(57)【要約】  本発明は、供給源細胞をリプログラミングして、軟骨細胞を産生するための方法および組成物であって、供給源細胞において、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体のタンパク質発現を活性化するかまたは増加させる工程を含む、前記方法および組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
供給源細胞をリプログラミングして、軟骨細胞を産生するための方法であって、供給源細胞において、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体のタンパク質発現を増加させる工程を含む、ここで、該供給源細胞がリプログラミングされて、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す、ここで：
−該供給源細胞が皮膚線維芽細胞であり、
−該１つまたはそれより多い転写因子が、表１に列挙する転写因子より選択される
前記方法。
【請求項２】
供給源細胞から、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を生成する方法であって：
−供給源細胞において、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体の量を増加させ；そして
−ターゲット細胞への分化を可能にするために十分な時間および条件下で、該供給源細胞を培養し；それによって、供給源細胞から、ターゲット細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を生成する工程を含む、ここで：
−該供給源細胞が皮膚線維芽細胞であり、
−該転写因子が、表１に列挙するものの１つまたはそれより多くである
前記方法。
【請求項３】
表１の単一の行に示す転写因子のタンパク質発現または量が増加している、請求項１または２の方法。
【請求項４】
以下の転写因子：
ａ）ＰＰＲＸ２、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２、ＡＨＲ、ＦＯＳＢおよびＪＵＮＢ；
ｂ）ＢＡＲＸ１、ＰＰＲＸ２、ＳＭＡＤ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２、ＡＨＲ、ＦＯＳＢおよびＪＵＮＢ；
ｃ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＰＰＲＸ２、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２、ＡＨＲ、ＦＯＳＢおよびＪＵＮＢ；
ｄ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＰＰＲＸ２、ＳＩＸ２、ＡＨＲ、ＦＯＳＢおよびＪＵＮＢ；
ｅ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＦＯＸＣ１、ＰＰＲＸ２、ＡＨＲ、ＦＯＳＢおよびＪＵＮＢ；
ｆ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２、ＰＰＲＸ２、ＦＯＳＢおよびＪＵＮＢ；
ｇ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２、ＡＨＲ、ＰＰＲＸ２およびＪＵＮＢ；または
ｈ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２、ＡＨＲ、ＦＯＳＢおよびＰＰＲＸ２
のタンパク質発現または量が増加している、請求項１または２の方法。
【請求項５】
供給源細胞をリプログラミングして、軟骨細胞を産生するための方法であって、供給源細胞において、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体のタンパク質発現を増加させる工程を含む、ここで、該供給源細胞がリプログラミングされて、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す、ここで：
−該供給源細胞が皮膚線維芽細胞であり、
−該１つまたはそれより多い転写因子が、ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２、ＡＨＲ、ＦＯＳＢおよびＪＵＮＢの１つまたはそれより多くである
前記方法。
【請求項６】
転写因子が、ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２、ＡＨＲ、およびＪＵＮＢである、請求項５の方法。
【請求項７】
軟骨細胞への分化を可能にするために十分な時間および条件下で、前記皮膚線維芽細胞を培養し；それによって、該皮膚線維芽細胞から、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を生成する工程を含む、請求項５または６の方法。
【請求項８】
前記皮膚線維芽細胞を、該１つまたはそれより多い転写因子をコードする少なくとも１つの核酸配列と接触させ、それによって、該１つまたはそれより多い転写因子の発現を増加させることによって、該１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体のタンパク質発現または量を、該皮膚線維芽細胞において増加させる、請求項５〜７のいずれか一項の方法。
【請求項９】
供給源細胞をリプログラミングして、軟骨細胞を産生するための方法であって、供給源細胞において、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体のタンパク質発現を増加させる工程を含む、ここで、該供給源細胞がリプログラミングされて、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す、ここで：
−該供給源細胞が胚性幹細胞であり、そして
−該１つまたはそれより多い転写因子が、表２に列挙する転写因子より選択される
前記方法。
【請求項１０】
供給源細胞から、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を生成する方法であって：
−供給源細胞において、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体の量を増加させ；そして
−ターゲット細胞への分化を可能にするために十分な時間および条件下で、供給源細胞を培養し；それによって、供給源細胞から、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を生成する工程を含む、ここで：
−供給源細胞が胚性幹細胞であり；
−転写因子が、表２に列挙するものの１つまたはそれより多くである
前記方法。
【請求項１１】
表２の単一の行に示すような転写因子のタンパク質発現または量が増加している、請求項９または１０の方法。
【請求項１２】
以下の転写因子：
ａ）ＨＯＸＡ１１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＮＦＫＢ１、ＦＯＸＣ１、ＡＨＲ、ＳＩＸ２およびＪＵＮＢ；
ｂ）ＢＡＲＸ１、ＰＲＲＸ２、ＳＭＡＤ６、ＮＦＫＢ１、ＦＯＸＣ１、ＡＨＲ、ＳＩＸ２およびＪＵＮＢ；
ｃ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＴＧＦＢ３、ＮＦＫＢ１、ＦＯＸＣ１、ＡＨＲ、ＳＩＸ２およびＪＵＮＢ；
ｄ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＩＲＦ１、ＦＯＸＣ１、ＡＨＲ、ＳＩＸ２およびＪＵＮＢ；
ｅ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＮＦＫＢ１、ＰＲＲＸ２、ＡＨＲ、ＳＩＸ２およびＪＵＮＢ；
ｆ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＮＦＫＢ１、ＦＯＸＣ１、ＰＲＲＸ２、ＳＩＸ２およびＪＵＮＢ；
ｇ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＮＦＫＢ１、ＦＯＸＣ１、ＡＨＲ、ＰＲＲＸ２およびＪＵＮＢ；または
ｈ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＮＦＫＢ１、ＦＯＸＣ１、ＡＨＲ、ＳＩＸ２およびＦＯＳＢ
のタンパク質発現または量が増加している、請求項９または１０の方法。
【請求項１３】
脱分化した軟骨細胞をリプログラミングして、再分化した軟骨細胞を産生するための方法であって、供給源細胞において、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体のタンパク質発現を増加させる工程を含む、ここで、該脱分化した軟骨細胞がリプログラミングされて、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す、ここで：
−該１つまたはそれより多い転写因子が、表３に列挙する転写因子より選択される
前記方法。
【請求項１４】
脱分化した軟骨細胞から、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を生成する方法であって：
−脱分化した軟骨細胞において、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体の量を増加させ；そして
−軟骨細胞への再分化を可能にするために十分な時間および条件下で、該脱分化した軟骨細胞を培養する工程を含む、ここで：
−該転写因子が、表３に列挙するものの１つまたはそれより多くである
前記方法。
【請求項１５】
表３の単一の行に示すような転写因子のタンパク質発現または量が増加している、請求項１３または１４の方法。
【請求項１６】
軟骨細胞の細胞培養の脱分化を防止する方法であって：
−細胞培養における軟骨細胞中の１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体の量を増加させ、それによって、該軟骨細胞の脱分化を防止し、そして軟骨細胞の細胞培養における軟骨細胞の少なくとも１つの特性を維持する、ここで該転写因子は、表３に列挙するものの１つまたはそれより多くである、
工程を含む、前記方法。
【請求項１７】
以下の転写因子：
ａ）ＩＬ１１、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１；
ｂ）ＳＯＸ９、ＴＣＦ４、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１；
ｃ）ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＨＯＸＡ７、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１；
ｄ）ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＴＣＦ４、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１；  ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１；
ｅ）ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＴＣＦ４、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１；
ｆ）ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＨＯＸＡ７、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１；
ｇ）ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ２、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１；
ｈ）ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１、ＨＯＸＡ７およびＰＲＲＸ１；または
ｉ）ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＨＯＸＡ７
のタンパク質発現または量が増加している、請求項１３〜１６のいずれか一項の方法。
【請求項１８】
前記脱分化した軟骨細胞が、軟骨細胞の増殖培養から得られるか、または変形性関節症を患う個体由来の生物学的試料から得られる、請求項１３〜１５または１７のいずれか一項の方法。
【請求項１９】
前記転写因子が、ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１の１つまたはそれより多くである、請求項１３〜１８のいずれか一項の方法。
【請求項２０】
前記転写因子が、ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１である、請求項１３〜１９のいずれか一項の方法。
【請求項２１】
供給源細胞を、１つまたはそれより多い転写因子の発現または量を増加させる剤と接触させることによって、該供給源細胞において、該１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体のタンパク質発現または量を増加させる、先行する請求項のいずれか一項の方法。
【請求項２２】
前記剤が：核酸、タンパク質、アプタマー、小分子、リボソーム、ＲＮＡｉ剤およびペプチド核酸（ＰＮＡ）、ならびにその類似体または変異体からなる群より選択される、請求項２１の方法。
【請求項２３】
供給源細胞を、１つまたはそれより多い転写因子の発現または量を増加させる、１つまたはそれより多い小分子と接触させることによって、該供給源細胞において、該１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体のタンパク質発現または量を増加させる、請求項１〜２２のいずれか一項の方法。
【請求項２４】
１つまたはそれより多い小分子が：［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、ロージン（ｒｈｏｓｉｎ）塩酸塩、ロイコボリン、ボリノスタットおよびフォルスコリンからなる群より選択される、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記供給源細胞を、［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、およびロージン塩酸塩と接触させる、請求項２１の方法。
【請求項２６】
前記供給源細胞を、［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、カルシトリオール、ロイコボリン、ボリノスタットおよびフォルスコリンと接触させる、請求項２１の方法。
【請求項２７】
前記供給源細胞を、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、カルシトリオール、ロイコボリンおよびボリノスタットと接触させる、請求項２１の方法。
【請求項２８】
前記剤が、表１〜４のいずれか１つに列挙する１つまたはそれより多い転写因子をコードする核酸である、請求項２１の方法。
【請求項２９】
前記供給源細胞を、軟骨細胞への分化を可能にするために十分な時間および条件下で培養する工程が、表６に示すような適切な培地中で、細胞を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３，１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０日間培養する工程を含む、請求項２〜４、９〜１２または１３〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
細胞の培養を低酸素条件下で実行する、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を、個体に投与する工程をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞であって、請求項１〜３１のいずれか一項記載の方法によって産生される、前記細胞。
【請求項３３】
細胞の少なくとも５％が、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞集団であって、細胞が請求項１〜３１のいずれか一項記載の方法によって産生される、前記細胞集団。
【請求項３４】
集団中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す、請求項３３記載の細胞集団。
【請求項３５】
軟骨細胞の少なくとも１つの特性が、形態学的マーカー、１つまたはそれより多い遺伝子の発現、あるいは１つまたはそれより多いペプチドまたはタンパク質／多糖複合体の産生より選択される、請求項１〜３１のいずれか一項の方法。
【請求項３６】
変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態の治療のための医薬品の製造における：［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、ロージン塩酸塩、ロイコボリン、ボリノスタットおよびフォルスコリンからなる群より選択される化合物の１つまたはそれより多くの使用。
【請求項３７】
変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態を治療する方法における使用のための、請求項３３または３４のいずれか一項記載の細胞集団の使用。
【請求項３８】
変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態を治療する方法における使用のための、［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、ロージン塩酸塩、ロイコボリン、ボリノスタットおよびフォルスコリンの１つまたはそれより多く。
【請求項３９】
変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態を治療する方法であって、こうした治療を必要とする個体に、［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、ロージン塩酸塩、ロイコボリン、ボリノスタットおよびフォルスコリンの１つまたはそれより多くを含む組成物を投与し、それによって、個体において、変形性関節症または他の状態を治療する工程を含む、前記方法。
【請求項４０】
変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態を治療する方法における使用のための、［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、ロージン塩酸塩、ロイコボリン、ボリノスタットおよびフォルスコリンの１つまたはそれより多くを含む、薬学的組成物。
【請求項４１】
軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を産生するための、請求項１〜３１のいずれか一項記載の方法における使用のためのキットであって、［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、ロージン塩酸塩、ロイコボリン、ボリノスタットおよびフォルスコリンの１つまたはそれより多くを含み、任意に、供給源細胞を、ターゲット細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞にリプログラミングするための使用説明書をさらに含む、前記キット。
【請求項４２】
供給源細胞タイプの軟骨細胞細胞タイプへの転換を促進するために有用な剤を同定するための方法であって：
−本明細書記載のいずれかの方法による、供給源細胞タイプの軟骨細胞への転換に必要な１つまたはそれより多い転写因子を決定し；
−供給源細胞タイプの軟骨細胞への転換に必要な１つまたはそれより多い転写因子の量を増加させる能力に関して、１つまたはそれより多い候補剤をスクリーニングする工程を含む；
ここで、１つまたはそれより多い転写因子の量を増加させる剤を、供給源細胞タイプの軟骨細胞への転換を促進するために有用な剤と決定する
前記方法。
【請求項４３】
軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を産生するための、請求項１〜３１のいずれか一項記載の方法における使用のためのキットであって、本明細書に記載するような１つまたはそれより多い転写因子をコードするヌクレオチド配列を含む１つまたはそれより多い核酸を含み、任意に、供給源細胞を、ターゲット細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞にリプログラミングするための使用説明書をさらに含む、前記キット。
【請求項４４】
供給源細胞をリプログラミングして、軟骨細胞を産生するためのプロセスであって、供給源細胞において、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体のタンパク質発現を増加させる工程を含む、ここで該供給源細胞はリプログラミングされて、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す、ここで：
−該供給源細胞が皮膚線維芽細胞であり、
−該１つまたはそれより多い転写因子が、ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２、ＡＨＲ、ＦＯＳＢおよびＪＵＮＢの１つまたはそれより多くである
前記プロセス。
【請求項４５】
転写因子が、ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２、ＡＨＲ、およびＪＵＮＢである、請求項４４のプロセス。
【請求項４６】
皮膚線維芽細胞を、軟骨細胞への分化を可能にするために十分な時間および条件下で培養し；それによって、皮膚線維芽細胞から、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を生成する工程をさらに含む、請求項４４または４５のプロセス。
【請求項４７】
皮膚線維芽細胞を、１つまたはそれより多い転写因子をコードする少なくとも１つの核酸配列と接触させ、それによって、１つまたはそれより多い転写因子の発現を増加させることによって、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体のタンパク質発現または量を、皮膚線維芽細胞において増加させる、請求項４４〜４６のいずれか一項のプロセス。
【請求項４８】
脱分化した軟骨細胞から、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を生成するためのプロセスであって、脱分化した軟骨細胞において、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体の量を増加させ；そして
−該脱分化した軟骨細胞を、軟骨細胞への分化を可能にするために十分な時間および条件下で培養し；それによって、脱分化した軟骨細胞から、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を生成する工程を含む、ここで：
−該転写因子が：ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１の１つまたはそれより多くである
前記プロセス。
【請求項４９】
軟骨細胞細胞培養の脱分化を防止するプロセスであって：
−細胞培養における軟骨細胞中の１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体の量を増加させ、それによって、該軟骨細胞の脱分化を防止し、そして軟骨細胞の細胞培養における軟骨細胞の少なくとも１つの特性を維持する、ここで転写因子は、ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１の１つまたはそれより多くである
工程を含む、前記プロセス。
【請求項５０】
転写因子が、ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１である、請求項４８または４９のプロセス。
【請求項５１】
皮膚線維芽細胞を、１つまたはそれより多い転写因子をコードする少なくとも１つの核酸配列と接触させ、それによって、１つまたはそれより多い転写因子の発現を増加させることによって、該１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体のタンパク質発現または量を、該皮膚線維芽細胞において増加させる、請求項４４〜５０のいずれか一項のプロセス。
【請求項５２】
皮膚線維芽細胞を：［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、ロージン塩酸塩、ロイコボリン、ボリノスタットおよびフォルスコリンより選択される１つまたはそれより多い小分子と接触させることによって、該１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体のタンパク質発現または量を、該皮膚線維芽細胞において増加させる、請求項４４〜５０のいずれか一項のプロセス。
【請求項５３】
細胞を、［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、およびロージン塩酸塩と接触させる、請求項５２のプロセス。
【請求項５４】
細胞を、［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、カルシトリオール、ロイコボリン、ボリノスタットおよびフォルスコリンと接触させる、請求項５２のプロセス。
【請求項５５】
細胞を、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、カルシトリオール、ロイコボリンおよびボリノスタットと接触させる、請求項５２のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その全内容が本明細書に援用される、オーストラリア仮出願ＡＵ２０１７９０２３８５に優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ある細胞タイプを別の細胞タイプに転換するための方法および組成物に関する。特に、本発明は、細胞の軟骨細胞への分化転換またはリプログラミングに関する。
【背景技術】
【０００３】
変性疾患によって引き起こされる関節軟骨病変および進行性軟骨喪失は、先進国における身体障害への主要な寄与要因である。変形性関節症（ＯＡ）は、滑膜関節に対するすべての主要な外傷的傷害の最終的なそして一般的な経路に相当する。ＯＡは、変性性関節疾患の最も一般的な型であり、そして身体疼痛および身体障害の主因である。先進社会における軟骨に関連する問題は、高齢集団および肥満発生率の増加により、将来的に劇的に増加すると予測される。
【０００４】
軟骨は、無血管組織であり、代謝活性および細胞密度は低く、主に、コラーゲンおよびプロテオグリカンが豊富な細胞外マトリックスからなる。修復細胞供給源へのアクセスが生得的に劣っている結果として、損傷を受けた軟骨の再生能は低い。
【０００５】
現在、損傷を受けた関節軟骨の元来の構造および機能を回復することが可能な、有効な薬物療法はない。このため、ＯＡおよび関連する整形外科障害を治療するための、細胞に基づく療法および生物学的な療法の発展が生じてきた。現在の臨床療法は、分節する関節の天然硝子質軟骨構造を再生するには不適切であり、その代わり、機械的に劣った線維軟骨を生じ、長期には治療の失敗のリスクが非常に増加する。さらに、細胞に基づく療法が完全な能力に達しうるには、新規細胞供給源および培養法が必要である。
【０００６】
細胞に基づく再生療法は、傷害、疾患または年齢によって損傷を受けた組織を置換するための特定の細胞タイプの生成を必要とする。細胞置換療法は、自身の容易にアクセス可能な組織、例えば皮膚または血液から直接、多様な療法的に重要な細胞タイプを迅速に生成する潜在能力を有する。こうした免疫学的にマッチした細胞はまた、移植後の拒絶に関してより少ないリスクを課すであろう。さらに、これらの細胞は、最終分化しているため、より少ない腫瘍原性を表すであろう。ＯＡの背景において、自己軟骨細胞および自己軟骨形成成体幹細胞を用いた、いくつかの臨床試験がある。これらの治療は、患者間可変性、クローン多様性、一貫しない能力、限定されたドナー組織およびＧＭＰ実験室における高価な増殖によって特徴づけられる。今日まで、構造、内容物、または組織化に関して、その天然の正常な型に軟骨を再生可能である細胞供給源はない。
【０００７】
分化転換は、多能性状態を経ずに、１つの細胞タイプを別のものに転換するプロセスであり、再生医薬に非常に有望でありうるが、いまだに信頼可能に適用されていない。１つの体細胞タイプの表現型を別のものにスイッチすることは可能でありうるが、転換に必要な要素を同定することは困難であり、そして大部分の場合、これらは未知である。細胞タイプの同一性を直接リプログラミングする要因の同定は、現在、とりわけ、ありうる要因のセットを徹底的に実験で試験する費用によって制限されており、これは非効率的で拡張不能なアプローチである。
【０００８】
１つの細胞タイプを別のものに転換するために必要な要因を同定するために、そして特に、状態を治療する際に有用性を有しうる、例えば軟骨細胞移植が必要な場合の、軟骨細胞への細胞タイプの転換のために、新規で、そして／または改善された方法に関する必要性がある。
【０００９】
本明細書における、いかなる先行技術への言及も、この先行技術がいかなる権威においても共通の一般的な知識の一部を形成することの承認または示唆ではなく、あるいはこの先行技術が、当業者によって、関連すると理解されるか、見なされるか、そして／または先行技術の他の部分と組み合わされると合理的に予期されうることの承認または示唆ではない。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、供給源細胞をリプログラミングするための方法であって、供給源細胞において、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体のタンパク質発現を増加させる工程を含む、ここで、該供給源細胞がリプログラミングされて、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す、ここで：
−供給源細胞が、皮膚線維芽細胞、胚性幹細胞、または脱分化した軟骨細胞からなる群より選択され、そして
−転写因子が、表１〜４に列挙するものの１つまたはそれより多くである
前記方法を提供する。
【００１１】
本発明は、供給源細胞から、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を生成する方法であって：
−供給源細胞において、１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体の量を増加させ；そして
−軟骨細胞への分化を可能にするために十分な時間および条件下で、供給源細胞を培養し；それによって、供給源細胞から、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を生成する工程を含む、ここで：
−供給源細胞が、皮膚線維芽細胞、胚性幹細胞、および脱分化した軟骨細胞からなる群より選択され；そして
−転写因子が、表１〜４に列挙するものの１つまたはそれより多くである
前記方法を提供する。
【００１２】
本発明はまた、皮膚線維芽細胞、胚性幹細胞、または脱分化した軟骨細胞をリプログラミングするための方法であって、供給源細胞において、表１〜４中の転写因子またはその変異体の１つまたはそれより多くのタンパク質発現を増加させる工程を含む、ここで、供給源がリプログラミングされて、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す、前記方法も提供する。
【００１３】
本発明は、供給源細胞を、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞にリプログラミングするための方法であって：ｉ）供給源細胞または供給源細胞を含む細胞集団を提供し；ｉｉ）前記供給源細胞を、１つまたはそれより多い転写因子の発現を活性化するかまたは増加させる１つまたはそれより多い剤と接触させ；そしてｉｉｉ）前記細胞または細胞集団を培養し、そして任意に、軟骨細胞の少なくとも１つの特性に関して、細胞または細胞集団を監視する工程を含む、ここで：
−供給源細胞が、皮膚線維芽細胞、胚性幹細胞、および脱分化した軟骨細胞からなる群より選択され；
−転写因子が、表１〜４に列挙するものの１つまたはそれより多くである
前記方法を提供する。
【００１４】
本発明は、供給源細胞を、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞にリプログラミングするための方法であって：ｉ）供給源細胞または供給源細胞を含む細胞集団を提供し；ｉｉ）前記供給源細胞を、１つまたはそれより多い転写因子の発現を活性化するかまたは増加させる１つまたはそれより多い小分子と接触させ；そしてｉｉｉ）前記細胞または細胞集団を培養し、そして任意に、軟骨細胞の少なくとも１つの特性に関して、細胞または細胞集団を監視する工程を含む、ここで：
−供給源細胞が、皮膚線維芽細胞、胚性幹細胞、および脱分化した軟骨細胞からなる群より選択され；
−転写因子が、表１〜４に列挙するものの１つまたはそれより多くである
前記方法を提供する。
【００１５】
好ましくは、転写因子は、ＳＯＸ９、ＰＰＡＲ  γ、ＢＭＰ−２、ＰＩＴＸ１、ＴＧＦβ３、ＶＤＲおよびＲＵＮＸ１の１つまたはそれより多くである。より好ましくは、ＳＯＸ９、ＰＰＡＲ  γ、ＢＭＰ−２、ＰＩＴＸ１、ＴＧＦβ３、ＶＤＲおよびＲＵＮＸ１の群におけるすべての転写因子が、供給源細胞と１つまたはそれより多い小分子の接触の結果、活性化されるかまたは増加した発現を有する。
【００１６】
好ましくは、転写因子の転写を活性化するかまたは増加させるための小分子は、［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、およびロージン（ｒｈｏｓｉｎ）塩酸塩の１つまたはそれより多くである。より好ましくは、８つすべての小分子を用いる。
【００１７】
本発明は、供給源細胞を、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞にリプログラミングするための方法であって：ｉ）供給源細胞または供給源細胞を含む細胞集団を提供し；ｉｉ）前記供給源細胞を、１つまたはそれより多い転写因子をコードするヌクレオチド配列を含む１つまたはそれより多い核酸でトランスフェクションし；そしてｉｉｉ）前記細胞または細胞集団を培養し、そして任意に、軟骨細胞の少なくとも１つの特性に関して、細胞または細胞集団を監視する工程を含む、ここで：
−供給源細胞が、皮膚線維芽細胞、胚性幹細胞、および脱分化した軟骨細胞からなる群より選択され；
−転写因子が、表１〜４に列挙するものの１つまたはそれより多くである
前記方法を提供する。
【００１８】
本明細書記載の本発明のいずれかの方法において、供給源細胞は線維芽細胞であり、そしてターゲット細胞は軟骨細胞であり、そして転写因子は、表１または４に列挙する転写因子のいずれかの１つまたはそれより多くである。
【００１９】
好ましい態様において、表１の単一の行に列挙する転写因子のすべてを用いてもよい。あるいは、因子は、以下に列挙する転写因子およびタンパク質の組み合わせであってもよい：
ａ）ＰＰＲＸ２、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２、ＡＨＲ、ＦＯＳＢおよびＪＵＮＢ；
ｂ）ＢＡＲＸ１、ＰＰＲＸ２、ＳＭＡＤ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２、ＡＨＲ、ＦＯＳＢおよびＪＵＮＢ；
ｃ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＰＰＲＸ２、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２、ＡＨＲ、ＦＯＳＢおよびＪＵＮＢ；
ｄ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＰＰＲＸ２、ＳＩＸ２、ＡＨＲ、ＦＯＳＢおよびＪＵＮＢ；
ｅ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＦＯＸＣ１、ＰＰＲＸ２、ＡＨＲ、ＦＯＳＢおよびＪＵＮＢ；
ｆ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２、ＰＰＲＸ２、ＦＯＳＢおよびＪＵＮＢ；
ｇ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２、ＡＨＲ、ＰＰＲＸ２およびＪＵＮＢ；または
ｈ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２、ＡＨＲ、ＦＯＳＢおよびＰＰＲＸ２。
【００２０】
好ましくは、線維芽細胞は皮膚線維芽細胞である。
本明細書に記載する本発明のいずれかの方法において、供給源細胞は胚性幹細胞であり、そしてターゲット細胞は軟骨細胞であり、そして転写因子は、表２に列挙する転写因子のいずれかの１つまたはそれより多くである。
【００２１】
好ましい態様において、表２の単一の行に列挙する転写因子のすべてを用いてもよい。あるいは、因子は、以下に列挙する転写因子およびタンパク質の組み合わせであってもよい：
ａ）ＨＯＸＡ１１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＮＦＫＢ１、ＦＯＸＣ１、ＡＨＲ、ＳＩＸ２およびＪＵＮＢ；
ｂ）ＢＡＲＸ１、ＰＲＲＸ２、ＳＭＡＤ６、ＮＦＫＢ１、ＦＯＸＣ１、ＡＨＲ、ＳＩＸ２およびＪＵＮＢ；
ｃ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＴＧＦＢ３、ＮＦＫＢ１、ＦＯＸＣ１、ＡＨＲ、ＳＩＸ２およびＪＵＮＢ；
ｄ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＩＲＦ１、ＦＯＸＣ１、ＡＨＲ、ＳＩＸ２およびＪＵＮＢ；
ｅ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＮＦＫＢ１、ＰＲＲＸ２、ＡＨＲ、ＳＩＸ２およびＪＵＮＢ；
