(57)【要約】ある特定の実施形態では、本発明は、有効量の抗インテグリンアルファ９（Ｉｔｇａ−９）治療剤を哺乳動物に投与することを含み、場合によりＶＥＧＦＲ−３を投与することによる、それらを必要とする哺乳動物において炎症性のまたは移植された組織または器官のリンパ管中の弁形成（ＶＧ）を抑制する方法を提供する。【選択図】なし
2020503255.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の抗インテグリンアルファ９（Ｉｔｇａ−９）治療剤を哺乳動物に投与することを含む、それらを必要とする前記哺乳動物において移植された組織または器官におけるリンパ管中の弁形成（ＶＧ）を抑制する方法。
【請求項２】
前記リンパ管が眼組織内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記眼組織が角膜組織である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記移植された組織が角膜移植片である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記組織が皮膚組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗Ｉｔｇａ−９治療剤がＩｔｇａ−９に対して特異的な結合剤である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記結合剤が抗体もしくは抗体断片、または抗Ｉｔｇａ−２ＲＮＡｉ分子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記治療剤が結膜下注射によって投与される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ＶＧが対照脈管と比較して少なくとも１０％抑制される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
リンパ弁の数が未治療の対照と比較して少なくとも１０％減少する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
リンパ管の数が未治療の対照と匹敵する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
抗Ｉｔｇａ−９抗体を含む有効量の治療剤を哺乳動物に投与することを含む、それらを必要とする前記哺乳動物において角膜の弁形成（ＶＧ）を予防または治療する方法。
【請求項１３】
前記角膜のＶＧが、移植、炎症、感染、ドライアイ、外傷または化学的損傷によって誘導される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療剤が医薬組成物内に存在する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記投与が局部投与または全身投与による、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記投与が結膜下、眼内、眼周囲、眼球後、筋肉内、局所、静脈内または皮下の投与による、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＶＥＧＦＲ−３を投与することをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
リンパ管においてインテグリンアルファ９（Ｉｔｇａ−９）を阻害する方法であって、前記リンパ管を抗Ｉｔｇａ−９治療剤と接触させることを含む、前記方法。
【請求項２０】
前記リンパ管をＶＥＧＦＲ−３と接触させることをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
組織または器官における病的なリンパ形成の治療的処置で使用するための、抗Ｉｔｇａ−９結合剤を含有する治療剤を含む組成物。
【請求項２２】
ＶＥＧＦＲ−３をさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
哺乳動物においてＶＧを阻害するのに有用な医薬を調製するための、抗Ｉｔｇａ−９結合剤の使用。
【請求項２４】
医学療法で使用するための、抗Ｉｔｇａ−９結合剤を含有する治療剤を含む組成物。
【請求項２５】
ＶＥＧＦＲ−３をさらに含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
有効量の治療剤を哺乳動物に投与すること含む、それらを必要とする前記哺乳動物において移植拒絶反応を阻害する方法であって、前記治療剤が抗Ｉｔｇａ−９治療剤である、前記方法。
【請求項２７】
ＶＥＧＦＲ−３を投与することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１０月２７日に出願された米国特許仮出願第６２／４１３，８６３号に対して優先権を主張するものである。上記で参照した出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられたＥＹ０１７３９２及び国防総省により与えられたＷ８１ＸＷＨ−１４−１−０４９６の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
リンパ網はほとんどの組織に入り込み、その機能障害は、幅広い障害、例えば、がん転移、炎症、移植拒絶反応、高血圧、肥満、及びリンパ浮腫と関係がある。歴史的な理由及び技術的制限が原因で、何世紀にもわたって無視された後、リンパの研究は、近年著しい注目を集め、大きな進展を遂げている。しかし、現在、リンパ系疾患に対する治療はほとんど存在しない。したがって、リンパ系疾患のための、及び移植拒絶反応を予防するための新規な治療が必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
ある特定の実施形態では、本発明は、有効量の抗インテグリンアルファ９（Ｉｔｇａ−９）治療剤を哺乳動物に投与することを含む、それらを必要とする哺乳動物において移植された組織または器官におけるリンパ管中の弁形成（ＶＧ）を抑制する方法を提供する。
【０００５】
ある特定の実施形態では、本発明は、リンパ管を抗Ｉｔｇａ−９治療剤と接触させることを含む、リンパ管においてインテグリンアルファ９（Ｉｔｇａ−９）を阻害する方法を提供する。
【０００６】
ある特定の実施形態では、本発明は、抗Ｉｔｇａ−９抗体を含む有効量の治療剤を哺乳動物に投与することを含む、それらを必要とする哺乳動物において角膜の弁形成（ＶＧ）を予防または治療する方法を提供する。
【０００７】
ある特定の実施形態では、本発明は、組織または器官における病的なリンパ形成の治療的処置で使用するための、抗Ｉｔｇａ−９結合剤を含有する治療剤を含む組成物を提供する。
【０００８】
ある特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物においてＬＧを阻害するのに有用な医薬を調製するための、抗Ｉｔｇａ−９結合剤の使用を提供する。
【０００９】
ある特定の実施形態では、本発明は、医学療法で使用するための、治療剤及び抗Ｉｔｇａ−９結合剤を含む組成物を提供する。
【００１０】
ある特定の実施形態では、本発明は、有効量の治療剤を哺乳動物に投与すること含む、それらを必要とする哺乳動物において移植拒絶反応を阻害する方法であって、治療剤が抗Ｉｔｇａ−９治療剤である方法を提供する。
【００１１】
本明細書で使用する場合「治療すること」は、ＶＧの少なくとも１つの症状を改善すること、ＶＧを治癒させること、及び／またはＶＧの発生を予防することを指す。
【００１２】
ある特定の実施形態では、方法はＶＥＧＦＲ−３を投与することをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ｉｔｇａ−９遮断によってリンパの弁形成が角膜移植後に抑制されることを示す図である。（図１Ａ）アイソタイプ対照処置角膜と比べて、Ｉｔｇａ−９遮断抗体処置角膜において有意に少ない弁を示す、代表的なホールマウント免疫染色画像。赤色：Ｉｔｇａ−９、緑色：ＬＹＶＥ−１。スケールバー、１００μｍ。（図１Ｂ）対照及び処置条件におけるリンパ弁及びリンパ管浸潤領域に関する比較定量化。抗Ｉｔｇａ−９処置は、弁形成のみを低減させた。実験は、対照に７匹のマウス及び処置群に８匹のマウスを用いて２回反復した。＊Ｐ＜０．０５、ｎ．ｓ．：有意でない。（図１Ｃ）抗Ｉｔｇａ−９処置に応じた、弁対リンパ浸潤領域の有意に低い比を示す比較定量化。実験は、対照に７匹のマウス及び処置群に８匹のマウスを用いて２回反復した。＊Ｐ＜０．０５。
【図２】角膜移植の後のリンパ管の極性分布に対してＩｔｇａ−９遮断が効果がなかったことを示す図である。（図２Ａ）定量化に使用される、鼻及び側頭の４分円領域の概略図。時計回りの８本の短い線は、移植片の境界にそって設置された縫合糸を示す。外部の黒い円：縁。内部の点線の円：移植片の境界。垂直線：鼻側と側頭側の間の分離。灰色の陰影領域：評価した鼻及び側頭の領域。（図２Ｂ）対照と処置条件の両方において、側頭側よりも有意に大きい鼻のリンパ浸潤領域を示す、比較定量化。実験は、対照に７匹のマウス及び処置群に８匹のマウスを用いて２回反復した。＊Ｐ＜０．０５。
【図３】Ｉｔｇａ−９遮断が角膜移植片の生存を促進したことを示す図である。（図３Ａ）それぞれ対照及び処置条件における、拒絶された及び生存した移植片の細隙灯検査の代表的な画像。（図３Ｂ）処置群において有意に高い生存率を示すカプラン・マイヤー生存曲線。＊Ｐ＜０．０５。
【図４】Ｉｔｇａ−９遮断が角膜のＬＧのこの極性に対して効果がないことを示す図である。
【図５】Ｉｔｇａ−９が血管壁よりも弁で高発現していることを示す図である。
【図６】ｌｔｇａ−９とＶＥＧＦＲ−３の複合遮断が、危険性の高い角膜移植の後にリンパ弁及び脈管形成を阻害すること（図６、緑色で示される脈管及び弁）ならびに移植片の生存を促進すること（図６Ｂ、カプラン・マイヤー生存曲線）を示す図である。
【図７】Ｉｔｇａ−９遮断が角膜の弁形成をインビボで阻害することを示す図である。（図７Ａ）対照アイソタイプ処理試料と比較して、Ｉｔｇａ−９遮断抗体処置角膜における有意に少ない弁を示す、代表的な免疫蛍光顕微鏡画像。赤色：Ｉｔｇａ−９、緑色：ＬＹＶＥ−１。スケールバー、５０ｌｍ。（図７Ｂ）弁形成を定量化する要約データ。＊Ｐ＜０．０５。
【図８】ヒト皮膚ＬＥＣにおけるＩｔｇａ−９の発現及び欠乏を示す図である。（図８Ａ）ヒトＬＥＣにおけるＩｔｇａ−９発現を示す代表的な免疫細胞蛍光顕微鏡画像。赤色：Ｉｔｇａ−９、青色：ＤＡＰＩ。スケールバー、５０ｌｍ。（図８Ｂ）スクランブルｓｉＲＮＡと比較した、Ｉｔｇａ−９ｓｉＲＮＡによるＩｔｇａ−９遺伝子のノックダウンを示すリアルタイムＰＣＲ解析。＊Ｐ＜０．０５。
【図９】Ｉｔｇａ−９のノックダウンがＬＥＣの生存率に影響を与えないことを示す図である。（図９Ａ）トランスフェクション後４８時間で、対照とＩｔｇａ−９ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞の間に細胞生存率に有意差がないことを示す、Ｇｕａｖａ  ＶｉａＣｏｕｎｔアッセイを用いるフローサイトメトリー解析。反復実験からの要約データを図９Ｂに示す。ｎ．ｓ．、有意でない。
【図１０】Ｉｔｇａ−９のノックダウンが増殖及び接着のＬＥＣ機能を阻害することを示す図である。（図１０Ａ）ＭＴＳ増殖アッセイを使用した場合の、Ｉｔｇａ−９ｓｉＲＮＡによるトランスフェクション後のＬＥＣの増殖の有意な抑制を示す要約データ。＊Ｐ＜０．０５。（図１０Ｂ）Ｉｔｇａ−９ｓｉＲＮＡによるトランスフェクション後のフィブロネクチンへのＬＥＣの接着の有意な低減を示す要約データ。＊Ｐ＜０．０５。
【図１１】Ｉｔｇａ−９のノックダウンがＬＥＣの遊走を阻害することを示す図である。（図１１Ａ）かき傷アッセイを使用した場合の、７２時間の期間にわたってＬＥＣの遊走の有意な低減を示す要約データ。＊Ｐ＜０．０５。（図１１Ｂ）７２時間目の細胞遊走の代表的な画像。スケールバー、１００ｌｍ。赤色：ＴＲＩＴＣコンジュゲート化ファロイジン。
【図１２】Ｉｔｇａ−９のノックダウンがＬＥＣの管形成を阻害することを示す図である。（図１２Ａ）Ｍａｔｒｉｇｅｌ上での管形成の有意な低減を示す代表的な顕微鏡画像。スケールバー、５００ｌｍ。（図１２Ｂ）管の全長に関する要約データ。＊Ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
過去何世紀にもわたって研究されてきた血管とは異なって、リンパの研究は新しい発見の分野を意味し、近年、指数関数的な成長を経験している（Ａｌｉｔａｌｏ，Ｋ．Ｔｈｅ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１１；１７：１３７１−１３８０、Ｔａｍｍｅｌａ  Ｔ，Ａｌｉｔａｌｏ  Ｋ：Ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｒｏｍｉｓｅ．Ｃｅｌｌ  ２０１０；１４０：４６０−４７６、Ｃｈｅｎ  Ｌ：Ｏｃｕｌａｒ  Ｌｙｍｐｈａｔｉｃｓ：Ｓｔａｔｅ−ｏｆ−ｔｈｅ−Ａｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗ．Ｌｙｍｐｈｏｌｏｇｙ  ２００９；４２：６６−７６、Ａｌｉｔａｌｏ  Ｋ，Ｔａｍｍｅｌａ  Ｔ，Ｐｅｔｒｏｖａ  ＴＶ：Ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ；Ｎａｔｕｒｅ  ２００５；４３８：９４６−９５３、Ｂｒｏｗｎ  Ｐ：Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ：ｕｎｌｏｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｒａｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００５；４３６：４５６−４５８、Ｆｏｌｋｍａｎ  Ｊ，Ｋａｉｐａｉｎｅｎ  Ａ：Ｇｅｎｅｓ  ｔｅｌｌ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃｓ  ｔｏ  ｓｐｒｏｕｔ  ｏｒ  ｎｏｔ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４；５：１１−１２、Ｒｏｃｋｓｏｎ  ＳＧ：Ｔｈｅ  ｂｒｏａｄ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｌｙｍｐｈａｔ  Ｒｅｓ  Ｂｉｏｌ；８：１０１）。リンパ網は、体内のほとんどの組織に入り込み、免疫監視、体液調節ならびに脂肪及びビタミンの吸収などの幅広い機能において、重要な役割を果たす。したがって、多数の疾患及び状態は、リンパ機能障害と関係があり、これらには、限定されないが、がん転移、組織及び主要な器官（心臓、腎臓及び肺）の移植拒絶反応、炎症性疾患及び免疫疾患、感染、喘息、肥満、糖尿病、ＡＩＤＳ、高血圧ならびにリンパ浮腫が含まれる。これらの障害は、身体に障害を起こす、外見を損なう、さらには生命を危うくする可能性がある。現在までに、リンパ系障害に対する有効な治療はほとんどないので、これは、新しい治療プロトコールに対する差し迫った需要がある分野である。
【００１５】
角膜は、その接近可能な位置、透明性及びリンパを含まないが誘導性である特色のため、リンパの研究にとって理想的な部位を提供する（Ｃｈｅｎ  Ｌ：Ｏｃｕｌａｒ  Ｌｙｍｐｈａｔｉｃｓ：Ｓｔａｔｅ−ｏｆ−ｔｈｅ−Ａｒｔ  Ｒｅｖｉｅｗ．Ｌｙｍｐｈｏｌｏｇｙ  ２００９；４２：６６−７６、Ｒｏｇｅｒｓ  ＭＳ，Ｂｉｒｓｎｅｒ  ＡＥ，Ｄ’Ａｍａｔｏ  ＲＪ：Ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｃｏｒｎｅａ  ｍｉｃｒｏｐｏｃｋｅｔ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｓｓａｙ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ２００７；２：２５４５−２５５０、Ｃｕｒｓｉｅｆｅｎ  Ｃ，Ｃｈｅｎ  Ｌ，Ｄａｎａ  ＭＲ，Ｓｔｒｅｉｌｅｉｎ  ＪＷ：Ｃｏｒｎｅａｌ  ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｃｏｒｎｅａ  ２００３；２２：２７３−２８１、Ｃｈｅｎ  Ｌ，Ｈａｎｎ  Ｂ，Ｗｕ  Ｌ：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ａｎｄ  ｂｌｏｏｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，ｉｎ“Ｆｒｏｍ  ｌｏｃａｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｔｏ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ”．Ｓｔａｎｌｅｙ  Ｐ．Ｌ．Ｌｅｏｎｇ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ．２０１１）。リンパの研究に角膜を使用することの成功は、腫瘍血管新生研究の祖父であるＪｕｄａｈ  Ｆｏｌｋｍａｎが推定したように、過去数世紀の間に、血管に関する基礎知識の３分の１より多くが角膜を用いた研究から得られたという事実から予測することができる。
【００１６】
通常の条件下ではリンパ管によってもたらされないが、リンパ形成（リンパ脈管新生、ＬＧ）は、炎症性損傷、感染性損傷、外傷性損傷、免疫原性損傷または化学的損傷の後に、多くの角膜疾患をともなう。一旦誘導されると、これは、免疫細胞の大量送達を増強し、移植拒絶反応も媒介する。集合的データによって、リンパ経路が角膜移植拒絶反応の主要な媒介物であることが示された（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  Ｔ，Ｂｏｃｋ  Ｆ，Ｙｕｅｎ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．：Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖｅｓｓｅｌｓ，ｎｏｔ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌｓ，ｐｒｉｍａｒｉｌｙ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１０；１８４：５３５−５３９、Ｚｈａｎｇ  Ｈ，Ｇｒｉｍａｌｄｏ  Ｓ，Ｙｕｅｎ  Ｄ，Ｃｈｅｎ  Ｌ：Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ＶＥＧＦＲ−３  ａｎｄ  ＶＬＡ−１  ｍａｒｋｅｄｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２０１１）。さらに、ＬＧは、（腎臓、心臓、肺、骨の移植体などの）体の他の部分における移植拒絶反応と関係があった（Ｋｅｒｊａｓｃｈｋｉ  Ｄ：Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｎｅｏａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｒｅｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ：ａ  ｄｒｉｖｉｎｇ  ｆｏｒｃｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ？Ｊ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２００６；１９：４０３−４０６、Ｋｅｒｊａｓｃｈｋｉ  Ｄ，Ｈｕｔｔａｒｙ  Ｎ，Ｒａａｂ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．：Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００６；１２：２３０−２３４、Ｊｅｌｌ  Ｇ，Ｋｅｒｊａｓｃｈｋｉ  Ｄ，Ｒｅｖｅｌｌ  Ｐ，Ａｌ−Ｓａｆｆａｒ  Ｎ：Ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ−ｉｍｐｌａｎｔ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ  ｉｍｐｌａｎｔｓ：ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ  ２００６；７７：１１９−１２７、Ｇｅｉｓｓｌｅｒ  ＨＪ，Ｄａｓｈｋｅｖｉｃｈ  Ａ，Ｆｉｓｃｈｅｒ  ＵＭ，  ｅｔ  ａｌ．：Ｆｉｒｓｔ  ｙｅａｒ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ  ２００６；２９：７６７−７７１）。
【００１７】
角膜移植は、すべての固形の器官及び組織の移植の中で最も一般的な形態である。これは非炎症性及び無リンパの宿主レッド（ｈｏｓｔ  ｒｅｄｓ）において高い生存率を享受するが、炎症性及びリンパが豊富な角膜に対して移植術が行われる場合、拒絶率は５０〜９０％ほどの高さになる可能性がある。現在までに、この高拒絶状況の有効な管理はまだほとんどない。残念ながら、（外傷性損傷、炎症性損傷、感染性損傷、または化学的損傷の後に）、角膜疾患の結果として目が見えない多くの患者は、この高拒絶カテゴリーに入る。予後不良が原因で、これらの患者は、移植手術の良い候補としてさえみなされず、視力回復に対する彼らの希望を断念しなければならない。したがって、本発明者らは、ＬＧ及び移植片拒絶を含めたその関連障害を治療するための新しい治療標的を特定することに関心がある。角膜は、ＬＧ研究のための理想的な部位を提供する。通常の条件におけるその接近可能な位置、透明性及び無リンパの特色のため、この組織は、先在する、またはバックグラウンドの脈管と区別する必要なしで誘導性リンパ増殖を研究するための好都合なモデルを提供する（Ｃｈｅｎ  Ｌ．Ｏｃｕｌａｒ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃｓ：ｓｔａｔｅ−ｏｆ−ｔｈｅ−ａｒｔ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｌｙｍｐｈｏｌｏｇｙ  ２００９；４２：６６−７６）。角膜のＬＧは、いくつかの病的な傷害、例えば、炎症、感染、外傷及び化学熱傷によって誘導され得、これは、移植拒絶反応の主要な媒介物である（Ｃｈｅｎ  Ｌ．Ｏｃｕｌａｒ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃｓ：ｓｔａｔｅ−ｏｆ−ｔｈｅ−ａｒｔ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｌｙｍｐｈｏｌｏｇｙ  ２００９；４２：６６−７６、Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  Ｔ，Ｂｏｃｋ  Ｆ，Ｙｕｅｎ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖｅｓｓｅｌｓ，ｎｏｔ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌｓ，ｐｒｉｍａｒｉｌｙ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１０；１８４：５３５−５３９、Ｙｕｅｎ  Ｄ，Ｐｙｔｏｗｓｋｉ  Ｂ，Ｃｈｅｎ  Ｌ．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ＶＥＧＦＲ−２  ａｎｄ  ＶＥＧＦＲ−３  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ａｎｄ  ｍｉｄｄｌｅ  ｓｔａｇｅｓ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２０１１；５２：２５９３−２５９７）。
【００１８】
本発明は、移植片の生存を促進するために角膜の弁形成（ＶＧ）を予防または治療することなどのいくつかの潜在用途を有する。
【００１９】
ある特定の実施形態では、本発明は、有効量の抗インテグリンアルファ９（Ｉｔｇａ−９）治療剤を哺乳動物に投与することを含む、それらを必要とする哺乳動物において移植された組織または器官におけるリンパ管中の弁形成（ＶＧ）を抑制する方法を提供する。
【００２０】
ある特定の実施形態では、リンパ管は眼組織内にある。
【００２１】
ある特定の実施形態では、眼組織は角膜組織である。
【００２２】
ある特定の実施形態では、移植された組織は角膜移植片である。
【００２３】
ある特定の実施形態では、抗Ｉｔｇａ−９治療剤はＩｔｇａ−９に対して特異的な結合剤である。
【００２４】
ある特定の実施形態では、結合剤は抗体または抗体断片である。
【００２５】
ある特定の実施形態では、結合剤は、Ｉｔｇａ−９の生成または活性を阻害するＲＮＡｉ分子である。
【００２６】
ある特定の実施形態では、治療剤は、結膜下注射によって投与される。
【００２７】
ある特定の実施形態では、ＶＧは、対照脈管と比較して少なくとも１０％抑制される。
【００２８】
ある特定の実施形態では、リンパ弁の数は未治療の対照と比較して少なくとも１０％減少する。
【００２９】
ある特定の実施形態では、リンパ管の数は未治療の対照と匹敵する。
【００３０】
ある特定の実施形態では、本発明は、リンパ管を抗Ｉｔｇａ−９治療剤と接触させることを含む、リンパ管においてインテグリンアルファ９（Ｉｔｇａ−９）を阻害する方法を提供する。
【００３１】
ある特定の実施形態では、本発明は、抗Ｉｔｇａ−９抗体を含む有効量の治療剤を哺乳動物に投与することを含む、それらを必要とする哺乳動物において角膜の弁形成（ＶＧ）を予防または治療する方法を提供する。
【００３２】
ある特定の実施形態では、角膜のＶＧは、移植、炎症、感染、ドライアイ、外傷または化学的損傷によって誘導される。
【００３３】
ある特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００３４】
