(57)【要約】  本発明は、トランスジェニック観賞魚、並びにｉｎ ｖｉｔｒｏ受精技術によってそのような魚を作製する方法に関する。また、そのようなトランスジェニック魚の個体群を確立する方法、及びそれらをマーケティング目的で観賞魚産業に提供する方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光タンパク質をコードする染色体に組み込まれた発現カセットを含むトランスジェニックレインボーシャークであって、ここで、当該レインボーシャークは、ＥＣＡＣＣに寄託されているオレンジ色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「オレンジ色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子を含む、トランスジェニックレインボーシャーク。
【請求項２】
繁殖力のあるトランスジェニックレインボーシャークとしてさらに定義される、請求項１に記載のトランスジェニックレインボーシャーク。
【請求項３】
前記魚が、前記組み込まれた発現カセットに対してホモ接合性である、請求項１に記載のトランスジェニックレインボーシャーク。
【請求項４】
前記魚が、前記組み込まれた発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項１に記載のトランスジェニックレインボーシャーク。
【請求項５】
トランスジェニックレインボーシャークを観賞魚市場に提供する方法であって、請求項１に記載のトランスジェニックレインボーシャークを得ること、及び観賞魚市場に配布することを含む、方法。
【請求項６】
前記魚が、飼育者によって商業的流通業者に流通される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記魚が、飼育者又は商業的流通業者によって小売業者に流通される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記小売業者が、観賞魚部門を有する多製品小売業者である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
トランスジェニックレインボーシャークを作製する方法であって、以下の：
（ａ）蛍光タンパク質をコードする染色体に組み込まれた発現カセットを含むレインボーシャークを得る工程、ここで、当該レインボーシャークは、ＥＣＡＣＣに寄託されている前記オレンジ色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「オレンジ色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子を含む； 及び
（ｂ）得られたレインボーシャークと第２のレインボーシャークを交配し、前記オレンジ色レインボーシャーク１形質転換現象を含むトランスジェニックレインボーシャークを提供する工程、を含む方法。
【請求項１０】
前記第２のレインボーシャークが、非トランスジェニックのレインボーシャークである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
蛍光タンパク質をコードする染色体に組み込まれた発現カセットを含む、請求項１に記載のトランスジェニックレインボーシャークの子孫であって、ここで、前記レインボーシャーク及び子孫が蛍光を発し、ＥＣＡＣＣに寄託されている前記オレンジ色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「オレンジ色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子を含む、トランスジェニックレインボーシャークの子孫。
【請求項１２】
繁殖力のあるトランスジェニックレインボーシャークとしてさらに定義される、請求項１１に記載の子孫魚。
【請求項１３】
前記魚が、前記組み込まれた発現カセットに対してホモ接合性である、請求項１１に記載の子孫魚。
【請求項１４】
前記魚が、前記組み込まれた発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項１１に記載の子孫魚。
【請求項１５】
トランスジェニック魚を観賞魚市場に提供する方法であって、請求項１１に記載の子孫魚を得ること、及び前記魚を観賞魚市場に配布することを含む、方法。
【請求項１６】
前記魚が、飼育者によって商業的流通業者に流通される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記魚が、飼育者又は商業的流通業者によって小売業者に流通される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記小売業者が、観賞魚部門を有する多製品小売業者である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
トランスジェニック魚を作製する方法であって、以下の：
（ａ）請求項１１に記載のトランスジェニック魚を得る工程； 及び
（ｂ）得られた魚と第２の魚を交配し、前記オレンジ色レインボーシャーク１形質転換現象を含むトランスジェニック魚を提供する工程、を含む方法。
【請求項２０】
前記第２の魚が、非トランスジェニック魚である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
蛍光タンパク質をコードする染色体に組み込まれた発現カセットを含むトランスジェニックレインボーシャークであって、ここで、当該レインボーシャークは、ＥＣＡＣＣに寄託されている紫色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「紫色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子を含む、トランスジェニックレインボーシャーク。
【請求項２２】
繁殖力のあるトランスジェニックレインボーシャークとしてさらに定義される、請求項２１に記載のトランスジェニックレインボーシャーク。
【請求項２３】
前記魚が、前記組み込まれた発現カセットに対してホモ接合性である、請求項２１に記載のトランスジェニックレインボーシャーク。
【請求項２４】
前記魚が、前記組み込まれた発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項２１に記載のトランスジェニックレインボーシャーク。
【請求項２５】
トランスジェニックレインボーシャークを観賞魚市場に提供する方法であって、請求項２１に記載のトランスジェニックレインボーシャークを得ること、及び観賞魚市場に配布することを含む、方法。
【請求項２６】
前記魚が、飼育者によって商業的流通業者に流通される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記魚が、飼育者又は商業的流通業者によって小売業者に流通される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記小売業者が、観賞魚部門を有する多製品小売業者である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
トランスジェニックレインボーシャークを作製する方法であって、以下の：
（ａ）蛍光タンパク質をコードする染色体に組み込まれた発現カセットを含むレインボーシャークを得る工程、ここで、当該レインボーシャークは、ＥＣＡＣＣに寄託されている前記紫色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「紫色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子を含む； 及び
