、またはそれ以上のCpG部位を含み得る。そのようなCpG部位は、核酸分子の3’→5’方向に沿って、「GpC」と呼ばれる得る。
【００７１】
用語「CpG島」は、本明細書において使用される場合、一般に、以下の基準を満たすゲノムDNAの連続領域を指す：(1)約0.6より大きい「観測値／予測値の比率」に対応するCpGジヌクレオチドの頻度を有すること；(2)約0.5より大きい「GC含有量」を有すること；および(3)少なくとも約0.2キロベース(kb)の長さを有すること；これらの基準に合う反復領域が排除またはマスクされるという可能性のある例外を伴う。CpG島を同定するための基準は、例えば、Gardiner-Garden et al. (J. Mol. Biol., 196:262-282, 1987)に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００７２】
用語「CpGリッチ」は、本明細書において使用される場合、一般に、高CpG含有量を有するゲノム領域を指し、ここで、DNAメチル化の大部分が生じ得る。高CpG含有量の領域は、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、またはそれ以上のCpG含有量を有し得る。いくつかの場合において、そのようなCpG含有量は1%より大きい。いくつかの態様において、CpGリッチ領域はCpG島およびプロモータ領域を含み得る。CpGリッチ領域は任意の長さを含み得る（例えば、少なくとも0.2 kbであるという長さ制限はない）。
【００７３】
用語「バイサルファイト変換」は、一般に、本明細書において使用される場合、非メチル化塩基（例えば、シトシン塩基）をウラシル塩基へ変換し、それによって塩基（例えば、メチル化シトシン）を保存するための生化学的プロセスを指す。バイサルファイト変換のための試薬の例としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸水素マグネシウム、および亜硫酸水素トリアルキルアンモニウムが挙げられる。
【００７４】
II．CpGリッチ領域を有するDNAの濃縮
本開示は、二本鎖もしくは一本鎖であり得るかまたは両方の特徴を有し得るcfDNAを含む、CpGリッチ領域を有する特定のDNAの効率的な濃縮を提供し、濃縮は、後続の解析がより効率的となることを可能にする。本開示は、特定の個体についてのスクリーニング、診断、予後、または処置局面のために臨床的に使用され得るcfDNAのメチル化に関する情報を得るための有用な方法、システム、および組成物を提供する。個体は、特定の疾患もしくは障害を有し得るか、または特定の疾患もしくは障害を有する疑いがあり得るか、または特定の疾患もしくは障害について治療計画を必要とし得、本開示は、がんの態様およびがんでない態様を包含する。
【００７５】
がん細胞は異常なDNAメチル化パターンを示し得る。高メチル化および／または低メチル化腫瘍DNA断片は、細胞アポトーシスまたは壊死のようなプロセスを介して血流中へ放出され得、ここで、それらは、血漿または尿のような体液中の循環セルフリーDNA(cfDNA)の一部となり得る。従って、cfDNAメチル化プロファイリングは、がんスクリーニングまたは他の疾患もしくは障害のスクリーニングについての有用な戦略である。全ゲノムバイサルファイトシーケンシングはDNAメチロームの包括的な視点を提供するが、全ゲノムをディープシーケンシングするのは高価であり得る。
【００７６】
リデューストリプリゼンテーションバイサルファイトシーケンシング(RRBS)は、高CpG含有量を有するゲノム領域、またはCpG部位の、メチル化プロファイリングについての費用効果の高い技術として行われ得る。ほとんどのDNAメチル化はCpG部位で生じるため、そのようなCpG部位は関心対象であり得る。RRBSにおいて、ゲノムDNAは制限エンドヌクレアーゼ（例えばMspI制限酵素）で消化され、断片が生成され得、断片はサイズ選択され、CpG密集領域を有する断片について濃縮され得る。これらの領域はゲノムのごく一部（約3%）を構成し得るが、ゲノムについての包括的なDNAメチル化情報を提供する。166塩基対(bp)の周りに特徴的なピークを示し得る、セルフリーDNAの断片化性質は、典型的なRRBSに難題をもたらし得る。特定のサイズ範囲（例えば、40〜220 bpのサイズ範囲）内の断片を選択するためにセルフリーDNA断片に対してRRBSを行うことは、cfDNA集団の全てまたはほぼ全てを選択し得、従って、低い濃縮をもたらし得る。
【００７７】
ゲノムDNAから生成されて典型的なRRBSライブラリー中に存在する断片のほとんどは、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、MspI）によって2回切断されている可能性があるが、これは、セルフリーDNAの断片化性質に起因して、セルフリーDNAについては当てはまらない可能性がある。従って、セルフリーDNAに対して典型的なRRBSを行うことは、限定的なCpG濃縮に起因して、難題をもたらし得る。CpGリッチ領域についてセルフリーDNAを濃縮するための方法およびシステムは、有利なことに、臨床診断適用へ向けてのメチル化プロファイリングを可能にし得る。
【００７８】
本開示の態様は、cfDNA中のCpG島の濃縮のための新規の技術を提供する。特定の態様は、費用効果の高いメチル化プロファイリングを容易にし、特定の局面において、本開示の方法は、例えば、液体生検での早期診断を含む、がん診断に有用である。
【００７９】
セルフリーDNA分子のCpGリッチ領域中のDNAメチル化を評価するための方法、組成物、およびシステムを、本明細書に提供する。CpGリッチ領域についてセルフリーDNA分子を濃縮するための方法、組成物、およびシステムは、有利なことに、臨床診断適用へ向けてのメチル化プロファイリングを可能にし得る。本開示は、血液由来試料または血漿由来試料または尿由来試料（またはその組み合わせ）のような、メチル化プロファイリングのためのcfDNAの1つまたは複数の試料からのライブラリーの調製を容易にすることを含む、CpGリッチ領域についてcfDNA分子を濃縮する改善された方法およびシステムを提供する。
【００８０】
本開示は、メチル化量および／または分子中の場所の解析のための分子の調製のための方法、組成物、およびシステムを提供する。いくつかの態様において、分子はcfDNAを含む。いくつかの態様において、cfDNAは、対象の1つまたは複数の身体試料から得られるかまたはこれに由来する。例えば、身体試料は、対象由来の、血液、血漿、血清、骨髄、脳脊髄液、胸腔内液、唾液、糞便、乳頭吸引液、頬擦過標本、痰、および／または尿試料であり得る。
【００８１】
がん細胞は、1つまたは複数の腫瘍抑制遺伝子の1つまたは複数の調節領域（プロモータ領域を含む）高メチル化、および1つまたは複数の遺伝子間領域の広範囲にわたる低メチル化のような、異常なDNAメチル化パターンを示し得る。従って、対象または患者のDNAメチル化プロファイルは、がん評価を含む臨床実務における評価についての標的として処理され得る。高メチル化および／または低メチル化腫瘍DNA断片は、細胞アポトーシスまたは壊死のようなプロセスを介して血流中へ放出され得、ここで、これらの循環腫瘍DNA(ctDNA)は、血漿中の循環セルフリーDNA(cfDNA)の一部となり得る。cfDNAメチル化プロファイリングの最小限に侵襲性のまたは非侵襲性の性質は、そのようなcfDNAメチル化プロファイリングを、がんについてのものを含む、任意の疾患または障害についての一般的なスクリーニングもしくは診断、予後、処置選択、または処置モニタリングのための有効な戦略とし得る。本開示は、メチル化プロファイリングについて情報を与えるゲノム領域（例えば、CpG島）についてcfDNA分子を処理または濃縮するための方法およびシステムを提供し、処理されたメチル化プロファイリングは、そのような処理または濃縮がない場合のメチル化プロファイリングと比較して、より有効に行われ得る。いくつかの態様において、対象は、疾患または障害（例えば、がん）を有するか、またはこれらを有する疑いがあるか、またはこれらを有するリスクがあり、cfDNA分子を処理してメチル化プロファイリングを行うことは、対象が、がんを有するか、またはがんを有する疑いがあるか、またはがんを有するリスクがあるかどうかの尤度を決定することを助け得る。
【００８２】
がんスクリーニングおよび腫瘍組織起源の同定を含む、非侵襲性スクリーニングのための方法において、（例えば、血漿、血液、および／または尿試料中の）対象の身体試料由来のセルフリーDNAの検出および特徴付けは、有効な方法であり得る。採血を含み得る、液体生検（これは流体生検または液相生検とも呼ばれ得る）法は、伝統的な組織生検とは異なり、様々な異なる悪性腫瘍を診断するために有用である。
【００８３】
本開示は、メチル化プロファイリングが、対象の身体試料からメチル化情報を提供するために特に有効であるような、セルフリーDNA中のCpG島の処理または濃縮に関する。いくつかの態様は、cfDNAのCpGリッチ領域中のDNAメチル化を評価する方法を含む。
【００８４】
いくつかの局面において、本開示は、ゲノムDNA分子ではなくセルフリーDNA分子に対して行われる方法およびシステムを提供する。そのような区別は、CpG島についてのゲノムDNAの処理または濃縮に適している方法およびシステムと、CpG島についてのセルフリーDNAの処理または濃縮についてあまり有効でない方法およびシステムとを区別し得る。いくつかの局面において、本開示は、ゲノムDNAと差異を有し得るcfDNAのメチル化解析を容易にするために、ゲノムDNAのメチル化解析を行うための方法を改善する方法およびシステムを提供する。
【００８５】
いくつかの局面において、本開示は、単一ヌクレオチドレベルでゲノムワイドメチル化プロファイルを処理および解析するために使用される効率的なハイスループット技術である、リデューストリプリゼンテーションバイサルファイトシーケンシング(RRBS)の適応を含む、改善された方法およびシステムを提供する。RRBS技術は、高CpG含有量を有するゲノムの領域を濃縮するために制限酵素およびバイサルファイトシーケンシングの組み合わせを使用し得、それによって、配列解析のために処理されるDNA分子またはヌクレオチドの量を低減する。いくつかの局面において、ゲノムDNA分子を濃縮するためのRRBS法は、cfDNA分子のプロセッシングとの適性または適合性のために適応され得る。
【００８６】
本開示は、セルフリーリデューストリプリゼンテーションバイサルファイトシーケンシング(cfRRBS)と呼ばれ得る、cfDNAの費用効果の高いメチル化プロファイリングについてのRRBSアナログアプローチを含み得る方法を提供する。いくつかの局面において、従来のRRBS法は、セルフリーDNAへの適用について改変または適応され得、これは以下を含む：cfDNAのジデオキシヌクレオチド(ddNTP)またはビオチン標識のような、3'末端および／もしくは5'末端でのライゲーションおよび／もしくはポリメラーゼ伸長をブロックするための、または、cfDNA分子の容易な除去のために設計された、cfDNA分子または断片のそのような末端の修飾を行う工程、DNA断片を生成するために（例えば、MspIのような酵素を使用する）cfDNA分子の酵素消化を行う工程、ならびにDNA断片からライブラリーを構築する工程。ライブラリーは、150 bp〜400 bpのような特定の範囲の長さについてのサイズ選択へ供され得る。本開示のいくつかの方法およびシステムにおいて、酵素によって認識可能な配列を含有しないかまたは1つだけ含有するDNA断片は廃棄され、その結果、酵素によって認識可能な配列を2つ以上含有する断片のみが濃縮される。いくつかの態様において、そのようなプロセスは、少なくとも1つのCpG部位を含む分子を濃縮し、それによって、スクリーニングおよび診断ツールの幅広い臨床応用のための費用効果の高いシーケンシングを容易にする。
【００８７】
本開示の態様は、CpG島を含む領域についてセルフリーDNA(cfDNA)分子の集合を濃縮することを含む。本開示の態様は、セルフリーDNAからCpG濃縮（例えば、CpG島含有）配列の集合を濃縮する方法を含む。
【００８８】
本開示の態様は、cfDNA試料中のシトシンメチル化プロファイルの解析のための方法を含む。cfDNA試料中のシトシンメチル化の検出のための方法が、本明細書に包含される。
【００８９】
対象由来のセルフリーDNA試料は、例えば腫瘍のまたは非固形がんの、スクリーニング、診断、予後、処置選択、または処置モニタリングのために、メチル化プロファイリングへ供され得る。例えば、研究は、あるメチル化プロファイルを有する患者は、手術、化学療法、放射線療法、標的療法、ホルモン療法、免疫療法、またはその組み合わせに最大に応答し得ることを示唆し得る。cfDNA試料の正確なメチル化プロファイリングは、潜在的に効果がない処置が患者へ処方または施されることを防ぎ得る。
