(57)【要約】  本開示は、細胞の混合集団を分析するためのシステムおよび方法を提供する。特に、本開示は、生体試料のデジタルサイトメトリー、生体試料のデジタル分析、生体試料のデジタル精製、個体の疾患の評価、および疾患治療の臨床転帰の予測のためのシステムおよび方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象からの生体試料のデジタルサイトメトリーのための方法であって、
（ａ）複数の異なる細胞型から生体高分子を含む生体試料を得ることと、
（ｂ）前記生体試料を処理して、前記生体高分子の特徴プロファイルを生成することであって、前記特徴プロファイルが、前記複数の異なる細胞型に関連する特徴を含む、生成することと、
（ｃ）デコンボリューションモジュールを使用して、前記特徴プロファイルを処理して、前記生体試料中の前記複数の異なる細胞型のうちの少なくとも１つの存在量を定量化することであって、前記存在量を定量化することが、一括修正手順を適用して前記定量化における技術的変動を除去することを含む、定量化することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記生体試料を得ることが、前記生体試料からの細胞の物理的単離を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記特徴プロファイルが、複数の遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）を含み、前記複数のＧＥＰのそれぞれが、前記複数の異なる細胞型のうちの異なる細胞型に対応する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記複数のＧＥＰが、前記複数の異なる細胞型のそれぞれの複数の細胞の単一細胞遺伝子発現測定値から生成される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記単一細胞遺伝子発現測定値が、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ）によって生成される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記存在量が、前記生体試料中の前記複数の異なる細胞型のうちの前記少なくとも１つの部分的存在量である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記存在量を定量化することが、前記特徴プロファイルと、第２の複数の異なる細胞型についての特徴シグネチャーの参照マトリックスとの間の回帰を最適化することを含み、前記特徴プロファイルが、前記参照マトリックスの線形結合としてモデル化される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記回帰を最適化することが、前記回帰の回帰係数のセットを解くことを含み、前記解が、線形損失関数およびＬ２−ノルムペナルティ関数を最小化する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記線形損失関数が線形ε不感度損失関数である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記最適化することが、サポートベクトル回帰（ＳＶＲ）または非負行列因子分解（ＮＭＦ）を使用することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＳＶＲが、ε−ＳＶＲまたはν（ｎｕ）−ＳＶＲである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体試料がバルク組織を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記生体試料が、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織または凍結組織を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記生体試料が、血液試料を含むか、または固形組織試料に由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記固形組織試料が、腫瘍試料を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記生体高分子が、核酸、タンパク質、代謝産物、炭水化物、糖、脂質、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記生体高分子が核酸を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸がＲＮＡ分子である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸がＤＮＡ分子である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記一括修正手順が、単一細胞参照モード（Ｓモード）で適用される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記一括修正手順が、バルク参照モード（Ｂモード）で適用される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
対象からの生体試料のデジタルサイトメトリーのための方法であって、
（ａ）複数の異なる細胞型から生体高分子を含む生体試料を得ることと、
（ｂ）前記生体試料を処理して、前記生体高分子の特徴プロファイルを生成することと、
（ｃ）デコンボリューションモジュールを使用して、前記特徴プロファイルを処理して、（ｉ）前記生体試料中の前記複数の異なる細胞型のうちの少なくとも１つを同定し、（ｉｉ）前記同定された前記複数の異なる細胞型のうちの少なくとも１つに対して細胞型状態を生成することと、を含む、方法。
【請求項２３】
前記デコンボリューションモジュールを使用して、前記特徴プロファイルを処理して、前記生体試料中の前記同定された前記複数の異なる細胞型のうちの少なくとも１つの存在量を定量化することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記生体試料を得ることが、前記生体試料からの細胞の物理的単離を含まない、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記特徴プロファイルが、複数の遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）を含み、前記複数のＧＥＰのそれぞれが、前記複数の異なる細胞型のうちの異なる細胞型に対応し、前記細胞型状態が、細胞型ＧＥＰを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記複数のＧＥＰが、前記複数の異なる細胞型のそれぞれの複数の細胞の単一細胞遺伝子発現測定値から生成される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記単一細胞遺伝子発現測定値が、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ）によって生成される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記存在量が、前記生体試料中の前記複数の異なる細胞型のうちの前記少なくとも１つの部分的存在量である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記存在量を定量化することが、前記特徴プロファイルと、第２の複数の異なる細胞型についての特徴シグネチャーの参照マトリックスとの間の回帰を最適化することを含み、前記特徴プロファイルが、前記参照マトリックスの線形結合としてモデル化される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記回帰を最適化することが、前記回帰の回帰係数のセットを解くことを含み、前記解が、線形損失関数およびＬ２−ノルムペナルティ関数を最小化する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記線形損失関数が線形ε不感度損失関数である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記最適化することが、サポートベクトル回帰（ＳＶＲ）または非負行列因子分解（ＮＭＦ）を使用することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＳＶＲが、ε−ＳＶＲまたはν（ｎｕ）−ＳＶＲである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記生体試料がバルク組織を含む、請求項２２〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記生体試料が、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織または凍結組織を含む、請求項２２〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記生体試料が、血液試料を含むか、または固形組織試料に由来する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記固形組織試料が、腫瘍試料を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記生体高分子が、核酸、タンパク質、代謝産物、炭水化物、糖、脂質、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２２〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記生体高分子が核酸を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記核酸がＲＮＡ分子である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記核酸がＤＮＡ分子である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記存在量を定量化することが、一括修正手順を適用して前記定量化における技術的変動を除去することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項４３】
前記一括修正手順が、単一細胞参照モード（Ｓモード）で適用される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記一括修正手順が、バルク参照モード（Ｂモード）で適用される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞型状態が、高解像度の細胞型状態である、請求項２２〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞型状態が、群レベルの細胞型状態である、請求項２２〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
対象からの生体試料のデジタルサイトメトリーのための方法であって、
（ａ）第１の複数の異なる細胞型からの生体高分子を含む複数の生体試料を得ることと、
（ｂ）前記複数の生体試料のそれぞれについて、前記生体試料を処理して前記生体高分子の特徴プロファイルを生成することであって、前記特徴プロファイルのそれぞれが、前記第１の複数の異なる細胞型に関連する特徴を含み、それによって第１の複数の特徴プロファイルを生成することと、
（ｃ）デコンボリューションモジュールを使用して、前記第１の複数の特徴プロファイルを処理して、前記複数の生体試料のそれぞれについて、前記第１の複数の異なる細胞型の中から選択される第２の複数の異なる細胞型の第２の複数の特徴プロファイルを決定し、それによって、前記複数の生体試料を、前記第２の複数の異なる細胞型の前記第２の複数の特徴プロファイルにデコンボリューションすることと、を含む、方法。
【請求項４８】
前記デコンボリューションモジュールを使用して、前記特徴プロファイルを処理して、前記生体試料中の前記第２の複数の異なる細胞型のそれぞれの存在量を定量化することをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記存在量が、前記生体試料中の前記複数の異なる細胞型のうちの前記少なくとも１つの部分的存在量である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記生体試料を得ることが、前記生体試料からの細胞の物理的単離を含まない、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記第１の複数の特徴プロファイルおよび前記第２の複数の特徴プロファイルが、遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）を含み、前記ＧＥＰのそれぞれが、前記複数の異なる細胞型のうちの異なる細胞型に対応する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＧＥＰが、前記複数の異なる細胞型のそれぞれの複数の細胞の単一細胞遺伝子発現測定値から生成される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記単一細胞遺伝子発現測定値が、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ）によって生成される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記存在量を定量化することが、前記特徴プロファイルと、第２の複数の異なる細胞型についての特徴シグネチャーの参照マトリックスとの間の回帰を最適化することを含み、前記特徴プロファイルが、前記参照マトリックスの線形結合としてモデル化される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
前記回帰を最適化することが、前記回帰の回帰係数のセットを解くことを含み、前記解が、線形損失関数およびＬ２−ノルムペナルティ関数を最小化する、請求項４７に記載の方法。
【請求項５６】
前記線形損失関数が線形ε不感度損失関数である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記最適化することが、サポートベクトル回帰（ＳＶＲ）または非負行列因子分解（ＮＭＦ）を使用することを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＳＶＲが、ε−ＳＶＲまたはν（ｎｕ）−ＳＶＲである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記生体試料がバルク組織を含む、請求項４７〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
前記生体試料が、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織または凍結組織を含む、請求項４７〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
前記生体試料が、血液試料を含むか、または固形組織試料に由来する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記固形組織試料が、腫瘍試料を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記生体高分子が、核酸、タンパク質、代謝産物、炭水化物、糖、脂質、またはそれらの組み合わせを含む、請求項４７〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記生体高分子が核酸を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記核酸がＲＮＡ分子である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記核酸がＤＮＡ分子である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記決定された第２の複数の特徴プロファイルを使用して、異なる細胞型特異的特徴を同定することをさらに含み、前記同定することが生物学的または機能的グループ化の予備知識を含まない、請求項４７に記載の方法。
【請求項６８】
前記存在量を定量化することが、一括修正手順を適用して前記定量化における技術的変動を除去することを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項６９】
前記一括修正手順が、単一細胞参照モード（Ｓモード）で適用される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記一括修正手順が、バルク参照モード（Ｂモード）で適用される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
対象からの生体試料のデジタルサイトメトリーのための方法であって、
（ａ）第１の複数の異なる細胞型から生体高分子を含む生体試料を得ることであって、前記生体試料を得ることが、前記生体試料からの細胞の物理的単離を含まない、得ることと、
（ｂ）前記生体試料を処理して、前記生体高分子の特徴プロファイルｍを生成することであって、前記特徴プロファイルが、前記第１の複数の異なる細胞型に関連する特徴を含む、生成することと、
（ｃ）前記特徴プロファイルｍと、第２の複数の異なる細胞型についての特徴シグネチャーの参照マトリックスＢとの間の回帰を最適化することであって、前記特徴プロファイルｍが、Ｂの線形結合としてモデル化され、前記最適化することが、前記回帰の回帰係数のセットを含むｆを解くことを含む、最適化することと、
（ｄ）少なくとも前記回帰係数のセットに基づいて、前記第２の複数の異なる細胞型の中から選択される異なる細胞型の存在量を前記生体試料中で定量化することと、を含む、方法。
【請求項７２】
対象からの生体試料のデジタルサイトメトリーのための方法であって、
（ａ）第１の複数の異なる細胞型から生体高分子を含む生体試料を得ることであって、前記生体試料がアーカイブ組織を含む、得ることと、
（ｂ）前記生体試料を処理して、前記生体高分子の特徴プロファイルｍを生成することであって、前記特徴プロファイルが、前記第１の複数の異なる細胞型に関連する特徴を含む、生成することと、
（ｃ）前記特徴プロファイルｍと、第２の複数の異なる細胞型についての特徴シグネチャーの参照マトリックスＢとの間の回帰を最適化することであって、前記特徴プロファイルｍが、Ｂの線形結合としてモデル化され、前記最適化することが、前記回帰の回帰係数のセットを含むｆを解くことを含む、最適化することと、
（ｄ）少なくとも前記回帰係数のセットに基づいて、前記第２の複数の異なる細胞型の中から選択される異なる細胞型の存在量を前記生体試料中で定量化することと、を含む、方法。
【請求項７３】
対象からの生体試料のデジタルサイトメトリーのための方法であって、
（ａ）第１の複数の異なる細胞型から生体高分子を含む生体試料を得ることと、
（ｂ）前記生体試料を処理して、前記生体高分子の特徴プロファイルｍを生成することであって、前記特徴プロファイルが、前記第１の複数の異なる細胞型に関連する特徴を含む、生成することと、
（ｃ）前記特徴プロファイルｍと、第２の複数の異なる細胞型についての特徴シグネチャーの参照マトリックスＢとの間の回帰を最適化することであって、前記特徴プロファイルｍが、Ｂの線形結合としてモデル化され、前記最適化することが、前記回帰の回帰係数のセットを含むｆを解くことを含む、最適化することと、
（ｄ）少なくとも前記回帰係数のセットに基づいて、前記第２の複数の異なる細胞型の中から選択される異なる細胞型の存在量を前記生体試料中で定量化することであって、前記特徴プロファイルが、複数の遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）を含み、前記複数のＧＥＰのそれぞれが、前記複数の異なる細胞型のうちの異なる細胞型に対応する、定量化することと、を含む、方法。
【請求項７４】
対象からの生体試料のデジタルサイトメトリーのための方法であって、
（ａ）第１の複数の異なる細胞型から生体高分子を含む生体試料を得ることと、
（ｂ）前記生体試料を処理して、前記生体高分子の特徴プロファイルｍを生成することであって、前記特徴プロファイルが、前記第１の複数の異なる細胞型に関連する特徴を含む、生成することと、
（ｃ）前記特徴プロファイルｍと、第２の複数の異なる細胞型についての特徴シグネチャーの参照マトリックスＢとの間の回帰を最適化することであって、前記特徴プロファイルｍが、Ｂの線形結合としてモデル化され、前記最適化することが、前記回帰の回帰係数のセットを含むｆを解くことを含む、最適化することと、
（ｄ）一括修正手順を使用して、少なくとも前記回帰係数のセットに基づいて、前記第２の複数の異なる細胞型の中から選択される異なる細胞型の存在量を前記生体試料中で定量化することであって、前記一括修正手順が、前記参照マトリックスＢと前記生体試料との間の技術的変動を除去する、定量化することと、を含む、方法。
【請求項７５】
前記生体試料がバルク組織を含む、請求項７１、７３、または７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
前記生体試料が、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織または凍結組織を含む、請求項７１〜７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７７】
前記生体試料が、血液試料を含むか、または固形組織試料に由来する、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記固形組織試料が、腫瘍試料を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記生体高分子が、核酸、タンパク質、代謝産物、炭水化物、糖、脂質、またはそれらの組み合わせを含む、請求項７１〜７４のいずれかに記載の方法。
【請求項８０】
前記生体高分子が核酸を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記核酸がＲＮＡ分子である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記核酸がＤＮＡ分子である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記特徴プロファイルが、複数の遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）を含み、前記複数のＧＥＰのそれぞれが、前記複数の異なる細胞型のうちの異なる細胞型に対応する、請求項７１、７２、または７４のいずれかに記載の方法。
【請求項８４】
前記複数のＧＥＰが、前記第１の複数の異なる細胞型のそれぞれの複数の細胞の単一細胞遺伝子発現測定値から生成される、請求項７３または８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記単一細胞遺伝子発現測定値が、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ）によって生成される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記一括修正手順が、単一細胞参照モード（Ｓモード）で適用される、請求項７４に記載の方法。
【請求項８７】
前記一括修正手順が、バルク参照モード（Ｂモード）で適用される、請求項７４に記載の方法。
【請求項８８】
対象からの生体試料のデジタル分析のための方法であって、
（ａ）第１の複数の異なる細胞型からの生体高分子を含む複数の生体試料Ｍのそれぞれについて、前記生体高分子の特徴プロファイルｍを得ることであって、前記特徴プロファイルｍのそれぞれが、前記第１の複数の異なる細胞型に関連する特徴を含む、得ることと、
（ｂ）複数のセットの係数Ｆを含むマトリックスを得ることと、
（ｃ）ノイズ閾値手順を使用して、前記複数の生体試料Ｍから、少なくとも前記複数のセットの係数Ｆに基づいて、前記第１の複数の異なる細胞型の中から選択された第２の複数の異なる細胞型の複数の代表的特徴Ｇを決定することであって、前記ノイズ閾値手順が、前記複数の代表的特徴Ｇの前記特徴決定におけるノイズを低減する、決定することと、を含む、方法。
【請求項８９】
（ｂ）が、前記特徴プロファイルｍのそれぞれと、前記第２の複数の異なる細胞型についての特徴シグネチャーの参照マトリックスＢとの間の回帰を最適化することを含み、前記特徴プロファイルｍが、Ｂの線形結合としてモデル化され、前記最適化することが、前記回帰の回帰係数のセットを含むｆを解くことを含み、それによって前記複数のセットの係数Ｆを提供する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記特徴決定が、信頼できない細胞型特異的遺伝子発現決定を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記生体試料のそれぞれがバルク組織を含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
（ａ）が、前記生体試料からの細胞の物理的単離を含まない、請求項９０または９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記生体試料のそれぞれがアーカイブ組織を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記生体試料のそれぞれが、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織または凍結組織を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記生体試料のそれぞれが、血液試料を含むか、または固形組織試料に由来する、請求項９１に記載の方法。
【請求項９６】
前記固形組織試料が、腫瘍試料を含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記生体高分子が、核酸、タンパク質、代謝産物、炭水化物、糖、脂質、またはそれらの組み合わせを含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９８】
前記生体高分子が核酸を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記核酸がＲＮＡ分子である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記核酸がＤＮＡ分子である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記特徴プロファイルが、複数の遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）を含み、前記複数のＧＥＰのそれぞれが、前記第１の複数の異なる細胞型のうちの異なる細胞型に対応する、請求項９０に記載の方法。
【請求項１０２】
前記複数の遺伝子発現プロファイルが、前記第１の複数の異なる細胞型のそれぞれの複数の細胞の単一細胞遺伝子発現測定値から生成される、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記単一細胞遺伝子発現測定値が、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ）によって生成される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
対象からの生体試料のデジタル分析のための方法であって、
（ａ）第１の複数の異なる細胞型からの生体高分子を含む複数の生体試料Ｍのそれぞれについて、前記生体高分子の特徴プロファイルｍを得ることであって、前記特徴プロファイルｍのそれぞれが、前記第１の複数の異なる細胞型に関連する特徴を含む、得ることと、
（ｂ）複数のセットの係数Ｆを含むマトリックスを得ることと、
（ｃ）前記複数の生体試料Ｍのそれぞれについて、非負行列因子分解（ＮＭＦ）を実行して、少なくとも前記複数のセットの係数Ｆに基づいて、前記第１の複数の異なる細胞型の中から選択される第２の複数の異なる細胞型の複数の特徴プロファイルＧを決定し、それによって、前記Ｆおよび前記Ｍを考慮して、前記複数の生体試料Ｍを前記Ｇにデコンボリューションすることと、を含む、方法。
【請求項１０５】
（ｂ）が、前記特徴プロファイルｍのそれぞれと、前記第２の複数の異なる細胞型についての特徴シグネチャーの参照マトリックスＢとの間の回帰を最適化することを含み、前記特徴プロファイルｍのそれぞれが、Ｂの線形結合としてモデル化され、前記最適化することが、前記回帰の回帰係数のセットを含むｆを解くことを含み、それによって前記複数のセットの係数Ｆを提供する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
対象からの生体試料のデジタル分析のための方法であって、
（ａ）第１の複数の異なる細胞型からの生体高分子を含む複数の生体試料Ｍのそれぞれについて、前記生体高分子の特徴プロファイルｍを得ることであって、前記特徴プロファイルｍのそれぞれが、前記第１の複数の異なる細胞型に関連する特徴を含む、得ることと、
（ｂ）複数のセットの係数Ｆを含むマトリックスを得ることと、
（ｃ）前記複数の生体試料Ｍのそれぞれについて、少なくとも前記複数のセットの係数Ｆに基づいて、前記第１の複数の異なる細胞型の中から選択される第２の複数の異なる細胞型の複数の細胞存在量Ｇを決定することであって、前記決定することが、非負行列因子分解（ＮＭＦ）を実行することを含み、前記Ｆおよび前記Ｍを考慮して、前記複数の生体試料Ｍを前記Ｇに分離する、決定することと、を含む、方法。
【請求項１０７】
（ｂ）が、前記特徴プロファイルｍのそれぞれと、前記第２の複数の異なる細胞型についての特徴シグネチャーの参照マトリックスＢとの間の回帰を最適化することを含み、前記特徴プロファイルｍのそれぞれが、Ｂの線形結合としてモデル化され、前記最適化することが、前記回帰の回帰係数のセットを含むｆを解くことを含み、それによって前記複数のセットの係数Ｆを提供する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ＮＭＦモデルが部分的観察を含む、請求項１０４〜１０７のいずれかに記載の方法。
【請求項１０９】
前記生体試料がバルク組織を含む、請求項１０４〜１０７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１０】
（ａ）が、前記生体試料からの細胞の物理的単離を含まない、請求項１０４〜１０７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１１】
前記生体試料がアーカイブ組織を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１２】
前記生体試料が、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織または凍結組織を含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記生体試料が、血液試料を含むか、または固形組織試料に由来する、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１４】
前記固形組織試料が、腫瘍試料を含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記生体高分子が、核酸、タンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１０４〜１０７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１６】
前記生体高分子が核酸を含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記核酸がＲＮＡ分子である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記核酸がＤＮＡ分子である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
前記特徴プロファイルが、複数の遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）を含み、前記複数のＧＥＰのそれぞれが、前記複数の異なる細胞型のうちの異なる細胞型に対応する、請求項１０４〜１０７のいずれかに記載の方法。
【請求項１２０】
前記ＮＭＦモデルが分割統治アプローチを含む、請求項１０４〜１０７のいずれかに記載の方法。
【請求項１２１】
マトリックスＺが前記Ｇおよび前記Ｆの積を含み、前記Ｇおよび前記Ｚの非対角要素が不明である、請求項１０４〜１０７のいずれかに記載の方法。
【請求項１２２】
前記決定された複数の特徴プロファイルＧを使用して、異なる細胞型特異的特徴を同定することをさらに含み、前記同定することが生物学的または機能的グループ化の予備知識を含まない、請求項１０４〜１０７のいずれかに記載の方法。
【請求項１２３】
前記複数の特徴プロファイルＧを決定することが、一括修正手順を適用して前記決定における技術的変動を除去することを含む、請求項１０４〜１０７のいずれかに記載の方法。
【請求項１２４】
前記一括修正手順が、単一細胞参照モード（Ｓモード）で適用される、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記一括修正手順が、バルク参照モード（Ｂモード）で適用される、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２６】
対象からの生体試料のデジタル精製のための方法であって、
（ａ）複数の異なる細胞型から生体高分子を含む生体試料を得ることと、
（ｂ）前記生体試料を処理して、前記生体高分子の特徴プロファイルを生成することであって、前記特徴プロファイルが、前記複数の異なる細胞型に関連する特徴の組み合わせを含む、生成することと、
（ｃ）前記複数の異なる細胞型の中から選択される異なる細胞型に対応する前記特徴プロファイルの断片部分を同定することと、を含む、方法。
【請求項１２７】
前記生体試料がバルク組織を含む、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
（ａ）が、前記生体試料からの細胞の物理的単離を含まない、請求項１２６または１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記生体試料がアーカイブ組織を含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３０】
前記生体試料が、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織または凍結組織を含む、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記生体試料が、血液試料を含むか、または固形組織試料に由来する、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３２】
前記固形組織試料が、腫瘍試料を含む、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記生体高分子が、核酸、タンパク質、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３４】
前記生体高分子が核酸を含む、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記核酸がＲＮＡ分子である、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記核酸がＤＮＡ分子である、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３７】
前記特徴プロファイルが、複数の遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）を含み、前記複数のＧＥＰのそれぞれが、前記複数の異なる細胞型のうちの異なる細胞型に対応する、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１３８】
１つ以上のプログラムを格納する非一時的なコンピュータ可読記憶媒体であって、前記１つ以上のプログラムが、コンピュータシステムの１つ以上のプロセッサによって実行されると、前記１つ以上のプロセッサに、請求項７１、８８、または１０４〜１０７のいずれかに記載の方法を実行させる命令を含む、非一時的なコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１３９】
１つ以上のプロセッサと、１つ以上のプログラムを格納するメモリとを含むシステムであって、前記１つ以上のプログラムが、コンピュータシステムの１つ以上のプロセッサによって実行されると、前記１つ以上のプロセッサに請求項７１、８８、または１０４〜１０７のいずれかに記載の方法を実行させる命令を含む、システム。
【請求項１４０】
個体の疾患を評価する方法であって、
（ａ）疾患を有する、または疾患を有する疑いのある個体から生体試料を得ることと、
（ｂ）請求項７１、８８、または１０４〜１０７のいずれかに記載の方法を実行することにより、前記生体試料中の異なる細胞型の存在量を定量化することと、
（ｃ）前記生体試料中の前記異なる細胞型の前記推定された存在量を、参照生体試料中の前記異なる細胞型の参照存在量と比較することであって、前記参照生体試料は、前記疾患を有する個体のコホートに由来し、前記異なる細胞型の前記推定された存在量は、前記疾患の診断または予後の指標である、比較することと、を含む、方法。
【請求項１４１】
前記参照存在量が、請求項７１、８８、または１０４〜１０７のいずれかに記載の方法を実行することにより定量化される、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
個体の疾患を評価する方法であって、
（ａ）疾患を有する、または疾患を有する疑いのある個体から生体試料を得ることと、
（ｂ）請求項７１、８８、または１０４〜１０７のいずれかに記載の方法を実行することにより、前記生体試料中の異なる細胞型の特徴を決定することと、
（ｃ）前記生体試料中の前記異なる細胞型の前記決定された特徴を、参照生体試料中の前記異なる細胞型の参照特徴と比較することであって、前記参照生体試料は、前記疾患を有する個体のコホートに由来し、前記異なる細胞型の前記特徴は、前記疾患の診断または予後の指標である、比較することと、を含む、方法。
【請求項１４３】
前記参照特徴が、請求項７１、８８、または１０４〜１０７のいずれかに記載の方法を実行することにより決定される、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
対象の疾患の進行を監視する方法であって、請求項７１、８８、または１０４〜１０７のいずれかに記載の方法を第１の時点および第２の時点で実行することを含み、前記第２の時点が、前記第１の時点より後で発生する、方法。
【請求項１４５】
前記第１の時点が、前記疾患について前記対象を治療する前であり、前記第２の時点が、前記疾患について前記対象を治療した後である、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
疾患治療の臨床転帰を予測する方法であって、
（ａ）請求項７１、８８、または１０４〜１０７のいずれかに記載の方法を実行することにより、対象から得られた試料に存在する複数の異なる細胞型のうちの異なる細胞型の存在量を定量化し、前記対象が疾患の治療を受けている、定量化することと、
（ｂ）前記試料中の前記異なる細胞型の前記定量化された存在量と、前記異なる細胞型と前記治療の臨床転帰との所定の関連性とを比較することと、
（ｃ）少なくとも前記比較に基づいて、前記治療の前記臨床転帰を予測することと、を含む、方法。
【請求項１４７】
対象からの生体試料のデジタルサイトメトリーのための方法であって、
（ａ）複数の異なる細胞型から生体高分子を含む生体試料を得ることと、
（ｂ）前記生体試料を処理して、前記生体高分子の特徴プロファイルを生成することであって、前記特徴プロファイルが、前記複数の異なる細胞型に関連する特徴を含む、生成することと、