（ｂ）得られたレインボーシャークと第２のレインボーシャークを交配し、前記紫色レインボーシャーク１形質転換現象を含むトランスジェニックレインボーシャークを提供する工程、を含む方法。
【請求項３０】
前記第２のレインボーシャークが、非トランスジェニックレインボーシャークである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
蛍光タンパク質をコードする染色体に組み込まれた発現カセットを含む、請求項２１に記載のトランスジェニックレインボーシャークの子孫であって、ここで、前記レインボーシャーク及び子孫が蛍光を発し、ＥＣＡＣＣに寄託されている前記紫色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「紫色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子を含む、トランスジェニックレインボーシャークの子孫。
【請求項３２】
繁殖力のあるトランスジェニックレインボーシャークとしてさらに定義される、請求項３１に記載の子孫魚。
【請求項３３】
前記魚が、前記組み込まれた発現カセットに対してホモ接合性である、請求項３１に記載の子孫魚。
【請求項３４】
前記魚が、前記組み込まれた発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項３１に記載の子孫魚。
【請求項３５】
トランスジェニック魚を観賞魚市場に提供する方法であって、請求項３４に記載の子孫魚を得ること、及び前記魚を観賞魚市場に配布することを含む、方法。
【請求項３６】
前記魚が、飼育者によって商業的流通業者に流通される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記魚が、飼育者又は商業的流通業者によって小売業者に流通される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記小売業者が、観賞魚部門を有する多製品小売業者である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
トランスジェニック魚を作製する方法であって、以下の：
（ａ）請求項３１に記載のトランスジェニック魚を得る工程； 及び
（ｂ）得られた魚と第２の魚を交配し、前記紫色レインボーシャーク１形質転換現象を含むトランスジェニック魚を提供する工程、を含む方法。
【請求項４０】
前記第２の魚が、非トランスジェニック魚である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
蛍光タンパク質をコードする染色体に組み込まれた発現カセットを含むトランスジェニックレインボーシャークであって、ここで、当該レインボーシャークは、ＥＣＡＣＣに寄託されている青色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「青色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子を含む、トランスジェニックレインボーシャーク。
【請求項４２】
繁殖力のあるトランスジェニックレインボーシャークとしてさらに定義される、請求項４１に記載のトランスジェニックレインボーシャーク。
【請求項４３】
前記魚が、前記組み込まれた発現カセットに対してホモ接合性である、請求項４１に記載のトランスジェニックレインボーシャーク。
【請求項４４】
前記魚が、前記組み込まれた発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項４１に記載のトランスジェニックレインボーシャーク。
【請求項４５】
トランスジェニックレインボーシャークを観賞魚市場に提供する方法であって、請求項４１に記載のトランスジェニックレインボーシャークを得ること、及び前記魚を観賞魚市場に配布することを含む、方法。
【請求項４６】
前記魚が、飼育者によって商業的流通業者に流通される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記魚が、飼育者又は商業的流通業者によって小売業者に流通される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記小売業者が、観賞魚部門を有する多製品小売業者である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
トランスジェニックレインボーシャークを作製する方法であって、以下の：
（ａ）蛍光タンパク質をコードする染色体に組み込まれた発現カセットを含むレインボーシャークを得る工程、ここで、当該レインボーシャークは、ＥＣＡＣＣに寄託されている前記青色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「青色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子を含む； 及び
（ｂ）得られたレインボーシャークと第２のレインボーシャークを交配し、前記青色レインボーシャーク１形質転換現象を含むトランスジェニックレインボーシャークを提供する工程、を含む方法。
【請求項５０】
前記第２のレインボーシャークが、非トランスジェニックレインボーシャークである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
蛍光タンパク質をコードする染色体に組み込まれた発現カセットを含む、請求項４１に記載のトランスジェニックレインボーシャークの子孫であって、ここで、前記レインボーシャーク及び子孫が蛍光を発し、ＥＣＡＣＣに寄託されている前記青色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「青色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子を含む、トランスジェニックレインボーシャークの子孫。
【請求項５２】
繁殖力のあるトランスジェニックレインボーシャークとしてさらに定義される、請求項５１に記載の子孫魚。
【請求項５３】
前記魚が、前記組み込まれた発現カセットに対してホモ接合性である、請求項５１に記載の子孫魚。
【請求項５４】
前記魚が、前記組み込まれた発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項５１に記載の子孫魚。
【請求項５５】
トランスジェニック魚を観賞魚市場に提供する方法であって、請求項５１に記載の子孫魚を得ること、及び前記魚を観賞魚市場に配布することを含む、方法。
【請求項５６】
前記魚が、飼育者によって商業的流通業者に流通される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記魚が、飼育者又は商業的流通業者によって小売業者に流通される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記小売業者が、観賞魚部門を有する多製品小売業者である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
トランスジェニック魚を作製する方法であって、以下の：
（ａ）請求項５１に記載のトランスジェニック魚を得る工程； 及び
（ｂ）得られた魚と第２の魚を交配し、前記青色レインボーシャーク１形質転換現象を含むトランスジェニック魚を提供する工程、を含む方法。
【請求項６０】
前記第２の魚が、非トランスジェニック魚である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
蛍光タンパク質をコードする染色体に組み込まれた発現カセットを含むトランスジェニックレインボーシャークであって、ここで、当該レインボーシャークは、ＥＣＡＣＣに寄託されている緑色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「緑色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子を含む、トランスジェニックレインボーシャーク。
