(57)【要約】  DNAのメチル化を決定する方法が提供される。1つの例示的だが、非限定的な実施形態において、方法は、i)核酸を含む生物学的試料を第1のカラム又はフィルターを含む第1のマトリックス材料に接触させる工程であって、当該マトリックス材料が、当該試料中の核酸を結合させ及び/又は濾過し、これにより、DNAを精製する、工程;ii)結合したDNAを第1のマトリックス材料から溶出し、DNAを変性して、溶出された変性したDNAを生成する工程;iii)溶出されたDNAを亜硫酸水素イオンの存在下で加熱して、脱アミノ化した核酸を生成する工程;iv)当該脱アミノ化した核酸を第2のマトリックス材料を含む第2のカラムに接触させ、当該脱アミノ化した核酸を当該第2のマトリックス材料に結合させる工程;v)脱アミノ化した核酸をアルカリ溶液と接触させて、亜硫酸水素塩で変換された核酸を生成することにより、結合した脱アミノ化した核酸を脱スルホン化する工程、及び/又は同時に溶出し、核酸を脱スルホン化する工程;vi)当該亜硫酸水素塩変換された核酸を当該第2のマトリックス材料から溶出する工程;並びにvii)当該亜硫酸水素塩で変換された核酸上でメチル化特異的PCR及び/又は核酸配列決定、及び/又は高分解能融解解析(HRM)を行い、当該核酸のメチル化を決定する工程を含み、少なくとも工程iv)〜vi)が、単一の反応カートリッジにおいて行われる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸のメチル化状態を決定するためのカートリッジのセットであって:
試料を受け取るチャンバー;
第1のマトリックス材料を含むカラム;
温度制御チャネル又はチャンバー;
試料除去チャンバー;並びに
試薬及び/又はバッファーを含有する複数のチャンバー
を含む第1のカートリッジであって、使用時に、前記チャンバーの少なくとも1つが、亜硫酸水素塩試薬を含有する、第1のカートリッジ;並びに
試料を受け取るチャンバー;
第2のマトリックス材料を含むカラム;
温度制御チャネル又はチャンバー;並びに
試薬及び/又はバッファーを含有する複数のチャンバー
を含む第2のカートリッジであって、使用時に、前記チャンバーの少なくとも1つが、脱スルホン化及び/又は溶出試薬を含有する、第2のカートリッジ
を含む、カートリッジのセット。
【請求項２】
前記第1のカートリッジ中の温度制御チャネル又はチャンバーが、熱サイクリングチャネル又はチャンバーである、請求項1に記載のカートリッジのセット。
【請求項３】
前記第2のカートリッジ中の温度制御チャネル又はチャンバーが、熱サイクリングチャネル又はチャンバーである、請求項1又は2に記載のカートリッジのセット。
【請求項４】
前記亜硫酸水素塩試薬が、亜硫酸水素アンモニウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素セシウム、及びDABSOからなる群から選択される化合物を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載のカートリッジのセット。
【請求項５】
前記亜硫酸水素塩試薬が、亜硫酸水素アンモニウムを含む、請求項4に記載のカートリッジのセット。
【請求項６】
前記亜硫酸水素塩が、亜硫酸酸化を防ぐためのスカベンジャー及び/又は触媒を含む試薬混合物において提供される、請求項1から5のいずれか一項に記載のカートリッジのセット。
【請求項７】
前記亜硫酸水素塩が、Trolox及びヒドロキノンからなる群から選択されるスカベンジャーを含む試薬混合物において提供される、請求項6に記載のカートリッジのセット。
【請求項８】
前記亜硫酸水素塩が、ポリアミンを触媒として含む試薬混合物において提供される、請求項6又は7に記載のカートリッジのセット。
【請求項９】
前記第1のカートリッジが、試料がカートリッジに入れられる時又はそれと近い時に亜硫酸水素塩試薬が加えられるように構成されている、請求項1から8のいずれか一項に記載のカートリッジのセット。
【請求項１０】
亜硫酸水素塩試薬が、前記第1のカートリッジ中の前記複数のチャンバーの1つにおいてコンポーネントとして提供される、請求項1から9のいずれか一項に記載のカートリッジのセット。
【請求項１１】
前記第2のカートリッジ中の複数のチャンバーを含む少なくとも1つのチャンバーが、PCRプライマー、及び/又はPCRプローブ、及び/又はPCRマスターミックスを含有する、請求項1から10のいずれか一項に記載のカートリッジのセット。
【請求項１２】
