(57)【要約】【解決手段】細菌を培養かつ保存するための方法および組成物が本明細書に記載され、培養かつ保存された細菌は、主題の方法以外の手段によって保存／保管された細菌と比較して改善された生存率／増殖を示す。より詳細には、凍結保存後の細菌生存率を改善するための方法および組成物が、本明細書に開示されている。【選択図】図１Ａ【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結保存後の細菌の生存率を改善するための方法であって、
ａ）アシダミノコッカス（Acidaminococcus）種、またはアシダミノコッカス（Acidaminococcaceae）科の構成種である第１の細菌種を、少なくとも１つの第２の細菌種と組み合わせて細菌混合物を生成することであって、前記第１の細菌種は、前記少なくとも１つの第２の細菌種に凍結保護を与えるのに十分な量で前記細菌混合物中に存在し、前記アシダミノコッカス科の構成種は、スクシニスピラ  モビリス（Succinispira mobilis）である、ことと、
ｂ）前記細菌混合物を培養して培養細菌混合物を生成することであって、前記培養は、前記培養細菌混合物中の前記少なくとも１つの第２の細菌種に前記凍結保護を与えるのに十分な時間にわたる、ことと、
ｃ）前記培養細菌混合物を凍結保存して、凍結保存細菌培養物を生成することと、
を含んでおり、
再構成後の前記凍結保存細菌培養物は、前記第１の細菌種の不存在下で前記少なくとも１つの第２の細菌種を含む再構成後の凍結保存細菌培養物の細菌増殖と比較して、細菌増殖アッセイにおいて前記少なくとも１つの第２の細菌種について少なくとも１０倍増加した細菌増殖を示す、方法。
【請求項２】
前記アシダミノコッカス種は、アシダミノコッカス  インテスティニ（Acidaminococcus intestini）またはアシダミノコッカス  フェルメンタンス（Acidaminococcus fermentans）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細菌混合物中の前記少なくとも１つの第２の細菌種に凍結保護を与えるのに十分な前記第１の細菌種の量は、前記細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜５０％である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌増殖アッセイは、細菌プレーティングアッセイである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記細菌プレーティングアッセイは、ｍＬ当たりコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）を測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの第２の細菌種は、凍結保護屈折性である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの第２の細菌種は、哺乳動物の糞便に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの第２の細菌種は、ヒトの糞便に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの第２の細菌種は、コプロコッカス  コメス（Coprococcus comes）、ドレア  フォルミシゲネランス（Dorea formicigenerans）、ユウバクテリウム  コントルタム（Eubacterium contortum）、ルミノコッカス  ラクタリス（Ruminococcus lactaris）、ユウバクテリウム  レクターレ（Eubacterium rectale）、フィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイ（Faecalibacterium prausnitzii）、ユウバクテリウム  エリゲンス（Eubacterium eligens）、ルミノコッカス  トルキース（Ruminococcus torques）、ロゼブリア  インテスティナーリス（Roseburia intestinalis）、アナエロスティペス  ハドルス（Anaerostipes hadrus）、ブラウティア  ルティ（Blautia luti）、ルミノコッカス  オベウム（Ruminococcus obeum）、ブラウティア  スターコリス（Blautia stercoris）、ドレア  ロンギカテナ（Dorea longicatena）、クロストリジウム  スパイロフォルメ（Clostridium spiroforme）、ユウバクテリウム  デスモランス（Eubacterium desmolans）、クロストリジウム  アエロトレランス（Clostridium aerotolerans）、クロストリジウム  ラクタティフェルメンタンス（Clostridium lactatifermentans）、ユウバクテリウム  ハリイ（Eubacterium hallii）、クロストリジウム  ハイレモンアエ（Clostridium hylemonae）、ロゼブリア  イヌリニボランス（Roseburia inulinivorans）、ロゼブリア  ホミニス（Roseburia hominis）、およびロゼブリア  ファエシス（Roseburia faecis）のうちの少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記凍結保存は、凍結および凍結乾燥を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記再構成は、再構成培地による前記凍結保存細菌培養物の希釈を含んでおり、前記凍結保存細菌培養物と前記再構成培地の比は１：１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記凍結保存細菌培養物は、凍結乾燥保護培地を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記凍結乾燥保護培地は、スクロース、フィコール７０、およびポリビニルピロリドンのうちの少なくとも１つを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記凍結保存細菌培養物は、リボフラビン、システイン、およびイヌリンのうちの少なくとも１つを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記凍結保存細菌培養物は、凍結保護培地を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記凍結保護培地は、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のうちの少なくとも１つを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記培養細菌混合物中の前記少なくとも１つの第２の細菌種に前記凍結保護を与えるのに十分な前記期間は、少なくとも３０分または少なくとも１時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記培養細菌混合物中の前記少なくとも１つの第２の細菌種に前記凍結保護を与えるのに十分な期間は、３０分〜２時間または１〜２時間の範囲である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の細菌種は、生存している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
凍結保存後の細菌の生存率を改善するための方法であって、
ａ）アシダミノコッカス  インテスティニまたはアシダミノコッカス  フェルメンタンスである第１の細菌種を、少なくとも１つの第２の細菌種と組み合わせて細菌混合物を生成することであって、前記第１の細菌種は、前記少なくとも１つの第２の細菌種に凍結保護を与えるのに十分な量で前記細菌混合物中に存在する、ことと、
ｂ）前記細菌混合物を培養して培養細菌混合物を生成することであって、前記培養は、前記培養細菌混合物中の前記少なくとも１つの第２の細菌種に前記凍結保護を与えるのに十分な時間にわたる、ことと、
ｃ）前記培養細菌混合物を凍結保存して、凍結保存細菌培養物を生成することと、
を含んでおり、
再構成後の前記凍結保存細菌培養物は、前記第１の細菌種の不存在下で前記少なくとも１つの第２の細菌種を含む再構成後の凍結保存細菌培養物の細菌増殖と比較して、細菌増殖アッセイにおいて前記少なくとも１つの第２の細菌種について少なくとも１０倍増加した細菌増殖を示す、方法。
【請求項２１】
前記細菌混合物中の前記少なくとも１つの第２の細菌種に凍結保護を与えるのに十分な前記第１の細菌種の量は、前記細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜５０％である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細菌増殖アッセイは、細菌プレーティングアッセイである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記細菌プレーティングアッセイは、ｍＬ当たりコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）を測定する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの第２の細菌種は、凍結保護屈折性である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの第２の細菌種は、哺乳動物の糞便に由来する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの第２の細菌種は、ヒトの糞便に由来する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの第２の細菌種は、コプロコッカス  コメス、ドレア  フォルミシゲネランス、ユウバクテリウム  コントルタム、ルミノコッカス  ラクタリス、ユウバクテリウム  レクターレ、フィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイ、ユウバクテリウム  エリゲンス、ルミノコッカス  トルキース、ロゼブリア  インテスティナーリス、アナエロスティペス  ハドルス、ブラウティア  ルティ、ルミノコッカス  オベウム、ブラウティア  スターコリス、ドレア  ロンギカテナ、クロストリジウム  スパイロフォルメ、ユウバクテリウム  デスモランス、クロストリジウム  アエロトレランス、クロストリジウム  ラクタティフェルメンタンス、ユウバクテリウム  ハリイ、クロストリジウム  ハイレモンアエ、ロゼブリア  イヌリニボランス、ロゼブリア  ホミニス、およびロゼブリア  ファエシスのうちの少なくとも１つである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記凍結保存は、凍結および凍結乾燥を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記再構成は、再構成培地による前記凍結保存細菌培養物の希釈を含んでおり、前記凍結保存細菌培養物と前記再構成培地の比は１：１である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記凍結保存細菌培養物は、凍結乾燥保護培地を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記凍結乾燥保護培地は、スクロース、フィコール７０、およびポリビニルピロリドンのうちの少なくとも１つを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記凍結保存細菌培養物は、リボフラビン、システイン、およびイヌリンのうちの少なくとも１つを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
前記凍結保存細菌培養物は、凍結保護培地を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
前記凍結保護培地は、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のうちの少なくとも１つを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記培養細菌混合物中の前記少なくとも１つの第２の細菌種に前記凍結保護を与えるのに十分な期間は、少なくとも３０分または少なくとも１時間である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３６】
前記培養細菌混合物中の前記少なくとも１つの第２の細菌種に前記凍結保護を与えるのに十分な期間は、３０分〜２時間または１〜２時間の範囲である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１の細菌種は、生存している、請求項２０に記載の方法。
【請求項３８】
前記細菌混合物中の前記第１の細菌種と前記少なくとも１つの第２の細菌種との比は、少なくとも１：１０である、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記細菌混合物中の前記第１の細菌種と前記少なくとも１つの第２の細菌種との比は、少なくとも１：１０である、請求項２０に記載の方法。
【請求項４０】
凍結保存製剤で使用するためのアシダミノコッカス種であって、再構成後の前記凍結保存製剤中に存在している他の細菌種の細菌生存率を向上させる、アシダミノコッカス種。
【請求項４１】
凍結保存製剤を含む組成物であって、
人工凍結保存培地中の細菌種の混合物を含み、前記混合物は、
ａ）アシダミノコッカス  インテスティニまたはアシダミノコッカス  フェルメンタンスである第１の細菌種と、
ｂ）少なくとも１つの第２の細菌種と、
を含み、
前記第１の細菌種は、前記人工凍結保存製剤の再構成時に前記少なくとも１つの第２の細菌種に凍結保護を与えるのに十分な量で前記凍結保存製剤中に存在し、
再構成後の前記人工凍結保存製剤は、前記第１の細菌種の不存在下で前記少なくとも１つの第２の細菌種を含む再構成後の人工凍結保存製剤の細菌増殖と比較して、細菌増殖アッセイにおいて前記少なくとも１つの第２の細菌種について少なくとも１０倍増加した細菌増殖を示す、組成物。
【請求項４２】
前記細菌混合物中の前記第２の細菌のうちの前記少なくとも１つに凍結保護を与えるのに十分な前記第１の細菌種の量は、前記人工凍結保存製剤中の細菌の総量の１０％〜５０％である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記細菌増殖アッセイは、細菌プレーティングアッセイである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４４】
前記細菌プレーティングアッセイは、ｍＬ当たりコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）を測定する、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの第２の細菌種は、凍結保護屈折性である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４６】
前記少なくとも１つの第２の細菌種は、哺乳類の糞便に由来する、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４７】
前記少なくとも１つの第２の細菌種は、ヒトの糞便に由来する、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４８】
