(57)【要約】  本出願は、唾液サンプルにおいて検出されるｍｉＲＮＡ及び／またはマイクロバイオームのレベル、ならびに患者情報を使用して自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）対象を定型発達（ＴＤ）対象または発達遅延（ＤＤ）対象と区別するための方法を提供する。この方法は、ＡＳＤの進行監視及びその治療支援に使用することができる。ＭｉＲＮＡまたはマイクロバイオームの数及び存在量は、ＲＮＡ−ｓｅｑ、ｑＰＣＲ、または他の方法によって決定される。マイクロＲＮＡ及び／またはマイクロバイオームのシークエンシングデータは、時間変動のないｍｉＲＮＡ及び／または微生物ＲＮＡの発現レベルまたは存在量に対して正規化することによって精度を向上させることで、サンプル採取時刻が調整されるか、またはこうしたレベルの概日変動が補正される。多変量ロジスティック回帰及び非線形分類手法が追加で使用されることで、ＡＳＤ状態が未知の対象においてＡＳＤ対象、ＤＤ対象、及びＴＤ対象を正確に区別するｍｉＲＮＡ及びマイクロバイオームのパネルが選択される。ｍｉＲＮＡ及びマイクロバイオームのこうしたパネルから、ＲＮＡアッセイキットが開発され得る。
2020512016.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を有すると疑われる対象、またはＡＳＤ関連症状を示すか、もしくは示す可能性を有する対象、のエピジェネティックデータ及び／またはマイクロバイオームデータを、１人または複数人の定型発達（ＴＤ）対照対象または発達遅延（ＤＤ）対照対象、あるいは一群のＴＤ対照対象及び／またはＤＤ対照対象と比較する方法であって、それぞれの健康な対照対象が、ＡＳＤを有さないか、またはＡＳＤの症状を有さないことが判明しており、前記方法が、
対象から採取された生物学的サンプルにおける１つもしくは複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のリード数、及び／またはＲＮＡ配列（微生物）によって同定される１つもしくは複数の微生物のリード数を決定すること、
前記対象のエピジェネティックデータ及び／またはマイクロバイオーム遺伝子配列データを正規化してサンプル間の数の変動を考慮することであって、１つまたは複数の不変ｍｉＲＮＡを使用して数を正規化することで、データを、その相対存在量に比例させて示す、前記考慮すること、
前記生物学的サンプルが採取された時刻を決定すること、
前記時刻を使用することによって、前記数が正規化されたｍｉＲＮＡデータ及びマイクロバイオームデータに対して時刻正規化を適用することで、前記対象のｍｉＲＮＡデータ及びマイクロバイオームデータを時刻に対してさらに正規化すること、ならびに
前記１つまたは複数のｍｉＲＮＡ及び／または微生物の、前記数及び時刻が正規化された存在量レベルを、１人もしくは複数人のＴＤ対照対象もしくはＤＤ対照対象、または一群のＴＤ対照対象もしくはＤＤ対照対象に由来する１つもしくは複数の対照ｍｉＲＮＡ及び／または１つもしくは複数の対照微生物の前記数及び時刻が正規化されたレベルと比較すること、
を含み、
前記対象のｍｉＲＮＡ及び／または微生物の前記１つまたは複数の前記レベルを、１人もしくは複数人のＴＤ対照対象もしくはＤＤ対照対象、または一群のＴＤ対照対象もしくはＤＤ対照対象に由来する同一の１つまたは複数のｍｉＲＮＡ及び／または微生物と比較したときの、前記レベルの増加または減少によって、前記対象がＡＳＤを有し得るか、またはＡＳＤ関連症状を示すか、もしくは示す可能性を有することが示される、前記方法。
【請求項２】
自閉症スペクトラム障害（「ＡＳＤ」）を検出または診断するための方法であって、前記方法が、
（ａ）ヒト対象から採取された唾液サンプルにおける１つまたは複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の存在量レベルまたは濃度レベル（複数可）を決定すること、及び
（ｂ）前記１つまたは複数のｍｉＲＮＡの前記決定された存在量レベルまたは濃度レベル（複数可）を、同一の１つまたは複数のｍｉＲＮＡの正常レベル（複数可）と比較することであって、前記正常（または対照）レベルが、１人の非ＡＳＤ対象に見られるもの、２人以上の非ＡＳＤ対象に由来する平均値、またはＡＳＤの１つもしくは複数の症状が現れる前に前記対象において決定された濃度レベル（複数可）である、前記比較すること、及び
（ｃ）前記１つまたは複数のｍｉＲＮＡの異常レベルを有する対象を、ＡＳＤを有するか、またはＡＳＤを有するリスクがより高いとして選択すること、
を含み、
前記１つまたは複数のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５０２、ｍｉＲ−５０２−３ｐ、ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９３−３ｐ、ｍｉＲ−４７０５−３ｐ、ｍｉＲ−４７０５−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４０−５ｐ、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３４０−３ｐ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−６６５−３ｐ、ｍｉＲ−６６５−５ｐ、ｍｉＲ３０７４、ｍｉＲ−３０７４−３ｐ、ｍｉＲ−３０７４−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍＩＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９２ａ、ｌｅｔ−７ｄ−３ｐ、ｍｉｒ−５９８、ｍｉＲ−３７４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１９７２、ｍｉＲ−６７５−３ｐ、ｍｉＲ−７７０６、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−６２０、ｍｉＲ−１２７７−５ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉｒ−９４４、及びｍｉＲ−６５５からなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される少なくとも１つである、前記方法。
【請求項３】
前記ｍｉＲＮＡ発現レベルが、ＲＮＡ発現レベルが実質的に不変の１つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子の存在量レベルもしくは平均存在量レベルに正規化され、及び／または前記ｍｉＲＮＡレベルが、前記１つもしくは複数のｍｉＲＮＡレベルの前記存在量の日内変動もしくは概日変動を補正するために正規化されるか、食物摂取もしくは心拍数を上昇させる運動に起因する前記１つもしくは複数のｍｉＲＮＡレベルの前記存在量の変動を補正するために正規化されるか、または年齢、性別、もしくは遺伝的背景の差異を補正するために調整される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）１つまたは複数のｍｉＲＮＡの存在量または濃度の決定が、ＲＮＡシークエンシング（「ＲＮＡ−ｓｅｑ」）、ｑＰＣＲ、ｍｉＲＮＡアレイ、またはマルチプレックスｍｉＲＮＡプロファイリングによって決定される、請求項２に記載の方法。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／ｋｉｔｓ／ｒｅｖｉｅｗ−ｏｆ−ｍｉｒｎａ−ａｓｓａｙ−ｍｅｔｈｏｄｓ−ｑｐｃｒ−ａｒｒａｙｓ−ａｎｄ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）。
【請求項５】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−３ｐからなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−５０２、ｍｉＲ−５０２−３ｐ、ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９３−３ｐ、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−４７０５−３ｐ、ｍｉＲ−４７０５−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４０−５ｐ、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３４０−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−６６５−３ｐ、ｍｉＲ−６６５−５ｐ、ｍｉＲ３０７４、ｍｉＲ−３０７４−３ｐ、及びｍｉＲ−３０７４−５ｐからなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍＩＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９２ａ、ｌｅｔ−７ｄ−３ｐ、ｍｉｒ−５９８、ｍｉＲ−３７４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１９７２、ｍｉＲ−６７５−３ｐ、ｍｉＲ−７７０６、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０ａ−５ｐ、及びｌｅｔ−７ｅ−５ｐからなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−６２０、及びｍｉＲ−１２７７−５ｐからなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９４４、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｍｉＲ−７７０６からなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−６２０、及びｍｉＲ−１２７７−５ｐからなる群から選択され、及び／またはｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−６２０、ｍｉＲ−１２７７−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ、及びｍｉＲ−１９３ａ−５ｐからなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される少なくとも１つである、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９４４、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｍｉＲ−７７０６からなる群から選択され、及び／またはｍｉＲ−６５５、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９４４、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｍｉＲ−７７０６からなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される少なくとも１つである、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３７４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、もしくはｍｉＲ−１９０ａ−５ｐからなる群から選択され、及び／またはｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉｒ−１９７２、及びｍｉＲ−７７０６からなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される少なくとも１つである、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−６２０、及びｍｉＲ−１２７７−５ｐからなる群から選択され、及び／またはｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−６２０、ｍｉＲ−１２７７−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、及びｍｉＲ−９４４からなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９４４、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｍｉＲ−７７０６からなる群から選択され、及び／またはｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｍｉＲ−７７０６からなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される少なくとも１つである、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−６２０、及びｍｉＲ−１２７７−５ｐからなる群から選択され、及び／またはｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−６２０、ｍｉＲ−１２７７−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、及びｍｉＲ−９４４からなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される少なくとも１つである、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９４４、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｍｉＲ−７７０６からなる群から選択され、及び／またはｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｍｉＲ−７７０６からなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される少なくとも１つである、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３７４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−１９０ａ−５ｐからなる群から選択され、及び／またはｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５９８、ｍｉｒ３７４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−６７５−３ｐ、ｍｉｒ−５００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、及びｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、のうちの少なくとも１つである、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
前記唾液サンプルが、特定の時刻に前記ヒト対象から採取され、前記サンプルのｍｉＲＮＡの前記濃度レベル（複数可）が、同一の時刻にその他は同一の条件の下で採取された唾液における正常なｍｉＲＮＡ値と比較される、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
前記唾液サンプルが、ｍｉＲＮＡの前記正常レベル（複数可）が決定された時刻とは異なる時刻に前記ヒト対象から採取される、請求項２に記載の方法であって、前記方法が、前記唾液サンプルにおいて決定された前記ｍｉＲＮＡレベル（複数可）の前記値を調整または正規化して、ｍｉＲＮＡレベル（複数可）の日内変動または概日変動を補正することをさらに含む、前記方法。
【請求項２０】
前記唾液サンプルが、ｍｉＲＮＡの前記正常レベル（複数可）が決定された時刻とは異なる時刻に前記ヒト対象から採取される、請求項２に記載の方法であって、前記方法が、前記唾液サンプルにおいて決定された前記ｍｉＲＮＡレベル（複数可）の前記値を調整または正規化することで、回帰モデルもしくは他の統計解析で使用されるｍｉＲＮＡレベル（複数可）の日内変動もしくは概日変動を補正するか、または年齢、性別、もしくは遺伝的背景を補正すること、をさらに含む、前記方法。
【請求項２１】
前記唾液サンプルが、覚醒から１時間以内、歯磨きもしくは口の洗浄の前、飲食前、及び／または心拍数を上昇させる運動の前に採取される、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
前記選択が、前記ｍｉＲＮＡのうちの４つ以上の異常レベルを有する対象を選択すること、及びＡＳＤの少なくとも１つの症状の可能性を有する前記異常ｍｉＲＮＡレベルのピアソン相関係数を任意選択で計算すること、を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
前記選択が、前記ｍｉＲＮＡのうちの２つ以上の異常レベルを有する対象を選択すること、及びＡＳＤの少なくとも１つの症状の可能性を有する前記異常ｍｉＲＮＡレベルのピアソン相関係数を任意選択で計算すること、を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ａｃｅｔｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｉｆｏｒｍａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の１種ＨＭＳＣ０７３Ｄ０５、Ｒｏｔｈｉａ  ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍａｒｓｈｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌｓ属の１種ＨＭＳＣ０７３Ｄ０９、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒからなる群、または上記微生物に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、もしくは１００％の類似性もしくは同一性を有するゲノムを有する微生物、から選択される１つまたは複数の唾液微生物に由来するＲＮＡ（複数可）の存在量レベル（複数可）を前記対象において決定すること、ならびに前記微生物ＲＮＡの前記発現レベル（複数可）を、同一の１つまたは複数の微生物ＲＮＡの正常レベル（複数可）と比較することであって、前記正常（または対照）発現レベルが、１人の非ＡＳＤ対象に見られるもの、２人以上の非ＡＳＤ対象に由来する平均値、または異常な日内リズムもしくは概日リズムと関連する状態、障害、もしくは疾患の１つもしくは複数の症状が現れる前に前記対象において決定された濃度レベル（複数可）である、前記比較すること、ならびに前記１つまたは複数の微生物ＲＮＡの異常発現レベルを有する対象を、ＡＳＤを有するか、またはＡＳＤを有するリスクがより高いとしてさらに選択すること、をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
唾液のｍｉＲＮＡレベルの決定または微生物ＲＮＡ発現レベル（複数可）の決定が、ＲＮＡシークエンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）によって実施される、請求項２または請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記シークエンシングデータ生リード数が、分位数正規化され、平均によって中心化され、それぞれの変数の標準偏差で除算され、データが正規化されることでサンプル間の数の変動が考慮され、及び／または１つまたは複数の不変ｍｉＲＮＡの発現に対してデータが正規化されることで相対発現レベル及び／または絶対発現レベルが示され、任意選択で、前記正規化データが統計的にさらに解析される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ｍｉＲＮＡの少なくとも１つの異常レベルを有する対象を、１つもしくは複数のｍｉＲＮＡの前記少なくとも１つの異常な唾液中レベルを低減し、及び／または１つもしくは複数の異常な微生物ＲＮＡ発現レベルを低減するレジメンで治療することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも２つの異なる時点で前記対象から唾液サンプルを採取すること、ならびに前記第２の唾液サンプルまたはその後の唾液サンプルが、正常に近づいたｍｉＲＮＡレベル（複数可）及び／または微生物ＲＮＡ発現レベルを有するときに治療レジメンの効力を決定すること、をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＡＳＤを有するか、またはＡＳＤを有するリスクがより高いとして選択された対象を、１つもしくは複数のｍｉＲＮＡまたは１つもしくは複数の微生物ＲＮＡ発現レベルの少なくとも１つの異常な唾液中レベルを低減するレジメンで治療することをさらに含み、前記レジメンが、外科的治療、薬物治療、ｍｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡアンタゴニストによる治療、抗微生物治療、食事療法もしくは栄養療法、理学療法、光線療法、心理療法、行動療法、または代替医学療法のうちの１つまたは複数を実施することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３０】
ｍｉＲＮＡ及び／または微生物ＲＮＡを検出するためのｍｉＲＮＡアッセイキットであって、前記ｍｉＲＮＡアッセイキットが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５０２、ｍｉＲ−５０２−３ｐ、ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９３−３ｐ、ｍｉＲ−４７０５−３ｐ、ｍｉＲ−４７０５−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４０−５ｐ、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３４０−３ｐ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−６６５−３ｐ、ｍｉＲ−６６５−５ｐ、ｍｉＲ３０７４、ｍｉＲ−３０７４−３ｐ、ｍｉＲ−３０７４−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍＩＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９２ａ、ｌｅｔ−７ｄ−３ｐ、ｍｉｒ−５９８、ｍｉＲ−３７４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１９７２、ｍｉＲ−６７５−３ｐ、ｍｉＲ−７７０６、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−６２０、ｍｉＲ−１２７７−５ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉｒ−９４４、及びｍｉＲ−６５５からなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに相補的であるか、あるいはその他の様式で前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡの増幅及び／または検出に適した１つ、２つ、または３つ以上のプローブまたはプライマーと、任意選択で、１つまたは複数のサンプル採取ツール、１つまたは複数のサンプル採取容器、前記ｍｉＲＮＡ及び／または微生物ＲＮＡを増幅及び／または検出及び／または定量化するための１つまたは複数の試薬、１つまたは複数の正または負の対照、１つまたは複数の反応基質または反応プラットフォーム、包装材料（複数可）、及び／または使用説明物と、を含む、前記ｍｉＲＮＡアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年３月２１日出願の仮特許出願第６２／４７４，３３９号、２０１７年４月１１日出願の同第６２／４８４，３５７号、２０１７年４月１１日出願の同第６２／４８４，３３２号、２０１７年５月５日出願の同第６２／５０２，１２４号、２０１７年９月５日出願の同第６２／５５４，１５４号、２０１７年１１月２４日出願の同第６２／５９０，４４６号、及び２０１８年１月２６出願の同第６２／６２２，３４１号の優先権を主張し、これらの文献の内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、口腔マイクロＲＮＡ及び／または口腔マイクロバイオームの検出、測定、及び解析（時間的変動を考慮するためのデータ正規化を含む）と、ＡＳＤの診断、障害または疾患の進行の監視、及びそれを必要とする対象の任意選択の治療と、を含む、幼児における自閉症及び自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の評価分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
４５人に１人の小児が自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を患っており、ＡＳＤは、関心及び行動が限定的かつ常同的であることに加えて、社会的な相互作用及びコミュニケーションの欠如が多様であることによって特徴付けられる。ＡＳＤリスクには遺伝的な寄与が存在するというかなりの証拠が存在するにもかかわらず、全発症数の１％超を説明し得る単一遺伝子変異は全く発見されていない。結果的に、ＡＳＤリスクに寄与する可能性のある因子としてエピジェネティック機構の研究に相当な関心が寄せられるようになってきている。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、現在ではよく認識されたヒト遺伝子発現のエピジェネティック制御因子であり、このエピジェネティック制御因子によって、すべての細胞型における多数の生物学的プロセスが影響を受ける。さらに、ｍｉＲＮＡは、それが合成される細胞から放出され、すべての細胞外液に含まれて全身を循環する。死後脳、ならびにＡＳＤ対象の細胞外液では、ｍｉＲＮＡのレベルが変化すことが知られている。脳と口腔内のほとんどの組織及び構造との間には密な神経連絡が存在するため、本発明者らの以前の研究では唾液に焦点を当てている。ＡＳＤ対象群（平均年齢９歳）を定型発達対照小児の対応群と区別する上でｍｉＲＮＡの小セットが潜在的な診断有用性を示すことを、本発明者らは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を使用することで発見している。ｍｉＲＮＡの知見に加えて、ＡＳＤ小児の唾液マイクロバイオームは、対照小児のものと比較して明確に異なるものであった。新たに得られた証拠は、宿主ｍｉＲＮＡと下部胃腸（ＧＩ）管または腸マイクロバイオームの常在細菌との間に強固な関連性が存在し得ることを示している。
【０００４】
医療提供者は、診断を早期に下し、根拠に基づく行動療法を勧めることによってＡＳＤ小児の転帰を改善するための機会を有する（Ｚｗａｉｇｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。治療を早期に開始することが社会的及び行動的な転帰を改善する一因となることが研究によって示唆された。
【０００５】
幼児の自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を正確に診断することは、自閉症の研究及び臨床診療において重要な優先事項であるが、重症度が非常に多様であり、症状の発現パターンが可変であるため、極めて困難なことである（Ｍａｃａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。こうした困難を助長しているのは、アメリカ精神医学会（ＡＰＡ）の診断及び統計マニュアル（ＤＳＭ）（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ（ＤＳＭ）ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＰＡ））が改版されるたびにＡＳＤの定義が変わり続けているということである。ＤＳＭ−５における現在のＡＳＤ基準は、社会的・情動的相互性、非言語的コミュニケーション、ならびに関係性の構築、維持、及び理解が欠如していることを含めて、「複数の状況にまたがって社会的コミュニケーション及び社会的相互作用が恒常的に欠如していること」を要求するものである。ＤＳＭ−５では、社会的コミュニケーション障害（ＳＣＤ）と呼ばれる新たな診断カテゴリーも導入されたが、ＳＣＤは、ＡＳＤの一部とは見なされない。ＳＣＤは、社会的状況では適切に言語を使用することができないが、その他の状況では、ＡＳＤで見られる関心の限定及び行動の常同性が見られない個体に適用される。本研究では、ＤＳＭ−５によって認知されるコミュニケーション障害（ＳＣＤを含む）のいずれかであると診断された小児、及びＤＳＭ−５によって特定不能の知的能力障害または全般的発達遅延と診断された小児を、本発明者らは、単に発達遅延（ＤＤ）と称す。発明者らは、ＡＳＤまたはＤＤと診断される疑いのない小児を定型発達（ＴＤ）と称す。さらに、発明者らは、ＴＤ小児とＤＤ小児とを統合したコホートを対照（Ｃ）、非ＡＳＤ、または非スペクトラム（ＮＳ）と互換的に称す。
【０００６】
ＡＳＤ及びＤＤについてのＤＳＭ−５診断による割り付けは、臨床的な標準基準と考えられてはいるものの、この割り付けの実施プロセスは具体的に詳細化されておらず、したがって、個々の医療専門家によるやや主観的な基準適用を使用して実施されることが多い。このことは、ＡＳＤ小児において適切な行動的介入が開始され得ると転帰が改善するという証拠が存在することを考慮すると、理想的な状況とは言い難いものである。ＡＳＤ小児を同定するプロセスの進歩を促すために、さまざまなスクリーニングツールが開発されている。しかしながら、最も広く受け入れられているスクリーニングツール（幼児の自閉症のための修正チェックリスト（改定版）（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｈｅｃｋｌｉｓｔ  ｆｏｒ  Ａｕｔｉｓｍ  ｉｎ  Ｔｏｄｄｌｅｒｓ  Ｒｅｖｉｓｅｄ）（Ｍ−ＣＨＡＴ−Ｒ）（２０１５））でさえ、特異度を欠いており、生後１８〜３０ヶ月の小児にのみに有効なものである（Ｒｏｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。補助的なスクリーニングツールが他にもいくつか提唱されており、こうしたスクリーニングツールには、脳ＭＲＩ、ＥＥＧ、視線追跡、ならびにさまざまな代謝物尺度、ＤＮＡ配列変化、酸化ストレス、及びミトコンドリア損傷（Ｇｏｌｄａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）が含まれる。しかしながら、こうしたスクリーニングツールはそれぞれ、かなりの制約を有しており、臨床診療において日常的に利用されるものは存在せず（Ｇｏｌｄａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、このことによって、診断的評価を確定させるための照会、及び介入療法の開始が遅れている（Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。診断ツール（自閉症診断観察スケジュール（ＡＤＯＳ）など）も使用されるが、それらの診断ツールは、誤って使用されることが多く、過剰診断を招き得るものである（Ｉｎ：Ｍｏｎｔｅｒｅｙ  Ｂａｙ  Ｆｏｒｕｍ  ２０１２、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，２０１２）。したがって、ＡＳＤに対する正確かつ客観的な診断バイオマーカーが開発されれば、現在の標準治療に加わる価値あるものとなるであろう。
【０００７】
ＡＳＤに影響する環境因子には、親（特に父親）の年齢、母親の食事及び健康、ならびに汚染物質及び毒素に対する妊娠前、出産前、及び出産後の曝露が含まれる（Ｄｕｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｓａｅｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｍｏｈａｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｔａｌｂｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。しかしながら、これらはストーリー全体を説明するものではなく、この理由は、ＡＳＤには強い遺伝的要素が存在することによるものである（Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ，２０１１）。一致率は、一卵性双生児で８８％、二卵性双生児で３１％と高くなっており（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、一方、両親が同じ兄弟姉妹の一致率は、母親または父親のみが同じ兄弟姉妹と比較すると２倍高い（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。こうした数字は、ＡＳＤの遺伝性が５０％に達し得ることを示唆している。さらに、ＡＳＤに関連付けられている個々の遺伝子の数は２，０００近いが（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、ＡＳＤ発症数の１％超を説明する単一コピー数多型は皆無である（Ｃｈａｈｒｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。実際、ＡＳＤは、遺伝的多様性によって影響を受けることが示されており、複数の遺伝因子及び非遺伝因子を介して単一の障害が生じる（Ｈｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。脆弱Ｘは、遺伝性の知的能力障害の最も一般的な形態であり、ＡＳＤの主な遺伝的原因であることが知られている。ＡＳＤ診断に影響を与える他の遺伝的な変異及び異形には、ＴＢＲＩ遺伝子の変異及びＣＡＣＮＡ１Ａ（カルシウムチャネル）の多型が含まれる（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｗｉｓｎｉｏｗｉｅｃｋａ−Ｋｏｗａｌｎｉｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【０００８】
ＡＳＤにおいて同定されている遺伝的及び環境的なリスクが多因子性であるという事実を考慮すると、ＡＳＤの病態形成においては１つまたは複数のエピジェネティック機構が役割を担い得る可能性がある（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。可能性のある機構は、中でも特に、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。ＭｉＲＮＡは、タンパク質へのｍＲＮＡの転写を抑制するか、または標的ｍＲＮＡの分解を促進することによって全遺伝子ネットワークの発現を制御することができる非コード核酸である（Ｆｏｌｌｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＡＳＤ小児におけるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の研究では、死後脳組織（Ａｂｕ−Ｅｌｎｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、血清（Ｇｈａｈｒａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、及び培養末梢リンパ芽球（Ｔａｌｅｂｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｓａｒａｃｈａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｇｈａｈｒａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｈｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）における発現パターンが異なることが示されている。こうした研究において同定されたｍｉＲＮＡのいくつかは、ＡＳＤに関与することが知られる遺伝子を標的とするものであるが（Ｂａｎｅｒｊｅｅ−Ｂａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、脳生検は、単純に侵襲性が高すぎてＡＳＤスクリーニングのモデルには適しておらず、培養リンパ芽球におけるｍｉＲＮＡの発現が生理学的に関連するものであるかについては、方法論的な懸念が存在する（Ｂａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。さらに、こうした研究は、スケールが小さく、神経発達の尺度を検証（例えば、ＡＤＯＳまたはＡＤＩ−Ｒ）して対象の臨床的特徴を特徴付けできていないものであった。言語発達遅滞、学習困難、及び社会的問題を含めて、ＡＳＤ小児が発達問題を広範囲にわたって示すことを考慮すると、上記の最後の点は重要なことである。したがって、信頼性のあるＡＳＤ診断基準を可能な限り早く確立し、同時に、異なる発達懸念を有する亜群を識別することが必要とされている。
【０００９】
現在では、脳が正常に発達及び機能するにはＭｉＲＮＡが必要不可欠であることが知られている。細胞外シグナル伝達の手段としてエクソソーム及び他の親油性担体の中にｍｉＲＮＡが封入され得ることは注目すべきことである。この特徴によって、唾液などの細胞外生体液においてｍｉＲＮＡのレベルを非侵襲的に測定することが可能であり（Ｈｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）、ｍｉＲＮＡが中枢神経系（ＣＮＳ）の障害に対する魅力的なバイオマーカー候補となっている（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＡＳＤ小児におけるｍｉＲＮＡの研究では、死後脳組織（Ａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｍｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、血清、及び培養末梢リンパ芽球（Ｓａｒａｃｈａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｇｈａｈｒａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）における発現パターンが異なることが示されている。こうした研究において同定されたｍｉＲＮＡのいくつかは、ＡＳＤに関与することが知られる遺伝子を標的とするものである（Ｈｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。脳生検は、明らかに侵襲性が高すぎてＡＳＤのスクリーニングには適しておらず、培養リンパ芽球におけるｍｉＲＮＡの発現が生理学的に関連するものであるかについては、方法論的な懸念が生じる。中咽頭が受ける脳神経支配が強固であり、グリンパティック構造に中咽頭が近いこと、ならびにＡＳＤ小児では感覚運動病態（食品テクスチャ感度（Ｓｃｈｒｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、味覚嫌悪、及び発語失行（Ｔｉｅｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）が観測されることを考慮し、本発明者らは、ＡＳＤ小児を定型発達同等小児と区別するために唾液ｍｉＲＮＡの可能性を以前に探索した（Ｈｉｃｋｓ，Ｉｇｎａｃｉｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。２４人のＡＳＤ小児のパイロット研究では、ＡＳＤでは唾液ｍｉＲＮＡが変化しており、ＡＳＤ小児の脳において変化することが報告されているｍｉＲＮＡと唾液ｍｉＲＮＡが幅広く相関することが実証された。
【００１０】
舌及び唾液腺の最も密な神経支配源の１つが顔面神経核に由来すること、ならびに特発性ＡＳＤまたはサリドマイド誘導性ＡＳＤを有する対象に由来する死後脳組織の研究において、この脳神経核に著しい異常が生じることが２０年超前に報告（Ｒｏｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）されていることは、ＡＳＤの神経発達理論を明確に裏付けるものである。したがって、唾液における細胞外ｍｉＲＮＡを定量化することで、ＡＳＤ小児における脳関連バイオマーカーを同定するための魅力的かつ侵襲性が最小限の手法が得られる。さらに、この方法では、以前の研究（Ａｂｕ−Ｅｌｎｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｍｕｎｄａｌｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｔａｌｅｂｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｓａｒａｃｈａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｇｈａｈｒａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）において利用された死後脳組織の分析（例えば、無酸素性脳傷害、ＲＮＡ分解、死後経過時間、末期状態）または末梢白血球の分析（発現変化の関連性、採血に伴う苦痛の関連性）に伴う制限の多くが最小化される。
【００１１】
まとめると、こうした研究は、ＡＳＤのスクリーニングにおいてｍｉＲＮＡを測定することの有用性を裏付けるものである。しかしながら、ＡＳＤ患者における以前のｍｉＲＮＡ研究の臨床的適用性は、以下のいくつかの因子によって限られたものとなっている：１）ＡＳＤの性質が幅広く多様であるにもかかわらず、５６人以上のＡＳＤ参加者に対してｍｉＲＮＡ研究が行われたことが全くない（Ｍｕｎｄａｌｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、２）ＡＳＤ診断が最初に行われる（すなわち、診断バイオマーカーパネルが臨床的に最も有用であると想定される）年齢（２〜６歳）の小児が参加したｍｉＲＮＡ研究が皆無である、３）ＡＳＤ小児を非自閉症発達遅延同等小児と比較したｍｉＲＮＡ研究が皆無である（比較を行うには、頑健な診断ツールセットを開発することが必要である）、及び４）ＡＳＤ表現型を区別（自閉症コミュニティーにとっての優先事項）するためにｍｉＲＮＡシグネチャーの能力を調べた研究が皆無である。
【００１２】
本発明者らは、こうした不完全な状況に対処し、予測的バリデーションのための唾液ｍｉＲＮＡの診断パネルを確立することを試みた。本発明者らは、ＡＳＤ小児、非自閉症発達遅延（ＤＤ）小児、及び定型発達（ＴＤ）小児における唾液のｍｉＲＮＡ濃度を特徴付ければ、スクリーニング（ＡＳＤとＴＤとの対比）及び診断（ＡＳＤとＤＤとの対比）の可能性を有するｍｉＲＮＡのパネルが同定されるであろうという仮説を立てた。本発明者らは、こうしたｍｉＲＮＡは、機能経路分析での脳関連標的となり、特定の自閉症表現型（コミュニケーション、社会化、及び常同的行動の標準化尺度で評価されるもの）との関連性を示すであろうとも仮定した。
【００１３】
胃腸（ＧＩ）管のマイクロバイオームは、哺乳類の生理機能に必要不可欠なものであり、重要な栄養成分（アミノ酸、葉酸、及びビタミンＢなど）の消化、合成、及び吸収を支援する。「微生物−腸−脳軸」を介してＧＩマイクロバイオームが宿主の行動及び神経発達にも影響を与えることが、蓄積する証拠によって示唆されている。この軸は、直接的な神経活性化、免疫調節、ならびにホルモンによるシグナル伝達、ペプチド作動性のシグナル伝達、及びエピジェネティックなシグナル伝達を含めて、いくつかの異なる様式を介して中枢神経系（ＣＮＳ）とＧＩ管との間に微生物介在性のクロストークが生じるという発展途上の概念を与えるものである。
【００１４】
