(57)【要約】本明細書では、炎症促進性ＭＲＰ２／ＨＸＡ３経路および／または抗炎症性Ｐ−ｇｐ／内在性カンナビノイド経路および／または抗炎症性ＭＲＰ１／Ｌ−ＡＭＥＮＤ経路を任意の組合せで標的にすることによって、好中球媒介性炎症を処置するための方法および組成物が開示され、被験体に、治療有効量の（ａ）多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）およびヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼの１つもしくは複数の活性および／もしくはレベルを阻害する１つもしくは複数の第１の化合物、ならびに／または（ｂ）１つもしくは複数のＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）のレベルおよび／もしくは活性を増大する１つもしくは複数の第２の化合物、ならびに／または（ｃ）多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）のレベルおよび／もしくは活性を増大する１つもしくは複数の第３の化合物を投与するステップを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
好中球媒介性炎症の処置を必要とする哺乳動物被験体の標的組織の好中球媒介性炎症を処置するための方法であって、前記被験体に、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）およびヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼの１つまたは複数を阻害する治療有効量の１つまたは複数の第１の化合物を投与するステップを含み、治療量の前記第１の化合物が、前記標的組織への好中球の遊走を低減する、方法。
【請求項２】
前記被験体に１つまたは複数のＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）を増大する治療有効量の１つまたは複数の第２の化合物を投与するステップをさらに含み、治療量の前記第２の化合物が、前記標的組織への好中球の遊走を低減する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体に多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）を増大する治療有効量の１つまたは複数の第３の化合物を投与するステップをさらに含み、治療量の前記第３の化合物が、前記標的組織への好中球の遊走を低減する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記被験体に多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）を増大する治療有効量の１つまたは複数の第２の化合物を投与するステップをさらに含み、治療量の前記第２の化合物が、前記標的組織への好中球の遊走を低減する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記投与するステップが、前記標的組織への局所投与および前記標的組織の管腔表面における投与からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記標的組織への好中球の遊走を低減する前記第１の化合物が、ポリマーにコンジュゲートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記炎症が、非感染性炎症である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
好中球媒介性炎症の処置を必要とする哺乳動物被験体の標的組織の好中球媒介性炎症を処置するための方法であって、前記被験体に、１つまたは複数のＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）を増大する治療有効量の１つまたは複数の第１の化合物を投与するステップを含み、治療量の前記第１の化合物が、前記標的組織への好中球の遊走を低減する、方法。
【請求項９】
前記被験体に、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）およびＨＸＡ３シンターゼの１つまたは複数を阻害する治療有効量の１つまたは複数の第２の化合物を投与するステップをさらに含み、治療量の前記第２の化合物が、前記標的組織への好中球の遊走を低減する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記被験体に多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）を増大する治療有効量の１つまたは複数の第３の化合物を投与するステップをさらに含み、治療量の前記第３の化合物が、前記標的組織への好中球の遊走を低減する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つまたは複数のＮＡＥを増大する前記１つまたは複数の第１の化合物が、カンナビノイド受容体タイプ２（ＣＢ２）アゴニストである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的組織への好中球の遊走を低減する前記第１の化合物が、ポリマーにコンジュゲートされる、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記被験体に多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）を増大する治療有効量の１つまたは複数の第２の化合物を投与するステップをさらに含み、治療量の前記第２の化合物が、前記標的組織への好中球の遊走を低減する、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
好中球媒介性炎症の処置を必要とする哺乳動物被験体の標的組織の好中球媒介性炎症を処置するための方法であって、前記被験体に、多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）を増大する治療有効量の１つまたは複数の第１の化合物を投与するステップを含み、治療量の前記第１の化合物が、前記標的組織への好中球の遊走を低減する、方法。
【請求項１５】
多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）およびヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼの１つまたは複数を阻害する１つまたは複数の第２の化合物を投与するステップをさらに含み、治療量の前記第２の化合物が、前記標的組織への好中球の遊走を低減する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記被験体に１つまたは複数のＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）を増大する治療有効量の１つまたは複数の第３の化合物を投与するステップをさらに含み、治療量の前記第３の化合物が、前記標的組織への好中球の遊走を低減する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験体に１つまたは複数のＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）を増大する治療有効量の１つまたは複数の第２の化合物を投与するステップをさらに含み、治療量の前記第２の化合物が、前記標的組織への好中球の遊走を低減する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記投与が、前記標的組織への局所投与および前記標的組織の管腔表面における投与の１つまたは複数である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的組織への好中球の遊走を低減する前記第１の化合物が、ポリマーにコンジュゲートされる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記炎症が、非感染性炎症である、請求項１、８、または１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記炎症が、感染性炎症である、請求項１、８、または１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＭＲＰ２を阻害する前記化合物が、式
【化２７】
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を有するプロベネシド−ポリマーコンジュゲートを含み、式中、Ｘは、１つまたは複数の原子を含むリンカーであり、ＰＯＬＹは、ポリマーである、
請求項１、９、または１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
Ｘが、置換または非置換Ｃ１〜ＣＸアルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニレン、またはヘテロアルケニレン基から選択されるリンカーであり、式中、ｘは、１〜１２の任意の整数であってよい、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＰＯＬＹが、デキストラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、過ヨウ素酸で酸化されたデキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、デキストリン、ヒドロキシエチル−デンプン（ＨＥＳ）、ポリ（２−エチル２−オキサゾリン）（ＰＥＯＺ）、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＡ／ＰＬＧＡ）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタアクリルアミド）、ポリグリセロール、２５ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリペプチド、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択されるポリマーである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＯＬＹが、４０ｋＤａのデキストランである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
ＰＯＬＹが、１０ｋＤａのデキストランである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
Ｘが、ヘキシルアミンであり、ＰＯＬＹが、過ヨウ素酸で酸化された４０ｋＤａのデキストランである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
ＰＯＬＹが、４０ｋＤａの２アームの分岐ＰＥＧアミンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
式
【化２８】
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を有する、化合物であって、式中、Ｘは、リンカーであり、ＰＯＬＹは、ポリマーである、
化合物。
【請求項３０】
Ｘが、置換または非置換Ｃ１〜ＣＸアルキレン、シクロアルキレン、シクロアルキルアルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニレン、またはヘテロアルケニレン基から選択されるリンカーであり、式中、ｘは、１〜１２の任意の整数であってよい、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３１】
ＰＯＬＹが、デキストラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、過ヨウ素酸で酸化されたデキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、デキストリン、ヒドロキシエチル−デンプン（ＨＥＳ）、ポリ（２−エチル２−オキサゾリン）（ＰＥＯＺ）、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＡ／ＰＬＧＡ）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタアクリルアミド）、ポリグリセロール、２５ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリペプチド、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択されるポリマーである、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３２】
ＰＯＬＹが、４０ｋＤａのデキストランである、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３３】
Ｘが、ヘキシルアミンであり、ＰＯＬＹが、過ヨウ素酸で酸化された４０ｋＤａのデキストランである、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３４】
ＰＯＬＹが、１０ｋＤａのデキストランである、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３５】
Ｘが、置換または非置換Ｃ１〜ＣＸアルキレン、シクロアルキレン、シクロアルキルアルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニレン、またはヘテロアルケニレン基から選択されるリンカーであり、式中、ｘは、１〜１２の任意の整数であってよく、ＰＯＬＹが、過ヨウ素酸で酸化された１０ｋＤａのデキストランである、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３６】
ＰＯＬＹが、ＰＥＧである、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３７】
ＰＯＬＹが、４０ｋＤａの２アームの分岐ＰＥＧアミンである、請求項３６に記載の化合物。
【請求項３８】
未処置対照と比較して、好中球媒介性炎症の低減を必要とする被験体の好中球媒介性炎症を低減することができる、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３９】
治療有効量の請求項２９に記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項４０】
炎症の処置または防止を必要とする被験体の炎症を処置または防止するための方法であって、前記被験体に、治療有効量の請求項２９に記載の化合物を投与するステップを含む、方法。
【請求項４１】
前記炎症が、直腸炎、精巣炎、クローン病、大腸炎、例えば潰瘍性結腸炎としても公知の潰瘍性大腸炎、感染性／非感染性腸炎、および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含む腸管疾患；肺炎球菌感染、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および肺線維症を含む炎症性肺状態；皮膚炎（湿疹）、酒さ、脂漏性皮膚炎、および乾癬を含む炎症性皮膚疾患；眼の疾患、例えばぶどう膜炎、網膜炎、角膜炎、および黄斑変性症；尿路感染を含む泌尿生殖器の疾患；骨盤腹膜炎、淋病感染、クラミジア感染、およびヘルペスを含む性感染病；ならびに尿道炎からなる群より選択される炎症状態から生じる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記炎症が、好中球媒介性炎症を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記投与が、上皮細胞を有効量の前記化合物と接触させることを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記処置によって、側底から頂端の方向に遊走する好中球の数が低減する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記炎症が、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病（ＣＤ）、または感染性および／もしくは非感染性腸炎と関連する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記炎症が、クローン病と関連し、前記処置または防止が、１つまたは複数のメサラミン生成物、コルチコステロイド製剤、回腸放出ブデソニド、アザチオプリン、６−メルカプトプリンおよびメトトレキセートを含むグルココルチコステロイド／ＥＥＮ免疫調節薬、インフリキシマブ、アダリムマブおよびセルトリズマブペゴルを含む抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）薬物、抗アルファ−４ベータ−７インテグリン抗体ベドリズマブ、ＡＢＴ−４９４、ならびにフィルゴチニブを投与することをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記炎症が、潰瘍性大腸炎と関連し、前記処置または防止が、５−アミノサリチレート、メサラミン、コルチコステロイド、マルチマトリクスブデソニド、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、インフリキシマブ、アダリムマブおよびゴリムマブを含む抗ＴＮＦ薬物、ベドリズマブ、トファシチニブ、ＡＢＴ−４９４、ならびにフィルゴチニブの１つまたは複数を投与することをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記炎症が、肺炎球菌感染、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および肺線維症からなる群より選択される感染性および／または非感染性炎症性肺状態と関連する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
前記炎症が、皮膚炎（湿疹）、酒さ、脂漏性皮膚炎、および乾癬からなる群より選択される炎症性皮膚疾患と関連する、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
ダルババンシン、オリタバンシン、キュビシン、テジゾリド、セフトビプロール、セフトビプロール、セフトロザン−タゾバクタム、ムピロシン、硫酸ネオマイシン・バシトラシン、ポリミキシンＢ、１−オフロキサシン、リン酸クリンダマイシン、硫酸ゲンタマイシン、メトロニダゾール、ヘキシルレゾルシノール、塩化メチルベンゼトニウム、フェノール、第四級アンモニウム化合物、ティーツリー油、ステロイド系薬剤、例えばコルチコステロイド、例えばヒドロコルチゾン、ヒドロキシルトリアムシノロンアルファメチルデキサメタゾン、リン酸デキサメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、吉草酸クロベタゾール、デソニド、デスオキシメタゾン、酢酸デスオキシコルチコステロン、デキサメタゾン、ジクロリゾン、二酢酸ジフロラゾン、吉草酸ジフルコルトロン、フルアドレノロン、フルクラロロンアセトニド、フルドロコルチゾン、ピバル酸フルメタゾン、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルコルチンブチルエステル、フルオコルトロン、酢酸フルプレドニデン（フルプレドニリデン）、フルランドレノロン、ハルシノニド、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフルオロソン、フルラドレナロンアセトニド、メドリゾン、アムシアフェル、アムシナフィド、ベタメタゾン、クロロプレドニゾン、酢酸クロロプレドニゾン、クロコルトロン、クレスシノロン、ジクロリゾン、ジフルプレドナート、フルクロロニド、フルニソリド、フルオロメトロン、フルペロロン、フルプレドニゾロン、吉草酸ヒドロコルチゾン、シクロペンチルプロピオン酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルタメート、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、トリアムシノロン、非ステロイド系薬剤、例えばＣＯＸ阻害剤、ＬＯＸ阻害剤、ｐ３８キナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、ならびにサイトカイン合成阻害剤、テトラサイクリン、ミノサイクリンおよびドキシサイクリン、またはそれらの任意の組合せからなる群より選択される１つまたは複数の抗生物質および／または抗炎症剤を投与するステップをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５１】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素を標的にする抗体、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を標的にする抗体、インターロイキンを標的にする抗体、およびメタロプロテイナーゼ−９を標的にする抗体からなる群より選択される１つまたは複数の抗体を投与するステップをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、参照によって本明細書に組み込まれる２０１７年７月１４日出願の同時係属の米国仮特許出願第６２／５３２，５３９号の優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府の資金による研究の記載
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって与えられた助成金番号ＤＫ０５６７５４の下で政府支援を得て行われた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
【０００３】
本開示の技術は、炎症促進性ＭＲＰ２／ＨＸＡ３経路および／または抗炎症性Ｐ−ｇｐ／内在性カンナビノイド経路および／または抗炎症性ＭＲＰ１／Ｌ−ＡＭＥＮＤ経路を任意の組合せで標的にすることによって、好中球媒介性炎症を処置するための方法であって、被験体に、治療有効量の（ａ）多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）およびヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼの１つもしくは複数の活性および／もしくはレベルを阻害する１つもしくは複数の第１の化合物、ならびに／または（ｂ）１つもしくは複数のＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）のレベルおよび／もしくは活性を増大する１つもしくは複数の第２の化合物、ならびに／または（ｃ）多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）のレベルおよび／もしくは活性を増大する１つもしくは複数の第３の化合物を投与するステップを含み、治療量の第１、第２および第３の化合物が、標的組織への好中球の遊走を低減する、方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
炎症、特に慢性炎症性疾患（ＣＩＤ）は、世界的に非常に蔓延しており、がん、心血管疾患、糖尿病、肥満、骨粗鬆症、関節リウマチ、炎症性腸疾患、喘息、およびＣＮＳ関連疾患、例えばうつ病およびパーキンソン病のような様々な疾患の発症の主な原因の１つとみなされている。上皮細胞は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）または様々な他の病原体による感染に応答して、膜ＡＢＣトランスポーター多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）の表面発現を劇的に増大する。エイコサノイドＨＸＡ３の細胞内生合成経路も同時に上方制御され、表面で増大したＭＲＰ２は、ＨＸＡ３を腸管腔に輸送する働きをする。これによって、上皮を横切るＨＸＡ３の濃度勾配が確立され、その勾配が、好中球の走化性を側底側から管腔内へと方向付けて、重症炎症過程をもたらす。このＭＲＰ／ＨＸＡ３経路は、複数の病原体による感染中、肺および腸管上皮の両方において保存される。しかし、その経路が、感染がない状態でも炎症を推進するかどうかについての証拠はない。
【０００５】
ＭＲＰ２レベルの増大と並行して、別のＡＢＣトランスポーターであるＰ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍによって表面において活発に低減されるが、その重要性は、まだ明らかになっていなかった。Ｐ−ｇｐの欠損は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に関連し、Ｐ−ｇｐの低減がＩＢＤ患者の上皮で観測されており、Ｐ−ｇｐをコードするｍｄｒ１遺伝子における単一ヌクレオチド多型がＩＢＤのリスクの増大と関連付けられている。Ｐ−ｇｐをコードするｍｄｒ１ａ遺伝子が欠如しているマウスは、自発性腸管炎症を発症する。しかし、この炎症過程の根本にある機序は不明である。したがって、炎症を低減する組成物および方法が、まだ必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、本開示は、それを必要とする哺乳動物被験体の標的組織の好中球媒介性炎症を処置するための方法であって、被験体に、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）およびヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼの１つまたは複数を阻害する治療有効量の１つまたは複数の第１の化合物を投与するステップを含み、治療量の第１の化合物が、標的組織への好中球の遊走を低減する、方法を提供する。
【０００７】
一部の実施形態では、該方法は、被験体に１つまたは複数のＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）を増大する治療有効量の１つまたは複数の第２の化合物を投与するステップをさらに含み、治療量の第２の化合物は、標的組織への好中球の遊走を低減する。
【０００８】
一部の実施形態では、該方法は、被験体に多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）を増大する治療有効量の１つまたは複数の第３の化合物を投与するステップをさらに含み、治療量の第３の化合物は、標的組織への好中球の遊走を低減する。
【０００９】
一部の実施形態では、該方法は、被験体に多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）を増大する治療有効量の１つまたは複数の第２の化合物を投与するステップをさらに含み、治療量の第２の化合物は、標的組織への好中球の遊走を低減する。
【００１０】
一部の実施形態では、投与するステップは、標的組織への局所投与および標的組織の管腔表面における投与からなる群より選択される。
【００１１】
一部の実施形態では、標的組織への好中球の遊走を低減する第１の化合物は、ポリマーにコンジュゲートされる。
【００１２】
一部の実施形態では、炎症は、非感染性炎症である。
【００１３】
一態様では、本開示は、それを必要とする哺乳動物被験体の標的組織の好中球媒介性炎症を処置するための方法であって、被験体に、１つまたは複数のＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）を増大する治療有効量の１つまたは複数の第１の化合物を投与するステップを含み、治療量の第１の化合物が、標的組織への好中球の遊走を低減する、方法を提供する。
【００１４】
一部の実施形態では、該方法は、被験体に、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）およびＨＸＡ３シンターゼの１つまたは複数を阻害する治療有効量の１つまたは複数の第２の化合物を投与するステップをさらに含み、治療量の第２の化合物は、標的組織への好中球の遊走を低減する。
【００１５】
一部の実施形態では、該方法は、被験体に多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）を増大する治療有効量の１つまたは複数の第３の化合物を投与するステップをさらに含み、治療量の第３の化合物は、標的組織への好中球の遊走を低減する。
【００１６】
一部の実施形態では、１つまたは複数のＮＡＥを増大する１つまたは複数の第１の化合物は、カンナビノイド受容体タイプ２（ＣＢ２）アゴニストである。
【００１７】
一部の実施形態では、標的組織への好中球の遊走を低減する第１の化合物は、ポリマーにコンジュゲートされる。
【００１８】
一部の実施形態では、該方法は、被験体に多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）を増大する治療有効量の１つまたは複数の第２の化合物を投与するステップをさらに含み、治療量の第２の化合物は、標的組織への好中球の遊走を低減する。
【００１９】
一態様では、本開示は、それを必要とする哺乳動物被験体の標的組織の好中球媒介性炎症を処置するための方法であって、被験体に、多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）を増大する治療有効量の１つまたは複数の第１の化合物を投与するステップを含み、治療量の第１の化合物が、標的組織への好中球の遊走を低減する、方法を提供する。
【００２０】
一部の実施形態では、該方法は、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）およびヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼの１つまたは複数を阻害する１つまたは複数の第２の化合物を投与するステップをさらに含み、治療量の第２の化合物が、標的組織への好中球の遊走を低減する。
【００２１】
一部の実施形態では、該方法は、被験体に１つまたは複数のＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）を増大する治療有効量の１つまたは複数の第３の化合物を投与するステップをさらに含み、治療量の第３の化合物が、標的組織への好中球の遊走を低減する。
【００２２】
一部の実施形態では、該方法は、被験体に１つまたは複数のＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）を増大する治療有効量の１つまたは複数の第２の化合物を投与するステップをさらに含み、治療量の第２の化合物は、標的組織への好中球の遊走を低減する。
【００２３】
一部の実施形態では、投与は、標的組織への局所投与および標的組織の管腔表面における投与の１つまたは複数である。
【００２４】
一部の実施形態では、標的組織への好中球の遊走を低減する第１の化合物は、ポリマーにコンジュゲートされる。
【００２５】
本明細書に開示される方法の一部の実施形態では、炎症は、非感染性炎症である。一部の実施形態では、炎症は、感染性炎症である。
【００２６】
本明細書に開示される方法の一部の実施形態では、ＭＲＰ２を阻害する化合物は、式
【化１】
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［式中、Ｘは、１つまたは複数の原子を含むリンカーであり、ＰＯＬＹは、ポリマーである］
を有するプロベネシド−ポリマーコンジュゲートを含む。
【００２７】
一部の実施形態では、Ｘは、置換または非置換Ｃ１〜ＣＸアルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニレン、またはヘテロアルケニレン基（式中、ｘは、１〜１２の任意の整数であってよい）から選択されるリンカーである。
【００２８】
一部の実施形態では、ＰＯＬＹは、デキストラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、過ヨウ素酸で酸化されたデキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、デキストリン、ヒドロキシエチル−デンプン（ＨＥＳ）、ポリ（２−エチル２−オキサゾリン）（ＰＥＯＺ）、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＡ／ＰＬＧＡ）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタアクリルアミド）、ポリグリセロール、２５ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリペプチド、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択されるポリマーである。一部の実施形態では、ＰＯＬＹは、４０ｋＤａのデキストランである。一部の実施形態では、ＰＯＬＹは、１０ｋＤａのデキストランである。一部の実施形態では、Ｘは、ヘキシルアミンであり、ＰＯＬＹは、過ヨウ素酸で酸化された４０ｋＤａのデキストランである。一部の実施形態では、ＰＯＬＹは、４０ｋＤａの２アームの分岐ＰＥＧアミンである。
【００２９】
一態様では、本開示は、式
【化２】
2020526537.tif 000004
［式中、Ｘは、リンカーであり、ＰＯＬＹは、ポリマーである］
を有する、化合物を提供する。
【００３０】
一部の実施形態では、Ｘは、置換または非置換Ｃ１〜ＣＸアルキレン、シクロアルキレン（ｃｙｃｌｏａｋｙｌｅｎｅ）、シクロアルキルアルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニレン、またはヘテロアルケニレン基（式中、ｘは、１〜１２の任意の整数であってよい）から選択されるリンカーである。
【００３１】
一部の実施形態では、ＰＯＬＹは、デキストラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、過ヨウ素酸で酸化されたデキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、デキストリン、ヒドロキシエチル−デンプン（ＨＥＳ）、ポリ（２−エチル２−オキサゾリン）（ＰＥＯＺ）、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＡ／ＰＬＧＡ）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタアクリルアミド）、ポリグリセロール、２５ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリペプチド、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択されるポリマーである。一部の実施形態では、ＰＯＬＹは、４０ｋＤａのデキストランである。一部の実施形態では、Ｘは、ヘキシルアミンであり、ＰＯＬＹは、過ヨウ素酸で酸化された４０ｋＤａのデキストランである。一部の実施形態では、ＰＯＬＹは、１０ｋＤａのデキストランである。
【００３２】
一部の実施形態では、Ｘは、置換または非置換Ｃ１〜ＣＸアルキレン、シクロアルキレン、シクロアルキルアルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニレン、またはヘテロアルケニレン基（式中、ｘは、１〜１２の任意の整数であってよい）から選択されるリンカーであり、ＰＯＬＹは、過ヨウ素酸で酸化された１０ｋＤａのデキストランである。
【００３３】
一部の実施形態では、ＰＯＬＹは、ＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＯＬＹは、４０ｋＤａの２アームの分岐ＰＥＧアミンである。
【００３４】
一部の実施形態では、本開示の化合物は、未処置対照と比較して、それを必要とする被験体の好中球媒介性炎症を低減することができる。
【００３５】
一部の実施形態では、本開示は、治療有効量の式Ｉの化合物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【００３６】
一部の実施形態では、本開示は、それを必要とする被験体の炎症を処置または防止するための方法であって、被験体に、治療有効量の式Ｉの化合物を投与するステップを含む、方法に関する。
【００３７】
一部の実施形態では、炎症は、直腸炎、精巣炎、クローン病、大腸炎、例えば潰瘍性結腸炎としても公知の潰瘍性大腸炎、感染性／非感染性腸炎、および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含む腸管疾患；肺炎球菌感染、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および肺線維症を含む炎症性肺状態；皮膚炎（湿疹）、酒さ、脂漏性皮膚炎、および乾癬を含む炎症性皮膚疾患；眼の疾患、例えばぶどう膜炎、網膜炎、角膜炎、および黄斑変性症；尿路感染を含む泌尿生殖器の疾患；骨盤腹膜炎、淋病感染、クラミジア感染、およびヘルペスを含む性感染病；ならびに尿道炎からなる群より選択される炎症状態から生じる。
【００３８】
一部の実施形態では、炎症は、好中球媒介性炎症を含む。
【００３９】
一部の実施形態では、投与は、上皮細胞を有効量の化合物と接触させることを含む。
【００４０】
一部の実施形態では、処置によって、側底から頂端の方向に遊走する好中球の数が低減する。
【００４１】
一部の実施形態では、炎症は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病（ＣＤ）、または感染性および／もしくは非感染性腸炎と関連する。
【００４２】
一部の実施形態では、炎症は、クローン病と関連し、処置または防止は、１つまたは複数のメサラミン生成物、コルチコステロイド製剤、回腸放出ブデソニド、アザチオプリン、６−メルカプトプリンおよびメトトレキセートを含むグルココルチコステロイド／ＥＥＮ免疫調節薬、インフリキシマブ、アダリムマブおよびセルトリズマブペゴルを含む抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）薬物、抗アルファ−４ベータ−７インテグリン抗体ベドリズマブ、ＡＢＴ−４９４、ならびにフィルゴチニブを投与することをさらに含む。
【００４３】