ある特定の実施形態では、治療剤は医薬組成物内に存在する。
【００３５】
ある特定の実施形態では、投与は局部投与または全身投与による。
【００３６】
ある特定の実施形態では、投与は、結膜下、眼内、眼周囲、眼球後、筋肉内、局所、静脈内、腹腔内または皮下の投与による。
【００３７】
ある特定の実施形態では、方法は、さらに、別の相乗的因子、例えば、ＶＥＧＦＲ−３を投与することを含む。
【００３８】
ある特定の実施形態では、本発明は、組織または器官における病的なリンパ形成の治療的処置で使用するための、抗Ｉｔｇａ−９結合剤を含有する治療剤を含む組成物を提供する。
【００３９】
ある特定の実施形態では、組成物は、さらに、別の相乗的因子、例えば、ＶＥＧＦＲ−３を含む。
【００４０】
ある特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物においてＬＧを阻害するのに有用な医薬を調製するための、抗Ｉｔｇａ−９結合剤の使用を提供する。
【００４１】
ある特定の実施形態では、本発明は、哺乳動物においてＬＧを阻害するのに有用な医薬を調製するために、抗Ｉｔｇａ−９結合剤及び別の相乗的因子、例えば、ＶＥＧＦＲ−３の使用を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、医学療法で使用するための、治療剤抗Ｉｔｇａ−９結合剤を含む組成物を提供する。
【００４２】
ある特定の実施形態では、組成物は、さらに、別の相乗的因子、例えば、ＶＥＧＦＲ−３を含む。
【００４３】
ある特定の実施形態では、本発明は、有効量の治療剤を哺乳動物に投与すること含む、それらを必要とする哺乳動物において移植拒絶反応を阻害する方法であって、治療剤が抗Ｉｔｇａ−９治療剤である方法を提供する。
【００４４】
ある特定の実施形態では、方法は、さらに、別の相乗的因子、例えば、ＶＥＧＦＲ−３を投与することを含む。
【００４５】
本発明者らは、インテグリンアルファ９の遮断が、リンパ弁形成を抑制し、移植片の生存を促進することを発見した。本データは、角膜などの組織において病的なリンパ弁形成を抑制するために、Ｉｔｇａ−９遮断剤を使用することができることを示す。Ｉｔｇａ−９遮断剤は、眼疾患を治療するために局部的または全身的に投与することができる（結膜下、眼内、眼周囲、眼球後、筋肉内、局所、静脈内、皮下など）。本発明は、体内の他のリンパ系障害、例えば、がん転移ならびに炎症性疾患及び免疫疾患を治療するのに使用することもできる。Ｉｔｇａ−９遮断ストラテジーは、リンパ弁形成を阻害するのに、及び移植拒絶反応などのリンパ系障害を治療するのに使用することができる可能性がある。ある特定の実施形態では、弁形成（ＶＧ）は少なくとも１０％抑制される。ある特定の実施形態では、ＶＧは、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％抑制される。ある特定の実施形態では、ＶＧは、治療効果を引き起こすのに十分であるレベルで抑制される。本明細書で使用する場合、用語「治療効果」は、病的及び行動的欠陥を含めた、関連する病態の異常性の変化；病態の進行までの時間の変化；疾患の症状の低減、軽減もしくは変化；またはその状態に苦しむ人の生活の質の向上を指す。治療効果は、医師によって定量的に測定することができ、または遮断薬剤が標的にするＶＧに苦しむ患者によって定性的に測定することができる。
【００４６】
一実施形態では、本発明は、適切な組織または細胞への局部投与によって、例えば、適切な細胞へのＩｔｇａ−９遮断剤の投与によって、対象または生物を本発明のＩｔｇａ−９遮断剤分子と接触させることを含む、対象または生物においてＶＧを治療または予防するための方法を特色とする。
【００４７】
Ｉｔｇａ−９遮断剤の送達方法としては、限定されないが、静脈内投与及び患者の眼の中への直接投与が挙げられる。
【００４８】
結合剤
本発明は、Ｉｔｇａ−９に特異的に結合する精製された結合剤（またはリガンド）、すなわち、「抗Ｉｔｇａ−９治療剤」を提供する。抗Ｉｔｇａ−９治療剤は、抗体でもよいし、小分子薬剤でもよい。抗Ｉｔｇａ−９治療剤である薬剤の例としては、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、ペプチド、小分子、低分子干渉ＲＮＡなどが挙げられる。
【００４９】
抗体
本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、ｓｃＦｖ、ヒト化、完全ヒト化またはキメラ化抗体、単鎖抗体、ダイアボディ、及びＦｃ領域を含まない抗体の抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ断片）を含む。ある特定の実施形態では、抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。「ヒト化」抗体は、３つのＣＤＲ（相補性決定領域）のみを含み、ヒト抗体配列の対応するフレームワーク及び定常領域に組換えで連結された、各ドナー抗体可変領域由来の少数の慎重に選択された「フレームワーク」残基（可変領域の非ＣＤＲ部分）を含むこともある。「完全ヒト化抗体」は、ヒト由来の抗体遺伝子のみを有するように遺伝子操作されているマウス由来のハイブリドーマ中で、またはヒト由来の抗体遺伝子のファージディスプレイライブラリーからの選択によって、作出される。
【００５０】
本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖもしくは「ナノボディ」）、ヒト化、完全ヒト化またはキメラ化抗体、単鎖抗体、ダイアボディ、及び抗体の抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ断片）を含む。ｓｃＦｖは、リンカーペプチドによって連結している、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常短く、約１０〜２５アミノ酸の長さである。可動性が重要な場合、リンカーはかなりの数のグリシンを含む。溶解度が重要な場合は、セリンまたはスレオニンがリンカー中で利用される。リンカーは、ＶＨのアミノ末端をＶＬのカルボキシ末端に連結することができ、またはリンカーは、ＶＨのカルボキシ末端をＶＬのアミノ末端に連結することができる。二価の（Ｄｉｖａｌｅｎｔ）（二価の（ｂｉｖａｌｅｎｔ）とも呼ばれる）ｓｃＦｖは、２つのｓｃＦｖを連結することによって生成することができる。例えば、二価のｓｃＦｖは、２つのＶＨ領域及び２つのＶＬ領域を含む単一ペプチドを生成することによって、作製することができる。あるいは、それぞれ単一の領域ＶＨ及び単一のＶＬ領域を含む２つのペプチドを二量体化することができる（「ダイアボディ」とも呼ばれる）。Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ：ｓｍａｌｌ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，”ＰＮＡＳ，Ｊｕｌｙ  １９９３，９０：６４４４−６４４８。二価性によって、抗体が、高結合活性で多量体抗原に結合することが可能になり、二重特異性によって、２つの抗原の架橋結合が可能になる。
【００５１】
本明細書で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の群、すなわち、小量で存在する天然に存在する突然変異体を除いて、その群を構成する抗体が均一である抗体群から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位と相互作用する。さらに、各モノクローナル抗体は、多様な抗原決定基に対する様々な抗体を典型的には含む一般的なポリクローナル抗体調製物と比較して、抗原上の単一の抗原決定基（エピトープ）を標的にする。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンが混入していないハイブリドーマ培養から生成されるという点で有利である。
【００５２】
形容詞「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体群から得られる抗体の特徴を示し、特定の方法によって生成される抗体を明示しない。例えば、本発明で使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ方法（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５，１９７５）または組換え方法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって生成することができる。本発明で使用されるモノクローナル抗体は、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８，１９９１、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７，１９９１）。本発明のモノクローナル抗体は、特に「キメラ化」抗体（免疫グロブリン）を含み、これは、重（Ｈ）鎖及び／または軽（Ｌ）鎖部分が特定の種または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに由来し、鎖の残りの部分が別の種または別の抗体クラスもしくはサブクラスに由来する。さらに、突然変異体抗体及びその抗体断片も本発明に含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５，１９８４）。
【００５３】
本明細書で使用する場合、用語「突然変異体抗体」は、１つまたは複数のアミノ酸残基が変わっている変異体アミノ酸配列を含む抗体を指す。例えば、抗体の可変領域は、抗原結合などのその生物学的特性を向上させるように改変することができる。そのような改変は、部位特異的変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８（１９８５）を参照されたい）、ＰＣＲベースの変異誘発、カセット変異誘発などによって達成することができる。そのような突然変異体は、抗体の重鎖または軽鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも７０％同一の、より好ましくは少なくとも７５％、より一層好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。本明細書で使用する場合、用語「配列同一性」は、配列を整列させ、必要に応じて配列同一性を最大にするためにギャップを適切に導入した後に、決定される、抗体の元のアミノ酸配列のものと同一の残基のパーセンテージと定義される。
【００５４】
特に、あるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の別のものに対する同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７，１９９３）によるアルゴリズムＢＬＡＳＴを使用して決定することができる。ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸなどのプログラムはこのアルゴリズムに基づいて開発された（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づくＢＬＡＳＴＮによってヌクレオチド配列を解析するために、例えば、スコア＝１００及びワード長＝１２のようにパラメーターをセットする。一方で、ＢＬＡＳＴに基づくＢＬＡＳＴＸによるアミノ酸配列の解析に使用されるパラメーターとしては、例えば、スコア＝５０及びワード長＝３が挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、各プログラム用のデフォルトパラメーターを使用する。そのような解析のための特定の技法は当技術分野で既知である（国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイト、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい）。
【００５５】
ポリクローナル及びモノクローナル抗体は、当業者に既知の方法によって調製することができる。
【００５６】
別の実施形態では、抗体または抗体断片は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０））によって報告された技法を使用して生成された抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１））及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１））は、ファージライブラリーからのマウス及びヒト抗体のそれぞれの単離を報告した。鎖シャフリング（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２））ならびに大規模ファージライブラリーを構築するための方法である組み合わせ感染及びインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３））に基づく高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の生成を説明する報告もある。モノクローナル抗体生成のための従来のハイブリドーマ技術を使用する代わりに、これらの技術をモノクローナル抗体を単離するのに使用することもできる。
【００５７】
本発明で使用される抗体は、既知の方法、例えば、プロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、硫酸塩を用いる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーから適切に選択される方法によって、またはこれらの併用によって、精製することができる。
【００５８】
本発明は、遺伝子工学によって生成された組換え抗体を使用することができる。上記の方法によって得られた抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマから単離する。遺伝子を適切なベクター中に挿入し、次いで、宿主中に導入する（例えば、Ｃａｒｌ，Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｊａｍｅｓ，Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ，１９９０を参照されたい）。本発明は、本発明の抗体をコードする核酸及びこれらの核酸を含むベクターを提供する。特に、逆転写酵素を使用して、抗体の可変領域（Ｖ領域）をコードするｃＤＮＡをハイブリドーマのｍＲＮＡから合成する。目的の抗体の可変領域をコードするＤＮＡを得た後、これを抗体の所望の定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡとライゲーションし、得られたＤＮＡコンストラクトを発現ベクター中に挿入する。あるいは、抗体の可変領域をコードするＤＮＡを抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクター中に挿入することができる。これらを、遺伝子が発現制御領域、例えば、エンハンサー及びプロモーターの調節下で発現するように発現ベクター中に挿入する。次いで、発現ベクターで宿主細胞を形質転換して、抗体を発現させる。本発明は、本発明の抗体を発現する細胞を提供する。本発明の抗体を発現する細胞としては、そのような抗体の遺伝子で形質転換された細胞及びハイブリドーマが挙げられる。
【００５９】
本発明の抗体としては、相補性決定領域（ＣＤＲ）またはＣＤＲに機能的に同等である領域を含む抗体も挙げられる。用語「機能的に同等」は、実施例で単離されたモノクローナル抗体のうちのいずれかのＣＤＲのアミノ酸配列と類似しているアミノ酸配列を含むことを指す。用語「ＣＤＲ」は、抗体可変領域（「Ｖ領域」とも呼ばれる）中の領域を指し、抗原結合の特異性を決定する。Ｈ鎖及びＬ鎖はそれぞれ、Ｎ末端からＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として指定される３つのＣＤＲを有する。これらのＣＤＲに隣接する４つの領域が存在し、これらの領域は「フレームワーク」と称され、それらのアミノ酸配列は高度に保存されている。ＣＤＲを他の抗体中に移植することができ、それにより、ＣＤＲを所望の抗体のフレームワークと組み合わせることによって、組換え抗体を調製することができる。ＣＤＲの１つまたは複数のアミノ酸を、その抗原に結合する能力を喪失ことなしに改変することができる。例えば、ＣＤＲ中の１つまたは複数のアミノ酸を、置換する、欠失させる、及び／または付加することができる。
【００６０】
ある特定の実施形態では、あるアミノ酸残基がアミノ酸側鎖の特性を保存することができるアミノ酸残基に突然変異される。アミノ酸側鎖の特性の例としては、以下が挙げられる：疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、ならびに次の側鎖を含むアミノ酸：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；水酸基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸及びアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。括弧内の文字は一文字アミノ酸コードを示す。各群内のアミノ酸置換は保存的置換と呼ばれる。１つまたは複数のアミノ酸残基が欠失している、付加された、及び／または置換された改変アミノ酸配列を含むポリペプチドが元の生物活性を保持することができることは周知である（Ｍａｒｋ  Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：５６６２−５６６６（１９８４）、Ｚｏｌｌｅｒ  Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ  Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００（１９８２）、Ｗａｎｇ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ  Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７９：６４０９−６４１３（１９８２））。突然変異アミノ酸の数は制限されないが、一般にその数は、各ＣＤＲのアミノ酸の４０％以内、好ましくは３５％以内、さらにより好ましくは３０％以内（例えば、２５％以内）に入る。アミノ酸配列の同一性は本明細書に記載のように決定することができる。
【００６１】
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低減するように人工的に改変された組換え抗体を使用することができる。例としては、キメラ抗体及びヒト化抗体が挙がられる。これらの改変抗体は、既知の方法を使用して生成することができる。キメラ抗体としては、互いに異なる種の可変領域及び定常領域を含む抗体、例えば、マウスなどの非ヒト哺乳動物の抗体の重鎖及び軽鎖可変領域とヒトの抗体の重鎖及び軽鎖定常領域とを含む抗体が挙げられる。そのような抗体は、（１）マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡにライゲーションすること、（２）これを発現ベクターに組み込むこと、及び（３）このベクターを宿主に導入して抗体を生成することによって、得ることができる。
【００６２】
再構成ヒト抗体とも呼ばれるヒト化抗体は、マウスなどの非ヒト哺乳動物の抗体のＨまたはＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体のＣＤＲで置換することによって得られる。そのような抗体を調製するための従来の遺伝子組換え技法が知られている（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、Ｐｒｅｓｔａ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい）。特に、マウス抗体のＣＤＲをヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）とライゲーションするように設計されているＤＮＡ配列は、それらの末端に重複部分を含むように構築された、いくつかのオリゴヌクレオチドを使用して、ＰＣＲによって合成される。ヒト化抗体は、（１）得られたＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡにライゲーションすること、（２）これを発現ベクター中に組み込むこと、及び（３）このベクターを宿主中にトランスフェクトして、抗体を得ることによって、得ることができる（欧州特許出願第ＥＰ２３９，４００号及び国際特許出願第ＷＯ９６／０２５７６号を参照されたい）。ＣＤＲが好ましい抗原結合部位を形成する場合に、ＣＤＲを介してライゲーションされるヒト抗体のＦＲが選択される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体に導入されるＣＤＲにも、フレームワーク配列にも含まれていない、付加的なアミノ酸残基（複数可）を含むことができる。そのようなアミノ酸残基は、通常、抗原を認識し、抗原に結合する抗体の能力をより正確に最適化するために導入される。例えば、必要に応じて、再構成ヒト抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように、抗体可変領域のフレームワーク領域中のアミノ酸を置換することができる（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
【００６３】
本発明の抗体のアイソタイプは限定されない。アイソタイプとしては、例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、ＩｇＤならびにＩｇＥが挙げられる。本発明の抗体は、抗原結合に関与する部分を含む抗体断片でもよく、またはその改変断片でもよい。用語「抗体断片」は完全長抗体の一部を指し、一般に、抗原結合ドメインまたは可変領域を含む断片を指す。そのような抗体断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、適切なリンカーで結合された重鎖Ｆｖ及び軽鎖Ｆｖを含む単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（複数可）、直鎖状抗体、ならびに抗体断片から調製される多重特異性抗体が挙げられる。以前は、プロテアーゼで自然抗体を消化することによって抗体断片が生成されており、現在は、遺伝子工学技法を使用して組換え抗体として抗体断片を発現するための方法も知られている（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）、Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４，１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８９，１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８９，１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９８９，１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ，１９９１，９，１３２−１３７を参照されたい）。
【００６４】
「Ｆｖ」断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位及び結合部位を含む。この領域は二量体（ＶＨ−ＶＬ二量体）であり、重鎖及び軽鎖のそれぞれの可変領域は非共有結合によって強く接続している。可変領域のそれぞれの３つのＣＤＲはお互いに相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を形成する。換言すれば、重鎖及び軽鎖からの、合計して６つのＣＤＲが抗体の抗原結合部位として一緒に機能する。しかし、可変領域（または、３つの抗原特異的ＣＤＲしか含まない半Ｆｖ）単独も、抗原を認識し、抗原に結合することができると知られているが、その親和性は完全な結合部位の親和性より低い。したがって、本発明の好ましい抗体断片はＦｖ断片であるが、これに限定されない。そのような抗体断片は、保存されている重鎖または軽鎖ＣＤＲの抗体断片を含み、その抗原を認識し、その抗原に結合することができるポリペプチドでもよい。
【００６５】
Ｆａｂ断片（Ｆ（ａｂ）とも称される）は、軽鎖定常領域及び重鎖定常領域（ＣＨ１）も含む。例えば、抗体のパパイン消化は、２種の断片、すなわち、単一の抗原結合ドメインとして働く、重鎖及び軽鎖の可変領域を含むＦａｂ断片と呼ばれる抗原結合性断片と、容易に結晶化するので「Ｆｃ」と呼ばれる残りの部分とを生成する。Ｆａｂ’断片は、これが、抗体のヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステイン残基を含む、重鎖ＣＨ１領域のカルボキシル末端に由来するいくつかの残基も有するという点において、Ｆａｂ断片と異なる。しかし、Ｆａｂ’断片は、両方とも、単一の抗原結合ドメインとして働く、重鎖及び軽鎖の可変領域を含む抗原結合性断片であるという点において、構造的にＦａｂと同等である。本明細書では、単一の抗原結合ドメインとして働く、重鎖及び軽鎖の可変領域を含み、パパイン消化によって得られるものと同等である抗原結合性断片は、これが、プロテアーゼ消化によって生成される抗体断片と同一でない場合でも、「Ｆａｂ様抗体」と称される。Ｆａｂ’−ＳＨは、その定常領域中に遊離チオール基を有する、１つまたは複数のシステイン残基を有するＦａｂ’である。Ｆ（ａｂ’）断片は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域中のシステイン残基間のジスルフィド結合を切断することによって生成される。他の化学的に架橋された抗体断片も当業者に知られている。抗体のペプシン消化は２つの断片をもたらし、１つは２つの抗原結合ドメインを含み、抗原と交差反応することができるＦ（ａｂ’）２断片であり、もう１つは、残りの断片（ｐＦｃ’と称される）である。本明細書では、ペプシン消化によって得られるものと同等である抗体断片は、これが、２つの抗原結合ドメインを含み、抗原と交差反応することができる場合に、「Ｆ（ａｂ’）２様抗体」と称される。そのような抗体断片は、例えば遺伝子工学によって、生成することもできる。そのような抗体断片は、例えば上記の抗体ファージライブラリーから、単離することもできる。あるいは、Ｆ（ａｂ’）２−ＳＨ断片は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主から直接回収することができ、次いで、化学的に架橋することによって、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成させることができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。代替方法では、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主の培養から直接単離することができる。
