(57)【要約】  本発明は、陽春砂抽出物を有効成分として含有する脂肪肝予防、治療又は改善用組成物に関する。本発明において、前記陽春砂抽出物は、水で抽出することを特徴とし、マウスの経口投与を基準にして１００ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ含まれていることを特徴とする脂肪肝予防、治療又は改善用組成物に関する。本発明は、陽春砂抽出物の脂肪肝生成に対する抑制効能及びその機転を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの肝内ＴＧの抑制、小胞体ストレス関連遺伝子発現の抑制、脂肪合成関連遺伝子発現の抑制効能を通じて確認することによって、陽春砂抽出物を有効成分として含有する脂肪肝予防、治療又は改善用組成物を提供する。【選択図】図３
2020518664.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
陽春砂抽出物を有効成分として含有する小胞体ストレスによって誘発される脂肪肝生成予防又は改善用健康機能食品組成物であって、前記陽春砂抽出物は、水で抽出し、マウスの経口投与を基準にして１００ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ含まれ、
前記陽春砂抽出物は、ＨｅｐＧ２細胞及びマウスにおいてツニカマイシンによって誘発されるトリグリセライドの生成を抑制し、マウスにおいて小胞体ストレス関連遺伝子ＧＲＰ７８及びＣＨＯＰのタンパク質及びｍＲＮＡの発現を抑制し、脂肪肝合成関連遺伝子ＡＣＣ（ａｃｅｔｙｌ  ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、ＦＡＳ（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＳＲＥＢＰ（ｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１のタンパク質及びｍＲＮＡの発現を抑制することを特徴とする小胞体ストレスによって誘発される脂肪肝の生成予防又は改善用健康機能食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、陽春砂抽出物を有効成分として含有する脂肪肝予防、治療又は改善用組成物に関する。
本発明は、前記陽春砂抽出物を水で抽出することを特徴とし、陽春砂抽出物の脂肪肝生成に対する抑制効能及びその機転を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの肝内ＴＧの抑制、小胞体ストレス関連遺伝子発現の抑制、脂肪合成関連遺伝子発現の抑制効能を通じて確認することによって、陽春砂抽出物を有効成分として含有する脂肪肝予防、治療又は改善用組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、健康な肝の脂肪比率は５％であり、これより多くの脂肪が蓄積された肝を脂肪肝という。最近、栄養状態が良くなり、成人病が増加するにつれて脂肪肝の患者が増加している。脂肪肝は、脂肪の過度な摂取によって肝内に脂肪が蓄積及び合成され、正常に脂肪代謝が行われないことから発病する疾患である。
【０００３】
脂肪肝は、飲み過ぎによるアルコール性脂肪肝と、肥満、糖尿病、高脂血症、薬物などによる非アルコール性脂肪肝とに分けることができる。アルコール性脂肪肝は、アルコールを多く摂取すると肝で脂肪合成が促進され、正常なエネルギー代謝が行われないことから発生する。
【０００４】
すなわち、脂肪肝は、その主な原因が飲酒及び肥満であり、血中脂肪質の濃度が高い高脂血症や糖尿病などの疾病と共に発生したり、副腎皮質ホルモン剤（ステロイド剤）や女性ホルモン剤などの薬剤が原因となって発生し得る。
【０００５】
脂肪肝は、ほとんどが症状を伴わないので外観上は健康に見えるが、疲労感及び全身倦怠感を感じたり、時々右上腹部における不快感や少しの痛みを感じることがある。したがって、その症状が明確に現われるよりは、肝機能検査のための血液検査及び超音波検査で異常所見が発見されることがほとんどである。
このような脂肪肝の治療方法は、アルコール性脂肪肝及び非アルコール性脂肪肝によって異なる。
【０００６】