腸マイクロバイオームは、自閉症研究における新たな分野である（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，１５（２），３３７）。この可能性を裏付けるものとして、糞便マイクロバイオーム要素とＡＳＤ症状との間には相関が存在することが最近の研究によって見出されている（Ｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｖｕｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７、Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。この現象を調べる研究のほとんどで、腸マイクロバイオームを調べるために１６Ｓ  ｒＲＮＡシークエンシングが使用されている（ＭｃＥｌｈａｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。例えば、腸におけるＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅは、自傷行動の増加と関連することが、あるグループによって見出された（Ｌｕｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。別の研究では、その増殖がＡＳＤと関連する４つの腸微生物属、及びその増殖が神経学的定型発達個体と関連する２つの属が見出された（Ｓｔｒａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。さらに、こうした研究のいくつかでは、観測されるマイクロバイオーム差異が、ＡＳＤで生じることが多い胃腸（ＧＩ）症状の根底をなし得るという証拠も得られている。例えば、ＡＳＤにおける便秘は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ／Ｓｈｉｇｅｌｌａ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍクラスターＸＶＩＩＩのレベルの上昇と関連することが明らかとなった（Ｓｔｒａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。ＧＩ症状とのそのような関連性が、ＡＳＤ個体によく見られる限定的な食事によって誘導されるかどうか、またはこうした微生物変化がそのようなＡＳＤエンドフェノタイプの原因であるかどうかは依然として不明のままではあるものの、こうしたデータは、ＡＳＤ小児の９０％近くが何らかの摂食関連懸念を抱える（Ｌｅｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）（こうした懸念は、食物選択性または可能性としてはＧＩ不耐性と関連することが最も多い（Ｓｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２））ことから、説得力があるものである。こうした非定型栄養パターンは、行動変化の一因になることに加えて、医学的問題（腸炎症、肥満（Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、便秘（Ｐａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、及び骨成長不良（Ｈｅｄｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）など）のリスクを増加させ得るものである。こうした可能性の統合を実証によって支援する新たな研究がＡＳＤげっ歯類モデルにおいて最近行われ、この研究では、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓで腸を再構成することでオキシトシンレベル、腹側被蓋野の可塑性、及び社会的行動が修復されることが実証された（Ｂｕｆｆｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）。健康な対象の腸から微生物を移すことによって治療されたヒト対象においても（この研究は、二重盲検またはプラセボ対照ではないが）同様のＡＳＤ症状改善が最近観測されている（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。
【００１５】
正確な機構は依然として謎のままではあるものの、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を含めて、幅広い精神神経障害及び神経発達障害においてＧＩマイクロバイオーム及び腸−脳軸に変化が生じるということも今やますます明らかになりつつある。実際、不相応な数のＡＳＤ患者が、便秘、慢性下痢、腹痛、及び胃食道逆流を含めて、ＧＩ併存疾患に苦しんでいる。ＡＳＤリスクの５０％近くが遺伝的異形（ヌクレオチド多型及びコピー数多型など）に起因するものの、遺伝子と環境との相互作用が（ＧＩマイクロバイオームの影響下で）腸−脳軸を介して作用し、ＡＳＤリスクを著しく調節し得る可能性がある。このことが顕著に見られる例としては、微生物がセロトニンレベルに対して影響を与えることが挙げられる。
【００１６】
セロトニントランスポーター遺伝子における多型は、ＡＳＤのリスクの一因である。しかしながら、セロトニン合成の大部分は、腸クロム親和性細胞においてトリプトファンがトリプトファンヒドロキシラーゼを介してセロトニンに変換されることによって生じる。ＧＩマイクロバイオームは、クロム親和性細胞に対する短鎖脂肪酸の作用を介してセロトニン合成を増進する。セロトニンが合成されると、その一部は末梢循環に流れ込むものの、その大部分は腸内で作用して腸運動を促進し、特に脳発達の初期に、ＣＮＳに潜在的に影響を与え得る。したがって、腸マイクロバイオームの乱れは、小児の遺伝的背景と協奏的に作用してセロトニンシグナル伝達を変え得るものである。
【００１７】
遺伝子と環境とが相互作用するというこの考えに立脚して、ＡＳＤでは腸−脳シグナル伝達が乱れているという証拠が蓄積されつつある。例えば、退行性自閉症及びＧＩ併存疾患を有する１３人の小児について行われた最近の研究では、糞便中のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ及び非芽胞形成性嫌気性菌のレベルが、定型発達対照に見られるものと比較して増加していることが同定された。２つの追加のＡＳＤマイクロバイオーム研究においても、糞便中のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍの存在量が乱れていることが報告されている。ＡＳＤ小児では、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ／Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ比が変化していることが他の調査においても認められているが、そうした変化の方向性には矛盾が存在する。追加の報告においても、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、及びＶｅｉｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅの変化がＡＳＤに関連付けられている。試験間でコンセンサスが得られていないことは、難しい問題ではあるが、高度に多様な障害の調査に使用するサンプルサイズが比較的小さいということによって部分的には説明され得る。こうした調査のサイズが小さいことは、ＡＳＤ参加者を表現型サブタイプに細分化することも妨げている。スケールを大きくして対処すれば、自閉症行動、ＧＩ病状、及び免疫機能へのマイクロバイオームの関連性に対する有用な洞察が得られる可能性がある。
【００１８】
ＡＳＤにおいてマイクロバイオームが潜在的な役割を果たすことは、ディスバイオシスによって社会的行動が変わり、そうした症状が、腸微生物が修復されることで寛解するといういくつかの動物試験によっても強い裏付けが得られている。ヒトＡＳＤでも、対応する知見が報告されている。例えば、バンコマイシンまたはテトラサイクリンを用いた抗生物質治療の研究では、ＡＳＤ患者の行動症状のいくつかを一時的に軽減することができている。１８人のＡＳＤ小児に糞便マイクロバイオータ移植治療を行う最近の研究においても、親によって報告されるＧＩ症状及びＡＳＤ症状の改善を伴って細菌多様性が改善されることが実証された。こうした効果は、介入後から８週間持続した。
【００１９】
注目すべき点は、ＡＳＤマイクロバイオームのほぼすべての研究において下部ＧＩ管に焦点が当てられているということである。一方で、中咽頭は、ＧＩ管の唯一の入り口として働くものであり、ＡＳＤ病状を示す部位にもなる。ＡＳＤ小児では、口の運動（発語）及び感覚（食品テクスチャ）の病状を患う割合が高まっており、本発明者らは、ＡＳＤ小児の唾液ではエピトランスクリプトミック変化が生じていることを以前に報告している。このことから、本発明者らは、ＡＳＤ小児では口腔マイクロバイオームにも乱れが生じている可能性があると推定するに至った。
【００２０】
本発明者らは、１８０人のＡＳＤ小児、１０６人の定型発達対照（ＴＤ）、及び６０人の非自閉症発達遅延（ＤＤ）小児の中咽頭に由来するハイスループットショットガンメタトランスクリプトームデータを使用してヒトマイクロバイオームを調べた。ＡＳＤ個体の下部ＧＩ管における存在量が変化している生物には、中咽頭における転写活性にも同様の変化が生じているであろうという仮説を立てた。さらに、特定のマイクロバイオームコミュニティーは、ＡＳＤエンドフェノタイプを区別するものであり、神経ホルモンシグナル伝達及び代謝制御と関連するｍＲＮＡの存在量と相関するであろうと推定した。
【００２１】
ヒトにおいて睡眠が適切に制御されることは、精神を正常にし、体を健康にする上で不可欠なことである。主要な臓器系の多くでは、睡眠覚醒サイクルまたは概日リズムと関連してその機能状態に変動が生じる。睡眠の乱れまたは概日リズムの崩壊は、自閉症、鬱病、パーキンソン病、及びアルツハイマー病を含めて、脳損傷及び多くの慢性脳疾患または慢性脳障害に共通する問題である。
【００２２】
睡眠覚醒サイクル中は、多数の分子変化、細胞変化、及び生理学的変化が生じる。こうした変化の多くが、概日制御因子遺伝子（ＣＬＯＣＫ及びＢＭＡＬ１など）と称されるものによって誘導される。こうしたものは、次に、生理学的に関連する遺伝子、タンパク質、及びホルモンの発現に多数の変化を生じさせる。明暗サイクルは別として、概日遺伝子の発現に影響を与える因子は、完全には理解されていない。まとめると、本発明者らのデータは、これまで知られていなかった、唾液のｍｉＲＮＡと微生物含量と間の関連性、ならびにｍｉＲＮＡ（及び／または微生物）自体に対する時間的影響（すなわち、時間的変動）を示唆するものである。時間的変動が生じるエピジェネティックデータ（シークエンシングデータまたは他のデータ）を正規化するための、本明細書に記載のシステム及び方法は、こうしたデータに時間的変動が影響し得る場合、任意の適切な用途において使用され得る。本明細書に記載のシステム及び方法は、医学的状態の発症及び／または医学的状態の変化を検出するための用途、より具体的には、神経学的障害（自閉症、睡眠障害、及び外傷性脳損傷（ＴＢＩ）など）の発症及び／または変化を検出するための用途において使用され得る。
【発明の概要】
【００２３】
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の臨床診断は、時間のかかる主観的評価に依存するものである。本発明者らの目的は、ＡＳＤ小児を定型発達（ＴＤ）同等小児及び非自閉症発達遅延（ＤＤ）同等小児と区別する上での唾液マイクロＲＮＡの有用性を調べることとした。別の目的は、ＡＳＤ表現型の中でマイクロＲＮＡパターンを探索して、所望の感度及び特異度を達成するためのアルゴリズムにおいて使用することとした。本発明者らの別の目的は、ＡＳＤ小児を定型発達（ＴＤ）同等小児及び非自閉症発達遅延（ＤＤ）同等小児と区別する上での口腔マイクロバイオームの有用性を調べることとした。
【００２４】
本発明者らの別の目的は、ＡＳＤのための迅速、正確、かつ客観的なスクリーニングツールとしてのｍｉＲＮＡとマイクロバイオームとの間の関連性の強度を調べることとした。
【００２５】
本発明者らの他の非限定的な目的は、口の唾液の日内変動に対するｍｉＲＮＡレベルとマイクロバイオームレベルとの間の関連性を決定すること、日内変動を有すると同定されたｍｉＲＮＡのいずれかが、概日遺伝子を制御することが知られるものであるかどうかを調べること、ならびに最も大きな概日変動度合を示すｍｉＲＮＡと微生物と間の関連性の強度を定量化すること、とした。
【００２６】
本発明のこれらの目的及び他の目的は、好ましい実施形態の後述の詳細な説明と併せることで、単独の実施形態またはその組み合わせのいずれにおいても、より明らかとなるであろう。
【００２７】
本開示の目的のより完全な用途及びその利点の多くは、下記の添付の図面と関連付けて考慮すると、容易に得られるであろうし、後述の詳細な説明を併せて参照することによってもその理解が深まるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１Ａ、図１Ｂは、ＰＣＡによって評価したＡＳＤ小児及びＴＤ小児のｍｉＲＮＡデータの球面性及び正規化を示す。図１Ｃは、赤色／グレースケールで示される、異常値を含むｍｉＲＮＡデータのボルケーノプロットを示す。
【図２】図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄは、ＡＳＤ小児とＴＤ小児との間の選択ｍｉＲＮＡの差異の箱ひげ図を示す。
【図３】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄは、ＡＳＤ小児とＴＤ小児との間の選択ｍｉＲＮＡの差異の箱ひげ図を示す。
【図４】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、図４Ｄは、ＡＳＤ小児とＴＤ小児との間の選択ｍｉＲＮＡの差異の箱ひげ図を示す。
【図５】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄは、ＡＳＤ小児とＴＤ小児との間の選択ｍｉＲＮＡの差異の箱ひげ図を示す。
【図６】図６Ａ、図６Ｂは、ＰＣＡによって評価したマイクロバイオームデータの球面性及び正規化を示す。図６Ｃは、赤色／グレースケールで示される、異常値を含むマイクロバイオームデータのボルケーノプロットを示す。
【図７】図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄは、ＡＳＤ小児とＴＤ小児との間の選択分類群の差異の箱ひげ図を示す。
【図８】図８Ａ、図８Ｂ、図８Ｃ、図８Ｄは、ＡＳＤ小児とＴＤ小児との間の選択分類群の差異の箱ひげ図を示す。
【図９】図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ、図９Ｄは、ＡＳＤ小児とＴＤ小児との間の選択分類群の差異の箱ひげ図を示す。
【図１０】図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄは、ＡＳＤ小児とＴＤ小児との間の選択分類群の差異の箱ひげ図を示す。
【図１１】訓練／発見の間に得られた、ＡＳＤ小児及びＴＤ小児に由来するｍｉＲＮＡのロジスティック回帰分類の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線及び曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。
【図１２】図１２Ａ〜Ｂは、交差検証の間に得られた、ＡＳＤ小児及びＴＤ小児に由来するｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ比のロジスティック回帰分類のＲＯＣ曲線、ＡＵＣ、感度、及び特異度を示す。
【図１３】分類群を用いたロジスティック回帰からＡＳＤサンプル及びＴＤサンプルのクラス確率を予測したものを示す。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｂは、ＡＳＤ小児とＴＤ小児との間の、分類群を用いたロジスティック回帰分類のＲＯＣ、ＡＵＣ、感度、及び特異度を示す。
【図１５】１１の分類群比のロジスティック回帰分類からサンプルのクラス確率を予測したものを示す。
【図１６】有意に異なるｍｉＲＮＡのうちの８つ、有意に異なる１０の分類群、これらに加えて年齢及び性別を用いたロジスティック回帰モデルの混同行列及び総括表を示す。このモデルでは、ＡＳＤ小児の＞９０％、及びＴＤ小児の＞８０％が正しく分類された（全体では８６．６％）。
【図１７】上位の異なるｍｉＲＮＡ変数及び分類群変数ならびに年齢のスピアマン相関行列を示す。
【図１８】ＡＳＤ（ｎ＝１２０）対象及びＴＤ（ｎ＝８５）対象におけるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの正規化レベルの箱ひげ図を示す（ｐ＝０．００２）。
【図１９】ＡＳＤと定型発達対照とを対比分類するロジスティック回帰モデルのＲＯＣ曲線及びＡＵＣを示す。１０のｍｉＲＮＡ及び３つのマイクロバイオータを含む１６の比から得られた曲線下面積（ＡＵＣ）は、交差検証（ＣＶ）訓練分析については０．８３５、ホールドアウト分析については０．８３４であった。
【図２０】ＡＳＤ小児と発達遅延小児との間のロジスティック回帰分類器のＲＯＣ曲線を示す。１３のｍｉＲＮＡ及び８つのマイクロバイオーム要素及び年齢を使用することで、訓練セット分析から得られた全精度は＞９１％であり、ナイーブサンプルの１／３ホールドアウト分析から得られた精度は７５．０％であった。
【図２１】図２１Ａ〜Ｂは、予定されたＡＵＣ分析の非劣性（Ａ）及び３群分類検定の評価者間信頼性（コーエンのカッパ係数）（Ｂ）に基づく検出力及びサンプルサイズ推定値を示す。こうした計算は、Ｈａｎｌｅｙ  ａｎｄ  ＭｃＮｅｉｌ（１９８３）、Ｏｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  ＭｃＣｌｉｓｈ（１９９７）、及びＦｌｅｉｓｓ，Ｌｅｉｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｋ（２００３）に記載の方法に基づくものである。
【図２２】ＡＳＤ小児とＴＤ小児との区別における、ｍｉＲＮＡ、分類群、及び患者特徴の異なる比の変数重要度を示す。右側のカラー／グレースケールのパネルは、ＴＤ（０）小児またはＡＳＤ（１）小児における比率が高いかまたは低いかを示す。
【図２３】ｍｉＲＮＡとマイクロバイオーム分類群とを組み合わせて使用するランダムフォレスト分類器の例のＲＯＣ曲線及びＡＵＣを示す。
【図２４】ロジスティック回帰分類器の例のＲＯＣ曲線及びＡＵＣを示す。
【図２５】ｍｉＲＮＡの比及びマイクロバイオームＲＮＡの比を含む、ＡＳＤ小児とＤＤ小児との間のロジスティック回帰分類器の例のＲＯＣ曲線及びＡＵＣを示す。
【図２６】図２６Ａは、ｑＰＣＲ分析におけるＰｒｅｖｏｔｅｌｌａｃａｅａ及びＰｒｅｖｏｔｅｌｌａの存在量を示す。図２６Ｂは、個々のコア口腔マイクロバイオーム分類群を使用する分類モデルのＲＯＣ及びＡＵＣを示す。
【図２７】コア口腔マイクロバイオーム分類群の普及率及び存在量を示す。すべての参加者（ｎ＝３４６）にわたって転写活性が最も高い１０の口腔分類群が示される。１０すべての分類群の相対存在量（ｘ軸）は口腔マイクロバイオームの０．５％を超えており、分類群はそれぞれ、サンプルの少なくとも７０％に１０以上の数で存在した（普及率は、赤色青色スケール／グレースケールで示される）。
【図２８】図２８Ａ〜Ｂは、コア口腔門を示す。すべての参加者（ｎ＝３４６）にわたる門レベルでの口腔転写物の存在量が、全体に占める割合として示される（Ａ）。Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ（５８％）が最も存在量の多い門であり、その次にＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ（１６％）及びＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（１１％）の存在量が多かった。Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門の中では（Ｂ）、ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓが最も存在量の多い（７２．４％）目であり、その次にＢａｃｉｌｌａｌｅｓ（２４．５％）の存在量が多かった。
【図２９】図２９Ａ〜Ｂは、種レベル（ｐ＝０．６０、Ｆ＝１．０１）（Ａ）または門レベル（ｐ＝０．４８、Ｆ＝０．７３）（Ｂ）でＡＳＤ群、ＴＤ群、及びＤＤ群の間にシャノンアルファ多様性の差異が存在しないことを示す。
【図３０】ブレイ・カーティス（Ｂｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ）ベータ多様性を示す。参加者間の微生物多様性を、ＡＳＤ群（赤色／グレースケール、ｎ＝１８０）、ＴＤ群（緑色／グレースケール、ｎ＝１０６）、及びＤＤ群（青色／グレースケール、ｎ＝６０）について群分散の均一性を調べる手法を使用して計算した。有意な群間差異（ｐ＝０．０４、Ｆ＝３．２５）が存在し、ＴＤ群のサンプル間多様性が最も大きかった。この二次元プロットは、参加者間の分散の３８．３％を説明するものである。９５％信頼区間は、カラー／グレースケールの楕円形によって示される。
【図３１】ＡＳＤ小児、ＴＤ小児、ＤＤ小児にわたって口腔門の存在量を示す。自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ、ｎ＝１８０）小児、定型発達（ＴＤ、ｎ＝１０６）小児、及び非自閉症発達遅延（ＤＤ、ｎ＝６０）小児について、１６の口腔門の相対存在量が示される。ノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定によって、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ（χ２＝３１．０、ＦＤＲ＝３．２Ｅ−０６）、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（χ２＝１４．８、ＦＤＲ＝０．００５）、及びＣａｌｄｉｔｒｉｃｈａｅｏｔａ（χ２＝９．６、ＦＤＲ＝０．０４）について、上記の３つの群の間に有意差（ＦＤＲ＜０．０５）が存在することが明らかとなった。
【図３２】図３２Ａ〜Ｂは、口腔分類学的プロファイルによってＡＳＤ小児がＴＤ同等小児及びＤＤ同等小児と区別されることを示す。部分的最小二乗判別分析を使用することで、ＡＳＤ群、ＴＤ群、及びＤＤ群の間の種レベルの分類学的プロファイル差異を二次元で視覚化した（Ａ）。群間の分散の４％を説明するモデルによって、ＡＳＤ参加者（赤色／グレースケール）がＴＤ（青色／グレースケール）同等小児及びＤＤ（緑色／グレースケール）同等小児と部分的に分離された。群の射影に最も不可欠な２０の分類群が、射影スコアでの変数重要度に基づいて示される（Ｂ）。こうした分類群の大部分（１４）は、ＴＤ群及びＤＤ群と比較してＡＳＤサンプルにおいて減少している（緑色／グレースケールの箱）。３つの分類群がＡＳＤ参加者において増加しており（赤グレースケールの箱）、３つは、中間の存在量パターンを示した（黄色／グレースケールの箱）。
【図３３】図３３Ａ、図３３Ｂ、図３３Ｃは、口腔分類群の転写活性によってＡＳＤ参加者が区別されることを示す。（Ａ）この分類群パネルは、ホールドアウトセットにおいてもほぼ同一の能力を発揮し、ＡＳＤ小児（７３／９０）及びＴＤ小児（３３／５３）を同定した（ＡＵＣ＝０．７９６）。（Ｂ）３つの比は、ナイーブサンプルのホールドアウトセットにおいても同様に能力を発揮し、ＡＳＤ小児（８２／９０）及びＤＤ小児（２１／３０）を同定した（ＡＵＣ＝０．７６５）。（Ｃ）ホールドアウトセットにおいて、この分類群パネルは、ＧＩ障害を有するＡＳＤ小児（７／２０）及びＧＩ障害を有さない小児（６７／７１）を同定した（ＡＵＣ＝０．８５７）。
【図３４】図３４Ａ、図３４Ｂ、図３４Ｃ、図３４Ｄ、図３４Ｅ、図３４Ｆ、図３４Ｇ、図３４Ｈは、差異を示したＫＥＧＧ経路を示しており、当該ＫＥＧＧ経路には、微生物エネルギー代謝（Ａ）、翻訳リボソーム構造及び翻訳リボソーム新生（Ｂ）、ピリミジン代謝（Ｃ）、リジン分解（Ｄ）、ヌクレオチド代謝（Ｅ）、炭素代謝（Ｆ）、ヌクレオチドの輸送及び代謝（Ｇ）が含まれていた。（Ｈ）は、代謝プロファイルの差異を示す。
【図３５】ＡＳＤ群、ＤＤ群、及びＴＤ群の間で唾液ｍｉＲＮＡ発現が異なることを示す。ＡＳＤ参加者（赤色／グレースケール、ｎ＝１８７）、ＤＤ参加者（緑色／グレースケール、ｎ＝６９）、及びＴＤ参加者（青色／グレースケール、ｎ＝１２５）の間で、クラスカル・ワリス検定での存在量差異（ＦＤＲ＜０．０５）を有する１４のｍｉＲＮＡがχ２統計量と共に示される。カラー／グレースケールの箱は、群の相対存在量（ピアソンの距離評価指標によって測定したもの）を示し、ｍｉＲＮＡは、完全クラスタリングアルゴリズムを使用するヒートマップにおいてクラスタリングした。
【図３６Ａ】唾液ｍｉＲＮＡプロファイルによってＡＳＤ群、ＤＤ群、及びＴＤ群が分離されることを示す。部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を使用することで、５２７の唾液ｍｉＲＮＡの存在量に基づいて３８１人の小児すべてを三次元空間にマッピングした。ＰＬＳ−ＤＡによって、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ；赤色／グレースケールのドット、ｎ＝１８７）小児が定型発達（ＴＤ；青色／グレースケールのドット、ｎ＝１２５）小児とほぼ完全に分離されることが実証され、分散の１４．１％が説明された。ＡＳＤ小児と非自閉症発達遅延（ＤＤ；緑色／グレースケールのドット、ｎ＝６９）小児との間の空間的な分離は不完全なものであった。
【図３６Ｂ】唾液ｍｉＲＮＡプロファイルによってＡＳＤ群、ＤＤ群、及びＴＤ群が分離されることを示す。５２７の個々のｍｉＲＮＡについて、射影における変数重要度（ＶＩＰ）スコアを決定し、ＶＩＰが≧２．０である２０のｍｉＲＮＡが示される。カラースケール／グレースケールは、ＡＳＤ群、ＴＤ群、及びＤＤ群の間の相対的な射影重要度を示す。アスタリスク付きで示されるｍｉＲＮＡは、ヒト患者を含む以前のｍｉＲＮＡ研究において同定されたものを示す。
【図３７】図３７Ａ〜Ｂは、唾液ｍｉＲＮＡによってＡＳＤ状態が同定されることを示す。ロジスティック回帰分析を使用することで、ＡＳＤ状態を同定するための２８のｍｉＲＮＡの能力を検定した。性別及びＧＩ障害の存在を調整しつつ４つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２７７−５ｐ）を利用した５つのｍｉＲＮＡ比のパネルでは、１００分割交差検証（ＣＶ）手法を使用すると、ＡＳＤ参加者及びＴＤ参加者の最初の５０％において得られた曲線下面積（ＡＵＣ）は０．７８８（９５％ＣＩ：０．６７７〜０．８７５）であった（Ａ）。このパネルでは、ナイーブなホールドアウトセットにおけるＡＵＣが０．７４４に維持された。年齢を調整しつつ４つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−３７４ｃ−５ｐ）を利用した４つのｍｉＲＮＡ比のパネルでは、１００分割ＣＶ手法を使用すると、ＡＳＤ参加者及びＤＤ参加者の最初の５０％において得られたＡＵＣは０．７１４（９５％ＣＩ：０．５６４〜０．８４７）であった（Ｂ）。このパネルでは、ナイーブなホールドアウトセットにおいて０．６０３）のＡＵＣが得られた。
【図３８】ＡＳＤ小児において変化する唾液ｍｉＲＮＡの機能的関連性を示す。１４の目的ｍｉＲＮＡに対して、そのｍＲＮＡ標的（ｍｉｃｒｏＴ−ｃｄｓアルゴリズムを用いてＤＩＡＮＡ  ｍｉＲＰａｔｈで同定したもの）の経路統合に基づく階層的クラスタリングを行った。これら１４のｍｉＲＮＡは、偶然によって予測されるものを上回る頻度で、４１のＫＥＧＧ経路に由来するｍＲＮＡを標的とするものであった。９つの脳関連経路においてそれぞれのｍｉＲＮＡが標的とするｍＲＮＡの数が、それぞれのｍｉＲＮＡのｍＲＮＡ標的の総数と共に示される。機能標的に基づいてここでクラスタリングされたｍｉＲＮＡの３つのペア（ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ／ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ／ｍｉＲ−９４４、及びｍｉＲ−６２０／ｍｉＲ−４７０５）は、ＡＳＤ群、ＴＤ群、及びＤＤ群の間の唾液中濃度パターンに基づいてもクラスタリングされたことに留意されたい（図３５）。
【図３９】概日分析についての採取１の２４サンプル及び採取２の４８サンプルの分析の結果、オーバーラップするｍｉＲＮＡのベン図を示す。
【図４０】３日（１日目、３日目、７日目）にまたがって４人の対象から２回／日（午前８時、午後８時）の頻度でサンプル採取した２４サンプルにおいて採取時刻に応じて変化した、概日分析における１９のオーバーラップｍｉＲＮＡについての存在量データのヒートマップクラスタリングを示す。
【図４１】４日（１日目、５日目、１０日目、１５日目）にまたがって３人の対象から４回／日（午前８時、午後１２時、午後４時、午後８時）の頻度でサンプル採取した４８サンプルにおいて採取時刻に応じて変化した、概日分析における１９のオーバーラップｍｉＲＮＡについての存在量データのヒートマップクラスタリングを示す。
【図４２】採取３（さまざまな時刻に採取を実施）の対象のうちの３人について示される、上位１９のｍｉＲＮＡのうちの１つの正規化データを示す。
【図４３】採取３の対象のうちの１人のマイクロバイオームにおける種の絶対存在量を示す。
【図４４】概日分析の採取１及び採取２のサンプルの分析の結果、オーバーラップする有意に変化した微生物のベン図を示す。
【図４５Ａ】概日微生物と概日変動ｍｉＲＮＡ（ｃｉｒｃａＭｉＲ）とのピアソン相関行列を示す。ｃｉｒｃａＭｉＲと微生物との間にいくつかの広い相関が存在することに注目されたい（左下、右上）。
【図４５Ｂ】概日微生物と概日変動ｍｉＲＮＡ（ｃｉｒｃａＭｉＲ）とのピアソン相関行列を示す。ｃｉｒｃａＭｉＲと微生物との間にいくつかの広い相関が存在することに注目されたい（左下、右上）。
【図４５Ｃ】概日微生物と概日変動ｍｉＲＮＡ（ｃｉｒｃａＭｉＲ）とのピアソン相関行列を示す。ｃｉｒｃａＭｉＲと微生物との間にいくつかの広い相関が存在することに注目されたい（左下、右上）。
【図４５Ｄ】概日微生物と概日変動ｍｉＲＮＡ（ｃｉｒｃａＭｉＲ）とのピアソン相関行列を示す。ｃｉｒｃａＭｉＲと微生物との間にいくつかの広い相関が存在することに注目されたい（左下、右上）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本明細書に記載のものと同様または同等の方法及び材料はすべて、本発明の実施または試験において使用することができ、適切な方法及び材料は、本明細書に記載される。本明細書で言及される刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献はすべて、それらの全体が参照によって組み込まれる。さらに、材料、方法、及び実施例は、例示にすぎず、別段の指定がない限り、限定は意図されない。
【００３０】
本出願は、唾液サンプルにおいて検出されるｍｉＲＮＡ及び／またはマイクロバイオームのレベル、ならびに患者情報を使用して自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）対象を定型発達（ＴＤ）対象または発達遅延（ＤＤ）対象と区別するための方法を提供する。この方法は、ＡＳＤの進行監視及びその治療支援に使用することができる。ｍｉＲＮＡまたはマイクロバイオームの数及び存在量は、ＲＮＡ−ｓｅｑ、ｑＰＣＲ、または他の方法によって決定される。マイクロＲＮＡ及び／またはマイクロバイオームのシークエンシングデータは、時間変動のないｍｉＲＮＡ及び／または微生物ＲＮＡの発現レベルまたは存在量に対して正規化することによって精度を向上させることで、サンプル採取時刻が調整されるか、またはこうしたレベルの概日変動が補正される。多変量ロジスティック回帰及び非線形分類手法が追加で使用されることで、ＡＳＤ状態が未知の対象においてＡＳＤ対象、ＤＤ対象、及びＴＤ対象を正確に区別するｍｉＲＮＡ及びマイクロバイオームのパネルが選択される。ｍｉＲＮＡ及びマイクロバイオームのこうしたパネルから、ＲＮＡアッセイキットが開発され得る。
【００３１】
唾液は、水、ムチン、タンパク質、塩、及び多くの場合、デンプン開裂酵素（プチアリンとして）を含む若干アルカリ性の分泌物であり、この分泌物は、唾液腺によって口に分泌され、摂取食物を潤し、多くの場合、デンプンの分解を開始させる。唾液は、顎下腺、耳下腺、及び／または舌下腺によって放出され、唾液放出は、交感神経系活性及び／または副交感神経系活性によって刺激され得る。交感神経性または副交感神経性の誘導によって主に放出される唾液は、マイクロＲＮＡの単離に使用することができる。
【００３２】
唾液は、喀出、スワブによる口の拭き取り、受動的なよだれ排出、または当該技術分野において知られる他の方法によって採取され得る。いくつかの実施形態では、唾液は、唾液腺から回収され得る。
【００３３】
いくつかの実施形態では、唾液サンプルは、例えば遠心分離またはろ過によって、さらに精製され得る。例えば、唾液サンプルは、０．２２ミクロン孔径または０．４５ミクロン孔径（これらに加えて、間に介在するすべての膜孔径サイズ）の膜を介してろ過され得、分離成分がマイクロＲＮＡの回収に使用される。
【００３４】
他の実施形態では、マイクロＲＮＡを分解するタンパク質または酵素が、唾液サンプルから除去、唾液サンプルにおいて不活化、または唾液サンプルにおいて中和され得る。
【００３５】
マイクロＲＮＡまたはｍｉＲＮＡは、約２２のヌクレオチドを含む非コードＲＮＡ小分子（植物、動物、及びいくつかのウイルスにおいて見られる）であり、この非コードＲＮＡ小分子は、ＲＮＡサイレンシング及び遺伝子発現の転写後制御において機能を果たす（Ａｍｂｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４を参照のこと）。マイクロＲＮＡは、ＣＬＯＣＫ、ＢＭＡＬ１、及び他の概日遺伝子を含めて、ヒト遺伝子の大部分の発現に影響を与える。ｍｉＲＮＡが、それを生成する細胞によって放出され、他の組織及び細胞とｍｉＲＮＡが相互作用する場所であるすべての細胞外液に含まれて全身を循環することは注目すべきことである。ヒトｍｉＲＮＡは、腸マイクロバイオームと呼ばれる下部胃腸管常在細菌細胞集団とさえ相互作用することが最近の証拠によって示されている。さらに、最近では、腸マイクロバイオームの概日変化が確立されている。
【００３６】
ｍｉＲＮＡの標準命名法では、「ｍｉＲ」という接頭辞が、その後にダッシュ及び番号を付けて使用されており、番号は、命名の順序を示すことが多い。例えば、ｍｉＲ−１２０と命名され、ｍｉＲ−１２０は、ｍｉＲ−２４１よりも前に発見された可能性がある。大文字の「ｍｉＲ−」は、ｍｉＲＮＡの成熟形態を指し、小文字の「ｍｉｒ−」は、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ及びｐｒｉ−ｍｉＲＮＡを指し、「ＭＩＲ」は、それをコードする遺伝子を指す。ヒトに由来するｍｉＲＮＡのいくつかは、「ｈｓａ−」という接頭辞で示される。
【００３７】
ｍｉＲＮＡ要素．
エクソソームならびに他の微小胞及び親油性担体を介するｍｉＲＮＡの細胞外輸送は、細胞が近位及び遠位の細胞の遺伝子発現を変えるための、確立されたエピジェネティック機構である。こうした微小胞及び担体は、それが細胞に結合及び侵入し得る場所である細胞外空間へと押し出され、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を遮断する（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。さらに、こうした微小胞及び担体は、さまざまな体液（血液及び唾液など）に存在するため（Ｇａｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、単に唾液を採取することによって、中枢神経系（ＣＮＳ）を起源とし得るエピジェネティック材料を測定することが可能となる。実際、唾液において検出されるｍｉＲＮＡの多くが、舌及び唾液腺を神経支配する感覚神経求心性終末及び運動神経遠心性終末を介して口腔に分泌され、それによって、ＡＳＤ個体のＣＮＳにおいて制御不全にあり得るｍｉＲＮＡをアッセイするための比較的直接的なウィンドウが得られると本発明者らは考えている。エピジェネティックデータには、ｍｉＲＮＡに関するデータが含まれる。
【００３８】
マイクロバイオーム要素．
ＡＳＤでは腸−脳軸が役割を担うという証拠が蓄積してきており、マイクロバイオームプロファイルの異常が中枢作用性の神経ペプチドの変動を促進し、自閉症行動を誘導するということさえ示唆されている（Ｍｕｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００３９】
こうした研究及び詳細な予備データに基づいて、本発明者らは、口腔マイクロバイオームの構成要素がＡＳＤの診断及び／または特定の行動症状と相関し得るという仮説を立てた。本発明者らの唾液ＲＮＡ診断技術を使用するとマイクロバイオームを同時に検出できることから、本発明者らは、マイクロバイオームの構成要素を含めることがＡＳＤの診断精度の改善に繋がり得るかどうかを評価した。マイクロトランスクリプトームのｍｉＲＮＡ要素とマイクロバイオーム要素とを一緒に監視するためのこの能力は、ｍｉＲＮＡのレベルが宿主マイクロバイオームと協奏的に強く変動し得るという最近のデータ（Ｄａｌｍａｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を踏まえると、重要性が増すものである。さらに、マウスにおいて腸マイクロバイオームが変化すると、脳ｍｉＲＮＡの発現が影響を受け、同時に不安症状も発症し得ることが他の最近の研究によって明らかとなっている。したがって、宿主ｍｉＲＮＡ要素とＧＩマイクロバイオーム要素とが相互作用し、それらが脳及び行動に複合的に作用することは、本発明者らの今回のバイオマーカー発見経路の重要な要素を構成するものである。
【００４０】
唾液のｍｉＲＮＡ要素及びマイクロバイオーム要素の発現は、ＴＤ対照及び非ＡＳＤ発達遅延（ＤＤ）小児と比較するとＡＳＤ小児では異なる。唾液における発現が異なるｍｉＲＮＡは、発達中の脳において発現するものであり（Ｚｉａｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、神経発達と機能的に関連する（Ｍｕｎｄａｌｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。本発明者らが探求した問題は以下の２つである：（１）同定されたバイオマーカーパネルが、ＡＳＤのための有用な分子診断ツールとなる上で十分な感度及び特異度を有するかどうかということ、ならびに（２）最初のＡＳＤ診断の時点でｍｉＲＮＡ及びマイクロバイオームのプロファイルがどのような外観を有するかということに加えて、ＡＳＤ小児を定型発達パターン小児と区別するために当該プロファイルを使用できるのか？ということ。本発明者らは、自身の唾液採取手法を洗練し、ＲＮＡ処理のためのソフトウェア／統計パイプラインを改善した。結果として、単一のサンプル中のヒトＲＮＡと非ヒトＲＮＡとの両方を測定することが可能になった。この手法によって、訓練セットでは８３．５％の精度、サイズが同一のナイーブなホールドアウト検証セットでは８３．４％の精度で９２人のＡＳＤ小児を５４人の定型発達小児（年齢２〜６歳）と頑健に区別する、１０のｍｉＲＮＡ及び３つの微生物種を含む１６の比のパネルを本発明者らは定義することができた。第２の解析では、本発明者らが、幾分か異なる分子マーカーセットを使用して、ＡＳＤ小児をＤＤ小児と正確に区別し、同等の感度及び特異度を達成できることが実証された。本発明者らによって開示される方法は、適切な重み付け係数を組み合わせるか、または比として使用することでＡＳＤとの関連性の予測を与えることができるセットｍｉＲＮＡ及び微生物分類群のセットを選択することも含む。
【００４１】
性別及びいくつかの他の生物学的関連因子は、本発明者らの診断ツールの有用性に対する結果の潜在的な改変因子であると考えられる。一例として、ＡＳＤの発症率は、女性と比較して男性の方が約５倍高いことが知られている。このような状況ではあるが、本発明者らが開発した分子診断ツールはいずれも、男性に対しても女性に対しても同等の精度を有することが絶対的に不可欠である。幅広い臨床的変数、生物学的変数、及び神経心理学的変数が、すべての対象のそれぞれの部位で収集され、すべての統計モデルにおいて具体的に調べられる。そのような変数には、年齢、性別、民族性、妊娠期間、出生時体重、周産期合併症、現在の体重、体型指数、現在の中咽頭状態（アレルギー性鼻炎、副鼻腔感染症、感冒／インフルエンザ、発熱、齲蝕）、睡眠障害、胃腸異常、食事、現在の投薬、慢性医学的問題、免疫状態、医学的アレルギー、食事制限、早期介入サービス、聴覚障害、視覚障害、手術歴、及び家族の精神疾患歴が含まれる。自閉症症候学（ＡＤＯＳ−２）、適応行動（Ｖｉｎｅｌａｎｄ−ＩＩＩ）、ならびに全般的な認知発達及び運動発達（Ｍｕｌｌｅｎ  Ｓｃａｌｅｓ  ｏｆ  Ｅａｒｌｙ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ）の標準化された、年齢に適した検証済尺度を使用して小児の厳密な神経心理学的評価も実施される。多くの小児が、記録に残るＭ−ＣＨＡＴ−Ｒ結果も有し得る。こうしたもののすべてと本発明者らの分子的研究の結果とが偏りのない様式で直接的に比較されることで、任意の交互作用効果の具体的な大きさが決定されるか、または目的のものとなり得る、データにおける関連性の存在が試験される。本発明者らは、患者データのセットまたは群をアルゴリズムへの入力にも使用した。
【００４２】
唾液などの生物学的サンプルからのｍｉＲＮＡの単離及びその分析は、当該技術分野において知られる方法によって実施することができ、こうした方法には、Ｙｏｓｈｉｚａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓａｌｉｖａｒｙ  ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｎｄ  Ｏｒａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０１３；９３６：３１３−３２４によって説明される方法、または市販のキット（ｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ単離キットなど）を使用することによる方法が含まれる。
【００４３】
射影における変数重要度（ＶＩＰ）スコアは、ＰＬＳモデルにおいて使用される射影におけるそれぞれの変数の重要度を推定するものであり、変数を選択するために使用されることが多い。１付近または１超のＶＩＰスコアを有する変数は、所与のモデルにおいて重要であると考えることができる。
【００４４】
最近の研究において、本発明者らは、日内変動に対するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）レベルの関連性を調べた。本発明者らは、概日遺伝子を標的とするｍｉＲＮＡの一部は、それ自体が強い概日リズムを示すであろうという仮説を立てた。ｍｉＲＮＡは、すべての細胞外液に含まれて体中を循環することができるため、ヒト唾液において測定を実施した。唾液サンプルを使用したもう１つの理由は、マイクロバイオームと呼ばれる、ヒトの口に存在する微生物のレベル及び多様性に対するｍｉＲＮＡの関連性を分析することが可能になるということである。下部ＧＩ管における以前の研究では、宿主ｍｉＲＮＡと常在細菌との間に強固な関連性が存在することが示されている。さらに、腸マイクロバイオームの概日変化は確立されている。したがって、本発明者らの１つの目的は、概日変動するｍｉＲＮＡ及び微生物のサブセットは相関して変化するという証拠を得ることとした。２０１７年３月２３日出願の米国仮出願第６２／４７５，７０５号、及び２０１８年３月２０日出願のＰＣＴ／ＵＳ１８／２３３３６は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４５】
最初の試験には１１人のヒト対象ボランティアが参加し、これらのヒト対象ボランティアから１日のさまざまな時刻に唾液サンプルの提供を受け、これを連日実施した。次世代シークエンシング（ＮＧＳ）、リアルタイムＰＣＲ、またはその他の方法を使用して唾液のｍｉＲＮＡ及び微生物含量の同定及び定量化を実施した後、統計解析を行った。本発明者らは、２つの独立したサンプルセットにおいて二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を最初に使用することで、採取時刻に応じて有意に変動するが、採取日による変動はないｍｉＲＮＡ及び微生物（日変動による影響を日常的に強く受けている可能性がある）を同定した。次に、こうしたｍｉＲＮＡ及び微生物のサブセットを、第３のサンプルセットに使用することで、多変量回帰を使用して採取時刻を予測した。結果から、確実に定量化された約４００のｍｉＲＮＡ及び２０００の微生物をヒト唾液が含むことが示された。これらの中で、１９の異なるｍｉＲＮＡ及び多くの微生物については、採取時刻に応じて強力かつ予測可能な変化が生じていることが明らかとなった。最初の２つのサンプルセットにおけるｍｉＲＮＡデータからモデルを開発し、このモデルによって、第３のサンプルセットの採取時刻を１５％以内の誤差範囲で予測することが可能であった。微生物データもまた、最初の２つのサンプルセットの採取時刻との強い相関を示したが、この微生物データは、第３のサンプルセットの採取時刻を予測するほどの精度を有さなかった。こうしたｍｉＲＮＡ及び微生物のいくつかの間にも高度に有意な相関が観測された。興味深いことに、時刻予測に最良のｍｉＲＮＡを生物情報学的に解析したところ、そのほとんどが、脳及び免疫機能に関与する遺伝子に加えて、少なくとも１つまたは複数の概日遺伝子を標的とするものであることが示された。まとめると、本発明者らのデータは、これまで知られていなかった、唾液のｍｉＲＮＡと微生物含量と間の関連性、ならびにｍｉＲＮＡ（及び／または微生物）自体に対する時間的影響（すなわち、時間的変動）を示唆するものである。時間的変動が生じるエピジェネティックデータ（シークエンシングデータまたは他のデータ）を正規化するための、本明細書に記載のシステム及び方法は、こうしたデータに時間的変動が影響し得る場合、任意の適切な用途において使用され得る。１つの例では、本明細書に記載のシステム及び方法は、医学的状態の発症及び／または医学的状態の変化を検出するための用途、より具体的には、神経学的障害（自閉症、睡眠障害、及び外傷性脳損傷（ＴＢＩ）など）の発症及び／または変化を検出するための用途において使用され得る。本発明者らの目的は、ＡＳＤ小児を定型発達（ＴＤ）同等小児及び非自閉症発達遅延（ＤＤ）同等小児と区別する上での唾液マイクロＲＮＡの有用性を調べることとした。別の目的は、ＡＳＤ表現型の中でマイクロＲＮＡパターンを探索することとした。本発明者らの別の目的は、ＡＳＤ小児を定型発達（ＴＤ）同等小児及び非自閉症発達遅延（ＤＤ）同等小児と区別する上での口腔マイクロバイオームの有用性を調べることとした。本発明者らの別の目的は、ＡＳＤのための迅速、正確、かつ客観的なスクリーニングツールとしてのｍｉＲＮＡとマイクロバイオームとの間の関連性の強度を調べることとした。１つの実施形態では、エピジェネティック配列データを正規化することで時間的変動が考慮される。
