(57)【要約】  癌の治療または予防のための薬剤が開示される。より詳細には、本発明は、癌（転移癌を含む）の発達、進行または再発を治療または阻害する方法および組成物で治療薬組合せを開示し、前記治療薬組合せは、NF-κB受容体（RANK）リガンドアンタゴニストおよび免疫チェックポイント分子を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
NF-κB（RANK）リガンド（RANKL）アンタゴニストおよび少なくとも1つの免疫チェックポイント分子（ICM）アンタゴニストを含む、それらから成る、または本質的にそれらから成る治療薬組合せ。
【請求項２】
少なくとも1つのICMアンタゴニストが、適切には以下から成る群から選択されるICMと拮抗する、請求項1に記載の治療薬組合せ：プログラム死1受容体（PD-1）、プログラム死リガンド1（PD-L1）、プログラム死リガンド2（PD-L2）、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4（CTLA-4）、A2Aアデノシン受容体（A2AR）、A2Bアデノシン受容体（A2BR）、B7-H3（CD276）、V-セットドメイン含有T細胞活性化阻害因子1（VTCN1）、BおよびTリンパ球減弱化因子（BTLA）、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）、リンパ球活性化遺伝子3（LAG3）、T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン3（TIM-3）、T細胞活性化のV-ドメインIgサプレッサー（VISTA）、5'-ヌクレオチダーゼ（CD73）、タクチル（CD96）、ポリオウイルス受容体（CD155）、DNAX付属分子-1（DNAM-1）、ポリオウイルス受容体関連2（CD112）、細胞傷害性調節性T細胞分子（CRTAM）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー4（TNFRS4；OX40；CD134）、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー4（TNFSF4；OX40リガンド（OX40L））、ナチュラルキラー細胞受容体2B4（CD244）、CD160、グルココルチコイド誘発TNFR関連タンパク質（GITR）、グルココルチコイド誘発TNFR関連タンパク質リガンド（GITRL）、誘発性共同刺激因子（ICOS）、ガレクチン9（GAL-9）、4-1BBリガンド（4-1BBL；CD137L）、4-1BB（4-1BB；CD137）、CD70（CD27リガンド（CD27L））、CD28、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、シグナル調節タンパク質（SIRP-1）、インテグリン関連タンパク質（IAP；CD47）；Bリンパ球活性化マーカー（BLAST-1；CD48）、ナチュラルキラー細胞受容体2B4（CD244）；CD40、CD40リガンド（CD40L）、ヘルペスウイルス侵入媒介因子（HVEM）、トランスメンブレンおよび免疫グロブリンドメイン含有2（TMIGD2）、HERV-H LTR-関連2（HHLA2）、血管内皮増殖阻害因子（VEGI）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー25（TNFRS25）、誘発性T細胞共同刺激因子リガンド（ICOLG；B7RP1）並びにIgおよびITIM（免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ）ドメインを有するT細胞免疫受容体（TIGIT）。
【請求項３】
少なくとも1つのICMアンタゴニストが、PD-1アンタゴニスト、PD-L1アンタゴニストおよびCTLA4アンタゴニストから選択される、請求項1に記載の治療薬組合せ。
【請求項４】
少なくとも1つのICMアンタゴニストが、CTLA-4アンタゴニスト以外であるかまたはCTLA-4アンタゴニストを除く、請求項1に記載の治療薬組合せ．
【請求項５】
少なくとも1つのICMアンタゴニストがPD-1アンタゴニストを含む、請求項1から4のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
【請求項６】
少なくとも1つのICMアンタゴニストがPD-L1アンタゴニストを含む、請求項1から5のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
【請求項７】
少なくとも1つのICMアンタゴニストが、PD-1アンタゴニストおよびPD-L1アンタゴニストを含む、請求項1から4のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
【請求項８】
少なくとも1つのICMアンタゴニストが、PD-1アンタゴニストおよびCTLA4アンタゴニストを含む、請求項1から3のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
【請求項９】
少なくとも1つのICMアンタゴニストが、PD-L1アンタゴニストおよびCTLA4アンタゴニストを含む、請求項1から3のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
【請求項１０】
RANKLアンタゴニストが、RANKLと特異的に結合する直接的RANKLアンタゴニストである、請求項1から9のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
【請求項１１】
RANKLアンタゴニストがRANKと特異的に結合する間接的RANKLアンタゴニストである、請求項1から9のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
【請求項１２】
RANKLアンタゴニストが抗原結合分子である、請求項1から11のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
【請求項１３】
個々のICMアンタゴニストが抗原結合分子である、請求項1から12のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
【請求項１４】
抗RANKL抗原結合分子が、アミノ酸配列TEYLQLMVY（配列番号:1）（すなわち、配列番号:2で示される自然のままのRANKL配列の残基233−241）を含むRANKLの領域と特異的に結合する、請求項10に記載の治療薬組合せ。
【請求項１５】
抗RANKL抗原結合分子がモノクローナル抗体（MAb）である、請求項10または請求項14に記載の治療薬組合せ。
【請求項１６】
抗RANKL抗原結合分子がMAbデノスマブまたはその抗原結合フラグメントである、請求項15に記載の治療薬組合せ。
【請求項１７】
抗RANK抗原結合分子が、配列番号:3に示される重鎖アミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項16に記載の治療薬組合せ。
【請求項１８】
抗RANK抗原結合分子が配列番号:4に示される軽鎖アミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項16または請求項17に記載の治療薬組合せ。
【請求項１９】
抗RANKL抗原結合分子がRANKLとの結合についてデノスマブと競合する、請求項14から18のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
【請求項２０】
RANKアンタゴニスト（例えば抗RANK抗原結合分子またはアンタゴニストペプチド）が、CDR2（すなわち残基44−85）およびCRD3（すなわち残基86−123）から選択されるシステイン富裕ドメイン（CRD）の少なくとも一部分に対応するアミノ酸配列と特異的に結合するか、または前記配列を含むか、前記配列から成るかもしくは本質的に前記配列から成る、請求項12に記載の治療薬組合せ。
【請求項２１】
RANKアンタゴニスト（例えば抗RANK抗原結合分子またはアンタゴニストペプチド）が、RANK CRD3の少なくとも一部分に対応するアミノ酸配列と特異的に結合するか、または前記配列を含むか、前記配列から成るかもしくは本質的に前記配列から成り、その代表的な例にYCWNSDCECCY（配列番号:5）、YCWSQYLCY（配列番号:6）が含まれる、請求項20に記載の治療薬組合せ。
【請求項２２】
RANKアンタゴニストが、アミノ酸配列VSKTEIEEDSFRQMPTEDEYMDRPSQPTDQLLFLTEPGSKSTPPFSEPLEVGENDSLSQCFTGTQSTVGSESCNCTEPLCRTDWTPMS（配列番号:7）（すなわち、配列番号:8に示される自然のままのRANK配列の残基330−417）の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する、請求項12に記載の治療薬組合せ。
【請求項２３】
抗RANK抗原結合分子がモノクローナル抗体（MAb）である、請求項12または請求項22に記載の治療薬組合せ。
【請求項２４】
抗RANK抗原結合分子が、MAb N-1H8、N-2B10、若しくはMAb 64C1385またはそれらの抗原結合フラグメントから選択される、請求項12に記載の治療薬組合せ。
【請求項２５】
抗RANK抗原結合分子が、RANKとの結合についてモノクローナル抗体64C1385、N-1H8またはN-2B10と競合する、請求項12および20から24のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
【請求項２６】
抗RANK抗原結合分子が、例えばNewaら（Newa et al., Mol Pharm. 11(1):81-9, 2014）によって開示される短鎖Fv（scFv）抗原結合分子またはその抗原結合フラグメントである、請求項12のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
【請求項２７】
それぞれのICMアンタゴニストが抗ICM抗原結合分子である、請求項1から26のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
【請求項２８】
抗ICM抗原結合分子が、抗PD-1抗原結合分子、抗PD-L1抗原結合分子および抗CTLA4抗原結合分子から選択される、請求項27に記載の治療薬組合せ。
【請求項２９】
抗PD-1抗原結合分子がMAbであり、その非限定的な例に、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、およびMEDI-0680（AMP-514）、AMP-224、JS001-PD-1、SHR-1210、Gendor PD-1、PDR001、CT-011、REGN2810、およびBGB-317またはその抗原結合フラグメントが含まれる、請求項28に記載の治療薬組合せ。
【請求項３０】
抗PD-1抗原結合分子が、PD-1との結合についてニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、AMP-224、JS001-PD-1、SHR-1210、Gendor PD-1、PDR001、CT-011、REGN2810、、BGB-317またはMEDI-0680と競合する、請求項28に記載の治療薬組合せ。
【請求項３１】
抗PD-1抗原結合分子が、アミノ酸配列SFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDR（配列番号:9）（すなわち、配列番号:10に示される自然のままのPD-1配列の残基62から86）、および/またはアミノ酸配列SGTYLCGAISLAPKAQIKE（配列番号:11）（すなわち、配列番号:10に示される自然のままのPD-1配列の残基118から136）の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する、請求項28から30のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
【請求項３２】
抗PD-1抗原結合分子が、アミノ酸配列NWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRV（配列番号:12）（すなわち、配列番号:10に示される自然のままのPD-1配列の残基66から97に対応する）の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する、請求項28から30のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
【請求項３３】
抗PD-L1抗原結合分子がMAbであり、その非限定的な例に、デュルバルマブ（MEDI4736）、アテゾリズマブ（Tecentriq）、アベルマブ、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480およびMPDL3280A、またはその抗原結合フラグメントが含まれる、請求項28に記載の治療薬組合せ。
【請求項３４】
抗PD-L1抗原結合分子が、アミノ酸配列SKKQSDTHLEET（配列番号:13）（すなわち、配列番号:14に示される完全長の自然のままのPD-L1アミノ酸配列の残基279から290）の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する、請求項28または請求項33に記載の治療薬組合せ。
【請求項３５】
抗PD-L1抗原結合分子が、PD-L1との結合についてデュルバルマブ（MEDI4736）、アテゾリズマブ（Tecentriq）、アベルマブ、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480およびMPDL3280Aのいずれか1つと競合する、請求項28または請求項33に記載の治療薬組合せ。
【請求項３６】
抗CTLA4抗原結合分子がMAbであり、その代表的な例にイピリムマブおよびトレメリムマブまたはその抗原結合フラグメントが含まれる、請求28に記載の治療薬組合せ。
【請求項３７】
抗CTLA4抗原結合分子が、CTLA4との結合についてイピリムマブまたはトレメリムマブと競合する、請求項28に記載の治療薬組合せ。
【請求項３８】
抗CTLA4抗原結合分子が、YASPGKATEVRVTVLRQA（配列番号:15）（すなわち配列番号:16に示される完全長の自然のままのCTLA4アミノ酸配列の残基26から42）、DSQVTEVCAATYMMGNELTFLDD（配列番号:17）（すなわち配列番号:16に示される自然のままのCTLA4アミノ酸配列の残基43から65）、およびVELMYPPPYYLGIG（配列番号:18）（すなわち配列番号:16に示される自然のままのCTLA4アミノ酸配列の残基96から109）から選択されるアミノ酸配列の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する、請求項28、36および37のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
【請求項３９】
RANKLアンタゴニストおよびICMアンタゴニストの一方または両方が抗原結合分子であり、当該抗原結合分子が免疫グロブリン定常鎖（例えばIgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3またはIgG4定常鎖）に連結した、請求項1から38のいずれかに記載の治療薬組合せ。
【請求項４０】
免疫グロブリン定常鎖が、κ軽鎖またはλ軽鎖から選択される軽鎖、並びにγ1重鎖、γ2重鎖、γ3重鎖およびγ4重鎖から選択される重鎖を含む、請求項39に記載の治療薬組合せ。
【請求項４１】
RANKLアンタゴニストおよび2つ以上の異なるICMアンタゴニストを含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る、請求項1から40のいずれかに記載の治療薬組合せ。
【請求項４２】
治療薬組合せが、RANKLアンタゴニスト並びにCTLA4アンタゴニスト、PD-1アンタゴニストおよびPD-L1アンタゴニストの少なくとも2つを含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る、請求項41に記載の治療薬組合せ。
【請求項４３】
個々のアンタゴニスト成分が別個の構成要素の形態で存在する、請求項1から42のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
【請求項４４】
個々のアンタゴニスト成分が互いに融合しているか、そうでなければ（直接的または間接的に）互いに複合体化される、請求項1から42のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
【請求項４５】
治療薬組合せがマルチ特異性アンタゴニスト薬剤の形態であり、RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストを含む、請求項44に記載の治療薬組合せ。
【請求項４６】
マルチ特異性薬剤が2つ以上のポリペプチドの複合体である、請求項45に記載の治療薬組合せ。
【請求項４７】
マルチ特異性薬剤が単一鎖ポリペプチドである、請求項45に記載の治療薬組合せ。
【請求項４８】
RANKLアンタゴニストが、それぞれのICMアンタゴニストのN-末端で複合体化される、請求項47に記載の治療薬組合せ。
【請求項４９】
RANKLアンタゴニストが、それぞれのICMアンタゴニストのC-末端で複合体化される、請求項47に記載の治療薬組合せ。
【請求項５０】
RANKLアンタゴニストおよびICMアンタゴニストが直接的に結合される、請求項48または請求項49に記載の治療薬組合せ。
【請求項５１】
RANKLアンタゴニストおよびICMアンタゴニストが、介在リンカー（例えばポリペプチドリンカー）によって結合される、請求項48または請求項49に記載の治療薬組合せ。
【請求項５２】
マルチ特異性アンタゴニスト薬剤が少なくとも2つの抗原結合分子を含む、請求項45から51のいずれか1項に記載の治療薬組合せ。
【請求項５３】
マルチ特異性抗原結合分子が組換え分子の形態で存在し、前記分子が、キメラ、ヒト化およびヒト抗原結合分子を含む、請求項52に記載の治療薬組合せ。
【請求項５４】
RANKLおよび少なくとも1つのICMに拮抗するマルチ特異性抗原結合分子であって、RANKLまたはRANKと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを、さらにそれぞれのICMについては当該ICMと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含むか、それらのフラグメントから成るか、または本質的にそれらのフラグメントから成る、前記マルチ特異性抗原結合分子。
【請求項５５】
抗体および/または抗原結合フラグメントが直接的に結合される、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項５６】
抗体および/または抗原結合フラグメントが、介在リンカー（例えば化学的リンカーまたはポリペプチドリンカー）によって結合される、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項５７】
抗体または抗原結合フラグメントが作動できるように結合される単鎖ポリペプチドの形態である、請求項54から56のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項５８】
互いに連結されるか、そうでなければ互いに会合して複合体を形成する、複数の別個のポリペプチドの形態にある、請求項54から56のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項５９】
二価、三価、または四価である、請求項54から58のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項６０】
少なくとも1つのICMが、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、A2AR、A2BR、CD276、VTCN1、BTLA、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、VISTA、CD73、CD96、CD155、DNAM-1、CD112、CRTAM、OX40、OX40L、CD244、CD160、GITR、GITRL、ICOS、GAL-9、4-1BBL、4-1BB、CD27L、CD28、CD80、CD86、SIRP-1、CD47、CD48、CD244、CD40、CD40L、HVEM、TMIGD2、HHLA2、VEGI、TNFRS25、ICOLGおよびTIGITから選択される、請求項54から59のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項６１】
二重特異性であり、抗ICM抗体またはその抗原結合フラグメントが、抗CTLA4抗体またはその抗原結合フラグメント以外である、請求項54から60のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項６２】
Fab、Fab’、F(ab’)2およびFv分子並びに相補性決定領域（CDR）から選択される抗原結合フラグメントを含む、請求項54から61のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項６３】
個々の抗体またはその抗原結合フラグメントが、IgG、IgM、IgD、IgA、およびIgEから成る群からそれぞれ独立に選択される定常ドメインを含む、請求項54から62のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項６４】
マルチ特異性抗原結合分子が、タンデムscFv（taFvまたはscFv2)、ジアボディ、dAb2/VHH2、ノブインホール誘導体、シードコッド-IgG、ヘテロFc-scFv、Fab-scFv、scFv-Jun/Fos、Fab’-Jun/Fos、トリボディ、DNL-F(ab)3、scFv3-CH1/CL、Fab-scFv2、IgG-scFab、IgG-scFv、scFv-IgG、scFv2-Fc、F(ab’)2-scFv2、scDB-Fc、scDb-CH3、Db-Fc、scFv2-H/L、DVD-Ig、tandAb、scFv-dhlx-scFv、dAb2-IgG、dAb-IgG、dAb-Fc-dAb、tandab、DART、BiKE、TriKE、mFc-VH、架橋MAb、CrossMAb、MAb2、静電気的に適合した抗体、対称性IgG様抗体、LUZ-Y、Fab-交換抗体、FIT-Ig、またはそれらの組合せから選択される、請求項54から61のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項６５】
免疫グロブリン定常鎖（例えばIgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、およびIgG4）に連結した抗原結合フラグメントを含む、請求項54から64のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項６６】
免疫グロブリン定常鎖が、κ軽鎖およびλ軽鎖から選択される軽鎖、および/またはγ1重鎖、γ2重鎖、γ3重鎖、およびγ4重鎖から選択される重鎖を含む、請求項65に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項６７】
アミノ酸配列TEYLQLMVY（配列番号:1）（すなわち、配列番号:2に示される自然のままのRANKL配列の残基233−241）の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する、抗RANKL抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項54から66のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項６８】
RANKの細胞外領域（すなわち、配列番号:8に示されるヒトRANK配列の残基30から212に対応する）と特異的に結合する、抗RANK抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項54から66のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項６９】
マルチ特異性抗原結合分子がPD-1と拮抗し、さらにSFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDR（配列番号:9）（すなわち、配列番号:10に示される自然のままのヒトPD-1配列の残基62から86）、SGTYLCGAISLAPKAQIKE（配列番号:11）（すなわち、配列番号:10に示される自然のままのヒトPD-1配列の残基118から136）、およびNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRV（配列番号:12）（すなわち、配列番号:10に示される自然のままのヒトPD-1配列の残基66から97）から選択されるアミノ酸配列の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する抗PD-1抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項54から68のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項７０】
抗PD-1抗体またはその抗原結合フラグメントが、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、およびMEDI-0680（AMP-514）、AMP-224、JS001-PD-1、SHR-1210、Gendor PD-1、PDR001、CT-011、REGN2810、BGB-317またはその抗原結合フラグメントから選択されるMAbの重鎖および軽鎖を含む、請求項54から69のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項７１】
マルチ特異性抗原結合分子がPD-L1と拮抗し、さらにSKKQSDTHLEET（配列番号:13）（すなわち、配列番号:14に示される自然のままのヒトPD-L1アミノ酸配列の残基279から290）と特異的に結合する抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、請求項54から68のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項７２】
抗PD-LD1抗体またはその抗原結合フラグメントが、デュルバルマブ（MEDI4736）、アテゾリズマブ（Tecentriq）、アベルマブ、BMS-936559/MDX-1105、およびMPDL3280A、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480またはその抗原結合フラグメントから選択されるMAbの重鎖および軽鎖を含む、請求項54から68および71のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項７３】
CTLA4と拮抗し、さらに抗CTLA4抗体またはその抗原結合フラグメントが、YASPGKATEVRVTVLRQA（配列番号:15）（すなわち、配列番号:16に示される完全長の自然のままのPD-CTLA4アミノ酸配列の残基26から42）、DSQVTEVCAATYMMGNELTFLDD（配列番号:17）（すなわち、配列番号:16に示される自然のままのCTLA4配列の残基43から65）、およびVELMYPPPYYLGIG（配列番号:18）（すなわち、配列番号:16に示される自然のままのCTLA4配列の残基96から109）から選択されるアミノ酸配列の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する、請求項54から68のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項７４】
抗CTLA4抗体またはその抗原結合フラグメントが、イピリムマブおよびトレメリムマブ、またはその抗原結合フラグメントから選択されるMAbの重鎖および軽鎖を含む、請求項54から68および73のいずれか1項に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項７５】
マルチ特異性抗原結合分子がCrossMAb様式にあり、かつRANKLおよびPD-1と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:240に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:241に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:242に対応するアミノ酸配列を含み、当該第四のポリペプチドが配列番号:244に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項７６】
マルチ特異性抗原結合分子がCrossMAb様式にあり、かつRANKLおよびPD-1と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:244に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:245に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:246に対応するアミノ酸配列を含み、当該第四のポリペプチドが配列番号:247に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項７７】
マルチ特異性抗原結合分子がCrossMAb様式にあり、かつRANKLおよびPD-1と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:248に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:249に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:250に対応するアミノ酸配列を含み、当該第四のポリペプチドが配列番号:251に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項７８】
マルチ特異性抗原結合分子がCrossMAb様式にあり、かつRANKLおよびPD-1と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:252に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:253に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:254に対応するアミノ酸配列を含み、当該第四のポリペプチドが配列番号:254に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項７９】
マルチ特異性抗原結合分子がCrossMAb様式にあり、かつRANKLおよびPD-1と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:256に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:257に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:258に対応するアミノ酸配列を含み、当該第四のポリペプチドが配列番号:259に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項８０】
マルチ特異性抗原結合分子がCrossMAb様式にあり、かつRANKLおよびPD-1と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:260に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:261に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:262に対応するアミノ酸配列を含み、当該第四のポリペプチドが配列番号:263に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項８１】
マルチ特異性抗原結合分子がCrossMAb様式にあり、かつRANKLおよびPD-1と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:264に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:265に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:266に対応するアミノ酸配列を含み、当該第四のポリペプチドが配列番号:267に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項８２】
マルチ特異性抗原結合分子がCrossMAb様式にあり、かつRANKLおよびPD-1と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:268に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:269に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:270に対応するアミノ酸配列を含み、当該第四のポリペプチドが配列番号:271に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項８３】
マルチ特異性抗原結合分子がCrossMAb様式にあり、かつRANKLおよびPD-1と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:272に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:273に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:274に対応するアミノ酸配列を含み、当該第四のポリペプチドが配列番号:275に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項８４】
マルチ特異性抗原結合分子がFIT-Ig様式にあり、かつRANKLおよびPD-1と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、および第三のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:276に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:277に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:278に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項８５】
マルチ特異性抗原結合分子がFIT-Ig様式にあり、かつRANKLおよびCTLA4と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、および第三のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:279に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:277に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:280に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項８６】
マルチ特異性抗原結合分子がFIT-Ig様式にあり、かつRANKLおよびPD-L1と拮抗し、当該マルチ特異性抗原結合分子が第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、および第三のポリペプチドを含み、当該第一のポリペプチドが配列番号:281に対応するアミノ酸配列を含み、当該第二のポリペプチドが配列番号:277に対応するアミノ酸配列を含み、当該第三のポリペプチドが配列番号:282に対応するアミノ酸配列を含む、請求項54に記載のマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項８７】
デリバリービヒクル（例えばリポソーム、ナノ粒子、ミクロ粒子、デンドリマーまたはシクロデキストリン）に収納される、請求項1から86のいずれかに記載の治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項８８】
RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストの各々を含む単一組成物の形態にある、請求項1から87のいずれかに記載の治療薬組合せ。
【請求項８９】
単一組成物が、RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストの混合物を含む、請求項87に記載の治療薬組合せ。
【請求項９０】
RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストが、別々の組成物中の別個の構成要素として提供される、請求項1から89のいずれかに記載の治療薬組合せ。
【請求項９１】
個々のアンタゴニストが抗原結合分子である、請求項1から90のいずれかに記載の治療薬組合せ。
【請求項９２】
ICMアンタゴニストが、調節性T（Treg）細胞が発現を欠くかまたは低レベルで発現するICMと拮抗する、請求項1から91のいずれかに記載の治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項９３】
少なくとも1つのICMアンタゴニストが、PD-1およびPD-L1の一方または両方から選択されるICMと拮抗する、請求項92に記載の治療薬組合せ。
【請求項９４】
抗RANKL抗原結合分子および抗PD-1抗原結合分子を含むか、それらの分子から成るか、または本質的にそれらの分子から成る、請求項1から93のいずれかに記載の治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項９５】
抗RANKL抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含むか、それらの分子から成るか、または本質的にそれらの分子から成る、請求項1から94のいずれかに記載の治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項９６】
抗RANKL抗原結合分子、抗PD-1抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含むか、それらの分子から成るか、または本質的にそれらの分子から成る、請求項1から95のいずれかに記載の治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項９７】
抗RANKL抗原結合分子、抗PD-1抗原結合分子および抗CTLA4抗原結合分子を含むか、それらの分子から成るか、または本質的にそれらの分子から成る、請求項1から96のいずれかに記載の治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子。
【請求項９８】
1つ以上の制御配列と作動できるように結合している請求項1から97のいずれかに記載のマルチ特異性抗原結合分子をコードする核酸配列を含む、1つの構築物または複数の構築物。
【請求項９９】
請求項98に規定する構築物を含む、宿主細胞。
【請求項１００】
請求項1から99のいずれかで規定される治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子、および医薬的に許容できる担体または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項１０１】
さらにまた、化学療法剤（例えば抗増殖/抗新形成薬、細胞増殖抑制剤、癌細胞侵襲阻害剤、増殖因子機能阻害剤、抗血管形成剤、血管損傷剤などから選択される）または免疫療法剤（例えばサイトカイン、サイトカイン発現細胞、抗体など）から選択される少なくとも1つの補助剤を含む、請求項100に記載の組成物。
【請求項１０２】
対象動物において免疫を刺激するかまたは増大させる方法であって、請求項1から101のいずれかで規定される治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子の有効量を対象動物に投与し、それによって当該対象動物において免疫を刺激するかまたは増大させる工程を含むか、前記工程から成る、または本質的に前記工程から成る、前記方法。
【請求項１０３】
刺激または増大される免疫が有益な宿主免疫応答を含み、その例示的な例に、腫瘍サイズの減少、腫瘍量の減少、疾患の安定化、内因性または外因性抗原に対する抗体の産生、免疫系の誘発、免疫系の1つ以上の構成要素の誘発、細胞媒介免疫およびその発生に必要とされる分子、液性免疫およびその発生に必要とされる分子、抗体依存細胞傷害性（ADCC）免疫およびその発生に必要とされる分子、補体媒介細胞傷害性（CDC）免疫およびその発生に必要とされる分子、ナチュラルキラー細胞、サイトカインおよびケモカイン並びにそれらの産生に必要とされる分子および細胞、抗体依存細胞傷害、補体依存細胞傷害、ナチュラルキラー細胞活性、および抗原増強細胞傷害のいずれか1つ以上が含まれる、請求項102に記載の方法。
【請求項１０４】
刺激または増大される免疫が炎症促進免疫応答を含む、請求項102または請求項103に記載の方法。
【請求項１０５】
対象動物における腫瘍に対する免疫抑制または耐性の発達もしくは進行を阻害する方法であって、腫瘍を請求項1から104のいずれかで規定される治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子と接触させ、それによって対象動物における腫瘍に対する免疫抑制または耐性の発達もしくは進行を阻害する工程を含むか、前記工程から成るか、または本質的に前記工程から成る、前記方法。
【請求項１０６】
治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子がまた、免疫系に腫瘍抗原を提示する抗原提示細胞（例えば樹状細胞）と接触する、請求項105に記載の方法。
【請求項１０７】
癌の発達、進行または再発を対象動物において阻害する方法であって、請求項1から106のいずれかで規定される治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子の有効量を対象動物に投与し、それによって癌の発達、進行または再発を対象動物において阻害する工程を含むか、前記工程から成るか、または本質的に前記工程から成る、前記方法。
【請求項１０８】
対象動物において癌を治療する方法であって、請求項1から106のいずれかで規定される治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子の有効量を対象動物に投与し、それによって当該対象動物において癌を治療する工程を含むか、前記工程から成るか、または本質的に前記工程から成る、前記方法。
【請求項１０９】
癌が、メラノーマ、乳癌、結腸癌、卵巣癌、子宮内膜および子宮癌、胃関連または胃の癌、膵臓癌、前立腺癌、唾液腺癌、肺癌、肝細胞癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、直腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓関連癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、精巣癌、食道癌、胆管の腫瘍、頭頸部癌、および扁平上皮細胞癌腫から選択される、請求項107または請求項108に記載の方法。
【請求項１１０】
癌が転移癌である、請求項107から109のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１１】
対象動物が免疫調節剤に対して低下または障害された応答性を有する、請求項102から110のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１２】
免疫調節剤が抗ICM抗原結合分子（例えば抗PD-1または抗PD-L1抗原結合分子）である、請求項111に記載の方法。
【請求項１１３】
さらにまた有効量の補助抗癌剤を同時発生的に投与する工程を含む、請求項102から112のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１４】
補助抗癌剤が、化学療法剤、体外放射線照射、標的に誘導される放射性同位元素、およびシグナル伝達阻害剤から選択される、請求項113に記載の方法。
【請求項１１５】
RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストを同時発生的に対象動物に投与する工程を含む、請求項102から114のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１６】
治療薬組合せが単一組成物の形態にある、請求項115に記載の方法。
【請求項１１７】
単一組成物が、RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストの混合物を含む、請求項116に記載の方法。
【請求項１１８】
個々のアンタゴニストが抗原結合分子である、請求項117に記載の方法。
【請求項１１９】
治療薬組合せのRANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストが、別々の組成物中で別個の構成要素として提供される、請求項115に記載の方法。
【請求項１２０】
RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストが同時に投与される、請求項119に記載の方法。
【請求項１２１】
RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストが逐次的に投与される、請求項119に記載の方法。
【請求項１２２】
RANKLアンタゴニストが、少なくとも1つのICMアンタゴニストの投与の前に投与される、請求項121に記載の方法。
【請求項１２３】
RANKLアンタゴニストが、少なくとも1つのICMアンタゴニストの投与の後で投与される、請求項121に記載の方法。
【請求項１２４】
免疫を刺激もしくは増大させるか、腫瘍に対する免疫抑制もしくは耐性の発達または進行を阻害するか、または対象動物において癌を治療するためのキットであって、請求項1から123のいずれかに記載の治療薬組合せ、医薬組成物、およびマルチ特異性抗原結合分子のいずれか1つ以上を含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、オーストラリア仮特許出願No. 2017902125（発明の名称“Aｇents for cancer therapy or prophylaxis and uses therefor（癌の治療または予防のための薬剤およびそのための使用）”）（2017年6月5日出願、その内容は参照によってその全体が本明細書に含まれる）に関し優先権を主張する。
本発明は概して癌を治療または予防する薬剤に関する。より具体的には、本発明は、癌（転移癌を含む）の発達、進行もしくは再発を治療または予防するための方法および組成物における、NF-κB受容体（RANK）リガンドのアンタゴニストおよび免疫チェックポイント分子を含む治療薬組合せに関する。
【背景技術】
【０００２】
国立癌研究所は、米国だけで3人に1人がその一生で癌と診断されると概算している。さらにまた、癌と診断された人の約50％から60％が最終的に当該疾患に倒れる。この疾患の広範囲の発生は、改善された抗癌治療、特に悪性癌の治療の必要性を強調する。
免疫療法は近年、癌治療で高い有望性を示し始め、転移メラノーマの治療では格段の進歩が達成されて、免疫チェックポイント分子封鎖抗体が承認された。イピリムマブ（抗細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4（CTLA-4）抗体）は、抗腫瘍免疫をアップレギュレートするように作用し、前記は、転移メラノーマを有する患者を含むフェース3試験で全生存の改善に密接に関係する最初の薬剤であった（以下を参照されたい：Wolchok et al., 2013, New Enｇl J Med, 369:122-133；Smyth et al., 2016, J. Clin. Oncol. 34（12）:e104-106）。まだ完全には解明されていない理由により、イピリムマブは患者の10％および15％のみが応答に関与し（Wolchock et al., 2013（上掲書）；Smyth et al.2016（上掲書））、治療患者の約30％が長期生存を示した（Bostwick et al., 2015, J Immunoth Cancer, 3:19）。したがって、単独療法および併用治療の開発における急速な進行にもかかわらず、癌に起因する当該疾患の負担は顕著には除去されていない。
免疫チェックポイント分子、プログラム死1（PD-1）に対するモノクローナル抗体（MAb）の抗CTLA4との併用は、PD-1単独と比較して、進行メラノーマで優れた腫瘍応答および生存利益をもたらした。このことはは、腫瘍による免疫侵襲の非重複性メカニズムを標的とする併用免疫療法の重要性を明示する（以下を参照されたい：Larkin et al., 2015, N Enｇ J Med, 373:23-24；Postow et al., 2015, N Enｇ J Med, 372:2006-2017；およびWolchok et al., 2013（上掲書））。しかしながら、固形および血液学的悪性疾患の免疫療法における1つの難題は、現行の免疫療法併用に対して主要な耐性を示す患者のための新規な標的を見つけることである。
【０００３】
NF-κBの受容体（RANK）およびそのリガンド（RANKL）は、それぞれ腫瘍壊死因子受容体およびリガンドスーパーファミリーのメンバーであり、CD40およびCD40Lに対して最も近い相同性を有する。RANK（TNFRSF11aとしても知られている）およびRANKL（TNSFF11）は、骨の恒常性におけるそれらの役割について臨床診療ではこれまでのところ最もよく理解されている。なぜならば、単球-マクロファージ系列からの骨芽細胞の分化はRANKLとRANK（骨髄性破骨前駆細胞で発現される）との相互作用を必要とするからである（以下を参照されたい：Douｇall et al., 1999, Genes Dev., 13:2412-24；およびKonｇ et al., 1999, Nature, 397:315-23）。完全にヒトのIｇG2抗RANKL抗体（デノスマブ）は、骨転移から生じる骨格関連イベントの予防のため、並びに骨の巨細胞腫瘍および骨粗しょう症の管理のための強力で忍容性が良好な抗吸収性薬剤として臨床診療で広く用いられている（以下を参照されたい：Branstetter et al., 2012, Clin Cancer Res, 18:4415-4424）; and Fizazi et al., 2011, Lancet, 377:813-22）。興味深いことに、フェース3試験の事後探査分析において、デノスマブは、小細胞性肺癌および骨転移を有する患者でゾレドロン酸と比較して全生存を増加させた（以下を参照されたい：Scaｇliotti et al., 2012, J. Thorac. Oncol., 7:1823-9）。RANKLはもともと樹状細胞特異的生存因子として識別された。前記因子は活性化T細胞によってアップレギュレートされ、成熟樹状細胞（DC）の表面のRANKと相互反応してアポトーシスを防止した（以下を参照されたい：Wonｇ et al., 1997, J Exp Med, 186:2075-2080；およびHochweller et al., 2005, Eur. J. Immunol., 35:1086-96）。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、NF-κBの活性化因子受容体（RANK）リガンド（RANKL）および免疫チェックポイント分子（ICM）（調節性T（Treｇ）細胞が発現を欠くかまたは低レベルで発現するICMを含む）との拮抗は、癌に対する免疫応答の相乗的増強をもたらすという驚くべき発見に部分的に依拠する。この発見が形を変えて、以下に記載するように、免疫を刺激または増大させる、免疫抑制または腫瘍に対する耐性の発達もしくは進行を阻害する、または癌の発達、進行もしくは再発を阻害する方法および組成物で実践された。
したがって、ある特徴では、本発明は、RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストを含む、それらから成る、または本質的にそれらから成る治療薬組合せを提供する。当該治療薬組合せは、それぞれRANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストを含む単一組成物（例えば混合物）の形態であり得る。また別には、RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストは、別々の組成物で別個の構成要素として提供され得る。
【０００５】
少なくとも1つのICMアンタゴニストは、適切には以下から成る群から選択されるICMと拮抗する：プログラム死1受容体（PD-1）、プログラム死リガンド1（PD-L1）、プログラム死リガンド2（PD-L2）、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4（CTLA-4）、A2Aアデノシン受容体（A2AR）、A2Bアデノシン受容体（A2BR）、B7-H3（CD276）、V-セットドメイン含有T細胞活性化阻害因子1（VTCN1）、BおよびTリンパ球減弱化因子（BTLA）、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（KIR）、リンパ球活性化遺伝子3（LAG3）、T細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン3（TIM-3）、T細胞活性化のV-ドメインIｇサプレッサー（VISTA）、5'-ヌクレオチダーゼ（CD73）、タクチル（CD96）、ポリオウイルス受容体（CD155）、DNAX付属分子-1（DNAM-1）、ポリオウイルス受容体関連2（CD112）、細胞傷害性調節性T細胞分子（CRTAM）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー4（TNFRS4；OX40；CD134）、腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー4（TNFSF4；OX40リガンド（OX40L））、ナチュラルキラー細胞受容体2B4（CD244）、CD160、グルココルチコイド誘発TNFR関連タンパク質（GITR）、グルココルチコイド誘発TNFR関連タンパク質リガンド（GITRL）、誘発性共同刺激因子（ICOS）、ガレクチン9（GAL-9）、4-1BBリガンド（4-1BBL；CD137L）、4-1BB（4-1BB；CD137）、CD70（CD27リガンド（CD27L））、CD28、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、シグナル調節タンパク質（SIRP-1）、インテグリン関連タンパク質（IAP；CD47）；Bリンパ球活性化マーカー（BLAST-1；CD48）、ナチュラルキラー細胞受容体2B4（CD244）；CD40、CD40リガンド（CD40L）、ヘルペスウイルス侵入媒介因子（HVEM）、トランスメンブレンおよび免疫グロブリンドメイン含有2（TMIGD2）、HERV-H LTR-関連2（HHLA2）、血管内皮増殖因子（VEGI）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー25（TNFRS25）、誘発性T細胞共同刺激因子リガンド（ICOLG；B7RP1）並びにIｇおよびITIM（免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ）ドメインを有するT細胞免疫受容体（TIGIT）。いくつかの実施態様では、少なくとも1つのICMアンタゴニストは、PD-1アンタゴニスト、PD-L1アンタゴニストおよびCTLA4アンタゴニストから選択される。いくつか実施態様では、少なくとも1つのICMアンタゴニストは、CTLA-4アンタゴニスト以外であるかまたはCTLA-4アンタゴニストを除く。いくつかの実施態様では、少なくとも1つのICMアンタゴニストはPD-1アンタゴニストを含む。いくつかの実施態様では、少なくとも1つのICMアンタゴニストはPD-L1アンタゴニストを含む。ある種の実施態様では、少なくとも1つのICMアンタゴニストは、PD-1アンタゴニストおよびPD-L1アンタゴニストを含む。他の実施態様では、少なくとも1つのICMアンタゴニストは、PD-1アンタゴニストおよびCTLA-4アンタゴニストを含む。他の実施態様では、少なくとも1つのICMアンタゴニストは、PD-L1アンタゴニストおよびCTLA4アンタゴニストを含む。具体的な実施態様では、ICMアンタゴニストは、Treｇ細胞が発現を欠くかまたは低レベルで発現するICMと拮抗する。それと同じおよびその他の実施態様のいくつかでは、ICMアンタゴニストは、Treｇ上でCTLA4よりも低いレベルで発現されるICM（例えばPD-1またはPD-L1）と拮抗する。それと同じまたはその他の実施態様のいくつかでは、ICMアンタゴニストは、Treｇ上よ���も免疫エフェクター細胞（例えばエフェクターT細胞、マクロファージ、樹状細胞、B細胞など）で高いレベルで発現されるICM（例えばPD-1またはPD-L1）と拮抗する。これらの実施態様の代表的な例では、少なくとも1つのICMアンタゴニストは、PD-1およびPD-L1の一方または両方から選択されるICMと拮抗する。
【０００６】
RANKLアンタゴニストは、RANKLに特異的に結合する直接的RANKLアンタゴニストであってもよく、またはRANKLの同族受容体、RANKに特異的に結合する間接的RANKLアンタゴニストでもよい。
多数のRANKLおよびICMアンタゴニストが当業界では公知であり、そのいずれも本発明の実施に用いことができる。多様な実施態様で、アンタゴニストはアンタゴニスト抗原結合分子である。
これらの実施態様のいくつかでは、RANKLアンタゴニストは、RANKLと特異的に結合する抗RANKL抗原結合分子である。このタイプの例示的実施例では、抗RANKL抗原結合分子は、アミノ酸配列TEYLQLMVY（配列番号:1）（すなわち、配列番号:2で示される自然のままのRANKL配列の残基233−241）の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する。
いくつかの実施態様では、抗RANKL抗原結合分子はモノクローナル抗体（MAb）である。抗RANKL抗原結合分子の非限定的な例は、MAbデノスマブまたはその抗原結合フラグメントである。適切には、抗RANKL抗原結合分子は、配列番号:3に示される重鎖アミノ酸配列またはその抗原結合フラグメント、および/または配列番号:4に示される軽鎖アミノ酸配列またはその抗原結合フラグメントを含む。
他の実施態様では、抗RANKL抗原結合分子はRANKLとの結合についてデノスマブと競合する。
いくつかの実施態様では、RANKLアンタゴニストはRANKと拮抗する。例えば、RANKアンタゴニスト（例えば抗RANK抗原結合分子またはアンタゴニストペプチド）は、CDR2（すなわち残基44−85）およびCRD3（すなわち残基86−123）から選択されるシステイン富裕ドメイン（CRD）の少なくとも一部分に対応するアミノ酸配列と特異的に結合するか、または前記を含むか、それらから成るかもしくは本質的に前記から成り得る。このタイプの非限定的な例では、RANKアンタゴニスト（例えば抗RANK抗原結合分子またはアンタゴニストペプチド）は、RANK CRD3の少なくとも一部分に対応するアミノ酸配列と特異的に結合するか、または前記を含むか、前記から成るかもしくは本質的に前記から成り、その代表的な例には、YCWNSDCECCY（配列番号:5）、YCWSQYLCY（配列番号:6）が含まれる。
【０００７】
他の実施態様では、RANKアンタゴニストは、アミノ酸配列VSKTEIEEDSFRQMPTEDEYMDRPSQPTDQLLFLTEPGSKSTPPFSEPLEVGENDSLSQCFTGTQSTVGSESCNCTEPLCRTDWTPMS（配列番号:7）（すなわち、配列番号:8に示される自然のままのRANK配列の残基330−417）の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する、抗RANK抗原結合分子である。適切には、抗RANK抗原結合分子はモノクローナル抗体（MAb）である。例示すれば、抗RANK抗原結合分子は、モノクローナル抗体64C1385或いはN-1H8およびN-2B10（Taylor et al. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2017;25（5）:299-307；およびBranstetter et al. J Bone Oncol. 2015;4（3）:59-68）またはその抗原結合フラグメントから選択できる。他の実施態様では、抗RANK抗原結合分子は、RANKとの結合についてモノクローナル抗体64C1385、N-1H8またはN-2B10と競合することができる。いくつかの実施態様では、抗RANK抗原結合分子は、例えばNewaら（Newa et al., Mol Pharm. 11（1）:81-9, 2014）によって開示される短鎖Fv（scFv）抗原結合分子またはその抗原結合フラグメントである。
適切には、それぞれのICMアンタゴニストは抗ICM抗原結合分子である。具体的な実施態様では、抗ICM抗原結合分子は、抗PD-1抗原結合分子、抗PD-L1抗原結合分子および抗CTLA4抗原結合分子から選択される。
抗PD-1抗原結合分子はMAbであり得る。その非限定的な例には、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、およびMEDI-0680（AMP-514）、AMP-224、JS001-PD-1、SHR-1210、Gendor PD-1、PDR001、CT-011、REGN2810、BGB-317またはその抗原結合フラグメントが含まれる。また別には、抗PD-1抗原結合分子は、PD-1との結合についてニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、またはMEDI-0680と競合するものであり得る。
いくつかの実施態様では、抗PD-1抗原結合分子は、アミノ酸配列SFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDR（配列番号:9）（すなわち、配列番号:10に示される自然のままのPD-1配列の残基62から86）、および/またはアミノ酸配列SGTYLCGAISLAPKAQIKE（配列番号:11）（すなわち、配列番号:10に示される自然のままのPD-1配列の残基118から136）の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する。それと同じおよびその他の実施態様のいくつかでは、抗PD-1抗原結合分子は、アミノ酸配列NWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRV（配列番号:12）（すなわち、配列番号:10に示される自然のままのPD-1配列の残基66から97に対応する）の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する。
【０００８】
いくつかの実施態様では、抗PD-L1抗原結合分子はMAbであり、その非限定的な例には、デュルバルマブ（MEDI4736）、アテゾリズマブ（Tecentriq）、アベルマブ、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480およびMPDL3280A、またはその抗原結合フラグメントが含まれる。このタイプの例示的な例では、抗PD-L1抗原結合分子は、アミノ酸配列SKKQSDTHLEET（配列番号:13）（すなわち、配列番号:14に示される完全長の自然のままのPD-L1アミノ酸配列の残基279から290）の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する。また別には、抗PD-L1抗原結合分子は、PD-L1との結合についてデュルバルマブ（MEDI4736）、アテゾリズマブ（Tecentriq）、アベルマブ、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480およびMPDL3280Aのいずれか1つと競合するものであり得る。
いくつかの実施態様では、抗CTLA4抗原結合分子はMAbであり、その代表的な例にはイピリムマブおよびトレメリムマブまたはその抗原結合フラグメントが含まれる。また別には、抗CTLA4抗原結合分子は、CTLA4との結合についてイピリムマブまたはトレメリムマブと競合するものであり得る。このタイプの例示的な例では、抗CTLA4抗原結合分子は、YASPGKATEVRVTVLRQA（配列番号:15）（すなわち配列番号:16に示される完全長の自然のままのCTLA4アミノ酸配列の残基25から42）、DSQVTEVCAATYMMGNELTFLDD（配列番号:17）（すなわち配列番号:16に示される自然のままのCTLA4アミノ酸配列の残基43から65）、およびVELMYPPPYYLGIG（配列番号:18）（すなわち配列番号:16に示される自然のままのCTLA4アミノ酸配列の残基96から109）から選択されるアミノ酸配列の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する。
【０００９】
いくつかの実施態様では、治療薬組合せは、抗RANKL抗原結合分子および抗PD-1抗原結合分子を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。他の実施態様では、治療薬組合せは、抗RANKL抗原結合分子および抗PDL1抗原結合分子を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。さらに他の実施態様では、治療薬組合せは、抗RANKL抗原結合分子、抗PD-1抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。さらに他の実施態様では、治療薬組合せは、抗RANKL抗原結合分子、抗PD-1抗原結合分および抗CTLA4抗原結合分子を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。他の実施態様では、治療薬組合せは、抗RANK抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。