アルコール性脂肪肝の治療方法としては、第一に、生活習慣の改善がある。すなわち、アルコール性脂肪肝は、飲み過ぎによって発病されるので、酒をやめることから治療を始め、健康状態を把握し、健康を持続的に管理することによって治療する。第二に、酒をやめたり、飲酒の回数を減らす方法以外に、抗酸化剤（ビタミンＥ、ビタミンＢ、Ｃ）を治療剤として用いて治療する方法がある。このとき、肝細胞保護剤であるウルソデオキシコール酸（ｕｒｏｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、ＵＤＣＡ）やシリマリン（ｓｉｌｙｍａｒｉｎ）などを用いて肝を保護する。
非アルコール性脂肪肝の治療方法としては、生活習慣の改善、手術的治療、薬物療法などがある。
【０００７】
脂肪肝疾患の患者の７０％〜８０％は肥満であり、その他の相当数の患者は過体重である。したがって、体重減少は、インスリン感受性を向上させ、脂肪肝を好転させ、最近は、体重の約５％程度のみを減量してもインスリン抵抗性が改善され、肝機能数値が好転するという報告がある。そこで、第一に、生活習慣の改善が何よりも重要である。
【０００８】
第二に、過去には肥満手術療法を多く使用しなかったが、最近は、高度肥満の患者が増加すると共に、高度肥満（体質量指数＞４０Ｋｇ／ｍ２又は体質量指数＞３５Ｋｇ／ｍ２以上）でありながら糖尿や高血圧などの危険因子が伴われた場合に肥満手術療法を勧める。これには、１）早期満腹感を誘導し、食物の摂取を減少させる施術（ｇａｓｔｒｉｃ  ｂａｎｄｉｎｇ）、２）小腸を迂回させ、吸収不良を誘導する施術（ｊｅｊｕｎｏｉｌｅａｌ  ｂｙｐａｓｓ）、３）前記二つの施術の効果を全て得るための施術（Ｒｏｕｘ−ｅｎ−Ｙ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｂｙｐａｓｓ、ｂｉｌｏｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｉｖｅｒｓｉｏｎ）がある。
【０００９】
第三に、薬物療法では、糖尿病治療剤、インスリン抵抗性改善薬物、抗酸化剤、肝細胞保護剤及び高脂血症治療薬物を用いる。糖尿病治療剤及びインスリン抵抗性改善薬物を用いると、ブドウ糖受容体を増加させ、筋肉での糖の吸収を促進し、脂肪細胞の分化を促進し、肝内脂肪の沈着を減少させるので脂肪肝及び脂肪肝炎の治療に効果がある。また、脂肪肝疾患の発生機転の一つである酸化ストレスを減少させるために抗酸化剤の使用が研究されており、高脂血症治療剤を用いると関連脂肪肝に効能があることが報告されている。
【００１０】
しかし、脂肪肝の薬物学的治療のための有用な薬物はほとんどない実情にあり、運動及び食餌療法が勧められている。また、前記薬物を用いる場合、むしろ、乳酸アシドーシス、筋肉へのミトコンドリア損傷、炎症、線維症などの多くの副作用も報告されている。脂肪肝は、相対的に初期には食餌調節で回復可能な軽い疾患であるが、長期間持続される場合、肝が損傷されながら肝の回復が不可能になることもある恐ろしい疾病である。したがって、このような脂肪肝の薬剤としても、短期及び長期服用しても副作用がない薬剤を選択しなければならない。
【００１１】
そこで、本出願人は、陽春砂（Ａｍｏｍｕｍ  ｖｉｌｌｏｓｕｍ  Ｌｏｕｒｅｉｒｏ）抽出物を用いることによって、副作用がなく、長期服用しても毒性がなく、脂肪肝予防、治療又は改善に効果がある本発明を案出した。
【００１２】
砂仁は、ショウガ科（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ）に属した緑殻砂（Ａｍｏｍｕｍ  ｖｉｌｌｏｓｕｍ  Ｌｏｕｒｅｉｒｏ  ｖａｒ．ｘａｎｔｈｉｏｉｄｅｓ  Ｔ．Ｌ．Ｗｕ  ｅｔ  Ｓｅｎｊｅｎ）又は陽春砂（Ａｍｏｍｕｍ  ｖｉｌｌｏｓｕｍ  Ｌｏｕｒｅｉｒｏ）のよく熟れた果実又は種子塊を意味し、本発明では陽春砂の果実を材料として用いた。
【００１３】
陽春砂は、主に福建省（Ｆｕｊｉａｎ）、広東省（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ）、広西チワン族自治区（Ｇｕａｎｇｘｉ）、雲南省（Ｙｕｎｎａｎ）で生産され、緑殻砂は、主にカンボジア（Ｃａｍｂｏｄｉａ）、インド（Ｉｎｄｉａ）、ラオス（Ｌａｏｓ）、ミャンマー（Ｍｙａｎｍａｒ）、タイ王国（Ｔｈａｉｌａｎｄ）、ベトナム（Ｖｉｅｔｎａｍ）などのインドシナ半島地域及び中国の広西チワン族自治区（Ｇｕａｎｇｘｉ）、雲南省（Ｙｕｎｎａｎ）の一部地域で産出される（Ｆｌｏｒａ  ｏｆ  Ｃｈｉｎａ，ｖ２４：３４７−３５６．２０００）。生産地が異なるので、古代には緑殻砂を別途に「縮砂仁」という名称で称した。
【００１４】