（ｃ）前記特徴プロファイルを処理して、前記生体試料中の前記複数の異なる細胞型のうちの少なくとも１つを同定することと、
（ｄ）デコンボリューションモジュールを使用して、前記特徴プロファイルを処理して、前記同定された前記複数の異なる細胞型のうちの少なくとも１つに対して細胞型状態を生成することと、を含む、方法。
【請求項１４８】
前記生体試料中の前記同定された前記複数の異なる細胞型のうちの少なくとも１つの存在量を定量化することをさらに含む、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記生体試料を得ることが、前記生体試料からの細胞の物理的単離を含まない、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５０】
前記特徴プロファイルが、複数の遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）を含み、前記複数のＧＥＰのそれぞれが、前記複数の異なる細胞型のうちの異なる細胞型に対応する、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５１】
前記複数のＧＥＰが、前記複数の異なる細胞型のそれぞれの複数の細胞の単一細胞遺伝子発現測定値から生成される、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記単一細胞遺伝子発現測定値が、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ）によって生成される、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記存在量が、前記生体試料中の前記複数の異なる細胞型のうちの前記少なくとも１つの部分的存在量である、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５４】
前記存在量を定量化することが、前記特徴プロファイルと、第２の複数の異なる細胞型についての特徴シグネチャーの参照マトリックスとの間の回帰を最適化することを含み、前記特徴プロファイルが、前記参照マトリックスの線形結合としてモデル化される、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５５】
前記回帰を最適化することが、前記回帰の回帰係数のセットを解くことを含み、前記解が、線形損失関数およびＬ２−ノルムペナルティ関数を最小化する、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記線形損失関数が線形ε不感度損失関数である、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
前記最適化することが、サポートベクトル回帰（ＳＶＲ）または非負行列因子分解（ＮＭＦ）を使用することを含む、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５８】
前記ＳＶＲが、ε−ＳＶＲまたはν（ｎｕ）−ＳＶＲである、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
前記生体試料がバルク組織を含む、請求項１４７〜１５２のいずれかに記載の方法。
【請求項１６０】
前記生体試料が、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織または凍結組織を含む、請求項１４７〜１５２のいずれかに記載の方法。
【請求項１６１】
前記生体試料が、血液試料を含むか、または固形組織試料に由来する、請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
前記固形組織試料が、腫瘍試料を含む、請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６３】
前記生体高分子が、核酸、タンパク質、代謝産物、炭水化物、糖、脂質、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１４７〜１５２のいずれかに記載の方法。
【請求項１６４】
前記生体高分子が核酸を含む、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記核酸がＲＮＡ分子である、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
前記核酸がＤＮＡ分子である、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６７】
前記一括修正手順が、単一細胞参照モード（Ｓモード）で適用される、請求項１４７〜１５２のいずれかに記載の方法。
【請求項１６８】
前記一括修正手順が、バルク参照モード（Ｂモード）で適用される、請求項１４７〜１５２のいずれかに記載の方法。
【請求項１６９】
前記細胞型状態が、高解像度の細胞型状態である、請求項１４７〜１５２のいずれかに記載の方法。
【請求項１７０】
前記細胞型状態が、群レベルの細胞型状態である、請求項１４７〜１５２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年７月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／５３５，６４５号の優先権の利益を主張し、そのすべてが参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
組織は、様々な細胞型で構成された複雑な生態系であり得、その異なる発生起源および機能状態によって区別し得る。組織組成を研究するための戦略は、基礎生物学および医学に重要な洞察をもたらすが、細胞の不均一性の包括的な評価は容易ではない。
【発明の概要】
【０００３】
本開示は、インシリコ組織解剖を実施して、無傷組織のＲＮＡプロファイルから細胞型存在量および細胞型（例えば、細胞型特異的）遺伝子発現を正確に推定するための計算フレームワークを提供する。単一細胞実験または分類された細胞サブセットからの細胞型発現シグネチャーを活用することにより、本開示のシステムおよび方法は、物理的解離、抗体、または生体物質なしで組織組成の包括的なポートレートを提供できる。このようなアプローチには、例えば、データ正規化およびインシリコ細胞精製のクロスプラットフォーム技術を用いて、組織遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）から細胞組成を列挙する方法が含まれ得る。後者により、個々の目的の細胞型のトランスクリプトームを、物理的に分離せずにバルクＲＮＡ混合物からデジタルに「精製」し得る。その結果、細胞分離や予備知識なしで、細胞型遺伝子発現の変化を推測することができる。
【０００４】
ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘと呼ばれるこのフレームワークの技術的性能および臨床的有用性を説明するために、本開示のシステムおよび方法を使用して、（１）単一細胞発現データでバルク組織組成をプロファイリングし、（２）解離せずに、悪性および腫瘍関連の細胞型のＧＥＰを精製し、（３）抗癌療法に関連する細胞型（例えば、細胞型特異的）シグネチャーを探索し得る。これらの結果は、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘが、研究および臨床環境での高解像度の細胞表現型検査の意味合いをもつ、複雑な組織を解読するための有用なツールであることを示す。
【０００５】
ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘプラットフォームの機能は、細胞型の列挙および遺伝子発現精製のための統合フレームワーク、クロスプラットフォームの変動を抑制するための専用の正規化スキーム、およびＲＮＡ混合物を細胞型（例えば、細胞型特異的）発現プロファイルに分離するためのアプローチの改善を含むことができる。これらの結果は、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘが、異なる供給源に由来する発現プロファイルを使用して、組織の不均一性に関する正確なポートレートを提供できることを示す。
【０００６】
一態様では、本開示は、対象からの生体試料のデジタルサイトメトリーのための方法を提供し、その方法は、（ａ）複数の異なる細胞型から生体高分子を含む生体試料を得ることと、（ｂ）該生体試料を処理して、該生体高分子の特徴プロファイルを生成することであって、該特徴プロファイルが、該複数の異なる細胞型に関連する特徴を含む、生成することと、（ｃ）デコンボリューションモジュールを使用して、該特徴プロファイルを処理して、該生体試料中の該複数の異なる細胞型のうちの少なくとも１つの存在量を定量化することであって、該存在量を定量化することが、一括修正手順を適用して該定量化における技術的変動を除去することを含む、定量化することと、を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、該生体試料を得ることは、該生体試料からの細胞（例えば、単一細胞）の物理的単離を含まない。いくつかの実施形態では、該特徴プロファイルが、複数の遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）を含み、該複数のＧＥＰのそれぞれが、該複数の異なる細胞型のうちの異なる細胞型に対応する。いくつかの実施形態では、該複数のＧＥＰが、該複数の異なる細胞型のそれぞれの複数の細胞の単一細胞遺伝子発現測定値から生成される。いくつかの実施形態では、該単一細胞遺伝子発現測定値が、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ）によって生成される。いくつかの実施形態では、該存在量が、該生体試料中の該複数の異なる細胞型のうちの該少なくとも１つの部分的存在量である。いくつかの実施形態では、該存在量を定量化することが、該特徴プロファイルと、第２の複数の異なる細胞型についての特徴シグネチャーの参照マトリックスとの間の回帰を最適化することを含み、該該特徴プロファイルが、該参照マトリックスの線形結合としてモデル化される。いくつかの実施形態では、該回帰を最適化することは、該回帰の回帰係数のセットを解くことを含み、該解は、線形損失関数およびＬ２−ノルムペナルティ関数を最小化する。いくつかの実施形態では、該線形損失関数は、線形ε不感度損失関数である。いくつかの実施形態では、該最適化することが、サポートベクトル回帰（ＳＶＲ）または非負行列因子分解（ＮＭＦ）を使用することを含む。いくつかの実施形態では、ＳＶＲは、ε−ＳＶＲまたはν（ｎｕ）−ＳＶＲである。いくつかの実施形態では、該生体試料はバルク組織を含む。いくつかの実施形態では、該生体試料は、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織または凍結組織を含む。いくつかの実施形態では、該生体試料が、血液試料を含むか、または固形組織試料に由来する。いくつかの実施形態では、該固形組織試料が、腫瘍試料を含む。いくつかの実施形態では、該生体高分子が、核酸、タンパク質、代謝産物、炭水化物、糖、脂質、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、該生体高分子が、核酸を含む。いくつかの実施形態では、前記該酸がＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該該酸がＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該一括修正手順が、単一細胞参照モード（Ｓモード）で適用される。いくつかの実施形態では、該一括修正手順が、バルク参照モード（Ｂモード）で適用される。
【０００８】
別の態様では、本開示は、対象からの生体試料のデジタルサイトメトリーのための方法を提供し、その方法は、（ａ）複数の異なる細胞型から生体高分子を含む生体試料を得ることと、（ｂ）該生体試料を処理して、該生体高分子の特徴プロファイルを生成することと、（ｃ）デコンボリューションモジュールを使用して、該特徴プロファイルを処理して、（ｉ）該生体試料中の該複数の異なる細胞型のうちの少なくとも１つを同定し、（ｉｉ）該同定された該複数の異なる細胞型のうちの少なくとも１つに対して細胞型状態を生成することと、を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、該デコンボリューションモジュールを使用して、該特徴プロファイルを処理して、該生体試料中の該同定された該複数の異なる細胞型のうちの少なくとも１つの存在量を定量化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記生体試料を得ることは、前記生体試料からの細胞（例えば、単一細胞）の物理的単離を含まない。いくつかの実施形態では、該特徴プロファイルが、複数の遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）を含み、該複数のＧＥＰのそれぞれが、該複数の異なる細胞型のうちの異なる細胞型に対応し、該細胞型状態が、細胞型ＧＥＰを含む。いくつかの実施形態では、該複数のＧＥＰが、該複数の異なる細胞型のそれぞれの複数の細胞の単一細胞遺伝子発現測定値から生成される。いくつかの実施形態では、該単一細胞遺伝子発現測定値が、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ）によって生成される。いくつかの実施形態では、該存在量が、該生体試料中の該複数の異なる細胞型のうちの該少なくとも１つの部分的存在量である。いくつかの実施形態では、該存在量を定量化することが、該特徴プロファイルと、第２の複数の異なる細胞型についての特徴シグネチャーの参照マトリックスとの間の回帰を最適化することを含み、該該特徴プロファイルが、該参照マトリックスの線形結合としてモデル化される。いくつかの実施形態では、該回帰を最適化することは、該回帰の回帰係数のセットを解くことを含み、該解は、線形損失関数およびＬ２−ノルムペナルティ関数を最小化する。いくつかの実施形態では、該線形損失関数は、線形ε不感度損失関数である。いくつかの実施形態では、該最適化することが、サポートベクトル回帰（ＳＶＲ）または非負行列因子分解（ＮＭＦ）を使用することを含む。いくつかの実施形態では、ＳＶＲは、ε−ＳＶＲまたはν（ｎｕ）−ＳＶＲである。いくつかの実施形態では、該生体試料はバルク組織を含む。いくつかの実施形態では、該生体試料は、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織または凍結組織を含む。いくつかの実施形態では、該生体試料が、血液試料を含むか、または固形組織試料に由来する。いくつかの実施形態では、該固形組織試料が、腫瘍試料を含む。いくつかの実施形態では、該生体高分子が、核酸、タンパク質、代謝産物、炭水化物、糖、脂質、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、該生体高分子が、核酸を含む。いくつかの実施形態では、前記該酸がＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該該酸がＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該存在量を定量化することが、一括修正手順を適用して該定量化における技術的変動を除去することを含む。いくつかの実施形態では、該一括修正手順が、単一細胞参照モード（Ｓモード）で適用される。いくつかの実施形態では、該一括修正手順が、バルク参照モード（Ｂモード）で適用される。いくつかの実施形態では、該細胞型状態が、高解像度の細胞型状態である。いくつかの実施形態では、該細胞型状態が、群レベルの細胞型状態である。
【００１０】
別の態様では、本開示は、対象からの生体試料のデジタルサイトメトリーのための方法を提供し、その方法は、（ａ）第１の複数の異なる細胞型からの生体高分子を含む複数の生体試料を得ることと、（ｂ）該複数の生体試料のそれぞれについて、該生体試料を処理して、該生体高分子の特徴プロファイルを生成することであって、該特徴プロファイルのそれぞれが、該第１の複数の異なる細胞型に関連する特徴を含み、それによって第１の複数の特徴プロファイルを生成することと、（ｃ）デコンボリューションモジュールを使用して、該第１の複数の特徴プロファイルを処理して、該複数の生体試料のそれぞれについて、該第１の複数の異なる細胞型の中から選択される第２の複数の異なる細胞型の第２の複数の特徴プロファイルを決定し、それによって、該複数の生体試料を、該第２の複数の異なる細胞型の該第２の複数の特徴プロファイルにデコンボリューションすることと、を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、方法は、該デコンボリューションモジュールを使用して、該特徴プロファイルを処理して、該生体試料中の該第２の複数の異なる細胞型のそれぞれのうちの少なくとも１つの存在量を定量化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、該存在量が、該生体試料中の該複数の異なる細胞型のうちの該少なくとも１つの部分的存在量である。いくつかの実施形態では、該生体試料を得ることは、該生体試料からの細胞（例えば、単一細胞）の物理的単離を含まない。いくつかの実施形態では、該第１の複数の特徴プロファイルおよび該第２の複数の特徴プロファイルが、遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）を含み、該ＧＥＰのそれぞれが、該複数の異なる細胞型のうちの異なる細胞型に対応する。いくつかの実施形態では、該複数のＧＥＰが、該複数の異なる細胞型のそれぞれの複数の細胞の単一細胞遺伝子発現測定値から生成される。いくつかの実施形態では、該単一細胞遺伝子発現測定値が、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ）によって生成される。いくつかの実施形態では、該存在量を定量化することが、該特徴プロファイルと、第２の複数の異なる細胞型についての特徴シグネチャーの参照マトリックスとの間の回帰を最適化することを含み、該該特徴プロファイルが、該参照マトリックスの線形結合としてモデル化される。いくつかの実施形態では、該回帰を最適化することは、該回帰の回帰係数のセットを解くことを含み、該解は、線形損失関数およびＬ２−ノルムペナルティ関数を最小化する。いくつかの実施形態では、該線形損失関数は、線形ε不感度損失関数である。いくつかの実施形態では、該最適化することが、サポートベクトル回帰（ＳＶＲ）または非負行列因子分解（ＮＭＦ）を使用することを含む。いくつかの実施形態では、ＳＶＲは、ε−ＳＶＲまたはν（ｎｕ）−ＳＶＲである。いくつかの実施形態では、該生体試料はバルク組織を含む。いくつかの実施形態では、該生体試料は、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織または凍結組織を含む。いくつかの実施形態では、該生体試料が、血液試料を含むか、または固形組織試料に由来する。いくつかの実施形態では、該固形組織試料が、腫瘍試料を含む。いくつかの実施形態では、該生体高分子が、核酸、タンパク質、代謝産物、炭水化物、糖、脂質、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、該生体高分子が、核酸を含む。いくつかの実施形態では、前記該酸がＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該該酸がＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、方法は、該決定された第２の複数の特徴プロファイルを使用して、異なる細胞型特異的特徴を同定することをさらに含み、該同定することは生物学的または機能的グループ化の予備知識を含まない。いくつかの実施形態では、該存在量を定量化することが、一括修正手順を適用して該定量化における技術的変動を除去することを含む。いくつかの実施形態では、該一括修正手順が、単一細胞参照モード（Ｓモード）で適用される。いくつかの実施形態では、該一括修正手順が、バルク参照モード（Ｂモード）で適用される。
【００１２】
別の態様では、本開示は、対象からの生体試料のデジタルサイトメトリーのための方法を提供し、その方法は、（ａ）第１の複数の異なる細胞型から生体高分子を含む生体試料を得ることであって、該生体試料を得ることが、該生体試料からの細胞（例えば、単一細胞）の物理的単離を含まない、得ることと、（ｂ）該生体試料を処理して、該生体高分子の特徴プロファイルｍを生成することであって、該特徴プロファイルが、該第１の複数の異なる細胞型に関連する特徴を含む、生成することと、（ｃ）該特徴プロファイルｍと、第２の複数の異なる細胞型についての特徴シグネチャーの参照マトリックスＢとの間の回帰を最適化することであって、該特徴プロファイルｍが、Ｂの線形結合としてモデル化され、該最適化することが、該回帰の回帰係数のセットを含むｆを解くことを含む、最適化することと、（ｄ）少なくとも該回帰係数のセットに基づいて、該第２の複数の異なる細胞型の中から選択される異なる細胞型の存在量を該生体試料中で定量化することと、を含む。
【００１３】
別の態様では、本開示は、対象からの生体試料のデジタルサイトメトリーのための方法を提供し、その方法は、（ａ）第１の複数の異なる細胞型から生体高分子を含む生体試料を得ることであって、該生体試料がアーカイブ組織を含む、得ることと、（ｂ）該生体試料を処理して、該生体高分子の特徴プロファイルｍを生成することであって、該特徴プロファイルが、該第１の複数の異なる細胞型に関連する特徴を含む、生成することと、（ｃ）該特徴プロファイルｍと、第２の複数の異なる細胞型についての特徴シグネチャーの参照マトリックスＢとの間の回帰を最適化することであって、該特徴プロファイルｍが、Ｂの線形結合としてモデル化され、該最適化することが、該回帰の回帰係数のセットを含むｆを解くことを含む、最適化することと、（ｄ）少なくとも該回帰係数のセットに基づいて、該第２の複数の異なる細胞型の中から選択される異なる細胞型の存在量を該生体試料中で定量化することと、を含む。
【００１４】
別の態様では、本開示は、対象からの生体試料のデジタルサイトメトリーのための方法を提供し、その方法は、（ａ）第１の複数の異なる細胞型から生体高分子を含む生体試料を得ることと、（ｂ）該生体試料を処理して、該生体高分子の特徴プロファイルｍを生成することであって、該特徴プロファイルが、該第１の複数の異なる細胞型に関連する特徴を含む、生成することと、（ｃ）該特徴プロファイルｍと、第２の複数の異なる細胞型についての特徴シグネチャーの参照マトリックスＢとの間の回帰を最適化することであって、該特徴プロファイルｍが、Ｂの線形結合としてモデル化され、該最適化することが、該回帰の回帰係数のセットを含むｆを解くことを含む、最適化することと、（ｄ）少なくとも該回帰係数のセットに基づいて、該第２の複数の異なる細胞型の中から選択される異なる細胞型の存在量を前記生体試料中で定量化することであって、該特徴プロファイルが、複数の遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）を含み、該複数のＧＥＰのそれぞれが、該複数の異なる細胞型のうちの異なる細胞型に対応する、定量化することと、を含む。
【００１５】
別の態様では、本開示は、対象からの生体試料のデジタルサイトメトリーのための方法を提供し、その方法は、（ａ）第１の複数の異なる細胞型から生体高分子を含む生体試料を得ることと、（ｂ）該生体試料を処理して、該生体高分子の特徴プロファイルｍを生成することであって、該特徴プロファイルが、該第１の複数の異なる細胞型に関連する特徴を含む、生成することと、（ｃ）該特徴プロファイルｍと、第２の複数の異なる細胞型についての特徴シグネチャーの参照マトリックスＢとの間の回帰を最適化することであって、該特徴プロファイルｍが、Ｂの線形結合としてモデル化され、該最適化することが、該回帰の回帰係数のセットを含むｆを解くことを含む、最適化することと、（ｄ）一括修正手順を使用して、少なくとも該回帰係数のセットに基づいて、該第２の複数の異なる細胞型の中から選択される異なる細胞型の存在量を該生体試料中で定量化することであって、該一括修正手順が、該参照マトリックスＢと該生体試料との間の技術的変動を除去する、定量化することと、を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、該生体試料はバルク組織を含む。いくつかの実施形態では、該生体試料は、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織または凍結組織を含む。いくつかの実施形態では、該生体試料が、血液試料を含むか、または固形組織試料に由来する。いくつかの実施形態では、該固形組織試料が、腫瘍試料を含む。いくつかの実施形態では、該生体高分子が、核酸、タンパク質、代謝産物、炭水化物、糖、脂質、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、該生体高分子が、核酸を含む。いくつかの実施形態では、前記該酸がＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該該酸がＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該特徴プロファイルが、複数の遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）を含み、該複数のＧＥＰのそれぞれが、該第１の複数の異なる細胞型のうちの異なる細胞型に対応する。いくつかの実施形態では、該複数のＧＥＰが、該第１の複数の異なる細胞型のそれぞれの複数の細胞の単一細胞遺伝子発現測定値から生成される。いくつかの実施形態では、該単一細胞遺伝子発現測定値が、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ）によって生成される。いくつかの実施形態では、該一括修正手順が、単一細胞参照モード（Ｓモード）で適用される。いくつかの実施形態では、該一括修正手順が、バルク参照モード（Ｂモード）で適用される。
【００１７】
別の態様では、本開示は、対象からの生体試料のデジタル分析のための方法を提供し、その方法は、（ａ）第１の複数の異なる細胞型からの生体高分子を含む複数の生体試料Ｍのそれぞれについて、該生体高分子の特徴プロファイルｍを得ることであって、該特徴プロファイルｍのそれぞれが、該第１の複数の異なる細胞型に関連する特徴を含む、得ることと、（ｂ）係数Ｆの複数のセットを含む行列を得ることと、（ｃ）ノイズ閾値手順を使用して、該複数の生体試料Ｍから、少なくとも該複数のセットの係数Ｆに基づいて、該第１の複数の異なる細胞型の中から選択された第２の複数の異なる細胞型の複数の代表的特徴Ｇを決定することであって、該ノイズ閾値手順が、該複数の代表的特徴Ｇの該特徴決定におけるノイズを低減する、決定することと、を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、（ｂ）は、該特徴プロファイルｍのそれぞれと、該第２の複数の異なる細胞型についての特徴シグネチャーの参照マトリックスＢとの間の回帰を最適化することを含み、該特徴プロファイルｍが、Ｂの線形結合としてモデル化され、該最適化することが、該回帰の回帰係数のセットを含むｆを解くことを含み、それによって該複数のセットの係数Ｆを提供する。いくつかの実施形態では、該特徴決定が、信頼できない細胞型特異的遺伝子発現決定を含む。いくつかの実施形態では、該生体試料のそれぞれはバルク組織を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）が、該生体試料からの細胞（例えば、単一細胞）の物理的単離を含まない。いくつかの実施形態では、該生体試料のそれぞれはアーカイブ組織を含む。いくつかの実施形態では、前記生体試料のそれぞれは、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織または凍結組織を含む。いくつかの実施形態では、該生体試料のそれぞれが、血液試料を含むか、または固形組織試料に由来する。いくつかの実施形態では、該固形組織試料が、腫瘍試料を含む。いくつかの実施形態では、該生体高分子が、核酸、タンパク質、代謝産物、炭水化物、糖、脂質、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、該生体高分子が、核酸を含む。いくつかの実施形態では、前記該酸がＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該該酸がＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該特徴プロファイルが、複数の遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）を含み、該複数のＧＥＰのそれぞれが、該第１の複数の異なる細胞型のうちの異なる細胞型に対応する。いくつかの実施形態では、該複数の遺伝子発現プロファイルが、該第１の複数の異なる細胞型のそれぞれの複数の細胞の単一細胞遺伝子発現測定値から生成される。いくつかの実施形態では、該単一細胞遺伝子発現測定値が、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ）によって生成される。
【００１９】
別の態様では、本開示は、対象からの生体試料のデジタル分析のための方法を提供し、その方法は、（ａ）第１の複数の異なる細胞型からの生体高分子を含む複数の生体試料Ｍのそれぞれについて、該生体高分子の特徴プロファイルｍを得ることであって、該特徴プロファイルｍのそれぞれが、該第１の複数の異なる細胞型に関連する特徴を含む、得ることと、（ｂ）複数のセットの係数Ｆを含むマトリックスを得ることと、（ｃ）該複数の生体試料Ｍのそれぞれについて、非負行列因子分解（ＮＭＦ）を実行して、少なくとも該複数のセットの係数Ｆに基づいて、該第１の複数の異なる細胞型の中から選択される第２の複数の異なる細胞型の複数の特徴プロファイルＧを決定することであって、それによって、該Ｆおよび該Ｍを考慮して、該複数の生体試料Ｍを該Ｇにデコンボリューションする、決定することと、を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、（ｂ）は、該特徴プロファイルｍのそれぞれと、該第２の複数の異なる細胞型についての特徴シグネチャーの参照マトリックスＢとの間の回帰を最適化することを含み、該特徴プロファイルｍのそれぞれが、Ｂの線形結合としてモデル化され、該最適化することが、該回帰の回帰係数のセットを含むｆを解くことを含み、それによって該複数のセットの係数Ｆを提供する。
【００２１】
別の態様では、本開示は、対象からの生体試料のデジタル分析のための方法を提供し、その方法は、（ａ）第１の複数の異なる細胞型からの生体高分子を含む複数の生体試料Ｍのそれぞれについて、該生体高分子の特徴プロファイルｍを得ることであって、該特徴プロファイルｍのそれぞれが、該第１の複数の異なる細胞型に関連する特徴を含む、得ることと、（ｂ）複数のセットの係数Ｆを含むマトリックスを得ることと、（ｃ）該複数の生体試料Ｍのそれぞれについて、少なくとも該複数のセットの係数Ｆに基づいて、該第１の複数の異なる細胞型の中から選択される第２の複数の異なる細胞型の複数の細胞存在量Ｇを決定することであって、該決定することが、非負行列因子分解（ＮＭＦ）を実行することを含み、該Ｆおよび該Ｍを考慮して、該複数の生体試料Ｍを該Ｇに分離する、決定することと、を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、（ｂ）は、該特徴プロファイルｍのそれぞれと、該第２の複数の異なる細胞型についての特徴シグネチャーの参照マトリックスＢとの間の回帰を最適化することを含み、該特徴プロファイルｍのそれぞれが、Ｂの線形結合としてモデル化され、該最適化することが、該回帰の回帰係数のセットを含むｆを解くことを含み、それによって該複数のセットの係数Ｆを提供する。いくつかの実施形態では、該ＮＭＦモデルは、部分的観察を含む。いくつかの実施形態では、該生体試料はバルク組織を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）が、該生体試料からの細胞（例えば、単一細胞）の物理的単離を含まない。いくつかの実施形態では、該生体試料はアーカイブ組織を含む。いくつかの実施形態では、該生体試料は、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織または凍結組織を含む。いくつかの実施形態では、該生体試料が、血液試料を含むか、または固形組織試料に由来する。いくつかの実施形態では、該固形組織試料が、腫瘍試料を含む。いくつかの実施形態では、該生体高分子が、核酸、タンパク質、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、該生体高分子が、核酸を含む。いくつかの実施形態では、前記該酸がＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該該酸がＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該特徴プロファイルが、複数の遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）を含み、該複数のＧＥＰのそれぞれが、該複数の異なる細胞型のうちの異なる細胞型に対応する。いくつかの実施形態では、該ＮＭＦモデルは、分割統治アプローチを含む。いくつかの実施形態では、マトリックスＺは、該Ｇと該Ｆの積を含み、該Ｇおよび該Ｚの非対角要素は不明である。いくつかの実施形態では、方法は、該決定された複数の特徴プロファイルＧを使用して、異なる細胞型特異的特徴を同定することをさらに含み、該同定することは生物学的または機能的グループ化の予備知識を含まない。いくつかの実施形態では、該複数の特徴プロファイルＧを決定することが、一括修正手順を利用して該決定における技術的変動を除去することを含む。いくつかの実施形態では、該一括修正手順が、単一細胞参照モード（Ｓモード）で適用される。いくつかの実施形態では、該一括修正手順が、バルク参照モード（Ｂモード）で適用される。
【００２３】
別の態様では、本開示は、対象からの生体試料のデジタル精製のための方法を提供し、その方法は、（ａ）複数の異なる細胞型から生体高分子を含む生体試料を得ることと、（ｂ）該生体試料を処理して、該生体高分子の特徴プロファイルを生成することであって、該特徴プロファイルが、該複数の異なる細胞型に関連する特徴の組み合わせを含む、生成することと、（ｃ）該生体試料中で、該複数の異なる細胞型の中から選択される異なる細胞型に対応する該特徴プロファイルの断片部分を同定することと、を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、該生体試料はバルク組織を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）が、該生体試料からの細胞（例えば、単一細胞）の物理的単離を含まない。いくつかの実施形態では、該生体試料はアーカイブ組織を含む。いくつかの実施形態では、該生体試料は、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織または凍結組織を含む。いくつかの実施形態では、該生体試料が、血液試料を含むか、または固形組織試料に由来する。いくつかの実施形態では、該固形組織試料が、腫瘍試料を含む。いくつかの実施形態では、該生体高分子が、核酸、タンパク質、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、該生体高分子が、核酸を含む。いくつかの実施形態では、前記該酸がＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該該酸がＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該特徴プロファイルが、複数の遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）を含み、該複数のＧＥＰのそれぞれが、該複数の異なる細胞型のうちの異なる細胞型に対応する。
【００２５】
別の態様では、本開示は、コンピュータシステムの１つ以上のプロセッサによって実行されると、該１つ以上のプロセッサに本明細書に開示の方法を実行させる命令を含む、該１つ以上のプログラムを格納する非一時的なコンピュータ可読記憶媒体を提供する。
【００２６】
別の態様では、本開示は、１つ以上のプロセッサを含むシステムと、コンピュータシステムの１つ以上のプロセッサによって実行されると、該１つ以上のプロセッサに本明細書に開示の方法を実行させる命令を含む、該１つ以上のプログラムを格納するメモリと、を提供する。
【００２７】
別の態様では、本開示は、個体の疾患を評価する方法を提供し、（ａ）疾患を有する、または疾患を有する疑いのある個体から生体試料を得ることと、（ｂ）本明細書に開示の方法を実行することにより、該生体試料中の異なる細胞型の存在量を定量化することと、（ｃ）該生体試料中の該異なる細胞型の該推定された存在量を、参照生体試料中の該異なる細胞型の参照存在量と比較することであって、該参照生体試料は、該疾患を有する個体のコホートに由来し、該異なる細胞型の該推定された存在量は、該疾患の診断または予後の指標である、比較することと、を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、該参照量は、本明細書に開示の方法を実施することにより定量化される。
【００２９】
別の態様では、本開示は、個体の疾患を評価する方法を提供し、（ａ）疾患を有する、または疾患を有する疑いのある個体から生体試料を得ることと、（ｂ）本明細書に開示の方法を実行することにより、該生体試料中の異なる細胞型の特徴を決定することと、（ｃ）該生体試料中の該異なる細胞型の該決定された特徴を、参照生体試料中の該異なる細胞型の参照特徴と比較することであって、該参照生体試料は、該疾患を有する個体のコホートに由来し、該異なる細胞型の該特徴は、該疾患の診断または予後の指標である、比較することと、を含む。いくつかの実施形態では、該参照量は、本明細書に開示の方法を実施することにより決定される。
【００３０】
別の態様では、本開示は、対象の疾患の進行を監視する方法であって、本明細書に開示の方法を第１の時点および第２の時点で実行することを含み、該第２の時点が、該第１の時点より後に発生する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、該第１の時点は、該疾患について該対象を治療する前であり、該第２の時点は、該疾患について該対象を治療した後である。
【００３１】
別の態様では、本開示は、疾患治療の臨床転帰を予測する方法を提供し、（ａ）本明細書に開示の方法を実施することにより、対象から得られた試料に存在する複数の異なる細胞型のうちの異なる細胞型の存在量を定量化し、該対象が疾患の治療を受けている、定量化することと、（ｂ）該試料中の該異なる細胞型の該定量化された存在量と、該異なる細胞型と該治療の臨床転帰との所定の関連性とを比較することと、（ｃ）少なくとも該比較に基づいて、該治療の該臨床転帰を予測することと、を含む。
【００３２】