【請求項６２】
繁殖力のあるトランスジェニックレインボーシャークとしてさらに定義される、請求項６１に記載のトランスジェニックレインボーシャーク。
【請求項６３】
前記魚が、前記組み込まれた発現カセットに対してホモ接合性である、請求項６１に記載のトランスジェニックレインボーシャーク。
【請求項６４】
前記魚が、前記組み込まれた発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項６１に記載のトランスジェニックレインボーシャーク。
【請求項６５】
トランスジェニックレインボーシャークを観賞魚市場に提供する方法であって、請求項６１に記載のトランスジェニックレインボーシャークを得ること、及び前記魚を観賞魚市場に配布することを含む、方法。
【請求項６６】
前記魚が、飼育者によって商業的流通業者に流通される、請求項４５に記載の方法。
【請求項６７】
前記魚が、飼育者又は商業的流通業者によって小売業者に流通される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記小売業者が、観賞魚部門を有する多製品小売業者である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
トランスジェニックレインボーシャークを作製する方法であって、以下の：
（ａ）蛍光タンパク質をコードする染色体に組み込まれた発現カセットを含むレインボーシャークを得る工程、ここで、当該レインボーシャークは、ＥＣＡＣＣに寄託されている前記緑色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「緑色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子を含む； 及び
（ｂ）得られたレインボーシャークと第２のレインボーシャークを交配し、前記緑色レインボーシャーク１形質転換現象を含むトランスジェニックレインボーシャークを提供する工程、を含む方法。
【請求項７０】
前記第２のレインボーシャークが、非トランスジェニックレインボーシャークである、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
蛍光タンパク質をコードする染色体に組み込まれた発現カセットを含む、請求項６１に記載のトランスジェニックレインボーシャークの子孫であって、ここで、前記レインボーシャーク及び子孫が蛍光を発し、ＥＣＡＣＣに寄託されている前記緑色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「緑色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子を含む、トランスジェニックレインボーシャークの子孫。
【請求項７２】
繁殖力のあるトランスジェニックレインボーシャークとしてさらに定義される、請求項７１に記載の子孫魚。
【請求項７３】
前記魚が、前記組み込まれた発現カセットに対してホモ接合性である、請求項７１に記載の子孫魚。
【請求項７４】
前記魚が、前記組み込まれた発現カセットに対してヘテロ接合性である、請求項７１に記載の子孫魚。
【請求項７５】
トランスジェニック魚を観賞魚市場に提供する方法であって、請求項７１に記載の子孫魚を得ること、及び前記魚を観賞魚市場に配布することを含む、方法。
【請求項７６】
前記魚が、飼育者によって商業的流通業者に流通される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記魚が、飼育者又は商業的流通業者によって小売業者に流通される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記小売業者が、観賞魚部門を有する多製品小売業者である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
トランスジェニック魚を作製する方法であって、以下の：
（ａ）請求項７１に記載のトランスジェニック魚を得る工程； 及び
（ｂ）得られた魚と第２の魚を交配し、前記緑色レインボーシャーク１形質転換現象を含むトランスジェニック魚を提供する工程、を含む方法。
【請求項８０】
前記第２の魚が、非トランスジェニック魚である、請求項７９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１８年３月２９日にＰＣＴ国際特許出願として提出されており、２０１７年３月３０日に出願された米国特許出願６２／４７８，８９８号、題トランスジェニックオレンジ色レインボーシャーク、及び２０１８年１月１０日に出願された米国特許出願６２／６１５，６２５号、題トランスジェニックオレンジ色レインボーシャーク、及び２０１７年３月３０日に出願された米国特許出願６２／４７８，９２３号、題トランスジェニック紫色レインボーシャーク、及び２０１８年１月１０日に出願された米国特許出願６２／６１５，６２８号、題トランスジェニック紫色レインボーシャーク、及び２０１８年１月１０日に出願された米国特許出願６２／６１５，６３４号、題トランスジェニック青色レインボーシャーク、及び２０１８年１月１０日に出願された米国特許出願６２／６１５，６３８号、題トランスジェニック緑色レインボーシャークの優先権を主張する。前述の参考文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、トランスジェニック魚に関する。具体的には、本発明は、オレンジ色のトランスジェニックレインボーシャークに関する。具体的には、本発明は、紫色のトランスジェニックレインボーシャークに関する。具体的には、本発明は、青色のトランスジェニックレインボーシャークに関する。具体的には、本発明は、緑色のトランスジェニックレインボーシャークに関する。
【背景技術】
【０００３】
導入
トランスジェニック技術は、宿主が新しい遺伝形質を獲得することを可能にする宿主生物への外来遺伝子の導入を伴う。トランスジェニック技術は、多くの潜在的な用途を有する。例えば、新しい種類の魚を作成するために、導入遺伝子を魚に導入することに用いられ得る。魚に外来遺伝子を導入する方法には、次のような多くの方法を含む： マイクロインジェクション（例えば、Zhu et al., 1985; Du et al., 1992）、エレクトロポレーション（Powers et al., 1992）、精子媒介遺伝子導入（Khoo et al., 1992; Sin et al., 1993）、遺伝子ボンバードメント又は遺伝子ガン（Zelenin et al., 1991）、リポソーム媒介遺伝子移入（Szelei et al., 1994）、及び筋肉組織へのＤＮＡの直接注射（Xu et al., 1999）。最初のトランスジェニック魚の報告は、マウスメタロチオネイン遺伝子プロモーター及びヒト成長ホルモン遺伝子からなるキメラ遺伝子コンストラクトを使用してZhu et al.,(1985)によって公開された。初期のトランスジェニック魚の研究のほとんどは、急速に成長する魚を生成することを目的とした成長ホルモン遺伝子導入に集中している。初期の試みの大部分は、異種成長ホルモン遺伝子とプロモーターを使用し、これらの魚の生産に失敗したが（例えば、Chourrout et al., 1986; Penman et al., 1990; Brem et al., 1988; Gross et al., 1992）、アトランティックサーモン、いくつかの種のパシフィックサーモン、及びドジョウを含むいくつかの魚種でトランスジェニック魚の成長の強化が実証されている（例えば、Du et al., 1992; Delvin et al., 1994, 1995; Tsai et al., 1995）。