RANKLまたはICMアンタゴニストが抗原結合分子であるいくつかの実施態様では、抗原結合分子は、免疫グロブリン定常鎖（例えばIｇG1、IｇG2a、IｇG2b、IｇG3またはIｇG4定常鎖）と連結する。免疫グロブリン定常鎖は、軽鎖（κ軽鎖またはラムダ軽鎖から選択される）および重鎖（γ1重鎖、γ2重鎖、γ3重鎖およびγ4重鎖から選択される）を含み得る。
ある種の実施態様では、治療薬組合せは、RANKLアンタゴニストおよび2つ以上の異なるICMアンタゴニストを含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。このタイプの代表的な例では、治療薬組合せは、RANKLアンタゴニスト並びにCTLA4アンタゴニスト、PD-1アンタゴニストおよびPD-L1アンタゴニストの少なくとも2つを含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。
【００１０】
治療薬組合せのアンタゴニスト成分は別個の構成要素の形態であり得る。そうでなければ、それらは互いに融合するか、または（直接的または間接的に）複合体化され得る。
具体的な実施態様では、治療薬組合せはマルチ特異性アンタゴニスト薬剤の形態であり、RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストを含む。マルチ特異性薬剤は2つ以上のポリペプチドの複合体であり得る。また別には、マルチ特異性薬剤は単一鎖ポリペプチドであり得る。RANKLアンタゴニストは、それぞれのICMアンタゴニストのN-末端でまたはC-末端で複合体化され得る。RANKLアンタゴニストおよびICMアンタゴニストは、直接的にまたは介在リンカー（例えばポリペプチドリンカー）によって結合され得る。有利な実施態様では、マルチ特異性アンタゴニスト薬剤は少なくとも2つの抗原結合分子を含む。適切には、そのようなマルチ特異性抗原結合分子は組換え分子の形態にある（キメラ、ヒト化およびヒト抗原結合分子を含む）。
関連する特徴では、本発明は、RANKLおよび少なくとも1つのICMに拮抗するマルチ特異性抗原結合分子を提供する。これらマルチ特異性抗原結合分子は、概して、RANKLまたはRANKと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを、さらにそれぞれのICMについては当該ICMと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。抗体および/または抗原結合フラグメントは、直接的にまたは介在リンカー（例えば化学的リンカーまたはポリペプチドリンカー）によって結合され得る。個々のマルチ特異性抗原結合分子は、抗体または抗原結合フラグメントが作動できるように結合されている単鎖ポリペプチドの形態であり得る。また別に、前記は、互いに連結され或いは会合して複合体を形成する複数の別個のポリペプチドを含むことができる。それと同じおよびその他の実施態様のいくつかでは、マルチ特異性抗原結合分子は二価、三価、または四価である。
【００１１】
少なくとも1つのICMは適切には以下から選択される：PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、A2AR、A2BR、CD276、VTCN1、BTLA、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、VISTA、CD73、CD96、CD155、DNAM-1、CD112、CRTAM、OX40、OX40L、CD244、CD160、GITR、GITRL、ICOS、GAL-9、4-1BBL、4-1BB、CD27L、CD28、CD80、CD86、SIRP-1、CD47、CD48、CD244、CD40、CD40L、HVEM、TMIGD2、HHLA2、VEGI、TNFRS25、ICOLGおよびTIGIT。具体的な実施態様では、ICMアンタゴニストは、Treｇ細胞が発現を欠くかまたは低レベルで発現するICMと拮抗する。それと同じおよびその他の実施態様のいくつかでは、ICMアンタゴニストは、TreｇでCTLA4よりも低いレベルで発現されるICM（例えばPD-1またはPD-L1）と拮抗する。それと同じおよびその他の実施態様のいくつかでは、ICMアンタゴニストは、Treｇよりも免疫エフェクター細胞（例えばエフェクターT細胞、マクロファージ、樹状細胞、B細胞など）でより高レベルで発現されるICM（例えばPD-1またはPD-L1）と拮抗する。これらの実施態様の代表的な例では、少なくとも1つのICMアンタゴニストは、PD-1およびPD-L1の一方または両方から選択されるICMと拮抗する。マルチ特異性抗原結合分子が二価である具体的な実施態様では、抗ICM抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗CTLA4抗体またはその抗原結合フラグメント以外である。
【００１２】
マルチ特異性抗原結合分子で使用が意図される抗原結合フラグメントは、Fab、Fab’、F（ab’）2およびFv分子並びに相補性決定領域（CDR）から選択され得る。いくつかの実施態様では、個々の抗体またはその抗原結合フラグメントは、IｇG、IｇM、IｇD、IｇA、およびIｇEから成る群からそれぞれ独立に選択される定常ドメインを含む。マルチ特異性抗原結合分子の非限定的な例は適切には以下を含む：タンデムscFv（taFvまたはscFv2）、ジアボディ、dAb2/VHH2、ノブインホール（knobs-in-holes）誘導体、シードコッド（Seedcod）-IｇG、ヘテロFc-scFv、Fab-scFv、scFv-Jun/Fos、Fab’-Jun/Fos、トリボディ、DNL-F（ab）3、scFv3-CH1/CL、Fab-scFv2、IｇG-scFab、IｇG-scFv、scFv-IｇG、scFv2-Fc、F（ab’）2-scFv2、scDB-Fc、scDb-CH3、Db-Fc、scFv2-H/L、DVD-Iｇ、tandAb、scFv-dhlx-scFv、dAb2-IｇG、dAb-IｇG、dAb-Fc-dAb、tandab、DART、BiKE、TriKE、mFc-VH、架橋MAb、CrossMAb、MAb2、FIT-Iｇ、静電気的に適合した抗体、対称性IｇG様抗体、LUZ-Y、Fab-交換抗体、または前記の組合せ。
適切な抗原結合フラグメントは、免疫グロブリン定常鎖（例えばIｇG1、IｇG2a、IｇG2b、IｇG3、およびIｇG4）に連結され得る。このタイプの代表的な例では、免疫グロブリン定常鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖から選択される軽鎖、および/またはγ1重鎖、γ2重鎖、γ3重鎖、およびγ4重鎖から選択される重鎖を含むことができる。
【００１３】
RANKLアンタゴニストが直接的なRANKLアンタゴニストであるいくつかの実施態様では、マルチ特異性抗原結合分子は、抗RANKL抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、前記は、アミノ酸配列TEYLQLMVY（配列番号:1）（すなわち、配列番号:2に示される自然のままのRANKL配列の残基233−241）の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する。RANKLアンタゴニストが間接的なRANKLアンタゴニストである他の実施態様では、マルチ特異性抗原結合分子は、抗RANK抗体またはその抗原結合フラグメントを含むことができ、前記は、RANKの細胞外領域（すなわち、配列番号:8に示されるヒトRANK配列の残基30から212に対応する）と特異的に結合する。
マルチ特異性抗原結合分子がPD-1と拮抗するいくつかの実施態様では、抗PD-1抗体またはその抗原結合フラグメントは、SFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDR（配列番号:9）（すなわち、配列番号:10に示される自然のままのヒトPD-1配列の残基62から86）、SGTYLCGAISLAPKAQIKE（配列番号:11）（すなわち、配列番号:10に示される自然のままのヒトPD-1配列の残基118から136）、およびNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRV（配列番号:12）（すなわち、配列番号:10に示される自然のままのヒトPD-1配列の残基66から97）から選択されるアミノ酸配列の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する。
同じ実施態様のいくつかおよび他の実施態様では、抗PD-1抗体またはその抗原結合フラグメントは、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、およびMEDI-0680（AMP-514）、AMP-224、JS001-PD-1、SHR-1210、Gendor PD-1、PDR001、CT-011、REGN2810、BGB-317またはその抗原結合フラグメントから選択されるMAbの重鎖および軽鎖を含む。
マルチ特異性抗原結合分子がPD-L1と拮抗するいくつかの実施態様では、抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントは、SKKQSDTHLEET（配列番号:13）（すなわち、配列番号:14に示される自然のままのヒトPD-L1アミノ酸配列の残基279から290）と特異的に結合する。このタイプの例示的抗体および抗原結合フラグメントは、デュルバルマブ（MEDI4736）、アテゾリズマブ（Tecentriq）、アベルマブ、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480およびMPDL3280A、またはその抗原結合フラグメントから選択されるMAbの重鎖および軽鎖を含むものを含む。
【００１４】
マルチ特異性抗原結合分子がCTLA4と拮抗するいくつかの実施態様では、抗CTLA4抗体またはその抗原結合フラグメントは、YASPGKATEVRVTVLRQA（配列番号:15）（すなわち、配列番号:16に示される完全長の自然のままのPD-CTLA4アミノ酸配列の残基25から42）、DSQVTEVCAATYMMGNELTFLDD（配列番号:17）（すなわち、配列番号:16に示される自然のままのCTLA4配列の残基43から65）、およびVELMYPPPYYLGIG（配列番号:18）（すなわち、配列番号:16に示される自然のままのCTLA4配列の残基96から109）から選択されるアミノ酸配列の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する。このタイプの例示的抗体および抗原結合フラグメントは、イピリムマブおよびトレメリムマブ、またはその抗原結合フラグメントから選択されるMAbの重鎖および軽鎖を含むものを含む。
いくつかの実施態様では、マルチ特異性抗原結合分子は、抗RANKL抗原結合分子および抗PD-1抗原結合分を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。他の実施態様では、マルチ特異性抗原結合分子は、抗RANKL抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。さらに他の実施態様では、マルチ特異性抗原結合分子は、抗RANKL抗原結合分子、抗PD-1抗原結合分および抗PD-L1抗原結合分子を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。さらに他の実施態様では、マルチ特異性抗原結合分子は、抗RANKL抗原結合分子、抗PD-1抗原結合分子および抗CTLA4抗原結合分子を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。他の実施態様では、マルチ特異性抗原結合分子は、抗RANK抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。
【００１５】
別の特徴では、本発明は、上記および本明細書のいずれかの場所に記載される治療薬組合せを生産する方法を提供する。これらの方法は概して、抗RANKLまたは抗RANK抗原結合分子および少なくとも1つの抗ICM抗原結合分子を組合わせて、それによって治療薬組合せを生産する工程を含む。いくつかの実施態様では、当該方法は治療薬組合せの標的ポリペプチド（例えばRANKL、RANKまたはICM）と特異的に結合する抗原結合分子を生成する工程を含み、前記工程は例えば以下の工程によって実施される：標的ポリペプチドに対応するアミノ酸配列を含む免疫性ポリペプチドで動物を免疫する工程；および標的ポリペプチドまたはその少なくとも1つの領域と特異的に結合する、当該動物のB細胞を識別および/または単離する工程；および当該B細胞によって発現される抗原結合分子を生産する工程。非限定的な例では、前記方法はさらにまた、そのようにして生産された抗原結合分子をデリバタイズして、抗原結合分子と同じエピトープ結合特異性を有する誘導抗原分子を生産する工程を含む。当該誘導抗原結合分子は抗体フラグメントから選択され得る。前記の例示的な例には以下が含まれる：Fab、Fab’、F（ab’）2、Fv）、単鎖（scFv）およびドメイン抗体（例えばサメおよびラクダ類抗体を含む）、並びに抗体および抗原結合/認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変構造を含む融合タンパク質。
いくつかの実施態様では、治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子は、デリバリービヒクル（例えばリポソーム、ナノ粒子、ミクロ粒子、デンドリマーまたはシクロデキストリン）に収納される。
さらに別の特徴では、本発明は、上記および本明細書のいずれかの場所に広く記載されるマルチ特異性抗原結合分子をコードする核酸配列を含む構築物（1つ以上の制御配列に作動できるように結合されている）を提供する。適切な構築物は、好ましくは発現構築物の抗体であり、その代表的な例にはプラスミド、コスミド、ファージおよびウイルスが含まれる。
本発明のさらに別の特徴は、上記および本明細書のいずれかの場所に広く記載される構築物を含む宿主細胞を提供する。
【００１６】
別の特徴では、本発明は、上記および本明細書のいずれかの場所に広く記載される治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子、および医薬的に許容できる担体もしくは希釈剤を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施態様では、組成物はさらにまた、化学療法剤（例えば抗増殖/抗新形成薬、細胞増殖抑制剤、癌細胞侵襲阻害剤、増殖因子機能阻害剤、抗血管形成剤、血管損傷剤などから選択される）または免疫療法剤（例えばサイトカイン、サイトカイン発現細胞、抗体など）から選択される少なくとも1つの補助剤を含む。
本発明のさらに別の特徴は、対象動物において免疫を刺激するかまたは増大させる方法を提供する。これらの方法は概して、上記に広く記載した治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子の有効量を対象動物に投与し、それによって対象動物において免疫を刺激するかまたは増大させる工程を含む。治療薬組合せでRANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストが別個の構成要素として提供される実施態様では、当該成分は適切には対象動物に同時発生的に投与される。このタイプの例示的な例では、RANKLアンタゴニストは少なくとも1つのICMアンタゴニストと同時に投与される。他の例示的な例では、RANKLアンタゴニストおよび少なくとも1つのICMアンタゴニストは逐次的に投与される。例えば、RANKLアンタゴニストは、少なくとも1つのICMアンタゴニストの投与前に投与することができる。適切には、RANKLアンタゴニストは、少なくとも1つのICMアンタゴニストの投与後に投与される。
典型的には、刺激または増大される免疫は有益な宿主免疫応答を含み、その例示的な例には以下のいずれか1つ以上が含まれる：腫瘍サイズの減少、腫瘍量の減少、疾患の安定化、内因性または外因性抗原に対する抗体の産生、免疫系の誘発、免疫系の1つ以上の成分の誘発、細胞媒介免疫およびその発生に必要とされる分子、液性免疫およびその発生に必要とされる分子、抗体依存細胞傷害性（ADCC）免疫およびその発生に必要とされる分子、補体媒介細胞傷害性（CDC）免疫およびその発生に必要とされる分子、ナチュラルキラー細胞、サイトカインおよびケモカイン並びにそれらの産生に必要とされる分子および細胞、抗体依存細胞傷害、補体依存細胞傷害、ナチュラルキラー細胞活性、および抗原増強細胞傷害。このタイプの代表的な例では、刺激または増大される免疫には炎症促進免疫応答が含まれる。
【００１７】
本発明のさらに別の特徴は、対象動物における腫瘍に対する免疫抑制または耐性の発達もしくは進行を阻害する方法を提供する。これらの方法は概して、腫瘍を上記で広く記載された治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子と接触させ、それによって対象動物における腫瘍に対する免疫抑制または耐性の発達もしくは進行を阻害する工程を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。適切には、治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子はまた、免疫系に腫瘍抗原を提示する抗原提示細胞（例えば樹状細胞）と接触する。
本発明のさらに別の特徴は、癌の発達、進行または再発を対象動物において阻害する方法を提供する。これらの方法は概して、上記および本明細書のいずれかの場所に広く記載された治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子の有効量を対象動物に投与し、それによって癌の発達、進行または再発を対象動物において阻害する工程を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。
関連する特徴では、本発明は対象動物において癌を治療する方法を提供する。これらの方法は概して、上記および本明細書のいずれかの場所に広く記載された治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子の有効量を対象動物に投与し、それによって当該対象動物において癌を治療する工程を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。
【００１８】
本発明にしたがって治療し得る癌の非限定的な例には以下が含まれる：メラノーマ、乳癌、結腸癌、卵巣癌、子宮内膜および子宮癌、胃関連または胃の癌（ｇastric or stomatch cancer）、膵臓癌、前立腺癌、唾液腺癌、肺癌、肝細胞癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、結腸直腸癌、腎臓癌、外陰癌、甲状腺癌、肝関連癌腫（hepatic carcinoma）、肛門癌腫、陰茎癌腫、精巣癌、食道癌、胆管の腫瘍、頭頸部癌、および扁平上皮細胞癌腫。いくつかの具体的な実施態様では、癌は転移癌である。
治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子の対象動物への投与を必要とする上記の特徴のいずれにおいても、対象動物は適切には免疫調節剤に対して低下または障害された応答性を有し、例えば、対象動物はICM分子アンタゴニスト（例えば抗PD-1または抗PD-L1免疫療法）に低下または障害された応答性を有する。
本発明の方法のいくつかで、有効量の補助抗癌剤は同時発生的に対象動物に投与される。いくつかの適切な補助抗癌剤には、化学療法剤、体外放射線照射、標的に誘導される放射性同位元素、およびシグナル伝達阻害剤が含まれる。しかしながら、他の公知の抗癌剤のいずれも、本発明の方法に関する使用で等しく適用可能である。
さらにまた別の特徴では、本発明は、対象動物において腫瘍に対する免疫抑制もしくは耐性の発達もしくは進行を阻害するためにまたは癌を治療するために、免疫を刺激または増大させるキットを提供する。これらのキットは、上記および本明細書のいずれかの場所に広く記載された治療薬組合せ、医薬組成物、およびマルチ特異性抗原結合分子のいずれか1つ以上を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】抗CTLA4および抗RANKL併用による実験肺転移の抑制は、NK細胞およびIFN-γ依存性であることを示すグラフである。5−10匹のC57BL/6野生型（WT）および遺伝子標的マウスのグループに（表示のように）、B16F10メラノーマ細胞（2ｘ105）を静脈内に注射した（A−C）。5−10匹のC57BL/6野生型（WT）のグループにRM1前立腺癌細胞（1ｘ104）を静脈内注射した（D）。-1、0および2日目（腫瘍接種に対応）に、cIｇ、抗CTLA4（UC10-4F10、ハムスターIｇG）および/または抗RANKL（IK22/5）（いずれも200μｇ/マウスi.p.）で表示のようにマウスを処理した。（B）-1、0および7日目にいくつかのマウスグループを抗CD8βまたは抗asGM1で追加処理した（いずれもそれぞれ100μｇ/マウスi.p．）。転移量は、肺表面のコロニーを数えることによって14日後に肺で定量した。各グループの平均±SEMが示される。併用における転移制御の改善は、表示のように統計的に有意であった（一元配置分散分析、テューキー多重比較；*P＜0.05、**P＜0.01、****P＜0.0001）。
【図２】抗CTLAのアイソタイプは、抗RANKLと併用されて実験的肺転移を抑制する抗CTLA4の有効性に影響を及ぼすことを示すグラフである。5−8匹のC57BL/6野生型（WT）マウスのグループに、表示のようにB16F10メラノーマ細胞（2ｘ105）を静脈内注射した。-1、0および2日目（腫瘍接種に対応）にマウスを表示のように以下により処理した:cIｇ（1D12、マウスIｇG2a）、種々のアイソタイプの抗CTLA4（UC10-4F10（ハムスターIｇG）、9D9（マウスIｇG2a、IｇG2b、IｇG1またはIｇG1 D265A）および/またはcIｇ（2A3、ラットIｇG2a）または抗RANKL（IK22/5）（いずれも200μｇ/マウスi.p.）。転移量は、肺表面のコロニーを数えることによって14日後に肺で定量した。各グループの平均±SEMが示される。（A）は2つのそれぞれ別個の実験のプールした結果である。併用対抗CTLA4単独（IｇG2aおよびハムスターアイソタイプ）の転移制御の改善は、表示のように統計的に有意であった（一元配置分散分析、テューキー多重比較；*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.0001）。（B）抗CTLA4-IｇG2aアイソタイプ単独による、および種々の併用による転移制御の改善は、表示のように統計的に有意であった（一元配置分散分析、シダック多重比較（抗CTLA4単独療法がcIｇと、および抗RANKLとの併用またはcIｇとの併用と比較される）；*P＜0.05、***P＜0.001、****P＜0.0001）。実験は1回実施された。
【図３】抗RANKLと併用された抗CTLA4はB16F10皮下腫瘍を抑制することを示すグラフである。5匹のC57BL/6野生型（WT）マウスのグループにB16F10メラノーマ細胞（1ｘ105）を皮下注射した。3、7、9および11日目（腫瘍接種に対応）に、マウスをcIｇ、抗CTLA4（UC10-4F10、ハムスターIｇG）（200μｇ、i.p.）で処理した。各グループの平均±SEMが示される。グラフはそれぞれ別個の7実験の代表的な増殖曲線である。
【図４】抗CTLA4のIｇG2aアイソタイプは抗RANKLと最も効果的に併用されて、B16F10皮下腫瘍を抑制することを示すグラフである。5匹のC57BL/6野生型（WT）マウスのグループにB16F10メラノーマ細胞（1ｘ105）を皮下注射した。（A）6、8、10および12日目（腫瘍接種に対応）に、または（B）3、7、9および11日目（腫瘍接種に対応）に、cIｇ、抗CTLA4（9D9、表示のようにマウスIｇG2aまたはIｇG1-D265A、50μｇをi.p.）、および/または抗RANKL（IK22/5、200μｇをi.p.）で表示のようにマウスを処理した。各グループの平均±SEMが示される。提示のように抗CTLA4および抗RANKLの併用による優れた皮下腫瘍増殖抑制は統計的に有意であった（一元配置分散分析、テューキー多重比較；*P＜0.05、**P＜0.01、****P＜0.0001）。抗CTLA4-IｇG2aと抗RANKLとの併用と単独療法またはcIｇとの間の相違は、提示のように有意であった（クルスカル-ワリス検定、ダン多重比較、ここで単独療法アームまたはcIｇは抗CTLA4-IｇG2aと抗RANKLとの併用と比較された；*P＜0.05、**P＜0.01、****P＜0.0001）。抗RANKLと併用した抗CTLA4-IｇG1-D265Aをどちらかの単独療法として比較したとき、有意差は観察されなかった。（C）B16F10皮下腫瘍増殖は、抗CTLA4-IｇG2aおよび抗RANKL療法の併用によって最大限に抑制される。7つのそれぞれ別個のプール実験（各グループにつき5−6マウス）について処理グループを比較した、予想される混合効果が繰返し再生さる腫瘍データ測定（loｇスケール）がグラフに示される。単独療法またはコントロールと比較して抗RANKLと抗CTLA4（mIｇG2a）との併用による優れた増殖抑制、および、コントロールと比較して優れてはいるが単独療法との比較ではそうではない抗RANKLと抗CTLA4（mIｇG1-D265A）との併用は表で提示するのように有意であった（ペアワイズ比較；**P＜0.01、****P＜0.0001）。
【図５】B16F10腫瘍ミクロ環境（TME）におけるRANKLおよびRANKの発現を示すグラフである。C57BL/6野生型（WT）のグループにB16F10メラノーマ細胞（1ｘ105）を皮下注射した（A−B）。3、7日目（腫瘍接種に対応）、および実験続行の場合には11および15日目にもまた、表示のようにcIｇ（1-1、ラットIｇG2a、200μｇ（i.p））または抗RANKL（IK22/5、200μｇ（i.p.））でマウスを処理した。2つのそれぞれ別個の実験（グループにつき各々3−5マウス）が（A−B）の各々で組み合わされる。表示の時点におけるRANKL発現とT細胞サブセットおよび器官部位との間の有意差が、（A）に示される（一元配置分散分析、テューキー多重比較；*P＜0.05、**P＜0.01、****P＜0.0001）。（B）腫瘍を16日目に分析した。表示のように、cIｇと抗RANKL処理グループとの間に有意差は観察されなかった。
【図６】抗CTLA4-IｇG2aおよび抗RANKL療法の併用の有効性はFcR、IFNγ、Batf3、およびCD8+ T細胞依存性であることを示すグラフである。C57BL/6野生型（WT）または遺伝子標的マウスのグループに、表示のようにB16F10メラノーマ細胞（1ｘ105）を皮下注射した（A−D）。3、7日目（腫瘍接種に対応）、および実験続行の場合には11および15日目にもまた表示のように以下によりマウスを処理した：cIｇ（1-1、ラットIｇG2a、200μｇ（i.p）＋1D12、マウスIｇG2aまたはIｇG1（抗CTLA4アイソタイプと適合するように）、50μｇ（i.p.））、抗CTLA4（9D9、表示のようにマウスIｇG2aまたはIｇG1-D265A、50μｇ（i.p.））および/または抗RANKL（IK22/5、200μｇ（i.p.））。（B）に表示するように、数匹のマウスは-1、0および7日目に以下を用いて腹腔内処置された：抗CD8βまたは抗asGM1（いずれも各々100μｇ/マウス（i.p.））。各グループの平均±SEMが示される。腫瘍増殖曲線のグループ間における相違は提示のとおり有意である（一元配置分散分析、テューキー多重比較；**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.0001）。cIｇおよびa-RANKLとa-CTLA4との併用で処理したWTグループは（A）および（C）では同じものであるが、解釈を容易にするために異なるグラフで表示される。抗CTLA4との抗RANKLの併用有効性はFcRおよびBatf3依存性である。
【図７】抗RANKLと抗CTLA4療法との併用は、腫瘍へのCD8+ T細胞の補充増加をもたらすことを示すグラフである。4−8匹のC57BL/6野生型（WT）マウスのグループにB16F10メラノーマ細胞（1ｘ105）を皮下注射した。データはそれぞれ別個の2−5実験からプールされる（A−H）。3、7、11および15日目に（A−E、G−H）、または3および11日目に（F）（腫瘍接種に対応）、マウスを表示のように以下により処理した:cIｇ（1-1、ラットIｇG2a、200μｇ（i.p.）＋1D12、マウスIｇG2a、50μｇ（i.p.））、抗CTLA4（9D9、IｇG2a、50μｇ（i.p.））および/または抗RANKL（IK22/5、200μｇ（i.p.））。サイズについての倫理的終末点に対応する末期（16日目）にマウスを犠牲にし（A−E、G−H）、FACS分析のために腫瘍を処理した。提示するように、9日目（F）および15−16日目（G）における、全生細胞のCD45+ TIL比率（A）、CD8+Ki-67+ T細胞比率（E）、CD8+ T細胞対Treｇ比（H）（TCRβ+CD4+、FoxP3+と規定される）の増加、並びにCD8+ T細胞対CD11b+GR1hi 細胞比の増加は有意である（一元配置分散分析、ダンネット多重比較、ここで各グループは抗CTLA4-IｇG2a＋抗RANKL併用療法と比較される；*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.0001）。（B）提示するように、全CD45+ TILの比率のようなCD8+ T細胞の増加は有意である（クルスカル-ワリス検定、ダン多重比較、ここで各グループは9D9 IｇG2a＋IK22/5併用と比較される；*P＜0.05、****P＜0.0001）。（C）腫瘍内のCD8+ T細胞数は併用療法により増加する（一元配置分散分析、ダンネット多重比較（ここで各グループは抗CTLA4-IｇG2a＋抗RANKL併用と比較される；**P＜0.01、****P＜0.0001）。（D）cIｇまたは抗RANKL処理と比較して、抗CTLA4-IｇG2aによるTreｇの減少は表示のとおり有意である（一元配置分散分析、テューキー多重比較；**P＜0.01）。
【図８】抗RANKLは、T細胞サイトカインの多機能性の増加によって抗CTLA4の有効性を改善することを示すグラフである。4−8匹のC57BL/6野生型（WT）マウスのグループにB16F10メラノーマ細胞（1ｘ105）を皮下接種した。（A−E）3、7、11および15日目に（腫瘍接種に対応）、マウスを表示のように以下により処理した: cIｇ（1-1、ラットIｇG2a、200μｇ（i.p.）＋1D12、マウスIｇG2a、50μｇ（i.p.））、抗CTLA4（9D9、IｇG2a、50μｇ（i.p.））および/または抗RANKL（IK22/5、200μｇ（i.p.））。マウスを腫瘍接種から16日目に犠牲にして腫瘍を処理し、ICSの実施前にex-vivoで刺激した。IFNγ（A）、IFNγおよびIL-2（B）またはIFNγ、IL2およびTNFα（C）（“三重陽性”）の共同発現の陽性染色によるCD8+ T細胞の比率の増加；並びに（D）併用療法によるIFNγ発現CD4+ T細胞の比率の増加は、提示のように有意である（クルスカル-ワリス検定、ダン多重比較、ここで各グループは9D9 IｇG2a＋IK22/5併用処理と比較される：*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.0001）。それぞれ別個の2−3のプール実験を示す（A−D）。2つのプール実験から、0、1、2または3つのサイトカイン（IFNγ、IL-2およびTNFα）を発現するCD8+ T細胞の平均比率が、提示のように4処理グループについて示される（E）。
【図９】PD1/PD-L1およびRANKLの共同封鎖は転移の相乗的抑制をもたらすことを示すグラフである。C57BL/6 WTマウスに、（A、C）B16F10メラノーマまたは（B、D）RM1前立腺癌腫を静脈内注射した（2ｘ105細胞）。-1、0および2日目に（腫瘍接種に対応）、表示のように以下によりマウスを処理した：cIｇ（2A3、200μｇ（i.p.））、（A−B）抗PD-1（RMP1-14、200μｇ（i.p.））または（C−D）抗PD-L1（10F.9G2、200μｇ（i.p.））、および/または抗RANKL（IK22/5、200μｇ（i.p.））。14日後に肺表面のコロニーを数えることによって転移量を定量した。グループにつき5匹のマウスの平均±SEMが示される。（A）の2つの実験がプールされる。併用による転移制御の改善は提示のとおり統計的に有意であった（一元配置分散分析、テューキー多重比較；*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.0001）。
【図１０】抗PD-1および抗RANKL MAbは腫瘍の皮下増殖を抑制することを示すグラフである。（A）C57BL/6または（B）BALB/c WT雄マウスのグループに、0日目に（A）MC38または（B）CT26癌腫（1ｘ105細胞）を皮下注射した。続いて、6、9、12および15日目に以下のいずれかでマウスを処理した:cIｇ（2A3または1-1、250mｇ i.p.）；抗PD-1単独（RMP1-14、250mｇ i.p.）；抗RANKL単独IK22/5、200mｇ i.p.）または表示のように前記の組合せ。腫瘍増殖をデジタルキャリパーを用いて測定し、腫瘍サイズをグループにつき5−6匹のマウスの平均±SEMとして提示する。提示のように皮下腫瘍の減少は有意である（一元配置分散分析、テューキー多重比較；*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.0001）。
【図１１】抗RANKLの皮下腫瘍増殖抑制能力は、Batf3依存性であるがFc受容体発現には依存性ではないことを示すグラフである。表示のように、C57Bl/6または遺伝子標的マウスのグループにMCA1956線維肉腫細胞（1ｘ106）を皮下注射した。3、7、11および15日目に（腫瘍接種に対応）、マウスを抗RANKL（IK22/5、200μｇ（ip））またはcIｇ（1-1、200μｇ（ip））で処理した。グループにつき5−7匹のマウスの平均±SEMが示される。提示するように、腫瘍サイズは、同様な遺伝子型の処理グループと比較して、一元配置分散分析（シダック多重比較）で有意に相違する（*P＜0.05）。
【図１２】腫瘍から浸潤する骨髄性細胞のRANKおよびPD-L1の共同発現を示すグラフである。C57Bl/6にMCA1956線維肉腫細胞（1ｘ106）を皮下注射した。腫瘍が約50mm3に達するまで一切処置をせずに22日間増殖させた。腫瘍を収集し、単一細胞懸濁物を作製し、フローサイトメトリーを実施した。パネルAでは、PD-L1およびCD103発現をRANK陽性ゲート分類CD11c+/MHCII+ DCで分析し、ほぼ100％のRANK陽性DCがPD-L1およびCD103の両方を発現することを示した。パネルBでは、CD11b+、F480+マクロファージでCD206およびRANK発現を分析し、腫瘍浸潤マクロファージの52％がRANKおよびCD206を共同発現することを示した。
【図１３】例示的RANKL-PD-1二重特異性抗体をコードするDNAベクターの模式図である。（A）RANKL-PD-1ジアボディをコードする発現ベクターを示す。（B）RANKL-PD-1トリボディをコードするDNA構築物を示す。第一の構築物はPD-1 Fab Lドメインおよび第一のRANKL scFvドメインをコードし、第二の構築物はPD-1 Fab Fdドメインおよび第二のRANKL scFvドメインをコードする。したがって生じたトリボディは、2つのRANKL結合フラグメントおよび単一PD-1結合フラグメントを有するであろう。（C）PD-1-RANKLトリボディをコードするDNA構築物を示す。第一の構築物は、RANKL Fab Lドメインおよび第一のPD-1 scFvドメインをコードし、第二の構築物は、RANKL Fab Fdドメインおよび第二のscFvドメインをコードする。
【図１４】例示的二重特異性抗RANKL抗PD-1トリボディの戯画図である。
【図１５】抗RANKL併用療法の有効性はTreｇ枯渇に完全には依存しないことを示すグラフである。C57BL/6 FoxP3-DTRマウスに、（A−C）B16F10メラノーマ細胞（1ｘ105）または（D−E）RM-1前立腺癌腫細胞（5ｘ104）を皮下注射した。（A−E）3、7、11および15日目、または（C−E）3、７および11日目（腫瘍接種に対応）に、表示のように以下でマウスを処理した:cIｇ（1-1；ラットIｇG2a、200μｇ（i.p.）＋1D12；マウスIｇG2a、50μｇ（i.p.））、DT（（A）では3日目のみ、（C−E）では3および7日目に250nｇ（i.p.））、および/または抗RANKL（IK22-5；ラットIｇG2a、200μｇ（i.p.））。（A、B）B16F10皮下腫瘍増殖（平均±SEMとして表示）、（C）B16F10腫瘍拒絶（処理後に樹立皮下腫瘍の完全な退縮と規定、腫瘍接種後15日目に判定）、（D）グループにつき4−6匹のマウスについて、RM-1腫瘍増殖（平均±SEMとして表示）、および（E）（D）で示した実験の全TILの比率としてTreｇが示される。提示するように統計的有意は、一元配置分散分析、テューキー多重比較によって示された（**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.0001）。
【図１６】RANKLはTMEにおいてPD-1hi発現T細胞を識別することを示すグラフである。（A−C）BALB/c野生型（WT）マウスのグループ（n＝10/グループ）に2ｘ105のCT26結腸癌腫細胞を皮下注射した。腫瘍接種後10日目に、等しい腫瘍サイズ中央値を有するグループにマウスを任意抽出し、以下に示す抗体の一用量で処理した：cIｇ（200μｇ）、抗CTLA4（9D9、mIｇG2aアイソタイプ、50μｇ）、抗PD-1（200μｇ）または表示の組合せ。処理から3日後に、腫瘍を採集し、CD45.2生細胞について白血球形態のフローサイトメトリーゲーティングのために処理した。（A）PD-1を発現するRANKL+（黒棒線）またはRANKL-（灰色棒線）CD8+ T細胞TILの比率、（B）RANKL+（黒棒線）またはRANKL-（灰色棒線）CD8+ T細胞TILによるPD-1発現レベル（幾何平均MFI（ｇMFI）として表現）、および（C）RANKL+（黒棒線）またはRANKL-（灰色棒線）CD8+ T細胞TILによるCTLA4発現レベル（幾何平均MFI（ｇMFI）として表現）。統計的差異は、（C）以外はテューキー多重比較による一元配置分散分析によって決定され、（C）ではマン-ホイットニー検定を用いて処理内グループが比較された（*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.0001）。
【図１７】PD-1/PD-L1単独またはCTLA4との併用によるRANKLの共同標的化は皮下腫瘍増殖を抑制することを示すグラフである。BALB/cの（A、B）野生型（WT）またはTRAMPトランスジェニックIマウス（n＝5−17/グループ）に、1ｘ105のCT26（A、B）または1ｘ106のTramp-C1前立腺癌腫Iを0日目に皮下注射し、腫瘍増殖をモニターした。（A−C）10、14、18および22日目（腫瘍接種に対応）に、またはI 20、24，28および32日目に以下の抗体でマウスを処理した：cIｇ（合計250−350μｇ）、抗CTLA4（9D9 mIｇG2a、50μｇ）、抗PD-1（クローンRMP1-14；A、D：250μｇ；C：100μｇ）、抗PD-L1（クローン10F.9G2；100μｇ）、抗RANKL（クローンIK22.5；200μｇ）、または表示のように前記の組合せ。腫瘍サイズは平均±SEMとして提示される。（A）はそれぞれ別個の2−3回の実験の代表例であり、他の全ての実験は1回実施された。表示のグループ間の統計的相違は、特段の指示がなければ、測定最終日のテューキーポスト-テスト分析による一元配置分散分析によって決定された（*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.0001）。（C）では、30日目における二重抗体併用および三重抗体併用間の腫瘍サイズの有意差が判定された。22日目の以下の比較はグラフには示されていない：抗PD-1対抗PD-1＋抗RANKL（****）；＃：35日目に2つの残留グループ間で有意な相違がアンペアードｔ検定によって決定された（*P＜0.05）。（B）で、＃は、アンペアードｔ検定によって決定された表示の比較についての有意な相違を示す（*P＜0.05）。（A、C）の括弧：腫瘍拒絶率（括弧が無い場合は拒絶が無いことを示す）。（A）では、2つの同一の実験の拒絶率をプールし、斜字体の括弧で提示した表示のグループの拒絶率間の有意差はカイ二乗（ｘ2）分析によって決定された（フィッシャーの正確確率検定；**P＜0.01）。
【図１８】TME内のRANK発現における好ましい初期変化が、ICBによる最初の処理後に見られることを示すグラフである。（A−C）BALB/c野生型（WT）マウス（n＝5−10/グループ）のグループに2ｘ105のCT26結腸癌腫細胞を皮下注射した。腫瘍接種後10日目に、等しい中央値の腫瘍サイズを有するグループにマウスを任意抽出し、表示の抗体の一用量で腹腔内処理した：cIｇ（200μｇ）、抗CTLA4（9D9、mIｇG2aアイソタイプ、50μｇ）、抗PD-1（クローンRMP1-14；200μｇ）または表示の組合せ。処理から3日後に、腫瘍を採集し、（A−D）白血球形態のCD45.2生細胞、または（E）リンパ球ゲートから排除された単一CD45.2+生細胞について、フローサイトメトリーゲート分類のために処理した。（A）RANKLを発現するCD8+ T細胞TILの比率、（B）RANKLを発現するｇp70特異性CD8+ T細胞TILの比率、および（C）RANKLを発現するCD4+ T細胞TILの比率を、表示の処理グループについて示す。平均±SEMが示される。統計的有意は、テューキーポストテスト分析による一元配置分散分析で決定され（A）、ここではダンポストテスト分析によるクルスカル-ワリス検定が用いられた（*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.0001）。
【図１９】抗PD-1対抗CTLA4処理後のTMEにおける固有の変化を示すグラフである。（A、B）BALB/c野生型（WT）マウス（n＝5−10/グループ）のグループに2ｘ105のCT26結腸癌腫細胞を皮下注射した。腫瘍接種後10日目に、等しい中央値の腫瘍サイズを有するグループにマウスを任意抽出し、表示の抗体の一用量で腹腔内処理した：cIｇ（200μｇ）、抗CTLA4（9D9、mIｇG2aアイソタイプ、50μｇ）、抗PD-1（クローンRMP1-14；200μｇ）または表示の組合せ。処理から3日後に、腫瘍を採集し、（A−D）白血球形態のCD45.2生細胞で、または（E）リンパ球ゲートから排除された単一CD45.2+生細胞でフローサイトメトリーゲート分類のために処理した。（A）表示の処理グループについて示された、ｇp70特異性CD8+ T細胞TILによる幾何平均蛍光強度（ｇMFI）のPD-1発現。（B）表示の処理グループについて示された、PD-L1を発現する細胞の比率。平均±SEMが示される。統計的有意は、テューキーポストテスト分析による一元配置分散分析で決定されたが、ただし（B）では、統計的有意は、表示の比較についてマン-ホイットニー検定によって決定された（*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.0001）。加えて、（A）では、抗PD-1単独または抗RANKLとの併用における表示の比較に関するｇMFIの統計的相違は、マン-ホイットニー検定によって決定された（#P＜0.05）。
【図２０】CTLA4との併用におけるRANKLの共同標的化は、皮下腫瘍増殖を抑制することを示すグラフである。BALB/c野生型（WT）マウス（n＝5−17/グループ）のグループに1ｘ105のCT26を0日目に皮下注射し、腫瘍増殖をモニターした。10、14、18および22日目（腫瘍接種に対応）に表示のとおり以下の抗体で腹腔内処理した：cIｇ（合計250−350μｇ）、抗CTLA4（9D9 mIｇG2a、50μｇ）、抗PD-1（クローンRMP1-14；A、D：250μｇ；C：100μｇ）、抗PD-L1（クローン10F.9G2；100μｇ）、抗RANKL（クローンIKK22.5；200μｇ）または前記の組合せ。腫瘍サイズは平均±SEMとして示される。表示グループ間の統計的相違は、特段の指定がなければ、測定最終日にテューキーポストテスト分析による一元配置分散分析で決定された（*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.0001）。＃は、アンペアードｔ検定によって決定した表示の比較についての有意差を示す（*P＜0.05）。
【図２１】抗PD-1および抗RANKLの最適な抗腫瘍効果は、抗体投与の順序によって影響されることを示すグラフである。C57Bl/6野生型（WT）マウス（n＝5/グループ）のグループに5ｘ105の3LL肺癌種細胞を皮下注射した。時期を同じくする処理グループ（黒記号）のために、8、12、16および20日目（腫瘍接種に対応）に表示のとおりcIｇ（1-1、100μｇ）、抗PD-1（RMP1-14、100μｇ）、および/または抗RANKL（IK22/5、100μｇ）でマウスを腹腔処理した。逐次処理グループ（色付き記号）（処理順序は図中の注釈で示される）については、8および12日目（腫瘍接種に対応）（第一の抗体）並びに16および20日目（腫瘍接種に対応）（第二の抗体）に、cIｇ（1-1、200μｇ）、抗PD-1（RMP1-14、200μｇ）、および/または抗RANKL（IK22/5、200μｇ）でそれぞれ表示のようにマウスを腹腔処理した。各処理グループについて、平均±SEM腫瘍サイズが示される。22日目のグループ間の統計的相違はテューキーポストテスト分析による一元配置分散分析で決定され、主要な比較が示される（*P＜0.05、**P＜0.01、****P＜0.0001）。2つのそれぞれ別個の実験がプールされた。
【図２２】RANKLがTMEにおいてPD1hi発現T細胞を識別することを示すグラフである。BALB/c野生型（WT）マウス（n＝10/グループ）のグループに2ｘ105のCT26結腸癌腫細胞を皮下注射した。腫瘍接種後13日目に腫瘍を採集し、CD45.2生細胞について白血球形態のフローサイトメトリーゲーティングのために処理した。PD-1発現を、RANKL+細胞またはRANKL-細胞のCD8+ T細胞TILについて分析した。
【図２３】抗RANKL/PD-1 FIT-Iｇの例示的作製および特徴付けを示す模式図である。（A）標識された抗原結合ドメインを有する抗RANKL/PD-1 FIT-Iｇの模式図である。“A”配列はデノスマブ抗体配列を示し、“B”配列はニボルマブ抗体配列を示す。（B）RANKL/PD-1 FIT-Iｇをコードする3つのDNA構築物の設計。“A”配列はデノスマブ抗体配列を示し、“B”配列はニボルマブ抗体配列を示す。
【図２４】RANKL/CTLA4 FIT-Iｇの例示的作製および特徴付けを示す模式図である。（A）標識された抗原結合ドメインを有する抗RANKL/CTLA4 FIT-Iｇの模式図である。“A”配列はデノスマブ抗体配列を示し、“B”配列はイピリムマブ抗体配列を示す。（B）RANKL/CTLA4 FIT-Iｇをコードする3つのDNA構築物の設計。“A”配列はデノスマブ抗体配列を示し、“B”配列はイピリムマブ抗体配列を示す。
【図２５】抗RANKL/PD-L1 FIT-Iｇの例示的作製および特徴付けを示す模式図である。（A）標識された抗原結合ドメインを有する抗RANKL/PD-L1 FIT-Iｇの模式図である。“A”配列はデノスマブ抗体配列を示し、“B”配列はアテゾリズマブ抗体配列を示す。（B）抗RANKL/PD-L1 FIT-Iｇをコードする3つのDNA構築物の設計。“A”配列はデノスマブ抗体配列を示し、“B”配列はアテゾリズマブ抗体配列を示す。
【図２６】表示の4つの鎖で作製された二重特異性抗RANKL/PD-1 CrossMAbの模式図である。重鎖抗体配列は無影/白色枠で示され、軽鎖抗体配列は灰色枠によって示される。RMP1-14 CH1およびCL配列は交換されヒトIｇG1 Fcに融合し（RMP1-14 CH-CL-huIｇG1Fcと称される）、IK22-5配列は変更されずにヒトIｇG1 Fcに融合する（IK22-5-huIｇG1Fc WT）。ヘテロダイマー化は、Fcドメインにおける表示の“ノブインホール”並びに追加のS354CおよびY349C変異によりさらに増強された。各ヒトFcドメインもまたD265A変異を有した。
【図２７】RMP1-14 CH-CL X IK225 WT二重特異性抗体CrossMAbの分析用SDS-PAGE/ウェスタンブロット分析を示す写真である。前記抗体は、一過性ExpiCHO-S細胞培養で発現され、タンパク質A親和性クロマトグラフィーによって精製された。レーンM1：タンパク質マーカー（TaKaRa, Cat. No.3452）、レーンM2：タンパク質マーカー（GenScript, Cat. No. M00521）、レーン1：還元状態、レーン2：非還元状態、レーンP：陽性コントロールとしてヒトIｇG1、カッパ（Siｇma, Cat.No.I5154）、一次抗体：ヤギ抗ヒトIｇG-HRP（GenScript, Cat. No.A00166）、一次抗体：ヤギ抗ヒトカッパ-HRP（SouthernBiotech, Cat. No. 2060-05）。
【図２８】HEK-293細胞によって一過性に発現されたマウスRANKLのフローサイトメトリーによる検出を示すグラフである。HEK-293親細胞の単一細胞懸濁物をトランスフェクトしないか、またはマウスRANKL構築物で一過性にトランスフェクトし、トランスフェクションから48時間後に、二工程インキュベーション手順で表面染色した。一次抗体は、2.5μｇのビオチン化ネズミRANK-Fc、2.5μｇのビオチン化抗RANKL/PD-1二重特異性抗体またはビオチン化アイソタイプコントロールAb（huIｇG1 mAbコントロール）で、前記はHEK-293細胞とともに氷上で30分間インキュベートされた。次いで、二次抗体（BioleｇendのAPC）とのインキュベーションを用い、さらに30分間氷上で一次抗体結合を検出した。サンプルおよびデータをFortessa（BD Biosciences）フローサイトメーターで分析し、ソフトウェア（FlowJo v10 software（Tree Star, Inc.））で分析した。
【図２９】RANKL-RANK結合の抗体競合を示すグラフである。マウスRANKLで一過性にトランスフェクトしたHEK-293細胞を、多様な濃度の抗RANKL/PD-1二重特異性mAb、抗RANKL mAb IK22-5、ラットIｇG2aアイソタイプコントロールまたはヒトIｇG1アイソタイプコントロールのいずれかとともに氷上で30分間インキュベートした。次いで、細胞を2.5μｇのビオチン化組換えネズミRANK-Fcとともにさらに30分間氷上でインキュベートした。FACS緩衝液（PBS＋10％FCS）で2回洗浄した後、ストレプトアビジン-APCとの最後のインキュベーションを氷上でさらに30分間実施した。サンプルおよびデータをFortessa（BD Biosciences）フローサイトメーターで分析し、ソフトウェア（FlowJo v10 software（Tree Star, Inc.））で分析した。2つのそれぞれ別個の実験によるRANK-Fｃ結合阻害の代表的なFACS図および要約データが示される。
【図３０】HEK-293細胞によって一過性に発現されたマウスPD-1のフローサイトメトリーによる抗体検出を示すグラフである。HEK-293親細胞の単一細胞懸濁物をトランスフェクトしないか、またはマウスPD-1プラスミドで一過性にトランスフェクトし、トランスフェクションから48時間後に、二工程インキュベーション手順で表面染色した。一次抗体は、2.5μｇの抗RANKL/PD-1二重特異性抗体またはアイソタイプコントロールAb（huIｇG1 mAbコントロール）で、前記はHEK-293細胞とともに氷上で30分間インキュベートされた。次いで、ヤギ抗ヒト二次抗体（Alexa Fluor 647（Thermo Fisher Scientific））とのインキュベーションを用い、さらに30分間氷上で抗体結合を検出した。サンプルおよびデータをFortessa（BD Biosciences）フローサイトメーターで分析し、ソフトウェア（FlowJo v10 software（Tree Star, Inc.））で分析した。アイソタイプコントロールによる染色は濃い灰色の影付き領域で示され、一方、抗RANKL/PD-1二重特異性抗体による染色は淡い灰色の影付き領域で示される。
【図３１】PD-1/PDL1結合の抗体競合を示すグラフである。マウスPD-1で一過性にトランスフェクトしたHEK-293細胞を、多様な濃度の抗RANKL/PD-1二重特異性mAb、抗PD-1 mAb RMP1-14、ラットIｇG2aアイソタイプコントロールまたはヒトIｇG1アイソタイプコントロールのいずれかとともに氷上で30分間インキュベートした。次いで、細胞を2.5μｇのビオチン化組換えネズミPD-L1-Fcとともにさらに30分間氷上でインキュベートした。FACS緩衝液（PBS＋10％FCS）で2回洗浄した後、ストレプトアビジン-APCとの最後のインキュベーションを氷上でさらに30分間実施した。サンプルおよびデータをFortessa（BD Biosciences）フローサイトメーターで分析し、ソフトウェア（FlowJo v10 software（Tree Star, Inc.））で分析した。2つのそれぞれ別個の実験によるPD-L1-Fc結合阻害の代表的なFACS図および要約データが示される。
【図３２】in vitro破骨細胞形成における抗RANKL/PD-1二重特異性抗体の阻害性効果を示すグラフである。抗IK22-5（陽性コントロール）、huIｇG1アイソタイプコントロールまたは抗RANKL/PD-1二重特異性抗体（1000nｇ/mLから50nｇ/mLの濃度）の存在下もしくは非存在下でネズミの骨髄（BM）細胞を培養した。BM細胞培養は、CSF-1およびマウスRANKLを補充したDMEMで実施された。7日後に、TRAP＋多核（4核以上）細胞をカウントした。データは三重複製培養の平均±SEMとして表される。
【図３３】二重特異性抗RANKL/PD-1によるRANKLおよびPD-1の共同標的化は、肺への実験的メラノーマ転移を抑制することを示すグラフである。C57BL/6野生型（WT）マウスのグループ（n＝6−10/グループ）に2ｘ105のB16F10メラノーマ細胞を静脈内注射した。-1、0および2日目（腫瘍接種に対応）に表示のように以下でマウスを処理した：cIｇ（200μｇ i.p.、組換えMac4-ヒトIｇG1 D265A）、抗RANKL（100μｇ i.p.、組換えIK22.5-ヒトIｇG1 D265A）、抗PD-1（100μｇ i.p.、組換えRMP1-14-ヒトIｇG1 D265A）、抗RANKL＋抗PD-1（それぞれ100μｇ i.p.）、抗RANKL-PD-1二重特異性抗体（50から200μｇ i.p.、ヒトIｇG1 D265A）。転移量は、肺表面のコロニーを数えることによって14日後に肺で定量した。平均±SEMが示される。表示グループ間の統計的相違は、ダンネット多重比較検定による一元配置分散分析によって決定された（*P＜0.05）。
【図３４】二重特異性抗RANKL/PD-1によるRANKLおよびPD-1の共同標的化は、肺への実験的前立腺癌転移を抑制することを示すグラフである。C57BL/6野生型（WT）マウスのグループ（n＝6/グループ）に2ｘ105のRM-1前立腺癌腫細胞を静脈内注射した。-1、0および2日目（腫瘍接種に対応）に表示のように以下でマウスを処理した：cIｇ（200μｇ i.p.、ヒトIｇG1 D265A）、抗RANKL（100μｇ i.p.、IK22.5ヒトIｇG1 D265A）、抗PD-1（100μｇ i.p.、ヒトIｇG1 D265A）、抗RANKL＋抗PD-1（それぞれ100μｇ i.p.）、抗RANKL-PD-1二重特異性抗体（100または200μｇ i.p.、ヒトIｇG1 D265A）。転移量は、肺表面のコロニーを数えることによって14日後に肺で定量した。平均±SEMが示される。表示グループ間の統計的相違は、テューキーポストテスト分析による一元配置分散分析によって決定された（**P＜0.01、***P＜0.001、****P＜0.0001、ns＝有意ではない）。
【図３５】二重特異性抗RANKL/PD-1によるRANKLおよびPD-1の共同標的化は、肺癌細胞株3LLの皮下腫瘍増殖を抑制することを示すグラフである。C57Bl/6野生型（WT）マウスのグループに5ｘ105の3LL肺癌種細胞を皮下注射した。表示のように8、12、16および20日目（腫瘍接種に対応）に（矢印で表示するように）腹腔内に以下によりマウスを処理した：cIｇ（400μｇ i.p.、ラットIｇG2a）、抗RANKL（100μｇ i.p.、IK22.5ラットIｇG2a）、抗PD-1（100μｇ i.p.、RMP1-14ラットIｇG2a）、抗RANKL＋抗PD-1（100μｇ i.p.それぞれIK22-5およびRMP1-14）、および一用量力価の抗RANKL-PD-1二重特異性抗体（100、200および400μｇ i.p.、ヒトIｇG1 D265A）。平均±SEM腫瘍サイズが、各処理グループについて示される。
【図３６】二重特異性抗RANKL/PD-1によるRANKLおよびPD-1の共同標的化は、結腸癌腫細胞株CT26の皮下腫瘍増殖を抑制することを示すグラフである。BALB/cマウスのグループ（n＝5−17/グループ）に1ｘ105のCT26を0日目に皮下注射し、腫瘍増殖をモニターした。9、17、18および21日目（腫瘍接種に対応）に腹腔内に以下の抗体を用いてマウスを処理した：cIｇ（合計300μｇ）、二重特異性抗RANKL/PD-1抗体（huIｇG1D265A骨格；表示のように100μｇまたは200μｇ）、抗PD-1（RMP1-14 100μｇ）、抗RANKL（IK22.5、100μｇ）、または表示のようにそれらの組合せ。腫瘍サイズを平均±SEMとして示した。
【図３７】二重特異性抗RANKL/PD-1によるRANKLおよびPD-1の共同標的化は、CT26腫瘍モデルにおける抗CTLA4処理の抗腫瘍有効性を増強することを示すグラフである。BALB/cマウスのグループ（n＝5−17/グループ）に1ｘ105のCT26を0日目に皮下注射し、腫瘍増殖をモニターした。9、17、18および21日目（腫瘍接種に対応）に腹腔内に以下の抗体を用いてマウスを処理した：cIｇ（合計300μｇ）、二重特異性抗RANKL/PD-1抗体（huIｇG1D265A骨格、200μｇ）、抗CTLA4（UC10-4F10、100μｇ）、抗PD-1（RMP1-14、100μｇ）、抗RANKL（IK22.5、100μｇ）、または表示のようにそれらの組合せ。腫瘍サイズを平均±SEMとして示した。
【図３８】二重特異性抗RANKL/PD-1によるRANKLおよびPD-1の共同標的化は、乳癌細胞株AT3-OVAの皮下腫瘍増殖を抑制することを示すグラフである。C57Bl/6野生型（WT）マウスのグループ（n＝6/グループ）に1ｘ106のAT3-OVAを0日目に皮下注射し、腫瘍増殖をモニターした。19、22、25および28日目（腫瘍接種に対応）に腹腔内に以下の抗体を用いてマウスを処理した：cIｇ（組換えMAC4-huIｇG1D265A骨格；200μｇ）、二重特異性抗RANKL/PD-1抗体（huIｇG1D265A骨格；表示のように100μｇまたは200μｇ）、抗PD-1（組換えRMP1-14-huIｇG1D265A骨格；100μｇ）、抗RANKL（組換えIK22.5-huIｇG1D265A骨格；100μｇ）、または表示のようにそれらの組合せ。腫瘍サイズを平均±SEMとして示した。
【００２０】
表A：配列の簡単な説明
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【発明を実施するための形態】
【００２１】
1．定義
特段の規定がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語および学術用語は、本発明が属する業界の業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等ないずれの方法および材料も本発明の実施または試験で用いることができるが、好ましい方法および材料を述べる。本発明の目的のために、以下の用語が下記に定義される。
冠詞“a”および“an”は、当該冠詞の文法的目的語の1つまたは2つ以上（すなわち少なくとも1つ）を指すために本明細書では用いられる。例示すれば、“an element（要素）”は、1つの要素または2つ以上の要素を意味する。
“約”によって、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重さまたは長さが示され、前記は、参照数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重さまたは長さに対して15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2また1％ほど変動する。
“同時発生的投与”もしくは“同時発生的に投与する”または“共同投与”などという用語は、2つ以上の活性物質を含む1つの単一組成物の投与、或いは各活性物質が、単一組成物としてそれら全ての活性物質を投与されたときに得られる有効な結果と同等であるように十分に短い期間内で同時期にもしくは同時にまたは逐次的に、別々の組成物としておよび/または別々のルートで投与および/またはデリバリーされることを指す。“同時に”とは、活性薬剤が実質的に同じ時に、望ましくは同じ処方物で一緒に投与されることを意味する。“同時期に”とは、活性薬剤が時間的に接近して投与されること、例えばある薬剤が別の薬剤の約1分から約1日以内前または後に投与されること意味する。任意の同時期が有用である。しかしながら、同時に投与されないときには、薬剤は、たいてい約1分から約8時間以内に、適切には約1時間から約4時間未満内に投与されるであろう。同時期に投与されるときには、薬剤は適切には対象動物の同じ部位に投与される。“同じ部位”という用語は厳密な位置を含むが、約0.5から約15センチメートル以内、好ましくは約0.5から約5センチメートル以内であり得る。本明細書で用いられる“別々に”という用語は、薬剤が、ある間隔で、例えば約1日から数週間または数ヶ月の間隔で投与されることを意味する。活性物質はどちらの順序で投与されてもよい。本明細書で用いられる“逐次的に”という用語は、薬剤が、連続して、例えば数分、数時間、数日または数週間の1つの間隔もしくは複数の間隔で投与されることを意味する。適切な場合には、活性薬剤は規則的な反復サイクルで投与され得る。
【００２２】
本明細書で用いられるように、“および/または（and/or）”は、関連する列挙項目の1つ以上の任意のかつ全ての可能な組合せ、同様にまた別の解釈が存在するときには組合せの除去（or）を指しかつ包含する。
“アンタゴニスト”という用語はもっとも広い意味で用いられ、RANKLまたはICMの1つ以上の生物学的活性もしくは機能（例えば結合、シグナリング、複合体形成、遊走、侵入、生存もしくは生存活性を含むがただし前記に限定されない）を、任意の環境で（in vitro、in situ、またはin vivoを含む）、部分的もしくは完全に遮断するか、阻害するか、停止するか、低下させるか、減少させるか、妨害するか、障害するか、または中和する任意の分子を含む。同様に、“拮抗する”、“拮抗”などという用語は、例えば上記および本明細書の別の場所で用いられるように、活性または機能の封鎖、阻害、停止、低下、減少、妨害、障害または中和を指すために互換的に用いられる。例示すれば、“拮抗する”は、活性または機能における約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％または100％の低下を指すことができる。
【００２３】
本明細書で用いられる“抗体”という用語は、少なくとも1つの相補性決定領域（CDR）（特定の抗原（例えばRANKLまたはICM）と特異的に結合または相互作用する）を含む、抗原結合分子または分子複合体を意味する。“抗体”という用語は免疫グロブリン分子を含み、前記は、4つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって相互接続された2つの重（H）鎖および2つの軽（L）鎖を、そのマルチマー（例えばIｇM）とともに含む。各重鎖は、重鎖可変領域（HCVRまたはVHと略称されることがある）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2およびCH3を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（LCVRまたはVLと略称されることがある）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は1つのドメイン（CL1）を含む。VHおよびVL領域はさらに、超可変領域（相補性決定領域と称される）に細分され、前記超可変領域にはより保存された領域（フレームワーク領域（FR）と称される）が散在する。各VHおよびVLは3つのCDRおよび4つのFRで構成され、前記はアミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で並んでいる：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本発明の種々の態様で、本発明の抗体（またはその抗原結合部分）のFRは、ヒト生殖細胞系列の配列と同一でも、または天然にもしくは人工的に改変されてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、2つ以上のCDRの並列分析に基づいて規定され得る。
抗体には任意のクラスの抗体、例えばIｇG、IｇA、またはIｇM（またはそのサブクラス）が含まれ、いずれの特定のクラスも要求されない。免疫グロブリンは、その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列にしたがって種々のクラスに割り振ることができる。以下の5つの主要なクラスの免疫グロブリンが存在し（IｇA、IｇD、IｇE、IｇG、およびIｇM）、それらのうちいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）に分けることができる（例えばIｇG1、IｇG2、IｇG3、IｇG4、IｇA1およびIｇA2）。免疫グロブリンの種々のクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。免疫グロブリンの種々のクラスの三次元構造のサブユニット構造は周知である。
【００２４】
“抗原結合フラグメント”、“抗原結合部分”、“抗原結合ドメイン”、および“抗原結合部位”という用語は本明細書では互換的に用いられ、抗原結合に加わる抗原結合分子の部分を指す。これらの用語は、天然に存在するか、酵素的に入手できるか、または遺伝子操作された任意のポリペプチドまたは糖タンパク質を含み、前記は抗原と特異的に結合して複合体を形成する。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば完全な抗体分子から標準的な技術を用いて誘導することができる。前記技術は、例えばタンパク質分解消化、または組換え遺伝子操作（抗体可変ドメインおよび場合によって定常ドメインをコードするDNAの操作および発現を必要とする）である。そのようなDNAは公知であり、例えば、商業的供給源、DNAライブラリー（例えばファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であり、または合成することができる。DNAを配列決定し、さらに化学的にまたは分子生物学的技術を用いて操作して、例えば1つ以上の可変ドメインおよび/または定常ドメインを適切な立体配置で並べるか、またはコドンの導入、システイン残基の作製、アミノ酸の改変、付加もしくは欠失などを実施することができる。