前記少なくとも１つの第２の細菌種は、コプロコッカス  コメス、ドレア  フォルミシゲネランス、ユウバクテリウム  コントルタム、ルミノコッカス  ラクタリス、ユウバクテリウム  レクターレ、フィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイ、ユウバクテリウム  エリゲンス、ルミノコッカス  トルキース、ロゼブリア  インテスティナーリス、アナエロスティペス  ハドルス、ブラウティア  ルティ、ルミノコッカス  オベウム、ブラウティア  スターコリス、ドレア  ロンギカテナ、クロストリジウム  スパイロフォルメ、ユウバクテリウム  デスモランス、クロストリジウム  アエロトレランス、クロストリジウム  ラクタティフェルメンタンス、ユウバクテリウム  ハリイ、クロストリジウム  ハイレモンアエ、ロゼブリア  イヌリニボランス、ロゼブリア  ホミニス、およびロゼブリア  ファエシスのうちの少なくとも１つである、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４９】
前記人工凍結保存培地は、凍結保存剤を含む、請求項４１に記載の組成物。
【請求項５０】
前記再構成は、再構成培地による前記凍結保存細菌培養物の希釈を含んでおり、前記凍結保存細菌培養物と前記再構成培地の比は１：１である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項５１】
前記人工凍結保存培地は、凍結乾燥保護培地を含む、請求項４１に記載の組成物。
【請求項５２】
前記凍結乾燥保護培地は、スクロース、フィコール７０、およびポリビニルピロリドンのうちの少なくとも１つを含む、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記人工凍結保存培地は、リボフラビン、システイン、およびイヌリンのうちの少なくとも１つを含む、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５４】
前記人工凍結保存細菌培養物は、凍結保護培地を含む、請求項４１に記載の組成物。
【請求項５５】
前記凍結保護培地は、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のうちの少なくとも１つを含む、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記第１の細菌種は、生存している、請求項４１に記載の組成物。
【請求項５７】
前記少なくとも１つの第２の細菌種は、治療有効量で存在する、請求項４１に記載の組成物。
【請求項５８】
薬学的に許容される賦形剤を更に含む、請求項４１に記載の組成物。
【請求項５９】
凍結保存製剤を含む医薬組成物において、
人工凍結保存培地中の細菌種の混合物であって、
ａ）アシダミノコッカス  インテスティニまたはアシダミノコッカス  フェルメンタンスである第１の細菌種と、
ｂ）治療有効量で存在する少なくとも１つの第２の細菌種と、
を含み、
前記第１の細菌種は、前記人工凍結保存製剤の再構成時に前記少なくとも１つの第２の細菌種に凍結保護を与えるのに十分な量で前記凍結保存製剤中に存在し、
再構成後の前記人工凍結保存製剤は、前記第１の細菌種の不存在下で前記少なくとも１つの第２の細菌種を含む再構成後の人工凍結保存製剤の細菌増殖と比較して、細菌増殖アッセイにおいて前記少なくとも１つの第２の細菌種について少なくとも１０倍増加した細菌増殖を示す、
混合物と、
薬学的に許容される賦形剤と、
を含む、医薬組成物。
【請求項６０】
胃腸疾患に苦しむ患者において前記胃腸疾患の症状を改善するための方法であって、請求項５９に記載の医薬組成物を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項６１】
前記胃腸疾患は、消化管のディスバイオシス、クロストリジウム  ディフィシル（Clostridium difficile）（クロストリディオイデス  ディフィシル（Clostridioides difficile））感染症、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、および憩室性疾患のうちの少なくとも１つを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記炎症性腸疾患は、クローン病および潰瘍性大腸炎のうちの少なくとも１つである、請求項６１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願の相互参照＞
本出願は、２０１７年４月２８日に提出された米国仮出願第６２／４９１，７３９号の優先権を主張しており、その全体は、参照によって全ての目的について本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書に開示されるのは、細菌を培養および保存／保管するための方法および組成物であり、培養および保存／保存された細菌は、主題の方法以外の手段によって保存／保管された細菌と比較した場合、生存率／増殖が改善される。より詳細には、凍結保存後の細菌生存率を改善するための方法および組成物が、本明細書に開示されている。
【背景技術】
【０００３】
細菌を保管するための多くの方法が存在している。しかし、特定の細菌ごとに選択されるそれぞれの保管方法は、細菌の適合性、実験目的および細胞生存率に関係している。通常、保管温度が低下するにつれて、細菌の保管期間は長くなる。温度が凝固点を下回ると、凍結保護剤を使用して、凍結過程によって引き起こされる細胞の損傷を低減できる場合がある。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
本発明は、添付の図面を参照して更に説明され、いくつかの図を通して、同様の構造は、同様の番号で参照される。示される図面は、必ずしも縮尺通りではなく、代わりに本発明の原理を例示することに一般的に重点が置かれている。更に、一部の特徴は、特定の構成要素の詳細を示すために誇張されている場合がある。
【０００５】
加えて、図に示されているいかなる測定値や仕様なども、限定ではなく例示を目的としている。したがって、本明細書で開示される特定の構造および機能の詳細は、限定するものとして解釈されるべきではなく、単に本発明を様々に使用することを当業者に教示するための代表的な基礎として解釈されるべきである。
【０００６】
【図１Ａ】本発明のいくつかの実施形態による方法で使用される単段ケモスタット容器を示す図である。
【図１Ｂ】本発明のいくつかの実施形態による方法で使用される単段ケモスタット容器を示す図である。
【０００７】
【図２】ダブルフラスコ装置を示す図であり、黒い矢印は０．２２μｍフィルタを取り付ける位置を示し、フィルタを自由に通過できる０．２２μｍよりも小さい分子（例えば、それぞれの培養物の代謝副生成物および細胞間シグナル伝達分子）を除いて、両方のボトルの内容物を効果的に分離したままにする。装置全体は、使用前に滅菌される。０．２２μｍフィルタは、Ａ．インテスティニ（A．intestini）とその共培養コンパニオン菌株との直接接触（細胞間）を防ぐ。
【発明の概要】
【０００８】
一態様では、凍結保存後の細菌の生存率を改善する方法が提示され、当該方法は、
ａ）アシダミノコッカス（Acidaminococcus）種、またはアシダミノコッカス（Acidaminococcaceae）科の構成種である第１の細菌種を、少なくとも１つの第２の細菌種と組み合わせて細菌混合物を生成することであって、第１の細菌種は、少なくとも１つの第２の細菌種に凍結保護を与えるのに十分な量で細菌混合物中に存在し、アシダミノコッカス科の構成種は、スクシニスピラ  モビリス（Succinispira mobilis）である、ことと、
ｂ）細菌混合物を培養して培養細菌混合物を生成することであって、培養は、培養細菌混合物中の少なくとも１つの第２の細菌種に凍結保護を与えるのに十分な時間にわたる、ことと、
ｃ）培養細菌混合物を凍結保存して凍結保存細菌培養物を生成することであって、再構成後の凍結保存細菌培養物は、第１の細菌種の不存在下で少なくとも１つの第２の細菌種を含む再構成後の凍結保存細菌培養物の細菌増殖と比較して、細菌増殖アッセイにおいて少なくとも１つの第２の細菌種について少なくとも１０倍増加した細菌増殖を示す、ことと、を含む。
【０００９】
特定の実施形態では、再構成後の凍結保存細菌培養物は、第１の細菌種の不存在下で少なくとも１つの第２の細菌種を含む再構成後の凍結保存細菌培養物の細菌増殖と比較して、細菌増殖アッセイにおいて少なくとも１つの第２の細菌種について少なくとも１０倍、２０倍、１００倍、１，０００倍、１０，０００倍、または１００，０００倍増加した細菌増殖を示す。
【００１０】
別の特定の実施形態では、再構成後の凍結保存細菌培養物は、少なくとも１つの第２の細菌種から本質的になる再構成後の凍結保存細菌培養物の細菌増殖と比較して、細菌増殖アッセイにおいて少なくとも１つの第２の細菌種について少なくとも１０倍増加した細菌増殖を示す。
【００１１】
更に別の実施形態では、アシダミノコッカス種は、アシダミノコッカス  インテスティニ（Acidaminococcus intestini）またはアシダミノコッカス  フェルメンタンス（Acidaminococcus fermentans）である。
【００１２】
別の特定の実施形態では、細菌混合物中の少なくとも１つの第２の細菌種に凍結保護を与えるのに十分な第１の細菌種の量は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜５０％である。
【００１３】
別の特定の実施形態では、細菌混合物中の第１の細菌種と少なくとも１つの第２の細菌種との比は、少なくとも１：１０である。
【００１４】
別の特定の実施形態では、細菌増殖アッセイは、細菌プレーティングアッセイである。より特定の実施形態では、細菌プレーティングアッセイは、ｍＬ当たりコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）を測定する。
【００１５】
更に別の特定の実施形態では、少なくとも１つの第２の細菌種は、凍結保護屈折性である。
【００１６】
更なる特定の実施形態では、少なくとも１つの第２の細菌種は、哺乳動物の糞便に由来する。より特定の実施形態では、少なくとも１つの第２の細菌種は、ヒトの糞便に由来する。更により特定の実施形態では、少なくとも１つの第２の細菌種は、コプロコッカス  コメス（Coprococcus comes）、ドレア  フォルミシゲネランス（Dorea formicigenerans）、ユウバクテリウム  コントルタム（Eubacterium contortum）、ルミノコッカス  ラクタリス（Ruminococcus lactaris）、ユウバクテリウム  レクターレ（Eubacterium rectale）、フィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイ（Faecalibacterium prausnitzii）、ユウバクテリウム  エリゲンス（Eubacterium eligens）、ルミノコッカス  トルキース（Ruminococcus torques）、ロゼブリア  インテスティナーリス（Roseburia intestinalis）、アナエロスティペス  ハドルス（Anaerostipes hadrus）、ブラウティア  ルティ（Blautia luti）、ルミノコッカス  オベウム（Ruminococcus obeum）、ブラウティア  スターコリス（Blautia stercoris）、ドレア  ロンギカテナ（Dorea longicatena）、クロストリジウム  スパイロフォルメ（Clostridium spiroforme）、ユウバクテリウム  デスモランス（Eubacterium desmolans）、クロストリジウム  アエロトレランス（Clostridium aerotolerans）、クロストリジウム  ラクタティフェルメンタンス（Clostridium lactatifermentans）、ユウバクテリウム  ハリイ（Eubacterium hallii）、クロストリジウム  ハイレモンアエ（Clostridium hylemonae）、ロゼブリア  イヌリニボランス（Roseburia inulinivorans）、ロゼブリア  ホミニス（Roseburia hominis）、およびロゼブリア  ファエシス（Roseburia faecis）のうちの少なくとも１つである。
【００１７】
別の実施形態では、凍結保存は、凍結および凍結乾燥を含む。
【００１８】
更に別の実施形態では、再構成は、再構成培地による凍結保存細菌培養物の希釈を含んでおり、凍結保存細菌培養物と再構成培地は、１：１の比である。特定の実施形態では、凍結保存細菌培養物は、凍結乾燥保護培地を含む。更に特定の実施形態では、凍結乾燥保護培地は、スクロース、フィコール７０、およびポリビニルピロリドンのうちの少なくとも１つを含む。別の特定の実施形態では、凍結保存細菌培養物は、リボフラビン、システイン、およびイヌリンのうちの少なくとも１つを含む。別の特定の実施形態では、凍結保存細菌培養物は、凍結保護培地を含む。より特定の実施形態では、凍結保護培地は、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のうちの少なくとも１つを含む。
【００１９】
別の実施形態では、培養細菌混合物中の少なくとも１つの第２の細菌種に凍結保護を与えるのに十分な期間は、少なくとも３０分または少なくとも１時間である。より特定の実施形態では、培養細菌混合物中の少なくとも１つの第２の細菌種に凍結保護を与えるのに十分な期間は、３０分〜２時間または１〜２時間の範囲である。
【００２０】
別の特定の実施形態では、第１の細菌種は、生存している。
【００２１】
更に別の特定の実施形態では、方法は、嫌気性条件下で実施される。
【００２２】
別の態様では、凍結保存後の細菌の生存率を改善する方法が提示され、当該方法は、
ａ）アシダミノコッカス  インテスティニまたはアシダミノコッカス  フェルメンタンスである第１の細菌種を、少なくとも１つの第２の細菌種と組み合わせて細菌混合物を生成することであって、第１の細菌種は、少なくとも１つの第２の細菌種に凍結保護を与えるのに十分な量で細菌混合物中に存在する、ことと、
ｂ）細菌混合物を培養して培養細菌混合物を生成することであって、培養は、培養細菌混合物中の少なくとも１つの第２の細菌種に凍結保護を与えるのに十分な時間にわたる、ことと、
ｃ）培養細菌混合物を凍結保存して凍結保存細菌培養物を生成することであって、再構成後の凍結保存細菌培養物は、第１の細菌種の不存在下で少なくとも１つの第２の細菌種を含む再構成後の凍結保存細菌培養物の細菌増殖と比較して、細菌増殖アッセイにおいて少なくとも１つの第２の細菌種について少なくとも１０倍増加した細菌増殖を示す、ことと、を含む。
【００２３】
特定の実施形態では、再構成後の凍結保存細菌培養物は、第１の細菌種の不存在下で少なくとも１つの第２の細菌種を含む再構成後の凍結保存細菌培養物の細菌増殖と比較して、細菌増殖アッセイにおいて少なくとも１つの第２の細菌種について少なくとも１０倍、２０倍、１００倍、１，０００倍、１０，０００倍、または１００，０００倍増加した細菌増殖を示す。
【００２４】
別の特定の実施形態では、再構成後の凍結保存細菌培養物は、少なくとも１つの第２の細菌種から本質的になる再構成後の凍結保存細菌培養物の細菌増殖と比較して、細菌増殖アッセイにおいて少なくとも１つの第２の細菌種について少なくとも１０倍増加した細菌増殖を示す。
【００２５】
別の特定の実施形態では、細菌混合物中の少なくとも１つの第２の細菌種に凍結保護を与えるのに十分な第１の細菌種の量は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜５０％である。
【００２６】
別の特定の実施形態では、細菌混合物中の第１の細菌種と少なくとも１つの第２の細菌種との比は、少なくとも１：１０である。
【００２７】
別の特定の実施形態では、細菌増殖アッセイは、細菌プレーティングアッセイである。より特定の実施形態では、細菌プレーティングアッセイは、ｍＬ当たりコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）を測定する。
【００２８】
更に別の特定の実施形態では、少なくとも１つの第２の細菌種は、凍結保護屈折性である。
【００２９】
