(57)【要約】  少なくとも１つの対物レンズによって、少なくとも１つの境界面を含む試料領域にレーザー光線を向け、対物レンズは、対物レンズの光軸又は光軸に対して平行な軸上にあって、集束面内にある集束点にレーザー光線を結像する機能を果たし、対物レンズ及び試料領域を、対物レンズの光軸に沿って、互いに対して複数の異なる相対変位位置に相対変位させ、各相対変位位置に関して、顕微鏡カメラの検出面の２次元部分領域のピクセルによって検出される、境界面において反射されて対物レンズを通過するレーザー光線の複数の強度値を捕捉し、各相対変位位置に関して、各最高強度値を確定し、最高強度値の推移を確定し、推移の少なくとも１つの最大値から基準相対変位位置を確定し、基準相対変位位置における試料領域の少なくとも１つの画像を捕捉することを含む、試料領域の画像を撮影する方法及び顕微鏡システムを提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料領域（２）の画像を撮影する方法であって、
少なくとも１つの対物レンズ（３）によって、レーザー光線（１９、１９ａ）を、少なくとも１つの境界面（５９）を含む前記試料領域（２）に向けるステップであって、前記対物レンズは、前記レーザー光線を、集束面（２７、２７ｂ）にあり、特に前記対物レンズの光軸又は該光軸に対して平行な軸上にある集束点に結像する機能を果たすものである、向けるステップと、
前記対物レンズ（３）及び前記試料領域（２）を、前記対物レンズ（３）の前記光軸（１３）に沿って、互いに対して複数の異なる相対変位位置に相対変位させるステップと、
各相対変位位置（Ｚ）に関して、顕微鏡カメラ（８）の検出面（２９）の２次元部分領域（６５）のピクセルによって検出される、前記境界面（５９）において反射されて前記対物レンズ（３）を通過する前記レーザー光線の複数の強度値を捕捉するステップと、
各相対変位位置（Ｚ）に関して、前記部分領域（６５）の捕捉された複数の前記各強度値の各最高強度値を確定するステップと、
前記各最高強度値が前記各相対変位位置（Ｚ）に割り当てられることにより、前記最高強度値の推移（６７）を確定するステップと、
前記最高強度値の前記推移（６７）の少なくとも１つの最大値から、基準相対変位位置（７９）を確定するステップと、
前記基準相対変位位置における前記試料領域の少なくとも１つの画像を捕捉するステップと
を含んでなる方法。
【請求項２】
前記レーザー光線（１９）は、コリメートされた平行な光線束を有し、前記レーザー光線（１９）の前記集束面は、前記対物レンズ（３）の焦点面（２７）と一致する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対物レンズ（３）及び前記試料領域を、第１の距離分解能を用いて、相対距離を最大距離から最小距離まで減少させることによって、互いに対して相対変位させることにより、前記推移に複数の最大値（７３、７５、７７）が含まれるようにするステップと、
前記複数の最大値（７３、７５、７７）に基づいて、前記基準相対変位位置（７９）を第１の基準相対変位位置として確定するステップと、
前記第１の距離分解能よりも高い第２の距離分解能で、第１の基準相対変位位置に向かって前記相対距離を増加させると同時に、前記各更なる相対変位位置における更なる最高強度値（８１）を捕捉するステップと、
前記更なる最高強度値（８１）に基づいて、極大値（８２）の存在を検出するステップと
を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記レーザー光線は、前記対物レンズに向かってコリメートされた平行な光線束（１９）を有し、さらに、前記レーザー光線（１９）の前記集束面は、前記対物レンズ（３）の焦点面（２７）と一致し、
前記方法は、各相対変位位置を、前記更なる最高強度値（８１）に基づいて検出された極大値（８５）が存在する又は存在した最終的な基準相対変位位置として設定することを更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記レーザー光線は、前記対物レンズに向かって収束する光線束（１９ａ）を有し、さらに、前記レーザー光線の前記集束面（２７ｂ）は、前記対物レンズの焦点面（２７）と一致せず、
前記方法は、予め確定された所与の値だけ、前記相対距離を最終的な基準相対変位位置（８５ｆ）まで繰り返し増加させることを更に含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記対物レンズ（３）及び前記試料領域（２）を、前記光軸（１３）に沿って、前記基準相対変位位置の上及び／又は下の最終的な各相対変位位置に、互いに対して相対変位させることと、
前記各最終的な相対変位位置における各画像を捕捉するとともに、前記各画像を記憶することと、
前記各画像に対する各フォーカスメトリックを確定するとともに、最良の前記フォーカスメトリックを有する各画像を選択することと、
を更に含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記レーザー光線（１９）の直径は、前記対物レンズ（３）の開口全体が照明される寸法である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記部分領域は、前記検出器面の１／１０よりも小さく、特に前記検出器面の１／１００よりも小さい、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記対物レンズ（３）と前記検出面（２９）との間の検出光線経路において、レンズ又はレンズ系（６）が配置され、該レンズ又は該レンズ系（６）は、前記対物レンズ（３）の焦点面（２７）を前記検出面（２９）に結像する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの境界面（５７、５９）は、空気に接触せず、
前記試料領域（２）は、有機試料（５１）を含み、該有機試料（５１）は、基板キャリア（４５）上に載置され、液体物質（４９）内に埋設され、カバーガラス（５３）によって覆われ、
さらに、前記カバーガラスの上面（５５）は、第１の境界面を形成し、
前記カバーガラスの下面（５７）は、第２の境界面を形成し、
前記基板キャリア（４５）の前記境界面（５９）は、第３の境界面を形成する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対物レンズ（３）と前記試料領域（２）との間の相対距離を、前記部分領域の前記ピクセルの強度値を捕捉しながら、最大距離を起点としてまず減少させ、
それにより、前記推移には、最初に、該推移の中の第１の極大値（７３）、後続する第２の極大値（７５）、及び最後に第３の極大値（７７）を含み、前記第３の極大値（７７）に基づいて前記基準相対変位位置（７９）を確定する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記基準相対変位位置は、第３の境界面において反射されたレーザー光線が集束して、前記検出面（２９）の前記部分領域（６５）に結像する、相対変位位置（７９）に対応し、
前記画像を撮影するために、前記基準相対変位位置（７９）を、所与の値に基づいて変化又は補正するものである、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１３】
前記レーザー光線（１９）の供給源（１０）と前記対物レンズ（３）との間に、前記対物レンズを通る前記レーザー光線（１９）を反射させるために、ダイクロイック又は非ダイクロイックのビームスプリッタ（１１、１１ａ、１１ｂ）が配置される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ビームスプリッタ（１１ｂ）は、楔形状を有し、前記ビームスプリッタ（１１ｂ）の前面（９１）及び背面（９３）の平面が、特に０．１度〜１度である楔角（α）で交差し、
前記楔角（α）は、前記ビームスプリッタの前面及び背面における反射を重畳させることによって生じる干渉パターンが、前記対物レンズの開口全体にわたって少なくとも１０個の最大値又は最小値を有するように選択されるか、又は、
少なくとも１つの更なる光学素子によって、楔形状を有する前記ビームスプリッタに起因する結像収差を補正するものである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
試料領域（２）の画像を撮影する顕微鏡システム（１００）であって、
レーザー光線（１９、１９ａ）を生成するように構成されたレーザー源（１０）と、
少なくとも１つの対物レンズ（３）であって、
該少なくとも１つの対物レンズ（３）は、前記レーザー光線（１９、１９ａ）を、少なくとも１つの境界面（５９）を含む前記試料領域（２）に向けるように構成され、該対物レンズ（３）は、前記レーザー光線（１９、１９ａ）を、集束面（２７、２７ｂ）にあり、特に該対物レンズの光軸又は該光軸に対して平行な軸上にある集束点に結像する機能を果たし、
該少なくとも１つの対物レンズ（３）は、前記光軸に沿って、前記試料領域（２）に対して、複数の異なる相対変位位置に変位可能である、少なくとも１つの対物レンズ（３）と、
検出面（２９）を有する少なくとも１つの顕微鏡カメラ（８）であって、該顕微鏡カメラは、各相対変位位置（Ｚ）に関して、前記境界面（５９）において反射されて前記対物レンズを通過する前記レーザー光線の複数の強度値を捕捉するように構成され、前記強度値を、顕微鏡カメラ（８）の検出面（２９）の２次元部分領域（６５）のピクセルによって検出する、少なくとも１つの顕微鏡カメラ（８）と、
少なくとも１つのプロセッサ（３３）であって、
各相対変位位置に関して、前記部分領域（６５）の捕捉された前記強度値の各最高強度値を確定し、
前記各最高強度値が前記各相対変位位置（Ｚ）に割り当てられることにより、前記最高強度値の推移（８１）を確定し、
前記最高強度値の推移（６７）の少なくとも１つの最大値（７７）から、基準相対変位位置（７９）を確定し、
前記基準相対変位位置（７９）に接近するために、駆動手段（１５）を調整し、
さらに、前記顕微鏡カメラ又は更なる顕微鏡カメラを用いて、前記試料領域の画像を捕捉するように構成される、少なくとも１つのプロセッサ（３３）と
を備えてなる顕微鏡システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料領域（Probenbereichs）の画像を撮影する方法、特に蛍光画像を撮影する方法に関し、さらに、試料領域の画像を撮影する顕微鏡システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には、光学機器のオートフォーカスの方法が記載されている。特許文献１では、測定光源及び対物レンズが、測定光源から発する実質的に平行な光線束（Strahlenbuendels）を観察対象物に結像し、反射像を生成するように設けられている。さらに、反射像からフォーカス位置を求め、対物レンズを位置決めするために好適な評価及び調整ユニットが設けられている。ここでは、正しいフォーカス位置までの距離に応じて直径が変化する同心円を伴って、画像が撮影される。