一部の実施形態では、炎症は、潰瘍性大腸炎と関連し、処置または防止は、５−アミノサリチレート、メサラミン、コルチコステロイド、マルチマトリクスブデソニド、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、インフリキシマブ、アダリムマブおよびゴリムマブを含む抗ＴＮＦ薬物、ベドリズマブ、トファシチニブ、ＡＢＴ−４９４、ならびにフィルゴチニブの１つまたは複数を投与することをさらに含む。
【００４４】
一部の実施形態では、炎症は、肺炎球菌感染、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および肺線維症からなる群より選択される感染性および／または非感染性炎症性肺状態と関連する。
【００４５】
一部の実施形態では、炎症は、皮膚炎（湿疹）、酒さ、脂漏性皮膚炎、および乾癬からなる群より選択される炎症性皮膚疾患と関連する。
【００４６】
一部の実施形態では、該方法は、ダルババンシン、オリタバンシン、キュビシン、テジゾリド、セフトビプロール、セフトビプロール、セフトロザン−タゾバクタム、ムピロシン、硫酸ネオマイシン・バシトラシン、ポリミキシンＢ、１−オフロキサシン、リン酸クリンダマイシン、硫酸ゲンタマイシン、メトロニダゾール、ヘキシルレゾルシノール、塩化メチルベンゼトニウム、フェノール、第四級アンモニウム化合物、ティーツリー油、ステロイド系薬剤、例えばコルチコステロイド、例えばヒドロコルチゾン、ヒドロキシルトリアムシノロンアルファメチルデキサメタゾン、リン酸デキサメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、吉草酸クロベタゾール、デソニド、デスオキシメタゾン、酢酸デスオキシコルチコステロン、デキサメタゾン、ジクロリゾン、二酢酸ジフロラゾン、吉草酸ジフルコルトロン、フルアドレノロン（ｆｌｕａｄｒｅｎｏｌｏｎｅ）、フルクラロロン（ｆｌｕｃｌａｒｏｌｏｎｅ）アセトニド、フルドロコルチゾン、ピバル酸フルメタゾン、フルオシノロン（ｆｌｕｏｓｉｎｏｌｏｎｅ）アセトニド、フルオシノニド、フルコルチン（ｆｌｕｃｏｒｔｉｎｅ）ブチルエステル、フルオコルトロン、酢酸フルプレドニデン（フルプレドニリデン）、フルランドレノロン、ハルシノニド、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド（ｆｌｕｃｅｔｏｎｉｄｅ）、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフルオロソン、フルラドレナロン（ｆｌｕｒａｄｒｅｎａｌｏｎｅ）アセトニド、メドリゾン、アムシアフェル（ａｍｃｉａｆｅｌ）、アムシナフィド、ベタメタゾン、クロロプレドニゾン（ｃｈｌｏｒｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ）、酢酸クロロプレドニゾン、クロコルトロン（ｃｌｏｃｏｒｔｅｌｏｎｅ）、クレスシノロン（ｃｌｅｓｃｉｎｏｌｏｎｅ）、ジクロリゾン、ジフルプレドナート、フルクロロニド、フルニソリド、フルオロメトロン（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈａｌｏｎｅ）、フルペロロン、フルプレドニゾロン、吉草酸ヒドロコルチゾン、シクロペンチルプロピオン酸（ｃｙｃｌｏｐｅｎｔｙｌｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）ヒドロコルチゾン、ヒドロコルタメート、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、トリアムシノロン、非ステロイド系薬剤、例えばＣＯＸ阻害剤、ＬＯＸ阻害剤、ｐ３８キナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、ならびにサイトカイン合成阻害剤、テトラサイクリン、ミノサイクリンおよびドキシサイクリン、またはそれらの任意の組合せからなる群より選択される１つまたは複数の抗生物質および／または抗炎症剤を投与するステップをさらに含む。
【００４７】
一部の実施形態では、該方法は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素を標的にする抗体、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を標的にする抗体、インターロイキンを標的にする抗体、およびメタロプロテイナーゼ−９を標的にする抗体からなる群より選択される１つまたは複数の抗体を投与するステップをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１Ａ〜１Ｉは、ＨＸＡ３が、ＤＳＳ大腸炎中に炎症を推進することを示す。５％ＤＳＳで７日間処置したマウスの粘膜擦過標本を、脂質について濃縮し、ＨＸＡ３の量をＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって定量した（図１Ａ）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、３％ＤＳＳで７日間処置し、９日目に屠殺した（図１Ｂ〜１Ｉ）。ＰＢＳ対照（ビヒクル）またはプロベネシドコンジュゲートの毎日の直腸投与を、４日目に開始して実施した。すべてのデータは、マン−ホイットニー片側ノンパラメトリックＵ検定による平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．（１群当たりｎ＝１０マウス）統計的有意性である。中結腸および遠位結腸のパラフィン包埋切片を、Ｈ＆Ｅで染色し、試料の正体について盲検にした訓練された研究者によってスコア化した（図１Ｃおよび１Ｄ）。矢印は、腸管腔への好中球の蓄積を強調している（図１Ｄ）。ミエロペルオキシダーゼ（ｍｐｏ）活性を、糞便（図１Ｅ）または結腸組織（図１Ｆ）から、ＡＤＨＰアッセイによって８分にわたって測定し（方法を参照されたい）、傾きを線形回帰によって算出した。組織については、傾きを全タンパク質含量に対して正規化した。粘膜固有層の全白血球を単離し、フローサイトメトリーのために染色した（図１Ｇ〜１Ｉ）。好中球を、生存／ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂｈｉ／Ｌｙ６Ｇ＋として特徴付けた。図１Ｇは、好中球のパーセントを示し、図１Ｈは、好中球の数を示し、図１Ｉは、結腸組織における好中球の代表的なプロットを示す。
【００４９】
【図２Ａ−Ｅ】図２Ａ〜２Ｆは、上皮細胞が、好中球の遊走を阻害するＰ−ｇｐ依存性内在性カンナビノイドを分泌することを示す。Ｔ８４上皮単層の上清を、脂質について濃縮し、９６ウェルの改変ＢｏｙｄｅｎチャンバアッセイにおいてＨＸＡ３誘導性遊走を阻害する能力について試験した（図２Ａ）。異なるドナーを用いる実験にわたって比較するために、個々の実験内の遊走値を、ビヒクル処置による濃縮ＨＸＡ３に対して正規化した。図２Ａ〜２Ｃについて、データは、３つの独立した実験の一元配置ＡＮＯＶＡによる平均比＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．（＊＝ｐ＜０．０５）である。図２Ｂは、Ｐ−ｇｐ発現をノックダウンする異なるｓｈＲＮＡ構築物を発現する細胞株（Ｂ４−ｍｄｒ１およびＢ５−ｍｄｒ１）の上清を用いて、図２Ａと同様に実施したものである。図２Ｃは、遊走アッセイで使用する前に、濃縮Ｔ８４上清をＦＡＡＨまたはＭＡＧＬで３７℃において３０分間事前処置したことを除いて、図２Ａと同様に実施したものである。Ｔ８４単層を、ビヒクルまたはベラパミルで処置してＰ−ｇｐ機能を阻害した後、上清を収集し、脂質を濃縮した。調製物をＨＰＬＣによって分離した。楕円は、ベラパミルで処置した細胞には存在しないピークを強調している（図２Ｄ）。対照またはＢ４−ｍｄｒ１ノックダウン細胞株の濃縮Ｔ８４上清を、エレクトロスプレーイオン化質量分析に供した。矢印は、アナンダミドＮａ＋付加物のピークを示している（図２Ｅ）。商業的に利用可能な内在性カンナビノイドおよび関連化合物を、９６ウェルの遊走アッセイで試験した（図２Ｆ）。化合物を、ＰＢＳに可溶性を示す最高濃度で使用した。データは、少なくとも３つの独立した実験の一元配置ＡＮＯＶＡによる平均＋／−ＳＥＭ（＊＝ｐ＜０．０５および＊＊＝ｐ＜０．０１）である。さらなる情報については、方法を参照されたい。
【図２Ｆ】図２Ａ〜２Ｆは、上皮細胞が、好中球の遊走を阻害するＰ−ｇｐ依存性内在性カンナビノイドを分泌することを示す。Ｔ８４上皮単層の上清を、脂質について濃縮し、９６ウェルの改変ＢｏｙｄｅｎチャンバアッセイにおいてＨＸＡ３誘導性遊走を阻害する能力について試験した（図２Ａ）。異なるドナーを用いる実験にわたって比較するために、個々の実験内の遊走値を、ビヒクル処置による濃縮ＨＸＡ３に対して正規化した。図２Ａ〜２Ｃについて、データは、３つの独立した実験の一元配置ＡＮＯＶＡによる平均比＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．（＊＝ｐ＜０．０５）である。図２Ｂは、Ｐ−ｇｐ発現をノックダウンする異なるｓｈＲＮＡ構築物を発現する細胞株（Ｂ４−ｍｄｒ１およびＢ５−ｍｄｒ１）の上清を用いて、図２Ａと同様に実施したものである。図２Ｃは、遊走アッセイで使用する前に、濃縮Ｔ８４上清をＦＡＡＨまたはＭＡＧＬで３７℃において３０分間事前処置したことを除いて、図２Ａと同様に実施したものである。Ｔ８４単層を、ビヒクルまたはベラパミルで処置してＰ−ｇｐ機能を阻害した後、上清を収集し、脂質を濃縮した。調製物をＨＰＬＣによって分離した。楕円は、ベラパミルで処置した細胞には存在しないピークを強調している（図２Ｄ）。対照またはＢ４−ｍｄｒ１ノックダウン細胞株の濃縮Ｔ８４上清を、エレクトロスプレーイオン化質量分析に供した。矢印は、アナンダミドＮａ＋付加物のピークを示している（図２Ｅ）。商業的に利用可能な内在性カンナビノイドおよび関連化合物を、９６ウェルの遊走アッセイで試験した（図２Ｆ）。化合物を、ＰＢＳに可溶性を示す最高濃度で使用した。データは、少なくとも３つの独立した実験の一元配置ＡＮＯＶＡによる平均＋／−ＳＥＭ（＊＝ｐ＜０．０５および＊＊＝ｐ＜０．０１）である。さらなる情報については、方法を参照されたい。
【００５０】
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、ＡＭＥＮＤがマウス腸管内に存在することを示す。５匹の野生型（ｗｔ）マウスまたはｍｄｒ１ａ−／−マウスの結腸擦過標本をプールし、図２Ａと同様に脂質について濃縮し、９６ウェルの遊走アッセイで試験した。データは、３つの独立した実験の一元配置ＡＮＯＶＡによる平均＋／−ＳＥＭ（＊＊＝ｐ＜０．０１）である。図３Ｂでは、示されている試料を、ＦＡＡＨを用いて３７℃で３０分間事前処置した。
【００５１】
【図４】図４Ａ〜４Ｈは、ＣＢ２欠損マウスが重症腸管炎症に罹患しやすく、好中球遊出が増大することを示す。ｗｔマウスまたはｃｎｒ２−／−マウスを、３％ＤＳＳで７日間処置し、９日目に屠殺した。すべての実験について、データは平均＋／Ｓ．Ｅ．Ｍであり、統計的分析を、マン−ホイットニー片側ノンパラメトリックＵ検定を用いて実施した。組織病理スコア付け、ミエロペルオキシダーゼ活性の測定およびフローサイトメトリー分析のための方法は、図１Ｅ〜１Ｉと同じである。体重は、０日目の体重に対するパーセンテージとして示し（ｎ＝１５匹のｗｔマウスおよび１４匹のｃｎｒ２−／−マウス）、ｐ値は、９日目の体重を指す（図４Ａ）。図４Ｂおよび４Ｃは、図１と同様に、中結腸および遠位結腸の組織病理である。矢印は、腸管腔への好中球の蓄積を強調している（図４Ｃ）。組織ｍｐｏ活性、ｎ＝１３匹のｗｔマウスおよび１１匹のｃｎｒ２−／−マウス（図４Ｅ）。糞便ｍｐｏ活性、ｎ＝１４匹のｗｔマウスおよび１２匹のｃｎｒ２−／−マウス（図４Ｄ）。フローサイトメトリー分析による、組織好中球の数（図４Ｆ）およびパーセンテージ（図４Ｇ）。粘膜固有層の好中球の代表的なプロット（図４Ｈ）。図４Ｆ〜４Ｈは、ｎ＝１３匹のｗｔマウスおよび１２匹のｃｎｒ２−／−マウスである。
【００５２】
【図５】図５は、プロベネシドコンジュゲートが、ＨＸＡ３誘導性の好中球遊走を有効に阻害することを示す。ＨＣＴ−８上皮単層を、反転させたトランスウェルインサート上で増殖させ、１００μＭプロベネシドコンジュゲートで１時間事前処置した。次に、単層を、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＳＬ１３４４で１時間、頂端側で感染させ、次に洗浄し、反転させた。好中球をウェル上部（側底側）に添加し、２時間遊走させた後、記載される通りｍｐｏを定量した。示されているデータは、代表的な実験の平均＋／−Ｓ．Ｄ．である。
【００５３】
【図６】図６は、Ｔ８４細胞におけるＰ−糖タンパク質のｓｈＲＮＡノックダウンを示す。Ｔ８４細胞を、ｍｄｒ１ａを標的にするｓｈＲＮＡ構築物を担持するレンチウイルス粒子で感染させた。細胞株Ｂ４〜Ｂ８は、独立した標的化構築物を含有しており、非トランスフェクト細胞（レーン１）および対照ｓｈＲＮＡをトランスフェクトした細胞（レーン２）と比較する。ライセートをゲル電気泳動法によって分離し、ニトロセルロースに移し、（ａ）Ｐ−ｇｐまたは（ｂ）ＧＡＰＤＨローディング対照についてプローブした。すべての構築物が、ウエスタンブロットによってＰ−ｇｐ発現の著しいノックダウンを誘導したので、クローンＢ４およびＢ５を、さらなる分析のために選択した。
【００５４】
【図７】図７は、ＡＭＥＮＤ分泌が、Ｐ−ｇｐ依存性であることを示す。Ｔ８４上皮細胞を、ビヒクルまたはＰ−ｇｐ阻害剤である４０μＭのベラパミル塩酸塩で処置した。濃縮上清画分を調製し、無細胞遊走アッセイでＡＭＥＮＤ阻害活性について評価した。ベラパミルによる事前処置によって、ＡＭＥＮＤ阻害性化合物の分泌が阻害された。示されているデータは、２つの独立した実験の代表値の平均＋／−ＳＤである。一元配置ＡＮＯＶＡにより＊＝ｐ＜０．０５。
【００５５】
【図８】図８は、ＦＡＡＨおよびＭＡＧＬアッセイが、内在性カンナビノイドに特異的であり、リポキシンＡ４の阻害活性に影響を及ぼさないことを示す。実験を、図２Ｃと同様に実施し、正規化した。リポキシンは１０ｎＭで使用した。データは、２つの独立した実験を合わせた平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．である。
【００５６】
【図９】図９は、Ｐ−ｇｐ欠損マウスにおけるＤＳＳ大腸炎を示す。ＦＶＢ野生型マウスおよびｍｄｒ１ａ−／−マウスを、図１と同様にＤＳＳで処置した。１群当たりｎ＝５匹のマウス。
【００５７】
【図１０】図１０は、腸管上皮における抗炎症性Ｐ−ｇｐ／内在性カンナビノイド経路および炎症促進性ＭＲＰ２／ＨＸＡ３経路を示す。恒常的な腸管内では、Ｐ−糖タンパク質は、上皮表面から内在性カンナビノイドを分泌する。分泌されたＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）は、好中球上のＣＢ２受容体を介して遊走を阻害し、抗炎症状態を維持するように作用する。炎症の間、Ｐ−ｇｐは下方制御され（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの場合には、カスパーゼ−３分解によって）、ＭＲＰ２／ＨＸＡ３経路が活性化される。ホスホリパーゼＡ２は、膜からアラキドン酸を遊離させ、アラキドン酸をＨＸＡ３に変換し、表面ＭＲＰ２を介して管腔に分泌する。ＨＸＡ３は、上皮層を横切って管腔へと好中球を誘引する濃度勾配を形成し、そこで炎症性損傷および病理を引き起こす。ＮＡＥのＦＡＡＨ代謝によってアラキドン酸（ａｒａｃｈａｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）が生じ、炎症促進性ＭＲＰ２／ＨＸＡ３経路にも供給し得ることは注目すべきである。
【００５８】
【図１１】図１１は、ヒト１２−リポキシゲナーゼ（Ａｌｏｘ１２）ｍＲＮＡ、完全ｃｄｓ、ｇｉ｜１８７１７０｜ｇｂ｜Ｍ５８７０４．１｜ＨＵＭＬＩＰＸＹＧ（配列番号０１）を示す。
【００５９】
【図１２−１】図１２は、ホモサピエンスＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー２（ＡＢＣＣ２）、ｍＲＮＡ＞ｇｉ｜５９４１９１０５２｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿０００３９２．４｜（配列番号０２）を示す。
【図１２−２】図１２は、ホモサピエンスＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー２（ＡＢＣＣ２）、ｍＲＮＡ＞ｇｉ｜５９４１９１０５２｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿０００３９２．４｜（配列番号０２）を示す。
【００６０】
【図１３−１】図１３は、ホモサピエンスＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＢ（ＭＤＲ／ＴＡＰ）、メンバー１（ＡＢＣＢ１）、ｍＲＮＡ＞ｇｉ｜３１８０３７５９８｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿０００９２７．４｜（配列番号０３）を示す。
【図１３−２】図１３は、ホモサピエンスＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＢ（ＭＤＲ／ＴＡＰ）、メンバー１（ＡＢＣＢ１）、ｍＲＮＡ＞ｇｉ｜３１８０３７５９８｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿０００９２７．４｜（配列番号０３）を示す。
【００６１】
【図１４】図１４は、ラットＡＬＯＸ１５：Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓのアラキドン酸１５−リポキシゲナーゼ（Ａｌｏｘ１５）、ｍＲＮＡ＞ｇｉ｜３１５４２１２４｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿０３１０１０．２｜（配列番号０４）を示す。
【００６２】
【図１５】図１５は、ヒトＦＡＡＨ：ホモサピエンス脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）、ｍＲＮＡ＞ｇｉ｜１６６７９５２８６｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿００１４４１．２｜（配列番号０５）を示す。
【００６３】
【図１６】図１６は、頂端表面上のＭＲＰ１タンパク質が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染中に低減するが、ＭＲＰ２は増大することを示す。非感染および感染ＮＩＨ−Ｈ２９２細胞を比較する、頂端表面ビオチン化のウエスタンブロット分析。細胞を感染させ、洗浄し、次に感染後１時間、３７度で静置した。次に、頂端表面をビオチンで標識し、溶解させた。試料をＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビーズを、左側のカラム上で特定したタンパク質のために架橋した抗体に曝露し、ストレプトアビジン−ＨＲＰを使用してプローブした。ＭＲＰ４および５は、感染時に増大をほとんど示さなかった。ＭＲＰ１は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅへの曝露時に９３％の低減を示した一方、ＭＲＰ２は２３０％の増大を示した。
【００６４】
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、感染中のＭＲＰの免疫蛍光を示す。極性ＮＩＨ−Ｈ２９２を、１０ＭＯＩのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅで感染させ、固定し、次にＭＲＰ２について染色した。ＩＦ画像を個々のチャネルに分離し、ＭＲＰ２が占める頂端表面積を測定した。図１７Ａでは、赤色で囲った領域は、細胞単層の頂端表面上の目的の領域を現す。Ｆ−アクチンを使用して、細胞の境界を調査し、頂端表面を限局化した。所与の遺伝子のタンパク質発現が占める面積のパーセンテージを、Ｆｉｊｉで完成した算出によって決定した。図１７Ａには、非感染細胞およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＨ２９２細胞のＭＲＰ２およびＦ−アクチン切片が示されている。その過程を、ＭＲＰ１、ＭＲＰ４、およびＭＲＰ５について反復した（図１７Ｂ）。非感染試料を感染試料と比較すると、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染は、ＭＲＰ１表面発現を低減し、ＭＲＰ２表面発現を増大するが、ＭＲＰ４またはＭＲＰ５に対しては効果がなく、これにより図１のビオチン化データが確認される。（試料１つ当たりｎ＝８）。
【００６５】
【図１８】図１８は、マウス肺におけるＭＲＰ１およびＭＲＰ２の発現を示す。マウスを、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅで気管内経路を介して感染させ、感染の２日後に屠殺した。肺を切除し、再膨張させ、切片にし、Ｍｒｐ１およびＭｒｐ２について染色した。Ｍｒｐ１発現は、ＰＢＳで処置したマウスと比較して、感染マウスの肺で低減したように見える（上）。Ｍｒｐ２は、特に細胞末端周辺で発現が増大したように見える（下）。
【００６６】
【図１９Ａ−Ｃ】図１９Ａ〜１９Ｅは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＲＰ２阻害を示す。本発明者らは、好中球の遊走のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを使用して、ＭＲＰ２阻害の結果を調査した。プロベネシド処置によってＭＲＰ２を阻害すると、側底から頂端の方向に遊走する好中球が低減する（図１９Ａ）。このｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果に従って、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスをＰＢＳまたはプロベネシドのいずれかで処置し、その後Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅで感染させた。プロベネシドで処置したマウスは、感染した肺から単離された気管支肺胞洗浄物（ＢＡＬ）においてＣｄ１１ｂ−陽性／Ｌｙ６ｇ−陽性細胞（好中球）がわずかであった（図１９Ｂ）。プロベネシドはまた、菌血症マウスの数および全体的菌血症を低減した（図１９Ｃ）。マン−ホイットニー検定から得られた、Ｄ１の菌血症データの統計（図１９Ｄ）は、Ｃｄ１１ｂ＋／Ｃｄ４５＋／Ｌｙ６ｇ−顆粒球が差異を示さなかったことを示しているが、このことは、効果が好中球に特異的である可能性が高いことを示す。これらのマウスは、ＣＦＵ数は統計的有意性に達しなかったが、菌血症を発症しなかったマウスと比較して細菌ＣＦＵにおよそ２倍の差異があったので、プロベネシドは保護効果を有していた可能性がある（図１９Ｅ）。菌血症を発症したマウスは、肺内の細菌負荷には差異がないように見えた。
【図１９Ｄ−Ｅ】図１９Ａ〜１９Ｅは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＲＰ２阻害を示す。本発明者らは、好中球の遊走のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを使用して、ＭＲＰ２阻害の結果を調査した。プロベネシド処置によってＭＲＰ２を阻害すると、側底から頂端の方向に遊走する好中球が低減する（図１９Ａ）。このｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果に従って、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスをＰＢＳまたはプロベネシドのいずれかで処置し、その後Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅで感染させた。プロベネシドで処置したマウスは、感染した肺から単離された気管支肺胞洗浄物（ＢＡＬ）においてＣｄ１１ｂ−陽性／Ｌｙ６ｇ−陽性細胞（好中球）がわずかであった（図１９Ｂ）。プロベネシドはまた、菌血症マウスの数および全体的菌血症を低減した（図１９Ｃ）。マン−ホイットニー検定から得られた、Ｄ１の菌血症データの統計（図１９Ｄ）は、Ｃｄ１１ｂ＋／Ｃｄ４５＋／Ｌｙ６ｇ−顆粒球が差異を示さなかったことを示しているが、このことは、効果が好中球に特異的である可能性が高いことを示す。これらのマウスは、ＣＦＵ数は統計的有意性に達しなかったが、菌血症を発症しなかったマウスと比較して細菌ＣＦＵにおよそ２倍の差異があったので、プロベネシドは保護効果を有していた可能性がある（図１９Ｅ）。菌血症を発症したマウスは、肺内の細菌負荷には差異がないように見えた。
【００６７】
【図２０Ａ−Ｃ】図２０Ａ〜２０Ｄは、分泌された上清が、抗炎症性（ＭＲＰ１）または炎症性（ＭＲＰ２）表現型を付与することを示す。炎症促進性脂質（図２０Ａでは三角によって表されている）を、感染Ｈ２９２単層から頂端上清をプールすることによって単離した。これをＣ−１８カラムに適用し、保存のためにメタノールで溶出した（図２０Ａ）。メタノールを、一定の窒素流の下で蒸発させ、ＨＢＳＳに再懸濁させて、好中球走化性因子として使用した。示した刺激に対してＨ２９２単層の側底から頂端チャンバに遊走する好中球の数が示される。脂質抽出物を、スクランブル対照またはＭＲＰ２ノックダウン細胞のいずれかから単離し、ナイーブＨ２９２細胞の頂端チャンバに適用した（図２０Ｂ）。ＭＲＰ２ノックダウン細胞の脂質は、スクランブル対照と比較して好中球の遊走の低減を示したが、このことは、ＭＲＰ２が炎症促進性刺激を排出することを暗示している。ｆＭＬＰは陽性対照として作用した。ＨＢＳＳ＋を、スクランブル対照細胞またはＭＲＰ１ノックダウン細胞の頂端表面に適用して、馴化培地を生成した（図２０Ｃ）。炎症促進性脂質を、非馴化培地、スクランブル対照の馴化培地、またはＭＲＰ１ノックダウン細胞の馴化培地（ＭＲＰ１  ＫＤ）を用いて再懸濁させた。非馴化培地は、最大量の好中球の遊走を促進し、無傷ＭＲＰ１を含むスクランブル対照細胞は、好中球数の低減を示し、ＭＲＰ１ノックダウン細胞は、非馴化培地と等しい数の好中球を誘導したが、このことは、ＭＲＰ１が好中球阻害活性を助ける可能性が高いことを示している。炎症促進性脂質の代わりに細菌感染を利用する類似モデルでは、ＭＲＰ２阻害剤であるプロベネシド（１００ｕＭ）は、ほぼ同じ効率で好中球の遊走を低減する（図２０Ｄ）。
【図２０Ｄ】図２０Ａ〜２０Ｄは、分泌された上清が、抗炎症性（ＭＲＰ１）または炎症性（ＭＲＰ２）表現型を付与することを示す。炎症促進性脂質（図２０Ａでは三角によって表されている）を、感染Ｈ２９２単層から頂端上清をプールすることによって単離した。これをＣ−１８カラムに適用し、保存のためにメタノールで溶出した（図２０Ａ）。メタノールを、一定の窒素流の下で蒸発させ、ＨＢＳＳに再懸濁させて、好中球走化性因子として使用した。示した刺激に対してＨ２９２単層の側底から頂端チャンバに遊走する好中球の数が示される。脂質抽出物を、スクランブル対照またはＭＲＰ２ノックダウン細胞のいずれかから単離し、ナイーブＨ２９２細胞の頂端チャンバに適用した（図２０Ｂ）。ＭＲＰ２ノックダウン細胞の脂質は、スクランブル対照と比較して好中球の遊走の低減を示したが、このことは、ＭＲＰ２が炎症促進性刺激を排出することを暗示している。ｆＭＬＰは陽性対照として作用した。ＨＢＳＳ＋を、スクランブル対照細胞またはＭＲＰ１ノックダウン細胞の頂端表面に適用して、馴化培地を生成した（図２０Ｃ）。炎症促進性脂質を、非馴化培地、スクランブル対照の馴化培地、またはＭＲＰ１ノックダウン細胞の馴化培地（ＭＲＰ１  ＫＤ）を用いて再懸濁させた。非馴化培地は、最大量の好中球の遊走を促進し、無傷ＭＲＰ１を含むスクランブル対照細胞は、好中球数の低減を示し、ＭＲＰ１ノックダウン細胞は、非馴化培地と等しい数の好中球を誘導したが、このことは、ＭＲＰ１が好中球阻害活性を助ける可能性が高いことを示している。炎症促進性脂質の代わりに細菌感染を利用する類似モデルでは、ＭＲＰ２阻害剤であるプロベネシド（１００ｕＭ）は、ほぼ同じ効率で好中球の遊走を低減する（図２０Ｄ）。
【００６８】
【図２１】図２１Ａ〜Ｂは、感染中のＭＲＰの調査を示す。ＮＩＨ−Ｈ２９２細胞を感染させ、次にＭＲＰプロファイルを、ｍＲＮＡ  ＲＴ−ＰＣＲ定量化、タンパク質ウエスタンブロット、および細胞表面ビオチン化（ウエスタンブロットと共に）の３つの異なる技術によって作製した。ＭＲＰ１、２、３、４、５、およびＰ−ｐｇを、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染時に可能な変化について調査した。ＲＴ−ＰＣＲにより、肺炎球菌感染中、ＭＲＰ１がわずかに低減し、ＭＲＰ２およびＭＲＰ５がわずかに増大したことが明らかになった（図２１Ｂ）。全細胞ライセートでは、ＧＡＰＤＨに対して正規化され、ＩｍａｇｅＪによって分析される通り、ウエスタンブロットの右に示される増大または低減が明らかになった（図２１Ａ）。Ｐ−ｇｐおよびＭＲＰ３は、これらの方法のいずれによっても検出不可能であった。
【００６９】
【図２２】図２２Ａおよび２２Ｂは、ＭＲＰノックダウン細胞のアポトーシスの試験を示す。対照構築物、ＭＲＰ１  ｓｈＲＮＡ、またはＭＲＰ２  ｓｈＲＮＡを有するＨ２９２細胞を、感染前（図２２Ａ）または感染後（図２２Ｂ）のいずれかに、アポトーシスのために染色した。どちらの場合も、染色手順中にアポトーシスの著しい増大はなかった。
【００７０】
【図２３】図２３は、ＭＲＰ１のヒトタンパク質配列、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００４９８７．２（配列番号０６）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書では以下の用語が使用され、その定義を指針のために提供する。
【００７２】
一般に、「置換されている」は、それに含有されている水素原子との１つまたは複数の結合が、非水素原子または非炭素原子との結合によって置き換えられている、以下に定義される通りの有機基（例えば、アルキル基）を指す。置換されている基には、炭素原子または水素原子との１つまたは複数の結合が、ヘテロ原子との二重結合または三重結合を含む１つまたは複数の結合によって置き換えられている基も含まれる。したがって、置換されている基は、別段の指定がない限り、１つまたは複数の置換基で置換されている。一部の実施形態では、置換されている基は、１、２、３、４、５、または６個の置換基で置換されている。当業者は、本発明の技術の置換されている基が、それが出現する化合物の単離を可能にする化学的に安定な基であることを理解されよう。置換基の例として、ハロゲン（すなわち、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩ）；ヒドロキシル；アルコキシ、アルケンオキシ（ａｌｋｅｎｏｘｙ）、アリールオキシ、アラルキルオキシ、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルオキシ、およびヘテロシクリルアルコキシ基；カルボニル（オキソ）；カルボキシレート；エステル；ウレタン；オキシム；ヒドロキシルアミン；アルコキシアミン；アラルコキシアミン；チオール；スルフィド；スルホキシド；スルホン；スルホニル；スルホンアミド；アミン；Ｎ−オキシド；アジド；アミド；尿素；アミジン；グアニジン；ニトロ基；ニトリル（すなわち、ＣＮ）等が挙げられる。
【００７３】
アルキル基には、（別段の指定がない限り）１〜１２個の炭素原子、典型的に１〜１０個の炭素を有し、または一部の実施形態では１〜８、１〜６もしくは１〜４個の炭素原子を有する、直鎖および分岐鎖のアルキル基が含まれる。アルキル基は、置換されていても置換されていなくてもよい。直鎖アルキル基の例として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、およびｎ−オクチル基などの基が挙げられる。分岐アルキル基の例として、それに限定されるものではないが、イソプロピル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチル、イソペンチル、および２，２−ジメチルプロピル基が挙げられる。代表的な置換アルキル基は、先に列挙されるものなどの置換基で１回または複数回置換されていてよく、置換アルキル基には、それに限定されるものではないが、ハロアルキル（例えば、トリフルオロメチル）、ヒドロキシアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル等が含まれる。一部の実施形態では、アルキル基は、１、２または３個の置換基で置換されている。
【００７４】
アルケニル基は、少なくとも１つの二重結合が２個の炭素原子の間に存在することを除いて、先に定義される通りの直鎖および分岐鎖アルキル基を含む。アルケニル基は、置換されていても置換されていなくてもよい。アルケニル基は、２〜１２個の炭素原子、典型的に２〜１０個の炭素を有し、または一部の実施形態では２〜８、２〜６もしくは２〜４個の炭素原子を有する。一部の実施形態では、アルケニル基は、１つ、２つ、または３つの炭素−炭素二重結合を有する。その例として、それに限定されるものではないが、中でもビニル、アリル、−ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ３）、−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ３）２、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ（ＣＨ３）、−Ｃ（ＣＨ２ＣＨ３）＝ＣＨ２が挙げられる。代表的な置換アルケニル基は、一置換されていてよく、または２回以上置換されていてよく、例えば先に列挙されるものなどの置換基で、例えばそれに限定されるものではないが、一置換、二置換または三置換されていてよい。
【００７５】
ヘテロアルキル基およびヘテロアルケニル基は、それぞれ、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１〜６個のヘテロ原子を含むアルキル基（本明細書で定義の通り）およびアルケニル基（本明細書で定義の通り）である。存在する各ヘテロ原子は、ヘテロアルキルまたはヘテロアルケニル基内の少なくとも１個の炭素原子に結合していることを理解されよう。一部の実施形態では、ヘテロアルキル（ｈｅｔｅｒｏａｋｌｙｌ）またはヘテロアルケニル（ｈｅｔｅｔｅｒｏａｌｋｅｎｙｌ）基は、１、２または３個のヘテロ原子を含む。ヘテロアルキルおよびヘテロアルケニル基は、置換されていても置換されていなくてもよい。ヘテロアルキル基の例として、それに限定されるものではないが、ＣＨ３ＣＨ２ＯＣＨ２、ＣＨ３ＮＨＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）ＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ２ＳＣＨ２、ＣＨ３ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２が挙げられる。ヘテロアルケニル基の例として、それに限定されるものではないが、ＣＨ２＝ＣＨＯＣＨ２、ＣＨ２＝ＣＨＮ（ＣＨ３）ＣＨ２、およびＣＨ２＝ＣＨＳＣＨ２が挙げられる。代表的な置換ヘテロアルキルまたはヘテロアルケニル（ｈｅｔｅｒｏａｌｋｅｎｅｙｌ）基は、例えば先に列挙されるものなどの置換基で、１回または複数回（例えば、１、２または３回）置換されていてよく、それらの基には、それに限定されるものではないが、ハロヘテロアルキル（例えば、トリフルオロメチルオキシエチル）、カルボキシアルキルアミノアルキル、メチルアクリレート等が含まれる。
【００７６】
シクロアルキル基は、環に３〜１２個の炭素原子を有し、または一部の実施形態では、３〜１０、３〜８もしくは３〜４、５もしくは６個の炭素原子を有する、単環式、二環式または三環式アルキル基を含む。シクロアルキル基は、置換されていても置換されていなくてもよい。例示的な単環式シクロアルキル基として、それに限定されるものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチル基が挙げられる。一部の実施形態では、シクロアルキル基は、３〜８個の環員を有し、一方、他の実施形態では、環炭素原子の数は、３〜５、３〜６、または３〜７の範囲である。二環式および三環式環系には、架橋シクロアルキル基および縮合環の両方、例えばそれに限定されるものではないが、ビシクロ［２．１．１］ヘキサン、アダマンチル、デカリニル等が含まれる。置換シクロアルキル基は、先に定義される通り、非水素基および非炭素基で１回または複数回置換されていてよい。しかし、置換シクロアルキル基には、先に定義される通りの直鎖または分岐鎖のアルキル基で置換されている環も含まれる。代表的な置換シクロアルキル基は、一置換されていてよく、または２回以上置換されていてよく、先に列挙されるものなどの置換基で置換されていてよい、例えばそれに限定されるものではないが、２，２−、２，３−、２，４−、２，５−または２，６−二置換シクロヘキシル基である。
【００７７】
シクロアルキルアルキル基は、アルキル基の水素結合または炭素結合が、先に定義される通りのシクロアルキル基との結合で置き換えられている、先に定義される通りのアルキル基である。シクロアルキルアルキル基は、置換されていても置換されていなくてもよい。一部の実施形態では、シクロアルキルアルキル基は、４〜１６個の炭素原子、４〜１２個の炭素原子、典型的に４〜１０個の炭素原子を有する。置換シクロアルキルアルキル基は、アルキル、シクロアルキル、またはその基のアルキル部分およびシクロアルキル部分の両方において置換されていてよい。代表的な置換シクロアルキルアルキル基は、一置換されていてよく、または２回以上置換されていてよく、例えば先に列挙されるものなどの置換基で、例えばそれに限定されるものではないが、一置換、二置換または三置換されていてよい。
【００７８】
本発明の技術の化合物における、２つまたはそれよりも多い結合点を有する本明細書に記載される基（すなわち、二価、三価、または多価）は、接尾辞「エン」を使用することによって指定される。例えば、二価のアルキル基は、アルキレン基であり、二価のシクロアルキル基は、シクロアルキレン基であり、二価のヘテロアルキル基は、ヘテロアルキレン基であり、二価のアルケニル基は、アルケニレン基等である。本発明の技術の化合物との単一結合点を有する置換されている基は、「エン」の名称では呼ばれない。したがって、例えばクロロエチルは、本明細書ではクロロエチレンと呼ばれない。
【００７９】
