(57)【要約】  ΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を有するヒト対象の処置に有用である新規核酸配列、ベクター、修飾細胞、ペプチドおよび医薬組成物が提供される。対応する方法および使用も提供される。
2020530274.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)、ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)およびＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)から選択されるペプチドに特異的に結合するＴＣＲα鎖ポリペプチドのＣＤＲ３を含むポリペプチド；および／または
(ｂ)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)、ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)およびＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)から選択されるペプチドに特異的に結合するＴＣＲβ鎖ポリペプチドのＣＤＲ３を含むポリペプチド
をコードする、単離核酸配列。
【請求項２】
核酸配列が(ａ)および(ｂ)両者をコードし、ここで、(ａ)および(ｂ)が一体となってＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)、ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)およびＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)から選択されるペプチドに特異的に結合する、請求項１に記載の単離核酸配列。
【請求項３】
コードされたポリペプチドがＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)に特異的に結合する、請求項１または２に記載の単離核酸配列。
【請求項４】
(ａ)のＣＤＲ３がＣＡＶＴＧＡＲＬＭＦ(配列番号２)と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の単離核酸配列。
【請求項５】
(ａ)のＣＤＲ３が配列番号３または配列番号４の核酸配列によりコードされる、請求項４に記載の単離核酸配列。
【請求項６】
(ｂ)のＣＤＲ３がＣＡＳＳＰＧＧＬＳＮＥＱＦ(配列番号５)と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項３〜５の何れかに記載の単離核酸配列。
【請求項７】
(ｂ)のＣＤＲ３が配列番号６または配列番号７の核酸配列によりコードされる、請求項６に記載の単離核酸配列。
【請求項８】
(ａ)のＣＤＲ３が配列番号１に特異的に結合するＴＣＲα鎖可変領域内であり、所望により(ａ)がＴＣＲα鎖定常領域をさらに含む、請求項３〜７の何れかに記載の単離核酸配列。
【請求項９】
ＴＣＲα鎖可変領域が配列番号８と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の単離核酸配列。
【請求項１０】
(ａ)のＴＣＲα鎖可変領域が配列番号９または配列番号１０の核酸配列によりコードされる、請求項９に記載の単離核酸配列。
【請求項１１】
(ｂ)のＣＤＲ３が配列番号１に特異的に結合するＴＣＲβ鎖可変領域内であり、所望により(ｂ)がＴＣＲβ鎖定常領域をさらに含む、請求項３〜１０の何れかに記載の単離核酸配列。
【請求項１２】
ＴＣＲβ鎖可変領域が配列番号１１と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の単離核酸配列。
【請求項１３】
(ｂ)のＴＣＲβ鎖可変領域が配列番号１２または配列番号１３の核酸配列によりコードされる、請求項１２に記載の単離核酸配列。
【請求項１４】
(ａ)のＣＤＲ３が配列番号８と少なくとも９０％配列同一性を有するＴＣＲα鎖可変領域内であり、ここで、ＣＤＲ３が配列番号２ののアミノ酸配列を有し、所望により(ａ)がＴＣＲα鎖定常領域を含む、請求項３〜１３の何れかに記載の単離核酸配列。
【請求項１５】
ＴＣＲα鎖可変領域ＣＤＲ１が配列番号１４のアミノ酸配列を有し、ＴＣＲα鎖可変領域ＣＤＲ２が配列番号１５のアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の単離核酸配列。
【請求項１６】
(ｂ)のＣＤＲ３が配列番号１１と少なくとも９０％配列同一性を有するＴＣＲβ鎖可変領域内であり、ここで、ＣＤＲ３が配列番号５ののアミノ酸配列を有し、所望により(ｂ)がＴＣＲβ鎖定常領域を含む、請求項３〜１５の何れかに記載の単離核酸配列。
【請求項１７】
ＴＣＲβ鎖可変領域ＣＤＲ１が配列番号１６のアミノ酸配列を有し、ＴＣＲβ鎖可変領域ＣＤＲ２が配列番号１７のアミノ酸配列を有する、請求項１６に記載の単離核酸配列。
【請求項１８】
ペプチドＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)がシステイニル化されている、請求項１〜１７の何れかに記載の単離核酸配列。
【請求項１９】
核酸配列がＴ細胞受容体をコードする、請求項１〜１８の何れかに記載の単離核酸配列。
【請求項２０】
請求項１〜１９の何れかに記載の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項２１】
ベクターがプラスミドまたはウイルスベクターであり、所望によりベクターがレトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、カナリアポックスウイルス、ヘルペスウイルス、ミニサークルベクターおよび合成ＤＮＡまたはＲＮＡからなる群から選択される、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
請求項１〜１９の何れかに記載の核酸配列または請求項２０または２１に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された、修飾細胞。
【請求項２３】
修飾細胞がＣＤ８  Ｔ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ガンマ−デルタＴ細胞、造血幹細胞、前駆細胞細胞、Ｔ細胞株またはＮＫ−９２細胞株からなる群から選択される、請求項２２に記載の修飾細胞。
【請求項２４】
修飾細胞がヒト細胞である、請求項２２または２３に記載の修飾細胞。
【請求項２５】
(ｉ)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)(ここで、アミノ酸システインはシステイニル化されている)；
(ii)ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)；
(iii)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)；
(iv)ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)；および
(ｖ)ＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)
から選択されるアミノ酸配列を含む、単離ペプチド。
【請求項２６】
ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)のアミノ酸システインがシステイニル化されている、請求項２５に記載のペプチド。
【請求項２７】
ペプチドが２０以下のアミノ酸を有する、請求項２５または２６に記載のペプチド。
【請求項２８】
ペプチドが
(ｉ)配列番号１(ここで、アミノ酸システインはシステイニル化されている)；
(ii)配列番号２６；
(iii)配列番号２７；
(iv)ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)；および
(ｖ)ＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)
から選択される配列からなる、請求項２７に記載のペプチド。
【請求項２９】
請求項２５〜２８の何れかに記載のペプチドをコードする、単離核酸配列。
【請求項３０】
請求項２９に記載の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項３１】
請求項１〜１９の何れかに記載の核酸配列または請求項２９、請求項２０、２１または３０に記載のベクター、請求項２２〜２４の何れかに記載の修飾細胞または請求項２５〜２８の何れかに記載の単離ペプチドおよび薬学的に許容される添加物、アジュバント、希釈剤および／または担体を含む、医薬組成物。
【請求項３２】
組成物が請求項２５〜２８の何れかに記載の単離ペプチド、請求項２９に記載の核酸または請求項３０に記載のベクターを含み、ワクチンとして製剤されている、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
ヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を処置または予防する方法であって、対象に治療有効量の請求項３１または３２に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項３４】
造血器腫瘍が骨髄腫瘍である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
骨髄腫瘍が急性骨髄性白血病である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
方法が対象における細胞介在免疫応答を誘発または増強する、請求項３３〜３５の何れかに記載の方法。
【請求項３７】
ヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍の処置または予防に使用するための、請求項３１または３２に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
造血器腫瘍が骨髄腫瘍である、請求項３７に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項３９】
骨髄腫瘍が急性骨髄性白血病である、請求項３７または３８に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項４０】
医薬組成物が対象における細胞介在免疫応答の誘発または増強において使用するためである、請求項３７〜３９の何れかに記載の使用のための医薬組成物。
【請求項４１】
ヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍の処置または予防用医薬の製造における、請求項３１または３２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４２】
造血器腫瘍が骨髄腫瘍である、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
骨髄腫瘍が急性骨髄性白血病である、請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
Ｔ細胞受容体を産生する方法であって、請求項１〜１９の何れかに記載の核酸配列と細胞を、配列番号１、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８または配列番号２９から選択されるペプチドに特異的に結合するＴ細胞受容体を産生するように、該核酸配列が該細胞に取り込まれ、発現される条件下で接触させることを含む、方法。
【請求項４５】
方法がエクスビボである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍についてのバイオマーカーとしてのペプチドの使用であって、ペプチドが、
(ｉ)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)、
(ii)ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)；
(iii)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)；
(iv)ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)；および
(ｖ)ＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)
から選択されるものである、使用。
【請求項４７】
ヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を診断する方法であって、
対象から単離したサンプル中のペプチドの存在を決定することを含み、ここで、ペプチドは(ｉ)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)；(ii)ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)；(iii)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)；(iv)ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)；および(ｖ)ＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)から選択され、
ここで、サンプル中の該ペプチドの存在が対象をΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を有するとして同定するものであり、そして該ペプチドの非存在が対象をΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を有しないとして同定するものである
方法。
【請求項４８】
ヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を処置または予防する方法であって、
(ｉ)該対象から単離したサンプル中のペプチドの存在を決定し、ここで、ペプチドはＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)、ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)およびＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)から選択されるものであり；そして
(ii)該対象に治療有効量の請求項３１または３２に記載の医薬組成物を投与する
ことを含む、方法。
【請求項４９】
ヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍の処置または予防に使用するための請求項３１または３２に記載の医薬組成物であって、該対象は該対象から単離されたサンプルにおけるペプチドの存在によりΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を有するとして同定されており、ここで、該ペプチドは
(ｉ)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)；
(ii)ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)；
(iii)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)；
(iv)ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)；および
(ｖ)ＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)
から選択されるものである、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍(Haematological Malignancies)を有するヒト対象の処置に有用な新規核酸配列、ベクター、修飾細胞、ペプチドおよび医薬組成物が提供される。対応する方法および使用も提供される。
【背景技術】
【０００２】
背景
造血器腫瘍は、血液およびリンパ系に影響する癌である。癌は血液形成組織(例えば骨髄)、または免疫系の細胞から始まり得る。造血器腫瘍の例は、骨髄性腫瘍、例えば急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)を含む。
【０００３】
急性骨髄性白血病は、分化が停止した骨髄前駆細胞の蓄積により特徴づけられる、骨髄の悪性疾患である。現在、標準的治療は、導入化学療法、続く集中的地固め化学療法または大量療法と自己または同種造血幹細胞移植(ａｌｌｏＳＣＴ)であり、≦６５歳の患者で４０〜４５％、＞６５歳の患者でわずか１０％の５年生存率に至る１−２。ａｌｌｏＳＣＴは低再発率と相関するが、この利益は高毒性により制限される。それ故に、ａｌｌｏＳＣＴでの処置は、全身状態良好であるが、細胞遺伝学的有害もしくは分子レベルでの異常または化学療法後の検出可能な永続的もしくは再発性疾患に基づく、予後不良性患者に限定される。患者の大部分で、化学療法後３年以内に再発が生じ、ＡＭＬの患者を処置し、生存を改善するための、高い有効性および毒性がないまたは限定的な新規標的療法の差し迫った必要性がある２。
【０００４】
ＡＭＬの分子特徴づけは、ここ数十年で加速している。全ゲノムおよびエクソームシーケンシングは、ＡＭＬが低突然変異負荷であり、患者あたり平均１３翻訳領域変異であることを示す。黒色腫および肺癌などの高突然変異負荷の癌タイプについて、体細胞変異のごく一部がネオ抗原をコードすることが示されている３。ネオ抗原は、ＨＬＡの影響下で腫瘍細胞に提示されたとき、特異的Ｔ細胞により認識され得る、腫瘍特異的ＤＮＡ変異から生じるペプチドである。この抗原の形成は、さらなるそれぞれの変異がネオ抗原を発生させる機会を高める、確率過程である。ＡＭＬにおける突然変異負荷が低いため、ネオ抗原の数は限定的であると推測される３。
【０００５】
ネオ抗原は、チェックポイント阻害剤またはインビトロ拡大腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ)の養子移植での処置後のインビボ癌拒絶抗原として働き得る３−４。チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４(イピリムマブ)またはＰＤ−１(ペムブロリズマブおよびニボルマブ)が介在するＴ細胞の阻害性シグナルを遮断し、それにより免疫系がネオ抗原を標的とすることが促進される、抗体である。チェックポイント阻害剤およびＴＩＬ治療は、高突然変異負荷の腫瘍での成功が証明されているが、低突然変異負荷の腫瘍には無効である。しかしながら、ＡＭＬにおける全体的突然変異負荷は低いものの、体細胞異常がしばしば限られた数のドライバー遺伝子で生じ、それらは複数の患者で繰り返し変異している５。その結果、ＡＭＬにおける反復変異から生じるネオ抗原は、標的免疫療法の開発に適切である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＡＭＬなどの骨髄性腫瘍を含む造血器腫瘍を処置するための新規免疫療法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要約
本発明者らは、変異型のヌクレオフォスミン(ΔＮＰＭ１またはＮＰＭ１ｍｕｔ)が、該変異タンパク質の形成が悪性造血細胞に制限されるため、骨髄性腫瘍(特にＡＭＬ)などの造血器腫瘍の免疫療法の理想的標的であると認識した。
【０００８】
ヌクレオフォスミン(ＮＰＭ１)は、ＡＭＬの患者の約３０％でしばしば変異するドライバー遺伝子である。５変異ＮＰＭ１はまた他のタイプの造血器腫瘍(例えば他の骨髄性腫瘍)でも観察されているが、ＡＭＬ以外の腫瘍での頻度ははるかに低い。変異ＮＰＭ１(ΔＮＰＭ１、またはＮＰＭ１ｍｕｔ)を有する患者は、遺伝子のエクソン１２に特徴的４塩基対(４−ｂｐ)フレームシフト挿入を担持する。結果としてのΔＮＰＭ１タンパク質は、野生型対応物より４アミノ酸(ＡＡ)長く、そのＣ末端の１１個のＡＡは、代替リーディングフレームに翻訳される(ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ)。その結果、ΔＮＰＭ１タンパク質は核原形質シャトルタンパク質として機能していた場所である核小体から、細胞質に移行する。６ΔＮＰＭ１タンパク質は、こうして細胞内に局在する。しかしながら、ＨＬＡ制限ΔＮＰＭ１由来ペプチドは、Ｔ細胞受容体に細胞表面で接近可能であり、故にＴ細胞により認識され得る。
【０００９】
初代ＡＭＬのＨＬＡクラスＩリガンドームの研究により、本発明者らは、ＨＬＡクラスＩに存在するΔＮＰＭ１の代替リーディングフレームによりコードされる５つのペプチドを同定した。５つの同定されたペプチドは、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)、ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)およびＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)である。これらのペプチドは、ΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬの処置または予防のための治療剤(例えばワクチン)として使用され得る２３。あるいは、それらをここに記載する修飾細胞(例えば特定したペプチドの一つにより特異的に認識されるＴ細胞受容体を有する末梢血リンパ球または腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ))を有するような患者の処置のための標的抗原として使用し得る。
【００１０】
有利には、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)、ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)およびＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)から選択されるペプチドに特異的なＴＣＲを発現するＴ細胞を、ΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬ処置の有効な免疫療法として使用できる。これらのペプチド特異的ＴＣＲを使用したＴＣＲ遺伝子導入アプローチは、それ故にΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬの患者の新規処置モダリティをもたらし得る。
【００１１】
本発明者らは、始めて、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬがＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ＡＭＬの患者から単離された初代ＡＭＬ細胞の表面に提示されることを示した。有利には、ペプチドは、それ故にＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ヒト患者におけるΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬを処置または予防するための治療剤(例えばワクチン)として使用できる。あるいは、ここに記載する修飾細胞(例えばＣＬＡＶＥＥＶＳＬを特異的に認識するＴ細胞受容体を有する末梢血リンパ球または腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ))を有するような患者の処置のための標的抗原として使用し得る。
【００１２】
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１の影響下で提示されるＣＬＡＶＥＥＶＳＬに特異的なＴ細胞受容体(ＴＣＲ)を有するＴ細胞が、健常個体からのＴ細胞レパートリーに存在するかを調べるために、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１四量体をＣＬＡＶＥＥＶＳＬについて作製し、そのシステイニル化バリアントおよび四量体陽性ＣＤ８  Ｔ細胞を健常個体からの末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)から単離した。いくつかの四量体陽性Ｔ細胞クローンを試験し、２つのみがＣＬＡＶＥＥＶＳＬへの特異的に結合およびＨＬＡ−Ａ＊０２：０１およびΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬの認識を示した。最も反応性のクローン(１Ａ２)のＴ細胞受容体を配列決定し、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋  Ｔ細胞に導入し、これは、共受容体非依存的様式でＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性初代ＡＭＬのΔＮＰＭ１での特異的認識および細胞溶解を示した。
【００１３】
本発明者らは、それ故にネオ抗原ＣＬＡＶＥＥＶＳＬに特異的に結合するＴＣＲを同定した。
【００１４】
有利には、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬに特異的なＴＣＲを発現するＴ細胞は、それ故に、ΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬを有するＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性患者の処置における有効な免疫療法として使用され得る。ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ特異的ＴＣＲを使用するＴＣＲ遺伝子導入アプローチは、それ故にΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬを有するＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性患者のための新規処置モダリティをもたらし得る。
【００１５】
さらに、ペプチドＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(および特にそのシステイニル化形態、すなわちＣ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬ)を、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性患者のΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬを処置または予防するための治療剤(例えばワクチン)として使用できる。ペプチド自体も、それ故に例えば単離形態でまたは医薬組成物として製剤されたとき有用である。
【００１６】
初代ＡＭＬのＨＬＡクラスＩリガンドームの研究により、本発明者らはまたΔＮＰＭ１のオルターナティブリーディングフレームによりコードされる別の９量体ペプチドおよび１１量体ペプチドも同定した(それぞれＡＶＥＥＶＳＬＲＫおよびＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ)。ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１およびＨＬＡ−Ａ＊１１：０１へのＡＶＥＥＶＳＬＲＫおよびＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫの各々の結合は、四量体産生のための単量体折り畳みにより確認した(ＣＬＡＶＥＥＶＳＬペプチドについてここに詳述するとおり)。従って、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫおよびＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫペプチドの各々を、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１陽性ヒト患者におけるΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬを処置または予防するための治療剤(例えばワクチン)として使用できる。あるいは、これらのペプチドの各々を、ここに記載する修飾細胞(例えばそれぞれＡＶＥＥＶＳＬＲＫまたはＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫを特異的に認識するＴ細胞受容体を有する末梢血リンパ球または腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ))を有するような患者の処置のための標的抗原として使用し得る。
【００１７】
四量体産生のための単量体折り畳みはまた、ＨＬＡ−Ａ＊０１：０１を用いるＡＶＥＥＶＳＬＲＫについて十分示されている(ＣＬＡＶＥＥＶＳＬペプチドについてここに詳述するとおり)。ＡＶＥＥＶＳＬＲＫがＨＬＡ−Ａ＊０１：０１に結合する能力は、それ故に確認されている。ＡＶＥＥＶＳＬＲＫはまたＨＬＡ−Ａ＊０３：０１およびＨＬＡ−Ａ＊１１：０１を欠くＨＬＡ−Ａ＊０１：０１陽性ＡＭＬ対象(ＡＭＬ４４４３)からのＨＬＡクラスＩリガンドームでも同定されている(図２参照)。従って、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫペプチドはまたＨＬＡ−Ａ＊０１：０１陽性ヒト患者におけるΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬを処置または予防するための治療剤(例えばワクチン)として使用できる。あるいは、このペプチドを、ここに記載する修飾細胞(例えばＡＶＥＥＶＳＬＲＫを特異的に認識するＴ細胞受容体を有する末梢血リンパ球または腫瘍浸潤性リンパ球(ＴＩＬ))を有するような患者の処置のための標的抗原として使用し得る。
【００１８】
ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１の影響下で提示されるＡＶＥＥＶＳＬＲＫに特異的なＴ細胞受容体(ＴＣＲ)を有するＴ細胞が健常個体からのＴ細胞レパートリーに存在するかを調べるために、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１四量体およびＨＬＡ−Ａ＊１１：０１四量体をＡＶＥＥＶＳＬＲＫについて産生し、四量体陽性ＣＤ８  Ｔ細胞を健常個体からの末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)から単離した。いくつかの四量体陽性Ｔ細胞クローンを試験し、一つが、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１の影響下でＡＶＥＥＶＳＬＲＫに特異的に結合を有することが示された(反応性クローン(３Ｂ３)；図３７)。さらに、一つのＴ細胞クローンが、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１の影響下でＡＶＥＥＶＳＬＲＫに特異的に結合を有することが示された(反応性クローン(６Ｆ１１)；図３７)。これらのクローン(６Ｆ１１および３Ｂ３)の各々の反応性も試験し(図３８および３９)、ここで、適切なＨＬＡ−Ａのみの影響下でΔＮＰＭ１ペプチドと存在するとき、各クローンによりサイトカイン放出が示された。
【００１９】
本発明者らは、それ故にＨＬＡ−Ａ＊０３：０１(クローン３Ｂ３からのＴＣＲ)またはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１(クローン６Ｆ１１からのＴＣＲ)の影響下でネオ抗原ＡＶＥＥＶＳＬＲＫに特異的に結合する２つのＴＣＲを同定した。
【００２０】