前記第2のカートリッジが、メチル化特異的PCRプライマー、メチル化特異的PCRプローブ、PCR酵素、及びPCR反応バッファーからなる群から選択される1つ又は複数の試薬を含有する1つ又は複数のチャンバーを含む、請求項1から11のいずれか一項に記載のカートリッジのセット。
【請求項１３】
前記第2のカートリッジが、メチル化特異的PCRプライマー、メチル化特異的PCRプローブ、PCR酵素、及びPCR反応バッファーからなる群から選択される1つ又は複数の試薬を含有する少なくとも2つのチャンバーを含有する、請求項12に記載のカートリッジのセット。
【請求項１４】
前記第2のカートリッジが、変換されたDNAのフォワード鎖のメチル化の検出のためのプライマー及びプローブを含有する少なくとも1つのチャンバーを含有する、請求項1から13のいずれか一項に記載のカートリッジのセット。
【請求項１５】
前記第2のカートリッジが、変換されたDNAのリバース鎖のメチル化の検出のためのプライマー及びプローブを含有する少なくとも1つのチャンバーを含有する、請求項1から14のいずれか一項に記載のカートリッジのセット。
【請求項１６】
前記PCRプライマー、及び/又はプローブ、及び/又は酵素が、ビーズとして提供される、請求項12から15のいずれかに記載のカートリッジのセット。
【請求項１７】
前記第2のカートリッジが、Table 5(表5)、Table 11(表11)、若しくはTable 12(表12)に示される1つ又は複数のプライマー、及び/或いはTable 5(表5)、Table 11(表11)、若しくはTable 12(表12)に示される1つ又は複数のプローブを含有する、請求項1から16のいずれか一項に記載のカートリッジのセット。
【請求項１８】
前記第2のカートリッジが、ネステッドPCR反応を使用してMGMTのメチル化を決定するための次のプローブ及びプライマー:
ヌクレオチド配列GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT(配列番号:263)を含む外部フォワードプライマー(248b);
ヌクレオチド配列:AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC(配列番号:265)を含む外部リバースプライマー(249b);
ヌクレオチド配列TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC(配列番号:266)を含む内部フォワードプライマー(250);
ヌクレオチド配列GCACTCTTCCGAAAACGAAACG(配列番号:267)を含む内部リバースプライマー(251);及び
ヌクレオチド配列  蛍光-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-ブロッカー(配列番号:268)を含むプローブ(252a)
を含有する、請求項17に記載のカートリッジのセット。
【請求項１９】
前記第2のカートリッジが、ネステッドPCR反応を使用してACTB(例えば、対照として)のメチル化を決定するための次のプローブ及びプライマー:
ヌクレオチド配列GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT(配列番号:103)を含む外部フォワードプライマー(102);
ヌクレオチド配列CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(配列番号:104)を含む外部リバースプライマー(103);
ヌクレオチド配列GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG(配列番号:149)を含む内部フォワードプライマー(148);
ヌクレオチド配列CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC(配列番号:150)を含む内部リバースプライマー(149);及び
ヌクレオチド配列  蛍光-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-ブロッカー(配列番号:179)を含むプローブ(178)
を含有する、請求項17又は18に記載のカートリッジのセット。
【請求項２０】
生物学的試料において核酸のメチル化を決定するためのシステムであって:
1つ又は複数の試料処理モジュールを含有するように構成されたエンクロージャーを含み、それぞれの試料処理モジュールが、請求項1〜19のいずれか一項に記載のカートリッジの前記セットの、取り外し可能なカートリッジである第1のカートリッジ及び/又は第2のカートリッジを保持するように構成され;
