(57)【要約】miR-1983阻害剤であって、CTCACCTGGAGCATGTTTTCT（配列番号１）の少なくとも一部分と相補的な抗miR-1983オリゴヌクレオチドを含み、前記部分はCTCACCTGGAGCATGTTTTCT（配列番号１）の少なくとも2から８ヌクレオチドを含む。
2020531542.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
miR-1983阻害剤であって、
CTCACCTGGAGCATGTTTTCT（配列番号１）の少なくとも一部分と相補的な抗miR-1983オリゴヌクレオチドを含み、
前記部分はCTCACCTGGAGCATGTTTTCT（配列番号１）の少なくとも2から８ヌクレオチドを含む、
miR-1983阻害剤。
【請求項２】
前記部分がTCACCTGGAGCATGT（配列番号４）である、請求項１に記載のmiR-1983阻害剤。
【請求項３】
前記抗miR-1983オリゴヌクレオチドはRNAを含む、請求項１または２に記載のmiR-1983阻害剤。
【請求項４】
前記抗miR-1983オリゴヌクレオチドが化学的に修飾されている、請求項１から３のいずれかに記載のmiR-1983阻害剤。
【請求項５】
前記化学的修飾が２’位での修飾である、請求項４に記載のmiR-1983阻害剤。
【請求項６】
前記修飾が２’Ｏメチル（２’O-Me）、2’-Ｏ-メトキシエチル（２’-O-MOE）、2’フルオロ（2’F）およびロックド核酸モノマー（LNAM）から選ばれる、請求項５に記載のmiR-1983阻害剤。
【請求項７】
前記抗miR-1983オリゴヌクレオチドが複数のヌクレオチドモノマーの化学修飾を含む、請求項６に記載のmiR-1983阻害剤。
【請求項８】
前記抗miR-1983オリゴヌクレオチドが複数のロックド核酸モノマー（LNAM）を含む、請求項７に記載のmiR-1983阻害剤。
【請求項９】
前記抗miR-1983オリゴヌクレオチドがロックド核酸（LNA）またはLNA/DNAミックスマーである請求項８に記載のmiR-1983阻害剤。
【請求項１０】
前記LNAが配列5’-3’、A*C*A*T/U*G*C*T/U*C*C*A*G*G*T/U*G*A（配列番号２）を含む、請求項９に記載のmiR-1983阻害剤。
【請求項１１】
前記LNAが配列5’-3’, A*C*A*T*G*C*T*C*C*A*G*G*T*G*A（配列番号２）を含む、請求項１０に記載のmiR-1983阻害剤。
【請求項１２】
前記LNAが配列5’-3’, A*C*A*U*G*C*U*C*C*A*G*G*U*G*A（配列番号２）を含む、請求項１０に記載のmiR-1983阻害剤。
【請求項１３】
前記抗miR-1983オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのミスマッチおよび四つまでのミスマッチを含む、請求項１から１２のいずれかに記載のmiR-1983阻害剤。
【請求項１４】
前記抗miR-1983オリゴヌクレオチドが二本鎖である、請求項１から１３のいずれかに記載のmiR-1983阻害剤。
【請求項１５】
前記抗miR-1983オリゴヌクレオチドが一本鎖である、請求項１から１３のいずれかに記載のmiR-1983阻害剤。
【請求項１６】
前記阻害剤が前記抗miR-1983オリゴヌクレオチドである、請求項１から１５のいずれかに記載のmiR-1983阻害剤。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれかに記載のmiR-1983阻害剤と希釈剤を含む、組成物。
【請求項１８】
鼻腔内製剤として剤型された請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記希釈剤が生理食塩水を含む、請求項１７または１８に記載の組成物。
【請求項２０】
細胞がインスリン抵抗性であるかどうか検出する方法であり、
前記方法は、miR-1983のレベルを測定し、基準値またはコントロールと比較することを含み、
コントロールに比較して増加したレベルは、細胞がインスリン抵抗性であることを示す、
方法。
【請求項２１】
前記細胞は神経細胞であり、適宜視床下部細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞はヒト細胞である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
対象における前糖尿病または糖尿病発症の可能性の増加を検出する方法であって、
前記方法は対象からの生体サンプル中のmiR-1983のレベルを測定し、
基準値またはコントロールと比較して増加したレベルは、対象が糖尿病を発症している可能性が高いことを示唆する、
方法。
【請求項２４】
前記検出が視床下部での一以上の神経ペプチドの調節不全の前に起こる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記一以上の神経ペプチドがNPY又はAgRPである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記サンプルが血清サンプルである請求項２３から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記miR-1983のレベルは定量PCR法で測定される、請求項２３から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記定量PCR法は細胞又は生物サンプルから得たRNAからｃDNAを作成し、前記ｃDNAを配列特異的プライマーを用いて増幅し、前記miR-1983のレベルを定量する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象はヒトである請求項２３から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記ヒト対象はボディマス指数が２５未満である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ヒト対象はボディマス指数が２５から２９である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ヒト対象はボディマス指数が３０以上である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
対象におけるインスリン感受性の改善方法であって、miR-1983阻害剤をそれを必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項３４】
前記miR-1983阻害剤は請求項１から１６のいずれかに記載のmiR-1983阻害剤、または、請求項１７から１９のいずれかに記載の組成物である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記miR-1983阻害剤は鼻腔内投与される、請求項３３または３４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、インスリン抵抗性に関連するmiRNAとその拮抗剤の治療剤としての使用に関する。
【０００２】
関連出願
本出願はPCT出願であり、2018年7月13日に出願された米国仮特許出願番号62/697,935及び2017年8月25日に出願された米国仮特許出願番号62/550,233の優先権をもとに米国特許第119条の利益を主張し、それぞれは本明細書全体に参照として組み込まれる。
【０００３】
配列表
コンピューター可読形式の配列表、「SequeceListing.txt」(9782バイト)、2018年8月23日作成、をここに参照として組み込む。
【背景技術】
【０００４】
視床下部は栄養状態とエネルギー恒常性の重要なモジュレーターとして機能する。摂食とエネルギー消費を調整する神経ペプチドY（NPY）/アグーチ関連ペプチド（AgRP）およびプロオピオメラノコルチン（POMC）を発現する細胞はエネルギー恒常性を維持するうえで重要である。弓状核（ARC）の第三脳室に近い正中隆起側に位置し（Gao and Horbath, 2008; Varela and Horvath, 2012）、アグーチ関連ペプチドを共発現するこれらのNPY神経細胞およびPOMC神経細胞は、まさに末梢ホルモンおよび食物成分のような血中因子の変化を感知するために備わっている。この情報は、健康的なエネルギーバランスを維持するために視床下部の他の神経細胞とさらなる脳の領域に伝えられる。特にインスリンとレプチンのような末梢シグナルへのそれらの反応を変える、NPY/AgRPまたはPOMC神経細胞集団の機能障害は、肥満、インスリン抵抗性、2型糖尿病（T2DM）の発症に関連している（Konner and Bruning, 2012; Roh et al., 2016)。肥満マウスにおいて、低脂肪食による体重減少が血中マイクロRNAの特異な発現を引き起こすことが確認されている(Hsieh et al., 2015)。
【０００５】
インスリン抵抗性は末梢組織においてかなりよく確立されているが、基となる病理は脳においてはほとんど明らかにされていない。齧歯類動物モデルでの脳インスリンシグナル伝達の研究は、食事により誘引される肥満、高脂肪食摂取に応じた肝糖新生の調節不全、および2型糖尿病において阻害される正常の白色脂肪組織での脂質新生と脂肪分解の維持、でのインスリンシグナル伝達の極めて重要な役割について明らかにし、成果を上げている。(Bruning et al., 2000; Obici et al., 2002b; Scherer et al., 2011)。さらに代謝調節不全の発症における脳の重要性のサポートとして、Cleggらは高脂肪食負荷による肥満の発症に先立ち、末梢組織より前に脳でインスリン抵抗性が起こることを見出した(Clegg et al., 2011)。実際、ARCのNPY/AgRP 神経細胞におけるインスリン受容体（InsR)レベルの一時的減少だけでさえ、ラットにおけるインスリン抵抗性と過食症を引き起こすのに十分である(Obici et al., 2002a)。一方ごく最近、特にNPY神経細胞でのインスリンシグナル伝達が食物摂取とエネルギーバランスのコントロールに重要であることが見いだされた（Loh et al., 2017)。したがって、中枢でのインスリンシグナル伝達の障害は末梢インスリン抵抗性の発症への原因因子として働く可能性があるが、この病理が起こるメカニズムについてはいまだ解明されていない。
【０００６】
インスリン抵抗性の火付け役である高インスリン血症は肥満とは別に独立して起こり得る(Rizza et al., 1985)。例えば、高レベルのインスリンにさらされたNPY/AgRP 神経細胞モデルは、８時間から２４時間の間でインスリン抵抗性になることが示されている（Mayer and Belsham, 2010a)。ｍRNAレベルではなく、InsRとInsR substrate-1 (IRS-1)のタンパク質発現レベルの減少が、観察された細胞内シグナリングの消失に寄与していた。プロテオソームおよびリソソーム経路はインスリンへの曝露の延長によるIRS-1とInsRそれぞれの分解に関連していた。同様に、POMC発現神経細胞モデルは、このパラダイムでインスリン抵抗性を発症させることがわかった(Nazarians-Armavil et al., 2014)。これらの実験により、視床下部細胞が高インスリンにさらされることにより、インスリンシグナル伝達経路において鍵となるタンパク質が分解されることが明らかになった。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の態様では、CTCACCTGGAGCATGTTTTCT (配列番号1)の少なくとも一部分に相補的な抗miR-1983オリゴヌクレオチドを有するmiR-1983阻害剤を提供し、前記部分はCTCACCTGGAGCATGTTTTCT (配列番号1)の少なくとも２から８ヌクレオチドを含む。
【０００８】
一実施形態では、miR-1983阻害剤は抗miR-1983オリゴヌクレオチドである。
【０００９】
本発明の他の態様では、miR-1983阻害剤と希釈剤を含む組成物である。
【００１０】
さらなる態様では、細胞がインスリン抵抗性かどうか検出する方法は、miR-1983のレベルを測定し、基準値やコントロールと比較することを含み、コントロールに比べてのレベルの増加は細胞がインスリン抵抗性であることを示す。
【００１１】
他の態様では、対象における前糖尿病または糖尿病発症の可能性の上昇を検出する方法で、その方法はその対象からの生体サンプルでのmiR-1983のレベルを測定することを含み、基準値またはコントロールと比較してのレベルの増加は、その対象が前糖尿病または糖尿病を発症している可能性が高いことを示す。
【００１２】
他の態様では、対象のインスリン感受性の改善方法であり、前記方法は、それを必要とする対象にmiR-1983を投与することを含む。
【００１３】
本開示の他の特徴および有用性については後述する詳細な説明から明らかになる。しかしながら、本開示の要旨と範囲内で様々な変更および修正が本願詳細な説明から当業者にとって明らかであろうから、詳細な説明および特定の実施例は、本開示の好ましい実施形態を示しているがただの例示として挙げられていることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
実施形態は図に関連して下記に述べられる。
【００１５】
【図１Ａ】図１はインスリン抵抗性の誘導によりmHypoE-46細胞において変化したmiRNAのマイクロアレイ(n=3)およびqPCRバリデーション(n=4から5)について示す。図１AはmiR-1983を示す。*p<0.05, ** p<0.01.
【図１Ｂ】図１BはmiR-20a-3pを示す。*p<0.05, ** p<0.01.
【図１Ｃ】図１CはmiR-296-5pを示す。*p<0.05, ** p<0.01.
【図１Ｄ】図１DはLet-7d-5pを示す。*p<0.05, ** p<0.01.
