(57)【要約】  本発明は、新規のアシル化オキシントモジュリン（ｏｘｙｎｔｏｍｏｄｕｌｉｎ）のペプチド類似体、及びこれを含む肥満又は過体重、又はこれらを伴う糖尿病予防及び治療用医薬組成物に関するもので、前記ペプチドは、天然型のオキシントモジュリンに比べて優れたグルカゴン様ペプチド−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１、ＧＬＰ−１）／グルカゴン（Ｇｌｕｃａｇｏｎ）受容体への二重活性化効能（ｄｕａｌ  ＧＬＰ−１Ｒ／ＧｌｕｃａｇｏｎＲ  ａｇｏｎｉｓｍ）と増加した生体内半減期を有し、これを含む医薬組成物は、肥満や糖尿などの代謝疾患の治療に有用である。
2020531442.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｉのアミノ酸配列を含むオキシントモジュリンペプチド類似体。
＜式Ｉ＞
Ｈｉｓ−Ｘ１−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘ１０−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６（配列番号４９）
（式中、
Ｘ１はＳｅｒ又はＡｉｂ（アミノイソ酪酸）であり；
Ｘ２はＡｓｐ又はＺであり；
Ｘ３はＴｙｒ又はＺであり；
Ｘ４はＳｅｒ又はＺであり；
Ｘ５はＬｙｓ又はＺであり；
Ｘ６はＴｙｒ又はＺであり；
Ｘ７はＬｅｕ又はＺであり；
Ｘ８はＡｓｐ又はＺであり；
Ｘ９はＳｅｒ、Ａｉｂ（アミノイソ酪酸）又はＺであり；
Ｘ１０はＧｌｎ又はＺであり；
Ｘ１１はＭｅｔ又はＬｅｕであり；
Ｘ１２はＡｓｎ又はＡｒｇであり；
Ｘ１３はＴｈｒ又はＡｌａであり；
Ｘ１４はＬｙｓ又はＺであり；
Ｘ１５はＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号５１）であるか存在せず；
Ｘ１６は、Ｘ１５が存在する場合、Ｚであるか存在せず；
Ｃ末端のアミノ酸は、任意にアミド化でき；
ここで、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１４又はＸ１６のうちの少なくとも１つがＺであり；
Ｚは、官能化されたＬｙｓであって、その側鎖にポリマー性部分とスペーサーの接合体であるＺ１と親油性脂質部分であるＺ２が接合された形態であり、ここで、Ｚ１はアシル官能基を介してＬｙｓ側鎖に直接接合され、Ｚ２はＺ１を介してＬｙｓ側鎖に接合され、Ｚ１は下記構造式（１）又は（２）であり、Ｚ２は下記構造式（３）又は（４）である。）
【化１】
2020531442.tif 000037
【化２】
2020531442.tif 000038
【化３】
2020531442.tif 000039
【化４】
2020531442.tif 000040
【請求項２】
Ｘ１位がＡｉｂであることを特徴とする、請求項１に記載のオキシントモジュリングペプチド類似体。
【請求項３】
Ｘ１１位がＬｅｕであり、Ｘ１２位がＡｒｇであり、Ｘ１３位がＡｌａであることを特徴とする、請求項１に記載のオキシントモジュリンペプチド類似体。
【請求項４】
Ｘ１０位がＧｌｎ又はＬｙｓであり、Ｘ１１又はＸ１２位がそれぞれＬｅｕ及びＡｒｇの中から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載のオキシントモジュリンペプチド類似体。
【請求項５】
前記スペーサーがＬ−グルタミン酸残基であって、そのγ−カルボン酸にはポリマー性部分が共有結合され、α−アミノ基には親油性脂質部分が共有結合されることを特徴とする、請求項１に記載のオキシントモジュリンペプチド類似体。
【請求項６】
前記ポリマー性部分としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を有し、モノマーとしてエチレングリコール、エタノールアミン及び乳酸を有するコポリマー、又はグリシン及びセリンを有するポリアミノ酸コポリマーであることを特徴とする、請求項１に記載のオキシントモジュリンペプチド類似体。
【請求項７】
前記Ｚが構造式（１）又は（２）のＺ１を有する、請求項１に記載のオキシントモジュリンペプチド類似体。
【請求項８】
前記親油性脂質部分Ｚ２は、炭素原子数がＣ１４−Ｃ２０である飽和炭化水素鎖を含み、該炭化水素鎖の末端炭素がカルボン酸型、一次アミド型、又は任意の単一アミノ酸と共有結合で連結されたカルボン酸型である、請求項１に記載のオキシントモジュリンペプチド類似体。
【請求項９】
前記Ｚが構造式（３）又は（４）のＺ２を有する、請求項１に記載のオキシントモジュリンペプチド類似体。
【請求項１０】
下記式Ｉ−１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のオキシントモジュリンペプチド類似体。
＜式Ｉ−１＞
ＨＸ１ＱＧＴＦＴＳＤＸ３ＳＫＹＬＤＸ９ＲＲＡＸ１０ＤＦＶＱＷＬＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６（配列番号５０）
（式中、
Ｘ１はＳｅｒ又はＡｉｂ（アミノイソ酪酸）であり；
Ｘ３はＴｙｒ又はＺであり；
Ｘ９はＳｅｒ、Ａｉｂ又はＺであり；
Ｘ１０はＧｌｎ又はＺであり；
Ｘ１１はＭｅｔ又はＬｅｕであり；
Ｘ１２はＡｓｎ又はＡｒｇであり；
Ｘ１３はＴｈｒ又はＡｌａであり；
Ｘ１４はＬｙｓ又はＺであり；
Ｘ１５はＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号５１）であるか存在せず；
Ｘ１６は、Ｘ１５が存在する場合、Ｚであるか存在せず、Ｃ末端はアミド化でき、
Ｚは前記式Ｉで定義したとおりである。）
【請求項１１】
前記ペプチド類似体は、化合物１（配列番号２）、化合物２（配列番号３）、化合物３（配列番号４）、化合物４（配列番号５）、化合物５（配列番号６）、化合物６（配列番号７）、化合物７（配列番号８）、化合物８（配列番号９）、化合物９（配列番号１０）、化合物１０（配列番号１１）、化合物１１（配列番号１２）、化合物１２（配列番号１３）、化合物１３（配列番号１４）、化合物１５（配列番号１６）、化合物１６（配列番号１７）、化合物１７（配列番号１８）、又は化合物１８（配列番号１９）であることを特徴とする、請求項１０に記載のオキシントモジュリンペプチド類似体。
【請求項１２】
下記式ＩＩのアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列内に分子内架橋を有する、オキシントモジュリンペプチド類似体。
＜式ＩＩ＞
Ｈｉｓ−Ｘ１７−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘ１８−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｘ１９−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘ２０−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ（配列番号５３）
（式中、
Ｘ１７はＳｅｒ又はＡｉｂ（アミノイソ酪酸）であり；
Ｘ１８はＺであり；
Ｘ１９はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｈｃｙ（ホモシステイン）、Ｌｙｓ又はＯｒｎ（オルニチン）であり；
Ｘ２０はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｈｃｙ（ホモシステイン）、Ｌｙｓ又はＯｒｎ（オルニチン）であり；
Ｘ１９とＸ２０は、分子内結合又は架橋剤を介して環状ペプチドを形成し、このとき、環状ペプチドは、２つの残基の間にアミド結合で形成されたラクタム環、又は２つの残基の間にジスルフィド結合で形成されたジスルフィド環、又は２つの残基の間に架橋剤結合で形成された架橋環を有するペプチドであり；
Ｃ末端のアミノ酸は任意にアミド化でき；
Ｚは前記式Ｉで定義したとおりである。）
【請求項１３】
Ｘ１９とＸ２０の分子内結合は、Ｘ１９とＸ２０がそれぞれＡｓｐ又はＧｌｕとＬｙｓ又はＯｒｎであるとき、又はそれぞれＬｙｓ又はＯｒｎとＡｓｐ又はＧｌｕであるときには、分子内ラクタム環形成結合であるか；或いは、Ｘ１９とＸ２０がそれぞれＣｙｓ又はＨｃｙとＣｙｓ又はＨｃｙであるときには、分子内ジスルフィド環形成結合であることを特徴とする、請求項１２に記載のオキシントモジュリンペプチド類似体。
【請求項１４】
Ｘ１９とＸ２０がそれぞれＣｙｓ又はＨｃｙとＣｙｓ又はＨｃｙであるとき、架橋剤は、両方のＣｙｓ又はＨｃｙ側鎖のチオール官能基に結合されて環を形成し、このとき、架橋剤は、Ｃ１−Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ３−Ｃ８飽和又は不飽和シクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、又はＣ５−Ｃ１２ヘテロアリール又は融合されたヘテロサイクリックアリールであることを特徴とする、請求項１３に記載のオキシントモジュリンペプチド類似体。
【請求項１５】
架橋剤は、
【化５】
2020531442.tif 000041
の中から選ばれることを特徴とする、請求項１４に記載のオキシントモジュリンペプチド類似体。
（式中、Ｒは水素又はＣ１−Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキルである。）
【請求項１６】
Ｘ１９とＸ２０がそれぞれＡｓｐ又はＧｌｕとＡｓｐ又はＧｌｕであるとき、架橋剤は、両方のＡｓｐ又はＧｌｕ側鎖のカルボキシル基にアミド結合で環を形成し、このとき、架橋剤は、ジアミノＣ１−Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキル、ジアミノＣ３−Ｃ８飽和又は不飽和シクロアルキル、アミノピペリジン、ピペラジン、ジアミノＣ６−Ｃ１０アリール、又はジアミノＣ５−Ｃ１２ヘテロアリール又は融合されたヘテロサイクリックアリールであることを特徴とする、請求項１２に記載のオキシントモジュリンペプチド類似体。
【請求項１７】
架橋剤は、
【化６】
2020531442.tif 000042
の中から選ばれることを特徴とする、請求項１６に記載のオキシントモジュリンペプチド類似体。
（式中、Ｒは水素又はＣ１−Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキルである。）
【請求項１８】
Ｘ１９とＸ２０がそれぞれＬｙｓ又はＯｒｎとＬｙｓ又はＯｒｎであるとき、架橋剤は、両方のＬｙｓ又はＯｒｎ側鎖のアミン基にアミド結合で環を形成し、このとき、架橋剤は、ジカルボニルＣ１−Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキル、ジカルボニルＣ３−Ｃ８飽和又は不飽和シクロアルキル、ジカルボニルＣ６−Ｃ１０アリール又はジカルボニルＣ５−Ｃ１２ヘテロアリール又は融合されたヘテロサイクリックアリールであることを特徴とする、請求項１２に記載のオキシントモジュリンペプチド類似体。
【請求項１９】
架橋剤は、
【化７】
2020531442.tif 000043
の中から選ばれることを特徴とする、請求項１８に記載のオキシントモジュリンペプチド類似体。
（式中、Ｒは水素又はＣ１−Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキルである。）
【請求項２０】
Ｘ１９とＸ２０がそれぞれＡｓｐ又はＧｌｕとＬｙｓ又はＯｒｎであるとき、又は、それぞれＬｙｓ又はＯｒｎとＡｓｐ又はＧｌｕであるとき、架橋剤は、Ａｓｐ又はＧｌｕ側鎖のカルボキシル基と架橋剤のアミン官能基とアミド結合で連結され、Ｌｙｓ又はＯｒｎ側鎖のアミン基には、架橋剤のカルボキシル官能基とアミド結合で連結されて環を形成し、このとき、架橋剤は、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅの中から選ばれるαアミノ酸、βアミノ酸、カルボニルＣ１−Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキルアミン、カルボニルＣ３−Ｃ８飽和又は不飽和アルキルアミン、カルボニルピペリジン、アミノベンゾイル、カルボニルＣ６−Ｃ１０アリールアミン又はカルボニルＣ５−Ｃ１２ヘテロアリールアミン又は融合されたヘテロサイクリックアリールアミンであることを特徴とする、請求項１２に記載のオキシントモジュリンペプチド類似体。
【請求項２１】
架橋剤は、
【化８】
2020531442.tif 000044
の中から選ばれることを特徴とする、請求項２０に記載のオキシントモジュリンペプチド類似体。
