(57)【要約】本明細書では、多能性幹細胞の分化を促進するための組成物、方法、およびキットが提供される。
2020518277.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞の分化を誘導する方法であって、前記方法は、
ａ）ｉ）多能性幹細胞を含む細胞培養物と、
ｉｉ）アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）２／３シグナル伝達の阻害剤であって、ノギン、ドルソモルフィン、ＬＤＮ−１９３１８９、同様の阻害機能を有する化合物、およびそれらの混合物からなる群から選択される前記アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）２／３シグナル伝達の阻害剤と、
ｉｉｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達の阻害剤であって、ＳＵ５４０２、ＢＧＪ３９８、ＦＧＦタンパク質ファミリーのメンバーまたはそれらの受容体に対する抗体、同様の阻害機能を有する化合物およびそれらの混合物からなる群から選択される、前記線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達の阻害剤、または
ｉｖ）ＦＧＦシグナル伝達の阻害剤に代えて、あるいはＦＧＦシグナル伝達の阻害剤と組み合わせた細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）シグナル伝達の阻害剤であって、ＰＤ０３２５９０１または同様の阻害機能を有する化合物およびそれらの混合物からなる群から選択される細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）シグナル伝達の阻害剤と、
を提供することと、
ｂ）ｉ）の多能性幹細胞を、ｉｉ）のＡＬＫ２／３の阻害剤と、ｉｉｉ）のＦＧＦの阻害剤、およびｉｖ）のＥＲＫシグナル伝達の阻害剤のうちの少なくとも一方と、を含む培地に同時に曝露することと、
ｃ）前記接触した多能性幹細胞の分化を誘導して、培養した前部外胚葉細胞の集団を生成することと、
を含む方法。
【請求項２】
前記前部外胚葉が、分化細胞の前記集団の少なくとも１０％を構成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記原始外胚葉が、前記阻害剤への曝露の２４時間以内に生じる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、体性幹細胞、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前部外胚葉細胞の前記集団が、中枢神経系（ＣＮＳ）前駆細胞、パターン形成可能な前駆細胞、ニューロン、グリア、および、表皮、神経堤および神経中胚葉の派生物からなる群より選択される細胞にさらに分化する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
幹細胞がヒト幹細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法であって、さらに、前記外胚葉を単離することを含む方法。
【請求項８】
ＡＬＫ２／３シグナル伝達の１つ以上の阻害剤、ＥＲＫシグナル伝達の１つ以上の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ（ＭＥＫ）１／２の１つ以上の阻害剤、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）１、２、３および／または４の１つ以上の阻害剤、ＷＮＴの１つ以上の阻害剤およびＷＮＴの１つ以上の活性化剤、のうちの少なくとも１つを含むキット。
【請求項９】
多能性幹細胞をさらに含む、請求項８記載のキット。
【請求項１０】
多能性幹細胞が、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、体性幹細胞、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群より選択される、請求項９記載のキット。
【請求項１１】
多能性幹細胞がヒトのものである、請求項９または請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記外胚葉をＷＮＴシグナル伝達の阻害剤と接触させることを含む、前記外胚葉をＰＡＸ６／ＦＯＸＧ１／ＳＩＸ３／ＯＴＸ２を発現する終脳神経上皮にパターン化することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記外胚葉をＷＮＴシグナル伝達の阻害剤およびソニックヘッジホッグ経路の活性化剤のうちの少なくとも一方と接触させることを含む、前記外胚葉をＰＡＸ６／ＦＯＸＧ１／ＳＩＸ３／ＯＴＸ２およびＮＫＸ２．１および／またはＮＫＸ２．２を発現する腹側終脳神経上皮にパターン化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記外胚葉をＷＮＴシグナル伝達の少なくとも１つの活性化剤と接触させることを含む、前記外胚葉をＰＡＸ６／ＯＴＸ２を発現する間脳神経上皮にパターン化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
幹細胞が体性幹細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記外胚葉をＷＮＴシグナル伝達の少なくとも１つの活性化剤と接触させることを含む、前記外胚葉をＰＡＸ６を発現しないがＯＴＸ２およびＰＡＸ５の少なくとも一方を発現する中脳神経上皮にパターン化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記外胚葉を線維芽細胞成長因子受容体ファミリーの活性化剤と接触させることをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記外胚葉をソニックヘッジホッグ経路の活性化剤と接触させることをさらに含む、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
中脳変換が、ＰＡＸ６のダウンレギュレーション、ＯＴＸ２の維持、およびＰＡＸ５のアップレギュレーションを介して２４時間以内に起こる、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
中脳変換が、ＰＡＸ６のダウンレギュレーション、ＯＴＸ２の維持、およびＰＡＸ５のアップレギュレーションを介して、１〜１００％の効率で４８時間以内に起こる、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１６〜２０のいずれか一項で形成された中脳神経上皮をＯＴＸ２／ＰＡＸ５／ＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａを発現する中脳底板にパターン化する方法であって、ＯＴＸ２／ＰＡＸ５／ＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａを発現する中脳底板を得るために前記中脳神経上皮をソニックヘッジホッグ経路の活性化剤と接触させることを含む、方法。
【請求項２２】
前記中脳神経上皮を線維芽細胞成長因子ファミリーおよび／または下流のＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達の阻害剤と接触させることをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記中脳神経上皮をＷＮＴシグナル伝達に対する阻害剤と接触させることをさらに含む、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記中脳神経上皮をＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤と接触させることをさらに含む、請求項２１〜２２または２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
中脳神経上皮の変換が２４〜４８時間以内に起こる、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の中脳神経上皮を未成熟ニューロンに分化させる方法であって、前記中脳神経上皮をＮｕｒｒ１、ベータｉｉｉチューブリン、チロシンヒドロキシラーゼまたはそれらの組み合わせと接触させることを含む方法。
【請求項２７】
前記中脳神経上皮をノッチ経路の１つ以上の阻害剤と接触させることをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記中脳神経上皮を、ニューロンの生存促進因子ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４またはそれらの組み合わせと接触させることをさらに含む、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記中脳神経上皮をＳＭＡＤシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることをさらに含む、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記中脳神経上皮を骨形態形成タンパク質経路の活性化剤と接触させることを含む、前記中脳神経上皮をＰＡＸ３／ＳＯＸ１０／ＳＯＸ９／ＯＴＸ２またはＰＡＸ３／ＳＯＸ１０／ＳＯＸ９／ＯＴＸ２／ＰＡＸ５を発現する頭蓋神経堤幹細胞に変換することをさらに含む、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記中脳神経上皮をＦＧＦシグナル伝達の阻害剤と接触させることをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
神経堤幹細胞の変換が２４〜４８時間以内に起こる、請求項３０または請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
幹細胞の分化を誘導する方法であって、前記方法は、
ａ）ｉ）多能性幹細胞を含む細胞培養物と、
ｉｉ）アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）２／３シグナル伝達の阻害剤と、
ｉｉｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達の阻害剤、または
ｉｖ）ＦＧＦシグナル伝達の阻害剤に代えて、あるいはＦＧＦシグナル伝達の阻害剤と組み合わせた細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）シグナル伝達の阻害剤と、
ｖ）ＷＮＴシグナル伝達の活性化剤と、
を提供することと、
ｂ）ｉ）の多能性幹細胞を、ｉｉ）のＡＬＫ２／３の阻害剤と、ｉｉｉ）のＦＧＦの阻害剤、およびｉｖ）のＥＲＫシグナル伝達の阻害剤のうちの少なくとも一方と、ｖ）のＷＮＴシグナル伝達の活性化剤と、を含む培養培地に同時に曝露することと、
ｃ）ｂ）の多能性幹細胞の、ＳＯＸ２／Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ／ＧＢＸ２／ＨＯＸＢ１を発現する培養された吻側後脳神経中胚葉の集団への分化を誘導することと、
を含む方法。
【請求項３４】
前記吻側後脳神経中胚葉が、細胞の前記集団の少なくとも１０％を構成する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記吻側後脳神経中胚葉が、前記阻害剤への曝露の２４時間以内に生じる、請求項３３または請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、体性幹細胞、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記吻側後脳神経中胚葉の集団が、中枢および末梢神経系前駆細胞、パターン形成可能な前駆細胞、ニューロン、グリア、および／または、表皮、神経堤および体節の派生物からなる群より選択される細胞にさらに分化する、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
幹細胞がヒト幹細胞である、請求項３３または請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記吻側後脳神経中胚葉を単離することをさらに含む、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記吻側後脳神経中胚葉を線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達の阻害剤と接触させることを含む、前記吻側後脳神経中胚葉をＳＯＸ１／ＧＢＸ２／ＨＯＸＢ１を発現する後脳神経上皮に変換することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
前記変換が２４時間以内に起こる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記吻側後脳神経中胚葉を骨形態形成タンパク質経路の活性化剤と接触させることを含む、前記吻側後脳神経中胚葉をＰＡＸ３／ＳＯＸ１０／ＳＯＸ９／ＨＯＸＢ１を発現する頭蓋神経堤幹細胞に変換することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
前記吻側後脳神経中胚葉をＦＧＦシグナル伝達の阻害剤と接触させること、および前記吻側後脳神経中胚葉をＭＥＫ／ＥＲＫの阻害剤と接触させること、のうちの少なくとも一方をさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
神経堤幹細胞の変換が２４〜４８時間以内に起こる、請求項４２または請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＳＯＸ１／ＧＢＸ２／ＨＯＸＢ１を発現する前記後脳神経上皮を、骨形態形成タンパク質経路の活性化剤と接触させることを含む、ＳＯＸ１／ＧＢＸ２／ＨＯＸＢ１を発現する前記後脳神経上皮をＰＡＸ３／ＳＯＸ１０／ＳＯＸ９／ＨＯＸＢ１を発現する頭蓋神経堤幹細胞に変換することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
ＳＯＸ１／ＧＢＸ２／ＨＯＸＢ１を発現する前記後脳神経上皮をＦＧＦシグナル伝達の阻害剤と接触させること、およびＳＯＸ１／ＧＢＸ２／ＨＯＸＢ１を発現する前記後脳神経上皮をＭＥＫ／ＥＲＫの阻害剤と接触させること、のうちの少なくとも一方をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記神経堤幹細胞の変換が２４〜４８時間以内に起こる、請求項４５または請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記吻側後脳神経中胚葉をＷＮＴシグナル伝達の活性化剤と接触させることを含む、前記吻側後脳神経中胚葉を尾側神経中胚葉に変換することをさらに含み、ＷＮＴシグナル伝達の活性化剤を前記吻側後脳神経中胚葉に単独でまたは線維芽細胞成長因子受容体ファミリーの活性化剤と組み合わせて接触させる、請求項３３に記載の方法。
【請求項４９】
前記吻側後脳神経中胚葉は、ＷＮＴ／ＦＧＦシグナル伝達への継続的な曝露により２４時間以内にＳＯＸ２／Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ／ＨＯＸＢ４を発現する尾側後脳神経中胚葉に変換される、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
尾側後脳神経中胚葉は、ＷＮＴ／ＦＧＦシグナル伝達への継続的な曝露で２４時間以内にＳＯＸ２／Ｔ／ＨＯＸＢ４／ＨＯＸＣ５を発現する頸部脊髄神経中胚葉に変換される、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
さらなるＦＧＦシグナル伝達の非存在下で持続性ＷＮＴ経路活性化により頸部脊髄中胚葉を体節組織に変換することができる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
頸部レベルの体節組織が２４〜４８時間以内に作製される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記尾側後脳神経中胚葉をＳＭＡＤシグナル伝達の活性化剤と接触させることを含む、前記尾側後脳神経中胚葉がＰＡＸ３／ＳＯＸ１０／ＳＯＸ９を発現する頭蓋神経堤幹細胞に変換される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記尾側後脳神経中胚葉をＦＧＦおよびＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達の少なくとも一方の阻害剤と接触させることをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記変換が２４〜４８時間以内に１〜１００％の効率で起こる、請求項５３または請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記頸部脊髄神経中胚葉をＳＭＡＤシグナル伝達の活性化剤と接触させることを含む、前記頸部脊髄神経中胚葉がＰＡＸ３／ＳＯＸ１０／ＳＯＸ９を発現する幹神経堤幹細胞に変換される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記尾側後脳神経中胚葉をＦＧＦおよびＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達の少なくとも一方の阻害剤と接触させることをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記変換が２４〜４８時間以内に起こる、請求項５６または請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞分化の促進に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト多能性幹細胞の分化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで漸進的により成熟した発生的に類似した胚構造を生成するために段階特異的に進行する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで外胚葉胚芽層を生成する最初の段階は、１９９８年に当該技術分野が始まって以来６日以内に進行することはない。そのため、外胚葉由来の細胞型を作製するには、外胚葉胚芽層を誘導するために少なくとも最低６日間は必要であり、その後発生的に後の事象が発生するためのさらなる時間が必要である。
【０００３】
この外胚葉胚芽層の位置的特徴は、一般的に前方とみなされ、頭頸部の細胞／組織を形成することができる。しかしながら、最近のデータは神経中胚葉と称される細胞集団を提示しており、それは後部外胚葉胚芽層および後部中胚葉胚芽層である。現在のところ、ヒト多能性幹細胞からの前部外胚葉胚芽層および後部神経中胚葉胚芽層の形成は、異なる時間枠内の異なる培養条件を利用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こっている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の派生と分化（タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）Ｋ．他、２００７年、Ｃｅｌｌ．、第１３１（５）巻、第８６１〜８７２頁、ユ（Ｙｕ）Ｊ他、２００年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第３１８（５８５８）巻、第１９１７〜１９２０頁）は、ヒト胚発生の理解に役立ち、そうでなければアクセスできない発生的に一時的な前駆細胞を研究する機会を提供し、負傷または疾患の症例における治療介入のためのツールでもある。エビデンスは、ｉＰＳＣ由来の前駆細胞は胎児由来の同等物と同様に機能し（リンドバル（Ｌｉｎｄｖａｌｌ）  Ｏ、ビョークランド（Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ）  Ａ、２０１１年、Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第８（４）巻、第５３９〜５４８頁、ビョークランド  Ａ、リンドバル  Ｏ、２０１７年、Ｊ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓ．、７（ｓ１）：Ｓ２３〜Ｓ３３）、ヒト宿主に生着して生存する能力を有していることを示唆しており、おそらくは細胞の損失または機能不全によって引き起こされるさまざまな病的状態を緩和することを可能にするものであろう。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｉＰＳＣ由来前駆細胞の最終的な成熟はまた、新規な治療薬の同定のための化学的スクリーニングもサポートし得る。これらの努力は、生きている患者からの組織獲得が問題となる中枢神経系の症状にとって特に重要である。
【０００５】
本明細書では、例えば、ＥＲＫシグナル伝達の阻害によって多能性幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）の分化を促進する組成物、方法、およびキットが提供される。
一実施形態は幹細胞における分化を誘導する方法を提供し、同方法は、ａ）多能性幹細胞を含む細胞培養物、ｉｉ）アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）２／３シグナル伝達の阻害剤であって、同阻害剤が、ノギン、ドルソモルフィン、ＬＤＮ−１９３１８９、同様の阻害機能を有する化合物およびそれらの混合物からなる群より選択されるアクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）２／３シグナル伝達の阻害剤、およびｉｉｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達の阻害剤であって、同阻害剤がＳＵ５４０２、ＢＧＪ３９８、ＦＧＦタンパク質ファミリーメンバーに対する抗体（例えば：Ａｎｔｉ−ＦＧＦ−２／ｂａｓｉｃ  ＦＧＦ（中和）抗体、ｃｌｏｎｅ  ｂＦＭ−１（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａカタログ番号０５−１１７））またはそれらの受容体、同様の阻害機能を有する化合物およびそれらの混合物からなる群より選択される線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達の阻害剤と、あるいはｉｖ）ＦＧＦシグナル伝達の阻害剤に代えて、若しくはＦＧＦシグナル伝達の阻害剤と組み合わせて、細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）シグナル伝達の阻害剤であって同阻害剤がＰＤ０３２５９０１または同様の阻害機能を有する化合物およびそれらの混合物からなる群より選択される細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）シグナル伝達の阻害剤と、を提供することと、ｂ）ｉ）の前記多能性幹細胞を、ｉｉ）のＡＬＫ２／３の阻害剤およびｉｉｉ）のＦＧＦの阻害剤、および／またはｉｖ）のＥＲＫシグナル伝達の阻害剤を含む培養培地に同時に曝露することと、ｃ）培養した前部外胚葉細胞の集団を生成するために、前記接触した多能性幹細胞の分化を誘導することと、を含む。
【０００６】
一実施形態において、前記前部外胚葉（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｅｃｔｏｄｅｒｍ）は、分化細胞の前記集団の少なくとも１０％から１００％までを含む。例えば、前記前部外胚葉は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％を含む。
【０００７】
一実施形態において、前記原始外胚葉（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｅｃｔｏｄｅｒｍ）は、前記阻害剤への曝露の２４時間以内に生じる。
一実施形態において、前記多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、体性幹細胞、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群から選択される。一実施形態において、幹細胞はヒト幹細胞である。
【０００８】
一実施形態において、前記前部外胚葉細胞の集団は、中枢神経系（ＣＮＳ）前駆細胞、パターン形成可能な前駆細胞、ニューロンおよびグリア；および表皮、神経堤および神経中胚葉の派生物（表皮幹細胞、ケラチノサイト、メラニン細胞、末梢ニューロン、シュワン細胞、間葉系間質細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、筋芽細胞を含む）からなる群より選択される細胞にさらに分化する。