別の態様では、本開示は、対象からの生体試料のデジタルサイトメトリーのための方法を提供し、その方法は、（ａ）複数の異なる細胞型から生体高分子を含む生体試料を得ることと、（ｂ）該生体試料を処理して、該生体高分子の特徴プロファイルを生成することと、（ｃ）該特徴プロファイルを処理して、該生体試料中の該複数の異なる細胞型のうちの少なくとも１つを同定することと、（ｄ）デコンボリューションモジュールを使用して、該特徴プロファイルを処理して、該同定された該複数の異なる細胞型のうちの少なくとも１つに対して細胞型状態を生成することと、を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、該生体試料中の該同定された該複数の異なる細胞型のうちの少なくとも１つの存在量を定量化することをさらに含む。いくつかの実施形態では、該生体試料を得ることは、該生体試料からの細胞（例えば、単一細胞）の物理的単離を含まない。いくつかの実施形態では、該特徴プロファイルが、複数の遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）を含み、該複数のＧＥＰのそれぞれが、該複数の異なる細胞型のうちの異なる細胞型に対応し、該細胞型状態が、細胞型ＧＥＰを含む。いくつかの実施形態では、該複数のＧＥＰが、該複数の異なる細胞型のそれぞれの複数の細胞の単一細胞遺伝子発現測定値から生成される。いくつかの実施形態では、該単一細胞遺伝子発現測定値が、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ）によって生成される。いくつかの実施形態では、該存在量が、該生体試料中の該複数の異なる細胞型のうちの該少なくとも１つの部分的存在量である。いくつかの実施形態では、該存在量を定量化することが、該特徴プロファイルと、第２の複数の異なる細胞型についての特徴シグネチャーの参照マトリックスとの間の回帰を最適化することを含み、該該特徴プロファイルが、該参照マトリックスの線形結合としてモデル化される。いくつかの実施形態では、該回帰を最適化することは、該回帰の回帰係数のセットを解くことを含み、該解は、線形損失関数およびＬ２−ノルムペナルティ関数を最小化する。いくつかの実施形態では、該線形損失関数は、線形ε不感度損失関数である。いくつかの実施形態では、該最適化することが、サポートベクトル回帰（ＳＶＲ）または非負行列因子分解（ＮＭＦ）を使用することを含む。いくつかの実施形態では、ＳＶＲは、ε−ＳＶＲまたはν（ｎｕ）−ＳＶＲである。いくつかの実施形態では、該生体試料はバルク組織を含む。いくつかの実施形態では、該生体試料は、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織または凍結組織を含む。いくつかの実施形態では、該生体試料が、血液試料を含むか、または固形組織試料に由来する。いくつかの実施形態では、該固形組織試料が、腫瘍試料を含む。いくつかの実施形態では、該生体高分子が、核酸、タンパク質、代謝産物、炭水化物、糖、脂質、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、該生体高分子が、核酸を含む。いくつかの実施形態では、前記該酸がＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該該酸がＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、該存在量を定量化することが、一括修正手順を適用して該定量化における技術的変動を除去することを含む。いくつかの実施形態では、該一括修正手順が、単一細胞参照モード（Ｓモード）で適用される。いくつかの実施形態では、該一括修正手順が、バルク参照モード（Ｂモード）で適用される。いくつかの実施形態では、該細胞型状態が、高解像度の細胞型状態である。いくつかの実施形態では、該細胞型状態が、群レベルの細胞型状態である。
【００３４】
本開示の追加の態様および利点は、本開示の例示的な実施形態のみが示され説明される以下の詳細な説明から当業者には容易に明らかになるであろう。理解されるように、本開示は、他の異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、本開示から逸脱することなく、様々な明らかな点について変更可能である。したがって、図面および明細書は、本質的に例示とみなされるべきであり、限定とみなされるべきではない。
【００３５】
（参照による組み込み）
本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同じように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３６】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することにより得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】インシリコサイトメトリーのフレームワークを示す。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘのワークフローには次のものが含まれる。（１）単一細胞または分類された細胞亜集団からＲＮＡをプロファイリングして、所与の組織型で目的の各細胞サブセットを識別することができるバーコード遺伝子からなる「シグネチャーマトリックス」を定義すること、（２）細胞型の割合を推測するために、シグネチャーマトリックスおよび（３）代表的な細胞型の発現シグネチャーをバルク組織ＲＮＡプロファイルに適用すること、（４）関連組織試料（例えば、チェックポイント遮断に対するレスポンダーおよび非レスポンダーからのメラノーマ腫瘍生検）のコホートから各細胞型の複数のトランスクリプトームを精製すること、（５）細胞型存在量および発現変動のデジタルプロファイルを分析して生物学的または臨床的疑問に対処すること、が含まれる。
【図２】単一細胞参照プロファイルを用いたバルク組織デコンボリューションを示す。（２ａ）左：６つの主要な白血球集団が示された、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者の末梢血からのｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑデータを埋め込んでいるｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔ−ＳＮＥ）。右：シグネチャーマトリックス遺伝子のヒートマップ。（２ｂ）一括修正の前後を示した、パネル（２ａ）のＰＢＭＣシグネチャーマトリックスを使用した全血（ｎ＝１２人の健常ドナー）の白血球頻度の列挙。フローサイトメトリーおよび全血球数（ＣＢＣ）によって決定されるグラウンドトゥルース比率と比較して、パフォーマンスをＲＭＳＥで示し、各血液サンプルについて５つの細胞型を評価する。以下の細胞型を評価する。Ｂ細胞（Ｂ）、ＮＫ細胞（ＮＫ）、ＣＤ８  Ｔ細胞（ＣＤ８）、ＣＤ４  Ｔ細胞（ＣＤ４）、および単球（Ｍｏｎｏ）。統計的有意性は、ウィルコクソン符号順位検定を用いて決定した。（２ｃ）２３個の頭頸部扁平上皮癌腫瘍からのｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑデータのｔ−ＳＮＥ図（左）および単一細胞のデコンボリューション性能のテスト手法（右）。Ｍａｃはマクロファージを示し、ＤＣは樹状細胞を示し、ＣＡＦは癌関連線維芽細胞を示し、Ｅｎｄｏは内皮細胞を示し、Ｍｙｏは筋細胞を示す。（２ｄ）パネル（２ｃ）からの２０個のヘルドアウト（ｈｅｌｄ−ｏｕｔ）の頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）腫瘍について、ｓｃＲＮＡ−ＳｅｑおよびＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘデコンボリューションによって測定された細胞型比率の一致。すべての腫瘍ＧＥＰは単一細胞データから再構築された。（２ｅ）多様なシグネチャーマトリックス、組織、およびプラットフォームにわたる細胞サブセット列挙の分析。デコンボリューションは、Ｂモード（ＬＭ２２、ＨＮＳＣＣ、および黒色腫シグネチャーマトリックス）またはＳモード（５’ＰＢＭＣおよび３’ＰＢＭＣシグネチャーマトリックス）一括修正で実行された（図７ａ〜ｈ）。グラウンドトゥルース細胞比率は、ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ（ＨＮＳＣＣ、黒色腫）またはフローサイトメトリーおよびコールターカウンター（血液）によって決定された。グレーバンド内の細胞サブセットは、ピアソン相関（Ｐ＜０．０５）によってグラウンドトゥルースと有意に一致している。シグネチャーマトリックスは、以前に報告されたＬＭ２２を除き、図２５に示す。ＨＮＳＣＣ、頭頸部扁平上皮癌。細胞サブセットの略語：ＤＣ、樹状細胞。Ｍａｓｔ、マスト細胞。Ｅｎｄｏ、内皮細胞。ＣＡＦ、癌関連線維芽細胞。（２ｆ）左：１０人のドナーからの膵島サブセットのｔ−ＳＮＥ図。そのうち５人はｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ、バルクＲＮＡ−Ｓｅｑ、およびＩＨＣによってプロファイリングされた（図８ｆ〜ｉも参照のこと）。右：ＩＨＣに対するｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ（上）およびバルクＲＮＡ−ＳｅｑのＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘデコンボリューション（下）によって定量化された４つの主要な膵島サブセットの頻度の一致を示す散布図。
【図３】代表的な細胞型特異的トランスクリプトームプロファイルの精製を示す。（ａ）インシリコ精製およびグループレベルの細胞型特異的ＧＥＰの検証のためのアプローチ。（ｂ）デジタルに精製された（ｘ軸）および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）精製された（ｙ軸）Ｂ細胞のゲノム全体の発現プロファイルと濾胞性リンパ腫（ＦＬ）リンパ節からのＣＤ８  Ｔ細胞とを比較する散布図。（ｃ）変動の幾何係数（ｃ．ｖ．）（ｘ軸）によって捕捉された、パネル（ｂ）（ｙ軸）中の各遺伝子の予測された発現レベルをその不確実性の関数として示す散布図。（ｄ）（ｂ）と同じであるが、各細胞型のｃ．ｖ．値のトランスクリプトーム全体の分布に基づいてノイズフィルタを適用した後である。（ｅ）フィルタありおよびなしで試料サイズ（ＦＬ）の関数として評価された、３つのＦＬ細胞サブセットの精製されたおよびグラウンドトゥルーストランスクリプトームスピアマンの間の相関。各試料サイズについて、腫瘍を、より大きなコホート（ｎ＝３１９）からの置換なしで１０回サブサンプリングした。データは、箱ひげ図として表される（中心線は中央値を示し、ボックス限界は、上部および下部四分位点を示し、ウィスカーは、１．５倍の四分位範囲を示し、点は、異常値を示す）。（ｆ）３つのＦＬ免疫サブセットの推定したおよびグラウンドトゥルース発現プロファイルを、ＬＭ２２遺伝子のセットを行として、免疫細胞型を列として比較するヒートマップ。発現されると予測されなかったか、または適応ノイズフィルタによって除去された遺伝子は、濃紺色で色付けられる。（ｇ）（ｄ）と同じであるが、免疫（ＣＤ４５＋）、上皮（上皮細胞接着分子陽性、ＥｐＣＡＭ＋）、および３１ＮＳＣＬＣ腫瘍のＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルからデジタルに選別された間質（ＣＤ１０＋またはＣＤ３１＋）細胞型である。グラウンドトゥルースＧＥＰ（ｙ軸）は、ＦＡＣＳ精製集団から得られた。
【図４】細胞型特異的発現の高解像度精製を示す。（４ａ）４つのランダムに混合された免疫サブセットのシリーズについて観察されていない（左）発現データおよび観察された（右）発現データの逸話的例を示す概略図であり、各々が、グラウンドトゥルース差動発現遺伝子（ＤＥＧ）の１つ以上のセットを有する（色付きのブロックのようなパターンによって示される）。（４ｂ）パネルａのバルク組織発現マトリックスに適用されたインシリコ精製の結果。（４ｃ）各細胞型について別々に行われ、ｂにおける各ブロックパターンに対応するクラスによって色分けされた（赤＝最も左のブロック、青＝最も右のブロック）、（ｂ）における精製された発現マトリックスのｔ−ＳＮＥ表現。（４ｄ）左：４つのランダムに混合された免疫サブセットの合成ＧＥＰマトリックスであり、そのうちの１つがブルズアイ（単球）の形状のＤＥＧを含有する。右：インシリコ精製の結果。（４ｅ）試料クラスが既知であるときの合成混合物中のＤＥＧ回収の感受性および特異性の分析。左：所与の倍率変化を有するＤＥＧをＣＤ８  Ｔ細胞の参照プロファイルに追加し、これを所定の割合で３つの他の免疫サブセットのランダム混合物にスパイクした。結腸癌細胞株ＧＥＰを各混合物に添加して、約５０％未知の含有量をシミュレートした。インシリコ精製後、既知のＣＤ８  Ｔ細胞ＤＥＧを、既知のＤＥＧクラスに対する倍率変化によって遺伝子をランク付けすることによって、各精製された細胞型において評価した。ＤＥＧ回収の曲線下面積（ＡＵＣ）を、倍率変化および細胞型スパイクイン画分の各組み合わせについて計算し、ヒートマップとして示した。パネル（４ａ）、（４ｂ）、および（４ｄ）におけるデータを、ヒートマップをレンダリングする前に、各遺伝子についてｌｏｇ２を調整し、中央値を中心にした。
【図５】バルク腫瘍生検の高解像度発現プロファイルを示す。（５ａ）〜（５ｃ）濾胞性リンパ腫（ＦＬ）腫瘍からのＢ細胞におけるＣＲＥＢＢＰ変異関連発現変化の分析。（５ａ）スキーマ。（５ｂ）ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘによって推定されるＣＲＥＢＢＰ変異体ＦＬ  Ｂ細胞ＧＥＰにおけるＭＨＣクラスＩＩ発現の喪失を確認するヒートマップ（左）および散布図（右）。プロットする前に、発現値は中央値が中心であった。（５ｃ）ＣＲＥＢＢＰ変異体ＦＬ腫瘍におけるより低い（左）またはより高い（右）Ｂ細胞発現に関連する公開された遺伝子セットの分析。スキャッタープロットは、中央値を中心にし、ＣＲＥＢＢＰ変異状態によって平均化した後の、デジタルに選別されたＢ細胞ＧＥＰにおける各遺伝子の対応するｌｏｇ２発現を示す。Ｂおよびｃにおけるグループ比較は、ウィルコクソン符号順位検定によって評価した。ＷＴ、野生型（ｎ＝９）；ＭＴ、変異体（ｎ＝１５）。（５ｄ）〜（５ｆ）非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍からの腫瘍細胞サブ集団の高解像度発現プロファイリング。（５ｄ）ＴＣＧＡからの１，０２０個のＮＳＣＬＣ腫瘍ＧＥＰにおける上皮細胞（Ｅｐｉｔｈ．、ＥｐＣＡＭ＋）、免疫細胞（Ｉｍｍ．、ＣＤ４５＋）、線維芽細胞（Ｆｉｂ．、ＣＤ１０＋）、および内皮細胞（Ｅｎｄｏ．、ＣＤ３１＋）の発現シグネチャーをプロファイリングおよび検証するためのスキーマ、（５ｅ）左：１，０２０個のＮＳＣＬＣ腫瘍から推定された集団特異的転写多様性を示すｔＳＮＥプロットであり、腫瘍組織学および隣接する正常組織を示すために色付けされている。プロットを１０に設定されたパープレキシティと共に作成した。右：腫瘍組織学によって色付けされた、対応するＦＡＣＳ精製集団からのＧＥＰのＰＣＡプロット。組織学的差はまた、陰影のある卵巣によっても強調されている。（５ｆ）２０名のＮＳＣＬＣ患者からの対応するＦＡＣＳ精製集団のＴＣＧＡ（左）およびＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルに特定された上皮集団、免疫集団および線維芽細胞集団におけるＤＥＧを示すヒートマップ（右）。中央値の中央化を各細胞集団に別々に適用した。ＬＵＡＤ、肺腺癌、ＬＵＳＣ、肺扁平上皮癌。
【図６】黒色腫におけるドライバ変異状態および免疫療法応答の細胞シグネチャーを示す。（６ａ）〜（６ｂ）黒色腫腫瘍細胞型における変異関連表現型状態の高解像度発現プロファイリング。（６ａ）上部：ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑによってプロファイリングされた８個の主細胞黒色腫腫瘍細胞型を示すｔＳＮＥプロット。下部：ＴＣＧＡからの３０１バルク黒色腫腫瘍におけるコンテキスト依存的発現変異を特徴付けおよび検証するためのスキーマ。（６ｂ）黒色腫におけるキードライバ変異に関連するＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘによって特定された細胞型特異的ＤＥＧを示すヒートマップ。明確性のために、ＴＣＧＡ腫瘍試料（ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ、左）および単一細胞ＧＥＰ（ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ、右）にわたって発現値を平均した。基礎データを、図１９に提供する。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘによって検出されたＤＥＧを有する細胞型および利用可能な単一細胞検証データのみが示される。ＣＡＦ、癌関連線維芽細胞；ＭＴ、変異体；ＷＴ、野生型。（６ｃ）左：正常なＣＤ８  Ｔ細胞参照プロファイルと以下の３つの黒色腫ＣＤ８  ＴＩＬ  ＧＥＰとの間のランクとして表される遺伝子発現の絶対差を示すヒートマップ：「推定された（ＦＦ）」、ＴＣＧＡによって生成された新鮮／凍結（ＦＦ）腫瘍の４７３個のバルクＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルから推定されたグループレベルＣＤ８  ＴＩＬ  ＧＥＰ；「推定された（ＦＦＰＥ）」、４２個のホルマリン固定パラフィン、包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍から予測されたグループレベルＣＤ８  ＴＩＬプロファイル；「ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ」、１９個の黒色腫患者の集約された単一細胞データに由来するグループレベルＣＤ８  ＴＩＬプロファイル。ヒートマップは、「推定された（ＦＦ）」ベクターおよび正常なＣＤ８  Ｔ細胞ＧＥＰのランクの差によって順序付けされる。すべての推定プロファイルは、適応ノイズフィルタによって処理された。ＦＦコホートで予測されるが、ＦＦＰＥコホートでは予測されない遺伝子（ノイズフィルタによる）は、後者では灰色で色付けられる。選択されたＴ細胞疲弊遺伝子が示される。右：ヒートマップにおける遺伝子の順序に対して評価した、以前に公開された黒色腫ＣＤ８  ＴＩＬ関連遺伝子セットの遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）。（６ｄ）単一の参照プロファイルを使用して、バルク黒色腫腫瘍におけるＰＤＣＤ１＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ８  Ｔ細胞の臨床関連性を特徴付けるためのフレームワーク。ＰＤＣＤ１＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ８  Ｔ細胞および残りのＣＤ８  Ｔ細胞は、橙色および濃紺色によって示される。（６ｅ）応答者および非応答者によって分層された、免疫療法を受けた黒色腫患者からのバルク腫瘍発現プロファイルにおけるＰＤＣＤ１＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ８  Ｔ細胞の推定レベル。データは、データ範囲全体を包含するウィスカーを有する箱ひげ図として表される。統計的比較は、マン・ホイットニー検定を用いて行った。（６ｆ）治療前腫瘍におけるＰＤＣＤ１＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ８  Ｔ細胞の推定レベルが高いおよび低い黒色腫患者間の全生存率の差を示すカプラン・マイヤープロット。患者を、ＰＤＣＤ１＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ８  Ｔ細胞の推定画分存在量中央値によって、高グループおよび低グループに分割し、その後、利用可能な全生存率データを有する２つの研究にわたってプールした。統計的有意性は、ログ順位検定によって計算した。ＨＲは、ハザード比を示す。９５％のＨＲ信頼区間を括弧に示す。
【図７】ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘを用いたクロスプラットフォームデコンボリューションを示す。（７ａ）所与の入力シグネチャーマトリックスに対して最も適切なＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ一括修正戦略を選択するための決定木：（ｉ）単一細胞参照モード（「Ｓモード」、パネル（７ｂ）、（７ｅ）、または（ｉｉ）バルク参照モード（「Ｂモード」、パネル（７ｃ）、（７ｆ）〜（７ｈ）。（７ｂ）〜（７ｃ）Ｓモード（７ｂ）およびＢモード（７ｃ）一括修正の概略図。（７ｄ）３’キットおよび５’キットを用いた１０倍のゲノムによってプロファイリングされたＰＢＭＣの２つの一般に入手可能な単一細胞トランスクリプトームデータセットのｔ−ＳＮＥ投影図。細胞標識を、Ｓｅｕｒａｔ  （例えば、ｖ１．４．０．１６）および正規マーカー遺伝子評価を使用して手動で決定し、シグネチャーマトリックスを生成するために使用した。（７ｅ）Ｓモードの評価であって、１０倍のクロム（パネル（７ｄ））によって生成されたＰＢＭＣサブセットの単一細胞参照プロファイルを使用した、健常なドナー（ｎ＝１２個のＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイル）からの全血の白血球デコンボリューションを示す。Ｓモード一括修正の前後のピアソン相関（左）とＲＭＳＥ（右）。グラウンドトゥルース細胞比率は、フローサイトメトリーおよび全血球数によって決定された。グループの差は、ウィルコクソン符号順位検定によって評価した。（７ｆ）Ｂモード一括調整の前後の両方において、ＲＮＡ−Ｓｅｑによってプロファイリングされた固定黒色腫腫瘍試料中のＬＭ２２免疫サブセットを列挙するためにＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘを適用した結果。グラウンドトゥルース比なしの性能を評価するために、選択された白血球サブ集団のデコンボリューション結果を、未調整のＲＮＡ−Ｓｅｑデータにおける正規マーカー遺伝子の発現と比較した。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ結果を、以前に記載されたアプローチを用いて全免疫含有量によってスケーリングし、各腫瘍試料の「正規化された免疫指標」を計算した。（７ｇ）５プラットフォーム、３つの組織型、および新鮮／凍結対固定組織保存状態にわたるＬＭ２２（アフィメトリクスマイクロアレイ）による細胞サブセット列挙に対するＢモード一括修正の影響：凍結保存されたＰＢＭＣ対フローサイトメトリー（ＧＳＥ６５１３３）のＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｂｅａｄｃｈｉｐマイクロアレイ、新鮮な全血対フローサイトメトリー／ＣＢＣのバルクＲＮＡ−Ｓｅｑ（本明細書の他の箇所で開示されるように）、ＦＦＰＥ黒色腫（Ｍｅｌ．）腫瘍対代用細胞マーカーのバルクＲＮＡ−Ｓｅｑ（パネルｂと同じ）、ならびにｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルからの再構築されたバルク黒色腫（Ｍｅｌ）およびＨＮＳＣＣ腫瘍（それぞれＳｍａｒｔ−Ｓｅｑ２；黒色腫瘍およびＨＮＳＣＣ腫瘍からの再構築された単一細胞発現データにおけるＴＩＬサブセット頻度）。点は、各細胞型の予測される画分と推測される画分との間のピアソン相関係数を表し、バープロットは、エラーバーとして表される９５％信頼区間を有する中央値を示す。（７ｈ）左：一括修正後のランクの絶対差によってランク付けした、（ｃ）の同じデータセットにおけるＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ一括修正のトランスクリプトーム全��の影響を示すヒートマップ。右：左パネルのランク付けされた遺伝子リストおよび黒色腫における非造血細胞に高度に特異的である遺伝子のセット（ｎ＝１３９）に対する事前ランク付けされた遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）の適用。遺伝子セットは、非免疫細胞と免疫細胞との間のｌｏｇ２空間において２を超えるシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）を有する遺伝子の黒色腫ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑデータを分析することによって導出された。この分析の前に、単一細胞データを集計して、細胞型ごとに５回のトランスクリプトーム複製を得た。ＮＥＳは、正規化された濃縮スコアを示す。
【図８】単一細胞参照プロファイルを用いた固形腫瘍および膵島の解剖を示す。（８ａ）図２ｄにおける結果の積み重ねられたバープロットの描写であり、単一細胞トランスクリプトームから再構築された２０個のＨＮＳＣＣ腫瘍試料における推定（左）および予測（右）細胞サブセット頻度を示す。（８ｂ）〜（８ｅ）黒色腫腫瘍の単一細胞誘導型デコンボリューション。（ｂ）１９個の黒色腫瘍からのｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑデータのｔ−ＳＮＥ可視化（左）および単一細胞デコンボリューション性能を試験するためのアプローチ（右）。（８ｃ）−（８ｄ）パネル（８ｂ）に関連する、単一細胞データから再構築された１７個のヘルドアウト（ｈｅｌｄ−ｏｕｔ）黒色腫瘍について、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘデコンボリューションによって測定された細胞型比率とｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑとの一致。観察された細胞サブセット比対予測された細胞サブセット比率の積み重ねられたバープロット（左）およびピアソン相関（右）が示される。（８ｅ）ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑによって測定されるような黒色腫ＴＩＬ比率の分析、パネル（８ｂ）のシグネチャーマトリックスを使用した皮膚皮膚黒色腫腫瘍のバルクＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルのデコンボリューション、およびＩＨＣ定量化。（８ｆ）〜（８ｉ）膵島の単一細胞誘導デコンボリューション。（８ｆ）１０個の頭頸部扁平上皮癌腫瘍からのｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑデータのｔ−ＳＮＥ可視化（左）および単一細胞デコンボリューション性能を試験するためのアプローチ（右）。（８ｇ）８個のヘルドアウト（ｈｅｌｄ−ｏｕｔ）の島（左）における９個の膵臓細胞型に関するｓｃＲＮＡ−ＳｅｑおよびＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ比率を、個々の細胞型の対応するピアソン相関係数（右）と比較する散布図。散布図のデータポイントは、バープロット（右）に一致するために細胞型によって色付けされる。（８ｈ）（８ｇ）と同じであるが、バルクＲＮＡ−ＳｅｑおよびｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑによってプロファイリングされた７個の島試料についてである。（ｇ）における再構築された腫瘍を分析するために使用される同じ単一細胞由来のシグネチャーマトリックスを、バルクＲＮＡ−Ｓｅｑ（ｘ軸）によってプロファイルされる同じ島試験片に適用した。顕著な細胞型を楕円で強調する。（ｉ）（１）ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ（注釈された細胞標識を用いて）、（２）単一細胞由来のシグネチャーマトリックス（パネル（８ｆ））を用いたバルク島のＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘデコンボリューション、および（３）非分解島におけるＩＨＣ定量化によって測定されるように、膵島におけるアルファ、ベータ、ガンマ、およびデルタ細胞比率の比較。（８ｅ）および（８ｉ）のデータは、平均＋／−標準誤差として表される。
【図９】バルク組織発現プロファイルにおける特定の細胞サブセットのデコンボリューションのためのデジタルゲーティングの評価を示す。（９ａ）ＰＤＣＤ１＋／ＣＴＬＡ４＋ＣＤ８  Ｔ細胞を、他の８個の主要な黒色腫腫瘍細胞型と共に列挙するための単一細胞由来のシグネチャーマトリックスを作成および検証するためのスキーマ（パネル（ｂ）、左上に示す）。（９ｂ）パネル（９ａ）におけるフレームワークを適用して、ＰＤＣＤ１＋ＣＤ８  Ｔ細胞の性能を試験するもの、ＣＴＬＡ４＋ＣＤ８  Ｔ細胞を評価するもの、および組織レジデントメモリ（ＴＲＭ）ＣＤ８  Ｔ細胞を評価するものの３つの追加のシグネチャーマトリックスを作製した。シグネチャーマトリックス構築から保持された１７個の再構築された黒色腫腫瘍に適用される各シグネチャーマトリックスのデコンボリューション性能を示す棒グラフが示される。各細胞サブセットに対して、推定された細胞比率と既知の細胞比率との間のピアソン相関（および対応する統計的有意性）が提供される。
【図１０】単一細胞誘導型デコンボリューションに対するキーパラメータの影響を示す。（１０ａ）パラメータスィープのスキーマ。細胞比率を推定するためのデコンボリューション性能を、表現型あたりの単一細胞の数、シグネチャーマトリックスあたりのドナーの数、および表現型あたりのマーカー遺伝子の範囲に関して評価した。（１０ｂ）単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑによってプロファイルされた２つの腫瘍型のパネル（１０ａ）におけるパラメータスイープの結果：頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）腫瘍および黒色腫腫瘍。推測された細胞比率と既知の細胞比率との間の一致を、ピアソン相関によって各細胞型について評価し、各パラメータの組み合わせの中央値相関係数を表形式で示す。黄金色および灰色は、それぞれ、より高い相関係数およびより低い相関係数を示す。（１０ｃ）パラメータ範囲の反対端から定義されるシグネチャーマトリックスの一貫性（ＴＣＧＡによってプロファイルされたバルク黒色腫瘍からのグループレベルＧＥＰを解消するためのパネル（１０ｂ）内の緑色および赤色の長方形によって示される）。ピアソン相関は、ｌｏｇ２調整された発現値上で行った。適応フィルタリング後に検出可能な発現を有する遺伝子のみを分析した。
【図１１】グループレベル発現精製に対するキーパラメータの影響を示す。（１１ａ）図３ｄに関連して、３０２個のＦＬ腫瘍試料から得られたＢ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、およびＣＤ４  Ｔ細胞の推定されたグループレベルＧＥＰのブランドアルトマンプロット。整合性は、線形回帰線および整合性相関係数（ＣＣＣ）によって定量的に捕捉される。（１１ｂ）図３ｅに関連して、図３ｅと同じであるが、グループレベルＧＥＰ推定に使用される腫瘍の数の関数としてＣＣＣ値の分布を示す。（１１ｃ）図３ｅに関連するが、発現推定に使用されるＦＬ腫瘍の数に対する検出可能な遺伝子（例えば、非ゼロ発現を有する遺伝子）の数を示す。データは箱ひげ図として表される（中央線、中央値；ボックス限界、上位および下位四分位数；ウィスカー、四分位範囲の１．５倍；点、異常値）。（１１ｄ）３０２個のＦＬ  ＧＥＰから濾胞性ヘルパーＴ細胞のトランスクリプトームを再構築するためのグループレベル発現精製の分析。プロファイルを、図３ｄにおけるＢ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞について説明されるように生成した。パネルａ、ｂ、およびｄにおける推定したＧＥＰを、分析前に適応ノイズフィルタによって処理した。（１１ｅ）図３ｅと同じであるが、分析された混合物試料の数と、適応ノイズフィルタの前後に示される、大規模なＰＢＭＣ試料コホート上の白血球トランスクリプトーム推定の性能との間の関係を示す。試料を、ＰＢＭＣコホート全体（ｎ＝８３）から５回置換せずにサブサンプリングした。ＬＭ２２シグネチャーマトリックスを、細胞型の列挙後およびトランスクリプトーム精製前に、１０個の主な白血球サブセットに崩壊させた。白血球参照プロファイルは、健常なドナーから得られた選別された末梢血液集団に由来し、正規化された。（１１ｆ）（１１ｅ）と同じであるが、非ゼロ発現の遺伝子の回収に対するＰＢＭＣ試料の数の影響を示す。（１１ｅ）および（１１ｆ）の線は、標準誤差を示すエラーバーでの手段として表される。（１１ｇ）および（１１ｈ）（１１ｅ）および（１１ｆ）と同じであるが、同じＰＢＭＣデータセット上の適応ノイズフィルタ（それぞれ、「フィルタされていない」および「フィルタされた」）の前後の両方において、トランスクリプトーム精製（１１ｇ）および非ゼロ発現（１１ｈ）を有するタンパク質コード遺伝子の画分の両方に対する推測された白血球存在量の影響を示す。（ｄ）における線形回帰株を、より低い細胞画分のパフォーマンスへの影響をモデル化するためにｘ＝０に推定した。
【図１２】高解像度発現精製のためのＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘフレームワークおよびアプローチを示す。（１２ａ）（１）細胞比率の列挙（上部）、（２）代表的な細胞型特異的トランスクリプトームの推定（中央）、および（３）高解像度トランスクリプトーム精製（下部）の、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘフレームワーク内の主要な客観的機能。対応する主な図は右に示され、不明な量は橙色で色付けられる。（１２ｂ）高解像度ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘの客観的機能。ここで、Ｍは既知であり、Ｆは以前に推定されており（パネル（ａ）、上部）、推定対象であるＧは、ｎ遺伝子×ｃ混合物試料×ｋ細胞型の３次元マトリックスである。（１２ｃ）簡単な逸話的例によって例示される高解像度ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘの概略図。ここでは、単一遺伝子は、単球およびナイーブＢ細胞において相互排他的な発現パターンを有し、ＣＤ８  Ｔ細胞およびＮＫ細胞において差次的発現を有さない４つの免疫サブセットによって発現される。４つのプロファイルを、バルク混合物ＧＥＰ  Ｍｉにランダムに混合する。アルゴリズムは、５つの主なステップで進む：（ｉ）バルクプロファイルを昇順に選別する。（ｉｉ）選別したベクターを反復ｔによって分割し、ブートストラップドＮＮＬＳをランク付けされたベクターのいずれかの側に適用して、代表的な細胞型特異的発現係数（ｇｔ１およびｇｔ２）を推定する。回帰制約およびウィンドウ長ｗを満たすｔのすべての可能な値についてこのプロセスを繰り返す。（ｉｉｉ）ｔの各値について、ｇｔ１、ｇｔ２、およびＦを使用してＭｉを推測し、Ｍｉの最適な近似をもたらすｇｔ１、ｇｔ２対を選択する。（ｉｖ）遺伝子ｉの発現推定値が各細胞型に対して有意であるかどうかを評価し、その場合、ステップｉｉｉから最適なｇ１およびｇ２対の各細胞型間で発現が有意に異なるかどうかを評価する。（ｖ）ブートトラップされたＮＮＬＳおよびスライドウィンドウを使用してＧ＊ｉの初期推定値を推定し、ステップｉｖに基づいてｇ１、ｇ２を絞り込み、Ｇｉをアンカー係数（調整されたｇ１、ｇ２）に適合し、Ｇｉの推定値を最終化するために元の順序を復元する。
【図１３】バルク組織におけるＤＥＧの発現と比較した単一細胞において特定されたＤＥＧの分析を示す。（１３ａ）いくつかの主要な膵島細胞型（ｘ軸）において、健常なドナーとＩＩ型糖尿病（Ｔ２Ｄ）を有する患者との間の、単一細胞（ｙ軸）から再構築されたバルク島に対する差次的発現遺伝子の倍率変化を示す散布図。単離された細胞型におけるすべてのＤＥＧおよび対応する倍率変化は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｅｇｅｒｓｔｏｌｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｉｓｌｅｔｓ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ  ２４，５９３−６０７（２０１６））によって補足表６に記載されているように得ることができる。バルク島の倍率変化は、（例えば、Ｓｅｇｅｒｓｔｏｌｐｅ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されるように）各膵島試料片中のすべての単一細胞ＧＥＰを合計し、得られたトランスクリプトームをＴＰＭに正規化し、各ＤＥＧの健常試験片とＴ２Ｄ試験片との間のｌｏｇ２倍変化を計算することによって得られた。全体として、細胞型特異的ＤＥＧの９８％は、バルク島で分析されるか、または個々の細胞型で分析されるかにかかわらず、同じ方向で倍率変化を示した。（１３ｂ）（１３ａ）と同じであるが、単離された細胞型（ｘ軸）におけるＤＥＧの倍率変化を、各遺伝子を昇順の発現に選別した後のＴ２Ｄドナーの相対歪み（ｙ軸）と比較する。濃縮を計算するために、Ｔ２Ｄを有する患者が１として表され、健常なドナーが０として表されるように、二元マトリックスを定義した。次いで、各遺伝子について、上位５０パーセンタイルの発現におけるＴ２Ｄ患者の画分を、０．５から差し引いた。したがって、歪みのない遺伝子は０の濃縮を受け、Ｔ２Ｄに対して歪んだ遺伝子は負の値を受け、健常なドナーに対して歪んだ遺伝子は正の値を受けた。これにより、ｘ軸（例えば、健常／Ｔ２Ｄ）における倍率変化方向との均等な比較が可能になった。この分析は、各遺伝子をバルク混合物におけるその発現によって選別することが、細胞型特異的転写異質性を通知することができることを示す。この概念は、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘによる高解像度トランスクリプトーム精製の最初のステップに活用される（図１２ｃ）。
【図１４】重複パターンを有するＤＥＧの高解像度精製を示す。左：４つの免疫サブセットの４００個の合成ＧＥＰ混合物を示すヒートマップであり、それぞれ固有の細胞型特異的ＤＥＧパターン：標的、一連の対角線に整列された正方形、および各々の逆を含む。右：高解像度ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ結果を示すヒートマップ。
【図１５】高解像度発現精製のパラメータスイープを示す。（１５ａ）８個の主な細胞型を含む再構築された黒色腫腫瘍におけるＤＥＧ回収を評価するためのパラメータスイープを描写するスキーマ。（ｉ）ＤＥＧを有する細胞型の総数（１、２、３、．．．、８）、（ｉｉ）腫瘍試料の総数（５０、１００、２００）、および（ｉｉｉ）ＤＥＧのｌｏｇ２倍変化（１、２、および３）を系統的に変化させることによって性能を評価した。図４ｅのようにＤＥＧ回収を評価した。細胞画分を、元のデータセットにおけるそれらの頻度に従って均一にサンプリングした。（１５ｂ）人工ＤＥＧを有する細胞型の数および（下部）ＤＥＧのｌｏｇ２倍変化の関数（上部）として、インシリコ腫瘍における異なる数の既知の細胞型特異的ＤＥＧの回収の曲線下面積（ＡＵＣ）を示すヒートマップ。（１５ｃ）ＡＵＣを除き、（１５ｂ）と同じであり、非ゼロ変異を有する推定した遺伝子に関して計算される。したがって、発現の証拠が不十分な遺伝子は考察から除外される。色付きバーの垂直線は、０．１のＡＵＣ間隔を示す。パネル（１５ｂ）に示されるように、ＤＥＧ回収は非常に特異的であり、１つの細胞型からの既知のＤＥＧが別の細胞型で評価されるとき、誤った検出率は、ランダムな確率（約０．５のＡＵＣ）以下である。より多くの腫瘍試料がプロファイリングされ、より高い倍率変化が評価されるにつれて、ＤＥＧ検出率が増加する。性能の適度な低減は、ＤＥＧを有する細胞型の数の関数としてみなされ得る。しかしながら、これらの結果は、細胞型特異的発現の重要でない証拠を有する遺伝子を含む、すべての遺伝子を反映する。パネル１５（ｃ）に示されるように、可変発現を有する遺伝子間の性能（例えば、非ゼロ変異で推定される）を考慮すると、ＤＥＧ回収のためのＡＵＣは、一貫して高い（平均＝０．９３、標準偏差＝０．０４）。
【図１６】ＤＬＢＣＬ分子サブタイプの高解像度精製を示す。（１６ａ）びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）腫瘍（例えば、Ｌｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｌａｒｇｅ−Ｂ−Ｃｅｌｌ  Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５９，２３１３−２３２３（２００８）、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって記載されるような、ＧＣＢ／ＡＢＣ  ＤＬＢＣＬ、ＣＨＯＰコホート）を、高解像度精製によって解剖するスキーマ。（１６ｂ）左：ＤＬＢＣＬ腫瘍からデジタルに精製したＢ細胞トランスクリプトーム内のＡＢＣとＧＣＢ  ＤＬＢＣＬとの間で特定されたＤＥＧを示すヒートマップ。試料は、以前に注釈されたサブタイプによってグループ化される。右：左パネルと同じ順序で同じ遺伝子を示すヒートマップであるが、健常なドナーに由来する生殖中心細胞および活性化Ｂ細胞について示されている。両方のヒートマップにおける発現データを、ヒートマップをレンダリングする前に、各遺伝子についてｌｏｇ２を調整し、中央値を中心にした。（１６ｃ）バルクＤＬＢＣＬ腫瘍とデジタルに精製されたＢ細胞とを比較する、以前に公開されたマーカー遺伝子に対するＧＣＢとＡＢＣ  ＤＬＢＣＬ  との間の差次的発現の有意性（−ｌｏｇ１０ｐ値は、同等でない変異を有する両側非対応ｔ検定から）。グループ間の統計的有意性は、両側対ｔ検定を用いて決定した。デジタルに精製されたＢ細胞における非ゼロ発現を有するマーカー遺伝子のみを評価した（１４４個の遺伝子のうちｎ＝１４１個；ＳＰＩＮＫ２、ＴＯＸ２、およびＦＡＭ４６Ｃを他の細胞型に割り当てた）。
