(57)【要約】  本発明は、コラゲナーゼ産生およびコラゲナーゼ製品の分野、特にコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩ組成物の再現性、純度、および安定性の改良に関し、この組成物は、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により測定された場合に少なくとも９５面積％純粋であり、かつ中性プロテアーゼを本質的に含まない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離され、かつ精製されたコラゲナーゼを含む薬物製品であって、中性プロテアーゼを本質的に含まない、薬物製品。
【請求項２】
前記製品が、前記製品１ｍｇあたり約１００ｎｇ未満の中性プロテアーゼを含む、請求項１に記載の薬物製品。
【請求項３】
前記製品が、前記製品１ｍｇあたり約７５ｎｇ未満の中性プロテアーゼを含む、請求項１に記載の薬物製品。
【請求項４】
前記製品が、前記製品１ｍｇあたり約５０ｎｇ未満の中性プロテアーゼを含む、請求項１に記載の薬物製品。
【請求項５】
前記製品が、前記製品１ｍｇあたり約２５ｎｇ未満の中性プロテアーゼを含む、請求項１に記載の薬物製品。
【請求項６】
前記コラゲナーゼが、Ｃ．ヒストリチクム由来のコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む、請求項１に記載の薬物製品。
【請求項７】
前記コラゲナーゼが、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩのうちの少なくとも１つである、請求項１に記載の薬物製品。
【請求項８】
前記コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩが、おおよそ１：１の比で存在する、請求項７に記載の薬物製品。
【請求項９】
Ｃ．ヒストリチクムから得られたか、またはそれに由来する単離され、かつ精製されたコラゲナーゼＩであって、中性プロテアーゼを本質的に含まない、コラゲナーゼＩ。
【請求項１０】
前記コラゲナーゼＩが、検出可能な量の中性プロテアーゼを含まない、請求項９に記載のコラゲナーゼＩ。
【請求項１１】
前記コラゲナーゼＩが、前記コラゲナーゼＩの１ｍｇあたり約１０００ｎｇ未満の中性プロテアーゼを含む、請求項９に記載のコラゲナーゼＩ。
【請求項１２】
前記コラゲナーゼＩが、前記コラゲナーゼＩの１ｍｇあたり約５００ｎｇ未満の中性プロテアーゼを含む、請求項９に記載のコラゲナーゼＩ。
【請求項１３】
Ｃ．ヒストリチクムから得られたか、またはそれに由来するコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを単離し、かつ精製するための方法であって、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの精製の間、金属レベルを制御することを含む、方法。
【請求項１４】
前記プロセスが、低レベルの、ニッケル、亜鉛、アルミニウム、ヒ素、カルシウム、カドミウム、クロム、銅、鉄、マグネシウム、および鉛からなる群より選択される金属に曝露される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ニッケルが、約２．０ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ニッケルが、約１．２ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ニッケルが、約１．０ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ニッケルが、約０．５ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ニッケルが、約０．９ｐｐｍ未満、約０．８ｐｐｍ未満、約０．７ｐｐｍ未満、約０．６ｐｐｍ未満、約０．５ｐｐｍ未満、約０．４ｐｐｍ未満、約０．３ｐｐｍ未満、約０．２ｐｐｍ未満、約０．１ｐｐｍ未満、約０．０９ｐｐｍ未満、約０．０８ｐｐｍ未満、約０．０７ｐｐｍ未満、約０．０６ｐｐｍ未満、約０．０５ｐｐｍ未満、約０．０４ｐｐｍ未満、約０．０３ｐｐｍ未満、約０．０２ｐｐｍ未満、または約０．０１ｐｐｍ未満からなる群より選択される量で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記亜鉛が、約８０ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記亜鉛が、約５０ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記亜鉛が、約２５ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記亜鉛が、約１０ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記亜鉛が、約５ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記亜鉛が、約３ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
前記亜鉛が、約１ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
単離され、かつ精製されたコラゲナーゼを作製するための方法であって、金属含量を制御および制限するプロセスにおいて前記コラゲナーゼを調製することを含み、かつ前記プロセスが、中性プロテアーゼからコラゲナーゼの複数の高度に純粋な画分を分離するための排除工程を含む、方法。
【請求項２８】
前記コラゲナーゼがコラゲナーゼＩであり、かつ前記排除工程が、コラゲナーゼＩの画分を分離する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記コラゲナーゼがコラゲナーゼＩＩであり、かつ前記排除工程が、コラゲナーゼＩＩの画分を分離する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記コラゲナーゼがコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含み、かつ前記コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの高度に純粋な画分が混合され、また得られた混合物が混合物１ｍｇあたり５０ｎｇ未満の中性プロテアーゼを有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記プロセスが、低レベルの、ニッケル、亜鉛、アルミニウム、ヒ素、カルシウム、カドミウム、クロム、銅、鉄、マグネシウム、および鉛からなる群より選択される金属に制限されている、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記金属がニッケルであり、かつ前記金属が約２．０ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記金属がニッケルであり、かつ前記金属が約１．２ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記金属がニッケルであり、かつ前記金属が約１．０ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記金属がニッケルであり、かつ前記金属が約０．５ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記金属がニッケルであり、かつ前記金属が約０．９ｐｐｍ未満、約０．８ｐｐｍ未満、約０．７ｐｐｍ未満、約０．６ｐｐｍ未満、約０．５ｐｐｍ未満、約０．４ｐｐｍ未満、約０．３ｐｐｍ未満、約０．２ｐｐｍ未満、約０．１ｐｐｍ未満、約０．０９ｐｐｍ未満、約０．０８ｐｐｍ未満、約０．０７ｐｐｍ未満、約０．０６ｐｐｍ未満、約０．０５ｐｐｍ未満、約０．０４ｐｐｍ未満、約０．０３ｐｐｍ未満、約０．０２ｐｐｍ未満、または約０．０１ｐｐｍ未満からなる群より選択される量で存在する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記金属が亜鉛であり、かつ前記金属が約８０ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記金属が亜鉛であり、かつ前記金属が約５０ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
前記金属が亜鉛であり、かつ前記金属が約２５ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記金属が亜鉛であり、かつ前記金属が約１０ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
前記金属が亜鉛であり、かつ前記金属が約５ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
前記金属が亜鉛であり、かつ前記金属が約３ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】
前記金属が亜鉛であり、かつ前記金属が約１ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４４】
前記排除工程が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で各画分を試験することと、前記ゲル上に検出可能な量の中性プロテアーゼを含まない画分のみをプールすることと、を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】
Ｃ．ヒストリチクムから得られたか、またはそれに由来する単離され、かつ精製されたコラゲナーゼＩを作製する方法であって、（ａ）コラゲナーゼＩの複数の高度に純粋な画分を中性プロテアーゼから分離することと、（ｂ）前記コラゲナーゼＩの高度に純粋な画分をコラゲナーゼＩ薬物原料中にプールすることと、を含む、方法。
【請求項４６】
前記分離工程が、ザイモグラフィーを用いて中性プロテアーゼの存在について各画分を試験することを含み、かつ前記プール工程が、ザイモグラフィーゲル上に検出可能な量の中性プロテアーゼを含まないコラゲナーゼＩを含有する画分のみをプールする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記コラゲナーゼＩ薬物原料が中性プロテアーゼを本質的に含まない、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記コラゲナーゼＩ薬物原料が、薬物原料１ｍｇあたり１００ｎｇ未満の中性プロテアーゼを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記コラゲナーゼＩ薬物原料が、薬物原料１ｍｇあたり７５ｎｇ未満の中性プロテアーゼを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記コラゲナーゼＩ薬物原料が、薬物原料１ｍｇあたり５０ｎｇ未満の中性プロテアーゼを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記コラゲナーゼＩ薬物原料が、薬物原料１ｍｇあたり２５ｎｇ未満の中性プロテアーゼを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記コラゲナーゼＩ薬物原料が、薬物原料１ｍｇあたり２０ｎｇ未満の中性プロテアーゼを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
前記コラゲナーゼＩ薬物原料が、薬物原料１ｍｇあたり１０ｎｇ未満の中性プロテアーゼを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
Ｃ．ヒストリチクムから得られたか、またはそれに由来する単離され、かつ精製されたコラゲナーゼＩを産生するためのプロセスであって、
ａ．Ｃ．ヒストリチクムを発酵させる工程と、
ｂ．コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む粗発酵液を回収する工程と、
ｃ．コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを精製する工程であって、
ｉ．前記粗発酵液をアニオン交換フィルターで濾過する工程、
ｉｉ．約８０ｐｐｍ未満の亜鉛および約１．２ｐｐｍ未満のニッケルを含む硫酸アンモニウムを用いて、工程（ｃ）（ｉ）からの濾液を沈殿させる工程、
ｉｉｉ．工程（ｃ）（ｉｉ）からの沈殿産物を再懸濁する工程、
ｉｖ．工程（ｃ）（ｉｉｉ）からの再懸濁液を疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに供する工程、
ｖ．イオン交換クロマトグラフィーを用いて、前記工程（ｃ）（ｉｖ）の濾液から前記コラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとを分離する工程、および
ｖｉ．前記工程（ｃ）（ｖ）の濾液を画分で収集する工程、を含む、精製する工程と、
ｄ．工程（ｃ）（ｖｉ）からの各画分中の収集されたコラゲナーゼＩＩの総量を推定する工程と、
ｅ．工程（ｃ）（ｖｉ）からの各画分中の収集されたコラゲナーゼＩの量を推定する工程と、
ｆ．プールされたコラゲナーゼＩの量が工程（ｄ）で推定された前記コラゲナーゼＩＩの量とほぼ同じになるまで、前記画分中のコラゲナーゼＩのピークから前記画分中のコラゲナーゼＩの末尾に向かってコラゲナーゼＩを含有する画分をプールする工程と、を含む、プロセス。
【請求項５５】
前記硫酸アンモニウムが、約８０ｐｐｍ未満の亜鉛および約１．２ｐｐｍ未満のニッケルを含む、請求項５４に記載のプロセス。
【請求項５６】
Ｃ．ヒストリチクムから得られたか、またはそれに由来する単離され、かつ精製されたコラゲナーゼＩを産生するためのプロセスであって、
ａ．Ｃ．ヒストリチクムを発酵させる工程と、
ｂ．コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む粗発酵液を回収する工程と、
ｃ．コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを精製する工程であって、
ｉ．前記粗発酵液をアニオン交換フィルターで濾過する工程、
ｉｉ．遷移金属を実質的に含まない硫酸アンモニウムを用いて、工程（ｉ）からの濾液を沈殿させる工程、
ｉｉｉ．工程（ｉｉ）からの沈殿産物を再懸濁する工程、
ｉｖ．工程（ｉｉｉ）からの再懸濁液を疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに供する工程、
ｖ．イオン交換クロマトグラフィーを用いて、前記工程（ｉｖ）の濾液から前記コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを分離する工程、ならびに
ｖｉ．前記工程（ｖ）の濾液を画分で収集する工程、を含む、精製する工程と、
ｄ．中性プロテアーゼからコラゲナーゼＩの複数の高度に純粋な画分を分離する工程と、
ｅ．前記コラゲナーゼＩの高度に純粋な画分をプールする工程と、を含む、プロセス。
【請求項５７】
前記分離工程（ｄ）が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で各画分を試験することを含み、かつ前記プール工程（ｅ）が、前記ゲル上に検出可能な量の中性プロテアーゼを含まないコラゲナーゼＩを含有する画分のみをプールする、請求項１７に記載のプロセス。
【請求項５８】
それぞれＣ．ヒストリチクムコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩからそれぞれ得られたか、またはそれに由来する単離され、かつ精製されたコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩからなる薬物製品を作製するためのプロセスであって、前記コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩが、約１対１の質量比を有し、かつ前記薬物製品が、逆相高速液体クロマトグラフィーにより判定された場合に少なくとも９５面積％純粋であり、
ａ．Ｃ．ヒストリチクムを発酵させる工程と、
ｂ．コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む粗発酵液を回収する工程と、
ｃ．濾過およびカラムクロマトグラフィーを介して粗回収液からコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを精製する工程であって、約８０ｐｐｍ未満の亜鉛レベルおよび約１．２ｐｐｍ未満のニッケルレベルを有する硫酸アンモニウム溶液を用いて前記コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを処理することを含む、精製する工程と、を含む、プロセス。
【請求項５９】
前記プロセスが、ニッケル、亜鉛、アルミニウム、ヒ素、カルシウム、カドミウム、クロム、銅、鉄、マグネシウム、および鉛からなる群より選択される、低レベルの金属に制限される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ニッケルが、約２．０ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ニッケルが、約１．２ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記ニッケルが、約１．０ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記ニッケルが、約０．５ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記ニッケルが、約０．９ｐｐｍ未満、約０．８ｐｐｍ未満、約０．７ｐｐｍ未満、約０．６ｐｐｍ未満、約０．５ｐｐｍ未満、約０．４ｐｐｍ未満、約０．３ｐｐｍ未満、約０．２ｐｐｍ未満、約０．１ｐｐｍ未満、約０．０９ｐｐｍ未満、約０．０８ｐｐｍ未満、約０．０７ｐｐｍ未満、約０．０６ｐｐｍ未満、約０．０５ｐｐｍ未満、約０．０４ｐｐｍ未満、約０．０３ｐｐｍ未満、約０．０２ｐｐｍ未満、または約０．０１ｐｐｍ未満からなる群より選択される量で存在する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
前記亜鉛が、約８０ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
前記亜鉛が、約５０ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６７】
前記亜鉛が、約２５ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６８】
前記亜鉛が、約１０ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６９】
前記亜鉛が、約５ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項５９に記載の方法。
【請求項７０】
前記亜鉛が、約３ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項５９に記載の方法。
【請求項７１】
前記亜鉛が、約１ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項５９に記載の方法。
【請求項７２】
Ｃ．ヒストリチクムから得られた中性プロテアーゼを製造するための方法であって、
ａ．Ｃ．ヒストリチクムを発酵させる工程と、
ｂ．中性プロテアーゼを含む粗発酵液を回収する工程と、
ｃ．アニオン交換フィルターおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して中性プロテアーゼを精製して、前記中性プロテアーゼを得る工程と、を含む、方法。
【請求項７３】
工程（ｃ）の前に硫酸アンモニウムを添加する工程をさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記硫酸アンモニウムが、約０．８Ｍ〜約１．２Ｍである、請求項７３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年３月２８日に出願された米国特許仮出願第６２／４７７，８４６号の優先権を主張し、これは、法により許容される最大範囲までその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、コラゲナーゼ産生およびコラゲナーゼ製品の分野、特にコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩ組成物の再現性、純度、および安定性の改良に関し、組成物は、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により測定された場合に少なくとも９５面積％純粋であり、かつ中性プロテアーゼを本質的に含まない。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ．ヒストリチクムの発酵から高度に純粋な（少なくとも９５％純粋な）コラゲナーゼを製造するためのプロセスが、米国特許第７，８１１，５６０号で以前に記載されている。コラゲナーゼＩおよびＩＩは、哺乳動物中に最も豊富にある構造タンパク質であるコラーゲンを分解する酵素である。これらの酵素は、さまざまなコラーゲン介在疾患、例えば、デュプイトラン拘縮、ペロニー病、脂肪腫、および癒着性関節包炎の治療のために使用される。米国特許第６，０８６，８７２号および同第５，５８９，１７１号は、デュプイトラン病の治療におけるコラゲナーゼ調製物の使用を開示している。米国特許第６，０２２，５３９号は、ペロニー病の治療におけるコラゲナーゼ調製物の使用を開示している。米国特許第６，９５８，１５０号および同第７，８４２，６７３号は、脂肪腫の治療におけるコラゲナーゼの使用を開示している。米国特許出願公報第２００６／０２０４４８Ａ１号は、癒着性関節包炎の治療におけるコラゲナーゼの使用を開示している。米国特許出願公報第２０１４／０３３５０７２号および同第２０１６／０２７９０４６号は、セルライトを治療するためのコラゲナーゼの使用を開示している。
【０００４】
コラゲナーゼの主な供給源は、Ｃ．ヒストリチクムの発酵からである。Ｃ．ヒストリチクムコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む注射用製剤は、商標名ＸＩＡＦＬＥＸ（登録商標）の下で販売されており、デュプイトラン拘縮およびペロニー病の治療のために米国食品医薬品局から認可されている。注射用製剤は、欧州および他の国では、ＸＩＡＰＥＸ（登録商標）と呼ばれている。コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩについてのアミノ酸配列は、それぞれｃｏｌＧおよびｃｏｌＨ遺伝子によりコードされている。ｃｏｌＧについてのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ８７２１５およびＭａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１８１（３）：９２３−９３３に記載されており、ｃｏｌＨについてのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ２９９８１およびＹｏｓｈｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７６（２１）：６４８９−６４９６に記載されている。コラゲナーゼＡＵＸＩは、約１１３ｋＤａの分子量を有するおおよそ１０００個のアミノ酸からなる単一ポリペプチド鎖を有する。コラゲナーゼＡＵＸＩＩも、約１１２ｋＤａの分子量を有するおおよそ１０００個のアミノ酸からなる単一ポリペプチド鎖を有する。
【０００５】
コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩは、金属プロテアーゼであり、その活性のために固く結合した亜鉛および緩く結合したカルシウムを必要とする（Ｅｄｄｉｅ  Ｌ．Ａｎｇｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈ．Ｅ．Ｖａｎ  Ｗａｒｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９８８，２７，７４０６−７４１２）。コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの両方は、コラーゲンのすべての型に対して幅広い特異性を有する（Ｓｔｅｉｎｂｒｉｎｋ，Ｄ；Ｂｏｎｄ，Ｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｗａｒｔ，Ｈ；（１９８５），ＪＢＣ，２６０ｐ２７７１−２７７６）。これらのコラゲナーゼは、生理的条件下でコラーゲンの三重らせん領域を加水分解することにより、コラーゲンを消化する（Ｓｔｅｉｎｂｒｉｎｋ，Ｄ；Ｂｏｎｄ，Ｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｗａｒｔ，Ｈ；（１９８５），ＪＢＣ，２６０ｐ２７７１−２７７６）。各コラゲナーゼは異なる特異性を示すが（すなわち、各々は切断のために異なる好ましいアミノ酸配列を有する）、併せて、それらはコラーゲンに対して相乗的な活性を有する（Ｍａｎｄｌ，Ｉ．，（１９６４），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３：ｐ．１７３７−１７４１；Ｖｏｓ−Ｓｃｈｅｐｅｒｋｅｕｔｅｒ，Ｇ  Ｈ，（１９９７），Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６：ｐ．４０３−４１２）。
【０００６】
療法において使用するためのコラゲナーゼは、哺乳動物、真菌類、および細菌供給源を含むさまざまな供給源から得られる場合がある。粗コラゲナーゼの１つの一般的供給源は、細菌の発酵プロセスから、具体的には、クロストリジウム・ヒストリチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）（Ｃ．ヒストリチクム）の発酵からである。Ｃ．ヒストリチクムから得られた粗コラゲナーゼは、多数のクロマトグラフィー技法のいずれかを用いて精製され得る。しかし、さまざまな毒素を含む、コラゲナーゼ以外の多くの他の酵素が、発酵液の中へと分泌される。
【０００７】
米国特許出願公報第２０１５／００１０５３２号で以前に記載されているように、コラゲナーゼを産生する発酵中のこれらの毒素の機能を調査するために、Ｃ．ヒストリチクム００４株から分泌された毒素のゲノム配列決定および分析を実施した。調査した毒素は、アルファ毒素（致死因子）、ベータ毒素（Ｉ型およびＩＩ型コラゲナーゼ）、ガンマ毒素（クロストリパイン）、デルタ毒素（中性プロテアーゼ）、イプシロン毒素（酸素不安定性ヘモリジン）であった。ゲノム配列分析に基づいて、コラゲナーゼおよびクロストリパインのみが、００４株の機能的毒素であると考えられた。他の毒素は、Ｃ．ヒストリチクムタンパク質と各モデルタンパク質との間の必須アミノ酸配列の差異に基づいて、非機能的であると考えられた。
【０００８】
中性プロテアーゼ（ＮＰ）とも知られているデルタ毒素は、Ｃ．ヒストリチクムからの金属プロテアーゼである。中性プロテアーゼは、金属プロテアーゼのＭ４ファミリーのメンバーであり、ＭＥＲＯＰＳペプチダーゼデータベースによれば、中性プロテアーゼは、共通配列モチーフ、基質特異性、およびコファクター要件を含む、Ｍ４ファミリーと構造的類似性を有する。テルモリシンは、Ｍ４ファミリーのうち、最も研究され、かつ理解されている酵素である。この研究に関連して、バチルス・サーモプロテオリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）からのテルモリシンが以前クローニングされ、かつ配列決定され、そしてその情報は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＣＡＡ５４２９１として登録された。テルモリシンは、３４．６ｋＤａの成熟酵素分子量を有する亜鉛金属プロテアーゼである。テルモリシンおよびＭ４ペプチドファミリーのすべてのメンバーは、シグナルペプチド、プロ配列、および成熟配列から構成される。
【０００９】