【０００９】
別の実施形態において、外胚葉は単離されている（ｉｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ）。
一実施形態は、ＡＬＫ２／３シグナル伝達の１つ以上の阻害剤、ＥＲＫシグナル伝達の１つ以上の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ（ＭＥＫ）１／２の１つ以上の阻害剤、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）１、２、３、および／または４の１つ以上の阻害剤、ＷＮＴの１つ以上の阻害剤、および／またはＷＮＴの１つ以上の活性化剤（例えば、ＡＬＫ２／３阻害剤はＬＤＮ１９３１８９であってもよく、ＦＧＦ阻害剤はＢＧＪ３９８であってもよく、ＭＥＫ阻害剤はＰＤであってもよく、ＷＮＴ活性化剤はＣＨＩＲ９９０２１またはＢＩＯであってもよい）を含むキットを提供する。一実施形態において、キットは多能性幹細胞を含む。一実施形態において、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、体性幹細胞、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群より選択される。一実施形態において、多能性幹細胞はヒトのものである。
【００１０】
一実施形態は、外胚葉をＷＮＴシグナル伝達の阻害剤と接触させることを含む、外胚葉をＰＡＸ６／ＦＯＸＧ１／ＳＩＸ３／ＯＴＸ２を発現する終脳神経上皮にパターン化する（ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）方法を提供し、ＷＮＴシグナル伝達の阻害剤は、ＤＫＫ１タンパク質、またはＸＡＶ９３９もしくはＷｎｔＣ５９を含むＤＫＫ１の化学的類似体、あるいは同様に機能してＷＮＴシグナル伝達を阻害する分子からなる群より選択される。
【００１１】
一実施形態は、前記外胚葉をＰＡＸ６／ＦＯＸＧ１／ＳＩＸ３／ＯＴＸ２およびＮＫＸ２．１および／またはＮＫＸ２．２を発現する腹側終脳神経上皮にパターン化する方法を提供し、同方法は、前記外胚葉をＷＮＴシグナル伝達の阻害剤と接触させることを含み、前記阻害剤は、ＤＫＫ１タンパク質、またはＸＡＶ９３９もしくはＷｎｔＣ５９を含むＤＫＫ１の化学的類似体、あるいは同様に機能してＷＮＴシグナル伝達を阻害する分子；および／またはソニックヘッジホッグ経路の活性化剤であって、ソニックヘッジホッグ、翻訳後修飾ソニックヘッジホッグタンパク質、またはソニックヘッジホッグ経路を刺激するソニックヘッジホッグに対する化学的類似体（プルモルファミン、スムーズンドアゴニスト、および類似の化学的類似体を含む）などを含むソニックヘッジホッグタンパク質ファミリーのメンバーからなる群より選択される。
【００１２】
一実施形態は、外胚葉をＷＮＴシグナル伝達の少なくとも１つの活性化剤と接触させることを含む、前記外胚葉をＰＡＸ６／ＯＴＸ２を発現する間脳神経上皮にパターン化する方法を提供し、活性化剤は、Ｗｎｔタンパク質、ＷＮＴ経路を刺激するＷＮＴに対する化学的類似体（ＢＩＯ、ＣＨＩＲ、および同様の活性を有する化合物を含む）からなる群より選択される。
【００１３】
一実施形態は、前記外胚葉を、ＰＡＸ６を発現しないがＯＴＸ２および／またはＰＡＸ５を発現する中脳神経上皮にパターン化する方法を提供し、同方法は、前記外胚葉をＷＮＴシグナル伝達の少なくとも１つの活性化剤と接触させることを含み、前記活性化剤はＷＮＴタンパク質または、ＢＩＯ、ＣＨＩＲ、および類似の活性を有する化合物を含む、ＷＮＴ経路を刺激するＷＮＴに対する化学的類似体、からなる群より選択される。一実施形態において、同方法は、前記外胚葉を、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８ｂ、ならびにＦＧＦ１およびＦＧＦ２の熱安定性変異体を含むＦＧＦタンパク質ファミリーのメンバーから選択される線維芽細胞成長因子受容体ファミリーの活性化剤と接触させることをさらに含む。一実施形態において、同方法は、前記外胚葉を、ソニックヘッジホッグ、翻訳後修飾ソニックヘッジホッグタンパク質、またはソニックヘッジホッグ経路を刺激するソニックヘッジホッグへの化学的類似体（プルモルファミン、スムーズンドアゴニスト、および類似の化学的類似体を含む）を含むヘッジホッグタンパク質ファミリーのメンバーから選択されるソニックヘッジホッグ経路の活性化剤と接触させることをさらに含む。一実施形態において、中脳変換（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）は、ＰＡＸ６のダウンレギュレーション、ＯＴＸ２の維持、およびＰＡＸ５のアップレギュレーションを介して、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、および約９０％の効率を含む１〜１００％の効率で２４時間〜約４８時間以内に起こる。
【００１４】
一実施形態は、ＯＴＸ２／ＰＡＸ５／ＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａを発現している中脳の底板を得るために、本明細書に記載されているように形成された前記中脳神経上皮をＯＴＸ２／ＰＡＸ５／ＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａを発現する中脳底板にパターン化する方法を提供し、同方法は、前記中脳神経上皮を、ソニックヘッジホッグ経路の活性化剤（ソニックヘッジホッグタンパク質、翻訳後修飾されたソニックヘッジホッグタンパク質、またはソニックヘッジホッグ経路を刺激するソニックヘッジホッグに対する化学的類似体（プルモルファミン、スムーズンドアゴニスト、および類似の化学的類似体を含む）を含む）と接触させることを含む。一実施形態において、同方法は、前記中脳神経上皮を、線維芽細胞成長因子ファミリーおよび／またはＶＥＧＦＲ２／ＦＧＦＲ２阻害剤であるＳＵ５４０２（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍカタログ番号１３１８２）、ＦＧＦＲ１／２／３／４阻害剤であるＢＧＪ３９８（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍカタログ番号１９１５７）、ＭＥＫ阻害剤であるＰＤ０３２５９０１（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍカタログ番号１３０３４）の１つ以上を含む下流のＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達の阻害剤と接触させることをさらに含む。一実施形態において、同方法は、前記中脳神経上皮をＷＮＴシグナル伝達の阻害剤と接触させることをさらに含み、同阻害剤は、タンキラーゼ阻害剤ＸＡＶ９３９（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍカタログ番号１３５９６）、またはポーキュパイン（ｐｏｒｃｕｐｉｎｅ）阻害剤、ＷｎｔＣ５９（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍカタログ番号１６６４４）、または同様に機能する分子を含むＬＲＰ６／ＦｒｉｚｚｌｅｄアンタゴニストＤＫＫ１タンパク質またはＤＫＫ１の化学的類似体（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈカタログ番号１２０−３０）である。一実施形態において、同方法は、前記中脳神経上皮をＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤と接触させることをさらに含み、同阻害剤は、アクチビン様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体２／３阻害剤ＬＤＮ１９３１８９（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍカタログ番号１９３９６）またはアクチビン様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体４／５／７阻害剤Ａ８３０１（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍカタログ番号９００１７９９）を含む。実施形態において、中脳神経上皮の変換は、２４〜４８時間以内に起こり、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％の効率を含む１〜１００％の効率で起こる。
【００１５】
一実施形態は、中脳神経上皮を、Ｎｕｒｒ１、ベータｉｉｉチューブリン、チロシンヒドロキシラーゼを発現する未熟なニューロンに分化させる方法を提供する。一実施形態において、同方法は、前記中脳神経上皮をノッチ経路の１以上の阻害剤と接触させることを含み、同阻害剤はＤＡＰＴおよび同様のノッチ阻害機能を有する化学物質、例えばガンマセクレターゼ阻害剤およびプレセニリン阻害剤を含む。
【００１６】
一実施形態において、同方法は、前記中脳神経上皮をニューロンの生存促進因子ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４またはそれらの組み合わせと接触させることをさらに含む。一実施形態において、同方法は、前記中脳神経上皮を、ＴＧＦＢスーパーファミリーリガンドであるアクチビンＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ３またはそれらの組み合わせを含むＳＭＡＤシグナル伝達の１つ以上の活性化剤と接触させることをさらに含む。
【００１７】
一実施形態は、前記中脳神経上皮を、ＰＡＸ３／ＳＯＸ１０／ＳＯＸ９／ＯＴＸ２またはＰＡＸ３／ＳＯＸ１０／ＳＯＸ９／ＯＴＸ２／ＰＡＸ５を発現する頭蓋神経堤幹細胞に分化させる方法を提供し、同方法は、前記中脳神経上皮を、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）および／またはＢＭＰ２などのＢＭＰファミリーの他のタンパク質を含む骨形態形成タンパク質経路の活性化剤と接触させることを含む。一実施形態において、同方法は、中脳神経上皮を、ＦＧＦシグナル伝達の阻害剤および／またはＭＥＫ／ＥＲＫの阻害剤と接触させることをさらに含み、前記ＦＧＦ阻害剤は、ＳＵ５４０２、ＢＧＪ３９８または類似の阻害機能を有する他の因子を含み、前記ＭＥＫ／ＥＲＫの阻害剤はＰＤ０３２５９０１を含む。一実施形態において、神経堤幹細胞の変換は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％の効率を含む、１〜１００％の効率で２４〜４８時間以内に起こる。
【００１８】
一実施形態は幹細胞の分化を誘導する方法を提供し、同方法は、ａ）多能性幹細胞を含む細胞培養物、ｉｉ）アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）２／３シグナル伝達の阻害剤であって、ノギン、ドルソモルフィン、ＬＤＮ−１９３１８９、同様の阻害機能を有する化合物およびそれらの混合物から選択される阻害剤ならびにｉｉｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達の阻害剤であって、ＳＵ５４０２、ＢＧＪ３９８、同様の阻害機能を有する化合物およびそれらの混合物から選択される阻害剤、またはｉｖ）ＦＧＦシグナル伝達の阻害剤に代えてもしくはＦＧＦシグナル伝達の阻害剤と組み合わせて、細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）シグナル伝達の阻害剤であって、ＰＤ０３２５９０１または同様の阻害機能を有する化合物およびそれらの混合物から選択される阻害剤；ｖ）ＷＮＴシグナル伝達の活性化剤であって、ＢＩＯ、ＣＨＩＲ９９０２１、同様の活性化機能を有する化合物およびそれらの混合物からなる群から選択される活性化剤を提供することと、ｂ）ｉ）の前記多能性幹細胞を、ｉｉ）のＡＬＫ２／３の阻害剤、ｉｉｉ）のＦＧＦの阻害剤、および／またはｉｖ）のＥＲＫシグナル伝達の阻害剤；およびｖ）のＷＮＴシグナル伝達の活性化剤を含む培養培地に同時に曝露することと、ｃ）ｂ）の前記多能性幹細胞の、ＳＯＸ２／Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ／ＧＢＸ２／ＨＯＸＢ１を発現する培養した吻側後脳神経中胚葉（ｒｏｓｔｒａｌ  ｈｉｎｄｂｒａｉｎ  ｎｅｕｒｏｍｅｓｏｄｅｒｍ）の集団への分化を誘導することと、を含む。一実施形態において、前記吻側後脳神経中胚葉は、前記細胞集団の少なくとも１０％から１００％までを構成する。例えば、前記前部外胚葉は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％を含む。一実施形態において、前記吻側後脳神経中胚葉は、前記阻害剤への曝露の２４時間以内に生じる。一実施形態において、前記多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、体性幹細胞、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群より選択される。一実施形態において、幹細胞はヒト幹細胞である。一実施形態において、吻側後脳神経中胚葉の前記集団は、中枢および末梢神経系前駆細胞、パターン形成可能な前駆細胞、ニューロン、グリア、および／または間葉系間質細胞およびその派生物（例えば、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞など）を含む表皮および神経堤の派生物、および間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋前駆細胞を含む体節組織の派生物、からなる群より選択される細胞にさらに分化する。
【００１９】
一実施形態において、同方法は、前記吻側後脳神経中胚葉をＳＯＸ１／ＧＢＸ２／ＨＯＸＢ１を発現する後脳神経上皮に変換することをさらに含み、前記吻側後脳神経中胚葉を線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達の阻害剤と接触させることを含み、前記線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達の阻害剤はＳＵ５４０２、ＢＧＪ３９８、ＦＧＦタンパク質ファミリーメンバーまたはその受容体に対する抗体、同様の阻害機能を有する化学物質、およびそれらの混合物からなる群より選択される。一実施形態において、変換は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％および約９０％の効率を含む、１〜１００％の効率で２４時間以内に起こるであろう。
【００２０】
一実施形態において、同方法は、前記吻側後脳神経中胚葉をＰＡＸ３／ＳＯＸ１０／ＳＯＸ９／ＨＯＸＢ１を発現する頭蓋（ｃｒａｎｉａｌ）神経堤幹細胞に変換することをさらに含み、同方法は、前記吻側後脳神経中胚葉を骨形態形成タンパク質経路の活性化剤と接触させることを含み、骨形態形成タンパク質経路の活性化剤は、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、およびＢＭＰ２などのＢＭＰファミリーの他のタンパク質から選択される。一実施形態は、前記吻側後脳神経中胚葉をＦＧＦシグナル伝達の阻害剤と接触させることを提供し、前記ＦＧＦシグナル伝達の阻害剤はＳＵ５４０２、ＢＧＪ３９８または同様の阻害機能を有する他の因子を含み、および／または前記吻側後脳神経中胚葉をＭＥＫ／ＥＲＫに対する阻害剤と接触させることを提供し、前記ＭＥＫ／ＥＲＫに対する阻害剤はＰＤ０３２５９０１を含む。一実施形態において、神経堤幹細胞の変換は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０、約８０％、および約９０％の効率を含む、１〜１００％の効率で２４〜４８時間以内に起こる。
【００２１】
一実施形態において、同方法は、ＳＯＸ１／ＧＢＸ２／ＨＯＸＢ１を発現する前記後脳神経上皮をＰＡＸ３／ＳＯＸ１０／ＳＯＸ９／ＨＯＸＢ１を発現する頭蓋神経堤幹細胞に変換することをさらに含み、同方法は、前記後脳神経上皮を骨形態形成タンパク質経路の活性化剤であって、骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、およびＢＭＰ２のようなＢＭＰファミリーの他のタンパク質を含む活性化剤と接触させることを含む。一実施形態は、ＳＯＸ１／ＧＢＸ２／ＨＯＸＢ１を発現する前記後脳神経上皮をＦＧＦシグナル伝達の阻害剤と接触させること、および／またはＳＯＸ１／ＧＢＸ２／ＨＯＸＢ１を発現する前記後脳神経上皮をＭＥＫ／ＥＲＫの阻害剤と接触させること、をさらに含み、前記ＦＧＦシグナル伝達の阻害剤はＳＵ５４０２、ＢＧＪ３９８または同様の阻害機能を有する他の因子を含み、ＭＥＫ／ＥＲＫの前記阻害剤はＰＤ０３２５９０１を含む。一実施形態において、前記神経堤幹細胞の変換は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、および約９０％の効率を含む、１〜１００％の効率で２４〜４８時間以内に起こる。
【００２２】
一実施形態において、同方法は、前記吻側後脳神経中胚葉を尾側（ｃａｕｄａｌｉｚｅｄ）神経中胚葉に変換することをさらに含み、同方法は、前記吻側後脳神経中胚葉をＷＮＴシグナル伝達の活性化剤と接触させることを含み、前記活性化剤は、ＷＮＴ、ＷＮＴ経路を刺激するＷＮＴに対するタンパク質または化学的類似体（ＢＩＯ、ＣＨＩＲおよび類似の活性を有する化合物を含む）を含み、ここで、ＷＮＴシグナル伝達の活性化剤を、単独で、または線維芽細胞成長因子受容体ファミリーの活性化剤と組み合わせて、吻側後脳神経中胚葉と接触させ、ここで、線維芽細胞成長因子受容体ファミリーの活性化剤は、線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ１）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞成長因子８ｂ（ＦＧＦ８ｂ）、またはＦＧＦ１および／またはＦＧＦ２の熱安定性変異体のような線維芽細胞成長因子タンパク質ファミリーのメンバーを含む。一実施形態において、前記吻側後脳神経中胚葉は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、および約９０％の効率を含む１〜１００％の効率で２４時間以内にＳＯＸ２／Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ／ＨＯＸＢ４を発現する尾側後脳神経中胚葉に変換できる。
【００２３】
別の実施形態において、尾側後脳神経中胚葉は、ＣＨＩＲ９９０２１およびＦＧＦを使用して２４時間以内にＳＯＸ２／Ｔ／ＨＯＸＢ４／ＨＯＸＣ５を発現する頸部脊髄神経中胚葉に、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、および約９０％の効率を含む１〜１００％の効率で２４時間以内に変換される。一実施形態において、添加されるＦＧＦシグナル伝達の非存在下での持続的なＷＮＴ経路の活性化により、頸部脊髄神経中胚葉を体節組織（ｓｏｍｉｔｅ  ｔｉｓｓｕｅ）に変換することができる。一実施形態において、頸部レベルの体節組織は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％および約９０％の効率を含む、１〜１００％の効率で２４〜４８時間以内に作製される。
【００２４】
一実施形態において、同方法は、前記尾側後脳神経中胚葉をＰＡＸ３／ＳＯＸ１０／ＳＯＸ９を発現する頸椎幹（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｓｐｉｎａｌ  ｔｒｕｎｋ）神経堤幹細胞に変換することをさらに含み、同方法は、前記尾側後脳神経中胚葉をデカペンタプレジック（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）（ＳＭＡＤ）シグナル伝達に対するＳＭＡマザーの活性化剤と接触させることを含み、ＳＡＭＤシグナル伝達の活性化剤は、ＢＭＰ２および／またはＢＭＰ４が含まれる。一実施形態は、前記頸部神経中胚葉をＦＧＦおよび／またはＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達の阻害剤と接触させることをさらに含み、前記ＦＧＦおよび／またはＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達の阻害剤は、ＦＧＦリガンドまたは受容体に対するブロッキング抗体および／または化学阻害剤であるＢＧＪ３９８、ＳＵ５４０２、ＰＤ０３２５９０１、または類似の機能を備えた薬剤（例えば、ＰＤ１７３０７４、ＳＵ６６６８、ＰＤ１６６２８５二塩酸塩、ＦＩＩＮ  １塩酸塩、ＰＤ１６１５７０、ＡＰ２４５３４；ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｓｅａｒｃｈ？ｃｏｍｍｏｎ＿ｎａｍｅ＝ＦＧＦ％２０Ｒｅｃｅｐｔｏｒ％２０Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓを含む）を含む。一実施形態において、前記変換は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％および約９０％の効率を含む、１〜１００％の効率で２４〜４８時間以内に起こる。
【００２５】
本発明は、（ｉ）幹細胞（例えば、ｈＰＳＣ）を取得すること（定義された、フィーダーフリー条件（例えば、組換え体ヒトビトロネクチン、ラミニン、またはフィブロネクチン上のＥｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）培地）で成長させる）と、（ｉｉ）アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）２／３および／または細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）シグナル伝達をブロックする条件下で、ＷＮＴ経路の胚芽層特異的調節を伴って、低密度コロニー継代時（１平方センチメートルあたり４〜８万個の細胞）に幹細胞を培養することと、によって前部（ａｎｔｅｒｉｏｒ）外胚葉および／または後部（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ）神経中胚葉のようなヒト原始外胚葉を生成する方法を提供する。一実施形態において、培養のための方法は、定義された（ｄｅｆｉｎｅｄ）条件を含む。別の実施形態において、定義されたシステムは、組換えタンパク質または化学合成されたマトリックスの使用を指す。一実施形態において、定義されたシステムは、組換えタンパク質および合成化学物質を含む培地用組成物の使用を指す。一実施形態において、幹細胞は単層で培養される。別の実施形態は、化合物ＬＤＮ１９３１８９およびＢＧＪ３９８、ＰＤ０３２５９０１および／またはＣＨＩＲ９９０２が補充された培地の使用を企図している。
【００２６】
一実施形態は、ＡＬＫ２／３シグナル伝達の第１の阻害剤、ＥＲＫシグナル伝達の第２の阻害剤、およびＷＮＴシグナル伝達の活性化剤を含むキットを提供する。一実施形態において、前記第１の阻害剤は、ノギンのジスルフィド結合ホモ二量体、ドルソモルフィン、ＬＤＮ１９３１８９、またはそれらの組み合わせ若しくは混合物からなる群より選択される。一実施形態において、前記ノギンは、マウス、ヒト、ラット、および／またはアフリカツメガエルのノギンから選択される。一実施形態において、前記第２の阻害剤はＥＲＫ経路を阻害する。一実施形態において、前記第２の阻害剤はシグナル伝達経路を阻害し、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）１、２、３および／または４からなる群より選択される。一実施形態において、前記第２の阻害剤は、ＳＵ５４０２、ＢＧＪ３９８および／またはその誘導体からなる群より選択される。一実施形態において、前記第２の阻害剤は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ（ＭＥＫ）１／２を阻害する。一実施形態において、前記第２の阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１および／またはその誘導体である。一実施形態において、ＷＮＴシグナル伝達の活性化剤は、ＧＳＫ３ｂ阻害剤、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ（６−ブロモインジルビン−３’−オキシム、ＷＮＴ経路活性化剤）、またはＷＮＴリガンド（例えば、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３）からなる群より選択される。一実施形態において、前記キットは、ヒト幹細胞のような幹細胞をさらに含む。一実施形態において、キットは説明書をさらに含む。
