(57)【要約】  細胞を溶解して、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を放出させ、抽出するための方法及びデバイスが開示される。本発明の方法では、より大きい金属球及びチューブの側面にビーズビーティング溶解の期間中に粘着し、それにより、ビーズビーティングプロセスの効率を大きく改善するセミドライケークを形成する微細ガラスビーズと細胞（例えば、芽胞）との混合物が使用される。本発明のデバイスは、十分な力が生じて、細胞を開裂させること、及び、金属球の衝撃が容器の内側表面の全体に分布させられ、その結果、細胞混合物のすべてが、細胞を壊すための十分な衝撃にさらされることを保証するカオス的動きを生じさせる。結果として、芽胞及びの他の溶解困難な微生物を数秒で開裂させることができる。本発明の方法は、ＤＮＡの完全性を保ちながら、溶解困難な細胞を迅速に開裂させることによって工程数及び操作時間を削減する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
約１ｃｍ〜約２．５ｃｍのストローク長さ、約０．２ｃｍ〜約１ｃｍのストローク高さ、及び約５Ｈｚ〜約５５Ｈｚの速度を有する、同時に生じる非周期的動き及びカオス的動きでサンプルを振とうするためのデバイス。
【請求項２】
サンプルをロースループット又はハイスループット分析のために好適な１つ又は複数のマイクロタイタープレート、個々の微量遠心チューブ又は他の容器に保持するように構成される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
マイクロタイタープレートが、８、１６、２４、４６、９６、３８４又は１５３６ウエルプレートからなる群から選択される、請求項２に記載のデバイス。
【請求項４】
同時に処理することができる微量遠心チューブの数が１〜９６個にまで及ぶ、請求項２に記載のデバイス。
【請求項５】
サンプル中の生物学的細胞を溶解してＤＮＡを前記細胞から放出させるための、以下の順次の工程を含む方法：
（ａ）生物学的細胞を含有する第１の水溶液又は非水性溶液を、（ｉ）直径が約２ミリメートル〜約１０ミリメートルである球体、及び（ｉｉ）直径が約２０マイクロメートル〜約１５０マイクロメートルであるビーズと混合して、セミドライケークを形成させる工程、
（ｂ）（ａ）の混合物を、ＤＮＡを前記細胞から放出させるために効果をもたらす期間にわたって非周期的及びカオス的動きで振とうする工程、
（ｃ）前記セミドライケークを第２の水溶液により洗浄して、前記ＤＮＡを含む細胞内容物を溶解及び／又は懸濁する工程、
（ｄ）前記ビーズを沈降させ、工程（ｂ）において放出される前記ＤＮＡ及び他の細胞構成成分を含有する上清を回収することによって、前記第２の水溶液を前記混合物における固体成分から分離する工程。
【請求項６】
第１の溶液が、（ｉ）水、生物学的緩衝液もしくは別の水溶液からなる群から選択される水溶液、又は（ｉｉ）セミドライケークを形成させるために十分な非水性溶液である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
第１の水溶液における生物学的細胞の体積がビーズ及び前記第１の水溶液の合計重量の約２０重量％である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
球体は直径が約４．５ミリメートルである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
球体は、モース硬度スケールで４以上である材料から製造される、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
材料が鋼である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ビーズは直径が約２０マイクロメートル〜約１５０マイクロメートルである、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
ビーズは直径が約１００マイクロメートルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ビーズは、モース硬度スケールで４以上である材料から製造される、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
材料がガラスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ビーズが第１の水溶液に、生物学的細胞及び前記第１の水溶液の合計重量の約８０％の濃度で加えられる、請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）における振とうが約５秒〜約１０分の期間にわたって行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項１７】