有利には、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫに特異的なＴＣＲを発現するＴ細胞は、それ故にΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬを有するＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１またはＨＬＡ−Ａ＊０１：０１陽性患者の処置における有効な免疫療法として使用できる。ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ特異的ＴＣＲを使用するＴＣＲ遺伝子導入アプローチは、それ故にΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬを有するＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１またはＨＬＡ−Ａ＊０１：０１陽性患者のための新規処置モダリティをもたらし得る。
【００２１】
さらに、ペプチドＡＶＥＥＶＳＬＲＫは、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１またはＨＬＡ−Ａ＊０１：０１陽性患者におけるΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬの処置または予防のための治療剤(例えばワクチン)として使用され得る。ペプチド自体も、それ故に例えば単離形態でまたは医薬組成物として製剤されたとき有用である。
【００２２】
本発明者らは、ペプチドＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)がＨＬＡ−Ａ＊０３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１により提示されることを示している。それ故に、このペプチドの何れかへの特異的に結合が、適切なＨＬＡの影響下で生じ得る(すなわちペプチドへの特異的に結合は、上記のとおり、適切なＨＬＡにより提示されるときのみ生じ得る)。
【００２３】
ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１の影響下で提示されるＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫに特異的なＴ細胞受容体(ＴＣＲ)を有するＴ細胞が健常個体からのＴ細胞レパートリーに存在するかを調べるために、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１四量体をＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫについて作製し、そのシステイニル化バリアントおよび四量体陽性ＣＤ８  Ｔ細胞を健常個体からの末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)から単離した。いくつかの四量体陽性Ｔ細胞クローンを試験し、一つがＨＬＡ−Ａ＊０３：０１の影響下でＣ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫに特異的に結合を有するとして同定された(反応性クローン(１Ｆ２)；図３７)。
【００２４】
本発明者らは、それ故にＨＬＡ−Ａ＊０３：０１でネオ抗原Ｃ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫに特異的に結合するＴＣＲ(クローン１Ｆ２からのＴＣＲ)を同定した。
【００２５】
有利には、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(および特にシステイニル化形態、すなわちＣ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ)に特異的なＴＣＲを発現するＴ細胞は、それ故に、ΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬを有するＨＬＡ−Ａ＊０３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１陽性患者の処置における有効な免疫療法として使用され得る。ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(および特にＣ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ)特異的ＴＣＲを使用するＴＣＲ遺伝子導入アプローチは、それ故にΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬを有するＨＬＡ−Ａ＊０３：０１およびＨＬＡ−Ａ＊１１：０１陽性患者のための新規処置モダリティをもたらし得る。
【００２６】
さらに、ペプチドＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(および特にそのシステイニル化形態、すなわちＣ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ)を、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１陽性患者のΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬを処置または予防するための治療剤(例えばワクチン)として使用できる。ペプチド自体も、それ故に例えば単離形態でまたは医薬組成物として製剤されたとき有用である。
【００２７】
本発明は、ΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬを有する患者の処置に特異的な適用を有する。しかしながら、ΔＮＰＭ１はまた他の形態の造血器腫瘍、特に骨髄性腫瘍を有する患者のサブセットにも存在する。本発明は、それ故に、骨髄性腫瘍(例えばＡＭＬ)のような、しかしこれに限定されないΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を有する患者に等しく適用される。
【００２８】
従って、ある態様において、本発明は、
(ａ)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)、ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)およびＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)から選択されるペプチドに特異的に結合するＴＣＲα鎖ポリペプチドのＣＤＲ３を含むポリペプチド；および／または
(ｂ)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)、ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)およびＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)から選択されるペプチドに特異的に結合するＴＣＲβ鎖ポリペプチドのＣＤＲ３を含むポリペプチド
をコードする単離核酸配列を提供する。
【００２９】
核酸配列は(ａ)および(ｂ)両者をコードでき、ここで、(ａ)および(ｂ)は一体となってＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)、ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)およびＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)から選択されるペプチドに特異的に結合する。
【００３０】
コードされたポリペプチドは、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)に特異的に結合し得る。ペプチドはシステイニル化形態であり得る。コードされたポリペプチドは、それ故に、Ｃ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬ(システイニル化形態)のみに特異的に結合し得る。
【００３１】
あるいは、コードされたポリペプチドは、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)に特異的に結合し得る。
【００３２】
あるいは、コードされたポリペプチドは、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)に特異的に結合し得る。ペプチドはシステイニル化形態であり得る。コードされたポリペプチドは、それ故に、Ｃ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(システイニル化形態)のみに特異的に結合し得る。
【００３３】
(ａ)のＣＤＲ３は、ＣＡＶＴＧＡＲＬＭＦ(配列番号２)と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。所望により、(ａ)のＣＤＲ３は配列番号３または配列番号４の核酸配列またはその遺伝的に変化した配列(すなわち遺伝暗号縮重の結果として同じタンパク質をコードする他の核酸配列)によりコードされる。
【００３４】
(ｂ)のＣＤＲ３は、ＣＡＳＳＰＧＧＬＳＮＥＱＦ(配列番号５)と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。所望により、(ｂ)のＣＤＲ３は、配列番号６もしくは配列番号７の核酸配列またはその遺伝的に変化した配列(すなわち遺伝暗号縮重の結果として同じタンパク質をコードする他の核酸配列)によりコードされる。
【００３５】
(ａ)のＣＤＲ３は、選択ペプチド(すなわち配列番号１、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８または配列番号２９)に特異的に結合するＴＣＲα鎖可変領域内であり得る。
【００３６】
(ａ)は、ＴＣＲα鎖定常領域をさらに含み得る。換言すると、(ａ)のポリペプチドは、選択ペプチドに特異的に結合する完全長ＴＣＲα鎖可変領域および完全長ＴＣＲα鎖定常領域を含み得る。
【００３７】
ＴＣＲα鎖可変領域は、配列番号８と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。所望により、(ａ)のＴＣＲα鎖可変領域は、配列番号９もしくは配列番号１０の核酸配列またはその遺伝的に変化した配列(すなわち遺伝暗号縮重の結果として同じタンパク質をコードする他の核酸配列)によりコードされる。
【００３８】
(ｂ)のＣＤＲ３は、選択ペプチド(すなわち配列番号１、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８または配列番号２９)に特異的に結合するＴＣＲβ鎖可変領域内であり得る。
【００３９】
(ｂ)は、ＴＣＲβ鎖定常領域をさらに含み得る。換言すると、(ｂ)のポリペプチドは、選択ペプチドに特異的に結合する完全長ＴＣＲα鎖可変領域および完全長ＴＣＲα鎖定常領域を含み得る。
【００４０】
(ｂ)のＴＣＲβ鎖可変領域は、配列番号１１と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。所望により、(ｂ)のＴＣＲβ鎖可変領域は、配列番号１２もしくは配列番号１３の核酸配列またはその遺伝的に変化した配列(すなわち遺伝暗号縮重の結果として同じタンパク質をコードする他の核酸配列)によりコードされる。
【００４１】
(ａ)のＣＤＲ３は、配列番号８に少なくとも９０％配列同一性を有するＴＣＲα鎖可変領域内であり得て、ここで、ＣＤＲ３は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。所望により(ａ)はＴＣＲα鎖定常領域を含む。
【００４２】
ここに記載する実施態様の何れにおいても、ＴＣＲα鎖可変領域ＣＤＲ１は配列番号１４のアミノ酸配列を有し得て、ＴＣＲα鎖可変領域ＣＤＲ２は配列番号１５のアミノ酸配列を有し得る。
【００４３】
(ｂ)のＣＤＲ３は、配列番号１１に少なくとも９０％配列同一性を有するＴＣＲβ鎖可変領域内であり得て、ここで、ＣＤＲ３は、配列番号５のアミノ酸配列を有する。所望により、(ｂ)はＴＣＲβ鎖定常領域を含む。
【００４４】
ここに記載する実施態様の何れにおいても、ＴＣＲβ鎖可変領域ＣＤＲ１は配列番号１６のアミノ酸配列を有し得て、ＴＣＲβ鎖可変領域ＣＤＲ２は配列番号１７のアミノ酸配列を有し得る。
【００４５】
選択したペプチドＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)はシステイニル化され得る。
【００４６】
選択したペプチドＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)はシステイニル化され得る。
【００４７】
核酸配列はＴ細胞受容体をコードし得る。
【００４８】
疑いを避けるため、本発明者らペプチドＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)はＨＬＡ−Ａ＊０２：０１により提示される(すなわちＨＬＡ−Ａ＊０２：０１限定的である)ことを同定した。さらに、本発明者らは、ペプチドＡＶＥＥＶＳＬＲＫおよびＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫが各々ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１により提示され、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫもＨＬＡ−Ａ＊０１：０１により提示されることを同定した。それ故に、これらのペプチドの何れかへの特異的に結合が、適切なＨＬＡで生じ得る(すなわちペプチドへの特異的に結合は、上記のとおり、適切なＨＬＡにより提示されるときのみ生じ得る)。
【００４９】
本発明の核酸配列は天然に存在しない核酸配列であり得る(例えば全配列がその全体として天然に生じないものであり得る)。例えば、本発明の核酸配列はプロモーターと操作可能に結合でき、ここで、該プロモーターは、天然で等価なヒト核酸配列と天然に関連していない(例えばヒトＴＣＲ配列またはそのフラグメント)；すなわちその天然環境で該核酸と天然に関連している全プロモーターではない。この状況において、このようなプロモーターは、外来性プロモーターと見なされ得る。適切なプロモーターの例は、他に記載される。
【００５０】
さらなる態様において、本発明は、本発明の核酸配列を含むベクターを提供する。
【００５１】
ベクターはプラスミドまたはウイルスベクターであり得る。所望により、ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、カナリアポックスウイルス、ヘルペスウイルス、ミニサークルベクターおよび合成ＤＮＡまたはＲＮＡからなる群から選択される。所望により、ベクターは、上記のとおり、核酸配列が操作可能に結合しているプロモーターを含む。
【００５２】
さらなる態様において、本発明は、本発明の核酸配列または本発明のベクターでトランスフェクトまたは形質導入された修飾細胞を提供する。
【００５３】
トランスフェクトまたは形質導入された本発明の核酸配列または本発明のベクターは、上記のとおり、プロモーターに操作可能に結合され得る。
【００５４】
修飾細胞は、ＣＤ８  Ｔ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ガンマ−デルタＴ細胞、造血幹細胞、前駆細胞細胞、Ｔ細胞株またはＮＫ−９２細胞株からなる群から選択され得る。
【００５５】
修飾細胞はヒト細胞であり得る。
【００５６】
さらなる態様において、本発明は、
(ｉ)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)(ここで、システインアミノ酸はシステイニル化されていてもされていなくてもよい)；
(ii)ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)；
(iii)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)(ここで、システインアミノ酸はシステイニル化されていてもされていなくてもよい)；
(iv)ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)；および
(ｖ)ＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)
から選択されるアミノ酸配列を含む、単離ペプチドを提供する。
【００５７】
特定の実施態様において、配列番号１のシステインアミノ酸はシステイニル化されている。
【００５８】
特定の実施態様において、配列番号２７のシステインアミノ酸はシステイニル化されている。
【００５９】
ペプチドは２０以下のアミノ酸を有し得る。
【００６０】
ペプチドは、
(ｉ)配列番号１(ここで、システインアミノ酸はシステイニル化されていてもされていなくてもよい)；
(ii)配列番号２６；
(iii)配列番号２７(ここで、システインアミノ酸はシステイニル化されていてもされていなくてもよい)；
(iv)配列番号２８；および
(ｖ)配列番号２９
から選択される配列からなり得る。
【００６１】
特定の実施態様において、ペプチドは配列番号１の配列からなり得て、ここで、配列番号１のシステインアミノ酸はシステイニル化されている。
【００６２】
特定の実施態様において、ペプチドは配列番号２７の配列からなり得て、ここで、配列番号２７のシステインアミノ酸はシステイニル化されている。
【００６３】
さらなる態様において、本発明は、本発明のペプチドをコードする単離核酸配列を提供する。
【００６４】
さらなる態様において、本発明は、本発明の核酸配列を含むベクターを提供すうｒ。
【００６５】
さらなる態様において、本発明は、本発明の核酸配列、本発明のベクター、本発明の修飾細胞または本発明の単離ペプチドおよび薬学的に許容される添加物、アジュバント、希釈剤および／または担体を含む医薬組成物を提供する。
【００６６】
医薬組成物は、該組成物が本発明の単離ペプチド(または該単離ペプチドをコードする核酸またはベクター)を含むとき、ワクチンとして製剤され得る。ペプチドおよび核酸のための適当なワクチン製剤は当分野で周知である。
【００６７】
さらなる態様において、本発明は、ヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を処置または予防する方法であって、対象に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００６８】
ヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を処置または予防する方法は、対象に治療有効量のここに記載するペプチド(または該ペプチドをコードする核酸(例えばＲＮＡまたはＤＮＡ)またはベクター)を投与することを含み得る。
【００６９】
例として、
(ｉ)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)(ここで、システインアミノ酸はシステイニル化されていてもされていなくてもよい)；
(ii)ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)；
(iii)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)(ここで、システインアミノ酸はシステイニル化されていてもされていなくてもよい)；
(iv)ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)；および
(ｖ)ＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)
から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる単離ペプチドを、免疫療法(例えばワクチンとして)として投与し得る。
【００７０】
特定の実施態様において、配列番号１のシステインアミノ酸はシステイニル化されている。
【００７１】
特定の実施態様において、配列番号２７のシステインアミノ酸はシステイニル化されている。
【００７２】
造血器腫瘍は骨髄腫瘍であり得る。
【００７３】
骨髄腫瘍は急性骨髄性白血病であり得る。
【００７４】
方法は、対象における細胞介在免疫応答を誘発または増強し得る。
【００７５】
疑いを避けるため、本発明者らは、ペプチドＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)がＨＬＡ−Ａ＊０２：０１限定的であることを同定した。さらに、本発明者らは、ペプチドＡＶＥＥＶＳＬＲＫおよびＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫが各々ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１およびＨＬＡ−Ａ＊１１：０１の何れかにより提示され、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫもＨＬＡ−Ａ＊０１：０１により提示されることを同定した。ＣＬＡＶＥＥＶＳＬおよび／またはＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫは、特にシステイニル化形態であり得る。
【００７６】
それ故に、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を処置または予防する方法は、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬに特異的に結合するポリペプチドをコードする核酸配列、このような核酸配列をコードするベクター、このような核酸配列またはベクターを含む修飾細胞またはＣＬＡＶＥＥＶＳＬをコードする核酸、このような核酸配列をコードするベクターまたは配列ＣＬＡＶＥＥＶＳＬを含むタンパク質もしくはペプチドを含む医薬組成物を優先的に使用し得る(この全て本明細書の他の箇所により詳細に記載されている)。ＣＬＡＶＥＥＶＳＬは、特にシステイニル化形態であり得る。
【００７７】
同様に、ヒト対象におけるＨＬＡ−Ａ＊０３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１が陽性であるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を処置または予防する方法は、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫまたはＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫに特異的に結合するポリペプチドをコードする核酸配列、このような核酸配列をコードするベクター、このような核酸配列またはベクターを含む修飾細胞またはＡＶＥＥＶＳＬＲＫまたはＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫをコードする核酸、このような核酸配列をコードするベクターまたは配列ＡＶＥＥＶＳＬＲＫまたはＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫを含むタンパク質もしくはペプチドを含む医薬組成物を優先的に使用し得る(この全て本明細書の他の箇所により詳細に記載されている)。
【００７８】
さらに、ヒト対象におけるＨＬＡ−Ａ＊０１：０１が陽性であるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を処置または予防する方法は、優先的にＡＶＥＥＶＳＬＲＫに特異的に結合するポリペプチドをコードする核酸配列、このような核酸配列をコードするベクター、このような核酸配列またはベクターを含む修飾細胞またはＡＶＥＥＶＳＬＲＫをコードする核酸、このような核酸配列をコードするベクターまたは配列ＡＶＥＥＶＳＬＲＫを含むタンパク質もしくはペプチドを含む医薬組成物を使用し得る(この全て本明細書の他の箇所により詳細に記載されている)。
【００７９】
ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫは、特にシステイニル化形態であり得る。
【００８０】
さらなる態様において、本発明は、ヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍の処置または予防に使用するための、本発明の医薬組成物を提供する。
【００８１】
ヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍の処置または予防に使用するための本発明の医薬組成物は、治療有効量のここに記載するペプチド(または該ペプチドをコードする核酸(例えばＲＮＡまたはＤＮＡ)またはベクター)を含み得る。
【００８２】
例として、医薬組成物は、
(ｉ)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)(ここで、システインアミノ酸はシステイニル化されていてもされていなくてもよい)；
(ii)ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)；
(iii)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)(ここで、システインアミノ酸はシステイニル化されていてもされていなくてもよい)；
(iv)ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)；および
(ｖ)ＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる単離ペプチドを含み得る。
【００８３】
医薬組成物は、免疫療法として(例えばワクチンとして)使用し得る。
【００８４】
特定の実施態様において、配列番号１のシステインアミノ酸はシステイニル化されている。
【００８５】
特定の実施態様において、配列番号２７のシステインアミノ酸はシステイニル化されている。
【００８６】
造血器腫瘍は骨髄腫瘍であり得る。
【００８７】
骨髄腫瘍は急性骨髄性白血病であり得る。
【００８８】
医薬組成物は、対象における細胞介在免疫応答の誘発または増強に使用するためであり得る。
【００８９】
上記のとおり、本発明者らは、ペプチドＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)がＨＬＡ−Ａ＊０２：０１限定的であることを同定した。さらに、本発明者らは、ペプチドＡＶＥＥＶＳＬＲＫおよびＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫが各々ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１およびＨＬＡ−Ａ＊１１：０１により提示され、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫもＨＬＡ−Ａ＊０１：０１により提示されることを同定した。
【００９０】
ＣＬＡＶＥＥＶＳＬおよび／またはＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫは、特にシステイニル化形態であり得る。
【００９１】
それ故に、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬに特異的に結合するポリペプチドをコードする核酸配列、このような核酸配列をコードするベクター、このような核酸配列またはベクターを含む修飾細胞またはＣＬＡＶＥＥＶＳＬをコードする核酸、このような核酸配列をコードするベクターまたは配列ＣＬＡＶＥＥＶＳＬを含むタンパク質もしくはペプチド(この全て本明細書の他の箇所により詳細に記載されている)を含む医薬組成物は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍の処置または予防のときに優先的に使用され得る。ＣＬＡＶＥＥＶＳＬは、特にシステイニル化形態であり得る。
【００９２】
同様に、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫまたはＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫに特異的に結合するポリペプチドをコードする核酸配列、このような核酸配列をコードするベクター、このような核酸配列またはベクターを含む修飾細胞またはＡＶＥＥＶＳＬＲＫまたはＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫをコードする核酸、このような核酸配列をコードするベクターまたは配列ＡＶＥＥＶＳＬＲＫまたはＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫを含むタンパク質もしくはペプチド(この全て本明細書の他の箇所により詳細に記載されている)を含む医薬組成物は、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１が陽性であるヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍の処置または予防のときに優先的に使用され得る。
【００９３】
さらに、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫに特異的に結合するポリペプチドをコードする核酸配列、このような核酸配列をコードするベクター、このような核酸配列またはベクターを含む修飾細胞またはＡＶＥＥＶＳＬＲＫをコードする核酸、このような核酸配列をコードするベクターまたは配列ＡＶＥＥＶＳＬＲＫを含むタンパク質もしくはペプチド(この全て本明細書の他の箇所により詳細に記載されている)を含む医薬組成物は、ＨＬＡ−Ａ＊０１：０１が陽性であるヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍の処置または予防のときに優先的に使用され得る。
【００９４】
ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫは、特にシステイニル化形態であり得る。
【００９５】
さらなる態様において、本発明は、ヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍の処置または予防用医薬の製造における本発明の医薬組成物の使用を提供する。
【００９６】
医薬組成物は、治療有効量のここに記載するペプチド(または該ペプチドをコードする核酸(例えばＲＮＡまたはＤＮＡ)またはベクター)を含み得る。
【００９７】
例として、医薬組成物は、
(ｉ)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)(ここで、システインアミノ酸はシステイニル化されていてもされていなくてもよい)；
(ii)ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)；
(iii)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)(ここで、システインアミノ酸はシステイニル化されていてもされていなくてもよい)；
(iv)ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)；および
(ｖ)ＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる単離ペプチドを含み得る。
【００９８】
医薬組成物は、免疫療法として(例えばワクチンとして)使用し得る。
【００９９】
特定の実施態様において、配列番号１のシステインアミノ酸はシステイニル化されている。
【０１００】
特定の実施態様において、配列番号２７のシステインアミノ酸はシステイニル化されている。
【０１０１】
造血器腫瘍は骨髄腫瘍であり得る。
【０１０２】
骨髄腫瘍は急性骨髄性白血病であり得る。
【０１０３】
本明細書の他の箇所に記載するとおり、本発明者らは、ペプチドＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)がＨＬＡ−Ａ＊０２：０１限定的であることを同定している。さらに、本発明者らは、ペプチドＡＶＥＥＶＳＬＲＫおよびＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫが各々ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１およびＨＬＡ−Ａ＊１１：０１により提示され、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫもＨＬＡ−Ａ＊０１：０１により提示されることを同定している。ＣＬＡＶＥＥＶＳＬおよび／またはＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫは、特にシステイニル化形態であり得る。