【００９０】
加えて、1つまたは複数のがん処置が、患者のメチル化プロファイルに少なくとも部分的に基づいて、患者へ処方または施され得る。患者のメチル化プロファイリングを行う方法は、組織からのゲノムDNA解析を含み得る。例えば、正常および／または腫瘍組織試料からのゲノムDNAのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)および断片解析が、メチル化プロファイリングを行うために一組の遺伝子座の各々で行われ得る。メチル化プロファイリングのそのような方法は、解析のために腫瘍組織の入手可能性を必要とし得る。いくつかの場合において、腫瘍組織の入手可能性は難題をもたらし得る。組織は、検索するために時間がかかりまた高価であり、病理学者との連携を必要とする。生検組織は、いくつかの場合において、入手が不可能でないとしても困難であり得、高価であり得、痛みを伴う手順を伴い得、潜在的ながんゲノム進化に起因して低度から中程度の臨床的妥当性をもたらし得る。いくつかの場合において、患者のメチル化プロファイリングは、最初のがん診断から数カ月どころか数年後まで入手可能でない場合がある。従って、メチル化プロファイリングを行うための液体生検アプローチは、早期の、より低侵襲性の、より低コストの腫瘍生検の代替法という利点を提供し得る。
【００９１】
メチル化プロファイリングを行うことは、対象から得られる身体試料のかなりの部分が腫瘍細胞に由来する場合に、比較的容易であり得る。しかし、血液試料に由来するセルフリーDNA(cfDNA)試料中において、cfDNAからの腫瘍DNAの検出、およびそれからのメチル化プロファイリングの評価は、感度が低くかつノイズの多いプロセスであり得る。そのような感度が低くかつ／またはノイズの多いシグナルからの腫瘍DNAの検出およびメチル化プロファイリングの評価は、非腫瘍DNAからの（例えば、腫瘍由来でない細胞由来のゲノムDNAからの）圧倒的なシグナルに起因して困難であり得る。本開示は、効率的なハイスループット様式でセルフリーDNA(cfDNA)分子からメチル化プロファイリングを行うための方法およびシステムを提供する。CpGリッチ領域を有する断片についてcfDNA分子を濃縮した後、濃縮断片は、対象のメチル化プロファイルを得るためにバイオインフォマティクスアプローチを使用して配列決定および処理され得る。
【００９２】
一局面において、本開示は、以下の工程を含む、対象の複数のセルフリーデオキシリボ核酸(DNA)分子を処理または解析するための方法を提供する：(a)アダプターとカップリングすることができない末端またはcfDNA分子の容易な除去のために設計されている末端を有する複数のセルフリーDNA(cfDNA)分子を、1つまたは複数のCpG部位を含有する断片を生成するために該セルフリーDNA分子の少なくともサブセットを断片化するのに十分な条件へ供し、複数のDNA断片を提供する工程；複数のDNA断片の末端へアダプターをカップリングし、非メチル化核酸塩基から区別可能であるメチル化核酸塩基を有する複数のタグ付加DNA断片を提供する工程；(b)該複数のタグ付加DNA断片またはその誘導体を核酸シーケンシングへ供し、複数の配列リードを生じさせる工程；ならびに(c)該複数の配列リードを処理し、(i)該複数の配列リードの両末端での該アダプターからの配列を同定し、そして(ii)該配列を同定すると、該複数のセルフリーDNA分子からのセルフリーDNA分子を1つまたは複数のCpG部位を有すると同定する工程。
【００９３】
別の局面において、本開示は、以下の工程を含む、対象の複数のセルフリーDNA(cfDNA)分子から複数のデオキシリボ核酸(DNA)断片を濃縮するための方法を提供する：(a)複数のセルフリーDNA分子またはその誘導体の少なくとも一部分の各々の片末端または両末端を修飾し、アダプターとカップリングすることができない末端またはcfDNA分子の容易な除去のために設計されている末端を有する複数の修飾されたセルフリーDNA分子を提供する工程；(b)該複数の修飾されたセルフリーDNA分子を、1つまたは複数のCpG部位を含有する断片を生成するために該修飾されたセルフリーDNA分子の少なくともサブセットの各々を断片化するのに十分な条件へ供し、複数のDNA断片を提供する工程；ならびに(c)該アダプターを該複数のDNA断片の末端へカップリングし、非メチル化核酸塩基から区別可能であるメチル化核酸塩基を有する複数のタグ付加DNA断片を提供する工程。
【００９４】
図1は、セルフリーDNA(cfDNA)のメチル化プロファイリングを行う一態様のフローチャートを図示する。操作105において、複数のセルフリーDNA(cfDNA)分子が、対象から得られ得る。次に、操作110において、複数のcfDNA分子の片末端または両末端は、修飾または標識付加へ供され、修飾されたcfDNA分子が生成され得る。次に、操作115において、修飾されたcfDNA分子の少なくとも一部分は、CpGリッチ領域について濃縮され得、ライブラリーが濃縮cfDNAから調製され得る。次に、操作120において、メチル化プロファイリング（例えば、バイサルファイトシーケンシング）は、調製されたライブラリーを使用して行われ得る。具体的な態様において、全ての操作が同じエンティティーによって行われ、一方、他の場合において、操作の全てが同じエンティティーによって行われるとは限らない。例えば、操作110および115は同じエンティティーによって行われ得、一方、操作105および120は、操作110および115を行うエンティティーとは異なるエンティティーによって行われ得る。他の場合において、操作110、115、および120は、同じエンティティーによって行われる。
【００９５】
図2は、Y形状アダプターでセルフリーRRBS(cfRRBS)を使用するcfDNAのメチル化プロファイリングの一態様を図示する。操作205において、cfDNA分子の片末端または両末端が（例えば、ブロッキング基で）修飾され得る。cfDNA分子は、1つまたは複数の後続の活性（例えば、アダプターライゲーション）が修飾cfDNA分子において行われるのを防ぐために修飾され得る。cfDNA分子の末端は、cfDNAの5’末端を（例えば、ホスファターゼ、例えば、仔ウシ腸アルカリホスファターゼを使用して）脱リン酸化することによって修飾され得る。5’末端の脱リン酸化は、例えば、修飾されたcfDNA分子の、アダプターライゲーションを防ぎ得る
【００９６】
cfDNA分子の末端は、cfDNAの3’末端への薬剤の付加によって修飾され得る。cfDNA分子の3’末端は、ジデオキシヌクレオチド(ddNTP)部分またはその機能的類似体で修飾され得る。ddNTP部分は、検出可能である標識（例えば、蛍光性シグナル、イオンシグナル、比色性シグナル、ビオチン化シグナル、または放射性シグナル）を含有し得る。いくつかの態様において、cfDNA分子の脱リン酸化5’末端もddNTP修飾3’末端も、アダプターへカップリングまたはライゲーションさせることができない。5’末端脱リン酸化、3’末端ddNTP修飾（例えば、標識付加）、またはその組み合わせを含む修飾を行うことは、アダプターとカップリングすることができない末端を有するcfDNA分子を生成し得る。いくつかの態様において、cfDNA分子の片末端または両末端の修飾は、0または1つの制限酵素（例えば、MspI）消化部位を含有するcfDNA断片がアダプターへカップリング（例えば、ライゲーション）されるのを防ぐ。そのような行為は、所望の分子についての濃縮の機会を増加させるだろう。
【００９７】
cfDNA分子は、cfDNA分子の片末端または両末端に1つまたは複数のブロッカーオリゴヌクレオチドを組み込むことによって修飾され得る。例えば、そのようなブロッカーオリゴヌクレオチドは、PCRブロッカーオリゴヌクレオチドであり得る。ブロッカーオリゴヌクレオチドの例としては、3'-Phosphatまたは3'-Inverted End（例えば、biomers.netによって提供されるようなもの）が挙げられる。cfDNA末端はビオチン化され得、ビオチン標識付加断片は、アビジンおよび／またはストレプトアビジンでコーティングされたビーズを含む、アビジンおよび／またはストレプトアビジンタンパク質および／またはビーズに基づくコンジュゲートまたは支持体を使用して、洗い流され得るかまたはそうでなければ排除され得る。cfDNA分子の片末端または両末端へのそのような修飾に起因して、制限酵素消化後の後続の操作において、修飾末端を有さない断片のみが、アダプターへカップリングまたはライゲーションされ得るか、または洗い流されない。そのような修飾は、両末端に制限酵素消化部位を有する断片のみが、調製されたライブラリーにおいて効率的に増幅されることを保証し得る。
【００９８】
cfDNA分子の片末端または両末端が修飾された後、操作210において、修飾されたcfDNA分子は制限酵素消化へ供され得、それによってcfDNA断片が生成され、その結果、修飾末端を有さない断片のみが、アダプターへカップリングまたはライゲーションされ得る。そのようなcfDNA断片について、両末端において制限酵素消化部位を有する断片のみが、調製されたライブラリーにおいて効率的に増幅され得る。修飾されたcfDNA分子は制限酵素で消化され得る。制限酵素は、メチル化形態、非メチル化形態、または両方のいずれかであるCpG部位付近のDNA（例えば、C^CG部位）を消化でき得る。制限酵素の例としては、MspI、HpaII、TaqI、もしくは他のもの、またはその混合物が挙げられる。制限酵素消化は1つまたは複数のCpG部位で修飾cfDNA分子を断片化し、それによって2つのタイプの断片を生成し得る：修飾された（例えばddNTP修飾された）末端（例えば3’末端または5’末端）を断片の片末端において有する断片、および修飾されていない（例えば標識されていない）末端を断片のいずれの末端においても有する断片。
【００９９】
アダプターライゲーション前に、操作215において、制限酵素消化（例えば、MspI消化）cfDNA断片は、アダプターがそれへカップリングまたはライゲーションするように修飾へ供され得る。例えば、両末端において修飾を欠くMspI消化断片の末端は、1つまたは複数の特定のヌクレオチドで修飾され得、その結果、修飾末端は、アダプター上の1つまたは複数の特定の相補的ヌクレオチドへ結合することができる。例えば、MspI消化DNA断片は、末端修復および／または核酸塩基（例えば、dNTP）テーリングへ供され得る。ddNTP修飾末端を有するcfDNA断片は、dNTPでテーリングされることができない場合があり、従って、そのような断片は、アダプターをそれへカップリングまたはライゲーションさせることができない場合がある。
【０１００】
操作215において、アダプターが、制限酵素消化DNA断片へカップリングまたはライゲーションされる。アダプターは、DNA断片へのカップリングのための任意の好適なタイプのもの（例えば、ライゲーションアダプター）であり得る。いくつかの態様において、アダプターはメチル化されており、それによって、DNA断片をメチル化核酸塩基が非メチル化核酸塩基から区別されることを可能にするために十分な条件へ供するための後続の操作によって（例えば、バイサルファイト変換によって）それらが影響されないことを可能にする。いくつかの態様において、アダプターはメチル化されていない。アダプターは、特定の二次または三次構造を有しても有さなくてもよい。アダプターは、ユーザーまたは別の団体によって作製されてもよく、またはそれらは商業的に得られてもよい。アダプターは、1つまたは複数の構造、例えば、フォーク（例えば、Y形状アダプターまたはループアダプター）を含み得る。例えば、図2は、Y形状アダプターでセルフリーRRBS(cfRRBS)を使用するcfDNAのメチル化プロファイリングを図示する。アダプターはステムループを含み得、例えば、図3は、ステムループアダプターでセルフリーRRBS(cfRRBS)を使用するcfDNAのメチル化プロファイリングを図示する。
【０１０１】
片末端においてddNTP修飾されている（例えば、ddNTP標識を有する）DNA断片は、アダプターを片末端のみへカップリングまたはライゲーションさせ得る。いくつかの態様において、アダプターは既知の配列を含み、これは、後の処理工程において、例えば、増幅用プライマーについての標的部位として、使用され得る。アダプターは、アダプターのDNAのそれぞれの側に、任意の好適な長さ、例えば、少なくとも約20、少なくとも約25、少なくとも約30、少なくとも約35、少なくとも約40、少なくとも約45、少なくとも約50、少なくとも約55、少なくとも約60、少なくとも約65、少なくとも約70、少なくとも約75、少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、または少なくとも約100 bpを有し得る。