振とうが２分間にわたって行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｂ）において細胞から放出されるＤＮＡが、テルビウム蛍光、ＯＤ２６０測定、インターカレーション色素蛍光、エンドポイントもしくはリアルタイムＰＣＲアッセイ、又は前記の任意の組合わせからなる群から選択される方法によって測定される、請求項５に記載の方法。
【請求項１９】
分離が、遠心分離、ろ過及び重力沈降からなる群から選択される方法によって行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項２０】
生物学的細胞が、糞便、細胞溶解物、組織、血液、腫瘍、舌、歯、頬スワブ、痰、粘液、創傷スワブ、皮膚スワブ、膣スワブ、又は、未処理サンプル、複雑なサンプル、混合物及びマイクロバイオームサンプルを含めて、ヒト、動物、植物もしくは環境のサンプルから最初に得られたいずれかの他の生物学的材料もしくは生物学的流体からなる群から選択されるサンプルに由来する、請求項５に記載の方法。
【請求項２１】
生物学的細胞が、芽胞、バイオフィルム、多細胞生物、単細胞生物、原核生物、真核生物、微生物、細菌、古細菌、原生動物、藻類、菌類及びウイルスからなる群から選択される生物に由来する、請求項５に記載の方法。
【請求項２２】
振とうが請求項１に記載のデバイスで行われる、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
細胞を溶解して、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を細胞内から放出させる、又は抽出するための方法及びデバイスが開示される。開示された方法では、より大きい金属球及びチューブの側面にビーズビーティング溶解の期間中に粘着し、それにより、ビーズビーティングプロセスの効率を大きく改善するセミドライケークを形成する微細ガラスビーズと細胞（例えば、芽胞）との混合物が使用される。金属球が容器の側面に当たるたびに細胞がガラスビーズ及び金属球にこびりつくため、細胞には衝撃が与えられる。本発明のデバイスは、第１には十分な力が生じて、細胞を開裂させることを保証するという、そして、第２には金属球の衝撃が容器の内側表面の全体に分布させられ、その結果、細胞混合物のすべてが、細胞を壊すための十分な衝撃にさらされることを保証するという二重の目的でカオス的動きを生じさせるように設計される。その結果が、適切な溶解を達成するためには最大で３０分間の煮沸又はビーティングを典型的には必要とする芽胞及び他の微生物を、開示されたセミドライ・ビーズビーティング法を使用して数秒で開裂させることができるということである。本発明の方法は、ＤＮＡの完全性を保ちながら、溶解困難な細胞を迅速に開裂させることによって工程数及び操作時間を削減する。
【背景技術】
【０００２】
細胞に基づく分析方法及びＤＮＡに基づく分析方法は多くの方法が、分析を容易にするために、ＤＮＡを細胞内から放出させることを含めて、細胞内容物を放出させることを必要とする。細胞を開裂させて、内容物を放出させることが、「溶解」と呼ばれる。例えば、ＤＮＡ配列決定技術を使用してマイクロバイオームを調べるために使用される方法は最初に、ＤＮＡが抽出され得るように微生物を溶解することが要求される。ほとんどのマイクロバイオームは、溶解技術に対するその感受性が極めて大きく異なる細菌、古細菌及び菌類の共同体である。差のある感受性により、溶解が非常に困難な細菌（通常の場合にはグラム陽性細菌）及び非常に容易な細菌（通常の場合にはグラム陰性細菌）が元のサンプルにおけるそれらの集団に比例して表されることを保証したいと思う微生物集団研究者には、重大な問題が引き起こされる。残念なことに、ほとんどの微生物溶解プロトコルは一部の微生物については申し分なく機能するが、他の微生物については不良である。（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｌｙｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ−Ｓａｎｑｉｎｇ  Ｙｕａｎ、Ｄｏｒａ  Ｂ．Ｃｏｈｅｎ、Ｊａｃｑｕｅｓ  Ｒａｖｅｌ、Ｚａｉｄ  Ａｂｄｏ、Ｌａｒｒｙ  Ｊ．Ｆｏｒｎｅｙ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（３）：ｅ３３８６５．