テルモリシンが細胞により産生される場合、これは、成熟酵素配列の前にあるタンパク質プロ配列がテルモリシンを阻害するため、不活性酵素（プロ酵素）として開始する。プロ配列は、分泌されたプロ酵素の大きさの３分の２を表し、一方で成熟酵素は、３分の１を表す。テルモリシン中のプロ配列は、自己触媒的に切断され、その目的とする環境において成熟酵素の活性化をもたらす。テルモリシン分泌ストラテジーは、中性プロテアーゼと共有され、Ｃ．ヒストリチクム中性プロテアーゼがまた不活性プロテアーゼとして開始することを結論付けるための根拠であった。同様に、その成熟形態でのＣ．ヒストリチクム中性プロテアーゼは、Ｈｅｒｂｅｒ（米国特許出願公報第２０１５／００１０５３２号）およびＭａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ，ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｉｔｓ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ａｎｄ  ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，９９：１０４８９−９９（２０１５）において記載されているように、テルモリシンと同様の分子量を有する。
【００１０】
その合成、分泌、活性化、および基質特異性におけるテルモリシンの類似性により、テルモリシンは、Ｃ．ヒストリチクム００４株からの中性プロテアーゼのためのモデルとなる。テルモリシンと中性プロテアーゼとの間のこれらの特質は、共有された構造的特徴に基づいて類似しているが、２つの酵素の間には、配列差異が存在する。本発明に関連して、Ｈｅｒｂｅｒ（米国特許出願公報第２０１５／００１０５３２号）における、デルタ毒素の以前のゲノム分析およびテルモリシンに対するホモロジー比較は、中性プロテアーゼは成長培地中に分泌された可能性があるが、自己触媒部位における異なるコンセンサス配列に起因して活性でなかったことを結論付けた。
【００１１】
テルモリシン（およびすべての中性プロテアーゼ）の特色的な特徴は、それが作用することのできる広範囲のタンパク質である。医薬、特に体内に注射される医薬中の非特異的プロテアーゼの存在は、それらが、微量で存在する場合でさえも、標的としない体内の酵素、細胞、および組織を不都合にも分解するために、問題である。
【００１２】
コラゲナーゼを作製するための以前のプロセスは、時に、非定型コラゲナーゼの分解をもたらすことがある。コラゲナーゼの効率的かつ効果的な商業的製造のために、毒素を含まない高度に純粋なコラゲナーゼの再現性のある製造が必要とされる。
【発明の概要】
【００１３】
本開示は、コラゲナーゼＩおよびＩＩ産物から検出可能な量の中性プロテアーゼを除去する、コラゲナーゼ製造のための改良されたプロセスを提供する。本開示は、医学的使用のための以前のコラゲナーゼ組成物と比べて分解を受けにくく、かつより純粋なコラゲナーゼ産物を提供する。一実施形態では、製造プロセス中のＣ．ヒストリチクムからの非定型コラゲナーゼＩおよびＩＩ分解の原因を同定するために、調査を実施した。Ｃ．ヒストリチクムからの中性プロテアーゼは、その活性のある成熟形態で、Ｃ．ヒストリチクムの発酵液中に存在することが見出された。さらに、この中性プロテアーゼは、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩに対して高度に活性があり、かつ両コラゲナーゼの有意な分解を引き起こす場合がある。精製プロセスの間にそれが継続して存在することにより、両コラゲナーゼも分解される場合がある。
【００１４】
以前は不活性であると考えられていた中性プロテアーゼは、予想に反して、より多い量の１つ以上の金属（例えば、ニッケルおよび亜鉛）の存在下で、広範囲にわたってより活性となる。この金属媒介活性は、百万分率レベルのかかる金属の存在下でのコラゲナーゼ製造プロセス中に、高いレベルのコラゲナーゼ産物断片を産生し、プロセスの少なくともイオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィー工程において純度不良を引き起こす。
【００１５】
本発明はまた、製造プロセスから中性プロテアーゼを単離するための方法、それをプロセスから除去するための方法、および製造プロセスにわたってその存在を判定するための方法も提供する。さらに、本発明は、高度に精製されたコラゲナーゼの改良された再現性および安定性を提供し、中性プロテアーゼを本質的に含まない（すなわち、検出可能な限界を下回る）コラゲナーゼＩおよびＩＩ産物を提供し、また中性プロテアーゼを本質的に含まないより安全かつより純粋なコラゲナーゼ組成物を提供する。
【００１６】
製造再現性は、発酵および精製プロセスの間、金属を制御することにより改良される。驚くべきことに、Ｃ．ヒストリチクムからのコラゲナーゼＩおよびＩＩの精製の間のある金属の存在または不在がコラゲナーゼ産物の純度に影響することが見出された。一実施形態では、約８０ｐｐｍ以上の亜鉛レベル、または約１ｐｐｍ以上のニッケルレベルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）により測定された場合に高いレベルでのコラゲナーゼＩ産物およびコラゲナーゼＩＩ産物不純物を生じ、薬物製品のためには許容されないレベルの不純物をもたらす。
【００１７】
別の実施形態では、亜鉛レベルが約２．７５ｐｐｍより高く、かつ約８０ｐｐｍ未満である場合、コラゲナーゼは断片に分解されない。また、精製プロセスの少なくとも１工程において、ニッケルレベルが約０．４ｐｐｍより高く、かつ約１ｐｐｍ未満である場合、コラゲナーゼは断片に分解されない。さらに、薬物精製プロセスを制御して、約３ｐｐｍ以下の亜鉛レベル、または約０．５ｐｐｍ以下のニッケルレベルを維持することは、高い純度でのコラゲナーゼ産物の製造の信頼性および再現性を改良する。高いレベルのコラゲナーゼ分解を引き起こさない微量の金属亜鉛およびニッケル（または他の金属）を伴うコラゲナーゼ製造プロセスを稼働することにより、以前のプロセスと比較して著しく改良された信頼性および再現性がもたらされる。
【００１８】
ある実施形態では、コラゲナーゼ製造プロセスの疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程のためのバッファー中に、ニッケルまたは亜鉛が存在する場合、中性プロテアーゼは、積極的にコラゲナーゼＩおよびＩＩをより小さな断片へと分解し、そして低い純度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に９５％未満の純度）のコラゲナーゼ産物をもたらす。いくつかの実施形態では、ニッケル（約０．４ｐｐｍ〜約１ｐｐｍの量の）および亜鉛（約２．８ｐｐｍ〜８４ｐｐｍの量の）は、ＨＩＣおよびタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）ユニット操作において、中性プロテアーゼ特異的活性を増幅せず、ＩＥＸユニット操作において有意に増大した産物断片不純物を引き起こさない。一実施形態では、ニッケルまたは亜鉛レベルについてのコラゲナーゼ製造プロセスの制御は、高い純度のコラゲナーゼＩおよびＩＩ産物を得るために重要である。
【００１９】
コラゲナーゼ組成物が中性プロテアーゼを本質的に含まないように、コラゲナーゼ製造プロセスから中性プロテアーゼを排除するか、または少なくともそれを低減することにより、産物の安全性が改良され、かつ中性プロテアーゼによる産物中のコラゲナーゼの分解が阻止される。コラゲナーゼ組成物は、製造プロセスにおいて少なくとも１つの中性プロテアーゼ排除工程を付加することにより、改良される。コラゲナーゼ産物の製造からの中性プロテアーゼの低減または排除は、以下の排除工程のうちの１つ以上により達成され得る：（ａ）ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルもしくはＨＰＬＣにより測定された場合に、約９０％未満のコラゲナーゼＩもしくはＩＩ含量を有し、かつ約７％超の含量の任意の単一の不純物を有する任意の画分を除外すること；（ｂ）ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルもしくはザイモグラフィーにより測定された場合に、検出可能なレベルの中性プロテアーゼを有する任意の画分を除外すること；または（ｃ）過剰なレベルの中性プロテアーゼを含有すると計算された任意の画分を除外すること。各々は、個別に、または組み合わせて使用され得る。
【００２０】
より具体的には、排除工程は、コラゲナーゼＩまたはコラゲナーゼＩＩ画分をプールする前に、コラゲナーゼを分離カラムまたはフィルター（または他の分離媒体）を通過させた後に収集され、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはザイモグラフィーアッセイにより試験された場合に検出可能なレベルの中性プロテアーゼを含有する画分を拒絶することも含んでもよい。ある実施形態では、画分は、それらが有意な量のコラゲナーゼを含有していても、拒絶されてもよい。排除はまた、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルまたはＨＰＬＣにより測定された場合に、約９０％未満のコラゲナーゼＩまたはＩＩ含量および約７％超の含量の任意の単一の不純物を有する任意のコラゲナーゼＩまたはＩＩ画分を拒絶または廃棄することも必要としてもよい。排除工程は、コラゲナーゼＩ画分がコラゲナーゼＩ産物のためにプールされるための制御のために、プロセス中で産生された推定量のコラゲナーゼＩＩの使用を含んでもよい。これらの工程のいずれもが、中性プロテアーゼを本質的に含まないコラゲナーゼＩおよびＩＩ産物を産生するために、コラゲナーゼ製造プロセスにおいて使用することができる。
【００２１】
中性プロテアーゼ排除の一実施形態は、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）画分の純度に対してプロセス制御を実施し、ここで、各画分は、純度および最も豊富にある不純物の両方について分析され、そして各画分は、画分を順方向でプロセスするために、この基準を満たす必要がある（プール、薬物製品、および薬学的製剤としての使用のために許容される）。この実施形態では、ＩＥＸ工程のコラゲナーゼＩピークの末端における中性プロテアーゼ溶離の位置的な性質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、濃度測定を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ、またはザイモグラフィー（濃度測定を伴うもしくは伴わない）アッセイによる検出可能な限界の中性プロテアーゼを示す画分（複数可）を自動的に拒絶することにより、中性プロテアーゼの除去のための効果的な機構を提供する。別の実施形態では、プールされたコラゲナーゼＩのおおよその量が、プロセスにより産生されたコラゲナーゼＩＩのおおよその量に適合するまで、コラゲナーゼＩピーク画分のみをプールすることと併せて、ＩＥＸ溶離から収集されたコラゲナーゼＩ画分のピーク画分は、所望の純度および不純物基準を満たす画分に基づいて、順方向でプロセスされる。この制御ストラテジーは、コラゲナーゼＩピークのさらなる末端画分の排除をもたらし、これによりプールされたコラゲナーゼＩの画分は、中性プロテアーゼを本質的に含まない。
【００２２】
本方法はさらに、本開示に従って薬学的製剤を調製するための方法、および本発明のコラゲナーゼ組成物を用いてコラーゲン介在疾患を患っている患者を治療するための方法を提供する。例えば、有効量のコラゲナーゼ、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、またはその組み合わせを投与することによってコラーゲン介在疾患を治療する方法が検討されている。一実施形態では、本開示は、コラーゲン介在症状の治療（例えば、セルライト）を必要とする患者におけるコラーゲン介在症状を治療する方法に関し、この方法は、患者に有効量のコラゲナーゼ組成物を投与する工程を含み、コラゲナーゼ組成物は、約０．６：１．４のコラゲナーゼＩ対コラゲナーゼＩＩ〜約１．４：０．６のコラゲナーゼＩ対コラゲナーゼＩＩの質量比で組み合わされたコラゲナーゼＩ産物およびコラゲナーゼＩＩ産物を含み、この組成物は、中性プロテアーゼを本質的に含まない。さらに、本開示は、より安定かつより安全な薬学的製剤を提供する。
【００２３】
本組成物および方法等のさらなる実施形態は、以下の説明、図面、実施例、および特許請求の範囲から明らかとなるだろう。前述および後述の説明から理解できるように、本明細書に記載されるありとあらゆる特徴、およびかかる特徴の２つ以上のありとあらゆる組み合わせは、かかる組み合わせに含まれる特徴が互いに矛盾しない限り、本開示の範囲内に含まれる。さらに、任意の特徴または特徴の組み合わせは、任意の実施形態または態様から特異的に除外されてもよい。さらなる態様および実施形態は、添付の実施例および図面と併せて考慮される場合に特に、以下の説明および特許請求の範囲において示される。
【００２４】
カラー図面への参照
本出願ファイルは、少なくとも１つのカラーで作成された図面を含む。カラー図面を伴う本出願公報のコピーは、請求に応じ、かつ所定の費用の支払いをすることで、特許庁より提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
前述の実施形態の特徴は、添付の図面への参照と併せて、以下の発明を実施するための形態を参照することにより、より容易に理解されるだろう。
【図１】ＡＵＸ−Ｉ／ＡＵＸ−ＩＩバンドについての応答の直線性を示すプロットの一例である。これは、１．１２５マイクログラム〜１．８７５マイクログラムの最小限の範囲にわたる既知の参照標準のマイクログラムに対する微量のコラゲナーゼのプロットであり、９８％より大きなＲ2値を有する。
【図２】Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェアにより作製された注釈付きの画像報告の一例である。レーン１は、既知の分子量のバンドを伴う分子量標準を含有する。レーン２は、適切なＡＵＸ中間体参照標準を含有する。残りのレーンは、各ＩＥＸ画分からの試料を含有する。主な産物のバンドは各レーンの上部のバンドであり、より下部にあるさらなるバンドの各々は不純物を表す。
【図３】ＡＵＸ−Ｉ３３ｋＤ不純物についての画分毎の不純物発生の頻度ならびに画分毎の不純物のパーセント相対量の平均および範囲を示す。
【図４】ＡＵＸ−Ｉ４５ｋＤ不純物についての画分毎の不純物発生の頻度ならびに画分毎の不純物のパーセント相対量の平均および範囲を示す。
【図５】ＡＵＸ−Ｉ５５ｋＤ不純物についての画分毎の不純物発生の頻度ならびに画分毎の不純物のパーセント相対量の平均および範囲を示す。
【図６】ＡＵＸ−Ｉ８０ｋＤ不純物についての画分毎の不純物発生の頻度ならびに画分毎の不純物のパーセント相対量の平均および範囲を示す。
【図７】ＡＵＸ−Ｉ９０ｋＤ不純物についての画分毎の不純物発生の頻度ならびに画分毎の不純物のパーセント相対量の平均および範囲を示す。
【図８】ＡＵＸ−Ｉ９６ｋＤ不純物についての画分毎の不純物発生の頻度ならびに画分毎の不純物のパーセント相対量の平均および範囲を示す。
【図９】ＡＵＸ−ＩＩ２５ｋＤ不純物についての画分毎の不純物発生の頻度ならびに画分毎の不純物のパーセント相対量の平均および範囲を示す。
【図１０】ＡＵＸ−ＩＩ３８ｋＤ不純物についての画分毎の不純物発生の頻度ならびに画分毎の不純物のパーセント相対量の平均および範囲を示す。
【図１１】ＡＵＸ−ＩＩ５０ｋＤ不純物についての画分毎の不純物発生の頻度ならびに画分毎の不純物のパーセント相対量の平均および範囲を示す。
【図１２】ＡＵＸ−ＩＩ６０ｋＤ不純物についての画分毎の不純物発生の頻度ならびに画分毎の不純物のパーセント相対量の平均および範囲を示す。
【図１３】ＡＵＸ−ＩＩ８０ｋＤ不純物についての画分毎の不純物発生の頻度ならびに画分毎の不純物のパーセント相対量の平均および範囲を示す。
【図１４】ＡＵＸ−ＩＩ９０ｋＤ不純物についての画分毎の不純物発生の頻度ならびに画分毎の不純物のパーセント相対量の平均および範囲を示す。
【図１５】ＡＵＸ−ＩＩ９２ｋＤ不純物についての画分毎の不純物発生の頻度ならびに画分毎の不純物のパーセント相対量の平均および範囲を示す。
【図１６】ＡＵＸ−ＩＩ９６ｋＤ不純物についての画分毎の不純物発生の頻度ならびに画分毎の不純物のパーセント相対量の平均および範囲を示す。
【図１７】ＩＥＸ画分あたりのタンパク質の典型的なグラムを示す。
【図１８】ＩＥＸ画分あたりの９０ｋＤ不純物の典型的な推定グラムを示す。
【図１９】ＡＵＸピークあたりのタンパク質のグラムに対する９０ｋＤ不純物の推定グラムを示す。
【図２０】ＡＵＸ−Ｉ不純物についての管理図を示す。
【図２１Ａ−２１Ｂ】ＡＵＸ−ＩＩ不純物についての管理図を示す。
【図２２】亜鉛スパイキング研究（ＤＥＶ−２５Ｃ）からの制御実行中の、ＩＥＸカラム後のＡＵＸ−ＩＩ画分中の不純物を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシー染色ゲルである。ＩＥＸカラムからのＡＵＸ−ＩＩピークは、６つの画分で収集された。このゲルは、ＡＵＸ−ＩＩ画分の典型的な純度および産物に関連する不純物の典型的なパターンを示す。  レーン１：分子量マーカー  レーン２：コラゲナーゼＩＩ  レーン３：画分＃１−９４．９％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン４：画分＃２−９８．１％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン５：画分＃３−９８．４％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン６：画分＃４−９７．３％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン７：画分＃５−９６．３％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン８：画分＃６−８９．９％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン９：ブランク  レーン１０：コラゲナーゼＩ  レーン１１：コラゲナーゼＩピークの画分＃１６（１．５μｇ／レーン）
【図２３】亜鉛スパイキング研究（実行ＤＥＶ−２５Ｃ）における制御実行中の、ＩＥＸカラム後のＡＵＸ−Ｉ画分中の不純物を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシー染色ゲルである。ＩＥＸカラムからのＡＵＸ−Ｉピークは、１０個の画分で収集された。このゲルは、ＡＵＸ−Ｉ画分の典型的な純度および産物に関連する不純物の典型的なパターンを示す。  レーン１：分子量マーカー  レーン２：コラゲナーゼＩ  レーン３：画分＃７−８７．７％純度  レーン４：画分＃８−８６．５％純度  レーン５：画分＃９−９２．０％純度  レーン６：画分＃１０−９５．８％純度  レーン７：画分＃１１−９７．８％純度  レーン８：画分＃１２−９７．１％純度  レーン９：画分＃１３−９７．０％純度  レーン１０：画分＃１４−９６．８％純度  レーン１１：画分＃１５−９６．５％純度
【図２４】亜鉛が８４ｐｐｍにスパイクされた亜鉛スパイキング研究（実行ＤＥＶ−２５Ｂ）からの、ＩＥＸカラム後のＡＵＸ−ＩＩ画分中の不純物を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシー染色ゲルである。ＩＥＸカラムからのＡＵＸ−ＩＩピークは、８つの画分で収集された。このゲルは、不純物の数および強度における増大を伴い、かつＡＵＸ−ＩＩ画分の純度における減少を伴う、亜鉛の存在により引き起こされる分解パターンを示す。このゲルでは、ＡＵＸ−ＩＩ画分のうちのいずれもが、プールのための純度基準を満たさない。  レーン１：分子量マーカー  レーン２：コラゲナーゼＩＩ  レーン３：画分＃１−６６．４％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン４：画分＃２−７５．５％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン５：画分＃３−７９．５％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン６：画分＃４−７６．７％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン７：画分＃５−７２．１％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン８：画分＃６−６３．９％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン９：画分＃７−５２．９％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン１０：画分＃８−４５．０％純度（１．５μｇ／レーン）
【図２５】亜鉛が８４ｐｐｍにスパイクされた亜鉛スパイキング研究（実行ＤＥＶ−２５Ｂ）からの、ＩＥＸカラム後のＡＵＸ−Ｉ画分中の不純物を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシー染色ゲルである。ＩＥＸカラムからのＡＵＸ−Ｉピークは、１０個の画分で収集された。このゲルは、不純物の数および強度における増大を伴い、かつＡＵＸ−Ｉ画分の純度における減少を伴う、亜鉛の存在により引き起こされる分解パターンを示す。このゲルでは、ＡＵＸ−Ｉ画分のうちのいずれもが、プールのための純度基準を満たさない。  レーン１：分子量マーカー  レーン２：コラゲナーゼＩ  レーン３：画分＃９−５４．９％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン４：画分＃１０−５０．９％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン５：画分＃１１−５６．２％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン６：画分＃１２−６５．２％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン７：画分＃１３−７０．４％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン８：画分＃１４−７０．０％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン９：画分＃１５−６７．５％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン１０：画分＃１６−６２．４％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン１１：画分＃１７−５８．８％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン１２：画分＃１８−５２．６％純度（１．５μｇ／レーン）
【図２６】ニッケルスパイキング研究（実行ＤＥＶ−２５Ａ）における制御実行からの、ＩＥＸカラム後のＡＵＸ−ＩＩ画分中の不純物を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシー染色ゲルである。ＩＥＸカラムからのＡＵＸ−ＩＩピークは、６つの画分で収集された。このゲルは、ＡＵＸ−Ｉ画分の典型的な純度および産物に関連する不純物の典型的なパターンを示す。  レーン１：分子量マーカー  レーン２：コラゲナーゼＩＩ  レーン３：画分＃１−９５．９％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン４：画分＃２−９７．１％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン５：画分＃３−９９．１％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン６：画分＃４−９８．２％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン７：画分＃５−９６．９％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン８：画分＃６−９２．３％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン９：ブランク  レーン１０：コラゲナーゼＩ  レーン１１：コラゲナーゼＩピークからの画分＃１６（１．５μｇ／レーン）
【図２７】ニッケルスパイキング研究（実行ＤＥＶ−２５Ａ）における制御実行からの、ＩＥＸカラム後のＡＵＸ−Ｉ画分中の不純物を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシー染色ゲルである。ＩＥＸカラムからのＡＵＸ−Ｉピークは、１０個の画分で収集された。このゲルは、ＡＵＸ−ＩＩ画分の典型的な純度および産物に関連する不純物の典型的なパターンを示す。  レーン１：分子量マーカー  レーン２：コラゲナーゼＩ  レーン３：画分＃７−８５．６％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン４：画分＃８−８５．２％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン５：画分＃９−９０．７％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン６：画分＃１０−９５．５％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン７：画分＃１１−９６．６％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン８：画分＃１２−９７．０％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン９：画分＃１３−９６．６％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン１０：画分＃１４−９６．８％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン１１：画分＃１５−９６．８％純度（１．５μｇ／レーン）
【図２８】ニッケルが１．２ｐｐｍにスパイクされたニッケルスパイキング研究（実行ＤＥＶ−２５Ｄ）からの、ＩＥＸカラム後のＡＵＸ−ＩＩ画分中の不純物を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシー染色ゲルである。ＩＥＸカラムからのＡＵＸ−ＩＩピークは、７つの画分で収集された。このゲルは、不純物の数および強度における増大を伴い、ＡＵＸ−ＩＩ画分の純度における減少を伴う、ニッケルの存在により引き起こされる分解パターンを示す。このゲルでは、ＡＵＸ−ＩＩ画分のうちのいずれもが、純度についてのプール基準を満たさない。  レーン１：分子量マーカー  レーン２：コラゲナーゼＩＩ  レーン３：画分＃１−７４．８％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン４：画分＃２−８１．８％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン５：画分＃３−８４．６％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン６：画分＃４−８５．６％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン７：画分＃５−８３．０％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン８：画分＃６−７２．３％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン９：画分＃７−６４．９％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン１０：ブランク  レーン１１：コラゲナーゼＩ  レーン１２：コラゲナーゼＩピークからの画分＃８−６２．７％純度（１．５μｇ／レーン）
【図２９】ニッケルが１．２ｐｐｍにスパイクされたニッケルスパイキング研究（実行ＤＥＶ−２５Ｄ）からの、ＩＥＸカラム後のＡＵＸ−Ｉ画分中の不純物を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシー染色ゲルである。ＩＥＸカラムからのＡＵＸ−Ｉピークは、１０個の画分で収集された。このゲルは、不純物の数および強度における増大を伴い、ＡＵＸ−Ｉ画分の純度における減少を伴う、ニッケルの存在により引き起こされる分解パターンを示す。このゲルでは、ＡＵＸ−Ｉ画分のうちのいずれもが、純度についてのプール基準を満たさない。  レーン１：分子量マーカー  レーン２：コラゲナーゼＩ  レーン３：画分＃９−６０．３％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン４：画分＃１０−６７．６％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン５：画分＃１１−８１．６％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン６：画分＃１２−８４．７％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン７：画分＃１３−８４．１％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン８：画分＃１４−８２．６％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン９：画分＃１５−８２．０％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン１０：画分＃１６−７２．４％純度（１．５μｇ／レーン）  レーン１１：画分＃１７−６８．６％純度（１．５μｇ／レーン）