【００４６】
１つの実施形態では、ｍｉＲＮＡ、マイクロバイオーム、及び患者情報に関するデータを、必要な場合は時間正規化して使用し、ＡＳＤをＴＤ及びＤＤと分けて診断、予後予測、及び／または区別するために使用した。別の実施形態では、疾患（ＡＳＤなど）及び／または関連障害の進行を評価した。別の実施形態では、スクリーニング対象者に由来するｍｉＲＮＡ及び／またはマイクロバイオームの定義されたセットを使用して、正常であることが判明している人のものと比較した。１つの実施形態では、ＲＮＡ及び分類群核酸を検出するためにＣ−ＤＮＡを使用した。別の実施形態では、ＲＮＡ及び分類群核酸を検出するためにプローブ及びマイクロアレイを使用した。ＡＳＤのスクリーニング、診断、予後予測、及び／または区別においては、さまざまな実施形態に対して時間正規化を使用した。
【００４７】
本発明のこうした目的及び実施形態ならびに他の目的及び実施形態は、好ましい実施形態の後述の詳細な説明と併せることで、単独の実施形態またはその組み合わせのいずれにおいても、より明らかとなるであろう。
【００４８】
実施形態１
自閉症スペクトラム障害（「ＡＳＤ」）もしくはＡＳＤと関連することが知られていない発達遅延（「ＤＤ」）を有すると疑われる対象、またはＡＳＤもしくは前記発達遅延の症状を示すか、もしくは示す可能性を有する対象、のエピジェネティックデータ及び／またはマイクロバイオームデータを、１人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象と比較する方法であって、それぞれの健康な対照対象が、ＡＳＤまたはＤＤを有さないことが判明しており、前記方法が、
対象から採取された生物学的サンプルにおける１つもしくは複数のマイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」）のリード数、及び／または１つもしくは複数の微生物トランスクリプトーム配列のリード数を決定すること、
前記対象のエピジェネティックデータ及び／または微生物データを正規化してサンプル間の数の変動を考慮することであって、１つまたは複数の不変ｍｉＲＮＡまたは他の不変ＲＮＡを使用して数を正規化することで、データを、その相対存在量に比例させて示す、前記考慮すること、
前記生物学的サンプルが採取された時刻を決定すること、
前記時刻を使用することによって、前記数が正規化されたｍｉＲＮＡデータ及び微生物トランスクリプトーム配列データに対して時刻正規化を適用することで、前記対象のｍｉＲＮＡ及び微生物ＲＮＡの存在量レベルを時刻に対してさらに正規化すること、ならびに
前記１つまたは複数のｍｉＲＮＡ及び／または微生物ＲＮＡの、前記数及び時刻が正規化された存在量レベルを、１人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象に由来する１つもしくは複数の対照ｍｉＲＮＡ及び／または１つもしくは複数の対照微生物ＲＮＡの、前記数及び時刻が正規化された存在量レベルと比較すること、
を含み、
前記対象のｍｉＲＮＡ及び／または微生物ＲＮＡのうちの前記１つまたは複数の前記存在量を、１人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象、あるいは１人もしくは複数人の発達遅延対照対象、または一群の発達遅延対照対象に由来する同一の１つまたは複数のｍｉＲＮＡ及び／または微生物ＲＮＡと比較したときの、前記存在量の増加または減少によって、前記対象がＡＳＤを有し得るか、またはＡＳＤ関連症状を示すか、もしくは示す可能性を有するか、あるいは前記対象がＤＤを有し得るか、またはＤＤ関連症状を示すか、もしくは示す可能性を有することが示される、前記方法。ｍｉＲＮＡまたは微生物ＲＮＡの増加または減少は、１人もしくは複数人の健康な対照対象、明らかに定型の発達を有する１人もしくは複数人の対象、１人もしくは複数人のＡＳＤ対象、または１人もしくは複数人のＤＤ対象、に由来する値と比較され得る。複数人の対象に由来する値が対照として使用されるとき、平均値が使用され得る。対照対象は、年齢、性別、もしくは遺伝的背景を対象として選択されるか、または年齢、性別、もしくは遺伝的背景が一致するようにされ得る。
実施形態１に記載の方法は、実施形態２〜３１によって記載される１つまたは複数の限定を伴って実施され得る。
【００４９】
実施形態２
自閉症スペクトラム障害（「ＡＳＤ」）を検出または診断するための方法であって、前記方法が、
（ａ）ヒト対象から採取された唾液サンプルにおける１つまたは複数のマイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」）の存在量レベルまたは濃度レベル（複数可）を決定すること、及び
（ｂ）前記１つまたは複数のｍｉＲＮＡの前記決定された存在量レベルまたは濃度レベル（複数可）を、同一の１つまたは複数のｍｉＲＮＡの正常レベル（複数可）と比較することであって、前記正常（または対照）レベルが、１人の非ＡＳＤ対象に見られるもの、２人以上の非ＡＳＤ対象に由来する平均値、またはＡＳＤの１つもしくは複数の症状が現れる前に前記対象において決定された存在量レベルもしくは濃度レベル（複数可）である、前記比較すること、及び
（ｃ）前記１つまたは複数のｍｉＲＮＡの異常レベルを有する対象を、ＡＳＤを有するか、またはＡＳＤを有するリスクがより高いとして選択すること、
を含み、
前記１つまたは複数のｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５０２、ｍｉＲ−５０２−３ｐ、ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９３−３ｐ、ｍｉＲ−４７０５−３ｐ、ｍｉＲ−４７０５−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４０−５ｐ、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３４０−３ｐ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−６６５−３ｐ、ｍｉＲ−６６５−５ｐ、ｍｉＲ３０７４、ｍｉＲ−３０７４−３ｐ、ｍｉＲ−３０７４−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍＩＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９２ａ、ｌｅｔ−７ｄ−３ｐ、ｍｉｒ−５９８、ｍｉＲ−３７４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１９７２、ｍｉＲ−６７５−３ｐ、ｍｉＲ−７７０６、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−６２０、ｍｉＲ−１２７７−５ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉｒ−９４４、及びｍｉＲ−６５５からなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される少なくとも１つである、前記方法。補完または代替の実施形態では、ｍｉＲＮＡまたは微生物ＲＮＡの増加または減少は、１人もしくは複数人の健康な対照対象、明らかに定型の発達を有する１人もしくは複数人の対象、１人もしくは複数人のＡＳＤ対象、または１人もしくは複数人のＤＤ対象、に由来する値と比較され得る。複数人の対象に由来する値が対照として使用されるとき、平均値が使用され得る。対照対象は、年齢、性別、もしくは遺伝的背景を対象として選択されるか、または年齢、性別、もしくは遺伝的背景が一致するようにされ得る。
【００５０】
実施形態３
前記ｍｉＲＮＡ存在量レベルが、ＲＮＡ存在量レベルが実質的に不変の１つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子の存在量レベルもしくは平均存在量レベルに正規化され、及び／または前記ｍｉＲＮＡレベルが、前記１つもしくは複数のｍｉＲＮＡレベルの前記存在量の日内変動もしくは概日変動を補正するために正規化されるか、食物摂取もしくは心拍数を上昇させる運動に起因する前記１つもしくは複数のｍｉＲＮＡの前記存在量の変動を補正するために正規化されるか、または年齢、性別、もしくは遺伝的背景の差異を補正するために調整される、実施形態２に記載の方法。
【００５１】
実施形態４
（ａ）１つまたは複数のｍｉＲＮＡの濃度の決定が、ＲＮＡシークエンシング（「ＲＮＡ−ｓｅｑ」）、ｑＰＣＲ、ｍｉＲＮＡアレイ、またはマルチプレックスｍｉＲＮＡプロファイリングによって実施される、実施形態２または実施形態３に記載の方法。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／ｋｉｔｓ／ｒｅｖｉｅｗ−ｏｆ−ｍｉｒｎａ−ａｓｓａｙ−ｍｅｔｈｏｄｓ−ｑｐｃｒ−ａｒｒａｙｓ−ａｎｄ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）。
【００５２】
実施形態５
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−３ｐからなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される、実施形態２、実施形態３、または実施形態４に記載の方法。
【００５３】
実施形態６
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−５０２、ｍｉＲ−５０２−３ｐ、ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９３−３ｐ、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−４７０５−３ｐ、ｍｉＲ−４７０５−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４０−５ｐ、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３４０−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−６６５−３ｐ、ｍｉＲ−６６５−５ｐ、ｍｉＲ３０７４、ｍｉＲ−３０７４−３ｐ、及びｍｉＲ−３０７４−５ｐからなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される、実施形態２、実施形態３、または実施形態４に記載の方法。
【００５４】
実施形態７
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍＩＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９２ａ、ｌｅｔ−７ｄ−３ｐ、ｍｉｒ−５９８、ｍｉＲ−３７４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１９７２、ｍｉＲ−６７５−３ｐ、ｍｉＲ−７７０６、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０ａ−５ｐ、及びｌｅｔ−７ｅ−５ｐからなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される、実施形態２、実施形態３、または実施形態４に記載の方法。
【００５５】
実施形態８
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−６２０、及びｍｉＲ−１２７７−５ｐからなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される、実施形態２、実施形態３、または実施形態４に記載の方法。
【００５６】
実施形態９
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９４４、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｍｉＲ−７７０６からなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される、実施形態２、実施形態３、または実施形態４に記載の方法。
【００５７】
実施形態１０
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−６２０、及びｍｉＲ−１２７７−５ｐからなる群から選択され、及び／またはｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−６２０、ｍｉＲ−１２７７−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ、及びｍｉＲ−１９３ａ−５ｐからなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される少なくとも１つである、実施形態２、実施形態３、または実施形態４に記載の方法。
【００５８】
実施形態１１
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９４４、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｍｉＲ−７７０６からなる群から選択され、及び／またはｍｉＲ−６５５、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９４４、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｍｉＲ−７７０６からなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される少なくとも１つである、実施形態２、実施形態３、または実施形態４に記載の方法。
【００５９】
実施形態１３
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３７４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、もしくはｍｉＲ−１９０ａ−５ｐからなる群から選択され、及び／またはｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉｒ−１９７２、及びｍｉＲ−７７０６からなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される少なくとも１つである、実施形態２、実施形態３、または実施形態４に記載の方法。
【００６０】
実施形態１３
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−６２０、及びｍｉＲ−１２７７−５ｐからなる群、及び／またはｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−６２０、ｍｉＲ−１２７７−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、及びｍｉＲ−９４４からなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される、実施形態２、実施形態３、または実施形態４に記載の方法。
【００６１】
実施形態１４
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９４４、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｍｉＲ−７７０６からなる群から選択され、及び／またはｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｍｉＲ−７７０６からなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される少なくとも１つである、実施形態２、実施形態３、または実施形態４に記載の方法。
【００６２】
実施形態１５
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−６２０、及びｍｉＲ−１２７７−５ｐからなる群から選択され、及び／またはｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−６２０、ｍｉＲ−１２７７−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、及びｍｉＲ−９４４からなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される少なくとも１つである、実施形態２、実施形態３、または実施形態４に記載の方法。
【００６３】
実施形態１６
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９４４、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｍｉＲ−７７０６からなる群から選択され、及び／またはｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｍｉＲ−７７０６からなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される少なくとも１つである、実施形態２、実施形態３、または実施形態４に記載の方法。
【００６４】
実施形態１７
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−３７４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−１９０ａ−５ｐからなる群から選択され、及び／またはｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５９８、ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−６７５−３ｐ、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、及びｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、のうちの少なくとも１つである、実施形態２、実施形態３、または実施形態４に記載の方法。
【００６５】
実施形態１８
前記唾液サンプルが、特定の時刻に前記ヒト対象から採取され、前記サンプルのｍｉＲＮＡの前記濃度レベル（複数可）が、同一の時刻にその他は同一の条件の下で採取された唾液における正常なｍｉＲＮＡ値と比較される、実施形態２〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【００６６】
実施形態１９
前記唾液サンプルが、ｍｉＲＮＡの前記正常レベル（複数可）が決定された時刻とは異なる時刻に前記ヒト対象から採取される、実施形態２〜１７のいずれか１つに記載の方法であって、前記方法が、前記唾液サンプルにおいて決定された前記ｍｉＲＮＡレベル（複数可）の前記値を調整または正規化して、ｍｉＲＮＡレベル（複数可）の日内変動または概日変動を補正することをさらに含む、前記方法。
【００６７】
実施形態２０
前記唾液サンプルが、ｍｉＲＮＡの前記正常レベル（複数可）が決定された時刻とは異なる時刻に前記ヒト対象から採取される、実施形態２〜１７のいずれか１つの実施形態に記載の方法であって、前記方法が、前記唾液サンプルにおいて決定された前記ｍｉＲＮＡレベル（複数可）の前記値を調整または正規化することで、回帰モデルもしくは他の統計解析で使用されるｍｉＲＮＡレベル（複数可）の日内変動もしくは概日変動を補正するか、または年齢、性別、もしくは遺伝的背景を補正すること、をさらに含む、前記方法。
【００６８】
実施形態２１
前記唾液サンプルが、覚醒から１時間以内、歯磨きもしくは口のすすぎの前、飲食前、及び／または心拍数を上昇させる運動の前に採取される、実施形態２〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【００６９】
実施形態２２
前記選択が、前記ｍｉＲＮＡのうちの４つ以上の異常レベルを有する対象を選択すること、及びＡＳＤの少なくとも１つの症状の可能性を有する前記異常ｍｉＲＮＡレベルのピアソン相関係数を任意選択で計算すること、を含む、実施形態２〜２１のいずれか１つに記載の方法。
【００７０】
実施形態２３
前記選択が、前記ｍｉＲＮＡのうちの１０以上の異常レベルを有する対象を選択すること、及びＡＳＤの少なくとも１つの症状の可能性を有する前記異常ｍｉＲＮＡレベルのピアソン相関係数を任意選択で計算すること、を含む、実施形態２〜２１のいずれか１つに記載の方法。
【００７１】
実施形態２４
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ａｃｅｔｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｉｆｏｒｍａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の１種ＨＭＳＣ０７３Ｄ０５、Ｒｏｔｈｉａ  ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍａｒｓｈｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌｓ属の１種ＨＭＳＣ０７３Ｄ０９、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒからなる群、または上記微生物に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、もしくは１００％の類似性もしくは同一性を有するゲノムを有する微生物、から選択される１つまたは複数の唾液微生物に由来するＲＮＡ（複数可）の存在量レベルを前記対象において決定すること、ならびに前記微生物ＲＮＡの前記存在量レベル（複数可）を、同一の１つまたは複数の微生物ＲＮＡの正常レベル（複数可）と比較することであって、前記正常（または対照）存在量レベルが、１人の非ＡＳＤ対象に見られるもの、２人以上の非ＡＳＤ対象に由来する平均値、または異常な日内リズムもしくは概日リズムと関連する状態、障害、もしくは疾患の１つもしくは複数の症状が現れる前に前記対象において決定された濃度レベル（複数可）である、前記比較すること、ならびに前記１つまたは複数の微生物ＲＮＡの異常存在量を有する対象を、ＡＳＤを有するか、またはＡＳＤを有するリスクがより高いとしてさらに選択すること、をさらに含む、実施形態２〜２３のいずれか１つに記載の方法。こうした微生物についての追加情報は、ｈｔｔｐｓ：／／＿ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／またはｈｔｔｐ：／／＿ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｅｏｍｅｓ／（これらは両方共、参照によって組み込まれる）において利用することができる。
【００７２】
参照ポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７．５％、少なくとも９０％、少なくとも９２．５％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列の同定には、ヌクレオチド基本局所アライメント検索ツール（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（ＢＬＡＳＴｎ）が使用され得る。高度の類似性を有する配列を発見するように最適化された代表的なＢＬＡＳＴｎ設定では、１０の期待閾値、２８の文字列長、０の問い合わせ幅中最大一致数、１／−２の一致／不一致スコア、及び線形ギャップコストが使用される。低複雑度領域は、フィルタリング／マスキングされ得る。デフォルト設定は、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＲＯＧＲＡＭ＝ｂｌａｓｔｎ＆ＢＬＡＳＴ＿ＰＲＯＧＲＡＭＳ＝ｍｅｇａＢｌａｓｔ＆ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ＆ＳＨＯＷ＿ＤＥＦＡＵＬＴＳ＝ｏｎ＆ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ｂｌａｓｔｈｏｍｅ（最終アクセス２０１８年３月１９日）（参照によって組み込まれる）によって記載されており、このリンク先の内容は、参照によって組み込まれる。
【００７３】
実施形態２５
唾液のｍｉＲＮＡレベルの決定または微生物ＲＮＡ存在量レベル（複数可）の決定が、ＲＮＡシークエンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）によって実施される、実施形態２〜２４のいずれか１つに記載の方法。（ｈｔｔｐｓ：／／＿ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／ＲＮＡ−Ｓｅｑ）。
【００７４】
実施形態２６
前記シークエンシングデータ生リード数が、分位数正規化され、平均によって中心化され、それぞれの変数の標準偏差で除算され、データが正規化されることでサンプル間の数の変動が考慮され、及び／または１つまたは複数の不変ｍｉＲＮＡの存在量に対してデータが正規化されることで相対存在量レベル及び／または絶対存在量レベルが示され、任意選択で、前記正規化データが統計的にさらに解析される、実施形態２５に記載の方法。
【００７５】
実施形態２７
ｍｉＲＮＡの少なくとも１つの異常レベルを有する対象を、１つもしくは複数のｍｉＲＮＡの前記少なくとも１つの異常な唾液中レベルを低減し、及び／または１つもしくは複数の異常な微生物ＲＮＡ存在量レベルを低減するレジメンで治療することをさらに含む、実施形態２〜２６のいずれか１つに記載の方法。
【００７６】
実施形態２８
少なくとも２つの異なる時点で前記対象から唾液サンプルを採取すること、ならびに前記第２の唾液サンプルまたはその後の唾液サンプルが、正常に近づいたｍｉＲＮＡレベル（複数可）及び／または微生物ＲＮＡ存在量レベルを有するときに治療レジメンの効力を決定すること、をさらに含む、実施形態２７に記載の方法。
【００７７】
実施形態２９
ＡＳＤを有するか、またはＡＳＤを有するリスクがより高いとして選択された対象を、１つもしくは複数のｍｉＲＮＡの少なくとも１つの異常な唾液中存在量、または１つもしくは複数の微生物ＲＮＡ存在量レベルを低減するレジメンで治療することをさらに含み、前記レジメンが、外科的治療、薬物治療、ｍｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡアンタゴニストによる治療、抗微生物治療、食事療法もしくは栄養療法、理学療法、光線療法、心理療法、行動療法、または代替医学療法のうちの１つまたは複数を実施することを含む、実施形態２〜２６のいずれか１つに記載の方法。
【００７８】
実施形態３０
ｍｉＲＮＡ及び／または微生物ＲＮＡを検出するためのｍｉＲＮＡアッセイキットであって、前記ｍｉＲＮＡアッセイキットが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５０２、ｍｉＲ−５０２−３ｐ、ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９３−３ｐ、ｍｉＲ−４７０５−３ｐ、ｍｉＲ−４７０５−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４０−５ｐ、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３４０−３ｐ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−６６５−３ｐ、ｍｉＲ−６６５−５ｐ、ｍｉＲ３０７４、ｍｉＲ−３０７４−３ｐ、ｍｉＲ−３０７４−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍＩＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９２ａ、ｌｅｔ−７ｄ−３ｐ、ｍｉｒ−５９８、ｍｉＲ−３７４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１９７２、ｍｉＲ−６７５−３ｐ、ｍｉＲ−７７０６、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−６２０、ｍｉＲ−１２７７−５ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉｒ−９４４、及びｍｉＲ−６５５からなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡに相補的であるか、あるいはその他の様式で前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡの増幅及び／または検出に適した１つ、２つ、または３つ以上のプローブまたはプライマーと、任意選択で、１つまたは複数のサンプル採取ツール、１つまたは複数のサンプル採取容器、前記ｍｉＲＮＡ及び／または微生物ＲＮＡを増幅及び／または検出及び／または定量化するための１つまたは複数の試薬、１つまたは複数の正または負の対照、１つまたは複数の反応基質または反応プラットフォーム、包装材料（複数可）、及び／または使用説明物と、を含む、前記ｍｉＲＮＡアッセイキット。
【００７９】
実施形態３１
ＡＳＤの少なくとも１つの症状と相関する少なくとも１つのｍｉＲＮＡの濃度を同定するための方法であって、前記方法が、
（ａ）１人または複数人の対象から唾液サンプルを採取すること、
（ｂ）前記サンプルにおけるｍｉＲＮＡをシークエンシングすること、
（ｃ）ｍｉＲＮＡ当たりのシークエンシングリードを数えることによって、存在量の異なるｍｉＲＮＡを同定し、配列リードデータを正規化し、正規化された配列リード数を、異なる時点で採取された唾液サンプル間で比較すること、
（ｄ）ハウスキーピング遺伝子もしくはハウスキーピングｍｉＲＮＡ（存在量が不変）のＲＮＡ発現、または２つ以上のハウスキーピング遺伝子に由来する平均化ＲＮＡ存在量に対して配列リードデータを正規化すること、
（ｅ）得られたデータのピアソン相関係数を計算し、１つまたは複数のｍｉＲＮＡの濃度レベル、及び唾液に見られる微生物に由来する１つまたは複数のＲＮＡ存在量レベル、及びＡＤＳの少なくとも１つの症状、を説明すること、
（ｆ）ＡＳＤの少なくとも１つの症状と相関する異常な存在量レベルを有するとして１つまたは複数のｍｉＲＮＡを選択すること、ならびに
（ｇ）任意選択で、ＤＩＡＮＡ  ｍｉＲｐａｔｈまたは他のソフトウェアを使用してｍｉＲＮＡの標的遺伝子を決定すること、
を含む、前記方法。
【００８０】
本発明の他の互換、補完、または代替の実施形態には、下記のものが含まれる：
【００８１】
実施形態３２
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）もしくはＡＳＤと関連することが知られていない発達遅延（「ＤＤ」）を有すると疑われる対象、またはＡＳＤもしくは前記発達遅延の症状を示すか、もしくは示す可能性を有する対象、のエピジェネティックデータ及び／またはマイクロバイオームデータを、１人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象と比較する方法であって、前記方法が、
対象から採取された生物学的サンプルにおける１つもしくは複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のリード数、及び／または１つもしくは複数の微生物トランスクリプトーム配列のリード数を決定すること、
前記対象のエピジェネティックデータ及び／または微生物トランスクリプトーム配列データを正規化してサンプル間の数の変動を考慮することであって、１つまたは複数の不変ｍｉＲＮＡまたは他の不変ＲＮＡを使用して数を正規化することで、データを、その相対存在量に比例させて示す、前記考慮すること、
前記生物学的サンプルが採取された時刻を決定すること、
前記時刻を使用することによって、前記数が正規化されたｍｉＲＮＡ及び微生物ＲＮＡに対して時刻正規化を適用することで、前記対象のｍｉＲＮＡ及び微生物ＲＮＡの存在量レベルを時刻に対してさらに正規化すること、ならびに前記１つまたは複数のｍｉＲＮＡ及び／または微生物ＲＮＡの、前記数及び時刻が正規化された存在量レベルを、１人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象に由来する１つもしくは複数の対照ｍｉＲＮＡ及び／または１つもしくは複数の対照微生物ＲＮＡの、前記数及び時刻が正規化された存在量レベルと比較すること、を含み、前記対象のｍｉＲＮＡ及び／または微生物ＲＮＡのうちの前記１つまたは複数の前記存在量レベルを、１人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象、あるいは１人もしくは複数人の発達遅延対照対象、または一群の発達遅延対照対象に由来する同一の１つまたは複数のｍｉＲＮＡ及び／または微生物ＲＮＡと比較したときの、前記存在量レベルの増加または減少によって、前記対象がＡＳＤを有し得るか、またはＡＳＤ関連症状を示すか、もしくは示す可能性を有することが示されるか、あるいは前記対象がＤＤを有し得るか、またはＤＤ関連症状を示すか、もしくは示す可能性を有することが示される、前記方法。補完または代替の実施形態では、ｍｉＲＮＡまたは微生物ＲＮＡの増加または減少は、１人もしくは複数人の健康な対照対象、明らかに定型の発達を有する１人もしくは複数人の対象、１人もしくは複数人のＡＳＤ対象、または１人もしくは複数人のＤＤ対象、に由来する値と比較され得る。複数人の対象に由来する値が対照として使用されるとき、平均値が使用され得る。対照対象は、年齢、性別、もしくは遺伝的背景を対象として選択されるか、または年齢、性別、もしくは遺伝的背景が一致するようにされ得る。
【００８２】
実施形態３３
前記対象のｍｉＲＮＡ及び／または微生物ＲＮＡのうちの前記１つまたは複数の前記存在量レベルを、１人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象、あるいは１人もしくは複数人の発達遅延対照対象、または一群の発達遅延対照対象に由来する同一の１つまたは複数のｍｉＲＮＡ及び／または微生物ＲＮＡと比較したときの、前記存在量レベルの正または負の差異によって、前記ＡＳＤ関連症状の重症度が示される、実施形態３２に記載の方法。
【００８３】
実施形態３４
前記ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−３ｐからなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される、実施形態３２に記載の方法。
【００８４】
実施形態３５
微生物ＲＮＡによって同定される前記微生物が、分類識別子１０９５７４９  Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｂｅｔｔｙａｅ  ＣＣＵＧ２０４２、分類識別子１２３６  Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、分類識別子１２３９  Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、分類識別子１７１５０８４  Ｒｏｔｈｉａ属の１種ＨＭＳＣ０６５Ｃ０３、分類識別子１７３９２９９  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の１種ＨＭＳＣ０５６Ｃ０１、分類識別子１７３９３３６  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の１種ＨＭＳＣ０７３Ｄ０５、分類識別子１７３９４０８  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の１種ＨＭＳＣ０７２Ｇ０４、分類識別子１８６８２６  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、分類識別子５３７０１１  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｏｐｒｉ  ＤＳＭ１８２０５、分類識別子７１２  Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ、分類識別子８８９２０６  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｉｓ  ＡＴＣＣ４９１２４からなる群、及び／または上記の微生物が変異した微生物もしくは上記の微生物の機能的ホモログである微生物（上記の微生物に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、もしくは１００％の類似性もしくは同一性を有するゲノムを有する微生物など）、から選択される、実施形態３２に記載の方法。参照ポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７．５％、少なくとも９０％、少なくとも９２．５％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはゲノム配列（上記の微生物に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のゲノム同一性を有するものなど）の同定には、ＢＬＡＳＴＮが使用され得る。
【００８５】
実施形態３６
前記生物学的サンプルが、唾液、脳脊髄液、血液、血清、血漿、尿、糞便、粘膜排出物、涙、または組織である、実施形態３２に記載の方法。
【００８６】
実施形態３７
１つまたは複数のｍｉＲＮＡ及び／または微生物の前記存在量レベルが、リアルタイムＰＣＲまたは次世代シークエンシングによって決定される、実施形態３２に記載の方法。
【００８７】
実施形態３８
対象における障害状態または疾患状態の進行の監視方法であって、前記方法が、
異なる時点で同一の対象から採取された少なくとも２つの生物学的サンプルを分析することで、前記少なくとも２つの生物学的サンプルのそれぞれにおける１つまたは複数のｍｉＲＮＡ及び／または微生物の、数及び時刻が正規化された存在量レベルを決定すること、ならびに
前記１つまたは複数のｍｉＲＮＡ及び／または微生物の前記決定されたレベルを経時的に比較することで、前記１つまたは複数の特定のｍｉＲＮＡ及び／または微生物の前記対象の、数及び時刻が正規化された存在量レベルの経時的な変化を決定すること、
を含み、
前記１つまたは複数のｍｉＲＮＡ及び／または微生物の、前記数及び時刻が正規化された存在量レベルの経時的な増加または減少によって、前記対象におけるＡＳＤまたはＡＳＤ関連症状の進行が示され、及び／または
前記１つまたは複数のｍｉＲＮＡ及び／または微生物の、前記数及び時刻が正規化された存在量レベルの前記存在量レベルの経時的な正または負の差異によって、前記対象におけるＡＳＤまたはＡＳＤ関連症状の進行が示される、前記方法。
【００８８】
実施形態３９
前記ｍｉＲＮＡが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−３ｐからなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される、実施形態３８に記載の方法。
【００８９】
実施形態４０
ＲＮＡによって同定される前記微生物が、分類識別子１０９５７４９  Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｂｅｔｔｙａｅ  ＣＣＵＧ２０４２、分類識別子１２３６  Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、分類識別子１２３９  Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、分類識別子１７１５０８４  Ｒｏｔｈｉａ属の１種ＨＭＳＣ０６５Ｃ０３、分類識別子１７３９２９９  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の１種ＨＭＳＣ０５６Ｃ０１、分類識別子１７３９３３６  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の１種ＨＭＳＣ０７３Ｄ０５、分類識別子１７３９４０８  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の１種ＨＭＳＣ０７２Ｇ０４、分類識別子１８６８２６  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、分類識別子５３７０１１  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｏｐｒｉ  ＤＳＭ１８２０５、分類識別子７１２  Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ、分類識別子８８９２０６  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｉｓ  ＡＴＣＣ４９１２４からなる群、及び／または上記の微生物が変異した微生物もしくは上記の微生物の機能的ホモログである微生物、から選択される、実施形態３８に記載の方法。
【００９０】
実施形態４１
前記生物学的サンプルが、唾液、脳脊髄液、血液、血清、血漿、尿、糞便、粘膜排出物、涙、または組織である、実施形態３８に記載の方法。
【００９１】
実施形態４２
１つまたは複数のｍｉＲＮＡ及び／または微生物の前記存在量レベルが、リアルタイムＰＣＲまたは次世代シークエンシングによって決定される、実施形態３８に記載の方法。
【００９２】
実施形態４３
対象の生物学的サンプルにおけるｍｉＲＮＡ配列（複数可）の検出方法であって、前記方法が、
前記対象から生物学的サンプルを採取すること、
ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−３ｐからなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される１つまたは複数のｍｉＲＮＡ配列のそれぞれに対する二本鎖相補ＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ）を創出すること、ならびに
ｃＤＮＡの存在、絶対量、または相対量を検出することであって、ｃＤＮＡの前記存在、絶対量、または相対量によって、前記相補ｍｉＲＮＡ配列の存在、絶対量、または相対量が示される、前記検出すること、
を含む、前記方法。
【００９３】
実施形態４４
対象の生物学的サンプルにおけるｍｉＢＩＯＭＥ配列（複数可）の検出方法であって、前記方法が、
前記対象から生物学的サンプルを採取すること、
分類識別子１０９５７４９  Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｂｅｔｔｙａｅ  ＣＣＵＧ２０４２、分類識別子１２３６  Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、分類識別子１２３９  Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、分類識別子１７１５０８４  Ｒｏｔｈｉａ属の１種ＨＭＳＣ０６５Ｃ０３、分類識別子１７３９２９９  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の１種ＨＭＳＣ０５６Ｃ０１、分類識別子１７３９３３６  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の１種ＨＭＳＣ０７３Ｄ０５、分類識別子１７３９４０８  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の１種ＨＭＳＣ０７２Ｇ０４、分類識別子１８６８２６  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、分類識別子５３７０１１  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｏｐｒｉ  ＤＳＭ１８２０５、分類識別子７１２  Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ、及び分類識別子８８９２０６  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｉｓ  ＡＴＣＣ４９１２４からなる群に属する微生物から選択される１つまたは複数の微生物ＲＮＡ配列のそれぞれに対する二本鎖相補ＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ）を創出すること、ならびに