【０００３】
特許文献２には、顕微鏡を試料に対して自動でフォーカスし、フォーカスされた試料の画像を撮影する方法及びシステムが開示されている。取得された測定値を分析し、いずれの測定値がピークを有するかを確定する。反射されたレーザー光線の測定値が、対物レンズの位置に対する顕微鏡の光軸に沿った基板の位置の関数としての最大強度を意味するピーク値として理解される。
【０００４】
特許文献３には、３次元試料領域内にある物体を結像する方法及び光学装置が開示されている。特許文献３では、試料領域の深度プロファイルを、光学的コヒーレンス干渉計によって求め、物体点における反射に起因する深度プロファイルにおけるピークを認識し、ピークの光路長位置を確定し、それに基づいて、物体点の幾何学的経路長位置を計算する。最後に、顕微鏡は、幾何学的経路長位置に基づいて、物体を結像するためにフォーカスを合わせる。
【０００５】
従来、顕微鏡画像は、様々な深度位置（Ｚ位置）で撮影され、最適なフォーカス位置は、撮影画像の構造的鮮明さを評価することによって確定されていた。しかしながら、この方法は、比較的時間がかかるため、多数の試料を高スループットで処理することは困難である。
【０００６】
特許文献４に記載の従来技術による解決策では、場合により平面的に拡張されたパターンを、反射境界面等の平面に投影する。次いで、反射されたパターンを、仮想的なマスク領域における画像捕捉ユニットを用いてピクセルごとに評価し、仮想的なマスク内の複数のピクセルの強度値（Intensitaetswerte）を統合することによって、対物レンズと境界面又は試料領域との間のフォーカスの尺度を導き出す。
【０００７】
したがって、従来技術の方法及びシステムは、全ての条件下において、顕微鏡法、特に蛍光顕微鏡法における試料の迅速かつ確実なフォーカスを保証することはできない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】独国特許出願公開第１０２００８０１５８８５号公報
【特許文献２】国際公開第２０１６／１３３７８７号公報
【特許文献３】独国特許出願公開第１０２０１４００２５８４号公報
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１７／００９０１７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、特に３次元試料領域に埋設された物体の迅速かつ確実なフォーカスを保証することができる、試料領域の画像を撮影する方法及び顕微鏡システムが要求される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記要求は、試料領域の画像を撮影する方法又は顕微鏡システムに関する独立請求項の主題によって満たされる。従属請求項は、本発明の特定の実施形態を規定する。
【００１１】
本発明の一実施形態によれば、試料領域の画像を撮影する方法であって、
少なくとも１つの対物レンズによって、レーザー光線を、少なくとも１つの境界面を含む試料領域に向けるステップであって、対物レンズは、レーザー光線を、集束面内にある集束点に結像する機能を果たし、集束面は、焦点面に対して平行であり、特に焦点面と一致し、集束点は、好ましくは対物レンズの光軸又は光軸に対して平行な軸上にあり、集束面は、更に好ましくは、対物レンズの光軸に対して垂直である、ステップと、
対物レンズ及び試料領域を、対物レンズの光軸に沿って、互いに対して複数の異なる相対変位位置に相対変位させるステップと、
各相対変位位置に関して、顕微鏡カメラの検出面の２次元部分領域のピクセルによって検出される、境界面において反射されて対物レンズを通過するレーザー光線の複数の強度値を捕捉するステップと、
各相対変位位置に関して、部分領域の検出された複数の各強度値の各最高強度値を確定するステップと、
各最高強度値が各相対変位位置に割り当てられることにより、最高強度値の推移を確定するステップと、
最高強度値の推移の少なくとも１つの極大値から、基準相対変位位置を確定するとともに、好ましくは基準相対変位位置に接近させるステップと、
好ましくは顕微鏡カメラの検出器面又は更なる顕微鏡カメラの検出器面の読取りによって、基準相対変位位置における試料領域の少なくとも１つの画像を捕捉するステップと
を含んでなる方法を提供する。
【００１２】
以下、本発明に係る方法及び本発明に係る装置の１つ以上の利点が読み手に理解されるように、より詳細な説明を行う。
【００１３】
対物レンズは、平行な光線経路又はコリメートされた平行な光線束として、レーザー光源に向いた対物レンズの光学的開口内へと入射するレーザー光線を、対物レンズの他方の側にある対物レンズの焦点面の一点に投影するように構成される。この点は、焦点とすることができ、又は、光線束が対物レンズの光軸を中心に正確に対称となっていない場合、焦点面において焦点からオフセットされた点となり得る。焦点面におけるちょうどこの点から、特に焦点から、対物レンズに再び入射するレーザー光線は、再び、開口側又は光学側で、レーザー源又は顕微鏡カメラに向かって平行な光線経路を形成する。
【００１４】
したがって、例えば、レーザー光線がコリメートされた平行な光線束である場合、対物レンズは、レーザー光線を、その全体強度で、対物レンズの焦点面における一点、特に焦点に投影する。この点、特にこの焦点から対物レンズによって受光され、対物レンズの他の側において平行なコリメートされた光線経路へと集束する光線経路は、対物レンズの下流に配置されるレンズ、好ましくは円筒レンズによって、検出面又は顕微鏡カメラが配置される結像点に投影することができる。
【００１５】
また、レーザー光線が平行な合成光線経路である場合、レーザー光線は、対物レンズによって焦点面の一点に投影され、この点は、焦点とすることができるか、又は焦点面において焦点からオフセットされた点とすることができる。これにより、レーザー光線の最大光学強度は、焦点面におけるこの点に存在する。したがって、この場合、又はこの例において、集束面と焦点面とは一致する。相対変位位置を変化させることで、試料領域の境界面がちょうど焦点面にくる場合、焦点面の点に投影されるレーザー光線は、再び対物レンズへと反射される。したがって、対物レンズ及び円筒レンズは、検出器面又は顕微鏡カメラにこの反射を結像する機能を果たす。したがって、検出器面の部分領域には、特に高い強度を有する少なくとも１つのピクセル又は少数のピクセルが存在する。これにより、部分領域において、特に有利な方法で、試料領域のフォーカスの尺度を得るために、部分領域内の最高強度値を簡単に考慮することができる。したがって、本明細書に記載のレーザー光線を使用することにより、部分領域のしばしば多数となる強度値を更に処理又はフィルタリングする必要はなく、対応する相対変位位置に対応する部分領域内の最高強度値がいずれであるかを確定するだけでよい。ここでは、いずれのピクセルが強度値の最大値を検出したかは重要ではないため、この方法は、特に高速となる。試料領域が対物レンズに対して別の相対変位位置に更に変位されると、レーザー光線の反射は、これまで焦点面における点及び特に焦点であった単一の点において起こるのではなく、試料領域又は境界面の平面的な領域で反射が起こる。したがって、これにより、レーザー光線の光学的強度は、レーザー光線が焦点面の単一の点のみで反射された場合よりも、部分領域のより大きな領域にわたって分散される。したがって、検出器面又は顕微鏡カメラ上の部分領域内にも、レーザー光線の光学的強度全体の合計を表す又は表すことができる強度値が生じる。ただし、この最高強度値は、レーザー光線が境界面によってちょうど焦点面の一点で反射される構成における最高強度値よりは小さくなる。したがって、部分領域又はそのピクセルを評価することによって、例えば絞りを用いて、反射パターンの正確なフィルタリング除去を考慮する必要はなく、各相対変位位置に対する最高強度値を評価することにより、特に高い空間分解能で、特に簡単かつ迅速なフォーカス又は基準相対変位位置の確定が可能になる。複数の境界面が存在する場合、基準相対変位位置を求めるために、最高強度値の推移を用いて、例えば第３の境界面を検出することができる。したがって、これにより、本方法の感度を高めることができ、深度方向における結像されるレーザー光線の広がりを、光学系の被写界深度と実質的に同じにすることができる。
【００１６】
レーザー光線がレーザー光源から対物レンズの開口に向かって収束する場合、レーザー光線は、対物レンズの焦点面と一致しないが焦点面に対して平行な集束面にある集束点に集束する。この場合、集束面は、対物レンズの光軸に対して垂直に延在する。また、境界面におけるレーザー光線の反射を、上述のように、部分領域の最高強度値を観察することによって検出する場合、境界面は、集束面にあるが、対物レンズの焦点面ではなく、特に焦点面よりも対物レンズに対していくらか近くにある。対物レンズに入射するレーザー光線の収束角が既知であるために、集束面と焦点面との間のこのオフセットが既知である場合、このオフセットを、記憶された又は所与の値として用いて、焦点面に向かって試料領域の最終的なフォーカスをもたらすことができる。これは、最初に、最高強度値の推移の複数の最大値に基づいて、第１の比較的粗い距離分解能で基準相対変位位置を推定し、次に、相対変位を方向転換した後、対物レンズ及び試料領域を、もう一度、第２のより細かい距離分解能で互いに対して位置決め又は変位させる場合に特に有利であり得る。より高い距離分解能でのこの二度目の変位の間、推移の中の決定的な最大値を再度検出する場合、高い精度を有する最大値の存在は、二度目の変位中、少なくとも２つの連続する最高強度値が現在の変位方向において負の一次導関数を示す場合に初めて検出することができる。また、相対変位の間の方向転換を必要とすることなく、焦点面における試料領域の実際のフォーカスに向けて試料領域を対物レンズに対して最終的に位置合わせするために、集束面と焦点面との間の上述した既知の光学的オフセットを利用することができる。相対変位中に方向転換が行われる場合、対物レンズ及び／又は試料領域の機械的ガイド部材の位置合わせ公差により、対物レンズと試料領域との間の実際に所望される相対位置に誤差が出るような影響がもたらされる場合がある。そのような位置合わせ公差は、運動機構のバックラッシュと称することもある。集束面と焦点面とが一致しない本明細書に記載の変形形態によって、上述の方向転換が不要となり、それにより、位置合わせ公差の悪影響を回避することができる。
