(57)【要約】本発明は、リンパ腫細胞のクラスターを取り囲むヒドロゲルカプセルを含む細胞微小区画の調製方法に関する。本発明はまた、かかる細胞微小区画および抗癌分子をスクリーニングするためのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロゲル層中に封入された悪性造血細胞を含有する細胞の凝集体を含む細胞微小区画の調製方法であって、ヒドロゲル溶液および悪性造血細胞を含む細胞溶液が同心円状に共押出され、次いで架橋される、方法。
【請求項２】
該悪性造血細胞がリンパ腫細胞である、請求項１に記載の細胞微小区画の調製方法。
【請求項３】
該細胞溶液が、リンパ系間質細胞および細胞外マトリックスをさらに含む、請求項２に記載の細胞微小区画の調製方法。
【請求項４】
該悪性造血細胞が白血病細胞である、請求項１に記載の細胞微小区画の調製方法。
【請求項５】
該細胞溶液が、髄質間質細胞および細胞外マトリックスをさらに含む、請求項４に記載の細胞微小区画の調製方法。
【請求項６】
該細胞溶液における細胞密度が１０・１０６から１００・１０６細胞／ｍＬであり、および／または該細胞溶液中の悪性造血細胞と間質細胞との数比が１：１から１：２である、請求項１−５のいずれか一項に記載の細胞微小区画の調製方法。
【請求項７】
該細胞溶液が、１から９０ｖｏｌ％の細胞および１０から９９ｖｏｌ％の細胞外マトリックスを含む、請求項３または５に記載の細胞微小区画の調製方法。
【請求項８】
請求項１−７のいずれか一項に記載の細胞微小区画の調製方法であって、
−該ヒドロゲル溶液に＋２ｋＶの電位を適用すること；および／または
−共押出手段および架橋溶液の間に電場を生成すること
から構成される追加の工程を含む、方法。
【請求項９】
請求項１−８のいずれか一項に記載の細胞微小区画の調製方法であって、
−該細胞微小区画を凍結すること；および／または
−該細胞微小区画のヒドロゲルカプセルを加水分解して、細胞凝集体を回収すること
から構成される後の工程を含む、方法。
【請求項１０】
請求項１−９のいずれか一項に記載の方法により得ることができる細胞微小区画であって、該微小区画の内部体積に拘束された凝集クラスターを形成する細胞の凝集体を含む閉じた三次元構造を形成し、前記凝集体が、少なくとも外側のヒドロゲル層中に封入された悪性造血細胞を含む、細胞微小区画。
【請求項１１】
ヒドロゲル層中に封入されたリンパ腫細胞の凝集体、またはヒドロゲル層中に封入された白血病細胞の凝集体からなる、請求項１０に記載の細胞微小区画。
【請求項１２】
該細胞微小区画が、該細胞凝集体と該ヒドロゲル層との間に細胞外マトリックス層をさらに含み、該細胞凝集体が、間質細胞、好ましくはＲｅｓｔｏ間質細胞をさらに含む、請求項１０に記載の細胞微小区画。
【請求項１３】
細胞凝集体中の悪性造血細胞と間質細胞との数比が１：１から１０００：１である、請求項１２に記載の細胞微小区画。
【請求項１４】
外側の層がアルギン酸塩を含む、請求項１０−１３のいずれか一項に記載の細胞微小区画。
【請求項１５】
該リンパ腫細胞が、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、未分化リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織のリンパ腫（ＭＡＬＴ）、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓のリンパ腫、皮膚Ｂ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫の細胞株または精製腫瘍細胞から選択される、請求項１１に記載の細胞微小区画。
【請求項１６】
５０μｍから１０００μｍ、優先的には１５０μｍから３００μｍ、または５００μｍから６００μｍの直径または最小寸法を有する、請求項１０−１５のいずれか一項に記載の細胞微小区画。
【請求項１７】
細胞密度が、微小区画あたり百から数千個の細胞、優先的には１００から１０，０００個の細胞である、請求項１０−１６のいずれか一項に記載の細胞微小区画。
【請求項１８】
ヒドロゲル層中に封入された細胞の凝集体を含む細胞微小区画であって、該細胞の凝集体が、リンパ腫細胞または白血病細胞などの悪性造血細胞および間質細胞を含み、該微小区画が、細胞の凝集体とヒドロゲル層との間に細胞外マトリックス層をさらに含む、細胞微小区画。
【請求項１９】
リンパ腫の処置のための化合物のスクリーニングまたは同定方法であって、以下の工程：
（ａ）所望により、請求項１０−１８のいずれか一項に記載の細胞微小区画のヒドロゲル層を溶解すること；
（ａ’）該細胞微小区画をテストされる化合物と接触させること；
（ｂ）該細胞微小区画の細胞凝集体の成長を少なくとも部分的に阻害し、および／または該細胞微小区画の細胞凝集体の細胞を少なくとも部分的に殺すことができる化合物を選択すること
を含む、方法。
【請求項２０】
リンパ腫または白血病などの悪性血液障害の処置のための化合物をスクリーニングまたは同定するための、請求項１０−１８のいずれか一項に記載の細胞微小区画の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性造血細胞を含む細胞微小区画の調製方法に関する。本発明はまた、かかる細胞微小区画、および特に医薬分野における、悪性血液障害を処置する可能性のある目的の分子をスクリーニングおよび同定するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血組織の癌または悪性血液障害は、血液系の細胞の増殖および分化の障害を特徴とする。最も一般的な悪性血液障害は、白血病およびリンパ腫である。
【０００３】
白血病は骨髄細胞の癌であり、赤血球、正常な白血球、および血小板を損なうほど、完全には分化していない白血球前駆体の異常かつ大量の増殖を特徴とする。白血病の４つの主なタイプ：急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）がある。
【０００４】
リンパ腫は、二次リンパ器官において発生するリンパ系の癌の群であり、リンパ系のすべての部分に拡がることができる。リンパ腫の２つの主なタイプ：ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）がある。ＮＨＬは、先進国において４０年間発生率が増加している癌であり、頻度の点で癌の中で１０位にランクする。
【０００５】
多くの場合化学療法および免疫療法を組み合わせている現在利用可能な処置は、多くの耐性または再発の存在のため、患者の一部において有効であるのみである。これに対する１つの理由は、候補分子をテストするための関連細胞モデルの欠如である。実際、現在、候補分子は、懸濁液中（非接着細胞の場合）または単層中（接着細胞の場合）で、細胞株上でｉｎ  ｖｉｔｒｏでテストされる。これらの２次元（２Ｄ）細胞モデルは、腫瘍内の細胞とは異なり、すべての細胞が栄養素および酸素、ならびに候補分子に同一にアクセスできるため、リンパ腫を代表しない。加えて、リンパ腫は、可溶性の膜分子を介して細胞外マトリックス中で互いに相互作用し、生体力学的力を受けるいくつかのタイプの細胞（微小環境細胞およびリンパ腫細胞）を含む二次リンパ器官内で形成および進化する。すべてのこれらの要素は、リンパ腫の発症に影響を及ぼすが、処置に対する反応にも影響を及ぼす。しかしながら、２Ｄモデルは、これらの現象を再現することを可能にせず、したがってリンパ腫の生理病理学的プロセスを弱く代表するのみである。
【０００６】