ｃＤＮＡの存在、絶対量、または相対量を検出することであって、ｃＤＮＡの前記存在、絶対量、または相対量によって、前記相補ｍｉＢＩＯＭＥ配列の存在、絶対量、または相対量が示される、前記検出すること、
を含む、前記方法。
【００９４】
実施形態４５
前記生物学的サンプルが、唾液、脳脊髄液、血液、血清、血漿、尿、糞便、粘膜排出物、涙、または組織である、実施形態４４に記載の方法。
【００９５】
実施形態４６
前記生物学的サンプルが、第１の時点で採取された第１の生物学的サンプルであり、前記ｃＤＮＡが、第１のｃＤＮＡである、実施形態４４に記載の方法であって、前記方法が、
第２の時点で第２の生物学的サンプルを前記対象から採取すること、
ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−３ｐからなる群から選択される１つまたは複数のｍｉＲＮＡ配列のそれぞれに対する第２のｃＤＮＡを創出すること、
分類識別子１０９５７４９  Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｂｅｔｔｙａｅ  ＣＣＵＧ２０４２、分類識別子１２３６  Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、分類識別子１２３９  Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、分類識別子１７１５０８４  Ｒｏｔｈｉａ属の１種ＨＭＳＣ０６５Ｃ０３、分類識別子１７３９２９９  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の１種ＨＭＳＣ０５６Ｃ０１、分類識別子１７３９３３６  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の１種ＨＭＳＣ０７３Ｄ０５、分類識別子１７３９４０８  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の１種ＨＭＳＣ０７２Ｇ０４、分類識別子１８６８２６  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、分類識別子５３７０１１  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｃｏｐｒｉ  ＤＳＭ１８２０５、分類識別子７１２  Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ、及び分類識別子８８９２０６  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｉｓ  ＡＴＣＣ４９１２４からなる群に属する微生物から選択される１つまたは複数の微生物ＲＮＡ配列のそれぞれに対する第２のｃＤＮＡを創出すること、ならびに
前記第２のｃＤＮＡの存在、絶対量、または相対量を検出することであって、前記第２の時点で得られた前記生物学的サンプルにおける前記第２のｃＤＮＡの前記存在、絶対量、または相対量によって、前記第２の時点の前記相補ｍｉＲＮＡ配列及び／または相補微生物配列の存在、絶対量、または相対量が示される、前記検出すること、ならびに
任意選択で、前記第１の時点で得られた結果を前記第２の時点で得られた結果と比較することによってＡＳＤ及び／またはＡＳＤ関連症状の進行を追跡すること、
をさらに含む、前記方法。
【００９６】
実施形態４７
対象がＡＳＤ及び／またはＡＳＤ関連症状を有するかどうかを決定するためのキットであって、前記キットが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４７０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５０２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ−３ｐからなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択されるｍｉＲＮＡのリボヌクレオチド配列に対応するリボヌクレオチド配列を有する２つ以上のｍｉＲＮＡプローブを含むプローブセットを含む、前記キット。
【００９７】
実施形態４８
前記プローブセットに結合した固体支持体をさらに含む、実施形態４７に記載のキット。
【００９８】
実施形態４９
下記のもののうちの少なくとも１つをさらに含む、実施形態４７に記載のキット：（ａ）負の対照として使用される１つの無作為に生成されたリボヌクレオチド配列、（ｂ）全ＲＮＡ分解に対する標準化対照として使用される、ハウスキーピング遺伝子に由来する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列、及び（ｃ）正の対照として使用される少なくとも１つの無作為に生成されたリボヌクレオチド配列。
【００９９】
実施形態５０
ｍｉＲＮＡの配列に対応するヌクレオチド配列を含む、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも２０のプローブを含む、マイクロアレイ。
【０１００】
実施形態５１
前記ｍｉＲＮＡのうちの少なくともいくつかが、ｍｉＲ−５０２、ｍｉＲ−５０２−３ｐ、ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９３−３ｐ、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−４７０５−３ｐ、ｍｉＲ−４７０５−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４０−５ｐ、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３４０−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−６６５−３ｐ、ｍｉＲ−６６５−５ｐ、ｍｉＲ３０７４、ｍｉＲ−３０７４−３ｐ、及びｍｉＲ−３０７４−５ｐからなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択され、支持体上に存在するものである、実施形態５０に記載のマイクロアレイ。
【０１０１】
実施形態５２
ｍｉＲ−５０２、ｍｉＲ−５０２−３ｐ、ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９３−３ｐ、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−４７０５−３ｐ、ｍｉＲ−４７０５−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４０−５ｐ、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３４０−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−６６５−３ｐ、ｍｉＲ−６６５−５ｐ、ｍｉＲ３０７４、ｍｉＲ−３０７４−３ｐ、及びｍｉＲ−３０７４−５ｐからなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択されるｍｉＲＮＡの配列に対応するヌクレオチド配列を含む少なくともプローブのセットと、
前記唾液サンプルに存在する少なくとも１つの微生物遺伝子配列を検出及び定量化することが可能なヌクレオチド配列を含む任意選択のプローブのセットであって、前記少なくとも１つの微生物配列が、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ａｃｅｔｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｉｆｏｒｍａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の１種ＨＭＳＣ０７３Ｄ０５、Ｒｏｔｈｉａ  ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍａｒｓｈｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌｓ属の１種ＨＭＳＣ０７３Ｄ０９、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒからなる群から選択される少なくとも１つの生物に由来するものである、前記任意選択のプローブのセットと、
を含む、実施形態５０または実施形態５１に記載のマイクロアレイ。
【０１０２】
実施形態５３
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）について分析される対象におけるｍｉＲＮＡ存在量プロファイルの検出方法であって、前記方法が、
前記対象から採取されたサンプル（好ましくは、前記サンプルは、唾液サンプルである）におけるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のプロファイル変化を、健康な個体または非ＡＳＤ発達遅延個体のｍｉＲＮＡプロファイルと比較して検出することを含み、前記ｍｉＲＮＡプロファイルが、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも２０のｍｉＲＮＡを含む、前記方法。
【０１０３】
実施形態５４
前記対象の唾液サンプルに存在する微生物遺伝子配列のプロファイルを検出して、健康な個体または非ＡＳＤ発達遅延個体の唾液に由来する微生物ＲＮＡのプロファイルと比較することをさらに含む、実施形態５３に記載の方法。
【０１０４】
実施形態５５
前記ｍｉＲＮＡのいくつかが、ｍｉＲ−５０２、ｍｉＲ−５０２−３ｐ、ｍｉＲ−５０２−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９３−３ｐ、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−４７０５−３ｐ、ｍｉＲ−４７０５−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４０−５ｐ、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３４０−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−６６５−３ｐ、ｍｉＲ−６６５−５ｐ、ｍｉＲ３０７４、ｍｉＲ−３０７４−３ｐ、及びｍｉＲ−３０７４−５ｐからなる群、及び／または上記のｍｉＲＮＡとシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される少なくとも１つである、実施形態５３に記載の方法。
【０１０５】
実施形態５６
ＲＮＡ配列によって同定される前記微生物が、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｔｉｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ａｃｅｔｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｉｆｏｒｍａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の１種ＨＭＳＣ０７３Ｄ０５、Ｒｏｔｈｉａ  ｄｅｎｔｏｃａｒｉｏｓａ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍａｒｓｈｉｉ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌｓ属の１種ＨＭＳＣ０７３Ｄ０９、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ、及びＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒからなる微生物の群から選択される少なくとも２つを含む、実施形態５４に記載の方法。
【０１０６】
実施形態５７
対象における自閉症スペクトラム障害の治療方法であって、前記方法が、行動療法、コミュニケーション療法、食事療法、投薬療法、及び代替医学療法のうちの１つまたは複数で前記対象を治療することを含み、前記対象が、請求項５３〜５６のいずれか１項に記載の方法によって前記自閉症スペクトラム障害の治療が必要であると同定される、前記方法。
【０１０７】
実施形態５８
前記自閉症スペクトラム障害が、精神障害の診断及び統計マニュアル第５版（ＤＳＭ−５，２０１３）において分類される社会的コミュニケーションの欠如、社会的相互作用の欠如、常同的行動パターンのうちの少なくとも１つを含む、実施形態５７に記載の方法。
【０１０８】
実施形態５９
自閉症スペクトラム障害と相関する、唾液サンプルに存在する少なくとも１つの微生物遺伝子配列を検出及び定量化することが可能なヌクレオチド配列を含むプローブのセットを含む、マイクロアレイ。
【０１０９】
実施形態６０
自閉症スペクトラム障害と相関するｍｉＲＮＡの配列に対応するヌクレオチド配列を含む、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも２０のプローブのセットをさらに含む、実施形態５９に記載のマイクロアレイ。
【０１１０】
実施形態６１
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）について分析される対象におけるｍｉＲＮＡ存在量プロファイルの検出方法であって、前記方法が、前記対象の唾液サンプルに存在する微生物遺伝子配列のプロファイルを検出して、健康な個体または非ＡＳＤ発達遅延個体の唾液に由来するｍＢＩＯＭＥのプロファイルと比較することを含む、前記方法。
【０１１１】
実施形態６２
ＡＳＤを検出または診断するための方法であって、前記方法が、
対象の唾液における１つまたは複数のＡＳＤ関連ｍｉＲＮＡを検出すること、
非ＡＳＤ対象のものを有意に下回る量または有意に上回る量で前記ｍｉＲＮＡが存在するときにＡＳＤを検出または診断すること、及び
任意選択で前記対象のＡＳＤを治療すること、
を含む。
【０１１２】
実施形態６３
検出または診断が、口腔−運動処理及び／または口腔−感覚処理に関する障害と関連する１つまたは複数のマイクロＲＮＡの異常レベルを検出することが含む、実施形態６２に記載の方法。
【０１１３】
実施形態６４
前記口腔−運動処理が、発語失行であり、及び／または前記口腔−感覚処理が、食品テクスチャ感度である、実施形態６３に記載の方法。
【０１１４】
実施形態６５
検出または診断が、軸索ガイダンス、神経栄養シグナル伝達、ＧＡＢＡ作動性シナプス、またはニコチン中毒、に関する障害と関連する１つまたは複数のマイクロＲＮＡの異常レベルを検出することを含む、実施形態６２に記載の方法。
【０１１５】
実施形態６６
検出または診断が、社会的情緒に関する障害または限定的／常同的行動と関連する１つまたは複数のマイクロＲＮＡの異常レベルを検出することを含む、実施形態６２に記載の方法。
【０１１６】
実施形態６７
前記１つまたは複数のマイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍＩＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９２ａ、ｌｅｔ−７ｄ−３ｐ、ｍｉｒ−５９８、ｍｉＲ−３７４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３７４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１９７２、ｍｉＲ−６７５−３ｐ、ｍｉＲ−７７０６、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９０ａ−５ｐ、及びｌｅｔ−７ｅ−５ｐからなる群から選択される少なくとも１つを含む、実施形態６２に記載の方法。
【０１１７】
実施形態６８
ＴＤ対象またはＤＤ対象におけるマイクロＲＮＡレベルと比較したときの、１つまたは複数のマイクロＲＮＡのレベル増加がＡＳＤと関連し、ＴＤ対象またはＤＤ対象におけるマイクロＲＮＡレベルと比較したときの、１つまたは複数のマイクロＲＮＡのレベル増加がＡＳＤと関連し、ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−６２０、及びｍｉＲ−１２７７−５ｐからなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの前記レベル増加が検出される、実施形態６２に記載の方法。
【０１１８】
実施形態６９
ＴＤ対象またはＤＤ対象におけるマイクロＲＮＡレベルと比較したときの、１つまたは複数のマイクロＲＮＡのレベル減少がＡＳＤと関連する、実施形態６２に記載の方法。
【０１１９】
実施形態７０
正常な対象におけるマイクロＲＮＡレベルと比較したときの、１つまたは複数のマイクロＲＮＡのレベル減少がＡＳＤと関連し、ＴＤ対象またはＤＤ対象におけるマイクロＲＮＡレベルと比較したときの、１つまたは複数のマイクロＲＮＡのレベル減少がＡＳＤと関連し、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９４４、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｍｉＲ−７７０６からなる群から選択される少なくとも１つのマイクロＲＮＡの前記レベル減少が検出される、実施形態６２に記載の方法。
【０１２０】
実施形態７１
少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、非ＡＳＤ対象のものを超える量で存在するｍｉＲＮＡからなる群から選択され、少なくとも１つのｍｉＲＮＡが、非ＡＳＤ対象のものを下回る量で存在するｍｉＲＮＡからなる群から選択されるときにＡＳＤを検出または診断することを含む、実施形態６２に記載の方法。
【０１２１】
実施形態７２
非ＡＳＤ対象のものを下回る量で存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡの正規化値に対する、非ＡＳＤ対象におけるものを超える量で存在する少なくとも１つのｍｉＲＮＡの正規化値の比が、少なくとも０．１、少なくとも０．２、少なくとも０．５、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９から１０までの範囲（すべての介在値及び中間値を含む）であるときにＡＳＤを検出または診断することを含み、前記比が、非ＡＳＤ対象におけるｍｉＲＮＡの量でｍｉＲＮＡの量を除算することによって決定される正規化値に基づく、実施形態６２に記載の方法。
【０１２２】
実施形態７３
ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−６２０、及びｍｉＲ−１２７７−５ｐからなる群から選択される前記ｍｉＲＮＡのうちの１つもしくは複数の増加、及び／またはｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−６２０、ｍｉＲ−１２７７−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ、及びｍｉＲ−１９３ａ−５ｐからなる群から選択される前記マイクロＲＮＡのうちの１つもしくは複数の減少、を検出することによって、ＡＳＤをＤＤと区別して検出または診断することをさらに含む、実施形態６２に記載の方法。
【０１２３】
実施形態７４
ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９４４、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｍｉＲ−７７０６からなる群から選択される前記ｍｉＲＮＡのうちの１つもしくは複数の減少、及び／またはｍｉＲ−６５５、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９４４、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｍｉＲ−７７０６からなる群から選択される前記ｍｉＲＮＡのうちの１つもしくは複数の増加、を検出することによって、ＡＳＤをＤＤと区別して検出または診断することをさらに含む、実施形態６２に記載の方法。
【０１２４】
実施形態７５
ｍｉｒ−３７４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、またはｍｉＲ−１９０ａ−５ｐのうちの少なくとも１つと、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉｒ−１９７２、またはｍｉＲ−７７０６のうちの少なくとも１つと、を検出することによって、ＡＳＤをＤＤと区別して検出または診断することをさらに含む、実施形態６２に記載の方法。
【０１２５】
実施形態７６
ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−６２０、及びｍｉＲ−１２７７−５ｐからなる群から選択される前記マイクロＲＮＡのうちの１つもしくは複数の増加、及び／またはｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−６２０、ｍｉＲ−１２７７−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、及びｍｉＲ−９４４からなる群から選択される前記マイクロＲＮＡのうちの１つもしくは複数の減少、を検出することによって、ＡＳＤをＴＤと区別して検出または診断することをさらに含む、実施形態６２に記載の方法。
【０１２６】
実施形態７７
ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９４４、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｍｉＲ−７７０６からなる群から選択される前記ｍｉＲＮＡのうちの１つもしくは複数の減少、及び／またはｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｍｉＲ−７７０６からなる群から選択される前記ｍｉＲＮＡのうちの１つもしくは複数の増加、を検出することによって、ＡＳＤをＴＤと区別して検出または診断することをさらに含む、実施形態６２に記載の方法。
【０１２７】
実施形態７８
ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−６２０、及びｍｉＲ−１２７７−５ｐからなる群から選択される前記ｍｉＲＮＡのうちの１つもしくは複数の増加、及び／またはｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−６２０、ｍｉＲ−１２７７−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、及びｍｉＲ−９４４からなる群から選択される前記ｍｉＲＮＡのうちの１つもしくは複数の減少、を検出することによって、ＡＳＤをＴＤと区別して検出または診断することをさらに含む、実施形態６２に記載の方法。
【０１２８】
実施形態７９
ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９４４、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｍｉＲ−７７０６からなる群から選択される前記ｍｉＲＮＡのうちの１つもしくは複数の減少、及び／またはｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｍｉＲ−７７０６からなる群から選択される前記ｍｉＲＮＡのうちの１つもしくは複数の増加、を検出することによって、ＡＳＤをＴＤと区別して検出または診断することをさらに含む、実施形態６２に記載の方法。
【０１２９】
実施形態８０
ｍｉＲ−３７４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、及びｍｉＲ−１９０ａ−５ｐのうちの少なくとも１つと、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−５９８、ｍｉｒ３７４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−６７５−３ｐ、ｍｉｒ−５００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３７４ａ−５ｐ、及びｌｅｔ−７ｅ−５ｐのうちの少なくとも１つと、を検出することによって、ＡＳＤを区別して検出または診断し、ＴＤを除外することをさらに含む、実施形態６２に記載の方法。
【０１３０】
実施形態８１
前記唾液が、スワブで採取される、実施形態６２に記載の方法。
【０１３１】
実施形態８２
前記対象が、少なくとも、生後０ヶ月、生後１ヶ月、生後２ヶ月、生後３ヶ月、生後４ヶ月、生後５ヶ月、生後６ヶ月、生後７ヶ月、生後８ヶ月、生後９ヶ月、生後１０ヶ月、生後１１ヶ月、もしくは生後１２ヶ月、または１歳、２歳、３歳、４歳、５歳、６歳、７歳、８歳、９歳、１０歳、１１歳、１２歳、１３歳、１４歳、１５歳、１６歳、１７歳、１８歳、１９歳、２０歳、２１歳、２２歳、２３歳、２４歳、もしくは２５歳である、実施形態６２に記載の方法。
【０１３２】
実施形態８３
非ＡＳＤ対象においてＤＤをＴＤと区別して検出または診断するための方法であって、前記方法が、
ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ及びｍｉＲ５８４−５ｐからなる群から選択されるｍｉＲＮＡのうちの１つもしくは複数の量の減少、及び／またはｌｅｔ−７ａ−５ｐ及びｍｉＲ−９４４の量の増加、を検出し、それによってＤＤ対象を検出すること、ならびに任意選択で前記ＤＤ対象を治療すること、あるいは
ｍｉＲ−６６５、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、及びｍｉＲ−９４４からなる群から選択されるｍｉＲＮＡのうちの１つもしくは複数の量の減少、及び／またはｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ及びｍｉＲ−１９３ａ−５ｐの量の増加、を検出し、それによってＴＤ対象を検出すること、ならびに任意選択で前記対象をＤＤ治療から外すこと、
を含む、前記方法。
【０１３３】
実施形態８４
ＡＳＤ、ＤＤ、またはＴＤと関連するマイクロＲＮＡを検出する２つ以上のプローブを含む、組成物。
【０１３４】
実施形態８５
唾液におけるｍｉＲＮＡを検出するためのキットであって、前記キットが、ｍｉＲＮＡを認識する１つ、２つ、または３つ以上のプローブと、任意選択の賦形剤、緩衝剤、プラットフォーム、容器、指示薬、包装材料、または使用説明物と、を含む、前記キット。
【０１３５】
実施形態８６
対象における脳発達、脳修復、または脳再生を監視するための方法であって、前記方法が、
前記対象の唾液における、脳発達、脳修復、または脳再生と関連する１つまたは複数のｍｉＲＮＡを検出すること、ならびに
脳発達、脳修復、または脳再生の状態下にない対照対象のものを有意に下回る量または有意に上回る量で前記ｍｉＲＮＡが存在するときに脳発達、脳修復、または脳再生の予後予測を行うこと、及び任意選択で、治療の開始、継続、変更、または中止の選択を行うこと、
を含む、前記方法。
【０１３６】
実施形態８７
予後予測が、所望の脳発達、脳修復、または脳再生と関連する１つまたは複数のｍｉＲＮＡの異常レベルを検出することを含む、実施形態８６に記載の方法。
【０１３７】
実施形態８８
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）存在量の時間的変動を考慮するためにエピジェネティック配列データを正規化する方法であって、前記方法が、
対象から採取された生物学的サンプルにおける１つまたは複数のｍｉＲＮＡのリード数を決定すること、
前記対象のエピジェネティックデータを正規化してサンプル間のリード数の変動を考慮することであって、前記リード数正規化において１つまたは複数の不変ｍｉＲＮＡが使用される、前記考慮すること、
前記生物学的サンプルが採取された時刻を決定すること、及び
前記リード数正規化ｍｉＲＮＡにアルゴリズムを適用することであって、前記アルゴリズムにおいて前記時刻が使用されることで前記対象のｍｉＲＮＡ存在量レベルが時刻に対して正規化される、前記適用すること、
を含む、前記方法。
【０１３８】
実施形態８９
障害または疾患が疑われる対象のエピジェネティックシークエンシングデータを、１人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象と比較する方法であって、それぞれの健康な対照対象が、ＡＳＤを有さないことが判明しており、前記方法が、
前記対象のエピジェネティック配列データを正規化してリード数の変動を考慮すること、
前記エピジェネティック配列データをさらに正規化して存在量の時間的変動を考慮すること、
前記対象のｍｉＲＮＡのうちの前記１つまたは複数の、前記リード数及び時刻が正規化された存在量レベルを、１人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象に由来する同一の１つまたは複数のｍｉＲＮＡのリード数及び時刻が正規化された存在量レベルと比較すること、
を含み、
前記対象のｍｉＲＮＡのうちの前記１つまたは複数の前記存在量レベルを、１人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象に由来する同一の１つまたは複数のｍｉＲＮＡと比較したときの、前記存在量レベルの増加または減少によって、前記対象が障害状態または疾患状態を有し得ることが示される、前記方法。
【０１３９】
実施形態９０
前記ｍｉＲＮＡが、Ａ群の概日変動マイクロＲＮＡ（ｃｉｒｃａＭｉＲ）からなる群、及び／または前記Ａ群のｃｉｒｃａＭｉＲのシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される、実施形態８９に記載の方法。
【０１４０】
実施形態９１
前記ｍｉＲＮＡが、Ａ群のｃｉｒｃａＭｉＲとＢ群のｃｉｒｃａＭｉＲとの両方からなる群、及び／または前記Ａ群のｃｉｒｃａＭｉＲ及びＢ群のｃｉｒｃａＭｉＲのシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される、実施形態８９に記載の方法。
【０１４１】
実施形態９２
前記対象が、ＡＳＤ関連症状を有すると疑われる、実施形態８９に記載の方法。
【０１４２】
実施形態９３
前記生物学的サンプルが、唾液、脳脊髄液、血液、血清、血漿、尿、糞便、粘膜排出物、涙、または組織である、実施形態８９に記載の方法。
【０１４３】
実施形態９４
対象における障害状態または疾患状態の進行の監視方法であって、前記方法が、
異なる時点で前記対象から採取された少なくとも２つの生物学的サンプルを分析することで、前記少なくとも２つの生物学的サンプルのそれぞれにおける１つまたは複数の特定のｍｉＲＮＡの、リード数及び時刻が正規化された存在量レベルを決定すること、ならびに
前記１つまたは複数の特定のｍｉＲＮＡの前記決定されたレベルを経時的に比較することで、前記１つまたは複数の特定のｍｉＲＮＡの、前記対象のリード数及び時刻が正規化された存在量レベルが経時的に変化しているかどうかを決定すること、
を含み、
前記１つまたは複数の特定のｍｉＲＮＡの、前記リード数及び時刻が正規化された存在量レベルの経時的な増加または減少によって、前記対象の障害状態または疾患状態が改善または悪化していることが示される、前記方法。
【０１４４】
実施形態９５
時刻正規化に供される前記ｍｉＲＮＡが、Ａ群のｃｉｒｃａＭｉＲからなる群、及び／または前記Ａ群のｃｉｒｃａＭｉＲのシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される、実施形態９４に記載の方法。
【０１４５】
実施形態９６
時刻正規化に供される前記ｍｉＲＮＡが、Ａ群のｃｉｒｃａＭｉＲ及びＢ群のｃｉｒｃａＭｉＲからなる群、及び／または前記Ａ群のｃｉｒｃａＭｉＲ及びＢ群のｃｉｒｃａＭｉＲのシード配列を共有するｍｉＲＮＡ、から選択される、実施形態９４に記載の方法。
【０１４６】
実施形態９７
前記生物学的サンプルが、唾液、脳脊髄液、血液、血清、血漿、尿、糞便、粘膜排出物、涙、または組織である、実施形態９４に記載の方法。
【０１４７】
実施形態９８
前記対象が、ＡＳＤ関連症状を有すると疑われる、実施形態９４に記載の方法。
【０１４８】
実施形態９９
マイクロバイオーム遺伝子配列存在量の時間的変動を考慮するためにエピジェネティック配列データを正規化する方法であって、前記方法が、
対象から採取された生物学的サンプルにおける１つまたは複数の微生物遺伝子配列存在量のリード数を決定すること、
前記対象のエピジェネティック配列データを正規化してサンプル間のリード数の変動を考慮することであって、前記リード数正規化において１つまたは複数の不変ｍｉＲＮＡが使用される、前記考慮すること、
前記生物学的サンプルが採取された時刻を決定すること、及び
前記リード数正規化微生物存在量にアルゴリズムを適用することであって、前記アルゴリズムにおいて前記時刻が使用されることで前記対象微生物存在量レベルが時刻に対して正規化される、前記適用すること、
を含む、前記方法。
【０１４９】
実施形態１００
障害状態または疾患状態を有する対象のエピジェネティック配列を、１人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象と比較する方法であって、それぞれの健康な対照対象が、前記障害または疾患を有さないことが判明しており、前記方法が、
対象のエピジェネティック配列データを正規化してリード数の変動を考慮すること、
前記エピジェネティック配列データをさらに正規化して存在量の時間的変動を考慮すること、
前記対象の微生物ＲＮＡ存在量のうちの前記１つまたは複数の、リード数及び時刻が正規化された存在量レベルを、１人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象に由来する同一の１つまたは複数の微生物の、リード数及び時刻が正規化された存在量レベルと比較すること、
を含み、
前記対象の微生物ＲＮＡのうちの前記１つまたは複数の前記存在量レベルを、１人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象に由来する同一の１つまたは複数の微生物ＲＮＡと比較したときの前記存在量レベルの増加または減少によって、前記対象が前記障害状態または疾患状態を有し得ることが示される、前記方法。
【０１５０】
実施形態１０１
前記微生物ＲＮＡが、Ｃ群の微生物ＲＮＡからなる群から選択される、実施形態１００に記載の方法。
【０１５１】
実施形態１０２
前記生物学的サンプルが、唾液、脳脊髄液、血液、血清、血漿、尿、糞便、粘膜排出物、涙、または組織である、実施形態１００に記載の方法。
【０１５２】
実施形態１０３
前記対象が、ＡＳＤ関連症状を有すると疑われる、実施形態１００に記載の方法。
【０１５３】
実施形態１０４
対象における障害状態または疾患状態の進行の監視方法であって、前記方法が、
異なる時点で前記対象から採取された少なくとも２つの生物学的サンプルを分析することで、前記少なくとも２つの生物学的サンプルのそれぞれにおける１つまたは複数の特定の微生物ＲＮＡの、リード数及び時刻が正規化された存在量レベルを決定すること、ならびに
前記１つまたは複数の特定の微生物ＲＮＡの前記決定されたレベルを経時的に比較することで、前記１つまたは複数の特定のｍｉＲＮＡの、前記対象のリード数及び時刻が正規化された存在量レベルが経時的に変化しているかどうかを決定すること、
を含み、
前記１つまたは複数の特定の微生物ＲＮＡの、前記リード数及び時刻が正規化された存在量レベルの経時的な増加または減少によって、前記対象の障害状態または疾患状態が改善または悪化していることが示される、前記方法。
【０１５４】
実施形態１０５
時刻正規化に供される微生物ＲＮＡが、Ｃ群の微生物ＲＮＡからなる群から選択される、実施形態１０４に記載の方法。
【０１５５】
実施形態１０６
前記生物学的サンプルが、唾液、脳脊髄液、血液、血清、血漿、尿、糞便、粘膜排出物、涙、または組織である、実施形態１０４に記載の方法。
【０１５６】
実施形態１０７
前記対象が、ＡＳＤ関連症状を有すると疑われる、実施形態１０４に記載の方法。
【０１５７】
実施形態１０８
第１の生物学的サンプルにおけるｍｉＲＮＡ及び／または微生物ＲＮＡ配列（複数可）あるいは複数のｍｉＲＮＡ及び／または微生物ＲＮＡ配列の検出方法であって、前記方法が、
対象から生物学的サンプルを採取すること、
Ａ群のｃｉｒｃａＭｉＲ、Ｂ群のｃｉｒｃａＭｉＲ、及びＣ群の微生物ＲＮＡから選択される１つまたは複数のｍｉＲＮＡ配列または微生物ＲＮＡ配列のそれぞれに対する二本鎖相補ＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ）を創出すること、ならびに
ｃＤＮＡの存在、絶対量、または相対量を検出することであって、ｃＤＮＡの前記存在、絶対量、または相対量によって、前記相補ｍｉＲＮＡ配列または相補微生物ＲＮＡ配列の存在、絶対量、または相対量が示される、前記検出すること、
を含む、前記方法。
【０１５８】
実施形態１０９
前記第１の生物学的サンプルが、唾液、脳脊髄液、血液、血清、血漿、尿、糞便、粘膜排出物、涙、または組織である、実施形態１０８に記載の方法。
【０１５９】
実施形態１１０
第２の生物学的サンプルにおけるｍｉＲＮＡ及び／または微生物ＲＮＡ配列（複数可）の検出方法であって、前記方法が、
第２の時点で前記対象から生物学的サンプルを採取すること、
Ａ群のｃｉｒｃａＭｉＲ、Ｂ群のｃｉｒｃａＭｉＲ、及びＣ群のｍｉＢｉｏｍｅから選択される１つまたは複数のｍｉＲＮＡ配列または微生物ＲＮＡ配列のそれぞれに対する二本鎖相補ＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ）を創出すること、ならびに
ｃＤＮＡの存在、絶対量、または相対量を検出することであって、前記第２の時点で得られた前記生物学的サンプルにおけるｃＤＮＡの前記存在、絶対量、または相対量によって、前記第２の時点の前記相補ｍｉＲＮＡ配列または相補ｍｉＢｉｏｍｅ配列（複数可）の存在、絶対量、または相対量が示される、前記検出すること、ならびに
前記第１の時点で得られた前記結果を前記第２の時点で得られた前記結果と比較することによって障害または疾患の進行を追跡すること、
を含む、前記方法。
【０１６０】
実施形態１１１
第２の時点で採取される前記生物学的サンプルが、唾液、脳脊髄液、血液、血清、血漿、尿、糞便、粘膜排出物、涙、または組織である、実施形態１１０に記載の方法。
【０１６１】
実施形態１１２
前記対象が、ＡＳＤ関連症状を有すると疑われる、実施形態１１０に記載の方法。
【０１６２】
実施形態１１３
時間リズムの変化を検出するための方法であって、前記方法が、
唾液におけるｍｉＲＮＡまたは微生物ＲＮＡのレベルの、少なくとも１つの異常パターンまたはパターン変化を、１人または複数人の正常な対象に由来する対照値と比較して検出すること、ならびに
ｍｉＲＮＡまたは微生物ＲＮＡの量の、少なくとも１つの異常パターンまたはパターン変化を有する対象を選択すること、ならびに任意選択で、
時間リズム変化と関連するＡＳＤまたはＡＳＤ関連症状を有する対象を選択し、任意選択で、前記ｍｉＲＮＡまたは微生物ＲＮＡの量の、前記少なくとも１つの異常パターンまたはパターン変化を低減または再同期する治療を実施すること、
を含む、前記方法。
【０１６３】
実施形態１１４
１つまたは複数のｍｉＲＮＡの量の前記異常パターンまたはパターン変化が検出される、実施形態１１３に記載の方法。
【０１６４】
一般に、本発明は、対象のｍｉＲＮＡ及び／またはｍｉＢＩＯＭＥの存在量レベルを、１人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象に由来する同一のｍｉＲＮＡ及び／または微生物ＲＮＡと比較したときの、当該存在量レベルの正または負の差異によって、ＡＳＤ関連症状の重症度を示すことをさらに提供する。
【０１６５】
さまざまな実施形態において、リアルタイムＰＣＲ、次世代シークエンシング、または他の適用可能な方法によってｍｉＲＮＡ及び／または微生物ＲＮＡの存在量レベルが決定され得る。
【０１６６】
さまざまな実施形態において、生物学的サンプルは、唾液、脳脊髄液、血液、血清、血漿、尿、糞便、粘膜排出物、涙、及び組織のうちの１つまたは複数であり得る。生物学的サンプルは、ヒト対象のものであり得る。
【０１６７】
上記のようにｍｉＲＮＡ配列及び微生物ＲＮＡ配列を検出することは、同一の実施形態において実施され得る。
【０１６８】
１つの実施形態では、本発明者らの目的は、対象における自閉症スペクトラム障害の治療方法を提供することとし、この方法は、行動療法、コミュニケーション療法、食事療法、投薬療法、及び代替医学療法のうちの１つまたは複数で対象を治療することを含み、対象は、前述の方法によって自閉症スペクトラム障害の治療が必要であると同定される。症状例として、対象の自閉症スペクトラム障害は、限定はされないが、精神障害の診断及び統計マニュアル第５版（２０１３）において分類される社会的コミュニケーションの欠如、社会的相互作用の欠如、常同的行動パターンのうちの少なくとも１つを含み得る。
【０１６９】
別の実施形態では、ＡＳＤを検出または診断するための方法は、対象の唾液における少なくとも１つのＡＳＤ関連ｍｉＲＮＡを検出すること、非ＡＳＤ対象のものを有意に下回る量または有意に上回る量で当該ｍｉＲＮＡが存在するときにＡＳＤを検出または診断すること、及び任意選択で対象のＡＳＤを治療すること、を含む。
【０１７０】
１つの実施形態では、正常な対象におけるｍｉＲＮＡレベルと比較したときの、１つまたは複数のｍｉＲＮＡのレベルの増加または減少は、ＡＳＤと関連する。ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−６２０、及びｍｉＲ−１２７７−５ｐからなる群から選択される１つまたは複数のｍｉＲＮＡのレベルの増加が検出される。ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１９３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−５８４−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９４４、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｍｉＲ−７７０６からなる群から選択される少なくとも１つのｍｉＲＮＡのレベルの減少が検出される。
【０１７１】
別の目的は、自閉症スペクトラム障害と相関するか、または自閉症スペクトラム障害の予測が得られる、唾液サンプルに存在する少なくとも１つの微生物遺伝子配列を検出及び定量化することが可能なヌクレオチド配列を含むプローブのセットを含むマイクロアレイを提供することとした。１つの実施形態では、マイクロアレイは、自閉症スペクトラム障害と相関するｍｉＲＮＡの配列に対応するヌクレオチド配列を含む少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０のプローブのセットをさらに含む。
【０１７２】
本発明は、一般的に説明されているが、ある特定の実施例を参照することによってさらに理解を深めることができる。しかしながら、こうした実施例は、例示のみを目的として本明細書で提供されており、別段の指定がない限り、限定は意図されない。
【実施例】
【０１７３】
実施例１．
この研究の目的は、数ある中でも特に、唾液ｍｉＲＮＡの差異によってＡＳＤ小児とＮＳ小児とをどのくらい良好に区別できるかを決定すること、口腔マイクロバイオームの差異によってＡＳＤ小児とＮＳ小児とをどのくらい良好に区別できるかを決定すること、ｍｉＲＮＡとマイクロバイオームとの間の関連性の強度を定量化すること、ならびに主要な知見の機能的結果を調べること、とした。
【０１７４】
方法
対象
すべての対象について親の同意を得た。ＡＳＤの確定診断、発達遅延（ＤＤ）の診断、または定型発達（ＤＤ）の健康な対照の診断のいずれかを有する２〜６歳の小児から全部で２５８サンプルを採取した。詳細なアンケート、Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動尺度（第２版）、及び自閉症診断観察スケジュール（第２版）を使用して包括的な医学的情報及び人口統計情報を入手した。
【０１７５】
【表１】
2020512016.tif 000003
ＡＳＤ診断＝臨床的なＤＳＭ−５基準、ＡＤＯＳ
発達遅延診断＝ＩＣＤ−１０によるコード付け（ＡＳＤのＤＳＭ−５基準を満たさない）
