(57)【要約】  本発明は、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び胚性幹細胞から誘導された細胞個体群から膵前駆細胞を濃縮する方法に関する。本明細書において、膵前駆細胞の濃縮のためのマーカーであるＣＤ５１及びＣＤ１７７、並びに肝前駆細胞の濃縮又は枯渇のためのＣＤ２７５が開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）膵前駆細胞を含む、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び／又は胚性幹細胞から誘導された細胞個体群を、膵前駆細胞上の細胞表面マーカー（ここでの細胞表面マーカーはＣＤ１７７である）に結合するリガンドに曝す工程、及び
（ｂ）リガンドに結合しない、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び／又は胚性幹細胞から誘導された細胞から、膵前駆細胞を分離し、これにより、該膵前駆細胞を精製する工程
を含む、膵前駆細胞を精製する方法。
【請求項２】
膵前駆細胞が、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＣＥＲ１、及び／又はＣＸＣＲ４、好ましくはＣＥＲ１を発現している、請求項１の方法。
【請求項３】
前記細胞個体群を、ＣＤ５１及び／又はＣＤ２７５に結合するリガンドに曝す工程をさらに含む、請求項１又は２の方法。
【請求項４】
前記リガンドが抗体又はその結合断片である、請求項１〜３のいずれか一項の方法。
【請求項５】
前記抗体が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項４の方法。
【請求項６】
前記リガンドが標識とコンジュゲートしている、請求項１〜５のいずれか一項の方法。
【請求項７】
前記マーカーの発現が、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって検出される、請求項１〜６のいずれか一項の方法。
【請求項８】
前記マーカーの発現がフローサイトメトリーによって検出される、請求項１〜７のいずれか一項の方法。
【請求項９】
前記分離工程が、アフィニティクロマトグラフィーを含む、請求項１〜８のいずれか一項の方法。
【請求項１０】
前記分離工程が、フローサイトメトリーを含む、請求項１〜８のいずれか一項の方法。
【請求項１１】
前記膵前駆細胞がヒトである、請求項１〜１０のいずれか一項の方法。
【請求項１２】
ＣＤ１７７陽性である、少なくとも５０％の膵前駆細胞を含む、精製された組成物。
【請求項１３】
前記膵前駆細胞が、膵前駆細胞上のＣＤ１７７に結合するリガンドに結合する、請求項１２の組成物。
【請求項１４】
前記膵前駆細胞がヒトである、請求項１２又は１３の組成物。
【請求項１５】
前記リガンドが捕捉用媒体上に固定されている、請求項１〜１１のいずれか一項の方法、又は請求項１２〜１４のいずれか一項の組成物。
【請求項１６】
捕捉用媒体がビーズを含む、請求項１５の方法又は組成物。
【請求項１７】
前記リガンドが磁性試薬にコンジュゲートしている、請求項１〜１１のいずれか一項の方法、又は請求項１２〜１４のいずれか一項の組成物。
【請求項１８】
前記方法によって得ることのできる精製された細胞組成物が、少なくとも５０％の膵前駆細胞を含む、請求項１〜１１のいずれか一項の方法。
【請求項１９】
多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び／又は胚性幹細胞から誘導された細胞個体群から膵前駆細胞を精製するための、膵前駆細胞上の細胞表面マーカー（ここでの該細胞表面マーカーはＣＤ１７７である）に結合するリガンドの使用。
【請求項２０】
ＣＤ１７７に結合するリガンドと、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞及び／又は胚性幹細胞を胚性内胚葉の細胞個体群へと分化させるための手段とを含む、キット。
【請求項２１】
膵前駆細胞が細胞表面上にＣＤ１７７を含む、請求項１〜１１若しくは１５〜１８のいずれか一項の方法、又は請求項１２〜１４のいずれか一項の組成物、又は請求項１７の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
自己免疫反応による膵島内のβ細胞の破壊は１型糖尿病の原因であるが、２型糖尿病においても、他の機序によって媒介されるものであるが、β細胞の破壊が、疾患の後期段階において起こり得る。しかしながら、これらの疾患、特に１型糖尿病を有する患者は、外からのインシュリンの送達を必要とするが、正しいインシュリン用量の選択は依然として難題であり、血糖コントロール不良となり得る。
【０００２】
膵島の再生能は非常に低いので、膵島細胞の移植により、改善された耐糖能及び血糖コントロールをもたらすことができる。しかしながら、膵島細胞の移植は、ドナー臓器への依拠、膵臓から膵島を単離する際の難題、及び免疫抑制薬の生涯におよぶ使用をはじめとする、様々な制約に煩わされる。多能性幹細胞は、ドナー膵島細胞の不足に対する可能性ある解決策をもたらす。
【０００３】
多能性幹細胞又は胚性幹細胞から膵前駆細胞又はβ細胞へと分化させるためのいくつかの方法が先行技術において記載されている。例は、Rezania et al., 2014、Pagliuca et al., 2014、D’Amour et al., 2006、又はKroon et al., 2008である。これら全ての方法により、有意な比のβ細胞がもたらされるが、これらの方法によって生成されたβ細胞は未熟であり、奇形種形成のリスクをもたらす可能性のあるいくつかの未分化な多能性幹細胞も含有している場合がある。
【０００４】
それ故、より高い比率の膵前駆細胞をもたらす、細胞の亜個体群を、分化中に濃縮することが重要である。膵臓及び膵島の発生中に細胞は様々な中間体を経る。１つの重要な中間体は、前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の段階である。ここで、膵系統又は例えば肝臓のような他の系統へと発達しつつあるすでに特殊化された亜個体群間で分化することが可能である。特許出願の米国特許出願第２００９/０２６３８９６Ａ１号及び国際公開公報第２０１６/１７００６９Ａ１号は、膵内胚葉細胞の濃縮のためのいくつかのマーカーを開示している。しかしながら、こうした特許出願は、膵β細胞への分化の後期段階にある亜個体群を選別する。そうした細胞は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤をアップレギュレートし、細胞補充療法用の大量の細胞を増幅する能力を失っている。細胞が依然として高度に増殖性である前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）段階の膵前駆細胞を選別することは、増幅の問題を克服し、多能性幹細胞からの大量の膵前駆細胞のスケールアップ可能な生産を可能とするだろう。
【０００５】
しかしながら、より初期の分化段階における膵臓となる運命を有する胚性内胚葉亜個体群についての新規で信頼性がありかつ好ましくは改善されたマーカーが依然として必要であり、これにより、有利には後続の製造プロセス中においても依然として増殖能を有する、異種細胞個体群の中からの特殊化した膵前駆細胞の選択が理想的に改善される。したがって、本出願の基礎にある技術的問題は、この必要性に対応することである。本発明の発明者らは驚くべきことに、細胞表面マーカーのＣＤ５１及び／又はＣＤ１７７を、胚性内胚葉の段階の将来の膵前駆細胞を濃縮するために使用することができ、一方、細胞表面マーカーのＣＤ２７５は、肝臓系統の将来の細胞を濃縮するために、又はこのような細胞を枯渇させるために使用することができることを発見した。肝臓系統の細胞の枯渇は、膵前駆細胞へと発達しない細胞を除去するために使用することができ、これにより、膵前駆細胞に発達することのできる細胞を濃縮することができる。さらに、奇形種形成細胞を選別することができ、ＣＤ１７７及びＣＤ２７５は、様々な細胞株及び様々なプロトコールにおける分化プロセスを評価するためのツールとしての役割を果たし得る。ＣＤ１７７亜個体群はさらに、増加したＷＮＴ／平面内細胞極性（planar cell polarity）（ＰＣＰ）シグナル伝達を示す。ＣＤ１７７＋細胞は、膜へのβ−カテニンの移行を示し、したがって、肝臓となる運命よりも膵臓となる運命を促進する（実施例２及び４、図２Ｃ〜Ｅ、図４Ｄ）。ＣＤ１７７＋細胞は、背側膵を効率的に発生し（実施例３及び７、図３Ｃ、Ｄ）、より緊密なクラスターを生成し、組織極性を有する（実施例５、図５Ｅ）。それらは、ＰＤＸ１又はＮＫＸ６．１のような膵転写因子のより高度な発現を示し（実施例５及び９、図５Ｃ）、単一ホルモン性細胞を生成する（実施例５及び９、図５Ｂ）。さらに、実施例２、６及び７に示されているように、ＣＤ１７７陽性細胞は、先行技術において公知であるＣＸＣＲ４陽性細胞（ＣＤ１８４）よりも膵前駆細胞となる確率がより高い細胞個体群を発生する。
【０００６】
発明の概要
本明細書に記載の実施態様は、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び／又は胚性幹細胞から誘導された膵前駆細胞を精製するための方法、並びに前記の精製された膵前駆細胞を含む組成物、並びに、ＣＤ１７７に対するリガンドと、膵前駆細胞から胚性内胚葉細胞個体群へと分化させるための手段とを含むキットに関する。
【０００７】
したがって、本発明は、
（ａ）膵前駆細胞を含む、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び／又は胚性幹細胞から誘導された細胞個体群を、膵前駆細胞上の細胞表面マーカー（ここでの細胞表面マーカーはＣＤ１７７である）に結合するリガンドに曝す工程、及び
（ｂ）リガンドに結合しない、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び／又は胚性幹細胞から誘導された細胞から、膵前駆細胞を分離し、これにより、該膵前駆細胞を精製する工程（ここでの該膵前駆細胞は好ましくは細胞表面上にＣＤ１７７を含む）
を含む、膵前駆細胞の精製法に関する。
【０００８】
本発明による（特殊化された）膵前駆細胞の精製法の別の利点は、スケールアップ可能な生産システムが可能であることであり得る。分化プロセスの最中、例えば内胚葉（ＤＥ）、前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）、又は後方腸管（ＰＧＴ）の段階における（特殊化された）膵前駆細胞の初期における選択は、少数の細胞個体群の中からの選別を可能とする。次いで、そうした細胞をその後に増幅させ、材料（培地、サイトカインなどを含む）は節約される。これに対し、先行技術は、分化の後期段階において選別する。この点ですでに多くの材料がすでに使用されている。したがって、この中の大部分が廃棄される。それ故、本発明は、膵臓系統細胞のより経済的な製造法を提供する。
【０００９】
本発明の方法に従って精製される膵前駆細胞は好ましくは、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＣＥＲ１、及び／又はＣＸＣＲ４、より好ましくはＣＥＲ１を発現している。
【００１０】
本発明の方法は好ましくは、さらなる工程、すなわち、ＣＤ５１及び／又はＣＤ２７５に結合するリガンドに該細胞個体群を曝す工程を含む。
【００１１】
好ましくは、本発明の方法による膵前駆細胞の精製のために使用されるＣＤ５１、ＣＤ１７７及び／又はＣＤ２７５に結合しているリガンドは、抗体又はその結合断片である。
【００１２】
本発明の方法に従って使用されるＣＤ５１、ＣＤ１７７及び／又はＣＤ２７５に結合している抗体又は抗体断片は好ましくは、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。
【００１３】
好ましくは、本発明の方法による膵前駆細胞の精製のために使用されるＣＤ５１、ＣＤ１７７及び／又はＣＤ２７５に結合しているリガンドは、標識とコンジュゲートしている。
【００１４】
好ましくは、細胞表面マーカーのＣＤ５１、ＣＤ１７７及び／又はＣＤ２７５の発現は、本明細書に記載の膵前駆細胞の精製法に従って、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）及び／又はフローサイトメトリーによって検出される。
【００１５】
本発明に記載の方法の分離工程は好ましくは、アフィニティクロマトグラフィー及び／又はフローサイトメトリーを含む。
【００１６】
本発明の方法に従って精製される膵前駆細胞は好ましくはヒトである。
【００１７】
本発明に記載の方法において使用されるリガンド又は本明細書に記載の膵前駆細胞の組成物は好ましくは、捕捉用媒体上に固定されている。該捕捉用媒体は好ましくはビーズを含み、及び／又は、該リガンドは好ましくは磁性試薬にコンジュゲートしている。
【００１８】
本発明に従って膵前駆細胞を精製する方法により好ましくは、少なくとも５０％の（特殊化された）膵前駆細胞を含む細胞組成物が得られる。
【００１９】
本発明の方法に従って精製される組成物は好ましくは、ＣＤ１７７陽性である少なくとも５０％の膵前駆細胞を含み、ここでの膵前駆細胞は好ましくは細胞表面上にＣＤ１７７を含む。好ましくは、本明細書に記載の組成物の膵前駆細胞は、膵前駆細胞上のＣＤ１７７に結合するリガンドに結合する。本発明の方法に従って精製された膵前駆細胞の組成物、及び／又は膵前駆細胞上のＣＤ１７７に結合したリガンドに結合した組成物の膵前駆細胞は好ましくはヒトである。
【００２０】
さらに、本発明は、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び／又は胚性幹細胞から誘導された細胞個体群から、膵前駆細胞（ここでの膵前駆細胞は好ましくは細胞表面上にＣＤ１７７を含む）を精製するための、膵前駆細胞上の細胞表面マーカー（ここでの細胞表面マーカーはＣＤ１７７である）に結合するリガンドの使用に関する。
【００２１】
本発明はまた、ＣＤ１７７に結合するリガンドと、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び／又は胚性幹細胞から胚性内胚葉細胞の個体群へと分化させるための手段とを含むキットに関する。
【００２２】
好ましくは、膵前駆細胞は好ましくは細胞表面上にＣＤ１７７を含む。
【００２３】
上記の方法及び組成物は、インビトロで培養された細胞に関することが理解されるだろう。しかしながら、上記のインビトロで分化された細胞組成物は、インビボにおける適用のためにも使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１−１】異なる胚性内胚葉（ＤＥ）を濃縮する新規な表面マーカー抗体の同定のためのスクリーニング設定。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）への分化の図示。Ｂ）既知の胚性内胚葉（ＤＥ）マーカーであるＦＯＸＡ２及びＣＸＣＲ４に対する、異なる胚性内胚葉（ＤＥ）亜個体群を濃縮することのできる、新規な表面マーカーの同定のための設定。Ｃ〜Ｄ）ＣＤ２７５及びＣＤ１７７は、ＦＯＸＡ２／ＳＯＸ１７陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）における明確に異なる胚性内胚葉（ＤＥ）亜個体群を濃縮する。Ｅ）ＣＤ１７７陽性の胚性内胚葉（ＤＥ）及びＣＤ２７５陽性の胚性内胚葉（ＤＥ）は、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）陽性の胚性内胚葉（ＤＥ）とは異なることを示す、４日目に選別された胚性内胚葉（ＤＥ）亜個体群の主成分（ＰＣＡ）分析。Ｆ）分化から４日後に１．５倍超でアップレギュレートされた遺伝子から生じたＧＯタームの遺伝子オントロジー分析。
【図１−２】異なる胚性内胚葉（ＤＥ）を濃縮する新規な表面マーカー抗体の同定のためのスクリーニング設定。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）への分化の図示。Ｂ）既知の胚性内胚葉（ＤＥ）マーカーであるＦＯＸＡ２及びＣＸＣＲ４に対する、異なる胚性内胚葉（ＤＥ）亜個体群を濃縮することのできる、新規な表面マーカーの同定のための設定。Ｃ〜Ｄ）ＣＤ２７５及びＣＤ１７７は、ＦＯＸＡ２／ＳＯＸ１７陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）における明確に異なる胚性内胚葉（ＤＥ）亜個体群を濃縮する。Ｅ）ＣＤ１７７陽性の胚性内胚葉（ＤＥ）及びＣＤ２７５陽性の胚性内胚葉（ＤＥ）は、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）陽性の胚性内胚葉（ＤＥ）とは異なることを示す、４日目に選別された胚性内胚葉（ＤＥ）亜個体群の主成分（ＰＣＡ）分析。Ｆ）分化から４日後に１．５倍超でアップレギュレートされた遺伝子から生じたＧＯタームの遺伝子オントロジー分析。
【図１−３】異なる胚性内胚葉（ＤＥ）を濃縮する新規な表面マーカー抗体の同定のためのスクリーニング設定。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）への分化の図示。Ｂ）既知の胚性内胚葉（ＤＥ）マーカーであるＦＯＸＡ２及びＣＸＣＲ４に対する、異なる胚性内胚葉（ＤＥ）亜個体群を濃縮することのできる、新規な表面マーカーの同定のための設定。Ｃ〜Ｄ）ＣＤ２７５及びＣＤ１７７は、ＦＯＸＡ２／ＳＯＸ１７陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）における明確に異なる胚性内胚葉（ＤＥ）亜個体群を濃縮する。Ｅ）ＣＤ１７７陽性の胚性内胚葉（ＤＥ）及びＣＤ２７５陽性の胚性内胚葉（ＤＥ）は、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）陽性の胚性内胚葉（ＤＥ）とは異なることを示す、４日目に選別された胚性内胚葉（ＤＥ）亜個体群の主成分（ＰＣＡ）分析。Ｆ）分化から４日後に１．５倍超でアップレギュレートされた遺伝子から生じたＧＯタームの遺伝子オントロジー分析。
【図１−４】異なる胚性内胚葉（ＤＥ）を濃縮する新規な表面マーカー抗体の同定のためのスクリーニング設定。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）への分化の図示。Ｂ）既知の胚性内胚葉（ＤＥ）マーカーであるＦＯＸＡ２及びＣＸＣＲ４に対する、異なる胚性内胚葉（ＤＥ）亜個体群を濃縮することのできる、新規な表面マーカーの同定のための設定。Ｃ〜Ｄ）ＣＤ２７５及びＣＤ１７７は、ＦＯＸＡ２／ＳＯＸ１７陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）における明確に異なる胚性内胚葉（ＤＥ）亜個体群を濃縮する。Ｅ）ＣＤ１７７陽性の胚性内胚葉（ＤＥ）及びＣＤ２７５陽性の胚性内胚葉（ＤＥ）は、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）陽性の胚性内胚葉（ＤＥ）とは異なることを示す、４日目に選別された胚性内胚葉（ＤＥ）亜個体群の主成分（ＰＣＡ）分析。Ｆ）分化から４日後に１．５倍超でアップレギュレートされた遺伝子から生じたＧＯタームの遺伝子オントロジー分析。
【図１−５】異なる胚性内胚葉（ＤＥ）を濃縮する新規な表面マーカー抗体の同定のためのスクリーニング設定。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）への分化の図示。Ｂ）既知の胚性内胚葉（ＤＥ）マーカーであるＦＯＸＡ２及びＣＸＣＲ４に対する、異なる胚性内胚葉（ＤＥ）亜個体群を濃縮することのできる、新規な表面マーカーの同定のための設定。Ｃ〜Ｄ）ＣＤ２７５及びＣＤ１７７は、ＦＯＸＡ２／ＳＯＸ１７陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）における明確に異なる胚性内胚葉（ＤＥ）亜個体群を濃縮する。Ｅ）ＣＤ１７７陽性の胚性内胚葉（ＤＥ）及びＣＤ２７５陽性の胚性内胚葉（ＤＥ）は、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）陽性の胚性内胚葉（ＤＥ）とは異なることを示す、４日目に選別された胚性内胚葉（ＤＥ）亜個体群の主成分（ＰＣＡ）分析。Ｆ）分化から４日後に１．５倍超でアップレギュレートされた遺伝子から生じたＧＯタームの遺伝子オントロジー分析。
【図１−６】異なる胚性内胚葉（ＤＥ）を濃縮する新規な表面マーカー抗体の同定のためのスクリーニング設定。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）への分化の図示。Ｂ）既知の胚性内胚葉（ＤＥ）マーカーであるＦＯＸＡ２及びＣＸＣＲ４に対する、異なる胚性内胚葉（ＤＥ）亜個体群を濃縮することのできる、新規な表面マーカーの同定のための設定。Ｃ〜Ｄ）ＣＤ２７５及びＣＤ１７７は、ＦＯＸＡ２／ＳＯＸ１７陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）における明確に異なる胚性内胚葉（ＤＥ）亜個体群を濃縮する。Ｅ）ＣＤ１７７陽性の胚性内胚葉（ＤＥ）及びＣＤ２７５陽性の胚性内胚葉（ＤＥ）は、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）陽性の胚性内胚葉（ＤＥ）とは異なることを示す、４日目に選別された胚性内胚葉（ＤＥ）亜個体群の主成分（ＰＣＡ）分析。Ｆ）分化から４日後に１．５倍超でアップレギュレートされた遺伝子から生じたＧＯタームの遺伝子オントロジー分析。
【図２−１】非古典的ＷＮＴ／平面細胞極性（ＰＣＰ）の経路は、ＣＤ１７７＋亜個体群において変動的に調節されている。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）への分化と、磁気細分離（ＭＡＣＳ）を使用した選別の図示。Ｂ）全ての亜個体群においてＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７の類似した発現を示すが、前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）マーカーのＣＥＲ１及びＨＨＥＸの点では明確に異なるプロファイルを示した、ｍＲＮＡの定量。Ｃ）ＣＸＣＲ４の亜個体群及びＣＤ２７５の亜個体群と比較して、ＣＤ１７７陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）亜個体群においてＷＮＴ／ＰＣＰ標的遺伝子のアップレギュレーションを示したマイクロアレイプロファイリング。Ｄ〜Ｅ）ＣＤ１７７陽性胚性内胚葉（＋ＤＥ）における、ＷＮＴ／ＰＣＰ標的遺伝子（ＤＶＬ２、ＲＯＲ２、ＣＥＬＳＲ１）及びリガンド（ＷＮＴ５Ａ及びＷＮＴ４）のアップレギュレーションを確認したｑＰＣＲ分析。Ｆ〜Ｇ）ＣＤ２７５陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）と比較して、ＣＤ１７７の陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）における、ＷＮＴ／ＰＣＰ標的遺伝子であるｐ−ＪＮＫのリン酸化を示したウェスタンブロット分析。
【図２−２】非古典的ＷＮＴ／平面細胞極性（ＰＣＰ）の経路は、ＣＤ１７７＋亜個体群において変動的に調節されている。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）への分化と、磁気細分離（ＭＡＣＳ）を使用した選別の図示。Ｂ）全ての亜個体群においてＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７の類似した発現を示すが、前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）マーカーのＣＥＲ１及びＨＨＥＸの点では明確に異なるプロファイルを示した、ｍＲＮＡの定量。Ｃ）ＣＸＣＲ４の亜個体群及びＣＤ２７５の亜個体群と比較して、ＣＤ１７７陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）亜個体群においてＷＮＴ／ＰＣＰ標的遺伝子のアップレギュレーションを示したマイクロアレイプロファイリング。Ｄ〜Ｅ）ＣＤ１７７陽性胚性内胚葉（＋ＤＥ）における、ＷＮＴ／ＰＣＰ標的遺伝子（ＤＶＬ２、ＲＯＲ２、ＣＥＬＳＲ１）及びリガンド（ＷＮＴ５Ａ及びＷＮＴ４）のアップレギュレーションを確認したｑＰＣＲ分析。Ｆ〜Ｇ）ＣＤ２７５陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）と比較して、ＣＤ１７７の陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）における、ＷＮＴ／ＰＣＰ標的遺伝子であるｐ−ＪＮＫのリン酸化を示したウェスタンブロット分析。
【図２−３】非古典的ＷＮＴ／平面細胞極性（ＰＣＰ）の経路は、ＣＤ１７７＋亜個体群において変動的に調節されている。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）への分化と、磁気細分離（ＭＡＣＳ）を使用した選別の図示。Ｂ）全ての亜個体群においてＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７の類似した発現を示すが、前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）マーカーのＣＥＲ１及びＨＨＥＸの点では明確に異なるプロファイルを示した、ｍＲＮＡの定量。Ｃ）ＣＸＣＲ４の亜個体群及びＣＤ２７５の亜個体群と比較して、ＣＤ１７７陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）亜個体群においてＷＮＴ／ＰＣＰ標的遺伝子のアップレギュレーションを示したマイクロアレイプロファイリング。Ｄ〜Ｅ）ＣＤ１７７陽性胚性内胚葉（＋ＤＥ）における、ＷＮＴ／ＰＣＰ標的遺伝子（ＤＶＬ２、ＲＯＲ２、ＣＥＬＳＲ１）及びリガンド（ＷＮＴ５Ａ及びＷＮＴ４）のアップレギュレーションを確認したｑＰＣＲ分析。Ｆ〜Ｇ）ＣＤ２７５陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）と比較して、ＣＤ１７７の陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）における、ＷＮＴ／ＰＣＰ標的遺伝子であるｐ−ＪＮＫのリン酸化を示したウェスタンブロット分析。
【図２−４】非古典的ＷＮＴ／平面細胞極性（ＰＣＰ）の経路は、ＣＤ１７７＋亜個体群において変動的に調節されている。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）への分化と、磁気細分離（ＭＡＣＳ）を使用した選別の図示。Ｂ）全ての亜個体群においてＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７の類似した発現を示すが、前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）マーカーのＣＥＲ１及びＨＨＥＸの点では明確に異なるプロファイルを示した、ｍＲＮＡの定量。Ｃ）ＣＸＣＲ４の亜個体群及びＣＤ２７５の亜個体群と比較して、ＣＤ１７７陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）亜個体群においてＷＮＴ／ＰＣＰ標的遺伝子のアップレギュレーションを示したマイクロアレイプロファイリング。Ｄ〜Ｅ）ＣＤ１７７陽性胚性内胚葉（＋ＤＥ）における、ＷＮＴ／ＰＣＰ標的遺伝子（ＤＶＬ２、ＲＯＲ２、ＣＥＬＳＲ１）及びリガンド（ＷＮＴ５Ａ及びＷＮＴ４）のアップレギュレーションを確認したｑＰＣＲ分析。Ｆ〜Ｇ）ＣＤ２７５陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）と比較して、ＣＤ１７７の陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）における、ＷＮＴ／ＰＣＰ標的遺伝子であるｐ−ＪＮＫのリン酸化を示したウェスタンブロット分析。