【００２５】
抗原結合フラグメントの非限定的な例には以下が含まれる：（i）Fabフラグメント；（ii）F（ab’）2フラグメント；（iii）Fdフラグメント；（iv）Fvフラグメント；（v）単鎖フラグメント（scFv）分子；（vi）dAbフラグメント；および（ｖii）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基から成る最小認識ユニット（例えば、単離された相補性決定領域（CDR）、例えばCDR3ペプチド）、または拘束FR3-CDR3-FR4ペプチド。例えば以下のその他の操作された分子もまた、本明細書で用いられる“抗原結合フラグメント”の表現内に包含される：ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体、ジアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モデュール免疫医薬品（SMIP）、およびサメ可変IｇNARドメイン。
抗体の抗原結合フラグメントは典型的には少なくとも1つの可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは任意のサイズまたはアミノ酸組成が可能であり、概ね1つ以上のフレームワークと隣接するかまたはインフレームの関係にある少なくとも1つのCDRを含む。VHドメインがVLドメインと結合される抗原結合フラグメントでは、VHおよびVLドメインは互いに任意の適切な配置で位置する。例えば、可変領域はダイマーであり、VH-VH、VH-VLまたはVL-VLダイマーを含むことができる。また別には、抗体の抗原結合フラグメントはモノマーVHまたはVLドメインを含むことができる。
【００２６】
ある種の実施態様では、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも1つの定常ドメインに共有結合で連結した少なくとも1つの可変ドメインを含むことができる。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内で見出され得る可変および定常ドメインの非限定的な例示的立体配置には以下が含まれる：（i）VH-CH1；（ii）VH-CH2（iii）VH-CH3；（iv）VH-CH1-CH2；（v）VH-CH1-CH2-CH3；（vi）VH-CH2-CH3；（vii）VH-CL；（viii）；VL-CH1；（ix）VL-CH2；（x）VL-CH3；（xi）VL-CH1-CH2；（xii）；VL-CH1-CH2-CH3；（xiii）VL-CH2-CH3；および（xiv）VL-CL。可変および定常ドメインの任意の立体配置で（上記に列挙した任意の例示的立体配置を含む）、可変および定常ドメインは互いに直接連結され得るか、または完全な若しくは部分的なヒンジまたはリンカー領域によって連結され得る。ヒンジ領域は少なくとも2つの（例えば5、10、15、20、40、60または60を超える）アミノ酸から成ることができ、前記は、単一ポリペプチド分子で隣接する可変および/または定常ドメイン間における可撓性または半可撓性連結を生じる。さらにまた、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、上記に列挙した可変および定常ドメインの立体配置のいずれかのホモダイマーまたはヘテロダイマー（または他のマルチマー）を含むことができ、前記は、互いにおよび/または1つ以上のモノマーのVHもしくはVLドメインと非共有結合（例えばジスルフィド結合）されてある。
完全な抗体分子に関して、抗原結合フラグメントは一特異性またはマルチ特異性（例えば二重特異性）であり得る。抗体のマルチ特異性抗原結合フラグメントは典型的には少なくとも2つの異なる可変ドメインを含み、ここで、各可変ドメインは、別々の抗原とまたは同じ抗原の異なるエピトープと特異的に結合することができる。任意のマルチ特異性抗原結合分子様式（本明細書に開示する例示的な二重特異性抗原結合分子様式を含む）が、当業界で利用可能な日常的技術を用い本発明の抗体の抗原結合フラグメントの関係で使用するために応用され得る。
【００２７】
本明細書で用いられる“抗原（antiｇen）”およびその文法的同等表現（例えば“抗原性の（antiｇenic）”）は、液性または細胞性免疫の生成物（例えば抗体分子またはT細胞受容体）と特異的に結合できる化合物、組成物または物質を指す。抗原は任意のタイプの分子であることができ、前記には例えば、ハプテン、単純な中間代謝物質、糖類（例えばオリゴ糖）、脂質、およびホルモンとともに巨大分子、例えば複雑な炭水化物（例えば多糖類）、リン脂質、およびタンパク質が含まれる。抗原の一般的なカテゴリーには、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原生動物および他の寄生生物抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患、アレルギーおよび移植片拒絶に関与する抗原、毒素、並びに他の雑多な抗原が含まれる。
“抗原結合分子”とは、標的抗原に対して結合親和性を有する分子を意味する。この用語は、免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメント、および抗原結合活性を示す非免疫グロブリン由来タンパク質フレームワークに及ぶことは理解されるであろう。本発明の実施に有用な代表的抗原結合分子には、抗体およびそれらの抗原結合フラグメントが含まれる。“抗原結合分子”という用語は、抗体および抗体の抗原結合フラグメントを含む。
“二重特異性抗原結合分子”という用語は、同じ抗原上の2つの別個のエピトープまたは2つの異なる抗原と結合する能力を有するマルチ特異性抗原結合分子を指す。二重特異性抗原結合分子は、二価、三価、または四価であり得る。本明細書で用いられるように、“価の（valent）”、“一価（valence）”、“複数価（valencies）”または前記語の他の文法的変形は、抗原結合分子の抗原結合部位の数を意味する。これらの抗原認識部位は、同じエピトープまたは異なるエピトープを認識することができる。二価および二重特異性分子は、例えば以下に記載される：Kostelny et al. J Immunol 148 （1992）:1547；Pack and Pluckthun Biochemistry 31 （1992） 1579；Gruber et al. J lmmunol （1994） 5368；Zhu et al. Protein Sci 6 （1997）:781；Hu et al. Cancer Res. 56 （1996）:3055；Adams et al. Cancer Res. 53 （1993）:4026；およびMcCartney, et al. Protein Enｇ. 8 （1995）:301。三価二重特異性抗原結合分子および四価二重特異性抗原結合分子もまた当業界で公知である。例えば以下を参照されたい：Kontermann RE （ed.）, Sprinｇer Heidelberｇ Dordrecht London New York, pp. 199- 216, 2011。二重特異性抗原結合分子はまた4より高い価数を有することができ、それらもまた本発明の範囲内である。そのような抗原結合分子は、例えばドックアンドロック複合体化方法（Chanｇ, C.-H. et al. In: Bispecific Antibodies. Kontermann RE, 2011（上掲書））によって作製することができる。
【００２８】
“特異的に結合する”または“特異的結合”という語句は、生理学的条件下でバックグラウンドの少なくとも2倍、より典型的にはバックグラウンド分子結合の10倍から100倍を超える2つの分子間の結合反応を指す。タンパク質である1つ以上の検出可能な結合薬剤を用いるとき、特異的結合は、タンパク質および他の生物学的物質の不均質集団で当該タンパク質の存在を決定することができる。したがって、指定の免疫アッセイ条件下で、特異的抗原結合分子は特定の抗原性決定基と結合し、それによってその存在を識別する。そのような条件下での抗原性決定基との特異的結合は、当該決定基に対するその特異性について選別される抗原結合分子を必要とする。この選別は、他の分子と交差反応する抗原結合分子を差し引くことによって達成され得る。多様な免疫アッセイ様式を用いて、抗原結合分子（例えば免疫グロブリン）をそれらが特定の抗原と特異的に免疫反応性であるように選別することができる。例えば、固相ELISA免疫アッセイを日常的に用いて、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選別することができる（特異的な免疫反応性を決定するために用いることができる免疫アッセイ様式および条件の説明については、例えば以下を参照されたい：Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 1988）。結合親和性および特異性を決定する方法もまた当業界では周知である（例えば以下を参照されたい：Harlow and Lane（上掲書）；Friefelder, “Physical Biochemistry: Applications to biochemistry and molecular bioloｇy”（W.H. Freeman and Co. 1976））。
分子に関して用いられるとき、“キメラ”という用語は、当該分子が、2つ以上の異なる起原または供給源に由来するか、それらの起源または供給源から入手または単離されたか、またはそれらの起源または供給源を土台とする部分を含むことを意味する。したがって、ポリペプチドが異なる起原の2つ以上のアミノ酸配列を含み、かつ以下の（1）または（2）を含むとき、当該ポリペプチドはキメラである：（1）天然では一緒に見出されないポリペプチド配列（すなわち、アミノ酸配列の少なくとも1つは他方のアミノ酸配列の少なくとも1つに対して異種である）、または（2）天然では隣り合わないアミノ酸配列。
【００２９】
“コード配列”とは、遺伝子のポリペプチド生成物または遺伝子の最終mRNA生成物（例えばスプライシング後の遺伝子のmRNA生成物）をコードするために必要な任意の核酸配列を意味する。対照的に、“非コード配列”という用語は、遺伝子のポリペプチド生成物または遺伝子の最終mRNA生成物をコードするために必要ではない任意の核酸配列を指す。
本明細書で用いられるように、“相補性決定領域”（CDR、すなわちCDR1、CDR2およびCDR3）という用語は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指し、その存在は抗原結合に必要である。各可変ドメインは典型的には3つの領域を有し、それらの領域はCDR1、CDR2およびCDR3として識別される。各相補性決定領域は以下のアミノ酸残基を含むことができる：例えばKabatによって規定される“相補性決定領域”のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインのおよその残基24−34（L1）、50−56（L2）および89−97（L3）並びに重鎖可変ドメインのおよその残基31−35（H1）、50−65（H2）および95−102（H3）；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunoloｇical Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991）、および/または“超可変ループ”のそれら残基（すなわち、軽鎖可変ドメインのおよその残基26−32（L1）、50−52（L2）および91−96（L3）並びに重鎖可変ドメインのおよその残基26−32（H1）、53−55（H2）および96−101（H3）；Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987）。いくつかの事例では、相補性決定領域は、Kabatが規定したCDR領域および超可変ループの両方のアミノ酸を含むことができる。
本明細書で用いられるように、“複合体”という用語は、互いに直接的におよび/または間接的に接触する分子（例えばペプチド、ポリペプチドなど）の集合物または凝集物を指す。具体的な実施態様では、“接触”またはより詳細には“直接的接触”は、強い非共有結合性相互作用（例えばファンデルワールス力、水素結合、イオン性および疎水性相互作用）が分子の相互作用の主流であり得るように2つ以上の分子が十分に接近していることを意味する。そのような実施態様では、分子（例えばペプチドおよびポリペプチド）複合体は、（例えばその構成要素分子の非凝集（または非複合体）状態と比較して）熱力学的に好ましい状態下で形成される。本明細書で用いられる、“ポリペプチド複合体”または“タンパク質複合体”という用語は、トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマー、オクタマー、ノナマー、デカマー、ウンデカマー、ドデカマー、またはより高順位のオリゴマーを指す。
【００３０】
本明細書を通して、文脈がそうではないことを要求しないならば、“含む（comprises, comprisinｇ）”という語は、記載の工程もしくは要素または工程もしくは要素のグループを包含するが、任意の他の工程もしくは要素または工程もしくは要素のグループも排除しないことを暗示すると理解されるであろう。したがって、“含む”などの用語の使用は、列挙要素は必要または必須であるが、他の要素は任意選択であり、存在してもしなくてもよいことを示す。“から成る”とは、“から成る”の語句の後に続くものは何であれ含まれ、かつそれに限定されることを意味する。したがって、“から成る”という語句は、列挙要素が必要であるかまたは必須であり、他の要素は存在し得ないことを示す。“本質的に〜から成る”とは、当該語句の後に列挙される要素を含むことを意味し、列挙要素について本開示で指定される活性または作用に干渉もしくは影響しない他の要素に限定される。したがって、“本質的に〜から成る”という語句は、列挙要素が必要かつ必須であるが、他の要素は任意選択であり、列挙要素の活性または作用に影響するか否かにかかわらず存在することもしないこともあることを示す。いくつかの実施態様では、サブユニット配列（例えばアミノ酸配列）の記述の中で“から成る”という語句は、当該配列が少なくとも1つの追加される上流のサブユニット（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50または50を超える）および/または少なくとも1つの追加される下流のサブユニット（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50または50を超える）を含むことができることを示し、ここで、上流サブユニットの数および下流サブユニットの数はそれぞれ独立に選択できる。
【００３１】
本明細書で用いられるように、2つ以上の要素または成分またはドメインが、化学的複合体化または組換え手段（例えば遺伝子融合）を含むいずれの手段であれ一緒に結合させるという文脈で、“複合体化する”、“連結する”、“融合する”または“融合”という用語およびそれらの文法的に同等な用語は互換的に用いられる。化学的複合体化（例えば異種二官能性架橋剤を用いる）は当業界で公知である。
本出願で用いられる“定常ドメイン”または“定常領域”という用語は、可変領域以外の抗体のドメインの全体を指す。定常領域は、抗原の結合に直接的に関与しないが、多様な免疫エフェクター機能を示す。
【００３２】
“構築物”という用語は、異なる供給源に由来する1つ以上の単離された核酸配列を含む組換え遺伝分子を指す。したがって、構築物は、異なる起原の2つ以上の核酸配列が単一核酸分子に組み立てられたキメラ分子であり、以下を含む任意の構築物が含まれる：（1）核酸配列、天然では一緒に見いだされない調節配列およびコード配列を含む（すなわち、ヌクレオチド配列の少なくとも1つは他方のヌクレオチド配列の少なくとも1つに対して異種である）、または（2）天然では隣り合わない機能性RNA分子の部分またはタンパク質をコードする配列、または（3）天然では隣り合わないプロモーターの部分。代表的な構築物には、任意の組換え核酸分子、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス、自律的に複製するポリヌクレオチド分子、ファージ、または直鎖状もしくは環状一本鎖もしくは二本鎖DNAまたはRNA核酸分子（1つ以上の核酸分子が作動できるように連結されてある核酸分子を含む）が含まれる。本発明の構築物は概して、問題の核酸配列の発現を指令するために必要なエレメントを含むであろう。前記問題の核酸配列もまた構築物中に収納され、例えば標的核酸配列または調節因子核酸配列である。そのようなエレメントには、問題の核酸配列に作動できるように連結される（したがって当該核酸配列の転写を指令する）制御エレメントも含まれ、さらにしばしばポリアデニル化配列も同様に含まれ得る。本発明のある種の実施態様では、構築物はベクター内に収納され得る。構築物の構成要素に加えて、ベクターは、例えば1つ以上の選別可能マーカー、1つ以上の複製起点（例えば原核細胞および真核細胞起原）、少なくとも1つのマルチクローニング部位、および/または宿主細胞ゲノムへの構築物の安定的な組込みを促進するためのエレメントを含むことができる。2つ以上の構築物が、単一核酸分子（例えば単一ベクター）に収納されてもよく、または2つ以上の別々の核酸分子（例えば2つ以上の別々のベクター）に収納されてもよい。“発現構築物”は概して少なくとも1つの制御配列を含み、前記配列は問題のヌクレオチド配列に作動できるように連結される。この態様では、例えば、発現されるべきヌクレオチド配列に作動できるように接続されたプロモーターは、生物またはその部分（宿主細胞を含む）での発現のための発現構築物中で提供される。本発明の実施について、構築物および宿主細胞を調製および使用するための通常的な組成物および方法は、当業者には周知である。例えば以下を参照されたい：Molecular Cloninｇ: A Laboratory Manual, 3rd edition Volumes 1, 2, and 3. J. F. Sambrook, D. W. Russell, and N. Irwin, Cold Sprinｇ Harbor Laboratory Press, 2000。
【００３３】
“制御エレメント”または“制御配列”とは、作動できるように連結されたコード配列の特定の宿主細胞での発現に必要な核酸配列（例えばDNA）を意味する。例えば原核細胞に適切な制御配列には、プロモーターおよび場合によってcis-作動性配列、例えばオペレーター配列およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞に適切な制御配列には、転写制御配列、例えばプロモーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー、翻訳制御配列、例えば翻訳エンハンサーおよび内部リボソーム結合部位（IRES）、mRNAの安定性を調節する核酸配列の他に、標的誘導配列（転写されたポリヌクレオチドによってコードされる生成物を細胞の細胞内区画または細胞外環境に誘導する）が含まれる。
“対応する”または“対応”とは、参照核酸配列に対して実質的な配列同一性を示す核酸配列を意味するか（例えば、参照核酸配列の全部または部分に対して、少なくとも約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％または100％もの配列同一性）、または参照アミノ酸配列に対して実質的な配列類似性または同一性を示すアミノ酸配列を意味する（例えば、参照アミノ酸配列の全部または部分に対して、少なくとも約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％または100％もの配列類似性または同一性）。
【００３４】
“細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA4）”（ALPS5、CD、CD152、CELIAC3、CTLA-4、GRD4、GSE、IDDM12としてもまた知られている）は、免疫チェックポイントとして機能し、免疫応答をダウンレギュレートするタンパク質受容体を指す。CTLA4は、T調節性細胞（Treｇ）では構成的に発現されるが、通常のT細胞では活性化後にアップレギュレートされるだけである。前記は、抗原提示細胞の表面でCD80およびCD86と結合するとき“オフ”スイッチとして機能する。本明細書で用いられる“CTLA4”という用語には、ヒトCTLA4（hCTLA4）、CTLA4の変種、アイソフォーム、および種ホモログ配列、およびhCTLA4と少なくとも1つの共通エピトープを有するアナログが含まれる。完全なhCTLA4はUniProt Acc. No. P16410で見出すことができる。
“DART”（二親和性再標的誘導試薬（dual affinity retarｇetinｇ reaｇent））は、少なくとも2つのポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子を指し、前記2つのポリペプチド鎖は結合して（特に共有結合的相互作用を介して）、少なくとも2つのエピトープ結合部位を形成する（前記部位は同じまたは異なるエピトープを認識できる）。DARTのポリペプチド鎖の各々は、免疫グロブリン軽鎖可変領域および免疫グロブリン重鎖可変領域を含むが、これらの領域は相互作用してエピトープ結合部位を形成することはない。むしろ、DARTポリペプチド鎖の一方の（例えば第一の）免疫グロブリン重鎖可変領域は、異なる（例えば第二の）DARTポリペプチド鎖の免疫グロブリン軽鎖可変領域と相互作用してエピトープ結合部位を形成する。同様に、DARTポリペプチド鎖の一方の（例えば第一の）免疫グロブリン軽鎖可変領域は、異なる（例えば第二の）DARTポリペプチド鎖の免疫グロブリン重鎖可変領域と相互作用してエピトープ結合部位を形成する。DARTは、一特異性、二重特異性、三重特異性などであることができ、したがって同時に1つ、2つ、3つまたは4つを超える異なるエピトープ（前記は同じまたは異なる抗原であり得る）と結合することができる。加えて、DARTは、一価、二価、三価、四価、五価、六価などであることができ、したがって同時に1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つまたは7つを超える分子と結合できる。これら2つはDARTの属性を決定し、すなわち特異性の程度および価数は一緒になって、例えば四価（すなわち4セットのエピトープと結合できる）の二重特異性抗体（すなわち2つのエピトープと結合できる）を生成することができる。DART分子は以下でより詳細に開示される：国際PCT公開No. WO 2006/113665、WO 2008/157379、およびWO 2010/080538。
【００３５】
疾患または症状（例えば癌）の治療または予防の関係で、“有効量”とは、一用量でのまたは逐次もしくは徐放系の部分としてのある量の活性薬剤の対象動物への投与を意味し、前記量は当該疾患または症状の治療または予防に有効である。有効量は、対象動物の健康および身体の状態並びに治療されるべき個体の分類学上のグループ、組成物の処方、医学的状況の評価、並びに他の関連要件にしたがって変動するであろう。
本明細書で用いられるように、“コードする”、“コードの”などの用語は、核酸が別の核酸またはポリペプチドを提供する能力を指す。例えば、核酸が転写されおよび/または翻訳されてポリペプチドを生成することができるならば、または転写および/または翻訳されてポリペプチドを生じ得る形態に核酸が処理されることが可能ならば、当該核酸配列は、ポリペプチドを“コードする”と称される。そのような核酸配列は、コード配列またはコード配列および非コード配列の両方を含むことができる。したがって、“コードする”、“コードの”などの用語は、DNA分子の転写から生じるRNA生成物、RNA分子の翻訳から生じるタンパク質、DNA分子が転写されてRNA生成物を形成し続いてRNA生成物の翻訳から生じるタンパク質、またはDNA分子が転写されてRNA生成物を提供しRNA生成物が処理されて処理RNA生成物（例えばmRNA）を提供し続いて処理RNA生成物の翻訳から生じるタンパク質を含む。
【００３６】
“エピトープ”および“抗原決定基”という用語は本明細書では互換的に用いられ、抗原結合分子またはその抗原結合フラグメントが結合する抗原の領域を指す。エピトープは、連続するアミノ酸（線状エピトープ）またはタンパク質の三次元折畳みによって並置される不連続アミノ酸（立体エピトープ）の両方から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは典型的には変性性溶媒への暴露に存続するが、一方、三次元折畳みによって形成されるエピトープは典型的には変性性溶媒による処理で失われる。典型的には、エピトープは、固有の空間配座の少なくとも3、より通常では少なくとも5または8−10アミノ酸を含む。エピトープの空間配座を決定する方法は、例えばｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴を含む（例えば以下を参照されたい：Morris G.E., Epitope Mappinｇ Protocols, Meth Mol Biol, 66, 1996）。エピトープマッピングの好ましい方法は表面プラズモン共鳴である。二重特異性抗体は二価、三価または四価であり得る。二重特異性抗体の関係で本明細書で用いられるとき、“価の”、“一価”、“複数価”または前記語の他の文法的変形は、抗体分子の抗原結合部位の数を意味する。これらの抗原認識部位は、同じエピトープまたは異なるエピトープを認識することができる。二価および二重特異性分子は、例えば以下に記載される：Kostelny et al. （1992） J Immunol 148:1547；Pack and Pluckthun （1992） Biochemistry 31 1579；Hollinｇer et al., 1993（上掲書）；Gruber et al. J lmmunol 5368；Zhu et al. （1997） Protein Sci 6:781；Hu et al. （1996） Cancer Res. 56:3055；Adams et al. （1993） Cancer Res. 53:4026；およびMcCartney, et al. （1995） Protein Enｇ. 8:301。三価二重特異性抗体および四価二重特異性抗体もまた当業界で公知である。例えば以下を参照されたい：Kontermann RE （ed.）, Sprinｇer Heidelberｇ Dordrecht London New York, pp. 199-216, 2011。二重特異性抗体はまた4より高い価数を有することができ、それらもまた本発明の範囲内である。そのような抗体は、例えばドックアンドロック複合体化方法（以下を参照されたい：Chanｇ, C.-H. et al. In: Bispecific Antibodies. Kontermann R E （ed.）, Sprinｇer Heidelberｇ Dordrecht London New York, pp. 199-216, 2011）によって作製することができる。
【００３７】
本明細書で用いられるように、“機能”、“機能性”などという用語は、生物学機能、酵素機能、または治療機能を指す。
“フレームワーク領域”（FR）はCDR残基以外の可変ドメインである。典型的には、各可変ドメインは、FR1、FR2、FR3およびFR4として識別される4つのFRを有する。CDRがKabatにしたがって規定される場合、軽鎖FR残基は、残基およそ1−23（LCFR1）、35−49（LCFR2）、57−88（LCFR3）、および98−107（LCFR4）に位置し、重鎖FR残基は、重鎖残基内の残基およそ1−30（HCFR1）、36−49（HCFR2）、66−94（HCFR3）、および103−113（HCFR4）に位置する。CDRが超可変ループのアミノ酸残基を含む場合、軽鎖FR残基は、軽鎖内の残基およそ1−25（LCFR1）、33−49（LCFR2）、53−90（LCFR3）、および97−107（LCFR4）に位置し、重鎖FR残基は、重鎖残基内の残基およそ1−25（HCFR1）、33−52（HCFR2）、56−95（HCFR3）、および102−113（HCFR4）に位置する。いくつかの事例では、CDRが、Kabatに規定されるCDRおよび超可変ループのCDRの両方のアミノ酸を含むとき、FR残基はそれにしたがって調整されるであろう。例えば、CDRH1がアミノ酸H26−H35を含むとき、重鎖FR1残基は1−25位に存在し、FR2残基は36−49位に存在する。
【００３８】
本明細書で用いられるように、細胞マーカーまたはバイオマーカーの測定に関して“より高い”という用語は、参照レベルと比較して、バイオマーカー測定レベルにおける統計的に有意かつ測定可能な相違を指し、この場合バイオマーカー測定値は参照レベルより高い。相違は、適切には少なくとも約10％、または少なくとも約20％、または少なくとも約30％、または少なくとも約40％、または少なくとも約50％、または少なくとも約60％、または少なくとも約70％、または少なくとも約80％、または少なくとも約90％である。
本明細書で用いられるように、細胞マーカーまたはバイオマーカーの測定に関して“より低い”という用語は、参照レベルと比較して、バイオマーカー測定レベルにおける統計的に有意かつ測定可能な相違を指し、この場合バイオマーカー測定値は参照レベル未満である。相違は、適切には、少なくとも約10％、または少なくとも約20％、または少なくとも約30％、または少なくとも約40％、または少なくとも約50％、または少なくとも約60％、または少なくとも約70％、または少なくとも約80％、または少なくとも約90％である。
“免疫チェックポイント分子”という用語は、免疫チェックポイントとして機能する受容体およびリガンドの両方を含む。免疫チェックポイントは、免疫系がそれ自身の身体を攻撃することを防ぐ免疫脱出メカニズムである。免疫チェックポイント受容体はT細胞上に存在し、抗原提示細胞上で発現される免疫チェックポイントリガンドと相互作用する。T細胞はMHC分子上に提示される抗原を認識して活性化され免疫反応を生じ、一方、上記と並行して発生する免疫チェックポイント受容体およびリガンド間の相互作用はT細胞の活性化を制御する。例示的な免疫チェックポイント分子には以下が含まれる：PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、A2AR、A2BR、B7-H3 CD276、VTCN1、BTLA、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、VISTA、CD73、CD96、CD155、DNAM-1、CD112、CRTAM、TNFRS4 （OX40, CD134）、TNFSF4 （OX40L）、CD244、CD160、GITR、GITRL、ICOS、GAL-9、4-1BBL （CD137L）、4-1BB （CD137）、CD70、CD27L、CD28、B7-1 （CD80）、B7-2 （CD86）、SIRP-1、IAP （CD47）、BLAST-1 （CD48）、CD244; CD40、CD40L、HVEM、TMIGD2、HHLA2、VEGI、TNFRS25、ICOLG （B7RP1）およびTIGIT（ただし前記に限定されない）。具体的な実施態様では、免疫チェックポイント分子はPD-1、PD-L1またはCTLA4である。
【００３９】
本発明の関係で“免疫エフェクター細胞”という用語は、免疫反応時にエフェクター機能を示す細胞と関係がある。例えば、そのような細胞は、サイトカインおよび/またはケモカインを分泌し、微生物を殺滅し、抗体を分泌し、感染細胞または癌細胞を認識し、場合によってそのような細胞を排除する。例えば、免疫エフェクター細胞は、T細胞（細胞傷害性T細胞、ヘルパーT細胞、腫瘍浸潤T細胞）、B細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、リンホカイン活性化キラー（LAK）細胞、好中球、マクロファージおよび樹状細胞である。
本発明の関係では、“免疫エフェクター機能”という用語は、免疫系の構成要素によって媒介される任意の機能を含み、前記機能は、例えば、ウイルス感染細胞または腫瘍細胞の殺滅、または腫瘍増殖阻害および/または腫瘍発達阻害（腫瘍播種および転移の阻害を含む）をもたらす。好ましくは、本発明の関係の免疫エフェクター機能はT細胞媒介エフェクター機能である。そのような機能は以下を含む：ヘルパーT細胞（CD4+ T細胞）に事例では、MHCクラスII分子に関係する抗原に由来する抗原または抗原ペプチドのT細胞受容体による認識、サイトカインの放出および/またはCD8+リンパ球（CTL）および/またはB細胞の活性化、並びにCTLの事例では、MHCクラスI分子に関係する抗原に由来する抗原または抗原ペプチドのT細胞受容体による認識、MHCクラスI分子の関係で提示される細胞の排除（すなわち、例えばアポトーシスまたはパーフォリン媒介細胞溶解を介するクラスI MHCによる抗原提示を特徴とする細胞の排除）、サイトカイン（例えばIFN-γおよびTNF-α）の産生、および抗原発現標的細胞の特異的な細胞溶解性殺滅。
【００４０】
“免疫系”という用語は、細胞、分子性成分およびメカニズム（それぞれ適応免疫および先天免疫の抗原特異的および非特異的カテゴリーを含む）を指し、前記は、損傷および傷害並びに物質に対する防御を提供し、後者は、抗原性分子（腫瘍、病原体および自己反応性細胞を含むが、ただしこれらに限定されない）を含む。“適応免疫系”とは、数日にわたって出現し特異的抗原と反応してこれを除去する抗原特異性細胞、分子性成分およびメカニズムを指す。適応免疫系は宿主の生涯を通して発達する。適応免疫系は白血球をベースにし、以下の2つの主要なセクションに分けられる：液性免疫系（主としてB細胞によって産生される免疫グロブリンを介して作用する）および細胞媒介免疫系（主としてT細胞を介して機能する）。
“リンカー”とは、2つの分子を接続し、しばしば所望の立体配置に2つの分子を配置するために役立つ分子または分子のグループ（例えばモノマーまたはポリマー）を意味する。具体的な実施態様では、“ペプチドリンカー”は、2つのタンパク質、ポリペプチド、ドメイン、領域またはモチーフを接続するアミノ酸配列を指し、前記は、抗原結合フラグメントがそれらの同族エピトープと特異的に結合できるようにそれらの間隔に適合するスペーサー機能を提供することができる。ある種の実施態様では、リンカーは、約2から約35アミノ酸、例えば約4から約20アミノ酸、または約8から約15アミノ酸、または約15から約25アミノ酸で構成される。
【００４１】
本明細書で用いられるように、“ミクロ環境”という用語は、生物学的細胞、組織または器官の結合性支持性枠組みを指す。本明細書で用いられるように、“腫瘍ミクロ環境”または“TME”という用語は腫瘍環境の任意のかつ全ての要素を指し、前記要素は、生存および/または拡張および/または拡散の悪性プロセスのために構造的および機能的環境を創出する。一般的に、“腫瘍ミクロ環境”または“TME”という用語は腫瘍が存在する細胞環境を指し、線維芽細胞、白血球および内皮細胞並びに細胞外マトリックス（ECM）を取り巻く直近の領域を含む。したがって、腫瘍ミクロ環境の細胞は、非悪性細胞（悪性細胞の増殖および生存を支える）と密接に関係する悪性細胞を含む。非悪性細胞（間質細胞とも呼ばれる）は、悪性細胞と同じ細胞間隙または悪性細胞の基部に隣接する細胞間隙を占めまたは蓄積し、腫瘍細胞増殖または生存を調節する。“間質細胞”という用語は線維芽細胞、白血球および血管細胞を含む。腫瘍ミクロ環境の非悪性細胞には、線維芽細胞、上皮細胞、血管細胞（血管およびリンパ管の内皮細胞および周皮細胞を含む）、在留性および/または補充される炎症細胞並びに免疫細胞（例えばマクロファージ、樹状細胞、顆粒球、リンパ球など）が含まれる。これらの細胞および特に活性化された線維芽細胞は転移の発達に活発に加わる。
【００４２】
本明細書で用いられる“モノクローナル抗体”という用語は、実質的に均質な抗体集団から入手される抗体を指す（すなわち、集団を構成する個々の抗体は同一であるが、わずかな量で存在し得る可能な天然に出現する変異は除かれる）。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一抗原エピトープに向けられる。修飾語の“モノクローナル”は、実質的に均質な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の生産を必要とすると解されるべきではない。例えば、本発明にしたがって用いられるモノクローナル抗体は、Kohlerら（Kohler et al., Nature 256: 495, 1975）によって最初に記載されたハイブリドーマによって作製され、上記に示す体細胞ハイブリダイゼーションによって改変することができる。或いは、モノクローナル抗体は他の組換えDNA方法（例えばU.S. Patent No. 4,816,567に記載）によって作製され得る。
“マルチ特異性抗原結合分子”という用語はそのもっとも広い意味で用いられ、特に少なくとも2つ（例えば2、3、4など）の異なるエピトープに対して特異性を有する抗原結合分子をカバーする（すなわち、1つの抗原の2つ以上の異なるエピトープと特異的に結合できるか、または2つ以上の異なる抗原のエピトープと特異的に結合できる）。
【００４３】
マーカーに適用される、“陰性”、“陽性”及び“低”発現レベルは、以下のように定義される。陰性発現（すなわち“−”）を有するかまたは“発現を欠く”細胞は、完全な抗体染色カクテル（追加の蛍光発光チャネルで問題の他のタンパク質を標識する）の存在下の蛍光チャネルでアイソタイプコントロールにより観察される発現の95パーセンタイル未満またはそれと同等の発現を示す細胞と本明細書では定義される。陰性事象を規定するこの手順は、“蛍光マイナスワン（fluorescence minus one）”（または“FMO”）染色と称されることは当業者には理解されるであろう。上記に記載したFMO染色手順を用いてアイソタイプコントロール抗体で観察される発現の95パーセンタイルより高い発現を有する細胞は、本明細書では“陽性”（すなわち“＋”）と定義される。“陽性”と広く規定される多様な集団が存在する。例えば、低い発現（すなわち“低”または“lo”）を有する細胞は概ね、FMO染色を用いアイソタイプコントロール抗体で決定される95パーセンタイルを超える観察発現を有し、かつ上記に記載のFMO染色手順を用いてアイソタイプコントロール抗体で観察される発現の95パーセンタイルの一標準偏差内の細胞と定義される。ICMに関して“低”または“lo”という用語は、1つ以上の他の別個の細胞または細胞集団（例えば免疫エフェクター細胞、例えばT細胞、B細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、NK T（NKT）細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞（DC）とともに腫瘍細胞）よりも低レベルでICMを発現する細胞または細胞集団（例えばTreｇ細胞（腫瘍ミクロ環境中のT細胞を含む））を指す。例えば、腫瘍ミクロ環境で、CTLA4はPD-1よりも有意に高いレベルでTreｇ上で発現され、PD-1は、免疫エフェクター細胞（エフェクターT細胞を含む）でTreｇ細胞上よりも有意に高いレベルで発現されることは公知である（Jacobs et al., 2009. Neuro-Oncoloｇy 11（4）: 394-402）。
【００４４】
本明細書で用いられる“作動できるように接続”または“作動できるように連結”という用語は、該当する複数の構成要素が、それらの意図された態様で機能することが許容される関係にある並列配置を指す。例えば、問題のヌクレオチド配列（例えばコードおよび/または非コード配列）に“作動できるように連結”された調節配列（例えばプロモーター）は、問題のヌクレオチド配列に対して当該制御配列の配置および/または向きが当該制御配列と適合する条件下で当該ヌクレオチド配列の発現を許容することをいう。制御配列は、それらが機能してヌクレオチド配列の発現を指令する限り問題のヌクレオチド配列と連続している必要はない。したがって、例えば、介在非コード配列（例えば翻訳されないが転写される配列）がプロモーターとコード配列との間に存在することが可能であり、プロモーター配列はなおコード配列に“作動できるように連結”されている。同様に、第一の抗原結合フラグメントを第二の抗原結合フラグメントに“作動できるように接続”することは、各抗原結合フラグメントのその同族エピトープとの結合を許容する態様にある抗原結合フラグメントの配置および/または向きを包含する。
“医薬的に許容できる担体”とは、生物学的に或いは別の態様で望ましい物質、すなわち何らかのまたは実質的な有害反応を引き起こすことなく選択した活性薬剤とともに対象動物に投与できる物質で構成される医薬ビヒクルを意味する。担体は、賦形剤および他の添加物（例えば希釈剤、洗剤、着色剤、湿潤または乳化剤、pH緩衝剤、保存料など）を含む。
【００４５】
“プログラム死1（PD-1）”（CD279、PD1、SLEB2、hPD-1、hPD-lおよびhSLE1としても知られている）は、CD28ファミリーに属する免疫阻害受容体を指す。PD-1は、in vivoで以前に活性化されたT細胞上で主として発現され、2つのリガンド（PD-L1およびPD-L2）に結合する。“PD-1”という用語は、PD-1のフラグメントとともに関連ペプチドを含み、前記には、対立遺伝子変種、スプライス変種、誘導変種、置換変種、欠失変種および/または挿入変種、融合ポリペプチド、および種間ホモログが含まれる（ただし前記に限定されない）。ある種の実施態様では、PD-1ポリペプチドは、末端残基、例えばリーダー配列残基、標的誘導残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基および/または融合タンパク質残基を含む（ただしこれらに限定されない）。好ましい実施態様では、“PD-1”には、ヒトPD-1（hPD-1）、変種、アイソフォーム、およびhPD-1の種ホモログ、並びにhPD-1と共通の少なくとも1つのエピトープを有するアナログが含まれる。完全なhPD-1配列はGenBank Accession No. U64863で見出され得る。
“プログラム死リガンド-1（PD-L1）”（CD274、B7-H、B7H1、PDCD1L1、PDCD1LG1、PDL1およびCD274分子としても知られている）は、PD-1に対する2つの細胞表面糖タンパク質の1つで（他はPD-L2である）、PD-L1は、PD-1との結合に際してT細胞活性化およびサイトカイン分泌をダウンレギュレートする。“PD-L1”という用語は、PD-L1のフラグメントとともに関連ペプチドを含み、前記には、対立遺伝子変種、スプライス変種、誘導変種、置換変種、欠失変種および/または挿入変種、融合ポリペプチド、および種間ホモログが含まれる（ただし前記に限定されない）。ある種の実施態様では、PD-1ポリペプチドは、末端残基、例えばリーダー配列残基、標的誘導残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基および/または融合タンパク質残基を含む（ただしこれらに限定されない）。好ましい実施態様では、本明細書で用いられる“PD-L1”には、ヒトPD-L1（hPD-L1）、変種、アイソフォーム、およびhPD-L1の種ホモログ、並びにhPD-L1と共通の少なくとも1つのエピトープを有するアナログが含まれる。完全なhPD-L1配列はGenBank Accession No. Q9NZQ7で見出され得る。
【００４６】
“ポリペプチド”、“タンパク質分子”、“ペプチド”および“タンパク質”という用語は本明細書では互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマー並びに前記の変種および合成アナログを指す。したがって、これらの用語は、1つ以上のアミノ酸残基が合成で天然には存在しないアミノ酸（例えば対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログ）であるアミノ酸ポリマーとともに、天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。これらの用語は、改変（例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化など）を排除しない。対象タンパク質分子の可溶形は特に有用である。本定義に含まれるものは、例えば1つ以上のアミノ酸アナログ（例えば非天然アミノ酸）を含むポリペプチドまたは置換結合を有するポリペプチドである。
“NF-κBの活性化因子受容体リガンド（RANKL）”（腫瘍壊死因子リガンドスパーファミリーメンバー11（TNFSF11）、TNF関連活性化誘発サイトカイン（TRANCE）、オステオプロテグリンリガンド（OPGL）および破骨細胞分化因子（ODF）としても知られている）は、とりわけNF-κBの活性化因子受容体（RANK）との結合を介して破骨細胞形成を促進するポリペプチドを指す。“RANKL” という用語は、RANKLのフラグメントとともに関連ペプチドを含み、前記には、対立遺伝子変種、スプライス変種、誘導変種、置換変種、欠失変種および/または挿入変種、融合ポリペプチド、および種間ホモログが含まれる（ただし前記に限定されない）。ある種の実施態様では、RANKLポリペプチドは、末端残基、例えばリーダー配列残基、標的誘導残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基および/または融合タンパク質残基を含む（ただしこれらに限定されない）。RANKLという用語には、ヒトRANKL（hRANKL）、変種、アイソフォーム、およびhRANKLの種ホモログ、並びにhRANKLと共通の少なくとも1つのエピトープを有するアナログが含まれる。完全なhRANKL配列はUniProt Accession No. O14788で見出され得る。
【００４７】
“NF-κBの活性化因子受容体（RANK）”（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー11a、NF-κBの活性化因子、CD265、FEO、LOH18CR1、ODFR、OFE、OPTB7、OSTS、PDB2、およびTRANCERとしても知られている）は、RANKリガンド（RANKL）に対する受容体およびRANK/RANKL/オステオプロテグリン（OPG）シグナリング経路の部分であるポリペプチドを指し、前記は破骨細胞の分化および活性化を調節する。前記は、骨再形成および修復、免疫細胞機能、リンパ節発達、温度調節、および乳腺発達に関与する。“RANK” という用語は、RANKのフラグメントとともに関連ペプチドを含み、前記には、対立遺伝子変種、スプライス変種、誘導変種、置換変種、欠失変種および/または挿入変種、融合ポリペプチド、および種間ホモログが含まれる（ただし前記に限定されない）。ある種の実施態様では、RANKポリペプチドは、末端残基、例えばリーダー配列残基、標的誘導残基、アミノ末端メチオニン残基、リジン残基、タグ残基および/または融合タンパク質残基を含む（ただしこれらに限定されない）。RANKという用語には、ヒトRANK（hRANK）、変種、アイソフォーム、およびhRANKの種ホモログ、並びにhRANKと共通の少なくとも1つのエピトープを有するアナログが含まれる。完全なhRANKL配列はUniProt Accession No. Q9Y6Q6で見出され得る。
【００４８】
本明細書で用いられるように、“組換え”抗原結合分子は、その生成が所望の抗体構造をコードする非天然DNA配列の生物での発現を必要とする任意の抗原結合分子を意味し、その非限定的な例には、タンデムscFv（taFvまたはscFv2）、ジアボディ、dAb2/VHH2、ノブイントゥホール（knob into holes）誘導体、SEED-lｇG、ヘテロFc-scFv、Fab-scFv、scFv-Jun/Fos、Fab’-Jun/Fos、トリボディ、DNL-F（ab）3、scFv3-CH1/CL、Fab-scFv2、IｇG-scFab、IｇG-scFv、scFv-lｇG、scFv2-Fc、F（ab’）2-scFv2、scDB-Fc、scDB-CH3、Db-Fc、scFv2-H/L、DVD-lｇ、tandAb、scFv-dhlx-scFv、dAb2-lｇG、dAb-lｇG、dAb-Fc-dAb、CrossMAb、MAb2、FIT-Iｇ、および前記の組合せが含まれる。
本明細書で用いられるように、“調節性T細胞”または“Treｇ”は、他のT細胞（エフェクターT細胞を含む）とともに先天的免疫系細胞の活性化を負の方向に調節するT細胞を指す。Treｇ細胞は、エフェクターT細胞応答の持続的抑制を特徴とする。いくつかの特徴では、TreｇはCD4+CD25+Foxp3+ T細胞である。
本明細書で互換的に用いられる“対象動物”、“患者”、“宿主”または“個体”という用語は、治療または予防が所望される、任意の対象動物、特に脊椎を有する対象動物、より具体的には哺乳動物の対象動物を指す。本発明の範囲に含まれる適切な脊椎動物には霊長類を含む脊索動物亜門の以下の任意のメンバーが含まれる（ただし前記に限定されない）。例えば人間、猿、類人猿では、猿の種、例えばマカク（Macaca）属（例えばカニクイザル、例えばマカカ・ファシクラリス（Macaca fascicularis））、および/またはアカゲザル（マカカ・ムラッタ（Macaca mulatta））およびヒヒ（パピオ・ウルシヌス（Papio ursinus））、その他にマーモセット（カリスリクス（Callithrix）属由来の種）、リスザル（サイミリ（Saimiri）属由来の種）、およびタマリン（サギヌス（Saｇuinus）属由来の種）、とともに類人猿の種、例えばチンパンジー（パン・トログロディテス（Pan troｇlodytes））；げっ歯類では、例えばマウス、ラット、モルモット；ウサギ類では、例えばウサギ、ノウサギ；ウシ類では例えば畜牛；ヒツジ類では例えばヒツジ；ヤギ類では例えばヤギ；ブタ類では例えばブタ；ウマ類では例えばウマ；イヌ類では例えばイヌ；ネコ類では例えばネコ；鳥類では例えばニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、カモ、ペットの鳥類（例えばカナリア、セキセイインコなど）；海洋哺乳動物では例えばイルカ、クジラ；爬虫類ではヘビ、カエル、トカゲなど；および魚類。好ましい対象動物は、癌に対する免疫応答を引き出す必要がある人間である。しかしながら、前述の用語は症状が存在すること暗示しないことは理解されるであろう。
【００４９】
“治療”、“治療する”、“治療される”などは、予防的および治療的処置の両方を含むことを意味し、前記処置は、（1）標的抗原の存在または異常発現に随伴する疾患もしくは症状、または（2）当該疾患もしくは症状の徴候、または（3）当該疾患もしくは症状の素因の発達または進行を防止し、軽減し、改変し、逆転させ、影響を付与し、阻害すること、前記を緩和または治癒することを含み（ただし前記に限定されない）、対象動物への防御免疫の付与を含む。
本明細書で用いられるように、“治療薬組合せ（併用）”という用語は、1つ以上の活性な医薬物質の組合せ、すなわち同時発生的に投与されるときに（すなわち併用療法）治療有用性を示す化合物を指す。したがって、化合物は単一組成物の形態にあるか（適切には化合物の混合物を含み）、または別々の組成物の形態にあることが可能である。典型的には、本発明の治療薬組合せ中のそのような化合物の各々は、当該化合物および医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物として存在するであろう。本発明の治療薬組合せ中の化合物は、各治療薬化合物の有益な作用が対象動物によって所望の時期に認識される投薬形で提供される。
本明細書で用いられるように、“三重特異性抗体”という用語は、第一のエピトープに対する特異性を有する少なくとも1つの第一の抗原結合ドメイン、第二のエピトープに対する特異性を有する第二の抗原結合ドメイン、および第三のエピトープに対する特異性を有する第三の抗原結合ドメインを含む抗体を指す（例えばRANKL並びにCTLA4、PD-1およびPD-L1の任意の2つ）。第一、第二および第三のエピトープは同じではないが（すなわち前記は異なる標的（例えばタンパク質）である）、前記はいずれも単一細胞にまたは少なくとも2つの細胞に存在することができる。
【００５０】
本明細書で用いられる“腫瘍”という用語は、任意の新形成細胞の成長および増殖生長（悪性または良性を問わない）、並びに全ての前癌性および癌性細胞および組織を指す。“癌”および“癌性”は、典型的には無制御な細胞の増殖によって部分的に特徴づけられる哺乳動物における生理学的状態を指すかまたは前記をいう。本明細書で用いられるように、“癌”という用語は、非転移および転移癌を指し、初期および後期癌を含む。“前癌性”という用語は、典型的には癌に先行するかまたは癌に発達する状態または増殖を指す。“非転移”とは、良性であるかまたは原発部位にとどまりリンパ管もしくは血管系または原発部位以外の他の組織に侵入していない癌を意味する。一般的には、非転移癌は、0、IまたはII期癌、場合によってIII期癌のいずれかである。“初期癌”とは、侵襲または転移していないか、または0、IまたはII期癌と分類される癌を意味する。“後期癌”という用語は、一般的にはIII期またはIV期癌を指すが、II期癌またはII期癌の亜期もまた指すことができる。II期癌を初期癌または後期癌として分類するか否かは、具体的な癌のタイプに左右されることは当業者には理解されるであろう。例示的な癌の例には以下が含まれる（ただしそれらに限定されない）：乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、尿路癌、甲状腺癌、腎癌、癌腫、メラノーマ、脳の癌、非小細胞肺癌、頭頸部の扁平上皮癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、結腸癌、および食道癌。例示的な実施態様では、癌は、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、および骨の癌から選択される。
【００５１】
“ベクター”とは、例えばプラスミド、バクテリオファージまたは植物ウイルスに由来し、その中に核酸配列を挿入するかまたはクローン化することができる核酸分子（好ましくはDNA分子）を意味する。ベクターは、好ましくは1つ以上の固有の制限部位を含み、所定の宿主細胞（標的細胞もしくは組織または前記の前駆細胞もしくは組織を含む）で自律的に複製する能力を有し得るか、またはクローン化配列が再生できるように当該所定の宿主のゲノムに組み込まれ得る。したがって、ベクターは、自律的に複製するベクター（すなわち余剰染色体性実体として存在するベクター）であり、その複製は染色体の複製に依存しない、例えば直鎖状または閉鎖環状プラスミド、余剰染色体性エレメント、ミニ染色体、または人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製を担保する任意の手段を含むことができる。また別には、ベクターは、宿主細胞に導入されるときゲノムに組み込まれ、それを組み込んだ染色体とともに複製されるものであり得る。ベクター系は、単一のベクターもしくはプラスミド、2つ以上のベクターもしくはプラスミドを含むことができ、それらは、宿主細胞のゲノムまたはトランスポゾンに導入されるべき全DNAをまとめて含む。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とのベクターの適合性に左右されるであろう。ベクターはまた、選別マーカー、例えば、適切な形質転換体の選別に用いることができる抗生物質耐性遺伝子を含むことができる。そのような耐性遺伝子の例は当業者には周知である。
本明細書に記載の各実施態様は、特段の規定がなければ実施態様の各々およびいずれの実施態様にも準用され得る。
【００５２】
2．略語
以下の略語が本出願を通して用いられる：
aa＝アミノ酸
CDR＝相補性決定領域
CTLA4＝細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4
Fc＝定常領域
FR＝フレームワーク
h＝時間
ICM＝免疫チェックポイント分子
Iｇ＝免疫グロブリン
MAb＝モノクローナル抗体
PD-1＝プログラム死1
PD-L1＝プログラム死リガンド1
RANKL＝NF-κBの活性化因子受容体リガンド
s＝秒
VH＝重鎖可変ドメイン
VL＝軽鎖可変ドメイン
【００５３】
3．治療薬組合せ
本発明は治療薬組合せを提供し、前記組み合わせは、とりわけ癌に対する免疫応答を対象動物において刺激または増大させるために有用である。これらの組成物は、概ね（1）NF-κBの活性化因子受容体リガンド（RANKL）アンタゴニスト、および（2）少なくとも1つの免疫チェックポイント分子（ICM）アンタゴニストを利用する。当該組成物は、これら2つの経路間における新規に識別された相乗作用を利用し、前記相乗作用は、腫瘍または癌部位におけるCD8+ T細胞の局在化の増加をもたらす。有利には、前記相乗性組成物は適切にはエフェクター細胞機能の増強を刺激し、例えば、増強されるエフェクターT細胞機能にはTh1型サイトカイン（例えばIFN-γおよび/またはIL-2）の生成および多機能性T細胞の割合の増加が含まれる。
いくつかの好ましい実施態様では、本発明のアンタゴニスト（すなわち、RANKLアンタゴニストおよびICMアンタゴニスト）は抗原結合分子である。適切な抗原結合分子は、組換え抗体、モノクローナル抗体（MAb）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、およびそのような抗体の抗原結合フラグメントを含む抗体およびそれらの抗原結合フラグメントから選択できる。
人間での適用のために、もともと他の種（例えばマウス）に由来する抗体の免疫原性を低下させることが所望される。これらは、キメラ抗体の構築によって、または“ヒト化”と呼ばれるプロセスによって実施できる。ここでは、“キメラ抗体”は、異なる種（例えばヒト）に由来するドメイン（例えば定常ドメイン）に融合した1つの種（例えばマウス）に由来するドメイン（例えば可変ドメイン）を含む抗体であると理解される。
【００５４】
“ヒト化抗体”は、非ヒト（例えばネズミ）抗体の配列とともにヒト抗体の配列を含む抗体の形態を指す。そのような抗体はキメラ抗体であり、前記は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む。一般的に、ヒト化抗体は。少なくとも1つ（典型的には2つ）の可変ドメインの実質的に全てを含み、前記では、超可変ループの全てもしくは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、フレームワーク（FR）領域の全てもしくは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のそれである。ヒト化抗体はまた、場合によって免疫グロブリン定常領域（Fc）（典型的にはヒト免疫グロブリンのそれ）の少なくとも部分を含むであろう（以下を参照されたい：Jones et al., Nature 321:522-525, 1986；Riechmann et al., Nature 332:323-329, 1988；およびPresta, Curr Op Struct Biol 2:593-596, 1992）。ヒト化は、Winterらの方法（Jones et al.（上掲書）；Riechmann et al．（上掲書）；Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988）に従い、げっ歯類の複数のCDRまたは1つのCDR配列を対応するヒト抗体の配列の代用とすることによって本質的に実施され得る。さらにまた、ヒトゲノムに由来する配列をベースにした抗体を作製するために複数の技術が開発され、前記は、例えばファージディスプレーによるかまたはトランスジェニック動物を用いる（以下を参照されたい：国際特許公開No. WO 90/05144；Marks et al., （1991） By-passinｇ immunisation. Human antibodies from V-ｇene libraries displayed on phaｇe, J Mol Biol, 222, 581-597；Knappik et al., J Mol Biol 296: 57-86, 2000；Carmen and Jermutus, Concepts in antibody phaｇe display, Briefinｇs in Functional Genomics and Proteomics 2002 1（2）:189-203；Lonberｇ and Huszar, Human antibodies from transｇenic mice. Int Rev Immunol 1995; 13（1）:65-93；Bruｇｇemann and Taussiｇ, Production of human antibody repertoires in transｇenic mice, Curr Opin Biotechnol 1997 8（4）: 455-8）。そのような抗体は本発明の関係では“ヒト抗体”である。
【００５５】
本発明はまた合成または組換え抗原結合分子を意図し、その生成は、所望の抗体構造をコードする自然のままではないDNA配列の生物での発現を必要とする。いくつかの実施態様では、合成または組換え抗原結合分子はマルチ特異性抗原結合分子であり、その代表的な例には以下が含まれる：タンデムscFv（taFvまたはscFv2）、ジアボディ、dAb2/VHH2、ノブイントゥホール誘導体、SEED-IｇG、ヘテロFc-scFv、Fab-scFv、scFv-Jun/Fos、Fab’-Jun/Fos、トリボディ、DNL-F（ab）3、scFv3-CH1/CL、Fab-scFv2、IｇG-scFab、IｇG-scFv、scFv-IｇG、scFv2-Fc、F（ab’）2-scFv2、scDB-Fc、scDb-CH3、Db-Fc、scFv2-H/L、DVD-Iｇ、tandAb、scFv-dhlx-scFv、dAb2-IｇG、dAb-IｇG、dAb-Fc-dAbおよび前記の組合せ。具体的な実施態様では、合成または組換え抗原結合分子は以下から選択される：IｇG様抗体（例えば、トリオマブ/クアドローマ（Trion Pharma/Fresenius Biotech）；ノブイントゥホール（Genentech）；CrossMAb（Roche）；静電気的に適合した抗体（AMGEN）；LUZ-Y（Genentech）；鎖交換操作ドメイン（SEED）体（EMD Serono）；ビオロニク（Merus）；およびFab交換抗体（Genmab））、合成IｇG様抗体（例えば、二重標的化（DT）-Iｇ（GSK/Domantis）；トゥインワン抗体（Genentech）；架橋MAb（karmanos cancer center）；MAb2（F-star）；およびCoy X-ボディ（Coy X/Pfizer）、IｇG融合物（例えば二重可変ドメイン（DVD）-Iｇ（Abbott）；IｇG様に特異性抗体（Eli Lilly）；Ts2Ab（Medimmune/AZ）；BsAb（ZymoGenetics）；HERCULES（Bioｇen Idec）；TvAb（Roche））、Fc融合物（例えば、ScFv/Fc 融合物（Academic Institution）；SCORPION（Emerｇent BioSolutions/Trubion, ZymoGenetics/BMS）；二重親和性再標的化技術（Fc-DART）（MacroGenics）；二重（ScFv）2-Fab（National Research Center for Antibody Medicine））、Fab融合物（例えばF（ab）2（Medarex/AMGEN）；二重作用またはBis-Fab（Genentech）；ドックアンドロック（DNL）（ImmunoMedics）；二価二重特異性（Biotechno）；およびFab-Fv（UCB-Celltech）、ScFv-およびジアボディ系抗体（例えば二重特異性T細胞エンゲージャー（BiTE）（Micromet）；タンデムジアボディ（Tandab）（Affimed）；DART（MacroGenics）；単鎖ジアボディ（Academic）；TCR様抗体、AIT（Receptor Loｇics）；ヒト血清アルブミンScFv融合物（Merrimack）；およびCOMBODIES（Epiｇen Biotech））、IｇG/非IｇG融合物（例えばイムノサイトカイン（EMDSerono, Philoｇen, ImmunGene, ImmunoMedics）；スーパー抗原融合タンパク質（Active Biotech）；およびイミューンモビライジングmTCRアゲインストゥキャンサー（ImmTAC））、並びにオリゴクローン抗体（例えばSymphoｇenおよびMerus）。
【００５６】
マルチ特異性抗原結合分子のその他の非限定的な例には、タンデムFab免疫グロブリン（Fabs-in-tandem immunoｇlobulin）（FIT-Iｇ）（Gonｇ et al., 2017. MAbs. 9（7）:1118-1128. doi: 10.1080/19420862.2017.1345401. Epub 2017 Jul 10. PubMedPMID: 28692328; PubMed Central PMCID: PMC5627593）が含まれ、前記は2つ以上の抗原と結合できる。FIT-Iｇ分子の設計では、親mAb由来の2つのFabドメインが十文字方向でタンデムに直接融合される。哺乳動物細胞で共同発現されるとき、3つのフラグメントは集合して四価のマルチ特異性FIT-Iｇ分子を形成する。例えば、二重特異性結合タンパク質は、2つの親モノクローナル抗体、mAb A（抗原Aと結合する）およびmAb B（抗原Bと結合する）を用いてFIT-Iｇとして構築できよう。FIT-Iｇ分子の設計では、親mAb由来の2つのFabドメインが十文字方向ででタンデムに直接融合される。哺乳動物細胞で共同発現されるとき、3つのフラグメントは集合して四価のマルチ特異性FIT-Iｇ分子を形成する。代表的な実施態様では、FIT-Iｇは、RANKLおよび少なくとも1つのICMと拮抗するためにマルチ特異性抗原結合分子を提供する。これらのマルチ特異性抗原結合分子は、一般的に、そのFIT-Iｇ分子として構築される抗体または抗原結合フラグメント（RANKLまたはRANK特異的に結合する）およびそれぞれのICMのために当該ICMと特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。RANKLアンタゴニストが直接的なRANKLアンタゴニストであるいくつかの実施態様では、マルチ特異性抗原結合分子は、抗RANKL抗体またはその抗原結合フラグメントを含む（前記はFIT-Iｇ分子に取り込まれるであろう）。RANKLアンタゴニストが間接的RANKLアンタゴニストである他の実施態様では、マルチ特異性抗原結合分子は、抗RANK抗体またはその抗原結合フラグメントを含む（前記はFIT-Iｇ分子に取り込まれるであろう）。少なくとも1つのICMは、適切にはPD-1、PD-L1またはCTLA-4から選択され、FIT-Iｇ分子に取り込まれる。マルチ特異性抗原結合分子がPD-1と拮抗するいくつかの実施態様では、マルチ特異性抗原結合分子は、抗PD-1抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。マルチ特異性抗原結合分子がPD-L1と拮抗するいくつかの実施態様では、マルチ特異性抗原結合分子は、抗PD-L1抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。マルチ特異性抗原結合分子がCTLA4と拮抗するいくつかの実施態様では、マルチ特異性抗原結合分子は、抗CTLA4抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。