前記システムが、カートリッジの前記セットの第1のカートリッジを操作して、前記第1のカートリッジに導入された試料において核酸の亜硫酸水素塩変換を行うために、試料処理モジュールを操作して試料処理を行うよう、並びに/又は
対応する取り外し可能な試料カートリッジ内の1つ又は複数の標的核酸の脱スルホン化を行うよう、及びメチル化を決定するよう
構成される、システム。
【請求項２１】
核酸のメチル化状態を決定する方法であって:
請求項1から19のいずれか一項に記載のカートリッジのセットにおける第1のカートリッジの試料チャンバーにおいて生物学的試料を用意する工程;及び前記第1のカートリッジを操作して、
前記試料中のDNAを前記第1のマトリックス材料に結合させ;
結合したDNAを洗浄し;
結合したDNAをマトリックス材料から溶出し;
溶出したDNAを前記亜硫酸水素塩試薬と組合せ; 
前記温度制御チャネル又はチャンバーにおいてDNAと亜硫酸水素塩試薬の混合物を加熱して、前記DNAの亜硫酸水素塩変換を行い;
亜硫酸水素塩で変換されたDNAを前記第1のカートリッジの試料除去チャンバーに移す
工程を含む方法。
【請求項２２】
請求項1から19のいずれか一項に記載のカートリッジのセットにおける第2のカートリッジの試料チャンバーにおいて亜硫酸水素塩で変換されたDNAを用意する工程;及び前記第2のカートリッジを操作して、
前記亜硫酸水素塩変換されたDNAを前記第2のマトリックス材料に結合させ;
結合した亜硫酸水素塩で変換されたDNAを洗浄し;
洗浄された亜硫酸水素塩で変換されたDNAを前記第2のマトリックス材料から溶出し; 
亜硫酸水素塩変換されたDNAを脱スルホン化する
工程を更に含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記第2のカートリッジが、脱スルホン化前に、亜硫酸水素塩で変換されたDNAを前記第2のマトリックス材料から溶出するよう操作される、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記第2のカートリッジが、脱スルホン化後又はその最中に、亜硫酸水素塩で変換されたDNAを前記第2のマトリックス材料から溶出するよう操作される、請求項22に記載の方法。
【請求項２５】
前記第2のカートリッジを操作して、前記変換された核酸上でメチル化特異的PCR及び/又は核酸配列決定、及び/又は高分解能融解解析(HRM)を行い、前記核酸のメチル化を決定する工程を含む、請求項22から24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
対象において癌又は癌の素因を検出する方法であって:
前記対象由来の生物学的試料を用意する工程であって、前記生物学的試料はDNAを含む、工程;
請求項1から19のいずれか一項に記載のカートリッジのセットを利用する工程を含み、カートリッジの前記セットの前記第1のカートリッジを使用して、前記DNAの亜硫酸水素塩変換が行われ;カートリッジの前記セットの前記第2のカートリッジを使用して、変換されたDNAが脱スルホン化され、メチル化状態が癌についてのマーカーである前記DNAにおける1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化が検出され、前記1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化における増大が、癌若しくは癌の素因の存在又は癌若しくは前癌の段階の指標である、方法。
【請求項２７】
DNAメチル化を決定するためのキットであって、
請求項1から19のいずれか一項に記載のカートリッジのセットの第1のカートリッジ及び/又は第2のカートリッジを含有する容器を含むキット。
【請求項２８】
前記カートリッジ又はカートリッジと離れた容器において変換試薬を含む、請求項27に記載のキット。
【請求項２９】
カートリッジと離れた容器において前記変換試薬を含む、請求項28に記載のキット。
【請求項３０】
カートリッジのチャンバーにおいて提供される前記変換試薬を含む、請求項28に記載のキット。
【請求項３１】
前記変換試薬が、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素セシウム、亜硫酸水素アンモニウム、及びDABSOからなる群から選択される化合物を含む、請求項28から30のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2016年12月12日に出願した先の米国仮出願第62/433,165号の優先権を主張し、それは、参照により全体が取り込まれる。