【図３０】Ｑ−セファロース高速（Ｑ−ＨＰ）クロマトグラムと、クマシー染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル画像である。ロード、ならびにマージしたＡＵＸ  ＩおよびＡＵＸ  ＩＩのプールした画分が示される。Ｑ  ＨＰクロマトグラムは、ＩＥＸクロマトグラフィーカラムを用いた、ＨＩＣクロマトグラフィー工程の廃水流からの中性プロテアーゼの精製を表す。ゲル画像は、ＩＥＸロードおよび精製にわたって収集された画分を示す。勾配の最後における中性プロテアーゼ溶離は、画分３において観察される。すべての不純物のＮ末端は、Ｅｄｍａｎ分解および精製された産物断片を用いる液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により判定される。テルモリシンをモデルプロテアーゼとして使用して、切断末端が、ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ．のタンパク質分析プログラムＰｅｐｔｉｄｅ  Ｃｕｔｔｅｒにおけるテルモリシン切断部位と適合するかどうかを判定した。すべての場合において、切断末端は、テルモリシン切断についてヒットした。Ｅｄｍａｎ分解およびＬＣ−ＭＳにより、精製された中性プロテアーゼを配列決定し、現プロセスの中性プロテアーゼＮ末端を同定した。これは、プロセスの単離された中性プロテアーゼが機能的である（活性がある）かを確認するために、分解研究のためにも用いた。
【図３１】Ｃ．ヒストリチクム（ＣＣＨ）中性プロテアーゼ（δ−毒素、ＣＨＬ＿２５７６）の推定されたゲノム配列である。青色強調部は、Ｅｄｍａｎ分解試験により同定されるような、Ｃ．ヒストリチクム００４株からの成熟中性プロテアーゼのＮ末端を識別し、青色で強調される。緑色強調部は、Ｌｙｓ−Ｃ／トリプシンＬＣ−質量分析により検出されるような、Ｃ．ヒストリチクムからの成熟中性プロテアーゼのセクションを識別する。
【図３２】ＳｃｈｅｃｈｔｅｒおよびＢｅｒｇｅｒのプロテアーゼ下位部位（ｓｕｂｓｉｔｅ）命名法を記載する。
【図３３】２つの酵素の間の完全なホモロジーを示す、rｎｐｒＡおよびコラゲナーゼＣ．ヒストリチクム（ＣＣＨと略される）中性プロテアーゼ（ＣＬＨ＿２５７６）の配列アライメントである。
【図３４】Ｃ．ヒストリチクム（ＣＣＨ）プロセス内産物ストリームの１２％のＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｎｏｖｅｘ（登録商標）カゼインザイモグラフィーＰＡＧＥ画像である：ロット１００８０８からのＭｕｓｔａｎｇ−Ｑ濾液（ＭＱＦ）、ＨＩＣロード、ＨＩＣ溶離液、およびＡＵＸ−ＩＩプール。使用したゲルは、１２％のＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ザイモグラムカゼインゲルである。ロット１００８０８を産生した製造プロセスは、高レベルの不純物を産生し、また古いプロセス制御方法を用いた。この画像では、中性プロテアーゼ活性は、ＭＱＦ、ＨＩＣロード、およびＨＩＣ溶離液において観察されたが、ＡＵＸ−ＩＩプールでは観察されない。ＨＩＣ溶離液試料中で観察された低いシグナルは、ＨＩＣ工程において生じる中性プロテアーゼの主なクリアランスを示す。  レーン１：＋コントロール（テルモリシン）、１ｎｇ  レーン２：分子量参照  レーン３：ブランク  レーン４：ＭＱＦ  Ｄｅｖ−２５Ａ、２μｇ  レーン５：ブランク  レーン６：ＨＩＣロード  Ｄｅｖ−１３、３μｇ  レーン７：ブランク  レーン８：ブランク  レーン９：ＨＩＣ溶離液  Ｄｅｖ−２５Ａ、４μｇ  レーン１０：ブランク  レーン１１：Ａｕｘ  ＩＩプール１０００８０８、１０μｇ  レーン１２：ブランク
【図３５】Ｃ．ヒストリチクム（ＣＣＨ）プロセス内産物ストリーム：高い亜鉛およびニッケル含量を伴うＨＩＣバッファーによる影響を受けたロットからの、第１のタンジェンシャルフローフィルター（ＴＦＦ−１）濃縮液、ＡＵＸ−Ｉプール、ＡＵＸ−Ｉ中間体、ＡＵＸ−ＩＩ中間体、薬物製品の、１２％のＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｎｏｖｅｘ（登録商標）カゼインザイモグラフィーＰＡＧＥ画像である。使用したゲルは、１２％のＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ザイモグラムカゼインゲルである。この場合、中性プロテアーゼは、ＴＦＦ−１濃縮液、ならびに低レベルのＡＵＸ−Ｉおよび薬物製品中で観察されたが、ＡＵＸ−ＩＩ中では観察されなかった。これらのデータは、ＡＵＸ−Ｉで溶離するＩＥＸ工程にわたる産物からの中性プロテアーゼ分離を実証している。  レーン１：＋コントロール（テルモリシン）、１ｎｇ  レーン２：分子量参照  レーン３：ブランク  レーン４：ＴＦＦ−１濃縮液１００００８０８、１０μｇ  レーン５：ブランク  レーン６：ＡＵＸ−Ｉプール１００００８０８、１０μｇ  レーン７：ブランク  レーン８：ＡＵＸ−Ｉ中間体１００００８０８、１０μｇ  レーン９：ブランク  レーン１０：ＡＵＸ−ＩＩ中間体１００００８０８、１０μｇ  レーン１１：ブランク  レーン１２：薬物原料１００００８０８、１０μｇ
【図３６】ロット１０００４１４ＡＵＸ−ＩＩ画分のコラゲナーゼＣ．ヒストリチクム（ＣＣＨ）ＩＥＸ画分保留液の１２％のＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｎｏｖｅｘ（登録商標）カゼインザイモグラフィーＰＡＧＥ画像である。使用したゲルは、１２％のＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ザイモグラムカゼインゲルである。これらの画分は、プロセスにおいて活性のある中性プロテアーゼが見出される前に産生された製造ロットからのものである。中性プロテアーゼは、ＡＵＸ−ＩＩ画分のいずれにおいても検出されなかった。  レーン１：＋コントロール（テルモリシン）、１ｎｇ  レーン２：分子量参照  レーン３：ＡＵＸ−ＩＩ画分１  １０００４１４、６．４μｇ  レーン４：ＡＵＸ−ＩＩ画分２  １０００４１４、１４．４μｇ  レーン５：ＡＵＸ−ＩＩ画分３  １０００４１４、１０μｇ  レーン６：ＡＵＸ−ＩＩ画分４  １０００４１４、１０μｇ  レーン７：ＡＵＸ−ＩＩ画分５  １０００４１４、１０μｇ  レーン８：ＡＵＸ−ＩＩ画分６  １０００４１４、１１．２μｇ  レーン９：ＡＵＸ−ＩＩ画分７  １０００４１４、６．２μｇ  レーン１０：ＡＵＸ−ＩＩ画分８  １０００４１４、５．８μｇ
【図３７】ロット１０００４１４ＡＵＸ−Ｉ画分のコラゲナーゼＣ．ヒストリチクム（ＣＣＨ）ＩＥＸ画分保留液の１２％のＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｎｏｖｅｘ（登録商標）カゼインザイモグラフィーＰＡＧＥ画像である。使用したゲルは、１２％のＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ザイモグラムカゼインゲルである。これらの画分は、プロセスにおいて活性のある中性プロテアーゼが見出される前に産生された製造ロットからのものである。中性プロテアーゼは、この方法を用いるＡＵＸ−Ｉ画分のいずれにおいても検出されなかった。  レーン１：分子量参照  レーン２：ＡＵＸ−Ｉ画分９  １０００４１４、８．８μｇ  レーン３：ＡＵＸ−Ｉ画分１０  １０００４１４、１０μｇ  レーン４：ＡＵＸ−Ｉ画分１１  １０００４１４、１０μｇ  レーン５：ＡＵＸ−Ｉ画分１２  １０００４１４、１０μｇ  レーン６：ＡＵＸ−Ｉ画分１３  １０００４１４、１０μｇ  レーン７：ＡＵＸ−Ｉ画分１４  １０００４１４、１０μｇ  レーン８：ＡＵＸ−Ｉ画分１５  １０００４１４、１０μｇ  レーン９：ＡＵＸ−Ｉ画分１６  １０００４１４、１４μｇ  レーン１０：ＡＵＸ−Ｉ画分１７  １０００４１４、１０μｇ
【図３８】ロット１０００４１４ＡＵＸ−ＩＩ画分１、７およびＡＵＸ−Ｉ画分８、１７のコラゲナーゼＣ．ヒストリチクム（ＣＣＨ）ＩＥＸ画分保留液の１２％のＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｎｏｖｅｘ（登録商標）カゼインザイモグラフィーＰＡＧＥ画像である。使用したゲルは、１２％のＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ザイモグラムカゼインゲルである。ロット１０００４１４を産生した製造プロセスは、低レベルの不純物をもたらし、古いプロセス制御方法を用いた。このゲル上で、画分は、元々のゲル（図１６および図１７）においてよりも高い濃度で実行された。中性プロテアーゼは、ＡＵＸ−Ｉピークの最後の画分（画分１７）においてのみ検出され、これは、ピークの末端での溶離におけるその位置的性質を実証している。  レーン１：＋コントロール（テルモリシン）、１ｎｇ  レーン２：分子量参照  レーン３：ＡＵＸ−ＩＩ画分１  １０００４１４  Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙ、１０μｇ  レーン４：ＡＵＸ−ＩＩ画分１  １０００４１４  ＬＤＳ、１０μｇ  レーン５：ＡＵＸ−ＩＩ画分７  １０００４１４  Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙ、９．３μｇ  レーン６：ＡＵＸ−ＩＩ画分７  １０００４１４  ＬＤＳ、９．３μｇ  レーン７：ＡＵＸ−Ｉ画分８  １０００４１４  Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙ、６．５μｇ  レーン８：ＡＵＸ−Ｉ画分８  １０００４１４  ＬＤＳ、６．５μｇ  レーン９：ＡＵＸ−Ｉ画分１７  １０００４１４  Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙ、１１μｇ  レーン１０：ＡＵＸ−Ｉ画分１７  １０００４１４  ＬＤＳ、１１μｇ  Ｔｒｉｓ−ＧｌｙおよびＬＤＳは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのための２つのバッファー系である。一方の系が他方に優れるかを評価するために、このゲルを実行した。違いは認められなかった。
【図３９】ロット００１１３８ＡＵＸ−Ｉ末尾画分１７、１８、１９のコラゲナーゼＣ．ヒストリチクム（ＣＣＨ）ＩＥＸ画分保留液の１２％のＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｎｏｖｅｘ（登録商標）カゼインザイモグラフィーＰＡＧＥ画像である。使用したゲルは、１２％のＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ザイモグラムカゼインゲルである。このゲルは、ＡＵＸ−Ｉピークの末端からの拒絶された画分を示す。３つの拒絶された画分の各々は、検出可能な中性プロテアーゼを含有した。画分１７および１８は、プロセス内プール基準に合格したが、１：１の産物標的プールストラテジーに基づいて拒絶された。これは、ＡＵＸ−Ｉおよび薬物製品から残留中性プロテアーゼを除去するプロセス制御を実証する。  レーン１：ＴＦＦ−１濃縮液Ｄｅｖ−２５Ａ、３４μｇ  レーン２：分子量参照  レーン３：ブランク  レーン４：ＡＵＸ−Ｉ画分７  Ｄｅｖ−２５Ａ、４．５μｇ  レーン５：ブランク  レーン６：ＡＵＸ−Ｉ画分１７  Ｄｅｖ−２５Ａ、５μｇ  レーン７：ブランク  レーン８：ＡＵＸ−Ｉ画分１７  ００１１３８、１４．８μｇ  レーン９：ブランク  レーン１０：ＡＵＸ−Ｉ画分１８  ００１１３８、１０．３μｇ  レーン１１：ブランク  レーン１２：ＡＵＸ−Ｉ画分１９  ００１１３８、８．１μｇ
【図４０Ａ−４０Ｂ】コラゲナーゼＣ．ヒストリチクム（ＣＣＨ）製造プロセス、ロット００１０９８７の１２％のＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｎｏｖｅｘ（登録商標）カゼインザイモグラフィーＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル画像である。使用したゲルは、１２％のＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ  Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ザイモグラムカゼインゲルである。このゲルは、ＡＵＸ−Ｉピークの末端からの拒絶された画分を示す。３つの拒絶された画分の各々が、検出可能な中性プロテアーゼを含有した。画分１７および１８は、プロセス内プール基準に合格したが、１：１の産物標的プールストラテジーに基づいて拒絶された。これは、ＡＵＸ−Ｉおよび薬物製品から残留中性プロテアーゼを除去するプロセス制御を実証する。図４０Ａは、プロセスにわたってのＡＵＸ−Ｉについての精製の状態を示す。図４０Ｂは、プロセスにわたってのＡＵＸ−ＩＩについての精製の状態を示す。  図４０Ａ  レーン１：陽性対照（ＴＬ）  レーン２：分子量参照  レーン３：なし  レーン４：Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ濾液、２．１μｇロード  レーン５：なし  レーン６：ＨＩＣ溶離液、４．９μｇロード  レーン７：なし  レーン８：ＡＵＸ−Ｉプール、１０μｇロード  レーン９：なし  レーン１０：ＡＵＸ−Ｉ中間体、１０μｇロード  レーン１１：なし  レーン１２：アッセイブランク  図４０Ｂ  レーン１：陽性対照（ＴＬ）  レーン２：分子量参照  レーン３：なし  レーン４：ＴＦＦ−１濃度、１０μｇロード  レーン５：なし  レーン６：ＡＵＸ−ＩＩプール、１０μｇロード  レーン７：なし  レーン８：ＡＵＸ−ＩＩ中間体、１０μｇロード  レーン９：なし  レーン１０：バルク薬物原料（薬物製品）、１０μｇロード  レーン１１：なし  レーン１２：アッセイブランク
【図４１】コラゲナーゼＩ画分およびコラゲナーゼＩＩの収集、ならびに純度基準を満たすかに基づく、それらのフォワードプロセシングを示す。
【図４２】各ＡＵＸ溶離ピーク中の総タンパク質の量に対するＡＵＸ−Ｉ産物のパーセント純度を提供する。
【図４３】各ＡＵＸ溶離ピーク中の総タンパク質の量に対するＡＵＸ−ＩＩ産物のパーセント純度を提供する。
【図４４】ＡＵＸ−Ｉ９０ｋＤａ不純物の管理図を表す。図４２で見られるＡＵＸ−Ｉ溶離ピークのパーセント純度レベルにおける減少は、高いレベルのＡＵＸ−Ｉ９０ｋＤａ不純物に主に起因する。
【図４５】ＡＵＸ−ＩＩ９６ｋＤａ不純物の管理図を表す。図４３で見られるＡＵＸ−ＩＩ溶離ピークのパーセント純度レベルにおける減少は、高いレベルのＡＵＸ−ＩＩ９６ｋＤａ不純物に主に起因する。
【図４６Ａ−４６Ｄ】さまざまなＡＵＸピークおよびバンドについての産物ピーク中の推定パーセントを提供する。これらの図により提供されるデータは、偏差３７９７に関連する是正措置および予防措置の実施後にＩＥＸ画分不純物を評価するための統計的分析において使用された。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
ここでさまざまな態様および実施形態が本明細書で十分に説明される。しかしこれらの態様および実施形態は、多くの異なる形態で具体化されてもよく、限定として解釈されるべきではない。むしろこれらの実施形態は、本開示が完全かつ完璧であり、当業者に対して本主題の範囲を十分に伝えるものとして提供される。本明細書で引用されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、上記または下記に関わらず、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２７】
Ｉ．定義
別段に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての用語および語句は、相反することが明確に示されるか、またはそれらの用語もしくは語句が用いられる文脈から明白である場合を除き、それらの用語および語句が当該技術分野において獲得した意味を含む。本明細書で記載されるものと同様または等価な任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、ここでは特定の方法および材料が記載される。
【００２８】
別段に述べない限り、個別の数値の使用は、「約」または「おおよそ」という単語に先行されているかのように、近似値として述べられる。同様に、本出願で特定されるさまざまな範囲の数値は、別段に明白に示されない限り、述べられた範囲内の最小値および最大値が両方とも「約」または「おおよそ」という単語に先行されているかのように、近似値として述べられる。このように、範囲内にある値と実質的に同じ結果に到達するために、述べられた範囲を上回るおよび下回る変形形態を用いることが可能である。本明細書で使用されるように、数値を参照する場合の用語「約」および「おおよそ」は、本開示の主題が最も密接に関連する技術分野または問題となる範囲もしくは要素に関する技術分野の当業者に対して、明瞭かつ通常の意味を有する。厳格な数値境界から広がる量は、多くの因子に依存する。例えば、考慮され得る因子のいくつかは、要素の重要性、および／または特許請求される主題の性能に対して所与の量の変形形態が有することになる効果、ならびに当業者に公知の他の考慮すべき事項を含む。本明細書で使用される場合、異なる数値について異なる量の有効桁を使用することは、単語「約」または「おおよそ」の使用がどのように特定の数値または範囲を広げるように作用するかを限定することを意味しない。したがって、一般的事項として、「約」または「おおよそ」は、数値を広げる。また、範囲の開示も、最小値および最大値の間のすべての値を含む連続的な範囲に加えて、用語「約」または「おおよそ」の使用により付与される広げられた範囲として意図される。結果として、本明細書では、数値の範囲の列挙は、単に、範囲内にある各々の別々の値を個別に参照するための簡略的な方法として役立つことが意図され、各々の別々の値は、それが本明細書で個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「コラゲナーゼ」は、標準コラゲナーゼアッセイにおいてコラゲナーゼ活性を示す１つ以上のタンパク質、例えば、コラゲナーゼＩおよび／またはコラゲナーゼＩＩを含むことを意味する。コラゲナーゼ組成物は、時にＡＵＸＩおよびＡＵＸＩＩと呼ばれる２つの微生物コラゲナーゼのうちの少なくとも１つを含み得る。用語「コラゲナーゼＩ」、「ＡＢＣＩ」、「ＡＵＸＩ」、「ＡＵＸ−Ｉ」、「コラゲナーゼＡＵＸＩ」、および「コラゲナーゼＡＢＣＩ」は、同じアミノ酸配列を有する同じ酵素を意味し、互換的に使用することができる。同様に、用語「コラゲナーゼＩＩ」、「ＡＢＣＩＩ」、「ＡＵＸＩＩ」、「ＡＵＸ−ＩＩ」、「コラゲナーゼＡＵＸＩＩ」、および「コラゲナーゼＡＢＣＩＩ」は、同じ酵素を指し、同じく互換的に使用することができる。これらのコラゲナーゼは、細菌細胞により分泌される。ある態様では、コラゲナーゼは、クロマトグラフィー方法によりＣ．ヒストリチクム培養上清から単離され、かつ精製される。他の態様では、コラゲナーゼは、組換え的に単離され、かつ精製され、かつ／または哺乳動物、真菌、および細菌供給源を含むさまざまな供給源から得られる。両コラゲナーゼは、特別なプロテアーゼであり、同じＥＣ番号（Ｅ．Ｃ３．４．２４．３）を共有する。他の態様では、コラゲナーゼ組成物は、コラゲナーゼＩまたはコラゲナーゼＩＩを含む。別の実施形態では、コラゲナーゼ組成物は、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの両方を含む。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「コラーゲン介在症状」は、コラーゲンに関わるいずれかの疾患または病気を意味する。本明細書で記載される組成物および方法により治療され得るコラーゲン介在症状の例は、デュプイトラン病；ペロニー病；フローズンショルダー（癒着性関節包炎）、ケロイド；肥厚性瘢痕；炎症性ざ瘡から生じるものなどの憂鬱な瘢痕；手術後癒着；尋常性ざ瘡；脂肪腫、ならびに外観を損なう症状、例えば、しわ、セルライト、および新生物繊維症を含むが、これらに限定されない。
【００３１】
語句「コラゲナーゼＩ産物」は、発酵から精製されたコラゲナーゼＩを意味し、精製工程からのコラゲナーゼＩの溶離は画分中に収集され、かつこれらの画分のうち任意の数が一緒にプールされる。
【００３２】
語句「コラゲナーゼＩＩ産物」は、発酵から精製されたコラゲナーゼＩＩを意味し、精製工程からのコラゲナーゼＩＩの溶離は画分中に収集され、かつこれらの画分のうち任意の数が一緒にプールされる。
【００３３】
語句クロストリジウム・ヒストリチクム「に由来する」は、Ｃ．ヒストリチクムを起源とするコラゲナーゼを意味する。これは、Ｃ．ヒストリチクムの発酵および組換えコラゲナーゼを有する他の生物を用いる発酵から得られたコラゲナーゼの両方を包含する。
【００３４】
用語「薬物原料」、「薬物製品」、または「コラゲナーゼ組成物」は互換的に使用することができ、いかなる任意選択の凍結乾燥も行う前の、コラゲナーゼＩ組成物、コラゲナーゼＩＩ組成物、またはコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとの両方の組成物を指すことが理解される。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「中性プロテアーゼを本質的に含まない」は、使用される特定の検出アッセイ（例えば、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、ザイモグラフィー、ＨＰＬＣ等）の検出可能な限界を下回ることを意味する。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「順方向でプロセスされた」は、最終的なコラゲナーゼＩ薬物原料またはコラゲナーゼＩＩ薬物原料を作製するためのプールするのに用いられる高度に精製されたコラゲナーゼＩまたはＩＩの画分を意味する。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「高度に精製された」または「高い純度」または「高度に純粋な」コラゲナーゼＩもしくはＩＩ、またはコラゲナーゼＩとＩＩとの組み合わせは、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により測定された場合に少なくとも９５面積％純粋、または少なくとも９６面積％純粋、または少なくとも９７面積％純粋、または少なくとも９８面積％純粋、または少なくとも９９面積％純粋、または約１００面積％純粋であるコラゲナーゼを意味する。さらに明確にするために、これは、ＲＰ−ＨＰＬＣにより測定された場合に少なくとも９５面積％〜約１００面積％の純度についてのすべての数値を含む。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「最も豊富にある不純物」は、濃度測定を伴うもしくは伴わないＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより測定された場合に、または別の許容される方法により測定された場合に、所与の工程（例えば、ＩＥＸ後）において最も高い存在を有するコラゲナーゼ断片を意味する。コラゲナーゼ断片は、精製プロセスにわたって見出される場合があり、任意の大きさであってもよいが、最も頻繁には、コラゲナーゼＩ断片については約３３ｋＤａ、４５ｋＤａ、５５ｋＤａ、８０ｋＤａ、または９０ｋＤａ、そしてコラゲナーゼＩＩ断片については、約２５ｋＤａ、３８ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、９２ｋＤａ、９２ｋＤａ、または９６ｋＤａの分子量にて見出される。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「中性プロテアーゼ排除」または「中性プロテアーゼ排除工程」は、コラゲナーゼ濾液が分離カラムまたはフィルターを通過した後の、製造の間に収集された画分の除去または拒絶を意味する。
【００４０】
「任意選択の」または「任意選択により」は、続いて記載される要素、成分、または状況が、生じても、生じなくてもよいことを意味し、これによりこの記載は、要素、成分、または状況が生じる場合、およびそれらが生じない場合を含む。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」または「賦形剤」は、非毒性、不活性の固体、半固体、または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、または製剤化補助剤を意味する。薬学的に許容される担体として役立つことのできる材料のいくつかの例は、糖、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース；デンプン、例えば、トウモロコシデンプン、およびジャガイモデンプン；セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース；粉末トラガント；麦芽；ゼラチン；タルク；グリコール、例えば、プロピレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチル、およびラウリル酸エチル；寒天；緩衝化剤、例えば、水酸化マグネシウム、および水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱性物質除去蒸留水；等張性食塩水；リンゲル液；エチルアルコール、およびリン酸バッファー溶液、ならびに他の非毒性相容性潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、およびステアリン酸マグネシウムであり、それだけでなく着色剤、放出剤、コーティング剤、着香剤、保存剤、および抗酸化剤も、製剤化担当者の判断に従って、組成物中に存在することができる。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「精製された画分」は、未分解コラゲナーゼＩがＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル濃度測定により測定された場合に少なくとも９０％の純度を有し、かつ最も豊富にある分解コラゲナーゼＩもしくはＩＩの不純物が７．５％以下であることを意味する。コラゲナーゼ製造プロセス工程からのコラゲナーゼＩＩ画分について「精製された画分」として適格とするために、未分解コラゲナーゼＩＩは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル濃度測定により測定された場合に少なくとも９０％の純度を有し、かつ最も豊富にある分解コラゲナーゼＩもしくはＩＩの不純物は７．５％以下である。例えば、精製されたコラゲナーゼＩ画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル濃度測定により測定された場合に、少なくとも約９０％または約９１．２％の未分解ＡＵＸ−Ｉを有してもよく、かつ最も豊富にある分解ＡＵＸ−ＩまたはＡＵＸ−ＩＩ不純物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル濃度測定により測定された場合に、約５％または約５．８％以下である。第２の例として、ＡＵＸ−ＩＩ画分を精製された画分として適格とするために、画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル濃度測定により測定された場合に、少なくとも約９０％または約９１．２％の純度の未分解ＡＵＸ−ＩＩを有してもよく、かつ最も豊富にある分解ＡＵＸ−ＩまたはＡＵＸ−ＩＩ不純物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル濃度測定により測定された場合に、約５％または約５．８％以下の純度である。
【００４３】
用語「対象」または「患者」は、本明細書では互換的に用いられ、ヒトまたは他の哺乳動物を指す。
【００４４】
ＩＩ．導入