【図１７】相関ベースのアプローチに対する高解像度精製の相対有用性を示す。（１７ａ）マイクロアレイによってプロファイルされた活性化および生殖中心Ｂ細胞を区別するＤＥＧの識別および評価のためのスキーマ。（１７ｂ）パネル（１７ａ）に記載されているように識別されたＤＥＧを示すヒートマップ。（１７ｃ）１５０個のバルクＤＬＢＣＬ腫瘍（例えば、Ｌｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されるような、ＧＣＢ／ＡＢＣ  ＤＬＢＣＬ、ＣＨＯＰコホート）における（１７ｂ）（行）からの各遺伝子と最も相関する細胞型（１０個の評価された免疫サブセット；列）を示すヒートマップ。示された系統に崩壊したＬＭ２２画分を使用して、各遺伝子の非対数発現ベクターと、すべてのバルク腫瘍にわたる各細胞型の推定した画分存在量との間のピアソン相関として相関を計算した。遺伝子は、パネル（１７ｂ）および（１７ｃ）において同一に順序付けされる。（１７ｄ）および（１７ｅ）以前に注釈された分子サブタイプ（ＡＢＣ  ＤＬＢＣＬ、青色；ＧＣＢ  ＤＬＢＣＬ、橙色）によって色付けされた、ＤＬＢＣＬ腫瘍における５個の最も存在する細胞型間の転写変異（ｌｏｇ２調整）を示すＰＣＡプロット。パネル（１７ｄ）における各ＰＣＡプロットは、パネル（１７ｃ）における各遺伝子をその最も相関する細胞型に比類なく割り当てることによって生成された（例えば、Ｂ細胞には、（１７ｃ）の最も左側の列で黄色で強調された遺伝子のみが使用された）。パネル（１７ｅ）における各プロットは、ＰＣＡを高解像度発現精製の出力に適用することによって生成し、これを相関ベースの戦略と同じ１５０個のバルクＤＬＢＣＬ腫瘍ＧＥＰ上で実行し、フィルタリングして、分析を同じ１，１００個のＤＥＧ（パネル（１７ａ）に記載されるように特定した）に限定した。
【図１８】以前の方法に対する高解像度遺伝子発現精製のベンチマーキングを示す。（１８ａ）生殖中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）と活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬとの間のＢ細胞において識別されたＤＥＧの分析（Ｌｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されるように、ｎ＝１５０個の腫瘍；ＧＣＢ／ＡＢＣ  ＤＬＢＣＬ、ＣＨＯＰコホート）。ＤＥＧの偽発見率（ＦＤＲ）（ｙ軸）および数（ｘ軸）に関連する高解像度精製およびｃｓＳＡＭの性能を示す。ＬＭ２２を用いて細胞比率推定値を得て、同じ推定値を両方の方法への入力として用いた。ＧＣＢおよびＡＢＣ標識をｃｓＳＡＭへの入力として提供したが、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘはクラス標識の事前知識なしに実行した。ＧＣＢとＡＢＣ  ＤＬＢＣＬとの間のＤＥＧを特定するために、マイクロアレイの有意性分析（ＳＡＭ）をＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ結果に適用した。両方の方法について、Ｓａｍを１００個の順列で実行した。（１８ｂ）健常なドナーに由来する活性化または生殖中心Ｂ細胞ＧＥＰにおけるそれらの濃縮についてＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘで指定されたＤＥＧ（パネル（１８ａ）から）の遺伝子セット濃縮分析。ＮＥＳ、正規化濃縮スコア。（１８ｃ）ＮＳＣＬＣ腫瘍の１８個のバルクＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルからの上皮細胞の試料レベルＧＥＰ推定のためのＩＳＯｐｕｒｅに対するＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘのベンチマーキングのためのスキーマ。（１８ｄ）パネル（１８ｃ）からの各推定した上皮トランスクリプトームを、ピアソン相関によって同じ患者からのその対応するＦＡＣＳ精製ＧＥＰに対して比較し、結果を箱ひげ図（１８個の試料）として示す。方法間の差異を、ウィルコクソン符号順位検定によって評価した。（１８ｅ）１８個のバルクＮＳＣＬＣ腫瘍のバルクＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルから精製された４個の主要細胞サブセットのトランスクリプトームを推測するための高解像度ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘの精度。性能を評価するために、各試料レベルトランスクリプトームを、（ｉ）対応する未選別バルク腫瘍および（ｉｉ）同じ患者由来の対応するＦＡＣＳ精製細胞サブセットのＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルと比較した。細胞選別スキームは、図５ｄに提供される。グループ比較を、ウィルコクソン符号順位検定によって評価した。
【図１９】黒色腫腫瘍細胞サブセットにおけるドライバ変異関連ＤＥＧの予測および検証を示す。図６ｂに関連して、バルク黒色腫腫瘍（ＴＣＧＡ）の高解像度精製によって識別されるように、（１９ａ）ＢＲＡＦまたは（１９ｂ）ＮＲＡＳ変異状態に関連する細胞型特異的ＤＥＧを示すヒートマップ。結果は、ＴＣＧＡからのインシリコ精製されたトランスクリプトーム（左）および検証コホートにおけるｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイル（右）について示される。遺伝子は、デジタルに精製されたトランスクリプトームにおける変異型グループと野生型グループとの間のそれらのｌｏｇ２倍変化によって、上から下に組織化される。上位３００個の過剰発現または低発現遺伝子のみが示される。発現の希薄性のため、ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルもまた、離れた右の変異状態によって平均化される。プロットする前に、遺伝子レベル発現データを、ｌｏｇ２空間でＺスコア正規化した。
【図２０】新鮮／凍結されたおよび固定された黒色腫腫瘍から推定されたＴＩＬ  ＧＥＰの比較を示す。白血球トランスクリプトーム細胞を、新鮮／凍結（ＴＣＧＡ；ｎ＝４７３個の腫瘍）の独立コホートからのＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘで推定し、ＲＮＡ−Ｓｅｑによってプロファイリングされたバルク黒色腫腫瘍を固定した（ｎ＝４２個の腫瘍）（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｖａｎ  Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＣＴＬＡ−４  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５０，２０７−２１１（２０１５）によって記載されるように）。非ゼロ発現を有する遺伝子のみが示される。ＬＭ２２シグネチャーマトリックスを、細胞型の列挙後およびトランスクリプトーム精製前に、１１個の主な白血球サブセットに崩壊させた。両方のデータセットに適応ノイズフィルタを適用した。ＳＫＣＭは皮膚皮膚黒色腫を示す。
【図２１】黒色腫患者におけるＰＤＣＤ１＋／ＣＴＬＡ４＋ＣＤ８  Ｔ細胞の生存率分析を示す。（２１ａ）９個の腫瘍細胞サブセットを区別する単一細胞由来の黒色腫シグネチャーマトリックス（図９ｂ、左上）と、ｎＣｏｕｎｔｅｒ  ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇプラットフォームとの間の重複を示すベン図（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｙｉｅｌｄｓ  ｉｎｓｉｇｈｔ  ｉｎｔｏ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（２０１６）によって記載されるように）。（２１ｂ）図９ｂ（左上パネル）と同じ分析であるが、パネル（２１ａ）に関連するＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒアッセイと重複する２４５個のシグネチャーマトリックス遺伝子を使用する。すべての腫瘍はシグネチャーマトリックス構築からヘルドアウト（ｈｅｌｄ−ｏｕｔ）単一細胞ＧＥＰから再構築された。（２１ｃ）〜（２１ｆ）免疫チェックポイント遮断に対する応答を予測するための遺伝子発現シグネチャー対デコンボリューション。（２１ｃ）ＰＣＤＣ１＋／ＣＬＴＡ４＋ＣＤ８  Ｔ細胞の推定レベルと、データセットにおける全生存率との間の関係を示すカプラン・マイヤー生存率プロット（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｖａｎ  Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．およびＮａｔｈａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｎｅｏｅｐｉｔｏｐｅ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｍｅｌａｎｏｍａｓ  Ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＣＴＬＡ−４  Ｂｌｏｃｋａｄｅ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１６）によって記載されるような）。各データセットにおけるそれらの中央値によって、ＰＣＤＣ１＋／ＣＬＴＡ４＋ＣＤ８  Ｔ細胞レベルを分層した。（２１ｄ）抗ＣＴＬＡ４療法で治療した黒色腫患者における全生存率を予測するための、ＰＤＣＤ１＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ８  Ｔ細胞のデコンボリューションを代用遺伝子発現シグネチャーと比較するカプラン・マイヤープロット。遺伝子発現および推定した画分の両方を、中央値分割によって分層し、有意性を、ログランク検定によって評価した。遺伝子発現シグネチャーを、ＰＤＣＤ１、ＣＴＬＡ４、およびＣＤ８Ａ（中央）またはＰＤＣＤ１およびＣＴＬＡ４（右）の幾何平均として計算した。（２１ｃ）および（２１ｄ）における統計的有意性は、ログ順位検定を用いて決定した。ＨＲは、ハザード比を示す。９５％のＨＲ信頼区間を括弧に示す。（２１ｅ）免疫療法に対する応答とＰＤＣＤ１＋ＣＴＬＡ４＋ＣＤ８  Ｔ細胞レベルまたは発現シグネチャーとの二元関連性（パネル（２１ｄ）と同じ）。有意性は、ウィルコクソンの順位和検定で評価し、−ｌｏｇ１０ｐ値として表す。（２１ｆ）抗ＣＴＬＡ４療法に対する応答の持続時間と、データセット内の細胞型存在量（左）またはｌｏｇ２  ＦＰＫＭ（１００万個あたりのトランスクリプトームのキロベースあ���りの断片）空間（右）における選択された遺伝子の平均発現のＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ推定値との間のスピアマン相関（例えば、Ｎａｔｈａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されるような）。
【図２２】本開示の方法を実装するようにプログラムまたはそうでなければ構成されたコンピュータシステムを示す。
【図２３】ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘを用いたクロスプラットフォームデコンボリューションを示す。（２３ａ）所与の入力シグネチャーマトリックスに対して最も適切なＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ一括修正戦略を選択するための決定木：（１）単一細胞参照モード（「Ｓモード」、パネル（２３ｇ）〜（２３ｉ）、または（２）バルク参照モード（「Ｂモード」、パネル（２３ｄ）〜（２３ｆ）。（２３ｂ〜ｃ）Ｓモード（２３ｂ）およびＢモード（２３ｃ）一括修正の概略図。（２３ｄ）図２ｂからのシグネチャーマトリックスおよび混合物データセットを用いたデコンボリューション性能の分析であるが、技術的変動を克服するためのＢモードおよびＳモード一括修正の相対有用性を比較する。（２３ｅ）３’キットおよび５’キットを用いた１０倍のゲノムによってプロファイリングされたＰＢＭＣの２つの一般に入手可能な単一細胞トランスクリプトームデータセットのｔ−ＳＮＥ投影図。細胞標識を、Ｓｅｕｒａｔ（例えば、ｖ１．４．０．１６）および正規マーカー遺伝子評価を使用して手動で決定し、２個のシグネチャーマトリックス、３’ＰＢＭＣ、および５’ＰＢＭＣを生成するために使用した。（２３ｆ）パネル（２３ｅ）からのデータセット間のプラットフォーム特異的一括効果を示すｔ−ＳＮＥプロット。（２３ｇ）〜（２３ｊ）単一細胞トランスクリプトームデータに由来する細胞型参照プロファイルを調整するためのＳモードの評価。（２３ｇ）パネル（２３ｅ）内のデータセットを使用して、異なる１０倍のクロムキット（パネル（２３ｆ）に由来する参照プロファイル間の技術的変動を最小限にするためのＳモードの適用を例示する、実験的アプローチの概略図。ここで、３’キットからのシグネチャーマトリックスを、５’キットに由来する再構成された血液試料に適用した。Ｓモード一括修正後、調整された３’細胞型参照プロファイルは、ヒートマップ（２３ｈ）およびピアソン相関（２３ｉ）によって示されるように、５’キットからのそれらの対応する参照プロファイルとより密接に整列される。（２３ｊ）（２３ｇ）と同じであるが、５’ＰＢＭＣ単一細胞データセットをマイクロアレイによってプロファイルされた選別された白血球サブセットで置き換える。細胞サブセットは、パネル（２３ｉ）のように色付けされる。パネル（２３ｇ）〜（２３ｊ）では、３’ＰＢＭＣシグネチャーマトリックス内の遺伝子のみを、各細胞型の参照プロファイルとして考慮した。（ｋ）１０倍のクロムによって生成されたＰＢＭＣサブセットの単一細胞参照プロファイルを用いた、健常なドナー由来の全血の白血球デコンボリューション（ｎ＝１２個のＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイル）を示す、Ｓモードの評価。Ｓモード一括修正の前後のピアソン相関（左）とＲＭＳＥ（右）。グラウンドトゥルース細胞比率は、フローサイトメトリーおよび全血球数によって決定された。グループの差は、ウィルコクソン符号順位検定によって評価した。（２３ｌ）５プラットフォーム、３つの組織型、および新鮮／凍結対固定組織保存状態にわたるＬＭ２２（アフィメトリクスマイクロアレイ）による細胞サブセット列挙に対するＢモード一括修正の影響：凍結保存されたＰＢＭＣ対フローサイトメトリー（ＧＳＥ６５１３３）のＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｂｅａｄｃｈｉｐマイクロアレイ、新鮮な全血対フローサイトメトリー／ＣＢＣのバルクＲＮＡ−Ｓｅｑ（本明細書の他の箇所で開示されるように）、ＦＦＰＥ黒色腫（Ｍｅｌ．）腫瘍対代用細胞マーカーのバルクＲＮＡ−Ｓｅｑ、ならびにｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルからの再構築されたバルク黒色腫（Ｍｅｌ）およびＨＮＳＣＣ腫瘍（それぞれＳｍａｒｔ−Ｓｅｑ２；黒色腫瘍およびＨＮＳＣＣ腫瘍からの再構築された単一細胞発現データにおけるＴＩＬサブセット頻度）。点は、各細胞型の予測されるレベルと推測されるレベルとの間のピアソン相関係数を表し、バープロットは、エラーバーとして表される９５％信頼区間を有する中央値を示す。評価可能な細胞型およびグラウンドトゥルース推定の詳細は、本明細書の他の箇所で提供される。ＦＦＰＥ黒色腫のグラウンドトゥルース比率なしの性能を評価するために、選択された白血球サブ集団のデコンボリューション結果を、未調整ＲＮＡ−Ｓｅｑデータ（ＰＴＰＲＣ対推測免疫含有量、ＣＤ１９対Ｂ細胞、ＣＤ３Ｄ対Ｔ細胞、ＣＤ８Ａ対ＣＤ８  Ｔ細胞、ＣＤ６８対単球／マクロファージ）における正規マーカー遺伝子の発現と比較し、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ結果を、総免疫によってスケーリングして、各腫瘍試料について「正規化免疫指標」を計算した。パネル（２３ｄ）、（２３ｉ）、および（２３ｊ）におけるデータは、平均＋／−標準偏差として表される。
【図２４】Ｓモード一括修正の概略図を示す。
【図２５】発現推定に使用されるＬＭ２２表現型グループ化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明の様々な実施形態が本明細書に示され説明される一方で、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかである。本発明から逸脱することなく、多数の変形、変化、および置換は当業者にとって思い当たり得る。本明細書に記載された本発明の実施形態の様々な代替が使用され得ることを理解するべきである。
【００３９】
定義
本明細書に別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明の属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に説明されるものと類似のまたは等価の任意の方法および材料を本発明の実施または検査に使用することができ、好ましい方法および材料を説明する。
【００４０】
本明細書で言及されるすべての特許および刊行物（そのような特許および刊行物内に開示されているすべての配列を含む）は、参照により明示的に組み込まれる。
【００４１】
本明細書で提供される見出しは、本発明の様々な態様または実施形態の限定ではない。したがって、直下に定義される用語は、全体として本明細書を参照することでより完全に定義される。
【００４２】
別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明の属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。それでも、明確さと参照の容易さのために、特定の用語を以下に定義する。
【００４３】
「複数」には、少なくとも２つのメンバーが含まれる。特定の場合では、複数は、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、または少なくとも１０９以上のメンバーを有し得る。
【００４４】
本明細書で使用される「物理システム」という用語は、要素（分子、細胞、組織、生物、電気回路、デバイス、電化製品、コンピュータ、車両、建物など）の集合を指し得、要素が直接的または間接的に、相互に機能的に関連している（例えば、システムの１つの要素の存在、位置、または活動が、システム内の別の要素の存在、位置、または活動に直接的または間接的に影響する）。いくつかの場合では、物理的システムは物理的試料である。
【００４５】
本明細書で使用される「物理的試料」という用語は、採取物が得られた環境からコヒーレント単位として物理的に単離され得る物質のあらゆる採取物（例えば、液体、気体形態の固体）を指し得る。本明細書で使用される「生体試料」という用語は、生物から得るか、生物を含むか、またはその一部を含むか（例えば、生物の組織試料、生検、細胞試料）のいずれかの物理的試料（例えば、固体または液状）を指す。生体試料は、細胞培養物または生物から得られ得る。生体試料は、生体試料の１つ以上の成分を除去することにより精製され得る。
【００４６】
本明細書で使用される「異なる成分」という用語は、あらゆる形態の物質（例えば、分子、化合物、タンパク質、核酸、細胞など）、またはその採取物を指し、経験的に決定された１つ以上の性質および／または機能的関連性に基づいて群に分類される。各異なる成分は、経験的に決定された１つ以上の性質および／または機能的関連性を共有する１つ以上のメンバーを有し得る。
【００４７】
本明細書で使用される「細胞サブセット」という用語は、その存在がＲＮＡレベルでの遺伝子発現、タンパク質発現、ゲノム変異、バイオマーカーなど、１つ以上の特徴によって特徴付けられる生体試料中のあらゆる細胞群を指し得る。細胞サブセットは、例えば、細胞型または細胞サブタイプであり得る。
【００４８】
本明細書で使用される「細胞サブセットの推定相対比率」または「細胞サブセットの相対比率のベクトル」という用語は、細胞サブセットのそれぞれの相対比率を指し得る（例えば、主題の方法の実施形態によって推定されるように）。このように、各細胞サブセットの相対比率は、ベクトルとして理解され得る（各細胞サブセットは該ベクトルの異なる次元である）。本明細書で使用される場合、「細胞サブセットの相対比率」とは、別の細胞サブセット、他の細胞サブセット、または相対比率が推定されているすべての細胞サブセットに対する細胞サブセットの比率（例えば、存在量）を指す。
【００４９】
本明細書で使用される「特徴」という用語は、経験的に決定された、物理的試料または物理的システム（例えば、物理的試料、生体試料など）の特性を指し得る。いくつかの場合では、特徴の存在量（例えば、値）は、試料または物理的システム中の異なる成分の存在量を示し得る（例えば、生体試料中の１つ以上の細胞サブセットの存在量を示す）。いくつかの場合では、特徴は、ｍＲＮＡでの遺伝子発現、タンパク質発現、特定の遺伝子型、バイオマーカー、またはそれらの組み合わせを含む。
【００５０】
本明細書で使用される「特徴プロファイル」という用語は、物理的試料（例えば、生体試料）または物理的システム中の特徴の集合の測定値のセットを指し得る。物理的試料または物理システムが複数の異なる成分を含む場合、任意の所与の特徴の測定値は、存在する各異なる成分の量に応じて、特徴に対する各異なる成分の寄与の組み合わせ（例えば、線形和などの合計）であり得る。特徴プロファイルは、特徴のそれぞれの測定値に対応する要素をもつベクトルｍで表し得る。
【００５１】
本明細書で使用される生体試料の「特徴プロファイル」という用語は、生体試料の特徴の集合の測定値を指し得る。試料の特徴プロファイルの例には、「遺伝子発現プロファイル」または「ＧＥＰ」（例えば、マイクロアレイ分析によって得られる）、タンパク質発現プロファイル、遺伝子型プロファイル（例えば、不均一な腫瘍細胞を有する試料のもの）、バイオマーカープロファイル（例えば、試料中の遊離バイオマーカーまたは試料の細胞中／細胞上のバイオマーカー）、ＤＮＡメチル化プロファイル（例えば、メチル化のレベルまたは変化が異なるＤＮＡを含む細胞を有する試料のもの）などが含まれる。特徴プロファイルは、１つ以上の細胞型、組織型、または細胞期の状態を表し得る。状態は、細胞型特異的、組織型特異的、または細胞期特異的であり得る。状態は、例えば、遺伝子発現プロファイル、タンパク質発現プロファイル、遺伝子型プロファイル、バイオマーカープロファイル、または特定の細胞型、組織型、または細胞ステージのＤＮＡメチル化プロファイルに対応し得る。状態は、本明細書の他所に記載のとおり、群レベルの状態または高解像度の状態であり得る。例えば、ＤＮＡメチル化プロファイルは、細胞特異的、組織特異的、および／または細胞期特異的であり得、したがって、特徴プロファイルには、細胞型、組織型などにわたるＤＮＡメチル化プロファイルが含まれ得る。
【００５２】
本明細書で使用される「特徴シグネチャー」という用語は、実質的に純粋なまたは高度に濃縮された異なる成分のメンバーの集合の特性（または代表）である特徴プロファイルを指し得る。複数の異なる要素の特徴シグネチャーの群は、マトリックスＢで表し得る。マトリックス内の１つの異なる要素は、特徴シグネチャーに、別の異なる要素と同じ特徴のセット有しても有さなくてもよい。
【００５３】
本明細書で使用される「細胞サブセット参照プロファイル」または「細胞サブセット特徴プロファイル」という用語は、特定の細胞サブセットに関連する特徴プロファイル（例えば、特徴の値）を指し得る。参照プロファイルは、精製または濃縮された細胞サブセットの特徴を測定することで取得し得る。いくつかの場合では、本明細書で使用される「細胞サブセット特徴シグネチャーの参照マトリックス」という用語は、複数の細胞サブセットの予想される特徴値のマトリックスを指す。一部の参照プロファイルは、「多重共線性」すなわち異なる細胞サブセットの参照プロファイルが高度に相関し、信頼性の高いデコンボリューションを防ぐことができる現象を示す。
【００５４】
本明細書で使用される「デコンボリューション」という用語は、細胞サブセットまたは細胞集団の混合物中の細胞サブセットまたは細胞集団の相対比率または存在量（例えば、絶対的または部分的存在量）を同定する（例えば、推定する）プロセスを指し得る。
【００５５】
「部分的表現」、「相対比率」、および「寄与」という用語は、特徴シグネチャーの参照マトリックスに含まれる異なる成分のすべてに起因する特徴の合計値に対する、異なる成分に起因する特徴の測定値の部分を指すために交換可能に使用され得る。
【００５６】
本明細書で使用される「サブセット」という用語は、初期マトリックスまたはベクトルの１つ以上の次元（例えば、特徴数）を減らすことにより得られるマトリックスまたはベクトル（例えば、特徴プロファイル）を指し得る。本明細書で使用される「スーパーセット」は、初期マトリックスまたはベクトルの１つ以上の次元を増加させることにより得られるマトリックスまたはベクトルを指し得る。「親マトリックス」または「親ベクトル」は、マトリックスまたはベクトルのスーパーセットを指し得る（例えば、「子」マトリックスまたはベクトル）。いくつかの場合では、親特徴プロファイルは、より多くの特徴を有することにより、親がスーパーセットである特徴プロファイルと異なる。
【００５７】
本明細書で使用される「再構成された特徴プロファイル」または「デコンボリューション結果」という用語は、異なる成分（例えば、細胞サブセット）および既知の参照マトリックスの推定相対比率（または表示割合）に基づいて計算された特徴プロファイルを指し得る。具体的には、再構成された特徴プロファイルは、異なる成分の推定相対比率、例えば、細胞サブセット（または「細胞サブセットの相対比率のベクトル」）と参照マトリックスの積から計算され得る。
【００５８】
本明細書で使用する「サポートベクトル回帰」または「ＳＶＲ」という用語は、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）のインスタンス、バイナリ分類問題の最適化方法のクラスを指し得、両方のクラスを最大限に分離する超平面が発見される。サポートベクトルは、超平面境界を決定する入力データのサブセットである。標準ＳＶＭとは異なり、ＳＶＲは入力データポイントに超平面を適合させて回帰を実行し、許容誤差ｅおよび一意の線形誤差ペナルティ（例えば、ε不感度損失関数）の範囲内で回帰を実行して、異常値および過剰適合に比較的。ＳＶＲの２つの主要タイプは、「ｎｕサポートベクトル回帰」（または「ν−ＳＶＲ」）および「イプシロン−サポートベクトル回帰」（またはε−ＳＶＲ）である。ν−ＳＶＲでは、νパラメータはトレーニング誤差ｅの上限とサポートベクトルの希薄性の両方を便利に制御する。
【００５９】
本明細書で使用される「モンテカルロサンプリング」という用語は、未知の確率論的エンティティにわたる分布を得るための反復ランダムサンプリングを指し得る。
【００６０】
本明細書で使用される「有意値」という用語は、帰無仮説が真であると仮定して結果を得ることの確率を指し得る。特定の実施形態では、帰無仮説は、シグネチャーマトリックス内の細胞サブセットが生体試料の所与の特徴プロファイルに表されないことである。特定の態様では、有意値は「ｐ値」であり得、それは本明細書で使用する場合、帰無仮説が真であると仮定して、実際に観察された結果に対して少なくとも極端なものとして、または近いものとして、試験統計結果を得ることの確率である。
【００６１】
本明細書で使用される「差測定値」という用語は、２つの値またはベクトル間の関係（例えば、差、相関、偏差など）の測定値を指し得る。
【００６２】
本明細書で使用される「誤差」という用語は、計算値または予測値からの値の偏差を指し得る。「二乗平均誤差」または「ＲＭＳＥ」という用語は、推定装置によって予測される値が推定される量と異なる量を指す。推定パラメータに関する推定装置のＲＭＳＥは、平均二乗誤差の平方根として定義される。
【００６３】
本明細書で使用される「相関係数」という用語は、線形適合の尺度を指し得る。「ピアソンの積率相関係数」または「ピアソンのＲ」は、２つの変数間の線形関係の強さと方向の尺度であり、変数の共分散を標準偏差の積で割ったものとして定義される。
【００６４】
本明細書で使用される「ＲＮＡトランスクリプトーム」という用語は、生体試料中の細胞の凝集ＲＮＡ発現レベルを指し得る。
【００６５】
本明細書で使用される「白血球」または「白血球細胞」という用語は、単球、好中球、好酸球、好塩基球、およびリンパ球を含む任意の免疫細胞を指し得る。本明細書で使用される「リンパ球」という用語は、リンパに一般的に見られる細胞を指し、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｔ細胞、およびＢ細胞を含む。上で列挙した免疫細胞型がさらなるサブセットに分割できることは、当業者には理解されよう。
【００６６】
本明細書で使用される「腫瘍浸潤白血球」（ＴＩＬ）という用語は、固形腫瘍に存在する白血球を指し得る。
【００６７】
本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒトまたは動物（例えば、非ヒト哺乳動物、類人猿、サル、チンパンジー、爬虫類、両生類、または鳥）を指し得る。対象は、疾患または障害を有する人、または疾患または障害を有すると疑われる人、または疾患または障害を有していないかもしくは有すると疑われていない人であり得る。疾患または障害は、感染症、免疫障害または免疫疾患、癌、遺伝性疾患、変性疾患、生活習慣病、傷害、希少疾患、または加齢性疾患であり得る。感染症は、細菌、ウイルス、真菌、および／または寄生虫によって引き起こされ得る。
【００６８】
本明細書で使用する「生体高分子」という用語は、一緒に共有結合したより小さな生体分子を含む大きな生体分子を指し得る。生体高分子は、核酸、タンパク質、代謝産物、炭水化物、糖、脂質、またはそれらの組み合わせを含み得る。核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）分子またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含み得る。
【００６９】
物理的試料および物理的システム
目的の物理的システムには、物理的システム内に複数の成分が存在し、物理的システムの特徴プロファイルに寄与する（例えば、線形モデルで近似できる方法で寄与する）任意の物理的システムが含まれる。物理的システムには、目的の成分が含まれる場合と含まれない場合がある。物理的システムには、任意の数の成分を含んでもよい。いくつかの場合では、物理的システムには、５以上（例えば、１０以上、２０以上）が含まれ、１００以上（例えば、１０３以上、１０４以上（１５，０００、２０，０００、または２５，０００以上など））が含まれ、例えば、経験的に決定された特性に関して相互に異なる、異なる（例えば、異なる）成分
【００７０】
いくつかの場合では、物理的システムは、以下でさらに説明するように、複数の異なる成分を含む物理的試料である。いくつかの実施形態において、物理的システムは、生体内または生体外の細胞の集合（例えば、組織試料中の細胞の集合）、生物の組織の集合、生態系または社会内の生物の集合などである。いくつかの実施形態では、物理的システムは、デバイス内の電気回路の集合、部屋内のデバイスの集合、ネットワーク上のコンピュータの集合、建物内の電化製品の集合、都市またはその一部内の建物の集合、道路または高速道路システム上の車両の集合などである。
【００７１】
物理的試料は、複数の異なる成分が物理的試料の特徴プロファイルに寄与する（例えば、線形モデルで近似できる方法で寄与する）異なる成分の混合を含む適切な試料であり得る。いくつかの実施形態では、以下でさらに説明するように、物理的試料は生体試料である。
【００７２】
いくつかの場合では、物理的試料は、大気試料、水試料、または土壌試料などの環境試料である。環境試料は、限定されないが、河川、海、湖、雨、雪、貯水池、下水、下水処理流出、農業流出、工業流出、水道水、飲料水、排気システム（例えば、産業排気、車両排気など）、堆肥、埋め立て、都市開発サイト、または農地などの任意の適切な供給源から得られ得る。いくつかの場合では、物理的試料は、食品試料、例えば、動物、例えば、ヒト、犬、猫、鳥、魚などによる消費に適した、または消費のために準備されている材料である。いくつかの場合では、物理的試料は、合成化学混合、例えば、肥料、コーティング（例、塗料、ラッカーなど）、薬剤、洗剤などの市販の化学混合である。
【００７３】
生体試料
本明細書で使用される「生体試料」（「試料」）という用語は、対象から得られた任意の試料、または対象から得られた試料に由来する任意の試料を指し得る。
【００７４】
生体試料は、バルク組織またはアーカイブ組織（例えば、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織、または凍結組織）を含み得る。生体試料は、血液試料を含むか、固形組織試料（例えば、腫瘍試料）に由来し得る。
【００７５】
本明細書で使用される「血液試料」という用語は、血漿、血液から単離された血液細胞などの血液から調製された任意の試料を指し得る。生体試料は、血液試料を含んでも、血液試料に由来してもよい。例えば、試料は、対象（例えば、癌患者）の末梢血から採取されてもよい。例えば、全血試料を対象（例えば、健常ドナー）から収集し、ＣＬＩＡ血液検査室でＦＡＣＳ（ＢＤ  ＢＴＮＫ６色ＩＶＤ）およびコールターカウンターで白血球組成を数えるために処理し、その後のＲＮＡ抽出およびライブラリー調製のために、試料のアリコートをＰＡＸｇｅｎｅ血液ＲＮＡチューブ（Ｑｉａｇｅｎ）に保存することができる。例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）密度勾配遠心分離を使用するなどして、対象の末梢血から採取することができる。生体試料は、解離により単細胞懸濁液に処理され得る。単一細胞懸濁液は、例えば、ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ３クローンＵＣＨＴ１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、パシフィックブルー抗ヒトＣＤ４クローンＲＰＡ−Ｔ４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ１４クローンＭ５Ｅ２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００抗ヒトＣＤ８クローンＲＰＡ−Ｔ８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＰＣ−Ｈ７抗ヒトＣＤ１９クローンＳＪ２５Ｃ１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ抗ヒトＣＤ４５ＲＯクローンＵＣＨＬ１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ−Ｃｙ７抗ヒトＣＤ５６クローンＨＣＤ５６（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、またはそれらの組み合わせで染色することによって処理され得る。単細胞懸濁液は、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）などで固定して処理できる。細胞試料は、ＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）を使用して行う分析によってＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩｕフローサイトメーター機器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などを用いた免疫表現型検査によって処理できる。免疫表現型検査を実行する場合、前方および側方散乱プロファイルに基づいてダブレットが除外され得る。
【００７６】
本明細書で使用される「固形組織試料」または「バルク組織試料」という用語は、リンパ節、採取臓器、生検（例えば、腫瘍生検）などの固形組織から得られた試料を指し得る。試料自体は再構成され、懸濁され得る。生体試料はバルク組織を含み得る。バルク組織は、対象（例えば、癌患者）の新鮮に切除された外科用腫瘍試料から採取されてもよい。生体試料は、解離により単細胞懸濁液に処理され得る。単一細胞懸濁液は、Ａ７００抗ヒトＣＤ４５クローンＨＩ３０（泛免疫細胞マーカー）、ＰＥ抗ヒトＣＤ３１クローンＸＷＭ５９（内皮細胞マーカー）、ＡＰＣ抗ヒトＥｐＣＡＭクローンＸ９Ｃ４（上皮細胞マーカー）、ＰＥ−Ｃｙ７抗ヒトＣＤ１０クローンＸＨＩ１０ａ（線維芽細胞マーカー）、またはそれらの組み合わせなどの１つ以上の細胞マーカーでＦＡＣＳソーティングすることによって処理され得る。
【００７７】
本明細書で使用される「アーカイブ組織試料」という用語は、長期保存を受けた組織試料を指す。生体試料はアーカイブ組織を含み得る。アーカイブ組織は、（ＦＦＰＥ組織を得るための）ホルマリン固定およびパラフィン包埋、ならびに凍結組織を得るための凍結（例えば、凍結保存）などの１つ以上の保存方法を使用してバルク組織を処理することで得ることができる。例えば、凍結保存腫瘍細胞懸濁液を解凍、処理、およびソートして、単一細胞懸濁液（例えば、ＦＬ腫瘍細胞懸濁液からのＣＤ５〜ＣＤ１９＋Ｂ細胞）を単離してもよい。
【００７８】
本明細書で使用される「精製試料」という用語は、１つ以上の細胞サブセットが濃縮される任意の試料を指し得る。試料は、サイズ、タンパク質発現等の特徴に基づいて細胞の除去または単離することによって精製され得る。
【００７９】
本明細書で使用される「遺伝子発現プロファイリング」という用語は、一般に、遺伝子発現を測定するための生体試料または単一細胞懸濁液上で測定方法を実行することを指す。遺伝子発現プロファイリングは、単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑ（ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ）、バルクＲＮＡ−Ｓｅｑ、マイクロアレイ、またはそれらの組み合わせを含んでよい。
【００８０】
いくつかの実施形態では、生体試料は、細胞培養物または生物からインビトロで得られ得る。特定の態様では、生物は、霊長類（例えば、ヒト）、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、ウサギ、または他の適切な動物などの動物であり得る。生物から採取された生体試料は、血液、脳、リンパ節、胸腺、骨髄、脾臓、骨格筋、心臓、結腸、胃、小腸、腎臓、肝臓、肺などの固形組織などの組織試料であり得る。組織試料は、臓器を収穫することによって、または当該技術分野で既知の生検を行うことによって得ることができる。特定の態様では、生体試料は、全血、血漿、または血液から得られた細胞などの血液試料である。
【００８１】
特定の態様では、生体試料は腫瘍生検であり得る。生検とは、対象から得られた（例えば、切除、針吸引などによって）癌細胞を含有する任意の組織試料を指す。生検は、細胞懸濁液、薄い切片（例えば、スライド上に取り付けられた組織切片）の形態、または任意の他の適切な形態であり得る。
【００８２】
特定の態様では、生体試料は、細胞分散溶液または懸濁液であり得る。この溶液は、５〜２５ｍＭなどの低濃度で許容される緩衝液と併せて、ウシ胎仔血清、ヒト血小板溶解物または他の因子を便利に補充した平衡塩溶液、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ、ハンクの平衡塩溶液等であり得る。便利な緩衝液としては、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液等が挙げられる。分離された細胞は、細胞の生存力を維持する任意の適切な培地に収集され得る。様々な培地は市販されており、多くの場合、ウシ胎仔血清またはヒト血小板溶解物で補充されているｄＭＥＭ、ＨＢＳＳ、ｄＰＢＳ、ＲＰＭＩ、Ｉｓｃｏｖｅ培地等を含む、細胞の性質に従って使用されてもよい。他の態様では、生検は組織切片であり得る。例えば、生検は顕微鏡スライド上に取り付けられた薄い組織切片であり得る。上記実施形態のいずれかの生体試料は、当業者に既知のように固定および／または透過性であってもよい。
【００８３】
試料は、例えば、粗形態の全試料であり得る。あるいは、試料は、分析の前に、例えば、密度勾配遠心分離、パニング、磁気ビーズソーティング、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）等によって分画して、１つ以上の目的の細胞型について濃縮し得る。
【００８４】
いくつかの場合では、生体試料は無細胞試料、例えば、細胞または組織ホモジネートである。いくつかの場合では、生体試料は単一の細胞を含む。