【００２７】
一実施形態は、幹細胞の分化を誘導する方法を提供し、同方法は、ａ）幹細胞を含む細胞培養物と、ｉｉ）ＡＬＫ２／３シグナル伝達の第１の阻害剤と、ｉｉｉ）ＥＲＫシグナル伝達の阻害剤の第２の阻害剤と、ｉｖ）ＷＮＴシグナル伝達の活性化剤と、を提供することと、ｂ）未分化幹細胞を分化細胞に誘導するための条件下で前記幹細胞をＡＬＫ２／３シグナル伝達の第１の阻害剤およびＥＲＫシグナル伝達の第２の阻害剤（そして任意選択的にＷＮＴシグナル伝達の活性化剤）と接触させることと、を含む。一実施形態において、前記第１の阻害剤は、ノギンのジスルフィド結合ホモ二量体、ドルソモルフィン、ＬＤＮ−１９３１８９、それらの組み合わせおよびそれらの混合物からなる群より選択される。一実施形態において、前記ノギンは、マウス、ヒト、ラット、および／またはアフリカツメガエルのノギンから選択される。一実施形態において、前記第２の阻害剤は、ＥＲＫシグナル伝達の阻害剤である。一実施形態において、前記第２の阻害剤はＢＧＪ３９８および／またはその誘導体である。一実施形態において、前記第２の阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１および／またはその誘導体である。一実施形態において、前記活性化剤はＷＮＴシグナル伝達を刺激する。別の実施形態において、前記活性化剤はＣＨＩＲ９９０２１および／またはその誘導体である。一実施形態において、前記分化細胞は原始外胚葉細胞または胚芽層細胞である。一実施形態において、前記分化細胞は、培養細胞の集団の一部である。一実施形態において、前記分化細胞は、培養細胞の前記集団の少なくとも１０％から１００％までである。一実施形態において、培養細胞の集団における前記分化細胞は、性決定領域Ｙ、ボックス１（ＳＯＸ１；アクセッションＮＰ＿００５９７７；参照により組み込まれる）タンパク質、および／またはペアードボックスシックス（ＰＡＸ６；アクセッションＮＰ＿０００２７１；参照により本明細書に組み込まれる）タンパク質（ＳＯＸ１およびＰａｘ６は細胞内抗原であり、標準的な方法論による分離は非実用的である）を発現する。一実施形態において、ＳＯＸ１および／またはＰＡＸ６は、誘導の２４時間以内に発現される。一実施形態において、前記ＳＯＸ１および／またはＰＡＸ６タンパク質は、培養細胞の前記集団の少なくとも１０％で発現される。一実施形態において、前記分化細胞は神経中胚葉胚芽層細胞である。一実施形態において、前記分化細胞は、培養細胞の集団の一部である。一実施形態において、前記分化細胞は、培養細胞の前記集団の少なくとも１０％から１００％までである。一実施形態において、培養細胞の集団における前記分化細胞は、性決定領域Ｙ、ボックス２（ＳＯＸ２；アクセッションＮＰ＿００３１７２．１；参照により組み込まれる）タンパク質、および／またはＢｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ；アクセッションＮＰ＿００３１７２．１、参照により組み込まれる）タンパク質（ＳＯＸ２およびＴは細胞内抗原であり、標準的な方法論による分離は非実用的である）を発現する。一実施形態において、前記ＳＯＸ２およびＴは、誘導の２４時間以内に発現される。一実施形態において、前記ＳＯＸ２およびＴタンパク質は、前記培養細胞の集団の少なくとも約１０％で発現される。一実施形態において、前記幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、体性幹細胞（例えば、ヒト）、および人工多能性幹細胞（ヒトｉＰＳＣなどのｉＰＳＣ）を含む胚性幹細胞からなる群より選択される。一実施形態において、前記非デフォルト分化細胞は外胚葉系統由来のものである。
【００２８】
一実施形態は、幹細胞の分化を誘導する方法を提供し、同方法は、ａ）ｉ）幹細胞（ヒト幹細胞など）を含む細胞培養物と、ｉｉ）ＡＬＫ２／３シグナル伝達の第１の阻害剤と、ｉｉｉ）ＥＲＫシグナル伝達の阻害剤の第２の阻害剤と、ｉｖ）ＡＬＫ４／５／７シグナル伝達の第３の阻害剤と、を提供することと、ｂ）未分化の幹細胞から分化細胞を誘導する条件下で、前記幹細胞とＡＬＫ２／３／４／５／７およびＥＲＫシグナル伝達の阻害剤と接触させることと、を含む。一実施形態において、前記第１の阻害剤は、ノギンのジスルフィド結合ホモ二量体、ドルソモルフィン、ＬＤＮ−１９３１８９、それらの組み合わせおよびそれらの混合物からなる群より選択される。一実施形態において、前記ノギンは、マウス、ヒト、ラット、およびアフリカツメガエルのノギンから選択される。一実施形態において、前記第２の阻害剤はＢＧＪ３９８およびその誘導体である。一の実施形態において、前記第２の阻害剤はＰＤ０３２５９０１およびその誘導体である。一実施形態において、前記第３の阻害剤は、ＡＬＫ４／５／７シグナル伝達の阻害剤である。一実施形態において、前記第３の阻害剤は、Ａ８３０１、ＳＢ４３１５４２およびそれらの誘導体からなる群から選択される。一実施形態において、前記分化細胞は原始外胚葉である。一実施形態において、前記分化細胞は、培養細胞の集団の一部である。一実施形態において、前記分化細胞は、培養細胞の前記集団の少なくとも１０％から１００％までである。一実施形態において、培養細胞の集団における前記分化細胞は、性決定領域Ｙ、ボックス１（ＳＯＸ１）タンパク質を発現する。一実施形態において、前記ＳＯＸ１は、誘導の２４時間以内に発現される。一実施形態において、前記ＳＯＸ１タンパク質は、培養細胞の前記集団の少なくとも１０％で発現される。一実施形態において、前記幹細胞は、胚性幹細胞（ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を含む）、体性幹細胞（例えば、ヒト）、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ（例えば、ヒト））からなる群より選択される。一実施形態において、前記非デフォルト分化細胞は外胚葉系統のものである。
【００２９】
一実施形態は、単離した（ｉｓｏｌａｔｅｄ）原始外胚葉を含む組成物を提供する。一実施形態において、前記単離された外胚葉は胚細胞に由来する。一実施形態において、前記原始外胚葉は、インビトロで（培養培地とともに）培養される。一実施形態において、前記外胚葉は基質に固定されている。一実施形態において、前記外胚葉および胚性幹細胞はヒトのものである。
【００３０】
一実施形態は、単離された神経中胚葉を含む組成物を提供する。一実施形態において、前記単離された神経中胚葉は胚細胞に由来する。一実施形態において、前記神経中胚葉は、インビトロで（培養培地とともに）培養される。一実施形態において、前記神経中胚葉は基質に固定される。一実施形態において、前記神経中胚葉および胚性幹細胞はヒトのものである。
【００３１】
一実施形態は、生物学的薬剤をスクリーニングする方法を提供し、同方法は、ｉ）外胚葉または神経中胚葉を含む細胞培養物、およびｉｉ）試験化合物を提供することと、ｂ）前記外胚葉または神経中胚葉を前記試験化合物と接触させることと、を含む。一実施形態において、生物学的薬剤は、外胚葉または神経中胚葉を所望の細胞系統にさらに分化させる能力についてスクリーニングされる。
【００３２】
本発明は、誘導された外胚葉の外胚葉アイデンティティ（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を評価する方法を企図している。この方法は、形態学的手段、機能的評価、および特定の系統に関連するタンパク質の発現またはダウンレギュレーションの測定を通じて行うことができる。
【００３３】
本発明はさらに、誘導された神経中胚葉の神経中胚葉アイデンティティを評価する方法を企図している。この方法は、形態学的手段、機能的評価、特定の系統に関連するタンパク質の発現またはダウンレギュレーションの測定を通じて行うことができる。
【００３４】
一実施形態は、分化細胞を提供する方法を提供し、同方法は、ａ）ｉ）多能性幹細胞（ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）など）の細胞培養物およびｉｉ）分化を誘導するための化合物を提供することと、ｂ）前記幹細胞を前記化合物と接触させることと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ヒト多能性幹細胞からの外胚葉の誘導における革新。概念実証は、ヒト胚性幹細胞の最初の派生とともに報告された自発的なｉｎ  ｖｉｖｏ奇形腫アッセイで確立された。最初のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は２０００年に説明され、最初の一方向性の（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）分化法は２００１年に説明された。最初の一方向性の単層法は２００４年に、最初の一方向性の単層フィーダーフリー法は２００６年に説明された。純度は、２００９年および２０１４年に改善された。本開示は、高純度を犠牲にすることなく、速度の大幅な改善を促進する新規な条件を実証する。
【図２Ａ】現在の多能性と一方向性の分化の考え方を示す。
【図２Ｂ】現在の多能性と一方向性の分化の考え方を示す。
【図２Ｃ】現在の多能性と一方向性の分化の考え方を示す。
【図３】ＳＵ／ＬＤＮ／ＳＢによるｈｉＰＳＣの三重阻害は、２４時間以内に均質なＳＯＸ１陽性神経前駆細胞を作製する。ｈｉＰＳＣラインＲ８８は、さまざまな組み合わせでＬＤＮ、ＳＢ、およびＳＵに曝露された。三重阻害により、ＮＡＮＯＧ染色の弱化、高ＳＯＸ２／ＳＯＸ１免疫陽性が示され、神経板系統決定（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）が示唆される。
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｃ：ＳＵ５４０２はＦＧＦシグナル伝達の阻害によって機能する。Ａ）ＳＵ／ＬＤＮ／ＳＢは、ｈｉＰＳＣラインのパネルに２４時間適用される。ＳＯＸ１／ＳＯＸ２免疫陽性およびＮＡＮＯＧ染色の弱化／不在によって証明されるように、神経誘導が起こっている。Ｂ）強力かつ選択的なＶＥＧＦＲ１／２／３阻害剤であるアキシチニブをＳＵ５４０２に代えて使用する。誘導は非常に高い濃度でのみ発生し、核の形態学的変化を引き起こす。Ｃ）強力かつ選択的なＦＧＦＲ１／２／３であるＢＧＪ３９８をＳＵ５４０２に代えて使用する。神経誘導時のＢＧＪ３９８の使用は、ＳＵ５４０２の使用時に見られるマーカ発現レベルと一致するか、それを超えるものである。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｃ：ＳＵ５４０２はＦＧＦシグナル伝達の阻害によって機能する。Ａ）ＳＵ／ＬＤＮ／ＳＢは、ｈｉＰＳＣラインのパネルに２４時間適用される。ＳＯＸ１／ＳＯＸ２免疫陽性およびＮＡＮＯＧ染色の弱化／不在によって証明されるように、神経誘導が起こっている。Ｂ）強力かつ選択的なＶＥＧＦＲ１／２／３阻害剤であるアキシチニブをＳＵ５４０２に代えて使用する。誘導は非常に高い濃度でのみ発生し、核の形態学的変化を引き起こす。Ｃ）強力かつ選択的なＦＧＦＲ１／２／３であるＢＧＪ３９８をＳＵ５４０２に代えて使用する。神経誘導時のＢＧＪ３９８の使用は、ＳＵ５４０２の使用時に見られるマーカ発現レベルと一致するか、それを超えるものである。
【図４Ｃ】図４Ａ〜Ｃ：ＳＵ５４０２はＦＧＦシグナル伝達の阻害によって機能する。Ａ）ＳＵ／ＬＤＮ／ＳＢは、ｈｉＰＳＣラインのパネルに２４時間適用される。ＳＯＸ１／ＳＯＸ２免疫陽性およびＮＡＮＯＧ染色の弱化／不在によって証明されるように、神経誘導が起こっている。Ｂ）強力かつ選択的なＶＥＧＦＲ１／２／３阻害剤であるアキシチニブをＳＵ５４０２に代えて使用する。誘導は非常に高い濃度でのみ発生し、核の形態学的変化を引き起こす。Ｃ）強力かつ選択的なＦＧＦＲ１／２／３であるＢＧＪ３９８をＳＵ５４０２に代えて使用する。神経誘導時のＢＧＪ３９８の使用は、ＳＵ５４０２の使用時に見られるマーカ発現レベルと一致するか、それを超えるものである。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｂ：神経誘導時にＥＲＫ阻害をＦＧＦ阻害に代える。Ａ）ＭＥＫ／ＥＲＫは成長因子シグナル伝達を仲介する。ＭＥＫ阻害剤であるＰＤ０３２５９０１をＳＵ５４０２の代わりに使用する。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｂ：神経誘導時にＥＲＫ阻害をＦＧＦ阻害に代える。Ａ）ＭＥＫ／ＥＲＫは成長因子シグナル伝達を仲介する。ＭＥＫ阻害剤であるＰＤ０３２５９０１をＳＵ５４０２の代わりに使用する。
【図６】ＳＵは主にＭＥＫ／ＥＲＫを介してＦＧＦＲ阻害剤として機能し、２４時間後の神経外胚葉形成を促進する。
【図７】ＦＧＦＲ２／ＶＥＧＦＲ２およびＡＬＫ２／３（ＬＤＮ／ＳＵ）の阻害は、２４時間のインキュベーション後にＳＯＸ１を促進するのに十分である。
【図８】神経上皮は前部デフォルトを採用している。
【図９】腹側前部マーカを作製できる。
【図１０】ＦＧＦ阻害とＢＭＰシグナル伝達の組み合わせは、中脳前駆細胞からの同種の頭蓋神経堤を促進する。
【図１１】１日目の神経上皮は、中脳底板（尾側／腹側）の表現型にパターン化できる。
【図１２】ＷＮＴシグナル伝達の勾配は、１日目の分子と組み合わせて後部（Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ）の運命を作製する。
【図１３】１日目の高ＷＮＴシグナル伝達により、共線性ＨＯＸ活性化が可能な１００％神経中胚葉が作製される。
【図１４】１日目の神経中胚葉誘導再現性アクロスライン（Ａｃｒｏｓｓ  Ｌｉｎｅｓ）。
【図１５Ａ】神経中胚葉の運命決定規則。
【図１５Ｂ】神経中胚葉の運命決定規則。
【図１５Ｃ】神経中胚葉の運命決定規則。
【図１６】体節形成可能な神経中胚葉（ＴＢＸ６）。
【図１７】規則１：ＦＧＦは神経中胚葉を安定化し、神経板形成を防止する。
【図１８】神経板形成中に背側／腹側のパターンが決定される。背側／腹側＝内側／外側。
【図１９】ＦＧＦ阻害とＢＭＰシグナル伝達の組み合わせは、神経中胚葉からの均一な体幹神経堤を促進する。
【図２０】神経堤前駆細胞は末梢神経に分化できる。
【図２１】脊椎底板はレチノイドに依存しない方法で４日以内に誘導され、ＯＬＩＧ２／ＮＫＸ２．２（プレＯＰＣマーカ）を発現する。
【図２２Ａ】多能性から外胚葉系統への離脱（ｅｘｉｔ）を調節するためのモデル。Ａ）確立された方法論は、未調節の内因性ＦＧＦシグナル伝達により、アクチビンシグナル伝達を抑制する。したがって、多能性の喪失は、ＦＧＦ５エピブラスト（ｅｐｉｂｌａｓｔ）中間体への移行を遅らせる。エピブラストからの移行中に、アクチビン（ａｃｔｉｖｉｎｇ）およびＢＭＰ抑制により外胚葉が生成される。Ｂ）ＦＧＦとアクチビンの両方が抑制されるため、ＦＧＦシグナル伝達の制御は、多能性からのより迅速な離脱を促進する。同様に、制御されたＦＧＦシグナル伝達によりエピブラスト中間体は一時的なものとなり、アクチビンおよびＢＭＰシグナル伝達の抑制により外胚葉が急速に促進される。これにより、誘導動態における６日の改善（６−ｄａｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）が得られる。
【図２２Ｂ】多能性から外胚葉系統への離脱（ｅｘｉｔ）を調節するためのモデル。Ａ）確立された方法論は、未調節の内因性ＦＧＦシグナル伝達により、アクチビンシグナル伝達を抑制する。したがって、多能性の喪失は、ＦＧＦ５エピブラスト（ｅｐｉｂｌａｓｔ）中間体への移行を遅らせる。エピブラストからの移行中に、アクチビン（ａｃｔｉｖｉｎｇ）およびＢＭＰ抑制により外胚葉が生成される。Ｂ）ＦＧＦとアクチビンの両方が抑制されるため、ＦＧＦシグナル伝達の制御は、多能性からのより迅速な離脱を促進する。同様に、制御されたＦＧＦシグナル伝達によりエピブラスト中間体は一時的なものとなり、アクチビンおよびＢＭＰシグナル伝達の抑制により外胚葉が急速に促進される。これにより、誘導動態における６日の改善（６−ｄａｙ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）が得られる。
【図２３】前後の神経上皮運命への直接アクセスのための統合プラットフォームと、背側／腹側パターン化の共通規則。
【図２４Ａ】脊髄の吻側尾側パターン化。（Ａ）初期発生（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）中、神経中胚葉前駆細胞（ＮＭＰ）は分化して脊髄の全長を生成する。（Ｂ）Ｈｏｘ遺伝子発現の組み合わせは、各レベル（Ｃ、Ｄ）から体のさまざまな異なる部分を神経支配する脊髄ニューロンのパターンを決定する。
【図２４Ｂ】脊髄の吻側尾側パターン化。（Ａ）初期発生（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）中、神経中胚葉前駆細胞（ＮＭＰ）は分化して脊髄の全長を生成する。（Ｂ）Ｈｏｘ遺伝子発現の組み合わせは、各レベル（Ｃ、Ｄ）から体のさまざまな異なる部分を神経支配する脊髄ニューロンのパターンを決定する。
【図２４Ｃ】脊髄の吻側尾側パターン化。（Ａ）初期発生（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）中、神経中胚葉前駆細胞（ＮＭＰ）は分化して脊髄の全長を生成する。（Ｂ）Ｈｏｘ遺伝子発現の組み合わせは、各レベル（Ｃ、Ｄ）から体のさまざまな異なる部分を神経支配する脊髄ニューロンのパターンを決定する。
【図２４Ｄ】脊髄の吻側尾側パターン化。（Ａ）初期発生（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）中、神経中胚葉前駆細胞（ＮＭＰ）は分化して脊髄の全長を生成する。（Ｂ）Ｈｏｘ遺伝子発現の組み合わせは、各レベル（Ｃ、Ｄ）から体のさまざまな異なる部分を神経支配する脊髄ニューロンのパターンを決定する。
【図２５Ａ】背側／腹側脊髄の複雑性、Ａ）神経管発生中のシグナル伝達勾配は、前駆細胞の背側／腹側のアイデンティティをパターン化する転写因子の組み合わせの発現を誘導する。これらの前駆細胞は、その後、成熟した脊髄で分化したニューロンの複雑性を生成する。神経管前駆細胞の初期の背側または腹側のアイデンティティは、Ｐａｘ３発現によって広く区別することができる。Ｂ）サイズおよびいくつかの軸索経路の違いにもかかわらず、成体ラットとヒトの脊髄は、背側／腹側のパターン化において重要な類似性と複雑性を共有している。（Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２００３年、第４（７）巻、第５８７〜９８頁およびＤｉｓｅａｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ、２０１６年、第９巻、第１１２５〜１１３７頁から改作した）。
【図２５Ｂ】背側／腹側脊髄の複雑性、Ａ）神経管発生中のシグナル伝達勾配は、前駆細胞の背側／腹側のアイデンティティをパターン化する転写因子の組み合わせの発現を誘導する。これらの前駆細胞は、その後、成熟した脊髄で分化したニューロンの複雑性を生成する。神経管前駆細胞の初期の背側または腹側のアイデンティティは、Ｐａｘ３発現によって広く区別することができる。Ｂ）サイズおよびいくつかの軸索経路の違いにもかかわらず、成体ラットとヒトの脊髄は、背側／腹側のパターン化において重要な類似性と複雑性を共有している。（Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２００３年、第４（７）巻、第５８７〜９８頁およびＤｉｓｅａｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ、２０１６年、第９巻、第１１２５〜１１３７頁から改作した）。
【図２６Ａ】Ａ）脊髄の位置情報は、吻尾側と背腹側のドメインを作製するために発生時に決定される。Ｂ）動物には、再現性のある２００Ｋｄｙｎｅの背側／尾側Ｔ８脊髄の挫傷（ｃｏｎｔｕｓｉｏｎ）負傷が与えられる。Ｃ）ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化は、吻尾側と背腹側の方向に基づいた特定の固有の位置アイデンティティを含む脊髄神経前駆細胞を生成するように指向されるであろう。負傷の位置と同所性に一致した細胞またはミスマッチ細胞を有する動物のコホートは、挫傷負傷の７日後に移植される。Ｄ）６ヶ月後、動物を屠殺し、負傷部位での再生への移植片の寄与を組織学的に調べる。負傷部位のキャビテーションにより、移植細胞のアイデンティティと生存率を共に測定する。順行性および逆行性軸索トレースを使用して、移植片への宿主軸索の移動距離を評価する。
【図２６Ｂ】Ａ）脊髄の位置情報は、吻尾側と背腹側のドメインを作製するために発生時に決定される。Ｂ）動物には、再現性のある２００Ｋｄｙｎｅの背側／尾側Ｔ８脊髄の挫傷（ｃｏｎｔｕｓｉｏｎ）負傷が与えられる。Ｃ）ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化は、吻尾側と背腹側の方向に基づいた特定の固有の位置アイデンティティを含む脊髄神経前駆細胞を生成するように指向されるであろう。負傷の位置と同所性に一致した細胞またはミスマッチ細胞を有する動物のコホートは、挫傷負傷の７日後に移植される。Ｄ）６ヶ月後、動物を屠殺し、負傷部位での再生への移植片の寄与を組織学的に調べる。負傷部位のキャビテーションにより、移植細胞のアイデンティティと生存率を共に測定する。順行性および逆行性軸索トレースを使用して、移植片への宿主軸索の移動距離を評価する。
【図２６Ｃ】Ａ）脊髄の位置情報は、吻尾側と背腹側のドメインを作製するために発生時に決定される。Ｂ）動物には、再現性のある２００Ｋｄｙｎｅの背側／尾側Ｔ８脊髄の挫傷（ｃｏｎｔｕｓｉｏｎ）負傷が与えられる。Ｃ）ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化は、吻尾側と背腹側の方向に基づいた特定の固有の位置アイデンティティを含む脊髄神経前駆細胞を生成するように指向されるであろう。負傷の位置と同所性に一致した細胞またはミスマッチ細胞を有する動物のコホートは、挫傷負傷の７日後に移植される。Ｄ）６ヶ月後、動物を屠殺し、負傷部位での再生への移植片の寄与を組織学的に調べる。負傷部位のキャビテーションにより、移植細胞のアイデンティティと生存率を共に測定する。順行性および逆行性軸索トレースを使用して、移植片への宿主軸索の移動距離を評価する。
【図２６Ｄ】Ａ）脊髄の位置情報は、吻尾側と背腹側のドメインを作製するために発生時に決定される。Ｂ）動物には、再現性のある２００Ｋｄｙｎｅの背側／尾側Ｔ８脊髄の挫傷（ｃｏｎｔｕｓｉｏｎ）負傷が与えられる。Ｃ）ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化は、吻尾側と背腹側の方向に基づいた特定の固有の位置アイデンティティを含む脊髄神経前駆細胞を生成するように指向されるであろう。負傷の位置と同所性に一致した細胞またはミスマッチ細胞を有する動物のコホートは、挫傷負傷の７日後に移植される。Ｄ）６ヶ月後、動物を屠殺し、負傷部位での再生への移植片の寄与を組織学的に調べる。負傷部位のキャビテーションにより、移植細胞のアイデンティティと生存率を共に測定する。順行性および逆行性軸索トレースを使用して、移植片への宿主軸索の移動距離を評価する。
【図２７】特定の目的２。分化中の背腹ドメインの特異性の改善。発生中の脊髄は、２つの波で生成される１２ドメインアーキテクチャで構成されている。分化決定（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の最初の波は、それぞれが単一のドメインに対応する転写因子のユニークな組み合わせを発現する原始的な神経上皮である脳室帯（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｚｏｎｅ）を作製する。神経上皮が有糸分裂後の神経芽細胞を作製し、それが脳室帯から外套層（ｍａｎｔｌｅ  ｚｏｎｅ）に移動することにより、分化決定の第２の波が発生する。これらの神経芽細胞は、脳室帯の特定の場所から発生し、外套層に入るときに転写因子の新しい組み合わせを獲得し、その後脊髄ニューロンの多様性を生成する。
【図２８Ａ】Ａ〜Ｃ、ｈｉＰＳＣ由来の同所性およびミスマッチの脊髄神経移植片の産生。Ａ）多能性（Ｎａｎｏｇ／Ｓｏｘ２共発現）を離脱して、神経中胚葉前駆細胞（Ｓｏｘ２／Ｔ共発現）を生成する。Ｂ）共線性ＨＯＸ活性化により、形成性脊髄のより尾側の細胞集団を産生する。Ｃ）神経板形成時の背側（Ｐａｘ３発現）および腹側分化決定（Ｐａｘ３−ｖｅ）、およびＤ）移植前の新生ニューロンへの成熟。
【図２８Ｂ】Ａ〜Ｃ、ｈｉＰＳＣ由来の同所性およびミスマッチの脊髄神経移植片の産生。Ａ）多能性（Ｎａｎｏｇ／Ｓｏｘ２共発現）を離脱して、神経中胚葉前駆細胞（Ｓｏｘ２／Ｔ共発現）を生成する。Ｂ）共線性ＨＯＸ活性化により、形成性脊髄のより尾側の細胞集団を産生する。Ｃ）神経板形成時の背側（Ｐａｘ３発現）および腹側分化決定（Ｐａｘ３−ｖｅ）、およびＤ）移植前の新生ニューロンへの成熟。
【図２８Ｃ】Ａ〜Ｃ、ｈｉＰＳＣ由来の同所性およびミスマッチの脊髄神経移植片の産生。Ａ）多能性（Ｎａｎｏｇ／Ｓｏｘ２共発現）を離脱して、神経中胚葉前駆細胞（Ｓｏｘ２／Ｔ共発現）を生成する。Ｂ）共線性ＨＯＸ活性化により、形成性脊髄のより尾側の細胞集団を産生する。Ｃ）神経板形成時の背側（Ｐａｘ３発現）および腹側分化決定（Ｐａｘ３−ｖｅ）、およびＤ）移植前の新生ニューロンへの成熟。