被験体に分子を「投与」するという用語は、被験体に分子を送達することを意味する。「投与」には、組成物の予防的投与（すなわち、疾患および／または疾患の１つもしくは複数の症状が検出可能になる前）および／または組成物の治療的投与（すなわち、疾患および／または疾患の１つもしくは複数の症状が検出可能になった後）が含まれる。本発明の技術の方法は、１つまたは複数の化合物を投与するステップを含む。２つ以上の化合物が投与されるべき場合、化合物は、一緒にして実質的に同時に投与することができ、かつ／または任意の順序で異なる時間に投与することができる。また、本発明の技術の化合物は、別の種類の薬物の投与または治療手順（例えば、手術）の前に、それと同時、および／またはその後に投与することができる。
【００８０】
「変える」および「改変する」という用語は、第２の試料と比較した（または第２の被験体と比較した）、第１の試料（または第１の被験体）における任意の分子（例えば、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）、多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）、ヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼ、Ｎ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）、アミノ酸配列、核酸配列、抗体等）、細胞、および／または現象のレベル（例えば、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）および／または多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）および／またはヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼおよび／またはＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）の活性レベル、遺伝子の発現レベル、疾患の症状、２つの分子の結合レベル、例えばホルモンリガンドとそのホルモン受容体との結合レベル、２つの分子の結合特異性、２つの分子の結合親和性、疾患の症状、疾患に対する特異性、疾患に対する感受性、結合親和性、酵素活性等）に言及する場合、増大および／または低減を指す。
【００８１】
「カンナビノイド受容体タイプ２」（「ＣＢ２」）は、ヒトにおいてＣＮＲ２遺伝子によってコードされるカンナビノイド受容体ファミリー由来のＧタンパク質結合受容体である。ＣＢ２受容体の主な内在性リガンドは、２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）である。
【００８２】
「コンジュゲートすること」という用語および文法的等価物は、目的の分子およびポリマーをコンジュゲートすることに言及する場合、目的の分子をポリマーに共有結合によって連結することを意味する。連結は、直接的であってよい。あるいは、連結は、連結基または連結部分を介する間接的なものであってよい。ポリマーとコンジュゲーションさせる方法は、融合タンパク質を生成するためにポリペプチドとコンジュゲーションさせるための方法を含めて、当技術分野で公知である（Ｐａｓｕｔ，  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ６：１６０−１７８  （２０１４）；  Ｍｅｄｓｃａｐｅ，  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（６）：９１５−９３５  （２０１０））。一部の実施形態では、コンジュゲートは、連結基であるジアミノヘキサンを介して、過ヨウ素酸で酸化された４０ｋＤａのデキストランに化学的にコンジュゲートしたプロベネシドによって例示される（実施例３）。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」または「薬学的有効量」という用語は、望ましい治療的および／または予防的効果を達成するのに十分な量、例えば、それを必要とする被験体の炎症（例えば、標的組織への好中球の遊走と関連する炎症）、または炎症と関連する疾患もしくは障害もしくは症状を完全にまたは部分的に改善する量を指す。治療的または予防的適用の文脈では、被験体に投与される組成物の量は、疾患の種類および重症度、ならびに個体の特徴、例えば全体的な健康状態、年齢、性別、体重および薬物に対する耐性に応じて決まる。組成物の量はまた、疾患の程度、重症度および種類に応じて決まる。当業者は、これらおよび他の因子に応じて適切な投与量を決定することができる。組成物は、１つまたは複数のさらなる治療化合物と組み合わせて投与することもできる。一部の実施形態では、複数の用量が投与される。さらにまたは代替として、一部の実施形態では、複数の治療組成物または化合物が投与される。本明細書に記載される方法では、治療化合物は、炎症（例えば、組織への好中球の遊走の増大と関連する炎症）と関連する疾患または障害の１つまたは複数の徴候または症状を有する被験体に投与することができる。
【００８４】
「内在性カンナビノイド」（「ＥＣ」）は、カンナビノイド受容体ＣＢ１およびＣＢ２、ならびにより近年になって説明されている非定型受容体ＧＰＲ５５およびＧＰＲ１１９に結合する化合物である。エイコサノイドタイプのＥＣの２つの主なクラスが、「Ｎ−アシルエタノールアミン」（「ＮＡＥ」）およびモノアシルグリセロール（ＭＡＧ）であり、それらはそれぞれ、脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）およびモノアシルグリセロールリパーゼ（ＭＡＧＬ）によって代謝される。「Ｎ−アシルエタノールアミン」は、内在性カンナビノイド（ｅｎｄｏｃａｎｎａｂｉｎｏｄ）であり、いくつかの種類のアシル基の１つが、エタノールアミンの窒素原子と連結する場合に形成されるある種の脂肪酸アミドである。Ｎ−アシルエタノールアミンは、脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）によって代謝される。例示的なＮ−アシルエタノールアミン内在性カンナビノイドとして、エタノールアミン、アラキドン酸（２０：４、ω−６）のアミドであるアナンダミド（ＡＥＡ）（Ｎ−アラキドノイルエタノールアミド）（図２Ｅ）、オレオイルエタノールアミド（ＯＥＡ）、およびアルファ−リノレノイルエタノールアミド（α−ＬＥＡ）（図２Ｆ）が挙げられる。
【００８５】
「上皮組織」は、上皮細胞、すなわち明確な頂端、側面および基底細胞膜領域／ドメインの特色となる極性細胞型を含有する。上皮細胞は、それらの側方膜（ｌａｔｅｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）によって互いに結合して、動物身体中の腔および表面を裏打ちする上皮シートを形成する。各細胞膜ドメインは、明確なタンパク質組成を有しており、それがそのドメインに明確な特性を付与し、上皮シートを横切る分子の方向性輸送を可能にする。上皮細胞の「頂端」領域は、密着結合の上にある領域と定義され、組織の管腔または外表面に面する頂端膜を含有する。上皮細胞の「側底」領域は、密着結合の下にある側面であり、基底膜と接触している側底膜を含有する。
【００８６】
「脂肪酸アミドヒドロラーゼ」、「ＦＡＡＨ」および「ＥＣ３．５．１．９９」は、セリンヒドロラーゼファミリーの酵素のメンバーを交換可能に指す。これは、アナンダミドを分解することが最初に示された。これは、ヒトでは、遺伝子ＦＡＡＨによってコードされ、ｍＲＮＡ配列番号０５によってコードされたヒトＦＡＡＨによって例示される（図１５）。
【００８７】
「ヘポキシリンＡ３シンターゼ」、「ＨＸＡ３シンターゼ」、「ＡＬＯＸ１２」、「１２−リポキシゲナーゼ」、「アラキドン酸１２−リポキシゲナーゼ」、「１２Ｓ−リポキシゲナーゼ」、「１２−ＬＯＸ」および「１２Ｓ−ＬＯＸ」は、染色体１７ｐ１３．３上の他のリポキシゲナーゼ（ｌｉｐｏｙｘｇｅｎａｓｅｓ）と共に位置する、ヒトにおいてＡＬＯＸ１２遺伝子によってコードされるリポキシゲナーゼタイプの酵素（すなわち、ｃｉｓ，ｃｉｓ−１，４−ペンタジエン構造を含有する脂質における多価不飽和脂肪酸の二原子酸素添加を触媒する酵素）を交換可能に指す。Ａｌｏｘ１２は、ｍＲＮＡ配列番号０１によってコードされたヒトＡｌｏｘ１２によって例示される（図１１）。Ａｌｏｘ１２はまた、ラットＡｌｏｘ１５によって例示され、これは、アラキドン酸を１５Ｓ−ヒドロペルオキシエイコサテトラエン酸に変換し、アラキドン酸のＣ−１２およびリノール酸に対して作用する。ラットＡｌｏｘ１５は、ｍＲＮＡ配列番号０４によってコードされる（図１４）。
【００８８】
「増大する」という用語は、化合物、例えばＮ−アシルエタノールアミンに言及する場合、Ｎ−アシルエタノールアミンのレベルおよび／または活性の増大を意味する。「増大する」、「増加する」、「上昇する」という用語および文法的等価物（「より高い」、「より多い」等を含む）は、第２の試料と比較した（または第２の被験体と比較した）、第１の試料（または第１の被験体）における任意の分子（例えば、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）、多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）、ヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼ、Ｎ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）、アミノ酸配列、および核酸配列、抗体等）、細胞、および／または現象のレベル（例えば、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）および／または多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）および／またはヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼおよび／またはＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）の活性レベル、遺伝子の発現レベル、疾患の症状、２つの分子の結合レベル、例えばホルモンリガンドとそのホルモン受容体との結合レベル、２つの分子の結合特異性、２つの分子の結合親和性、疾患の症状、疾患に対する特異性、疾患に対する感受性、結合親和性、酵素活性等）に言及する場合、第１の試料（または第１の被験体）における分子、細胞および／または現象の量が、第２の試料（または第２の被験体）におけるよりも、任意の当技術分野で許容される分析の統計法を使用して統計的に有意な任意の量だけ多いことを意味する。一実施形態では、第１の試料（または第１の被験体）における分子、細胞および／または現象の量は、第２の試料（または第２の被験体）における同じ分子、細胞および／または現象の量よりも、少なくとも１０％多く、少なくとも２５％多く、少なくとも５０％多く、少なくとも７５％多く、および／または少なくとも９０％多い。これには、第２の試料（または第２の被験体）における同じ分子、細胞および／または現象の量よりも、それに限定されるものではないが、少なくとも１０％多い、少なくとも１５％多い、少なくとも２０％多い、少なくとも２５％多い、少なくとも３０％多い、少なくとも３５％多い、少なくとも４０％多い、少なくとも４５％多い、少なくとも５０％多い、少なくとも５５％多い、少なくとも６０％多い、少なくとも６５％多い、少なくとも７０％多い、少なくとも７５％多い、少なくとも８０％多い、少なくとも８５％多い、少なくとも９０％多い、および／または少なくとも９５％多い量の第１の試料（または第１の被験体）における分子、細胞、および／または現象が含まれる。一実施形態では、第１の試料（または第１の被験体）は、それに限定されるものではないが、本発明の技術の組成物および／または方法を使用して操作された試料（または被験体）によって例示される。さらなる実施形態では、第２の試料（または第２の被験体）は、それに限定されるものではないが、本発明の技術の組成物および／または方法を使用して操作されていない試料（または被験体）によって例示される。代替の実施形態では、第２の試料（または第２の被験体）は、それに限定されるものではないが、第１の被験体と比較して異なる投与量および／または異なる期間および／または異なる投与経路で、本発明の技術の組成物および／または方法を使用して操作された試料（または被験体）によって例示される。一実施形態では、第１および第２の試料（または被験体）は、例えば、１つの試料（または被験体）に対して、本発明の技術の組成物および／または方法の異なるレジメン（例えば、投与量、期間、投与経路等）の効果を決定することが求められる場合には、同じであってよい。別の実施形態では、第１および第２の試料（または被験体）は、例えば、１つの試料（被験体）に対する本発明の技術の組成物および／または方法の効果を比較する場合には、例えば臨床治験に参加している患者および入院中の別の個体のように異なっていてよい。
【００８９】
「阻害する」という用語は、化合物、例えば、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）、ヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼ等に言及して使用される場合、ＨＸＡ３の活性および／またはレベルの阻害を意味する。「阻害する」、「低減する」、「減少する」、「抑制する」、「低下する」という用語および文法的等価物（「より低い」、「より少ない」等を含む）は、第２の試料と比較した（または第２の被験体と比較した）、第１の試料（または第１の被験体）における任意の分子（例えば、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）、多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）、ヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼ、Ｎ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）、アミノ酸配列、および核酸配列、抗体等）、細胞、および／または現象のレベル（例えば、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）および／または多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）および／またはヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼおよび／またはＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）の活性レベル、遺伝子の発現レベル、疾患の症状、２つの分子の結合レベル、例えばホルモンリガンドとそのホルモン受容体との結合レベル、２つの分子の結合特異性、２つの分子の結合親和性、疾患の症状、疾患に対する特異性、疾患に対する感受性、結合親和性、酵素活性等）に言及する場合、第１の試料（または第１の被験体）における分子、細胞および／または現象の量が、第２の試料（または第２の被験体）におけるよりも、任意の当技術分野で許容される分析の統計法を使用して統計的に有意な任意の量だけ少ないことを意味する。一実施形態では、第１の試料（または第１の被験体）における分子、細胞および／または現象の量は、第２の試料（または第２の被験体）における同じ分子、細胞および／または現象の量よりも、少なくとも１０％少なく、少なくとも２５％少なく、少なくとも５０％少なく、少なくとも７５％少なく、および／または少なくとも９０％少ない。別の実施形態では、第１の試料（または第１の被験体）における分子、細胞、および／または現象の量は、第２の試料（または第２の被験体）における同じ分子、細胞および／または現象の量よりも、５％〜１００％の任意のパーセンテージ数値だけ少なく、例えばそれに限定されるものではないが、１０％〜１００％、２０％〜１００％、３０％〜１００％、４０％〜１００％、５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％、８０％〜１００％、および９０％〜１００％少ない。一実施形態では、第１の試料（または第１の被験体）は、それに限定されるものではないが、本発明の技術の組成物および／または方法を使用して操作された試料（または被験体）によって例示される。さらなる実施形態では、第２の試料（または第２の被験体）は、それに限定されるものではないが、本発明の技術の組成物および／または方法を使用して操作されていない試料（または被験体）によって例示される。代替の実施形態では、第２の試料（または第２の被験体）は、それに限定されるものではないが、第１の被験体と比較して異なる投与量および／または異なる期間および／または異なる投与経路で、本発明の技術の組成物および／または方法を使用して操作された試料（または被験体）によって例示される。一実施形態では、第１および第２の試料（または被験体）は、例えば、１つの試料（または被験体）に対して、本発明の技術の組成物および／または方法の異なるレジメン（例えば、投与量、期間、投与経路等）の効果を決定することが求められる場合には、同じであってよい。別の実施形態では、第１および第２の試料（または被験体）は、例えば、１つの試料（被験体）に対する本発明の技術の組成物および／または方法の効果を比較する場合には、例えば臨床治験に参加している患者および入院中の別の個体のように異なっていてよい。
【００９０】
「粘膜組織」は、様々な管状構造を裏打ちする粘膜組織を指す。粘膜組織は、上皮、粘膜固有層を含み、消化管では平滑筋層（粘膜筋板）を含む。
【００９１】
「多剤耐性関連タンパク質２」、「多剤耐性タンパク質２」（「ＭＲＰ２」）、「胆管側多選択性有機アニオントランスポーター１」（「ｃＭＯＡＴ」）、「ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣメンバー２」（「ＡＢＣＣ２」）は、ヒトにおいてＡＢＣＣ２遺伝子によってコードされるタンパク質を指すために交換可能に使用される。ＭＲＰ２は、ｍＲＮＡ配列番号０２によってコードされたヒトＭＲＰ２によって例示される（図１２）。
【００９２】
「多剤耐性タンパク質１」、「ＭＲＰ１」および「ＡＢＣＣ１」は、重要な治療薬を含む、広範な基質特異性を有する一方向性排出トランスポータータンパク質を指すために交換可能に使用される。このトランスポーターの主な役割の一部は、（ｉ）生体異物および内在性代謝産物の排出、（ｉｉ）炎症性メディエーター（例えば、ＬＴＣ４）の輸送、ならびに（ｉｉｉ）酸化ストレスに対する防御である。１９０ｋＤａのＭＲＰ１は、２つの膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）からなるコア構造を有しており、２つのドメインのそれぞれには、ヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）が続く。ＭＲＰ１は、ＭＲＰ２、３、６、および７と共通して、予測される５つの膜貫通セグメントを有する第３のＴＭＤ（ＴＭＤ０）およびリンカー領域（Ｌ０）によってコア構造に結合した余分な細胞質ＮＨ２末端を含有する（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６（１９）：１３０７６−１６０８２  （２００１））。ＴＭＤ０は、細胞膜へのＭＲＰ１の輸送にとって重要であると思われ（Ｂａｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  １１３（Ｐｔ  ２４）：４４５１−４４６１  （２０００））、ＴＭＤ０およびＬ０の正確な役割、機序、および依存性は、重要な研究の対象となっている（Ｗｅｓｔｌａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ  １６（５）：２４８３−２４９２  （２００５））。ＭＲＰ１は、疎水性のアニオン性分子、グルクロニドおよびグルタチオンコンジュゲート、ならびに内在性グルタチオンを輸送する、広範な基質特異性を有している。多くのＭＲＰ１基質がグルタチオンにコンジュゲートされるが、遊離グルタチオンの共輸送がしばしば観測されており、その共輸送は、例えばビンクリスチンおよびダウノルビシンの輸送を刺激すると思われる（Ｈｏｏｉｊｂｅｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４６９：４７−５１（２０００））。グルタチオン自体は、ＭＲＰ１の低親和性基質である（Ｋｍ＝１〜５ｍＭ）。複数のアロステリック的に協同的な非オーバーラップ基質結合部位が想定され、それによって、なぜ様々な基質が相互阻害し、かつ相互刺激するかについて説明することができる（Ｂａｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ  −  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ４５３：６２１−６４１（２００７））。炎症性サイトカインＬＴＣ４およびその主な代謝産物ＬＴＤ４は、最も高い親和性のＭＲＰ１基質の一部であり、このことは、ＬＴＣ４生成細胞からのサイトカイン放出におけるＭＲＰ１の非常に重要な役割を示唆している。実際、細胞内ＬＴＣ４蓄積が、ｍｒｐ１（−／−）マウスで観測された（Ｒｏｂｂｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  １０３：７５７−７６８  （２０００））。さらに、ノックアウトｍｒｐ１（−／−）マウスは、通常の表現型を伴って生存可能であり、健康で繁殖力を有するが、細胞傷害性薬物に対して過敏であった（Ｗｉｊｎｈｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ３：１２７５−１２７９  （１９９７））。ＭＲＰ１は、ＤＮＡ配列ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０２８２６８．１によってコードされたヒトタンパク質配列ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００４９８７．２（配列番号０６��（図２３）によって例示される。ＭＲＰ１において少なくとも１５の天然に存在する変異が特定されており、それらの多くは、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏ輸送活性に影響を及ぼすことが見出されている。多型および変異誘発の研究は、Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  １８：４３９−４８１  （２０１１）において総説されている。多くのＭＲＰ１  ＳＮＰが公知であるが、集団におけるそれらの発生は、比較的少ないことが報告されている。中国本土の集団では、Ｃｙｓ４３Ｓｅｒ（１２８Ｇ＞Ｃ）、Ｔｈｒ７３Ｉｌｅ（２１８Ｃ＞Ｔ）、Ａｒｇ７２３Ｇｌｎ（２１６８Ｇ＞Ａ）およびＡｒｇ１０５８Ｇｌｎ（３１７３Ｇ＞Ａ）のＭＲＰ１多型対立遺伝子頻度は、それぞれ０．５％、１．４％、５．８％および０．５％であった（Ｊｉ−Ｙｅ  Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９（３）：２０６−２１６  （２００９））。
【００９３】
「Ｐ−糖タンパク質」（「Ｐ−ｇｐ」）は、排出膜トランスポーターであり、細胞取込み、ならびに生体異物および毒性物質の分布の制限に関与する。Ｐ−ｇｐは、ｍＲＮＡ配列番号０３によってコードされたヒトＰ−ｇｐによって例示される（図１３）。
【００９４】
「ポリマー」は、一緒に結合した多数の類似の単位から主になり、または完全にそれからなる分子構造を有する物質である。ポリマーは、天然に存在するもの（例えば、セルロース、ポリペプチド、ヌクレオチド配列等）であってよく、または人工のもの（例えば、プラスチック、樹脂等）である。ポリマーは、それらがコンジュゲートする薬物の担体として使用することができ、コンジュゲートされた薬物の溶解度を増強し、その薬物動態プロファイルを改善し、薬物を分解から保護し、ある特定の条件下で、例えばｐＨ変化、またはエステラーゼ、リパーゼもしくはプロテアーゼなどの酵素の存在下で薬物を放出することができる。さらに、標的化部分または可溶化剤をコンジュゲートに導入して、その治療指数を引き上げることもできる（Ｍｅｄｓｃａｐｅ，  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５（６）：９１５−９３５（２０１０））。ポリマーは、例えばコンジュゲートされた薬物が、特定の身体区画に（例えば、胃腸管腔から下層組織に）入るのを防止することによって、ポリマーにコンジュゲートされた薬物の分布を制限するために利用することもできる。ポリマーは、天然ポリマーおよび／または合成直鎖ポリマーであってよく、それには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、過ヨウ素酸で酸化されたデキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、デキストリン、ヒドロキシエチル−デンプン（ＨＥＳ）、ポリ（２−エチル２−オキサゾリン）（ＰＥＯＺ）、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＡ／ＰＬＧＡ）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタアクリルアミド）、ポリグリセロール、２５ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、およびポリペプチドが含まれる。一部の実施形態では、ポリマーは、過ヨウ素酸で酸化された４０ｋＤａのデキストランに化学的にコンジュゲートしたプロベネシドによって例示される、過ヨウ素酸で酸化された４０デキストランである（実施例３）。
【００９５】
「ＳｉｐＡ」および「ＳａｌｍｏｎｅｌｌａＴ３ＳＳエフェクタータンパク質」は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｓｔｒ．ＳＬ１３４４の完全なゲノム配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０１６８１０．１）のＤＮＡ配列（Ｌｏｃｕｓ  ｔａｑ）ＳＬ１３４４＿２８６１によってコードされたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ｓｔｒ．ＳＬ１３４４（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ８６６１８．１）のアミノ酸配列によって例示される通り、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａによって生成されたタンパク質を指すために交換可能に使用される。ＳｉｐＡ配列は、国際公開第２０１５／０８９２６８号によって提供されている。
【００９６】
炎症に罹患し得る「標的組織」には、それに限定されるものではないが、上皮組織、粘膜組織等が含まれる。例示的な上皮組織および／または粘膜組織として、「炎症性疾患」、例えば腸管疾患（直腸炎、精巣炎、クローン病、大腸炎（例えば、潰瘍性結腸炎（ｃｏｌｉｔｉｓ  ｕｌｃｅｒｏｓａ）としても公知の潰瘍性大腸炎（ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ））、感染性／非感染性腸炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）等によって例示される）、炎症性肺状態（例えば、肺炎球菌感染、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および肺線維症）、炎症性皮膚疾患（例えば、皮膚炎（湿疹）、酒さ、脂漏性皮膚炎、および乾癬）、眼の疾患（ぶどう膜炎、網膜炎、角膜炎、黄斑変性症等によって例示される）、泌尿生殖器の疾患（例えば、尿路感染）、性感染病（例えば、淋病感染および／またはクラミジア感染、ならびにヘルペスによって例示される潰瘍形成疾患によって例示される炎症性疾患を含む骨盤腹膜炎）、尿道炎等を生じる、胃腸管、肺（例えば、気管支組織）、肝臓、胃、結腸、脳、胆嚢、腎臓、女性生殖器、眼、尿路等が挙げられる。本明細書で使用される場合、「標的組織」は、解剖学的空間、例えば腸管腔も包含する。
【００９７】
「処置すること」、「処置する」、「処置された」または「処置」は、本明細書で使用される場合、被験体、例えばヒトにおける本明細書に記載される疾患または障害（例えば、炎症）の処置を包含し、それには、（ｉ）疾患もしくは障害の阻害、すなわちその発症を抑止すること、（ｉｉ）疾患もしくは障害の軽減、すなわち障害の退行を引き起こすこと、（ｉｉｉ）障害の進行を減速すること、および／または（ｉｖ）疾患もしくは障害の１つもしくは複数の症状の進行を阻害、軽減もしくは減速することが含まれる。症状は、当技術分野で公知の方法、例えば生検および組織学、ならびに関連する酵素レベル、代謝産物または循環抗原または抗体（または他のバイオマーカー）を決定するための血液検査、生活の質の質問票、患者が記録した症状スコア、ならびにイメージング試験によって評価することができる。
【００９８】
本明細書で使用される場合、障害または状態の「防止」またはそれを「防止すること」は、統計的試料において、対照試料と比較して処置した試料における障害もしくは状態の発生を低減し、または対照試料と比較して障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状の発生を遅延させる化合物を指す。
【００９９】
記載される通り、医学的疾患および状態の様々な処置方法または防止方法は、「実質的」を意味することを企図され、これは、完全な処置または防止を含むが、完全には満たない処置または防止も含み、生物学的または医学的に関連する一部の結果が達成されることも理解されたい。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「被験体」、「個体」または「患者」という用語は、個々の生物、脊椎動物、哺乳動物、またはヒトであってよい。「哺乳動物」には、ヒト、非ヒト霊長類、マウス（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、トリ等が含まれる。一部の実施形態では、哺乳動物は、マウスである。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
【０１０１】
本発明の技術の方法および／または組成物による処置を「必要とする」被験体には、炎症に「罹患している」被験体（すなわち、炎症の１つまたは複数の臨床症状および／または不顕性症状を経験している、かつ／または示している被験体）、および炎症の「リスク」がある被験体が含まれる。処置を「必要とする」被験体には、炎症の動物モデルが含まれる。炎症の「リスク」がある被験体は、現在、炎症症状を示しておらず、疾患の１つまたは複数の症状を示す素因を持っている被験体を指す。この素因は、家族の病歴、遺伝的因子、環境因子、例えば環境に存在する有害な化合物への曝露等に基づき得る。本発明の技術は、任意の特定の徴候または症状に限定されることを企図されない。したがって、本発明の技術が、不顕性症状から本格的な炎症性疾患までの任意の範囲の疾患を経験している被験体を包含し、その被験体は、炎症性疾患と関連する指標（例えば、徴候および症状）の少なくとも１つを示していることが企図される。
【０１０２】
「実質的に同じ」、「実質的に変えない」、「実質的に不変」および文法的等価物は、任意の分子（例えば、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）、多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）、ヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼ、Ｎ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）、アミノ酸配列、核酸配列、抗体等）、細胞、および／または現象のレベル（例えば、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）および／または多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）および／またはヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼおよび／またはＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）の活性レベル、遺伝子の発現レベル、疾患の症状、２つの分子の結合レベル、例えばホルモンリガンドとそのホルモン受容体との結合レベル、２つの分子の結合特異性、２つの分子の結合親和性、疾患の症状、疾患に対する特異性、疾患に対する感受性、結合親和性、酵素活性等）に言及する場合、第１の試料（または第１の被験体）における分子、細胞および／または現象の量が、第２の試料（または第２の被験体）と比較して統計的に有意な量だけ増大も低減もしないことを意味する。したがって、一実施形態では、第１の試料（または第１の被験体）における分子、細胞、および／または現象の量は、第２の試料（または第２の被験体）における量の９０％〜１００％（例えば、９１％〜１００％、９２％〜１００％、９３％〜１００％、９４％〜１００％、９５％〜１００％、９６％〜１００％、９７％〜１００％、９８％〜１００％、および／または９９％〜１００％を含む）である。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、構成成分の「重量パーセント」は、具体的に反対のことを記載しない限り、構成成分が含まれる製剤または組成物の総重量に対する重量である。
【０１０４】
ＩＩ．概要
本発明の技術は、好中球媒介性炎症を処置するための方法および組成物を提供する。特に、本発明の技術は、それを必要とする哺乳動物被験体の標的組織の好中球媒介性炎症を処置するための方法であって、被験体に、多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）のレベルおよび／もしくは活性を増大する治療有効量の１つもしくは複数の第１の化合物を投与するステップであって、ここで治療量の第１の化合物は、標的組織への好中球の遊走を低減する、ステップ、ならびに／または多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）およびヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼの１つもしくは複数を阻害する治療有効量の１つもしくは複数の第２の化合物を投与するステップであって、ここで治療量の第２の化合物は、標的組織への好中球の遊走を低減する、ステップ、ならびに／または１つもしくは複数のＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）を増大する治療有効量の１つもしくは複数の第３の化合物を投与するステップを含み、ここで治療量の第３の化合物は、標的組織への好中球の遊走を低減する、方法を提供する。
【０１０５】
一実施形態では、本開示は、炎症促進性ＭＲＰ２／ＨＸＡ３経路を標的にすることによって好中球媒介性炎症を処置するための方法であって、被験体に、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）およびヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼの１つまたは複数の活性および／またはレベルを阻害する治療有効量の１つまたは複数の化合物を投与するステップを含み、治療量の化合物が標的組織への好中球の遊走を低減する、方法を提供する。
【０１０６】
別の実施形態では、本開示はまた、抗炎症性Ｐ−ｇｐ／内在性カンナビノイド経路を標的にすることによって好中球媒介性炎症を処置するための方法であって、被験体に、１つまたは複数のＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）のレベルおよび／または活性を増大する治療有効量の１つまたは複数の化合物を投与するステップを含み、治療量の化合物が標的組織への好中球の遊走を低減する、方法を提供する。
【０１０７】
さらなる実施形態では、本開示はさらに、好中球媒介性炎症を処置するための方法であって、被験体に、多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）のレベルおよび／または活性を増大する治療有効量の１つまたは複数の第２の化合物を投与するステップを含み、治療量の化合物が標的組織への好中球の遊走を低減する、方法を提供する。
【０１０８】
さらに別の実施形態では、本開示は、抗炎症性Ｐ−ｇｐ／内在性カンナビノイド経路および炎症促進性ＭＲＰ２／ＨＸＡ３経路の両方を標的にすることによって好中球媒介性炎症を処置するための方法であって、被験体に、治療有効量の（Ａ）多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）およびヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼの１つまたは複数の活性および／またはレベルを阻害する１つまたは複数の第１の化合物、ならびに（Ｂ）１つまたは複数のＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）のレベルおよび／または活性を増大する１つまたは複数の第２の化合物を投与するステップを含み、治療量の第１および第２の化合物が標的組織への好中球の遊走を低減する、方法を提供する。
【０１０９】