【０１０２】
アダプターが1つまたは複数のステムループを含む場合、修飾（操作305における）、制限酵素消化（操作310における）、ならびに、末端修復および／またはdAテーリングならびにアダプターライゲーション（操作315における）を行った後、アダプター連結DNA断片は、ステムループを線形化する1つまたは複数の酵素、例えば、制限酵素またはUSER（商標）(Uracil-Specific Excision Reagent) 酵素を使用して、操作320において消化され得、それによって、ウラシル残基(U)の場所で単一ヌクレオチドギャップが生成される。いくつかの態様において、線形化は、エンドヌクレアーゼ、ウラシルグリコシラーゼもしくはその機能的類似体、またはその組み合わせを使用して行われる。いくつかの態様において、エンドヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼVIIIまたはその機能的類似体である。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼはウラシルデオキシリボ核酸(DNA)グリコシラーゼである。USER（商標）酵素は、New England BioLabsから入手可能である、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)およびDNAグリコシラーゼ-リアーゼエンドヌクレアーゼVIIIの混合物であり得る。他の態様において、USER（商標）の代替品はUracil-DNA Excision Mix (Epicentre)であり、ここで、Uracil-DNA Excision Mixは、2つの酵素、HK（商標）-UNG (Heat-Killable Uracil N-Glycosylase [UNG] )およびエンドヌクレアーゼIVからなる。HK-UNGは、DNA分子中のウラシル-デオキシヌクレオチドからウラシル塩基を切断し、dUTP組み込みの場所に無塩基部位を作るように構成されており、ここで、エンドヌクレアーゼIVは、続いて、無塩基部位でのホスホジエステル結合を切断する。ステムループを線形化するために使用される1つまたは複数の酵素の使用は、後続のバイサルファイト変換（操作320における）、増幅（操作325における）、およびメチル化プロファイリング（操作330における；本明細書において他の箇所に記載される通り）のための調製においてDNAの2つの鎖の分離を容易にし得る。
【０１０３】
操作220において、アダプター連結DNA断片は、メチル化核酸塩基が非メチル化核酸塩基から区別されることを可能にするために十分な条件へ供され得る。そのような条件は、例えば、バイサルファイト変換によって適用され得、これは、非メチル化シトシン残基（核酸塩基）をウラシル残基（核酸塩基）へ変換するが、メチル化シトシン残基には影響を与えない。バイサルファイト変換における使用に適している亜硫酸水素塩の例としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸水素マグネシウム、および亜硫酸水素トリアルキルアンモニウムが挙げられ、1つまたはその組み合わせが用いられ得る。
【０１０４】
バイサルファイト変換に続いて、操作225において、バイサルファイト変換DNA分子は、増幅へ供され得る。DNA分子は、選択的にまたは非選択的に増幅され得る。例えば、DNA分子は、選択的増幅または標的増幅によって対象のゲノムまたはトランスクリプトーム由来の1つまたは複数の領域について選択的に濃縮され得る。別の例として、DNA分子は、ユニバーサル増幅、全ゲノム増幅、または非選択的増幅によって、非選択的に増幅され得る。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む、任意の種類の増幅が行われ得る。いくつかの態様において、増幅は、増幅用のプライマーについての標的として、アダプター由来の既知の配列を使用し得る。いくつかの態様において、増幅は、DNA分子の両末端でのカップリングまたはライゲーションされたアダプターに著しく依存し得、その結果、両末端にアダプターを有する断片のみが、効率的に増幅される一方、0または1つの末端にアダプターを有する他の断片は、著しくより低い効率で増幅され、それによって、両末端に制限酵素（例えば、MspI）消化部位を有しかつさらにCpG島を含むcfDNA断片についてDNA分子の集合が濃縮される。操作230において、増幅された断片は、次いで、本明細書において他の箇所に記載されるような、メチル化プロファイリングへ続いて供され得る。
【０１０５】
DNA分子は、バイサルファイト変換後、しかしサイズ選択前に、増幅へ供され得る。DNA分子が増幅へ供される場合、アダプターが両末端へカップリングまたはライゲーションされている分子のみが、効率的に増幅可能であり得る。アダプターがカップリングもしくはライゲーションされていない分子または1つのアダプターのみが片末端へカップリングもしくはライゲーションされている分子について、増幅は遥かに効率が低い可能性があり、それによってごくわずかな生成物が生じる。従って、いくつかの態様において、調製されたライブラリーは、アダプターが両末端へカップリングまたはライゲーションされている、両末端に制限酵素（例えば、MspI）消化部位を有する配列を有する断片のみを含有し得る。そのような場合において、調製されたライブラリーは、その中にCpG濃縮DNA領域（例えば、CpGリッチ領域および／またはCpG島）を含み得る。いくつかの態様において、両末端に制限酵素（例えば、MspI）消化部位を有し、かつ、所定範囲（例えば、約40 bp〜約220 bp）内の元のDNA長（アダプターへのカップリングまたはライゲーション前）を有する断片は、CpGリッチ領域であり得る。
【０１０６】
いくつかの態様において、アダプターは、二本鎖または一本鎖ライゲーションアダプターを含み得る。例えば、図4は、一本鎖ライゲーションアダプターでセルフリーRRBS(cfRRBS)を使用するcfDNAのメチル化プロファイリングを図示する。図4に示されるように、そのような一本鎖ライゲーションアダプターが、cfDNAのCpGリッチ領域を濃縮するために方法またはシステムにおいて使用される場合、バイサルファイト変換は、制限酵素（例えば、MspI）消化および末端修復後、しかしアダプターライゲーション前に、行われ得る。例えば、cfDNA分子は、片末端または両末端の修飾（操作405において）、制限酵素消化および／または末端修復（操作410において）、バイサルファイト変換（操作415において）、ならびに一本鎖アダプターライゲーション（操作420において）へ供され得る。この工程の順序は、cfDNAのCpGリッチ領域を濃縮するために方法またはシステムにおいて平滑末端、Y形状アダプター、またはステムループアダプターを使用する場合とは区別され得、ここで、バイサルファイト変換は、制限酵素消化されアダプターライゲーションされた分子に対して行われる。いくつかの態様において、一本鎖ライゲーションアダプターは、メチル化されていてもメチル化されていなくてもよい。一本鎖ライゲーションアダプターは、未修飾末端（例えば、それへカップリングまたはライゲーションされ得る末端）を有するバイサルファイト変換DNA断片（例えば、元は非メチル化シトシン残基の代わりにウラシル残基を有する）へライゲーション可能であるように構成され得る。次いで、一本鎖ライゲーションアダプターを有するアダプター連結断片は、後続の増幅（操作425において）およびメチル化プロファイリング（操作430において）へ供され得る。
【０１０７】
いくつかの態様において、末端修飾された（例えば、末端標識された、例えば、ビオチン標識された）セルフリーDNA分子および断片は、（例えば、MspIによる）制限酵素消化後にライブラリー調製において（例えば、ストレプトアビジン磁気ビーズによって）除去または分離される。例えば、図5は、ストレプトアビジン磁気ビーズによる除去を伴ってセルフリーRRBS(cfRRBS)を使用するcfDNAのメチル化プロファイリングを図示する。cfDNA分子は、片末端または両末端の修飾（操作505において）およびMspI（または他の制限酵素）消化（操作510において）へ供され得る。末端修飾されそしてMspI消化された断片、および末端修飾されたがMspI消化されなかったセルフリーDNA分子は、磁気除去（例えば、ストレプトアビジン磁気ビーズによる）を使用して除去することができる。残りの断片は、続いて、末端修復および／またはdAテーリングならびにアダプターライゲーション（操作520において）、バイサルファイト変換（操作525において）、増幅（操作530において）、ならびにメチル化プロファイリング（操作535において）へ供され得る。あるいは、末端修飾された断片のそのような除去は、アダプターライゲーション後に行われ得、その結果、ビオチン-ddNTPの代わりにビオチン-dNTPを使用することができ、この場合、アダプターライゲーションをブロックするための末端修飾は不必要であり得る。
【０１０８】
アダプターは、cfDNA分子のユニーク分子識別子を与える1つまたは複数のバーコードを含み得る。そのような場合において、1つまたは複数のバーコードを有するアダプターは、平滑末端、ステムループ型、またはフォーク形状（Y形状）アダプターであり得る。ステムループ型アダプターが分子バーコード無しで利用される場合、アダプターは、アダプターの集合内でユニークでない共通配列を有する。フォーク形状アダプターが分子バーコード無しで利用される場合、アダプターはアダプターの集合内でユニークである共通配列を有する。分子バーコードが利用される場合、それが平滑末端、ステムループ型、またはフォーク形状（Y形状）アダプターであるかどうかにかかわらず、さらに多くのユニーク配列が存在する。具体的な態様において、分子バーコードは、同じおよび異なる配列を有するバーコードの集合である。同じ配列を有するバーコードについて、複数のDNA分子を標識するために妥当な量があるべきである。
【０１０９】
いくつかの態様において、試料バーコードがライブラリー調製のために使用される。一例において、試料インデックス付けは、PCR増幅のための一組の12種類のユニークなインデックス付けプライマー（12種類の試料バーコードを含有する）を使用して行われ得、その結果、異なる試料がインデックス付けまたはバーコード化される場合、異なる試料について異なる試料バーコードを含有する異なるインデックス付けプライマーが使用され得る（例えば、試料#1についてはインデックス/バーコード#5を選ぶ、試料#2についてはインデックス/バーコード#7を選ぶなど）。この様式において、後続のシーケンシング用の試料を考慮する場合、異なる試料が、多重シーケンシングを行うために一緒にプールされ得、それによってコストおよび時間の節約を達成する。しかし、試料バーコードにより、シーケンシングリードを使用して、どのリードがどの試料に由来するかを表示および区別することができる。
【０１１０】
ステムループ型アダプターが使用される場合、バーコードは、アダプター配列ではなく（ライブラリーのPCR増幅用の）インデックス付けプライマーにおいて設計され得る。そのような場合において、アダプター配列は共通配列を含み得る。フォーク形状（Y形状）アダプターが使用される場合、バーコードはアダプター配列において設計され得、（ライブラリーのPCR増幅用の）プライマー配列は共通配列を含み得る。
【０１１１】
図6Aは、切断型Y形状アダプターの一例を図示し、図6Bは、末端にバーコードを有する切断型Y形状アダプターの一例を図示し、図6Cは、末端にバーコードと酵素消化によって残された核酸塩基とを有する切断型Y形状アダプターの一例を図示する。図6Bに示されるように、Y形状アダプターは、「NN…N」ランダム核酸塩基（例えば、「A」、「T」、「C」、または「G」）のストリングによって示されるようなバーコードをそれらの二本鎖末端に有し得、その結果、二本鎖末端は、バーコードを有さないY形状アダプター（図6A）と比較した場合、（例えば、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約50、または約50超の核酸塩基だけ）長さが延長されている。図6Cに示されるように、Y形状アダプターは、末端にバーコードと酵素消化によって残された核酸塩基とを有し得、その結果、二本鎖末端は、バーコードを有さないY形状アダプター（図6A）、ならびにバーコードを有するが酵素消化部位を有さないY形状アダプター（図6B）、バーコードと酵素消化によって残された核酸塩基とを有するY形状アダプター（図6C）と比較した場合、（例えば、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、または約10核酸塩基だけ）長さが延長されている。