（式中、Ｒは水素又はＣ１−Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキルである。）
【請求項２２】
前記ペプチド類似体は、化合物１４（配列番号１５）、化合物１９（配列番号２０）、化合物２０（配列番号２１）、化合物２１（配列番号２２）、化合物２２（配列番号２３）、化合物２３（配列番号２４）、化合物２４（配列番号２５）、化合物２５（配列番号２６）、化合物２７（配列番号２８）、化合物２８（配列番号２９）、化合物２９（配列番号３０）、化合物３０（配列番号３１）、化合物３１（配列番号３２）、化合物３２（配列番号３３）、化合物３３（配列番号３４）、化合物３４（配列番号３５）、化合物３５（配列番号３６）、化合物３６（配列番号３７）、化合物３７（配列番号３８）、化合物３８（配列番号３９）であることを特徴とする、請求項１２に記載のペプチド類似体。
【請求項２３】
請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のペプチド類似体を含み、医薬的に許容される賦形剤を含む、肥満又は過体重によって引き起こされるか特徴付けられる病態の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のペプチド類似体を含み、医薬的に許容される賦形剤を含む、肥満又は過体重を伴うインスリン非依存性糖尿病の治療又は予防用医薬組成物。
【請求項２５】
請求項１２乃至２２のいずれか一項に記載のペプチド類似体を含み、医薬的に許容される賦形剤を含む、肥満又は過体重によって引き起こされるか特徴付けられる病態の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１２乃至２２項のいずれか一項に記載のペプチド類似体を含み、医薬的に許容される賦形剤を含む、肥満又は過体重を伴うインスリン非依存性糖尿病の治療又は予防用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オキシントモジュリンペプチド類似体、及びこれを含む肥満又は過体重、又はこれを伴うインスリン非依存性糖尿病の予防又は治療に使用することができる医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
代謝性疾患（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）は、ブドウ糖、脂肪、タンパク質などの代謝異常から生じる病気であって、主にブドウ糖と脂肪代謝の異常により誘発される癌、糖尿病、骨代謝疾患、脂肪肝、肥満、心血管系疾患などを通称する。２００１年に報告された全米コレステロール教育プログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ；ＮＣＥＰ）のＡＴＰＩＩＩ（ａｄｕｌｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｐａｎｅｌ  ＩＩＩ）又は２０１２年に発表された国際糖尿病連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ；ＩＤＦ）による代謝性疾患の診断基準は、次のとおりである。（１）腰回りが男１０２又は９４ｃｍ（それぞれＮＣＥＰ又はＩＤＦ）、女子８８又は８０ｃｍ（それぞれＮＣＥＰ又はＩＤＦ）以上である腹部肥満、（２）中性脂肪（ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ）１５０ｍｇ／ｄＬ以上の高中性脂肪血症、（３）ＨＤＬコレステロールが男４０ｍｇ／ｄＬ、女性５０ｍｇ／ｄＬ以下、（４）血圧１３０／８５ｍｍＨｇ以上の高血圧、又は（５）空腹時血糖（ｆａｓｔｉｎｇ  ｇｌｕｃｏｓｅ）１１０ｍｇ／ｄＬ以上などの５つの危険因子のうち３つ以上を示す場合に代謝性疾患に分類することができる。
【０００３】
世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ；ＷＨＯ）によれば、全世界の肥満有病率は、１９８０年から２０１４年の間に２倍以上増加しており、２０１４年には１８歳以上の成人のうち３９％（男性３８％、女性４０％）が過体重、１３％（男性１１％、女性１５％）が肥満であった。このような肥満及び過体重の根本的な原因はカロリー摂取と消費間のエネルギー不均衡であって、脂肪が多くエネルギー密度が高い食事や現代社会の仕事の性格、交通手段の変化、都市化の増加などによる身体活動の低下が肥満の危険要素として考えられている。肥満に伴う疾患の一つである糖尿病も、その有病率が急速に増加している傾向にあり、１９８０年に１８歳以上の成人中の４．７％であった有病率が２０１５年には８．５％へと上昇した。糖尿病の有病率は、中産階級と低所得国でより急速に増えており、失明、腎不全、心臓麻痺、脳卒中などの主な原因となる。
【０００４】
グルカゴンは、膵臓のアルファ細胞で生産されるホルモンであって、一般に、ブドウ糖の新生合成だけでなく、肝臓に貯蔵されるグリコーゲンを分解して血糖を高める役割を果たすが、貯蔵されたグリコーゲンが枯渇すると、グルカゴンは、肝臓と腎臓がブドウ糖を新たに合成するようにし、食欲を抑制し、貯蔵されている中性脂肪（Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）を脂肪酸に分解してエネルギー代謝量の増加による体重減少にも影響があることが知られている(Diabetes.co.uk. the global diabetes community, Anim Sci J. 2016;87(9):1090-1098)。
【０００５】
ＧＬＰ−１（Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１）は、グルカゴン誘導体の一つであって、血糖を減少させる役割を果たすペプチドホルモンである。食後に小腸のＬ−細胞から分泌され、半減期が２分未満と非常に短いが、ブドウ糖によって分泌が増加すると、膵臓のベータ細胞からのインスリン分泌を誘導することにより、究極的に血糖を調節し、ベータ細胞機能を改善させる役割を果たすことが報告されている。また、グルカゴン分泌阻害、胃空腹抑制、食物摂取減少の機能を持つ(Physiol Rev. 2007;87(4):1409-1439)。Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋのリラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）は、２型糖尿病及び肥満適応症に対して開発された治療薬であって、１日１回注射されるヒトＧＬＰ−１誘導体である。リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）は、持続性ＧＬＰ−１受容体アゴニストであって、内因性ＧＬＰ−１と同じ受容体に結合してブドウ糖依存的にインスリン分泌を促進させることにより血糖を調節し、食欲を減少させて体重増加を抑制し、中性脂肪を下げる作用によって、２型糖尿病に対してはＶｉｃｔｏｚａ、肥満に対してはＳａｘｅｎｄａという名前で米国及び欧州で発売された(Expert Rev Cardiovasc Ther. 2015;13(7):753-767)。リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）の他にも、エクセナタイド（Ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）、リキシセナチド（Ｌｉｘｉｓｅｎａｔｉｅ）、アルビグルチド（ａｌｂｉｇｌｕｔｉｄｅ）及びデュラグルチド（ｄｕｌａｇｌｕｔｉｄｅ）などが糖尿病治療薬として開発された。しかし、このようなＧＬＰ−１受容体アゴニストの副作用としては、吐き気、嘔吐、食欲不振、頭痛、便秘、腹部膨満感の発生などが報告されている(Korean J Med. 2014;87(1):9-13)。
【０００６】
オキシントモジュリンは、グルカゴンの前駆体であるプログルカゴン（ｐｒｏｇｌｕｃａｇｏｎ）に由来するペプチドであって、グルカゴンの完全な２９個のアミノ酸配列を含む３７個のアミノ酸ペプチドから構成されており、ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体の両方に結合する二重作用を有する。食物摂取を減少させるとともにエネルギー代謝を増加させることにより体重減少効果を示すが、このようなオキシントモジュリンの作用は、選択的なＧＬＰ−１受容体アゴニストよりも優れることが知られており、グルカゴン受容体の活性化によるブドウ糖の増加に起因する高血糖のリスクは、一緒に活性化されるＧＬＰ−１受容体によるインスリン分泌を介して血糖が調節されることにより解消できることが報告されている。オキシントモジュリンは、非臨床試験で飼料摂取量及び体重の減少、エネルギー消費の増加、及び糖代謝の向上に影響することが報告されており(Diabetes. 2009;58(10):2258-2266)、臨床試験においても、過体重及び肥満の患者に１日３回ずつ４週間皮下投与をした場合に平均２．３ｋｇの体重減少を示すことが確認されており(Diabetes. 2005;54:2390-2395)、プラセボ群に比べて有意なインスリン分泌及び血糖減少効果も確認されており(Diabetes. 2013;62(Suppl. 1):A48)、別の臨床試験では、オキシントモジュリンの持続的な注入による嘔吐や食欲促進などの副作用なしにエネルギー摂取を減少させることが確認されており(J Clin Endocrinol Metab. 2003;88:4696-4701)、血糖調節、食物摂取の減少、満腹感の増進などの機能を示すことができるので、肥満治療及び血糖調節を目的とする新たな治療法として脚光を浴びている(Molecular metabolism. 2014;3:241-251)。しかし、オキシントモジュリンは、ＧＬＰ−１のようにジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−ＩＶ；ＤＰＰ−ＩＶ）によって切断され、生体内で不安定に非常に短い半減期を有する(J Biol Chem. 2002;278: 22418-22423)。
【０００７】
したがって、ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体にバランスよく選択的に結合して薬理学及び治療学的な面でオキシントモジュリンの作用を長期間持続させ、各ホルモンペプチドの副作用を克服することができるＤＰＰ−ＩＶ耐性オキシントモジュリン誘導体についての研究が報告されており(Diabetes. 2009;58(10):2258-2266)、メルク（Ｍｅｒｃｋ）、Ｚｅａｌａｎｄ、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ、韓米薬品などのさまざまな会社で先導物質についての開発が進行中である。
【０００８】
このような背景の下で、本発明は、（１）ＤＰＰ−ＩＶに対する抵抗性を付与し、（２）アシル化による代謝安定性を最適化させ、（３）ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対して元のオキシントモジュリンよりも優れた活性を示す合成オキシントモジュリンペプチド類似体の開発による肥満又は肥満を伴う糖尿病の治療に使用するための治療用医薬組成物に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、従来のオキシントモジュリンよりもＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する活性が高く、アシル化によって化学的に安定化されて(Molecular metabolism 2013;2:468-479)生体内半減期が増加したオキシントモジュリンペプチド類似体を提供し、肥満又は過体重、又はこれらを伴うインスリン非依存性糖尿病によって引き起こされるか特徴付けられる病態の予防又は治療に使用することができるオキシントモジュリンペプチド類似体及びこれを含む医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の課題を解決するために、本発明は、オキシントモジュリンペプチド類似体である下記式Ｉのアミノ酸配列を含む新規なペプチドを提供する。
＜式Ｉ＞
Ｈｉｓ−Ｘ１−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘ１０−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６（配列番号４９）