【００６６】
用語「ダイアボディ（Ｄｂ）」は、遺伝子融合によって構築された二価の抗体断片を指す（例えば、Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１）。一般に、ダイアボディは２つのポリペプチド鎖の二量体である。ポリペプチド鎖のそれぞれにおいて、同一鎖中の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）は短いリンカー、例えば、約５残基のリンカーを介して接続しており、その結果、これらは互いに結合することができない。これら２つの間のリンカーは短すぎるので、同じポリペプチド鎖中のＶＬ及びＶＨは単鎖Ｖ領域断片を形成することができないが、代わりに二量体を形成する。したがって、ダイアボディは、２つの抗原結合ドメインを有する。約５残基のリンカーを介してＶＬａ−ＶＨｂ及びＶＬｂ−ＶＨａを形成するように、２つのタイプの抗原（ａ及びｂ）に対するＶＬ及びＶＨ領域が組み合わされ、次いでこれらが共発現される場合、これらは、二重特異性Ｄｂとして分泌される。本発明の抗体は、そのようなＤｂでもよい。
【００６７】
単鎖抗体（「ｓｃＦｖ」とも称される）は、抗体の重鎖Ｖ領域と軽鎖Ｖ領域を連結することによって調製することができる（ｓｃＦｖの総説として、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”Ｖｏｌ．１１３，ｅｄｓ．Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい）。単鎖抗体を調製するための方法は当技術分野で既知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、第５，２６０，２０３号、第５，０９１，５１３号及び第５，４５５，０３０を参照されたい）。そのようなｓｃＦｖでは、重鎖Ｖ領域及び軽鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して互いに連結している（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，１９８８，８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖ中の重鎖Ｖ領域及び軽鎖Ｖ領域は、同じ抗体に由来してもよいし、異なる抗体に由来してもよい。Ｖ領域をライゲーションするのに使用されるペプチドリンカーは、１２〜１９残基からなる任意の単鎖ペプチドでもよい。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、上記の抗体の重鎖または重鎖のＶ領域をコードするＤＮＡ及び上記の抗体の軽鎖または軽鎖のＶ領域をコードするＤＮＡから選択される、所望のアミノ酸配列をコードする完全なＤＮＡまたは部分的なＤＮＡのいずれかを鋳型として使用して、ならびに２つの末端を規定するプライマー対を使用して、ＰＣＲによって増幅することができる。ペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡとそれぞれ重鎖及び軽鎖にライゲーションされるＤＮＡの両末端を規定するプライマー対との組み合わせを使用して、さらなる増幅を続いて行うことができる。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築した後、従来の方法を使用して、これらのＤＮＡを含む発現ベクターを得ることができ、これらの発現ベクターによって宿主を形質転換する。さらに、得られた宿主を使用して、従来の方法に従って、ｓｃＦｖを得ることができる。これらの抗体断片は、上で概要を述べたように、抗体断片をコードする遺伝子を得て、これらを発現させることによって、宿主中で生成することができる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの様々なタイプの分子に結合している抗体を修飾抗体として使用することができる。抗体を修飾するための方法は当技術分野で既に確立されている。本発明では、用語「抗体」は上記の抗体も包含する。
【００６８】
得られた抗体を均一に精製することができる。抗体は、タンパク質を単離及び精製するために日常的に使用される方法によって、単離及び精製することができる。抗体は、例えば、カラムクロマトグラフィー、濾過、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、及び等電点分画電気泳動から適切に選択される１つまたは複数の方法の併用によって、単離及び精製することができる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。そのような方法は上に列挙したものに限定されない。クロマトグラフィー法としては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、及び吸着クロマトグラフィーが挙げられる。これらのクロマトグラフィー法は、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ及びＦＰＬＣを使用して行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーで使用されるカラムとしては、プロテインＡカラム及びプロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡカラムとしては、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ及びセファロースＦ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。抗体は、抗原が固定化されている担体を使用して、抗原結合を利用することによって精製することもできる。
【００６９】
本発明の抗体は、標準的な方法（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａを参照されたい）に従って製剤化することができ、医薬的に許容可能な担体及び／または添加剤を含むことができる。本発明は、本発明の抗体ならびに医薬的に許容可能な担体及び／または添加剤を含む組成物（試薬及び医薬品を含める）に関する。例示的担体としては、界面活性剤（例えば、ＰＥＧ及びＴｗｅｅｎ）、賦形剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、着色剤、着香剤、防腐剤、安定化剤、緩衝剤（例えば、リン酸、クエン酸及び他の有機酸）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、懸濁化剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、流動性促進剤及び矯味剤が挙げられる。しかし、本発明で用いることができる担体は、このリストに限定されない。実際、下記の一般に使用される他の担体を適宜用いることができる：軽質無水ケイ酸、ラクトース、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセタート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセリド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ショ糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩など。組成物は、他の低分子量ポリペプチド、タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン及び免疫グロブリン、ならびにアミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン及びリジンを含むこともできる。組成物が注射用水溶液として調製される場合は、これは、例えば、生理食塩水、デキストロース、ならびに、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール及び塩化ナトリウムを含めた他の補助剤を含む等張液を含むことができ、これは、適切な可溶化剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール及びＰＥＧ）ならびに非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０及びＨＣＯ−５０）も含むことができる。
【００７０】
必要ならば、本発明の抗体は、マイクロカプセル（ヒドロキシセルロース、ゼラチン、ポリメチルメタクリレートなどで作られているマイクロカプセル）中にカプセル化することができ、コロイド状薬物送達システム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）の成分にすることができる（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ”，Ｏｓｌｏ  Ｅｄ．（１９８０）を参照されたい）。さらに、持続性放出薬物の作製方法が既知であり、これらを本発明の抗体に適用することができる（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）、Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２）、米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許出願第５８，４８１号、Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６（１９８３）、ＥＰ：１３３，９８８）。
【００７１】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子
ＲＮＡｉ分子は、「低分子干渉ＲＮＡ」または「短干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」または「低分子ヘアピン型ＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」または「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」でもよい。ＲＮＡｉ分子は、目的の核酸配列、例えばＩｔｇａ−９を標的にするヌクレオチドのＲＮＡ二本鎖である。本明細書で使用する場合、用語「ＲＮＡｉ分子」は、ｓｈＲＮＡのサブセットを包含する総称である。「ＲＮＡ二本鎖」は、ＲＮＡ分子の２つの領域の間の相補的対形成によって形成される構造体を指す。ＲＮＡｉ分子は、ＲＮＡｉ分子の二本鎖部分のヌクレオチド配列が標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるという点で、遺伝子を「標的にする」。ある特定の実施形態では、ＲＮＡｉ分子は、Ｉｔｇａ−９をコードする配列を標的にする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ分子の二本鎖の長さは３０塩基対未満である。いくつかの実施形態では、二本鎖は、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１または１０塩基対の長さでもよい。いくつかの実施形態では、二本鎖の長さは１９〜２５塩基対の長さである。ある特定の実施形態では、二本鎖の長さは１９または２１塩基対の長さである。ＲＮＡｉ分子のＲＮＡ二本鎖部分は、ヘアピン構造の一部でもよい。二本鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、二本鎖を形成する２つの配列の間に位置するループ部分を含むことができる。ループは長さがさまざまであり得る。いくつかの実施形態では、ループは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３ヌクレオチドの長さである。ある特定の実施形態では、ループは９ヌクレオチドの長さである。ヘアピン構造は、３’または５’突出部分を含むこともできる。いくつかの実施形態では、突出は０、１、２、３、４または５ヌクレオチドの長さの３’または５’突出である。
【００７２】
ＲＮＡｉ分子は核酸配列にコードされ得、核酸配列はプロモーターを含むこともできる。核酸配列はポリアデニル化シグナルを含むこともできる。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化シグナルは合成最小ポリアデニル化シグナルである。
【００７３】
「ノックダウン」、「ノックダウン技術」は、ＲＮＡｉ分子の導入前の遺伝子発現と比較して標的遺伝子の発現が低減され、これによって、標的遺伝子産物の生成阻害をもたらすことができる、遺伝子サイレンシングの技法を指す。用語「低減される」は、標的遺伝子発現が１〜１００％下がっていることを示すために本明細書で使用される。換言すれば、ポリペプチドまたはタンパク質への翻訳に利用可能なＲＮＡの量が最小化される。例えば、タンパク質の量は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５または９９％低減され得る。いくつかの実施形態では、発現は約９０％低減される（すなわち、ＲＮＡｉ分子が投与されていない細胞と比較して、細胞あたりわずか約１０％のタンパク質量しか観察されない）。遺伝子発現のノックダウンは、例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの使用によって導くことができる。
【００７４】
「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」は、ＲＮＡｉ分子によって引き起こされる配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングの方法である。ＲＮＡｉの間、ＲＮＡｉ分子は、標的ｍＲＮＡの分解を誘導し、その結果、遺伝子発現を配列特異的に阻害する。ＲＮＡｉ分子の使用をともなうＲＮＡｉは、植物、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、トリパノソーマ、プラナリア、ヒドラ、及びマウスを含めたいくつかの脊椎動物種において、特定の遺伝子の発現をノックダウンするのに首尾よく適用されている。
【００７５】
本発明の方法に従って、ＲＮＡｉによってＩｔｇａ−９の発現を改変することができる。例えば、Ｉｔｇａ−９の蓄積を細胞中で抑制することができる。用語「抑制すること」は、特定の細胞中に存在する転写産物の数または量の減少、低減または排除を指す。例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によってＩｔｇａ−９をコードするｍＲＮＡの蓄積を細胞中で抑制することができ、例えば、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とも呼ばれる配列特異的二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって、遺伝子が発現抑制される。これらのｓｉＲＮＡは、一緒にハイブリダイズした２つの別々のＲＮＡ分子でもよく、これらは、ＲＮＡ分子の２つの部分が一緒にハイブリダイズして、二本鎖を形成した単一のヘアピンでもよい。
【００７６】
用語「遺伝子」は、生物学的機能と関係がある核酸の任意のセグメントを指すのに広く使用される。したがって、遺伝子は、コード配列及び／またはその発現に必要とされる調節配列を含む。例えば、「遺伝子」は、調節配列を含む、ｍＲＮＡ、機能的ＲＮＡまたは特定のタンパク質を発現する核酸断片を指す。「遺伝子」は、例えば、他のタンパク質に対する認識配列を形成する非発現ＤＮＡセグメントも含む。「遺伝子」は、目的の供給源からのクローニング、または既知であるか予測される配列情報からの合成を含めて、様々な供給源から得ることができ、所望のパラメーターを有するように設計されている配列を含むことができる。「アレル」は、染色体上の所与の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態のうちの１つである。
【００７７】
用語「核酸」は、糖、リン酸及びプリンまたはピリミジンのいずれかである塩基を含むモノマー（ヌクレオチド）からなる、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）及び一本鎖または二本鎖形態のいずれかのそれらのポリマーを指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似した結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似した方法で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。別段指示がない限り、特定の核酸配列は、保存的に改変されたそれらの変異体（例えば、縮重コドン置換）及び相補的配列、ならびに明示的に示される配列も包含する。特に、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって、達成することができる。「核酸断片」は所与の核酸分子の一部である。
【００７８】
「ヌクレオチド配列」は、一本鎖でも二本鎖でもよく、場合により、ＤＮＡまたはＲＮＡポリマー中への組み込みができる合成、非天然または変化したヌクレオチド塩基を含む、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーである。
【００７９】
用語「核酸」、「核酸分子」、「核酸断片」、「核酸配列もしくはセグメント」、または「ポリヌクレオチド」は互換的に使用され、遺伝子、遺伝子にコードされるｃＤＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡとも互換的に使用され得る。
【００８０】
本発明は、単離されたまたは実質的に精製された核酸組成物を包含する。本発明において、「単離された」または「精製された」ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、その天然環境から離れて存在し、したがって天然の生成物ではないＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。単離ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、精製された形態で存在することができ、または例えばトランスジェニック宿主細胞などの非天然環境中に存在することができる。例えば、「単離された」もしくは「精製された」核酸分子またはそれらの生物学的に活性な部分は、組換え技法によって生成された場合に、他の細胞性物質もしくは培養培地を実質的に含んでおらず、または化学合成された場合に、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含んでいない。一実施形態では、「単離された」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中で核酸に天然に隣接する配列（すなわち、核酸の５’及び３’末端に位置する配列）を含んでいない。例えば、様々な実施形態では、単離された核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然に隣接するヌクレオチド配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満を含むことができる。開示されるヌクレオチド配列の断片及び変異体も本発明によって包含される。「断片」または「部分」は、ヌクレオチド配列の完全長または完全長未満を意味する。
【００８１】
「天然に存在する」、「天然の」または「野生型」は、人工的に生成されたものとはと異なるものとして、自然界に見いだすことができる物体を説明するのに使用される。例えば、自然界の供給源から単離することができ、研究室において人によって意図的に改変されていない（ウイルスを含めた）生物中に存在するタンパク質またはヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００８２】
分子の「変異体」は、天然の分子の配列と実質的に類似している配列である。ヌクレオチド配列については、変異体は、遺伝暗号の縮重のために、天然のタンパク質の同一アミノ酸配列をコードする配列を含む。これらのような天然に存在するアレル変異体は、分子生物学的技法を使用することで、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びハイブリダイゼーション技法を用いて、特定することができる。変異体ヌクレオチド配列は、天然のタンパク質をコードする、例えば、部位特異的変異誘発を使用することによって生成されたもの、及びアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードするものなど、合成由来のヌクレオチド配列も含む。一般に、本発明のヌクレオチド配列変異体は、天然の（内在性の）ヌクレオチド配列に対して、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％まで、例えば、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％まで、一般に、少なくとも８０％、例えば、８１％〜８４％、少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％までの配列同一性を有する。
【００８３】
用語「キメラの」は、１）自然界で一緒に見られない調節配列及びコード配列を含むＤＮＡ配列、または２）天然に隣接していないタンパク質部分をコードする配列、または３）天然に隣接していないプロモーター部分を含む遺伝子またはＤＮＡを指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列を含むことができ、または同じ供給源に由来するが、天然に見られるものと異なる様式で配置された調節配列及びコード配列を含むことができる。
【００８４】
「導入遺伝子」は、形質転換によってゲノム中に導入された遺伝子を指す。導入遺伝子としては、例えば、形質転換される特定の細胞のＤＮＡに対して異種または同種のいずれかであるＤＮＡが挙げられる。さらに、導入遺伝子としては、非天然生物に挿入される天然の遺伝子、またはキメラ遺伝子が挙げられる。
【００８５】
用語「内在性遺伝子」は、生物のゲノムにおいてその天然の位置にある天然の遺伝子を指す。
【００８６】
「外来性」遺伝子は、遺伝子移入によって導入された、宿主生物に通常は見いだされない遺伝子を指す。
【００８７】
用語「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、本明細書で互換的に使用される。
【００８８】
特定の核酸配列の「保存的に改変された変異」は、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を指す。遺伝暗号の縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が任意の所与のポリペプチドをコードする。例えば、コドンＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ及びＡＧＧはすべてアミノ酸のアルギニンをコードする。したがって、アルギニンがコドンによって指定されるどの位置においても、コードされるタンパク質を変えることなく、コドンを記載される対応するコドンのうちのいずれかに変えることができる。そのような核酸変異は、「保存的に改変された変異」の１種である「サイレント変異」である。特記した場合を除き、ポリペプチドをコードする本明細書に記載のどの核酸配列も可能なすべてのサイレント変異を説明する。核酸中の各コドン（通常はメチオニンに対する唯一のコドンであるＡＴＧを除く）を標準的な技法によって機能的に同一の分子をもたらすように改変することができることを、当業者なら認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各「サイレント変異」は、各記載される配列中に潜在している。
【００８９】
「組換えＤＮＡ分子」は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）に記載のように、ＤＮＡ配列を結合させるのに使用される組換えＤＮＡ技術及び手順を使用して結合されるＤＮＡ配列の組み合わせである。
【００９０】