【００５７】
抗体の可変領域は、典型的には単鎖Fv（scFv）またはFabフラグメントとして単離される。いくつかの実施態様では、抗原結合分子は2つ以上のscFvフラグメントを含む。scFvフラグメントは、短い10−25アミノ酸リンカーによって連結されるVHおよびVLドメインで構成される。いったん単離されると、scFvフラグメントは当業界で公知の任意の可撓性ペプチドリンカー（例えばAla-Ala-Ala、Gly-Gly-Gly-Gly-Serなどの1回以上の繰り返し）で連結され得る。得られたポリペプチド、タンデムscFv（taFvまたはscFv2）は多様な態様で、taFvの各scFvについてVH-VLまたはVL-VHの順序で並べることができる（Kontermann（上掲書））。
本発明では、抗体は、抗原に対して少なくとも約105 mol-1、106 mol-1以上、好ましくは107 mol-1以上、より好ましくは108 mol-1以上、もっとも好ましくは109 mol-1以上の結合比活性（Ka）を有することを特徴とし得る。当業者は抗体の結合親和性を容易に、例えばスキャチャード分析によって決定できる（以下を参照されたい：Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949）。
3.1NF-κBの活性化因子受容体（RANK）リガンド（RANKL）のアンタゴニスト
本発明の治療薬剤における使用に適切なRANKLアンタゴニストには、RANKL（例えばヒトRANKL）と拮抗することができる任意の分子が含まれる。例示すれば、RANKLアンタゴニストはポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗原結合分子、炭水化物、または小分子であり得る。いくつかの好ましい実施態様では、RANKLアンタゴニストは、抗RANKL抗原結合分子（例えばMAbまたはその抗原結合フラグメント）である。そのような抗RANKL抗原結合分子は、自然のままのRANKL、例えば、以下のアミノ酸配列を有する自然のままのヒトRANKLの領域またはエピトープと特異的に結合する：
MRRASRDYTKYLRGSEEMGGGPGAPHEGPLHAPPPPAPHQPPAASRSMFVALLGLGLGQVVCSVALFFYFRAQMDPNRISEDGTHCIYRILRLHENADFQDTTLESQDTKLIPDSCRRIKQAFQGAVQKELQHIVGSQHIRAEKAMVDGSWLDLAKRSKLEAQPFAHLTINATDIPSGSHKVSLSSWYHDRGWAKISNMTFSNGKLIVNQDGFYYLYANICFRHHETSGDLATEYLQLMVYVTKTSIKIPSSHTLMKGGSTKYWSGNSEFHFYSINVGGFFKLRSGEEISIEVSNPSLLDPDQDATYFGAFKVRDID
（配列番号:2）
【００５８】
適切には、本発明の抗RANKL抗原結合分子は、一般的に、RANKLの細胞外ドメインの領域またはエピトープ（すなわち配列番号:2に示すヒトRANKL配列の残基69から317に対応する）と結合する。いくつかのより具体的な実施態様では、抗RANKL抗原結合分子は、適切にはRANKLの受容体結合ドメインの領域（配列番号:2に示すヒトRANKL配列の残基162から317に対応する）と結合する。例示すれば、抗RANKL抗原結合分子は、アミノ酸配列TEYLQLMVY（配列番号:1）（すなわち配列番号:2に示す自然のままのヒトRANKL配列の残基233から241）の1つ以上のアミノ酸と特異的に結合する。
ヒトRANKLと特異的に結合する公知のMAbの例は、U.S. Patent Appl Pub No. 2016/0333101および2012/0087923に記載され、それらの内容は、参照によってその全体が本明細書に含まれる。
本発明に関する使用に適切なそのような抗RANKL MAbの1つはデノスマブである。したがって、いくつかの実施態様では、抗RANKL抗原結合分子は、完全なヒトのIｇG2 MAbデノスマブまたはその抗原結合フラグメントを含む。同じ実施態様のいくつかまたは他の実施態様では、抗RANKL抗原結合分子は、表1に示すCDR配列を含む。
2020522529.tif 000009
このタイプの限定的な例では、抗RANKL抗原結合分子は、下記に例示のために示すデノスマブの重鎖アミノ酸配列：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号:3）、
またはその抗原結合フラグメントを含み、その例示的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれから成るか、または本質的にそれから成る：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS（配列番号:25）。
【００５９】
これらの実施例および他の実施例のいくつかでは、抗RANKL抗原結合分子は、下記に示すデノスマブの軽鎖アミノ酸配列：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRGRYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVFYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:4）、
またはその抗原結合フラグメントを含み、その例示的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれから成るか、または本質的にそれから成る：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRGRYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVFYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIK（配列番号:26）。
デノスマブの重鎖および軽鎖の完全長配列はそれぞれ配列番号:7および8に示される：
MEFGLSWLFLVAILKGVOCEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEOTAVYYCAKDPGTTVIMSWFOPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号:27）（ここでIｇG2シグナルペプチドには下線が付されている）；および
METPAOLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRGRYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVFYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:28）（ここでカッパシグナルペプチドには下線が付されている）。
【００６０】
本発明の実施で用いることができる他の例示的な抗RANKL抗原結合分子には、EP 1257648（その内容は参照によってその全体が本明細書に含まれる）に開示された抗RANKL抗原結合分子が含まれる。代表的な実施態様では、抗RANKL抗原結合分子は、表2に示すCDR配列を含む。
2020522529.tif 000010
これらの実施態様のいくつかでは、抗RANKL抗原結合分子は、下記に例示のために示す重鎖アミノ酸配列：
AQVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC（配列番号:35）、
またはその抗原結合フラグメントを含み、その例示的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれから成るか、または本質的にそれから成る：
QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS（配列番号:36）。
これらの実施態様および他の実施態様のいくつかでは、抗RANKL抗原結合分子は、下記に例示のために示す軽鎖アミノ酸配列：
SHSALEIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRYLNWYQLKPGKAPRLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPEDIATYYCQHTRAFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESATEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:37）、
またはその抗原結合フラグメントを含み、その代表的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれから成るか、または本質的にそれから成る：
EIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRYLNWYQLKPGKAPRLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPEDIATYYCQHTRAFGQGTKVEIK（配列番号:38）。
【００６１】
他の代表的な実施態様では、抗RANKL抗原結合分子は、表3に示すCDR配列を含む。
2020522529.tif 000011
これらの実施態様のいくつかでは、抗RANKL抗原結合分子は、下記に例示のために示す重鎖アミノ酸配列：
AEVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC（配列番号:45）、
またはその抗原結合フラグメントを含み、その例示的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれから成るか、または本質的にそれから成る：
EVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS（配列番号:46）。
これらの実施態様および他の実施態様のいくつかでは、抗RANKL抗原結合分子は、下記に例示のために示す軽鎖アミノ酸配列：
SHSALEIVLTQSPATLSFSPGERATLSCRASQSVGSYLAWYQQRPGQAPRPLIYDATNRATGIPTRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQHRRTFGRGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:47）、
またはその抗原結合フラグメントを含み、その代表的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれから成るか、または本質的にそれから成る：
EIVLTQSPATLSFSPGERATLSCRASQSVGSYLAWYQQRPGQAPRPLIYDATNRATGIPTRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQHRRTFGRGTKLEIK（配列番号:48）。
【００６２】
多様な実施態様で、抗RANKL抗原結合分子は、可変軽鎖（VL）アミノ酸配列および可変重鎖（VH）アミノ酸配列を含む。ここで個々のVL鎖は、フレームワークアミノ酸配列によって分離されるCDR1（VL）、CDR2（VL）およびCDR3（VL）と称されるCDRアミノ酸配列を含み、
CDR1（VL）は、RASQSISRYLN（配列番号:49）、RASQSVGSYLA（配列番号:50）、RASQSVSSSSLA（配列番号:51）およびSGDALPKQY（配列番号:52）から成る群から選択され、
CDR2（VL）は、GASSLQS（配列番号:53）、DATNRAT（配列番号:54）、GASSRAT（配列番号:55）、およびEDSERPS（配列番号:56）から成る群から選択され、
CDR3（VL）は、QHTRA（配列番号:57）、QHRRT（配列番号:58）、QQYGA（配列番号:59）、およびQSTDSSGTYVV（配列番号:60）から成る群から選択され、
ここで、CDR1（VL）、CDR2（VL）およびCDR3（VL）は互いにそれぞれ独立に選択され、
ここで、各VH鎖は、フレームワークアミノ酸配列によって分離されるCDR1（VH）、CDR2（VH）およびCDR3（VH）と称されるCDRアミノ酸配列を含み、
CDR1（VH）は、NYAIH（配列番号:61）、NYPMH（配列番号:62）、およびDXAMH（配列番号:63）から成る群から選択され、
CDR2（VH）は、WINAGNGNTKFSQKFQG（配列番号:64）、VISYDGNNKYYADSVKG（配列番号:65）、およびGISMNSGRIGYADSVKO（配列番号:66）から成る群から選択され、
CDR3（VH）は、DSSNMVRGIIIAYYFDY（配列番号:67）、GGGGFDY（配列番号:68）、およびGGSTSARYSSGWYY（配列番号:69）から成る群から選択され、
ここで、CDR1（VH）、CDR2（VH）およびCDR3（VH）は互いにそれぞれ独立に選択される。
具体的な実施態様では、抗RANKL抗原結合分子はVLおよびVH鎖を含み、ここで、
VL鎖は、配列RASQSISRYLN（配列番号:49）を有するCDR1、配列GASSLQS（配列番号:53）を有するCDR2、および配列QHTRA（配列番号:57）を有するCDR3を含み、
VH鎖は、配列NYAIH（配列番号:61）を有するCDR1、配列WINAGNGNTKFSQKFQG（配列番号:64）を有するCDR2、および配列DSSNMVRGIIIAYYFDY（配列番号:67）を有するCDR3を含み、
ここで、各VLおよびVH鎖のCDR1、CDR2およびCDR3はフレームワークアミノ酸配列によって分離される。
【００６３】
他の実施態様では、RANKLアンタゴニストは間接的アンタゴニストであり、前記はRANKL結合パートナーと特異的に結合する。例示すれば、RANKLアンタゴニストは、RANKの機能活性を阻害または無効にする。RANK（TNFRSF11A、NF-κBの受容体活性因子、およびCD265としても知られている）は、腫瘍壊死因子受容体（TNFR）分子サブファミリーのメンバーである。RANKは、骨格筋、胸腺、肝臓、結腸、小腸、副腎、破骨細胞、乳腺上皮細胞、前立腺、血管細胞および膵臓で構成的に発現される。
いくつかの実施態様では、RANKアンタゴニストは、RANKLと相互作用するRANKの領域に対応するアミノ酸配列を含むか、それらから成るか、または本質的に前記から成り、その代表的な例は、CDR2（すなわち残基44−85）およびCRD3（すなわち残基86−123）から選択される少なくとも1つのCRDを含む。このタイプの非限定的な例では、RANKアンタゴニストは、RANK CRD3に対応するアミノ酸配列を含むか、それらから成るか、または本質的に前記から成り、その代表的な例はYCWNSDCECCY（配列番号:5）、YCWSQYLCY（配列番号:6）を含む。
他の実施態様では、RANKアンタゴニストは、抗RANK抗原結合分子（例えばMAbまたはその抗原結合フラグメント）であり、前記は、自然のままのRANK、例えば自然のままのヒトRANK（UniProt accession no. Q9Y6Q6）（下記の代表的な完全長アミノ酸配列を有する）の領域またはエピトープと特異的に結合する：
MAPRARRRRPLFALLLLCALLARLQVALQIAPPCTSEKHYEHLGRCCNKCEPGKYMSSKCTTTSDSVCLPCGPDEYLDSWNEEDKCLLHKVCDTGKALVAVVAGNSTTPRRCACTAGYHWSQDCECCRRNTECAPGLGAQHPLQLNKDTVCKPCLAGYFSDAFSSTDKCRPWTNCTFLGKRVEHHGTEKSDAVCSSSLPARKPPNEPHVYLPGLIILLLFASVALVAAIIFGVCYRKKGKALTANLWHWINEACGRLSGDKESSGDSCVSTHTANFGQQGACEGVLLLTLEEKTFPEDMCYPDQGGVCQGTCVGGGPYAQGEDARMLSLVSKTEIEEDSFRQMPTEDEYMDRPSQPTDQLLFLTEPGSKSTPPFSEPLEVGENDSLSQCFTGTQSTVGSESCNCTEPLCRTDWTPMSSENYLQKEVDSGHCPHWAASPSPNWADVCTGCRNPPGEDCEPLVGSPKRGPLPQCAYGMGLPPEEEASRTEARDQPEDGADGRLPSSARAGAGSGSSPGGQSPASGNVTGNSNSTFISSGQVMNFKGDIIVVYVSQTSQEGAAAAAEPMGRPVQEETLARRDSFAGNGPRFPDPCGGPEGLREPEKASRPVQEQGGAKA（配列番号:8）。
【００６４】
本発明の抗RANK抗原結合分子は、一般的に、RANKの細胞外ドメインの領域（例えば、配列番号:8に示すヒトRANK配列の残基30から212に対応する）と結合し、その非限定的な例は以下を含む：VSKTEIEEDSFRQMPTEDEYMDRPSQPTDQLLFLTEPGSKSTPPFSEPLEVGENDSLSQCFTGTQSTVGSESCNCTEPLCRTDWTPMS（配列番号:7）（すなわち、配列番号:8に示す自然のままのRANK配列の残基330−417）。このタイプのいくつかの実施態様では、抗RANK抗原結合分子は、MAb 64C1385（Abcam）、N-1H8、およびN-2B10、またはその抗原結合分子（前記のキメラおよびヒト化抗原結合分子を含む）から選択される。他の実施態様では、抗RANK抗原結合分子は、RANKとの結合についてMAb 64C1385、N-1H8またはN-2B10と競合する。
いくつかの実施態様で、抗RANK抗原結合分子は、Newaら（2014、上掲書）による例示のために開示される短鎖Fv（scFv）抗原結合分子またはその抗原結合フラグメントである。このタイプの代表的な抗原結合分子は、表4に示すCDR配列を含むことができる。
2020522529.tif 000012
より具体的な実施態様では、抗RANK抗原結合分子は、以下の重鎖アミノ酸配列：
MAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGDGYYTDYADSVGRFTISRDNSKNTLYLQNSLRAEDTAVYYCAKNAYSFDYWGQGTLVTVS（配列番号:76）もしくはMAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGDGYYTDYADSVGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNAYSFDYWGQGTLVTVS（配列番号:77）、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGDGYYTDYADSVGRFTISRDNSKNTLYLQNSLRAEDTAVYYCAKNAYSFDYWGQGTLVTVS（配列番号:78）、またはEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGDGYYTDYADSVGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKNAYSFDYWGQGTLVTVS（配列番号:79）。
同じまたは他の実施態様のいくつかでは、抗RANK抗原結合分子は、以下の軽鎖アミノ酸配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGSSSPNTFGQGTKVEIKRAAA（配列番号:80）、
またはその抗原結合フラグメントを含むことができ、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGSSSPNTFGQGTKVEIK（配列番号:81）。
【００６５】
3.2免疫チェックポイント分子（ICM）アンタゴニスト
治療に用いることができる適切な任意のICMアンタゴニストが本発明の実施で使用するために意図される。例えば、適切なICMアンタゴニストは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、および小分子を含む。いくつかの好ましい実施態様では、ICMアンタゴニストは抗原結合分子である。
本発明の治療薬組合せと拮抗するICMには、以下から選択される阻害性ICMの任意の1つ以上が含まれる:PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、A2AR、A2BR、CD276、VTCN1、BTLA、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、VISTA、CD73、CD96、CD155、DNAM-1、CD112、CRTAM、OX40、OX40L、CD244、CD160、GITR、GITRL、ICOS、GAL-9、4-1BBL、4-1BB、CD27L、CD28、CD80、CD86、SIRP-1、CD47、CD48、CD244、CD40、CD40L、HVEM、TMIGD2、HHLA2、VEGI、TNFRS25およびICOLG。治療薬組合せがRANKLアンタゴニストおよびただ1つのICMアンタゴニストを含む実施態様では、ICMは適切にはCTLA-4以外である。
いくつかの好ましい実施態様では、治療薬組合せに含まれるICMアンタゴニストはPD-1アンタゴニストである。これに関して、“PD-1アンタゴニスト”には、任意の化学的化合物または生物学的分子が含まれ、前記は、PD-L1（例えば癌細胞表面で発現されるPD-L1）とPD-1（免疫細胞（例えばT細胞、B細胞、またはNKT細胞）で発現される）との結合を阻む。PD-1のまた別の名称または同義語には、PDCD1、PD1、CD279およびSLEB2が含まれる。ヒトPD-1の代表的な成熟アミノ酸配列（UniProt accession no. Q15116）は以下に示される：
PGWFLDSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL（配列番号:）。
【００６６】
ヒトPD-1と結合し、したがって本発明で使用されるMAbの例は、以下に記載されている：米国特許公開US2003/0039653、US2004/0213795、US2006/0110383、US2007/0065427、US2007/0122378、US2012/237522、および国際PCT公開WO2004/072286、WO2006/121168、WO2006/133396、WO2007/005874、WO2008/083174、WO2008/156712、WO2009/024531、WO2009/014708、WO2009/114335、WO2010/027828、WO2010/027423、WO2010/036959、WO2010/029435、WO2010/029434、WO2010/063011、WO2010/089411、WO2011/066342、WO2011/110604、WO2011/110621、およびWO2012/145493（前記の完全な内容は参照によって本明細書に含まれる）。本発明の目的に有用な特別なMAbには、抗PD-1MAbニボルマブ、ペムブロリズマブ、およびピジリズマブとともにヒト化抗PD-1抗体h409A11、h409A16、およびh409A17（国際特許公開WO2008/156712に記載）が含まれる。
本発明の抗PD-1抗原結合分子は、好ましくは、PD-1の細胞外ドメインの領域と結合する。例示すれば、抗PD-1抗原結合分子は、ヒトPD-1の細胞外ドメインの領域と特異的に結合でき、前記領域は、アミノ酸配列SFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDR（配列番号:9）（すなわち、配列番号:10に示す自然のままのPD-1配列の残基62から86）およびSGTYLCGAISLAPKAQIKE（配列番号:11）（すなわち、配列番号:10に示す自然のままのPD-1配列の残基118から136）の一方または両方を含む。別の例では、抗PD-1抗原結合分子は、ヒトPD-1の細胞外ドメインの領域と特異的に結合でき、前記領域は、アミノ酸配列NWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRV（配列番号:12）（すなわち、配列番号:10に示す自然のままのヒトPD-1配列の残基66から97に対応する）を含む。
ある種の実施態様では、抗PD-1抗原結合分子は、完全にヒト化されたIｇG4 MAbニボルマブ（米国特許8,008,449号（前記は参照によってその全体が本明細書に含まれる）に詳細に記載（“5C4”と称される））またはその抗原結合フラグメントを含む。このタイプの代表的な例では、抗PD-1抗原結合分子は表5に示すCDR配列を含む。
2020522529.tif 000013
【００６７】
より具体的な実施態様では、抗PD-1抗原結合分子は、例えば下記に示されるニボルマブの重鎖アミノ酸配列：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号:88）、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS（配列番号:89）。
同じおよび他の実施態様のいくつかでは、抗PD-1抗原結合分子は、例えば下記に示すニボルマブの軽鎖アミノ酸配列：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:90）、
またはその抗原結合フラグメントを含むことができ、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK（配列番号:91）。
【００６８】
また別の実施態様では、抗PD-1抗原結合分子は、ヒト化IｇG4 MAbペムブロリズマブまたはその抗原結合フラグメントを含む。このタイプの非限定的な例では、抗PD-1抗原結合分子は、表6に示すCDR配列を含む。
2020522529.tif 000014
いくつかの実施態様では、抗PD-1抗原結合分子は、PD-1との結合についてMAbペムブロリズマブと競合する。
追加の実施態様では、抗PD-1抗原結合分子は、例えば下記に示すペムブロリズマブの重鎖アミノ酸配列：
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号:98）、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る：
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS（配列番号:99）。
同様に、抗PD-1抗原結合分子は、例えば下記に示すペムブロリズマブの軽鎖アミノ酸配列：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:100）、
またはその抗原結合フラグメントを含むことができ、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK（配列番号:101）。
【００６９】
このタイプのさらに他の実施態様では、抗PD-1抗原結合分子は、MAbピジリズマブまたはその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの関連する実施態様では、抗PD-1抗原結合分子は、表7に示すCDR配列を含む。
2020522529.tif 000015
より具体的な実施態様では、抗PD-1抗原結合分子は、下記に示すピジリズマブの重鎖アミノ酸配列：
QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLQWMGWINTDSGESTYAEEFKGRFVFSLDTSVNTAYLQITSLTAEDTGMYFCVRVGYDALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号:108）、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る：
QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLQWMGWINTDSGESTYAEEFKGRFVFSLDTSVNTAYLQITSLTAEDTGMYFCVRVGYDALDYWGQGTLVTVSS（配列番号:109）。
同じおよび他の実施態様のいくつかでは、抗PD-1抗原結合分子は、下記に示すピジリズマブの軽鎖アミノ酸配列：
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCSARSSVSYMHWFQQKPGKAPKLWIYRTSNLASGVPSRFSGSGSGTSYCLTINSLQPEDFATYYCQQRSSFPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:110）、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る：
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCSARSSVSYMHWFQQKPGKAPKLWIYRTSNLASGVPSRFSGSGSGTSYCLTINSLQPEDFATYYCQQRSSFPLTFGGGTKLEIK（配列番号:111）。
【００７０】
他の適切なMAbは国際特許公開WO2015/026634に記載される（前記は参照によってその全体が本明細書に含まれる）。これらにはMAbまたはその抗原結合フラグメントが含まれ、前記は以下を含む：（a）アミノ酸配列RASKSVSTSGFSYLH（配列番号:112）、LASNLES（配列番号:113）およびQHSWELPLT（配列番号:114）（それぞれCDR1、CDR2およびCDR3）を有する軽鎖、並びにアミノ酸配列SYYLY（配列番号:115）、GVNPSNGGTNFSEKFKS（配列番号:116）およびRDSNYDGGFDY（配列番号:117）（それぞれCDR1、CDR2およびCDR3）を有する重鎖；または（b）アミノ酸配列RASKGVSTSGYSYLH（配列番号:118）、LASYLES（配列番号:119）およびQHSRDLPLT（配列番号:120）（それぞれCDR1、CDR2およびCDR3）を有する軽鎖、並びにアミノ酸配列NYYMY（配列番号:121）、GINPSNGGTNFNEKFKN（配列番号:122）およびRDYRFDMGFDY（配列番号:123）（それぞれCDR1、CDR2およびCDR3）を有する重鎖。
例示すれば、そのようなMAbは、（a）以下を含む重鎖可変領域：
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS（配列番号:124）またはその変種もしくは抗原結合フラグメント、および
以下から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK（配列番号:125）、
IVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRASKGVSTSGYSYLHWYLQKPGQSPQLLIYLASYLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQHSRDLPLTFGQGTKLEIK（配列番号:126）、もしくは
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRASKGVSTSGYSYLHWYLQKPGQSPQLLIYLASYLESGVPDRFSGSGSGTAFTLKISRVEAEDVGLYYCQHSRDLPLTFGQGTKLEIK（配列番号:127）、またはその変種もしくは抗原結合フラグメント。
【００７１】
さらにまた例示的な実施態様では、PD-1 MAbは、以下を含むIｇG1重鎖：
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号:128）またはその変種もしくは抗原結合フラグメント、および
以下のいずれか1つを含む軽鎖を含む:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:129）、
EIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRASKGVSTSGYSYLHWYLQKPGQSPQLLIYLASYLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQHSRDLPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:130）、
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRASKGVSTSGYSYLHWYLQKPGQSPQLLIYLASYLESGVPDRFSGSGSGTAFTLKISRVEAEDVGLYYCQHSRDLPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:131）、またはその変種もしくは抗原結合フラグメン。
【００７２】
他の実施態様では、ICMアンタゴニストはPD-L1アンタゴニストである。PD-L1のまた別の名称または同義語には、PDCD1L1、PDL1、B7H1、B7-4、CD274、およびB7-Hが含まれる。
一般的に、PD-L1アンタゴニストは、下記に示すヒトPD-L1（UniProt accession no. Q9NZQ7）の自然のままのアミノ酸配列に特異的に結合する:
MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYVVEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIVYWEMEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYNKINQRILVVDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNERTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET（配列番号:14）。
適切には、PD-L1アンタゴニストは抗PD-L1抗原結合分子である。例示すれば、本発明での使用に適切な抗PD-L1抗原結合分子には、抗PD-L1 MAbデュルバルマブ（MEDI4736）、アテゾリズマブ（Tecentriq）、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480、MPDL3280Aが含まれる。これらおよびその他の抗PD-L1抗体は以下に記載される：国際公開WO2007/005874およびWO2010/077634、並びに米国特許8,217,149号および8,779,108号（前記の各々の全体は参照によって本明細書に含まれる）。さらにまた、抗PD-L1 MAbは、国際PCT特許公開WO2016/007,235（その全内容はまた参照によって本明細書に含まれる）に記載される。
抗PD-L1抗原結合分子は、PD-L1の細胞外ドメインの領域と適切に結合する。例示すれば、抗PD-L1抗原結合分子は、アミノ酸配列SKKQSDTHLEET（配列番号:13）（すなわち配列14に示す自然のままのPD-L1配列の残基279から290）を含むヒトPD-L1の細胞外ドメインの領域と特異的に結合することができる。ある種の実施態様では、抗PD-L1抗原結合分子は、完全にヒト化されたIｇG1 MAbデュルバルマブ（国際PCT公開WO2011/066389および米国特許公開2013/034559（参照によってその全体が本明細書に含まれる）で“MEDI4736”に関連して記載される）またはその抗原結合フラグメントを含む。このタイプの代表的な実施態様では、抗PD-L1抗原結合分子は表8に示すCDR配列を含む。
2020522529.tif 000016
【００７３】
より具体的な実施態様では、抗PD-L1抗原結合分子は、例えば下記に示すデュルバルマブの重鎖アミノ酸配列：
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号:138）、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る：
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS（配列番号:139）。
同じおよび他の実施態様のいくつかでは、抗PD-L1抗原結合分子は、以下の軽鎖アミノ酸配列：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:140）、
またはその抗原結合フラグメントを含むことができ、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIK（配列番号:141）。
また別には、抗PD-L1抗原結合分子は、PD-L1との結合についてMAbデュルバルマブと競合する。
【００７４】
他の実施態様では、抗PD-L1抗原結合分子は、完全にヒト化されたIｇG1 MAbアテゾリズマブ（米国特許8,217148号（参照によってその全体が本明細書に含まれる）に記載）またはその抗原結合フラグメントを含む。このタイプの代表的な実施態様では、抗PD-L1抗原結合分子は表9に示すCDR配列を含む。
2020522529.tif 000017
より具体的な実施態様では、抗PD-L1抗原結合分子は、例えば下記に示すアテゾリズマブの重鎖アミノ酸配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号:148）、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS（配列番号:149）。
同じおよび他の実施態様のいくつかでは、抗PD-L1抗原結合分子は、例えば以下に提供されるアテゾリズマブの軽鎖アミノ酸配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:150）、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK（配列番号:151）。
また別に、抗PD-L1抗原結合分子は、PD-L1との結合についてMAbアテゾリズマブと競合する。
【００７５】
他の実施態様では、抗PD-L1抗原結合分子は、完全にヒト化されたIｇG1 MAbアベルマブ（米国特許8,217148号（参照によってその全体が本明細書に含まれる）に記載）またはその抗原結合フラグメントを含む。このタイプの代表的な実施態様では、抗PD-L1抗原結合分子は表10に示すCDR配列を含む。
2020522529.tif 000018
具体的な実施態様では、抗PD-L1抗原結合分子は、例えば以下に提供されるアベルマブの重鎖アミノ酸配列：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号:158）、
またはその抗原結合フラグメントを含ことができ、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS（配列番号:159）。
同じおよび他の実施態様のいくつかでは、抗PD-L1抗原結合分子は、例えば以下に示されるアベルマブの軽鎖アミノ酸配列：
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS（配列番号:160）、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る：
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL（配列番号:161）。
また別には、抗PD-L1抗原結合分子は、PD-L1との結合についてMAbアベルマブと競合する。
【００７６】
いくつかの実施態様では、ICMアンタゴニストはCTLA4のアンタゴニストである。CTLA4のまた別の名称または同義語にはALPS5、CD、CD152、CELIAC3、CTLA-4、GRD4、GSE、IDDM12が含まれる。一般的には、CTLA4アンタゴニストは、例えば下記に示すヒトCTLA4（UniProt accession no. P16410）の成熟アミノ酸配列と特異的に結合する：
KAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDFLLWILAAVSSGLFFYSFLLTAVSLSKMLKKRSPLTTGVYVKMPPTEPECEKQFQPYFIPIN（配列番号:16）。
適切には、CTLA4アンタゴニストは抗CTLA4抗原結合分子である。例示すれば、本発明での使用に適切な抗CTLA4抗原結合分子には、抗CTLA4 MAbイピリムマブ（BMS-734016、MDX-010、MDX-101）およびトレメリムマブ（チシリムマブ、CP-675,206）が含まれる。
抗CTLA4抗原結合分子は、CTLA4の細胞外ドメインの領域と適切に結合する。例示すれば、抗CTLA4抗原結合分子は、以下のアミノ酸配列のいずれか1つ以上を含む、ヒトCTLA4の細胞外ドメインの領域と特異的に結合することができる：YASPGKATEVRVTVLRQA（配列番号:15）（すなわち、配列番号:16に示す自然のままのCTLA4配列の残基26から42）、DSQVTEVCAATYMMGNELTFLDD（配列番号:17）（すなわち、配列番号:16に示す自然のままのCTLA4配列の残基43から65）、およびVELMYPPPYYLGIG（配列番号:18）（すなわち、配列番号:16に示す自然のままのCTLA4配列の残基96から109）。また別に或いは加えるに、抗CTLA4抗原結合分子は、CTLA4の成熟形の以下の残基のいずれか1つ以上および好ましくは全てを含むヒトCTLA4の細胞外ドメインの領域と特異的に結合することができる：K1、A2、M3、E33、R35、Q41、S44、Q45、V46、E48、L91、I93、K95、E97、M99、P102、P103、Y104、Y105、L106、I108、N110。
ある種の実施態様では、抗CTLA4抗原結合分子は、ヒトIｇG1 MAbイピリムマブ（例えば国際公開WO2014/209804および米国特許公開No 2015/0283234（参照によってその全体が本明細書に含まれる）に記載）またはその抗原結合フラグメントを含む。このタイプの代表的な実施態様では、抗CTLA4抗原結合分子は表11に示すCDR配列を含む。
2020522529.tif 000019
【００７７】
より具体的な実施態様では、抗CTLA4抗原結合分子は、例えば下記に示すイピリムマブの重鎖アミノ酸配列：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号:168）、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS（配列番号:169）。
同じおよび他の実施態様のいくつかでは、抗CTLA4抗原結合分子は、例えば以下に示す軽鎖アミノ酸配列：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:170）、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK（配列番号:171）。
【００７８】
抗CTLA4抗原結合分子は、ヒトIｇG2 MAbトレメリムマブ（例えば米国特許公開No 2009/0074787（参照によってその全内容が本明細書に含まれる）に記載）またはその抗原結合フラグメントを含む。このタイプの代表的な実施態様では、抗CTLA4抗原結合分子は表12に示すCDR配列を含む。
2020522529.tif 000020
より具体的な実施態様では、抗CTLA4抗原結合分子は、例えば下記に示すトレメリムマブの重鎖アミノ酸配列：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYIQMNSLRAEDTAVYYCARDPRGATLYYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号:178）、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記の非限定的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、それから成るか、または本質的にそれから成る：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS（配列番号:179）。
同じおよび他の実施態様のいくつかでは、抗CTLA4抗原結合分子は、例えば以下に示すトレメリムマブの軽鎖アミノ酸配列：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLDWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPFTFGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:180）、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記の代表的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、前記配列から成るか、または本質的に前記配列から成る：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINSYLDWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSTPFTFGPGTKVEIK（配列番号:181）。
【００７９】
他の実施態様では、ICMアンタゴニストはB7-H3アンタゴニストである。一般的に、本発明のB7-H3アンタゴニストは、例えば下記に示すヒトB7-H3（UniProt accession no. Q5ZPR3）の自然のままのアミノ酸配列と特異的に結合する：
MLRRRGSPGMGVHVGAALGALWFCLTGALEVQVPEDPVVALVGTDATLCCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFAEGQDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYQGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSILRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHSSVTITPQRSPTGAVEVQVPEDPVVALVGTDATLRCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSFTEGRDQGSAYANRTALFPDLLAQGNASLRLQRVRVADEGSFTCFVSIRDFGSAAVSLQVAAPYSKPSMTLEPNKDLRPGDTVTITCSSYRGYPEAEVFWQDGQGVPLTGNVTTSQMANEQGLFDVHSVLRVVLGANGTYSCLVRNPVLQQDAHGSVTITGQPMTFPPEALWVTVGLSVCLIALLVALAFVCWRKIKQSCEEENAGAEDQDGEGEGSKTALQPLKHSDSKEDDGQEIA（配列番号:182）
適切には、B7-H3アンタゴニストは抗B7-H3抗原結合分子である。例示すれば、本発明での使用に適切な抗B7-H3抗原結合分子は、MAbエノブリツズマブまたはその抗原結合フラグメントである。いくつかの実施態様では、抗B7-H3抗原結合分子は表13に示すCDR配列を含む。
2020522529.tif 000021
より具体的な実施態様では、抗B7-H3抗原結合分子は、例えば下記に示すエノブリツズマブの重鎖アミノ酸配列：
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSDSSAIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCGRGRENIYYGSRLDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELVGGPSVFLLPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTLRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPLVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号:189）、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記の非限定的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、前記配列から成るか、または本質的に前記配列から成る：
VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSDSSAIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCGRGRENIYYGSRLDYWGQGTTVTVSS（配列番号:190）。
同じおよび他の実施態様のいくつかでは、抗B7-H3抗原結合分子は、例えば以下に提供するエノブリツズマブの軽鎖アミノ酸配列：
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:191）、
またはその抗原結合フラグメントを含み、前記の代表的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、前記配列から成るか、または本質的に前記配列から成る：
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAPKALIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPFTFGQGTKLEIK（配列番号:192）。
いくつかのまた別の実施態様では、抗B7-H3抗原結合分子は、B7-H3との結合についてMAbエノブリツズマブと競合する。
【００８０】
他の実施態様では、ICMアンタゴニストはIDOアンタゴニストである。ヒトIDOの成熟アミノ酸配列（UniProt accession no. P14902）は例えば以下に示される：
MAHAMENSWTISKEYHIDEEVGFALPNPQENLPDFYNDWMFIAKHLPDLIESGQLRERVEKLNMLSIDHLTDHKSQRLARLVLGCITMAYVWGKGHGDVRKVLPRNIAVPYCQLSKKLELPPILVYADCVLANWKKKDPNKPLTYENMDVLFSFRDGDCSKGFFLVSLLVEIAAASAIKVIPTVFKAMQMQERDTLLKALLEIASCLEKALQVFHQIHDHVNPKAFFSVLRIYLSGWKGNPQLSDGLVYEGFWEDPKEFAGGSAGQSSVFQCFDVLLGIQQTAGGGHAAQFLQDMRRYMPPAHRNFLCSLESNPSVREFVLSKGDAGLREAYDACVKALVSLRSYHLQIVTKYILIPASQQPKENKTSEDPSKLEAKGTGGTDLMNFLKTVRSTTEKSLLKEG（配列番号:193）。
いずれのIDOアンタゴニストも本発明の治療薬での使用に適切である。これまでのところ、以下の3つの小分子IDO阻害剤が臨床使用のために開発されている：GDC-0919（1-シクロヘキシル-2-（5H-イミダゾ[5,1-a]イソインドール-5-イル）エタノール）、インドキシモド（1-メチル-D-トリプトファン）、およびエパカドスタット（1,2,5-オキサジアゾール-3-カルボキシミダミド, 4-（（2-（（アミノスルホニル）アミノ）エチル）アミノ）-N-（3-ブロモ-4-フルオロフェニル）-N'-ヒドロキシ-, （C（Z））-）。これら分子の各々の分子構造は下記に提供される：
【００８１】
【化１】
2020522529.tif 000022
【００８２】
いくつかの実施態様では、ICMアンタゴニストはKIRアンタゴニストである。このタイプの好ましい実施態様では、KIRアンタゴニストは、KIR2-DL-1、-2、および-3、並びにそれらのリガンド間の相互作用を封鎖する。ヒトKIR（すなわちKIR2-DL1（（UniProt accession no. P43626）の成熟アミノ酸配列は例えば下記に提供される：
HEGVHRKPSLLAHPGPLVKSEETVILQCWSDVMFEHFLLHREGMFNDTLRLIGEHHDGVSKANFSISRMTQDLAGTYRCYGSVTHSPYQVSAPSDPLDIVIIGLYEKPSLSAQPGPTVLAGENVTLSCSSRSSYDMYHLSREGEAHERRLPAGPKVNGTFQADFPLGPATHGGTYRCFGSFHDSPYEWSKSSDPLLVSVTGNPSNSWPSPTEPSSKTGNPRHLHILIGTSVVIILFILLFFLLHRWCSNKKNAAVMDQESAGNRTANSEDSDEQDPQEVTYTQLNHCVFTQRKITRPSQRPKTPPTDIIVYTELPNAESRSKVVSCP（配列番号:194）。
本発明での使用に適切な抗KIR抗原結合分子は、当業界で周知の方法を用いて生成することができる。また別に、当業界で承認されているKIR抗原結合分子を用いてもよい。例えば、抗KIR抗原結合分子は、例えばWO2014/066532（その全内容は参照によってその全体が本明細書に含まれる）に記載される、完全にヒト化されたMAbリリルマブまたはその抗原結合フラグメントを含む。適切には、抗KIR抗原結合分子は表14に示すCDR領域を含む。
2020522529.tif 000023
【００８３】
このタイプの代表的な実施態様では、抗KIR抗原結合分子は、例えば下記に示す、リリルマブの重鎖可変ドメインアミノ酸配列：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSFYAISWVRQAPGQGLEWMGGFIPIFGAANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSDDTAVYYCARIPSGSYYYDYDMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号:201）、
またはその抗原結合フラグメントを含むことができ、前記の代表的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、前記配列から成るか、または本質的に前記配列から成る：
MELSSLRSDDTAVYYCARIPSGSYYYDYDMDVWGQGTTVTVSS（配列番号:202）。
同じおよび他の実施態様のいくつかでは、抗KIR抗原結合分子は、例えば以下に示す、リリルマブの軽鎖可変ドメインアミノ酸配列：
EIVLTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWMYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:203）、
またはその抗原結合フラグメントを含むことができ、前記の代表的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、前記配列から成るか、または本質的に前記配列から成る：
EIVLTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWMYTFGQGTKLEIKRT（配列番号:204）。
【００８４】
また別の実施態様では、ICMアンタゴニストはLAG-3アンタゴニストである。LAG-3は503アミノ酸のI型トランスメンブレンタンパク質であり、4つの細胞外Iｇ様ドメインを有する。LAG-3は、活性化T細胞、NK細胞、B細胞および形質細胞様DC上で発現される。ヒトLAG-3（UniProt accession no. P18627）の代表的な成熟アミノ酸配列は下記に示される：
LQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPGAQRSGRAPGALPAGHLLLFLILGVLSLLLLVTGAFGFHLWRRQWRPRRFSALEQGIHPPQAQSKIEELEQEPEPEPEPEPEPEPEPEPEQL（配列番号:205）。
いくつかの実施態様では、LAG-3アンタゴニストは抗LAG-3抗原結合分子である。例示すれば、適切な抗LAG-3抗原結合分子は抗LAG-3ヒト化MAb BMS-986016である。他の抗LAG-3抗体は、米国特許公開No. 2011/0150892並びに国際PCT公開No. WO2010/019570およびWO2014/008218（前記の各々は参照によってその全体が本明細書に含まれる）に記載される。
いくつかの実施態様では、抗LAG-3抗原結合分子は表15に示すCDR配列を含む。
2020522529.tif 000024
【００８５】
抗LAG-3抗原結合分子は適切には、MAb BMS-986016またはその抗原結合フラグメントを含む。より具体的には、いくつかの実施態様では、抗LAG-3抗原結合分子は、例えば以下に示すBMS-986016の重鎖アミノ酸配列、
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSDYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHRGSTNSNPSLKSRVTLSLDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAFGYSDYEYNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号:212）、
またはその抗原結合フラグメントを有し、前記の代表的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、前記配列から成るか、または本質的に前記配列から成る：
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSDYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHRGSTNSNPSLKSRVTLSLDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAFGYSDYEYNWFDPWGQGTLVTVSS（配列番号:213）。
同様に、抗LAG-3抗原結合分子は、配列番号:45に示され、さらに下記に提供されるBMS-986016の軽鎖アミノ酸配列：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTNLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:214）、
またはその抗原結合フラグメントを含むことができ、前記の代表的な例は、以下のアミノ酸配列を含むか、前記配列から成るか、または本質的に前記配列から成る：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTNLEIK（配列番号:215）。
【００８６】
4．マルチ特異性抗原結合分子
本発明は、異なる特異性を有する抗原結合分子から形成されるマルチ特異性抗原結合分子を提供し、前記は、RANKLまたはRANKおよび少なくとも1つのICMと結合する。ある種の実施態様では、第一の抗原結合特異性を有する抗原結合分子は、1つ以上の他の分子実体、例えば第二の抗原結合特異性を有する別の抗原結合分子に機能的に連結されて（例えば化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合または他の態様によって）、二重特異性抗原結合分子を生成することができる。本発明の関係で使用できる具体的な例示的マルチ特異性様式には以下が含まれる（ただしそれらに限定されない）：単鎖ジアボディ（scDb）、タンデムscDb（Tandab）、直鎖状ダイマーscDb（LD-scDb）、環状ダイマーscDb（CD-scDb）、二重特異性Tsaibouエンゲージャー（BiTE；タンデムdi-scFv）、ジスルフィド安定化Fvフラグメン（Brinkmann et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1993; 90: 7538-7542）、タンデムtri-scFv、トリボディ、二重特異性Fab2、二ミニ抗体、テトラボディ、scFv-Fc-scFv融合物、二ジアボディ、DVD-Iｇ、IｇG-scFab、scFab-dsscFv、Fv2-Fc、IｇG-scFv融合物、例えばbsAb（軽鎖C-末端に連結されたscFv）、Bs1Ab（軽鎖N-末端に連結されたscFv）、Bs2Ab（重鎖N-末端に連結されたscFv）、Bs3Ab（重鎖C-末端に連結されたscFv）、Ts1Ab（重鎖および軽鎖の両方のN-末端に連結されたscFv）、Ts2Ab（重鎖のC-末端に連結されたdsscFv）、およびノブイントゥホール（KiHs）（KiH技術によって調製された二重特異性IｇG）、SEED技術（SEED-IｇG）およびデュオボディ（デュオボディ技術によって調製された二重特異性IｇG）、一VH一VLドメイン（KiHまたはデュオボディの2つの異なる重鎖の1つのC-末端に各々が融合して1つの機能的ドメインが形成される）。本明細書での使用に特に適切なものは、単鎖ジアボディ（scDb）、特に二重特異性モノマーscDbである。多様なマルチ特異性構築物を考察および提示する概論のためには、例えば以下を参照されたい：Chan Carter, Nature Reviews Immunoloｇy 10 （2010） 301-316；Klein et al., MAbs 4（2012） 1-11；Schubert et al., Antibodies 1 （2012） 2-18；Byrne et al., Trends in Biotechnoloｇy 31 （2013） 621；Metz et al., Protein Enｇineerinｇ Desiｇn & Selection 25（2012） 571-580；および前記に引用された参考文献。
【００８７】
具体的な実施態様では、本発明は、RANKまたはRANKLと特異的に結合する第一の抗原結合分子（例えば抗体または抗体フラグメント）、およびICMと特異的に結合する第二の抗原結合分子（例えば抗体または抗体フラグメント）を含む二重特異性抗原結合分子を提供する。具体的な実施態様では、ICMはCTLA-4以外である。二重特異性抗原結合分子は、適切には、上記および本明細書の他の場所で詳細に記載される抗原結合分子のいずれかを含む。
例示すれば、第一の抗原結合分子はヒトRANKLの領域に特異的に結合することができ、第二の抗原結合分子は、ヒトPD-1の領域に、好ましくはヒトPD-1の細胞外ドメインの領域に特異的に結合することができる。
これらの実施態様の非限定的な例は、表1−3のいずれか1つに示されるCDR配列を含む第一の抗原結合分子を含む。このタイプの具体的な例では、第一の抗原結合分子は、MAbデノスマブの少なくとも1つの抗原結合フラグメントを含むことができる。
適切には、PD-1と特異的に結合する第二の抗原結合分子は、表4−6のいずれか1つに示されるCDR配列を含む。このタイプの具体的な例では、第二の抗原結合分子は、ニボルマブ、ペムブロリズマブおよびピジリズマブから選択されるMAbのいずれか1つの少なくとも1つの抗原結合フラグメントを含むことができる。
【００８８】
他の実施態様では、第二の抗原結合分子は、ヒトPD-L1の領域に、好ましくはヒトPD-L1の細胞外ドメインの領域に特異的に結合する。したがって、いくつかの実施態様では、第二の抗原結合分子はPD-L1の領域と特異的に結合し、表5−9のいずれか1つに示されるCDR配列を含む。このタイプの具体的な例では、第二の抗原結合分子は、デュルバルマブ、アテゾリズマブおよびアベルマブから選択されるMAbのいずれか1つの少なくとも1つの抗原結合フラグメントを含むことができる。
さらに他の実施態様では、第二の抗原結合分子はヒトCTLA4の領域と特異的に結合する。したがって、いくつかの実施態様では、第二の抗原結合分子はヒトCTLA4と特異的に結合し、表10−11のいずれか1つに示されるCDR配列を含む。このタイプの具体的な例では、第二の抗原結合分子は、イピリムマブおよびトレメリムマブから選択されるMAbのいずれか1つの少なくとも1つの抗原結合フラグメントを含む。
本発明はまた、RANKLまたはRANKに対して特異性を有するRANKアンタゴニスト抗原結合分子、および2つ以上のICMに対して特異性を有する複数のICMアンタゴニスト抗原結合分子を含むマルチ特異性構築物を提供する。非限定的な例では、複数のICMアンタゴニスト抗原結合分子は、以下から選択されるICM組合せに対して特異性を有する：（1）PD-1およびPD-L1、（2）PD-1およびCTLA4、（3）PD-L1およびCTLA4、並びに（4）PD-1、PD-L1およびCTLA4。マルチ特異性構築物は、特定のICM組合せに対して特異性を有する任意の適切な抗体または抗原結合フラグメント（本明細書に開示する抗体または抗原結合フラグメントを含む）を含むことができる。
本発明のマルチ特異性抗原結合分子は、当業界で周知の多数の方法によって生成できる。適切な方法には以下が含まれる：生物学的方法（例えば体細胞ハイブリダイゼーション）、遺伝学的方法（例えば所望の抗体構造をコードする自然のままではないDNA配列の生物での発現）、化学的方法（例えば2つの構造の化学的結合）、または前記の組合せ（以下を参照されたい：Kontermann R E （ed.）, Bispecific Antibodies, Sprinｇer Heidelberｇ Dordrecht London New York, 1-28, 2011）。
【００８９】
4.1二重特異性抗原結合分子を作製する化学的方法
化学的に結合させた二重特異性抗原結合分子は、2つの現存抗体または抗体フラグメント（例えば上記および本明細の他の場所に記載されたもの）の化学的カップリングから生じる。典型的なカップリングは、2つの異なる完全長抗体の架橋、2つの異なるFab’フラグメントの架橋による二重特異性F（ab’）2の生成、およびF（ab’）2フラグメントと異なるFab’フラグメントとの架橋による二重特異性F（ab’）3の生成を含む。化学的結合のためには、酸化的再結合手法を用いることができる。従来の方法は、ホモまたはヘテロ官能性架橋試薬の使用を含む（上掲書）。
ヘテロ二官能性架橋試薬は、2つの別個の反応基（例えば抗体分子上の）に対する反応性を有する。ヘテロ二官能性架橋試薬の例には以下が含まれる：SPDP（N-スクシンイミジル-3-（2-ピリジルジチオ）プロピオネート）、SATA（スクシンイミジルアセチルチオアセテート）、SMCC（スクシンイミジルtrans-4-（マレイミジルエチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレート）、EDAC（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、PEAS（N-（（2-ピリジルジチオ）エチル）-4-アジドサリチルアミド）、ATFB-SE（4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロ安息香酸、スクシンイミジルエステル）、ベンゾフェノン-4-マレイミド、ベンゾフェノン-4-イソチオシアネート、4-ベンゾイル安息香酸、スクシンイミジルエステル、アジ化ヨードアセトアミド、ヨードアセトアミドアルキン、Click-iTマレイミドDIBOアルキン、アジド（PEO）4プロピオン酸、スクシニミジルエステル、アルキン、スクシンイミジルエステル、Click_iTスクシンイミジルエステルDIBOアルキン、スルホ-SBED（スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミジル-2-（6-[ビオチンアミド]-2-（p-アジドバンズアミド）-ヘキサノアミド）エチル-1,3’-ジチオプロピオネート）、光反応性アミノ酸（例えばL-photo-ロイシンおよびL-photo-メチオニン）、NHS-ハロアセチル架橋剤（例えばスルホ-SIAB）、SIAB、SBAP、SIA、NHS-マレイミド架橋剤（例えばスルホ-SMCC）、SM（PEG）nシリーズ架橋剤、SMCC、LC-SMCC、スルホ-EMCS、EMCS、スルホ-GMBS、GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、MBS、スルホ-SMPB、SMPB、AMAS、BMPS、SMPH、PEG12-SPDP、PEG4-SPDP、スルホ-LC-SPDP、LC-SPDP、SMPT、DCC（N,N’-ジシクロヘキシルカルボジイミド）、EDC（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、NHS（N-ヒドロキシスクシンイミド）、スルホ-NHS（N-ヒドロキシスルホスクシンイミド）、BMPH、EMCH、KMUH、MPBH、PDPHおよびPMPI。