式中、
Ｘ１はＳｅｒ又はＡｉｂ（アミノイソ酪酸）であり；
Ｘ２はＡｓｐ又はＺであり；
Ｘ３はＴｙｒ又はＺであり；
Ｘ４はＳｅｒ又はＺであり；
Ｘ５はＬｙｓ又はＺであり；
Ｘ６はＴｙｒ又はＺであり；
Ｘ７はＬｅｕ又はＺであり；
Ｘ８はＡｓｐ又はＺであり；
Ｘ９はＳｅｒ、Ａｉｂ（アミノイソ酪酸）又はＺであり；
Ｘ１０はＧｌｎ又はＺであり；
Ｘ１１はＭｅｔ又はＬｅｕであり；
Ｘ１２はＡｓｎ又はＡｒｇであり；
Ｘ１３はＴｈｒ又はＡｌａであり；
Ｘ１４はＬｙｓ又はＺであり；
Ｘ１５はＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号５１）であるか存在せず；
Ｘ１６は、Ｘ１５が存在する場合、Ｚであるか存在せず；
Ｃ末端のアミノ酸は、任意にアミド化でき；
ここで、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１４又はＸ１６のうちの少なくとも１つがＺであり；
Ｚは、官能化されたＬｙｓであって、その側鎖にポリマー性部分とスペーサーの接合体であるＺ１と親油性脂質部分であるＺ２が接合された形態であり、ここで、Ｚ１はアシル官能基を介してＬｙｓ側鎖に直接接合され、Ｚ２はＺ１を介してＬｙｓ側鎖に接合され、Ｚ１は下記構造式（１）又は（２）であり、
【００１１】
【化１】
2020531442.tif 000003
【００１２】
【化２】
2020531442.tif 000004
【００１３】
Ｚ２は下記構造式（３）又は（４）である。
【００１４】
【化３】
2020531442.tif 000005
【００１５】
【化４】
2020531442.tif 000006
【００１６】
本発明において、アミノ酸は、下記略語を併用記載した。
【００１７】
Ａｌａ（Ａ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｉｂ（アミノイソ酪酸）。
【００１８】
本発明において、用語「オキシントモジュリン（ｏｘｙｎｔｏｍｏｄｕｌｉｎ）」とは、グルカゴンの前駆体であるプレグルカゴンから作られるペプチドを意味し、天然型のオキシントモジュリンは、ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号１）のアミノ酸配列を有する。
【００１９】
本発明において、Ｚの構成要素の一つであるＺ１は、ポリマー性部分としてポリエチレングリコールを有し、モノマーとしてエチレングリコール、エタノールアミン及び乳酸を有する共重合体、又はモノマーとしてグリシン及びセリンを有するポリアミノ酸共重合体の形を持つことができ、ポリアミノ酸は、ＧＧＳＧＳＧのアミノ酸配列（配列番号配列番号５２）であり、本発明の化合物は、前記ポリマー性部分の繰り返し単位を２個以上持つことができる。
【００２０】
また、Ｚ１は、一末端に上述のオキシントモジュリンペプチド類似体の任意の残基又はその側鎖に付着するための官能基を持つことができる。好ましくはアシル基であり、この場合、側鎖のアミノ基にアミド結合の形で付着することができ、幾つかの実施態様において、Ｚ１は、一末端にスペーサーと結合されるための官能基を持つことができる。好ましくはアミノ基であり、この場合、スペーサーのカルボキシ基にアミド結合の形で付着することができ、Ｚ１は、好ましくは水溶性を有し、よって、両親媒性又は親水性であり得る。
【００２１】
本発明において、スペーサーは、Ｌ−グルタミン酸残基であって、そのγ−カルボン酸には、ポリマー性部分であるＺ１が共有結合され、α−アミノ基には、親油性脂質部分であるＺ２が共有結合され、２つ以上の繰り返し単位を持つことができる。
【００２２】
Ｚの別の構成要素であるＺ２の脂質部分はスペーサーと直接接合され、スペーサーはポリマー性部分に直接接合され、ポリマー性部分は、本発明のオキシントモジュリンペプチド類似体のＸ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１４又はＸ１６位に存在するアミノ酸残基の側鎖と直接接合でき、好ましくは、この接合を可能にするアミノ酸残基としてＬｙｓが導入できる。
【００２３】
また、Ｚ２は、Ｃ１４〜Ｃ２０の飽和炭化水素鎖を含み、この炭化水素鎖の末端炭素がカルボン酸型、一次アミド型、又は任意の単一のアミノ酸と共有結合で連結されたカルボン酸型であるペプチド誘導体である。この時、炭化水素鎖は分枝状又は直鎖状であり得る。炭化水素鎖がスペーサーに付着するために必要な官能基は、上述した脂質部分の一部を形成し、アシル基、スルホニル基、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｓ原子などを含むことができる。
【００２４】
したがって、スペーサーの付着は、エステル、スルホニルエステル、チオエステル、アミド又はスルホンアミドを介して行われ得る。好ましくは、炭化水素鎖は、アシル基を介してアミド結合の形でスペーサーのアミノ基に接合される。よって、炭化水素鎖は、特にアルカノイル基形態の一部であり得る。
【００２５】
特定の理論にその解釈の制限を受けようとするものではないが、親油性脂質部分は血流内でアルブミンと結合することにより、本発明の化合物が血流内のさまざまな分解酵素の基質として反応することを防止して、その生体内半減期を向上させるものとされる。
【００２６】
本発明において、オキシントモジュリンペプチド類似体内の一つ以上のアミノ酸側鎖は、ポリマー性部分とスペーサーを介して親油性脂質部分に接合され、このような化学的変形は、本発明のオキシントモジュリンペプチド誘導体の生体内可用性又は／及び半減期を増加させたり、生体利用率を増加させたりするなどの薬学的に有利な効果を誘導することができる。
【００２７】
前記式Ｉのアミノ酸配列を含む新規なペプチドは、天然型のオキシントモジュリンの２番位に存在するＳｅｒ残基をＡｉｂに置換して製造することができる。本発明の前記実施態様で提示された化合物は、オキシントモジュリンペプチド類似体Ｘ１位にＡｉｂが導入された場合であって、天然型のオキシントモジュリンと比較してジペプチジルペプチダーゼＩＶに対してさらに大きい抵抗性を有するものとされる。結果的に、本発明のオキシントモジュリンペプチド類似体は、天然型のオキシントモジュリンに比べて改善された生体内安定性を有する。
【００２８】
また、前記本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体は、天然型のオキシントモジュリンの２７番位に存在するＭｅｔ残基をＬｅｕに置換し、２８番位に存在するＡｓｎ残基をＡｒｇに置換し、２９番位に存在するＴｈｒ残基をＡｌａに置換して製造することができ、例えば、下記実施態様中の化合物１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ。１３）の場合、Ｘ１１位をＬｅｕ、Ｘ１２位をＡｒｇ、Ｘ１３位をＡｌａにそれおぞれ置換して製造したものである。
【００２９】
本発明において、好ましいオキシントモジュリンペプチド誘導体は、下記式Ｉ−１のアミノ酸配列を含む新規なペプチドである。
【００３０】
＜式Ｉ−１＞
ＨＸ１ＱＧＴＦＴＳＤＸ３ＳＫＹＬＤＸ９ＲＲＡＸ１０ＤＦＶＱＷＬＸ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６（配列番号配列番号５０）
前記アミノ酸配列において、
Ｘ１はＳｅｒ又はＡｉｂ（アミノイソ酪酸）であり；
Ｘ３はＴｙｒ又はＺであり；
Ｘ９はＳｅｒ、Ａｉｂ又はＺであり；
Ｘ１０はＧｌｎ又はＺであり；
Ｘ１１はＭｅｔ又はＬｅｕであり；
Ｘ１２はＡｓｎ又はＡｒｇであり；
Ｘ１３はＴｈｒ又はＡｌａであり；
Ｘ１４はＬｙｓ又はＺであり；
Ｘ１５は、ＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号配列番号５１）であるか存在せず；
Ｘ１６は、Ｘ１５が存在する場合、Ｚであるか存在せず、Ｃ末端はアミド化でき、
Ｚは前記式Ｉで定義したとおりである。
【００３１】
前記式Ｉのペプチド類似体を含む実施態様には、化合物１（配列番号配列番号２）、化合物２（配列番号配列番号３）、化合物３（配列番号配列番号４）、化合物４（配列番号配列番号５）、化合物５（配列番号配列番号６）、化合物６（配列番号配列番号７）、化合物７（配列番号配列番号８）、化合物８（配列番号配列番号９）、化合物９（配列番号配列番号１０）、化合物１０（配列番号配列番号１１）、化合物１１（配列番号配列番号１２）、化合物１２（配列番号配列番号１３）、化合物１３（配列番号配列番号１４）、化合物１５（配列番号配列番号１６）、化合物１６（配列番号配列番号１７）、化合物１７（配列番号配列番号１８）、化合物１８（配列番号配列番号１９）を含むことができる。
【００３２】
また、前記本発明に係る式Ｉのオキシントモジュリンペプチド類似体は、アミノ酸配列内に一つ以上の分子内架橋、すなわち、Ｘ９とＸ１０は分子内結合（ラクタム化、ジスルフィド（ｄｉ−ｓｕｌｆｉｄｅ）結合）又は架橋剤（ｃｒｏｓｓ  ｌｉｎｋｅｒ）を介して環状ペプチドを形成することができる。
【００３３】
したがって、本発明の他の目的は、下記式ＩＩのアミノ酸配列を含む新規なオキシントモジュリンペプチド類似体を提供することである。
＜式ＩＩ＞
Ｈｉｓ−Ｘ１７−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｘ１８−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｘ１９−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘ２０−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ（配列番号配列番号５３）
式中、
Ｘ１７はＳｅｒ又はＡｉｂ（アミノイソ酪酸）であり；
Ｘ１８はＺであり；
Ｘ１９はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｈｃｙ（ホモシステイン）、Ｌｙｓ又はＯｒｎ（オルニチン）であり；
Ｘ２０はＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｈｃｙ（ホモシステイン）、Ｌｙｓ又はＯｒｎ（オルニチン）であり；
Ｘ１９とＸ２０は、分子内結合又は架橋剤を介して環状ペプチドを形成することができ、このとき、環状ペプチドは、２つの残基の間にアミド結合で形成されたラクタム環、又は２つの残基の間にジスルフィド結合で形成されたジスルフィド環、又は２つの残基の間に架橋剤結合で形成された架橋環を有するペプチドであり；
Ｃ末端のアミノ酸は任意にアミド化でき；
Ｚは、官能化されたＬｙｓであって、その側鎖にポリマー性部分とスペーサーの接合体であるＺ１と親油性脂質部分であるＺ２が接合された形態であり、ここで、Ｚ１はアシル官能基を介してＬｙｓ側鎖に直接接合され、Ｚ２はＺ１を介してＬｙｓ側鎖に接合され、Ｚ１は下記構造式（１）又は（２）であり、
【００３４】
【化５】
2020531442.tif 000007
【００３５】
【化６】
2020531442.tif 000008
【００３６】
Ｚ２は下記構造式（３）又は（４）である。
【００３７】
【化７】
2020531442.tif 000009
【００３８】
【化８】
2020531442.tif 000010
【００３９】
Ｘ１９とＸ２０の分子内結合は、Ｘ１９とＸ２０がそれぞれＡｓｐ（又はＧｌｕ）とＬｙｓ（又はＯｒｎ）であるとき、又はそれぞれＬｙｓ（又はＯｒｎ）とＡｓｐ（又はＧｌｕ）であるときには、分子内ラクタム環形成結合であるか；或いは、Ｘ１９とＸ２０がそれぞれＣｙｓ（又はＨｃｙ）とＣｙｓ（又はＨｃｙ）であるときには、分子内ジスルフィド環形成結合であり；
Ｘ１９とＸ２０がそれぞれＣｙｓ（又はＨｃｙ）とＣｙｓ（又はＨｃｙ）であるとき、架橋剤は、両方のＣｙｓ（又はＨｃｙ）側鎖のチオール官能基に結合されて環を形成し、このとき、架橋剤は、Ｃ１−Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ３−Ｃ８飽和又は不飽和シクロアルキル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、又はＣ５−Ｃ１２ヘテロアリール又は融合されたヘテロサイクリックアリールであり、好ましくは、
【００４０】
【化９】
2020531442.tif 000011
【００４１】
であり；
Ｒは水素又はＣ１−Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキルであり；