【００１７】
一実施形態によれば、レーザー光線は、コリメートされた平行な光線束を含み、レーザー光線の集束面は、対物レンズの焦点面と一致する。特に、集束点は、対物レンズの焦点と一致することが好ましい。特に、レーザー光線の断面直径は、対物レンズの開口と実質的に同じである。
【００１８】
本願では、焦点面という用語は、焦点距離面という用語で呼ぶ場合もある。
【００１９】
一実施形態によれば、提案される方法は、
第１の距離分解能を用いて、対物レンズと試料領域との間の相対距離を最大距離から最小距離まで減少させることによって、対物レンズ及び試料領域を互いに対して相対変位させることにより、推移に複数の最大値が含まれるようにするステップと、
複数の最大値に基づいて、基準相対変位位置を第１の基準相対変位位置として確定するステップと、
第１の距離分解能よりも高い第２の距離分解能で、第１の基準相対変位位置に向かって相対距離を増加させると同時に、各更なる相対変位位置における更なる最高強度値を捕捉するステップと、
更なる最高強度値に基づいて、極大値の存在を検出するステップと
を更に含む。
【００２０】
一実施形態によれば、レーザー光線は、対物レンズに向かってコリメートされた平行な光線束を有し、さらに、レーザー光線の集束面は、対物レンズの焦点面と一致する。この場合、更なる最高強度値に基づいて検出された極大値が存在する又は存在した相対変位位置を、最終的な基準相対変位位置として設定する。
【００２１】
一実施形態によれば、レーザー光線は、対物レンズに向かって収束する光線束を有し、さらに、レーザー光線の集束面は、対物レンズの焦点面と一致しない。この場合、予め確定された所与の値だけ、相対距離を最終的な基準相対変位位置まで繰り返し増加させる。したがって、集束面は、この実施形態では、対物レンズの焦点面とは一致せず、焦点面に対して平行である。集束面は、光軸に対して垂直に延在する。
【００２２】
顕微鏡カメラ又は更なる顕微鏡カメラの検出面のピクセルを読み取る前に、レーザー光線の供給源を停止させることができ、試料の蛍光光線を励起するために、蛍光源を起動することができる。
【００２３】
レーザー光線は、可視及び／又は不可視の波長域の電磁放射線（例えば、赤外線、紫外線）を含むことができる。
【００２４】
本方法は、本発明の一実施形態に係る顕微鏡システムによって実行することができる。
【００２５】
試料領域は、２つの横方向に拡張されるとともに、それらの方向に垂直の深度方向に拡張されている、３次元に拡張された試料領域とすることができる。特に、試料領域内の特定の深度に、（生体）試料を配置することができ、この試料のフォーカスされた画像、特に蛍光画像が撮影される。したがって、この方法（及び顕微鏡システム）は、特に自己免疫診断において、免疫蛍光標本の評価に使用することができる。特に、この方法及び顕微鏡システムは、間接法免疫蛍光検査（ＩＩＦＴ）を補助することができる。この方法により、試料の迅速なフォーカスが必要とされる、検出される試料の迅速な処理を保証することができる。
【００２６】
対物レンズは、対物レンズの光軸に沿って連続して配置することができる、１つ以上のレンズを含むことができる。対物レンズは、例として、１０倍、２０倍、又は例えば４０倍の拡大率を提供し、例として、０．３〜０．８の開口数を有することができる。画像を撮影するために最終的に使用される試料領域からの光は、可視光、例えば、緑色光、赤色光、及び／又は青色光を含み、特に、蛍光励起後の蛍光放射によって、試料領域から放射することができる。
【００２７】
また、試料が顕微鏡の物体面において鮮明に結像される（深度）範囲、いわゆる被写界深度は、対物レンズの開口数ＮＡに依存する。また、被写界深度ｔｗと、結像される光スペクトルの焦点波長λ０と、開口数ＮＡとの間には、以下の関係がある。
ｔｗ＝λ０／ＮＡ２
【００２８】
被写界深度は、例えば、５００ｎｍ〜６０００ｎｍ、特に７００ｎｍ〜１１００ｎｍとすることができる。本発明の実施形態は、対物レンズの被写界深度と実質的に同じ精度で基準相対変位位置を確定することができる。したがって、確実なフォーカスを保証することができる。
【００２９】
対物レンズと試料領域とを相対変位させるために、対物レンズ及び／又は試料領域を変位させることができる。この場合、対物レンズと試料領域との間の距離が変化し、対物レンズと試料領域との相対移動が起こる。この方法は、プロセッサによって駆動手段を制御することによって行うことができ、駆動手段は、対物レンズ及び／又は試料領域の位置を変化又は変位させる。
【００３０】
対物レンズと試料領域とを相対変位させる（又はＺ方向、すなわち深度方向に沿って移動させる）ために、例えば、試料領域を、固定された対物レンズに対して移動させることができるか、又は、対物レンズを、固定された試料領域に対して（Ｚ方向、すなわち深度方向において）移動させることができる。
【００３１】
使用されるレーザー装置は、例えば、可視の赤色波長域の発光スペクトルを有することができる。特に、このレーザー光線は、試料領域の画像を撮影するように意図された波長に重なる波長を有することができる。例えば、レーザー光線の波長は、蛍光顕微鏡法において検出される発光スペクトルに重なることができる。したがって、一方では画像のフォーカス及び他方では画像の意図された撮影を補助するために、１つのみの（単一の）顕微鏡カメラを必要とすることが好ましい。レーザー光線は、例えば、ビームスプリッタを用いて、対物レンズの光線経路に結合することができる。レーザー光線の断面の大きさは、対物レンズの入射領域（又は開口若しくは瞳開口）の直径と実質的に同じとすることができることが好ましい。
【００３２】
少なくとも１つの境界面は、例えば、平坦な境界面、例えば、固体物質と空気との間、固体物質と液体との間、又は固体物質と（有機）試料との間の境界面とすることができる。少なくとも１つの境界面の存在により、フォーカスが容易になり、又はフォーカスの信頼性を高めることができる。
【００３３】
従来、顕微鏡カメラ又は更なる顕微鏡カメラは、画像を撮影するために設けることができ、ここでは、画像は、顕微鏡カメラの検出面のピクセルの強度値の合算によって形成することができる。しかし、フォーカス（特に基準相対変位位置の確定）には、顕微鏡カメラの検出面全体の２次元部分領域のピクセルのみが必要とされ、すなわち読み取られ、部分領域外の検出面の残りのピクセルを時間のかかる方法で読み取る必要はない。これにより、この方法は迅速に行うことができる。２次元部分領域は、例えば、２４４０×２０４８ピクセルの好ましい検出器面において１６×１６ピクセルとなるサイズを有することができ、これは、特に、検出器面の約０．００５％に相当する。
【００３４】
対物レンズの物体側焦点面の一点、特に焦点から異なる方向に発するレーザー光線は、対物レンズによって屈折して平行な光線になり、そのため、焦点面の視点からは、対物レンズの後ろ（又は光路の下流）に、平行な光線束が存在する。対物レンズの下流にあるレンズ（例えば、円筒レンズ等）は、この更なるレンズの像側の焦点面における一点に平行光線を集める。また、この更なるレンズの像側の焦点面に、顕微鏡カメラの検出面がある。検出面は、例えば、感光セル、例えばＣＣＤ又はＣＭＯＳ感光セルのアレイ又は視野（特に、２次元視野）とすることができる。
【００３５】
部分領域の所定の面積の大きさは、実質的に、対物レンズの物体側焦点面における特定の点から異なる方向に放射される光のみが、所定の面積のピクセルによって検出されることを確実にするように、特に選択することができることが好ましい。したがって、対物レンズの物体面以外からの光を検出から除外することができる。所定の面積の大きさは、例えば、数平方マイクロメートルとすることができる。
【００３６】
対物レンズと試料領域との間の距離を、個別の相対変位位置に沿って深度方向に変化させる間、同時に、２次元部分領域のピクセルの強度値が読み取られる。次いで、各相対変位位置（すなわち、対物レンズと試料領域との間の各距離）に関して、ピクセルの強度値の最高強度値が確定される。したがって、各相対変位位置に関して、部分領域のただ１つのピクセルの値が最高強度値として確定される。
【００３７】
このようにして確定された各最高強度値は、適切な相対変位位置（すなわち、対物レンズと試料領域との間の距離）に割り当てられる。したがって、多数の異なる相対変位位置に関して多数の最高強度値が確定される。ここでは、異なる相対変位位置に関して得られる推移は、複数の極大値又は大域的最大値を含むことができる。極大値及びまた大域的最大値は、境界面のうちの１つにおけるレーザー光線の反射を各々示すことができる。また、基準相対変位位置は、例えば、対物レンズと試料領域との間の距離に対応することができ、この距離において、レーザー光線は、試料領域内の特定の境界面に、特に、以降はバイオチップとも称する基板キャリア（特にバイオチップの表面）と被覆媒体（又は埋設媒体）との間の境界面に集束する。また、基準相対変位位置を求めることにより、画像を撮影するための相対変位位置を設定することが容易になり得る。例えば、画像は、基準相対変位位置の設定において撮影することができる。次いで、基準相対変位位置の周りの位置において、例えば、対物レンズと試料領域との間の距離がいくらか（数マイクロメートル）大きくなる（及び／又は小さくなる）他の相対変位位置において、更なる画像を撮影することができることが好ましい。試料領域内に配置された試料の性質及び幾何形状に関する更なる知識により、画像を撮影する相対変位位置を、基準相対変位位置を起点として適切に調整することを容易にすることができる。
【００３８】
基準相対変位位置を確定するために、対物レンズ及び試料領域の相対変位の間に、多数の部分画像を撮影することができ、各最高強度値に関する評価を連続的に行うことができることが好ましい。この場合、例えば、毎秒数千の部分画像を撮影することができる。露光時間は、マイクロ秒領域とすることができる。２つの部分画像間の深度方向の段階幅は、２００ｎｍ〜１０００ｎｍ、特に約５００ｎｍとすることができる。２つの部分画像間の段階幅は、顕微鏡の被写界深度よりも大きくてはならない。
【００３９】
これにより、画像を撮影するための確実なフォーカスを保証することができ、迅速なフォーカス確定に起因する高スループットを保証することができる。
【００４０】
一実施形態によれば、本方法は、
対物レンズ及び試料領域を、光軸に沿って、基準相対変位位置又は最終的な基準相対変位位置の上及び／又は下の各最終的な相対変位位置に、互いに対して相対変位させるステップと、
第１の顕微鏡カメラ又は更なる顕微鏡カメラを用いて、各最終的な相対変位位置における各画像を捕捉するとともに、各画像を記憶するステップと、
各画像に対して各フォーカスメトリック（Fokusmetriken）を確定するステップと、