細菌は、下気道感染の最も一般的な原因であり、世界中の他の多くの感染、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびマラリアよりも大きい疾患負荷をもたらす。アメリカ疾病予防管理センター（ＣＤＣ）は、細菌によって誘導される大部分の市中肺炎を引き起こす細菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎球菌）が、米国では毎年５００，０００の肺炎症例を引き起こしていると推定している。これらの症例の３０％もの多くが、菌血症も発症し、全症例の致死率は５〜７％に達しているおそれがあり、年間およそ３５，０００人が死亡している。菌血症の診断後の死亡率は著しく高く、症例の２０％に近い（Ｍｏｏｒｅ  ａｎｄ  Ｐｉｌｉｓｈｖｉｌｌｉ，  “Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ”．  Ｉｎ：  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅ−Ｐｒｅｖｅｎｔａｂｌｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅ−Ｐｒｅｖｅｎｔａｂｌｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｈａｍｂｏｒｓｋｙ  ａｎｄ  Ｗｏｌｆｅ，  Ｅｄｓ．  １３ｔｈ  ｅｄ．  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  ２０１５；  Ｐｉｌｉｓｈｖｉｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ”．  Ｃｈａｐｔｅｒ  １１．  ２０１２．  Ｉｎ：  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅ−ｐｒｅｖｅｎｔａｂｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｒｏｕｓｈ  ａｎｄ  Ｂａｌｄｙ，  Ｅｄｓ．  ５ｔｈ  ｅｄ．  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，  Ａｔｌａｎｔａ，  ＧＡ，  ２００８）。さらに、肺炎球菌疾患は、ワクチンおよび抗生物質による処置が利用可能になっているにもかかわらず、年間およそ５０〜１００万人の若年者の死亡に寄与している（Ｍｏｏｒｅ  ａｎｄ  Ｐｉｌｉｓｈｖｉｌｌｉ，  ２０１５；  Ｐｉｌｉｓｈｖｉｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ”．  Ｃｈａｐｔｅｒ  １１．  ２０１２．  Ｉｎ：  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅ−ｐｒｅｖｅｎｔａｂｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｒｏｕｓｈ  ａｎｄ  Ｂａｌｄｙ，  Ｅｄｓ．  ５ｔｈ  ｅｄ．  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，  Ａｔｌａｎｔａ，  ＧＡ，  ２００８；  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．  “Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ”．  Ｎｏ．  １４，  ２０１２，  ８７，  １２９−１４４．  Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｐａｐｅｒ  ｏｎ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  （Ａｐｒｉｌ  ２０１２））。
【０１１０】
肺炎をもたらす呼吸器感染中の特徴的な病理は、肺毛細血管から管腔空間への多形核細胞（ＰＭＮまたは好中球）の動員である（Ｌｏｏｓｌｉ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，  Ｔｒａｎｓ．  Ａｍ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃｌｉｍａｔｏｌ．  Ａｓｓｏｃ．  ７４：１５−２８  （１９６２））。この応答は、細菌感染を最初に排除するように働くが、肺傷害および肺機能障害にも直接的に寄与する（Ｂａｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ６１（６）：２２２４−２２２９  （１９８６）；  Ｆｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  ４８（３）：３４４−３５１  （１９８１）；  Ｍｅｎｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｏｒａｘ  ６３（５）：４４７−４５２  （２００８））。実際、過度の炎症は、肺炎球菌肺炎の処置の初期の処置失敗および死亡率の主な原因である（Ｍｅｎｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００８））。さらに、血液への細菌浸潤が、炎症中の管腔空間へのＰＭＮ浸潤によって媒介され得ることを示す文献が増えつつある（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７５（４）：１５８６−１５９７  （２００７）；  Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  ９（５）：４０４−４１４  （２０１１）；  Ａｔｔａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７６（１１）：５３５０−５３５６  （２００８）；  Ｂｈｏｗｍｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９１（１０）：５１１５−５１２３  （２０１３））。
【０１１１】
肺炎球菌感染中のＰＭＮ流入の制御の根本にある機序をよりよく理解するために、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ誘導性のＰＭＮ遊走の宿主メディエーターおよび肺炎球菌肺感染後の敗血症における炎症の役割を調査した。肺炎球菌感染中の肺気道へのＰＭＮ遊走は、肺上皮細胞における１２−リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）の作用を介してアラキドン酸から誘導されたエイコサノイドである脂質走化性因子ヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）の生成を必要とすることが観測された（Ｂｈｏｗｍｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１３））。１２−ＬＯＸの薬理学的阻害または遺伝子破壊は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅで感染したマウスの肺へのＰＭＮ流入を著しく低減し、そうでなければ致死性の肺炎球菌による肺チャレンジに対してマウスを一様に生存させた（Ｂｈｏｗｍｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１３））。これらの知見は、肺炎球菌肺炎症が、１２−ＬＯＸ依存性ＨＸＡ３生成およびその後のＰＭＮ経上皮遊走によって肺上皮を撹乱することによって、高レベルの菌血症および全身感染にとって少なくとも部分的に必要となることを示している。
【０１１２】
腸管上皮に最初に重点を置いた研究では、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポーター多剤耐性関連タンパク質２（ＭＲＰ２；ＡＢＣＣ２またはｃ−ＭＯＡＴとしても公知）が、ＨＸＡ３の放出を容易にし、その分泌が粘膜表面における炎症性事象をモジュレートする状態によって制御されることが明らかになっている（Ｐａｚｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８１（１１）：８０４４−８０５２  （２００８））。上皮細胞の頂端表面へのＨＸＡ３の分泌は、腸管上皮の密着結合複合体を横切る勾配を確立し、ＰＭＮによって使用される走化性勾配を生成して、炎症部位における粘膜管腔を標的にする（Ｍｒｓｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０１（１９）：７４２１−７４２６  （２００４））。ＡＢＣトランスポーターは、元々、様々な細胞傷害性薬物を追い出すそれらの能力の結果として臨床的多剤耐性に寄与することが特定されたが、新しく出現した報告では、ＡＢＣトランスポーターが、宿主防御においてある役割を果たすことができ、炎症部位への免疫エフェクター細胞の遊走に関与していることがさらに記録された。さらに、多くの内在性ＡＢＣトランスポーター基質は、免疫制御効果を示す（Ｆｕｒｕｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  Ｏｔｈｅｒ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｄｉａｔ  １０６：３７−４４  （２０１３）；  Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ７３（１）：２４３−２５１  （２００８）；  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｄｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ  ４４９（６）：６８２−６８８  （２００６）；  Ｂｌｏｋｚｉｊｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８３（５１）：３５６３０−３５６３７  （２００８）；  Ｅｎｇｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｌａｍｍ．  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ．  １３（３）：２９１−２９７  （２００７）；  Ｐａｎｗａｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６１（１０）：５７３３−５７４４  （１９９８）；  Ｙａｃｙｓｈｙｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６０（８）：６７７−６８７  （１９９９））。しかし、炎症性事象中の肺においてこの活性を媒介するこのようなＡＢＣトランスポーターは、まだ特定されていない。
【０１１３】
細菌誘導性肺炎に対する特徴的な免疫反応は、血管系から肺の管腔空間へのＰＭＮの侵襲である（Ｌｏｏｓｌｉ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，  （１９６２））。この応答は、先天免疫を強化するように働くが、肺傷害および肺機能障害にも直接的に寄与する（Ｂａｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ６１（６）：２２２４−２２２９  （１９８６）；  Ｆｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ，  ４８（３）：３４４−３５１  （１９８１））。ＰＭＮの走化性力学および殺菌機能については多くのことが公知であるが、肺／気道上皮へのＰＭＮの動員を支配する機序は、十分には理解されていない。実際、肺炎球菌肺炎感染中に先天的免疫応答を媒介する多くの分子は冗長であり、かつ／またはＰＭＮ動員にとって重要ではない。例えば、ＴＬＲは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからのシグナル伝達を媒介するが、ＴＬＲ２が欠乏してもＴＬＲ４が欠乏しても、肺炎球菌肺炎中のＰＭＮ浸潤は損なわれない（Ｋｎａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７２（５）：３１３２−３１３８  （２００４）；  Ｂｒａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７２（２）：７８８−７９４  （２００４））。セレクチン、ＶＬＡ−４、およびＰＣＡＭ−１は、多くの炎症応答中のＰＭＮ動員に必要とされるが、肺炎球菌肺炎中は必要とされない（Ｍｉｚｇｅｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８４（２）：６３９−６４５  （１９９６）；  Ｔａｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  １６６（１）：５３−６０  （２００２）；  Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９９（３）：５２６−５３３  （１９９７）；  Ｔａｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  １６７（２）：１６４−１７０  （２００３））。ＣＤ１１／ＣＤ１８およびＩＣＡＭ−２は、肺において様々な刺激によって誘発されるＰＭＮ動員を最大限にする役割を果たすと考えられるが、肺炎球菌肺炎中は、ＰＭＮ動員には著しく寄与しない（Ｍｉｚｇｅｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６３（２）：９９５−９９９  （１９９９）；  Ｍｉｚｇｅｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃ．  Ｂｉｏｌ．  ６４（３）：２９１−２９７  （１９９８））。ＩＣＡＭ−１は、好中球の移動を完全に誘発する役割を果たし得るが、この効果は２４時間で喪失すると考えられる（Ｍｉｚｇｅｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８））。また、ＣＸＣケモカインは、肺炎球菌肺炎におけるＰＭＮ輸送において役割を果たすことが十分に考証されているが、ＰＭＮ動員におけるそれらの機能的冗長性により、治療剤としてのそれらの有効性が制限される（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７５（１１）：７５３０−７５３５  （２００５）；  Ｅｌｉａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．  １２（７）：５６５−５７３  （２０１０）；  Ｓｅｙｏｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２９（４５）：８００２−８０１１  （２０１１））。
【０１１４】
ＭＲＰ／ＨＸＡ３経路は、肺および腸管上皮の両方における複数の病原体による感染中に保存されることが示されているので、その経路が、感染がない状態でも炎症を推進するかどうかについて調査した（実施例３）。
【０１１５】
Ｐ−ｇｐをコードするｍｄｒ１ａ遺伝子が欠如したマウスは、自発性腸管炎症を発症する。Ｐ−ｇｐの欠如により炎症が促進されるという証拠、および公知の外因性Ｐ−ｇｐ基質の特徴により、Ｐ−ｇｐが、内在性生物活性脂質を分泌することができ、その脂質が、ＨＸＡ３媒介性遊走に拮抗するように働くことができるという仮説が得られた。恒常的上皮細胞の、Ｐ−ｇｐ依存性分泌型リピドーム（ｌｉｐｉｄｏｍｅ）を分析して、ＨＸＡ３媒介性好中球の遊走を阻害することができる脂質を特定した（実施例４）。
【０１１６】
例証された腸管腔（実施例３〜７）および例証された肺（実施例８〜１０）などの実施例３〜１０のデータは、好中球遊出の制御を理解するための意味合いを有している。
【０１１７】
本明細書のデータ（実施例３〜７）は、炎症促進性ＭＲＰ２／ＨＸＡ３軸と均衡するように作用する抗炎症性Ｐ−ｇｐ／内在性カンナビノイド経路を定義付けた（図１０）。さらに、提案されたこの動的関係は、１）Ｐ−ｇｐ機能不全と大腸炎の相関、２）Ｐ−ｇｐのための内在性非生体異物基質の存在、および３）ＣＢ２アゴニストによる大腸炎症状の抑制についての報告の根本にある機序を含む、いくつかの科学的疑問に対する潜在的に可能な説明を提供する。したがって、腸の管腔表面における炎症促進性ＭＲＰ２／ＨＸＡ３および／または抗炎症性Ｐ−ｇｐ／内在性カンナビノイド経路のモジュレーションは、炎症性疾患、例えば腸疾患を処置するための局所治療の開発にとって新しい手段となる。さらに、ＭＲＰ２／ＨＸＡ３経路は、感染性および非感染性肺炎症において保存され、このことは、この経路およびＰ−ｇｐ／内在性カンナビノイド経路が、他の粘膜表面における炎症を同様に制御し得ることを示唆している。
【０１１８】
したがって、一実施形態では、本発明の技術は、炎症促進性ＭＲＰ２／ＨＸＡ３経路を標的にすることによって好中球媒介性炎症を処置するための方法を提供する（図１０）。特定の実施形態では、それを必要とする哺乳動物被験体の標的組織の好中球媒介性炎症を処置するためのこの方法は、被験体に、ａ）多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）、およびｂ）ヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼの１つまたは複数の活性および／またはレベルを阻害する治療有効量の１つまたは複数の第１の化合物を投与するステップを含み、治療量の第１の化合物は、標的組織への好中球の遊走を低減する。本明細書のデータは、ＭＲＰ２／ＨＸＡ３の炎症促進的役割が、肺（実施例８〜１０）および腸管（実施例３〜７）の両方において類似しており、非感染性（無菌）炎症および病原体によって引き起こされる感染性（敗血症性）炎症の両方において類似していることを示している。
【０１１９】
一部の実施形態では、抗炎症性Ｐ−ｇｐ／内在性カンナビノイド経路を標的にすることによって炎症を処置することが望ましい場合もある（図１０）。したがって、一実施形態では、該方法はさらに、被験体に、１つまたは複数のＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）のレベルおよび／または活性を増大する治療有効量の１つまたは複数の第２の化合物を投与するステップを含み、治療量の第２の化合物は、標的組織への好中球の遊走を低減する。
【０１２０】
気道上皮におけるＡＢＣトランスポーターが、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染中にＰＭＮの遊走を支配する免疫調節的役割を果たすかどうかを決定するために、本明細書のデータ（実施例８〜１０）を得た。本明細書で実証される通り、ＡＢＣトランスポーターＭＲＰ１およびＭＲＰ２は、肺炎球菌感染中に異なる形で発現されるだけでなく、対照ＰＭＮ遊走の相反する役割を有する基質を活発に排出する。このユニークな関係を特徴付けると、ＭＲＰ１は、恒常的状態にある間、ＰＭＮ遊走を抑制する基質を排出するように見えるが、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａによる感染中、頂端表面におけるこのトランスポーターの発現は、著しく減少する。それとは対照的に、ＭＲＰ２は、ＰＭＮ遊走を促進する基質を排出し、肺炎球菌感染中、このトランスポーターは、頂端表面上に非常に豊富に存在する。したがって、実施例８〜１０のデータにより、肺系におけるＡＢＣトランスポーターが、ＰＭＮ応答を抑制する恒常的経路と、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどの病原体への応答中に活性化する炎症経路との間の平衡を制御する上である役割を果たし得ることが確立される。この平衡の調節不全は、先天的炎症応答の非常に特異的であるが有用なアームを支配する。
【０１２１】
実施例８〜１０に提示されているデータにより、排出トランスポーターが、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染中に肺上皮を横切るＰＭＮ遊走と協調する、上皮に特異的な均衡系が明らかになった。具体的には、ＭＲＰ１の発現は、非感染基底状態では、免疫抑制分子（すなわち、Ｌ−ＡＭＥＮＤ）の排出を媒介して、恒常性を維持し、非特異的ＰＭＮ遊走からのあらゆる付帯的損傷を防止する。ＭＲＰ２表面発現は、同じ恒常的状態で非常に低く、この経路の抗炎症性アームを強化する。しかし、ＭＲＰ１の発現は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅが導入されると低下して、感染部位における抗炎症性分子の有効濃度を低減する。逆に、ＭＲＰ２の頂端発現は増大して、ＨＸＡ３のような脂質ＰＭＮ走化性因子の排出を容易にし、エイコサノイドであるＨＸＡ３は、次にＰＭＮを感染／傷害部位に誘引することができ、多くの他の細菌感染においてある役割を果たすことが示されている（Ｐａｚｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００８）；  Ｍｒｓｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４）；  Ｈｕｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７３（９）：５７１２−５７２０  （２００４）；  Ｍｕｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７６（８）：３６１４−３６２７  （２００８）；  Ｂｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  １４（１）：１２０−１３２  （２０１２））。ＨＸＡ３が、上皮バリアを横切ってＰＭＮの動員を先導する炎症促進性メディエーターであるという１つの主張は、炎症ベースの疾患、例えば乾癬および感染性／非感染性腸炎におけるこの強力なＰＭＮ走化性因子の存在および機能の増大についての近年の報告によって強化されている（Ｍｒｓｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４）；  Ａｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １１０（４）：３０３−３１０  （１９９８））。ＨＸＡ３は、ラット肺でも検出されているが（Ｐａｃｅ−Ａｓｃｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  ８７５（２）：４０６−４０９  （１９８６））、細菌性肺感染から生じるＰＭＮ動員過程におけるその正確な役割は、まだ理解の途中である。
【０１２２】
実施例８〜１０の結果は、ＨＸＡ３／ＭＲＰ２およびＬ−ＡＭＥＮＤ／ＭＲＰ１軸が、肺の炎症を調節する一助になり得る普遍的機序の一部であることを示唆している。ＭＲＰ２の極性発現およびこのＨＸＡ３／ＭＲＰ２軸の活性は、炎症状態の間に大幅に増大し、この経路には、ＩＬ−８などのＰＭＮ動員を推進する他の走化性因子とは冗長性ではない。本明細書で提示されるデータは、ＭＲＰ１発現および活性が、抗炎症状態に対応すると同時に、ＨＸＡ３／ＭＲＰ２軸が、病原菌から保護するために粘膜表面に保存された機序であることを示す他の文献と合致している（Ｐａｚｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００８）；  Ｂｌｏｋｚｉｊｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００８）；  Ａｇｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０１１））。さらに、実施例８〜１０では、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染中のＭＲＰ２の遮断によって、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染マウスの肺へのＰＭＮ流入が著しく低減し、次に感染後の血中に検出された細菌量が低減したことが見出された。このような知見は、肺炎球菌肺炎症によって誘導されたＰＭＮ流入が、細菌感染の病理に寄与し得るという概念を支持する。
【０１２３】
Ｓｃｈｕｌｔｚらは、網羅的Ｍｒｐ１ノックアウトマウスが、肺炎球菌感染中に保護される一方、野生型同腹子は感染に屈したことを既に報告している（Ｓｃｈｕｌｔｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６６（６）：４０５９−４０６４  （２００１））。実施例８〜１０では、感染の４８時間後に、Ｍｒｐ１−／−ＢＡＬＦにおける細胞外ロイコトリエンＣ４（ＬＴＣ４）は、野生型マウスよりも少ないことが示された。細胞内ＬＴＣ４は、当然ながらより高いことが見出され、ＬＴＣ４の放出は、マウスＭｒｐ１の排除によって阻害されるという結論が得られた。ＬＴＣ４の保持は、この特定の研究では細胞傷害性であることが示唆されており（Ｂｌｏｋｚｉｊｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００８））、それによってＰＭＮアポトーシスが生じ、ＢＡＬＦにおける好中球数が減少し得るが、この結果はまさに、Ｓｃｈｕｌｔｚが感染の４８時間後に実証しているものである。この場合、このような好中球数の減少は、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．およびＢｈｏｗｍｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．によって暗示されている通り、上皮壁の破損を防止し、細菌浸潤を低減して、細菌クリアランスの他の手段により肺炎球菌感染を排除することができる。このデータによって提示される見かけの逆説は、ＭＲＰ１活性がＰＭＮ遊出の抑止を助けるという本発明者らの仮説と合致すると思われる。感染した上皮が、ＬＴＣ４誘導性アポトーシスを受けないことを保証するために、ＭＲＰ１欠損上皮および対照細胞の感染前および感染後の両方のアネキシンＶ染色（図２２Ａおよび２２Ｂ）を試験して、ＭＲＰ１欠乏と関連するＰＭＮ遊走のいかなる増大も、上皮細胞傷害によって引き起こされないことを示した。
【０１２４】
ＭＲＰ１／Ｌ−ＡＭＥＮＤは、抗炎症状態を決定付けるが（実施例８〜１０）、ＭＲＰ２／ＨＸＡ３は炎症促進性状態を決定付ける（実施例３〜７）という仮説は、上皮細胞が、ＰＭＮ遊出を先導する場合を決定するためのシグナルを統合するセンサーとして作用する（ＡＢＣ排出トランスポーターを制御することによって）という概念を組み込む。したがって、不適切な炎症応答は制限するが、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどの病原体（または他の炎症促進性刺激）の存在に応答する態勢にあるという、定常状態の設定点が確立される。このＰＭＮ応答は、目下の感染調節において役割を果たすことができるが、好中球活性化が長引くと、健康に有害な作用が生じ、宿主にとっての費用対効果の関係が浮き彫りになるとも考えられる。本明細書で提示されるデータは、肺炎球菌感染中のＰＭＮ流入の制御の根本にある機序をより良く理解することが、最終的に感染の封じ込めを可能にすると同時に有害な肺炎症を弱める、改善された治療を設計するのに有用となり得ることを実証する。
【０１２５】
したがって、本発明の技術のさらなる実施形態では、被験体に、多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）のレベルおよび／または活性を増大する治療有効量の１つまたは複数の化合物を投与することが望ましい場合があり、治療量のこの１つまたは複数の化合物は、標的組織への好中球の遊走を低減する（実施例８〜１０）。一部の実施形態では、ＭＲＰ１の上方制御は、Ｌ−ＡＭＥＮＤおよび／または抗炎症性である他のカンナビノイドを用いて疾患を処置する場合には不要となり得る（しかし、必要に応じて含まれ得る）。
【０１２６】
多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）のレベルの増大は、例えば、ＭＲＰ−１をコードするｍＲＮＡ配列のトランスフェクションを使用することによって、組織特異的プロモーターの下でＭＲＰ−１遺伝子インサートを担持するウイルスベクターを使用することによって（Ｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ５（３）：２６１−２６６，  ＤＯＩ：  １０．４１６１／ｃｂｔ．５．３．２３８１）、小分子、例えばイベルメクチン（ＳＴＲＯＭＥＣＴＯＬ（登録商標））を使用することによって（Ｒａｚａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐａｒａｓｉｔｅｓ  ＆  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ９：５２２，  ＤＯＩ：  １０．１１８６／ｓ１３０７１−０１６−１８０６−９  （２０１６））、および抗がん薬などを使用することによって達成することができる。それに限定されるものではないが、ドキソルビシンおよびビンブラスチンを含む数々の化学療法剤が、ＭＲＰ１発現を誘導することが報告されており、ＣＡＲを介する核内ホルモン制御の役割が報告されている（Ｂａｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ  −  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ４５３：６２１−６４１  （２００７））。
【０１２７】
一部の実施形態では、本発明の技術の方法は、必要に応じて、１つまたは複数の抗生物質および／または抗炎症剤を投与するステップをさらに含むことができる。単独で、または本発明の技術の方法と組み合わせて使用される抗生物質／抗炎症剤の例として、それに限定されるものではないが、ダルババンシン（ＤＡＬＶＡＮＣＥ（登録商標）、ＸＹＤＡＬＢＡ（登録商標））、オリタバンシン（ＯＲＢＡＣＴＩＶＥ（登録商標））、ダプトマイシン（Ｃｕｂｉｃｉｎ（登録商標））、テジゾリド（ＳＩＶＥＸＴＲＯ（登録商標））、セフトビプロール（ＺＥＶＴＥＲＡ（登録商標）、ＭＡＢＥＬＩＯ（登録商標））、セフトロザン−タゾバクタム（ＺＥＲＢＡＸＡ（登録商標））、ムピロシン、硫酸ネオマイシン・バシトラシン、ポリミキシンＢ、１−オフロキサシン、リン酸クリンダマイシン、硫酸ゲンタマイシン、メトロニダゾール、ヘキシルレゾルシノール、塩化メチルベンゼトニウム、フェノール、第四級アンモニウム化合物、ティーツリー油、ステロイド系薬剤、例えばコルチコステロイド、例えばヒドロコルチゾン、ヒドロキシルトリアムシノロンアルファメチルデキサメタゾン、リン酸デキサメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、吉草酸クロベタゾール、デソニド、デスオキシメタゾン、酢酸デスオキシコルチコステロン、デキサメタゾン、ジクロリゾン、二酢酸ジフロラゾン、吉草酸ジフルコルトロン、フルアドレノロン、フルクラロロンアセトニド、フルドロコルチゾン、ピバル酸フルメタゾン、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルコルチンブチルエステル、フルオコルトロン、酢酸フルプレドニデン（フルプレドニリデン）、フルランドレノロン、ハルシノニド、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフルオロソン、フルラドレナロンアセトニド、メドリゾン、アムシアフェル、アムシナフィド、ベタメタゾン、クロロプレドニゾン、酢酸クロロプレドニゾン、クロコルトロン、クレスシノロン、ジクロリゾン、ジフルプレドナート、フルクロロニド、フルニソリド、フルオロメトロン、フルペロロン、フルプレドニゾロン、吉草酸ヒドロコルチゾン、シクロペンチルプロピオン酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルタメート、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、トリアムシノロン、非ステロイド系薬剤、例えばＣＯＸ阻害剤、ＬＯＸ阻害剤、ｐ３８キナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、ならびにサイトカイン合成阻害剤、テトラサイクリン、ミノサイクリンおよびドキシサイクリン、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
【０１２８】
一部の実施形態では、本発明の技術の方法は、必要に応じて、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン、メタロプロテイナーゼ−９の１つまたは複数を標的にする抗体（例えば、抗体ＧＳ−５７４５、Ｇｉｌｅａｄ）などの１つまたは複数の抗体を投与するステップをさらに含むことができる。
【０１２９】
例えば、クローン病では、本発明の技術の方法のいずれか１つは、１つまたは複数のメサラミン生成物、コルチコステロイド製剤、従来のコルチコステロイドおよび回腸放出ブデソニドの両方、グルココルチコステロイド／ＥＥＮ免疫調節薬（例えば、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、およびメトトレキセート）、抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）薬物（例えば、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ、Ｊａｎｓｓｅｎ）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ、ＡｂｂＶｉｅ）、およびセルトリズマブペゴル（Ｃｉｍｚｉａ、ＵＣＢ））、抗アルファ−４ベータ−７インテグリン抗体ベドリズマブ（Ｅｎｔｙｖｉｏ、武田）、ＪＡＫ阻害剤ＡＢＴ−４９４（ＡｂｂＶｉｅ）、ならびにフィルゴチニブ（ＧＬＰＧ０６３４、ＧａｌａｐａｇｏｓおよびＧｉｌｅａｄ）（Ｓａｎｄｂｏｒｎ，  Ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ＆  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １２，  Ｉｓｓｕｅ  ７，  Ｊｕｌｙ  ２０１６）を投与するステップをさらに含むことが望ましい場合がある。
【０１３０】
潰瘍性大腸炎では、本発明の技術の方法のいずれか１つは、５−アミノサリチレート（ａｍｉｎｏｓａｌｙｃｙｌａｔｅ）、メサラミン、従来のコルチコステロイドまたはマルチマトリクスブデソニド（Ｕｃｅｒｉｓ、Ｓａｌｉｘ）（結腸に薬物を送達する）、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、抗ＴＮＦ薬物（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、およびゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ、Ｊａｎｓｓｅｎ））、ベドリズマブ、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤（例えば、トファシチニブ（Ｘｅｌｊａｎｚ、Ｐｆｉｚｅｒ）、ＡＢＴ−４９４（ＡｂｂＶｉｅ）、ならびにフィルゴチニブ（ＧＬＰＧ０６３４、ＧａｌａｐａｇｏｓおよびＧｉｌｅａｄ））（Ｓａｎｄｂｏｒｎ  ２０１６）の１つまたは複数を投与するステップをさらに含むことが望ましい場合がある。
【０１３１】
ＩＩＩ．本発明の技術の化合物
本発明の技術は、好中球媒介性炎症およびそれと関連する状態を処置するための組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明の技術は、多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）のレベルおよび／もしくは活性を増大する第１の化合物、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）およびヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼの１つもしくは複数を阻害する第２の化合物、ならびに／または１つもしくは複数のＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）を増大する第３の化合物の１つまたは複数を含む組成物を提供する。
【０１３２】
Ａ．ＭＲＰ１を増大する化合物
一部の実施形態では、多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）のレベルの増大は、例えば、ＭＲＰ−１をコードするｍＲＮＡ配列のトランスフェクションを使用することによって、組織特異的プロモーターの下でＭＲＰ−１遺伝子インサートを担持するウイルスベクターを使用することによって（Ｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ５（３）：２６１−２６６，  ＤＯＩ：  １０．４１６１／ｃｂｔ．５．３．２３８１）、小分子、例えばイベルメクチン（ＳＴＲＯＭＥＣＴＯＬ（登録商標））を使用することによって（Ｒａｚａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐａｒａｓｉｔｅｓ  ＆  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ９：５２２，  ＤＯＩ：  １０．１１８６／ｓ１３０７１−０１６−１８０６−９  （２０１６））、および抗がん薬などを使用することによって達成することができる。それに限定されるものではないが、ドキソルビシンおよびビンブラスチンを含む数々の化学療法剤が、ＭＲＰ１発現を誘導することが報告されており、ＣＡＲを介する核内ホルモン制御の役割が報告されている（Ｂａｋｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ  −  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ４５３：６２１−６４１  （２００７））。
【０１３３】
Ｂ．ＭＲＰ２阻害剤
一部の実施形態では、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）を阻害する化合物は、ＭＲＰ２  ＲＮＡｉ；３−（［３−（２−［７−クロロ−２−キノリニル］エテニル）フェニル−（３−ジメチルアミノ−３−オキソプロピル）−チオ−メチル］チオ）プロパン酸（「ＭＫ５７１」およびＣｙｓＬＴ１（ＬＴＤ４）ロイコトリエン受容体インバースアゴニストとしても公知）（Ｔｏｃｒｉｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）（Ｇｅｎｕｕｓｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  ＰＮＡＳ  １０１：２４７０−２４７５）；ＭＲＰ２のプロベネシド阻害によって例示される（実施例３）プロベネシド（「ＰＲＯＢＡＬＡＮ（商標）」としても公知）；ＦＵＲＯＳＥＭＩＤＥ（登録商標）；ＲＩＴＯＮＡＶＩＲ（登録商標）；ＳＡＱＵＩＮＡＶＩＲ（登録商標）；ＬＡＭＩＶＵＤＩＮＥ（登録商標）；ＡＢＡＣＡＶＩＲ（登録商標）；ＥＭＴＲＩＣＩＴＡＢＩＮＥ（登録商標）；ＥＦＡＶＩＲＥＮＺ（登録商標）；ＤＥＬＡＶＩＲＤＩＮＥ（登録商標）；ＮＥＶＩＲＡＰＩＮＥ（登録商標）；ＣＩＤＯＦＯＶＩＲ（登録商標）；ＡＤＥＦＯＶＩＲ（登録商標）；およびＴＥＮＯＦＯＶＩＲ（登録商標）の１つまたは複数によって例示される。
【０１３４】
一部の実施形態では、ＭＲＰ２を阻害する化合物は、ヘポキシリンＡ３シンターゼを阻害する化合物（例えばヘポキシリンＡ３シンターゼＲＮＡｉ）の１つまたは複数によって例示される。
【０１３５】