【図２Ａ】図２は成体細胞株においてmiR-1983が制御されていることを示し、インスリン処理によって恒久的に上方制御されないことを示す。インスリン抵抗性は、図２A雌mHypoA-NPY/GFP (n=3から7)細胞株および
【図２Ｂ】図２B雄mHypoA-POMC/GFP-2 (n=8から16)細胞株、の両方において、miR-20a-3pではなくmiR-1983で特有の変化を引き起こす。
【図２Ｃ】図２Cは、48時間後(48h)、InsR(インスリン受容体)β(IRβ)サブユニットタンパク質レベルの損失は持続しているが、mHypoE-46細胞でのmiR-1983の増加は見られないことを示す(n=8)。データは平均±標準偏差で表した。*P<0.05, ** P<0.01, **** P<0.0001
【図３Ａ】図３はmiR-1983のmRNA ターゲットのインシリコおよびインビトロ分析を示す。  図3Aは調査対象のmiR-1983遺伝子ターゲットを評価するためのインシリコ解析のワークフロースキームであり、
【図３Ｂ】図３Bはマウスにおけるインスリン受容体(Insr)３’-非翻訳領域（UTR）のターゲットスキャン分析（上部）とmiR-1983のInsr３’ -非翻訳領域配列ターゲット領域の種間保存配列アライメント（下部）である。
【図３Ｃ】図3Cは mHypoE-46 細胞にmiR-1983 miRNA ミミック（模倣体） (25 nM)を24時間(24h)トランスフェクション後、Insr（インスリン受容体）のmRNAレベルは変化しない(n=4)ことを示す。
【図３Ｄ】図３Dは mHypoE-46 cellsにmiR-1983 miRNA ミミック (25 nM)を24時間トランスフェクション後、InsR（インスリン受容体）β(IRβ)タンパクレベルは減少する(n=4)ことを示す。
【図３Ｅ】図３Eは mHypoE-46 cellsにmiR-1983 miRNA ミミック (25 nM)を４８時間(48h)トランスフェクション後、InsrのmRNAレベルは変化しないが(n=4)、一方、InsRβタンパク質レベルは減少することを示す。
【図３Ｆ】図３FはmiR-1983 ミミックと同時に3000 bpまでの 3’Insr-非翻訳領域配列を含むpmirGLO ベクター (1 μg)のトランスフェクション(グループあたりn=3から4独立実験、それぞれ3回行った)を示す。データは、平均±誤差*P<0.05, ** P<0.01で示す。
【図４Ａ】図４は７から９週間高脂肪食を与えたC57BL/6マウスで、神経ペプチドのmRNAレベルは雌雄で同様な変化を示すにもかかわらず、miR-1983は雄の視床下部では増加し、雌ではしないことを示す。７から９週間、６0%高脂肪食（HFD）負荷雄および雌C57BL/6マウスは、スクロースでカロリーを一致させたコントロール食(Chow)を与えたマウスと比較して、体重（図4A, n=4から7/群）および
【図４Ｂ】空腹時血糖(図4B, n=3から7/群)が増加した。
【図４Ｃ】雄C57BL/6マウスにおいて、同様の減少変化が、Npy（神経ペプチドY）、 Agrp（アグーチ関連ペプチド）の発現に見られたが、Pomc（プロオピオメラノコルチン）発現では見られなかった(図4 CおよびD, n=7から8/群)。
【図４Ｄ】雌C57BL/6マウスにおいて、同様の減少変化が、Npy（神経ペプチドY）、 Agrp（アグーチ関連ペプチド）の発現に見られたが、Pomc（プロオピオメラノコルチン）発現では見られなかった(図4 CおよびD, n=7から8/群)。
【図４Ｅ】雄C57BL/6のみ空腹時インスリンの増加を示した（n=7から8/群)。
【図４Ｆ】雄C57BL/6のみ視床下部miR-1983レベルの増加を示した(n=7から8/群)。
【図５Ａ】図５は、5週間高脂肪食(HFD)負荷した雄CD-1マウスの視床下部において、神経ペプチドmRNAレベルの完全な変化に先行して、miR-1983が増加したが、10週間高脂肪食負荷したマウスではされなかったことを示す。スクロースでカロリーを一致させたコントロール食（Chow）を与えた場合と比較して、5週間 ６０％高脂肪食を与えたマウスでは空腹時血糖(図5A, n=4/群)が増加した。
【図５Ｂ】スクロースでカロリーを一致させたコントロール食（Chow）を与えた場合と比較して、5週間 ６０％高脂肪食を与えたマウスでは，血中インスリンレベル(図5B, n=8/群)が増加した。
【図５Ｃ】これらのマウスの視床下部において、Npy, AgRP, Pomc,または Insr(インスリン受容体) mRNAレベルの変化なしに(図5D, n=8から14/群)、miR-1983の発現は増加した(図5C, n=9から12)。
【図５Ｄ】これらのマウスの視床下部において、Npy, AgRP, Pomc,または Insr(インスリン受容体) mRNAレベルの変化なしに(図5D, n=8から14/群)、miR-1983の発現は増加した(図5C, n=9から12)。
【図５Ｅ】同じ食物を10週間与えたマウスでは、視床下部miR-1983レベルは増加せず(図5E, n=10から11/群)、
【図５Ｆ】Npy およびAgRP mRNAは減少し、Pomc mRNAは増加した。Insr (インスリン受容体)mRNA量の変化は見られなかった（図5F, n=8から11/群)。データは平均±標準誤差で示す。*p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001
【図６Ａ】図6は5週間60%高脂肪食（HFD）負荷CD-1雌マウスの視床下部においてmiR-1983は増加しないが、一方、雄マウスではmiR-1983は視床下部と血清で増加し、腎臓でレベルが減少することを示す。どちらの性別でも、コントロールおよび６０％高脂肪食の両方の群で体重増加が見られ、（図６Ａは雄マウス）、
【図６Ｂ】（図６Ｂは雌マウス）
【図６Ｃ】６０％高脂肪食群では合計体重増加がChow（スクロースでカロリーを一致させたコントロール食）負荷同腹兄弟に比較して増加した。
【図６Ｄ】図６DはChowまたは６０％高脂肪食負のいずれかを与えた、雄および雌CD-1マウスの4時間空腹時血糖(n=7から9/群) (n=7から9/群)を示す。
【図６Ｅ】図６Eは視床下部miR-1983と空腹時インスリンレベルのchow(n=7から8)または60％高脂肪食負荷雄CD-1マウス、とMKR (n=8)マウスでの比較を示す。
【図６Ｆ】図６Fは視床下部miR-1983と空腹時インスリンレベルの、Chow (n=7-8)負荷または60% 高脂肪食 (n=8)負荷雌CD-1マウス、とMKR (n=3) マウスでの比較を示す。
【図６Ｇ】雄(図6G, n=7-9/group)と
【図６Ｈ】雌(図6H, n=8から9/群)マウスにおいて、AgRPまたはPomc mRNA量の変化なしに、低いNpy mRNAレベルがみられたが、Insr mRNAレベルの増加は雌マウスのみで見られた。
【図６Ｉ】図６Iはchow負荷または60% 高脂肪食負荷、雄CD-1 マウスの筋肉、腎臓、血清でのmiR-1983レベルを示す。データは平均±標準誤差で示す。*p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001
【図７Ａ】図７は5週間60%高脂肪食（HFD）負荷CD-1 マウスでのmiR-1983阻害剤またはコントロールインビボ鼻腔内輸送において、インスリン感受性、空腹時血糖および視床下部InsRβタンパク質レベルの変化が誘導されることを示す。図７Aは60%高脂肪負荷マウスへのインビボ miR-1983阻害剤投与実験パラダイム（タイムライン）を示す。
【図７Ｂ】これらの動物は、Chowと比較して、体重増加(図7B, n=5から6/群)が大きく、
【図７Ｃ】合計体重の増加(図７C n=5から6/群)も大きかった。
【図７Ｄ】図７Dは腹腔内インスリン負荷試験（IpITT）（4時間空腹、１ユニットインスリン/体重ｋｇ）(n=5から6/群)を示す。
【図７Ｅ】図７EはmiR-1983阻害剤の鼻腔内投与後2週間後の空腹時血糖レベルを示す。
【図７Ｆ】図７Fは視床下部神経ペプチドNpy, Agrp, PomcおよびInsr mRNAレベルが5週間後60%高脂肪負荷の両方のグループで減少したことを示す。
【図７Ｇ】図７Gは5週間試験の終わりに、InsRβサブユニットタンパク質は、60%高脂肪負荷マウスで減少したが、miR-1983阻害剤群では減少しなかったことを示す(n=5から6/グループ)。データは平均±標準誤差で示す。*p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001
【図８】図８はmHypoE-46細胞株の100 nM インスリン処理で変化した60個のmiRNAのマイクロアレイヒートマップを示す。
【図９】図９はビークル（溶媒） PBS(Veh)および100 nMインスリン(Ins)、4時間および24時間処理群での60個のmiRNAの変化のベン図を示す。
【図１０Ａ】図１０Aは100 nMインスリンで4時間または24時間処理したmHypoE-46細胞において、InsRのｍRNAレベルは変化しないままである(n=5)ことを示すバリデーションデータを示す。データは平均±標準誤差で示す。**** P <0.0001。
【図１０Ｂ】図１０Bはこの細胞モデルが、インスリン抵抗性の特徴であるInsRβサブユニットタンパク質レベルの減少を示す、ことを示す。データは平均±標準誤差で示す。**** P <0.0001。
【図１１Ａ】図１１は血清miR-1983レベルは雄マウスおよび雄、雌両ヒト対象における血中インスリンレベルと相関することを示す。（図１１A）
【図１１Ｂ】図１１BはChowまたは60%高脂肪食（HFD）を与えた雄、雌CD-1マウスの全体重(n=8から9/群)を示す。
【図１１Ｃ】ボディマス指数が、２５未満（n=2, ５被験者はmiR-1983が検出できないレベルであった）、２５から２９．９（n=8）および３０を超える（n=9）、の三つのボディマス指数群で分けた、ヒト被験者における血清miR-1983レベル。
【図１１Ｄ】図１１Dは様々な血中パラメータと血清miR-1983レベルの相関分析を示す（塗りつぶし円は統計的有意である、全分析の詳細は表1を参照）。
【図１１Ｅ】図１１Eはヒトにおける血清インスリン（左）およびインスリン抵抗性指数（HOMA-IR）（右）スコアの血清miR-1983レベルとの線形回帰分析を示す。他に示さない限り、データは平均±標準誤差で示す。* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001,**** P<0.0001。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
別段の定義がない限り、本開示に関連して使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈上特に示されない限り、単数項は複数を含み、複数項は単数を含む。例えば、用語「細胞」は、単一の細胞ならびに複数の細胞または細胞集団を含む。一般に、本明細書に記載される、細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、ならびにそれらの技術は、当該技術分野において周知かつ一般的に使用されるものである（Green and Sambrook, 2012を参照のこと）。
【００１７】
本明細書における終点による数値範囲の記載は、その範囲内に含まれるすべての数、分数および少数（たとえば、1から5には、1、1.5、2、2.75、3、3.90、4、および5が含まれる）を含む。また、それらのすべての数および分数・小数は、「約」という用語によって変更されるであろうことも理解されるべきである。さらに、「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことを理解されたい。「約」という用語は、参照数のプラスまたはマイナス0.1から20%、5から２0%、または10から20%、好ましくは5から15%、より好ましくは5%または10%を意味する。
【００１８】
本明細書で使用される、用語「含む、包含する、含有する」およびその派生語は、記載された特徴、要素、構成要素、グループ、整数、および/または工程の存在を明示する開放型用語であることが意図されているが、記載されていないほかの特徴、要素、構成要素、グループ、整数、および/またはステップの存在を除外しない。上記は、用語「含む」、「有する」およびそれらの派生語のような類似の意味を有する単語にも適用される。最後に、本明細書で使用される「実質的に」、「約」および「およそ」などの程度の用語は、最終結果が大幅に変更されない程度に修正された用語の妥当なずれ量を意味する。この偏差が、用語の意味を否定しない場合には、これら程度の用語は、修飾される用語の少なくとも±5%の偏差を含むものと解釈されるべきである
【００１９】
本開示の範囲を理解する上で、本明細書で使用される用語「成る」およびその派生語は、記載された特徴、要素、構成要素、グループ、整数、および/または工程の存在を明示する閉鎖型用語であることを意図し、また、記載されていない他の特徴、要素、構成要素、グループ、整数、および/またはステップの存在を除外する。
【００２０】
さらに、特定のセクションに記載された定義および態様は、当業者が理解できる程度に適切であり、本明細書に記載された他の実施形態に適用可能であることが意図されている。例えば、以下の各節では、本開示の異なる態様をより詳細に定義する。例えば、以下の各節では、本開示の異なる態様をより詳細に定義する。そのように定義された各態様は、反対のことが明確に示されない限り、任意の他の態様と組み合わせることができる。特に、好ましいまたは有利であると示された任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示された任意の他の1つまたは複数の特徴と組み合わせることができる。
【００２１】
本明細書で使用される「約」、「実質的に」、および「およそ」などの程度用語は、最終結果が大幅に変わらないように修飾された用語の妥当な量の偏差を意味する。これらの程度の用語は、この偏差が、用語の意味を否定しない場合には、これらの程度の用語は、修飾される用語の少なくとも±5%の偏差を含むものと解釈されるべきである。
【００２２】
本明細書中で使用される、用語「核酸」は、天然起源の塩基、糖および糖間(バックボーン)結合からなるヌクレオシドまたはヌクレオチドモノマーの配列を指す。この用語はまた、非天然起源のモノマーまたはその部分を含む修飾または置換された配列を含む。本開示の核酸は、デオキシリボ核酸配列(DNA)またはリボ核酸配列(RNA)であってよく、アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシルを含む天然に生じる塩基を含んでよい。配列はまた、例えばヌクレアーゼ耐性を増加させるような、修飾された塩基を含んでもよい。核酸は、二本鎖または一本鎖のいずれであってもよく、センス鎖またはアンチセンス鎖を表す。さらに、用語「核酸」は、相補的核酸配列、ならびにコドンが最適化された、または同義のコドン等価体を含む。本明細書中で使用される、用語「単離された核酸配列」とは、組換えDNA技術によって生成される場合、細胞材料または培地を実質的に含まない核酸を指し、化学的に合成される場合、化学的前駆体または他の化学物質を指す。単離された核酸はまた、その核酸が由来する核酸にもともと隣接する配列（すなわち、核酸の5’および3’末端に位置する配列）を実質的に含まない。用語「核酸」は、例えば、「アンチセンス核酸」「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「miRNA」、抗miRNAなども含むことができる。
【００２３】
本明細書で使用される、用語「オリゴヌクレオチド」とは、天然および非天然に生じる塩基、糖、および糖間（バックボーン）結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマー配列を含む短い核酸を指し、一本鎖および二本鎖分子、RNA、およびDNAを含む。典型的には、オリゴヌクレオチドは、非天然に生じるモノマーを含む50モノマー未満、より典型的には30モノマー以下である。用語「オリゴヌクレオチド」は、例えば、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」および「miRNA」を含み、同様に「ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド」、「モルホリノオリゴヌクレオチド」のようなオリゴヌクレオチド類似体を含む。
【００２４】