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３３８６５；加えて、プラスミドＤＮＡを回収するために使用される迅速かつ簡便なアルカリ溶解技術では典型的に、マイクロバイオームスクリーニングのための標的である微生物ゲノムＤＮＡもまた除去される（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｌｙｓｉｓ  ｏｐｅｎｓ  ｃｅｌｌｓ  ｂｕｔ  ｒｅｍｏｖｅｓ  ｇＤＮＡ−Ｂｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｃ．及びＤｏｌｙ，Ｊ．、Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．７（６）、１９７９、１５１３−１５２４；対照的に、ＫＯＨ溶解を、細菌のゲノムＤＮＡを回収するために使用することができる。Ｒａｇｈｕｎａｔｈａｎ，Ａｒｕｍｕｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．“Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ．”Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７１．６（２００５）：３３４２−３３４７．ＰＭＣ．Ｗｅｂ．２９  Ｓｅｐｔ．２０１６）。細胞の完全性を、リゾチーム（ペプチドグリカン細胞壁への酵素的攻撃）、強塩基（化学的攻撃）、界面活性剤（細胞膜を可溶化する）、ビーズビーティング又は振とう（機械的破裂）、及び熱ＤＮＡ抽出による方法を含めて様々な異なる生化学的方法に基づいて攻撃し、マイクロバイオームのプロファイリング結果に影響を与えている多数の溶解技術がこの技術分野では知られている：Ｗａｇｎｅｒ  Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ  Ｂ、Ｗａｉｔｅ  ＤＷ、Ｔａｙｌｏｒ  ＭＷ．Ｅｖａｌｕａ��ｉｎｇ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｕｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｄｕｅ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒ−ｓｕｂｊｅｃｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２０１５；６：１３０．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｍｉｃｂ．２０１５．００１３０）。公開された、又は市販のＤＮＡ調製方法はほとんどが、これらの方法の１つ又は複数を、とりわけ多くのサンプルを一度に取り扱うときには、通常の場合にはかなりの時間を要し得る順次の（sequential）工程で細胞を溶解するために使用している。個々の溶解方法は通常、溶解が不完全又は部分的であっても、プロトコルが実施されるための十分なＤＮＡが得られる適用のためには十分であるが、これらの方法は、ＤＮＡが元の共同体に比例してマイクロバイオームサンプルから得られないことが多く、また、ある種の微生物を完全に溶解することができない場合がある。例えば、界面活性剤に基づく溶解は、細胞壁が弱く、かつ、細胞膜が堅牢な細胞のサブセットを破裂させる場合があり、しかし、細胞壁が堅牢な界面活性剤耐性微生物を開裂させないことがあり、これにより、界面活性剤耐性細胞に由来するＤＮＡが、得られたＤＮＡ調製物において少ないこと、又は存在しないことが引き起こされる。別の例において、細胞膜が堅牢な細胞を溶解するために十分な微生物のビーズビーティングは、容易に溶解した細胞からプロセスにおいて早期に放出されるＤＮＡの剪断又は破壊をもたらす場合がある。加えて、これらの様々な溶解方法は、互いに互換性がない傾向があり、組み合わせて使用されるならば、順次に実施される必要がある。例えば、リゾチームは界面活性剤又は強塩基の存在下では機能しないであろう。ある種の界面活性剤は強塩基の存在下で沈殿する。ビーズビーティングは、加熱プロセスと組み合わせることが困難である。個々の短所が、別個の溶解プロトコルを連続して実行することによって克服される場合があるが、これは、関係する複雑さ、時間及びコストを増大させる。重要なことに、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）など）は溶解後に除去しなければならない。これは、ＳＤＳは下流側のＤＮＡ操作を妨害するからである。加えて、ある種の微生物は、プロトコルの順序に依存して、順次に実行される溶解プロトコルに対して耐性である場合がある。例えば、頑強なペプチドグリカン細胞壁を有するある種の微生物は、強塩基又はリゾチームによる初期の処理から守る脂質二重層の外層膜を有する場合がある。多数の方法を同時に組み合わせることが、又は長い一連の多数の工程が、サンプル中のすべての微生物からＤＮＡを得るために効果的であるかもしれない。しかし、すべての細胞を開裂させる１つだけの方法を使用することになれば、著しい改善となるであろう。