【０００４】
レインボーシャーク（Epalzeorhynchos frenatum）は、タイ産の淡水コイ科である。ヒレの色は赤からオレンジレッドに変化するが、体は、黒又は濃い灰色から明るい銀色に変化する。アルビノの形態は、これらより黒い斑点を欠き、体色は、バター又はパール色の外観を有する。しかしながら、観賞魚業界では、灰色又はパール色の体は、様々な色を効率的に示すことに役立たない。蛍光タンパク質を用いた遺伝子組み換えでの色素形成が改変されたそのようなレインボーシャークの利用可能性は、様々な色をより良く見せることにより、観賞魚業界により良い製品をもたらすだろう。
【０００５】
多くの蛍光タンパク質が、当該技術分野で知られており、種々の緑、黄色、オレンジ色、青、又は紫色を示す蛍光タンパク質を含む、種々の細胞プロセス調査に使用されている。蛍光タンパク質を含むトランスジェニック実験は、遺伝子組換えの新しいマーカー及びレポーターを提供するが、そのようなタンパク質を発現するレインボーシャークの開発及び産生の分野での進歩は限られている。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
トランスジェニックレインボーシャーク
特定の実施形態において、本開示は、トランスジェニック蛍光を発する魚を作製すること、そのような魚を観賞魚産業に提供することに関する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、トランスジェニック魚又はトランスジェニック魚の作製方法が提供される。特定の実施形態において、当該トランスジェニック魚は、繁殖力のある、トランスジェニックの、蛍光を発する魚である。特定の実施形態において、開示されたコンストラクト及び方法で使用する魚は、レインボーシャークである。レインボーシャークの皮膚の色は、皮膚の色素細胞によって決定され、色素細胞は、メラノソーム（黒色又は茶色）、キサントソーム（黄色）、エリトロソーム（オレンジ色又は赤色）、又はイリドソーム（白色を含む虹色）と称される色素顆粒を含む。色素細胞当たりの色素顆粒の数、サイズ、及び密度は、魚の皮膚の色に影響する。
【０００８】
少なくとも1つの例示的な実施形態において、形質転換現象（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｖｅｎｔ）と称される特定のトランスジェニック組み込み現象（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｅｖｅｎｔ）を含むトランスジェニックレインボーシャーク又はその子孫が提供される。これらの魚は、例えば、見た目が美しいオレンジ色を体現しているため、特に興味深いものである。これらの特定のトランスジェニック現象を含むトランスジェニック魚は、形質転換現象についてホモ接合性又はヘテロ接合性（例えば、半接合性を含む）であり得る。形質転換現象を欠く魚と交配されたホモ接合性の魚は、ほぼ全ての場合において、１００％のヘテロ接合性の子孫を産する。これら特定のトランスジェニック現象を含む卵、精子、及び胚も、本発明の一部として含まれる。
【０００９】
特定のトランスジェニック組み込み現象に関するそのような一実施形態において、染色体に組み込まれた導入遺伝子を含むオレンジ色のレインボーシャーク又はその子孫が提供され、ここで、当該レインボーシャークは、ＥＣＡＣＣに寄託されているオレンジ色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「オレンジ色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子を含む。染色体に組み込まれた導入遺伝子は、1つの組み込まれた発現カセット又は２つ以上の組み込まれた発現カセットに存在し得る。特定の態様において、そのようなトランスジェニックレインボーシャークは、繁殖力のあるトランスジェニックレインボーシャークである。そのようなトランスジェニックレインボーシャークは、導入遺伝子又は組み込まれた発現カセットに対してホモ接合性又はヘテロ接合性（例えば、半接合性を含む）であり得る。
【００１０】
また、オレンジ色レインボーシャーク形質転換現象を含むトランスジェニックレインボーシャークを観賞魚市場に提供する方法も開示される。いくつかの実施形態において、当該方法は、染色体に組み込まれた導入遺伝子を含むトランスジェニックレインボーシャーク又はその子孫を得ることを含み、ここで、当該レインボーシャークは、ＥＣＡＣＣに寄託されているオレンジ色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「オレンジ色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子、及び当該魚を観賞魚市場に配布することを含む。そのような魚は、飼育者によって商業的流通業者に配布され得、又はそのような魚は、飼育者又は商業的流通業者によって、例えば、観賞魚部門を有する多製品小売業者等の小売業者に配布され得る。
【００１１】
いくつかの態様において、トランスジェニックレインボーシャークを作製する方法は、以下：
（ａ）蛍光を発し、１つ以上の染色体に組み込まれた導入遺伝子又は発現カセットを含むレインボーシャークを得る工程、ここで、当該レインボーシャークは、ＥＣＡＣＣに寄託されているオレンジ色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「オレンジ色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子を含む； 及び
（ｂ）得られたレインボーシャークと第２のレインボーシャークを交配し、オレンジ色レインボーシャーク１形質転換現象を含むトランスジェニックレインボーシャークを提供する工程、を含む。第２のレインボーシャークは、トランスジェニック又は非トランスジェニックレインボーシャークであり得る。
【００１２】
さらなる実施形態において、トランスジェニック生物を産生する方法も提供され、当該方法は、トランスジェニック子孫を産生するために、ＥＣＡＣＣに寄託されているような精子を含むオレンジ色レインボーシャーク１形質転換を含む精子を使用することを含む。そのような子孫は、例えば、レインボーシャーク、コイ目（Ｃｙｐｒｉｎｉｆｏｒｍｅｓ）ファミリーの種、エパルゼオリンコス（Ｅｐａｌｚｅｏｒｈｙｎｃｈｏｓ）属の種、レインボーシャークに関連する種又は属、又は他の魚種又は属であり得る。いくつかの態様において、当該魚は、当該技術分野で知られている、又は本明細書に記載されるインビトロ受精技術を使用して産生され得る。
【００１３】
少なくとも１つの例示的な実施形態において、本明細書において形質転換現象と称される特定のトランスジェニック組み込み現象を含むトランスジェニックレインボーシャーク又はその子孫が提供される。これらの魚は、例えば、見た目が美しい紫色を体現しているため、特に興味深いものである。これら特定のトランスジェニック現象を含むトランスジェニック魚は、形質転換現象についてホモ接合性又はヘテロ接合性（例えば、半接合性を含む）であり得る。形質転換現象を欠く魚と交配されたホモ接合の魚は、ほぼ全ての場合、１００％のヘテロ接合性の子孫を産する。これら特定のトランスジェニック現象を含む卵、精子、及び胚も、本発明の一部として含まれる。
【００１４】
そのような特定のトランスジェニック組み込み現象に関する一実施形態において、染色体に組み込まれた導入遺伝子を含む紫色トランスジェニックレインボーシャーク又はその子孫が提供され、当該レインボーシャークは、ＥＣＡＣＣに寄託されている紫色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「紫色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子を含む。染色体に組み込まれた導入遺伝子は、１つの組み込まれた発現カセット又は２つ以上の組み込まれた発現カセットに存在し得る。特定の態様において、そのようなトランスジェニックレインボーシャークは、繁殖力のあるトランスジェニックレインボーシャークである。そのようなトランスジェニックレインボーシャークは、導入遺伝子又は組み込まれた発現カセットに関してホモ接合性又はヘテロ接合性（例えば、半接合性を含む）であり得る。