本明細書で使用される、用語「化学修飾されたオリゴヌクレオチド」は、少なくとも一つの非天然に生じるモノマー（例えば修飾モノマー）を含むオリゴヌクレオチドを指す。そのような化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、非修飾オリゴヌクレオチドと同様またはより良好な結合能を有することができる。この文脈において使用される場合と同様に、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、特定の修飾を欠くポリヌクレオチドの20%以内の結合特異性でその標的に結合することを意味する。化学修飾は、ロックド核酸(LNA)中に見出されるものであるか、または、リボース部分の2'位置で修飾された2'-フルオロ（2'-F）、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)または2'-O-メチル(2'-O-Me)、または六員モルホリン環が糖部分またはリン酸基中の非結合酸素原子の一つが硫黄に置換されたホスホロチオエート（PS）結合を置換したモルホリノモノマーであることができる。非天然に生じるモノマーは、一以上の化学修飾を含むことができる。例えば、ホスホロチオエート結合はまた、上記の化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドのいずれかに組み込むことができる。このような修飾または置換された核酸は、ヌクレアーゼ存在下での安定性の増大などの特性のために、天然に存在する形態よりも好ましい。この用語はまた、2つ以上の化学的に異なる領域を含むキメラ核酸を含む。例えば、キメラ核酸は、有益な特性（例えば、ヌクレアーゼ耐性の増加、細胞への取り込みの増加）を与える修飾ヌクレオチドの少なくとも一つの領域、修飾ヌクレオチドの二つもしくは領域を含むことができる。例えば、キメラ核酸は、有益な特性（例えば、ヌクレアーゼ耐性の増加、細胞への取り込みの増加）を与える修飾ヌクレオチドの少なくとも一つの領域、修飾ヌクレオチドの二つの領域を含むことができる。
【００２５】
「アンチセンス核酸」または「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、例えばmiR-1983に相補的、のように「センス」核酸に相補的なヌクレオチド配列を含む。適宜に、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合することができる。例えば、核酸は、標的DNAまたはRNAに結合するDNA、RNAまたは化学アナログ（例えば、1つ以上の修飾モノマーを含む）を含むことができる。アンチセンス核酸分子は、天然に生じるヌクレオチド、または、分子の生物学的安定性を増大させるか、または例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドのような標的（ターゲット）RNAまたはDNAで形成された二本鎖の物理的安定性を増大させるように設計された種々の修飾ヌクレオチド、を用いて化学的に合成されることができる。アンチセンス核酸は、標的鎖全体に対して、またはその一部に対してのみ相補的であることができる。当技術分野で知られているように、アンチセンス配列は、種々の方法を用いて作製することができる。アンチセンス配列は、高効率調節領域の制御下でアンチセンス配列が産生される組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態で細胞に導入された発現ベクターを用いて生物学的に産生されることができ、その活性はベクターが導入される細胞型によって決定され得る。さらに、アンチセンス配列は製造業者から購入することができる。
【００２６】
本明細書において使用される用語「抗miR-1983オリゴヌクレオチド」は、少なくとも７ヌクレオチド長さのアンチセンスヌクレオチドを意味し、配列5’−3’, CTCACCTGGAGCATGTTTTCT（配列番号１）の少なくとも２から８ヌクレオチドに相補的である。抗miR-1983は、例えば、DNA, RNA,またはLNAモノマーや他の修飾基、または任意のそれらの組み合わせで構成されることができる。
【００２７】
「コード領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指す。
【００２８】
遺伝子またはcDNAの用語「非コード領域」は、アミノ酸（すなわち、5’および3’非翻訳領域とも呼ばれる）に翻訳されないコード領域に隣接する5’および3’配列を指す。
【００２９】
用語「モルホリノモノマー」は、核酸塩基、6員モルホリン環、および非イオン性ホスホロジアミデートサブユニット間結合を含むサブユニットを意味する。モルホリノオリゴヌクレオチドは、約25モルホリノノサブユニットの短鎖である。各モルホリノは、リボ核酸（RNA）の塩基対表面の小さな（25ベースまで）領域をブロックする。
【００３０】
本明細書中で使用される、用語「細胞」は、複数の細胞を含み、細胞株を含む。
【００３１】
本明細書において使用される用語「細胞株」は、インビトロで不定期間増殖する遺伝的に均一な不死化細胞の群を指す。細胞株は一つのクローン（たとえばモノクローナル細胞株）または一つ以上のクローン（たとえばポリクローナル細胞株）に由来することができる。
【００３２】
本明細書で用いられる用語「生体サンプル」は、対象由来の液体または組織サンプルを指す。液体サンプルの例は、限定されるものではないが、血液、血漿、血清、尿、脊髄液、リンパ液、涙、唾液、痰およびミルクを含む。組織サンプルの例は、脳組織サンプルまたは神経組織サンプルを含む。組織サンプルの例は、脳組織サンプルまたは神経組織サンプルを含む。このような生物学的サンプルを得る方法は、標準的な血液回収手順を含む当技術分野で公知であるが、これに限定されるものではない。
【００３３】
本明細書で用いられる用語「方法」とは、化学的、薬理学的、生物学的、生化学的、および医学的技術の実施者によって既知の方法、手段、技術、および手順に知られているか、またはそれらから容易に開発された方法、手段、技術、および手順を含むがこれらに限定されない、与えられた仕事を達成するための方法、手段、技術、および手順を指す。
【００３４】
本明細書で用いられる用語「治療」は、インスリン抵抗性進行の遅延または反転、インスリン感受性の改善のような健康状態の臨床的又は審美的症状の実質の改善、または病態の臨床的または審美的症状の出現の実質的な抑制、のような病状の進行を廃止し、実質的に阻害し、遅延または反転させることを含む。
【００３５】
本明細書で用いる、用語「投与」とは、鼻腔内投与経路のような有効な経路により、有効量のmiR-1983阻害剤を含む組成物のような薬剤を対象に提供または与えることを意味する。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」は状態の徴候又は症状を減らす又は取り除くような、望ましい反応を生み出すのに十分な、miR-1983阻害剤のような薬剤の量を指す。いくつかの例において、「有効量」は、体の不調または病気のいずれか一以上の症状および/または根底にある原因を治療する（予防を含む）ものである。有効量は、特定の疾患または状態の一以上の徴候または症状、例えばインスリン抵抗性または前糖尿病に関連する一以上の徴候または症状、の発生を予防する量を含む、治療に有効な量であってよい。
【００３７】
本明細書で使用される、用語「相補性」は、第一の核酸と第二の核酸との間の核酸塩基対形成能を意味する。
【００３８】
本明細書で使用される、用語「インスリン感受性」とは、インスリンホルモンの正常な作用に細胞が応答する生理学的状態を指す。これは、インスリンの正常な作用に細胞が応答できない生理的状態であるインスリン抵抗性とは対照的である。従って、細胞、組織、または対象における「インスリン感受性の改善」は、参照レベル（例えば、方法および/または薬剤を使用する前のインスリン感受性）と比較した場合の、細胞、組織、または対象におけるインスリン感受性の増加を意味する。
【００３９】
本明細書で使用される、用語「ロックド核酸（LNA）」とは、２’位の酸素原子（2'-O）と４’位の炭素原子（4'-C）のメチレン架橋の導入によって、リボースがC3'-endo構造に固定される二環式RNA類似体を指す。望ましいLNAモノマーとその合成方法は米国特許番号6,043,060, 6,268,490,、PCT公開番号WO 01/07455, WO 01/00641, WO 98/39352, WO 00/56746, WO 00/56748 およびWO 00/66604および科学論文Morita et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12(1):73-76, 2002; Hakansson et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 11(7):935-938, 2001; Koshkin et al., J. Org. Chem. 66(25):8504-8512, 2001; Kvaerno et al., J. Org. Chem. 66(16):5498-5503, 2001; Halkansson et al., J. Org. Chem. 65(17):5161-5166, 2000; Kvaerno et al., J. Org. Chem. 65(17):5167-5176, 2000; Pfundheller et al., Nucleosides Nucleotides 18(9):2017-2030, 1999; and Kumar et al, Bioorg. Med. Chem. Lett. 8(16):2219-2222, 1998.に開示される。
【００４０】
用語「ミックスマー」は、天然および非天然に生じるヌクレオチドの両方を含むオリゴヌクレオチドを指す。しかしながら、5つ以上の天然に存在するヌクレオチドの連続配列は存在しない。
【００４１】
用語「A*C*A*T/U*G*C*T/U*C*C*A*G*G*T/U*G*A」(配列番号2)は前記配列のオリゴヌクレオチドである。「A*C*A*T/U*G*C*T/U*C*C*A*G*G*T/U*G*A」はmiRNA誘導サイレンシング複合体に関連するmiR-1983の相補鎖である。
【００４２】
本明細書で使われる、用語「ミスマッチ」は二重鎖領域における一以上のミスマッチヌクレオチドを指す。
【００４３】
本明細書で使用される、用語「希釈剤」は、投与される化合物の生物学的活性および特性を損なわず、対象を刺激せず、投与される活性化合物の生理学的活性および特性を阻害しない、薬学的に許容される担体を指す。希釈剤には、当業者に公知であるように、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、保存塩、保存剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、そのような材料およびそれらの組合せが含まれる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Edを参照。Mack Printing Company,1990,pp.1289-1329、参照により本明細書に組みこまれる）。いずれかの従来の担体が活性成分と不適合である場合を除き、医薬組成物におけるその使用が考えられる。細胞膜を越える核酸の輸送を可能にし、または増強する希釈剤もまた、使用することができる。
【００４４】
本明細書で使用される、用語「前糖尿病」は、血糖レベルが正常より高いが、糖尿病と診断されるほど十分に高くない状態を指す。前糖尿病は、経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）において開始2時間後での血糖レベルが140mg/dLから199mg/dLまでのレベルである。
【００４５】
本明細書で使用される、用語「鼻腔内製剤」とは、鼻腔内送達のために製剤化された薬学的組成物を指し、粉末、水溶液、水性エアロゾル、点鼻液滴、および/またはエアロゾルの形態であることができる。
【００４６】
本明細書で使用される「薬学的組成物」は、一以上の有効成分の調剤物を指し、例えば、生理的に適した担体のような一以上の化学成分とmiR-1983阻害剤などが挙げられる。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
【００４７】
本明細書で用いられる、用語「増幅」とは、標的ポリヌクレオチド、標的ポリヌクレオチドサロゲート、またはそれらの組み合わせの少なくとも一部が、典型的には、鋳型依存的に、直線的または指数関数的に核酸配列を増幅するための広範な技術を含むがこれらに限定されない方法で複製される任意の手段を指す。増幅工程を実施するための例示的な手順は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を含む。本発明の教示において使用することができる追加の技術の説明は、とりわけ、以下の他の場所に見出すことができる。Sambrook et al. Molecular Cloning, 3rd Edition; Ausbel et al.; PCR Primer: A Laboratory Manual, Diffenbach, Ed., Cold Spring Harbor Press (1995); The Electronic Protocol Book, Chang Bioscience (2002), Msuih et al., J. Clin. Micro. 34:501-07 (1996); The Nucleic Acid Protocols Handbook, R. Rapley, ed., Humana Press, Totowa, N.J. (2002); Abramson et al., Curr Opin Biotechnol. 1993 February; 4(1):41-7, U.S. Pat. No. 6,027,998; U.S. Pat. No. 6,605,451, Barany et al., PCT Publication No. WO 97/31256; Wenz et al., PCT Publication No. WO 01/92579; Day et al., Genomics, 29(1): 152-162 (1995), Ehrlich et al., Science 252:1643-50 (1991); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990); Favis et al., Nature Biotechnology 18:561-64 (2000); and Rabenau et al., Infection 28:97-102 (2000); Belgrader, Barany, and Lubin, Development of a Multiplex Ligation Detection Reaction DNA Typing Assay, Sixth International Symposium on Human Identification, 1995 (available on the world wide web at: promega.com/geneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html); LCR Kit Instruction Manual, Cat. #200520, Rev. #050002, Stratagene, 2002; Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:188-93 (1991); Bi and Sambrook, Nucl. Acids Res. 25:2924-2951 (1997); Zirvi et al., Nucl. Acid Res. 27:e40i-viii (1999); Dean et al., Proc Natl Acad Sci USA 99:5261-66 (2002); Barany and Gelfand, Gene 109:1-11 (1991); Walker et al., Nucl. Acid Res. 20:1691-96 (1992); Polstra et al., BMC Inf. Dis. 2:18-(2002); Lage et al., Genome Res. 2003 February; 13(2):294-307, and Landegren et al., Science 241:1077-80 (1988), Demidov, V., Expert Rev Mol Diagn. 2002 November; 2(6):542-8., Cook et al., J Microbiol Methods. 2003 May; 53(2):165-74, Schweitzer et al., Curr Opin Biotechnol. 2001 February; 12(1):21-7, 米国特許番号 5,830,711, 米国特許番号 6,027,889, 米国特許番号 5,686,243, P.C.T.公開番号 W00056927A3, and P.C.T. 公開番号 WO9803673A1.