一方、中国では本物と認めるが、韓国では偽物として取り扱われる海南砂（Ａｍｏｍｕｍ  ｌｏｎｇｉｌｉｇｕｌａｒｅ  Ｔ．Ｌ．Ｗｕ）の果実も大量に流通されている状況である。しかし、Ｓｈｅｎ等（ＳＨＥＮ  Ｌｉ  ＷＡＮＧ  Ｙａｎｇ  ＪＩＡＮＧ  Ｋｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ＨＰＬＣ  Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ  ｏｆ  Ａｍｏｍｕｍ  ｖｉｌｌｏｓｕｍ  Ｌｏｕｒ．，Ａｍｏｍｕｒｎ  ｖｉｌｌｏｓｕｍ  Ｌｏｕｒ．ｖａｒ．ｘａｎｔｈｉｏｉｄｅｓ  Ｔ．Ｌ．Ｗｕ  ｅｔ  Ｓｅｎｊｅｎ  ａｎｄ  Ａｍｏｍｕｍ  ｌｏｎｇｉｌｉｇｕｌａｒｅ  Ｔ．Ｌ．Ｗｕ．Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ．２０１６：５１（１２）；１０３９−１０４３．）は、ＲＰ−ＨＰＬＣ研究の結果、成分上、３種類の砂仁が高い類似度を示すが、海南砂と陽春砂の場合は化学成分が類似する一方、緑殻砂の場合は前記海南砂及び陽春砂と明らかに相違しているので、これに対する薬理及び臨床効能の比較が究明されるべきであると述べた。
【００１５】
脂肪肝は、肥満、糖尿病などの代謝疾患の前段階或いは兆候と見なされ、脂肪肝の発生は、ツーヒットワーキングモデル（ｔｗｏ−ｈｉｔ  ｗｏｒｋｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ）で説明される。肝の脂肪症がファーストヒット（ｆｉｒｓｔ  ｈｉｔ）に該当し、このファーストヒットは、炎症、飽和脂肪酸などの肝損傷によって発生するセカンドヒット（ｓｅｃｏｎｄ  ｈｉｔ）において肝を脆弱な状態にする。最近の研究では、ＧＲＰ７８、ＣＨＯＰ、ＸＢＰ−１などの小胞体ストレスマーカーを用いることによって、小胞体ストレスがこのような過程でセカンドヒットとして重要な要因であることを証明し、その結果、脂肪肝の悪化を防止するために小胞体ストレスを減少させる方法を研究することが重要となった。
【００１６】
そこで、本研究は、陽春砂抽出物の脂肪肝予防及び改善効能を立証するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで脂肪肝の化学的誘導因子であるツニカマイシン（ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎ）で小胞体（Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ（ＥＲ））ストレスを起こしたＨｅｐＧ２細胞及びＣ５７ＢＬ／６マウスモデルを用いて陽春砂抽出物の効能を明らかにすることによって本発明を完成した。
【００１７】
一方、先行技術文献を検討すると、大韓民国登録特許公報第１０−１４３１６１０号には、烏梅及び紫草抽出物を有効成分として含む肥満、脂質異常症、脂肪肝又は糖尿の予防又は治療用薬剤学的組成物が記載されており、大韓民国登録特許公報第１０−１２０６５４３号には、栗皮抽出物を含む脂肪肝の予防又は治療用組成物に効果があることが記載されている。
【００１８】
しかし、前記各先行技術文献は、陽春砂（Ａｍｏｍｕｍ  ｖｉｌｏｓｕｍ）とは異なる天然物を用いて効能を明らかにしたものであって、本発明とは区別されると言える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】大韓民国登録特許公報第１０−１４３１６１０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の技術的課題は、陽春砂抽出物を有効成分として含有する脂肪肝予防、治療又は改善用組成物を提供することにある。
【００２１】
本発明の技術的課題は、陽春砂抽出物の小胞体ストレスによる脂肪肝生成に対する抑制効能及びその機転を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで小胞体ストレス誘導因子であるツニカマイシンを投与し、小胞体ストレス関連ＧＲＰ７８及びＣＨＯＰ遺伝子発現の抑制、脂肪合成関連ＳＲＥＢＰ−１発現の抑制を通じて確認することによって、陽春砂抽出物を有効成分として含有する脂肪肝予防、治療又は改善用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、陽春砂抽出物を含有する脂肪肝予防、治療又は改善用組成物を提供することによって技術的課題を解決しようとする。