最良のフォーカスメトリックを有する画像を選択するステップと
を更に含む。最良のフォーカスメトリックを有しない他の画像は、破棄されることが好ましい。これにより、画像が直接記憶されるため、ユーザが観察したり調整を行ったりする必要なく、フォーカスが最適となる画像を自動的に取得することが可能になる。また、本方法の最後に、顕微鏡を、対物レンズ及び試料領域が互いに対して最適に位置合わせされる動作状態にする必要はなく、画像は、後の時点でメモリから呼び出すことができる。ここで述べたフォーカスメトリックは、以下の演算子、すなわち、マー−ヒルドレス演算子（Marr-Hildreth-Operator）、ＬｏＧ（Laplacian-of-Gaussian）、及びＤｏＧ（Difference-of-Gaussian）のうちの１つ以上に基づくことができることが好ましい。
【００４１】
一実施形態によれば、レーザー光線の直径は、対物レンズの開口全体を照明するような寸法になっている。
【００４２】
一実施形態によれば、部分領域は、検出器面の１／１０よりも小さく、特に検出器面の１／１００よりも小さい。好ましくは、部分領域は、５０×５０ピクセルよりも小さく、特に２０×２０ピクセルよりも小さい。
【００４３】
本発明の一実施形態によれば、本方法は、部分領域が、３５０μｍ２〜６４００μｍ２、特に７５０μｍ２〜１３００μｍ２の大きさを有し、特に１６×１６ピクセルを形成するように構成される。ここで、検出面は、特に、部分領域の大きさの１０倍〜１００倍の大きさを有する。選択される部分領域が小さいほど、方法をより迅速に実行することができる。
【００４４】
一実施形態によれば、対物レンズと検出面との間の検出光線経路には、対物レンズの焦点面を検出面に結像するレンズ、特に円筒レンズが配置される。対物レンズの後ろ（又は光路の下流）には、平行な光線経路が存在することができ、平行光線は、円筒レンズによって像側の焦点面に結像することができる。したがって、円筒レンズに対する対物レンズの変位は、円筒レンズの像側の焦点面に平行光線を結像するのに影響を与えない。したがって、対物レンズの焦点面における特定の共通の点、特に焦点から異なる方向に発する光線のみが、検出面の部分領域内の特定の点に到達する。したがって、所定の面積の大きさを適切に選択することにより、散乱光（対物レンズの物体側の焦点面における一点以外から異なる方向に発する）を、フォーカスのための検出から除外することができる。
【００４５】
本発明の一実施形態によれば、本方法は、少なくとも１つの境界面、特に２つの境界面が、空気に接触しないように構成され、試料領域は、特に有機試料を含み、有機試料は、バイオチップに載置され、液体物質に埋設され、カバーガラスによって覆われ、さらに、特に、カバーガラスの上面は、第１の境界面を形成し、カバーガラスの下面は、第２の境界面を形成し、バイオチップの表面は、第３の境界面を形成する。有機試料は、例として、例えば染色された及び／又は１つ以上の蛍光マーカー若しくは蛍光分子と混合された組織学的試料を含むことができる。蛍光マーカー又は蛍光分子は、有機試料における所定の位置又は受容体又は抗原に結び付くことができる。液体物質は、例えばグリセリンを含むことができる。有機試料は、例えば、湿った有機試料である場合があり、この場合、試料が乾燥することを防ぐことができる。本発明の実施形態は、液体内に（３次元的に、すなわち、実質的に全ての側が）埋設された有機試料を結像することを可能にする。境界面は、境界面の上下の屈折率の変化によって特徴付けることができる。例えば、液体媒体と固体媒体との間の境界面では、空気から固体媒体、例えばガラスへの境界面の場合よりも、屈折率の変化が少ない場合がある。境界面における屈折率の変化が小さいほど、境界面における反射率も小さくなり得る。本発明に係る方法を用いると、第３の境界面における反射が比較的少ないにもかかわらず、この反射を検出することができる。
【００４６】
本発明の一実施形態によれば、本方法は、対物レンズと試料領域との間の相対距離を、部分領域のピクセルの強度値を捕捉しながら、最大距離を起点としてまず減少させ、それにより、特に、最初に、第１の境界面からのレーザー光線の反射による第１の極大値が生じ、その後、第２の境界面からのレーザー光線の反射による第２の極大値が生じ、最後に、第３の境界面からのレーザー光線の反射による第３の極大値が生じることを検出するように構成される。第１の極大値は、相対変位位置に応じた最大値の推移の大域的最大値とすることができる。３つの最大値（極大値）の全てが、相対変位位置に応じた最大値の推移の中で検出されるため、フォーカスの信頼性を向上することができる。最大値（極大値）は、相対変位位置に応じた最大値の推移内で、例えば、ピクセルの強度の所定の閾値を超えた場合に確定することができる。閾値は、例えば、事前に検出された最大値（極大値）から導出することができる。第１の極大値は、第２の極大値よりも大きいものとすることができ、第２の極大値は、さらに、第３の極大値よりも大きいか、又は実質的に第３の極大値と同じ大きさとすることができる。この一連の最大値が検出される場合、境界面の識別の信頼性、ひいてはフォーカスの確定を向上することができる。この場合、基準相対変位位置は、第３の最大値に基づいて確定される。
【００４７】
本発明の一実施形態によれば、本方法は、基準相対変位位置が、第３の境界面、特にバイオチップの表面において反射するレーザー光線が検出面の部分領域に集束して結像される相対変位位置に対応するように構成される。特に、画像を撮影する相対変位位置は、試料に関する既知の知識から、基準相対変位位置を起点として調整される。例えば、（バイオチップ上の）試料の厚さは、少なくともおおよそ既知とすることができ、所与の値として設定することができる。試料タイプ又は基板タイプを好適なものにするために、例えば、対物レンズと試料領域との間の距離を、基準相対変位位置（バイオチップの表面が対物レンズの焦点面にある）を起点として、所与の値に応じて、例えば、数マイクロメートル（試料の既知の厚さによる）だけ、変更又は補正することができる。そして、補正された基準相対変位位置の周りにある変位位置において、更に複数の画像を撮影することができることが好ましい。
【００４８】
本発明の一実施形態によれば、本方法は、レーザー光線の供給源と対物レンズとの間に、対物レンズを通るレーザー光線を反射させるために、ダイクロイック又は非ダイクロイックのビームスプリッタが配置され、特に、レーザー光線の反射率が５％〜２０％であるように構成される。したがって、レーザー光線は、対物レンズの光線経路に簡単な方法で結合することができる。したがって、レーザー光線の反射率が比較的小さい場合、例えば、実質的に１０％である場合、画像の撮影のために意図された光の僅かな部分のみを、顕微鏡カメラによる検出から除外することもできる。別の実施形態において、試料領域の画像が撮影される場合、ビームスプリッタを光線経路から排除することもできる。
【００４９】
本発明の一実施形態によれば、本方法は、ビームスプリッタが楔形状を有するように構成され、ビームスプリッタの前面及び背面の平面が、特に、例えば０．１度〜１度である楔角で切断され、楔角及び部分領域の大きさは、特に、ビームスプリッタの前面又は背面から反射した後、及び試料領域から反射した後のレーザー光線の反射のみが、部分領域に結像されるように選択される。楔形状を有するビームスプリッタにより、平面プレートとして形成されるビームスプリッタでは前面及び背面における反射によって発生する可能性がある干渉が生じることを回避することができる。フォーカスのために、特に、楔形状のビームスプリッタの前面において反射するレーザー光を用いることができる。楔形状のビームスプリッタの背面において反射するレーザー光は、対物レンズの物体側焦点面において、横方向の異なる場所に集束する。顕微鏡カメラの検出面の２次元部分領域の大きさ及び位置を好適に選択することによって、光線形状のビームスプリッタにおいて反射するこのレーザー光線を、検出から除外することができる。したがって、本方法は、更に向上させることができる。部分領域は、検出器面の全てのピクセルを含むことが好ましい。
【００５０】
本発明の一実施形態によれば、本方法は、基準相対変位位置を確定するために、部分領域のピクセルの強度値を、対物レンズ及び試料領域の相対変位の間、１秒間に１０００回〜１００００回読み取るように構成される。
【００５１】
試料領域の画像を撮影する方法に関連して個々に又は任意の組合せで記載される特徴は、本発明の実施形態によれば、試料領域の画像を撮影する顕微鏡システムにも個々に又は任意の組合せで使用することができることが理解されたい。
【００５２】
本発明の一実施形態によれば、試料領域の画像を撮影する顕微鏡システムであって、
レーザー光線を生成するように構成されたレーザー源と、
レーザー光線を、少なくとも１つの境界面を含む試料領域に向けるように構成された少なくとも１つの対物レンズであって、対物レンズは、さらに、レーザー光線を、焦点面に対して平行であり、好ましくは焦点面と一致する集束面内にあり、好ましくは対物レンズの光軸又は光軸に対して平行な軸上にある集束点に結像する機能を果たし、さらに、対物レンズは、光軸に沿って、試料領域に対して複数の異なる相対変位位置に変位可能である、少なくとも１つの対物レンズと、
さらに、検出面を有する少なくとも１つの顕微鏡カメラであって、顕微鏡カメラは、各相対変位位置に関して、境界面において反射されて対物レンズを通過するレーザー光線の複数の強度値を捕捉するように構成され、強度値は、顕微鏡カメラの検出面の２次元部分領域のピクセルによって検出される、少なくとも１つの顕微鏡カメラと、
少なくとも１つのプロセッサであって、各相対変位位置に関して、部分領域の捕捉された強度値の各最高強度値を確定するように構成され、さらに、各最高強度値が各相対変位位置に割り当てられることにより、最高強度値の推移を確定するように構成され、さらに、最高強度値の推移（６７）の少なくとも１つの極大値から基準相対変位位置を確定するように構成され、さらに、基準相対変位位置に接近するために駆動手段（１５）を調整するように構成され、さらに、顕微鏡カメラ又は更なる顕微鏡カメラによって、試料領域の画像を捕捉するように構成される、少なくとも１つのプロセッサと
を備えてなる顕微鏡システムを提供する。
【００５３】
以下、本発明の実施形態を、添付図面を参照して説明する。本発明は、記載又は図示の実施形態に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の一実施形態に係る顕微鏡システムの概略側面図である。
【図２】図１に示されている顕微鏡システムを使用して画像を撮影することができる試料を有する試料領域の概略側面図又は側面断面図である。
【図３】顕微鏡カメラによって撮影された画像の一例を示す図である。