【０１０４】
それ故に、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬに特異的に結合するポリペプチドをコードする核酸配列、このような核酸配列をコードするベクター、このような核酸配列またはベクターを含む修飾細胞または配列ＣＬＡＶＥＥＶＳＬを含む単離ペプチド(この全て本明細書の他の箇所により詳細に記載されている)を含む医薬組成物は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍の処置または予防用医薬の製造に優先的に使用され得る。ＣＬＡＶＥＥＶＳＬは、特にシステイニル化形態であり得る。
【０１０５】
同様に、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫまたはＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫに特異的に結合するポリペプチドをコードする核酸配列、このような核酸配列をコードするベクター、このような核酸配列またはベクターを含む修飾細胞または配列ＡＶＥＥＶＳＬＲＫまたはＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫを含む単離ペプチド(この全て本明細書の他の箇所により詳細に記載されている)を含む医薬組成物は、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１が陽性であるヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍の処置または予防用医薬の製造に優先的に使用され得る。
【０１０６】
さらに、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫに特異的に結合するポリペプチドをコードする核酸配列、このような核酸配列をコードするベクター、このような核酸配列またはベクターを含む修飾細胞または配列ＡＶＥＥＶＳＬＲＫを含む単離ペプチド(この全て本明細書の他の箇所により詳細に記載されている)を含む医薬組成物は、ＨＬＡ−Ａ＊０１：０１が陽性であるヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍の処置または予防用医薬の製造に優先的に使用され得る。
【０１０７】
ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫは、特にシステイニル化形態であり得る。
【０１０８】
さらなる態様において、本発明は、本発明の核酸配列と細胞を、配列番号１、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９から選択されるペプチドに特異的に結合するＴ細胞受容体を産生するように、該核酸配列が該細胞に取り込まれ、発現される条件下で接触させることを含む、Ｔ細胞受容体を産生する方法を提供する。
【０１０９】
方法はエクスビボであり得る。
【０１１０】
上記のとおり、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫおよびＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫの何れかへの特異的結合が、適切なＨＬＡの状況で生じ得る(例えばペプチドへの特異的結合は、上記のとおり、それが適切なＨＬＡにより提示されたときのみ生じ得る)。
【０１１１】
さらなる態様において、本発明は、ヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍についてのバイオマーカーとしてのペプチドの使用を提供し、ここで、ペプチドは、
(ｉ)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)(ここで、システインアミノ酸はシステイニル化されていてもされていなくてもよい)；
(ii)ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)；
(iii)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)(ここで、システインアミノ酸はシステイニル化されていてもされていなくてもよい)；
(iv)ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)；および
(ｖ)ＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)
から選択される。
【０１１２】
特定の実施態様において、配列番号１のシステインアミノ酸はシステイニル化されている。
【０１１３】
特定の実施態様において、配列番号２７のシステインアミノ酸はシステイニル化されている。
【０１１４】
さらなる態様において、本発明は、ヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を診断する方法であって、
対象から単離したサンプル中のペプチドの存在を決定することを含み、ここで、ペプチドは(ｉ)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)(ここで、システインアミノ酸はシステイニル化されていてもされていなくてもよい)；(ii)ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)；(iii)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)(ここで、システインアミノ酸はシステイニル化されていてもされていなくてもよい)；(iv)ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)；および(v)ＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)から選択され、
ここで、サンプル中の該ペプチドの存在が対象をΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を有するとして同定するものであり、そして該ペプチドの非存在が対象をΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を有しないとして同定するものである、
方法を提供する。
【０１１５】
特定の実施態様において、配列番号１のシステインアミノ酸はシステイニル化されている。
【０１１６】
特定の実施態様において、配列番号２７のシステインアミノ酸はシステイニル化されている。
【０１１７】
さらなる態様において、本発明は、ヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を処置または予防する方法であって、
(ｉ)対象から単離したサンプル中のペプチドの存在を決定し、ここで、ペプチドはＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)(ここで、システインアミノ酸はシステイニル化されていてもされていなくてもよい)、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)(ここで、システインアミノ酸はシステイニル化されていてもされていなくてもよい)；ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)；およびＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)から選択されるものであり；そして(ii)対象に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与する
ことを含む、方法を提供する。
【０１１８】
特定の実施態様において、配列番号１のシステインアミノ酸はシステイニル化されている。
【０１１９】
特定の実施態様において、配列番号２７のシステインアミノ酸はシステイニル化されている。
【０１２０】
ペプチドの各々およびそのＨＬＡ限定性質(および特に特定のＨＬＡ状態の対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍の処置または予防方法における使用のための適切な医薬組成物の文脈において)に関する先の説明は、ここで等しく適用される。
【０１２１】
さらなる態様において、本発明は、ヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍の処置または予防に使用するための本発明の医薬組成物を提供し、ここで、対象は、該対象から単離したサンプル中のペプチドの存在によりΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を有するとして同定されており、ここで、ペプチドは、
(ｉ)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)(ここで、システイン残基はシステイニル化されていてもいなくてもよい)；
(ii)ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)；
(iii)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)(ここで、システイン残基はシステイニル化されていてもいなくてもよい)；
(iv)ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)；および
(ｖ)ＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)
から選択される。
【０１２２】
この態様において、ΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を有するとして同定されている対象は、該対象から単離したサンプル中のペプチドの存在により処置前に既にΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を有するとして診断されており、ここで、ペプチドは、
(ｉ)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)(ここで、システイン残基はシステイニル化されていてもいなくてもよい)；
(ii)ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)；
(iii)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)(ここで、システイン残基はシステイニル化されていてもいなくてもよい)；
(iv)ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)；および
(ｖ)ＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)
から選択される。
【０１２３】
特定の実施態様において、配列番号１のシステインアミノ酸はシステイニル化されている。
【０１２４】
特定の実施態様において、配列番号２７のシステインアミノ酸はシステイニル化されている。
【０１２５】
ペプチドの各々およびそのＨＬＡ限定性質(および特に特定のＨＬＡ状態の対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍の処置または予防のときに使用するための適切な医薬組成物おいて)に関する先の説明は、ここで等しく適用される。
【０１２６】
本願の明細書および特許請求の範囲をとおして、用語「含む」および「包含」およびその文法的異形は、「含むがそれに限定されない」ことを意味し、かつそれらは他の部分、添加物、成分、整数または工程を除外することを意図しない(そして除外しない)。
【０１２７】
本願の明細書および特許請求の範囲をとおして、単数表現は、文脈から他の解釈が必要でない限り、複数を包含する。特に、不定冠詞が使用されるとき、記載は、文脈から他の解釈が必要でない限り、複数および単数を意図するとして解釈されるべきである。
【０１２８】
本発明の特定の態様、実施態様または例と組み合わせて記載される特性、整数、特徴、化合物、化合物部分または基は、矛盾しない限り、ここに記載するあらゆる他の態様、実施態様または例に適用可能であると解釈されるべきである。
【０１２９】
ここに引用する特許、科学および技術文献は、出願時の当業者が利用可能であった知識を証明する。ここに引用する登録特許、公開され、係属中の特許出願および他の刊行物の全記載を、各々が特にかつ個々に引用により包含させると記載されたのと同程度に引用により本明細書に包含させる。何らかの矛盾がある場合、本明細書が優先する。
【０１３０】
本発明の種々の態様を以下にさらに詳述する。
【０１３１】
図面の簡単な説明
本発明の実施態様を添付する図面を参照してさらにここに記載する。当該各図面は次のとおりである。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】図１は、ΔＮＰＭ１を伴うＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ＡＭＬから溶出したペプチドとしてのＣ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬの検証を提供する。ΔＮＰＭ１を伴うＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ＡＭＬ１０１９７からの溶出ペプチド(上部)および第一残基のシステイニル化後の合成ペプチドＣ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬ(下部)についてのマススペクトルを示す。データは、両ペプチド間のマススペクトルの完全一致を示す。
【０１３３】
【図２】図２は、初代ＡＭＬから溶出したΔＮＰＭ１ペプチドの検証を提供する。ＡＭＬからの溶出ペプチド(上部)および合成ペプチド(下部)についてタンデムマススペクトルを示す。Ｃ＊＝Ｃｙｓ残基のシステイニル化。(Ａ)ＡＭＬ１０１９７(上部)およびＡＭＬ３３６１(中央部)からの溶出ペプチドおよび合成ペプチドＣ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬおよびＡＭＬ３３６１からの溶出ペプチドおよび合成ペプチドＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(下部)についてのタンデムマススペクトル。(Ｂ)ＡＭＬ９４４８(上部)、ＡＭＬ５４４４(中央部)およびＡＭＬ５５１８(下部)からの溶出ペプチドおよび合成ペプチドＡＶＥＥＶＳＬＲＫについてのタンデムマススペクトル。(Ｃ)ＡＭＬ６４９８(上部)およびＡＭＬ４４４３(中央部)からの溶出ペプチドおよび合成ペプチドＡＶＥＥＶＳＬＲＫおよびＡＭＬ９４４８からの溶出ペプチドおよび合成ペプチドＣ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(下部)についてのタンデムマススペクトル。(Ｄ)ＡＭＬ６４９８からの溶出ペプチドおよび合成ペプチドＣ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(上部)、ＡＭＬ３３６１からの溶出ペプチドおよび合成ペプチドＶＥＥＶＳＬＲＫ(中央部)およびＡＭＬからの溶出ペプチド５５１８および合成ペプチドＡＶＥＥＶＳＬＲ(下部)についてのタンデムマススペクトル。
【０１３４】
【図３】図３は、ΔＮＰＭ１についてのＣＤ８細胞は、ΔＮＰＭ１−ＣＬＡとΔＮＰＭ１−Ｃ＊ＬＡ  ｐＭＨＣ四量体の混合を使用してＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性健常個体からのＰＢＭＣから単離された単一細胞であったことを示す。Ａ. 増大中のＴ細胞クローンを、ｐＭＨＣ四量体での染色について試験した。Ｔ細胞クローン１Ａ２(上部)および４Ａ８(下部)は両者ともΔＮＰＭ１−ＣＬＡ四量体について陽性であり、クローン１Ａ２のみがΔＮＰＭ１−Ｃ＊ＬＡで染色された。Ｂ. 四量体陽性Ｔ細胞クローン１Ａ２(上部)および４Ａ８(下部)を、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡにより、用量設定濃度の非システイニル化ΔＮＰＭ１ペプチドＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(丸)、システイニル化ΔＮＰＭ１ペプチドＣ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬ(四角)または無関係ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１制限ＣＭＶペプチドＮＬＶＰＭＶＡＴＶ(三角)で外来性に充填したＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性Ｔ２細胞に対する反応性について試験した。クローン１Ａ２のみが、システイニル化および非システイニル化両者のΔＮＰＭ１ペプチドの認識を示した。無関係ＮＬＶＰＭＶＡＴＶペプチドに対する反応性は見られなかった。２個のウェルでのＩＦＮ−γの平均放出(ng／ml)を示す。Ｃ. クローン１Ａ２(上部)および４Ａ８(中央部)を、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡにより５つのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性初代ＡＭＬに対する反応性について試験した。パネルは、３つのΔＮＰＭ１を伴うＡＭＬおよび２つのｗｔＮＰＭを伴うＡＭＬ１を含んだ。Ｔ細胞クローン１Ａ２は全３つのΔＮＰＭ１を伴うＡＭＬと種々の程度で反応し、クローン４Ａ８は、３つのＡＭＬ中２つでのみ認識された。両Ｔ細胞クローンは、ｗｔＮＰＭを伴うＡＭＬ１を認識できなかった。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１特異的アロ反応性Ｔ細胞クローン(Ａｌｌｏ−Ａ２クローン；下部)を陽性対照として含めた。２個のウェルでのＩＦＮ−γの平均放出(ng／ml)を示す。
【０１３５】
【図４】図４は、ＴＣＲ遺伝子移入後のΔＮＰＭ１に対する特異性を示す。クローン１Ａ２のΔＮＰＭ１特異的ＴＣＲα鎖およびβ鎖の遺伝子を、ＴＣＲ遺伝子移入のために修飾ＭＰ７１−ＴＣＲ−ｆｌｅｘレトロウイルスベクターにクローン化した。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性健常個体から単離したＣＤ８およびＣＤ４細胞を、ΔＮＰＭ１についてのＴＣＲおよび、対照として、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１制限ＣＭＶペプチドＮＬＶＰＭＶＡＴＶについてのＴＣＲでレトロウイルスにより形質導入した。形質導入６日後、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞を、マウスＴＣＲ−Ｃβに対するＡＰＣ接合抗体および磁性抗ＡＰＣビーズを使用して精製した。Ａ. ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞を、形質導入７日後ＣＤ８またはＣＤ４およびＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(ΔＮＰＭ１−ＣＬＡ；左)またはＮＬＶＰＭＶＡＴＶ(ＣＭＶ−ＮＬＶ；右)についてのｐＭＨＣ四量体に対する抗体を使用して、フローサイトメトリーにより分析した。ΔＮＰＭ１についてのＴＣＲで形質導入したＣＤ８(ＣＤ８ФＮＰＭ１)およびＣＤ４(ＣＤ４ФＮＰＭ１)細胞はΔＮＰＭ１−ＣＬＡ四量体で染色されたが、ＣＭＶ−ＮＬＶ四量体ではされなかった。対照的に、ＣＭＶ特異的ＴＣＲで形質導入したＣＤ８(ＣＤ８ФＣＭＶ)およびＣＤ４(ＣＤ４ФＣＭＶ)Ｔ細胞は、ＣＭＶ−ＮＬＶ四量体への結合を示したが、ΔＮＰＭ１−ＣＬＡ四量体へは示さなかった。結果はドナー１について示すが、ドナー２でも結果は類似した。Ｂ. ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞を、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡによりその標的ペプチドに対する反応性について分析した。ＴＣＲ形質導入ＣＤ８およびＣＤ４細胞を、用量設定濃度のΔＮＰＭ１ペプチドＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(丸)またはＣＭＶ由来ペプチドＮＬＶＰＭＶＡＴＶ(四角)を外来性に充填したＴ２細胞と共インキュベートした。ＣＤ８ФＮＰＭ１(上部左)およびＣＤ４ФＮＰＭ１(下部左)は、３０〜１００nM濃度のＣＬＡＶＥＥＶＳＬを充填したＴ２細胞の最大半量認識を示すが(点線)、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶを充填したＴ２細胞は認識されなかった。逆に、ＣＤ８ФＣＭＶ(上部右)およびＣＤ４ФＣＭＶ(下部右)は、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶを充填したＴ２細胞に対して反応性であったが、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬではなかた。２個のウェルでのＩＦＮ−γの平均放出(ng／ml)をドナー１について示すが、ドナー２でも結果は類似した。Ｃ. ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞(ＣＤ８ФＮＰＭ１およびＣＤ４ФＮＰＭ１は黒棒で示す；ＣＤ８ФＣＭＶおよびＣＤ４ФＣＭＶは灰色棒で示す)を、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡにより、ＨＬＡクラスＩ(Ｗ６／３２)またはＨＬＡクラスII(ＰｄＶ５.１)に対する遮断抗体の非存在下または存在下、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ＡＭＬ細胞株のΔＮＰＭ１(ＯＣＩ−ＡＭＬ３)またはｗｔＮＰＭ１(ＯＣＩ−ＡＭＬ２)での認識について試験した。ΔＮＰＭ１についてのＴＣＲで形質導入したＣＤ８およびＣＤ４細胞によるＯＣＩ−ＡＭＬ３の認識は、ＨＬＡクラスＩが介在する。２個のウェルのＩＦＮ−γの平均放出(ng／ml)をドナー２について示す。
【０１３６】
【図５】図５は、ＴＣＲ遺伝子移入後の初代ＡＭＬのΔＮＰＭ１の認識を示す。ＴＣＲ形質導入ＣＤ８およびＣＤ４細胞を、９つのΔＮＰＭ１サンプルおよび４つのｗｔＮＰＭ１サンプルを含む１３のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性初代ＡＭＬのパネルに対する反応性について、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡにより試験した。ΔＮＰＭ１についてのＴＣＲで形質導入したＣＤ８(ＣＤ８ФＮＰＭ１；上部パネル；黒色棒)およびＣＤ４(ＣＤ４ФＮＰＭ１；下部パネル；黒色棒)細胞は、全９つのΔＮＰＭ１を伴うＡＭＬと反応したが、ｗｔＮＰＭを伴うＡＭＬ１とはせず、一方１３のＡＭＬサンプルの何れも、ＣＭＶ特異的ＴＣＲの移入後、ＣＤ８(ＣＤ８ФＣＭＶ；上部パネル；濃灰色棒)またはＣＤ４(ＣＤ４ФＣＭＶ；下部パネル；濃灰色棒)細胞で認識されなかった。ＴＣＲ形質導入ＣＤ８およびＣＤ４細胞はまたΔＮＰＭ１を伴うＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陰性ＡＭＬも認識しなかった(データは示していない)。ａｌｌｏ−Ａ２クローン(薄灰色棒)を陽性対照として入れる。２個のウェルでのＩＦＮ−γの平均放出(ng／ml)をドナー１について示す。
【０１３７】
【図６】図６は、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡにより単球由来成熟ＤＣで試験したＴＣＲ形質導入Ｔ細胞を示す。ΔＮＰＭ１についてのＴＣＲ(ＣＤ８ФＮＰＭ１およびＣＤ４ФＮＰＭ１；黒色棒)またはＣＭＶ(ＣＤ８ФＣＭＶおよびＣＤ４ФＣＭＶ；中間灰色棒)で形質導入したドナー２からのＴ細胞を、自己単球由来成熟ＤＣならびにＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性(ＡＭＬ８８６１)または陰性(ＡＭＬ５８７)であるΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬに対する反応性について試験した。自己成熟ＤＣおよびＡＭＬ８８６１について、ａｌｌｏ−Ａ２クローン(薄灰色棒)を陽性対照として入れ、ＡＭＬ５８７をＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２結合ＳＭＣＹペプチドと導入し、陽性対照としてのＳＭＣＹ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞クローンによる認識について試験した(濃灰色棒)。２個のウェルでのＩＦＮ−γの平均放出(ng／ml)を示す。
【０１３８】
【図７】図７は、５１Ｃｒ放出アッセイでのＴＣＲ遺伝子移入後のΔＮＰＭ１を伴う初代ＡＭＬの溶解を示す。ＴＣＲ形質導入ＣＤ８およびＣＤ４細胞を、４つのΔＮＰＭ１サンプルおよび２つのｗｔＮＰＭ１サンプルを含む６つのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性初代ＡＭＬのパネルの９時間５１Ｃｒ放出アッセイによる細胞溶解能について試験した。ΔＮＰＭ１についてのＴＣＲで形質導入したＣＤ８(ＣＤ８ФＮＰＭ１；黒丸)およびＣＤ４(ＣＤ４ФＮＰＭ１；黒四角)細胞は、全４つのΔＮＰＭ１を伴うＡＭＬの特異的溶解を示したが、ｗｔＮＰＭを伴うＡＭＬ１では示さず、一方６つのＡＭＬサンプルのいずれも、ＣＭＶ特異的ＴＣＲの移入後、ＣＤ８(ＣＤ８ФＣＭＶ；灰色丸)またはＣＤ４(ＣＤ４ФＣＭＶ；下部パネル；灰色四角)細胞により特異的に溶解されなかった。ａｌｌｏ−Ａ２クローン(灰色三角)を陽性対照として入れる。３個のウェルでの特異的溶解の平均パーセンテージを、３０：１のＥ：Ｔ比でドナー２について示すが、ドナー１でも結果は類似した。
【０１３９】
【図８】図８は、配列番号１の免疫原性ペプチドアミノ酸配列を示す。配列番号１のシステインアミノ酸はシステイニル化されていてもいなくてもよいことは注意すべきである。
【０１４０】
【図９】図９は、ＣＤＲ３のアミノ酸配列(ＴＣＲα鎖)(配列番号２)を示す。
【０１４１】
【図１０】図１０は、ＣＤＲ３をコードする非最適化核酸配列(ＴＣＲα鎖)(配列番号３)を示す。
【０１４２】
【図１１】図１１は、ＣＤＲ３をコードする最適化核酸配列(ＴＣＲα鎖)(配列番号４)を示す。
【０１４３】
【図１２】図１２は、ＣＤＲ３のアミノ酸配列(ＴＣＲβ鎖)(配列番号５)を示す。
【０１４４】
【図１３】図１３は、ＣＤＲ３をコードする非最適化核酸配列(ＴＣＲβ鎖)(配列番号６)を示す。
【０１４５】
【図１４】図１４は、ＣＤＲ３をコードする最適化核酸配列(ＴＣＲβ鎖)(配列番号７)を示す。
【０１４６】
【図１５】図１５は、α鎖可変領域のアミノ酸配列(配列番号８)(ＣＤＲ３下線)を示す。
【０１４７】
【図１６】図１６は、α鎖可変領域をコードする非最適化核酸配列(配列番号９)(ＣＤＲ３下線)を示す。
【０１４８】
【図１７】図１７は、α鎖可変領域をコードする最適化核酸配列(配列番号１０)(ＣＤＲ３下線)を示す。
【０１４９】
【図１８】図１８は、β鎖可変領域のアミノ酸配列(配列番号１１)(ＣＤＲ３下線)を示す。
【０１５０】
【図１９】図１９は、β鎖可変領域をコードする非最適化核酸配列(配列番号１２)(ＣＤＲ３下線)を示す。
【０１５１】
【図２０】図２０は、β鎖可変領域をコードする最適化核酸配列(配列番号１３)(ＣＤＲ３下線)を示す。
【０１５２】
【図２１】図２１は、ＣＤＲ１のアミノ酸配列(ＴＣＲα鎖)(配列番号１４)を示す。
【０１５３】
【図２２】図２２は、ＣＤＲ２のアミノ酸配列(ＴＣＲα鎖)(配列番号１５)を示す。
【０１５４】
【図２３】図２３は、ＣＤＲ１のアミノ酸配列(ＴＣＲβ鎖)(配列番号１６)を示す。
【０１５５】
【図２４】図２４は、ＣＤＲ２のアミノ酸配列(ＴＣＲβ鎖)(配列番号１７)を示す。
【０１５６】
【図２５】図２５は、ＣＤＲ１をコードする非最適化核酸配列(ＴＣＲα鎖)(配列番号１８)を示す。
【０１５７】
【図２６】図２６は、ＣＤＲ１をコードする最適化核酸配列(ＴＣＲα鎖)(配列番号１９)を示す。
【０１５８】
【図２７】図２７は、ＣＤＲ２をコードする非最適化核酸配列(ＴＣＲα鎖)(配列番号２０)を示す。
【０１５９】
【図２８】図２８は、ＣＤＲ２をコードする最適化核酸配列(ＴＣＲα鎖)(配列番号２１)を示す。
【０１６０】
【図２９】図２９は、ＣＤＲ１をコードする非最適化核酸配列(ＴＣＲβ鎖)(配列番号２２)を示す。
【０１６１】
【図３０】図３０は、ＣＤＲ１をコードする最適化核酸配列(ＴＣＲβ鎖)(配列番号２３)を示す。
【０１６２】
【図３１】図３１は、ＣＤＲ２をコードする非最適化核酸配列(ＴＣＲβ鎖)(配列番号２４)を示す。
【０１６３】
【図３２】図３２は、ＣＤＲ２をコードする最適化核酸配列(ＴＣＲβ鎖)(配列番号２５)を示す。
【０１６４】
【図３３】図３３は、配列番号２６の免疫原性ペプチドアミノ酸配列を示す。
【０１６５】
【図３４】図３４は、配列番号２７の免疫原性ペプチドアミノ酸配列を示す。配列番号２７のシステインアミノ酸はシステイニル化されていてもいなくてもよいことは注意すべきである。
【０１６６】
【図３５】図３５は、配列番号２８の免疫原性ペプチドアミノ酸配列を示す。
【０１６７】
【図３６】図３６は、配列番号２９の免疫原性ペプチドアミノ酸配列を示す。
【０１６８】
図３７〜３９は、Ａ＊０３；０１およびＡ＊１１：０１におけるΔＮＰＭ１ペプチドに対するＴ細胞を示す。ΔＮＰＭ１ペプチドＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(ＡＶＥ)、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(ＣＬＡ)およびＣ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(Ｃ＊ＬＡ；第一残基システイニル化)を伴うＰＥ接合ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１四量体の混合物またはＡＶＥＥＶＳＬＲＫを伴う単一ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１四量体を使用して、特異的Ｔ細胞をＨＬＡ−Ａ＊０３：０１および／またはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１陽性健常個体からそれぞれ単離した。Ｃ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫおよび、対照としてＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫを伴うＨＬＡ−Ａ＊０３：０１四量体を、ＵＶ交換(それぞれＵＶ−Ｃ＊ＬＡおよびＵＶ−ＣＬＡ)により産生した。
【０１６９】
【図３７】図３７は、ＰＥ接合ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１  ＵＶ−Ｃ＊ＬＡ(クローン１Ｆ２；左)、Ａ＊０３：０１  ＡＶＥ(クローン３Ｂ３；中央)およびＡ＊１１：０１  ＡＶＥ(クローン６Ｆ１１；右)四量体へのＴ細胞クローン結合を示す。
【０１７０】