【００８５】
特定の態様では、主題の方法は、生体試料中の細胞サブセットの相対比率を推定する前に、試料、例えば、生体試料（例えば、上述の）を得ることを含む。
【００８６】
異なる細胞サブセット
本開示による生体試料の異なる細胞サブセット（例えば、細胞型）は、生体試料の特徴プロファイルに寄与する任意の異なる細胞型であり得る。
【００８７】
いくつかの実施形態では、細胞の異なるサブセットは、異なる細胞周期段階の細胞のサブセットを含む。細胞のサブセットは、間期、有糸分裂期、またはサイトカイン形成を含むが、これらに限定されない、任意の適切な細胞周期段階にある細胞を含んでもよい。いくつかの実施形態では、細胞サブセット中の細胞は、分裂前期、中期、後期、または終期にある。いくつかの場合では、細胞のサブセットの細胞は、静止状態（Ｇ０期）、Ｇ１チェックポイント（Ｇ１期）、複製されたＤＮＡであるが有糸分裂前（Ｇ２期）、またはＤＮＡ複製（Ｓ期）中である。
【００８８】
いくつかの実施形態では、異なる細胞サブセットは、１つ以上の細胞内の異なる機能的経路を含む。目的の機能的経路としては、細胞シグナル伝達経路、遺伝子調節経路、または代謝経路が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の方法は、シグナル伝達または代謝経路の複数の特徴を測定すること（例えば、シグナル伝達経路におけるタンパク質の活性化状態を測定すること、遺伝子調節ネットワークにおける遺伝子の発現レベルを測定すること、代謝経路における代謝産物のレベルを測定すること等）によって、細胞、細胞の集合、組織等の異なるシグナル伝達経路または代謝経路の相対活性を推定する方法であり得る。目的の細胞シグナル伝達経路としては、限定されないが、サイトカインシグナル伝達、死因子シグナル伝達、成長因子シグナル伝達、生存因子シグナル伝達、ホルモンシグナル伝達、Ｗｎｔシグナル伝達、ヘッジホッグシグナル伝達、ノッチシグナル伝達、細胞外マトリックスシグナル伝達、インスリンシグナル伝達、カルシウムシグナル伝達、Ｇタンパク質結合受容体シグナル伝達、神経伝達物質シグナル伝達、およびこれらの組み合わせなどの任意の適切なシグナル伝達経路が挙げられる。代謝経路としては、限定されないが、糖分解、糖新生、クエン酸周期、発酵、尿素周期、脂肪酸代謝、ピリミジン生合成、グルタミン酸アミノ酸基合成、ポルフィリン代謝、アスパラギン酸アミノ酸基合成、芳香族アミノ酸合成、ヒスチジン代謝、分枝アミノ酸合成、リン酸ペントース経路、プリン生合成、グルコロン酸代謝、イノシトール代謝、セルロース代謝、スクロース代謝、デンプンおよび糖原代謝、ならびにこれらの組み合わせなどの任意の好適な代謝経路を挙げることができる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、細胞サブセットは、その存在が１つ以上の特徴（ＲＮＡレベルでの遺伝子発現、タンパク質発現、ゲノム突然変異、バイオマーカーなど）によって特徴付けられる生体試料中のあらゆる細胞群であり得る。細胞サブセットは、例えば、細胞型または細胞サブタイプであり得る。
【００９０】
特定の態様では、１つ以上の細胞サブセットは白血球（例えば、白血球細胞またはＷＢＣ）であり得る。潜在的な白血球細胞サブセットとしては、単球、樹状細胞、好中球、好酸球、好塩基球、およびリンパ球が挙げられる。これらの白血球サブセットは、さらに細分することができ、例えば、リンパ球サブセットは、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８  Ｔ細胞、ＣＤ４ナイーブＴ細胞、ＣＤ４メモリＲＯ非活性化Ｔ細胞、ＣＤ４メモリＲＯ活性化Ｔ細胞、濾胞ヘルパーＴ細胞、調節性Ｔ細胞など）、およびＢ細胞（ナイーブＢ細胞、メモリＢ細胞、形質細胞）を含む。免疫細胞サブセットは、活性化（または刺激）状態に基づいてさらに分離され得る。
【００９１】
特定の態様では、白血球は、血液癌、自己免疫疾患、骨髄異形成症候群などの白血球障害を有する個体からのものであり得る。血液疾患の例としては、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および骨髄腫が挙げられる。自己免疫疾患の例としては、円形脱毛症、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、糖尿病（１型）、糸状腎炎、グレイブス病、ギラン・バーレ症候群、特発性血小板減少性紫斑、重症筋無力症、いくつかの形態の心筋炎、多発性硬化症、ペンフィガス／ペンフィガイド、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁硬化症、乾癬、関節リウマチ、硬皮症／全身性硬化症、シェーグレン症候群、および全身性エリテマトーデスが挙げられる。
【００９２】
特定の態様では、１つ以上の細胞サブセットには、腫瘍浸潤白血球（ＴＩＬ）が含まれ得る。腫瘍浸潤性白血球は、生体試料中の癌細胞と混合し得るか、または上記もしくは当該技術分野で既知の任意の方法によって濃縮され得る。
【００９３】
特定の態様では、１つ以上の細胞サブセットには、血液癌、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、および脳腫瘍などの癌細胞が含まれ得る。
【００９４】
目的の細胞サブセットとしては、神経細胞、星細胞、オリゴデンドロサイト、およびミクログリアを含む脳細胞、ならびにそれらの前駆細胞を挙げることができる。他の目的の細胞サブセットとしては、血液、脳、リンパ節、胸腺、骨髄、脾臓、骨格筋、心臓、結腸、胃、小腸、腎臓、肝臓、肺などの固形組織を含む、任意の生体組織の幹細胞、多能性幹細胞、および前駆細胞が挙げられる。
【００９５】
特徴
目的の特徴としては、物理的試料（例えば、生体試料）、または１つ以上の異なる成分（例えば、細胞サブセッ）トの存在を示し得る物理的システムの任意の特徴が挙げられる。特定の態様では、特徴の存在量（例えば、値）は、１つ以上の異なる成分、例えば細胞サブセットの存在量を示し得る。特徴は、試料、例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質、特定の遺伝子型、バイオマーカーなどの生体試料の特徴の集合であり得る。
【００９６】
遺伝子発現および／または細胞遺伝子型などの特徴は、興味深い場合がある。例えば、細胞型および／または状態は、遺伝子発現によって分化され得る。別の例では、癌細胞は、突然変異に起因する遺伝的異質性に基づいて分化し得る。そのような特徴は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法（例えば、ＲＮＡから合成された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の定量的ＰＣＲ）、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、ＤＮＡ−ｓｅｑ、ＤＮＡマイクロアレイ、タイリングアレイ、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ（登録商標）ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）、ノーザンブロット、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）などを含む、当該技術分野で既知の任意の手段によって測定され得る。タンパク質発現などの特徴は、ウェスタンブロット、タンパク質マイクロアレイ、ＥＬＩＳＡ、他の免疫アッセイ、質量分析などの当該技術分野で既知の任意の手段によって測定され得る。
【００９７】
いくつかの実施形態では、特徴プロファイルは、任意の適切な方法によって得られた、異なる化学化合物の適切な測定された特性を含む。場合によっては、特徴は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）（例えば、１Ｈ、１３Ｃ、２Ｈ、６Ｌｉ、１０Ｂ、１１Ｂ、１４Ｎ、１５Ｎ、１７Ｏ、１９Ｆ、２３Ｎａ、２９Ｓｉ、３１Ｐ、３５Ｃｌ、１１３Ｃｄ、１２９Ｘｅ、または１９５Ｐｔ  ＮＭＲ）スペクトル、電磁放射線（例えば、紫外線、可視光線、赤外線）吸収および／または放出スペクトル、円形二色スペクトル、ラマンスペクトル、質量スペクトル、ならびにクロマトグラム（例えば、親和性クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等から）を含む。
【００９８】
特徴（無細胞バイオマーカーなど）は、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、質量分析、クロマトグラフィー（例えば、薄層クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーなど）を含む、当該技術分野で既知の任意の手段によって測定され得る。例えば、特徴は、クロマトグラフまたは質量スペクトル上で観察されるピークの強度であってもよい。
【００９９】
特定の態様では、この方法は、物理的試料（例えば、生体試料）、または物理的システムから特徴測定値を取ることを含み得る。他の態様では、方法は、公的に入手可能なＤＮＡマイクロアレイデータベース、ＲＮＡ−ｓｅｑデータベース、および／またはＤＮＡ−ｓｅｑデータベースなどのデータベース、あるいは他の適切な特徴測定値のデータベースからの特徴測定値を得ることを含み得る。
【０１００】
特徴シグネチャーの参照プロファイルは、精製または濃縮された異なる成分（例えば、異なる細胞サブセット）の特徴を測定することによって取得することができる。例えば、細胞サブセットは、上述のように、密度勾配遠心分離、パニング、磁気ビーズソーティング、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）等によって精製されてもよい。あるいは、細胞サブセットは、例えば、前駆体細胞の刺激および／または分化を介してインビトロで培養されてもよい。細胞サブセットの単離後、細胞サブセットの特徴を（例えば、上記のように、または当業者に既知のように）測定してもよい。特定の態様では、細胞サブセットの遺伝子発現を（例えば、ＤＮＡマイクロアレイ分析で）測定して、細胞サブセットの遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）を得ることができる。
【０１０１】
いくつかの場合では、細胞環境などで薬理学的または誘導的にシグナル伝達経路を選択的に活性化することにより、シグナル伝達経路の成分を含む機能的な無細胞システムの特徴を測定することにより、シグナル伝達経路である異なる成分の特徴シグネチャーを得られる。いくつかの場合では、化学化合物である異なる成分の特徴シグネチャーは、化学化合物の実質的に純粋なまたは濃縮された試料の特徴を測定することによって得られる。
【０１０２】
特定の態様では、シグネチャーマトリックスは、上記の細胞サブセットのいずれかの特定のｍＲＮＡ、タンパク質、遺伝子型、および／またはバイオマーカーのレベルを含む。シグネチャーマトリックスは、以前の研究において「塩基または塩基マトリックス」と呼ばれることが多く、例えば精製または濃縮された細胞集団の差次的発現分析によって得ることができる。遺伝子シグネチャーマトリックスは、変動またはノイズを入力する線形システムの安定性を測定する条件番号と呼ばれる固有のマトリックス特性を最小化することによって、より堅牢にすることができる。特定の態様では、シグネチャーマトリックスの安定性は、例えば、Ｒのカッパ関数で計算された２ノルム条件数を介して測定され得る。
【０１０３】
同じシグネチャーマトリックス内のいくつかの参照プロファイルは、複数の異なる成分、例えば細胞型の参照プロファイルが高度に相関する現象である「多重共線性」を呈し得る。多重共線性は、主題の方法における有意性値によって報告され得るように、物理的試料（例えば、生体試料）中の相対量の異なる成分（例えば、細胞サブセット）のデコンボリューションを防止し得るか、またはデコンボリューションの信用を低減し得る。主題の発明のシグネチャーマトリックス（ＶＩＦ）によって測定されるような、本発明のシグネチャーマトリックスにおける２つの参照プロファイル間の多重共線性の厳格度は、１以上、例えば、２以上、５以上、１０以上、１５以上（２０以上を含む）であってもよく、場合によっては、５０以下、例えば、４０以下、３０以下、２０以下、１５以下（１０以下を含む）であってもよい。
【０１０４】
場合によっては、参照マトリックスは、１以上、例えば、２以上、５以上、８以上、１０以上、１５以上、２０以上、５０以上、１００以上、５００以上（１，０００以上を含む）の２ノルム条件数を有し、いくつかの実施形態では、１０４以下、例えば、１０３以下、５００以下、２５０以下、２００以下、１５０以下、１００以下、５０以下、３０以下、２０以下、１５以下、８以下（５以下を含む）の２ノルム条件数を有する。いくつかの実施形態では、参照マトリックスは、１〜５（例えば、５〜８、８〜１０、８〜１５、１０〜１５、１５〜２０、２０〜３０、２０〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１００〜２００、１００〜２５０、１００〜５００、５００〜１，０００、１，０００〜１０，０００を含む）の範囲の２ノルム条件数を有する。
【０１０５】
参照マトリックスの条件数は、任意の適切な方法を使用して調整され得る。場合によっては、初期参照マトリックスの条件数は、マトリックスから１つ以上の特徴を追加または削除することによって低減され、それによって、より低い条件数を有する初期参照マトリックスのスーパーセットまたはサブセットを生成する。このプロセスは、最終参照マトリックスの十分に低い条件数が得られるまで反復され得る。
【０１０６】
特定の態様では、参照マトリックスは、２以上、例えば５以上、１０以上（１５以上を含む）の異なる成分（例えば、細胞サブセット）に関連付けられる（によって発現される）少なくとも１つの特徴（例えば、遺伝子）、例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０（少なくとも１００を含む）の特徴を含み得る。場合によっては、参照マトリックスは、２〜２０、例えば２〜１５、２〜１２（５〜１０を含む）の異なる成分（例えば、細胞サブセット）に関連付けられる（によって発現される）少なくとも１つの特徴（例えば、遺伝子）、例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０（少なくとも１００を含む）の特徴を含み得る。場合によっては、参照マトリックスは、複数の異なる成分（例えば、細胞サブセット）に関連付けられる（例えば、によって発現される）１０，０００以下、例えば５，０００以下、１，０００以下、５００以下、２００以下（１００以下を含む）の特徴（例えば、遺伝子）を含み得る。
【０１０７】
特定の態様では、シグネチャーマトリックスに含める候補特徴がフィルタリングされ得る。特定の実施形態では、低い値および／または分散を有する特徴は、シグネチャーマトリックスからフィルタリングされ得る。例えば、他の候補特徴と比較して９０％、８０％、７５％、５０％、または２５％より低い値および／または分散を伴う特徴は、フィルタリングされ得る。別の例では、他の候補特徴と比較して９０％、８０％、７５％、５０％、または２５％を超える値および／または分散を伴う特徴がシグネチャーマトリックスに含まれ得る。いくつかの実施形態では、シグネチャーマトリックスで表されない異なる成分が豊富な特徴は、シグネチャーマトリックスに含まれない。いくつかの実施形態では、シグネチャーマトリックスで表されない異なる成分の閾値より高値を有する特徴は、シグネチャーマトリックスに含まれない。
【０１０８】
目的の異なる成分、例えば細胞サブセットに対してより予測的である特徴は、シグネチャーマトリックスに含まれ得る。例えば、この方法は、所与の異なる成分（例えば、細胞サブセット、または物理的試料／物理的システム）における所与の特徴の濃縮スコア（ＥＳ）を、その特徴の他の異なる成分（例えば、細胞サブセット、または物理的試料／物理的システム）とのすべての対比較から得られる線形モデル係数の合計に基づいて計算することを含み得る。特定の態様では、特徴は、他の異なる成分、例えば細胞サブセットと比較した、異なる成分、例えば細胞サブセットの特徴の値の倍数変化に基づいてシグネチャーマトリックスに含めるために選択され得る。例えば、１つの異なる成分（例えば、細胞サブセット）において、任意の他の異なる成分（例えば、細胞サブセット）よりも２倍以上、５倍以上、１０倍以上、または２０倍以上の特徴が、シグネチャーマトリックスに含まれるように選択され得る。逆に、特徴は、多重共線性を低減するために、シグネチャーマトリックスから除外され得る。
【０１０９】
特定の態様では、主題の方法は、１つ以上の異なる成分（例えば、細胞サブセット）を単離すること、および１つ以上の異なる成分（例えば、細胞サブセット）の特徴を測定してシグネチャーマトリックスを得ることを含む。例えば、第１の生体試料中の細胞は、ＦＡＣＳによって別個の細胞サブセットに分離され得る。別個の細胞サブセットをＤＮＡマイクロアレイによって分析して、別個の細胞サブセットの各々について遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）を得ることができる。次いで、各細胞サブセットのＧＥＰをコンパイルして、各細胞サブセットのいくつかの遺伝子の発現の値を有するシグネチャーマトリックスを生成してもよい（例えば、図１７に見られる）。
【０１１０】
試料の特徴プロファイルの例としては、「遺伝子発現プロファイル」または「ＧＥＰ」（例えば、マイクロアレイ分析によって得られる）、タンパク質発現プロファイル、遺伝子型プロファイル（例えば、不均一な腫瘍細胞を有する試料のもの）、バイオマーカープロファイル（例えば、試料中の遊離バイオマーカーもしくは試料の細胞中／細胞上のバイオマーカー）、ＤＮＡメチル化プロファイル（例えば、メチル化のレベルもしくは変化が異なるＤＮＡを含む細胞を有する試料のもの）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、ＤＮＡメチル化プロファイルは、細胞特異的、組織特異的、および／または細胞期特異的であり得、したがって、特徴プロファイルには、細胞型、組織型等にわたるＤＮＡメチル化プロファイルが含まれ得る。ＤＮＡメチル化プロファイルは、例えば、試料の重亜硫酸塩配列決定によって測定され得る。
【０１１１】
試料の特徴プロファイルは、上述のように得ることができる（例えば、特徴は、生体試料から直接測定され得るか、または特徴プロファイルは、公的に入手可能なＤＮＡマイクロアレイデータベースなどのデータベースから得ることができる）。上述のように、生体試料は、任意の細胞型を含んでもよい。特定の実施形態では、試料の特徴プロファイルは、ベンチマークデータセットであり得る。
【０１１２】
本方法は、物理的試料または物理的システムにおける異なる成分の画分表現を推定する高感度法を提供することができ、ここで異なる成分は、低画分で存在する。いくつかの実施形態では、物理的試料または物理的システムは、試料中に存在する第２の複数の異なる成分の総量の１０％未満（例えば、８．０％未満、６．０％未満、４．０％未満、２．０％未満、１．０％未満を含む）の濃度で、場合によっては、０．０１％以上（例えば、０．０５％以上、０．１％以上、０．５％以上、１．０％以上を含む）の濃度で、特徴シグネチャーで表される少なくとも１つの異なる成分を含む。いくつかの実施形態では、物理的試料または物理的システムは、試料中に存在する第２の複数の異なる成分の総量の０．０１％〜１０％（例えば、０．０５％〜８．０％、０．１％〜６．０％、０．１％〜４．０％、０．１％〜２．０％を含む）の範囲の濃度で、特徴シグネチャーで表される少なくとも１つの異なる成分を含む。
【０１１３】
本方法は、シグネチャーマトリックスに表されていない異なる成分の存在下で、物理的試料または物理的システムにおける異なる成分の画分表現を堅牢に推定することを提供し得る。いくつかの実施形態では、特徴シグネチャーに表される異なる成分は、試料中の異なる成分の総量の５０％以下、例えば４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１０％以下、（５％以下を含む）、および場合によっては、１％以上、例えば５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、３５％以上（４０％以上を含む）で試料中に存在する。いくつかの実施形態では、特徴シグネチャーに表される異なる成分は、１〜５０％、例えば５〜５０％、１０〜５０％（２０〜４５％を含む）の範囲で試料中に存在する。
【０１１４】
特定の態様では、生体試料は、シグネチャーマトリックスによって表されない細胞を含み得る。例えば、生体試料中の細胞の５％以上、１０％以上、２５％以上、５０％以上、７５％以上、５％〜５０％、５％以下、１０％以下、２５％以下、または５０％以下は、シグネチャーマトリックス中の細胞サブセットによって表されない場合がある。
【０１１５】
あるいは、または加えて、生体試料は、１０％以下、５％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、０．２５％以下、０．１％以下、０．１％〜１０％、０．２５％〜２％などの低量で存在するシグネチャーマトリックスによって表される細胞サブセットを含み得る。
【０１１６】
序論
組織組成は、表現型変形の主要な決定因子であり、疾患転帰に影響を及ぼす重要な要因であり得る。ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑは、細胞異質性を特徴付けるための強力な技術であり得るが、それは、大きな試料コホートにとっては実用的ではなく、通常の臨床治療の一部として収集された固定標本に適用されない場合がある。これらの課題を克服するために、本開示は、バルク組織トランスクリプトームからの細胞型特異的遺伝子発現プロファイル（ＧＥＰ）および細胞型存在量の同時推定を可能にするインシリコサイトメトリーためのプラットフォームを提供する。インシリコ精製のために本明細書に開示される方法を使用して、バルク組織組成は、ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ由来の参照シグネチャーを使用して正確に推定され得る。開示された方法およびシステムは、無偏向細胞型発見を、大規模な組織解剖と関連付けることができる。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘと呼ばれるこの統合されたフレームワークの有用性は、黒色腫を含む複数の腫瘍型で実証することができ、単一細胞参照プロファイルを使用して、新鮮な、凍結された、および固定された臨床標本を解剖し、腫瘍浸潤白血球（ＴＩＬ）と免疫療法応答との間の関連性を明らかにする。デジタルサイトメトリーは、単一細胞プロファイリングの努力を増強し、抗体、分解、または生存細胞なしで費用対効果の高い高スループット組織特徴付けを可能にすることができる。
【０１１７】
フローサイトメトリーおよび免疫組織化学（ＩＨＣ）などの免疫表現型決定アプローチは、事前選択されたマーカー遺伝子の小さな組み合わせに依存し得、同時に照合され得る細胞型の数を制限し得る。対照的に、単一細胞ｍＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ）を、単一細胞懸濁液（ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ）からの数百〜数千個の個々の細胞の無偏向転写プロファイリングに使用することができる。この技術の力にもかかわらず、大型試料コホートの分析は実用的でなくてもよく、多くの固定臨床標本（例えば、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料）は、単一細胞懸濁液に解離されてもよい。さらに、細胞型表現に対する組織分解の影響はよく理解されていない場合がある。
【０１１８】
混合物試料のゲノムプロファイルから細胞含有量を直接解剖するための計算技術は、ＦＡＣＳ精製またはインビトロ分化／刺激された細胞サブセットに由来する細胞型特異的「バーコード」遺伝子（例えば、「シグネチャーマトリックス」）の専門的なナレッジベースに依存し得る。目的の細胞型が十分に定義されているときに有用であるが、そのような遺伝子シグネチャーは、新規の細胞型および細胞型ＧＥＰの発見、ならびに複雑な組織における主要な細胞表現型の完全なスペクトルを捕捉するために最適ではない場合がある。
【０１１９】
本開示は、無傷組織のＲＮＡプロファイルから細胞型存在量および細胞型（例えば、細胞型特異的）遺伝子発現を正確に推定するための計算フレームワークを提供する（図１）。単一細胞実験または分類された細胞サブセットからの細胞型発現シグネチャーを活用することにより、本開示のシステムおよび方法は、物理的解離、抗体、または生体物質なしで組織組成の包括的なポートレートを提供できる。そのようなアプローチには、例えば、クロスプラットフォームデータ正規化およびインシリコ細胞精製の技術を用いて、組織ＧＥＰから細胞組成を列挙するための方法が含まれ得る。後者により、個々の目的の細胞型のトランスクリプトームを、物理的に分離せずにバルクＲＮＡ混合物からデジタルに「精製」し得る。その結果、細胞分離や予備知識なしで、細胞型特異的遺伝子発現の変化を推測することができる。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘと呼ばれるこのフレームワークの技術的性能および臨床的有用性を説明するために、本開示のシステムおよび方法を使用して、（１）単一細胞発現データでバルク組織組成をプロファイリングし、（２）解離せずに、悪性および腫瘍関連の細胞型のＧＥＰを精製し、（３）抗癌療法に関連する細胞型特異的シグネチャーを探索することができる。これらの結果は、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘが、研究および臨床環境での高解像度の細胞表現型検査の意味合いをもつ、複雑な組織を解読するための有用なツールであることを示す。
【０１２０】
ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘプラットフォームは、インシリコ組織解剖に使用することができる。プラットフォームの機能は、細胞型の列挙および遺伝子発現精製のための統合フレームワーク、クロスプラットフォームの変動を抑制するための専用の正規化スキーム、およびＲＮＡ混合物を細胞型特異的発現プロファイルに分離するためのアプローチの改善を含むことができる。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘは、末梢血、膵島標本、および悪性腫瘍（例えば、そのうち３５０はプロファイリングされる）の分析に使用され得る。これらの結果は、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘが、異なる供給源に由来する発現プロファイルを使用して、組織の不均一性に関する正確なポートレートを提供できることを示す。
【０１２１】
本明細書に記載されるシステムおよび方法を使用して、包括的なヒト細胞アトラスを定義することができる。ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑデータセットを組み合わせるための新興の技術と併せたデータ生成の急速なペースを考慮すると、単一細胞参照マップを広範に適用する方法は、特に組織が制限され、固定され、または分解することが困難な設定において重要であり得る。腫瘍組織および健康な組織の研究では、単一細胞参照プロファイルを使用して、組織組成の詳細な照合を行うことができ、対象間の不均一性は、デコンボリューションの結果に影響を及ぼす主要な要因ではない。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘは、プラットフォームまたは保存状態とは関係なく、複雑な組織からの細胞サブセットＧＥＰの堅牢な分子プロファイリングを可能にするための現在のアプローチを上回ることができる。発現分析のための複数の技術を柔軟に組み込むことによって、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘは、表現型カテゴリが既知のときの細胞型ＧＥＰの迅速な評価（図１、ステップ３、図３ａ〜ｇ）、および追加の詳細が所望されるときの発現変動の高解像度プロファイリングを容易にすることができる（図１、ステップ４、図４ａ〜ｅ）。これらの特徴を有すると、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ分析は、特定の細胞型を標的化することに依存する診断アプローチおよび治療アプローチを通知するための意味をもつ、腫瘍微小環境内の異種型相互作用の改善された理解を提供し得る。
【０１２２】
加えて、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘを使用して、複雑な組織における細胞不均一性を復号化することができる。この戦略を使用して、単一細胞トランスクリプトームからの目的の細胞サブセットを「デジタルゲート」し、バルク組織ＧＥＰ（例えば、臨床治験からの固定標本）のコホートにおけるこれらの細胞の同一性および発現パターンをプロファイルし、ゲノム特徴および臨床転帰を含む様々なメタデータとのそれらの関連性を系統的に決定することができる。したがって、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘは、生物学的発見の統計的なパワーを増加させ、それによって再現可能な研究を促進するための有用性を有することができる。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘアプローチの一般性および他の技術とシームレスに統合する能力を考慮して、インシリコサイトメトリーでは、ヒト、マウス、および他のメタゾンにおける多細胞系の分析を強化することができる。
【０１２３】
本明細書で使用される「ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ」という用語は、一般に、個々の細胞の発現プロファイルを得るための単一細胞ＲＮＡ配列決定方法を指す。例えば、単一細胞ライブラリーは、Ｃｈｒｏｍｉｕｍをｖ２化学（１０ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）と共に使用して、ＰＢＭＣ単一細胞懸濁液（例えば、癌患者から）から調製することができる。そのような単一細胞ライブラリー（例えば、ＮｅｘＴＳｅｑ  ５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ））を配列決定することができる。配列決定読み取り値は、例えば、Ｃｅｌｌ  Ｒａｎｇｅｒ１．２（１０ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して、アラインメント、フィルタリング、重複解除、および／またはデジタルカウントマトリックスへの変換によって処理され得る。外れ値細胞は、（１）異常に高い／低いミトコンドリア遺伝子発現（例えば、１０％超もしくは１％未満のミトコンドリア含有量を有する細胞が除去され得る）および／または（２）細胞あたりによって検出される発現遺伝子の数と、細胞あたり検出される固有の分子識別子（ＵＭＩ）の数とを比較することによって識別されるように、潜在的な二重項／多重項に基づいて（例えば、３，５００超および５００未満の発現遺伝子を有する細胞が除去され得る）、識別およびフィルタリングされ得る。クラスターは、（１）ＵＭＩの数およびミトコンドリア含有量の割合に対する遺伝子発現の依存性を回帰させること、ならびに（２）データの主成分の適切な数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０を超える）上で「ＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒｓ」を実行することによって（例えば、Ｓｅｕｒａｔ  ｖ．１．４．０．１６を使用して）特定されてもよい。細胞標識は、正規白血球マーカー遺伝子（例えば、ＭＳ４Ａ１高＝Ｂ細胞；ＣＤ８Ａ高およびＧＮＬＹ低＝ＣＤ８  Ｔ細胞；ＣＤ３Ｅ高、ＣＤ８Ａ低、およびＧＮＬＹ低＝ＣＤ４  Ｔ細胞；ＧＮＬＹ高およびＣＤ３Ｅ低＝ＮＫ細胞；ＧＮＬＹ高およびＣＤ３Ｅ高＝ＮＫＴ細胞；ＣＤ１４高＝単球）の発現に従って割り当てられてもよい。Ｃｈｒｏｍｉｕｍ  ｖ２（５′および３′キット）によってプロファイルされた健康なドナーからの公的に入手可能なＰＢＭＣデータセットは、以下の軽微な修正を伴ってダウンロードされ（表１）、上記のように前処理されてもよい。品質管理中、５′ＰＢＭＣについて５０００超の発現遺伝子、３′ＰＢＭＣについて４０００超の発現遺伝子、および２００未満の発現遺伝子を有する細胞が除外され得る。Ｓｅｕｒａｔ「ＦｉｎｄＣｌｕｓｔｅｒｓ」は、解像度パラメータが０．６に設定された最初の２０の主コンポーネントに適用され得る。細胞標識は、上述のように割り当てられ得る。加えて、骨髄細胞は、高ＣＤ６８発現によって定義され得、巨核球は、高ＰＰＢＰ発現によって定義され得、樹状細胞は、高ＦＣＥＲ１Ａ発現によって定義され得る。
【０１２４】
本明細書で使用される「バルクＲＮＡ−Ｓｅｑ」という用語は、一般に、バルク細胞集団または組織の発現プロファイルを得るためのバルクＲＮＡ配列決定方法を指す。例えば、全ＲＮＡは、製造業者の推奨に従って、例えばＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、例えばＰＡＸｇｅｎｅチューブに保存された血液試料から単離されてもよい。ＲＮＡは、例えば、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して定量化し、品質を評価してもよい。ライブラリー調製は、例えば、製造業者の推奨に従ってＲＮＡエキソームキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して行われ得る。ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーは、一緒に多重化され、例えば、２ｘ１５０ｂｐ読み取り値を使用する単一のＨｉＳｅｑ  ４０００レーン（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して配列決定されてもよい。例えば、全ＲＮＡは、製造業者の推奨に従ってＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＰＢＭＣ試料から（例えば、ＮＳＣＬＣ癌患者から）単離されてもよい。例えば、ＲＮＡ  ６０００  Ｐｉｃｏチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を備えた２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、ＲＮＡ分子を定量化し、品質を評価することができる。ＲＮＡ分子のライブラリー調製は、例えば、メーカーの推奨に従ってＳＭＡＲＴｅｒ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ−Ｐｉｃｏキット（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施することができる。ライブラリーは、例えば、Ｑｕｂｉｔ  ３．０蛍光計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量化され得る。ライブラリーの品質は、例えば、Ｄ１０００スクリーンテープを備えた４２００  ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して評価されてもよい。ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーは、好適な配列決定機器（例えば、２×１５０塩基対（ｂｐ）読み取り値を使用するＮｅｘｔＳｅｑ  ５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ））上で配列決定され得る。別の例として、全ＲＮＡは、例えば、ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡマイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、バルク腫瘍（例えば、ＮＳＣＬＣ）およびソートされた細胞集団（例えば、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約１，０００、約５，０００、約１０，０００、約１５，０００、約２０，０００、約２５，０００、または２５，０００を超える細胞の範囲）から抽出されてもよい。全ＲＮＡの量（例えば、約１０ナノグラム（ｎｇ）、約２０ｎｇ、約３０ｎｇ、約４０ｎｇ、約５０ｎｇ、または５０ｎｇ超）は、例えば、Ｏｖａｔｉｏｎ  ＲＮＡ−ＳｅｑシステムＶ２（ＮｕＧＥＮ）を使用して増幅されてもよい。得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を（例えば、超音波処理（Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｓ２システムによって）１５０〜２００ｂｐの平均サイズに剪断してもよく、（例えば、ＮＥＢＮｅｘｔ  ＤＮＡライブラリー調製マスターミックス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して）ＤＮＡライブラリーを構築するために使用してもよい。ライブラリーを、好適な配列決定機器（例えば、ＨｉＳｅｑ  ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上で配列決定して、試料あたり平均１億（Ｍ）個の読み取り値を有する１００ｂｐ対の末端読み取り値を生成することができる。
【０１２５】
デコンボリューション分析の文脈における線形性を最大化するために、生のＦＡＳＴＱ読み取り値は、ＧＥＮＣＯＤＥ  ｖ２３参照転写物、−ｂｉａｓＣｏｒｒｅｃｔフラグ、および他のデフォルトパラメータを使用して（例えば、Ｓａｌｍｏｎ  ｖ０．８．２６５で）処理され得る。ＲＮＡ−Ｓｅｑ定量化結果は、Ｒパッケージｔｘｉｍｐｏｒｔ６６を使用して単一の遺伝子レベルＴＰＭマトリックスにマージされ得る。
【０１２６】
マイクロアレイを使用し、マイクロアレイを使用してグラウンドトゥルース参照プロファイルを生成し得る。全ＲＮＡは、バルクＦＬ標本およびソートされたＢ細胞から抽出され得、収率および品質について評価され得る。相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）は、線形増幅後の１００ｎｇの全ＲＮＡ（３′ＩＶＴ発現、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）から調製し、次いで製造業者のプロトコルに従ってＨＧＵ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０マイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）にハイブリダイズしてもよい。得られたＣＥＬデータファイルは、ＦＬリンパ節からＦＡＣＳソートされたＣＤ４およびＣＤ８腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む公的に入手可能なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータセットプールすることができる（ＧＳＥ２７９２８４０）。結果として得られたデータセットを、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒの「ａｆｆｙ」パッケージを使用してＲＭＡ正規化し、カスタムチップ定義ファイル（例えば、Ｂｒａｉｎａｒｒａｙバージョン２１．０、ｈｔｔｐ：／／ｂｒａｉｎａｒｒａｙ．ｍｂｎｉ．ｍｅｄ．ｕｍｉｃｈ．ｅｄｕ／Ｂｒａｉｎａｒｒａｙ／）を使用してＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子識別子にマッピングし、ＨＵＧＯ遺伝子シンボルに変換してもよい。ソートされた細胞サブセットの複製を組み合わせて、発現値の幾何平均を使用して、グラウンドトゥルース参照プロファイル（例えば、図３ｂに示される）を作成した。
【０１２７】