Ｘ１９とＸ２０がそれぞれＡｓｐ（又はＧｌｕ）とＡｓｐ（又はＧｌｕ）であるとき、架橋剤は、両方のＡｓｐ（又はＧｌｕ）側鎖のカルボキシル基にアミド結合で環を形成し、このとき、架橋剤は、ジアミノＣ１−Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキル、ジアミノＣ３−Ｃ８飽和又は不飽和シクロアルキル、アミノピペリジン、ピペラジン、ジアミノＣ６−Ｃ１０アリール、又はジアミノＣ５−Ｃ１２ヘテロアリール又は融合されたヘテロサイクリックアリールであり、
好ましくは、
【００４２】
【化１０】
2020531442.tif 000012
【００４３】
であり；
Ｒは水素又はＣ１−Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキルであり；
Ｘ１９とＸ２０がそれぞれＬｙｓ（又はＯｒｎ）とＬｙｓ（又はＯｒｎ）であるとき、架橋剤は、両方のＬｙｓ（又はＯｒｎ）側鎖のアミン基にアミド結合で環を形成し、このとき、架橋剤は、ジカルボニルＣ１−Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキル、ジカルボニルＣ３−Ｃ８飽和又は不飽和シクロアルキル、ジカルボニルＣ６−Ｃ１０アリール又はジカルボニルＣ５−Ｃ１２ヘテロアリール又は融合されたヘテロサイクリックアリールであり、好ましくは、
【００４４】
【化１１】
2020531442.tif 000013
【００４５】
であり；
Ｒは水素又はＣ１−Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキルであり；
Ｘ１９とＸ２０がそれぞれＡｓｐ（又はＧｌｕ）とＬｙｓ（又はＯｒｎ）であるとき、又は、それぞれＬｙｓ（又はＯｒｎ）とＡｓｐ（又はＧｌｕ）であるとき、架橋剤は、Ａｓｐ（又はＧｌｕ）側鎖のカルボキシル基と架橋剤のアミン官能基とアミド結合で連結され、Ｌｙｓ（又はＯｒｎ）側鎖のアミン基には、架橋剤のカルボキシル官能基とアミド結合で連結されて環を形成し、このとき、架橋剤は、αアミノ酸（Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅなど）、βアミノ酸、カルボニルＣ１−Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキルアミン、カルボニルＣ３−Ｃ８飽和又は不飽和アルキルアミン、カルボニルピペリジン、アミノベンゾイル、カルボニルＣ６−Ｃ１０アリールアミン又はカルボニルＣ５−Ｃ１２ヘテロアリールアミン又は融合されたヘテロサイクリックアリールアミンであり、好ましくは、
【００４６】
【化１２】
2020531442.tif 000014
【００４７】
であり；
Ｒは水素又はＣ１−Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキルである。
【００４８】
前記式Ｉのアミノ酸配列内に一つ以上の分子内架橋を持つことができる式ＩＩのペプチド類似体を含む実施態様には、化合物１４（配列番号１５）、化合物１９（配列番号２０）、化合物２０（配列番号２１）、化合物２１（配列番号２２）、化合物２２（配列番号２３）、化合物２３（配列番号２４）、化合物２４（配列番号２５）、化合物２５（配列番号２６）、化合物２７（配列番号２８）、化合物２８（配列番号２９）、化合物２９（配列番号３０）、化合物３０（配列番号３１）、化合物３１（配列番号３２）、化合物３２（配列番号３３）、化合物３３（配列番号３４）、化合物３４（配列番号３５）、化合物３５（配列番号３６）、化合物３６（配列番号３７）、化合物３７（配列番号３８）、化合物３８（配列番号３９）を含むことができる。
【００４９】
前記式ＩＩのペプチドの架橋は、式Ｉの配列内で３個のアミノ酸の間隔を置いて分離された２つの任意のアミノ酸がそれぞれ含んでいる残基内又は側鎖内の任意の官能基間の化学的共有結合、又はイオン間の相互作用によって行われ得る。好ましくは、Ｘ１９残基とＸ２０残基のアミノ酸側鎖同士にラクトン環、ラクタム環又はジスルフィド環を形成しながら架橋が行われることもあり、Ｘ１９残基とＸ２０残基のアミノ酸側鎖と架橋剤の連結を介して環を形成しながら架橋が行われることもある。
【００５０】
前記式ＩＩのアミノ酸配列を含む新規なペプチドは、天然型のオキシントモジュリンの１６番位に存在するＳｅｒ残基をＣｙｓ又はＨｃｙに置換し、２０番位に存在するＧｌｎ残基をＣｙｓ又はＨｃｙに置換した後、分子内ジスルフィド環を形成して製造することができ、例えば、下記実施態様中の化合物２８（配列番号２９）の場合には、Ｘ１９位をＣｙｓ、Ｘ２０位をＣｙｓにそれぞれ置換した後、分子内ジスルフィド環を形成して製造することができる。
【００５１】
また、前記本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体は、天然型のオキシントモジュリンの１６番位に存在するＳｅｒ残基をＣｙｓ又はＨｃｙに置換し、２０番位に存在するＧｌｎ残基をＣｙｓ又はＨｃｙに置換した後、架橋剤で２残基を連結して環を形成して製造することができ、例えば、下記実施態様中の化合物２２（配列番号２３）の場合には、Ｘ１９位をＣｙｓ、Ｘ２０位をＣｙｓにそれぞれ置換した後、架橋剤で２残基を連結して環を形成して製造することができる。
【００５２】
また、前記本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体は、天然型のオキシントモジュリンの１６番位に存在するＳｅｒ残基をＡｓｐ又はＧｌｕに置換し、２０番位に存在するＧｌｎ残基をＬｙｓ又はＯｒｎに置換した後、分子内ラクタム環を形成して製造することができ、例えば、下記実施態様中の化合物２６（配列番号２７）の場合には、Ｘ１９位をＡｓｐ、Ｘ２０位をＬｙｓにそれぞれ置換した後、分子内ラクタム環を形成して製造することができ、化合物１４（配列番号１５）、化合物１９（配列番号２０）、化合物２０（配列番号２１）、化合物２４（配列番号２５）、化合物２５（配列番号２６）の場合には、Ｘ１９位をＧｌｕ、Ｘ２０位をＬｙｓにそれぞれ置換した後、分子内ラクタム環を形成して製造することができる。
【００５３】
また、前記本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体は、天然型のオキシントモジュリンの１６番位に存在するＳｅｒ残基をＡｓｐ又はＧｌｕに置換し、２０番位に存在するＧｌｎ残基をＬｙｓ又はＯｒｎに置換した後、架橋剤で２残基を連結して環を形成して製造することができ、例えば、下記実施態様中の化合物３７（配列番号３８）、化合物３８（配列番号３９）の場合には、Ｘ１９位をＡｓｐ、Ｘ２０位をＬｙｓにそれぞれ置換した後、架橋剤で２残基を連結して環を形成して製造することができ、化合物３３（配列番号３４）、化合物３４（配列番号３５）、化合物３５（配列番号３６）、化合物３６（配列番号３７）の場合、Ｘ１９位をＧｌｕ、Ｘ２０位をＬｙｓにそれぞれ置換した後、架橋剤で２残基を連結して環を形成して製造することができる。
【００５４】
また、前記本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体は、天然型のオキシントモジュリンの１６番位に存在するＳｅｒ残基をＬｙｓ又はＯｒｎに置換し、２０番位に存在するＧｌｎ残基をＡｓｐ又はＧｌｕに置換した後、分子内ラクタム環を形成して製造することができ、例えば、下記実施態様中の化合物２１（配列番号２２）の場合、Ｘ１９位をＬｙｓ、Ｘ２０位をＧｌｕに置換した後、分子内ラクタム環を形成して製造することができ、化合物２７（配列番号２８）の場合、Ｘ１９位をＬｙｓ、Ｘ２０位をＡｓｐにそれぞれ置換した後、分子内ラクタム環を形成して製造することができる。
【００５５】
また、前記本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体は、天然型のオキシントモジュリンの１６番位に存在するＳｅｒ残基をＬｙｓ又はＯｒｎに置換し、２０番位に存在するＧｌｎ残基をＡｓｐ又はＧｌｕに置換した後、架橋剤で２残基を連結して環を形成して製造することができ、例えば、下記実施態様中の化合物３２（配列番号３３）の場合には、Ｘ１９位をＬｙｓ、Ｘ２０位をＧｌｕにそれぞれ置換した後、架橋剤で２残基を連結して環を形成して製造することができる。
【００５６】
また、前記本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体は、天然型のオキシントモジュリンの１６番位に存在するＳｅｒ残基をＡｓｐ又はＧｌｕに置換し、２０番位に存在するＧｌｎ残基をＡｓｐ又はＧｌｕに置換した後、架橋剤で２残基を連結して環を形成して製造することができ、例えば、下記実施態様中の化合物２３（配列番号２４）、化合物２９（配列番号３０）、化合物３０（配列番号３１）の場合、Ｘには１９位をＧｌｕ、Ｘ２０位をＧｌｕにそれぞれ置換した後、架橋剤で２残基を連結して環を形成して製造することができる。
【００５７】
また、前記本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体は、天然型のオキシントモジュリンの１６番位に存在するＳｅｒ残基をＬｙｓ又はＯｒｎに置換し、２０番位に存在するＧｌｎ残基をＬｙｓ又はＯｒｎに置換した後、架橋剤で２残基を連結して環を形成して製造することができ、例えば、下記実施態様中の化合物３１（配列番号３２）の場合には、Ｘ１９位をＬｙｓ、Ｘ２０位をＬｙｓにそれぞれ置換した後、架橋剤で２残基を連結して環を形成して製造することができる。
このような分子内架橋は、ペプチドのアルファ螺旋構造を安定化させてＧＬＰ−１受容体及び／又はグルカゴン受容体においてその選択性や薬理上効能を増加させるものとされる(ACS Chem Biol. 2016;11:324-328)。
【００５８】
本発明のオキシントモジュリンペプチド類似体は、化学的に変形することができる。特に、ペプチドをなすそれぞれのアミノ酸残基は、様々なスペーサー又はリンカーと直接連結でき、また、それぞれの残基は、アルキル化、ジスルフィド結合形成、金属錯化、アミド化、エステル化、酸化、還元などの化学的反応を起こして、該当する化学的産物に変形することができる。特に、本発明のオキシントモジュリンペプチド類似体の構造に存在する任意のカルボキシ末端又はアミノ末端は、エステル化、アミド化、アシル化などによって類似体化できる。さらに、本発明のオキシントモジュリンペプチド類似体は、その構造に存在する任意のアミン基の酸付加塩、又は任意のカルボキシ基のカルボン酸塩又はそのアルカリ付加塩として提供できる。
【００５９】
また、本発明は、前記ペプチド類似体を有効成分とし、医薬的に許容される賦形剤を含む、肥満又は過体重及びこれを伴う糖尿病の予防及び治療用医薬組成物に関するものである。
本発明の用語「予防」とは、目的とする疾患の発症を抑制又は遅延させる全ての行為を意味する。また、本発明の用語「治療」とは、発生した病気の症状を軽減、改善又は緩和させる全ての行為を意味する。
【００６０】
特に、本発明のペプチド類似体は、グルカゴン受容体とＧＬＰ−１受容体に対する二重アゴニストであって、食物摂取におけるＧＬＰ−１の効果と脂肪代謝とエネルギー消費におけるグルカゴンの効果を全て示すので、本発明のペプチド類似体を含む肥満又は過体重及びこれを伴う糖尿病の予防及び治療用医薬組成物は、過度に蓄積された脂肪の除去と食物摂取抑制の組み合わせ効果によって体重調節において医学的に有利な効果を誘導することができる。
【００６１】
また、本発明のペプチド類似体とこれを含む医薬組成物は、血糖を減少させるので、肥満を伴う糖尿病の予防又は治療に使用できる。特に肥満を伴うインスリン非依存性糖尿病である２型糖尿病を治療するために使用できる。特定の理論にその解釈の制限を受けようとするものではないが、本発明のペプチド類似体を含む医薬組成物は、グルカゴン誘導体の一つであって血糖を減少させる役割をするＧＬＰ−１受容体への活性が高いため、究極的には血糖調節に有用である。
【００６２】
したがって、本発明のペプチド類似体を含む医薬組成物は、肥満、病的肥満、手術前病的肥満、肥満関連炎症、肥満関連胆嚢疾患、肥満誘導された睡眠無呼吸、肥満を伴う糖尿病の治療及び予防などの、過体重によって引き起こされるか特徴付けられる任意の病態の直接又は間接治療法の一環として、単独で投与されるか、或いは他の関連薬剤と併用投与され得る。また、本発明のペプチド類似体を含む医薬組成物は、体重による効果の結果であるか、これに関連している可能性のある病態、例えば、代謝症候群、高血圧、動脈硬化誘発脂質異常症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、冠状動脈心臓病、又は脳卒中の予防のために単独で投与されるか或いは他の関連薬剤と併用投与され得る。