更なる特定の実施形態では、少なくとも１つの第２の細菌種は、哺乳動物の糞便に由来する。より特定の実施形態では、少なくとも１つの第２の細菌種は、ヒトの糞便に由来する。更により特定の実施形態では、少なくとも１つの第２の細菌種は、コプロコッカス  コメス、ドレア  フォルミシゲネランス、ユウバクテリウム  コントルタム、ルミノコッカス  ラクタリス、ユウバクテリウム  レクターレ、フィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイ、ユウバクテリウム  エリゲンス、ルミノコッカス  トルキース、ロゼブリア  インテスティナーリス、アナエロスティペス  ハドルス、ブラウティア  ルティ、ルミノコッカス  オベウム、ブラウティア  スターコリス、ドレア  ロンギカテナ、クロストリジウム  スパイロフォルメ、ユウバクテリウム  デスモランス、クロストリジウム  アエロトレランス、クロストリジウム  ラクタティフェルメンタンス、ユウバクテリウム  ハリイ、クロストリジウム  ハイレモンアエ、ロゼブリア  イヌリニボランス、ロゼブリア  ホミニス、およびロゼブリア  ファエシスのうちの少なくとも１つである。
【００３０】
別の実施形態では、凍結保存は、凍結および凍結乾燥を含む。
【００３１】
更に別の実施形態では、再構成は、再構成培地による凍結保存細菌培養物の希釈を含んでおり、凍結保存細菌培養物と再構成培地との比は、１：１である。より特定の実施形態では、凍結保存細菌培養物は、凍結乾燥保護培地を含む。更に特定の実施形態では、凍結乾燥保護培地は、スクロース、フィコール７０、およびポリビニルピロリドンのうちの少なくとも１つを含む。別の特定の実施形態では、凍結保存細菌培養物は、リボフラビン、システイン、およびイヌリンのうちの少なくとも１つを含む。別の特定の実施形態では、凍結保存細菌培養物は、凍結保護培地を含む。より特定の実施形態では、凍結保護培地は、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のうちの少なくとも１つを含む。
【００３２】
別の実施形態では、培養細菌混合物中の少なくとも１つの第２の細菌種に凍結保護を与えるのに十分な期間は、少なくとも３０分または少なくとも１時間である。より特定の実施形態では、培養細菌混合物中の少なくとも１つの第２の細菌種に凍結保護を与えるのに十分な期間は、３０分〜２時間または１〜２時間の範囲である。
【００３３】
別の特定の実施形態では、第１の細菌種は、生存している。
【００３４】
更に別の特定の実施形態では、方法は、嫌気性条件下で実施される。
【００３５】
別の態様では、アシダミノコッカス種は、凍結保存製剤で使用するために存在し、アシダミノコッカス種は、再構成後の凍結保存製剤中に共に存在している他の細菌種の細菌生存率を向上させる。
【００３６】
別の態様では、凍結保存製剤を含む組成物が提示され、
人工凍結保存培地中の細菌種の混合物を含み、当該混合物は、
ａ）アシダミノコッカス  インテスティニまたはアシダミノコッカス  フェルメンタンスである第１の細菌種と、
ｂ）少なくとも１つの第２の細菌種と、
を含み、
ここで、第１の細菌種は、人工凍結保存製剤の再構成時に少なくとも１つの第２の細菌種に凍結保護を与えるのに十分な量で凍結保存製剤中に存在し、
再構成後の人工凍結保存製剤は、第１の細菌種の不存在下で少なくとも１つの第２の細菌種を含む再構成後の人工凍結保存製剤の細菌増殖と比較して、細菌増殖アッセイにおいて少なくとも１つの第２の細菌種について少なくとも１０倍増加した細菌増殖を示す。
【００３７】
組成物の一実施形態では、再構成後の凍結保存細菌培養物は、少なくとも１つの第２の細菌種から本質的になる再構成後の凍結保存細菌培養物の細菌増殖と比較して、細菌増殖アッセイにおいて少なくとも１つの第２の細菌種について少なくとも１０倍増加した細菌増殖を示す。
【００３８】
組成物の別の実施形態では、細菌混合物中の少なくとも１つの第２の細菌種に凍結保護を与えるのに十分な第１の細菌種の量は、人工凍結保存製剤中の細菌の総量の１０％〜５０％である。
【００３９】
組成物の更に別の実施形態では、細菌増殖アッセイは、細菌プレーティングアッセイである。組成物の更なる実施形態では、細菌プレーティングアッセイは、ｍＬ当たりコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）を測定する。
【００４０】
組成物の別の実施形態では、少なくとも１つの第２の細菌種は、凍結保護屈折性である。
【００４１】
組成物の更なる実施形態では、少なくとも１つの第２の細菌種は、哺乳類の糞便に由来する。組成物の更に別の実施形態では、細菌種は、ヒトの糞便に由来する。組成物のより特定の実施形態では、少なくとも１つの第２の細菌種は、コプロコッカス  コメス、ドレア  フォルミシゲネランス、ユウバクテリウム  コントルタム、ルミノコッカス  ラクタリス、ユウバクテリウム  レクターレ、フィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイ、ユウバクテリウム  エリゲンス、ルミノコッカス  トルキース、ロゼブリア  インテスティナーリス、アナエロスティペス  ハドルス、ブラウティア  ルティ、ルミノコッカス  オベウム、ブラウティア  スターコリス、ドレア  ロンギカテナ、クロストリジウム  スパイロフォルメ、ユウバクテリウム  デスモランス、クロストリジウム  アエロトレランス、クロストリジウム  ラクタティフェルメンタンス、ユウバクテリウム  ハリイ、クロストリジウム  ハイレモンアエ、ロゼブリア  イヌリニボランス、ロゼブリア  ホミニス、およびロゼブリア  ファエシスのうちの少なくとも１つである。
【００４２】
組成物の別の実施形態では、人工凍結保存培地は、凍結保存剤を含む。
【００４３】
組成物の更に別の実施形態では、再構成は、再構成培地による凍結保存細菌培養物の希釈を含んでおり、凍結保存細菌培養物と再構成培地の比は１：１の比である。
【００４４】
組成物の更なる実施形態では、人工凍結保存培地は、凍結乾燥保護培地を含む。組成物の特定の実施形態では、凍結乾燥保護培地は、スクロース、フィコール７０、およびポリビニルピロリドンのうちの少なくとも１つを含む。組成物の別の特定の実施形態では、人工凍結保存培地は、リボフラビン、システイン、およびイヌリンのうちの少なくとも１つを含む。組成物の更に別の実施形態では、人工凍結保存細菌培養物は、凍結保護培地を含む。組成物のより特定の実施形態では、凍結保護培地は、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のうちの少なくとも１つを含む。
【００４５】
組成物の別の実施形態では、第１の細菌種は、生存している。
【００４６】
組成物の別の実施形態では、少なくとも１つの第２の細菌種は、治療有効量で存在する。
【００４７】
別の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される賦形剤を更に含む。
【００４８】
別の態様では、凍結保存製剤を含む医薬組成物が提示され、当該医薬組成物は、
人工凍結保存培地中の細菌種の混合物であって、当該混合物は、
ａ）第１の細菌種であって、第１の細菌種は、アシダミノコッカス  インテスティニまたはアシダミノコッカス  フェルメンタンスである、第１の細菌種と、
ｂ）少なくとも１つの第２の細菌種であって、少なくとも１つの第２の細菌種は、治療有効量で存在する、少なくとも１つの第２の細菌種と、を含み、
第１の細菌種は、人工凍結保存製剤の再構成時に少なくとも１つの第２の細菌種に凍結保護を与えるのに十分な量で凍結保存製剤中に存在し、
再構成後の人工凍結保存製剤は、第１の細菌種の不存在下で少なくとも１つの第２の細菌種を含む再構成後の人工凍結保存製剤の細菌増殖と比較して、細菌増殖アッセイにおいて少なくとも１つの第２の細菌種について少なくとも１０倍増加した細菌増殖を示す、混合物と、
薬学的に許容される賦形剤と、
を含む、医薬組成物が提示される。
【００４９】
別の態様では、胃腸疾患に苦しむ患者の胃腸疾患の症状を改善する方法が提示され、その方法は、凍結保存製剤を含む医薬組成物を患者に投与することを含む。その実施形態では、胃腸疾患は、消化管のディスバイオシス（dysbiosis）、クロストリジウム  ディフィシル（Clostridium difficile）（クロストリディオイデス  ディフィシル（Clostridioides difficile））感染症、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、および憩室性疾患のうちの少なくとも１つを含む。その更なる実施形態では、炎症性腸疾患は、クローン病および潰瘍性大腸炎のうちの少なくとも１つである。
【００５０】
別の態様では、方法が提示され、当該方法は、
アシダミノコッカス  インテスティニまたはアシダミノコッカス  フェルメンタンスである第１の細菌種を取得することと、
第２の細菌種を取得することと、
十分な量の第１の細菌種を、十分な量の第２の細菌種と組み合わせて、細菌混合物を作製することであって、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜５０％のアシダミノコッカス  インテスティニを含む、ことと、
細菌混合物を一定期間培養して、培養混合物を得ることと、
培養混合物を保管して凍結保存細菌培養物を得ることと、
を含む方法であって、
凍結保存細菌培養物が再構成されると、再構成凍結保存細菌培養物は、第２の細菌種から本質的になる再構成細菌ストックと比較して、第２の細菌種のｍＬ当たりコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）で測定された細菌増殖が少なくとも１０倍増加している。
【００５１】
いくつかの実施形態では、第２の細菌種は、哺乳動物の糞便に由来する。いくつかの実施形態では、第２の細菌種は、ヒトの糞便に由来する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、方法は、調製された培養混合物を凍結乾燥することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、凍結乾燥保護培地を添加することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、調製された培養混合物を凍結することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、凍結保護培地を添加することを更に含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、第２の細菌種は、コプロコッカス  コメス、ドレア  フォルミシゲネランス、ユウバクテリウム  コントルタム、ルミノコッカス  ラクタリス、ユウバクテリウム  レクターレ、フィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイ、ユウバクテリウム  エリゲンス、ルミノコッカス  トルキース、ロゼブリア  インテスティナーリス、アナエロスティペス  ハドルス、ブラウティア  ルティ、ルミノコッカス  オベウム、ブラウティア  スターコリス、ドレア  ロンギカテナ、クロストリジウム  スパイロフォルメ、ユウバクテリウム  デスモランス、クロストリジウム  アエロトレランス、クロストリジウム  ラクタティフェルメンタンス、ユウバクテリウム  ハリイ、クロストリジウム  ハイレモンアエ、ロゼブリア  イヌリニボランス、ロゼブリア  ホミニス、ロゼブリア  ファエシス、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、培養は、少なくとも３０分である。いくつかの実施形態では、培養は、３０分〜２時間である。いくつかの実施形態では、培養は、１時間〜２時間である。いくつかの実施形態では、培養は、少なくとも１時間である。
【００５５】
いくつかの実施形態では、アシダミノコッカス  インテスティニまたはアシダミノコッカス  フェルメンタンスは、生存している。
【００５６】
いくつかの実施形態では、保管することは、リボフラビン、システイン、イヌリン、またはそれらの任意の組み合わせの溶液を添加することを含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜５０％のアシダミノコッカス  インテスティニまたはアシダミノコッカス  フェルメンタンスを含む。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本発明は組成物を提供し、当該組成物は、
保管細菌混合物であって、
アシダミノコッカス  インテスティニまたはアシダミノコッカス  フェルメンタンスである十分な量の第１の細菌種と、
十分な量の第２の細菌種と、
を含む保管細菌混合物を含んでおり、
保管細菌混合物が再構成されると、再構成保存細菌混合物は、第２の細菌種から本質的になる再構成細菌ストックと比較して、ｍＬ当たりコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）で測定された細菌増殖が、少なくとも１０倍増加している。
【００５９】
いくつかの実施形態では、第２の細菌種は、コプロコッカス  コメス、ドレア  フォルミシゲネランス、ユウバクテリウム  コントルタム、ルミノコッカス  ラクタリス、ユウバクテリウム  レクターレ、フィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイ、ユウバクテリウム  エリゲンス、ルミノコッカス  トルキース、ロゼブリア  インテスティナーリス、アナエロスティペス  ハドルス、ブラウティア  ルティ、ルミノコッカス  オベウム、ブラウティア  スターコリス、ドレア  ロンギカテナ、クロストリジウム  スパイロフォルメ、ユウバクテリウム  デスモランス、クロストリジウム  アエロトレランス、クロストリジウム  ラクタティフェルメンタンス、ユウバクテリウム  ハリイ、クロストリジウム  ハイレモンアエ、ロゼブリア  イヌリニボランス、ロゼブリア  ホミニス、ロゼブリア  ファエシス、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、アシダミノコッカス  インテスティニは、生存している。いくつかの実施形態では、第２の細菌種は、生存している。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
開示を明確にするために、限定することなく、本発明の詳細な説明は、本発明の特定の特徴、実施形態または用途を説明または例示する以下のサブセクションに分割される。
【００６２】
ヒトの糞便に由来するいくつかの微生物は、凍結条件および凍結乾燥条件にさらされた後、増殖しないか、著しく減少した増殖を示す。これらの微生物は、アシダミノコッカス  インテスティニ（１４  ＬＧ）（「Ａ．インテスティニ」）またはアシダミノコッカス  フェルメンタンス（ＤＳＭ  ２０７３１）（「Ａ．フェルメンタンス」）と共培養する場合、凍結および凍結乾燥後の増殖および生存率の増加を示した。理論に束縛されるものではないが、Ａ．インテスティニまたはＡ．フェルメンタンスの保護特性の背後にあるメカニズムは、微生物代謝産物または薬剤およびそれらの効果ではなく、主に微生物間で発生する物理的相互作用に起因する可能性がある。
【００６３】
アシダミノコッカスは、フィルミクテス門（細菌）の属である。アシダミノコッカス属は、Ａ．インテスティニおよびＡ．フェルメンタンスの２種を含む。これらの種は、増殖のための唯一のエネルギー源としてアミノ酸を使用することができる嫌気性双球菌である。これらの種は、グラム陰性である。これらの種は、Ａｌｌ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｔｒｅｅ（１６Ｓ  ｒＲＮＡに基づく系統樹）によって決定されるように、アシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）に近い近縁種である。
【００６４】
Ａ．フェルメンタンスは、特に、ヒト集団では一般的ではないことが注目に値する。
【００６５】
＜定義＞