【０１１２】
図7Aは、ステムループアダプターの一例を図示し、図7Bは、末端にバーコードを有するステムループアダプターの一例を図示し、図7Cは、末端にバーコードと酵素消化によって残された核酸塩基とを有するステムループアダプターの一例を図示する。図7Bに示されるように、ステムループアダプターは、「NN…N」ランダム核酸塩基（例えば、「A」、「T」、「C」、または「G」）のストリングによって示されるようなバーコードをそれらの二本鎖末端に有し得、その結果、二本鎖末端は、バーコードを有さないステムループアダプター（図7A）と比較した場合、（例えば、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約50、または約50超の核酸塩基だけ）長さが延長されている。図7Cに示されるように、ステムループアダプターは、末端にバーコードと酵素消化によって残された核酸塩基とを有し得、その結果、二本鎖末端は、バーコードを有さないステムループアダプター（図7A）およびバーコードを有するが酵素消化によって残された核酸塩基を有さないステムループアダプター（図7B）と比較した場合、（例えば、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、または約10核酸塩基だけ）長さが延長されている。酵素消化によって残された核酸塩基（図7C）は、例えば制限酵素によって、消化された後に残存する酵素消化部位の一部である。
【０１１３】
図8A〜8Dは、種々の一本鎖ライゲーションアダプターの例を図示する。一本鎖ライゲーションアダプターは、「NN…N」ランダム核酸塩基（例えば、「A」、「T」、「C」、または「G」）のストリングによって示されるような延長部分をそれらの二本鎖末端に有し得、その結果、二本鎖末端は、（例えば、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約50、または約50超の核酸塩基だけ）長さが延長されている。
【０１１４】
図9は、RRBSアッセイからの生成物のゲル電気泳動とcfRRBSアッセイからのものとの比較を図示する。インプットDNA分子は3つの異なる領域：65 bpの長さを有する「A」領域、242 bpの長さを有する「B」領域、および66 bpの長さを有する「C」領域を含み、MspI制限酵素認識部位（「切断部位」）が、「A」および「B」領域の間ならびに「B」および「C」領域の境界に位置し、同じインプットDNA分子を、2つの異なるアッセイ：典型的なRRBSアッセイ（操作905において）および本開示のcfRRBSアッセイ（操作910において）を使用して処理すると仮定する。
【０１１５】
典型的なRRBSアッセイにおいて（操作905において）、MspI制限酵素は、2つのMspI制限酵素認識部位でインプットDNA分子を消化し、それによってインプットDNA分子から領域「A」および領域「B」の両方を断片化し、3つの分離した「A」、「B」、および「C」断片を生成する。これらの3つの断片の各々は、両末端において60-bpアダプターへライゲーションされ、それによって、185 bpの長さを有するアダプター連結「A」断片、362 bpの長さを有するアダプター連結「B」断片、および186 bpの長さを有するアダプター連結「C」断片が生成される。この結果はインプットcfDNA分子について望ましくない場合があり、何故ならば、3つのアダプター連結断片は全て、効率的に増幅されると予測され得、一方、「B」断片のみが、濃縮されることが望まれるCpGリッチ領域を含有するためである。
【０１１６】
本開示のcfRRBSアッセイにおいて（操作910において）、インプットDNA分子は、先ず、「A」領域および「C」領域の各々の片末端（露出した末端）がアダプターへカップリングまたはライゲーション不能となるように修飾される。次に、MspI制限酵素は、2つのMspI制限酵素認識部位でインプットDNA分子を消化し、それによってインプットDNA分子から領域「A」および領域「B」の両方を断片化し、3つの分離した「A」、「B」、および「C」断片を生成する（典型的なRRBSアッセイと同様）。しかし、この場合、「B」断片のみが両末端においてアダプターにライゲーションされることができ、一方、「A」および「B」断片は両末端においてアダプターにライゲーションされることができない。従って、cfRRBSアッセイは、362 bpの長さを有するアダプター連結「B」断片のみを生成する。この結果はインプットcfDNA分子について望ましく、何故ならば、濃縮されることが望まれるCpGリッチ領域を含有する「B」断片のみが、効率的に増幅されると予測され得るためである。
【０１１７】
操作915において、ゲル電気泳動が、典型的なRRBSアッセイからの生成物およびcfRRBSアッセイからの生成物の両方に対して行われる。図9に示されるように、典型的なRRBSアッセイおよびcfRRBSアッセイは両方とも、360-bp範囲内の所望の生成物を生成する。しかし、典型的なRRBSアッセイは200-bp範囲内の偽生成物を生成し、一方、cfRRBSアッセイは、120-bp範囲内のアダプター二量体（これらは、望まれない後続の増幅または他の解析を回避するために効率的にサイズ選択され得る）以外の偽生成物を生成しない。従って、このような原理証明アッセイは、cfDNAメチル化プロファイリングへ向けてCpGリッチ領域cfDNAを濃縮するために本開示のcfRRBSアッセイを行う利点を実証する。
【０１１８】
III．CpGリッチ領域を有する濃縮DNAのメチル化プロファイリング
cfDNA分子の試料がCpGリッチ領域について濃縮された後、メチル化プロファイリングが、濃縮DNA分子に対して行われ得る。例えば、シーケンシングリードは、任意の好適なシーケンシング法を使用して濃縮DNA分子から作成され得る。シーケンシング法は、第一世代シーケンシング法、例えば、Maxam-GilbertもしくはSangerシーケンシング、またはハイスループットシーケンシング（例えば、次世代シーケンシングもしくはNGS）法であり得る。ハイスループットシーケンシング法は、少なくとも10,000、100,000、100万、1000万、1億、10億、またはそれ以上のポリヌクレオチド分子を同時に（または実質的に同時に）配列決定し得る。シーケンシング法としては、パイロシーケンシング、シーケンシング・バイ・シンセシス、単一分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、半導体シーケンシング、シーケンシング・バイ・ライゲーション、シーケンシング・バイ・ハイブリダイゼーション、Digital Gene Expression (Helicos)、超並列シーケンシング、例えばHelicos、Clonal Single Molecule Array (Solexa/Illumina)、PacBio、SOLiD、Ion Torrent、またはNanoporeプラットフォーム、BGISEQを使用するシーケンシング、またはその組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１１９】
いくつかの態様において、シーケンシングは、全ゲノムシーケンシング(WGS)を含む。いくつかの態様において、シーケンシングは、例えば参照DNA試料の、全ゲノムバイサルファイトシーケンシング(WGBS)を含む。いくつかの態様において、シーケンシングは、複数の遺伝子座を含有するパネルを使用する標的シーケンシングを含む。シーケンシングは、所望のパフォーマンス（例えば、正確度、感度、特異度、陽性反応予測値(PPV)、陰性反応予測値(NPV)、または受信者操作特性(ROC)の曲線下面積(AUC)）で対象におけるメチル化プロファイリングを行うために十分な深さで行われ得る。いくつかの態様において、シーケンシングは、少なくとも約5X、少なくとも約10X、少なくとも約20X、少なくとも約50X、少なくとも約75X、少なくとも約100X、少なくとも約125X、少なくとも約150X、少なくとも約175X、または少なくとも約200Xの深さで行われる。
【０１２０】
いくつかの態様において、複数の遺伝子座は、CpG島、高メチル化領域および／もしくは低メチル化領域、ならびに／または、そのような高メチル化領域および／もしくは低メチル化領域に隣接する領域のような、ゲノムのコードおよび／または非コードゲノム領域に対応し得る。ゲノム領域は、がんドライバー突然変異または遺伝的バリアントのような、ゲノムのがん関連（または腫瘍関連）コードおよび／または非コードゲノム領域に対応し得る。遺伝的バリアントは、例えば、一塩基バリアント(SNV)、コピー数バリアント(CNV)、挿入または欠失(indel)、融合遺伝子、高メチル化、および低メチル化を含み得る。
【０１２１】
いくつかの態様において、対象のメチル化プロファイリングを行うことは、参照ゲノムへcfDNAシーケンシングリードを整列させることを含み得る。参照ゲノムは、ゲノム（例えば、ヒトゲノム）の少なくとも一部分を含み得る。参照ゲノムは、全ゲノム（例えば、全ヒトゲノム）を含み得る。いくつかの態様において、参照ゲノムは、CpGリッチ領域、CpG島、高メチル化領域および／もしくは低メチル化領域、ならびに／または、そのような高メチル化領域および／もしくは低メチル化領域に隣接する領域のような、ゲノムのコードおよび／または非コードゲノム領域に対応する複数のゲノム領域を含み得る。複数のゲノム領域は、がんドライバー突然変異または遺伝的バリアントのような、ゲノムのがん関連（または腫瘍関連）コードおよび／または非コードゲノム領域に対応し得る。遺伝的バリアントは、例えば、一塩基バリアント(SNV)、コピー数バリアント(CNV)、挿入または欠失(indel)、融合遺伝子、高メチル化、および低メチル化を含み得る。整列は、例えば、Burrows-Wheelerアルゴリズムまたは他のアライメントアルゴリズム（例えば、バイサルファイト変換リードに適しているもの）を使用して行われ得る。
【０１２２】
いくつかの態様において、対象中においてメチル化プロファイリングを行うことは、複数の遺伝子座の各々についてのcfDNAシーケンシングリードの定量的尺度を与えることを含む。所与の遺伝子座（例えば、CpGリッチ領域、CpG島、高メチル化領域、低メチル化領域、高メチル化領域に隣接する領域、または低メチル化領域に隣接する領域）と整列させるDNAシーケンシングリードのカウントのような、cfDNAシーケンシングリードの定量的尺度を与え得る。例えば、所与のCpGリッチ領域またはCpG島と整列するシーケンシングリードの一部分または全部を有するcfDNAシーケンシングリードは、そのCpGリッチ領域またはCpG島についての定量的尺度へ向けてカウントされ得る。
【０１２３】
特異的および非特異的CpGリッチ領域および／またはCpG島のパターンの組み合わせは、対象のメチル化プロファイルを形成し得る。CpGリッチ領域および／またはCpG島のこれらのパターンの経時的変化は、対象のメチル化プロファイルの変化を示し得る。そのような変化は、1つまたは複数の特定のCpG部位のメチル化の非存在の存在（presence of absence）、特定のCpGリッチ部位もしくは島のメチル化のレベルの増加、特定のCpGリッチ部位もしくは島のメチル化のレベルの減少などを含み得る。
【０１２４】
いくつかの態様において、結合測定がメチル化プロファイリングについて行われ得、これは、複数の濃縮cfDNA断片中の複数のCpGリッチ領域および／またはCpG島に選択的であるプローブを使用して、濃縮cfDNA断片をアッセイすることを含み得る。いくつかの態様において、プローブは、CpGリッチ領域および／またはCpG島の核酸配列と配列相補性を有する核酸分子である。いくつかの態様において、核酸分子は、プライマーまたは濃縮配列である。いくつかの態様において、アッセイは、アレイハイブリダイゼーションもしくはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、または核酸シーケンシングの使用を含む。
【０１２５】
いくつかの態様において、cfDNA分子は、複数の遺伝子座の少なくとも一部分について濃縮される。いくつかの態様において、濃縮は、複数のcfDNA分子を増幅することを含む。例えば、複数のcfDNA分子は、選択的増幅によって（例えば、CpG島の核酸配列と配列相補性を有する核酸分子を含む一組のプライマーまたはプローブを使用することによって）増幅され得る。その代わりにまたは組み合わせて、複数のcfDNA分子は、ユニバーサル増幅によって（例えば、ユニバーサルプライマーを使用することによって）増幅され得る。いくつかの態様において、濃縮は、複数のcfDNA分子の少なくとも一部分を選択的に単離することを含む。