【００２３】
本発明において、前記陽春砂抽出物は、マウスの経口投与を基準にして１００ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ含まれていることを特徴とする脂肪肝予防、治療又は改善用組成物を提供することによって技術的課題を解決しようとする。
【００２４】
本発明において、前記陽春砂抽出物を水で抽出することを特徴とする脂肪肝予防、治療又は改善用組成物を提供することによって技術的課題を解決しようとする。
【００２５】
本発明において、前記陽春砂抽出物は、ＨｅｐＧ２細胞及びマウスにおけるツニカマイシンによる脂肪生成の抑制、マウスにおける小胞体ストレス関連遺伝子ＧＲＰ７８、ＣＨＯＰのタンパク質及びｍＲＮＡ発現の抑制、脂肪肝合成関連遺伝子ＡＣＣ（ａｃｅｔｙｌ  ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、ＦＡＳ（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＳＲＥＢＰ（ｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１のタンパク質及びｍＲＮＡ発現の抑制を特徴とする脂肪肝予防、治療又は改善用組成物を提供することによって技術的課題を解決しようとする。
【００２６】
本発明において、前記陽春砂抽出物は、小胞体ストレスによる脂肪肝の生成に対して脂肪肝予防、治療又は改善用組成物を提供することによって技術的課題を解決しようとする。
本発明は、陽春砂抽出物を有効成分として含有する脂肪肝及び肝疾患予防及び改善健康機能食品組成物を提供することによって技術的課題を解決しようとする。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の実験例によって陽春砂抽出物の脂肪肝予防、治療又は改善の効能を確認するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの肝内脂肪蓄積抑制効能に対して確認した。
【００２８】
本発明の実験例によって陽春砂抽出物で処理した後、小胞体ストレス誘導因子であるツニカマイシンで処理して確認した結果、ＨｅｐＧ２細胞及びＣ５７ＢＬ／６マウスにおいてツニカマイシンによるＴＧ含量の増加を有意に抑制した。また、小胞体ストレス関連ＧＲＰ７８及びＣＨＯＰ遺伝子の発現が抑制され、脂肪合成関連ＳＲＥＢＰ−１の発現が抑制された。
【００２９】
これを通じて、ツニカマイシン誘導小胞体ストレス及び脂肪合成による脂肪肝生成に対する陽春砂抽出物の効能が立証された。そこで、本発明者等は、陽春砂抽出物を含む脂肪肝予防、治療又は改善効能組成物を開発することによって本発明を完成した。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の実験例を通じて陽春砂抽出物の濃度による細胞内毒性を示すグラフである。
【図２】本発明の実験例を通じて陽春砂抽出物の濃度による細胞内ＴＧ生成抑制を示すグラフである。
【図３】本発明の実験例を通じて陽春砂抽出物の濃度による動物でのＴＧ生成抑制を示すグラフである。
【図４】本発明の実験例を通じて陽春砂抽出物のツニカマイシンによる小胞体ストレス関連遺伝子の発現に及ぼす影響を示すグラフである。
【図５】本発明の実験例を通じて陽春砂抽出物のツニカマイシンによる脂肪合成関連遺伝子の発現に及ぼす影響を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本明細書及び特許請求の範囲に使用された用語や単語は、通常的又は辞書的な意味に限定して解釈してはならなく、発明者は、自分の発明を最善の方法で説明するために用語の概念を適宜定義できるという原則に立脚し、本発明の技術的思想に符合する意味及び概念で解釈しなければならない。
【００３２】
したがって、本明細書に記載した実施例、参照例及び図面に示した事項は、本発明の最も好ましい一例に過ぎなく、本発明の技術的思想を全て代弁するものではないので、本出願時点において、これらに取って代わる多様な均等物及び変形例があり得ることを理解しなければならない。
実験例１．陽春砂抽出物の脂肪肝生成抑制効能評価
１）試薬
【００３３】