本明細書で使用されるとき、単数形の「ある」および「その」は、文脈が明らかにそうでないと示さない限り、複数形を含む。態様または実施形態が、マーカッシュグループまたは他のグループ化代替物に関して記載される場合、それによって本発明がグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関してもまた記載されていることを、当業者は認識するであろう。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、用語「含む（comprising）」、「含む（including）」、「有する」、およびそれらの文法上の変形語は、述べられた特徴、工程または構成要素を特定するものと解釈されるべきであるが、１つ以上の追加の特徴、工程、構成要素またはそれらのグループの追加を排除しない。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、「から本質的になる」という用語は、述べられた特徴、工程または構成要素を指し、追加の要素を更に含んでもよいが、それらの追加の要素が述べられた特徴、工程または構成要素の基本特性に実質的に影響しない場合に限る。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、「培養」または「培養する」という用語は、制御された実験室条件下で微生物を所定の培地で繁殖させることにより微生物を増加させる方法を指す。いくつかの実施形態では、培地は、図１Ａおよび図１Ｂに示される装置を使用して生成され、米国公開出願第２０１４０３６３３９７号または同第２０１４０３４２４３８号に記載された方法を使用する。
【００６９】
本明細書で使用されるとき、「凍結乾燥」という用語は、組成物が最初に凍結され、その後、凍結状態のままで昇華および脱着を受けて、組成物中の水および溶媒の大部分を減少させる過程を指し、短期、中期、または長期の保存のために指定された保管温度で生物学的反応および化学反応を制限することを意図する。
【００７０】
本明細書で使用されるとき、「原液希釈」という用語は、典型的にはプレーティングされるかまたは培地で増殖する未希釈培養物を指す。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、「再構成（reconstituteまたはreconstituting）」という用語は、凍結微生物および／または乾燥微生物を復活させる方法をしており、当該方法は、好適な再構成培地で希釈して、生存している微生物の再構成組成物を生成することを含む。例示的な再構成培地には、限定することなく、１倍リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または生存率を保持する同様の生理的塩溶液、再構成を受ける細菌に適した細菌培養培地が挙げられる。他の再構成培地には、ヘミンおよびメナジオンを補充したトリプトソイブロス、ブレインハートインフュージョンブロス、ウィルキンス−チャルグレンブロス、難培養性嫌気性ブロスが挙げられる。
【００７２】
数値の前に「約」という用語が付いている場合、「約」という用語は、±１０％を示すことを意図する。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、「嫌気性細菌」とは、通性嫌気性細菌および厳密に嫌気性である細菌を指す。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、「標準培地」とは、栄養ブロスおよび寒天プレートなどの微生物用の一般的および／または市販の増殖培地を指し、その多くの変形例が当技術分野で既知である。標準培地は、一般に、細菌増殖のための少なくとも炭素源、例えば、グルコースなどの糖と、細菌の増殖に必要な様々な塩、例えば、マグネシウム、窒素、リン、および／または硫黄と、水とを含む。標準培地の非限定的な例には、ルリス−ベルターニ（ＬＢ）培地、Ａ１ブロス、および本明細書に記載の培地が挙げられる。本明細書で提供される方法で使用するための標準培地は、通常の一般知識に基づいて当業者によって選択されるであろう。「標準培養培地」および「標準実験室培養培地」という用語は、本明細書で互換的に使用される。
【００７５】
本明細書で使用されるとき、「純粋な分離物」、「単一の分離物」および「分離物」という用語は、他の細菌種または菌株から分離して、例えば、純培養で増殖した単一の細菌種または菌株を含む培養物を指すために、互換的に使用される。
【００７６】
本明細書の表に列挙されている菌株について、最も近縁の細菌種は、ＮＡＳＴサーバでアラインメントされ、次いで、ＧｒｅｅｎＧｅｎｅｓ分類サーバを使用して分類された、１６Ｓ  ｒＲＮＡ完全長配列を使用して決定した。
【００７７】
＜糞便の収集および糞便からの細菌処理＞
提供者は、実験室近くの専用便所で、提供された滅菌ポットに糞便を排泄するように求められる。ポットは、直ちに実験室に運ばれ、排泄から５分以内に嫌気性容器に入れられる。分離物のうちのいくつか、特にロゼブリア属の種は、酸素に対して非常に感受性であることに留意し、したがって、排泄試料をたとえ短期間（５分）であっても酸素への曝露から保護することが重要である。
【００７８】
嫌気性チャンバに入れてから、１０ｇの糞便試料を５０ｍＬの滅菌した前還元（pre-reduced）生理食塩水に量り入れ、滅菌ストマッカー袋に入れ、そのストマッカー袋をストマッカー装置内に置き、２分間破砕して試料を均一化する。次いで、ホモジネートを滅菌遠心分離管に入れ、低速で回転させて大きな粒子を沈降させ、それにより大きな粒子の沈降物を本質的に含まない処理済み試料を生成する。
【００７９】
次いで、２ラウンドの微生物分離を次のように実施してもよい。ホモジネート上清の一連の希釈液を、滅菌した前還元生理食塩水で作製する。１００μＬのそれぞれの希釈液を、以下のように調製した４連の寒天培地に個別にプレーティングする。
５％脱線維素ヒツジ血液が補充された難培養性嫌気性寒天培地（Ｌａｂ  ９０）；
血液補充なしの難培養性嫌気性寒天；
難培養性嫌気性寒天＋５％脱線維素ヒツジ血液＋３％「水金」（以下で説明）；
難培養性嫌気性寒天＋３％水金；
デマン−ロゴサ−シャーぺ（ＭＲＳ）培地（Ｏｘｉｏｉｄ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（英国、ハンプシャー州）から購入）、ラクトバチルス（Lactobacillus）属の種およびビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属の種に富む）；
実験室内で調合されたムチン寒天（ムチンを唯一の炭素源とする最小培地。これを使用するのは、ヒト腸管微生物叢のいくつかの菌種がムチンを炭素源として利用することが既知であるためである）；および
ＬＳ１７４  Ｔ細胞（ムチンを分泌するヒト結腸細胞株。ＡＴＣＣから入手可能）のコンフルエントな培養物から採取した３％ｖ／ｖの使用済み細胞培養上清を補充した寒天であるＬＳ寒天。
【００８０】
微生物の選択には、胞子形成する微生物を同定するためのスクリーニング工程もまた任意選択的に含まれてもよい。そのようなスクリーニングは、典型的には、微生物集団をエタノールショックに曝露することにより実施される。この目的のために、微生物のホモジネート試料を１００％エタノールに２０分〜１時間曝露し、次いで、微生物を遠心沈殿させ、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、以下のようにプレーティングする。これは、ホモジネート試料の一部で実施される追加工程である。内生胞子は、エタノールに耐性があるが、活発に増殖している細胞は、耐性がないため、胞子形成微生物を選別する。
【００８１】
細胞培養培地を、最小必須培地の１パッケージ（Ｇｉｂｃｏ＃４１５００−０３４）；２．２ｇの炭酸水素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）；４．７６６ｇのＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）；１０ｍＬの１００ｍＭピルビン酸ナトリウム溶液；１０％（ｖ／ｖ）の熱不活性化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）（５６℃で３０分）から調製し、再蒸留水で１リットルまで増やし、０．２２μｍ孔径フィルタ（ミリポア）を通して滅菌してよい。使用済み細胞培養培地は、３７℃にて５％ＣＯ２で５日間培養したＬＳＩ７４Ｔ細胞の上清から採取し、０．２２μｍ孔径フィルタを通してろ過して宿主細胞を除去した培地である。この培地が使用されるのは、いくつかの細菌分離菌株がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖および成長のためにヒト細胞シグナルが必要であるためである。
【００８２】
プレートは通常、加湿された嫌気性チャンバ（Ｒｕｓｋｉｎｎ（英国、Ｂｒｉｄｇｅｎｄ）製のＢｕｇ  Ｂｏｘ）内で２週間インキュベートされ、数日ごとに増殖が検査される。分離されたコロニーを新しいプレートに採取し、同じ時間増殖させて、純粋な培養物が得られるようにする。増殖した２番目または３番目のコロニータイプも除去する。特定の実施形態では、培養物は、嫌気性細菌の保護のために設計されたミルク−グリセロール−ジメチルスルホキシド混合物を含み、６０ｇのカーネーションスキムミルクパウダー（Ｚｅｈｒ’ｓ）、５ｍＬのＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）および５ｍＬのグリセロール（Ｓｉｇｍａ）を含有し、２回蒸留したＨ２Ｏにより、全体積を５００ｍＬにした。
【００８３】
菌株が分離されると、上記のようにそれぞれ異なる培地タイプでそれぞれの分離菌株を培養し、どの培地が最高の増殖をもたらすかを判定することにより、最適な増殖条件が、経験的に決定される。菌株が常に嫌気性環境に保たれていることに注意することが重要である。それらの菌株は、嫌気性環境以外では決して扱われず、例えば、本発明者らは、オープンベンチで生菌を決して扱わず、微生物は、常に可能な限り健康に保たれる。
【００８４】
特性評価の第２ラウンドでは、ケモスタットを使用して、まずｉｎ  ｖｉｔｒｏで微生物群集全体を安定化させる。約１か月後に定常状態（平衡）に達した後、上記のように希釈およびプレーティング方法を使用して、更に微生物の分離を試みる。ケモスタットは、群集を効果的にサンプリングして培養するために使用され、また元の糞便試料にわずかしか存在していなかった可能性のあるいくつかの腸管微生物を増やすためにも使用される。これらの生物は、例えば、粘膜と密接に関連している微生物であり、結腸の死細胞とともに「剥離」する。ケモスタット環境では、これらの微生物の一部が生き残って効果的に増殖し、上記のようにプレート培養できるように微生物の数が増える。
【００８５】
「培養された」および「増殖した」という用語は、本明細書では時々交換可能に使用される。
【００８６】
＜単段ケモスタットおよび接種＞
ヒトの遠位腸管から細菌を分離するための例示的なプロトコルを以下に示す。本発明者らは、米国公開出願第２０１４０３４２４３８号に記載されているように、Ｍｕｌｔｉｆｏｒｓ発酵システム（Ｉｎｆｏｒｓ、スイス）を改変することにより、ヒト遠位腸管内微生物叢をモデル化する単段ケモスタット容器を開発した。発酵システムからケモスタットへの変換は、コンデンサを遮断し、培養物中に窒素ガスをバブリングすることにより達成された。圧力が蓄積すると、排出物を金属管（以前はサンプリングチューブ）の外側へ設定された高さに押し出し、４００ｍＬの作業体積を維持できるようにする。
【００８７】
実験の継続期間にわたって、培養物中にろ過窒素ガス（Ｐｒａｘａｉｒ）をバブリングすることにより、容器を嫌気性に保った。温度（３７℃）およびｐＨ（７．０に設定、通常、培養中に６．９〜７前後で変動）は、コンピュータ操作システムによって自動的に制御かつ維持された。システムは、５％（ｖ／ｖ）ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）および５％（ｗ／ｖ）ＮａＯＨ（Ｓｉｇｍａ）を使用して培養ｐＨを維持した。増殖培地を４００ｍＬ／日（１６．７ｍＬ／時間）の速度で容器に連続的に供給して、２４時間の保持時間、遠位腸管の保持時間を模倣するように設定された値を得た。６５時間の別の保持時間（−１４８ｍＬ／日、６．２ｍＬ／時間）もまた試験して、ケモスタット群集の組成に対する保持時間の影響を判定した。
【００８８】
増殖培地は、オートクレーブ滅菌による殺菌に耐えられない成分を含んでいたため、容器は、４００ｍＬのｄｄＨ２Ｏでオートクレーブした。オートクレーブ中、金属管が容器の底に達するように、排出管を調整した。容器が冷却されたら、排出管は、コンピュータ操作ユニットの残りの部分に取り付けられ、ろ過された窒素ガスが水を通してバブリングされ、容器を加圧し、かつ排水した。次いで、排出管を作業体積（４００ｍＬ）まで上げ、３００ｍＬの滅菌培地を容器にポンプで注入した。次いで、容器を一晩撹拌し、加熱し、かつ脱気した。容器内の汚染を確認するために、それぞれの容器を無菌的にサンプリングし、難培養性５％脱線維素ヒツジ血液が補充された嫌気性寒天（ＦＡＡ）上に（好気的および嫌気的の両方で）プレートアウトした。汚染が確実に回避されるように、接種の１日前および接種の直前にこの手順を繰り返した。
【００８９】
＜糞便接種物の収集および調製＞
新鮮な糞便試料は、健康な女性または男性のドナーに至るまで（例えば、既知の障害／疾患を有する個人への便の提供前の１０年間に抗生物質の使用歴がない）、様々なヒトのドナーから分離することができる。これらの実験における糞便の収集および使用については、研究倫理委員会（ＲＥＢ）の承認が得られている。
【００９０】
接種物を調製するために、新鮮な排泄糞便試料を採取し、嫌気性チャンバ（９０％Ｎ２、５％ＣＯ２および５％Ｈ２の雰囲気下）内にすぐに入れる。１０％（ｗ／ｖ）糞便スラリーは、５ｇの新鮮な糞便を５０ｍＬの嫌気性リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１分間、ストマッカー（Ｔｅｋｍａｒ  Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ  Ｌａｂ  Ｂｌｅｎｄｅｒ、Ｓｅｗａｒｄ製）に浸して軟らかくすることにより調製する。得られた糞便スラリーを１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、大きな食物残渣を除去する。得られた上清は、接種材料として使用してもよい。
【００９１】
＜接種過程＞
４００ｍＬの最終作業体積を得るために、例えば、１０％接種材料１００ｍＬを、それぞれの容器内の滅菌培地３００ｍＬに添加する。接種直後、ｐＨ制御がオンになり、容器のｐＨは、約６．９〜７．０に調整され、維持される。接種後の最初の２４時間の間は、群集をバッチ培養で増殖させ、群集がｉｎ  ｖｉｖｏ条件からｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件に適応し、培養物の流出を防ぐようにする。この間、継続的にｐＨを調整しながら、容器を加熱し、脱気し、かつ撹拌する。この２４時間の後、供給ポンプがオンになり、容器がケモスタットとして動作する。新鮮な培地が継続的に追加され、排出物が継続的に除去される。
【００９２】
ケモスタットでは、培養条件および培地の供給が一定に維持される。一般に、ケモスタットシステムは、遠位腸管通過時間を模倣するために、２４時間の保持時間に設定される。
【００９３】
＜増殖培地の調製＞
培地は、次の手順で調製してもよい（２Ｌの場合）。
【００９４】
混合物１：
【００９５】
次の試薬を１８００ｍＬの蒸留水（ｄｄＨ２０）に溶解させた：ペプトン水、４ｇ（Ｏｘｉｏｉｄ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）；酵母エキス、４ｇ（Ｏｘｉｏｉｄ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）；ＮａＨＣＯ３、４ｇ（Ｓｉｇｍａ）；ＣａＣｌ２、０．０２ｇ（Ｓｉｇｍａ）；ペクチン（柑橘類由来）、４ｇ（Ｓｉｇｍａ）；キシラン（ブナ材由来）、４ｇ（Ｓｉｇｍａ）；アラビノガラクタン、４ｇ（Ｓｉｇｍａ）；デンプン（小麦由来、未修飾）、１０ｇ（Ｓｉｇｍａ）；カゼイン、６ｇ（Ｓｉｇｍａ）；イヌリン（ダリア塊茎由来）、２ｇ（Ｓｉｇｍａ）；ＮａＣｌ、０．２ｇ（Ｓｉｇｍａ）。オートクレーブ後、体積が１８００ｍＬに減少したため、水（ｄｄＨ２Ｏ）を添加して１９００ｍＬとした。混合物を１２１℃で６０分間オートクレーブすることにより滅菌し、一晩冷却させた。