発達状態は、Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動尺度−３で決定した。
参加時点で唾液を１回採取した。
−非絶食状態
−水道水での口腔のすすぎ
−舌下腺及び耳下腺
−採取時刻の制限なし
【０１７６】
次世代シークエンシング
唾液のｍｉＲＮＡ及びマイクロバイオーム存在量の同定及び定量化は、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＳＵＮＹ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｒｅ（ＳＵＮＹＭＡＣ）においてＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００機器での次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を使用して実施した。Ｐａｒｔｅｋ  ＦｌｏｗソフトウェアのＳｈｒｉｍｐ（登録商標）２アルゴリズムを使用してｍｉＲｂａｓｅ２１データベースに対するＮＧＳリードのアライメントを実施することで成熟ｍｉＲＮＡを同定した。Ｋ−ＳＬＡＭを使用してヒトマイクロバイオームデータベースに対するリードの追加アライメントを実施した。
【０１７７】
データ解析
この研究では、ＡＳＤ小児及び対照小児に焦点を当てた。ｍｉＲＮＡデータ及びマイクロバイオームデータを別々に正規化することで全リード数の差異を調整し、分位数正規化を行った。正規化値の球面性をスクリーニングした後、主成分分析（ＰＣＡ）を使用して統計解析を実施した。データをフィルタリングすることで、欠損が６０％を超えるものを除外し、ＰＣＡ結果に基づいて極度の異常値サンプルを除外した。ノンパラメトリックマン・ホイットニー検定を最初に使用することで、有意な診断効果を有する最も頑健なｍｉＲＮＡ及びマイクロバイオーム分類識別子をスクリーニングした。次に上位の有意なｍｉＲＮＡ及び分類識別子を診断分類モデルにおいて使用し、相関行列を得た。最も強い予測有用性を示したｍｉＲＮＡを、Ｄｉａｎａ  ＴｏｏｌｓのｍｉＲｐａｔｈ（登録商標）を使用する機能解析に供した。結果は、図１〜１７に示される。
【０１７８】
唾液のｍｉＲＮＡ変数及びマイクロバイオーム分類群変数は、ＡＳＤ小児を定型発達対照と区別する能力を示し、交差検証によるその精度は、約７５〜８０％である。最良のｍｉＲＮＡ分類器及び分類群分類器は、それらを組み合わせると、ＡＳＤ小児に対する精度が９０％を超えることを含めて、全体精度レベルが８６％を超える能力を発揮した。ｍｉＲＮＡ分類器及び分類群分類器の多くが、互いに有意な相関を示す。上位のｍｉＲＮＡ分類器は、アンフェタミン中毒、軸索ガイダンス、オキシトシンシグナル伝達を含めて、ＡＳＤにとって重要ないくつかの目的生物学的経路に多く見られるｍＲＮＡを標的とするものである。表６を参照のこと。
【０１７９】
【表２】
2020512016.tif 000004
【０１８０】
2020512016.tif 000005
【０１８１】
【表４】
2020512016.tif 000006
【０１８２】
−３ｐまたは−５ｐが付いていないｍｉＲＮＡは、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡである。リストには成熟形態も含まれる（含まれないこともあり得る）。例えば、ｍｉＲ−６６５は、ｍｉＲ−６６５−３ｐ及びｍｉＲ−６６５−５ｐとしても含まれ、ｍｉＲ−５０２−３ｐは、ｍｕＲ−５０２及びｍｉＲ−５０２−５ｐとしても含まれる。本明細書に記載されるその他のｍｉＲＮＡについても同じである。
【０１８３】
得られたデータを分位数正規化し、平均によって中心化した。
【０１８４】
【表５】
2020512016.tif 000007
【０１８５】
【表６】
2020512016.tif 000008
【０１８６】
【表７】
2020512016.tif 000009
【０１８７】
年齢及び性別を考慮するロジスティック回帰分析では、８つのｍｉＲＮＡ、１０のマイクロバイオータ、及び８６％の精度が得られた。
【０１８８】
【表８】
2020512016.tif 000010
【０１８９】
【表９】
2020512016.tif 000011
2020512016.tif 000012
2020512016.tif 000013
【０１９０】
唾液は、ｍｉＲＮＡ要素とマイクロバイオーム要素との両方を含む。そうした要素は、脳発達経路との機能的関連性を有する。唾液のマイクロバイオーム及びｍｉＲＮＡのプロファイルは、ＡＳＤ小児において変化していた。そうしたプロファイルを使用することで、ＡＳＤ小児を定型発達対照と正確に区別することができる。
【０１９１】
実施例２
ＡＳＤ対象の唾液では脳関連ｍｉＲＮＡの発現差異が検出され、この発現差異は、ＡＳＤ分類を予測するものであり、適応行動の神経発達尺度と関連し得るという仮説を立てた。こうであれば、迅速、簡単、かつ非侵襲性のＡＳＤ診断が可能になり得る。この仮説を検証するパイロット研究では、年齢及び性別を一致させた対照と比較して、ＡＳＤ患者ではｍｉＲＮＡが異なって発現することが発見された。
【０１９２】
こうしたｍｉＲＮＡが、発達中の脳において発現し、神経発達に機能的に関連することもさらに明らかとなった。
【０１９３】
ｍｉＲＮＡが唾液に存在することに加えて、唾液サンプルにおけるＲＮＡのかなりの部分が、実際のところは、ヒト起源のものではないことを本発明者らはこれまでに確かめている。追加調査の後、この知見によって、唾液ＲＮＡ  ＮＧＳデータを確実に利用することで、完全な唾液マイクロトランスクリプトーム（ｍｉＲＮＡ要素及びマイクロバイオーム要素を含む）を完全に特徴付けできると決定付けることが可能であった。こうしたｍｉＲＮＡ要素及びマイクロバイオーム要素には、宿主ｍｉＲＮＡ、ならびに常在し、転写的に活性なすべての細菌、ウイルス、真菌、古細菌、及び酵母が含まれる。さらに、ＡＳＤ小児のこうした網羅的口腔マイクロトランスクリプトームは、定型発達小児のものとは異なり、口腔のｍｉＲＮＡ要素及びマイクロバイオーム要素のいくつかは、転写物レベルで高度に頑健な相関を示すことを本発明者らは見出している。このことは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓについて図１８に示されており、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、１２０人のＡＳ対象と８５人のＴＤ対象とで有意に異なり（ｐ＝０．００２）、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐのレベルと関連（ｐ＝１．０５ｅ−４）していた。
【０１９４】
全体として、本発明者らは、１８８人のＡＳＤ小児及び１１６人の定型発達（ＴＤ）対照に由来するサンプルの確認及び分析を完了した。こうしたサンプルの半分は、診断アルゴリズムを開発するという目標の追及に使用した。したがって、ＤＳＭ５標準による臨床コンセンサスによって診断が確定した２〜６歳の９４人のＡＳＤ小児、ならびに年齢及び性別を一致させた５８人のＴＤ対照からなる対象を使用してアルゴリズムの訓練を実施した。具体的には、いずれかの第一度近親者がＡＳＤを有する小児は対照群から除外し、既知の症候性表現型（すなわち、レット症候群、結節性硬化症、アンジェルマン症候群、脆弱Ｘ、２２ｑＤＳ）を有する小児は、両方の群から除外した。健康なＴＤ対照については、事前に予定された小児科健診の時点で採取を主に実施し、ＡＳＤ小児については、Ｐｅｎｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｈｅｒｓｈｅｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  Ｃｌｉｎｉｃ、及びＳＵＮＹ  Ｕｐｓｔａｔｅ’ｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｂｅｈａｖｉｏｒ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｆａｍｉｌｙ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｌｉｎｉｃ、またはＭａｒｇａｒｅｔ  Ｌ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒへの臨床検診の時点で採取を主に実施した。サンプル採取の時点で、さまざまな医学的データ、人口統計データ、及び神経心理学的データを収集した。こうした収集データには、年齢、性別、民族性、妊娠期間、出生時体重、周産期合併症、体型指数、現在の中咽頭状態（アレルギー性鼻炎、副鼻腔感染症、感冒／インフルエンザ、発熱、齲蝕）、睡眠障害、胃腸異常、食事、現在の投薬、慢性医学的問題、免疫状態、医学的アレルギー、食事制限、早期介入サービス、聴覚障害、視覚障害、手術歴、及び家族の精神疾患歴が含まれる。
【０１９５】
水による簡単なすすぎの後に、非絶食状態においてＯＲＡｃｏｌｌｅｃｔ（登録商標）ＲＮＡ採取キット（ＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｅｋ；Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａ）を使用して唾液を採取し、Ｆ．Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ博士の指示の下でＳＵＮＹ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｒｅ（ＳＵＮＹＭＡＣ）研究室で処理するまで室温で保管した。ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＬＳを使用してＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｅｋ  ＲＮＡ精製プロトコールに従って唾液ＲＮＡを単離した後、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して２回目の精製を実施した。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用してＲＮＡサンプルの収量及びクオリティーを評価してから、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）低分子ＲＮＡサンプル調製プロトコール（Ｉｌｌｕｍｉｎａ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を用いてライブラリーを構築した。マルチプレックス化したサンプルを、サンプル当たりの標的深度を１０００万リードとしてＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００機器で分析した。脱マルチプレックス化し、フィルタリングしてＰＣＲ重複及びクオリティーが不十分なリードを除去し、さらに、インデックス配列及びアダプター配列をトリミングした後、得られたＦＡＳＴＱ（登録商標）ファイル（それぞれのサンプルにおいて見つかった配列を、それぞれの塩基についてのクオリティースコアと共に含む）のクオリティー評価指標を調べた。
【０１９６】
クオリティーが不十分なリード（平均ｑスコア＜３０）と、４つのクオリティー評価指標（リード総数、特有のリード（％）、ＧＣ含量（％）、及び平均クオリティースコア）において群平均値からのＲＮＡリード量のずれが１．５標準偏差を超えるサンプルと、を除去した後、残りのリード及びサンプルを、２つの異なる下流ワークフローに使用することで、下記のように宿主ｍｉＲＮＡ要素及びマイクロバイオーム要素をマッピングした：（１）Ｐａｒｔｅｋ  Ｆｌｏｗ環境（Ｐａｒｔｅｋ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）においてＳＨＲｉＭＰ２（登録商標）アライナーを使用してヒトゲノム参照配列のビルドｈｇ３８に対するリードの全ゲノムアライメントを実施した。次に、それぞれのサンプル中のｍｉＲＮＡ総数を、ｍｉＲＢａｓｅ２１データベースにおける成熟配列及び前駆配列に対して定量化した。（２）Ｋ−ＳＬＡＭ（登録商標）ソフトウェアパッケージのカスタム設定を使用してＮＣＢＩマイクロバイオームゲノムデータベースに対する微生物ＲＮＡアライメントを実施した。（３）ｍｉＲＮＡ要素及びマイクロバイオーム要素のフィルタリングを実施することで、サンプルの統合セットの少なくとも１０％におけるリード数が≧１０であるマッピングされた実体のみを考慮するようにした。（４）ｍｉＲＮＡデータ及びマイクロバイオームデータの分位数正規化を別々に実施した。（５）Ｐａｒｔｅｋ  Ｆｌｏｗ、ＮＣＳＳ１１、ならびにＭｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｔアプリケーション及びＭｅｔａｂｏａｎａｌｙｓｔアプリケーションにおいて開発されたＲツールを使用して、ｍｉＲＮＡデータ及びマイクロバイオームデータに対して発現差異分析及び多変量分類分析を実施することで、ＡＳＤ小児とＴＤ小児とを最良に区別するか、またはＡＳＤ小児とＤＤ小児とを最良に区別するｍｉＲＮＡ及びマイクロバイオームを同定した。上記の分析は、年齢、性別、及び他の潜在的な交絡変数の効果を調整して実施した。発現差異分析の際には、ベンジャミーニ・ホッホベルク偽発見率（ＦＤＲ）アルゴリズムを使用して多重検定のための調整を実施した。群間の発現差異が最も大きなｍｉＲＮＡを組み合わせて多変量ロジスティック回帰分類モデルに導入し、サンプルの１／２をバランスよく選んだサブサンプルを使用する訓練の中で１００分割モンテ・カルロ交差検証を実施し、５、１０、１５、２０、及び２５の異なるｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ比、ならびにマイクロバイオーム要素について作成した受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を用いてモデル全体の感度及び特異度を計算した。次に、全体としての能力が最良の特徴を両方のデータセットから同定し、結合ｍｉＲＮＡ／マイクロバイオーム分類器の構築に使用し、この分類器をホールドアウトサンプルにおいて評価した。
【０１９７】
Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ（登録商標）経路解析（ＩＰＡ）ソフトウェアのプロプライエタリコア解析ワークフローを使用してコンセンサスｍｉＲＮＡ知見の系レベルの解析を実施することで、脳特異的な経路及びネットワークを同定すると共に、特定のｍｉＲＮＡ標的の活性化または抑制を予測し、マイクロバイオームデータについては、ＰＩＣｒＵＳ（登録商標）ツール及びＫＥＧＧ（登録商標）ツールを使用した。本発明者らは、ＤＩＡＮＡ  ＴＯＯＬＳ（登録商標）スイートのｍｉｒＰａｔｈ（登録商標）バージョン３解析パッケージを使用する経路エンリッチメント解析を用いてＩＰＡ解析を補完した。
【０１９８】
厳格なＱＣフィルタリングを実施した後、本発明者らは、ＡＳＤ小児に由来する１８８サンプル、定型発達（ＴＤ）小児に由来する１１６サンプル、及び発達遅延（ＤＤ；ＩＣＤ−１０によるコード付け（ＡＳＤのＤＳＭ−５基準を満たさない）によって診断した）小児に由来する６２サンプルを得た。ロジスティック回帰を使用し、性別及び睡眠障害を調整することで、本発明者らは、１０のｍｉＲＮＡ及び３つの微生物種を含む１６の比を見出した（表１０を参照のこと）。アルゴリズムを開発及び訓練するために９２人のＡＳＤ小児及び５４人のＴＤ小児の解析を最初に実施した際には、上記の比によって８３．５％の精度でＡＳＤが予測された。同一の比及びベータ係数を使用して、９２人のＡＳＤ小児及び５４人のＴＤ小児の群（目的２）においてアルゴリズムを検証すると、精度は８３．４％となり、本質的に同一の精度が得られた（図１９を参照のこと）。
【０１９９】
【表１０】
2020512016.tif 000014
【０２００】
本発明者らは、提示の分子診断の利点は、ＡＳＤ小児をＴＤ小児と区別するだけでなく、ＡＳＤ小児をＤＤ小児とも区別する能力を有することにあると決定付けた。この目的を達成するために、本発明者らは、この課題を達成し得る個々のｍｉＲＮＡ及びマイクロバイオームバイオマーカーの最適なパネルを開発した。こうした対象を比較するロジスティック回帰分析を、年齢、ＢＭＩ、性別、睡眠障害、食物アレルギー、及びＧＩ障害の潜在的な効果を考慮しつつ使用することで、本発明者らはモデルを生成させた。このモデルの生成においては、１３のｍｉＲＮＡ、８つのマイクロバイオーム要素、及び年齢のパネルを利用し、訓練セットにおけるこのモデルの分類精度は９１％（ＡＳＤについては精度９４％、ＤＤについては精度８０．５％）であり、ＡＵＣは＞０．９２であった（図２０を参照のこと）。ホールドアウト検証サンプル（サンプル全体の１／３に相当する）では、同一のモデルによって達成された全精度は＞７５％であった（ＡＳＤについては８４％であったが、ＤＤについては約５０％にすぎなかった）。
【０２０１】
経路解析．
バイオマーカースクリーニングにおいて同定された上位のｍｉＲＮＡに対する背景を得るために、こうしたｍｉＲＮＡを、ＤＩＡＮＡ  ＴＯＯＬＳ（登録商標）ｍｉＲｐａｔｈにおける経路エンリッチメント解析に供した。この解析によって、唾液バイオマーカーｍｉＲＮＡが標的とするいくつかの脳関連ＫＥＧＧ群が明らかとなった。こうしたＫＥＧＧ経路において最も目立ったものは、神経発達群及び神経伝達の神経伝達群、ならびにオキシトシンシグナル伝達群であった。上位にランク付けされた標的遺伝子ＫＥＧＧ経路：ｃＡＭＰシグナル伝達（ｐ＝０．０００９、４８遺伝子）、アンフェタミン中毒（ｐ＝０．０００９、１７遺伝子）、ＭＡＰＫシグナル伝達（ｐ＝０．０００９、５６遺伝子）、軸索ガイダンス（ｐ＝０．００１７、３２遺伝子）、ドーパミン作動性シナプス（ｐ＝０．００２４、３２遺伝子）、オキシトシンシグナル伝達（ｐ＝０．０１７、３１遺伝子）。
【０２０２】
ｍｉＲＮＡ解析の補完として、機能的クラスタリングのいずれかの証拠について最も予測的な個々の細菌を同定するデータを調べた。ＴＤ対照と比較してＡＳＤ小児の唾液では、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ及びＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓのレベルが減少する傾向、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の種、Ｒｏｔｈｉａ属の種、及びＣａｍｐｌｙｌｏｂａｃｔｅｒ属の種が増加する傾向があることを本発明者らは突き止めた。
【０２０３】
【表１１】
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（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｏｍｅ，Ｄｅ  Ｆｉｌｉｐｐｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
こうした知見のいくつかは、ＡＳＤ対象における糞便研究から得られた結果と類似している。
【０２０４】
まとめると、唾液は、ｍｉＲＮＡ要素とマイクロバイオーム要素との両方を含んでおり、両方のプロファイルがＡＳＤ患者では変化する。さらに、こうしたプロファイルを使用することでＡＳＤ小児を正確に区別することができ、この精度は、ナイーブなホールドアウトサンプルにおいて維持される。最終的に、唾液に由来するデータは、脳関連ｍｉＲＮＡ及び標的遺伝子経路と強く関連するものであり、これらの脳関連ｍｉＲＮＡ及び標的遺伝子経路は、ＡＳＤと特に関連すると思われることに加えて、ＡＳＤ対象に由来する糞便サンプルにおいて実施された他のマイクロバイオーム研究から得られた知見とも特に関連すると思われる。
【０２０５】
実施例３
ＡＳＤ小児、ＤＤ小児、及びＴＤ小児からなる、より大きなサンプルサイズを使用し、上記のものと同様の方法を用いた実施例である。サンプルサイズを４００とした結果、３群分類検定について約９４％の検出力が得られた（図２１Ａ〜Ｂを参照のこと）。
【０２０６】
実施例４
ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＬＳを使用してＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｅｋ  ＲＮＡ精製プロトコールに従って唾液ｍｉＲＮＡの盲検サンプルを精製した後、ＲＮｅａｓｙミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して２回目の精製を実施する。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用してＲＮＡサンプルの収量及びクオリティーを評価してから、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）低分子ＲＮＡサンプル調製プロトコール（Ｉｌｌｕｍｉｎａ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてライブラリーを構築する。マルチプレックス化したサンプルを、ＳＵＮＹ  Ｕｐｓｔａｔｅにおいてサンプル当たりのリード数が３００〜５００万となるようにＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）機器で分析する。バーコードインデックスに基づいてサンプルを脱マルチプレックス化し、フィルタリングしてＰＣＲ重複及びクオリティーが不十分なリードを除去し、インデックス配列及びアダプター配列をトリミングした後、得られたＦＡＳＴＱファイル（それぞれのサンプルにおいて見つかったすべての配列を、それぞれの塩基についてのクオリティースコアと共に含む）のクオリティー評価指標を調べる。クオリティーが不十分な配列（クオリティースコア＜３０）を除去した後、残ったリードを、２つの異なる下流ワークフローにおいて使用することで、下記のように宿主ｍｉＲＮＡ及び微生物ＲＮＡをマッピングする：１）Ｐａｒｔｅｋ  Ｆｌｏｗソフトウェア（Ｐａｒｔｅｋ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）及びＳＨＲｉＭＰ２（登録商標）アライナーを使用してヒトゲノム参照配列のビルドｈｇ３８に対するリードの全ゲノムアライメントを実施する。次に、それぞれのサンプル中のｍｉＲＮＡ総数を、ｍｉｒＢＡＳＥ２１データベースにおける成熟配列及び前駆配列に対して定量化する。２）Ｋ−ＳＬＡＭソフトウェアを使用してＮＣＢＩマイクロバイオームゲノムデータベースに対する微生物ＲＮＡアライメントを実施する。
【０２０７】
実施例５
ロジスティック回帰モデルおいて、実施例４のサンプルに由来する患者データ、ｍｉＲＮＡ、及びマイクロバイオームデータの比を使用する実施例である。
【０２０８】
【表１２】
2020512016.tif 000016
2020512016.tif 000017
2020512016.tif 000018
【０２０９】
【表１３】
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2020512016.tif 000020
【０２１０】
実施例６
マイクロバイオームデータ及びｍｉＲＮＡデータを使用して非線形統計学習法（例えば、ランダムフォレスト）を利用した実施例である。
【０２１１】
【表１４】
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【０２１２】
実施例７
ロジスティック回帰分類器において、患者データ、ｍｉＲＮＡ、及び微生物データの補正（ｚ−スコア）比を使用した実施例である。
【０２１３】
【表１５】
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【０２１４】
実施例８
ｍｉＲＮＡの比及びマイクロバイオームデータの比を統計学習モデルに入力した実施例である。
【０２１５】
【表１６】
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2020512016.tif 000026
【０２１６】
【表１７】
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【０２１７】
【表１８】
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【０２１８】
実施例９
ＡＳＤにおけるＭｉＲＮＡ：１２の研究によって、発現差異を有する２１９のｍｉＲＮＡが同定されており、３４のｍｉＲＮＡ（１６％）は、複数の研究にまたがってオーバーラップしており、２７のｍｉＲＮＡは、変化の方向が同一であった。
【０２１９】
【表１９】
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自閉症では、腸マイクロバイオームが変化する（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）：
２０の自閉症と２０の対照との対比、
糞便１６Ｓ  ｒＤＮＡ、
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａは、自閉症症状と相関したが、食事とは相関しなかった。図２６Ａ〜Ｂ。
【０２２０】
実施例１０
方法
この横断的な観察症例対照研究は、Ｐｅｎｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ及びＳｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの独立した審査委員会によって承認されたものである。この試験に参加するすべての小児の親からインフォームドコンセントを書面で得た。
【０２２１】
参加者
この研究には、年齢２〜６歳の小児（ｎ＝３４６）が参加した。発達状態に基づいて参加者を３つの群（ＡＳＤ（ｎ＝１８０）、ＴＤ（ｎ＝１０６）、ＤＤ（ｎ＝６０））に分けた。ＡＳＤは、アメリカ精神医学会の診断及び統計マニュアル第５版（ＤＳＭ−５）に規定される基準を使用して臨床医のコンセンサス診断によって定義した。幼児における自閉症のための修正チェックリスト（改定版）（ＭＣＨＡＴ−Ｒ）でのＡＳＤスクリーニングの結果が陰性であり、医師による標準化された評価での定型発達マイルストーン（例えば、幼児の健康状態調査、親による発達状態の評価）を満たす小児をＴＤ参加者に含めた。定型発達のＩＣＤ−１０診断（例えば、表出性発語遅延、知的能力障害、行動懸念）を有し、臨床医による評価でＡＳＤのＤＳＭ−５基準を満たさない小児をＤＤ群に含めた。栄養管依存、活性な齲蝕、発熱、上気道感染症、または現在服薬中の経口抗生物質がある小児は、すべての群から除外した。第一度近親者がＡＳＤを有する家族歴がある小児、または日常的な小児専門医ケアを必要とする慢性の医学的状態を有する小児は、ＴＤ群から除外した。表現型の亜群解析では、注意欠陥多動性障害を有するＡＳＤ小児（ＡＤＨＤ、ｎ＝４３）、またはＧＩ障害を有するＡＳＤ小児（ｎ＝３９）を、所与の状態を有さないＡＳＤ小児と比較した。ＡＤＨＤは、親による調査によって同定し、可能なときはＩＣＤ−１０診断によって確認した。ＧＩ障害は、親による調査によって報告される便秘、逆流、慢性腹痛、食物感受性、または再発性の下痢として定義し、カルテ審査によって確認した。
【０２２２】
データ収集
すべての参加者の親に対して小児の医学的調査／人口統計調査及びＶｉｎｅｌａｎｄ適応行動尺度（ＶＡＢＳ）（第２版）を参加時点で実施した。ＡＳＤ参加者（ｎ＝１３８）及びＤＤ参加者（ｎ＝２１）のほとんどに対して自閉症診断観察スケジュール（ＡＤＯＳ）（第２版）を実施するか、または利用可能なときはカルテ審査によって以前の評価スコアを文書化した。ＡＤＯＳの実施は、訓練された有資格の医療専門家によって実施した。収集した参加者特徴には、以下のものが含まれる：１）人口統計情報（年齢、性別、民族性、体型指数）、２）口腔因子／ＧＩ因子（採取時刻、最後の食事の時刻、最後の歯磨きの時刻、プロバイオティクスの使用、ＧＩ障害歴、医薬／食物アレルギー、食事制限）、及び３）医療歴（妊娠期間、出産経路、出生時体重、喘息状態、ワクチン接種状況）。こうした因子は、口腔マイクロバイオームのプロファイルと関連する可能性に基づいて選択した。
【０２２３】
サンプル採取及びＲＮＡ分析
参加時点でそれぞれの参加者から唾液を採取した。口腔を水ですすいだ後、最後の飲食から少なくとも１５分経過した後に、非絶食状態の口の舌下領域及び耳下腺領域から、ＯＲＡｃｏｌｌｅｃｔ（登録商標）スワブ（ＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｅｋ，Ｏｔｔａｗａ  Ｃａｎａｄａ）を使用して唾液を採取した。スワブを−２０Ｃで保管してから、Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて処理した。標準化されたＴｒｉｚｏｌ手法及びＲＮｅａｓｙミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して唾液ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの収量及びクオリティーをＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで調べてから、ライブラリーを構築し、次世代シークエンシングを用いて定量化した。マルチプレックス化したサンプルを、サンプル当たりの単一末端５０塩基リードの数を１０００万とする標的深度でＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で処理した。アダプターのトリミング及びＱＣ解析の後、ｋ−ＳＬＡＭソフトウェアを使用してＲＮＡリードをヒトマイクロバイオームデータベースにアライメントした。以前に記載したように、微生物遺伝子を網羅的かつ分類学的に分類及び同定するためにｋマー法での配列アライメントを使用した。サンプルの少なくとも２０％において生リード数が１０以上である分類群のみの存在量差異を調べた。個々のＲＮＡ転写物を解析に供すことはしなかった。代わりに、本発明者らは、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍａｎａｌｙｓｔソフトウェアを使用して、京都遺伝子ゲノム百科事典（ＫＥＧＧ）微生物データベースを相互参照することによって微生物転写物のコミュニティーによって示される経路及びオントロジーを調べた。このデータベースは、８２のＫＥＧＧオントロジー（ＫＯ）経路セット、１１のＫＥＧＧ代謝セット、及び２０のオルソロガス群クラスター（ＣＯＧ）機能セットからなるものである。サンプルの少なくとも１０％における存在生リード数が５以上の転写物に限定してマッピングを実施した。分位数正規化を実施した後、Ｍｅｔａｂｏａｎａｌｙｓｔソフトウェアを使用して分類学的データと経路レベルデータとの両方の群間差異を解析することで、観測された存在数のノンパラメトリック群間比較を実施した。こうしたデータセットは、刊行物の受理後にＮＣＢＩ配列リードアーカイブにて公的に利用可能となる。
【０２２４】
統計解析
ＡＳＤ群とＴＤ群またはＤＤ群との間の医学的特徴、人口統計特徴、及び神経心理学的特徴の差異をスチューデント両側ｔ検定で評価し、未調整のｐが＜０．０５であることによって有意差を定義した。最大の存在量（存在濃度が最も高い）及び普及率（存在サンプル数が最も多い）を有する分類群を種レベル及び門レベルで報告した。こうした分類学的プロファイルからシャノンアルファ多様性指数及びブレイ・カーティスベータ多様性指数（群等分散性法）を計算し、３つの群の間で比較した。すべての参加者の間の分類群発現差異を多変量部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）で視覚化し、射影における変数重要度を、それぞれの分類群について決定した。３つの群の間の個々の分類群差異をノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定で調べた後、マン・ホイットニーＵ検定での群間事後比較（ＡＳＤ：ＴＤまたはＡＳＤ：ＤＤ）を実施した。ｑ＜０．０５とする、多重検定セットのためのＦＤＲ調整を行って一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用することで診断群間のＫＥＧＧ経路転写物の差異を評価した。チューキーの正直有意差（Ｈｏｎｅｓｔｌｙ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）（ＨＳＤ）検定を使用して、３つすべての群の間での事後検定を実施した。
【０２２５】
分類群と、事前定義したＡＳＤエンドフェノタイプセットと、の関連性を下記のように評価した：１）ＧＩ障害あり／なしのＡＳＤ参加者の間の分類群差異、及びＡＤＨＤあり／なしのＡＳＤ参加者の間の分類群差異を、ノンパラメトリックマン・ホイットニーＵ検定で調べた。２）日常生活のコミュニケーション、社会化、及び活動のＶＡＢＳ下位尺度についてＡＳＤ参加者を３つの適応行動群（１００の平均値を下回る群、１００の平均値を１標準偏差超下回る群、または１００の平均値を２標準偏差超下回る群）に分け、群間の分類学的差異をノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定で評価した。３）ＡＤＯＳでの自閉症行動尺度（社会的情緒、限定的／常同的行動、及び総スコア）と口腔分類群活性との間の関連性をピアソンの相関で評価した。表現型と分類学的なものとの比較のそれぞれについてベンジャミーニ・ホッホベルク偽発見率（ＦＤＲ）調整値が＜０．０５である因子を報告した。
【０２２６】
口腔分類群と臨床的特徴との間の関連性を、ピアソンの相関（連続変数向け）またはスピアマンの順位検定（二値変数向け）で評価した。１）ＡＳＤ：ＴＤ、２）ＡＳＤ：ＤＤ、及び３）診断間にまたがるＧＩ障害表現型を比較して、口腔マイクロバイオームにおける分類群レベルの診断精度を多変量ロジスティック回帰分析で評価した。それぞれの群に由来するサンプルの最初の５０％（無作為に選択したもの）及び１０分割交差検証手順を使用して、分類精度を受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線で視覚化した。サンプルの残りの５０％を使用することで、それぞれの比較のための予測モデルを検証した。曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、９５％信頼区間を報告した。
【０２２７】
結果
参加者特徴
ＡＳＤ群（ｎ＝１８０）は、平均年齢が生後５３（±１６）ヶ月であり、８５％が男子であり、５９％がコーカサス人種であった（表１）。ＴＤ参加者（ｎ＝１０６）は、平均で１０ヶ月若く（４３±１６ヶ月）、６０％が男子であり、６３％がコーカサス人種であった。ＤＤ群（ｎ＝６０）は、平均年齢が生後５０（±１３）ヶ月であり、７０％が男子、６７％がコーカサス人種であった。ＡＳＤ対象（午後１２：２９±２：４８）、ＴＤ対象（午後１２：２１±２：４３）、及びＤＤ対象（午後１２：４３±２：４３）の間で平均採取時刻に差異は存在しなかった。最後の食事からの経過時間または最後の歯磨きからの経過時間においても群間差異は存在しなかった。ＴＤ小児のプロバイオティクス摂取率は０％であったのに対して、ＡＳＤ小児及びＤＤ小児のプロバイオティクス摂取は３％にすぎなかった。ＧＩ障害を有する比率は、ＴＤ群（３％）と比較してＡＳＤ参加者（２２％）で高かったが、ＤＤ群（２０％）との比較では高くなかった。食物または薬剤のアレルギーを有する比率は、ＴＤ参加者（９％）及びＤＤ参加者（８％）と比較してＡＳＤ参加者（２１％）で高かったが、これらの参加者が食事制限をしている比率は同様であった。出生時体重に群間差異は存在しなかったが、ＡＳＤ群の小児の帝王切開率（１９％）は、ＴＤ参加者（９％）及びＤＤ参加者（８％）と比較して高かった。喘息またはワクチン接種の比率に群間差異は存在しなかった。ＡＳＤ群の日常生活の社会化ドメインに対する平均ＶＡＢＳスコア（７３±１３）及び日常生活の活動ドメインに対する平均ＶＡＢＳスコア（７５±１４）は、ＴＤ群及びＤＤ群と比較して低かった。ＡＳＤ群の平均ＶＡＢＳコミュニケーションスコア（７２±１８）は、ＴＤ参加者（１０３±１５）とは異なっていたが、ＤＤ参加者（７６±１７）とは異なっていなかった。ＡＳＤ対象の社会的情緒ドメインに対するＡＤＯＳの総スコア（１３±５）ならびに限定的かつ常同的な行動ドメインに対するＡＤＯＳの総スコア（３±１）は、ＤＤ参加者（それぞれ６±４及び２±１）と比較して高かった。
【０２２８】
【表２０】
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スチューデントの両側ｔ検定で有意（ｐ＜０．０５）な群間差異を有する特徴は、アスタリスク付きで示される。Ｖｉｎｅｌａｎｄドメイン標準スコアが示される（この標準スコアでは、１００が平均スコアである）。自閉症診断観察スケジュール（ＡＤＯＳ）の総スコアが示される。略語：自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、定型発達（ＴＤ）、非自閉症発達遅延（ＤＤ）、胃腸（ＧＩ）、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、日常生活の活動（ＡＤＬ）、限定的かつ常同的な行動（ＲＲＢ）。
【０２２９】
微生物多様性プロファイル
すべてのサンプルの中で、サンプル当たり平均で７９０，０３１の分類学的リードが存在した。ＡＳＤ群（７８５，７６６）、ＴＤ群（８２３，４８０）、及びＤＤ群（７３８，３３５）の間で平均リード数に差はなかった。サンプルの≧２０％において数が≧１０の分類群のみを含むように分類学的リードをフィルタリングした。こうした基準を満たす７５３の分類群の中で、すべてのサンプルに存在した分類群の数は４１であった。
【０２３０】
コア口腔マイクロバイオーム（サンプルの＞７０％に存在し、相対存在量が＞０．５％である分類群として定義される）には１０の分類群が含まれた（図２７）：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（生リード総数３．９ｘ１０７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（２．０ｘ１０７）、Ｇｅｍｅｌｌａ属の１種である口腔分類群９２８（３．５ｘ１０７）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ（２．０ｘ１０７）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（９．２ｘ１０６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ  Ｂ６（７．３ｘ１０６）、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ（５．１ｘ１０６）、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃａｅ（６．０ｘ１０６）、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（５．６ｘ１０６）、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の１種である口腔分類群０６４（３．６ｘ１０６）。すべてのサンプルの中で最も存在量の多い口腔門は、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ（リードの５８％）であり、次いでＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ（１６％）及びＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（１１％、図２８Ａ）であった。Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門の中で最も突出した分類目は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ（リードの７２％）及びＢａｃｉｌｌａｌｅｓ（２５％、図２８Ｂ）であった。種レベル（ｐ＝０．６０、Ｆ＝１．０１、図２９Ａ）または門レベル（ｐ＝０．４８、Ｆ＝０．７３、図２９Ｂ）においてＡＳＤ群、ＴＤ群、及びＤＤ群の間でシャノンアルファ多様性に差異は存在しなかった。群等分散性手法で測定したブレイ・カーティスベータ多様性では、ＡＳＤ群、ＴＤ群、及びＤＤ群の間に有意差（ｐ＝０．０４、Ｆ＝３．２５）が存在することが示され、視覚化されたサンプル間多様性は、ＴＤ群で最大であった（図３０）。
【０２３１】
微生物差異
ＡＳＤ群、ＴＤ群、及びＤＤ群の間の差異を、ノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定を用いて門レベル及び種レベルで探索した。ＡＳＤ群、ＴＤ群、及びＤＤ群の間に有意差（ＦＤＲ＜０．０５）がある分類群は、１２存在した（表２１）。
【０２３２】
【表２１】
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クラスカル・ワリス検定で自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）群、定型発達（ＴＤ）群、及び非自閉症発達遅延（ＤＤ）群の間で有意（誤検出率（ＦＤＲ）＜０．０５）差を有する種が示される。ＡＳＤ群：ＴＤ群の間及びＡＳＤ群：ＤＤ群の間の倍率変化（ＦＣ）が記載される。
【０２３３】
こうした分類群のうちの４つは、マン・ホイットニーＵ検定でＡＳＤ群とＴＤ群との間で発現差異（ＦＤＲ＜０．０５）を示した。ＡＳＤ小児では、２つの分類群が上昇しており（Ｌｉｍｎｏｈａｂｉｔａｎｓ属の１種６３ＥＤ３７−２、ｐ＝０．０１；Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、ｐ＝０．０４９）、２つの分類群が減少していた（Ｒａｍｌｉｂａｃｔｅｒ  ｔａｔａｏｕｉｎｅｎｓｉｓ  ＴＴＢ３１０、ｐ＝０．０００９；Ｍｕｃｉｌａｇｉｎｉｂａｃｔｅｒ属の１種ＰＡＭＣ２６６４０，ｐ＝０．０００９）。ＡＳＤ小児とＤＤ小児との間で有意差（ＦＤＲ＜０．０５）を示した分類群は存在しなかった。Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ（χ２＝３１．０、ＦＤＲ＝３．２Ｅ−０６）、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（χ２＝１４．８、ＦＤＲ＝０．００５）、及びＣａｌｄｉｔｒｉｃｈａｅｏｔａ（χ２＝９．６，ＦＤＲ＝０．０４）について、３つの診断群の間で、門での差異が観測された（図３１）。こうした差異は、大半がＡＳＤ／ＴＤ変動に起因するものであった（表２２）。
【０２３４】
【表２２】
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【０２３５】
Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓのみが、ＴＤ群（倍率変化＝１．２８、ＦＤＲ＝０．００１）ともＤＤ群（ＦＣ＝０．０３、ＦＤＲ＝０．０２）とも、ＡＳＤとの間で差異を有していた。注目すべきことに、ＴＤ参加者と対比するとＡＳＤ参加者におけるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓの発現は、名目上は低いものであったが（ＦＣ＝０．８９，ＦＤＲ＝０．０５１）、ＡＳＤ群のＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ比には全く変化が観測されなかった。部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を使用することで、ＡＳＤ群、ＴＤ群、及びＤＤ群の間の種レベルでの分類学的プロファイル差異を二次元で視覚化した。群間の分散の４％を説明するモデルによって、ＡＳＤ参加者、ＴＤ参加者、及びＤＤ参加者が部分的に分離された（図３２Ａ）。群を異なって射影するために最も不可欠な２０の分類群が示される（図３２Ｂ）。これら２０の分類群の中で、１４の分類群は、ＡＳＤサンプルにおいて相対的に減少し、３つの分類は、ＴＤ群及びＤＤ群と比較してＡＳＤ参加者の唾液において増加する。
【０２３６】
ＡＳＤ表現型の中でのマイクロバイオーム変動
門レベル及び分類群レベルでのマイクロバイオーム要素中の変動を一般的なＡＳＤ  表現型の中で探索した（表２３）。
【０２３７】
【表２３】
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自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）表現型の間の門レベルデータ及び種レベルデータの比較を、医学的形質、適応行動、及び自閉症特徴について完成させた。胃腸障害あり／なしのＡＳＤ対象、及び注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）あり／なしのＡＳＤ対象を、マン・ホイットニーＵ検定によって比較した。それぞれの比較ごとに門差異／種差異の数が記載される。適応行動（Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動尺度−第２版によって測定したもの）は、平均スコア（１００）を下回るか、平均スコア（１００）を１標準偏差超下回るか、または平均スコア（１００）を２標準偏差超下回るものとして定義し、微生物の差異を、ノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定で群間比較した。自閉症形質は、自閉症診断観察スケジュール−第２版を用いて定量化し、口腔マイクロバイオームレベルとの関連性を、ピアソン相関解析を用いて決定した。個々の門差異／種差異が示されており、ＧＩ表現型間の種差異は、表２４において別に確認することができる。