【図３８】図３８は、Ｔ細胞クローン３Ｂ３(左)を用量設定濃度のΔＮＰＭ１ペプチドＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(三角)、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(丸)またはＣ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(四角)で外来性にパルスしたＨＬＡ−Ａ＊０３：０１で形質導入したＴ２細胞に対する反応性を試験した。種々のペプチド濃度(nM)でのＧＭ−ＣＳＦの放出(ng／ml)が示される。Ｔ細胞クローン６Ｆ１１(右)を、用量設定濃度のΔＮＰＭ１ペプチドＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(三角)で外来性にパルスしたＨＬＡ−Ａ＊１１：０１で形質導入したＴ２細胞に対する反応性を示した。種々のペプチド濃度(nM)でのＩＦＮ−γの放出(ng／ml)が示される。
【０１７１】
【図３９】図３９は、Ｋ５６２細胞、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１またはＡ＊１１：０１で形質導入したＫ５６２、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１またはＡ＊１１：０１ならびに完全長野生型またはΔＮＰＭ１をコードする遺伝子で形質導入したＫ５６２およびＯＣＩ−ＡＭＬ２およびＡ＊０３：０１またはＡ＊１１：０１で形質導入したそれぞれ野生型およびΔＮＰＭ１を内因性に発現するＯＣＩ−ＡＭＬ３細胞株に対する反応性についてＴ細胞クローン３Ｂ３(左)および６Ｆ１１(右)を試験したものを示す。ＧＭ−ＣＳＦ(クローン３Ｂ３)またはＩＦＮ−γ(クローン６Ｆ１１)の放出がng／mlで示される。
【発明を実施するための形態】
【０１７２】
詳細な記載
変異体ＮＰＭ１(ΔＮＰＭ１)由来のペプチドの免疫原性は以前に試験されており１４、そこで、ΔＮＰＭ１のアミノ酸配列全体のインシリコ・スクリーニングが、どのペプチドがＨＬＡ−Ａ＊０２：０１により提示される可能性があるかを予測するために使用された。ＣＬＡＶＥＥＶＳＬを含むＨＬＡ−Ａ＊０２：０１結合が予測されるペプチドを合成により産生した。健常個体およびΔＮＰＭ１  ＡＭＬ患者から単離されたＣＤ８＋  Ｔ細胞を該ペプチドで刺激し、Ｔ細胞応答を測定した。試験したペプチドの２個のみ(ＡＩＱＤＬＣＬＡＶおよびＡＩＱＤＬＣＶＡＶ)がインビトロで免疫応答を誘発することが判明した。これらのペプチドは、それ故にΔＮＰＭ１の最も顕著なエピトープであると見なされ、故にさらなる試験に使用した。
【０１７３】
本発明者らは、本発明により、ΔＮＰＭ１陽性初代ＡＭＬのＨＬＡクラスＩリガンドームに存在する５つの異なるペプチド(すなわちＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)、ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)およびＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９))を同定した。
【０１７４】
本発明者らはまた、本発明により、ΔＮＰＭ１内の全ての可能なペプチドで、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬペプチドがＨＬＡ−Ａ＊０２：０１癌患者から単離された初代ΔＮＰＭ１  ＡＭＬ細胞の表面に提示され、さらに該ペプチドが単離初代ＡＭＬ細胞表面にシステイニル化形態で見られることも驚くべきことに示した。
【０１７５】
本発明者らはまた、本発明により、ΔＮＰＭ１由来ペプチドＡＶＥＥＶＳＬＲＫおよびＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫが各々ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１およびＨＬＡ−Ａ＊１１：０１により提示され、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫもＨＬＡ−Ａ＊０１：０１により提示されることも驚くべきことに発見した。
【０１７６】
本発明者らは、健常ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性個体のＴ細胞レパートリーからのＣＬＡＶＥＥＶＳＬと反応性であるＴ細胞受容体を単離およびクローン化した。これらのＴ細胞受容体が、末梢血リンパ球の遺伝子操作に使用でき、遺伝的に修飾したリンパ球が、ΔＮＰＭ１を有するＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ＡＭＬを効率的に致死させることを証明した。これらのＴＣＲは、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬを有する患者の処置における有効な免疫療法として有利に使用され得る。
【０１７７】
本発明者らはまた、健常ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１陽性個体のＴ細胞レパートリーからＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(特に、このペプチドのシステイニル化バリアント)と反応性のＴ細胞クローンも単離した。このクローンからのＴＣＲは、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１陽性ΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬを有する患者の処置における有効な免疫療法として有利に使用され得る。
【０１７８】
本発明者らはまた、それぞれ健常ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１およびＨＬＡ−Ａ＊１１：０１陽性個体のＴ細胞レパートリーからＡＶＥＥＶＳＬＲＫと反応性である２つのＴ細胞クローンも単離した。これらのクローンからのＴＣＲは、ΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬを有するＨＬＡ−Ａ＊０３：０１およびＨＬＡ−Ａ＊１１：０１陽性患者の処置における有効な免疫療法として有利に使用され得る。
【０１７９】
ＴＣＲポリペプチド成分をコードする核酸配列
本発明は、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)、ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)およびＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)から選択されるペプチドに特異的に結合するＴ細胞受容体成分をコードする核酸配列を提供する。核酸配列は、Ｔ細胞受容体の大きな構成成分をコードする大きな核酸配列の一部を形成し得る(例えばＴＣＲα鎖可変領域、ＴＣＲβ鎖可変領域、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖など)。核酸配列は、機能的Ｔ細胞受容体をコードする大きな核酸配列の一部も形成し得る(すなわち所望により２つのタンパク質またはポリペプチドの同じベクターによる協調的発現を可能にするリンカー配列により離された、機能的ＴＣＲα鎖および機能的ＴＣＲβ鎖をコードする。これに関するさらなる詳細は下に提供する。
【０１８０】
核酸配列は、Ｔ細胞受容体の小さな成分、例えばＴＣＲα鎖ポリペプチドのＣＤＲ３ドメインまたはＴＣＲβ鎖ポリペプチドのＣＤＲ３ドメインのみをコードし得る。核酸配列は、それ故にペプチド特異性の必須成分を提供する「構成成分」と見なし得る。本発明の核酸配列は、本発明の核酸配列が取り込まれたとき、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)、ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)およびＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)から選択されるペプチドに特異的に結合するＴＣＲα鎖可変領域および／またはＴＣＲβ鎖可変領域をコードする新規核酸配列が産生されるように、ＴＣＲ可変鎖の他の要素をコードする別の核酸配列(例えばベクター)に取り込まれ得る。本発明の核酸配列は、それ故に選択ΔＮＰＭ１ペプチドに対するＴＣＲ特異性の必須成分として有用であり得て、故にΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬを標的とするための必要な抗原結合活性および特異性を備えたＴＣＲ可変領域をコードする核酸配列を産生するために使用され得る。
【０１８１】
Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)は、標的細胞上の主要組織適合抗原(ＭＨＣ)分子に結合する(提示される)ペプチドの認識を担う、Ｔ細胞(Ｔリンパ球)の表面に見られる分子である。本発明は、ＭＨＣの適切な血清型の状況で特定のペプチド、例えばＨＬＡ−Ａ＊０２：０１の影響下でＣＬＡＶＥＥＶＳＬ；または各々ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１およびＨＬＡ−Ａ＊１１：０１の何れかの影響下でＡＶＥＥＶＳＬＲＫまたはＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫの一つまたはＨＬＡ−Ａ＊０１：０１の影響下でＡＶＥＥＶＳＬＲＫと相互作用するＴＣＲをコードする核酸配列に関する。
【０１８２】
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１は、ＨＬＡ−Ａ血清型群内の世界的によくあるヒト白血球抗原血清型である。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に対するＴＣＲにより提示されるペプチドは、「ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１限定的」であるとして記載する。
【０１８３】
ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１およびＨＬＡ−Ａ＊０１：０１も、ＨＬＡ−Ａ血清型群内でよくあるヒト白血球抗原血清型である。ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１に対するＴＣＲにより提示されるペプチドは、「ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１限定的」であるとして記載する。同様に、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１に対するＴＣＲにより提示されるペプチドは、「ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１限定的」であるとして記載する。同様に、ＨＬＡ−Ａ＊０１：０１に対するＴＣＲにより提示されるペプチドは、「ＨＬＡ−Ａ＊０１：０１限定的」であるとして記載する。
【０１８４】
ＴＣＲは、２つの異なるポリペプチド鎖からなる。ヒトにおいて、ＴＣＲの９５％は、アルファ(α)鎖およびベータ(β)鎖からなる(それぞれＴＲＡおよびＴＲＢによりコード)。ＴＣＲがＨＬＡの状況で(例えば、適切にＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１)の影響下でペプチドと結合したとき、Ｔ細胞はシグナル伝達により活性化される。
【０１８５】
ＴＣＲのアルファ鎖およびβ鎖は、配列が高度に可変である。各鎖は、２つの細胞外ドメイン、可変領域(Ｖ)および定常領域(Ｃ)からなる。定常領域はＴ細胞膜に近位であり、続いて膜貫通領域および短細胞質テイルがあり、同時に可変領域は、ペプチド／ＨＬＡ−Ａ複合体に結合する。
【０１８６】
各鎖の可変領域は、３つの超可変領域(相補性決定領域(ＣＤＲ)とも称される)を有する。従って、ＴＣＲアルファ鎖はＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、ＴＣＲβ鎖も(異なる)ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。アルファ鎖およびβ鎖の各々において、ＨＬＡ−Ａにより提示されるペプチドの認識を主に担うのは、ＣＤＲ３である。
【０１８７】
ある態様において、本発明は、(ａ)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)、ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)およびＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)から選択されるペプチドに特異的に結合するＴＣＲα鎖ポリペプチドのＣＤＲ３を含むポリペプチド；および／または(ｂ)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)、ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)およびＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)から選択されるペプチドに特異的に結合するＴＣＲβ鎖ポリペプチドのＣＤＲ３を含むポリペプチドをコードする単離核酸配列を提供する。
【０１８８】
特定の実施態様において、コードされたポリペプチドは、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)に特異的に結合する。ＣＬＡＶＥＥＶＳＬはシステイニル化形態であり得る。コードされたポリペプチドは、システイニル化形態にのみ特異的に結合し得る。
【０１８９】
特定の実施態様において、コードされたポリペプチドは、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)に特異的に結合する。
【０１９０】
特定の実施態様において、コードされたポリペプチドは、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)に特異的に結合する。ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫはシステイニル化形態であり得る。コードされたポリペプチドは、システイニル化形態にのみ特異的に結合し得る。
【０１９１】
核酸配列は(ａ)、(ｂ)または(ａ)および(ｂ)をコードし得る。核酸配列は、それ故に、Ｔ細胞受容体ポリペプチドのＣＤＲ３を含む少なくとも一つのポリペプチドをコードし、ここで、ＣＤＲ３は、次のペプチドＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)、ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)またはＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)の一つに特異的に結合する。
【０１９２】
核酸配列は、アルファ鎖ＣＤＲ３およびβ鎖ＣＤＲ３を含み得て、ここで、アルファ鎖ＣＤＲ３およびβ鎖ＣＤＲ３は、一体となって、選択ペプチドに特異的に結合する。
【０１９３】
核酸配列は、それ故に「ＴＣＲα鎖ポリペプチドのＣＤＲ３」(ここではアルファ鎖ＣＤＲ３またはα鎖ＣＤＲ３とも称する)および／または「ＴＣＲβ鎖ポリペプチドのＣＤＲ３」(ここではβ鎖ＣＤＲ３またはβ鎖ＣＤＲ３とも称する)をコードする。
【０１９４】
アルファ鎖ＣＤＲ３は配列番号２のものまたは下記バリアントの一つであり得る。同様に、β鎖ＣＤＲ３は、配列番号５のものまたは下記バリアントの一つであり得る。これらの特異的ＣＤＲ３は、本発明者らにより、配列番号１のペプチドに特異的に結合することが発見されたことは注意すべきである。
【０１９５】
(ａ)について下記の並べ替えを、(ｂ)について記載する並べ替えと組み合わせ得る(例えば機能的Ｔ細胞受容体をコードする適切な核酸配列を形成するため(すなわち所望により２つのタンパク質またはポリペプチドの同じベクターによる協調的発現を可能にするリンカー配列により分離された、機能的ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコードする))。
【０１９６】
ポリペプチド(ａ)  −  ＴＣＲアルファ鎖の成分
ある実施態様において、(ａ)のＣＤＲ３は、配列番号２のアミノ酸配列を有するかまたはその機能的バリアントであり得る(すなわちここで、バリアントは配列番号１のペプチドに特異的に結合する能力を保持する)。このような機能的バリアントは、配列番号２の天然に存在する、合成または合成により改善された機能的バリアントであり得る。用語「バリアント」はホモログも含む。機能的バリアントは、一般に、配列番号２の１個以上のアミノ酸の保存的置換または該タンパク質の重大でない領域の重大でないアミノ酸の置換、欠失または挿入のみを含む。
【０１９７】
非機能的バリアントは、配列番号１に特異的に結合しない、配列番号２のアミノ酸配列バリアントである。非機能的バリアントは、一般に配列番号２のアミノ酸配列の非保存的置換、欠失または挿入または未熟な切断または重大なアミノ酸または重大な領域における置換、挿入もしくは欠失を含む。機能的および非機能的バリアントを同定する方法は、当業者に周知である。
【０１９８】
ある実施態様において、(ａ)のＣＤＲ３は、配列番号２のペプチドに特異的に結合する能力を維持しながら、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。換言すると、配列番号２の配列に比して１アミノ酸置換を有する機能的ＣＤＲ３も包含される。上記のとおり、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換であり得る。同様に、パーセント同一性は、対照配列(例えば配列番号２)の全長に対する同一性のパーセンテージとして計算され得る。
【０１９９】
(ａ)のＣＤＲ３が配列番号２のアミノ酸配列を有する例において、ＣＤＲ３は、配列番号３または配列番号４の核酸配列またはその遺伝的に変化した配列(すなわち遺伝暗号縮重の結果として同じタンパク質をコードする他の核酸配列)によりコードされ得る。配列番号４は、クローン１Ａ２のＣＤＲ３の核酸配列のコドン最適化バージョンであることは注意すべきである(非最適化配列は配列番号３)。従って、(ａ)のポリペプチドは、配列番号３または配列番号４の核酸配列またはその遺伝的に変化した配列(すなわち遺伝暗号縮重の結果として同じタンパク質をコードする他の核酸配列)によりコードされ得る。
【０２００】
ある実施態様において、(ａ)のポリペプチドは、ＴＣＲα鎖可変領域内に配列番号１のペプチドに特異的に結合するＣＤＲ３(例えば上記で定義した配列番号２のＣＤＲ３またはそのバリアント)を含む。換言すると、(ａ)のポリペプチドは、特定のＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖可変領域を含み得て、ここで、ＴＣＲα鎖可変領域(およびその中のＣＤＲ３)は、配列番号１のペプチドに特異的に結合する。当業者には明確であるとおり、用語「ＴＣＲα鎖可変領域」は、ＴＣＲアルファ鎖の可変(Ｖ)領域(細胞外ドメイン)をいい、故に、３つの超可変領域(ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および特定のＣＤＲ３)ならびに介在配列を含むが、可変鎖の一部を形成しないアルファ鎖の定常(Ｃ)領域は含まない。
【０２０１】
コードされるＴＣＲα鎖可変領域は、特定のＣＤＲ３に加えて、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１またはその機能的バリアント(すなわちここで、該バリアントは、配列番号１のペプチドのＮ末端に特異的に結合する能力を保持する)を含み得る。このような機能的バリアントは、配列番号１４の天然に存在する、合成または合成により改善された機能的バリアントであり得る。用語「バリアント」はホモログも含む。機能的バリアントは、一般に、配列番号１４の１個以上のアミノ酸の保存的置換または該タンパク質の重大でない領域の重大でないアミノ酸の置換、欠失または挿入のみを含む。
【０２０２】
非機能的バリアントは、配列番号１のペプチドのＮ末端に特異的に結合しない配列番号１４のアミノ酸配列バリアントである。非機能的バリアントは、一般に配列番号１４のアミノ酸配列の非保存的置換、欠失または挿入または未熟な切断または重大なアミノ酸または重大な領域における置換、挿入もしくは欠失を含む。機能的および非機能的バリアントを同定する方法は、当業者に周知である。
【０２０３】
ある実施態様において、(ａ)のＣＤＲ１(例えばアルファ鎖可変領域内)は、配列番号１ののペプチドのＮ末端に特異的に結合する能力を維持しながら、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８５％配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。換言すると、配列番号１４の配列に比して１アミノ酸置換を有する機能的ＣＤＲ１も包含される。上記のとおり、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換であり得る。同様に、パーセント同一性は、対照配列(例えば配列番号１４)の全長に対する同一性のパーセンテージとして計算され得る。
【０２０４】
(ａ)のＣＤＲ１(例えばアルファ鎖可変領域内)が配列番号１４のアミノ酸配列を有する例において、ＣＤＲ１は、配列番号１８または配列番号１９の核酸配列またはその遺伝的に変化した配列(すなわち遺伝暗号縮重の結果として同じタンパク質をコードする他の核酸配列)によりコードされ得る。配列番号１９は、クローン１Ａ２のＣＤＲ１の核酸配列のコドン最適化バージョンであることは注意すべきである(非最適化配列は配列番号１８)。従って、(ａ)のポリペプチドは、配列番号１８または配列番号１９の核酸配列またはその遺伝的に変化した配列(すなわち遺伝暗号縮重の結果として同じタンパク質をコードする他の核酸配列)によりコードされ得る。
【０２０５】
コードされるＴＣＲα鎖可変領域は、特定のＣＤＲ３(および所望により上記特定のＣＤＲ１)に加えて、配列番号１５のアミノ酸配列またはその機能的バリアント(すなわちここで、バリアントはＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に特異的に結合する能力を保持する)を有するＣＤＲ２も含み得る。このような機能的バリアントは、配列番号１５の天然に存在する、合成または合成により改善された機能的バリアントであり得る。用語「バリアント」はホモログも含む。機能的バリアントは、一般に、配列番号１５の１個以上のアミノ酸の保存的置換または該タンパク質の重大でない領域の重大でないアミノ酸の置換、欠失または挿入のみを含む。
【０２０６】
非機能的バリアントは、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に特異的に結合しない配列番号１５のアミノ酸配列バリアントである。非機能的バリアントは、一般に配列番号１５のアミノ酸配列の非保存的置換、欠失または挿入または未熟な切断または重大なアミノ酸または重大な領域における置換、挿入もしくは欠失を含む。機能的および非機能的バリアントを同定する方法は、当業者に周知である。
【０２０７】
ある実施態様において、(ａ)のＣＤＲ２(例えばアルファ鎖可変領域内)は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に結合する能力を保持しながら、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８５％配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。換言すると、配列番号１５の配列に比して１アミノ酸置換を有する機能的ＣＤＲ２も包含される。上記のとおり、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換であり得る。同様に、パーセント同一性は、対照配列(例えば配列番号１５)の全長に対する同一性のパーセンテージとして計算され得る。
【０２０８】
(ａ)のＣＤＲ２(例えばアルファ鎖可変領域内)が配列番号１５のアミノ酸配列を有する例において、ＣＤＲ２は、配列番号２０または配列番号２１の核酸配列またはその遺伝的に変化した配列(すなわち遺伝暗号縮重の結果として同じタンパク質をコードする他の核酸配列)によりコードされ得る。配列番号２１は、クローン１Ａ２のＣＤＲ２の核酸配列のコドン最適化バージョンであることは注意すべきである(非最適化配列は配列番号２０)。従って、(ａ)のポリペプチドは、配列番号２０または配列番号２１の核酸配列またはその遺伝的に変化した配列(すなわち遺伝暗号縮重の結果として同じタンパク質をコードする他の核酸配列)によりコードされ得る。
【０２０９】
(ａ)のポリペプチドは、それ故に上に詳述した(配列特異的またはそのバリアントにより)ＣＤＲを、ＣＤＲ間の適切な介在配列と共に含むＴＣＲアルファ鎖可変領域を含み得る。
【０２１０】
(ａ)のＴＣＲアルファ鎖可変領域は、配列番号８のアミノ酸配列またはその機能的バリアント(すなわちここで、バリアントは配列番号１のペプチドに特異的に結合する能力を保持する)を有し得る。このような機能的バリアントは、配列番号８の天然に存在する、合成または合成により改善された機能的バリアントであり得る。用語「バリアント」はホモログも含む。機能的バリアントは、一般に、配列番号８の１個以上のアミノ酸の保存的置換または該タンパク質の重大でない領域の重大でないアミノ酸の置換、欠失または挿入のみを含む。
【０２１１】
非機能的バリアントは、配列番号１に特異的に結合しない、配列番号８のアミノ酸配列バリアントである。非機能的バリアントは、一般に配列番号８のアミノ酸配列の非保存的置換、欠失または挿入または未熟な切断または重大なアミノ酸または重大な領域における置換、挿入もしくは欠失を含む。機能的および非機能的バリアントを同定する方法は、当業者に周知である。
【０２１２】
ある実施態様において、(ａ)のＴＣＲアルファ鎖可変領域は、配列番号１のペプチドに特異的に結合する能力を保持しながら、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％(または少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％)配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。換言すると、配列番号８の配列に比して、１以上のアミノ酸置換を有する機能的ＴＣＲアルファ鎖可変領域も包含される。上記のとおり、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換であり得る。配列番号８に比した配列の可変性は、全て、ＴＣＲアルファ鎖可変領域のＣＤＲを形成しない領域にあり得る(すなわちバリアントは、配列番号２、配列番号１４および／または配列番号１５のＣＤＲを有し、なお配列番号８に比して２５％(またはそれ以下)配列可変性を有し得る)。換言すると、配列番号８のＣＤＲの配列は、上に特定した「少なくとも７５％同一性」パラメータ内で、適宜配列の残りを変えながら、維持される。同様に、パーセント同一性は、対照配列(例えば配列番号８)の全長に対する同一性のパーセンテージとして計算され得る。
【０２１３】
例として、(ａ)のポリペプチドは、ＴＣＲα鎖可変領域内に配列番号８のアミノ酸配列に少なくとも７５％(例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％など)配列同一性を有するＣＤＲ３を含み得て、ここで、ＣＤＲ３は、配列番号２のアミノ酸配列を有する。この例では、ＴＣＲα鎖可変領域ＣＤＲ１は配列番号１４のアミノ酸配列を有し得て、ＴＣＲα鎖可変領域ＣＤＲ２は配列番号１５のアミノ酸配列を有し得る。
【０２１４】
(ａ)のＴＣＲアルファ鎖可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を有する例において、ＴＣＲアルファ鎖可変領域は配列番号９または配列番号１０の核酸配列またはその遺伝的に変化した配列(すなわち遺伝暗号縮重の結果として同じタンパク質をコードする他の核酸配列)によりコードされ得る。配列番号１０は、クローン１Ａ２のＴＣＲアルファ鎖可変領域の核酸配列のコドン最適化バージョンであることは注意すべきである(非最適化配列は配列番号９)。従って、(ａ)のポリペプチドは、配列番号９または配列番号１０の核酸配列またはその遺伝的に変化した配列(すなわち遺伝暗号縮重の結果として同じタンパク質をコードする他の核酸配列)によりコードされ得る。
【０２１５】
疑いを避けるため、(ａ)のポリペプチドは、ＴＣＲα鎖可変領域(上に明記したとおり)およびＴＣＲα鎖定常領域を含み得る。適当な定常領域の例は、ここで使用されるＧｅｎＳｃｒｉｐｔのＭＰ７１−ＴＣＲ−ｆｌｅｘレトロウイルスベクターによりコードされる。しかしながら、本発明はこの特異的定常領域に限定されず、任意の適切なＴＣＲα鎖定常領域を包含する。定常領域はマウス由来、ヒト由来またはヒト化であり得る。適切な定常領域を同定または産生する方法は当業者に周知であり、十分に通常の能力の範囲内である。
【０２１６】
単なる例として、定常領域は、マウスまたはヒト定常領域が予めクローン化された、レンチウイルス、レトロウイルスまたはプラスミドベクターなどのベクターだけでなく、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、カナリアポックスウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによってもコードされ得るまたはそれに由来し得る。近年、ミニサークルもまたＴＣＲ遺伝子移入について報告されている(R Monjezi, C Miskey, T Gogishvili, M Schleef, M Schmeer, H Einsele, Z Ivics and M Hudecek in Leukemia 2016により公開されたミニサークルベクターからの非ウイルスSleeping Beauty転位(transposition))。さらに、ネイキッド(合成)ＤＮＡ／ＲＮＡもＴＣＲ導入に使用し得る。例として、LV コアn et al., BioTechniques 2015に記載の予めクローン化されたＴＣＲ−ＣａおよびＣｂ遺伝子を有するｐＭＳＧＶレトロウイルスベクターも、適切な定常領域の提供のために使用し得る。
【０２１７】
ポリペプチド(ｂ)  −  ＴＣＲβ鎖の成分
ある実施態様において、(ｂ)のＣＤＲ３は、配列番号５のアミノ酸配列を有するかまたはその機能的バリアントであり得る(すなわちここで、バリアントは配列番号１のペプチドに特異的に結合する能力を保持する)。このような機能的バリアントは、配列番号５の天然に存在する、合成または合成により改善された機能的バリアントであり得る。用語「バリアント」はホモログも含む。機能的バリアントは、一般に、配列番号５の１個以上のアミノ酸の保存的置換または該タンパク質の重大でない領域の重大でないアミノ酸の置換、欠失または挿入のみを含む。
【０２１８】
非機能的バリアントは、配列番号１に特異的に結合しない、配列番号５のアミノ酸配列バリアントである。非機能的バリアントは、一般に配列番号５のアミノ酸配列の非保存的置換、欠失または挿入または未熟な切断または重大なアミノ酸または重大な領域における置換、挿入もしくは欠失を含む。機能的および非機能的バリアントを同定する方法は、当業者に周知である。
【０２１９】
ある実施態様において、(ｂ)のＣＤＲ３は、配列番号５のペプチドに特異的に結合する能力を維持しながら、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。換言すると、配列番号５の配列に比して１アミノ酸置換を有する機能的ＣＤＲ３も包含される。上記のとおり、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換であり得る。同様に、パーセント同一性は、対照配列(例えば配列番号５)の全長に対する同一性のパーセンテージとして計算され得る。
【０２２０】