【図２−５】非古典的ＷＮＴ／平面細胞極性（ＰＣＰ）の経路は、ＣＤ１７７＋亜個体群において変動的に調節されている。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）への分化と、磁気細分離（ＭＡＣＳ）を使用した選別の図示。Ｂ）全ての亜個体群においてＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７の類似した発現を示すが、前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）マーカーのＣＥＲ１及びＨＨＥＸの点では明確に異なるプロファイルを示した、ｍＲＮＡの定量。Ｃ）ＣＸＣＲ４の亜個体群及びＣＤ２７５の亜個体群と比較して、ＣＤ１７７陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）亜個体群においてＷＮＴ／ＰＣＰ標的遺伝子のアップレギュレーションを示したマイクロアレイプロファイリング。Ｄ〜Ｅ）ＣＤ１７７陽性胚性内胚葉（＋ＤＥ）における、ＷＮＴ／ＰＣＰ標的遺伝子（ＤＶＬ２、ＲＯＲ２、ＣＥＬＳＲ１）及びリガンド（ＷＮＴ５Ａ及びＷＮＴ４）のアップレギュレーションを確認したｑＰＣＲ分析。Ｆ〜Ｇ）ＣＤ２７５陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）と比較して、ＣＤ１７７の陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）における、ＷＮＴ／ＰＣＰ標的遺伝子であるｐ−ＪＮＫのリン酸化を示したウェスタンブロット分析。
【図３−１】亜個体群の濃縮は、腹側の膵前駆細胞と背側の膵前駆細胞を識別することができる。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）への分化及び磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）を使用した選別、その後のさらなる後方腸管への分化の図示。Ｂ）ＣＤ１７７＋細胞、ＣＸＣＲ４＋細胞、及びＣＤ２７５＋細胞における、腹側膵前駆細胞マーカーＳＯＸ１７の発現。ＰＤＸ１の発現は、膵前駆細胞の形成を示すことが示される。Ｃ）ＣＤ１７７陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）と比較してＣＤ２７５陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）の方が、腹側膵前駆細胞マーカーＳＯＸ１７のより高い発現を示した、ｍＲＮＡ定量。Ｄ）ＣＤ２７５＋及びＣＸＣＲ４＋と比較した、ＣＤ１７７＋における背側膵前駆細胞遺伝子（ノギン、ＭＮＸ１、ＰＴＣＨ１）のアップレギュレーションを確認したｑＰＣＲ分析。Ｅ）ＣＤ１７７＋細胞と比較してＣＤ２７５＋細胞の方がＳＯＸ１７のより高い発現を示した代表的なＦＡＣＳプロット。
【図３−２】亜個体群の濃縮は、腹側の膵前駆細胞と背側の膵前駆細胞を識別することができる。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）への分化及び磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）を使用した選別、その後のさらなる後方腸管への分化の図示。Ｂ）ＣＤ１７７＋細胞、ＣＸＣＲ４＋細胞、及びＣＤ２７５＋細胞における、腹側膵前駆細胞マーカーＳＯＸ１７の発現。ＰＤＸ１の発現は、膵前駆細胞の形成を示すことが示される。Ｃ）ＣＤ１７７陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）と比較してＣＤ２７５陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）の方が、腹側膵前駆細胞マーカーＳＯＸ１７のより高い発現を示した、ｍＲＮＡ定量。Ｄ）ＣＤ２７５＋及びＣＸＣＲ４＋と比較した、ＣＤ１７７＋における背側膵前駆細胞遺伝子（ノギン、ＭＮＸ１、ＰＴＣＨ１）のアップレギュレーションを確認したｑＰＣＲ分析。Ｅ）ＣＤ１７７＋細胞と比較してＣＤ２７５＋細胞の方がＳＯＸ１７のより高い発現を示した代表的なＦＡＣＳプロット。
【図３−３】亜個体群の濃縮は、腹側の膵前駆細胞と背側の膵前駆細胞を識別することができる。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）への分化及び磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）を使用した選別、その後のさらなる後方腸管への分化の図示。Ｂ）ＣＤ１７７＋細胞、ＣＸＣＲ４＋細胞、及びＣＤ２７５＋細胞における、腹側膵前駆細胞マーカーＳＯＸ１７の発現。ＰＤＸ１の発現は、膵前駆細胞の形成を示すことが示される。Ｃ）ＣＤ１７７陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）と比較してＣＤ２７５陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）の方が、腹側膵前駆細胞マーカーＳＯＸ１７のより高い発現を示した、ｍＲＮＡ定量。Ｄ）ＣＤ２７５＋及びＣＸＣＲ４＋と比較した、ＣＤ１７７＋における背側膵前駆細胞遺伝子（ノギン、ＭＮＸ１、ＰＴＣＨ１）のアップレギュレーションを確認したｑＰＣＲ分析。Ｅ）ＣＤ１７７＋細胞と比較してＣＤ２７５＋細胞の方がＳＯＸ１７のより高い発現を示した代表的なＦＡＣＳプロット。
【図３−４】亜個体群の濃縮は、腹側の膵前駆細胞と背側の膵前駆細胞を識別することができる。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）への分化及び磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）を使用した選別、その後のさらなる後方腸管への分化の図示。Ｂ）ＣＤ１７７＋細胞、ＣＸＣＲ４＋細胞、及びＣＤ２７５＋細胞における、腹側膵前駆細胞マーカーＳＯＸ１７の発現。ＰＤＸ１の発現は、膵前駆細胞の形成を示すことが示される。Ｃ）ＣＤ１７７陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）と比較してＣＤ２７５陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）の方が、腹側膵前駆細胞マーカーＳＯＸ１７のより高い発現を示した、ｍＲＮＡ定量。Ｄ）ＣＤ２７５＋及びＣＸＣＲ４＋と比較した、ＣＤ１７７＋における背側膵前駆細胞遺伝子（ノギン、ＭＮＸ１、ＰＴＣＨ１）のアップレギュレーションを確認したｑＰＣＲ分析。Ｅ）ＣＤ１７７＋細胞と比較してＣＤ２７５＋細胞の方がＳＯＸ１７のより高い発現を示した代表的なＦＡＣＳプロット。
【図４−１】ＣＤ１７７＋亜個体群は特殊化された膵前駆細胞であるが、ＣＤ２７５＋亜個体群は肝でプライミングされた前駆細胞である。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）への分化及び磁気細胞分離を使用した選別、その後の膵前駆細胞へのさらなる分化の図示。Ｂ）肝前駆細胞マーカー（ＨＨＥＸ、ＡＦＰ、ＴＴＲ）及び膵前駆細胞マーカー（ＰＤＸ１）の発現を示したｑＰＣＲによる定量。Ｃ）ＣＤ１７７＋細胞及びＣＤ２７５＋細胞におけるＰＤＸ１の免疫蛍光染色の代表的画像。Ｄ）ＣＤ１７７＋細胞（膜）、ＣＤ２７５＋細胞（細胞質及び核）、及びＣＸＣＲ４＋細胞（膜）における、β−カテニン局在化を示した、免疫細胞化学的染色の代表的画像。Ｅ〜Ｆ）細胞周期状態を示すためにＰＩについて染色されたＣＤ２７５＋細胞及びＣＤ１７７＋細胞の代表的なＦＡＣＳプロット及びグラフ分析。
【図４−２】ＣＤ１７７＋亜個体群は特殊化された膵前駆細胞であるが、ＣＤ２７５＋亜個体群は肝でプライミングされた前駆細胞である。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）への分化及び磁気細胞分離を使用した選別、その後の膵前駆細胞へのさらなる分化の図示。Ｂ）肝前駆細胞マーカー（ＨＨＥＸ、ＡＦＰ、ＴＴＲ）及び膵前駆細胞マーカー（ＰＤＸ１）の発現を示したｑＰＣＲによる定量。Ｃ）ＣＤ１７７＋細胞及びＣＤ２７５＋細胞におけるＰＤＸ１の免疫蛍光染色の代表的画像。Ｄ）ＣＤ１７７＋細胞（膜）、ＣＤ２７５＋細胞（細胞質及び核）、及びＣＸＣＲ４＋細胞（膜）における、β−カテニン局在化を示した、免疫細胞化学的染色の代表的画像。Ｅ〜Ｆ）細胞周期状態を示すためにＰＩについて染色されたＣＤ２７５＋細胞及びＣＤ１７７＋細胞の代表的なＦＡＣＳプロット及びグラフ分析。
【図４−３】ＣＤ１７７＋亜個体群は特殊化された膵前駆細胞であるが、ＣＤ２７５＋亜個体群は肝でプライミングされた前駆細胞である。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）への分化及び磁気細胞分離を使用した選別、その後の膵前駆細胞へのさらなる分化の図示。Ｂ）肝前駆細胞マーカー（ＨＨＥＸ、ＡＦＰ、ＴＴＲ）及び膵前駆細胞マーカー（ＰＤＸ１）の発現を示したｑＰＣＲによる定量。Ｃ）ＣＤ１７７＋細胞及びＣＤ２７５＋細胞におけるＰＤＸ１の免疫蛍光染色の代表的画像。Ｄ）ＣＤ１７７＋細胞（膜）、ＣＤ２７５＋細胞（細胞質及び核）、及びＣＸＣＲ４＋細胞（膜）における、β−カテニン局在化を示した、免疫細胞化学的染色の代表的画像。Ｅ〜Ｆ）細胞周期状態を示すためにＰＩについて染色されたＣＤ２７５＋細胞及びＣＤ１７７＋細胞の代表的なＦＡＣＳプロット及びグラフ分析。
【図４−４】ＣＤ１７７＋亜個体群は特殊化された膵前駆細胞であるが、ＣＤ２７５＋亜個体群は肝でプライミングされた前駆細胞である。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）への分化及び磁気細胞分離を使用した選別、その後の膵前駆細胞へのさらなる分化の図示。Ｂ）肝前駆細胞マーカー（ＨＨＥＸ、ＡＦＰ、ＴＴＲ）及び膵前駆細胞マーカー（ＰＤＸ１）の発現を示したｑＰＣＲによる定量。Ｃ）ＣＤ１７７＋細胞及びＣＤ２７５＋細胞におけるＰＤＸ１の免疫蛍光染色の代表的画像。Ｄ）ＣＤ１７７＋細胞（膜）、ＣＤ２７５＋細胞（細胞質及び核）、及びＣＸＣＲ４＋細胞（膜）における、β−カテニン局在化を示した、免疫細胞化学的染色の代表的画像。Ｅ〜Ｆ）細胞周期状態を示すためにＰＩについて染色されたＣＤ２７５＋細胞及びＣＤ１７７＋細胞の代表的なＦＡＣＳプロット及びグラフ分析。
【図４−５】ＣＤ１７７＋亜個体群は特殊化された膵前駆細胞であるが、ＣＤ２７５＋亜個体群は肝でプライミングされた前駆細胞である。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）への分化及び磁気細胞分離を使用した選別、その後の膵前駆細胞へのさらなる分化の図示。Ｂ）肝前駆細胞マーカー（ＨＨＥＸ、ＡＦＰ、ＴＴＲ）及び膵前駆細胞マーカー（ＰＤＸ１）の発現を示したｑＰＣＲによる定量。Ｃ）ＣＤ１７７＋細胞及びＣＤ２７５＋細胞におけるＰＤＸ１の免疫蛍光染色の代表的画像。Ｄ）ＣＤ１７７＋細胞（膜）、ＣＤ２７５＋細胞（細胞質及び核）、及びＣＸＣＲ４＋細胞（膜）における、β−カテニン局在化を示した、免疫細胞化学的染色の代表的画像。Ｅ〜Ｆ）細胞周期状態を示すためにＰＩについて染色されたＣＤ２７５＋細胞及びＣＤ１７７＋細胞の代表的なＦＡＣＳプロット及びグラフ分析。
【図５−１】ＣＤ１７７陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）は、コンパクトで成熟した単一ホルモン性β細胞をインビトロにおいて生成する。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から膵β細胞への分化の図示。Ｂ）ＣＤ１７７＋細胞及びＣＸＣＲ４＋細胞を使用することによって生成された、ＩＮＳ（インシュリン）＋細胞、ＧＣＧ（グルカゴン）＋細胞、及びＩＮＳ／ＧＣＧ二重陽性細胞の比率を示したグラフ表示。Ｃ）膵転写因子ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１、並びにインシュリン（ＩＮＳ）ホルモン及びグルカゴン（ＧＬＵ）ホルモンについて陽性である細胞の比率を示した代表的なＦＡＣＳプロット。Ｄ）ＣＤ１７７＋細胞及びＣＸＣＲ４＋細胞から生成されたβ細胞における、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＮＫＸ２．２のような膵転写因子の発現を示したｑＰＣＲ分析。ＣＸＣＲ４＋細胞と比較してＣＤ１７７＋細胞における、より多くのインシュリン（ＩＮＳ）及びより少ないグルカゴン（ＧＣＧ）の発現を示したｍＲＮＡ定量。成熟マーカーＭＡＦＡも、ＣＸＣＲ４＋細胞と比較してＣＤ１７７＋細胞においてアップレギュレートされている。Ｅ）ＣＸＣＲ４＋亜個体群と比較して小さくコンパクトな構造を示したＣＤ１７７＋亜個体群の代表的な画像。
【図５−２】ＣＤ１７７陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）は、コンパクトで成熟した単一ホルモン性β細胞をインビトロにおいて生成する。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から膵β細胞への分化の図示。Ｂ）ＣＤ１７７＋細胞及びＣＸＣＲ４＋細胞を使用することによって生成された、ＩＮＳ（インシュリン）＋細胞、ＧＣＧ（グルカゴン）＋細胞、及びＩＮＳ／ＧＣＧ二重陽性細胞の比率を示したグラフ表示。Ｃ）膵転写因子ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１、並びにインシュリン（ＩＮＳ）ホルモン及びグルカゴン（ＧＬＵ）ホルモンについて陽性である細胞の比率を示した代表的なＦＡＣＳプロット。Ｄ）ＣＤ１７７＋細胞及びＣＸＣＲ４＋細胞から生成されたβ細胞における、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＮＫＸ２．２のような膵転写因子の発現を示したｑＰＣＲ分析。ＣＸＣＲ４＋細胞と比較してＣＤ１７７＋細胞における、より多くのインシュリン（ＩＮＳ）及びより少ないグルカゴン（ＧＣＧ）の発現を示したｍＲＮＡ定量。成熟マーカーＭＡＦＡも、ＣＸＣＲ４＋細胞と比較してＣＤ１７７＋細胞においてアップレギュレートされている。Ｅ）ＣＸＣＲ４＋亜個体群と比較して小さくコンパクトな構造を示したＣＤ１７７＋亜個体群の代表的な画像。
【図５−３】ＣＤ１７７陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）は、コンパクトで成熟した単一ホルモン性β細胞をインビトロにおいて生成する。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から膵β細胞への分化の図示。Ｂ）ＣＤ１７７＋細胞及びＣＸＣＲ４＋細胞を使用することによって生成された、ＩＮＳ（インシュリン）＋細胞、ＧＣＧ（グルカゴン）＋細胞、及びＩＮＳ／ＧＣＧ二重陽性細胞の比率を示したグラフ表示。Ｃ）膵転写因子ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１、並びにインシュリン（ＩＮＳ）ホルモン及びグルカゴン（ＧＬＵ）ホルモンについて陽性である細胞の比率を示した代表的なＦＡＣＳプロット。Ｄ）ＣＤ１７７＋細胞及びＣＸＣＲ４＋細胞から生成されたβ細胞における、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＮＫＸ２．２のような膵転写因子の発現を示したｑＰＣＲ分析。ＣＸＣＲ４＋細胞と比較してＣＤ１７７＋細胞における、より多くのインシュリン（ＩＮＳ）及びより少ないグルカゴン（ＧＣＧ）の発現を示したｍＲＮＡ定量。成熟マーカーＭＡＦＡも、ＣＸＣＲ４＋細胞と比較してＣＤ１７７＋細胞においてアップレギュレートされている。Ｅ）ＣＸＣＲ４＋亜個体群と比較して小さくコンパクトな構造を示したＣＤ１７７＋亜個体群の代表的な画像。
【図５−４】ＣＤ１７７陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）は、コンパクトで成熟した単一ホルモン性β細胞をインビトロにおいて生成する。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から膵β細胞への分化の図示。Ｂ）ＣＤ１７７＋細胞及びＣＸＣＲ４＋細胞を使用することによって生成された、ＩＮＳ（インシュリン）＋細胞、ＧＣＧ（グルカゴン）＋細胞、及びＩＮＳ／ＧＣＧ二重陽性細胞の比率を示したグラフ表示。Ｃ）膵転写因子ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１、並びにインシュリン（ＩＮＳ）ホルモン及びグルカゴン（ＧＬＵ）ホルモンについて陽性である細胞の比率を示した代表的なＦＡＣＳプロット。Ｄ）ＣＤ１７７＋細胞及びＣＸＣＲ４＋細胞から生成されたβ細胞における、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＮＫＸ２．２のような膵転写因子の発現を示したｑＰＣＲ分析。ＣＸＣＲ４＋細胞と比較してＣＤ１７７＋細胞における、より多くのインシュリン（ＩＮＳ）及びより少ないグルカゴン（ＧＣＧ）の発現を示したｍＲＮＡ定量。成熟マーカーＭＡＦＡも、ＣＸＣＲ４＋細胞と比較してＣＤ１７７＋細胞においてアップレギュレートされている。Ｅ）ＣＸＣＲ４＋亜個体群と比較して小さくコンパクトな構造を示したＣＤ１７７＋亜個体群の代表的な画像。
【図５−５】ＣＤ１７７陽性の胚性内胚葉（＋ＤＥ）は、コンパクトで成熟した単一ホルモン性β細胞をインビトロにおいて生成する。Ａ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から膵β細胞への分化の図示。Ｂ）ＣＤ１７７＋細胞及びＣＸＣＲ４＋細胞を使用することによって生成された、ＩＮＳ（インシュリン）＋細胞、ＧＣＧ（グルカゴン）＋細胞、及びＩＮＳ／ＧＣＧ二重陽性細胞の比率を示したグラフ表示。Ｃ）膵転写因子ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１、並びにインシュリン（ＩＮＳ）ホルモン及びグルカゴン（ＧＬＵ）ホルモンについて陽性である細胞の比率を示した代表的なＦＡＣＳプロット。Ｄ）ＣＤ１７７＋細胞及びＣＸＣＲ４＋細胞から生成されたβ細胞における、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＮＫＸ２．２のような膵転写因子の発現を示したｑＰＣＲ分析。ＣＸＣＲ４＋細胞と比較してＣＤ１７７＋細胞における、より多くのインシュリン（ＩＮＳ）及びより少ないグルカゴン（ＧＣＧ）の発現を示したｍＲＮＡ定量。成熟マーカーＭＡＦＡも、ＣＸＣＲ４＋細胞と比較してＣＤ１７７＋細胞においてアップレギュレートされている。Ｅ）ＣＸＣＲ４＋亜個体群と比較して小さくコンパクトな構造を示したＣＤ１７７＋亜個体群の代表的な画像。
【図６−１】新規なＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）の亜個体群及びＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）の亜個体群の同定。Ａ）添加された増殖因子及び低分子を示した、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）への分化の図示。Ｂ〜Ｃ）異種個体群を示したＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７＋細胞（ｂ）及び見かけ上は同質なＦＯＸＡ２＋／ＳＯＸ１７＋（ｃ）胚性内胚葉（ＤＥ）の代表的なＦＡＣＳプロット。Ｄ〜Ｅ）ＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７についての、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７ｈｉｇｈ細胞、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７ｍｉｄ細胞、及びＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７ｌｏｗ細胞の遺伝子発現プロファイル（全ての遺伝子についてｎ＝３つの生物学的レプリケート、１つの点あたりｎ＝２の技術的レプリケート）。Ｆ〜Ｇ）ＣＥＲ１及びＨＨＥＸについて、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７ｈｉｇｈ細胞、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７ｍｉｄ細胞、及びＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７ｌｏｗ細胞の遺伝子発現プロファイル（全ての遺伝子についてｎ＝３つの生物学的レプリケート、１つの点あたりｎ＝２の技術的レプリケート）。＊は、試料間の有意性を示す。平均値±標準偏差、＊＊ｐ＜０．０５。
【図６−２】新規なＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）の亜個体群及びＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）の亜個体群の同定。Ａ）添加された増殖因子及び低分子を示した、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）への分化の図示。Ｂ〜Ｃ）異種個体群を示したＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７＋細胞（ｂ）及び見かけ上は同質なＦＯＸＡ２＋／ＳＯＸ１７＋（ｃ）胚性内胚葉（ＤＥ）の代表的なＦＡＣＳプロット。Ｄ〜Ｅ）ＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７についての、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７ｈｉｇｈ細胞、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７ｍｉｄ細胞、及びＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７ｌｏｗ細胞の遺伝子発現プロファイル（全ての遺伝子についてｎ＝３つの生物学的レプリケート、１つの点あたりｎ＝２の技術的レプリケート）。Ｆ〜Ｇ）ＣＥＲ１及びＨＨＥＸについて、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７ｈｉｇｈ細胞、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７ｍｉｄ細胞、及びＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７ｌｏｗ細胞の遺伝子発現プロファイル（全ての遺伝子についてｎ＝３つの生物学的レプリケート、１つの点あたりｎ＝２の技術的レプリケート）。＊は、試料間の有意性を示す。平均値±標準偏差、＊＊ｐ＜０．０５。
【図７−１】ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）亜個体群、ＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）亜個体群、及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）亜個体群の分子プロファイリングは、明確に異なるサインを明らかとする。Ａ〜Ｃ）ＣＤ１７７＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群対ＣＤ２７５＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群（Ｂ）、ＣＤ１７７＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群対ＣＸＣＲ４＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群（Ｃ）、及びＣＤ２７５＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群対ＣＸＣＲ４＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群（Ａ）において、選択され有意に濃縮された遺伝子オントロジー（ＧＯ）タームの棒グラフ。Ｄ）ＣＸＣＲ４＋、ＣＤ１７７＋、及びＣＤ２７５＋において発現変動する遺伝子を示したヒートマップ。Ｅ〜Ｆ）濃縮された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）亜個体群の細胞質内（Ｃ）及び核内（Ｎ）におけるβ−カテニンの核分画（Ｅ）及び定量（Ｆ）。
【図７−２】ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）亜個体群、ＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）亜個体群、及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）亜個体群の分子プロファイリングは、明確に異なるサインを明らかとする。Ａ〜Ｃ）ＣＤ１７７＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群対ＣＤ２７５＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群（Ｂ）、ＣＤ１７７＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群対ＣＸＣＲ４＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群（Ｃ）、及びＣＤ２７５＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群対ＣＸＣＲ４＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群（Ａ）において、選択され有意に濃縮された遺伝子オントロジー（ＧＯ）タームの棒グラフ。Ｄ）ＣＸＣＲ４＋、ＣＤ１７７＋、及びＣＤ２７５＋において発現変動する遺伝子を示したヒートマップ。Ｅ〜Ｆ）濃縮された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）亜個体群の細胞質内（Ｃ）及び核内（Ｎ）におけるβ−カテニンの核分画（Ｅ）及び定量（Ｆ）。
【図７−３】ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）亜個体群、ＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）亜個体群、及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）亜個体群の分子プロファイリングは、明確に異なるサインを明らかとする。Ａ〜Ｃ）ＣＤ１７７＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群対ＣＤ２７５＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群（Ｂ）、ＣＤ１７７＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群対ＣＸＣＲ４＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群（Ｃ）、及びＣＤ２７５＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群対ＣＸＣＲ４＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群（Ａ）において、選択され有意に濃縮された遺伝子オントロジー（ＧＯ）タームの棒グラフ。Ｄ）ＣＸＣＲ４＋、ＣＤ１７７＋、及びＣＤ２７５＋において発現変動する遺伝子を示したヒートマップ。Ｅ〜Ｆ）濃縮された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）亜個体群の細胞質内（Ｃ）及び核内（Ｎ）におけるβ−カテニンの核分画（Ｅ）及び定量（Ｆ）。