【００６３】
本発明において、「投与」は、適切な方法で患者に治療用途の物質を導入することを意味し、本発明のペプチド類似体を含む医薬組成物は、薬物が目的の組織に到達して目的の効能を示すことができる限り、さまざまな製剤の形で様々な経路を介して投与できる。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与などが可能であるが、その剤形と投与方法は制限されない。
【００６４】
本発明のオキシントモジュリンペプチド類似体を含む医薬組成物は、医薬的に許容される担体を含むことができる。医薬的に許容される担体は、経口投与の場合には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを多様に使用することができる。
【００６５】
本発明のオキシントモジュリンペプチド類似体の製剤化に使用できる担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシア、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム又は鉱物油などがある。
【００６６】
本発明のオキシントモジュリンペプチド類似体を含む医薬組成物は、上述し担体と混合して多様に製造できる。例えば、経口投与の場合には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ、ウェーハなどの形で製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプル又は多数回投薬の形で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤などにも剤形化することができる。
【００６７】
本発明に係る投与量又は服用量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、排泄率及び疾患の重症度に応じてその範囲が多様であり、成人を基準とした投与量は、１日当たり０．００１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇであり得る。
【発明の効果】
【００６８】
本発明は、新規のアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体を提供し、本発明によるペプチド類似体は、天然型のオキシントモジュリンに比べてＧＬＰ−１受容体とグルカゴン受容体の両方に対してさらに優れた活性を持っている。特に、本発明は、ＧＬＰ−１受容体に比べてグルカゴン受容体アゴニストとしてより高い生物学的活性を示す。
【００６９】
したがって、本発明に係る新規のアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体を含む医薬組成物は、一次的に肥満又は過体重によって引き起こされるか特徴付けられる病態の予防又は治療に有用に適用でき、さらには肥満又は過体重を伴うインスリン非依存性糖尿病の予防又は治療の目的のためにも使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明によるアシル化オキシントモジュリン類似体のマウスから単回体重減少薬効評価結果を示すグラフである。
【図２】本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体のマウスで１週間繰り返し体重減少薬効評価結果を示すグラフであって、図２ａは体重減少結果、図２ｂは累積飼料摂取量結果を示すグラフである。
【図３】本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体のラットから５日繰り返し体重減少薬効評価結果を示すグラフであって、図３ａは体重減少結果、図３ｂは累積飼料摂取量結果を示すグラフである。
【図４】本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体のマウスで１０日繰り返し体重減少薬効評価結果を示すグラフであって、図４ａは体重減少結果、図４ｂは累積飼料摂取量結果を示すグラフである。
【図５】本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体のマウスで１０日繰り返し体重減少薬効評価結果を示すグラフであって、図５ａは体重減少結果、図５ｂは累積飼料摂取量結果を示すグラフである。
【図６】本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体のマウスで１週間繰り返し体重減少薬効評価結果を示すグラフであって、図６ａは体重減少結果、図６ｂは累積飼料摂取量結果を示すグラフである。
【図７】本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体のマウスで２週間繰り返し体重減少薬効評価結果を示すグラフであって、図７ａ及び図７ｃは体重減少結果、図７ｂは図７ａに表記されたアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体の累積飼料摂取量結果を示すグラフ、図７ｄは図７ｃに表記されたアシルオキシントモジュリンペプチド類似体の累積飼料摂取量結果を示すグラフである。
【図８】本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体のマウスで２週間繰り返し体重減少薬効評価結果を示すグラフであって、図８ａは体重減少結果、図８ｂは累積飼料摂取量結果を示すグラフである。
【図９】本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体のマウスで５日繰り返し体重減少薬効評価結果を示すグラフであり、図９ａは体重減少結果、図９ｂは累積飼料摂取量結果を示すグラフである。
【図１０】本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体のマウスで４週間繰り返し体重減少薬効評価結果を示すグラフであって、図１０ａは体重減少結果、図１０ｂは体脂肪減少結果、図１０ｃは累積飼料摂取量結果を示すグラフである。
【図１１】本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体のマウスで耐糖能改善効果検定結果を示すグラフである。
【図１２】本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体のマウスで６週間繰り返し血糖調節薬効評価結果を示すグラフであって、図１２ａは最終非絶食血糖結果、図１２ｂは糖化ヘモグロビン上昇抑制結果を示すグラフである。
【図１３】本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体のマウスで４週間繰り返し血糖調節薬効評価結果を示すグラフであって、図１３ａは経時的な非絶食血糖結果、図１３ｂは糖化ヘモグロビン上昇抑制及び改善に対する結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
本発明についてのより具体的な内容を下記の実施例及び実験例によって説明する。これらの実施例は、本発明の理解を助けるためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
＜実施例１＞アシル化オキシントモジュリンペプチド類似体の合成
本発明の一部のアミノ酸が含まれているペプチドと定型的なペプチド配列は、商業化されたペプチド合成会社、例えば、米国のＡｍｅｒｉｃａｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐａｎｙやＢａｃｈｅｍ、又は韓国のＡｎｙｇｅｎから合成及び購入が可能である。
【００７２】
本発明において、アシル化オキシントモジュリンペプチド類似体を合成するために、自動合成器であるｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．社製のＳｙｍｐｈｏｎｙ  Ｘ（合成ｓｃａｌｅ：０．１ｍｍｏｌ）モデルを用いた。本発明によって合成されたアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体化合物１（配列番号２）乃至化合物３８（配列番号３９）の構造は、表１及び表２に示した。具体的な合成過程は、次のとおりである。
【００７３】
Ｆｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨ（１ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１ｍｍｏｌ）、ＮＭＭ（ｎ−ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ）（２ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（７ｍｌ）の混合液を、Ｆｍｏｃが除去されたレジン（ｒｅｓｉｎ）に入れ、室温で１時間撹拌する。反応液を排出させ、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎａｍｉｄｅ）７ｍｌで２回洗浄する。２０％ピペリジンＤＭＦ溶液（５ｍｌ）でＦｍｏｃ除去（ｃｌｅａｖａｇｅ）反応を室温で５分間、２回行った後、ＤＭＦ（７ｍｌ）で６回洗浄する。この過程を自動合成器を用いて繰り返しながらアミノ酸をカップリング（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）させる。
【００７４】
Ｋ（Ｌｙｓ）ｓｉｄｅはＦｍｏｃ−Ｋ（ｄｄｅ）−ＯＨを用いてカップリングし、最後のＨ（Ｈｉｓ）はＢｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−ＯＨを用いてカップリングする。２％ヒドララジン（ｈｙｄｒａｌａｚｉｎｅ）を用いて保護化されたｄｄｅの除去後、ＰＥＧ２、ｒＥ、Ｃ１８、Ｃ１８  ｄｉａｃｉｄなどをカップリングさせる。ラクタム環は、Ｇｌｕ（Ｏａｌｌ）及びＬｙｓ（Ａｌｌｏｃ）に組み込まれたアミノ酸を用いてカップリングし、保護基の除去後に過量のＨＢＴＵ及びＤＩＰＥＡを用いてラクタム結合を行う。ジスルフィド環は、保護基に組み込まれたＳｅｒアミノ酸を用いてカップリングし、保護基の除去後にジスルフィド結合を行う。架橋剤を導入しようとする位置に適切な保護基に組み込まれたアミノ酸を用いてカップリングし、保護基の除去後にアミドカップリング試薬などを用いて架橋剤と２つのアミノ酸間の結合を行う。
【００７５】
上記で得たペプチド−レジン（ｐｅｐｔｉｄｅ−ｒｅｓｉｎ）０．１ｍｍｏｌにＲｅａｇｅｎｔ  Ｋ（トリフルオロ酢酸、水、チオアニソール、１，２−エタンジチオール（８７．５、５．０、５．０、２．５））溶液８ｍｌを５〜１０℃に冷却した後、室温で２〜３時間撹拌する。ｄｒａｉｎの後、少量のＴＦＡでレジンを洗浄し、ろ液を合わせてジエチルエーテル１００ｍｌに入れて結晶化させた後、生成された固体を濾過し、粗（ｃｒｕｄｅ）ペプチドを得る。得られた粗ペプチドをｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ＨＰＬＣで精製して目的化合物を得る。
【００７６】
分子量分析はｓｈｉｍａｄｚｕＡｘｉｍａ  Ａｓｓｕｒａｎｃｅ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用い、ＭａｔｒｉｘはＣＨＣＡ（α−Ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）を用いた。
【００７７】
【表１−１】
2020531442.tif 000015
【００７８】
【表１−２】
2020531442.tif 000016
【００７９】
【表１−３】
2020531442.tif 000017
【００８０】
【表１−４】
2020531442.tif 000018
【００８１】
【表２−１】
2020531442.tif 000019
【００８２】
【表２−２】
2020531442.tif 000020
【００８３】
【表２−３】
2020531442.tif 000021
【００８４】
＜比較例１＞オキシントモジュリンペプチド類似体の合成