ｆ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＮＦＫＢ１、ＦＯＸＣ１、ＰＲＲＸ２、ＳＩＸ２およびＪＵＮＢ；
ｇ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＮＦＫＢ１、ＦＯＸＣ１、ＡＨＲ、ＰＲＲＸ２およびＪＵＮＢ；または
ｈ）ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＮＦＫＢ１、ＦＯＸＣ１、ＡＨＲ、ＳＩＸ２およびＦＯＳＢ。
【００２２】
好ましくは、胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である。
本明細書記載の本発明のいずれかの方法において、供給源細胞は脱分化した軟骨細胞であり、そしてターゲット細胞は軟骨細胞であり、そして転写因子は、表３に列挙する転写因子のいずれかの１つまたはそれより多くである。
【００２３】
好ましい態様において、表３の単一の行に列挙する転写因子のすべてを用いてもよい。あるいは、因子は、以下に列挙する転写因子およびタンパク質の組み合わせであってもよい：
ａ）ＩＬ１１、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１；
ｂ）ＳＯＸ９、ＴＣＦ４、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１；
ｃ）ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＨＯＸＡ７、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１；
ｄ）ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＴＣＦ４、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１；  ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１；
ｅ）ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＴＣＦ４、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１；
ｆ）ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＨＯＸＡ７、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１；
ｇ）ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ２、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１；
ｈ）ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１、ＨＯＸＡ７およびＰＲＲＸ１；または
ｉ）ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＨＯＸＡ７。
【００２４】
好ましくは、軟骨細胞の少なくとも１つの特性は、いずれかの１つまたはそれより多いターゲット細胞マーカーの上方制御、および／または細胞形態における変化である。関連するマーカーは、本明細書に記載され、そして当業者に知られる。軟骨細胞に関する例示的なマーカーには：ＣＤ４４、ＣＤ４９、ＣＤ１０、ＣＤ９、ＣＤ９５、インテグリンα１０β１、ＣＤ１０５、ＳＯＸ９、ＳＭＡＤ３、ＳＯＸ５、ＳＯＸ６、ＳＭＡＤ  ５／６、硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生、アグリカン、ＩＩ型コラーゲン（ＣＯＬ２Ａ１の発現）が含まれる。
【００２５】
典型的には、軟骨細胞分化に適した条件には、十分な時間、および適切な培地中で、細胞を培養する工程が含まれる。培養の十分な時間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３，１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０日間であってもよい。適切な培地は、表６に示すものであってもよい。
【００２６】
本明細書に記載するいずれかの方法において、方法には、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を増殖させ、集団において、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞の比率を増加させる工程をさらに含んでもよい。細胞を増殖させる工程は、以下に記載するように、細胞集団を生成するために十分な時間および条件下で、培養中にあってもよい。
【００２７】
本明細書に記載するいずれかの方法において、方法には、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞または細胞を含む細胞集団を、個体に投与する工程がさらに含まれてもよい。
【００２８】
本発明はまた、初代軟骨細胞の脱分化を防止するための方法も提供する。脱分化を防止するためのアプローチは、脱分化した細胞を再分化した軟骨細胞にリプログラミングするためのアプローチを反映することが理解されるであろう。こうしたものとして、脱分化した軟骨細胞を再分化した軟骨細胞にリプログラミングするための、本明細書に記載するいずれかの他の方法はまた、初代軟骨細胞の脱分化を防止するためにも使用可能である。
【００２９】
本発明はまた、本明細書に記載するような方法によって産生された、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞も提供する。細胞は単離された細胞であってもよい。
本発明はまた、細胞の少なくとも５％が、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示し、そして本明細書に記載するような方法によって産生される細胞集団も提供する。好ましくは、集団中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す。細胞集団は、単離された集団、または実質的に純粋な細胞集団であってもよい。
【００３０】
本発明はまた、本明細書に開示するような軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を産生するためのキットにも関する。いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載する転写因子またはその変異体をコードする１つまたはそれより多い核酸配列を有する１つまたはそれより多い核酸を含む。
【００３１】
代替態様において、キットは、本明細書に記載する１つまたはそれより多い転写因子またはその変異体の発現を活性化するかまたは増加させるための１つまたはそれより多い小分子を含む。より好ましくは、キットは、以下の小分子：［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、およびロージン（ｒｈｏｓｉｎ）塩酸塩の１つまたはそれより多くを含む。
【００３２】
好ましくは、キットを用いて、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を産生してもよい。好ましくは、キットを、皮膚線維芽細胞、胚性幹細胞または脱分化した軟骨細胞である供給源細胞とともに用いてもよい。いくつかの態様において、キットは、本明細書に開示するような方法にしたがって、供給源細胞を、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞にリプログラミングするための使用説明書をさらに含む。好ましくは、本発明は、本明細書記載の本発明の方法で用いた際のキットを提供する。
【００３３】
本発明は、少なくとも１つの軟骨細胞、および軟骨細胞において１つまたはそれより多い転写因子の活性またはタンパク質発現を増加させる少なくとも１つの剤を含む、組成物に関する。さらに、転写因子は、本明細書記載の転写因子のいずれであってもよい。好ましくは、転写因子は、表１〜４に記載されるようなものである。
【００３４】
本発明のいずれかの態様において、剤は、［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、ロージン塩酸塩、ロイコボリンおよびフォルスコリンの１つまたはそれより多くであってもよい。
【００３５】
いずれかの態様において、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）、または供給源細胞においてクロマチンを開放するためのいずれかの他の分子を用いて、小分子剤の有効性を増加させてもよい。１つの例において、分子はＨＤＡＣ阻害剤、ボリノスタットである。
【００３６】
典型的には、本明細書に記載するような転写因子のタンパク質発現または量は、細胞と、転写因子の発現を活性化するかまたは増加させる剤を接触させることによって増加する。いずれかの態様において、剤は：ヌクレオチド配列、タンパク質、アプタマーおよび小分子、リボソーム、ＲＮＡｉ剤およびペプチド核酸（ＰＮＡ）ならびにその類似体または変異体からなる群より選択される。特定の態様において、剤は外因性である。好ましい態様において、剤は小分子である。特定の態様において、ヌクレオチド配列は、１つまたはそれより多い転写因子の発現を増加させるための、転写活性化系の一部（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系またはＴＡＬＥＮで使用するためのｇＲＮＡ）として含まれる。
【００３７】
いくつかの態様において、小分子は：［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、ロージン塩酸塩、ロイコボリンおよびフォルスコリンより選択される。
【００３８】
好ましくは、小分子剤には、レチノイン酸、あるいはその類似体または誘導体が含まれ：［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、オールトランスレチノイン酸および９−シスレチノイン酸のいずれかの１つまたはそれより多くが含まれる。
【００３９】
いくつかの態様において、本明細書に記載するような１つまたはそれより多い転写因子のタンパク質発現または量を増加させるために、小分子の組み合わせを用いる。例えば、特定の態様において、小分子の組み合わせには、少なくともレチノイン酸あるいはその類似体または誘導体およびカルシトリオールが含まれる。あるいは、小分子の組み合わせには、少なくとも［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、カルシトリオール、ロイコボリン、ボリノスタットおよびフォルスコリンが含まれる。あるいは、小分子の組み合わせには、少なくとも（オールトランス）レチノイン酸、９−シスレチノイン酸、カルシトリオール、ロイコボリンが含まれてもよい。
【００４０】
特定の好ましい態様において、小分子の組み合わせは：［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、およびロージン塩酸塩である。あるいは、小分子の組み合わせは：［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、カルシトリオール、ロイコボリン、フォルスコリンおよびボリノスタットである。あるいは、小分子の組み合わせは：オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、カルシトリオール、ロイコボリンおよびボリノスタットである。
【００４１】
いくつかの態様において、本明細書に記載するような転写因子のタンパク質発現または量は、細胞において、転写因子をコードするか、またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸を導入することによって増加する。好ましくは、転写因子をコードするヌクレオチド配列は、表３に列挙する寄託番号を持つ配列に対して、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。
【００４２】
好ましくは、核酸にはさらに、異種プロモーターが含まれる。好ましくは、核酸はベクター、例えばウイルスベクターまたは非ウイルスベクター中にある。好ましくは、ベクターは、宿主細胞ゲノム内に組み込まれないゲノムを含むウイルスベクターである。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであってもよい。
【００４３】
本明細書に記載するようないずれかの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実行される１つまたはそれより多い、あるいはすべての工程を有してもよい。
【００４４】
さらなる態様において、本発明は、変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態を治療する方法における使用のための、［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、ロージン塩酸塩、ロイコボリン、ボリノスタットおよびフォルスコリンの１つまたはそれより多くを提供する。好ましくは、本発明は、変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態を治療する方法における使用のため、少なくともレチノイン酸またはその誘導体（例えば［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸）を含む。あるいは、本発明は、変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態を治療する方法における使用のため、少なくともカルシトリオールを含む。より好ましくは、本発明は、変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態を治療する方法における使用のため、少なくともレチノイン酸またはその誘導体およびカルシトリオールを含む。
【００４５】
さらに好ましい態様において、本発明は、変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態を治療する方法における使用のための［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、およびロージン塩酸塩を提供する。さらに、本発明は、変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態を治療する方法における使用のための［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、カルシトリオール、ロイコボリン、フォルスコリンおよびボリノスタットを提供する。さらになお、本発明は、変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態を治療する方法における使用のためのオールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、カルシトリオール、ロイコボリンおよびボリノスタットを提供する。
【００４６】
本発明はまた、変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態を治療する方法であって、こうした治療を必要とする個体に、［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、ロージン塩酸塩、ロイコボリン、ボリノスタットおよびフォルスコリンの１つまたはそれより多くを含む組成物を投与し、それによって、個体において、変形性関節症または他の状態を治療する工程を含む、前記方法も提供する。好ましくは、組成物は、少なくともレチノイン酸またはその誘導体（例えば［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸）を含む。あるいは、組成物は少なくともカルシトリオールを含む。より好ましくは、組成物は少なくともレチノイン酸またはその誘導体およびカルシトリオールを含む。
【００４７】
さらに、本発明は、変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態の治療のための医薬品の製造における、［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、ロージン塩酸塩、ロイコボリン、ボリノスタットおよびフォルスコリンの１つまたはそれより多くの使用を含む。好ましくは、本発明は、変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態の治療のための医薬品の製造における、少なくともレチノイン酸またはその誘導体（例えば［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸）の使用を含む。あるいは、本発明は、変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態の治療のための医薬品の製造における、少なくともカルシトリオールの使用を含む。より好ましくは、本発明は、少なくともレチノイン酸またはその誘導体およびカルシトリオールの使用を含む。
【００４８】
さらに好ましい態様において、本発明は、変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態の治療のための医薬品の製造における［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、およびロージン塩酸塩の使用を提供する。さらに、本発明は、変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態の治療のための医薬品の製造における［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、カルシトリオール、ロイコボリン、フォルスコリンおよびボリノスタットの使用を提供する。さらになお、本発明は、変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態の治療のための医薬品の製造におけるオールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、カルシトリオール、ロイコボリンおよびボリノスタットの使用を提供する。
【００４９】
なお、さらに、本発明は、変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態を治療する方法における使用のための、［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、ロージン塩酸塩、ロイコボリン、ボリノスタットおよびフォルスコリンの１つまたはそれより多くを含む、薬学的組成物を提供する。好ましくは、薬学的組成物は、少なくともレチノイン酸またはその誘導体（例えば［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸）を含む。あるいは、薬学的組成物は、少なくともカルシトリオールを含む。より好ましくは、薬学的組成物は、少なくともレチノイン酸またはその誘導体およびカルシトリオールを含む。