用語「異種遺伝子」、「異種ＤＮＡ配列」、「外来ＤＮＡ配列」、「異種ＲＮＡ配列」、「外来ＲＮＡ配列」または「異種核酸」は、特定の宿主細胞にとって外来性である供給源に由来するか、同じ供給源由来であるが、その元のまたは天然の形態から改変されているかのいずれかの配列をそれぞれ指す。したがって、宿主細胞中の異種遺伝子には、特定の宿主細胞にとって内在性であるが、例えば、ＤＮＡシャッフリングの使用を介して改変された遺伝子が含まれる。この用語には、天然に存在しない複数コピーの天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡ配列も含まれる。したがって、この用語は、細胞にとって外来性もしくは異種性である、または細胞にとって同種であるが、宿主細胞核酸内のその要素が通常見られない位置ある、ＤＮＡまたはＲＮＡセグメントを指す。外来ＤＮＡセグメントは、外来ポリペプチドをもたらすように発現される。
【００９１】
「同種の」ＤＮＡまたはＲＮＡ配列は、それが導入される宿主細胞と天然に関係がある配列である。
【００９２】
「野生型」は、天然に見られる通常の遺伝子または生物を指す。
【００９３】
「ゲノム」は、生物の完全な遺伝物質を指す。
【００９４】
「ベクター」は、特に、任意のウイルスベクター、及び自己伝播性または可動性であってもよいし、そうでなくてもよく、細胞のゲノム中への組み込みによって原核生物のまたは真核生物の宿主を形質転換することができる、または染色体外に存在するができる（例えば、複製開始点を有する自律複製プラスミド）、二本鎖または一本鎖の直鎖状または環状形態の任意のプラスミド、コスミド、ファージまたはバイナリーベクターを含むように定義される。
【００９５】
本明細書で使用する場合「発現カセット」は、終結シグナルに作動可能に連結されていてもよい目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる、適切な宿主細胞内で特定のヌクレオチド配列の発現を導くことができる核酸配列を意味する。コード領域は通常、目的の機能的ＲＮＡ、例えばＲＮＡｉ分子をコードする。目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットはキメラでもよい。発現カセットはまた、天然に存在するが、異種発現に有用な組換え形態で得られたものでもよい。発現カセット中のヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターまたは宿主細胞がある種の特定の刺激に曝露される場合のみ転写を開始する調節性プロモーターの制御下にあってもよい。多細胞生物の場合には、プロモーターは、特定の組織もしくは器官または発生段階に特異的でもよい。
【００９６】
そのような発現カセットは、目的のヌクレオチド配列に連結した転写開始領域を含むことができる。そのような発現カセットは、制御領域の転写調節下にあるように目的の遺伝子を挿入するための複数の制限部位が備わっている。発現カセットは、選択マーカー遺伝子をさらに含むことができる。
【００９７】
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。これは、ｃＤＮＡなどの「中断されていないコード配列」（すなわち、イントロンを欠く）を構成することができ、またはこれは、適切なスプライスジャンクションによって結合している１つもしくは複数のイントロンを含むことができる。「イントロン」は、一次転写産物に含まれるが、タンパク質に翻訳され得る成熟ｍＲＮＡを生成するために、細胞内におけるＲＮＡの切断及び再ライゲーションを介して除去される、ＲＮＡの配列である。
【００９８】
用語「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）は、コード配列の翻訳開始コドン及び翻訳終止コドンの間の配列を指す。用語「開始コドン」及び「終止コドン」は、それぞれタンパク質合成（ｍＲＮＡ翻訳）の開始及び連鎖停止を指定する、コード配列中の３つの隣接するヌクレオチド（「コドン」）の単位を指す。
【００９９】
「機能的ＲＮＡ」は、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、または翻訳され得ないが、それにもかかわらず少なくとも１つの細胞プロセスに影響を与える他のＲＮＡを指す。
【０１００】
用語「ＲＮＡ転写産物」または「転写産物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒性転写から得られる生成物を指す。ＲＮＡ転写産物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、これは一次転写産物と称され、またはこれは、一次転写産物の転写後プロセシングに由来するＲＮＡ配列でもよく、成熟ＲＮＡと称される。「伝令ＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）は、イントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡに相補的であり、ｍＲＮＡに由来する、一本鎖または二本鎖のＤＮＡを指す。
【０１０１】
「調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内、または下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性または関連するコード配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列である。調節配列としては、エンハンサー、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン及びポリアデニル化シグナル配列が挙げられる。これらは、天然配列及び合成配列ならびに合成及び天然配列の組み合わせでもよい配列を含む。上記のように、用語「適切な調節配列」はプロモーターに限定されない。しかし、本発明で有用ないくつかの適切な調節配列としては、限定されないが、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、発生特異的プロモーター、調節性プロモーター及びウイルスプロモーターが挙げられるであろう。
【０１０２】
「５’非コード配列」は、コード配列に対して５’（上流）に位置するヌクレオチド配列を指す。これは、開始コドン上流の完全にプロセシングを受けたｍＲＮＡに存在し、ｍＲＮＡへの一次転写産物のプロセシング、ｍＲＮＡの安定性または翻訳効率に影響を及ぼし得る。
【０１０３】
「３’非コード配列」は、コード配列に対して３’（下流）に位置し、ポリアデニル化シグナル配列及びｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる他の調節シグナルをコードする配列を含み得る、ヌクレオチド配列を指す。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を及ぼすことを特徴とする。
【０１０４】
用語「翻訳リーダー配列」は、ＲＮＡに転写され、翻訳開始コドンの上流（５’）の完全にプロセシングを受けたｍＲＮＡに存在する、プロモーターとコード配列の間の遺伝子のＤＮＡ配列部分を指す。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡへの一次転写産物のプロセシング、ｍＲＮＡの安定性または翻訳効率に影響を及ぼし得る。
【０１０５】
用語「成熟」タンパク質は、そのシグナルペプチドを有さない、翻訳後にプロセシングを受けたポリペプチドを指す。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物を指す。「シグナルペプチド」は、前駆体ペプチドを形成するポリペプチドとともに翻訳され、それが分泌経路に入るのに必要とされる、ポリペプチドのアミノ末端の延長を指す。用語「シグナル配列」は、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を指す。
【０１０６】
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼ及び適切な転写に必要とされる他の因子を認識させることによってコード配列の発現を指示及び／または制御する、通常そのコード配列に対して上流（５’）にあるヌクレオチド配列を指す。「プロモーター」は、転写開始部位を特定する働きをするＴＡＴＡボックス及び他の配列から構成される短いＤＮＡ配列であるミニマルプロモーターを含み、発現の制御のために、調節エレメントがそれに加えられる。「プロモーター」は、ミニマルプロモーター＋コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができる調節エレメントを含むヌクレオチド配列も指す。このタイプのプロモーター配列は、近位の及びより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントはエンハンサーと称されることが多い。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができ、プロモーターの先天的なエレメントでもよく、またはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントでもよい、ＤＮＡ配列である。これは、両方の向き（正常または反転）で作用することができ、プロモーターから上流または下流のいずれかに動かされた場合でさえも、機能することができる。エンハンサー及び他の上流プロモーターエレメントの両方ともその作用を媒介する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に結合する。プロモーターは、その全体が天然の遺伝子に由来してもよく、または天然に見られる異なるプロモーターに由来する異なるエレメントからなってもよく、またはさらに合成ＤＮＡセグメントから構成されてもよい。プロモーターは、生理的または発生的条件に応じて転写開始の有効性を制御するタンパク質因子の結合に関与するＤＮＡ配列を含むこともできる。本発明で使用することができるプロモーターの例としては、マウスＵ６ＲＮＡプロモーター、合成ヒトＨ１ＲＮＡプロモーター、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ及びＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが挙げられる。
【０１０７】
「開始部位」は、位置＋１としても定義される、転写される配列の一部である第１ヌクレオチドの周囲の位置である。この部位に対して、遺伝子のすべての他の配列及びその制御領域が番号付けされる。下流配列（すなわち、３’方向のさらなるタンパク質コード配列）は正と称され、一方で、上流配列（５’方向の制御領域の大部分）は負と称される。
【０１０８】
不活性である、または上流の活性化がない場合にプロモーター活性が大きく低減しているプロモーターエレメント、特にＴＡＴＡエレメントは、「ミニマルまたはコアプロモータ」と称される。適切な転写因子が存在する場合には、ミニマルプロモーターは転写を可能にするように機能する。したがって「ミニマルまたはコアプロモータ」は、転写開始に必要とされるすべての基本エレメント、例えば、ＴＡＴＡボックス及び／またはイニシエーターのみからなる。
【０１０９】
「構成的発現」は、構成的または調節性プロモーターを使用する発現を指す。「条件付き」及び「調節性発現」は、調節性プロモーターによって制御される発現を指す。
【０１１０】
「作動可能に連結される」は、１つの配列の機能が別の配列の影響を受けるような単一の核酸断片上の核酸配列の結合を指す。例えば、調節ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列の発現に影響を及ぼす（すなわち、コード配列または機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある）ように２つの配列が置かれる場合、調節ＤＮＡ配列は、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列「に作動可能に連結される」またはそのＤＮＡ配列「と結合している」と言われる。コード配列は、センスまたはアンチセンスの向きで調節配列に作動可能に連結され得る。
【０１１１】
「発現」は、細胞における内在性遺伝子、異種遺伝子もしくは核酸セグメントまたは導入遺伝子の転写及び／または翻訳を指す。例えば、ｓｉＲＮＡコンストラクトの場合には、発現は、ｓｉＲＮＡのみの転写を指すことができる。さらに、発現は、センス（ｍＲＮＡ）または機能的ＲＮＡの転写及び安定な蓄積を指す。発現は、タンパク質の生成を指すこともできる。
【０１１２】
「変化レベル」は、正常なまたは形質転換されていない細胞または生物のものと異なる、トランスジェニックの細胞または生物における発現レベルを指す。
【０１１３】
「過剰発現」は、正常なまたは形質転換されていない細胞または生物における発現レベルを超える、トランスジェニックの細胞または生物における発現レベルを指す。
【０１１４】
「アンチセンス阻害」は、内在性遺伝子または導入遺伝子からのタンパク質の発現を抑制することができるアンチセンスＲＮＡ転写産物の生成を指す。
【０１１５】
「転写停止断片」は、転写を終結させることができる、１つまたは複数の調節シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナル配列を含む、ヌクレオチド配列を指す。例としては、ノパリン合成酵素をコードする遺伝子及びリブロースビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニットをコードする遺伝子の３’非調節領域が挙がられる。
【０１１６】
「翻訳停止断片」は、翻訳を終結させることができる、１つまたは複数の調節シグナル、例えば、３フレームすべてにおける１つまたは複数の終止コドンを含む、ヌクレオチド配列を指す。コード配列の５’末端の開始コドンに隣接して、またはその近くに翻訳停止断片を挿入することは、翻訳をもたらさないか、または不適切な翻訳をもたらす。部位特異的組換えによる翻訳停止断片の切除は、開始コドンを使用する適切な翻訳を妨げない部位特異的な配列をコード配列中に残す。
【０１１７】
用語「シス作用配列」及び「シス作用エレメント」は、その機能が、それらが同じ分子上にあることを必要とする、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。レプリコン上のシス作用配列の例は、ウイルス複製開始点である。
【０１１８】
用語「トランス作用配列」及び「トランス作用エレメント」は、その機能が、それらが同じ分子上にあることを必要としない、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。
【０１１９】
「染色体に組み込まれた」は、共有結合による、外来性の遺伝子または核酸コンストラクトの宿主ＤＮＡ中への組み込みを指す。遺伝子が「染色体に組み込まれて」いない場合は、これらは、「一過的に発現される」可能性がある。遺伝子の一過的発現は、宿主染色体中に組み込まれていないが、例えば、自律複製プラスミドまたは発現カセットのいずれかの一部として、またはウイルスなどの別の生物システムの一部として、独立に機能する遺伝子の発現を指す。
【０１２０】
次の用語は、２つ以上の核酸またはポリヌクレオチドの間の配列関係を説明するのに使用される：（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較ウィンドウ」、（ｃ）「配列同一性」、（ｄ）「配列同一性のパーセンテージ」、及び（ｅ）「実質的同一性」。
【０１２１】
（ａ）本明細書で使用する場合、「参照配列」は、配列比較に対する基礎として定義された配列である。参照配列は、指定の配列のサブセットまたは全体でもよく、例えば、完全長のｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列などである。
【０１２２】
（ｂ）本明細書で使用する場合、「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチド配列の連続的な指定されたセグメントについて言及し、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列は、２つの配列の最適なアライメントのために、参照配列（これは付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。一般に、比較ウィンドウは、少なくとも２０個の連続的なヌクレオチドの長さであり、場合により、３０個、４０個、５０個、１００個、またはそれより長くてもよい。ポリヌクレオチド配列中へギャップが含まれることが原因の、参照配列に対する高い類似性を回避するために、ギャップペナルティーが典型的には導入され、マッチ数から引かれることを当業者なら理解する。
【０１２３】
比較のための配列のアライメント方法は当技術分野で周知である。したがって、任意の２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。
【０１２４】
これらの数学的アルゴリズムのコンピューターの実装は、配列同一性を決定するための配列比較に利用可能である。そのような実装としては、限定されないが、以下が挙げられる：ＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム中のＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）；ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）ならびにＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ、バージョン８中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡから入手可能）。これらのプログラムを使用するアライメントは、デフォルトパラメーターを使用して実施することができる。
【０１２５】
ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターを通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベースの配列中の同じ長さのワードと整列させた場合にいくつかの正の値の閾値スコアＴとマッチするかそれを満たす、クエリ配列中の長さＷのショートワードを特定することによって、最初に高スコア配列対（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは隣接ワードスコア閾値と称される。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけ出すための検索を開始するためのシードとして働く。次いでワードヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列にそって両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（１対のマッチする残基に対する報酬スコア；常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコア行列を使用して累積スコアが計算される。各方向におけるワードヒットの拡張は、累積アライメントスコアがその最大達成値から数量Ｘだけ遠ざかる場合、１つまたは複数の負のスコアリング残基アライメントの蓄積のために累積スコアがゼロ以下になる場合、またはいずれかの配列の末端に達する場合に停止される。
【０１２６】
配列同一性パーセントの計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析も実施する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列間のマッチが偶然に生じると思われる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸配列は、参照核酸配列との試験核酸配列の比較における最少合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列と類似していると考えられる。
【０１２７】
比較目的でギャップの入ったアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０内）が利用可能である。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０内）を使用して、分子間の遠縁の関連性を検出する反復検索を実施することができる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合は、それぞれのプログラム（例えば、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を使用する。アライメントは、検査によって手動で実施することもできる。
【０１２８】
本発明の目的で、本明細書に開示されるプロモーター配列に対する配列同一性パーセントを決定するためのヌクレオチド配列の比較は、好ましくは、デフォルトパラメーターを用いるＢｌａｓｔＮプログラム（バージョン１．４．７以降）または任意の同等プログラムを使用して行われる。「同等プログラム」は、問題になっている任意の２つの配列について、好ましいプログラムによって作成された対応するアライメントと比較した場合に、同一のヌクレオチドマッチ及び同一の配列同一性パーセントを有するアライメントを作成する、任意の配列比較プログラムが意図される。
【０１２９】
（ｃ）本明細書で使用する場合、２つの核酸配列における「配列同一性」または「同一性」は、配列比較アルゴリズムまたは目視検査によって測定した際に、特定の比較ウィンドウにわたって最大一致について整列させた場合に同一である、２つの配列におけるヌクレオチドの特定のパーセンテージについて言及する。
【０１３０】
（ｄ）本明細書で使用する場合、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列させた配列を比較することによって決定される値を意味し、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適なアライメントのために、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。パーセンテージは、両方の配列に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得て、比較ウィンドウ中の位置の総数でマッチした位置の数を割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【０１３１】
（ｅ）ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」という用語は、標準的なパラメーターを使用する記載のアライメントプログラムのうちの１つを使用して、参照配列と比較した際に、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％または７９％、好ましくは、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％または８９％、より好ましくは、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％または９４％、最も好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列をポリヌクレオチドが含むことを意味する。
【０１３２】
ヌクレオチド配列が実質的に同一である別の指標は、ストリンジェントな条件下で２つの分子が互いにハイブリダイズするかどうかである。一般に、ストリンジェントな条件は、定められたイオン強度及びｐＨにおいて特定の配列に対する熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。しかし、ストリンジェントな条件は、本明細書で特に限定される場合、所望の程度のストリンジェンシーに応じて約１℃〜約２０℃の範囲の温度を包含する。
【０１３３】
配列比較については、典型的には、１つの配列は試験配列が比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合は、試験配列及び参照配列はコンピューターに入力され、必要ならば、サブ配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムによって、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列（複数可）の配列同一性パーセントが計算される。
【０１３４】
上記のように、２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、ストリンジェントな条件下で２つの分子が互いにハイブリダイズすることである。フレーズ「に特異的にハイブリダイズする」は、その配列が複合混合物（例えば、全細胞）のＤＮＡまたはＲＮＡ中に存在する場合、ストリンジェントな条件下における特定のヌクレオチド配列のみに対する分子の結合、二本鎖形成またはハイブリダイズを指す。「実質的に結合する」は、プローブ核酸と標的核酸の間の相補的ハイブリダイゼーションを指し、標的核酸配列の所望の検出を達成するようにハイブリダイゼーション媒体のストリンジェンシーを低減させることによって適応させることができる軽微なミスマッチを包含する。
【０１３５】
サザン及びノーザンハイブリダイゼーションなどの核酸ハイブリダイゼーション実験における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存的であり、異なる環境パラメーター下で異なる。長い配列ほど高い温度で特異的にハイブリダイズする。Ｔｍは、完全にマッチしたプローブに標的配列の５０％がハイブリダイズする（定められたイオン強度及びｐＨ下での）温度である。特異性は、典型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数であり、重要な因子は最終的な洗浄液のイオン強度及び温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについては、Ｔｍは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ及びＷａｈｌの方程式：