【図４】図４ａ、図４ｂおよび図４ｃは、異なる相対変位位置において記録された部分画像を有する、顕微鏡カメラの検出面の部分領域の一例を示す図である。図４ｄは、部分領域内の所定の面積の一例を示す図である。
【図５】方法の一実施形態に従って確定される、相対変位位置に応じた最高強度値の推移を示す図である。
【図６】方法の一実施形態に従って確定される、相対変位位置に応じた最大値の推移における極大値の更なる一例を示す図である。
【図７】本発明の一実施形態に係る顕微鏡システムの、プレート形状のビームスプリッタの領域の概略側面断面図である。
【図８】本発明の一実施形態に係る顕微鏡システムの一部の、楔形状のビームスプリッタの領域の概略側面断面図である。
【図９】対物レンズの焦点面と一致しない集束面にレーザー光線が集束する、本発明に係る顕微鏡システムの実施形態を示す図である。
【図１０】図１０ａおよび図１０ｂは、異なる光学面における境界面でのレーザー光線の反射を示す図である。
【図１１】図１１ａ、図１１ｂ、図１１ｃおよび図１１ｄは、本発明に係る方法の一実施形態を実施する場合の試料領域の異なる位置を示す図であり、ここでは、レーザー光線の集束面が対物レンズの焦点面に対してオフセットされている。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
図１の概略側面断面図に示されている顕微鏡システム１００は、対物レンズ３を備え、対物レンズ３は、対物レンズの光軸１３に沿って試料領域２に対して変位可能である。通常、対物レンズ３及び試料領域２は、光軸１３に沿って互いに対して相対的に変位可能とすることができる。このために、対物レンズ３が固定されている一方で、顕微鏡テーブル１（又は対物レンズ３）を矢印方向１７（すなわち、Ｚ方向又は鉛直方向）に沿って変位させるか、又は、顕微鏡テーブル１が固定されている一方で、対物レンズを変位させるように構成された、駆動手段１５が設けられる。顕微鏡システム１００は、対物レンズ３を通して試料領域２に向けられるレーザー光線１９を生成するように構成されたレーザー装置１０を更に備える。レーザー光源又はレーザー装置１０は、コリメート光学系１０ａを備え、コリメート光学系１０ａによって、レーザー光線を、平行なコリメートされた光線束へと形成することができる。コリメート光学系１０ａは、レーザー光線を、収束した光線束として形成するために調整可能であることが好ましい。図２に関して以下で更に説明するように、試料領域は、少なくとも１つの境界面を含む。レーザー光線１９を対物レンズ３に通して導くために、ビームスプリッタ１１が更に設けられる。対物レンズ３は、レーザー光線を集束点に結像する機能を果たす。集束点は、対物レンズの光軸又はこの光軸に対して平行な軸上にあり、かつ集束面内にある。集束面は、対物レンズの焦点面に対して平行であり、好ましくは焦点面と一致する。集束面は、対物レンズ３の光軸に対して垂直に延在する。
【００５６】
一実施形態において、レーザー光線１９の集束面は、対物レンズの焦点面と一致する。特に、集束点は、対物レンズの焦点と一致することが好ましい。すなわち、集束点は、焦点面内にあることが好ましい。この場合、レーザー光線１９は、図１に示されているように、コリメートされた平行な光線束を有することが好ましい。レーザー光線１９の断面直径ｄは、ここでは、レーザー光線１９が対物レンズ３に入射する位置における対物レンズ３の開口と実質的に同じであることが好ましい。換言すれば、レーザー光線１９の直径ｄは、レーザー光線１９が対物レンズ３に入射する位置における対物レンズ３の開口全体を照明するような寸法となっている。
【００５７】
更なる一実施形態において、図９に関して更に後述するように、レーザー光線は、対物レンズに向かって収束する光線束を有する。この場合、レーザー光線の集束面は、対物レンズの焦点面とは一致せず、特に、集束点は、対物レンズの焦点と一致しないことが好ましい。この場合、レーザー光線の集束面は、対物レンズの焦点面よりも、対物レンズに対する距離が小さいことが好ましい。ただし、ここでも、集束面は、対物レンズ３の光軸に対して垂直に延在する。集束面は、ここでも、焦点面に対して平行に延在する。
【００５８】
図１の顕微鏡システム１００は、検出面２９を有する少なくとも１つの顕微鏡カメラ８を更に備える。顕微鏡カメラ８は、検出面の２次元部分領域のピクセルによって検出される、試料領域２から反射されて対物レンズ３を通過するレーザー光線１９の強度値を捕捉するように構成される。ここで図１に示されている顕微鏡システムの実施形態１００において、対物レンズ３及び円筒レンズ６を通過した赤色光を偏向するために、顕微鏡カメラ８に、赤色成分を有する光を反射するフィルタセット７が設けられる。このために、赤緑チャネル分離（Rot-Gruen-Kanaltrennung）を行うフィルタセット７が設けられる。特に、フィルタセット７は、半透性ミラー２１及び赤色フィルタ２３を備える。赤色フィルタ２３は、赤色波長帯域外の波長を除去し、所望の赤色帯域の波長のみを顕微鏡カメラ８の検出面２９に入射させるようになっている。
【００５９】
フィルタセット７は、所望の緑色帯域のみを、好ましくは存在する第２の顕微鏡カメラ９へと通過させる緑色フィルタ２５を更に備えることが好ましい。第２の顕微鏡カメラ９は任意のものであり、他の実施形態では、単一の顕微鏡カメラのみを設ければよい。フィルタセット７も任意であり、他の実施形態ではなくてもよい。これらの実施形態では、第２の顕微鏡カメラ９の代わりに顕微鏡カメラ８を、光軸１３に沿って配置することができる。ただし、特定の蛍光観察では、異なる２つの顕微鏡カメラ又は検出チャネルによって、複数の蛍光体の蛍光を別々に撮影することが有利であり得る。
【００６０】
顕微鏡システムは、光線経路において対物レンズ３と顕微鏡カメラ８との間に配置され、対物レンズ３とともに対物レンズ３の焦点面２７を顕微鏡カメラ８の検出面２９に結像する、（図１に概略的に示されている）レンズ６、特に円筒レンズ、又はレンズ系６を更に備える。特に、対物レンズ及びレンズ６は、対物レンズの焦点面の焦点を、検出面２９が存在する像面の像点に結像する機能を果たす光学系をともに形成する。顕微鏡カメラ８の検出面２９は、レンズ６の焦点面３１にある。
【００６１】
システム１００は、各相対変位位置に関して、境界面において反射されて対物レンズを通過するレーザー光線の複数の強度値を捕捉することができる。ここでは、顕微鏡カメラ８の検出面２９の２次元部分領域のピクセルの強度値が検出される。
【００６２】
顕微鏡システム１００は、各相対変位位置に関して、部分領域６５の捕捉される強度値の各最高強度値を確定するように構成されたプロセッサ３３を更に備える。このようにして確定された最高強度値は、対応する相対変位位置に割り当てられ、そうした各相対変位位置に対する各最高強度値から、最高強度値の推移が確定されるようになっている。そして、最高強度値の推移の特に少なくとも１つの極大値から、基準相対変位位置が確定される。ここで、プロセッサは、制御ユニット３７を使用して、基準相対変位位置に接近するために駆動手段１５を制御する。さらに、プロセッサ３３は、顕微鏡カメラ８又は更なる顕微鏡カメラ９によって、試料領域の画像を捕捉する。ここで、プロセッサ３３は、制御装置３７に要求信号３８を送信し、Ｚ方向の特定の位置に調整する要求を出す。
【００６３】
このために、例えばコンピュータ内に備えることができるプロセッサ３３は、顕微鏡カメラ８と通信接続し、特に赤色チャネルにおける、検出面２９の部分領域のピクセルの強度の強度信号３５を捕捉する又は読み取る。また、このカメラ８を介して、特に赤色チャネルにおける試料領域の画像を捕捉するために、プロセッサ３３は、検出面２９のピクセルの強度の強度信号３５を捕捉する又は読み取ることができる。
【００６４】
プロセッサ３３は、特に緑色チャネルにおける、好ましくは検出面２９ａのピクセルの強度の強度信号３５ａを読み取り、試料領域の画像を捕捉するために、更なる顕微鏡カメラ９と更に通信接続することが好ましい。
【００６５】
顕微鏡システム１００は、制御ユニット又は制御装置３７を更に備え、制御ユニット又は制御装置３７は、同様に、プロセッサ３３に接続され（又はプロセッサを備え）、顕微鏡テーブル１（又は対物レンズ３）を変位させるように、制御信号３９によって駆動部１５を制御するように構成される。さらに、独立してＺ位置（すなわち、相対変位位置）を測定し、制御装置３７と通信する測定システムＭＳを設けることができる。
【００６６】
したがって、試料領域２の画像を撮影するために、基準相対変位位置に基づいて、画像を撮影する相対変位位置を確定して調整し、最終的に、顕微鏡カメラ８又は顕微鏡カメラ９によって画像を撮影する。
【００６７】
図２の概略側面断面図においてより大きく詳細が示されているように、試料領域２は、バイオチップが埋め込まれたスライドを備える。試料領域２は、凹部４３を有するプレート形状の構造を有するスライド４１を備える。スライド４１の凹部４３には、バイオチップ４５が配置され、接着剤４７によってスライド４１に取り付けられる。バイオチップ４５の周りでは、凹部４３内にグリセリン４９が充填される。バイオチップ４５上には、（生体）試料５１が配置される。したがって、試料５１は、グリセリン４９内に埋設される。カバーガラス５３は、凹部４３及び凹部４３内にあるグリセリン４９に囲まれた試料５１を覆う。カバーガラス５３は、第１の境界面を形成する上面５５と、第２の境界面を形成する下面５７とを有する。バイオチップ４５の表面５９は、第３の境界面を形成する。特に、この第３の境界面５９は、本発明の一実施形態に係るフォーカス方法において確定される。
【００６８】
レーザー光線１９が対物レンズ３によってバイオチップ４５の表面５９（すなわち、第３の境界面）に集束するとき、基準相対変位位置（対物レンズ３と試料領域２との間の相対的な垂直距離）が得られる。この基準相対変位位置が見つかると、試料５１が、例えば可視光によって照明されるか又は好適な蛍光励起光によって照明される場合、顕微鏡カメラ８の検出面２９の好ましくは全体の読取りによって、１つ以上の画像を撮影することができる。代替的に、ここでは、カメラ９の検出面２９ａが使用される。
【００６９】
図１に示されている実施形態において、相対変位位置（対物レンズ３と試料領域２との間の距離）を変化させるために、対物レンズ３が固定されている一方で、顕微鏡テーブル１が鉛直に変位される。他の実施形態において、顕微鏡テーブル１を固定しておくことができる一方で、対物レンズ３を鉛直に変位させることができる。
【００７０】