これらの２Ｄモデルの欠点を克服するために、ヒトの癌細胞が移植または注入される動物モデルが開発された。しかしながら、かかる動物モデルは高価で、再現が難しく、そして一般にヒトの悪性血液障害の生理学的現象を代表しない。
【０００７】
最近、三次元（３Ｄ）癌細胞培養が開発された。これらの３Ｄ培養は、癌の進行のメカニズムを研究し、そして癌処置をより良くテストするために特に魅力的である。実際、マトリックス内または凝集体中で３Ｄにおいて成長した細胞は、組織および腫瘍により近い構造を有し、そしてｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍の遺伝子の発現に類似する遺伝子の発現を示す(Gravelle et al., 2014, Am. J. Pathol. 184:2082-295; Weiswald et al., 2009, Br. J. Cancer 101:473-482)。加えて、癌細胞／間質細胞の相互作用を模倣する３Ｄ共培養モデルは、腫瘍ニッチを少なくとも部分的に再現し、そして腫瘍の進行または薬剤耐性への影響を研究することを可能にする。
【０００８】
３Ｄリンパ腫培養の開発に関して、いくつかの技術が開発された。一般に、３Ｄリンパ腫モデルは、コラーゲンスポンジ(Kobayashi et al. 2010. Trends Immunol. 31:422-428)、いわゆるハンギングドロップ技術(Gravelle et al. 2014. Am. J. Pathol. 184:282-295)、またはポリスチレン構造(Caicedo-Carvajal et al. 2011. J. Tissue Eng 2011:362326)を使用して得られる。しかしながら、これらの技術は、コストおよび再現性の両方の点で多くの欠点を有し、新しい医薬品の産業規模の研究にほとんど関連性がない。加えて、開発された３Ｄ培養は、腫瘍微小環境のいずれの要素も統合せず、ゆえに関連性が制限される。
【０００９】
ゆえに、病的生理学的におよび／または悪性血液障害の機械的特性の点で代表的であり、そして過剰なコスト無しで大規模に製造できる３Ｄ細胞培養システムに対する必要性が残る。
【発明の概要】
【００１０】
リンパ腫の、およびｉｎ  ｖｉｖｏで受ける生物学的および機械的現象の最も代表的な３Ｄ細胞培養システムの開発に取り組むことにより、発明者らは、共押出システムを使用して、少なくとも外側のヒドロゲルカプセルに囲まれた悪性造血細胞を含む細胞微小区画を、自動化され再現可能な様式で作り上げることが可能であることを発見した。より正確には、本発明者らは、ヒドロゲル溶液を、リンパ腫細胞、および所望によりリンパ系間質細胞、すなわちリンパ腫に浸潤する間質細胞に近いもの、ならびに細胞外マトリックスを含む細胞溶液と共押出することにより、該細胞が、ヒドロゲルカプセル内で凝集して、リンパ腫内の細胞組織化に近似する、細胞塊に組織化することを発見した。加えて、本発明者らは、悪性造血細胞と共押出される細胞のタイプに応じて、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍ニッチを模倣する腫瘍ニッチを再現することが可能であることを発見した。ゆえに、細胞の性質および細胞間相互作用が、リンパ腫性または白血病性腫瘍ニッチにおいて観察されるものと実質的に類似する微小区画を得ることが可能である。本発明に従って開発される細胞微小区画は、特にリンパ腫および／または白血病の処置のための新しい候補分子のスクリーニングおよび同定に、悪性血液障害の３Ｄモデルとして特に関連する。加えて、本発明による方法は、完全に制御された次元の非常に大量の微小区画を得ることを可能にする。得られた微小区画は扱いやすく、特に医薬分野における大規模な使用に特に適している。
【００１１】
したがって、本発明の主題は、ヒドロゲル層中に封入された悪性造血細胞を含有する細胞の凝集体を含む細胞微小区画の調製方法であって、ヒドロゲル溶液および悪性造血細胞を含む細胞溶液が同心円状に共押出され、次いで架橋される方法である。
【００１２】
有利には、細胞溶液は、リンパ腫細胞または白血病細胞を含む。
【００１３】
細胞の相互作用および組織化の点で、腫瘍ニッチに近似する細胞微小区画を得るために、細胞溶液中で間質細胞および細胞外マトリックスを提供することも可能である。
【００１４】
本発明の別の主題は、ヒドロゲル層中に封入された少なくとも悪性造血細胞を含む細胞の凝集体を含む、本発明による方法により得ることができる細胞微小区画である。
【００１５】
本発明によれば、細胞微小区画は、ヒドロゲル層中に封入された細胞の単一凝集体からなる。
【００１６】
一実施形態において、該微小区画は、ヒドロゲル層中に封入されたリンパ腫細胞のみからなる細胞の凝集体を含む。別の実施形態において、微小区画は、ヒドロゲル層中に封入された白血病細胞のみからなる細胞の凝集体を含む。
【００１７】
別の実施形態において、該微小区画は、特にリンパ腫細胞およびリンパ系間質細胞から構成される細胞の凝集体、ならびに細胞の凝集体とヒドロゲル層との間の細胞外マトリックス層を含む。
【００１８】
別の実施形態において、該微小区画は、特に白血病細胞および髄質間質細胞から構成される細胞の凝集体、ならびに細胞の凝集体とヒドロゲル層との間の細胞外マトリックス層を含む。
【００１９】
本発明はまた、ヒドロゲル層中に封入された細胞の凝集体を含む細胞微小区画であって、該細胞の凝集体が、リンパ腫細胞または白血病細胞などの悪性造血細胞および間質細胞を含み、該細胞微小区画が、細胞の凝集体とヒドロゲル層との間に細胞外マトリックス層をさらに含む、細胞微小区画に関する。
【００２０】
本発明の別の主題は、リンパ腫の処置および／または予防のための化合物のスクリーニングまたは同定方法であって、以下の工程：
（ａ）場合によりヒドロゲル層無しで、本発明による細胞微小区画をテストされる化合物と接触させること；
（ｂ）該細胞微小区画の細胞凝集体の成長を少なくとも部分的に阻害し、および／または該細胞微小区画の細胞凝集体の細胞を少なくとも部分的に殺すことができる化合物を選択することを含む方法である。
【００２１】
有利には、かかるスクリーニング方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。
【００２２】
本発明の別の主題は、リンパ腫または白血病などの悪性血液障害の処置のための化合物をスクリーニングまたは同定するための、本発明による細胞微小区画の使用である。
【００２３】
有利には、スクリーニングのためのかかる使用は、インビトロでの使用である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】図１：アルギン酸塩カプセル中へのＳＵＤＨＬ４およびＨＬＹ１リンパ腫細胞の封入。ＳＵＤＨＬ４およびＨＬＹ１細胞はＧＦＰを発現する。図１Ａは、封入後の異なる時間（Ｄ１−Ｄ１１）での位相差および蛍光におけるカプセルの画像を示し、該画像はＯｌｙｍｐｕｓ  ＣＫＸ４１顕微鏡（１０ｘ対物レンズ）で取得される。図１Ｂは、ＩｍａｇｅＪ（登録商標）ソフトウェアを使用して、写真からアルギン酸塩カプセル内の細胞クラスターについて測定された成長曲線を示す。
【図１Ｂ】図１：アルギン酸塩カプセル中へのＳＵＤＨＬ４およびＨＬＹ１リンパ腫細胞の封入。ＳＵＤＨＬ４およびＨＬＹ１細胞はＧＦＰを発現する。図１Ａは、封入後の異なる時間（Ｄ１−Ｄ１１）での位相差および蛍光におけるカプセルの画像を示し、該画像はＯｌｙｍｐｕｓ  ＣＫＸ４１顕微鏡（１０ｘ対物レンズ）で取得される。図１Ｂは、ＩｍａｇｅＪ（登録商標）ソフトウェアを使用して、写真からアルギン酸塩カプセル内の細胞クラスターについて測定された成長曲線を示す。