【００１５】
紫色レインボーシャーク１形質転換現象を含むトランスジェニックレインボーシャークを観賞魚市場に提供する方法も開示される。いくつかの実施形態において、当該方法は、染色体に組み込まれた導入遺伝子を含むトランスジェニックレインボーシャーク又はその子孫を得ることを含み、ここで、当該レインボーシャークは、ＥＣＡＣＣに寄託されている紫色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「紫色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子、及び観賞魚業界に魚を配布することを含む。そのような魚は、飼育者によって商業的流通業者に配布され得、又はそのような魚は、飼育者又は商業的流通業者によって、例えば、観賞魚部門を有する多製品小売業者等の小売業者に配布され得る。
【００１６】
いくつかの態様において、トランスジェニックレインボーシャークを作製する方法は、以下：
（ａ）蛍光を発し、１つ以上の染色体に組み込まれた導入遺伝子又は発現カセットを含むレインボーシャークを得る工程、ここで、当該レインボーシャークは、ＥＣＡＣＣに寄託されている紫色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「紫色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子を含む； 及び
（ｂ）得られたレインボーシャークと第２のレインボーシャークを交配し、紫色レインボーシャーク１形質転換現象を含むトランスジェニックレインボーシャークを提供する工程、を含む。第２のレインボーシャークは、トランスジェニック又は非トランスジェニックレインボーシャークであり得る。
【００１７】
さらなる実施形態において、トランスジェニック生物を産生する方法も提供され、当該方法は、トランスジェニック子孫を産生するために、ＥＣＡＣＣに寄託されているような精子を含む紫色レインボーシャーク１形質転換を含む精子を使用することを含む。そのような子孫は、例えば、レインボーシャーク、コイ目ファミリーの種、エパルゼオリンコス属の種、レインボーシャークに関連する種又は属、又は他の魚種又は属であり得る。いくつかの態様において、当該魚は、当該技術分野で知られている、又は本明細書に記載されるインビトロ受精技術を使用して産生され得る。
【００１８】
少なくとも１つの例示的な実施形態において、本明細書において形質転換現象と称される特定のトランスジェニック組み込み現象を含むトランスジェニックレインボーシャーク又はその子孫が提供される。これらの魚は、例えば、見た目が美しい青色を体現しているため、特に興味深いものである。これら特定のトランスジェニック現象を含むトランスジェニック魚は、形質転換現象についてホモ接合性又はヘテロ接合性（例えば、半接合性を含む）であり得る。形質転換現象を欠く魚と交配されたホモ接合の魚は、ほぼ全ての場合、１００％のヘテロ接合性の子孫を産する。これら特定のトランスジェニック現象を含む卵、精子、及び胚も、本発明の一部として含まれる。
【００１９】
そのような特定のトランスジェニック組み込み現象に関する一実施形態において、染色体に組み込まれた導入遺伝子を含む青色トランスジェニックレインボーシャーク又はその子孫が提供され、当該レインボーシャークは、ＥＣＡＣＣに寄託されている青色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「青色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子を含む。染色体に組み込まれた導入遺伝子は、１つの組み込まれた発現カセット又は２つ以上の組み込まれた発現カセットに存在し得る。特定の態様において、そのようなトランスジェニックレインボーシャークは、繁殖力のあるトランスジェニックレインボーシャークである。そのようなトランスジェニックレインボーシャークは、導入遺伝子又は組み込まれた発現カセットに関してホモ接合性又はヘテロ接合性（例えば、半接合性を含む）であり得る。
【００２０】
青色レインボーシャーク１形質転換現象を含むトランスジェニックレインボーシャークを観賞魚市場に提供する方法も開示される。いくつかの実施形態において、当該方法は、染色体に組み込まれた導入遺伝子を含むトランスジェニックレインボーシャーク又はその子孫を得ることを含み、ここで、当該レインボーシャークは、ＥＣＡＣＣに寄託されている青色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「青色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子、及び観賞魚業界に魚を配布することを含む。そのような魚は、飼育者によって商業的流通業者に配布され得、又はそのような魚は、飼育者又は商業的流通業者によって、例えば、観賞魚部門を有する多製品小売業者等の小売業者に配布され得る。
【００２１】
いくつかの態様において、トランスジェニックレインボーシャークを作製する方法は、以下：
（ａ）蛍光を発し、１つ以上の染色体に組み込まれた導入遺伝子又は発現カセットを含むレインボーシャークを得る工程、ここで、当該レインボーシャークは、ＥＣＡＣＣに寄託されている青色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「青色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子を含む； 及び
（ｂ）得られたレインボーシャークと第２のレインボーシャークを交配し、青色レインボーシャーク１形質転換現象を含むトランスジェニックレインボーシャークを提供する工程、を含む。第２のレインボーシャークは、トランスジェニック又は非トランスジェニックレインボーシャークであり得る。
【００２２】
さらなる実施形態において、トランスジェニック生物を産生する方法も提供され、当該方法は、トランスジェニック子孫を産生するために、ＥＣＡＣＣに寄託されているような精子を含む青色レインボーシャーク１形質転換を含む精子を使用することを含む。そのような子孫は、例えば、レインボーシャーク、コイ目ファミリーの種、エパルゼオリンコス属の種、レインボーシャークに関連する種又は属、又は他の魚種又は属であり得る。いくつかの態様において、当該魚は、当該技術分野で知られている、又は本明細書に記載されるインビトロ受精技術を使用して産生され得る。
【００２３】
少なくとも１つの例示的な実施形態において、本明細書において形質転換現象と称される特定のトランスジェニック組み込み現象を含むトランスジェニックレインボーシャーク又はその子孫が提供される。これらの魚は、例えば、見た目が美しい緑色を体現しているため、特に興味深いものである。これら特定のトランスジェニック現象を含むトランスジェニック魚は、形質転換現象についてホモ接合性又はヘテロ接合性（例えば、半接合性を含む）であり得る。形質転換現象を欠く魚と交配されたホモ接合の魚は、ほぼ全ての場合、１００％のヘテロ接合性の子孫を産する。これら特定のトランスジェニック現象を含む卵、精子、及び胚も、本発明の一部として含まれる。
【００２４】