薬草である陽春砂はＣｏｒｅＳｃｉｅｎｃｅｓ（ソウル、韓国）で購買した。ツニカマイシンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈで購買し（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）、抗ＧＲＰ７８（ａｎｔｉ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７８）、ホモログ・タンパク質（ＣＨＯＰ）、抗ＸＢＰ−１（ａｎｔｉ−Ｘ−ｂｏｘ−ｂｉｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙで購買した（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）。細胞生存率アッセイ試薬（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｒｅａｇｅｎｔ）であるＥＺ−ｃｙｔｏｘｙはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈで購買した。
２）陽春砂を抽出する段階
【００３４】
水で陽春砂を抽出することによって抽出物を得る段階である。設計条件に応じて他の溶媒が使用されてもよく、抽出溶媒の種類に応じて抽出温度、抽出時間、溶媒の量及び残留成分処理方式などが異なる形で設計され得る。抽出溶媒としても多様な溶媒が使用可能であるが、抽出可能な溶媒としては、水、エタノール、メタノール、脂肪油、グリセリン、麻油、エチルアセテート、アセトン、ブタノール及びイソプロパノールなどがある。好ましくは、本発明では、水で陽春砂を抽出した。
３）細胞生存率試験（Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔ）
【００３５】
ヒト肝細胞癌細胞株（Ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）ＨｅｐＧ２は、肝疾患効能を評価するためにＡＴＴＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）で購買した（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）。ＨｅｐＧ２細胞は、１０％の加熱不活性化したＦＢＳ（ｈｅａｔ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）及び１％の抗生物質で補強されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）で培養した。
【００３６】
細胞生存率アッセイ試薬としてはＥＺ−ｃｙｔｏｘｙを用いた。テトラゾリウム塩（Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｓａｌｔ）を用いて生成されるホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）を吸光度を通じて測定した。陽春砂抽出物の細胞毒性を調査するために、ＨｅｐＧ２細胞に細胞生存率アッセイ試薬であるＥＺ−ｃｙｔｏｘｙを用いて陽春砂抽出物１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌの濃度別の細胞に対する毒性を確認した。
図１は、本発明の実験例を通じて陽春砂抽出物の濃度による細胞内毒性を示すグラフである。
【００３７】
その結果、１０００μｇ／ｍｌの濃度で５０％〜６０％の細胞生存率を確認し、１００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌの濃度で有意味な細胞毒性が示されなかった。これを通じて、高濃度の陽春砂抽出物に毒性があることを確認し、そこで、本発明では、１００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌの濃度を使用した。本発明では、１０００μｇ／ｍｌ以上は高い細胞毒性のために実験で排除し、試験群は、それぞれ陽春砂抽出物１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌを投与する３つのグループに分けた。
４）陽春砂抽出物の細胞内ＴＧ抑制効能評価
【００３８】
ヒト肝細胞癌細胞株（Ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）ＨｅｐＧ２は、肝細胞として細胞内ＴＧ抑制効能を評価するために選定した。ＨｅｐＧ２細胞は、１０％の加熱不活性化したＦＢＳ（ｈｅａｔ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）及び１％の抗生物質で補強されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）で培養した。