【背景技術】
【０００２】
高等真核生物のゲノムは、修飾されたヌクレオシド5-メチルシトシン(5-meC)を含有する。この修飾は、通常、インタクトな2重らせんからの標的シトシンのフリッピング及びメチルトランスフェラーゼ酵素によるS-アデノシルメチオニンからのメチル基の移動を含む反応においてシトシンが5-メチルシトシンに変換されている、ジヌクレオチドCpGの一部として見出される(例えば、Klimasauskasら(1994)、Cell 76:357〜369頁を参照)。この酵素変換は、脊椎動物に存在することが知られたDNAの主要なエピジェネティック修飾であり、正常な胚発生に必須である(例えば、Bird(1992)、Cell 70:5〜8頁;Laird及びJaenisch(1994)、Human Mol. Genet.3:1487〜1495頁;並びにLiら(1992)、Cell 69:915〜926頁を参照)。
【０００３】
真核生物において、DNAメチル化は、ゲノムインプリンティング、染色体不安定性、及びX染色体不活性化のような正常な細胞プロセスを調節する。典型的には、DNAメチル化は、CpGアイランド若しくはショアと名付けられた、遺伝子プロモーター中又は近くのジヌクレオチド5'-CpG-3'部位におけるシトシンの5番目の炭素位置で生じる。メチル化は、転写機構を直接的又はクロマチンリモデリングタンパク質の動員を通じて間接的のいずれかで阻害することにより転写を下方制御することによって遺伝子発現を制御する。染色体メチル化パターンは、胚発生中に動的に変化し、正しいメチル化パターンは、個体の寿命を通じて維持されなければならない。メチル化パターンにおける変化は、加齢と結び付けられ、発癌中に生じる初期の変化のなかには、DNAメチル化におけるエラーがある。したがって、遺伝子プロモーターにおけるメチル化の検出は、とりわけ、癌を有する患者の診断及び/又はモニタリングに重要である。
【０００４】
DNAメチル化を含むエピジェネティックな変化は、どのように遺伝子情報がメッセンジャーRNA(mRNA)に転写されるかを定めるDNA-RNA-タンパク質の軸を妨げる。ゲノムDNAバリエーション、mRNAコピー数とタンパク質レベルの間の相関は、DNAメチル化レベルにより説明され得る。したがって、DNAメチル化レベルと対応する下流のmRNAレベルの同時測定は、エピジェネティックな細胞調節の機序を理解するのに重要であり得る。
【０００５】
メチル化を効率的かつ正確に検出し、定量するためのいくつかの方法が、開発されている。最も一般的な技術は、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換する亜硫酸水素塩変換方法である。変換されると、DNAのメチル化特性は、標準的なPCR技術、配列決定方法等により決定することができる。
【０００６】
亜硫酸水素塩変換及びDNA精製に適したいくつかのDNAメチル化キットが存在する(例えば、Zymo Research社のEZ DNAメチル化(商標)キット)。大抵のキットは、変換前に、いくつかの工程、試薬、及びインキュベーション時間を伴い(一部のキットは、組織又は血漿/血清を出発材料として利用し得るが)精製されたDNAをしばしば必要とする。
【０００７】
典型的には、亜硫酸水素塩変換プロセスは、少なくとも4つの工程:1)DNA変性;2)亜硫酸水素塩インキュベーション;3)DNA精製;及び4)脱スルホン化を必要とする。最後の脱スルホン化工程は、カラム上又は溶液中で完了し、続いてエタノール沈殿され得る。現在、使用者が、プロセス全体、DNA精製、亜硫酸水素塩インキュベーション、脱スルホン化、第2のDNA精製、及びメチル化特異的PCR全てを1つの工程で完了することを可能にするメチル化キットは存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第6,027,998号
【特許文献２】米国特許第6,605,451号
【特許文献３】PCT公開公報第WO97/31256号
【特許文献４】PCT公開公報第WO01/92579
【特許文献５】米国特許第5,830,711号
【特許文献６】米国特許第6,027,889号
【特許文献７】米国特許第5,686,243号
【特許文献８】PCT国際公開第W00056927A3号