一部の実施形態では、ＭＲＰ２を阻害する化合物は、脂肪酸アミドヒドロラーゼ（ＦＡＡＨ）を阻害する１つまたは複数の化合物、例えばＦＡＡＨ  ＲＮＡｉ；ＦＡＡＨ阻害剤Ｉ（ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ：２９５３８０）４−フェニルメトキシフェニル）Ｎ−ブチルカルバメート）；ＵＲＢ５９７（ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ：１３８３８８４）３’−カルバモイル−［１，１’−ビフェニル］−３−イルシクロヘキシルカルバメート；ＦＡＡＨ阻害剤１（ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ：１１９０４１４）Ｎ−（４−（６−メチルベンゾ［ｄ］チアゾール−２−イル）フェニル）−１−（チオフェン−２−イルスルホニル）ピペリジン−４−カルボキサミド；ＦＡＡＨ阻害剤、２ｌ（ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ：７１６９９７８６）；ＦＡＡＨ阻害剤、２ｉ（ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ：７１６９９７８５）Ｎ−シクロヘキシルカルバミン酸４−（ジメチルアミノ）−３−フェニルフェニルエステル；ＦＡＡＨ阻害剤、２ｈ（ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ：７１６９９７８４）Ｎ−シクロヘキシルカルバミン酸４−（ヒドロキシメチル）−３−フェニルフェニルエステル；ＦＡＡＨ阻害剤、２ｊ（ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ：５８８０１１３６）；ＦＡＡＨ阻害剤、２ｅ（ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ：５８８０１１３５）；ＦＡＡＨ阻害剤、２ａ（ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ：５８８０１１３４）；ＦＡＡＨ阻害剤、２ｂ（ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ：５８８０１１２９）；ＦＡＡＨ阻害剤、２ｆ（ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ：５８８０１１２６）カルバミン酸、シクロヘキシル−、６−メチル［１，１’−ビフェニル］−３−イルエステル；ＦＡＡＨ阻害剤、２ｋ（ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ：５８８０１１２５）；ＦＡＡＨ阻害剤、２ｃ（ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ：５７５８２４８０）；ＦＡＡＨ阻害剤、２ｇ（ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ：４４６２６３６３）；ＦＡＡＨ阻害剤、２ｄ（ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ：４４６２６３６２）；ＡＭ３７４、パルミチルスルホニルフルオリド；ＡＲＮ２５０８、フルルビプロフェンの誘導体；ＢＩＡ１０−２４７４；ＢＭＳ−４６９９０８；ＣＡＹ−１０４０２；ＪＮＪ−２４５；ＪＮＪ−１６６１０１０；ＪＮＪ−２８８３３１５５；ＪＮＪ−４０４１３２６９；ＪＮＪ−４２１１９７７９；ＪＮＪ−４２１６５２７９；ＬＹ−２１８３２４０；カンナビジオール；ＭＫ−３１６８；ＭＫ−４４０９；ＭＭ−４３３５９３；ＯＬ−９２；ＯＬ−１３５；ＰＦ−６２２；ＰＦ−７５０；ＰＦ−３８４５；ＰＦ−０４４５７８４５；ＰＦ−０４８６２８５３；ＲＮ−４５０；ＳＡ−４７；ＳＡ−７３；ＳＳＲ−４１１２９８；ＳＴ−４０６８；ＴＫ−２５；ＵＲＢ５２４；ＵＲＢ５９７（ＫＤＳ−４１０３、Ｋａｄｍｕｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＵＲＢ６９４；ＵＲＢ９３７；ＶＥＲ−１５６０８４；Ｖ−１５８８６６；およびＣｈｅｍＣｒｕｚ（登録商標）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｄａｌｌａｓ、Ｔｅｘａｓ）製の多重ＦＡＡＨ阻害剤によって例示される。
【０１３６】
一部の実施形態では、ＭＲＰ２を阻害する化合物は、Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）を阻害する１つまたは複数の化合物、例えばＰ−ｇｐ  ＲＮＡｉ；ＳｉｐＡ；および小分子（例えば、ゾスキダル三塩酸塩（ＬＹ３３５９７９）；ＶＡＬＳＰＯＤＡＲ（登録商標）（ＰＳＣ８３３）（Ｐ−ｇｐ媒介性ＭＤＲの阻害剤）；ＣＰ１００３５６塩酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；およびエラクリダール塩酸塩（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって例示される。また、国際公開第２００４０７１４９８Ａ１号、国際公開第２０１４１０６０２１Ａ１号、国際公開第２００５０３３１０１Ａ１号、国際公開第２００４００９５８４Ａ１号、国際公開第２００２０３０９１５Ａ２号、米国特許出願第２０１０００２９７５５Ａ１号、および米国特許出願第２００６００７３１９６Ａ１号）を参照されたい。
【０１３７】
本発明の技術の化合物を投与する組成物の種類を制限する意図はないが、一部の実施形態では、本発明の技術の化合物（例えば、標的組織への好中球の遊走を低減する化合物、ならびに／またはＭＲＰ２およびＨＸＡ３シンターゼの１つもしくは複数の活性および／もしくはレベルを阻害する化合物、ならびに／またはＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）のレベルおよび／もしくは活性を増大する化合物）、および／または多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）を増大する化合物は、ポリマーにコンジュゲートされる。
【０１３８】
本発明の技術のプロベネシドコンジュゲート
一部の実施形態では、本発明の技術は、式Ｉ
【化３】
2020526537.tif 000005
［式中、Ｘは、リンカーであり、ＰＯＬＹは、ポリマーである］
によって定義されるプロベネシド−ポリマーコンジュゲートを開示する。
【０１３９】
一部の実施形態では、ＰＯＬＹは、デキストラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、過ヨウ素酸で酸化されたデキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、デキストリン、ヒドロキシエチル−デンプン（ＨＥＳ）、ポリ（２−エチル２−オキサゾリン）（ＰＥＯＺ）、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＡ／ＰＬＧＡ）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタアクリルアミド）、ポリグリセロール、２５ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、およびポリペプチドからなる群より選択されるポリマーである。一部の実施形態では、ＰＥＧポリマーは、直鎖モノアミンおよびモノアルデヒド、直鎖バイアミン（ｂｉ−ａｍｉｎｅ）およびバイアルデヒド（ｂｉ−ａｌｄｅｈｙｄｅ）、複数アームのアミンおよび複数アームのアルデヒド、分岐の１つ、２つおよび複数アームのアミンおよびアルデヒド、ならびに複数アームのフォーク型アミンおよびアルデヒドを含む、アミン（ＮＨ２）およびアルデヒド（ＣＨＯ）で官能化される。これらのポリマーは、本明細書に記載される通り、任意の分子量を有することができる。
【０１４０】
一部の実施形態では、ポリマーは、約１００Ｄａ〜約８００ｋＤａの範囲の平均分子量を有する。（別段指定されない限り、「平均分子量」は、重量平均分子量を意味する）。一部の実施形態では、ポリマーは、約１ｋＤａ〜約８００ｋＤａの範囲の平均分子量を有する。一部の実施形態では、ポリマーは、１ｋＤａ未満の平均分子量を有する。一部の実施形態では、ポリマーは、１０ｋＤａ未満の平均分子量を有する。一部の実施形態では、ポリマーの平均分子量は、約１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１２５ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１７５ｋＤａ、２００ｋＤａ、２２５ｋＤａ、２５０ｋＤａ、２７５ｋＤａ、３００ｋＤａ、３２５ｋＤａ、３５０ｋＤａ、３７５ｋＤａ、４００ｋＤａ、４２５ｋＤａ、４５０ｋＤａ、４７５ｋＤａ、５００ｋＤａ、５５０ｋＤａ、６００ｋＤａ、６５０ｋＤａ、７００ｋＤａ、７５０ｋＤａ、８００ｋＤａ、またはこれらの値の２つを含むその間の任意の範囲である。
【０１４１】
本明細書に記載されるポリマーは、いくつかの異なる幾何形状のいずれかを有することができる。例えば、一部の実施形態では、ポリマーは、直鎖ポリマー、分岐ポリマー、フォーク型ポリマー、またはこれらのポリマーのいずれかの組合せである。
【０１４２】
一部の実施形態では、プロベネシドは、リンカーＸを介してポリマーに結合される。一部の実施形態では、リンカーは、例えば結合能による干渉を回避するために、プロベネシド化合物とポリマーを遠ざけるためのスペーサとして働くことができる。リンカーは、１つまたは複数の原子、例えば、Ｃ、Ｎ、またはＯから選択される１つまたは複数の原子を含む。一部のこのような実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のＨ原子、例えば、ＮＨ、Ｎ（ＣＨ３）、またはＣＨ２をさらに含むことができる。
【０１４３】
一部の実施形態では、リンカーは、生分解性リンカーである。一部の実施形態では、生分解性リンカーは、２〜１０個のアミノ酸残基を有するオリゴペプチドを含む。残基は、天然に存在するアミノ酸から選択することができる。
【０１４４】
一部の実施形態では、リンカーは、置換または非置換Ｃ１〜ＣＸアルキレン、シクロアルキレン、シクロアルキルアルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニレン、またはヘテロアルケニレン基（式中、ｘは、１〜１２、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２の任意の整数であってよい）を含む。例えば、リンカーは、水素原子の１つまたは複数が、フッ素原子、例えば１、２または３またはそれよりも多くのフッ素である、Ｃ１〜Ｃｘフルオロアルキル基を含むことができる。一部の実施形態では、Ｘは、それに限定されるものではないが（Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン）−ＮＨ（例えば、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＮＨ）、（Ｃｎアルキレン）ＮＨ（Ｃｐアルキレン）（式中、ｎ、ｐは、独立に、１〜１０の整数であるが、ｎ＋ｐは、１０を超えない）（例えば、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２）、ＮＨ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン）ＮＨ（例えば、ＮＨ（ＣＨ２）５ＮＨ、ＮＨ（ＣＨ２）６ＮＨ、ＮＨ（ＣＨ２）８ＮＨ）、またはＮＨ（Ｃｎアルキレン）ＮＨ（Ｃｐアルキレン）（式中、ｎおよびｐは、既に定義される通りの整数である）（例えば、ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２、ＮＨ（ＣＨ２）６ＮＨＣＨ２）を含む、１つまたは２つのＮＨ基を含有するヘテロアルキレンである。一部の実施形態では、Ｘは、それに限定されるものではないが（Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン）−Ｏ（例えば、ＣＨ２ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２Ｏ）、（Ｃｎアルキレン）Ｏ（Ｃｐアルキレン）（式中、ｎ、ｐは、独立に、１〜１０の整数であるが、ｎ＋ｐは、１０を超えない）（例えば、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２）、Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン）Ｏ（例えば、Ｏ（ＣＨ２）５Ｏ、Ｏ（ＣＨ２）６Ｏ、Ｏ（ＣＨ２）８Ｏ）、またはＯ（Ｃｎアルキレン）Ｏ（Ｃｐアルキレン）（式中、ｎおよびｐは、既に定義される通りの整数である）（例えば、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２、Ｏ（ＣＨ２）６ＯＣＨ２）を含む、１つまたは２つの酸素原子を含有するヘテロアルキレンである。一部の実施形態では、Ｘは、それに限定されるものではないが、ＮＨ−（Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン）Ｏ、（例えば、ＮＨ（ＣＨ２）５Ｏ、ＮＨ（ＣＨ２）６Ｏ、ＮＨ（ＣＨ２）８Ｏ）、またはＮＨ（Ｃｎアルキレン）Ｏ（Ｃｐアルキレン）（式中、ｎおよびｐは、既に定義される通りの整数である）（例えば、ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２、Ｏ（ＣＨ２）６ＮＨＣＨ２）を含む、ＯおよびＮＨ基を含有するヘテロアルキレンである。
【０１４５】
プロベネシド−ポリマーコンジュゲートは、当技術分野で公知の標準技術を使用して調製することができる。一部の実施形態では、官能基の１つが保護されている、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択されるヘテロ原子を含有する少なくとも２つの官能基を含有する二官能性リンカーは、標準エステル、チオエステルおよびアミド結合形成技術を使用してコンジュゲートすることができる。例えば、アミノ基の１つがウレタン保護基（例えば、Ｂｏｃ、Ｃｂｚ等）によって保護されるジアミノ−アルキレンリンカーは、カップリング剤（例えば、ＤＣＣ、ＥＤＣ／ＨＯＢｔ等）の存在下でプロベネシドにカップリングすることができる。あるいは、プロベネシドの活性なエステル、混合無水物または酸ハロゲン化物誘導体を調製し、モノ保護ジアミンと反応させることができる。（例えば、Ｂｏｄａｎｓｋｙ，  Ｍ．  ＆  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，  Ａ．，  Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８４を参照されたい）。保護基は除去することができ、遊離アミンは、還元条件下でポリマーのアルデヒド誘導体と反応して、コンジュゲートを提供する。同様に、保護されたアルデヒド（例えば、１，１−ジメトキシ）およびアミンを含むリンカーを、プロベネシドとカップリングさせ、脱保護してアルデヒドを形成し、アミノ担持ポリマーを用いる還元的アミノ化に供してコンジュゲートを形成することができる。プロベネシドおよびポリマーを連結するための、α，ω−カルボキシアミン、α，ω−アミノアルコール、α，ω−カルボキシアルコール、α，ω−アミノチオール等を使用するこれらのスキームの変形形態は、当業者によって容易に理解されよう。
【０１４６】
Ｃ．ＮＡＥを増大する化合物
Ｎ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）を増大する化合物の種類を制限する意図はないが、一部の実施形態では、ＮＡＥを増大する化合物は、カンナビノイド受容体タイプ２（ＣＢ２）「アゴニスト」（すなわち、ＣＢ２に特異的に結合し、活性化する化合物）である。例示的なＣＢ２アゴニストとして、ＧＷ−４０５，８３３、ＡＭ−１２４１、ＨＵ−３０８、ＪＷＨ−０１５、ＪＷＨ−１３３、Ｌ−７５９，６３３、Ｌ−７５９，６５６、ベータ−カリオフィレン、アラキドニルシクロプロピルアミド、およびアラキドニル−２’−クロロエチルアミドが挙げられる。
【０１４７】
ＩＶ．本発明の技術の組成物の使用
本発明の技術は、それを必要とする哺乳動物被験体の標的組織の好中球媒介性炎症を処置、防止または改善するための方法であって、被験体に、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）およびヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼの１つまたは複数を阻害する治療有効量の１つまたは複数の第１の化合物を投与するステップを含み、治療有効量の第１の化合物が、標的組織への好中球の遊走を低減する、方法を提供する。一部の実施形態では、第１の化合物は、プロベネシドコンジュゲートである。一部の実施形態では、プロベネシドコンジュゲートは、プロベネシド−過ヨウ素酸で酸化された４０ｋＤａのデキストランコンジュゲートである。一部の実施形態では、該方法は、被験体に、１つまたは複数のＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）を増大する治療有効量の１つまたは複数の第２の化合物を投与するステップをさらに含み、治療量の第２の化合物は、標的組織への好中球の遊走を低減する。さらなる実施形態では、該方法は、被験体に、多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）のレベルおよび／または活性を増大する治療有効量の１つまたは複数の第２および／または第３の化合物を投与するステップをさらに含み、治療量の１つまたは複数の第２および／または第３の化合物は、標的組織への好中球の遊走を低減する。別の実施形態では、本発明の技術の化合物は、単独または任意の組合せで、標的組織の局所表面および／または標的組織の管腔表面に投与される。さらなる実施形態では、標的組織への好中球の遊走を低減する第１の化合物は、ポリマーにコンジュゲートされる。別の実施形態では、炎症は、非感染性および／または感染性炎症である。
【０１４８】
本発明の技術はまた、それを必要とする哺乳動物被験体の標的組織の好中球媒介性炎症を処置、改善または防止するための方法であって、被験体に、１つまたは複数のＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）を増大する治療有効量の１つまたは複数の第１の化合物を投与するステップを含み、治療量の第１の化合物が、標的組織への好中球の遊走を低減する、方法を提供する。一実施形態では、該方法は、被験体に、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）およびＨＸＡ３シンターゼの１つまたは複数を阻害する治療有効量の１つまたは複数の第２の化合物を投与するステップをさらに含み、治療量の第２の化合物は、標的組織への好中球の遊走を低減する。一部の実施形態では、第２の化合物は、プロベネシドコンジュゲートである。一部の実施形態では、プロベネシドコンジュゲートは、プロベネシド−過ヨウ素酸で酸化された４０ｋＤａのデキストランコンジュゲートである。別の実施形態では、該方法は、被験体に、多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）のレベルおよび／または活性を増大する治療有効量の１つまたは複数の第２および／または第３の化合物を投与するステップをさらに含み、治療量の１つまたは複数の第２および／または第３の化合物は、標的組織への好中球の遊走を低減する。さらなる実施形態では、１つまたは複数のＮＡＥを増大する１つまたは複数の第１の化合物は、カンナビノイド受容体タイプ２（ＣＢ２）アゴニストである。別の実施形態では、標的組織への好中球の遊走を低減する第１の化合物は、ポリマーにコンジュゲートされる。
【０１４９】
一態様では、本発明の技術の方法および組成物は、式Ｉ
【化４】
2020526537.tif 000006
［式中、Ｘは、リンカーであり、ＰＯＬＹは、ポリマーである］
によって定義されるプロベネシド−ポリマーコンジュゲート、およびそれを必要とする被験体の標的組織の好中球媒介性炎症を処置、改善または防止するためのこれらのコンジュゲートの１つまたは複数の使用に関する。他の実施形態では、プロベネシドコンジュゲートと、１つまたは複数の化合物（例えば、ＭＲＰ１のレベルおよび／もしくは活性を増大する化合物、またはＮＡＥを増大する化合物）の組合せは、これに関して相乗効果を示す。
【０１５０】
一部の実施形態では、本発明の技術の方法および組成物は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、例えば潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、クローン病（ＣＤ）、および感染性／非感染性腸炎を処置、改善または防止するための、式Ｉのプロベネシドコンジュゲートの１つまたは複数の使用に関する。他の実施形態では、プロベネシドコンジュゲートと、１つまたは複数の化合物（例えば、ＭＲＰ１のレベルおよび／もしくは活性を増大する化合物、またはＮＡＥを増大する化合物）の組合せは、これに関して相乗効果を示す。
【０１５１】
一部の実施形態では、本発明の技術の方法および組成物は、それに限定されるものではないが、肺炎球菌感染、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および肺線維症を含む感染性および非感染性炎症性肺状態を処置、改善または防止するための、式Ｉのプロベネシドコンジュゲートの１つまたは複数の使用に関する。他の実施形態では、プロベネシドコンジュゲートと、１つまたは複数の化合物（例えば、ＭＲＰ１のレベルおよび／もしくは活性を増大する化合物、またはＮＡＥを増大する化合物）の組合せは、これに関して相乗効果を示す。
【０１５２】
一部の実施形態では、本発明の技術の方法および組成物は、それに限定されるものではないが、皮膚炎（湿疹）、酒さ、脂漏性皮膚炎、および乾癬を含む炎症性皮膚疾患を処置、改善または防止するための、式Ｉのプロベネシドコンジュゲートの１つまたは複数の使用に関する。他の実施形態では、プロベネシドコンジュゲートと、１つまたは複数の化合物（例えば、ＭＲＰ１のレベルおよび／もしくは活性を増大する化合物、またはＮＡＥを増大する化合物）の組合せは、これに関して相乗効果を示す。
【０１５３】
本発明の技術の方法は、身体の一部が傷害および／または感染に反応する、限局的身体状態である「炎症」を処置するのに有用である。炎症の典型的な症状は、発熱、発赤、腫脹、疼痛、および／または機能喪失である。これらは、炎症過程中に生じる生理的変化の症状発現である。この過程の主な３つの構成成分は、（１）血管内径および血管を通る血流の速度変化（血行動態変化）、（２）毛細血管透過性の増大、ならびに（３）白血球滲出である。「好中球媒介性炎症」は、好中球が小血管内膜に移動し（辺縁趨向）、密集形態で内皮を覆う（舗装（ｐａｖｅｍｅｎｔｉｎｇ））、白血球滲出および炎症ステージを指す。最終的に、これらの好中球は、内皮空間を移動し、血管外空間に逃避する（移動）。好中球は、血管外に到達すると、自由に移動し、走化性によって傷害部位に引き付けられる。炎症領域への好中球（およびマクロファージ）の蓄積は、貪食によって外来粒子を中和するように作用する。
【０１５４】
炎症には、発熱、発赤、腫脹、疼痛および機能喪失の古典的徴候を特徴とし、血管および滲出過程が優勢な、通常急激に発生する急性炎症；粘液および上皮残屑の大量放出を特徴とする、主に粘膜表面に影響を及ぼす形態であるカタル性炎症；新しい結合組織の形成を主に特徴とする長期的および持続的炎症である慢性炎症（急性形態または長期的な低悪性度形態の継続である場合がある）；器官間質に主に影響を及ぼす炎症である、間質性炎症；創傷または傷害に続く炎症である外傷性炎症；表面上または表面近くの壊死によって組織が喪失し、局所的欠損（潰瘍）が創出される潰瘍性炎症が含まれる。
【０１５５】
炎症は、感染性および／または非感染性であり得る。「感染性」炎症は、体内に普通は存在しない微生物、例えば細菌、ウイルス、および寄生生物の侵襲および増殖と関連し、かつ／またはそれらによって引き起こされる炎症を指す。それとは対照的に、「非感染性」炎症は、体内に普通は存在しない微生物、例えば細菌、ウイルス、および寄生生物の侵襲および増殖と関連せず、かつ／またはそれらによって引き起こされていない炎症を指す。
【０１５６】
別の実施形態では、本発明の技術は、炎症促進性ＭＲＰ２／ＨＸＡ３経路を標的にすることによって好中球媒介性炎症を処置するための方法を提供する（図１０）。特定の実施形態では、それを必要とする哺乳動物被験体の標的組織の好中球媒介性炎症を処置するためのこの方法は、被験体に、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）およびヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼの１つまたは複数の活性および／またはレベルを阻害する治療有効量の１つまたは複数の第１の化合物を投与するステップを含み、治療量の第１の化合物は、標的組織への好中球の遊走を低減する。一部の実施形態では、化合物は、プロベネシドコンジュゲートである。
【０１５７】
本発明の技術のプロベネシドコンジュゲートの生物学的効果の決定
様々な実施形態では、適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを実施して、本発明の技術の特異的組成物の効果を決定し、その投与が処置に適応されるかどうかを決定する。様々な実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、代表的な細胞系アッセイ、例えば好中球遊走アッセイを用いて実施することができる。他の実施形態では、動物モデルの典型となるｉｎ  ｖｉｖｏモデルを使用して、所与のプロベネシドコンジュゲートが、単独で、または１つもしくは複数のさらなる化合物（例えば、ＭＲＰ２およびＨＸＡ３シンターゼの１つもしくは複数を阻害するさらなる化合物、ＭＲＰ１のレベルおよび／もしくは活性を増大する化合物、またはＮＡＥを増大する化合物）との組合せで、疾患または状態の処置において所望の効果を発揮するかどうかを決定することができる。治療において使用するための化合物は、ヒト被験体で試験する前に、それに限定されるものではないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ等を含む適切な動物モデル系において試験することができる。同様にｉｎ  ｖｉｖｏ試験のために、ヒト被験体に投与する前に、当技術分野で公知の動物モデル系のいずれかを使用することができる。
【０１５８】
Ｖ．プロベネシドコンジュゲートおよび他の治療剤との組合せ治療
一部の実施形態では、本発明の技術のプロベネシドコンジュゲートは、疾患または状態を防止、改善、または処置するための１つまたは複数のさらなる治療剤と組み合わせることができる。
【０１５９】
一実施形態では、追加の治療剤は、相乗的治療効果がもたらされるように、本発明の技術のプロベネシドコンジュゲートと組み合わせて被験体に投与される。
【０１６０】
一部の実施形態では、本発明の技術のプロベネシドコンジュゲートは、先のセクションＩＩＩＡに記載される、多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）のレベルを増大する１つまたは複数の化合物と組み合わされる。
【０１６１】
一部の実施形態では、本発明の技術のプロベネシドコンジュゲートは、先のセクションＩＩＩＢに記載される、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）およびヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼの１つまたは複数を阻害する１つまたは複数のさらなる化合物と組み合わされる。
【０１６２】
一部の実施形態では、本発明の技術のプロベネシドコンジュゲートは、先のセクションＩＩＩＣに記載される、Ｎ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）を増大する１つまたは複数のさらなる化合物と組み合わされる。
【０１６３】
一部の実施形態では、本発明の技術のプロベネシドコンジュゲートは、それに限定されるものではないが、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む、好中球媒介性炎症および好中球媒介性炎症と関連する状態を処置するための１つまたは複数のさらなる治療剤と組み合わされる。一部の実施形態では、本発明の技術は、多剤耐性タンパク質１（ＭＲＰ１）のレベルおよび／もしくは活性を増大する第１の化合物、多剤耐性タンパク質２（ＭＲＰ２）およびヘポキシリンＡ３（ＨＸＡ３）シンターゼの１つもしくは複数を阻害するプロベネシドコンジュゲートなどの第２の化合物、ならびに／または１つもしくは複数のＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）を増大する第３の化合物の１つまたは複数を含む組成物を提供する。
【０１６４】
複数の治療剤（例えば、プロベネシドコンジュゲート、ＭＲＰ１のレベルおよび／もしくは活性を増大する化合物、ＭＲＰ２およびＨＸＡ３シンターゼのさらなる阻害剤、ならびに／またはＮＡＥを増大する化合物）は、任意の順序で、またはさらには同時に投与することができる。同時の場合、複数の治療剤は、単一の統一された形態で、または複数の形態で（単なる例として、単一製剤または２つの別個の製剤いずれかとして）提供され得る。治療剤の一方を、複数回用量で与えることができ、または両方を複数回用量として与えることができる。同時でない場合、複数回用量の間のタイミングは、０週を超え４週未満で変わり得る。さらに、方法、組成物および製剤の組合せは、２つの薬剤だけの使用に限定されない。
【０１６５】
一部の実施形態では、本発明の技術の方法は、被験体に、１つまたは複数のＮ−アシルエタノールアミン（ＮＡＥ）のレベルおよび／または活性を増大する治療有効量の少なくとも１つの化合物を投与するステップをさらに含み、治療量の化合物は、標的組織への好中球の遊走を低減する。
【０１６６】
一実施形態では、ＮＡＥを増大する化合物は、ＮＡＥを増大する化合物の種類を制限することを企図せず、カンナビノイド受容体タイプ２（ＣＢ２）「アゴニスト」（すなわち、ＣＢ２に特異的に結合し、活性化する化合物）である。ＣＢ２アゴニストは、ＧＷ−４０５，８３３、ＡＭ−１２４１、ＨＵ−３０８、ＪＷＨ−０１５、ＪＷＨ−１３３、Ｌ−７５９，６３３、Ｌ−７５９，６５６、ベータ−カリオフィレン、アラキドニルシクロプロピルアミド、およびアラキドニル−２’−クロロエチルアミドによって例示される。
【０１６７】
一部の実施形態では、本発明の技術の方法は、１つまたは複数の抗生物質および／または抗炎症剤を投与するステップをさらに含むことができる。単独で、または本発明の技術の方法と組み合わせて使用される抗生物質／抗炎症剤の例として、それに限定されるものではないが、ダルババンシン（ＤＡＬＶＡＮＣＥ（登録商標）、ＸＹＤＡＬＢＡ（登録商標））、オリタバンシン（ＯＲＢＡＣＴＩＶＥ（登録商標））、ダプトマイシン（Ｃｕｂｉｃｉｎ（登録商標））、テジゾリド（ＳＩＶＥＸＴＲＯ（登録商標））、セフトビプロール（ＺＥＶＴＥＲＡ（登録商標）、ＭＡＢＥＬＩＯ（登録商標））、セフトビプロール（ＺＥＶＴＥＲＡ（登録商標）、ＭＡＢＥＬＩＯ（登録商標））、セフトロザン−タゾバクタム（ＺＥＲＢＡＸＡ（登録商標））、ムピロシン、硫酸ネオマイシン・バシトラシン、ポリミキシンＢ、１−オフロキサシン、リン酸クリンダマイシン、硫酸ゲンタマイシン、メトロニダゾール、ヘキシルレゾルシノール、塩化メチルベンゼトニウム、フェノール、第四級アンモニウム化合物、ティーツリー油、ステロイド系薬剤、例えばコルチコステロイド、例えばヒドロコルチゾン、ヒドロキシルトリアムシノロンアルファメチルデキサメタゾン、リン酸デキサメタゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、吉草酸クロベタゾール、デソニド、デスオキシメタゾン、酢酸デスオキシコルチコステロン、デキサメタゾン、ジクロリゾン、二酢酸ジフロラゾン、吉草酸ジフルコルトロン、フルアドレノロン、フルクラロロンアセトニド、フルドロコルチゾン、ピバル酸フルメタゾン、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルコルチンブチルエステル、フルオコルトロン、酢酸フルプレドニデン（フルプレドニリデン）、フルランドレノロン、ハルシノニド、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフルオロソン、フルラドレナロンアセトニド、メドリゾン、アムシアフェル、アムシナフィド、ベタメタゾン、クロロプレドニゾン、酢酸クロロプレドニゾン、クロコルトロン、クレスシノロン、ジクロリゾン、ジフルプレドナート、フルクロロニド、フルニソリド、フルオロメトロン、フルペロロン、フルプレドニゾロン、吉草酸ヒドロコルチゾン、シクロペンチルプロピオン酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルタメート、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、トリアムシノロン、非ステロイド系薬剤、例えばＣＯＸ阻害剤、ＬＯＸ阻害剤、ｐ３８キナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、ならびにサイトカイン合成阻害剤、テトラサイクリン、ミノサイクリンおよびドキシサイクリン、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
【０１６８】
一部の実施形態では、本発明の技術の方法は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン、メタロプロテイナーゼ−９の１つまたは複数を標的にする抗体（例えば、抗体ＧＳ−５７４５、Ｇｉｌｅａｄ）などの１つまたは複数の抗体を投与するステップをさらに含むことができる。
【０１６９】
一部の実施形態では、本開示は、クローン病を処置、改善、または防止するための方法であって、１つまたは複数の本発明の技術の化合物を、少なくとも１つのまたは複数のメサラミン生成物、コルチコステロイド製剤、従来のコルチコステロイドおよび回腸放出ブデソニドの両方、グルココルチコステロイド／ＥＥＮ免疫調節薬（例えば、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、およびメトトレキセート）、抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）薬物（例えば、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ、Ｊａｎｓｓｅｎ）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ、ＡｂｂＶｉｅ）、およびセルトリズマブペゴル（Ｃｉｍｚｉａ、ＵＣＢ））、抗アルファ−４ベータ−７インテグリン抗体ベドリズマブ（Ｅｎｔｙｖｉｏ、武田）、ＪＡＫ阻害剤ＡＢＴ−４９４（ＡｂｂＶｉｅ）、ならびにフィルゴチニブ（ＧＬＰＧ０６３４、ＧａｌａｐａｇｏｓおよびＧｉｌｅａｄ）（Ｓａｎｄｂｏｒｎ，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ＆  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １２（７）  （２０１６））と組み合わせて投与するステップを含む、方法を包含する。
【０１７０】
一部の実施形態では、本開示は、潰瘍性大腸炎を処置、改善、または防止するための方法であって、１つまたは複数の本発明の技術の化合物を、５−アミノサリチレート、メサラミン、従来のコルチコステロイドまたはマルチマトリクスブデソニド（Ｕｃｅｒｉｓ、Ｓａｌｉｘ）（結腸に薬物を送達する）、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、抗ＴＮＦ薬物（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、およびゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ、Ｊａｎｓｓｅｎ））、ベドリズマブ、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤（例えば、トファシチニブ（Ｘｅｌｊａｎｚ、Ｐｆｉｚｅｒ）ＡＢＴ−４９４（ＡｂｂＶｉｅ）、ならびにフィルゴチニブ（ＧＬＰＧ０６３４、ＧａｌａｐａｇｏｓおよびＧｉｌｅａｄ））（Ｓａｎｄｂｏｒｎ、２０１６）の１つまたは複数と組み合わせて投与するステップを含む、方法を包含する。
【０１７１】
ＶＩ．投与方法
細胞、器官、または組織を本発明の技術の化合物と接触させるための当業者に公知の任意の方法を用いることができる。適切な方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏ方法が含まれる。
【０１７２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、典型的に培養試料を含む。例えば、細胞を、リザーバー（例えば、組織培養プレート）に置き、所望の結果を得るのに適した適切な条件下で化合物と共にインキュベートすることができる。適切なインキュベーション条件は、当業者によって容易に決定され得る。
【０１７３】
ｅｘ  ｖｉｖｏ方法は、典型的に、哺乳動物、例えばヒトから取り出された細胞、器官または組織を含む。細胞、器官または組織は、例えば、適切な条件下で化合物と共にインキュベートすることができる。接触させられた細胞、器官または組織は、典型的に、ドナーに戻されるか、レシピエントに置かれるか、または将来的な使用のために保存される。したがって、化合物は、一般に、薬学的に許容される担体中にある。
【０１７４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ方法は、典型的に、本発明の技術の化合物を、哺乳動物、例えばヒトに投与するステップを含む。本発明の技術の化合物は、治療のためにｉｎ  ｖｉｖｏで使用される場合、例えば哺乳動物を処置する所望の結果を得るのに有効な量で、哺乳動物に投与される。有効量は、医師および臨床医に知られている方法によって、前臨床治験および臨床治験中に決定される。用量および投与レジメンは、被験体の疾患または状態の程度、使用される本発明の技術の特定の化合物の特徴、例えばその治療指数、被験体、および被験体の病歴に応じて変わる。
【０１７５】
本発明の方法において、例えば医薬組成物または医薬品において有用な有効量の本発明の技術の化合物は、医薬組成物または医薬品を投与するためのいくつかの周知の方法のいずれかによって、それを必要とする哺乳動物に投与することができる。本発明の技術の化合物は、全身的または局所的に投与することができる。