そのような特定のトランスジェニック組み込み現象に関する一実施形態において、染色体に組み込まれた導入遺伝子を含む緑色トランスジェニックレインボーシャーク又はその子孫が提供され、当該レインボーシャークは、ＥＣＡＣＣに寄託されている緑色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「緑色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子を含む。染色体に組み込まれた導入遺伝子は、１つの組み込まれた発現カセット又は２つ以上の組み込まれた発現カセットに存在し得る。特定の態様において、そのようなトランスジェニックレインボーシャークは、繁殖力のあるトランスジェニックレインボーシャークである。そのようなトランスジェニックレインボーシャークは、導入遺伝子又は組み込まれた発現カセットに関してホモ接合性又はヘテロ接合性（例えば、半接合性を含む）であり得る。
【００２５】
緑色レインボーシャーク１形質転換現象を含むトランスジェニックレインボーシャークを観賞魚市場に提供する方法も開示される。いくつかの実施形態において、当該方法は、染色体に組み込まれた導入遺伝子を含むトランスジェニックレインボーシャーク又はその子孫を得ることを含み、ここで、当該レインボーシャークは、ＥＣＡＣＣに寄託されている緑色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「緑色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子、及び観賞魚業界に魚を配布することを含む。そのような魚は、飼育者によって商業的流通業者に配布され得、又はそのような魚は、飼育者又は商業的流通業者によって、例えば、観賞魚部門を有する多製品小売業者等の小売業者に配布され得る。
【００２６】
いくつかの態様において、トランスジェニックレインボーシャークを作製する方法は、以下：
（ａ）蛍光を発し、１つ以上の染色体に組み込まれた導入遺伝子又は発現カセットを含むレインボーシャークを得る工程、ここで、当該レインボーシャークは、ＥＣＡＣＣに寄託されている緑色レインボーシャーク１形質転換現象を含む「緑色レインボーシャーク１形質転換現象、」精子を含む； 及び
（ｂ）得られたレインボーシャークと第２のレインボーシャークを交配し、緑色レインボーシャーク１形質転換現象を含むトランスジェニックレインボーシャークを提供する工程、を含む。第２のレインボーシャークは、トランスジェニック又は非トランスジェニックレインボーシャークであり得る。
【００２７】
さらなる実施形態において、トランスジェニック生物を産生する方法も提供され、当該方法は、トランスジェニック子孫を産生するために、ＥＣＡＣＣに寄託されているような精子を含む緑色レインボーシャーク１形質転換を含む精子を使用することを含む。そのような子孫は、例えば、レインボーシャーク、コイ目ファミリーの種、エパルゼオリンコス属の種、レインボーシャークに関連する種又は属、又は他の魚種又は属であり得る。いくつかの態様において、当該魚は、当該技術分野で知られている、又は本明細書に記載されるインビトロ受精技術を使用して産生され得る。
【００２８】
この明細書において使用される場合「ａ」又は「ａｎ」は１つ以上を意味し得る。本請求項で用いられる場合、「含む」という単語と併せて使用される際、「ａ」又は「ａｎ」という単語は、１つ又は複数を意味し得る。
【００２９】
請求項における「又は」という用語の使用は、代替案のみを示すように明示的に示されていない限り、又は代替案が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、当該開示は、代替案及び「及び／又は」のみを参照する定義をサポートする。本明細書で使用される「他の」とは、少なくとも２つ以上を意味する場合がある。
【００３０】
本出願全体を通して、用語「約」は、値が装置の誤差の固有の変動、値を決定するために採用されている方法、又は研究対象の間に存在する変動を含むことを示すために用いられる。本方法、キット及び組成物の何れかの任意の実施形態は、記載された特徴及び／又は工程を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）／含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）／含む（ｃｏｎｔａｉｎ）／有する（ｈａｖｅ）よりむしろ、本質的になる又はからなることが可能である。
【００３１】
従って、請求項の何れかにおいて、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、所定のクレームの範囲を他の方法で制限のない結合動詞を使用することから変更する目的で、上記に列挙された制限のない結合動詞の何れかと置き換えることで達成され得る。本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。本発明の本質及び範囲内の様々な変更及び改変は、この詳細な説明から当業者に明らかになるが、しかしながら、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、例示のみのために与えられていることを理解すべきである。
【００３２】
発明の詳細な説明
トランスジェニック魚
いくつかの態様において、本開示は、トランスジェニック魚に関する。トランスジェニック魚の作製方法は、例えば、米国特許出願７，１３５，６１３；７，８３４，２３９に記載されており、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、クラゲＰｈｉａｌｉｄｉｕｍ ｓｐ．由来の黄色蛍光タンパク質ＰｈｉＹＦＰの強化されたバリアントであるＴｕｒｂｏＹＦＰ（Shagin et al., 2004）等、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）をコードする発現カセットを使用して、トランスジェニックオレンジ色レインボーシャークが生み出され得る。他の実施例において、紫色蛍光タンパク質（ＰＦＰ）をコードする発現カセットを使用してトランスジェニック紫色レインボーシャークが生み出され得る。他の実施例において、トランスジェニック青色レインボーシャークは、ＴａｇＢＦＰ等の青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）をコードする発現カセット、又は非蛍光青色色素タンパク質と組み合わせたＴａｇＢＦＰを使用して生み出され得る。他の実施例において、トランスジェニック緑色レインボーシャークは、ｚｓＧｒｅｅｎ１等の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする発現カセットを使用して生み出され得る。
【００３３】
商業的価値、特に観賞魚産業内の商業的価値のある魚の種及び品種に属する魚を使用することが好ましい。そのような魚は、限定されないが、ナマズ、ゼブラフィッシュ及び他のダニオ属、メダカ、カープ（ｃａｒｐ）、ティラピア、金魚、テトラ、バーブ、シャーク（レインボーシャーク等のｃｙｐｒｉｎｉｄａｅファミリー）、エンジェルフィッシュ、ドジョウ、コイ、グラスフィッシュ、ディスカス、ウナギ、ハゼ、グラミー、グッピー、クシフォフォルス、ハチェットフィッシュ、モリーフィッシュ、又はパンガシウスを含む。本開示の中で使用するための特定の魚は、レインボーシャーク、Ｅｐａｌｚｅｏｒｈｙｎｃｈｏｓ ｆｒｅｎａｔｕｍである。レインボーシャークは、人気が高まっている鑑賞動物であり、様々な色を加えることでの商業的価値が存在するであろう。レインボーシャークの胚は、簡単に利用可能であり、ほぼ透明である。レインボーシャークの皮膚の色は、メラノソームと称される色素顆粒を含む皮膚の色素細胞によって決定される。色素細胞当たりのメラノソームの数、サイズ、及び密度は、魚の皮膚の色に影響する。
【００３４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精