【００２５】
【図２】図２：リンパ腫または白血病細胞のみ（Ａ）またはリンパ腫または白血病細胞、および間質細胞（Ｂ）を含む、本発明による細胞微小区画の形成。１：ヒドロゲルカプセル、２：カプセルルーメン、３：リンパ腫細胞、４：成長期、５：リンパ腫細胞のクラスターを含むヒドロゲルカプセル、６：ヒドロゲルカプセル溶解工程、７：リンパ腫細胞クラスター、８：細胞外マトリックス層、９：間質細胞、１０：成長期、１１：リンパ腫細胞および間質細胞のクラスターを含むヒドロゲルカプセル、１２：リンパ腫細胞および間質細胞のクラスター。
【００２６】
【図３】図３：ＤＯＨＨ２濾胞性リンパ腫細胞およびリンパ系間質細胞(Resto, Ame-Thomas Blood 2007; 109:693)のクラスターをＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の内側の層でコーティングされたアルギン酸塩カプセル中に含む、封入後Ｄ９での細胞微小区画。画像は、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ８顕微鏡（１０ｘ対物レンズ）を使用して、位相差において得られた。
【００２７】
【図４】図４：ＤＯＨＨ２濾胞性リンパ腫細胞のクラスター（Ａ）およびＤＯＨＨ２濾胞性リンパ腫細胞およびＲｅｓｔｏ細胞のクラスター（Ｂ）を含む細胞微小区画のアルギン酸カプセルの封入後Ｄ９での溶解。
【００２８】
【図５】図５：異なる封入時間後のＳＵＤＨＬ４リンパ腫細胞（５Ａ）またはＨＬＹ１リンパ腫細胞（Ｂ）を含む細胞クラスター中の死細胞のフローサイトメトリー分析。
【００２９】
【図６】図６：リンパ腫細胞の成長に対する間質腫瘍ニッチの追加効果の分析。Ｒｅｓｔｏ細胞のみ（Ａ）、ＤＯＨＨ２リンパ腫細胞のみ（Ｂ）、Ｒｅｓｔｏ細胞およびＤＯＨＨ２リンパ腫細胞（Ｃ）を含むＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の内側の層でカバーされたアルギン酸塩カプセル中の細胞微小区画の画像。該画像は、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ８顕微鏡（１０ｘ対物レンズ）を使用して、位相差において得られた。スケールバーは、すべての３つの画像について同じである。
【００３０】
【図７】図７：リンパ腫細胞のみを含む本発明による細胞微小区画からのＨＬＹ１細胞の懸濁液（懸濁液）またはＨＬＹ１細胞のクラスターを、エトポシド（μｇ／ｍＬ）またはシスプラチン（μＭ）の増加する用量と、４８時間接触させた後の細胞死に対するエトポシド（Ａ）およびシスプラチン（Ｂ）の比較効果。
【００３１】
【図８】図８：間質細胞の前腫瘍リンパ間質への分化を示している細胞微小区画。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の内側の層でコーティングされたアルギン酸塩カプセル中にＤＯＨＨ２濾胞性リンパ腫細胞およびＲｅｓｔｏリンパ間質細胞のクラスターを含む、封入後Ｄ８での細胞微小区画。ＣＤ２０（Ｂリンパ球を明らかにする）、ＧＦＰ（Ｒｅｓｔｏ細胞を明らかにする）およびＴＧ２染色は、固定したパラフィン包埋スフェロイド上で実施された。画像は、ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡、２０ｘ対物レンズの下で撮られた。右側の画像は、初めの３つの画像の重ね合わせである。矢印は、ＴＧ２を発現しているＲｅｓｔｏ（ＧＦＰ＋）細胞を示す。
【００３２】
【図９】図９：懸濁液中またはスフェロイド中で成長したＳＵＤＨＬ４細胞におけるドキソルビシンの拡散の研究。懸濁液中で成長した、または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）（Ｍｇ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ）およびＲｅｓｔｏ細胞有りまたは無しで３Ｄにおいて成長した７日後のＳＵＤＨＬ４細胞は、ドキソルビシン（１μＭ）で２４時間処理される。３Ｄ成長細胞の解離後、該細胞の蛍光強度がフローサイトメトリーで分析された。
【００３３】
【図１０】図１０：細胞微小区画中への抗体の浸透を示す代表的な画像。Ａ）抗ＣＤ１９−ＰＥ  ＡＢによる染色。Ａａ）ＥＣＭおよびＲｅｓｔｏ間質細胞の存在下で３Ｄにおいて成長したＤＯＨＨ２濾胞性リンパ腫細胞（ＳＣ−ＧＦＰ＋）を含有する微小区画。Ａｂ）ＥＣＭの存在下で３Ｄにおいて成長したＤＬＢＣＬ  ＳＵＤＨＬ４細胞を含有する微小区画。Ｂ）リツキシマブ（ＲＴＸ）−６３３による染色。Ｂａ）Ｂｂ）において可視化された、ＥＣＭおよびＲｅｓｔｏ間質細胞の存在下で３Ｄにおいて成長したＤＯＨＨ２濾胞性リンパ腫細胞（ＳＣ−ＧＦＰ＋）を含有する微小区画。カプセルは、ＡＢとともに１２時間インキュベートされ、次いで、２５ｘ対物レンズを有するＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡により画像化される。核はＤＡＰＩにより青く染色される。該カプセルの輪郭が見える（画像上の周辺の線）。
【００３４】
【図１１】図１１：２Ｄ中（懸濁液）または３Ｄ±ＥＣＭ±Ｒｅｓｔｏ中で成長したＤＬＢＣＬ  ＳＵＤＨＬ４細胞に対するドキソルビシンおよびエトポシドの細胞毒性効果の比較。封入後Ｄ７での細胞またはスフェロイドは、薬剤により４８時間処置される。該処置の最後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）３Ｄ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞生存能力が測定される。
【００３５】
【図１２】図１２：セザリーリンパ腫を有する患者からの初代培養のＴリンパ球からの時間の関数としての本発明による細胞微小区画の形成。封入後の異なる培養時間で、細胞は、生細胞を可視化するためにカルセイン−ＡＭにより染色され、そして死細胞を可視化するためにヨウ化プロピジウム（ＰＩ）により染色される。核は、ＤＡＰＩにより染色される。スフェロイドが非常に高密度である場合、封入の１０日後（Ｄ１０）に細胞死の増加が認められる。
【００３６】
発明の詳細な説明
細胞微小区画
本発明の主題は、ヒドロゲルシェル中に封入された悪性造血細胞の凝集体またはクラスターを含む３Ｄ細胞微小区画である。
【００３７】
本発明の文脈において、「ヒドロゲル層」、「ヒドロゲルカプセル」または「ヒドロゲルシェル」なる語は、液体、優先的には水により膨潤したポリマー鎖のマトリックスから形成される三次元構造を指す。有利には、ヒドロゲル層中の１つまたは複数のポリマーは、温度、ｐＨ、イオンなどの刺激にさらされたときに架橋できるポリマーである。有利には、使用されるヒドロゲルは、細胞に対して毒性がないという意味で生体適合性である。加えて、ヒドロゲル層は、細胞微小区画中に含有される細胞に酸素および栄養分の拡散を与えるのを可能にし、そしてそれらが生存するのを可能にしなければならない。有利には、該ヒドロゲル層はまた、医薬分子などの分子がテストのために通過することを可能にする。ヒドロゲル層中のポリマーは、天然または合成起源であることができる。例えば、外側のヒドロゲル層は、ポリスチレンスルホン酸ナトリウムなどのスルホネートポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレングリコールジアクリレートなどのアクリレートポリマー、化合物ゼラチンメタクリレート、多糖類、特にジェランガムなどの細菌起源の多糖類、またはペクチンまたはアルギン酸塩などの植物起源のもののうちの１つ以上のポリマーを含有する。一実施形態において、外側のヒドロゲル層は、少なくともアルギン酸塩を含む。好ましくは、該外側のヒドロゲル層は、アルギン酸塩のみを含む。本発明の文脈において、「アルギン酸塩」は、β−Ｄ−マンヌロン酸塩（Ｍ）およびα−Ｌ−グルロン酸塩（Ｇ）、その塩および誘導体から形成される線状多糖類を指す。有利には、アルギン酸塩は、アルギン酸ナトリウムであり、８０％を超えるＧおよび２０％未満のＭで構成され、１００から４００ｋＤａの平均分子量（例えばＰＲＯＮＯＶＡ（登録商標）ＳＬＧ１００）および密度（重量／体積）による０．５％から５％の総濃度を有する。