【図７−４】ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）亜個体群、ＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）亜個体群、及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）亜個体群の分子プロファイリングは、明確に異なるサインを明らかとする。Ａ〜Ｃ）ＣＤ１７７＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群対ＣＤ２７５＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群（Ｂ）、ＣＤ１７７＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群対ＣＸＣＲ４＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群（Ｃ）、及びＣＤ２７５＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群対ＣＸＣＲ４＋の胚性内胚葉（ＤＥ）個体群（Ａ）において、選択され有意に濃縮された遺伝子オントロジー（ＧＯ）タームの棒グラフ。Ｄ）ＣＸＣＲ４＋、ＣＤ１７７＋、及びＣＤ２７５＋において発現変動する遺伝子を示したヒートマップ。Ｅ〜Ｆ）濃縮された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）亜個体群の細胞質内（Ｃ）及び核内（Ｎ）におけるβ−カテニンの核分画（Ｅ）及び定量（Ｆ）。
【図８−１】ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）は、ＰＤＸ１＋膵前駆細胞へと効率的に分化する。Ａ〜Ｂ）ＰＤＸ１の細胞内ＦＡＣＳ分析（Ａ）並びにＰＤＸ１ｈｉｇｈ細胞及びＰＤＸ１ｌｏｗ細胞の比率を示した、ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、ＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導された膵前駆細胞（ＰＰ）の定量（Ｂ）。Ｃ〜Ｄ）ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、ＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導された膵前駆細胞（ＰＰ）における、ＰＤＸ１ｈｉｇｈ細胞及びＰＤＸ１ｌｏｗ細胞の免疫蛍光染色（Ｄ）及び分析（Ｃ）。尺度バー５０μm。Ｅ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から膵β様細胞への分化中におけるＣＤ１７７＋、ＣＤ２７５＋、及びＣＸＣＲ４＋の発現。Ｆ）肝分化プロトコール。Ｇ）濃縮された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）亜個体群における、初期肝前駆細胞マーカーであるＨＨＥＸ、ＴＴＲ、及びＡＦＰの発現のｑＰＣＲによる定量。
【図８−２】ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）は、ＰＤＸ１＋膵前駆細胞へと効率的に分化する。Ａ〜Ｂ）ＰＤＸ１の細胞内ＦＡＣＳ分析（Ａ）並びにＰＤＸ１ｈｉｇｈ細胞及びＰＤＸ１ｌｏｗ細胞の比率を示した、ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、ＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導された膵前駆細胞（ＰＰ）の定量（Ｂ）。Ｃ〜Ｄ）ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、ＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導された膵前駆細胞（ＰＰ）における、ＰＤＸ１ｈｉｇｈ細胞及びＰＤＸ１ｌｏｗ細胞の免疫蛍光染色（Ｄ）及び分析（Ｃ）。尺度バー５０μm。Ｅ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から膵β様細胞への分化中におけるＣＤ１７７＋、ＣＤ２７５＋、及びＣＸＣＲ４＋の発現。Ｆ）肝分化プロトコール。Ｇ）濃縮された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）亜個体群における、初期肝前駆細胞マーカーであるＨＨＥＸ、ＴＴＲ、及びＡＦＰの発現のｑＰＣＲによる定量。
【図８−３】ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）は、ＰＤＸ１＋膵前駆細胞へと効率的に分化する。Ａ〜Ｂ）ＰＤＸ１の細胞内ＦＡＣＳ分析（Ａ）並びにＰＤＸ１ｈｉｇｈ細胞及びＰＤＸ１ｌｏｗ細胞の比率を示した、ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、ＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導された膵前駆細胞（ＰＰ）の定量（Ｂ）。Ｃ〜Ｄ）ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、ＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導された膵前駆細胞（ＰＰ）における、ＰＤＸ１ｈｉｇｈ細胞及びＰＤＸ１ｌｏｗ細胞の免疫蛍光染色（Ｄ）及び分析（Ｃ）。尺度バー５０μm。Ｅ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から膵β様細胞への分化中におけるＣＤ１７７＋、ＣＤ２７５＋、及びＣＸＣＲ４＋の発現。Ｆ）肝分化プロトコール。Ｇ）濃縮された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）亜個体群における、初期肝前駆細胞マーカーであるＨＨＥＸ、ＴＴＲ、及びＡＦＰの発現のｑＰＣＲによる定量。
【図９】ＧＡＴＡ６及びＳＯＸ２の発現に基づいた、ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）細胞、ＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）細胞、及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）細胞から誘導された膵前駆細胞の特徴付け。Ａ）後方前腸マーカーのＧＡＴＡ６及びＰＤＸ１の共発現についての、濃縮された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）亜個体群から誘導された膵前駆細胞の免疫蛍光染色。尺度バー５０μm。
【図１０】ＣＤＸ２及びＰＴＦ１Ａの発現に基づいた、ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）細胞、ＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）細胞、及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）細胞から誘導された膵前駆細胞の特徴付け。Ａ）腸マーカーのＣＤＸ２及びＰＤＸ１の共発現についての、濃縮された前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）亜個体群から誘導された膵前駆細胞の免疫蛍光染色。尺度バー５０μm。Ｂ）外分泌膵マーカーのＰＴＦ１Ａ及びＰＤＸ１の共発現についての、濃縮された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）亜個体群から誘導された膵前駆細胞の免疫蛍光染色。尺度バー、５０μm。
【図１１−１】ＷＮＴ分泌阻害は、膵分化を促進する。Ａ）ＷＮＴ分泌阻害はＩＷＰ２を使用してＳ２段階で実施される、膵前駆細胞への分化のプロトコールの概観。Ｂ〜Ｄ）ＩＷＰ２を用いての処置前（Ｂ、Ｃ）（尺度バー、５０μm）及び処置後（Ｂ、Ｄ）（尺度バー、２０μm）においてＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、ＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から生成されたＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋を発現している細胞の比率についてのＦＡＣＳによる定量（Ｂ）及び免疫細胞化学（Ｃ〜Ｄ）。Ｅ〜Ｆ）細胞周期から細胞が出たことを明らかとする、様々な前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）サブセットにおけるＥｄＵ＋細胞についてのＥｄＵによる染色（Ｅ）及び定量（Ｆ）。尺度バー、８０μm。（Ｇ）様々な前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）亜個体群におけるＳ４及びＳ５の段階におけるＮＧＮ３のｍＲＮＡ分析。（ｎ＝３、生物学的レプリケート）。エラーバーは＋/−標準偏差を示す；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、対応のない両側ｔ検定。データは１８Ｓに対して正規化された。
【図１１−２】ＷＮＴ分泌阻害は、膵分化を促進する。Ａ）ＷＮＴ分泌阻害はＩＷＰ２を使用してＳ２段階で実施される、膵前駆細胞への分化のプロトコールの概観。Ｂ〜Ｄ）ＩＷＰ２を用いての処置前（Ｂ、Ｃ）（尺度バー、５０μm）及び処置後（Ｂ、Ｄ）（尺度バー、２０μm）においてＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、ＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から生成されたＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋を発現している細胞の比率についてのＦＡＣＳによる定量（Ｂ）及び免疫細胞化学（Ｃ〜Ｄ）。Ｅ〜Ｆ）細胞周期から細胞が出たことを明らかとする、様々な前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）サブセットにおけるＥｄＵ＋細胞についてのＥｄＵによる染色（Ｅ）及び定量（Ｆ）。尺度バー、８０μm。（Ｇ）様々な前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）亜個体群におけるＳ４及びＳ５の段階におけるＮＧＮ３のｍＲＮＡ分析。（ｎ＝３、生物学的レプリケート）。エラーバーは＋/−標準偏差を示す；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、対応のない両側ｔ検定。データは１８Ｓに対して正規化された。
【図１１−３】ＷＮＴ分泌阻害は、膵分化を促進する。Ａ）ＷＮＴ分泌阻害はＩＷＰ２を使用してＳ２段階で実施される、膵前駆細胞への分化のプロトコールの概観。Ｂ〜Ｄ）ＩＷＰ２を用いての処置前（Ｂ、Ｃ）（尺度バー、５０μm）及び処置後（Ｂ、Ｄ）（尺度バー、２０μm）においてＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、ＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から生成されたＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋を発現している細胞の比率についてのＦＡＣＳによる定量（Ｂ）及び免疫細胞化学（Ｃ〜Ｄ）。Ｅ〜Ｆ）細胞周期から細胞が出たことを明らかとする、様々な前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）サブセットにおけるＥｄＵ＋細胞についてのＥｄＵによる染色（Ｅ）及び定量（Ｆ）。尺度バー、８０μm。（Ｇ）様々な前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）亜個体群におけるＳ４及びＳ５の段階におけるＮＧＮ３のｍＲＮＡ分析。（ｎ＝３、生物学的レプリケート）。エラーバーは＋/−標準偏差を示す；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、対応のない両側ｔ検定。データは１８Ｓに対して正規化された。
【図１２−１】ＣＤ１７７＋の濃縮された胚性内胚葉（ＤＥ）細胞は、ＮＫＸ６．１＋/ＩＮＳ＋β様細胞を効率的に生成する。Ａ）ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＮＥＵＲＯＤ１の発現についての、ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から生成されたＳ６細胞のｑＰＣＲによる遺伝子発現。エラーバーは＋/−標準偏差を示す；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、対応のない両側ｔ検定。データは１８Ｓに対して正規化された。Ｂ〜Ｃ）ＰＤＸ１とＮＫＸ６．１（Ｂ）及びＮＫＸ６．１とインシュリン（ＩＮＳ）（Ｃ）の発現についての、ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導されたβ細胞及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導されたβ細胞の代表的なＦＡＣＳプロット。Ｄ）様々な転写因子及び膵ホルモンを発現している、細胞の比率について、Ｓ６段階の細胞のＦＡＣＳによる定量。Ｅ〜Ｆ）（Ｅ）ＰＤＸ１とＣ−ペプチド、及び（Ｆ）ＮＫＸ６．１とＩＮＳについて、濃縮されたＣＤ１７７陽性胚性内胚葉（＋ＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性胚性内胚葉（＋ＤＥ）から誘導されたＳ６の細胞の代表的な免疫蛍光染色。核内ＤＡＰＩ染色も同様に示されている。尺度バー、５０μm。Ｇ）ヒト膵島と比較して、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＮＫＸ２．２などの膵内分泌転写因子について、選別された亜個体群から誘導されたβ様細胞のｍＲＮＡの定量。Ｈ）濃縮された亜個体群から生成されたβ様細胞内における膵ホルモンであるインシュリン（ＩＮＳ）及びグルカゴン（ＧＣＧ）のｍＲＮＡ転写物の定量。Ｉ）多ホルモン性細胞をマークするインシュリン（ＩＮＳ）及びグルカゴン（ＧＣＧ）の発現について、濃縮された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）亜個体群から生成された段階６の細胞の代表的なＦＡＣＳプロット。
【図１２−２】ＣＤ１７７＋の濃縮された胚性内胚葉（ＤＥ）細胞は、ＮＫＸ６．１＋/ＩＮＳ＋β様細胞を効率的に生成する。Ａ）ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＮＥＵＲＯＤ１の発現についての、ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から生成されたＳ６細胞のｑＰＣＲによる遺伝子発現。エラーバーは＋/−標準偏差を示す；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、対応のない両側ｔ検定。データは１８Ｓに対して正規化された。Ｂ〜Ｃ）ＰＤＸ１とＮＫＸ６．１（Ｂ）及びＮＫＸ６．１とインシュリン（ＩＮＳ）（Ｃ）の発現についての、ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導されたβ細胞及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導されたβ細胞の代表的なＦＡＣＳプロット。Ｄ）様々な転写因子及び膵ホルモンを発現している、細胞の比率について、Ｓ６段階の細胞のＦＡＣＳによる定量。Ｅ〜Ｆ）（Ｅ）ＰＤＸ１とＣ−ペプチド、及び（Ｆ）ＮＫＸ６．１とＩＮＳについて、濃縮されたＣＤ１７７陽性胚性内胚葉（＋ＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性胚性内胚葉（＋ＤＥ）から誘導されたＳ６の細胞の代表的な免疫蛍光染色。核内ＤＡＰＩ染色も同様に示されている。尺度バー、５０μm。Ｇ）ヒト膵島と比較して、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＮＫＸ２．２などの膵内分泌転写因子について、選別された亜個体群から誘導されたβ様細胞のｍＲＮＡの定量。Ｈ）濃縮された亜個体群から生成されたβ様細胞内における膵ホルモンであるインシュリン（ＩＮＳ）及びグルカゴン（ＧＣＧ）のｍＲＮＡ転写物の定量。Ｉ）多ホルモン性細胞をマークするインシュリン（ＩＮＳ）及びグルカゴン（ＧＣＧ）の発現について、濃縮された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）亜個体群から生成された段階６の細胞の代表的なＦＡＣＳプロット。
【図１２−３】ＣＤ１７７＋の濃縮された胚性内胚葉（ＤＥ）細胞は、ＮＫＸ６．１＋/ＩＮＳ＋β様細胞を効率的に生成する。Ａ）ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＮＥＵＲＯＤ１の発現についての、ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から生成されたＳ６細胞のｑＰＣＲによる遺伝子発現。エラーバーは＋/−標準偏差を示す；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、対応のない両側ｔ検定。データは１８Ｓに対して正規化された。Ｂ〜Ｃ）ＰＤＸ１とＮＫＸ６．１（Ｂ）及びＮＫＸ６．１とインシュリン（ＩＮＳ）（Ｃ）の発現についての、ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導されたβ細胞及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導されたβ細胞の代表的なＦＡＣＳプロット。Ｄ）様々な転写因子及び膵ホルモンを発現している、細胞の比率について、Ｓ６段階の細胞のＦＡＣＳによる定量。Ｅ〜Ｆ）（Ｅ）ＰＤＸ１とＣ−ペプチド、及び（Ｆ）ＮＫＸ６．１とＩＮＳについて、濃縮されたＣＤ１７７陽性胚性内胚葉（＋ＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性胚性内胚葉（＋ＤＥ）から誘導されたＳ６の細胞の代表的な免疫蛍光染色。核内ＤＡＰＩ染色も同様に示されている。尺度バー、５０μm。Ｇ）ヒト膵島と比較して、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＮＫＸ２．２などの膵内分泌転写因子について、選別された亜個体群から誘導されたβ様細胞のｍＲＮＡの定量。Ｈ）濃縮された亜個体群から生成されたβ様細胞内における膵ホルモンであるインシュリン（ＩＮＳ）及びグルカゴン（ＧＣＧ）のｍＲＮＡ転写物の定量。Ｉ）多ホルモン性細胞をマークするインシュリン（ＩＮＳ）及びグルカゴン（ＧＣＧ）の発現について、濃縮された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）亜個体群から生成された段階６の細胞の代表的なＦＡＣＳプロット。
【図１３−１】ＣＤ１７７＋の濃縮された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）は、インビトロにおいてより多くのβ様細胞を生成する。Ａ）２日間と３日間を比較した分化プロトコールの概略。Ｂ）２日間及び３日間の設定におけるＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、ＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から生成されたＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋の比較。Ｃ）ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）に由来するクラスターにおいてβ様細胞を生成する分化プロトコールの説明。Ｄ）ＣＤ１７７から誘導されたβ様細胞及びＣＸＣＲ４から誘導されたβ様細胞の形態；ＤＡＰＩ（青色）及びＥ−カドヘリン（ＣＡＤ）（緑色）。尺度バー、２０μm。グラフは凝集物のサイズ（μm）を示す。Ｅ）成熟マーカーのＭＡＦＡ、ＧＬＵＴ１、及びＵＣＮ３についてのβ様細胞の遺伝子発現プロファイル。データは、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）と比較した変化倍率として表現される。エラーバーは＋/−標準偏差を示す；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、対応のない両側ｔ検定。データは１８Ｓに対して正規化された。Ｆ、Ｈ〜Ｉ）ＭＡＦＡ（左）、インシュリン（ＩＮＳ）（中央）（挿入図はより高い拡大率の画像を示す）（Ｈ）、及びＮＫＸ６．１（緑色、核）とＧＬＵＴ１（緑色、膜）（Ｉ）の発現についてのＦＡＣＳによる定量（Ｆ）並びに免疫組織化学。ＤＡＰＩは、青色で示されている。尺度バーは、低拡大率の画像では５０μm、高拡大率の画像では５μmである。Ｇ）ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導されたβ様細胞及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導されたβ様細胞による、静的なグルコース刺激性ヒトインシュリン分泌（ｎ＝４、１つのバッチあたり５つの技術的レプリケートを含む）。データは、基礎インシュリンレベルと比較した変化倍率として表現され、細胞数に対して正規化されている。Ｊ〜Ｋ）ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉細胞（＋ＡＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）細胞から生成されたＳ７の細胞における、β細胞成熟マーカーであるＭＡＦＡ（Ｊ）及びＧＬＵＴ１（Ｋ）についての代表的なＦＡＣＳプロット。
【図１３−２】ＣＤ１７７＋の濃縮された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）は、インビトロにおいてより多くのβ様細胞を生成する。Ａ）２日間と３日間を比較した分化プロトコールの概略。Ｂ）２日間及び３日間の設定におけるＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、ＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から生成されたＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋の比較。Ｃ）ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）に由来するクラスターにおいてβ様細胞を生成する分化プロトコールの説明。Ｄ）ＣＤ１７７から誘導されたβ様細胞及びＣＸＣＲ４から誘導されたβ様細胞の形態；ＤＡＰＩ（青色）及びＥ−カドヘリン（ＣＡＤ）（緑色）。尺度バー、２０μm。グラフは凝集物のサイズ（μm）を示す。Ｅ）成熟マーカーのＭＡＦＡ、ＧＬＵＴ１、及びＵＣＮ３についてのβ様細胞の遺伝子発現プロファイル。データは、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）と比較した変化倍率として表現される。エラーバーは＋/−標準偏差を示す；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、対応のない両側ｔ検定。データは１８Ｓに対して正規化された。Ｆ、Ｈ〜Ｉ）ＭＡＦＡ（左）、インシュリン（ＩＮＳ）（中央）（挿入図はより高い拡大率の画像を示す）（Ｈ）、及びＮＫＸ６．１（緑色、核）とＧＬＵＴ１（緑色、膜）（Ｉ）の発現についてのＦＡＣＳによる定量（Ｆ）並びに免疫組織化学。ＤＡＰＩは、青色で示されている。尺度バーは、低拡大率の画像では５０μm、高拡大率の画像では５μmである。Ｇ）ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導されたβ様細胞及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導されたβ様細胞による、静的なグルコース刺激性ヒトインシュリン分泌（ｎ＝４、１つのバッチあたり５つの技術的レプリケートを含む）。データは、基礎インシュリンレベルと比較した変化倍率として表現され、細胞数に対して正規化されている。Ｊ〜Ｋ）ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉細胞（＋ＡＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）細胞から生成されたＳ７の細胞における、β細胞成熟マーカーであるＭＡＦＡ（Ｊ）及びＧＬＵＴ１（Ｋ）についての代表的なＦＡＣＳプロット。
【図１３−３】ＣＤ１７７＋の濃縮された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）は、インビトロにおいてより多くのβ様細胞を生成する。Ａ）２日間と３日間を比較した分化プロトコールの概略。Ｂ）２日間及び３日間の設定におけるＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、ＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から生成されたＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋の比較。Ｃ）ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）に由来するクラスターにおいてβ様細胞を生成する分化プロトコールの説明。Ｄ）ＣＤ１７７から誘導されたβ様細胞及びＣＸＣＲ４から誘導されたβ様細胞の形態；ＤＡＰＩ（青色）及びＥ−カドヘリン（ＣＡＤ）（緑色）。尺度バー、２０μm。グラフは凝集物のサイズ（μm）を示す。Ｅ）成熟マーカーのＭＡＦＡ、ＧＬＵＴ１、及びＵＣＮ３についてのβ様細胞の遺伝子発現プロファイル。データは、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）と比較した変化倍率として表現される。エラーバーは＋/−標準偏差を示す；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、対応のない両側ｔ検定。データは１８Ｓに対して正規化された。Ｆ、Ｈ〜Ｉ）ＭＡＦＡ（左）、インシュリン（ＩＮＳ）（中央）（挿入図はより高い拡大率の画像を示す）（Ｈ）、及びＮＫＸ６．１（緑色、核）とＧＬＵＴ１（緑色、膜）（Ｉ）の発現についてのＦＡＣＳによる定量（Ｆ）並びに免疫組織化学。ＤＡＰＩは、青色で示されている。尺度バーは、低拡大率の画像では５０μm、高拡大率の画像では５μmである。Ｇ）ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導されたβ様細胞及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導されたβ様細胞による、静的なグルコース刺激性ヒトインシュリン分泌（ｎ＝４、１つのバッチあたり５つの技術的レプリケートを含む）。データは、基礎インシュリンレベルと比較した変化倍率として表現され、細胞数に対して正規化されている。Ｊ〜Ｋ）ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉細胞（＋ＡＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）細胞から生成されたＳ７の細胞における、β細胞成熟マーカーであるＭＡＦＡ（Ｊ）及びＧＬＵＴ１（Ｋ）についての代表的なＦＡＣＳプロット。