コラゲナーゼは、当業者に周知であるさまざまな発酵方法により産生することができる。Ｃ．ヒストリチクムから得られた粗コラゲナーゼは、色素リガンドアフィニティクロマトグラフィー、ヘパリンアフィニティクロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および金属キレート化クロマトグラフィーを含むさまざまな方法により以前から精製されてきた。粗製および部分的に精製されたコラゲナーゼは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（ＳＩＡＬ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびＡｄｖａｎｃｅ  Ｂｉｏｆａｃｔｕｒｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｌｙｎｂｒｏｏｋ、Ｎ．Ｙを含む、多くの供給元から市販されている。Ｃ．ヒストリチクムから得られる粗コラゲナーゼの発酵および精製方法はまた、米国特許第７，８１１，５６０号にも記載されている。
【００４５】
以下で詳述されるように、本発明は、（ａ）精製の間の金属含量を制御することと、（ｂ）最終的なコラゲナーゼ製品、例えば、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩ薬物原料から中性プロテアーゼを低減または排除することと、を含むことによる、コラゲナーゼ製品を製造するための改良された方法を提供する。本開示は、供給源に関わらず、コラゲナーゼの製造および使用に対して、一般的に適用可能である。これは、Ｃ．ヒストリチクムに由来するコラゲナーゼＩおよびＩＩに限定することを意図しない。
【００４６】
ＩＩＩ．コラゲナーゼの改良された製造
高度に純粋なコラゲナーゼ（例えば、コラゲナーゼＩおよびＩＩ薬物原料）を製造する本発明の方法の一般的な一態様では、方法は、（１）少なくともコラゲナーゼ（複数可）および中性プロテアーゼを液体発酵培地の中へと分泌する細菌を発酵させる工程と、（２）培地からコラゲナーゼを精製する工程（任意選択で高塩組成物での処理を含む）と、（３）互いからコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとを分離する工程と、（４）コラゲナーゼＩ部分およびコラゲナーゼＩＩ部分の一方または両方から中性プロテアーゼを低減または排除して、それらが中性プロテアーゼを本質的に含まないようにする工程と、（５）中性プロテアーゼの除去後の高度に純粋なコラゲナーゼ薬物原料を産生する工程と、を含む。任意選択で、薬学的に許容される賦形剤をかかる薬物原料に添加して、本明細書のいずれかの箇所に記載されているような薬学的製剤を形成する。
【００４７】
Ａ．コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩなどのコラゲナーゼを作製するための発酵。
本開示は、コラゲナーゼを発酵培地の中へと分泌する任意の細菌の発酵を包含する。かかる発酵の例としては、アクチノマヅラ・マヅレ（Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ  ｍａｄｕｒａｅ）、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、クロストリジウム・ヒストリチクム、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、スタフィロコッカスｓｐｐ．（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ビブリオ・アルギノリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、およびビブリオ・バルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）からのものが挙げられる。このリストは網羅的なものではなく、当業者に周知であるコラゲナーゼを分泌する他の細菌生物も使用することができる。例えば、米国特許第７，８１１，５６０号を参照されたい。Ｃ．ヒストリチクムにより分泌されるタンパク質は、Ｉ型およびＩＩ型コラゲナーゼ、およびさまざまな毒素（例えば、中性プロテアーゼ、クロストリパイン、アエロリジン様ヘモリジン、および酸素不安定性ヘモリジン）を含む。
【００４８】
発酵培地は、コラゲナーゼがその中へと分泌される任意の培地であり得る。発酵培地は、炭素源、窒素源、塩、微量栄養素、および水を含んでもよい。炭素源は、限定はされないが、糖または他の炭化水素を含み得る。窒素源は、限定はされないが、大豆食品などの食品を含んでもよく、または酵母抽出物などの抽出物を含んでもよく、またはペプトンもしくはトリプトンなどの消化前ポリペプチドを含んでもよい。ペプトンは、動物由来（ウシ由来培地またはブタ由来培地など）であってもよい。ペプトンは、動物以外の供給源由来（野菜由来、または他の植物由来など）であってもよい。
【００４９】
Ｂ．コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの精製
一般的な精製技法は、フィルター、クロマトグラフィー、および沈殿を含むが、これら限定されない。当該技術分野において周知であるように、Ｃ．ヒストリチクムからのコラゲナーゼＩおよびＩＩの精製のある特定の態様を実施することができる。例えば、米国特許第７，８１１，５６０号を参照されたい。
【００５０】
コラゲナーゼ精製プロセスはさらに、以下の工程のうちの少なくとも１つを含む：（１）少なくとも第１のアニオン交換工程、ＨＩＣ工程、および第１のバッファー交換工程において亜鉛および／またはニッケル濃度を制御する工程；（２）アニオン交換工程のいずれかからＡＵＸ−Ｉの後方の画分を廃棄する工程；（３）コラゲナーゼＩＩからコラゲナーゼＩを分離した後、ピーク画分からプールしたコラゲナーゼＩの量が、製造プロセスからのコラゲナーゼＩＩの量とおおよそ等しくなるまで、コラゲナーゼＩのみのピーク画分をプールする工程；ならびに（４）コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、またはコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとの両方のプール工程についての純度基準を設定する工程。これらの工程の使用は、中性プロテアーゼを本質的に含まないコラゲナーゼＩ産物を産生する。同様に、コラゲナーゼＩＩ産物は、中性プロテアーゼを本質的に含まない。
【００５１】
培地からのコラゲナーゼおよび毒素の濾過は、デプスフィルター、遠心分離、マイクロ濾過、タンジェンシャルフロー濾過、珪藻土濾床、および真空濾過の使用によるなどの多数の方法により達成することができる。一実施形態では、濾過は、デプスフィルター、続いて、０．２ミクロン滅菌グレードフィルターを用いて実施される。
【００５２】
一実施形態では、精製プロセスは、デプスフィルター（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ  ＨＣ  ＰＯＤ）、続いて、アニオン交換濾過（例えば、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑフィルター）、続いて、濾過（例えば、０．４５μフィルター）、および濾液を約０．８Ｍ〜１．２Ｍの濃度の高塩組成物（例えば、硫酸アンモニウム）に曝露することによる濾液の調整、続いて、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（例えば、フェニルＳＦＦ  ｌｏｗ−ｓｕｂ）、続いて、バッファー交換（例えば、タンジェンシャルフロー濾過もしくは透析）、続いて、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、ＱセファロースＨＰアニオン交換カラム）、続いて、バッファー交換（例えば、タンジェンシャルフロー濾過もしくは透析）を通して、発酵したＣ．ヒストリチクム（例えば、プロテオーゼペプトンなどのブタ由来培地）からコラゲナーゼを回収することを含み得る。さらに、ロイペプチンが、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程に付加され、イオン交換工程にわたって維持されてもよい。
【００５３】
高塩組成物は、溶解性に基づきタンパク質の分離を可能とするものである。Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ系列（離液系列）からの塩が使用されてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、またはそれらの混合物からなる群より選択される溶液である。高塩組成物は、さまざまな濃度で使用することができる。例えば、硫酸アンモニウムは、約０．８Ｍ〜約１．２Ｍ、または約０．９Ｍ〜約１．１Ｍ、または約１Ｍの範囲の濃度で使用されてもよい。
【００５４】
高塩組成物が金属汚染物質を含まない、または金属含量が低いことは有利である。いくつかの実施形態では、高塩組成物は、以下の仕様のうち１つ以上を満たす。
【表１】
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【００５５】
別の実施形態では、高塩組成物は、約８５ｐｐｍ、または８０ｐｐｍ、または７５ｐｐｍ、または７０ｐｐｍ、または６５ｐｐｍ、または６０ｐｐｍ、または５５ｐｐｍ、または５０ｐｐｍ、または４５ｐｐｍ、または４０ｐｐｍ、または３５ｐｐｍ、または３０ｐｐｍ、または２５ｐｐｍ、または２０ｐｐｍ、または１５ｐｐｍ、または１０ｐｐｍ、または９ｐｐｍ、または８ｐｐｍ、または７ｐｐｍ、または６ｐｐｍ、または５ｐｐｍ、または４ｐｐｍ、または３ｐｐｍ、または２ｐｐｍ、または１ｐｐｍ未満の量で存在する亜鉛を有してもよい。ニッケルは、高塩組成物中に、約１．５ｐｐｍ、または１．４ｐｐｍ、または１．３ｐｐｍ、または１．２ｐｐｍ、または１．１ｐｐｍ、または１．０ｐｐｍ、または０．９ｐｐｍ、または０．８ｐｐｍ、または０．７ｐｐｍ、または０．６ｐｐｍ、または０．５ｐｐｍ、または０．４ｐｐｍ、または０．３ｐｐｍ、または０．２ｐｐｍ、または０．１ｐｐｍ未満の量で存在してもよい。
【００５６】
原材料の金属含量は、認定販売元から超高純度の原材料を入手することにより制御され得る。一態様では、ニッケル濃度は約１．２ｐｐｍ未満であり、もしくは亜鉛濃度は約８４．４ｐｐｍ未満であるか、またはニッケル濃度は約１．２ｐｐｍ未満であり、かつ亜鉛濃度は約８４．４ｐｐｍ未満である。他の態様では、ニッケル濃度、亜鉛濃度、またはニッケルおよび亜鉛の両方の濃度が、約０．１ｐｐｍ未満である。
【００５７】
一実施形態では、Ｃ．ヒストリチクムに由来するコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩは、単離され、かつ精製され、そして精製プロセスは、金属レベルを制御する。さらなる一実施形態では、Ｃ．ヒストリチクムに由来するコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩは、単離され、かつ精製され、精製プロセスは、ニッケル、亜鉛、アルミニウム、ヒ素、カルシウム、カドミウム、クロム、銅、鉄、マグネシウム、鉛、またはそれらの組み合わせのレベルを制御する。
【００５８】
さらなる一実施形態では、本開示は、Ｃ．ヒストリチクムに由来するコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの単離および精製の方法に関し、精製プロセスは、ニッケルおよび／または亜鉛レベルを制御する。
【００５９】
本発明の一実施形態では、コラゲナーゼＩおよび／またはＩＩのための製造プロセスならびに薬物製品の形成の間のニッケル濃度は、約１００ｐｐｍ未満、または約７５ｐｐｍ未満、または約５０ｐｐｍ未満、または約４０ｐｐｍ未満、または約３０ｐｐｍ未満、または約２０ｐｐｍ未満、または約１０ｐｐｍ未満、または約５ｐｐｍ未満、または約３．０ｐｐｍ未満、または約２．９ｐｐｍ未満、または約２．８ｐｐｍ未満、または約２．７ｐｐｍ未満、または約２．６ｐｐｍ未満、または約２．５ｐｐｍ未満、または約２．４ｐｐｍ未満、または約２．３ｐｐｍ未満、または約２．２ｐｐｍ未満、または約２．１ｐｐｍ未満、または約２．０ｐｐｍ未満、または約１．９ｐｐｍ未満、または約１．８ｐｐｍ未満、または約１．７ｐｐｍ未満、または約１．６ｐｐｍ未満、または約１．５ｐｐｍ未満、または約１．４ｐｐｍ未満、または約１．３ｐｐｍ未満、または約１．２ｐｐｍ未満、または約１．１ｐｐｍ未満、または約１．０ｐｐｍ未満、または約０．９ｐｐｍ未満、または約０．８ｐｐｍ未満、または約０．７ｐｐｍ未満、または約０．６ｐｐｍ未満、または約０．５ｐｐｍ未満、または約０．４ｐｐｍ未満、または約０．３ｐｐｍ未満、または約０．２ｐｐｍ未満、または約０．１ｐｐｍ未満、または約０．０９ｐｐｍ未満、または約０．０８ｐｐｍ未満、または約０．０７ｐｐｍ未満、または約０．０６ｐｐｍ未満、または約０．０５ｐｐｍ未満、または約０．０４ｐｐｍ未満、または約０．０３ｐｐｍ未満、または約０．０２ｐｐｍ未満、または約０．０１ｐｐｍ未満である。
【００６０】
本発明の別の実施形態では、コラゲナーゼＩおよび／またはＩＩのための製造プロセスならびに薬物製品の形成の間の亜鉛濃度は、約１０００ｐｐｍ未満、または約９５０ｐｐｍ未満、または約９００ｐｐｍ未満、または約８５０ｐｐｍ未満、または約８００ｐｐｍ未満、または約７５０ｐｐｍ未満、または約７００ｐｐｍ未満、または約６５０ｐｐｍ未満、または約６００ｐｐｍ未満、または約５５０ｐｐｍ未満、または約５００ｐｐｍ未満、または約４５０ｐｐｍ未満、または約４００ｐｐｍ未満、または約３５０ｐｐｍ未満、または約３００ｐｐｍ未満、または約２５０ｐｐｍ未満、または約２００ｐｐｍ未満、または約１５０ｐｐｍ未満、または約１２５ｐｐｍ未満、または約１００ｐｐｍ未満、または約９５ｐｐｍ未満、または約９０ｐｐｍ未満、または約８５ｐｐｍ未満、または約８４ｐｐｍ未満、または約８０ｐｐｍ未満、または約７５ｐｐｍ未満、または約７０ｐｐｍ未満、または約６５ｐｐｍ未満、または約６０ｐｐｍ未満、または約５５ｐｐｍ未満、または約５０ｐｐｍ未満、または約４５ｐｐｍ未満、または約４０ｐｐｍ未満、または約３５ｐｐｍ未満、または約３０ｐｐｍ未満、または約２５ｐｐｍ未満、または約２０ｐｐｍ未満、または約１５ｐｐｍ未満、または約１０ｐｐｍ未満、または約９ｐｐｍ未満、または約８ｐｐｍ未満、または約７ｐｐｍ未満、または約６ｐｐｍ未満、または約５ｐｐｍ未満、または約４ｐｐｍ未満、または約３ｐｐｍ未満、または約２ｐｐｍ未満、または約１ｐｐｍ未満、または約０．９ｐｐｍ未満、または約０．８ｐｐｍ未満、または約０．７ｐｐｍ未満、または約０．６ｐｐｍ未満、または約０．５ｐｐｍ未満、または約０．４ｐｐｍ未満、または約０．３ｐｐｍ未満、または約０．２ｐｐｍ未満、または約０．１ｐｐｍ未満である。
【００６１】
Ｃ．コラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとの分離
コラゲナーゼＩとＩＩとを、当業者に周知の任意の技法により分離することができる。例えば、コラゲナーゼＩとＩＩとを、イオン交換クロマトグラフィーを用いて互いから分離することができる。イオン交換クロマトグラフィーの１つの型は、アニオン交換カラム、例えば、Ｑ−セファロースカラムであってもよい。
【００６２】
Ｄ．中性プロテアーゼの低減または排除
一般的な一態様では、複数のコラゲナーゼが存在する場合には、コラゲナーゼを互いに分離した後に、中性プロテアーゼを排除する工程が生じる。コラゲナーゼは、溶離工程の間にイオン交換クロマトグラフィーを用いて分離される。コラゲナーゼの溶離は一般的に複数のピークで生じ、ここで、コラゲナーゼＩは、１つのピーク中にあり、コラゲナーゼＩＩは、第２のピーク中にある。各ピークは、各溶離ピークの経時的な画分として収集され得る。
【００６３】
コラゲナーゼＩ産物およびコラゲナーゼＩＩ産物からの中性プロテアーゼの低減または排除は、以下の排除工程のうちの１つ以上により達成され得る：（ａ）ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルもしくはＨＰＬＣにより測定された場合に、約９０％未満のコラゲナーゼＩもしくはＩＩ含量を有し、かつ約５％以上の含量の任意の単一の不純物を有する任意の画分を除外すること；（ｂ）ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルもしくはザイモグラフィーにより測定された場合に、検出可能なレベルの中性プロテアーゼを有する任意の画分を除外すること；または（ｃ）過剰なレベルの中性プロテアーゼを含有すると計算された任意の画分を除外すること。各々は以下で説明されており、個別に、または組み合わせて使用され得る。
【００６４】
画分のサイズは限定されないが、例示的な産業用サイズの画分は、約２００ｍＬ、または３００ｍＬ、または４００ｍＬ、または５００ｍＬ、または６００ｍＬ、または７００ｍＬ、または８００ｍＬ、または９００ｍＬ、または１０００ｍＬ、または１１００ｍＬ、または１２００ｍＬ、または１３００ｍＬ、または１４００ｍＬ、または１５００ｍＬ、または１６００ｍＬ、または１７００ｍＬ、または１８００ｍＬ未満、またはそれ以上未満であり得る。
【００６５】
画分あたりのコラゲナーゼの量は限定されないが、例示的な産業用サイズの画分は、約０．１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、またはそれ以上、例えば、約０．２ｇ／Ｌ、または０．５ｇ／Ｌ、または０．８ｇ／Ｌ、または１．１ｇ／Ｌ、または１．４ｇ／Ｌ、または１．７ｇ／Ｌ、または２．０ｇ／Ｌ、または２．３ｇ／Ｌ、または２．６ｇ／Ｌ、または２．９ｇ／Ｌ、または３．２ｇ／Ｌ、または３．５ｇ／Ｌ、または３．８ｇ／Ｌ、または４．１ｇ／Ｌ、または４．４ｇ／Ｌ、または４．７ｇ／Ｌ、または５．０ｇ／Ｌ、または６ｇ／Ｌ、または７ｇ／Ｌ、または８ｇ／Ｌ、または９ｇ／Ｌ、または１０ｇ／Ｌ、またはそれ以上のいずれのタンパク質濃度を含み得る。
【００６６】
コラゲナーゼのパーセント純度は、当業者に公知の任意の方法を用いて、各画分について判定され得る。１つの例示的な方法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび濃度測定を用いる純度測定である。濃度測定ソフトウェアは、ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドを強度量に変換する任意のソフトウェアであり得る。かかるソフトウェアの一例は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（登録商標）である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、任意の数のレーンを有してもよく、一般的なレーンの数は、１０レーンまたは１５レーンを含む。各レーンについてのウェルサイズは異なってもよいが、一般的なウェルサイズは、１５〜５０マイクロリットルを保持する。一般に、ウェル中に適合するタンパク質の任意の量をロードすることができるが、目的の産物の分析に十分な典型的な量は、約０．５〜約５マイクログラムのタンパク質のうちの任意のものである。
【００６７】
画分中の中性プロテアーゼの存在についてのアッセイも実施され得る。当業者に公知の、画分中の中性プロテアーゼの存在を判定するための任意の方法が用いられ得る。例示的な方法は、先に述べたような、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または濃度測定を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥを含む。他の例示的な方法は、カゼインザイモグラフィー、または濃度測定を伴うカゼインザイモグラフィーを含む。カゼインザイモグラフィーは、中性プロテアーゼが作用することができるが、コラゲナーゼが作用することのできないゲル中に埋め込まれた牛乳カゼインを典型的に用いる、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。したがって、中性プロテアーゼを含有するザイモグラフィーゲル中のバンドは、コラゲナーゼまたは他の不純物を含有するバンドとは異なる色として出現する。一般に、本開示に関連するザイモグラフィーアッセイについての検出限界（ＬＯＤ）は、濃度測定ソフトウェアを用いると約０．５ｎｇのタンパク質であり、視覚的には約０．２〜０．３ｎｇである。しかし、使用される方法そのものに依存して、より少量が検出される場合がある。
【００６８】
一般に、不純物について試験する場合、目的の一次産物（複数可）を分析するために使用したものより多い量のタンパク質がウェルの中へとロードされる。不純物は、目的の一次産物のために使用したのと同じ量のタンパク質を用いて検出される場合があるが、目的の一次産物を分析または検出するためにウェル中にロードされた量の少なくとも約２または３または４または５または６または７または８または９または１０または１２または１５または２０倍以上の量のロードを必要とし得る。これは特に、目的の産物の純度が増大するにつれ、当てはまる。一般に、本開示に関連する中性プロテアーゼを検出するためにウェルの中へとロードされたタンパク質の量は、約１マイクログラム〜約１００マイクログラム、例えば、約５マイクログラム、８マイクログラム、または１０マイクログラム、または１２マイクログラム、または１５マイクログラム、または２０マイクログラム、または３０マイクログラム、または５０マイクログラム、または７５マイクログラム、またはそれ以上である。
【００６９】
ある特定の態様では、本開示は、中性プロテアーゼを低減または排除するために３つの異なる方法を提供する。
【００７０】
１．排除ストラテジー１
このストラテジーに従って、純度について選択された仕様を満たさない画分は除外され、かつさらなる順方向のプロセスからは排除される。各画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは濃度測定を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてアッセイされ、ゲル上のレーン中の各バンドは、レーン上部のウェルの中へとロードされた総タンパク質のパーセントに対応する。バンドは、コラゲナーゼＩもしくはコラゲナーゼＩＩに対応してもよく、またはコラゲナーゼもしくは他のタンパク質（例えば、中性プロテアーゼ）の断片の形態の不純物に対応してもよい。それぞれコラゲナーゼＩ産物もしくはコラゲナーゼＩＩ産物を作製するためのプール工程のために許容されるレベルのコラゲナーゼＩもしくはコラゲナーゼＩＩは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に、少なくとも８０面積％である。
【００７１】
別の実施形態では、コラゲナーゼＩ産物を作製するためのプール工程のために許容されるレベルのコラゲナーゼＩは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に、少なくとも約８１％、または８２％、または８３％、または８４％、または８５％、または８６％、または８７％、または８８％、または８８．５％、または８９．０％、または８９．５％、または９０％、または９０．５％、または９１％、または９１．５％、または９２％、または９２．５％、または９３％、または９３．５％、または９４％、または９４．５％、または９５％、または９５．５％、または９６％、または９６．５％、または９７％、または９７．５％、または９８％、または９８．５％、または９９％、または９９．５％、または１００面積％である。
【００７２】
一実施形態では、コラゲナーゼＩＩ産物を作製するためのプール工程のために許容されるレベルのコラゲナーゼＩＩは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に、少なくとも約８１％、または８２％、または８３％、または８４％、または８５％、または８６％、または８７％、または８８％、または８８．５％、または８９．０％、または８９．５％、または９０％、または９０．５％、または９１％、または９１．５％、または９２％、または９２．５％、または９３％、または９３．５％、または９４％、または９４．５％、または９５％、または９５．５％、または９６％、または９６．５％、または９７％、または９７．５％、または９８％、または９８．５％、または９９％、または９９．５％、または１００面積％である。
【００７３】
一実施形態では、コラゲナーゼＩ薬物原料についての許容されるレベルの最も豊富にある不純物（コラゲナーゼＩＩから精製され、かつ分離された後であるが、それがコラゲナーゼＩＩと混合される前）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に、コラゲナーゼＩ薬物原料の、約２０％、または１９％、または１８％、または１７％、または１６％、または１５％、または１４％、または１３％、または１２％、または１１％、または１０％、または９％、または８％、または７％、または６％、または５％、または４％、または３％、または２％、または１％、または０．７５％、または０．５％、または０．２５％、または０．１％（ｗ／ｗ）未満である。最も豊富にある不純物の量は、濃度測定を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定されてもよい。
【００７４】
別の実施形態では、コラゲナーゼＩＩ薬物原料についての許容されるレベルの最も豊富にある不純物（コラゲナーゼＩから精製され、かつ分離された後であるが、それがコラゲナーゼＩと混合される前）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に、薬物原料の、約２０％、または１９％、または１８％、または１７％、または１６％、または１５％、または１４％、または１３％、または１２％、または１１％、または１０％、または９％、または８％、または７％、または６％、または５％、または４％、または３％、または２％、または１％、または０．７５％、または０．５％、または０．２５％、または０．１％（ｗ／ｗ）未満である。最も豊富にある不純物の量は、濃度測定を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定されてもよい。
【００７５】
さらに、混合したコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩ薬物原料についての許容されるレベルの最も豊富にある不純物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に、薬物原料の、約５％、または４％、または３％、または２％、または１％、または０．７５％、または０．５％、または０．２５％、または０．１％（ｗ／ｗ）未満である。最も豊富にある不純物の量は、濃度測定を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定されてもよい。
【００７６】
さらに、ある特定の実施形態では、選択された画分が、コラゲナーゼＩまたはコラゲナーゼＩＩ産物の中へと一旦プールされると、このようなプールされた画分の全体的な純度は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより測定された場合に、少なくとも約９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％、または１００％である。別の実施形態では、このようなプールされた画分の全体的な純度は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより測定された場合に、約８０％〜１００％である。
【００７７】
２．排除ストラテジー２
このストラテジーに従って、画分は、それが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、濃度測定を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ、カゼインザイモグラフィー、濃度測定を伴うカゼインザイモグラフィー、またはそれらの組み合わせにより測定された場合に、検出可能なレベルの中性プロテアーゼを有する場合、さらなるプロセシング（フォワードプロセシング）から拒絶される。各画分中のタンパク質の濃度は、当業者に公知の任意の方法により判定される。ゲルの各ウェルは、任意の量のタンパク質を用いてロードすることができる。いくつかの実施形態では、ロードされたタンパク質の量は、約０．１マイクログラム〜約１００マイクログラム、例えば、約９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１マイクログラムである。ゲル上に検出可能なレベルの中性プロテアーゼを含有するいずれの画分は、プールされることを拒絶される。
【００７８】
３．排除ストラテジー３
このストラテジーに従って、コラゲナーゼＩ画分は、溶離ピークに対する画分の位置およびプールされた推定量のコラゲナーゼＩＩに基づいて、プールされる。言い換えると、コラゲナーゼＩＩの溶離ピークは、コラゲナーゼＩ画分をプールすることを可能にするための識別子として使用される。
【００７９】
プールされるコラゲナーゼＩの画分は、コラゲナーゼＩ溶離ピークの任意の画分（複数可）からのものとすることができる。複数の画分がプールされる場合、画分は、連続的な画分であっても、非連続的な画分であってもよい。いくつかの実施形態では、コラゲナーゼＩ画分の溶離ピーク最大から開始して、ピークの両サイド上を末端へ向かって均一に移動する画分が、プールされる。別の実施形態では、コラゲナーゼＩ純度、または最も豊富にある不純物、またはその両方についての特定の純度基準を満たす第１の画分から開始して、次いで、コラゲナーゼＩ溶離ピーク最大へ向かって移動する画分が、プールされる。いくつかの実施形態では、検出可能なレベルの中性プロテアーゼ（当業者に公知の任意の技法により測定された場合）を含有していない任意の画分から開始して、コラゲナーゼＩ溶離ピークの開始へ向かって移動する画分が、収集される。