【００４８】
本明細書で使われる用語「miR-1983阻害剤」はmiR-1983の細胞内発現または活性を減少する薬剤を意図する。さらに詳しくは、薬剤はmiR-1983に直接働くか、miR-1983の前駆体に非直接的に働いてmicroRNA-1983の発現を翻訳レベルで減少し、発現したmiR-1983分解を促進またはmiR-1983の活性を阻害し、それによってmiR-1983の発現レベルまたは活性を減らす。「miR-1983」阻害剤は例えば、抗miR-1983オリゴヌクレオチドおよび、例えばラベルまたは標識、安定化部分および/または輸送部分を有する抗miR-1983オリゴヌクレオチドの修飾形を含む。
【００４９】
用語「インスリン抵抗性の改善」とは、一般に、インスリン抵抗性の徴候または症状、または発症し始めた後の病的状態を改善する治療的介入を指す。「改善する」とは、一般に疾患の徴候または症状の数または重症度が減少することをいう。
【００５０】
上記の開示は、一般に、本出願を記載する。以下の具体例を参照することにより、より完全に理解することができる。これらの実施例は、単に例示の目的で記載されており、本開示の範囲を限定することを意図していない。形態の変更及び等価物の代替は、状況が手段を示唆または表現しているとして考えることができる。本明細書では特定の用語が使用されているが、そのような用語は説明的な意味で意図されており、限定の目的ではない。
【００５１】
組成と方法
複数の研究は、個々にまたは互いに共同して、代謝性疾患におけるmiRNAに関係して行われている（Feng et al., 2016; Hashimoto and Tanaka, 2016; Vienberg et al., 2016）。いくつかの研究は、視床下部組織におけるインスリン感受性の媒介にmiRNA調節が関与していることを示している。例えば、ob/obレプチン欠損マウスの視床下部におけるmiR‐200aのサイレンシングは、レプチン受容体とInsR基質2(IRS-2)の両方の発現レベルを増加させることによって、レプチンおよびインスリンシグナル伝達を改善するのに十分であった(Crepin et al., 2014)。また、miRNA生合成の必須成分の一つであるDicer（ダイサー）の視床下部ノックダウンは、miR‐103のミミック（Vinnikov et al.,2014）の脳室内（ICV）輸送により逆転された可能性のある摂食亢進性肥満を生じる。複数の研究は、中枢神経系(CNS)のmiRNAが全身エネルギーホメオスタシスの調節に重要な役割を果たしている可能性があり、視床下部が特有で特異的代謝状態のmiRNA特異的特徴を表す可能性があることを示唆している。そのような特徴は、ヒト疾患の治療における診断ツールまたは治療標的として機能し得る。インスリンシグナル伝達が代謝ホメオスタシスにとって極めて重要であり、視床下部ニューロンがこのバランスを達成する上で重要な役割を果たしているといえる。本発明者らは、確立されたインビトロ細胞を用いて、高脂肪食（HFD）を与えたマウスにおいて同時に起こるインスリン抵抗性の誘導により、神経細胞が特徴的なmiRNA発現プロファイルを示すかどうかを調べた。
【００５２】
miR-1983がインスリン抵抗性の誘導に直接関連することが見いだされ、視床下部におけるmiR-1983の上昇は、高脂肪食負荷マウスの血清中で上昇したレベルと一致し、これは中枢性インスリン抵抗性のバイオマーカーである可能性が示唆された。加えて、miR-1983は太りすぎや肥満のヒトにおいて現れることが確認され、彼らの血清miR-1983レベルは血中インスリンレベルとインスリン抵抗性の程度に相関することが確認された（インスリン抵抗性指標、HOMA-IR）。最後に、miR-1983阻害剤の鼻腔内輸送がマウスでの体全体のインスリンシグナル伝達とグルコースホメオスタシスの回復をすることが確認された。
【００５３】
視床下部レベルでのインスリン抵抗性は、グルコースホメオスタシスの調節不全に先行する可能性がある。本明細書では、インスリン受容体（InsR）蛋白質の逆調節を伴うインビトロ摂食関連視床下部細胞株において、インスリン誘導インスリン抵抗性の誘導中にマイクロRNA miR-1983が有意に変化し、これはInsRがmiR-1983の下流標的であることを示唆している。ヒト血清でのmiR-1983レベルの調査からHOMA-IRを含むインスリン抵抗性の程度と正の相関があることが明らかになった。miR-1983 LNA阻害剤の鼻腔内曝露は、高脂肪食負荷マウスのInsRタンパク質レベルを維持する一方で、インスリン感受性と空腹時血糖レベルを回復する。同時に、これらの結果はmiR-1983が糖尿病への進行を止める可能性のある早期の視床下部インスリン抵抗性へのターゲットとなりうる予測バイオマーカーとなりえることを示す。
【００５４】
第一の態様ではmiR-1983阻害剤は、CTCACCTGGAGCATGTTTTCT(配列番号１)の少なくとも一部に相補的であり、その部分はCTCACCTGGAGCATGTTTTCT （配列番号1)の２から８ヌクレオチドを含有する。一実施形態において、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは配列番号1のヌクレオチド１から２１、１から２０、１から１９、１から１８、１から１７、１から１６、1 から 15、1 から14、1から13, 1から1２、１から１１、１から１０、１から９、または１から８に相補的である。別の実施形態において、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは配列番号1のヌクレオチド２から２１、２から２０、２から１９、２から１８、２から１７、２から１６、２から15、２から14、２から13、 ２から1２、２から１１、２から１０、２から９、または２から８に相補的である。
【００５５】
一実施形態において、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは、少なくとも、TCACCTGGAGCATGT（配列番号４）である部分、またはその配列を含む部分に相補的である。他の実施形態において、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは、少なくともTCACCTGGAGCATG (配列番号５), TCACCTGGAGCAT (配列番号６), TCACCTGGAGCA (配列番号７), TCACCTGGAGC (配列番号８), TCACCTGGAG (配列番号９), TCACCTGGA (配列番号１０), TCACCTGG (配列番号１１), または TCACCTG (配列番号１２)である部分、またはこれら配列を含む部分に相補的である。他の実施形態において、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは、少なくともCTCACCTGGAGCATGT (配列番号13), CTCACCTGGAGCATG (配列番号14), CTCACCTGGAGCAT (配列番号15), CTCACCTGGAGCA (配列番号16), CTCACCTGGAGC (配列番号17), CTCACCTGGAG (配列番号18), CTCACCTGGA (配列番号19), CTCACCTGG (配列番号20), または CTCACCTG (配列番号21) である部分またはそれら配列を含む部分に相補的である。
【００５６】
一実施形態において、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは、配列番号２の9 から15, 8から15, 7から15, 6 から15, 5 から15, 4から15, 3 から15, 2 から15, または 1 から15ヌクレオチドである、またはそれらを含むヌクレオチドである。抗miR-1983オリゴヌクレオチドは、例えば、約２１ヌクレオチドまたは21ヌクレオチドまで、約２５ヌクレオチドまたは2５ヌクレオチドまで、約３０ヌクレオチドまたは３０ヌクレオチドまで、約３５ヌクレオチドまたは３５ヌクレオチドまで、約４０ヌクレオチドまたは４０ヌクレオチドまで、約４５ヌクレオチドまたは４５ヌクレオチドまで、約５０ヌクレオチドまたは５０ヌクレオチドまで、の長さ、または、例えばDNAおよび/またはRNA配列の安定化配列を含む、例えば１３２ヌクレオチドまでの長さであることができる。
【００５７】
別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは、RNAモノマーを含む。一実施形態において、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは、DNAモノマー、RNAモノマー、LNAモノマーまたはその組み合わせを含む。例えば、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは、DNAモノマーのみ、RNAモノマーのみ、DNA およびLNAモノマー、RNAおよびLNAモノマー、またはLNAモノマー単独を含む。
【００５８】
別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは、化学的に修飾されている。例えば、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼの存在において安定性を増強する一以上の化学修飾を含む。別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは、非化学的に修飾されたヌクレオチドと化学的に修飾されたヌクレオチドの両方を本願するキメラ核酸である。別の実施形態では、ヌクレアーゼ耐性はまた、硫黄原子がリン酸基の非架橋酸素原子の1つを置換するホスホロチオエート結合への親ホスホジエステル結合のバックボーン修飾によって改善し、または6員環モルホリンが糖部分を置換するモルホリノオリゴマーを使用することによって改善される。モルホリノは、例えば、荷電されておらず、本質的にヌクレアーゼによる分解に抵抗性である。
【００５９】
別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは２’位での化学修飾を含む。例えば、米国特許20130116419に記載されているような「クリックケミストリー」を含むが、これに限定されない化学修飾方法を用いて、2’位置での化学修飾を合成することができる。化学的に修飾された核酸は、異なる製造業者から購入することができる。化学的に修飾された核酸は、異なる製造業者から購入することができる。別の実施形態では、化学修飾は、2’ Oメチル（2’ O-Me）、2’ -O-メトキシエチル（２’ O-MOE）、2’フルオロ(2’F)、ロックド核酸モノマー(LNAM)、アルキン官能基、またはリガンドを標的化するために有用な他の官能基であることができる。
【００６０】
別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは２’ O-メチル(2’ O-Me)、２’ O-メトキシエチル(2’ O-MOE)、２’フルオロ(2’ F)およびロックド核酸モノマー(LNAM)から選ばれる化学修飾を含む。別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは一以上の2’ O-Me化学修飾を含む。別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは一以上の2’ O-MOE化学修飾を含む。別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは一以上の2’ F化学修飾を含む。別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは一以上のLNAM化学修飾を含む。別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは2’ O-Me、 2’ O-MOE、および 2’F化学修飾の組み合わせを含む。別の実施形態では、化学的に修飾されたオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知の方法を用いて合成される。別の実施形態において、修飾オリゴヌクレオチドは製造業者から購入される。
【００６１】
別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは複数のヌクレオチドモノマーの化学修飾を含む。一実施形態では、抗miR-1983は2’O-Me、 2’ O-MOE,、2’Fの一つまたはそれらの組み合わせの複数の化学修飾を含む。別の実施形態では、抗miR-1983は複数のLNAMのみを含む。別の実施形態では、化学修飾オリゴヌクレオチドは製造業者から購入される。
【００６２】
別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは複数のロックド核酸モノマー(LNAM)を含む。一実施形態において、オリゴヌクレオチドは、連続しているか、または1つ以上の非LNAヌクレオチドによって分離されている一以上のLNAヌクレオチドを含む。
【００６３】
別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドはロックド核酸(LNA)またはLNA/DNAミックスマーである。1つの実施形態において、ミックスマーは、5を超える隣接するDNAモノマーを含有しない。別の実施形態では、オリゴマーはLNAとRNAモノマーを含有する。別の実施形態では、5以上の連続したモノマーは存在しない。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、リボース糖部分が「ロックされた」固定型である2’ -O、4’ -C-メチレンリボヌクレオシド（構造A）を含有するロックドヌクレオチドまたはLNAを含有する。別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは少なくとも一つの2’, 4’ - C架橋2 ’デオキシリボヌクレオシド（CDNA、構造Ｂ）を含む。例えば、米国特許6,403,566 および Wang et al. (1999) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 9: 1147-1150  が参照され、これらは両方とも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６４】
別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは、ロックド核酸（LNA）またはLNA/DNAミックスマーであり、LNAは5’-3’, A*C*A*T/U*G*C*T/U*C*C*A*G*G*T/U*G*A (配列番号２),またはその一部を含有し、その部分は少なくとも7ヌクレオチド長で配列番号２の９から１５の位置のヌクレオチドを含有する。例えば抗miR-1983オリゴヌクレオチドがLNAであるとき、ヌクレオチド内架橋（アスタリスクで示される）はホスホロチオエートヌクレオチド内架橋である。
【００６５】
ロックド核酸（LNA（登録商標））は、リボース環がワトソン-クリック結合にとって理想的な型で「ロック（架橋、固定）」された高親和性RNA類似体のクラスである。LNA（登録商標）オリゴヌクレオチドは、相補的DNAまたはRNA鎖にハイブリダイズしたときに高い熱安定性を示す。加えて、LNA（登録商標）オリゴヌクレオチドは、高い熱融解温度（Tm）を保持したまま、従来のDNAまたはRNAオリゴヌクレオチドより短く作成されることができる。LNA（登録商標）オリゴヌクレオチドは、LNA（登録商標）とDNAまたはRNAの混合物からなることができる。オリゴヌクレオチドへのLNA（登録商標）の組み込みは、PCR、マイクロアレイおよびin situハイブリダイゼーションを含む多くのハイブリダイゼーションベースの技術に対する感度および特異性を改善することが示されている。
【００６６】
別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドはDNAおよびLNAモノマーのみを含有する。
【００６７】
アスタリスクは、LNAのバックボーンを形成するヌクレオチド間結合、場合によりホスホジエステル、または好ましくはホスホロチオエート、ヌクレオチド間結合を示す。
【００６８】