試料５１（例えば、蛍光体と混合することができる）の蛍光を励起するために、好適な、例えば青色の発光スペクトルの励起光２０１を生成する光源４（例えば、ＬＥＤ）が用いられる。蛍光フィルタセット５を介して、励起光及び蛍光のスペクトル分離が行われる。対物レンズ３及び円筒レンズ６によって、物体面２７に放射される蛍光が、拡大されて双方の顕微鏡カメラ８、９に結像される。蛍光の光線は、対物レンズ３と円筒レンズ６との間で平行に進む。したがって、対物レンズ３と円筒レンズ６との間の空間は、「無限空間」とも称される。このために、蛍光フィルタセット５は、蛍光励起光２０１を反射する一方で、蛍光は実質的に反射せずに通過させることができる、ダイクロイックミラー６１を備えることができる。
【００７１】
撮像の前に迅速なフォーカスを行うために、レーザー及びカメラに基づくシステムを用いて、顕微鏡撮影前の試料を光学的に測定する。ここでは、バイオチップの表面のピント位置（Schaerfenposition）を確定するために、例えば、レーザー装置１０の可視赤色発光スペクトルを有する光を使用し、その光を、ビームスプリッタプレート１１を用いて対物レンズ３の光軸１３に結合する。この場合、顕微鏡の無限空間（すなわち、光線が互いに平行に進む部分）において結合を行うことができる。ここで、レーザー光線１９は、図示されていない光学系によって、平行な光線束１９へと形成される。この実施形態では、レーザー光線は、コリメートされた平行な光線束を有する。一実施形態において、レーザー光線の集束面は、対物レンズの焦点距離面と一致する。レーザー光線の断面直径は、対物レンズの開口と実質的に同じであることが好ましい。
【００７２】
レーザー光線１９は、蛍光フィルタセット５を透過し、対物レンズ３によって顕微鏡システム１００の物体面２７に集束する。光学的境界面が対物レンズ３のフォーカス面２７にある場合、レーザー光線１９の点形状の反射が生じ、対物レンズ３及び円筒レンズ６を通して、顕微鏡カメラ８に、特に顕微鏡カメラ８の検出面２９に結像される。レーザー光線１９の反射は、カメラの画像における点形状の信号として現れ、その強度は、スライドの材料における境界面の移行部に依存する。
【００７３】
図３は、顕微鏡カメラ８の検出面２９全体によって撮影されるような、点形状のレーザー反射の全体画像を示している。顕微鏡カメラ８によって記録された全体画像６３は、例えば、１０２４×１０２４ピクセルである。
【００７４】
基準相対変位位置（すなわち、バイオチップ４５の表面５９が対物レンズ３の焦点面２７に配置される位置）を確定する方法において、対物レンズ３と試料領域２との間の距離又は相対変位位置を変化させながら、顕微鏡カメラ８の検出面２９全体のピクセルの部分領域のみを読み取る。
【００７５】
さらに、図４ａ、図４ｂ、及び図４ｃは、検出面２９の例示的な部分領域６５ａ、６５ｂ、６５ｃを示し、また、それらの部分領域６５ａ、６５ｂ、６５ｃ内に含まれるピクセルによって検出される強度を、異なる相対変位位置に関するレーザー反射の画像のグレー値として示している。部分領域６５ａ、６５ｂ、６５ｃは、例えば、１６×１６ピクセルで形成することができる。ここで、図４ａ、図４ｂ、及び図４ｃは、対物レンズ３と試料領域２との間の相対距離に関して、ｚ＝−０．５μｍ、ｚ＝０μｍ、及びｚ＝＋０．５μｍの場合に生じる部分画像を示している。バイオチップ４５の表面５９が対物レンズの焦点面２７に配置されると、ｚ＝０μｍの場合の確定すべき基準相対変位位置が得られる。また、各最高強度値Ｇｍａｘも示されている。対物レンズのフォーカス面がスライドにおける対応する境界面から離れる場合（図４ａ、図４ｃを参照）、レーザー信号は、減衰して又は拡大して結像される。図４ａ、図４ｂ、及び図４ｃから、約±５００ｎｍの変位の場合で既に個々のピクセルの出力が著しく低下し、すなわち、ちょうど基準相対変位位置をとる場合、すなわち図４ｂの場合に、部分領域にわたる最高ピクセル強度が最大となることが明らかである。本明細書に記載のシステムを使用することにより、対物レンズの焦点面の焦点にレーザー光線を集束させることで、ｚ位置の特に精密な空間分解能を得ることができる。平面的に広がった全体のパターンが部分領域の複数のピクセルに投影される場合、このパターンは、理想的な集束位置において、ここで用いられるレーザー光線よりも空間的に大きな広がりも有するため、Ｚ方向の空間分解能がより粗く又はより低い精度にもなり得る。さらに、そのようなパターン投影では、本発明に係る方法において可能であるように、部分領域の個々の最高ピクセル強度をフォーカスの尺度として考慮するだけでは不十分であり、複数のピクセルを統合しなければならず、複数のピクセルの共通の分析によって、フォーカスの尺度として平面パターンに関してフォーカスを確定しなければならない。これは、本発明に従って部分領域の個々のピクセルの最高強度を考慮するよりも明らかに時間がかかる。
【００７６】
バイオチップ表面のフォーカス位置（すなわち、バイオチップ４５の表面５９が対物レンズ３の焦点面２７内にある、対物レンズ３と試料領域２との間の相対距離）を確定するため、好ましくは第１の距離分解能又は空間分解能で、顕微鏡テーブル１をＺ方向１７において顕微鏡システム１００のフォーカス面２７を通して動かす。これは、Ｚ方向にモータ駆動される対物レンズマウントを用いて、又は顕微鏡テーブル１の移動によって達成することができる。フォーカスの確定のために、顕微鏡カメラ８による距離分解能又は空間分解能に対応する画像捕捉レートに対するレーザー反射の強度推移がプロットされる。可能な最高画像レートを達成することができるように、僅かな部分領域（例えば、図４ａ、図４ｂ、図４ｃに示されている部分領域６５）のみを読み取り、プロセッサ３３に送信する。例えば、部分領域は、１６×１６ピクセルを有することができ、それにより、１秒あたり数千の画像、例えば約３０００の画像という画像捕捉レートが達成可能である。
【００７７】
図４ｄは、例として、好ましくは使用される所定の面積６６を示しており、この面積６６において、部分領域（例えば、６５ａ、６５ｂ、６５ｃ）にわたる最大値を求めるために、１つ以上のピクセルの強度値が捕捉及び評価される。所定の面積６６は、個々のピクセルの面積にちょうど対応することができるか、又は、所定の面積６６をカバーするために、複数のピクセルをまとめることができる。
【００７８】
特定の相対距離（相対変位位置）に関してプロットされた部分画像の各々について、最高ピクセルグレー値又は最高強度値を求めることができる。制御装置３７において要求信号２８が認識されることによって、プロセッサ３３は、カメラデータ又は強度値を対応する相対変位位置に関連付け、さらに、基準相対変位位置を確定することができる。
【００７９】
図５は、相対変位位置に応じた（各相対変位位置に対する）所定の最高強度値の推移６７の一例を、座標システムにおける曲線６７として示している。横座標６９には、相対変位位置（Ｚ位置）がプロットされ、縦座標７１には、対応する相対変位位置での部分領域における各最高強度値がプロットされる。最低Ｚ値は、ここでは、試料領域が対物レンズから最も遠くなる位置を示し、最高Ｚ値は、ここでは、試料領域が対物レンズに最も近くなる位置を示す。まず、対物レンズと試料領域との間の相対距離を、最大距離から最小距離まで第１の距離分解能で減少させることによって、対物レンズ及び試料領域を互いに対して相対変位させる。ここでは、複数の最大値を含む最高強度値の推移が確定される。この推移には、特に、推移の中の第１の極大値７３と、その後の第２の極大値７５と、最後の第３の極大値７７とが含まれる。
【００８０】
曲線６７は、図２に示されているように試料領域の幾何形状に基づく特徴的な信号パターン（「オートフォーカス信号」）を示している。試料領域２の構造が既知であるので、信号推移６７から、バイオチップ４５のＺ位置、特にバイオチップ４５の表面５９を確定することができる。
【００８１】
曲線６７（オートフォーカス信号）は、第１の境界面５５（カバーガラス５３の上面）におけるレーザー光線１９の反射によって生じる第１の最大値７３を含む。さらに、曲線６７は、カバーガラス５３の下面５７（第２の境界面）からのレーザー光線１９の反射によって生じる第２の最大値７５を含む。最後に、曲線６７は、バイオチップ４５の表面５９（第３の境界面）からのレーザー光線１９の反射によって生じる第３の最大値７７を含む。ここで、バイオチップ表面５９のフォーカス位置又は基準相対変位位置は、第３の信号最大値７７のＺ位置７９の確定によって得られる。
【００８２】
続いて、マイクロコントローラ又は制御装置３７と、対物レンズ３を変位させる駆動手段とを用いて、対物レンズ３は、対物レンズと試料領域との間の距離を広げながら、求められたフォーカス位置又は基準相対変位位置の方向に、再び引き返すことができる。これは、特に、第１の距離分解能よりも高い、すなわち細かい第２の距離分解能を用いて行われる。ここでは、移動の長さは、Ｚ方向における動きと同時に監視及び評価されるオートフォーカス信号によって制御する。この場合、各更なる相対変位位置における各更なる最高強度値を確定し、更なる強度値に基づいて図６の最大値８２の存在を検出する。レーザー光線が、対物レンズに向かってコリメートされた平行な光線束を有し、さらに、レーザー光線の集束面が対物レンズの焦点面に一致する場合、相対変位位置は、更なる最高強度値に基づいて検出された極大値が存在する又は存在した最終的な基準相対変位位置へと調整されることが好ましい。
【００８３】
これに関して、図６は、バイオチップ４５の表面５９からのレーザー光線１９の反射によって生じるオートフォーカス信号、すなわち、推移の中の位置８５における第３の最大値８２を示している。横座標８３上のＺ位置に応じた部分領域内の更なる最高強度値の推移８１は、開口数が０．５で２０倍の拡大率を有する対物レンズを使用して確定される。ここでは、放射波長λ０＝６３５ｎｍのレーザー装置が使用される。この信号８１の軸方向分解能は、例えば、約２．１μｍまでの半値幅Δから確定することができる。基準相対変位位置８５は、例えば、最大値８２が生じるＺ位置として、又は曲線８１の重心若しくは最大値８２の重心として確定することができる。次いで、対物レンズを、試料領域に対して、更なる最高強度値の最大値８２が存在した相対変位位置８５まで変位させることができる。これにより、例えば、位置８５ａにおける値８２ａが次に存在することがわかって初めて、位置８５における値８２を最大値８２として認識することができるため、場合によっては、位置８５ａから位置８５に戻らなければならないので、図１の駆動部１５の更なる方向転換が必要となる。
【００８４】
以下の条件が満たされた場合に、最終的な基準相対変位位置としてのフォーカス位置に到達したものとみなされ、移動を停止することが好ましい。
・オートフォーカス信号の予め規定された閾値を超えた場合。この閾値は、事前に求められたオートフォーカス信号の信号レベルから求められる。
・オートフォーカス信号が極大値８２に達した場合。
【００８５】