【図１３−４】ＣＤ１７７＋の濃縮された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）は、インビトロにおいてより多くのβ様細胞を生成する。Ａ）２日間と３日間を比較した分化プロトコールの概略。Ｂ）２日間及び３日間の設定におけるＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、ＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から生成されたＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋の比較。Ｃ）ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）に由来するクラスターにおいてβ様細胞を生成する分化プロトコールの説明。Ｄ）ＣＤ１７７から誘導されたβ様細胞及びＣＸＣＲ４から誘導されたβ様細胞の形態；ＤＡＰＩ（青色）及びＥ−カドヘリン（ＣＡＤ）（緑色）。尺度バー、２０μm。グラフは凝集物のサイズ（μm）を示す。Ｅ）成熟マーカーのＭＡＦＡ、ＧＬＵＴ１、及びＵＣＮ３についてのβ様細胞の遺伝子発現プロファイル。データは、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）と比較した変化倍率として表現される。エラーバーは＋/−標準偏差を示す；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、対応のない両側ｔ検定。データは１８Ｓに対して正規化された。Ｆ、Ｈ〜Ｉ）ＭＡＦＡ（左）、インシュリン（ＩＮＳ）（中央）（挿入図はより高い拡大率の画像を示す）（Ｈ）、及びＮＫＸ６．１（緑色、核）とＧＬＵＴ１（緑色、膜）（Ｉ）の発現についてのＦＡＣＳによる定量（Ｆ）並びに免疫組織化学。ＤＡＰＩは、青色で示されている。尺度バーは、低拡大率の画像では５０μm、高拡大率の画像では５μmである。Ｇ）ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導されたβ様細胞及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導されたβ様細胞による、静的なグルコース刺激性ヒトインシュリン分泌（ｎ＝４、１つのバッチあたり５つの技術的レプリケートを含む）。データは、基礎インシュリンレベルと比較した変化倍率として表現され、細胞数に対して正規化されている。Ｊ〜Ｋ）ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉細胞（＋ＡＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）細胞から生成されたＳ７の細胞における、β細胞成熟マーカーであるＭＡＦＡ（Ｊ）及びＧＬＵＴ１（Ｋ）についての代表的なＦＡＣＳプロット。
【図１３−５】ＣＤ１７７＋の濃縮された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）は、インビトロにおいてより多くのβ様細胞を生成する。Ａ）２日間と３日間を比較した分化プロトコールの概略。Ｂ）２日間及び３日間の設定におけるＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、ＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から生成されたＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋の比較。Ｃ）ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）に由来するクラスターにおいてβ様細胞を生成する分化プロトコールの説明。Ｄ）ＣＤ１７７から誘導されたβ様細胞及びＣＸＣＲ４から誘導されたβ様細胞の形態；ＤＡＰＩ（青色）及びＥ−カドヘリン（ＣＡＤ）（緑色）。尺度バー、２０μm。グラフは凝集物のサイズ（μm）を示す。Ｅ）成熟マーカーのＭＡＦＡ、ＧＬＵＴ１、及びＵＣＮ３についてのβ様細胞の遺伝子発現プロファイル。データは、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）と比較した変化倍率として表現される。エラーバーは＋/−標準偏差を示す；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、対応のない両側ｔ検定。データは１８Ｓに対して正規化された。Ｆ、Ｈ〜Ｉ）ＭＡＦＡ（左）、インシュリン（ＩＮＳ）（中央）（挿入図はより高い拡大率の画像を示す）（Ｈ）、及びＮＫＸ６．１（緑色、核）とＧＬＵＴ１（緑色、膜）（Ｉ）の発現についてのＦＡＣＳによる定量（Ｆ）並びに免疫組織化学。ＤＡＰＩは、青色で示されている。尺度バーは、低拡大率の画像では５０μm、高拡大率の画像では５μmである。Ｇ）ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導されたβ様細胞及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導されたβ様細胞による、静的なグルコース刺激性ヒトインシュリン分泌（ｎ＝４、１つのバッチあたり５つの技術的レプリケートを含む）。データは、基礎インシュリンレベルと比較した変化倍率として表現され、細胞数に対して正規化されている。Ｊ〜Ｋ）ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉細胞（＋ＡＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）細胞から生成されたＳ７の細胞における、β細胞成熟マーカーであるＭＡＦＡ（Ｊ）及びＧＬＵＴ１（Ｋ）についての代表的なＦＡＣＳプロット。
【図１３−６】ＣＤ１７７＋の濃縮された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）は、インビトロにおいてより多くのβ様細胞を生成する。Ａ）２日間と３日間を比較した分化プロトコールの概略。Ｂ）２日間及び３日間の設定におけるＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、ＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）、及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から生成されたＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋の比較。Ｃ）ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）に由来するクラスターにおいてβ様細胞を生成する分化プロトコールの説明。Ｄ）ＣＤ１７７から誘導されたβ様細胞及びＣＸＣＲ４から誘導されたβ様細胞の形態；ＤＡＰＩ（青色）及びＥ−カドヘリン（ＣＡＤ）（緑色）。尺度バー、２０μm。グラフは凝集物のサイズ（μm）を示す。Ｅ）成熟マーカーのＭＡＦＡ、ＧＬＵＴ１、及びＵＣＮ３についてのβ様細胞の遺伝子発現プロファイル。データは、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）と比較した変化倍率として表現される。エラーバーは＋/−標準偏差を示す；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、対応のない両側ｔ検定。データは１８Ｓに対して正規化された。Ｆ、Ｈ〜Ｉ）ＭＡＦＡ（左）、インシュリン（ＩＮＳ）（中央）（挿入図はより高い拡大率の画像を示す）（Ｈ）、及びＮＫＸ６．１（緑色、核）とＧＬＵＴ１（緑色、膜）（Ｉ）の発現についてのＦＡＣＳによる定量（Ｆ）並びに免疫組織化学。ＤＡＰＩは、青色で示されている。尺度バーは、低拡大率の画像では５０μm、高拡大率の画像では５μmである。Ｇ）ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導されたβ様細胞及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）から誘導されたβ様細胞による、静的なグルコース刺激性ヒトインシュリン分泌（ｎ＝４、１つのバッチあたり５つの技術的レプリケートを含む）。データは、基礎インシュリンレベルと比較した変化倍率として表現され、細胞数に対して正規化されている。Ｊ〜Ｋ）ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉細胞（＋ＡＤＥ）及びＣＸＣＲ４陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）細胞から生成されたＳ７の細胞における、β細胞成熟マーカーであるＭＡＦＡ（Ｊ）及びＧＬＵＴ１（Ｋ）についての代表的なＦＡＣＳプロット。
【図１４−１】パラメーターを変化させることによる誘導効率。Ａ〜Ｂ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）／前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）への内胚葉分化スキーム。ＦＡＣＳプロット（Ａ）は、胚性内胚葉（ＤＥ）／前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の段階の、ｈＨ１、ｈＭＥＬ１−ＮＫＸ６．１及びヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）における、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１７７＋の亜個体群及びＣＸＣＲ４＋／ＣＤ２７５＋の亜個体群の比率（Ｂ）を示す。Ｃ〜Ｅ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から以前に公開された内胚葉分化プロトコールの適応。Ｆ）３つの異なる内胚葉誘導プロトコールを使用して人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から誘導された胚性内胚葉（ＤＥ）細胞における、ＣＸＣＲ４を発現している全個体群の比率についてのＦＡＣＳによる定量（ｎ＝３の生物学的レプリケート）。Ｇ）以前に公開されたプロトコールを使用して生成された胚性内胚葉（ＤＥ）におけるＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１７７＋を発現している細胞及びＣＸＣＲ４＋／ＣＤ２７５＋を発現している細胞の比率についてのＦＡＣＳによる定量。Ｈ）胚性内胚葉（ＤＥ）の誘導の最中における、ＴＧＦ−β及びＢＭＰのシグナル伝達の用量依存的阻害の図示。Ｉ〜Ｋ）経路を全く阻害せずに（Ｉ、条件１）、ＢＭＰ阻害剤であるＤＭＨ１を使用したＢＭＰシグナル伝達の高度阻害を用いて（Ｊ、条件２）、中程度のＢＭＰ阻害及び低度のＴＧＦ−βの阻害（Ｋ、条件３）を使用して生成された、ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）の亜個体群及びＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）の亜個体群の比率を示した円グラフ。
【図１４−２】パラメーターを変化させることによる誘導効率。Ａ〜Ｂ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）／前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）への内胚葉分化スキーム。ＦＡＣＳプロット（Ａ）は、胚性内胚葉（ＤＥ）／前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の段階の、ｈＨ１、ｈＭＥＬ１−ＮＫＸ６．１及びヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）における、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１７７＋の亜個体群及びＣＸＣＲ４＋／ＣＤ２７５＋の亜個体群の比率（Ｂ）を示す。Ｃ〜Ｅ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から以前に公開された内胚葉分化プロトコールの適応。Ｆ）３つの異なる内胚葉誘導プロトコールを使用して人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から誘導された胚性内胚葉（ＤＥ）細胞における、ＣＸＣＲ４を発現している全個体群の比率についてのＦＡＣＳによる定量（ｎ＝３の生物学的レプリケート）。Ｇ）以前に公開されたプロトコールを使用して生成された胚性内胚葉（ＤＥ）におけるＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１７７＋を発現している細胞及びＣＸＣＲ４＋／ＣＤ２７５＋を発現している細胞の比率についてのＦＡＣＳによる定量。Ｈ）胚性内胚葉（ＤＥ）の誘導の最中における、ＴＧＦ−β及びＢＭＰのシグナル伝達の用量依存的阻害の図示。Ｉ〜Ｋ）経路を全く阻害せずに（Ｉ、条件１）、ＢＭＰ阻害剤であるＤＭＨ１を使用したＢＭＰシグナル伝達の高度阻害を用いて（Ｊ、条件２）、中程度のＢＭＰ阻害及び低度のＴＧＦ−βの阻害（Ｋ、条件３）を使用して生成された、ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）の亜個体群及びＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）の亜個体群の比率を示した円グラフ。
【図１４−３】パラメーターを変化させることによる誘導効率。Ａ〜Ｂ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）／前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）への内胚葉分化スキーム。ＦＡＣＳプロット（Ａ）は、胚性内胚葉（ＤＥ）／前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の段階の、ｈＨ１、ｈＭＥＬ１−ＮＫＸ６．１及びヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）における、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１７７＋の亜個体群及びＣＸＣＲ４＋／ＣＤ２７５＋の亜個体群の比率（Ｂ）を示す。Ｃ〜Ｅ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から以前に公開された内胚葉分化プロトコールの適応。Ｆ）３つの異なる内胚葉誘導プロトコールを使用して人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から誘導された胚性内胚葉（ＤＥ）細胞における、ＣＸＣＲ４を発現している全個体群の比率についてのＦＡＣＳによる定量（ｎ＝３の生物学的レプリケート）。Ｇ）以前に公開されたプロトコールを使用して生成された胚性内胚葉（ＤＥ）におけるＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１７７＋を発現している細胞及びＣＸＣＲ４＋／ＣＤ２７５＋を発現している細胞の比率についてのＦＡＣＳによる定量。Ｈ）胚性内胚葉（ＤＥ）の誘導の最中における、ＴＧＦ−β及びＢＭＰのシグナル伝達の用量依存的阻害の図示。Ｉ〜Ｋ）経路を全く阻害せずに（Ｉ、条件１）、ＢＭＰ阻害剤であるＤＭＨ１を使用したＢＭＰシグナル伝達の高度阻害を用いて（Ｊ、条件２）、中程度のＢＭＰ阻害及び低度のＴＧＦ−βの阻害（Ｋ、条件３）を使用して生成された、ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）の亜個体群及びＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）の亜個体群の比率を示した円グラフ。
【図１４−４】パラメーターを変化させることによる誘導効率。Ａ〜Ｂ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）／前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）への内胚葉分化スキーム。ＦＡＣＳプロット（Ａ）は、胚性内胚葉（ＤＥ）／前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の段階の、ｈＨ１、ｈＭＥＬ１−ＮＫＸ６．１及びヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）における、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１７７＋の亜個体群及びＣＸＣＲ４＋／ＣＤ２７５＋の亜個体群の比率（Ｂ）を示す。Ｃ〜Ｅ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から以前に公開された内胚葉分化プロトコールの適応。Ｆ）３つの異なる内胚葉誘導プロトコールを使用して人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から誘導された胚性内胚葉（ＤＥ）細胞における、ＣＸＣＲ４を発現している全個体群の比率についてのＦＡＣＳによる定量（ｎ＝３の生物学的レプリケート）。Ｇ）以前に公開されたプロトコールを使用して生成された胚性内胚葉（ＤＥ）におけるＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１７７＋を発現している細胞及びＣＸＣＲ４＋／ＣＤ２７５＋を発現している細胞の比率についてのＦＡＣＳによる定量。Ｈ）胚性内胚葉（ＤＥ）の誘導の最中における、ＴＧＦ−β及びＢＭＰのシグナル伝達の用量依存的阻害の図示。Ｉ〜Ｋ）経路を全く阻害せずに（Ｉ、条件１）、ＢＭＰ阻害剤であるＤＭＨ１を使用したＢＭＰシグナル伝達の高度阻害を用いて（Ｊ、条件２）、中程度のＢＭＰ阻害及び低度のＴＧＦ−βの阻害（Ｋ、条件３）を使用して生成された、ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）の亜個体群及びＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）の亜個体群の比率を示した円グラフ。
【図１４−５】パラメーターを変化させることによる誘導効率。Ａ〜Ｂ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）／前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）への内胚葉分化スキーム。ＦＡＣＳプロット（Ａ）は、胚性内胚葉（ＤＥ）／前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の段階の、ｈＨ１、ｈＭＥＬ１−ＮＫＸ６．１及びヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）における、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１７７＋の亜個体群及びＣＸＣＲ４＋／ＣＤ２７５＋の亜個体群の比率（Ｂ）を示す。Ｃ〜Ｅ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から以前に公開された内胚葉分化プロトコールの適応。Ｆ）３つの異なる内胚葉誘導プロトコールを使用して人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から誘導された胚性内胚葉（ＤＥ）細胞における、ＣＸＣＲ４を発現している全個体群の比率についてのＦＡＣＳによる定量（ｎ＝３の生物学的レプリケート）。Ｇ）以前に公開されたプロトコールを使用して生成された胚性内胚葉（ＤＥ）におけるＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１７７＋を発現している細胞及びＣＸＣＲ４＋／ＣＤ２７５＋を発現している細胞の比率についてのＦＡＣＳによる定量。Ｈ）胚性内胚葉（ＤＥ）の誘導の最中における、ＴＧＦ−β及びＢＭＰのシグナル伝達の用量依存的阻害の図示。Ｉ〜Ｋ）経路を全く阻害せずに（Ｉ、条件１）、ＢＭＰ阻害剤であるＤＭＨ１を使用したＢＭＰシグナル伝達の高度阻害を用いて（Ｊ、条件２）、中程度のＢＭＰ阻害及び低度のＴＧＦ−βの阻害（Ｋ、条件３）を使用して生成された、ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）の亜個体群及びＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）の亜個体群の比率を示した円グラフ。
【図１４−６】パラメーターを変化させることによる誘導効率。Ａ〜Ｂ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）／前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）への内胚葉分化スキーム。ＦＡＣＳプロット（Ａ）は、胚性内胚葉（ＤＥ）／前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の段階の、ｈＨ１、ｈＭＥＬ１−ＮＫＸ６．１及びヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）における、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１７７＋の亜個体群及びＣＸＣＲ４＋／ＣＤ２７５＋の亜個体群の比率（Ｂ）を示す。Ｃ〜Ｅ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から以前に公開された内胚葉分化プロトコールの適応。Ｆ）３つの異なる内胚葉誘導プロトコールを使用して人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から誘導された胚性内胚葉（ＤＥ）細胞における、ＣＸＣＲ４を発現している全個体群の比率についてのＦＡＣＳによる定量（ｎ＝３の生物学的レプリケート）。Ｇ）以前に公開されたプロトコールを使用して生成された胚性内胚葉（ＤＥ）におけるＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１７７＋を発現している細胞及びＣＸＣＲ４＋／ＣＤ２７５＋を発現している細胞の比率についてのＦＡＣＳによる定量。Ｈ）胚性内胚葉（ＤＥ）の誘導の最中における、ＴＧＦ−β及びＢＭＰのシグナル伝達の用量依存的阻害の図示。Ｉ〜Ｋ）経路を全く阻害せずに（Ｉ、条件１）、ＢＭＰ阻害剤であるＤＭＨ１を使用したＢＭＰシグナル伝達の高度阻害を用いて（Ｊ、条件２）、中程度のＢＭＰ阻害及び低度のＴＧＦ−βの阻害（Ｋ、条件３）を使用して生成された、ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）の亜個体群及びＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）の亜個体群の比率を示した円グラフ。
【図１４−７】パラメーターを変化させることによる誘導効率。Ａ〜Ｂ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から胚性内胚葉（ＤＥ）／前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）への内胚葉分化スキーム。ＦＡＣＳプロット（Ａ）は、胚性内胚葉（ＤＥ）／前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の段階の、ｈＨ１、ｈＭＥＬ１−ＮＫＸ６．１及びヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）における、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１７７＋の亜個体群及びＣＸＣＲ４＋／ＣＤ２７５＋の亜個体群の比率（Ｂ）を示す。Ｃ〜Ｅ）ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から以前に公開された内胚葉分化プロトコールの適応。Ｆ）３つの異なる内胚葉誘導プロトコールを使用して人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から誘導された胚性内胚葉（ＤＥ）細胞における、ＣＸＣＲ４を発現している全個体群の比率についてのＦＡＣＳによる定量（ｎ＝３の生物学的レプリケート）。Ｇ）以前に公開されたプロトコールを使用して生成された胚性内胚葉（ＤＥ）におけるＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１７７＋を発現している細胞及びＣＸＣＲ４＋／ＣＤ２７５＋を発現している細胞の比率についてのＦＡＣＳによる定量。Ｈ）胚性内胚葉（ＤＥ）の誘導の最中における、ＴＧＦ−β及びＢＭＰのシグナル伝達の用量依存的阻害の図示。Ｉ〜Ｋ）経路を全く阻害せずに（Ｉ、条件１）、ＢＭＰ阻害剤であるＤＭＨ１を使用したＢＭＰシグナル伝達の高度阻害を用いて（Ｊ、条件２）、中程度のＢＭＰ阻害及び低度のＴＧＦ−βの阻害（Ｋ、条件３）を使用して生成された、ＣＤ１７７陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）の亜個体群及びＣＤ２７５陽性の前方胚性内胚葉（＋ＡＤＥ）の亜個体群の比率を示した円グラフ。
【００２５】
詳細な説明
以下の記載は、本発明を理解する際に有用であり得る情報を含む。本明細書において提供された情報のどれもが、先行技術であるか、又は今回特許請求された本発明に関連していることを、あるいは、具体的に又は暗に言及されているどの刊行物もが先行技術であることを認めるものではない。
【００２６】
定義
本明細書において表現されている数字の範囲は、示されている終点を含み、記載されている数字の範囲の終点と終点との間の全ての整数を記載していることが理解されるだろう。明確に反対のことを意図しない限り、単数形のクレーム用語は複数形も範囲内である。
【００２７】
本明細書において使用する「多能性幹細胞」は、３胚葉を形成する３つのそれぞれの胚細胞系統並びに胚性外細胞を生じることのできる細胞である。そうした胚葉は内胚葉、中胚葉、及び外胚葉である。本発明の脈絡では、膵前駆細胞及び／又は肝前駆細胞を形成する内胚葉系統の細胞が好ましい。しかしながら、多能性細胞は、全生物を産生できなくてもよい。
【００２８】