Ｔｍ８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ
から見積もることができ、
式中、Ｍは一価の陽イオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Ｌは塩基対におけるハイブリッドの長さである。Ｔｍは１％のミスマッチごとに約１℃低下し、したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーション及び／または洗浄条件は、所望の同一性の配列にハイブリダイズするように調整することができる。例えば、＞９０％同一性を有する配列が求められる場合、Ｔｍを１０℃下げることができる。一般に、ストリンジェントな条件は、定められたイオン強度及びｐＨにおける特異的な配列及びその相補体に対する熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。しかし、激しくストリンジェントな条件は、Ｔｍより１、２、３または４℃低いハイブリダイゼーション及び／または洗浄を利用することができ、中程度にストリンジェントな条件は、Ｔｍより６、７、８、９または１０℃低いハイブリダイゼーション及び／または洗浄を利用することができ、低ストリンジェンシー条件は、Ｔｍより１１、１２、１３、１４、１５または２０℃低いハイブリダイゼーション及び／または洗浄を利用することができる。この方程式、ハイブリダイゼーション及び洗浄組成物ならびに所望のＴを使用して、ハイブリダイゼーション及び／または洗浄液のストリンジェンシーの変動が本質的に説明されることを当業者は理解するであろう。所望の程度のミスマッチが４５℃（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴをもたらす場合、より高い温度を使用することができるようにＳＳＣ濃度を高めることが好ましい。一般に、定められたイオン強度及びｐＨにおける特異的な配列について、Ｔｍより約５℃低くなるように、非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件が選択される。
【０１３６】
非常にストリンジェントな洗浄条件の例は、約１５分間にわたる７２℃の０．１５Ｍ  ＮａＣｌである。ストリンジェントな洗浄条件の例は、１５分間にわたる６５℃の０．２×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明のために、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ２００１を参照されたい）。しばしば、バックグラウンドのプローブシグナルを除去するために、低ストリンジェンシー洗浄が高ストリンジェンシー洗浄に先行する。短い核酸配列（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）については、ストリンジェントな条件は、典型的には、ｐＨ７．０〜８．３で、約１．５Ｍ未満、より好ましくは約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または、他の塩）の塩濃度を含み、温度は、典型的には少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を加えて達成することもできる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて無関係のプローブについて観察されるものよりも２×（または、それ以上）のシグナル対ノイズは、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。極めてストリンジェントな条件は、特定の核酸分子のＴｍに等しくなるように選択される。
【０１３７】
極めてストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴｍに等しくなるように選択される。サザンまたはノーザンブロットにおいてフィルター上に１００個より多くの相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントな条件の例は、５０％ホルムアミドであり、例えば、３７℃の５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション、及び６０〜６５℃の０．１×ＳＳＣにおける洗浄である。例示的な低ストリンジェンシー条件としては、３７℃の３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いるハイブリダイゼーション、及び５０〜５５℃の１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）における洗浄が挙げられる。例示的な中程度ストリンジェンシー条件としては、３７℃の４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション、及び５５〜６０℃の０．５×〜１×ＳＳＣにおける洗浄が挙げられる。
【０１３８】
用語「形質転換」は、遺伝学的に安定な遺伝をもたらす、宿主細胞のゲノム中への核酸断片の移行を指す。「宿主細胞」は、外来核酸分子によって形質転換された、または形質転換することができる細胞である。形質転換された核酸断片を含む宿主細胞は、「トランスジェニック」細胞と称される。
【０１３９】
「形質転換された」、「形質導入された」、「トランスジェニック」及び「組換え体」は、異種核酸分子が導入された宿主細胞を指す。本明細書で使用する場合、用語「トランスフェクション」は、真核（例えば、哺乳類）細胞中へのＤＮＡの送達を指す。用語「形質転換」は、原核（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞中へのＤＮＡの送達を指すのに本明細書で使用される。用語「形質導入」は、ウイルス粒子を細胞に感染させることを指すのに本明細書で使用される。当技術分野で一般に知られているゲノム中に核酸分子を安定して組み込むことができる。ＰＣＲの既知の方法は、限定されないが、対プライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的にミスマッチしたプライマーなどを使用する方法が挙げられる。例えば、「形質転換された」、「形質転換体」及び「トランスジェニック」細胞は、形質転換プロセスを経ており、その染色体中に組み込まれた外来性遺伝子を含む。用語「形質転換されていない」は、形質転換プロセスを経ていない正常細胞を指す。
【０１４０】
「遺伝子改変細胞」は、組換え核酸または異種核酸（例えば、１つまたは複数のＤＮＡコンストラクトまたはそれらのＲＮＡ対応物）の導入により改変された細胞を意味し、そのような遺伝子改変の一部またはすべてを保持するそのような細胞の後代をさらに含む。
【０１４１】
本明細書で使用する場合、ヌクレオチド分子に関する用語「由来する」または「に向けられる」は、目的の特定の分子に相補的配列同一性を有する分子を意味する。
【０１４２】
「遺伝子サイレンシング」は、遺伝子発現、例えば、導入遺伝子、異種遺伝子及び／または内在性遺伝子の発現の抑制を指す。遺伝子サイレンシングは、転写に影響を及ぼすプロセスを通して、及び／または転写後メカニズムに影響を及ぼすプロセスを通して、媒介され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシングは、ＲＮＡ干渉を介して、ｓｉＲＮＡが配列特異的に目的の遺伝子のｍＲＮＡの分解を開始する場合に、生じる。いくつかの実施形態では、遺伝子サイレンシングはアレル特異的でもよい。「アレル特異的」遺伝子サイレンシングは、遺伝子の１つのアレルの特異的サイレンシングを指す。
【０１４３】
「ノックダウン」、「ノックダウン技術」は、ＲＮＡｉ分子の導入前の遺伝子発現と比較して標的遺伝子の発現が低減され、これによって、標的遺伝子産物の生成阻害をもたらすことができる、遺伝子サイレンシングの技法を指す。用語「低減される」は、標的遺伝子発現が１〜１００％下がっていることを示すために本明細書で使用される。例えば、発現は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５または９９％さえも低減され得る。遺伝子発現のノックダウンは、ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの使用によって導くことができる。例えば、ｓｉＲＮＡの使用を伴い得る「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」は、植物、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、トリパノソーマ、プラナリア、ヒドラ、及びマウスを含めたいくつかの脊椎動物種において、特定の遺伝子の発現をノックダウンするのに首尾よく適用されている。
【０１４４】
「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」は、ｓｉＲＮＡによって開始される配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングの方法である。ＲＮＡｉはいくつかの生物、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、線虫、真菌及び植物で見られ、抗ウイルス性防御、トランスポゾン活性のモジュレーション、及び遺伝子発現の調節に関与すると考えられている。ＲＮＡｉの間、ＲＮＡｉ分子は標的ｍＲＮＡの分解を誘導し、その結果、遺伝子発現を配列特異的に阻害する。
【０１４５】
「低分子干渉」または「短干渉ＲＮＡ」またはｓｉＲＮＡは、目的の遺伝子を標的にするヌクレオチドのＲＮＡ二本鎖である。「ＲＮＡ二本鎖」は、ＲＮＡ分子の２つの領域間の相補的対形成によって形成される構造体を指す。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの二本鎖部分のヌクレオチド配列が標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるという点で、遺伝子を「標的にする」。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの二本鎖の長さは３０ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態では、二本鎖は、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１または１０ヌクレオチドの長さでもよい。いくつかの実施形態では、二本鎖の長さは１９〜２５ヌクレオチドの長さである。ｓｉＲＮＡのＲＮＡ二本鎖部分は、ヘアピン構造の一部でもよい。二本鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、二本鎖を形成する２つの配列の間に位置するループ部分を含むことができる。ループは長さがさまざまであり得る。いくつかの実施形態では、ループは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３ヌクレオチドの長さである。ヘアピン構造は、３’または５’突出部分を含むこともできる。いくつかの実施形態では、突出は０、１、２、３、４または５ヌクレオチドの長さの３’または５’突出である。ｓｉＲＮＡ分子を形成するために、ループ領域とともに、またはループ領域なしで、「センス」及び「アンチセンス」配列を使用することができる。本明細書で使用する場合、用語ｓｉＲＮＡは、配列特異的ＲＮＡｉを媒介することができる核酸分子、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短干渉オリゴヌクレオチド、短干渉核酸、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）などを説明するのに使用される他の用語と同等であることが意図される。さらに、本明細書で使用する場合、用語ＲＮＡｉは、配列特異的ＲＮＡ干渉、例えば、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、またはエピジェネティックサイレンシングを説明するのに使用される他の用語と同等であることが意図される。例えば、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、転写後レベルまたは転写前レベルの両方でエピジェネティックに遺伝子をサイレンシングするのに使用することができる。非限定例では、本発明のｓｉＲＮＡ分子による遺伝子発現のエピジェネティックモジュレーションは、遺伝子発現を変化させるためのクロマチン構造またはメチル化パターンのｓｉＲＮＡ媒介性改変から生じ得る。別の非限定例では、本発明のｓｉＲＮＡ分子による遺伝子発現のモジュレーションは、ＲＩＳＣを介する、ＲＮＡ（コーディングＲＮＡまたはノンコーディングＲＮＡのいずれか）のｓｉＲＮＡ媒介性切断から、または代わりに、当該技術分野において知られているように翻訳阻害から生じ得る。
【０１４６】
ｓｉＲＮＡは核酸配列にコードされ得、核酸配列はプロモーターを含むこともできる。核酸配列はポリアデニル化シグナルを含むこともできる。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化シグナルは合成最小ポリアデニル化シグナルである。
【０１４７】
本明細書で使用する場合、「治療すること」は、疾患もしくは状態の少なくとも１つの症状を改善すること、疾患もしくは状態を治癒させること、及び／または疾患もしくは状態の発生を予防することを指す。
【０１４８】
本発明のＲＮＡｉ分子は、当技術分野に知られている任意の方法によって、例えば、インビトロ転写によって、組換えで、または合成手段によって生成することができる。一例を挙げれば、ＲＮＡｉ分子は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼなどの組換え酵素とＤＮＡオリゴヌクレオチド鋳型とを使用することによって、インビトロで生成することができる。
【０１４９】
本発明の核酸分子
用語「単離された及び／または精製された」は、その天然細胞環境から、及び細胞の他の成分、例えば核酸またはポリペプチドとの結合からの核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のインビトロ単離であって、その結果、これをシーケンス、複製及び／または発現することができる、インビトロ単離を指す。例えば、「単離された核酸」は、ＲＮＡｉ分子に転写される３１個未満の連続的なヌクレオチドを含むＤＮＡ分子でもよい。そのような単離されたＲＮＡｉ分子は、（当技術分野で周知の方法によって、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１において定義されるように）、例えば、目的の遺伝子中の配列に相補的であるかハイブリダイズし、ストリンジェントな条件下で安定して結合したままである、二本鎖の２１塩基対の長さのヘアピン構造を形成することができる。したがって、ＲＮＡまたはＤＮＡは、これが、ＲＮＡまたはＤＮＡの天然源において通常は付随している少なくとも１つの混入核酸を含まず、好ましくは、いかなる他の哺乳類のＲＮＡまたはＤＮＡも実質的に含んでいないという点において、「単離されている」。フレーズ「それが通常は付随している少なくとも１つの混入源核酸を含まない」は、核酸が供給源または天然細胞に再導入されるが、異なる染色体上の位置にある、またはそうでなければ、例えば、ベクターまたはプラスミド中で、供給源細胞で通常は見いだされない核酸配列が隣接している場合を含む。
【０１５０】
ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列に加えて、本発明の核酸分子としては二本鎖の干渉ＲＮＡ分子が挙げられ、これも標的遺伝子の発現を阻害するのに有用である。
【０１５１】
本明細書で使用する場合、用語「組換え核酸」、例えば、「組換えＤＮＡ配列またはセグメント」は、任意の適切な細胞性供給源に由来するかそれから単離され、続いて、インビトロで化学的に変化され得、その結果、その配列が天然に存在しないか、それが、外来ＤＮＡで形質転換されていないゲノム中に位置すると思われるようには位置していない天然に存在する配列に対応する、核酸、例えば、ＤＮＡを指す。供給源に「由来する」あらかじめ選択されたＤＮＡの例は、所与の生物内で有用な断片として特定され、次いで、本質的に純粋な形態で化学合成されるＤＮＡ配列であろう。供給源から「単離された」そのようなＤＮＡの例は、化学的手段によって、例えば、制限酵素の使用によって、該供給源から切除されるか取り出され、その結果、それが、本発明で使用するために、遺伝子工学の方法によってさらに操作され得る、例えば、増幅され得る、有用なＤＮＡ配列であろう。
【０１５２】
したがって、制限消化からの所与のＤＮＡ断片の回収または単離は、電気泳動によるポリアクリルアミドまたはアガロースゲルでの消化物の分離、既知の分子量のマーカーＤＮＡ断片の移動度に対してその移動度を比較することによる目的の断片の特定、所望の断片を含むゲル切片の取り出し、及びＤＮＡからのゲルの分離を用いることができる。したがって、「組換えＤＮＡ」としては、完全合成ＤＮＡ配列、半合成ＤＮＡ配列、生物源から単離されたＤＮＡ配列及びＲＮＡに由来するＤＮＡ配列ならびにこれらの混合物が挙げられる。
【０１５３】
塩基置換を有する核酸分子（すなわち、変異体）は、当技術分野で既知の様々な方法によって調製される。これらの方法としては、限定されないが、天然源からの単離（天然に存在する配列変異体の場合）、または以前に調製した変異体もしくは非変異体バージョンの核酸分子のオリゴヌクレオチド媒介性（もしくは部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発及びカセット変異誘発による調製が挙げられる。
【０１５４】
オリゴヌクレオチド媒介性変異誘発は置換変異体を調製するための方法である。手短に言えば、所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドをＤＮＡ鋳型にハイブリダイズさせることによって、ｓｉＲＮＡをコードする核酸を変化させることができ、この場合、鋳型は、未変化のまたは天然の遺伝子配列を含むプラスミドまたはバクテリオファージの一本鎖形態である。ハイブリダイゼーション後に、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、このようにしてオリゴヌクレオチドプライマーを組み込み、ｓｉＲＮＡをコードする核酸中に選択された変化をコードするであろう鋳型の完全な第２の相補鎖を合成する。一般に、少なくとも２５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドが使用される。最適なオリゴヌクレオチドは、突然変異をコードするヌクレオチド（複数可）のいずれかの側の鋳型に完全に相補的な１２〜１５ヌクレオチドを有するであろう。これによって、オリゴヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡ鋳型分子に正しくハイブリダイズすることが確実になる。オリゴヌクレオチドは当技術分野で既知の技法を使用して容易に合成される。
【０１５５】
ＤＮＡ鋳型は、バクテリオファージＭ１３ベクターに由来するいずれかであるベクター（市販のＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９ベクターが適切である）、または一本鎖ファージ複製開始点を含むベクターによって、生成することができる。したがって、突然変異させるＤＮＡをこれらのベクターのうちの１つに挿入して、一本鎖鋳型を生成することができる。一本鎖鋳型の生成は、Ｃｈａｐｔｅｒ  ３  ｏｆ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１に記載されている。あるいは、一本鎖ＤＮＡ鋳型は、標準的な技法を使用して二本鎖プラスミド（または他の）ＤＮＡを変性させることによって、生成することができる。
【０１５６】
（例えばアミノ酸配列変異体を生成する目的で）天然のＤＮＡ配列を変化させるために、適切なハイブリダイゼーション条件下で、オリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型にハイブリダイズさせる。次いで、通常ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片であるＤＮＡ重合酵素を加えて、合成のためのプライマーとしてオリゴヌクレオチドを使用して鋳型の相補鎖を合成する。したがって、ヘテロ二本鎖分子は、その結果、ＤＮＡの一方の鎖はＤＮＡの突然変異型をコードし、他方の鎖（元の鋳型）は天然の未変化のＤＮＡ配列をコードするように形成される。次いで、このヘテロ二本鎖分子で適切な宿主細胞、通常Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１などの原核生物を形質転換する。細胞を増殖させてから、細胞をアガロースプレート上にプレーティングし、３２−リン酸で放射標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用してスクリーニングして、突然変異したＤＮＡを含む細菌コロニーを特定する。次いで、突然変異した領域を取り出し、適切なベクター、一般に、典型的には適切な宿主の形質転換に用いられるタイプの発現ベクター中に入れる。
【０１５７】
直前に記載された方法は、プラスミドの両鎖が突然変異（複数可）を含むホモ二本鎖分子が作出されるように改変することができる。改変は以下の通りである：上記のように、一本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型にアニールさせる。３種のデオキシリボヌクレオチド、すなわち、デオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）及びデオキシリボチミジン（ｄＴＴＰ）の混合物をｄＣＴＰ−（＊Ｓ）と呼ばれる改変チオデオキシリボシトシン（これは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得ることができる）と混合する。この混合物を鋳型オリゴヌクレオチド複合体に加える。ＤＮＡポリメラーゼをこの混合物に加えると、突然変異塩基を除いては鋳型と同一のＤＮＡの鎖が生成される。さらに、この新しいＤＮＡ鎖は、ｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ−（＊Ｓ）を含み、これは、新しいＤＮＡ鎖を制限酵素消化から保護する働きをする。
【０１５８】
二本鎖のヘテロ二本鎖の鋳型鎖に適切な制限酵素でニックを入れた後、変異誘発される部位（複数可）を含む領域を超えて、鋳型鎖をＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼまたは別の適切なヌクレアーゼで消化することができる。次いで、反応を停止して、部分的に一本鎖化されただけの分子を残す。次いで、４種すべてのデオキシリボヌクレオチド三リン酸、ＡＴＰ及びＤＮＡリガーゼの存在下でＤＮＡポリメラーゼを使用して、完全な二本鎖のＤＮＡホモ二本鎖を形成する。次いで、このホモ二本鎖分子でＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０１などの適切な宿主細胞を形質転換することができる。
【０１５９】
ｓｉＲＮＡを設計するための確立された判断基準が存在する。しかし、遺伝子発現を抑制するｓｉＲＮＡのメカニズムは完全には理解されておらず、同じ遺伝子の異なる領域から選択されるｓｉＲＮＡは一様に効果的には機能しないので、非常に多くの場合、有効性を比較するために、いくつかのｓｉＲＮＡを同時に生成しなくてはならない。
【０１６０】
本発明の方法にとって改善可能な疾患及び状態
本発明のある特定の実施形態では、本発明の発現カセットに対する哺乳類レシピエントは、遺伝子サイレンシング療法に適している状態を有する。本明細書で使用する場合、「遺伝子サイレンシング療法」は、治療的ｓｉＲＮＡをコードする外来核酸物質のレシピエントへの投与、及びそれに続く、インサイチュでの投与された核酸物質の発現を指す。したがって、フレーズ「ｓｉＲＮＡ療法に適している状態」は、遺伝性疾患（すなわち、１つまたは複数の遺伝子異常に起因し得る疾患状態）、後天性病態（すなわち、先天的異常に起因し得えない病的状態）、がん及び予防的プロセス（すなわち、疾患または望まれない医学的状態の予防）などの状態を包含する。「状態と関係がある」遺伝子は、治療される状態の原因または原因の一部のいずれかである遺伝子である。そのような遺伝子の例としては、Ｉｔｇａ−９と関係がある遺伝子が挙げられる。また、ウイルスベクターから発現されるｓｉＲＮＡは、記載されるベクター系を使用して、インビボ抗ウイルス療法に使用することができる。
【０１６１】
したがって、本明細書で使用する場合、用語「治療的ｓｉＲＮＡ」は、レシピエントに対して有益効果を有する任意のｓｉＲＮＡを指す。したがって、「治療的ｓｉＲＮＡ」は、治療的ｓｉＲＮＡと予防的ｓｉＲＮＡの両方を包含する。
【０１６２】
製剤及び投与方法
本発明の薬剤は、好ましくは、疾患と関係がある少なくとも１つの症状の軽減をもたらすために投与される。投与される量は、限定されないが、選択される組成物、特定の疾患、哺乳動物の体重、健康状態及び年齢、ならびに予防または治療のどちらが達成されるべきかを含めた様々な因子によって変動する。
【０１６３】
本発明は、薬剤、例えば、抗体または抗体断片の投与によって、哺乳動物においてＬＧを治療することを想定する。本発明による治療剤の投与は、例えば、レシピエントの生理状態、投与の目的が治療的であるか予防的であるか、及び当業者に既知の他の因子に応じて、連続的でもよく、または断続的でもよい。本発明の薬剤の投与は、あらかじめ選択された期間にわたって本質的に連続的でもよく、または一連の間隔を空けた投与でもよい。局部と全身の両方の投与が意図される。