本発明と比較するために、構造的に類似性を持つオキシントモジュリンペプチド類似体を、実施例１の方法で合成した。下記化合物３９は、非アシル化オキシントモジュリンペプチド類似体であり、化合物４０及び４１は、アシル化位置が異なるオキシントモジュリンペプチド類似体であり、化合物４２乃至４６は、アシル化末端が異なるオキシントモジュリンペプチド類似体であり、化合物４７は、大韓民国公開特許公報第２０１２−１３９５７９号に公知になっているものであり、リング構造を持つ非アシル化オキシントモジュリンペプチド類似体である。前記化合物３９乃至４７の合成されたオキシントモジュリンペプチド類似体の構造は、表３及び表４に示した。
【００８５】
【表３】
2020531442.tif 000022
【００８６】
【表４】
2020531442.tif 000023
【００８７】
＜実験例１＞ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体の活性化能検定
細胞にヒトＧＬＰ−１又はグルカゴン受容体を一時的に過発現させ、本発明の類似体が受容体を活性化させることにより増加するサイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）が順次サイクリックアデノシン一リン酸反応性プロモーター（ＣＲＥ）を活性化させると、以後増加するルシフェラーゼ活性度を、各受容体の活性化に対する効能の意味で評価した。
【００８８】
陽性対照薬物としては、ＧＬＰ−１とグルカゴンをそれぞれの評価に使用した。ＧＬＰ−１アゴニストである糖尿病治療薬としての承認を受けたリラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）及びセマグルチド（Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅ）、オキシントモジュリンペプチド類似体である臨床第２相試験中のＭＥＤＩ０３８２(Diabetes, Obesity and Metabolism 2016; 18: 1176-1190, Lancet 2018; 391: 2607-2618)及び前記化合物３９乃至４７のペプチドを合成し、これを比較例として使用した。
【００８９】
細胞は、中国ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）にヒトＧＬＰ−１又はグルカゴン発現ベクター（Ｏｒｉｇｅｎｅ社製）をホタルルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）又はウミシイタケルシフェラーゼ（ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の発現を誘導することができるそれぞれのプラスミドＤＮＡと一緒にリポフェクタミンプラス試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて前記細胞に一時的にトランスファクションさせた。３時間トランスフェクションの後、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む栄養培地（α−ＭＥＭ）に交換した。翌日、本発明の類似体及び０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むα−ＭＥＭ培地に交換し、６時間後に、細胞が浸漬された培地と同量のデュアルルシフェラーゼ検索試薬（Ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｒｅａｇｅｎｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えて、連続的にホタルルシフェラーゼ及びウミシイタケルシフェラーゼの活性を測定した。ホタルルシフェラーゼ活性は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性に補正してトランスフェクションに対する効率を算出した。
【００９０】
受容体の活性効能は、本発明の類似体に対する多重濃度評価を実施し、本発明の類似体のＧＬＰ−１又はグルカゴン最大効果に対する相対的活性化度（％）を求め、５０％の活性化を示す濃度（ＥＣ５０）を非線形回帰分析を用いて算出した値を表５に示した。
【００９１】
【表５−１】
2020531442.tif 000024
【００９２】
【表５−２】
2020531442.tif 000025
【００９３】
実験の結果、本発明によるアシル化オキシントモジュリン類似体の化合物は、内因性ホルモンオキシントモジュリンよりもＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対するＥＣ５０値が著しく低いため、ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する活性が優れることが分かる。また、現在市販されている糖尿病治療薬であるリラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）とセマグルチド（Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅ）とを比較した場合には、ＧＬＰ−１受容体に対する活性が優れており、現在臨床中のオキシントモジュリンペプチド類似体であるＭＤＩ０３８２と比較した場合には、グルカゴン受容体に対する活性は優れており、ＧＬＰ−１受容体に対する活性は類似している。
【００９４】
本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体である化合物３は、非アシル化オキシントモジュリンペプチド類似体である比較例の化合物３９と比較した場合にはＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する活性を非常に増加させたことが分かるので、オキシントモジュリンペプチド類似体のアシル化は活性の増加に大きな影響を及ぼすものと評価される。
【００９５】
また、Ｘ２位にアシル化された比較例の化合物４０とＸ１４位にアシル化された比較例の化合物４１は、それぞれＸ３、Ｘ９、Ｘ１０位にアシル化された本発明による化合物３、化合物１５、化合物１６と比較した場合には、ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する活性が非常に減少したことが分かるので、オキシントモジュリンペプチド類似体に対するアシル化位置が活性に大きな影響を与えるものと評価される。
【００９６】
また、Ｚ１のポリマー性部分であって２−（２−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈｏｘｙ）ａｃｅｔｏｙｌ基がそれぞれ１〜４個からなる本発明によるアシル化された化合物３、化合物１０、化合物１７、化合物１８は、２−（２−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈｏｘｙ）ａｃｅｔｏｙｌ基の個数によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性の差はなく、いずれもＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する活性が優れている。
【００９７】
また、Ｚ２であって親油性脂質部分の末端にカルボン酸を有するアシル化された比較例の化合物４２、化合物４３、化合物４４は、脂質炭素の長さに関係なく、親油性脂質部分の末端が炭化水素である本発明による化合物３のようなアシル化化合物に比べて、ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する低い活性を示した。また、Ｚ２であって親油性脂質部分の末端にカルボン酸とＧｌｙ、Ｖａｌで結合された構造を持つ比較例の化合物４５、化合物４６は、親油性脂質部分の末端が炭化水素である本発明による化合物３のような化合物に比べて、ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する低い活性を示すため、Ｚ２であって親油性脂質部分の末端に極性置換基を有するアシル化化合物は、低いｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を示すことが分かる。
【００９８】
また、非アシル化オキシントモジュリン環状ペプチド類似体である比較例の化合物４７は、分子内の同じ形式のラクタム環構造を持つアシル化された本発明による化合物１４に比べて、グルカゴン受容体に対する低い活性を示すため、オキシントモジュリンペプチド類似体のアシル化は活性の増加を誘導することが分かる。
【００９９】
また、本発明によるアシル化オキシントモジュリン環状ペプチド類似体のうち、ジスルフィドで分子内結合を持つ化合物２８は、他のアシル化オキシントモジュリン環状ペプチド類似体化合物２２に比べて、ＧＬＰ−１及びグルカゴン受容体に対する低い活性を示すため、アシル化オキシントモジュリン環状ペプチド類似体の分子内環の大きさが活性に影響を与えることが分かる。
＜実験例２＞本発明によるペプチドの単回体重減少薬効評価
本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体の体重減少薬効を評価するために、オス実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ｍｏｕｓｅ）に高脂肪含有食餌を供給し、高脂肪の食餌によって肥満が誘導されたマウスを用いて実験前の体重によって群分離した後、評価した。本発明による化合物３を０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０が含有されている蒸留水に溶解し、１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量となるように調製した後、マウスに単回皮下注射した。その後、毎日１回、一定の時間に体重及び飼料摂取量を測定し、その結果を図１に示した。
【０１００】
実験の結果、溶媒のみを注射した対照群に比べて、累積飼料摂取量の有意な差がないにも拘らず、対照群の体重減少率に比べて化合物３の注射後に体重減少が観察された。その効果が４日間持続されることが分かる。よって、生体内で不安定であって非常に短い半減期を示すので、体重減少薬効評価のためには１日１回以上の投与が必要なオキシントモジュリンに比べて、本発明のアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体は、化学的安定性の改善により、単回投与のみでも体重減少に対する薬効が一定期間維持できることが分かる。
＜実験例３＞本発明によるペプチドの１週間繰り返し体重減少薬効評価
本実験は、本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体の体重減少薬効を市販中の糖尿病／肥満治療薬と比較するために、オス実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ｍｏｕｓｅ）に高脂肪含有食餌を供給し、高脂肪の食餌によって肥満が誘導されたマウスを用いて実験前の体重によって群分離した後、評価した。本発明の実施例のうち、化合物３を０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０が含有されている蒸留水に溶解して１００ｎｍｏｌ／ｋｇ又は３００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量となるように調製し、対照物質として、糖尿病／肥満治療薬として市販されているリラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）を同じ溶媒に溶解して１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量となるように調製した後、表６に記載されているように、１日１回合計６日間皮下注射した。毎日１回、一定の時間に体重及び飼料摂取量を測定して、リラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）とアシル化オキシントモジュリン類似体の体重減少薬効を比較し、７日目から投与を中止し、体重の回復を確認することにより、その結果を図２ａ及び図２ｂに示した。
【０１０１】
【表６】
2020531442.tif 000026
【０１０２】