外部データセットは、正規化設定を使用してダウンロードおよび分析される次世代配列決定（ＮＧＳ）データセットを含んでもよい。そのような外部データセットは、１００万あたりの転写物（ＴＰＭ）、１００万あたりの転写物１キロベースあたりの読み取り値（ＲＰＫＭ）、または１００万あたりの転写物１キロベースあたりの断片（ＦＰＫＭ）空間のうちの１つ以上を含んでもよい。ｌｏｇ２空間における分析の場合、ｌｏｇ２調整の前に、１の値を発現値に追加してもよい。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイデータセットは、マイクロアレイで説明されるように、バルク組織およびグラウンドトゥルース細胞サブセットが同じＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォーム上でプロファイルされた場合にＲＭＡを使用し、そうでなければＭＡＳ５正規化を使用して要約および正規化され得る。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒデータは、任意の追加の前処理なしに、非ログ線形空間でバッチ補正を用いてダウンロードおよび分析され得る。
【０１２８】
本明細書で使用される「単一細胞シグネチャーマトリックス」という用語は、一般に、生体試料中に表され得る細胞型の表現型を含むマトリックスを指す。入力データセットからの発現データは、上述のように要約され得る。細胞型表現の変動性およびｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑデータにおける固有のノイズを考慮して、単一細胞差次的発現解析における偶発的ドロップアウトに対処し、細胞レベルスケーリング因子を推定し、技術的および生物学的ノイズ成分をモデル化するための技術を開発してもよい。単一細胞表現型を定義するのに有用であるが、細胞標識が割り当てられた後にそのような技術を適用するとき、デコンボリューション性能の有意な増加は観察されない場合がある。ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑデータにおける細胞下位集団の発見は焦点ではない場合があるため、以下のアプローチに記載されるように、前処理ステップが限定され得る。
【０１２９】
単一細胞発現値は、まず１００万あたりの転写物（ＴＰＭ）に正規化され、１細胞あたりの転写物の数をよりよく近似させるために１０で除してもよい。各細胞表現型について、ｌｏｇ２空間における低平均発現を有する遺伝子は、品質管理フィルタとして０に設定され得る。より低密度の遺伝子カバレッジのため、フィルタは１０ｘ  Ｃｈｒｏｍｉｕｍによって生成されたデータに適用されない場合がある。少なくとも３個の単一細胞によって表される各細胞型について、すべての利用可能な単一細胞ＧＥＰの５０％は、置換なしにランダムサンプリングを使用して選択されてもよい（３個しか利用可能でなかった場合、２個の細胞がサンプリングされたように、画分試料サイズを切り上げてもよい）。プロファイルは、非ログ線形空間における合計によって集計され得、各集団レベルのＧＥＰは、ＴＰＭに正規化され得る。このプロセスは、細胞型ごとに集約されたトランスクリプトーム複製物（例えば、２、３、４、５、または５を超える）を生成するために繰り返されてもよい。例えば、ｓｃＲＮＡ−ＳｅｑおよびバルクＲＮＡ−Ｓｅｑシグネチャーマトリックスは、以下の典型的なパラメータ：細胞型あたりの遺伝子の最小数＝３００、細胞型あたりの遺伝子の最大数＝５００、ｑ値０．０１、および分位正規化なしで、前述のように生成されてもよい。
【０１３０】
例えば、ＨＮＳＣＣ  ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑデータに由来するシグネチャーマトリックスは、腫瘍ＩＤ  ＭＥＥＩ１８（原発腫瘍）およびＭＥＥＩ２５（原発腫瘍および対リンパ節転移）に関してトレーニングされてもよい（図２ｃ）。別の例として、ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑデータに由来するシグネチャーマトリックスは、腫瘍ＩＤ８０および８８（図６ａ、８ｂ〜ｅ、９、１５、および１９）上でトレーニングされてもよい。以前に注釈された細胞表現型標識は、ＣＤ８  Ｔ細胞を除いて両方の場合に用いてもよく、ＣＤ８  Ｔ細胞は、ＣＤ８ＡまたはＣＤ８Ｂを発現するＴリンパ球（非対数ＴＰＭ＞０）として定義されてもよい。膵島シグネチャーマトリックス（図２ｆおよび８ｆ〜ｉ）は、以前に割り当てられた細胞表現型を使用して、試料ＩＤ  ＨＰ１５０８５０１Ｔ２ＤおよびＨＰ１５０４９０１に関してトレーニングされてもよい。肥満細胞および主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）ＩＩ細胞は、トレーニングコホート内の単一細胞（例えば、３細胞未満）が不十分である場合、島シグネチャーマトリックスから省略され得る。α細胞における高発現マーカー遺伝子であるグルカゴンは、膵島トレーニングデータにおけるデコンボリューション性能に悪影響を及ぼし得るため、省略され得る。
【０１３１】
本明細書で使用される「デジタルゲーティング」という用語は、一般に、細胞集団を（例えば、マーカー遺伝子の高／低発現または高／中／低発現に基づいて）２つ以上の別個のセットに（例えば選択、包含、または除外によって）ソーティングすることを指す。図６ｄおよび９に示されるように、単一細胞は、複数（例えば、７）の以前に注釈された表現型に従って事前に標識されてもよい。Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、内皮細胞、癌関連線維芽細胞、および悪性黒色細胞。Ｔリンパ球は、ＣＤ８ＡまたはＣＤ８Ｂ（非対数ＴＰＭ＞０）の発現によって、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞にさらに分割されてもよい。例えば、ＣＤ８  Ｔ細胞は、以下のように別個の下位集団にさらに細分されてもよい。ＰＤＣＤ１および／またはＣＴＬＡ４発現に陽性の候補ＣＤ８  Ｔ細胞を単離するために、ＣＤ８  Ｔ細胞は、ＰＤＣＤ１（ＣＤ８  Ｔ細胞間のＰＤＣＤ１発現値の非対数ＴＰＭ＞５パーセンタイル）および／またはＣＴＬＡ４（ＣＤ８  Ｔ細胞間のＣＴＬＡ４発現値の非対数ＴＰＭ＞５パーセンタイル）の発現によって分割され得る。候補組織レジデントメモリ（ＴＲＭ）ＣＤ８  Ｔ細胞を単離するために、ＣＣＲ７（非対数ＴＰＭ＝０）ではなく、ＩＴＧＡＥ（非対数ＴＰＭ＞０）およびＣＤ６９（非対数ＴＰＭ＞０）を発現するＣＤ８  Ｔ細胞を選択してもよい。
【０１３２】
ｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔ−ＳＮＥ）によるｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑデータの視覚化は、デフォルトパラメータを有するＲにおけるＲｔｓｎｅパッケージを使用して行われ得る。図２ｆおよび８ｆに示されるように、ＣｏｍＢａｔは、ｔ−ＳＮＥ予測の前にドナー固有の変動を排除することができる。
【０１３３】
ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ分析フレームワークの概要
様々な計算方法を開発して、細胞型存在量、細胞型特異的ＧＥＰ、または両方をバルク組織発現プロファイルから推測してもよい。これらの方法は、生体混合物試料を線形方程式のシステムとしてモデル化することができ、ここで、ｎ遺伝子を有する単一の混合物トランスクリプトームｍが、Ｈ、ｋ個の異なる細胞型にわたる同じｎ個の遺伝子の発現プロファイルからなるｎ×ｋ細胞型発現マトリックス、および細胞型混合比率からなるサイズｋのベクターｆの産物として表される。
【０１３４】
ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ内でこのモデルを使用して細胞型存在量を推測する方法の一例として、Ｍをｎ個の遺伝子およびｃ個の混合物ＧＥＰを有するｎ×ｃマトリックスとし、マトリックスＢをｋ個の細胞サブセット（例えば、シグネチャーまたはベースマトリックス）のそれぞれについて差別的マーカー遺伝子を含有するＨのサブセットとする。ＭおよびＢを与えられた場合、次いで、以下の方程式を使用して、カラム［ｆ１，ｆ２，．．．，ｆｃ］を有するｋ×ｃ画分存在量マトリックスであるＦを推定することができる。
Ｂ×Ｆ・，ｊ＝Ｍ・，ｊ，１≦ｊ≦ｃ          （１）
式中、すべてのｉ、ｊについてＦｉ，ｊ≧０である場合、システムは過剰に決定され（例えば、ｎ＞ｋ）、ｍおよびＢの発現データは、非対数線形空間で表される。（Ｍｉ，・およびＭ・ｊは、マトリックスＭの行ｉおよび列ｊをそれぞれ示すことができることに留意する）いくつかのアプローチは、各混合物試料について、推測される混合係数が合計して１になるように、Ｆを正規化するか、またはＦに追加の制約を課すことができ、Ｆを（Ｂにおける細胞サブセットに関して）細胞型比率として直接解釈できるようになる。例えば、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ法を使用して、ｖ−サポートベクトル回帰の実装を使用してＦを推定してもよく、これは（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第ＵＳ２０１６／０２１７２５３号に記載されるように）細胞型参照プロファイル間のノイズ、不明な混合物含有量、および共線性に堅牢であり得る機械学習技術である。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ法を使用して、例えば、クロスプラットフォーム分析のための適切なバッチ補正技術でＦを推定することができる。
【０１３５】
群レベルの細胞型特異的遺伝子発現精製
ＦがＭについて決定されると、発現デコンボリューションまたは以前の知識（例えば、コールターカウンター、フローサイトメトリー）のいずれかを通じて、Ｆにおける各細胞型に対する代表的な推定ＧＥＰは、以下の一次方程式のシステムを解くことによって推定することができる。
Ｈｉ，・×Ｆ＝Ｍｉ，・，１≦ｉ≦ｎ              （２）
式中、Ｈは、ｎ個の遺伝子およびｋ個の細胞型のｎ×ｋ発現マトリックスであり、すべてのｉ、ｊについてＨｉ，ｊ≧０であり、Ｆは、上記のように、各混合物試料について相対細胞画分が合計して１になるという制約で定義される。上記の方程式１と同様に、システムは過剰に決定されてもよく（ｃ＞ｋ）、ｃとｋとの間のより大きなデルタは、一般にＧＥＰ推定の改善をもたらす（図３ｅおよび１１）。遺伝子発現の生物学的に現実的な推定を確実にするために、非負最小二乗回帰（ＮＮＬＳ）は、最適化フレームワークを用いて、非負制約で最小二乗問題を解いてもよい。ＮＮＬＳは、単純な混合物およびトイの例では堅牢であり得るが、実際の組織試料内に固有のより複雑な混合物に対するその性能は、線形システムにおけるノイズ、不精度、および欠損したデータによって影響され得る。様々なデータ正規化およびフィルタリング技術が、そのような問題を軽減するのに役立つように適用され得る（図３ｂ〜ｄ）。
【０１３６】
高解像度発現精製
バルク組織（例えば、図３ａ〜ｇにおけるインシリコ精製における）からの細胞型特異的遺伝子発現を推定するための方程式２の有用性にもかかわらず、各細胞型に対する単一の代表的なＧＥＰの推定に限定され得る。したがって、複数の目的の状態間の細胞型特異的差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）を探索するために、細胞型トランスクリプトームは、各条件（例えば、所与の療法に対する応答者対非応答者、早期対進行期疾患等）に対して再生成する必要がある場合がある。この問題により広範に対処するために、方程式２におけるモデルは、「高解像度」インシリコ細胞精製のための方法（例えば、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ）内で拡張され得る。
【０１３７】
そのようなアプローチは、バルク組織ＧＥＰ（例えば、Ｍ）のマトリックスを、等しいサイズのｋ遺伝子発現マトリックス（Ｆにおける各細胞サブセットに対して１つ）に分解することを含んでよい。この方法は、表現型クラス構造に対して非依存であり得、部分的な観察を伴う非負行列分解（ＮＭＦ）問題として式化することができる。例えば、ＭおよびＦを上記のように定義し（それぞれｎ×ｃおよびｃ×ｋマトリックス）、後者がＣＩＢＥＲＳＯＲＴによって推定されると仮定する。次いで、各遺伝子ｉについて、ｋ細胞型によるｃ混合物試料のｃ×ｋ発現マトリックスとして本明細書で定義される発現マトリックスＧｉを決定することができる。ＭおよびＦを固定してＧについて求解すると、以下の制約されたマトリックス分解問題が生じる場合がある。
Ｆ×Ｇｉ，・，・＝Ｐｉ，・，・，１≦ｉ≦ｎ              （３）
式中、
ｄｉａｇ（Ｐｉ，・，・）＝Ｍｉ，・，１≦ｉ≦ｎ          （４）
およびすべてのｉ、ｊ、ｋについては、Ｇｉ，ｊ，ｋ≧  ０である。方程式１および方程式２の線形システムとは異なり、３次元（３Ｄ）ｎ×ｃ×ｋマトリックスであってもよいＧに対する閉形式解は存在し得ず、特に追加の制約（例えば、規則化）なしで、非負行列因子分解（ＮＭＦ）のための既存の技術は、生物学的に合理的な推定を生じる可能性が低い場合がある。したがって、図１４に概略的に示されるヒューリスティックアルゴリズムを使用してＧを推定することができる。
【０１３８】
Ｇを推測するためのアプローチは、生物学的に合理的な解を生成しながら、問題の取り扱い性を向上させ得る２つの異なる仮定を行ってもよい。第１に、各遺伝子を独立して分析することができると仮定することができる。遺伝子間共分散関係を無視することは、いくつかの遺伝子の解像力に影響を及ぼし得るが、この仮定は、実際に有効であると見出され得る（図４ａ〜ｅ、５、６ａ〜ｂ、および１３）。第２に、所与の遺伝子に関して、細胞型特異的差次的発現の少なくともいくつかの証拠が、統計的に有意でない場合であっても、バルク組織試料において検出可能であると仮定することができる。
【０１３９】
この仮説は、以前に公開された細胞型特異的ＤＥＧのデータセットを使用して評価され得る。具体的には、ＤＥＧは、膵臓内分泌島細胞型（例えば、５細胞型）内の発現を考慮し（各細胞型は、全内分泌膵島内の約５％〜約４４％の中央画分存在量を含む）、非糖尿病正常対象（例えば、６対象）と２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）患者（例えば、４患者）との間の差次的発現レベルを比較するときに、１．２倍を超える変化を呈する遺伝子として以前に定義されてもよい。重要なことに、これらのＤＥＧは、ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑプロファイリングによって同定され、インシリコで再構築されたバルク島における差次的発現の証拠の試験を可能にした。既知の表現型クラスによってグループ化されると、Ｔ２Ｄに関連するＤＥＧの９８％は、再構築された島における正しい配向の少なくともいくらかの倍率差を示す（図１３ａ）。この結果は、細胞型特異的ＤＥＧが、表現型クラス標識の予備知識なしにバルク組織で認識され得ることを示唆し得る。実際に、各遺伝子が発現レベルによって再構築された島において独立して順序付けされ、各ベクターが高発現群および低発現群に均等に分割される（例えば、５０パーセンタイル分割）とき、糖尿病患者からのデータは、以前に定義された細胞型特異的ＤＥＧの８０％について低発現または高発現に歪み得る。これらの遺伝子のうち、濃縮方向は、９９％の症例において既知の倍率変化の配向に一致した（図１３ｂ）。したがって、バルク遺伝子発現データの変動を活用して、基礎となる細胞下位集団における潜在的表現型クラス構造を推測することができる。
【０１４０】
これらの基本的な仮定を混合マトリックスＭおよび細胞型画分存在量マトリックスＦと共に考慮すると、高解像度精製のためのヒューリスティックアルゴリズムを開発することができる。このヒューリスティックの概要を以下に概説し、対応するグラフィック要約を図１２ｃに示す。
【０１４１】
各遺伝子ｉについて、その対応する混合ベクトルＭｉ，・は、監督されていないアプローチを使用してバルク発現の違いに基づいて、２つのクラスに分層されてもよい（図１２ｃ、ステップｉ、ｉｉ）。細胞型特異的遺伝子発現係数ｇ１およびｇ２は、各クラスについて推定されてもよく（図１２ｃ、ステップｉｉ）、データに最適な適合性を有するｇ１、ｇ２対が見出されてもよい（図１２ｃ、ステップｉｉｉ）。
【０１４２】
次に、統計試験を行って、所与の遺伝子が各細胞型によって発現されるかどうかを判定し、そうである場合、ｇ１とｇ２との間で有意に異なるかどうかを評価してもよい（図１２ｃ、ステップｉｖ）。
【０１４３】
次に、前述のステップを満たす遺伝子／細胞型の組み合わせについて、連続発現値は、回帰分割統治アルゴリズム戦略によって推定され得る。遺伝子が有意に発現されるが、混合物試料にわたって有意に変動しない場合、定常発現値が推定されてもよく、そうでなければ、それは発現しないものに設定されてもよい。マトリックスＧには、細胞型特異的発現データが取り込まれ得る（図１２ｃ、ステップｖ−ｉ）。
【０１４４】
次に、ｇ１およびｇ２係数は、有意性試験の結果に従って改変され得る（例えば、所与の細胞型について、発現がｇ１とｇ２との間で有意に異ならない場合、ｇ１およびｇ２における係数は、同じ値に設定され得る。図１２ｃ、ステップｖ−ｉｉ）。
【０１４５】
次に、Ｇにおける連続発現ベクターを調整して、以前に決定した調整されたｇ１およびｇ２係数とのそれらの合致性を最大化してもよい（図１２ｃ、ステップｖ−ｉｉｉ）。
【０１４６】
最後に、最終推定細胞型特異的発現マトリックス（例えば、Ｇ）は、データベースに保存されてもよい（例えば、ディスクに書き込まれてもよい）。
【０１４７】
このフレームワーク内で、細胞型特異的遺伝子発現ベクターは、ＮＮＬＳを使用して方程式２（上記）で推定され得る。Ｍｉ，・全体にわたる発現の変動を捕捉するために、方程式２は、同様の発現値によってグループ化された混合試料のサブセット上で反復求解され得る。各サブセットのサイズは、長さｗの摺動ウィンドウによって制御され得る。ＮＮＬＳ制約を満たすために、かつ表現型クラスの重複を避けるために、ｗは、区間ｋ＜ｗ≦（ｃ／２）によって境界されてよく、式中、ｋは細胞型の数を示し、ｃは試料の数を示す。このアプローチの良好な性能は、幅広い範囲のｗ値にわたって観察され得る。しかしながら、群レベルの発現精製の飽和度分析（図３ｅ、１１）内で、より大きなｗ値で観察される限界増加を考慮して、ｗはｋよりも４〜５倍大きく設定されてもよく、実際の考慮事項と性能を均衡させてもよい。線形システムにおける潜在的な不安定性に対処し、堅牢な標準誤差および信頼区間を有する発現係数を推定するために、ＮＮＬＳは、ブートストラップを使用して実行されてもよい。
【０１４８】
ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ一括修正
一括修正技術は、発現プロファイリングにおける技術的変動を最小限に抑えるために開発されてもよく、遺伝子発現デコンボリューションに適用されてもよい。以前の方法を使用して、そのような一括修正は、特定の状況では不可能ではないが、非常に困難であり得る。例えば、ＴＣＧＡ腫瘍試料からの対マイクロアレイとＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルとの間の遺伝子レベルの技術的変動をモデル化するために、４自由度を有する立方体スプラインを使用する以前のアプローチは、対試料が利用可能である場合に潜在的に有用であるが、新しい発現データセットおよびアーカイブ発現データセットがそのような対を欠いている場合には、非常に困難であり得る。別の例として、細胞標準プロファイルとバルク組織ＧＥＰとの間の技術的変動を排除するために適用され得る経験的ベイズ法であるＣｏｍＢａｔは、バッチが同じ組織型からのＧＥＰを表すときに潜在的に有用であるが、バッチが異なる組織型からのＧＥＰを表すとき、細胞存在量推定の著しい歪みを導入するために、不可能ではないが、非常に困難であり得る。
【０１４９】
発現プロファイリングにおける技術的変動の問題を克服するために、本開示は、（例えば、シグネチャーマトリックスと混合物試料の入力セットとの間の）技術的差を最小限に抑えるための一括修正手順を提供する。例えば、そのようなアプローチは、Ｍと、細胞参照プロファイルから推定される混合物試料Ｍ＊の一致するセットとの間で一括修正を行ってもよい。クロスプラットフォームの技術的変動またはクロスサンプルの技術的変動などの技術的変動は、低減、最小化、または除去され得る。一括修正を行うことは、試料型がバッチ間で比較可能であることを確実にするのに役立ち、したがって、潜在的な推定アーチファクトと両方のプラットフォーム上でプロファイルされた対試料の必要性を回避することができる。
【０１５０】
デコンボリューション方法（例えば、異なる細胞型の混合物から細胞型状態を識別または定量化するための）は、（例えば、シグネチャーマトリックスとバルク混合物プロファイルとの間の）技術的変動を低減するために一括修正手順を実行することを含み得る。例えば、バルク参照モード（例えば、Ｂモード）一括修正は、以下のように行われてもよい。一般に、単一細胞トランスクリプトームプロファイリングに由来する参照表現型を含む、デコンボリューション方法（例えば、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴ）がＲＮＡ−Ｓｅｑに適用され得るが、そのような方法は、シグネチャーマトリックスとバルク混合物プロファイルとの間の技術的変動を明示的に処理しない場合がある。技術的変動には、クロスプラットフォーム技術的変動またはクロスサンプル技術的変動が含まれ得る。例えば、技術的変動は、異なるプラットフォーム（例えば、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ、マイクロアレイ、１０ｘ  Ｃｈｒｏｍｉｕｍ、ＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ２、液滴ベースの技術、ＵＭＩベースの技術、非ＵＭＩベースの技術、３′／５′偏向技術）および／または異なる試料型（例えば、新鮮な／冷凍された試料、ＦＦＰＥ試料、単一細胞試料、バルクソートされた細胞集団もしくは細胞型、および細胞集団もしくは細胞型の混合物を含む試料）にわたるシグネチャーマトリックスの特徴プロファイルおよびバルク混合物の特徴プロファイルの取得から生じる場合がある。例えば、同じタイプの発現データ（例えば、ＧＥＰ）を有する特徴プロファイルが異なるプラットフォームを使用して取得される場合、クロスプラットフォーム技術的変動が生じる場合がある。技術的変動は、デコンボリューション結果を可変的に混乱させる可能性があるため、少なくとも２つの異なる戦略を含み得る正規化ワークフロー（図７ａ〜ｈ）を適用して、プラットフォーム（例えば、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、マイクロアレイ）および組織貯蔵タイプ（例えば、新鮮な／凍結された対ＦＦＰＥ）にわたって遺伝子発現デコンボリューションを確実に適用することができる。例えば、最も適切な戦略を選択する際にユーザを導く決定木を図７ａに提供する。決定木は、実行されるバルクモード一括修正（例えば、Ｂモード）手順および／または単一細胞一括修正（例えば、Ｓモード）手順の選択を支援するために使用され得る。
【０１５１】
バルク参照モード（例えば、Ｂモード）一括修正は、バルクソートされた参照プロファイル（例えば、バルクＲＮＡ−Ｓｅｑまたはマイクロアレイ）に由来するシグネチャーマトリックスと混合物試料の入力セットとの間の技術的差異を除去することができる（図７ｃ）。例えば、一括修正は、異なる細胞型の混合物に対する１つの細胞型の特徴プロファイル間の技術的差異を除去し得る。この技術はまた、転写物がバルク混合物ＧＥＰ（例えば、ＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ２によってプロファイルされたＵＭＩなしの完全長転写物）と類似して測定されることを条件として、ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑプラットフォームに由来するシグネチャーマトリックスに適用され得る。混合物試料Ｍのセットを与えられた場合、バルク参照モード一括修正アプローチは、一連の推定混合物試料Ｍ＊を作成することを含んでよく、ここで後者は、（非対数線形空間において）Ｍにおける推定細胞型比率と対応するシグネチャーマトリックスプロファイルとの線形組み合わせを含む。戦略は一般的であってもよく、異なるデコンボリューションおよび一括修正方法（図７ｆ〜ｈ）に柔軟に対応することができるが、ＣｏｍＢａｔ（経験的ベイズ法）を使用して、ｌｏｇ２調整後のＭとＭ＊との間のバッチ効果を排除してもよい。バッチ効果が除去されると、細胞比率は、非対数線形空間における調整混合物試料を使用して再推定され得る（図７ｆ〜ｇ）。細胞型列挙に加えて、このアプローチはまた、細胞型特異的遺伝子発現精製に適用され得、それによって、発現レベルが低いか、またはシグネチャーマトリックスにおける細胞型の集合から欠如している遺伝子のダウンウェイトを可能にする（図７ｈ）。この技術は、一括修正手順を実行するために、少なくとも約３〜５個の混合物試料を必要とし得る。
【０１５２】
上記のＢモード一括修正技術にかかわらず、過剰なクロスプラットフォーム技術的変動が存在する場合（例えば、存在することが予想される細胞型がバルクＧＥＰ試料中で脱落することが観察される場合）、デコンボリューションが不良に行われ得るか、または失敗し得る。例えば、この現象は、１０ｘ  Ｃｈｒｏｍｉｕｍ由来のシグネチャーマトリックスを使用して観察され得る（図２ｂおよび７ｅ）。ＵＭＩベースの方法および１０ｘなどの３′／５′偏向方法と、ＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ２などのＵＭＩなしの完全な転写物を捕捉する方法との間のトランスクリプトーム表現の大きな差異を考慮すると、そのような不一致は驚くほどではない場合がある。Ｂモード一括修正が細胞ドロップアウトに適切に対処できず、したがって、そのような変動を克服するのに不十分であり得るため、単一細胞参照モード一括修正が、１０ｘ  Ｃｈｒｏｍｉｕｍに由来するシグネチャーマトリックスに関与するデコンボリューション方法および他の液滴ベースの技術またはＵＭＩベースの技術に適用され得る（図７ｂ）。単一細胞参照モード（例えば、Ｓモード）一括修正は、以下のように（図２４の概略図によって例示されるように）行われてもよい。
【０１５３】
Ｂモード一括修正と同様に、Ｓモードの目的は、技術的変動を最小限に抑えながら、ｃ試料を含有する混合物ＧＥＰ  Ｍのセットから細胞頻度Ｆを得ることであってもよい。高い全体性能の場合、このアプローチは、少なくとも２つの手順、すなわち初期細胞頻度推定相（相１）、および混合マトリックスではなくシグネチャーマトリックスが調整される改良相（相２）の連続的な適用を含んでもよい。相１において、目標は、（１）シグネチャーマトリックスＢおよび（２）Ｂが導出された単一細胞参照プロファイルのセットＲを考慮して、混合物試料Ｍのセット内の細胞頻度Ｆ＊の初期推定値を得ることであってよい（図７ｂ）。これを達成するために、まず、Ｒ内の単一細胞ＧＥＰから再構成されたｃ人工混合物プロファイルＭ＊のシリーズを作成してもよい。混合係数は、正規分布Ｎ（μ、σ）に従って決定してもよく、ここでμは、Ｒ｛μ１、μ２、．．．、μｎ｝中のＢからの各細胞型の画分存在量に設定され、σは、｛２μ１、２μ２、．．．、２μｎ｝に設定される。次いで、各細胞サブセットからの単一細胞トランスクリプトームを、この分布に従ってランダムにサンプリングし、ＴＰＭ空間におけるｃバルク発現プロファイルに凝集してもよい。ＣｏｍＢａｔを、その後にｌｏｇ２空間でＭおよびＭ＊に適用して、それぞれ調整された混合物ＭａｄｊおよびＭａｄｊ＊を得ても良く、推定された細胞頻度（Ｆ＊）は、元のシグネチャーマトリックス（Ｂ）を使用してＭａｄｊ（ｌｏｇ空間内）から推定されてもよい。
【０１５４】
第２の相では、細胞比率推定値は、（１）シグネチャーマトリックスＢ上で一括修正を実行すること、および（２）調整されたシグネチャーマトリックスを元の混合物セットＭに適用することによってさらに精製されてもよい。相１と同様に、プロセスは、単一細胞をサンプリングしてＲからｃ人工混合物を作成することによって開始されてもよい。しかしながら、この場合、細胞型は、相１から得られたそれらの推定頻度Ｆ＊に従ってサンプリングされてもよく、推定混合物Ｍ＊＊の新しいマトリックスをもたらす。次いで、ＣｏｍＢａｔを、ｌｏｇ２空間でＭおよびＭ＊＊に適用して、それぞれ調整混合物ＭａｄｊおよびＭａｄｊ＊＊を得ることができる。Ｍａｄｊ＊＊を非対数線形空間に変換した後、Ｂにおける各遺伝子の細胞型発現係数を再構築するために、Ｍａｄｊ＊＊およびＦ＊の両方をＮＮＬＳへの入力として使用して（方程式２を参照）、調整されたシグネチャーマトリックスＢａｄｊを得ることができる。特に、グループモード発現精製（図１）とは異なり、ＳモードにおけるＮＮＬＳのこの使用は、適応ノイズフィルタリングを必要としない場合がある。これは、（１）Ｍａｄｊ＊＊における各人工混合物の細胞混合比率がＦ＊から導出され、したがって１００％確実に知られてよく、（２）ＣｏｍＢａｔは、各遺伝子のｌｏｇ２発現プロファイルに線形形質転換のみを適用してよく、それによってバルク発現値の相対順序を保持するからである。したがって、Ｍａｄｊ＊＊〜Ｂにおける調整を伝播するためにＮＮＬＳを適用するための条件は理想的であり得る。Ｂａｄｊが得られると、元の混合物Ｍからセル周波数を推定することができる。Ｂモード一括修正と同様に、Ｓモード内でＣｏｍＢａｔを適用するには、少なくとも約３  〜  ５個の混合物試料が必要であり得る。ＮＮＬＳを実行するためには、細胞型よりも多くの混合物試料が必要とされ得る（式２を参照）が、この要件を満たさないデータセットについては、Ｆ＊からランダムに描かれた周波数ベクトルを使用してＲから追加の人工混合物を作成し得る。各追加の偽混合物は、バッチ修正の前に、その対応する混合物試料とＭで対合され得る。
【０１５５】
ソフトウェアの実装
ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘは、ＲおよびＰＨＰに基づいてそのバックエンドを有するＷｅｂフレームワーク内で開発され得る（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｃｉｂｅｒｓｏｒｔｘ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕによって記載されるように）。このウェブフレームワークは、特定のハードウェア、ソフトウェアパッケージおよびライブラリー、およびファイルシステム属性への固有の依存を最小限に抑え得る。ユーザは、図１の各ステップを含む、本明細書に記載される結果の再現を可能にし得るいくつかの段階的チュートリアルを用いた詳細なガイドを提示され得る。このインターフェースを通じて、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘは、ユーザが、（１）対象の各細胞型の発現プロファイルを定義する遺伝子を列挙する署名遺伝子ファイルと共に、異なる細胞型のバルク混合物を表す遺伝子発現データを処理することを可能にし得る。後者の場合、ユーザは参照細胞型に既存／キュレートされたシグネチャーマトリックスを使用し得るか、純粋な細胞集団の参照遺伝子発現プロファイルを提供することでカスタムシグネチャー遺伝子ファイルを作成し得る。具体的には、カスタムシグネチャー遺伝子マトリックスを作成するために、ユーザは、目的の単一細胞型または細胞集団の表現型同一性と共に、バルク選別試料からの単一細胞ＲＮＡ配列決定データまたはデータを提供することができる。
【０１５６】
これらの入力ファイルを考慮すると、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘは、（２）その前駆体と同様に、混合物中に存在する各細胞型の画分表現の埋め込みを可能にし得る。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘはまた、上記の重要なバッチ修正方法を実装する際に、バルクＲＮＡ−Ｓｅｑデータからの復元をサポートする。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘはまた、上述の２つの異なるモード（例えば、グループレベルおよび高分解）でシリコ精製細胞型における個体のＧＥＰの埋め込みを可能にする。次いで、得られた埋め込まれた画分および埋め込まれたＧＥＰは、視覚化およびダウンロードのためのヒートマップ、テーブル、および積み重ねられたバープロットとしてレンダリングされてもよい。
【０１５７】
インタラクティブなＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘユーザインターフェースは、ｊＱｕｅｒｙ  ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ライブラリーおよびオープンソースライブラリー（ｐｈｐＭａｉｌｅｒ、ｉｄｉｏｒｍ、ｂｌｕｅｉｍｐ  ｊＱｕｅｒｙ−Ｆｉｌｅ−Ｕｐｌｏａｄ、ＤａｔａＴａｂｌｅｓ、ｐｈｐＥｘｃｅｌおよびｍＰＤＦを含む）を使用して実装され得、Ｔｗｉｔｔｅｒ  Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ  ２．３．２を使用して実装されるウェブサイトのグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）を有する。サイトは、仮想マシン上のＡｐａｃｈｅサーバ上で実行され得、ユーザおよびジョブデータをＭｙＳＱＬデータベースに記憶し得る。しかしながら、ユーザはデータを完全に制御し、必要に応じて削除することができる。各ユーザの環境は、ベンチマーキングに使用される例示的なデータセット、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘの使用および入力データの準備のためのチュートリアル、および他の例示的なファイルを含む。
【０１５８】
ＮＳＣＬＣ細胞サブセットのグループレベル精製
図３ｇで分析したＮＳＣＬＣ試料上で酵素的リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）枯渇を使用したにもかかわらず、ＴＰＭスケールリードの大部分（３０〜９０％）は、ミトコンドリアｒＲＮＡ、特にＭＴ−ＲＮＲ１（ミトコンドリアコード１２Ｓ  ＲＮＡ）およびＭＴ−ＲＮＲ２（ミトコンドリアコード１６Ｓ  ＲＮＡ）に由来し得る。この混乱変数を除去するために、これらの転写物を除去してよく、データマトリックスをＴＰＭ空間に再規格化してよい。発現精製のためのＮＳＣＬＣシグネチャーマトリックス（図３ｇ）を生成するために、上皮（ＥｐＣＡＭ＋）、造血（ＣＤ４５＋）、内皮（ＣＤ３１＋）、および間質（ＣＤ１０＋）細胞のＧＥＰを分析し、これらのそれぞれを、ドナーから得られた一次ＮＳＣＬＣ腫瘍生検からＦＡＣＳによって選別した。シグネチャーマトリックスパラメータは、本明細書の他の箇所でシグネチャーマトリックス構築のために記載されるものと同一であってもよいが、ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑに用いられる前処理ステップなしであってもよい。何百もの遺伝子（一例では、９３３遺伝子）からなる得られたシグネチャーマトリックスを、別のドナーセット（一例では、ｎ＝２６）から得られたバルクＮＳＣＬＣ腫瘍試料の全転写プロファイルに適用してもよく、結果を分析して、グループレベルの細胞型特異的ＧＥＰを求めることができる。グラウンド真実細胞型ＧＥＰは、第２のドナーセットから分類されたＥｐＣＡＭ＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ３１＋、およびＣＤ１０＋細胞ＦＡＣＳの複製ＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルの幾何平均を取ることによって誘導され得る。
【０１５９】
合成ＧＥＰ混合物の生成および分析
図４ａにおける模擬ＧＥＰ混合物は、ＬＭ２２に基づくソースデータから得られたｋ＝４細胞型（ナイーブＢ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、ＮＫ細胞、および単球）の参照プロファイルを使用して作製してもよい。コンセプトの最初の証拠として、分析は、転写体からランダムに選択された１，０００個の遺伝子、ならびにＬＭ２２シグネチャーマトリックスからのすべての５４７個の遺伝子に限定され得る。次に、４つの細胞型発現ベクターは、ｌｏｇ２調整され得、それらのそれぞれはｍ＝４００回コピーされ得る。可変性は、４つの細胞型にわたる各遺伝子ｊの標準偏差ｓｄｊを計算することによって、および各遺伝子の発現値ｖを、分布Ｎ（ｖ、ｓｄｊ／５）からランダムな値を描画することによって置き換えることによって導入され得る。生物学的分類をシミュレートするために、第１の２００および第２の２００試料が２つのクラスに分層されるように、ＤＥＧを各細胞型に添加してもよい。重複ＤＥＧパターンは、図４ａ（左パネル）にそれぞれオレンジ細胞、緑細胞、青色細胞、および紫色細胞によって描写されるように、単球、Ｂ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、およびＮＫ細胞ＧＥＰに挿入されてもよい。ＤＥＧは、５倍高い発現レベルを反映するように作製され得る。次に、ｍ×ｋ行列は、Ｎ（１／ｋ、１／（２ｋ））を有する正規分布からランダムに描かれた混合物係数から生成されてよい。各混合物の係数は、合計１に正規化され得る。混合する前に、合成細胞型ＧＥＰは、非対数線形空間に変換され得る。次に、それらをそれらの対応する混合係数に従って組み合わせてもよく、４００個の模擬組織ＧＥＰを得てもよい。高分解能ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘは、例えば、単球、Ｂ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、およびＮＫ細胞のバーコード遺伝子を含有するＬＭ２２シグネチャーマトリックスのサブセットである２０（＝５×ｋ）のウィンドウサイズおよびＬＭ４を使用して、得られた混合物データセット上で行われ得る。
【０１６０】
図４ｄにおける合成データセットについて、上記のアプローチは、ｍ＝１１，８４５（ＬＭ２２が由来するソースデータセット内の遺伝子の完全なリスト）および以下の変化で繰り返され得る。まず、上方制御されたＤＥＧは、単球ＧＥＰに「ブルセイ」標的（３つの同心円）の形状で埋め込まれ得る。バルク混合物中のＤＥＧ画像をマスクするために、ＤＥＧは、２２個の遺伝子ごとに単球ＧＥＰに添加されてもよく、逆（等しい倍率変化の下方制御ＤＥＧ）は、交互順序（例えば、６６個の遺伝子ごと）で残りの細胞型ＧＥＰ（ｎ＝３）に添加されてもよい。次に、埋め込まれたブルズアイを回収するために、上記のように高解像度のＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ方法を適用し得る。
【０１６１】
図１４における合成データセットについて、分析がＬＭ２２におけるすべての遺伝子と共に３，０００個の遺伝子のランダム選択に限定されることを除き、図４ｄに使用されるアプローチを繰り返してもよい。次に、２つの上方制御されたＤＥＧパターンを埋め込んでもよい：標的を単球ＧＥＰに埋め込んでもよい（図４ｄに示されるが、他の遺伝子ごとに挿入されている）、および１０個の対角線で整列された正方形のセットをＣＤ８  Ｔ細胞ＧＥＰに埋め込んでもよい（すべての遺伝子に添加されている）。これらのＤＥＧを混合物プロファイルに混乱させるために、下方制御されたＤＥＧは、それぞれのパターンを補完する相互方法でｂ細胞およびＮＫ細胞に挿入されてもよい。上記のように高分解能ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘを適用することができる。
【０１６２】
高解像度ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘによる細胞型特異的ＤＥＧ検出の分析
５つの細胞型を有する合成腫瘍は、以下のように分析され得る。模擬混合物は、本明細書の他の箇所に記載されるように作製されてもよいが、この場合、ｋは５０個の混合物に設定されてもよく、ｍは３，０００個の遺伝子（ＬＭ２２を含有する）に設定されてもよく、ＤＥＧは、ＣＤ８  Ｔ細胞プロファイルに排他的に挿入されてもよい（試料２６〜５０、すべてのＤＥＧは、ベースラインレベルと比較して過剰発現された）。現実的な設定の範囲にわたるパフォーマンスを評価するために、（１）ＤＥＧ倍率変化（１．５〜５倍）および（２）ＣＤ８  Ｔ細胞の平均分数存在量（１％〜２５％）の異なる組み合わせについて、別個の５０個の混合物のセットを評価してよい（図４ｅ）。高解像度ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ法は、例えば、長さ１６（＝４ｋ）のウィンドウを使用して、ＬＭ４シグネチャーマトリックス（上述）を使用して、すべての混合物試料上で行われ得る。不明な混合物含有量（例えば、腫瘍中の悪性細胞）の存在を評価するために、分析は、各混合物データセットに平均５０％のＨＣＴ１１６（結腸癌細胞株）を添加することによって、およびバッチ修正を伴う高分解能ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘを適用することによって繰り返され得る。ＣＤ８  Ｔ細胞およびＨＣＴ１１６の平均比率がそれらの標的存在量に設定され得ることを除き、本明細書の他の箇所に記載されるように、混合係数を模擬するために同じ戦略が適用され得る。前述と同じＨＣＴ１１６  ＧＥＰデータセットおよび発現正規化ステップを使用し得る。曲線下面積は、既知のＤＥＧクラス（それぞれ２５個の試料）間のｌｏｇ２空間における遺伝子レベル倍率変化を計算することによって、および既知のＤＥ遺伝子（陽性）と残りの遺伝子（陰性）との間の結果として生じる量を比較することによって評価され得る。特異性を評価するために、このプロセスは、各埋め込まれた細胞型Ｇｅｐについて繰り返され得る。