【００３９】
小胞体ストレスによって増加した中性脂肪（ＴＧ）に対する陽春砂抽出物の抑制効果を調査するために、ＨｅｐＧ２細胞を濃度別の陽春砂抽出物（１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ）で処理し、対照群を１６時間にわたって培養した。３時間後、各群をツニカマイシン（２μｇ／ｍｌ）で処理し、２４時間にわたって培養を持続した。
【００４０】
培養後、ＴＧ含量を測定するために、ＨｅｐＧ２細胞はクロロホルム−メタノール−Ｈ２Ｏ溶液（８：４：３、ｖ／ｖ／ｖ）で均質化された。この細胞は、１時間にわたって常温でインキュベートして遠心分離した（３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）。上層液は除去した後、沈殿物は２４時間乾燥した。エタノールで溶解した後、肝臓（ｈｅｐａｔｉｃ）ＴＧ（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）はＴＧキット（ＡＭ  １５７Ｓ−Ｋ  ａｎｄ  ＡＭ  ２０２−Ｋ、Ａｓａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、韓国）を用いて検査し、タンパク質の濃度に標準化された。
図２は、本発明の実験例を通じて陽春砂抽出物の濃度による細胞内ＴＧ生成抑制を示すグラフである。
【００４１】
その結果、ツニカマイシンは、対照群に比べて中性脂肪（ＴＧ）の含量が有意的に増加した。しかし、陽春砂抽出物で前処理した群では、ツニカマイシンによるＴＧの増加を濃度依存的に抑制させた。すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴＧアッセイの結果、陽春砂抽出物がＨｅｐＧ２細胞でツニカマイシンによって誘発されたＴＧレベルの増加を濃度依存的に抑制することが確認された。このような結果を通じて、陽春砂抽出物は、ＨｅｐＧ２細胞で細胞内（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）ＴＧレベルを減少させる効果を有することが分かった。
５）マウスモデルでの陽春砂抽出物の肝臓ＴＧレベルに対する効果
【００４２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの陽春砂抽出物の小胞体ストレスによる中性脂肪蓄積抑制効果をｉｎ  ｖｉｖｏモデルで確認するためにＣ５７ＢＬ／６マウスに多様な濃度の陽春砂抽出物を投与した後、ツニカマイシンを投与し、肝に蓄積された中性脂肪の量を測定した。
【００４３】
動物は、２４ｇ〜２６ｇのＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢）をＣｅｎｔｒａｌ  Ｌａｂ．Ａｎｉｍａｌ  Ｉｎｃ．（ソウル、韓国）で購入した。鼠達は、無作為に５グループ（ｎ＝６）に分けられた：非投与対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）、陽性対照群（ツニカマイシン単独処理群）、ツニカマイシンと陽春砂抽出物１００ｍｇ／ｋｇ投与群、ツニカマイシンと陽春砂抽出物２００ｍｇ／ｋｇ投与群、ツニカマイシンと陽春砂抽出物５００ｍｇ／ｋｇ投与群。３日間環境に適応させるために、動物飼育室で一般配合飼料及び水を十分に供給した。
【００４４】
陽春砂抽出物を経口で７日間投与した。７日目に、ツニカマイシン（１ｍｇ／ｋｇ体重）を２４時間にわたって腹腔内注射で投与した。動物実験は、円光大学の動物実験倫理委員会（Ｗｏｎｋｗａｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）で承認を受けており、実験室動物の使用及び管理は機関のガイドライン（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ）に従った。
【００４５】