【００９６】
混合物２：
【００９７】
次の試薬（全てＳｉｇｍａから購入）を１００ｍＬの蒸留水に溶解させた（混合物２Ａ）：Ｋ２ＨＰＯ４、０．０８ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、０．０８ｇ；ＭｇＳＯ４、０．０２ｇ；ヘミン（Hemin）、０．０１ｇ；メナジオン（Menadione）、０．００２ｇ。胆汁酸塩（１ｇ）を５０ｍＬの蒸留水に溶解させた（混合物２Ｂ）。Ｌ−システインＨＣｌ（１ｇ）もまた５０ｍＬの蒸留水に溶解させた（混合物２Ｃ）。混合物２Ｂおよび混合物２Ｃを溶解させた後、それらを混合物２Ａに添加すると、微細な白色沈殿物が形成された。次いで、透明な茶色の溶液が形成されるまで、この沈殿物を６Ｍ  ＫＯＨの滴下により溶解させた（混合物２）。この混合物（全体積２００ｍＬ）を、０．２２μｍフィルタを通してフィルタ処理することによって滅菌した。
【００９８】
培養培地（「培地１」）：最終体積が２Ｌに達するように、混合物２（０．２Ｌ）を混合物１（１．８Ｌ）に無菌的に添加する。その後の発泡を防ぐために、５ｍＬの消泡剤Ｂシリコーンエマルション（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）をそれぞれの２Ｌボトルの培地に無菌的に添加した。培地を使用するまで４℃で最大２週間保管した。ケモスタットに加える前日およびケモスタットを外した直後に、わずかな培地をＦＡＡ上に（好気的かつ嫌気的に）プレーティングして、汚染をチェックした。
【００９９】
培地は、コンピュータ操作システムによって速度が制御されるぜん動ポンプを使用して、それぞれの容器にポンプで注入された。ボトルから培地を容器にポンプで注入するために、標準のＧＬ−４５ガラスボトルの蓋（ＶＷＲ）には、２本のステンレス鋼金属チューブに合うように孔が開けられていた。混合物１を調製する際に、培地ボトルには、必要なシリコーンチューブおよび０．２２μｍフィルタの全てが取り付けられていた。
【０１００】
それぞれの容器には、２Ｌ体積の培地を有する１本の培地ボトルから供給した。培地を容器に供給するチューブもまたそれぞれの培地ボトルが変更されると変更されることから、これは、細菌が容器から滅菌培地リザーバに逆増殖するのを防ぐのに役立つ。それぞれのボトルをケモスタットに追加する前、およびそれぞれのボトルをケモスタットから取り外した後、それぞれのボトルを補充ＦＡＡ上にプレーティングし、好気的かつ嫌気的に増殖させる。
【０１０１】
本明細書で使用されるとき、「凍結保存剤」という用語は、氷の結晶の形成を低減または防止し、かつ／または細菌細胞を（氷の形成により生じる）増加した溶質濃度から保護する薬剤を指す。一般的な凍結保護剤には、ジメチルスルホキシド、スキムミルク、複合糖類が挙げられる。
【０１０２】
本明細書で使用されるとき、「凍結保護屈折性（cryoprotection refractive）」または「凍結保護感受性」という用語は、凍結保護剤の存在下でさえ、凍結過程中にかなりの損傷を被り、それにより凍結条件下での生存を妨げるほど十分に脆弱である生物を指す。
【０１０３】
本明細書で使用されるとき、「凍結保護」という用語は、微生物細胞を凍結し、微生物細胞を仮死状態に保持するための極低温（＜７０℃）の使用を指す。
【０１０４】
本明細書で使用されるとき、「細菌増殖アッセイ」という用語は、凍結保存の前後に微生物の生存率を決定するために使用される（複数の）方法を指す。希釈系列および寒天上の直接プレート計数のいずれかを使用して、または、例えば、ヨウ化プロピジウムなどを使用して生細胞対死細胞を特異的に染色したフローサイトメトリーにより、凍結保存の前後に、細胞増殖を定量化する。
【０１０５】
本明細書で使用されるとき、「凍結保存」という用語は、保管中に可能な限り高い生存率を維持することを意図して微生物培養物を凍結する行為を指す。
【０１０６】
本明細書で使用されるとき、「凍結保存細菌培養物」という用語は、凍結保護剤で処理され、最適温度（＜７０℃）で保管された細菌細胞を指す。
【０１０７】
＜細菌の保管方法＞
いくつかの実施形態では、本発明は、
アシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）である第１の細菌種を取得することと、
第２の細菌種を取得することと、
十分な量の第１の細菌種を、十分な量の第２の細菌種と組み合わせて、細菌混合物を生成することであって、当該細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜５０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む、ことと、
細菌混合物をある期間にわたって培養して、培養混合物を得ることと、
培養混合物を保管して、凍結保存細菌培養物を得ることと、
を含む方法であって、
凍結保存細菌培養物が再構成されると、再構成凍結保存細菌培養物は、第２の細菌種から本質的になる再構成細菌ストックと比較して、第２の細菌種のｍＬ当たりコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）で測定された細菌増殖が少なくとも１０倍増加している、
方法を提供する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、第２の細菌種は、哺乳動物の糞便に由来する。いくつかの実施形態では、第２の細菌種は、ヒトの糞便に由来する。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、方法は、調製された培養混合物を凍結乾燥することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、凍結乾燥保護培地を添加することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、調製された培養混合物を凍結することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、凍結保護培地を添加することを更に含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、第２の細菌種は、コプロコッカス  コメス、ドレア  フォルミシゲネランス、ユウバクテリウム  コントルタム、ルミノコッカス  ラクタリス、ユウバクテリウム  レクターレ、フィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイ、ユウバクテリウム  エリゲンス、ルミノコッカス  トルキース、ロゼブリア  インテスティナーリス、アナエロスティペス  ハドルス、ブラウティア  ルティ、ルミノコッカス  オベウム、ブラウティア  スターコリス、ドレア  ロンギカテナ、クロストリジウム  スパイロフォルメ、ユウバクテリウム  デスモランス、クロストリジウム  アエロトレランス、クロストリジウム  ラクタティフェルメンタンス、ユウバクテリウム  ハリイ、クロストリジウム  ハイレモンアエ、ロゼブリア  イヌリニボランス、ロゼブリア  ホミニス、ロゼブリア  ファエシス、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、培養は、少なくとも３０分である。いくつかの実施形態では、培養は、３０分〜２時間である。いくつかの実施形態では、培養は、１時間〜２時間である。いくつかの実施形態では、培養は、少なくとも１時間である。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、アシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）は、生存している。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、保管することは、リボフラビン、システイン、イヌリン、またはそれらの任意の組み合わせの溶液を添加することを含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜５０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。
【０１１５】
＜第１の細菌種の取得＞
いくつかの実施形態では、アシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）は、生存している。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、アシダミノコッカス  インテスティニは、アシダミノコッカス  インテスティニ（１４  ＬＧ）、アシダミノコッカス  インテスティニ（ＧＡＭ７）、アシダミノコッカス  インテスティニ（ＣＣ１／６  Ｄ９）、またはこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、アシダミノコッカス  インテスティニは、アシダミノコッカス  インテスティニ（ＲｙＣ−ＭＲ９５）、アシダミノコッカス  インテスティニ（ＤＮＦ００４０４）、アシダミノコッカス  インテスティニ（ＡＤＶ  ２５５．９９）、アシダミノコッカス  インテスティニ（ＤＳＭ  ２１５０５）、またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、アシダミノコッカス  フェルメンタンスは、アシダミノコッカス  フェルメンタンス（ＤＳＭ  ２０７３１）、アシダミノコッカス  フェルメンタンス  ロゴサ（ＶＲ４；ＡＴＣＣ（登録商標）２５０８５（商標）から購入可能）、）、アシダミノコッカス  フェルメンタンス（ＲＹＣ４０９３）、アシダミノコッカス  フェルメンタンス（ＲＹＣ４３５６）、アシダミノコッカス  フェルメンタンス（ＲＹＣ−ＭＲ９５）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、アシダミノコッカス科標準種は、スクシニスピラ  モビリス（ＤＳＭ  ６２２２；ＡＴＣＣ（登録商標）７００８４５（商標）から購入可能）、スクシニスピラ  モビリス（ＤＳＭ  ６２２２Ｔ）、またはそれらの任意の組み合わせである。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、アシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）は、哺乳類の糞便に由来する。いくつかの実施形態では、アシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）は、ヒトの糞便に由来する。いくつかの実施形態では、アシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）は、健康な患者に由来する。いくつかの実施形態では、アシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１４０３４２４３８号に開示された方法に従って健康な患者に由来する。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、アシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）は、胃腸疾患の患者に由来する。いくつかの実施形態では、アシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）は、米国特許出願第２０１４０３４２４３８号に開示された方法に従って胃腸疾患の患者から取得される。いくつかの実施形態では、アシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）は、米国特許出願第２０１４０３６３３９７号に開示された方法に従って胃腸疾患の患者から取得される。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、胃腸疾患は、ディスバイオシス、クロストリジウム  ディフィシル（クロストリディオイデス  ディフィシル）感染、炎症性腸疾患、すなわち、クローン病および潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、および／または憩室性疾患を含む。
【０１２２】
＜第２の細菌種の取得＞
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第２の細菌種は、哺乳類の糞便に由来する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第２の細菌種は、ヒトの糞便に由来する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第２の細菌種は、健康な患者に由来する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第２の細菌種は、米国特許出願第２０１４０３４２４３８号に開示された方法に従って健康な患者に由来する。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第２の細菌種は、コプロコッカス  コメス、ドレア  フォルミシゲネランス、ユウバクテリウム  コントルタム、ルミノコッカス  ラクタリス、ユウバクテリウム  レクターレ、フィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイ、ユウバクテリウム  エリゲンス、ルミノコッカス  トルキース、ロゼブリア  インテスティナーリス、アナエロスティペス  ハドルス、ブラウティア  ルティ、ルミノコッカス  オベウム、ブラウティア  スターコリス、ドレア  ロンギカテナ、クロストリジウム  スパイロフォルメ、ユウバクテリウム  デスモランス、クロストリジウム  アエロトレランス、クロストリジウム  ラクタティフェルメンタンス、ユウバクテリウム  ハリイ、クロストリジウム  ハイレモンアエ、ロゼブリア  イヌリニボランス、ロゼブリア  ホミニス、ロゼブリア  ファエシス、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第２の細菌種は、胃腸疾患を有する患者に由来する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第２の細菌種は、米国特許出願第２０１４０３４２４３８号に開示された方法に従って胃腸疾患を有する患者から取得される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第２の細菌種は、米国特許出願第２０１４０３６３３９７号に開示された方法に従って胃腸疾患の患者から取得される。
【０１２５】
＜細菌混合物の作製＞
いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の０．１％〜９９．９％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１％〜９９．９％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜９９．９％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の２０％〜９９．９％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の３０％〜９９．９％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の４０％〜９９．９％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の５０％〜９９．９％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の６０％〜９９．９％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の７０％〜９９．９％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の８０％〜９９．９％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の９０％〜９９．９％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の０．１％〜９０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の０．１％〜８０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の０．１％〜７０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の０．１％〜６０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の０．１％〜５０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の０．１％〜４０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の０．１％〜３０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の０．１％〜２０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の０．１％〜１０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜９０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜８０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜７０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜６０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜５０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜４０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜３０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜２０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の２０％〜９０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の３０％〜９０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の４０％〜９０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の５０％〜９０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の６０％〜９０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の７０％〜９０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の８０％〜９０％の間のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の３０％〜８０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の４０％〜７０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の５０％〜６０％のアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）を含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の０．１％〜９９．９％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１％〜９９．９％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜９９．９％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の２０％〜９９．９％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の３０％〜９９．９％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の４０％〜９９．９％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の５０％〜９９．９％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の６０％〜９９．９％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の７０％〜９９．９％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の８０％〜９９．９％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の９０％〜９９．９％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の０．１％〜９０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の０．１％〜８０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の０．１％〜７０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の０．１％〜６０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の０．１％〜５０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の０．１％〜４０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の０．１％〜３０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の０．１％〜２０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の０．１％〜１０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜９０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜８０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜７０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜６０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜５０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜４０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜３０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の１０％〜２０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の２０％〜９０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の３０％〜９０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の４０％〜９０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の５０％〜９０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の６０％〜９０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の７０％〜９０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の８０％〜９０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の３０％〜８０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の４０％〜７０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、細菌混合物は、細菌混合物中の細菌の総量の５０％〜６０％で少なくとも１つの第２の細菌種を含む。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、細菌混合物は、少なくともアシダミノコッカス種（例えば、アシダミノコッカス  インテスティニもしくはアシダミノコッカス  フェルメンタンス）またはアシダミノコッカス科標準種（例えば、スクシニスピラ  モビリス）および第２の細菌種を含む。いくつかの実施形態では、第２の細菌種は、コプロコッカス  コメス、ドレア  フォルミシゲネランス、ユウバクテリウム  コントルタム、ルミノコッカス  ラクタリス、ユウバクテリウム  レクターレ、フィーカリバクテリウム  プラウスニッツィイ、ユウバクテリウム  エリゲンス、ルミノコッカス  トルキース、ロゼブリア  インテスティナーリス、アナエロスティペス  ハドルス、ブラウティア  ルティ、ルミノコッカス  オベウム、ブラウティア  スターコリス、ドレア  ロンギカテナ、クロストリジウム  スパイロフォルメ、ユウバクテリウム  デスモランス、クロストリジウム  アエロトレランス、クロストリジウム  ラクタティフェルメンタンス、ユウバクテリウム  ハリイ、クロストリジウム  ハイレモンアエ、ロゼブリア  イヌリニボランス、ロゼブリア  ホミニス、ロゼブリア  ファエシス、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１３６】
＜細菌混合物の培養＞
いくつかの実施形態では、培養は、少なくとも３０分である。いくつかの実施形態では、培養は、３０分〜２時間である。いくつかの実施形態では、培養は、１時間〜２時間である。いくつかの実施形態では、培養は、少なくとも１時間である。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、培養は、最大４８時間まで実行され得る。いくつかの実施形態では、培養は、１時間〜４８時間である。いくつかの実施形態では、培養は、最大４８時間まで実行され得る。いくつかの実施形態では、培養は、２時間〜４８時間である。いくつかの実施形態では、培養は、４時間〜４８時間である。いくつかの実施形態では、培養は、８時間〜４８時間である。いくつかの実施形態では、培養は、１２時間〜４８時間である。いくつかの実施形態では、培養は、２４時間〜４８時間である。いくつかの実施形態では、培養は、１時間〜２４時間である。いくつかの実施形態では、培養は、１時間〜１２時間である。いくつかの実施形態では、培養は、１時間〜８時間である。いくつかの実施形態では、培養は、１時間〜４時間である。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、方法は、細菌混合物を一定期間培養して、培養混合物をもたらすことを含む。いくつかの実施形態では、培養は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１４０３４２４３８号に開示された方法を用いて実施される。
【０１３９】
＜凍結保存細菌培養物＞
いくつかの実施形態では、凍結保存細菌培養物は、リボフラビン、システイン、イヌリン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、凍結保存細菌培養物は、凍結乾燥保護培地を含む。いくつかの実施形態では、凍結乾燥保護培地は、スクロース、フィコール７０、ポリビニルピロリドン、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、凍結保存細菌培養物は、凍結保護培地を含む。いくつかの実施形態では、凍結保護培地は、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、培養細菌混合物を凍結保存することは、培養細菌混合物に好適な凍結保存組成物を添加することと、培養細菌混合物および好適な凍結保存組成物を含む組成物を凍結して、凍結細菌凍結保存組成物を生成することと、を含む。いくつかの実施形態では、凍結は、０セルシウス度（℃）以下である。いくつかの実施形態では、凍結は、−２０℃以下である。いくつかの実施形態では、凍結は、−６０℃以下である。いくつかの実施形態では、凍結は、−８０℃以下である。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、凍結は、０セルシウス度（℃）以下である。いくつかの実施形態では、凍結は、−２０℃以下である。いくつかの実施形態では、凍結は、−６０℃以下である。いくつかの実施形態では、凍結は、−８０℃以下である。いくつかの実施形態では、凍結は、−１００〜０℃である。いくつかの実施形態では、凍結は、−８０〜０℃である。いくつかの実施形態では、凍結は、−６０〜０℃である。いくつかの実施形態では、凍結は、−４０〜０℃である。いくつかの実施形態では、凍結は、−２０〜０℃である。いくつかの実施形態では、凍結は、−１００〜−２０℃である。いくつかの実施形態では、凍結は、−１００〜−４０℃である。いくつかの実施形態では、凍結は、−１００〜−６０℃である。いくつかの実施形態では、凍結は、−１００〜−８０℃である。いくつかの実施形態では、凍結は、−８０〜−２０℃である。いくつかの実施形態では、凍結は、−６０〜−４０℃である。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、培養細菌混合物を凍結保存することは、培養細菌混合物に好適な凍結保存組成物を添加することと、培養細菌混合物および好適な凍結保存組成物を含む組成物を凍結して、凍結細菌凍結保存組成物を生成することと、凍結細菌凍結保存組成物を凍結乾燥して、凍結保存細菌培養物を生成することと、を含む。いくつかの実施形態では、凍結乾燥は、当業者に既知の典型的に使用される方法を使用して実施される。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、培養細菌混合物を保存して保存細菌培養物を生成することは、培養細菌混合物に好適な保存組成物を添加することと、培養細菌混合物および好適な保存組成物を含む組成物を凍結乾燥して、脱水保存細菌培養物を生成することと、を含む。いくつかの実施形態では、凍結乾燥は、当業者に既知の典型的に使用される方法を使用して実施される。
【０１４６】
＜凍結保存細菌培養物の再構成＞