【０１６３】
８細胞型を有する模擬黒色腫腫瘍は、以下のように分析され得る。黒色腫患者由来の単細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルは、本明細書の他の箇所に記載されるように得られ得、以前に注釈された７つの細胞表現型に従って標識され得る。Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、内皮細胞、癌関連線維芽細胞、および悪性細胞。Ｔリンパ球は、合計ｋ＝８の評価可能な細胞型について、ＣＤ８ＡまたはＣＤ８Ｂ（非対数ＴＰＭ＞０）の発現によってＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞に分割されてもよい。次に、黒色腫腫瘍をシミュレートするために、解離された腫瘍にわたる細胞型頻度の分布を反映するアプローチを使用してもよい。具体的には、各合成腫瘍を構築するために、各細胞型は、１回に１回繰り返され得、その細胞型に対応するすべての単一細胞は、元のコホート内のランダムに選択された腫瘍から選択され得る。
【０１６４】
このプロセスは、複数の腫瘍（例えば、５０、１００、または２００）のコホートを作製するために反復され得る。各合成腫瘍について、非対数線形空間における単細胞Ｇｅｐは、合計によって凝集され、ＴＰＭによって正規化され得る。各コホートについて、以下が変化し得る：（１）人工ＤＥＧを有する細胞型の総数（ｄ＝１、２、３、．．．、８）、および（２）ＤＥＧのｌｏｇ２倍変化（ｆｃ＝１、２、および３）（図１５ａ）。ｄおよびｆｃの各値について、例えば、０．５の平均ｆｃおよびｓｄで、正規分布から描かれた発現値を、ランダムに選択された複数の（例えば、約２，０００）遺伝子のセットに加えることによって、人工ＤＥＧを作製してもよい。差動発現は、ｄ、ＤＥＧを有する細胞型の数に応じて異なるシミュレーションを行うことができる。ｄ＝１の場合、細胞型ＧＥＰの半分は、人工ＤＥＧを有するクラスに割り当てられ得、半分は、それらのベースライン値を保持し得る。ｄ＞１の場合、目的は、塊状腫瘍転写産物におけるＤＥＧの回復を妨げる方法でＤＥＧをシミュレートすることであってもよい。これを行うために、クラスサイズは、ｄで割った腫瘍の数よりも２５％大きいように設定されてよく、得られるＤＥＧクラスは、細胞型にわたって均等にタイルをかけてよい。細胞比率を列挙するために、同じ８種類の細胞を捕捉する２つの腫瘍に由来する黒色腫シグネチャーマトリックスを使用してもよい（図８ｂ）。すべての合成腫瘍は、残りの１７個の保留腫瘍に由来し得る。長さ３２（＝４ｋ）のウィンドウは、高解像度転写トーム精製のために使用され得る。５種の細胞型を有する合成腫瘍について、上述のように精度を評価してもよい。ＤＥＧ回復を最大化するｌｏｇ２倍変化を得ることができる（例えば、９５％信頼区間＋／−０．００９を有する０．１１の平均）。
【０１６５】
高分解能ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘを有する原発性腫瘍検体の分析
リンパ腫図５ａ〜ｃおよび１６について、長さ４０（＝４ｋ）のウィンドウを使用し、ＬＭ２２を、細胞型の列挙および前の転写体精製後にｋ＝１０個の主な白血球サブセットに折り畳んだ。
【０１６６】
ＮＳＣＬＣ．図５ｄ〜ｆおよび１８ｃ〜ｅについて、長さ２０のウィンドウを使用して、本明細書の他の箇所に記載されるシグネチャーマトリックスを使用してｋ＝４細胞型を列挙した。ＴＣＧＡ  （Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ）試料の高解像度精製のために、ＬＵＡＤおよびＬＵＳＣ腫瘍（および隣接する正常組織）のＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルを均一に処理し、正規化し、単一の発現マトリックスにマージし、異常値およびバッチ効果の証拠についてｔ−ＳＮＥによって視覚化してもよい。推定される異常値試料を特定し、さらなる分析から省略することができる。高解像度精製後、細胞型特異的ＤＥＧは、ＬＵＡＤ腫瘍試料とＬＵＳＣ腫瘍試料との間で特定され得る。有意性についてＤＥＧをフィルタリングするために、例えば、追加のストリンジェンシーについて０．５未満のＱ値閾値と連結された模擬黒色腫腫瘍（図１５ａ〜ｃ）におけるＤＥＧ回復の感受性および特異性を最大化する、経験的に由来する閾値（例えば、０．１超のｌｏｇ２倍変化）を適用し得る。
【０１６７】
黒色腫図６ｂについて、長さ３２（＝４ｋ）のウィンドウを使用してもよく、ｋ＝８種の主な細胞型を標的とする単一細胞由来の黒色腫シグネチャーマトリックスを使用してもよい（図８ｂ）。ＤＥＧは、ＮＳＣＬＣについて上述したように濾過されてもよい。
【０１６８】
バルク黒色腫生検におけるＰＤＣＤ１＋／ＣＴＬＡ４＋ＣＤ８  Ｔ細胞の分析
ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ法は、ＰＤＣＤ１＋／ＣＴＬＡ４＋ＣＤ８  Ｔ細胞を８種の他の主要細胞型と共に列挙するように設計された黒色腫シグネチャーマトリックスを使用して、一括修正を用いて適用して、ＲＮＡ−Ｓｅｑによってプロファイルされた２つおよびＮａｎｏＳｔｒｉｎｇによってプロファイルされた３つのデータセットからのバルク黒色腫腫瘍における細胞組成物を列挙してよい（図９）。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  ｎカウンターによって尋問される遺伝子の数が少ないことを考慮して、シグネチャーマトリックス内の重複遺伝子は、単一細胞から再構築された黒色腫腫瘍上でベンチマークされ得、良好な性能を示すことが見出され得る（図２１ａ〜ｂ）。
【０１６９】
統計分析
既知の細胞型特徴と予測される細胞型特徴（例えば、割合またはＧＥＰ）との間の線形一致は、示されるように、ピアソン相関（ｒ）またはスピアマン相関（ｒｈｏ）によって決定されてもよい。コンコーディネーション相関係数（ＣＣＣ）は、例えばＲパッケージＤｅｓｃＴｏｏｌｓからのＣＣＣ関数を使用して予測および予想されるｌｏｇ２調整された発現プロファイルを比較することによって決定され得る。データが通常分布されるとき、グループ比較は、不等しい変異を有する両側ｔ検定または適切に対ｔ検定を使用して決定されてもよく、そうでなければ、両側ウィルコクソン検定を適用してもよい。複数の仮説試験は、例えば、ベンジャミニおよびホッチバーグ法を使用して行われ得る。Ｐ＜０．０５の結果は有意とみなされ得る。統計分析は、ＲおよびＰｒｉｓｍ  ｖ７（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）で実施され得る。サンプルサイズの推定は、事前に指定された効果サイズを検出するのに十分な電力を確保するために行われない場合がある。
【０１７０】
コンピュータシステム
本開示は、本開示の方法を実装するようにプログラムされたコンピュータシステムを提供する。図２２は、例えば、生体試料から特徴プロファイルを生成し、特徴プロファイルと、異なる細胞型に関する特徴シグネチャーの参照マトリックスとの間の回帰を最適化し、生体試料中の異なる細胞型の存在量を定量化するようにプログラムされるか、またはそれ以外の方法で構成されるコンピュータシステム２２０１を示す。
【０１７１】
コンピュータシステム２２０１は、例えば、生体試料から特徴プロファイルを生成すること、特徴プロファイルと、異なる細胞型の特徴署名の参照マトリックスとの間の回帰を最適化すること、および生体試料中の異なる細胞型の豊富性を定量化することなど、本開示の分析、計算、および生成の様々な態様を調節することができる。コンピュータシステム２２０１は、ユーザの電子デバイスまたは電子デバイスに対して遠隔に位置するコンピュータシステムであってもよい。電子デバイスは、モバイル電子デバイスであり得る。
【０１７２】
コンピュータシステム２２０１は、単一のコアまたはマルチコアプロセッサ、または並列処理のための複数のプロセッサであり得る中央処理ユニット（ＣＰＵ、本明細書において「プロセッサ」および「コンピュータプロセッサ」も含む）２２０５を含む。コンピュータシステム２２０１はまた、メモリまたはメモリ位置２２１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み取り専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶ユニット２２１５  （例えば、ハードディスク）、１つ以上の他のシステムと通信するための通信インターフェース２２２０（例えば、ネットワークアダプタ）、ならびにキャッシュ、他のメモリ、データ記憶装置、および／または電子ディスプレイアダプタなどの周辺デバイス２２２５を含む。メモリ２２１０、記憶ユニット２２１５、インターフェース２２２０、および周辺デバイス２２２５は、マザーボードなどの通信バス（ソリッドライン）を介してＣＰＵ  ２２０５と通信する。記憶ユニット２２１５は、データを記憶するためのデータ記憶ユニット（またはデータリポジトリ）であり得る。コンピュータシステム２２０１は、通信インターフェース２２２０を用いて、コンピュータネットワーク（「ネットワーク」）２２５０に動作可能に結合され得る。ネットワーク２２３０は、インターネット、インターネットおよび／またはエクストラネット、またはインターネットと通信しているイントラネットおよび／またはエクストラネットであってもよい。
【０１７３】
いくつかの場合では、ネットワーク２２３０は、通信および／またはデータネットワークである。ネットワーク２２３０は、クラウドコンピューティングなどの分散型コンピューティングを可能にすることができる１つ以上のコンピュータサーバを含むことができる。例えば、１つ以上のコンピュータサーバは、例えば、生体試料から特徴プロファイルを生成すること、特徴プロファイルと、異なる細胞型に関する特徴シグネチャーの参照マトリックスとの間の回帰を最適化すること、および生体試料中の異なる細胞型の存在量を定量化することなど、ネットワーク２２３０（「クラウド」）を介したクラウドコンピューティングが、本開示の分析、計算、および生成の様々な態様を実行することを可能にし得る。このようなクラウドコンピューティングは、例えば、Ａｍａｚｏｎ  Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  （ＡＷＳ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ａｚｕｒｅ、Ｇｏｏｇｌｅクラウドプラットフォーム、およびＩＢＭクラウドなどのクラウドコンピューティングプラットフォームによって提供され得る。ネットワーク２２３０は、いくつかの場合、コンピュータシステム２２０１を支援して、ピアツーピアネットワークを実装することができ、これは、コンピュータシステム２２０１に結合されたデバイスがクライアントまたはサーバとして動作することを可能にし得る。
【０１７４】
ＣＰＵ ２２０５は、１つ以上のコンピュータプロセッサおよび／または１つ以上のグラフィックス処理ユニット（ＧＰＵ）を含んでよい。ＣＰＵ ２２０５は、プログラムまたはソフトウェアに具体化され得る一連の機械可読命令を実行することができる。命令は、メモリ２２１０などのメモリ位置に保存され得る。命令は、ＣＰＵ ２２０５に向けられ得、ＣＰＵ ２２０５はその後、本開示の方法を実装するためにＣＰＵ ２２０５をプログラムまたは別様に構成することができる。ＣＰＵ ２２０５によって実行される動作の例は、フェッチ、デコード、実行、および書き戻しを含むことができる。
【０１７５】
ＣＰＵ ２２０５は、集積回路などの回路の一部であり得る。システム２２０１の１つ以上の他の構成要素を回路に含めることができる。いくつかの場合では、回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。
【０１７６】
記憶ユニット２２１５は、ドライバ、ライブラリー、および保存されたプログラムなどのファイルを記憶することができる。記憶ユニット２２１５は、ユーザデータ、例えば、ユーザの好みおよびユーザプログラムを記憶することができる。いくつかの場合では、コンピュータシステム２２０１は、イントラネットまたはインターネットを介してコンピュータシステム２２０１と通信しているリモートサーバ上に位置するなど、コンピュータシステム２２０１の外部にある１つ以上の追加のデータ記憶ユニットを含むことができる。
【０１７７】
コンピュータシステム２２０１は、ネットワーク２２３０を介して１つ以上のリモートコンピュータシステムと通信することができる。例えば、コンピュータシステム２２０１は、ユーザのリモートコンピュータシステムと通信することができる。リモートコンピュータシステムの例としては、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレートまたはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ(登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ  Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ(登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ対応デバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、またはパーソナルデジタルアシスタントが挙げられる。ユーザは、ネットワーク２２３０を介してコンピュータシステム２２０１にアクセスすることができる。
【０１７８】
本明細書に記載される方法は、例えばメモリ２２１０または電子記憶ユニット２２１５などのコンピュータシステム２２０１の電子記憶位置に記憶された機械（例えば、コンピュータプロセッサ）実行可能コードによって実装され得る。マシン実行可能コードまたはマシン可読コードは、ソフトウェアの形式で提供することができる。使用中、コードはプロセッサ２２０５によって実行され得る。いくつかの場合では、プロセッサ２２０５がすぐにアクセスできるように、コードをストレージユニット２２１５から取り出してメモリ２２１０に保存することができる。いくつかの状況では、電子記憶ユニット２２１５が除外され得、機械実行可能命令がメモリ２２１０上に記憶される。
【０１７９】
コードは、コードを実行するように適合されたプロセッサを有するマシンと共に使用するために事前にコンパイルされ、構成され得るか、またはランタイム中にコンパイルされ得る。コードは、コードが事前にコンパイルされた、またはコンパイルされた状態で実行できるように選択され得るプログラミング言語で供給することができる。
【０１８０】
コンピュータシステム２２０１などの本明細書に提供されるシステムおよび方法の態様は、プログラミングに具体化することができる。本技術の様々な態様は、典型的には、機械（またはプロセッサ）実行可能コードおよび／または機械可読媒体のタイプ上に担持されるか、またはそのタイプに具体化される関連データの形態である「製品」または「製品」と考えられ得る。機械実行可能コードは、メモリ（例えば、読み取り専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスクなどの電子記憶ユニットに記憶され得る。「ストレージ」タイプの媒体は、ソフトウェアプログラミングのためにいつでも非一時的なストレージを提供し得る、コンピュータ、プロセッサなどの有形メモリのいずれかまたはすべて、または様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどのそれらの関連するモジュールを含み得る。ソフトウェアのすべてまたは一部は、インターネットまたは様々な他の通信ネットワークを介して通信され得る。このような通信は、例えば、管理サーバまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームにソフトウェアを別のコンピュータまたはプロセッサにロードすることを可能にし得る。したがって、ソフトウェア要素をもつことができる別のタイプの媒体は、ローカルデバイス間の物理的インターフェースにわたって、有線および光学的固定線ネットワークを介して、および様々な空気リンクを介して使用されるなどの光学、電気および電磁波を含む。有線または無線リンク、光学リンクなどのそのような波浪を運ぶ物理的要素は、ソフトウェアを運ぶ媒体としても考えられ得る。本明細書で使用される場合、非一時的で有形の「記憶」媒体に限定されない限り、コンピュータまたは機械「可読媒体」などの用語は、実行のためにプロセッサに命令を提供することに関与する任意の媒体を指す。
【０１８１】
したがって、コンピュータ実行可能コードなどの機械可読媒体は、有形記憶媒体、キャリア波形媒体または物理伝送媒体を含むが、これらに限定されない多くの形態をとってもよい。不揮発性記憶媒体としては、例えば、図面に示されるデータベース等を実装するために使用され得る任意のコンピュータ（複数可）等の記憶装置のうちのいずれかなどの光ディスクまたは磁ディスクが挙げられる。揮発性記憶媒体は、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどのダイナミックメモリを含む。有形伝送媒体としては、同軸ケーブル、コンピュータシステム内のバスを含むワイヤを含む銅線および繊維光学系が挙げられる。キャリア波伝送媒体は、電気信号または電磁信号、または無線周波数（ＲＦ）および赤外線（ＩＲ）データ通信中に生成されるものなどの音波または光波の形態をとってもよい。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形態は、例えば、フロッピーディスク、可撓性ディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤまたはＤＶＤ−ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード紙テープ、孔のパターンを有する任意の他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップまたはカートリッジ、データまたは命令を輸送するキャリア波形、そのようなキャリア波形を輸送するケーブルまたはリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／またはデータを読み取ることができる任意の他の媒体を含む。コンピュータ可読媒体のこれらの形態の多くは、実行のためにプロセッサに１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスを担持することに関与し得る。
【０１８２】
コンピュータシステム２２０１は、例えば、生体試料からの特徴プロファイル、特徴プロファイルと、異なる細胞型の特徴シグネチャーの参照マトリックスとの間の回帰のソリューション、ならびに生体試料中の異なる細胞型の存在量を示す視覚ディスプレイを提供するためのユーザインターフェース（ＵＩ）２２４０を備える電子ディスプレイ２２３５を含み得るか、またはそれと通信し得る。ＵＩの例としては、グラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）およびウェブベースのユーザインターフェースが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８３】
本開示の方法およびシステムは、１つ以上のアルゴリズムによって実装され得る。アルゴリズムは、中央処理ユニット２２０５によって実行されるとソフトウェアによって実装され得る。アルゴリズムは、例えば、生体試料から特徴プロファイルを生成し、特徴プロファイルと、異なる細胞型の特徴署名の参照マトリックスとの間の回帰を最適化し、生体試料中の異なる細胞型の存在量を定量化することができる。
【０１８４】
デコンボリューションモジュールは、１つ以上のデコンボリューションアプリケーション、例えば、サポートベクトル回帰（ＳＶＲ）アプリケーションまたは非負行列因数分解（ＮＭＦ）アプリケーションを含み得る。これは、メモリに格納された１つ以上のプログラムを含み、本開示の１つ以上の実施形態による方法を実行する命令を含み得る。復元アプリケーション（例えば、ＳＶＲアプリケーションまたはＮＭＦアプリケーション）は、以下の例示的なモジュールまたはそのサブセットもしくはスーパーセットのいずれかを含んでもよい。
【０１８５】
いくつかの事例では、復元モジュールは、本開示の１つ以上の実施形態に従って、異なる構成要素、例えば、細胞サブセット（例えば、細胞タイプ）、特徴署名の参照マトリックスを使用して、物理試料中の異なる構成要素、例えば、細胞サブセット（例えば、細胞タイプ）の相対比率または存在量を定量するために、線形損失関数およびＬ２標準ペナルティ関数を最小限にするサポートベクトル回帰または任意の他の回帰アルゴリズムを物理試料（例えば、生体試料）の特徴プロファイルに適用するように構成され得る。
【０１８６】
復元モジュールは、本開示の１つ以上の実施形態に従って、署名マトリックスに含める特徴を選択（またはフィルタリング）し、かつ／または特徴プロファイル（複数可）を選択するように構成され得る選択モジュールを含み得る。
【０１８７】
復元モジュールは、本開示の１つ以上の実施形態に従って、ｎｕの異なる値にわたって最も低い誤差で結果を判定するように構成され得るＲＭＳＥモジュールを含み得る。
【０１８８】
復元モジュールは、有意性値モジュールを含んでもよく、これは、ａ）親特徴プロファイルからランダムに選択される特徴を含有するランダム特徴プロファイルｍ＊を生成し、親特徴プロファイルを含み、ｍ＊とｍ＊が同じユークリードノルムを有することと、ｂ）ｍ＊と参照マトリックスＢとの間の回帰を最適化し、ｍ＊がＢの線形結合としてモデル化され、最適化することが、回帰の回帰係数のセットを含むｆ＊を解くことを含み、解が、線形損失関数と、Ｌ２ノルムペナルティ関数とを最小化することと、ｃ）ｆ＊と参照マトリックスＢの乘積を計算して、再構成された特徴プロファイルを生成することと、ｄ）ランダム特徴プロファイルｍ＊と再構成された特徴プロファイルとの間の回帰を決定することと、ｅ）回帰係数のセットから決定された測定値の分布に基づいて有意性値を決定することと、を含み、ｉが、１以上である。有意性値モジュールは、ステップｂ）でデコンボリューションモジュール、例えば、ＳＶＲモジュールを用いてもよい。重要性値モジュールは、本開示の他の実施形態のいずれかを実行するようにさらに構成され得る。
【０１８９】
復元モジュールは、本開示の他の実施形態のいずれかを実行するための追加のモジュールをさらに含んでもよい。特定の態様では、デコンボリューションモジュールは、コンピュータとは別のポータブルコンピュータ可読記憶媒体に保存され得る。
【０１９０】
デコンボリューションモジュールは、ユーザによって構成可能であり得る。例えば、デコンボリューションモジュールは、ユーザが、デコンボリューションアルゴリズム（例えば、ＳＶＲ）をヌの値に適用するように特徴プロファイルおよび／または署名マトリックスなどの１つ以上の設定を決定することを可能にするように構成されたユーザインターフェースモジュール、特徴が選択モジュールによって選択される基準、有意性値モジュールによって実行される反復の数、または本開示の１つ以上の実施形態を可能にする任意の他の設定を含んでよい。
【実施例】
【０１９１】
ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ方法は、フレームワークとして、バルク組織のゲノムプロファイルから細胞組成を堅牢に評価するための機械学習技術を使用することができる。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ方法は、シリコ解剖の概念を蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）に拡張し、新たな単一細胞配列決定の努力を活用し、それによって細胞型の列挙および細胞型特異的遺伝子発現精製のためのフレームワークを提供し得る（図１に示されるように）。以下の実施例では、このアプローチを説明し、検証する。まず、バルク組織における細胞型比率を推定するための単一細胞参照プロファイルを使用し、続いて、新鮮／凍結および固定組織標本のＲＮＡプロファイルから細胞型特異的遺伝子発現シグネチャーを精製するための分析技術を使用する。
【０１９２】
実施例１：ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑによる組織解剖
ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘプラットフォームは、単一細胞参照プロファイルを含む、様々な供給源に由来する細胞シグネチャーを使用して、大規模な組織特徴付けを可能にすることができる（図１、ステップ１および２）。単一細胞またはバルクソートされた転写データからシグネチャーマトリックスを導出するための分析技術を開発し、混乱した技術的変動の原因としてバッチ効果を最小限に抑えた（図７ａ〜ｈおよび図８ａ〜ｉ）。次いで、１０個のＧｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｈｒｏｍｉｕｍ（液滴ベース）およびＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ２（プレートベース、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を含む、バルク組織由来のＲＮＡ混合物における細胞比率を列挙するためのｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑプラットフォームの有用性を調査した。
【０１９３】
Ｃｈｒｏｍｉｕｍ  ｖ２（３′アッセイ）を使用して、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者から得られた２つの連続性末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料から単一細胞ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーを生成した。監督されていないクラスタリングおよび正規マーカー遺伝子評価は、両方の採血における６つの主要な白血球サブセット（Ｂ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、および単球；図２ａに示されるように）を明らかにした。デコンボリューション性能を評価するために、シグネチャーマトリックスを構築して、これら６つの細胞サブセットを区別し、シグネチャーマトリックスを、１２名の健康な成人から得られた血液のバルクＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルの検証コホートで試験した。
【０１９４】
直接サイトメトリーおよび蛍光免疫表現型によって決定されるグラウンドトゥルース細胞比率と比較して、未補正のデコンボリューション結果は、バルク混合物中のいくつかの細胞型について明確な推定バイアスを示した（図２ｂおよび６）。そのようなバイアスは、例えば、ライブラリー調製中の固有の分子識別子の可変使用、または転写物に沿った差次的３′バイアスによって導入され得るように、シグネチャーマトリックスとバルクＲＮＡ−Ｓｅｑデータとの間のプラットフォーム特異的変動によって駆動され得る。実際に、一括修正スキーム（図６ａ）の適用後、デコンボリューション結果は、グラウンドトゥルース細胞比率と比較して有利である（図２ｂおよび６ｅ）。公的に入手可能なＣｈｒｏｍｉｕｍ  ｖ２  ＰＢＭＣデータ（３′および５′キット）、ならびにマイクロアレイを使用してプロファイリングされた精製白血球サブセット（図６ｄ〜ｇ）を含む、他のデータセットおよびシグネチャーマトリックスを分析する際の一括修正によって、性能の同様の増加を得た。これらのシステム的な改善を考慮して、別段の記載がない限り、一括修正を、その後のすべてのクロスプラットフォーム分析に適用した。これらのデータは、デコンボリューション実験におけるクロスプラットフォーム変動を最小限に抑える値、およびバルク組織組成を解剖するためのｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルの約束を強調した。
【０１９５】
次に、分析を固形腫瘍生検に拡張し、単一細胞をＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ２によってプロファイリングした。頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）および黒色腫（それぞれｎ＝１８および１９患者）に焦点を当て、デコンボリューション性能を最初に、表現型定義における解離関連人工物および異質性を制御する設定で試験した。ＨＮＳＣＣ患者からの１８個の原発腫瘍および５個のリンパ節転移のデータセットでは、２個の原発腫瘍標本および１個のリンパ節生検を含むトレーニングコホートからシグネチャーマトリックスを作成した。このマトリックスは、これらの腫瘍において、悪性細胞、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、内皮細胞、筋細胞、ならびに癌関連線維芽細胞（図２ｃ）の全１０種類の主要細胞を区別した。注釈された表現型を有する単一細胞から再構築された保留腫瘍を使用して評価したとき、デコンボリューション結果は、グラウンドトゥルース比と高度に一致した（図２ｄおよび図７ａ）。さらに、これらの結果は、シグネチャーマトリックスを構築するために使用される腫瘍およびリンパ節の特定の組み合わせに依存しなかった。また、稀であるか、または単離することが難しい細胞下位集団内の、免疫療法応答に潜在的に関連する浸潤性黒色腫の異なるＣＤ８  Ｔ細胞サブセットなどを含む、腫瘍型（ＨＮＳＣＣまたは黒色腫）および細胞型にわたって強力な性能を維持した（図７ｂ〜ｄおよび８）。
【０１９６】
これらの好ましい結果を考慮して、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘデコンボリューションに対するキーシグネチャーマトリックス関連パラメータの影響（表現型あたりの細胞数および分析されたドナー試料の数を含む）を検討した。パラメータ値の範囲にわたって、細胞比率推定に対する適度な影響が観察された（図９ａ〜ｂ）。さらに、その供給源にかかわらず、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘシグネチャーマトリックスは、プラットフォーム、データセット、または組織にわたって適用されるかにかかわらず、強力な一般化性を示した（図２ｅ）。
【０１９７】
次に、単一細胞誘導型デコンボリューションの技術的態様を検証した後、その有用性を、様々な一次組織を使用して、実際の生物学的混合物の特徴付けについて調査した。上述の黒色腫生検からの単一細胞由来のシグネチャーマトリックスを活用して、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘを適用して、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）からの黒色腫ＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルを解剖した。予期せず、バルク腫瘍における予測細胞型比率と元のｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ結果を比較すると、Ｂ／Ｔリンパ球およびマクロファージの画分表現において顕著な差が観察された（図７ｅ）。これらの細胞サブセットは、ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑデータセットにおいて互いに選択されていないため、そのような組成的歪みは、単一細胞単離および配列決定による技術的人工物、またはデコンボリューションアプローチ自体のいずれかから生じる可能性がある。前者を裏付けるために、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ推定値は、独立した黒色腫コホートにおける免疫組織化学（ＩＨＣ）による直接ＴＩＬの現場列挙と高度に一致した（図７ｅ）。さらに、ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ（ＳＭＡＲＴ−Ｓｅｑ２）、バルクＲＮＡ−Ｓｅｑ、およびＩＨＣによってプロファイリングされたヒト膵島のデータセットにおいて、同じ歪み現象が観察された（図２ｆおよび７ｆ〜ｉ）。一致する島標本の直接比較では、バルク組織におけるＩＨＣによって決定された細胞画分は、バルク島デコンボリューション結果と強く相関したが、ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑとは相関しなかった（図２ｆおよび７ｉ）。これらのデータは、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘをさらに検証し、解離関連歪みを軽減しながら、固形組織組成を特徴付けるためのその値を強調する。
【０１９８】
実施例２：物理的な細胞単離なしの細胞型特異的遺伝子発現
単一細胞またはバルクソートされた集団に由来する細胞型特異的トランスクリプトームプロファイルは、細胞同一性および機能に関する貴重な洞察を提供することができる。しかしながら、そのようなプロファイルは、例えば、大きなコホートおよび固定された臨床試料に関して取得することが困難であり得る。精製された細胞型が利用可能であっても、組織の解離および保存条件は、下流分析を不明瞭にする遺伝子発現の非生物学的変化を引き起こし得る。バルク組織ＲＮＡプロファイルを細胞型特異的トランスクリプトームに数学的に分離することは、これらの問題を克服する可能性があるが、そのような技術は、実際の組織試料を使用して厳格な検証を必要とし得る。したがって、高度に最適化されたマーカー遺伝子を含むシグネチャーマトリックスを使用して、新鮮な／凍結されたおよび固定された腫瘍を含む非分解組織試料から生物学的に有意なトランスクリプトームプロファイルを学習することができるかどうかを評価した（図３ａ）。
【０１９９】
代表的な細胞型特異的トランスクリプトームが、新鮮な／凍結された原発腫瘍生検から正確に推測できるかどうかを試験するために、３０２個の腫瘍を未治療濾胞リンパ腫（ＦＬ）患者からプロファイリングし、共通のアプローチを試験し、各細胞型の比率を使用して混合試料群から各細胞型の単一代表的ＧＥＰを推測する。Ｂ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、およびＣＤ４  Ｔ細胞は、ＦＬ腫瘍細胞の大部分を含み得、ＦＡＣＳによって容易に精製され得るため、これら３個のサブセットを使用して、アプローチの精度を評価した。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘはまた、単一細胞由来のシグネチャーマトリックスをサポートしているが、ＬＭ２２（２２ヒト造血細胞サブセットを区別するためのマイクロアレイ由来のシグネチャーマトリックス）および非負最小二乗回帰（ＮＮＬＳ）を用いて、以前の方法（ＣＩＢＥＲＳＯＲＴと称される）を適用して、技術的因子について直接制御しながら免疫比率を列挙した。重要なことに、ＬＭ２２は、対試料を使用して同じ３個のＦＬ細胞サブセットを正確に分解する能力について、フローサイトメトリーに対して以前に検証された。加えて、この実験におけるすべての発現データは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイによってプロファイリングされ、プラットフォーム特異的因子とは関係なくシリコ発現精製の実現可能性の評価を可能にした。最初に、Ｂ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞を、ＦＬリンパ節における高存在量および低存在量の細胞型の例として検査した（それぞれ＞５０％対約５〜１０％）。
【０２００】
推定された細胞型トランスクリプトームおよびＦＡＣＳ精製細胞型トランスクリプトームは、合理的に良好に相関したが、かなりのノイズが、広範な発現レベルにわたって多くの遺伝子の発現推定値を歪めた（図３ｂ）。したがって、各細胞型に関する信頼性のない推定遺伝子を除去するための適応ノイズフィルタ（図３ｃ）を定義した。この戦略は、シリコ精製トランスクリプトームとＦＡＣＳ精製細胞由来のトランスクリプトームとの間の相関を著しく改善した（図３ｄおよび１１ａ）。
【０２０１】
次いで、トランスクリプトーム再構築の精度に影響を及ぼす主要な要因を調査した（図３ｅおよび１１ａ〜ｈ）。３０２個のＦＬ  ＧＥＰのセットを使用して、プロファイリングされた腫瘍の数とＢ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、およびＣＤ８  Ｔ細胞にわたるトランスクリプトーム推定の精度との間の予測可能な関係が観察され、各々が、ＦＬ腫瘍間で１０倍以上の頻度で変化し得る（図３ｅおよび１１ｂ）。最大の増加は、細胞型より少なくとも４〜５倍多い混合物試料を分析するときに達成されたが（図３ｅ）、濾過スキームは、コホートサイズ（ｃ）、細胞型の数（ｋ）、および全体的な細胞型存在量（ｃ＞ｋを前提とする、図３ｅ、１１ｂ〜ｅおよび１１ｇ）に関係なく、以前のアプローチと比較して均一に性能を向上させた。以前に同定された細胞同一性マーカーを解像するために有利な性能が観察された（図３ｆ）。ＦＬリンパ節における濾胞ヘルパーＴ細胞（図１１ｄ）、ＰＢＭＣにおける白血球サブセット（図１１ｅ〜ｈ）、ならびにＮＳＣＬＣ腫瘍のＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルからの上皮、免疫、および間質サブセット（図３ｇ）を含む、他の細胞型について同様の結果を得た。さらに、同一の細胞型を照合することを条件として、異なる単一細胞由来のシグネチャーマトリックスの使用は、結果に有意に影響しなかった（図１０ｂ〜ｃ）。
【０２０２】
実施例３：高解像度での細胞型特異的発現精製
細胞型特異的差次的発現をバルク標本から推測することができる。いくつかの場合では、上述の戦略は、混合試料群（例えば、「群レベル」のＧＥＰ、図１、工程３）が与えられた各細胞型に対する単一の代表的発現プロファイルの学習に限定され得る。そのようなプロファイルは、試料特異的ではなく、それらの間の差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）の同定などの下流分析を行うために、目的の各条件の生成を必要とし得る。試料レベルのデコンボリューションについて公開されたアプローチが説明されているが、これらは２つの細胞成分を有する混合物のみを考慮することができる。ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘ法は、バルク遺伝子発現および推定された細胞比率を入力として使用して、部分的な観察を有する非負行列因子分解問題として遺伝子発現デコンボリューションをモデル化することができる（図１２ａ〜ｃ）。このアプローチは、混合物ＧＥＰの単一マトリックスを、基礎となる細胞型特異的発現マトリックスのセットに分離する（図４ａ〜ｂ）。これらの発現プロファイルが得られた後、それらを事後分析して、個々の目的の細胞型について、遺伝子発現の試料レベルの変動およびパターンに関する洞察を得ることができる。数値近似を含んでよいマトリックス要因分解問題を解決するために、アルゴリズム（例えば、分割および征服アルゴリズム）を使用して、生物学的に現実的な解決策を生成することができる（図１２ａ〜ｃおよび図１３ａ〜ｂ）。
【０２０３】
各々が１つ以上の細胞型でＤＥＧを含有する一連の合成混合物を作成して、方法の「高解像度」細胞精製能力を試験した（図１、ステップ４）。これらのシミュレートされたＤＥＧには、ブロック様パターン（実際の組織で見られるものを連想させる）、および非線形の幾何学形状が含まれ、これらのすべては、以前の計算技術によって確認することが困難であり得る。顕著には、この方法は、隠された標的（「ブルズアイ」）を含む、すべての試験されたケースにおいて予想されるＤＥＧパターンを回復した（図４ｂ〜ｄおよび１４）。さらに、グループモード（図１、ステップ３）とは異なり、得られた高解像度プロファイルは、監督されていない分析およびクラス発見のための標準的な方法（例えば、図４ｃ）に本質的に適合した。したがって、高解像度精製は、（例えば、生体的または機能的に定義されたグループ化の）事前の知識なしに、多様な試料レベルの発現パターンをマスク解除するための汎用的なアプローチであり得る。