【図２８Ｄ】Ａ〜Ｃ、ｈｉＰＳＣ由来の同所性およびミスマッチの脊髄神経移植片の産生。Ａ）多能性（Ｎａｎｏｇ／Ｓｏｘ２共発現）を離脱して、神経中胚葉前駆細胞（Ｓｏｘ２／Ｔ共発現）を生成する。Ｂ）共線性ＨＯＸ活性化により、形成性脊髄のより尾側の細胞集団を産生する。Ｃ）神経板形成時の背側（Ｐａｘ３発現）および腹側分化決定（Ｐａｘ３−ｖｅ）、およびＤ）移植前の新生ニューロンへの成熟。
【図２９Ａ】本明細書に記載の本発明で使用される複数の因子のリスト。これらの因子は、単独で、または任意の組み合わせで使用できる。
【図２９Ｂ】本明細書に記載の本発明で使用される複数の因子のリスト。これらの因子は、単独で、または任意の組み合わせで使用できる。
【図２９Ｃ】本明細書に記載の本発明で使用される複数の因子のリスト。これらの因子は、単独で、または任意の組み合わせで使用できる。
【図２９Ｄ】本明細書に記載の本発明で使用される複数の因子のリスト。これらの因子は、単独で、または任意の組み合わせで使用できる。
【図２９Ｅ】本明細書に記載の本発明で使用される複数の因子のリスト。これらの因子は、単独で、または任意の組み合わせで使用できる。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
脊髄負傷に起因する感覚と運動機能の喪失は、個人が自立を失い、生活の質と寿命を著しく低下させる可能性がある。臨床的には、脊椎負傷は位置または「レベル」によって分類され、脊椎は、頭部から尾部への負傷、およびそれらの完全性、によって同脊椎が影響を受けるか、または脊髄全体にわたり前方から後方にいかに深く負傷が発生したかに従って分類される。脊髄の各レベルは体の異なる領域を支配するため、脊柱に沿った損傷の位置は、失われた機能の程度を決定する。機能は負傷レベルにて、およびその下方で失われるものであるが、それは、局所的に接続している切断された軸索と、大脳運動皮質からその負傷レベルを通過して脊椎をさらに下降する遠く離れた接続を作製する皮質脊髄軸索と、に起因する。ヒト多能性幹細胞を使用して行われた神経組織の移植は、脊髄負傷後の機能を回復するための臨床治療として提唱されている。移植は、失われた神経組織を置き換えることができ、新しい神経ネットワークを提供する。移植は、負傷部位の上方の損傷を受けていない組織から負傷の下方の損傷を受けていない組織への宿主軸索再生のためのブリッジ組織としても機能し得る。
【００３７】
これまでの研究では、特定の身体領域内で発生する損傷は、同所移植（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｇｒａｆｔｉｎｇ）と称される、その特定の領域に属する細胞によって修復される可能性が最も高いことが示されている。この前提に基づいて、最近の刊行物は、脊髄修復のための移植組織の起源の重要性を強調している。脳由来の移植片は、負傷した脊髄への生着に失敗したが、脊髄由来の移植片は、同じ負傷環境でよりよく機能していた。しかしながら、特定の解剖学的起源によって定義されたヒト多能性幹細胞由来の神経前駆細胞の産生は技術的に困難であることが証明されており、それは同所移植を探索するために設計される研究を制限するものである。本明細書にて提供されるのは、ヒト多能性幹細胞からの神経パターン化を誘導し、正確に制御するための新しい技術であり、現在、脊髄負傷の動物モデルの負傷位置に同所性に適合した脊髄神経移植片を試験する位置にある。
【００３８】
ヒト多能性幹細胞の分化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで漸進的により成熟した発生的に類似した胚構造を生成するために段階特異的に進行する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏですべての外胚葉を生成する最初の段階は、この分野が１９９８年に始まって以来６日より早く進行してはいなかった。そのため、任意の神経細胞型を作製するには、外胚葉を誘導するために少なくとも６日間が必要であり、その後、発生的に後の事象が生ずるまでの時間がさらに必要である。本明細書で提供される組成物および方法は、この間隔を２４時間未満に短縮し、これらの発生的に後の事象が生ずるための新しい加速された時間枠を作製する。したがって、既存のニューロン分化プロトコルは、効率を高めるために、本明細書で開示されている新しい時間枠内で書き直すことができる。
【００３９】
現在のところ、当該技術の従事者は、分化の次の段階に進む前に６日間待つことを余儀なくされている。実験操作から次の結果までの時間が少なくとも１週間であるため、生産性が制限される。実験者はその週は待機し、実験を実行し、結果を分析し、新しい実験を開始する必要があり、実験数の合計は年間５０に制限される。これにより、時間についての非効率性が生ずる。代替的に、実験者は、以前の操作の結果を知ることなく、より迅速に実験を開始するかもしれない。そのようなシナリオでは、失敗する運命にある実験的なブランチが追跡され、時間と材料に関して非効率が生ずることになる。
【００４０】
本明細書では、外胚葉を１日／２４時間（またはそれ以下）で生成するための組成物と方法を提供し、それにより、実験を計画し、実行し、データ分析することになり、ダウンタイムまたは失敗した実験ブランチの追跡による生産性の損失を抑えながら最善の道を進めることができるため、効率が向上する。外胚葉には、前臨床および臨床環境での用途がある。
【００４１】
アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）２、３および細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）の併用阻害は、同期神経誘導を２４時間以内に促進する。未分化ヒト多能性幹細胞は、ＬＤＮ１９３１８９およびＢＧＪ３９８の小分子の組み合わせに曝露されたとき、９５％ＮＡＮＯＧ／ＳＯＸ２陽性、ＳＯＸ１／ＰＡＸ６陰性の免疫表現型から、９５％ＮＡＮＯＧ陰性／ＳＯＸ２陽性、ＰＡＸ６および／またはＳＯＸ１陽性の免疫表現型へ移行する。ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤ＰＤ０３２５９０１はこの環境でのＢＧＪ３９８の使用を完全に置き換えるため、線維芽細胞成長因子受容体阻害剤ＢＧＪ３９８は下流のＥＲＫシグナル伝達を阻害することがわかっている。この発見は現在、すべての神経系統の細胞型を導出するためのプロトコルを構築できる最もシンプルかつ効率的なプラットフォームであり、既存の方法を大幅に改善している。
【００４２】
同様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで神経中胚葉を生成する最初の段階は３日より早く進行することはなかった。そのため、神経細胞または中胚葉細胞型を作製するには、神経中胚葉を誘導するのに少なくとも３日間必要であり、その後、発生的に後の事象が生ずるまでの時間がさらに必要である。本明細書で提供される組成物および方法は、この間隔を２４時間未満に短縮し、これらの発生的に後の事象が生ずるための新しい加速された時間枠を作製する。したがって、既存の神経中胚葉分化プロトコルは、効率を高めるために、本明細書で開示されている新しい時間枠内で書き直すことができる。
【００４３】
現在のところ、当該技術の従事者は、分化の次の段階に進む前に３日間待つことを余儀なくされている。実験操作から次の結果までの時間が少なくとも３日であるため、生産性が制限される。実験者はその時間は待機し、実験を実行し、結果を分析し、新しい実験を開始する必要があり、実験数の合計は年間１００に制限されることになる。これにより、時間についての非効率性が生ずる。代替的に、実験者は、以前の操作の結果を知ることなく、より迅速に実験を開始するかもしれない。そのようなシナリオでは、失敗する運命にある実験的なブランチが追跡され、時間と材料に関して非効率が生ずることになる。
【００４４】
本明細書では、神経中胚葉を１日／２４時間（またはそれ以下）で生成するための組成物と方法を提供し、それにより、実験を計画し、実行し、データ分析することとなり、ダウンタイムまたは失敗した実験ブランチの追跡による生産性の損失を抑えながら最善の道を進めることができるため、効率が向上する。したがって、神経中胚葉には、前臨床および臨床環境での用途がある。
【００４５】
アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）２、３、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）の併用阻害、およびＷＮＴ経路の活性化は、同期神経中胚葉形成を２４時間以内に促進する。未分化ヒト多能性幹細胞は、ＬＤＮ１９３１８９、ＢＧＪ３９８、およびＣＨＩＲ９９０２１の小分子の組み合わせに曝露されたとき、９５％ＮＡＮＯＧ／ＳＯＸ２陽性、Ｔ陰性の免疫表現型から９５％ＮＡＮＯＧ陰性／ＳＯＸ２／Ｔ陽性の免疫表現型に移行する。ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ阻害剤ＰＤ０３２５９０１はこの環境でのＢＧＪ３９８の使用を完全に置き換えるため、線維芽細胞成長因子受容体阻害剤ＢＧＪ３９８は下流のＥＲＫシグナル伝達を阻害することがわかっている。この発見は現在、すべての神経中胚葉系統の細胞型を導出するためのプロトコルを構築できる最もシンプルで最も効率的なプラットフォームであり、既存の方法を３倍に改善している。
【００４６】
定義
本開示の記載および特許請求において、以下の用語は、以下に記載の定義に従って使用される。別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができる。ラジカル、置換基、および範囲について以下に列記する特定の値は、単なる例示であり、他の定義された値、またはラジカルと置換基の定義された範囲内の他の値を排除するものではない。
【００４７】
本明細書で使用される場合、冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、冠詞の文法的対象の１つまたは２つ以上、すなわち少なくとも１つを指す。例として、「１つの要素」は、１つの要素または複数の要素を意味する。
【００４８】
本明細書で使用される場合、語句「および／または」は、そのように結合された要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきであり、例えば、ある場合には連言的に存在し、他の場合には選言的に存在する要素である。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「または（ｏｒ）」は、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。たとえば、アイテムのリストを区切る場合、「および／または」または「または」は包括的であると解釈されるものであり、たとえば、複数のアイテムのうち少なくとも１つを含むが、複数のアイテムも含み、任意選択的に追加のリストされていないアイテムを含む。「のうちのただ１つ（ｏｎｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」、「のうちの正確に１つ（ｅｘａｃｔｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」などの明確に反対であることが示されている唯一の用語、または特許請求の範囲で使用される場合の「〜のみからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、多数の要素または列記された要素の正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用される場合「または（ｏｒ）」という用語は、「いずれか（ｅｉｔｈｅｒ）」、「どちらか（ｏｎｅ  ｏｆ）」、「どちらかのみ（ｏｎｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」、または「正確にどちらか（ｅｘａｃｔｌｙ  ｏｎｅ  ｏｆ）」のような排他的用語が先行しうる場合、排他的な代替（即ち、「一方または他方であるが両方ではない」）を示すものとしてのみ解釈される。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、およそ、その範囲の、おおよそ、またはその前後を意味する。「約」という用語が数値範囲と組み合わせて使用される場合、記載される数値の上下の境界を拡大することにより、その範囲を修飾する。一般に、「約」という用語は、本明細書中では、２０％の変動により記載された値の上下で数値を修正するために使用される。
【００５１】
「単離される」という用語は、１つ以上の因子、細胞または、ｉｎ  ｖｉｖｏでの同因子、１つ以上の細胞に伴う１つ以上の細胞成分、を伴わない、因子、１つ以上の細胞を指す。
【００５２】
「細胞」には、ヒトを含む哺乳動物などの脊椎動物からの細胞を含む。哺乳動物には、限定されるものではないが、ヒト、家畜、競技用動物および愛玩動物が含まれる。「動物」という用語に含まれるものは、イヌ、ネコ、魚、アレチネズミ、モルモット、ハムスター、ウマ、ウサギ、ブタ、マウス、サル（例えば、類人猿、ゴリラ、チンパンジーまたはオランウータン）、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシおよび鳥である。
【００５３】
「前駆細胞」は、幹細胞の分化中に産生される細胞であって、最終分化した子孫の特徴のすべてではないが一部を有する細胞である。「内皮前駆細胞」などの定義された前駆細胞は、系統を決定する（ａｒｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）ものであるが、特定の、または最終的に分化した細胞型を決定しない。
【００５４】
「自己複製（Ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）」とは、それらが生じたものと同一の分化能を有する複製娘幹細胞を産生する能力を指す。この文脈で使用される同様の用語は「増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）」である。
【００５５】
「拡大（Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）」とは、分化しない細胞の増殖を指す。
細胞の文脈での「多能性」とは、３つの胚芽層：内胚葉（胃内層、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、または外胚葉（表皮組織および神経系）、のいずれかに分化する可能性／能力を有する幹細胞を指す。しかしながら、細胞の多能性は、胚のすべての細胞を適切に形成できる完全な多能性細胞、例えば胚性幹細胞やｉＰＳＣ（以下を参照）から、完全な多能性細胞の特徴の全てを示していないかもしれないが３つの胚芽層の全ての細胞を形成できる不完全または部分的な多能性細胞までにわたる連続体である。
【００５６】
「生着する（ｅｎｇｒａｆｔ）」または「生着（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）」とは、細胞接触およびｉｎ  ｖｉｖｏでの既存の対象組織への組み込みのプロセスを指す。
「サイトカイン」とは、幹細胞、前駆細胞、または分化細胞のホーミングなど、細胞運動を誘導または増強する細胞因子を指す。サイトカインは、そのような細胞の分裂を刺激することもある。
【００５７】
「分化因子」とは、細胞因子、好ましくは成長因子または系統決定を誘発する因子を指す。
本明細書で使用する場合、「相同の（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」とは、２つのポリマー分子間、たとえば２つの核酸分子間、たとえば２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子間、または２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列の類似性を指す。２つの分子の両方のサブユニットの位置が同じ単量体サブユニットによって占められている場合、たとえば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンによって占められている場合、それらはその位置で相同である。２つの配列間の相同性は、一致する位置または相同である位置の数の直接的な関数であり、たとえば、２つの化合物配列の位置の半分（たとえば、長さがポリマーの１０のサブユニットの５つの位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同であり、位置の９０％、たとえば１０のうちの９が一致または相同である場合、２つの配列は９０％の相同性を共有している。例として、ＤＮＡ配列の３’ＡＴＴＧＣＣ５’および３’ＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を共有している。本明細書において提供されるペプチドは、表Ｉで提供されるものと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」と同義で使用される。
２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。たとえば、２つの配列を比較するのに役立つ数学的アルゴリズムは、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）とアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）のアルゴリズム、（１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８７巻、第２２６４−２２６８頁）および、カーリンとアルトシュルの改変されたもの（１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９０巻、第５８７３−５８７７頁）、である。このアルゴリズムは、アルトシュル他のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（１９９０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２１５巻、４０３−４１０頁）に組み込まれており、例えば、ＮＣＢＩ  ＷｅｂサイトのＢＬＡＳＴツールを使用して、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｌｏｃａｔｏｒを備えたＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ワールドワイドＷｅｂサイトからアクセスできる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本明細書に記載の核酸に相同なヌクレオチド配列を得るために、次のパラメーター：ギャップペナルティ＝５；ギャップ拡張ペナルティ＝２；ミスマッチペナルティ＝３；マッチ報酬＝１；期待値１０．０；ワードサイズ＝１１、を使用して、ＮＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩ  Ｗｅｂサイトで「ｂｌａｓｔｎ」と指定）で実行できる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本明細書に記載のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を取得するために、ＸＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩ  Ｗｅｂサイトで「ｂｌａｓｔｎ」と指定）またはＮＣＢＩ「ｂｌａｓｔｐ」プログラムで、次のパラメーター：期待値１０．０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス、を使用して実行できる。アルトシュル他（１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２５巻、第３３８９−３４０２頁）に記載されているように、比較の目的でギャップ付きアラインメントを得るために、ギャップ付き（Ｇａｐｐｅｄ）ＢＬＡＳＴを利用することができる。代替的に、ＰＳＩ−ＢｌａｓｔまたはＰＨＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の距離の関係を検出する（同文献）、および共通のパターンを共有する分子間の関係を検出する反復検索を実行できる。ＢＬＡＳＴ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔ、およびＰＨＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトのパラメーター（たとえば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を使用できる。
【００５９】
２つの配列間の同一性の割合は、ギャップを許可するかどうかにかかわらず、上記と同様の手法を使用して決定できる。同一性パーセントの計算では、通常、完全一致がカウントされる。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「実質的に相同なアミノ酸配列」は、参照抗体鎖のアミノ酸配列に対して、少なくとも約９５％の相同性、好ましくは少なくとも約９６％の相同性、より好ましくは少なくとも約９７％の相同性、さらにより好ましくは少なくとも約９８の％相同性、最も好ましくは少なくとも約９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列が含まれる。アミノ酸配列の類似性または同一性は、ＢＬＡＳＴ（基本的なローカルアライメント検索ツール）２．０．１４アルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴＰおよびＴＢＬＡＳＴＮプログラムを使用して計算できる。これらのプログラムに使用されるデフォルト環境は、本発明の目的のために実質的に類似のアミノ酸配列を識別するのに適している。
【００６１】
本明細書で使用される「治療する」、「治療すること」または「治療」は、負傷または疾患に関連する状態および／または負傷または疾患に関連する状態の症状を治療すること、予防すること、改善すること、または阻害すること、を含む。
【００６２】
「有効量」とは一般に、パフォーマンスの向上など、望ましい局所的または全身的効果をもたらす量を意味する。例えば、有効用量は、有益なまたは望ましい臨床結果に影響を及ぼすのに十分な量である。前記用量は、１回以上の投与で投与することができ、任意の事前に選択された量の細胞を含むことができる。有効用量と見なされるものの正確な決定は、サイズ、年齢、負傷および／または疾患、または治療中、および負傷が発生してから、または疾患が始まってからの時間など、各被験者に個別の要因に基づく場合がある。当業者、特に医師は、有効用量を構成する細胞の数を決定することができるだろう。
【００６３】
「共投与」は、２つ以上の薬剤の同時および／または連続投与を含み得る。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語は、米国特許法でそれらに帰属する意味を有することができ、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することができる。本明細書で使用される場合、「含んでいる」または「含む」などは、限定することなく含むことを意味する。
【００６４】
実施形態
本開示は、一般的に、幹細胞生物学の分野、より具体的には、新規な培養条件を使用した、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）または多能性幹細胞（胚性幹細胞（ＥＳＣ）、体細胞（例えば、成体）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む）のような幹細胞の分化に関する。具体的には、前部外胚葉および神経中胚葉を得るための方法が提供される。さらに、本発明の方法を使用して得られた前部外胚葉は、最終的に表皮、神経管、および神経堤の構造を生じさせる前駆細胞へのさらなるパターン化に使用することができる。さらに、本発明の方法を使用して得られた神経中胚葉は、最終的に表皮、神経管、神経堤、および体節の構造を生じさせる前駆細胞へのさらなるパターン化に使用することができる。
【００６５】
本開示は、特に前部外胚葉を取得するための、ＰＳＣに由来する神経前駆細胞の集団を取得する方法に関する。具体的には、本発明の方法は、最終的に表皮、神経管、および神経堤の構造を生じさせる前駆細胞へのさらなるパターン化に使用するために、ＰＳＣの前部外胚葉を誘導する。
【００６６】