ホモ二官能性架橋試薬は、分子（例えば抗体）上の同じ反応基に対して反応性を有する。ホモ二官能性架橋試薬の例には以下が含まれる：DTNB（5,5’-ジチオビス（2-ニトロ安息香酸）、o-PDM（o-フェニレンジマレイミド）、DMA（ジメチルアジピミデート）、DMP（ジメチルピメリミデート）、DMS（ジメチルスベリミデート）、DTBP（ジチオビスプロピオンイミデート）、BS（PEG）5、BS（PEG）9、BS3、BSOCOES、DSG、DSP、DSS、DST、DTSSP、EGS、スルホ-EGS、TSAT、DFDNB、BM（PEG）n架橋リンカー、BMB、BMDB、BMH、BMOE、DTMEおよびTMEA。
【００９０】
4.2二重特異性抗原結合分子を作製する生物学的方法
体細胞ハイブリダイゼーションは、2つの別個のハイブリドーマ細胞株の融合（特異的抗体生成B細胞とミエローマ細胞の融合）であり、前記は、異なる抗体重鎖（すなわちVHAおよびVHB）および軽鎖（すなわちVLAおよびVLB）を生成することができるクアドローマを生じる（Kontermann（上掲書））。これらの重鎖および軽鎖は細胞内でランダムに組み合わされ、二重特異性抗原結合分子（例えばVLA鎖と組み合わされたVHA鎖およびVLB鎖と組み合わされたVHB鎖）とともに、いくつかの非機能性（例えば2つのVLB鎖と組み合わされた2つのVHA鎖）および一特異性（例えば2つのVHA鎖と組み合わされた2つのVHA鎖）抗原結合分子を生じる。続いて二重特異性抗原結合分子を、確立された方法（例えば2つの異なる親和性クロマトグラフィーカラム）を用いて精製することができる。
一特異性抗原結合分子と同様に、二重特異性抗原結合分子はまた、抗原結合の下流でFc媒介作用を引き出すFc領域を含むことができる。これらの作用は、例えばペプシン消化により二重特異性抗体からFc領域をタンパク分解切断することによって低下させて、二重特異性F（ab’）2分子を生成することができる（上掲書）。
4.3マルチ特異性抗原結合分子を作製する遺伝学的方法
マルチ特異性抗原結合分子はまた、当業界で確立された遺伝学的手段、例えば所望の抗体構造に対応するDNA配列を含むプラスミドのin vitro発現によって生成することができる（例えば上掲書（Kontermann）を参照されたい）。
【００９１】
4.4ジアボディ
いくつかの実施態様では、マルチ特異性抗原結合分子はジアボディである。ジアボディは、例えばRANKLおよびICMと結合する抗体に由来する2つの別々のポリペプチド鎖で構成され、各鎖は2つの可変ドメイン（VHA-VLBおよびVHB-VLAまたはVLA-VHBおよびVLB-VHA）を有する。典型的には、可変ドメインを接合させるポリペプチドリンカーは短い（すなわち約2、3、4、5、6、7、8、8または10アミノ酸）。短いポリペプチドリンカーは、同じ鎖上のVHおよびVLドメインの結合を防ぎ、したがって異なる鎖上のVHおよびVLドメインの結合を促進する。形成されるヘテロダイマーは両標的抗原に対して機能性である（例えばVHB-VLAを有するVHA-VLBまたはVLB-VHAを有するVLA-VHB）。しかしながら、ホモダイマーもまた形成され（例えばVHA-VLBを有するVHA-VLB、VHB-VLAを有するVHB-VLAなど）、非機能性分子をもたらす。ホモダイマー化を防ぐいくつかの手法が当業界で公知であり、以下が含まれる：ジスルフィド結合を導入して2つのポリペプチド鎖を共有結合により接合する方法、一方の鎖に大きなアミノ酸を他方の鎖に小さなアミノ酸を含むようにポリペプチド鎖を改変する方法（上記および本明細書の他の場所で考察されるノブイントゥホール構造物）、およびC-末端伸長部にシステイン残基を付加する方法。別の手法は、2つのポリペプチド鎖をポリペプチドリンカー配列によって接合して、taFvよりもコンパクトな構造を示す単鎖ジアボディ分子（scDb）を生成する。scDbまたはジアボディをまたIｇG1 CH3ドメインまたはFc領域に融合させて、二ジアボディを生成することができる。二ジアボディの例にはscDb-Fc、Db-Fc、scDb-CH3、およびDb-CH3が含まれるが、ただし前記に限定されない。加えて、scDbを用いて四価の二重特異性分子を作製することができる。scDbのポリペプチドリンカー配列を約15アミノ酸から約5アミノ酸に短くすることによって、ダイマー性単鎖ジアボディ分子を生じる。前記はTandAbとして知られる（Muller and Kontermann, Bispecific Antibodies Kontermann R E （ed.）, Sprinｇer Heidelberｇ Dordrecht London New York, 83-100, 2011）。
【００９２】
4.5抗原結合分子を生成する他の結合技術
本発明のマルチ特異性抗原結合分子を生成する別の適切な手法は、ヘテロダイマー形成ペプチドを抗体分子（例えばscFvまたはFab）のC-末端に接合あるいは連結する工程を含む。
この手法の非限定的な例は、jun-fosロイシンジッパーに連結した抗体フラグメントの使用である（例えば、scFv-Jun/FosおよびFab’-Jun/Fos）。
二重特異性抗原結合分子を生成する追加の方法は、ビオチンを有する異なる抗原結合フラグメントを用いて2つの抗体を誘導し、続いて2つの抗体をストレプトアビジンを介して連結し、得られた二重特異性抗体をその後で精製および単離する。
本発明の二重特異性抗原結合分子の追加のタイプには、各抗原について2つ以上の抗原結合部位を含むものが含まれる。例えば、追加のVHおよびVLドメインを現存する抗体のVHおよびVLドメインのN-末端に融合させて、抗原結合部位をタンデムに効果的に並べることができる。これらのタイプの抗体は二重可変ドメイン抗体（DVD-Iｇ）として公知である（以下を参照されたい：Tarcsa, E. et al., in Bispecific Antibodies. Kontermann（上掲書、ページ171-185））。1つの抗原に対して2つ以上の抗原結合部位を含む抗体を生成する別の方法は、scFvフラグメントを重鎖のN-末端または軽鎖のC-末端に融合させることである（下記で詳細に考察される）。
抗体またはマルチ特異性抗原結合分子複合体もしくは構築物の抗原結合フラグメントは、IｇM、IｇG、IｇD、IｇA、IｇE（前記はそれらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって互いに区別される）またはそのフラグメントから成る群からそれぞれ独立に選択される。これらIｇクラスのいくつかはさらにまた、サブクラス（例えばIｇG1、IｇG2、IｇG3およびIｇG4、IｇA1およびIｇA2）に分割される。抗体の種々のクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。5つの抗体クラスの全てに見出すことができる軽鎖定常領域（CL）は、κ（カッパ）およびλ（ラムダ）から選択される。抗原認識および結合能力を保持する抗体フラグメントは、Fab、Fab’、F（ab’）2およびFvフラグメントである。さらにまた、第一および第二の抗原結合フラグメントは直接的またはリンカー（例えばペプチドリンカー）によって接続される。
【００９３】
IｇG足場を用いる二重特異性抗原結合分子の生成
定常免疫グロブリンドメインを適切に用いて、2つのポリペプチド鎖のヘテロダイマー化（例えばIｇG様抗体）を促進することができる。二重特異性抗体作製のためのこの手法には、2つのポリペプチドへのノブイントゥホール構造の導入およびCLおよびCH1ドメインの天然に存在するヘテロダイマー形成の利用が含まれる（以下を参照されたい：Kontermann, supra, pp. 1 -28, 2011；Ridｇway et al., Protein Enｇ. 1996 Jul;9（7）:617-21；Atwell et al., J Mol Biol.1997 Jul 4;270（1）:26-35）。
本発明の組換え抗原結合分子の大半は操作されて、IｇG様（それらはまたFcドメインを含むことを意味する）であることができる。操作されたポリペプチド鎖のヘテロダイマー化を必要とするジアボディと同様に、IｇG様抗原結合分子もまた、異なる特異性を有する2つの抗体の類似の重鎖または重鎖および軽鎖の相互作用を防ぐためにヘテロダイマー化を必要とする（Jin, P. and Zhu, Z. In: Bispecific Antibodies. Kontermann RE （ed.）, Sprinｇer Heidelberｇ Dordrecht London New York, pp. 151-169, 2011）。
【００９４】
ノブイントゥホール（knobs-into-holes）構造は、所望のヘテロダイマーの1つの鎖に大きなアミノ酸（ノブ）（knob）を導入し、所望のヘテロダイマーの他の鎖に小さなアミノ酸（ホール）（hole）を導入することによってポリペプチド鎖のヘテロダイマー化を促進する。立体相互作用は、ノブとノブとの相互作用またはホールとホールとの相互作用よりもノブとホールとの相互作用に有利に働くであろう。二重特異性IｇG様抗体に関しては、ノブイントゥホール（KiH）構造をFc領域のCH3ドメインに導入することによって、類似の重鎖のホモダイマー化を防ぐことができる。同様に、同じ抗原に対して特異的な重鎖および軽鎖の相互作用の促進は、VH-VL境界面でKiH構造を操作することによって達成することができる。具体的には、KiH方法論では、大きなアミノ酸が重鎖の1つのCH3ドメインに導入される（その側鎖は他の重鎖のCH3ドメインの適切に設計された窪みに適合する）（例えば以下を参照されたい：Ridｇeway et al., Protein Enｇ. 9（1996）, 617-621；およびAtwell et al., J. Mol. Biol. 270（1997）, 677-681（前記文献は参照によって本明細書に含まれる））。したがって、重鎖のヘテロダイマーはどちらかのホモダイマーよりも安定である傾向を有し、発現されるポリペプチドでより大きな割合を占める。加えて、所望の軽鎖/重鎖対の会合は、二重特異性抗体の1つのFab（Fab領域）の改変（軽鎖と重鎖の間で定常領域または定常および可変領域を“交換”する）によって誘導することができる。したがって、改変Fabドメインではそれぞれ、重鎖は例えばCL-VHまたはCL-VLドメインを含み、軽鎖はCHI-VLまたはCHI-VHドメインを含むことになろう。これは、改変鎖の重鎖/軽鎖Fab部分（すなわち改変軽鎖または重鎖）と標準/非改変アームの重鎖/軽鎖Fab部分との相互作用を防ぐ。解説すれば、改変アームのFabドメインの重鎖（CLドメインを含む）は、好ましくは、非改変アーム/Fabドメインの軽鎖（前記もまたCLドメインを含む）と相互作用しない（重鎖/軽鎖の“不適切な”または望ましくない対形成を防ぐ）。“不適切な”軽鎖/重鎖の結合を防ぐこの技術は、“CrossMAb”技術と称され、KiH技術と併用されるときには、所望の二重特異性分子の目覚ましく増強された発現をもたらす（例えば以下を参照されたい：Schaefer et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011; 108（27）:11187-92；および米国特許公開No 2010/0159587（前記は参照によってその全体が本明細書に含まれる））。KiH構造の他の例も存在し、上記に考察した例を制限と解釈してはならない。Fc領域のヘテロダイマー化を促進する他の方法には、Fcドメインへの荷電極性の操作（Gunasekaran et al., 2010）およびSEED技術（SEED-IｇG）（Davis et al., Protein Enｇ Des Sel. 2010 Apr;23（4）:195-202, 2010）が含まれる。
【００９５】
具体的な実施態様では、マルチ特異性抗原結合分子はCrossMAbであり、前記は、抗体ドメイン交換がKiH方法論に基づき、それぞれ別個の親抗体から誘導される。軽鎖の誤対形成は、ドメインクロスオーバーおよびKiH方法によりヘテロダイマー化された重鎖を用いて克服される。ドメインクロスオーバーでは、可変ドメインまたは定常ドメインのどちらかが軽鎖および重鎖間で交換されて2つの非対称性Fabアームを形成して軽鎖の誤対形成を回避し、一方、“クロスオーバー”は抗原結合親和性を維持する。天然の抗体と比較して、CrossMAbはより高い安定性を示す。いくつかの異なるCrossMAb様式が存在する：例えば異なる領域で交換されるFab、VH-VLおよびCH1-CL。好ましい実施態様では、マルチ特異性抗原結合分子はCrossMAbCH1-CL様式に基づき、前記は二重特異性抗体のCH1およびCL領域を交換する。
追加のヘテロダイマー化IｇG様抗原結合分子には、ヘテロFc-scFvs、Fab-scFvs、IｇG-scFv、およびscFv-IｇGが含まれる（ただし前記に限定されない）。ヘテロFc-scFvsは2つの別個のscFvをヘテロダイマー化が可能なFcドメインに連結し、一方、Fab-scFvsは1つのエピトープに特異的なFabドメインを含み、前記Fabドメインは異なるエピトープに特異的なscFvに連結されている。IｇG-scFvおよびscFv-IｇGはIｇG様抗体であり、前記はそれらのC-末端およびN-末端にそれぞれ連結されたscFvを有する（上掲書（Kontermann R E （ed.））の151−169ページ参照されたい）。
【００９６】
代表的なCrossMAbの実施態様は本明細書のセクション5.4に記載される。前記では、操作された突起が、第一のIｇG様ポリペプチドの境界面に、そのCH3ドメイン内の当該ポリペプチドの少なくとも1つの接触残基を置き換えることによって作出される。具体的には、第一のポリペプチド上で置き換えられるべき接触残基は366位のIｇG残基（残基の番号付与はFc結晶構造による（Deisenhofer, Biochem. 20:2361, 1981））に対応し、ここで操作される突起は、最初の残基をコードする核酸を最初の残基よりも大きな側鎖体積を有する持込み残基をコードする核酸で置き換える工程を含む。具体的には、366位のスレオニン（T）残基がトリプトファン（W）に変異させられる。第二の工程では、操作された窪みが、第二のポリペプチドの境界面に、そのCH3ドメイン内の当該ポリペプチドの少なくとも1つの接触残基を置き換えることによって作出され、ここで操作される窪みは、最初の残基をコードする核酸を最初の残基よりも小さな側鎖体積を有する持込み残基をコードする核酸で置き換える工程を含む。具体的には、第二のポリペプチド上で置き換えられるべき接触残基は407位のIｇG残基に対応する。具体的には、407位のチロシン（Y）残基がアラニン（A）に変異させられる。この操作手順は、IｇG1、IｇG2a、IｇG2b、IｇG3およびIｇG4から成る群から選択される、種々のIｇGサブタイプで実施することができる。
CrossMAbの別の例示的な例では、マルチ特異性抗原結合分子は、例えばWO2008119353およびWO 2011131746（その各々は参照によってその全体が本明細書に含まれる）に記載されたデュオボディプラットフォーム/cFAE（GenMAb）を土台にすることができ、前記では、二重特異性抗体は、2つの異なる宿主で別々の成分抗体の発現によって作出され、続いて精製および組立てられて、2つの一特異的抗体間での制御されたFabアームの交換により二特異的ヘテロダイマー抗体が得られる。2つの一特異性出発タンパク質のCH3領域に非対称性で適合する変異（例えばF405LおよびK409R（EU番号付与インデックスによる））を導入することによって、Fabアーム交換と同様な力が働いて、方向が定められた、したがって収量が安定したヘテロダイマー対が減数的条件下でもたらされ得る（例えば以下に記載される：Labrijn et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2013;110（13）:5145-5150；Gramer et al. MAbs 2013;5（6）: 962-973；Labrijn et al. Nature Protocols 2014;9（10）:2450-63（前記文献は参照によってその全体が本明細書に含まれる））。実際、二重特異性ヒトIｇG1 Abを2つの精製親抗体から作製することができる（親抗体の各々は対応するただ1つの相補的な変異（K409RまたはF405L）を有する）。この同じ手法をヒトIｇG1、IｇG2、IｇG3またはIｇG4骨格で実施することができる（上掲書（Labrijn 2013））。
【００９７】
4.7  静電気的ステアリング
他の実施態様では、マルチ特異性抗原結合分子は静電気的ステアリングに基づく（Amｇen、前記では、CH3における荷電相補性が選択した変異により変更され、静電気的ステアリング効果を介して抗体Fcヘテロダイマー形成増強がもたらされる（Gunasekaran et al., J Biol Chem 2010;285（25）:19637-46；WO 2009089004 A1（前記は参照によって本明細書に含まれる））。この同じ手法をヒトIｇG1、IｇG2、IｇG3またはIｇG4骨格で実施することができる（WO 2009089004 A1）。リンカー。
リンカーを用いて異なる抗原結合分子を共有結合させ、少なくとも2つの抗原結合分子を含むキメラ分子を形成することができる。抗原結合分子間の連結は空間的関係を提供して、個々の結合分子とそれらの対応する同族エピトープとの結合を可能にすることができる。これに関して、個々のリンカーは、2つの別個の機能的な抗原結合分子の結合のために機能する。リンカーのタイプには、化学リンカーおよびポリペプチドリンカーが含まれるが、ただし前記に限定されない。
リンカーは化学的リンカーであることができ、例えば以下が含まれる：アルキレン鎖、ポリエチレングリコール（PEG）鎖、ポリコハク酸無水物、ポリ-L-グルタミン酸、ポリ（エチレンイミン）、オリゴ糖、アミノ酸鎖、または他の任意の適切な連結。ある種の実施態様では、リンカーそのものは生理学的条件下で安定であることができ（例えばアルキレン鎖）、或いは、前記は、生理学的条件下で、例えば酵素によって（例えば結合はペプチダーゼのための基質であるペプチド配列を含む）、または加水分解によって（例えば結合は加水分解可能な基、例えばエステルまたはチオエステルを含む）切断可能であることができる。リンカーは生物学的に非活性であることができ（例えばPEG、ポリグリコール酸、またはポリ乳酸鎖）、或いは、前記は生物学的に活性であることができる（例えばオリゴもしくはポリペプチドなどで、前記は当該部分から切断されたとき、受容体と結合し酵素を不活化する）。リンカーは、第一および第二の抗体または抗原結合フラグメントと、任意の適切な結合または官能基（炭素-炭素結合、エステル、エーテル、アミド、アミン、カルボネート、カルバメート、スルホンアミドなどを含む）によって結合させることができる。
【００９８】
ある種の実施態様では、リンカーは、少なくとも1つ（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または11以上）の誘導または非誘導アミノ酸である。このタイプの例示的な例では、リンカーは、好ましくは非免疫原性で可撓性で、例えばセリンおよびグリシン配列またはAla-Ala-Alaの繰返しを含むものである。実際の構築物に応じて、リンカーは長くても（例えば長さが12アミノ酸を超える）、短くてもよい（例えば長さが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12アミノ酸）。例えば、単鎖ジアボディを作製するために、第一および第三のリンカーは好ましくは長さが約3から約12アミノ酸であり（より好ましくは長さが約5アミノ酸）、第二のリンカーは好ましくは長さが12アミノ酸より長い（より好ましくは長さが約15アミノ酸）。リンカーの長さを3残基未満に減少させることによって、二重特異性抗体を所望にしたがって二価、三価、または四価にすることを可能にする本発明に単鎖抗体を強制することができる。
代表的なペプチドリンカーは、[AAA]n、[SGGGG]n、[GGGGS]n、[GGGGG]n、[GGGKGGGG]n、[GGGNGGGG]n、[GGGCGGGG]nから選択することができ、ここでnは1から10、適切には1から5、より適切には1から3の整数である。
【００９９】
5．マルチ特異性抗原結合構築物
本発明のある特徴は、異なる特異性を有する複数の抗原結合分子を含み、それらが直接的にまたはリンカーを介して一緒に融合或いは接合されているキメラ構築物に関する。
5.1抗RANKL-抗PD-1ジアボディ
本発明は、二重特異性で抗RANKL抗原結合分子および抗PD-1抗原結合分子を含むマルチ特異性構築物を意図し、その代表的な例は、以下から選択される配列を含むか、前記配列から成るか、または本質的に前記配列から成る：
a）EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspｇeratlscrasqsvssylawyqqkpｇqaprlliydasnratｇiparfsｇsｇsｇtdftltisslepedfavyycqqssnwprtfｇqｇtkveik [SGGGG]n QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspｇtlslspｇeratlscrasqsvrｇrylawyqqkpｇqaprlliyｇassratｇipdrfsｇsｇsｇtdftltisrlepedfavfycqqyｇssprtfｇqｇtkveik（配列番号:216）
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAｂデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
b）QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspｇtlslspｇeratlscrasqsvrｇrylawyqqkpｇqaprlliyｇassratｇipdrfsｇsｇsｇtdftltisrlepedfavfycqqyｇssprtfｇqｇtkveik [SGGGG]n EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspｇeratlscrasqsvssylawyqqkpｇqaprlliydasnratｇiparfsｇsｇsｇtdftltisslepedfavyycqqssnwprtfｇqｇtkveik（配列番号:217）
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
【０１００】
c）QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspｇeratlscrasqsvssylawyqqkpｇqaprlliydasnratｇiparfsｇsｇsｇtdftltisslepedfavyycqqssnwprtfｇqｇtkveik [SGGGG]n QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvｇdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpｇkaprlliyｇasslqsｇvpsrfsｇsｇsｇaeftltisslqpediatyycqhtrafｇqｇtkveik（配列番号:218）
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
d）QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvｇdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpｇkaprlliyｇasslqsｇvpsrfsｇsｇsｇaeftltisslqpediatyycqhtrafｇqｇtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspｇeratlscrasqsvssylawyqqkpｇqaprlliydasnratｇiparfsｇsｇsｇtdftltisslepedfavyycqqssnwprtfｇqｇtkveik（配列番号:219）
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
e）EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspｇeratlscraskｇvstsｇysylhwyqqkpｇqaprlliylasylesｇvparfsｇsｇsｇtdftltisslepedfavyycqhsrdlpltfｇｇｇtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS [SGGGG]n eivltqspｇtlslspｇeratlscrasqsvrｇrylawyqqkpｇqaprlliyｇassratｇipdrfsｇsｇsｇtdftltisrlepedfavfycqqyｇssprtfｇqｇtkveik（配列番号:220）
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
【０１０１】
f）QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS [SGGGG]n eivltqspｇtlslspｇeratlscrasqsvrｇrylawyqqkpｇqaprlliyｇassratｇipdrfsｇsｇsｇtdftltisrlepedfavfycqqyｇssprtfｇqｇtkveik [SGGGG]n EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspｇeratlscraskｇvstsｇysylhwyqqkpｇqaprlliylasylesｇvparfsｇsｇsｇtdftltisslepedfavyycqhsrdlpltfｇｇｇtkveik（配列番号:221）
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
ｇ）QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspｇeratlscraskｇvstsｇysylhwyqqkpｇqaprlliylasylesｇvparfsｇsｇsｇtdftltisslepedfavyycqhsrdlpltfｇｇｇtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvｇdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpｇkaprlliyｇasslqsｇvpsrfsｇsｇsｇaeftltisslqpediatyycqhtrafｇqｇtkveik（配列番号:222）
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
h）QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvｇdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpｇkaprlliyｇasslqsｇvpsrfsｇsｇsｇaeftltisslqpediatyycqhtrafｇqｇtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspｇeratlscraskｇvstsｇysylhwyqqkpｇqaprlliylasylesｇvparfsｇsｇsｇtdftltisslepedfavyycqhsrdlpltfｇｇｇtkveik（配列番号:223）
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
【０１０２】
5.2抗RANKL-抗PD-1ジアボディ
また別に、二重特異性構築物は、抗RANKL抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含み、その代表的な例は、以下から選択される配列を含むか、前記配列から成るか、または本質的に前記配列から成る：
a）EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspｇtlslspｇeratlscrasqrvsssylawyqqkpｇqaprlliydassratｇipdrfsｇsｇsｇtdftltisrlepedfavyycqqyｇslpwtfｇqｇtkveik [SGGGG]n VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspｇtlslspｇeratlscrasqsvrｇrylawyqqkpｇqaprlliyｇassratｇipdrfsｇsｇsｇtdftltisrlepedfavfycqqyｇssprtfｇqｇtkveik（配列番号:224）
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
b）VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspｇtlslspｇeratlscrasqsvrｇrylawyqqkpｇqaprlliyｇassratｇipdrfsｇsｇsｇtdftltisrlepedfavfycqqyｇssprtfｇqｇtkveik [SGGGG]n EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspｇtlslspｇeratlscrasqrvsssylawyqqkpｇqaprlliydassratｇipdrfsｇsｇsｇtdftltisrlepedfavyycqqyｇslpwtfｇqｇtkveik（配列番号:225）
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
【０１０３】
c）QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspｇtlslspｇeratlscrasqrvsssylawyqqkpｇqaprlliydassratｇipdrfsｇsｇsｇtdftltisrlepedfavyycqqyｇslpwtfｇqｇtkveik [SGGGG]n VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvｇdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpｇkaprlliyｇasslqsｇvpsrfsｇsｇsｇaeftltisslqpediatyycqhtrafｇqｇtkveik（配列番号:226）
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
d）VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvｇdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpｇkaprlliyｇasslqsｇvpsrfsｇsｇsｇaeftltisslqpediatyycqhtrafｇqｇtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspｇtlslspｇeratlscrasqrvsssylawyqqkpｇqaprlliydassratｇipdrfsｇsｇsｇtdftltisrlepedfavyycqqyｇslpwtfｇqｇtkveik（配列番号:227）
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
【０１０４】
e）EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvｇdrvtitcrasqdvstavawyqqkpｇkapklliysasflysｇvpsrfsｇsｇsｇtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfｇqｇtkveik [SGGGG]n EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspｇtlslspｇeratlscrasqsvrｇrylawyqqkpｇqaprlliyｇassratｇipdrfsｇsｇsｇtdftltisrlepedfavfycqqyｇssprtfｇqｇtkveik（配列番号:228）
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
f）EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspｇtlslspｇeratlscrasqsvrｇrylawyqqkpｇqaprlliyｇassratｇipdrfsｇsｇsｇtdftltisrlepedfavfycqqyｇssprtfｇqｇtkveik [SGGGG]n EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvｇdrvtitcrasqdvstavawyqqkpｇkapklliysasflysｇvpsrfsｇsｇsｇtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfｇqｇtkveik（配列番号:229）
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
【０１０５】
ｇ）QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvｇdrvtitcrasqdvstavawyqqkpｇkapklliysasflysｇvpsrfsｇsｇsｇtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfｇqｇtkveik [SGGGG]n EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvｇdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpｇkaprlliyｇasslqsｇvpsrfsｇsｇsｇaeftltisslqpediatyycqhtrafｇqｇtkveik（配列番号:230）
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
h）EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvｇdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpｇkaprlliyｇasslqsｇvpsrfsｇsｇsｇaeftltisslqpediatyycqhtrafｇqｇtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvｇdrvtitcrasqdvstavawyqqkpｇkapklliysasflysｇvpsrfsｇsｇsｇtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfｇqｇtkveik（配列番号:231）
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
【０１０６】
5.3抗RANKL-抗CTLA4ジアボディ
また別に、二重特異性構築物は、抗RANKL抗原結合分子および抗CTLA4抗原結合分子を含み、その代表的な例は、以下から選択される配列を含むか、前記から成るか、または本質的に前記から成る：
a）EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspｇtlslspｇeratlscrasqsvｇssylawyqqkpｇqaprlliyｇafsratｇipdrfsｇsｇsｇtdftltisrlepedfavyycqqyｇsspwtfｇqｇtkveik [SGGGG]n QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspｇtlslspｇeratlscrasqsvrｇrylawyqqkpｇqaprlliyｇassratｇipdrfsｇsｇsｇtdftltisrlepedfavfycqqyｇssprtfｇqｇtkveik（配列番号:232）
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
b）QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspｇtlslspｇeratlscrasqsvrｇrylawyqqkpｇqaprlliyｇassratｇipdrfsｇsｇsｇtdftltisrlepedfavfycqqyｇssprtfｇqｇtkveik [SGGGG]n EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspｇtlslspｇeratlscrasqsvｇssylawyqqkpｇqaprlliyｇafsratｇipdrfsｇsｇsｇtdftltisrlepedfavyycqqyｇsspwtfｇqｇtkveik（配列番号:233）
ここで、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
【０１０７】
c）QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspｇtlslspｇeratlscrasqsvｇssylawyqqkpｇqaprlliyｇafsratｇipdrfsｇsｇsｇtdftltisrlepedfavyycqqyｇsspwtfｇqｇtkveik [SGGGG]n QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvｇdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpｇkaprlliyｇasslqsｇvpsrfsｇsｇsｇaeftltisslqpediatyycqhtrafｇqｇtkveik（配列番号:234）
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
d）QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvｇdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpｇkaprlliyｇasslqsｇvpsrfsｇsｇsｇaeftltisslqpediatyycqhtrafｇqｇtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspｇtlslspｇeratlscrasqsvｇssylawyqqkpｇqaprlliyｇafsratｇipdrfsｇsｇsｇtdftltisrlepedfavyycqqyｇsspwtfｇqｇtkveik（配列番号:235）
ここで、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
e）EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvｇdrvtitcrasqsinsyldwyqqkpｇkapklliyaasslqsｇvpsrfsｇsｇsｇtdftltisslqpedfatyycqqyystpftfｇpｇtkveik [SGGGG]n QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspｇtlslspｇeratlscrasqsvrｇrylawyqqkpｇqaprlliyｇassratｇipdrfsｇsｇsｇtdftltisrlepedfavfycqqyｇssprtfｇqｇtkveik（配列番号:236）
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
f）QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspｇtlslspｇeratlscrasqsvrｇrylawyqqkpｇqaprlliyｇassratｇipdrfsｇsｇsｇtdftltisrlepedfavfycqqyｇssprtfｇqｇtkveik [SGGGG]n EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvｇdrvtitcrasqsinsyldwyqqkpｇkapklliyaasslqsｇvpsrfsｇsｇsｇtdftltisslqpedfatyycqqyystpftfｇpｇtkveik（配列番号:237）
ここで、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
【０１０８】
ｇ）QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvｇdrvtitcrasqsinsyldwyqqkpｇkapklliyaasslqsｇvpsrfsｇsｇsｇtdftltisslqpedfatyycqqyystpftfｇpｇtkveik [SGGGG]n QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvｇdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpｇkaprlliyｇasslqsｇvpsrfsｇsｇsｇaeftltisslqpediatyycqhtrafｇqｇtkveik（配列番号:238）
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
h）QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvｇdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpｇkaprlliyｇasslqsｇvpsrfsｇsｇsｇaeftltisslqpediatyycqhtrafｇqｇtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvｇdrvtitcrasqsinsyldwyqqkpｇkapklliyaasslqsｇvpsrfsｇsｇsｇtdftltisslqpedfatyycqqyystpftfｇpｇtkveik（配列番号:239）
ここで、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
【０１０９】
5.4抗RANKL-抗PD-1 CrossMAb構築物
本発明はまたCrossMAbマルチ特異性抗原結合分子を意図する。CrossMAb構築の第一の工程では、操作された突起が、第一のIｇG様ポリペプチドの境界面に、そのCH3ドメイン内の当該ポリペプチドの少なくとも1つの接触残基を置き換えることによって作出される。具体的には、第一のポリペプチド上で置き換えられるべき接触残基は366位のIｇG残基（残基の番号付与はFc結晶構造による（Deisenhofer, Biochem. 20:2361, 1981））に対応し、ここで、操作される突起は、最初の残基をコードする核酸を最初の残基よりも大きな側鎖体積を有する持込み残基をコードする核酸で置き換える工程を含む。具体的には、366位のスレオニン（T）残基がトリプトファン（W）に変異させられる。第二の工程では、操作された窪みが、第二のポリペプチドの境界面に、そのCH3ドメイン内の当該ポリペプチドの少なくとも1つの接触残基を置き換えることによって作出され、ここで、操作される窪みは、最初の残基をコードする核酸を最初の残基よりも小さな側鎖体積を有する持込み残基をコードする核酸で置き換える工程を含む。具体的には、第二のポリペプチド上で置き換えられるべき接触残基は407位のIｇG残基に対応する。具体的には、407位のチロシン（Y）残基がアラニン（A）に変異させられる。この操作手順は、IｇG1、IｇG2a、IｇG2b、IｇG3およびIｇG4から成る群から選択される、種々のIｇGサブタイプで実施することができる。
続く工程では、ヘテロダイマー二重特異性IｇGで起こり得る2つの軽鎖/重鎖相互作用間の識別を促進するために、所望される軽鎖/重鎖対の結合を、二重特異性抗体の1つのFab（Fab領域）を改変することによって誘発し、軽鎖および重鎖間で定常領域または定常領域と可変領域を“交換”することができる（例えば上掲書（Schaefer et al., 2011）参照）。したがって、改変Fabドメインではそれぞれ、重鎖は例えばCL-VHまたはCL-VLドメインを含み、軽鎖はCHI-VLまたはCHI-VHドメインを含むことになろう。これは、改変鎖の重鎖/軽鎖Fab部分（すなわち改変軽鎖または重鎖）と標準/非改変アームの重鎖/軽鎖Fab部分との相互作用を防ぐ。解説すれば、改変アームのFabドメインの重鎖（CLドメインを含む）は、好ましくは、非改変アーム/Fabドメインの軽鎖（前記もまたCLドメインを含む）と相互作用しない（重鎖/軽鎖の“不適切な”または望ましくない対形成を防ぐ）。“不適切な”軽鎖/重鎖の結合を防ぐこの技術は、“CrossMAb”技術と称され、KiH技術と併用されるときには、所望の二重特異性分子の目覚ましく増強された発現をもたらす（例えば上掲書（Schaefer et al.）を参照されたい）。
ヘテロダイマー二重特異性IｇG抗体の作製は、第一に、二重特異性IｇGの4鎖をコードする抗体遺伝子を哺乳動物系発現ベクターでクローニングし、哺乳動物細胞（例えばHEK293）での分泌性発現を可能にする。抗体鎖cDNAの各々を一緒に等モル比で、HEK293細胞に293フェクチンまたは同様な技術を用いてトランスフェクトし、抗体含有細胞培養上清を採集し、タンパク質Aセファロースを用いて抗体を上清から精製する。
いくつかの実施態様では、抗RANKL抗原結合分子および抗PD-1抗原結合分子の両方を含む二重特異性ヘテロダイマーIｇGは、2重鎖2軽鎖構築物を用いて構築することができ、この場合、重鎖CH3ドメインの一方は366位で改変され（T366W）（“ノブ”と称される）、他方の重鎖CH3ドメインは407位で改変されて（Y407A）（“ホール”と称される）、重鎖のKiHヘテロダイマー化を促進する。
【０１１０】
5.4.1デノスマブCrossMAbのための構築物−CH1-CL交換
例示的デノスマブCrossMAbはIｇG2に由来する重鎖配列を含むことができ、所望の軽鎖/重鎖対形成は、Iｇ鎖間でCH1およびCLドメインが交換されるように抗RANKL抗原結合分子のFabドメインを改変することによって誘導され得る。この構築のために、以下の4つの構築物が用いられる。
構築物1
デノスマブCrossMAb CH1-CL huIｇG2ノブ（KNOB）変異、重鎖
【０１１１】
2020522529.tif 000025
【０１１２】
（配列番号２４０）
ここで、IｇG2シグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVHは通常大文字で表示され、デノスマブCLは太字の小文字で表示され、ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、デノスマブCH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、T366W置換は太字の大文字で表示される。
構築物2
デノスマブCrossMAb CH1-CL軽鎖
【０１１３】
2020522529.tif 000026
【０１１４】
（配列番号２４１）
ここで、カッパシグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVLは通常大文字で表示され、デノスマブCH1ドメインは太字の小文字で表示される。
構築物3
ニボルマブIｇG2ホール変異、重鎖
【０１１５】
2020522529.tif 000027
【０１１６】
（配列番号２４２）
ここで、ニボルマブVHは通常大文字で表示され、ニボルマブCH1は太字の小文字で表示され、HuIｇG2ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、HuIｇG2CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、Y407A置換は太字の大文字で表示される。
構築物4
ニボルマブ軽鎖
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:243）。
【０１１７】
5.4.2デノスマブCrossMAbのための構築物−VH-VL交換
デノスマブCrossMAbのための別の実施態様では、所望の軽鎖/重鎖対形成は、Iｇ鎖間でVHおよびVLドメインが交換されるように抗RANKL抗原結合分子のFabドメインを改変することによって誘導され得る。ある実施態様では、前記は、IｇG2に由来する重鎖配列を含み、重鎖のヘテロダイマー化はKiH改変によって促進される。この構築のために、以下の4つの構築物が用いられる。
構築物1
デノスマブCrossMAb VH-VL huIｇG2ノブ変異、重鎖
【０１１８】
2020522529.tif 000028
【０１１９】
（配列番号２４４）
ここで、IｇG2シグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVLは通常大文字で表示され、デノスマブCH1ドメインは太字の小文字で表示され、ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、デノスマブCH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、T366W置換は太字の大文字で表示される。
構築物2
デノスマブCrossMAb VH-VL軽鎖
【０１２０】
2020522529.tif 000029
【０１２１】
（配列番号２４５）
ここで、カッパシグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVHは通常大文字で表示され、デノスマブCLドメインは太字の小文字で表示される。
構築物3
ニボルマブIｇG2ホール変異、重鎖
【０１２２】
2020522529.tif 000030
【０１２３】
（配列番号２４６）
ここで、ニボルマブVHは通常大文字で表示され、ニボルマブCH1は太字の小文字で表示され、HuIｇG2ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、HuIｇG2CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、Y407A置換は太字の大文字で表示される。
構築物4
ニボルマブ軽鎖
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:247）
【０１２４】
5.4.3デノスマブCrossMAbのための構築物−Fab-Fab交換
デノスマブCrossMAbのさらに別の実施態様では、所望の軽鎖/重鎖対形成は、Iｇ鎖間でFabドメインが交換されるように抗RANKL抗原結合分子のFabドメインを改変することによって誘導され得る。この実施態様では、前記は、IｇG2に由来する重鎖配列を含み、重鎖のヘテロダイマー化はKiH改変によって促進される。この構築のために、以下の4つの構築物が用いられる。
構築物1
デノスマブCrossMAb Fab huIｇG2ノブ変異、重鎖
【０１２５】
2020522529.tif 000031
【０１２６】
（配列番号２４８）
ここで、IｇG2シグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVLは通常大文字で表示され、デノスマブCLドメインは太字の小文字で表示され、ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、デノスマブCH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、T366W置換は太字の大文字で表示される。
構築物2
デノスマブCrossMAb Fab軽鎖
【０１２７】
2020522529.tif 000032
【０１２８】
（配列番号２４９）
ここで、カッパシグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVHは通常大文字で表示され、デノスマブCH1ドメインは太字の小文字で表示される。
構築物3
ニボルマブIｇG2ホール変異、重鎖
【０１２９】
2020522529.tif 000033
【０１３０】
（配列番号２５０）
ここで、ニボルマブVHは通常大文字で表示され、ニボルマブCH1ドメインは太字の小文字で表示され、HuIｇG2ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、HuIｇG2CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、Y407A置換は太字の大文字で表示される。
構築物4
ニボルマブ軽鎖
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:251）。
【０１３１】
5.4.4デノスマブCrossMAbのための構築物−CH1-CL交換
デノスマブCrossMAbのさらに別の実施態様では、デノスマブCrossMAbはIｇG4に由来する重鎖配列を含む。この実施態様では、所望の軽鎖/重鎖対形成は、Iｇ鎖間でCH1およびCLドメインが交換されるように抗RANKL抗原結合分子のFabドメインを改変することによって誘導され得る。この構築のために、以下の4つの構築物が用いられる。
構築物1
デノスマブCrossMAb CH1-CL huIｇG4ノブ変異、重鎖
【０１３２】
2020522529.tif 000034
【０１３３】
（配列番号２５２）
ここで、IｇG2シグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVHは通常大文字で表示され、デノスマブCLドメインは太字の小文字で表示され、IｇG4ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IｇG4 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、T366W置換は太字の大文字で表示される。
構築物2
デノスマブCrossMAb CH1-CL軽鎖
【０１３４】
2020522529.tif 000035
【０１３５】
（配列番号２５３）
ここで、カッパシグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVLは通常大文字で表示され、デノスマブCH1ドメインは太字の小文字で表示される。
構築物3
ニボルマブIｇG4ホール変異、重鎖
【０１３６】
2020522529.tif 000036
【０１３７】
（配列番号２５４）
ここで、ニボルマブVHは通常大文字で表示され、ニボルマブCH1ドメインは太字の小文字で表示され、IｇG4ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IｇG4 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、Y407A置換は太字の大文字で表示される。
構築物4
ニボルマブ軽鎖
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:255）。
【０１３８】
5.4.5デノスマブCrossMAbのための構築物−VH-VL交換−IｇG4 CH
デノスマブCrossMAbのさらに別の実施態様では、所望の軽鎖/重鎖対形成は、Iｇ鎖間でVHおよびVLドメインが交換されるように抗RANKL抗原結合分子のFabドメインを改変することによって誘導され得る。この実施態様では、前記は、IｇG4に由来する重鎖配列を含み、重鎖のヘテロダイマー化はKiH改変によって促進される。この構築のために、以下の4つの構築物が用いられる。
構築物1
デノスマブCrossMAb VH-VL huIｇG4ノブ変異、重鎖
【０１３９】
2020522529.tif 000037
【０１４０】
（配列番号２５６）
ここで、IｇG2シグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVLは通常大文字で表示され、デノスマブCH1ドメインは太字の小文字で表示され、IｇG4ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IｇG4 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、T366W置換は太字の大文字で表示される。
構築物2
デノスマブCrossMAb VH-VL軽鎖
【０１４１】
2020522529.tif 000038
【０１４２】
（配列番号２５７）
ここで、カッパシグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVHは通常大文字で表示され、デノスマブCLドメインは太字の小文字で表示される。
構築物3
ニボルマブIｇG4ホール変異、重鎖
【０１４３】
2020522529.tif 000039
【０１４４】
（配列番号２５８）
ここで、ニボルマブVHは通常大文字で表示され、ニボルマブCH1ドメインは太字の小文字で表示され、IｇG4ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IｇG4 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、Y407A置換は太字の大文字で表示される。
構築物4
ニボルマブ軽鎖
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:259）。
【０１４５】
5.4.6デノスマブCrossMAbのための構築物−Fab-Fab交換−IｇG4 CH
デノスマブCrossMAbの別の実施態様では、所望の軽鎖/重鎖対形成は、Iｇ鎖間でFabドメインが交換されるように抗RANKL抗原結合分子のFabドメインを改変することによって誘導され得る。この実施態様では、前記は、IｇG4に由来する重鎖配列を含み、重鎖のヘテロダイマー化はKiH改変によって促進される。この構築のために、以下の4つの構築物が用いられる。
構築物1
デノスマブCrossMAb Fab huIｇG4ノブ変異、重鎖
【０１４６】
2020522529.tif 000040
【０１４７】
（配列番号２６０）
ここで、IｇG2シグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVLは通常大文字で表示され、デノスマブCLドメインは太字の小文字で表示され、IｇG4ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IｇG4 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、T366W置換は太字の大文字で表示される。
構築物2
デノスマブCrossMAb Fab軽鎖
【０１４８】
2020522529.tif 000041
【０１４９】
（配列番号２６１）
ここで、カッパシグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVHは通常大文字で表示され、デノスマブCH1ドメインは太字の小文字で表示される。
構築物3
ニボルマブIｇG4ホール変異、重鎖
【０１５０】
2020522529.tif 000042
【０１５１】
（配列番号２６２）
ここで、ニボルマブVHは通常大文字で表示され、ニボルマブCH1は太字の小文字で表示され、IｇG4ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IｇG4 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、Y407A置換は太字の大文字で表示される。
構築物4
ニボルマブ軽鎖
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:263）。
【０１５２】
5.4.7デノスマブCrossMAbのための構築物−CH1-CL交換−IｇG4 CH
デノスマブCrossMAbのさらに別の実施態様はIｇG1に由来する重鎖配列を含む。この実施態様では、所望の軽鎖/重鎖対形成は、Iｇ鎖間でCH1およびCLドメインが交換されるように抗RANKL抗原結合分子のFabドメインを改変することによって誘導され得る。この構築のために、以下の4つの構築物が用いられる。
構築物1
デノスマブCrossMAb CH1-CL huIｇG1ノブ変異、重鎖
【０１５３】
2020522529.tif 000043
【０１５４】
（配列番号２６４）
ここで、IｇG2シグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVHは通常大文字で表示され、デノスマブCLドメインは太字の小文字で表示され、IｇG1ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IｇG1 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、T366W置換は太字の大文字で表示される。
構築物2
デノスマブCrossMAb CH1-CL軽鎖
【０１５５】
2020522529.tif 000044
【０１５６】
（配列番号２６５）
ここで、カッパシグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVLは通常大文字で表示され、デノスマブCH1ドメインは太字の小文字で表示される。
構築物3
ニボルマブIｇG1ホール変異、重鎖
【０１５７】
2020522529.tif 000045
【０１５８】
（配列番号２６６）
ここで、ニボルマブVHは通常大文字で表示され、ニボルマブCH1ドメインは太字の小文字で表示され、IｇG1ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IｇG1 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、Y407A置換は太字の大文字で表示される。
構築物4
ニボルマブ軽鎖
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:267）。
【０１５９】
5.4.8デノスマブCrossMAbのための構築物−VH-VL交換−IｇG1 CH
デノスマブCrossMAbの別の実施態様では、所望の軽鎖/重鎖対形成は、Iｇ鎖間でVHおよびVLドメインが交換されるように抗RANKL抗原結合分子のFabドメインを改変することによって誘導され得る。ある実施態様では、前記は、IｇG1に由来する重鎖配列を含み、重鎖のヘテロダイマー化はKiH改変によって促進される。この構築のために、以下の4つの構築物が用いられる。
構築物1
デノスマブCrossMAb VH-VL huIｇG1ノブ変異、重鎖
【０１６０】
2020522529.tif 000046
【０１６１】
（配列番号２６８）
ここで、IｇG2シグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVLは通常大文字で表示され、デノスマブCH1ドメインは太字の小文字で表示され、IｇG1ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IｇG1 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、T366W置換は太字の大文字で表示される。
構築物2
デノスマブCrossMAb VH-VL軽鎖
【０１６２】
2020522529.tif 000047
【０１６３】
（配列番号２６９）
ここで、カッパシグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVHは通常大文字で表示され、デノスマブCLドメインは太字の小文字で表示される。
構築物3
ニボルマブIｇG1ホール変異、重鎖
【０１６４】
2020522529.tif 000048
【０１６５】
（配列番号２７０）
ここで、ニボルマブVHは通常大文字で表示され、ニボルマブCH1ドメインは太字の小文字で表示され、IｇG1ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IｇG1 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、Y407A置換は太字の大文字で表示される。
構築物4
ニボルマブ軽鎖
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:271）。
【０１６６】
5.4.9デノスマブCrossMAbのための構築物−Fab-Fab交換−IｇG1 CH
デノスマブCrossMAbの別の実施態様では、所望の軽鎖/重鎖対形成は、Iｇ鎖間でFabドメインが交換されるように抗RANKL抗原結合分子のFabドメインを改変することによって誘導され得る。ある実施態様では、前記は、IｇG1に由来する重鎖配列を含み、重鎖のヘテロダイマー化はKiH改変によって促進される。この構築のために、以下の4つの構築物が用いられる。
構築物1
デノスマブCrossMAb Fab huIｇG1ノブ変異、重鎖
【０１６７】
2020522529.tif 000049
【０１６８】
（配列番号２７２）
ここで、IｇG2シグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVLは通常大文字で表示され、デノスマブCLドメインは太字の小文字で表示され、IｇG1ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IｇG1 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、T366W置換は太字の大文字で表示される。
構築物2
デノスマブCrossMAb Fab軽鎖
【０１６９】
2020522529.tif 000050
【０１７０】
（配列番号２７３）
ここで、カッパシグナルペプチドは下線付き大文字で表示され、デノスマブVHは通常大文字で表示され、デノスマブCH1ドメインは太字の小文字で表示される。
構築物3
ニボルマブIｇG1ホール変異、重鎖
【０１７１】
2020522529.tif 000051
【０１７２】
（配列番号２７４）
ここで、ニボルマブVHは通常大文字で表示され、ニボルマブCH1ドメインは太字の小文字で表示され、IｇG1ヒンジ領域は下線付き小文字で表示され、IｇG1 CH2-CH3ドメインは通常小文字で表示され、Y407A置換は太字の大文字で表示される。
構築物4
ニボルマブ軽鎖
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号:275].