特定の実施態様では、出発物質として使用される多能性細胞は、ヒト胚性幹細胞をはじめとする幹細胞である。本明細書において使用する「胚性」は、単一の接合体から始まり、発生した配偶子細胞以外の多能性細胞又は全能性細胞をもはや全く含まない多細胞構造で終わる、生物の一連の発生段階を指す。配偶子の融合によって誘導された胚に加えて、「胚性」という用語は、体細胞核への導入によって誘導された胚も指す。ヒト胚性幹細胞は、国際公開公報第０３/０４６１４１号及びYoung 2008に概略が示されているように、破壊を伴うことなく胚から単離され得る。
【００２９】
本明細書において使用する「人工多能性幹細胞」（ｉＰＳＣ）は、分化した細胞又は成体細胞から一種の多能性幹細胞へと直接変換されることのできる細胞である。ｉＰＳＣの作製は、Takahashi et al.2006によって開拓され、胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は多能性幹細胞（ＰＳＣ）に非常に似ている細胞型を生じる。
【００３０】
図５Ａは、幹細胞からβ細胞への分化の概観を示す。様々な段階及び応答している細胞個体群は、以下に定義されるだろう。
【００３１】
本明細書において使用する「膵前駆細胞」（ＰＰ）は一般的に、内分泌前駆細胞へと、さらには膵β細胞へと分化することのできる細胞である。例えば図５Ａを参照されたい。したがって、ＰＰは、前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）、後方腸管（ＰＧＴ）、ＰＰ１、ＰＰ２、内分泌細胞（ＥＮ）、及びβ幹細胞（ＳＣ−β）を含む。本明細書において使用する「胚性内胚葉」（ＤＥ）は、腸管、又は例えば膵臓若しくは肝臓のような腸管から誘導される臓器の細胞へと分化することのできる、多能性細胞を指す。特定の実施態様によると、胚性内胚葉細胞、及びそれから誘導された細胞は、哺乳動物細胞であり、好ましい実施態様では、胚性内胚葉及び／又は前方胚性細胞はヒト細胞である。本明細書において使用する「前方胚性内胚葉」（ＡＤＥ）という語句は、膵系統細胞へと特に発達することのできる胚性内胚葉（ＤＥ）の亜個体群を説明し（実施例２参照）、実施例２に概略が示されているような増加したＷｎｔ及び非古典的な平面細胞極性（ＰＣＰ）シグナル伝達によって特徴付けられる。前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）を規定するマーカーとしては、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、及びＣＥＲ１が挙げられる。前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の細胞は好ましくは、本発明に従って膵前駆細胞を精製する方法に使用される。好ましくは、膵前駆細胞は、前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）、胚性内胚葉（ＤＥ）、後方腸管（ＰＧＴ）、及び／又は腹側前腸（ＶＦＧ）の細胞である。より好ましくは、膵前駆細胞は、前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の細胞である。好ましくは、膵前駆細胞は好ましくは、細胞表面上にＣＤ１７７を含む。
【００３２】
本明細書において使用する「後方腸管」（ＰＧＴ）は、中間体の細胞個体群を指す。それは、マーカーのＦＯＸＡ２、ＨＮＦ１α（ＨＮＦ１Ａ）、ＨＮＦ４α（ＨＮＦ４Ａ）の発現によって特徴付けられる。
【００３３】
本明細書において使用する２つのさらなる細胞個体群は、「段階１の膵前駆細胞」（ＰＰ１）及び「段階２の膵前駆細胞」（ＰＰ２）である。それらは、膵系統の発生における中間体の細胞個体群を示す。ＰＰ１の典型的なマーカーとしてはＦＯＸＡ２及びＰＤＸ１が挙げられ、ＰＰ２の典型的なマーカーとしてはＦＯＸＡ２、ＰＤＸ１、及びＮＫＸ６．１が挙げられる。
【００３４】
膵前駆細胞（ＰＰ）は、本明細書において「内分泌細胞」（ＥＮ）と称される、ニューロゲニン３（ＮＧＮ３）を発現している膵系統細胞へとさらに分化することができる。この細胞型の典型的なマーカーとしては、ＦＯＸＡ２、ＮＧＮ３、及びＮＫＸ２．２が挙げられる。
【００３５】
本明細書において使用する「膵β細胞」（ＳＣ−β）という用語は、ホルモンを分泌することができ、また、インビトロ又はインビボにおいてこのようなホルモンの分泌を刺激又は奏功する様々な薬剤に対して応答性でもある、内分泌細胞を指す。例えば、本明細書において記載されているような「成熟」内分泌細胞は、例えば、グルコースに対して応答性であり、生理学的に適した様式でインシュリンを放出する、細胞である。本明細書において使用する「未熟」という用語は、ホルモンを完全に分泌することができないか、又は他の実施態様では、インビトロでの様々な刺激に因りホルモンを完全に分泌することができない、細胞を指す。
【００３６】
本明細書に記載の実施態様の追加の態様に関して、本明細書に記載の多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）から誘導された細胞型を、実施例にさらに記載されているように濃縮、枯渇、単離、分離、選別、及び／又は精製することができる。本明細書において使用する「濃縮された」又は「精製された」という用語、すなわち、他の既知の細胞個体群の枯渇に因り濃縮された又は精製されたということは、細胞個体群がいくつかの選択プロセスにかけられ、これにより該個体群が濃縮及び／又は精製されることを示す。また、対象細胞はまた、比較的濃縮及び／又は精製されていると考えられ、すなわち、別の多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）から誘導された型の個体群と比較して、又は元来の若しくは初期の細胞培養液と比較して、特定の多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）から誘導された細胞型個体群が有意により多い。すなわち、時に特定の多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）から誘導された細胞型の濃縮又は精製は、１つ以上の既知の多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）から誘導された細胞型を、別の多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）から誘導された細胞型から「枯渇させること」又は「分離すること」又は「選別すること」を含み得る。例えば、いくつかの実施態様では、特定の多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）から誘導された細胞型は、それらがリガンド及び／又は薬剤及び／又は抗体及び／又は固相マトリックス若しくは半固相マトリックスに結合させた抗体と結合又は交差反応しないために、濃縮又は精製される。このような濃縮又は精製された個体群は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）の細胞培養液から「枯渇された」又は「分離された」又は「選別された」と言うことができる。さらなる一例として、このような枯渇させた又は分離させた又は選別された多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）個体群は、標準的なアフィニティクロマトグラフィー法における通過画分に；すなわち別の言い方をすると、非結合画分に認められ得るか又は単離され得る。したがって、特定の実施態様では、既知又は未知の細胞型の培養液を枯渇させることによって、多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）から誘導された細胞型を濃縮及び精製することが有利である。このようにして、濃縮された又は精製された細胞個体群は、結合又は付着した抗体を有していない。精製された個体群から抗体を除去する必要が全くないので、細胞療法のための濃縮された又は精製された細胞の使用は改善される。
【００３７】
特定の実施態様では、「濃縮された」、「単離された」、「分離された」、「選別された」、「精製された」という用語又はその等価な用語は、特定の細胞表現型を有する、例えば、その細胞表現型に特徴的な特定の細胞マーカーを発現しているか又は特定の細胞マーカー遺伝子を発現していない、所望の細胞系統又は所望の細胞を少なくとも約３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％含有している、細胞培養液又は細胞個体群又は細胞試料を指す。
【００３８】
本明細書において使用する「リガンド」は、細胞上のマーカー若しくは標的若しくは受容体若しくは膜タンパク質、又は試料中若しくは溶液中の可溶性分析物に、特異的に結合するか又は交差反応する、部分又は結合パートナーを指す。
【００３９】
本明細書において使用する「マーカー」、「エピトープ」、「標的」、「受容体」又はその等価体は、観察又は検出され得る、任意の分子を指し得る。例えば、マーカーは、核酸、例えば特定の遺伝子の転写物、遺伝子のポリペプチド産物、例えば膜タンパク質、又は遺伝子以外の産物を含む。「細胞表面マーカー」は細胞表面に存在するマーカーである。
【００４０】
本明細書において使用する「捕捉用媒体」は、細胞個体群試料から分離されることが可能である、任意のマトリックス又は媒体、例えば生理学的に適合性のビーズを指す。このような媒体の特徴としては、屈折率、サイズ、光散乱強度、磁性、又は、独特な蛍光サインを与える蛍光検出用色素を有することが挙げられる。例えば、固相捕捉用媒体のあるサブセットは、安定なコロイド状粒子、例えば、直径約０．０５〜約１０μmの範囲のサイズ（すなわちコロイドのサイズ）のビーズを含む。このようなビーズは、デキストラン、アミノデキストラン、アルデヒド、及び／又は硫酸官能基を含み得る。好ましくは、捕捉用媒体はビーズを含む。
【００４１】
ＣＤ５１は、インテグリンαＶ及びビトロネクチン受容体αサブユニットとしても知られているが、これは細胞間接着並びに基底膜及び細胞外マトリックスリガンドへの結合に関与しているヘテロ二量体糖タンパク質ファミリーであるインテグリンの一員である。ＣＤ５１は、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリノーゲン、及び他のタンパク質に対する受容体の一部である。ＣＤ５１のＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号はＰ０６７５６であり、そのＨＵＧＯ番号はＨＧＮＣ：６１５０である。
【００４２】
ＣＤ１７７は、ヒト好中球同種抗原２ａ（ＨＮＡ−２ａ）、ＮＢ１糖タンパク質（ＮＢ１ＧＰ）、又は真性一次性赤血球増多症タンパク質１（ＰＲＶ−１）としても知られているが、これは好中球の活性化において役割を果たしている、グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合細胞表面糖タンパク質である。該タンパク質は、血小板内皮細胞接着分子−１に結合することができ、好中球の血管外移動の際に機能することができる。そのＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号はＱ８Ｎ６Ｑ３であり、そのＨＵＧＯ番号はＨＧＮＣ：３００７２である。
【００４３】
ＣＤ２７５は、誘導性Ｔ細胞共刺激因子リガンド（ＩＣＯＳリガンド）、Ｂ７ホモログ２（Ｂ７−Ｈ２）、Ｂ７様タンパク質ＧＩ５０、又はＢ７関連タンパク質１（Ｂ７ＲＰ−１）としても知られているが、これはＴ細胞特異的細胞表面受容体ＩＣＯＳに対するリガンドである。Ｔ細胞増殖及びサイトカイン分泌のための共刺激シグナルとして作用し；Ｂ細胞の増殖及び形質細胞への分化も誘導する。そのＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号はＯ７５１４４であり、そのＨＵＧＯ番号はＨＧＮＣ：１７０８７である。
【００４４】
実施態様の詳細な説明
本明細書には、細胞表面マーカーと交差反応するリガンドを使用して、様々な多能性幹細胞（ＰＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及び／又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）から誘導された細胞型を同定及び特徴付けするための方法及びキットが記載されている。細胞表面マーカーは、受容体、膜タンパク質、及び／又はエピトープであり得る。好ましい細胞表面マーカーは、ＣＤ５１、ＣＤ１７７、及びＣＤ２７５である。好ましくは、同定された及び／又は特徴付けられた細胞型は、膵前駆細胞、好ましくは細胞表面マーカーＣＤ５１及び／又はＣＤ１７７を使用して同定された膵前駆細胞である。さらに本明細書には、本発明に記載の方法又はキットから得られた膵前駆細胞の組成物も記載されている。胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、好ましい実施態様ではヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である。多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）から誘導された細胞の一般的な作製法は、D'Amour 2005、D'Amour 2006、Rezania 2014、Pagliuca 2014、及びKroon 2008に記載されている。本発明の好ましいプロトコールは、Rezania 2014のプロトコールである。このプロトコールはまた、図５Ａにも簡潔に要約されている。
【００４５】
したがって、本発明は、
（ａ）膵前駆細胞を含む、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び／又は胚性幹細胞から誘導された細胞個体群を、膵前駆細胞上の細胞表面マーカー（ここでの細胞表面マーカーはＣＤ１７７である）に結合するリガンドに曝す工程、及び
（ｂ）リガンドに結合しない多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び／又は胚性幹細胞から誘導された細胞から膵前駆細胞を分離し、これにより、該膵前駆細胞を精製する工程
を含む、膵前駆細胞の精製法に関する。
【００４６】
本発明の方法はまた、膵系統へと特殊化された（前方（Ａ））胚性内胚葉（ＤＥ）亜個体群などの、膵前駆細胞の亜個体群を精製する方法として理解され得る。膵系統へと特殊化された（前方（Ａ））胚性内胚葉（ＤＥ）亜個体群などの、膵前駆細胞の亜個体群を精製するこの方法は、（ａ）特殊化された（前方（Ａ））胚性内胚葉（ＤＥ）細胞を含む、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び／又は胚性幹細胞から誘導された細胞個体群を、特殊化された（前方（Ａ））胚性内胚葉（ＤＥ）細胞上の細胞表面マーカー（ここでの細胞表面マーカーはＣＤ１７７である）に結合するリガンドに曝す工程、及び（ｂ）リガンドに結合しない、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び／又は胚性幹細胞から誘導された細胞から、特殊化された（前方（Ａ））胚性内胚葉（ＤＥ）細胞を分離し、これにより、特殊化された（前方（Ａ））胚性内胚葉（ＤＥ）細胞を精製する工程を含み得る。膵系統へと特殊化された亜個体群は、好ましくは膵系統細胞へと発達する亜個体群である。
【００４７】
読者の簡便性のために、効率的な膵細胞の生成のための細胞表面マーカーＣＤ１７７を使用した胚性内胚葉（ＤＥ）亜個体群を単離する例示的で非限定的な手順が記載されるだろう。図５Ａでは、手順の概観が示されている：まず、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を、Rezania 2014のプロトコールを使用して胚性内胚葉（ＤＥ）へと分化させる。第二に、得られた胚性内胚葉（ＤＥ）を次いで、ＣＤ１７７陽性細胞について、例えば磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）により選別する。これらのＣＤ１７７陽性細胞は、前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）細胞の亜個体群としても記載され得るが、これは次いで、第三に、膵β細胞へのさらなる分化のために使用される。
【００４８】
本発明の方法における膵前駆細胞の精製のために、膵前駆細胞は、膵系統へと特殊化された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）細胞であってもよいが、これは表面上にＣＤ１７７を発現しているはずである。表面上にＣＤ１７７を発現していない膵前駆細胞は、本発明によって包含されない。図８Ｅに示されているように、胚性内胚葉（ＤＥ）／前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）、後方腸管（ＰＧＴ）、又は腹側前腸（ＶＦＧ）の段階における膵前駆細胞は、ＣＤ１７７を発現している。したがって、膵前駆細胞の精製は好ましくは、胚性内胚葉（ＤＥ）／前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）、後方腸管（ＰＧＴ）、又は腹側前腸（ＶＦＧ）の段階、より好ましくは胚性内胚葉（ＤＥ）／前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の段階、あるいは最も好ましくは前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の段階で実施される。これは、膵系統の細胞に非常に初期に、すなわち、細胞の運命が先行技術において公知のマーカーによって決定され得る前に、分化する傾向のある、妥当な亜個体群の選別を可能とする。
【００４９】
したがって、１つの好ましい実施態様では、膵前駆細胞は前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の細胞である。別の実施態様では、膵前駆細胞は、前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）及び／又は後方腸管（ＰＧＴ）の細胞である。別の好ましい実施態様では、膵前駆細胞は、胚性内胚葉（ＤＥ）、前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）、後方腸管（ＰＧＴ）、及び／又はＶＦＧ（腹側前腸）の細胞である。
【００５０】
本発明は、胚性内胚葉（ＤＥ）又は前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の段階で膵前駆細胞を単離する場合に特に有用である。ここでは、膵系統に分化する傾向のある（前方（Ａ））胚性内胚葉（ＤＥ）亜個体群と、他の細胞型、例えば肝系統へと分化する傾向のある他の亜個体群との間のＣＤ１７７の発現差が最も高い（図８Ｅも参照）。しかしながら、後方腸管（ＰＧＴ）又は腹側前腸（ＶＦＧ）の細胞もＣＤ１７７及びＣＤ２７５を発現する。したがって、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び／又は胚性幹細胞から誘導された細胞は、前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）、胚性内胚葉（ＤＥ）、後方腸管（ＰＧＴ）、及び／又は腹側前腸（ＶＦＧ）の細胞である。１つの好ましい実施態様では、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び／又は胚性幹細胞から誘導された細胞は、前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の細胞である。
【００５１】
膵前駆細胞、又はより正確には、膵系統に特殊化された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の亜個体群の精製を、本発明の目的であると理解することができる。それ故、本発明の方法に従って精製された膵前駆細胞は好ましくは、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、及び／又はＣＥＲ１を発現する。より好ましくは、本発明の方法に従って精製された膵前駆細胞は、ＣＥＲ１を発現する。あるいは、本発明の方法に従って精製された膵前駆細胞は、ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、及び／又はＣＸＣＲ４を発現していてもよい。先行技術において公知のマーカーである、ＣＸＣＲ４＋（ＣＤ１８４）細胞と比較して増加したＣＤ１７７＋細胞のＰＤＸ１の発現が、前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の亜個体群のさらなる分化後に観察された（実施例５、図５Ｃ）。本発明の方法に従って精製された膵前駆細胞は、膵臓及び十二指腸のホメオボックス遺伝子１（ＰＤＸ１）を発現し得る。
【００５２】
１つの実施態様では、多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）から誘導された細胞個体群を、ＣＤ５１及び／又はＣＤ２７５に結合するリガンドとさらに接触させる。細胞の分離法に応じて、分化のために使用されるリガンドの順序は変更される。好ましい環境では、肝系統の細胞となる傾向のあるＣＤ２７５を発現している細胞（実施例４及び７を参照）を、多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）から誘導された細胞個体群から枯渇させることができる。この脈絡における枯渇は、所望ではない細胞型にしか分化することができない個体群からのそのような細胞の、除去を意味する。それによって、膵系統の細胞が濃縮される。別の好ましい環境では、ＣＤ１７７に加えて、細胞表面マーカーＣＤ５１が、膵系統細胞の濃縮のために使用される。フローサイトメトリーでは、３つ全てのマーカーを同時に適用することができるが、磁性ビーズによる選別（磁気細胞分離（ＭＡＣＳ））のような他の精製法では、枯渇及び濃縮は、２つ以上の別々の工程で行なわれなければならない。
【００５３】
本発明の好ましい実施態様では、リガンドは、抗体又は抗体断片である。抗体又は抗体断片は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と特異的に結合（免疫反応）する抗原結合部位を含有している分子を含む。このような抗体又は断片は、任意の天然の供給源に由来するポリクローナル抗体、並びにクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥの天然の又は組換え型のモノクローナル抗体、ハイブリッド誘導体、並びに抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、ヒト化抗体又はヒト抗体、抗体の相補性決定領域を含有している組換え型の又は合成の構築物、そのＦｃ抗体断片、一本鎖Ｆｖ抗体断片（ｓｃＦｖ）、所望の細胞表面受容体に結合する、抗体の機能的に等価な結合特徴を保持するに十分な相補性規定領域（ＣＤＲ）を共有している、合成抗体又はキメラ抗体の構築物、並びにファージディスプレイによって生成された結合断片を含む。特定のクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びその他などの、その上にサブクラスも有する。さらに、ヒトでは、軽鎖はκ鎖であっても、又はλ鎖であってもよい。モノクローナル抗体は、全てが特有な親細胞のクローンである、同一な免疫細胞によって作られた抗体である。モノクローナル抗体は、同じエピトープに結合するという点から、一価の親和性を有することができる。これとは対照的に、ポリクローナル抗体は、複数のエピトープに結合し、これは通常、いくつかの異なる形質細胞系統によって作られる。本発明の好ましい実施態様では、抗体はモノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体である。
【００５４】
本発明のリガンド、好ましくは抗体は好ましくは、それらの検出を容易にするための標識とコンジュゲートしているか又は結合している。１つの実施態様では、そうした標識は、当技術分野において標準的に使用される放射性、蛍光、磁気、発光、化学発光、生物学的若しくは酵素学的なタグ、又は標識を含む。いくつかの実施態様では、標識は、単独で又は他の分子若しくはタンパク質と協奏して作用しながら、シグナルを与えることのできる低化学分子であり得、このシグナルは直接的に又は間接的に検出可能である。特に好ましい実施態様は、磁性ビーズへのリガンドの結合である。抗体などのポリペプチドにコンジュゲート又は結合させることのできる検出可能な標識の非制限的な例としては、放射性標識、例えば３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、７６Ｂｒ、８６Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、又は１７７Ｌｕ、酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ、フルオロフォア、クロモフォア、化学発光剤、キレート複合体、色素、コロイド状金、又はラテックス粒子が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５５】
リガンドは、抗体の他に、ムテイン又は他の結合性分子、例えば人工アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）、核酸アプタマー、アフィマー、アフィボディ、アフィリン、アフィチン（ナノフィチン（nanofitin））、アルファボディ、アンチカリン（anticalin）、アビマー、フィノマー（fynomer）、クニッツドメインペプチド、又はモノボディであってもよい。
【００５６】
本発明の別の実施態様では、標識はまた、基質と相互作用して検出可能なシグナルを発生する酵素；又は、抗体との結合によって、若しくは適切に標識されたリガンドとの結合によって、検出することのできるタンパク質であってもよい。様々な酵素系、例えば、グルコースオキシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと連動したヘキソキナーゼがアッセイにおいて作動して比色定量シグナルを顕現する。使用され得る他の標識系としてはナノ粒子又は量子ドットが挙げられる。
【００５７】
細胞におけるＣＤ５１、ＣＤ１７７、及び／又はＣＤ２７５の発現は、様々な方法を用いて検出され得る。本発明の１つの実施態様では、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、ノザンブロット、マイクロアレイ、ポリメラーゼ連鎖反応、及び／又は定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）が検出のために使用される。本発明の好ましい実施態様では、フローサイトメトリーが、ＣＤ５１、ＣＤ１７７、及び／又はＣＤ２７５の発現の検出のために使用され、本発明の別の好ましい実施態様では、ｑＰＣＲがＣＤ５１、ＣＤ１７７、及び／又はＣＤ２７５の発現の検出のために使用される。
【００５８】
本明細書において使用する「定量ポリメラーゼ連鎖反応」（ｑＰＣＲ）又は「リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応」（リアルタイムＰＣＲ）は、ポリメラーゼ連鎖反応に基づいた検査技術を指す。それは、ＰＣＲの最中に、すなわち、従来のＰＣＲのようにその終了時ではなくリアルタイムで、標的化ＤＮＡ分子の増幅をモニタリングする。リアルタイムＰＣＲは定量的に（定量リアルタイムＰＣＲ）及び半定量的に、すなわち、特定量のＤＮＡ分子より上／下において（半定量リアルタイムＰＣＲ）使用され得る。リアルタイムＰＣＲでＰＣＲ産物を検出するための２つの一般的な方法は当業者には公知である：どのような二本鎖ＤＮＡにインターカレートする非特異的蛍光色素、又は、プローブとその相補的配列のハイブリダイゼーション後にのみ検出が可能となる蛍光リポーターで標識されたオリゴヌクレオチドからなる配列特異的ＤＮＡプローブ。