【０１２６】
いくつかの態様において、対象中においてメチル化プロファイリングを行うことは、偏差の定量的尺度を得るために濃縮cfDNA断片の配列リードを処理することを含む。いくつかの態様において、偏差の定量的尺度は、1つまたは複数の参照cfDNA試料に対するzスコアである。参照cfDNA試料は、特定のメチル化プロファイルを有する対象からおよび／または特定のメチル化プロファイルを有しない対象から得られ得る。参照cfDNA試料は、がんタイプ（例えば、膵臓がん、肝臓がん、肺がん、結腸直腸がん、白血病、膀胱がん、骨がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、頭頸部がん、黒色腫、卵巣がん、精巣がん、腎臓がん、肉腫、胆管がん、甲状腺がん、胆嚢がん、脾臓がん、および前立腺がん）を有する対象からまたはがんタイプを有しない対象から得られ得る。参照cfDNA試料は、がんの特定のステージ（ステージI、ステージII、ステージIII、もしくはステージIVを含む）を有するかまたはがんの特定のステージを有しない対象から得られ得る。参照cfDNA試料は、異常な組織特異的細胞死を有する対象から得られ得る。
【０１２７】
いくつかの態様において、対象中においてメチル化プロファイリングを行うことは、偏差の定量的尺度が所定の基準を満たす場合、対象の逸脱したcfDNAメチル化プロファイルを決定することを含む。いくつかの態様において、所定の基準は、対象のメチル化プロファイルのzスコア（または複数のzスコアから計算される定量的尺度）が所定の数より多いまたは所定の数より少ないことである。所定の数は、約0.1、約0.2、約0.5、約1、約1.5、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、または約5超であり得る。
【０１２８】
いくつかの態様において、複数の遺伝子座は、CpGリッチ領域、CpG島、高メチル化領域および／もしくは低メチル化領域、ならびに／または、そのような高メチル化領域および／もしくは低メチル化領域に隣接する領域を含む。複数の遺伝子座は、少なくとも約10個の異なる遺伝子座、少なくとも約20個の異なる遺伝子座、少なくとも約30個の異なる遺伝子座、少なくとも約40個の異なる遺伝子座、少なくとも約50個の異なる遺伝子座、少なくとも約75個の異なる遺伝子座、少なくとも約100個の異なる遺伝子座、少なくとも約500個の異なる遺伝子座、少なくとも約1000個の異なる遺伝子座、少なくとも約5000個の異なる遺伝子座、少なくとも約10000個の異なる遺伝子座、少なくとも約50000個の異なる遺伝子座、少なくとも約100000個の異なる遺伝子座、少なくとも約500000個の異なる遺伝子座、少なくとも約100万個の異なる遺伝子座、少なくとも約200万個の異なる遺伝子座、少なくとも約300万個の異なる遺伝子座、少なくとも約400万個の異なる遺伝子座、少なくとも約500万個の異なる遺伝子座、少なくとも約1000万個の異なる遺伝子座、少なくとも約2500万個の異なる遺伝子座、少なくとも約5000万個の異なる遺伝子座、少なくとも約7500万個の異なる遺伝子座、少なくとも約1億個の異なる遺伝子座、または1億個を超える異なる遺伝子座を含み得る。異なる遺伝子座の場所は、同じ遺伝子中、同じ染色体上、または異なる染色体上であってもなくてもよい。
【０１２９】
いくつかの態様において、対象の逸脱したcfDNAメチル化プロファイルの決定は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の感度で行われる。
【０１３０】
いくつかの態様において、対象の逸脱したcfDNAメチル化プロファイルの決定は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の特異度で行われる。
【０１３１】
いくつかの態様において、対象の逸脱したcfDNAメチル化プロファイルの決定は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の陽性反応予測値(PPV)で行われる。
【０１３２】
いくつかの態様において、対象の逸脱したcfDNAメチル化プロファイルの決定は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の陰性反応予測値(NPV)で行われる。
【０１３３】
いくつかの態様において、対象の逸脱したcfDNAメチル化プロファイルの決定は、少なくとも約0.5、少なくとも約0.6、少なくとも約0.7、少なくとも約0.75、少なくとも約0.8、少なくとも約0.85、少なくとも約0.9、少なくとも約0.95、少なくとも約0.96、少なくとも約0.97、少なくとも約0.98、または少なくとも約0.99の受信者操作特性(ROC)の曲線下面積(AUC)で行われる。
【０１３４】
いくつかの態様において、対象中においてメチル化プロファイリングを行うことは、偏差の定量的尺度が所定の基準を満たす場合、対象の正常なcfDNAメチル化プロファイルを決定することを含む。いくつかの態様において、所定の基準は、対象のメチル化プロファイルのzスコア（または複数のzスコアから計算される定量的尺度）が所定の数より多いまたは所定の数より少ないことである。所定の数は、約0.1、約0.2、約0.5、約1、約1.5、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、または約5超であり得る。
【０１３５】
いくつかの態様において、対象の正常なcfDNAメチル化プロファイルの決定は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の感度で行われる。
【０１３６】
いくつかの態様において、対象の正常なcfDNAメチル化プロファイルの決定は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の特異度で行われる。
【０１３７】
いくつかの態様において、対象の正常なcfDNAメチル化プロファイルの決定は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の陽性反応予測値(PPV)で行われる。
【０１３８】
いくつかの態様において、対象の正常なcfDNAメチル化プロファイルの決定は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の陰性反応予測値(NPV)で行われる。
【０１３９】
いくつかの態様において、対象の正常なcfDNAメチル化プロファイルの決定は、少なくとも約0.5、少なくとも約0.6、少なくとも約0.7、少なくとも約0.75、少なくとも約0.8、少なくとも約0.85、少なくとも約0.9、少なくとも約0.95、少なくとも約0.96、少なくとも約0.97、少なくとも約0.98、または少なくとも約0.99の受信者操作特性(ROC)の曲線下面積(AUC)で行われる。
【０１４０】
いくつかの態様において、対象は、がんと診断されたか、またはがんを有する疑いがあるか、またはがんを有するリスクがある。例えば、がんは、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、肝胆道がん、白血病、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、皮膚がん、精巣がん、腎臓がん、肉腫、胆管がん、前立腺がん、甲状腺がん、胆嚢がん、脾臓がん、または尿路がんを含む、1つまたは複数のタイプであり得る。
【０１４１】
いくつかの態様において、対象の得られたcfDNAメチル化プロファイルに基づいて（例えば、逸脱したcfDNAメチル化プロファイルまたは正常なcfDNAメチル化プロファイルを決定して）、本開示の方法は、対象の疾患または障害（例えば、がん）を処置するために治療有効用量の1つまたは複数の処置を施す工程を含む。いくつかの態様において、処置は、化学療法、放射線療法、標的療法、免疫療法、またはその組み合わせを含む。対象の得られたメチル化プロファイルに基づいて、対象の既存の処置は中止され得、かつ、別の処置が対象へ施され得る。あるいは、対象の得られたメチル化プロファイルに基づいて、対象の既存の処置は継続され得、かつ／または、別の処置が対象へ施され得る。個体は、メチル化プロファイルのアウトカムに基づいて1つまたは複数の処置に対して難治性と見なされ得、結果として、処置は、決して与えられず、または、与えられるが、同じ個体についての後のメチル化プロファイルのアウトカムに基づいて中止されるか、または一定の数の用量および／もしくは期間が経過した後に中止される。
【０１４２】
対象の得られたcfDNAメチル化プロファイルは、がんの診断、がんの予後、または対象中の腫瘍の進行もしくは退縮の表示を決定するために評価され得る。加えて、1つまたは複数の臨床転帰が、cfDNAメチル化プロファイル評価またはモニタリング（例えば、2つ以上の時点間のcfDNAメチル化プロファイルの差）に基づいて割り当てられ得る。そのような臨床転帰は以下のうちの1つまたは複数を含み得る：1つまたは複数のタイプの腫瘍を含むがんと対象を診断すること、1つまたは複数のタイプおよび／もしくはステージの腫瘍を含むがんと対象を診断すること、がんを有する対象の予後予測を行うこと（例えば、対象について処置（例えば、手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、標的療法  免疫療法、もしくは他の処置）の臨床過程を表示、処方、または施すこと、対象について行為（例えば、処置無し、モニタリングを継続すること（例えば規定された時間間隔に基づく）、現在の処置を停止すること、別の処置に切り替えること）の別の臨床過程を表示、処方、または施すこと、あるいは対象について予想される生存期間を示すこと。
【０１４３】
いくつかの態様において、対象についてのcfDNAメチル化プロファイルを決定することは、1つまたは複数の遺伝子座（例えば、複数のCpGリッチ領域および／またはCpG島）について1つまたは複数の所定の閾値を決定することを含む。所定の閾値（例えば、複数のCpGリッチ領域および／またはCpG島の各々についてのもの）は、1つまたは複数の対照対象（例えば、ある疾患もしくは障害を有するもしくは有しないことが既知の患者、ある腫瘍タイプを有するもしくは有しないことが既知の患者、あるステージのある腫瘍タイプを有するもしくは有しないことが既知の患者、または、疾患もしくは障害の臨床症状を有するもしくは示すと診断されない健康な対象）由来の1つまたは複数の試料に対してcfDNAメチル化プロファイリングを行い、そして対照試料のcfDNAメチル化プロファイルに基づいて適切な所定の閾値を特定することによって生じさせてもよい。
【０１４４】
所定の閾値は、対象の逸脱したcfDNAメチル化プロファイルの決定または正常なcfDNAメチル化プロファイルの決定の、所望の感度、特異度、陽性反応予測値(PPV)、陰性反応予測値(NPV)、または正確度に基づいて、調節され得る。例えば、所定の閾値は、対象の逸脱したcfDNAメチル化プロファイル状態を決定する高感度が望まれる場合、より低く調節され得る。あるいは、所定の閾値は、対象の逸脱したcfDNAメチル化プロファイルを決定する高特異度が望まれる場合、より高く調節され得る。所定の閾値は、対照対象から得られた対象試料の、受信者操作特性(ROC)の曲線下面積(AUC)を最大化するように調節され得る。所定の閾値は、対象の逸脱したcfDNAメチル化プロファイルの決定において偽陽性(FP)と偽陰性(FN)との所望のバランスを達成するように調節され得る。
【０１４５】
いくつかの態様において、対象のcfDNAメチル化プロファイルを決定することは、第2の後の時点でcfDNAメチル化プロファイリングを繰り返すことをさらに含む。第2の時点は、第1の時点に対してのcfDNAメチル化プロファイルの適切な比較のために選ばれ得る。第2の時点の例は、外科的切除後の時点、処置の効率をモニタリングするために対象における疾患もしくは障害（例えば、がん）を処置するための処置施与中もしくは処置施与後の時点、または、例えば対象における残存疾患もしくはがんの再発についてモニタリングするために、疾患もしくは障害（例えば、がん）が処置後に対象において検出不可能となった後の時点、に対応し得る。
【０１４６】