【０００３】
ビーズビーティングを行うための様々なデバイス及び振とう機がこの技術分野では知られている。例については表１を参照されたい。多数のサンプルを処理することができるビーズビーター及び振とう機は、強力なモーターと、使用者には危険であり得る高速運動する部品とにより、大きくて、重たくなる傾向がある。本明細書中に開示されるデバイスは、小型、効率的、及び安全である。この技術分野において知られているより小型の器具では典型的に、少数のサンプルが一度に処理される。本明細書中に開示されるデバイスは１〜４８個のサンプルを一度に処理することができる。この技術分野において知られているデバイスでは、規則的又は単純な動きが、サンプルを処理するために使用され、これに対して、開示されたデバイスでは、より威力のある衝撃をもたらすランダムな動きと、より均一な溶解をより遅い速度（危険性がより少ない速度）におけてより少ない時間でもたらす広範囲にわたる動きとが使用される。
【表１】
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【０００４】
本明細書中に開示される方法及びデバイスでは、最も困難な微生物芽胞（枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の芽胞が例として本明細書中に記載される）でさえも含めて、細胞を溶解するために迅速に働き、それにもかかわらず、比例した溶解が望まれる、又は必要である様々な適用及び技術（例えば、高精度のマイクロバイオーム特徴づけなど）のために必要とされる大きいアンプリコンを生じさせるための十分なサイズのＤＮＡを保持するビーズビーティング手法が利用される。結果は、サンプル中のすべての細胞を均一に開裂させ、それにより、様々な異なる細胞構成成分を含有するサンプル（例えば、マイクロバイオームなど）の全体にわたるより代表的なＤＮＡプロフィルを与える簡便で、迅速なプロトコルである。
【発明の概要】
【０００５】
短い時間で、例えば、１分未満で完了させることができ、かつ、重要なことに、改善された品質及び量のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を溶解困難なサンプル（例えば、細菌芽胞など）からもたらすことができる、細胞（例えば、マイクロバイオームに存在する細菌など）の溶解を行うための方法及びデバイスが開示される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】１個だけの４．５ミリメートルの鋼球と、０．０５グラムの１００マイクロメートルのガラスビーズとを含有する２ミリリットルの微量遠心チューブを示す。
【図２】鋼球の外面に形成されるセミドライケークを示す。
【図３】ビーズビーティング後におけるジピコリン酸（ＤＰＡ）の放出を示すグラフである。ＤＰＡは、多くの細菌芽胞のコアの内部に存在する化合物であり、芽胞が溶解された後でのみ放出され、ＴｂＣｌ３と一緒にされたときに蛍光によって検出することができる。サンプルを、増大する量の時間にわたってビーズビーティングに供した。それぞれのサンプルが、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）芽胞のＴＥにおける１ＯＤ／ｍｌ溶液の４ｕｌからなった。芽胞を、図１に示されるような２ｍｌの遠心チューブにおける５ｍｇのガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ、Ｇ４６４９）に加えた。芽胞混合物を含有するチューブを、指示された量の時間にわたって機器でのビーズビーティングに供した。ビーズビーティングが完了したとき、１５０ｕｌのＴＥをガラスビーズに加え、そこから１００マイクロリットルの溶解物を回収した。それぞれの時点からの７５マイクロリットルの溶解物をＤＰＡアッセイで使用した。溶解物を、０．２ｕＭ  ＴｂＣｌ３及び０．１Ｍ  Ｋ−ＨＥＰＥＳを含有する５０ｕｌの溶液を含有する黒色の平底９６ウエルプレートに加えた。９６ウエルプレートを２７０ｎＭの励起及び５４５ｎＭの発光において蛍光プレートリーダーで読み取った。ジピコリン酸の蛍光に対応する相対的蛍光ユニット数をそれぞれのサンプルについて記録し、プロットした。コントロール溶解は、３０分間煮沸された４ｕｌの芽胞を含有した。