【００５９】
組織特異的遺伝子産物の発現はまた、ｍＲＮＡレベルで、ノザンブロット分析、ドットブロットハイブリダイゼーション分析によって、又は標準的な増幅法において配列特異的プライマーを使用した逆転写酵素により開始されるポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出され得る。
【００６０】
細胞表面マーカーの発現、すなわち、細胞の染色強度は、フローサイトメトリーによってモニタリングされ得、ここではレーザーは蛍光色素の量的レベルを検出する（これは、特定の試薬、例えば抗体に結合した細胞表面マーカーの量に比例する）。染色の絶対レベルは、具体的な蛍光色素及び試薬調製物により異なり得るが、データを、対照に対して正規化することができる。選択されたパラメーターの解読値は、例えば細胞表面分子に対する蛍光抗体の使用を通しての、１回の分析の最中に同時に又は順番に解読することができる。一例として、これらを、様々な蛍光色素、蛍光ビーズ、タグ、例えば量子ドットなどでタグ化することができる。
【００６１】
いくつかの実施態様では、任意の多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）から誘導された細胞型又は多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）から誘導された細胞個体群における任意のマーカーの発現レベルは、標準化された又は正規化された対照マーカーと比較して、少なくとも約４倍高く、少なくとも約６倍高く、少なくとも約８倍高く、少なくとも約１０倍高く、少なくとも約１５倍高く、少なくとも約２０倍高く、少なくとも約４０倍高く、少なくとも約８０倍高く、少なくとも約１００倍高く、少なくとも約１５０倍高く、少なくとも約２００倍高く、少なくとも約５００倍高く、少なくとも約７５０倍高く、少なくとも約１０００倍高く、少なくとも約２５００倍高く、少なくとも約５０００倍高く、少なくとも約７５００倍高く、又は少なくとも約１０，０００倍高い。この脈絡におけるマーカーは、ＣＤ５１、ＣＤ１７７、及び／又はＣＤ２７５を含むだけでなく、本明細書において定義されているような細胞個体群用の細胞表面マーカーも含む。
【００６２】
本発明の方法に従って使用される細胞の多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）から誘導された細胞は、任意の哺乳動物から得ることができる。いくつかの実施態様では、細胞は、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ウマ、及び／又は生産動物に由来する。好ましい実施態様では、該細胞はヒトに由来する。
【００６３】
本発明による分離工程のための実施態様は、本明細書に記載のもの、例えば抗体でコーティングされた磁性ビーズ（ＭＡＣＳ）、アフィニティクロマトグラフィー、及び固体マトリックス若しくは固相捕捉用媒体、例えばプレート、カラムなどに付着させた抗体を用いた「パンニング」、又は他の簡便で利用可能な技術を含む。正確な分離をもたらす技術としては、細胞表面及び細胞内のパラメーター並びに形状変化及び粒度を測定するのに有用な、並びに、抗体に連結される試薬又はプローブに連結される試薬として使用されるビーズの分析に有用な、フローサイトメトリー法が挙げられる。フローサイトメトリーを用いて得られたそうしたデータを使用して、当業者は亜個体群を同定し得、次いで、特定の亜個体群を単離し得る。好ましくは、これらのデータは、ＣＤ５１、ＣＤ１７７、及び／又はＣＤ２７５の発現に基づいて、多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）から誘導された亜個体群の中から膵前駆細胞を選別するために使用され得る。ＭＡＣＳ及びフローサイトメトリーの使用が実施例において例示されている。
【００６４】
本明細書に記載の本発明の１つの実施態様では、アフィニティクロマトグラフィーが、多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）から誘導された細胞の精製に使用される。アフィニティクロマトグラフィーは、抗原と抗体間、酵素と基質間、又は受容体とリガンド間の相互作用などの、高度に特異的な相互作用に基づいた、生化学的混合物の分離法である。それは、分子特性、例えば細胞表面マーカーの発現などを活用することによって、混合物内の生物学的分子又は細胞亜個体群を精製するために使用される一種のクロマトグラフィー検査技術である。リガンド、例えば生物学的巨大分子、例えば抗体又はその断片、酵素、及び／又は他のタンパク質は、数種類の異なる結合及び相互作用を通して高い特異性で他の分子と相互作用する。このような相互作用は、水素結合、イオン性相互作用、ジスルフィド橋、疎水性相互作用などを含む。アフィニティクロマトグラフィーの高い選択性は、所望の分子が固定相との相互作用を可能とすることによって引き起こされ、カラム内に捕捉されるようになり、これにより、相互作用せず最初に溶出されるであろう所望ではない物質から分離される。本発明の好ましい実施態様では、分離工程は、アフィニティクロマトグラフィーを含む。
【００６５】
本発明のさらなる実施態様では、フローサイトメトリーが、多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）から誘導された細胞個体群の精製のために使用される。本発明の好ましい実施態様では、分離工程は、フローサイトメトリーを含む。例えば表面マーカーの発現の検出のために使用されるフローサイトメトリーに加えて、それは、特定の亜個体群の分離を可能とし、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）と称されることの多い装置と組み合わせることができる。それは、各細胞の特異的な光散乱及び蛍光の特徴に基づいて、生物学的細胞の異種混合物を２つ以上の容器に、一度に一細胞ずつ、選別するための方法を提供する。それは、個々の細胞に由来する蛍光シグナルの迅速で客観的で数量的な記録、並びに、特に関心の高い細胞の物理的分離をもたらすので、有用な科学装置である。
【００６６】
細胞懸濁液は、狭くて急速に流れている液体流の中心に取り込まれる。流動は、それらの直径に関して細胞と細胞の間が大きく分離されるように配置される。振動機序は、細胞の流れが壊れて個々の液滴になることを引き起こす。システムは、一滴あたり細胞が一つを超える確率が低くなるように調整される。流れが壊れて液滴になる直前に、流動は蛍光測定ステーションを通過し、そこで関心対象の各細胞の蛍光特徴が測定される。流れが壊れて液滴になるまさにその点に荷電用リングが配置される。蛍光強度が測定される直前にリングの底部に電荷が配置され、流れから壊れて液滴になると、反対の電荷が液滴上に捕捉される。次いで、荷電した液滴は、それらの荷電に基づいて容器内へと液滴の向きを変える静電偏向システムを通って落下する。システムによっては、荷電は流れに直接かけられ、離脱した液滴は、流れと同じ符号の電荷を保持している。次いで、流れは、液滴が離脱した後に中性に戻る。特定の亜個体群の検出のために、リガンド、好ましくは抗体は、標識、好ましくは本明細書に記載のような蛍光標識を含む。各細胞表面マーカーが異なる標識で標識されている場合、本明細書に記載の異なる細胞個体群間で識別し、これにより、所望の亜個体群を濃縮することが可能である。
【００６７】
細胞個体群の中の特定の亜個体群を単離する目的のために、以下の実施態様において要約されている、磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）を使用し得る：１つの実施態様では、リガンドは捕捉用媒体上に固定される。捕捉用媒体は好ましくはビーズを含み、特に好ましい実施態様では、ビーズは磁性である。好ましい実施態様では、リガンドは磁性ビーズにコンジュゲートしている。
【００６８】
１つの実施態様では、本明細書に記載のリガンド、薬剤、及び／又は抗体は、磁性試薬に直接的に又は間接的にコンジュゲートしている。「磁性試薬」は、直接的結合／共有結合による結合又は間接的結合を介して、リガンドと反応することのできる粒子である。本明細書において使用する「磁性試薬」内の「磁性」という用語は、全ての亜型の磁性粒子（これは当業者には周知である方法を用いて調製され得る）、特に強磁性粒子、超常磁性粒子、及び常磁性粒子を指す。好ましくは、磁性試薬は、磁性ビーズである。磁性試薬への直接的なコンジュゲーションは、当技術分野において公知であるような、様々な化学的連結基の使用によって達成される。いくつかの実施態様では、抗体は、側鎖アミノ基又はスルフヒドリル基及びヘテロ官能性架橋試薬を通して磁性試薬に結合している。多くのヘテロ官能性化合物を、実体への連結に利用することができる。例えば、少なくとも、抗体上に反応性スルフヒドリル基、及び磁性粒子上に反応性アミノ基を有する、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）、又は４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）を使用することができる。磁気分離装置の一例は、国際公開公報第９０/０７３８０号、ＰＣＴ/ＵＳ９６/００９５３、及び欧州特許第４３８５２０号に記載されている。精製された細胞個体群を、任意の適切な培地、好ましくはＳｔｅｍＭＡＣＳ ＩＰＳ Ｂｒｅｗ（ミルテニー・バイオテク社）に収集することができる。次いで、膵前駆細胞を、さらなる分化のためにＳｔｅｍＭＡＣＳ ＩＰＳ−Ｂｒｅｗ培地中に播種してもよい。
【００６９】
本発明の１つの実施態様では、磁気細胞選別が、細胞個体群の中の亜個体群の分離のために使用される。細胞を磁気的に分離する方法は、例えばインビトロジェン社、ステムセルテクノロジーズ社、セルプロ社（シアトル）、又はアドバンスト・マグネティクス社（ボストン）から市販されている。例えば、モノクローナル抗体を、ダイナール（Dynal）Ｍ４５０のような磁性ポリスチレン粒子又は類似した磁性粒子と直接結合させることができ、これを例えば細胞分離のために使用することができる。ダイナビーズ技術はカラムベースではなく、その代わりに細胞の付着したこれらの磁性ビーズは、試料管内で液相の動態を持ち、マグネティックラック上に管を置くことによって細胞が単離される。しかしながら、試料から細胞を濃縮、選別、及び／又は検出するための好ましい実施態様では、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片が、例えば多糖による有機コーティングを有するコロイド状の超常磁性微粒子と共に使用される（磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ（登録商標））技術（ミルテニー・バイオテク社、ベルギッシュグラートバハ、ドイツ））。これらの粒子（ナノビーズ又はマイクロビーズ）はモノクローナル抗体又はその抗原結合断片に直接コンジュゲートされていても、あるいは、抗免疫グロブリン、アビジン、又は抗ハプテン特異的マイクロビーズと共に使用されてもよい。ＭＡＣＳ（登録商標）技術は、細胞を、特定の表面抗原に対して指向される抗体又はその抗原結合断片でコーティングされた磁性ナノ粒子と共にインキュベートすることによって、細胞の分離を可能とする。これにより、この抗原を発現している細胞の、磁性ナノ粒子への付着が引き起こされる。その後、細胞溶液を、強い磁場に置かれたカラムに移す。この工程では、（抗原を発現している）細胞はナノ粒子に付着し、カラム上に留まり、一方、他の（抗原を発現していない）細胞は通過する。この方法を用いて、細胞を、特定の抗原（群）に対して正に又は負に分離することができる。正の選択では、磁性カラムに付着している、関心対象の抗原（群）を発現している細胞は、カラムを磁場から取り除いた後に、洗い流されて別の容器に入る。負の選択では、使用される抗体は、関心対象ではない細胞上に存在することが知られている、表面抗原（群）に対して指向されている。細胞／磁性ナノ粒子溶液をカラムに適用した後、これらの抗原を発現している細胞はカラムに結合し、通り抜ける画分は関心対象の細胞を含有しているのでそれを収集する。これらの細胞は、ナノ粒子に結合させた抗体によって標識されていないので、それらは「手付かずのまま」である。手順は、直接的な磁気標識を使用して行なっても、又は間接的な磁気標識を使用して行なってもよい。直接的な標識では、特異的な抗体を磁性粒子に直接結合させる。直接的な磁気標識が可能ではないか又は所望ではない場合に、間接的な標識が簡便な代替選択肢である。任意の細胞表面マーカーに対して指向される、一次抗体、特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、一次抗体の組合せをこの標識戦略に使用することができる。一次抗体は、コンジュゲートされていないか、ビオチニル化されているか、又はフルオロフォアがコンジュゲートされてい���かのいずれかであり得る。その後、磁気標識が抗免疫グロブリンマイクロビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、又は抗フルオロフォアマイクロビーズを用いて達成される。上記のプロセスはまた、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）（ミルテニー・バイオテク有限会社、ドイツ）又はＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（ミルテニー・バイオテク有限会社、ドイツ）などの閉じた系で実施されてもよい。
【００７０】
本明細書において使用する「閉じた系」という用語は、新規物質の導入などの培養プロセスを実施している間、並びに細胞の増殖、分化、活性化、遺伝子改変、及び／又は分離などの細胞培養工程を実施している間に、細胞培養液の汚染のリスクを低減する、任意の閉じた系を指す。このような系は、適正製造基準下（ＧＭＰ）又はＧＭＰに似た条件（「無菌」）下での操作を可能とし、これにより、臨床的に適用可能な細胞組成物が得られる。閉じた系の一例はＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）（ミルテニー・バイオテク有限会社、ドイツ、国際公開公報第２００９/０７２００３号）である。
【００７１】
本明細書において使用する「自動化された方法」又は「自動化されたプロセス」という用語は、装置及び／又はコンピューター及びコンピューターソフトウェア（さもなければ、操作者によって手動で実施されるだろう又は実施され得る）の使用を通して、自動化された任意のプロセスを指す。自動化されている方法（プロセス）は、ヒトの介入の必要性がより少なく、ヒトが実現するのに必要な時間がより短い。場合によっては、方法の少なくとも１つの工程が、ヒトの支援又は介入を全く伴わずに実施される場合に該方法は自動化されている。優先的には、該方法の全ての工程が、ヒトの支援又は介入を伴うことなく実施される場合に該方法は自動化されている。
【００７２】
本発明に従って膵前駆細胞を精製する方法により、本発明の１つの実施態様において、ＣＤ５１及び／又はＣＤ１７７陽性である、膵前駆細胞を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％含む、細胞組成物が得られる。好ましい実施態様では、該組成物は、少なくとも５０％のＣＤ１７７陽性細胞を含む。続いて、この組成物を、膵β細胞の生成のために使用することができる。好ましくは、該組成物に含まれる細胞、好ましくは膵前駆細胞はヒトである。さらなる実施態様では、該組成物は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％のＣＤ２７５陰性膵前駆細胞を含む。好ましい実施態様では、該組成物は、ＣＤ２７５陰性である、少なくとも５０％の膵前駆細胞を含む。好ましくは、該組成物に含まれる細胞はヒトである。
【００７３】
別の実施態様では、膵前駆細胞の組成物は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％のＣＤ２７５陽性細胞を含む。肝特異的細胞表面マーカーのＣＤ２７５について選別された、この特定の実施態様では、膵前駆細胞は、むしろ肝前駆細胞と見なされるべきである。それ故、このような組成物は、肝系統の細胞を生成するために使用することができる。したがって、本発明はまた、
（ａ）肝前駆細胞を含む、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び／又は胚性幹細胞から誘導された細胞個体群を、肝前駆細胞上の細胞表面マーカー（ここでの、細胞表面マーカーはＣＤ２７５である）に結合するリガンドに曝す工程、及び
（ｂ）リガンドに結合しない、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び／又は胚性幹細胞から誘導された細胞から、肝前駆細胞を分離し、これにより、該肝前駆細胞を精製する工程
を含む、肝前駆細胞の精製法に関する。
【００７４】
肝前駆細胞の精製法は好ましくは、さらなる工程、すなわち、ＣＤ５１及び／又はＣＤ１７７に結合するリガンドに、該細胞個体群を曝す工程を含む。
【００７５】
好ましくは、本発明の方法に従って肝前駆細胞を精製するために使用されるＣＤ５１、ＣＤ１７７、及び／又はＣＤ２７５に結合しているリガンドは、抗体又はその結合断片である。
【００７６】
肝前駆細胞を精製する方法に従って使用されるＣＤ５１、ＣＤ１７７、及び／又はＣＤ２７５に結合している抗体又は抗体断片は好ましくは、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。
【００７７】
好ましくは、ＣＤ５１、ＣＤ１７７、及び／又はＣＤ２７５に結合し、本発明の方法に従って肝前駆細胞を精製するために使用されるリガンドは、標識にコンジュゲートしている。
【００７８】
好ましくは、細胞表面マーカーのＣＤ５１、ＣＤ１７７、及び／又はＣＤ２７５の発現は、本明細書に記載の肝前駆細胞を精製する方法に従って、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）及び／又はフローサイトメトリーによって検出される。
【００７９】
肝前駆細胞を精製する方法の分離工程は好ましくは、アフィニティクロマトグラフィー及び／又はフローサイトメトリーを含む。
【００８０】
本発明の方法に従って精製される肝前駆細胞は好ましくはヒトである。
【００８１】
本明細書に記載の肝前駆細胞又は肝前駆細胞の組成物を精製する方法に記載の方法に使用されるリガンドは好ましくは、捕捉用媒体上に固定されている。捕捉用媒体は好ましくはビーズを含み、及び／又はリガンドは好ましくは磁性試薬にコンジュゲートしている。
【００８２】
本発明に従って肝前駆細胞を精製する方法により好ましくは、少なくとも５０％の肝前駆細胞を含む細胞組成物が得られる。
【００８３】
肝前駆細胞を精製する方法に従って精製される組成物は好ましくは、ＣＤ２７５陽性である少なくとも５０％の肝前駆細胞を含む。好ましくは、本明細書に記載の組成物の肝前駆細胞は、肝前駆細胞上のＣＤ２７５に結合するリガンドに結合する。本発明の方法に従って精製される肝前駆細胞の組成物及び／又は肝前駆細胞上のＣＤ２７５に結合するリガンドに結合する組成物の肝前駆細胞は好ましくはヒトである。
【００８４】
さらに、本発明は、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び／又は胚性幹細胞から誘導された細胞個体群から肝前駆細胞を精製するための、肝前駆細胞上の細胞表面マーカー（ここでの細胞表面マーカーはＣＤ２７５である）に結合するリガンドの使用に関する。
【００８５】
本発明はまた、ＣＤ２７５に結合するリガンドと、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び／又は胚性幹細胞を、肝前駆細胞個体群へと分化させるための手段とを含む、キットにも関する。
【００８６】
本発明の好ましい実施態様では、本発明の方法によって作製された組成物に含まれる膵前駆細胞は、細胞表面上のＣＤ５１、ＣＤ１７７、及び／又はＣＤ２７５に結合するリガンドに結合する。好ましくは、該組成物の膵前駆細胞は、細胞表面上のＣＤ１７７に結合するリガンドに結合する。より好ましい実施態様では、該組成物に含まれる細胞はヒトである。
【００８７】
本発明は、さらなる実施態様において、多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）から誘導された個体群及び／又は組成物から、膵前駆細胞を精製するための、細胞表面マーカーに結合するリガンドの使用に関する。好ましくは、表面マーカーは、ＣＤ５１、ＣＤ１７７、及び／又はＣＤ２７５である。１つ以上の表面マーカーが存在していてもよい。より好ましい表面マーカーはＣＤ１７７である。好ましい実施態様は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）から誘導された細胞個体群から膵前駆細胞を精製するための、膵前駆細胞上の細胞表面マーカー（ここでの細胞表面マーカーはＣＤ１７７である）に結合するリガンドの使用を指す。
【００８８】
さらなる実施態様では、本発明は、
（ａ）膵前駆細胞を含む、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び／又は胚性幹細胞から誘導された細胞個体群を、膵前駆細胞上の細胞表面マーカー（ここでの細胞表面マーカーはＣＤ１７７である）に結合するリガンドに曝す工程、及び
（ｂ）リガンドに結合しない、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び／又は胚性幹細胞から誘導された細胞から、膵前駆細胞を分離し、これにより、該膵前駆細胞（ここでの膵前駆細胞は好ましくは表面上にＣＤ１７７を含む）を精製する工程
を含む、膵前駆細胞を精製するための、細胞表面マーカー（ここでの細胞表面マーカーはＣＤ５１、ＣＤ１７７及び／又はＣＤ２７５、好ましくはＣＤ１７７である）に結合するリガンドの使用に関する。
【００８９】
キット
本発明はまた、ＣＤ１７７に結合するリガンドと、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及び／又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）を、胚性内胚葉（ＤＥ）、膵前駆細胞（ＰＰ１及び／又はＰＰ２）、及び／又はブドウ糖濃度依存的にインシュリンを産生することのできる膵β細胞の個体群へと分化させるための手段とを含む、キットにも関する。
【００９０】
本明細書において使用する「分化させるための手段」又は「分化のための手段」は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及び／又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）から、胚性内胚葉（ＤＥ）、膵前駆細胞（ＰＰ）、及び／又はブドウ糖濃度依存的にインシュリンを産生することのできる膵β細胞の個体群への分化を誘導することのできる、様々な細胞培地（基礎培地又は補足培地）を含む。
【００９１】
本明細書において「基礎培地」は、培養中の細胞増殖を支持するのに効果的なアミノ酸、ビタミン、塩、及び栄養分の溶液を指すが、通常はこれらの化合物は、追加の化合物が補足されなければ細胞増殖を支持しないだろう。栄養分は、炭素源、好ましくは糖、より好ましくは細胞によって代謝され得るブドウ糖、並びに、細胞が生存するのに必要とされる他の化合物を含む。これらは、細胞自身が合成することのできない化合物である。多くの様々な基礎培地が当業者には公知である。本発明によって言及される好ましい基礎培地は、ＭＣＤＢ１３１培地、ＩＰＳ−Ｂｒｅｗ培地、及び／又はＢＬＡＲ培地である。
【００９２】
好ましい実施態様では、基礎培地に様々な増殖刺激因子及び分化刺激因子が補足されることにより「補足培地」が形成される。様々な補足物質が当業者には公知である。好ましい補足物質を以下の表１に列挙する：
【００９３】
【表１】
2020524525.tif 000002
2020524525.tif 000003
【００９４】
補足培地は、基礎培地と、当業者には公知である１つ及び／又はそれ以上の補足物質、好ましくは表１の補足物質との組合せによって作製され得る。追加の実施態様では、基礎培地に追加するための予め混合された補足物質を使用してもよい。さらなる実施態様は、液体、好ましくは水の添加によって補足培地を形成することのできる、乾燥粉末形態の簡便なブレンド又は補足成分を含む。本発明によるキットは、特定の実施態様では、基礎培地、補足培地、及び／又は予め混合された補足物質を含む。
【００９５】
好ましい実施態様では、キットは、上記で教義された成分、例えば、試料中の細胞標的に結合する少なくとも１つの可溶性リガンド、試料中の可溶性分析物に結合する少なくとも１つの可溶性リガンド、又は少なくとも１つの競合する可溶性分析物（好ましくは標識されている）；及び可溶性分析物に直接結合するか、可溶性分析物に間接的に結合するか、又は可溶性分析物に結合した可溶性リガンドに結合する、固相捕捉用媒体を含有している。該キットはまた、特定のアッセイを実施するための説明書、様々な希釈液及び緩衝液、並びに、シグナル発生試薬、例えばフルオロフォア、酵素基質、補因子、及び発色原も含む。他の成分としては、比色定量のためのインジケーター図表、使い捨て手袋、除染説明書、スティック状アプリケーター又は容器、及び試料調製用カップを含み得る。
【００９６】
別の実施態様では、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、及び／又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）から、胚性内胚葉（ＤＥ）、膵前駆細胞（ＰＰ）、及び／又はブドウ糖濃度依存的にインシュリンを産生することのできる膵β細胞への分化を誘導することのできる細胞培地は、ＳｔｅｍＭＡＣＳ ＩＰＳ−Ｂｒｅｗ培地（ミルテニー・バイオテク社）である。膵β細胞の分化のためのサイトカインの補足された、この細胞培地を用いて、多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）を、胚様体フォーマットを使用して分化させてもよい。
【００９７】
１つの実施態様では、上記のイムノアッセイの実施に有用なキットは、一成分として、細胞マーカー又は細胞標的に結合しかつ第一の検出可能な標識と会合している複数の第一のリガンドに会合した、固体マトリックス又は固相捕捉用媒体を含む。該キットはさらに、第二、第三、及び／又は第四の細胞マーカー又は細胞標識及び／又は可溶性分析物に結合することのできる第二、第三、及び／又は第四のリガンドを含む。第二、第三、及び／又は第四のリガンドは、第二、第三、及び／又は第四の検出可能な標識と会合している。
【００９８】
このようなキットは、特定の細胞型又は結合した成分又は可溶性抗原又はその分析物を濃縮、単離、枯渇、分離、選別、精製、及び／又はそのレベルを決定するために、多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）の個体群、及び／又は多能性幹細胞（ＰＳＣ）／人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）／胚性幹細胞（ＥＳＣ）から誘導された細胞個体群試料を評価するのに有用である。このような診断用キットは、本明細書に記載の実施態様の色素、リガンド、捕捉用媒体、及び他の成分を含有している。このようなキットはまた、上記に例示されているか、実施される予定の具体的なアッセイの他の成分に予め付着されているか、又は選択された成分、例えば基質に付着させるために別々に提供された標識を含有している。あるいは、このようなキットは、このような組成物の単純な混合物、又は単純な混合物を調製するための手段を含有していてもよい。