いくつかの実施形態では、凍結保存細菌培養物を再構成することは、凍結培養物または凍結かつ凍結乾燥（フリーズドライ）培養物について当該技術分野で既知の方法を使用して実施することができる。非限定的な例として、凍結乾燥培養物を再構成するために、好適な量の培地を使用して、ストリーキング、培養チューブでの増殖などのために細菌種を再水和することができる。更なる非限定的な例として、凍結培養物を再構成するために、凍結培養物の一部を解凍し、プレート、培養物などに接種するために使用することができる。いくつかの実施形態では、培地は、米国特許出願第２０１４０３４２４３８号に開示された方法に従って胃腸疾患を有する患者から取得される。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、凍結保存細菌培養物が再構成されたとき、再構成凍結保存細菌培養物は、少なくとも１つの第２の細菌種から本質的になる再構成細菌ストックと比較して、少なくとも１つの第２の細菌種のｍＬ当たりコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）で測定された細菌増殖が、少なくとも１０倍増加している。いくつかの実施形態では、凍結保存細菌培養物が再構成されたとき、凍結保存細菌培養物は、少なくとも１つの第２の細菌種から本質的になる再構成細菌ストックと比較して、少なくとも１つの第２の細菌種のｍＬ当たりコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）で測定された細菌増殖が、少なくとも１００倍増加している。いくつかの実施形態では、凍結保存細菌培養物が再構成されたとき、再構成凍結保存細菌培養物は、少なくとも１つの第２の細菌種から本質的になる再構成細菌ストックと比較して、少なくとも１つの第２の細菌種のｍＬ当たりコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）で測定された細菌増殖が、少なくとも１，０００倍増加している。いくつかの実施形態では、凍結保存細菌培養物が再構成されたとき、再構成凍結保存細菌培養物は、少なくとも１つの第２の細菌種から本質的になる再構成細菌ストックと比較して、少なくとも１つの第２の細菌種のｍＬ当たりコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）で測定された細菌増殖が、少なくとも１０，０００倍増加している。いくつかの実施形態では、凍結保存細菌培養物が再構成されたとき、再構成凍結保存細菌培養物は、少なくとも１つの第２の細菌種から本質的になる再構成細菌ストックと比較して、少なくとも１つの第２の細菌種のｍＬ当たりコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）で測定された細菌増殖が、少なくとも１００，０００倍増加している。いくつかの実施形態では、凍結保存細菌培養物が再構成されたとき、再構成凍結保存細菌培養物は、少なくとも１つの第２の細菌種から本質的になる再構成細菌ストックと比較して、少なくとも１つの第２の細菌種のｍＬ当たりコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）で測定された細菌増殖が、少なくとも１，０００，０００倍増加している。いくつかの実施形態では、凍結保存細菌培養物が再構成されたとき、再構成凍結保存細菌培養物は、少なくとも１つの第２の細菌種から本質的になる再構成細菌ストックと比較して、少なくとも１つの第２の細菌種のｍＬ当たりコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）で測定された細菌増殖が、少なくとも１０，０００，０００倍増加している。
【０１４８】
＜細菌組成物＞
一態様では、凍結保存製剤を含む組成物が提示され、
人工凍結保存培地中の細菌種の混合物を含み、当該混合物は、
ａ）アシダミノコッカス  インテスティニまたはアシダミノコッカス  フェルメンタンスである第１の細菌種と、
ｂ）少なくとも１つの第２の細菌種と、
を含み、
ここで、第１の細菌種は、人工凍結保存製剤の再構成時に少なくとも１つの第２の細菌種に凍結保護を与えるのに十分な量で凍結保存製剤中に存在し、
再構成後の人工凍結保存製剤は、第１の細菌種の不存在下で少なくとも１つの第２の細菌種を含む再構成後の人工凍結保存製剤の細菌増殖と比較して、細菌増殖アッセイにおいて少なくとも１つの第２の細菌種について少なくとも１０倍増加した細菌増殖を示す。
本明細書で使用されるとき、人工凍結保存培地は、細胞（例えば、細菌細胞）を凍結保存するのに適した合成培地を指し、「人の手」によって作られる。
【０１４９】
＜細菌増殖アッセイ＞
細菌細胞の生存能力および増殖能力を決定するための様々なアッセイが当技術分野で既知である。例示的な実施形態では、細菌増殖アッセイは、好適な基質（例えば、好適な細菌増殖培地を含む寒天プレート）上にストリーキング／プレーティングし、当該細菌の増殖に適した条件下でプレートをインキュベートすることを含む。特定の実施形態では、プレートは、嫌気性条件下でインキュベートされる。例えば、本明細書に提示される実施例を参照されたい。
【０１５０】
別の例示的な実施形態では、細菌増殖アッセイは、細胞選別を伴う。フローサイトメトリーは、細菌の生存率、代謝状態、抗原マーカーの分析に使用される。フローサイトメトリーは、試料中の生菌の数を決定するために日常的に使用される。生細胞は無傷の膜を有し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）などの色素に対して不透過性であり、色素は、膜が損傷した細胞にのみ入り込む。例えば、チアゾールオレンジ（ＴＯ）は、浸透性染料であり、様々な程度で生細胞および死細胞である全ての細胞に入る。グラム陰性菌では、ＥＤＴＡによるリポ多糖層の喪失が、ＴＯの取り込みを促進する。したがって、これらの２つの色素の組み合わせは、生菌と死菌を識別するための迅速で信頼できる方法を提供する。細菌の計数が重要な場合、フローサイトメトリービーズ標準であるＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して、試料中の生菌数、死菌数、および総菌数を正確に定量化することができる。
【０１５１】
フローサイトメトリーの例示的なプロトコルは、次のとおりである。
【０１５２】
［細菌］
培養された細菌について、染色緩衝液中で５×１０５〜９×１０６細菌／ｍＬのおおよその濃度範囲に希釈する。殺傷細菌を調製するために、０．５ｍＬのＳＰＯＲ−ＫＬＥＮＺ（商標）（Ｓｔｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、カタログ番号６５２５−０１）殺菌剤で希釈する前に、０．５ｍＬの培養液を５分間混合する。
【０１５３】
［染色］
１．１２×７５ｍｍポリスチレンチューブにラベルを付ける。
２．細菌懸濁液または試料をボルテックスし、染色緩衝液で少なくとも１:１０に希釈する。
３．染色緩衝液で上記のように希釈した細菌懸濁液２００μＬを添加する。
４．５．０μＬのそれぞれの色素溶液をチューブに添加する。最終染色濃度は、ＴＯについては４２０ｎＭ、ＰＩについては４８μｍである。
５．ボルテックスし、室温で５分間インキュベートする。
６．５０μＬのＢＤ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓを染色チューブにリバースピペッティングし、生菌、死菌、および総菌の濃度を決定する。
７．例えば、ＢＤ  ＦＡＣＳブランドのフローサイトメータ（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータまたは同等品）で分析する。
【０１５４】
［フローサイトメータのセットアップ］
【０１５５】
１．ＢＤ  ＣａｌｉＢＲＩＴＥ（商標）３ビーズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号３４９５０２）と、ＢＤ  ＦＡＣＳＣｏｍｐ（商標）またはＢＤ  ＡｕｔｏＣＯＭＰ（商標）ソフトウェアなどの適切なソフトウェアとを使用して、光電子増倍管（ＰＭＴ）電圧および蛍光補正を設定し、使用前に機器の感度を確認する。
【０１５６】
２．機器の初期設定は、次のとおりにすべきである。
・閾値−ＳＳＣ
・ＦＳＣ−Ｅ０１、対数増幅
・ＳＳＣ−３７５  Ｖ、対数増幅
・ＦＬ１−６００  Ｖ、対数増幅
・ＦＬ３−８００  Ｖ、対数増幅
・補正−使用せず
【０１５７】
３．実際の設定は、用途によって異なる場合があり、次のように最適化すべきである。側方散乱（ＳＳＣ）に閾値を設定し、希釈細菌の未染色試料を使用してＰＭＴ電圧および閾値レベルを調整する。細菌集団は、ＦＳＣ対ＳＳＣプロットの縮尺に完全に合うように位置決めすべきである（図１Ａ）。個々のＦＳＣおよびＳＳＣのヒストグラムをチェックして、釣鐘型の集団が見えることを確認すべきである。母集団全体が存在しない場合は、ＰＭＴ値を調整してピークをヒストグラム上に位置決めして、母集団全体が見えるようになるまで閾値を下げる。電圧を更に上げるにつれて、バックグラウンドノイズがヒストグラムの下端で明らかになるはずである。ＰＭＴ電圧と閾値とのバランスにより、細菌とノイズとの間の谷の少なくとも一部でピーク全体を観察できるはずである。実際のピーク形状およびノイズからの分解能は、細菌の形態と試料マトリックスによって異なることとなる。
【０１５８】
４．ＦＬ１およびＦＬ３のＰＭＴ電圧を設定して、未染色集団をＦＬ１対ＦＬ３プロットの左下の象限に配置する。
【０１５９】
［データ収集および分析］
【０１６０】
１．ＳＳＣ閾値を使用して、ＢＤ  ＦＡＣＳブランドのフローサイトメータで調製試料を取得する。取得−分析モードにおいて、ＢＤ  ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（商標）ＰｒｏまたはＢＤ  ＬＹＳＹＳ（商標）ＩＩソフトウェアでデータを取得する。細菌集団Ｒ１の周囲にライブゲートがあるＦＳＣ対ＳＳＣプロットを設定する。ＢＤ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓを使用する場合は、ＦＳＣ対ＳＳＣプロットでビーズの周りに領域Ｒ２を設定する。ＦＬ２対ＳＳＣドットプロットおよびＦＬ１対ＦＬ３プロットの染色細菌集団の周囲に別の領域Ｒ３を設定し、結合パラメータＦＳＣ、ＳＳＣ、およびＦＬ２（［Ｒ１  ＯＲ  Ｒ２］  ＡＮＤ  Ｒ３でゲートされたＦＬ１対ＦＬ３）でゲートして、染色結果を表示する（図１Ｃ）。
【０１６１】
２．合計１０，０００イベントを取得する。
【０１６２】
３．分析モードにおいて、生存集団、死滅集団、および損傷集団の周りに直線領域を描く。
【０１６３】
４．ＢＤ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓを使用している場合、絶対カウントを決定する。
【０１６４】
［対照］
【０１６５】
未染色の細菌試料を使用して、ＰＭＴ電圧が適切に設定されていることを確認する。アッセイのバックグラウンドが低いことを確認するために、細菌試料と同じように希釈した培地または試料マトリックスのアリコートを希釈し、染色し、かつ取得する。生菌と死菌との混合物を使用して、染色された生菌集団、損傷菌集団、および死菌集団が十分に分離されていることを確認する。
【０１６６】
ＰＩに加えて、他の生体染色として、限定することなく、エチジウムブロミド、フルオレセインジアセテート、アクリジンなどをフローサイトメトリーで使用して、生菌／死菌細胞数を決定してもよい。
【実施例】
【０１６７】
＜実施例１：菌株生存率＞
【０１６８】
ヒトの糞便に由来する多くの微生物は、生存率の低下によって証明されるように、凍結および凍結乾燥に対する感受性を示し、極端な場合には凍結および凍結乾燥に耐えられない。これが問題となるのは、糞便試料から生成することができる集団の微生物多様性を変化させ、それにより、その微生物集団が、元の材料を代表しないものになるからである。有益な特性を持つ種が凍結および凍結乾燥に対する感受性を示す状況では、感受性種の資源を維持する能力を制限かつ／または妨害するため、一次源由来の感受性種の新たに分離された供給源への定期的なアクセスが必要である。
【０１６９】
凍結するために、本明細書に記載の共培養物の１ｍＬのアリコートを含むバイアルを−８０℃の冷凍庫に入れ、少なくとも２４時間凍結させた。凍結乾燥するために、凍結乾燥過程に使用した凍結乾燥機は、Ｌａｂｃｏｎｃｏ  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ／Ｆｒｅｅｚｏｎｅ  ４．５，７７５００００であった。微生物を再構成するために、次のプロトコルを使用した。
【０１７０】
（１）再構成培地（１倍ＰＢＳ）を嫌気性チャンバに一晩入れて、培地を脱気した。再構成プロトコルの全体が、嫌気性チャンバで実施された。共培養物体積と再構成培地との１：１の比を使用して、共培養物を再構成した。例えば、１ｍＬの共培養物体積を凍結かつ凍結乾燥した場合、１ｍＬを使用して培養物を再構成した。
【０１７１】
（２）１ｍＬの再構成培地を、凍結共培養物を含むバイアルに分注し、嫌気性チャンバ内に１５分間放置した。バイアルを数分ごとに反転させ、培養物を完全に混合した。
【０１７２】
（３）次いで、この培養物をプレーティングして、ｃｆｕ／ｍＬを決定した。
【０１７３】
凍結保護培地および凍結乾燥保護培地を使用しても、表１に示す菌株などの感受性菌株は、１０２ｃｆｕ／ｍＬ以下の再構成値を示した。８菌株全て（米国特許出願第２０１４０３６３３９７号に記載されているようにヒトの糞便に由来するＭＥＴ−１定義群集に由来）もまたバッチごとの不一致を経験し、原液希釈であっても凍結乾燥から再び増殖しない場合があった。
【０１７４】
【表１】
2020518284.tif 000002
【０１７５】
＊ＮＧ−難培養性嫌気性寒天（ＦＡＡ）プレート上での細菌培養物の未希釈アリコートの増殖なし
【０１７６】
＜実施例２：アシダミノコッカス  インテスティニ（１４  ＬＧ）との共培養＞
【０１７７】
６  ＦＭ、４３  ＦＡＡ、Ｆ１  ＦＡＡ、１  ＦＡＡ、２９  ＦＡＡ、１８  ＦＡＡ、３９  ＦＡＡおよび３０  ＦＡＡ（ＭＥＴ−１由来）の一晩培養物の希釈系列をＦＡＡ上にプレーティングして、開始ｃｆｕ／ｍＬを決定した（例えば、表２を参照されたい）。次いで、８菌株全てを、アシダミノコッカス  インテスティニ１４  ＬＧ（ＯＤ６００＝０．７８２）の一晩培養物と、等分（１０ｍＬ：１０ｍＬ）で、個別に２時間共培養した。次いで、培養物を遠心分離し、固形物濃度１０％で５％リボフラビン／システイン／イヌリンに再懸濁した。試料を１ｍＬ体積に分注し、−８０℃で一晩凍結した。次いで、試料を凍結乾燥し、再構成し、プレーティングして回収ｃｆｕ／ｍＬを決定した。８菌株全てで混合培養が観察された（これは予想通りであり、１４  ＬＧおよび対象菌株の両方の存在を示唆する）。コロニー形態の違いが、１４  ＬＧと対象のそれぞれの菌株との間で観察され、それらの個々の同一性は、サンガーシーケンシングによって確認した。対象の菌株由来のコロニーを計数し、おおよその回収ｃｆｕ／ｍＬとして使用することができる（例えば、表２を参照されたい）。
【０１７８】
【表２】
2020518284.tif 000003
【０１７９】
再構成すると、８菌株全てが凍結条件および凍結乾燥条件で生き残っただけでなく、予測どおりのロバスト性で生き残った（例えば、これらに限定されないが、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の細菌種が生存し、ＦＡＡプレート上で増殖した）。
【０１８０】
１４  ＬＧとの共培養もまた、異なる糞便ドナー（「ＮＢ２」−プログラムの一部としてカナダでＦＭＴドナーになるように健康スクリーニングを受けた平均体格指数（ＢＭＩ）の健康な２８歳の男性）から分離された菌株のコホートでも実施された。３９菌株のうち、２１菌株は、従来の凍結保護剤および凍結保護剤の方法を使用した凍結および凍結乾燥から１０，０００倍または少なくとも１０−４の（４倍連続）希釈で増殖しなかった。これらの菌株を、１４  ＬＧの一晩培養物と、等分（１０ｍＬ：１０ｍＬ）で、個別に２時間共培養した。次いで、培養物を遠心分離し、固形物濃度１０％で５％リボフラビン／システイン／イヌリンに再懸濁した。試料を１ｍＬ体積に分注し、−８０℃で一晩凍結した。次いで、試料を凍結乾燥し、再構成し、アリコートを希釈せずにＦＡＡプレート上にプレーティングして、回収ｃｆｕ／ｍＬを決定した。２１菌株すべてで混合培養が観察された（これは予想されており、１４  ＬＧおよび対象菌株の両方の存在を示唆する）。コロニー形態の違いが、１４  ＬＧと対象のそれぞれの菌株との間で観察され、それらの個々の同一性は、サンガーシーケンシングによって確認した。対象の菌株のコロニーを計数し、おおよその回収ｃｆｕ／ｍＬとして使用することができる（例えば、表３を参照されたい）。
【０１８１】
【表３】
2020518284.tif 000004
【０１８２】
再構成すると、ドナーＮＢ２由来の２１菌株全てが凍結条件および凍結乾燥条件を生き残っただけでなく、予測どおりのロバスト性で生き残った（例えば、これらに限定されないが、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の細菌種が生存し、ＦＡＡプレート上で増殖した）。
【０１８３】