(ｂ)のＣＤＲ３が配列番号５のアミノ酸配列を有する例において、ＣＤＲ３は、配列番号６または配列番号７の核酸配列またはその遺伝的に変化した配列(すなわち遺伝暗号縮重の結果として同じタンパク質をコードする他の核酸配列)によりコードされ得る。配列番号７は、クローン１Ａ２のＣＤＲ３の核酸配列のコドン最適化バージョンであることは注意すべきである(非最適化配列は配列番号６)。従って、(ｂ)のポリペプチドは、配列番号６または配列番号７の核酸配列またはその遺伝的に変化した配列(すなわち遺伝暗号縮重の結果として同じタンパク質をコードする他の核酸配列)によりコードされ得る。
【０２２１】
ある実施態様において、(ｂ)のポリペプチドは、配列番号１のペプチドに特異的に結合するＴＣＲβ鎖可変領域内にＣＤＲ３(例えば上記で定義した配列番号５のＣＤＲ３またはそのバリアント)を含む。換言すると、(ｂ)のポリペプチドは、特定のＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖可変領域を含み、ここで、ＴＣＲβ鎖可変領域(およびその中のＣＤＲ３)は、配列番号１のペプチドに特異的に結合する。当業者には明確であるとおり、用語「ＴＣＲβ鎖可変領域」は、ＴＣＲβ鎖の可変(Ｖ)領域(細胞外ドメイン)をいい、故に、３つの超可変領域(ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および特定のＣＤＲ３)ならびに介在配列を含むが、可変鎖の一部を形成しないβ鎖の定常(Ｃ)領域は含まない。
【０２２２】
コードされるＴＣＲβ鎖可変領域は、特定のＣＤＲ３に加えて、配列番号１６のアミノ酸を有するＣＤＲ１またはその機能的バリアント(すなわちここで、バリアントは配列番号１のペプチドのＣ末端に特異的に結合する能力を保持する)を含み得る。このような機能的バリアントは、配列番号１６の天然に存在する、合成または合成により改善された機能的バリアントであり得る。用語「バリアント」はホモログも含む。機能的バリアントは、一般に、配列番号１６の１個以上のアミノ酸の保存的置換または該タンパク質の重大でない領域の重大でないアミノ酸の置換、欠失または挿入のみを含む。
【０２２３】
非機能的バリアントは、配列番号１のペプチドのＣ末端に特異的に結合しない配列番号１６のアミノ酸配列バリアントである。非機能的バリアントは、一般に配列番号１６のアミノ酸配列の非保存的置換、欠失または挿入または未熟な切断または重大なアミノ酸または重大な領域における置換、挿入もしくは欠失を含む。機能的および非機能的バリアントを同定する方法は、当業者に周知である。
【０２２４】
ある実施態様において、(ｂ)のＣＤＲ１(例えばβ鎖可変領域内)は、配列番号１のペプチドのＣ末端に特異的に結合する能力を維持しながら、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。換言すると、配列番号１６の配列に比して１アミノ酸置換を有する機能的ＣＤＲ１も包含される。上記のとおり、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換であり得る。同様に、パーセント同一性は、対照配列(例えば配列番号１６)の全長に対する同一性のパーセンテージとして計算され得る。
【０２２５】
(ｂ)のＣＤＲ１(例えばβ鎖可変領域内)が配列番号１６のアミノ酸配列を有する例において、ＣＤＲ１は、配列番号２２または配列番号２３の核酸配列またはその遺伝的に変化した配列(すなわち遺伝暗号縮重の結果として同じタンパク質をコードする他の核酸配列)によりコードされ得る。配列番号２３は、クローン１Ａ２のＣＤＲ１の核酸配列のコドン最適化バージョンであることは注意すべきである(非最適化配列は配列番号２２)。従って、(ｂ)のポリペプチドは、配列番号２２または配列番号２３の核酸配列またはその遺伝的に変化した配列(すなわち遺伝暗号縮重の結果として同じタンパク質をコードする他の核酸配列)によりコードされ得る。
【０２２６】
コードされるＴＣＲβ鎖可変領域は、特定のＣＤＲ３(および所望により上記特定のＣＤＲ１)に加えて、配列番号１７のアミノ酸配列またはその機能的バリアント(すなわちここで、バリアントはＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に特異的に結合する能力を保持する)を有するＣＤＲ２も含み得る。このような機能的バリアントは、配列番号１７の天然に存在する、合成または合成により改善された機能的バリアントであり得る。用語「バリアント」はホモログも含む。機能的バリアントは、一般に、配列番号１７の１個以上のアミノ酸の保存的置換または該タンパク質の重大でない領域の重大でないアミノ酸の置換、欠失または挿入のみを含む。
【０２２７】
非機能的バリアントは、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に特異的に結合しない配列番号１７のアミノ酸配列バリアントである。非機能的バリアントは、一般に配列番号１７のアミノ酸配列の非保存的置換、欠失または挿入または未熟な切断または重大なアミノ酸または重大な領域における置換、挿入もしくは欠失を含む。機能的および非機能的バリアントを同定する方法は、当業者に周知である。
【０２２８】
ある実施態様において、(ｂ)のＣＤＲ２(例えばβ鎖可変領域内)は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１に結合する能力を保持しながら、配列番号１７のアミノ酸配列に少なくとも９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。換言すると、配列番号１７の配列に比して１アミノ酸置換を有する機能的ＣＤＲ２も包含される。上記のとおり、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換であり得る。同様に、パーセント同一性は、対照配列(例えば配列番号１７)の全長に対する同一性のパーセンテージとして計算され得る。
【０２２９】
(ｂ)のＣＤＲ２(例えばβ鎖可変領域内)が配列番号１７のアミノ酸配列を有する例において、ＣＤＲ２は、配列番号２４または配列番号２５の核酸配列またはその遺伝的に変化した配列(すなわち遺伝暗号縮重の結果として同じタンパク質をコードする他の核酸配列)によりコードされ得る。配列番号２５は、クローン１Ａ２のＣＤＲ２の核酸配列のコドン最適化バージョンであることは注意すべきである(非最適化配列は配列番号２４)。従って、(ｂ)のポリペプチドは、配列番号２４または配列番号２５の核酸配列またはその遺伝的に変化した配列(すなわち遺伝暗号縮重の結果として同じタンパク質をコードする他の核酸配列)によりコードされ得る。
【０２３０】
(ｂ)のポリペプチドは、それ故に上に詳述した(配列特異的またはそのバリアントにより)ＣＤＲを、ＣＤＲ間に、適切な介在配列と共に含むＴＣＲβ鎖可変領域を含み得る。
【０２３１】
(ｂ)のＴＣＲβ鎖可変領域は、配列番号１１のアミノ酸配列またはその機能的バリアント(すなわちここで、バリアントは配列番号１のペプチドに特異的に結合する能力を保持する)を有し得る。このような機能的バリアントは、配列番号１１の天然に存在する、合成または合成により改善された機能的バリアントであり得る。用語「バリアント」はホモログも含む。機能的バリアントは、一般に、配列番号１１の１個以上のアミノ酸の保存的置換または該タンパク質の重大でない領域の重大でないアミノ酸の置換、欠失または挿入のみを含む。
【０２３２】
非機能的バリアントは、配列番号１に特異的に結合しない、配列番号１１のアミノ酸配列バリアントである。非機能的バリアントは、一般に配列番号１１のアミノ酸配列の非保存的置換、欠失または挿入または未熟な切断または重大なアミノ酸または重大な領域における置換、挿入もしくは欠失を含む。機能的および非機能的バリアントを同定する方法は、当業者に周知である。
【０２３３】
ある実施態様において、(ｂ)のＴＣＲβ鎖可変領域は、配列番号１のペプチドに特異的に結合する能力を保持しながら、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％(または少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％)配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。換言すると、配列番号１１の配列に比して、１以上のアミノ酸置換を有する機能的ＴＣＲβ鎖可変領域も包含される。上記のとおり、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換であり得る。配列番号１１に比した配列の可変性、全て、ＴＣＲβ鎖可変領域のＣＤＲを形成しない領域にあり得る(すなわちバリアントは、配列番号５、配列番号１６および／または配列番号１７のＣＤＲを有し、なお配列番号１１に比して２５％(またはそれ以下)配列可変性を有し得る)。換言すると、配列番号１１のＣＤＲの配列は、上に特定した「少なくとも７５％同一性」パラメータ内で、適宜配列の残りを変えながら、維持される。同様に、パーセント同一性は、対照配列(例えば配列番号１１)の全長に対する同一性のパーセンテージとして計算され得る。
【０２３４】
例として、(ｂ)は、ＴＣＲβ鎖可変領域内に配列番号１１のアミノ酸配列に少なくとも７５％(例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％など)配列同一性を有するＣＤＲ３を含み得て、ここで、ＣＤＲ３は、配列番号５のアミノ酸配列を有する。この例では、ＴＣＲβ鎖可変領域ＣＤＲ１は配列番号１６のアミノ酸配列を有し得て、ＴＣＲβ鎖可変領域ＣＤＲ２は配列番号１７のアミノ酸配列を有し得る。
【０２３５】
(ｂ)のＴＣＲβ鎖可変領域が配列番号１１のアミノ酸配列を有する例において、ＴＣＲβ鎖可変領域は配列番号１２または配列番号１３の核酸配列またはその遺伝的に変化した配列(すなわち遺伝暗号縮重の結果として同じタンパク質をコードする他の核酸配列)によりコードされ得る。配列番号１３は、クローン１Ａ２のＴＣＲβ鎖可変領域の核酸配列のコドン最適化バージョンであることは注意すべきである(非最適化配列は配列番号１２)。従って、(ｂ)のポリペプチドは、配列番号１２または配列番号１３の核酸配列またはその遺伝的に変化した配列(すなわち遺伝暗号縮重の結果として同じタンパク質をコードする他の核酸配列)によりコードされ得る。
【０２３６】
疑いを避けるため、(ｂ)はＴＣＲβ鎖可変領域(上に明記したとおり)およびＴＣＲβ鎖定常領域を含み得る。適当な定常領域の例は。ここで使用されるＧｅｎＳｃｒｉｐｔのＭＰ７１−ＴＣＲ−ｆｌｅｘレトロウイルスベクターによりコードされる。しかしながら、本発明はこの特異的定常領域に限定されず、任意の適切なＴＣＲβ鎖定常領域を包含する。定常領域はマウス由来、ヒト由来またはヒト化であり得る。適切な定常領域を同定または産生する方法は当業者に周知であり、十分に通常の能力の範囲内である。
【０２３７】
単なる例として、定常領域は、マウスまたはヒト定常領域が予めクローン化された、レンチウイルス、レトロウイルスまたはプラスミドベクターなどのベクターだけでなく、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、カナリアポックスウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによってもコードされ得るまたはそれに由来し得る。近年、ミニサークルがＴＣＲ遺伝子移入についてまた記載されている(R Monjezi, C Miskey, T Gogishvili, M Schleef, M Schmeer, H Einsele, Z Ivics and M Hudecek in Leukemia 2016により公開されたミニサークルベクターからの非ウイルスSleeping Beauty転位)。さらに、ネイキッド(合成)ＤＮＡ／ＲＮＡもＴＣＲ導入に使用し得る。例として、本発明者らにより使用される予めクローン化されたＴＣＲ−ＣａおよびＣｂ遺伝子を有するＭＰ７１−ＴＣＲ−ｆｌｅｘレトロウイルスベクターまたはLV コアn et al., BioTechniques 2015に記載の予めクローン化されたＴＣＲ−ＣａおよびＣｂ遺伝子を有するｐＭＳＧＶレトロウイルスベクターも、適切な定常領域の提供のために使用し得る。
【０２３８】
本発明の核酸分子が(ａ)および(ｂ)両者によりコードされる例において、(ａ)のポリペプチドは、リンカー、例えば同じベクターによる２つのタンパク質またはポリペプチドを可能とするリンカーを介して、(ｂ)のポリペプチドに結合され得る。例として、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ(Ｐ２Ａ)配列を含むリンカーが使用でき、例えば、口蹄疫ウイルス(Ｆ２Ａ)、ウマ鼻炎Ａウイルス(Ｅ２Ａ)またはA.L. Szymczak et al., Nature Biotechnology 22, 589 - 594 (2004)により公開されたThosea asignaウイルス(Ｔ２Ａ)または２Ａ様配列からの２Ａ配列である。２Ａおよび２Ａ様配列は、核酸分子が転写および翻訳されたら、切断可能であるリンカーである。リンカーの他の例は、同じ転写物による２つのタンパク質またはポリペプチドの翻訳を可能とする配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)である。あらゆる他の適切なリンカーも使用され得る。適切なリンカーの同定は、十分に当業者の日常的な能力の範囲内である。さらなる例として、(ａ)をコードする核酸配列および(ｂ)をコードする核酸配列を、デュアル内部プロモーターを有するベクターにクローン化し得る(例えばS Jones et al., Human Gene Ther 2009参照)。
【０２３９】
さらなる適切なポリペプチドドメインも本発明の核酸配列によりコードされ得る。単なる例として、核酸配列は、コードしたポリペプチドの修飾細胞の細胞表面膜への輸送のために提供される、膜ターゲティング配列を含み得る。他の適切なさらなるドメインは、周知であり、例えば、ＷＯ２０１６／０７１７５８に記載される。
【０２４０】
ある実施態様において、本発明の核酸配列は可溶性ＴＣＲをコードし得る。例えば、核酸配列は(ａ)および(ｂ)をコードしてよく、ここで、(ａ)および(ｂ)は、それぞれＴＣＲアルファ鎖およびβ鎖の可変領域および所望によりＣＤ３アゴニスト(例えば抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ)などの免疫モジュレーター分子を含む。ＣＤ３抗原は、成熟ヒトＴ細胞、胸腺細胞およびナチュラルキラー細胞のサブセットに呈示される。これはＴＣＲと関連し、ＴＣＲのシグナル伝達に関与する。ヒトＣＤ３抗原に特異的な抗体は、周知である。一つのこのような抗体は、始めてＦＤＡにより承認されたモノクローナル抗体である、マウスモノクローナル抗体ＯＫＴ３である。他のＣＤ３に特異的な抗体も報告されている(例えばＷＯ２００４／１０６３８０；米国特許出願公開２００４／０２０２６５７；米国特許６,７５０,３２５参照)。免疫動員性抗癌ｍＴＣＲ(ＩｍｍＴＡＣ；Immunocore Limited, Milton Partk, Abington, Oxon, United Kingdom)は、親和性モノクローナルＴ細胞受容体(ｍＴＣＲ)ターゲティングと治療的な作用機序(すなわち、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ)を組み合わせた二機能性タンパク質である。他の例において、本発明の可溶性ＴＣＲを、放射性同位体または毒性薬物と組み合わせ得る。適切な放射性同位体および／または毒性薬物は当分野で周知であり、当業者により容易に同定され得る。
【０２４１】
ある実施態様において、本発明の核酸配列は、(ａ)のポリペプチド(例えばＴＣＲアルファ鎖可変領域)が(ｂ)のポリペプチド(例えばＴＣＲβ鎖可変領域)および例えばＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインに融合した定常領域に結合されたキメラ一鎖ＴＣＲをコードし得る。この例では、リンカーは切断不可能である。別の実施態様において、本発明の核酸配列は、(ａ)のポリペプチド(例えばＴＣＲアルファ鎖可変領域)および(ｂ)のポリペプチド(例えばＴＣＲβ鎖可変領域)が各々ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインに結合されたキメラ二鎖ＴＣＲをコードし得る。このような一鎖ＴＣＲおよび二鎖ＴＣＲの製造方法は当分野で周知である；例えばRA Willemsen et al, Gene Therapy 2000参照。
【０２４２】
本発明はまた本発明のペプチドをコードする単離核酸配列(および対応するベクター)も提供する。核酸配列およびベクターに関する全ての一般的記載は、等しく適用される。当業者は、ここに提供するペプチド配列に基づき、適当な核酸配列およびベクターを容易に同定する。
【０２４３】
ベクターおよび修飾細胞
ある態様において、本発明は、ここに記載する核酸配列を含むベクターを提供する。任意の適切なベクターが使用され得る。単なる例として、ベクターはプラスミドまたはレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターであり得る。アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、カナリアポックスウイルス、ヘルペスウイルス、ミニサークルベクターおよびネイキッド(合成)ＤＮＡ／ＲＮＡも使用され得る(ミニサークルベクターの詳細について、例えばR Monjezi, C Miskey, T Gogishvili, M Schleef, M Schmeer, H Einsele, Z Ivics and M Hudecek in Leukemia 2016により公開されたミニサークルベクターからの非ウイルスSleeping Beauty転位参照)。
【０２４４】
所望により、ベクターは、プロモーターに操作可能に結合された核酸配列を含む。
【０２４５】
ここで使用する用語「ベクター」は、操作可能に結合されている他の核酸配列の輸送が可能な核酸配列をいう。ベクターは自律複製可能であるかまたは宿主ＤＮＡに統合され得る。ベクターは、組み換えＤＮＡ挿入のための制限酵素部位を含んでよく、かつ１以上の選択可能マーカーまたは自殺遺伝子を含んでよい。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージまたはコスミドの形の核酸配列であり得る。好ましくは、ベクターは細胞での発現に適する(すなわち、ベクターは「発現ベクター」である)。好ましくは、ベクターは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞またはＣＤ４＋  Ｔ細胞などのヒトＴ細胞での発現に適する。ある態様において、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ベクターなどのウイルスベクターである。所望により、ベクターは、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、カナリアポックスウイルス、ヘルペスウイルス、ミニサークルベクターおよび合成ＤＮＡまたは合成ＲＮＡからなる群から選択される。
【０２４６】
好ましくは、(発現)ベクターは宿主細胞で繁殖可能であり、後代に安定して伝達される。
【０２４７】
ここで使用する「操作可能に結合」は、下記調節エレメントの一つまたは組み合わせと一体となった互いに機能的関係にある、例えば、翻訳領域配列の発現を指示するように連結された関係の、翻訳領域配列をいう。
【０２４８】
ベクターは制御配列を含み得る。ここで使用する「制御配列」は、遺伝子発現を制御できるＤＮＡまたはＲＮＡ要素をいう。発現調節配列の例は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、ＴＡＴＡ−ボックス、配列内リボソーム進入部位(ＩＲＥＳ)、転写因子の付着部位、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位などを含む。所望により、ベクターは、発現される核酸配列に操作可能に結合した１以上の制御配列を含む。制御配列は、構成的発現を指示するものならびに組織特異的制御および／または誘導性配列を含む。
【０２４９】
ベクターはプロモーターを含み得る。ここで使用する「プロモーター」は、ＤＮＡにおける、ＲＮＡポリメラーゼが結合して、転写を開始するヌクレオチド配列をいう。プロモーターは、誘導性でも構成的に発現されるものでもよい。あるいは、プロモーターはリプレッサーまたは刺激タンパク質の制御下にある。プロモーターは、宿主細胞で天然にみられるものではない(例えば外来性プロモーターであり得る)。当業者は、標的タンパク質の発現に使用するための適切なプロモーターを認識し、ここで、選択プロモーターは宿主細胞による。
【０２５０】
ベクターは転写ターミネーターを含み得る。ここで使用する「転写ターミネーター」は、ＤＮＡのＲＮＡへの翻訳を担うＲＮＡポリメラーゼの機能を停止させる、ＤＮＡ要素をいう。好ましい転写ターミネーターは、ＧＣリッチ二分対称領域が前にあるＴ残基の連続により特徴づけられる。
【０２５１】
ベクターは、翻訳調節要素を含み得る。ここで使用する「翻訳調節要素」は、ｍＲＮＡの翻訳を制御するＤＮＡまたはＲＮＡ要素をいう。好ましい翻訳調節エレメントは、リボソーム結合部位である。好ましくは、翻訳調節要素は、プロモーターと相同の系、例えばプロモーターおよびその付随リボソーム結合部位由来である。好ましいリボソーム結合部位は知られ、選択宿主細胞による。
【０２５２】
ベクターは、制限酵素認識部位を含み得る。ここで使用する「制限酵素認識部位」は、制限酵素により認識されるＤＮＡのモチーフをいう。
【０２５３】
ベクターは選択可能マーカーを含み得る。ここで使用する「選択可能マーカー」は、宿主細胞で発現したとき、該選択可能マーカー遺伝子を発現する細胞の選択を可能とする表現型を細胞に与える、タンパク質をいう。一般にこれは、宿主細胞に新規な有利な性質(例えば抗生物質耐性)を与えるタンパク質または細胞表面に発現され、故に抗体結合に利用可能であるタンパク質であり得る。適切な選択可能マーカーは当分野で周知である。
【０２５４】
所望により、ベクターは自殺遺伝子も含み得る。ここで使用する「自殺遺伝子」は、特定の薬物での処理により修飾細胞の死を誘発するタンパク質をいう。例として、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子により修飾された細胞でガンシクロビルを含むヌクレオシドアナログでの処理により、ヒトＣＤ２０により修飾された細胞で抗ＣＤ２０モノクローナル抗体での処理によりおよび誘導性カスパーゼ９(ｉＣａｓｐ９)により修飾された細胞でＡＰ１９０３での処理により、自殺は誘発され得る(BS Jones, LS Lamb, F Goldman, A Di Stasi; Improving the safety of cell therapy products by suicide gene transfer. Front Pharmacol. (2014) 5:254によりレビュー)。適切な自殺遺伝子は当分野で周知である。
【０２５５】
好ましくは、ベクターはここに記載するポリペプチドの宿主細胞による発現に必要な遺伝要素を含む。宿主細胞での転写および翻訳に必要な要素は、プロモーター、目的のタンパク質の翻訳領域および転写ターミネーターを含む。
【０２５６】
当業者は、(発現)ベクターの調製に利用可能な分子技術およびどのように(発現)ベクターが適切な宿主細胞に形質導入またはトランスフェクトされ得るか(それにより本発明の修飾細胞を産生するか)を十分に認識する。本発明の(発現)ベクターは、形質転換、トランスフェクションまたは形質導入などの慣用技術により細胞に導入され得る。「形質転換」、「トランスフェクション」および「形質導入」は、一般に異質(外来性)核酸配列を宿主細胞に導入する方法をいい、それ故にエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、遺伝子銃送達、レトロウイルス、レンチウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクターでの形質導入、リポフェクション、スーパーフェクションなどの方法を包含する。使用される具体的な方法は、一般にベクターおよび細胞両者のタイプによる。核酸配列およびベクターをヒト細胞などの宿主細胞に導入するための適切な方法は、当分野で周知である；例えばSambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y; Ausubel et al (1987) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY; Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110; Luchansky et al (1988) Mol. Microbiol. 2, 637-646参照。発現ベクターの調製およびその適切な宿主細胞への導入に適するさらなる慣用の方法は、例えばＷＯ２０１６／０７１７５８に詳述されている。
【０２５７】
ある実施態様において、宿主細胞をベクター(例えばウイルスベクター)とインビトロ、エクスビボで接触させ、ある実施態様において、宿主細胞をベクター(例えばウイルスベクター)とインビボで接触させることは理解される。
【０２５８】
用語「宿主細胞」は、本発明の核酸配列またはベクターが導入(例えば形質導入)され得るあらゆる細胞をいう。核酸分子またはベクターが細胞に導入されたら、ここでは「修飾細胞」と称され得る。核酸分子またはベクターが宿主細胞に導入されたら、得られた修飾細胞はコードしたポリペプチドを発現させることが(および例えばコードしたポリペプチドをその意図する機能のために正確に局在化させる、例えばコードされるＴＣＲを細胞表面に輸送することが)できなければならない。
【０２５９】
用語「修飾細胞」は、遺伝的に改変された(例えば形質転換またはトランスフェクト)細胞をいう。本用語は、特定の対象細胞およびまたそのような細胞の子孫または潜在的子孫もいう。ある修飾が変異または環境的影響により後代で生じ得るため、このような子孫は、実際、親細胞と同一ではないことがあり得るが、なお、ここで使用する本用語の範囲内に入る。
【０２６０】
宿主細胞(およびその修飾細胞)は、一般に真核生物細胞および特にヒト細胞(例えばＣＤ８＋  Ｔ細胞またはＣＤ４＋  Ｔ細胞またはそれらの混合物などのＴ細胞)である。宿主細胞(およびその修飾細胞)は、それが後に投与されるのと同じ個体由来の細胞を意味する自己細胞(例えばＣＤ８＋  Ｔ細胞またはＣＤ４＋  Ｔ細胞またはそれらの混合物などの自己Ｔ細胞)であり得る。換言すると、宿主細胞(およびその修飾細胞)は、処置される対象からの単離Ｔ細胞であり得る。好適には、宿主細胞(およびその修飾細胞)は、血液サンプルから、例えば白血球分離により単離され得る。
【０２６１】
宿主細胞(およびその修飾細胞)は、ＴＣＲ遺伝子移入後抗腫瘍免疫を付与できるあらゆる細胞であり得る。適切な細胞の非限定的例は、自己または同種ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、ＮＫＴ細胞、ガンマ−デルタＴ細胞、造血幹細胞または他の前駆細胞細胞およびＴＣＲ遺伝子移入後抗腫瘍免疫を付与できる任意の他の自己または同種細胞もしくは細胞株(例えばＮＫ−９２またはＴ細胞株)を含む。
【０２６２】
有利には、修飾細胞は、該修飾細胞がΔＮＰＭ１悪性細胞を特異的に標的とし、故にΔＮＰＭ１を有する造血器腫瘍の処置または予防に使用され得る免疫療法を提供するように、本発明の核酸配列またはベクター(例えばＴＣＲまたはＴＣＲ成分部分)によりコードされるポリペプチドを発現できる。この使用についてのさらなる詳細を以下に説明する。
【０２６３】
免疫原性ペプチド
本発明者らは、ΔＮＰＭ１陽性初代ＡＭＬ患者のＨＬＡクラスＩリガンドームに存在する５つのペプチド、すなわちＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)、ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)およびＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)を同定した。
【０２６４】
念のため、特に断らない限り、ここでの「配列番号１」への一般的な言及は、システイニル化および非システイニル化両者の形態のペプチドＣＬＡＶＥＥＶＳＬを包含する。
【０２６５】
単離ペプチドとして、本発明は、特にアミノ酸配列ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)を含む単離ペプチドを提供し、ここで、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)におけるアミノ酸システインはシステイニル化されている場合を含む。
【０２６６】
特定の実施態様において、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬにおけるアミノ酸システインはシステイニル化されている。
【０２６７】
念のため、特に断らない限り、ここでの「配列番号２７」への一般的な言及は、システイニル化および非システイニル化両者の形態のペプチドＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫを包含する。
【０２６８】
単離ペプチドとして、本発明は、特にアミノ酸配列ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)を含む単離ペプチドを提供し、ここで、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)におけるアミノ酸システインはシステイニル化されている場合を含む。
【０２６９】
特定の実施態様において、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫにおけるアミノ酸システインはシステイニル化されている。
【０２７０】
本発明は、それ故に(ｉ)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)(ここで、アミノ酸システインはシステイニル化されていてもされていなくてもよい)；(ii)ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)；(iii)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)(ここで、アミノ酸システインはシステイニル化されていてもされていなくてもよい)；(iv)ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)；および(ｖ)ＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)から選択されるアミノ酸配列を含む、単離ペプチドを提供する。
【０２７１】
特定の実施態様において、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬまたはＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫにおけるアミノ酸システインはシステイニル化されている。
【０２７２】
ここで使用する「単離ペプチド」は、その天然環境にないペプチドをいう。ペプチドは、それ故に合成起源であり得る(あるいは、本来天然であるが、その天然環境から単離されている)。
【０２７３】
単離ペプチドは、比較的短くてよい(すなわち２０以下のアミノ酸；例えば１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１または１０アミノ酸を超えない)。ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列(ここで、アミノ酸システインはシステイニル化されていてもされていなくてもよい)、配列番号２６、配列番号２７(ここで、アミノ酸システインはシステイニル化されていてもされていなくてもよい)、配列番号２８または配列番号２９のみからなり得る。
【０２７４】
特定の実施態様において、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬまたはＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫにおけるアミノ酸システインはシステイニル化されている。
【０２７５】