【０１６４】
インビボにおける使用については、本明細書に記載の治療剤は、一般に、投与より前に医薬組成物中に組み込まれる。そのような組成物中に、本明細書に記載の１種または複数の治療的化合物は活性成分（複数可）として存在する（すなわち、代表的なアッセイを使用して測定した場合に、嚢胞性線維症の症状に対して統計学的に有意な効果をもたらすのに十分であるレベルで存在する）。医薬組成物は、１種または複数のそのような化合物を、特定の投与様式に適することが当業者に知られている任意の医薬的に許容可能な担体（複数可）と組み合わせて含む。さらに、他の医薬的に活性な成分（他の治療剤を含める）が組成物中に存在してもよいが、そうである必要はない。
【０１６５】
病態／状態を治療することに関連して、用語「治療有効量」は、単回用量として、または複数回用量で投与される場合に、病態／状態の任意の症状、態様または特徴に対して任意の検出可能な陽性効果を有することができる、単独のまたは医薬組成物中に含まれる場合のいずれかの化合物の量を指す。そのような効果は、有益であるために絶対的である必要はない。
【０１６６】
本明細書で使用する場合、用語「治療する」、「治療すること」及び「治療」は、任意の症状を予防するために、病態／状態の臨床症状の発症より前に化合物を投与すること、及び病態／状態の任意の症状、態様または特徴を軽減するまたは排除するために、病態／状態の臨床症状の発症の後に化合物を投与することを含む。このような治療することは、有用であるために絶対的である必要はない。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、本治療剤は、例えば、経口的に、医薬的に許容可能なビヒクル、例えば、不活性な希釈剤または吸収性食用担体と組み合わせて、全身投与することができる。これらは、硬殻または軟殻ゼラチンカプセル中に封入することができ、錠剤中に圧縮することができ、または患者の食事の食物と直接混ぜることができる。経口的治療投与については、活性化合物を１種または複数の賦形剤と組み合わせることができ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤などの形態で使用することができる。そのような組成物及び調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含むべきである。組成物及び調製物のパーセンテージは、当然ながら変動する可能性があり、好都合には、所与の単位剤形の約２〜約６０％の重量であり得る。そのような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、有効投薬量レベルが得られるようなものである。
【０１６８】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などは、結合剤、例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチン；賦形剤、例えば、リン酸二カルシウム；崩壊剤、例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸など；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム；及び甘味剤、例えば、ショ糖、フルクトース、ラクトースもしくはアスパルテームを含むこともでき、または着香剤、例えば、ペパーミント、ハッカ、冬緑油もしくはチェリーフレーバリングを加えることができる。単位剤形がカプセル剤である場合、これは、上記のタイプの材料に加えて、液体担体、例えば、植物油またはポリエチレングリコールを含むことができる。様々な他の材料が、コーティング剤として、またはそうでなければ固体単位剤形の物理的形態を改変するために、存在可能である。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、ゼラチン、ワックス、シェラックまたは糖などでコーティングすることができる。シロップ剤またはエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてのショ糖またはフルクトース、防腐剤としてのメチル及びプロピルパラベン、色素及び着香料、チェリーまたはオレンジフレーバーを含むことができる。当然ながら、任意の単位剤形の調製で使用される任意の材料は、使用量において、医薬的に許容可能であり、実質的に無毒であるべきである。さらに、持続性放出調製物及びデバイス中に活性化合物を組み込むことができる。
【０１６９】
活性化合物は、（例えば、静脈内に、皮下に、または腹腔内に）注射または注入によって投与することもできる。活性化合物またはその塩の溶液は、場合により無毒の界面活性剤と混合された水中で調製することができる。分散体を、グリセロール、液状ポリエチレングリコール、トリアセチン及びそれらの混合物中で、ならびに油中で調製することもできる。通常の保管及び使用条件下で、これらの調製物は微生物の増殖を防止するために防腐剤を含む。
【０１７０】
注射または注入に適した医薬剤形は、無菌の注射可能なまたは注入可能な溶液または分散体の即時調製に適している活性成分を含む無菌の水溶液もしくは分散体または無菌の粉末を含むことができ、これらは、場合によりリポソーム中にカプセル化される。すべての場合において、究極的な剤形は、製造及び貯蔵条件下で、無菌であり、流動性であり、安定であるべきである。液体担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）、植物油、無毒のグリセリルエステル及びこれらの適切な混合物を含む、溶媒または液体分散媒体でもよい。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成によって、分散体の場合には必要とされる粒径の維持によって、または界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって、もたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、緩衝液または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中で使用することによって、もたらすことができる。
【０１７１】
無菌の注射可能な溶液は、必要に応じて上で列挙した様々な他の成分とともに、必要量の活性化合物を適切な溶媒中に組み込み、続いて、濾過滅菌することにより調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌の粉末の場合には、好ましい調製方法は真空乾燥及び凍結乾燥技法であり、これらは、先に滅菌濾過した溶液中に存在する活性成分＋任意の追加的な所望の成分の粉末をもたらす。
【０１７２】
局所投与については、本化合物は、純粋な形で、すなわち、それらが液体である場合に適用することができる。しかし、一般に、固体でもよいし、液体でもよい皮膚科学的に許容可能な担体と組み合わせて、組成物または製剤としてそれらを皮膚に投与することが望ましい。
【０１７３】
有用な固体担体としては、微粉砕固体、例えば、タルク、クレー、微結晶セルロース、シリカ、アルミナなどが挙げられる。有用な液体担体としては、場合により、無毒の界面活性剤を用いて、本化合物を有効なレベルで溶解または分散することができる、水、アルコールもしくはグリコールまたは水−アルコール／グリコール混合物が挙げられる。所与の使用のために特性を最適化する目的で、補助剤、例えば、芳香剤及び追加的な抗菌剤を加えることができる。得られた液体組成物は、包帯及び他の手当用品を含浸させるのに使用される吸収パッドから塗布することができ、またはポンプ型スプレーもしくはエアゾールスプレーを使用して患部上にスプレーすることができる。
【０１７４】
使用者の皮膚に直接塗布するために、広げることができるペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、石鹸剤などを形成する目的で、増ちょう剤、例えば、合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸の塩及びエステル、脂肪アルコール、改質セルロースまたは改質無機物質を液体担体とともに用いることもできる。
【０１７５】
本発明の化合物を皮膚に送達するのに使用することができる有用な皮膚科学的組成物の例は、当技術分野で既知であり、例えば、Ｊａｃｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第４，６０８，３９２号）、Ｇｅｒｉａ（米国特許第４，９９２，４７８号）、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第４，５５９，１５７号）及びＷｏｒｔｚｍａｎ（米国特許第４，８２０，５０８号）を参照されたい。
【０１７６】
本発明の化合物の有用な投薬量は、それらのインビトロ活性と動物モデルにおけるインビボ活性を比較することによって決定することができる。マウス及び他の動物における有効投薬量をヒトへ外挿するための方法は、当技術分野に知られており、例えば、米国特許第４，９３８，９４９号を参照されたい。
【０１７７】
一般に、ローション剤などの液体組成物中の本発明の化合物（複数可）の濃度は、約０．１〜２５ｗｔ−％、好ましくは約０．５〜１０ｗｔ−％である。ゲル剤または粉末剤などの半固体または固体組成物中の濃度は、約０．１〜５ｗｔ−％、好ましくは約０．５〜２．５ｗｔ−％である。
【０１７８】
治療における使用に必要とされる化合物またはその活性な塩もしくは誘導体の量は、選択される特定の塩によってだけでなく、投与経路、治療を受ける状態の性質ならびに患者の年齢及び状態によっても変動し、最終的に担当医師または臨床医の裁量による。
【０１７９】
しかし、一般に、適切な用量は、約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、１日あたり約１０〜約７５ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、１日あたりレシピエントのキログラム体重あたり３〜約５０ｍｇの範囲であり、好ましくは６〜９０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲、最も好ましくは１５〜６０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
【０１８０】
化合物は、好都合には単位剤形で投与され、これは、例えば、単位剤形あたり５〜１０００ｍｇ、好都合には１０〜７５０ｍｇ、最も好都合には５０〜５００ｍｇの活性成分を含む。
【０１８１】
理想的には、活性成分は、約０．５〜約７５μＭ、好ましくは、約１〜５０μＭ、最も好ましくは約２〜約３０μＭという活性化合物のピーク血漿濃度を達成するように投与されるべきである。これは、例えば、場合により生理食塩水中の活性成分の０．０５〜５％溶液の静脈内注射により達成することができ、または約１〜１００ｍｇの活性成分を含むボーラスとして経口投与することができる。望ましい血中レベルは、約０．０１〜５．０ｍｇ／ｋｇ／時間をもたらすための持続注入によって、または約０．４〜１５ｍｇ／ｋｇの活性成分（複数可）を含む断続注入によって、維持することができる。
【０１８２】
所望の用量は、好都合には、単回用量で、または適切な間隔で投与される分割用量として、例えば、１日あたり２、３、４またはそれ以上のサブ用量として、与えることができる。サブ用量それ自体を、例えば、吸入器からの複数回の吸入、または眼への複数滴の投与によるなど、いくつかの別々の大まかに間隔を空けた投与にさらに分割することができる。
【実施例】
【０１８３】
以下の非限定的実施例によって本発明を次に例示する。
【０１８４】
実施例１
要約
目的。リンパ経路は移植拒絶反応を媒介する。本発明者らは、最近、リンパ管はリンパ脈管新生の間に角膜中に管腔弁を発生し、これらの弁はインテグリンアルファ９（Ｉｔｇａ−９）を発現し、リンパ流動の方向付けにおいて重要な役割を果たすことを報告した。本研究では、本発明者らは、同種異系角膜移植モデルを使用して、Ｉｔｇａ−９の遮断が移植後に弁形成を抑制することができるかどうか、及びこの効果が移植片のアウトカムにどのように影響するかを調べた。
【０１８５】
方法。完全にミスマッチしたＣ５７ＢＬ／６（ドナー）とＢＡＬＢ／ｃ（レシピエント）マウスの間で同所性角膜移植を行った。レシピエントを無作為化して、Ｉｔｇａ−９遮断抗体またはアイソタイプ対照のいずれかの結膜下注射を８週間にわたって週２回与えた。角膜移植を眼部細隙灯顕微鏡検査によってインビボで評価し、カプラン・マイヤー生存曲線を使用して解析した。さらに、リンパ管と弁の両方について、免疫蛍光顕微鏡によって、ホールマウント全層角膜をエクスビボで評価した。
【０１８６】
結果。抗Ｉｔｇａ−９処置は、移植後のリンパの弁形成を抑制した。本発明者らの処置は、リンパ管形成または角膜におけるそれらの鼻極性分布に影響を及ぼさなかった。さらに重要なことに、Ｉｔｇａ−９遮断は、移植片の生存の有意な促進をもたらした。
【０１８７】
結論。リンパの弁形成は移植拒絶反応に決定的に関与する。Ｉｔｇａ−９の標的化は、免疫応答を妨げ、移植片の生存を促進するための新しい有効なストラテジーを提供し得る。
【０１８８】
序論
リンパ脈管系は、体液恒常性、食事性脂肪吸収及び免疫監視の維持において必須の機能を有する。リンパ系の機能障害は、がん転移から炎症及び移植拒絶反応までの幅広い疾患及び障害で見いだされている。移植において、移植失敗は主に拒絶が原因であるが、現行の治療は有効性が限られている。研究によって、リンパ経路の分子遮断によって移植免疫をモジュレートすることができることが示され、リンパ管が新しい治療ストラテジーの開発のための重要なモジュレーターのうちの１つとして明らかになった。
【０１８９】
研究の多くはリンパ管の形成またはリンパ脈管新生（ＬＧ）の調節に注目してきたが、本発明者らは、ＬＧの進行に従ってリンパ管が管腔弁を発生し、これらの弁が、免疫細胞及び免疫応答に対する抗原を含む脈管内部のリンパの流動のガイドにおいて、極めて重要な役割を果たすことを最近明らかにした（Ｔｒｕｏｎｇ  Ｔ，Ａｌｔｉｏｋ  Ｅ，Ｙｕｅｎ  Ｄ，Ｅｃｏｉｆｆｉｅｒ  Ｔ，Ｃｈｅｎ  Ｌ．Ｎｏｖｅｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖａｌｖｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２０１１；６：ｅ２１９１８、Ｋａｎｇ  ＧＪ，Ｅｃｏｉｆｆｉｅｒ  Ｔ，Ｔｒｕｏｎｇ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｒａｖｉｔａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｖａｌｖｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ２０１６；６：１９４５９、Ｔｒｕｏｎｇ  Ｔ，Ｈｕａｎｇ  Ｅ，Ｙｕｅｎ  Ｄ，Ｃｈｅｎ  Ｌ．Ｃｏｒｎｅａｌ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖａｌｖｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ３２０  ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  ｖｉｓｕａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１４；５５：１８７６−１８８３）。これらのリンパ弁の形成または弁形成（ＶＧ）の介入が移植片の生存をモジュレートすることができるかどうかはまだ決定されておらず、これが本研究の焦点である。
【０１９０】
Ｉｔｇａ−９は、細胞−細胞及び細胞−マトリックス相互作用を媒介するインテグリンファミリーに属する。以前に、この分子は角膜中に新しく形成されたリンパ弁で高発現しており、その遺伝子ノックダウンは、ヒト皮膚リンパ管内皮細胞の機能、例えば、増殖、接着、遊走及び管形成をインビトロで阻害できることが報告された。縫合糸設置モデルを用いて、短期の２週間の研究においてＩｔｇａ−９遮断が炎症性ＶＧを抑制できることが示された（Ａｌｔｉｏｋ  Ｅ，Ｅｃｏｉｆｆｉｅｒ  Ｔ，Ｓｅｓｓａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｌｐｈａ−９  Ｍｅｄｉａｔｅｓ  Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  Ｖａｌｖｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  ｖｉｓｕａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１５；５６：６３１３−６３１９）。これらの予備的結果は、以下のことを解明する絶好の機会を示す。（１）Ｉｔｇａ−９遮断が、炎症よりもはるかに複雑な工程である、移植によって誘導されるＶＧ及び／またはＬＧを妨げるための新しいストラテジーとして使用することができるかどうか。移植は、外来性抗原に対する免疫応答ならびにより大きな程度のＶＧ及びＬＧを誘発する。（２）移植拒絶反応において、ＶＧが重要な役割を果たすかどうか。現在までに、この態様に関する報告はない。（３）Ｉｔｇａ−９遮断を使用して、移植片のアウトカムを向上させることができるかどうか。コルチコステロイドの現在のレジメンは有効性が限られており、また、日和見感染、緑内障及び白内障などの多くの副作用と関係がある。リンパ特異的標的化は、移植片の生存を促進するための、より的確なアプローチを提供し得る。したがって、本研究の結果は、移植免疫へ新しい洞察を与えることができるだけでなく、移植拒絶反応ならびにおそらく他のリンパ及び免疫関連疾患を治療するための新規なストラテジーを提供することもできる。
【０１９１】
方法
動物
６〜８週齢の雄のＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）を実験で使用し、それぞれの外科的処置のために、ケタミン、キシラジン及びアセプロマジン（それぞれ、５０ｍｇ、１０ｍｇ及び１ｍｇ／ｋｇ体重）の混合物を使用してマウスに麻酔をかけた。眼及び視覚研究における動物の使用に関するＡＲＶＯ声明（ＡＲＶＯ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ａｎｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に従ってすべてのマウスを処置し、すべてのプロトコールはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙの動物飼育及び使用委員会によって承認された。
【０１９２】
角膜移植
以前に報告されているように（Ｚｈａｎｇ  Ｈ，Ｇｒｉｍａｌｄｏ  Ｓ，Ｙｕｅｎ  Ｄ，Ｃｈｅｎ  Ｌ．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ＶＥＧＦＲ−３  ａｎｄ  ＶＬＡ−１  ｍａｒｋｅｄｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  ｖｉｓｕａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１１；５２：６５２９−６５３５、Ｋａｎｇ  ＧＪ，Ｅｃｏｉｆｆｉｅｒ  Ｔ，Ｔｒｕｏｎｇ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｒａｖｉｔａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｖａｌｖｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ２０１６；６：１９４５９）、完全にミスマッチしたＣ５７ＢＬ／６（ドナー）とＢＡＬＢ／ｃ（レシピエント）の間で同所性角膜移植を行った。基本的に、２ｍｍ径のマイクロキュレット（Ｋａｔｅｎａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｄｅｎｖｉｌｌｅ、ＮＪ）でドナーの中央角膜に印をつけ、バナス剪刀（Ｓｔｏｒｚ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏ、Ｓａｎ  Ｄｉｍａｓ、ＣＡ）でこれを切除した。１．５ｍｍ径のマイクロキュレットを用いて、レシピエントの移植床を同様に調製し、８つの断続１１−０ナイロン縫合糸（Ｓｈａｒｐｏｉｎｔ；Ｖａｎｇｕａｒｄ）でドナーボタンをレシピエント床中に固定した。抗菌性軟膏剤を手術の終わりに塗布した。
【０１９３】
医薬的介入
以前に報告されているように１１、レシピエントマウスを無作為化して、ハムスターもしくはマウスのＩｔｇａ−９抗体（６．４μｇ；Ｄｒ．Ｔｏｓｈｉｍｉｔｓｕ  Ｕｅｄｅ、Ｈｏｋｋａｉｄｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの好意により提供された）またはそのアイソタイプ対照のハムスターＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）のいずれかで結膜下注射を行った。移植当日及びその後手術してから最大で８週まで、結膜下注射を週２回行った。
【０１９４】
移植角膜のインビボ評価
移植手術後、３日目にすべての眼を最初に調べ、７日目に角膜縫合糸を除去した。標準的なスキームに従って、眼部細隙灯顕微鏡検査によって８週間にわたって週２回移植片を評価した。基本的に、移植片の不透明化の程度は、０（透明及びコンパクトな移植片）〜５＋（前眼房の全体的な不明瞭化をともなう最大混濁）の間で等級付けした。３週後に２＋またはそれ以上の混濁スコアを、または２週目に３＋またはそれ以上の混濁スコアを有する移植片を拒絶されたとみなした。
【０１９５】
角膜の免疫蛍光顕微鏡観察
以前に記載されているように（Ｔｒｕｏｎｇ  Ｔ，Ａｌｔｉｏｋ  Ｅ，Ｙｕｅｎ  Ｄ，Ｅｃｏｉｆｆｉｅｒ  Ｔ，Ｃｈｅｎ  Ｌ．Ｎｏｖｅｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖａｌｖｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２０１１；６：ｅ２１９１８、Ｋａｎｇ  ＧＪ，Ｅｃｏｉｆｆｉｅｒ  Ｔ，Ｔｒｕｏｎｇ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｒａｖｉｔａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ３１８  Ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｖａｌｖｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ２０１６；６：１９４５９、Ｔｒｕｏｎｇ  Ｔ，Ｈｕａｎｇ  Ｅ，Ｙｕｅｎ  Ｄ，Ｃｈｅｎ  Ｌ．Ｃｏｒｎｅａｌ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖａｌｖｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  ｖｉｓｕａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１４；５５：１８７６−１８８３）、実験を行った。手短に言えば、ホールマウント全層角膜を移植後８週目に採取し、免疫蛍光染色のためにアセトン中で固定した。精製されたウサギ−マウスＬＹＶＥ−１（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）抗体及びヤギ−抗マウスＩｔｇａ−９抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）とともに試料を順次インキュベートし、これらは、それぞれ、ＦＩＴＣ−コンジュゲートロバ−抗ウサギ及びＣｙ３−コンジュゲートロバ−抗ヤギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）によって可視化した。試料をＶｅｃｔｏｒ  Ｓｈｉｅｌｄマウント媒体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）でカバーし、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ４．８ソフトウェアを有するＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ  Ｍ１落射蛍光デコンボリューション顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって調べた。
【０１９６】
リンパ管及び弁の定量化