【００８０】
プールされるコラゲナーゼＩの量は、推定されたコラゲナーゼＩＩ（総コラゲナーゼＩＩ溶離ピーク、プールされたコラゲナーゼＩＩ量、またはそれ以外のもの）の量とは異なってもよい。いくつかの実施形態では、コラゲナーゼＩＩの推定量は、コラゲナーゼＩの推定量の約２倍であってもよく、またはコラゲナーゼＩの推定量の約１．５倍であってもよく、またはコラゲナーゼＩの推定量の約３倍であってもよい。任意の特定の比、例えば、約１：１．２のコラゲナーゼＩ対コラゲナーゼＩＩ、または約１：１．１、または１：１．３、または１：１．４、またはそれ以上のコラゲナーゼＩ対コラゲナーゼＩＩなどが機能することになる。
【００８１】
例えば、ストラテジーは、（ａ）上述した純度要件に合格する画分中に含有された溶離したおおよその量のコラゲナーゼＩＩを計算すること、および（ｂ）（ａ）で計算されたコラゲナーゼＩＩの量に対するコラゲナーゼＩのおおよそ１：１の質量比を作り出すコラゲナーゼＩＩのおおよその量を超えるコラゲナーゼＩ溶離ピークからの末尾画分を廃棄することを含み、コラゲナーゼＩ画分のプールは、コラゲナーゼＩ溶離ピーク末尾の最初の通過画分について開始し、そして最終的なコラゲナーゼＩ画分に向かって移動する。この方法により産生されるコラゲナーゼ組成物は、中性プロテアーゼを本質的に含まない。
【００８２】
別の実施形態では、本開示は、Ｃ．ヒストリチクムに由来するコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを製造するプロセスに関し、このプロセスは、（ａ）クロマトグラフィーを用いてコラゲナーゼＩＩからコラゲナーゼＩを分離する工程と、（ｂ）コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩについて別々に工程（ａ）から溶離画分を収集する工程と、（ｃ）濃度測定分析を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に画分中のタンパク質の総量の約９１．８％未満のコラゲナーゼＩもしくはコラゲナーゼＩＩを有するか、濃度測定分析を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に画分中のタンパク質の総量の約５．８％超の任意の単一の不純物を有する任意の画分を廃棄する工程と、（ｄ）（ｃ）の純度要件に合格する画分中に含有された溶離したコラゲナーゼＩＩのおおよその量を計算する工程と、（ｄ）で計算されたコラゲナーゼＩＩの量に対するコラゲナーゼＩのおおよそ１：１の質量比を作り出すおおよその量のコラゲナーゼＩＩを超えるコラゲナーゼＩ溶離ピークからの末尾画分を廃棄する工程であって、末尾コラゲナーゼＩ画分の廃棄が、コラゲナーゼＩ溶離ピークの末尾あたりから開始して、ピーク最大に向かって移動する、廃棄する工程、を含む。この方法により産生されるコラゲナーゼ組成物は、中性プロテアーゼを本質的に含まない。
【００８３】
Ｅ．中性プロテアーゼの除去後の、薬物製品および製剤の最終化
中性プロテアーゼ排除工程の後で、かつそれがコラゲナーゼＩＩと混合される前のコラゲナーゼＩ薬物原料は、濃度測定を伴うまたは伴わないカゼインザイモグラフィーにより測定された場合に、コラゲナーゼＩ薬物原料１ｍｇあたり約５０ｎｇ未満の中性プロテアーゼを有し得る。あるいは、これは、濃度測定を伴うまたは伴わないカゼインザイモグラフィーにより測定された場合に、コラゲナーゼＩ薬物原料１ｍｇあたり、約４０ｎｇ、または３０ｎｇ、または２０ｎｇ、または１０ｎｇ、または５ｎｇ、または１ｎｇ未満、またはそれより少ない中性プロテアーゼを有し得る。
【００８４】
別の態様では、中性プロテアーゼ排除工程の後で、かつそれがコラゲナーゼＩと混合される前のコラゲナーゼＩＩ薬物原料は、濃度測定を伴うまたは伴わないカゼインザイモグラフィーにより測定された場合に、コラゲナーゼＩＩ薬物原料１ｍｇあたり約５０ｎｇ未満の中性プロテアーゼを有し得る。あるいは、これは、濃度測定を伴うまたは伴わないカゼインザイモグラフィーにより測定された場合に、コラゲナーゼＩＩ薬物原料１ｍｇあたり、約４０ｎｇ、または３０ｎｇ、または２０ｎｇ、または１０ｎｇ、または５ｎｇ、または１ｎｇ未満、またはそれより少ない中性プロテアーゼを有し得る。
【００８５】
さらに、最終的な混合されたコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩ薬物原料は、濃度測定を伴うまたは伴わないカゼインザイモグラフィーにより測定された場合に、コラゲナーゼＩおよびＩＩ薬物原料１ｍｇあたり約５０ｎｇ未満の中性プロテアーゼを有し得る。あるいは、これは、濃度測定を伴うまたは伴わないカゼインザイモグラフィーにより測定された場合に、コラゲナーゼＩおよびＩＩ薬物原料１ｍｇあたり、約４０ｎｇ、または３５ｎｇもしくは３０ｎｇ、または２５ｎｇ、または２０ｎｇ、または１５ｎｇ、または１０ｎｇ、または５ｎｇ、または４ｎｇ、または３ｎｇ、または２ｎｇ、または１ｎｇ未満、またはそれより少ない中性プロテアーゼを有し得る。
【００８６】
別の実施形態では、コラゲナーゼ薬物原料は、濃度測定を伴うまたは伴わないカゼインザイモグラフィーにより測定された場合に、コラゲナーゼ１ｍｇあたり、約１０００ｎｇ、または７５０ｎｇ、または５００ｎｇ、または２５０ｎｇ、または１００ｎｇ、または７５ｎｇ、または５０ｎｇ、または４０ｎｇ、または３５ｎｇもしくは３０ｎｇ、または２５ｎｇ、または２０ｎｇ、または１５ｎｇ、または１０ｎｇ、または５ｎｇ、または４ｎｇ、または３ｎｇ、または２ｎｇ、または１ｎｇ未満、またはそれより少ない中性プロテアーゼを有する。
【００８７】
一例では、存在する中性プロテアーゼの量は、約５マイクログラム〜約２０マイクログラムのコラゲナーゼを有するウェル中の中性プロテアーゼの測定された量と比較することにより、判定される。例えば、ザイモグラフィー試験方法のための試料は、試料１ｕＬあたり０．５ｕｇのＡＵＸ−Ｉで調製され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に２０ｕＬでロードされる。これは、ゲル上で１０ｕｇのＡＵＸ−Ｉロードを生じる。ザイモグラフィー試験方法は、０．５ｎｇの中性プロテアーゼの検出限界を有する。したがって、検出限界は、１０ｕｇのＡＵＸ−Ｉあたり０．５ｎｇのＮＰである。
【数１】
2020524128.tif 000003
【００８８】
別の実施形態では、本開示は、Ｃ．ヒストリチクムに由来するコラゲナーゼ組成物に関し、コラゲナーゼ組成物は、コラゲナーゼＩ産物およびコラゲナーゼＩＩ産物を含み、コラゲナーゼ産物は、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により測定された場合に少なくとも９５面積％純粋であり、またコラゲナーゼＩ産物は、中性プロテアーゼを本質的に含まない。
【００８９】
いくつかの実施形態では、コラゲナーゼ組成物または薬学的製剤は、おおよそ１対１のコラゲナーゼＩ対コラゲナーゼＩＩの質量比を有する。しかし、他の質量比のコラゲナーゼＩ対コラゲナーゼＩＩが企図される。質量比は、約１：１０〜約１０：１のコラゲナーゼＩ対コラゲナーゼＩＩのいずれかの範囲であり得る。好ましくは、質量比は、約１：３〜約３：１のコラゲナーゼＩ対コラゲナーゼＩＩである。より好ましくは、質量比は、約０．９：１〜約１：１．４のコラゲナーゼＩ対コラゲナーゼＩＩである。例えば、質量比は、約１：１、または１：１．５、または１．５：１、または２．４：１、１：２．１、または１：１．３、または１：１．４、または１．４：１、または１．３：１のコラゲナーゼＩ対コラゲナーゼＩＩであり得る。一態様では、コラゲナーゼＩ対コラゲナーゼＩＩの質量比は、約１：１である。一実施形態では、コラゲナーゼ濃縮液は、１．５２８の消衰係数を有する。
【００９０】
さらに、本発明は、Ｃ．ヒストリチクムに由来するコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含むコラゲナーゼ組成物を提供し、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩは、約０．９：１〜約１：１．４のコラゲナーゼＩ対コラゲナーゼＩＩの質量比（例えば、約１：１）を有し、コラゲナーゼ組成物は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより測定された場合に少なくとも９０面積％の純度、またはＲＰ−ＨＰＬＣにより測定された場合に少なくとも約９５面積％、もしくはＲＰ−ＨＰＬＣにより測定された場合に少なくとも９７面積％、またはＲＰ−ＨＰＬＣにより測定された場合に少なくとも９８面積％の純度、またはＲＰ−ＨＰＬＣにより測定された場合に少なくとも９９面積％の純度を有する。
【００９１】
本発明の薬学的製剤は、１つ以上の薬学的に許容される担体または賦形剤と共に製剤化された治療有効量の本発明のコラゲナーゼ組成物を含む。
【００９２】
別の実施形態では、亜鉛および／またはニッケルの濃度は、コラゲナーゼ、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、もしくはコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとの両方の製造プロセスの間に制御され、薬物製品の形成は、コラゲナーゼ産物について約８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％のプロセス再現性をもたらし、またはＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高圧液体クロマトグラフィー）により測定された場合に少なくとも約９５面積％、少なくとも約９６面積％、少なくとも約９７面積％、少なくとも約９８面積％、少なくとも約９９面積％、もしくは１００面積％のコラゲナーゼＩ産物もしくはコラゲナーゼＩＩの産物純度をもたらす。
【００９３】
一実施形態では、本開示は、Ｃ．ヒストリチクムに由来するコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの単離および精製のための方法に関し、ニッケルレベルおよび亜鉛レベルは、約９５％超純粋なコラゲナーゼＩもしくはコラゲナーゼＩＩの改良されたプロセス再現性をもたらすコラゲナーゼ精製プロセスの間、制御される。
【００９４】
一例では、精製プロセスは、フィルター（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ  ＨＣ  ＰＯＤ）を通して、続いて、コラゲナーゼのＨＩＣカラムに対する結合を促進するために、硫酸アンモニウム濃度（例えば、６０％飽和の硫酸アンモニウムでの）を用いてＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ濾液を１Ｍに調整して、次いで、硫酸アンモニウム中に沈殿したコラゲナーゼを再懸濁または溶解し、続いて、アニオンイオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑカラムを用いる）、続いて、濾過（例えば、０．４５μフィルター）、続いて、バッファー交換（例えば、透析もしくはタンジェンシャルフロー濾過）、次いで、濾液を疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（例えば、Ｑ−セファロース）にわたって実行し、続いて、ロイペプチンを添加し、続いて、バッファー交換により、発酵したＣ．ヒストリチクム（例えば、ブタ由来培地（好ましくは、プロテオーゼペプトン））培地からコラゲナーゼを回収することを含む。
【００９５】
別の例では、精製プロセスは、デプスフィルター（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ  ＨＣ  ＰＯＤ）を通して、続いて、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ濾過）、続いて、塩（好ましくは、硫酸アンモニウム）を添加して、約０．８Ｍ〜約１．２Ｍ（例えば、約１Ｍの硫酸アンモニウム）の濃度にし、続いて、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（例えば、フェニルセファロース）、続いて、バッファー交換（例えば、ＴＦＦを用いて硫酸アンモニウムを除去する）、続いて、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｑ−セファロースカラムを用いる）、続いて、ＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩについて別々にアニオン交換クロマトグラフィーから濾液の画分を収集し、次いで、ＡＵＸ−Ｉの画分を共にプールし、ＡＵＸ−ＩＩの画分を共にプールして、発酵したＣ．ヒストリチクム（例えば、野菜由来培地中で発酵した）からコラゲナーゼを回収することを含む。ロイペプチンが、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程、第１のバッファー交換工程、および第２のアニオン交換クロマトグラフィー工程において精製プロセスに添加されてもよい。
【００９６】
本方法による精製プロセスの一例は、フィルター（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ  ＨＣ  ＰＯＤ）を通して、続いて、少なくとも１つの０．２ミクロンフィルターを通して濾過し、続いて、流出液が約０．８Ｍ〜約１．２Ｍの硫酸アンモニウム濃度に調整されているアニオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ濾過）、続いて、疎水性相互作用（ＨＩＣ）カラム（例えば、フェニルセファロース）、続いて、バッファー交換（例えば、ＴＦＦを用いて硫酸アンモニウムを除去する）、続いて、アニオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｑ−セファロース）、続いて、ＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩについて別々にアニオン交換クロマトグラフィーから溶離液の画分を収集し、次いで、ＡＵＸ−Ｉの画分を共にプールし、ＡＵＸ−ＩＩの画分を共にプールし、続いて、薬学的製剤バッファーの中へと（例えば、タンジェンシャルフロー濾過を用いてｐＨ８にて１０ｍＭのＴｒｉｓ、６０ｍＭのスクロースの中へと）バッファー交換して、発酵したＣ．ヒストリチクムからコラゲナーゼを回収することを含む。任意選択でロイペプチンが、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程、第１のバッファー交換工程、および第２のイオン交換クロマトグラフィー工程において精製プロセスに添加されてもよい。
【００９７】
本発明のある特定の実施形態では、コラゲナーゼ精製手順は、ａ）イオン交換クロマトグラフィーを用いて、好ましくは、アニオン交換カプセルフィルター（例えば、ＭＵＳＴＡＮＧ  Ｑ）を用いて、粗回収液を濾過する工程と、ｂ）好ましくは、約１Ｍの最終的な濃度へと硫酸アンモニウムを添加する工程と、ｃ）好ましくは、０．４５μｍのフィルターを通して粗回収液を濾過する工程と、ｄ）濾液を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、好ましくは、フェニルセファロース６ＦＦ（ｌｏｗ  ｓｕｂ）カラムを通して供する工程と、ｅ）好ましくは、ＨＩＣ後溶離産物に対して約０．２ｍＭの最終的な濃度へと、ロイペプチンを溶離液に添加する工程と、ｆ）好ましくは、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によるバッファー交換を用いて、硫酸アンモニウムを除去し、ロイペプチンを維持する工程と、ｇ）好ましくは、０．４５μｍのフィルターを通して、工程（ｆ）の混合物を濾過する工程と、ｈ）イオン交換クロマトグラフィーを用いて、好ましくは、Ｑ−セファロース高速（Ｑ  ＨＰ）カラムを用いてコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとを分離する工程と、ｉ）中性プロテアーゼ排除工程を実施する工程と、を含む。任意選択で、ｊ）工程（ｉ）の後、好ましくは、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩについて別々にＴＦＦ濃度を調製し、かつ製剤化することにより、コラゲナーゼＩおよびＩＩのバッファー交換を別々に実施する工程であって、ＴＦＦが１０および／または３０ＫのＭＷＣＯ（分子量カットオフ）のＰＥＳまたはＲＣ−ポリエーテルスルホンまた再生セルロースフィルターメンブレンを伴うタンジェンシャルフローフィルターである（ＴＦＦは、選択したタンパク質を保持および濃縮し、タンパク質を１つのバッファー溶液から別のものへと交換する手段を提供する）、工程と、ｋ）好ましくは、０．２μｍの濾過系を通して、バッファー交換したコラゲナーゼＩおよびＩＩを別々に濾過する工程と、を含む、さらなる工程が実施され得る。
【００９８】
本方法の一実施形態は、コラゲナーゼ、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、またはコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとの両方を製造するための方法を含み、亜鉛および／またはニッケルの濃度は、製造プロセスの間のニッケルの濃度が約０．２ｐｐｍ未満となり、かつ／または製造プロセスの間の亜鉛の濃度が約１ｐｐｍ未満となるように、プロセスにおいて制御され、そしてこれらの金属濃度は、約９０％超のプロセス再現性をもたらし、またコラゲナーゼ、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、またはコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩの両方についてＲＰ−ＨＰＬＣにより測定された場合に約９５面積％超の純度を達成する。本方法の別の実施形態は、コラゲナーゼ、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、またはコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの製造プロセス中の亜鉛およびニッケルレベルをモニタリングすることを含み、これらの金属濃度が約９５％超純粋なコラゲナーゼ組成物の約９５％超のプロセス再現性をもたらすように、製造プロセスの間のニッケルの濃度は約０．２ｐｐｍ未満に維持され、かつ／または製造プロセスの間の亜鉛の濃度は約１ｐｐｍ未満に維持される。
【００９９】
本開示は、コラゲナーゼ、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、またはコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとの両方を製造するための方法をさらに含み、製造プロセスの間のニッケルの濃度が約０．２ｐｐｍ未満となり、かつ／または製造プロセスの間の亜鉛の濃度が約１ｐｐｍ未満となり、これらの金属濃度が、約９５％超純粋なコラゲナーゼ、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、またはコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとの両方を達成する、約９０％超のプロセス再現性をもたらすように、亜鉛および／またはニッケルの濃度は、プロセスにおいてモニターされ、かつ／または制御される。本方法の別の実施形態は、コラゲナーゼ、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、またはコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとの両方の製造プロセスにおける亜鉛およびニッケルレベルのモニタリングを含み、これらの金属濃度が、約９５％超のプロセス再現性、およびコラゲナーゼ、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、またはコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとの両方についてＲＰ−ＨＰＬＣにより測定された場合に約９５面積％超の純度をもたらすように、製造プロセスの間のニッケルの濃度が約０．２ｐｐｍ未満に維持され、かつ／または製造プロセスの間の亜鉛の濃度が約１ｐｐｍ未満に維持される。
【０１００】
本方法のさらなる一実施形態は、コラゲナーゼ、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、またはコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとの両方を製造するための方法を含み、製造プロセスの間のニッケルの濃度が約０．５ｐｐｍ未満となり、かつ／または製造プロセスの間の亜鉛の濃度が約１０ｐｐｍ未満となり、そしてこれらの金属濃度が、コラゲナーゼ、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、またはコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとの両方についてＲＰ−ＨＰＬＣにより測定された場合に約９５面積％超の純度を達成する、約９０％超のプロセス再現性をもたらすように、亜鉛および／またはニッケルの濃度は、プロセスにおいてモニターおよび／または制御される。本方法のさらなる別の実施形態は、コラゲナーゼ、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、またはコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとの両方を製造するための方法を含み、製造プロセスの間のニッケルの濃度が約０．５ｐｐｍ未満となり、かつ／または製造プロセスの間の亜鉛の濃度が約１０ｐｐｍ未満となり、そしてこれらの金属濃度が、コラゲナーゼ、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、またはコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとの両方についてＲＰ−ＨＰＬＣにより測定された場合に約９５面積％超の純度を達成する、約９５％超のプロセス再現性をもたらすように、亜鉛および／またはニッケルの濃度は、プロセスにおいてモニターされ、かつ／または制御される。
【０１０１】
本方法のさらなる一実施形態は、コラゲナーゼ、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、またはコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとの両方を製造するための方法を含み、亜鉛および／またはニッケルの濃度は、製造プロセスの間のニッケルの濃度が約０．５ｐｐｍ未満となり、かつ／または製造プロセスの間の亜鉛の濃度が約１０ｐｐｍ未満となるように、プロセスにおいて制御され、これらの金属濃度は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより測定された場合に約９５面積％超の純粋なコラゲナーゼ組成物を達成する、約９５％超のプロセス再現性をもたらす。
【０１０２】
本方法のさらなる別の実施形態は、コラゲナーゼ、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、またはコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとの両方を製造するための方法を含み、亜鉛および／またはニッケルの濃度は、製造プロセスの間のニッケルの濃度が約０．５ｐｐｍ未満となり、かつ／または製造プロセスの間の亜鉛の濃度が約１０ｐｐｍ未満となるように、プロセスにおいて制御され、これらの金属濃度は、コラゲナーゼ、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、またはコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとの両方についてＲＰ−ＨＰＬＣにより測定された場合に約９５面積％超の純度を達成する、約９５％超のプロセス再現性をもたらす。
【０１０３】
コラゲナーゼ、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、またはコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとの両方を製造するための方法がさらに開示され、亜鉛および／またはニッケルの濃度は、製造プロセスの間のニッケルの濃度が約０．５ｐｐｍ未満となり、かつ／または製造プロセスの間の亜鉛の濃度が約１０ｐｐｍ未満となるように、プロセスにおいて制御され、これらの金属濃度は、コラゲナーゼ、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、またはコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとの両方についてＲＰ−ＨＰＬＣにより測定された場合に約９７面積％超の純度を達成する、約９０％超のプロセス再現性をもたらす。
【０１０４】
本開示は、コラゲナーゼ、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、またはコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとの両方を製造するための方法をさらに企図し、亜鉛および／またはニッケルの濃度は、製造プロセスの間のニッケルの濃度が約０．５ｐｐｍ未満となり、かつ／または製造プロセスの間の亜鉛の濃度が約１０ｐｐｍ未満となるように、プロセスにおいて制御され、これらの金属濃度は、コラゲナーゼ、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、またはコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとの両方についてＲＰ−ＨＰＬＣにより測定された場合に約９７面積％超の純度を達成する、約９５％超のプロセス再現性をもたらす。
【０１０５】
別の実施形態では、本開示は、Ｃ．ヒストリチクムに由来するコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの製造プロセスに関し、このプロセスは、（ａ）クロマトグラフィーを用いてコラゲナーゼＩＩからコラゲナーゼＩを分離する工程と、（ｂ）コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩについて別々に工程（ａ）からの溶離画分を収集する工程と、（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび濃度測定、またはザイモグラフィーを用いて中性プロテアーゼについて各画分をアッセイする工程と、（ｄ）濃度測定分析を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に画分中のタンパク質の総量の約９１．８％未満のコラゲナーゼＩまたはコラゲナーゼＩＩを有するか、濃度測定分析を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に画分中のタンパク質の総量の約５．８％超の任意の単一の不純物を有するか、または（ｃ）において試験された場合に検出可能なレベル中性プロテアーゼを示す、任意の画分を廃棄する工程と、（ｅ）コラゲナーゼＩ産物について合格したコラゲナーゼＩの画分のみをプールし、コラゲナーゼＩＩ産物について合格したコラゲナーゼＩＩの画分のみをプールする工程であって、プールされたコラゲナーゼＩ産物またはコラゲナーゼＩＩ産物が、ＲＰ−ＨＰＬＣにより測定された場合に少なくとも９５面積％純粋である、工程と、を含む。この方法により生成されるコラゲナーゼ組成物は、本質的に中性プロテアーゼを含まない。
【０１０６】