ただし、バイオチップの表面は、試料５１の層厚が、顕微鏡システム１００の被写界深度よりも部分的に大きい場合があるため、蛍光顕微鏡法にとって最適な撮像面をなすとは限らない。したがって、求められたフォーカス位置又は求められた最終的な基準相対変位位置の周りで、複数の蛍光画像を作成することができる。したがって、試料領域の複数の画像の捕捉を、最終的な基準相対変位位置を起点として、図１のカメラ８又は更なるカメラ９を用いて行うことができることが好ましい。カメラ８は、赤色チャネルにおける画像を捕捉することが好ましい。カメラ９は、緑色チャネルにおける画像を捕捉することが好ましい。この場合、対物レンズ及び試料領域は、光軸に沿って、最終的な基準相対変位位置の上及び／又は下の最終的な各相対変位位置に、互いに対して相対変位する。この場合、第１の顕微鏡カメラ８又は更なる顕微鏡カメラ９を用いて、最終的な各相対変位位置における各画像を捕捉することが更に行われる。次いで、プロセッサ３３が、各画像を記憶し、各画像に対する各フォーカスメトリックを確定する。ここで、プロセッサ３３は、最良のフォーカスメトリックを有する各画像を選択する。プロセッサ３３は、最良のフォーカスメトリックを有しない他の画像を破棄することが好ましい。
【００８６】
図５から見て取れるように、最大値は、特定のパターンの信号レベルを有する。極大値７７の信号レベルが事前に確定された又は所与の閾値よりも大きい場合、さらに、極大値が実際に存在する場合、すなわち、基準相対変位位置７９の左右における強度値が、ちょうど基準相対変位位置７９にある強度よりも小さい場合、推移のうち、第３の最大値７７を、例えば確実に検出されたものとして認識することができることが好ましい。したがって、レーザー光線１９がバイオチップ４５の表面５９上に集束する基準相対変位位置を、信頼できる方法で求めることができることが好ましい。最大値７３、７５、及び７７を互いに確実に分離することができるように、本発明の一実施形態によれば、オートフォーカスシステムの分解能は、顕微鏡システムの被写界深度と略同じである。平行なレーザー光線１９の直径ｄ（図１を参照）は、顕微鏡対物レンズ３の開口全体を照明するような寸法になっていることが好ましい。例えば、赤色放射波長（例えば、λ０＝６３５ｎｍ）を有し、開口数０．５の場合で、ｔｗ＝約２．５４μｍの被写界深度をもたらすレーザー装置を用いることができる。
【００８７】
フォーカス面２７の外側から反射する光が測定値に重畳され、本方法の軸方向分解能を低減させることを防止するために、通常使用される開口絞りを必要とすることなく、レーザー装置及び検出器の物理的特性が利用されることが有利である。レーザー装置１０の有効放射面は、数μｍとすることができ、したがって点光源が存在することが有利である。これにより、光源の開口絞りを省くことができる。
【００８８】
本発明の一実施形態によれば、各Ｚ測定点（各相対変位位置）において、信号強度は、各々、検出面２９の部分領域において最高強度値を有するピクセルによってのみ規定されることから、検出器の開口絞りを省くこともできる。このようにして、ピクセル面積に対応する面積を有する数平方マイクロメートルの仮想的な開口絞りを模倣することができる。ピクセルのサイズによっては、１つ以上のピクセルによって所定の面積をもたらすことができる。この場合、１６×１６ピクセルというより大きなカメラ画像領域が評価されることによって、本方法は、同時に、画像領域中心からのレーザー位置の偏差に対してロバストとなり得る。露光時間が短い場合、フォーカス面の外側からの不鮮明に結像する反射の影響を大幅に低減することができるため、得られる信号は、フォーカス面２７からのレーザー反射によって略排他的に規定される。ピクセルサイズとして、例えば３．４５μｍ×３．４５μｍを用いることができ、露光時間は、例えば、２０μ秒〜１０００μ秒とすることができる。
【００８９】
図７は、例えば、図１に示されている顕微鏡システム１００において使用することができる、本発明の一実施形態に係るビームスプリッタ１１ａを、概略側面断面図で示している。ビームスプリッタ１１ａは、前面８７及び背面８９を有する平行プレートビームスプリッタであり、レーザー光線１９を各々反射し、反射された２つの異なる部分光線Ｉ１及びＩ２を導くことができる。２つの部分光線Ｉ１及びＩ２は、対物レンズ３を通して焦点面２７に重畳され、それにより、性能の変動が生じ得る。この性能の変動を低減するために、低コヒーレント光源を使用することができ、それにより、干渉を低減することができる。
【００９０】
代替的には、この性能の変動を低減するために、図８の断面図に概略的に示されているような、僅かな楔角を有するビームスプリッタプレート１１ｂ（「楔形プレート」）を使用することができる。楔形プレート１１ｂは、互いに平行でなく、角度αで互いに対して傾斜している前面９１及び背面９３を有する。この楔形プレートを（例えば、図１に示されている顕微鏡システム１００において）ビームスプリッタ１１として使用することによって、前面９１及び背面９３におけるレーザー光１９のレーザー反射を異なる方向に偏向させ、部分光線Ｉ１及びＩ２が得られる。それにより、部分光線Ｉ１及びＩ２は、異なる角度で対物レンズ３に入射し、その後、対物レンズの焦点面２７における異なる２つの位置９５又は９７に集束する。したがって、これらの位置９５及び９７は、物体面２７において側方にオフセットされる。双方の部分光線Ｉ１、Ｉ２は、ここでは観察位置において重畳することなく、したがって、妨げとなる干渉も起こらない。
【００９１】
対物レンズの入射瞳において、双方の部分光線Ｉ１及びＩ２を更に重畳することができる。ただし、重畳位置では干渉変調が生じ、その空間周波数は、ビームスプリッタの楔角に依存する。入射瞳における変調パターンの最小値及び最大値の好ましくない位置による性能損失を回避するため、楔角は、少なくとも、干渉パターンが対物レンズの開口全体にわたって少なくとも１０個の最大値又は最小値を有する大きさで選択すべきである。
【００９２】
楔角を有するビームスプリッタ１１ｂは、顕微鏡システム１００の撮像にも影響を与える場合がある。すなわち、例えば、顕微鏡画像の波長に依存した横方向の変位、及び１次元方向の歪みが生じる可能性がある。したがって、ビームスプリッタの最大楔角は、各顕微鏡用途に応じて異なる。例えば、楔角として、α＝０．５度を例として選択することができる。
【００９３】
原則として、発生し得る結像収差は、好適な更なる光学素子又は画像評価の方法によって補正することができる。例えば、第２の楔形ビームスプリッタプレートを設けることができ、第２の楔形ビームスプリッタプレートは、第１のビームスプリッタプレートと同一であり、角度変化が双方のビームスプリッタの楔形状によって互いに相殺されるように、顕微鏡の無限空間に配置される。
【００９４】
本発明に係る方法及びシステムは、様々な利点をもたらすことができる。
【００９５】
赤色チャネルにおける試料領域の１つ以上の画像のフォーカス及び捕捉のために、赤色チャネルにおける顕微鏡カメラを二重の用途で使用することによって、追加の検出器は不要となる。これにより、部品コスト及び調整労力が削減される。したがって、追加で必要となる部品の数は、光線拡張コリメートレーザーモジュールと、ビームスプリッタとに限定することができる。
【００９６】
カメラデータにおける個々のピクセルの評価によって、光検出器と開口絞りとの組合せ（コンフォーカル技法）に匹敵する、Ｚ方向における高い分解能を得ることができる。同時に、各測定深度に対して、多数のピクセル（通常は１６×１６）を有する検出器領域が捕捉されるため、開口絞り用途において一般的な高い調整労力を不要とすることができる。また、領域内、すなわち部分領域内のどのピクセルが、最大グレー値を検出する又は含むかは重要でない。
【００９７】
検出器領域の選択も（例えば、顕微鏡の初期化段階の間に）動的に行うことができるため、レーザー信号は、カメラの検出器面上の略任意の場所にあることができる。したがって、この方法は、開口絞りに基づくオートフォーカス用途と比較して非常にロバストである。
【００９８】
光源として、例えば約８３０ｎｍの近赤外線（ＮＩＲ）の放射波長を有するレーザーモジュールを使用することができる。この場合、レーザー光を対物レンズの光線経路に結合するために、ダイクロイックビームスプリッタ１１を用いることができる。この場合、楔形状のビームスプリッタプレートは、必要とならない。
【００９９】
干渉に起因する信号変動を回避するために、原則として、低コヒーレント光源、例えばスーパールミネッセンスダイオード又はコヒーレンス長が低減されたレーザー光源を利用することもできる。この場合、楔形状のビームスプリッタプレートを、単純なビームスプリッタ（平行プレート）に置き換えることができる。放射波長は、可視であるか又は近赤外にあることもできる。
【０１００】
マイクロコントローラによって制御されるＺ方向の動き（相対変位位置の変化）は、モータ駆動される対物レンズマウント又はモータ駆動される顕微鏡テーブルを用いて転換することができる。
【０１０１】
本発明の実施形態によれば、（検出面の前に）固定開口絞りは使用されず、カメラの検出器領域の個々のピクセルの輝度が評価される。評価に使用される所定の面積６６（図４ｄを参照）の寸法は、従来使用される物理的な開口絞りの開口の大きさの範囲とすることができる。
【０１０２】
上記で図１、図５、及び図６に関して記載した方法の実施形態によれば、レーザー光線は、対物レンズに向かってコリメートされた平行な光線束を有し、さらに、レーザー光線の集束面は、対物レンズの焦点面と一致する。この実施形態によれば、図５の最大値７７に基づいて第１の基準相対変位位置７９を確定した後、続いて、第１の距離分解能よりも高い第２の距離分解能で、第１の基準相対変位位置に向かって相対距離を増加させる。この場合、同時に、各更なる相対変位位置における更なる最高強度値を捕捉し、それにより、更なる最高強度値に基づいて極大値の存在を検出した場合に、各相対変位位置を、更なる最高強度値に基づいて検出された極大値が存在する又は存在した最終的な基準相対変位位置として設定する。上述したように、これには更なる方向転換を必要とし得る。このような方向転換が起こると、図１の駆動手段１５の運動機構のいわゆるバックラッシュにより、対物レンズと試料領域との間に不整合が生じる場合があり、その結果、フォーカスの質が低下する可能性がある。
【０１０３】
ここで、図９に基づいて、バックラッシュに起因する対物レンズと試料領域との間の不整合を回避するために、そのような方向転換を回避することができる、方法の更なる実施形態を記載する。レーザー光源１０は、コリメート光学系１０ａによって、レーザー光線が対物レンズに向かって収束する光線束１９ａを有するように調整される。これには、対物レンズ３によって、レーザー光線１９ａの集束面２７ｂが対物レンズの焦点面２７に一致しないようにする効果がある。したがって、特に、集束点が焦点面２７に存在しないようにする効果がある。この場合、フォーカス点は、レーザー装置のコリメート光学系を介して、特に顕微鏡の焦点から対物レンズに向かって、好ましくは対物レンズの被写界深度の３倍〜１０倍の量だけ変位する。この場合、集束レーザー光線の収束角（半開口角）は、好ましくは−１分〜−１５分の範囲とすることができるが、この値に限定されない。