別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは配列5’-3’, A*C*A*T*G*C*T*C*C*A*G*G*T*G*A (配列番号2)、または少なくとも９から１５ヌクレオチドを含有するその配列の一部分、を含有する。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドはRNAおよびLNAモノマーのみを含む。
【００６９】
別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは配列5’-3’, A*C*A*U*G*C*U*C*C*A*G*G*U*G*A (配列番号2)または少なくとも９から１５ヌクレオチドを含有するその配列の一部分を含有する。別の態様では、オリゴヌクレオチドは１、２、３または４変異ＤＮＡまたはＲＮＡモノマーA*C*A*T/U*G*C*T/U*C*C*A*G*G*T/U*G*A (配列番号 2)または少なくとも９から１５ヌクレオチドを含有するその配列の一部分を含む。
【００７０】
別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは少なくとも一つのミスマッチおよび四つまでのミスマッチを含有することができる。前記ミスマッチはmiRNA配列に関連し、例えば、7モノマーを抗miRオリゴヌクレオチドの中央に含有することができる。前記ミスマッチは位置3、4、5、6のいずれかでできる。
【００７１】
別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは二本鎖である。例えば、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは二本鎖分子として合成・構成され、のちに変性されることができる。別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは一重鎖として合成される。
【００７２】
別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは一重鎖である。
【００７３】
別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは同一、または、60%, 70%, 80%または90%まで配列番号2の核酸配列と同一の配列を有する。所定の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは配列番号2から1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 または 10ヌクレオチドの違いを有する。さらなる実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドはmiR-1983と同じ長さ、またはmiR-1983より短い長さを有する。所定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号1の5’末端で7または8ヌクレオチドに相補的である。別の実施形態では、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは、長さが約または上限7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50のヌクレオチドまたは132ヌクレオチドまでの任意の数のヌクレオチド、または、その範囲で派生できる任意の範囲のヌクレオチドである。別の実施形態において、抗miR-1983オリゴヌクレオチドは、長さが7から10、10から20、20から50、50から75、75から100、または100から132ヌクレオチドであるか、またはその中で派生可能な任意の範囲のヌクレオチドである。
【００７４】
別の実施形態では、抗miR-1983阻害剤は、抗miR-1983オリゴヌクレオチドに結合する、例えば、FITC、TRITC、Texas Red、Alexa（バイオプローブ）などの励起可能でUV/VISまたは赤外波長で発光する蛍光色素のようなマーカー分子または標識分子を含有する。
【００７５】
一実施形態では、抗miR-1983阻害剤は、細胞膜と血液脳関門を越えることを容易にする、抗miR-1983オリゴヌクレオチドの一端または両端に、輸送部分を含む。例えば、細胞内送達を容易にするように、タンパク質形質導入ドメインとも呼ばれる短いシグナルペプチド、および、コレステロールドメイン、ラウリン酸、およびC32官能性を有するリトコール酸誘導体などの親油性基は、オリゴヌクレオチドに結合される。DOTAP（または他のカチオン性脂質）、DDAB、DHDEABおよびDOPEのような脂質、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミンおよびこれらのデンドリマーのような非脂質ベースのポリマー、および他のポリマーを含む核酸と複合体を形成し、細胞内送達を改善する他の物質も生成される。組み合わせも使用できる。例えば、所定の実施形態では、DOTAPおよびコレステロールまたはコレステロール誘導体などの脂質の組み合わせが使用される(米国特許第6,770,291, ここに参照として組み込まれる)。
【００７６】
別の実施形態では、miR-1983阻害剤は阻害剤の安定性を高めるため安定化部分を含有する。
【００７７】
さらなる態様はmiR-1983阻害剤および適宜希釈剤を含有する。希釈剤は、当業者に公知であるように、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤(抗菌剤、抗真菌剤等)、等張剤、塩、保存剤、結合剤、潤滑剤、例えば材料およびそれらの組合せでることができ、核酸とともに用いることができる（例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329  を参照、ここに参照として組み込まれる）。いずれかの従来の担体が活性成分と不適合である場合を除き、医薬組成物におけるその使用が考えられる。
【００７８】
別の実施形態では、組成物希釈剤は生理食塩水を含む。
【００７９】
一実施形態では、組成物は鼻腔内製剤として処方される。一実施形態では、鼻腔内製剤は、粉末、水溶液、点鼻薬、および/またはエアロゾルの形態であることができる。
【００８０】
別の実施形態では、鼻腔内投与用の固体製剤は、ラクトース、デンプンまたはデキストランのような賦形剤を含有することができる。例えば、吸入器装置または吸入器で使用するためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、抗miR-1983オリゴヌクレオチドまたは組成物の粉末混合物およびラクトース、デンプンまたはデキストランなどの適切な粉末賦形剤を含有して製剤化することができる。別の実施形態では、鼻腔内投与用の液体製剤は、エアロゾル、点鼻薬および/または定量噴霧の形態で使用するための水性または油性溶液であることができる。
【００８１】
エアゾール製剤は、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、プロパン、窒素または他の適当なガスのような加圧可能な噴射剤中に入れることができる。製剤は、例えば、適切な噴射剤を使用して、加圧パック、ネブライザーまたは他の吸入装置からエアゾールスプレーの形態で送達することができる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、吸入を介した鼻腔内投与のための製剤は、リポソーム製剤を含むが、これに限定されない。
【００８３】
いくつかの実施形態では、鼻腔内送達のための薬学的組成物は、吸入デバイスを用いて投与される。用語「吸入デバイス」は対象の鼻腔経路へのmiR-1983阻害剤投与を可能にする任意のデバイスを意味する。吸入装置には、定量噴霧吸入器（MDI）、ドライパウダー吸入器（DPI）、ジェットネブライザーおよび超音波ネブライザーを含むネブライザー、熱気化器、ソフトミスト吸入器、温熱エアロゾル吸入器、および電気流体力学ベースの溶液噴霧吸入器などの装置が含まれる。吸入装置には高効率ネブライザーも含まれている。いくつかの実施形態において、ネブライザーは、ジェットネブライザー、超音波ネブライザー、脈動膜ネブライザー、複数の開口を有する振動メッシュまたはプレートを含むネブライザー、振動発生器および水性チャンバを含むネブライザー、または対象の鼻腔へのエアロゾル化水溶液の吸気流を補助するという特徴のある制御装置を使用するネブライザーである。ネブライザー、定量噴霧式吸入器、およびソフトミスト吸入器は、吸入しやすい大きさの液滴を含むエアロゾルを形成することによって薬剤を送達する。
【００８４】
加圧されたエアロゾルの場合、計量された量を送達するバルブを提供することによって投与単位を決定することができる。例えば、吸入装置は、定量噴霧器が取り付けられた小さな硬質ボトルであってもよい。
【００８５】
miR-1983阻害剤は、例えば直接注入（任意でカニュレーションを選択してもよい）または脳室内(ICV)投与によって、脳に直接投与してもよい。
【００８６】
他の送達方法を使用することができ、例えば、miR-1983阻害剤は輸送モイエティを含有する。例えば、投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮下、経口および経粘膜を含む。
【００８７】
別の態様は細胞がインスリン抵抗性かどうか検出する方法であり、miR-1983のレベルを測定すること、基準値またはコントロールと比較することを含有し、ここでコントロールと比較し増加したレベルは細胞がインスリン抵抗性であることを示す。一実施形態では、コントロールは、正常なインスリン感受性を有するマウス細胞である。別の実施形態では、コントロールは、正常なインスリン感受性を有するヒト細胞である。
【００８８】
別の実施形態では、細胞は神経細胞であり、適宜視床下部細胞である。別の実施形態では、細胞は視床下部細胞である。別の実施形態では、細胞はニューロペプチドYを発現する視床下部細胞である。
【００８９】
別の態様は、対象において前糖尿病または糖尿病を発症の可能性の増大を検出する方法であり、その方法は対象からの生体サンプルでのmiR-1983のレベルを測定することを含み、ここで、基準値またはコントロールと比較して増加したレベルは、対象が糖尿病を発症している可能性が高いことを示す。一実施形態では、コントロールは、正常なインスリン感受性を有するマウス細胞である。別の実施形態では、コントロールは、正常なインスリン感受性を有するヒト細胞である。
【００９０】
細胞またはサンプル中のmiRNAのレベルは、PCRを基にした方法を用いて、または一以上のハイブリダイゼーションプローブを用いて検出することができる。一実施形態では、miR-1983レベルの測定にはマイクロアレイ解析を使用することが含まれる。別の実施形態では、定量PCR分析はmiR-1983のレベルを測定するために使われる。さらに別の実施形態では、miRNAのレベルは、miRNAを単離し、前記miRNAをハイブリダイゼーションプローブ、例えば本明細書に記載のアンチセンス分子とハイブリダイズさせることによって検出される。
【００９１】
別の実施形態ではmiR-1983のレベルの測定は以下を含む。
(a) 隣接するA残基の配列を有するポリアデニル化miRNAを形成するようにmiRNAをATPおよびポリ（A)ポリメラーゼでポリアデニル化、  (b) 以下を含む反応混合物中でcDNAを形成するためのポリアデニル化miRNAの逆転写。(i) miRNAの少なくとも二つの3’末端ヌクレオチドとポリアデニル化miRNAの隣接するA残基の配列と相補性を有し、それとともにハイブリダイズし、ポリアデニル化miRNAに相補的なcDNAの合成を開始する、長さが40ヌクレオチド以下のファーストプライマー、(ii)逆転写酵素、(iii) 4種すべてのデオキシリボヌクレオシド三リン酸。  (c) 以下を含む反応混合物中でのcDNAを含むDNA分子の増幅。(i)cDNA、(ii)ファーストプライマー、(iii)cDNAの3’ヌクレオチドに十分に相補的で、それとハイブリダイズし、伸長産物の合成を開始するセカンドプライマー、(iv) DNAポリメラーゼ、(v)4種すべてのデオキシリボヌクレオシド三リン酸、および  (d) 増幅されたDNAの存在および/または量がmiRNAの存在および/または量に対応する、増幅されたDNA分子の検出および/または定量。
さらなる実施形態では、miRNAレベルの測定中に使用されるプライマーは、Balcells et al., 2018に記載された方法を使用して設計される。別の実施形態では、増幅されたcDNA分子の検出および/または定量は、リアルタイムRT-PCRを利用することを含む。さらなる実施形態では、増幅されたcDNAの検出および/または定量は、ゲル電気泳動を利用することを含む。
【００９２】
miRNAの血清レベルが検出されている。一実施形態では、生物学的サンプルは、血液、血漿または血清、尿または組織のうちの一つである。
【００９３】
一実施形態では、生物学的サンプルは、少なくとも8時間絶食した対象から採取される。別の実施形態では、方法は、インスリンおよび/またはグルコースレベルを測定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、コレステロールおよび/またはLDLなどの脂質も測定される。いくつかの実施形態では、方法はmiR-1983のノーマライズしたレベルを測定することを含み、適宜snoRNA202のような内部コントロールのレベルでノーマライズする。
【００９４】
一実施形態では、対象はBMIが少なくとも25である対象であり、一実施形態では、対象は例えばインスリンまたはインスリン増感剤を服用していない前糖尿病患者である。
【００９５】
実施例に示したように、miR-1983の検出または予め決定された標準または以前のレベルに対して増加したmiR-1983のレベルは、インスリン抵抗性の発症を予測する。それは初期のマーカーであり、インスリン抵抗性の発現に先行する。それはインスリン抵抗性に向かうかもしれない対象を特定する機会を提供し、また早期介入を提供する。
【００９６】
一実施形態では、生物学的サンプルは血清サンプルである。別の実施形態では、血清サンプルは、標準ヒト血液回収手順を用いて回収される。
【００９７】
別の実施形態では、miR-1983のレベルは定量PCRアッセイによって測定される。別の実施形態では、PCR法以外の他の増幅過程は、米国特許第 5,830,711, 米国特許第 6,027,889, 米国特許第5,686,243, P.C.T.出願第W00056927A3, および P.C.T.公開第WO9803673A1 などに記載の方法を用いる。
【００９８】
別の実施形態では、定量PCR法は、細胞または生物学的試料から得られたRNAからcDNAを生成すること、特定のプライマー配列を用いてcDNAを増幅すること、miR-1983のレベルを定量することを含む。
【００９９】
miR-1983のレベルが増加した対象についてはさらなる変化について監視し、食事療法または前糖尿病または糖尿病に適切な治療によって処置される。miR-1983のレベルが増加した対象については、例えば本発明で述べられた抗miR阻害剤で処置されることができる。
【０１００】
よって、別の態様は、対象のインスリン感受性を改善する方法である。前記方法はmiR-1983阻害剤または前記阻害剤を含有する組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。一実施形態において、それを必要とする対象は、インスリン抵抗性または前糖尿病を有する動物である。別の実施形態では、それを必要とする対象は、インスリン抵抗性または前糖尿病を有するヒトである。さらに別の実施形態では、それを必要とする対象は糖尿病と診断されている。本発明で述べられるいずれのmiR-1983阻害剤もそれらの組み合わせを含めて投与することができる。
【０１０１】
一実施形態では、対象が一以上のインスリン抵抗性の徴候を示したとき、例えば、他の抗糖尿病薬が通常処方されるであろう前に、対象はmiR-1983阻害剤または前記阻害剤を含む組成物を投与される。
【０１０２】
miR1983のレベルは、レベルが上昇したことを確認するためにmiR-1983を投与する前に測定されることができる。よって、一態様では、miR-1983のレベルが上昇している対象は、miR-1983阻害剤を投与される。
【０１０３】