別の実施形態では、本開示は、Ｃ．ヒストリチクムに由来するコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを製造するプロセスに関し、このプロセスは、（ａ）クロマトグラフィーを用いてコラゲナーゼＩＩからコラゲナーゼＩを分離する工程と、（ｂ）コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩについて別々に工程（ａ）からの溶離画分を収集する工程と、（ｃ）濃度測定分析を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に画分中のタンパク質の総量の約９１．８％未満のコラゲナーゼＩもしくはコラゲナーゼＩＩを有する、濃度測定分析を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に画分中のタンパク質の総量の約５．８％超の任意の単一の不純物を有する任意の画分を廃棄する工程と、（ｄ）（ｃ）の純度要件を合格する画分中に含有された溶離したコラゲナーゼＩＩのおおよその量を計算する工程と、（ｄ）で計算されたコラゲナーゼＩＩ量に対するコラゲナーゼＩのおおよそ１：１の質量比を作り出すコラゲナーゼＩのおおよその量を超えるコラゲナーゼＩ溶離ピークからの末尾画分を廃棄する工程であって、コラゲナーゼＩ画分のプールが、コラゲナーゼＩ溶離ピーク末尾の第１に通過する画分あたりから開始して、最終的なコラゲナーゼＩ画分に向かって移動する、廃棄する工程と、を含む。この方法により生成されるコラゲナーゼ組成物は、本質的に中性プロテアーゼを含まない。
【０１０７】
本開示は、Ｃ．ヒストリチクムに由来するコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを製造するプロセスに関し、このプロセスは、（ａ）クロマトグラフィーを用いてコラゲナーゼＩＩからコラゲナーゼＩを分離する工程と、（ｂ）コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩについて別々に工程（ａ）からの溶離画分を収集する工程と、（ｃ）濃度測定分析を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に画分中のタンパク質の総量の約９１．８％未満のコラゲナーゼＩもしくはコラゲナーゼＩＩ、濃度測定分析を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に画分中のタンパク質の総量の約５．８％超の任意の単一の不純物を有する任意の画分を廃棄する工程と、（ｄ）（ｃ）の純度要件に合格する画分中に含有された溶離したコラゲナーゼＩＩのおおよその量を計算する工程と、（ｄ）で計算されたコラゲナーゼＩＩ量に対するコラゲナーゼＩのおおよそ１：１の質量比を作り出すおおよそのコラゲナーゼＩの量を超えるコラゲナーゼＩ溶離ピークからの末尾画分を廃棄する工程であって、末尾コラゲナーゼＩ画分の廃棄が、コラゲナーゼＩ溶離ピークの末尾あたりから開始して、ピーク最大に向かって移動する、工程と、を含む。この方法により生成されるコラゲナーゼ組成物は、本質的に中性プロテアーゼを含まない。
【０１０８】
本開示は、Ｃ．ヒストリチクムに由来するコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの製造プロセスに関し、（ａ）中性プロテアーゼは、製造プロセスの間にコラゲナーゼＩ産物から本質的に排除され、かつ（ｂ）ニッケル、亜鉛、アルミニウム、ヒ素、カルシウム、カドミウム、クロム、銅、鉄、マグネシウム、鉛、またはそれらの組み合わせの濃度は、製造プロセスの間、制御される。
【０１０９】
別の実施形態では、本開示は、（ａ）アニオン交換フィルターを通して、Ｃ．ヒストリチクムからの発酵液を濾過することと、（ｂ）硫酸アンモニウムを工程（ａ）の濾液に添加することと、（ｃ）工程（ｂ）の濾液を、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに供することと、（ｄ）ロイペプチンを工程（ｃ）の溶離液に添加することと、（ｅ）工程（ｄ）の混合物から硫酸アンモニウムを除去することと、（ｆ）工程（ｅ）の混合物を濾過することと、（ｇ）イオン交換クロマトグラフィーを用いて工程（ｆ）の混合物中のコラゲナーゼＩとＩＩとを分離することと、を含む、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを精製するための方法に関し、ニッケル、亜鉛、アルミニウム、ヒ素、カルシウム、カドミウム、クロム、銅、鉄、マグネシウム、鉛、またはそれらの組み合わせの濃度は、精製プロセスの間、制御される。
【０１１０】
さらなる一実施形態では、本開示は、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを精製するための方法に関し、（ａ）アニオン交換フィルターを通して、Ｃ．ヒストリチクムからの発酵液を濾過することと、（ｂ）硫酸アンモニウムを工程（ａ）の濾液に添加することと、（ｃ）工程（ｂ）の濾液を、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに供することと、（ｄ）ロイペプチンを工程（ｃ）の溶離液に添加することと、（ｅ）工程（ｄ）の混合物から硫酸アンモニウムを除去することと、（ｆ）工程（ｅ）の混合物を濾過することと、（ｇ）イオン交換クロマトグラフィーを用いて工程（ｆ）の混合物中のコラゲナーゼＩとＩＩとを分離することと、を含み、ニッケルの濃度または亜鉛の濃度は、精製プロセスの間、制御される。
【０１１１】
本開示はまた、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを精製するための方法にも関し、（ａ）アニオン交換フィルターを通して、Ｃ．ヒストリチクムからの発酵液を濾過することと、（ｂ）硫酸アンモニウムを工程（ａ）の濾液に添加することと、（ｃ）工程（ｂ）の濾液を、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに供することと、（ｄ）ロイペプチンを工程（ｃ）の溶離液に添加することと、（ｅ）工程（ｄ）の混合物から硫酸アンモニウムを除去することと、（ｆ）工程（ｅ）の混合物を濾過することと、（ｇ）イオン交換クロマトグラフィーを用いて工程（ｆ）の混合物中のコラゲナーゼＩとＩＩとを分離することと、（ｈ）工程（ｇ）の溶離液からのコラゲナーゼＩまたはコラゲナーゼＩＩから中性プロテアーゼを除去することと、を含む。
【０１１２】
さらに、本開示は、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを精製するための方法に関し、（ａ）アニオン交換フィルターを通して、Ｃ．ヒストリチクムからの発酵液を濾過することと、（ｂ）硫酸アンモニウムを工程（ａ）の濾液に添加することと、（ｃ）工程（ｂ）の濾液を、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに供することと、（ｄ）ロイペプチンを工程（ｃ）の溶離液に添加することと、（ｅ）工程（ｄ）の混合物から硫酸アンモニウムを除去することと、（ｆ）工程（ｅ）の混合物を濾過することと、（ｇ）イオン交換クロマトグラフィーを用いて工程（ｆ）の混合物中のコラゲナーゼＩとＩＩとを分離することと、を含み、ニッケルレベルおよび亜鉛レベルは、コラゲナーゼ精製プロセスの間、制御される。
【０１１３】
別の実施形態では、本開示は、Ｃ．ヒストリチクムに由来する単離され、かつ精製されたコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩからなる薬物製品を産生するためのプロセスに関し、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩは、約１対１の質量比を有し、薬物製品は、逆相高速液体クロマトグラフィーにより測定された場合に少なくとも９５面積％純粋であり、プロセスは、以下の（ａ）Ｃ．ヒストリチクムを発酵させる工程と、（ｂ）コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む粗発酵液を回収する工程と、（ｃ）濾過およびカラムクロマトグラフィーを介して粗回収液からコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを精製する工程であって、（ｉ）アニオン交換フィルターを通して、Ｃ．ヒストリチクムからの発酵液を濾過する工程と、（ｉｉ）硫酸アンモニウムを工程（ｉ）の濾液に添加する工程と、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の濾液を、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに供する工程と、（ｉｖ）ロイペプチンを工程（ｉｉｉ）の溶離液に添加する工程と、（ｖ）工程（ｉｖ）の混合物から硫酸アンモニウムを除去する工程と、（ｖｉ）工程（ｖ）の混合物を濾過する工程と、（ｖｉｉ）イオン交換クロマトグラフィーを用いて工程（ｖｉ）の混合物中のコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとを分離する工程と、を含む、工程と、（ｄ）工程（ｃ）からの精製されたコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを約１対１の比で組み合わせる工程と、を含み、ニッケル、亜鉛、アルミニウム、ヒ素、カルシウム、カドミウム、クロム、銅、鉄、マグネシウム、鉛、またはそれらの組み合わせの濃度は製造プロセスの間制御される。
【０１１４】
さらに、本開示は、Ｃ．ヒストリチクムに由来する単離され、かつ精製されたコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩからなる薬物製品を産生するためのプロセスに関し、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩは、約１対１の質量比を有し、かつ薬物製品は、逆相高速液体クロマトグラフィーにより測定された場合に少なくとも９５面積％純粋であり、プロセスは、（ａ）Ｃ．ヒストリチクムを発酵させる工程と、（ｂ）コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む粗発酵液を回収する工程と、（ｃ）濾過およびカラムクロマトグラフィーを介して粗回収液からコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを精製する工程であって、（ｉ）アニオン交換フィルターを通して、Ｃ．ヒストリチクムからの発酵液を濾過する工程と、（ｉｉ）硫酸アンモニウムを工程（ｉ）の濾液に添加する工程と、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の濾液を、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに供する工程と、（ｉｖ）ロイペプチンを工程（ｉｉｉ）の溶離液に添加する工程と、（ｖ）工程（ｉｖ）の混合物から硫酸アンモニウムを除去する工程と、（ｖｉ）工程（ｖ）の混合物を濾過する工程と、（ｖｉｉ）イオン交換クロマトグラフィーを用いて工程（ｖｉ）の混合物中のコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとを分離する工程と、を含む、工程と、（ｄ）工程（ｃ）からの精製されたコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを約１対１の比で組み合わせる工程であって、ニッケルレベル、亜鉛レベル、または亜鉛およびニッケルレベルが製造プロセスの間制御される、工程と、を含む。
【０１１５】
本開示は、Ｃ．ヒストリチクムに由来する単離され、かつ精製されたコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩからなる薬物製品を産生するためのプロセスに関し、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩは、約１対１の質量比を有し、かつ薬物製品は、逆相高速液体クロマトグラフィーにより測定された場合に少なくとも９５面積％純粋であり、プロセスは、（ａ）Ｃ．ヒストリチクムを発酵させる工程と、（ｂ）コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む粗発酵液を回収する工程と、（ｃ）濾過およびカラムクロマトグラフィーを介して粗回収液からコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを精製する工程であって、（ｉ）アニオン交換フィルターを通して、Ｃ．ヒストリチクムからの発酵液を濾過する工程と、（ｉｉ）硫酸アンモニウムを工程（ｉ）の濾液に添加する工程と、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の濾液を、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに供する工程と、（ｉｖ）ロイペプチンを工程（ｉｉｉ）の溶離液に添加する工程と、（ｖ）工程（ｉｖ）の混合物から硫酸アンモニウムを除去する工程と、（ｖｉ）工程（ｖ）の混合物を濾過する工程と、（ｖｉｉ）イオン交換クロマトグラフィーを用いて工程（ｖｉ）の混合物中のコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとを分離する工程であって、分離工程がさらに、（ａ）コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩについて別々に（ｖｉｉ）からの溶離画分を収集することと、（ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはザイモグラフィーを用いて中性プロテアーゼについて各画分をアッセイすることと、（ｃ）濃度測定分析を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に画分中のタンパク質の総量の約９１．８％未満のコラゲナーゼＩもしくはコラゲナーゼＩＩを有するか、濃度測定分析を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に画分中のタンパク質の総量の約５．８％超の任意の単一の不純物を有するか、または（ｂ）において試験された場合に検出可能なレベルの中性プロテアーゼを示す、任意の画分を廃棄することと、をさらに含む、工程と、（ｄ）コラゲナーゼＩ産物について合格したコラゲナーゼＩの画分のみをプールし、かつコラゲナーゼＩＩ産物について合格したコラゲナーゼＩＩの画分のみをプールする工程と、を含む。この方法により生成されるコラゲナーゼ組成物は、本質的に中性プロテアーゼを含まない。
【実施例】
【０１１６】
以下の実施例は、本開示のある特定の実施形態を実証するために含まれる。しかし、当業者であれば、本開示に照らして、開示される特定の実施形態に修正を加えることができ、かつ本発明の精神および範囲から逸脱することなく類似または同様の結果をなお得ることができること、を理解するはずである。したがって、示されるすべての事項は、例示として解釈されるものであり、限定を意味するものではない。
【０１１７】
実施例１−最適化されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法により分析された場合の、ＩＥＸ画分不純物のカテゴリー分類および傾向
表１に示されるように、Ｃ．ヒストリチクムから得られた製造されたコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの１３個の異なるロットから、ＩＥＸ画分を試験した。ロットの各々においてＩＥＸ溶離液から収集した各コラゲナーゼ画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で実行し、そしてＢｉｏ−Ｒａｄデンシトメーターおよび添付の濃度測定分析ソフトウェアを用いるゲル濃度測定を用いて分析した。各ロットの各画分について、未分解コラゲナーゼＩまたはＩＩのパーセント純度、および各可視不純物（コラゲナーゼ断片またはそれ以外）のパーセントを判定した。
【表２】
2020524128.tif 000004
【０１１８】
ソフトウェアにより報告される分子量の値を用いて、かつ分子量マーカーレーン中に位置する既知の分子量バンドの縦方向の位置に対して不純物の縦方向の位置を比較することにより、不純物は、４つの主なカテゴリー（９０ｋＤ、８０ｋＤ、５５ｋＤ、および４０ｋＤ）に階層化される。カテゴリーに適合しない不純物は、「その他」として分類した。ゲル濃度測定を利用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法は、現在のＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法を単独で用いる場合よりも多くの不純物バンドを解析することができる。
【０１１９】
Ａ．ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動および濃度測定によるコラゲナーゼＣ．ヒストリチクムイオン交換クロマトグラフィー画分中のメジャーおよびマイナーバンドの定量化
この方法は、４〜１２％のＮｕＰＡＧＥゲル（ＭＥＳバッファー）およびコロイド状クマシー染色を使用するドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて、コラゲナーゼＣ．ヒストリチクムイオン交換クロマトグラフィー画分の純度および不純物を判定する。この方法は、メジャーバンド（パーセントＡＵＸ−Ｉ、ＡＵＸ−ＩＩ、またはその両方）および産物断片もしくは他の不純物のマイナーバンド（パーセントマイナーバンド）の相対的定量化を可能にするゲルの濃度測定分析を使用する。
【０１２０】
一般に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのためにゲルのウェルの中へとロードされたコラゲナーゼの量は、濃度測定ソフトウェアを用いて見られるバンドの強度に対して直線的である。例えば、コラゲナーゼバンドについての応答の直線性は、＞０．９８のＲ2値を伴う１．１２３〜１．８７５μｇ（標的の７５％〜１２５％）のコラゲナーゼにわたって、既知の参照標準のμｇに対してコラゲナーゼをプロットすることで実証することが可能である。典型的な直線プロットの一例が図１に示される。
【０１２１】
分析される試料のために参照標準が使用されるべきである。例えば、ＩＥＸ工程からのＡＵＸ−Ｉの溶離画分を分析するためにＡＵＸ−Ｉ中間体参照標準を使用することができる。ゲルのための最終的な試料（Ｃ２＝０．１５ｍｇのタンパク質／ｍＬ）を産生するために必要とされる参照標準および試料の量は、以下の式により計算される：Ｃ1Ｖ1＝Ｃ2Ｖ2
Ｃ1＝試験される試料の初期濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ｖ1＝初期濃度における必要とされる試料の容量（μＬ）
Ｃ2=１ｍｇ／ｍＬ（最終的な試料調製物の濃度）
Ｖ2=最終的な試料調製物の容量（μＬ）
【０１２２】
Ｂ．不純物カテゴリー分類
ｉ．不純物分類に対するアプローチ
画分不純物は、濃度測定を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて画分の試料を分析することからもたらされるゲルの分析に基づいて判定することができる。各ゲルをデンシトメーター上に置き、デンシトメーター（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄデンシトメーター）を用いて、ゲル画像をスキャンして、デンシトメーターソフトウェア（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェア）の中へと入れる。分析者は、ソフトウェアがゲルレーンおよび適切なバンドを正確に識別したことを確認する。ソフトウェアは、図２に示される代表的な画像のような、注釈付きの画像報告を作り出す。
【０１２３】
図２では、レーン１は、既知の分子量のバンドを伴う分子量標準を含有する。レーン２は、適切なＡＵＸ中間体参照標準を含有する。残りのレーンは、各ＩＥＸ画分からの試料を含有する。主な産物のバンドは各レーンの上部のバンドであり、より下部にあるさらなるバンドの各々は不純物を表す。
【０１２４】
ＩＥＸ画分において観察された不純物の傾向分析は、重要なプロセス性能情報を提供することができる。不純物は、傾向分析を成功させるために、ロット毎の分子量に基づいて一貫してカテゴリー分けされるべきである。濃度測定ソフトウェアは、各不純物について明白な分子量を報告し得るが、報告された明白な分子量に基づくカテゴリーは、ゲル画像中にいくつかの通常のバリエーションを有し、近接のバンドと組み合わされたバリエーションは、曖昧かつ重複した分類範囲につながる可能性がある。代わりに、ＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩ不純物についての推奨される分子量カテゴリーは、既知の分子量レーン中のバンドの縦方向の位置に対して画分不純物の縦方向（ｙ軸）の位置を視覚的に比較することに基づくことができる。
【０１２５】
総数１２８個のＡＵＸ−Ｉ画分および９９個のＡＵＸ−ＩＩ画分を分析した。１３バッチのうち３つ以上で現れた不純物を、カテゴリーに割り当てた。各カテゴリーの説明を以下に提供する。
【０１２６】
ｉｉ．不純物分類の結果
ＡＵＸ−Ｉ
ＡＵＸ−Ｉ画分不純物カテゴリーは、３３ｋＤ、４５ｋＤ、５５ｋＤ、８０ｋＤ、９０ｋＤ、および９６ｋＤを含む。各不純物カテゴリーの説明を、図３〜図８に提供する。各図は、以下を含む：
・第１のパネル：所与の不純物が、評価に含まれた１３個のロットの各画分において観察された、パーセント頻度。
・第２のパネル：画分番号ごとの所与の不純物についての相対量（パーセントとして報告される）の平均（ドット）および範囲（エラーバー）。
・第３のパネル：分子量標準に対するバンドの視覚的な縦方向の位置についての説明。
・第４のパネル：ソフトウェアにより所与のバンドについて報告された明白な分子量の範囲。
【０１２７】
ＡＵＸ−ＩＩ
ＡＵＸ−ＩＩ画分不純物カテゴリーは、２５ｋＤ、３８ｋＤ、５０ｋＤ、６０ｋＤ、８０ｋＤ、９０ｋＤ、９２ｋＤ、および９６ｋＤを含む。各不純物の説明を、図９〜図１６に提供する。図パネルは、ＡＵＸ−Ｉについて説明したものと同じである。
【０１２８】
分析した８７７個の不純物バンドのうち、３つのバンドは、上記カテゴリーに対して適切ではなく、「その他」として分類された。これらの不純物の詳細は、表２に含まれる。
【表３】
2020524128.tif 000005
【０１２９】
Ｃ．不純物傾向
ｉ．不純物傾向に対するアプローチ
不純物をカテゴリー分けした後、それらを傾向付けして、プロセス性能をモニターすることができる。異なるタンパク質濃度において複数の不純物、複数のＩＥＸ画分が存在し、かつ結果が相対量として報告されるために、画分不純物傾向は複雑である可能性がある。しかし、下記のように、ＡＵＸピークあたりの総タンパク質に対する目的の不純物のパーセントとして画分不純物を報告することにより、傾向を単純化することができる。
【０１３０】
各ＩＥＸ画分中のタンパク質の量は、画分容量とＵＶA280による画分タンパク質濃度を乗算することにより、判定することができる。得られた値は、画分あたりのタンパク質のグラムである。画分あたりのタンパク質のグラムの典型的なプロファイルを図１７に提供する。
【０１３１】
記載されたようなＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび濃度測定方法を利用することにより、各ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル画分レーン中で検出された総タンパク質に対するパーセントとしてのＩＥＸ画分不純物をもたらす。同量のタンパク質（１．５μｇのタンパク質／レーン）を各画分レーンにロードする。したがって、各画分中の各不純物のグラムは、不純物パーセンテージを小数に変換して（１００で割る）、次いで、画分あたりのタンパク質のグラムを乗算することにより、推定することができる。例えば、図１８は、ＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩの両方の画分において一般的に観察される、グラム単位で表される、９０ｋＤ不純物の典型的なプロファイルを示す。
【０１３２】
各ＡＵＸ  Ｉ、ＡＵＸ  ＩＩ、または不純物についてのタンパク質のグラムは、画分毎に計算することができる。あるいは、画分あたりのタンパク質および目的の不純物のグラムを、ＡＵＸピーク毎に合計することができる。この数学的演算を視覚的に表現したものが図１９で提供される。
【０１３３】
次いで、ＡＵＸピークあたりのタンパク質の量に対する目的の不純物のパーセントは、目的の不純物のグラムをタンパク質の総ＡＵＸピークグラムで除算し、次いで、得られた数値を１００倍して、値をパーセンテージに変換することにより、計算することができる。ＡＵＸピークあたりの総タンパク質に対する目的の不純物のパーセントとして表される最終的な値に到達するための方程式を以下に要約する：
【数２】
2020524128.tif 000006
式中、
［タンパク質］i,jは、第ｊの不純物を含有する第ｉの画分のタンパク質濃度である。
Ｖi,jは、第ｊの不純物を含有する第ｉの画分のリットル単位の容量である。
不純物値i,jは、第ｉの画分中の第ｊの不純物のパーセント不純物である。
［タンパク質］iは、ＵＶA280による第ｉの画分のタンパク質濃度である。
Ｖiは、第ｉの画分のリットル単位の容量である。
Ｌは、１リットルである。
【０１３４】
上記方程式を用いて、検出された不純物の各々の量を傾向付けて、プロセス性能を評価することができる。上記方程式はまた、順方向でプロセスされた画分のみにおける目的の不純物の相対量を表すために容易に修正することもできる。
【０１３５】
さまざまな方法を用いて傾向付けを実施することができる。１つの方法は、個々の値についてのシューハート管理図を用いる。個々についてのシューハート管理図は、ルーチンの変動に起因する結果（管理図限界内）と、例外的な変動に起因する結果（管理限界を超える）とを区別するために使用される、統計的ツールである。プロセス変動性を推定するために、２つの連続的な観察の移動範囲を用いて、管理限界を計算する。管理図中の緑色の水平線は、平均結果を表す。赤色の水平線は、上方および下方管理限界を表し、以下のように計算される：
【数３】
2020524128.tif 000007
である。
【０１３６】
個々の値についてのシューハート管理図を用いて生み出された限界は、産物の品質を示すことを意図しない。したがって、管理限界の外側にある結果は、品質の影響を自動的に指し示すものではなく、すべての利用可能なデータの文脈から全体論的に評価される必要があることになる。
【０１３７】
ｉｉ．不純物傾向結果
個々についてのシューハート管理図を用いて、表１に列挙したロットの不純物を傾向付けした。ＡＵＸ−Ｉ不純物は図２０において傾向付けされ、ＡＵＸ−ＩＩ不純物は図２１Ａおよび２１Ｂにおいて傾向付けされた。ロットは、製造場所により特徴付けされる。各管理図について、異なるｘ軸スケールを用いた。この報告書において提示される評価に基づく推奨される不純物カテゴリーは、表３に含まれる。
【表４】
2020524128.tif 000008
【０１３８】
ＩＥＸ画分不純物の傾向は、重要なプロセス性能情報を提供することができる。ＡＵＸピークあたりの総タンパク質に対する目的の不純物のパーセントとして不純物を報告することは、不純物傾向付けを単純化するために、推奨される。
【０１３９】
実施例２−精製プロセス中の金属
Ａ．コラゲナーゼＩおよびＩＩ産物の製造における異常な不純物レベル
コラゲナーゼＩおよびＩＩ産物の純度における実質的な減少が、通常の製造プロセスの間に生じた。製造プロセスのイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）工程後に見られる不純物の同一性を判定することを含む分析を実施した。コラゲナーゼＩ産物は、約１１３ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有し、またコラゲナーゼＩＩ産物は、約１１２ｋＤａのＭＷを有する。コラゲナーゼのルーチンの製造の間、ＩＥＸ工程から明らかに、高レベルの不純物が不可解にも生じた。これらの高レベルの不純物は、最適化されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の、４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、および９６ｋＤａにおいて出現した。
【０１４０】
Ｂ．不純物産物の増大の潜在的な原因
次いで、高レベルの不純物の原因を調査した。Ｃ．ヒストリチクムは、コラゲナーゼ（ＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩ）に加えて、２つのプロテアーゼ、クロストリパインおよび中性プロテアーゼを産生する。両方のプロテアーゼは、活性のために金属コファクターを必要とする。カルシウムは、クロストリパインのためのコファクターであり、活性のために必要とされる。カルシウムはまた、中性プロテアーゼのためのコファクターであるが、構造安定性のためのみに必要とされる。カルシウムが中性プロテアーゼの結合部位から除かれると、酵素は自己触媒により分解される。亜鉛は、中性プロテアーゼのためのコファクターであり、中性プロテアーゼ活性のために必要とされる。
【０１４１】