【０１７６】
本明細書に記載される本発明の技術の化合物は、本明細書に記載される障害を処置または防止するために、被験体に投与するための医薬組成物に単独でまたは組合せで組み込むことができる。このような組成物は、典型的に、活性剤および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与と適合性のある、生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤、ならびに吸収遅延剤等を含む。補足的な活性化合物を、組成物に組み込むこともできる。
【０１７７】
一部の実施形態では、本開示の医薬組成物は、化合物または混合物を、錠剤、カプセル剤または丸剤として経口投与可能にするか、あるいは非経口、静脈内、皮内、筋肉内もしくは皮下、または経皮投与可能にするのに適した、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含有する。
【０１７８】
医薬組成物は、典型的に、所期の投与経路と適合性を示すように製剤化される。本開示の医薬組成物の投与は、当業者に公知の任意の手段によって達成され得る。投与経路には、それに限定されるものではないが、非経口、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、経口、鼻腔内／呼吸器（例えば、吸入）、経皮（局所）、舌下、眼、膣内、直腸、および経粘膜投与が含まれる。全身経路には、経口および非経口が含まれる。吸入による投与のために、普通はいくつかの種類のデバイスが使用される。これらのデバイスの種類には、定量吸入器（ＭＤＩ）、呼気駆動型（ｂｒｅａｔｈ−ａｃｔｕａｔｅｄ）ＭＤＩ、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、スペーサ／保持チャンバとＭＤＩの組合せ、および噴霧器が含まれる。
【０１７９】
経口投与では、化合物は、活性化合物を、当技術分野で周知の薬学的に許容される担体と組み合わせることによって容易に製剤化することができる。このような担体によって、本開示の化合物を、処置される被験体によって経口摂取されるように、錠剤、丸剤、糖剤、カプセル剤、液体、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤等として製剤化することができる。経口使用のための医薬調製物は、必要に応じて得られた混合物を粉砕し、所望に応じて適切な助剤を添加した後に顆粒混合物を加工して、錠剤または糖剤コアを得ることにより、固体賦形剤として得ることができる。適切な賦形剤は、特に、充填剤、例えばラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、バレイショデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などである。所望に応じて、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加することができる。必要に応じて、経口製剤は、生理食塩水、もしくは内部酸性条件を中和するための緩衝液で製剤化することもでき、または任意の担体を用いずに投与することができる。
【０１８０】
経口で使用することができる医薬調製物には、ゼラチン製のプッシュフィット式カプセル剤、ならびにゼラチンおよび可塑剤、例えばグリセロールまたはソルビトール製の封止軟カプセル剤が含まれる。プッシュフィット式カプセル剤は、充填剤、例えばラクトース、結合剤、例えばデンプン、および／または滑沢剤、例えばタルクもしくはステアリン酸マグネシウム、および必要に応じて安定剤と混合して、活性成分を含有することができる。軟カプセルでは、活性化合物は、適切な液体、例えば脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールに溶解させるか、または懸濁させることができる。さらに、安定剤を添加することができる。経口投与のために製剤化されたミクロスフェアを使用することもできる。このようなミクロスフェアは、当技術分野で十分に定義されている。経口投与のためのすべての製剤は、このような投与に適した投与量であるべきである。
【０１８１】
口腔投与では、組成物は、従来の方式で製剤化された錠剤またはロゼンジ剤の形態をとることができる。
【０１８２】
吸入による投与では、本開示に従って使用するための化合物は、加圧パックまたは噴霧器から提示されるエアロゾルスプレーの形態で、適切な噴霧体、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスの使用を伴って、好都合に送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、計量された量を送達するための弁を提供することによって決定することができる。吸入器または通気器において使用するために、化合物および適切な粉末基剤、例えばラクトースまたはデンプンの粉末ミックスを含有する、例えばゼラチンのカプセル剤およびカートリッジを製剤化することができる。
【０１８３】
化合物は、全身送達することが望ましい場合、注射によって、例えばボーラス注射または持続注入によって非経口投与するために製剤化することができる。注射のための製剤は、単位剤形で、例えばアンプルまたは多用量容器に添加される保存剤と共に入れて提示され得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁物、溶液またはエマルジョンなどの形態をとることができ、製剤用薬剤、例えば懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤を含有することができる。
【０１８４】
非経口投与のための医薬製剤には、水溶性形態の活性化合物の水溶液が含まれる。さらに、活性化合物の懸濁物は、適切な油性注射懸濁物として調製することができる。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソームが含まれる。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を増大する物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有することができる。必要に応じて、懸濁物はまた、適切な安定剤、または化合物の溶解度を増大して高度に濃縮された溶液を調製することを可能にする薬剤を含有することができる。
【０１８５】
あるいは活性化合物は、使用前に適切なビヒクル、例えば発熱物質を含まない無菌水を用いて構成するために、粉末形態であってよい。
【０１８６】
化合物は、例えば従来の坐剤基剤、例えばカカオバターまたは他のグリセリドを含有する坐剤または停留浣腸などの、直腸または膣内組成物に製剤化することもできる。
【０１８７】
一部の実施形態では、投与は、処置される組織の局所および／または管腔表面で行われる。組成物の「局所」投与は、組成物を皮膚と接触させることを意味する。「管腔表面」は、開放内部空間または管状器官の腔、例えば血液が流れる動脈または静脈の中心内部空間；胃腸管内部；肺の気管支経路；腎尿細管および集合尿細管の内部；膣の単一経路で始まり、子宮内の２つの管腔に分かれて共に卵管に続く女性生殖器経路を指す。
【０１８８】
一部の実施形態では、本発明の技術の化合物は、標的組織に局所投与されるか、および／または標的組織の管腔表面に投与される。これは、化合物の潜在的な全身毒性副作用を低減するのに有利である。
【０１８９】
他の送達系には、時限放出、遅延放出または持続放出送達系が含まれ得る。このような系は、化合物の反復投与を回避して、被験体および医師への利便性を増すことができる。多くの種類の放出送達系が利用可能であり、当業者に公知である。放出送達系には、ポリマーベース系、例えばポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ酸無水物が含まれる。薬物を含有する先のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に記載されている。送達系には、ステロールを含む脂質、例えばコレステロール、コレステロールエステルおよび脂肪酸または中性脂肪、例えばモノ−、ジ−、およびトリ−グリセリド；ヒドロゲル放出系；サイラスティック系；ペプチドベース系；ワックスコーティング；従来の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠剤；部分的に融合した移植片等である非ポリマー系も含まれる。具体例として、それに限定されるものではないが、（ａ）本開示の薬剤がマトリクス内の形態で含有される浸食系、例えば米国特許第４，４５２，７７５号、第４，６７５，１８９号および第５，７３６，１５２号に記載されているもの、ならびに（ｂ）例えば米国特許第３，８５４，４８０号、第５，１３３，９７４号および第５，４０７，６８６号に記載されている、活性な構成成分がポリマーから調節された速度で浸透する拡散系が挙げられる。さらに、ポンプベースのハードウェア送達系を使用することができ、その一部は、移植に適合している。
【０１９０】
ＶＩＩ．核酸を細胞に送達するための方法
一部の実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチド（例えば、干渉ＲＮＡ）およびまたはタンパク質は、阻害剤であるオリゴヌクレオチドおよびまたはタンパク質を発現するように操作された発現ベクターによって、細胞に送達することができる。発現ベクターは、制御配列に作動可能に結合し、ＲＮＡ転写物として発現され得るように、望ましい配列を、例えば制限およびライゲーションによって挿入することができるものである。発現ベクターは、典型的に、タンパク質または阻害性オリゴヌクレオチドをコードする配列であるインサート、例えばｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを含有する。ベクターはさらに、ベクターを形質転換したもしくはしていない、またはベクターをトランスフェクトしたもしくはしていない細胞の特定に使用するのに適した１つまたは複数のマーカー配列を含有することができる。マーカーには、例えば、抗生物質または他の化合物に対する抵抗性または感受性のいずれかを増大または低減する、タンパク質をコードする遺伝子、標準アッセイまたは蛍光性タンパク質等によって検出可能な活性を有する酵素をコードする遺伝子が含まれる。
【０１９１】
本明細書で使用される場合、コード配列（例えば、タンパク質コード配列、ｍｉＲＮＡ配列、ｓｈＲＮＡ配列）および制御配列は、そのコード配列の発現または転写をその制御配列の影響または調節下に置くようなやり方で共有結合によって連結する場合には、「作動可能に」結合するとされる。コード配列が機能的タンパク質に翻訳されることが望ましい場合、２つのＤＮＡ配列は、５’制御配列におけるプロモーターの誘導が、コード配列の転写をもたらす場合、ならびに２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらさず、（２）プロモーター領域がコード配列の転写を方向付ける能力を妨害せず、また（３）対応するＲＮＡ転写物がタンパク質に翻訳される能力を妨害しない場合、作動可能に結合するとされる。したがって、プロモーター領域は、プロモーター領域がそのＤＮＡ配列を転写することができ、したがって、得られた転写物が、所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得る場合、コード配列に作動可能に結合することができる。コード配列は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡをコードし得ることを理解されよう。
【０１９２】
遺伝子発現に必要な制御配列の正確な性質は、種または細胞型によって変わり得るが、一般に必要に応じて、転写および翻訳の開始にそれぞれ関与する５’非転写配列および５’非翻訳配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等を含むはずである。このような５’非転写制御配列は、作動可能に結合した遺伝子の転写調節のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。制御配列は、所望に応じてエンハンサー配列または上流のアクチベーター配列を含むこともできる。本開示のベクターは、必要に応じて５’リーダー配列またはシグナル配列を含むことができる。
【０１９３】
一部の実施形態では、核酸分子を送達するためのウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスおよび弱毒化ポックスウイルスを含むポックスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス、およびＴｙウイルス様粒子からなる群より選択される。外因性核酸を送達するために使用されているウイルスおよびウイルス様粒子の例として、複製欠損アデノウイルス、改変レトロウイルス、非複製レトロウイルス、複製欠損セムリキ森林ウイルス、カナリアポックスウイルスおよび高度弱毒化ワクシニアウイルス誘導体、非複製ワクシニアウイルス、複製ワクシニアウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、レンチウイルスベクターおよびＴｙウイルス様粒子が挙げられる。
【０１９４】
ある特定の適用に有用な別のウイルスは、アデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、広範な細胞型および種に感染することができ、操作して複製欠損にすることができる。アデノ随伴ウイルスはさらに、熱および脂質溶媒安定性、造血細胞を含む多様な系列の細胞への高頻度形質導入、ならびに重複感染阻害が欠如し、したがって多重連続形質導入を可能にすることなどの利点を有する。アデノ随伴ウイルスは、部位に特異的な方式でヒト細胞ＤＮＡに組み込み、それによって、挿入変異誘発の可能性および挿入遺伝子発現の変動性を最小限に抑えることができる。さらに、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、組織培養で、選択圧がない状態で１００回を超える継代の間受け継がれており、このことは、アデノ随伴ウイルスゲノムの組み込みが、比較的安定な事象であることを暗示している。アデノ随伴ウイルスは、染色体外で機能することもできる。
【０１９５】
一般に、他の有用なウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子で置き換えられている非細胞変性真核生物ウイルスに基づくものである。非細胞変性ウイルスには、そのライフサイクルに、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写と、その後の宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルスの組み込みが伴う、ある特定のレトロウイルスが含まれる。一般に、レトロウイルスは、複製欠損である（例えば、所望の転写物の合成を方向付けることはできるが、感染性粒子を製造することはできない）。遺伝的に変えられたこのようなレトロウイルス発現ベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの高効率の遺伝子形質導入に対する一般的な実用性を有している。複製欠損レトロウイルスを生成するための標準プロトコール（外因性遺伝物質をプラスミドに組み込み、プラスミドで覆われたパッケージング細胞をトランスフェクトし、パッケージング細胞株によって組換えレトロウイルスを生成し、組織培養培地からウイルス粒子を収集し、標的細胞をウイルス粒子で感染させるステップを含む）は、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，  Ｍ．，  “Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９０）およびＭｕｒｒｙ，  Ｅ．Ｊ．  Ｅｄ．  “Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，”  ｖｏｌ．  ７，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｃｌｉｆｔｏｎ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  （１９９１）に提供されている。一部の実施形態では、ＤＵＸ４のエピジェネティックモジュレーター（例えば、干渉ＲＮＡまたは遺伝子編集複合体）が、レンチウイルスベクターによって細胞（例えば被験体の細胞）に送達される。
【０１９６】
核酸分子がｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれで宿主に導入されるかに応じて、本開示の核酸分子を細胞に導入するための様々な技術を用いることができる。このような技術には、核酸分子−リン酸カルシウム沈殿物のトランスフェクション、ＤＥＡＥと関連する核酸分子のトランスフェクション、目的の核酸分子を含む前述のウイルスを用いるトランスフェクションまたは感染、リポソーム媒介性トランスフェクション等が含まれる。他の例として、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈによるＮ−ＴＥＲ（商標）ナノ粒子トランスフェクション系、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎによる昆虫細胞のためのＦｅｃｔｏＦｌｙ（商標）トランスフェクション試薬、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．によるポリエチレンイミン「Ｍａｘ」、Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．による独自の非ウイルストランスフェクションツール、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＬＴＸトランスフェクション試薬、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅによるＳａｔｉｓＦｅｃｔｉｏｎ（商標）トランスフェクション試薬、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）トランスフェクション試薬、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ＳｃｉｅｎｃｅによるＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎによるＧＭＰに準拠したｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ（商標）トランスフェクション試薬、およびＮｏｖａｇｅｎによるＩｎｓｅｃｔ  ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（登録商標）トランスフェクション試薬が挙げられる。
【実施例】
【０１９７】
本発明の技術を、限定的なものとして決して解釈されるべきではない以下の実施例によって、さらに例示する。
【０１９８】
（実施例１：材料および方法）
以下は、後述の実施例で使用した例示的な材料および方法の簡単な説明である。
【０１９９】
ヒト細胞株。継代５０〜７９のＴ８４腸管上皮細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）を、ダルベッコ改変イーグル培地、ならびに１４ｍＭのＮａＨＣＯ３、１５ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．５）、４０ｍｇ／リットルのペニシリン、８ｍｇ／リットルのアンピシリン、９０ｍｇ／リットルのストレプトマイシンおよび５％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したハムＦ１２栄養混合物の混合物中で増殖させた。ＨＣＴ−８結腸癌細胞（ＡＴＣＣ）およびＨ２９２肺上皮癌細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１８−４８）を、１０％熱不活化ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０中で増殖させた。
【０２００】
ＨＣＴ−８上皮細胞のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ感染。ＨＣＴ−８細胞単層を増殖させ、０．３３ｃｍ２環担持型の、コラーゲンでコーティングした反転させた５μｍ孔ポリカーボネートフィルター（Ｃｏｓｔａｒ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）上で維持した。細胞を、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋（ＨＢＳＳ＋／＋）を含むハンクス緩衝塩溶液中１００μＭのプロベネシドコンジュゲートを用いて頂端側および側底側を処置し、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄した後、細胞を、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ血液型亜型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ株ＳＬ１３４４を用いてＭＯＩ３７５で１時間、頂端側を感染させた。広範囲に洗浄した後、好中球（１×１０６）を側底表面に添加し、単層を介して２時間遊出させ、下記の通り定量した。
【０２０１】
濃縮ヘポキシリンＡ３の生成。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株ＰＡ０１を、ＬＢブロス中３７℃で好気的に一晩増殖させた。培養物をＨＢＳＳ＋／＋で１回洗浄し、細菌６×１０７個／ｍＬの濃度で再懸濁させた。１６２ｃｍ２のフラスコ中、Ｈ２９２単層を１時間感染させ、ＨＢＳＳで洗浄し、次にＨＢＳＳ＋／＋中で５時間インキュベートした。収集した上清を、逆相クロマトグラフィーによってオクタデシルシラン（Ｃ１８）カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ）に捕捉し、水で洗浄し、メタノールで溶出した。試料を−２０℃で保存し、個々の実験に必要な体積に乾燥させ、必要に応じてＨＢＳＳ＋／＋に再懸濁させた。濃縮ＨＸＡ３のそれぞれの新しいバッチを、実験で使用する前に質について試験し、一般に１：４〜１：８の濃度で使用した。
【０２０２】
Ｐ−ｇｐノックダウンＴ８４細胞株の作製。ｐＬＫ０．１プラスミドバックグラウンドのｍｄｒ１ａ遺伝子を標的にするｓｈＲＮＡ構築物を含有する精製ＤＮＡを、ＵＭａｓｓ  ＲＮＡｉ  ｃｏｒｅから得た。構築物は、以下の通りであった。Ｂ４（クローンＩＤ：ＴＲＣＮ０００００５９６８３）、Ｂ５（クローンＩＤ：ＴＲＣＮ０００００５９６８４）、Ｂ６（クローンＩＤ：ＴＲＣＮ０００００５９６８５）、Ｂ７（クローンＩＤ：ＴＲＣＮ０００００５９６８６）、Ｂ８（クローンＩＤ：ＴＲＣＮ０００００５９６８７）。レンチウイルスを、Ｔｒａｎｓ−ＩＴ−ＬＴ１脂質（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ）を使用してｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ．２Ｇ、およびｐＬＫ０．１プラスミド構築物をパッケージング細胞（２９３Ｔ）にトランスフェクトすることによって生成した。４８時間後、レンチウイルス上清を回収し、８μｇ／ｍＬのポリブレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と合わせ、２０％コンフルエント単層中Ｔ８４細胞に適用した。この過程を、２４時間後、および第２のトランスフェクションの４８時間後に反復し、抵抗性細胞を、５μｇ／ｍＬのピューロマイシンを用いて選択した。安定なトランスフェクタント株が得られたら、ウエスタンブロットによって、抗Ｐ−ｇｐモノクローナル抗体Ｃ２１９（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰ−ｇｐ発現の低減を確認した。
【０２０３】
濃縮ＡＭＥＮＤの生成。Ｔ８４細胞を、１６２ｃｍ２のフラスコ中コンフルエント単層として増殖させ、Ｍｇ２＋／Ｃａ２＋を含むハンクス緩衝食塩溶液（ＨＢＳＳ＋／＋）中３７℃、５％ＣＯ２で平衡化した。細胞をベラパミルで処置するために、４０μＭのベラパミル塩酸塩（Ｓｉｇｍａ）が全インキュベーション中に含まれていた。５時間にわたって収集した細胞上清を、３０本のフラスコからプールし、凍結乾燥させ、水に再懸濁させ、Ａｍｉｃｏｎ  １，０００Ｄａカットオフ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を介してＮ２陽圧を用いて限外濾過した。試料を、Ｃ１８  Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ（登録商標）ＳｅｐＰａｋカラムに捕捉し、水およびヘキサンで洗浄し、メタノールで溶出し、Ｎ２ガス下で乾燥させ、−８０℃で保存した。試料を、遊走実験で使用する前に、必要に応じてＨＢＳＳ＋／＋に再懸濁させた。試料を、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ  ＧＰＣＲβ−アレスチン活性アッセイ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）でスクリーニングするために、ＰＢＳに再懸濁させて、スクリーニングのための１０００倍溶液を提供した。
【０２０４】
９６ウェルの好中球遊走。すべての研究を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ＩＲＢの承認に従って実施した。末梢血好中球を、既に記載されている通り（Ｈｕｒｌｅｙ，  Ｂ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７３：５７１２−５７２０  （２００４））、酸性クエン酸デキストロースで抗凝固処理した末梢血から２％ゼラチン沈殿によって精製した。赤血球を、冷ＮＨ４Ｃｌ緩衝液中で溶解させることによって除去し、好中球をＨＢＳＳ−／−（Ｃａ２＋なしかつＭｇ２＋なし）で洗浄し、最終体積５×１０７／ｍＬまで再懸濁させた。細孔径３μｍの９６ウェルＨＴＳトランスウェルフィルタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、０．１ｍｇ／ｍＬのラット尾コラーゲンでコーティングし、一晩乾燥させた。濃縮ＨＸＡ３（先を参照）を、１：１０希釈のビヒクル対照、濃縮ＡＭＥＮＤ（以下参照）、または指定濃度の精製内在性カンナビノイド化合物と共に、下のウェルに添加した。５×１０５個の好中球を、１：１０ビヒクルまたは精製内在性カンナビノイドと共に上のウェルに添加し、５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーターに入れ、２時間遊走させた。上のウェルを除去し、遊出した好中球を、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を用いて溶解させた。クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．２）を、０．１Ｍまで添加し、０．１Ｍクエン酸ナトリウム中等体積の２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を試料に添加した。ミエロペルオキシダーゼ（ｍｐｏ）活性を測定した。好中球細胞当量を、標準曲線と比較することによって算出し、個々の実験のデータを１００％ＨＸＡ３遊走に対して正規化した。データは、少なくとも３つの独立した実験から得られた平均＋／−ＳＥＭである。統計的分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して実施した。データを、適宜実験条件に合わせて、一元配置ＡＮＯＶＡまたはマン−ホイットニー非パラメトリックＵ検定のいずれかによって分析した。
【０２０５】
遊走アッセイで使用した精製化合物。すべての化合物を、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）から得、製造者の指示および経験的観測に基づいてＰＢＳに可溶性である最高濃度で再懸濁させ、次に１：１０希釈して、指定最終濃度に到達させた。
アラキドノイルエタノールアミド（ＡＥＡ）、ＣＡＳ番号９４４２１−６８−８を、０．０１ｍｇ／ｍＬで使用した。
α−リノレノイルエタノールアミド（α−ＬＥＡ）、ＣＡＳ番号５７０８６−９３−８を、０．００５ｍｇ／ｍＬで使用した。
リノレオイルエタノールアミド（ＬＥＡ）、ＣＡＳ番号６８１７１−５２−８を、０．０００１ｍｇ／ｍＬで使用した。
γ−リノレノイルエタノールアミド（γ−ＬＥＡ）、ＣＡＳ番号１５０３１４−３７−７を、０．０００１ｍｇ／ｍＬで使用した。
２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）、ＣＡＳ番号５３８４７−３０−６を、０．０１ｍｇ／ｍＬで使用した。
２−リノレオイルグリセロール（２−ＬＧ）、ＣＡＳ番号３４４３−８２−１を、０．０１ｍｇ／ｍＬで使用した。
２−（１４，１５−エポキシエイコサトリエノイル）グリセロール、ＣＡＳ番号８４８６６７−５６−１を、０．００５ｍｇ／ｍＬで使用した。
Ｎ−アラキドイルエタノールアミド（ＮＡＥ）、ＣＡＳ番号９４４２１−６９−９を、０．００５ｍｇ／ｍＬで使用した。
Ｏ−アラキドノイルエタノールアミン（Ｏ−ＡＥＡ）、ＣＡＳ番号４４３１２９−３５−９を、０．００１ｍｇ／ｍＬで使用した。
ノラジンエーテル（ＮＥ）、ＣＡＳ番号２２２７２３−５５−９を、０．００１ｍｇ／ｍＬで使用した。
１２−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（１２−ＨＥＴＥ）、ＣＡＳ番号７１０３０−３７−０を、０．００５ｍｇ／ｍＬで使用した。
２０−ＨＥＴＥエタノールアミド（２０−ＨＥＴＥ  Ｅｔｈ）、ＣＡＳ番号９４２０６９−１１−６を、０．００５ｍｇ／ｍＬで使用した。
オレオイルエタノールアミド（ＯＥＡ）、ＣＡＳ番号１１１−５８−０を、０．０１ｍｇ／ｍＬで使用した。
２パルミトイルグリセロール（２−ＰＧ）、ＣＡＳ番号２３４７０−００−０を、０．０５ｍｇ／ｍＬで使用した。
２−オレオイルグリセロール（２−ＯＧ）、ＣＡＳ番号３４４３−８４−３を、０．００２ｍｇ／ｍＬで使用した。
パルミトイルエタノールアミド（ＰＥＡ）、ＣＡＳ番号５４４−３１−０を、０．００００００５ｍｇ／ｍＬで使用した。
過酸化物を含まないアラキドン酸製剤（ｐｆＡＡ）、ＣＡＳ番号５０６−３２−１を、０．１２５ｍｇ／ｍＬで使用した。
【０２０６】
ＡＭＥＮＤのＬＣ／ＭＳ分析。先の通りＭｅＯＨで溶出した調製物を、Ｎ２流（ｇ）下で乾燥させ、ＭｅＯＨ／緩衝液に再懸濁させ、ＨＰＬＣによってＶｙｄａｃ（Ｈｅｓｐｅｒｉａ、ＣＡ）Ｃ１８（１０ｕｍ；３００Å）半分取カラム（１０×２５０ｃｍ）を使用して分離した。活性なＡＭＥＮＤ画分を、５ｍＭトリエチルアミン酢酸（ｐＨ７．２）で平衡化したＨＰＬＣ／質量分析（Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｃ１８（４ｕｍ、１２０Å）分析ＨＰＬＣカラム（４．６×１５０ｍｍ））によって、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱＤｅｃａエレクトロスプレー質量分析計を使用することによって溶出物を分析して特徴付けた。
【０２０７】
選択した試料を、高質量精度の決定のために分析し、０．２％ギ酸を含む５０：５０アセトニトリル：Ｈ２Ｏに可溶化した。ＭＡＸＩＳ−ＨＤ超高分解能四重極飛行時間型（ＵＨＲ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦ）質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ  ＧｍｂＨ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、これをシリンジドライバー（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｂｏｎａｄｕｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）につなぎ、試料溶液を３μＬ／分の速度で注入した。
【０２０８】
窒素を噴霧ガスとして作用させ、圧力２バールで適用した。乾燥ガスも窒素であり、流量８Ｌ／分および温度２００℃で供給した。正イオンモードを、対応するキャピラリー電圧−４５００Ｖで使用した。完全な走査データだけを取得した。試料のバッチごとに、５ｍＭギ酸ナトリウムクラスターの溶液も分析した。これは、質量範囲７５〜１０００ｍ／ｚにわたって外部データファイル較正物質として作用した。再較正した検出質量および同位体パターンを、ＦｉｎｄＦｏｒｍｕｌａツールで使用して、２ｍＤａの検出質量内で潜在的理論式の一覧を作製した。検出した同位体パターンを使用して、この一覧を分類した。
【０２０９】
データ取得および自動処理は、Ｃｏｍｐａｓｓ  ＯｐｅｎＡｃｃｅｓｓ  １．７ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ  ＧｍｂＨ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって調節し、データ処理は、ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ  ３．４（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｋ  ＧｍｂＨ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して行った。各ステップにおいて、試料を氷上およびＮ２ガス下にできる限り維持することによって、試料の分解および酸化を回避するように注意を払った。イオン強度による相対的定量化を、プロトン化およびナトリウム付加（ｓｏｄｉａｔｅｄ）イオンの強度を合計することによって実施して、様々な生物学的ナトリウムレベルに起因する付加物形成において可能な変動を相殺した。
【０２１０】
マウス実験。Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびｃｎｒ２−／−マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、ＦＶＢｗｔおよびｍｄｒ１ａ−／−を、Ｔａｃｏｎｉｃから購入した。６〜１２週齢の雌マウスを使用し、遺伝子型を実験前に２〜４週間混合して、微生物叢を等しくした。マウスを、飲料水中３％ＤＳＳ（分子量３６，０００〜５０，０００、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）で７日間処置し、次に通常の水に戻し、疾患ピークを示した９日目に屠殺した。中結腸および遠位結腸の試料を、１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、切片にし、病理組織学的分析のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。各試料を、（１）上皮過形成および杯状細胞枯渇の程度、（２）粘膜固有層への白血球浸潤、（３）影響を受けた組織の面積、ならびに（４）重症の炎症、例えば陰窩膿瘍、粘膜下炎症および潰瘍のマーカーの存在の４つの基準について、半定量的に０〜３で段階分けした。試料は、試料の正体について盲検にした訓練された研究者によってスコア化され、中結腸および遠位結腸の値を平均化して、結腸組織病理スコアを得た。
【０２１１】
粘膜固有層白血球の単離およびフローサイトメトリー。粘膜固有層からの細胞懸濁物を、既に記載されている通り調製した（Ｂｕｏｎｏｃｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。腸管組織を小片に切断し、１０％ＦＢＳおよび５ｍＭのＥＤＴＡを含むＲＰＭＩで処置して上皮細胞を除去し、次に、１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼタイプＶＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に、１時間の２つの期間にわたってインキュベートした。次に、細胞を、不連続な３０／４０／７５％勾配のＰｅｒｃｏｌｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用し、４０／７０％界面から回収した。細胞をＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで洗浄し、抗Ｆｃ受容体（αＣＤ１６／３２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共にインキュベートし、Ｚｏｍｂｉｅ  Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ赤外染料（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色し、次にＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｇ、およびＬｙ６ＣまたはＧｒ１に対する抗体で表面染色した。試料をＭＡＣＳｑｕａｎｔ分析機１０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に流し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアバージョン１０（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を使用して分析した。
【０２１２】
マウス試料におけるミエロペルオキシダーゼ含量の分析。試料を、記載されている通り、ミエロペルオキシダーゼ活性についてアッセイした（例えば、Ｐｕｌｌｉ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８，  ｅ６７９７６  （２０１３）を参照されたい）。結腸の組織切片を、液体Ｎ２中で凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。切片を、溶解マトリクスＤ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を含む臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＨＴＡＢ、Ｓｉｇｍａ）緩衝液に入れ、ＦａｓｔＰｒｅｐ−２４ホモジナイザーをレベル６で用いて４０秒間ホモジナイズした。試料をＡＢＴＳと合わせ、蛍光を８分にわたって読み取った。傾きを、線形回帰によってＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して算出し、ビシンコニン（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｃ）酸アッセイ（ＢｉｏＲａｄ）によって測定される通り、個々の試料についてタンパク質含量に対して正規化した。糞便試料を分析するために、糞便含量を秤量し、ＨＴＡＢ緩衝液を１０μＬ／ｍｇの比で添加し、算出した傾きを直接使用した。