単離ペプチドを、ヒト対象にΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を処置または予防するために投与し得る。例えば、単離ペプチドを、対象にその免疫応答を誘発または増強するために投与し得る。該ペプチドは、それ故に対象に、対象におけるＴ細胞活性化(例えばインビボＴ細胞活性化)の誘発のために投与でき、ここで、活性化Ｔ細胞は、該ペプチドに特異的である(故にΔＮＰＭ１陽性悪性細胞を特異的に標的とする)。
【０２７６】
単離ペプチドを、ΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬの処置または予防のためのペプチドワクチンとして投与し得る。単離ペプチドを、ΔＮＰＭ１陽性悪性細胞に特異的なＴ細胞の活性化の誘発または増強のために投与し得る。
【０２７７】
本発明者らは、(ｉ)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)、(ii)ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)；および(iii)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)が、Ｔ細胞に結合するΔＮＰＭ１ペプチドであることを示している。これらのペプチドは、インビボでΔＮＰＭ１陽性対象のＴ細胞レパートリーに提示される。これらのペプチドのＴ細胞への結合が、ここで示されている。これらのペプチドは、それ故に、他の治療(例えばここに記載するＡＣＴ)の補助剤として特に有用であり得る、個別化ワクチンの開発のためにさらに探索され得る、真実の免疫原性ΔＮＰＭ１特異的抗原を表す。これらの免疫原性ペプチドは、それ故にペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、樹状細胞ベースの治療および養子ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞ベースの治療の形態で免疫療法として使用され得る(適当な総括について、引用文献２３参照)。
【０２７８】
本発明者らはまたiv)ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)および(ｖ)ＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)が初代ＡＭＬの表面に提示されるＨＬＡ結合ペプチドであることも示している。
【０２７９】
(ｉ)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)(ここで、アミノ酸システインはシステイニル化されていてもされていなくてもよい)；(ii)ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)；(iii)ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)(ここで、アミノ酸システインはシステイニル化されていてもされていなくてもよい)；(iv)ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)；および(ｖ)ＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)から選択されるアミノ酸配列を含む単離ペプチドは、それ故に免疫療法として有用であり得る。例えば、このような単離ペプチドを、ΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬを有する、発症するリスクのあるまたは有することが疑われる対象の免疫療法として使用し得る。これらのペプチドをコードする核酸配列およびベクターもこの目的で有用であり得る。
【０２８０】
投与のための特定のペプチドは、対象のＨＬＡ−Ａ状態に基づき選択され得る。本明細書の他の箇所に説明するとおり、配列番号１の配列を含むペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１が陽性である対象への投与に特に適当である可能性があり、一方配列番号２６または配列番号２７の配列を含むペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１が陽性である対象への投与に特に適当である可能性がある。
【０２８１】
本発明の単離ペプチドはまた、１個を超える上記ペプチドを含む、組成物でも提供され得る。例として、単離ペプチドは、(ａ)アミノ酸配列ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)(ここで、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)におけるアミノ酸システインはシステイニル化されている)を含む単離ペプチド；および(ｂ)アミノ酸配列ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)(ここで、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)におけるアミノ酸システインはシステイニル化されていない)を含む単離ペプチドの混合物を含む組成物として提供(および／または投与)され得る。この組成物は、Ｔ細胞活性化(例えば対象におけるインビボＴ細胞活性化)の誘発に使用でき、ここで、活性化Ｔ細胞が配列番号１のペプチドのシステイニル化および／または非システイニル化形態の一方(または両方)に特異的であるＴＣＲを有するために、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１が陽性である対象のΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍の処置または予防に特に有用であり得る。
【０２８２】
別の例として、(ａ)配列番号２６のアミノ酸配列を含む単離ペプチドおよび(ｂ)配列番号２７のアミノ酸配列を含む単離ペプチドの混合物を含むペプチド組成物が提供され得る。この組成物はＨＬＡ−Ａ＊０３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１が陽性である対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍の処置または予防に、これらのペプチドの両者がこれらのＨＬＡ−Ａ血清型の何れかにより提示されるため、特に有用であり得る。
【０２８３】
ペプチドＣＬＡＶＥＥＶＳＬと同様、配列番号２７のペプチドはまた、そのシステイニル化および非システイニル化形態でワクチン接種に使用され得る。それ故に、別の例として、単離ペプチドは、(ａ)配列番号２７のアミノ酸配列(アミノ酸システインがシステイニル化されている)を含む単離ペプチド；および(ｂ)配列番号２７のアミノ酸配列(ここで、アミノ酸システインがシステイニル化されていない)を含む単離ペプチドの混合物を含む組成物として提供(および／または投与)され得る。この組成物は、Ｔ細胞活性化(例えば対象におけるインビボＴ細胞活性化)の誘発に使用でき、ここで、活性化Ｔ細胞が配列番号２７のペプチドのシステイニル化および／または非システイニル化形態の一方(または両方)に特異的であるＴＣＲを有するために、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１が陽性である対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍の処置または予防に特に有用であり得る。
【０２８４】
医薬組成物
ここに記載する核酸配列、ベクター、修飾細胞、単離タンパク質またはペプチドは、医薬組成物の一部として提供され得る。有利には、このような組成物は、ΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を有するヒト対象に、ΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍の処置または予防のために(例えばΔＮＰＭ１標的特異的免疫応答の誘発または増強により)、投与され得る。特に適当な組成物は、本明細書の他の箇所に詳述したとおり、ヒト対象のＨＬＡ−Ａ血清型に基づき選択し得る。
【０２８５】
医薬組成物は、ここに記載する核酸配列、ベクター、修飾細胞または単離タンパク質またはペプチドを、薬学的に許容される添加物、アジュバント、希釈剤および／または担体と共に含み得る。
【０２８６】
組成物は、常に薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、防腐剤、適合性担体、アジュバントおよびサイトカインなどの補足的免疫増強剤および所望により他の治療剤または化合物を含み得る。
【０２８７】
ここで使用する「薬学的に許容される」は、生物学的にまたは他の点で望ましくないものではない物質、すなわち、個体に選択した核酸配列、ベクター、修飾細胞または単離ペプチドと共に何ら望ましくない生物学的効果を起こすことなくまたはそれが含まれる医薬組成物の他の成分の何れかと有害な方法で相互作用することなく、投与され得る物質である。
【０２８８】
添加物は、製剤の増量または最終剤形における活性成分の治療効果増強、例えば、薬物吸収または溶解度促進の目的で含まれる、活性成分(例えばここに提供する核酸配列、ベクター、修飾細胞または単離ペプチド)と共に製剤される天然または合成物質である。添加物はまた粉末流動性または非粘着性質の促進などにより関係する活性物質の取り扱いを助けるために、それに加えて、期待される貯蔵期間中の変性を阻止するなどのインビトロ安定性の補助のために、製造過程において有用であり得る。薬学的に許容される添加物は当分野で周知である。適当な添加物は、それ故に当業者に容易に特定され得る。例として、適当な薬学的に許容される添加物は、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどを含む。
【０２８９】
アジュバントは、製剤中の他の薬剤の効果を修飾する薬理学的および／または免疫学的薬剤である。薬学的に許容されるアジュバントは当分野で周知である。適当なアジュバントは、それ故に、当業者に容易に特定され得る。
【０２９０】
希釈剤は、希釈する薬剤である。薬学的に許容される希釈剤は当分野で周知である。適当な希釈剤は、それ故に、当業者に容易に特定され得る。
【０２９１】
担体は、用いる投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、かつ製剤中の他の成分と適合性である。用語「担体」は、活性成分が投与を容易にするために組み合わせられる、天然または合成の、有機または無機成分をいう。薬学的に許容される担体は当分野で周知である。適当な担体は、それ故に、当業者に容易に特定され得る。
【０２９２】
対象の処置
本発明の組成物は、有利にヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍の処置または予防に使用され得る。適切な組成物は、本明細書の他の箇所に詳述したとおり、ヒト対象のＨＬＡ−Ａ血清型に基づき選択され得る。
【０２９３】
ある実施態様において、ここに記載するΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を処置または予防する方法は、対象における免疫応答(例えば細胞介在応答)の誘発または増強をもたらす(例えばＨＬＡ−Ａ限定的ペプチドを提示する悪性細胞への標的免疫応答)。
【０２９４】
用語「免疫応答の誘発または増強」は、処置前の免疫応答と比較して、処置中または処置後の対象の免疫応答(例えばＴ細胞介在免疫応答などの細胞介在免疫応答)の増加をいう。「誘発または増強された」免疫応答は、それ故に処置するΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍を直接的または間接的に標的とする免疫応答の、あらゆる測定可能な増加を包含する。
【０２９５】
本発明の組成物は、ヒト対象におけるΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍、特にΔＮＰＭ１陽性骨髄腫瘍、より特にはΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬの処置または予防に使用され得る。
【０２９６】
ΔＮＰＭ１陽性である可能性があり、故に本発明により処置され得る造血器腫瘍を当業者は十分に認識する。同様に、当業者は、ΔＮＰＭ１陽性である可能性があり、故に本発明により処置され得る骨髄性腫瘍を十分に認識する。
【０２９７】
ここで使用する用語「処置」および「処置する」は、状態、障害または症状(すなわちこの場合造血器腫瘍)の病理の進展の予防または改変を意図して実施される介入を含むと解釈される。従って、「処置」は、治療的処置および、目的が標的状態、障害または症状の予防または減速(低減)である予防的もしくは防止的手段の両者をいう。それ故に、「処置」は、例えば、対象から得たサンプルで測定して、処置前の悪性細胞の量または濃度と比較して、悪性細胞の量または濃度の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％の減少、減速または阻害をいう。悪性細胞の量または濃度を測定する方法は、例えば、対象から得たサンプルのＣＬＡＶＥＥＶＳＬ、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ、ＶＥＥＶＳＬＲＫおよび／またはＡＶＥＥＶＳＬＲなどのΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍特異的バイオマーカーのｑＲＴ−ＰＣＲおよび定量化を含む。
【０２９８】
ここで使用する用語「対象」は、記載した状態、障害または症状を有するまたは有するリスクにある個体、例えば、ヒトをいう。対象は患者、すなわち本発明による処置を必要とする対象であってよい。対象は、該状態、障害または症状について処置を受けていてよい。あるいは、対象は、本発明による処置の前に処置されていない。
【０２９９】
ここに記載する組成物は、注射または長時間のゆっくりした点滴を含む、任意の慣用の経路により対象に投与し得る。投与は、例えば、点滴または筋肉内、血管内、腔内、脳内、病巣内、直腸、皮下、皮内、硬膜外、髄腔内、経皮投与により得る。
【０３００】
ここに記載する組成物は、上記投与方式に適する任意の形態であり得る。例えば、修飾細胞を含む組成物は、点滴に適する任意の形態であり得る。さらなる例として、非経腸注射(皮下、筋肉内、血管内または点滴を含む)に適する形態は、無菌溶液、懸濁液またはエマルジョンを含む；局所投与に適する形態は、軟膏またはクリームを含む；そして直腸投与に適する形態は坐薬を含む。あるいは、投与経路は、標的領域への直接注射または領域性送達もしくは局所送達により得る。本発明の組成物の適当な投与量の特定は、十分に当業者の日常的な能力の範囲内である。
【０３０１】
有利には、本発明の組成物は、患者に既に存在する免疫レパートリーに関わらず、迅速で、信頼でき、かつΔＮＰＭ１特異的ペプチド(例えばＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)、ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)またはＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９))に特異性を有する大量のＴ細胞を産生できるアプローチである、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)遺伝子移入の使用のために製剤され得る。ＴＣＲ遺伝子移入の使用により、点滴に適する修飾自己細胞は数日以内に産生され得る。
【０３０２】
有利には、本発明の組成物は、ワクチンとして使用するために製剤され得る(例えばＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)、ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)またはＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)から選択される１以上のペプチドを含む組成物は、ペプチドワクチンとしての使用に適する医薬組成物として製剤され得る)。適当なペプチドワクチン製剤は当分野で周知である。
【０３０３】
好ましくは、本発明の医薬組成物は、ワクチン、好ましくはペプチドベースのワクチンである。このようなペプチドベースのワクチンは、ＡＭＬなどのΔＮＰＭ１陽性造血器腫瘍の予防または処置のために使用され得る。
【０３０４】
医薬組成物は、好ましくは、対象、好ましくはヒトまたは動物対象への投与のためであり、それ故にそれに適するように製剤される。好ましくは、投与は、非経腸、例えば静脈内、皮下、筋肉内、真皮内、皮内および／または腫瘍内投与、すなわち注射である。
【０３０５】
好ましくは、医薬組成物は、医薬投与量単位を構成するペプチドの量を含むまたはそれからなる。医薬投与量単位は、ここでは、ある時点で対象に適用される活性成分(すなわちペプチドベースのワクチン中のペプチドの総量)の量をいう。医薬投与量単位は、対象に一体積で、すなわちシングルショットで適用してよく、または好ましくは体の別の位置に、例えば右および左肢に、適用される２、３、４、５またはそれ以上の別々の体積またはショットで適用してよい。医薬投与量の別々の体積の組成は異なってよく、すなわち活性成分および／またはアジュバントの異なる種または組成を含み得ることは理解される。
【０３０６】
総医薬投与量または実質的に同時に適用する複数ショットの場合その一部を含む一注射体積またはショット(すなわちある時点で一か所に適用される体積)は、１００μl〜２mLまたは１００μl〜１mLであり得る。一注射体積は１００μl、２００μl、３００μl、４００μl、５００μl、６００μl、７００μl、８００μl、９００μl、１mL、１.１mL、１.２mL、１.３mL、１.４mL、１.５mL、１.６mL、１.７mL、１.８mL、１.９mL、２mL、３mLまたはその間の任意の数値であり得る。
【０３０７】
好ましくは、ある時点で対象に適用するペプチドの医薬投与量単位または総量は、ある時点で単回または複数回注射のいずれであれ、０.１μg〜２０mgの範囲、例えば約０.１μg、０.５μg、１μg、５μg、１０μg、１５μg、２０μg、３０μg、４０μg、５０μg、６０μg、７０μg、８０μg、９０μg、１００μg、１５０μg、２００μg、２５０μg、３００μg、３５０μg、４００μg、４５０μg、５００μg、６５０μg、７００μg、７５０μg、８００μg、８５０μg、９００μg、１mg、１.５mg、２mg、２.５mg、３mg、３.５mg、４mg、４.５mg、５mg、５.５mg、６mg、６.５mg、７mg、７.５mg、８mg、８.５mg、９mg、９.５mg、１０mg、１５mgまたは約２０mgまたはその間の任意の数値の量のペプチドを含む。医薬投与量単位の好ましい範囲は、０.１μg〜２０mg、１μg〜１０mg、１０μg〜５mg、０.５mg〜２mg、０.５mg〜１０mgまたはｌmg〜５mgまたは２〜４mgである。
【０３０８】
ここに記載する組成物は、有効量で投与されるためのものである。「有効量」は、単独でまたはさらなる用量と共に、所望の(治療的または非治療的)応答を生じる量である。使用すべき有効量は、例えば、治療的(または非治療的)目的、投与経路および患者／対象の状態による。例えば、ある患者／対象のための本発明の組成物の適当な投与量は、本発明の組成物の作用を修飾することが知られる種々の因子、例えば重症度および造血器腫瘍のタイプ、体重、性別、食習慣、投与時間および経路、他の薬物治療および他の関係する臨床的因子を考慮して、担当医(または組成物を投与する者)により決定され得る。投与量およびスケジュールは、特定の状態、障害または症状、患者／対象の全体的状態により変わり得る。有効な投与量は、インビトロまたはインビボ方法により決定され得る。
【０３０９】
本発明の組成物は、有利に単位剤形で提供される。
【０３１０】
ＴＣＲを産生する方法
ある態様において、本発明は、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(配列番号１)、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２６)、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２７)、ＶＥＥＶＳＬＲＫ(配列番号２８)およびＡＶＥＥＶＳＬＲ(配列番号２９)から選択されるペプチドに特異的に結合するＴ細胞受容体を産生する方法であって、本発明の核酸配列(またはベクター)と宿主細胞を、該核酸配列(またはベクター)が細胞に取り込まれ、発現され、Ｔ細胞受容体を産生する条件下で接触させることを含む、方法を提供する。
【０３１１】
方法は、宿主細胞上で、エクスビボまたはインビトロで実施され得る。あるいは、方法はインビボで実施でき、ここで、核酸配列(またはベクター)は対象に投与され、宿主細胞と、インビボで、該核酸配列が宿主細胞に取り込まれ、発現され、Ｔ細胞受容体を産生する条件下で接触させる。ある実施態様において、方法はヒトまたは動物身体の処置方法ではない。
【０３１２】
適切なインビボ、核酸配列(またはベクター)と宿主細胞を、核酸配列(またはベクター)が細胞に取り込まれ、発現される条件下で接触させるインビトロおよびエクスビ方法は、本明細書の他の箇所に記載されるとおり、周知である。
【０３１３】
一般的定義
ここで使用する「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」は、オリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列をいうために相互交換可能に使用される。ヌクレオチド配列はゲノム、合成または組み換え起源であってよく、二本鎖または一本鎖(センスまたはアンチセンス鎖を表す)であってよい。用語「ヌクレオチド配列」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびＲＮＡ(例えばｍＲＮＡ)およびヌクレオチドアナログの使用により産生されたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含む。
【０３１４】
ここで使用する「単離核酸配列」は、その天然環境にもあるその天然に結合する配列と結合されているとき、その天然環境にはない核酸配列をいう。換言すると、単離核酸配列は、天然ヌクレオチド配列ではなく、ここで、「天然ヌクレオチド配列」は、その天然環境にあり、天然に結合しているプロモーター全体と操作可能に結合しているとき、そのプロモーターもまたその天然環境にある、ヌクレオチド配列全体をいう。
【０３１５】
ここで使用する「ＣＬＡＶＥＥＶＳＬに特異的に結合する」は、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬペプチドへの選択的結合をいう。ある条件下、例えば、ここに記載するイムノアッセイで、「ＣＬＡＶＥＥＶＳＬに特異的に結合する」ポリペプチドは、このペプチドに選択的に結合し、他のペプチドに相当量で結合しない。それ故に、ポリペプチドは、対照抗原性ペプチドに結合するより、少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍または１００倍多い親和性で、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬに結合し得る。選択的結合はまた、本発明の核酸またはベクターを発現する修飾細胞の状況で、間接的にも決定され得る。例えば、ここに記載するようなアッセイにおいて、修飾細胞は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１の影響下でＣＬＡＶＥＥＶＳＬを提示する細胞に対して特異的に反応性である(例えば初代ΔＮＰＭ１  ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ＡＭＬ細胞またはΔＮＰＭ１遺伝子が導入されている何らかのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性細胞株)。それ故に、修飾細胞は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１の影響下でＣＬＡＶＥＥＶＳＬを提示しない対照細胞株に対するその反応性と比較したとき、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１の状況でＣＬＡＶＥＥＶＳＬを提示する細胞に少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍または１００倍多く結合し得る。
【０３１６】
選択的結合は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１によるＣＬＡＶＥＥＶＳＬの状況においてであり得る。換言すると、ある実施態様において、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬに特異的に結合するポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１により提示されるとき(すなわち結合されるとき)またはＨＬＡ−Ａ＊０２：０１により提示されるときと等価な構造的形状であるときのみそうなり得る。
【０３１７】
矛盾する記載がない限り、「ＣＬＡＶＥＥＶＳＬに特異的に結合する」ポリペプチドは、(ｉ)システイニル化形態のＣＬＡＶＥＥＶＳＬ、(ii)非システイニル化形態のＣＬＡＶＥＥＶＳＬまたは(iii)システイニル化形態のＣＬＡＶＥＥＶＳＬおよび非システイニル化形態のＣＬＡＶＥＥＶＳＬの両者に結合し得る。同様に、特に断らない限り、「配列番号１」または「ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ」への一般的記載は、システイニル化および非システイニル化形態のペプチドＣＬＡＶＥＥＶＳＬの両者を包含する。
【０３１８】
ここで使用する「ＡＶＥＥＶＳＬＲＫに特異的に結合する」は、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫペプチドへの選択的結合をいう。ある条件下、例えば、ここに記載するイムノアッセイで、「ＡＶＥＥＶＳＬＲＫに特異的に結合する」ポリペプチドは、このペプチドに選択的に結合し、他のペプチドに相当量で結合しない。それ故に、ポリペプチドは、対照抗原性ペプチドに結合するより、少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍または１００倍多い親和性で、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫに結合し得る。選択的結合はまた、本発明の核酸またはベクターを発現する修飾細胞の影響下で、間接的にも決定され得る。例えば、ここに記載するようなアッセイにおいて、修飾細胞は、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１またはＨＬＡ−Ａ＊０１：０１の影響下でＡＶＥＥＶＳＬＲＫを提示する細胞に対して特異的に反応性である(例えば初代ΔＮＰＭ１  ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１またはＨＬＡ−Ａ＊０１：０１陽性ＡＭＬ細胞またはΔＮＰＭ１遺伝子が導入されている何らかのＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１またはＨＬＡ−Ａ＊０１：０１陽性細胞株)。それ故に、修飾細胞は、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１またはＨＬＡ−Ａ＊０１：０１の状況でＡＶＥＥＶＳＬＲＫを提示しない対照細胞株に対するその反応性と比較したとき、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１またはＨＬＡ−Ａ＊０１：０１の影響下でＡＶＥＥＶＳＬＲＫを提示する細胞に少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍または１００倍多く結合し得る。
【０３１９】
選択的結合は、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１またはＨＬＡ−Ａ＊０１：０１のみによるＡＶＥＥＶＳＬＲＫの影響下においてであり得る。換言すると、ある実施態様において、ＡＶＥＥＶＳＬＲＫに特異的に結合するポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１により提示されるとき(すなわち結合されるとき)またはＨＬＡ−Ａ＊０１：０１またはＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１またはＨＬＡ−Ａ＊０１：０１により提示されるときと等価な構造的形状であるときのみそうなり得る。
【０３２０】
同様に、ここで使用する「ＣＬＡＶＥＥＶＳＬに特異的に結合するＲＫ」は、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫペプチドへの選択的結合をいう。ある条件下、例えば、ここに記載するイムノアッセイで、「ＣＬＡＶＥＥＶＳＬに特異的に結合するＲＫ」ポリペプチドは、このペプチドに選択的に結合し、他のペプチドに相当量で結合しない。それ故に、ポリペプチドは、対照抗原性ペプチドに結合するより、少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍または１００倍多い親和性で、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫに結合し得る。選択的結合はまた、本発明の核酸またはベクターを発現する修飾細胞の影響下で、間接的にも決定され得る。例えば、ここに記載するようなアッセイにおいて、修飾細胞は、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１の状況でＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫを提示する細胞に対して特異的に反応性である(例えば初代ΔＮＰＭ１  ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１陽性ＡＭＬ細胞またはΔＮＰＭ１遺伝子が導入されている何らかのＨＬＡ−Ａ＊０３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１陽性細胞株)。それ故に、修飾細胞は、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１の状況でＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫを提示しない対照細胞株に対するその反応性と比較したとき、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１の状況でＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫを提示する細胞に少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍または１００倍多く結合し得る。
【０３２１】
選択的結合は、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１のみによるＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫの影響下においてであり得る。換言すると、ある実施態様において、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬに特異的に結合するＲＫポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１により提示されるとき(すなわち結合されるとき)またはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１またはＨＬＡ−Ａ＊０３：０１またはＨＬＡ−Ａ＊１１：０１により提示されるときと等価な構造的形状であるときのみそうなり得る。