【００３８】
有利には、ヒドロゲル層は、必要に応じて、細胞凝集体の構造に影響を与えることなくヒドロゲル層が包む細胞凝集体からの該ヒドロゲル層の分離またはその分解を促進するために、天然多糖類（例えばアルギン酸ナトリウム）などの細胞忌避性ポリマー、またはポリエチレングリコール単位を含むポリマーを含む。
【００３９】
本発明による細胞区画は、ヒドロゲルシェルの内部体積における、細胞が相互作用する凝集性クラスター中で組織化された細胞の凝集体の存在を特徴とする。
【００４０】
本発明によれば、細胞凝集体は悪性造血細胞を含む。「悪性造血細胞」なる語は、リンパ系前駆細胞（すなわち、リンパ球）または骨髄系前駆細胞（すなわち、赤血球、白血球、血小板）の分化から生じる癌細胞を指す。優先的に、本発明の文脈において、悪性造血細胞は、リンパ腫細胞および白血病細胞から選択される。
【００４１】
本発明の特定の実施形態によれば、外側のヒドロゲルシェル中に含有される細胞凝集体は、リンパ腫細胞を含む。本発明の文脈において、「リンパ腫細胞」は、悪性リンパ系細胞を指す。有利には、リンパ腫細胞は、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、未分化リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）のリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、および／または脾臓のリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｂ細胞リンパ腫から選択される。
【００４２】
本発明の別の特定の実施形態によれば、外側のヒドロゲルシェル中に含有される細胞凝集体は白血病細胞を含む。本発明の文脈において、「白血病細胞」は、悪性血液細胞を指す。特に、白血病細胞は、急性骨髄芽球性白血病細胞、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、急性白血病から選択することができる。
【００４３】
本発明によれば、悪性造血細胞は、細胞モデルに由来することができるが、患者から得られてもよい。特定の患者からのリンパ腫細胞または白血病細胞の使用は、該患者のリンパ腫または白血病の処置に特に適した１つまたは複数の分子を同定するために、オーダメイド医療の文脈において、特に興味深い可能性がある。この場合、患者の腫瘍細胞は、使用前に有利に精製される。有利には、細胞培養への抗体の導入を避けるために、精製はネガティブセレクションにより行われる。
【００４４】
一実施形態において、細胞微小区画の細胞凝集体は、リンパ腫細胞のみを含む。ヒドロゲルカプセル内の凝集性細胞クラスターへのリンパ腫細胞の組織化は、リンパ腫の細胞内で観察される耐性に近似する外部分子の浸透に対する耐性を該細胞に与える。
【００４５】
別の実施形態において、細胞微小区画の細胞凝集体は、白血病細胞のみを含む。
【００４６】
別の実施形態において、および腫瘍ニッチを組織学的に近似するために、細胞凝集体は、悪性造血細胞に加えて間質細胞を含む。選択された間質細胞の性質は、関連する悪性造血細胞の性質に有利に依存する。この場合、微小区画は、細胞外マトリックス層をさらに含む。実際、本発明者らは、細胞外マトリックスの存在が、間質細胞の接着および生存ならびにヒドロゲルカプセル内の混合された細胞凝集体の形成に必要であることを示した。本発明によれば、細胞外マトリックス層は、ヒドロゲルシェルの内表面を有利にカバーする。細胞外マトリックス層は、細胞培養、特に間質細胞の培養を促進するタンパク質および細胞外化合物の混合物を含む。優先的に、細胞外マトリックスは、α１、α４またはα５サブユニット、β１またはβ２サブユニット、およびγ１またはγ３サブユニットを含有するラミニン、エンタクチン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、ならびにＴＧＦ−ベータおよび／またはＥＧＦなどの成長因子などの構造タンパク質を含む。一実施形態において、細胞外マトリックス層は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）および／またはＧｅｌｔｒｅｘ（登録商標）からなるか、またはそれらを含有する。
【００４７】
特定の実施形態において、悪性造血細胞は、リンパ腫細胞であり、間質細胞は、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）などのリンパ系間質細胞、またはより具体的にはＲｅｓｔｏ細胞である。Ｒｅｓｔｏ細胞は、扁桃腺由来の間質細胞として定義される。Ｒｅｓｔｏ細胞の単離および特徴づけは、文献Ame-Thomas et al. Blood 2007に記載されているプロトコルに従って行うことができる。扁桃腺を断片に切り、ＤＮａｓｅＩおよびコラゲナーゼＩＶを含有する溶液中でインキュベートする。次いで、細胞懸濁液は、Ｐｅｒｃｏｌｌ（登録商標）グラジエント上に置かれる。１５％／２５％Ｐｅｒｃｏｌｌ（登録商標）画分の界面での細胞が培養される。４８時間の培養後、間質細胞（Ｒｅｓｔｏ）がプラスチックに付着し、懸濁された細胞が除去される。Ｒｅｓｔｏ細胞は、紡錘状の形態、ならびに造血細胞マーカー（ＣＤ４５）の不在および間葉細胞マーカー（ＣＤ１０５、ＣＤ９０およびＣＤ７３）の存在を特徴とする。これらの細胞は、脂肪細胞系、軟骨芽細胞系、および骨芽細胞系への分化の可能性をも特徴とする。Ｒｅｓｔｏ細胞は、二次リンパ器官における網状線維芽細胞に類似する特性：腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αおよびリンホトキシン（ＬＴ）−α１β２に反応したケモカインの分泌、フィブロネクチンおよびトランスグルタミナーゼネットワークを有するとして知られている。
【００４８】
より一般的に、細胞の凝集体は、リンパ腫細胞に加えて、リンパ腫の微小環境において通常存在する細胞を含んでもよい。本発明の文脈において、「微小環境細胞」は、リンパ腫細胞でない細胞の凝集体中に存在する細胞を指す。ゆえに、本発明によれば、細胞凝集体は、間質細胞に加えて、マクロファージなどの免疫系細胞をも含んでもよい。
【００４９】
特定の実施形態において、悪性造血細胞は、白血病細胞であり、間質細胞は、ＨＳ−５細胞などの骨髄間質細胞または骨髄間葉系間質細胞（ＭＳＣ）である。
【００５０】
有利には、細胞凝集体中のリンパ腫細胞と間質細胞との比は１：１から１０００：１である。細胞株由来のリンパ腫細胞の場合、間質細胞と比較してリンパ腫細胞の量は指数関数的に増加する傾向があり、該比は経時的に変化してもよい。一般に、通常細胞のヒドロゲルシェル中への封入の８日（Ｄ８）以内に、微小区画が最大サイズに一度到達すると、該細胞はもはやヒドロゲルシェル内で成長できず、リンパ腫細胞と間質細胞との比は１：１から１０，０００：１である。