【００５０】
本発明は、変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態を治療する方法における使用のための、［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、およびロージン塩酸塩を含む薬学的組成物を提供する。さらに、本発明は、変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態を治療する方法における使用のための、［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、カルシトリオール、ロイコボリン、フォルスコリンおよびボリノスタットを含む薬学的組成物を提供する。さらになお、本発明は、変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態を治療する方法における使用のためのオールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、カルシトリオール、ロイコボリンおよびボリノスタットを含む薬学的組成物を提供する。
【００５１】
本発明のさらなる側面および先行する段落に記載する側面のさらなる態様は、例として、そして付随する図に言及しながら提供する、以下の説明から明らかになるであろう。
本明細書で開示し、そして定義する本発明は、言及する、あるいは本文または図から明らかである個々の特徴の２つまたはそれより多くのすべての代替の組み合わせに拡張されることが理解されるであろう。これらの異なる組み合わせはすべて、本発明の多様な代替側面を構成する。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】小分子を用いて、軟骨細胞にリプログラミングされた線維芽細胞の巨視的外見。
【図２】ＳＯＸ９発現に基づく線維芽細胞・軟骨細胞転換の時間経過。
【図３】軟骨細胞にリプログラミングされた線維芽細胞におけるＳＭＡＤシグナル伝達タンパク質の発現。
【図４】軟骨細胞にリプログラミングされた線維芽細胞の３Ｄペレット。
【図５】細胞由来のペレットの組織学的分析：Ａ：対照（Ａ）およびＢ：小分子［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、およびロージン塩酸塩での処理後。
【図６−１】小分子カクテルを用いた、培養増殖させ、脱分化させたヒト関節軟骨細胞の再分化。軟骨細胞をヒト軟骨から単離し、そして数回の継代（ｘ６）を通じて、２Ｄ培養で増殖させ、脱分化を誘導した。増殖した細胞を、小分子を伴いまたは伴わず、正常酸素および低酸素下で、２Ｄ培養で２週間インキュベーションした。細胞に提供された小分子は：［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、およびロージン塩酸塩である。２つのハウスキーピング遺伝子（真核生物翻訳伸長因子２；ＥＥＦおよびβ２−マクログロブリン）に対するｑＰＣＲを用いて、ＳＯＸ９発現を定量化した；ｎ＝１。
【図６−２】小分子カクテルを用いた、培養増殖させ、脱分化させたヒト関節軟骨細胞の再分化。軟骨細胞をヒト軟骨から単離し、そして数回の継代（ｘ６）を通じて、２Ｄ培養で増殖させ、脱分化を誘導した。増殖した細胞を、小分子を伴いまたは伴わず、正常酸素および低酸素下で、２Ｄ培養で２週間インキュベーションした。細胞に提供された小分子は：［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、およびロージン塩酸塩である。２つのハウスキーピング遺伝子（真核生物翻訳伸長因子２；ＥＥＦおよびβ２−マクログロブリン）に対するｑＰＣＲを用いて、ＳＯＸ９発現を定量化した；ｎ＝１。
【図７−１】ヒト皮膚線維芽細胞から軟骨細胞への転換中の多様な時点での軟骨細胞遺伝子マーカーＳＭＡＤ３、ＣＯＬ１０Ａ１、ＡＣＡＮ、ＣＯＬ２Ａ１およびＣＯＬ１Ａ２の発現。
【図７−２】ヒト皮膚線維芽細胞から軟骨細胞への転換中の多様な時点での軟骨細胞遺伝子マーカーＳＭＡＤ３、ＣＯＬ１０Ａ１、ＡＣＡＮ、ＣＯＬ２Ａ１およびＣＯＬ１Ａ２の発現。
【図８】ヒト線維芽細胞（ＨＤＦ）から軟骨細胞への転換中の細胞の免疫蛍光染色。細胞を、リプログラミング因子（ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）または対照（ＧＦＰのみ）をコードするレンチウイルスに感染させた。第１行はＤＡＰＩによる核染色を示し、第２列はＧＦＰ染色を示し、第３列は軟骨細胞マーカー、アグリカンに関する染色を示し、そして第４列は同じ視野の位相画像を示す。
【図９】ヒト線維芽細胞（ＨＤＦ）から軟骨細胞への転換中の細胞の免疫蛍光染色。細胞を、誘導性プロモーターの制御下で転写因子を、または対照（ＧＦＰのみ）をコードするレンチウイルスに感染させた。第１行はＤＡＰＩによる核染色を示し、第２列はＧＦＰ染色を示し、第３列は軟骨細胞マーカー、アグリカンに関する染色を示し、そして第４列は同じ視野の位相画像を示す。
【図１０】ヒト線維芽細胞（ＨＤＦ）から軟骨細胞への転換中の細胞の免疫蛍光染色。細胞を、誘導性プロモーターの制御下で転写因子を、または対照（ＧＦＰのみ）をコードするレンチウイルスに感染させた。第１行はＤＡＰＩによる核染色を示し、第２列はＧＦＰ染色を示し、第３列は軟骨細胞マーカーＲＵＮＸ２に関する染色を示し、そして第４列は同じ視野の位相画像を示す。
【図１１】小分子を用いた、増殖させ、脱分化させたヒト関節軟骨細胞の再分化。小分子とのインキュベーション後のＳＯＸ９の発現を示すｑＰＣＲデータ。陰性対照：ＤＭＳＯ（ビヒクル）。陽性対照：ＴＧＦβ。小分子カクテル：「８つすべて」（表７を参照されたい）；「Ｅ」（表８を参照されたい）および「Ｆ」（表９を参照されたい）。
【図１２】小分子を用いた、増殖させ、脱分化させたヒト関節軟骨細胞の再分化。小分子とのインキュベーション後のＳＯＸ５の発現を示すｑＰＣＲデータ。陰性対照：ＤＭＳＯ（ビヒクル）。陽性対照：ＴＧＦβ。小分子カクテル：「８つすべて」（表７を参照されたい）；「Ｅ」（表８を参照されたい）および「Ｆ」（表９を参照されたい）。
【図１３】小分子を用いた、増殖させ、脱分化させたヒト関節軟骨細胞の再分化。小分子とのインキュベーション後のＩＩ型コラーゲンの発現を示すｑＰＣＲデータ。陰性対照：ＤＭＳＯ（ビヒクル）。陽性対照：ＴＧＦβ。小分子カクテル：「８つすべて」（表７を参照されたい）；「Ｅ」（表８を参照されたい）および「Ｆ」（表９を参照されたい）。
【図１４】小分子を用いた、増殖させ、脱分化させたヒト関節軟骨細胞の再分化。小分子とのインキュベーション後のＩ型コラーゲン（脱分化のマーカー）およびＸ型コラーゲン（肥大性変形性関節症（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）のマーカー）の発現を示すｑＰＣＲデータ。陰性対照：ＤＭＳＯ（ビヒクル）。陽性対照：ＴＧＦβ。小分子カクテル：「８つすべて」（表７を参照されたい）；「Ｅ」（表８を参照されたい）および「Ｆ」（表９を参照されたい）。
【図１５】小分子を用いた、新鮮に単離した初代軟骨細胞の脱分化の防止。小分子とのインキュベーション後のＳＯＸ９の発現を示すｑＰＣＲデータ。小分子は軟骨細胞の脱分化を防止した。陰性対照：ＤＭＳＯ（ビヒクル）。陽性対照：ＴＧＦβ。小分子カクテル：「８つすべて」（表７を参照されたい）；「Ｅ」（表８を参照されたい）および「Ｆ」（表９を参照されたい）。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本発明の特定の態様に対して、ここで詳細に言及するであろう。本発明は、その態様と組み合わせて記載されるが、本発明がこれらの態様に限定されないことが理解されるであろう。それとは逆に、本発明は、請求項によって定義されるような本発明の範囲内に含まれうる、すべての代替物、修飾、および同等物を含むと意図される。
【００５４】
当業者は、本発明の実施において使用されうる、本明細書に記載するものと類似のまたは同等の多くの方法および材料を認識するであろう。本発明は、いかなる意味でも、記載する方法および材料に限定されない。本明細書に開示し、そして定義する本発明は、言及されるか、あるいは本文または図から明らかである個々の特徴の２つまたはそれより多くのすべての代替の組み合わせに拡張されることが理解されるであろう。これらの異なる組み合わせはすべて、本発明の多様な代替側面を構成する。
【００５５】
本明細書を解釈する目的のため、単数形で用いられる用語にはまた複数形も含まれ、そして逆も当てはまる。本明細書において、文脈が明らかに別に要求しない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに該用語の変形、例えば「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」は、さらなる添加物、構成要素、整数または工程を排除するとは意図されない。
【００５６】
細胞をリプログラミングするプロセスは、細胞が生じうる子孫のタイプを改変し、そしてこうしたプロセスには、順方向プログラミングおよび分化転換の別個のプロセスが含まれる。いくつかの態様において、多分化能細胞または多能性細胞の順方向プログラミングは、多分化能細胞または多能性細胞よりも、より分化した表現型を有する細胞タイプの少なくとも１つの特性を示す細胞を提供する。他の態様において、１つの体細胞の分化転換は、別の体細胞タイプの少なくとも１つの特性を示す細胞を提供する。
【００５７】
本発明は、供給源細胞が、ターゲット細胞になる直前に、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）になることを伴わない、供給源細胞からターゲット細胞への直接リプログラミングまたは分化転換のための組成物および方法を提供する。ｉＰＳ細胞技術と比較して、分化転換は、非常に効率的であり、そして下流適用のため、奇形腫形成のリスクは非常に低い。さらに、分化転換は、１つの細胞タイプから別のタイプへの直接転換のため、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用可能である一方、ｉＰＳ細胞技術はそのようには使用できない。
【００５８】
本発明は、特に、供給源細胞の軟骨細胞への分化転換に対して向けられる。これらの軟骨細胞は、置換軟骨が提供される必要がある場合を含む、変性性関節疾患によって特徴づけられる状態いずれかを患う個体における、自己軟骨細胞移植を含めて、広範囲の適用に有用性を有しうる。本発明の方法にしたがって治療されうる状態の例には、変形性関節症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、反応性関節炎および淋菌性関節炎が含まれる。
【００５９】
本発明はまた、多数回の培養継代の結果として脱分化されている、培養増殖させた軟骨細胞の「再分化」のための方法も提供する。さらに、本発明には、増殖させた細胞培養において、軟骨細胞の脱分化を防止するための方法も含まれる。したがって、方法は、初代軟骨細胞が、個体から得られ、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されるシナリオにおいて適用を有する。初代軟骨細胞を培養するための先行技術の方法が、数回の継代後、細胞の脱分化を生じることが知られる。しかし、本発明の方法は、脱分化を防止するか、あるいは細胞を軟骨細胞に「再分化」させることによって、脱分化を逆転させるように、軟骨細胞を培養するための方法および条件を提供することによって、この限界を克服する。
【００６０】
もちろん、本発明はまた、本明細書に記載する方法にしたがって、例えば、傷害の部位（例えば損傷を受けた関節またはその他）で、脱分化した軟骨細胞を治療し、それによって、脱分化した軟骨細胞の、ｉｎ  ｖｉｖｏでの再分化、そしてしたがって、生理学的に活性である軟骨細胞への転換を刺激することによって、細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで軟骨細胞に転換するシナリオも意図する。
【００６１】
本明細書において、「分化転換」は、細胞の形態学的および機能的特性が、（中間の多能性状態または前駆体細胞タイプを経ることなく）別の細胞タイプのものに転換されるように、１つのタイプの（または１つのタイプの体細胞の特性を有する）体細胞をリプログラミングする方法を指す。用語、分化転換は、用語「細胞系譜リプログラミング」または「細胞リプログラミング」または「細胞転換」と交換可能に使用可能である。用語、分化転換には、必然的に、細胞が、分化した細胞タイプの特性のいくつかまたはすべての特性をもはや所持しないように、脱分化されている状況が含まれる。この情報の特に好ましい適用において、脱分化した軟骨細胞は、軟骨細胞にリプログラミングされるかまたは「再分化」することも可能である。
【００６２】
供給源細胞は、体細胞または疾患細胞を含めて、本明細書に記載するいずれかの細胞タイプであってもよい。体細胞は、成体細胞、あるいは成体または非胚性細胞の１つまたはそれより多い検出可能な特性を示す、成体由来の細胞であってもよい。疾患細胞は、疾患または状態の１つまたはそれより多い検出可能な特性を示す細胞であってもよく、例えば細胞は、軟骨形成能の喪失と関連する変性状態を伴う個体から得られた、脱分化した軟骨細胞であってもよい。好ましい供給源細胞には、線維芽細胞（皮膚線維芽細胞を含む）、胚性幹細胞、および脱分化した軟骨細胞が含まれる。
【００６３】
本明細書において、用語「体細胞」は、生殖系列細胞とは対照的に、生物の体を形成するいずれかの細胞を指す。哺乳動物において、生殖系列細胞（「配偶子」としてもまた知られる）は、精子および卵子であり、これらは受精中に融合して、接合子と呼ばれる細胞を産生し、ここからすべての哺乳動物胚が発生する。哺乳動物の体内のすべての他の細胞タイプは、これらが作製される精子および卵子（生殖母細胞）ならびに未分化幹細胞を除いて、体細胞であり：内臓、皮膚、骨、血液、および結合組織は、すべて、体細胞で構成される。いくつかの態様において、体細胞は、「非胚性体細胞」であり、これは、胚に存在せずまたは胚から得られておらず、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏでこうした細胞の増殖から生じない体細胞を意味する。いくつかの態様において、体細胞は、「成体体細胞」であり、これは、胚または胎児以外の生物に存在し、そしてこれらから得られるか、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏでこうした細胞の増殖から生じる細胞を意味する。例えばテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のレベルを増加させることによって、体細胞を不死化して、細胞の限定されない供給を提供することも可能である。例えば、内因性遺伝子からのＴＥＲＴの転写を増加させることによって、あるいはいずれかの遺伝子送達法または系を通じて、導入遺伝子を導入することによって、ＴＥＲＴのレベルを増加させることも可能である。
【００６４】
別に示さない限り、本明細書に記載するように、供給源細胞をリプログラミングするための方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で実行可能である（ｉｎ  ｖｉｖｏで実施する場合、体細胞は、被験体内に存在し、そしてしたがって、これにはｉｎ  ｓｉｔｕ転換も含まれ、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施する場合、培養中で維持されている単離体細胞を用いる）。
【００６５】
胚性細胞、例えば胚性幹細胞は、胚性細胞株に由来する細胞であってもよく、そして胚または胎児に直接由来していなくてもよい。あるいは、胚性細胞は、胚または胎児に由来してもよいが、細胞は、胚または胎児の破壊または発生に対するいかなる負の影響も伴わずに得られるかまたは単離されている。
【００６６】
分化した体細胞は、胎児、新生児、年少者または成体の、ヒトを含む霊長類個体由来の細胞を含めて、本発明の方法において、適切な供給源細胞である。適切な体細胞には、限定されるわけではないが、骨髄細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、造血細胞、角化細胞、肝細胞、腸細胞、間葉系細胞、骨髄前駆細胞および脾臓細胞が含まれる。あるいは、体細胞は、それ自体、他のタイプの細胞に増殖および分化可能な細胞であってもよく、これには血液幹細胞、筋／骨幹細胞、脳幹細胞および肝臓幹細胞が含まれる。適切な体細胞は、転写因子をコードする遺伝物質を含む転写因子の取り込みのため、受容性であるか、または科学的文献において一般的に知られる方法を用いて、受容性にされることが可能である。取り込みを増進する方法は、細胞タイプおよび発現系に応じて多様でありうる。適切な形質導入効率を有する受容性体細胞を調製するために用いられる例示的な条件は、一般の当業者に周知である。出発体細胞は、約２４時間の倍加時間を有してもよい。
【００６７】
用語「単離細胞」は、本明細書において、元来見られた生物から除去されている細胞、またはこうした細胞の子孫を指す。任意に、細胞は、例えば他の細胞の存在下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養されている。任意に、細胞は、後に、第二の生物内に導入されるか、または該細胞（または該細胞がその子孫である細胞）が単離された生物内に再導入される。
【００６８】
用語、細胞の単離された集団に関して「単離された集団」は、本明細書において、細胞の混合されたまたは異種の集団から取り除かれ、そして分離されている細胞集団を指す。いくつかの態様において、単離された集団は、細胞が単離されたかまたは濃縮された異種集団に比較した際、実質的に純粋な細胞集団である。
【００６９】
用語、特定の細胞集団に関して「実質的に純粋な」は、総細胞集団を構成する細胞に関して、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％純粋である細胞集団を指す。言い換えると（Ｒｅｃａｓｔ）、用語、ターゲット細胞集団に関して「実質的に純粋な」または「本質的に精製された」は、本明細書の用語によって定義した際、ターゲット細胞またはその子孫ではない細胞を約２０％より少なく、より好ましくは約１５％、１０％、８％、７％より少なく、最も好ましくは約５％、４％、３％、２％、１％より少なく、または１％未満しか含有しない細胞集団を指す。
【００７０】
本明細書において、「軟骨細胞」への言及は、軟骨細胞の特性を有するいずれかの細胞への言及を指す。細胞は、細胞表面マーカー、遺伝子発現レベルまたは巨大分子の産生を含む、１つまたはそれより多いマーカーに基づいて、軟骨細胞の特性を有すると定義されてもよい。特性はまた、１つまたはそれより多い形態学的特質であってもよい。
【００７１】
例えば、本発明のいずれかの態様において、軟骨細胞に特徴的なタンパク質マーカーは、ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＳＯＸ６、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＣＤ４４、ＣＤ４９、ＣＤ１０、ＣＤ９、ＣＤ９５、インテグリンα１０β１、ＣＤ１０５、ＶＥＧＦ、ＣＯＬ２Ａ１である。本発明のいずれかの態様において、硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生、アグリカンの沈着、ヒアルロン酸およびＩＩ型コラーゲンの産生は、軟骨細胞に特徴的でありうる。