以前に報告されているように（Ｔｒｕｏｎｇ  Ｔ，Ｈｕａｎｇ  Ｅ，Ｙｕｅｎ  Ｄ，Ｃｈｅｎ  Ｌ．Ｃｏｒｎｅａｌ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖａｌｖｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  ｖｉｓｕａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１４；５５：１８７６−１８８３、Ａｌｔｉｏｋ  Ｅ，Ｅｃｏｉｆｆｉｅｒ  Ｔ，Ｓｅｓｓａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｌｐｈａ−９  Ｍｅｄｉａｔｅｓ  Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  Ｖａｌｖｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  ｖｉｓｕａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１５；５６：６３１３−６３１９、Ｃｕｒｓｉｅｆｅｎ  Ｃ，Ｃｈｅｎ  Ｌ，Ｂｏｒｇｅｓ  ＬＰ，ｅｔ  ａｌ．ＶＥＧＦ−Ａ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｈｅｍａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ２００４；１１３：１０４０−１０５０、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＣＡ，Ｒａｓｂａｎｄ  ＷＳ，Ｅｌｉｃｅｉｒｉ  ＫＷ．ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  ｔｏ  ＩｍａｇｅＪ：２５  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１２；９：６７１−６７５、Ｙｕｅｎ  Ｄ，Ｇｒｉｍａｌｄｏ  Ｓ，Ｓｅｓｓａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２  ｉｎ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  ｖｉｓｕａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１４；５５：３３２０−３３２７）、解析を行った。手短に言えば、ＬＧ評価については、ＬＹＶＥ−１＋脈管構造をＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウェアによって解析した（Ｔｒｕｏｎｇ  Ｔ，Ｈｕａｎｇ  Ｅ，Ｙｕｅｎ  Ｄ，Ｃｈｅｎ  Ｌ．Ｃｏｒｎｅａｌ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖａｌｖｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  ｖｉｓｕａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１４；５５：１８７６−１８８３、Ｃｕｒｓｉｅｆｅｎ  Ｃ，Ｃｈｅｎ  Ｌ，Ｂｏｒｇｅｓ  ＬＰ，ｅｔ  ａｌ．ＶＥＧＦ−Ａ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｈｅｍａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ２００４；１１３：１０４０−１０５０、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＣＡ，Ｒａｓｂａｎｄ  ＷＳ，Ｅｌｉｃｅｉｒｉ  ＫＷ．ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  ｔｏ  ＩｍａｇｅＪ：２５  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１２；９：６７１−６７５）。リンパ浸潤領域を全角膜領域に対して正規化して、各試料についてパーセンテージカバレッジスコアを得た。
【０１９７】
角膜縁アーケードの最も内側のリンパ管の輪郭を描くことにより全角膜領域を測定し、角膜内部のＬＹＶＥ−１＋リンパ網の輪郭を描き出すことによりリンパ浸潤領域を決定した。さらに、６時及び１２時の位置を通る垂直の正中線を参照して角膜を４等分し、鼻及び側頭の４分円を使用して、各試料の極性リンパ管分布を解析した。管腔弁も評価し、ＬＹＶＥ−１＋脈管の長さに沿って走る限局的なＩｔｇａ−９＋／ＬＹＶＥ−１−領域を弁として特定し、各試料について定量化した。１００％であると定義される対照条件の平均に対して正規化することによって、パーセンテージスコアを得た。
【０１９８】
統計解析
データは、平均＋ＳＥＭとして表す。マンホイットニーのＵ検定を使用して、群間の差異の統計的有意性を評価した。カプラン・マイヤー生存曲線によって、角膜移植片の生存を評価した。ｎｌｍｅＲパッケージを使用して、Ｒ  Ｓｔｕｄｉｏプラットフォーム（Ｒ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｉｎｃ．、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いて構築した線形混合モデルによって、関連解析を行った。すべての他の統計解析は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて行った。Ｐ＜０．０５を有意であるとみなした。
【０１９９】
結果
角膜移植後のリンパの弁形成に対するＩｔｇａ−９遮断の効果
移植によって誘導される角膜のＬＧ及びＶＧに対するＩｔｇａ−９遮断の効果を最初に研究した。Ｉｔｇａ−９中和体またはアイソタイプ対照のいずれかを、手術日から開始して週２回結膜下注射した。図１Ａで示すように、Ｉｔｇａ−９遮断抗体による処置の後に、角膜リンパ管は、対照条件と比較して有意に少ない弁を含んでいた。反復実験からの要約データを図１Ｂに示す（左パネル；Ｐ＜０．０５）。しかし、図１Ｂ（右パネル）に示すように、この処置はＬＧには効果がなかった。弁の数量対リンパ浸潤領域の比に関するさらなる解析によって、対照条件と比較して、処理したものにおいて、このパラメーターの有意な低減が明らかになった（図１Ｃ；Ｐ＜０．０５）。
【０２００】
リンパ管の鼻優勢分布に対するＩｔｇａ−９遮断の効果
以前に、角膜リンパ管は、炎症性ＬＧにおいてユニークな鼻優勢分布パターンを認めることが報告された（Ｔｒｕｏｎｇ  Ｔ，Ｈｕａｎｇ  Ｅ，Ｙｕｅｎ  Ｄ，Ｃｈｅｎ  Ｌ．Ｃｏｒｎｅａｌ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖａｌｖｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  ｖｉｓｕａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１４；５５：１８７６−１８８３、Ｅｃｏｉｆｆｉｅｒ  Ｔ，Ｙｕｅｎ  Ｄ，Ｃｈｅｎ  Ｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖｅｓｓｅｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃｏｒｎｅａ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  ｖｉｓｕａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１０；５１：２４３６−２４４０）。この現象が移植関連ＬＧにも顕在化するかどうか、及びこれがＩｔｇａ−９処置の影響を受けるかどうかを調べるために、図２Ａに例示するように、鼻及び側頭の４分円を比較することによって、ＬＧの極性に対するＩｔｇａ−９遮断の効果を次に調べた。結果は、処置群及び対照群の両方において、リンパ管は鼻側により多く分布しており、Ｉｔｇａ−９遮断は、角膜のＬＧのこの極性に対して効果がないことを示した（図２Ｂ及び図４）。Ｒ  Ｓｔｕｄｉｏプラットフォーム（Ｒ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｉｎｃ．、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いて構築した線形混合モデルを使用するさらなる関連解析もＬＧの極性分布は角膜領域のみと関係があり、抗Ｉｔｇａ−９遮断とは関係がないことを確認した。
【０２０１】
角膜移植片の生存に対するＩｔｇａ−９遮断の効果
角膜移植片の生存に対するＩｔｇａ−９遮断の効果をさらに評価するために、処置群及び対照群の両方において移植片を調べ、手術してから最大で８週まで週２回それらの生存率を評価した。図３に示すように、結果は、この処置による、移植片の生存の有意な促進を示した。対照群と処置群の両方における移植片拒絶は、移植してから約２．５週後に始まったが、カプラン・マイヤー生存曲線（Ｐ＜０．０５）によって解析した場合に、８週間の研究の終わりまで、有意に高いパーセンテージの移植片が処置群において生存した。
【０２０２】
考察
本研究では、Ｉｔｇａ−９は角膜移植誘導性ＶＧに決定的に関与し、その分子遮断はこのプロセスを効果的に抑制できることを初めて示した。この治療ストラテジーは、角膜のＬＧまたは鼻分布のその極性に影響を及ぼさないことも示した。さらに重要なことは、脈管それ自体ではなくリンパ弁を低減させることによって、より高い移植片生存率を達成することが可能あったことを示す最初の証拠が提示されることである。
【０２０３】
Ｉｔｇａ−９遮断が、移植においてリンパ管を乱すことなくリンパ弁形成を抑制したという発見は、縫合誘導性炎症モデルに関する以前の報告（Ａｌｔｉｏｋ  Ｅ，Ｅｃｏｉｆｆｉｅｒ  Ｔ，Ｓｅｓｓａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．３２３  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｌｐｈａ−９  Ｍｅｄｉａｔｅｓ  Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  Ｖａｌｖｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  ｖｉｓｕａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１５；５６：６３１３−６３１９）と矛盾がない。リンパ弁はリンパ管よりもＩｔｇａ−９介入に応答性であるように思われる。これは、Ｉｔｇａ−９は血管壁よりも弁で高発現している（図５）という事実によって説明することができる。リンパ弁と脈管の間の不一致は発生の間でも観察され、この場合、Ｉｔｇａ−９ノックアウトマウスにおいて、リンパ弁の数の減少が検出されたが、脈管では検出されなかった（Ｂａｚｉｇｏｕ  Ｅ，Ｘｉｅ  Ｓ，Ｃｈｅｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ａｌｐｈａ９  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｍａｔｒｉｘ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖａｌｖｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｃｅｌｌ  ２００９；１７：１７５−１８６）。本研究で使用される処置レジメンを用いて、明白な副作用は観察されなかった。
【０２０４】
リンパ弁形成の阻止が移植片の生存を有意に高めることができることは注目に値する。この発見は、リンパ経路が求心性アームとして働く、免疫反射アームの弱体化を示す。これは、Ｉｔｇａ−９ノックアウトマウスが、リンパ管は存在したが完全性が損なわれた両側性乳び胸で誕生直後に死んだ以前の発生的な報告（Ｈｕａｎｇ  ＸＺ，Ｗｕ  ＪＦ，Ｆｅｒｒａｎｄｏ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．Ｆａｔａｌ  ｂｉｌａｔｅｒａｌ  ｃｈｙｌｏｔｈｏｒａｘ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａ９ｂｅｔａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０００；２０：５２０８−５２１５．）ともよく一致する。さらに、リンパ管は、成熟し機能的になると、弁を備えている。したがって、リンパ弁の標的化によって、リンパ管の成熟プロセスが妨げられ、それによって、それらを機能障害性にした可能性がある。
【０２０５】
要約すると、本研究は、移植拒絶反応の媒介におけるリンパＶＧの重要な役割を明らかにする。本研究は、この病理過程を効果的に妨げるための、及び移植片の生存を向上させるための新規な治療的ストラテジーも提供する。角膜からの結果は、体内のより広範なリンパ疾患及び免疫疾患を治療するためのＩｔｇａ−９に基づく新しい療法の開発に、いくらかの手掛かりを与える可能性がある。
【０２０６】
実施例２
さらなる研究によって、ｌｔｇａ−９とＶＥＧＦＲ−３の複合遮断は、危険性の高い角膜移植の後にリンパ弁及び脈管形成を阻害すること（図６、緑色で示される脈管及び弁）及び移植片の生存を促進することが示された（図６Ｂ、カプラン・マイヤー生存曲線）。
【０２０７】
実施例３
目的。本発明者らは、最近、炎症性リンパ脈管新生の間に、角膜リンパ管がインテグリンアルファ−９（Ｉｔｇａ−９）陽性弁を発生することを報告した。本研究の目的は、インビボでの角膜のリンパ弁形成におけるＩｔｇａ−９の役割及びインビトロでのリンパ管内皮細胞（ＬＥＣ）の機能をさらに調べることである。
【０２０８】
方法。標準的なマウス縫合糸設置モデルを使用して、インビボにおけるリンパ弁形成に対するＩｔｇａ−９遮断の効果を、Ｉｔｇａ−９中和抗体を使用して研究した。免疫蛍光顕微鏡解析のためにホールマウント角膜を採取した。さらに、ヒト皮膚ＬＥＣ培養系を使用して、細胞機能に対するＩｔｇａ−９遺伝子のノックダウンの効果を、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用して調べた。
【０２０９】
結果。インビボにおけるＩｔｇａ−９遮断は、炎症性角膜中に形成されるリンパ弁の数を有意に減少させた。さらに、ヒトＬＥＣにおけるＩｔｇａ−９遺伝子のノックダウンは、増殖、接着、遊走及び管形成の細胞機能を抑制する。
【０２１０】
結論。Ｉｔｇａ−９は角膜のリンパ弁形成に決定的に関与する。Ｉｔｇａ−９経路のさらなる研究は、眼の内部及び外部の両方に生じるリンパ関連疾患を治療するための新規なストラテジーを提供し得る。
【０２１１】
序論
リンパ網はほとんどの組織に広がり、組織液恒常性及び免疫監視において重要な機能を果たす。炎症、がん転移及び移植拒絶反応を含めた幅広い疾患及び状態がリンパ機能障害と関係がある１〜５。リンパ系と関係がある疾患の蔓延にもかかわらず、依然として、リンパ系障害に利用可能な治療はほとんどない。したがって、これは、新しい治療ストラテジーに対して差し迫った需要がある分野である。
【０２１２】
リンパ管内皮ヒアルロナン受容体−１（ＬＹＶＥ−１）及び転写因子プロスペロホメオボックスタンパク質−１（Ｐｒｏｘ−１）などのいくつかのリンパ特異的マーカーの発見で、リンパ研究の分野は過去１０年間で急速に発展した６、７。リンパ系におけるインテグリンの役割を指し示す証拠が増加しているが、これはまだ十分に調べられていない８。インテグリンは、細胞−細胞及び細胞−マトリックス相互作用に関与するヘテロ二量体細胞表面膜貫通糖タンパク質のファミリーである９〜１１。本発明者ら及び他の研究者のいくつかの研究により、インテグリンａ５ｂ１、ａ１ｂ１及びａ４ｂ１が炎症関連または腫瘍関連リンパ脈管新生（ＬＧ、新しいリンパ管の形成）を媒介することが示された１２〜１５。ごく最近、本発明者らは、角膜リンパ管は、炎症性ＬＧが進行するに従って管腔弁を発生し、内皮層からなるこれらの弁は、インテグリンａ９ｂ１（Ｉｔｇａ−９）を発現し、炎症性角膜においてリンパ流動を導くように機能することを報告した１６、１７。しかし、角膜のリンパ弁形成及びリンパ管内皮細胞（ＬＥＣ）の機能におけるＩｔｇａ−９の直接の役割は、依然として解明されていないままであり、これが本研究の焦点である。これらの問題点に対する解答は、リンパ系疾患のための新しい治療ストラテジーの開発に必須である。
【０２１３】
本明細書では、弁形成をともなう角膜炎症性ＬＧのインビボのマウスモデル及びインビトロのヒトＬＥＣ培養系を使用して、本発明者らは、Ｉｔｇａ−９がインビボにおける角膜のリンパ弁形成及びインビトロにおけるＬＥＣの機能に決定的に関与することを示す最初の証拠を提供する。中和抗体によるインビボにおけるＩｔｇａ−９遮断は、炎症性角膜におけるリンパ弁形成を有意に抑制する。さらに、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるＬＥＣにおけるＩｔｇａ−９の欠乏は、増殖、接着、遊走及び管形成などの重要な細胞プロセスをインビトロで停止する。まとめると、本研究は、角膜のリンパ弁形成におけるＩｔｇａ−９の重要な役割を明らかにする。インビボの動物研究とインビトロヒトの細胞研究の組み合わせは、眼の内部及び外部の両方で生じるリンパ系障害を治療するための新しい治療ストラテジーのさらなる開発のための、非常に橋渡し的な情報を提供するはずである。
【０２１４】
方法
動物
６〜８週齢の正常な成体の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスをＴａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ、ＵＳＡ）から購入した。眼及び視覚研究における動物の使用に関するＡＲＶＯ声明ならびに研究所の動物飼育及び使用委員会によって承認されたプロトコールに従って、すべてのマウスを処置した。それぞれの外科的処置のために、ケタミン、キシラジン及びアセプロマジン（それぞれ、５０、１０及び１ｍｇ／ｋｇ体重）の混合物を使用してマウスに麻酔をかけた。
【０２１５】
角膜のリンパ脈管新生の誘導及び遮断抗体の投与
以前に述べられているように１６、縫合糸設置モデルを使用して、弁形成をともなう角膜炎症性ＬＧを誘導した。手短に言えば、３つの１１−０ナイロン縫合糸（ＡＲＯＳｕｒｇｉｃａｌ、Ｎｅｗｐｏｒｔ  Ｂｅａｃｈ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、前眼房中に入り込むことなく角膜実質中に設置した。続いて、マウスを無作為化して、６．４ｌｇのハムスター抗マウスＩｔｇａ−９遮断抗体１８またはアイソタイプ対照ハムスターＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）のいずれかを、縫合後０日目から始めて２週間にわたって週２回結膜下注射した。実験は、各群に合計で１０匹のマウスを用いて２回反復した。
【０２１６】
免疫蛍光顕微鏡アッセイ及びリンパ弁の定量化
以前に報告されているように１６、１９、実験を行った。手短に言えば、免疫蛍光染色のために、ホールマウント角膜をアセトン中に固定した。精製されたウサギ−抗マウスＬＹＶＥ−１（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）及びヤギ−抗マウスＩｔｇａ−９抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）とともに試料を順次インキュベートし、これは、それぞれ、ＦＩＴＣコンジュゲートロバ−抗ウサギ及びＣｙ３−コンジュゲートロバ−抗ヤギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）によって可視化した。試料をＶｅｃｔｏｒ  Ｓｈｉｅｌｄマウント媒体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）でマウントし、ＺＥＮデジタルイメージングソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．、（Ｇｅｒｍａｎｙ）を有するＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０  ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ倒立共焦点顕微鏡を使用して調べた。ＬＹＶＥ−１ｐリンパ管の長さに沿ったＩｔｇａ−９ｐ限局的な領域を弁として特定した。角膜あたりのリンパ弁の数を定量化し、スコアが１００％であると定義される対照群に対して正規化することによって、パーセンテージスコアを得た１６、１９。
【０２１７】
リンパ管内皮細胞の培養及び免疫細胞蛍光顕微鏡アッセイ
以前に記載されているように１３、１９、実験を行った。手短に言えば、ヒト新生児マイクロダーマルＬＥＣをＬｏｎｚａ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）から購入し、製造者の指示書に従って、ＥＧＭ−２ＭＶ細胞培養培地（Ｌｏｎｚａ）中で維持した。ＬＥＣの染色については、細胞をウサギ抗ヒト−Ｉｔｇａ−９抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ、ＵＳＡ）とともにインキュベートし、Ｃｙ３−コンジュゲートロバ−抗ウサギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）によって可視化した。ＤＡＰＩマウント媒体（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で試料をマウントした。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ２落射蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｉｎｃ．）でデジタル画像を得た。
【０２１８】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション
以前に報告されているように１３、１９、実験を行った。ヒトＩｔｇａ−９ｍＲＮＡ（５０−ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＡＡＡ  ＧＴＣ  ＧＴＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ−３０）に対して、特注設計のｓｉＲＮＡ二本鎖をＱｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）が合成した。スクランブルｓｉＲＮＡ対照は、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）から購入した。トランスフェクションは、製造者の指示書に従って、トランスフェクション試薬（ＲＮＡｉＭａｘ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びｏｐｔｉ−ＭＥＭ血清低減培地を用いて、５％ＣＯ２の加湿したエアーインキュベーターにおいて３７８Ｃで行った。
【０２１９】
逆転写及びリアルタイムＰＣＲ
前述のように、及び定量的リアルタイムＰＣＲ実験（ＭＩＱＥ）ガイドラインの刊行物についての最小限の情報に基づいて１３、１９、２０、実験を行った。ｓｉＲＮＡトランスフェクションから４８時間後に、ＱｉａｇｅｎのＲＮＡｅａｓｙミニキットを用いて、ＬＥＣから全ＲＮＡを抽出し、精製した。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ合成キットを使用して、逆転写を行った。プライマー配列は以下通りであった：ヒトＩｔｇａ−９、フォワード５０−ＣＧＧ  ＡＡＴ  ＣＡＴ  ＧＴＣ  ＴＣＣ  ＡＡＣ  ＣＴ−３０及び５０−ＴＣＴ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＡＧ−３０；ヒトｂ−アクチン、フォワード  ５０−ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＣＡ  ＣＣＡ  ＣＡＣ  ＣＴＴ  ＣＴ−３０、リバース５０−ＧＧＧ  ＧＴＧ  ＴＴＧ  ＡＡＧ  ＧＴＣ  ＴＣＡ  ＡＡ−３．０。ＣＦＸ９６配列検出システムを用いるＳｓｏＦａｓｔ  ＥｖａＧｒｅｅｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、リアルタイムＰＣＲを行った。アクチンのＤ−Ｃｔに対して正規化した標的遺伝子のＤ−Ｃｔ（閾値サイクル）からＩｔｇａ−９遺伝子の相対的発現を計算した。
【０２２０】
フローサイトメトリー
ＬＥＣのトランスフェクションから４８時間後に、Ｇｕａｖａ  ＶｉａＣｏｕｎｔアッセイ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）によってＬＥＣの生存率を評価した。Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  ＨＴサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及びＩｎＣｙｔｅ２．６ソフトウェア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、データを得た。Ｇｕａｖａ  ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬中の２つのＤＮＡ結合色素の差次的浸透性によって、生存細胞及び非生存細胞を評価した。一方の色素はすべての有核細胞を染色し（赤色蛍光チャネル）、一方で、他方の色素は非生細胞を染色する（黄色蛍光チャネル）。生細胞をゲートし（Ｒ１）、全集団に対するパーセンテージを計算した。実験は３回反復し、スコアが１００％であると定義される対照条件に対してパーセンテージスコアを正規化した。
【０２２１】
増殖アッセイ
以前に記載されているように１３、１９、９６ウェルプレート中にＬＥＣを播種した。Ｉｔｇａ−９ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡのいずれかによるｓｉＲＮＡトランスフェクションから４８時間後に、製造業者のプロトコールに従って、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）のＭＴＳ増殖アッセイに細胞をかけた。アッセイは３連で行い、３回反復した。
【０２２２】
接着アッセイ
以前に記載されているように１３、Ｉｔｇａ−９ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡのいずれかによるｓｉＲＮＡトランスフェクションから４８時間後に、フィブロネクチンでコーティングされた９６ウェルプレート中にＬＥＣを播種した。プレートを３７８Ｃで１時間インキュベートし、２回洗浄し、ＨＢＳＳ中のカルセイン（１ｌｇ／ｍＬ）とともに室温で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄し、マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５ｅ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で蛍光強度を測定した。アッセイは３連で行い、３回反復した。