【００５１】
一実施形態において、Ｄ８での細胞微小区画における細胞密度は、百個から数千個の細胞である。例えば、２００μｍの直径を有する微小区画は、好ましくは１００から１０，０００個の細胞を含有する。
【００５２】
優先的に、細胞微小区画は閉じられている。外側のヒドロゲル層は、細胞微小区画にサイズおよび形状を与える。微小区画は、細胞の封入に適合する任意の形状、特にスフェロイド、卵形または管状の形状を有することができる。細胞凝集体は、該ヒドロゲル層の内部体積中に拘束されており、該細胞がコンフルエンスに一度到達すると、該凝集体はもはや体積を増やすことはできない。
【００５３】
特定の実施形態において、細胞微小区画は、５０μｍから６００μｍの直径または最小寸法を有する。「最小寸法」なる語は、ヒドロゲル層の外表面上の点と微小区画の中心との間の最小距離の２倍を意味する。有利には、外側のヒドロゲル層の厚さは、微小区画の半径の５％から３０％を表す。本発明の文脈において、層の「厚さ」は、微小区画の中心から放射状に延びる該層の寸法である。
【００５４】
特定の例示的な実施形態において、細胞微小区画は、５０μｍから３００μｍの直径または最小寸法を有する。かかる寸法は、細胞凝集体の中心の細胞を含む細胞凝集体中のすべての細胞が、ヒドロゲル層を介して拡散する酸素および栄養素に十分にアクセスできることを保証する。ゆえに、かかる微小区画内で、すべての細胞がヒドロゲルシェルを介して拡散する小分子に十分にアクセスでき、低酸素および／または壊死は観察されない。
【００５５】
別の例示的な実施形態において、細胞微小区画は、５００μｍから６００μｍの直径または最小寸法を有する。この場合、細胞凝集体の中心の細胞は、ヒドロゲルシェルを介して拡散する酸素および栄養素にほとんどまたはまったくアクセスできない。かかる微小区画は、リンパ腫において時々起こることができる低酸素および／または壊死の研究にとって特に魅力的である。
【００５６】
細胞微小区画の調製方法
本発明の別の主題は、外側のヒドロゲルシェル中に封入された悪性造血細胞を含有する細胞の凝集体を含む細胞微小区画を得るための細胞微小区画の調製方法に関する。細胞の封入後、それらは、ヒドロゲルシェル内で再組織化し、凝集性クラスターを形成するだろう。封入は、ヒドロゲルを架橋できる架橋溶液により架橋される前に、ヒドロゲル溶液が細胞溶液と共押出される同心共押出プロセスにより実行される。「同心共押出」なる語は、１つの溶液が他のものを囲むように、溶液が共押出されることを意味する。この場合、同心共押出は、ヒドロゲル溶液が細胞溶液を囲むようなものである。一実施形態において、共押出された溶液の液滴は、次いで、ヒドロゲルを架橋し、ゆえに細胞の周りにヒドロゲルカプセルを形成することができる架橋剤を含む架橋溶液中に落ちる。別の実施形態において、溶液は、架橋溶液中に直接共押出されて、細胞が組織化される外側のヒドロゲルチューブを形成する。別の実施形態において、共押出された溶液の液滴は、（架橋溶液から作られる）架橋エアロゾルを通過して、細胞溶液の液滴の周りのヒドロゲル層の少なくとも部分的な架橋を可能にする。有利には、部分的に架橋された微小区画は、次いで架橋が終了する架橋溶液中に落ちる。
【００５７】
ヒドロゲルおよび細胞を同心円状に共押出させるいずれの押出プロセスも使用できる。特に、Alessandri et al.、（PNAS, September 10, 2013 vol. 110 no. 37 14843-14848; Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, pp. 1593-1604)、またはOnoe et al.、(Nat Material 2013, 12(6):584-90）に記載されている方法および微小流体装置を適合させることにより、本発明による細胞微小区画を製造することが可能である。例えば、本発明による方法は、特許ＦＲ２９８６１６５に記載されている同心二重壁押出装置により実施される。
【００５８】
本発明の文脈において、「架橋溶液」は、アルギン酸塩などの少なくとも１つの親水性ポリマーを含むヒドロゲルと接触させたときに、それに架橋するように適合された少なくとも１つの架橋剤を含む溶液を意味する。架橋溶液は、例えば、少なくとも１つの二価カチオンを含む溶液であることができる。架橋溶液はまた、アルギン酸塩または架橋される親水性ポリマーの別の既知の架橋剤、または照射または当技術分野において既知の任意の他の技術による架橋を可能にするように適合された溶媒、例えば水またはアルコールを含む溶液であってもよい。有利には、架橋溶液は、少なくとも１つの二価カチオンを含む溶液である。優先的に、二価カチオンは、溶液中のアルギン酸塩を架橋するために使用されるカチオンである。例えば、それは、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋およびＳｒ２＋からなる群から選択される二価カチオン、またはこれらの二価カチオンの少なくとも２つの混合物であってもよい。二価カチオン、例えばＣａ２＋は、対イオンと組み合わせて、当業者に周知の、例えばＣａＣｌ２またはＣａＣＯ３溶液を形成することができる。架橋溶液はまた、ＣａＣＯ３−ＧＤＬ溶液を形成する、グルコノデルタラクトン（ＧＤＬ）に結合したＣａＣＯ３を含む溶液であってもよい。架橋溶液はまた、ＣａＣＯ３−ＣａＳＯ４−ＧＤＬ混合物であることができる。本発明による方法の特定の実施形態において、架橋溶液は、特にＣａ２＋形態のカルシウムを含む溶液である。架橋溶液はまた、ポリリジンを含む溶液であってもよい。当業者は、二価カチオンのおよび／または対イオンの性質ならびにその濃度を、本発明の方法の他のパラメーター、特に使用されるポリマーの性質および所望の速度および／または架橋度に合わせることができる。例えば、架橋溶液中の二価カチオンの濃度は、１０から１０００ｍＭである。架橋溶液は、時間および／または温度を含む特定の条件下でヒドロゲル被覆の架橋を改善するために、上記以外の当業者に周知の成分を含んでもよい。
【００５９】
本発明によれば、ヒドロゲル溶液は細胞溶液と共押出される。
【００６０】
有利には、細胞溶液中の細胞密度は、１×１０６から１００×１０６細胞／ｍＬである。
【００６１】
特定の実施形態において、共押出に使用される細胞溶液は、培地中に懸濁されたリンパ腫細胞のみを含有する。
【００６２】
特定の実施形態において、共押出に使用される細胞溶液は、培地中に懸濁された白血病細胞のみを含有する。
【００６３】
別の実施形態において、共押出に使用される細胞溶液は、細胞外マトリックス中に懸濁されたリンパ腫細胞およびリンパ系間質細胞を含む。有利には、細胞溶液中のリンパ腫細胞と間質細胞との数比は、１：１から１：２である。所望により、かかる溶液はまた、優先的にマクロファージから選択される免疫細胞を含んでもよい。この場合、細胞溶液中のリンパ腫細胞と微小環境細胞との数比は、有利には１：１から１：２である。
【００６４】
別の実施形態において、共押出に使用される細胞溶液は、細胞外マトリックス中に懸濁された白血病細胞および髄質間質細胞を含む。有利には、細胞溶液中の白血病細胞と間質細胞との数比は、１：１から１：２である。
【００６５】
細胞溶液が細胞外マトリックスを含む場合、細胞懸濁液は、有利には該溶液の体積の５０％から９５％を表し、一方で細胞外マトリックスは、該体積の５％から５０％を表す。
【００６６】
特定の実施形態において、共押出はまた、ソルビトールを含む中間溶液を含む。この場合、共押出は、ヒドロゲル溶液と細胞溶液との間で中間溶液が押出されるように実行される。