商業的養殖において、オレンジ色、紫色、青色、緑色レインボーシャークを含むレインボーシャークは、自然産卵されないが、過去数十年にわたって非蛍光の対応物の複製に使用されてきた、同じ、長年にわたる、業界標準のプロセスを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで産卵される。同時に、レインボーシャークは、メスは産卵ごとにかなりの数の卵を産卵し、扱いやすく、繁殖しやすいため、ホルモン誘導の理想的な候補である。一般的に、レインボーシャークは、季節的な繁殖動物であり、５月〜１０月頃に最も簡単に産卵させることができる。レインボーシャークが、性的に成熟するためにおよそ１年かかる。１歳のメスは、産卵ごとに最大１，０００個の卵を放つことができるが、より年齢が高いメスは、繁殖の条件が整っていれば産卵ごとに最大１０，０００個の卵を放つことができる。メスは、季節ごとに１回又は２回産卵可能である。オスは、月に２回又は３回の頻度で精子を放つことができる。オバプリム（Ｏｖａｐｒｉｍ）と呼ばれる排卵誘発に最もよく使用されるホルモンは、ＦＤＡによって観賞魚での使用が承認されている。それは、サケ科のゴナドトロピン放出ホルモン類似体及びドーパミンアンタゴニストが含まれる。オバプリムは、一貫した結果を生み出し、投与が容易であり、広く市販されている。この種の業界標準の繁殖情報（蛍光及び非蛍光表現型の両方）を以下に示すが、正確な詳細は、生産者ごとに若干異なり得る。
【００３５】
シャークの種親は、好ましくは、少なくとも３００ガロンの容量の屋内タンクに保管され得るが、通常は、屋外の土の池で前処理される。繁殖の前処理を終えると、レインボーシャークは、屋外の土の池から大きな屋内の保持バットに移される。繁殖のために、前処理された種親は、保持バットから取り出され、このタイプの使用のためにＦＤＡが承認したトリカイン等の鎮静剤を含む水に入れる。魚は、横になると十分に鎮静されているとみなされる。この時点で、本魚は、鎮静剤を含む水から取り出され、重量が測定され、オバプリムが注射される。オスも、精子を誘導するために、オバプリム注射を受けることがある。メスは、通常、注射後７時間で排卵を開始する； 排卵が始まると魚を優しく絞ると卵が自由に流れ出る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精の準備をするために、卵は、次いで、乾燥したボウル内で搾出（ｓｔｒｉｐｐ）される必要がある。オスのレインボーシャークからの数滴の白子は、同じボウルに同様に搾出される必要がある。０．５ｍＬ（約１０滴）の水と一緒に卵と精子を攪拌すると、受精プロセスが開始される。２０秒後、さらに２ｍＬの水を追加する必要がある。このプロセスにより卵は約３０秒以内に受精される。受精すると、卵は、マクドナルド型の卵ハッチングジャーに入れられ得る。卵は、最初の３０分間で膨張し、浮力を有する。そのため、卵の損失を避けるために、ハッチングジャーの流量を最初にできるだけ低く調整する必要がある。流量を、頻繁に確認し、必要に応じて調整する必要がある。稚魚に、孵化後２日目に新たに孵化後アルテミアノープリイ（Ａｒｔｅｍｉａ ｎａｕｐｌｉｉ）を与える必要があり、稚魚に、１週間アルテミアを与え続ける必要がある。その時点から、稚魚は、調理食品への移行を開始し、５日間の生餌と重複することができる。孵化後２週間で、稚魚を、バット及び／又は池に移すことができ、成熟するまで成長を続ける。
【００３６】
凍結精子からの受精
魚の精子の凍結方法は、当該技術分野で周知であり； 例えば、Walker and Streisinger (1983) and Draper and Moens (2007)を参照、これらは両方とも全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に開示されるトランスジェニック魚を得るために、冷凍レインボーシャークの精子を使用して卵を受精させることができる。
【００３７】
少なくとも１つの方法において、前処理したメスを保持バットから取り出し、このタイプの使用のためにＦＤＡが承認したトリカイン等の鎮静剤を含む水に入れた。魚は、横になると十分に鎮静されているとみなされる。鎮静されると、本魚は、鎮静剤を含む水から取り出され、重量が測定され、オバプリムが注射される。注射されたメスは、通常、注射後７時間で排卵を開始する； 排卵が始まると魚を優しく絞ると卵が自由に流れ出る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精の準備をするために、卵は、次いで、乾燥したボウル内で搾出される必要がある。数匹のメスからの卵をプールすることができる； 卵は、数分間受精させないでおくことができる。凍結した精子は、ウォーターバス中３３℃で１８〜２０秒間解凍される。精子が解凍されたら、室温のハンクス液７０μＬをバイアルに加えて混合する。次いで、精子は、すぐに卵に加えられ、穏やかに混合される。０．５ｍＬ（約１０滴）の水と一緒に卵と精子を攪拌すると、受精プロセスが開始される。２０秒後、さらに２ｍＬの水を追加する必要がある。このプロセスにより卵は約３０秒以内に受精される。受精すると、卵は、マクドナルド型の卵ハッチングジャーに入れられ得る。卵は、最初の３０分間で膨張し、浮力を有する。そのため、卵の損失を避けるために、ハッチングジャーの流量を最初にできるだけ低く調整する必要がある。流量を、頻繁に確認し、必要に応じて調整する必要がある。稚魚に、孵化後２日目に新たに孵化後アルテミアノープリイを与える必要があり、稚魚に、１週間アルテミアを与え続ける必要がある。その時点から、稚魚は、調理食品への移行を開始し、５日間の生餌と重複することができる。孵化後２週間で、稚魚を、バット及び／又は池に移すことができ、成熟するまで成長を続ける。Parichy and Johnson, 2001（その全体が参照により組み込まれる）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精に関するさらなる実施例を提供する。
【００３８】
本開示はさらに、オレンジ色レインボーシャーク形質転換現象を含むトランスジェニック魚の子孫、並びにトランスジェニック魚の卵、精子細胞、胚、又はゲノムに組み込まれたトランスジェニックコンストラクトを含む他の細胞に由来するトランスジェニック魚を包含する。本開示で使用される「子孫」は、本発明の２匹のトランスジェニック魚の交配、又は本発明の第１のトランスジェニック魚を本発明のトランスジェニック魚ではない第２の魚に交配することにより生じ得る。後者の場合、第２の魚は、例えば、野生型魚、特定の魚の系統、突然変異体の魚、又は他のトランスジェニック魚であり得る。第２の魚は同じ種でも、異なる種又は属でもよい。これらの交配のハイブリッドの子孫は、これらの他の系統に由来する利点と組み合わされた蛍光に関する導入遺伝子の利点を有する。
【００３９】
オレンジ色レインボーシャーク１形質転換現象を含む魚を識別する最も簡単な方法は、当該魚がオレンジ色で、非トランスジェニック魚とすぐに区別できるため、目視検査によるものである。
【００４０】
本開示はさらに、紫色レインボーシャーク形質転換現象を含むトランスジェニック魚の子孫、並びにトランスジェニック魚の卵、精子細胞、胚、又はゲノムに組み込まれたトランスジェニックコンストラクトを含む他の細胞に由来するトランスジェニック魚を包含する。本開示で使用される「子孫」は、本発明の２匹のトランスジェニック魚の交配、又は本発明の第１のトランスジェニック魚を本発明のトランスジェニック魚ではない第２の魚に交配することにより生じ得る。後者の場合、第２の魚は、例えば、野生型魚、特定の魚の系統、突然変異体の魚、又は他のトランスジェニック魚であり得る。第２の魚は同じ種でも、異なる種又は属でもよい。これらの交配のハイブリッドの子孫は、これらの他の系統に由来する利点と組み合わされた蛍光に関する導入遺伝子の利点を有する。
【００４１】
紫色レインボーシャーク１形質転換現象を含む魚を識別する最も簡単な方法は、当該魚が紫色で、非トランスジェニック魚とすぐに区別できるため、目視検査によるものである。
【００４２】