【０１０４】
対物レンズ３及びレンズ６、及びカメラ８、並びに特にミラー７は、光線が、対物レンズ３の焦点面２７の共通の点、特に焦点面２７の焦点から検出器面２９の一点に結像するように、各光学的距離において互いに位置決めされているため、バイオチップ４５の境界面又は表面５９が焦点面２７にある場合でも、レーザー光線点の反射の正確な結像が検出器面の正確な一点には生じない。しかし、焦点面２７と集束面２７ｂとの間には更なる反射面２７ｃがあり、反射面２７ｃにおいて、境界面又はバイオチップ４５の表面５９がレーザー光線のそのような反射をもたらすことにより、この反射は同様に、検出器面２９上の一点に点状に結像する。
【０１０５】
これに関して、図１０ａ及び図１０ｂは、対物レンズ３の光学的開口、対物レンズの焦点２７１を有する焦点面２７、及び集束点２７２を有するレーザー光線の集束面２７ｂを詳細に示している。更なる反射面２７ｃは、焦点面２７と集束面２７ｂとの間に位置する。境界面又はバイオチップの表面５９は、更なる反射面２７ｃにあることが想定される。入射するレーザー光線１９ａは、実質的に更なる反射面２７ｃにおいて反射し、反射されたレーザー光線１９ｂとして対物レンズに再び導かれる。このレーザー光線１９ｂは、更なる反射面２７ｃではなく正しい焦点面２７において反射した場合と同様となるような角度で対物レンズ３に入射する。換言すれば、レーザー光線１９ａは、更なる反射面２７ｃにおける試料境界面で反射し、逆行するレーザー光線１９ｂは、対物レンズ３の焦点面２７の共通点２７１、特に焦点面２７の焦点２７１からの光線１９ｃと見かけ上同様となる。したがって、更なる反射面２７ｃにおいて反射されたこのレーザー光線１９ｂに関して、図９の検出器面２９の一点に正しい点形状の結像が生じる。
【０１０６】
更なる反射面２７ｃと事実上の焦点面２７との間の距離又はオフセットＶは、較正のために顕微鏡に設置された基準試料によって予め求めることができ、所与の値をプロセッサ３３内に記憶することができるようになっており、この所与の値は、その後、方法の実施形態に入力することができる。
【０１０７】
図１０ｂは、更なる反射面の効果を、更なる光線経路１９ａ、１９ｂ、１９ｃに関して再度示している。以下では、図１０ａ及び図１０ｂに基づいて説明した、フォーカス点を変位させるこの効果を、バックラッシュを回避するためにいかにして利用することができるかを記載する。
【０１０８】
まず、上記で説明したように、対物レンズ及び試料領域の互いに対する相対変位は、相対距離を、第１の距離分解能を用いて最大距離から最小距離まで減少させることによって行われ、したがって、最高強度値の上述の推移は、図５に示されているように複数の最大値を有することが想定される。さらに、基準相対変位位置は、複数の最大値に基づいて、第１の基準相対変位位置として確定されることが想定される。さらに、バイオチップの表面５９は、図１１ａに示されているように、境界面として、レーザー光線の集束面２７ｂと対物レンズ３との間に存在することが想定される。ここで、対物レンズ３と試料領域との間又は対物レンズ３とバイオチップの表面５９との間の相対距離を、第１の基準相対変位位置に向かって、変位方向Ｒにおいて、第１の距離分解能よりも高い第２の距離分解能で増加させる場合、また同時に、各更なる相対変位位置における更なる最高強度値を捕捉する場合、図６に示されている更なる強度値の曲線８１は、右から最大値８２の方向に出発するものとみなすことができる。
【０１０９】
また、図１１ｂに示されているように、バイオチップの表面５９がちょうど更なる反射面２７ｃにある場合、曲線の推移８１内に、位置８５における最大値８２が生じる。この場合、対物レンズ３と試料領域との間の距離が更に拡大するように、更なる第２の分解能精度又は第２の分解能精度幅だけ、対物レンズを試料領域に対して（又はその逆に）変位させる。変位方向は、方向Ｒとして描写されている。
【０１１０】
バイオチップの表面５９が、図１１ｂに示されている位置にある場合、すなわち更なる反射面２７ｃにある場合、位置８５の最大値８２が生じる。バイオチップの表面５９が、図１１ｃに示されている位置にある場合、すなわち更なる反射面２７ｃの下にある場合、位置８５ａの値８２ａは、最大値８２よりも小さくなる。したがって、推移８１の更なる最高強度値に基づいて、以前の位置８５において極大値８２が存在したことを検出することができる。ここで、試料領域又はバイオチップの表面５９と対物レンズとの間の相対距離を、図１１ｃに対応する位置８５ａから、予め確定された所与の値の分、試料領域又はバイオチップの表面５９が焦点面にある図１１ｄに対応する最終的な基準相対変位位置８５ｆに、所与の値だけ増加させるだけでよいことが好ましい。この増加又はこの所与の値は、焦点面２７と更なる反射面２７ｃとの間のオフセットＶから、試料領域又はバイオチップの表面５９が図１１ｂの位置から図１１ｃの位置まで変位した後の第２の分解能精度幅を差し引いたものに対応して選択される。この更なる増加は、方向転換を行うことなく同じ方向Ｒにおいて行われる。したがって、これにより、試料領域又はバイオチップの表面５９を位置８５ａから位置８５ｆに変位させることによって最大値８２（図６）を検出した後、方向転換を行う必要がなくなり、それにより、駆動部１５（図１）の運動機構のバックラッシュに起因する不正確性も回避される。焦点面と集束面との間のオフセットＶが存在しない場合、位置８５ａから位置８５への方向転換を行わなければならず、したがって、バックラッシュが、試料領域の位置決めに関して、ひいてはフォーカス結果に関して悪影響を与える。
【０１１１】
曲線８１の測定値又は更なる最高強度値は、変動及びノイズによって重畳される場合があるため、最大値８２及び最終的な基準相対変位位置の特定は、以下に記載のとおりに行われることが好ましい。まず、曲線８１は、第２の距離分解能を用いて右から左に出発する。次に、位置８５ｃの以前の値８２ｃ又は現在の最大値８５ｃから位置８５ｄの現在の値８２ｄまで、連続的な値の減少が認められる場合、位置ウィンドウの内部で、これまでに検出された現在の最大値８２ｃよりも大きい更なる値を発見することができるか否かを、左に向かってチェックする。これが当てはまるのは、図示のウィンドウＦＥを位置８５ｃから左に向かって適用すると、値８２ｃよりも大きな値が発見されることによると想定される。続いて、その後、位置８５における最大値８２が発見される場合、位置８５ａにおいて、より小さな値８２ａが発見されるが、ウィンドウＦＥ内で、現在の最大値８２よりも大きな値は存在しない。この場合、試料領域又はバイオチップの表面５９は、位置８５ｅにある。また、集束面と焦点面との間のオフセットＶは、それに応じて考慮することができるため、試料領域又はバイオチップの表面５９は、位置８５ｅから所与の値又は送り値Ｖ２だけ、最終的な基準相対変位位置である位置８５ｆへと更に変位する。所与の値Ｖ２は、Ｖ２＝Ｖ−ＦＥによって確定されることが好ましい。
【０１１２】
本発明の実施形態は、３次元試料領域内にあり、特に空気に接触しない境界面を有する光学的境界面への確実なフォーカスを可能にする。試料領域内にある境界面におけるレーザー反射は、原則として、空気に対する表面におけるレーザー反射よりも弱い。例えば、グリセリン対バイオチップの境界面（すなわち、第３の境界面）の反射率は、たったの０．０２９％とすることができる。それに対して、空気対カバーガラス上面の境界面の反射率は、約４．３％とすることができる。したがって、フォーカスに関連する境界面は、試料表面対空気の信号よりも約１５０倍小さい信号を出す。それにもかかわらず、相対変位位置に応じた特徴的な反射パターンの認識に基づいて、バイオチップ表面への確実なフォーカスを達成することができる。
【０１１３】
特定の実施要件に応じて、本発明の実施例は、プロセッサ及び／又は制御ユニットを、ハードウェア及び／又はソフトウェアにおいて実装することができる。ここで述べたプロセッサ及び／又は制御ユニットは、ここでは、少なくとも１つのユニットとして、又は複数のユニットを組み合わせて実装することができる。この実装は、デジタル記憶媒体、例えば、フロッピーディスク、ＤＶＤ、Ｂｌｕ−Ｒａｙディスク、ＣＤ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、若しくはフラッシュメモリ、ハードディスク、又は、電子的に読取り可能な制御信号が記憶される他の磁気メモリ若しくは光学メモリを使用して行うことができ、これらは、各方法を実行するように、プログラマブルハードウェアコンポーネントとインタラクトすることができる又はインタラクトする。プログラマブルハードウェアコンポーネントは、制御ユニットとして、コンピュータプロセッサ（ＣＰＵ＝Central Processing Unit）、コンピュータ、コンピュータシステム、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ＝Application-Specific Integrated Circuit）、集積回路（ＩＣ＝Integrated Circuit）、ワンチップシステム（ＳＯＣ＝System on Chip）、プログラマブル論理素子、又はマイクロプロセッサを備えるフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ＝Field Programmable Gate Array）によって形成することができる。したがって、デジタル記憶媒体は、機械可読又はコンピュータ可読のものとすることができる。したがって、いくつかの実施例は、本明細書に記載の方法を実行するようにプログラマブルコンピュータシステム又はプログラマブルハードウェアコンポーネントとインタラクトするようになっている、電子的に可読な制御信号を含むデータキャリアを備える。一般に、本発明の実施例又は実施例の一部は、プログラム、ファームウェア、コンピュータプログラム、若しくはプログラムコードを有するコンピュータプログラム製品として、又はデータとして実装することができる。プログラムコード又はデータは、プログラムがプロセッサ又はプログラマブルハードウェアコンポーネント上で実行される際に、方法又は方法の一部を実行するのに効果的である。
【図１】
2020524819.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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