【図４】ビーズビーティング後に細菌芽胞から放出されたＤＮＡの品質及び相対的量の評価を示すグラフである。ＤＮＡの品質を、Ｓｈｏｒｅｌｉｎｅ  Ｂｉｏｍｅ  １６Ｓ  Ｖ１−Ｖ９  ＤＮＡ精製及びＰＣＲ増幅キット（Ｓｈｏｒｅｌｉｎｅ  Ｂｉｏｍｅ  ｃａｔ＃ＳＢＶ１９−１６）を使用して、細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の１５００塩基のＶ１〜Ｖ９領域のＰＣＲによって評価した。相対的量を、それぞれのビーズビーティング時点についてのＣｑを比較することによって評価した。図３に記載される同じ溶解物の５マイクロリットルを０．１ｕｌの１：２０  ＥｖａＧｒｅｅｎ（Ｂｉｏｔｕｍ、ｃａｔ＃３１０００）と混合し、ＰＣＲ反応液に加え、Ｓｙｂｒ色素を検出するために設定されるＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈサーモサイクラーを使用して製造者の説明書に従って増幅した。Ｃｑ値をそれぞれの時点について記録し、プロットした。
【図５】本明細書中に記載される方法による溶解の後における芽胞からのＤＰＡの放出及びＤＮＡの対応する放出を示すグラフである。芽胞の溶解を、図３での場合のようにテルビウム蛍光アッセイを使用して測定した。ＤＮＡ量を、図４での場合のようにｑＰＣＲ定量によって測定した。芽胞を、Ｘ軸で詳述されるように最大で１０分間にわたってビーズビーティングに供した。
【図６】芽胞の煮沸溶解の期間中における芽胞溶解及びＤＮＡ量を示すグラフである。芽胞の溶解を、図３での場合のようにテルビウム蛍光アッセイを使用して測定した。ＤＮＡ量を、図４での場合のようにｑＰＣＲ定量によって測定した。芽胞をＴＥに懸濁し、Ｘ軸で示される時間にわたって１００℃の温度（煮沸）に供した。
【図７】ＤＰＡの放出が、振とうの時間及び強度を変化させたときの芽胞溶解の指標としてそれぞれの試験について測定されたことを示すグラフである。
【図８ａ】ビーズビーター試作品の略図である。上記の「発明の概要」節で議論される試作品の様々な構成要素が示される。
【図８ｂ】上記の「発明の概要」節で議論されるような「フリーエレメント」のストライカーバー及びスロット領域の細部の概略である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明とみなされる主題が、本明細書の末尾における請求項において特に指摘され、明確に特許請求される。本発明の前述の目的、特徴及び利点ならびに他の目的、特徴及び利点が、添付された図面と併せて理解される以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【０００８】
ＤＮＡに基づく分析方法、例えば、米国特許出願第１５／３７２，５８８号（発明の名称：「標的を絞った多重ハイスループットスクリーニングのためのＤＮＡ調製方法」、Ｍａｒｋ  Ｄｒｉｓｃｏｌｌ及びＴｈｏｍａｓ  Ｊａｒｖｉｅ、これはその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載される方法は、標的マイクロバイオームにおける細胞を溶解することによってＤＮＡをもたらしており、溶解後において、得られたＤＮＡは、すべての細菌及び古細菌に存在する１６Ｓ、２３Ｓ又は他のｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）遺伝子配列を標的とするＰＣＲ増幅におけるテンプレートとして使用される。微生物は、そのｒＲＮＡ遺伝子配列を使用して特定することができ、しかし、ｒＲＮＡ遺伝子配列は、必ずしもすべてではないが、ほとんどの細菌及び古細菌においてわずかに異なる。ｒＲＮＡ遺伝子配列における変化は、細菌及び古細菌の個々の種が、その種のための識別配列として、すなわち、その種のための指紋として役立つ、ｒＲＮＡ遺伝子における特徴的なＤＮＡ変化を有していることを意味する。様々なキット、プロトコル及びソフトウェアが、ｒＲＮＡ遺伝子配列を使用して、サンプル中の微生物の包括的なフィンガープリンティングを可能にしており、また、一度で多くのサンプルの高精度での同時ｒＲＮＡフィンガープリンティングを可能にしている。既知の微生物は、ｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ配列を微生物ゲノムのデータベースにマッピングすることによって配列決定後に特定することができる。未知の微生物は、データベースにおける微生物のいずれとも異なるｒＲＮＡ配列を含むことになり、しかし、その特有のｒＲＮＡ配列を使用して突きとめることができる。加えて、サンプルにおけるそれぞれの微生物について得られる読み取りの数から、サンプルにおけるそれぞれの微生物の相対的存在量を明らかにすることができる。相対的存在量は、一つ一つのマイクロバイオームの状態の重要な指標となり得る。微生物の相対的存在量を変化させる、又はある特定の微生物を完全に除外する溶解技術は、調べられているマイクロバイオームの状態を誤って特徴づける配列決定結果を引き起こす可能性がある。記載されるような本発明は、サンプルからの微生物の正しい相対存在量を達成するための改善された溶解方法である。