【０１７３】
一特異性二価親抗体の作製および精製に続いて、記載のように（Labrijn et al. Nature Protocols 2014;9（10）:2450-63）、2つの一特異性抗体間における制御されたFabアーム交換を介して、二重特異性ヘテロダイマーを組み立てることができる。
多様な実施態様では、抗RANKL抗原結合分子は、FabドメインがIｇ鎖間で交換されるように抗RANKL抗原結合分子のFabドメインを含み、配列番号:272（デノスマブCrossMAb Fab huIｇG1ノブ変異、重鎖）および配列番号:273（デノスマブCrossMAb Fab軽鎖）を含む。
他の実施態様では、抗RANKL抗原結合分子のFabドメインは、VHおよびVLドメインがIｇ鎖間で交換されるように改変されて、配列番号:268（デノスマブCrossMAb VH-VL huIｇG1ノブ変異、重鎖）および配列番号:269（デノスマブCrossMAb VH-VL軽鎖）を含む。
【０１７４】
6．医薬組成物
本発明の医薬組成物は概して、上記および本明細書の他の場所に記載の治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子を含み、前記は1つ以上の医薬的に許容できる担体とともに処方される。場合によって、医薬組成物は1つ以上の他の化合物、薬剤、成分および/または物質を含む。選択される投与経路に関係なく、本発明の治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子は、当業者に公知の通常的方法によって医薬的に許容できる剤形に処方される（例えば以下を参照されたい：Reminｇton, The Science and Practice of Pharmacy；21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, Pa.）。
本発明の医薬組成物は、所望される効果的な任意の方法で対象動物に投与することができる。例えば、医薬組成物は、経口摂取のために、または眼への局所投与のための軟膏もしくは点眼液として、または非経口もしくは任意の適切な他の投与（例えば腹腔内、皮下、外用、皮内、吸入、肺内、直腸、膣、舌下、筋肉内、静脈内、動脈内、またはリンパ内投与）のために処方され得る。さらにまた、本発明の医薬組成物は、下記に詳細に記載する1つ以上の補助的治療と一緒に投与され得る。所望の場合には、本発明の医薬組成物を被包化するか、さもなければ胃または他の分泌物に対して保護することができる。
本発明の医薬組成物は1つ以上の活性成分を含むことができ、前記は、1つ以上の医薬的に許容できる担体、場合によって1つ以上の他の化合物、薬剤、成分および/または物質と混合物されてある。選択される投与経路に関係なく、本発明の二重特異性抗体は、当業者に公知の通常的方法によって医薬的に許容できる剤形に処方される（例えば以下を参照されたい：Reminｇton, The Science and Practice of Pharmacy；21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, Pa.）。
【０１７５】
医薬的に許容できる担体は当業界で周知であり（例えば以下を参照されたい：Reminｇton, The Science and Practice of Pharmacy；21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, Pa.；および米国局方（American Pharmaceutical Association, Washinｇton, D.C.））、以下が含まれる：糖（例えばラクトース、シュクロース、マンニトール、およびソルビトール）、デンプン、セルロース調製物、リン酸カルシウム（例えばリン酸二カルシウム、リン酸三カルシウムおよびリン酸水素カルシウム）、クエン酸ナトリウム、水、水溶液（例えば食塩水、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロース塩化ナトリウム注射液、乳酸リンゲル注射液）、アルコール（例えばエチルアルコール、プロピルアルコール、およびベンジルアルコール）、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール）、有機エステル（例えばオレイン酸エチルおよびトリグリセリド）、生物分解性ポリマー（例えばポリラクチド-ポリグリコリド、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物））、弾性マトリックス、リポソーム、微小球、油（例えばトウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油、ゴマ油、綿実油、および落花生油）、カカオ脂、ワックス（例えば座薬ワックス）、パラフィン、シリコーン、タルク、シリシレートなど。本発明の医薬組成物で用いられる医薬的に許容できる担体の各々は、処方物の他の成分と適合でき対象動物に対して傷害性でないという意味で“許容できる”必要がある。選択される剤形および意図される投与経路に適する担体は当業界で周知であり、選択剤形および投与方法で許容できる担体は、当業界で通常の技量を用いて決定され得る。
【０１７６】
本発明の医薬組成物は、場合によって、医薬組成物（治療用抗原結合分子調製物を含む）で普通に用いられる追加の成分および/または物質を含む。これらの成分および物質は当業界で周知であり、以下が含まれる：（1）充填剤または増量剤、例えばデンプンラクトース、シュクロース、グルコース、マンニトール、ケイ酸；（2）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、シュクロースおよびアカシア；（3）保湿剤、例えばグリセロール；（4）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび炭酸ナトリウム；（5）薬剤保持溶液、例えばパラフィン；（6）吸収促進剤、例えば四級アンモニウム化合物；（7）湿潤剤、例えばセチルアルコールおよび一ステアリン酸グリセロール；（8）吸収剤、例えばカオリンおよびベントナイト粘度；（9）滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、およびラウリル硫酸ナトリウム；（10）懸濁剤、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカント；（11）緩衝剤；（12）賦形剤、例えばラクトース、乳糖、ポリエチレングリコール、動植物脂肪、油、ワックス、パラフィン、カカオ脂、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、サリチル酸塩、酸化亜鉛、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド粉末；（13）不活性希釈剤、例えば水または他の溶媒；（14）保存料；（15）界面活性剤；（16）分散剤；（17）制御放出または吸収遅延剤、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、生物分解性ポリマー、リポソーム、微小球、一ステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、およびワックス；（18）乳白剤；（19）アジュバント；（20）湿潤剤；（21）乳化および分散剤；（22）可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、カルボン酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、油（特に綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、ひまし油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル；（23）噴射剤、例えばクロロフルオロ炭化水素および揮発性非置換炭化水素、例えばブタンおよびプロパン；（24）抗酸化剤；（25）処方物を目的のレシピエントの血液と等張にする薬剤、例えば糖および塩化ナトリウム；（26）膨張剤；（27）被覆物質、例えばレシチン；および（28）甘味剤、風味剤、着色剤、香料および保存料。そのような成分または物質の各々は、処方物の他の成分と適合でき対象動物に対して傷害性でないという意味で“許容できる”必要がある。選択される剤形および意図される投与経路に適する成分および物質は当��界で周知であり、選択剤形および投与方法で許容できる成分および物質は、当業界で通常の技量を用いて決定され得る。
【０１７７】
経口投与に適する本発明の医薬組成物は、カプセル、カシェー、ピル、錠剤、散剤、顆粒、溶液または懸濁液、エリキシルまたはシロップ、トローチ、ボーラス、舐め薬またはペーストの形態であることができる。これらの処方物は、当業界で公知の方法によって、例えば通常的なパンコーティング、混合、顆粒化または凍結乾燥プロセスの手段によって調製することができる。
経口投与用の固体剤形（カプセル、錠剤、ピル、糖衣錠、散剤、顆粒など）は、例えば活性成分を以下と混合することによって調製できる：1つ以上の医薬的に許容できる担体、および場合によって1つ以上の充填剤、増量剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、溶解遅延剤、吸収促進剤、湿潤剤、吸収剤、滑沢剤および/または着色剤。同様なタイプの固体組成物は、適切な賦形剤を用い充填軟質および硬質ゼラチンカプセルとして利用され得る。錠剤は、打錠または成形によって、場合により1つ以上の付属成分とともに製造できる。打錠錠剤は、適切な結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、保存料、崩壊剤、界面活性または分散剤を用いて調製できる。成形錠剤は適切な機械で成形することによって製造できる。錠剤および他の固体剤形（例えば糖衣錠、カプセル、ピルおよび顆粒）は、場合によって刻み目をつけるか、またはコーティングおよび殻（例えば腸溶皮および製薬業界で周知の他のコーティング）を用いて調製できる。それらはまた、その中の活性成分の徐放出または制御放出を提供するために処方され得る。それらは、例えば細菌保持フィルターでろ過することによって滅菌することができる。これらの組成物はまた場合によって乳白剤を含むことができ、さらに、活性成分のみを好ましくは胃腸管の一定の部分で場合によって遅延態様で放出する組成物であってもよい。活性成分はまたマイクロカプセル化された形態であってもよい。
【０１７８】
直腸または膣投与用の本発明の医薬組成物は座薬として提供でき、前記は、1つ以上の活性成分を1つ以上の適切な非刺激性担体と混合することによって調製され得る。前記非刺激性担体は、室温で固体であるが体温では液体で、したがって直腸または膣腔で融解して活性化合物を放出する。膣投与に適切な本発明の医薬組成物にはまたペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム剤が含まれ、前記は、当業界で適切であることが知られている医薬的に許容できる担体を含む。
経口投与用の液体剤形には、医薬的に許容できるエマルジョン、ミクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルが含まれる。液体剤形は、当業界で普通に用いられる適切な不活性希釈剤を含む。不活性希釈剤の他に、経口組成物はまた、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、風味剤、着色剤、香料、および保存料を含むことができる。懸濁液は懸濁剤を含むことができる。
非経口投与に適切な本発明の医薬組成物は、1つ以上の薬剤/化合物/抗原結合分子を含み、それらは、1つ以上の医薬的に許容できる無菌的な等張の水性もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液またはエマルジョン、或いは無菌的散剤（使用直前に無菌的注射可能溶液または分散液に再構成される）と組合される。前記は、適切な抗酸化剤、緩衝剤、処方物を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁もしくは膨張剤を含む。適切な流動性は、例えばコーティング物質の使用によって、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持できる。これら組成物はまた、適切なアジュバント、例えば湿潤剤、乳化剤および分散剤を含むことができる。前記はまた等張剤を含むことが所望され得る。加えて、注射可能医薬形の吸収延長は、吸収を遅延させる薬剤の含有によって達成され得る。
【０１７９】
局所投与または経皮投与のための剤形には、パウダー、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、膏薬、点滴剤および吸入剤が含まれる。活性薬剤（例えば治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子）は、無菌的条件下で適切な医薬的に許容できる担体と混合できる。軟膏、ペースト、クリームおよびゲルは賦形剤を含むことができる。パウダーおよびスプレーは賦形剤および噴射剤を含むことができる。
いくつかの事例では、医薬組成物の効果を延長させるために、皮下注射または筋肉内注射の吸収速度を遅くすることが所望される。これは、水への溶解性が低い結晶または非晶質物質を液体懸濁物に混合することによって達成できる。
活性薬剤（例えば治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子）の吸収速度はその分解速度に左右され、前記は順に結晶サイズおよび結晶形に左右され得る。また別には、非経口投与薬剤または抗体の吸収遅延は、活性薬剤または抗体を油性ビヒクルに溶解または懸濁することによって達成できる。注射可能なデポ剤は、活性成分のミクロ被包化マトリックスを生物分解性ポリマーで形成することによって製造できる。活性成分対ポリマー比および利用される具体的なポリマーの性質に応じて、活性成分放出速度を制御することができる。注射可能なデポ剤処方物はまた、身体組織に適合するリポソームまたはミクロエマルジョンに薬剤を閉じ込めることによって調製できる。注射可能な物質は、例えば細菌保持フィルターでろ過することによって滅菌することができる。
処方物は、単位用量またはマルチ用量封入容器（例えばアンプルおよびバイアル）で提供でき、凍結乾燥状態で保存することができる（前記は、使用直前に無菌的な液状担体、例えば注射水の添加のみを必要とする）。上記に記載したタイプの無菌的散剤、顆粒および錠剤から即席の注射溶液および懸濁液を調製することができる。
【０１８０】
6.1補助治療
上記および本明細書の他の場所で開示する治療薬組合せ、マルチ特異性抗原結合分子、および医薬組成物は、1つ以上の追加の治療薬剤（例えば、抗ガン剤、細胞傷害性または細胞増殖抑制剤、ホルモン治療、ワクチン、および/または免疫治療）と共同投与することができる。また別に或いは加えるに、治療薬剤、二重特異性抗体、および医薬組成物は、他の治療用式（外科手術、放射線照射、冷凍外科手術および/または温熱療法を含む）と併用して投与される。そのような併用療法は、有利には、投与される治療薬剤のより低い投薬量の使用を可能にし、したがって生じ得る毒性または合併症を回避する。
例えば、本明細書で開示する併用療法はまた標準的癌治療と組合わせることができる。例えば、PD-1単一療法は、化学療法レジメンと効果的に併用されることが知られている。これらの例では、投与される化学療法剤の用量を減少させることが可能である（Mokyr, M. et al. （1998） Cancer Research 58: 5301-5304）。ある種の実施態様では、本明細書に記載の方法および組成物は、1つ以上の他の抗体分子、化学療法、他の抗癌療法（例えば標的誘導抗癌療法、または腫瘍溶解薬剤）、細胞傷害薬剤、免疫系療法（例えばサイトカイン）、外科的および/または放射線照射工程と併用して投与される。併用投与できる例示的な細胞傷害剤には、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、抗代謝剤、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、インターカレーション剤、シグナル伝達経路に干渉できる薬剤、アポトーシス促進薬剤、プロテアソーム阻害剤および放射線照射（例えば局所または全身照射）が含まれる。
【０１８１】
いくつかの実施態様では、治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子は、対象動物の治療で既に日常的に標準物として用いられる化学療法剤と組合わせて用いられる。適切な化学療法剤には以下が含まれる：アナストロゾール（ARIMIDEX）、ビカルタミド（CASODEX）、ブレオマイシン硫酸塩（BLENOXANE）、ブスルファン（MYLERAN）、ブスルファン注射液（BUSULFEX）、カペシタビン（XELODA）、N4-ペントキシカルボニル-5-デオキシ-5-フルオロシチジン、カルボプラチン（PARAPLATIN）、カルムスチン（BICNU）、クロラムブシル（LEUKERAN）、シスプラチン（PLATINOL）、クラドリビン（LEUSTATIN）、シクロホスファミド（CYTOXANまたはNEOSAR）、シタラビン、シトシンアラビノシド（CYTOSAR-U）、シタラビンリポソーム注射液（DEPOCYT）、ダカルバジン（DTIC-DOME）、ダクチノマイシン（アクチノマイシンD、Cosmeｇan）、ダウノルビシン塩酸塩（CERUBIDINE）、ダウノルビシンクエン酸塩リポソーム注射液（DAUNOXOME）、デキサメタゾン、ドセタキセル（TAXOTERE）、ドキソルビシン塩酸塩（ADRIAMYCIN, RUBEX）、エトプシド（VEPESID）、フルダラビンリン酸塩（FLUDARA）、5-フルオロウラシル（ADRUCIL、EFUDEX）、フルタミド（EULEXIN）、テザシチビン、ゲムシタビン（GEMZAR）、ヒドロキシウレア（HYDREA）、イダルビシン（IDAMYCIN）、イフォスファミド（IFEX）、イリノテカン（CAMPTOSAR）、L-アスパラギナーゼ（ELSPAR）、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（ALKERAN）、6-メルカプトプリン（PURINETHOL）、メトトレキセート（FOLEX）、ミトキサントロン（NOVANTRONE）、ミロターグ、パクリタキセル（TAXOL）、nab-パクリタキセル（ABRAXANE）、フェニックス（イットリウム90/MX-DTPA）、ペントスタチン、ポリフェプロサン20（カルムスチンインプラントを伴う（GLIADELウェファー）、タモキシフェンクエン酸塩（NOLVADEX）、テニポシド（VUMON）、6-チオグアニド、チオテパ、、チラパザミン（TIRAZONE）、トポテカン塩酸塩（注射用）（HYCAMPTIN）、ビンブラスチン（VELBAN）、ビンクリスチン（ONCOVIN）、およびビノレルビン（NAVELBINE）（ただしこれらに限定されない）。
【０１８２】
例示的アルキル化剤には以下が含まれる：ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルフォネート、ニトロソウレア、およびトリアゼン：ウラシルマスタード（AMINOURACIL MUSTARD、CHLORETHAMINACIL、DEMETHYLDOPAN、DESMETHYLDOPAN、HAEMANTHAMINE、NORDOPAN、URACIL NITROGEN MUSTARD、URACILLOST、URACILMOSTAZA、URAMUSTIN、URAMUSTINE）、クロルメチン（MUSTARGEN）、シクロホスファミド（CYTOXAN、NEOSAR、CLAFEN、ENDOXAN、PROCYTOX、REVIMMUNE）、ダカルバジン（DTIC-DOME）、イフォスファミド（MITOXANA）、メルファラン（ALKERAN）、クロラムブシル（LEUKERAN）、ピポブロマン（AMEDEL、VERCYTE）、トリエチレンメラミン（HEMEL、HEXALEN、HEXASTAT）、トリエチレンチオホスホルアミド、テモゾロミド（TEMODARおよびTEMODAL）、チオテパ（THIOPLEX）、ブスルファン（BUSILVEX、MYLERAN）、カルムスチン（BICNU）、ロムスチン（CCNUCEENU）、ストレプトゾシン（ZANOSAR）、オキサリプラチン（ELOXATIN）；ダクチノマイシン（アクチノマイシンDとしても知られている、COSMEGEN）；メルファラン（L-PAM、L-サルコリシン、フェニルアラニンマスタード、ALKERAN）、アルトレタミド（ヘキサメチルメラミン（HMM）、HEXALEN）、ベンダムスチン（TREANDA）、ブスルファン（BUSULFEXおよびMYLERAN）、カルボプラチン（PARAPLATIN）、シスプラチン（CDDP、PLATINOLおよびPLATINOL-AQ）、クロラムブシル（LEUKERAN）、ダカルバジン（DTIC、DICおよびイミダゾールカルボキサミド、DTIC-DOME）、アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（HMM）、HEXALEN）、イフォスファミド（IFEX）、プレドヌムスチン、プロカルバジン（MATULANE）、およびチオテパ（チオホスファミド、TESPAおよびTSPA、THIOPLEX）。
【０１８３】
例示的なアントラサイクリンには例えば以下が含まれる：ドキソルビシン（ADRIAMYCINおよびRUBEX）、ブレオマイシン（LENOXANE）、ダウノルビシン（ダウノルビシン塩酸塩、ダウノマイシン、ルビドマイシン塩酸塩、およびCERUBIDINE）、ダウノルビシンリポソーマル（ダウノルビシンクエン酸リポソーム、およびDAUNOXOME）、ミトキサントロン（DHADおよびNOVANTRONE）、エピルビシン（ELLENCE）、イダルビシン（IDAMYCINおよびIDAMYCIN PFS）、マイトマイシンC（MUTAMYCIN）、ゲルダナマイシン、ハービマイシン、ラビドマイシン、およびデスアセチルラビドマイシン。
上記および本明細書の他の場所で開示する薬剤、抗体および方法で組合わせて用いることができる、例示的なビンカアルカロイドには以下が含まれる：ビノレルビン酒石酸塩（NAVELBINE）、ビンクリスチン（ONCOVIN）、ビンデシン（ELDISINE）、およびビンブラスチン（ビンブラスチン硫酸塩、ビンカロイコブラスチン、VLB、ALKABAN-AQおよびVELBAN）（ただしこれらに限定されない）。
本発明で用いることができる例示的なプロテアソーム阻害剤には以下が含まれる：ボルテゾミブ（VELCADE）、カルフィルゾミブ（PX-171-007）、マリゾミブ（NPI-0052）、イキサゾミブクエン酸塩（MLN-9708）、デランゾミブ（CEP-18770）、O-メチル-N-[（2-メチル-5-チアゾリル）カルボニル]-L-セリル-O-メチル-N-[（1S）-2-[（2R）-2-メチル-2-オキシラニル]-2-オキソ-1-（フェニルメチル）エチル]-L-セリナミド（ONX-0912）；ダノプレビル（RG7227、CAS 850876-88-9）、イキサゾミブ（MLN2238、CAS 1072833-77-2）、および（S）-N-[（フェニルメトキシ）カルボニル]-L-ロイシル-N-（1-ホルミル-3-メチルブチル）-L-ロイシンアミド（MG-132、CAS 133407-82-6）（ただしこれらに限定されない）。
いくつかの実施態様では、薬剤（例えば治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子）は、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば受容体チロシンキナーゼ（RTK）阻害剤）と組合わせて用いることができる、例示的なチロシンキナーゼ阻害剤には以下が含まれる：上皮増殖因子（EGF）経路阻害剤（例えば上皮増殖因子受容体（EGFR）阻害剤）、血管内皮増殖因子（VEGF）経路阻害剤（例えば血管内皮増殖因子受容体（VRGFR）阻害剤（例えば阻害剤、VEGFR-2阻害剤、VEGFR-3阻害剤））、血小板由来増殖因子（PDGF）経路阻害剤（例えば血小板由来増殖因子受容体（PDGFR）阻害剤（例えばPDGFR-β阻害剤））、RAF-1阻害剤、KIT阻害剤およびRET阻害剤（ただしこれらに限定されない）。
【０１８４】
いくつかの実施態様では、本発明の組成物はヘッジホッグ経路阻害剤とともに処方される。癌の治療で有効であることが知られている適切なヘッジホッグ阻害剤には以下が含まれる：アキシチニブ（AG013736）、ボスチニブ（SKI-606）、セディラニブ（RECENTIN、AZD2171）、ダサチニブ（SPRYCEL、BMS-354825）、エルロチニブ（TARCEVA）、ゲフィチニブ（IRESSA）、イマチニブ（GLEEVEC、CGP57148B、STI-571）、ラパチニブ（TYKERB、TYVERB）、レスタウルチニブ（CEP-701）、ネラチニブ（HKI-272）、ニロチニブ（TASIGNA）、セマキサニブ（セマキサニブ、SU5416）、スミチニブ（SUTENT、SU11248）、トセラニブ（PALLADIA）、バンデタニブ（ZACTIMA、ZD6474）、バタラニブ（PTK787、PTK/ZK）、トラスツズマブ（HERCEPTIN）、ベバシズマブ（AVASTIN）、リツキシマブ（RITUXAN）、セツキシマブ（ERBITUX）、パニツムマブ（VECTIBIX）、ラニビズマブ（Lucentis）、ニロチニブ（TASIGNA）、ソラフェニブ（NEXAVAR）、アレムツズマブ（CAMPATH）、ゲムツズマブオゾガミシン（MYLOTARG）、ENMD-2076、PCI-32765、AC220、ドビチニブ乳酸塩（TKI258、CHIR-258）、BIBW 2992（TOVOKTM）、SGX523、PF-04217903、PF-02341066、PF-299804、BMS-777607、ABT-869、MP470、BIBF 1120（VARGATEF（商標））、AP24534、JNJ-26483327、MGCD265、DCC-2036、BMS-690154、CEP-11981、チボザニブ（AV-951）、OSI-930、MM-121、XL-184、XL-647、XL228、AEE788、AG-490、AST-6、BMS-599626、CUDC-101、PD153035、ペリチニブ（EKB-569）、バンデタニブ（ザクチマ）、WZ3146、WZ4002、WZ8040、ABT-869（リニファニブ）、AEE788、AP24534（ポナチニブ）、AV-951（チボザニブ）、アキシチニブ、BAY 73-4506（レゴラフェニブ）、ブリバニブアラニネート（BMS-582664）、ブリバニブ（BMS-540215）、セジラニブ（AZD2171）、CHIR-258（ドビチニブ）、CP 673451、CYC116、E7080、Ki8751、マスチニブ（AB1010）、MGCD-265、モテサニブ二リン酸塩（AMG-706）、MP-470、OSI-930、パゾパニブ塩酸塩、PD173074、ソラフェニブトシレート（Bay 43-9006）、SU 5402、TSU-68（SU6668）、バタラニブ、XL880（GSK1363089、EXEL-2880）、ビスモデギブ（2-クロロ-N-[4-クロロ-3-（2-ピリジニル）フェニル]-4-（メチルスルフォニル）-ベンズアミド、GDC-0449（PCT公開公報WO 06/028958で開示）、1-（4-クロロ-3-（トリフルオロメチル）フェニル）-3-（（3-（4-フルオロフェニル）-3,4-ジヒドロ-4-オキソ-2-キナゾリニル）メチル）-ウレア（CAS 330796-24-2）、N-[（2S,3R,3'R,3aS,4'aR,6S,6'aR,6'bS,7aR,12'aS,12'bS）-2',3',3a,4,4',4'a,5,5',6,6',6'a,6'b,7,7',7a,8',10',12',12'a,12'b-エイコサヒドロ-3,6,11',12'b-テトラメチルスピロ[フロ[3,2-b]ピリジン-2（3H）,9'（1'H）-ナフト[2,1-a]アズレン]-3'-イル]- メタンスルホンアミド（IPI926、CAS 1037210-93-7）、4-フルオロ-N-メチル-N-[1-[4-（1-メチル-1H-ピラゾール5-イル）-1-フタラジニル]-4-ピペリジニル]-2-（トリフルオロメチル）-ベンズアミド（LY2940680、CAS 1258861-20-9）、エリスモデギブ（LDE225）（ただし前記に限定されない）。
【０１８５】
ある種の実施態様では、本発明の組成物は血管内皮増殖因子（VEGF）受容体阻害税とともに処方される。前記阻害剤には以下が含まれる：ベバシズマブ（AVASTIN）、アキシチニブ（INLYTA）、ブリバニブアラニネート（BMS-582664、（S）-（（R）-1-（4-（4-フルオロ-2-メチル-1H-インドール-5-イルオキシ）-5-メチルピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-6-イルオキシ）プロパン-2-イル）2-アミノプロパノエート）、ソラフェニブ（NEXAVAR）、パゾパニブ（VOTRIENT）、スニチニブマレイン酸塩（SUTENT）、セジラニブ（AZD2171、CAS 288383-20-1）、バルガテフ（BIBF1120、CAS 928326-83-4）、フォレチニブ（GSK1363089）、テラチニブ（BAY57-9352、CAS 332012-40-5）、アパチニブ（YN968D1、CAS 811803-05-1）、イマチニブ（GLEEVEC）、ポナチニブ（AP24534、CAS 943319-70-8）、チボザニブ（AV951、CAS 475108-18-0）、レゴラフェニブ（BAY73-4506、CAS 755037-03-7）、バタラニブ二塩酸塩（PTK787、CAS 212141-51-0）、ブリバニブ（BMS-540215、CAS 649735-46-6）、バンデタニブ（CAPRELSAまたはAZD6474）、モテサニブ二リン酸塩（AMG706、CAS 857876-30-3、N-（2,3-ジヒドロ-3,3-ジメチル-1H-インドール-6-イル）-2-[（4-ピリジニルメチル）アミノ]-3-ピリジンカルボキサミド（PCT国際公開公報WO 02/066470に記載））、ドビチニブ二乳酸（TKI258、CAS 852433-84-2）、リンファニブ（ABT869、CAS 796967-16-3）、カボザンチニブ（XL184、CAS 849217-68-1）、レスタウルチニブ（CAS 111358-88-4）、N-[5-[[[5-（1,1-ジメチルエチル）-2-オキサゾリル]メチル]チオ]-2-チアゾリル]-4-ピペリジンカルボキサミド（BMS38703、CAS 345627-80-7）、（3R,4R）-4-アミノ-1-（（4-（（3-メトキシフェニル）アミノ）ピロロ[2,1-f][1,2,4]トリアジン-5-イル）メチル）ピペリジン-3-オール（BMS690514）、N-（3,4-ジクロロ-2-フルオロフェニル）-6-メトキシ-7-[[（3aα,5β,6aα）-オクタヒドロ-2-メチルシクロペンタ[c]ピロル-5-イル]メトキシ]-4-キナゾリンアミン（XL647、CAS 781613-23-8）、4-メチル-3-[[1-メチル-6-（3-ピリジニル）-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-イル]アミノ]-N-[3-（トリフルオロメチル）フェニル]-ベンズアミド（BHG712、CAS 940310-85-0）、およびアフリベルセプト（EYLEA）（ただしこれらに限定されない）。
【０１８６】
いくつかの実施態様では、本発明の組成物はPI3K阻害剤とともに処方される。ある実施態様では、PI3K阻害剤は、PI3Kのデルタおよびガンマアイソフォームの阻害剤である。組み合わせて使用できる例示的なPI3K阻害剤は、例えばWO2010/036380、WO2010/006086、WO09/114870、WO05/113556（それらの内容は参照によって本明細書に含まれる）に記載される。適切には、PI3K阻害剤には以下が含まれる：4-[2-（1H-インダゾール-4-イル）-6-[[4-（メチルスルフォニル）ピペラジン-1-イル]メチル]チエノ[3,2-d]ピリミジン-4-イル]モルフォリン（GDC-0941としても知られている（国際PCT公開公報WO 09/036082およびWO 09/055730に記載））、2-メチル-2-[4-[3-メチル-2-オキソ-8-（キノリン-3-イル）-2,3-ジヒドロイミダゾ[4,5-c]キノリン-1-イル]フェニル]プロピオニトリル（BEZ235またはNVP-BEZ 235（国際PCT公開公報WO06/122806に記載））；4-（トリフルオロメチル）-5-（2,6-ジモルフォリノピリミジン-4-イル）ピリジン-2-アミン（BKM120またはNVP-BKM120（国際PCT公開公報WO2007/084786に記載））、トザセルチブ（VX680またはMK-0457、CAS 639089-54-6）；（5Z）-5-[[4-（4-ピリジニル）-6-キノリニル]メチレン]-2,4-チアゾリジンジオン（GSK1059615、CAS 958852-01-2）；（1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR）-5-（アセチルオキシ）-1-[（ジ-2-プロペニルアミノ）メチレン]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-オクタヒドロ-11-ヒドロキシ-4-（メトキシメチル）-4a,6a-ジメチル-シクロペンタ[5,6]ナフト[1,2-c]ピラン-2,7,10（1H）-トリオン（PX866、CAS 502632-66-8）；8-フェニル-2-（モルフォリン-4-イル）-クロメン-4-オン（LY294002、CAS 154447-36-6）、2-アミノ-8-エチル-4-メチル-6-（1H-ピラゾル-5-イル）ピリド[2,3-d]ピリミジン-7（8H）-オン（SAR 245409またはXL 765）、1,3-ジヒドロ-8-（6-メトキシ-3-ピリジニル）-3-メチル-1-[4-（1-ピペラジニル）-3-（トリフルオロメチル）フェニル]-2H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-2-オン、（2Z）-2-ブテンジオエート（1:1）（BGT 226）、5-フルオロ-3-フェニル-2-[（1S）-1-（9H-プリン-6-イルアミノ）エチル]-4（3H）-キナゾリノン（CAL101）、2-アミノ-N-[3-[N-[3-[（2-クロロ-5-メトキシフェニル）アミノ]キノキサリン-2-イル]スルファモイル]フェニル]-2-メチルプロパンアミド（SAR 245408またはXL 147）、および（S）-ピロリジン-1,2-ジカルボン酸2-アミド1-（{4-メチル-5-[2-（2,2,2-トリフルオロ-1,1-ジメチル-エチル）-ピリジン-4-イル]-チアゾール-2-イル}-アミド）（BYL719）。
【０１８７】
いくつかの実施態様では、本明細書に開示する組成物はmTOR阻害剤とともに処方され、前記阻害剤は、例えば以下の1つ以上から選択される1つ以上のmTORである：ラパマイシン、テムシロリムス（TORISEL）、AZD8055、BEZ235、BGT226、XL765、PF-4691502、GDC0980、SF1126、OSI-027、GSK1059615、KU-0063794、WYE-354、Palomid 529（P529）、PF-04691502、またはPKI-587、リダフォロリムス（正式にはデフェロリムス、（1R,2R,4S）-4-[（2R）-2 [（1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R）-1,18-ジヒドロキシ-19,30-ジメトキシ-15,17,21,23,29,35-ヘキサメチル-2,3,10,14,20-ペンタオキソ-11,36-ジオキサ-4-アザトリシクロ[30.3.1.04,9]ヘキサトリアコンタ-16,24,26,28-テトラエン-12-イル]プロピル]-2-メトキシシクロヘキシルジメチルフォスフィネートとして知られ、AP23573およびMK8669としてもまた知られ、さらにPCT公開WO03/064383に記載されているもの）、エベロリムス（ARINITORまたはRAD001）、ラパマイシン（AY22989、SIROLIMUS）、シマピモド（CAS 164301-51-3）、エムシロリムス（5-{2,4-ビス[（3S）-3-メチルモルフォリン-4-イル]ピリド[2,3-d]ピリミジン-7-イル}-2-メトキシフェニル）メタノール（AZD8055）、2-アミノ-8-[trans-4-（2-ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル]-6-（6-メトキシ-3-ピリジニル）-4-メチル-ピリド[2,3-d]ピリミジン-7（8H）-オン（PF04691502、CAS 1013101-36-4）、およびN2-[1,4-ジオキソ-4-[[4-（4-オキソ-8-フェニル-4H-1-ベンゾピラン-2-イル）モルフォリニウム-4-イル]メトキシ]ブチル]-L-アルギニルグリシル-L-α-アスパルチルL-セリン-、分子内塩（SF1126、CAS 936487-67-1）、（1r,4r）-4-（4-アミノ-5-（7-メトキシ-1H-インドール-2-イル）イミダゾ[1,5-f][1,2,4]トリアジン-7-イル）シクロヘキサンカルボン酸（OSI-027）；およびXL765。
【０１８８】
いくつかの実施態様では、本発明の組成物は、BRAF阻害剤、例えばGSK2118436、RG7204、PLX4032、GDC-0879、PLX4720およびソラフェニブトシレート（Bay 43-9006）と組合わせて用いることができる。更なる実施態様では、BRAF阻害剤には以下が含まれる：レゴラフェニブ（BAY73-4506、CAS 755037-03-7）、ツビザニブ（AV951、CAS 475108-18-0）、ベムラフェニブ（ZELBORAF, PLX-4032, CAS 918504-65-1）、エンコラフェニブ（LGX818としても知られている）、1-メチル-5-[[2-[5-（トリフルオロメチル）-1H-イミダゾール-2-イル]-4-ピリジニル]オキシ]-N-[4-（トリフルオロメチル）フェニル-1H-ベンゾイミダゾル-2-アミン（RAF265、CAS 927880-90-8）、5-[1-（2-ヒドロキシエチル）-3-（ピリジン-4-イル）-1H-ピラゾール-4-イル]-2,3-ジヒドロインデン-1-オンオキシム（GDC-0879、CAS 905281-76-7）、5-[2-[4-[2-（ジメチルアミノ）エトキシ]フェニル]-5-（4-ピリジニル）-1H-イミダゾール-4-イル]-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-オンオキシム（GSK2118436またはSB590885）、（+/-）-メチル（5-（2-（5-クロロ-2-メチルフェニル）-1-ヒドロキシ-3-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-イソインドール-1-イル）-1H-ベンゾイミダゾル-2-イル）カルバメート（XL-281およびBMS908662としても知られている）、およびN-（3-（5-クロロ-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-3-カルボニル）-2,4-ジフルオロフェニル）プロパン-1-スルフォンアミド（PLX4720としても知られている）（ただしこれらに限定されない）。
【０１８９】
本発明の組成物はまたMEK阻害剤と組合わせて用いることができる。以下を含む任意のMEK阻害剤を組合わせて用いることができる：セルメチニブ（5-[（4-ブロモ-2-クロロフェニル）アミノ]-4-フルオロ-N-（2-ヒドロキシエトキシ）-1-メチル-1H-ベンゾイミダゾール-6-カルボキサミド（AZD6244またはARRY 142886（PCT公開公報WO2003/077914に記載））、トラメチニブジメチルスルフォキシド（GSK-1120212、CAS 1204531-25-80）、RDEA436、N-[3,4-ジフルオロ-2-[（2-フルオロ-4-ヨードフェニル）アミノ]-6-メトキシフェニル]-1-[（2R）-2,3-ジヒドロオキシプロピル]-シクロプロパンスルフォンアミド（RDEA119またはBAY869766（PCT公開公報WO2007/014011に記載））、AS703026、BIX 02188、BIX 02189、2-[（2-クロロ-4-ヨードフェニル）アミノ]-N-（シクロプロピルメトキシ）-3,4-ジフルオロ-ベンズアミド（CI-1040またはPD184352としても知られている（PCT公開公報WO2000/035436に記載））、N-[（2R）-2,3-ジヒドロキシプロポキシ]-3,4-ジフルオロ-2-[（2-フルオロ-4-ヨードフェニル）アミノ]-ベンズアミド（PD0325901（PCT公開WO2002/006213に記載））2’-アミノ-3’-メトキシフラボン（PD98059）、2,3-ビス[アミノ[（2-アミノフェニル）チオ]メチレン]-ブタンジニトリル（U0126（米国特許2,779,780号に記載））、XL-518（GDC-0973、Cas No. 1029872-29-4）、G-38963、およびG02443714（AS703206としても知られている）、または前記の医薬的に許容できる塩もしくは溶媒和化合物（ただしこれらに限定されない）。他のMEK阻害剤はWO2013/019906、WO03/077914、WO2005/121142、WO2007/04415、WO2008/024725およびWO2009/085983に記載されている（前記文献の内容は参照によって本明細書に含まれる）。MEK阻害剤の更なる例には以下が含まれる：ベニメチニブ（6-（4-ブロモ-2-フルオロフェニルアミノ）-7-フルオロ-3-メチル-3H-ベンゾイミダゾール-5-カルボン酸（2-ヒドロキシエトキシ）-アミド（MEK162、CAS 1073666-70-2（PCT公開公報WO2003/077914に記載））、2,3-ビス[アミノ[（2-アミノフェニル）チオ]メチレン]-ブタンジニトリル（U0126（米国特許2,779,780号に記載））、（3S,4R,5Z,8S,9S,11E）-14-（エチルアミノ）-8,9,16-トリヒドロキシ-3,4-ジメチル-3,4,9,19-テトラヒドロ-1H-2-ベンゾキサシクロテトラデシン-1,7（8H）-ジオン]（E6201（PCT公開WO2003/076424に記載））、ベヌラフェニブ（PLX-4032、CAS 918504-65-1）、（R）-3-（2,3-ジヒドロキシプロピル）-6-フルオロ-5-（2-フルオロ-4-ヨードフェニルアミノ）-8-メチルピリド[2,3-d]ピリミジン-4,7（3H,8H）-ジオン（TAK-733、CAS 1035555-63-5）、ピマセルチブ（AS-703026、CAS 1204531-26-9）、2-（2-フルオロ-4-ヨードフェニルアミノ）-N-（2-ヒドロキシエトキシ）-1,5-ジメチル-6-オキソ-1,6-ジヒドロピリジン-3-カルボキサミド（AZD 8330）、および3,4-ジフルオロ-2-[（2-フルオロ-4-ヨードフェニル）アミノ]-N-（2-ヒドロキシエトキシ）-5-[（3-オキソ-[1,2]オキサジナン-2-イル）メチル]ベンズアミド（CH 4987655またはRo 4987655）（ただしこれらに限定されない）。
【０１９０】
いくつかの実施態様では、本発明の組成物は、JAK2阻害剤（例えばCEP-701、INCB18424、CP-690550（タソシチニブ））と一緒に投与される。例示的なJAK阻害剤には以下が含まれる：ルクソリチニブ（JAKAFI）、トファシニチブ（CP690550）、アキシチニブ（AG013736、CAS 319460-85-0）、5-クロロ-N2-[（1S）-1-（5-フルオロ-2-ピリミジニル）エチル]-N4-（5-メチル-1H-ピラゾール-3-イル）-l2,4-ピリミジンジアミン（AZD1480、CAS 935666-88-9）、（9E）-15-[2-（1-ピロリジニル）エトキシ]-7,12,26-トリオキサ-19,21,24-トリアザテトラシクロ[18.3.1.12,5.114,18]-ヘキサコサ-1（24）,2,4,9,14,16,18（25）,20,22-ノナエン（SB-1578、CAS 937273-04-6）、モメロチニブ（CYT 387）、バリシチニブ（INCB-028050またはLY-3009104）、パクリチニブ（SB1518）、（16E）-14-メチル-20-オキサ-5,7,14,27-テトラアザテトラシクロ[19.3.1.12,6.18,12]ヘプタコサ-1（25）,2,4,6（27）,8,10,12（26）,16,21,23-デカン（SB 1317）、ガンドチニブ（LY 2784544）、およびN,N-シシクロプロピル-4-[（1,5-ジメチル-1H-ピラゾル-3-イル）アミノ]-6-エチル-1,6-ジヒドロ-1-メチル-イミダゾ[4,5-d]ピロロ[2,3-b]ピリジン-7-カルボキサミド（BMS 911543）（ただしこれらに限定されない）。
さらに他の実施態様では、本発明の組成物は、ワクチン（例えば樹状細胞腎癌（DC-RCC）ワクチン）と併用して投与される。ある種の実施態様では、医薬組成物とDC-RCCワクチンとの組合せを用いて、癌、例えば本明細書に記載する癌（例えば腎癌、例えば転移腎細胞癌腫（RCC）または明細胞腎細胞癌腫（CCRCC））が治療される。
【０１９１】
さらに他の実施態様では、本明細書に記載する医薬組成物は、化学療法および/または免疫療法と併用して投与することができる。例えば、骨髄腫を治療するために当該組成物を単独でまたは以下の1つ以上と組合わせて用いることができる：化学療法または他の抗癌剤（例えばサリドマイドアナログ、例えばレナリドミド）、抗TM3抗体、腫瘍抗原パルス処理樹状細胞、腫瘍細胞および樹状細胞の融合（電気的融合）、または悪性形質細胞によって生成された免疫グロブリンイディオタイプによるワクチン免疫。ある実施態様では、当該組成物を抗TIM-3抗体と組合わせて用い、骨髄腫（例えば多発性骨髄腫）を治療することができる。
いくつかの実施態様では、本発明の組成物を化学療法と組合わせて用い、肺癌（例えば非小細胞肺癌）を治療する。いくつかの実施態様では、肺癌を治療するために、当該医薬組成物は白金ダブレット療法と一緒に用いられる。
さらに別の実施態様では、本明細書に開示する医薬組成物を用いて、腎癌、例えば腎細胞癌腫（RCC）（例えば明細胞腎細胞癌腫（CCRCC）または転移RCC）を治療することができる。抗PD-1またはPD-L1抗体分子は以下の1つ以上と併用して投与することができる：免疫系手法（例えばインターロイキン-2またはインターフェロン-γ）、標的誘導薬剤（例えばVEGF阻害剤、例えばVEGFに対するモノクローナル抗体；VEGFチロシンキナーゼ阻害剤（例えばスニチニブ、ソラフェニブ、アキシチニブおよびパゾパニブ）；RNAi阻害剤；またはVEGFシグナリングの下流媒介因子の阻害剤、例えばラパマイシンの哺乳動物標的（mTOR）の阻害剤、例えばエベロリムスおよびテムシロリムス。
【０１９２】
膵臓癌の治療のために、組合わせて用いられる適切な補助治療薬の例には以下が含まれる：化学療法剤、パクリタキセルまたはパクリタキセル系薬剤（例えばパクリタキセル処方物、たとえばTAXOL、アルブミン安定化ナノ粒子パクリタキセル処方物（例えばABRAXANE）またはリポソームパクリタキセル処方物）、ゲムシタビン（例えばゲムシタビン単独またはAXP107-11併用）、他の化学療法剤、例えばオキサリプラチン、5-フルオロウラシル、カペシタビン、ルビテカン、エピルビシン塩酸塩、NC-6004、シスプラチン、ドセタキセル（例えばTAXOTERE）、マイトマイシンC、イフォスファミド、インターフェロン、チロシンキナーゼ阻害剤（例えばEGFR阻害剤（例えばエルロチニブ、パニツムマブ、セツキシマブ、ニモツズマブ）、HER2/neu受容体阻害剤（例えばトラスツズマブ）、二重キナーゼ阻害剤（例えばボスチニブ、サラカチニブ、ラパチニブ、バンデタニブ）、マルチキナーゼ阻害剤（例えばソラフェニブ、スニチニブ、XL184、パゾパニブ）VEGF阻害剤（例えばベバシズマブ、AV-951、ブリバニブ）、放射性免疫療法（例えばXR303）、癌ワクチン（例えばGVAX、スルビビンペプチド）、COX-2阻害剤（例えばセレコキシブ）、IGF-1受容体阻害剤（例えばAMG 479、MK-0646）、mTOR阻害剤（例えばエベロリムス、テムシロリムス）、IL-6阻害剤（例えばCNTO 328）、サイクリン依存キナーゼ阻害剤（例えばP276-00、UCN-01）、改変エネルギー代謝指向（AEMD）化合物（例えばCPI-613）、HDAC阻害剤（例えばボリノスタット）、TRAIL受容体2（TR-2）アゴニスト（例えばコナツムマブ）、MEK阻害剤（例えばAS703026、セルメチニブ、GSK1120212）、Raf/MEK二重キナーゼ阻害剤（例えばRO5126766）、ノッチシグナリング阻害剤（例えばMK0752）、モノクローナル抗体-抗体融合タンパク質（例えばL19IL2）、クルクミン、HSP90阻害剤（例えばタネスピマイシン、STA-9090）、rIL-2、デニロイキンジフチトクス、トポイソメラーゼ1阻害剤（例えばイリノテカン、PEP02）、スタチン（例えばシムバスタチン）、第VIIa因子阻害剤（例えばPCI-27483）、AKT阻害剤（例えばRX-0201））、低酸素症活性化プロドラッグ（例えばTH-302）、メトフォルミン塩酸塩、ガンマ-セクレターゼ阻害剤（例えばRO4929097）、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤（例えば3-AP）、イムノトキシン（例えばHuC242-DM4）、PARP阻害剤（例えばKU-0059436、ベリパリブ）、CTLA-4阻害剤（例えばCP-675,206、イピリムマブ）、AdV-tk療法、プロテアソーム阻害剤（例えばボルテゾミブ（Velcade）、NPI-0052）、チアゾリジンジオン（例えばピオグリタゾン）、NPC-1C、オーロラキナーゼ阻害剤（例えばR763/AS703569）、CTGF阻害剤（例えばFG-3019）、siG12D LODER、および放射線療法（例えば, and radiation therapy （e.ｇ.,トモテラピー、定位放射線照射、プロトン療法）、外科手術、および前記の組合せ（ただし前記に限定されない）。ある種の実施態様では、パクリタキセルまたはパクリタキセル系薬剤およびゲムシタビンの組合せを、本明細書に記載する医薬組成物と一緒に用いることができる。
【０１９３】
小細胞肺癌の治療に組合わせて用いられる適切な治療の例には以下が含まれる：化学療法剤（例えばエトポシド、カルボプラチン、シスプラチン、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、リポソームSN-38、ベンダムスチン、テモゾロミド、ベロテカン、NK012、FR901228、フラボピリドール）、チロシンキナーゼ阻害剤、例えばEGFR阻害剤（例えばエルロチニブ、ゲフチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ）、マルチキナーゼ阻害剤（例えばソラフェニブ、スニチニブ）、VEGF阻害剤（例えばベバシズマブ、バンデタニブ）、癌ワクチン（例えばGVAX）、Bcl-2阻害剤（例えばオブリメルセンナトリウム、ABT-263）、プロテアソーム阻害剤（例えばボルテゾミブ（Velcade）、NPI-0052）、パクリタキセルまたはパクリタキセル系薬剤、ドセタキセル、IGF-1受容体阻害剤（例えばAMG 479）、HGF/SF阻害剤（例えばAMG 102、MK-0646）、クロロキン、オーロラキナーゼ阻害剤（例えばMLN8237）、放射性免疫療法（例えばTF2）、HSP90阻害剤（例えばタネスピマイシン、STA-9090）、mTOR阻害剤（例えばエベロリムス）、Ep-CAM-/CD3-二重特異性抗体（例えばMT110）、CK-2阻害剤（例えばCX-4945）、HDAC阻害剤（例えばベリノスタット）、SMOアンタゴニスト（例えばBMS 833923）、ペプチド癌ワクチン、および放射線療法（例えば強度調整放射線療法（IMRT）、小分割放射線療法）、外科手術、および/または前記の組合せ（ただし前記に限定されない）。
【０１９４】
非小細胞肺癌の治療に組合わせて用いられる適切な治療の例には以下が含まれる：化学療法剤（例えばビノレルビン、シスプラチン、ドセタキセル、ペメトレキセド二ナトリウム、エトポシド、ゲムシタビン、カルボプラチン、リポソームSN-38、TLK286、テモゾロミド、トポテカン、ペメトレキセド二ナトリウム、アザシチジン、イリノテカン、テガフル-ギメラシル-オテラシルカリウム、サパシタビン）、チロシンキナーゼ阻害剤、例えばEGFR阻害剤（例えばエルロチニブ、ゲフィチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ネシツムマブ、PF-00299804、ニモツズマブ、RO5083945）、MET阻害剤（例えばPF-02341066、ARQ 197）、PI3K阻害剤（例えばXL147、GDC-0941）、Raf/MEK二重キナーゼ阻害剤（例えばRO5126766）、PI3K/mTOR二重キナーゼ阻害剤（例えばXL765）、SRC阻害剤（例えばダサチニブ）、二重阻害剤（例えばBIBW 2992、GSK1363089、ZD6474、AZD0530、AG-013736、ラパチニブ、MEHD7945A、リニファニブ）、マルチキナーゼ阻害剤（例えばソラフェニブ、スニチニブ、パゾパニブ、AMG 706、XL184、MGCD265、BMS-690514、R935788）、VEGF阻害剤（例えばエンドスター、エンドスタチン、ベバシズマブ、セディラニブ、BIBF 1120、アキシチニブ、チボザニブ、AZD2171）、癌ワクチン（例えばBLP25リポソームワクチン、GVAX、組換えDNAおよびアデノウイルス発現L523Sタンパク質）、Bcl-2阻害剤（例えばオブリメルセンナトリウム）、プロテアソーム阻害剤（例えばボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、NPI-0052、MLN9708）、パクリタキセルまたはパクリタキセル系薬剤、ドセタキセル、IGF-1受容体阻害剤（例えばシクスツムマブ、MK-0646、OSI 906、CP-751、871、BIIB022）、ヒドロキシクロロキン、HSP90阻害剤（例えばタネスピマイシン、STA-9090、AUY922、XL888）、mTOR阻害剤（例えばエベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス）、Ep-CAM-/CD3-二重特異性抗体（例えばMT110）、CK-2阻害剤（例えばCX-4945）、HDAC阻害剤（例えばMS 275、LBH589、ボリノスタット、バルプロ酸、FR901228）、DHFR阻害剤（例えばプララトレキセート）、レチノイド（例えばベキサロテン、トレチノイン）、抗体-薬剤複合体（例えばSGN-15）、ビスホスホネート（例えばゾレドロン酸）、癌ワクチン（例えばベラゲンプマツセル-L）、低分子量ヘパリン（LMWH）（例えばチンザパリン、エノキサパリン）、GSK1572932A、メラトニン、タラクトフェリン、ジメンサ、トポイソメラーゼ阻害剤（例えばアムルビシン、エトポシド、カレニテシン）、ネルフィナビル、シレンジチド、ErbB3阻害剤（例えばMM-121、U3-1287）、サバイビン阻害剤（例えばYM155、LY2181308）、エリブリンメシレート、COX-2阻害剤（例えばセレコキシブ）、ペグフィルグラスチム、ポロ様キナーゼ1阻害剤（例えばBI 6727）、TRAIL受容体2（TR-2）アゴニスト（例えばCS-1008）、CNGRCペプチド−TNFアルファ複合体、ジクロロアセテート（DCA）、HGF阻害剤（例えばSCH 900105）、SAR240550、PPAR-ガンマアゴニスト（例えばCS-7017）、ガンマ-セクレターゼ阻害剤（例えばRO4929097）、エピジェネティック療法（例えば5-アザシチジン）、ニトログリセリン、MEK阻害剤（例えばAZD6244）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（例えばUCN-01）、コレステロール-Fus1、抗チューブリン剤（例えばE7389）、ファルネシル-OH-トランスフェラーゼ阻害剤（例えばロナファルニブ）、イムノトキシン（例えばBB-10901、SS1 （dsFv） PE38）、フォンダパリヌクス、血管破壊剤（例えばAVE8062）、PD-L1阻害剤（例えばMDX-1105、MDX-1106）、ベータ-グルカン、NGR-hTNF、EMD 521873、MEK阻害剤（例えばGSK1120212）、エポシロンアナログ（例えばイキサベピロン）、キネシン-スピンドル阻害剤（例えば4SC-205）、テロメア標的剤（例えばKML-001）、P70経路阻害剤（例えばLY2584702）、AKT阻害剤（例えばMK-2206）、血管新生阻害剤（例えばレナリドミド）、ノッチシグナリング阻害剤（例えばOMP-21M18）、放射線療法、外科手術、および前記の組合せ（ただしこれらに限定されない）。
【０１９５】
卵巣癌の治療に組合わせて用いられる適切な治療の例には以下が含まれる：化学療法剤（例えばパクリタキセルまたはパクリタキセル系薬剤、ドセタキセル、カルボプラチン、ゲムシタビン、ドキソルビシン、トポテカン、シスプラチン、イリノテカン、TLK286、イフォスファミド、オラパリブ、オキサリプラチン、メルファラン、ペメトレキセド二ナトリウム、SJG-136、シクロフォスファミド、エトプシド、デシタビン）、グレリンアンタゴニスト（例えばAEZS-130）、免疫療法（例えばAPC8024、オレゴボマブ、OPT-821）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えばEGFR阻害剤（例えばエルロチニブ）、二重阻害剤（例えばE7080）、マルチキナーゼ阻害剤（例えばAZD0530、JI-101、ソラフェニブ、スニチニブ、パゾパニブ）、ON 01910.Na、VEGF阻害剤（例えばベバシズマブ、BIBF 1120、セディラニブ、AZD2171）、PDGFR阻害剤（例えばIMC-3G3）、パクリタキセル、トポイソメラーゼ阻害剤（例えばカレニテシン、イリノテカン）、HDAC阻害剤（例えばバルプロエート、ボリノスタット）、葉酸受容体阻害剤（例えばファルレツズマブ）、アンギオポエチン阻害剤（例えばAMG 386）、エポシロンアナログ（例えばイキサベピロン）、プロテアソーム阻害剤（例えばカルフィルゾミブ）、IGF-1受容体阻害剤（例えばOSI 906、AMG 479）、PARP阻害剤（例えばベリパリブ、AG014699、イニパリブ、MK-4827）、オーロラキナーゼ阻害剤（例えばMLN8237、ENMD-2076）、血管新生阻害剤（例えばレナリドミド）、DHFR阻害剤（例えばプララトレキセート）、放射性免疫療法剤（例えばHu3S193）、スタチン（例えばロバスタチン）、トポイソメラーゼ1阻害剤（例えばNKTR-102）、癌ワクチン（例えばp53合成長ペプチドワクチン、自家性OC-DCワクチン）、mTOR阻害剤（例えばテムシロリムス、エベロリムス）、BCR/ABL阻害剤（例えばイマチニブ）、ET-A受容体アンタゴニスト（例えばZD4054）、TRAIL受容体2（TR-2）アゴニスト（例えばCS-1008）、HGF/SF阻害剤（例えばAMG 102）、EGEN-001、ポロ様キナーゼ1阻害剤（例えばBI 6727）、ガンマ-セクレターゼ阻害剤（例えばRO4929097）、Wee-1阻害剤（例えばMK-1775）、抗チューブリン剤（例えばビノレルビン、E7389）、イムノトキシン（例えばデニロイキンジフチトクス）、SB-485232、血管破壊剤（例えばAVE8062）、インテグリン阻害剤（例えばEMD 525797）、キネシンスピンドル阻害剤（例えば4SC-205）、レブリミド、HER2阻害剤（例えばMGAH22）、ErrB3阻害剤（例えばMM-121）、放射線療法、および前記の組合せ（ただしこれらに限定されない）。
【０１９６】
骨髄腫の治療（単独または併用療法がある）に組合わせて用いられる適切な治療の例には以下が含まれる：化学療法または他の抗癌剤（例えばサリドマイドアナログ、例えばレナリドミド）、HSCT（Cook, R. （2008） J Manaｇ Care Pharm. 14（7 Suppl）:19-25）、抗TIM3抗体（Hallett, WHD et al. （2011） J of American Society for Blood and Marrow Transplantation 17（8）:1133-145）、腫瘍抗原パルス処理樹状細胞、腫瘍細胞と樹状細胞との融合（例えば電気的融合）、または悪性形質細胞によって生成された免疫グロブリンイディオタイプによるワクチン免疫（以下で概括される：Yi, Q. （2009） Cancer J. 15（6）:502-10）。
慢性リンパ球性白血病（CLL）の治療に本発明の組成物とともに用いられる適切な治療の例には以下が含まれる：化学療法剤（例えばフルダラビン、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、クロラムブシル、ベンダムスチン、クロラムブシル、ブスルファン、ゲムシタビン、メルファラン、ペントスタチン、ミトキサントロン、5-アザシチジン、ペメトレキセド二ナトリウム）、チロシンキナーゼ阻害剤、例えばEGFR阻害剤（例えばエルロチニブ）、BTK阻害剤（例えばPCI-32765）、マルチキナーゼ阻害剤（例えばMGCD265、RGB-286638）、CD-20標的薬剤（例えばリツキシマブ、オファツムマブ、RO5072759、LFB-R603）、CD52標的薬剤（例えばアレムツズマブ）、プレドニゾロン、ダルベポエチンアルファ、レナリドミド、Bcl-2阻害剤（例えばABT-263）、免疫療法（例えばアロジェニックCD4+メモリーTh1様T細胞/微粒子結合抗CD3/抗CD28、自家サイトカイン誘導キラー細胞（CIK））、HDAC阻害剤（例えばボリノスタット、バルプロ酸、LBH589、JNJ-26481585、AR-42）、XIAP阻害剤（例えばAEG35156）、CD-74標的薬剤（例えばミラツズマブ）、mTOR阻害剤（例えばエベロリムス）、AT-101、イムノトキシン（例えばCAT-8015、抗Tac（Fv）-PE38（LMB-2））、CD37標的薬剤（例えばTRU-016）、放射性免疫療法（例えば131-トシツモマブ）、ヒドロキシクロロキン、ペリフォシン、SRC阻害剤（例えばダサチニブ）、サリドマイド、PI3Kデルタ阻害剤（例えばCAL-101）、レチノイド（例えばフェンレチノイド）、MDM2アンタゴニスト（例えばRO5045337）、プレリキサホル、オーロラキナーゼ阻害剤（例えばMLN8237、TAK-901）、プロテアソーム阻害剤（例えばボルテゾミブ）、CD-19標的薬剤（例えばMEDI-551、MOR208）、MEK阻害剤（例えばABT-348）、JAK-2阻害剤（例えばINCB018424）、低酸素活性化プロドラッグ（例えばTH-302）、パクリタキセルまたはパクリタキセル系薬剤、HSP90阻害剤、AKT阻害剤（例えばMK2206）、HMG-CoA阻害剤（例えばシムバスタチン）、GNKG186、放射線療法、骨髄移植、幹細胞移植、および前記の組合せ（ただし前記に限定されない）。
【０１９７】
急性リンパ球性白血病（ALL）の治療に組合わせて用いられる適切な治療の例には以下が含まれる：化学療法剤（例えばプレドニゾロン、デキサメタゾン、ビンクリスチン、アスパラギナーゼ、ダウノルビシン、シクロフォスファミド、シタラビン、エトポシド、チオグアニン、メルカプトプリン、クロファラビン、リポソームアンナマイシン、ブスルファン、エトポシド、カペシタビン、デシタビン、アザシチジン、トポテカン、テモゾロミド）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えばBCR/ABL阻害剤（例えばイマチニブ、ニロチニブ））、ON 01910.Na）、マルチキナーゼ阻害剤（例えばソラフェニブ）、CD-20標的薬剤（例えばリツキシマブ）、CD52標的薬剤（例えばアレムツズマブ）、HSP90阻害剤（例えばSTA-9090）、mTOR阻害剤（例えばエベロリムス、ラパマイシン）、JAK-2阻害剤（例えばINCB018424）、HER2/neu受容体阻害剤（例えばトラスツズマブ）、プロテアソーム阻害剤（例えばボルテゾミブ）、メトトレキセート、アスパラギナーゼ、CD-22標的薬剤（例えばエプラツズマブ、イノツズマブ）、免疫療法（例えば自家サイトカイン誘導キラー細胞（CIK）、AHN-12）、ブリナツモマブ、サイクリン依存キナーゼ阻害剤（例えばUCN-01）、CD45標的薬剤（例えばBC8）、MDM2アンタゴニスト（例えばRO5045337）、イムノトキシン（例えばCAT-8015、DT2219ARL）、HDAC阻害剤（例えばJNJ-26481585）、JVRS-100、パクリタキセルまたはパクリタキセル系薬剤、STAT3阻害剤（例えばOPB-31121）、PARP阻害剤（例えばベリパリブ）、EZN-2285、放射線療法、ステロイド、骨髄移植、幹細胞移植、または前記の組合せ（ただしこれらに限定されない）。
【０１９８】
急性骨髄性白血病（AML）の治療に組合わせて用いられる適切な治療の例には以下が含まれる：化学療法剤（例えばシタラビン、ダウノマイシン、イダルビシン、クロファラビン、デシタビン、ボサロキシン、アザシチジン、クロファラビン、リバビリン、CPX-351、トレオスルファン、エラシタラビン、アザシチジン）。チロシンキナーゼ阻害剤（例えばBCR/ABL阻害剤（例えばイマチニブ、ニロチニブ）、ON 01910.Na、マルチキナーゼ阻害剤（例えばミドスタウリン、SU 11248、キザルチニブ、ソラフィニブ））イムノトキシン（例えばゲムツズマブオゾガミシン）、DT388IL3融合タンパク質、HDAC阻害剤（例えばボリノスタット、LBH589）、プレリキサホル、mTOR阻害剤（例えばエベロリムス）、SRC阻害剤（例えばダサチニブ）、HSP90阻害剤（例えばSTA-9090）、レチノイド（例えばベキサロテン）、オーロラキナーゼ阻害剤（例えばBI 811283）、JAK-2阻害剤（例えばINCB018424）、ポロ様キナーゼ阻害剤（例えばBI-6727）、セネルセン、CD45標的薬剤（例えばBC8）、シクリン依存キナーゼ阻害剤（例えばUCN-01）、MDM2アンタゴニスト（例えばRO5045337）、mTOR阻害剤（例えばエベロリムス）、LY573636-ナトリウム、ZRx-101、MLN4924、レナリドミド、免疫療法（例えばAHN-12）、ヒスタミン二塩酸塩、放射線療法、骨髄移植、幹細胞移植、および前記の組合せ（ただしこれらに限定されない）。
【０１９９】
多発性骨髄腫（MM）の治療に本発明の組成物とともに用いられる適切な治療の例には以下が含まれる：化学療法剤（例えばメルファラン、アミフォスチン、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、クロファラビン、ベンダムスチン、フルダラビン、アドリアマイシン、SyB L-0501）、サリドマイド、レナリドミド、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ポマリドミド、プロテアソーム阻害剤（例えばボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、MLN9708）、癌ワクチン（例えばGVAX）、CD-40標的薬剤（例えばSGN-40、CHIR-12.12）、ペリフォシン、ゾレドロン酸、免疫療法（例えばMAGE-A3、NY-ESO-1、HuMax-CD38）、HDAC阻害剤（例えばボリノスタット、LBH589、AR-42）、アプリジン、シクリン依存キナーゼ阻害剤（例えばPD-0332991、ジナシクリブ）、三酸化ヒ素、CB3304、HSP90阻害剤（例えばKW-2478）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えばEGFR阻害剤（例えばセツキシマブ）、マルチキナーゼ阻害剤（例えばAT9283））、VEGF阻害剤（例えばベバシズマブ）、プレリキサホル、MEK阻害剤（例えばAZD6244）、IPH2101、アトルバスタチン、イムノトキシン（例えばBB-10901）、NPI-0052、放射性免疫療法（例えばイットリウムY90イブリツモマブチウキセタン）、STAT3阻害剤（例えばOPB-31121）、MLN4924、オーロラキナーゼ阻害剤（例えばENMD-2076）、IMGN901、ACE-041、CK-2阻害剤（例えばCX-4945）、放射線療法、骨髄移植、幹細胞移植、および前記の組合せ（ただしこれらに限定されない）。