本発明は、特に神経中胚葉を得るために、ＰＳＣに由来する後神経（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｎｅｕｒａｌ）前駆細胞および後部中胚葉（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｍｅｓｏｄｅｒｍ）前駆細胞の集団を得る方法に関する。具体的には、本発明の方法は、最終的に表皮、神経管、神経堤、および体節の構造を生じさせる前駆細胞へのさらなるパターン化に使用するために、ＰＳＣの神経中胚葉を誘導する。
【００６７】
幹細胞
方法は、広範な未分化幹細胞株にわたり機能し、実施が簡単である。本明細書で提供される組成物、方法およびキットで使用するための幹細胞は、ヒトを含む任意の脊椎動物幹細胞であり得る。
【００６８】
幹細胞には、限定されるものではないが、胚性幹細胞（ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を含む）、体性幹細胞（例えば、ヒト）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ（例えば、ヒト））が含まれる。
【００６９】
胚性幹細胞は、初期の着床前胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞である。ヒト胚は、受精の４〜５日後に胚盤胞の段階に達し、その時点で５０〜１５０個の細胞で構成される。
【００７０】
体性幹細胞には、未分化細胞である成体幹細胞であって、細胞分裂によって増殖して、死にかけている細胞を補充し、損傷した組織を再生する、発生後に体全体に見られる成体幹細胞が含まれる。
【００７１】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣとも称される）は、成体細胞から直接生成できる多能性幹細胞の一種である。ｉＰＳＣは、通常、特定の多能性関連遺伝子セットまたは「リプログラミング因子」の産物を特定の細胞型に導入することで誘導される。リプログラミング因子の本来のセットは、転写因子Ｏｃｔ４（Ｐｏｕ５ｆ１）、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ、およびＫｌｆ４である。この組み合わせはｉＰＳＣの製造において最も一般的であるが、各因子は関連する転写因子、ｍｉＲＮＡ、小分子、または系統指定子などの非関連遺伝子（たとえば、ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８、Ｇｌｉｓ１）に機能的に置き換えることができる。
【００７２】
幹細胞、およびそれから分化したそれらの細胞は、拡大し、さらに、当業者が利用可能な培地および細胞培養方法によってさらに分化および／または凍結することができる。
阻害剤、サイトカインおよびその他の因子
本発明の方法、組成物およびキットで使用される阻害剤には、限定されるものではないが、ブロッキング抗体、ＷＮＴシグナル伝達を活性化するＧＳＫ３ｂの１つ以上の阻害剤、またはＷＮＴ受容体Ｆｒｉｚｚｌｅｄに対するタンパク質リガンド、ＷＮＴの１つ以上の活性化剤を含む、ＡＬＫ２／３シグナル伝達の１つ以上の阻害剤、ＥＲＫシグナル伝達の１つ以上の阻害剤、ＡＬＫ４／５／７シグナル伝達の１つ以上の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ（ＭＥＫ）１／２の１つ以上の阻害剤、および／または線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦ）１、２、３、および／または４の１つ以上の阻害剤を含む。
【００７３】
そのような阻害剤／活性化剤は、限定されるものではないが、ノギンのジスルフィド結合ホモ二量体（マウス（アクセッション番号ＮＭ＿００８７１１（ｍＲＮＡ）、ＮＰ＿０３２７３７．１（タンパク質）およびＮＰ＿０３２７３７（タンパク質）、ヒト（アクセッション番号ＮＭ＿００５４５０（ｍＲＮＡ）およびＮＰ＿００５４４１（タンパク質））、ラット、および／またはアフリカツメガエル（ラット；アクセッション番号ＮＰ＿０３７１２２．１（タンパク質）、アフリカツメガエル；アクセッション番号ＮＰ＿００１１６５３６９（タンパク質）ノギン）；ドルソモルフィン（６−［４−（２−ピペリジン−１−イルエトキシ）フェニル］−３−ピリジン−４−イルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）；ＬＤＮ−１９３１８９（４−［６−［４−（１−ピペラジニル）フェニル］ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル］−キノリン塩酸塩；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）；ＢＧＪ３９８（３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシフェニル）−１−（６−（４−（４−エチルピペラジン−１−イル）−フェニルアミノ）ピリミジン−４−イル）−１−メチル尿素、ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ５３２３５５１０）；ＰＤ０３２５９０１（Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、Ａ８３０１（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−Ｎ−フェニル−４−キノリン−４−イルピラゾール−１−カルボチオアミド；ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ１６２１８９２４）；ＳＢ４３１５４２（４−（５−ベンゾール［１，３］ジオキソール−５−イル−４−ピルジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ベンズアミド水和物、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド水和物、４−［４−（３，４−メチレンジオキシフェニル）−５−（２−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド水和物；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）；ＳＵ５４０２（３−［４−メチル−２−（２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−１Ｈ−ピロール−３−イル］−プロピオン酸、ＰＦ−０２９６９２０７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ（両方ともＷＮＴ経路を活性化するＧＳＫ３−ベータ阻害剤であり、トクリス（Ｔｏｃｒｉｓ）のＣａｙｍａｎｃｈｅｍで購入可能）およびその誘導体およびその組み合わせ、を含む。
【００７４】
さらなる阻害剤／活性化剤とそれらに関する詳細は図２９にある。
タンパク質である活性化剤または阻害剤に関しては、１つ以上の保存的アミノ酸置換も含めることができる。本明細書で使用される「保存的アミノ酸置換」という用語は、本明細書では、以下の５つのグループのうちの１つ内のアミノ酸交換として定義される：
Ｉ．小さな脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性の負に帯電した残基とそのアミド
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
ＩＩＩ．極性の正に帯電した残基
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
ＩＶ．脂肪族の大きな非極性残基
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ；
Ｖ．大きな芳香族残基
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
また、天然リガンドへの特異的結合またはタンパク質の機能を果たすことができる完全長タンパク質の天然または合成部分を包含するポリペプチドの「生物学的に活性なフラグメント（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）」または「生体活性フラグメント（ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」などのポリペプチドのフラグメントも含まれる。
【００７５】
ｉ．アミノ酸置換およびアミノ酸／ペプチド修飾
特定の実施形態において、開示された方法および組成物は、上述の保存的置換などの１つ以上の置換されたアミノ酸残基を有するペプチドの調製を含み得る。例えば、種々の実施形態において、ペプチド配列の構造的、物理的および／または治療的特徴は、１つ以上のアミノ酸残基を置換することにより最適化され得る。
【００７６】
当業者は、一般に、ペプチドにおけるアミノ酸置換は、典型的に、比較的類似した特性の別のアミノ酸によるアミノ酸の置換を伴うことを認識するであろう（すなわち、保存的アミノ酸置換）。様々なアミノ酸の特性、およびタンパク質の構造と機能に対するアミノ酸置換の影響は、当技術分野における広範な研究と知識の主題であった。
【００７７】
例えば、得られたポリペプチドが上記の特性の類似または改善されたプロファイルを有することを期待して、親ポリペプチド配列において以下の等比体積的および／または保存的なアミノ酸の変更を行うことができる：
アルキル置換疎水性アミノ酸の置換：アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、ノルロイシン、Ｓ−２−アミノ酪酸、Ｓ−シクロヘキシルアラニン、または分岐した、環状および直鎖アルキル、アルケニルまたはアルキニル置換を含むＣ１〜１０炭素からの脂肪族側鎖で置換された他の単純なα−アミノ酸を含む。
【００７８】
芳香族置換疎水性アミノ酸の置換：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ビフェニルアラニン、１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、２−ベンゾチエニルアラニン、３−ベンゾチエニルアラニン、ヒスチジン、これまでに列記した芳香族アミノ酸のアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アザ、ハロゲン化（フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード）またはアルコキシ置換型、その実例は次のとおりである：２−、３−または４−アミノフェニルアラニン、２−、３−または４−クロロフェニルアラニン、２−、３−または４−メチルフェニルアラニン、２−、３−または４−メトキシフェニルアラニン、５−アミノ−、５−クロロ−、５−メチル−または５−メトキシトリプトファン、２’−、３’−、または４’−アミノ−、２’−、３’−または４’−クロロ−、２、３、または４−ビフェニルアラニン、２’、３−’または４’−メチル−２、３または４−ビフェニルアラニン、および２−または３−ピリジルアラニン。
【００７９】
塩基性機能を含むアミノ酸の置換：アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン、２，３−ジアミノプロピオン酸、ホモアルギニン、前述のアミノ酸のアルキル、アルケニル、またはアリール置換（Ｃ１−Ｃ１０分岐、直鎖、または環状）誘導体、置換基がヘテロ原子上にあるかどうか（例えば、アルファ窒素、遠位窒素もしくは窒素、またはプロＲ位置のアルファ炭素上など）、を含む。例示的な例として供される化合物には、Ｎ−イプシロン−イソプロピル−リジン、３−（４−テトラヒドロピリジル）−グリシン、３−（４−テトラヒドロピリジル）−アラニン、Ｎ、Ｎ−ガンマ、ガンマ’−ジエチル−ホモアルギニンが含まれる。アルキル基がアルファ炭素のプロ−Ｒ位置を占める、アルファメチルアルギニン、アルファメチル２，３−ジアミノプロピオン酸、アルファメチルヒスチジン、アルファメチルオルニチンなどの化合物も含まれる。また、アルキル、芳香族、ヘテロ芳香族（ヘテロ芳香族基が１つ以上の窒素、酸素、または硫黄原子を単独または組み合わせて、有する）カルボン酸または、酸塩化物、活性エステル、活性アゾリドおよび関連誘導体）およびリジン、オルニチン、または２，３−ジアミノプロピオン酸などの多くの周知の活性化誘導体のいずれかから形成されるアミドも含まれる。
【００８０】
酸性アミノ酸の置換：アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、チロシン、２，４−ジアミノプリオピオン酸、オルニチンまたはリジン、およびテトラゾール置換アルキルアミノ酸のアルキル、アリール、アリールアルキル、およびヘテロアリールスルホンアミドを含む。
【００８１】
側鎖アミド残基の置換：アスパラギン、グルタミン、およびアスパラギンまたはグルタミンのアルキルまたは芳香族置換誘導体を含む。
ヒドロキシル含有アミノ酸の置換：セリン、スレオニン、ホモセリン、２，３−ジアミノプロピオン酸、およびセリンまたはスレオニンのアルキルまたは芳香族置換誘導体を含む。また、上に列記した各カテゴリー内のアミノ酸は、同じグループの別のものに置き換えることができると理解されている。
【００８２】
たとえば、アミノ酸のハイドロパシーインデックスを（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）考慮することができる（カイト（Ｋｙｔｅ）およびドーリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）、１９８２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第１５７巻、第１０５−１３２頁）。アミノ酸の相対的なハイドロパシー特性は、結果として得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これがタンパク質と他の分子との相互作用を定義する。各アミノ酸には、その疎水性と電荷特性に基づいてハイドロパシーインデックスが割り当てられている（カイトおよびドーリトル、１９８２年）これらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）およびアルギニン（−４．５）である。保存的置換を行う際、ハイドロパシーインデックスが＋／−２以内であるアミノ酸の使用が好ましく、＋／−１以内がより好ましく、＋／−０．５以内がさらにより好ましい。
【００８３】
アミノ酸置換は、アミノ酸残基の親水性も考慮に入れることがある（たとえば、米国特許第４，５５４，１０１号明細書）。親水性の値はアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０）；グルタミン酸（＋３．０）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）。グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５．＋−０．１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸を類似の親水性の他のものと交換することが好ましい。
【００８４】
その他の考慮事項には、アミノ酸側鎖のサイズが含まれる。例えば、グリシンまたはセリンなどのコンパクトな側鎖を有するアミノ酸を、例えばトリプトファンまたはチロシンなどの嵩高い側鎖を有するアミノ酸に置き換えることは一般に好ましくないだろう。タンパク質の二次構造に対するさまざまなアミノ酸残基の影響も考慮事項である。経験的研究を通じて、タンパク質ドメインがアルファヘリックス、ベータシート、または逆回転の二次構造を採用する傾向に対する異なるアミノ酸残基の影響が決定されており、当技術分野で知られている（例えば、チョウ（Ｃｈｏｕ）およびファスマン（Ｆａｓｍａｎ）、１９７４年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第１３巻、第２２２−２４５頁、１９７８年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第４７巻、２５１−２７６頁、１９７９年、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、第２６巻、第３６７−３８４頁）
そのような考察および広範な経験的研究に基づいて、保存的アミノ酸置換の表が構築されており、当技術分野で知られている。例えば：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシン。代替的に、Ａｌａ（Ａ）ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｖａｌ；Ａｒｇ（Ｒ）ｇｌｎ、ａｓｎ、ｌｙｓ；Ａｓｎ（Ｎ）ｈｉｓ、ａｓｐ、ｌｙｓ、ａｒｇ、ｇｌｎ；Ａｓｐ（Ｄ）ａｓｎ、ｇｌｕ；Ｃｙｓ（Ｃ）ａｌａ、ｓｅｒ；Ｇｌｎ（Ｑ）ｇｌｕ、ａｓｎ；Ｇｌｕ（Ｅ）ｇｌｎ、ａｓｐ；Ｇｌｙ（Ｇ）ａｌａ；Ｈｉｓ（Ｈ）ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ａｒｇ；Ｉｌｅ（Ｉ）ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｌｅｕ；Ｌｅｕ（Ｌ）ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｉｌｅ；Ｌｙｓ（Ｋ）ｇｌｎ、ａｓｎ、ａｒｇ；Ｍｅｔ（Ｍ）ｐｈｅ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；Ｐｈｅ（Ｆ）ｌｅｕ、ｖａｌ、ｉｌｅ、ａｌａ、ｔｙｒ；Ｐｒｏ（Ｐ）ａｌａ；Ｓｅｒ（Ｓ）、ｔｈｒ；Ｔｈｒ（Ｔ）ｓｅｒ；Ｔｒｐ（Ｗ）ｐｈｅ、ｔｙｒ；Ｔｙｒ（Ｙ）ｔｒｐ、ｐｈｅ、ｔｈｒ、ｓｅｒ；Ｖａｌ（Ｖ）ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ａｌａ。
【００８５】
アミノ酸置換に関するその他の考慮事項には、残基がタンパク質の内部に位置するか、溶媒に曝露されるかが含まれる。内部残基の場合、保存的置換には以下が含まれる。ＡｓｐおよびＡｓｎ；ＳｅｒおよびＴｈｒ；ＳｅｒおよびＡｌａ；ＴｈｒおよびＡｌａ；ＡｌａおよびＧｌｙ；ＩｌｅおよびＶａｌ；ＶａｌおよびＬｅｕ；ＬｅｕおよびＩｌｅ；ＬｅｕおよびＭｅｔ；ＰｈｅおよびＴｙｒ；ＴｙｒおよびＴｒｐ。（たとえば、ＰＲＯＷＬロックフェラー大学のＷｅｂサイトを参照）。溶媒に曝露される残基の場合、保存的置換には以下が含まれる。ＡｓｐおよびＡｓｎ；ＡｓｐおよびＧｌｕ；ＧｌｕおよびＧｌｎ；ＧｌｕおよびＡｌａ；ＧｌｙとＡｓｎ；ＡｌａおよびＰｒｏ；ＡｌａおよびＧｌｙ；ＡｌａおよびＳｅｒ；ＡｌａおよびＬｙｓ；ＳｅｒおよびＴｈｒ；ＬｙｓおよびＡｒｇ；ＶａｌおよびＬｅｕ；ＬｅｕおよびＩｌｅ；ＩｌｅおよびＶａｌ；ＰｈｅおよびＴｙｒ（同著者）。アミノ酸置換の選択を支援するために、ＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス、Ｄａｙｈｏｆｆマトリックス、Ｇｒａｎｔｈａｍマトリックス、ＭｃＬａｃｈｌａｎマトリックス、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅマトリックス、Ｈｅｎｉｋｏｆｆマトリックス、Ｍｉｙａｔａマトリックス、Ｆｉｔｃｈマトリックス、Ｊｏｎｅｓマトリックス、Ｒａｏマトリックス、ＬｅｖｉｎマトリックスおよびＲｉｓｌｅｒマトリックスのようなさまざまなマトリックスが構築されている（同著者）。
【００８６】
アミノ酸置換の決定では、正に荷電した残基（たとえば、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）と負に荷電した残基（たとえば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）の間のイオン結合（塩橋）、または近くのシステイン残基間のジスルフィド結合の形成など、分子間または分子内結合の存在を考慮することもできる。
【００８７】
活性に悪影響を与えることなく他の修飾も組み込むことができ、これらには、限定されるものではないが、天然のＬ−異性体の１つ以上のアミノ酸の、Ｄ−異性体のアミノ酸による置換が含まれる。したがって、ペプチドは、１つ以上のＤ−アミノ酸残基を含んでいてもよく、またはすべてがＤ−型であるアミノ酸を含んでいてもよい。本発明に従うペプチドのレトロインベルソ型、例えば、すべてのアミノ酸がＤ−アミノ酸型で置換されている逆型ペプチドも企図される。
【００８８】
本明細書に記載のペプチドはまた、非タンパク質構成アミノ酸である非天然アミノ酸、例えば、β−アミノ酸（β３およびβ２）、ホモアミノ酸、プロリンおよびピルビン酸誘導体、３−置換アラニン誘導体、グリシン誘導体、環置換フェニルアラニンおよびチロシン誘導体、直鎖コアアミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸、アミノ酸および／またはＬ−およびＤ−アミノ酸を含む重原子アミノ酸（保護または非保護形態）を含む。そのような非天然アミノ酸は、例えば、半減期、活性および／または溶解度を増加させるために使用することができる。ペプチドは、プローブおよび／またはタグを含むこともできる。
【００８９】
本発明のタンパク質部分の可能な化学修飾には、周知の方法に従って、循環器系での滞留時間を延長し、免疫原性を低下させるためのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他のポリマー（デキストランなど）を用いた誘導体化も含まれる（たとえば、リシ（Ｌｉｓｉ）他、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４：１９（１９８２）、；ボーチャンプ（Ｂｅａｕｃｈａｍｐ）他、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３１：２５（１９８２）、グッドソン（Ｇｏｏｄｓｏｎ）他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：３４３（１９９０）を参照）。
【００９０】
ペプチドの安定性を高め、および／または生分解性を低下させるために、ペプチド化学部分またはさらなる（修飾した、またはＤ−）アミノ酸のアミノ、またはカルボキシ末端に付加することも有利かもしれない。
【００９１】
本発明のペプチド結合模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃ）は、当業者に周知のペプチド骨格修飾を含む。そのような修飾には、アミド窒素、アルファ炭素、アミドカルボニルの修飾、アミド結合の完全な置換、延長、削除、または骨格架橋が含まれる。一般的に、スポトーラ（Ｓｐａｔｏｌａ）のＣｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第ＶＩＩ巻（ワインスタイン（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）編、１９８３年）を参照されたい。いくつかのペプチド骨格修飾が知られており、本発明の実施に使用することができる。
【００９２】
無論、本発明のタンパク質またはペプチドは、活性に影響を与えることなく修飾されたアミノ酸残基を組み込んでもよいことが理解されよう。例えば、末端は、「望ましくない分解」からＮ末端およびＣ末端を保護および／または安定化するのに適した化学置換基であるブロッキング基を含むように誘導体化することができ、「望ましくない分解」なる用語は、化合物の機能に影響を与える可能性が高い、その末端での化合物のあらゆる種類の酵素的、化学的または生化学的分解、すなわち、その末端での化合物の連続的な分解を包含することを意味する。
【００９３】
ブロッキング基には、ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性に悪影響を与えないペプチド化学の分野で従来使用されている保護基が含まれる。例えば、適切なＮ末端ブロッキング基は、Ｎ末端のアルキル化またはアシル化により導入され得る。適切なＮ末端ブロッキング基の例には、Ｃ１−Ｃ５分岐または非分岐アルキル基、ホルミルおよびアセチル基などのアシル基、ならびにアセトアミドメチル（Ａｃｍ）基などのその置換形態が含まれる。アミノ酸のデスアミノ類似体も有用なＮ末端ブロッキング基であり、ペプチドのＮ末端に結合させるか、Ｎ末端残基の代わりに使用することができる。Ｃ末端のカルボキシル基が組み込まれているか組み込まれていない適切なＣ末端ブロッキング基には、エステル、ケトンまたはアミドが含まれる。エステルまたはケトン形成アルキル基、特にメチル、エチル、プロピルなどの低級アルキル基、および一級アミン（−ＮＨ２）などのアミド形成アミノ基、およびメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノなどのモノ−およびジ−アルキルアミノ基は、Ｃ末端ブロッキング基の例である。アグマチンなどの脱カルボキシル化アミノ酸類似体も有用なＣ末端ブロッキング基であり、ペプチドのＣ末端残基に結合させるか、その代わりに使用できる。さらに、末端の遊離アミノおよびカルボキシル基を合わせてペプチドから完全に除去して、ペプチド活性に影響を与えることなく、そのデスアミノおよび脱カルボキシル化形態を得ることができることが理解されよう。