【０００９】
本明細書中で使用される場合、「非周期的動き」は、規則的な繰り返し周期又は軌道運動を有さず、非規則的な時間間隔で繰り返される動きをどのような動きであれ意味する。
【００１０】
本明細書中で使用される場合、「ランダムな動き」及び「カオス的動き」は、速度及び三次元方向が絶えず変化する動きをどのような動きであれ意味するために交換可能に使用される。
【００１１】
本明細書中で使用される場合、「セミドライケーク」は、重量あたりサンプル（例えば、芽胞又は微生物）の１％〜３０重量％の水分を有する生物学的細胞のサンプルを意味する。
【００１２】
本明細書中で使用される場合、「ミクロン」及び「マイクロメートル」は、１メートルの１００万分の１に等しい長さの単位を意味するために交換可能に使用される。
【００１３】
本明細書中には、約１ｃｍ〜約２．５ｃｍのストローク長さ及び約５Ｈｚ〜約５０Ｈｚの速度を有する、同時に生じる非周期的動き及びランダムな動きでサンプルを振とうするためのデバイスが開示される。いくつかの実施形態において、デバイスは、サンプルをハイスループット分析のために好適な微量遠心チューブ又はマイクロタイタープレート又は他の容器に保持するように構成される。いくつかの実施形態において、同時に処理することができるチューブの数が１個〜９６個の間である。いくつかの実施形態において、マイクロタイタープレートは、８、１６、２４、４６、９６又は３８４ウエルプレートからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、チューブ又はマイクロタイタープレートにおけるウエルの容積が２００マイクロリットル〜２ｍｌの間である。
【００１４】
本明細書中には、サンプル中の生物学的細胞を溶解して、ＤＮＡを細胞から放出させるための方法であって、（ａ）１つ又は複数の生物学的細胞を含有する第１の水溶液又は半固体サンプルを、（ｉ）４．５ｍｍの鋼球（又は他の生体適合性材料の球）及び（ｉｉ）約１００ミクロンのビーズ（ガラス又はモース硬度スケールで４以上の他の材料）と混合して、セミドライケークを形成させる工程、（ｂ）（ａ）の混合物を、ＤＮＡを細胞から放出させるために効果的な期間にわたって非周期的かつランダムな動きで振とうする工程、（ｃ）セミドライケークを第２の水溶液に再懸濁し、ビーズを沈降させる工程、（ｄ）第２の水溶液を、混合物における沈降した固体成分から回収する工程の順次の工程を含み、生物学的細胞から放出されたＤＮＡが回収後の第２の水溶液に存在する、方法が開示される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、第１の水溶液は水である。いくつかの実施形態において、第１の水溶液は、ｐＨを制御するために、又は生物学的活性を制限するためにトリスもしくは他の緩衝剤、塩又は界面活性剤を含有する。いくつかの実施形態において、第１の溶液は、ビーズに加えられたときにセミドライケークを形成させるために十分な非水性液体である。いくつかの実施形態において、第１の水溶液は１つ又は複数の生物学的細胞を含有する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、鋼球は直径が約２ミリメートル〜約１０ミリメートルである。いくつかの実施形態において、鋼球は直径が約４．５ミリメートルである。いくつかの実施形態において、ガラスビーズは直径が約１０マイクロメートル〜約３００マイクロメートルである。いくつかの実施形態において、ガラスビーズは直径が約１００マイクロメートルである。いくつかの実施形態において、ガラスビーズは、ガラスビーズが重量比で約８３％の濃度で第１の水溶液に加えられる（例えば、５０ｍｇのビーズに対して１０ｕｌ（１０ｍｇ）のサンプル）。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ガラスビーズは４０％〜９９重量％の濃度で水溶液に加えられる。
【００１８】
いくつかの実施形態において、振とうすることが約５秒〜約１０分の期間にわたって行われる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、振とうすることが２分間行われる。