一実施形態では、インスリン感受性を改善することは、薬剤の投与前のベースラインレベルと比較して、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%以上増加するインスリン感受性のレベルが改善することを意味し、例えば、腹腔内インスリン負荷試験（IpITT）によって測定され、適宜ここで、インスリン抵抗性なしと診断された対象と同じくらいまで感受性が上昇する。
【０１０４】
別の実施形態では、miR-1983阻害剤又は前記阻害剤を含有する組成物は、神経細胞に接触することができる、及び/または神経細胞を標的とすることができる方法で投与される。別の実施形態では、miR-1983阻害剤又は前記阻害剤を含有する組成物は視床下部神経細胞に接触することができる、及び/または神経細胞を標的とすることができる方法で投与される。例えば、いくつかの実施形態では、miR-1983阻害剤または前記阻害剤を含む組成物は鼻腔内投与される。
【０１０５】
別の実施形態では、投与される抗miR-1983オリゴヌクレオチドは、任意で希釈剤を含む一以上の成分を含む組成物に含まれる。別の実施形態では、希釈剤は生理食塩水または本願発明で述べる他の希釈剤である。
【０１０６】
別の実施形態では、前記miR-1983阻害剤または前記阻害剤を含む組成物は、貼付剤または静脈内注入により鼻腔内投与される。
【０１０７】
前記miR-1983阻害剤は他の治療剤とともに投与できる。特にmiR-1983阻害剤は鼻腔内に投与できる他の治療剤とともに投与することができる。一実施形態において、別の治療剤はレプチンである。
【０１０８】
本明細書では、それを必要とする対象を治療するためのmiR-1983阻害剤と組成物の使用を提供する。
【０１０９】
また、本明細書で述べられたmiR-1983阻害剤を含む鼻腔輸送器具を提供する。一実施形態では、前記器具は鼻腔スプレーポンプまたは加圧送達装置である。
【０１１０】
上記開示は、本出願を一般的に記載する。以下の具体例を参照することにより、より完全な理解が得られる。これらの実施例は、単に例示の目的で記載されており、本開示の範囲を限定することを意図していない。形態の変更及び等価物の代替は、状況が手段を示唆または表現しているとして考えることができる。本明細書では特定の用語が使用されているが、そのような用語は説明的な意味で意図されており、限定の目的ではない。
【実施例】
【０１１１】
以下の非限定的な実施例は、本開示の例示である。
【実施例１】
【０１１２】
視床下部NPY発現神経細胞でのインスリン抵抗性の誘導は、miR-1983およびmiR-20a-3pレベルを変化する。
【０１１３】
NPYとAgRPを発現し分泌するmHypoE‐46細胞株は、そのインスリンへの反応についてよく特徴づけられており、インスリン抵抗性が細胞レベルで発生する機構が確認されている（Mayer and Belsham,2010,a）。特に興味深いことに、インスリン抵抗性の発生時のInsR（インスリン受容体）またはInsR基質1（インスリン受容体基質１、IRS-1）タンパク質の消失には、mRNA転写産物レベルでの変化は関与しなかった。このような発見により別の制御の層が存在することが示唆された。これはmiRNAを介すると仮定された。miRNAはmRNAのp-bodyを隔離してタンパク質の翻訳を妨げることができる小さなRNA分子である(Bhattacharyya et al., 2006; Liu et al., 2005)。この仮定について調べるため、インスリンにより誘導されたインスリン抵抗性の状態によってmiRNAが変化するかどうか広範に決定するため、mHypoE-46細胞をビークル(溶媒)または100 nMインスリンで4時間及び24時間処理し、それらのトータルRNAをマイクロアレイ解析に送った。これらのタイムポイントは正常なシグナル伝達条件下でインスリンに反応するmiRNA（4時間後）とインスリン抵抗性が確立したmiRNA（24時間後）とを区別するために選択された。マイクロアレイデータは、すべてのグループにわたって、６０個のmiRNAが著しく変化したことを明らかにした(図8)。そこで、4時間インスリン処置したグループと24時間インスリン処置したグループの間でのみ変化したこれらのmiRNAを決定するためにデータを選別した。１２個のmiRNAはビークルと比較して24時間のタイムポイントで著しく異なることがわかり、これらを倍数変化の大きさによって順位付けした。２４時間タイムポイントで増加した上位４つのmiRNAはqPCRによるバリデーション用に選ばれた。マイクロアレイ解析により特定されたインスリン抵抗性の特徴を確認するために、mHypoE-46細胞をビークルまたは100 nMインスリンで4時間と24時間処理し、qPCRとウエスタンブロッティングをInsR mRNAとタンパク質の定量のために行った(図10)。miRNAのqPCRバリデーションは、miR-1983（図１A）およびmiR-20a-3p（図１B）のみ100 nMインスリン処理によって、24時間でアップレギュレーションが持続しており、miR-296-5p (図1C) または Let-7d-5p (図1D)ではしていないことを明らかにした。これらの発見をもとに、miR-1983 and miR-20a-3pをさらなる実験的解析に選んだ。この実施例の方法は実施例１０で見つけることができる。
【実施例２】
【０１１４】
miR-1983は、インスリン抵抗性の間、POMC発現細胞株に比して、NPY発現細胞株において異なった調節を受けるが、インスリン抵抗性を誘導したNPY神経細胞でmiR-1983レベルは恒久的に上昇しない。
【０１１５】
miR-1983 およびmiR-20a-3pでの変化がmHypoE-46（雄）細胞株に特有であるかどうか決定するため、成体由来でクローン化していないmHypoA-NPY/GFP（雌）とmHypoA-POMC/GFP-2（雄）細胞株を、インスリン抵抗性を誘導するのに十分な、100 nMインスリンまたはビークル（溶媒）で16時間処理した(Wellhauser et al., 2016)（図２Aと図２Bそれぞれ）。miR-1983のレベルはmHypoA-NPY/GFP細胞株において増加することが見いだされ、長期のインスリン処理への反応におけるmiR-1983レベルの上昇は、起源（胚対成体）や性別（雄対雌）に関係なくNPY細胞の間で保存されていることを示唆している。
【０１１６】
miRNAがARC（弓状核）の神経細胞集団間でも異なって発現する可能性があるという発見に照らして(Herzer et al., 2012)、mHypoA-POMC/GFP-2細胞株もまたインスリン曝露によってmiR-1983に同様の変化を現すかどうかについて試験を行った。NPY/AgRP細胞モデルとは異なり、16時間100 nMインスリン曝露はmiR-1983レベルの減少を引き起こした。したがって、与えられたパラダイム下でNPY/AgRP および POMCモデルの両方がインスリン抵抗性になるにもかかわらず、特定のmiRNAはこれらの神経細胞集団間で異なるようだ。これら二つの神経細胞株における相反するインスリンの効果についてみられたことは、一般に、これら二つの細胞集団においてみられインスリンへの反応での異なるシグナル伝達に特有であり(Belgardt et al., 2009)、miR-1983へのインスリン抵抗性の効果はNPY発現神経細胞に特有であるという可能性を示す。mHypoA-NPY/GFP または mHypoA-POMC/GFP-2細胞のいずれかにおいてmiR-20a-3pの変化はなかったことは、この特定のmiRNAへのインスリンの効果はmHypoE-46細胞株を越えて保存されていないであろうことを示す。
【０１１７】
いったんmiR-1983をmHypoE-46 モデルにおけるインスリン抵抗性のマーカーとして定義し、次に、インスリン抵抗性の発症がmiR-1983レベルの一過性の変化または恒久的な変化のどちらを誘導するかについて調べた。qPCRとウエスタンブロッティングのデータは、48時間100 nMインスリン処理後、miR-1983のレベルは正常にレベルに戻るのにも関わらず、InsR βサブユニットのレベルは低いままであることを明らかにした。したがって、miR-1983のこの細胞モデルでの変化は実際一過性であり、インスリン曝露への反応において特定のタイムフレームで起こり、miR-1983は、インスリン感受性能をもはや維持しない神経細胞における最終段階の確固たるマーカーではなく、インスリン抵抗性の進行や発展への貢献者のようであることを示している。本実施例で使われた方法は実施例１０に見られる。
【実施例３】
【０１１８】
miR-1983はインビトロでInsRタンパク質を標的とする。
【０１１９】
インスリンによるmiR-1983制御のタイムラインが決まったので、最終的なmRNA標的の解明とこれらの標的がmHypoE‐46モデルにおける耐性の発展にどのように寄与するかの同定を行った。インシリコバイオインフォマティクス解析は、InsR の3’非翻訳領域（UTR）がmiR-1983の可能標的であり、ｍRNAのこのシード配列（seed 配列、seed sequence）もまたヒトを含む種間で保存されている(図3A, 3B)ことを明らかにした。注目すべきは、miR-1983自体はヒトにおいて保存されていることがオンラインデータベースリソースでまだ認識されていないが、このmiRNAレベルは、乾癬のヒト皮膚に存在し、正常皮膚より上昇していることが発見された（Edinger et al., 2014）。より最近、イソロイシンpre-トランスファーRNA(pre-tRNA)から特有に派生するmiR-1983によって、ヒト細胞で完全に機能するmiRNAになる工程について述べられている(Hasler et al., 2016)。
【０１２０】
miR-1983がInsRの3’非翻訳領域の述べられた領域に結合できるかどうか調べるため、この領域を含むpmirGLOベクターのトランジエントトランスフェクションをmiR-1983ミミック（模倣体）またはネガティブコントロール存在下で行った。ルシフェラーゼアッセイの結果は、miR-1983ミミックは生成する発光量を48時間後約１５％まで減少することを明らかにした。
【０１２１】
mHypoE-46神経細胞でのmiR-1983のミミックのトランスフェクションでは、24時間後、miR-1983レベルが上昇した。確認されたmiR-1983の上昇は、24時間後でのインスリン感受性またはInsR mRNAレベルに影響を与えなかった(Figure 3C)。それにもかかわらず、miR-1983レベル単独の増加は、InsRのタンパク質レベルを24時間後２０％まで(Figure 3D)、48時間後３５％まで(Figure 3E)減少させるのに十分であり、一方、24時間または48時間後のInsR mRNAレベルはタイムポイントにかかわらず変化しないまま(Figure 3D, and E)であることが分かった。これらは、miR-1983がインスリン抵抗性が発展する過程に貢献している可能性があることを示唆している。まとめると、以前の結果を組み合わせたデータは、miR-1983は高レベルのインスリンへの曝露によっておこる神経細胞での早期のインスリン抵抗性のためのマーカーであることを指し示している。最後に、miR-1983が、インスリン抵抗性がすでに発症しているインビボの視床下部において制御されるかどうかについての疑問について取り扱う。つまり、マウスでインスリン抵抗性を誘導することができる高脂肪食摂取の、視床下部でのmiR-1983レベルへの効果について、調べる。この例で使用される方法は、実施例10に見られる。
【実施例４】
【０１２２】
雄C57BL/6マウスは、7から9週間の60％高脂肪食負荷後、視床下部miR-1983の増加を示す。
【０１２３】
雌雄両方のC57BL/6マウスを60% 高脂肪食負荷に7から9週間置いたところ、雌雄とも体重が有意に増加し、血糖値が上昇した（図4Aおよび4B）。これらの末梢性変化は雄雌両方においてNpyおよびAgrp両方のmRNAレベルの減少を伴い、雌マウスでのPomcの増加を伴った（図４Cと４D）。雄C57BL/6マウスは7週間で、インスリン抵抗性を示す血中インスリンレベルの増加およびそれらの視床下部でのmiR-1983の増加を示した。つまりC57BL/6マウス株において、インスリンの高血中レベルが伴うときのみ６０％高脂肪食への曝露が視床下部miR-1983 レベルの増加を生じさせるようだ。7週間で雌マウスはインスリンの増加をまだ示さなかったので、miR-1983の変化は検出されなかった。いずれの性においてもInsRのmRNAレベルに変化は見られなかった（図4Cおよび4D）。インビボ雄マウスでmiR-1983の変化が見られたことから、次のゴールは、これがマウスの一株特有のものであるのかどうか、この発現に関するタイムラインは保存されているかどうかを決定することである。この例で使用される方法は、実施例10に見られる。
【実施例５】
【０１２４】
６０％高脂肪食食餌雄CD-1マウスの視床下部で見られるmiR-1983の上昇は、高脂肪食曝露の長さに依存する。
【０１２５】
雄CD‐1マウスは、C57BL/6系統と比較してより短い時間枠である５から６週間の６０％高脂肪食負荷で末梢インスリン抵抗性を発症することが知られている(Liu et al., 2016)ので、このタイムポイントで空腹時血糖を測定した。雄CD‐1マウスは、C57BL/6系統と比較してより短い時間枠である５から６週間の６０％高脂肪食負荷で末梢インスリン抵抗性を発症することが知られている(Liu et al., 2016)ので、このタイムポイントで空腹時血糖を測定した。5週間の高脂肪食負荷は、視床下部Npy、AgRP、PomcまたはInsR mRNAの変化を生じることなく（図5D）、視床下部で空腹時血糖（図５A）、血中インスリン（図５B）およびmiR-1983（図５C）レベルを増加した。高脂肪食負荷の時間が10週まで伸びた時、検出される視床下部でのmiR-1983レベルは実験グループ間でもはや違いはなかった。しかしながら、Chowと比較して高脂肪食を与えたマウスでは、10週後、NpyとAgRPのmRNA量は低下し、Pomcは増加した（図５F）。ここでも、Insr mRNAのレベルに変化は見られなかった（図５F）。これらのデータは、雄CD-1マウスのmiR-1983の増加は神経ペプチドレベルの変化の前に起こることを示した。雄CD-1マウスでのmiR-1983制御のタイミングが決まったので、餌を与える期間が5週間以内での雌マウスの反応を調べた。この例で使用される方法は、実施例10に見られる。
【実施例６】
【０１２６】
CD-1雄マウスは、5週間６０％高脂肪食負荷5週間後、視床下部と血清でmiR-1983の上昇を示すが、腎臓では減少を示す。
【０１２７】
5週間にわたるChowまたは60%高脂肪食負荷で雄（図6A）と雌（図6B）CD‐1マウスの両方が有意な体重増加（図11A)を示し、両性の総体重増加は60% 高脂肪食群で約二倍大きかった（図6AおよびC）。空腹時血中グルコースは雌において上昇するが、雄マウスでは上昇せず（図６D）、雄マウスは空腹時血中インスリンレベルおよびmiR-1983の増加を示した（それぞれ図６Eおよび図６F）。神経ペプチドmRNAレベルを調べたところ、雄と雌でNpyの低下が見られ、を明らかにし(図6G)、雌でのみInsR mRNAが7%増加した（図6Gと6H）。雌雄両方で、視床下部におけるmiR-1983の増加が、高脂肪食とは独立して、高インスリン血症によって引き起こされるかどうか決定するため、雌雄両方のMKRマウスから視床下部を集めた。これらのマウスは、高脂肪食曝露なしのCD-1マウスと比したとき、比較できる血中インスリンのレベルと関連して視床下部のmiR-1983の上昇を示した(Figure 6E and F)。
【０１２８】
雄マウスでの視床下部のレベルで変化が認められたので、筋肉や肝臓といった他の代謝関連組織におけるmiR-1983もまた変化するかどうかについて調べた。また、アルドステロンにより制御されるマウスの組織でmiR-1983は以前に見いだされたので(Edinger et al., 2014)、腎臓でのレベルについても分析した。ヒラメ筋でのmiR-1983に変化はなく、腎臓では減少し（図６I）、肝臓ではこのmiRNAは検出されなかった。
【０１２９】
miRNAはマウスおよびヒトの血漿および血清中で検出可能であり、代謝性疾患を推定するバイオマーカーとなり得る。以前、高脂肪食摂取マウスの血中でmiR-1983は検出されたので、雄CD-1マウスでの血清レベルを評価した。miR-1983のレベルは高脂肪食摂取マウス血清で3倍近く増加し（図６I）、血清インスリンレベルとmiR-1983の間で著しい相関関係がみられた（ｐ＝０．０３、図１１ｂ）。