【００７２】
本発明のいずれかの態様において、軟骨細胞に特徴的な形態学的特質には、白色細胞外マトリックスの発展および立方状の外見の発展が含まれてもよい。
当業者はまた、軟骨細胞のものから供給源細胞の特徴を区別する（言い換えると、供給源細胞表現型の喪失に関して試験する）ための手段を知っているであろう。例えば、本明細書の実施例に提供するように、軟骨細胞の産生のための適切な供給源細胞には、皮膚線維芽細胞、胚性幹細胞および脱分化した軟骨細胞が含まれる。当業者は、皮膚線維芽細胞および軟骨細胞の特性の間を容易に区別することが可能であり、例えば：Ｉ型コラーゲンの産生は、皮膚線維芽細胞に特徴的であり、そして軟骨細胞に特徴的であるＩＩ型コラーゲンの産生とは区別されるものとする。
【００７３】
さらに、当業者は、脱分化した軟骨細胞および（分化した）軟骨細胞の特性の間を区別することが可能であろう。例えば、脱分化した軟骨細胞は、分化した軟骨細胞のマーカー遺伝子発現の漸進的な喪失によって特徴づけられる（例えば、ＳＯＸ９、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ５、ＣＤ４４、ＣＤ４９、ＣＤ１０、ＣＤ９、ＣＤ９５、インテグリンα１０β１、ＣＤ１０５、ＶＥＧＦ、ＳＯＸ５／６、硫酸化グリコサミノグリカンＧＡＧ、アグリカン、ヒアルロン酸およびＩＩ型コラーゲンのいずれか１つの発現減少または喪失）。脱分化した軟骨細胞はまた、線維芽細胞遺伝子、Ｉ型コラーゲンの発現増加によっても特徴づけられる。
【００７４】
供給源細胞は、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す場合、本発明の方法によって、軟骨細胞に転換されているか、または軟骨細胞様細胞になっていると決定される。例えば、ヒト線維芽細胞は、線維芽細胞が、本発明記載の処理後、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す場合、軟骨細胞様細胞に転換されたと同定されるであろう。典型的には、細胞は、軟骨細胞の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたはそれより多くの特性を示すであろう。例えば、いずれかの１つまたはそれより多い軟骨細胞マーカーの上方制御および／または細胞形態の変化が検出可能になった場合、細胞は、軟骨細胞様細胞であると同定されるかまたは決定される。軟骨細胞マーカーの例には、ＳＯＸ９、ＣＯＬ２Ａ１、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ６、ＣＤ４４、ＣＤ４９、ＣＤ１０、ＣＤ９、ＣＤ９５、インテグリンα１０β１、ＣＤ１０５が含まれ、そして細胞形態は、立方状の外見である。
【００７５】
本発明のいずれかの側面において、細胞形態、遺伝子発現プロファイル、活性アッセイ、タンパク質発現プロファイル、表面マーカープロファイル、または分化能の分析によって、軟骨細胞特性を決定してもよい。特性またはマーカーの例には、本明細書に記載するものおよび当業者に知られるものが含まれる。適切なマーカーの他の例には、例えば、細胞によるＩＩ型コラーゲン、アグリカンおよび硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生に関するものが含まれる。
【００７６】
皮膚線維芽細胞を、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞に転換するために使用可能な転写因子または他のタンパク質を、以下の表１に示す。
表１の各行に示すような転写因子またはタンパク質のいずれかの１つまたはそれより多くを用いて、皮膚線維芽細胞を軟骨細胞に分化転換することも可能である。例えば、各行に示すような、いずれかの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つすべての転写因子のタンパク質発現または量を、本発明の目的のために用いてもよい。
【００７７】
表１：皮膚線維芽細胞を軟骨細胞にリプログラミングするための因子
【００７８】
【表１−１】
2020524515.tif 000002
【００７９】
【表１−２】
2020524515.tif 000003
【００８０】
本明細書において、被覆率（％被覆度）は、列挙する転写因子によって直接制御されており、そして供給源細胞およびターゲット細胞タイプの間で、発現が改変されていると予測される遺伝子の割合を指す。例えば、表１の第１行に示す転写因子は、その発現が、供給源細胞をターゲット細胞に転換するためにターゲティングされている遺伝子の９７．７５％の発現を直接制御する。
【００８１】
本発明者らはまた、上記の好ましい転写因子群に加えて、他のものに関して容易に置換可能であるいくつかの転写因子またはタンパク質があることも見出してきている。例えば、表１の第１行に示すような転写因子の好ましい群、ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２、ＡＨＲ、ＦＯＳＢおよびＪＵＮＢの背景において、本発明者らは、これらの転写因子のいずれも、転写因子ＰＰＲＸ２で置換可能であることを見出してきている。言い換えると、所定の因子、ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２、ＡＨＲ、ＦＯＳＢおよびＪＵＮＢのいずれかのタンパク質発現または量を増加させることが不可能である場合（例えば、発現を直接増加させるために利用可能な核酸構築物がない場合、または発現増加を刺激するための転写因子を直接ターゲティングする小分子がない場合）、その代わり、ＰＰＲＸ２の発現を増加させるよう試みることが可能である。言い換えると、本発明の方法にしたがって、皮膚線維芽細胞を軟骨細胞に分化転換するよう試みる際、転写因子ＰＰＲＸ２は、ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２、ＡＨＲ、ＦＯＳＢおよびＪＵＮＢのいずれに対しても置換可能である。
【００８２】
胚性幹細胞を、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞に転換するために使用可能な転写因子を、以下の表２に示す。
表２の各行に示すような転写因子のいずれかの１つまたはそれより多くを用いて、胚性幹細胞を軟骨細胞に転換することも可能である。例えば、各行に示すようないずれかの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つすべての転写因子のタンパク質発現または量を、本発明の目的のために用いてもよい。
【００８３】
表２：胚性幹細胞を軟骨細胞にリプログラミングするための転写因子
【００８４】
【表２−１】
2020524515.tif 000004
【００８５】
【表２−２】
2020524515.tif 000005
【００８６】
本発明者らはまた、表２に示すような転写因子の上記の好ましい群に加えて、他のものに関して容易に置換可能であるいくつかの転写因子があることも見出している。例えば、表２の第１行に示すような転写因子の好ましい群、ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＮＦＫＢ、ＦＯＸＣ１、ＡＨＲ、ＳＩＸ２、およびＪＵＮＢの背景において、本発明者らは、転写因子ＰＩＴＸ１、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２およびＡＨＲのいずれも、転写因子ＰＰＲＸ２で置換可能であることを見出してきている。言い換えると、所定の転写因子、ＰＩＴＸ１、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２およびＡＨＲのいずれかのタンパク質発現または量を増加させることが不可能である場合（例えば、発現を直接増加させるために利用可能な核酸構築物がない場合、または発現増加を刺激するための転写因子を直接ターゲティングする小分子がない場合）、その代わり、ＰＰＲＸ２の発現を増加させるよう試みることが可能である。言い換えると、本発明の方法にしたがって、胚性幹細胞を軟骨細胞に分化転換するよう試みる際、転写因子ＰＰＲＸ２は、ＰＩＴＸ１、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２およびＡＨＲのいずれに対しても置換可能である。
【００８７】
なお、さらに、表２の第１行に示すような転写因子の好ましい群の背景において、本発明者らは、転写因子ＢＡＲＸ１が、転写因子ＨＯＸＡ１１で置換可能であることを見出してきている。さらに、転写因子ＳＭＡＤ６はＴＧＦβ３で置換可能であり、ＮＦκＢはＩＲＦ１で置換可能であり、そしてＪＵＮＢはＦＯＸＢで置換可能である。言い換えると、所定の転写因子、ＢＡＲＸ１、ＳＭＡＤ６、ＮＦκＢおよびＪＵＮＢのいずれかのタンパク質発現または量を増加させることが不可能である場合（例えば、発現を直接増加させるために利用可能な核酸構築物がない場合、または発現増加を刺激するための転写因子を直接ターゲティングする小分子がない場合）、その代わり、それぞれ、ＨＯＸＡ１１、ＴＧＦβ３、ＩＲＦ１またはＪＵＮＢの発現を増加させるよう試みることが可能である。
【００８８】
脱分化した軟骨細胞を、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞に転換するために使用可能な転写因子を以下の表３に示す。
表２の各行に示すような転写因子のいずれかの１つまたはそれより多くを用いて、脱分化した軟骨細胞を軟骨細胞に転換することも可能である。例えば、各行に示すようないずれかの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つすべての転写因子のタンパク質発現または量を、本発明の目的のために用いることも可能である。
【００８９】
表３：脱分化した軟骨細胞を軟骨細胞にリプログラミングするための転写因子
【００９０】
【表３】
2020524515.tif 000006
【００９１】
本発明者らはまた、表３に示すような転写因子の上記の好ましい群に加えて、他のものに関して容易に置換可能であるいくつかの転写因子があることも見出している。例えば、表３の第１行に示すような転写因子の好ましい群、ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１の背景において、本発明者らは、転写因子ＳＯＸ９は、タンパク質ＩＬ１１で置換可能であることを見出してきている。言い換えると、転写因子ＳＯＸ９のタンパク質発現または量を増加させることが不可能である場合（例えば、発現を直接増加させるために利用可能な核酸構築物がない場合、または発現増加を刺激するための転写因子を直接ターゲティングする小分子がない場合）、その代わり、ＩＬ１１の発現を増加させるよう試みることが可能である。言い換えると、本発明の方法にしたがって、脱分化した軟骨細胞を（再分化）軟骨細胞に分化転換するよう試みる際、ＩＬ１１は、ＳＯＸ９に対して置換可能である。
【００９２】
なお、さらに、本発明者らは、表３の第１行に示すような転写因子の好ましい群の背景において、転写因子ＳＯＸ５、ＲＵＮＸ１およびＶＤＲが、転写因子ＴＣＦ４で置換可能であることを見出してきている。さらに、転写因子ＶＥＧＦＡ、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１はＨＯＸＡ７で置換可能である。ＮＲ２Ｆ１はＨＯＸＡ７またはＮＲ２Ｆ２のいずれかで置換可能である。
【００９３】
本明細書で言及する転写因子およびタンパク質は、ＨＵＧＯ遺伝子命名委員会（ＨＧＮＣ）記号によって言及される。表４は、本明細書に列挙する因子に関する例示的なＥｎｓｅｍｂｌｅ遺伝子ＩＤおよびＵｎｉｐｒｏｔ  ＩＤを提供する。ヌクレオチド配列はＥｎｓｅｍｂｌデータベース（Ｆｌｉｃｅｋら（２０１４）．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌｕｍｅ  ４２，  Ｉｓｓｕｅ  Ｄ１．  Ｐｐ．  Ｄ７４９−Ｄ７５５）バージョン８３由来である。本発明での使用がやはり意図されるのは、本明細書に言及する因子のいずれかの相同体、オルソログまたはパラログである。
【００９４】
当業者は、例えば、供給源細胞における転写因子の量の増加を提供するか、あるいは供給源細胞において転写因子を組換え的に発現するための核酸等を提供する目的のため、本発明の方法を実行する際に、この情報を用いてもよいことを認識するであろう。
【００９５】
表４：本明細書に言及する転写因子およびタンパク質のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を同定する寄託番号。
【００９６】
【表４−１】
2020524515.tif 000007
【００９７】
【表４−２】
2020524515.tif 000008
【００９８】
【表４−３】
2020524515.tif 000009
【００９９】
【表４−４】
2020524515.tif 000010
【０１００】
ポリペプチドに言及した際の用語「変異体」は、全長ポリペプチドに対して、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。本発明は、表１および２に列挙する転写因子の変異体ならびに表３に列挙する配列を含めて、本明細書に記載する転写因子の変異体の使用を意図する。変異体は、全長ポリペプチドの断片または天然存在スプライス変異体であってもよい。変異体は、ポリペプチドの断片に対して、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドであってもよく、ここで、断片は、全長野生型ポリペプチドまたはそのドメインが、関心対象の機能的活性、例えば供給源細胞タイプのターゲット細胞タイプへの転換を促進する能力を有する限り、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％である。いくつかの態様において、ドメインは、配列のいずれかのアミノ酸位から始まって、そしてＣ末端に伸長し、長さ少なくとも１００、２００、３００、または４００アミノ酸である。タンパク質の活性を排除するかまたは実質的に減少させるような当該技術分野に知られる変動は、好ましくは回避される。いくつかの態様において、変異体は、全長ポリペプチドのＮおよび／またはＣ末端部分を欠き、例えばいずれかの末端から、最大１０、２０、または５０アミノ酸を欠く。いくつかの態様において、ポリペプチドは、成熟（全長）ポリペプチドの配列を有し、これによって、１つまたはそれより多い部分、例えばシグナルペプチドが、正常細胞内タンパク質分解的プロセシング中に（例えば翻訳と同時のまたは翻訳後プロセシング中に）除去されている、ポリペプチドを意味する。天然に発現する細胞から精製することによる以外で、タンパク質を産生するいくつかの態様において、タンパク質はキメラポリペプチドであり、これによって、該タンパク質が２つまたはそれより多い異なる種に由来する部分を含有することを意味する。天然に発現する細胞から精製することによる以外で、タンパク質を産生するいくつかの態様において、タンパク質は誘導体であり、これによって、これらの配列がタンパク質の生物学的活性を実質的に減少させない限り、タンパク質に関連しないさらなる配列を、タンパク質が含むことを意味する。当業者は、特定のポリペプチド変異体、断片、または誘導体が、機能性であるかどうかを知っているか、または当該技術分野に知られるアッセイを用いて、容易に確認することが可能である。例えば、実施例において本明細書に開示するようなアッセイを用いて、転写因子の変異体が、供給源細胞をターゲット細胞タイプに転換する能力を評価してもよい。他の好適なアッセイには、検出可能なマーカー、例えばルシフェラーゼをコードする核酸配列に機能可能であるように連結された転写因子結合部位を含有するレポーター構築物の転写を活性化する能力を測定することが含まれる。本発明の特定の態様において、機能的変異体または断片は、全長野生型ポリペプチドの活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれより多くを有する。
【０１０１】
用語、転写因子の量を増加させることに関する、「の量を増加させる」は、関心対象の細胞（例えば供給源細胞、例えば線維芽細胞）における転写因子の量を増加させることを指す。いくつかの態様において、転写因子の量は、転写因子の量が、対照（例えば前記発現カセットのいずれも導入されていない線維芽細胞）に比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより多い場合、関心対象の細胞（例えば１つまたはそれより多い転写因子をコードするポリヌクレオチドの発現を指示する発現カセットが導入されている細胞）において「増加している」。しかし、転写因子（あるいはそれをコードするプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ）の転写、翻訳、安定性または活性の量、割合または効率を増加させるいずれかの方法を含む、転写因子の量を増加させるいずれかの方法が意図される。さらに、転写発現の負の制御因子の下方制御または干渉、存在する翻訳の効率の増加（例えばＳＩＮＥＵＰ）もまた考慮される。
【０１０２】
用語「剤」は、本明細書において、限定されるわけではないが、小分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド、薬剤、イオン等のいずれかの化合物または物質を意味する。「剤」は、限定なしに、合成および天然存在タンパク質性および非タンパク質性実体を含む、いずれかの化学的実体または部分であってもよい。いくつかの態様において、剤は、限定なしに、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡザイム、糖タンパク質、ｓｉＲＮＡ、リポタンパク質、アプタマー、ならびにその修飾および組み合わせ等を含む、核酸、核酸類似体、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、核酸、アミノ酸、または炭水化物のオリゴマーである。特定の態様において、剤は、化学部分を有する小分子である。例えば、化学部分は、未置換または置換アルキル、芳香族、または複素環部分を含み、マクロライド、レプトマイシンおよび関連する天然産物またはその類似体が含まれる。化合物は、所望の活性および／または特性を有することが知られてもよいし、または多様な化合物のライブラリーから選択されてもよい。
【０１０３】
本発明の特に好ましい態様において、剤は小分子である。
小分子を、転写因子を活性化するか、転写因子の量を増加させるか、または転写因子をコードする遺伝子の発現を増加させるために用いる場合、小分子は、以下を含む群より選択されてもよい：
・［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、
・ベータ−エストラジオール、
・カルシトリオール、
・シグリタゾン、
・カルトゲニン、
・塩化リチウム、
・メラトニン、
・ロージン塩酸塩、
・ロイコボリンカルシウム（葉酸）、
・フォルスコリン、および
・レチノイン酸（オールトランスまたは９−シス）。