【０２３８】
ＡＤＨＤあり／なしのＡＳＤ対象の間の発現差異、及びＧＩ障害あり／なしのＡＳＤ対象の間の発現差異をノンパラメトリックマン・ホイットニー手法で調べた。ＡＤＨＤを有するＡＳＤ小児とＡＤＨＤを有さないＡＳＤ小児との間で発現差異を有する分類群または門は存在しなかった。ＧＩ障害を有するＡＳＤ患者とＧＩ障害を有さないＡＳＤ患者との間に有意差（ＦＤＲ＜０．０５）を有する門は存在しなかったが、２８の分類群には当該有意差が存在した（表２４）。
【０２３９】
【表２４】
2020512016.tif 000034
【０２４０】
ＧＩ障害を有するＡＳＤ小児では、これらの分類群のうちの３つは下方制御されており、２５の分類群は上方制御されていた。これら２８の分類群はいずれも、ＡＳＤ：ＴＤ比較及びＡＳＤ：ＤＤ比較において同定されたものとオーバーラップしなかった。適応行動（日常生活のコミュニケーション、社会化、及び活動）のドメイン標準スコアを、平均値（１００）を下回るか、平均値（１００）を１標準偏差超下回るか、または平均値（１００）を２標準偏差超下回るものとして特徴付け、ＡＳＤ参加者間の門差異／分類群差異をクラスカル・ワリス検定で同定した。ＡＳＤコミュニケーション群の間には、１つ門（Ｃｌａｄｉｔｒｉｃｈａｅｏｔａ）及び５つの分類群（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、及びＰａｓｔｅｒｕｒｅｌｌａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に差異が存在した。日常生活の社会化表現型の間、または日常生活の活動表現型の間には、門レベルまたは分類群レベルの差異は存在しなかった。ピアソン相関を使用して、ＡＤＯＳでの限定的／常同的行動スコア、社会化スコア、及び総スコアとマイクロバイオーム要素との関連性を調べた。門レベルでは、ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａのレベルが、ＡＤＯＳの社会的情緒スコア（Ｒ＝０．２４；ＦＤＲ＝０．０３６）及びＡＤＯＳの総スコア（Ｒ＝０．２５；ＦＤＲ＝０．０１９）と有意に相関した（Ｒ＞０．２０、ＦＤＲ＜０．０５）。ＡＤＯＳの限定的／常同的行動スコアと相関する門は存在しなかった。分類群レベルでは、ＡＤＯＳの限定的／常同的行動スコアと相関する要素は４つ存在した（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ  ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ、及びＣｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の１種ＩＨＢ  Ｂ  １７０１９）。ＡＤＯＳの社会化スコアまたはＡＤＯＳの総スコアと相関する分類群は存在しなかった。
【０２４１】
口腔マイクロバイオーム要素と臨床的特徴との関連性
スピアマン順位解析（二値変数）またはピアソン相関解析（連続変数）で、臨床的特徴と個々の門レベルとの間に有意な（Ｒ≧０．２０、ＦＤＲ＜０．０５）関連性は存在しなかった。個々の分類群は、年齢、体型指数、採取時刻、最後の食事からの経過時間、及び最後の歯磨きからの経過時間との関連性を示した（表２５）。
【０２４２】
【表２５】
2020512016.tif 000035
2020512016.tif 000036
種レベルデータと臨床的特徴／人口統計特徴との間の関連性が示される。連続変数についてはピアソン解析を利用し、二値変数についてはスピアマン順位解析を使用した。
【０２４３】
臨床的特徴と関連する分類群はいずれも、ＡＳＤ患者において「変化」しているか、またはＡＳＤエンドフェノタイプ間で「変化」していると同定された分類群とオーバーラップしなかった。唾液採取時刻で見られた分類群相関数（２１）が最も大きく、これらの分類群のうちの１５分類群は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に由来するものであった。最後の歯磨きからの経過時間とＣａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ  ＣＤ３６との間には最も強い相関が見られた（Ｒ＝０．４３、ＦＤＲ＝０．０４８）。注目すべきことに、食事制限、食物／薬剤アレルギー、プロバイオティクスの使用、及びワクチン接種状況は、口腔分類学的濃度との相関を全く示さなかった。
【０２４４】
分類精度
ＡＳＤ状態及びＧＩ表現型を同定する上での個々の分類群の有用性を多変量ロジスティック回帰分析で探索し、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析によって分類精度を視覚化した。それぞれの比較について、それぞれの群の参加者の５０％を使用して、予測精度を有する分類群間の比を同定した後、こうした比を、残りの５０％のナイーブな「ホールドアウト」サンプルにおいて検証した。８つの分類群を含む５つの比（Ｍｕｃｉｌａｇｉｎｉｂａｃｔｅｒ／Ｒａｍｌｉｂａｃｔｅｒ  ｔａｔａｏｕｉｎｅｎｓｉｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ／Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ／Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ／Ｌｉｍｎｏｈａｂｉｔａｎｓ、Ｒａｍｌｉｂａｃｔｅｒ  ｔａｔａｏｕｉｎｅｎｓｉｓ／Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｔｒｉｆｉｃａｎｓ）が、訓練セットにおいてＡＳＤ参加者（６６／９０）及びＴＤ参加者（３８／５３）を正しく同定し、０．７９５のＡＵＣ（９５％ＣＩ：０．７１１〜０．８７２）を示した。この分類群パネルは、ホールドアウトセットにおいてもほぼ同一の能力を発揮し（図３３Ａ）、ＡＳＤ小児（７３／９０）及びＴＤ小児（３３／５３）を同定した（ＡＵＣ＝０．７９６）。５つの分類群を含む３つの比（Ｃｈａｍａｅｓｉｐｈｏｎ  ｍｉｎｕｔｕｓ／  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ／Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の１種ＰＫ１５／Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ）は、訓練セットにおいてＡＳＤ小児（６４／９０）及びＤＤ小児（２０／３０）を正しく同定し、０．７７０のＡＵＣ（９５％ＣＩ：０．６４３〜０．８６７）を示した。これら３つの比は、ナイーブサンプルのホールドアウトセットにおいても同様の能力を発揮し、ＡＳＤ小児（８２／９０）及びＤＤ小児（２１／３０）を同定した（ＡＵＣ＝０．７６５）（図３３Ｂ）。分類群レベルもまた、ＧＩ障害を有するＡＳＤ小児を、ＧＩ障害を有さないＡＳＤ小児と区別する上での有用性を示した。５つの分類群を含む３つの比（Ｍｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ  Ｍ０４−２４０１９６／Ｓｉｄｅｒｏｘｙｄａｎｓ  ｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ  ＥＳ−１、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ  ＯＲ  ７４Ａ／Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｄｉｐｒｏｐｒｉｏｎｉｃｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ／Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ  ＯＲ  ７４Ａ）によって、ＧＩ障害を有するＡＳＤ小児（１７／１９）及びＧＩ障害を有さないＡＳＤ小児（５１／７０）が訓練セットにおいて正しく同定された（ＡＵＣ＝０．８３９、９５％ＣＩ：０．７５９〜０．９５８）。ホールドアウトセットでは、この分類群パネルによって、ＧＩ障害を有するＡＳＤ小児（７／２０）及びＧＩ障害を有さない小児（６７／７１）が同定された（ＡＵＣ＝０．８５７）（図３３Ｃ）。
【０２４５】
メタボローム経路プロファイリング
中咽頭において測定した微生物ＲＮＡ転写物の機能特性をＫＥＧＧ微生物データベースへのアライメントによって調べた。サンプルの少なくとも１０％に５つ以上のアライメントを有するものを含むようにＫＥＧＧ経路をフィルタリングし、分位数正規化を行った。これによって全部で１１３のＫＥＧＧ経路のセットが得られた。１１３の経路の中で、７つの経路は、ＡＳＤ群、ＴＤ群、及びＤＤ群の間で、見られる頻度が異なっていた（ＦＤＲ＜０．０５）（表２６）。
【０２４６】
【表２６】
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ノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定を使用することで、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）小児、定型発達（ＴＤ）小児、または非自閉症発達遅延小児の口腔マイクロバイオームの間に生じている差異について１１３のＫＥＧＧ経路を調べた。誤検出率（ＦＤＲ）が＜０．０５であるＫＥＧＧ経路が示される。マン・ホイットニー検定を群間事後対比として使用した。
【０２４７】
差異が生じているＫＥＧＧ経路には、微生物エネルギー代謝、翻訳リボソーム構造及び翻訳リボソーム新生、ピリミジン代謝、リジン分解、ヌクレオチド代謝、炭素代謝、ならびにヌクレオチドの輸送及び代謝が含まれていた（図３４Ａ〜Ｈ）。
【０２４８】
考察
本発明者らが知る限り、この研究は、ＡＳＤ小児におけるマイクロバイオームを最も大きな規模で調査したものであり、中咽頭サンプルを利用したのは、この研究が初めてである。この研究によって、定型発達同等小児と比較しても、発達遅延を有する非自閉症同等小児と比較しても、ＡＳＤ小児の口腔マイクロトランスクリプトームプロファイルは異なるものであるということが確立された。こうした分類学的パターンは、腸マイクロバイオームの以前の報告といくらかオーバーラップしただけでなく、こうした分類学的パターンによって、中咽頭に特有の新規の変化も同定された。
【０２４９】
腸と同様に、中咽頭は、ＡＳＤの症状が顕著な部位である。ＡＳＤ小児は、運動機能障害（発語失行）及び感覚機能障害（食品テクスチャ及び味覚）を患う割合が高い。さらに、中咽頭は、ＧＩ管への唯一の入口点であり、宿主と環境との主要な相互作用部位となっている。５つの脳神経（Ｖ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ、及びＸＩＩ）によって中咽頭が感覚及び運動の神経支配を受けることで、中咽頭と中枢神経系との間には大きなつながりができ、腸−脳軸（脳神経Ｘを介しても大きな影響を及ぼす）のための妥当な交換経路が生じる。したがって、ＧＩ障害を有するＡＳＤ小児において特定のマイクロトランスクリプトームプロファイルが増進することは驚くべきことではない。注目すべきことに、本発明者らは、こうした「変化」のいくつかが特定の自閉症特徴とも関連することを見出した。例えば、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓのレベルは、ＧＩ障害を有するＡＳＤ小児においても、平均値を２標準偏差超下回る適応コミュニケーションスコアを有するＡＳＤ小児においても、減少している。同様に、Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ  ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒのレベル及びＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａのレベルは、それぞれ限定的／常同的行動の尺度及び社会的情緒の尺度と相関しており、ＧＩ障害を有する小児では「変化」していた。そのような傾向は、ＧＩ管と関連しないＡＳＤ表現型（ＡＤＨＤ）が門レベルまたは種レベルでのマイクロバイオームプロファイルの差異を示さなかったことを考慮すると、特に際立つものである。
【０２５０】
ＡＳＤへの遺伝的寄与を強調している最近の研究に照らすと、微生物変化のみが自閉症行動を誘導するものであるという可能性は低い。しかしながら、マイクロバイオームの変化は、動物モデルにおいて非定型の社会的行動、コミュニケーション行動、及び常同的行動と関連している。このつながりに対する１つの機構は、メタボロームの乱れであり得る。本明細書では、ＡＳＤ小児において（ＤＤ同等小児及びＴＤ同等小児と比較して）乱れた微生物ＲＮＡプロファイルが、中咽頭において代謝経路を異なって標的とすることが示された。ＧＩ管における微生物活性が、宿主栄養に必須の化合物の代謝において重要な役割を担うことはよく確立されたことである。本明細書では、本発明者らは、リジン分解と関連する微生物ＲＮＡがＡＳＤ小児の中咽頭において上方制御されることを同定した。リジンは、分解されるとグルタミン酸を生じるケト原性アミノ酸である。グルタミン酸は、学習及び記憶に関与する重要な神経伝達物質であり、ＡＳＤ患者の血漿においても中枢神経系においても、そのレベルが高まっていることが報告されている。ＴＤ小児及びＤＤ小児と比較してＡＳＤ小児の口腔マイクロバイオータではエネルギー代謝転写物及び炭素代謝転写物が増加するという証拠も見つかった。ＫＥＧＧのエネルギー代謝エントリーは、実際は、一連のサブカテゴリーを含んでいる（酸化的リン酸化、光合成、炭素固定、メタン代謝、窒素代謝、及び硫黄代謝）。これらの中で、さらに綿密に調べたところ、酸化的リン酸化（１．６倍）及びメタン代謝（１．２倍）に関与する細菌転写物の発現増加によってエネルギー代謝の増加がＡＳＤ小児において誘導されることが強く示唆された。
【０２５１】
宿主と微生物との相互作用によって社会的行動に変化が生じ得る第２の機構は、無症候性の病状を介するものである。例えば、本明細書において本発明者らは、ＡＳＤ小児では口腔のＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａが門レベル（図３１）及び種レベル（表２１）で変化していることを報告し、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａのレベルを使用することで自閉症小児を定型発達同等小児と区別し得ることを示している。Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａは、ＧＩ障害、枯草熱、及びそう痒症を含めて、重病を引き起こし得るシアノトキシンを産生する水系病原体である。ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ神経毒素であるβ−Ｎ−メチルアミノ−Ｌ−アラニン（ＢＭＡＡ）は、パーキンソン病及びアルツハイマー病などの神経変性状態に寄与することが提唱されている。さらに、神経学的定型発達兄弟姉妹と比較してＡＳＤ小児の糞便マイクロバイオームではｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａのレベルが乱れていることがＳｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）によって以前に報告されている。
【０２５２】
臨床的意義
ＡＳＤ小児の中咽頭において見られる特有のマイクロトランスクリプトームプロファイルからは、患者のスクリーニング、診断、または分類のための客観的ツールが得られる。本発明者らは、８つの口腔分類群のレベルによってＡＳＤ小児が定型発達同等小児と区別される可能性があり、５つの分類群の特有のパネルによってほぼ８０％の精度でＡＳＤ対象及びＤＤ対象が分類されることを本明細書に示した。本発明者らは、唾液におけるマイクロＲＮＡのレベルによってＡＳＤ小児が健康な対照と区別され得ることを実証した。唾液マイクロＲＮＡのいくつかの乱れが、マイクロバイオームとの宿主相互作用によって誘導され得ると考えることは興味深いことである。細胞間シグナル伝達分子としてのマイクロＲＮＡの役割、及び正常な脳発達におけるその重要度を考慮すると、微生物とマイクロＲＮＡとのクロストークは、腸−脳軸が機能する１つの機構であり得る。
【０２５３】
大規模な個々のマイクロバイオームプロファイリングもまた、治療標的に対する潜在的な手段に光を当てるものである。抗微生物介入またはプロバイオティクス介入によって自閉症行動が変化することが、いくつかの以前の研究によって実証されている。こうした研究では、非標的化手法を使用して腸マイクロバイオータをリセットすることに成功している。特定の行動特徴尺度と共に多数のＡＳＤ小児が研究されたときに明らかになる分類学的特徴が多様であることを考慮すると、より標的化された手法が適切であると思われる。例えば、こうした知見に基づくと、ＧＩ障害及びコミュニケーション障害を有する自閉症小児におけるＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ種が回復するように仕向けるプロバイオティクスからは、個別化された恩恵が得られる可能性がある。あるいは、ＧＩ障害及び常同的行動を有するＡＳＤ小児におけるＲｉｅｍｅｒｅｌｌａ種を特異的に標的とするように選択される抗生物質は、臨床的な有用性を有するものであり得る。おそらく、口腔マイクロバイオーム手法の最大の利点は、この手法によって、必要に応じて経時的にマイクロバイオームを繰り返し収集することが容易となり、その結果、標的化治療に応じて生じるこうした微生物コミュニティーの変化を追跡できるということである。
【０２５４】
限界
ＡＳＤ群、ＴＤ群、及びＤＤ群にわたって口腔マイクロバイオームに影響を与え得る可能性のあるあらゆる変数を制御することは不可能である。この研究では、関連因子が厳密に収集されており（表２０）、その結果、完全な透明性を伴って結果を解釈することができる。注目すべき点は、ＡＳＤ群、ＴＤ群、及びＤＤ群の間で異なった唯一の口腔因子／ＧＩ因子はＧＩ障害率及び食物／薬剤アレルギー率であり、後者は、いずれの口腔分類群の発現パターンとも関連性しなかったということである。ＧＩ障害と関連する１つの口腔分類群（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａ  ａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ  Ｙｂ２）（表２４）は、年齢とも弱い関連性を有し（表２５）、ＡＳＤ対象の中でＧＩ障害を検出する上での有用性を有する第２の口腔分類群（Ｓｉｄｅｒｏｘｙｄａｎｓ  ｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｃｕｓ  ＥＳ１）は、年齢及び採取時刻とも関連していた。したがって、この研究において同定された微生物因子のいくつかは、経時的なＧＩ管の変化によって交絡している可能性がある。発達中の小児の中で口腔マイクロバイオームを時系列的に解析することが、こうした関連性の解明に有用である。
【０２５５】
この研究の結果を依然の文献と比較するときに考慮される第２の因子は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ手法ではなく、ハイスループットメタトランスクリプトームシークエンシングを使用したことである。今回の研究では、得られた値から得られるものは、単なる微生物存在量ではなく、異なる種及び分類群に由来するマイクロバイオーム内の直接的な転写活性尺度である。この手法によって、ＫＯデータベースを介してＲＮＡ特性を機能的に調べることが可能になるが、以前の文献との比較が少し困難にもなる。したがって、糞便マイクロバイオームで以前に報告された微生物の乱れのパターンは、転写活性へと存在量が直接的に変換されていなかったのであれば（すなわち、そうした研究における細菌が遺伝子産物転写を活発に行っていなかった場合）、この手法では見過ごされる可能性がある。
【０２５６】
結論
ＡＳＤ小児ではＧＩマイクロバイオームが乱れているという証拠が次々と出ている。今回の研究では、この乱れが中咽頭に及ぶことで、微生物コミュニティーの転写活性が影響を受け得ることが示された。そのような変化は、ＡＳＤ併存疾患（ＧＩ障害など）ならびに社会的行動及び常同的行動と関連するものと思われる。この関連性の機構は、微生物代謝の変化に起因するか、または病原性微生物と宿主との関連性を介して生じ得るものである。一方で、口腔の分類学的及び機能的なプロファイリングからは、ＡＳＤ表現型の客観的マーカーとしての有用性が得られる可能性がある。
【０２５７】
実施例１１
参加者．
この多施設横断的前向き症例対照研究には、Ｐｅｎｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅまたはＳＵＮＹ  Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおいて小児科健診または発達専門家のケアを受けている年齢２〜６歳の３９６人の小児が参加した。この２〜６歳の年齢群は、スクリーニング及び診断のバイオマーカーが最も臨床的に有益であると想定される時期である、ＡＳＤ診断の最少年齢の小児が含まれるという理由で選択した。募集は、学術機関、外来患者、一次ケアクリニック、及び三次ケアクリニックにおいて２０１５年１０月〜２０１７年８月に実施した。１９７人のＡＳＤ小児、１２８人のＴＤ小児、及び７１人のＤＤ小児が唾液ＲＮＡシークエンシング及び臨床評価に参加した。それぞれの場所から募集によって集まったＡＳＤ参加者、ＴＤ参加者、及びＤＤ参加者の数はほぼ等しかった。ＴＤ対照群及びＤＤ対照群とＡＳＤ参加者とを比較することで、それぞれスクリーニング及び診断ｍｉＲＮＡバイオマーカー候補を同定することが可能であった。ＡＳＤ状態は、診断及び統計マニュアル（ＤＳＭ）−５診断によって定義し、直近１２ヶ月以内に医師の評価によって確認したものであり、自閉症診断観察スケジュール（ＡＤＯＳ）−ＩＩ（または他の標準化評価ツール（自閉症スペクトラム障害のためのチェックリスト、自閉症診断面接−改訂版、または小児自閉症評定尺度など））での評価によって裏付けを取った。ＴＤ状態は、ＭＣＨＡＴ−Ｒでの自閉症スクリーニングで陰性歴を有することに加えて、直近１２ヶ月以内の小児科健診において定型発達が文書化されていることによって定義した。ＤＤ状態は、定期訪問時点での標準化スクリーニング（幼児の健康状態調査、ＭＣＨＡＴ−Ｒ、または親による発達状態評価）によって粗大運動、微細運動、表出的コミュニケーション、受容コミュニケーション、または社会化の臨床的欠如が認められるが、こうした欠如がＡＳＤのＤＳＭ−５基準は満たさないことによって定義した。標的を絞って募集をかけることによって参加者の年齢及び性別がＡＳＤ群、ＤＤ群、及びＴＤ群にわたって一致するようにした。すべての群の除外基準としたものには、栄養管依存、活性な歯周病、上気道感染症、発熱、交絡性の神経機能障害（すなわち、脳性麻痺、てんかん）または感覚機能障害（すなわち、盲目、聾）、及び行政管理下にある者が含まれる。第一度近親者がＡＳＤを有する家族歴があるＴＤ参加者、または日常の投薬または小児専門医ケアを必要とする慢性の医学的状態を有するＴＤ参加者も除外した。
【０２５８】
参加者の特徴付け．
すべての参加者について、年齢、性別、民族性、妊娠期間、出生時体重、周産期合併症、現在の体重、体型指数、中咽頭状態（例えば、アレルギー性鼻炎）、食事制限、投薬、慢性医学的問題、免疫状態、医学的アレルギー、早期介入サービス、手術歴、及び家族の精神疾患歴を含めて、詳細な医学的及び人口統計的な特徴付けを実施した。ＡＳＤ小児の中での注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）（Ｇａｒｇａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）及び胃腸（ＧＩ）障害（Ｍｏｌｌｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）の有病率を考慮し、これら２つのよく見られる医学的併存疾患を同定するための調査質問を含めた。ＧＩ障害は、親による報告での便秘、下痢、腹痛、もしくは逆流の存在、ＩＣＤ−１０カルテ審査、または小児の投薬リストにある便柔軟剤／緩下剤の使用によって定義した。ＡＤＨＤは、親による報告、またはＩＣＤ−１０カルテ審査によって定義した。コミュニケーション、社会化、及び日常生活活動における適応能力を、Ｖｉｎｅｌａｎｄ適応行動尺度（ＶＡＢＳ）−ＩＩを使用してすべての参加者において測定し、標準化スコアを報告した。ＡＳＤ参加者及びＤＤ参加者（ｎ＝１６４）について可能なときは、自閉症症候学（ＡＤＯＳ−ＩＩ）の評価を完了させた。社会的情緒（ＳＡ）、限定的常同的行動（ＲＲＢ）、及びＡＤＯＳ−ＩＩの総スコアを記録した。
【０２５９】
【表２７】
2020512016.tif 000038
【０２６０】
唾液採取及びＲＮＡ処理．
Ｐ−１５７核酸安定化スワブ（ＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｅｋ；Ｏｔｔａｗａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を使用して非絶食状態のすべての小児から唾液を採取した。可能なときは歯を避けるように注意しながら、口腔の舌下領域及び耳下腺領域から５〜１０秒間にわたって唾液を採取した（Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｓｅｃｕｒｅ（ｈｔｔｐｓ）：／／ｗｗｗ．ｙｏｕｔｕｂｅ．ｃｏｍ／ｗａｔｃｈ？ｖ＝ＡｚＣｐＨＷｑｈＲＱｓ＆ｆｅａｔｕｒｅ＝ｙｏｕｔｕ．ｂｅ）。
【０２６１】
唾液の採取時刻を記録し、安定化溶液においてスワブを室温で最大４週間保持してから−２０℃で保管した。標準的なＴｒｉｚｏｌ法を使用して唾液ｍｉＲＮＡを精製した後、ＲＮｅａｓｙミニカラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いて２回目の精製を実施した。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用してＲＮＡサンプルの収量及びクオリティーを評価してからライブラリーを構築した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）低分子ＲＮＡサンプル調製プロトコール（Ｉｌｌｕｍｉｎａ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてＵｐｓｔａｔｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＳＵＮＹ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ＣｏｒｅにおいてＲＮＡをシークエンスした。ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）５００機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で５０塩基対の単一末端リードとし、それぞれのサンプルごとの標的リード深度を１０００万リードとした。それぞれのサンプルのリードを、ＳＨＲｉＭＰ２（登録商標）アライナーを用いてＰａｒｔｅｋ  Ｆｌｏｗ（Ｐａｒｔｅｋ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）においてヒトゲノムのビルドｈｇ３８にアライメントした。それぞれのサンプル中のｍｉＲＮＡ総数を、ｍｉＲＢａｓｅの前駆マイクロＲＮＡ及び成熟マイクロＲＮＡ（ｖ２１）を用いて定量化した。クオリティーが不十分なリード（平均ｑスコア＜３０）を除外し、成熟ｍｉＲＮＡのリード総数が２０，０００未満の１５サンプルを除外した。この結果、最終的に１８７のＡＳＤサンプル、６９のＤＤサンプル、及び１２５のＴＤサンプルを比較した。アライメントされた２８１３の成熟ｍｉＲＮＡの中で、本発明者らは、５２７の成熟ｍｉＲＮＡの群間発現差異を調べた。５２７のｍｉＲＮＡには、１）頑健な発現を有するｍｉＲＮＡ（サンプルの少なくとも１０％において生リード数が１０を超えるもの；ｎ＝３７５）、ならびに２）以前のＡＳＤ研究（１７）において同定されており、唾液において検出可能なｍｉＲＮＡ（サンプルの１０％において生の数が１を超えるもの；ｎ＝１５２）を含めた。統計解析を行う前に、リード数を分位数正規化し、平均によって中心化し、それぞれの変数の標準偏差で除算した。
【０２６２】
統計解析．
この研究の主目的は、以下の２つの臨床有用性を提供し得るｍｉＲＮＡを同定することとした：１）ＡＳＤ参加者とＤＤ参加者とを区別（ロジスティック回帰分析）するための診断パネルとしての有用性、ならびに２）ＡＳＤ参加者とＴＤ参加者とを区別（ロジスティック回帰分析）するためのスクリーニングパネルとしての有用性。ＡＳＤ／ＴＤ群間またはＡＳＤ／ＤＤ群間の医学的特徴及び人口統計特徴の差異をスチューデントの両側ｔ検定を使用して比較した。ノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定及び部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を使用することで、ＡＳＤ／ＴＤ群及びＡＳＤ／ＤＤ群を区別するための個々のｍｉＲＮＡ候補を同定した。群間有意差（誤検出率（ＦＤＲ）＜０．０５）があり、及び／または絶対回帰係数の、ＰＬＳ−ＤＡでの重み付けされた総和が≧２．０であるｍｉＲＮＡをバイオマーカー検証のために選択した。バイオマーカーの探索は、バイオマーカーワークフロー（Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）を使用してＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ  Ｒパッケージ（ＭｃＧｉｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ，Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ｈｔｔｐ）：／／ｗｗｗ．ｍｅｔａｂｏａｎａｌｙｓｔ．ｃａ／ｆａｃｅｓ／ＭｏｄｕｌｅＶｉｅｗ．ｘｈｔｍｌ）で実施した。
【０２６３】
サンプルの５０％を訓練セットとして利用する１００分割モンテ・カルロ交差検証手順で多変量ロジスティック回帰分析を行うことで、ｍｉＲＮＡの２つのパネルを選択した（ＡＳＤ／ＴＤ及びＡＳＤ／ＤＤ）。この訓練セットを使用することで、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ比に対する閾値（カットオフ）濃度を決定し、こうしたｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ比を、個々の参加者にまたがるｍｉＲＮＡ総濃度の変動に対する第２の対照として、個々のｍｉＲＮＡの代わりに利用した。モデルの「過剰適合」を回避し、ｍｉＲＮＡによるＡＳＤ参加者の正確な区別を確実なものとするために、ＡＳＤ／ＴＤサンプルまたはＡＳＤ／ＤＤサンプルの残りの５０％を含むナイーブな「ホールドアウト」セットにおいてそれぞれのパネルを検証した。
【０２６４】
訓練、交差検証、及びホールドアウト検証の間に生成された受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線に由来する曲線下面積（ＡＵＣ）解析を使用してそれぞれのパネルの能力を評価した。有意レベルを０．０５として両側ｚ検定を使用する事前の検出力分析によって、この参加者数からは＞９０％の検出力が得られることが示唆されたことから、観測ＡＵＣが０．８０であるならば、それぞれの診断アルゴリズムの真のＡＵＣは０．７０を超えるものと結論付けた。
【０２６５】
唾液のｍｉＲＮＡ濃度と自閉症表現型特徴と間の関連性を、ＦＤＲを調整してスピアマンの順位相関（二値変数向け）またはピアソンの相関（連続変数向け）で探索した。目的の表現型特徴には、１）適応行動スコア（ＶＡＢＳ−ＩＩ）、２）自閉症形質（ＡＤＯＳ−ＩＩスコア）、及び３）医学的併存疾患（ＧＩ障害またはＡＤＨＤのあり／なし）を含めた。唾液のｍｉＲＮＡ濃度と、交絡性の医学的特徴／人口統計特徴（すなわち、年齢、性別、民族性、体型指数、喘息、アレルギー性鼻炎、採取時刻、最後の食事の時刻、食事制限）と、の間の関連性もまた、ピアソンの相関またはスピアマンの順位相関で評価した。ｍｉＲＮＡと変数との関連性で、Ｒ＞［０．２５］及びＦＤＲ＜０．０５であるものはいずれも、有意として報告した。
【０２６６】
第２の解析では、以下の２つのｍｉＲＮＡセットについてｍＲＮＡ標的を調べた：１）最初のクラスカル・ワリス検定に基づくとＡＳＤ群、ＴＤ群、及びＤＤ群の間で「変化」しているｍｉＲＮＡ、ならびに２）ＡＤＯＳ試験での自閉症特徴と関連するｍｉＲＮＡ。それぞれのｍｉＲＮＡセットについて、ＤＩＡＮＡ  ｍｉｒＰａｔｈ  ｖ３オンラインソフトウェア（Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ｈｔｔｐ）：／／ｓｎｆ−５１５７８８．ｖｍ．ｏｋｅａｎｏｓ．ｇｒｎｅｔ．ｇｒ／）ｈｔｔｐ：／／ｓｔｒｉｎｇ−ｄｂ．ｏｒｇ）（Ｖｌａｃｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）において機能解析を実施した。ｍｉｃｒｏＴ−ＣＤＳアルゴリズムを利用することでそれぞれのｍｉＲＮＡの種特異的遺伝子標的を同定した。ＤＩＡＮＡ（登録商標）ｍｉｒＰａｔｈによって、フィッシャーの正確確率検定を使用して標的が有意に（ＦＤＲ＜０．０５）多く見られるＫＥＧＧ経路を同定した。信頼度の高いｍＲＮＡ標的（ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの相互作用が実験的に検証されており、ｍｉｃｒｏＴ−ＣＤＳスコアが≧０．９７５であるもの）のリストを、Ｓｔｒｉｎｇ  ｖ１０ソフトウェア（Ｓｚｋｌａｒｃｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）において中程度の厳密度設定（相互作用スコア＞０．４０）を使用してタンパク質間相互作用ネットワークについて調べた。ＳＦＡＲＩ自閉症データベース（Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｓｅｃｕｒｅ（ｈｔｔｐｓ）：／／ｇｅｎｅ．ｓｆａｒｉ．ｏｒｇ／ｄａｔａｂａｓｅ／ｈｕｍａｎ−ｇｅｎｅ／）（Ａｂｒａｈａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）に存在する９６１の自閉症関連遺伝子がｍＲＮＡ標的リスト中に多く見られるかを、イェーツの補正をしてカイ二乗検定を行うことで探索した。オーバーラップｍＲＮＡの数を、約２０，０００のコードｍＲＮＡを無作為にサンプル採取したものと比較したときにどのくらい多く見られるかと併せて報告した。
【０２６７】
参加者特徴．
スチューデントの両側ｔ検定を使用することで、ＡＳＤ群、ＴＤ群、及びＤＤ群の間で人口統計特徴、医学的特徴、及び中咽頭特徴を比較した（表２６）。ＡＳＤ参加者の平均年齢（５４±１５ヶ月）は、ＴＤ参加者（４７±１８ヶ月）と比較して高かったが（ｐ＝０．００６）、ＤＤ参加者（５０±１３ヶ月、ｐ＝０．０７６）との比較では高くはなかった。ＡＳＤ群の男子率（１６１／１８７、８６％）は、ＴＤ群（７６／１２６、６０％、ｐ＝１．０Ｅ−６）及びＤＤ群（４８／６９、７０％、ｐ＝０．０１５）と比較して高かった。ＡＳＤ小児のＧＩ障害率（３５／１８７、１９％）は、ＴＤ小児（２／１２５、２％、ｐ＝５．４Ｅ−７）と比較して高かったが、ＤＤ小児（１３／６９、１９％、ｐ＝０．９２）との比較では高くなかった。ＡＳＤ群のＡＤＨＤ率（４３／１８７、２５％）もまた、ＴＤ群（１０／１２５、８％、ｐ＝０．０００３）と比較すると高かったが、ＤＤ群（２１／６９、３０％、ｐ＝０．２６）との比較では高くなかった。コーカサス人種小児率（２７４／３８１、７２％）、平均体型指数（１８．９±１１ｋｇ／ｍ２）、喘息率（４３／３８１、１１％）もしくはアレルギー性鼻炎率（８１／３８１、２１％）、唾液採取時刻（１３：００±３時間）、または食事制限率（５０／３８１、１３％）は、３群間で有意差（ｐ＜０．０５）はなかった。
【０２６８】
精神神経特徴は、ＶＡＢＳ−ＩＩ（適応行動、３つすべての群）ならびにＡＤＯＳ−ＩＩ（自閉症特徴、ＡＳＤ群及びＤＤ群のみ）と関連していた。スチューデントの両側ｔ検定を使用して３群間で標準スコアを比較した。ＡＳＤ小児の標準化コミュニケーションスコア（７３±２０）は、ＴＤ小児（１０３±１７、ｐ＝３．５Ｅ−２７）及びＤＤ小児（７９±１７、ｐ＝０．０４４）と比較して低かった。ＡＳＤ群の社会化の平均スコア（７３±１５）及び日常生活の活動の平均スコア（７５±１５）もまた、ＴＤ群（社会化＝１０８±１８、ｐ＝２．０Ｅ−３３；日常生活の活動＝１０３±１５、ｐ＝１．７Ｅ−２９）及びＤＤ群（社会化＝８２±２０、ｐ＝０．００６；日常生活の活動＝８３±１９、ｐ＝０．００９）と比較して低かった。ＡＳＤ小児のＡＤＯＳ−ＩＩの社会的情緒要素の平均スコア（１３±５）及びＡＤＯＳ−ＩＩの限定的／常同的行動要素の平均スコア（３±２）は、ＤＤ対応小児（社会的＝５±３、ｐ＝２．０Ｅ−１１；限定的／常同的行動＝１±１、ｐ＝３．１Ｅ−９）と比較して高かった。これによって、ＡＳＤ群のＡＤＯＳ−ＩＩの総スコア（１６±６）は、ＤＤ群（６±４、ｐ＝１．９Ｅ−１３）と比較して高いという結果が得られた。
【０２６９】
唾液ｍｉＲＮＡ発現．
５２７の成熟ｍｉＲＮＡの濃度を、ＡＳＤ参加者、ＴＤ参加者、及びＤＤ参加者の唾液において探索した。これら５２７のｍｉＲＮＡの中で、８０のｍｉＲＮＡは、あらゆる参加者の唾液に存在した。すべての参加者にわたって唾液中濃度が最も高いｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２０３ａ−３ｐであり、この実験における生リード総数８．４４ｘ１０７のうちの１．１４ｘ１０６（１．４％）を占めた。クラスカル・ワリスノンパラメトリック検定によって、ＡＳＤ群、ＴＤ群、及びＤＤ群の間で有意（ＦＤＲ＜０．０５）差を有する１４のｍｉＲＮＡを同定した（図３５）。変化が最も大きいｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２８−３ｐ（χ２＝３４．２、ＦＤＲ＝１．６２Ｅ−５）であり、ｍｉＲ−２８−３ｐは、ＴＤ小児及びＤＤ小児と比較してＡＳＤ小児において下方制御されていた。他の４つのｍｉＲＮＡもまた、ＴＤ群と比較してもＤＤ群と比較してもＡＳＤ群において相対的に下方制御されていた（ｍｉＲ１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、及びｍｉＲ−７７０６）。ＴＤ群と比較してもＤＤ群と比較してもＡＳＤ群において相対的に上方制御されているｍｉＲＮＡは４つ存在した（ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−４７０５、ｍｉＲ−６２０、及びｍｉＲ−１２７７−５ｐ）。これら１４のｍｉＲＮＡのうちの１つ（ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ）のみが、ＡＳＤ患者のｍｉＲＮＡに関する以前の研究において「変化」しているとして同定されたものであった（Ｍｕｎｄａｌｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０２７０】
ＡＳＤ状態を同定する上での唾液ｍｉＲＮＡプロファイルの有用性をＰＬＳ−ＤＡで探索した。５２７のｍｉＲＮＡの唾液ｍｉＲＮＡプロファイルを使用して個々の参加者を三次元空間にマッピングした。この手法の結果、ＡＳＤ群とＴＤ群とがほぼ完全に分離され、ＤＤ参加者は中間にアライメントされた（図３６Ａ）。これによって、参加者間の唾液ｍｉＲＮＡ発現の分散の１４．１％が説明された。ＰＬＳＤ−ＤＡによる参加者の射影における個々のｍｉＲＮＡの重要度は、絶対回帰係数（ＶＩＰ）の重み付けされた総和によって決定した。２０のｍｉＲＮＡが、有意な（ＶＩＰ≧２．０）変数射影重要度を示した（図３６Ｂ）。これら２０のｍｉＲＮＡのうちの６つは、クラスカル・ワリス検定で同定された１４のｍｉＲＮＡとオーバーラップしていた（ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−７７０６、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ）。これら２０のｍｉＲＮＡのうちの５つは、ヒトＡＳＤ対象における以前のｍｉＲＮＡ研究において同定されたものとオーバーラップしていた（ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ（Ｍｕｎｄａｌｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｔａｌｅｂｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、ｍｉＲ−５９８−５ｐ（Ａｂｕ−Ｅｌｎｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、ｍｉＲ−５００ａ−３ｐ（Ｇｈａｈｒａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、ｍｉＲ−１９０ａ−５ｐ（Ｓａｒａｃｈａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０２７１】
分類精度．
１００分割交差検証手順を用いてロジスティック回帰分析を行うことで、ＡＳＤスクリーニング（ＡＳＤ小児とＴＤ小児との対比）及び診断（ＡＳＤ小児とＤＤ小児との対比）において潜在的な有用性を有するバイオマーカーツールセットを構築及び検証した。
【０２７２】
それぞれの群の小児のうちの半分を無作為に選択し、ＰＬＳ−ＤＡ／クラスカル・ワリス検定で同定した２８のｍｉＲＮＡを使用して、ＡＳＤ小児をＴＤ同等小児またはＤＤ同等小児と区別するためのｍｉＲＮＡパネルを構築した。次に、確立したパネルを、サンプルの残りの５０％を含むナイーブなホールドアウトセットにおいて検証した。ＡＳＤ参加者とＴＤ参加者との比較では、４つのｍｉＲＮＡ（性別及びＧＩ障害の存在を調整したもの）を含む５つの比によって、交差検証セットにおいてＡＳＤ小児（７４／９３）及びＴＤ小児（４２／６２）を同定することに成功した（ＡＵＣ＝０．７８８、９５％ＣＩ：０．６７７〜０．８７５、図３７Ａ）。ホールドアウトセットでは、このパネルによって、ＡＳＤ小児（７６／９４）及びＴＤ小児（３５／６３）が正しく同定された（ＡＵＣ＝０．７４４、９５％ＣＩ：０．７２２〜０．８６７）。ＡＳＤ参加者とＤＤ参加者との比較では、４つのｍｉＲＮＡ（年齢を調整したもの）を含む４つの比によって、交差検証セットにおいてＡＳＤ小児（６０／９３）及びＤＤ小児（２２／３４）を同定することに成功した（ＡＵＣ＝０．７１４、９５％ＣＩ：０．５６４〜０．８４７、図３７Ｂ）。ホールドアウトセットでは、このパネルによって、ＡＳＤ小児（８４／９４）及びＤＤ小児（１６／３５）が正しく同定された（ＡＵＣ＝０．８０３、９５％ＣＩ：０．６０３〜０．８２７）。
【０２７３】
ＡＳＤ表現型の中での唾液ｍｉＲＮＡの発現．