【００９９】
参考文献
本明細書に引用されている全ての文書及び特許文書の内容は、参照によりその全体が組み入れられる。
【０１００】
【表２】
2020524525.tif 000004
【０１０１】
実施例
以下の実施例は本発明を説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものと捉えられるべきではない。実施例は、説明の目的で含まれ、本発明は特許請求の範囲によってのみ制限される。
【０１０２】
材料及び方法
特記しない限り、以下の方法及び材料が使用された：
【０１０３】
細胞入手源
ヒト膵島は、インフォームドコンセントの下でルドベック研究所Ｃ１１（ウプサラ、スウェーデン）から入手した。Ｈ９ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株は、ＷｉＣｅｌｌ研究所（マディソン、ウィスコンシン州）から入手した。Ｍｅｌ１−ＮＫＸ６．１−ＧＦＰ及びＭｅｌ１−ＩＮＳ−ＧＦＰは、オーストラリア幹細胞研究センター（クレイトン、ヴィクトリア州）から入手した。エピソームの初期化されたｉＰＳ細胞株は、ＭＯＤＹ−４患者の対照群から研究室において作製された（ギブコ社のヒトエピソームｉＰＳ細胞、カタログ番号Ａ１８９４５、ライフテクノロジーズ社、カリフォルニア州）。両方の細胞株は、セルラインジェネティクス社（マディソン、ウィスコンシン州）によって本物であることが証明され、ロンザ社のＭｙｃｏＡｌｅｒｔマイコプラズマ検出キット（ロンザ社、カタログ番号ＬＴ０７−４１８）を使用することによってマイコプラズマを含まないことが確認された。ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞株を、ロベルト・コッホ研究所の許可の下で使用した。
【０１０４】
インビトロにおけるヒト多能性幹細胞から膵β様細胞への分化
Ｈ９細胞、Ｍｅｌ１−ＮＫＸ６．１−ＧＦＰ細胞、及びｉＰＳ細胞を、ＳｔｅｍＭＡＣＳ ｉＰＳ−Ｂｒｅｗ培地（ミルテニー・バイオテック社、ドイツ、カタログ番号１３０−１０４−３６８）中で１：３０に希釈されたＧｅｌｔｒｅｘ（インビトロジェン社、イギリス、カタログ番号Ａ１４１３３０２）上で培養した。約７０〜８０％の集密度で、培養液を、Ｍｇ２＋及びＣａ２＋を含まない１×ＤＰＢＳ（インビトロジェン社、カタログ番号１４１９０）で濯ぎ、その後、０．５mMのＥＤＴＡ（アプリケム社、カタログ番号１２６０４−０２１）と共に３７℃で２〜３分間インキュベートした。単一の細胞をｉＰＳ−Ｂｒｅｗで濯ぎ、１，３００rpmで３分間遠心分離にかけた。得られた細胞ペレットを、Ｙ−２７６３２（１０μM；シグマアルドリッチ社：ミズーリ州、カタログ番号Ｙ０５０３）の補足されたｉＰＳ−Ｂｒｅｗ培地中に懸濁し、単一細胞懸濁液をＧｅｌｔｒｅｘでコーティングされた表面上に約１．５〜２×１０５個の細胞/cm2で播種した。培養液にｉＰＳ−Ｂｒｅｗ培地を毎日フィードし、播種から２４時間後に分化が始まり、その結果、開始時に約９０％の集密度が得られた。細胞を初日に、０．５％のＢＳＡ（シグマ社、カタログ番号１０７７５８３５００１）、１００ng/mlのアクチビンＡ（ペプロテック社、カタログ番号１２０−１４−３００）、及び２５ng/mlのＷＮＴ３Ａ（ペプロテック社、カタログ番号３１５−２０）の補足されたＭＣＤＢ１３１培地を使用して胚性内胚葉へと分化した。次の２日間かけて、細胞を、０．５％のＢＳＡ及び１００ng/mlのアクチビンＡの補足されたＭＣＤＢ１３１を用いて処理した。β細胞への分化については、Rezania, et.al; 2014のβ細胞分化プロトコールを使用した１４。要するに、細胞を、０．５％のＢＳＡ、５０ng/mlのＦＧＦ７（ペプロテック社、カタログ番号１００−１９−１００）、及び０．２５mMのビタミン（Ｖｉｔ）Ｃ（シグマ社、カタログ番号１２０−１４−３００）の補足されたＭＣＤＢ１３１を用いて２日間かけて原始腸管へと分化させた。後前腸への分化のために、細胞をさらに、１×グルタマックス（ギブコ社、カタログ番号Ａ１２８６０−０１）、２％のＢＳＡ（カタログ番号１０７７５８３５００１）、０．２５mMのビタミン（Ｖｉｔ）Ｃ（シグマ社、カタログ番号Ａ４５４４−２５Ｇ）、５０ng/mlのＦＧＦ７、０．２５μMのＳＡＮＴ−１（シグマ社、カタログ番号Ｓ４５７２−５ＭＧ）、１μMのレチノイン酸（シグマ社、カタログ番号Ｒ２６２５−５０ＭＧ）、１００nMのＬＤＮ１９３１８９（シグマ社、カタログ番号０４−００７４）、１：２００のＩＴＳ−Ｘ（ギブコ社、カタログ番号５１５００−０５６）及び２００nMのＴＰＢ（メルク・ミリポア社、カタログ番号５６５７４０−１ＭＧ）の補足されたＭＣＤＢ１３１培地に２日間曝した。ＷＮＴ阻害実験だけのために、１．２５μMのＩＷＰ２（トクリス社、カタログ番号３５３３−１０）を培養液に加えた。次いで、細胞をさらに、１×グルタマックス、１０mMの最終ブドウ糖濃度、２％のＢＳＡ、０．２５mMのビタミン（Ｖｉｔ）Ｃ、２ng/mlのＦＧＦ７、０．２５μMのＳＡＮＴ−１、０．１μMのレチノイン酸、２００nMのＬＤＮ１９３１８９、１：２００のＩＴＳ−Ｘ、及び１００nMのＴＰ��の補足されたＭＣＤＢ１３１を使用して３日間かけて膵内胚葉へと分化させた。膵内分泌前駆体の誘導のために、細胞を次に、１×グルタマックス、２０mMの最終ブドウ糖濃度、２％のＢＳＡ、０．２５μMのＳＡＮＴ−１、０．０５μMのレチノイン酸、１００nMのＬＤＮ１９３１８９、１：２００のＩＴＳ−Ｘ、１μMのＴ３（シグマ社、カタログ番号Ｔ６３９７−１００ＭＧ）、１０μMのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（エンゾライフサイエンス社、カタログ番号ＡＬＸ−２７０−４４５−Ｍ００５）、１０μMの硫化亜鉛（シグマ社、カタログ番号ＳＩ Ｚ０２５１−１００Ｇ）、及び１０μg/mlのヘパリン（シグマ社、カタログ番号Ｈ３１４９）の補足されたＭＣＤＢ１３１培地に３日間曝した。最後の工程の内分泌前駆細胞を、１×グルタマックス、２０mMの最終ブドウ糖濃度、２％のＢＳＡ、１００nMのＬＤＮ１９３１８９、１：２００のＩＴＳ−Ｘ、１μMのＴ３、１０mMのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、１０μMの硫化亜鉛、１００nMのγセクレターゼ阻害剤ＸＸ（メルク社、カタログ番号５６５７８９）の補足されたＭＣＤＢ１３１に最初の７日間のみ曝し、７〜１５日目の間は１０μg/mlのヘパリンに曝すことによってホルモン陽性細胞を生成した。β様細胞の成熟のために、以前の段階の細胞を、２％のＢＳＡ、１：２００のＩＴＳ−Ｘ、１μMのＴ３、１０μMのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ、１０μMの硫化亜鉛、１mMのＮ−アセチルシステイン（シグマ社、カタログ番号Ａ９１６５）、１０μMのトロロックス（ＥＭＤ、カタログ番号６４８４７１）、２μMのＲ４２８（セレックケム社、カタログ番号Ｓ２８４１）、及び１０mg/mlのヘパリンを用いて１５日間かけて処理した。
【０１０５】
前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の亜個体群の選別
分化４日目（胚性内胚葉（ＤＥ）／前方胚性内胚葉（ＡＤＥ））に、分化した試料を収集し、表面マーカーについて染色した。表面マーカーの染色のために、１００μlの容量のＭＣＤＢ１＋０．５％ＢＳＡ中１×１０６個の細胞あたり１０μlの抗体（Ａｂ）（ＡＰＣ）にコンジュゲートしている）を加えた。細胞を、暗闇で氷上で１５分間かけて染色した。抗体を磁気で標識するために、染色された細胞をＰＢＳで３回洗浄して抗体を除去し、その後、計１０００万個の細胞あたり２０μLの抗ＡＰＣマイクロビーズを含む８０mlのＭＣＤＢ１３１＋０．５％ＢＳＡ培地中に懸濁した。細胞を３７℃で１５分間インキュベートした。細胞を、１〜２mlのＰＢＳで洗浄し、次いで、５００μLのＭＣＤＢ１３１＋０．５％ＢＳＡ中、最大２０×１０６個の細胞となるまで懸濁し、磁気選別に進めた。前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の亜個体群の磁気選別のために、ＬＳカラムを磁気選別装置に入れた。カラムをＰＢＳ ３mlで濯いだ。細胞懸濁液をカラムにアプライし、標識されていない細胞を含有している通過画分は廃棄した。次いで、カラムを３mlのＰＢＳで３回洗浄した。カラムを分離装置から取り出し、それを５mlの培地で流すことによって、抗体陽性細胞を収集した。次いで、細胞を、１０μMのＹ化合物の補足されたｉＰＳ−Ｂｒｅｗ培地に、２〜１０×１０３個の細胞の播種密度で、超低接着丸底９６ウェルプレートの１ウェルに播種して、さらなる分化及び染色のために、ＩＢＩＤチャンバーの１ウェル中に凝集物すなわち４×１０５個の細胞を形成した。
【０１０６】
定量ｑＰＣＲ分析及び遺伝子プロファイリング
分化した細胞における遺伝子発現を、Ｔａｑｍａｎアレイ（アプライドバイオシステムズ社）によって評価した。データを、発現スイートソフトウェア（アプライドバイオシステムズ社）を使用して分析し、ΔΔＣｔ法を使用して未分化ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に対して正規化した。
【０１０７】
免疫蛍光染色及びウェスタンブロット
免疫細胞化学のために、細胞又は凝集物を４％のＰＦＡで固定した。次いで、細胞に、遮断緩衝液中０．５％のサポニンを使用して透過性処理を行なった。ウェスタンブロットのために、細胞を、選別直後にＲＩＰＡ緩衝液中で解離した。細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分割し、ＰＶＤＦ膜（バイオラッド社）に転写し、抗体と共にインキュベートした。タンパク質のバンドを、ＨＲＰにコンジュゲートさせた抗体及び化学発光試薬（ミリポア社）を使用して可視化した。該バンドを、ＩｍａｇｅＪを用いて定量した。
【０１０８】
フローサイトメトリー分析
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及び分化した細胞を解離し、単一細胞懸濁液を調製した。細胞を固定し、透過性処理を行ない、胚性内胚葉（ＤＥ）、膵内胚葉、膵前駆細胞、及びホルモン陽性マーカーについて染色した。ＦＡＣＳゲーティングを、アイソタイプ抗体を使用して決定した。
【０１０９】
静的なグルコース刺激性インシュリン分泌
生成されたβ様細胞の静的なグルコース刺激性インシュリン分泌（ＧＳＩＳ）が、以前に記載されたプロトコールに基づいて実施された１４、５６。簡潔に言えば、５つの凝集物（合計で１，００，０００個の細胞）を拾い上げ、ＫＲＢＨ緩衝液（脱イオン水中でありかつ滅菌ろ過された、１２９mM ＮａＣｌ、４．８mM ＫＣｌ、２．５mM ＣａＣｌ２、１．２mM ＭｇＳＯ２、１mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１．２mM ＫＨ２ＰＯ４、５mM ＮａＨＣＯ３、１０mM ＨＥＰＥＳ、及び０．１％ＢＳＡ）で３回濯ぎ、次いで、ＫＲＢＨ緩衝液中で３７℃で１時間かけて平衡化した。次いで、凝集物を、２．８mMのグルコースの添加されたＫＲＢＨ緩衝液中で室温で６０分間インキュベートした。上清を収集し、凝集物を、１６．７mMのグルコースの添加されたＫＲＢＨ緩衝液中に６０分間かけて移した。上清を再度収集した。実験終了時に、細胞凝集物を解離して単一細胞とし、細胞数を計数して、ＧＳＩＳを正規化した。メルコディア社のヒトインシュリンＥＬＩＳＡキット（メルコディア社、カタログ番号１０−１１１３−０１）を使用して、製造業者のプロトコールに従って上清試料中のインシュリン含量を測定した。
【０１１０】
アフィメトリックスマイクロアレイ分析
遺伝子プロファイリングのために、全ＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙミニキット（キアゲン社、カタログ番号２１７００４）を使用して抽出し、ＲＮＡの完全性を、アジレント社の２１００バイオアナライザー（アジレント社のＲＮＡ６０００ピコキット）を使用して確認し、高い品質のＲＮＡのみ（ＲＩＮ＞７）をマイクロアレイ分析のために使用した。全ＲＮＡ（５ng）を、Ｅｎｃｏｒｅビオチンモジュール（ニュージェネレーション社）と組み合わせたＯｖａｔｉｏｎ Ｐｉｃｏ ＷＴＡシステムＶ２を使用して増幅した。増幅されたｃＤＮＡを、アフィメトリックス社のヒト遺伝子ＳＴ２．０アレイ（アフィメトリックス社、９０２１１３）にハイブリダイズさせた。染色及び走査（ＧｅｎｅＣｈｉｐスキャナー３０００ ７Ｇ）を、Ｅｎｃｏｒｅビオチンプロトコールにおいて示唆されているような小さな改変を含むアフィメトリックス社の発現プロトコールに従って実施した。発現コンソール（ｖ.１.４.１.４６、アフィメトリックス社）を品質制御のために使用した。全てのその後のコンピューター分析は、バイオコンダクタパッケージを使用してＲで実施された。発現データは、オリゴパッケージ（バージョン１.４２.０）を使用してＲＭＡで正規化し、プローブセットを、パッケージhugene20sttranscriptcluster.db（バージョン８．７．０）を使用してアノテーション付けした。発現変動分析は、リマパッケージ（バージョン３．３４．９）を使用して実施し、多重検定のためにＰ値をベンジャミン・ホックベルグ補正によって調整した。未調整ｐ値が、０．０１の閾値より低く、変化倍率が１．５以上であった場合に、遺伝子は発現変動したと判断された。機能的エンリッチメントは、ＨＯＭＥＲを使用して実施された５７。全てのマイクロアレイデータは、アクセッション番号ＧＳＥ１１３７９１（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE113791）下でＧＥＯから入手可能である。
【０１１１】
画像分析
画像は、ライカ社のＳＰ５共焦点顕微鏡及びツァイス社のＬＳＭ８８０エアリースキャン共焦点顕微鏡を用いて取得した。ライカ社の共焦点顕微鏡によって撮影された画像を、ライカ社のＬＡＳ ＡＦ Ｌｉｔｅを使用して分析した。ツァイス社の共焦点顕微鏡によって撮影された画像を、ツァイス社のＺｅｎブルーソフトウェアを使用して分析した。
【０１１２】
統計分析
全ての数値は、少なくとも３回の独立した実験から特別に指定されない限り、平均値±標準偏差として示される。統計学的有意性は、Ｐ＜０．０５として定義される。試料サイズは、図の説明文に提供されている。全ての統計は、グラフパッドプリズムソフトウェア７（グラフパッドソフトウェア社、ラホヤ、カリフォルニア州）を使用して実施された。数値は、各実験について指示されているように対応のない又は対応のあるｔ検定を使用して比較された。簡潔に言えば、分化の全期間におよぶ（Ｓ１〜Ｓ７）遺伝子発現の分析は、対応のないｔ検定を使用して実施された。対応のない両側ｔ検定を使用して、ＣＤ１７７から誘導されたβ様細胞と、ＣＸＣＲ４から誘導されたβ様細胞との間でホルモン含量を比較した。全てのｑＰＣＲデータは、対応のない両側ｔ検定によって比較された。ＣＸＣＲ４の前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）細胞、ＣＤ１７７の前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）細胞、及びＣＤ２７５の前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）細胞から誘導されたＰＤＸ１＋細胞の発現レベル間の比較を、一元分散分析を使用して実施した。治験者は、本発明者らの治験において処置群に対して盲検的ではなく、試料サイズを決定するために統計学的検定は全く使用されなかった。
【０１１３】
実施例１：異なる胚性内胚葉を濃縮する新規な表面マーカー抗体の同定
計画の主な仮説は、胚性内胚葉（ＤＥ）において異なる亜個体群を濃縮することのできる、新規な表面マーカーを発見することであった。インビボにおいて、胚性内胚葉は、ＴＧＦβ及びＷｎｔ３Ａの勾配シグナルを用いてパターン形成され、その後、このパターン形成は次に、様々な器官を発生することが知られている。最初の目的は、このパターン形成効果が、インビトロにおいても存在しているかどうかを解明することであった。最初の実験のために、２つの既知の胚性内胚葉（ＤＥ）マーカーであるＦＯＸＡ２及びＣＸＣＲ４を使用して、分化プロセスを評価した。
【０１１４】
インビトロにおける胚性内胚葉（ＤＥ）の生成のために、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を、集密となるまでＩＰＳ−Ｂｒｅｗ培地（多能性培地）中でフィーダーフリー条件でｇｅｌｔｒｅｘ上で培養した。次に、培地を、２０ng/mlのＷｎｔ３ａ及び１００ng/mlのアクチビンＡ（ＡＡ）の補足された分化用培地（ＭＣＤＢ１＋１×グルタマックス＋０．５％ＢＳＡ）へと１日目に交換した。２日目から４日目に、細胞を、１００ng/mlのアクチビンＡ（ＡＡ）の補足された分化用培地で処理した。分化スキームを図１Ａに示す。
【０１１５】
翌日、細胞をＥＤＴＡを用いてトリプシン処理し、ミルテニー社のプレート上に２００，０００個の細胞/ウェルの播種密度で置き、表面抗体及びＣＸＣＲ４を用いて暗闇で室温で１５分間かけてまず染色した。１５分後、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで細胞内ＦＯＸＡ２の染色のために４％ＰＦＡで固定した。次いで、細胞を、遮断溶液と共に０．５％トリトンＸを用いて透過性処理を３０分間以内で行ない、次いで、一次ＦＯＸＡ２抗体を細胞に１時間かけて加えた。二次抗体の染色を次に３０分間かけて行ない、その後、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ分析をミルテニー・バイオテク社のＭＡＣＳ Ｑｕａｎｔを使用して実施した。図１Ｂは、既知の胚性内胚葉（ＤＥ）のマーカーであるＦＯＸＡ２及びＣＸＣＲ４に対して異なる胚性内胚葉（ＤＥ）亜個体群を濃縮することのできる、新規な表面マーカーの同定についてのスクリーニング設定を示す。ＣＤ１７７及びＣＤ２７５という２つのマーカーが、明確に異なる胚性内胚葉（ＤＥ）の亜個体群のマーカーとして同定された（図１Ｃ）。
【０１１６】
胚性内胚葉（ＤＥ）における新規抗体の分布を確認するために、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）をまず、上記のプロトコールを使用して胚性内胚葉（ＤＥ）へと分化させ、その後、細胞を、ＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４（ＦＯＸＡ２、ＳＯＸ１７、及びＣＸＣＲ４は全て胚性内胚葉（ＤＥ）をマークする）と共にＣＤ１７７又はＣＤ２７５について染色した。胚性内胚葉（ＤＥ）においてＣＤ１７７又はＣＤ２７５によってマークされた細胞の定量は、ＦＡＣＳを使用して実施された。結果は、ＣＤ１７７及びＣＤ２７５が、ＣＸＣＲ４＋胚性内胚葉（ＤＥ）の個体群及びＦＯＸＡ２＋/ＳＯＸ１７＋胚性内胚葉（ＤＥ）の個体群のどちらにおいても、異なる前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の亜個体群であることを示す（図１Ｄ）。
【０１１７】
ＰＣＡ（主成分分析）のために、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）をまず４日間かけて、上記の分化プロトコールを使用して胚性内胚葉（ＤＥ）へと分化させ、その後、細胞を、ＣＤ１７７、ＣＤ２７５、及びＣＸＣＲ４（対照）を用いて染色し、磁気標識（ミルテニー・バイオテク社）を使用して選別した。ＲＮＡを、製造業者のプロトコールを使用して細胞から単離した。マイクロアレイ分析は、アフィメトリックスアレイを使用してドイツ研究センターヘルムホルツ協会（Helmholtz Zentrum）で実施された。ＰＣＡ分析は、ＣＤ１７７の亜個体群とＣＸＣＲ４の亜個体群とＣＤ２７５の亜個体群の間の有意な分子的差異を明らかとする（図１Ｅ）。これはさらにＧＯ分析においても明白であり、この分析でもそれらはシグナル伝達経路の発現変動を示す（図１Ｆ）。
【０１１８】
実施例２：ＣＤ１７７＋亜個体群における、非古典的ＷＮＴ／ＰＣＰ経路は、変動的に調節されている
胚性内胚葉（ＤＥ）の亜個体群のさらなる特徴付けのために、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を胚性内胚葉（ＤＥ）へと分化させ、次いで、それらをＣＤ１７７、ＣＤ２７５、及びＣＸＣＲ４で染色した後にＭＡＣＳで細胞を選別した。次いで、これらの細胞を、マイクロアレイ、ｑＰＣＲによる定量、及びウェスタンブロットにかけて、亜個体群における特異的な差異を見つけ出した。分化及び選別を示すスキームを図２Ａに示す。
【０１１９】
胚性内胚葉マーカーであるＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７をまず、全ＲＮＡレベルについて確認した。亜個体群間のＦＯＸＡ２のレベルとＳＯＸ１７のレベルとの差異は全く観察されなかった。次に、前方胚性内胚葉マーカー（ＡＤＥ）、例えばケルベロス（Cerberus）１（ＣＥＲ１）及びＨＨＥＸ（造血で発現するホメオボックスタンパク質）を分析した。インビボにおいて、その後、形成された胚性内胚葉（ＤＥ）の内胚葉は前側及び後側へとパターン形成される。前側は肺、肝、及び膵などの器官を発生し、一方、後側は腸を発生する。膵臓は本発明の脈絡においてより関心が高いので、前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）マーカーのＣＥＲ１及びＨＨＥＸについてのみ確認した。ＣＤ１７７＋胚性内胚葉（ＤＥ）はＣＥＲ１亜個体群において濃縮され、一方、ＣＤ２７５＋胚性内胚葉（ＤＥ）はＨＨＥＸ亜個体群において濃縮され、一方、ＣＸＣＲ４＋胚性内胚葉（ＤＥ）は全胚性内胚葉（ＤＥ）をマークすることが観察された（図２Ｂ）。
【０１２０】
次に、これらの亜個体群において変動的に調節されている様々なシグナル伝達経路をマイクロアレイに基づいて分析した。ＷＮＴ／ＰＣＰ経路の標的遺伝子、例えばＤＶＬ２、ＲＯＲ２、及びＪＮＫは全て、マイクロアレイにおいて、ＣＤ２７５＋胚性内胚葉（ＤＥ）及びＣＸＣＲ４＋胚性内胚葉（ＤＥ）の亜個体群と比較して、ＣＤ１７７＋胚性内胚葉（ＤＥ）の亜個体群において高度に発現されていたことが分かった（図２Ｃ）。ＭＡＣＳにより濃縮されたＣＤ１７７＋個体群、ＣＤ２７５＋個体群、及びＣＸＣＲ４＋個体群の三方比較における、遺伝子オントロジー（ＧＯ）及び遺伝子発現変動分析は、内胚葉パターン形成及び増殖の調節、並びに膵細胞となる運命への特殊化に関与する、経路に関連した遺伝子の濃縮を示した（図７Ａ〜Ｄ）。これらは、活性化ＦＧＦＲ１経路のＴＧＦ−β下流シグナル伝達の正の調節、ＭＡＰＫカスケードの正の調節、レチノイン酸（ＲＡ）により媒介されるシグナル伝達、並びに、古典的及び非古典的ＷＮＴ／平面細胞極性（ＰＣＰ）シグナル伝達の調節を含んでいた。ｑＰＣＲによるこれらの遺伝子の定量は、ＣＸＣＲ４＋胚性内胚葉（ＤＥ）及びＣＤ２７５＋胚性内胚葉（ＤＥ）と比較して、ＣＤ１７７＋胚性内胚葉（ＤＥ）における、全てのＷＮＴ／ＰＣＰシグナル伝達成分、例えばＤＶＬ２、ＲＯＲ２、ＷＮＴ５ａ、及びＷＮＴ４の有意な発現を示し、このことは、ＣＤ１７７＋胚性内胚葉（ＤＥ）における活性なＷＮＴ／ＰＣＰシグナル伝達を示す（図２Ｄ、２Ｅ）。ＣＤ１７７＋胚性内胚葉（ＤＥ）におけるＷＮＴ／ＰＣＰシグナル伝達の標的であるＪＮＫのリン酸化は、これらの細胞におけるＷＮＴ／ＰＣＰ経路の活性化を確認する（図２Ｆ及び図２Ｇ）。対照的に、古典的リガンドであるＷＮＴ３Ａ及びその標的遺伝子であるＡＸＩＮ２の発現は、ＣＤ２７５＋前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の亜個体群においてアップレギュレートされていた（図７Ｅ）。β−カテニンの核への移行は、古典的ＷＮＴ活性化の特徴であり、したがって、本発明者らは、単離された亜個体群における免疫蛍光及び核分画によって、核内及び細胞質内のβ−カテニンの分布について試験した。β−カテニンの蓄積は、ＣＤ２７５＋個体群及びＣＸＣＲ４＋個体群の核画分において観察され（図７Ｆ）、ＣＤ２７５＋前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の亜個体群の免疫蛍光染色において核に蓄積している明瞭な兆候が観察された（図４Ｄ）。これらの結果は、ＣＤ２７５＋前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の前駆細胞が、古典的なＷＮＴ−β−カテニンシグナル伝達を受け、肝臓となる運命へと特殊化され得、一方、ＣＤ１７７＋前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の前駆細胞は、非古典的なＷＮＴ／ＰＣＰシグナル伝達を受け、膵臓となる運命へと特殊化され得ることを示唆する。
【０１２１】
実施例３：亜個体群の濃縮は、腹側の膵前駆細胞と背側の膵前駆細胞を識別することができる
ＷＮＴ／ＰＣＰ経路は、膵臓の発生中に主要な役割を果たすことが知られているので、インビトロにおいて様々な膵臓発生段階においてこれらの異なる胚性内胚葉（ＤＥ）の亜個体群の分化能を探索することを決断した。このために、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を胚性内胚葉（ＤＥ）へと分化させ、次いで、新規抗体を使用してＣＤ１７７＋の胚性内胚葉（ＤＥ）の亜個体群、ＣＤ２７５＋の胚性内胚葉（ＤＥ）の亜個体群、及びＣＸＣＲ４＋の胚性内胚葉（ＤＥ）の亜個体群について選別した。次いで、これらの亜個体群をさらに、Rezania et.al, 2014のプロトコールを使用して、まず原始腸管へと分化させ、その後、膵前駆細胞（ＰＰ）へと分化させた。実験スキームを図３Ａに示す。
【０１２２】
インビボにおける膵臓の発生プロセス中に、原始腸管は腹側前腸内胚葉及び背側前腸内胚葉を発生する。腹側前腸内胚葉は、肝臓及び膵臓の両方の前駆細胞を発生し、一方、背側前腸内胚葉は、膵前駆細胞のみを発生する。ＳＯＸ１７は、腹側前腸内胚葉のマーカーである。ＣＤ１７７＋細胞では、ＳＯＸ１７の発現は、胚性内胚葉（ＤＥ）段階の間にピークに達し、細胞が原始腸管へと入るにつれて低下することが観察された。興味深いことに、ＣＤ１７７＋細胞では、ＳＯＸ１７の発現は、分化が膵前駆細胞の段階へと進むにつれて次第に低下する。しかしながら、ＣＤ２７５＋細胞及びＣＸＣＲ４＋細胞では、胚性内胚葉（ＤＥ）段階における初回ピーク後に、ＳＯＸ１７の発現は、原始腸管において低下し、その後、膵前駆細胞の形成中に維持され、このことは、ＣＤ２７５＋細胞及びＣＸＣＲ４＋細胞は、ＣＤ１７７＋細胞と比較して、より多くの腹側前腸内胚葉細胞を生成することを示唆する（図３Ｂ）。ＰＤＸ１の発現は、膵前駆細胞の分化を評価するための対照として使用される。図３ＥのＦＡＣＳデータは、ＣＤ２７５＋細胞及びＣＸＣＲ４＋細胞と比較して、ＣＤ１７７＋細胞においてよりＳＯＸ１７の発現が低いことを明らかとする。
【０１２３】
ＣＤ１７７＋細胞がより多くの背側膵前駆細胞を生成するかどうかを識別するために、腹側（図３Ｃ）及び背側の膵遺伝子（図３Ｄ）を、ｑＰＣＲを使用して評価した。運動ニューロン及び膵ホメオボックス１（ＭＮＸ１）、Ｐａｔｃｈｅｄ１（ＰＴＣＨ１）、及びノギン（ＮＯＧ）などの有意により高いレベルの背側膵マーカーが、ＣＤ２７５＋細胞及びＣＸＣＲ４＋細胞と比較して、ＣＤ１７７＋細胞において観察され、このことは、ＣＤ１７７＋細胞が、背側膵前駆細胞を発生するが、ＣＤ２７５＋細胞及びＣＸＣＲ４＋細胞は腹側膵前駆細胞を発生することを示す。
【０１２４】
実施例４
ＣＤ１７７＋亜個体群は、特殊化された膵前駆細胞であり、一方、ＣＤ２７５＋亜個体群は肝臓でプライミングされる前駆細胞である