いくつかの態様において、対象のcfDNAメチル化プロファイルを決定することは、第1のcfDNAメチル化プロファイルと第2のcfDNAメチル化プロファイルとの差を決定することをさらに含み、この差は対象の腫瘍の進行もしくは退縮を示す。その代わりにまたは組み合わせて、方法は、第1の時点および第2の時点の関数としての第1のcfDNAメチル化プロファイルおよび第2のcfDNAメチル化プロファイルのプロットをコンピュータプロセッサによって作成することをさらに含み得る。プロットは対象の腫瘍の進行もしくは退縮を示し得る。例えば、コンピュータプロセッサは、x軸上の、2つ以上のcfDNAメチル化プロファイルに対応するデータについての収集時に対応する時間に対する、y軸上の2つ以上のcfDNAメチル化プロファイルのプロットを作成し得る。
【０１４７】
第1のcfDNAメチル化プロファイルと第2のcfDNAメチル化プロファイルとの、決定された差、または差を示すプロットは、対象の腫瘍の進行もしくは退縮を示し得る。例えば、第2のcfDNAメチル化プロファイルの偏差が第1のcfDNAメチル化プロファイルの偏差よりも大きい場合、その差は、例えば、腫瘍進行、対象中の腫瘍に対する処置の無効力、継続中の処置に対する腫瘍の抵抗性、対象中の他の部位への腫瘍の転移、または対象中の残存疾患もしくはがんの再発を示し得る。あるいは、第2のcfDNAメチル化プロファイルの偏差が第1のcfDNAメチル化プロファイルの偏差よりも小さい場合、その差は、例えば、腫瘍退縮、対象中の腫瘍の外科的切除の有効性、対象中の疾患もしくは障害（例えば、がん）に対する処置の有効性、または対象中の残存疾患もしくはがんの再発の欠如を示し得る。
【０１４８】
cfDNAメチル化プロファイルの評価および／またはモニタリング後、1つまたは複数の臨床転帰が、cfDNAメチル化プロファイル評価またはモニタリング（例えば、2つ以上の時点間のcfDNAメチル化プロファイルの差）に基づいて割り当てられ得る。そのような臨床転帰は以下のうちの1つまたは複数を含み得る：1つまたは複数のタイプの腫瘍を含むがんと対象を診断すること、1つまたは複数のタイプおよび／もしくはステージの腫瘍を含むがんと対象を診断すること、がんを有する対象の予後予測を行うこと（例えば、対象について処置（例えば、手術、化学療法、放射線療法、標的療法  免疫療法、もしくは他の処置）の臨床過程を表示、処方、または施すこと、対象について行為（例えば、処置無し、モニタリングを継続すること（例えば規定された時間間隔に基づく）、現在の処置を停止すること、別の処置に切り替えること）の別の臨床過程を表示、処方、または施すこと、あるいは対象について予想される生存期間を示すこと。
【０１４９】
IV．CpGリッチ領域を有する濃縮DNAについての適用
特定の態様において、cfDNA中のCpGリッチ領域またはCpG島について濃縮するために本明細書に包含される方法またはシステムを使用して生成されたライブラリーは、適用のために利用される。ある局面において、ライブラリーは、1つまたは複数の特徴についてアッセイされる。ライブラリーは、ライブラリーの分子の一部または全部中のメチル化部位の量および／または場所を決定するためにアッセイされ得る。具体的な態様において、メチル化パターンが、1つまたは複数の特定の部位を含む、ライブラリーの分子の一部または全部中の少なくとも一部分について決定される。メチル化プロファイリングが、ライブラリーの分子の一部または全部のうちの少なくとも一部分について行われ得る。
【０１５０】
いくつかの態様において、1つまたは複数のメチル化部位またはマーカーは、がんを含む様々な特定の疾患または障害についての血漿メチル化バイオマーカーを含み得る。差次的にメチル化されたマーカー遺伝子は、ある疾患もしくは障害の特徴（がんのタイプ、ステージ、予後、処置応答など）を有する患者由来のメチル化プロファイルデータを健康な対照由来のメチル化プロファイルデータと比較することによって、同定され得る。同定される異なるがんに特異的な様々なメチル化プロファイルを用いて、本明細書に開示される態様は、簡単な非侵襲性の液体生検に基づいて、多くのタイプのがんを検出することができ、さらに具体的な臨床的検討のために腫瘍場所情報を提供することができる。メチル化プロファイルは、例えば、非侵襲性液体生検に基づいて、任意の疾患または障害を検出するために使用することができる。
【０１５１】
いくつかの場合において、cfDNAメチル化プロファイルは、対象が、疾患または障害を示すcfDNAメチル化プロファイルを有するかどうかの決定に基づいて、対象または患者を診断するために使用され得る。ある態様において、cfDNAメチル化プロファイルに基づいて対象を診断する方法は、患者ががんを有するかどうか、がんを示すcfDNAメチル化プロファイルを作成する工程を含む。ある態様において、cfDNAメチル化プロファイルは、本明細書に包含される方法、組成物、およびシステムを使用して、セルフリーDNAを含む患者由来の生体試料を処理することによって作成される。
【０１５２】
いくつかの態様において、cfDNAメチル化プロファイルは、がんの症状を有するか、がんについて無症候性であるか、がんの家族歴もしくは患者病歴を有するか、がんについてリスクがあるか、またはがんと診断されたことがある、患者を診断するために使用することができる。患者は哺乳動物患者であり得るが、ほとんどの態様において、患者はヒトである。がんは、悪性、良性、転移性、または前がんであり得る。なおさらなる態様において、がんは、黒色腫、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺がん、肝細胞がん、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、膠芽腫、歯肉がん、舌がん、白血病、神経芽細胞腫、頭部がん、頸部がん、乳がん、膵臓がん、前立腺がん、腎がん、骨がん、精巣がん、卵巣がん、肝臓がん、中皮腫、子宮頸がん、胃腸がん、リンパ腫、脳がん、結腸がん、肉腫、胆嚢がん  甲状腺がん、脾臓がん、または膀胱がんである。がんは、腫瘍細胞から構成される腫瘍を含み得る。
【０１５３】
いくつかの態様において、がん診断のためにCpG島含有またはCpGリッチDNAを濃縮する本明細書における方法およびシステムに基づいてその必要の決定後にがん患者におけるがんを処置するための方法がある。そのような処置方法は、本明細書に開示される方法に基づいて患者ががんを有すると決定された後、有効量の化学療法、放射線療法、ホルモン療法、標的療法、もしくは免疫療法（またはその組み合わせ）を患者へ施す工程を含み得る。がんの発生源が決定され得、この場合、処置は、その起源のがんに対して調整される。いくつかの態様において、腫瘍切除は、処置として行われ、または他の処置の1つと共の処置の一部であり得る。化学療法薬の例としては、アルキル化剤、例えば、二官能性アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン）または単官能性アルキル化剤（例えば、ダカルバジン(DTIC)、ニトロソ尿素類、テモゾロミド（経口ダカルバジン））；アントラサイクリン類（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、およびバルルビシン；細胞骨格を破壊する、タキサン類（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン、タキソテール）；エポチロン類；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えば、ボリノスタット、ロミデプシン）；トポイソメラーゼI阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン）；トポイソメラーゼII阻害剤（例えば、エトポシド、テニポシド、タフルポシド（tafluposide））；キナーゼ阻害剤（例えば、ボルテゾミブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ベムラフェニブ、およびビスモデギブ）；ヌクレオチド類似体およびヌクレオチド前駆体類似体（例えば、アザシチジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メルカプトプリン、メトトレキサート、チオグアニン（tioguanine）（以前はチオグアニン（thioguanine））；ペプチド抗生物質（例えば、ブレオマイシン、アクチノマイシン）；白金系抗新生物薬（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）；レチノイド類（例えば、レチノイン（retinoin）、アリトレチノイン、ベキサロテン）；ならびに、ビンカアルカロイド類（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン）が挙げられるが、これらに限定されない。免疫療法の例としては、細胞療法、例えば樹状細胞療法（例えば、キメラ抗原受容体を伴う）；抗体療法（例えば、アレムツズマブ、アテゾリズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、ペンブロリズマブ、リツキシマブ、またはこれらの抗体のうちの1つと同じ標的を有する他の抗体、例えば、CTLA-4、PD-1、PD-L1、もしくは他のチェックポイント阻害剤）；ならびに、サイトカイン療法（例えば、インターフェロンまたはインターロイキン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５４】
いくつかの態様において、対象を診断するためにcfDNAメチル化プロファイリングを使用する方法は、生検を行うこと、CATスキャンを行うこと、マンモグラムを行うこと、超音波検査を行うこと、または、患者のメチル化プロファイルを決定する前もしくは後にがん性である疑いがある組織を他の方法で評価することをさらに伴い得る。いくつかの態様において、見つけられたがんは、がん分類または病期分類（例えば、ステージI、ステージII、ステージIII、もしくはステージIV）において分類される。
【０１５５】
特定の態様において、cfDNA中のCpG島を濃縮する方法およびシステムによって得られるcfDNAメチル化プロファイルは、処置中および／または処置後を含む、療法のモニタリングおよび／または腫瘍進行のモニタリングのために利用される。例えば、採血が、1つまたは複数の処置レジメンの全体にわたって腫瘍進行をモニタリングするために様々な時点で行われ得、そこからのcfDNAがアッセイされ得る。
【０１５６】
ある態様において、本開示の方法およびシステムによって得られるcfDNAメチル化プロファイルは、例えば、組織生検が可能でないかまたはアーカイブに保管された腫瘍試料が遺伝子解析のために利用可能でない場合、病期の評価のためにまたは予後バイオマーカーとして利用され得る。
【０１５７】
いくつかの態様において、本明細書に提供されるcfDNA中のCpGリッチ領域を濃縮する方法およびシステムによって得られるcfDNAメチル化プロファイルは、がんのスクリーニングおよび早期発見のために使用され得る。例えば、採血が、がんを早期発見するためにまたはがんに対する素因を確認するためにがんのいかなる症状も有さない個体から定期的に行われ得る。
【０１５８】
いくつかの態様において、本明細書に提供されるcfDNA中のCpGリッチ領域を濃縮する方法およびシステムによって得られるcfDNAメチル化プロファイルは、ダウン症候群および胎児中の他の染色体異常の同定についての母体血漿または血清からの胎児DNAの出生前検査のために使用され得る。
【０１５９】
いくつかの態様において、本明細書に提供されるcfDNA中のCpGリッチ領域を濃縮する方法およびシステムによって得られるcfDNAメチル化プロファイルは、多発性硬化症、外傷性／虚血性脳損傷、糖尿病、膵炎、またはアルツハイマー病のような、他のタイプの疾患の診断のために使用され得る。
【０１６０】
本明細書において議論される任意の態様が、本発明の任意の方法、システム、キット、コンピュータ可読媒体、または装置に関して実施され得、逆もまた同様であることが意図される。さらに、本発明の装置は、本発明の方法を達成するために使用することができる。
【０１６１】
V．本開示のキット
本明細書に記載される組成物のいずれもキット中に含まれ得る。非限定的な例において、cfDNAおよび／またはcfDNAの収集のための1つもしくは複数の装置、酵素、プライマー、ddNTP、アダプター、dNTP、1つもしくは複数のブロッキング剤、バイサルファイト変換試薬、緩衝液、他の化学物質（ATP、DTTなどを含む）、またはそれらの任意の組み合わせが、キット中に含まれ得る。