唾液ｍｉＲＮＡの発現パターンをＡＳＤ表現型の中で探索した。ＡＳＤ参加者におけるＧＩ障害の存在は、２つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−４７００−３ｐ、Ｒ＝０．３７、ＦＤＲ＝６．３Ｅ−５；ｍｉＲ−４４８５−３ｐ、Ｒ＝−０．２７、ＦＤＲ＝０．０４３）の唾液中レベルと有意に（Ｒ＞［０．２５］、ＦＤＲ＜０．０５）相関しており、これらのｍｉＲＮＡのうちの１つ（ｍｉＲ−４７００−３ｐ）は、以前のＡＳＤ研究において同定されたものであった。ＡＤＨＤの存在は、唾液ｍｉＲＮＡ発現と相関しなかった。ＶＡＢＳ−ＩＩ試験の社会化要素での標準化スコアと相関するｍｉＲＮＡは５つ存在し（ｍｉＲ−１５２−３ｐ、Ｒ＝０．３０、ＦＤＲ＝０．０２３；ｍｉＲ−３７９−５ｐ、Ｒ＝−０．３０、ＦＤＲ＝０．０２３；ｍｉＲ−４７８１−３ｐ、Ｒ＝−０．２８、ＦＤＲ＝０．０３８；ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、Ｒ＝−０．２８、ＦＤＲ＝０．０３９；ｍｉＲ−２２１−３ｐ、Ｒ＝０．２８、ＦＤＲ＝０．０３９）、これらのｍｉＲＮＡのうちの２つ（ｍｉＲ−３７９−５ｐ（Ｍｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）及びｍｉＲ−２２１−３ｐ（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）は、ＡＳＤ研究において以前に同定されたものであった。ＶＡＢＳ−ＩＩ試験での日常生活のコミュニケーションスコアまたは日常生活の活動スコアと相関するｍｉＲＮＡは存在しなかった。ＡＤＯＳ−ＩＩでの社会的情緒とは８つのｍｉＲＮＡが相関し（ｍｉＲ−２２３−３ｐ、Ｒ＝０．３４、ＦＤＲ＝０．００８２；ｍｉＲ−１４２−３ｐ、Ｒ＝０．３３、ＦＤＲ＝０．００８２；ｍｉＲ−１８２−５ｐ、Ｒ＝−０．３１、ＦＤＲ＝０．０１６；ｍｉＲ−１４２−５ｐ、Ｒ＝０．３１、ＦＤＲ＝０．０１６；ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、Ｒ＝−０．２９、ＦＤＲ＝０．０３５；ｍｉＲ−１８１ｃ−５ｐ、Ｒ＝０．２９、ＦＤＲ＝０．０３６；ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、Ｒ＝−０．２９、ＦＤＲ＝０．０３６；ｍｉＲ−１４３−３ｐ、Ｒ＝０．２８、ＦＤＲ＝０．０４４）、これらのｍｉＲＮＡのうちの６つは、ＡＳＤ研究において以前に同定されたものであり（ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ（１７））、上記の８つのｍｉＲＮＡのうちの１つは、この研究におけるＡＳＤ／ＤＤ分類パネルにおいて利用したものであった（ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ）。ＡＤＯＳ−ＩＩでの限定的／常同的行動とは１０のｍｉＲＮＡが相関し（ｍｉＲ−１３６−３ｐ、Ｒ＝０．５２、ＦＤＲ＝１．７Ｅ−８；ｍｉＲ−８４８５、Ｒ＝０．４２、ＦＤＲ＝３．２１Ｅ−５；ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ、Ｒ＝０．３８、ＦＤＲ＝０．０００５；ｍｉＲ−３６７９、Ｒ＝０．３６、ＦＤＲ＝０．００１１；ｍｉＲ−５７３、Ｒ＝０．３３、ＦＤＲ＝０．００４９；ｍｉＲ−６７３３−５ｐ、Ｒ＝０．３０、ＦＤＲ＝０．０２２；ｍｉＲ−８０６１、Ｒ＝０．２９、ＦＤＲ＝０．０２６；ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、Ｒ＝０．２８、ＦＤＲ＝０．０４０；ｍｉＲ−７６６−５ｐ、Ｒ＝０．２８、ＦＤＲ＝０．０４５；ｍｉＲ−４３１−５ｐ、Ｒ＝０．０２８、ＦＤＲ＝０．４５）、これらのｍｉＲＮＡのうちの４つは、以前のＡＳＤ研究において同定されたものであった（ｍｉＲ−１３６−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、及びｍｉＲ−４３１−５ｐ（Ｈｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６））。注目すべきことに、１０のｍｉＲＮＡのすべてが限定的／常同的行動スコアと正の相関を有していた。最終的に、６つのｍｉＲＮＡが、ＡＤＯＳ−ＩＩでの総スコアと相関し（ｍｉＲ−２２３−３ｐ、Ｒ＝０．３５、ＦＤＲ＝０．００４３；ｍｉＲ−１４２−３ｐ、Ｒ＝０．３４、ＦＤＲ＝０．００４３；ｍｉＲ−１４２−５ｐ、Ｒ＝０．３１、ＦＤＲ＝０．０１５、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、Ｒ＝−０．３１、ＦＤＲ＝０．０２１；ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、Ｒ＝−０．２８、ＦＤＲ＝０．０４９）、６つのｍｉＲＮＡのすべてが、以前のＡＳＤｍｉＲＮＡ研究において同定されたものであった（Ｈｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６））。これらのｍｉＲＮＡのうちの１つ（ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ）は、ＴＤ参加者及びＤＤ参加者と比較してＡＳＤ小児において下方制御されており、ＰＬＳ−ＤＡによる群射影において有意な変数重要度を示した。
【０２７４】
ｍｉＲＮＡ発現に対する臨床的特徴の影響．
唾液ｍｉＲＮＡ発現と臨床的特徴／人口統計特徴との関連性を、ピアソンの相関検定（連続）またはスピアマンの順位相関検定（二値）で評価した。５２７のｍｉＲＮＡの発現と、参加者の性別、民族性、体型指数、食事制限、喘息状態、またはアレルギー性鼻炎状態と、の間には有意な関連性（Ｒ＜［０．２５］、ＦＤＲ＜０．０５）は存在しなかった。検定した医学的変数／人口統計変数のすべての中で、唾液採取時刻が、関連するｍｉＲＮＡの数が最も大きかった（ｎ＝２１）。ｍｉＲ−２１０−３ｐレベルと唾液採取時刻との間の関連性が最も強かった（Ｒ＝−０．３５、検定統計量＝−６．６、ＦＤＲ＝４．２Ｅ−８）。最後の食事からの経過時間と関連するｍｉＲＮＡは１つ（ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ）存在した（Ｒ＝０．２５、検定統計量＝４．２、ＦＤＲ＝０．０１２）。採取時刻または最後の食事からの経過時間と関連するこれら２２のｍｉＲＮＡの中で、１２のｍｉＲＮＡは、以前のｍｉＲＮＡ研究において潜在的なバイオマーカーとして同定されたものであった。これらのｍｉＲＮＡはいずれも、今回の研究では、ＡＳＤ小児の唾液では「変化」していなかった。バイオマーカーツールセットの開発における年齢の重要度を考慮すると、参加者年齢が、３４のｍｉＲＮＡと弱く（Ｒ＜［０．２５］）、しかし有意に（ＦＤＲ＜０．０５）関連したことは注目すべきことである。これらのｍｉＲＮＡはいずれも、今回のバイオマーカーパネルでは利用してなかったが、これらのｍｉＲＮＡのうちの１５のｍｉＲＮＡは、以前のＡＳＤｍｉＲＮＡ研究において潜在的な標的として同定されたものである（Ｈｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。
【０２７５】
３８１人の小児（年齢２〜６歳）のこの症例対照研究では、ＡＳＤ小児、ＴＤ小児、またはＤＤ小児の間でレベルが異なる２８の唾液ｍｉＲＮＡが同定された。２つの異なるｍｉＲＮＡパネルによって、年齢、性別、及び／またはＧＩ障害を調整しつつ、診断潜在力（ＡＳＤとＤＤとの対比）及びスクリーニング潜在力（ＡＳＤとＴＤとの対比）が示された。唾液ｍｉＲＮＡのサブセットもまた、適応行動または自閉症行動の尺度と相関した。まとめると、こうしたｍｉＲＮＡ群の標的は、神経発達と強く関連し、かつＡＳＤ病態形成に関与する遺伝子であった。
【０２７６】
ＡＳＤ小児の中咽頭におけるｍｉＲＮＡのレベルを乱し得る潜在的な機構はいくつか存在する。ＡＳＤ小児おける食事制限（Ｓｃｈｒｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）が唾液ｍｉＲＮＡ環境を変え得ることは確かである。しかしながら、今回の研究では、唾液のｍｉＲＮＡレベルと食事制限の存在との間に関連性は全く見出されておらず、２つのｍｉＲＮＡのみがＧＩ障害と強く関連した。さらに、ＡＳＤ群、ＤＤ群、及びＴＤ群の間で食事制限率に差異は存在しなかった。多くのＡＳＤ小児が歯磨きに抵抗感を有することを考慮すると、唾液ｍｉＲＮＡの乱れに対する第２の潜在的な機構は、歯科衛生の差異である可能性がある（Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。この理由から、この研究では、活性な歯性感染または齲蝕を有する小児を厳密に除外した。唾液ｍｉＲＮＡの変化の一部を誘導し得る、ＡＳＤ小児の口腔マイクロバイオームの変化というものは確かに存在するが（Ｖｕｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）、マイクロバイオームの差異は、齲蝕に関与する細菌とはほとんど無関係である（Ｓｔｒｕｚｙｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０２７７】
唾液ｍｉＲＮＡの別の供給源には、口を神経支配し、体性機能及び自律神経機能を制御する４つの脳神経が含まれる。ＡＳＤ小児は、口腔−運動処理（発語失行（Ｔｉｅｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）及び口腔−感覚処理（食品テクスチャ感度（Ｃｅｒｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）に困難を抱えている。こうした処理を誘導する脳神経におけるｍｉＲＮＡ発現のパターンには「変化」が存在する可能性がある。この研究において同定された唾液ｍｉＲＮＡが脳と関連することは、軸索ガイダンス、神経栄養シグナル伝達、ＧＡＢＡ作動性シナプス、及びニコチン中毒を含めて、こうした唾液ｍｉＲＮＡが標的とするｍＲＮＡの機能によって裏付けられる。例えば、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ（今回の研究の診断パネルとスクリーニングパネルとの両方において利用されるもの）は、軸索ガイダンスに関与する７つのｍＲＮＡを標的としており、これらのうちの２つ（ＳＬＩＴ３及びＳＲＧＡＰ３）は、自閉症候補遺伝子である（Ａｂｒａｈａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ＳＬＩＴ３タンパク質産物は、別の自閉症候補遺伝子であるＲＯＢＯ１のタンパク質産物と相互作用することによって軸索伸長における分子ガイダンスキューとして働く（Ｇｒｅａｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＲＯＢＯ１が、この研究においてＡＳＤ状態と関連した１４のｍｉＲＮＡのうちの別のｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−９４４の標的であることは注目すべきことである。特筆すべきは、唾液中濃度（図３５）においても機能（図３８）においてもｍｉＲ−９４４とｍｉＲ−１４８ａ−５ｐとが高度に相関することである。したがって、これら２つのｍｉＲＮＡの変化は、協奏的に働いて軸索ガイダンスを乱し、ＡＳＤ表現型を引き起こし得る。このことは、ＡＤＯＳ−ＩＩ試験での社会的情緒及び全自閉症症状とｍｉＲ−１４８ｂ（ｍｉＲ−１４８ａのホモログ）のレベルがなぜ高度に相関するのかということを部分的に説明し得るものである。
【０２７８】
他の標的には、プリオン病、モルヒネ中毒、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−シグナル伝達、Ｗｎｔシグナル伝達、神経膠腫、内在性カンナビノイドシグナル伝達、及び概日同調と関連するｍＲＮＡが含まれる。
【０２７９】
グリンパティック系は、脳関連ｍｉＲＮＡが唾液に流入するさらに別の潜在的経路となる。グリンパティック系における血管周囲ドレナージ腔が解剖学的に中咽頭に近いことで、腸と脳とのクロストークならびにｍｉＲＮＡ移行のための有望な経路が創出される（Ｈｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。グリンパティック系によって示される日内活性が顕著なものであることを踏まえると（Ｊｅｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、この移行の間接的な裏付けは、唾液のｍｉＲＮＡレベルと採取時刻との間の驚くべき相関にある可能性がある。さらに、ＡＳＤ関連ｍｉＲＮＡのｍＲＮＡ標的は、概日関連経路に多く見られ、睡眠障害は、ＡＳＤ小児の間でよく見られる医学的表現型である（Ｍｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。
【０２８０】
唾液のｍｉＲＮＡレベルが自閉症行動に関連するということは、ＡＤＯＳ−ＩＩでの自閉症症状尺度と多数の唾液ｍｉＲＮＡが関連することによって裏付けられる。こうしたｍｉＲＮＡのいくつが、健康な対照と比較してＡＳＤ患者では「変化」していることが以前の研究によって説明されているが（Ｈｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、今回の調査のサンプルサイズからは、その発現パターンをＡＳＤ表現型の中で十分に探究する能力が得られる。本明細書では、本発明者らは、社会的情緒と関連する８つのｍｉＲＮＡ、及び限定的／常同的行動と関連する１０のｍｉＲＮＡを同定した。これらのｍｉＲＮＡのうちの１つ（ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ）は、ＡＳＤ患者に由来する死後脳（Ａｂｕ−Ｅｌｎｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、血液（Ｍｕｎｄａｌｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、及びリンパ芽球（Ｓａｒａｃｈａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）の３つの別々の研究において以前に同定されたものである。ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐと同様に、ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐは、軸索ガイダンスに関与するいくつかのｍＲＮＡ（ｎ＝２０）を標的としており（Ｖｌａｃｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、これらのうちの４つ（ＳＥＭＡ５Ａ、ＮＴＮＧ１、ＳＲＧＡＰ３、及びＭＡＰＫ１）は、自閉症候補遺伝子である（Ａｂｒａｈａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。したがって、ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐは、脳発達における重要な転写物を標的とすることによって、増加性の様式で自閉症行動を誘導し得る。この状況においては、ｍｉＲ−１０６ａ−５ｐ（及び他の同様のＡＤＯＳ関連ｍｉＲＮＡ）の測定は、何らかの予後予測有用性を与えるか、または治療応答のバイオマーカーとして役立ち得る。
【０２８１】
この研究によって、ＡＳＤ状態を診断及びスクリーニングし得る２つのｍｉＲＮＡパネルも同定された。ナイーブなホールドアウトセットにおいて、当該診断パネル（ＡＳＤとＤＤとの対比）からは、８９％の感度及び４６％の特異度が得られ、当該スクリーニングパネル（ＡＳＤとＴＤとの対比）からは、８１％の感度及び５６％の特異度が得られた。これらのツールは、現在利用されている主観的尺度（例えば、ＭＣＨＡＴ−Ｒ（Ｃｈａｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６））と同様の精度を有することに加えて、迅速、客観的、かつ非侵襲性であるという利点を有している。一方で、視線追跡マーカー（Ｆｒａｚｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｌｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、イメージングマーカー（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、遺伝子マーカー（Ｖｅｅｎｓｔｒａ−ＶａｎｄｅｒＷｅｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、及び電気生理学的マーカー（Ｐｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）におけるバイオマーカー研究の登場によっても、ＡＳＤ状態の同定にかなりの明るい見通しが示されている。ＡＳＤの評価は、こうした要素のそれぞれを協奏的に利用する多元的手法を必要とするものでもあり得る。
【０２８２】
以前の研究において同定されたｍｉＲＮＡ（Ｈｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）はいずれも、今回のコホートにおけるＡＳＤ状態を同定する頑健な能力を示さなかった。このことは、血液及びリンパ芽球のｍｉＲＮＡが確実に唾液に移行（もしくは唾液で発現）しないことによるものである得るか、または大きな多様な自閉症小児集団に対して小さなコホート由来の知見を反映することが不可能なことを反映するものであり得る。以前に同定されたｍｉＲＮＡバイオマーカーの多く（ｎ＝１１）が採取時刻との関連性を示したことも注目すべきことであり、採取時刻は、ＡＳＤのｍｉＲＮＡ調査において常に考慮するということがなされてこなかった因子である。血清に基づくｍｉＲＮＡのかなりの割合が日内変動を示すという最近の知見（４４）を考慮すると、こうした知見は、血液に基づくバイオマーカーにも当てはまる可能性がある。ｍｉＲＮＡ発現と概日リズムとの間の相互作用を調べる研究をさらに行うことが、睡眠覚醒サイクルにおけるこうした分子の役割の理解に重要であり得ると共に、こうした追加の研究からは、臨床用途向けのｍｉＲＮＡバイオマーカーを開発する上で有用な情報が得られる。今回のＡＳＤ診断／スクリーニングパネルにおいて利用したｍｉＲＮＡはいずれも、採取時刻と有意に関連しなかったことに加えて、この研究では、ＡＳＤコホート、ＴＤコホート、及びＤＤコホートの間で採取時刻差異が存在しなかったことは重要なことである。
【０２８３】
驚くべきことに、本発明者らのパイロット調査（Ｈｉｃｋｓ，Ｉｇｎａｃｉｏ，ｅｔ  ａｌ．，２０１６）において同定された唾液ｍｉＲＮＡとこの研究において同定されたものとの間にオーバーラップはほとんど存在しなかった。このことは、研究プロトコールにおける３つの重要な差異に起因し得るものである；１）パイロット研究では唾を吐いて得た唾液を使用した一方で、本調査ではスワブ手法で唾液を採取した。この変更は、ＡＳＤ小児が要望に応じて唾を吐くことは困難であるために実施したものである。このことによって、細胞由来のｍｉＲＮＡと（小胞）担体由来のｍｉＲＮＡとの比に差異が生じた可能性がある。２）パイロット研究には年齢が５〜１４歳の小児が含まれていた一方で、今回の研究には２〜６歳の参加者が参加した。この変更は、ＡＳＤ診断が最初に実施され、スクリーニング／診断試験が最も必要とされる年齢（Ｚｗａｉｇｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）の小児を獲得するために実施した。このことによって、年齢と関連して発現するｍｉＲＮＡのサブセットが影響を受けた可能性がある。３）パイロット研究では「高機能」ＡＳＤ（平均ＡＤＯＳ−ＩＩスコア＝１０．６±４．１）小児を標的とした一方で、この大規模追跡調査研究には重症度にかかわらず、すべてのＡＳＤ小児（平均ＡＤＯＳ−ＩＩスコア＝１６±６）を含めた。唾液ｍｉＲＮＡ発現が自閉症症状のレベル（ＡＤＯＳ−ＩＩによって測定されるもの）と関連することを考慮すると、今回の研究を拡大して多様なＡＳＤ小児集団を含めると、観測可能な群間差異の変化につながる可能性がある。
【０２８４】
生理学的バイオマーカーを同定及び試験するときに考慮しなければならない医学的因子及び人口統計因子は多数存在する。今回の研究の有望な性質は、こうした因子の多くを、群間で同一の採取手法、保管手法、及びサンプル処理手法を利用することによって管理することを可能にするものである。本発明者らは、年齢、性別、民族性、体型指数、及び採取時刻などの関連因子に基づいて群を一致させることも試みた。しかし残念ながら、これらの因子のすべてを完全に一致させることはほぼ不可能であり、今回のコホートには、年齢及び性別の群間差異が存在する。しかしながら、この研究で利用した年齢範囲（２〜６歳）は、多くのバイオマーカー研究と比較して極度に狭く、ＡＳＤ群とＴＤ群と間に結果的に生じる年齢差異（７ヶ月）がｍｉＲＮＡ発現に対して有意な影響を与える可能性が低いことは注目すべきことである。さらに、この研究において同定されたｍｉＲＮＡバイオマーカーはいずれも、年齢または性別と有意な相関を示しておらず、これらの人口統計変数は、多変量回帰解析を行う上で調整された。
【０２８５】
この研究は、自閉症小児を定型発達同等小児または非自閉症発達遅延同等小児と区別するために唾液ｍｉＲＮＡを使用し得るという大規模な証拠を与えるものである。この研究は、唾液ｍｉＲＮＡのレベルが適応行動及び自閉症行動の尺度と相関し、こうしたｍｉＲＮＡが、ＡＳＤの病態形成に関与する経路を標的とすることを示す。臨床的に実施するためには、より低年齢のコホートにおいて唾液ｍｉＲＮＡパネルを予測的に検証する調査が将来には不可欠であろう。唾液ｍｉＲＮＡ発現に影響し得る因子をさらに特徴付けることも重要であろう。
【０２８６】
実施例１２
この実施例では、強い概日リズムを示すｍｉＲＮＡの一部が既知の概日遺伝子を標的とし、特定の微生物と関連して周期変動するという仮説を立てた。
【０２８７】
方法
この研究には１１人のヒト対象ボランティアが参加し、３回の異なるサンプル採取において連日のさまざまな時刻に当該ボランティアから唾液サンプルの提供を受けた。スワブを介して唾液を採取し、唾液調製キットを使用して調製した。
【０２８８】
生物学的サンプルとして唾液を採取した実施例では、精製処理（必要な場合）は、例えば、ＴＲＩ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＬＳを使用するＯｒａｇｅｎｅ  ＲＮＡ精製プロトコール、ＴｒｉＺｏｌ精製法、または同様の方法に従う唾液ＲＮＡの精製を含み得る。Ｏｒａｇｅｎｅ精製プロトコールは、一般に、複数のパートを含む。第１のパートでは、サンプルを８秒以上激しく振とうし、そのままのバイアルにおいて水浴で１時間またはエアーインキュベーターで２時間、サンプルを５０℃でインキュベートする。第２のパートでは、２５０〜５００μＬ分量の唾液を微量遠心管に移し、この微量遠心管を９０℃で１５分間インキュベートし、室温に冷却する。この微量遠心管を氷上で１０分間インキュベートとし、最高速度（＞１３，０００ｘｇ）で唾液サンプルを３分間遠心分離し、清澄な上清を新たな微量遠心管に移し、沈殿物を捨て、２倍の体積の冷却した９５％ＥｔＯＨを清澄な上清に添加し、混合する。この上清混合物を−２０℃で３０分間インキュベートし、微量遠心管を最高速度で遠心分離にかけ、上清を捨てて沈殿物を回収する。この沈殿物を３５０μＬのＲＬＴ緩衝液に溶解し、溶解したペレット混合物に３５０μＬの７０％ＥｔＯＨを添加し、ボルテックスによって混合する。最初の２つのパートの後には、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙによる精製手順が実施され得る。
【０２８９】
精製処理は、例えば、ＱｉａｇｅｎによるＲＮｅａｓｙミニスピンカラムを使用して唾液サンプルを精製する第２の精製ステップをさらに含み得る。生物学的サンプルの精製は、任意の適切な数のステップを任意の適切な順序で含み得る。精製処理は、対象から採取した生物学的サンプルの型によっても異なり得る。精製した生物学的サンプルの収量及びクオリティーは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒなどの装置を介して評価することで、例えば、ＲＮＡの収量及びクオリティーが所定の閾値を超えるかどうかが決定され得る。
採取１：１日目、３日目、及び７日目に採取した午前８時及び午後８時のサンプル。
採取２：１日目、５日目、１０日目、及び１５日目の午前８時、午後１２時、午後４時、及び午後８時のサンプル。
採取３：１日目及び２日目の１日を通じて１２回採取（非反復）。
【０２９０】
Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＳＵＮＹ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｒｅ（ＳＵＮＹＭＡＣ）において、ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）低分子ＲＮＡライブラリー調製キットプロトコール（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に従ってＮｅｘｔＳｅｑ  ５００機器での次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を使用して唾液のｍｉＲＮＡ及び微生物含量の同定及び定量化を実施した。Ｐａｒｔｅｋ  ＦｌｏｗソフトウェアにおいてＳＨＲＲｉＭＰ２（登録商標）アルゴリズムを使用してｍｉＲｂａｓｅ２１データベースへのＮＧＳリードのアライメントを実施することで成熟ｍｉＲＮＡを同定した。Ｋｒａｋｅｎソフトウェア及びＯｎｅＣｏｄｅｘ（登録商標）ソフトウェアを使用してマイクロバイオームリードのマッピングを実施することで、両方に一貫して見られる微生物のみを同定した。「リード」または「リード数」という用語は、ｍｉＲＮＡまたはマイクロバイオームの発現データを調整してサンプル間の変動を考慮するための任意の方法に適用されることが理解されよう。こうした方法は、唾液に予測可能なレベルで常に存在するある特定の対照ｍｉＲＮＡまたは対照代謝物の発現レベルを使用して、サンプルにおけるすべてのｍｉＲＮＡのレベルを正規化することで、当該レベルの比較精度を向上させることができるものなどである。
【０２９１】
代替の実施形態では、蛍光法を使用してｍｉＲＮＡ及び／またはマイクロバイオームのレベルが決定され得る。１つの例では、本明細書に記載の標的ｍｉＲＮＡのいくつかまたはすべてを標的とする別々のリガンド群が基材にまとめて固定化され得る。標的ｍｉＲＮＡ配列及び標的マイクロバイオーム配列には、それがリガンドに結合する前または後に、蛍光タグ（または非蛍光色素）が付加され得る。この用途では、それぞれのリガンド群の相対強度が、存在するｍｉＲＮＡ及び／またはマイクロバイオームの定量化尺度であり得る。この方法は、チップ型アッセイで実行され得る。他の適切なチップ型アッセイを使用することでも、ｍｉＲＮＡ及び／またはマイクロバイオームのレベルが決定され得る。
【０２９２】
統計解析
採取１及び採取２のサンプルセットにおいて二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施することで、採取時刻に応じて有意に変動するが、採取日による変動はないｍｉＲＮＡ及び微生物（日変動による影響を日常的に強く受けている可能性がある）を同定した。次に、こうしたｍｉＲＮＡ及び微生物のサブセットを第３のサンプルセットにおいて使用することで、多変量線形回帰を使用する採取時刻の予測精度を評価した。最も強い概日周期変動を示したｍｉＲＮＡをｃｉｒｃａＭｉＲと命名し、アノテーションされた全部で１３９の概日遺伝子の予測制御因子であるかについてＩｎｇｅｎｕｉｔｙ経路解析（ＩＰＡ）ソフトウェアを使用して調べた。次に、概日遺伝子を標的とするｃｉｒｃａＭｉＲが、最も強い概日変動微生物と関連するという証拠についてピアソン相関解析を使用して調べた。ｃｉｒｃａＭｉＲが標的とする遺伝子の機能を、その特定の生物学的機能についてＩＰＡソフトウェア及びｍｉＲｐａｔｈソフトウェアを使用して調べた。
【０２９３】
結果
エピジェネティックデータ（例えば、ｍｉＲＮＡ及び／またはマイクロバイオーム）に関連する統計量（例えば、分散、全分散、または平均分散）の差異、及び／またはエピジェネティックデータの発現レベル（例えば、リード数、蛍光など）の差異を使用することで、健康な対象（小児及び／または成人）と特定の疾患、障害、または状態を患う対象とを区別し得ることが暫定的な結果によって示された。本明細書に記載のシステム及び方法に基づいて区別することが可能な特定の疾患または障害は、限定はされないが、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、睡眠障害、及び／または外傷性脳損傷であり得る。いくつかの実施形態では、ある特定の対象（例えば、ＡＳＤ患者）は、正常な健康対象と比較して小さな平均分散を有し得る。他の実施形態では、ある特定の対象は、正常な健康対象と比較して大きな平均分散を有し得る。
【０２９４】
２４サンプルのデータセット：全部で３５のｍｉＲＮＡは、高度に有意な採取時刻効果（ＦＤＲ＜０．００１）を示したが、採取日の効果は示さなかった。
４８サンプルのデータセット：全部で４１のｍｉＲＮＡは、高度に有意な採取時刻効果（ＦＤＲ＜０．００１）を示したが、採取日の効果は示さなかった。
図３９に示されるように、１９のｍｉＲＮＡは、両方において共通して変化しており、これら１９のｍｉＲＮＡが第３のデータセットにおいて採取時刻を予測する能力を調べた。
【０２９５】
ｃｉｒｃａＭｉＲによる時刻予測
【表２８】
2020512016.tif 000039
【０２９６】
微生物知見
【表２９】
2020512016.tif 000040
【０２９７】
微生物による時刻予測
【表３０】
2020512016.tif 000041
【０２９８】
ｃｉｒｃａＭｉＲの他の機能
【表３１】
2020512016.tif 000042
【０２９９】
ｃｉｒｃａＭｉＲ及びマイクロバイオームは、表３２及び表３３に示される：
【表３２】
2020512016.tif 000043
【０３００】
【表３３】
2020512016.tif 000044
【０３０１】
表３２〜３３は、本明細書に記載の方法を使用して健康な対象を疾患または障害を有する対象と区別するために使用され得るｃｉｒｃａＭｉＲ及びマイクロバイオームを示す。さらに、上の表にあるｍｉＲＮＡのいずれかと同一のシード配列を共有する他のｍｉＲＮＡを使用することで、健康な対象が疾患または障害を有する対象と区別され得る。
【０３０２】
図４０では、３日（１日目、３日目、７日目）にまたがって４人の対象から２回／日（午前８時、午後８時）の頻度でサンプル採取した２４サンプルにおいて採取時刻に応じて変化した１９のｍｉＲＮＡについての発現データのヒートマップクラスタリングが示される。図４１では、４日（１日目、５日目、１０日目、１５日目）にまたがって３人の対象から４回／日（午前８時、午後１２時、午後４時、午後８時）の頻度でサンプル採取した４８サンプルにおいて採取時刻に応じて変化した１９のｍｉＲＮＡについての発現データのヒートマップクラスタリングが示される。図４２では、採取３（さまざまな時刻に採取を実施）の対象のうちの３人について示される、上位１９のｍｉＲＮＡのうちの１つの正規化データが示される。図４３では、採取３の対象のうちの１人のマイクロバイオームにおける種の絶対存在量が示される。図４４では、採取１及び採取２のサンプルの分析の結果、オーバーラップする有意に変化した微生物のベン図が示される。図４５Ａ〜Ｄでは、概日微生物とｃｉｒｃａＭｉＲとのピアソン相関行列が示される（ｃｉｒｃａＭｉＲと微生物との間にいくつかの広い相関が存在することに注目されたい（左下、右上））。
【０３０３】
結論
唾液のｍｉＲＮＡレベル及びマイクロバイオームレベルの一部は、強い概日パターンを示す。この知見は、非常に新規のものであり、これまでに説明されたことがない。唾液のｍｉＲＮＡ及び微生物のいくつかの間には、非常に有意な相関が存在する。ほとんどの唾液ｃｉｒｃａＭｉＲは、脳、代謝、及びがんの機能に関与する遺伝子に加えて、少なくとも１つまたは複数の概日遺伝子を標的とする。
【０３０４】
さらに、本開示は、２つ以上のｍｉＲＮＡプローブのプローブセットを含む、対象が疾患、障害、または状態を有するかどうかの決定に適したキットを企図する。それぞれのｍｉＲＮＡプローブは、本明細書に記載の特定のｍｉＲＮＡに対応するリボヌクレオチド配列を含み得る。１つの実施態様では、キットは、２つ以上のｍｉＲＮＡプローブに結合した固体支持体をさらに含み得る。１つの実施態様では、キットは、下記のもののうちの少なくとも１つをさらに含み得る：（ａ）負の対照としての使用に適した１つの無作為に生成されたｍｉＲＮＡ配列、（ｂ）全ＲＮＡ分解に対する標準化対照として使用される、ハウスキーピング遺伝子に由来する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列、または（ｃ）正の対照として使用される少なくとも１つの無作為に生成された配列。あるいは、プローブセットは、本明細書に記載の特定のマイクロバイオームに由来するＤＮＡ配列に対応するリボヌクレオチド配列を有するｍｉＲＮＡプローブを含み得る。
【０３０５】
本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することを目的とするものにすぎず、本発明の限定は意図されない。
【０３０６】
本明細書で使用される見出し（「背景技術」及び「発明の概要」など）ならびに小見出しは、本発明に含まれる論題の一般構成が意図されるものにすぎず、本発明の開示内容またはその任意の態様の限定は意図されない。具体的には、「背景技術」に開示される主題は、新規の技術を含み得、先行技術の記載を構成し得ない。「発明の概要」に開示される主題は、本技術またはその任意の実施形態の全範囲を網羅的または完全に開示するものではない。特定の有用性を有するものとして本明細書のセクション内に含まれる材料の分類または議論は、便宜上なされるものであり、当該材料が任意の所与の組成物において使用されるとき、当該材料が必ずまたはもっぱら本明細書でのその分類に従って機能しなくてはならないと推論すべきではない。
【０３０７】
本明細書で使用される「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、別に文脈上明確に示されない限り、複数形も含むことが意図される。
【０３０８】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び／または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、本明細書で使用されるとき、記載の特徴、ステップ、操作、要素、及び／または成分の存在を特定するが、１つまたは複数の他の特徴、ステップ、操作、要素、成分、及び／またはその群の存在または追加を排除しないことがさらに理解されよう。
【０３０９】
本明細書で使用される「及び／または」という用語は、関連する記載項目のうちの１つまたは複数のいずれか及びすべての組み合わせを含み、「／」と略され得る。
【０３１０】
リンクは、ｈｔｔｐ：を削除するか、またはスペースもしくは下線付きスペースをｗｗｗの前に挿入することによって無効化されている。場合によっては、「最終アクセス」日にリンクを介して利用可能なテキストは、参照によって組み込まれ得る。
【０３１１】
本明細書で使用されるように、本明細書及び特許請求の範囲では、実施例において使用されるものを含めて、別段の明示的な指定がない限り、数字はすべて、「実質的に」、「約」、または「およそ」という言葉によって修飾される場合と同様に解釈され得、例え当該用語が明示的に記載されないとしてもそのように解釈され得る。「約」または「およそ」という語句は、大きさ及び／または位置を説明するときに使用されることで、記載の値及び／または位置が値及び／または位置の合理的な予測範囲内にあることを示し得る。例えば、数値は、記載の値（または値の範囲）＋／−０．１％の値、記載の値（または値の範囲）＋／−１％の値、記載の値（または値の範囲）＋／−２％の値、記載の値（または値の範囲）＋／−５％の値、記載の値（または値の範囲）＋／−１０％の値、記載の値（または値の範囲）＋／−１５％の値、記載の値（または値の範囲）＋／−２０％の値などを有し得る。本明細書に記載の数値範囲はいずれも、その中に含まれるすべての部分的範囲を含むことが意図される。
【０３１２】
特定のパラメーター（温度、分子量、重量パーセントなど）に対する値及び値の範囲の開示は、本明細書で有用な他の値及び値の範囲を排除するものではない。所与のパラメーターに対する２つ以上の特定の例示値は、当該パラメーターに対して請求され得る値の範囲の終点を定義し得ることが想定される。例えば、パラメーターＸが値Ａを有すると本明細書で例示され、値Ｚを有するとも例示されるのであれば、パラメーターＸは、約Ａ〜約Ｚの値の範囲を有し得ることが想定される。同様に、パラメーターに対する値の２つ以上の範囲の開示は（そのような範囲が入れ子のものであるか、オーバーラップするものであるか、または異なるものであるかにかかわらず）、開示の範囲の終点を使用して請求され得る値の範囲のすべての可能な組み合わせを含むことが想定される。例えば、パラメーターＸが１〜１０の範囲の値を有すると本明細書で例示されるのであれば、単なる例にすぎないが、１〜９、１〜８、１〜７、２〜９、２〜８、２〜７、３〜９、３〜８、３〜７、４〜６、または７〜１０、８〜１０、もしくは９〜１０を含めて、パラメーターＸに対する部分範囲も説明される。範囲は、その終点ならびに終点の内側の値を含み、例えば、０〜５という範囲は、０、＞０、１、２、３、４、＜５、及び５を含む。
【０３１３】
本明細書で使用される「好ましい」及び「好ましくは」という言葉は、ある特定の状況の下で、ある特定の利点を与える、本技術の実施形態を指す。しかしながら、同一または他の状況の下では、他の実施形態も好ましくあり得る。さらに、１つまたは複数の好ましい実施形態の記載は、他の実施形態が有用ではないことを暗示するものではなく、本技術の範囲から他の実施形態を排除することは意図されない。
【０３１４】
本明細書で言及される組成パーセントはすべて、別段の指定がない限り、全組成に占める重量によるものである。本明細書で使用される「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という言葉及びその異形は、非限定が意図され、その結果、リストにおける項目の記載は、本技術の材料、組成物、装置、及び方法において同様に有用であり得る他の同様の項目を排除するものではない。同様に、「できる」及び「得る」という用語ならびにその異形は、非限定が意図され、その結果、ある特定の要素または特徴を実施形態が含むことができるか、または含み得るという記載は、そうした要素または特徴を含まない、本発明の他の実施形態を排除するものではない。
【０３１５】
「第１の」及び「第２の」という用語は、さまざまな特徴／要素（ステップを含む）を説明するために本明細書で使用され得るが、こうした特徴／要素は、別に文脈上示されない限り、こうした用語によって限定されるべきではない。こうした用語は、１つの特徴／要素を別の特徴／要素と区別するために使用され得る。したがって、本発明の教示内容から逸脱することなく、後述の第１の特徴／要素は、第２の特徴／要素と呼ばれる可能性があり、同様に、後述の第２の特徴／要素は、第１の特徴／要素と呼ばれる可能性がある。
【０３１６】
説明及び特定の実施例は、本技術の実施形態を示す一方で、例示のみを目的とすることが意図され、本技術の範囲の限定は意図されない。さらに、記載の特徴を有する複数の実施形態の記載は、追加の特徴を有する他の実施形態、または記載の特徴の異なる組み合わせを含む他の実施形態を排除することは意図されない。特定の実施例は、本技術の組成物及び方法をどのように調製及び使用するかを例示することを目的として提供されており、別段の明示的な記載がない限り、本技術の所与の実施形態が、調製もしくは試験されたことがあるか、または調製もしくは試験されたことがないということを示すことは意図されない。
【０３１７】
上記の教示内容を踏まえると、本発明に対して多数の改変及び変形を行うことが可能である。したがって、添付の特許請求の範囲内で、本明細書で具体的に説明されるものとは別に本発明を実施できることが理解されよう。
【０３１８】
本明細書で言及される刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献はすべて、それらの全体が参照によって組み込まれる。さらに、材料、方法、及び実施例は、例示にすぎず、別段の指定がない限り、限定は意図されない。
【０３１９】
文献：
１．Ｚｗａｉｇｅｎｂａｕｍ  Ｌ，Ｂａｕｍａｎ  ＭＬ，Ｆｅｉｎ  Ｄ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｋ，Ｂｕｉｅ  Ｔ，Ｄａｖｉｓ  ＰＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｅａｒｌｙ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ａｕｔｉｓｍ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ：Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．２０１５；１３６（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １）：Ｓ４１−Ｓ５９．
２．Ｄａｗｓｏｎ  Ｇ，Ｒｏｇｅｒｓ  Ｓ，Ｍｕｎｓｏｎ  Ｊ，Ｓｍｉｔｈ  Ｍ，Ｗｉｎｔｅｒ  Ｊ，Ｇｒｅｅｎｓｏｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ａｎ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｏｄｄｌｅｒｓ  Ｗｉｔｈ  Ａｕｔｉｓｍ：Ｔｈｅ  Ｅａｒｌｙ  Ｓｔａｒｔ  Ｄｅｎｖｅｒ  Ｍｏｄｅｌ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．２０１０；１２５（１）：ｅ１７−ｅ２３．
３．Ｍａｃａｒｉ  ＳＬ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｄ，Ｇｅｎｇｏｕｘ  ＧＷ，Ｓａｕｌｎｉｅｒ  ＣＡ，Ｋｌｉｎ  ＡＪ，Ｃｈａｗａｒｓｋａ  Ｋ．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｓｔａｔｕｓ  ｆｒｏｍ  １２  ｔｏ  ２４  ｍｏｎｔｈｓ  ｉｎ  ｉｎｆａｎｔｓ  ａｔ  ｒｉｓｋ  ｆｏｒ  Ａｕｔｉｓｍ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ：ａ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｒｅｐｏｒｔ．Ｊ  Ａｕｔｉｓｍ  Ｄｅｖ  Ｄｉｓｏｒｄ  ２０１２；４２：２６３６−４７．
４．Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｃｈｅｃｋｌｉｓｔ  ｆｏｒ  Ａｕｔｉｓｍ  ｉｎ  Ｔｏｄｄｌｅｒｓ，Ｒｅｖｉｓｅｄ（Ｍ−ＣＨＡＴ−Ｒ（商標））．Ａｕｔｉｓｍ  Ｓｐｅａｋｓ，２０１５．（Ａｃｃｅｓｓｅｄ  Ｄｅｃ．２８，２０１５，ａｔ  Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｓｅｃｕｒｅ：／／ＷｏｒｌｄＷｉｄｅＷｅｂ．ａｕｔｉｓｍｓｐｅａｋｓ．ｏｒｇ／ｗｈａｔ−ａｕｔｉｓｍ／ｄｉａｇｎｏｓｉｓ／ｓｃｒｅｅｎ−ｙｏｕｒ−ｃｈｉｌｄ．）
５．Ｒｏｂｉｎｓ  ＤＬ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃａｒｅ  ｓｅｔｔｉｎｇｓ．Ａｕｔｉｓｍ  ２００８；１２：５３７−５６．
６．Ｇｏｌｄａｎｉ  ＡＡ，Ｄｏｗｎｓ  ＳＲ，Ｗｉｄｊａｊａ  Ｆ，Ｌａｗｔｏｎ  Ｂ，Ｈｅｎｄｒｅｎ  ＲＬ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ａｕｔｉｓｍ．Ｆｒｏｎｔ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２０１４；５：１００．
７．Ｄａｗｓｏｎ  Ｍ，Ｇｅｒｎｓｂａｃｈｅｒ  ＭＡ．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  ａｕｔｉｓｍ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｓ．Ｌａｎｃｅｔ  ２０１０；３７５：７２２−３；ａｕｔｈｏｒ  ｒｅｐｌｙ  ３．
８．ＭｏｎｔｅｒｅｙＢａｙＦｏｒｕｍ．Ａｌｌ  ｔｈａｔ  ｇｌｉｔｔｅｒｓ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｇｏｌｄ−ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＤＯＳ  ａｋｉｎ  ｔｏ  ｆｏｏｌ’ｓ  ｇｏｌｄ  ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｆｏｒ  ａｕｔｉｓｍ．Ｉｎ：Ｍｏｎｔｅｒｅｙ  Ｂａｙ  Ｆｏｒｕｍ  ２０１２．
９．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ＬＡ．Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｒｅｖｉｅｗ：Ｔｈｅ  Ａｕｔｉｓｍ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｓｃｈｅｄｕｌｅ（ＡＤＯＳ）．Ｉｎ：Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ  Ａｕｔｉｓｍ；２０１２．
１０．Ｄｕｒｋｉｎ  ＭＳ，Ｍａｅｎｎｅｒ  ＭＪ，Ｎｅｗｓｃｈａｆｆｅｒ  ＣＪ，ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｐａｒｅｎｔａｌ  ａｇｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ａｍ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  ２００８；１６８：１２６８−７６．
１１．Ｈｕａｎｇ  ＴＮ，Ｈｓｕｅｈ  ＹＰ．Ｂｒａｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  Ｔ−ｂｒａｉｎ−１  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｂｒａｉｎ  ｗｉｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｆｒｏｎｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２０１５；９：４０６．