【０２０４】
次に、モデル化腫瘍混合物中のＤＥＧの検出方法の分析性能（例えば、感受性および特異性）を評価した。シミュレートされたＤＥＧを、ＣＤ８  Ｔ細胞トランスクリプトームに「スパイク」して、２つの既知のＣＤ８表現型クラスを作成した。次いで、これらのＣＤ８  ＧＥＰを、モデル化された腫瘍において他の３つの免疫サブセットとインシリコでランダムに混合し、結腸癌細胞株を含めて、５０％の未知の含有量をシミュレートした（図４ｅ、左）。高解像度精製後、細胞型特異的トランスクリプトームを定義されたＤＥＧクラスにグループ化して、性能を評価した。広範囲の細胞スパイクインレベルおよび発現倍率変化にわたって、以前に定義されたＤＥＧを、高感受性および特異性でＣＤ８  Ｔ細胞中で回収した（図４ｅ、右）。さらに、１２．５％および５％の画分存在量で、予想されるＤＥＧは、ＣＤ８  Ｔ細胞において、それぞれわずか２倍（ＡＵＣ＝０．８４）または４倍（ＡＵＣ＝０．８５）の発現変化で検出可能であった（図４ｅ、右）。同様の分析感受性および特異性が別の実験で観察され、ここで黒色腫腫瘍をプールされたｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑデータを使用してシミュレートし、コホートサイズ、ＤＥＧを有する細胞型の数、および差次的発現の大きさに関して性能を評価した（図１５ａ〜ｃ）。
【０２０５】
実施例４：様々な腫瘍下位集団の高解像度プロファイリング
高解像度ＧＥＰ精製の強力な技術的性能は、腫瘍を含む実際のバルク組織試料を解剖するための有用性を示唆している。したがって、悪性細胞における分子異質性のパターンが以前に説明されている２つの癌から始まる、いくつかのヒト腫瘍型における細胞状態を解決する能力を検査した。
【０２０６】
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は、Ｂ細胞分化状態の違いに基づいて２つの主要な分子サブタイプに分類することができる：生殖中心様（ＧＣＢ）および活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ。重要なことに、これらのＢ細胞サブセットの下にあるＧＥＰは、精製された原発ＤＬＢＣＬ腫瘍Ｂ細胞および腫瘍細胞株において明らかであり得るが、別個のシグネチャーを有する他のＴＩＬにおいては明らかでない。以前に注釈された細胞起源サブタイプを有する１５０個のＤＬＢＣＬリンパ節生検のＧＥＰを使用して、Ｂ細胞に既知のＧＣＢ／ＡＢＣ差を正しく付与することにおけるその性能について、１０個の主要な白血球サブセットの高解像度プロファイリングを評価した。このアプローチは、クラス標識に対して盲目であったが、Ｂ細胞におけるサブタイプ特異的発現差は、正常なＧＣ細胞および活性化Ｂ細胞のサブタイプと高度に一致し、かつバルクＤＬＢＣＬ腫瘍よりも平均で約９倍有意であった（図１６ａ〜ｃ）。これらの結果を、２つの代替方法と比較した。（１）細胞存在量との相関に基づいてバルク組織発現パターンを個々の細胞型に割り当てるための一般的なアプローチ、および（２）表現型クラスおよび細胞型頻度が既知であるときに、細胞型特異的ＤＥＧを推定するための前述の技術。いずれの場合においても、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘは、細胞型特異性と所与の有意性閾値で検出可能なＤＥＧの数の両方に関して優れた性能を示した（図１７ａ−ｅおよび１８ａ−ｂ）。
【０２０７】
ＦＬは、非常に一般的な非ホジキンリンパ腫であり得、ＦＬ腫瘍におけるＣＲＥＢＢＰ突然変異は、Ｂ細胞における抗原提示の喪失と関連付けられ得る。この関連付けは、ＦＡＣＳ精製ＦＬＢ細胞を使用して観察されたが、これらの腫瘍における正常Ｂ細胞または他の細胞型ではないため、高解像度精製を、バルク腫瘍ＧＥＰおよび対腫瘍遺伝子型からこの結果を再現する能力について評価した（図５ａ）。実際に、ＣＲＥＢＢＰ突然変異状態によって腫瘍を分層した後、前述のシグネチャーは、ＣＲＥＢＢＰ突然変異腫瘍におけるＭＨＣ  ＩＩ発現の喪失を含む、デジタルソートされたＢ細胞発現プロファイルにおいて容易に検出可能であった（図５ｂ〜ｃ）。ＤＬＢＣＬに関して観察されたように（図１７ａ〜ｅ）、これらの遺伝子の大部分は、Ｂ細胞の存在量と相関せず、デコンボリューションなしのバルク組織におけるそれらの発見を妨げた。したがって、２つの異なる悪性腫瘍において、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘは、物理的な細胞単離または表現型のグループ化に関する予備知識なしに、既知の状況依存的な細胞状態を容易に確認し、新規生物学を明らかにする約束を強調した。
【０２０８】
分析複数の細胞型にも拡張しながら本出願を例示するために、ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーを、同じ標本からＦＡＣＳ精製された上皮、造血、内皮、および線維芽細胞サブセットを含む、２２回の外科的に切除されたＮＳＣＬＣバルク腫瘍生検から生成した（図５ｄ）。４患者のサブセットからシグネチャーマトリックスを導出した後、高解像度プロファイリングを適用して、１８腫瘍ＧＥＰの検証セットからこれら４つの集団をデジタル解剖した。一致する患者試料上のＦＡＣＳ精製された細胞集団との直接比較において、シリコプロファイルは、精製の成功の強力な証拠を示した（図１８ｃ〜ｅ）。加えて、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘは、バルク腫瘍から上皮細胞のＧＥＰを精製するための以前の方法と比較して、有意な利点を示した（図１８ｃ〜ｄ）。
【０２０９】
したがって、同じシグネチャーマトリックスを適用して、ＴＣＧＡからの５１８個の肺腺癌（ＬＵＡＤ）腫瘍、５０２個の肺扁平上皮細胞癌（ＬＵＳＣ）腫瘍、および１１０個の隣接する正常組織のバルクＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルから上皮、造血、内皮、および線維芽細胞ＧＥＰを解像した（図５ｄ）。Ｔ−ＳＮＥを使用して、インシリコ精製された細胞集団における分布を視覚化し、探索した（図５ｅ）。以下の推定外れ値試料を同定し、さらなる分析から省略した。ＴＣＧＡ．４４．６７７５．０１Ｃ．０２Ｒ．Ａ２７７．０７、ＴＣＧＡ．４４．３９１８．０１Ａ．０１Ｒ．Ａ２７８．０７、ＴＣＧＡ．４４．２６５６．０１Ａ．０２Ｒ．Ａ２７８．０７、ＴＣＧＡ．４４．４１１２．０１Ａ．０１Ｒ．Ａ２７８．０７、ＴＣＧＡ．４４．２６６５．０１Ｂ．０６Ｒ．Ａ２７７．０７、ＴＣＧＡ．４４．２６６８．０１Ａ．０１Ｒ．Ａ２７８．０７、ＴＣＧＡ．４４．２６６６．０１Ａ．０１Ｒ．Ａ２７８．０７、ＴＣＧＡ．４４．６７７５．０１Ａ．１１Ｒ．Ａ２７８．０７、ＴＣＧＡ．４４．６１４７．０１Ａ．１１Ｒ．Ａ２７８．０７、ＴＣＧＡ．４４．２６６５．０１Ａ．０１Ｒ．Ａ２７８．０７、ＴＣＧＡ．４４．２６６２．０１Ａ．０１Ｒ．Ａ２７８．０７、ＴＣＧＡ．４４．６１４６．０１Ａ．１１Ｒ．Ａ２７８．０７、ＴＣＧＡ．４４．５６４５．０１Ａ．０１Ｒ．Ａ２７８．０７、ＴＣＧＡ．４４．３９１７．０１Ａ．０１Ｒ．Ａ２７８．０７、ＴＣＧＡ．４４．６１４７．０１Ｂ．０６Ｒ．Ａ２７７．０７、ＴＣＧＡ．４４．２６６６．０１Ｂ．０２Ｒ．Ａ２７７．０７、ＴＣＧＡ．４４．４１１２．０１Ｂ．０６Ｒ．Ａ２７７．０７、ＴＣＧＡ．４４．３９１８．０１Ｂ．０２Ｒ．Ａ２７７．０７、ＴＣＧＡ．４４．３９１７．０１Ｂ．０２Ｒ．Ａ２７７．０７、ＴＣＧＡ．４４．２６６８．０１Ｂ．０２Ｒ．Ａ２７７．０７、ＴＣＧＡ．４４．６１４６．０１Ｂ．０４Ｒ．Ａ２７７．０７、ＴＣＧＡ．４４．２６６２．０１Ｂ．０２Ｒ．Ａ２７７．０７、ＴＣＧＡ．４４．５６４５．０１Ｂ．０４Ｒ．Ａ２７７．０７、およびＴＣＧＡ．４４．２６５６．０１Ｂ．０６Ｒ．Ａ２７７．０７。これにより、癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）における別個の表現型シフトを含む、各ＮＳＣＬＣ組織学的サブタイプ（例えば、ＬＵＡＤ対ＬＵＳＣ）に対する差次的発現パターンの監督されていない発見が可能になった。対照的に、腫瘍関連内皮細胞および隣接する正常組織は、組織学的サブタイプに関係なく一緒にクラスター化した。これらの結果を検証するために、それらを２０名の患者からのＦＡＣＳ精製されたＮＳＣＬＣ細胞型と比較した。全体トランスクリプトームレベルにおいて、および単離された細胞サブセットにおける差次的発現のパターンに関して強い整合性が観察され、インシリコ所見を検証した（図５ｅ〜ｆ）。さらに、結果は、ＮＳＣＬＣにおける細胞不均一性の他の報告されたｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑプロファイルと一致した。
【０２１０】
ＮＳＣＬＣ患者からのバルク腫瘍およびＦＡＣＳ精製された細胞サブセットの識別子を表１に示す。
【０２１１】
【表１】
2020527946.tif 000003
【０２１２】
総合的に、これらのデータは、発現変動を学習するためのデジタルセルソーティングの有用性を示し、バルク標本中の分子経路を解剖するためのその値を強調する。
【０２１３】
実施例５：シリコサイトメトリーの黒色腫への適用
デジタルサイトメトリーの分析ワークフロー（図１）を確立した後、対応する技術を包括的なツールキット（ｈｔｔｐ：／／ｃｉｂｅｒｓｏｒｔｘ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ）に統合した。次いで、黒色腫を有する患者から切除された腫瘍生検における細胞異質性を特徴付けるために、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘの３つの潜在的な適用を分析した（図６ａ〜ｈ）。方法の多様な能力を例示するために、以下の技術の各々を順次適用した：高解像度発現精製（図１、ステップ４、図６ａ〜ｂ）、群レベルの発現精製（図１、ステップ３、図６ｃ）、および単一細胞参照プロファイルを使用する多様なプラットフォームにわたる細胞組成の列挙（図１、ステップ１および２、図６ｄ〜ｆ）。
【０２１４】
癌性ＢＲＡＦ突然変異は、黒色腫の半分を超えて発生し得、承認された標的療法によって阻害され得るが、ＮＲＡＳ突然変異は、非ＢＲＡＦ突然変異型黒色腫腫瘍の約半分において発生し得るが、そのような療法を欠く場合がある。重要な突然変異が細胞状態にどのように影響するかを理解することは、新規の治療戦略につながる可能性がある。黒色腫腫瘍からの単一細胞参照プロファイルを使用して、シグネチャーマトリックスを構築し、高解像度発現精製を使用して、ＴＣＧＡによってプロファイリングされた３０１個のバルク黒色腫腫瘍のトランスクリプトームから８種の主要細胞型を解剖した（図６ａ）。インシリコ精製細胞サブセット内では、ＢＲＡＦまたはＮＲＡＳ突然変異状態に従って黒色腫を区別する悪性細胞およびＣＡＦ内で多くの有意なＤＥＧが発見された（図６ｂ）。これらの所見を、突然変異データが入手可能であった原発性黒色腫からのｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑデータを使用して検証し、個々の悪性細胞および／またはＣＡＦ内のＢＲＡＦおよびＮＲＡＳ遺伝子型に関連するＧＥＰの確認を可能にした（図６ｂおよび１９ａ〜ｂ）。これらのデータは、単一細胞レベルでアプローチを検証し、ヒト腫瘍標本における体細胞変異と細胞表現型との間の理解不十分な関連性を解明する可能性をさらに例示する。
【０２１５】
腫瘍浸潤ＣＤ８  Ｔ細胞は、慢性抗原刺激によって、または炎症シグナルへの過剰曝露によって、「消耗」状態に駆動され得る。現行および新興の癌免疫療法に対するこれらの細胞の重要性を考慮して、次にＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘを使用して、消耗表現型を特徴付ける遺伝子発現の変化を検討した。健康な末梢血白血球に由来するＬＭ２２を使用して、ＴＣＧＡ２７によってプロファイリングされた新鮮な／凍結された黒色腫腫瘍における免疫組成を列挙した。群レベルの発現精製を行って、代表的なＣＤ８  ＴＩＬ発現プロファイルを推定した。正常な末梢血ＣＤ８  Ｔ細胞のベースライン参照プロファイルに対して推定ＣＤ８  ＴＩＬ  ＧＥＰを順位付けすることによって、ＰＤＣＤ１およびＣＴＬＡ４を含む、重要な消耗マーカーが推定ＣＤ８  ＴＩＬ  ＧＥＰにおいて強烈に過剰発現したことが観察された（図６ｃ）。加えて、ＣＤ８  ＴＩＬ特異的遺伝子は、単一細胞ＲＮＡ−ＳｅｑおよびＦＡＣＳによって黒色腫腫瘍から単離されたＣＤ８  Ｔ細胞について観察された遺伝子と一致した（図６ｃ）。独立したコホートからのＦＦＰＥ腫瘍に対する分析を繰り返すときにも、同様の結果が得られた（図６ｃおよび２０）。したがって、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘは、単一細胞プロファイリングを必要とすることなく、固定腫瘍などの複雑な組織に浸潤する細胞下位集団の表現型状態の変化を正確に学習することができる。
【０２１６】
別に、転移性黒色腫のレジメンは、消耗したＴ細胞上のＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ４発現を標的とする単剤または併用剤免疫療法によるチェックポイント遮断を用いることができる。患者のサブセットは、耐久性のある抗腫瘍Ｔ細胞応答を達成し得るが、臨床転帰は異質のままであり、効果的な予測バイオマーカーが欠如し得る。高レベルのＰＤＣＤ１（ＰＤ−１をコードする）またはＣＴＬＡ４を発現するＣＤ８  ＴＩＬは、これらの療法の重要な標的であり、両方のマーカーを発現するＣＤ８  ＴＩＬは、ＰＤ１遮断を受ける黒色腫患者におけるフローサイトメトリーによって最近示されたように、応答と相関し得ることを示唆する。
【０２１７】
この仮説を試験するために、黒色腫瘍の単一細胞参照プロファイルを使用して、８つの他の主要な腫瘍細胞型と併せてＰＤＣＤ１＋／ＣＴＬＡ４＋ＣＤ８  Ｔ細胞を含有するシグネチャーマトリックスを構築した（図６ｄ、９ｂ、および２１ａ〜ｂ）。シグネチャーマトリックスを一括修正で適用して、公的に入手可能な３つの黒色腫発現データセットを照合した（図６ｄ）。これらには、ＲＮＡ−ＳｅｑまたはＮａｎｏＳｔｒｉｎｇによってプロファイリングされ、ＰＤ−１またはＣＴＬＡ４遮断の前、間、または後に得られたＦＦＰＥおよび新鮮な／凍結された黒色腫腫瘍のバルク発現データが含まれていた。我々の仮説を裏付けるために、ＰＤＣＤ１＋／ＣＴＬＡ４＋ＣＤ８  Ｔ細胞の推定レベルは、３つすべての試験において応答と有意に関連付けられた（図６ｅ）。さらに、これらの細胞の検出は、このメタ分析における全生存期間を有意に分層し、個々のデータセットにおける生存期間曲線を分離し、かつ重要なマーカー遺伝子よりも生存期間および応答に有意に関連していた（図６ｆおよび２１ｃ〜ｆ）。これらのデータは、単一細胞参照プロファイルに由来する候補バイオマーカーの迅速な評価のためのＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘの有用性を示し、黒色腫患者における腫瘍浸潤ＰＤＣＤ１＋／ＣＴＬＡ４＋ＣＤ８  Ｔ細胞のさらなる分析が必要であることを示唆する。
【０２１８】
実施例６：代表的な細胞型特異的発現プロファイルの推定
以下に示す方程式（５）〜（８）を使用して、ＣＩＢＥＲＳＯＲＴｘアルゴリズムを実行する（例えば、代表的な細胞型特異的発現プロファイルを推定する）ことができる。
Ｂ×Ｆ・，ｊ＝Ｍ・，ｊ，１≦ｊ≦ｃ          （５）
Ｈｉ，・×Ｆ＝Ｍｉ，・，１≦ｉ≦ｎ            （６）
Ｆ×Ｇｉ，・，・＝Ｐｉ，・，・，１≦ｉ≦ｎ        （７）
ｄｉａｇ（Ｐｉ，・，・）＝Ｍｉ，・，１≦ｉ≦ｎ    （８）
【０２１９】
Ｂ（ｍ個の遺伝子×ｋ個の異なる細胞型からなるｍ×ｋシグネチャーマトリックス（例えば、ＬＭ２２）であり得る）およびＭ（ｎ個の遺伝子×ｃ個の試料からなるＧＥＰのｎ×ｃの混合物であり得る）を与えられた場合、方程式５の目標は、Ｆ（Ｍにおける各試料のｋ個の細胞サブセットの画分存在量からなるｋ×ｃマトリックスであり得る）を推定することである。方程式６の目標は、ＦおよびＭを与えられた場合、Ｈ（代表的な細胞型特異的発現シグネチャーのｎ×ｋマトリックスであり得る）を推定することである。方程式７および８の目標は、ＦおよびＭを与えられた場合、Ｇ（ｎ個の遺伝子、ｃ個の試料、およびｋ個の細胞型からなるｎ×ｃ×ｋマトリックスであり得る）を推定することである。
【０２２０】
Ｒにおけるｎｎｌｓパッケージを使用する非負最小二乗回帰（ＮＮＬＳ）を用いて、ＦおよびＭを与えられた場合、Ｈについて方程式６を解く（例えば、回帰係数のセットを解くことによって回帰を最適化する）。ＮＮＬＳは、非負制約を施行することによって生物学的に合理的な溶液を生成することができるため、選択された。交換なしのサブサンプリングを組み込んで、結果の信頼性を向上させ、標準誤差および信頼区間を計算した。各遺伝子に対する回帰係数の有意性を推定するために、通常の線形最小二乗に従来使用される同一のアプローチをＮＮＬＳに適応した。ここでは、回帰係数の有意性は、まずそれを分析的に導出された標準誤差で除し、次いで得られた商をスチューデントｔ分布を使用してｐ値に変換することによって決定される。各細胞型について、ベンジャミニ・ホックバーグ法を使用して複数の仮説試験のためにｐ値を補正した。所与の遺伝子ｉおよび細胞型ｊに関して調整されたｐ値（例えば、ｑ値）が非常に有意であった（デフォルトではｑ値＜１０−５）場合、遺伝子ｉにおいてｑ値＞０．２５を有する他のすべての細胞型は、わずかに検出されるとみなされた（発現を０に設定）。交絡ノイズをさらに低減するために、遺伝子を、サブサンプリング回帰係数の自然対数を使用して計算したそれらの幾何変動係数（幾何ｃ．ｖ．）に基づいてフィルタリングした。幾何ｃ．ｖ．閾値を適応アプローチを使用して定義した。具体的には、各細胞型について、各幾何ｃ．ｖ．を昇順にランク付けし、次いで各ｃ．ｖ．を２次元座標系にマッピングして、すべてのｃ．ｖ．値の１パーセンタイルまたは７５パーセンタイルのいずれかの最大値として定義される、最大ｃ．ｖ．（「ｃｖｍａｘ」）に達するまで最も低いｃ．ｖ．（「ｃｖ１」）が座標（１、ｃｖ１）になり、第２の最も低いｃ．ｖ．が（２、ｃｖ２）になる。次いで、ユークリッド空間内の（０、ｃｖｍａｘ）から最も遠い点として定義される、ｃ．ｖ．曲線において、曲折点を特定した。この閾値に対応する幾何ｃ．ｖ．を、適応細胞型特異的ノイズ閾値として使用した（図３ｂ〜ｅおよび１１ａ〜ｈ）。
【０２２１】
実施例７：高解像度細胞型特異的発現プロファイルの推定
高解像度細胞型特異的発現プロファイルの推定のためのアルゴリズムは、図１２ｃに提示される対応するスキーマと平行な以下の主要なステップを使用して実行され得る。
【０２２２】
混合マトリックスＭにおける各遺伝子ｉについて、このアプローチは、その発現ベクターＭｉ，・（以下、簡潔性のためにＭｉと示す）を昇順にソートすることによって開始し、ベクターＭ＊ｉをもたらす（図１２ｃ、ステップｉ）。バルク混合物中に検出可能なシグナルを有する任意の細胞型特異的ＤＥＧは、この順序に影響を及ぼし得、最も顕著なシグナルは、分布の片側に歪み得る（例えば、図１３ｂ）。
【０２２３】
次に、Ｆにおける混合試料（Ｆ＊と示す）を、Ｍ＊ｉにおける試料の順序に一致するように再順序付けし、反復ｔを定義し、これはｗと等しく、方程式６を解くときに使用する混合試料の数を指定するパラメータであった。［ｗ，（１＋ｃ−ｗ）］におけるｔの各整数値について、方程式６を２回：１回は、指数１〜ｔにおよぶＭ＊ｉにおける混合物試料について、１回は、指数（ｔ＋１）〜ｃを有するＭ＊ｉにおける混合物試料について求解した。したがって、ｔの各値について、このプロセスは、代表的な細胞型特異的遺伝子発現係数の２つのベクター、それぞれｇ１およびｇ２の２つのベクターを生成する（簡潔性のために、ここでは指数ｉが省略されることに留意されたい。図１２ｃ、ステップｉｉ）。
【０２２４】
Ｇｔｉは、ｇ１のｔ行、続いてｇ２のｃ−ｔ行からなるｃ×ｋマトリックスである。Ｇｔｉは、２自由度（遺伝子あたり２つの可能な値）で細胞型特異的発現推定値を捕捉するため、Ｇｉ、・、・（以下、Ｇｉと示す）の粗略近似値である。ＧｔｉおよびＦ＊由来の再構成混合物と元のソートされた混合物Ｍ＊ｉとの間の適合性を評価するために、残留二乗和を計算し、以下の方程式を最小化するｔの値を決定した。
【数１】
2020527946.tif 000004
【０２２５】
方程式９を最小限に抑えるｔの値は、マトリックスＧｔ′ｉおよび基礎となる発現係数ベクトルの対、ｇ′１およびｇ′２を定義し、これらはＦを与えられた場合にＭ＊ｉを最適に再構成する（図１２ｃ、ステップｉｉｉ）。
【０２２６】
次に、各遺伝子／細胞型対を一連の統計的試験を受けて、遺伝子が（１）有意に発現され、（２）ｇ′１とｇ′２との間で有意に異なるかどうかを確認する（図１２ｃ、ステップｉｖ）。前者について、１００回の反復を用いたブートストラップを使用して、ＮＮＬＳをすべての混合物試料に適用した。各遺伝子ｉについて、各細胞型の中央発現値は、ベクターｇｇｌｏｂａｌとして保存される。各遺伝子／細胞型対の経験的ｐ値は、係数が０に等しい回数を１００で除したものとして計算される。このアプローチの十分に確立された利点にもかかわらず、不適切な試料サイズまたは不十分なブートストラップドローに起因する不正確性の影響を受ける可能性がある。例えば、後者は、経験的ｐ値に下限値を課し、それは他の例外的な統計的支持を有する遺伝子（例えば、細胞型マーカー遺伝子）について著しく過小評価され得る。したがって、実施例５に記載される同一のアプローチを使用して、複数の仮説試験のために調整された分析的に導出されたｐ値を考慮した。後者が所与の遺伝子ｉおよび細胞型ｊに関して非常に有意である（デフォルトでは、ｑ値＜１０−５）場合、遺伝子ｉにおいてｑ値＞０．０１を有するすべての他の細胞型は、重要でないとみなされる（ｑ値を１に設定）が、他のすべてのｑ値は変更されない。両方の試験の出力を組み合わせるために、フィッシャーの方法を使用して、それらの整合性に基づいてｐ値を増加またはペナルティ化した。これらの試験は独立していないため、フィッシャーの方法の出力はメタスコアであり、ｐｇｌｏｂａｌとして示す。ｐｇｌｏｂａｌ＜α（デフォルトでは＝０．０５）を有する遺伝子／細胞型対は、著しく検出可能であると考えられる。
【０２２７】
有意に検出可能な発現を有する遺伝子／細胞型対について、次いで、ｇ′１とｇ′２との間の差次的発現がないヌル仮説を試験した。これは、以下の２つの異なる統計試験を使用して達成される。まず、ブートストラップを介して得られるｇ′１およびｇ′２（それぞれ、ｓｄ１およびｓｄ２として示す）の標準偏差に基づく分布がガウスであるという仮定の単純化を行う。次いで、ｇ′１とｇ′２との間の差をｓｄ１およびｓｄ２の二乗和の平方根で除したものとして、差次的発現のＺスコアを計算することは些細なことである。結果として得られるＺスコアは、各細胞型に対して１つの両側ｐ値に変換され、ベクターｐ１として記憶される。
【０２２８】
別に、順列分析を使用して差次的発現を試験した。ここで、Ｆ＊（Ｆｒａｎｄと示される）の行（例えば、試料）をシャッフルし、方程式６は、（ｔ′＋１）〜ｃの指数を有するＦｒａｎｄおよび混合物試料を使用して求解し、ｇ′２（ｇｒ２と示される）のランダム化バージョンをもたらす。差分ベクトル｜ｇｒ２−ｇ′１｜を保存し、プロセスを５０回繰り返す。次いで、差分ベクトルのヌル分布を試験統計と比較し、｜ｇ′２−ｇ′１｜および経験的ｐ値を、この試験統計を超えるランダム化されたデルタの分数として計算する。得られたｐ値は、ベクトルｐ２として記憶される。各試験は、非常に異なる様式で差次的発現を評価するため、ｐ１およびｐ２は、フィッシャーの方法を使用してメタスコアｐｄｅｇに組み合わされる。このメタ分析アプローチの有用性にもかかわらず、入力ｐ値は形式的に独立していないため、フィッシャーの方法の出力はメタスコアと呼ばれ、ｐ値ではない。
【０２２９】
次に、グローバル係数ｇｇｌｏｂａｌおよび差次的細胞型発現ベクターｇ′１およびｇ′２は、上記の統計フィルタリングステップを反映するように更新される（図１２ｃ、ステップｖ−ｉｉ）。まず、Ｆ＊ｉ←Ｆ＊を各遺伝子ｉに対して定義し、Ｆ＊ｉにおける画分存在量ベクトルを、遺伝子ｉにおけるｇ′１とｇ′２との間の重要でない発現を有する細胞型に対してゼロに設定する。次いで、Ｆ＊ｉおよびｇｇｌｏｂａｌを計算するための上記の同じ手順を使用して、各遺伝子についてｇｇｌｏｂａｌを再計算する。ｇ′１およびｇ′２を更新するには、Ｆ＊ではなくＦ＊ｉを使用し、方程式９を使用して新しい最適な切断点ｔ′および対応するマトリックスＧｔ′Ｉを識別する。
【０２３０】
次いで、メタスコアベクトルｐｄｅｇに基づいて、ｇ′１、ｇ′２をさらに絞り込むために一連のステップを実行する。具体的には、所与の遺伝子ｉおよび細胞型ｊに関して、ｇ′１、ｇ′２における対発現係数間の差は、各細胞型の差次的発現における推定統計的信頼性を反映する方法で低減される（図１２ｃ、ステップｖ−ｉｉ）。これを達成するために、まず、各細胞サブセットｊの分数と発現ベクターＭｉとの間の相関（および対応する−ｌｏｇ１０ｐ値、ｐｃｏｒと示される）を、シグネチャーマトリックス内の残りの細胞サブセットを回帰させた後に計算する。次いで、ｌを、ｐｄｅｇ（上記）の−ｌｏｇ１０ｐ値に等しく設定する。あるいは、細胞サブセットが０．０５のｐ値閾値で有意でない場合、ｌをｐｃｏｒに等しく設定する。ｌが−ｌｏｇ１０空間内にあるため、それをその最大値ｌｍａｘで除し（閾値−ｌｏｇ１０（０．０５）で有意である場合）、最大値は、ｇ′１での発現がｇ′２よりも高い細胞サブセットについて別々に計算され、逆も同様である。これにより、所与の細胞サブセットに関する発現係数間の倍率変化が、差次的発現における推定統計的信頼性を捕捉するｌ＊に比例して低減するように、ｇ′１およびｇ′２を調節するために使用される新しいベクトルｌ＊が生じる。調整後、（デフォルトでは）１．１倍未満の倍率変化を有するｇ′１およびｇ′２の対発現係数は、わずかに異なると考えられ、それらの対応するグローバル係数（ｇｇｌｏｂａｌ）に設定される。ヒューリスティックであるが、このアプローチは、最も有意な遺伝子／細胞型対に対するデルタを同時に保持しながら、推定された発現における誤りの差を大幅に低減することができる。ｇ′１およびｇ′２が調整されると、Ｇｔ′ｉは方程式９を使用して再推定される。
【０２３１】
これまでの改善にもかかわらず、Ｇｔ′ｉは、依然として遺伝子／細胞型対あたり最大２つの異なる値に限定され得る。複数の自由度を有する平滑発現係数を推定するために、方程式６を、Ｍ＊ｉにおけるすべての可能なウィンドウ位置について、長さｗの摺動ウィンドウ内で順次求解し、マトリックスＱｉを得る（図１２ｃ、ステップｖ−ｉ）。Ｑｉは、Ｇｉよりｗ−１行が少ないため、Ｑｉの２つのバージョンが作成され、１つはＱｉの上部に追加された行１のｗ−１コピー（Ｑ′ｉと示す）を有し、１つはＱｉの下部に追加された行ｃのｗ−１コピー（Ｑ″ｉとを示す）を有する。次いで、これら２つのマトリックスを平均化し、Ｑｉ←（Ｑ′ｉ＋Ｑ″ｉ）／２を設定する。この手順は、自由度ｃを有する平滑発現ベクターをもたらすが、各ウィンドウ内の混合物試料が、最小限の細胞型特異的発現変動で十分に類似しているという仮定に依存し得る。言い換えれば、所与の細胞型に関する試料固有の発現の違いは、ウィンドウ間で捕捉されているにもかかわらず、所与のウィンドウ内で平均化され得る。この問題は、回帰フレームワーク内の数値の不安定性のリスクにもかかわらず、ｗのサイズを減らすことによって部分的に対処することができる。
【０２３２】
加えて、Ｍ＊ｉにおけるバルク発現がソートされているため、低発現を有する領域をカバーするウィンドウは、不適切な情報コンテンツによって不正確な推定をもたらし得る。同じ問題は、サイズが不十分な窓から生じる可能性がある。これらの潜在的な問題に対処するのに役立つために、Ｑｉにおける発現係数は、Ｇｔ′ｉ内のｇ′１およびｇ′２の最終値に基づいて調整される（図１２ｃ、ステップｖ−ｉｉｉ）。具体的には、各細胞型ｊについて、Ｑｉ，ｊ，・の発現係数は、通常の最小二乗回帰を使用して、Ｇｔ′ｉ，ｊ，・に個々に適合させる。これにより、ｇ′１およびｇ′２がアンカーポイントとして機能すること、および順序付け混合物にわたって細胞型特異的発現の差（例えば、高〜低、または低〜高）の方向性が維持されるよう保証することが可能になる。他のアプローチを使用してもよいが、最大２つの異なる値を有する剛性ベクトルを適合する際にある程度の柔軟性を可能にするため、ＲＬＲが用いられる。得られたマトリックスは、Ｑ′ｉと示される。
【０２３３】
最後に、各遺伝子について、Ｑ′ｉにおける混合物試料の元の順序を復元し、これをＧｉとして保存する（図１２ｃ、ステップｖ−ｉｖ）。全ての遺伝子にわたってＧｉを３ＤマトリックスＧに凝集した後、各細胞型特異的発現マトリックスをディスクに書き込む。
【０２３４】
実施例８：デコンボリューションの一括修正
１０×Ｃｈｒｏｍｉｕｍを使用した１２個の全血ＲＮＡ−Ｓｅｑ試料の細胞型列挙を行った。図２３ｄに示されるように、結果は、Ｓモード補正を使用し、細胞レベルの性能の著しい改善を示す。加えて、図２３ｆに示されるように、バッチ効果から生じるプラットフォーム特異的な技術的変動は、３′キットおよび５′キットを使用して１０×ＧｅｎｏｍｉｃｓによってＰＢＭＣの２つの公的に入手可能な単一細胞トランスクリプトームデータセットをプロファイリングすることによって生成されたデータセット間で観察された（図２３ｅ）。図２３ｇの概略図に示されるように、Ｓモード一括修正をこれらのデータセットに適用して、異なる１０×Ｃｈｒｏｍｉｕｍキットに由来する参照プロファイル間の技術的変動を最小限に抑えた）。３′キットからのシグネチャーマトリックスを、５′キットに由来する再構築血液試料に適用した。Ｓモード一括修正後、調整された３′細胞型参照プロファイルは、ヒートマップ（図２３ｈ）およびピアソン相関（図２３ｉ）によって実証されるように、５′キットからのそれらの対応する参照プロファイルとより密接に整列される。図２３ｊに示されるように、５′ＰＢＭＣ単一細胞データセットをマイクロアレイによってプロファイリングされた選別された白血球サブセットで置き換えたとき、図２３ｇと類似した結果が観察された。
【０２３５】
実施例９：腫瘍遺伝子型決定
バルクＲＮＡ−Ｓｅｑを、以下のようにマイクロアレイを使用して行った。バルクＦＬ標本およびソートされたＢ細胞から全ＲＮＡを抽出し、収率および品質について評価した。直線増幅後の１００ｎｇの全ＲＮＡからｃＲＮＡを調製し（３′ＩＶＴ発現、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、次いで製造業者のプロトコルに従ってＨＧＵ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０マイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）にハイブリダイズした。すべてのＣＥＬファイルを、ＦＬリンパ節からＦＡＣＳソートされたＣＤ４およびＣＤ８  ＴＩＬを含む公的に入手可能なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータセット（ＧＳＥ２７９２８）とプールした。次いで、結果として得られたデータセットを、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒの「ａｆｆｙ」パッケージを使用してＲＭＡ正規化し、カスタムチップ定義ファイル（Ｂｒａｉｎａｒｒａｙバージョン２１．０、ｈｔｔｐ：／／ｂｒａｉｎａｒｒａｙ．ｍｂｎｉ．ｍｅｄ．ｕｍｉｃｈ．ｅｄｕ／Ｂｒａｉｎａｒｒａｙ／）を使用してＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子識別子にマッピングし、ＨＵＧＯ遺伝子シンボルに変換した。ソートされた細胞サブセットの複製を組み合わせて、発現値の幾何平均を使用して、グラウンドトゥルース参照プロファイル（例えば、図３ｂ）を作成した。
【０２３６】
Ｄｅｅｐ配列決定によるＣａｎｃｅｒパーソナライズプロファイリング（ＣＡＰＰ−Ｓｅｑ）を、専用リンパ腫標的配列決定パネルおよび試料処理プロトコルを使用して、このコホートからの１２個の冷凍保存されたＦＬ腫瘍生検に適用した（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｎｅｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎ  ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ  ｗｉｔｈ  ｂｒｏａｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｃｏｖｅｒａｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０，５４８（２０１４）に記載されている）。異型呼び出しは、生殖細胞系対照として用いられた一致する末梢血液白血球で行った。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００機器上で２×１００ｂｐの読み取り値を使用して、高スループット配列決定を行った。ＣＲＥＢＢＰホットスポット突然変異は、リジンアセチルトランスフェラーゼ（ＫＡＴ）ドメイン内で生じ得るため、ＫＡＴドメイン内の非サイレント異型（単一ヌクレオチド異型および挿入／欠失）のみを「変異体」とみなした。試料サイズを増加させるために、ＦＬコホートからの１２名の以前に遺伝子型決定された患者のＣＲＥＢＢＰ突然変異状態も分析した。
【０２３７】
実施例１０：単一セル由来参照プロファイルのパラメータスイープ
デコンボリューションパフォーマンスに対するキーシグネチャーマトリックスパラメータの影響を系統的に評価するために、パラメータスイープを行い、以下を評価した。（１）表現型あたりの細胞数（３、５、１０、２０、および４０）、（２）細胞型あたりのシグネチャー遺伝子数（５０〜１５０、１５０〜３００、および３００〜５００の範囲）、ならびに（３）ドナー試料数（１、２、または３）（図１０ａ）。我々は、トレーニング／検証フレームワーク内で、黒色腫およびＨＮＳＣＣ腫瘍について別個の単一細胞由来のシグネチャーマトリックスを作成した（図１０ａ）。結果の堅牢さを確実にするために、各パラメータの組み合わせをランダムサンプリングによって３回試験した（図１０ａ）。加えて、分析は、悪性細胞（ＨＮＳＣＣ、黒色腫）、ＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞（ＨＮＳＣＣ、黒色腫）、Ｂ細胞（黒色腫）、および線維芽細胞（ＨＮＳＣＣ）のすべての評価されたパラメータ設定にわたるトレーニングデータセットおよび検証データセットの両方における十分な表現を確実にするためにそれぞれ選択された以下の細胞表現型に限定された。ドナーを、細胞表現型あたり少なくとも２０個の細胞を有する試料のセットからサンプリングした（ＨＮＳＣＣ腫瘍の場合、ドナーＩＤ  ＨＮ１６＿Ｔ、ＨＮ１７＿Ｔ、ＨＮ２５＿ＬＮ、ＨＮ２５＿Ｔ、ＨＮ１８＿Ｔ、黒色腫瘍の場合、ドナーＩＤ７９、８０、８８、８９）。４つのＨＮＳＣＣ試料（ＨＮ１０＿Ｔ、ＨＮ１３＿Ｔ、ＨＮ２４＿ＬＮ、およびＨＮ７＿Ｔ）は、各々が評価された表現型にわたって合計５０個未満の細胞を含有していたため除外された。１名のドナーのみをサンプリングする場合、細胞が不十分（５０個未満）であるために黒色腫ドナー８８も除外された。総合的に、データセットごとに１２６個のシグネチャーマトリックスを試験した。性能を、シグネチャーマトリックス構築から保持された再構築腫瘍試料からのグラウンドトゥルース細胞比率に対する中央細胞レベル相関として定量化した（図１０ｂ）。
【０２３８】
加えて、３つのｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ法（ＳｍａｒｔＳｅｑ２、３′−および５′−バイアスされた１０×Ｃｈｒｏｍｉｕｍ発現プロファイリングキット）および３つの組織型（再構築された黒色腫腫瘍、再構築されたＨＮＳＣＣ腫瘍、および末梢血）にわたって、単一細胞誘導型デコンボリューションを評価した。すべての場合において、推定された比率を、フローサイトリー／コールターカウンター（血液試料）またはｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ（黒色腫、ＨＮＳＣＣ）によって定量化されたグラウンドトゥルース頻度と比較した。健康なドナーに由来する２２個の造血サブセットを区別するためのマイクロアレイ由来のシグネチャーマトリックスＬＭ２２も試験した。シグネチャーマトリックスおよび組織試料の両方に存在する細胞型のみを考慮し、比較前にすべての細胞画分を１個に正規化した（図２ｅ）。ＨＮＳＣＣおよび黒色腫腫瘍におけるＣＤ８／ＣＤ４  Ｔ細胞を除き、以前に注釈された細胞表現型のみを評価した。これらは、本明細書の他の箇所に記載されるように定義され、黒色腫シグネチャーマトリックスを使用してＨＮＳＣＣ腫瘍において評価され、逆も同様である。すべての場合、１０ｘ由来のシグネチャーマトリックスに対するＳモード一括修正および残りのシグネチャーマトリックスに対するＢモード一括修正を使用して、デコンボリューションを一括修正で適用した。
【０２３９】
実施例１１：シグネチャーマトリックス
細胞画分の推定に続くが、発現推定の前に、ＬＭ２２デコンボリューション結果を、Ｂ欄に示される対応する図を用いて、図２５に示される主要な表現型群に合計することによって崩壊させた。注目すべきことに、ＬＭ２２−ｍｅｒｇｅ１０において、両方のサブセットにおける高ＣＤ８発現レベルおよびＦＡＣＳソートされた細胞集団に由来する公的に入手可能なＣＤ８  Ｔ細胞グラウンドトゥルースプロファイルにおけるｇｄ  Ｔ細胞枯渇の不在のために、ｇｄ  Ｔ細胞をＣＤ８  Ｔ細胞とマージした（ＧＳＥ２８４９１、ＧＳＥ２７９２８）。
【０２４０】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され説明される一方で、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかである。本発明は、本明細書内に提供される特定の実施例によって制限されることは意図されない。本発明は、前述の明細書を参照して説明されているが、本明細書の実施形態の説明および例示は、限定的な意味で解釈されることを意図するものではない。本発明から逸脱することなく、多数の変形、変化、および置換は、ここで当業者にとって思い当たるであろう。さらに、本発明のすべての態様は、様々な条件および変数に依存する本明細書に記載される具体的な描写、構成、または相対的な比率に限定されないことを理解されたい。本明細書に記載された本発明の実施形態の様々な代替が、本発明の実施において使用され得ることを理解するべきである。したがって、本発明はまた、任意のそのような代替、修正、変形、または等価物を包含することも企図される。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの等価物をそれによって包含することが意図される。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
2020527946.tif 000007
【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１１−７】
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【図１１−８】
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【図１１−９】
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【図１１−１０】
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【図１１−１１】
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【図１１−１２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２３−４】
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【図２３−５】
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【図２３−６】
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【図２３−７】
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【図２３−８】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【国際調査報告】
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