【０２１３】
結腸粘膜におけるＨＸＡ３の質量分析。マウスの飲料水に５％ＤＳＳを入れてマウスに投与し、７日目に屠殺した。未処置またはＤＳＳで処置したマウス（マウス９匹／コホート）から近位結腸を回収し、３つの腸管セグメントをプールした。腸管表面を、ＰＢＳ中ラバーポリスマンを用いて擦過することによって粘膜擦過標本を収集し、ＨＸＡ３含量を、既に記載されている通り分析した（Ｍｕｍｙ，  Ｋ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７６：３６１４−２７  （２００８））。
【０２１４】
（実施例２：プロベネシドコンジュゲートの合成）
デキストラン−プロベネシドコンジュゲートの一般的合成の例示的な例を、スキーム１に示す。
【化５】
2020526537.tif 000007
【０２１５】
デキストラン−プロベネシドコンジュゲートの合成の概説。デキストラン１．１は、多糖類である。その平均分子量は、典型的に約１０００ダルトン〜約１，０００，０００ダルトンの範囲である。デキストランジオール官能基の酸化により、デキストラン−ジアルデヒド１．２が生成される。酸化のために使用した酸化剤には、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウムが含まれる。水またはアルコールと水の混合物を、酸化反応のための溶媒として使用する。デキストラン−ジアルデヒド１．２のための文献による調製には、Ｈｉｃｋｓ  ＆  Ｍｏｌｄａｙ，  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．  ２６：１００２−１０１３  （１９８５）のものが含まれる。
【０２１６】
デキストランアルデヒド１．２は、アルキルジアミン１．３を用いる還元的アミノ化を容易に受けて、デキストラン−アルキルジアミン１．４を生じる。反応は、還元剤の存在下で、適切な溶媒中、１．２を過剰のアルキルジアミン１．３と接触させることによって行う。アルキルジアミンの一例は、ヘキシルジアミンである。還元的アミノ化を行うための試薬には、水素化ホウ素ナトリウムおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムが含まれる。典型的に使用される溶媒は、水およびアルコールと水の混合物であり、ｐＨはｐＨ５．５〜８．５の間に維持される。得られるデキストラン−アルキルアミン１．４のアミン置換レベルは、反応条件に応じて約５％〜約７０％である。本明細書に記載される方法では、Ｈｉｃｋｓ  ＆  Ｍｏｌｄａｙ  （１９８５）の方法を用いて、デキストランから１．４を調製した。
【０２１７】
スキーム１に示される通り、デキストラン−アルキルジアミン１．４を、プロベネシド１．５とカップリングして、デキストラン−プロベネシドコンジュゲート１．６を生成し、ここでｎは、１〜１０の任意の整数であってよい。カップリング反応は、デキストラン−アルキルジアミン１．４の末端の第一級アミノ基とプロベネシド１．５のカルボン酸基との間で生じる、アミド結合形成反応である。カルボン酸基を、最初に、様々な試薬によって活性化する。活性化試薬には、それに限定されるものではないが、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、エチル−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、（７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ）、ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド（ＢＯＰ−クロリド）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、およびカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）が含まれる。カップリング反応を実施するために使用される溶媒には、それに限定されるものではないが、二塩化メチレン、エーテル、酢酸エチル、トルエン、およびテトラヒドロフランが含まれる。典型的な反応時間は、約１５分から約１２時間までの範囲である。反応の進行は、プロトンＮＭＲによってモニタリングすることができる。アミドカップリングは、約５％〜約９５％のポリマーアミン誘導体化をもたらすことができる。分析的な特徴付けには、残りの遊離アミン（カップリング反応の程度）の直接測定、およびプロトンＮＭＲ、質量分析または他の適切な分析技術によるプロベネシドカップリング生成物の測定が含まれる。
【０２１８】
デキストラン−プロベネシドコンジュゲートの合成
【化６】
2020526537.tif 000008
【０２１９】
デキストラン−プロベネシドコンジュゲート１．３Ａの調製。４０ｋＤａのデキストラン−ヘキシルアミン（０．５ｇ、０．２６３ミリモルのＮＨ２）を、ＭＥＳ緩衝液２０ｍＬに溶解させ、プロベネシド（１１２ｍｇ、１．５倍モル過剰）を添加した。反応混合物、ｐＨ６．２５を、室温で激しく撹拌して、透明溶液を得た。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ；２００ｍｇ）を添加し、反応混合物を１５分間撹拌した。反応混合物を、透析管（１５ｋＤａ膜）に移した。透析後、Ｄｘ−プロベネシド１．３Ａを、凍結乾燥によって乾燥粉末として単離した。プロベネシドコンジュゲート１．３Ｂを、同じ方法によって、１０ｋＤａのデキストラン−ヘキシルアミン１．１Ｂを使用して調製する。
【０２２０】
デキストラン−プロベネシドコンジュゲートの代替合成
【化７】
2020526537.tif 000009
【０２２１】
デキストラン−プロベネシドコンジュゲート２．５の調製。モノ−Ｂｏｃヘキサンジアミン２．１（ＣＡＳ番号５１８５７−１７−１、１グラム）およびプロベネシド１．２（１．５モル当量）を、二塩化メチレン（１５ｍＬ）に溶解させる。ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．５モル当量）を添加し、反応混合物を３時間撹拌する。溶液を濾過して、ジシクロヘキシル尿素（ｄｉｓｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｕｒｅａ）を除去し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去する。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、７５０ｍｇのＢｏｃ−アミド２．２を提供する。化合物を、ＮＭＲおよび質量分析によって特徴付ける。
【０２２２】
トリフルオロ酢（ｔｒｉｆｕｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ）酸（１ｍＬ）を、Ｂｏｃ−アミド２．２（５００ｍｇ）の二塩化メチレン（１０ｍＬ）溶液に添加する。反応混合物を２時間撹拌し、溶媒をロータリーエバポレーターで除去する。残留物を酢酸エチルに溶解させ、飽和重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄する。有機溶媒を、固体硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、酢酸エチル溶媒を、ロータリーエバポレーターを使用して除去して、アミン２．３を得る。化合物２．３が定量的収量で得られ、任意のさらなる精製は必要ない。化合物を、ＮＭＲおよび質量分析によって特徴付ける。
【０２２３】
デキストランアルデヒド２．４（５００ｍｇ）を、ホウ酸ナトリウム水溶液（４００ｍＭ溶液５ｍＬ、ｐＨ８．５）に溶解させる。プロベネシドアミノヘキシルアミド２．３（メタノール２ｍＬに予め溶解させた５モル当量）を添加した後、新しく調製したシアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液（１０モル当量の３モル濃度水溶液）を添加する。反応混合物を２５℃で４時間撹拌する。反応混合物を透析バッグに移し、水に対して２４時間透析する（それぞれ１Ｌの水を２回交換する）。透析バッグの内容物をガラスバイアルに移し、溶液を凍結乾燥させて、ポリマーコンジュゲート２．５を得る。化合物を、ＮＭＲおよび質量分析によって特徴付ける。
【０２２４】
グリシダール（ｇｌｙｃｉｄａｌ）ベースのデキストラン−プロベネシドコンジュゲートの合成
【化８】
2020526537.tif 000010
【０２２５】
デキストラン−プロベネシドコンジュゲート３．２の調製。デキストランアルデヒドポリマー３．１（５００ｍｇ）を、ホウ酸ナトリウム水溶液（４００ｍＭ溶液５ｍＬ、ｐＨ８．５）に溶解させる。プロベネシドアミノヘキシルアミド２．３（メタノール２ｍＬに予め溶解させた５モル当量）を添加した後、新しく調製したシアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液（１０モル当量の３モル濃度水溶液）を添加する。反応混合物を２５℃で４時間撹拌する。反応混合物を透析バッグに移し、水に対して２４時間透析する（それぞれ１Ｌの水を２回交換する）。透析バッグの内容物をガラスバイアルに移し、溶液を凍結乾燥させて、ポリマーコンジュゲート３．２を得る。化合物を、ＮＭＲおよび質量分析によって特徴付ける。
【０２２６】
ＰＥＧ−プロベネシドコンジュゲートの合成
【化９】
2020526537.tif 000011
【０２２７】
デキストラン−プロベネシドコンジュゲート４．２の調製。撹拌棒を装着した２５ｍＬの丸底フラスコに、０．１Ｍの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸水溶液（ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．０）（１０ｍＬ）およびＰＥＧアミン４．１（４０，０００ＭＷの２アームの分岐ＰＥＧアミン、ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎカタログ番号ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＧＬ２−４００ＰＡ、５００ｍｇ）を充填する。プロベネシド１．２（３モル当量）を添加し、透明溶液が得られるまで反応混合物を激しく撹拌する。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（３モル当量）を添加し、反応混合物を３０分間撹拌する。反応混合物を透析バッグに移し、水に対して２４時間透析する（それぞれ１Ｌの水を２回交換する）。透析バッグの内容物をガラスバイアルに移し、溶液を凍結乾燥させて、ポリマーコンジュゲート４．２を得る。化合物を、ＮＭＲおよび質量分析によって特徴付ける。
【０２２８】
さらなるＰＥＧ−プロベネシドコンジュゲートの合成。スキーム５およびスキーム３と同様にして、プロベネシドの様々なＰＥＧコンジュゲートを、ＰＥＧの様々な誘導体を使用し、アミドカップリングまたは還元的アミノ化のいずれかを使用して調製することができる。これらは、以下のスキーム６〜１９に図示されている。
【化１０】
2020526537.tif 000012
分子量：５，０００
化学名：α−アミノプロピル−ω−メトキシ、ポリオキシエチレン
ＣＡＳ番号：１１６１６４−５３−５
ＮＯＦカタログ番号：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−２０Ｈ
【化１１】
2020526537.tif 000013
分子量４０，０００
化学名：α−アミノプロピル−ω−メトキシ、ポリオキシエチレン
ＣＡＳ番号：１１６１６４−５３−５
ＮＯＦカタログ番号：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−４０Ｔ
【化１２】
2020526537.tif 000014
分子量５，０００
化学名：α−メトキシ−ω−（３−オキソプロポキシ）、ポリオキシエチレン
ＣＡＳ番号：１２５０６１−８８−３
ＮＯＦカタログ番号：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−０５０ＡＬ
【化１３】
2020526537.tif 000015
分子量４０，０００
化学名：α−メトキシ−ω−（３−オキソプロポキシ）、ポリオキシエチレン
ＣＡＳ番号：１２５０６１−８８−３
ＮＯＦカタログ番号：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−４００ＡＬ２
【化１４】
2020526537.tif 000016
分子量５，０００
化学名：α−アミノプロピルオキシ−ω−（アミノプロピルオキシ）、ポリオキシエチレン
ＣＡＳ番号：２５３２２−６８−３
ＮＡＮＯＣＳカタログ番号：ＰＧ２−ＡＭ−５Ｋ
【化１５】
2020526537.tif 000017
分子量３０，０００
化学名：ジ−（α−アミノプロピルオキシ）−ω−（３−オキソプロポキシ）、ポリオキシエチレン
ＣＡＳ番号：２５３２２−６８−３
ＮＯＦカタログ番号：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＤＥ−３００ＰＡ
【化１６】
2020526537.tif 000018
分子量５０００
化学名：α−オキソプロキシ（ｏｘｏｐｒｏｘｙ）−ω−（３−オキソプロポキシ）、ポリオキシエチレン
ＮＡＮＯＣＳカタログ番号：ＰＧ２−ＡＬ−５ｋ
【化１７】
2020526537.tif 000019
４アームのＰＥＧ、−（（ＣＨ２）３−ＮＨ２）
分子量：１０，０００
化学名：ペンタエリスリトールテトラ（アミノプロピル）ポリオキシエチレン
ＣＡＳ番号：８０４５１４−６７−８
ＮＯＦカタログ番号：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＨＧＥＯ−１００ＰＡ
【化１８】
2020526537.tif 000020
８アームのＰＥＧ、−（（ＣＨ２）３−ＮＨ２）８
分子量：１５，０００
化学名：ヘキサグリセロールオクタ（アミノプロピル）ポリオキシエチレン
ＮＯＦカタログ番号：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＨＧＥＯ−１５０ＰＡ
【化１９】
2020526537.tif 000021
２アームの分岐ＰＥＧ、−（ＣＨ２）３−ＮＨ２
分子量：４０，０００
化学名：２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−（アミノプロピルオキシ）プロパン
ＮＯＦカタログ番号：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＰＡ
【化２０】
2020526537.tif 000022
３アームの分岐ＰＥＧ、−（ＣＨ２）３−ＮＨ２
分子量：５０，０００
化学名：２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１［（３−アミノプロピル）ポリオキシエチレン−オキソプロピルアミノカルボニル−オキシ］−プロパン
ＮＯＦカタログ番号：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ３−４００ＰＡ１００Ｕ
【化２１】
2020526537.tif 000023
４アームの分岐ＰＥＧ、−（ＣＨ２）３−ＮＨ２
分子量：４０，０００
化学名：２，３−ビス−［２’，３’−ジ（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１’−プロピル］ポリオキシエチレン−オキシ−１−（アミノプロピルオキシ）プロパン
ＮＯＦカタログ番号：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ４−４００ＰＡ
【化２２】
2020526537.tif 000024
２アームのＰＥＧ、−（（ＣＨ２）２−ＮＨ２）２
分子量：４０，０００
化学名：１，３−ビス（２−アミノエトキシ）２，２−ビス（メチル−ポリオキシエチレン−オキシメチル）プロパン（アミノプロピルオキシ）プロパン
ＮＯＦカタログ番号：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＰＴＥ２−４００ＥＡ
【化２３】
2020526537.tif 000025
２アームのＰＥＧ、−（（ＣＨ２）２−ＮＨ２）２
分子量：２０，０００
化学名：１，３−ビス（２−アミノエトキシ）２，２−ビス（メチル−ポリオキシエチレン−オキシメチル）プロパン（アミノプロピルオキシ）プロパン
ＮＯＦカタログ番号：ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＰＴＥ２−２００ＥＡ
【０２２９】
ＰＥＧアミンコンジュゲート５．２、６．２、９．２、１０．２、１２．２、１３．２、１４．２、１５．２、１６．２、１７．２、および１８．２を調製するための一般手順。撹拌棒を装着した２５ｍＬの丸底フラスコに、０．１Ｍの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸水溶液（ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．０）（１０ｍＬ）およびアミンポリマーアミン（５００ｍｇ）を充填する。プロベネシド１．２（３モル当量）を添加し、透明溶液が得られるまで反応混合物を激しく撹拌する。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（３モル当量）を添加し、反応混合物を３０分間撹拌する。反応混合物を透析バッグに移し、水に対して２４時間透析する（それぞれ１Ｌの水を２回交換する）。透析バッグの内容物をガラスバイアルに移し、溶液を凍結乾燥させて、ポリマーコンジュゲートを得る。化合物を、ＮＭＲおよび質量分析によって特徴付ける。
【０２３０】
ＰＥＧアルデヒドコンジュゲート７．２、８．２、および１１．２を調製するための一般手順。反応容器に、ポリマーアルデヒド（５００ｍｇ）およびホウ酸ナトリウム水溶液（４００ｍＭの溶液５ｍＬ、ｐＨ８．５）を充填する。プロベネシドアミノヘキシルアミド２．３（メタノール２ｍＬに予め溶解させた５モル当量）を添加した後、新しく調製したシアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液（１０モル当量の３モル濃度水溶液）を添加する。反応混合物を２５℃で４時間撹拌する。反応混合物を透析バッグに移し、水に対して２４時間透析する（それぞれ１Ｌの水を２回交換する）。透析バッグの内容物をガラスバイアルに移し、溶液を凍結乾燥させて、ポリマーコンジュゲートを得る。化合物を、ＮＭＲおよび質量分析によって特徴付ける。
【０２３１】
（実施例３：プロベネシドコンジュゲートは結腸腔への好中球浸潤を低減する）
ＭＲＰ／ＨＸＡ３経路が、肺および腸管上皮の両方において複数の病原体による感染中に保存されることが示されているので（Ｂｏｌｌ，  Ｅ．  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １４：１２０−３２  （２０１２）；  Ｍｕｍｙ，  Ｋ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７６：３６１４−２７  （２００８）；  Ｈｕｒｌｅｙ，  Ｂ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７３：５７１２−５７２０  （２００４））、その経路が、感染がない状態でも炎症を推進するかどうかについて分析した。
【０２３２】
デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）によってマウスを処置すると、上皮損傷および好中球流入によって特徴付けられる急性結腸炎症が誘導される（Ｏｋａｙａｓｕ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ９８：６９４−７０２  （１９９０））。結腸粘膜擦過標本の半定量的ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析は、ＤＳＳを用いる処置によって上皮表面におけるＨＸＡ３の分泌が強力に誘導されたことを明らかにした（図１Ａ）。このＨＸＡ３の増大が疾患に寄与することを確認するために、ＨＸＡ３分泌を、ＭＲＰ２のプロベネシド阻害によって遮断した（Ｐａｚｏｓ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８１：８０４４−５２  （２００８））。プロベネシドを、還元的アミド化反応によって、過ヨウ素酸で酸化された４０ｋＤａのデキストランに化学的にコンジュゲートした。結合したデキストランのサイズが理由で、腸管へのこの化合物の直腸内送達は、管腔ＭＲＰ２を標的にするが、全身循環には到達しないと予測される。このコンジュゲートは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染アッセイにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで機能的であった（図５）。プロベネシド−デキストランコンジュゲートの直腸内投与によるＭＲＰ２／ＨＸＡ３経路のｉｎ  ｖｉｖｏ阻害によって、ＤＳＳにより誘導される腸管病理および結腸短絡（ｃｏｌｏｎ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）が著しく低減した（図１Ｂ〜１Ｄ）。結腸組織病理の分析によって、プロベネシド−デキストランコンジュゲートで処置したマウスでは、結腸腔への好中球浸潤が低減したことが明らかになり（図１Ｄ）、このことは、糞便試料におけるミエロペルオキシダーゼの著しい低減によって確認された（図１Ｅ）。それとは逆に、粘膜固有層における好中球の定量化によって、プロベネシド処置による有意差は明らかにならなかったが（図１Ｆ〜１Ｉ）、このことは、処置によって、上皮を横切る管腔への遊走が主に遮断されたことを示している。これらの知見は、ＭＲＰ２／ＨＸＡ３経路の他の研究と合致しており、経上皮の好中球遊走が、炎症性病理を増悪する上である役割を果たし得ることを示唆している。
【０２３３】
したがって、これらの結果は、本発明の技術のプロベネシドコンジュゲートが、組織への好中球浸潤を低減し、炎症状態、例えば結腸炎症を処置する方法において有用であることを示している。
【０２３４】
（実施例４：Ｐ−糖タンパク質はＡＭＥＮＤを分泌する）
静止Ｔ８４結腸上皮細胞から上清を収集し、限外濾過して、１ｋＤａよりも小さい化合物を収集した後、逆相液体クロマトグラフィーによって脂質を濃縮した。これらの脂質濃縮上清は、無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、ＨＸＡ３によって刺激された初代ヒト好中球の遊走を阻害することができた（図２Ａ）。この活性を示す未知の化合物を、活性をモジュレートする上皮好中球のディスコース（Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ｄｉｓｃｏｕｒｓｅ）にちなんで「ＡＭＥＮＤ」と命名した。ＡＭＥＮＤがＰ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）によって特異的に分泌されることを確認するために、ｍｄｒ１ａを標的にするｓｈＲＮＡを発現する安定なノックダウンＴ８４細胞株を創出し、Ｐ−ｇｐ発現の低減をウエスタンブロットによって確認した（図６）。Ｐ−ｇｐ欠損細胞からの濃縮上清は、ＡＭＥＮＤ活性が欠如しており、好中球遊走を阻害しなかった（図２Ｂ）。Ｐ−ｇｐの阻害剤であるベラパミルを用いる野生型細胞の処置後に、類似の結果が得られた（図７）。
【０２３５】
（実施例５：好中球遊走の阻害に関与するＡＭＥＮＤ構成成分）
好中球遊走の阻害に関与するＡＭＥＮＤ構成成分を特定するために、受容体活性化についてプローブする標的指向的手法を行った。濃縮ＡＭＥＮＤを、Ｇタンパク質サブタイプとは独立したβ−アレスチン活性のためのアッセイで、ＧＰＣＲパネルに対するアゴニストおよびアンタゴニスト活性の両方についてスクリーニングした。ＡＭＥＮＤは、遊走阻害剤としての役割と合致して、主に、走化性因子受容体を含むＧＰＣＲにおいてアンタゴニスト活性を示した（表１）。しかし、観測された最強シグナルは、末梢性カンナビノイド受容体であるＣＢ２におけるアゴニスト活性についてのものであり、これはＡＭＥＮＤが１つまたは複数の内在性カンナビノイドとして特定されることを裏付ける。
【表１−１】
2020526537.tif 000026
【表１−２】
2020526537.tif 000027
【０２３６】
表１に関して、Ｔ８４細胞からＡＭＥＮＤの大規模調製物を調製し、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘ  ＧＰＣＲベータ−アレスチン活性化アッセイにおいてアゴニストモードおよびアンタゴニストモードの両方でスクリーニングした。活性パーセント（活性％）を、両方のモードについて示す。アンタゴニスト活性については、列挙したアゴニストによるＧＰＣＲ活性化の阻害パーセントを示す。１〜２列および３〜４列は、ＡＭＥＮＤが１０％の任意の閾値を超えるアゴニスト活性を示したＧＰＣＲを示す。５〜７列および８〜１７列のＧＰＣＲは、マイナスの阻害パーセンテージを有していたが、アゴニストアッセイでは対応する活性を有していなかった。１８〜２１列は、ＡＭＥＮＤがアゴニスト活性およびアンタゴニスト活性の両方を示したＧＰＣＲを含有しており、これは、この混合物の独立した構成成分を反映し得る。２２〜４６列は、ＡＭＥＮＤが１０％の任意のカットオフを超えるアンタゴニスト活性を示したＧＰＣＲを含有している。
【０２３７】
ＡＭＥＮＤ活性が内在性カンナビノイドによって提供されることを確認するために、これらの酵素に対するその感受性を調査した。ＦＡＡＨを用いる濃縮ＡＭＥＮＤの処置によって、ＡＭＥＮＤの阻害活性が完全に排除されたが、ＭＡＧＬを用いる処置では、ＨＸＡ３誘導性遊走を阻害するＡＭＥＮＤの能力は低減されず（図２Ｃ）、このことは、ＡＭＥＮＤがＮＡＥクラスに属していることを示唆している。酵素処置の特異性を確認するために、遊走を阻害する非内在性カンナビノイド脂質リポキシンＡ４を用いて類似の実験を実施したが、ＦＡＡＨまたはＭＡＧＬによる失活に対して感受性ではなかった（図８）。
【０２３８】
（実施例６：ＡＭＥＮＤの特徴付け）
ＡＭＥＮＤの特定を、質量分析によってさらに絞り込んだ。ベラパミルで処置したまたはベラパミルで処置しなかった上皮細胞から調製した濃縮ＡＭＥＮＤ調製物を、逆相ＨＰＬＣに供すると、潜在的ＡＭＥＮＤ化合物を含有するベラパミルがない状態で、特異的なピークが明らかになった（図２Ｄ）。対照およびＰ−ｇｐ欠損マウスからの濃縮ＡＭＥＮＤ調製物を、エレクトロスプレー質量分析実施に正イオンモード（ＬＣ／ＭＳ）で供し、ＮＡＥおよびＭＡＧクラスの両方のいくつかの内在性カンナビノイドのレベルが、Ｐ−ｇｐがない状態で低減したことが見出された（表２）。相対的存在量の質的分析では、アナンダミド（ＡＥＡ）に合致するＨ＋およびＮａ＋付加物質量についてのピークプロファイルにおける顕著な差異が明らかになった（図２Ｅ）。これらのＰ−ｇｐによって輸送されたどのＥＣが、実際のＡＭＥＮＤ阻害活性を示すかを決定するために、精製した化合物を無細胞遊走アッセイで試験した。ＡＥＡ、オレオイルエタノールアミド（ＯＥＡ）、およびアルファ−リノレノイルエタノールアミド（α−ＬＥＡ）だけが著しい阻害活性を示したので、これらのＮＡＥを推定上のＡＭＥＮＤ構成成分として特定した（図２Ｆ）。
【表２】
2020526537.tif 000028
【０２３９】
表２に関して、半定量的ＭＳ分析を実施して、対照Ｔ８４細胞からの濃縮ＡＭＥＮＤ調製物を、ｓｈＲＮＡ媒介性Ｐ−ｇｐノックダウン（Ｂ４−ｍｄｒ１ａおよびＢ５−ｍｄｒ１ａ）のものと比較した。各化合物の相対的存在量を、アナンダミド−ｄ８標準の測定強度と比較することによって算出した。これは単に、アナンダミド自体について正確に定量的なものであるが、残りの化合物についての試料間の相対的単位の比較が可能になった。
【０２４０】
（実施例７：内在性カンナビノイド経路）
膜タンパク質は、上皮を横切ってアナンダミドおよび２−ＡＧを輸送することができると考えられたが、細胞へのおよび細胞からの内在性カンナビノイド輸送の機序は、ほとんど理解されてない。現在、このトランスポーターの正体はＰ−ｇｐとして確立されているので、この経路が腸管内で活性であるかどうかを調査した。ＷＴマウスおよびＰ−ｇｐ欠損（ｍｄｒ１ａ−／−）マウスの結腸からの粘膜擦過標本を、ＡＭＥＮＤについて濃縮し、好中球の遊走を阻害するそれらの能力について評価した。ＷＴマウスからのこれらのｅｘ  ｖｉｖｏ擦過標本は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡＭＥＮＤと同様に遊走を阻害したが、ｍｄｒ１ａ−／−マウスからの擦過標本は、阻害活性が欠如していた（図３Ａ）。ＷＴマウスからの擦過標本をＦＡＡＨで事前処置した場合、擦過標本はそれらの阻害活性を喪失したが、これにより、これらの試料がＮ−アシルエタノールアミン内在性カンナビノイド（ＮＡＥ  ＥＣ）を含有していたことが確認された（図３Ｂ）。
【０２４１】
Ｐ−ｇｐによるＥＣの分泌はｉｎ  ｖｉｖｏで生じることが実証されているので、ＥＣの分泌が腸管内でＨＸＡ３機能を制御するかどうかを調査した。過去の報告と合致して、Ｐ−ｇｐ依存性ＥＣ分泌が欠如しているｍｄｒ１ａ−／−マウスは、自発性大腸炎を発症することに加えて、ＤＳＳ大腸炎に対する感受性がより高い（図９）。同様に、ＡＭＥＮＤに応答できないＣＢ２欠損マウス（ｃｎｒ２−／−）では、ＤＳＳ誘導性大腸炎に対する感受性の増大が実証された（図４Ａ〜４Ｃ）。特に、そのマウスは、腸管腔への好中球の遊走の劇的な増加を示したが（図４Ｃ、４Ｄ）、組織への好中球の蓄積は、大きな影響を受けなかった（図４Ｅ〜４Ｈ）。これらの並列実験では、機能的Ｐ−ｇｐ／ＡＭＥＮＤ経路が存在しないと、腸管の恒常性が撹乱され、マウスは炎症性疾患をより急速に発生しやすいことが確立される。正常な好中球遊出が、プロベネシドによりＤＳＳ大腸炎中に遮断された場合（図１）、上皮を横切る遊走は、疾患病理に寄与する著しい組織損傷を特異的に引き起こした。
【０２４２】
（実施例８：Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染中のＭＲＰ発現パターンの調査）
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染中の炎症応答を研究するために、ＰＭＮ遊走のｉｎ  ｖｉｔｒｏのモデルを、タイプＩＩ肺胞上皮細胞型であるヒト粘膜表皮肺癌細胞株、ＮＣＩ−Ｈ２９２（本明細書では「Ｈ２９２」と特定される）の極性単層を使用して確立した。排出トランスポーターが、宿主を防御する上である役割を果たすという認識が深まっていることを考慮して、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染中のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が異なる遺伝子を分析するという目的でこのモデルを使用して、ＭＲＰの発現プロファイルをさらに調査した。ｍＲＮＡを抽出し、ＭＲＰ１、２、３、５およびＭＤＲ１（Ｐ−糖タンパク質、すなわちＰ−ｇｐをコードする遺伝子）の発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲによって定量すると、ＭＲＰ１がＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染中に穏やかに低減した一方、ＭＲＰ２およびＭＲＰ５の両方の発現がわずかな増大を示したことが見出された。しかし、これらの変化のいずれも、統計的に有意ではなかった（図２１Ｂ）。また、ベースラインにおいてまたは肺炎球菌感染中にＭＤＲ１の検出可能な発現はなかった。さらに、タンパク質の発現についてウエスタンブロットによって分析した細胞ライセートは、肺炎球菌感染中、ＭＲＰ１の類似の低減を示した（図２１Ａ）。ＭＲＰ２は、全細胞含量のわずかな低減を示した一方、ＭＲＰ４およびＭＲＰ５はわずかな増大を示したが、これらの変化は統計的に有意ではない。ＭＲＰ３およびＰ−ｇｐは、ＲＴ−ＰＣＲデータと同様に、ウエスタンブロットによって検出不可能であった。したがって、これらのタンパク質は、Ｈ２９２細胞によっては発現されず、または調査した条件下では測定不可能であると推測されるが、これは、これらのトランスポーターを基底状態で測定した過去の研究と合致している。
【０２４３】
（実施例９：ＭＲＰ１およびＭＲＰ２はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ感染中に多様な発現パターンを示す）
全細胞ｍＲＮＡおよびタンパク質において著しい変化はほとんど観測されなかったが、ＭＲＰは、全体的細胞局在に影響を及ぼし得る翻訳後修飾を受けることが十分に考証されている。ＭＲＰの主な活性は、細胞内空間から細胞外環境にペイロードを排出することなので、排出タンパク質の細胞内局在は非常に重要である。タンパク質が、そのリガンドを細胞外空間に排出するようにそれ自体指向されていなければ、このようなポンプの活性は無用なはずである。したがって、肺炎球菌感染がＭＲＰ翻訳後修飾または細胞内局在を惹起し得るかどうかを調査した。この可能性を調査するために、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染またはハンクス緩衝塩溶液による非感染処置の後に、極性細胞単層の頂端表面を選択的にビオチン化した。この方法は、肺炎球菌感染に応答するタンパク質発現の変化を頂端表面において特異的に特定可能にするので、頂端で発現されたＭＲＰを、肺炎球菌感染の非存在および存在下で調査した。感染した管腔空間に免疫調節物質を排出する可能性が高いそれらのトランスポーターに重点を置く手段として、頂端表面を選択的に標識した。
【０２４４】
肺炎球菌感染中にＭＲＰ１、−２、および−５の発現が修正されることを考慮して（図２１Ａ〜Ｂ）、これらのトランスポーターを調査した。図１６に示される通り、肺炎球菌感染後に、頂端表面のＭＲＰ１の著しい低減が検出された一方、ＭＲＰ２の頂端表面発現は著しく増大した。このような結果は、ｍＲＮＡ発現データ（およびＭＲＰ１によるタンパク質の発現データ、図２１Ａ〜Ｂ）と合致している。しかし、表面発現されたＭＲＰ４およびＭＲＰ５の名目上の変化しかなく、これらの変化は、ＭＲＰ１およびＭＲＰ２について観測された変化と比較して有意ではなかった（図１６）。免疫細胞化学によって、肺炎球菌感染は、ＭＲＰ１発現における低減、およびＭＲＰ２発現における相反する増大をもたらすことがさらに確認された（図１７Ｂ）。免疫蛍光では、ＭＲＰ４の表面発現には変化が観測されず、ＭＲＰ５の表面発現が極めて少なかったが、それによって、肺のＭＲＰ５の大部分が細胞内に保持されるという知見が確認されると思われる。ビオチン化および免疫蛍光データに照らして、検出可能であり、細胞表面に局在し、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによる感染中にモジュレートされるＭＲＰ１および２の調査に研究の重点を置いた。
【０２４５】
このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ観測が、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＲＰの局在の変化と相関するかどうかを調査するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、２．５×１０５ＣＦＵのＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅで感染させ、またはＰＢＳで模擬処置した。感染後２日目、最初に症状が認められた後、マウスを屠殺した。その後、肺を切除し、切片にし、ＭＲＰ１およびＭＲＰ２の両方について免疫組織化学的検査を実施した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの知見と同様に、肺炎球菌感染は、ＭＲＰ１タンパク質の発現を低減し、ＭＲＰ２の発現を相反して増大した（図１８）。
【０２４６】
（実施例１０：好中球遊出に対するＭＲＰ１およびＭＲＰ２の効果）
これらの観測を秤にかけると、ＭＲＰ１の発現は、基底状態において高いが、感染中には低下するので、このトランスポーターは、恒常性が保たれている間は免疫抑制性正常状態（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｔｏｎｅ）を確立する上である役割を果たし得る一方、ＭＲＰ２は、感染中に増大し、炎症促進能において機能し得ると考えられる。この仮説を試験するために、感染の文脈におけるトランスポーター動態の機能的結果を分析した。ＡＢＣ排出トランスポーターであるＭＲＰ２の発現は、上皮炎症の状態で上方制御され、１２／１５−ＬＯＸ経路は、このＭＲＰ２上方制御を最大限に誘導するための要件として関与するとされている。過去に、肺炎球菌感染中の肺気道へのＰＭＮ遊走には、肺上皮細胞において１２−リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）の作用によってアラキドン酸から誘導されたエイコサノイドである脂質走化性因子ヘポキシリンＡ３の生成が必要であることが観測された。ＭＲＰ２は、ＨＸＡ３の排出トランスポーターであることも示されているので、同様にＭＲＰ２の薬理学的阻害が肺炎球菌感染中のＰＭＮ経上皮遊走をどの程度遮断するかについてを分析した。
【０２４７】
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、モデル肺上皮を横切るＰＭＮ経上皮遊走を誘導することができ、ここで十分に確立されたｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル系が利用される。簡潔には、Ｈ２９２細胞を、透過性支持体上に播種してバリアを形成し、それによってｉｎ  ｖｉｖｏ構造を模倣する。次に、新しく単離されたヒト好中球を、トランスウェルの側底チャンバに適用して、好中球が、上皮によって放出された走化性因子に応答して上皮層を横断できるようにする。ＭＲＰが、ＰＭＮの遊出にどのように影響を及ぼし得るかを調査するために、Ｈ２９２極性単層を、感染前にＭＲＰ２阻害剤であるプロベネシドに曝露し（方法を参照されたい）、このような処置によってＰＭＮの遊走が阻害されるかどうかを試験した。予想通り、プロベネシドで処置した試料は、模擬処置した対照試料よりも遊走好中球が著しく少なかったが、このことは、この十分に確立された好中球遊出モデルにおいて一部の遊走促進効果がＭＲＰ２活性によって媒介されたことを示している。