実験の結果、本発明による化合物３とリラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）を同じ用量（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）で注射した群の累積飼料摂取量に有意な差がないにも拘らず、リラグルチドの場合は約１２．２％の体重が減少し、化合物３の場合は約２４．６％の体重が減少した。また、化合物３の用量を３００ｎｍｏｌ／ｋｇで注射した場合には、体重が約３７．８％減少したことが分かるので、本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体は、リラグルチドよりも２倍以上優れた用量依存的な体重減少効果があり、投与中止後にもビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）対照群に比べて低い体重を維持した。
＜実験例４＞本発明によるペプチドの５日繰り返し体重減少薬効評価
本実験は、本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体の最大体重減少効果を確認するために、オス実験用ラット（Ｗｉｓｔａｒ  ｒａｔ）に高脂肪含有食餌を供給し、高脂肪の食餌によって肥満が誘導されたラットを用いて実験前の体重によって群分離した後、評価した。本発明の実施例のうち、化合物３を０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０が含有されている蒸留水に溶解して１００ｎｍｏｌ／ｋｇ又は３００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量となるように調製した後、表７に記載されているように、１日１回合計４日間皮下注射した。毎日１回、一定の時間に体重及び飼料摂取量を測定して初期体重に比べて経時的な体重減少薬効を確認し、５日目から投与を中止し、体重の回復を確認することにより、その結果を図３ａ及び図３ｂに示した。
【０１０３】
【表７】
2020531442.tif 000027
【０１０４】
実験の結果、ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）対照群に比べて、化合物３を注入した群の累積飼料摂取量に有意な差を示し、両方の用量とも約１２．５％レベルの体重減少薬効が観察された。投与中止後も、ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）対照群に比べて低い体重を維持した。
＜実験例５＞本発明によるペプチドの１０日繰り返し体重減少薬効評価
本実験は、本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体の体重減少薬効を市販中の糖尿病治療薬と比較するために、オス実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ｍｏｕｓｅ）に高脂肪含有食餌を供給し、高脂肪の食餌によって肥満が誘導されたマウスを用いて実験前の体重によって群分離した後、評価した。本発明の実施例のうち、化合物３を０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０が含有されている蒸留水に溶解して１００ｎｍｏｌ／ｋｇ又は３００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量となるように調製し、糖尿病治療薬として市販されているセマグルチドを同じ溶媒に溶解して１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量となるように調製した後、表８に記載されているように、３日に１回の間隔で皮下注射し、合計１０日間評価した。毎日１回、一定の時間に体重及び飼料摂取量を測定してセマグルチドとアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体の体重減少薬効を比較し、その結果を図４ａ及び図４ｂに示した。
【０１０５】
【表８】
2020531442.tif 000028
【０１０６】
実験の結果、同じ用量（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）で、化合物３はセマグルチドよりもさらに多くの累積飼料摂取量が測定されたにも拘らず、体重減少薬効はセマグルチドに比べて優れている（化合物３：１３．９％、セマグルチド：９．７％）。また、化合物３の用量を３００ｎｍｏｌ／ｋｇで注射した場合には、体重が約１６．９％減少したことが分かるので、本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体は、セマグルチドに比べて優れた用量依存的な体重減少薬効が観察された。
＜実験例６＞本発明によるペプチドの１０日繰り返し体重減少薬効評価
本実験は、本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体の構造によって、ペプチド内のポリマー数の差又は環状ペプチドの形成による体重減少薬効を比較するために、オス実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ｍｏｕｓｅ）に高脂肪含有食餌を供給し、高脂肪の食餌によって肥満が誘導されたマウスを用いて実験前の体重によって群分離した後、評価した。本発明による化合物３、１０及び１４を０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０が含有されている蒸留水に溶解し、１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量となるように調製した後、表９に記載されているように、３日に１回の間隔で皮下注射し、合計１０日間評価した。毎日１回、一定の時間に体重及び飼料摂取量を測定して化合物３と化合物１０及び化合物１４の体重減少薬効を比較し、その結果を図５ａ及び図５ｂに示した。
【０１０７】
【表９】
2020531442.tif 000029
【０１０８】
実験の結果、同じ用量で、ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）対照群に比べて、化合物１０と化合物１４による累積飼料摂取量はそれぞれ２０％と２７％の有意な減少、化合物３による累積飼料摂取量はビヒクル対照群に比べて約１７％減少が観察された。体重減少の面では、３つの化合物はいずれも初期体重に比べて約１９〜２２％の優れた薬効、環状ペプチド化合物１４は化合物３及び化合物１０に比べて多少優れた傾向を示した。
＜実験例７＞本発明によるペプチドの１週間繰り返し体重減少薬効評価
本実験は、本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体の構造によって、ペプチド内の親油性脂質部分又はポリマー数の差による体重減少薬効を比較するために、オス実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ｍｏｕｓｅ）に高脂肪含有食餌を供給し、高脂肪の食餌によって肥満が誘導されたマウスを用いて実験前の体重によって群分離した後、評価した。本発明による化合物３、化合物１３及び化合物１８を０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０が含有されている蒸留水に溶解し、１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量となるように調製した後、表１０に記載されているように、３日に１回の間隔で皮下注射し、合計７日間評価した。毎日１回、一定の時間に体重及び飼料摂取量を測定して化合物３と化合物１３及び化合物１８の体重減少薬効を比較し、その結果を図６ａ及び図６ｂに示した。
【０１０９】
【表１０】
2020531442.tif 000030
【０１１０】
実験の結果、同じ用量で、化合物１８は化合物３と類似の優れた体重減少薬効が確認されたのに対し、化合物１３は体重に対する有意な薬効はなかった。化合物１３は、化合物３に比べて約１０倍以上鈍感なｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬効を示した。これは動物実験につながり、親油性脂質部分の末端構造による体重減少薬効消失を確認することにより、構造的な重要性を確認することができた。
＜実験例８＞本発明によるペプチドの２週間繰り返し体重減少薬効評価
本実験は、本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体のうち、環状ペプチド構造による体重減少薬効を比較するために、オス実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ｍｏｕｓｅ）に高脂肪含有食餌を供給し、高脂肪の食餌によって肥満が誘導されたマウスを用いて実験前の体重によって群分離した後、評価した。本発明による化合物３、化合物２１〜２５を０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０が含有されている蒸留水に溶解し、１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量となるように調製した後、表１１に記載されているように、３日に１回の間隔で皮下注射し、合計２週間評価した。毎日１回、一定の時間に体重及び飼料摂取量を測定し、化合物３と化合物２１〜２５の体重減少薬効を比較して、その結果を図７ａ〜図７ｄに示した。
【０１１１】
【表１１】
2020531442.tif 000031
【０１１２】
実験の結果、同じ用量で、化合物３に比べて化合物２３と化合物２５はさらに多くの累積飼料摂取量が算出され、化合物２１と化合物２２は化合物３と類似レベルの累積飼料摂取量が算出された。体重の面では、化合物３は化合物２１、化合物２３及び化合物２５に比べて同等レベル以上の体重減少、化合物２５は化合物３に比べて優れた体重減少薬効が確認された。一方、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｓｓａｙで一緒に評価された他の化合物に比べてグルカゴン受容体活性能が多少弱かった化合物２４は、初期体重に比べて１３．４％レベルの有意な体重減少薬効を示したので、化合物３に比べて劣った体重減少薬効を示した。化合物２５は、化合物３に比べて類似の体重減少薬効を示したが、累積飼料摂取量がさらに少なかった。これに対し、化合物２２は、化合物３に比べて類似の体重減少薬効を示したが、累積飼料摂取量は類似している。アシル化オキシントモジュリン環状ペプチド類似体は、構造によって体重減少薬効パターンの違いを示した。
＜実験例９＞本発明によるペプチドの２週間繰り返し体重減少薬効評価
本実験は、＜実験例８＞に続いて、本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体の低用量での体重減少薬効を比較するために、オス実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ｍｏｕｓｅ）に高脂肪含有食餌を供給し、高脂肪の食餌によって肥満が誘導されたマウスを用いて実験前の体重によって群分離した後、評価した。本発明による化合物３及び化合物２２を０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０が含有されている蒸留水に溶解して３０ｎｍｏｌ／ｋｇ又は１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量となるように調製した後、表１２に記載されているように、３日に１回の間隔で皮下注射し、合計２週間評価した。毎日１回、一定の時間に体重及び飼料摂取量を測定し、化合物３と化合物２２の体重減少薬効を比較して、その結果を図８ａ及び図８ｂに示した。
【０１１３】
【表１２】
2020531442.tif 000032
【０１１４】
実験の結果、同じ用量で、化合物２２は化合物３に比べてさらに多くの累積飼料摂取量が測定され、化合物２２の１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量群ではビヒクル対照群レベルの飼料摂取量を示したにも拘らず、７．５％レベルの体重減少薬効が観察された。また、化合物２２の３０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量群では、化合物３と同じ用量群と比較してより多くの飼料を摂取したにも拘らず、体重減少薬効は類似のレベルであった。これは、化合物２２が化合物３に比べてグルカゴン受容体活性化能に起因した薬効にさらに影響されることを示唆する。
＜実験例１０＞本発明によるペプチドの５日繰り返し体重減少薬効評価