【０３２２】
矛盾する記載がない限り、「ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫに特異的に結合する」ポリペプチドは、(ｉ)システイニル化形態のＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ、(ii)非システイニル化形態のＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫまたは(iii)システイニル化形態のＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫおよび非システイニル化形態のＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫの両者に結合し得る。同様に、特に断らない限り、「配列番号２７」または「ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ」への一般的記載は、システイニル化および非システイニル化形態のペプチドＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫの両者を包含する。
【０３２３】
ここで使用する「ＶＥＥＶＳＬＲＫに特異的に結合する」は、ＶＥＥＶＳＬＲＫペプチドへの選択的結合をいう。ある条件下、例えば、ここに記載するイムノアッセイで、「ＶＥＥＶＳＬＲＫに特異的に結合する」ポリペプチドは、このペプチドに選択的に結合し、他のペプチドに相当量で結合しない。それ故に、ポリペプチドは、対照抗原性ペプチドに結合するより、少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍または１００倍多い親和性で、ＶＥＥＶＳＬＲＫに結合し得る。選択的結合はまた、本発明の核酸またはベクターを発現する修飾細胞の状況で、間接的にも決定され得る。例えば、ここに記載するようなアッセイにおいて、修飾細胞は、適切なＨＬＡ−Ａの状況でＶＥＥＶＳＬＲＫを提示する細胞に対して特異的に反応性である(例えば初代ΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬ細胞またはΔＮＰＭ１遺伝子が導入されている何らかの適切なＨＬＡ−Ａ陽性細胞株)。それ故に、修飾細胞は、適切なＨＬＡ−Ａの影響下でＶＥＥＶＳＬＲＫを提示しない対照細胞株に対するその反応性と比較したとき、適切なＨＬＡ−Ａの影響下でＶＥＥＶＳＬＲＫを提示する細胞に少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍または１００倍多く結合し得る。
【０３２４】
選択的結合は、適切なＨＬＡ−ＡのみによるＶＥＥＶＳＬＲＫの状況においてであり得る。換言すると、ある実施態様において、ＶＥＥＶＳＬＲＫに特異的に結合するポリペプチドは、適切なＨＬＡ−Ａにより提示されるとき(すなわち結合されるとき)または適切なＨＬＡ−Ａにより提示されるときと等価な構造的形状であるときのみそうなり得る。
【０３２５】
ここで使用する「ＡＶＥＥＶＳＬＲに特異的に結合する」は、ＡＶＥＥＶＳＬＲペプチドへの選択的結合をいう。ある条件下、例えば、ここに記載するイムノアッセイで、「ＡＶＥＥＶＳＬＲに特異的に結合する」ポリペプチドは、このペプチドに選択的に結合し、他のペプチドに相当量で結合しない。それ故に、ポリペプチドは、対照抗原性ペプチドに結合するより、少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍または１００倍多い親和性で、ＡＶＥＥＶＳＬＲに結合し得る。選択的結合はまた、本発明の核酸またはベクターを発現する修飾細胞の状況で、間接的にも決定され得る。例えば、ここに記載するようなアッセイにおいて、修飾細胞は、適切なＨＬＡ−Ａの状況でＡＶＥＥＶＳＬＲを提示する細胞に対して特異的に反応性である(例えば初代ΔＮＰＭ１陽性ＡＭＬ細胞またはΔＮＰＭ１遺伝子が導入されている何らかの適切なＨＬＡ−Ａ陽性細胞株)。それ故に、修飾細胞は、適切なＨＬＡ−Ａの状況でＡＶＥＥＶＳＬＲを提示しない対照細胞株に対するその反応性と比較したとき、適切なＨＬＡ−Ａの状況でＡＶＥＥＶＳＬＲを提示する細胞に少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍または１００倍多く結合し得る。
【０３２６】
選択的結合は、適切なＨＬＡ−ＡのみによるＶＥＥＶＳＬＲＫの影響下においてであり得る。換言すると、ある実施態様において、ＶＡＥＥＶＳＬＲに特異的に結合するポリペプチドは、適切なＨＬＡ−Ａにより提示されるとき(すなわち結合されるとき)または適切なＨＬＡ−Ａにより提示されるときと等価な構造的形状であるときのみそうなり得る。
【０３２７】
「非必須」(または「重大でない」)アミノ酸残基は、生物学的活性を無くす、より好ましくは、実質的に変えることなく、野生型配列(例えば、ここに配列番号により特定する配列)から改変できる残基をいい、一方「必須」(または「重大な」)アミノ酸残基はこのような変化をもたらす。例えば、保存されているアミノ酸残基は、特に改変が受け入れられないと予測されるが、例外として、ドメインの疎水性コア内のアミノ酸残基は、一般に活性を顕著に変えることなく、ほぼ等価な疎水性を有する他の残基に置き換えられ得る。
【０３２８】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。それ故に、タンパク質の非必須(または重大でない)アミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置き換えられる。あるいは、他の実施態様において、変異を無作為に導入でき、得られた変異体を、活性を保持する変異体を同定するために活性をスクリーニングし得る。
【０３２９】
配列間の配列相同性または同一性(これらの用語はここで相互交換可能に使用される)の計算は次のとおり実施される。
【０３３０】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列を、最適比較目的でアラインする(例えば、ギャップを第一および第二アミノ酸または核酸配列の一方または両方に最適アラインメントのために入れてよく、非相同配列を比較目的で無視できる)。好ましい実施態様において、比較目的でアラインした対照配列の長さは、対照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８２％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一配列のある位置が、第二配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占拠されているならば、これら分子はその位置で同一である(ここで使用するアミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」に等しい)。２配列間のパーセント同一性は、２配列の最適アラインメントのために導入が必要であったギャップ数および各ギャップ長を考慮して、これら配列により共有される位置の関数である。
【０３３１】
２配列間の配列の比較およびパーセント同一性決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。好ましい実施態様において、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで利用可能)の  ＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453)アルゴリズムを使用して、ＢＬＯＳＵＭ  ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスおよびギャップ荷重１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ荷重１、２、３、４、５または６を使用して決定される。他の好ましい実施態様において、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ(http://www.gcg.comで利用可能)のＧＡＰプログラムを使用して、ＮＷＳｇａｐｄｎａ.ＣＭＰマトリクスおよびギャップ荷重４０、５０、６０、７０または８０および長さ荷重１、２、３、４、５または６を使用して決定される。特に好ましいパラメータのセット(および実施者が、ある分子が本発明の配列同一性または相同性制限の範囲内であるかどうかの決定に、どのパラメータを適用すべきか不確かであるならば、使用すべきものである)は、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４およびフレームシフトギャップペナルティ５を用いるＢＬＯＳＵＭ  ６２スコアリングマトリクスである。
【０３３２】
あるいは、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム(version 2.0)に組み込まれているMeyers et al. ((1989) CABIOS 4:11-17)のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０荷重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して、決定される。
【０３３３】
ここに記載する核酸およびタンパク質配列は、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために、公開されたデータベースに対するサーチを実施する「クエリー配列」として使用され得る。このようなサーチは、Altschul, et al. ((1990) J. Mol. Biol. 215:403-410)のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム(version 2.0)を使用して実施できる。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチを、スコア＝１００、語長＝１２で、ＮＢＬＡＳＴプログラムを用いて実施して、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチを、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３を用いて実施して、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でのギャップ付アラインメントを得るために、ギャップ付ＢＬＡＳＴがAltschul et al. (1997, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402)に記載のとおり利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付ＢＬＡＳＴプログラムを使用するとき、各プログラム(例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ)のデフォルトパラメータが使用され得る。<http://www.ncbi.nlm.nih.gov>参照。
【０３３４】
ここに記載するポリペプチドおよび核酸分子は、配列番号により特定される配列と十分にまたは実質的に同一であるアミノ酸配列または核酸配列を有し得る。用語「十分に同一」または「実質的に同一」は、第一および第二アミノ酸またはヌクレオチド配列が共通の構造的ドメインまたは共通の機能的活性を有するために、十分数または最小数の第二アミノ酸またはヌクレオチド配列と同一または等価(例えば類似側鎖を有する)であるアミノ酸残基またはヌクレオチドを含む、第一アミノ酸またはヌクレオチド配列をいうためにここで使用する。例えば、少なくとも約６０％または６５％同一性、凡そ７５％同一性、さらに８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を有する共通の構造的ドメインを含む複数アミノ酸またはヌクレオチド配列は、ここでは、十分にまたは実質的に同一であるとして定義される。
【０３３５】
他に定義しない限り、ここで使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が関連する分野の当業者に共通して理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley and Sons, NY (1 94);およびHale and Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)は、本発明で使用される用語の大部分の一般的辞書を当業者に提供する。ここに記載するものに類似するまたは等価なあらゆる方法および物質が、本発明の実施に際して有用であるが、より好ましい方法および物質がここに記載されている。従って、以下に定義する用語は、本明細書を全体として参照してより完全に記載される。また、ここで使用する単数表現は、文脈から明らかに他の解釈が必要ではない限り、複数を含む。特に断らない限り、それぞれ核酸は左から右に５’から３’配向で記載し、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ配向で記載する。本発明は、方法、プロトコールおよび試薬は当業者により使用される状況により変わり得るため、これらが記載されている特定のものに限定されないことは理解されるべきである。
【０３３６】
本発明の態様を、次の非限定的実施例により示す。
【実施例】
【０３３７】
材料および方法
試験設計
この試験の目的は、(１)初代ＡＭＬのΔＮＰＭ１からのＨＬＡクラスＩリガンドの同定、(２)ΔＮＰＭ１からのＨＬＡクラスＩリガンドに特異的なＴＣＲを有するＣＤ８細胞の単離および(３)遺伝子移入後初代ＡＭＬの特異的認識および溶解に介在できる、ΔＮＰＭ１からのＨＬＡクラスＩリガンドに対するＴＣＲの同定であった。ＨＬＡクラスＩリガンドームデータを、タンデムマススペクトロメトリーを使用して１２の初代ＡＭＬから作成し、ΔＮＰＭ１のオルターナティブリーディングフレームにマッチするペプチドをサーチした。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１  ｐＭＨＣ四量体を一つの同定されたペプチドについて産生し、６名のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ＡＭＬ患者および６名の健常ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性個体からの特異的ＣＤ８細胞の単離に使用した。健常個体から単離したＴ細胞クローンを、ｐＭＨＣ四量体染色についてスクリーニングし、四量体陽性Ｔ細胞クローンをＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡによりペプチド負荷Ｔ２細胞およびΔＮＰＭ１またはｗｔＮＰＭ１を伴う初代ＡＭＬに対する反応性を試験した。一つの反応性が強いＴ細胞クローンから、ＴＣＲを配列決定し、レトロウイルスＭＰ７１−ＴＣＲ−ｆｌｅｘベクターにクローン化した。このベクターを、２名の健常ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性個体からのＣＤ８およびＣＤ４細胞にＴＣＲを導入するために使用し、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞をフローサイトメトリーにより評価した。ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡによりＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ＡＭＬ細胞株およびΔＮＰＭ１またはｗｔＮＰＭ１を伴う初代ＡＭＬの認識について試験し、特異的溶解を５１Ｃｒ放出アッセイにより測定した。
【０３３８】
サンプル採取および細胞培養
ヘルシンキ宣言に基づくインフォームド・コンセントと共にライデン大学医療センター施設内審査委員会(the Institutional Review Board of the Leiden University Medical Center)の承認後、末梢血および骨髄サンプルをＡＭＬの患者および健常個体から採取した。末梢血および骨髄単核細胞をFicoll-Isopaque分離により単離し、凍結保存した。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１型健常個体からのＰＢＭＣ単離のために、バフィーコートをSanquin(Amsterdam, Netherlands)に注文した。Ｔ細胞を、５％熱不活性化ウシ胎児血清(ＦＢＳ; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, United States)、５％ヒト血清、１.５％Ｌ−グルタミン(Lonza)、１％ペニシリン／ストレプトマイシン(Lonza)および１００IU／ml  ＩＬ−２(Novartis, Basel, Switzerland)添加イスコフ改変ダルベッコ培地(ＩＭＤＭ; Lonza, Basel, Switzerland)からなるＴ細胞培地(ＴＣＭ)で培養した。野生型ＮＰＭ１(ＯＣＩ−ＡＭＬ２)およびΔＮＰＭ１(ＯＣＩ−ＡＭＬ３)を発現するＡＭＬ細胞株をＤＳＭＺ(Braunschweig, Germany)に注文し、２０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン含有最小必須培地アルファ(ＭＥＭα; Gibco)で培養した。初代ＡＭＬおよびＴ２細胞を１０％ＦＢＳ、１.５％Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン含有ＩＭＤＭで培養した。単球をＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ１４ビーズ(Miltenyi Biotec)を用いる磁気細胞分離装置(ＭＡＣＳ; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)により、ＰＢＭＣから単離した。単離単球を１００ng／mL  ＧＭ−ＣＳＦ(Novartis, Basel, Switzerland)および５００IU／mL  ＩＬ−４(Schering-Plough, Kenilworth, NJ)含有培地で、未熟樹状細胞(ＤＣ)まで７日間培養した。最後の２日間、１００ng／mL  ＧＭ−ＣＳＦ、１０ng／mL  ＴＮＦ−α(Cellgenix, Freiburg, Germany)、１０ng／mL  ＩＬ−１β(Cellgenix)、１０ng／mL  ＩＬ−６(Cellgenix)、１μg／mL  プロスタグランジンＥ２(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)および５００IU／mL  ＩＦＮ−γ(Boehringer-Ingelheim, Ingelheim, Germany)を添加して、成熟を誘発した。
【０３３９】
初代ＡＭＬのＨＬＡクラスＩリガンドーム
１２の初代ＡＭＬサンプルの細胞ペレットを、５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０mM  ＮａＣｌ、５mM  エチレンジアミン四酢酸および０,５％Zwittergent 3-12(ｐＨ８.０)中で溶解させ、Complete protease inhibitor(Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, United States)を添加した。４℃で溶解緩衝液中、細胞を転回させながら２時間インキュベーション後、調節物を、１０分間、１０００ｇで４℃で遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、３５分間、１３,０００ｇで４℃でインキュベートした。上清をプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂビーズ(GE Healthcare Life Sciences, Chicago, Illinois, United States)で予め浄化し、プロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂビーズ上のピメルイミド酸ジメチル(ＤＭＰ)固定化Ｗ６／３２抗体(３mg／ml  樹脂)を用いる免疫親和性カラムに、１ml／分の流速で付した。溶解緩衝液ならびに１Ｍ、１２０mMおよび無ＮａＣｌ含有１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８.０)緩衝液の５〜１０カラム体積で洗浄後、結合したＨＬＡクラスＩ−ペプチド複合体を３〜４カラム体積の１０％酢酸でカラムから溶出させ、解離させた。ペプチドを、１０kDa膜(Macrosep Advance Centrifugal Devices With Supor Membrane, Pall Corporation, Port Washington, New York, United States)を通してＨＬＡクラスＩ分子から分離した。濾液を凍結乾燥させた。
【０３４０】
溶出ペプチドプールを、４μl／分で流す自家製ＳＣＸカラム(３２０μ内径、１５cm、ポリスルホエチルＡ  ３μm、Ｐｏｌｙ  ＬＣ)を用いる強カチオン交換クロマトグラフィー(ＳＣＸ)により分画した。勾配を、１０分間、１００％溶媒Ａ(１００／０.１  水／トリフルオロ酢酸ｖ／ｖ)で流し、その後直線勾配を開始して１５分間かけて１００％溶媒Ｂ(６５／３５／０.１  ２５０mM  ＫＣｌ／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸ｖ／ｖ／ｖ)に到達するまで流し、続いてさらに１５分間かけて１００％溶媒Ｃ(６５／３５／０.１  ５００mM  ＫＣｌ／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸ｖ／ｖ／ｖ)まで流した。勾配を１００％溶媒Ｃで５分間維持し、その後１００％溶媒Ａに再び切り替えた。２０個の４μlフラクションを、２０μl  ９５／３／０.１  水／アセトニトリル／ＦＡ  ｖ／ｖ／ｖが予め入ったバイアルに集めた。ペプチドフラクションを凍結乾燥させ、９５／３／０.１  水／アセトニトリル／ギ酸ｖ／ｖ／ｖに溶解し、先に記載された(３８)ナノフロー液体クロマトグラフィー１１００  ＨＰＬＣシステム(Agilent Technologies, Santa Clara, California, United States)を備えたLTQ-FTUltraまたはeasy-nLC1000を備えたQ-Exactiveのいずれかのデータ依存的タンデムマススペクトロメトリー(ＭＳ)により分析した。ペプチドを６〜１０μl／分、１,５cmカラム(１００μm内径; ReproSil-Pur C18-AQ、３μm、Dr. Maisch HPLC GmbH, Ammerbuch-Entringen, Germany)にトラップし、１５０nl／分で２０cmカラム(５０μm内径; ReproSil-Pur C18-AQ、３μm)に溶出させた。カラムを、０.１％ギ酸中の０〜４０％アセトニトリルの１２０分勾配で展開した。カラムの底をチップ(内径約５μm)に抜き出し、そこから溶離剤をマススペクトロメーターに噴霧した。フルスキャンＭＳスペクトルを、ＦＴ−ＩＣＲで２５,０００の分解能で、３,０００,０００の目標値で取得した。二つの最も強いイオンを、ＦＴ−ＩＣＲにおける選択イオンモニタリング走査で、５０,０００の分解能で、５０,０００の目標累積値による精密質量測定のために単離した。次いで選択したイオンを、１０,０００の目標値で衝突誘起解離を使用する線形イオントラップでフラグメント化した。Q-Exactiveマススペクトロメーターをｔｏｐ１０−ｍｏｄｅで操作した。パラメータは、１７,０００の強度閾値で、ＭＳ／ＭＳについて２０ms(フルスキャン)の３,０００,０００／最大充填時間でＡＧＣ目標値で分解能７０,０００および６０msの１００,０００／最大充填時間のＡＧＣ目標値で分解能１７,５００であった。Ａｐｅｘトリガーを１〜１０秒に設定し、許容電荷は２〜６であった。Proteome Discoverer version 2.1(Thermo Fisher Scientific)をペプチドおよびタンパク質同定のために使用し、同定用マスコット・ノード(mascot node)を使用し、UniProt Homo Sapiensデータベース(UP000005640；２０１５年１月；６７９１１エントリー)と共にmascot version 2.2.04を使用した。システインのメチオニン酸化およびシステイニル化を可変修飾として設定した。ペプチド割り当てをQ-Exactiveデータについて１０ppmの前駆体許容性および２０mmuのＭＳ／ＭＳ断片化許容性ならびにLTQ-FTUltraデータについてそれぞれ２ppmおよび０.５Daで行った。ΔＮＰＭ１由来ペプチドの同定をその合成対応物により決定した。
【０３４１】
ペプチド合成およびｐＭＨＣ四量体産生
ペプチドを、標準Ｆｍｏｃ化学により合成し、ジメチルスルホキシドに溶解した。ペプチドのシステイニル化を１mMペプチドを２mM  １,４−ジチオスレイトールの５０mM  重炭酸アンモニウム溶液で１５分間、５０℃で処理し、続いて１０mM遊離システインおよび１５mM  Ｈ２Ｏ２を３０分間、ＲＴで加えることにより行った。ｐＭＨＣ四量体を先に概説されたとおり産生した(７、８)。すなわち、組み換えＨＬＡ−Ａ＊０２：０１重鎖およびヒトβ２−ミクログロブリンからなる単量体をゲル濾過ＨＰＬＣおよびビオチニル化により精製した。適切なペプチドと折りたたんだ後、ｐＭＨＣ四量体を、ＰＥ接合ストレプトアビジン(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)の付加により産生させた。ＵＶ交換ｐＭＨＣ四量体を、ＵＶ感受性ペプチド含有ビオチニル化ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１単量体を、システイニル化ΔＮＰＭ１ペプチド存在下３６６nm  ＵＶ光に曝すことにより産生させた。１時間のペプチド交換後、単量体を１時間、４℃でインキュベートし、続いて４０００ｇで１０分間、１５℃で遠心分離した。四量体をストレプトアビジン接合ＰＥを上清に添加することにより産生した。ｐＭＨＣ四量体を４℃で保存した。
【０３４２】
抗体およびＦＡＣＳ分析
Ｔ細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８(BD Biosciences, San Jose, California, United States)およびＴＣＲ−Ｖβ５.１(Beckman Coulter, Brea, California, United States)に対するＦＩＴＣ接合抗体、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８ならびにマウスＴＣＲ−ＣβおよびＰＥ接合ｐＭＨＣ四量体に対するＡＰＣ接合抗体およびＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８(BD Biosciences)に対する抗体で染色した。細胞をBD CellQuest Proソフトウェア(BD Biosciences)を使用してBD FACSCalibur II(BD Biosciences)で測定し、分析をFlowJoソフトウェア(Flowjo, LLC, Ashland, Oregon, United States)で実施した。
【０３４３】
Ｔ細胞単離および培養
ｐＭＨＣ四量体陽性ＣＤ８  Ｔ細胞を、先に記載されたとおり(９)、ＡＭＬの患者および健常個体からのＰＢＭＣから単離した。すなわち、ＨＬＡ−＊０２：０１陽性ＡＭＬ患者および健常個体からのＰＢＭＣをΔＮＰＭ１ペプチド含有ＰＥ接合ｐＭＨＣ四量体で１時間、４℃で染色し、続いて抗PE MicroBeads(Miltenyi Biotec)を使用してＭＡＣＳ単離した。単離細胞をCD8-Alexa Fluor 700(Invitrogen)、CD4-FITC、CD14-FITCおよびCD19-FITC(BD Biosciences)抗体で染色し、ｐＭＨＣ四量体陽性ＣＤ８  Ｔ細胞が、BD FACSDiva v6ソフトウェア(BD Biosciences)を使用してBD FACSAria III細胞選別機(BD Biosciences)からソートされた単一細胞であった。単一Ｔ細胞を、９６ウェルＵ底培養プレート(Costar, Sigma-Aldrich)でウェルあたり１００μl  ＴＣＭ中、５０,０００照射同種ＰＢＭＣ、５０００照射同種ＥＢＶ−ＬＣＬおよび０.８μg／ml  ＰＨＡ(Oxoid Microbiology Products, Thermo Fisher Scientific)で刺激した。増大中のＴ細胞クローンを、照射フィーダー細胞およびＰＨＡで１０〜１４日毎に再刺激した。
【０３４４】
Ｔ細胞反応性アッセイ
Ｔ細胞認識を、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡ(Sanquin)により測定した。スティミュレーター細胞(３０,０００細胞)を、３８４ウェル平底プレート(Greiner Bio One, Kremsmuenster, Austria)でウェルあたり４０μl  ＴＣＭ中、Ｔ細胞(２０００細胞)と共インキュベートした。一夜共インキュベーション後、培養上清を採取して、ＩＦＮ−γ放出を測定した。ペプチド認識アッセイにおいて、Ｔ２細胞(１５,０００細胞)を３０分間、３７℃で、用量設定ペプチド濃度とインキュベートし、２回洗浄して、その後Ｔ細胞と共インキュベーションした。遮断アッセイにおいて、標的細胞(１０,０００細胞)を６０分間、ＲＴで、飽和濃度の抗体遮断ＨＬＡクラスＩ(Ｗ６／３２)またはＨＬＡクラスII(ＰｄＶ５.２)とプレインキュベートし、その後Ｔ細胞を加えた。Ｔ細胞介在細胞毒性を５１クロム放出アッセイで測定した。初代ＡＭＬ細胞を１００μＣｉ  Ｎａ２５１ＣｒＯ４で１時間、３７℃で標識し、洗浄し、９６ウェルＵ底培養プレート(Costar)のウェルあたり１００μl  ＴＣＭ中Ｔ細胞と種々のＥ：Ｔ比で共インキュベートした。自発的および最大５１Ｃｒ放出を、それぞれウェルあたり１００μl  ＴＣＭまたは１００μl  ＴＣＭと１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００(Sigma-Aldrich)を含む別々のプレートで測定した。９時間の共インキュベーション後、２５μl  培養上清を採取し、９６ウェル  LumaPlate(PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, United States)に移した。カウント毎分(cpm)での５１Ｃｒ放出を、２４５０  Microbeta２プレートカウンター(PerkinElmer)で測定した。
【０３４５】
ＴＣＲクローニングおよびレトロウイルス上清の産生
クローン１Ａ２のＴＣＲ  αおよびβ鎖利用を、先に記載されたとおり(９)、わずかに変えて決定した。すなわち、Ｔ細胞を溶解させ、ｍＲＮＡをDynabeads mRNA DIRECTキット(Invitrogen)で単離した。ＴＣＲ特異的ｃＤＮＡを２つのＴＣＲ−Ｃβ特異的プライマー、ＴＣＲ−Ｃα特異的プライマー、ＳＡ.ｒｔアンカー鋳型−スイッチングオリゴヌクレオチド(ＴＳＯ)およびSMARTScribe逆転写酵素(Takara, Clontech, Mountain View, California, United States)を使用して産生した。第一鎖ｃＤＮＡ合成中、SMARTScribe逆転写酵素は３’非鋳型ポリシトシン末端を付加し、これはＴＳＯのアニーリングおよび第二鎖ｃＤＮＡ合成を可能とする。ＴＣＲ増幅を、ＴＣＲ−ＣαまたはＣβ領域へのアニーリングのためにPhusion Flash(Thermo Fisher Scientific)、アンカー特異的プライマーおよびネスティッドプライマーを使用してＰＣＲにより実施した。クローン１Ａ２についてのＴＣＲ配列がサンガーシーケンシング(Macrogen, Amsterdam, Netherlands)およびImMunoGeneTics(ＩＭＧＴ)データベース(１０)によりＴＲＡＶ１２−２およびＴＲＢＶ５−１として同定された。コドン最適化ＴＲＡＶ１２−２およびＴＲＢＶ５−１配列を合成し、GenScript(Piscataway, New Jersey, United States)によりＭＰ７１−ＴＣＲ−ｆｌｅｘレトロウイルスベクター(１１)にクローン化した。ＭＰ７１−ＴＣＲ−ｆｌｅｘにおいて、マウスＴＣＲ−Ｃαおよび−Ｃβ領域は、ＴＣＲの選択対合および発現の促進のための、ブタテッショウウイルス由来Ｐ２Ａ配列に連結されたさらなるシステイン残基を含んだ。構築物をパッケージング細胞Φ−ＮＸ−Ａ(ATCC, Manassas, Virginia, United States)にトランスフェクトし、トランスフェクション４８時間および７２時間後のレトロウイルス上清を採取し、−８０℃で凍結させた。ＣＭＶ由来ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１制限ペプチドＮＬＶＰＭＶＡＴＶについてのＴＣＲをコードするＭＰ７１−ＴＣＲ−ｆｌｅｘは、Prof. Dr. T.N. Schumacher (Division of Immunology, Netherlands Cancer Institute, Amsterdam, the Netherlands)により恵与された。