【０１３０】
miRNAは、体内のさまざまな組織に存在するだけでなく、マウスとヒトの両方の血漿および血清中にも発見されており、エキソソームに封入されているか、Argonaute 2(AGO2)のようなタンパク質に結合しているため、非常に安定である(Turchinovich et al., 2011; Valadi et al., 2007)。以前のmiRNA研究でmiR-1983は血中で検出されることができることが示されたので、雄CD-1マウスの血清でのmiR-1983のレベルを評価した(Hsieh et al., 2015)。5週間高脂肪食負荷後、雄CD-1マウスの血清でのmiR-1983のレベルは3倍近く上昇した（図１２B）。したがって、視床下部でのmiR-1983増加のタイミングは5週間での血中で検出できた増加と一致する。
【０１３１】
この発見から、miR-1983の血清レベルが他の血中パラメーターと相関するかどうかについて調べた。血清でのmiR-1983とグルコースレベルとの相関傾向および、血清でのmiR-1983とインスリンレベルでの著しい相関が発見された。このような発見から、実施例７に概説するように、miR-1983がヒト患者でのそのようなパラメーターと相関するかどうかについて評価した。
【実施例７】
【０１３２】
ヒトでのインスリン抵抗性のバイオマーカーとしてのmiR-1983の血清レベル
【０１３３】
本明細書では、マウスでの血清miR-1983の上昇は視床下部でのそれと一致し、これは、血清レベルは視床下部の変化の代用として用いることができることを示唆する。
【０１３４】
miR-1983はヒトにおいて述べられている（Edinger et al., 2014; Hasler et al., 2016)。このようなことから、ヒト対象の血清でのこのmiRNA分析を決定した。
【０１３５】
miR-1983は血中インスリンレベルの増加とHOMA-IRスコアと相関する。
【０１３６】
過多体重および肥満と分類されるボディマス指数（BMI）25以上の全てのヒト対象においてmiR-1983は検出された（図１１C）。miR-1983の血清レベルはさまざまな血中パラメーターと著しく相関し（図１１D、表１）、線形回帰分析により示されるように、インスリンの増加とHOMA-IRスコアは最も正の相関を呈する。これらのデータはマウスでの発見を支持し、miR-1983がインスリン抵抗性の血中指標となりえるという発見を支持する。データはmiR-1983がインスリン抵抗性の発症の異なる段階で検出されることを示唆する。使用した方法の詳細は実施例１０に示す。
【表１】
2020531542.tif 000003
【実施例８】
【０１３７】
６０％高脂肪食摂取CD1雄マウスでのmiR-1983の阻害はインスリン感受性、空腹時血糖を改善し、視床下部でのInsRタンパク質プロテインの回復をする。
【０１３８】
雄CD-1マウスの６０％高脂肪食への反応において、miR-1983は生体での一以上の場所において変化することから、miR-1983阻害剤の直接鼻腔内曝露を用いて、特に視床下部でのmiR-1983レベルの関係について決定することに着手した。この例で使用される方法は、実施例10に見られる。
【０１３９】
一実験例は、特に脳でのmiR-1983の阻害が、６０％高脂肪食負荷による体全体のインスリン感受性を変えるかどうかについて試験するよう設計された。インビボLNA miRNA miR-1983阻害剤を鼻腔内単回投与した６０％高脂肪食摂取雄CD-1マウス、および、インビボLNA miRNAネガティブコントロールを同様に投与した６０％高脂肪食摂取雄CD-1マウス、の両方の群は、インビボLNA miRNA ネガティブコントロールを与えられたchow群に比して、5週間の実験中、等しく体重が増加した（図７Bおよび７C）。miR-1983によるInsR制御のインビトロでの発見をインビボでの研究のつなげるために、マウスのインスリン感受性を、miR-1983阻害剤鼻腔曝露後またはネガティブコントロール曝露後一週間で調べた。インスリンの腹腔内（IP）投与後１０分及び２０分で、ネガティブコントロールを与えられた対象に対して、阻害剤処理６０％高脂肪食摂取マウスのインスリン感受性の有意な改善が見られた（図７D）。鼻腔内投与後二週間でのすべてのマウスの空腹時血糖を分析した結果、阻害剤を与えられた高脂肪食摂取群は、高脂肪食摂取ネガティブコントロール群と比較して有意に低い値を示したが、それらはchow摂取動物と比較してなお上昇していた（図７E）。5週間実験の終了後、マウスの視床下部を集めたところ、miR-1983はネガティブコントロールに比して阻害剤処置群では減少したままであり、chowコントロール群に比して、どちらの群でもAgRP、PomcおよびInsrのmRNA levelsは類似しており、Npy mRNAはどちらの群でも同様に減少した（図７F）。図７Gに示したように、高脂肪食負荷miR-1983阻害剤処理動物は、コントロール動物と比して視床下部でのInsRタンパク質のレベルが類似していたが、ネガティブコントロール投与群ではmiR-1983レベルの増加に対応してInsRレベルの著しい減少がみられた。つまり、このような結果は、miR-1983阻害剤を受け取った高脂肪食摂取動物で見られたインスリン感受性の増加は、視床下部でのInsRタンパク質のシグナル伝達の保持によるものであることを示唆する。この例で使用される方法は、実施例10に見られる。
【実施例９】
【０１４０】
miR-1983阻害剤の鼻腔内投与の使用を介してのヒトでのmiR-1983の阻害
【０１４１】
一般に、研究者はこれらの阻害剤をステレオタキシックカニューレションおよび注射または脳室内（ICV）を介して脳に投与するが、Exiqonにより製造されるインビボ用miR-1983 LNA阻害剤（配列番号２）の鼻腔内送達は、血液脳またはCSF脳関門をバイパスすることにより視床下部を選択的に標的とするようにヒトで使用される可能性がある。多くのペプチドの鼻腔内投与が高浸透で視床下部に到達することが示されており、したがって、本研究において弓状核が抗miRNAの標的となることができると示唆される(Meredithら、2015年)。一方ICV投与と比較して一般に使われないが、鼻腔内投与方法により、miR-206がマウス脳での脳由来神経栄養因子(BDNF)を制御する役割を果たすことが成功裏に見出されている(Lee et al., 2012)。本研究の結果は、高脂肪食2週間負荷後でのmiR-1983阻害剤の単回投与は、コントロールLNA受領群に比して、一週間後の腹腔内インスリン負荷試験(IpITT)によって測定されるインスリン感受性の改善及び2週間後の空腹時血糖を低下させることに十分であることを示した。miR-1983阻害剤の単回投与だけでインスリン感受性は著しく改善することが見いだされた。LNA miR阻害剤は、未修飾オリゴヌクレオチドと比較して安定性が増加しており、これはインビボでのこれらの薬剤の長期持続効果を説明することができる。抗miR-1983オリゴヌクレオチドの投与はまた、高脂肪食負荷CD-1雄マウスの視床下部でのInsRタンパク質の減少を抑制し（図７G）、さらに、このmiRNAの下流ターゲットとしてInsRが関係しているというインビトロデータを支持する。
【実施例１０】
【０１４２】
方法
【０１４３】
細胞モデルと培養条件
マウスmHypoE‐46（雄）、mHypoA‐NPY/GFP（雌）、mHypoA‐POMC/GFP‐2（雄）細胞株を、以前に述べられている（Belsham et al., 2004; Dhillon et al., 2011; Mayer and Belsham, 2009, 2010a; Nazarians-Armavil et al., 2014; Wellhauser et al., 2016）ように、5%ウシ胎児血清 （FBS、Gibco、Thermofisher Scientific、Waltham, MA）および1%ペニシリン-ストレプトマイシン（Gibco）を添加した5.5 mMグルコースダルベッコ改変イーグル培地（DMEM;Sigma-Aldrich、St. Louis MO, USA)で、37°C、5% CO2で培養した。
【０１４４】
動物モデル
C57Bl/6、CD-1およびMKR株の雌雄マウスを7週齢でCharles River Laboratories（Montreal, QC, Canada）から購入し、実験開始前の一週間順化させた。マウスは12:12の明暗スケジュール(午前7時から午後7時)で飼育した。動物実験はすべてトロント大学の動物愛護委員会の承認を得て行われた。CD‐1およびC57BL/6マウスに、60% kcalを脂肪から得る食(60% 高脂肪食)またはコントロール食(7%スクロース、高脂肪食とカロリー一致)  （D12492およびD12450J、Research Diets,Inc.,New Brunswick,NJ,USA)をそれぞれ、与えた。MKRマウスにTeklad Diet8664(Envigo,Madison, WI, USA)を与えた。必要に応じて、マウスの体重を週1回測定し、5週間の餌投与期間中の体重増加を追跡した。すべての動物をイソフルランで安楽死させ、4から16時間絶食させた後(図の凡例に示されているように)、組織および血液を採取し、分析用に処理するまで-80°Cで保存した。インスリンレベルを分析するために収集した血液を、ヘパリンコーティングシリンジを用いて収集し、その後、試料を4°Cで10分間6,000×gで回転し、血漿を単離し、-80°Cで保存した。血清サンプルを、麻酔下で心臓穿刺により回収し、氷上で1時間凝固させ、次いで、3,000×gで10分間遠心分離し(Hsieh et al.,2015)、その後、サンプルを-80°Cで保存した。CD‐1（雄）およびC57（雌雄）マウスの初期集団から視床下部組織を得た。これらのマウスからの代謝パラメーターのさらなる詳細は発表されている（Liu et al., 2016; Prentice et al., 2014）。
【０１４５】
ヒト患者試験参加者
ヒト患者試験は、the University Health Network Research Ethics Boardにより承認され、ヘルシンキ宣言に従って実施された。様々なボディマス指数（BMI）およびインスリン感受性を有する被験者を募集した。合計24人の被験者を本研究に含めた。全体では、11人の男性 (m) と13人の女性 (f) をBMIで分類し、25未満(m=2、f=4)、25から29(m=6、f=3)および30以上(m=3、f=6)であった。血清を一晩絶食させた状態で非コーティングチューブに採取し、凝固させ、4°Cで15分間、3,000×gで回転した。血清は直ちに-20°Cで凍結し、長期保存のために-80°Cに移動した。血中グルコースの測定はグルコースメーターで測定した。血中インスリンは、トロント総合病院（TGH）コア実験室のAbbott Architect i2000システム上のElisaを介して、またはHI-14K|ヒトインスリン特異的ラジオイムノアッセイ（EMD Millipore、Etobicoke, ON, Canada）によって製造元の指示に従って測定した。TGHのコア実験室にて、記載されている他のすべての血中血液パラメーターを分析した。インスリン抵抗性指数(HOMA-IR)はHOMA2モデル(Levy et al.,1998)を用いて決定した。
【０１４６】
インビボでのmiR-1983阻害剤またはコントロールの鼻腔内投与
順化期間後、マウスを2週間、コントロール食または６０％高脂肪食で飼育した。2週間の最終日、Exiqon(Woburn, MA, USA)によって合成され、滅菌済み0.9%生理食塩水に1 nmol/ulの濃度で溶解した、注文のインビボロックド核酸(LNA) miR-1983阻害剤(5’-3’, A*C*A*T*G*C*T*C*C*A*G*G*T*G*A)（配列番号２）またはネガティブコントロール(5’-3’, A*C*G*T*C*T*A*T*A*C*G*C*C*C*A) （配列番号３）をマウスに投与した。上述したように、マウスをイソフランで麻酔し、腹ばいに置き、10 nmolトータルのmiR-1983阻害剤またはネガティブコントロールを総量10 ulで鼻腔内投与した。マウスの呼吸への影響を最小にするために、鼻腔内での処理の保持を最大にしながら、阻害剤またはネガティブコントロールを、マウスの対において単回投与2.5μl、各小滴の間隔を二分で投与した。マウスを麻酔下で腹ばいに置いた。その後、マウスを麻酔から回復させ、清潔なホームケージに戻し、食餌療法を継続させた。投与一週間および二週間後、マウスに腹腔内インスリン負荷試験(IpITT)を行った。合計5週間の食餌療法後、マウスを安楽死させ(上記詳細のように)、組織および血清を採取し、-80°Cで保存した。
【０１４７】
腹腔内インスリン負荷試験(IpITT)
マウスはインスリン負荷試験および血糖測定前に4時間絶食させた。マウスはインスリン負荷試験および血糖測定前に4時間絶食させた。それらの尾から1mm以下の血液滴の収集を可能にするために、EMLAクリーム(リドカイン2.5%、プリロカイン2.5%、AztraZeneca)をそれらの尾の先端に塗布し、血液収集前に効果を生じさせた。基礎となる血糖サンプルは、尾部を絞ることで得、血糖計(Bayer Contour USB )に挿入したグルコースストリップに血液の液滴を注いだ。マウスにはkg体重あたり1国際単位(IU)のインスリン(Humulin R, Eli-lily)を注射した。さらに、次のタイムポイント(10、20、60、30、および120分)で血糖測定を行った。インスリンは、保存Humulinを濾過滅菌(0.22μm)した0.9%生理食塩水中の0.1%遊離脂肪酸を含まないウシ血清アルブミン(BSA)で希釈することによって調製した。マウスの血糖測定のための絶食とインスリン負荷試験の開始は、全ての実験でほぼ同じ時間に行った。
【０１４８】
マイクロアレイ実験分析およびバリデーション
miR-1983発現を調べるため、mHypoA-NPY/GFPおよびmHypoA-POMC/GFP-2細胞株を、以前の実験からこれらの細胞株がインスリン抵抗性を引き起こすのに十分な時間である16時間、100 nM insulinで処理した。miR-1983発現を調べるため、以前の実験をもとにこれらの細胞株がインスリン抵抗性を引き起こすのに十分な時間である16時間、100 nM insulinでmHypoA-NPY/GFPおよびmHypoA-POMC/GFP-2細胞株を処理した。620プローブを含むmiRBase v15に基づくマウスmiRNAとマウス関連ウイルスmiRNAへのNanostring nCounter AnalysisSystemでのmiRNA分析のため、the Princess Margaret Genomics Centreに提出する前に、トータルRNAは、Nanodrop 2000c分光光度計(Thermofisher Scientific)で量と質を評価した。コードカウントは、ノーマライゼーションファクターを計算するために幾何平均法を用いてポジティブコントロールに対してノーマライズした。次に、ノーマライゼーションファクターを計算するために、上位100遺伝子と幾何平均法を用いてCodeSetコンテントノーマライゼーションを行った。ノーマライズしたコードカウントを統計解析のためにlog2値に変換した。マイクロアレイの結果を受けて、mHypoE-46細胞での実験を繰り返し、Purelink Mini RNA単離カラム(Ambion、Thermofisher Scientific、Waltham, MA)を用いてRNA単離を行った。デオキシリボヌクレアーゼ（DNase）処理は、製造業者(サーモフィッシャー・サイエンティフィック)の指示に従ってon-column Purelink DNaseを用いてRNA単離中に行った。RNAを定量し、Nanodrop2000c分光光度計(Thermofisher Scientific)で純度を評価した。
【０１４９】
miRNA標的同定
miRNA標的は、Mirwalk 2.0ソフトウェア（Dweep and Gretz, 2015; Dweep et al., 2011）を用いて同定した。関心のある経路に分類するために、pantherdb.org(Mi et al., 2013; Mi et al., 2016)を用いて、四つのアルゴリズムすべて(mirWalk、miRanda(Betel et al., 2010; Betel et al., 2008)、RNA22(Miranda et al., 2006)、Targetscan(Lewis et al., 2005))に現れる潜在的標的を選択した。インスリンシグナル伝達経路に関与することが見出されたmRNA標的を、さらなる研究のために選択した。受け入れられている文献（Betel et al., 2010）に従い、よいmiRSVRスコアを有するとしてmiRNA標的は確証され、ヒトとマウスのmRNA配列間で類似した標的部位はTargetscanマウス(Agarwal et al., 2015; Lewis et al., 2005)を用いて同定された。