肝脂質（Ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｉｐｉｄ）は、次の手順に従って肝から抽出された。肝臓組織（ｌｉｖｅｒ  ｔｉｓｓｕｅ）は、クロロホルム−メタノール溶液（２：１、ｖ／ｖ）で均質化され、１時間にわたって常温でインキュベートして遠心分離した（３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）。上層液は除去した後、沈殿物は２４時間乾燥した。エタノールで溶解した後、肝臓ＴＧ（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）は、ＴＧキット（ＡＭ  １５７Ｓ−Ｋ  ａｎｄ  ＡＭ  ２０２−Ｋ、Ａｓａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、Ｋｏｒｅａ）を用いて検査し、タンパク質濃度に標準化された。
図３は、本発明の実験例を通じて陽春砂抽出物の濃度による動物でのＴＧ生成抑制を示すグラフである。
【００４６】
その結果、ツニカマイシン群では、肝のＴＧ含量が対照群に比べて２倍以上増加したが、陽春砂抽出物で処理した群は、ツニカマイシンによる肝での脂肪蓄積を濃度依存的に抑制した。すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験ではＣ５７ＢＬ／６マウスに陽春砂抽出物で前処理し、２４時間にわたってツニカマイシンを注射した後、  肝臓ＴＧレベルを測定して確認したが、肝臓ＴＧレベルは、ツニカマイシン注射後に著しく増加した。しかし、陽春砂抽出物は、このようなＴＧレベルの増加を濃度依存的に減少させた。このような結果を通じて、陽春砂抽出物の中性脂肪蓄積抑制効果をｉｎ  ｖｉｖｏモデルでも確認することができた。
６）陽春砂抽出物のツニカマイシンによる小胞体ストレス関連遺伝子発現に及ぼす影響
【００４７】
本発明では、陽春砂抽出物による脂肪肝改善が小胞体ストレスの減少と関連するかどうかを確認するために、小胞体ストレスマーカーである関連した遺伝子であるＧＲＰ７８及びＣＨＯＰのタンパク質及びｍＲＮＡ量を測定した。
【００４８】
陽春砂抽出物の小胞体ストレスに対する抑制効果を調査するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに多様な濃度の陽春砂抽出物を７日間投与した。その後、薬剤学的（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）小胞体ストレス誘導要因としてツニカマイシンを投与し、肝で小胞体ストレスと関連した遺伝子であるＧＲＰ７８及びＣＨＯＰのタンパク質及びｍＲＮＡ量を測定した。
【００４９】
ｃＤＮＡテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）、プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターＭＩＸを含む反応混合物及び７５００ファーストＲＴ−ＰＣＲシステムを用いてリアルタイムＰＣＲを測定し、トータル（Ｔｏｔａｌ）ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実験用鼠から分離した。
【００５０】
また、タンパク質（４０μｇ  ｐｅｒ  ｗｅｌｌ）は、８％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって分離され、ＰＶＤＦ（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）メンブレン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移した。ブロックしたメンブレン（ｂｌｏｃｋｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）は、小胞体ストレスのマーカーである７８−ｋＤａ  ＧＲＰ７８；ＢｉＰ（ｇｌｕｃｏｓｅ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）及びＣＨＯＰ（Ｃ／ＥＢＰ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に対する一次抗体と培養した。タンパク質は、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）ウェスタンブロット検出キット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて検査した。
図４は、本発明の実験例を通じて陽春砂抽出物のツニカマイシンによる小胞体ストレス関連遺伝子発現に及ぼす影響を示すグラフである。