【特許文献９】PCT国際公開第W09803673A1号
【特許文献１０】PCT特許公開第WO/2014/052551号
【特許文献１１】米国特許第5,958,349号
【特許文献１２】米国特許第6,403,037号
【特許文献１３】米国特許第6,440,725号
【特許文献１４】米国特許第6,783,736号
【特許文献１５】米国特許第6,818,185号
【特許文献１６】米国特許公開第2006/0068399号
【特許文献１７】欧州特許第0070685号
【特許文献１８】米国特許第5,210,015号
【特許文献１９】米国特許第5,538,848号
【特許文献２０】米国特許第6,150,097号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Klimasauskasら、(1994)、Cell76:357〜369頁
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【非特許文献４】Liら、(1992)、Cell69:915〜926頁
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【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書において考慮される様々な実施形態は、次のうちの1つ又は複数を含み得るが、これらに限定されない。
【００１１】
本明細書において考慮される様々な実施形態は、次のうちの1つ又は複数を含むが、これらに限定されない。
【００１２】
実施形態1:核酸のメチル化状態を決定する方法であって:
i)核酸を含む生物学的試料を第1のカラム又はフィルターを含む第1のマトリックス材料に接触させる工程であって、当該マトリックス材料が、当該試料中の核酸と結合及び/又は濾過し、これにより、DNAを精製する、工程;
ii)結合したDNAを第1のマトリックス材料から溶出し、DNAを変性して、溶出された変性したDNAを生成する工程;
iii)溶出されたDNAを亜硫酸水素塩試薬の存在下で加熱して、脱アミノ化された核酸を生成する工程;
iv)当該脱アミノ化された核酸を第2のカラムを含む第2のマトリックス材料に接触させて、当該脱アミノ化された核酸を当該第2のマトリックス材料に結合させる工程;
v)脱アミノ化された核酸をアルカリ溶液と接触させて、変換された(例えば、亜硫酸水素塩で変換された)核酸を生成することにより、結合した脱アミノ化された核酸を脱スルホン化する工程及び/又は核酸を同時に溶出し、脱スルホン化する工程;
vi)当該亜硫酸水素塩変換された核酸を当該第2のマトリックス材料から溶出する工程;並びに
Vii)当該変換された核酸上でメチル化特異的PCR及び/又は核酸配列決定、及び/又は高分解能融解解析(HRM)を行い、当該核酸のメチル化を決定する工程
を含み、少なくとも工程iv)〜vi)が、単一の反応カートリッジにおいて行われる、方法。
【００１３】
実施形態2:少なくとも工程iv)〜vi)が、単一の反応カートリッジにおいて行われる、実施形態1の方法。
【００１４】
実施形態3:少なくとも工程iii)〜vi)が、単一の反応カートリッジにおいて行われる、実施形態1の方法。
【００１５】
実施形態4:少なくとも工程ii)〜vi)が、単一の反応カートリッジにおいて行われる、実施形態1の方法。
【００１６】
実施形態5:少なくとも工程i)〜vi)が、単一の反応カートリッジにおいて行われる、実施形態1の方法。
【００１７】
実施形態6:工程viiが、同じ反応カートリッジにおいて行われる、実施形態1〜5のいずれか1つに記載の方法。
【００１８】
実施形態7:当該第1のマトリックス材料及び当該第2のマトリックス材料が、同じカラムを形成する同じ材料である、実施形態1〜6のいずれか1つに記載の方法。
【００１９】
実施形態8:当該第1のマトリックス材料及び当該第2のマトリックス材料が、異なるカラムを形成する、実施形態1〜7のいずれか1つに記載の方法。
【００２０】
実施形態9:当該メチル化特異的PCRが、行われる場合には、当該カートリッジにおいて行われる、実施形態1〜8の実施形態のいずれか1つに記載の方法。
【００２１】
実施形態10:当該核酸配列決定が、行われる場合には、当該カートリッジ又は当該カートリッジに連結された装置において行われる、実施形態1〜9のいずれか1つに記載の方法。
【００２２】