【００６７】
特定の実施形態において、ヒドロゲル溶液の押出速度は、５から１００ｍＬ／時間、優先的には１５から６０ｍＬ／時間である。
【００６８】
特定の実施形態において、細胞溶液の押出速度は、５から１００ｍＬ／時間、優先的には１０から５０ｍＬ／時間である。
【００６９】
特定の実施形態において、中間溶液の押出速度は、５から１００ｍＬ／時間、優先的には１０から５０ｍＬ／時間である。
【００７０】
細胞微小区画の直径または最小寸法および／またはヒドロゲル層の厚さを適合させるために、異なる溶液の共押出速度は、当業者により容易に合わすことができる。優先的に、細胞溶液および中間溶液の押出速度は同じである。有利には、ヒドロゲル溶液の押出速度は、細胞溶液および場合により中間溶液の押出速度に実質的に等しい。
【００７１】
本発明による方法の特定の実施形態において、ヒドロゲル溶液、中間溶液および細胞溶液は、共押出装置の３つの同心区画中に装填され、その結果、第１の流れを形成するヒドロゲル溶液は、第２の流れを形成する中間溶液を取り囲み、それ自体が第３の流れを形成する細胞溶液を取り囲む。３つの流れが出る押出装置の先端は、架橋溶液の上で開く。例えば、該押出装置の先端は、架橋溶液から約５０ｃｍ、±１０ｃｍである。共押出装置の出口で電界が生成され、微小液滴の形成が可能になる。この目的のために、例えば、銅リングが、共押出装置の出口から約１ｃｍに配置される。微小液滴は、ヒドロゲル層が架橋される架橋槽中へ連続的に落ち、細胞の周りに外側のシェルを形成する。代替的にまたは追加的に、該押出装置の先端は、架橋溶液の微小液滴により形成される架橋エアロゾル中に開き、その結果、微小液滴のヒドロゲル層は、エアロゾルの微小液滴と接触して架橋し始める。架橋は、必要であれば、微小液滴を受け取る架橋溶液中で継続してもよい。
【００７２】
共押出装置の出口での液滴の多分散性を改善し、ゆえに架橋溶液に到達する前に微小液滴が融合するのを防ぐために、＋１から＋５ｋＶの電位、特に＋２ｋＶの電位が、例えばヒドロゲル溶液中に配置された電極により、ヒドロゲル溶液に適用できる。
【００７３】
本発明による方法は、サイズおよび組成の点で実質的に同一の数千個の微小区画を非常に迅速に得ることを可能にする。
【００７４】
本発明による方法は、リンパ腫細胞などの悪性造血細胞を外側のヒドロゲルシェル中に封入することを可能にする。わずか数時間後、ヒドロゲルシェル中に含有される細胞は、再組織化し、凝集して、数日後に凝集性になる細胞のクラスターを形成する。
【００７５】
有利には、共押出により得られた細胞微小区画は、使用される前に２から１２日間、優先的には４から１０日間、適切な培地中で維持される。有利には、この待ち時間は、細胞が凝集して、リンパ腫内の細胞のクラスターを模倣する細胞クラスターを形成することを可能にする。
【００７６】
本発明によれば、共押出により得られた細胞性微小区画を、そのまま、すなわち外側のヒドロゲルシェルと共に使用することが可能である。そうでなければ、細胞凝集体を回収するために、いかなる使用前にもヒドロゲルシェルを加水分解することが可能である。また、その後の使用のために、（ヒドロゲルシェルとの）共押出により得られた細胞微小区画を凍結することが可能である。
【００７７】
適用
本発明による細胞微小区画は、多くの適用、特に薬理学的目的のために使用することができる。
【００７８】
本発明による細胞微小区画は、悪性血液障害に対する作用を有する候補分子の同定および／または検証テストのために使用することができる。細胞微小区画中に含有される悪性造血細胞に応じて、特定のタイプの悪性血液障害を標的とすることが可能である。
【００７９】
本発明によれば、細胞微小区画を、直接、すなわち外側のヒドロゲルシェルと共に使用することが可能である。特に、アルギン酸塩などの一部のヒドロゲルの透過性は、２００ｋＤａ以下の分子量を有する分子を通過させるのに十分である。したがって、細胞微小区画上でこれらの分子を直接研究することが可能である。より高い分子量を有する分子の場合、テストを実施する前に外側のヒドロゲルシェルを加水分解することが可能である。ゆえに、研究は、細胞クラスター上で直接行われる。有利には、ヒドロゲルシェルの加水分解は、細胞クラスターが適切に形成されること、および該細胞が凝集性であることを保証するために、共押出の６または１０日後に実行される。
【００８０】
本発明による細胞微小区画はまた、リンパ腫または白血病を有する対象からの細胞を使用するオーダメイド医療において使用して、該対象に最も適切な処置を選択する前に、異なる処置に対する該対象の反応を特異的にテストすることができる。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００８１】
実施例１：細胞微小区画を得る方法
材料および方法
細胞：
ヒトびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）細胞株（ＳＵＤＨＬ４およびＨＬＹ１）
ヒト濾胞性リンパ腫細胞株（ＤＯＨＨ２）
ネガティブセレクションにより精製された患者の生検からのＢリンパ球(Maby-El Hajjami et al. Can Res 2009: 69 (7) 3228:37)
「Ｒｅｓｔｏ」間質細胞(Ame-Thomas et al. (Blood 2007))
【００８２】
溶液：
架橋溶液：３７°Ｃでの１００ｍＭ  ＣａＣｌ２
中間溶液：３００ｍＭソルビトール
ヒドロゲル溶液：０．５ｍＭ  ＳＤＳ中の２．５％ｗ／ｖアルギン酸塩（ＬＦ２００ＦＴＳ）
細胞外マトリックス：Ｃｌａｓｓｉｃ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（フェノールレッドなしかつ成長因子あり）
【００８３】
共押出装置
−それぞれ滅菌２．５％アルギン酸塩を含有する３本のＨａｍｉｌｔｏｎ  １２ｍｌシリンジおよび滅菌３００ｍＭソルビトールを含有する他の２本のＨａｍｉｌｔｏｎ  １２ｍｌシリンジ
−標準Ｔｅｆｌｏｎチューブ、直径１３ｍｍ
−ｎｅＭＥＳＹＳ（登録商標）シリンジポンプ（ＣＥＴＯＮＩ）および関連ソフトウェア
−３Ｄ印刷された注入チップ（文献Alessandri K et al., 2016を参照）
【００８４】
共押出方法
アルギン酸塩カプセルを、Alessandri et al.(PNAS 2013, DOI:10.1073/pnas.1309482110 および LOC 2016 DOI:10.1039/c6lc00133e)および出願ＷＯ２０１３１１３８５５に記載されている方法に従って得る。
【００８５】
より正確には、およそ１・１０６個の細胞を、ソルビトールおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の溶液中に再懸濁して、５０ｖｏｌ％  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）により１００μＬの最終体積を得る。該細胞溶液を４℃で保存する。
【００８６】
カプセルの製造のための微小流体共押出装置を、架橋溶液を含有するペトリ皿のおよそ５０ｃｍ上に配置する。
【００８７】
次いで、アルギン酸塩溶液、ソルビトール溶液、および細胞溶液を、微小流体共押出装置中へ共注入し、カルシウム槽中へ落ちるときに架橋される複合液滴を形成させる。共押出装置を１０秒間操作して、１秒間あたり約５０００個のアルギン酸塩カプセル、合計で約５０，０００個のカプセルを製造する。次いで、該カプセルを保持する４０μｍメッシュのセルストレーナーによりカルシウム槽をろ過することにより、アルギン酸塩カプセルを回収する。後者を培地ベースによりすすぎ、次いで最終培地中に再懸濁する。