【００９４】
本発明の酸付加塩も機能的等価物として企図される。したがって、ペプチドの水溶性塩を提供するべく、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、または酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、タタリック酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの有機酸で処理された本発明に従うペプチドは、本発明での使用に適している。
【００９５】
修飾（通常は一次配列を変更しない）には、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのポリペプチドの化学的誘導体化、たとえば、アセチル化またはカルボキシル化が含まれる。グリコシル化の修飾も含まれ、例えば、ポリペプチドのグリコシル化パターンをその合成および処理中またはさらなる処理ステップジに修飾することにより作製されるもの、例えば、ポリペプチドを、グリコシル化に影響する酵素、例えば、哺乳類のグリコシル化または脱グリコシル化酵素にさらすことにより作製されるものも含まれる。また、リン酸化アミノ酸残基を有する配列、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニンも含まれる。
【００９６】
タンパク質分解に対する耐性を改善するため、または溶解特性を最適化するため、または治療薬としてより適切にするために、通常の分子生物学的技術を使用して修飾されたポリペプチドも含まれる。そのようなポリペプチドの類似体には、天然に存在するＬ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−アミノ酸または天然に存在しないまたは非標準の合成アミノ酸を含むものが含まれる。本発明のペプチドは、本明細書に列記される特定の例示的なプロセスのいずれかの生成物に限定されない。
【００９７】
本発明は、構造を有するベータ−アラニン（β−アラニン、β−Ａｌａ、ｂＡ、およびβＡとも称される）の使用を含む。
【００９８】
【化１】
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【００９９】
議論したように、本発明のペプチドリガンドの修飾または最適化は本出願の範囲内である。修飾または最適化されたペプチドは、ペプチド結合リガンドの定義に含まれる。具体的には、同定されたペプチド配列を修飾して、その効力、薬物動態学的挙動、安定性、および／または他の生物学的、物理的、化学的特性を最適化することができる。
【０１００】
実際に使用される最適化された濃度は、５００ｎＭ  ＬＤＮ１９３１８９、５００ｎＭ  Ａ８３０１または１０ｕＭ  ＳＢ３５４３２、１００ｎＭ  ＢＧＪ３９８または１ｕＭ  ＰＤ  ＰＤ０３２５９０１、１５ｕＭ  ＳＵ５４０２である。ＬＤＮ１９３１８９は１０ｎＭ〜１ｕＭ、Ａ８３０１は１０ｎＭ〜１０ｕＭ、ＳＢ３５４３２は１ｕＭ〜５０ｕＭ、ＢＧＪ３９８は１０ｎＭ〜５ｕＭ、ＰＤ０３２５９０１は１００ｎＭ〜５ｕＭ、ＳＵ５４０２は１ｕＭ〜３０ｕＭ、ＣＨＩＲ９９０２１は１ｍＭ〜６ｍＭで機能する。大部分の細胞は、１２〜１８時間の曝露後にＰＡＸ６／ＳＯＸ１またはＳＯＸ２／Ｔの発現を確立している。４８時間以上の曝露は細胞死を引き起こす。
【０１０１】
分化した細胞型
一実施形態において、前記幹細胞は前部外胚葉に分化する。一実施形態において、本明細書に開示される分化方法に従って、分化した細胞（外胚葉）は、培養細胞の前記集団の少なくとも１０％から１００％までである。当業者は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）などの様々な周知の方法を使用して、集団における外胚葉細胞の割合を容易に決定することができる。外胚葉を含む集団の範囲は、本明細書に記載の方法により産生される外胚葉細胞の、約５０〜５５％、５５〜６０％、および６５〜７０％を含み、約７０〜７５％、７５〜８０％、８０〜８５％および約８５〜９０％、９０〜９５％、および９５〜１００％を含む。しかしながら、約１０〜２５％、２５〜３０％、３０〜３５％、３５〜４０％、４０〜４５％、および４５〜５０％などの純度の低い集団も有用である。外胚葉細胞の濃度は、集団内の遺伝子発現プロファイルに従って決定できる。
【０１０２】
本明細書で提供される方法によって作製された前部外胚葉は、中枢および／または末梢神経系前駆細胞、パターン化可能な前駆細胞、ニューロン（４，５）（ＮｅｕＮ／ベータ−ＩＩＩ−チューブリンを発現する）およびグリア（２６）（ＯＬＩＧ２／ＳＯＸ１０を発現する）；および表皮の派生物（２７）（サイトケラチン１４およびｐ６３を発現する）および神経堤（１１）（Ｐａｘ３／ＳＯＸ１０／ＳＯＸ９／ｐ７５／ＨＮＫを発現する）からなる群から選択される細胞にさらに分化され得る。さらに、これらの集団は、表面外胚葉、神経堤幹細胞、脊髄神経上皮、脊髄（２８）、および体節（ＴＢＸ６を発現する）を形成できる神経中胚葉前駆体（３０）（ＳＯＸ２／Ｔを発現する）を形成するように誘導でき、それは、筋肉前駆細胞（ミオゲニン／ＰＡＸ３／７）、軟骨細胞前駆細胞、線維芽細胞前駆細胞、および骨芽細胞前駆細胞にさらに分化し得る。
【０１０３】
一実施形態において、前記幹細胞は神経中胚葉に分化する。一実施形態において、本明細書に開示される分化方法に従って、分化した細胞（神経中胚葉）は、培養細胞の前記集団の少なくとも１０％から１００％までである。当業者は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）などの様々な周知の方法を使用して、集団における神経中胚葉の割合を容易に決定することができる。神経中胚葉を含む集団の範囲は、本明細書に記載の方法により産生される外胚葉細胞の、約５０〜５５％、５５〜６０％、および６５〜７０％を含み、約７０〜７５％、７５〜８０％、８０〜８５％および約８５〜９０％、９０〜９５％、および９５〜１００％を含む。しかしながら、約１０〜２５％、２５〜３０％、３０〜３５％、３５〜４０％、４０〜４５％、および４５〜５０％などの純度の低い集団も有用である。神経中胚葉の濃度は、集団内の遺伝子発現プロファイルに従って決定できる。
【０１０４】
本明細書で提供される方法によって作製された神経中胚葉は、中枢および末梢神経系前駆細胞、パターン化可能な前駆細胞、ニューロン（４、５）（ＮｅｕＮ／ベータ−ＩＩＩ−チューブリンを発現する）およびグリア（２６）（ＯＬＩＧ２／ＳＯＸ１０を発現する）；および表皮の派生物（２７）（サイトケラチン１４およびｐ６３を発現する）および神経堤（１１）（ＰＡＸ３／ＳＯＸ１０／ＳＯＸ９／ｐ７５／ＨＮＫを発現する）からなる群から選択される細胞にさらに分化され得る。さらに、これらの集団を誘導して体節組織（２９）（ＴＢＸ６を発現する）を形成することができ、それはさらに筋肉前駆細胞（ミオゲニン／ＰＡＸ３／７）、軟骨細胞前駆細胞、線維芽細胞前駆細胞、および骨芽細胞前駆細胞に分化できる。
【０１０５】
細胞培養
分化の間、本発明の細胞は、当技術分野で十分に確立されており、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から市販されている培養培地で培養することができる。そのような培地には、限定されるものではないが、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ  Ｆ１２培地、イーグルの最小必須培地、Ｆ−１２Ｋ培地、イスコーブの改変ダルベッコ培地、またはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。使用される細胞に必要な培地および／または培地添加物の濃度を改変または調節することは、当業者の技術の範囲内である。ピルビン酸ナトリウムの有無にかかわらず、多くの培地が低グルコース製剤として利用可能であることも明らかである。
【０１０６】
哺乳動物の血清による細胞培養培地の補充も企図される。血清には、多くの場合、生存率と拡大に必要な細胞因子と成分が含まれる。血清の例には、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清（ＢＳ）、仔ウシ血清（ＣＳ）、胎児仔ウシ血清（ＦＣＳ）、新生児ウシ血清（ＮＣＳ）、ヤギ血清（ＧＳ）、ウマ血清（ＨＳ）、ヒト血清、ニワトリ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、ラット血清（ＲＳ）、血清代替物、およびウシ胚液が含まれる。補体カスケードの成分を不活性化する必要があると思われる場合、血清は５５〜６５℃で熱不活性化できることが理解される。血清濃度の調整、または培養培地からの血清の回収も、１つ以上の望ましい細胞型の生存を促進するために使用できる。一実施形態において、内胚葉前駆細胞は、種細胞型に特異的なＦＢＳ／または血清の存在下で培養される。例えば、約５％〜約１５％を含む約０．５％〜約５％以上の総血清（例えば、ＦＢＳ）濃度で幹細胞を単離および／または拡大させることができる。血清の濃度は経験的に決定できる。
【０１０７】
追加の補充物（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を使用して、最適な成長と拡大のために微量元素を細胞に供給することもできる。そのような補充物には、インスリン、トランスフェリン、セレンナトリウム、およびそれらの組み合わせが含まれる。これらの成分は、限定されるものではないが、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、アール塩溶液、抗酸化補充物、ＭＣＤＢ−２０１補充物、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ニコチンアミド、アスコルビン酸および／またはアスコルビン酸−２−リン酸並びにさらなるアミノ酸のような塩溶液に含まれる。多くの細胞培養培地にはすでにアミノ酸が含まれているが、ただし、細胞を培養する前に補充が必要なものもある。そのようなアミノ酸には、限定されるものではないが、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イノシトール、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、およびＬ−バリンが含まれる。
【０１０８】
抗生物質は通常、細菌、マイコプラズマ、および真菌の混入を軽減するために細胞培養でも使用される。通常、使用される抗生物質または抗真菌化合物は、ペニシリン／ストレプトマイシンの混合物であるが、限定されるものではないが、アンホテリシン（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標））、アンピシリン、ゲンタマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ナリジキシン酸、ネオマイシン、ナイスタチン、パロモマイシン、ポリミキシン、ピューロマイシン、リファンピシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、タイロシンおよびゼオシンを含んでいてもよい。
【０１０９】
ホルモンも細胞培養に有利に使用でき、限定されるものではないが、Ｄ−アルドステロン、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、デキサメタゾン、β−エストラジオール、ヒドロコルチゾン、インスリン、プロラクチン、プロゲステロン、ソマトスタチン／ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、チロトロピン、サイロキシン、およびＬ−サイロニンを含んでいてもよい。β−メルカプトエタノールは、細胞培養培地に補充することもできる。
【０１１０】
細胞の種類と分化した細胞の運命に応じて、脂質と脂質担体を使用して細胞培養培地を補充することもできる。そのような脂質および担体には、限定されるものではないが、とりわけ、シクロデキストリン（α、β、γ）、コレステロール、アルブミンに共役したリノール酸、アルブミンに共役したリノール酸およびオレイン酸、非共役リノール酸、アルブミンに共役したリノール−オレイン−アラキドン酸、非共役およびアルブミンに共役したオレイン酸が含まれる。アルブミンは、脂肪酸を含まない製剤にも同様に使用できる。
【０１１１】
フィーダー細胞層（ｆｅｅｄｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌａｙｅｒｓ）の使用も企図される。フィーダー細胞は、緻密な（ｆａｓｔｉｄｉｏｕｓ）培養細胞の増殖をサポートするために使用される。フィーダー細胞は、照射によって不活性化された正常な細胞である。培養では、フィーダー層は他の細胞の基底層として機能し、それ自体のさらなる成長または分裂をすることなく細胞因子を供給する（リム（Ｌｉｍ）およびボドナー（Ｂｏｄｎａｒ）、２００２年）。肝細胞培養で通常使用されるフィーダー層細胞の例は、肝細胞および胚線維芽細胞である（スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）、Ａ．他、２０００年）が、内胚葉前駆細胞の最適な成長、生存率、および拡大を可能にするのに有利な細胞成分および因子を供給することができる任意の有糸分裂後の細胞であってもよい。場合によっては、白血病抑制因子（ＬＩＦ）には抗分化特性があるため、細胞を未分化の増殖状態に保つためにフィーダー細胞層は必要ではない。多くの場合、定義された濃度のＬＩＦの補充は、細胞を未分化状態に維持するために必要なすべてである。
【０１１２】
培養中の細胞は、懸濁液中に維持され得るか、細胞外マトリックス成分や合成または生体高分子などの固体支持体に付着させることができる。細胞は、多くの場合、固体支持体への付着を促進する追加因子（付着因子など）（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＶ型コラーゲン、コンカナバリンＡ、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、「スーパーフィブロネクチン」および／またはフィブロネクチン様ポリマー、ゼラチン、ラミニン、ポリ−Ｄおよびポリ−Ｌ−リジン、マトリゲル（商標）、トロンボスポンジン、および／またはビトロネクチンなど）を必要とする。
【０１１３】
また、細胞の維持条件には、細胞が未分化の形態のままになることを可能にする細胞因子が含まれていてもよい。細胞が自己複製する（例えば、それらが生じた細胞と同一の分化能を有する複製娘細胞を生成するために；この文脈で使用される類似の用語は「増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）」）ことを可能にするが別の細胞（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ）を生成しない補充物は当業者には明らかであるが、同補充物は分化する前に培地から除去されるべきである。すべての細胞がこれらの因子を必要とするわけではないことも明らかである。実際、これらの因子は、細胞の種類に応じて、望ましくない効果を誘発する場合がある。
【０１１４】
筋原性前駆細胞は、本明細書に記載のマーカ（遺伝子および／またはタンパク質）に基づいて選択することができる。したがって、本発明の細胞を同定および／または単離するために、単独で、または上記の方法と一緒に、正の自然選択（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）法を使用することができる。正の自然選択の方法には、限定されるものではないが、免疫ブロット法、免疫蛍光法、および／または酵素結合免疫吸着アッセイを含む、顕微鏡法および／または他の検出手段を使用した視覚的選択が含まれ得る。正の自然選択の他の方法には、限定されるものではないが、追加の選択的培養技術（たとえば、可変細胞密度またはＣＯ２量）、フローサイトメトリー、ＲＴ−ＰＣＲ、および／または細胞分離のマイクロチップベースの方法が含まれる。
【０１１５】
細胞の投与
本明細書に記載されるように調製された細胞は、限定されるものではないが、局所注射、カテーテル投与、全身注射、腹腔内注射、非経口投与、動脈内注射、静脈内注射、脳室内注入、胎盤内注射、子宮内注射、外科的心筋内注射、経心内膜注射、経血管注射、冠動脈内注射、経血管注射、筋肉内注射、目的の組織への外科的注入、または組織表面への直接適用（例えば、手術中または傷の上に）を含む、当技術分野で利用可能な様々な方法によって対象に投与することができる。
【０１１６】
静脈内注射は、細胞投与の最も簡単な方法であるが、幹細胞が目的の組織に到達するためには、幹細胞のホーミングへのより高い依存度が必要である。負傷した組織への細胞の「ホーミング」は、移植された細胞をその成長と機能に有利な環境に集中させるであろう。ホーミングを促進するためのサイトカインによる患者の前治療は、本発明の方法で企図される別の代替案である。ホーミング信号の強度が低い場合、細胞を筋肉に直接注入すると、より好ましい結果が得られる。特定のサイトカイン（たとえば、幹細胞、前駆細胞、分化細胞のホーミングなど、細胞の動きを誘発または増強する細胞因子）は、損傷した筋肉組織の部位への細胞またはその分化した対応物の移動を促進できる。サイトカインには、限定されるものではないが、間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が含まれる。サイトカインには、ホーミングプロセスを促進するＩＣＡＭ、ＶＣＡＭなどの内皮接着分子の発現を促進するものも含まれる。
【０１１７】
血管新生により、新たに形成される組織の生存率を高めることができる。血管新生を促進する因子には、限定されるものではないが、ＶＥＧＦ、ａＦＧＦ、アンジオゲニン、アンジオテンシン−１およびアンジオテンシン−２、ベータセルリン、ｂＦＧＦ、Ｘ因子およびＸａ因子、ＨＢ−ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、アンジオモジュリン、アンジオトロピン、アンジオポエチン−１、プロスタグランジンＥ１およびプロスタグランジンＥ２、ステロイド、ヘパリン、１−ブチリルグリセロール、ニコチン酸アミドが含まれる。
【０１１８】
アポトーシスを減少させる因子は、筋肉などの新しい組織の形成を促進することもある。アポトーシスを減少させる因子には、限定されるものではないが、β−ブロッカー、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥ阻害剤）、ＡＫＴ、ＨＩＦ、カルベジロール、アンジオテンシンＩＩタイプ１受容体拮抗薬、カスパーゼ阻害剤、カリポリド、およびエニポリドが含まれる。
【０１１９】
外因性因子（例：サイトカイン、分化因子（例：系統決定を誘導する、成長因子および血管新生因子などの細胞因子）、血管新生因子、および抗アポトーシス因子）は、骨格筋細胞の前、後、または同時に投与できる。投与量は可変であり、最初の投与とそれに続く投与が含まれる場合がある。
【０１２０】
自家単核骨髄細胞の現在のヒトでの研究では、１〜４×１０７個の細胞の範囲の経験的用量が使用されている。しかしながら、異なるシナリオでは、目的の組織に注入される細胞の量を最適化する必要がある。したがって、投与される細胞の量は、治療される対象によって異なる。一実施形態において、１０４〜１０８個、より好ましくは１０５〜１０７個、最も好ましくは３×１０７個の幹細胞、および任意で、１日あたり５０〜５００μｇ／ｋｇのサイトカインをヒト対象に投与することができる。局所的な筋肉の配置／注射では、わずか４０，０００個の細胞が投与されてもよい。ただし、有効な用量とみなされるものの正確な決定は、サイズ、年齢、疾患または負傷、サイズの損傷、損傷が発生してからの時間、および送達のモード（直接注射−低用量、静脈内−高用量）に関連する因子を含み、各患者個人の因子に基づいていてもよい。
【０１２１】
当業者は、組成物中の、および本発明の方法で投与される、細胞および任意の添加剤、ビヒクル、および／または担体の量を容易に決定することができる。典型的には、（活性細胞および／またはサイトカインに加えて）任意の添加物は、リン酸緩衝生理食塩水中に０．００１〜５０重量％溶液の量で存在し、活性成分は例えば、約０．０００１〜約１重量％を含む、約０．０００１〜約０．０５重量％若しくは約０．００１〜約２０重量％を含む、約０．０１〜約１０重量％を含む、および約０．０５〜約５重量％を含む、約０．０００１〜約５重量％のような、マイクログラムからミリグラムのオーダーで存在する。無論、動物またはヒトに投与される任意の組成物、および特定の投与方法では、したがって、適切な動物モデル（例えば、マウスなどのげっ歯類）で致死量（ＬＤ）およびＬＤ５０を決定するなど、毒性を決定する、組成物の投与量、その中の成分の濃度、および適切な応答を誘発する組成物を投与するタイミングを決定することが好ましい。
【０１２２】
本発明の治療用組成物を投与する場合、一般に、単位投与量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）で製剤化されるであろう。注射に適した医薬製剤には、滅菌水溶液および分散液が含まれる。担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。
【０１２３】
さらに、抗菌防腐剤、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝液を含む、組成物の安定性、無菌性、および等張性を高める種々の添加剤を加えることができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって保証され得る。多くの場合、等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを含めることが望ましいであろう。注射可能な医薬形態の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらされ得る。しかしながら、本発明によれば、使用される任意のビヒクル、希釈剤、または添加剤は、細胞と適合性でなければならない。
【０１２４】
滅菌注射液は、本発明の実施に利用される細胞を、必要に応じて様々な量の他の成分を含む必要量の適切な溶媒に組み込むことにより調製することができる。
一実施形態において、細胞を最初に投与し、その後、細胞をさらに投与することにより維持することができる。例えば、細胞は１つの注射方法により投与され、その後、異なるまたは同じタイプの方法によりさらに投与され得る。例えば、筋肉機能を適切なレベルにするために、外科的注射により細胞を投与することができる。次いで、患者のレベルは、例えば静脈内注射によって維持され得るが、患者の状態に依存して他の投与形態が使用されてもよい。
【０１２５】
ヒト被験者は一般にイヌや他の実験動物よりも長く治療されるため、治療の長さは病気の進行および効果の長さに比例することに留意されたい。用量は、単回投与であっても、数日間にわたる複数回投与であってもよい。したがって、当業者は、過度の実験をすることなく、本開示および本明細書で引用した文書および当技術分野の知識からの技術により、動物実験（例えばラット、マウス、イヌなど）からヒトにスケールアップすることができる。治療の長さは一般に、病気の進行および薬物の効果の長さ、ならびに治療される対象に比例する。
【０１２６】
本発明の細胞を含む組成物の例には、懸濁液、および無菌懸濁液またはエマルジョンなどの直接投与用または静脈内投与用の製剤（例えば、注射可能な投与）、を含む投与用の液体製剤が含まれる。そのような組成物は、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの適切な担体、希釈剤、または賦形剤と混合してもよい。組成物は凍結乾燥することもできる。組成物は、投与経路および所望の製剤に応じて、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ゲル化または粘度増強添加剤、防腐剤、香味剤、色素などの補助物質を含むことができる。参照により本明細書に組み込まれる「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥ」、第１７版、１９８５年、のような標準的なテキストは、過度の実験を行うことなく適切な製剤を調製するために参照することができる。
【０１２７】
本発明の組成物は、液体製剤、例えば、選択されたｐＨに緩衝され得る等張性水溶液、懸濁液、エマルジョンまたは粘性組成物として簡便に提供される。通常、液体製剤は、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物よりも調製が容易である。さらに、液体組成物は、特に注射による投与がいくぶん便利である。一方、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間を提供するために、適切な粘度範囲内で配合することができる。
【０１２８】
適切な担体および他の添加剤の選択は、投与の正確な経路および特定の剤形の性質、たとえば液体剤形（たとえば、組成物を溶液、懸濁液、ゲルまたは、時間放出型または液体充填型などの別の液体型）に依存するであろう。