【０１６２】
キットのコンポーネントは、水性媒体中にまたは凍結乾燥形態でパッケージされ得る。キットは容器を含み得、容器は、コンポーネントが置かれ、いくつかの場合において、適切に小分けされている場合がある、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器、または他の容器を一般に含み得る。キット中に複数のコンポーネントが存在する場合、キットはまた、さらなるコンポーネントが別々に配置され得る第2の、第3の、および／または他のさらなる容器を一般に含有する。しかし、コンポーネントの様々な組み合わせがバイアル中に含まれ得る。本開示のキットは、キットコンポーネントが商業用の閉じた囲い中に含有されることを可能にし得る。そのような容器は、所望のバイアルが保持される射出またはブロー成形プラスチック容器を含み得る。
【０１６３】
本開示のキットは、複数のセルフリーデオキシリボ核酸(DNA)分子を解析するための方法のような、本明細書に提供される方法を行うための説明書を含み得る。そのような説明書は、物理的形態（例えば、印刷された説明書）または電子的形態（例えば、ユーザーインターフェース上での表示用の説明書についてのウェブインク）であり得る。
【実施例】
【０１６４】
VI．実施例
以下の実施例は、本開示のある態様をより完全に説明するために提示される。しかし、以下の実施例は、本開示の広い範囲を限定するものとして、決して解釈されるべきではない。
【０１６５】
実施例1：リデューストリプリゼンテーションバイサルファイトシーケンシングを使用するセルフリーDNAの処理(cfRRBS)
がん細胞は異常なDNAメチル化パターンを示し得る。高メチル化および／または低メチル化腫瘍DNA断片は、細胞アポトーシスまたは壊死のようなプロセスを介して血流中へ放出され得、ここで、それらは、血漿または尿のような体液中の循環セルフリーDNA(cfDNA)の一部となり得る。そのようなcfDNAは、がんスクリーニングのような臨床診断適用のためにメチル化プロファイリングへ供され得る。例えば、全ゲノムバイサルファイトシーケンシングはDNAメチロームの包括的な視点を提供するが、全ゲノムをディープシーケンシングするのは高価であり得る。ゲノムDNAから生成されて典型的なRRBSライブラリー中に存在する断片のほとんどは、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、MspI）によって2回切断されている可能性があるが、これはセルフリーDNAについては当てはまらない可能性がある。従って、セルフリーDNAに対して典型的なRRBSを行うことは、限定的なCpG濃縮に起因して、難題をもたらし得る。CpGリッチ領域についてセルフリーDNA分子を濃縮することは、有利なことに、臨床診断適用へ向けてのメチル化プロファイリングを可能にし得る。
【０１６６】
cfRRBS法は以下の実施例ワークフローによって説明され得る。
【０１６７】
先ず、10 ngのインプットセルフリーDNA(cfDNA)を、対象から得られた血漿から抽出した。次に、インプットcfDNA分子を脱リン酸化し、ジデオキシヌクレオチド(ddNTP)部分（標識）で修飾した。次に、修飾されたcfDNA分子を、一晩、10 UのMspI制限酵素によって次いで消化し、DNA断片が生成された。次に、DNA断片を、5 Uのクレノウ断片exo-ならびに1ミリモル濃度(mM) dATP、0.1 mM dGTP、および0.1 mM dCTPの混合物で、末端修復およびdAテーリングした。dAテーリング化DNAを、次いで、T4 DNAリガーゼによってTruSeq多重化メチル化アダプターとライゲーションした。
【０１６８】
バーコード（例えば、ユニーク分子識別子）が、いくつかの場合において、シーケンシングエラーまたはPCRバイアスの抑制を容易にするために添加され得る。アダプター連結DNA断片を含有するライゲーション混合物を、Agencourt AMPure XPビーズで精製し、次いで、バイサルファイト変換へ供した。次に、バイサルファイト変換されたライブラリーを、20サイクル増幅し、150〜400 bpの範囲についてサイズ選択した。調製されたライブラリーは、必須のメチル化情報を持つ、高度に濃縮されたCpGリッチ領域およびCpG島を含有し、それによって、cfDNAシーケンシング費用を著しく低減させ、がんの早期診断のような適用を容易にする。
【０１６９】
実施例2：セルフリーDNAメチル化プロファイリングのためのリデューストリプリゼンテーションバイサルファイトシーケンシングライブラリーの調製
図2に図示されるように、cfRRBS法の例は、10 ngのインプットcfDNAを仔ウシ腸アルカリホスファターゼ(NEB)で脱リン酸化することによってなど、インプットcfDNA分子を脱リン酸化することから開始し得、次いで、10 Uターミナルトランスフェラーゼ(NEB)によって100ピコモル濃度(pM)ジデオキシヌクレオチド(ddNTP)を用いてなど、cfDNA分子をddNTP部分（例えば、標識されていても標識されていなくてもよい、「A」、「C」、「G」、または「T」）で修飾する。
【０１７０】
次に、10 Uメチル化非感受性制限酵素MspI(NEB)を使用し、断片を37℃で15時間消化した。次に、5 Uのクレノウ断片exo- (NEB)、ならびに1 mM dATP、0.1 mM dGTP、および0.1 mM dCTPの混合物を、30℃で20分間、次いで37℃で20分間、DNAと共にインキュベートすることによって、末端修復およびdA-テーリングのために使用した。dAテーリング化DNAを、次いで、16℃で20時間インキュベートすることによって30 Weiss U T4 DNAリガーゼ(Thermoscientific（登録商標）)により500ナノモル濃度(nM)メチル化ステムループ型アダプターとライゲーションし、次いで、37℃で15分間、USER（商標）酵素(NEB)と共にインキュベートした。次に、アダプター連結DNA断片を含有する、ライゲーション混合物を、Agencourt AMPure XPビーズ(Beckman Coulter)を使用して精製し、2回のバイサルファイト変換を、Epitect Plus Bisulfite Kit (Qiagen)を使用して行った。ライブラリーを、12サイクルについてKAPA HiFi HotStart Uracil+ReadyMix PCR Kitを使用して増幅およびインデックス付けし、次いで、150〜400 bpの範囲についてサイズ選択した。最終ライブラリーはTruSeq（登録商標）DNAと似ており、Illuminaプラットフォームシーケンシングと適合性がある。
【０１７１】
この手順を行うことによって、0または1つのみのMspI認識可能配列を含有するDNA断片は廃棄され、一方、2つ以上のMspI認識可能配列を含有する断片のみが濃縮される。この手順は、各々の濃縮DNA断片が、少なくとも1つのCpG部位を有する配列リードを含有することを保証し、結果として、費用効果の高いシーケンシングを可能にし、診断ツールの幅広い臨床応用を容易にする。
【０１７２】
cfRRBSプロトコルのパフォーマンスを試験するために、既知の配列を有しかつ2つのMspI消化部位を含有する373-bpインプットDNA断片を使用して、研究を行った。RRBSライブラリーを生成するために100 ngインプットDNA試料を使用したが、cfRRBSライブラリーを生成するために10 ngインプットDNA試料を使用した。図9に示されるように、3つの断片（A、B、およびC）全てを濃縮する典型的なRRBSとは異なり、cfRRBSは、両末端に2つのMspI認識可能配列を有する断片Bのみを濃縮すると予想される。
【０１７３】
cfRRBSワークフローの概念実証が、調製されたライブラリーのDNAゲル電気泳動によって示された。図9に示されるように、予想通り、RRBS手順は約360 bp断片および約260 bp断片を両方とも生成したが、cfRRBS手順は約360 bp断片のみを生成した。低いインプットDNA量に起因して、cfRRBSライブラリーにおいて形成された目に見える量の約120 bpアダプター二量体がある。これらのアダプター二量体は、例えば、150〜400 bpの長さを有する断片のゲル切り出しサイズ選択によって、効率的に除去され得る。
【０１７４】
例において、図3に関して：
1．操作305において、DNAの5’末端が、例えば仔ウシ腸アルカリホスファターゼで、脱リン酸化され、DNAの3’末端が、例えばddNTPで、修飾される。この工程の一つの目的は、MspI消化前にDNA分子のいずれの末端へもアダプターライゲーションされるDNA分子の能力を損なうことである。これは、両末端にMspI消化部位を有する断片のみが両末端でアダプターへライゲーションされ得、従って、効率的に増幅され、調製ライブラリーが生成されることを確実にするために、cfRRBSライブラリー調製において有用な工程である。
【０１７５】
2．操作310において、MspI消化がアダプター連結DNA分子に対して行われ、両末端にMspI部位を有するDNA断片（中央ボックス）、ならびに片末端にMspI部位を有する断片（左および右ボックス）が生成される。
【０１７６】
3．操作310において、MspI消化DNA断片がアダプターライゲーションのために調製される。ddNTP標識付加末端はdAテーリング不能であるため、それらの末端は次の工程においてアダプターへライゲーションされることができない。従って、所望の断片が両末端においてdAテーリングされ得、一方、他の断片（増幅されるのが望まれない断片）は、片末端においてのみdAテーリングされ得るか、または両末端においてdAテーリングされることができない。
【０１７７】
4．操作315において、アダプター（例えば、ステムループ型アダプター）が、dAテーリング化DNA断片へライゲーションされる。
【０１７８】
5．操作320において、USER（商標）(Uracil-Specific Excision Reagent; NEB)処理が、ステムループを線形形状に切断することによってステムループを線形化するために、アダプター連結DNA断片に対して行われ、その結果、DNAの2つの鎖は後続のバイサルファイト変換において分離され得る。
【０１７９】
6．操作320において、ステムループの線形化後、非メチル化シトシン(C)残基をウラシル残基(U)へ変換するために、バイサルファイト変換が行われる。
【０１８０】
7．操作325において、両末端にアダプターを有する断片（下部ボックス）のみが、PCRによって効率的に増幅され得る。片末端のみへライゲーションされたアダプターを有する断片の増幅は、非効率的かつごくわずかであると予想される。従って、調製されたcfRRBSライブラリーは、両末端にMspI消化部位を有するcfDNA断片のみを含み、それによって、CpGリッチ領域について濃縮されたDNA断片が生成されると予想される。これらのDNA断片はメチル化プロファイリング（操作330において）の準備ができている。
【０１８１】
VII．コンピュータシステム
本開示は、本開示の方法を実行するようにプログラムされているコンピュータシステムを提供する。図10は、例えば、以下のように、プログラムされているかまたはそうでなければ構成されているコンピュータシステム1001を示す：配列リードを処理し、(i)配列リードの両末端でのアダプターからの配列を同定し、そして(ii)配列を同定すると、セルフリーDNA分子を1つまたは複数のCpG部位を有すると同定する；DNA断片のメチル化状態を測定し、メチル化プロファイルを提供する；参照に対してメチル化プロファイルを処理する；そして、メチル化プロファイルを処理し、疾患もしくは障害を有するまたは有する疑いがあるという対象の尤度を求める。コンピュータシステム1001は、例えば、以下のような、本開示の解析、計算、および作成の様々な局面を調節することができる：配列リードを処理し、(i)配列リードの両末端でのアダプターからの配列を同定し、そして(ii)配列を同定すると、セルフリーDNA分子を1つまたは複数のCpG部位を有すると同定すること；DNA断片のメチル化状態を測定し、メチル化プロファイルを提供すること；参照に対してメチル化プロファイルを処理すること；および、メチル化プロファイルを処理し、疾患もしくは障害を有するまたは有する疑いがあるという対象の尤度を求めること。コンピュータシステム1001は、ユーザーの電子デバイス、または電子デバイスに関して遠隔設置されているコンピュータシステムであり得る。電子デバイスはモバイル電子デバイスであり得る。
【０１８２】