製造プロセスストリームにおける広範な産物分解は、製造実行中の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）ユニット操作後に、初めて検出された。調査したＨＩＣプロセスバッファー原材料は、硫酸アンモニウム（ＡＳ）、Ｔｒｉｓ−塩基（トロメタミン、または「Ｔｒｉｓ」）、および約３７％の濃縮された塩酸（ＨＣｌ）を含んだ。調査は、原材料中の金属成分の判定を含んだ。イオン結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）は、その感受性およびそれが検出および定量可能である金属の幅広いパネルのために、金属含量を測定するために選択された。ＩＣＰ−ＭＳは、カルシウムおよび亜鉛を含む３４の金属イオンを測定するために十億分率（ｐｐｂ）の感受性を有する。
【０１４２】
ＩＣＰ−ＭＳにより試験された微量金属は、カルシウム、ニッケル、および亜鉛のレベルに関して上記原材料の各々について、以下に提示される。これらの特定の金属レベルは、Ｔｒｉｓロット（表７）およびＨＣｌロット（表８）と比較して、試験した硫酸アンモニウムのいくつかのロット（表４〜６）において顕著により高い濃度で見出された。Ｔｒｉｓ−塩基および濃縮ＨＣｌは、検出された低レベルの亜鉛、カルシウム、およびニッケル金属、ならびにプロセスバッファー中で使用されたそれらの比較的低い濃度に基づいて、さらなる試験から除外された。
【０１４３】
ｉ．硫酸アンモニウム試験：
【表５】
2020524128.tif 000009
【０１４４】
低レベルの不純物（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に約５面積％以下の）を産生した硫酸アンモニウムロットのカルシウムレベルは、高レベルの不純物（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定される場合に５面積％より多い）を引き起こした硫酸アンモニウムのロットよりも高かったので、カルシウムは不純物の原因として、除外された。これらのデータは、製造実行中で観察された不純物へのコラゲナーゼＩおよびＩＩ分解の潜在的な原因としてカルシウム汚染を除外した。コラゲナーゼ製造中に高レベルの不純物を産生した試験した硫酸アンモニウムのロットには、増大したレベルの亜鉛およびニッケルの存在を有した。これらのデータは、ニッケル汚染と観察された産物分解との間の可能性のある関連性を示唆した。両方のロットは相当量の高レベルのニッケルを含有していたので、製造プロセスに対する亜鉛の影響は、これらのデータからは明確ではなかった。亜鉛およびニッケルイオンレベルの潜在的な影響を、以下にさらに考察されるスパイキング研究において探求した。
【０１４５】
硫酸アンモニウムの歴史的なロットも調査した。
【表６】
2020524128.tif 000010
【表７】
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【０１４６】
５つの歴史的な硫酸アンモニウムロットについてのカルシウムレベル（表５）は、２４０〜８７０ｐｐｂの範囲であった。さらに、いずれの高められたカルシウムレベルも、製造プロセスの異常において見られた高レベルの不純物を産生しなかった。亜鉛含量は、約１３０〜２９８０ｐｐｂの範囲であった。歴史的なロットのニッケル含量は、約１４０〜１８０ｐｐｂの範囲であった。それぞれ約１１５０ｐｐｂおよび約１０２０ｐｐｂである、高レベルの産物不純物を産生した２つの硫酸アンモニウムロットのニッケル含量とこれらのデータとを比較すると、ニッケル汚染への耐性は低い。硫酸アンモニウムロット間のニッケルにおける相対的差異は、６〜８倍であるが、この差異は、歴史的な硫酸アンモニウムロット内で１０倍を超えて変動した亜鉛などの他の金属よりもはるかに低い。また、Ａｖａｎｔｏｒ硫酸アンモニウムロット９９４２８の低い亜鉛含量（２５０ｐｐｂ）は、製造プロセスにおいて見られた高レベルの不純物は、高度にニッケルに感受性があったことを示唆している。要するに、調査は、精製プロセスの産物はプロセスにおいてニッケルレベルおよび亜鉛レベルの両方に感受性があったが、プロセスにおける亜鉛への耐性がニッケルへの耐性よりも高いことを実証した。
【０１４７】
ＥＭＤ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ硫酸アンモニウムロット中のカルシウムレベル（表６）は、試験した硫酸アンモニウムロットに関連する偏差よりも低く、歴史的な硫酸アンモニウムロットのカルシウムレベル（表５）に匹敵した。ＥＭＤ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ硫酸アンモニウムロット中の亜鉛イオンレベルは、概して、試験したＡｖａｎｔｏｒロットよりも低かった（表３）。ニッケルイオンレベルは、試験した４つの開発硫酸アンモニウムロットＥＭＤ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅについて、１００ｐｐｂの定量限界（ＬＯＱ）未満であった。
【０１４８】
ｉｉ．Ｔｒｉｓ試験：
Ｔｒｉｓ−塩基の２つのロットは、高レベルの不純物を生じた製造プロセスの前、およびそのプロセスを通して、商業生産において使用された原材料（Ａｖａｎｔｏｒロット６１７１２）と、実験室スケールの調査的研究のために使用された開発材料（Ｆｉｓｈｅｒロット１２６９２８）と、を表す。表７において示されるように、Ｔｒｉｓ−塩基は、バッチ間で匹敵するレベルのカルシウムおよびニッケルを含有した。２つのロット間での顕著な差異は、亜鉛含量であった。開発材料の亜鉛含量は、ＬＯＱ、１００ｐｐｂ未満であった。高レベルの不純物および低レベルの不純物を産生する製造プロセス中に存在するニッケルおよび亜鉛のレベルが非常に類似していたので、Ｔｒｉｓは、コラゲナーゼ分解に寄与する原材料であるとはみなされなかった。
【表８】
2020524128.tif 000012
【０１４９】
ｉｉｉ．ＨＣｌ試験：
両方のＨＣｌロットは、高レベルの不純物を生じた製造プロセスの間に用いられた原材料であった。表８は、カルシウムレベルが、ＡＳロット中で検出されたレベルに匹敵するものであり、一方、亜鉛およびニッケル含量はＬＯＱ（１００ｐｐｂ）未満であったことを示す。高レベルの不純物および低レベルの不純物を産生する製造プロセスについて存在するニッケルおよび亜鉛のレベルが非常に類似しており、かつ検出可能限界を下回るものであったので、ＨＣｌは、コラゲナーゼ分解に寄与する原材料とはみなされなかった。
【表９】
2020524128.tif 000013
【０１５０】
Ｃ．亜鉛およびニッケルスパイキング研究
本質的に亜鉛またはニッケルを含まないことが知られている２つの異なる硫酸アンモニウムロット（Ｆｉｓｈｅｒロット１４７６２１４Ａ、表４、およびＥＭＤロットＡＭＯ５５６３１６、表５）を用いて、実験室スケールの精製研究を実施して、硫酸アンモニウムロットに関連する偏差において検出された相対濃度での亜鉛またはニッケルの存在が、高レベルの不純物を産生した製造プロセスにおいて観察された産物の分解に関与しているかどうかを判定した。硫酸アンモニウムＦｉｓｈｅｒロット１４７６２１４Ａを用いる実験室スケールでの初期調査的研究は、典型的な数の通過ＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩ画分を産生し、このＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩ画分のほぼすべては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル濃度測定により測定された場合に少なくとも９１．２％の未分解ＡＵＸ−Ｉ／ＡＵＸ−ＩＩ純度を有し、かつ最も豊富にある分解されたＡＵＸ−ＩまたはＡＵＸ−ＩＩ不純物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル濃度測定により測定された場合に５．８％以下である。ＥＭＤ硫酸アンモニウムロットの試験は、ＬＯＱ未満（＜１００ｐｐｂ）の亜鉛およびニッケル含量を示した。
【０１５１】
研究のためにこれらの硫酸アンモニウムロットを使用して、開始材料として、高レベルの不純物を産生した製造プロセスからの以前は凍結していた、解凍Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ濾液（ＭＱＦ）を用いて、規格（ｑｕａｌｉｆｉｅｄ）ＨＩＣおよびＩＥＸスモールスケールモデルからなる制御実行を実施した。ＭＱＦは、ＨＩＣ、ＴＦＦ、およびＩＥＸ工程を通して処理された。クロマトグラフィー工程のための有効なロード範囲の中間点で、ＨＩＣおよびＩＥＸ工程の両方をロードした。ＨＩＣ工程については１０℃、ＩＥＸ工程については４℃に設定したクロマトグラフィーキャビネットを用いる冷蔵条件下で、すべてのユニット操作を実施した。ＩＥＸ画分は、濃度測定を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。プールのために先に進んだ画分は、９１．２％以上の純度での未分解コラゲナーゼＩまたはＩＩ、および５．８％以下の最も豊富にある分解されたコラゲナーゼＩまたはＩＩ不純物を必要とした。
【０１５２】
亜鉛スパイキング研究は、Ｆｉｓｈｅｒロット１４７６２１４Ａからの硫酸アンモニウムを利用した。この研究は、ＥＭＤロットＡＭ０５５６３１６からの硫酸アンモニウムを利用するニッケルスパイキング研究に先行した。両方の硫酸アンモニウムロットは、１００ｐｐｂレベル未満の亜鉛およびニッケルを有すると判定された。
【０１５３】
亜鉛スパイキング研究において、Ｆｉｓｈｅｒロット１４７６２１４Ａからの硫酸アンモニウムは、ＺｎＣｌ2でスパイクされ、ＨＩＣバッファー中の亜鉛濃度を約８４ｐｐｍに上昇させた。亜鉛でスパイクされたバッファーを用いて処理された材料からのＩＥＸ画分結果は、プロセスバッファーにさらなる亜鉛を添加されずに処理された材料からもたらされたＩＥＸ画分結果と比較された。ニッケルスパイキング研究のために、ＥＭＤロットＡＭ０５５６３１６からの硫酸アンモニウムを、ＮｉＣｌ2で約１．２ｐｐｍにスパイクした。研究は以下で別々に考察される。
【０１５４】
ｉ．亜鉛スパイキング研究：
制御実行、ＤＥＶ−２５Ｃは、ＩＥＸ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定された場合に、典型的な結果を生じた。亜鉛スパイクしたバッファーを用いて実施したＤＥＶ−２５Ｂは、ＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩの有意な分解をもたらした。
【０１５５】
制御実行、ＤＥＶ−２５ＣについてのＩＥＸ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像を、図２２および２３に提示する。これらの図についての濃度測定データは、以下の表９および１０にて集計される。ＡＵＸ−ＩＩピークは、６つの画分からなり、そのうち、１〜５の画分がプール基準を満たした。最後の画分は、プール基準を満たさなかったが、これは、典型的なプロセス性能と一致する（図２２および表９を参照されたい）。ＡＵＸ−Ｉピークは、１０個の画分（画分７〜１６）からなり、そのうち、９〜１５の画分がプール基準を満たした。ＡＵＸ−Ｉ画分がプール基準を満たすためには、画分は、未分解ＡＵＸ−Ｉが少なくとも９１．２％の純度であり、かつ最も豊富にある分解されたＡＵＸ−ＩまたはＡＵＸ−ＩＩ不純物が５．８％以下の純度である必要があった。同様に、ＡＵＸ−ＩＩ画分がプール基準を満たすためには、画分は、未分解ＡＵＸ−Ｉが少なくとも９１．２％の純度であり、かつ最も豊富にある分解されたＡＵＸ−ＩまたはＡＵＸ−ＩＩ不純物が５．８％以下の純度である必要があった。これらの特定の要件の下、初めの２つのＡＵＸ−Ｉ画分（画分７および８）ならびに最後のＡＵＸ−Ｉ画分（１６）は、プール基準を満たさなかった（図２３および表１０を参照されたい）。画分は、精製されているＡＵＸ−ＩまたはＡＵＸ−ＩＩのピークを表すので、画分にわたってのベル型の純度曲線は、通常である。
【表１０】
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【表１１】
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【０１５６】
対照的に、８４ｐｐｍの亜鉛スパイクランＤＥＶ−２５Ｂから産生されたＩＥＸ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ／濃度測定分析は、＜５．８％の最大許容限界（％、最も豊富にある不純物）を十分に超えるコラゲナーゼ不純物断片を含有した。ＡＵＸ−ＩまたはＡＵＸ−ＩＩ画分のいずれもが、プール基準を満たさなかった（図２４および２５、表１１および１２）。この研究は、Ａｖａｎｔｏｒロット７０３３９からの硫酸アンモニウムにおいて見出されるレベルまでのＨＩＣバッファーの亜鉛汚染が、製造プロセスにおいて観察され、かつ高レベルの不純物を産生したような、コラゲナーゼ分解を促進することを示す。
【表１２】
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【表１３】
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【０１５７】
ｉｉ．ニッケルスパイキング研究：
制御実行、ＤＥＶ−２５ＡについてのＩＥＸ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ画像を、図２６および２７にて提示する。これらの図についての濃度測定データは、以下の表１３および１４にて集計される。ＡＵＸ−ＩＩピークは、６つの画分からなる。すべての画分は、プール基準を満たした（図２６および表１３を参照されたい）。ＡＵＸ−Ｉピークは、１０個の画分からなり、そのうち、９〜１５の画分がプール基準を満たした。初めの３つのＡＵＸ−Ｉ画分（画分７〜９）および最後のＡＵＸ−Ｉ画分（画分１６）は、プール基準を満たさなかった（図２７および表１４を参照されたい）。この場合も、画分は精製されるＡＵＸ−ＩまたはＡＵＸ−ＩＩのピークを表すので、画分にわたってのベル型の純度曲線は、通常である。
【表１４】
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【表１５】
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【０１５８】
対照的に、ニッケルでスパイクした実行４では、ＨＩＣバッファーは、１．２ｐｐｍの塩化ニッケルを含有した。ＨＩＣバッファー中の１．２ｐｐｍでのニッケルの存在は、高レベルの不純物を産生する製造プロセスにおいて経験されるものに匹敵する、ＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩ画分中に産物断片を産生した。ＡＵＸ−ＩまたはＡＵＸ−ＩＩ画分のいずれもが、プール基準を満たさなかった（図２８および２９、表１５および１６）。これらの結果は、硫酸アンモニウムロット中の１．２ｐｐｍでのニッケル汚染が、異常な製造プロセスから見られる高レベルの不純物と一致する、コラゲナーゼ分解を促進することを実証している。
【表１６】
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【表１７】
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【０１５９】
Ｄ．ＨＩＣ  ＣＩＰ水洗浄からの中性プロテアーゼの単離および同定
本発明の以前には、コラゲナーゼＩまたはＩＩの断片形態での不純物は、コラゲナーゼ精製プロセスの間のクロストリパイン分解、既知宿主細胞汚染の結果であると考えられていた。クロストリパインは、コラゲナーゼＩおよびＩＩを断片へと切断すると考えられており、これは、Ｃ．ヒストリチクム発酵において、ならびにコラゲナーゼ精製プロセスの間、存在し、かつ活性があることが知られていた。Ｈｅｒｂｅｒ（米国特許出願公報第２０１５／００１０５３２号）における以前のホモロジーモデリングおよびゲノム配列分析により、中性プロテアーゼ（別の切断酵素）が発酵の間に分泌されるが、これは、プロ配列領域のＣ末端部と成熟タンパク質のＮ末端部の間にある自己触媒領域における著しい変異に起因して、非機能的であった、ということが予測された。
【０１６０】
ルーチンの製造プロセスにおける不純物の増大したレベルは、さらなる調査を必要とした。この調査は、不純物が、Ｃ．ヒストリチクムからの中性プロテアーゼにより産生されたコラゲナーゼＩ（ＡＵＸ−Ｉ）およびコラゲナーゼＩＩ（ＡＵＸ−ＩＩ）の断片であったことを判定した。ＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩのアミノ酸配列を、バイオインフォマティクスリソースポータルＥｘＰＡＳｙ．ｏｒｇのＰｅｐｔｉｄｅ  Ｃｕｔｔｅｒプログラムにおいて用いて、クロストリパインおよびテルモリシン切断ルールを用いて、理論的タンパク質切断部位リストを産出した。テルモリシンは、それがＭ４ファミリーのハロタイプ中にあるために、Ｃ．ヒストリチクムからの中性プロテアーゼについてのモデルプロテアーゼとして選択された。ＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩ配列におけるクロストリパインおよびテルモリシンにより産生された切断部位の調査は、ＩＥＸ画分中に含有された特徴付けられたルーチンの産物断片（４０ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、および９６ｋＤａ）の大部分について、末端切断部位の肯定的な適合をもたらした。主な産物断片およびそれらのそれぞれの切断酵素の特徴付けを以下の表１７に要約する：
【表１８】
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【０１６１】
ＩＥＸ画分からのＩＥＸ画分不純物カテゴリーの完全なリストは、実施例１の表３に記載されている。不純物は、表３に記録された分子量（ＭＷ）のうちのいずれか１つで生じ得る。しかし、最も一般的な不純物は、ＡＵＸ−Ｉについては４５ｋＤａ、５５ｋＤａ、８０ｋＤａ、および９０ｋＤａで、またＡＵＸ−ＩＩについては３８ｋＤａ、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、８０ｋＤａ、および９０ｋＤａで、生じる。時々、表３で特定されたもの以外の分子量での不純物が生じる場合がある（表３では「その他」として表される）。
【０１６２】
Ｃ．ヒストリチクムから精製された中性プロテアーゼを産生するために、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程の定置洗浄（ＣＩＰ）廃水流から中性プロテアーゼを精製する方法が開発された。ＨＩＣ  ＣＩＰ水洗浄流出水の２リットル画分をピークにわたって手動で収集した。ピーク最大値を含有する画分を容量で１０倍に濃縮し、その後、１０ｍＭのＴｒｉｓ、３ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ８．０、５℃の６ダイアフィルトレーション容量（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）を用いてバッファー交換した。この操作は、単一の０．１ｍ2のＰｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）５ｋＤａ公称分子量カットオフタンジェンシャルフローフィルターを用いて行った。濃縮されたバッファー交換された洗浄水を、１０ｍＭのＴｒｉｓ、３ｍＭのＣａＣｌ2、ｐＨ８．０で平衡化したＱセファロース高速（Ｑ  ＨＰ）カラムにロードした。平衡バッファーをロードした後、０〜５０％のバッファーＢ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、３ｍＭのＣａＣｌ2、３６０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）からの２５カラム容量の勾配を用いる前に、カラムを洗浄した。２つのクラスターは、カラムから溶離したピークを合わせたものであり、かつ自動化画分化により収集された。クマシー染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、検出可能な限界内に他のタンパク質種を含まない、３４ｋＤａのタンパク質が、第２のピーククラスター内に溶離したことを示した（図３０、ゲルレーン３）。ピーク最大試料を、２０ｍＭのリン酸カリウムへとバッファー交換し、−７０℃で凍結貯蔵した。
【０１６３】
この廃水流、ＨＩＣ定置洗浄（ＣＩＰ）手順の水洗浄工程は、０．５ＭのＮａＯＨでカラムをフラッシングしてＣＩＰを開始する前にＨＩＣユニット操作を完了した後、ＨＩＣカラムを注射用水（ＷＦＩ）でフラッシングすることにより産生される。水洗浄は、ＨＩＣカラムからの中性プロテアーゼの溶離を引き起こした。廃水流からの中性プロテアーゼの単離は成功し、ＨＩＣプロセス廃水流中であるにも関わらず、コラゲナーゼ製造プロセス中において酵素の存在を確認した。単離された中性プロテアーゼは、３４ｋＤａの明白な分子量を有した。
【０１６４】
８０ｋＤａの断片は、潜在的な切断部位のＰ２’位にあるプロリン残基に起因して、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｕｔｔｅｒプログラムを用いるいずれのプロテアーゼ切断ルールにも適合しない、唯一の特徴付けられた断片であった。しかし、プロセス単離された中性プロテアーゼまたは市販バージョンのＣ．ヒストリチクム中性プロテアーゼ（Ｓｅｒｖａからの）のいずれかとＡＵＸ−Ｉを混合することにより、８０ｋＤａの断片は、再度作製された。さらに、ＭＥＲＯＰＳデータベースを用いる８０ｋＤａの断片についての切断部位の評価は、テルモリシンがＴｈｒ−６９３−Ｇｌｙ６９４ペプチド結合を切断してＡＵＸ−Ｉから８０ｋＤａの断片を作製することが可能であることを明らかにした。したがって、コラゲナーゼ産物の製造中に典型的に出現する５つすべてのＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩ産物断片は、中性プロテアーゼのタンパク質分解性切断産物である。製造条件下では、５０ｋＤａおよび９６ｋＤａの不純物は、クロストリパイン分解からの切断産物でもある可能性がある。
【０１６５】
ＡＵＸ−ＩＩ画分中に存在する特徴付けされていない９６ｋＤａの断片は、理論的には、クロストリパインおよび中性プロテアーゼの両方について、複数の切断部位、Ｎ末端およびＣ末端の両方に適合した。９６ｋＤａの断片は、ＡＵＸ−ＩＩを中性プロテアーゼに曝露することにより再度作製された。このｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ分析および中性プロテアーゼ消化研究は、中性プロテアーゼが、Ｃ．ヒストリチクム発酵および／または精製における産物断片の形成に関与する酵素であることを暗示している。
【０１６６】
上述したように、コラゲナーゼ製造プロセスから単離された中性プロテアーゼは、３４ｋＤａの明らかな分子量を有した。これは、中性プロテアーゼのプロ配列が、自己活性化または別の宿主酵素のいずれかにより切断されたことを示し、中性プロテアーゼがＣ．ヒストリチクム製造プロセスにおいて活性であることを示唆している。
【０１６７】
次に、プロ配列がそれ自身自己切断して、活性かつ成熟中性プロテアーゼを産生するかどうかを判定するために、これを行うことは不可能であるように推測されたが、調査を実施した。中性プロテアーゼのＮ末端の識別は、テルモリシンについてのコンセンサス配列要件とＣ．ヒストリチクム中性プロテアーゼのＮ末端に隣接する配列とを比較することにより、プロ酵素の自己触媒適格性を評価するための主要なデータを提供することになる。続いて精製された中性プロテアーゼをＮ末端識別に供し、Ｇｌｎ２２０残基を酵素のＮ末端として識別した。このＮ末端は、２０１５年にＭａｅｄａらによって、最近公開されたＣ．ヒストリチクム中性プロテアーゼのＮ末端と適合する。
【０１６８】
さらに、クロストリパインではなく中性プロテアーゼが、コラゲナーゼ製造プロセスの間に観察されたルーチンのコラゲナーゼ断片のすべてを産生するタンパク質分解性酵素であることが見出された。ＡＵＸ−Ｉ／ＡＵＸ−ＩＩ消化研究におけるＨＩＣ  ＣＩＰ水洗浄からの単離された中性プロテアーゼの使用は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定された場合にルーチンの断片の明白な分子量と一貫する産物断片を産生した。これらの消化研究は、上記したような製造プロセスから単離された中性プロテアーゼを用いた。
【０１６９】
Ｅ．Ｃ．ヒストリチクム中性プロテアーゼＮ末端の識別
用いたＮ末端識別方法は、直交性であり、Ｅｄｍａｎ分解配列決定およびＬｙｓ−Ｃ／トリプシンでの消化後のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＮ末端識別である。両方の試験のための試料は、同じ精製実行から調製され、中性プロテアーゼ溶離ピークの異なる画分を表した。Ｅｄｍａｎ分解分析は、中性プロテアーゼのＮ末端領域の以下の５つの残基：Ｇｌｎ２２０−Ａｌａ２２４を同定した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ消化分析は、分析中２つのペプチド：Ｇｌｎ２２０Ａｌａ−Ａｒｇ２２７およびＧｌｙ２２８−Ｌｙｓ２３６として検出された、中性プロテアーゼのＮ末端領域のより大きなストレッチを同定した。同定されたアミノ酸は、図３１で強調されている。
【０１７０】
中性プロテアーゼの識別されたＮ末端を用いて、プロ酵素のヘキサペプチドコンセンサス配列領域を調べた。コンセンサス配列は、成熟酵素のＮ末端およびそれに続く２つの残基と組み合わされた、テルモリシンのプロ配列のＣ末端の３つの残基に対応する。テルモリシンについては、コンセンサス配列は、Ｖａｌ２３０ＬｙｓＳｅｒＩｌｅＴｈｅｒＧｌｙ２３６である。Ｉｌｅ２３３は、テルモリシンのＮ末端である。コンセンサス配列を記載するために、Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ＆Ｂｅｒｇｅｒのプロテアーゼ下位部位命名法が用いられる（図３２を参照されたい）。テルモリシンの自己触媒のために必要とされるアミノ酸特徴は、Ｐ３位にある非極性残基（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＶａｌ）、Ｐ１位にある極性残基またはプロリン（Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｐ）、およびΡ１’位にある非極性残基である。テルモリシンのコンセンサス配列のインスペクションは、それが３つすべての要件を満たすことを示す。
【０１７１】
Ｃ．ヒストリチクム中性プロテアーゼの識別されたＮ末端（Ｇｌｎ２２０）を用いると、理論的コンセンサス配列は、Ｌｙｓ２１７ＳｅｒＣｙｓＧｌｎＡｌａＴｈｒ２２２である。このヘキサペプチド領域は、Ｃｙｓ２１９が極性残基であること以外は、自己触媒のための下位部位特徴のいずれにも従わない。しかし、それは、規則において適当な残基として記載されていない。文献を参照しても、システインの構造的特徴がＰ１部位の適当な残基からそれを除外するかどうかは不明であり、それについては研究者による研究はされていなかった。テルモリシンの自己触媒配列の規則に基づくと、Ｃ．ヒストリチクム中性プロテアーゼは、自己触媒成分とはならないはずである。
【０１７２】
Ｃ．ヒストリチクムＡＴＴＣ１９４０１中性プロテアーゼの完全な遺伝子産物の配列（分泌配列、プロ配列、および成熟配列）は、Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．２０１５により最近公開された。活性中性プロテアーゼを生じる中性プロテアーゼ基質特異性の研究を可能とするために、遺伝子産物をクローニングし、発現させた。組換え中性プロテアーゼ（rｎｐｒＡ）およびＣ．ヒストリチクム中性プロテアーゼ遺伝子産物配列の配列アライメントは、結果として１００％のホモロジーをもたらした（図３３を参照されたい）。したがって、コラゲナーゼＣ．ヒストリチクム（ＣＣＨ）製造プロセス中の中性プロテアーゼは、自己触媒能を有し、成長培地中でプロ配列を自己切断して機能的成熟酵素となる不活性プロ酵素前駆体として分泌され、ＣＣＨ発酵の典型的な特徴であることが、判定された。
【０１７３】
Ｆ．製造プロセス中の中性プロテアーゼの存在の調査
調査を実施して、活性中性プロテアーゼが異常な製造プロセス実行に特有のものであるか、またはプロセスのルーチンの特徴であるかを判定した。製造プロセス中のコラゲナーゼ断片パターンを分析した。異常な製造プロセス実行中のＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩ  ＩＥＸ画分の分解パターンは、典型的な製造プロセス実行での典型的な断片の相対的分子量に一貫するが、はるかに高レベルである。クロストリパインおよび中性プロテアーゼ切断ルールに対して、各々の特徴付けられた産物断片の切断部位を評価することで、中性プロテアーゼが、不純物として識別された産物断片を産生することが示唆された。ＣＩＰ廃水流を含むＨＩＣユニット操作全体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行って、おおよそ３４ｋＤａのタンパク質バンドが、プロセスストリームの両方に存在するかどうかを判定した。ＣＩＰ方法の水洗浄部分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ評価によるこの明白な分子量と一貫するバンドを含有した。ＨＩＣ水洗浄試料はまた、分析的スパイキング研究においてＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩを分解する（異常な製造プロセス実行において観察されたパターンに類似する）ことを示した。