【００５１】
その結果、ツニカマイシン対照群に比べて、陽春砂抽出物の投与後、ツニカマイシンを投与した群間でＧＲＰ７８及びＣＨＯＰのタンパク質及びｍＲＮＡの発現が有意に減少した。これにより、陽春砂抽出物が肝細胞で薬剤学的小胞体ストレス誘導因子に対して抑制効能を有することを確認することができた。
７）ツニカマイシンによる脂肪合成関連遺伝子発現に陽春砂抽出物が及ぼす影響
陽春砂抽出物の肝保護効果の機転を明らかにするために、陽春砂抽出物の脂質生成（ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）に対する効果を調査した。
【００５２】
すなわち、陽春砂抽出物の小胞体ストレス誘発中性脂肪の抑制効果機転を確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに濃度別の陽春砂抽出物を７日間投与した。その後、小胞体ストレス誘導因子であるツニカマイシンを投与し、肝で脂肪合成と関連した遺伝子として知られているＡＣＣ（ａｃｅｔｙｌ  ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）、ＦＡＳ（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）、ＳＲＥＢＰ（ｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１の発現量を測定した。
図５は、本発明の実験例を通じて陽春砂抽出物のツニカマイシンによる脂肪合成関連遺伝子の発現に及ぼす影響を示すグラフである。
【００５３】
その結果、ツニカマイシン投与対照群に比べて、陽春砂抽出物投与群では、肝で脂肪合成を誘導する遺伝子として知られているＡＣＣ及びＦＡＳ  ｍＲＮＡが有意に減少した。また、ＡＣＣ及びＦＡＳの発現に影響を与える転写因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）として知られているＳＲＥＢＰ−１の発現がツニカマイシン投与対照群に比べて有意に減少した。
【００５４】
先行研究では、小胞体ストレスが主な脂肪形成転写因子であるＳＲＥＢＰ−１を活性化させ、ＡＣＣ及びＦＡＳなどの脂質合成遺伝子（ｌｉｐｏｇｅｎｉｃ  ｇｅｎｅ）の発現を増加するものと知られている。これを通じて、陽春砂抽出物が小胞体ストレスで促進されたＳＲＥＢＰ−１の発現を抑制し、ＦＡＳ及びＡＣＣなどの脂質生成を抑制することによって脂肪肝を改善させることを確認することができる。
８）統計処理
【００５５】
データは、平均（Ｓ．Ｅ．Ｍ．）の平均±標準誤差（Ｍｅａｎ±ｓｔａｎｄａｒｄ  ｅｒｒｏｒ）として表現した。統計的に重要な相違点は一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）によって測定した後、ダンカンの多重範囲検定（Ｄｕｎｃａｎ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｒａｎｇｅ  ｔｅｓｔ）を行った。統計分析において、０．０５より小さいかそれと同じｐ値は有意なものと見なす。
９）考察
陽春砂抽出物の脂肪肝予防、治療又は改善の効能を確認するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの中性脂肪蓄積抑制効能に対して確認した。
【００５６】
まず、ＨｅｐＧ２細胞において、陽春砂抽出物は５００μｇ／ｍｌの濃度まで毒性が示されなかった。そこで、それぞれの濃度の陽春砂抽出物で処理した後、小胞体ストレス誘導因子であるツニカマイシンで処理して確認した結果、ＨｅｐＧ２細胞及びＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、陽春砂抽出物はツニカマイシンによるＴＧ含量の増加を有意に抑制した。
【００５７】
また、小胞体ストレス関連ＧＲＰ７８及びＣＨＯＰ遺伝子の発現が抑制され、脂肪合成関連ＳＲＥＢＰ−１の発現が抑制された。これを通じて、ツニカマイシン誘導小胞体ストレス及び脂肪合成による脂肪肝生成に対する陽春砂抽出物の効能が立証された。そこで、本発明では、陽春砂抽出物の脂肪肝予防、治療又は改善効能組成物を開発した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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