【００２０】
いくつかの実施形態において、細胞溶解が、芽胞の内部においてＤＮＡと一緒に見出されるジピコリン酸のテルビウム蛍光によって測定される。
【００２１】
いくつかの実施形態において、溶解期間中のＤＮＡの放出の後には、ＵＶ分光法（ＯＤ２６０）が続く。
【００２２】
いくつかの実施形態において、溶解期間中のＤＮＡの放出がＤＮＡ蛍光アッセイによって判定される。
【００２３】
いくつかの実施形態において、第２の水溶液からの鋼及びガラスビーズの分離が、遠心分離、ろ過及び重力沈降からなる群から選択される方法によって行われる。
【００２４】
いくつかの実施形態において、生物学的細胞は、糞便、細胞溶解物、組織、血液、腫瘍、舌、歯、頬スワブ、痰、粘液、創傷スワブ、皮膚スワブ、膣スワブ、又は、未処理サンプル、複雑なサンプル、混合物及びマイクロバイオームサンプルを含めて、ヒト、動物、植物もしくは環境のサンプルから最初に得られたいずれかの他の生物学的材料もしくは生物学的流体からなる群から選択されるサンプルに由来する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、生物学的細胞は、芽胞、バイオフィルム、多細胞生物、単細胞生物、原核生物、真核生物、微生物、細菌、古細菌、原生動物、藻類及び菌類からなる群から選択される生物に由来する。
【００２６】
いくつかの実施形態において、振とう機ユニットは、多数のプレート又はチューブを装着することができる堅い平らなチューブ又はプレート支持体エレメント（フリーエレメント）を有する（図８ａ及び図８ｂ）。いくつかの実施形態において、最大で４８個のサンプル容器チューブをフリーエレメントに装着することができる。好ましい実施形態において、フリーエレメントは、一般にはフリーエレメントの動きを２つの自由度に制約する剛性連結によって、それぞれの自由度と直交して配置されるスロットとともに固定エレメント（ベース）に接続される。回転モーターエレメントがベースエレメントに取り付けられ、エネルギーを、フリーエレメントにおけるスロットと周期的に接触するストライカーバーによってフリーエレメントに伝える。このストライカーバーは一方の端でモーター軸に取り付けられ、反対側の端が自由である。好ましい実施形態において、フリーエレメントにおけるスロットの幅はストライカーバーの自由端よりも実質的に大きく、これにより、サンプルが非周期的な動き及びランダムな動きで同時に振とうされる。フリーエレメントと、回転するストライカーバーとの間における動きの不連続かつ非直線的なカオス的関係は、両方の自由度でのフリーエレメントの周期的な急加速を提供するストライカーバーとフリーエレメントとの間での一般には弾性衝突を生じさせ、このことは打撃の力を増大させ、かつ、細胞ケーク及び鋼球衝撃の両方をサンプル容器の内部全体にわたってランダムに分布させる。この全体的なランダムな作用により、完全な細胞溶解が数秒で可能となる。
【００２７】
例
以下は、本明細書中に開示される細胞溶解方法の例示的な実施形態である：
工程１：２マイクロリットルの枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）芽胞（１ＯＤ／ｍｌ）を８ｕｌの水に懸濁して、１０μｌの混合物とした。
【００２８】
工程２：１個だけの４．５ｍｍの鋼球と、０．０５ｇのガラスビーズ（酸洗したもの、１００ｕｍ、Ｓｉｇｍａ  Ｇ４６４９）とを含有する２ｍｌの微量遠心チューブ（Ｄｏｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃ＲＮ２０００−ＧＭＴ）を準備した（図１を参照のこと）。
【００２９】
工程３：１０μｌの芽胞懸濁物を鋼ビーズ/ガラスビーズの混合物に加えた。
【００３０】
工程４：チューブを振とう機に置いた。セミドライケークが振とう期間中にビーズの外面に生じ（図２を参照のこと）、その結果、ビーズがチューブ壁に当たるたびに、衝撃が、芽胞及び細胞を含有するガラスビーズケーキに与えられ続ける。ケークがまた、ビーティング期間中にチューブの側壁に生じる。
【００３１】
工程５：芽胞の溶解により、ジピコリン酸（ＤＰＡ）が放出され、これを、テルビウムの蛍光を介して測定することができる。図３はビーズビーティング後のＤＰＡの放出を示し、図４はビーズビーティング後のＤＮＡの放出を示す。コントロールの溶解は、３０分間煮沸された芽胞を含有した。３０分間の煮沸は芽胞を開裂させ、しかし、３０分間の煮沸はまた、ＤＮＡを選択的に破壊するので、ＤＰＡ放出のみが、コントロール溶解については示される。
【００３２】