【０１２９】
溶液、懸濁液、およびゲルは通常、細胞に加えて大量の水（好ましくは精製水、滅菌水）を含んでいる。ｐＨ調整剤（たとえば、ＮａＯＨなどの塩基）、乳化剤または分散剤、緩衝剤、防腐剤、湿潤剤、およびゲル化剤（たとえば、メチルセルロース）などの他の成分も少量存在する。組成物は等張性であり得る、すなわち、それらは血液および涙液と同じ浸透圧を有し得る。
【０１３０】
本発明の組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウム、またはデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコールまたは他の無機または有機溶質などの他の薬学的に許容される薬剤を使用して達成できる。特にナトリウムイオンを含む緩衝液には塩化ナトリウムが好ましい。
【０１３１】
組成物の粘度は、必要に応じて、薬学的に許容される増粘剤を使用して選択したレベルに維持できる。メチルセルロースは、容易かつ経済的に入手可能であり、扱いやすいため、好ましい。他の適切な増粘剤には、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが含まれる。増粘剤の好ましい濃度は、選択された薬剤と所望の粘度に依存する。粘性組成物は、通常、そのような増粘剤の添加により溶液から調製される。
【０１３２】
組成物の寿命を延ばすために、薬学的に許容される防腐剤または細胞安定剤を使用することができる。好ましくは、保存剤が必要な場合、本発明に記載の細胞の生存率または有効性に影響を及ぼさない組成物を選択することは、十分に当業者の範囲内である。
【０１３３】
組成物は、特定の患者の年齢、性別、体重、状態、および投与に使用される組成物形態（例えば、固体対液体）などの要因を考慮して、医学および獣医学の当業者が利用可能な用量で、技術によって投与することができる。
【０１３４】
初期投与およびさらなる用量または連続投与のための適切なレジーム（ｒｅｇｉｍｅｓ）も可変であり、初期投与とそれに続く投与を含み得る。
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態をさらに説明することを意図しており、本発明の範囲を決して限定するものではない。
【実施例】
【０１３５】
実施例１
材料  方法
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の培養
継代する前に、組換えヒトビトロネクチンストック溶液（５００ｕｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＡＦ−１４０−０９、アメリカ合衆国ニュージャージー州ロッキーヒル）をＤＰＢＳ＋／＋（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１４０４０−１３３、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ウォルサム）で１：１００に希釈し、そして９．６ｃｍ２の組織培養処理ウェル（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニューハンプシャー州ハンプトン）を室温で１時間コーティングするために使用した。ｈＰＳＣは、１ｍＬの高張クエン酸緩衝液（１１）または同等物で１回洗浄し、コロニー剥離が起こるまで３７℃で６分間、１ｍＬの高張クエン酸緩衝液（１１）で培養した。コロニーを収集し、粉砕により２５〜５０個の細胞断片に処理し、５ｍＬのＥｓｓｅｎｔｉａｌ６培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ１５１６４０１、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて解離をクエンチした。懸濁液を１５ｍＬコニカル管に収集し、２００ＸＧで１分間遠心分離した。上清を吸引し、１：６のスプリット比を想定して、ペレットを１．２ｍＬのＥｓｓｅｎｔｉａｌ６培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ２８５８５０１、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ウォルサム）に再懸濁した。０．２ｍＬの培養液を、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地を含むｒｈＶＴＮでコーティングしたウェルに播種した。培養物は、毎日の培地の交換を伴ってＥｓｓｅｎｔｉａｌ８培地で維持し、３日ごとに継代した。
【０１３６】
神経上皮へのｈｉＰＳＣの加速分化
ＬＤＮ−１９３１８９ＨＣｌ（５００ｎＭ、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、カタログ番号Ｓ７５０７、アメリカ合衆国テキサス州ヒューストン）およびＢＧＪ３９８（１００ｎＭ、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、カタログ番号Ｓ２１８３、アメリカ合衆国テキサス州ヒューストン）を補充したＥｓｓｅｎｔｉａｌ６からなる分化培地を組み合わせて、６ウェルプレートのビトロネクチンでコーティングしたウェル毎に２ｍＬを分配した。上記のように、ｈＰＳＣは小さな塊（塊ごとに２５〜５０個の細胞）に解離した。０．２〜０．４ｍＬの培養液を、分化培地を含むｒｈＶＴＮでコーティングしたウェルに播種した。
【０１３７】
中脳底板神経上皮の加速された生産
１日目に分化した神経上皮細胞は、ＣＨＩＲ９９０２１（１４００ｎＭ、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号４４２３、英国ブリストル（Ｂｒｉｓｔｏｌ））、ＳＡＧ（２５０ｎＭ、ＣａｙｍａｎＣｈｅｍ、カタログ番号１１９１４、アメリカ合衆国ミシガン州アンアーバー（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ））およびＦＧＦ２（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、アメリカ合衆国ニュージャージー州ロッキーヒル（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ））を補充したＥｓｓｅｎｔｉａｌ６で２４〜４８時間処理した。２日目または３日目の中脳前駆細胞は、ｗｎｔ−ｃ５９（２５０ｎＭ、ＣａｙｍａｎＣｈｅｍ、カタログ番号１６６４４）、ＳＡＧ（２５０ｎＭ、ＣａｙｍａｎＣｈｅｍ、カタログ番号９１２５４５−８６−９）およびＢＧＪ３９８（１００ｎＭ、ＣａｙｍａｎＣｈｅｍ、カタログ番号１９１５７）を補充したＥｓｓｅｎｔｉａｌ６で２４時間処理し、２４〜４８時間以内にＯＴＸ２／ＬＭＸ１Ａ／ＦＯＸＡ２陽性細胞を作製した。
【０１３８】
神経中胚葉前駆細胞の加速された生産
ＬＤＮ−１９３１８９ＨＣｌ（５００ｎＭ、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、カタログ番号Ｓ７５０７、アメリカ合衆国テキサス州ヒューストン）、ＢＧＪ３９８（１００ｎＭ、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、カタログ番号Ｓ２１８３、アメリカ合衆国テキサス州ヒューストン）およびＣＨＩＲ９９０２１（３ｕＭ、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号４４２３、英国ブリストル）を補充したＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ６からなる分化培地を組み合わせて、６ウェルプレートのビトロネクチンでコーティングしたウェル毎に２ｍＬを分配した。上記のように、ｈＰＳＣは小さな塊（塊ごとに２５〜５０個の細胞）に解離した。０．２〜０．４ｍＬの培養液を、分化培地を含むｒｈＶＴＮでコーティングしたウェルに播種した。
【０１３９】
脊髄神経上皮の加速された生産
１日目の神経中胚葉前駆細胞を、ＣＨＩＲ９９０２１（３ｕＭ、Ｔｏｃｒｉｓ、カタログ番号４４２３、英国ブリストル）およびＦＧＦ−ＢａｓｉｃＴＳ（登録商標）（２０ｎｇ／ｍＬ、Ｈｕｍａｎｚｙｍｅ、カタログ番号ＨＺ−１２８６、アメリカ合衆国イリノイ州シカゴ）を補充したＥｓｓｅｎｔｉａｌ６からなる分化培地に２４時間、曝露した。この２日目の神経中胚葉は、ＢＧＪ３９８（１００ｎＭ、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、カタログ番号Ｓ２１８３、アメリカ合衆国テキサス州ヒューストン）を補充したＥｓｓｅｎｔｉａｌ６からなる分化培地にさらに曝露され、ＰＡＸ３／ＳＯＸ１／ＨＯＸＢ４陽性神経上皮細胞の３日目の集団を作製した。
【０１４０】
脊椎底板神経上皮の加速された生産
２日目の脊髄神経中胚葉前駆細胞を、ＳＡＧ（５００ｎＭ）、ＢＧＪ３９８（１００ｎＭ）およびＷＮＴ−ｃ５９（２５０ｎＭ）を補充したＥｓｓｅｎｔｉａｌ６からなる分化培地に２４時間曝露して、ＳＯＸ１＋／ＦＯＸＡ２＋／ＮＫＸ２．２＋／ＨＯＸＢ４＋細胞の集団を３日目と４日目の間に作製した。
【０１４１】
結果
ヒト中枢神経系の発生は、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の分化によってｉｎ  ｖｉｔｒｏでモデル化できる。ｈＰＳＣ分化の初期段階では、神経外胚葉（ＮＥ）および中内胚葉（ｍｅｓｅｎｄｏｄｅｒｍ）の胚芽層が作製され、それらは最終的に成人の体内のすべての組織を生じる。中内胚葉はＷＮＴの活性化によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで急速に誘導されるが、受動的条件下ではＮＥは比較的ゆっくりと形成される。このＮＥは、背側−前部表現型にデフォルト設定されているが、後部ＮＥの形成には、前部ＮＥの尾側変換、または神経中胚葉（ＮＭ）中間体を介したｈＰＳＣからの直接誘導が必要である。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの形成とｈＰＳＣ由来ＮＥの吻側−尾側の位置決めには、大きく異なる長期にわたる培養条件が必要である。本明細書では、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達の拮抗作用によってＮＥの領域固有の生産が加速できることが実証されている。アクチビン様キナーゼ受容体２／３および線維芽細胞成長因子受容体１／２／３／４の拮抗作用と同時に、低および高ＷＮＴシグナル伝達下で、それぞれ２４時間以内にｈＰＳＣから前部神経板および後部ＮＭの両方の形成が生じることが分かった。
【０１４２】
それは前部と後部の運命に迅速に、直接アクセスするための統一されたメカニズムを提供することにより、ＮＥ系統の形成に関係するので、データはＦＧＦの論争の役割を明確にする。この戦略は、ｈＰＳＣ由来の脳および脊髄の神経細胞型を加速的に生産するための有用な方法として機能し、発生ペーシングの調節における成長因子シグナル伝達の役割を示し、その拮抗作用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化プロトコルを短縮するために活用できる。
【０１４３】
ｈＰＳＣの未分化状態は、ＦＧＦおよびＴＧＦｂ１の外因性の供給によって刺激されるＥＲＫおよびＳＭＡＤシグナル伝達によって維持されることが示されている。ｈＰＳＣの初期分化に関連するのでＳＭＡＤ経路の変調は十分に説明されているが、同様の目的でのＥＲＫシグナル伝達の変調に関する情報はほとんど普及していなかった。従って、ＥＲＫ阻害の効果を、特に、定義された条件下での神経形成のプロセス中に調べた。
【０１４４】
受容体レベルと下流の細胞内エフェクターレベルの両方でＥＲＫ経路が阻害される条件をアッセイした。ＶＥＧＦＲ２／ＦＧＦＲ２阻害剤ＳＵ５４０２を、ＡＬＫ２／３受容体拮抗薬ＬＤＮ１９３１８９およびＡＬＫ４／５／７受容体拮抗薬Ａ８−３０−１を含む既知の神経形成条件と組み合わせて、未分化多能性幹細胞に対する複合効果を観察した。２４時間の培養後、培養物は、核対細胞質比の増加を含む、位相差顕微鏡下で微妙な形態変化を示した。これらの条件下でさらに４８時間培養を続けると、細胞死が生じた（データは示していない）。
【０１４５】
多能性およびＮＥ形成に関連するさまざまな転写因子について、細胞死の前に２４時間分化培養物を分析した。未分化の対照培養物と比較して、ＳＵ５４０２で処理した培養物ではＮＡＮＯＧ陽性の減少が示され、それは初期段階の多能性離脱（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｅｘｉｔ）を示唆している。ｈＰＳＣとＮＥの両方に共通するＳＯＸ２が維持された。一方、ＳＵ５４０２で処理した培養物は、９０％超の細胞でＳＯＸ１陽性を示し、初期段階のＮＥ形成を示した（図３）。
【０１４６】
追加のｈＰＳＣ系統を、３つの阻害剤のカクテルを使用して同じ方法でアッセイし、ＳＯＸ１免疫反応性の観点から示差的な応答が認められた。ＳＵ５４０２は、ＦＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ２に対する制限された特異性により、一部の系統のＦＧＦおよびＶＥＧＦシグナル伝達を不完全に抑制し、ＳＯＸ１免疫反応性の不完全な獲得をもたらすと考えられる。ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、およびＶＥＧＦＲ４を標的とする汎ＦＧＦＲおよびＶＥＧＦＲ阻害剤ＢＧＪ３９８およびアキシチニブは別々の条件で使用され、アキシチニブは比較的高濃度でのみＳＯＸ１免疫反応性を誘導するが、ＢＧＪ３９８は低濃度でも、試験したすべての系統でＳＯＸ１を完全に誘導することが明らかとなった。これらのデータは、ＳＵ５４０２の神経化作用がＦＧＦＲ阻害剤としての機能に大きく起因することを示していた。
【０１４７】
阻害剤カクテルからの１つの分子の差し引き（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎｓ）は、ＢＧＪ３９８およびＬＤＮ１９３１８９の組み合わせによる共処置がＳＯＸ１免疫陽性細胞の大部分の集団を作製するのに十分である一方で、任意の他の２つの阻害剤の組み合わせは２４時間後にＳＯＸ１免疫反応性を誘導できなかったことを示した。単一阻害剤条件も同様に、ＳＯＸ１免疫反応性を誘導できなかった（図７）。
【０１４８】
ＢＧＪ３９８がその機能を発揮した下流のメカニズムをよりよく理解するために、ＦＧＦシグナル伝達カスケードの種々の成分に対する阻害剤を分析した。ｐ３８に対する小分子阻害剤であるＳＢ２３９０６３は標準的な神経化条件下では効果がなかった（データは示していない）が、ＭＥＫ阻害剤であるＰＤ０３２５９０１はＢＧＪ３９８と同様に機能してＮＥの形成を促進した（図４Ａ〜Ｃ）。
【０１４９】
本明細書で提供されるシステムで派生したＮＥが他によって派生したものと同様の発生上の柔軟性を維持することを確認するために、産生されたＮＥは吻側−尾側神経軸に沿って種々の領域に向かってさらにパターン化（分化）された。神経板の吻側−尾側アイデンティティは、終脳、間脳、中脳（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ）、後脳（ｍｅｔｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ）、および脊髄間の解剖学的細分化を描写する転写因子コードによって説明できる。終脳構造は、転写因子の組み合わせＳＯＸ１＋／ＦＯＸＧ１＋／ＯＴＸ２＋／ＰＡＸ５−を発現することが知られているが、一方、間脳、中脳、および後脳構造は、ＳＯＸ１＋／ＦＯＸＧ１−／ＯＴＸ２＋／ＰＡＸ５−／ＨＯＸＢ４−、ＳＯＸ１＋／ＦＯＸＧ１−／ＯＴＸ２＋／ＰＡＸ５＋／ＨＯＸＢ４−、ＳＯＸ１＋／ＦＯＸＧ１−／ＯＴＸ２−／ＰＡＸ５＋／ＨＯＸＢ４−、およびＳＯＸ１＋／ＦＯＸＧ１＋／ＯＴＸ２−／ＰＡＸ５−／ＨＯＸＢ４＋の組み合わせをそれぞれ発現する。中脳の構造は、ドーパミン作動性ニューロンを生成する能力のために研究者にとって興味深いものであり、これは特にパーキンソンの研究者にとって重要である。ＷＮＴおよびＦＧＦシグナル伝達を調節する前述の条件を適応させて、本明細書に記載のシステムで生成された１日目の神経板は、転写因子コードＳＯＸ１＋／ＦＯＸＧ１−／ＯＴＸ２＋／ＰＡＸ５＋／ＨＯＸＢ４−を発現する３日目の神経上皮を産生することができた（図１１）。適切な吻側−尾側のアイデンティティが確立されたので、これらの培養物はソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達にさらされ、ＦＯＸＡ２免疫陽性によって示されるように４日目の腹側底板表現型を促進した（図１１）。他のものは、これらのＳＯＸ１＋／ＯＴＸ２＋／ＰＡＸ５＋／ＦＯＸＡ２＋神経上皮細胞が、適切な条件下でドーパミン作動性神経前駆細胞にさらに分化することを示している（ＰＭＩＤ：２６０１５５３６）。
【０１５０】
現在のところ、脊髄を含む中枢神経系の最も尾側のセグメントの起源をめぐる論争が存在する。脊髄組織を生成するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件は、ＳＯＸ１＋／ＦＯＸＧ１−／ＯＴＸ２−／ＰＡＸ５−／ＨＯＸＢ４＋陽性の頸髄組織を作製するために、ＦＧＦ、ＷＮＴおよびレチノイン酸などの因子で尾方化される（ｃａｕｄａｌｉｚｅｄ）ＳＯＸ１＋／ＦＯＸＧ１＋／ＯＴＸ２＋／ＰＡＸ５−／ＨＯＸＢ４−を発現する前部神経板の形成に伝統的に依存している。代替的に、脊髄は神経中胚葉構造に由来することが示唆されており、それにより、ＳＯＸ１−／ＳＯＸ２＋／Ｔ＋／ＴＢＸ６−／ＨＯＸＢ４−集団は、尾方化されたＳＯＸ１−／ＳＯＸ２−／Ｔ＋／ＴＢＸ６−／ＨＯＸＢ４＋神経中胚葉として維持され、あるいはＳＯＸ１−／ＳＯＸ２−／Ｔ＋／ＴＢＸ＋／ＨＯＸＢ４＋体節組織またはＳＯＸ１＋／ＳＯＸ２＋／Ｔ−／ＴＢＸ６−／ＨＯＸＢ４＋脊髄組織のいずれかにさらに分化されるｈＰＳＣから直接作製される。１日目の神経外胚葉は、尾方化因子（ｃａｕｄａｌｉｚｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ）の組み合わせに曝露され、アゴニストＣＨＩＲ９９０２１を使用した高レベルのＷＮＴシグナル伝達は、２日目までにＳＯＸ１−／ＳＯＸ２＋／Ｔ＋／ＴＢＸ６−／ＨＯＸＢ４−集団を誘導するのに十分であること、しかしながら、さらなるＦＧＦシグナル伝達は、より高い純度を維持し、ライン間変動を低減することが明らかとなった（図１３）。さらなる２４時間のＷＮＴ／ＦＧＦシグナル伝達により、この集団はＳＯＸ１−／ＳＯＸ２＋／Ｔ＋／ＴＢＸ６−／ＨＯＸＢ４＋頸部レベルの神経中胚葉に変換された（図１３）。
【０１５１】
前述のシナリオでは、神経中胚葉の生成に神経外胚葉中間体を使用した。神経中胚葉はｈＰＳＣから直接誘導できることが示されているため、これが神経中胚葉を直接誘導できるかどうかを調べるために、高レベルのＷＮＴシグナル伝達を１日目の神経外胚葉条件に組み込んだ。ＬＤＮ１９３１８９、ＢＧＪ３９８およびＣＨＩＲ９９０２１に曝露された未分化培養物は、２４時間以内にＳＯＸ１−／ＳＯＸ２＋／Ｔ＋／ＴＢＸ６−／ＨＯＸＢ４−免疫表現型を採用することが示された。ＣＨＩＲ９９０２１とともにさらに２４時間培養すると、これらの２日目の培養物でＨＯＸＢ４転写因子が上方制御され、ＳＯＸ１−／ＳＯＸ２＋／Ｔ＋／ＴＢＸ６−／ＨＯＸＢ４＋神経中胚葉の集団が作製された（図１２）。
【０１５２】
神経中胚葉を脊髄神経上皮に変換するには、レチノイン酸シグナル伝達が必要であることが示されている。２日目の神経中胚葉はさまざまな濃度のレチノイン酸に曝露されたが、これによりＳＯＸ１＋／ＳＯＸ２＋／Ｔ−／ＴＢＸ６−／ＨＯＸＢ４＋脊髄神経上皮およびＳＯＸ１−／ＳＯＸ２＋／Ｔ＋／ＴＢＸ６＋／ＨＯＸＢ４＋体節組織で構成される混合集団が作製されることが明らかとなった（図示せず）。レチノイドは発生中の脊髄で複数の同時機能を発揮し、ＦＧＦシグナル伝達を阻害する一方で、ＷＮＴおよびＳＨＨシグナル伝達の両方を活性化することが示されている。これらのレチノイン酸の独立した機能は、前述の経路のモジュレーターを使用して分析され、３日目のＦＧＦ撤退により、体節組織を汚染することなく神経中胚葉と頸椎組織の両方の混合物が作製され、ＢＧＪ  ３９８で活発に阻害されたＦＧＦシグナル伝達が神経中胚葉または体節組織の証拠を欠く脊髄神経上皮の純粋な集団を作製されることが発見された（図１５）。この脊髄神経上皮は、追加のマーカに関してさらに特徴付けられ、それは、初期の脊髄神経板マーカである部分的にＰＡＸ３陽性であることが発見された。３日目の条件をＰＡＸ３を最大化するべく最適化し、頸部神経板上皮の均一な発現ＰＡＸ３の純粋な集団を誘導するには、ＦＧＦ阻害に加えて中程度のＷＮＴシグナル伝達が必要であることが発見された（図１８）。これらのレチノイド非依存性脊髄神経上皮細胞の背腹パターン化の能力を調べるために、３日目の培養物をＳＨＨシグナル伝達に曝露した。これにより、底板表現型を示すＰＡＸ６−／ＳＯＸ１＋／ＮＫＸ２．２＋／ＦＯＸＡ２＋集団が生成された。これらの細胞のサブセットは、さらなる腹側マーカであるＯＬＩＧ２を共発現した。
【０１５３】
まとめると、これら２つの主要な知見は、前例のない速度と簡潔さで背−腹パターン化に適格なｈＰＳＣ由来の前部または後部神経運命への１つのアクセスを可能にし、現在２つの異なる研究分野が広く異なる培養条件に依存しているものを統一することを目的とする柔軟なシステムを示している。これらの知見は、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏでのタイミングに関して、現在の技術を改善する。神経上皮の生産のための技術は、規律が設立されて以来、かなりの改良が見られたが、神経上皮変換のために必要とされる最低７日間は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの絶対的な発生速度のリミットとして示されたままである。本明細書に記載の方法論の中心は、この変換を強制するＦＧＦ阻害剤を含めることであり、それはこれまでに成功することはなく調査されていることである。しかしながら、これらの研究は、神経上皮変換を監視するための代替のマーカに依存して、ここで効果がないことを実証し、未分化および化学的に複雑な条件で未分化ｈＰＳＣを維持し、そして、凝集中の変換を強制した、化学を利用していた。これらのような違いは重要であり、分化軌道に影響を与えることが示されている。
【０１５４】
神経中胚葉組織自体は、説得力があるがその背後に限られたデータを伴う、初期の研究分野である。以前に説明されているように、共線性ｈｏｘ活性化は探索されなかったが、代わりに神経中胚葉から神経上皮の運命移行について詳細に焦点を当ててきた。興味深いのは、ＦＧＦＲ拮抗作用がｈＰＳＣと神経中胚葉から神経上皮への移行の両方に役立ち、ステムネスの維持におけるＦＧＦシグナル伝達カスケードの役割を強化し、これが自己複製プログラムを中止するための一般化された戦略であることを示唆していることである。
【０１５５】
おそらく最も興味深いのは、開示されたシステムに由来する４日目の脊椎底板神経上皮である。ｈＰＳＣからのそのような構造のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの産生は、文献にまだ完全には記載されていない。ｈＰＳＣ由来の脊髄オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を作製するために設計された多数の分化プロトコルは、ＯＬＩＧ２＋／ＮＫＸ２．２＋中間体に依存している。現在の定説では、脊髄ＯＰＣはＯＬＩＧ２＋／ＮＫＸ２．２−ｐＭＮドメインからレチノイド依存的に発生し、それは、ＳＨＨシグナル伝達を続けてｐＭＮ＊ＯＬＩＧ２＋／ＮＫＸ２．２＋集団に変換されることを示している。本明細書で説明したように、ＯＰＣは、ＦＯＸＡ２＋／ＮＫＸ２．２＋／ＯＬＩＧ２＋表現型レチノイドに依存せずに後で取得するＦＯＸＡ２＋／ＮＫＸ２．２＋／ＯＬＩＧ２−底板中間体に由来する可能性がある。これは、脊髄ＯＰＣはすべて、レチノイド非依存性神経中胚葉由来の脊髄床板ではなく、前部神経板のレチノイド依存性の尾方化に依存しているため、現在利用可能なプロトコルを使用してｈＰＳＣから脊髄ＯＰＣを生成することの困難さを部分的に説明できる。
【０１５６】
実施例２
はじめに
負傷後の脊髄の損傷は、負傷部位での脊髄ニューロンとグリアの死をもたらし得る。この損傷には、負傷部位に存在するニューロンの完全な損失が含まれるが、自発運動の制御に関与する、負傷を介して大脳運動皮質から下行する軸索も切断する。これらの皮質脊髄ニューロンに対する損傷は、負傷のすぐ上の一部の運動機能に直接影響を与えるが、より重要なことに、負傷の下方のすべての運動機能の完全な喪失につながる可能性がある。脊髄負傷部位への神経移植は、脊髄負傷の動物モデルにて機能的な回復を改善することが示されており、患者においては初期の臨床治験に到達している。しかしながら、これらの治験からの患者の結果はまちまちであり、移植した組織の正確な細胞表現型を理解するためには改善が必要であることを示唆している。損傷した脊髄への神経細胞の移植の前提は、宿主内で失われた神経接続が神経移植によって修復できるという期待である。移植片は、既存の宿主ニューロンに栄養サポートと再生の手がかりを提供することでもある。しかしながら、これらの治療パラダイムは、多くの場合、脊椎の複雑な発生神経解剖学を無視する特徴付けが乏しい組織を利用しており、それは、異なる負傷を受けた患者個人がどのように治療に応答するかに影響を与え得る。