実施形態11:当該カートリッジが、当該第1のマトリックス材料を含むカラム、試料を受け取るチャンバー、温度制御チャネル又はチャンバー、試薬及び/又はバッファーを含む複数のチャンバーを含み、使用時に、当該チャンバーの少なくとも1つが脱スルホン化/溶出バッファーを含有し、当該カートリッジが、場合により、当該第2のマトリックス材料を含む第2のカラムを含む、実施形態1〜10のいずれか1つに記載の方法。
【００２３】
実施形態12:使用時に、当該チャンバーの少なくとも1つが、亜硫酸水素イオンをもたらす試薬を含有する、実施形態11の方法。
【００２４】
実施形態13:当該第2のカラムが存在しない、実施形態11〜12のいずれか1つに記載の方法。
【００２５】
実施形態14:当該第2のカラムが存在する、実施形態11〜13のいずれか1つに記載の方法。
【００２６】
実施形態15:当該カートリッジが、当該温度制御チャネル若しくはチャンバーに加えて、熱サイクリングチャネル又はチャンバーを含む、実施形態11〜14のいずれか1つに記載の方法。
【００２７】
実施形態16:当該温度制御チャネル又はチャンバーが、熱サイクリングチャネル又はチャンバーである、実施形態11〜14のいずれか1つに記載の方法。
【００２８】
実施形態17:当該カートリッジが、メチル化特異的PCRプライマー、メチル化特異的PCRプローブ、PCR酵素、及びPCR反応バッファーからなる群から選択される1つ又は複数の試薬を含有する1つ又は複数のチャンバーを含む、実施形態11〜16のいずれか1つに記載の方法。
【００２９】
実施形態18:当該カートリッジが、亜硫酸水素塩で変換されたDNAのフォワード鎖のメチル化を検出するための1つ若しくは複数のプライマー及びプローブを含有する1つ又は複数のチャンバーを含む、実施形態17の方法。
【００３０】
実施形態19:当該カートリッジが、亜硫酸水素塩で変換されたDNAのリバース鎖のメチル化を検出するための1つ若しくは複数のプライマー及びプローブを含む1つ又は複数のチャンバーを含む、実施形態17〜18のいずれか1つに記載の方法。
【００３１】
実施形態20:当該試料を受け取るチャンバー、当該カラム、当該複数のチャンバー、及び存在する場合には、当該温度制御チャネル若しくはチャンバー及び/又は熱サイクリングチャネル若しくはチャンバーが、選択的に流体連通にある、実施形態11〜19のいずれか1つに記載の方法。
【００３２】
実施形態21:当該試料を受け取るチャンバー、当該カラム、当該複数のチャンバー、及び存在する場合には、当該熱サイクリングチャネル又はチャンバーが、マイクロ流体チャネル及びバルブにより選択的に流体連通にある、実施形態20の方法。
【００３３】
実施形態22:当該試料を受け取るチャンバー、当該カラム、当該複数のチャンバー、及び存在する場合には、当該熱サイクリングチャネル若しくはチャンバー又は当該熱サイクリングチャネル若しくはチャンバーへのポートが、中心バルブの周囲に設けられ、当該中心バルブ中のチャネルと選択的に流体連通にあり、当該中心バルブが、当該中心バルブと流体連通にあるチャンバーに又はそこから流体を引き出す能力があるプランジャーを収納する、実施形態20の方法。
【００３４】
実施形態23:当該カートリッジが、使用時に:
試料を含有する第1のチャンバー;
グアニジニウムチオシアネート-エタノール(GTC-EtOH)溶液を含有する第2のチャンバー;
亜硫酸水素塩試薬を含有する第3のチャンバー;
バッファーを含有する第4のチャンバー;
リンス溶液を含有する第5のチャンバー;及び
溶出/脱スルホン化試薬を含有する第6のチャンバー
を含む、実施形態11〜22のいずれか1つに記載の方法。
【００３５】
実施形態24:第1のチャンバーが、GTC-EtOH-Tween抽出/沈殿試薬において当該試料を含有する、実施形態23の方法。
【００３６】
実施形態25:GTC-ETOH-Tweenバッファーが、試料がカートリッジに入れられる時又はそれと近い時に加えられる、実施形態23〜24のいずれか1つに記載の方法。
【００３７】
実施形態26:亜硫酸水素塩試薬が、試料がカートリッジに入れられる時又はそれと近い時にカートリッジに加えられる、実施形態23〜25のいずれか1つに記載の方法。
【００３８】
実施形態27:GTC-ETOH-Tweenバッファーが、カートリッジのコンポーネントとして提供される、実施形態23の方法。
【００３９】
実施形態28:亜硫酸水素塩試薬が、カートリッジのコンポーネントとして提供される、実施形態23〜25のいずれか1つに記載の方法。
【００４０】
実施形態29:当該カートリッジが、PCRプライマー及び/又はプローブ及び/又はPCR酵素を含有する第7のチャンバーを含む、実施形態11〜28のいずれか1つに記載の方法。