【０１５０】
逆転写（RT）、定量PCR（ｑPCR）とｍRNA分析のためのプライマー設計
mRNA分析のために、500ngから1μgのトータルRNAを、製造業者の説明に従ってABI high capacity cDNA archive kitを介し一本鎖cDNA 合成のために利用した。qPCRは、Platinum(R)SYBR(R)Green qPCR SuperMix-UDG w/ROX(Thermofisher Scientific)およびPrimer Quest online tool(Integrated DNA Technologies(IDT)、Coralville、IA)を用いて設計したプライマーを用いて実施した。プライマー配列については表2を参照のこと。すべての細胞系について、12.5または25ngのcDNAのサンプルを、3つずつ、qPCRのための10ul反応に加え、25、125、6.25、3.125 ngの用量曲線を用いて、絶対RNA値を計算した。全ての動物組織サンプルの25ng cDNAをトリプリケートで反応させ、delta delta CT法(Livak and Schmittgen, 2001)を用いて動物群間の相対倍率変化を計算した。分析のために、全遺伝子のトータルmRNAレベルをヒストン3a（Histone 3a）でノーマライズした。プレートは、以下の条件下でABI7900HT Thermal Cycler上で以下の条件で作動させた。50°C2で２分間、95°Cで2分間、40°Cで95秒および15°Cで1分間の60サイクル後、メルトカーブ95°Cで15秒、60°Cで15秒および95°Cで15秒。ABI7900HT Thermal Cyclerからのデータを、ABI Prism 7000SDS 2.4ソフトウェア(ABI)を用いて分析した。
【表２】
2020531542.tif 000004
【０１５１】
miRNA解析のためのRT-PCR
miRNA分析のために、100から250ngのトータルRNAを用いて、Taqman（登録商標）miRNA逆転写キット（Thermofisher Scientific）およびTaqman（登録商標）miRNAアッセイ専用プライマーを用いてcDNAを作製し、miR‐1983(ID:121204_mat)、miR‐20a‐3p(ID:002491)、miR‐296‐5p(ID:000527)およびLet‐7d‐5p(ID:002283)のRTおよびqPCR反応を行った。qPCRは、25ngのcDNAを10 μｌ Taqman（登録商標）Fast Advanced Master mix（Thermofisher Scientific）に入れ、トリプリケートで行った。プレートをABI7900HTサーマルサイクラーにいれ、以下の条件下で反応させた。50°Cで2分間、95°Cで20秒、４０サイクルの９５°Cで1秒間および60°Cで20秒。デルタ‐デルタCT法を用いて、群間の相対的な倍率変化を計算した。miRNAレベルをsnoRNA202(ID:001232)レベルでノーマライズした（Livak and Schmittgen, 2001）。
【０１５２】
マウス血清RT-qPCRからの miRNA単離
Ambion（登録商標）PARIS Kit（Thermofisher Scientific）を用いて血清サンプルを単離した。簡単に述べれば、サンプルを氷上で解凍し、200μlの各サンプルを2X変性溶液と組み合わせ、氷上で5分間インキュベートした。その後、miRNA レベルをノーマライズするための内部コントロールとして、25 fmol のIDTで合成されたcel-miR-39-3p RNA (配列 5’−3’; UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG (配列番号37) をそれぞれのサンプルに加えた。cDNAはTaqMan Advanced miRNA cDNA合成キットを用いて合成し、製造業者のプロトコールの仕様に従って、miR-1983(表3)およびcel-mir-39(ID:478293_mir)用TaqMan Advanced miRNAアッセイおよびTaqman Fast Advancedマスターミックスを用いて、10ul反応液、トリプリケートでqPCRを行った。データは示さないが、ヒト血清サンプルをまた、既知のヒト血中microRNA(Villard et al., 2015)、miR-142-3p(TaqMan ID: 477910)およびmiR-222-3p (Taqman ID: 477982)の存在下で分析した。サンプルをプレート（上記のように）に入れ、ABI7900HTサーマルサイクラーで95°Cで20秒、95°Cで1秒および60°Cで２0秒を４０サイクルでPCR反応させた。実験群の比較はデルタ‐デルタCT法(Livak and Schmittgen, 2001)により行った。 
【表３】
2020531542.tif 000005
ヒトmiR-1983は6番染色体で、マウスmiR-1983は13番染色体で発見された。アカゲザルは同じmiRNA-1983の配列をもっている（第4染色体で発見された）。
【０１５３】
mHypoE-46細胞を100ｍｍ細胞培養ディッシュで７０から７５％コンフルエントまで培養し、5 ug/ml の Dharmafect 3 (Dharmacon, GE, location)を用いて、製造会社の説明書に従って、25 nMのmiRNA-1983ミミックまたはネガティブコントロール（Thermofisher Scientific）をmHypoE-46細胞に24時間または48時間トランスフェクトした。次いで、10nMインスリンで15分間処理する前に、細胞を1X PBSで洗浄し、血清不含5.5 mM DMEM（Sigma-Aldrich、St. Louis MO, USA）中に1時間入れた。細胞を氷冷1XPBSで洗浄した後、製造業者の説明書に従ってAmbion（登録商標）PARISキットを用いてトータルタンパク質およびRNA（miRNAを含む）を単離した。
【０１５４】
Insr 3’非翻訳領域（UTR）のpmirGLOへのクローニングおよびコンストラクトおよびmiRNA-1983ミミックのmHypoE-46細胞へのコトランスフェクション
Insr遺伝子の3’ UTRを、pmirGLOベクター（Promega corporation, Madison WI, USA）のマルチプルクローニングサイトに相補的な制限酵素部位を付加するように設計されたプライマーを用いて、マウスゲノムDNA（Genomic DNA Purification Kit、Thermofisher Scientific)から増幅した。ベクターおよび3’ UTRの両方の制限消化後、2つをライゲーションし、HB101コンピテントセルに形質転換した。正しい配置で挿入されことを調べるため、アンピシリン耐性バクテリアコロニーを選択し、増殖させてDNAを単離した。制限酵素および緩衝液は、Cell Signaling Technology Inc. (Danvers, MA, USA)から購入した。３’非翻訳領域 Insr挿入物を含有するベクターDNAを、Center for Applied Genomics（TCAG,Toronto, ON, Canada)で配列決定（プライマーについては表2参照）のために送った。トランスフェクションのために、mHypoE-46細胞を6ウェルプレート中（Sarstedt, Montreal, QC, Canada）で70から75%コンフルエントまで培養した。次いで、25nMのmiRNA-1983ミミックまたはネガティブコントロール（上記で使用したように）および5ugのpmiRGLO-Emptyまたは3’ UTR Insrを、ウェル当たり6ulのTurbofect（Dharmacon, GE, location）を用いて、製造業者の説明書に従って、48時間トランスフェクトした。細胞を氷冷した1×PBSで一回洗浄し、その後、細胞を製造業者の説明書に従って、ウェル当たり450μlのPassive Lysis Buffer （Biotium Inc., Fremont, CA, USA)で溶解した。
【０１５５】
タンパク質精製、SDS−PAGEとウェスタンブロッティング
タンパク質を、以前述べられたように(Nazarians-Armavil et al., 2014)、または製造業者の説明に従ってAmbion（登録商標）PARISキットを使用して、単離し、BCA protein assay kit (Pierce,Thermofisher Scientific)を使用して定量した。ウェスタンブロッティングは、各サンプルあたり15から25ugのタンパク質(サンプルバッファー、Biorad、TCEP bond breaker solution)(Thermofisher Scientific,Waltham,MA,USA 煮沸用)を10%ビス-アクリルアミド-トリスゲル上で分離し、そしてiBlot2ドライブロッティングシステム(Thermofisher Scientific)を用いて0.2μmポリフッ化ビニリデン(PVDF) Immun-Blot メンブレン(Bio-Rad,Hercules,CA,USA )上に移した。InsRβサブユニット、α-チューブリン、リン酸化AKTおよびトータルAKTに対する抗体(抗マウス、ウサギ抗体)、ならびにウサギ二次抗体IgG、およびSignalfire elite ECL試薬を、Cell Signaling Technology Inc.(Danvers, MA, USA)から購入した。ローディングコントロールとして使用するβ-アクチン抗体は、Sigma-Aldrichから購入した。全ての一次抗体(1:1000)を、5%ノンファットミルク含有0.1% Tween-20を含むトリス緩衝生理食塩水（TBS-T）中、4°Cにて一晩インキュベートした。次いで、抗ウサギ二次抗体(1:7500)を使用し、5%ノンファットミルク含有1×TBS-T中で室温で2時間インキュベートした。次に、ブロットを0.1% TBS-Tで30分間洗浄し、Kodak Imaging3000ステーション（Eastman Kodak Company、Rochester, NY) 上で映し出した。トータルAKT検出のために、Restore PLUS Stripping Buffer (Thermofisher Scientific)を用いて抗体をはがし、再プローブした。マウス視床下部組織に対するウェスタンブロッティングは、全ての群を処理し、ゲル上に流し、抗体とインキュベートし、同時にイメージングする、というように行った。デンシトメトリーはImage J Software (Image J software,NIH,Bethesda,MD,USA,http://imagej.nih.gov/ij/)を用いて行った。
【０１５６】
パルミチン酸処理mHypoE細胞株
mHypoE‐46細胞株を滅菌水または50μMのパルミチン酸ナトリウム(Sigma-Aldrich)で24時間処理した。パルミチン酸ナトリウム溶液は、粉末と滅菌水を混合し、完全に溶解するまで混合物を65°Cに加熱することによって調製した。次いで、溶液を温かい(37°C)細胞培養培地に直接添加し、細胞を直ちに処理した。miR‐1983レベルの評価は上記のように完了した。
【０１５７】
統計解析
GraphPad Prism Version 6.0 cを用いて全データを分析した。記載のように、スチューデントt検定、一元または二元配置分散分析（one or two-wayANOVA）、その後にBonferroniまたはFisherのLSD post-hoc 解析を実施した。p値が０．０５以下（p<0.05）の場合、データは統計的に有意であると考えられる。すべてのデータは±標準偏差として示されている。
【実施例１１】
【０１５８】
C57Bl/6雌マウスは高脂肪食曝露後の神経ペプチドレベルにおいて同様のパターンを示し、その方向と大きさは35% 高脂肪食を12週間与えた雌C56Bl/6マウスで観察されたものと同等であった(Lee et al.,2010)。全体として、これらの研究で観察されたNpyとPomc mRNAレベルのそれぞれの代償性変化は、以前に報告されたもの(Bergen et al.,1999)と同様であった。インシュリン負荷後の成体雌mHypoA‐NPY/GFP細胞モデルにおけるmiR‐1983の明らかな増加が見られたが、同じ変化は高脂肪食を与えた後のインビボでは見られなかった。この所見は、もし雌の視床下部神経細胞がより高いインスリンレベルになるように長期曝露を経験したら、miR‐1983が増加するかもしれないが、両系統の雌マウスは分析した時間枠内に高インスリン血症を発症しないため、miR‐1983量の変化は観察されないという考えを支持する。高脂肪食の摂取および他の生理学的変化がmiR‐1983を変化させる可能性があったが、そのようなことではないようである。
【０１５９】
血中インスリンのインビボでの変化には視床下部miR-1983の変化が必要であるという考えをサポートするため、高脂肪食を含む最も豊富な飽和脂肪酸、パルミチン酸50 μM で24時間mHypoE-46細胞を処理したところ、インスリンで見られるものとは逆に、miR-1983レベルの著しい減少が引き起こされた。この知見は、同様のNpy/AgRP神経細胞モデルを用いた以前のデータ、すなわち、パルミチン酸がインスリンと比較して代替えメカニズムを介してインスリン抵抗性を誘導することが確認された(Mayer and Belsham, 2010b)データとも一致している。これは、肥満関連および高脂肪食関連2型糖尿病に対する痩せているヒトと過体重のヒトの両方で肥満とは関係なく高インスリン血症を発症している2型糖尿病を示唆している。
【０１６０】
C57Bl/6とCD‐1バックグラウンドの両方の雌マウスによる高脂肪食の消費は、有意な体重増加と空腹時血糖値の両方をもたらした。一般に、雌マウスは高脂肪食を与えられている時間がより長くなるまで末梢でインスリン抵抗性にならないと考えられているが(Medrikova et al.,2012)、本研究の時間枠内で主要な神経ペプチドであるNpy、AgRPおよびPomcのmRNAレベルの、雄マウスと同様な変化がみられたことは驚くべきことである。雌マウスは雄マウスほど早期に末梢神経系の変化を示さないため、高脂肪食を用いた研究の大部分が雌マウスを除外しているが、この知見は、脳のレベルでは、神経ペプチド含有量において実際著しい変化を示す可能性があるため、代謝研究において雄マウスと並行して検討すべきであることを示唆する。
【０１６１】
CD-1雄マウスでの神経細胞レベルの調節不全の前にmiR-1983の変化が現れ、マウスを10週間高脂肪食負荷にしたままにした時、変化は消えた。このインビボデータはインビトロで見られた、miR-1983が24時間後に上昇し、48時間後では上昇しないことに一致する。以前の研究では、C57Bl/6マウスに8週間５８％高脂肪食負荷後、元気を回復させることができる低脂肪食負荷にした時、かなりの数の他のmiRNAの間で、miR-1983は3倍近い著しい減少を示したが、それらの高脂肪食群では12週間後、miR-1983の増加は見られなかった(Hsieh et al., 2015)。視床下部におけるmiRNA発現へのタイミングの影響は以前の研究で示され、2週間45% 高脂肪食を与えたラットおよびその後一か月および三か月後のmiRNAレベルの調査では、調べた各miRNA種で影響は異なることを明らかにした(Sangiao-Alvarellos et al., 2014)。
【０１６２】
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【図１Ａ】
2020531542.tif 000006
【図１Ｂ】
2020531542.tif 000007
【図１Ｃ】
2020531542.tif 000008
【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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