１２．Ｓａｅｅｄｉ  Ｓａｒａｖｉ  ＳＳ，Ｄｅｈｐｏｕｒ  ＡＲ．Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｏｒｇａｎｏｃｈｌｏｒｉｎｅ  ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ，ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ，ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：Ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ２０１５．
１３．Ｍｏｈａｍｅｄ  Ｆｅｌ  Ｂ，Ｚａｋｙ  ＥＡ，Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ  ＡＢ，ｅｔ  ａｌ．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈａｉｒ  Ａｌｕｍｉｎｕｍ，Ｌｅａｄ，ａｎｄ  Ｍｅｒｃｕｒｙ  ｉｎ  ａ  Ｓａｍｐｌｅ  ｏｆ  Ａｕｔｉｓｔｉｃ  Ｅｇｙｐｔｉａｎ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ：Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｒｉｓｋ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｈｅａｖｙ  Ｍｅｔａｌｓ  ｉｎ  Ａｕｔｉｓｍ．Ｂｅｈａｖ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２０１５；２０１５：５４５６７４．
１４．Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＲＪ，Ｔａｎｃｒｅｄｉ  ＤＪ，Ｏｚｏｎｏｆｆ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｍａｔｅｒｎａｌ  ｐｅｒｉｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎａｌ  ｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎｔａｋｅ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｄｅｌａｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＣＨＡＲＧＥ（ＣＨｉｌｄｈｏｏｄ  Ａｕｔｉｓｍ  Ｒｉｓｋｓ  ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｔｕｄｙ．Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ２０１２；９６：８０−９．
１５．Ｔａｌｂｏｔｔ  ＥＯ，Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＬＰ，Ｒａｇｅｒ  ＪＲ，Ａｒｅｎａ  ＶＣ，Ｓｈａｒｍａ  ＲＫ，Ｓｔａｃｙ  ＳＬ．Ａｉｒ  ｔｏｘｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ：ｔｈｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ．Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ２０１５；１４：８０．
１６．Ｌｉｕ  Ｄ，Ｚｈａｎ  ＪＹ，Ｓｈａｏ  Ｊ．［Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ］．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ  Ｄａｎｇ  Ｄａｉ  Ｅｒ  Ｋｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ  ２０１５；１７：１１４７−５３．
１７．Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ  ＤＨ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｏｇｎ  Ｓｃｉ  ２０１１；１５：４０９−１６．
１８．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＲＥ，Ｌａｗ  ＪＫ，Ｙｅｎｏｋｙａｎ  Ｇ，ＭｃＧｒｅａｄｙ  Ｊ，Ｋａｕｆｍａｎｎ  ＷＥ，Ｌａｗ  ＰＡ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅ  ｏｆ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｍｏｎｇ  ２７７  ｔｗｉｎ  ｐａｉｒｓ．Ａｒｃｈ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ａｄｏｌｅｓｃ  Ｍｅｄ  ２００９；１６３：９０７−１４．
１９．Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏ  ＪＮ，Ｔｏｄｏｒｏｖ  Ａ，Ｈｉｌｔｏｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ａｕｔｉｓｍ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｈａｌｆ  ｓｉｂｌｉｎｇｓ：ｓｔｒｏｎｇ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＡＳＤ．Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２０１３；１８：１３７−８．
２０．Ｘｕ  ＬＭ，Ｌｉ  ＪＲ，Ｈｕａｎｇ  Ｙ，Ｚｈａｏ  Ｍ，Ｔａｎｇ  Ｘ，Ｗｅｉ  Ｌ．ＡｕｔｉｓｍＫＢ：ａｎ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ  ｏｆ  ａｕｔｉｓｍ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２０１２；４０：Ｄ１０１６−２２．
２１．Ｃｈａｈｒｏｕｒ  ＭＨ，Ｙｕ  ＴＷ，Ｌｉｍ  ＥＴ，ｅｔ  ａｌ．Ｗｈｏｌｅ−ｅｘｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｏｍｏｚｙｇｏｓｉｔｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｅ  ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ａｕｔｉｓｍ．ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１２；８：ｅ１００２６３５．
２２．Ｈｕｉ  Ｚ，Ｙｏｎｇｃｈａｏ  Ｚ，Ｙｏｎｇｑｉｎｇ  Ｚ．Ｒｅｃｅｎｔ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｙｉ  Ｃｈｕａｎ  ２０１５；３７：８４５−５４．
２３．Ｗｉｓｎｉｏｗｉｅｃｋａ−Ｋｏｗａｌｎｉｋ  Ｂ，Ｋａｓｔｏｒｙ−Ｂｒｏｎｏｗｓｋａ  Ｍ，Ｓｔａｎｋｉｅｗｉｃｚ  Ｐ．［Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｂａｓｅｓ  ｏｆ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ］．Ｍｅｄ  Ｗｉｅｋｕ  Ｒｏｚｗｏｊ  ２０１３；１７：２０７−２３．
２４．Ｌｉ  Ｊ，Ｙｏｕ  Ｙ，Ｙｕｅ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｇｅｎｅ  ＣＡＣＮＡ１Ａ  ｉｎ  Ａｕｔｉｓｍ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｎ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１５；１０：ｅ０１４２８８７．
２５．Ｈａｌｌ  Ｌ，Ｋｅｌｌｅｙ  Ｅ．Ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｔｏ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ａｕｔｉｓｍ．Ａｕｔｉｓｍ．２０１４；１８（８）：８７２−８１．
２６．Ｆｏｌｌｅｒｔ  Ｐ，Ｃｒｅｍｅｒ  Ｈ，Ｂｅｃｌｉｎ  Ｃ．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ａ  ｍａｔｔｅｒ  ｏｆ  ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｆｒｏｎｔ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１４；７：５．
２７．Ａｂｕ−Ｅｌｎｅｅｌ  Ｋ，Ｌｉｕ  Ｔ，Ｇａｚｚａｎｉｇａ  ＦＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ．Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００８；９：１５３−６１．
２８．Ｇｈａｈｒａｍａｎｉ  Ｓｅｎｏ  ＭＭ，Ｈｕ  Ｐ，Ｇｗａｄｒｙ  ＦＧ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｍｉＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ２０１１；１３８０：８５−９７．
２９．Ｔａｌｅｂｉｚａｄｅｈ  Ｚ，Ｂｕｔｌｅｒ  ＭＧ，Ｔｈｅｏｄｏｒｏ  ＭＦ．Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  ｅｘａｍｉｎｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｎ  ａｕｔｉｓｍ．Ａｕｔｉｓｍ  Ｒｅｓ  ２００８；１：２４０−５０．
３０．Ｓａｒａｃｈａｎａ  Ｔ，Ｚｈｏｕ  Ｒ，Ｃｈｅｎ  Ｇ，Ｍａｎｊｉ  ＨＫ，Ｈｕ  ＶＷ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄ  ２０１０；２：２３．
３１．Ｈｉｃｋｓ  ＳＤ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  ＦＡ．Ａ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  Ａｕｔｉｓｍ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｆｒｏｎｔ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２０１６；７：１７６．
３２．Ｂａｎｅｒｊｅｅ−Ｂａｓｕ  Ｓ，Ｌａｒｓｅｎ  Ｅ，Ｍｕｅｎｄ  Ｓ．Ｃｏｍｍｏｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ＡＳＤ  Ｇｅｎｅｓ．Ｆｒｏｎｔ  Ｎｅｕｒｏｌ  ２０１４；５：２０５．
３３．Ｂａｒｏｎ  ＣＡ，Ｌｉｕ  ＳＹ，Ｈｉｃｋｓ  Ｃ，Ｇｒｅｇｇ  ＪＰ．Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｓ  ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｕｔｉｓｍ．Ｊ  Ａｕｔｉｓｍ  Ｄｅｖ  Ｄｉｓｏｒｄ  ２００６；３６：９７３−８２．
３４．Ｈｉｃｋｓ  ＳＤ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｊ，Ｃａｒｎｅｙ  ＭＣ，Ｂｒａｍｌｅｙ  Ｈ，Ｏｌｙｍｐｉａ  ＲＰ，Ｌｏｅｆｆｅｒｔ  ＡＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｌｉｖａ  ａｎｄ  Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  Ｆｌｕｉｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｔｒａｕｍａｔｉｃ  Ｂｒａｉｎ  Ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．２０１７．
３５．Ｓｕｎ  Ｅ，Ｓｈｉ  Ｙ．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ：Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｂｉｇ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．２０１５；２６８：４６−５３．
３６．Ａｎｄｅｒ  ＢＰ，Ｂａｒｇｅｒ  Ｎ，Ｓｔａｍｏｖａ  Ｂ，Ｓｈａｒｐ  ＦＲ，Ｓｃｈｕｍａｎｎ  ＣＭ．Ａｔｙｐｉｃａｌ  ｍｉＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｃｏｒｔｅｘ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ，ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ，ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｍｏｌ  Ａｕｔｉｓｍ．２０１５；６：３７．
３７．Ｍｏｒ  Ｍ，Ｎａｒｄｏｎｅ  Ｓ，Ｓａｍｓ  ＤＳ，Ｅｌｌｉｏｔｔ  Ｅ．Ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉＲ−１４２  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎｄ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｔｈａｔ  ｔａｒｇｅｔ  ｔｈｅ  ｏｘｙｔｏｃｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｕｔｉｓｍ  ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ  ｃｏｒｔｅｘ．Ｍｏｌ  Ａｕｔｉｓｍ．２０１５；６：４６．
３８．Ｓａｒａｃｈａｎａ  Ｔ，Ｚｈｏｕ  Ｒ，Ｃｈｅｎ  Ｇ，Ｍａｎｊｉ  ＨＫ，Ｈｕ  ＶＷ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄ．２０１０；２（４）：２３．
３９．Ｇｈａｈｒａｍａｎｉ  Ｓｅｎｏ  ＭＭ，Ｈｕ  Ｐ，Ｇｗａｄｒｙ  ＦＧ，Ｐｉｎｔｏ  Ｄ，Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＣＲ，Ｃａｓａｌｌｏ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｍｉＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２０１１；１３８０：８５−９７．
４０．Ｈｉｃｋｓ  ＳＤ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  ＦＡ．Ａ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  Ａｕｔｉｓｍ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｆｒｏｎｔ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２０１６；７：１７６．
４１．Ｍｕｎｄａｌｉｌ  Ｖａｓｕ  Ｍ，Ａｎｉｔｈａ  Ａ，Ｔｈａｎｓｅｅｍ  Ｉ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｋ，Ｙａｍａｄａ  Ｋ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｒｕｍ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｉｓｍ．Ｍｏｌ  Ａｕｔｉｓｍ．２０１４；５：４０．
４２．Ｏｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ＮＡ，ＭｃＣｌｉｓｈ  ＤＫ．Ｓａｍｐｌｅ  ｓｉｚｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｂｉｎｏｒｍａｌ  ＲＯＣ  ｃｕｒｖｅ  ｉｎｄｉｃｅｓ．Ｓｔａｔ  Ｍｅｄ．１９９７；１６：１５２９−４２．
４３．Ｇａｌｌｏ  Ａ，Ｔａｎｄｏｎ  Ｍ，Ａｌｅｖｉｚｏｓ  Ｉ，Ｉｌｌｅｉ  ＧＧ．Ｔｈｅ  ｍａｊｏｒｉｔｙ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｓａｌｉｖａ  ｉｓ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  ｉｎ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ．ＰＬＯＳ  Ｏｎｅ  ２０１２；７：ｅ３０６７９．
４４．Ｒｏｄｉｅｒ  ＰＭ，Ｉｎｇｒａｍ  ＪＬ，Ｔｉｓｄａｌｅ  Ｂ，Ｎｅｌｓｏｎ  Ｓ，Ｒｏｍａｎｏ  Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｉｃａｌ  ｏｒｉｇｉｎ  ｆｏｒ  ａｕｔｉｓｍ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ａｎｏｍａｌｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｒａｎｉａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｍｏｔｏｒ  ｎｕｃｌｅｉ．Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １９９６；３７０：２４７−６１．
４５．Ｍｕｌｌｅ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｈａｒｐ，Ｗ．Ｇ．，＆  Ｃｕｂｅｌｌｓ，Ｊ．Ｆ．，Ｔｈｅ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ：ａ  ｎｅｗ  ｆｒｏｎｔｉｅｒ  ｉｎ  ａｕｔｉｓｍ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  Ｅｅｐｏｒｔｓ，１５（２），３３７（２０１３）．
４６．Ａｄａｍｓ，Ｊａｍｅｓ  Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｆｌｏｒａ  ａｎｄ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｔａｔｕｓ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｉｓｍ−ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｔｏ  ｔｙｐｉｃａｌ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ．ＢＭＣ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１．１（２０１１）：２２．
４７．Ｋａｎｇ，Ｄ．Ｗ．，Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｇ．，Ｉｌｈａｎ，Ｚ．Ｅ．，Ｗａｌｌｓｔｒｏｍ，Ｇ．，ＬａＢａｅｒ，Ｊ．，Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ｂ．，＆  Ｋｒａｊｍａｌｎｉｋ−Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．（２０１３）．Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｆｅｒｍｅｎｔｅｒｓ  ｉｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ  ｏｆ  ａｕｔｉｓｔｉｃ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ，８（７），ｅ６８３２２．
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４９．Ｌｕｎａ  ＲＡ，Ｍａｇｅｅ  Ａ，Ｒｕｎｇｅ  ＪＫ，Ｖｅｎｋａｔａｃｈａｌａｍ  Ａ，ＲｕｂｉｏＧｏｎｚａｌｅｓ  Ｍ，Ｖｅｒｓａｌｏｖｉｃ  Ｊ．Ａ  Ｃａｓｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｕｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ｉｎ  ＡＳＤ：Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ＧＩ  ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  Ｓｙｍｐｔｏｍｓ．Ｉｎ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｆｏｒ  Ａｕｔｉｓｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＩＭＦＡＲ）．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ；２０１６．
５０．Ｓｔｒａｔｉ  Ｆ，Ｃａｖａｌｉｅｒｉ  Ｄ，Ａｌｂａｎｅｓｅ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  ｅｖｉｄｅｎｃｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｉｎ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ２０１７；５：２４．
５１．Ｌｅｄｆｏｒｄ  ＪＲ，Ｇａｓｔ  ＤＬ．Ｆｅｅｄｉｎｇ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｉｓｍｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｆｏｃｕｓ  Ａｕｔｉｓｍ  Ｏｔｈｅｒ  Ｄｅｖ  Ｄｉｓａｂｌ．２００６；２１：１５３−６６．
５２．Ｓｈａｒｐ  ＷＧ，Ｊａｑｕｅｓｓ  ＤＬ，Ｌｕｃｋｅｎｓ  ＣＴ．Ｍｕｌｔｉ−ｍｅｔｈｏｄ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｍｏｎｇ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｒｅｓ  Ａｕｔｉｓｍ  Ｓｐｅｃｔｒ  Ｄｉｓｏｒｄ．２０１２；７：５６−６５．
５３．Ｈｉｌｌ  ＡＰ，Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ  ＫＥ，Ｆｏｍｂｏｎｎｅ  Ｅ．Ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  Ａｕｔｉｓｍ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．２０１５  Ｏｃｔ  １：ｐｅｄｓ−２０１５．
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５５．Ｈｅｄｉｇｅｒ  ＭＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｂｏｎｅ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｉｎ  ｂｏｙｓ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｉｓｍ  ｏｒ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｊ  Ａｕｔｉｓｍ  Ｄｅｖ  Ｄｉｓｏｒｄ．２００８；３８：８４８−５６．
５６．Ｂｕｆｆｉｎｇｔｏｎ，Ｓｈｅｌｌｙ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｏｃｉａｌ  ａｎｄ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｄｅｆｉｃｉｔｓ  ｉｎ  ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ．Ｃｅｌｌ  １６５．７（２０１６）：１７６２−１７７５．
５７．Ｋａｎｇ，Ｄ．Ｗ．，Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ｂ．，Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ａ．Ｃ．，Ｂｏｒｏｄｙ，Ｔ．，Ｃｈｉｔｔｉｃｋ，Ｌ．，Ｆａｓａｎｏ，Ａ．，．．．＆  Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｅ．Ｌ．（２０１７）．
５８．Ｄａｌｍａｓｓｏ，Ｇ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｈ．Ｔ．Ｔ．，Ｙａｎ，Ｙ．，Ｌａｒｏｕｉ，Ｈ．，Ｃｈａｒａｎｉａ，Ｍ．Ａ．，Ａｙｙａｄｕｒａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｈｏｓｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｉａ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，６（４），ｅ１９２９３（２０１１）．
５９．Ｚｉａｔｓ  ＭＮ，Ｒｅｎｎｅｒｔ  ＯＭ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ．Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２０１４；１９：８４８−５２．
６０．Ｄｅ  Ｆｉｌｉｐｐｏ  Ｃ，Ｃａｖａｌｉｅｒｉ  Ｄ，Ｄｉ  Ｐａｏｌａ  Ｍ，Ｒａｍａｚｚｏｔｔｉ  Ｍ，Ｐｏｕｌｌｅｔ  ＪＢ，Ｍａｓｓａｒｔ  Ｓ，Ｃｏｌｌｉｎｉ  Ｓ，Ｐｉｅｒａｃｃｉｎｉ  Ｇ，Ｌｉｏｎｅｔｔｉ  Ｐ，Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｄｉｅｔ  ｉｎ  ｓｈａｐｉｎｇ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｆｒｏｍ  Ｅｕｒｏｐｅ  ａｎｄ  ｒｕｒａｌ  Ａｆｒｉｃａ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１０  Ａｕｇ  １７；１０７（３３）．
６１．Ｋａｎｇ  Ｄ−Ｗ，Ｐａｒｋ  ＪＧ，Ｉｌｈａｎ  ＺＥ，Ｗａｌｌｓｔｒｏｍ  Ｇ，ＬａＢａｅｒ  Ｊ，Ａｄａｍｓ  ＪＢ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｍｉｃｒｏｆｌｏｒａ  ｏｆ  Ａｕｔｉｓｔｉｃ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（７）：ｅ６８３２２．
６２．Ｇａｒｇａｒｏ  ＢＡ，Ｒｉｎｅｈａｒｔ  ＮＪ，Ｂｒａｄｓｈａｗ  ＪＬ，Ｔｏｎｇｅ  ＢＪ，Ｓｈｅｐｐａｒｄ  ＤＭ．Ａｕｔｉｓｍ  ａｎｄ  ＡＤＨＤ：ｈｏｗ  ｆａｒ  ｈａｖｅ  ｗｅ  ｃｏｍｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｍｏｒｂｉｄｉｔｙ  ｄｅｂａｔｅ？  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｂｉｏｂｅｈａｖ  Ｒｅｖ．２０１１；３５（５）：１０８１−８．
６３．Ｍｏｌｌｏｙ  ＣＡ，Ｍａｎｎｉｎｇ−Ｃｏｕｒｔｎｅｙ  Ｐ．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｉｓｍ  ａｎｄ  ａｕｔｉｓｔｉｃ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ａｕｔｉｓｍ．２００３；７（２）：１６５−７１．
６４．Ｘｉａ  Ｊ，Ｐｓｙｃｈｏｇｉｏｓ  Ｎ，Ｙｏｕｎｇ  Ｎ，Ｗｉｓｈａｒｔ  ＤＳ．ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ：ａ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ  ｄａｔａ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００９；３７（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ６５２−６０．
６５．Ｖｌａｃｈｏｓ  ＩＳ，Ｚａｇｇａｎａｓ  Ｋ，Ｐａｒａｓｋｅｖｏｐｏｕｌｏｕ  ＭＤ，Ｇｅｏｒｇａｋｉｌａｓ  Ｇ，Ｋａｒａｇｋｏｕｎｉ  Ｄ，Ｖｅｒｇｏｕｌｉｓ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．ＤＩＡＮＡ−ｍｉＲＰａｔｈ  ｖ３．０：ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｓｕｐｐｏｒｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１５；４３（Ｗ１）：Ｗ４６０−６．
６６．Ｓｚｋｌａｒｃｚｙｋ  Ｄ，Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ  Ａ，Ｗｙｄｅｒ  Ｓ，Ｆｏｒｓｌｕｎｄ  Ｋ，Ｈｅｌｌｅｒ  Ｄ，Ｈｕｅｒｔａ−Ｃｅｐａｓ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．ＳＴＲＩＮＧ  ｖ１０：ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ，ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｏｖｅｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅｅ  ｏｆ  ｌｉｆｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１５；４３（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ４４７−５２．
６７．Ｈｕａｎｇ  Ｆ，Ｌｏｎｇ  Ｚ，Ｃｈｅｎ  Ｚ，Ｌｉ  Ｊ，Ｈｕ  Ｚ，Ｑｉｕ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ａｕｔｉｓｍ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ＭｉＲＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１５；１０（６）：ｅ０１２９０５２．
６８．Ｗｕ  ＹＥ，Ｐａｒｉｋｓｈａｋ  ＮＮ，Ｂｅｌｇａｒｄ  ＴＧ，Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ  ＤＨ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ，ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｅｓ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１６；１９（１１）：１４６３−７６．
６９．Ｎｇｕｙｅｎ  ＬＳ，Ｌｅｐｌｅｕｘ  Ｍ，Ｍａｋｈｌｏｕｆ  Ｍ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｃ，Ｆｒｅｇｅａｃ  Ｊ，Ｓｉｑｕｉｅｒ−Ｐｅｒｎｅｔ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｌｉｖｉｎｇ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｍｉＲＮＡｓ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｆｏｒ  ａｕｔｉｓｍ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｍｏｌ  Ａｕｔｉｓｍ．２０１６；７：１．
７０．Ｈｉｃｋｓ  ＳＤ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  ＦＡ．Ａ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  Ａｕｔｉｓｍ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｆｒｏｎｔ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２０１６；７：１７６．
７１．Ｓｃｈｒｅｃｋ  ＫＡ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｋ，Ｓｍｉｔｈ  ＡＦ．Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｅａｔｉｎｇ  ｂｅｈａｖｉｏｒｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｕｔｉｓｍ．Ｊ  Ａｕｔｉｓｍ  Ｄｅｖ  Ｄｉｓｏｒｄ．２００４；３４（４）：４３３−８．
７２．Ｖｕｏｎｇ  ＨＥ，Ｈｓｉａｏ  ＥＹ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｇｕｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ｉｎ  Ａｕｔｉｓｍ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２０１７；８１（５）：４１１−２３．
７３．Ｓｔｒｕｚｙｃｋａ  Ｉ．Ｔｈｅ  ｏｒａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ｉｎ  ｄｅｎｔａｌ  ｃａｒｉｅｓ．Ｐｏｌ  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１４；６３（２）：１２７−３５．
７４．Ｔｉｅｒｎｅｙ  ＣＤ，Ｋｕｒｔｚ  Ｍ，Ｓｏｕｄｅｒｓ  Ｈ．Ｃｌｅａｒ  ａｓ  ｍｕｄ：ａｎｏｔｈｅｒ  ｌｏｏｋ  ａｔ  ａｕｔｉｓｍ，ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ａｐｒａｘｉａ  ｏｆ  ｓｐｅｅｃｈ  ａｎｄ  ａｕｄｉｔｏｒｙ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｅｄｉａｔｒ．２０１２；２４（３）：３９４−９．
７５．Ｃｅｒｍａｋ  ＳＡ，Ｃｕｒｔｉｎ  Ｃ，Ｂａｎｄｉｎｉ  ＬＧ．Ｆｏｏｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｊ  Ａｍ  Ｄｉｅｔ  Ａｓｓｏｃ．２０１０；１１０（２）：２３８−４６．
７６．Ｊｅｓｓｅｎ  ＮＡ，Ｍｕｎｋ  ＡＳ，Ｌｕｎｄｇａａｒｄ  Ｉ，Ｎｅｄｅｒｇａａｒｄ  Ｍ．Ｔｈｅ  Ｇｌｙｍｐｈａｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ａ  Ｂｅｇｉｎｎｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓ．２０１５；４０（１２）：２５８３−９９．
７７．Ｍｉａｎｏ  Ｓ，Ｇｉａｎｎｏｔｔｉ  Ｆ，Ｃｏｒｔｅｓｉ  Ｆ．Ｓｌｅｅｐ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；２０１６．１１１−２８  ｐ．
７８．Ｃｈａｒｍａｎ  Ｔ，Ｂａｉｒｄ  Ｇ，Ｓｉｍｏｎｏｆｆ  Ｅ，Ｃｈａｎｄｌｅｒ  Ｓ，Ｄａｖｉｓｏｎ−Ｊｅｎｋｉｎｓ  Ａ，Ｓｈａｒｍａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｔｗｏ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ  ｉｎ  ＵＫ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ｃｈｉｌｄ  ｈｅａｌｔｈ  ｓｅｒｖｉｃｅｓ．Ｄｅｖ  Ｍｅｄ  Ｃｈｉｌｄ  Ｎｅｕｒｏｌ．２０１６；５８（４）：３６９−７５．
７９．Ｆｒａｚｉｅｒ  ＴＷ，Ｋｌｉｎｇｅｍｉｅｒ  ＥＷ，Ｂｅｕｋｅｍａｎｎ  Ｍ，Ｓｐｅｅｒ  Ｌ，Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ  Ｌ，Ｐａｒｉｋｈ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  Ａｕｔｉｓｍ  Ｒｉｓｋ  Ｉｎｄｅｘ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒｅｍｏｔｅ  Ｅｙｅ  Ｔｒａｃｋｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄ  ＆  Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２０１６；５５（４）：３０１−９．
８０．Ｌｏｔｈ  Ｅ，Ｓｐｏｏｒｅｎ  Ｗ，Ｈａｍ  ＬＭ，Ｉｓａａｃ  ＭＢ，Ａｕｒｉｃｈｅ−Ｂｅｎｉｃｈｏｕ  Ｃ，Ｂａｎａｓｃｈｅｗｓｋｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ａｕｔｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１６；１５（１）：７０−３．
８１．Ｗｏｌｆｆ  ＪＪ，Ｇｕ  Ｈ，Ｇｅｒｉｇ  Ｇ，Ｅｌｉｓｏｎ  ＪＴ，Ｓｔｙｎｅｒ  Ｍ，Ｇｏｕｔｔａｒｄ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｗｈｉｔｅ  ｍａｔｔｅｒ  ｆｉｂｅｒ  ｔｒａｃｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ６  ｔｏ  ２４  ｍｏｎｔｈｓ  ｉｎ  ｉｎｆａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｉｓｍ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２０１２；１６９（６）：５８９−６００．
８２．Ｖｅｅｎｓｔｒａ−ＶａｎｄｅｒＷｅｅｌｅ  Ｊ，Ｂｌａｋｅｌｙ  ＲＤ．Ｎｅｔｗｏｒｋｉｎｇ  ｉｎ  ａｕｔｉｓｍ：ｌｅｖｅｒａｇｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ，ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ａｎｄ  ｍｏｄｅｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｎｅｗ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．２０１２；３７（１）：１９６−２１２．
８３．Ｐｅｔｅｒｓ  ＪＭ，Ｔａｑｕｅｔ  Ｍ，Ｖｅｇａ  Ｃ，Ｊｅｓｔｅ  ＳＳ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ＩＳ，Ｔａｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｒａｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｉｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｉｃ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｓｙｎｄｒｏｍｉｃ  ａｕｔｉｓｍ：ａ  ｇｒａｐｈ  ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＥＥＧ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ．ＢＭＣ  Ｍｅｄ．２０１３；１１：５４．
８４．Ａｍｂｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ，Ｎａｔｕｒｅ，４３１（７００６）：３５０−５（Ｓｅｐ  １６，２００４）．
８５．Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ：ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｅｌｌ，１１６（２）：２８１−９７（Ｊａｎ  ２３，２００４）．
８６．Ｓｏｎ  ＪＳ，Ｚｈｅｎｇ  ＬＪ，Ｒｏｗｅｈｌ  ＬＭ，Ｔｉａｎ  Ｘ，Ｚｈａｎｇ  Ｙ，Ｚｈｕ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｆｅｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｉｎ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  Ａｕｔｉｓｍ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｔｙｐｉｃａｌ  Ｓｉｂｌｉｎｇｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｉｍｏｎｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １０（１０）：ｅ０１３７７２５．
８７．Ｇｒｅａｖｅｓ  Ｅ，Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｆ，Ｅｓｎａｌ−Ｚｕｆｉａｕｒｒｅ  Ａ，Ｇｉａｋｏｕｍｅｌｏｕ  Ｓ，Ｈｏｒｎｅ  ＡＷ，Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ＰＴ．Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＲ）ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｎｅｕｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｒｅｐｅｌｌｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ  ＳＬＩＴ３．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２０１４；１５５（１０）：４０１５−２６．
８８．Ｈｉｃｋｓ  ＳＤ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｊ，Ｃａｒｎｅｙ  ＭＣ，Ｂｒａｍｌｅｙ  Ｈ，Ｏｌｙｍｐｉａ  ＲＰ，Ｌｏｅｆｆｅｒｔ  ＡＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｌｉｖａ  ａｎｄ  Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  Ｆｌｕｉｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｔｒａｕｍａｔｉｃ  Ｂｒａｉｎ  Ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．，２０１８  Ｊａｎ  １；３５（１）：６４−７２．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｎｅｕ．２０１７．５１１１．Ｅｐｕｂ  ２０１７  Ｏｃｔ  ２７．
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４５Ｃ】
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【図４５Ｄ】
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【国際調査報告】
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