【０２２３】
遊走アッセイ
Ｉｔｇａ−９ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡのいずれかによるｓｉＲＮＡトランスフェクションから４８時間後に、１０−ｌＬのピペットチップを使用して、ＬＥＣ単層内に直線的な傷をつけた。かき傷をつけてから０、２４及び７２時間後に微分干渉（ＤＩＣ）位相画像を得て、細胞単層における創傷閉鎖を可視化した。ＴＳｃｒａｔｃｈｐｒｏｇｒａｍ（Ｔｏｂｉａｓ  Ｇｅｂａｃｋ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ  Ｓｃｈｕｌｚ、ＥＴＨ  Ｚｕｒｉｃｈ）を使用して、創傷治癒についてかき傷を解析した。創傷閉鎖の間の細胞遊走の可視化のために、ＴＲＩＴＣコンジュゲート化ファロイジン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して細胞を染色した。
【０２２４】
管形成アッセイ
以前に記載されているように１３、１９、Ｉｔｇａ−９ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡのいずれかによるｓｉＲＮＡトランスフェクションから４８時間後に、固化したＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含む９６ウェルプレート中にＬＥＣを播種した（２  ３  １０４細胞／ウェル）。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ａ１倒立顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、播種後２４時間で管形成を画像化した。管の位相画像を得（Ｑｃａｐｔｕｒｅ；Ｑｉｍａｇｉｎｇ、Ｓｕｒｒｅｙ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ＩｍａｇｅＪ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／；米国国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡによるパブリックドメインで提供される）を使用して、ウェルあたりの管の全長を計算した。アッセイは３連で行い、少なくとも３回反復した。
【０２２５】
統計解析
結果は平均６ＳＥＭとして報告し、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、異なる群の間の有意性レベルを決定するために、スチューデントのｔ検定を使用した。Ｐ＜０．０５である場合に、差異を統計学的に有意であるとみなした。
【０２２６】
結果
インビボにおける角膜のリンパ弁形成に対するＩｔｇａ−９遮断の効果
本発明者らは、最初に、炎症性ＬＧにおける角膜のリンパ弁形成に対するＩｔａｇ−９遮断の効果を研究することに着手した。標準的な縫合糸設置モデルを使用して、ＬＧをともなう炎症性角膜に形成される弁の数に対するＩｔｇａ−９中和抗体の結膜下送達の効果を評価した。図７Ａに示すように、Ｉｔｇａ−９遮断抗体による処置の後、角膜リンパ管は、対照条件と比較して有意に少ない弁を含んでいた。反復実験からの要約データを図７Ｂに示す（＊Ｐ＜０．０５）。
【０２２７】
ＬＥＣにおけるＩｔｇａ−９の発現及び欠乏
リンパ弁は内皮細胞の２つの層に挟まれた細胞外マトリックスでできている。インビトロでリンパ管内皮細胞におけるＩｔｇａ−９の特定の役割をさらに調べるために、本発明者らは、次にヒトＬＥＣ培養系を用いた。図８Ａに示すように、本発明者らは、最初に、免疫細胞蛍光顕微鏡解析によって、これらの細胞におけるＩｔｇａ−９の発現を確認した。次いで、ｓｉＲＮＡ媒介性遺伝子サイレンシングアプローチによって、これらのＬＥＣにおけるＩｔｇａ−９発現がダウンレギュレートされ得るかどうかを評価した（図８Ｂ）。リアルタイムＰＣＲ解析からの本発明者らのデータは、Ｉｔｇａ−９ｓｉＲＮＡによるトランスフェクションの後に、ＬＥＣにおけるＩｔｇａ−９発現が約５０％有意に低減することを示した。図９に示すように、Ｇｕａｖａ  ＶｉａＣｏｕｎｔアッセイを用いるフローサイトメトリー解析によって、トランスフェクションはＬＥＣの生存率に直接効果がないことも確認した。まとめると、これらのデータは、ｓｉＲＮＡによるトランスフェクションは、インビトロにおいてＬＥＣにおけるＩｔｇａ−９の機能的役割を研究するのに使用することができることを示す。
【０２２８】
ＬＥＣの増殖に対するＩｔｇａ−９の欠乏の効果
本発明者らは、次に、ｓｉＲＮＡアプローチを使用して、増殖に関するＬＥＣ機能におけるＩｔｇａ−９の役割をより深く探究し、評価した。Ｉｔｇａ−９ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡのいずれかによるｓｉＲＮＡトランスフェクションから４８時間に、以前に報告されているように１９、ＬＥＣをＭＴＳ増殖アッセイにかけた。図１０Ａに示すように、本発明者らのデータは、対照条件と比較して、Ｉｔｇａ−９ｓｉＲＮＡ処理がＬＥＣの増殖の有意な低減をもたらすことを示した（＊Ｐ＜０．０５）。この結果は、Ｉｔｇａ−９の関与がＬＥＣの増殖を調節することを示唆する。ＬＥＣの接着に対するＩｔｇａ−９の欠乏の効果。インテグリンは、細胞外タンパク質への細胞接着に必須である。Ｉｔｇａ−９がＬＥＣの接着に重要であるかどうかを調べるために、Ｉｔｇａ−９ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡで細胞をトランスフェクトし、Ｉｔｇａ−９リガンドのフィブロネクチンでコーティングしたウェル上で接着アッセイにかけた。図１０Ｂに示すように、ＬＥＣのＩｔｇａ−９欠乏は、フィブロネクチンへの細胞接着の有意な低減をもたらし（＊Ｐ＜０．０５）、これによって、Ｉｔｇａ−９は細胞外マトリックスとのＬＥＣの相互作用にも極めて重要であることが示される。ＬＥＣの遊走に対するＩｔｇａ−９の欠乏の効果。細胞遊走は、インテグリンと細胞外マトリックスタンパク質の間の相互作用に主に依存しているプロセスであり、本発明者らは、次に、創傷治癒のかき傷アッセイを使用して、ＬＥＣの遊走に対するＩｔｇａ−９の重要性を調べた。Ｉｔｇａ−９ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡのいずれかによるｓｉＲＮＡトランスフェクションの後に、７２時間にわたってＬＥＣをモニターした。図１１Ａに示すように、Ｉｔｇａ−９ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＬＥＣは、創傷後２４及び７２時間という研究した両時点で、スクランブルｓｉＲＮＡでトランスフェクトした対照細胞よりも大きな開放創領域を示した（＊Ｐ＜０．０５）。さらに、創傷治癒に対するＩｔｇａ−９の阻害効果は、対照群の細胞が視野の大部分にわたって増殖したより遅い時点で、より大きかった（図１１Ｂ）。これらの結果は、Ｉｔｇａ−９がＬＥＣの遊走に必須であることを明示する。
【０２２９】
ＬＥＣの管形成に対するＩｔｇａ−９の欠乏の効果
本発明者らは、３次元培養系を使用して、毛細管型の管に組織化するＬＥＣの能力に対するＩｔｇａ−９の欠乏の効果も調べた。Ｉｔｇａ−９ｓｉＲＮＡまたはスクランブルｓｉＲＮＡのいずれかでトランスフェクションしてから４８時間後に、固化した基底膜マトリックス、ＭａｔｒｉｇｅｌにＬＥＣを播種して、管形成を可能にさせた。このアッセイの結果は、図１２Ａに示すように、ＬＥＣにおけるＩｔｇａ−９の欠乏が、管の全長の劇的な低減をもたらすことを示した。反復実験からの要約データを図１２Ｂに示す（＊Ｐ＜０．０５）。これらの結果は、マクロスケール構造体へのＬＥＣの組織化におけるＩｔｇａ−９の重要な役割を意味する。
【０２３０】
考察
本研究では、本発明者らは、インビボの動物モデルとインビトロのヒト細胞モデルの両方を使用して、角膜のリンパ弁形成及びＬＥＣにおけるＩｔｇａ−９の必須の役割を示した。本発明者らは、本研究から２つの相互依存的な結論を導き出すことができる。第１に、Ｉｔｇａ−９遮断抗体を使用する実験を通して示すように、インビボにおけるリンパ弁形成はＩｔｇａ−９によって堅固に調節されている。第２に、ｓｉＲＮＡノックダウンアプローチによって明らかにされたように、Ｉｔｇａ−９はインビトロにおけるＬＥＣプロセス、例えば、増殖、遊走及び接着に決定的に関与している。インビボのデータは、炎症性角膜におけるリンパ弁形成を妨げるための新しいストラテジーを示唆する一方で、インビトロの結果は、ＬＥＣの様々な機能におけるＩｔｇａ−９の役割の根底にあると考えられるメカニズムに関して、より多くの詳細を提供し、これらは、一緒に弁形成のプロセスを編成する。細胞外マトリックスへの細胞固定は、主としてインテグリンに基づく結合を介して媒介され、細胞内環境と細胞外環境の間に強い結び付きをもたらす１１。インテグリンは、ａ及びｂサブユニットに依存して、細胞外マトリックスタンパク質に特異性を有する。Ｉｔｇａ−９に対する主なリガンドのうちの１つは、ヒトがん細胞モデルで報告されているように２１、フィブロネクチンである。ヒトＬＥＣを用いる本研究では、Ｉｔｇａ−９標的化ｓｉＲＮＡを使用して、本発明者らは、Ｉｔｇａ−９の欠乏の際に、フィブロネクチンへのＬＥＣの接着が有意に阻害されることを示すことができる。さらに、細胞遊走の中心にあるものは細胞−マトリックス接着複合体であり、これは、主として、細胞外マトリックスを細胞内アクチンに連結するインテグリンからなる２２。ＬＥＣの遊走におけるＩｔｇａ−９の役割を特定するために、本発明者らは、創傷治癒かき傷アッセイによって、細胞遊走に対するＩｔｇａ−９の消失の効果を調べた。本発明者らは、Ｉｔｇａ−９を欠くＬＥＣは、時間の経過とともにかき傷表面にわたって完全に増殖した対照ＬＥＣと比べると、かき傷のすべてにわたって決して十分に遊走しないことを示すことができる。増殖データとまとめると、細胞外マトリックスへのＬＥＣの結合に関連するプロセスにおけるＩｔｇａ−９の重要性は、疑いの余地がなくなる。これらの基本的なプロセスに関するさらなる研究は、治療介入のための新しい標的を明かす可能性がある。さらに、本発明者らのインビトロデータは、Ｉｔｇａ−９が欠乏したＬＥＣは、それらが培養中に毛細管型の管を形成する能力を失ったことを示す。しかし、Ｉｔｇａ−９遮断抗体を用いる本発明者らのインビボ処置レジメンは、リンパ管の有意な低減は示さないが、弁の有意な低減は示す。それにもかかわらず、この矛盾現象は、発生の間の非眼性組織におけるリンパ弁形成に関する以前の研究でも観察されている。特に、Ｂａｚｉｇｏｕ  ｅｔ  ａｌ２３は、Ｉｔｇａ−９ノックアウトマウスにおけるリンパ弁形成を調べ、Ｉｔｇａ−９ホモ接合体において、弁の数の減少を報告したが、リンパ管の数の減少は報告しなかった。中和抗体を用いる本発明者らのインビボデータについての１つの考えられる説明は、Ｉｔｇａ−９が脈管��りも角膜のリンパ弁でより高発現しており１６、１７、これが、抗Ｉｔｇａ−９処置に対して弁をより感受性にし得るということである。これは、さらなる研究の根拠となる。まとめると、これらの結果は、脈管を乱すことなくリンパ弁形成を操作するための理想的な標的としてＩｔｇａ−９を指定する。疾患管理において弁と脈管の両方の介入が必要とされる場合に、弁／脈管標的化アプローチの組み合わせが必要であることも示唆され、これはまた、さらなる研究を要求する。リンパ管は免疫反射弓の求心性アームを構成し１、その管腔弁は脈管内部のリンパ（免疫細胞を含む）流動を導くように機能するので、角膜の内部に形成される脈管及び／または弁の数を操作することによって、免疫応答の程度ならびに様々な段階での疾患の進行及び消退をおそらく妨げることができることが推測される。要約すると、本研究は、角膜の弁形成への新しい洞察を提示するだけでなく、眼の内部または外部に生じる幅広いリンパ系疾患のためのＩｔｇａ−９に基づく新しい療法のさらなる開発に、いくらかの手掛かりを与える可能性がある。
【０２３１】
実施例３参考文献
１．Ｃｈｅｎ  Ｌ．Ｏｃｕｌａｒ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃｓ：ｓｔａｔｅ−ｏｆ−ｔｈｅ−ａｒｔ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｌｙｍｐｈｏｌｏｇｙ．２００９；４２：６６−７６．
２．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  Ａ，Ｄｅｔｍａｒ  Ｍ．Ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１１；２：１１４６−１１５８．
３．Ａｌｉｔａｌｏ  Ｋ．Ｔｈｅ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１１；１７：１３７１−１３８０．
４．Ｚｈａｎｇ  Ｈ，Ｇｒｉｍａｌｄｏ  Ｓ，Ｙｕｅｎ  Ｄ，Ｃｈｅｎ  Ｌ．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ＶＥＧＦＲ−３  ａｎｄ  ＶＬＡ−１  ｍａｒｋｅｄｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２０１１；５２：６５２９−６５３５．
５．Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  Ｔ，Ｂｏｃｋ  Ｆ，Ｙｕｅｎ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖｅｓｓｅｌｓ，ｎｏｔ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌｓ，ｐｒｉｍａｒｉｌｙ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；１８４：５３５−５３９．
６．Ｂａｎｅｒｊｉ  Ｓ，Ｎｉ，Ｊ，Ｗａｎｇ，ＳＸ，ｅｔ  ａｌ．ＬＹＶＥ−１，ａ  ｎｅｗ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｏｆｔｈｅ  ＣＤ４４  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ｉｓ  ａ  ｌｙｍｐｈ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９９；１４４：７８９−８０１．
７．Ｗｉｇｌｅ  ＪＴ，Ｏｌｉｖｅｒ，Ｇ．Ｐｒｏｘ１  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｃｅｌｌ．１９９９；９８：７６９−７７８．
８．Ａｖｒａａｍｉｄｅｓ  ＣＪ，Ｇａｒｍｙ−Ｓｕｓｉｎｉ  Ｂ，Ｖａｒｎｅｒ  ＪＡ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ｉｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．２００８；８：６０４−６１７．
９．Ｂｅｒｍａｎ  ＡＥ，Ｋｏｚｌｏｖａ  ＮＩ，Ｍｏｒｏｚｅｖｉｃｈ  ＧＥ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｉｏｋｈｉｍｉｉａ．２００３；６８：１２８４−１２９９．
１０．Ｓｔｅｐｐ  ＭＡ．Ｃｏｒｎｅａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．２００６；８３：３−１５．
１１．Ｇｉａｎｃｏｔｔｉ  ＦＧ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９；２８５：１０２８−１０３３．
１２．Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  Ｔ，Ｏｎｄｅｒｋａ  Ｊ，Ｂｏｃｋ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａ５  ｂｌｏｃｋａｄｅ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２００７；１７１：３６１−３７２．
１３．Ｇｒｉｍａｌｄｏ  Ｓ，Ｙｕｅｎ  Ｄ，Ｅｃｏｉｆｆｉｅｒ  Ｔ，Ｃｈｅｎ  Ｌ．Ｖｅｒｙ  ｌａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−１  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２０１１；５２：４８０８−４８１２．
１４．Ｇａｒｍｙ−Ｓｕｓｉｎｉ  Ｂ，Ｍａｋａｌｅ  Ｍ，Ｆｕｓｔｅｒ  Ｍ，Ｖａｒｎｅｒ  ＪＡ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖｅｓｓｅｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００７；４２６：４１５−４３８．
１５．Ｃｈｅｎ  Ｌ，Ｈｕｑ  Ｓ，Ｇａｒｄｎｅｒ  Ｈ，ｄｅ  Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ  ＡＲ，Ｂａｒａｂｉｎｏ  Ｓ，Ｄａｎａ  ＭＲ．Ｖｅｒｙ  ｌａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  １  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｍａｒｋｅｄｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｃｏｒｎｅａｌ  ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ．Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２００７；１２５：７８３−７８８．
１６．Ｔｒｕｏｎｇ  Ｔ，Ａｌｔｉｏｋ  Ｅ，Ｙｕｅｎ  Ｄ，Ｅｃｏｉｆｆｉｅｒ  Ｔ，Ｃｈｅｎ  Ｌ．Ｎｏｖｅｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖａｌｖｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ．２０１１；６：ｅ２１９１８．
１７．Ｔｒｕｏｎｇ  Ｔ，Ｈｕａｎｇ  Ｅ，Ｙｕｅｎ  Ｄ，Ｃｈｅｎ  Ｌ．Ｃｏｒｎｅａｌ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖａｌｖｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２０１４；５５：１８７６−１８８３．
１８．Ｋａｎａｙａｍａ  Ｍ，Ｋｕｒｏｔａｋｉ  Ｄ，Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ａｌｐｈａ９  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｊｏｉｎｔ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１８２：８０１５−８０２５．
１９．Ｙｕｅｎ  Ｄ，Ｇｒｉｍａｌｄｏ  Ｓ，Ｓｅｓｓａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２  ｉｎ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２０１４；５５：３３２０−３３２７．
２０．Ｂｕｓｔｉｎ  ＳＡ，Ｂｅｎｅｓ  Ｖ，Ｇａｒｓｏｎ  ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＭＩＱＥ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ：ｍｉｎｉｍｕｍ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２００９；５５：６１１−６２２．
２１．Ｌｉａｏ  ＹＦ，Ｇｏｔｗａｌｓ  ＰＪ，Ｋｏｔｅｌｉａｎｓｋｙ  ＶＥ，Ｓｈｅｐｐａｒｄ  Ｄ，Ｖａｎ  ＤｅＷａｔｅｒ  Ｌ．Ｔｈｅ  ＥＩＩＩＡ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｉｓ  ａ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ  ａｌｐｈａ  ９ｂｅｔａ  １  ａｎｄ  ａｌｐｈａ  ４ｂｅｔａ  １  ｐｒｏｖｉｄｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｂｙ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００２；２７７：１４４６７−１４４７４．
２２．Ｌｏｃｋ  ＪＧ，Ｗｅｈｒｌｅ−Ｈａｌｌｅｒ  Ｂ，Ｓｔｒｏｍｂｌａｄ  Ｓ．Ｃｅｌｌ−ｍａｔｒｉｘ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ：ｍａｓｔｅｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．２００８；１８：６５−７６．
２３．Ｂａｚｉｇｏｕ  Ｅ，Ｘｉｅ  Ｓ，Ｃｈｅｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ａｌｐｈａ９  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｍａｔｒｉｘ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｄｕｒｉｎｇ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖａｌｖｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ．２００９；１７：１７５−１８６．
【０２３２】
前述の明細書及び実施例は本発明を十分に開示し、可能にするが、これらは、本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の範囲は、本明細書に添付の特許請求の範囲によって定められる。
【０２３３】
すべての刊行物、特許及び特許出願は参照により本明細書に組み込まれる。前述の明細書において、ある特定の実施形態に関して本発明を説明し、例示の目的で多くの詳細を記載したが、本発明は、さらなる実施形態が可能であること、及び本明細書に記載の詳細のいくつかは、本発明の基本原理を逸脱することなくかなり変動し得ることは、当業者に明白である。
【０２３４】
本発明を説明する文脈における用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」ならびに類似した指示物の使用は、本明細書で別段指示がない限り、または明らかに文脈によって否定されない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈される。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特記しない限り、オープンエンド用語（すなわち、「含むが、それらに限定されない」を意味する）として解釈される。本明細書における値の範囲の記述は、本明細書で別段指示がない限り、範囲内に入るそれぞれの別々の値に個々に言及する簡略方法として働くことが単に意図され、それぞれの別々の値は、それらが個々に本明細書に記載されるかのように明細書中に組み込まれる。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書で別段指示がない限り、または明らかに文脈によって否定されない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる実施例または例示的な言葉（例えば、「などの」）の使用は、本発明をよりよく例示することを単に意図し、別段主張されない限り、本発明の範囲を限定しない。本明細書のいかなる言葉も、特許請求していない任意の要素が本発明の実施に不可欠であると示すものとして解釈されるべきでない。
【０２３５】
本発明を実施するための本発明者らが知っている最良の形式を含む、本発明の実施形態が、本明細書に記載される。前述の説明を読めば、これらの実施形態の変形形態が当業者に明らかとなるであろう。本発明者らは、当業者が適宜そのような変形形態を用いることを期待し、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されたもの以外の方法で本発明が実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用可能な法律に許容されるように、本明細書に添付の特許請求の範囲に記載される主題のすべての改変及び均等物を含む。さらに、本明細書で別段指示がない限り、または文脈に明らかに矛盾していない限り、それらのすべての可能な変形形態における上記の要素の任意の組み合わせが本発明に包含される。
【図１】
2020503255.tif 000003
【図２】
2020503255.tif 000004
【図３】
2020503255.tif 000005
【図４】
2020503255.tif 000006
【図５】
2020503255.tif 000007
【図６】
2020503255.tif 000008
【図７】
2020503255.tif 000009
【図８】
2020503255.tif 000010
【図９】
2020503255.tif 000011
【図１０】
2020503255.tif 000012
【図１１】
2020503255.tif 000013
【図１２】
2020503255.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月4日(2019.7.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020503255000001.app
【国際調査報告】
2020503255.tif 000015
2020503255.tif 000016