最後の図において、ＣＤ２７５＋細胞及びＣＸＣＲ４＋細胞は腹側膵前駆細胞を発生するが、ＣＤ１７７＋細胞は背側膵前駆細胞を発生することが確認されているので、これらの亜個体群における肝臓のサインを調べることを決断した。このために、細胞をまず、胚性内胚葉（ＤＥ）へと分化させ、その後、抗体に基づいて選別し、その後、これらの細胞をさらに、Rezania et.al, 2014のプロトコールを使用して、膵前駆細胞の段階へと分化させた。実験設定の概観を図４Ａに示す。
【０１２５】
膵前駆細胞の段階へと分化させた後、ｑＰＣＲ分析のために、全ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡへと転写した。ｍＲＮＡの定量は、ＨＨＥＸ、ＴＴＲ、及びＡＦＰなどの肝前駆細胞マーカー遺伝子が、ＣＤ１７７＋細胞と比較して、ＣＤ２７５＋細胞及びＣＸＣＲ４＋細胞において有意にアップレギュレートされ（図４Ｂ）、一方、膵前駆細胞マーカーのＰＤＸ１は、ＣＤ１７７＋細胞においてより多く発現されたことを示し（図４Ｂ、Ｃ）、このことから、本発明者らは、ＣＤ２７５＋細胞及びＣＸＣＲ４＋細胞は、腹側前腸内胚葉を発生し、その後、腹側の膵臓及び肝臓を発生し、一方、ＣＤ１７７＋細胞は、背側前腸内胚葉及び背側膵前駆細胞を発生すると考えた。
【０１２６】
肝細胞は、細胞周期から逸脱する膵前駆細胞と比較して高度に増殖性であるので、本発明者らは、β−カテニンの発現又はＷＮＴ３Ａのサイン、並びにこれらの特定の亜個体群の細胞周期プロファイルを分析した。ＷＮＴ３Ａシグナル伝達経路は、細胞の増殖を増強する。これは、肝前駆細胞において特に当てはまる。β−カテニンの代表的な免疫蛍光染色は、ＣＤ１７７＋細胞におけるβ−カテニンの膜への移行を示すが、一方、ＣＤ２７５＋細胞においては核内及び細胞質内により多く局在する（図４Ｄ）。細胞周期状態を示すためにＰＩについて染色されたＣＤ２７５＋細胞及びＣＤ１７７＋細胞の代表的なＦＡＣＳプロット及びグラフ分析を図４Ｅに示す。一般的に、肝前駆細胞を発生するＣＤ２７５＋細胞は、細胞の大半がＳ期を循環し、高度に増殖性の亜個体群であり、一方、膵前駆細胞を発生するＣＤ１７７＋細胞は、細胞周期から逸脱し、大半の細胞はＧ１期にあり（図４Ｆ）、このことは本発明者らの仮説を支持する。
【０１２７】
実施例５：ＣＤ１７７＋胚性内胚葉（ＤＥ）は、コンパクトで成熟した単一ホルモン性β細胞をインビトロにおいて生成する
ＷＮＴ／ＰＣＰ経路は、胚性内胚葉（ＤＥ）のＣＤ１７７＋亜個体群において活性化されていることが知られているので、これらの細胞から膵β細胞への分化能をさらに調べた。活性化ＷＮＴ／ＰＣＰ経路は、インビボにおいて膵β細胞の形成及び成熟を助けることがすでに証明されている。したがって、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を胚性内胚葉（ＤＥ）へと分化させ、ＣＤ１７７及びＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）を使用して選別し、その後、Rezania et.al, 2014のプロトコールを使用して、膵β細胞へとさらに分化させた。実験設定の概観を図５Ａに示す。
【０１２８】
段階６において、細胞を、ｍＲＮＡの定量及びＦＡＣＳのために収集した。ＦＡＣＳのために、細胞を、膵転写因子のＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を用いて染色した。ＣＤ１７７＋細胞が、ＣＸＣＲ４＋細胞と比較して、より多くのＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋細胞を生成したことが観察された（図５Ｃ）。より興味深いことには、インシュリン（ＩＮＳ）及びグルカゴン（ＧＬＵ又はＧＣＧ）のホルモンについて染色した場合には、ＣＤ１７７＋細胞の大半がインシュリン陽性（ＩＮＳ＋）であり、一方、ＣＸＣＲ４＋細胞の大半がインシュリン陽性（ＩＮＳ＋）／グルカゴン（ＧＬＵ＋）陽性を示し、このことは、ＣＸＣＲ４＋細胞が多ホルモン性細胞の大半を発生し、一方、ＣＤ１７７＋細胞は単一ホルモン性β細胞を発生することを示す（図５Ｂ）。
【０１２９】
ｍＲＮＡによる膵転写遺伝子（例えばＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ２．２）の定量は、ＣＸＣＲ４＋細胞と比較して、ＣＤ１７７＋細胞において、これらの遺伝子のより高度な発現を示した。ＣＤ１７７＋細胞はまた、ＣＸＣＲ４＋細胞と比較して、より高い発現レベルのインシュリン（ＩＮＳ）遺伝子と、より低い発現レベルのグルカゴン（ＧＣＧ）遺伝子も示した。全ての中で最も興味深い事実は、ＣＸＣＲ４＋β細胞と比較して、ＣＤ１７７＋β細胞における、成熟マーカーであるＭＡＦＡ（ＭＡＦ ＢＺＩＰ転写因子Ａ）のより高度な発現である。このようなＭＡＦＡの発現は、ヒト膵島におけるその発現レベルと同等であり、このことは、ＣＤ１７７＋細胞において活性化されたＷＮＴ／ＰＣＰのシグナル伝達は成熟したβ細胞を生成することができることを示す（図５Ｄ）。
【０１３０】
ＣＤ１７７＋亜個体群を選別する際の別の顕著な特色は、それが、ＣＸＣＲ４＋細胞と比較して、小さくコンパクトな構造を生成したことである。このコンパクトさは、ＣＤ１７７＋細胞における活性化された非古典的ＷＮＴシグナル伝達に起因し得、これは細胞内に頂端側・基底膜の極性を確立することができ、これにより、ＣＤ１７７＋β細胞の成熟及び自己組織化が補助される（図５Ｅ）。
【０１３１】
実施例６：新規なＣＤ１７７＋前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の亜個体群及びＣＤ２７５＋前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の亜個体群のさらなる分析
自己組織化及び空間パターン形成が近年、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を使用して研究されている。現在のヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）分化プロトコールは、分化４日目（Ｄ４）に、１つ又は２つのマーカー遺伝子、すなわちＣＸＣＲ４又はＦＯＸＡ２／ＳＯＸ１７によって測定したところ、均質であると思われる胚性内胚葉（ＤＥ）個体群を誘発する（図６ａ〜ｃ）。内胚葉の分化が均質であるかどうかを調べるために、本発明者らはＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）及びｃ−ＫＩＴ（ＣＤ１１７）マーカーの発現に基づいた蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用し、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって、誘発された内胚葉を分析した（図６ｂ及び６ｄ〜ｇ）。驚くべきことには、本発明者らは、ＣＤ１１７が、ＣＸＣＲ４＋内胚葉のサブセット（６３．３％）のみをマークし、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７＋二重陽性個体群は、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７ｈｉｇｈ（２１．３％）、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７ｍｉｄ（１５．４％）、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７ｌｏｗ（２６．６％）、及びＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１７７−（１５．３％）の亜個体群に分類され得ることを発見した（図６ｂ）。興味深いことには、本発明者らは、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７ｌｏｗ亜個体群に対して、選別されたＣＸＣＲ４＋／ＣＤ１１７ｈｉｇｈ亜個体群では、ＦＯＸＡ２及びＳＯＸ１７の発現レベルは逆であること（図６ｄ、ｅ）、並びに特定の亜個体群における前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）マーカーであるケルベロス１（ＣＥＲ１）及びＨＨＥＸの発現は増加したことを発見した（図６ｆ、ｇ）。ＦｏｘＡ２及びＳｏｘ１７は、マウス原腸胚形成中の内胚葉において逆の前方／後方の勾配に沿って発現されている。これらの結果は、内胚葉が分子的に不均質であり、インビボにおける内胚葉と同じように、隣接する細胞型相互作用を通して培養中に何らかの種類のパターン情報を受け取ることを示唆する。
【０１３２】
ＸＭ００１ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、Ｈ１ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、及びＭｅｌ１−ＮＫＸ６．１−ｅＧＦＰ細胞株では、ＣＸＣＲ４＋内胚葉誘導効率は９０％に達し、それから最大１/３のＣＤ２７５＋の前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）細胞又は２/３のＣＤ１７７＋の前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）細胞が誘導され得る（図１４Ａ、Ｂ）。さらなる分析のために、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株を、その優れた膵への分化能のために使用した。本発明者らが３つの以前に確立された内胚葉誘導スキームを比較したところ、本発明者らは、ほぼ同一レベルのＣＸＣＲ４＋胚性内胚葉（ＤＥ）の誘導で、２つの前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）亜個体群の誘導効率において顕著な差異を観察した（図１４Ｃ〜Ｇ）。要するに、これらの結果は、本発明者らが、ＣＸＣＲ４＋混合内胚葉個体群中の明確に異なる前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）亜個体群を識別する、２つの新規表面マーカーを発見したことを示唆した。特に、前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の分化効率は、化学的誘導スキーム及び細胞株の遺伝子的バックグラウンドに依存し、このことは、分化の初期段階における品質制御が保証されることにより、分化効率は改善されることを意味しており、これは本発明の使用によって実施され得る。
【０１３３】
前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の分化効率がインビトロにおいてモルフォゲンによって調節され得るかどうかをさらに試験するために、本発明者らは、阻害剤の実験を実施し、ここでは本発明者らはＷＮＴ３Ａ及びアクチビンＡ（ＡＡ）によって内胚葉を初日に誘導し、その後、４日目まで低分子阻害剤のＤＭＨ１及びＳＢ４３１５４２をそれぞれ使用して、内胚葉分化中にＢＭＰ及び／又はＴＧＦ−βのシグナル伝達強度を調整した（図１４Ｈ）。標準的な分化中では、２０ng/mlのＷＮＴ３Ａ及び１００ng/mlのアクチビンＡ（ＡＡ）は、混合ＣＸＣＲ４＋胚性内胚葉（ＤＥ）個体群において、３５．５％のＣＤ１７７＋前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）及び２１％のＣＤ２７５＋前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）を誘導する（図１４Ｉ）。高いレベルのＴＧＦ−βシグナル伝達（１００ng/mlのアクチビンＡ（ＡＡ））及びＢＭＰの阻害（４μMのＤＭＨ１）により、ＣＤ１７７＋前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）は３５％から８０．５％まで有意に増加し、一方、ＣＤ２７５＋前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の誘導は僅かに減少した（１４％）（図１４Ｊ）。一方で、低いレベルのＢＭＰ阻害剤（２．５μMのＤＭＨ１）及びＴＧＦ−βの阻害（１μMのＳＢ４３１５４２）は、ＣＤ２７５＋胚性内胚葉（ＤＥ）の分化を支持し（５４．０％）（図１４Ｋ）、このことは、異なる量及び品質の前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）がインビトロで誘発され得ることを示唆する。
【０１３４】
実施例７：ＣＤ１７７＋亜個体群は膵前駆細胞へと分化し、ＣＤ２７５＋亜個体群は肝前駆細胞へと分化することができる
本発明者らはさらに、インビトロにおいて、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）により誘導される膵及び内分泌の分化の最中における、ＣＸＣＲ４、ＣＤ１７７、及びＣＤ２７５の表面マーカーの発現を詳細に研究した。ＣＤ１７７及びＣＤ２７５の発現は、前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の開始及びパターン形成の最中にピークに達し、腸管及び膵前駆細胞の形成中に次第に減少し、ここでのＣＤ１７７及びＣＤ２７５の発現はほぼ無視できた（図８Ｅ）。しかしながら、本発明者らは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から誘導されるβ様細胞が形成されるまで、膵及び内分泌の分化中にＣＸＣＲ４の高い発現を観察した。ＣＤ１７７＋前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の亜個体群及びＣＤ２７５＋前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の亜個体群における細胞運命特殊化経路の異なる活性化により、優先的な系統の割り当てがなされるかどうかを試験するために、本発明者らは、肝臓及び膵臓となる運命へのインビトロにおける分化能を探索した。肝の分化能を試験するために、本発明者らは、選別された細胞を肝細胞へと分化させ３３、初期肝前駆細胞遺伝子のＡＦＰ、ＴＴＲ、及びＨＨＥＸの発現を試験した（図８Ｇ）。顕著には、ＨＨＥＸ、ＡＦＰ、及びＴＴＲのｍＲＮＡ転写物の発現は、ＣＤ１７７＋から誘導された前駆細胞と比較したところ、ＣＸＣＲ４＋から誘導された初期肝前駆細胞及びＣＤ２７５＋から誘導された初期肝前駆細胞において有意にアップレギュレートされていた（図８Ｇ）。他方で、本発明者らが膵への分化能について試験したところ（図８Ａ）、約６８．８％のＣＤ１７７＋前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）がＰＰ１の段階のＰＤＸ１＋膵前駆細胞へと効率的に分化し、一方、僅か５０％のＣＸＣＲ４＋から誘導された内胚葉細胞及び４２．３％のＣＤ２７５＋から誘導された内胚葉細胞がＰＰ１段階へと分化したことを発見した（図８Ａ）。さらに、ＣＤ１７７＋から誘導されたＰＰ１細胞は、ＰＰ１段階で非常に高いレベルのＰＤＸ１を発現した（図８Ｂ、Ｃ）。免疫蛍光分析は、これらの所見を実証し、このことは、特殊化された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の亜個体群の選別が、膵臓となる運命への分化能を増強することができることを示唆する（図８Ｃ、Ｄ）。本発明者らはまた、濃縮された細胞における膵発生に重要な調節因子であるＧＡＴＡ６の発現を分析した。ＣＤ１７７＋から誘導されたＰＰは、ＣＸＣＲ４＋から誘導されたＰＰ及びＣＤ２７５＋から誘導されたＰＰと比較したところ、ＧＡＴＡ６及びＰＤＸ１の両方のより均一な発現を示した（図９Ａ）。１０個の他の内胚葉から誘導された器官前駆細胞の方向付けされていない生成を除外するために、本発明者らは、ＰＰ２の段階で選別されたどの亜個体群にも発現されていなかった、肺（ＳＯＸ２＋）及び腸（ＣＤＸ２＋）マーカーを試験した（図１０Ａ）。さらに、本発明者らは、マーカーとしてＰＴＦ１Ａを使用して、膵外分泌分化を除外した（図１０Ｂ）。要するに、これらの結果は、ＣＤ１７７＋前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の亜個体群が、膵系統へとより均一かつ効率的に分化することを示唆する。
【０１３５】
実施例８：腸管パターン形成中のＷＮＴ３Ａの分泌阻害は、膵臓となる運命を促進する
ＷＮＴ分泌阻害が、膵臓となる運命の誘導を促進するかどうかを試験するために、本発明者らは、胚性内胚葉（ＤＥ）の段階においてＣＤ２７５＋亜個体群、ＣＤ１７７＋亜個体群、及びＣＸＣＲ４＋亜個体群を濃縮し、それらを２次元でゲルトレックスでコーティングされた皿に播種した（図１１Ａ）。本発明者らは、Ｗｎｔリガンドのパルミトイル化及び分泌を選択的に阻害する、ポーキュパイン化学物質阻害剤であるＩＷＰ２を使用した。ＩＷＰ２の添加が、前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）亜個体群から膵臓となる運命への全体的な分化に影響を及ぼすかどうかを確認するために、本発明者らは、選別された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）亜個体群に、Ｓ２の原始腸管形成及びパターン形成の最中にＩＷＰ２を添加し、その後、Ｓ４のＰＰ２へとさらに分化させた（図１１Ａ）。ＩＷＰ２を含まない標準的な分化条件下において、ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋についてのＦＡＣＳ分析は、ＣＤ１７７＋の濃縮された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）から誘導された約７５％の二重陽性ＰＰ２細胞を示し、一方、ＣＤ２７５＋から誘導された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）からは僅か約３０％、ＣＸＣＲ４＋から誘導された胚性内胚葉（ＤＥ）からは約４５％が生成された（図１１Ｂ、Ｃ）。ＩＷＰ２の添加後、ＣＸＣＲ４＋（７５％）及びＣＤ２７５＋（５０％）から誘導されたＰＤＸ１＋/ＮＫＸ６．１＋ＰＰ２細胞の比率は劇的に増加し、このことは、ＷＮＴ分泌阻害が、膵分化を促進することを示唆する（図１１Ｂ、Ｄ）。ＣＤ１７７＋から誘導されたＰＰ２におけるＰＤＸ１＋/ＮＫＸ６．１＋二重陽性ＰＰ２細胞の比率に差は全く観察されず、このことは、ＣＤ１７７＋／ＣＥＲ１＋前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）前駆細胞は、古典的なＷＮＴシグナル伝達活性化から遮蔽され、これは本発明者らの以前の結果と一致する。古典的なＷｎｔ／β−カテニン経路の別の特徴は、細胞増殖をトリガーする細胞周期調節因子の活性化である。ＥｄＵパルス標識によるＣＤ１７７＋から誘導されたＰＰ、ＣＤ２７５＋から誘導されたＰＰ、及びＣＸＣＲ４＋から誘導されたＰＰにおける細胞増殖の評価は、ＣＤ１７７＋から誘導されたＰＰの約１５％が、ＥｄＵ陽性であり、比較してＣＤ２７５＋から誘導されたＰＰでは５０％、ＣＸＣＲ４＋から誘導されたＰＰでは６０％であったことが明らかとなった（図１１Ｅ、Ｆ）。膵分化の初期段階の間のＮＧＮ３の抑制は、インシュリンとグルカゴンとを発現している多ホルモン性細胞の生成を低減させるのに必須である３９。したがって、本発明者らは、Ｓ４のＣＤ１７７＋から誘導されたＰＰ、ＣＤ２７５＋から誘導されたＰＰ、及びＣＸＣＲ４＋から誘導されたＰＰ、並びにＳ５の内分泌前駆細胞（ＥＰ）における、ＮＧＮ３ ｍＲＮＡの誘導について確認した。ＮＧＮ３ ｍＲＮＡは、二次元培養液中のＣＸＣＲ４＋から誘導されたＰＰ２及びＥＰ、並びにＣＤ２７５＋から誘導されたＰＰ２及びＥＰと比較したところ、ＣＤ１７７＋から誘導されたＰＰ２において緊密に調節され、ＣＤ１７７＋から誘導されたＳ５のＥＰにおいて非常に効率的に誘導されていた（図１１Ｇ）。
【０１３６】
実施例９：ＣＤ１７７＋前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）は、幹細胞（ＳＣ）から誘導されたβ様細胞を効率的に生成する
ＣＤ１７７＋の濃縮された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）が、幹細胞（ＳＣ）から誘導されたβ様細胞をより効率的に生成するかどうかを決定するために、本発明者らは、ＭＡＣＳにより濃縮された胚性内胚葉（ＤＥ）及び前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）をＳ６のＩＮＳ＋／ＮＫＸ６．１＋細胞へと分化させた（図５Ａ）。ＣＸＣＲ４＋の濃縮された胚性内胚葉（ＤＥ）及びＤ２７５＋の濃縮された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）は、Ｓ６において、膵及び内分泌マーカー遺伝子のＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＮＥＵＲＯＤ１の同じように低いｍＲＮＡレベルを発現したので（図１２Ａ）、本発明者らは、ＣＤ１７７＋の濃縮された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）を、ＣＸＣＲ４＋の濃縮された混合胚性内胚葉（ＤＥ）と比較することを決めた。重要なβ細胞マーカー遺伝子、例えばＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ２．２のｍＲＮＡ転写物は、ＣＤ１７７＋から誘導されたβ様細胞において比較的高かった（図１２Ａ、Ｇ）。約６５％のＣＤ１７７＋から誘導されたβ様細胞及びＣＸＣＲ４＋から誘導されたβ様細胞は、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１タンパク質の両方を合成した（図１２Ｂ、Ｄ）。ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１のタンパク質レベルは異なっていなかったが、本発明者らは、ＩＮＳ及びＧＣＧのホルモンのｍＲＮＡ転写物の顕著な差に気付いた（図１２Ｈ）。ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の同等な効力が、ＣＸＣＲ４＋から誘導されたβ様細胞と、ＣＤ１７７＋から誘導されたβ様細胞との間に観察されたが、Ｃペプチド＋／ＰＤＸ１＋細胞及びＩＮＳ＋／ＮＫＸ６．１＋細胞の発現は、ＣＸＣＲ４＋から誘導されたβ様細胞において減少していた（図１２Ｃ〜Ｆ）。Ｓ６において、約１３．２％のＣＤ１７７＋から誘導されたβ様細胞、及び１０．１％のＣＸＣＲ４＋から誘導されたβ様細胞は多ホルモン性細胞であった（図１２Ｄ、Ｉ）。
【０１３７】
実施例１０：ＣＤ１７７＋の濃縮された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）は、インビトロにおいてより多くのβ様細胞を生成する
続いて、本発明者らは、分化の初期段階の最中に前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）前駆細胞の濃縮が、分化、成熟、及び機能を改善したかどうかを決定した。極性及びコンパクトさの確立は、β様細胞の成熟に重要な役割を果たしているので、本発明者らは、選別された細胞の２次元培養対３次元培養が、膵分化中の重要な転写因子であるＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の誘導及び発現に影響を及ぼすかどうかを試験することを決定した。それ故、本発明者らは、ＣＤ１７７＋胚性内胚葉（ＤＥ）／前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）細胞及びＣＸＣＲ４＋胚性内胚葉（ＤＥ）／前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）細胞を選別し、これらを、２次元接着培養液中で又は再凝集後に３次元クラスター中でのいずれかで、膵前駆細胞へとさらに分化させた（図１３Ａ）。選別された及び分化した胚性内胚葉（ＤＥ）／前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の亜個体群から誘導されたＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋ＰＰ２の量の間に明白な差は認められなかったが、本発明者らは、３次元培養液中のＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋二重陽性ＰＰ２の量の僅かな増加を観察した（図１３Ｂ）。したがって、本発明者らは、３次元において濃縮された胚性内胚葉（ＤＥ）／前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の亜個体群から、Ｓ７の幹細胞（ＳＣ）から誘導されたβ様細胞へと分化させることを決断した。このために、本発明者らは、ＣＤ１７７＋内胚葉個体群及びＣＸＣＲ４＋内胚葉個体群を濃縮し、低接着皿上に該細胞を蒔いて再凝集させ３次元クラスターを形成した。Ｓ７への分化は、本発明者らの改変されたプロトコールに基づいて、凝集させた３次元クラスター上で実施された（図１３Ｃ）。興味深いことには、ＣＤ１７７＋前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の前駆細胞におけるβ−カテニンの濃縮に沿った（図４Ｄ）、ＣＤ１７７＋から誘導されたβ様３次元クラスターにおける、所定のＥ−カドヘリン陽性（ＣＡＤ＋）接着接合部を有する濃密でコンパクトな凝集物の形成が観察された（図１３Ｄ）。まず、ＣＤ１７７＋から誘導されたβ様細胞は、成熟したβ細胞転写因子のＭＡＦＡを発現していることが確認された。ほぼ６０％のＣＤ１７７＋から誘導されたβ様細胞が、ＩＮＳ及びＭＡＦＡを発現していた（図１３Ｆ、Ｈ、Ｊ）。ＣＤ１７７＋から誘導されたβ様細胞では、本発明者らはまた、上昇したレベルのＭＡＦＡ、ＧＬＵＴ１、及びＵＣＮ３ ｍＲＮＡ転写物を発見した（図１３Ｅ）。特に、グルコース輸送体のＧＬＵＴ１及びＵＣＮ３のｍＲＮＡ発現は、ＣＸＣＲ４＋から誘導されたβ様細胞と比較してＣＤ１７７＋から誘導されたβ様細胞において有意により高く、このことは、膵に特殊化された前方胚性内胚葉（ＡＤＥ）の単離が、異質なＣＸＣＲ４＋混合胚性内胚葉（ＤＥ）と比較したところ、より同質なβ様細胞への分化を促進することを意味する（図１３Ｅｅ）。ＦＡＣＳによるタンパク質の定量は、約７０％のＣＤ１７７＋から誘導されたβ様細胞がＧＬＵＴ１及びＩＮＳを発現したことを確認した（図１３Ｆ、Ｋ）。免疫細胞化学データは、ＣＤ１７７から誘導されたβ様細胞の膜におけるＧＬＵＴ１の存在を明らかとし、一方、非常に低いＧＬＵＴ１の発現が、ＣＸＣＲ４＋から誘導されたβ様細胞において認められ、このことは、ＣＤ１７７から誘導されたβ様細��の改善された成熟状態及び機能状態を示す（図１３Ｆ、Ｊ）。最後に、本発明者らは、静的なグルコース刺激性インシュリン分泌（ＧＳＩＳ）によって、ＣＤ１７７＋から誘導されたβ様細胞及びＣＸＣＲ４＋から誘導されたβ様細胞の機能性を試験した。ＣＤ１７７＋から誘導されたβ様細胞は、１６．７mMのグルコースを用いての１時間の静的グルコース刺激時に、明らかに改善された応答を示した（図１３Ｇ）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２Ｅ−１２Ｆ】
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【図１２−３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１４−７】
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【国際調査報告】
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