【００８８】
多分散性を改善するために、アルギン酸塩中に、電極を介して＋２ｋＶの電位を適用した。直径３ｃｍの接地された銅リングを、微小流体共押出装置の先端から約１ｃｍに配置し、液滴を電鋳するために必要な電界を生成させる。
【００８９】
Ａ］ＳＵＤＨＬ４またはＨＬＹ１リンパ腫細胞のみを含む細胞微小区画
封入の前に、リンパ腫細胞を、５％ＣＯ２の存在下、３７°Ｃの湿潤雰囲気中で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ中で培養する。
【００９０】
封入の時点で、細胞を遠心分離し、１０・１０６から１００・１０６細胞／ｍＬの割合でソルビトール（３００ｍＭ）中に再懸濁する。
【００９１】
封入後、カプセルあたりの細胞の数は、３０から１００の間で変わる。カプセルを、３７℃のＣＯ２オーブン中で、１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ中で培養する。培地を２から３日ごとに交換する。
【００９２】
細胞クラスターの成長を定量化するために、カプセルを、９６ウェルプレート中へ１ウェルあたり１個のカプセルで分ける。次いで、細胞株が蛍光タンパク質を発現する場合、位相差および蛍光において、細胞クラスターを定期的（２日ごと）に画像化する。このことは、経時的な細胞の固有のクラスターの成長を表す一連の写真をもたらす。これらの写真から、ＩｍａｇｅＪ（登録商標）ソフトウェアを使用して細胞クラスターの面積を測定し、成長曲線を確立する（図１Ｂ）。
【００９３】
ゆえに、封入後に細胞クラスターがＤ４−Ｄ１０の間に形成されることを観察する。より正確には、Ｄ６とＤ１０との間で、細胞が凝集し、アルギン酸塩カプセル中に単一の塊を形成することを観察する（図１Ａ）。
【００９４】
Ｂ］リンパ腫細胞および間質細胞を含む細胞微小区画
リンパ節の微小環境を近似するために、リンパ腫細胞（ＤＯＨＨ２）を、細胞外マトリックスＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）および「Ｒｅｓｔｏ」間質細胞と共培養する。
【００９５】
Ｒｅｓｔｏ細胞を、５％ＣＯ２の３７°Ｃの湿潤雰囲気中で、１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ中で最初に培養した。封入の時点で、該細胞を、トリプシンの作用により支持体から引き離し、次いでリンパ腫細胞の存在下で細胞外マトリックス中に１：１の比で再懸濁する。
【００９６】
Ｒｅｓｔｏ細胞およびリンパ腫細胞の細胞密度は、１０−５０・１０６細胞／ｍＬで変わることができる。
【００９７】
共押出封入法は、細胞外マトリックスによるアルギン酸塩カプセルの内壁のコーティングを得ることを可能にする。該コーティングは、間質細胞の接着を可能にし、腫瘍ニッチの形成を促進する。該細胞は、２−３日以内に自由に組織化し、培養の４−１０日後に凝集性細胞のクラスターを形成する（図３）。
【００９８】
Ｃ］患者の細胞から製造される細胞微小区画
本発明により、セザリー症候群（皮膚型Ｔ細胞リンパ腫の白血病型）を有する患者からのリンパ球細胞から、微小区画を製造した。封入後、該細胞は、アルギン酸塩カプセル内で成長し、約１０日後に細胞のクラスターを形成する（図１２）。このことは、本発明による方法が、患者の初代細胞から細胞微小区画を得ることを可能にすることを確認し、このことはオーダメイド医療における該方法の使用を示唆する。
【実施例２】
【００９９】
実施例２：細胞微小区画の分析
Ａ］リアルタイムイメージング
ＳＵＤＨＬ４またはＨＬＹ１細胞のクラスターを含有するカプセルを、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭによりカバーされたアガロースウェル中に配置する（Ｄ１−Ｄ６で）。画像の取得を、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０）により行う。２つのタイプの分析：フルオロフォアによる微小区画の標識化後の時間ｔでの分析、および所望によりフルオロフォアによる細胞の標識化後の断続的イメージングにおける分析を実施する。該細胞を、死細胞を可視化するためにカルセイン−ＡＭおよびヨウ化プロピジウムにより染色し；細胞核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２により青く染色する。
【０１００】
ゆえに、カプセル内の細胞の移動ならびに細胞間の相互作用をモニターすることが可能である。
【０１０１】
Ｂ］パラフィン切片免疫蛍光
細胞クラスター内の細胞中のタンパク質の発現または局在化を研究できるように、パラフィン切片免疫蛍光技術を、カプセル分析に適合させた：細胞クラスターを含有するカプセルを収集し、２％の低融点アガロースゲル中に含めた。ゲル化すると、カプセルを含有するアガロースブロックを、４％パラホルムアルデヒド固定液中に３０分間浸す。固定後、試料を、免疫組織蛍光について従来記載されているプロトコルに従って処置する。
【０１０２】
細胞活性化のマーカーであるＫｉ６７タンパク質の発現、および細胞死の評価に使用される切断されたカスパーゼ−３の発現を評価した。クラスターの中心にほぼ対応する細胞クラスター切片上で、染色を実行した。
【０１０３】
細胞クラスター内で、細胞死または増殖の局所化を観察しない。これらの観察は、免疫不全マウス中への異種移植後に得られたＳＵＤＨＬ４細胞腫瘍において行われたものにかなり匹敵する。
【０１０４】
Ｃ］細胞クラスター中の細胞外マトリックスの分析
リンパ節微小環境の特徴の１つは、間質細胞および腫瘍Ｂリンパ球により分泌される細胞外マトリックスの存在である。細胞外マトリックスは、主にフィブロネクチン、コラーゲンＩ、およびラミニンで構成される。
【０１０５】
免疫蛍光分析は、微小区画の細胞クラスター中のこれらの３つのタイプのマトリックスの存在を示したが、一方で懸濁液中で成長した同じ細胞は、これらのマトリックスを発現しない。
【０１０６】
Ｄ］アルギン酸カプセルの溶解
細胞クラスターのハイスループットの定性的および定量的分析のために、ヒドロゲルカプセル中に含有される細胞を回収できることが重要である。回収されると、フローサイトメトリーにより、またはハイスループットシーケンシング、生化学アッセイなどの任意のその他の適切な分析方法により、それらは分類および／または分析できる。
【０１０７】
（封入後Ｄ９での）微小区画を収集し、１ｍＭ  ＥＧＴＡを添加したリン酸緩衝液中に該微小区画を浸漬することにより、アルギン酸塩カプセルを溶解する。図４は、ＳＵＤＨＬ４リンパ腫細胞のみを含む細胞クラスターを含有するカプセル（図４Ａ）、およびＤＯＨＨ２リンパ腫細胞および間質細胞を含む細胞クラスターを含有するカプセル（図４Ｂ）の溶解の例を示す。
【０１０８】
カプセルの溶解後、細胞クラスターを構成する細胞は分散せず、細胞外マトリックスの存在に適合する凝集性を示すことがわかる。
【０１０９】
Ｅ］フローサイトメトリー
細胞クラスター内の細胞カウントおよび異なる成長段階での死細胞の割合にアクセスするために、アルギン酸カプセルを溶解して、該細胞クラスターを解離させ、アポトーシスマーカー（ＴＭＲＭ）とインキュベートし、次いでカウントビーズの存在下でフローサイトメーターにより分析する（図５）。
【０１１０】
経時的に、細胞カウントが増加する一方で、細胞クラスター内の死細胞の割合はＤ３とＤ１０との間で減少することを観察し、このことは図１Ａに記載されているスフェロイドの体積の増加と相関する。