【０１０４】
本明細書において、ＡＭ５８０は、［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＣＡＳ番号１０２１２１−６０−８）を指し、そして選択的ＲＡＲαアゴニストとして作用するレチノイン酸類似体である。ＡＭ５８０は、軟骨細胞分化中に中枢的な役割を果たす転写因子ＳＯＸ９の強力な刺激因子である。ＡＭ５８０を、カタログ番号０７６０でＴｏｃｒｉｓからを含めて、いくつかの商業的供給者から購入してもよい。
【０１０５】
レチノイン酸のいずれかの類似体は、ＳＯＸ９の発現を増加させる／刺激するためを含めて、本発明の方法において有用性を有しうることが理解されるであろう。例えば、レチノイン酸類似体ＡＭ５８０の利用に加えて、小分子は、（オールトランス）レチノイン酸または９−シスレチノイン酸であってもよい。（オールトランス）レチノイン酸（ＣＡＳ番号：３０２−７９−４）はまた、トレチノインまたはＡＴＲＡとしても知られ、そしてカタログ番号Ｒ２６１５でＳｉｇｍａからを含めて、いくつかの商業的供給者から購入可能である。９−シスレチノイン酸はまた、アルトレチノイン（ＣＡＳ番号：５３００−０３−８）としても知られ、カタログ番号Ｒ４６４３でＳｉｇｍａからを含めて、いくつかの商業的供給源から購入可能である。
【０１０６】
ＳＯＸ９の量を増加させることに加えて、レチノイン酸（およびその類似体、例えばＡＭ５８０）を用いて、ＮＲ２Ｆ１、ＲＵＮＸ１、ＳＯＸ５、およびＨＯＸＡ７を活性化し／その量を増加させてもよい。
【０１０７】
本明細書において、ベータ−エストラジオール（ベータ−エストラジオール（ｏｅｓｔｒａｄｉｏｌ）またはβ−エストラジオールともスペリングする）は、内因性エストロゲン受容体アゴニストを指し、これはまた、８Ｒ，９Ｓ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１３−メチル−６，７，８，９，１１，１２，１４，１５，１６，１７−デカヒドロシクロペンタ［α］フェナントレン−３，１７−ジオール、エストラ−１，３，５（１０）トリエン−３，１７β−ジオール、または１７β−エストラジオールとも称される。ベータ−エストラジオールはまた、そのＣＡＳ番号５０−２８−２によっても称されうる。ベータ−エストラジオールは、転写因子ＰＩＴＸ１の発現を刺激することも可能であり、該因子は、軟骨形成細胞の分化および成熟に非常に重要である。ＰＩＴＸ１の喪失または不活性化は、正常後肢発生の喪失、および適切な軟骨発生の防止を導く。ベータ−エストラジオールは、カタログ番号２８２４でＴｏｃｒｉｓからを含めて、いくつかの商業的供給者から購入可能である。
【０１０８】
本明細書において、カルシトリオールは、１，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールまたは１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（ＣＡＳ番号３２２２２−０６−３）を指す。カルシトリオールは、ビタミンＤのホルモン活性代謝産物であり、そしてビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）の活性化因子である。ＶＤＲは、核受容体であり、軟骨細胞内で、破骨細胞形成の制御因子であり、そして肥大性分化に対する影響を有する。カルシトリオールはまた、ＶＤＲの刺激を通じて、転写因子ＶＥＧＦの発現を間接的に刺激するためにも使用可能である。さらに、カルシトリオールを用いて、ＪＵＮＢを活性化し／その量を増加させることも可能である。カルシトリオールは、カタログ番号２５５１でＴｏｃｒｉｓからを含めて、いくつかの商業的供給者から購入可能である。
【０１０９】
本明細書において、シグリタゾンは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）の選択的アゴニストを指す。シグリタゾンは、ＣＡＳ番号７４７７２−７７−３を有するチアゾリジンジオンであり、そしてカタログ番号１３０７でＴｏｃｒｉｓからを含めて、いくつかの商業的供給者から購入可能である。シグリタゾンは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）の選択的アゴニストであり、これは次に、ＶＥＧＦＡの発現を刺激することも可能である。軟骨内のＰＰＡＲγそしてその結果ＶＥＧＦＡの活性化を通じた血管系の刺激はまた、完全に機能性の組織での治癒の促進を導きうる。
【０１１０】
本明細書において、カルトゲニンは、２−［（ビフェニル−４−イル）カルバモイル］安息香酸、Ｎ−ビフェニル（ｂｉｐｈｅｎｕｌ）−４−イル−フタル酸または４’−フェニル−フタルアニル酸（ＣＡＳ番号４７２７−３１−５）を指す。カルトゲニンは、例えばカタログ番号４５１３でＴｏｃｒｉｓ等、いくつかの商業的供給者から購入可能である。カルトゲニンは、ＲＵＮＸ１経路の活性化を通じて、ヒト間葉系幹細胞の軟骨形成分化を誘導した。
【０１１１】
本明細書において、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）は、本発明にしたがって使用可能なイオン性化合物である。ＬｉＣｌは、ＴＧＦβ３経路を直接ターゲティングし、そしてそれによって間接的に転写因子ＳＯＸ９およびアグリカン（軟骨特異的プロテオグリカンコアタンパク質、ＣＳＰＣＰまたはコンドロイチン硫酸プロテオグリカン１としても知られる）の発現を増加させる。ＴＧＦβ３を介して、ＬｉＣｌはまた、細胞におけるＩＩ型コラーゲンの量も増加させうる。塩化リチウム（ＣＡＳ番号７４４７−４１−８）は、いくつかの商業的供給者から、例えばカタログ番号８５１４４１１２でＳｉｇｍａから得ることができる。
【０１１２】
本明細書において、メラトニンは、メラトニン受容体のホルモンアゴニストであり、そしてまた、Ｎ−アセチル−５−メトキシ−トリプタミン（ＣＡＳ番号７３−３１−４）としても知られる。メラトニンは、ＢＭＰ−２の発現を上方制御するために用いられ、これは次に、ＳＭＡＤ６の発現を上方制御する。メラトニンは、カタログ番号３５５０でＴｏｃｒｉｓからを含めて、いくつかの商業的供給者から得ることができる。
【０１１３】
本明細書において、ロージン塩酸塩（Ｄ−トリプトファン（２Ｅ）−２−（６−キノキサリニルメチレン）ヒドラジド塩酸塩；ＣＡＳ番号１２８１８７０−４２−５）は、ＲｈｏＡのグアニンヌクレオチド交換因子への結合を阻害する、Ｒｈｏ  ＧＴＰアーゼ阻害剤である。ロージン塩酸塩は、転写因子ＳＯＸ９の発現を増加させ、これは次いで、ＳＯＸ５およびＳＯＸ６の発現に対して下流効果を有する。ＳＯＸ５、ＳＯＸ６およびＳＯＸ９は、すべて軟骨形成中に発現され、そしてタンデムで働いて、軟骨形成マーカーを発現する。ロージン塩酸塩は、カタログ番号５００３でＴｏｃｒｉｓからを含めて、いくつかの商業的供給者から購入可能である。
【０１１４】
本明細書において、ロイコボリンカルシウム（ＣＡＳ番号１４９２−１８−８）はまた、フォリン酸としても知られる。フォリン酸は、テトラヒドロ葉酸の５−ホルミル誘導体である。これは、容易に他の還元葉酸誘導体（例えば５，１０−メチレンテトラヒドロフォレート、５−メチルテトラヒドロフフォレート）に転換され、したがって、葉酸のものと同等のビタミン活性を有する。転写因子ＰＰＲＸ１の量を増加させるため、ロイコボリンを用いてもよい。ロイコボリンカルシウムは、カタログ番号ＰＨＲ１５４１でＳｉｇｍａからを含めて、いくつかの商業的供給者から購入可能である。
【０１１５】
本明細書において、フォルスコリン（コレオノールとしてもまた知られる、ＣＡＳ番号６６４２８−８９−５）は、インドの植物コレウス（Ｃｏｌｅｕｓ）（プレクトランサス・バルバツス（Ｐｌｅｃｔｒａｎｔｈｕｓ  ｂａｒｂａｔｕｓ））によって産生されるラブダン・ジテルペンである。他の名称には、パシャナブヘディ（ｐａｓｈａｎａｂｈｅｄｉ）、インド・コレウス、マカンディ（ｍａｋａｎｄｉ）、ＨＬ−３６２、ＮＫＨ４７７、およびマオ・ホウ・キアオ・ルイ・フア（ｍａｏ  ｈｏｕ  ｑｉａｏ  ｒｕｉ  ｈｕａ）が含まれる。天然産物の大きなジテルペンファミリーの他のメンバーと同様、フォルスコリンは、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）から得られる。フォルスコリンは、テトラヒドロピラン由来複素環の存在を含めて、いくつかのユニークな機能的要素を含有する。フォルスコリンは、転写因子ＦＯＳＢの量を増加させるために用いられうる。フォルスコリンは、カタログ番号１０９９でＴｏｃｒｉｓからを含めて、いくつかの商業的供給者から購入可能である。
【０１１６】
特定の好ましい態様において、１つより多い小分子を本発明の方法にしたがって用いる場合、ＡＭ５８０、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、β−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、ロージン塩酸塩、ロイコボリン、ボリノスタット、およびフォルスコリンのいずれかの２つ、いずれかの３つ、いずれかの４つ、いずれかの５つ、いずれかの６つ、またはいずれかの７つを用いる。好ましくは、少なくともＡＭ５８０（またはレチノイン酸、あるいはオールトランスまたは９−シスレチノイン酸の代替類似体）およびカルシトリオールを用いる。
【０１１７】
さらにさらなる態様において、１つまたはそれより多い小分子は、ＡＭ５８０、β−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、およびロージン塩酸塩の８つすべてであってもよい。
【０１１８】
さらになお、１つまたはそれより多い小分子は、ＡＭ５８０、カルシトリオール、ロイコボリン、ボリノスタットおよびフォルスコリンの５つすべてであってもよい。
あるいは、１つまたはそれより多い小分子は、（オールトランス）レチノイン酸、９−シスレチノイン酸、カルシトリオール、ロイコボリンおよびボリノスタットの５つすべてであってもよい。
【０１１９】
表５：皮膚線維芽細胞の軟骨細胞への転換のための小分子剤およびターゲット転写因子
【０１２０】
【表５−１】
2020524515.tif 000011
【０１２１】
【表５−２】
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【０１２２】
【表５−３】
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【０１２３】
本発明のさらにさらなる態様において、小分子または転写因子のプロモーター領域へのアクセス可能性を増加させる分子を、本発明のアプローチと組み合わせて用いてもよい。例えば、クロマチンを開放する分子を、転写因子のいずれかの組み合わせと、または本明細書に記載するいずれかの小分子と組み合わせて用いてもよい。クロマチンを開放するために用いてもよい分子の一例は、ボリノスタットである。
【０１２４】
本明細書において、ボリノスタット（ＣＡＳ番号：１４９６４７−７８−９、スベラニロヒドロキサム酸、スベロイル＋アニリド＋ヒドロキサム酸としても知られ、ＳＡＨＡと略され、そして「ゾリンザ」として販売される）は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）を阻害する、より大きなクラスのメンバーである。ボリノスタットはまた、やはりヒストン脱アセチル化酵素の活性部位に見られる亜鉛イオンのキレート剤としても作用する。ボリノスタットは、カタログ番号４６５２でＴｏｃｒｉｓからを含めて、商業的供給者から購入可能である。
【０１２５】
用語「外因性」は、細胞または生物におけるタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドと関連して用いた際、人工的または天然手段によって、細胞または生物内に導入されているタンパク質、遺伝子、核酸、またはポリヌクレオチドを指し；あるいは、細胞と関連して用いた際、人工的または天然手段によって、単離され、そして続いて他の細胞または生物内に導入される細胞を指す。外因性核酸は、異なる生物または細胞に由来していてもよいし、あるいは生物または細胞内に天然に存在する１つまたはそれより多いさらなる核酸コピーであってもよい。外因性細胞は、異なる生物由来であってもよいし、または同じ生物由来であってもよい。限定されない例として、外因性核酸は、天然細胞のものと異なる染色体位置にあるものであるか、またはそうでなければ、天然に見られるものとは異なる核酸配列によって隣接されている。外因性核酸はまた、染色体外、例えばエピソームベクターであってもよい。
【０１２６】
供給源細胞タイプからターゲット細胞タイプへの転換に必要な１つまたはそれより多い転写因子の量を増加させる能力に関する、１つまたはそれより多い候補剤のスクリーニングには、転写因子の産生または発現を可能にする系と、候補剤を接触させ、そして転写因子の量が増加しているかどうかを決定する工程が含まれてもよい。系は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、例えば生物における組織または細胞であってもよいし、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏの生物から単離された細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系、あるいは細胞または組織におけるｅｘ  ｖｉｖｏであってもよい。転写因子の量を、直接または間接的に、そしてタンパク質またはＲＮＡ（例えばｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡ）いずれかの量を決定することによって、測定してもよい。候補剤は、転写因子をコードする遺伝子の転写におけるいずれかの工程を増加させるか、または対応するｍＲＮＡの翻訳を増加させることによって、転写因子の量を増加させるように機能する。あるいは、候補剤は、転写因子をコードする遺伝子の転写のリプレッサーの阻害活性、あるいは転写因子をコードするｍＲＮＡまたは転写因子自体のタンパク質の分解を引き起こす分子の活性を減少させてもよい。
【０１２７】
適切な検出手段には、放射性核種、酵素、補酵素、蛍光体（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）、化学発光体、色素原、酵素基質または補因子、酵素阻害剤、補欠分子族錯体、フリーラジカル、粒子、色素等の標識の使用が含まれる。こうした標識試薬を、多様な周知のアッセイ、例えばラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、蛍光イムノアッセイ等で用いてもよい。例えば、米国特許第３，７６６，１６２号；第３，７９１，９３２号；第３，８１７，８３７号；および第４，２３３，４０２号を参照されたい。
【０１２８】
本発明の方法には、ハイスループットスクリーニング適用が含まれる。例えば、転写因子の産生または発現を可能にする系のアリコットを、マルチウェルプレートの異なるウェル内で、複数の候補剤に曝露する、本発明にしたがったいずれかのアッセイを含む、ハイスループットスクリーニングアッセイを用いてもよい。さらに、本開示にしたがったハイスループットスクリーニングアッセイは、いずれかの種類のミニチュア化アッセイ系において、複数の候補剤に曝露された、転写因子の産生または発現を可能にする系のアリコットを伴う。
【０１２９】
開示の方法は、限定されるわけではないが、例えばプレートあたり２４、４８、９６または３８４ウェルのマルチウェルプレート、マイクロチップまたはスライドを含めて、ミニチュア化のいずれかの許容されうる方法を通じて、アッセイ系において、「ミニチュア化」されてもよい。マイクロチップ支持体上で行えるようにアッセイサイズを減少させてもよく、これには、好適に、より少ない量の試薬および他の材料が含まれる。ハイスループットスクリーニングにつながるプロセスのいかなるミニチュア化も本発明の範囲内である。
【０１３０】
本発明のいずれかの方法において、ターゲット細胞を、供給源細胞を得た哺乳動物と同じ哺乳動物内にトランスファーしてもよい。言い換えると、本発明の方法で用いる供給源細胞は、自己細胞であってもよく、すなわちターゲット細胞を投与しようとする同じ個体から得られていてもよい。あるいは、ターゲット細胞を、別の個体内に同種間でトランスファーしてもよい。好ましくは、細胞は、個体における医学的状態を治療するかまたは防止する方法において、被験体に対して自己である。
【０１３１】
用語「細胞培養培地」（本明細書においてまた、「培養培地」または「培地」とも称される）は、細胞生存性を維持し、そして増殖を補助する栄養素を含有する、細胞を培養するための培地である。細胞培養培地は、適切な組み合わせで以下のいずれを含有してもよい：塩（単数または複数）、緩衝剤（単数または複数）、アミノ酸、グルコースまたは他の糖（単数または複数）、抗生物質、血清または血清置換物、および他の構成要素、例えばペプチド増殖因子等。特定の細胞タイプに通常用いられる細胞培養培地は、当業者に知られる。本発明の方法で使用するための例示的な細胞培養培地を、表６に示す。
【０１３２】
表６．多様な細胞タイプを培養するために使用可能な細胞培養培地
【０１３３】
【表６】
2020524515.tif 000014
【０１３４】
本明細書に記載するような核酸または核酸を含むベクターには、上記の表４に言及する１つまたはそれより多い配列、あるいは表１〜３に列挙するいずれかの１つまたはそれより多い転写因子をコードする配列が含まれてもよい。
【０１３５】
用語「発現」は、適用可能である場合、限定されるわけではないが、例えば、転写、翻訳、フォールディング、修飾およびプロセシングを含めて、ＲＮＡおよびタンパク質を産生し、そして適切であるように、タンパク質を分泌する際に関与する細胞プロセスを指す。
【０１３６】
用語「単離された」または「部分的に精製された」は、本明細書において、核酸またはポリペプチドの場合、天然供給源に見られるように核酸またはポリペプチドとともに存在する、そして／または細胞によって発現されるか、または分泌されるポリペプチドの場合、分泌された際に、核酸またはポリペプチドとともに存在するであろう、少なくとも１つの他の構成要素（例えば核酸またはポリペプチド）から分離された核酸またはポリペプチドを指す。化学的に合成された核酸またはポリペプチド、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳を用いて合成されたものは、「単離された」と見なされる。
【０１３７】
用語「ベクター」は、宿主または供給源細胞内に導入するためにＤＮＡ配列を挿入可能であるキャリアーＤＮＡ分子を指す。好ましいベクターは、連結されている核酸の自律複製および／または発現が可能であるものである。これらが機能可能であるように連結されている遺伝子の発現を指示することが可能なベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と称される。したがって、「発現ベクター」は、宿主細胞において、関心対象の遺伝子の発現に必要とされる必要な制御領域を含有する特殊化ベクターである。いくつかの態様において、関心対象の遺伝子は、ベクター中の別の配列に機能可能であるように連結されている。ベクターはウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターを用いる場合、ウイルスベクターは複製不全であることが好ましく、これは例えば複製のためにコードするすべてのウイルス核酸を除去することによって達成可能である。複製不全ウイルスベクターは、なおその感染特性を保持し、そして複製するアデノウイルスベクターと類似の方式で細胞に進入するが、ひとたび細胞に受け入れられたら、複製不全ウイルスベクターは、複製もまた増殖もしない。ベクターはまた、リポソームおよびナノ粒子、ならびにＤＮＡ分子を細胞に送達する他の手段も含む。