本開示はさらに、青色レインボーシャーク形質転換現象を含むトランスジェニック魚の子孫、並びにトランスジェニック魚の卵、精子細胞、胚、又はゲノムに組み込まれたトランスジェニックコンストラクトを含む他の細胞に由来するトランスジェニック魚を包含する。本開示で使用される「子孫」は、本発明の２匹のトランスジェニック魚の交配、又は本発明の第１のトランスジェニック魚を本発明のトランスジェニック魚ではない第２の魚に交配することにより生じ得る。後者の場合、第２の魚は、例えば、野生型魚、特定の魚の系統、突然変異体の魚、又は他のトランスジェニック魚であり得る。第２の魚は同じ種でも、異なる種又は属でもよい。これらの交配のハイブリッドの子孫は、これらの他の系統に由来する利点と組み合わされた蛍光に関する導入遺伝子の利点を有する。
【００４３】
青色レインボーシャーク１形質転換現象を含む魚を識別する最も簡単な方法は、当該魚が青色で、非トランスジェニック魚とすぐに区別できるため、目視検査によるものである。
【００４４】
本開示はさらに、緑色レインボーシャーク形質転換現象を含むトランスジェニック魚の子孫、並びにトランスジェニック魚の卵、精子細胞、胚、又はゲノムに組み込まれたトランスジェニックコンストラクトを含む他の細胞に由来するトランスジェニック魚を包含する。本開示で使用される「子孫」は、本発明の２匹のトランスジェニック魚の交配、又は本発明の第１のトランスジェニック魚を本発明のトランスジェニック魚ではない第２の魚に交配することにより生じ得る。後者の場合、第２の魚は、例えば、野生型魚、特定の魚の系統、突然変異体の魚、又は他のトランスジェニック魚であり得る。第２の魚は同じ種でも、異なる種又は属でもよい。これらの交配のハイブリッドの子孫は、これらの他の系統に由来する利点と組み合わされた蛍光に関する導入遺伝子の利点を有する。
【００４５】
緑色レインボーシャーク１形質転換現象を含む魚を識別する最も簡単な方法は、当該魚が緑色で、非トランスジェニック魚とすぐに区別できるため、目視検査によるものである。
【実施例】
【００４６】
本発明の特定の実施形態は、以下の実施例を参照にしてされに説明される。これらの実施例は、本発明の単なる例示であることを意図しており、本発明の範囲を限定又は制限することを決して意図しておらず、条件、パラメーター、試薬、又は本発明の技術を実施するために排他的に利用されなければならない出発物質を提供するものとして解釈されるべきではない。
【００４７】
実施例１−オレンジ色トランスジェニックレインボーシャーク
オレンジ色を示すトランスジェニック魚が提供される。これらの魚で体現された特定のトランスジェニック現象は、「オレンジ色レインボーシャーク１形質転換現象」と表される。これらの魚の精子を使用して、レインボーシャークの卵を受精させ、それによってこれらの特定のトランスジェニック組み込み現象を含むトランスジェニックレインボーシャークを繁殖させることができる。この系統の精子は、「オレンジ色レインボーシャーク１」としてブダペスト条約の規定に基づき、欧州細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｎｇｌａｎｄ、ＣＲＹＯＳＴＯＲＥＳ、Ｂｌｄ． １７、 Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、ＳＰ４ ＯＪＧ、イギリス、に寄託された。
【００４８】
実施例２−紫色トランスジェニックレインボーシャーク
紫色を示すトランスジェニック魚が提供される。これらの魚で体現された特定のトランスジェニック現象は、「紫色レインボーシャーク１形質転換現象」と表される。これらの魚の精子を使用して、レインボーシャークの卵を受精させ、それによってこれらの特定のトランスジェニック組み込み現象を含むトランスジェニックレインボーシャークを繁殖させることができる。この系統の精子は、「紫色レインボーシャーク１」としてブダペスト条約の規定に基づき、欧州細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｎｇｌａｎｄ、ＣＲＹＯＳＴＯＲＥＳ、Ｂｌｄ． １７、 Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、ＳＰ４ ＯＪＧ、イギリス、に寄託された。
【００４９】
実施例３−青色トランスジェニックレインボーシャーク
青色を示すトランスジェニック魚が提供される。これらの魚で体現された特定のトランスジェニック現象は、「青色レインボーシャーク１形質転換現象」と表される。これらの魚の精子を使用して、レインボーシャークの卵を受精させ、それによってこれらの特定のトランスジェニック組み込み現象を含むトランスジェニックレインボーシャークを繁殖させることができる。この系統の精子は、「青色レインボーシャーク１」としてブダペスト条約の規定に基づき、欧州細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｎｇｌａｎｄ、ＣＲＹＯＳＴＯＲＥＳ、Ｂｌｄ． １７、 Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、ＳＰ４ ＯＪＧ、イギリス、に寄託された。
【００５０】
実施例４−緑色トランスジェニックレインボーシャーク
緑色を示すトランスジェニック魚が提供される。これらの魚で体現された特定のトランスジェニック現象は、「緑色レインボーシャーク１形質転換現象」と表される。これらの魚の精子を使用して、レインボーシャークの卵を受精させ、それによってこれらの特定のトランスジェニック組み込み現象を含むトランスジェニックレインボーシャークを繁殖させることができる。この系統の精子は、「緑色レインボーシャーク１」としてブダペスト条約の規定に基づき、欧州細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｎｇｌａｎｄ、ＣＲＹＯＳＴＯＲＥＳ、Ｂｌｄ． １７、 Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、ＳＰ４ ＯＪＧ、イギリス、に寄託された。
【００５１】
蛍光トランスジェニック魚は、市場で観賞魚として使用される。安定的に発現するトランスジェニック系統は、トランスジェニック固体を野生型魚、突然変異体魚、又は他のトランスジェニック魚と交配することにより開発され得る。目的のトランスジェニック魚は、白色光、日光、紫外線、青色光、又はトランスジェニック魚のオレンジ色、紫色、緑色又は青色の可視化を可能にする他の有用な照明条件で魚を観察することにより、非トランスジェニック魚と区別され得る。
【００５２】
蛍光トランスジェニック魚は、細胞系統や細胞移行の追跡等の胚研究に使用できるため、科学研究のツールの市場でも貴重なはずである。加えて、これらの魚は、遺伝子モザイク実験及び魚の癌モデルにおいて細胞をマークするために用いられ得る。
【００５３】
本明細書において開示及び請求される組成物及び／又は方法の全ては、本開示に照らして過度の実験を行うことなく、作製及び実行され得る。本発明の組成物及び方法が、好ましい実施形態に関して記載されてきたが、本発明の概念、本質及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法の組成物及び／又は方法、並びに工程又は一連の工程において、変形が適用できることが明らかであろう。より具体的には、化学的及び生理学的に関連する特定の薬剤を、本明細書に記載の薬剤の代わりに使用し、同じ又は類似の結果を達成できることは明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の置換及び改変の全ては、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の本質、範囲、及び概念内にあるとみなされる。
【国際調査報告】
2020512018.tif 000002
2020512018.tif 000003
2020512018.tif 000004