前立腺癌の治療に本発明の組成物とともに用いられる適切な治療の例には以下が含まれる：化学療法剤（例えばドセタキセル、カルボプラチン、フルダラビン）、アビラテロン、ホルモン療法（例えばフルタミド、ビカルタミド、ニルタミド、シプロテロン酢酸塩、ケトコナゾール、アミノグルテチミド、アバレリクス、デガレリクス、リュプロリド、ゴセレリン、トリプトレリン、ブセレリン）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば二重キナーゼ阻害剤（例えばラパタニブ）、マルチキナーゼ阻害剤（例えばソラフィニブ））、VEGF阻害剤（例えばベバシズマブ）、TAK-700、癌ワクチン（例えばBPX-101、PEP223）、レナリドミド、TOK-001、IGF-1受容体阻害剤（例えばシクスツムマブ）、TRC105、オーロラAキナーゼ阻害剤（例えばMLN8237）、プロテアソーム阻害剤（例えばボルテゾミブ）、OGX-011、放射性免疫療法（例えばHuJ591-GS）、HDAC阻害剤（例えばバルプロ酸、SB939、LBH589）、ヒドロキシクロロキン、mTOR阻害剤（例えばエベロリムス）、ドビチニブ乳酸、ジインドリルメタン、エファビレンズ、OGX-427、ゲニステイン、IMC-3G3、バフェチニブ、CP-675,206、放射線療法もしくは外科手術、または前記の組合せ（ただしこれらに限定されない）。
【０２００】
併用療法は、外科手術、放射線療法（ただし前記に限定されない）を含む現存癌治療用式の1つ以上と組合わせて実施できる。放射線療法は、例えば外部ビーム療法（照射野が設計される三次元原体照射療法を必要とする）、局所照射（例えば予め選択した標的または器官に向けられる照射）、または集束照射である。集束照射は、定位放射線手術、分割定位放射線手術、および強度調整放射線療法から成る群から選択できる。集束照射は、粒子ビーム（プロトン）、コバルト60（フォトン）、および線形加速器（ｘ線）（WO2012/177624（参照によってその全体が本明細書に含まれる）に記載）から成る群から選択される放射線源を有する。
放射線療法は、いくつかの方法の1つまたは複数の方法の1つの組合せを介して実施され得る。前記方法には、外部ビーム療法、内部放射線療法、インプラント放射線、定位放射線手術、全身性放射線療法、照射療法および永続的または一過性組織内小線源療法が含まれる。“小線源療法”という用語は、腫瘍または他の増殖組織の疾患部位の近くで体内に挿入される空間的に閉じ込められた放射性物質を介してデリバリーされる放射線療法を指す。前記用語は、放射性同位元素（例えばAt-211、I-131、I-125、Y-90、Re-186、Re-188、Sm-153、Bi-212、P-32、およびLuの放射性同位元素）（ただし前記に限定されない）への暴露を含むことが意図される。本開示の細胞コンディショナーとして使用される適切な放射線源には固体および液体の両方が含まれる。非限定的に例示すれば、放射線源は、放射性核種、例えば固体源としてI-125、I-131、Yb-169、Ir-192、固体源としてI-125、またはフォトン、ベータ粒子、ガンマ放射線、また他の治療線を放出する他の放射性核種であり得る。放射性物質はまた、放射性核種の任意の溶液で作製された液体（例えばI-125またはI-131の溶液）でもよい。或いは、放射性の液体は、固体の放射性核種（例えばAu-198、Y-90）の小粒子を含む適切な液体のスラリーを用いて生成することができる。さらにまた、放射性核種はゲルまたは放射性微小球として具体化され得る。
【０２０１】
7．治療方法
対象動物において癌を治療する方法はまた本発明によって要約される。前記方法は、上記および本明細書の他の場所で広範囲にに記載した薬剤（例えば治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子）の有効量を対象動物に投与する工程を含む。
本発明にしたがえば、RANKLに拮抗しかつ少なくとも1つのICMに拮抗する本発明の薬剤（例えば治療薬組合せまたはマルチ特異性抗原結合分子）は、癌または腫瘍と診断された後で治療的に用いられ得るか、或いは、対象動物が癌または腫瘍を発達させる前に予防的に用いられ得る。本発明は、したがって以下の（a）−（d）で使用される、RANKLおよび少なくとも1つのICMに拮抗する治療薬組合せ、マルチ特異性抗原結合分子、および医薬組成物を提供する：（a）癌の治療、（b）癌の進行の遅延、（c）癌罹患患者の生存延長、または（d）癌に対する細胞媒介免疫応答の刺激。したがって、本発明はまた以下の（a）−（d）のための方法を提供する：（a）癌の治療、（b）癌の進行の遅延、（c）癌罹患患者の生存延長、または（d）癌に対する細胞媒介免疫応答の刺激。本発明の実施により適切に治療され得る癌には、メラノーマ、乳癌、結腸癌、卵巣癌、子宮内膜および子宮の癌、胃に関する（ｇastric）または胃の癌、膵臓癌、前立腺癌、唾液腺癌、肺癌、肝細胞癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、肝臓癌（liver cancer）、膀胱癌、ヘパトーマ、直腸癌、結腸直腸癌、腎臓癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌（hepatic carcinoma）、肛門癌腫、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆管の腫瘍、頭頸部癌、扁平上皮癌が含まれる。
【０２０２】
与えられた任意の対象動物のための同時発生的かまたは逐次的な特定の用量レジメンは、患者の個々の診断された疾患または患者の病期と併せたものに基づいて確立され得る。例えば、患者が攻撃性が低い癌を有すると、または癌がより早期と診断されたら、抗RANKL薬剤とその後に続く抗ICM薬剤の同時発生的投与および/または抗RANKL薬剤とその後に続くICM薬剤の逐次投与に対して臨床的利益および/または免疫関連応答が達成される蓋然性の増加を対象動物は有することができる。また別に、患者がより攻撃性の癌を有すると、または癌がより後期であると診断されたら、患者は、前記時を同時発生的投与および/または逐次的投与に対して臨床的利益および/または免疫関連応答が達成される蓋然性の低下を有する可能性があり、したがって、前記抗RANKL薬剤および/または抗ICM薬剤療法のより高用量を投与するか、或いはより攻撃的な用量レジメンまたはどちらかの薬剤もしくは併用療法を担保することを推奨し得る。ある特徴では、抗RANKL抗原結合分子、例えばデノスマブの用量レベル増加は、個々の適用または個体のための典型的な抗RANKL薬剤用量（例えば約0.3mｇ/kｇ、約1mｇ/kｇ、約3mｇ/kｇ、約10mｇ/kｇ、約15mｇ/kｇ、約20mｇ/kｇ、約25mｇ/kｇ、約30mｇ/kｇ）よりも約10、20、30、40、50、60、70、80、90または95％を超えるか、または個々の適用または個体のための典型的な用量よりも約1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、または10倍を超える抗RANKL薬剤であろう。別の特徴では、抗ICM薬剤の用量レベル増加は、個々の適用または個体のための典型的な抗PD-1薬剤用量（例えば約0.03mｇ/kｇ、約0.1mｇ/kｇ、約0.3mｇ/kｇ、約3mｇ/kｇ、約10mｇ/kｇ、約15mｇ/kｇ、約20mｇ/kｇ、約25mｇ/kｇ、約30mｇ/kｇ；または約3mｇ、約4mｇ、約5mｇ、約6mｇ、約7mｇ、約8mｇ、約9mｇ、約10mｇ、約11mｇ、約12mｇ、約13mｇ、約14mｇ、約15mｇまたは約16mｇ）よりも約10、20、30、40、50、60、70、80、90または95％を超えるか、または個々の適用のための典型的な用量よりも約1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、または10倍を超える抗ICM薬剤であろう。
【０２０３】
抗RANKL薬剤および/または抗ICM薬剤の治療的に有効な量は、それがたとえば生物薬剤である場合には好ましくは対象動物に注射されるであろう。用いられる実際の投薬量は、患者の要件および治療される症状の重篤度に応じて変動し得る。個々の状況について適切な出発投薬量の決定は当業者の能力の範囲内であるが、ただし適応症および疾患の病期を考慮することは治療レジメンの評価に有益であろう。それにもかかわらず、任意の個々の対象動物のための具体的な用量レベルおよび投与頻度は変動可能であり、多様な要因（用いられる具体的な化合物の活性、化合物の代謝安定性および作用の長さ、患者の種、年齢、体重、一般的健康状態、性別および食事、投与態様および時期、排出速度、薬剤の組合せ、および個々の症状の重篤度を含む）に左右されることは理解されよう。治療のために好ましい対象には、動物、もっとも好ましくは哺乳動物種、例えば人間および家畜動物、例えばイヌ、ネコなどの癌患者（患畜）が含まれる。
【０２０４】
8．キット
本発明の更なる実施態様は対象動物の癌を治療するキットである。このキットは本明細書で開示する任意の医薬組成物を含む。
本発明のキットで使用するために、医薬組成物は、適切な治療薬組合せおよび/またはマルチ特異性抗原結合分子、および場合によって癌治療のための指示を含む。キットはまた、対象動物に医薬組成物を投与する際に使用するために、各医薬組成物および同封の他の試薬のための適切な貯蔵容器（例えばアンプル、バイアル、チューブなど）を含む。医薬組成物および他の試薬は、任意の都合の良い形態で（例えば医薬組成物の溶液または散剤で）存在し得る。キットはさらにまた包装容器を含むことができ、場合によって前記は、医薬組成物および他の随意の試薬を収納する1つ以上の仕切りを有する。
本発明を容易に理解し実行するために、個々の好ましい実施態様が、非限定的な以下の例によってこれから記述されるであろう。
【実施例１】
【０２０５】
CTLA4およびRANKLの共同封鎖による肺転移の抑制はNK細胞およびIFN-ガンマに左右される
実験的B16F10メラノーマ肺転移を有するマウスで、ハムスター抗CTLA4（UC10-4F10）および抗RANKL（IK22/5）MAbの組合せで治療された野生型（WT）マウスは、いずれかの抗体だけまたはコントロール免疫グロブリン（cIｇ）で治療されたマウスと比較して転移に対して優れた転移耐性を示した（図1A）。抗CTLA4および抗RANKL併用療法の作用メカニズムを、CD8+もしくはNK細胞を枯渇させた野生型マウスまたはパーフォリンもしくはIFNγ欠損マウスで決定した。図1Bに示すように、併用の有効性はNK細胞の存在を必要としたがCD8+ T細胞を必要とせず、さらにIFNγは重要でありパーフォリンの重要度はIFNγよりも低かった（図1C）。NK細胞に対する同様な依存性は、前記と同じ動物を抗CTLA4および抗RANKL併用療法で治療後に前立腺癌腫RM-1の実験的肺転移の効果的な制御で示された（図1D）。
【実施例２】
【０２０６】
抗RANKLはIｇG2aアイソタイプのCTLA4抗体と最適な相乗作用を示す
抗CTLA4の免疫グロブリン定常領域が抗腫瘍活性に影響すると報告されたので（Selby et al., 2013, Cancer Immunol. Res., 1（1）:32-42）、次に本発明者らは、実験的B16F10肺転移の抑制における抗RANKLとの相乗作用に種々の抗CTLA4抗体アイソタイプがどのように影響するかを評価した（図2）9D9は、多数のアイソタイプ（IｇG1、IｇG2aおよびIｇG2bを含む）として生成された抗CTLAクローンであり、一方、別のアイソタイプ（IｇG1-D265A）は、全てのFcγ受容体（FcγR）との結合を排除する変異を含んでいた（上掲書（Selby et al., 2013）。図2Aに示すように、抗CTLA4のIｇG2aアイソタイプ（黒丸）単独は、抗CTLA4のハムスタークローン（黒逆三角形）と比較して肺転移のより強い抑制をもたらし、この抑制はどちらかの抗CTLA4クローンへの抗RANKLの添加によりさらに増加した。同様に、RM-1およびLWT1肺転移の有意な抑制がまた、マウスIｇG2a抗CTLA4および抗RANKL併用療法で認められた（図2C）。
興味深いことに、他の3つの抗CTLA4アイソタイプ単独（IｇG2b（黒ダイアモンド）、IｇG1（黒四角）またはIｇG1-D265A（黒六角形））は、抗CTLA4-IｇG2aアイソタイプ（黒丸）と比較して肺転移抑制で有効ではなく、それらは、cIｇ治療グループ（黒三角）と比較して有意な肺転移抑制をもたらさなかった（図2B）。しかしながら、抗CTLA4のハムスター（白逆三角形）またはマウスIｇG2b（白ダイアモンド）アイソタイプへの抗RANKLの添加は、cIｇ（黒三角形）と比較して有意な肺転移抑制をもたらした。それにもかかわらず、抗RANKLおよび抗CTLA4-IｇG2aクローン（白丸）で治療されたグループは、抗RANKLと抗CTLA4-IｇG2bとの併用よりも顕著に優れていた（図2B）。全体的に見れば、抗RANKL治療単独は有意には転移を抑制しなかったが、特定の抗CTLA4アイソタイプ（もっとも目覚ましくはIｇG2aのそれ）と組合わせて用いられたとき転移制御を顕著に改善させた（図2A、B）。
【実施例３】
【０２０７】
抗RANKLおよび抗CTLA4は皮下B16F10メラノーマの増殖を抑制する
次に、RANKLおよびCTLA4の二重封鎖の有効性を、皮下B16F10メラノーマ（概して免疫原性が低い）を有するマウスで評価した（図3）。肺転移モデルと同様に、併用療法は単一療法と比較してより強い増殖抑制を再び示したが、抗CTLA4ハムスタータイプとの併用効果は有意ではなかった。
【実施例４】
【０２０８】
抗RANKLおよび抗CTLA4は皮下B16F10メラノーマの増殖を抑制する
肺転移モデルと同様に、併用療法は再び抗体アイソタイプに依存し、ハムスターアイソタイプ（図3）ではなくて抗CTLA4-IｇG2aアイソタイプのときに有意な増殖抑制が観察された（図4）。7つのそれぞれ別個のプール実験の縦断的分析を実施し、抗CTLA4-IｇG2aまたは抗CTLA4（IｇG1-D265A）および/または抗RANKLのFcR非嵌合クローンをコントロールIｇと比較した（図4C）。全体的に見れば、データは、抗CTLA4-IｇG2aと抗RANKLの組合せは、単一療法またはcIｇと比較して腫瘍増殖を有意に抑制することを示した（図4C）。対照的に、抗CTLA4-IｇG1-D265Aおよび抗RANKLの組合せはcIｇ治療グループより優れていたが、単一療法としてのどちらの治療にも劣っていた（図4C）。同様に、抗CTLA4-IｇG2aアイソタイプを含む併用療法で治療されたマウスの終了時点における腫瘍質量もまた、対応する単一療法治療グループと比較して有意に減少した。しかしながらこの利点は、抗CTLA4-IｇG1-D265Aアイソタイプを含む併用療法で理療されたグループでは、抗CTLA4-IｇG1-D265A単独で治療されたマウスと比較して観察されなかった（図4B）。
【実施例５】
【０２０９】
腫瘍ミクロ環境におけるRANKLおよびRANKの発現
次に、B16F10腫瘍のミクロ環境（TME）におけるRANKLおよびRRANKの発現を明確にした（図5）。腫瘍内RANKLの大半はT細胞の小部分によって発現され、発現はより早い時点（9日目）で高く、脾臓よりも腫瘍で高く、CD4+ T細胞と比較してより多くのCD8+ T細胞が腫瘍内でRANKLを発現した（図5A）。全体的に見れば、腫瘍浸潤白血球（TIL）の約20％がRANKを発現し（ただしその幅は極めて広い）、CD11bの染色より90％多く（データは示していない）、腫瘍内RANKは腫瘍浸潤骨髄性細胞によってほぼ独占的に発現されることを示唆している。腫瘍浸潤マクロファージ（TAM）の約40％、MDSCの60％、およびDCの低いが変動し得る割合（5−20％）がRANKを発現した（図4B）。抗RANKLによる治療は、これらの細胞タイプにおける骨髄性RANK発現を有意には変化させなかった（図5B）。最近、Ly6ClowMHCIIhigh腫瘍内マクロファージは、炎症性M1サブタイプと一致するRNA発現プロフィールを有することがB16メラノーマモデルで報告され、一方、MHCIIlow/negative発現を有するものは、免疫抑制M2表限型を有すると考えられた（De Henau et al., 2016, Nature, 539（7629）:443-7）。特に、本発明者らのB16F10モデルでは、RANKを発現するLy6C/Ly6G （GR-1）low TAMのより大きな割合が、RANKを発現しないものと比較して陰性または低いMHCII発現を有し、RANK発現TAM集団は、RANKを発現しないTAMよりも強い抑制性を有する可能性があることを示唆する（データは示していない）。しかしながら、抗RANKL治療は、B16F10またはRM-1皮下腫瘍で、CD11b+骨髄性TILの割合、CD206（M2マーカー）発現TAMの割合を変化させなかった（データは示していない）。RANKL発現またはRANK発現細胞の1％未満がCD45.2陰性であり（どちらのin vivo腫瘍内発現レベルも無視できることを示す）、加えてこの試験で用いられた全ての腫瘍株はフローサイトメトリーで評価したとき、RANKLまたはRANK発現について陰性であった（データは示していない）。
【実施例６】
【０２１０】
抗RANKLおよび抗CTLA4-IｇG2aの併用療法の抗腫瘍有効性はFcrRIV受容体、IFNγおよびCD8+ T細胞依存性である
次に、本発明者らは、皮下B16F10腫瘍モデルにおけるエフェクターリンパ球の存在および機能と同様に、抗RANKLと抗CTLA4-IｇG2aとの併用の有効性のFc受容体に対する依存を評価した（図6）。抗CTLA4-IｇG2aの公知の作用メカニズムと一致して、B16F10に対する抗RANKLとのその併用活性は、FcγRIVまたはFcEγRを欠くマウスでは停止したが、FcγRIIIでは停止しなかった（図6A）。抗CTLA4 MAbはFcγRIV依存性であるが、RANKLの封鎖が同様な要求を有するか否かは明確ではなかった。次に、抗CTLA4-mIｇG2aおよび抗RANKLによるB16F10腫瘍増殖の制御におけるCD8+ T細胞およびNK細胞の役割を、各サブセットの選択的枯渇によって評価した（図6B）。CD8+ T細胞を枯渇させたとき、併用療法の抗腫瘍有効性はほぼ完全に停止した。対照的に、NK細胞枯渇は影響がなく、この併用療法のCD8+ T細胞に対する依存を示した（図6B）。転移環境で観察された結果と同様に、この併用療法はIFNγ依存性であったが、パーフォリン依存性ではなかった。（図6C）。この併用療法における、クロスプレゼンテーション機能を有するCD8α+の通常のDCに対する本質的役割はまた、転写因子Batf3に欠損を有するマウスを使用することによっ明示示された。併用療法の有効性はWT治療マウスと比較してこれらのマウスで停止した（図6D）。
【実施例７】
【０２１１】
CTLA4およびRANKL封鎖後のCD8+ T細胞腫瘍への流入
併用療法のメカニズムおよびCD8+ T細胞の役割の更なる理解のために、抗CTLA4（IｇG2a）および抗RANKLの最適な併用療法で治療した皮下B16F10腫瘍でTILの組成を評価した（図7）。終了時点の腫瘍で評価したとき、CD45+ TILの割合は、cIｇまたは単一療法治療グループと比較して併用療法で有意に増加した（図7A）。対照的に、この増加は、抗CTLA4-IｇG1-D265Aアイソタイプを含む併用療法で治療したマウスでは観察されなかった（データは示していない）。併用療法治療グループにおけるCD45+ TILにおける増加は、CD8+ T細胞の目覚ましい増加（割合（図7B）および絶対数（図7C）の両方）によってほとんど説明された。繰り返せば、これらの変化は、9D9-IｇG1-D265Aアイソタイプを含む併用療法では見られなかった（データは示していない）。
Treｇ（CD4+Foxp3+）の割合（腫瘍中のCD4+ T細胞のパーセンテージとして）は、抗CTLA4-IｇG2a単一療法で減少した（このアイソタイプの作用の報告メカニズムと一致する（Selby et al., 2013, Cancer Immunol. Res., 1（1）:32-42））が、しかしながら、抗RANKL抗体の添加によりさらにまた減少した。加えて、CD11b+細胞でのFcγ-IV発現は、腫瘍で併用療法を用いてもさらに増加することはなく（データは示していない）、TMEにおけるTreｇ枯渇の増強はこの併用の作用メカニズムを説明できないことを示唆する。脾臓では、Treｇの割合または数に有意な変化は治療グループ間で検出されなかった（データは示していない）。全体的に見れば、本発明者らには、これらのモデルにおける併用療法の作用メカニズムはより効率的なTreｇの枯渇によるものとは思われない。
抗RANKLの別の潜在的な作用メカニズムはT細胞増殖の増強であり得よう。しかしながら、本発明者らは、抗CTLA4単一療法と比較して、併用治療群でのKi-67発現CD8+ T細胞の更なる増加を全く観察しなかった（図7E）。このことは、併用治療後の腫瘍で観察される追加のCD8+ T細胞は選択的なCD8+ T細胞補充の結果の可能性を示唆している。したがって、併用療法によるCD8+ T細胞の流入は、抑制性免疫細胞（例えばTreｇまたは骨髄性細胞）の増加の欠如と相俟って、抗腫瘍活性に有利となるようにTMEを変化させることができる。実際、CD8+ 対Treｇ比の有意な増加が、早い時点（9日目）で測定したときに認められた（図7F）。加えて、MDSCに対するCD8+ T細胞の比は、併用療法で有意に増加した（図7H）。重要なことに、観察されたこれらの変化は腫瘍に特異的であった。なぜならば、白血球サブセットの割合における有意な変化は、これら腫瘍を有するマウスの脾臓では観察されなかったからである（データは示していない）。
【実施例８】
【０２１２】
抗RANKLおよび抗CTLA4療法はT細胞のサイトカイン産生および多機能性を高める
本発明者らはまた、この併用免疫療法が、実験終了点（16日目）のB16F10腫瘍でCD8 およびCD4+ T細胞のTh1サイトカイン産生（IFNγ、TNF、IL-2）に対してどのような影響を有するかを評価した（図8）。TNFαは刺激後ex vivoでもっとも一般的に産生されるサイトカインであったが、有意な相違は、cIｇまたは単一療法と比較して、併用療法後のCD8+ T細胞によるIFNγ（図8A）およびIL-2（データは示していない）の産生で認められた。さらにまた、IFNγおよびIL-2（図8B）またはIFNγ、IL-2およびTNFα（図8C）を共同発現するCD8+ T細胞もまた併用療法で増加した。同様な発見がCD4+ T細胞で、特にIFNγを産生した割合で観察された（図8D）。cIｇ治療グループのCD8+ T細胞の大半は刺激後にサイトカインを産生せず、一方、併用療法は最大の多機能性を有するT細胞を産生し、単一療法グループは中間の表現型を示した（図8E）。サイトカイン多機能性に対する併用療法の効果は腫瘍特異的であった。なぜならばこれらの相違は、腫瘍を有するマウスの脾臓T細胞では観察されなかったからである（データは示していない）。
【０２１３】
実施例1−8のための材料と方法
細胞培養
マウスメラノーマ細胞株B16F10（ATCC）およびLWT1並びに前立腺癌腫細胞株RM-1は、以前の記載にしたがって維持、注射およびモニターした（Ferrari de Andrade et al., 2014, Cancer Res, 74:7298-7308）。線維肉腫細胞株MCA1956（MCA接種C57BL/6野生型マウスに由来）は、Robert Schreiber（Washinｇton University School of Medicine, St Louis, MO, USA）から寄贈された。前立腺癌細胞株Tramp-C1は記載にしたがって（Dalezis et al., 2012, In Vivo, 26:75-86）維持したが、ただしデヒドロイソアンドロステロンは用いなかった。全ての細胞株はマイコプラズマ陰性について日常的に検査したが、細胞株信頼性は日常的には実施しなかった。
マウス
C57BL/6野生型（WT）マウスは所内交配されるか、または業者（Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research）から購入した。C57BL/6パーフォリン欠損（pfp-/-）、インターフェロン欠損（IFNγ-/-）、Fc受容体欠損（FcγRIII、FcγRIVおよびFcεγR）、Batf3転写因子欠損（Batf3-/-）（以下に記載：Hildner et al., 2008, Science, 322:1097-1100）およびFoxP3-DTR（以下に記載：Tenｇ et al., 2010, Cancer Res, 70:7800-7809）マウスは、QIMRB（QIMR Berｇhofer Medical Research Institute）で所内交配された。全マウスを6から16週齢で用いた。5から13匹のマウスのグループを実験的腫瘍転移アッセイおよび皮下（s.c.）腫瘍増殖に用いた。全ての実験がQIMRB動物倫理委員会で承認された。
抗体
精製抗マウス抗RANKL（IK22/5; rat IｇG2a（Kamijo S. et al., 2006, Biochem Biophys Resh Commun, 347:124-132））、抗CTLA4（UC10-4F10、ハムスターIｇG）、およびコントロール抗体（ハムスターIｇ、1-1またはIｇG2a、2A3）は所内で作製するかまたは業者（BioXcell（West Lebanon, NH））から購入した。抗CTLA4クローン9D9（表示の多様なアイソタイプ）およびコントロール抗体1D12（マウスIｇG2a）は業者（Bristol-Myers Squibb（San Francisco, CA））から供給された。NK細胞を枯渇させるための抗体（抗asialoGM1（Wako））または抗CD8β（53.5.8（BioXcell））は表示のように投与された。
皮下腫瘍モデル
B16F10（1ｘ105）、RM-1（5ｘ104）、MCA1956（1ｘ106）またはTRAMP-C1（1ｘ106）の腫瘍形成のために、雌（B16F10, MCA1956）または雄（RM-1, TRAMP-C1）マウスの脇腹の皮下に細胞を接種した。治療抗体の処置は表示のように腫瘍接種後3−12日目に開始し2−4日毎に最大4用量まで投与した。腫瘍はデジタルカリパーを用いて二次元で測定し、腫瘍サイズを平均±SEMとして提示する。
実験的肺転移モデル
B16F10、RM-1またはLWT1の単一細胞懸濁物を表示のマウス株の尾静脈に静脈内注射した。14日目に肺を採集し、解剖顕微鏡下で表面の腫瘍結節をカウントした。腫瘍接種に対し-1日目、0日目および2日目に、表示の抗体治療を抗CTLA4および/または抗RANKL MAbを用いて実施した。CD8+ T細胞またはNK細胞を枯渇させる抗体は、腫瘍接種に対し-1日目、0日目および7日目に表示のように投与した。
【０２１４】
フローサイトメトリー
腫瘍を有するマウスを2つの時点（9日目または終了点（腫瘍が倫理的終点サイズに達したために実験を終了させる時点））で犠牲にした。腫瘍、流入領域リンパ節（鼠径部）および脾臓を収集し、湿潤重量を記録した。以前に記載されたように（上掲書（Tenｇ et al., 2010））、表示の器官から単一細胞懸濁物を作成した。
以下の抗体（Bioleｇend、eBioscience、BD）を用いた：CD4-BV605（RM4-5）、CD8-BV711（53-6.7）、CD11b-BV650（M1/70）、CD11b-PE（M1/70）、CD11c-PE（N418）、精製CD16.2（9E9）その後にヤギ抗ハムスターFITC、CD206-AF647およびCD206-PECy7（C068C2）、およびZombie Aqua生存/死染料；TCRβ-PerCP-Cy5.5（H57-597）、CD45.2-A780（104）、Ly6C/Ly6G（GR-1）-EF450（RB6-8C5）、MHCII-APC（M5/114.15.2）、CD265 （RANK）-PE （R12-31）；RANKL-AF647（IK22/5）。細胞内サイトカイン染色（ICS）のためには、細胞を4時間細胞刺激カクテル（1/1000）（eBioscience）で刺激した。続いて、Cytofix/Cytoperm（BD）による固定/透過処理の前に、上記に記載したように細胞を表面染色し、さらにIFNγ-AF488（Bioleｇend）、TNFα-PE（BD）、およびIL-2-パシフィックブルー（Bioleｇend）で染色した。
細胞内転写因子染色のためには、固定する前に、上記に記載したように細胞を表面染色し、さらにFoxp3/転写因子染色緩衝液セット（eBioscience）を用い製造業者のプロトコルにしたがって透過処理し、FoxP3-EF450またはFoxP3-AF488（FJK-16s）およびKi67-EF450（Sol185）（eBioscience）で染色した。全ての免疫細胞分析は最初に生存単一CD45.2+でゲート分類した。T細胞はTCRβ+NK1.1-と規定された。NK細胞はTCRβ-NK1+と規定された。DCはCD11c+MHCIIhigh細胞と規定された。腫瘍関連マクロファージ（TAM）はCD11b+F4/80+ non-DC細胞と規定された。MDSCはCD11b+, Ly6C/Ly6G （GR-1）hi, non-TAM, non-DC細胞と規定された。サンプルの絶対カウントを決定するために、サンプルをフローサイトメトリーにかける直前に、流体カウントビーズ（BD Biosciences）を添加した。全てのデータをフォルテッサ（Fortessa）4（BD）フローサイトメーターで収集し、FlowJo v10ソフトウェア（Tree Star, Inc.）を用いて分析した。
統計分析
グラフパッドプリズム（GraphPad Prism）ソフトウェアを統計分析に用いた。カラム分析のためには、ブラウン-フォーサイス検定を用いて等分散を評価した。有意でない場合、ダンの多重比較による一元配置分散分析を用いた。グループ間で不等分散の場合には、シダックまたはダネットの多重比較によるクルスカル-ウォリス分析を適切なように用いた。縦断的腫瘍増殖分析のためには、実験内マウスのみについて治療グループランダム効果モデルを用いた。P値が0.05未満である場合、データは統計的に有意であるとみなした。
【実施例９】
【０２１５】
RANKLおよびPD-1-PD-L1相互作用の共同封鎖による肺転移の抑制
抗RANKLと抗PD-1（図9A−B）または抗RANKLと抗PD-L1（図9C−D）の併用は、メラノーマ（B16F10）または前立腺癌（RM1）の肺転移モデルで転移に対する優れた耐性をもたらす。
【実施例１０】
【０２１６】
RANKLおよびPD-1の共同封鎖による皮下腫瘍増殖の抑制
実験的転移モデルのこれらの結果を広げるために、次に、皮下腫瘍を有するマウスでRANKLおよびPD-1の二重封鎖の有効性を評価した。PD-1感受性細胞株MC38およびPD-1中間応答細胞株CT26（ともに結腸癌モデル）で、抗RANKLの添加は抗PD-1有効性を増強した（図10A−B）。樹立がより進んだ腫瘍に対してより遅い時点で当該療法が開始されたときに、CT26に対する組合せの有効性は維持された（データは示していない）。
【実施例１１】
【０２１７】
抗RANKLの皮下腫瘍増殖抑制能力はBatF3に依存するがFc受容体発現には依存しない
いくつかの免疫調整抗体の有効性には、抗体依存細胞傷害性による抗原発現細胞の枯渇（Dahan et al., 2015, Cancer Cell, 28（3）:285-295）、或いは標的抗原のアゴニスト活性の枯渇（Dahan et al., 2016, Cancer Cell, 29（6）:820-831）が算入されている。これらプロセスはともに腫瘍ミクロ環境内でのFc受容体の嵌合を必要とする。加えて、ある種の抗体（例えば抗CD137、抗PD-L1）は、CD103+ Batf3-依存樹状細胞の存在を要求する（Sanchez-Paulete et al., 2016, Cancer Discov. 6（1）:71-9）。したがって、抗RANKLの作用メカニズムの理解のために、Fc受容体またBatF3依存樹状細胞に対する抗RANKL有効性の依存を遺伝子標的マウスで試験した。C57Bl/6または遺伝子標的マウスのグループにMCA1956線維肉腫細胞（1ｘ106）を皮下注射した。腫瘍接種に対して3、7、11および15日目に、抗RANKL（IK22/5、200μｇ i.p.）またはcIｇ（1-1, 200μｇ i.p.）でマウスを処理した。抗RANKL MAb IK22/5は、MCA1956皮下腫瘍で単一療法として有効性を示した（図11）。抗RANKLの抗腫瘍有効性はFcεRγを欠くマウスで温存された。このことは、RANKLのその受容体、RANKに対する封鎖により生じ、RANKL発現細胞の枯渇を介して機能するものではない抗RANKLの作用メカニズムと一致する。対照的に、抗RANKL IK22/5の抗腫瘍有効性はBatF3を欠くマウスで停止し、CD103+ DC媒介クロスプレゼンテーションに関する本質的な役割を示唆した。これらのデータは、RANK発現骨髄性細胞（例えば樹状細胞、MDSCまたはマクロファージ）とRANKL発現細胞（例えばリンパ球、リンパ節細胞または他の間質成分）との間の免疫抑制性または免疫寛容原性機軸を腫瘍ミクロ環境において抗RANKLが破壊する作用メカニズムと一致する。
【実施例１２】
【０２１８】
腫瘍の浸潤骨髄性細胞におけるRANKおよびPD-L1の共同発現
上記に記載したMCA1956腫瘍における抗RANKLのメカニズムに関するデータが与えられたことを考慮すると、腫瘍ミクロ環境内のRANKLの潜在的役割は、RANKL受容体（RANK）を発現し得るBatF3依存樹状細胞における作用を介するものである。2つの免疫抑制経路を封鎖する二重特異性抗体の場合、同じ細胞タイプ上の複数の標的抗原の共同発現は、機能性が標的細胞そのものとなるので有利となろう。単一細胞タイプ上での複数標的抗原の共同発現もまた、腫瘍ミクロ環境内での二重特異性様式のより細胞特異的または組織特異的作用、およびより強い細胞選択性によるより低い周辺毒性を危険なものとして排斥し得る。また別に或いは付け加えて、2つの別個の細胞でトランス態様で発現される2つの免疫抑制経路を封鎖する二重特異性抗体もまた有益である。なぜなら、2つの別個の免疫抑制メカニズムを同時に阻害できるからである。
【０２１９】
したがって、骨髄性細胞区画におけるRANKおよびPD-L1または他の抗原の二重特異性標的誘導のための理論的根拠として、これらの因子の発現をフローサイトメトリーによって腫瘍浸潤骨髄性細胞で分析した。WT C57BL/6マウスにMCA1956細胞（1ｘ106細胞/マウス）を皮下注射した。腫瘍がほぼ50mm3に達するまで一切治療しないで22日間増殖させた。腫瘍を収集し単一細胞懸濁物を作成し、上記のようにフローサイトメトリーを実施した。CD11c+/MHCII+樹状細胞（DC）のフローサイトメトリー分析は、RANK陽性DCの100％がまたPD-L1およびCD103を発現することを示した（図12A）。MCA1956皮下腫瘍から単離した腫瘍浸潤マクロファージで同様な分析を実施した（CD11b+、F4/80+でゲート分類）。この分析は、腫瘍浸潤CD11b+/F480+細胞の52％がRANKおよびCD206を共同発現し、一方、RANK陰性CD11b+/F480+の7％のみがCD206を発現することを示した（図12B）。
要約すれば、抗RANKL IK22/5 MAbの抗腫瘍有効性はBatF3を欠くマウスで停止し、このことはCD103+樹状細胞（DC）媒介クロスプレゼンテーションに関する本質的役割を示唆する。これらのデータは、RANK発現骨髄性細胞（例えば樹状細胞またはマクロファージ）とRANKL発現細胞（例えばリンパ球、リンパ節細胞または他の間質成分）との間の免疫抑制性または免疫寛容原性機軸を腫瘍ミクロ環境で抗RANKLが破壊する作用メカニズムと一致する。腫瘍由来のCD11c+/MHCII+ DCのフローサイトメトリー分析は、RANK陽性DCの100％がまたPD-L1およびCD103を発現することを示した。同様な分析は、RANK陽性腫瘍浸潤マクロファージにおけるCD206発現の有意な豊富さを示した。2つの免疫抑制経路を封鎖する二重特異性抗体の場合、同じ細胞タイプ上の標的抗原共同発現は、機能性が標的細胞固有であるので有利となろう。単一細胞タイプ上での標的抗原の共同発現はまた、腫瘍ミクロ環境内での二重特異性様式のより細胞特異的または組織特異的作用およびより強い細胞選択性のためにより低い周辺毒性を排斥することができる。また別に或いは付け加えれば、2つの別個の細胞でin trans発現される2つの免疫抑制経路を封鎖する二重特異性抗体もまた有益である。なぜなら、2つの別個の免疫抑制メカニズムを同時に阻害できるからである。
総合すれば、これらの観察は、腫瘍内のRANK陽性DCにおけるPD-L1発現の顕著な豊富さを示し、cis状態のこれら2つの抗原の二重特異性標的誘導のための更なる理論的根拠を提供する。PD-L1を標的とする様式は腫瘍におけるチェックポイント阻害剤として確実に実証され、抗RANK二重特異性の合理的なパートナーを提供する。加えて、RANKに付随するCD103およびCD206の高度な共同発現は、RANKを標的とする二重特異性様式のための追加の抗原パートナーを提唱する。
【実施例１３】
【０２２０】
抗RANKおよび抗PD-1ジアボディ
二重特異性単鎖ジアボディを以下および図13Aに示すように構築する。具体的には、抗RANKL抗体（例えばデノスマブ）の可変重鎖を、抗PD-1抗体の可変軽鎖に5アミノ酸リンカーを介して連結し、前記を続いて抗PD-1抗体の可変重鎖に15アミノ酸リンカーを介して連結し、前記を抗RANKL抗体の可変軽鎖に別の5アミノ酸リンカーを介して連結する。
二重特異性単鎖ジアボディの例示的構築物では、RANKL抗体の可変重鎖（以下のアミノ酸配列を有するデノスマブVH：EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS（配列番号:3））が、第一のリンカー（SG4）を介して抗PD-1抗体の可変軽鎖（以下のアミノ酸配列を有するニボルマブVL：EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK（配列番号:91））に連結され、前記は、続いて第二のリンカー（（SG4）3）を介して、抗PD-1抗体の可変重鎖（以下の配列を有するニボルマブVH：QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS（配列番号:88））に連結され、その後第三のリンカー（SG4）を介して、抗RANKL抗体の可変軽鎖（以下のアミノ酸配列を有するデノスマブVL：EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRGRYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVFYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIK（配列番号:4））に連結される。
二重特異性抗体をコードするDNAを発現ベクター（例えばpSecTaｇ2/HyｇroA（Invitroｇen））でクローニングする。続いて、得られた二重特異性抗体コードプラスミドを標準的プロトコルを用いて増幅、抽出および精製する。
発現プラスミドをヒト腎細胞株293Tに、LipfectAMINE-plus（Invitroｇen）を用いて一過性にトランスフェクトし培養する。上清を0.22μmのPVDFフィルターで滅菌し、40％のPEG20,000溶液を用いて濃縮する。HiTrapキレーティHPカラム（GE Healthcare）を用いて前記濃縮上清を精製する。
【実施例１４】
【０２２１】
抗RANKLおよび抗PD-1トリボディ
図13Bに示すように、二重特異性トリボディの生成のために1対のプラスミドが要求される。具体的には、ヒトκ軽鎖の定常領域に融合した抗PD-1抗体の可変軽鎖を含む単鎖ポリペプチドをコードする第一の構築物が調製され、前記は抗RANKL抗体の可変重鎖にアミノ酸リンカーを介して連結される。精製を容易にするために、タグ（例えばhisタグ（His6））を単鎖ポリペプチドのC-末端に付加することができる。ヒトIｇG2の定常領域1に融合した抗PD-1抗体の可変重鎖を含む単鎖ポリペプチドをコードする第二の構築物もまた調製され、前記は抗RANKL抗体の可変重鎖に第一のアミノ酸リンカーを介して連結され、前記は次に、抗RANKL抗体の可変軽鎖に第二のアミノ酸リンカーを介して連結される。精製を容易にするために、タグ（例えばhisタグ（His6））がまた当該単鎖ポリペプチドのC-末端に付加され得る。
2つの構築物を2つの別々の発現ベクターでクローニングする。前記は典型的にはプラスミド、例えばpCAGGSの形態であり得る（De Sutter et al., 1992, Gene 113, 223-230）。得られた二重特異性トリボディをコードするプラスミド対（pCAGGS-FabL-scFv-His6およびpCAGGS-FabFd-scFv-His6）を続いて増幅、抽出および精製する。
また別のプラスミド対が図13Cに示される。この実施態様では、ヒトκ軽鎖の定常領域に融合した抗RANKL抗体の可変軽鎖を含む単鎖ポリペプチドをコードする第一の構築物が調製され、前記は抗PD-1抗体の可変重鎖にアミノ酸リンカーを介して連結される。精製を容易にするために、タグ（例えばhisタグ（His6））がまた当該単鎖ポリペプチドのC-末端に付加され得る。ヒトIｇG2の定常領域1に融合した抗RANKL抗体の可変重鎖を含む単鎖ポリペプチドをコードする第二の構築物が調製され、前記は抗PD-1抗体の可変重鎖に第一のアミノ酸リンカーを介して連結され、前記は次に、抗PD-1抗体の可変軽鎖に第二のアミノ酸リンカーを介して連結される。このタイプの例示的トリボディは図14に示される。
【実施例１５】
【０２２２】
アンタゴニスト活性を決定するためのアッセイ
RANKLおよびRANKリガンド-受容体対はヒトおよびマウスタンパク質間で交差反応性を有し、等しい結合活性および機能活性が検出される（Bossen et al., 2006, J Biol Chem., 281（20）:13964-71）。抗原およびアッセイ調製物のために市場で入手できるRANKLおよびRANKの多様な組換え型が存在する。RANKLおよび抗RANK抗体はともに、RANKのCRD2およびCRD3または完全長RANK（すなわちCRD1、2、3、4を含む）と選択的に結合するであろう。
TNFスーパーファミリーリガンド/受容体相互作用はELISAによって評価でき（例えば以下を参照されたい：Schneider et al., 2014, Methods Enzymol., 545:103-25; Kostenuik et al., 2009, J. Bone Miner Res., 24（2）:182-95）、RANKLまたはRANKアンタゴニストのための単純明快なスクリーニングを提供する。RANKLおよびRANK阻害剤の生物学的活性は、以前に記載されたように、ネズミRAW264.7マクロファージ（破骨細胞の前駆細胞として機能する）の培養での破骨細胞形成（および条件付け培地でのTRAP5bの生成）を用いてELISAでモニターすることができる（Kostenuik et al., 2009（上掲書）；Xu et al., 2000, J. Bone Miner Res., 15（11）:2178-86）。
抗RANK抗体の交差反応性はTNFスーパーファミリーの他の関連メンバーに対してスクリーニングすることができる。フローサイトメトリーまたはELISAによるスクリーニングをこれに関して用いることができる。
RANKLまたはRANKアンタゴニストに対するアンタゴニスト活性の決定では、RANK受容体においてアゴニスト活性もまた有し得るいずれのRANKLまたはRANKアンタゴニストも排除することが好ましい。抗RANK抗体のアゴニスト活性のin vitroスクリーニングは、例えば以下の研究者によって記載されたように（Schneider et al., 2014（上掲書）；およびChypre et al., 2016, Immunol. Lett., 171:5-14）、RANK-Fas Jurkatアッセイで二価または一価抗体型を用いて実施することができる。関連するTNFRメンバー、EDARに対する抗体の分析は、アゴニスト活性との相関性は抗体の親和性ではなくいったん結合したものをゆっくりと切り離すそれらの能力（小さなkoff）であることを示した（Kowalczyk-Quintas et al., 2011, J. Biol. Chem., 286（35）:30769-79）。同様に、TNFRメンバー、FASに対する抗体の分析は、受容体親和性と（アゴニスト）潜在能力との間の逆の相関性を示した（Chodorｇe et al., 2012, Cell Death Differ., 19（7）:1187-95）。注目すべきことには、ファージスクリーンは、他のTNFRメンバー（例えばTRAILR）に対してアゴニスト活性を有するscFvを識別した（Dobson et al., 2009, MAbs, 1（6）:552-62）。
【０２２３】
二重特異性形式で第二の標的（例えばPD-L1）に関して抗RANK結合物質を試験して、結合性および機能性RANKLのアンタゴニスト作用の封鎖が維持されることを実証することもまた可能である。例えば、細胞株を操作してRANKをPD-L1と一緒に発現させ（例えばRANK-Fasキメラとして（Schneider et al., 2014（上掲書））、RANKアンタゴニスト活性を確認することができよう。また別には、PD-L1の発現がRANK陽性破骨細胞前駆細胞で既に示されており（An et al., 2016, Blood, 128（12）:1590-603）、in vitro機能アッセイを開発してRANK結合物質およびPD-L1結合物質を調べることが可能である。破骨細胞形成はRANK封鎖に対処し、一方、PD-1結合またはT細胞抑制を用いて、PD-L1封鎖に対処することができよう。後者を支持すれば、上掲書（An et al., 2016）は、抗PD-L1は破骨細胞始原細胞培養のCTL活性を増加させることを示した。
抗RANKまたは抗RANKL抗体（RANKLアンタゴニスト）のin vivo活性は、二価または一価抗体型を用いて調べて、破骨細胞アンタゴニスト機能をマウス試験で調べることができる。抗RANKまたは抗RANKL抗体でチャレンジしたマウスの骨密度の分析（ｘ-線またはDEXAによる）もまた実施できる。また別には、ヒトRANKLの皮下注射でチャレンジした正常マウスの高カルシウム血症に対する抗RANKまたは抗RANKL抗体の影響を、血中イオン化カルシウムまたは血清TRAP5bを毎日4日間モニターすることによって評価することができる。抗RANKまたは抗RANKL抗体（RANKLアンタゴニスト）はまた、腫瘍応答について（陽性コントロール抗RANKL MAbについて本明細書の図9に示すように）MCA1956腫瘍モデルで試験することができよう。RANKL刺激（例えばRANKLの組換え型）および阻害（例えば組換えOPG-Fc）のための陽性コントロールはin vitroおよびin vivo試験のために容易に入手できる（Lacey et al., 2012, Nat Rev Druｇ Discov., 11（5）:401-19）。
【実施例１６】
【０２２４】
抗RANKL MAbの抗腫瘍有効性はT調節性細胞（Treｇ）を必要としない
以前の発表で、RANK発現乳癌のマウスモデルの転移促進におけるRANK発現Treｇの役割（Tan et al., Nature 470 （2011）, 548-553）、またはUV誘発皮膚炎症の抑制における皮膚RANKL-RANK相互作用を介する全身性Treｇ制御の役割（Loser et al., Nat. Med 12（2006）, 1372-1379）が報告された。免疫療法の抗RANKL併用有効性におけるあらゆるTreｇの本質的役割をさらに評価するために、FoxP3-DTRマウスモデルを用いた。これらのマウスでは、ジフテリア毒素受容体（DTR）がfoxp3遺伝子座の制御下で発現され、ジフテリア毒素（DT）の投与を介してTreｇの条件性およびほぼ完全な枯渇を可能にし、抗腫瘍免疫増強がもたらされる（Tenｇ et al., 2010（上掲書））。より強いB16F10メラノーマ皮下腫瘍増殖抑制の傾向が観察され（図15A−C）、DTと併用して抗RANKL（IK22.5）が投与されたときにDT単独と比較してより大きな割合のマウスが治癒した（図15A−C）。加えて、DTおよび抗RANKLで治療されたFoxP3-DTRマウスで、皮下RM-1前立腺癌の増殖抑制増強の同様な傾向もまた観察された（図15D）。終末点におけるRM-1腫瘍のFACS分析は、DT単独によるほぼ完全なTreｇ枯渇を示し、抗RANKLがDTと併用されたときにTreｇの更なる枯渇は認められなかった（図15E）。総合すれば、これらのモデルにおける併用療法の作用メカニズムは、より効果的なTreｇ枯渇が原因であるとは思われず、ほぼ完全な腫瘍内Treｇ枯渇の環境で抗RANKL mAbの有効性は損なわれない。実際、抗RANKLとDT誘発Treｇ枯渇との併用で追加される有効性は、DT単独と比較してFoxP3-DTRマウスで観察され、この場合、両DT含有アームは、終末点のcIｇと比較して95％を超えるTreｇ枯渇を示し、したがって、抗RANKLの作用メカニズムはTreｇに関して直接的ではないことを示している。
【実施例１７】
【０２２５】
腫瘍浸潤リンパ球でRANKLとCTLA4の共同発現と比較したRANKLおよびPD-1の別個の共同発現
前臨床の結果は、抗RANKL封鎖が、抗CTLA4またはPD-1/PD-L1封鎖の抗腫瘍有効性を高めることを示したが、これは別個のメカニズムを介して生じるという証拠が存在し、前記は、報告されたCTLA4対PD-1封鎖の非オーバーラップ作用メカニズムと一致する。例えば、マウスのCT26腫瘍から単離されたT細胞で、ほとんど全てのCD8+RANKL+ T細胞TIL（＞90％）がPD-1を共同発現し、対照的にCD8+RANKL-T細胞TILの40％未満がPD-1陽性であった（図16A）。さらにまた、PD-1のMFIは、CD8+ RANKL-T細胞と比較してCD8+RANKL+で少なくとも3倍高く、前者はPD-1hi細胞と識別された（図16B）。発現分析では、CTLA4発現は、RANKL+ CD8+ T細胞でそのRANKL-対応細胞と比較して有意に高いことが示された（図16C）。RANKL-発現細胞が一般的により増殖性で別の免疫チェックポイント（CTLA4）を低発現することを考慮すれば、PD-1共発現の豊富さにもかかわらず、CT26モデルにおけるRANKL+ CD8+ T細胞TILの特徴は疲弊表現型ではなく活性化表現型により一致する。
【実施例１８】
【０２２６】
抗PD-1、抗CTLA4および抗RANKL抗体の三重併用は腫瘍を有するマウスで抗腫瘍応答およびT細胞エフェクター機能を改善する
PD-1およびCTLA4の組合せ免疫チェックポイント封鎖（ICB）がある種の臨床環境（例えば進行メラノーマ）で新興の標準治療であるので、抗RANKLの付加が、抗CTLA4および抗PD-1/抗PD-L1併用療法の抗腫瘍有効性をさらに改善できるか否かを評価した（図17）。まず初めに樹立されたCT26腫瘍を有するWTマウスの抑制において、低用量抗PD-1（100μｇ）を用いる組合せで抗RANKLを評価した（図17A）。抗PD-1への抗RANKLの付加は腫瘍増殖を有意に抑制したが、三重併用療法は、いずれの二重併用療法と比較してもCT26腫瘍マウスの腫瘍増殖を有意に抑制し、重要なことに、抗CTLAプラス抗PD-1組合せへの抗RANKLの付加は腫瘍拒絶率を改善した（図17A）。次に、抗RANKLと併用された抗PD-1の抗CTLA4存在下または非存在下におけるCT26皮下腫瘍増殖抑制有効性を評価した（図17B）。抗PD-1単独と比較して、前記は（抗RANKLおよび抗PD-1単一療法と同様に）最少有効性を有し、抗PD-1および抗RANKLの組合せが腫瘍増殖を有意に抑制した（図17B）。加えて、抗PD-1および抗RANKLの抗CTLA4との三重併用が、CT26皮下増殖の抑制に最も有効で、この三重併用を特に二重ICB（抗PD-L1および抗CTLA4）と比較したとき、小さいが有意な相違が明白であった（図17B）。最後に、三重併用療法（抗PD-1＋抗CTLA4＋抗RANKL）の腫瘍増殖制御能力を自発性TRAMPトランスジェニックマウス（皮下Tramp-C1前立腺癌腫を有する）でも評価した。内因性腫瘍特異的T細胞が免疫寛容化され得る環境設定で、三重併用療法は、皮下腫瘍増殖の制御で再びもっとも有効であり、選択した二重療法およびcIｇと比較して16匹のマウスうち15匹がそれらの腫瘍を完全に拒絶した（図17C）。三重併用療法で観察された腫瘍制御の増加は、抗CTLA4プラス抗PD-1二重併用療法と比較してIFNγおよびTFNαの共同発現に反映されるように、腫瘍浸潤CD8+およびCD4+ T細胞のTh1型サイトカイン多機能性の有意な増加と相関関係があった。TILエフェクター機能におけるこの増加は腫瘍でのみ観察され、三重併用療法で治療されたマウスの脾臓では観察されなかった。
【実施例１９】
【０２２７】
抗RANKLおよび抗PD-1/PD-L1併用療法或いは抗RANKLおよび抗CTLA4併用療法を別個に交差調整し得るTMEの固有の変化
CT26モデルで抗RANKLが免疫チェックポイント封鎖（ICB）療法を改善するメカニズムを調べるために、RANKLを発現するCD8+ T細胞の割合を評価した（図18A）。cIｇ処置マウスで、約5％がRANKLを発現したが、これは抗PD-1単一療法後に10％以上増加した。さらにまた、RANKL発現は、ｇp70反応性CD8+ T細胞TILのサブセットの間で増え（cIｇ処置マウスでほぼ15％）、抗PD-1単一療法、抗CTLA4単一療法またはcIｇと比較して、二重ICBを受けた腫瘍で有意に増加した（図18B）。CD8+ T細胞TILと比較して、より小さな割合のCD4+ T細胞TILがRANKLを発現するが、抗PD-1は同様にRANKL発現を増加させた（図18C）。RANKL発現の主要な腫瘍内供給源のアップレギュレーションを介して、抗PD-1の投与はおそらくTMEをプライミングしてRANKL封鎖に応答し（図18A−C）、一方、抗CTLA4単一療法は、CD4+またはCD8+ T細胞TILでRANKLレベルを有意には変化させなかった。抗PD-1単独（または抗PD-1＋抗CTLA4併用）はそれ自体RANKL発現を腫瘍浸潤T細胞によって増加させ、一方、RANKL増加は抗CTLA4単独後にTILで観察されないという観察は、抗RANKL＋抗PD-1/PD-L1併用を介して達成される抗腫瘍効能は、抗RANKL＋抗CTLA4併用と比較して別個のメカニズムを介して生じることを提唱する。この実験で抗CTLA4治療単独もまたRANKL発現レベルを変化させなかった理由は不明である。1つの説明は、RANKLは一般的に、T細胞活性化後初期に（特に免疫寛容環境下で）アップレギュレートされるという観察に基づく（Hochweller et al., 2005. Eur J Immunol 35:1086-96）。
【０２２８】
浸潤T細胞の表現型を調査すると、抗RANKLの抗PD-1療法への付加、対、抗RANKLの抗CTLA4療法への付加後に観察されるTMEの追加される別個の変化が観察された。以前の報告は、腫瘍浸潤PD-1hi T細胞は抗PD-1療法に非感受性で疲弊表現型を提示することを示した。しかしながら、いくつかの免疫療法（例えば抗CD40）は、PD-1hi T細胞でのPD-1レベルを低下させそれらを再びPD-1封鎖に感受性にすることができる（Nｇiow et al., 2015, Cancer Res 75:3800-11）。これと一致して、抗PD-1＋抗RANKLの投与は、ｇp70特異性CD8+ T細胞TILで（非選別CD8+ T細胞TILでも同様に）PD-1発現を一層低下させた（図19A）（ただし、抗PD-1単一療法はcIｇと比較してPD-1発現を有意に弱めた）。重要なことに、抗CTLA4（単独または併用）の抗RANKLへの添加は、CD8+ T細胞TILのPD-1レベルを有意には変化させず、PD-1発現調整は、抗PD-1単一療法および抗RANKL＋抗PD-1併用療法で固有に観察され、抗CTLA4療法では観察されないことが示された。興味深いことに、ｇp70特異性CD8+ T細胞TILによるPD-1発現は、抗CTLA4を抗PD-1および抗RANKLにさらに添加してもさらに低下することはなかった
【０２２９】
加えて、腫瘍の非リンパ系CD45.2+構成要素におけるPD-L1（PD-1のリガンド）の発現をCT26モデルで評価した（図19B）。ICBにとって二次的な適応免疫性耐性と歩調を合わせて、PL-D1を発現する細胞の割合は抗PD-1の一用量投与後にわずかに増加したが、前記は抗RANKLが抗PD-1とともに投与されたとき軽減された（図19B）。抗CTLA4の添加はPD-L1の発現に影響を与えなかった（図19A−B）。これらの結果は、抗RANKLは、非リンパ系TILにおける免疫抑制PD-L1の発現の調整を介して抗PD-1または抗PD-1＋抗CTLA4療法を改善し、このメカニズムは抗RANKLと抗CTLA4との組み合わせとは別個であったことを暗示している。
総合すれば、これらのデータは、抗RANKLが抗PD-1/PD-L1有効性を増強するメカニズムは、抗RANKL封鎖による抗CTLA4有効性の増強とは別個であることを提唱する。第一に、これらのデータは、抗PD-1および抗CTLA4の抗腫瘍有効性はRANKL封鎖によってさらに改善され得ること、およびこの三重併用療法の抗腫瘍有効性はいずれの二重併用よりも優れていること示した。第二に、抗RANKLと異なる併用療法との固有メカニズムによる相互作用は、RANKL阻害時のTMEの変化によって説明できるかもしれない（前記メカニズムはある種の併用療法と固有に交差調整するであろう）。抗CTLA4による治療はT細胞TILでのRANKLレベルを変化させなかった。したがって、通常、RANKLの低発現を示す腫瘍（例えばメラノーマ）では、交差調整仮説は、抗PD-1投与はTMEにおいてRANKLのアップレギュレーションをもたらし、したがってRANKシグナリングの増加を生じ、同時発生的かまたはその後に続くRANKL封鎖への応答に対して腫瘍をプライミグし得ることを予測する。閾レベルを超えるT細胞TILによるPD-1発現は抗PD-1抗体に対する耐性をもたらし、このレベル以下に発現を低下させる手法（例えばまた別の免疫療法との併用）は治療利益をもたらすことが、以前に前臨床モデルで示された（Selby et al., 2013. Cancer Immunol Res 1:32-42；Nｇiow et al., 2015（上掲書））。記載したこのCT26の分析では、二重抗RANKLおよび抗PD-1治療の治療感受性は、腫瘍ミクロ環境における有利な変化（T細胞によるPD-1発現の低下およびPD-L1発現の低下の両方を含む）と密接に関係していた。腫瘍ミクロ環境におけるこれらの変化は、抗CTLA4 mAb単独による治療時には観察されず、CTLA-4およびPD-1は、非オーバーラップ作用メカニズムを調節することを示唆し、同時発生的抗RANKLとの併用療法は、別個の阻害性経路および別個のメカニズムを介して生じることを提唱する。
【実施例２０】
【０２３０】
抗RANKL mAbの最適投与は免疫チェックポイント封鎖と同時発生的にまたは前記封鎖の後で実施される
二重免疫チェックポイント封鎖（ICB）療法（抗PD-1および抗CTLA4治療の併用）に対する抗RANKL抗体の最適な順序を評価した。結腸癌腫CT26の皮下増殖抑制で、同時発生的抗体療法（腫瘍接種後8、12、16、20日目に抗体治療）を逐次療法（8、12、または16、20日目に等しい抗体総用量）と比較した。有意に優れた増殖抑制が、二重ICB療法と同時発生的か、または前記療法の後で抗RANKL MAbを投与したときに達成された（図20）。同時発生的抗RANKL単一療法と比較して、二重ICB療法後の逐次抗RANKLは腫瘍増殖を有意に抑制した。しかしながら、この順序は同時発生的な二重ICB単独療法よりも有効性は低かった（図20）。
マウス3LL肺腺癌モデルで抗RANKLおよび抗PD-1併用の抗腫瘍効能もまた試験し、mAbの最適な順序を調べた。同時発生的なmAb療法の腫瘍増殖抑制活性を逐次療法として与えられるmAbの等しい総用量と比較した。前臨床データは、抗RANKLおよび抗PD-1 mAb併用は、療法が同時発生的に与えられるかまたは逐次的に与えられるかにかかわらず、単一療法またはコントロールIｇと有効性において優れていた（図21）。抗RANKL治療前の逐次抗PD-1療法は、抗PD-1療法前の抗RANKL治療と比較して有意に大きな腫瘍体積減少をもたらした（p＜0.01）（図21）。抗PD-1が後に続く逐次抗RANKLは有意に腫瘍増殖を抑制したが、しかしながらこの順序は抗RANKLおよび抗PD-1の同時発生的な治療よりも有効性は低かった。
総合すれば、これらのデータは、前臨床モデルで観察される抗腫瘍効能は、順序に関係なくRANKL封鎖および抗PD-1抗体の併用時に（各抗体単独と比較して）増強されることを示す。しかしながら、データは、二重ICB（抗PD-1および抗CTLA4）または抗PD-1単独が後に続く逐次抗RANKLは、同時発生的な治療よりも有効性が有意に低いことを確かに示した。したがって、これらのデータは、抗RANKL療法の実施は、抗PD-1/PD-L1または抗CTLA4（または両方）との併用治療と同時発生的か（またはその後で）生じるべきであることを提唱する。さらにまた、抗PD-1/PD-L1または抗CTLA4（または両方）との併用で、抗RANKLによる同時発生的な治療は、その後に連続する抗RANKLによる治療よりも優れた抗腫瘍応答を達成することを示すデータは、マルチ特異性（例えば二特異異性）抗体（前記は同時にRANKLおよびPD-1、PD-L1および/またはCTLA4を封鎖するであろう）の潜在的な活性を支持する。
【実施例２１】
【０２３１】
マルチ特異性アンタゴニストを用いてRANKLおよびPD-1を共同標的とする合理的根拠としてのRANKLおよびPD-1の細胞上での共同発現
2つの免疫抑制経路を封鎖する二重特異性抗体の場合、同じ細胞タイプ上での複数の標的抗原の共働発現は、機能が標的細胞そのものとなるために有利であろう。単一細胞タイプ上の複数の標的抗原の共同発現もまた、腫瘍ミクロ環境内の二重特異性様式のより細胞特異的または組織特異的作用、および腫瘍内のより強い細胞選択性によるより低い周辺毒性を危険なものとして排斥し得る。また別に或いは付け加えて、2つの別個の細胞でトランス態様で発現される2つの免疫抑制経路を封鎖する二重特異性抗体もまた有益である。なぜなら、2つの別個の免疫抑制メカニズムを同時に阻害できるからである。
したがって、TMEにおけるRANKおよびPD-1のマルチ特異性標的誘導のための理論的根拠として、腫瘍浸潤免疫細胞上でのこれらの因子の共同発現は斟酌されるべきである。CT26腫瘍モデルにおける抗PD-1併用抗RANKLの抗腫瘍有効性およびメカニズムに関するデータは既に述べ、上記に記載したように、T細胞TIL上でのRANKLおよびPD-1の共同発現はこのモデルで特徴づけた。例えば、マウスのCT26腫瘍から単離したT細胞では、ほとんど全てのCD8+RANKL+ T細胞TIL（＞90％）がPD-1を共同発現し、比較して、CD8+RANKL- T細胞TILの40％未満がPD-1陽性であった（図16）。さらにまた、PD-1のMFIは、CD8+RANKL- T細胞と比較してCD8+RANKL+で3倍高く、前者をPD1hi細胞として識別した（図16）。一例として、腫瘍浸潤CD8+RANKL+ T細胞の98.5％がPD-1を発現し、一方、CD8+RANKL- T細胞の44％がPD-1を発現し（図22）、TILにおける非常に高レベルのRANKL/PD-1共同発現を提示した。
【実施例２２】
【０２３２】
四価抗RANKL/PD-1 FIT-Iｇ構築物（デノスマブ＋ニボルマブ）の設計
RANKLおよび少なくとも1つのICMと拮抗するマルチ特異性抗体の一例は、2つの抗体（その1つはRANKLと結合し（mAb A）、その1つはPD-1と結合する（mAb B））から構築されるマルチ特異性FIT-Iｇ抗体として構築することができる。例示すれば、第一の抗原結合分子はヒトRANKLの領域と特異的に結合でき、第二の抗原結合分子はヒトPD-1の領域に（好ましくはヒトPD-1の細胞外ドメインの領域に）特異的に結合できる。本発明で使用される適切な1つのそのような抗RANKL mAbはデノスマブである。したがって、いくつかの実施態様では、抗RANKL抗原結合分子は、完全にヒトのIｇG2 mAbデノスマブ、またはその抗原結合フラグメントを含む。同じ実施態様のいくつかおよび他の実施態様では、抗RANKL抗原結合分子は、本明細書の表1に示すCDR配列を含む。マルチ特異性FIT-Iｇ抗体の具体的な例では、第二の抗原結合分子は、ニボルマブ、ペムブロリズマブおよびピジリズマブから選択されるmAbの任意の1つの少なくとも1つの抗原結合フラグメントを含むことができる。本発明で使用される適切な1つの抗PD-1 mAbはニボルマブである。
RANKLおよびPD-1の両方と結合しそれらと拮抗する三価マルチ特異性FIT-Iｇ分子を構築するために、デノスマブの軽鎖（VL-CL）ドメインをニボルマブの重鎖（VH-CH1-CH2-CH3）とそのNH2-末端でタンデムに直接融合させる。第二の構築物はデノスマブのVH-CH1であり、第三の構築物はニボルマブのVL-CLである。抗RANKL/PD-1 FIT-Iｇ分子の模式図は図23Aに示され、抗RANKL/PD-1 FIT-IｇのDNA構築設計は図23Bに示される。3つのDNA構築物の全てを哺乳動物発現ベクターでサブクローニングし、タンパク質の産生は、3つのDNA構築物の全ての哺乳動物発現ベクターへ（HEK-293）の一過性トランスフェクション時に達成することができる。RANKL/PD-1 FIT-Iｇ分子の精製はタンパク質A精製によって達成することができる。
【０２３３】
RANKL/PD-1 FIT-Iｇ構築物#1：VL（デノスマブ）-CL（デノスマブ）-VH-CH1-CH2-CH3（ニボルマブ）のアミノ酸配列（655aa）：
【０２３４】
2020522529.tif 000052
【０２３５】
（配列番号２７６）
ここで、抗RANKL抗体（デノスマブ）軽鎖（US 7,364,736 B2）可変領域（VL）の成熟アミノ酸は列は大文字で示され、定常領域（CL）は小文字で示され、抗PD-1抗体（ニボルマブ、WO2006/121 168）重鎖（VH-CH1-CH2-CH3）は太字の大文字で示される。
RANKL/PD-1 FIT-Iｇ構築物#2：VH-CH1（デノスマブ）のアミノ酸配列（218aa）：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEOTAVYYCAKDPGTTVIMSWFOPWGQGTLVTVSSastkｇpsvfplapcsrstsestaalｇclvkdyfpepvtvswnsｇaltsｇvhtfpavlqssｇlyslssvvtvpssnfｇtqtytcnvdhkpsntkvdktv（配列番号:277）、
ここで、抗RANKL抗体（デノスマブ）重鎖（US 7,364,736 B2）可変領域（VH）の成熟アミノ酸配列は大文字で示され、定常領域（CH1）は小文字で示される。
RANKL/PD-1 FIT-Iｇ構築物#3：VL-CL（ニボルマブ）のアミノ酸配列（214aa）：
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVaapsvfifppsdeqlksｇtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsｇnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqｇlsspvtksfnrｇec（配列番号:278）、
ここで、抗PD-1抗体軽鎖（ニボルマブ、WO2006/121 168）可変領域（VL）の成熟アミノ酸配列は大文字で示され、定常領域（CL）は小文字で示される。
【実施例２３】
【０２３６】
四価抗RANKL/CTLA4 FIT-Iｇ構築物（デノスマブ＋イピリムマブ）の設計
RANKLおよび少なくとも1つのICMと拮抗するマルチ特異性抗体の1つの例は、2つの抗体（その1つはRANKLと結合し（mAb A）、その1つはCTLA4と結合する（mAb B））から構築されるマルチ特異性FIT-Iｇ抗体として構築することができる。例示すれば、第一の抗原結合分子はヒトRANKLの領域と特異的に結合でき、第二の抗原結合分子はヒトCTLA4の領域に（好ましくはヒトCTLA4の細胞外ドメインの領域に）特異的に結合できる。本発明で使用される適切な1つのそのような抗RANKL mAbはデノスマブである。したがって、いくつかの実施態様では、抗RANKL抗原結合分子は、完全にヒトのIｇG2 mAbデノスマブ、またはその抗原結合フラグメントを含む。同じ実施態様のいくつかおよび他の実施態様では、抗RANKL抗原結合分子は、本明細書の表1に示すCDR配列を含む。マルチ特異性FIT-Iｇ抗体の具体的な例では、第二の抗原結合分子は、イピリムマブおよびトレメリムマブから選択されるmAbの任意の1つの少なくとも1つの抗原結合フラグメントを含む。本発明で使用される適切な1つのそのような抗CTLA4 mAbはイピリムマブである。