工程６：ＤＮＡの品質を、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子、すなわち、微生物を特定するために頻繁に使用される１５００塩基のアンプリコンのＰＣＲによって評価した（図５を参照のこと）。このアンプリコンは多くの典型的なアンプリコン標的よりも長いため、このアンプリコンをＤＮＡ品質の指標として選んだ。その結果、このアンプリコンが無傷で存在するならば、そのことは、ＤＮＡがほとんどのＰＣＲ適用又は配列決定適用のための十分な品質であることを示す。振とう機でのビーズビーティングを、ＤＮＡ損傷の蓄積率を調べるために、芽胞を溶解するために必要とされる以上に延長した。芽胞の溶解を、図３での場合のようにＤＰＡについてのテルビウムアッセイを使用して追った；芽胞の溶解が２分までに最大に達した。リアルタイムＰＣＲを、図４に記載されるようにサンプルに対して行った。リアルタイムＰＣＲは、ビーズビーティングが行われない場合についてはＣｑが２５であったのとは対照的に、２、３、４及び１０分のビーズビーティングの場合については１７サイクルの区別できないＣｑ値をもたらした。この８サイクルの違いは、ＤＮＡ濃度が、コントロール（ビーズビーティング非実施）反応により含まれる０．１ｎｇの総量から２５０倍増大したことを示している。さらに、Ｃｑに対する変化が１０分のビーズビーティングの後で認められなかったことには留意しなければならない。このことから、さらに８分のビーズビーティングは、芽胞から放出される増幅可能なテンプレートＤＮＡの品質に影響を与えていないことが示される。
【００３３】
比較として、芽胞溶解及びＤＮＡ量を、図６に示されるように芽胞の煮沸溶解の期間中に追った。セミドライ・ビーズビーティングにより認められるＤＮＡ量における急激な増大とは対照的に、ＤＮＡにおける急激な減少が、ほんの５分にすぎない煮沸により認められた。加えて、３０〜４５秒のセミドライ・ビーズビーティングとは対照的に、煮沸による最大の芽胞溶解には１２分を要した。このことから、ビーズビーティングは煮沸溶解よりも２０倍を超えて高速であることが明らかにされる。ビーズビーティングとは対照的に、芽胞が溶解したことがＤＰＡ蛍光アッセイにより示された後では、ＤＮＡの増大が認められなかった。このことは、芽胞を破壊するために必要とされる時間及び温度が同時にＤＮＡを破壊していることを示す。
【００３４】
ビーズビーティングのパラメーターもまた、本明細書中に開示される新規な振とう機デバイスを使用して検討した。図７に示されるように、振とう時間及び振とう速度を二連で変化させ、ＤＰＡの放出を芽胞溶解の指標としてそれぞれの試験について測定した。１０及び５５ビート／秒（ＢＰＳ）での振とうは著しい芽胞溶解を示した。およそ６ＢＰＳでの振とうは一定でなく、著しい溶解が２つの試験の１つについて認められた。このことから、６ＢＰＳを超える速度が好ましいことが明らかにされる。芽胞を陽性コントロールとして３０分間煮沸した。
【００３５】
振とう機の強度を５５ビート／秒に至るまで調べ、図７に示されるのと類似する結果が得られた。ランダム振とう作用と組み合わされるセミドライケーク・ビーティングプロセスの使用は、小さいストローク長さを有する、これにより、他のビーズビーティングプロセスのために使用される振とう機のコスト及び潜在的な運動エネルギー危険性を低下させる新規な振とう機設計を可能にする。このことはその結果として、より強力なモーター、広範囲にわたる安全機能、及びより複雑かつ高価な設計の必要性を低下させ、これにより、振とう機設計のコスト及び複雑さを減らし、可搬性と、同時に処理することができるサンプルの数とを、重量及び設置面積を減らしながら増大させる。
【００３６】
現時点で開示される方法及びデバイスは、細胞及び芽胞の溶解を必要とするいずれかの適用のために、例えば、マイクロバイオームシーケンシング（例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡ又は標的を絞った他の遺伝子プロファイリング）、ＤＮＡ適用（例えば、全ゲノムショットガンプロファイリング）、非ＤＮＡ適用（例えば、タンパク質、ＲＮＡ、代謝産物及びオルガネラ）、及び溶解困難な病原体についての診断適用などのために有用であり得る。
【００３７】
本発明の１つ又は複数の実施形態が記載されている。それにも関わらず、様々な改変が、本発明の精神及び範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解されるであろう。したがって、他の様々な実施形態が以下の請求項の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【国際調査報告】
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