【０１１１】
Ｆ］リンパ腫細胞成長に対する腫瘍ニッチの追加効果
患者からの腫瘍Ｂリンパ球ならびに特定の細胞株は、単独で培養した場合、生存および／または細胞クラスターを形成することができない。図６（Ａ−Ｃ）に見られるように、リンパ節（Ｃ：Ｒｅｓｔｏ＋ＤＯＨＨ２細胞）中に見出されるものに類似する腫瘍ニッチの再構成は、腫瘍Ｂリンパ球の成長を促進する。
【０１１２】
Ｇ］間質細胞の前腫瘍性リンパ性間質への分化
濾胞性リンパ腫腫瘍ニッチの形成中に、間質細胞は、とりわけ細胞外マトリックス安定化および細胞接着において役割を有するトランスグルタミナーゼ２（ＴＧ２）を発現する前腫瘍性リンパ間質(Thomazy et al., 2003; Ohe et al., 2016)に分化する。
【０１１３】
図８に見られるように、腫瘍Ｂ細胞および細胞外マトリックスの存在下でのＲｅｓｔｏ間質細胞（ＦＲＣ）の培養は、免疫染色により明らかにされるＴＧ２の発現をもたらす。このことは、本発明による３Ｄ細胞培養モデルが、リンパ腫腫瘍ニッチの主要な特徴、すなわちＢリンパ球に対する間質の追加効果および前腫瘍間質中への間質の分化を再現することを示す。
【実施例３】
【０１１４】
実施例３：抗癌分子のスクリーニング
特定のリンパ腫の化学耐性は、３Ｄ構造中への薬物の浸透不良および微小環境細胞の存在に部分的に関連していることを認識する。
【０１１５】
２つの従来の化学療法（シスプラチンおよびエトポシド）の有効性を、増加する濃度のこれらの分子により処置される、懸濁液中で成長した細胞（２Ｄ）上および本発明による細胞微小区画からの細胞クラスター（３Ｄ）上で並行してテストした。４８時間のインキュベーション後、該細胞をＴＭＲＭにより染色し（アルギン酸カプセルを最初に溶解させ、細胞クラスターを解離させる）、次いでサイトメーターにより分析して、分子の各用量に対する細胞死の割合を評価する。
【０１１６】
結果は、腫瘍の構造により近い構造を有する細胞クラスター（３Ｄ）中で組織化された細胞が、懸濁液中で成長した同じ細胞よりも従来の化学療法に対する感受性が低いことを示す（図７）。このことは、本発明による３Ｄモデルが、懸濁された細胞よりも抗癌剤のスクリーニングにより関連していることを確認する。
【実施例４】
【０１１７】
実施例４：細胞微小区画中の薬物拡散
Ａ］従来の化学療法
前臨床癌の創薬は、すべての治療試験のうちで最も成功率が低く、候補化合物の５％未満がフェーズＩＩＩ臨床試験に入る。これらの失敗に対する１つの説明は、腫瘍内の薬物の拡散を再現できる関連モデルの欠如である。実際、前臨床テストから臨床試験への移行中の分子の有効性の低下を説明する１つの仮説は、腫瘍内の細胞密度が薬物の浸透および拡散を遅くし、それによりその有効性が低下するというものだろう。
【０１１８】
上記の実施例３に示すように、発明による３Ｄモデルは、リンパ腫腫瘍ニッチ内の薬物の拡散の研究に関連する。
【０１１９】
薬物拡散テストのために、（Ｂ細胞リンパ腫の標準処置においても使用される）ドキソルビシンの自家蛍光特性を使用した。
【０１２０】
ゆえに、懸濁液中で、または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）またはＲｅｓｔｏ間質細胞有りまたは無しで３Ｄにおいて成長したＳＵＤＨＬ４細胞を、ドキソルビシン（１μＭ）有りまたは無しで２４時間インキュベートした。
【０１２１】
次いで、細胞の蛍光強度を、フローサイトメトリーにより測定した。
【０１２２】
結果は、本発明による微小区画中で３Ｄにおいて成長した細胞は、２Ｄにおいて成長した細胞よりも蛍光性が低いことを示し、これは、３Ｄの文脈において、該細胞が化学療法によりさらされにくいことを示唆する。非常に興味深いことに、マトリックスおよびＲｅｓｔｏ細胞の存在下で細胞を３Ｄにおいて成長させると、薬物の拡散がさらに遅くなることを観察する（図９）。ゆえに、本発明によるスフェロイド内の分子の拡散を遅らせることにより（および腫瘍内の類推により）、該微小環境が薬物耐性において役割を果たすことができることが示される。
【０１２３】
Ｂ］抗体
Ｂ細胞リンパ腫の標準処置は、成熟Ｂリンパ球の表面上に発現されるＣＤ２０に対する免疫療法と組み合わせた従来の多剤併用化学療法で構成される。
【０１２４】
本発明による３Ｄ細胞培養システムにおける特定の免疫療法の治療可能性をテストできるようにするために、抗体（ＡＢ）が微小区画に浸透できることを示すことは興味深い。
【０１２５】
このことをテストするために、
−フィコエリトリン（ＰＥ）に直接結合した抗ＣＤ１９  ＡＢ（Ｂリンパ球中で非常に強く発現される）、または
−Ｂ細胞リンパ腫に使用される治療用ＡＢであり、フルオロフォア（λｅｘ＝６３３ｎｍ）と直接結合しているリツキシマブ
の存在下、封入後Ｄ７−Ｄ９で、スフェロイドをインキュベートした。
【０１２６】
ＡＢとの一晩のインキュベーション後、スフェロイド内で細胞の染色を観察する（図１０）。このことは、本発明による３Ｄモデルが治療用ＡＢのスクリーニングに適していることを示す。
【０１２７】
Ｃ］薬物への反応
上記に示すように、薬物拡散は、本発明による３Ｄ構造において変更される。本実験の目的は、該変更が化学耐性と相関しているかどうかを検証することである。該目的のために、２つの従来の化学療法（ドキソルビシンおよびエトポシド）の有効性を、増加する濃度のこれらの化学療法分子により処置される、懸濁液（２Ｄ）中で成長した細胞上、およびＲｅｓｔｏ間質細胞有りまたは無しで、リンパ腫細胞単独を含有するかまたはＥＣＭの存在下での本発明による細胞微小区画からの細胞クラスター上で並行してテストした。
【０１２８】
４８時間のインキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）３Ｄ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞内ＡＴＰを測定することにより、細胞の生存を評価した。
【０１２９】
結果は、腫瘍の構造に近い構造を有する細胞クラスター（３Ｄ）中で組織化された細胞（リンパ腫細胞＋ＥＣＭ±Ｒｅｓｔｏ）が、懸濁液中で成長した同じ細胞よりも従来の化学療法に対する感受性が低いことを示す（図１１および表１）。
【０１３０】
このことは、本発明による３Ｄモデルが、懸濁された細胞よりも抗癌剤のスクリーニングにより関連していることを確認する。
【０１３１】
【表１】
2020524523.tif 000002
【図１Ａ】
2020524523.tif 000003
【図１Ｂ】
2020524523.tif 000004
【図２】
2020524523.tif 000005
【図３】
2020524523.tif 000006
【図４】
2020524523.tif 000007
【図５】
2020524523.tif 000008
【図６】
2020524523.tif 000009
【図７】
2020524523.tif 000010
【図８】
2020524523.tif 000011
【図９】
2020524523.tif 000012
【図１０】
2020524523.tif 000013
【図１１】
2020524523.tif 000014
【図１２】
2020524523.tif 000015
【国際調査報告】
2020524523.tif 000016
2020524523.tif 000017
2020524523.tif 000018
2020524523.tif 000019
2020524523.tif 000020
2020524523.tif 000021