【０１５７】
胚発生中、脊髄は神経中胚葉前駆体（ＮＭＰ）からなる増殖ゾーンを利用して、後脳の基部から「首から尾へ」伸びる（図２４Ａ）。この成長が起こると、脊柱はステムネス（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）因子の振動を介して連続的に分割され、結果として共線ＨＯＸ遺伝子活性化と称されるものが生じる。各脊髄セグメントは、特定のＨＯＸコードから発生し、それを維持するため、このように一意である（図２４Ｂ）。このコードは、吻側−尾側のパターン化と椎骨のセグメンテーションの基礎になっている（図２４Ｃ）。ＨＯＸコードは、ｅｐｈ／ｅｐｈｒｉｎを介した軸索ガイダンス、筋肉の神経支配のための皮質脊髄軸索離脱の制御などの多数の発生プロセスを調節し（図２４Ｄ）、成熟した生物の正常な運動機能に寄与する。
【０１５８】
脊髄の複雑なニューロンの多様性を作製する背腹パターン（「後部から前部の（ｂａｃｋ−ｔｏ−ｆｒｏｎｔ）」）を付与する追加の位置情報が各脊髄セグメント内に作製される（図２５）。脊髄セグメント内のこのニューロンの多様性は、中央パターンジェネレーターの反射回路、反射神経を担い、皮質脊髄路の神経支配末端を提供する。吻尾側と背腹側のパターン化を合わせて、発生中に脊椎がどのように作製されるか、成人期にどのように脊椎が正常に機能するか、およびどのように負傷後の脊髄再生に役割を果たすことができるか、を決定する。
【０１５９】
特定の解剖学的状況（ｃｏｎｔｅｘｔ）内で発生した組織損傷は、同所移植と称される、その特定の状況に属する移植片によって修復される可能性が最も高くなる。これまでの研究は、前肢を制御する脊髄への前肢の皮質脊髄ニューロンの優先的な神経支配を示す一方で、後肢の皮質脊髄ニューロンは、同様に後肢を制御する脊髄を神経支配することを示してきた。これは、領域固有の細胞のアイデンティティが軸索ガイダンスに重要な役割を果たすことを示唆している。さらに、最近の出版物は、移植片が脊椎の再生に寄与するための適切な位置情報の重要性を強調している。残念ながら、技術的な制限により、脊髄に提案されているほとんどの移植戦略は同所性ではなく、現在、移植された細胞の頭部から尾部および後部から前部の位置情報を負傷部位と一致させることができない。研究および臨床試験での神経細胞移植は、通常、胎児の脳または脊髄に由来する前駆細胞の不特定の混合物、または適切なパターン化をもたらさない不正確で不十分に制御された多能性幹細胞分化手順の産物である。
【０１６０】
本明細書で開示されるのは、改善された速度および神経誘導およびパターン化の制御である。これらの新しい技術の開発の１つは、ヒトｉＰＳＣ由来の脊髄神経前駆細胞の吻尾側と背腹側の両方のアイデンティティを高純度で正確に制御できるようになったことである（図２６を参照）。これにより、脊髄負傷中に損傷が発生した場所に応じて細胞生産を調整することができる。特に、負傷が場所と完全性に関して非常に変化しやすい患者にとって、これは臨床ケアへの患者特有のアプローチを可能にするため、貴重なツールを提供する。現在行われている他のすべての研究が神経解剖学のこの側面を無視しているため、これは満たされていないニーズである。
【０１６１】
ｈＰＳＣ由来の脊髄組織の同所移植は、患者の脊椎再生について最大の可能性があると考えられている。これらの同所移植片は、特定の負傷部位に統合し、神経再生を誘導するための最高の能力を有しているであろう。
【０１６２】
材料／方法／結果
細胞の生産：ここでは、軸筋骨格系と脊髄の一般的な発生前駆細胞である神経中胚葉細胞を効率的に生成する新規なｈＰＳＣ分化プロトコルを提供する。線維芽細胞成長因子、骨形成タンパク質、ｗｎｔ、およびヘッジホッグシグナル伝達の連続的なタイミング調整により、未分化ｈＰＳＣ（図２８Ａ）が誘導されて、多能性を離脱し、２４時間以内にＳｏｘ２／Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｔ）共発現神経中胚葉前駆細胞を形成し（図２８Ｂ）、その後、進行し、３日目までに純粋な吻側／背側ＨＯＸＢ４／ＰＡＸ３−陽性、若しくは吻側／腹側ＨＯＸＢ４−陽性／ＰＡＸ３−陰性の脊髄組織（図２８Ｃ）、または６日目までに、尾側／背側ＨＯＸＣ８／ＰＡＸ３−陽性若しくは尾側／腹側ＨＯＸＣ８−陽性／ＰＡＸ３−陰性の脊髄組織、のいずれかを生成する。これらの細胞は、その後、ヌードラットの尾側／背側脊髄挫創負傷モデルへの移植のために神経芽細胞に成熟する。
【０１６３】
動物研究：この最初の研究には、合計４０匹のヌードラットが使用される。ヌードラットは、免疫不全のため異種移植片を容易に受け入れることができるので選択されている。すべてのラットは、第８胸椎で中程度の挫創性脊髄負傷を受ける（Ｕｌｔｉｍａｔｅ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  Ｉｍｐａｃｔｏｒ）。動物が治療を受ける前に、２週間が経過することが許容される。各１０匹のラットに、４つの位置移植片のいずれかを移植する。各移植群の各コホートは、動物の回復、移植片の統合、および皮質脊髄軸索の移動を可能にするために、移植後６か月間維持される。６か月後に６匹の動物を屠殺し、脊髄を取り出して、標準の組織学的および免疫組織化学的方法を使用して分析する。各コホートからの３匹の動物は順行性トレースを受け、各コホートからの最後の３匹の動物は逆行性トレースを受ける。トレース試験には、屠殺と分析の前にさらに２〜４週間が必要である。
【０１６４】
位置移植片の移植。負傷後２週間に、３２ゲージ針（０．５インチ（１．２７ｃｍ）長、３０°の面取りチップ）を備えた１０μｌのハミルトンシリンジを使用し、病変の中心点（ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）および同中心点から吻側１ｍｍおよび尾側１ｍｍの部位にて、３つの別々のかつ等しい注入部位へ細胞移植片（１０μｌ、５００，０００細胞／μｌ）を注入した。自動マイクロインジェクタを使用して、細胞を１μｌ／分の速度で注入する。注射針は、細胞の逆流を最小限に抑えるために、注入後１分間はそのままにしておき、その後、先端をゆっくりと引き抜く。
【０１６５】
組織学および免疫組織化学。屠殺時に、ラットを経心臓的に灌流し、組織を凍結保護し、包埋し、２０μｍの連続した矢状断面に凍結切片を作成する。一部の切片は、一般的な形態のために、ルクソールファーストブルー（ＬＦＢ）（ミエリン染色）およびヘアモトキシリン（ｈｅａｍｏｔｏｘｙｏｌｉｎ）およびエオシン（ＨおよびＥ）で染色する。蛍光免疫染色では、検証済みの抗体を使用して、星状細胞（ＧＦＡＰ）、ヒト核抗原（ｈＮＡ）、ヒト細胞質マーカ（Ｓｔｅｍ１２１）、ベータＩＩＩについてグリア線維性酸性タンパク質を特定する。
【０１６６】
未成熟および成熟ニューロンを標識するチューブリン（ＴＵＪ１）、分裂細胞を標識するＫｉ−６７、成熟ニューロン、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２）およびセロトニン５ＨＴを標識する神経核（ＮｅｕＮ）。次に、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、５５５、または６４７に共役した二次抗体とともに切片を培養する。陰性対照は、一次抗体を省略することで得られる。ＤＡＰＩはＤＮＡを対比染色して、個々の細胞の識別を支援する。各特定のアイデンティティを表現するヒト移植細胞（ＨＮＡまたはＳＣ１２１を使用して検出）の割合は、移植された各ラット脊髄について計算される。コードキャビテーション（ｃｏｒｄ  ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）の体積は、前述のように決定される。簡単に説明すると、各切片のキャビテーションの領域は、イメージングソフトウェアを使用して追跡される。サンプルの総脊髄面積が測定される。総キャビティ体積と総脊髄体積は、カバリエリ法を使用して計算され、キャビテーションの割合が決定される。
【０１６７】
逆行性軸索トレース。フルオロゴールド（Ｆｌｕｏｒｏｇｏｌｄ）は、負傷部位を介して無傷の軸索を有する皮質および脳幹のニューロンを識別するために利用される。麻酔下では、創傷は６か月後に再び開かれ、負傷部位が再び露出する。フルオロゴールドは、負傷部位の１．５ｍｍ尾側（下）の脊髄に注入される。トレースの１４日後、動物は灌流され、脳が除去されて処理される。脳全体を、４０μｍの厚さの切片にてクライオスタットで切断する。切片を蛍光顕微鏡で検査し、運動皮質および赤核（運動協調に関与する吻側中脳領域）、外側前庭核、網様体形成、縫線核、青斑核における各ラットの標識ニューロンをカウントする。
【０１６８】
順行性軸索トレース。ビオチン化デキストランアミン（ＢＤＡ）を使用して、皮質脊髄軸索を特定し、負傷部位を横断する軸索があるかどうか、および移植されたニューロンがこれらの軸索の負傷部位を介して中継システムを提供できるかどうかを判断する。要約すると、麻酔下では感覚運動皮質が６か月で露出し、前述のようにＢＤＡが注入される。２８日後、動物は灌流され、脊髄が処理される。脊髄は、２０μｍの厚さの切片にてクライオスタットで切断される。移植された細胞は、ヒト細胞質マーカＳＣ１２１で検出され、移植片へのＢＤＡ標識皮質脊髄路再生の距離が測定される。
【０１６９】
文献
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７．Ｂｅａｔｔｉｅ  ＧＭ，他、２００５年、アクチビンａは、フィーダー層の不在下でヒト胚性幹細胞の多能性を維持する（Ａｃｔｉｖｉｎ  ａ  ｍａｉｎｔａｉｎｓ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｆｅｅｄｅｒ  ｌａｙｅｒｓ．）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２３（４）：４８９−４９５
８．Ｌｕｄｗｉｇ  ＴＥ，他、２００６年、定義された条件でのヒト胚性幹細胞の誘導（Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４（２）：１８５−１８７
９．Ｙａｏ  Ｓ，他、２００６年、化学的に定義された条件でのヒト胚性幹細胞の長期的な自己複製および誘導分化（Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０３（１８）：６９０７−６９１２
１０．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，他、２００７年、既定の因子による成体ヒト線維芽細胞からの多能性幹細胞の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．）Ｃｅｌｌ．１３１（５）：８６１−８７２
１１．Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ＳＭ，他、２００９年、ｓｍａｄシグナル伝達の二重阻害による、ヒトｅｓおよびｉｐｓ細胞の非常に効率的な神経変換（Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｓ  ａｎｄ  ｉｐｓ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｄｕａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）２７（３）：２７５−２８０
１２．Ｎａｇａｏｋａ  Ｍ，他、２０１０．組換えｅ−カドヘリン基質上の完全に定義された条件を使用したヒト多能性幹細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ  ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ．）ＢＭＣ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．１０：６０
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１４．Ｃｈｅｎ  Ｇ，他、２０１１年、ヒトｉｐｓｃの派生および培養のための化学的に定義された条件（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｉｐｓｃ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ．）Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．８（５）：４２４−４２９
１５．Ｊａｅｇｅｒ  Ｉ，他、２０１１年、ｆｇｆ／ｅｒｋシグナル伝達の一時的に制御された変調は、マウスおよびヒト多能性幹細胞における中脳ドーパミン作動性神経前駆細胞の運命を方向づける（Ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｇｆ／ｅｒｋ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｍｉｄｂｒａｉｎ  ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｆａｔｅ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．１３８（２０）：４３６３−４３７４
１６．Ｊｉｎ  Ｓ，他、２０１２年、ヒト人工多能性幹細胞の拡大および方向性分化のための、合成された、異種成分を含まないペプチド表面（Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ，  ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｆｏｒ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．７（１１）：ｅ５０８８０
１７．Ｍｉｙａｚａｋｉ  Ｔ，他、２０１２年、ラミニンｅ８フラグメントは、解離したヒト多能性幹細胞の効率的な接着と拡大をサポートする（Ｌａｍｉｎｉｎ  ｅ８  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．）Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．３：１２３６
１８．Ｃｏｎｇ  Ｌ，他、２０１３年、ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓシステムを使用した多重ゲノム工学（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ．）Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３９（６１２１）：８１９−８２３
１９．Ｌｉｐｐｍａｎｎ  ＥＳ，他、２０１４年、定義されたヒト多能性幹細胞培養は、低分子阻害剤なしで非常に効率的な神経上皮の誘導を可能にする（Ｄｅｆｉｎｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．３２（４）：１０３２−１０４２
２０．Ｓｈａｒｍａ  Ａ，他、２０１４年、コクサッキーウイルスｂ３誘発性心筋炎および抗ウイルス薬スクリーニングプラットフォームのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとしてのヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞（Ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ａｓ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ  ｂ３−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍ．）Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．１１５（６）：５５６−５６６
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２２．Ｎａｇａｏｋａ  Ｍ，他、２０１５年、ヒト多能性幹細胞の肝細胞様細胞への分化のための定義された基質としてのビトロネクチンベースの組換えタンパク質の設計（Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａ  ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ．）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．１０（８）：ｅ０１３６３５０
２３．細胞および遺伝子両方のガイダンス（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＆  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｇｕｉｄａｎｃｅｓ．）２０１６年、米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）；ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ＢｉｏｌｏｇｉｃｓＢｌｏｏｄＶａｃｃｉｎｅｓ／ＧｕｉｄａｎｃｅＣｏｍｐｌｉａｎｃｅＲｅｇｕｌａｔｏｒｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／Ｇｕｉｄａｎｃｅｓ／ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ／ｄｅｆａｕｌｔ．ｈｔｍ．
２４．Ｋａｎｇ  ＨＷ，他、２０１６年、構造的完全性を備えたヒトスケールの組織構造を生成する３Ｄバイオプリンティングシステム（Ａ  ３ｄ  ｂｉｏｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｈｕｍａｎ−ｓｃａｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ．）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３４（３）：３１２−３１９
２５．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ；Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ（２００６年、既定の因子によるマウス胚および成体線維芽細胞培養物からの多能性幹細胞の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ）．Ｃｅｌｌ．１２６（４）：６６３−７６
２６．Ｋｅｉｒｓｔｅａｄ  ＨＳ，他、２００５年、ヒト胚性幹細胞由来のオリゴデンドロサイト前駆細胞移植は、脊髄負傷後に再ミエリン化し、運動を回復する（Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ  ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｔｏｒｅ  ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｕｒｙ．）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５（１９）：４６９４−４７０５
２７．Ｋｏｇｕｔ  Ｉ，他、２０１４年、ヒト誘導多能性幹細胞のケラチノサイト系統への分化（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ａ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｌｉｎｅａｇｅ．）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１１９５：１−１２
２８．Ｌｉｐｐｍａｎｎ  ＥＳ，他、２０１５年、ヒト多能性幹細胞由来神経外胚葉における決定論的ｈｏｘパターニング（Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃ  ｈｏｘ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍ．）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．４（４）：６３２−６４４
２９．Ｃｈａｌ  Ｊ，他、２０１６年、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト多能性幹細胞からのヒト筋線維および衛星様細胞の生成（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｓｃｌｅ  ｆｉｂｅｒｓ  ａｎｄ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．）Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．１１（１０）：１８３３−１８５０
３０．Ｇｏｕｔｉ  Ｍ，他、２０１４年、神経中胚葉前駆細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生成により、脊髄および近軸中胚葉のアイデンディディの分化決定におけるｗｎｔシグナル伝達の異なる役割が明らかになる（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ａｎｄ  ｐａｒａｘｉａｌ  ｍｅｓｏｄｅｒｍ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ．）ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．１２（８）：ｅ１００１９３７
３１．Ｗａｌｓｈ  Ｐ，他、２０１７年、定義された培養条件は、ヒト誘導多能性幹細胞からの低分子支援神経前駆細胞を加速する（Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ  Ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．）Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎａｔｉｏｎ  ２６（１２）：１８９０−１９０２
３２．ＰＭＩＤ１１１６３２５６前脳の発達（Ｐｒｏｓｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）
３３．ＰＭＩＤ１２４６１５５１  前脳の解析（Ｐａｒｓｉｎｇ  Ｐｒｏｓｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ）
３４．ＰＭＩＤ１４９６０２７２  初期の前脳の発達（Ｅａｒｌｙ  Ｆｏｒｅｂｒａｉｎ  Ｄｅｖ）
３４．ＰＭＩＤ１９１４３０４９  終脳の発達（Ｔｅｌｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）
３６．ＰＭＩＤ２４０１４４１９  神経誘導ブリバンロウ（Ｎｅｕｒａｌ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｂｒｉｖａｎｌｏｕ）
３７．ＰＭＩＤ２０７１５１８２  ショラー誘導およびＦＧＦ（Ｓｃｈｏｌｅｒ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＦＧＦ）
３８．ＰＭＩＤ２０２０７２２５  Ｓｃｈｏｌｅｒ  Ｔｅｓａｒ  ＦＧＦ，誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ），種（Ｓｐｅｃｉｅｓ）
３９．ＰＭＩＤ２１９９７８７８  Ｗｉｓｃｏ  ＦＧＦ／ＥＲＫ，誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）
すべての出版物、特許および特許出願、ならびにアクセッション番号、ならびにそこに見られるヌクレオチドおよび／またはタンパク質配列は、参照により本明細書に組み込まれている。前述の明細書では、本発明をその特定の好ましい実施形態に関連して説明し、多くの詳細を例示の目的で説明したが、本発明が追加の実施形態に影響されやすいことは当業者には明らかであろう。そして本明細書で説明される特定の詳細は、本発明の基本原理から逸脱することなくかなり変更されてもよい。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図２９Ｅ】
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【国際調査報告】
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