【０３４６】
ＴＣＲ遺伝子移入
２つのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性健常個体(ドナー１および２)からのＰＢＭＣを解凍し、ＣＤ４およびＣＤ８細胞を抗ＣＤ４  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ(Miltenyi Biotec)、続くＣＤ８  Ｔ細胞単離キット(Miltenyi Biotec)を使用して、ＭＡＣＳにより単離した。ＣＤ８およびＣＤ４細胞を照射自己フィーダーおよび０.８μg／ml  ＰＨＡで、２４ウェル平底培養プレート(Costar)で刺激した。刺激２日後、Ｔ細胞を、先に記載されたとおり(９、１２)レトロウイルス形質導入のために２４ウェル平底懸濁液培養プレート(Greiner Bio-One)に移した。Ｔ細胞の添加前、プレートを３０mg／mL  レトロネクチン(Takara, Clontech)で被覆し、２％ヒト血清アルブミン(Sanquin)で遮断した。レトロウイルス上清を添加し、プレートを３０００ｇで２０分間、４℃で遠心分離した。Ｔ細胞を、ウェルあたり３００,０００細胞でウイルス上清と共にプレートに加えた。一夜インキュベーション後、Ｔ細胞を２４ウェル平底培養プレートに移した。形質導入６日後、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞をマウスＴＣＲ−Ｃβに対するＡＰＣ接合抗体で１５分間、４℃で染色し、続いて抗APC MicroBeads(Miltenyi Biotec)を使用してＭＡＣＳ単離した。ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞を、照射同種ＰＢＭＣおよびＥＢＶ−ＬＣＬおよび０.８μg／ml  ＰＨＡで１０〜１４日毎に再刺激した。分析前、再刺激ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞を上記のとおり抗マウスＴＣＲ−Ｃβ−ＡＰＣおよび抗ＡＰＣ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄを使用してＭＡＣＳにより富化した。
【０３４７】
結果
初代ＡＭＬのＨＬＡクラスＩリガンドームにおけるΔＮＰＭ１の存在
ΔＮＰＭ１ペプチドがＨＬＡクラスＩにより処理され、提示されるかを調べるために、本発明者らは１２の初代ＡＭＬサンプルからＨＬＡクラスＩ表面分子を免疫沈降させ、結合溝からペプチドを溶出させ、ペプチドームをマススペクトロメトリーにより分析した。表Ｉは、１２のＡＭＬサンプルのＨＬＡクラスＩ分類およびそのＮＰＭ１の変異状態を示す。ＮＰＭ１遺伝子のエクソン１２への４bpフレームシフト挿入が、初代ＡＭＬの３０％で生じる反復性変異である。１２の初代ＡＭＬ中８つで、ΔＮＰＭ１の存在がＰＣＲフラグメント分析により示された。全ての患者は、既知染色体再編ｉｎｖ(１６)(ｐ１３ｑ２２)を担持した１ＡＭＬ以外、細胞遺伝学により正常核型であった。末梢血または骨髄サンプルで測定したＢｌａｓｔパーセンテージは、５５〜９８％の範囲であった。
【０３４８】
【表１】
2020530274.tif 000003
ａ  ΔＮＰＭ１患者は、ＮＰＭ１遺伝子のエクソン１２にタンパク質のＣ末端でフレームシフトを引き起こす４bp挿入を担持した。
ｂ  ＡＭＬの患者からの末梢血および骨髄サンプルで測定したＢｌａｓｔパーセンテージ。
＊  抗ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１抗体ＢＢ７.２を使用してペプチド溶出が実施されたＡＭＬサンプル。
【０３４９】
エクソン１２における反復性４bp挿入は、オルターナティブリーディングフレームで翻訳されるＣ末端にその野生型対応物より４  ＡＡ長い１１  ＡＡ(ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ)であるΔＮＰＭ１タンパク質をもたらす。このオルターナティブΔＮＰＭ１タンパク質から、正常リーディングフレームにおける１０のＮ末端残基、続くオルターナティブリーディングフレーム(ＭＴＤＱＥＡＩＱＤＬＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ)における１１のＣ末端ＡＡに伸びるタンパク質領域を、１２の初代ＡＭＬから分析したＨＬＡクラスＩリガンドームにおけるマッチングペプチドがサーチされた。これは、ｗｔＮＰＭを伴うＡＭＬ１ではなく、ΔＮＰＭ１を伴うＡＭＬにおける２つの８量体ペプチド(ＶＥＥＶＳＬＲＫおよびＡＶＥＥＶＳＬＲ)、２つの９量体ペプチド(ＣＬＡＶＥＥＶＳＬおよびＡＶＥＥＶＳＬＲＫ)および１つの１１量体ペプチド(ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ)の存在を確認した(表１)。７つの初代ＡＭＬから溶出した全５つのリガンドを、マススペクトロメトリーにより合成ペプチドで検証した(図１および２)。合成ペプチドでのＣＬＡＶＥＥＶＳＬおよびＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫのタンデムマススペクトルの検証は、インビトロで第一残基のシステイニル化により実施された。ＮｅｔＭＨＣｐａｎ  ３.０によるＨＬＡクラスＩ結合親和性の予測は、エピトープＣＬＡＶＥＥＶＳＬのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１への結合を示唆し、一方エピトープＡＶＥＥＶＳＬＲＫおよびＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫはＨＬＡ−Ａ＊０３：０１ならびにＨＬＡ−Ａ＊１１：０１および恐らくＡＶＥＥＶＳＬＲＫについてはＨＬＡ−Ａ＊０１：０１に結合する可能性が示唆された(表２)。ＣＬＡＶＥＥＶＳＬのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１への結合ならびにＡＶＥＥＶＳＬＲＫおよびＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫのＨＬＡ−Ａ＊０３：０１およびＡ＊１１：０１への結合は、単量体再折りたたみにより確認された。ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１がコーカサス人種集団の５０％で発現されるため、本発明者らは、３つ中２つのΔＮＰＭ１を伴うＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ＡＭＬ(ＡＭＬ１０１９７およびＡＭＬ３３６１)で検出されたＣＬＡＶＥＥＶＳＬに焦点を絞った。
【０３５０】
【表２】
2020530274.tif 000004
ａ  ペプチドが溶出された初代ＡＭＬサンプルにより発現された全ての他のＨＬＡクラスＩアレルに対する予測結合親和性(nM)の下限。
Ｎ.Ａ. 該当なし。
【０３５１】
初代ＡＭＬ上のΔＮＰＭ１のＴ細胞認識
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１制限エピトープＣＬＡＶＥＥＶＳＬが免疫療法による標的であり得るネオ抗原であるかを試験するために、本発明者らは、ＡＭＬの患者の特異的Ｔ細胞を試験した。ＰＥ接合ｐＭＨＣ四量体をＣＬＡＶＥＥＶＳＬ(ΔＮＰＭ１−ＣＬＡ)およびそのシステイニル化バリアントＣ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬ(ΔＮＰＭ１−Ｃ＊ＬＡ)について産生し、これらの四量体の混合物を、化学療法後寛解したΔＮＰＭ１  ＡＭＬを有する６名のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性患者のＰＢＭＣからの特異的Ｔ細胞の単離に使用した。ｐＭＨＣ四量体の一方または両方に結合するＴ細胞を、磁性抗ＰＥビーズで富化し、単一四量体陽性ＣＤ８細胞をフローサイトメトリーにより単離した(表３)。
【０３５２】
【表３】
2020530274.tif 000005
ａ  診断後日数。
ｂ  ＰＢＭＣ、末梢血単核細胞。Ｔ細胞単離に使用されたΔＮＰＭ１  ＡＭＬを有するＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性患者からのＰＢＭＣ数が示される。
ｃ  ＰＢＭＣを、抗ＣＤ８−ＡＬＸ７００およびＣＬＡＶＥＥＶＳＬおよびそのシステイニル化バリアントＣ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬに対するＰＥ接合ｐＭＨＣ四量体の混合物で染色した。選別された四量体陽性ＣＤ８細胞数が示される。
ｄ  ΔＮＰＭ１−ＣＬＡまたはΔＮＰＭ１−Ｃ＊ＬＡ四量体について陽性であるＴ細胞クローン数。
【０３５３】
計４１の四量体陽性ＣＤ８細胞を、４患者の４２＊１０６  ＰＢＭＣから単離し、その中で３患者からの５つのＴ細胞をクローン的に増殖させた。しかしながら、５つのＴ細胞クローンいずれもΔＮＰＭ１−ＣＬＡ四量体またはΔＮＰＭ１−Ｃ＊ＬＡ四量体で染色されず、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬに対するＴ細胞は存在しないかまたは検出閾値未満の頻度であることが示される。それ故に、同じ戦略に従い、６名のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性健常個体からの多数のＰＢＭＣにおける特異的Ｔ細胞をサーチした(表４)。８〜５５で数が変動する四量体陽性ＣＤ８細胞が、各健常個体から計４６０〜１９７０×１０６  ＰＢＭＣから単離された。これらの細胞で、クローン的に増殖させた５個体からの３１のＴ細胞および４個体からの１３のＴ細胞クローンがΔＮＰＭ１−ＣＬＡ四量体について陽性であった。これらの１３クローンで、３つのＴ細胞クローンがΔＮＰＭ１−Ｃ＊ＬＡ四量体で染色できた(表および図３Ａ)。
【０３５４】
【表４】
2020530274.tif 000006
ａ  ＰＢＭＣ、末梢血単核細胞。Ｔ細胞単離に使用したＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性健常個体からのＰＢＭＣ数が示される。
ｂ  ＰＢＭＣを抗ＣＤ８−ＡＬＸ７００およびＣＬＡＶＥＥＶＳＬおよびそのシステイニル化バリアントＣ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬに対するＰＥ接合ｐＭＨＣ四量体の混合物で染色した。選別された四量体陽性ＣＤ８細胞数が示される。
ｃ  ΔＮＰＭ１−ＣＬＡ四量体に陽性の増大中のＴ細胞クローン数。
ｄ  ΔＮＰＭ１−Ｃ＊ＬＡ四量体に陽性の増大中のＴ細胞クローン数。
ｎ.ｄ. 実施せず。
【０３５５】
１３の四量体陽性ＣＤ８クローンがその標的ペプチドに反応性であるかを決定するために、クローンを、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ、システイニル化バリアントＣ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬまたは無関係ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１制限ＣＭＶペプチドＮＬＶＰＭＶＡＴＶの外来性に付加したＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性Ｔ２細胞の認識について試験した。１３のΔＮＰＭ１−ＣＬＡ四量体陽性クローン中、２つのＴ細胞クローン(１Ａ２および４Ａ８)は、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ負荷Ｔ２細胞に特異的反応性を示したが、対照ペプチドＮＬＶＰＭＶＡＴＶには示さなかった(図３Ｂ)。クローン１Ａ２も、Ｃ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬ負荷Ｔ２細胞の認識を示した。これらの結果は、四量体データに一致し、第一残基のシステイニル化がクローン４Ａ８によるＴ細胞認識を消滅させることを示す。しかしながら、クローン１Ａ２によるペプチド認識は、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬならびにＣ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬに対するその特異的反応性により説明されるとおり、システイニル化と無関係であった。クローン１Ａ２および４Ａ８の抗腫瘍能を試験するために、Ｔ細胞反応性を３つのΔＮＰＭ１を伴うサンプルおよび２つのｗｔＮＰＭ１を伴うサンプルを含む５つのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性初代ＡＭＬのパネルで測定した。Ｔ細胞クローン１Ａ２は、種々の程度で全３つのΔＮＰＭ１を伴うＡＭＬに対する反応性を示し、一方クローン４Ａ８は、３つのうち２つのΔＮＰＭ１を伴うサンプルに比較的低い反応性を示した(図３Ｃ)。クローン１Ａ２によるＡＭＬに対する強いＴ細胞反応性は、初代ＡＭＬの細胞表面から溶出するシステイニル化ΔＮＰＭ１ならびに非システイニル化ΔＮＰＭ１を認識するその能力により説明される。ＷｔＮＰＭ１を伴うＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ＡＭＬ(図３Ｃ)またはΔＮＰＭ１を伴うＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陰性ＡＭＬ(データは示していない)に対するＴ細胞反応性は観察されなかった。これらのデータは、ΔＮＰＭ１に特異的であるＴＣＲを有するＴ細が健常個体のＴ細胞レパートリーに存在し、これらのＴ細胞が特にΔＮＰＭ１を伴う初代ＡＭＬ上のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１により提示される内因性ネオ抗原としてＣＬＡＶＥＥＶＳＬを認識したことを示す。
【０３５６】
初代ＡＭＬの標的ΔＮＰＭ１へのＴＣＲ遺伝子移入
ΔＮＰＭ１が、初代ＡＭＬの３０％で生じる反復性４bp挿入であり、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１がコーカサス人種集団の５０％で発現されるため、本発明者らは、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬをＴＣＲ遺伝子移入の理想的標的と考えた。初代ＡＭＬは、クローン１Ａ２により最も強く認識され、このクローンからｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡをΔＮＰＭ１に対するＴＣＲα鎖およびβ鎖の可変領域の配列に対して産生した。Ｔ細胞クローン１Ａ２により発現されるＴＲＡＶ１２−２およびＴＲＢＶ５−１のコドン最適化遺伝子配列を合成し、修飾ＭＰ７１−ＴＣＲ−ｆｌｅｘレトロウイルスベクターにクローン化した。ＴＣＲα鎖およびβ鎖の優先結合および発現を促進するために、ＴＣＲの可変領域をＰ２Ａ配列に結合したマウス定常領域とインフレームでクローン化した。ΔＮＰＭ１に対するＴＣＲおよび、対照として、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１制限ＣＭＶペプチドＮＬＶＰＭＶＡＴＶに対するＴＣＲを、健常ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性個体(ドナー１および２)からのＰＢＭＣから単離したＣＤ８およびＣＤ４細胞に導入した。形質導入６日後、ＴＣＲ形質導入ＣＤ８およびＣＤ４細胞を、マウスＴＣＲ−Ｃβに対するＡＰＣ接合抗体および磁性抗ＡＰＣビーズを使用して精製した。フローサイトメトリー分析は、ΔＮＰＭ１についてのＴＣＲで形質導入したＣＤ８細胞(ＣＤ８ФＮＰＭ１)へのΔＮＰＭ１−ＣＬＡ四量体の特異的結合を示した(図４Ａ)。対照的に、ＣＭＶ−ＮＬＶ四量体は、ΔＮＰＭ１についてのＴＣＲで形質導入したＣＤ８細胞に結合せず、一方、ＣＭＶ特異的ＴＣＲで形質導入したＣＤ８細胞(ＣＤ８ФＣＭＶ)はＣＭＶ−ＮＬＶ四量体で染色できたが、ΔＮＰＭ１−ＣＬＡ四量体ではされなかった。ＴＣＲ形質導入ＣＤ４細胞(ＣＤ４ФＮＰＭ１およびＣＤ４ФＣＭＶ)について、結果はＣＤ８細胞についてのものに類似し、ΔＮＰＭ１−ＣＬＡ四量体のＴＣＲ形質導入Ｔ細胞への結合は、ＣＤ８共受容体と無関係に生じることを示した。ＴＣＲ形質導入ＣＤ８およびＣＤ４細胞は、マウスＴＣＲ−Ｃβに対する抗体でも染色でき、ΔＮＰＭ１についてのＴＣＲで形質導入したＣＤ８およびＣＤ４細胞は、ヒトＴＣＲ−Ｖβ５.１に対する抗体にも特異的結合を示した(データは示していない)。
【０３５７】
次いで、本発明者らは、ΔＮＰＭ１についてのＴＣＲで形質導入したＣＤ８およびＣＤ４細胞の機能性を分析し、ＣＭＶペプチドＮＬＶＰＭＶＡＴＶとの共インキュベーションではなく、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬを負荷したＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性Ｔ２細胞との共インキュベーションによるＩＦＮ−γの特異的放出を示した(図４Ｂ)。ＩＦＮ−γの特異的放出は、ΔＮＰＭ１を有するＡＭＬ細胞株ＯＣＩ−ＡＭＬ３との共インキュベーションでも観察されたが、ｗｔＮＰＭ１を有するＡＭＬ細胞株ＯＣＩ−ＡＭＬ２での刺激では観察されなかった(図４Ｃ)。
【０３５８】
ＴＣＲ形質導入ＣＤ８およびＣＤ４細胞を、その後、９つのΔＮＰＭ１を伴うサンプルおよび４つのｗｔＮＰＭ１を伴うサンプルを含む１３のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性初代ＡＭＬのパネルに対する反応性について試験した。ΔＮＰＭ１についてのＴＣＲで形質導入後、ＣＤ８およびＣＤ４細胞の両者は全９つのΔＮＰＭ１を伴う初代ＡＭＬの認識を示したが、ｗｔＮＰＭを伴うＡＭＬ１の特異的認識は観察されなかった(図５)。ΔＮＰＭ１についてのＴＣＲで形質導入したＣＤ８およびＣＤ４細胞は、ΔＮＰＭ１を伴うＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陰性ＡＭＬおよびｗｔＮＰＭ１を有する成熟ＤＣに対する反応性も欠く(図６)。次に、形質導入Ｔ細胞を、ドナー１および２からの単球由来成熟ＤＣならびに強抗原処理および提示能を備えた非悪性細胞型として４０のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性第三者ＥＢＶ−ＬＣＬのパネルに対する反応性について試験した。ΔＮＰＭ１についてのＴＣＲで形質導入したＣＤ８およびＣＤ４細胞は成熟ＤＣまたはＥＢＶ−ＬＣＬを認識できず、ｗｔＮＰＭ１遺伝子の選択的翻訳が生じず、この遺伝子がＣＬＡＶＥＥＶＳＬを模倣するペプチドを産生しないことを示した。要約すると、データは、ＣＤ８およびＣＤ４細胞への遺伝子移入により、ΔＮＰＭ１についてのＴＣＲは、ΔＮＰＭ１を伴う初代ＡＭＬ上のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１により提示される内因性ネオ抗原としてＣＬＡＶＥＥＶＳＬの特異的認識をもたらす。
【０３５９】
最後に、本発明者らは、初代ＡＭＬに対するＴＣＲ形質導入ＣＤ８およびＣＤ４細胞の細胞溶解能を試験した。ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞を、９時間５１クロム放出アッセイで４つのΔＮＰＭ１を伴うサンプルおよび２つのｗｔＮＰＭ１を伴うサンプルを含む６つのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性初代ＡＭＬのパネルで試験した。ΔＮＰＭ１についてのＴＣＲで形質導入したＣＤ８およびＣＤ４細胞両者は、ΔＮＰＭ１を伴うＡＭＬの特異的溶解を示したが、ｗｔＮＰＭを伴うＡＭＬ１は示さなかった(図７)。結論として、結果は、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬが、共受容体非依存的様式でＴＣＲ遺伝子移入により効率的に標的とされ得るΔＮＰＭ１を伴う初代ＡＭＬに発現される治療的ネオ抗原であることを示す。
【０３６０】
考察
本発明者らは、初代ＡＭＬのＨＬＡクラスＩリガンドームにおけるΔＮＰＭ１(ＣＬＡＶＥＥＶＳＬ)によりコードされるＨＬＡ−Ａ＊０２：０１制限９量体ペプチドを同定した。このペプチドに特異的なＴＣＲを有するＴ細胞クローンを健常個体から単離し、このクローンの一つからのＴＣＲは、ＣＤ８およびＣＤ４細胞へのレトロウイルス導入によりΔＮＰＭ１を伴う初代ＡＭＬの特異的認識および溶解を示し、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬが、共受容体非依存的様式でＴＣＲ遺伝子移入により標的とされ得るＡＭＬ上の治療的ネオ抗原であることを示す。
【０３６１】
１２の初代ＡＭＬのＨＬＡクラスＩリガンドームデータを使用して、本発明者らは、内因性に処理され、ΔＮＰＭ１を伴うＡＭＬに提示されるペプチドとしてＣ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬを同定した。システイニル化の非存在下では、溶出ペプチドと合成ペプチドにマッチは見られないが、データは、非システイニル化ＣＬＡＶＥＥＶＳＬペプチドもＡＭＬに提示される強い証拠を示す。ＴＣＲクローニングおよび遺伝子移入のために選択したクローン１Ａ２は、合成Ｃ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬおよびＣＬＡＶＥＥＶＳＬペプチド両者を認識した。本クローンは両ｐＭＨＣ四量体でも染色されたが、四量体とシステイニル化ペプチドの結合は弱かった。セリン置換した合成ペプチドを試験した実験で、エピトープの第一残基がクローン１Ａ２の反応性に必須ではないことが確認された。しかしながら、クローン４Ａ８について、結果は異なった。クローン４Ａ８はＣＬＡＶＥＥＶＳＬを認識したが、Ｃ＊ＬＡＶＥＥＶＳＬはせず、非システイニル化ペプチドを有するｐＭＨＣ四量体のみＴ細胞クローンに結合できた。Ｔ細胞認識のためのペプチドの第一残基の重要性は、第一残基がセリンに置換された合成ペプチドに対するクローン４Ａ８の反応性の欠如によって確認された。顕著なことに、システイニル化ペプチドが認識できないにも関わらず、クローン４Ａ８は、３のΔＮＰＭ１を伴うＡＭＬの２つに反応性を示した。クローン１Ａ２および４Ａ８のこの反応性パターンに基づき、本発明者らは、システイニル化ならびに非システイニル化ΔＮＰＭ１ペプチドバリアントが細胞表面に発現されるが、エピトープの発現レベルはＡＭＬ間で異なり得ることを示唆した。ＨＬＡクラスＩリガンドームにＣＬＡＶＥＥＶＳＬがない理由は不明であるが、低表面発現または溶出ペプチドのマススペクトルの品質の低さにより説明され得る。
【０３６２】
興味深いことに、ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３遺伝子(ＦＬＴ３−ＩＴＤ)における随伴性内部タンデム重複非存在下でΔＮＰＭ１を担持する患者は、化学療法後の生存が改善し、それ故に、しばしば同種幹細胞移植の必要性が回避される１, ２, ５, １３。ΔＮＰＭ１由来ペプチドに対するインビボ免疫応答は、特にΔＮＰＭ１タンパク質が、核小体から、プロテアソーム分解および続くＨＬＡクラスＩ抗原提示経路による処理に感受性である細胞質に移行するため、この好ましい予後を強調する６。Greiner et al.１４はインビトロで健常ボランティアおよびＡＭＬの患者における、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬを含むΔＮＰＭ１由来の９つのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１制限ペプチドに対するＴ細胞応答をサーチした。ＣＤ８細胞とペプチド負荷ＰＢＭＣの共培養後、９ペプチド中２個に対するＴ細胞応答が、健常ボランティアおよび患者両者で示されたが、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬに対する免疫応答は測定されなかった。彼らは、続いてΔＮＰＭ１  ＡＭＬを有する２５患者をスクリーニングし、これらの２つのΔＮＰＭ１由来ペプチドに対して免疫応答を有する患者の全生存が、免疫応答がない患者より優位に高いことを確認した１５。しかしながら、この試験でスクリーニングした患者数は少なく、ＦＬＴ３変異状態は決定されなかった。最近のデータは、ＦＬＴ３−ＩＴＤを有する患者、特に高アレル比の変異対野生型ＦＬＴ３遺伝子発現を有する患者は、ＮＰＭ１変異状態と無関係に、ＦＬＴ３−ＩＴＤがない患者に比して予後が悪いことを示す１３。この観察は、ΔＮＰＭ１に対する免疫応答のインビボ誘導が好ましい予後を支持することを強化するが、好ＡＭＬ腫瘍増殖のための内因性因子の重要性およびましくない予後を有するＡＭＬを処置するためのΔＮＰＭ１  ＴＣＲ遺伝子治療の関連性を支持する。
【０３６３】
ＡＭＬは、数ドライバー変異のみを有する数百の体細胞変異を担持する単一創始クローンから生じる。サブクローンは、細胞に生存優位性を与えるさらなる変異の蓄積により、創始クローンから出現し得る。その結果、サブクローンにおける変異の大部分は、創始クローンにより共有され、少数はクローン特異的である。ＡＭＬのこの不均一組成は、誘導または地固め治療後の永続性または再発性疾患におけるクローン進化の機会を増やす。共有される変異から生じるネオ抗原のターゲティングは、創始クローンならびにサブクローンの根絶のための魅力的免疫療法戦略である。パッセンジャー変異から生じるネオ抗原は、Ｔ細胞による腫瘍の免疫編集の結果として容易に喪失され得て、腫瘍免疫回避をもたらす。免疫回避は、ドライバー変異により産生されたネオ抗原が標的であるとき、これらが悪性形質転換に必須であり、全腫瘍細胞に提示されるため、生じる可能性が低い１６。現在まで、ドライバー変異により生じる数ネオ抗原しか同定されておらず、その中で、変異体ＫＲＡＳが膵臓癌の４５％および結腸直腸癌の１３％で発現される抗原である１７。ドライバー変異により生じネオ抗原のる免疫回避の可能性は低いが、Tran et al. は、転移結腸直腸癌を有する患者における、ＨＬＡ−Ｃ＊０８：０２喪失による、変異体ＫＲＡＳのＴＣＲ遺伝子治療からの回避を示している。なお、白血病誘発初期に生じるクローンドライバー変異としてのΔＮＰＭ１は、免疫療法の魅力的標的のままである。ΔＮＰＭ１はまた初代ＡＭＬの３０％というその高変異頻度に基づき、理想的標的でもある６。特徴的４bpフレームシフト挿入は、翻訳領域配列の限られた数の位置(８５９、８６０および８６１)で生じ、正確な４bp配列は異なり得るが、変異の大部分は、同じ１１アミノ酸オルターナティブリーディングフレーム(ＣＬＡＶＥＥＶＳＬＲＫ)をコードする。本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１におけるこのオルターナティブリーディングフレームの最初の９残基をターゲティングするＴＣＲを同定した。このＴＣＲは、ΔＮＰＭ１を伴うＡＭＬの患者の処置のための将来的遺伝子治療に使用され得る。臨床試験は、ΔＮＰＭ１  ＴＣＲ遺伝子治療の有効性および潜在的毒性およびＨＬＡ−Ａ＊０２：０１の喪失による免疫回避が、ＡＭＬの長期寛解を妨害する重要なものであるか否かを示す。
【０３６４】
クローン１Ａ２から単離されたＴＣＲは、ＣＤ８ならびにＣＤ４細胞への導入によりΔＮＰＭ１を有するＨＬＡ−Ａ＊０２：０１陽性ＡＭＬ細胞の特異的認識および溶解に介在することが示され、該ＴＣＲが共受容体非依存的様式でＡＭＬに免疫反応性を再指向させ得ることが示される。抗腫瘍免疫におけるＣＤ４細胞の重要な役割は、最近数十年でより明白になってきている。伝統的に、ＣＤ４細胞はＣＤ８細胞の補助を提供し、腫瘍排除改善および免疫学的記憶の誘導をもたらすことが知られている。しかしながら、ＣＤ４細胞がＣＤ８細胞非存在下でも腫瘍拒絶に介在し得ることを示唆する証拠が増えている。ＣＤ８枯渇同種骨髄移植またはドナーリンパ球注入を受けた血液系腫瘍を有する患者は、非修飾幹細胞移植またはドナーリンパ球を受けた患者と類似する移植片対白血病応答を発症し、一方移植片対宿主疾患の発生率および重症度は低減した。自己状況において、ＨＬＡクラスII制限腫瘍関連抗原またはネオ抗原に対するＣＤ４細胞の養子移植は、それぞれ転移黒色腫および胆管細胞癌を有する患者の腫瘍退縮をもたらした１８。しかしながら、腫瘍がしばしばＨＬＡクラスIIを発現しないため、ＨＬＡクラスIIに無関係な抗原−受容体を発現するＣＤ８およびＣＤ４細胞の混合物の投与が好ましく、優れた抗腫瘍免疫をもたらす可能性がある。実際、Turtle et al.１９、２０は、同じＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体を発現する一定比のＣＤ８およびＣＤ４細胞の投与が、再発性または難治性Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫およびＢ細胞急性リンパ芽球性白血病を有する患者の相当数で完全寛解をもたらしたことを示した。同様に、マウスで先に示されたとおり、ＣＬＡＶＥＥＶＳＬのようなＨＬＡクラスＩ制限エピトープを指向する同一ＴＣＲを発現するＣＤ８およびＣＤ４細胞の養子移植は、強力な抗腫瘍免疫に至り得る。
【０３６５】
近年、ΔＮＰＭ１は、ＡＭＬの患者における微小残存病変を測定する信頼できるマーカーとして記載されている２１。化学療法後の患者の末梢血における定量的ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるΔＮＰＭ１転写物残存が、３年間のフォローアップ内の疾患再発と相関した。ΔＮＰＭ１の予後価値は、ＦＬＴ３−ＩＴＤまたは変異ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３アルファ(ＤＮＭＴ３Ａ)などの存在のような他のリスク因子と無関係であることが示された１、２、５、１３。著者らにとって重要な知見は、診断時好ましい分子署名(無ＦＬＴ３−ＩＴＤまたは変異ＤＮＭＴ３Ａ)を有した患者における二回目の化学療法サイクル後のΔＮＰＭ１の存在転写物が、比較的予後が悪い患者の群を特徴付け、一方、好ましくない分子プロファイル(ＦＬＴ３−ＩＴＤ、変異ＤＮＭＴ３Ａまたは両者)を有する患者における二回目の化学療法サイクル後のΔＮＰＭ１転写物の非存在が、比較的予後良好な患者で顕著であったことである２１。それ故に、疾患状態のマーカーとしてのΔＮＰＭ１を使用して、ａｌｌｏＳＣＴに適格な患者を選択することを可能とし、化学療法後の永続性または再発性疾患を処置するためのΔＮＰＭ１  ＴＣＲ遺伝子治療のための患者の最適時機および選択を可能にする。最終的に、臨床試験がＡＭＬが低処置関連死亡率でΔＮＰＭ１  ＴＣＲ遺伝子移入により効率的に処置され得ることを示したとき、診断時の有害分子異常または化学療法後の検出可能な永続性または再発性疾患に基づき、予後不良なΔＮＰＭ１  ＡＭＬを有する患者のための標準的治療としてａｌｌｏＳＣＴにとって変わり得て、それによりＡＭＬの患者の全生存が改善され得る。
【０３６６】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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