【０１３８】
用語「機能可能であるように連結された」は、コード配列の発現に必要な制御配列が、コード配列の発現を達成するように、コード配列に関して適切な位置でＤＮＡ分子中に配置されることを意味する。この同じ定義はときに、発現ベクターにおけるコード配列および転写制御要素（例えばプロモーター、エンハンサー、および終結要素）の配置に適用される。用語「機能可能であるように連結された」には、発現しようとするポリヌクレオチド配列の直前に適切な開始シグナル（例えばＡＴＧ）を有し、そして発現制御配列の制御下でのポリヌクレオチド配列の発現、およびポリヌクレオチド配列にコードされる所望のポリペプチドの産生を可能にする正しい読み枠を維持することが含まれる。
【０１３９】
用語「ウイルスベクター」は、細胞への核酸構築物のキャリアーとしての、ウイルスまたはウイルス関連ベクターの使用を指す。構築物は、感染または細胞内への形質導入のため、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターを含む、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）またはその他のような非複製性の不全ウイルスゲノム内に、組み込まれ、そしてパッケージングされてもよい。ベクターは、細胞ゲノム内に取り込まれてもまたは取り込まれなくてもよい。構築物には、望ましい場合、トランスフェクションのためのウイルス配列も含まれてもよい。あるいは、構築物は、エピソーム複製可能なベクター、例えばＥＰＶおよびＥＢＶベクター内に取り込まれてもよい。
【０１４０】
本明細書において、用語「アデノウイルス」は、アデノウイルス科のウイルスを指す。アデノウイルスは、ヌクレオカプシドおよび二本鎖直鎖ＤＮＡゲノムで構成される、中程度の大きさ（９０〜１００ｎｍ）の非エンベロープ（裸の）正二十面体ウイルスである。
【０１４１】
本明細書において、用語「非組込みウイルスベクター」は、宿主ゲノム内に組み込まれないウイルスベクターを指し；該ウイルスベクターによって送達される遺伝子の発現は一時的である。宿主ゲノム内への組込みはほとんどまたはまったくないため、非組込みウイルスベクターは、ゲノムにおいて、ランダムな点で挿入することによるＤＮＡ突然変異を産生しない利点を有する。例えば、非組込みウイルスベクターは、染色体外に留まり、そしてその遺伝子を宿主ゲノム内に挿入せず、潜在的に内因性遺伝子の発現を破壊することがない。非組込みウイルスベクターには、限定されるわけではないが、以下：アデノウイルス、アルファウイルス、ピコルナウイルス、およびワクシニアウイルスが含まれうる。これらのウイルスベクターは、これらのいずれも、ある稀な状況においては、ウイルス核酸を宿主細胞ゲノム内に組み込む可能性があるにもかかわらず、該用語を本明細書で用いる際、「非組込み」ウイルスベクターである。重要なことは、本明細書に記載する方法で用いるウイルスベクターは、使用する条件下で、一般に、またはその生活環の主な部分として、宿主細胞ゲノム内にその核酸を組み込まないことである。
【０１４２】
療法において使用するための安全性を増加させ、望ましい場合、選択および濃縮マーカーを含め、そして含有するヌクレオチド配列の発現を最適化するため、科学文献に一般的に知られる方法を用いて、本明細書記載のベクターを構築し、そして操作してもよい。ベクターには、ベクターが供給源細胞タイプにおいて自己複製することを可能にする、構造的構成要素が含まれるはずである。例えば、既知のエプスタイン・バーｏｒｉＰ／核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）の組み合わせ（例えば、その全体が本明細書に示されたかのように援用される、Ｌｉｎｄｎｅｒ，  Ｓ．Ｅ．およびＢ．  Ｓｕｇｄｅｎ，  Ｔｈｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｒｅｐｌｉｃｏｎ  ｏｆ  Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，  ｌｉｃｅｎｓｅｄ，  ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ，  Ｐｌａｓｍｉｄ  ５８：１  （２００７）を参照されたい）は、ベクター自己複製を支持するために十分であり、そして哺乳動物、特に霊長類、細胞において機能することが知られる他の組み合わせもまた使用してもよい。本発明で使用するために適した発現ベクターの構築のための標準的な技術は、一般の当業者に周知であり、そして、その全体が示されるかのように本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，”（第３版  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．  Ｙ．  ２００１）などの刊行物に見出されうる。
【０１４３】
本発明の方法において、転換に必要な適切な転写因子をコードする遺伝材料を、１つまたはそれより多いリプログラミングベクターを通じて、供給源細胞内に送達する。各転写因子を、供給源細胞におけるポリヌクレオチドの発現を駆動しうる異種プロモーターに機能可能であるように連結された転写因子をコードするポリヌクレオチド導入遺伝子として、供給源細胞内に導入してもよい。
【０１４４】
適切なリプログラミングベクターは、感染性または複製適合性ウイルスを生じさせるために十分なウイルスゲノムのすべてまたは一部をコードしない、エピソームベクター、例えばプラスミドを含めて、本明細書に記載するいずれかのものであるが、ベクターは、１つまたはそれより多いウイルスから得られる構造要素を含有してもよい。１つまたは複数のリプログラミングベクターを単一の供給源細胞内に導入してもよい。１つまたはそれより多い導入遺伝子を、単一のリプログラミングベクター上に提供してもよい。１つの強い恒常的な転写プロモーターが、発現カセットとして提供されてもよい、複数の導入遺伝子のための転写制御を提供してもよい。ベクター上の別個の発現カセットが、別個の強い恒常性プロモーターの転写制御下にあってもよく、これらのプロモーターは、同じプロモーターのコピーであってもよいし、または別個のプロモーターであってもよい。多様な異種プロモーターが当該技術分野に知られ、そしてこれらを、転写因子の所望の発現レベルなどの要因に応じて用いてもよい。以下に例示するように、供給源細胞において、別個の強度を有する別個のプロモーターを用いて、別個の発現カセットの転写を制御することが好適でありうる。転写プロモーターの選択における別の考慮は、プロモーター（単数または複数）をサイレンシングするレートである。当業者は、遺伝子（単数または複数）の産物が、リプログラミング法において、その役割を完了したかまたは実質的に完了した後、１つまたはそれより多い導入遺伝子または導入遺伝子発現カセットの発現を減少させることが好適でありうることを認識するであろう。例示的なプロモーターは、ヒトＥＦ１α伸長因子プロモーター、ＣＭＶサイトメガロウイルス極初期プロモーター、およびＣＡＧニワトリアルブミンプロモーター、ならびに他の種由来の対応する相同プロモーターである。ヒト体細胞において、ＥＦ１αおよびＣＭＶはどちらも、強いプロモーターであるが、ＣＭＶプロモーターの制御下での導入遺伝子の発現が、ＥＦ１αプロモーターの制御下での導入遺伝子の発現よりもより早期に停止されるように、前者は後者よりも、より効率的にサイレンシングされる。転写因子は、リプログラミング効率を調節するために変動させうる相対比で、供給源細胞において発現されうる。好ましくは、複数の導入遺伝子が単一の転写物上にコードされる場合、内部リボソーム進入部位が、転写プロモーターから遠位の、導入遺伝子（単数または複数）の上流に提供される。因子の相対比は、送達する因子に応じて多様でありうるが、本開示を把握している一般の当業者は、因子の最適な比を決定可能である。
【０１４５】
当業者は、複数のベクターを通じるよりも、単一のベクターを通じて、すべての因子を導入する方が好適に効率的であるが、総ベクターサイズが増加するにつれて、ベクターを導入することがますます困難になることを認識するであろう。当業者はまた、ベクター上の転写因子の位置が、時間的発現および生じるリプログラミング効率に影響を及ぼしうることを認識するであろう。こうしたものとして、出願者らは、ベクターの組み合わせに対して、因子の多様な組み合わせを使用した。リプログラミングを支持する、いくつかのこうした組み合わせを本明細書に示す。
【０１４６】
リプログラミングベクター（単数または複数）を導入した後、そして供給源細胞がリプログラミングされている間、ベクターはターゲット細胞中に存在し続けることが可能であり、この間、導入された導入遺伝子が転写され、そして翻訳される。導入遺伝子発現は、ターゲット細胞タイプにリプログラミングされている細胞においては、好適に下方制御されるかまたは停止されてもよい。リプログラミングベクター（単数または複数）は、染色体外にとどまってもよい。極端に低い効率で、ベクター（単数または複数）は、細胞ゲノム内に組み込まれうる。以下の実施例は、本発明を例示することを意図し、いかなる意味でも限定することを意図しない。
【０１４７】
本発明とともに使用するための、細胞、組織または生物の形質転換のための核酸送達に適した方法には、本明細書に記載するような、または一般の当業者に知られるであろうような、核酸（例えばＤＮＡ）が細胞、組織または生物内に導入されうる、実質的にいずれかの方法が含まれると考えられる（例えば、ＳｔａｄｔｆｅｌｄおよびＨｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６（５）：３２９−３３０  （２００９）；  Ｙｕｓａら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６：３６３−３６９  （２００９）；  Ｗｏｌｔｊｅｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４５８，  ７６６−７７０  （９  Ａｐｒ．  ２００９））。こうした方法には、限定されるわけではないが、ｅｘ  ｖｉｖｏトランスフェクションによるなどのＤＮＡの直接送達（Ｗｉｌｓｏｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４４：１３４４−１３４６，  １９８９、ＮａｂｅｌおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２６：７１１−７１３，  １９８７）が含まれ、任意に、脂質に基づくトランスフェクション試薬、例えばＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）またはリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いても、注入（各々、本明細書に援用される、米国特許第５，９９４，６２４号、第５，９８１，２７４号、第５，９４５，１００号、第５，７８０，４４８号、第５，７３６，５２４号、第５，７０２，９３２号、第５，６５６，６１０号、第５，５８９，４６６号および第５，５８０，８５９号）によってもよく、これにはマイクロインジェクション（本明細書に援用される、ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １０１：１０９４−１０９９，  １９８５；米国特許第５，７８９，２１５号）が含まれ；エレクトロポレーション（本明細書に援用される、米国特許第５，３８４，２５３号；  Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ６：７１６−７１８，  １９８６；  Ｐｏｔｔｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：７１６１−７１６５，  １９８４）によってもよく；リン酸カルシウム沈殿（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ５２：４５６−４６７，  １９７３；  ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ７（８）：２７４５−２７５２，  １９８７；  Ｒｉｐｐｅら，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １０：６８９−６９５，  １９９０）によってもよく；ＤＥＡＥ−デキストランを用いた後、ポリエチレングリコールを用いることによってもよく（Ｇｏｐａｌ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ５：１１８８−１１９０，  １９８５）；直接超音波装填（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８４：８４６３−８４６７，  １９８７）によってもよく；リポソーム仲介性トランスフェクション（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  ７２１：１８５−１９０，  １９８２；  Ｆｒａｌｅｙら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７６：３３４８−３３５２，  １９７９；  Ｎｉｃｏｌａｕら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １４９：１５７−１７６，  １９８７��  Ｗｏｎｇら，  Ｇｅｎｅ，  １０：８７−９４，  １９８０；  Ｋａｎｅｄａら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４３：３７５−３７８，  １９８９；  Ｋａｔｏら，  Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６６：３３６１−３３６４，  １９９１）によってもよく、そして受容体仲介性トランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７：８８７−８９２，  １９８８；  ＷｕおよびＷｕ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６２：４４２９−４４３２，  １９８７）によってもよく；そしてこうした方法のいずれかの組み合わせによってもよく、これらの各々は本明細書に援用される。
【０１４８】
会合する分子の細胞内への導入を仲介可能ないくつかのポリペプチドが以前記載されてきており、そしてこれは本発明に適応可能である。例えば、Ｌａｎｇｅｌ  （２００２）  Ｃｅｌｌ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓを参照されたい。膜を渡る輸送を増進するポリペプチド配列の例には、限定されるわけではないが、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ホメオタンパク質、アンテナペディア転写タンパク質（ＡｎｔＨＤ）（Ｊｏｌｉｏｔら，  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．  ３：  １１２１−３４，  １９９１；  Ｊｏｌｉｏｔら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８８：  １８６４−８，  １９９１；  Ｌｅ  Ｒｏｕｘら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：  ９１２０−４，  １９９３）、単純ヘルペスウイルス構造タンパク質ＶＰ２２（ＥｌｌｉｏｔｔおよびＯ’Ｈａｒｅ，  Ｃｅｌｌ  ８８：  ２２３−３３，  １９９７）；ＨＩＶ−１転写活性化因子ＴＡＴタンパク質（ＧｒｅｅｎおよびＬｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｃｅｌｌ  ５５：  １１７９−１１８８，  １９８８；  ＦｒａｎｋｅｌおよびＰａｂｏ，  Ｃｅｌｌ  ５５：  １  ２８９−１１９３，  １９８８）；カポジＦＧＦシグナル配列（ｋＦＧＦ）；タンパク質形質導入ドメイン−４（ＰＴＤ４）；ペネトラチン、Ｍ９１８、トランスポータン−１０；核局在化配列、ＰＥＰ−Ｉペプチド；両親媒性ペプチド（例えば、ＭＰＧペプチド）；送達増進輸送体、例えば米国特許第６，７３０，２９３号に記載されるもの（限定されるわけではないが、少なくとも５〜２５またはそれより多い連続アルギニン、あるいは３０、４０または５０アミノ酸の連続セット中に５〜２５またはそれより多いアルギニンを含むペプチド配列を含むペプチド配列を含み；限定されるわけではないが、十分な、例えば少なくとも５つのグアニジノまたはアミジノ部分を有するペプチドを含む）；ならびに商業的に入手可能なペネトラチンＴＭ１ペプチド、およびフランス・パリのＤｉａｔｏｓ  Ｓ．Ａ．より入手可能なＶｅｃｔｏｃｅｌｌ（登録商標）プラットホームのＤｉａｔｏｓペプチドベクター（「ＤＰＶ」）が含まれる。ＷＯ／２００５／０８４１５８およびＷＯ／２００７／１２３６６７、ならびに該文献に記載されるさらなる輸送体もまた参照されたい。これらのタンパク質は形質膜を通過可能であるだけでなく、他のタンパク質、例えば本明細書に記載する転写因子を付着させると、これらの複合体の細胞取り込みを刺激するために十分である。
【０１４９】
本発明には、以下の限定されない実施例が含まれる。
【実施例】
【０１５０】
実施例１
線維芽細胞から軟骨細胞への転換のための候補転写因子は、Ｒａｃｋｈａｍら（２０１６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ４８（３）：  ３３１−３３５に以前記載された方法にしたがって同定された。
【０１５１】
正常酸素または低酸素条件下、単層（２Ｄ）で、線維芽細胞を増殖させた。軟骨は、十分な血管系が存在しないため、特に低酸素の環境であることが知られることから、両方の条件下で実験を行った。低酸素条件下での実験の実行は、該方法論でｉｎ  ｖｉｖｏ治療を推定可能であることを示す。
【０１５２】
以下の表７に示すような小分子の混合物を、表に明記する濃度で、線維芽細胞培養に添加した：
表７：皮膚線維芽細胞を軟骨細胞に転換するために用いる小分子
【０１５３】
【表７】
2020524515.tif 000015
【０１５４】
１０日間の期間に渡って、線維芽細胞は巨視的外見を変え、そして培養中の単離天然軟骨細胞と関連する典型的な立方状外見をとった（図１）。
実施例２
遺伝子発現研究を行って、分子レベルで転換を確認した。実施例１由来の転換線維芽細胞を採取し、そしてＲＮＡを抽出して、軟骨形成遺伝子（例えばアグリカンおよびＩＩ型コラーゲン）の下流上方制御を駆動する転写因子である、ＳＯＸ９の発現を決定した。
【０１５５】
遺伝子発現実験の結果は、線維芽細胞の軟骨細胞表現型への転換を確認する。図２は、第９日をピークとし、そして少なくともさらに３日間（実験が終了するまで）、レベルを安定化させる、処理した細胞におけるＳＯＸ９の漸次的上方制御を示す。
【０１５６】