【０１７４】
コラゲナーゼ製造プロセスにおけるこれらの工程の他にも、残留中性プロテアーゼは、ＨＩＣ溶離液およびＴＦＦ−１濃縮液産物ストリーム中でも見出された。ＩＥＸ画分、ＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩ  ＩＥＸプール、ＡＵＸ−Ｉ中間体、ＡＵＸ−ＩＩ中間体、および薬物製品の調査により、中性プロテアーゼが、それがＡＵＸ−Ｉピーク末尾と共に溶離されるＩＥＸユニット操作の末尾ＡＵＸ−Ｉ画分に隔離されていることが明らかになった。これらの画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／濃度測定分析のプロセス内純度限界を満たさない画分に起因して、産物ストリームから排除され得る。
【０１７５】
実施例３−プロセス制御
中性プロテアーゼ活性は、３つの製造プロセス実行のＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ濾液、ＨＩＣ溶離液、およびタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）濃縮液プロセス試料内で見出された。ルーチンの製造実行のＩＥＸ  ＡＵＸ−Ｉ画分を中性プロテアーゼザイモグラフィー活性アッセイにおいて試験し、プロテアーゼは、これらの試料の末尾画分中で活性を示した。これらのデータは、ＨＩＣカラムから共に溶離する残留中性プロテアーゼが、ＩＥＸカラムから溶離する末尾ＡＵＸ−Ｉ画分中に隔離されることを示唆している。末尾画分の大部分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ濃度測定画分試験のプロセス内純度限界を満たさず、したがって、ＡＵＸ−Ｉ中間体を産生するためにプールされない。しかし、少量の中性プロテアーゼを含有する画分を順方向でプロセスしないことを確実にする、さらなる手順制御を実施した。さらなる手順は、フォワードプロセシングからさらなるＡＵＸ−Ｉ末尾画分を拒絶するように作用する。ザイモグラフィー活性分析により示唆される、中性プロテアーゼ溶離の明白な位置的性質は、これらの手順が、薬物製品を製剤化する前に産物ストリームから中性プロテアーゼを排除するように作用することを示す。これらのプロセス制御は、以下で考察される。
【０１７６】
ザイモグラフィーは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル内で共重合した基質（カゼイン）、およびゲルからＳＤＳを除去する際に再生するある特定の酵素の能力を利用する、電気泳動に基づく酵素活性アッセイである。ＳＤＳ除去後、再生した酵素を一定時間インキュベートさせておき、共重合したカゼイン基質を分解させる。活性がクマシー染色により検出され、ここで、酵素の明白な分子量に対応する分解されたカゼイン領域は、染色を吸収しない白色ゾーンとして現れる。ゲルの残りの部分は、ゲル中に含有されたカゼインと複合体化するクマシー色素により青色に染色される。カゼインは、Ｃ．ヒストリチクム中性プロテアーゼによるタンパク質分解攻撃に感受性があるが、Ｃ．ヒストリチクムクロストリパインまたはコラゲナーゼには感受性のない、牛乳タンパク質である。したがって、このＰＡＧＥに基づく活性アッセイは、活性のある中性プロテアーゼの存在について製造産物ストリームをスクリーニングするための能力を提供した。
【０１７７】
アッセイは、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ濾液、ＨＩＣ溶離液、ＴＦＦ−１濃縮液、および最後のＩＥＸ  ＡＵＸ−Ｉ末尾画分中の中性プロテアーゼシグナルを実証した。中性プロテアーゼは、ＨＩＣ工程において主に除去されるが、カラムに強力に結合されたままであり、カラム洗浄プロセスの水洗浄中に溶離する。微量の中性プロテアーゼは、ＨＩＣカラムからコラゲナーゼと共に精製され、ＩＥＸカラムに結合する。この微量の中性プロテアーゼは、最後のＡＵＸ−Ｉ画分中の産物収集の末端にあるカラムから脱着し始める。中性プロテアーゼは、コラゲナーゼＩＩからコラゲナーゼＩを分離し、溶離液ピークにわたって画分中のそれぞれの溶離液を収集した後、以下の排除工程：（１）プールされ得るコラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩ、またはコラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとの両方の画分に対して改良された基準限界を組み込む工程と、（２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはザイモグラフィー電気泳動により試験された場合に検出可能なレベルの中性プロテアーゼを含有する画分を拒絶する、改良された画分プールストラテジーを組み込む工程と、（３）ＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩ精製画分の約１：１（等しい収量）のプールストラテジーを組み込む工程と、のうちの少なくとも１つを実施することにより除去することができる。ここで、ザイモグラフィーデータおよびＩＥＸプロセス制御が考察される。
【０１７８】
Ａ．プールの改良−カゼインザイモグラフィー電気泳動の場合に中性プロテアーゼを含まない画分のみを収集する
Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ濾液、ＨＩＣ溶離液、ＴＦＦ−１濃縮液、ＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩ中間体、および薬物製品の実験室スケール実行の試料をザイモグラフィー電気泳動により試験した。データは、図３４および３５で提示される。これらの試料は、２つの異なる実行（Ｄｅｖ−１３およびＤｅｖ２５Ａ）からのものであった。ザイモグラフィー画像は、濃度測定によりスキャンされ、中性プロテアーゼバンドをいくつかの試料型として強調するのを補助するために用いた注釈付き画像は、低い中性プロテアーゼシグナルを示した。バンド可視化を補助するために、ゲルの反転画像を用いて、典型的なクマシーゲル画像（青色染色されたタンパク質分解性バンド）を産生した。中性プロテアーゼは、ＭＱＦ、ＨＩＣロード、およびＨＩＣ溶離液などの初期プロセス試料中で検出された（図３４を参照されたい）。中性プロテアーゼバンドは、ＭＱＦおよびＨＩＣロード試料中、約３４ｋＤａの明白な分子量にて容易に観察される。これらの３つの試料型について総タンパク質ロードは、２μｇ（ＭＱＦ）、３μｇ（ＨＩＣロード）、および４μｇ（ＨＩＣ溶離液）から増大しているが、ＨＩＣ溶離液中性プロテアーゼ応答は実質的により低いことに注目されたい。ＨＩＣ溶離液試料中の中性プロテアーゼバンドは、かすかではあったが、濃度測定ソフトウェアの「選択したバンド」の特徴を用いて強調を要求するのには十分であった。これは、ＨＩＣ工程にわたる中性プロテアーゼの有意なクリアランスを実証する。
【０１７９】
ＴＦＦ−１濃縮液、ＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩプール、中間体、および薬物製品について、１０μｇの総タンパク質のより高いロード質量を用いて、これらの試料中の潜在的な中性プロテアーゼシグナルを増幅した。ＴＦＦ−１濃縮液（Ｄｅｖ−２５Ａ）試料は、約３４ｋＤａにおいて拡散したバンドを産生するのに十分な濃度で中性プロテアーゼを含有した。ＡＵＸ−Ｉプール、ＡＵＸ−Ｉ中間体、および薬物製品は、濃度測定ソフトウェアにより強調され、かつレーン６、８、および１２で観察可能である、検出可能な中性プロテアーゼを含有した（図３５を参照されたい）。３４ｋＤａのバンドはゲル中で可視的であった。しかし、得られた画像は、バンドを明確に見るための十分な忠実性を伴うものではなかった。ＡＵＸ−ＩＩ中間体は、検出可能な中性プロテアーゼを含有しなかったし、その前駆体ＡＵＸ−ＩＩプールも同様だった（図３４）。これらのデータは、中性プロテアーゼが、ＩＥＸ工程にわたって産物から分離され、ＡＵＸ−ＩプールおよびＡＵＸ−Ｉ中間体でも明らかなように、ＡＵＸ−Ｉピーク中で共に溶離することを実証している。これらのデータはまた、ザイモグラフィーにより測定される場合に検出可能なレベルの中性プロテアーゼを含有する任意の画分は拒絶され、かつプール工程に含まないようにするべきであることも実証している。
【０１８０】
典型的な製造プロセスからのＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩ溶離液ピークのＩＥＸ画分をカゼインザイモグラフィーアッセイで実行して、中性プロテアーゼが画分中で検出可能であるかどうか、またそれが特異的な位置に含有されているかどうかを判定した。図３６および３７は、アッセイからのゲル画像を含有した。ＡＵＸ−ＩＩの画分のいずれもが、この方法により検出可能な濃度で中性プロテアーゼを含有しなかった。選択した試料をより高い濃度で実行し、ＩＥＸ画分中の中性プロテアーゼの存在を排除した（図３８を参照されたい）。
【０１８１】
この典型的な製造実行の最後のＡＵＸ−Ｉ画分（１７）において、低い中性プロテアーゼシグナルが検出された。ＩＥＸカラムからの中性プロテアーゼ溶離のこの位置的な性質は、図３８（レーン９、１０）および３９（レーン８、１０、および１２）で図示されている。この場合も、この検出は、残留中性プロテアーゼ（ＨＩＣまたはＴＦＦ−１工程において排除されなかった）が、ＡＵＸ−Ｉピーク収集の最後にＩＥＸカラムから部分的に放出することを示唆している。その製造実行のＡＵＸ−Ｉピーク末尾における中性プロテアーゼ汚染の位置的性質、および古い製造方法にはＡＵＸ−Ｉプール中に最後のＡＵＸ−Ｉ画分が含まれていることから、図３５において見られる、製造実行のＡＵＸ−Ｉプール、ＡＵＸ−Ｉ中間体、および薬物製品中で検出された中性プロテアーゼの存在が説明される。したがって、カゼインザイモグラフィーアッセイにより測定された場合に検出可能なレベルの中性プロテアーゼをまったく含有しないプール画分は、中性プロテアーゼを本質的に含まないコラゲナーゼ組成物を産生し得る。
【０１８２】
本発明は、自動拒絶の特徴も含み得る。本発明以前では、これらのＡＵＸ−Ｉ画分は、ＡＵＸ−Ｉプールを作製するために通過したＡＵＸ−Ｉ画分を混合する間に、手動的に拒絶された。少なくとも最後の２つのＡＵＸ−Ｉ画分の自動拒絶は、残留中性プロテアーゼはこれらの画分中に通常共に溶離するために、残留中性プロテアーゼがＡＵＸ−Ｉ中間体に進入するのを阻止する。
【０１８３】
次の段落で記載するように、改良されたＩＥＸプールストラテジーの実施により、ＡＵＸ−Ｉ画分およびＡＵＸ−ＩＩ画分のプールの間の末端部汚染が除去される。
【０１８４】
Ｂ．プールの改良−ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に最小純度限界を満たす画分の収集
コラゲナーゼ、ＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩは、まずＡＵＸ−ＩＩ溶離、続いて、ＡＵＸ−Ｉを用いる勾配溶離の間、不連続のピークとしてＩＥＸカラムから溶離する。ピークを約１リットルのアリコートにて手動画分化により収集する。濃度測定を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、これらの画分を純度について試験する。連続したＡＵＸ−ＩまたはＡＵＸ−ＩＩ画分は、コラゲナーゼＩ産物またはコラゲナーゼＩＩ産物を作製するためのプールのために利用可能である。歴史的に、濃度測定を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に少なくとも８８．５面積％純粋であり、かつ濃度測定を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に１０面積％超の単一の不純物を有しないＡＵＸ−ＩまたはＡＵＸ−ＩＩの画分は、コラゲナーゼＩ産物またはコラゲナーゼＩＩ産物を産生するためにプールされた。これらの限界を満たさなかった画分は、順方向でプロセスされず、したがって、産物ストリームから排除された。
【０１８５】
通過画分のための基準を改良することは、コラゲナーゼ組成物の全体的な純度を改良するだけでなく、ＡＵＸ−Ｉ末尾から中性プロテアーゼをさらに排除するのにも役立つ。ＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩ画分が、濃度測定を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に少なくとも９１．２面積％のＡＵＸ−ＩまたはＡＵＸ−ＩＩの純度を有し、かつ最も多量にある単一の不純物が、濃度測定を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に５．８面積％以下である場合に、通過画分のための限界を引き上げることにより中性プロテアーゼを除去することができる。
【０１８６】
調査の一部として、歴史的なバッチデータに基づいてＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩ画分をプールするための計画した偏差を実施した。ＡＵＸ−Ｉ画分１２〜１６およびＡＵＸ−ＩＩ画分２〜５をプールし、順方向でプロセスして、薬物原料（バルク薬物原料またはＢＤＳと呼ばれることもある）を作製した。薬物製品の放出試験は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるより高い限界の仕様外（ＯＯＳ）純度と、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による傾向外（ＯＯＴ）純度とをもたらし、ＩＥＸ画分のより低い純度を確認した。この計画された偏差は、図３５において提示されるデータをもたらした。製造実行からのＡＵＸ−Ｉプール、ＡＵＸ−Ｉ中間体、および薬物製品中で検出された中性プロテアーゼは、計画された偏差によりプールされた末尾ＡＵＸ−Ｉ画分（１６）により寄与された。ザイモグラフィー電気泳動アッセイに対する検出の限界は、約０．５ｎｇの中性プロテアーゼである。図３５におけるバンドは、実際のカゼインザイモグラフィーゲル自体の上で可視的であったが、０．５ｎｇの限界よりわずかに低く−１０マイクログラムのロード量のコラゲナーゼ組成物を用いておおよそ０．２〜０．３ｎｇの中性プロテアーゼであった。
【０１８７】
Ｃ．プールの改良−過剰なＡＵＸ−Ｉ収量を最小限にするためのＡＵＸ−ＩＩ収量の適合
本発明はまた、通過ＡＵＸ−ＩＩ画分をプールし、かつ通過ＡＵＸ−Ｉ画分をプールして、プール工程において約１：１の質量比のＡＵＸ−Ｉ対ＡＵＸ−ＩＩのプールを産生することにより産生される、理論的なグラム量のＡＵＸ−ＩＩを評価することを含み得る。例えば、プールされたＡＵＸ−Ｉの量は、ＡＵＸ−ＩＩのグラムの１．３倍であり得る。任意の過剰なＡＵＸ−ＩまたはＡＵＸ−ＩＩは、バルク薬物原料（コラゲナーゼ組成物）の製造後に、廃棄することができる。これは典型的には、ＡＵＸ−Ｉプールから排除されるべき初期プロセス内限界を満たした、１つ以上の末尾ＡＵＸ−Ｉ画分をもたらす。この実施は、製造プロセス中で中性プロテアーゼを排除するための二次的なプロセス制御である。
【０１８８】
一例として、プールされたコラゲナーゼＩのおおよその量が、プロセスにより産生されたコラゲナーゼＩＩのおおよその量に適合するまで、コラゲナーゼＩピーク画分のみをプールすることと併せて、ＩＥＸ溶離から収集されたコラゲナーゼＩ画分のピーク画分は、所望の純度および不純物基準を満たす画分に基づいて、順方向でプロセスされる。第１に、ＡＵＸ−ＩＩ画分が収集され、最終末尾画分を排除した後に、プロセスからの総ＡＵＸ−ＩＩの理論的な量を計算することができる。第２に、各画分中のＡＵＸ−Ｉの理論的量を判定する。次いで、濃度測定を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に少なくとも９１．２面積％の純度を含有し、かつ濃度測定を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定された場合に約５．８％超の単一の不純物を含有しない第１のＡＵＸ−Ｉ画分から開始して、プールされたＡＵＸ−Ｉの量が、ＡＵＸ−ＩＩについて計算された総量の約１．３倍となるまで、ＡＵＸ−Ｉについて連続的な画分をプールする。この方法により生成されるコラゲナーゼ組成物は、本質的に中性プロテアーゼを含まない。
【０１８９】
この制御ストラテジーは、コラゲナーゼＩピークのさらなる末端画分の排除をもたらし、結果として、プールされたコラゲナーゼＩの画分は、中性プロテアーゼを本質的に含まない。
【０１９０】
実施例４−プロセスからの中性プロテアーゼのクリアランス
ニッケルまたは亜鉛に起因する固有の中性プロテアーゼ活性の増幅が、ＩＥＸ画分のより高い不純物レベルをもたらす、上述の小規模なスパイキング研究により実証された。重要なことには、中性プロテアーゼクリアランス研究は、研究（ロット００１１３３８）中に含まれた３つのＨＩＣ溶離液のうちの１つのみで検出可能な中性プロテアーゼ活性を見出し、一方で、３つのすべてのロットは、ＴＦＦ−１濃縮液試料中に検出可能な中性プロテアーゼ活性を含有した。典型的なＨＩＣ溶離液およびＴＦＦ−１濃縮液中に存在する微量レベルは、ＩＥＸ画分中の高められた産物断片を促進しないが、それでも製造プロセス実行は、高レベルの不純物を産生し、小規模なスパイキング研究実行は、ＨＩＣ溶離液、ＴＦＦ−１濃縮液、およびＩＥＸ画分中に存在する増大された断片を含有した。これらの結果は、ニッケルおよび亜鉛イオンがＨＩＣおよびＴＦＦ−１ユニット操作において中性プロテアーゼ特異的活性を増幅し、ＩＥＸユニット操作中に増大した産物断片不純物を引き起こすことを示唆している。
【０１９１】
中性プロテアーゼクリアランス研究を実施して、これが、薬物製品を作製する前のコラゲナーゼ製造プロセスの産物ストリームから効果的に排除されるかを確認した。この研究は、以下の２つの最近開発された中性プロテアーゼ活性に基づく試験方法を用いて、下流プロセスの産物ストリーム保留試料を試験することにより、３つの歴史的な薬物製品ロットに対して行われた：（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはザイモグラフィーアッセイにより測定された場合に検出可能なレベルの中性プロテアーゼを含有する、イオン交換工程からのＡＵＸ  Ｉ溶離画分を、ＡＵＸ−Ｉプール工程から拒絶すること、および（２）イオン交換工程からプールされたおおよそ１：１の質量比のＡＵＸＩＩに基づきＡＵＸＩの最大ピーク画分をプールすること。この研究において試験した産物ストリームを以下の表１９中に列挙する。製造産物ストリーム中の中性プロテアーゼ活性の検出のための試験方法は、蛍光に基づくマイクロプレートアッセイおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥザイモグラフィー方法である。これらの試験方法の各々からのデータは、以下で別々に考察される。
【表１９】
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【０１９２】
Ａ．蛍光マイクロプレート中性プロテアーゼ活性アッセイ
半定量的蛍光活性アッセイを用いて、表１９で列挙された試料型を試験した。このアッセイは、使用のために好適には純粋ではなかった中性プロテアーゼの唯一の市販供給源として、テルモリシン（ＴＬ）の市販の調製物を標準曲線のために利用する。アッセイのための定量限界（ＬＯＱ）は、０．０６２５ＡＵ／ｍＬ（０．０１８６６ＡＵ／ｍｇのＴＬ）である。Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ濾液のみが、定量化可能なレベルの中性プロテアーゼ活性を含有した。さらに下流のすべての試料型は、アッセイのＬＯＱ未満であった。試験した３つの製造ロットについてのデータは、以下の表２０に提示される。
【表２０】
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【０１９３】
Ｂ．ザイモグラフィーアッセイ
中性プロテアーゼ活性についてのザイモグラフィーアッセイは、すべてのＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ濾液試料、ＨＩＣ溶離液（ロット００１１３３８）のうちの１つのロット、およびすべてのＴＦＦ−１濃縮液試料において、肯定的な中性プロテアーゼバンド検出をもたらした。ＴＦＦ−１濃縮液の下流の試料型はいずれも中性プロテアーゼ活性を示さない。Ｃ．ヒストリチクムロット０００９７４９、００１０９８７、および００１１３３８からのデータは、以下の表２１に提示される。ロット００１０９８７のザイモグラフィーゲル画像は、図４０に提示される。画像は、反転クマシー染色表示であり、低振幅のシグナル検出、例えば、中性プロテアーゼバンドを可能にするための改良されたコントラストを提供する。
【表２１】
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【０１９４】
中性プロテアーゼクリアランス研究は、マイクロプレートアッセイにおけるＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ濾液試料後の検出可能な活性の欠失、およびザイモグラフィーアッセイにより評価された場合にＨＩＣ溶離液試料（ロット００１１３３８）の１つにおいて存在する低レベルの活性により明らかであるように、中性プロテアーゼが主としてＨＩＣクロマトグラフィー工程にてクリアランスされることを実証する。ザイモグラフィーアッセイは、３つすべてのＴＦＦ−１濃縮液試料中の低い中性プロテアーゼ活性を明らかにし、中性プロテアーゼが、溶離工程の間にＨＩＣカラムから部分的に放出され、一方で、酵素の大部分は依然としてカラムに結合したままであることを確認した。それぞれのＴＦＦ−１濃縮液中で検出された低い活性を伴う、２つのＨＩＣ溶離液試料中の中性プロテアーゼ活性の欠失は、このユニット操作中のダイアフィルトレーション開始前に生じる６倍濃度に起因する。ＴＦＦ−１濃縮液中に存在する残留中性プロテアーゼは、中性プロテアーゼがＡＵＸ−Ｉ末尾画分と共に部分的に共溶離するＩＥＸユニット操作の間に産物ストリームから排除される（図３９を参照されたい）。ＩＥＸ画分純度プロセス限界および手順制御（等価質量の中間体を標的とする、最後の２つのＡＵＸ−Ｉ画分の自動拒絶）は、ＡＵＸ−Ｉ中間体および薬物製品を産生する前の製造プロセスから残留中性プロテアーゼを除去するＡＵＸ−Ｉプールから末尾ＡＵＸ−Ｉ画分を除外する。
【０１９５】
実施例５−微量の中性プロテアーゼの排除効果
実施例４において示されるように、コラゲナーゼピークの末尾末端にあるより少ないＡ280コラゲナーゼピーク画分をプールすることは、すべてではないにしても、大部分の微量の中性プロテアーゼも除去し、その結果、ＡＵＸ  Ｉのプール画分により作製されたコラゲナーゼＩ産物は、本質的に中性プロテアーゼを含まない。各コラゲナーゼのＩＥＸ精製工程後に、プールされた溶離画分の定量的評価を実施し、改良された製造プロセスの効果を以前の製造プロセスと比較した。
【０１９６】
ＩＥＸ画分において観察された相対的純度および不純物レベルの傾向分析は、重要なプロセス性能情報を提供する。かかる１つの方法を実施例１にて記載する。この実施例では、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを以下のロットから試験した：
【表２２】
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【０１９７】
表２２に列挙した各製造実行のために、ＡＵＸ  ＩおよびＡＵＸ  ＩＩ溶離画分を、実施例１において記載されるように、産物の純度および不純物のパーセンテージについて測定した。各画分中の不純物のパーセンテージは、断片あたりを基準としたものだけでなく、総不純物を基準としたものとの両方に対して測定された。
【０１９８】
各ＡＵＸ  ＩまたはＡＵＸ  ＩＩ溶離ピーク中の総タンパク質の量に対して、非定型硫酸アンモニウムロットにより影響されたパーセント純度および各不純物のパーセントを、コンピュータープログラムであるＣｏｎｔｒｏｌ  Ｃｈａｒｔｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓを用いてプロットした。Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｃｈａｒｔｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓは、ルーチンの変動に起因する結果（管理図限界内）と、例外的な変動に起因する結果（管理図限界を超える）とを区別するために使用される、統計的ツールである。プロセス変動性を推定するために、２つの連続的な観察物の移動範囲を用いて、管理限界を計算する。管理図中の緑色の水平線は、平均結果を表す。赤色の水平線は、
【数４】
2020524128.tif 000027
、として計算された上方および下方管理図限界を表す。
【０１９９】
各ＡＵＸ溶離ピーク中の総タンパク質の量に対するＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩ産物のパーセント純度は、図４２および図４３において提供される。図４２および図４３で見られるＡＵＸ−ＩおよびＡＵＸ−ＩＩ溶離ピークのパーセント純度レベルにおける減少は、図４４および図４５にそれぞれ示されるように、高いレベルのＡＵＸ−Ｉ９０ｋＤａおよびＡＵＸ−ＩＩ９６ｋＤａ不純物に主に起因する。
【０２００】
典型的な製造実行におけるＡＵＸ  ＩおよびＡＵＸ  ＩＩ産物ピークパーセンテージについての生データは、図４６Ａおよび４６Ｂに示され、ＡＵＸＩおよびＡＵＸ  ＩＩの主な不純物パーセンテージについての対応する生データは、図４６Ｂ〜４６Ｄにおいて示される。主な不純物は、上流製造プロセス中の中性プロテアーゼ存在に起因する、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩからの９０ｋＤａおよび９６ｋＤａの分解産物である。
【０２０１】
図４６Ａ〜４６Ｄにおいて示されるように、以前のプロセシング方法を用いて精製されたコラゲナーゼＩについての生データは、９４．５％＋／−１．０％の平均純度を有する。改良されたプロセシング方法を用いて精製されたコラゲナーゼＩについての生データは、９５．８％＋／−１．０％の改善された平均純度を有する。ＡＵＸ  Ｉプールについての０．３％の統計的に有意な改良は、改良された製造方法を用いることにより中性プロテアーゼを本質的に含まないコラゲナーゼＩ産物が産生される、さらなる証拠となる。驚くことではないが、中性プロテアーゼはＡＵＸ  ＩＩを伴うイオン交換カラムから溶離しないので、コラゲナーゼＩＩ（ＡＵＸ−ＩＩ）の純度は依然として変化しない。改良されたプロセスを用いたとしても、中性プロテアーゼは、改良されたプロセス中でさえ精製のより初期工程において依然として存在するために、精製産物中の９０ｋＤａおよび９６ｋＤａのコラゲナーゼ不純物ピークの長引く存在は、予期されないものではない。
【０２０２】
上記の本方法の実施形態は、単なる例示を意図しており、さまざまな変形形態および修正形態が当業者には明らかであろう。すべてのかかる変形形態および修正形態は、添付の特許請求の範囲のいずれかにおいて定義されるような本発明の範囲内にあることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2020524128.tif 000032
【図６】
2020524128.tif 000033
【図７】
2020524128.tif 000034
【図８】
2020524128.tif 000035
【図９】
2020524128.tif 000036
【図１０】
2020524128.tif 000037
【図１１】
2020524128.tif 000038
【図１２】
2020524128.tif 000039
【図１３】
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【図１４】
2020524128.tif 000041
【図１５】
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【図１６】
2020524128.tif 000043
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４６Ｄ】
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【国際調査報告】
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