本実験は、本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体の体重減少薬効を、市販中の糖尿病／肥満治療薬及びオキシントモジュリンペプチド類似体として開発されている先導物質と比較するために、オス実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ｍｏｕｓｅ）に高脂肪含有食餌を供給し、高脂肪の食餌によって肥満が誘導されたマウスを用いて実験前の体重によって群分離した後、評価した。本発明の実施例のうち、化合物３を０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０が含有されている蒸留水に溶解して３０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量となるように調製し、比較例として、糖尿病／肥満治療薬として市販されているリラグルチド及び臨床試験中のＭＥＤＩ０３８２を同じ溶媒に溶解して３０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量となるように調製した後、表１３に記載されているように、１日１回、合計４日間皮下注射した。毎日１回、一定の時間に体重及び飼料摂取量を測定してリラグルチド及びＭＥＤＩ０３８２と類似体の体重減少薬効を比較し、その結果を図９ａ及び図９ｂに示した。
【０１１５】
【表１３】
2020531442.tif 000033
【０１１６】
実験の結果、同じ用量で評価された３つの物質のうち、化合物３投与群で初期体重に比べて最も優れた体重減少薬効が観察された（化合物３：１８．６％、リラグルチド：１２．７％、ＭＥＤＩ０３８２：８．０％）。
＜実験例１１＞本発明によるペプチドの４週間繰り返し体重減少薬効評価
本実験は、本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体の体重減少薬効を市販中の糖尿病治療薬と比較するために、オス肥満及び糖尿病実験マウス（ＦＡＴＺＯ  ｍｏｕｓｅ）に高脂肪含有食餌を供給し、実験前の体重、体脂肪、非絶食血糖及び糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）によって群分離した後、評価した。本発明による化合物３と化合物２２を０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０が含有されている蒸留水に溶解して３０ｎｍｏｌ／ｋｇ又は１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量となるように調製し、糖尿病治療薬として市販されているセマグルチドを同じ溶媒に溶解して１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量となるように調製した後、表１４に記載されているように、３日に１回の間隔で皮下注射し、合計４週間評価した。毎日１回、一定の時間に体重及び飼料摂取量を測定し、剖検前４週目に体脂肪を測定してセマグルチドに比べて本発明によるオキシントモジュリンペプチド類似体の体重及び体脂肪減少薬効を比較し、その結果を図１０ａ乃至図１０ｃに示した。
【０１１７】
【表１４】
2020531442.tif 000034
【０１１８】
実験の結果、同じ用量（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）だけでなく、低い３０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で、本発明による化合物３及び化合物２２は、セマグルチドよりさらに多くの累積飼料摂取量が測定されたにも拘らず、体重減少薬効は非常に優れていることが分かるが、これは、本発明によるオキシントモジュリンペプチド類似体が、ＧＬＰ−１受容体アゴニストであるセマグルチドとは異なり、ＧＬＰ−１とグルカゴン受容体の両方に作用するメカニズムを持っていることを示唆する。
＜実験例１２＞本発明によるペプチドのマウスにおける耐糖能改善効果検定
本実験は、オス実験用マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ｍｏｕｓｅ）に、本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体の耐糖能改善効果を食後血糖調節能改善効果の意味として評価した。実験用マウスを実験前日絶食させた後、本発明による化合物３又は化合物２２又は化合物２５を０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０が含有されている蒸留水に溶解して調製し、ブドウ糖投与の３０分前に皮下注射した。オキシントモジュリンペプチド類似体注射の３０分後にブドウ糖溶液を経口投与し、薬物注射及びブドウ糖溶液投与の直前、ブドウ糖溶液投与後２時間の間、指定された時間に尾静脈を介して全血の血糖を測定した。その結果は、経時的な血糖値曲線の曲線下面積（Ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ；ＡＵＣ）を算出し、対照群の血糖ＡＵＣと比較して類似体及び比較物質の血糖ＡＵＣを百分率で算出して、耐糖能改善薬効を評価した。化合物別にそれぞれ別々の実験を行い、化合物２２又は化合物２５を評価する際には、化合物３の３０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量を比較例として追加して合計した結果を図１１に示した。
【０１１９】
実験の結果、ペプチド類似体は、３０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量以上で有意且つ用量依存的な血糖ＡＵＣの減少を示し、特に化合物２５は、評価されたすべての用量群で有意な耐糖能改善薬効及び化合物３と化合物２２に比べて３倍以上優れた耐糖能薬効が観察された。
＜実験例１３＞本発明によるペプチドの６週間繰り返し血糖調節薬効評価
本実験は、本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体の血糖調節薬効を市販中の糖尿病治療薬と比較するために、オス糖尿病実験用マウス（ｄｂ／ｄｂ  ｍｏｕｓｅ）を実験前の非絶食血糖、糖化ヘモグロビン及び体重によって群分離した後、評価した。本発明による化合物３を０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０が含有されている蒸留水に溶解して１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量となるように調製し、糖尿病治療薬として市販されているセマグルチドを同じ溶媒に溶解して１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量となるように調製した後、表１５に記載されているように、３日に１回の間隔で皮下注射し、合計６週間評価した。週１回の薬物投与２４時間後、非絶食血糖、体重及び飼料摂取量を測定し、３週、５週及び６週には糖化ヘモグロビンを測定して、セマグルチドと本発明によるオキシントモジュリンペプチド類似体の血糖調節薬効を比較し、その結果を図１２ａ及び図１２ｂに示した。
【０１２０】
【表１５】
2020531442.tif 000035
【０１２１】
実験の結果、同じ用量（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）で、本発明による化合物３は評価初期にセマグルチドに比べて同等以下の薬効を示したが、長期間投与によってセマグルチドに比べて優れた血糖調節薬効を示した。ビヒクル対照群の最終非絶食血糖は、５８１ｍｇ／ｄＬと非常に重度の糖尿特性を示したが、これに対し、対照物質セマグルチドの最終非絶食血糖は３４２ｍｇ／ｄＬであり、化合物３の最終非絶食血糖は２７４ｍｇ／ｄＬと有意な血糖上昇抑制が観察された。糖化ヘモグロビンも、ビヒクル対照群の場合、初期数値に比べて最終数値が５．１５％Ｐｏｉｎｔ増加したが、セマグルチド投与群では２．６５％Ｐｏｉｎｔ、化合物３投与群では１．７３％Ｐｏｉｎｔだけ増加して、薬物による糖化ヘモグロビン上昇抑制薬効が確認された。よって、本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体は、セマグルチド（Ｓｅｍａｇｌｕｔｉｄｅ）に比べて糖尿発症の遅延に対する優れた薬効が観察された。
＜実験例１４＞本発明によるペプチドの４週間繰り返し血糖調節薬効評価
本実験は、＜実験例１１＞と同様の実験であって、本発明によるアシル化オキシントモジュリンペプチド類似体の血糖調節薬効を市販中の糖尿病治療薬と比較するために、オス肥満及び糖尿病実験マウス（ＦＡＴＺＯ  ｍｏｕｓｅ）に高脂肪含有食餌を供給し、実験前の体重、体脂肪、非絶食血糖及び糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）によって群分離した後、評価した。本発明による化合物３と化合物２２を０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０が含有されている蒸留水に溶解して３０ｎｍｏｌ／ｋｇ又は１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量となるように調製し、糖尿病治療薬として市販されているセマグルチドを同じ溶媒に溶解して１００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量となるように調製した後、表１６に記載されているように、３日に１回の間隔で皮下注射し、合計４週間評価した。毎日１回、一定の時間に体重及び飼料摂取量を測定し、約１０日の間隔で投与２４時間後の非絶食血糖を測定した。また、剖検前４週目に糖化ヘモグロビンを測定し、セマグルチドと本発明によるオキシントモジュリンペプチド類似体の血糖調節薬効を比較し、その結果を図１３ａ及び図１３ｂに示した。
【０１２２】
【表１６】
2020531442.tif 000036
【０１２３】
実験の結果、同じ用量（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）で、本発明による化合物３及び化合物２２投与群でセマグルチドと同様レベルの優れた血糖調節薬効及び糖化ヘモグロビン上昇抑制薬効が観察された。これは、本発明によるオキシントモジュリンペプチド類似体が、＜実験例１１＞で示した体重減少とともに血糖調節が同時に可能な薬効を持っていることを示唆する。
【図１】
2020531442.tif 000045
【図２ａ】
2020531442.tif 000046
【図２ｂ】
2020531442.tif 000047
【図３ａ】
2020531442.tif 000048
【図３ｂ】
2020531442.tif 000049
【図４ａ】
2020531442.tif 000050
【図４ｂ】
2020531442.tif 000051
【図５ａ】
2020531442.tif 000052
【図５ｂ】
2020531442.tif 000053
【図６ａ】
2020531442.tif 000054
【図６ｂ】
2020531442.tif 000055
【図７ａ】
2020531442.tif 000056
【図７ｂ】
2020531442.tif 000057
【図７ｃ】
2020531442.tif 000058
【図７ｄ】
2020531442.tif 000059
【図８ａ】
2020531442.tif 000060
【図８ｂ】
2020531442.tif 000061
【図９ａ】
2020531442.tif 000062
【図９ｂ】
2020531442.tif 000063
【図１０ａ】
2020531442.tif 000064
【図１０ｂ】
2020531442.tif 000065
【図１０ｃ】
2020531442.tif 000066
【図１１】
2020531442.tif 000067
【図１２ａ】
2020531442.tif 000068
【図１２ｂ】
2020531442.tif 000069
【図１３ａ】
2020531442.tif 000070
【図１３ｂ】
2020531442.tif 000071
【配列表】
2020531442000001.app
【国際調査報告】
2020531442.tif 000072
2020531442.tif 000073
2020531442.tif 000074
2020531442.tif 000075
2020531442.tif 000076
2020531442.tif 000077
2020531442.tif 000078
2020531442.tif 000079