【０２４８】
ＭＲＰ２機能がプロベネシドによって邪魔される条件下で、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染を調査した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、気管を介して１×１０５〜３×１０５の間の細菌で感染させて大葉性肺炎を生じさせ、菌血症および敗血症に進行した後、マウスが感染に屈した。プロベネシドをプライマーとして感染の３時間前に送達し、感染の３時間後に再び送達した。
【０２４９】
感染後１日目、プロベネシドで処置したマウスの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）は、ＰＢＳで処置したマウスよりも３５％少ない好中球を示した（図１９Ｂ）。プロベネシド処置は、Ｄ１には菌血症の症例は少なく、実際に菌血症を発症したマウスは、ＰＢＳで処置したマウスと比較して血中ＣＦＵがおよそ１０分の１であった（図１９Ｃ）。ＢＡＬＦにおけるＰＭＮが低減したにもかかわらず、マウス肺における他の顆粒球の低減は観測されず（図１９Ｄ）、プロベネシドの効果は好中球に特異的であると思われるという結論に至った。感染の４８時間後、この傾向は継続して、プロベネシドで処置したマウスにおける菌血症では１０分の１になったが（図１９Ｃ）、これらは、もはや統計的に有意な値ではない。感染の４８時間後の肺における細菌数は、循環に侵襲する細菌の数が低減したにもかかわらず同じであった。したがって、ＭＲＰ２阻害は、感染の２４時間後に肺への好中球浸潤を制限するのに有効であり、このことは、感染の４８時間後に継続する菌血症の低減に対応している。
【０２５０】
ＭＲＰ１またはＭＲＰ２活性がどのように炎症に影響を及ぼし得るかをより深く解明するために、ＭＲＰ１またはＭＲＰ２発現のいずれかをノックダウンする（ＭＲＰノックダウン）、構成的に発現されたｓｈＲＮＡ  Ｈ２９２細胞株を作製した。ＭＲＰ１が抗炎症性カスケードに関与するという仮説と合致して、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅで感染したＭＲＰ１欠損細胞は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａで感染した場合のスクランブル対照細胞と比較して、著しく多いＰＭＮ経上皮遊走を誘導したことが見出された。さらに、ＭＲＰ２ノックダウン細胞はまた、プロベネシドを用いた結果と同様に（図１９Ａ）、対照細胞と比較してＰＭＮ経上皮遊走を支持しなかった。このことは、肺炎球菌感染中、上皮誘導性のＭＲＰ１活性がＰＭＮ経上皮遊走を抑制する一方、ＭＲＰ２発現および活性が、上皮を横切る好中球遊出に必要であることを示唆している。
【０２５１】
これらの結果は、ＭＲＰ１が、免疫抑制性の基質を排出する一方、ＭＲＰ２が、炎症促進性の基質を分泌することを暗示しているので、感染した極性Ｈ２９２細胞単層の頂端上清から生物活性脂質を単離することによって、この結果を再現する試みを実施した（図２０Ａ）。過去の研究では、ＭＲＰ２が、細菌感染中に腸管内にＨＸＡ３を排出し、ＰＭＮ経上皮遊走が、ＨＸＡ３生成に絶対的に依存することが示されている。これらの研究では、上清から脂質抽出物を収集し、１，０００Ｄａカットオフ膜を備えたＡｍ  ｉｃｏｎ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して限外濾過した。塩の除去および脂質の濃縮は、Ｃ１８  Ｂａｃｋｅｒｂｏｎｄ抽出カラムを使用して達成した。脂質抽出物を、スクランブル対照またはＭＲＰ２ノックダウン細胞のいずれかから単離し、ナイーブＨ２９２細胞の頂端チャンバに適用した。図２０Ｂに示される通り、ＭＲＰ２ノックダウン細胞（ＭＲＰ２  ＫＤ）からの濃縮脂質は、スクランブル対照と比較してＰＭＮの遊走の低減を示したが、このことは、ＭＲＰ２が炎症促進性刺激を排出しており、ＨＸＡ３を排出している可能性が最も高いことを暗示している。
【０２５２】
類似の戦略を使用し、ハンクス緩衝液を、スクランブル対照細胞またはＭＲＰ１ノックダウン細胞の頂端表面に適用して、馴化培地を生成した。次に、図２０Ｃに図示される通り、炎症促進性脂質を、非馴化培地、ＭＲＰ１を含有するスクランブル対照の馴化培地、またはＭＲＰ１欠損細胞の馴化培地を用いて再懸濁させた。非馴化培地への脂質抽出物の曝露によって、最大量のＰＭＮ遊走が促進された。しかし、無傷ＭＲＰ１を用いた細胞の培地で馴化したスクランブル対照細胞は、ＰＭＮ遊走の著しい低減を示し（免疫抑制物質を含有する）、一方、ＭＲＰ１ノックダウン細胞（免疫抑制物質が欠如している）で馴化した培地は、ＰＭＮ遊走を低減せず、非馴化上清と合致するＰＭＮ遊走レベルを示した。したがって、ＭＲＰ１欠損細胞におけるこの阻害剤の分泌を妨害することによって、制限が除去され、好中球の遊走が増大した。本発明者らは、この免疫抑制物質をＬ−ＡＭＥＮＤ（肺活性をモジュレートする上皮好中球のディスコース（Ｌｕｎｇ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ｄｉｓｃｏｕｒｓｅ））と呼ぶ。まとめると、これらの結果は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅによって誘発されるＰＭＮ遊出を刺激するＭＲＰ２／ＨＸＡ３経路の能力を抑制（均衡）するように作用するＭＲＰ１／Ｌ−ＡＭＥＮＤ経路の証拠を提供する。
【０２５３】
本発明者らは、好中球（ＰＭＮ）遊走のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを使用して、ＭＲＰ２阻害の結果を調査した。ＮＩＨ−Ｈ２９２細胞を、感染前に１００μＭのＭＲＰ２阻害剤であるプロベネシド（横縞）と共にインキュベートし、またはＰＢＳで模擬処置した（黒色）。次に、対照およびプロベネシドで処置した細胞の両方を洗浄し、１０ＭＯＩのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅで感染させた。好中球を、膜構築物の側底チャンバに入れ、感染後に遊走できるようにした。頂端チャンバに移動した好中球を、改変ミエロペルオキシダーゼアッセイを用いて好中球の標準数に対して定量した。少なくとも３回反復した代表的データセットが、図２０Ｄに示されている。プロベネシド前処置は、上皮細胞層および増殖膜を介して側底から頂端チャンバに移動する好中球の数を、模擬処置細胞と比較して有効に低減した。非感染細胞を、白色で標識された「緩衝液」で表す。独立Ｔ−検定を使用して統計を実施した。これらの結果は、プロベネシドによるＭＲＰ２阻害によって、好中球の遊走が低減することを示している。
【０２５４】
（実施例１１：本発明の技術の化合物による好中球の遊走の阻害）
この実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで好中球の遊走を阻害する本発明の技術の化合物の有効性を実証する。
【０２５５】
末梢血好中球を、既に記載されている通り（Ｈｕｒｌｅｙ，  Ｂ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７３：５７１２−５７２０  （２００４））、酸性クエン酸デキストロースで抗凝固処理した末梢血から２％ゼラチン沈殿によって精製する。赤血球を、冷ＮＨ４Ｃｌ緩衝液中で溶解させることによって除去し、好中球をＨＢＳＳ−／−（Ｃａ２＋なしかつＭｇ２＋なし）で洗浄し、最終体積５×１０７／ｍＬまで再懸濁させる。細孔径３μｍの９６ウェルＨＴＳトランスウェルフィルタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、０．１ｍｇ／ｍＬのラット尾コラーゲンでコーティングし、一晩乾燥させる。濃縮ＨＸＡ３（先を参照）を、１：１０希釈のビヒクル対照、または所定濃度の本発明の技術の化合物と共に、下のウェルに添加する。５×１０５個の好中球を、１：１０ビヒクルまたは精製した内在性カンナビノイドと共に上のウェルに添加し、５％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーターに入れ、２時間遊走させる。上のウェルを除去し、遊出した好中球を、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を用いて溶解させる。クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．２）を、０．１Ｍまで添加し、０．１Ｍクエン酸ナトリウム中等体積の２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を試料に添加する。ミエロペルオキシダーゼ（ｍｐｏ）活性を測定する。好中球細胞当量を、標準曲線と比較することによって算出し、個々の実験のデータを１００％ＨＸＡ３遊走に対して正規化する。データは、少なくとも３つの独立した実験から得られた平均＋／−ＳＥＭである。統計的分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して実施する。データを、実験条件に適宜合わせて、一元配置ＡＮＯＶＡまたはマン−ホイットニー非パラメトリックＵ検定のいずれかによって分析する。
【０２５６】
本発明の技術の化合物は、実施例３の図１Ｄ〜１Ｅに示されるものなどの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで好中球の遊走を阻害する高い有効性を示すと予測される。これらの結果は、現状の技術の化合物が、好中球の遊走を阻害するための方法において、例えば好中球の遊走によって引き起こされるか、好中球の遊走をもたらすか、またはそれ以外で好中球の遊走と関連する疾患または状態の防止または処置などにおいて有用であることを実証する。
【０２５７】
（実施例１２：大腸炎の防止および処置のための本発明の技術の化合物）
この実施例は、動物モデルおよびヒト被験体における大腸炎の防止および処置のための本発明の技術の化合物の使用を実証する。
【０２５８】
動物モデル
この実施例で使用するのに適した動物モデルには、それに限定されるものではないが、本明細書に記載されるものなどの大腸炎を有する動物が含まれる。当業者は、以下の説明が例示的であり、適宜他の動物モデルに適用され得ることを理解されよう。
【０２５９】
総説。Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびｃｎｒ２−／−マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、ＦＶＢｗｔおよびｍｄｒ１ａ−／−を、Ｔａｃｏｎｉｃから購入する。６〜１２週齢の雌マウスを使用し、遺伝子型を実験前に２〜４週間混合して、微生物叢を等しくする。マウスを、飲料水中３％ＤＳＳ（分子量３６，０００〜５０，０００、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）で７日間処置し、次に通常の水に戻し、疾患ピークを示した９日目に屠殺する。中結腸および遠位結腸の試料を、１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、切片にし、病理組織学的分析のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。各試料を、（１）上皮過形成および杯状細胞枯渇の程度、（２）粘膜固有層への白血球浸潤、（３）影響を受けた組織の面積、ならびに（４）重症の炎症、例えば陰窩膿瘍、粘膜下炎症および潰瘍のマーカーの存在の４つの基準について、半定量的に０〜３で段階分けする。試料は、試料の正体について盲検にした訓練された研究者によってスコア化され、中結腸および遠位結腸の値を平均化して、結腸組織病理スコアを得る。
【０２６０】
被験体は、本明細書に記載される方法に従って、例えば直腸内投与によって本発明の技術の化合物を投与される。一部の実施形態では、化合物は、１日１回、週１回、または月１回投与される。一部の実施形態では、化合物は、１日に複数回、週に複数回、または月に複数回投与される。対照被験体には、ビヒクルを単独で投与する。
【０２６１】
粘膜固有層白血球の単離およびフローサイトメトリー。粘膜固有層からの細胞懸濁物を、既に記載されている通り調製する（Ｂｕｏｎｏｃｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。腸管組織を小片に切断し、１０％ＦＢＳおよび５ｍＭのＥＤＴＡを含むＲＰＭＩで処置して上皮細胞を除去し、次に、１００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼタイプＶＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に、１時間の２つの期間にわたってインキュベートする。次に、細胞を、不連続な３０／４０／７５％勾配のＰｅｒｃｏｌｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用し、４０／７０％界面から回収する。細胞をＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで洗浄し、抗Ｆｃ受容体（αＣＤ１６／３２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と共にインキュベートし、Ｚｏｍｂｉｅ  Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ赤外染料（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色し、次にＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｇ、およびＬｙ６ＣまたはＧｒ１に対する抗体で表面染色する。試料をＭＡＣＳｑｕａｎｔ分析機１０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に流し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアバージョン１０（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）を使用して分析する。
【０２６２】
マウス試料におけるミエロペルオキシダーゼ含量の分析。試料を、記載されている通り、ミエロペルオキシダーゼ活性についてアッセイする。結腸の組織切片を、液体Ｎ２中で凍結し、使用するまで−８０℃で保存する。切片を、溶解マトリクスＤ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を含む臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＨＴＡＢ、Ｓｉｇｍａ）緩衝液に入れ、ＦａｓｔＰｒｅｐ−２４ホモジナイザーをレベル６で用いて４０秒間ホモジナイズする。試料をＡＢＴＳと合わせ、蛍光を８分にわたって読み取る。傾きを、線形回帰によってＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して算出し、ビシンコニン酸アッセイ（ＢｉｏＲａｄ）によって測定される通り、個々の試料についてタンパク質含量に対して正規化する。糞便試料を分析するために、糞便含量を秤量し、ＨＴＡＢ緩衝液を１０μＬ／ｍｇの比で添加し、算出した傾きを直接使用する。
【０２６３】
結腸粘膜におけるＨＸＡ３の質量分析。マウスの飲料水に５％ＤＳＳを入れてマウスに投与し、７日目に屠殺する。未処置またはＤＳＳで処置したマウス（マウス９匹／コホート）から近位結腸を回収し、３つの腸管セグメントをプールする。腸管表面を、ＰＢＳ中ラバーポリスマンを用いて擦過することによって粘膜擦過標本を収集し、ＨＸＡ３含量を、既に記載されている通り分析する（Ｍｕｍｙ，  Ｋ．  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７６：３６１４−３６２７  （２００８））。
【０２６４】
結果。本発明の技術の化合物の直腸内投与によって、ＤＳＳにより誘導される腸管病理および結腸短絡が対照動物と比較して著しく低減すると予測される。結腸組織病理の分析によって、化合物で処置したマウスでは、結腸腔への好中球浸潤が低減したことが示され、このことは、糞便試料におけるミエロペルオキシダーゼの著しい低減によって確認される。
【０２６５】
したがって、これらの結果は、本発明の技術の化合物が、ｉｎ  ｖｉｖｏで好中球浸潤を低減する方法において、例えば好中球の遊走と関連する炎症状態、例えば大腸炎の防止および処置において有用であることを示している。
【０２６６】
ヒト被験体
大腸炎または関連障害を有すると診断されているか、または有することが疑われており、現在、大腸炎または関連障害の１つまたは複数の症状および／または病理を示しているヒト被験体は、当技術分野で公知の認められている選択基準を使用して募集される。
【０２６７】
防止および処置方法：被験体は、本発明の技術の化合物を、疾患のステージおよび重症度とつりあった投与量および頻度で投与される。一部の実施形態では、化合物は、１日１回、週１回、または月１回投与される。一部の実施形態では、化合物は、１日に複数回、週に複数回、または月に複数回投与される。
【０２６８】
ヒトにおける防止および処置方法を実証するために、被験体は、大腸炎または関連障害の症状および／または病理を発症する前または発症した後に本発明の技術の化合物が投与され、当技術分野で公知の方法を使用して、症状／病理の逆転または予測される症状／病理の減弱について評価される。
【０２６９】
結果：本発明の技術の化合物は、ヒト被験体における大腸炎および関連障害の症状および／または病理の逆転を誘導すると予測される。これらの結果は、本発明の技術の化合物が、このような障害の防止および処置に有用であり、有効であることを示す。
【０２７０】
（実施例１３：嚢胞性線維症の防止および処置のための本発明の技術の化合物）
この実施例は、動物モデルおよびヒト被験体の嚢胞性線維症の防止および処置のための本発明の技術の化合物の使用を実証する。
【０２７１】
動物モデル
この実施例において使用するのに適した動物モデルには、それに限定されるものではないが、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）変異を有するマウス、ブタおよびフェレットモデルを含む、当技術分野で公知の嚢胞性線維症動物モデルが含まれる。当業者は、以下の説明が例示的であり、適宜他の動物モデルに適用され得ることを理解されよう。
【０２７２】
１２９／ＦＶＢ非近交系バックグラウンドのΔＦ５０８変異についてホモ接合性の若年成体雌ＣＦマウスおよびそれらの野生型同腹子を、静圧式アイソレータケージで飼育する。腸管閉塞を防止するために、ＣＦマウスを液体食（Ｐｅｐｔａｍｅｎ（登録商標）、Ｎｅｓｔｌｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）で離乳させる。Ｐｅｐｔａｍｅｎを毎日取り換える。非ＣＦマウスには、標準食（Ｐａｖａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ−Ｃａｒｆｉｌ、Ｏｕｄ−Ｔｕｒｎｈｏｕｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を与え、週１回ケージを殺菌し、新しい寝床を補充するときにそれを交換する。脱塩し、酸性にした水を自由に摂取させる。各動物の遺伝子型を、テールクリップＤＮＡのＴａｑｍａｎ定量的ＰＣＲ多重分析（Ｔａｑｍａｎ、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して２１日齢目にチェックする。Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して対立遺伝子特異的ＰＣＲのために設計したプライマーおよび副溝結合剤（ＭＧＢ）プローブは、以下の通りである。フォワードプライマー＝５’−ＴＴＴＣＴＴＧＧＡＴＴＡＴＧＣＣＧＧＧＴＡ−３’、リバースプライマー＝５’−ＧＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＣＡＣＴ−３’、野生型特異的プローブ＝５’−ＦＡＭ−ＡＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＡＴＧＡＴＡＴＴ−ＭＧＢ−３’、変異体特異的プローブ＝５’−ＶＩＣ−ＡＡＣＡＣＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴＴＴＣ−ＭＧＢ−３’。
【０２７３】
肺炎症の誘導。防止方法では、性別および体重がマッチした１０〜１４週齢のＣＦマウスおよび正常ホモ接合性野生型マウスを、本発明の技術の化合物でエアロゾル吸入によって４週間にわたり、１日１回事前処置する。対照被験体には、ビヒクルを単独で投与する。喉頭鏡および細いピペットチップを使用して、生理食塩水５０μｌ中１０μｇ／２０ｇ（体重）のＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を口から気管に滴下注入することによって、急性肺炎症を誘導する。本発明の技術の化合物の投与は、ＬＰＳを投与するときには停止する。
【０２７４】
処置方法では、性別および体重がマッチしたＣＦマウスおよび正常ホモ接合性野生型マウスに、事前処置なしに前述の通りＬＰＳを投与する。肺炎症を確認した後、被験体に、本明細書に記載される方法に従って、本発明の技術の化合物を投与する。対照被験体には、ビヒクルを単独で投与する。肺炎症のパラメータを、本明細書に記載されるか、またはそうでなければ当技術分野で公知の方法を使用して、処置プロトコールの完了時に評価する。
【０２７５】
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）。ＬＰＳ滴下注入後の選択された時点で、マウスを、ナトリウムペントバルビタール（Ａｂｂｏｔｔ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、ＵＳＡ）２０ｍｇをｉ．ｐ．注射することによって屠殺する。ＢＡＬは、記載されている通り、気管をカニューレ挿入し、滅菌生理食塩水１ｍｌで洗浄することによって実施する。ＢＡＬ流体（ＢＡＬＦ）を遠心分離し（２５０×ｇ、１０分、４℃）、上清をアリコートに分け、さらなる生化学的測定のために−２０℃で保存する。鑑別細胞計数（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ）を、サイトスピン調製物で、ＤｉｆｆＱｕｉｃｋ染色（Ｄａｄｅ、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して実施する。
【０２７６】
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性。ＢＡＬを実施した後、肺に右心室を介して生理食塩水を灌流し、切除する。肺ホモジネートのＭＰＯ活性を、既に記載されている通り、１０分にわたって４９０ｎｍで評価する。
【０２７７】
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）。ＢＡＬＦ試料のＬＤＨ活性を、当技術分野で公知の方法を使用して分光光度的に評価する。
【０２７８】
サイトカインアッセイ。マウスマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αおよびＩＬ−１０（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）の濃度を、標準サンドイッチ酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）をそれぞれの製造者のプロトコールに従って使用して、ＢＡＬＦ中で測定する。
【０２７９】
組織病理。未洗浄の肺全体を切除し、４％緩衝パラホルムアルデヒドで気管を介して膨張を固定し、光学顕微鏡法のために厚さ５μｍに処理する。スライドを、ヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｉｌｉｎ）およびエオシン、またはＭａｓｓｏｎトリクローム染色で染色する。
【０２８０】
細菌学。ＢＡＬＦ試料を、多価非選択的培地である５％ヒツジ血液を含むコロンビア寒天ベース上に置く。サブロー寒天（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）およびマッコンキー培地を使用して、それぞれ酵母および真菌、ならびにグラム陰性菌について選択する。プレートを、３５℃の従来のインキュベーターに最小２４時間入れる。すべての試験を二連で実施する。
【０２８１】
統計。結果を、平均±ＳＥＭとして表す。統計データを、ＳＡＳ−ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ、ＵＳＡ）を使用して分析する。群間比較を、一元配置分散分析を使用して評価する。事後比較を、適宜スチューデントｔ検定またはＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ  ＨＳＤ検定を使用して行う。帰無仮説は、ｐ＜０．０５で棄却する。正規分布変数の平均が異なっておらず（ｔ検定）、母集団の分散が均質である（スネデカーＦ検定）ことを特定した後、異なる実験からプールしたデータについて、アルファレベルを、ボンフェローニ補正に従って調整する。
【０２８２】
結果。本発明の技術の化合物の投与は、肺炎症嚢胞性線維症の動物モデルの処置および防止に有効であると予測される。これらの結果は、本発明の技術の化合物が、嚢胞性線維症を処置し、かつその疾患と関連する肺炎症を処置／防止する方法に有用であることを示している。
【０２８３】
ヒト被験体
嚢胞性線維症を有すると診断されているか、または有することが疑われており、現在、嚢胞性線維症の１つまたは複数の症状および／または病理を示しているヒト被験体は、当技術分野で公知の認められている選択基準を使用して募集される。
【０２８４】
防止および処置方法。被験体は、本発明の技術の化合物を、疾患のステージおよび重症度とつりあった投与量および頻度で投与される。一部の実施形態では、化合物は、１日１回、週１回、または月１回投与される。一部の実施形態では、化合物は、１日に複数回、週に複数回、または月に複数回投与される。
【０２８５】
ヒトにおける防止および処置方法を実証するために、被験体は、嚢胞性線維症の症状および／または病理を発症する前または発症した後に本発明の技術の化合物が投与され、当技術分野で公知の方法を使用して、症状／病理の逆転または予測される症状／病理の減弱について評価される。例えば、被験体は、嚢胞性線維症と関連する肺炎症を発症する前または発症した後に本発明の技術の化合物が投与される。次に、被験体は、当技術分野で公知の方法を使用して、肺炎症の防止、逆転、または減弱について評価される。
【０２８６】
結果。本発明の技術の化合物は、ヒト被験体の嚢胞性線維症の症状および／または病理、例えば肺炎症の逆転を誘導すると予測される。これらの結果は、本発明の技術の化合物が、嚢胞性線維症および嚢胞性線維症関連肺炎症の防止および処置に有用であり、有効であることを示している。
【０２８７】
（実施例１４：好中球媒介性皮膚障害の防止および処置のための本発明の技術の化合物）
この実施例は、動物モデルおよびヒト被験体における好中球媒介性皮膚障害、例えば皮膚炎（湿疹）、酒さ、脂漏性皮膚炎、および乾癬の防止および処置のための本発明の技術の化合物の使用を実証する。当業者は、乾癬に関して以下に説明する実施例が、好中球媒介性皮膚障害の例であり、その方法が、いかなる好中球媒介性皮膚障害にも一般に適用できることを理解されよう。
【０２８８】
動物モデル
この実施例に適した動物モデルには、それに限定されるものではないが、自然変異を有するモデル、遺伝子操作された動物、免疫学的モデル、および薬理学的モデルを含む任意の許容される乾癬モデルが含まれる。自然変異モデルには、それに限定されるものではないが、ａｓｅｂｉａ（Ｓｃｄ１ａｂ／Ｓｃｄ１ａｂ）、慢性増殖性皮膚炎（Ｓｈａｒｐｉｎｃｐｄｍ／Ｓｈａｒｐｉｎｃｐｄｍ）、鱗状皮膚（Ｔｔｃ７ｆｓｎ／Ｔｔｃ７ｆｓｎ）変異についてホモ接合性のマウスが含まれる。遺伝子操作されたモデルには、キー制御分子を異所的に発現するか、または当技術分野で公知のキー制御分子が欠如している動物が含まれる。免疫学的モデルには、養子移植および当技術分野で公知の関連方法を受けた動物被験体が含まれる。薬理学的モデルには、乾癬または乾癬関連状態を誘導する薬剤が投与された被験体、例えば、イミキモド（ＩＭＱ）、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）−７およびＴＬＲ−８アゴニストを局所投与した被験体が含まれる。
【０２８９】
当業者は、以下の説明が例示的であり、適宜他の動物モデルに適用され得ることを理解されよう。
【０２９０】
材料。イミキモド（ＩＭＱ、５％クリーム、Ｂｅｓｅｌｎａ（登録商標））を、持田製薬（日本、東京）から購入する。酪酸プロピオン酸ベタメタゾン（０．０５％軟膏、Ａｎｔｅｂａｔｅ（登録商標））を、鳥居薬品（日本、東京）から購入する。リアルタイムＰＣＲプローブおよび関連薬剤を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）から購入する。
【０２９１】
動物。７〜１２週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスおよび雄ＣＢ−１７ｓｃｉｄマウスを、特異的病原体が存在しない条件下で２３±３℃の室温および５５±１５％の空気湿度において１２時間の明／暗サイクル環境で飼育し、食餌および水を自由に摂取させる。
【０２９２】
皮膚炎症の誘導。ＩＭＱ５％クリームを、左耳皮膚の内側および／または外側に１日１回塗布する。ＩＭＱの用量は、耳の外側に２５０ｕｇ、外側に５００ｕｇ、または内側と外側の両方に２５０ｕｇのいずれかである。ベタメタゾン軟膏または関連する軟膏基剤を、左耳の内側および／または外側の両方に体積５ｕＬで１日２回塗布する。皮膚炎症の定量的指数としての左耳の厚さを、ＩＭＱ塗布の前に厚さゲージ（ＩＤＡ−１１２Ｍ、ミツトヨ、日本、川崎）を利用して１日１回測定する。対照被験体には、ビヒクルを単独で投与する。
【０２９３】
防止方法では、被験体を、ＩＭＱ曝露前に所定の期間にわたって、局所適用によって本発明の技術の化合物で事前処置する。
【０２９４】
処置方法では、被験体は、ＩＭＱ誘導性炎症を確認した後に所定の期間にわたって、当技術分野で公知の方法を使用して本発明の技術の化合物を局所投与される。
【０２９５】
被験体を二酸化炭素ガスによって安楽死させ、紅斑および鱗屑について全体的な形態を検査した後、左耳を回収する。回収した組織の一部をスライスし、１０％ホルマリン緩衝溶液で固定し、組織学的パラフィン切片を調製するために処理する。切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、光顕微鏡検査に供する。残りの組織は、リアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡ分析のために−８０℃で保存する。
【０２９６】
リアルタイムＰＣＲアッセイ。耳組織の全ＲＮＡ試料を、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖｅｎｌｏ、ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、製造者の指示に従って得る。本発明の研究において目的のサイトカインをコードする転写物のレベルを、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイによって、ＲＮＡ−ｔｏ−Ｃｔ（商標）１−Ｓｔｅｐ  Ｋｉｔを使用して測定する。
【０２９７】
例示的な標的には、それに限定されるものではないが、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１βが含まれる。標的転写物レベルを、ＧＡＰＤＨ転写物レベルに対して正規化する。
【０２９８】
統計的分析。耳の厚さの値を、１日目に測定した事前処置の値からの増大として示し、平均±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）として表す。統計的有意性を、Ｆ検定の後、アスピン−ウェルチｔ−検定およびバートレット検定によって、その後耳の厚さではダネット検定またはスティール検定によって、ｍＲＮＡ転写物レベルではバートレット検定の後、チューキー検定またはスティール−ドゥワス検定によって分析する。０．０５未満のｐ値を、統計的に有意とみなした。
【０２９９】
結果。組織の厚さ、炎症性遺伝子発現、および皮膚の好中球浸潤によって測定される通り、本発明の技術の化合物の投与によって、ＩＭＱ誘導性炎症が防止または低減されると予測される。これらの結果は、本発明の技術の化合物が、それに限定されるものではないが、皮膚炎（湿疹）、酒さ、脂漏性皮膚炎、および乾癬を含む、炎症および皮膚の好中球浸潤と関連する状態の防止および処置において有用であることを示している。
【０３００】
ヒト被験体
好中球媒介性皮膚障害、例えば皮膚炎（湿疹）、酒さ、脂漏性皮膚炎、または乾癬を有すると診断されているか、または有することが疑われており、現在、その障害の１つまたは複数の症状および／または病理を示しているヒト被験体は、当技術分野で公知の認められている選択基準を使用して募集される。
【０３０１】
防止および処置方法。被験体は、本発明の技術の化合物を、疾患のステージおよび重症度とつりあった投与量および頻度で投与される。一部の実施形態では、化合物は、１日１回、週１回、または月１回投与される。一部の実施形態では、化合物は、１日に複数回、週に複数回、または月に複数回投与される。
【０３０２】
ヒトにおける防止および処置方法を実証するために、被験体は、好中球媒介性皮膚障害の症状および／または病理を発症する前または発症した後に本発明の技術の化合物が投与され、当技術分野で公知の方法を使用して、症状／病理の逆転または予測される症状／病理の減弱について評価される。例えば、被験体は、好中球媒介性皮膚障害またはその症状を発症する前または発症した後に本発明の技術の化合物が投与される。次に、被験体は、当技術分野で公知の方法を使用して、障害または症状の防止、逆転、または減弱について評価される。
【０３０３】
結果。本発明の技術の化合物は、好中球媒介性皮膚障害、例えば皮膚炎（湿疹）、酒さ、脂漏性皮膚炎、および乾癬の症状および／または病理の逆転を誘導すると予測される。これらの結果は、本発明の技術の化合物が、ヒト被験体の好中球媒介性皮膚障害の防止および処置に有用であり、有効であることを示している。
【化２４】
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【化２５】
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【化２６】
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【０３０４】
先の明細書で言及されているそれぞれすべての刊行物および特許文書は、あらゆる目的でその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。記載される本発明の技術の方法および系の様々な改変および変更は、本発明の技術の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかとなろう。本発明の技術を具体的な実施形態と関連して記載してきたが、特許請求される通りの本発明の技術は、このような具体的な実施形態に過度に限定されるべきではない。実際、当技術分野およびそれに関係する分野の技術者に明らかとなる本発明の技術を行うための記載される方法の様々な改変が、以下の特許請求の範囲内に含まれることが企図される。
【０３０５】
均等論
本発明の技術は、本願に記載される特定の実施形態に関して制限されるものではなく、本発明の技術の個々の態様の単一の例として企図される。当業者に明らかとなる通り、その精神および範囲から逸脱することなく、本発明の技術の多くの改変および変更が行われ得る。本明細書に列挙されているものに加えて、本発明の技術の範囲内の機能的に等価な方法および装置は、先の説明から当業者に明らかとなろう。このような改変および変更は、添付の特許請求の範囲内にあることが企図される。本発明の技術は、このような特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の完全な範囲を伴って、添付の特許請求の範囲の条項によってのみ制限されるべきである。本発明の技術は、当然のことながら変わり得る特定の方法、試薬、化合物、組成物または生物系に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のものであり、制限することを企図されないことも理解されたい。
【図１】
2020526537.tif 000034
【図２Ａ−Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2020526537.tif 000042
【図９】
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【図１０】
2020526537.tif 000044
【図１１】
2020526537.tif 000045
【図１２−１】
2020526537.tif 000046
【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2020526537.tif 000054
【図１９Ａ−Ｃ】
2020526537.tif 000055
【図１９Ｄ−Ｅ】
2020526537.tif 000056
【図２０Ａ−Ｃ】
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【図２０Ｄ】
2020526537.tif 000058
【図２１】
2020526537.tif 000059
【図２２】
2020526537.tif 000060
【図２３】
2020526537.tif 000061
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月13日(2020.7.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020526537000001.app
【国際調査報告】
2020526537.tif 000062
2020526537.tif 000063
2020526537.tif 000064
2020526537.tif 000065