幹細胞の軟骨形成中のＳＯＸ９の上方制御は、ＳＭＡＤと呼ばれるタンパク質の上流シグナル伝達ファミリーによって駆動される。ＳＭＡＤファミリーメンバーの発現を、表７に示す小分子と組み合わせて、２Ｄで１４日間培養した線維芽細胞で決定した。図２および３に示す結果は、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＳＭＡＤ６の発現増加を示し、転換された細胞が、成熟軟骨細胞に発生することを示す。
【０１５７】
軟骨形成の駆動は、２Ｄから３Ｄ培養への移動を必要とする。発生中に行われる軟骨形成細胞の凝縮（ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）は、軟骨細胞の成熟を駆動する際の非常に重要な工程である。転換された軟骨細胞で凝縮が起こっているかどうかを決定するため、２Ｄ培養で１４日間増殖させた細胞を、遠心分離によってペレットにし、そしてさらに２１日間培養する。ペレットは、巨視的に表れる、白色細胞外マトリックスを集積させ、そして触れると固いようであった（天然軟骨と類似）。これらの特徴は、細胞の治療群でのみ観察され、対照群では観察されず、対照群は柔らかく、そして分散していた（図４を参照されたい）。
【０１５８】
処理した細胞の細胞ペレット（ここで、軟骨細胞の特性を示している）を、組織学によるさらなる分析に供した。細胞を、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ染色）によって、広いマトリックス沈着に関して、そして軟骨形成分化のマーカーに関して（アグリカンおよびＩＩ型コラーゲンの沈着）染色した。線維芽細胞マーカー、Ｉ型コラーゲンの存在を検出するための染色もまた行って、ドナー細胞表現型の喪失を評価した。
【０１５９】
図５Ａは、対照（未処理）細胞の組織学的結果を示す。細胞ペレットは小さく、マトリックス沈着はほとんどないようである。軟骨形成マーカーに関する染色は陰性であったが、Ｉ型コラーゲンに関しては陽性であり、線維芽細胞タイプから軟骨細胞への転換がなかったことが示された。図５Ｂは、処理した細胞に関する結果を示す。細胞ペレットは対照細胞に関するものより大きく、そして細胞外マトリックスに関して広範に染色される。重要なことに、細胞は、アグリカンおよびＩＩ型コラーゲンに関して陽性に染色された。
【０１６０】
実施例３
軟骨細胞をヒト軟骨から得た。細胞を、数回の継代を通じて２Ｄに増殖させ、脱分化を誘導した（変形性関節症において、または初代軟骨細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの典型的な継代において生じるような、疾患または脱分化軟骨細胞を再現するため）。
【０１６１】
増殖した細胞を、実施例１に列挙する小分子を伴いまたは伴わず、正常酸素および低酸素条件下で、２Ｄ培養で２週間インキュベーションした。
再分化が起こるかどうかを決定するため、細胞に対して、遺伝子発現分析を行った。ＳＯＸ９遺伝子発現は、脱分化した軟骨細胞が、「天然」または再分化した軟骨細胞に転換されていることを示した（図６）。
【０１６２】
結論：
適切な転写因子の発現を増加させ、そして線維芽細胞を軟骨細胞にロバストに転換するために使用可能な、小分子セットが同定されてきている。同じ分子はまた、脱分化した軟骨細胞を再分化軟骨細胞に転換するためにも有用である。
【０１６３】
実施例４
ヒト皮膚線維芽細胞を７ｘ１０４細胞／ｃｍ２でウェルプレート上に植え付け、２４時間後、ＬＳＧＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む培地１０６中で、転写因子のウイルス形質導入を行った。植え付けた翌日、転写因子ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２、ＡＨＲおよびＪＵＮＢならびにＩＲＥＳ−ＧＦＰをコードするレンチウイルス粒子を、ポリブレン（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含む培地１０６中で細胞に形質導入した。次いで、形質導入直後に６０分間、ウェルプレートを１９００ｒｐｍで遠心分離した。第２日、培地を軟骨細胞分化培地（ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））、１０％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１ｘ非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン・ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５ｎｇ／ｍｌ  ＢＦＧＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で置き換えた。実験全体で、培地を２日ごとに交換した。実験を２Ｄで行い、そして第１４日で終了した。
【０１６４】
形質導入後、第０日、第７日および第１４日に、軟骨細胞マーカーの遺伝子発現を行って、線維芽細胞から軟骨細胞への転換を監視した（図７）。同じ時点で、細胞をアグリカン（軟骨細胞マーカー）に関して染色した（図８）。データは、線維芽細胞から軟骨細胞への転換の成功を示す（例えば、図８における転写因子で形質導入した細胞におけるアグリカンの陽性染色の存在）。
【０１６５】
実施例５
ヒト皮膚線維芽細胞を植え付け、そして実施例４に記載するものと類似の方法を用いて、転写因子のドキシサイクリン誘導性発現をコードするレンチウイルス粒子でトランスフェクションした。転写因子は、ＢＡＲＸ１、ＰＩＴＸ１、ＳＭＡＤ６、ＦＯＸＣ１、ＳＩＸ２、ＡＨＲ、ＦＯＳＢおよびＪＵＮＢであった。ドキシサイクリンを用いて、転写因子発現を誘導した。ＥＧＦＰをコードするレンチウイルス粒子を陰性対照として用いた。
【０１６６】
第７日、細胞をアグリカンおよびＲＵＮＸ２（どちらも軟骨細胞分化のマーカー）に関して染色した（図９および１０を参照されたい）。対照に比較して、転写因子の発現に際して、アグリカンおよびＲＵＮＸ２の有意な上方制御があった。
【０１６７】
実施例６
損傷を受けていないヒト軟骨から得た軟骨細胞を、実施例３に記載する方法に類似の小分子とともに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベーションした。ＤＭＳＯ（ビヒクル）を陰性対照として含めた。ＴＧＦβは、軟骨形成分化を駆動することが知られるため、この増殖因子を陽性対照として用いた。
【０１６８】
小分子混合物は表７に記載するとおりである（「８つすべて」）か、または以下にさらに記載するとおりであった。
表８：代替小分子混合物Ｅ
【０１６９】
【表８】
2020524515.tif 000016
【０１７０】
表９：代替小分子混合物Ｆ
【０１７１】
【表９】
2020524515.tif 000017
【０１７２】
実施例７
増殖した細胞を、表７（「８つすべて」）、８（組み合わせＥ）および９（組み合わせＦ）に列挙する小分子を伴いまたは伴わず、正常酸素および低酸素条件下、２Ｄ培養で２週間インキュベーションした。
【０１７３】
細胞に対して、遺伝子発現分析を行い、再分化が起こったかどうかを決定した。ＳＯＸ９遺伝子発現は、脱分化した軟骨細胞が、「天然」または再分化軟骨細胞に転換したことを示した（図１１）。小分子は、軟骨細胞分化の子のマーカーのレベルを増加させる際、ＴＧＦβよりもより有効であった。
【０１７４】
ＳＯＸ５遺伝子発現はまた、陰性対照に比較して、小分子混合物ＥおよびＦとインキュベーションした際にも増加した。このマーカーの増加は、低酸素条件よりも正常酸素条件下でより明らかであった（図１２）。
【０１７５】
さらに、ＩＩ型コラーゲンの発現は、ＴＧＦβによるよりも、小分子によって、より高い度合いまで増加した（図１３）。
１つの個体から得た細胞からの予備的結果によって、アグリカンの発現もまた、表８および９で同定する混合物でのインキュベーション後、低酸素条件において、やはり増加する。
【０１７６】
ＴＧＦβとは対照的に、実施例１で試験した小分子（「８つすべて」）、ならびに表８および９に列挙するような小分子はすべて、１型コラーゲン（未分化または脱分化軟骨細胞のマーカー）およびＸ型コラーゲン（変形性関節症において、一般的に発現する肥大性因子）の発現を減少させた（図１４）。
【０１７７】
実施例８
患者から取り除いた組織から軟骨細胞を単離した。細胞をフラスコ内に植え付け、そして４８時間接着／順応することを可能にした。培地を、小分子を含有する細胞転換培地で９日間置き換えた。
【０１７８】
ＴＧＦβは、軟骨形成分化を駆動することが知られるため、この増殖因子を陽性対照として、培地中に含めた。
結果（図１５）は、初代軟骨細胞の脱分化を防止しうる、細胞培地中の小分子の使用を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月25日(2020.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
供給源細胞をリプログラミングして、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を産生するための方法であって：
ｉ）供給源細胞または供給源細胞を含む細胞集団を提供し；
ｉｉ）該供給源細胞と、２つまたはそれより多い転写因子の発現を活性化するかまたは増加させる１つまたはそれより多い剤を接触させ；そして
ｉｉｉ）該細胞または細胞集団を培養し、そして、軟骨細胞の少なくとも１つの特性に関して、該細胞または細胞集団を監視してもよい
工程を含む、ここで：
−該転写因子が、表１〜４に列挙するものの２つまたはそれより多くである
前記方法。
【請求項２】
前記供給源細胞が、多能性細胞、多分化能細胞または体細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記多能性細胞が胚性幹細胞である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記供給源細胞が、線維芽細胞、皮膚線維芽細胞または脱分化した軟骨細胞である、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記供給源細胞が皮膚線維芽細胞であり、そして前記転写因子が、表１または４に列挙する転写因子のいずれかの２つまたはそれより多くである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記供給源細胞が脱分化した軟骨細胞であり、そして前記転写因子が、表３に列挙する転写因子のいずれかの２つまたはそれより多くである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
脱分化した軟骨細胞から、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を生成する方法であって：
−脱分化した軟骨細胞において、２つまたはそれより多い転写因子またはその変異体の量を増加させ；そして
−軟骨細胞への再分化を可能にするために十分な時間および条件下で、該脱分化した軟骨細胞を培養する工程を含む、ここで：
−該転写因子が表３に列挙するものの２つまたはそれより多くである
前記方法。
【請求項８】
表３の単一の行に示す転写因子のタンパク質発現または量が増加している、請求項７の方法。
【請求項９】
軟骨細胞の細胞培養の脱分化を防止する方法であって：
−脱分化した軟骨細胞または脱分化した軟骨細胞を含む細胞集団を提供し；
−該脱分化した軟骨細胞を、２つまたはそれより多い転写因子の発現を活性化させるかまたは増加させる１つまたはそれより多い剤と接触させ；そして
−該脱分化した細胞または細胞集団を培養し、そして、軟骨細胞の少なくとも１つの特性に関して、細胞または細胞集団を監視してもよい、それによって、軟骨細胞の脱分化を防止し、そして軟骨細胞の細胞培養において、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を維持する
工程を含む、
−ここで、該転写因子が、表３に列挙するものの２つまたはそれより多くである
前記方法。
【請求項１０】
以下の転写因子：
ａ）ＩＬ１１、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１；
ｂ）ＳＯＸ９、ＴＣＦ４、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１；
ｃ）ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＨＯＸＡ７、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１；
ｄ）ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＴＣＦ４、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１；  ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１；
ｅ）ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＴＣＦ４、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１；
ｆ）ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＨＯＸＡ７、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１；
ｇ）ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ２、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１；
ｈ）ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１、ＨＯＸＡ７およびＰＲＲＸ１；または
ｉ）ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＨＯＸＡ７
のタンパク質発現または量が増加している、請求項１〜９のいずれか一項の方法。
【請求項１１】
前記脱分化した軟骨細胞が、軟骨細胞の増殖培養から得られるか、または変形性関節症を患う個体由来の生物学的試料から得られる、請求項４または６または７〜１０のいずれか一項の方法。
【請求項１２】
前記転写因子が、ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１の２つまたはそれより多くである、請求項１〜１１のいずれか一項の方法。
【請求項１３】
前記転写因子が、ＳＯＸ９、ＳＯＸ５、ＶＥＧＦＡ、ＲＵＮＸ１、ＶＤＲ、ＮＲ２Ｆ１、ＦＯＳＢおよびＰＲＲＸ１である、請求項１〜１１のいずれか一項の方法。
【請求項１４】
供給源細胞を、２つまたはそれより多い転写因子の発現または量を増加させる剤と接触させることによって、該供給源細胞において、該２つまたはそれより多い転写因子またはその変異体のタンパク質発現または量を増加させる、先行する請求項のいずれか一項の方法であって、好ましくは、該剤が：核酸、タンパク質、アプタマー、小分子、リボソーム、ＲＮＡｉ剤およびペプチド核酸（ＰＮＡ）、ならびにその類似体または変異体からなる群より選択され、そしてより好ましくは、剤が、表１〜４のいずれか１つに列挙する１つまたはそれより多い転写因子をコードする核酸である、前記方法。
【請求項１５】
供給源細胞を、２つまたはそれより多い転写因子の発現または量を増加させる、１つまたはそれより多い小分子と接触させることによって、該供給源細胞において、該２つまたはそれより多い転写因子のタンパク質発現または量を増加させる、請求項１〜１４のいずれか一項の方法であって、好ましくは、該１つまたはそれより多い小分子が：［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、ロージン（ｒｈｏｓｉｎ）塩酸塩、ロイコボリン、ボリノスタットおよびフォルスコリンからなる群より選択される、前記方法。
【請求項１６】
前記供給源細胞を、［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、およびロージン塩酸塩と接触させる、請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記供給源細胞を、［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、カルシトリオール、ロイコボリン、ボリノスタットおよびフォルスコリンと接触させる、請求項１５の方法。
【請求項１８】
前記供給源細胞を、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、カルシトリオール、ロイコボリンおよびボリノスタットと接触させる、請求項１５の方法。
【請求項１９】
前記供給源細胞を、軟骨細胞への分化を可能にするために十分な時間および条件下で培養する工程が、表６に示すような適切な培地中で、細胞を、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３，１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０日間培養する工程を含む、ここで、好ましくは該細胞の培養を低酸素条件下で行う、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞を、個体に投与する工程をさらに含む、先行する請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞であって、請求項１〜２０のいずれか一項記載の方法によって産生される、前記細胞。
【請求項２２】
細胞の少なくとも５％が、軟骨細胞の少なくとも１つの特性を示す細胞集団であって、細胞が請求項１〜２０のいずれか一項記載の方法によって産生される、前記細胞集団。
【請求項２３】
軟骨細胞の少なくとも１つの特性が、形態学的マーカー、１つまたはそれより多い遺伝子の発現、あるいは１つまたはそれより多いペプチドまたはタンパク質／多糖複合体の産生より選択される、請求項１〜２２のいずれか一項の方法。
【請求項２４】
変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態を治療する方法において使用するための、請求項２２記載の細胞集団。
【請求項２５】
変形性関節症または軟骨組織の変性によって特徴づけられる他の状態を治療する方法における使用のための、［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸（ＡＭ５８０）、オールトランスレチノイン酸、９−シスレチノイン酸、ベータ−エストラジオール、カルシトリオール、シグリタゾン、カルトゲニン、塩化リチウム、メラトニン、ロージン塩酸塩、ロイコボリン、ボリノスタットおよびフォルスコリンの１つまたはそれより多く。
【請求項２６】
少なくとも１つの軟骨細胞、および軟骨細胞において２つまたはそれより多い転写因子の活性またはタンパク質発現を増加させる少なくとも１つの剤を含む組成物であって、該転写因子が、表１〜４に列挙する転写因子のいずれであってもよい、前記組成物。
【国際調査報告】
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