コンピュータシステム1001は、中央処理装置（CPU；本明細書においてまた「プロセッサ」および「コンピュータプロセッサ」）1005を含み、これは、シングルコアもしくはマルチコアプロセッサ、または並列処理のための複数のプロセッサであり得る。コンピュータシステム1001はまた、メモリまたはメモリロケーション1010（例えば、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置1015（例えば、ハードディスク）、1つまたは複数の他のシステムとの通信するための通信インターフェース1020（例えば、ネットワークアダプタ）、ならびに周辺デバイス1025、例えば、キャッシュ、他のメモリ、データ記憶装置および／または電子ディスプレイアダプタを含む。メモリ1010、記憶装置1015、インターフェース1020および周辺デバイス1025は、マザーボードのような、通信バス（実線）を通じてCPU 1005と通信状態にある。記憶装置1015は、データを保存するためのデータ記憶装置（またはデータレポジトリ）であり得る。コンピュータシステム1001は、通信インターフェース1020の助けを借りてコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）1030へ動作可能に接続され得る。ネットワーク1030は、インターネット、イントラネットおよび／もしくはエクストラネット、またはインターネットと通信状態にあるイントラネットおよび／もしくはエクストラネットであり得る。ネットワーク1030は、いくつかの場合において、電気通信および／またはデータのネットワークである。ネットワーク1030は、1つまたは複数のコンピュータサーバーを含むことができ、これはクラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にすることができる。例えば、1つまたは複数のコンピュータサーバーは、ネットワーク1030（「クラウド」）上のクラウドコンピューティングが、例えば、以下のような、本開示の解析、計算、および作成の様々な局面を行うことを可能にし得る：配列リードを処理し、(i)配列リードの両末端でのアダプターからの配列を同定し、そして(ii)配列を同定すると、セルフリーDNA分子を1つまたは複数のCpG部位を有すると同定すること；DNA断片のメチル化状態を測定し、メチル化プロファイルを提供すること；参照に対してメチル化プロファイルを処理すること；および、メチル化プロファイルを処理し、疾患もしくは障害を有するまたは有する疑いがあるという対象の尤度を求めること。そのようなクラウドコンピューティングは、例えば、Amazon Web Services (AWS)、Microsoft Azure、Google Cloud Platform、およびIBMクラウドのような、クラウドコンピューティングプラットフォームによって提供され得る。ネットワーク1030は、いくつかの場合において、コンピュータシステム1001の助けを借りて、ピアツーピアネットワークを実施することができ、これは、コンピュータシステム1001に連結されたデバイスが、クライアントまたはサーバーとして動くことを可能にし得る。
【０１８３】
CPU 1005は、プログラムまたはソフトウェアで具体化され得る一連の機械可読命令を実行することができる。この命令は、メモリ1010などのメモリロケーションに保存され得る。この命令は、CPU 1005に向けることができ、これは後に、本開示の方法を実施するようにCPU 1005をプログラムまたはそうでなければ構成することができる。CPU 1005により行われる操作の例は、フェッチ、デコード、実行、およびライトバックを含み得る。
【０１８４】
CPU 1005は、集積回路などの回路の一部であり得る。システム1001の1つまたは複数の他のコンポーネントを回路に含めることができる。いくつかの場合において、回路は特定用途向け集積回路(ASIC)である。
【０１８５】
記憶装置1015は、ドライバー、ライブラリー、およびセーブされたプログラムなどのファイルを保存することができる。記憶装置1015は、ユーザーデータ、例えばユーザーの嗜好性およびユーザーのプログラムを保存することができる。コンピュータシステム1001は、いくつかの場合において、イントラネットまたはインターネットを通じてコンピュータシステム1001と通信状態にあるリモートサーバー上に位置付けられるなど、コンピュータシステム1001の外側にある1つまたは複数のさらなるデータ記憶装置を含み得る。
【０１８６】
コンピュータシステム1001は、ネットワーク1030を通じて1つまたは複数のリモートコンピュータシステムと通信することができる。例えば、コンピュータシステム1001は、ユーザー（例えば、医師、看護師、介護者、患者、または対象）のリモートコンピュータシステムと通信することができる。リモートコンピュータシステムの例は、パーソナルコンピュータ（例えば、持ち運び可能なPC）、スレートまたはタブレットPC（例えば、Apple（登録商標）iPad、Samsung（登録商標）Galaxy Tab）、電話、スマートフォン（例えば、Apple（登録商標）iPhone、Android対応デバイス、Blackberry（登録商標））、または携帯情報端末を含む。ユーザーは、ネットワーク1030を介してコンピュータシステム1001にアクセスすることができる。
【０１８７】
本明細書に記載されるような方法は、例えばメモリ1010または電子記憶装置1015など、コンピュータシステム1001の電子記憶装置の場所に保存された機械（例えばコンピュータプロセッサ）実行可能コードによって実施することができる。機械実行可能または機械可読コードは、ソフトウェアの形で提供することができる。使用中、コードはプロセッサ1005により実行され得る。いくつかの場合において、コードは、記憶装置1015から検索され、プロセッサ1005による即時のアクセスのためにメモリ1010に保存され得る。いくつかの状況において、電子記憶装置1015は排除することができ、機械実行可能命令はメモリ1010に保存される。
【０１８８】
コードは、コードを実行するのに適したプロセッサを持つ機械との使用のために予めコンパイルされかつ構成することができ、または、実行時間中にコンパイルされ得る。コードは、予めコンパイルされたまたはアズコンパイルされた（as-compiled）様式でコードが実行することを可能にするために選択することができる、プログラミング言語で供給され得る。
【０１８９】
コンピュータシステム1001のような、本明細書に提供されるシステムおよび方法の局面は、プログラミングにおいて具体化され得る。この技術の様々な局面は、典型的に、一種の機械可読媒体において実行されるまたは具体化される機械（またはプロセッサ）実行可能コードおよび／または関連データの形の、「製品」または「製造物品」として考えられ得る。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、リードオンリーメモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスクなどの電子記憶装置に保存することができる。「記憶」型の媒体は、様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどの、コンピュータやプロセッサなどの有形メモリ、あるいはその関連するモジュールの何れかまたは全てを含むことができ、これは、ソフトウェアプログラミングのためにいかなる時も非一時的な記憶を提供し得る。ソフトウェアの全てまたは一部は時に、インターネットまたは他の様々な電気通信ネットワークを通じて通信され得る。そのような通信は、例えば、１つのコンピュータまたはプロセッサから別のものへの、例えば、管理サーバーまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのローディングを可能にし得る。従って、ソフトウェア要素を持ち得る別のタイプの媒体は、有線および光地上通信線ネットワークを通じたならびに様々なエアリンク（air-link）にわたる、ローカルデバイス間の物理インターフェースにわたって使用されるものなどの、光波、電波、および電磁波を含む。有線または無線リンク、光リンクなどの、そのような波を運ぶ物理要素もまた、ソフトウェアを持つ媒体と見なされ得る。本明細書において使用される場合、非一時的で有形の「記憶」媒体に制限されなければ、コンピュータまたは機械「可読媒体」などの用語は、実行のためのプロセッサに命令を提供することに関与する任意の媒体を指す。
【０１９０】
従って、コンピュータ実行可能コードなどの機械可読媒体は、有形記憶媒体、搬送波媒体、または物理伝送媒体を含むがこれらに限定されない、多くの形態をとってもよい。不揮発性記憶媒体は、例えば、図面に示されるデータベースなどを実装するために使用され得るものなど、任意のコンピュータなどにおける記憶デバイスの何れかといった、光ディスクまたは磁気ディスクを含む。揮発性記憶媒体は、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどのダイナミックメモリを含む。有形伝送媒体は、同軸ケーブル；コンピュータシステム内のバスを含むワイヤーを含む、銅線および光ファイバーを含む。搬送波伝送媒体は、電気信号または電磁気信号の形態、あるいは、無線周波（RF）および赤外線（IR）データ通信中に生成されるものなどの音波または光波の形態をとってもよい。従って、コンピュータ可読媒体の共通の形態は、例えば：フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、CD-ROM、DVD、またはDVD-ROM、任意の他の光学媒体、パンチカードペーパーテープ、ホールのパターンを備えた任意の他の物理的記憶媒体、RAM、ROM、PROM、およびEPROM、FLASH-EPROM、任意の他のメモリチップまたはカートリッジ、データまたは命令を運ぶ搬送波、そのような搬送波を運ぶケーブルまたはリンク、または、コンピュータがプログラミングコードおよび／またはデータを読み取り得る任意の他の媒体を含む。コンピュータ可読媒体のこれらの形態の多くは、実行のためのプロセッサへの1つまたは複数の命令の1つまたは複数のシーケンスを保持することに関与し得る。
【０１９１】
コンピュータシステム1001は、例えば、メチル化プロファイル、メチル化プロファイルを示すレポート、および／または、疾患もしくは障害を有するまたは有する疑いがあるという対象の尤度を提供するために、ユーザーインターフェース（UI）1040を含む電子ディスプレイ1035を含むか、またはそれと通信状態にあることができる。UIの例は、限定されないが、グラフィカルユーザーインターフェース（GUI）およびウェブベースのユーザーインターフェースを含む。
【０１９２】
本開示の方法およびシステムは、1つまたは複数のアルゴリズムによって実施することができる。アルゴリズムは、中央処理装置1005による実行の後にソフトウェアによって実施することができる。アルゴリズムは、例えば、以下が可能である：配列リードを処理し、(i)配列リードの両末端でのアダプターからの配列を同定し、そして(ii)配列を同定すると、セルフリーDNA分子を1つまたは複数のCpG部位を有すると同定する；DNA断片のメチル化状態を測定し、メチル化プロファイルを提供する；参照に対してメチル化プロファイルを処理する；そして、メチル化プロファイルを処理し、疾患もしくは障害を有するまたは有する疑いがあるという対象の尤度を求める。本発明の好ましい態様が本明細書中に記載および説明されたが、このような態様はほんの一例として提供されるものであることは、当業者に明白であろう。本発明が明細書内で提供される具体例によって限定されることは、意図されない。本発明は前述の明細書に関して記載されたが、本明細書中の態様の記載および例示は、限定的な意味で解釈されることを目的としていない。多数の変形、変更、および置き換えは、本発明から逸脱することなく、ここで当業者に明白であろう。さらに、本発明の全ての局面は、様々な条件および変数に依存する、本明細書で説明される具体的な描写、構成、または相対的な比率に限定されないことを、理解されたい。本明細書に記載される本発明の態様の様々な代案が、本発明の実施において用いられ得ることを理解されたい。従って、本発明はまた、そのような代替、改変、変形、または同等物を包含するものであることが考慮される。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲およびその同等物の範囲内の方法および構造は、それにより包含されることが、意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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