＜実施例３：アシダミノコッカス  インテスティニ１４  ＬＧのフィルタ滅菌済み上清との共培養＞
【０１８４】
４３  ＦＡＡ、Ｆ１  ＦＡＡ、および６  ＦＭの一晩培養物を未希釈アリコートを使用してＦＡＡプレート上にプレーティングし、開始ｃｆｕ／ｍＬを決定した（例えば、表４を参照されたい）。次いで、４３  ＦＡＡ、Ｆ１  ＦＡＡおよび６  ＦＭを、１４ＬＧ（ＯＤ６００＝０．７６３）の一晩培養物のフィルタ滅菌済み（０．２２μｍフィルタ）上清と、等分（１０ｍＬ：１０ｍＬ）で、個別に２時間共培養した。次いで、培養物を４０００ｒｐｍで遠心分離し、固形物濃度１０％で５％リボフラビン／システイン／イヌリンに再懸濁した。試料を１ｍＬ体積に分注し、−８０℃で一晩凍結した。次いで、試料を凍結乾燥し、再構成し、プレーティングして回収ｃｆｕ／ｍＬを決定した。原液プレートを含む全ての再構成プレートでは、全ての菌株について増殖が観察されなかった（例えば、表４を参照されたい）。これは、１４  ＬＧの保護特性は、生存している微生物間の相互作用の結果であり、微生物の分泌産物ではないことを示唆する。
【０１８５】
【表４】
2020518284.tif 000005
【０１８６】
＊難培養性嫌気性寒天（ＦＡＡ）プレート上での細菌培養物の未希釈アリコートの増殖なし
【０１８７】
＜実施例４：アシダミノコッカス  インテスティニ（ＧＡＭ  ７、ＣＣ１／６  Ｄ９）の他の菌株との共培養＞
【０１８８】
様々なドナーの糞便試料から分離されたアシダミノコッカス  インテスティニの他の菌株もまた試験された。ＧＡＭ  ７は、肥満の個人の糞便試料から分離されたＡ．インテスティニの菌株であり、ＣＣ１／６  Ｄ９は、結腸直腸癌の個人の腸生検から分離されたＡ．インテスティニの菌株であった。１  ＦＡＡおよび３９  ＦＡＡの一晩培養物を、ＧＡＭ  ７（ＯＤ６００＝０．７７６）またはＣＣ１／６  Ｄ９（ＯＤ６００＝１．２１６）のいずれかの一晩培養物と、等分（１０ｍＬ：１０ｍＬ）で、個別に２時間共培養した。次いで、培養物を遠心分離し、固形物濃度１０％で５％リボフラビン／システイン／イヌリンに再懸濁した。試料を１ｍＬ体積に分注し、−８０℃で一晩凍結した。次いで、試料を凍結乾燥し、再構成し、未希釈アリコートを使用してＦＡＡプレート上にプレーティングし、回収ｃｆｕ／ｍＬを決定した。最も近い種の同一性を決定するために、サンガーシーケンシング用にコロニーを計数し、採取し、かつ送付した。ＧＡＭ  ７またはＣＣ１／６  Ｄ９のうちのいずれかとの共培養は、１  ＦＡＡおよび３９  ＦＡＡの両方に対して比較的ロバストかつ一貫した再構成値をもたらし、１４  ＬＧと共培養したときに観察された再構成値と同等または上回った（例えば、表５および６を参照されたい）。これらの結果は、凍結および凍結乾燥の前のＡ．インテスティニとの共培養の保護特性が、特定の菌株ではなく種に関連する能力であることを示唆する。
【０１８９】
【表５】
2020518284.tif 000006
【０１９０】
【表６】
2020518284.tif 000007
【０１９１】
＜実施例５：アシダミノコッカス  インテスティニ（２５  ＭＲＳ、５  ＭＭおよび１２  ＦＭＵ）以外の菌株との共培養＞
【０１９２】
Ａ．インテスティニの代替微生物を共培養用に選択し、凍結および凍結乾燥中の保護が、Ａ．インテスティニに特有の特性であるか、または単に他の微生物との共培養の副産物であるかを判定した。ラクトバチルス  カゼイ（Lactobacillus casei）（２５  ＭＲＳ）およびバクテロイデス  オバツス（Bacteroides ovatus）（５  ＭＭ）は、本発明者らの微生物のＭＥＴ−１リストから選択され、ファスコラルクトバクテリウム  スクシナテュテンス（Phascolarctobacterium succinatutens）（１２  ＦＭＵ）は、微生物のＮＢ２リストから選択され、共培養のためのＡ．インテスティニの代替物として使用された。１  ＦＡＡおよび３９  ＦＡＡ（ＭＥＴ−１から）の一晩培養物を、２５  ＭＲＳ（ＯＤ６００＝１．３）または５  ＭＭ（ＯＤ６００＝１．３）のいずれかの一晩培養物と、等分（１０ｍＬ：１０ｍＬ）で、個別に２時間共培養した。加えて、１４  ＦＭＵ、９  ＮＡ、１７  ＦＭＵおよび５  ＴＳＡＢ（ＮＢ２由来）を、１２  ＦＭＵ（ＯＤ６００＝０．１６６）の一晩培養物と、等分（１０ｍＬ：１０ｍＬ）で、個別に２時間共培養した。次いで、培養物を遠心分離し、固形物濃度１０％で５％リボフラビン／システイン／イヌリンに再懸濁した。試料を１ｍＬ体積に分注し、−８０℃で一晩凍結した。次いで、試料を凍結乾燥し、再構成し、ＦＡＡプレート上の未希釈アリコートを使用してプレーティングし、回収ｃｆｕ／ｍＬを決定した。最も近い種の一致／同一性を決定するために、サンガーシーケンシング用にコロニーを計数し、採取し、かつ送付した。３９  ＦＡＡおよび１  ＦＡＡと５  ＭＭまたは２５  ＭＲＳのうちのいずれかとの共培養では、再構成時に３９  ＦＡＡまたは１  ＦＡＡのいずれの増殖も観察されなかった（例えば、表７および８を参照されたい）。同様に、１２  ＦＭＵと１４  ＦＭＵ、９  ＮＡ、１７  ＦＭＵまたは５  ＴＳＡＢとの共培養では、再構成時に１４  ＦＭＵ、９  ＮＡ、１７  ＦＭＵまたは５  ＴＳＡＢの増殖は観察されなかった（例えば、表９を参照されたい）。これらの結果は、凍結および凍結乾燥前のＡ．インテスティニとの共培養の保護特性は、Ａ．インテスティニに関連付けられた能力であり、単に任意の２つの微生物の共培養の結果ではないことを示唆する。
【０１９３】
【表７】
2020518284.tif 000008
【０１９４】
＊難培養性嫌気性寒天（ＦＡＡ）プレート上での細菌培養物の未希釈アリコートの増殖なし
【０１９５】
【表８】
2020518284.tif 000009
【０１９６】
＊難培養性嫌気性寒天（ＦＡＡ）プレート上での細菌培養物の未希釈アリコートの増殖なし
【０１９７】
【表９】
2020518284.tif 000010
【０１９８】
＊難培養性嫌気性寒天（ＦＡＡ）プレート上での細菌培養物の未希釈アリコートの増殖なし
【０１９９】
＜実施例６：凍結保護剤／凍結乾燥保護剤を使用しない１４  ＬＧとの共培養＞
【０２００】
凍結保護剤または凍結乾燥保護剤を使用せずに共培養を行い、１４  ＬＧとの共培養が凍結／凍結乾燥に対して感受性である菌株の生存を促進するのに十分かどうかを判定した。１  ＦＡＡおよび３９  ＦＡＡの一晩培養物を、１４  ＬＧ（ＯＤ６００＝０．６３３）の一晩培養物と、等分（１０ｍＬ：１０ｍＬ）で、個別に２時間共培養した。次いで、培養物を遠心分離し、固形物濃度１０％でｄｄＨ２Ｏに再懸濁した。試料を１ｍＬ体積に分注し、−８０℃で一晩凍結した。次いで、試料を凍結乾燥し、再構成し、ＦＡＡプレート上の未希釈アリコートを使用してプレーティングし、回収ｃｆｕ／ｍＬを決定した。本明細書に記載のプロセスを使用して同一性を決定するために、サンガーシーケンシングのためにコロニーを計数し、採取し、かつ送付した。凍結保護培地／凍結乾燥保護培地を使用しない１４ＬＧの共培養は、１  ＦＡＡおよび３９  ＦＡＡの両方の一貫した生存をもたらした（例えば、表１０を参照されたい）。しかし、１４  ＬＧおよび凍結保護培地／凍結乾燥保護培地との共培養を組み合わせて使用すると、１  ＦＡＡおよび３９  ＦＡＡの両方は、共培養のみの場合よりも高い再構成値であった（例えば、表２および表１０を参照されたい）。これらの結果は、１４  ＬＧとの共培養が、凍結および凍結乾燥中の感受性微生物の生存率を改善するのに十分であることを実証するが、凍結保護培地／凍結乾燥保護培地を更に補充すると増殖の増加が観察される（例えば、凍結保護剤／凍結乾燥保護培地を使用した場合、感受性微生物の生存率は、これらに限定されないが、１００倍、１，０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍改善された。）。
【０２０１】
【表１０】
2020518284.tif 000011
【０２０２】
＜実施例７：死んだ１４  ＬＧとの共培養＞
【０２０３】
死んだ１４  ＬＧとの共培養は、その保護特性が生存している微生物間で起こる相互作用の結果であるかどうかを判定するために行われた。１４  ＬＧ（ＯＤ６００＝０．６７６）の一晩培養物を２０分間煮沸して、全ての生細胞を破壊した。次いで、この培養物を未希釈アリコートを使用してＦＡＡプレート上にプレーティングし、増殖が観察されないことを確認した。１  ＦＡＡおよび３９  ＦＡＡの一晩培養物を、煮沸した１４  ＬＧと、等分（１０ｍＬ：１０ｍＬ）で、個別に２時間共培養した。次いで、培養物を遠心分離し、固形物濃度１０％で５％リボフラビン／システイン／イヌリンに再懸濁した。試料を１ｍＬ体積に分注し、−８０℃で一晩凍結した。次いで、試料を凍結乾燥し、再構成し、プレーティングして回収ｃｆｕ／ｍＬを決定した。原液プレート上を含め（例えば、難培養性嫌気性寒天（ＦＡＡ）プレート上の細菌培養物の未希釈アリコート）、どの希釈でも増殖は観察されなかった（例えば、表１１を参照されたい）。この観察結果は、１４  ＬＧ共培養の保護特性が、生存している微生物間で起こる相互作用の結果であることを示す。あるいは、煮沸手順は、保護特性に役割を果たす１４  ＬＧ細胞のいくつかの物理的特徴を変更または破壊した。
【０２０４】
【表１１】
2020518284.tif 000012
【０２０５】
＊難培養性嫌気性寒天（ＦＡＡ）プレート上での細菌培養物の未希釈アリコートの増殖なし
【０２０６】
＜実施例８：１４  ＬＧ共培養の代替タイミングおよび濃度＞
【０２０７】
実施された全ての実験において、細菌分離物の１４  ＬＧとの共培養を、等分で２時間行った。しかし、共培養はまた、異なる希釈度および異なる継続期間後に試験された。１:２０（１４  ＬＧ：菌株Ｘ）および１:１０（１４  ＬＧ：菌株Ｘ）の希釈を、それぞれ０分、３０分および１時間の時点で８つの感受性微生物のそれぞれについて試験した。６  ＦＭ、４３  ＦＡＡ、Ｆ１  ＦＡＡ、１  ＦＡＡ、２９  ＦＡＡ、１８  ＦＡＡ、３９  ＦＡＡおよび３０  ＦＡＡの一晩培養物を増殖させ、適切な希釈で適切な継続期間にわたり１４  ＬＧと共培養し、次いで、前述のように処理した。試料を再構成し、プレーティングして、回収ｃｆｕ／ｍＬを決定した。結果は菌株ごとに異なるが、共培養の継続期間および１４  ＬＧの濃度が増加するにつれて、再構成値が改善することを示す傾向がある（例えば、表１２を参照されたい）。これは、凍結および凍結乾燥中に感受性微生物を保護するように１４  ＬＧが採用したメカニズムが、最適に機能するために時間を必要とすることを示唆する。
【０２０８】
【表１２】
2020518284.tif 000013
【０２０９】
＊ＮＧ−難培養性嫌気性寒天（ＦＡＡ）プレート上での細菌培養物の未希釈アリコートの増殖なし
【０２１０】
＜実施例９：近い近縁種アシダミノコッカス  フェルメンタンス（ＤＳＭ  ２０７３１）との共培養＞
【０２１１】
アシダミノコッカス  フェルメンタンスを共培養試験に選択して、凍結および凍結乾燥中に与えられた保護が、Ａｌｌ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｔｒｅｅ（１６Ｓ  ｒＲＮＡに基づく系統樹）においてアシダミノコッカス  インテスティニの最も近い近縁種によって共有される特性であるかどうかを判定した。Ｂ−６  ＣＮＡ（ＮＢ２由来のユウバクテリウム  エリゲンス）、Ｂ−１０  ＦＡＡ（ＮＢ２由来のロゼブリア  インテスティナーリス）、ＤＳＭ  ２０７３１（ＤＳＭＺ菌株バンク由来のアシダミノコッカス  フェルメンタンス）、１４  ＬＧ（ＭＥＴ−１から分離されたアシダミノコッカス  インテスティニ）およびＤＳＭ  ２１５０５（ＤＳＭＺ菌株バンク由来のアシダミノコッカス  インテスティニ）を、この実験において使用した。Ｂ−６  ＣＮＡ（ＯＤ６００＝０．８）およびＢ−１０  ＦＡＡ（ＯＤ６００＝０．２３２）の一晩培養物を、ＤＳＭ  ２０７３１（ＯＤ６００＝０．６８５）、１４  ＬＧ（ＯＤ６００＝０．７７７）またはＤＳＭ  ２１５０５（ＯＤ６００＝０．７６２）のいずれかの一晩培養物と、等分（１０ｍＬ：１０ｍＬ）で、個別に２時間共培養した。次いで、培養物を遠沈させ、固形物濃度１０％で５％リボフラビン／システイン／イヌリンに再懸濁した。試料を１ｍＬ体積に分注し、−８０℃で一晩凍結した。次いで、試料を凍結乾燥し、再構成し、プレーティングして回収ｃｆｕ／ｍＬを決定した。同一性を決定するために、サンガーシーケンシング用にコロニーを計数し、採取し、かつ送付した。Ａ．フェルメンタンスとの共培養は、Ｂ−６  ＣＮＡのＡ．インテスティニほどロバストではないが、それでもなお、いかなる共培養も用いない凍結および凍結乾燥と比較して、Ｂ−６  ＣＮＡおよびＢ−１０  ＦＡＡの両方の一貫した回収を可能にした（表１３および１４）。これらの結果は、Ａ．フェルメンタンスが、Ａ．インテスティニのように、いくつかの微生物に対してロバストな保護を提供しない場合もあるが、それでもなおＡ．フェルメンタンスが、使用しない場合に凍結および凍結乾燥に耐えられない微生物の一貫した回収を可能にすることを示唆する。
【０２１２】
【表１３】
2020518284.tif 000014
【０２１３】
＊原液プレート上で増殖なし。
【０２１４】
【表１４】
2020518284.tif 000015
【０２１５】
＊原液プレート上で増殖なし。
【０２１６】
＜実施例１０：Ａ．インテスティニ凍結保護／凍結乾燥保護には細胞間接触が必要か？＞
【０２１７】
Ａ．インテスティニとの共培養過程中に、凍結保護／凍結乾燥保護を付与するために細胞間接触が必要かどうかは不明である。この問題を調査するために、共培養ダブルフラスコ装置を使用した（図２を参照されたい）。
【０２１８】
Ｂ−６  ＣＮＡ（ＮＢ２由来のユウバクテリウム  エリゲンス）は、３つの異なる方法で試験した。最初に、Ｂ−６  ＣＮＡの一晩培養物を遠心分離し、固形物濃度１０％で５％リボフラビン／システイン／イヌリンに再懸濁した。第二に、Ｂ−６  ＣＮＡの一晩培養物を１４  ＬＧ（ＭＥＴ−１由来のＡ．インテスティニ）の一晩培養物と等分（１０ｍＬ：１０ｍＬ）で２時間共培養した。次いで、培養物を遠沈し、固形物濃度１０％でｄｄＨ２Ｏに再懸濁した。第三に、１００ｍＬのＢ−６  ＣＮＡの一晩培養物を、１００ｍＬの１４  ＬＧの一晩培養物と共培養ダブルフラスコ装置内で（すなわち、Ｂ−６  ＣＮＡは、一方側／ボトル内にあり、１４  ＬＧは他方側にあり）２時間共培養した。３つの異なる処置群全てに由来する試料を１ｍＬ体積に分注し、−８０℃で一晩凍結した。次いで、試料を凍結乾燥し、再構成し、プレーティングして回収ｃｆｕ／ｍＬを決定した。Ｂ−６  ＣＮＡは、１４  ＬＧと直接接触させて共培養した場合にのみ回収された（表１５）。これらの研究結果は、Ａ．インテスティニ共培養の保護特性が、Ａ．インテスティニとその共培養コンパニオン菌株との間の直接的な細胞間接触の結果である可能性を示唆する。これらの結果はまた、上記の実施例７において見出された結果に、フィルタ滅菌Ａ．インテスティニ上清との共培養の無効性を説明する証拠を追加する。
【０２１９】
【表１５】
2020518284.tif 000016
【０２２０】
＊原液プレート上で増殖なし。
【０２２１】
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されるのと同程度に、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。加えて、本出願における任意の参考文献の引用または特定は、そのような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることの承認として解釈されるべきではない。セクションの見出しが使用されている範囲内で、それらは必ずしも制限するものとして解釈されるべきではない。
【０２２２】
本発明の多くの実施形態が説明されたが、これらの実施形態は例示のみであり、限定ではないことを理解されたい。
【図１Ａ】
2020518284.tif 000017
【図１Ｂ】
2020518284.tif 000018
【図２】
2020518284.tif 000019
【国際調査報告】
2020518284.tif 000020
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