RANKLおよびCTLA4の両方と結合しそれらと拮抗する三価マルチ特異性FIT-Iｇ分子を構築するために、デノスマブの軽鎖（VL-CL）ドメインをイピリムマブの重鎖（VH-CH1-CH2-CH3）とそのNH2-末端でタンデムに直接融合させる。第二の構築物はデノスマブのVH-CH1であり、第三の構築物はイピリムマブのVL-CLである。抗RANKL/CTLA4 FIT-Iｇ分子の模式図は図24Aに示され、抗RANKL/CTLA4 FIT-IｇのDNA構築設計は図24Bに示される。3つのDNA構築物の全てを哺乳動物発現ベクターでサブクローニングし、タンパク質の産生は、3つのDNA構築物の全ての哺乳動物発現ベクターへ（HEK-293）の一過性トランスフェクション時に達成することができる。RANKL/CTLA4 FIT-Iｇ分子の精製はタンパク質A精製によって達成することができる。
RANKL/CTLA4 FIT-Iｇ構築物#1：VL（デノスマブ）-CL（デノスマブ）-VH-CH1-CH2-CH3（イピリムマブ）のアミノ酸配列（663aa）：
【０２３７】
2020522529.tif 000053
【０２３８】
（配列番号２７９）
ここで、抗RANKL抗体（デノスマブ）軽鎖（US 7,364,736 B2）可変領域（VL）の成熟アミノ酸は列は大文字で示され、定常領域（CL）は小文字で示され、抗CTLA4抗体（イピリムマブ、US20150283234）重鎖（VH-CH1-CH2-CH3）は太字の大文字で示される。
RANKL/CTLA4 FIT-Iｇ構築物#2：VH-CH1（デノスマブ）のアミノ酸配列（214aa）：
本配列は、上記のRANKL/PD-1 FIT-Iｇ構築物＃2のために用いられたVH-CH1デノスマブ構築物（配列番号:277）と同じものである。
RANKL/CTLA4 FIT-Iｇ構築物#3：VL-CL（イピリムマブ）のアミノ酸配列（215aa）：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGAFSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVaapsvfifppsdeqlksｇtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsｇnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqｇlsspvtksfnrｇec（配列番号:280）、
ここで、抗CTLA4抗体軽鎖（イピリムマブ、US20150283234）可変領域（VL）の成熟アミノ酸配列は大文字で示され、定常領域（CL）は小文字で示される。
【実施例２４】
【０２３９】
四価抗RANKL/PD-L1 FIT-Iｇ構築物（デノスマブ＋アテゾリズマブ）の設計
RANKLおよび少なくとも1つのICMと拮抗するマルチ特異性抗体の1つの例は、2つの抗体（その1つはRANKLと結合し（mAb A）、その1つはPD-L1と結合する（mAb B））から構築されるマルチ特異性FIT-Iｇ抗体として構築することができる。例示すれば、第一の抗原結合分子はヒトRANKLの領域と特異的に結合でき、第二の抗原結合分子はヒトPD-L1の領域に（好ましくはヒトPD-L1の細胞外ドメインの領域に）特異的に結合できる。本発明で使用される適切な1つのそのような抗RANKL mAbはデノスマブである。したがって、いくつかの実施態様では、抗RANKL抗原結合分子は、完全にヒトのIｇG2 mAbデノスマブ、またはその抗原結合フラグメントを含む。同じ実施態様のいくつかおよび他の実施態様では、抗RANKL抗原結合分子は、本明細書の表1に示すCDR配列を含む。マルチ特異性FIT-Iｇ抗体の具体的な例では、第二の抗原結合分子は、デュルバルマブ（MED14736）、アテゾリズマブ（Tecentriq）、アベルマブ、BMS-936559/MDX-1105、MSB0010718C、LY3300054、CA-170、GNS-1480およびMPDL3280Aから選択されるmAbの任意の1つの少なくとも1つの抗原結合フラグメント、またはその抗原結合フラグメントを含む。本発明で使用される適切な1つのそのような抗PD-L1 mAbはアテゾリズマブである。
RANKLおよびPD-L1の両方と結合しそれらと拮抗する三価マルチ特異性FIT-Iｇ分子を構築するために、デノスマブの軽鎖（VL-CL）ドメインをアテゾリズの重鎖（VH-CH1-CH2-CH3）とそのNH2-末端でタンデムに直接融合させる。第二の構築物はデノスマブのVH-CH1であり、第三の構築物はアテゾリズのVL-CLである。抗RANKL/PD-L1 FIT-Iｇ分子の模式図は図25Aに示され、抗RANKL/PD-L1 FIT-Iｇ分子のDNA構築設計は図25Bに示される。3つのDNA構築物の全てを哺乳動物発現ベクターでサブクローニングし、タンパク質の産生は、3つのDNA構築物の全ての哺乳動物発現ベクターへのHEK-293での一過性トランスフェクション時に達成することができる。RANKL/PD-L1 FIT-Iｇ分子の精製はタンパク質A精製によって達成することができる。
RANKL/PD-L1 FIT-Iｇ構築物#1：VL（デノスマブ）-CL（デノスマブ）-VH-CH1-CH2-CH3（アテゾリズマブ）のアミノ酸配列（663aa）：
【０２４０】
2020522529.tif 000054
【０２４１】
（配列番号２８１）
ここで、抗RANKL抗体（デノスマブ）軽鎖（US 7,364,736 B2）可変領域（VL）の成熟アミノ酸は列は大文字で示され、定常領域（CL）は小文字で示され、抗PD-L1抗体（アテゾリズマブ、米国特許8,217148号）重鎖（VH-CH1-CH2-CH3）は太字の大文字で示される。
RANKL/PD-L1 FIT-Iｇ構築物#2：VH-CH1（デノスマブ）のアミノ酸配列：
本配列は、上記のRANKL/PD-1 FIT-Iｇ構築物＃2のために用いられるVH-CH1デノスマブ構築物（配列番号:277）と同じものである。
RANKL/PD-L1 FIT-Iｇ構築物#3：VL-CL（アテゾリズマブ）のアミノ酸配列（214aa）：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPsvfifppsdeqlksｇtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsｇnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqｇlsspvtksfnrｇec（配列番号:282）、
ここで、抗PD-L1抗体（アテゾリズマブ、米国特許8,217148号）軽鎖可変領域（VL）の成熟アミノ酸配列は大文字で示され、定常領域（CL）は小文字で示される。
【実施例２５】
【０２４２】
二重特異性抗RANKL/PD-1抗体（IK22-5/RMP1-14）の構築
マウスRANKLおよびマウスPD-1の両方に結合するヘテロダイマー（二重特異性）抗体を、Fabコード配列をヒトIｇG1骨格に融合させることによって作製した。ヘテロダイマー二重特異性IｇG抗体の組立ては、IｇG重鎖へ相補性KIH変異をまず初めに導入することによって達成された。所望の軽鎖/重鎖対の結合は、“CrossMab”アプローチ（例えば以下を参照されたい：Schaefer et al., 2011. Proc Natl Acad Sci U S A 108: 11187-11192）によって促進された（前記アプローチでは、二重特異性抗体の1つのFab（Fab領域）の改変は、軽鎖と重鎖間の定常領域または定常および可変領域の“交換”である）。D265A変異もまたヒトIｇG1 Fcドメインに導入し、Fc受容体との結合を低下させさらにエフェクター機能を低下させた。これらの技術を用いて、二重特異性抗RANKL/PD-1抗体（RMP1-14 CH-CL X IK22/5 WT二重特異性とも呼ばれる）を構築し、標準的技術によって生成および精製した。さらにまた、二重特異性抗RANKL/PD-1抗体は両方の標的と結合でき、in vitroおよびin vivoでRANKLおよびPD-1に対してアンタゴニスト活性を有する。
mAb cDNA配列は、抗RANKL IK22-5（Kamijo et al., 2006. Biochem Biophys Res Commun. 347（1）:124-32）および抗PD-1 RMP1-14（Curran et al., 2010. Proc Natl Acad Sci U S A 107（9）:4275-80）をコードするラットハイブリドーマから得られた。全RNAは、市販試薬（TRIzol（商標）試薬（Ambion, Cat. No. : 15596-026））の技術マニュアルにしたがって当該ハイブリドーマ細胞から単離した。続いて、全RNAをcDNAに逆転写した。アイソタイプ特異的アンチセンスプライマーまたはユニバーサルプライマーを市販のcDNA合成キット（PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara, Cat. No. 6110A））の技術マニュアルにしたがって用いた。VHおよびVLの抗体フラグメントを、cDNA末端迅速増幅（RACE）の標準的操作手順にしたがって標準的技術により増幅した。増幅抗体フラグメントを別々に標準的クローニングベクターでクローニングし、さらにDNA配列決定を実施した。抗RANKL mAb IK22-5並びに抗PD-1 mAb RMP1-14の可変ドメインおよびリーダー配列のアミノ酸配列が提供される（下記参照）。免疫グロブリン可変領域の配列分析並びにフレームワーク（FR）およびCDRの決定は、NCBIヌクレオチドBLAST、IMGT/V QuestプログラムおよびNCBI IｇBLASTアルゴリズムを用いて達成された。
【０２４３】
ラットモノクローナル抗体の抗RANKL mAb IK22-5の可変ドメインのアミノ酸配列：
重鎖IK22-5：アミノ酸配列（135aa）
【０２４４】
2020522529.tif 000055
【０２４５】
2020522529.tif 000056
【０２４６】
軽鎖IK22-5：アミノ酸配列（126aa）
【０２４７】
2020522529.tif 000057
【０２４８】
2020522529.tif 000058
【０２４９】
ラットモノクローナル抗体の抗PD-1 mAb RMP1-14の可変ドメインのアミノ酸配列：
重鎖RMP1-14：アミノ酸配列（138aa）
【０２５０】
2020522529.tif 000059
【０２５１】
2020522529.tif 000060
【０２５２】
軽鎖RMP1-14：アミノ酸配列（131aa）
【０２５３】
2020522529.tif 000061
【０２５４】
2020522529.tif 000062
【実施例２６】
【０２５５】
RANKLおよびPD-1と結合する能力を有するマルチ特異性抗原結合分子（二重特異性抗RANKL/PD-1抗体、RMP1-14 CH-CL X IK22/5 WT二重特異性とも呼ばれる）を作製するために、“CrossMAb”技術を利用した。前記では、二重特異性抗体の1つのFab（Fab領域）を改変して軽鎖および重鎖の間で定常領域または定常領域および可変領域を“交換”することによって、所望の軽鎖/重鎖対を誘発することができる。第二に、重鎖のヘテロダイマーの特異的な対を生じるために、2つの重鎖のFcドメインの“ノブインホール”（knobs-in-holes）（KiH）変異を利用した。ラットモノクローナル抗体可変領域（IK22-5およびRMP1-14由来）をコードするDNAを、ヒトIｇG1 Fcドメインとの融合物として合成した。“不適切な”軽/重鎖の結合を防ぐこの技術は、“CrossMab”技術と称され、KiH技術と併用されるとき、所望の二重特異性分子の目覚ましく増強された発現をもたらす（例えば以下を参照されたい：Schaefer et al., 2011. Proc Natl Acad Sci U S A 108: 11187-11192）。
二重特異性抗RANKL/PD-1抗体のCrossMab型を作製するために、RMP1-14（抗PD-1抗体）配列を操作し、CH1およびCL配列が交換された“CrossMabCH1-CL”とした（RMP1-14 CH-CL-huIｇG1Fcと称される）。抗RANKL抗体（IK22-5）のFab領域は無変化であった（IK22-5-huIｇG1Fc WTと称される）。ポリペプチド鎖のヘテロダイマー化は、大きなアミノ酸（ノブ）を所望のヘテロダイマーの一方の鎖に導入し、小さなアミノ酸（ホール）を所望のヘテロダイマーの他方の鎖に導入することによって促進された（“ノブインホール”（KiH）構造と呼ばれる）（例えば以下を参照されたい：Ridｇeway et al., Protein Enｇ. 9（1996）, 617-621；およびAtwell et al., J. Mol. Biol. 270（1997）, 677-681）。具体的には、“ノブ”変異（T366W）がIK22-5-huIｇG1Fc WTのCH3ドメインに導入され、3つのホール変異（T366S、L368A、およびY407V）がRMP1-14 CH-CL-huIｇG1Fcの重鎖に導入された。加えて、2つのCys残基が導入され（S354Cが“ノブ”（knob）側に、Y349Cが“ホール”（hole）側に）、安定的なジスルフィド結合を形成し、さらにヘテロダイマー化を増強した。さらにまた、D265A変異もまた、IK22-5-huIｇG1Fc WTおよびRMP1-14 CH-CL-huIｇG1Fcの両方のヒトIｇG1 Fcドメインに導入された。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の模式図は図26に示される。
【０２５６】
二重特異性CrossMab抗RANKL/PD-1抗体の4つの抗体鎖のアミノ酸配列
IK22-5-huIｇG1Fc WT重鎖（465aa）：
【０２５７】
2020522529.tif 000063
【０２５８】
2020522529.tif 000064
【０２５９】
IK22-5-huIｇG1Fc WT軽鎖（232aa）：
【０２６０】
2020522529.tif 000065
【０２６１】
2020522529.tif 000066
【０２６２】
RMP1-14 CH-CL-huIｇG1Fc重鎖（473aa）：
【０２６３】
2020522529.tif 000067
【０２６４】
2020522529.tif 000068
【０２６５】
RMP1-14 CH-CL-huIｇG1Fc軽鎖（233aa）：
【０２６６】
2020522529.tif 000069
【０２６７】
組換え二重特異性抗体を作製するために、4つの鎖の各々をコードするcDNAを哺乳動物細胞ベクターpcDNA3.4でサブクローニングし、トランスフェクション等級プラスミドを標準的技術を用いて大規模調製した。二重特異性抗体は、4つの発現プラスミド（RMP1-14 CH-CL-huIｇG1FcおよびIK22-5-huIｇG1Fc WTの重鎖および軽鎖をコードする）を等しい比率で用い、無血清ExpiCHO発現培地（Thermo Fisher Scientific）で増殖させた懸濁ExpiCHO-S細胞での一過性発現によって生成された。細胞（1Lの培養体積）をエーレンマイヤーフラスコ（Corninｇ Inc.）で37°C、8％CO2でオービタルシェーカーで維持し、トランスフェクションから14日目に収集した細胞培養上清を精製に用いた。抗体力価は、通常のIｇG1抗体の一過性発現力価の範囲内であった。細胞培養ブロスを遠心分離し、続いてろ過した。モノフィニティA樹脂（Monofinity A Resin）事前充填カラム1mL（GenScript, Cat.No.L00433-11）にろ過上清を1.0mL/分でローディングした。洗浄し適切な緩衝液で溶出させた後、抗体の溶出分画をプールし、緩衝液をPBS（pH7.2）に交換した。タンパク質を0.22μmフィルターで滅菌し、無菌的に梱包し-80°Cで保存した。
分子量、収量および純度の決定のために、続いて精製タンパク質を標準的プロトコルを用いSDS-PAGE、ウェスタンブロットおよびHPLCによって分析した。非還元状態のSDS-PAGEおよびウェスタンブロットに基づいて、〜80kDa、〜100kDa、および150kDa（計算M.W.は145kDa）の概算分子量の標的タンパク質が検出された（図27に示される）。提示したSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析から、〜55kDaおよび〜25kDaの概算分子量を有する抗体重鎖および軽鎖が検出された。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の純度は85.86％（SEC-HPLCで概算）であり、濃度は3.69mｇ/mLであった（A280で測定（透過係数：1,494））。
二重特異性抗RANKL/PD-1抗体は、懸濁ExpiCHO-S細胞培養での発現後に、追加のin vitro実証およびin vivo試験のための標準的タンパク質A親和性クロマトグラフィーにより高純度で得られた。
【実施例２７】
【０２６８】
二重特異性抗RANKL/PD-1抗体のin vitro特徴付け
HEK-293上のmuRANKLと結合する二重特異性抗RANKL/PD-1抗体（IK22-5/RMP1-14）
二重特異性抗RANKL/PD-1抗体が細胞上で発現されるRANKLと結合する能力を特徴付けるために、フローサイトメトリー分析を実施した。muRANKLをコードするcDNAで一過性にトランスフェクトされたHEK-293細胞で測定したシグナル強度を、トランスフェクトされなかったHEK-293細胞で得られたシグナル強度と比較することによって、相互作用の特異性を決定した。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体は非トランスフェクトHEK-293細胞を認識できなかったが、muRANKL発現細胞には結合した（図28）。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体とmuRANKLとの結合は、陽性コントロール、muRANK-Fcで観察されたものと非常に類似していた（図28）。したがって、RANKL/PD-1抗体は、細胞表面で発現されたmuRANKLの細胞外ドメインを高親和性で認識した。
【実施例２８】
【０２６９】
二重特異性抗RANKL/PD-1抗体（IK22-5/RMP1-14）のRANK-Fc結合との競合
リガンド結合を封鎖する二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の能力を、組換えmuRANKL-Fc（RANKLの高親和性受容体）との競合アッセイで試験した。HEK-293細胞をmuRANKLで一過性にトランスフェクトし、アイソタイプコントロール抗体（ラットIｇG2aおよびhuIｇG1）、陽性コントロール抗muRANKL抗体（IK22-5ラットIｇG2a）および二重特異性抗RANKL/PD-1の存在下でRANK-Fcの結合を試験した。抗RANKL/PD-1二重特異性抗体は、RANK-FcのmuRANKL結合を、陽性コントロール抗RANKL抗体IK22-5と同様に完全に封鎖することができた（図29）。抗RANKL/PD-1二重特異性抗体はアンタゴニスト活性を示し、抗RANKL mAb IK22-5で観察されたIC50（1.1μｇ/mL）に対して2.6μｇ/mLのIC50でRANK-FcのmuRANKL結合を封鎖した。ラットIｇG2aもヒトIｇG1アイソタイプコントロールもRANK-FcのRANKL結合を封鎖しなかった。
【実施例２９】
【０２７０】
二重特異性抗RANKL/PD-1（IK22-5/RMP1-14）のHEK-293細胞異所性発現PD-1との結合
細胞上で発現されるPD-1と結合する二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の能力を特徴付けるために、フローサイトメトリー分析を実施した。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体は、muPD-1トランスフェクトHEK-293細胞と特異的に結合したが、非トランスフェクトHEK-293細胞とは結合しなかった（図30）。したがって、RANKL/PD-1抗体は、細胞表面で発現されるmuPD-1の細胞外ドメインを高い親和性で特異的に認識した。
【実施例３０】
【０２７１】
二重特異性抗RANKL/PD-1抗体（IK22-5/RMP1-14）のPD-L1-Fc結合との競合
リガンド結合を封鎖する二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の能力を、組換えmuPD-L1-Fc（PD-1の高親和性リガンド）との競合アッセイで試験した。HEK-293細胞をmuPD-1で一過性にトランスフェクトし、アイソタイプコントロール抗体（ラットIｇG2aおよびhuIｇG1）、陽性コントロール抗muPD-1抗体（RMP1-14ラットIｇG2a）および二重特異性抗RANKL/PD-1の存在下でPD-L1-Fcの結合を試験した。抗RANKL/PD-1二重特異性抗体は、PD-L1-FcのmuPD-1結合を陽性コントロール抗PD-1抗体RMP1-14と同様に封鎖することができた（図31）。抗RANKL/PD-1二重特異性抗体は、コントロール抗PD-1 mAb RMP1-14で観察されたものと比較してPD-L1-FcのPD-1結合の封鎖でアンタゴニスト活性を示した。ラットIｇG2aもヒトIｇG1アイソタイプコントロールもPD-L1-FcのPD-1結合を封鎖しなかった。
【実施例３１】
【０２７２】
細胞ベース機能アッセイにおける抗RANKL/PD-1二重特異性抗体のアンタゴニスト活性
細胞ベース機能アッセイにおける二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の機能阻害効果を評価するために、in vitro破骨細胞形成におけるこの抗体の効果を試験した。in vitro TRAP+破骨細胞アッセイの方法は本質的に文献に記載された通りであった（Simonet et al., 1997. Cell 89（2）: 309-19）。正常BL/6マウスの骨髄（BM）細胞を96ウェル平底プレートに25000細胞/ウェルの密度で、ヒト組換えCSF-1（Preprotech）（50nｇ/mL）補充完全DMEM（10％FCS＋PS＋Glu）（総体積200μL/ウェル）に播種した。48時間培養後、培地をヒト組換えCSF-1（50nｇ/mL）および可溶性muRANKL（Miltenyi）（200nｇ/mL）を補充した完全DMEMに置き換えた。細胞をCSF-1およびRANKLとともに（抗体阻害剤存在下および非存在下で）4日間培養し、続いて、TRAP+の多核（3核を超える）破骨細胞をカウントした。破骨細胞形成は、以前に記載された（Simonet et al., 1997（上掲書））TRAP細胞化学染色によって評価した。陽性コントロール抗体IK22-5の効果と同様に、抗RANKL/PD-1二重特異性抗体の添加は用量依存態様でTRAP+多核細胞の形成を阻害したが、コントロールヒトIｇGの添加は阻害しなかった（図32）。100nｇ/mLの濃度では、抗RANKL mAb IK22-5および二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の両方が、破骨細胞形成を完全に封鎖した。これらの結果は、抗RANKL/PD-1二重特異性抗体は、RANKLおよびin vitro破骨細胞分化に対するアンタゴニスト活性を維持することを示した。
【実施例３２】
【０２７３】
二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の腫瘍モデルでのin vitro試験
二重特異性抗RANKL/PD-1抗体によるRANKLおよびPD-1の共同標的化は実験的肺転移の抑制において抗RANKLまたは抗PD-1単一療法よりも優れている
転移を制御する二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の効果を試験するために、実験的B16F10メラノーマ肺転移を有する野生型（WT）マウスを用いた。マウスを-1、0および2日目に（腫瘍接種に対応）以下で処置した：cIｇ（200μｇ i.p.、組換えMac4-ヒトIｇG1 D265A）、抗RANKL（100μｇ i.p.、組換えIK22.5-ヒトIｇG1 D265A）、抗PD-1（100μｇ i.p.、組換えRMP1-14-ヒトIｇG1 D265A）、抗RANKL＋抗PD-1（各々100μｇ i.p.）、および表示の用量力価の抗RANKL/PD-1二重特異性抗体（50から200μｇ i.p.、ヒトIｇG1 D265A）。抗RANKLまたは抗PD-1単独は、コントロール免疫グロブリン（cIｇ）処置グループと比較して控えめな有効性を示し、一方、2抗体（抗RANKLおよび抗PD-1）による併用治療または二重特異性抗RANKL/PD-1抗体による治療は転移制御を有意に改善した（図33）。
二重特異性抗体による治療は、どちらかの抗体単独または抗PD-1抗体および抗RANKL抗体の併用よりも強いin vivo肺転移阻害効果を有すると期待される。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体は肺転移量で用量依存減少を示し、100および200μｇ用量グループは、抗PD-1単独と比較して優れた肺転移減少をもたらした（それぞれ*p＜0.05、***p＜0.001）。抗PD-1抗体および抗RANKL抗体の併用治療と比較して（各抗体は100μｇで投与され、すなわち合計抗体は200μｇ）、等しい抗体用量（200μｇの二重特異性抗RANKL/PD-1）での二重特異性抗RANKL/PD-1抗体による治療は、転移制御で少なくとも等しい改善を達成した（図33）。
二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の同様な効果が、実験的PM1前立腺癌肺転移を有するWTマウスで観察された（図34）。-1、0および2日目に（腫瘍接種に対応）に、cIｇ（200μｇ i.p.、ヒトIｇG1 D265A）、抗RANKL（100μｇ i.p.、IK22.5ヒトIｇG1 D265A）、抗PD-1（100μｇ i.p.、ヒトIｇG1 D265A）、抗RANKL＋抗PD-1（それぞれ100μｇ i.p.）、表示したとおりの抗RANKL-PD-1二重特異性抗体（100または200μｇ i.p.、ヒトIｇG1 D265A）でマウスを処置した。抗RANKLまたは抗PD-1単独は、コントロール免疫グロブリン（cIｇ）処置グループと比較して控えめな有効性を示し、一方、2抗体（抗RANKLおよび抗PD-1）による併用治療または二重特異性抗RANKL/PD-1抗体による治療は転移制御を有意に改善した（図34）。
二重特異性抗体による治療は、どちらかの抗体単独または抗PD-1抗体および抗RANKL抗体併用よりも強いin vivo肺転移阻害効果を有すると期待される。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体は肺転移量で用量依存減少を示し、200μｇ用量グループは、抗PD-1単独と比較して優れた肺転移減少をもたらした（*****p＜0.0001）。抗PD-1抗体および抗RANKL抗体の併用治療と比較して（各抗体は100μｇで投与され、すなわち合計抗体は200μｇ）、等しい全体的抗体用量（200μｇの二重特異性抗RANKL/PD-1）での二重特異性抗RANKL/PD-1抗体による治療は、転移制御で等価の改善を達成した（図34）。これらの結果は、二重特異性抗RANKL/PD-1抗体は、等しい用量で治療された抗PD-1および抗RANKL MAb併用グループと比較して等価の転移制御を達成することを提示し、二重特異性抗RANKL/PD-1は優れた有効性を有することを示す。
【実施例３３】
【０２７４】
二重特異性抗RANKL/PD-1によるRANKLおよびPD-1の共同標的化は肺癌細胞株3LLの皮下腫瘍増殖を抑制する
皮下腫瘍の増殖における抗RANKL/PD-1二重特異性抗体の活性を試験するために、マウス3LL肺腺癌腫モデルを利用した。マウスを8、12、16および20日目に（腫瘍接種に対応）以下で処置した：cIｇ（400μｇ i.p.、ラットIｇG2a）、抗RANKL（100μｇ i.p.、IK22-5ラットIｇG2a）、抗PD-1（100μｇ i.p.、RMP1-14ラットIｇG2a）、抗RANKL＋抗PD-1（100μｇ i.p.、それぞれIK22-5およびRMP1-14）、および表示の用量力価の抗RANKL/PD-1二重特異性（100から400μｇ i.p.、ヒトIｇG1 D265A）。抗RANKL mAb IK22-5単独の治療は3LL皮下腫瘍増殖に全く効果はなく、一方、抗PD-1単独は、コントロール免疫グロブリン（cIｇ）処置グループと比較して控えめな有効性を提示した。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の全ての用量が、cIｇまたはコントロール抗RANKL処置単独と比較して、3LLの皮下腫瘍増殖を軽減する活性を明確に有した。抗RANKL/PD-1抗体の200μｇ用量の抗腫瘍効果は、2抗体（抗RANKLおよび抗PD-1、各々100μｇ）による併用治療の等価の総用量（200μｇ）で観察されたものと同様であった。これらのデータは、皮下腫瘍モデルにおける二重特異性抗RANKL/PD-1抗体のin vivo有効性を確認した。
【実施例３４】
【０２７５】
二重特異性抗RANKL/PD-1によるRANKLおよびPD-1の共同標的化は結腸癌細胞株CT26の皮下腫瘍増殖を抑制する
二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の有効性を、皮下CT26結腸腫瘍を有するマウスで抗RANKLおよび抗PD-1抗体による併用治療と比較した（図36）。CT26腫瘍を有するマウスでは、抗RANKLまたは抗PD-1（100μｇ）のどちらも単一療法として最小限の効果を有したが、併用療法（抗RANKLプラス抗PD-1、各々100μｇ）が用いられたとき、樹立腫瘍の増殖抑制が観察された（図2A）。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の100μｇおよび200μｇ用量は、cIｇ、抗PD-1治療単独、またはコントロール抗RANKL治療単独と比較して、CT26の皮下腫瘍増殖を明確に軽減した。抗PD-1単一療法に対する応答の欠如は、この腫瘍がこの免疫療法および単一薬剤による治療に対していくらかの耐性を提示することを示し、二重特異性抗RANKL/PD-1抗体はこの耐性を克服する。二重特異性抗体による治療はCT26腫瘍制御でin vivo阻害効果を有することが期待され、前記阻害効果は、単独抗体または抗PD-1抗体および抗RANKL抗体の併用よりも強い。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の200μｇ用量の抗腫瘍効果は、2抗体（抗RANKLおよび抗PD-1、各々100μｇ）による併用治療の等価の総用量（200μｇ）で観察されたものと同様であった（図36）。これらのデータは、皮下腫瘍モデルにおける二重特異性抗RANKL/PD-1抗体のin vivo有効性を確認した。
【実施例３５】
【０２７６】
二重特異性抗RANKL/PD-1によるRANKLおよびPD-1の共同標的化はCT26腫瘍モデルにおける抗CTLA4治療の抗腫瘍有効性を増強する
本明細書に提示した結果は、抗PD-1/PD-L1および抗CTLA4療法の併用、抗PD-1/PD-L1単一療法、または抗CTLA4単一療法の抗腫瘍有効性は、RANKL封鎖を加えることによってさらに改善され得ることを示す。さらにまた、この三重併用療法（抗RANKLプラス抗PD-1プラス抗CTLA4）の抗腫瘍有効性はいずれの二重併用よりも優れていた。これらのデータは、抗RANKLが抗PD-1/PD-L1有効性を増強するメカニズムは、抗RANKL封鎖による抗CTLA4有効性増強のメカニズムとは別個であることを提唱する。
抗RANKL/PD-1二重特異性抗体が（単一薬剤治療として）、抗CTLA4 mAbの抗腫瘍有効性を増強し得るか否かを調べるために、皮下CT26結腸腫瘍を有するマウスで、二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の有効性を（単独または抗CTLA4と併用して）以下と比較した：抗CTLA4治療単独、抗CTLA4プラス抗PD-1の併用治療、または抗RANKLプラス抗PD-1プラス抗CTLA4（三重治療療法）。このモデルでは、抗CTLA4による治療は、腫瘍増殖で控えめな減少をもたらし、前記減少は抗PD-1の添加に際して（抗CTLA4プラス抗PD-1組合せで）改善された（図37）。抗CTLA4プラス抗PD-1組合せへの抗RANKL mAbの添加（三重治療療法）は腫瘍制御をさらに改善した。抗RANKL/PD-1二重特異性抗体の抗CTLA4 mAbへの添加は、二重特異性抗RANKL/PD-1抗体または抗CTLA4治療単独のどちらで観察されたものよりも強い程度で腫瘍増殖を確かに減少させ、三重療法（抗RANKLプラス抗PD-1プラス抗CTLA4）と比較して腫瘍制御を改善した（図37）。これらのデータは、抗CTLA4の皮下抗腫瘍有効性を増強する抗RANKL/PD-1（単一薬剤治療として）の能力を示す。
【実施例３６】
【０２７７】
二重特異性抗RANKL/PD-1によるRANKLおよびPD-1の共同標的化は乳癌細胞株AT3OVAの皮下腫瘍増殖を抑制する
AT3OVA乳房腫瘍を有するマウスで、二重特異性抗RANKL/PD-1抗体を抗RANKLおよび抗PD-1抗体による併用治療と比較した（図38）。AT3OVA腫瘍を有するマウスで、抗RANKLまたは抗PD-1（100μｇ）は単一療法として最小限の効果を有したが、併用療法（抗RANKLプラス抗PD-1、各々100μｇ）が用いられたときは樹立腫瘍の抑制が観察された（図38）。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の100μｇおよび200μｇ用量は、cIｇ、抗PD-1治療単独またはコントロール抗RANKL治療単独と比較して、AT3OVAの皮下腫瘍増殖を明確に減少させた。抗PD-1単一療法に対する応答の欠如は、この腫瘍がこの免疫療法および単一薬剤による治療に対していくらかの耐性を提示することを示し、二重特異性抗RANKL/PD-1抗体はこの耐性を克服する。二重特異性抗体による治療はAT3OVA腫瘍制御でin vivo阻害効果を有することが期待され、前記阻害効果は、単独抗体または抗PD-1抗体および抗RANKL抗体の併用よりも強い。二重特異性抗RANKL/PD-1抗体の200μｇ用量の抗腫瘍効果は、2抗体（抗RANKLおよび抗PD-1、各々100μｇ）による併用治療の等価の総用量（200μｇ）で観察されたものと同様であった（図38）。これらのデータは、皮下乳房腫瘍モデルにおける二重特異性抗RANKL/PD-1抗体のin vivo有効性を確認する。
【０２７８】
本明細書に引用される全ての特許、特許出願、および特許公開は参照によってその全体が本明細書に含まれる。
本明細書のいずれの参考文献の引用も、そのような参考文献が本出願の“先行技術”として利用可能であることを容認するものと解されるべきではない。
本明細書を通してその目的は本発明の好ましい実施態様を記載することであり、いずれか1つの実施態様または特定の特徴収集物に本発明を限定しない。したがって、本開示に照らし、多様な改変および変更を本発明の範囲から外れることなく個々の実施態様で実行し得ることは当業者には理解されるであろう。そのような改変および変更は全て添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【図１Ａ−Ｂ】
2020522529.tif 000070
【図１Ｃ−Ｄ】
2020522529.tif 000071
【図２】
2020522529.tif 000072
【図３】
2020522529.tif 000073
【図４Ａ−Ｂ】
2020522529.tif 000074
【図４Ｃ】
2020522529.tif 000075
【図５】
2020522529.tif 000076
【図６Ａ−Ｂ】
2020522529.tif 000077
【図６Ｃ−Ｄ】
2020522529.tif 000078
【図７Ａ−Ｄ】
2020522529.tif 000079
【図７Ｅ−Ｈ】
2020522529.tif 000080
【図８Ａ−Ｄ】
2020522529.tif 000081
【図８Ｅ】
2020522529.tif 000082
【図９】
2020522529.tif 000083
【図１０】
2020522529.tif 000084
【図１１】
2020522529.tif 000085
【図１２Ａ】
2020522529.tif 000086
【図１２Ｂ】
2020522529.tif 000087
【図１３】
2020522529.tif 000088
【図１４】
2020522529.tif 000089
【図１５Ａ−Ｃ】
2020522529.tif 000090
【図１５Ｄ−Ｅ】
2020522529.tif 000091
【図１６】
2020522529.tif 000092
【図１７Ａ−Ｂ】
2020522529.tif 000093
【図１７Ｃ】
2020522529.tif 000094
【図１８Ａ−Ｃ】
2020522529.tif 000095
【図１９】
2020522529.tif 000096
【図２０】
2020522529.tif 000097
【図２１】
2020522529.tif 000098
【図２２】
2020522529.tif 000099
【図２３】
2020522529.tif 000100
【図２４】
2020522529.tif 000101
【図２５】
2020522529.tif 000102
【図２６】
2020522529.tif 000103
【図２７】
2020522529.tif 000104
【図２８】
2020522529.tif 000105
【図２９】
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【図３０】
2020522529.tif 000107
【図３１】
2020522529.tif 000108
【図３２】
2020522529.tif 000109
【図３３】
2020522529.tif 000110
【図３４】
2020522529.tif 000111
【図３５】
2020522529.tif 000112
【図３６】
2020522529.tif 000113
【図３７】
2020522529.tif 000114
【図３８】
2020522529.tif 000115
【配列表】
2020522529000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月12日(2020.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
表A：配列の簡単な説明
2020522529.tif 000116
2020522529.tif 000117
2020522529.tif 000118
2020522529.tif 000119
2020522529.tif 000120
2020522529.tif 000121
2020522529.tif 000122
2020522529.tif 000123
2020522529.tif 000124
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
5．マルチ特異性抗原結合構築物
本発明のある特徴は、異なる特異性を有する複数の抗原結合分子を含み、それらが直接的にまたはリンカーを介して一緒に融合或いは接合されているキメラ構築物に関する。
5.1抗RANKL-抗PD-1ジアボディ
本発明は、二重特異性で抗RANKL抗原結合分子および抗PD-1抗原結合分子を含むマルチ特異性構築物を意図し、その代表的な例は、以下から選択される配列を含むか、前記配列から成るか、または本質的に前記配列から成る：
a）EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspgeratlscrasqsvssylawyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqssnwprtfgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:216）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:291）に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:292）に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAｂデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:293）に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
b）QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik [SGGGG]n EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspgeratlscrasqsvssylawyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqssnwprtfgqgtkveik
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:217）に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:294）に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:295）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:296）対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
c）QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspgeratlscrasqsvssylawyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqssnwprtfgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:218）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:297）に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:298）に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:299）に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
d）QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspgeratlscrasqsvssylawyqqkpgqaprlliydasnratgiparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqssnwprtfgqgtkveik
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:219）に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:300）に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:301）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbニボルマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:302）に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
e）EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspgeratlscraskgvstsgysylhwyqqkpgqaprlliylasylesgvparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqhsrdlpltfgggtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:220）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:303）に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:304）に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:305）に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
f）QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik [SGGGG]n EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspgeratlscraskgvstsgysylhwyqqkpgqaprlliylasylesgvparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqhsrdlpltfgggtkveik
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:221）に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:306）に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:307）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:308）に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
g）QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspgeratlscraskgvstsgysylhwyqqkpgqaprlliylasylesgvparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqhsrdlpltfgggtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:222）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:309）に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:310）に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:311）に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
h）QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspatlslspgeratlscraskgvstsgysylhwyqqkpgqaprlliylasylesgvparfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqhsrdlpltfgggtkveik
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:223）に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:312）に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:313）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-1 MAbペムブロリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:314）に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
5.2抗RANKL-抗PD-1ジアボディ
また別に、二重特異性構築物は、抗RANKL抗原結合分子および抗PD-L1抗原結合分子を含み、その代表的な例は、以下から選択される配列を含むか、前記配列から成るか、または本質的に前記配列から成る：
a）EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqrvsssylawyqqkpgqaprlliydassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygslpwtfgqgtkveik [SGGGG]n VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:224）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:315）に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:316）に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:317）に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
b）VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik [SGGGG]n EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqrvsssylawyqqkpgqaprlliydassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygslpwtfgqgtkveik
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:225）に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:318）に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:319）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:320）に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
c）QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqrvsssylawyqqkpgqaprlliydassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygslpwtfgqgtkveik [SGGGG]n VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:226）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:321）に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:322）に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:323）に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
d）VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqrvsssylawyqqkpgqaprlliydassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygslpwtfgqgtkveik
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:227）に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:324）に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:2325）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbデュルバルマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:326）に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
e）EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvstavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfgqgtkveik [SGGGG]n EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:228）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:327）に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:328）に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:329）に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
f）EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik [SGGGG]n EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvstavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfgqgtkveik
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:229）に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:330）に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:331）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:332）に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
g）QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvstavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfgqgtkveik [SGGGG]n EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:230）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:333）に対応し、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:334）に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:335）に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
h）EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdvstavawyqqkpgkapklliysasflysgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqylyhpatfgqgtkveik
ここで、
大文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:231）に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:336）に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:337）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗PD-L1 MAbアテゾリズマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:338）に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
5.3抗RANKL-抗CTLA4ジアボディ
また別に、二重特異性構築物は、抗RANKL抗原結合分子および抗CTLA4抗原結合分子を含み、その代表的な例は、以下から選択される配列を含むか、前記から成るか、または本質的に前記から成る：
a）EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvgssylawyqqkpgqaprlliygafsratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspwtfgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:232）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:339）に対応し、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:340）に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:341）に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
b）QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik [SGGGG]n EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvgssylawyqqkpgqaprlliygafsratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspwtfgqgtkveik
ここで、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:233）に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:342）に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:343）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:344）に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
c）QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvgssylawyqqkpgqaprlliygafsratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspwtfgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:234）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:345）に対応し、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:346）に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:347）に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
d）QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvgssylawyqqkpgqaprlliygafsratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygsspwtfgqgtkveik
ここで、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:235）に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:348）に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:349）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbイピリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:350）に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
e）EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsinsyldwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyystpftfgpgtkveik [SGGGG]n QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik
ここで、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:236）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:351）に対応し、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:352）に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:353）に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
f）QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvrgrylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavfycqqygssprtfgqgtkveik [SGGGG]n EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDPGTTVIMSWFDPWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsinsyldwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyystpftfgpgtkveik
ここで、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:237）に対応し、
小文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:354）に対応し、
大文字通常表示は、抗RANKL MAbデノスマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:355）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:356）に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
g）QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsinsyldwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyystpftfgpgtkveik [SGGGG]n QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik
ここで、
大文字通常表示は、EP1257648で開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:238）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:357）に対応し、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:358）に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:359）に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
h）QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYTMHWVRQAPGKGLEWVTFISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARTGWLGPFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n eivmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisrylnwyqlkpgkaprlliygasslqsgvpsrfsgsgsgaeftltisslqpediatyycqhtrafgqgtkveik [SGGGG]n QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYDFSNYAIHWVRQAPGQRLEWMGWINAGNGNTKFSQKFQGRITVTRDTAASTAYMELRSLRSEDTAVYYCARDSSNMVRGIIIAYYFDYWGQGTLVTVSS [SGGGG]n diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsinsyldwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqyystpftfgpgtkveik
ここで、
大文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:239）に対応し、
小文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:360）に対応し、
大文字通常表示は、EP1257648に開示される抗RANKL抗体の別の実施態様の可変重鎖アミノ酸配列（配列番号:361）に対応し、
小文字下線付き表示は、抗CTLA4 MAbトレメリムマブの可変軽鎖アミノ酸配列（配列番号:362）に対応し、
[SGGGG]nの各出現は可撓性リンカーであり、ここで、n＝1、2、3、または4であり、好ましくは第一および第三の可撓性リンカーの場合はn＝1で、第二の可撓性リンカーの場合にはn＝3である。
【国際調査報告】
2020522529.tif 000125
2020522529.tif 000126
2020522529.tif 000127
2020522529.tif 000128