【００４１】
実施形態30:当該カートリッジが、PCRプライマー及び/又はプローブ及び/又はPCR酵素も含有する第8のチャンバーを含む、実施形態11〜29のいずれか1つに記載の方法。
【００４２】
実施形態31:当該PCRプライマー、及び/又はプローブ、及び/又は酵素が、ビーズとして提供される、実施形態29〜30のいずれか1つに記載の方法。
【００４３】
実施形態32:当該生物学的試料が、細胞、組織、及び核酸を含有する生体体液からなる群から選択される1つ又は複数の試料を含む、実施形態1〜31のいずれか1つに記載の方法。
【００４４】
実施形態33:当該生物学的試料が、全血、血漿、血清、唾液、粘液、尿、痰、膵液、及び脳脊髄液からなる群から選択される生体体液を含む、実施形態32の方法。
【００４５】
実施形態34:当該生物学的試料が、組織試料、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織、新鮮凍結組織、穿刺吸引(FNA)、及びコア生検からなる群から選択される試料を含む、実施形態32の方法。
【００４６】
実施形態35:当該生物学的試料を溶解溶液と接触させる工程を含む、実施形態1〜34のいずれか1つに記載の方法。
【００４７】
実施形態36:当該試料を受け取るチャンバーにおいて当該試料を用意する工程、及び当該試料を抽出/沈殿溶液と接触させる工程を含む、実施形態35の方法。
【００４８】
実施形態37:当該マトリックス材料が、ガラス又はシリカ、イオン交換樹脂、セルロース、及びヒドロキシアパタイトからなる群から選択されるカラム材料を含む、実施形態1〜36のいずれか1つに記載の方法。
【００４９】
実施形態38:当該マトリックス材料がガラスを含む、実施形態37の方法。
【００５０】
実施形態39:当該亜硫酸水素イオンが、亜硫酸水素アンモニウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素セシウム、及びDABSOからなる群から選択される化合物として提供される、実施形態1〜38のいずれか1つに記載の方法。
【００５１】
実施形態40:当該亜硫酸水素イオンが、亜硫酸水素アンモニウムにより提供される、実施形態39の方法。
【００５２】
実施形態41:当該亜硫酸水素塩が、亜硫酸酸化及び/又は触媒を妨げるためのスカベンジャーを含む試薬混合物において提供される、実施形態1〜40のいずれか1つに記載の方法。
【００５３】
実施形態42:当該亜硫酸水素塩が、Trolox及びヒドロキノンからなる群から選択されるスカベンジャーを含む試薬混合物において提供される、実施形態41の方法。
【００５４】
実施形態43:当該亜硫酸水素塩が、ポリアミンを触媒として含む試薬混合物において提供される、実施形態41〜42のいずれか1つに記載の方法。
【００５５】
実施形態44:結合したDNAを溶出する当該工程が、低濃度の水酸化カリウム又は他の塩基を使用して当該DNAを溶出し、変性する工程を含む、実施形態1〜43のいずれか1つに記載の方法。
【００５６】
実施形態45:結合したDNAを溶出する当該工程が、当該DNAをpH約10.5より高いpHを有するアルカリ溶液で溶出し、変性する工程を含む、実施形態44の方法。
【００５７】
実施形態46:結合したDNAを溶出する当該工程が、当該DNAをpH約12より高いpHを有するアルカリ溶液で溶出し、変性する工程を含む、実施形態44の方法。
【００５８】
実施形態47:当該アルカリ溶液が、10〜15mM KOH溶液である、実施形態45〜46の方法。
【００５９】
実施形態48:溶出されたDNAを亜硫酸水素イオンとインキュベートして、脱アミノ化された核酸を生成する当該工程が、DNAを約6M〜約7Mの範囲にある濃度を有する亜硫酸水素アンモニウム溶液においてインキュベートする工程を含む、実施形態1〜47のいずれか1つに記載の方法。
【００６０】
実施形態49:溶出されたDNAを亜硫酸水素イオンとインキュベートして、脱アミノ化された核酸を生成する当該工程が、DNAを約6.5Mの濃度を有する亜硫酸水素アンモニウム溶液においてインキュベートする工程を含む、実施形態48の方法。
【００６１】
実施形態50:当該インキュベート工程が、濃亜硫酸水素塩溶液中のDNAを当該カートリッジ中の温度制御チャネル又はチャンバーに移す工程、及び当該混合物を加熱する工程を含む、実施形態49の方法。
【００６２】
実施形態51:当該インキュベート工程が、濃亜硫酸水素塩溶液を約60℃〜約95℃の温度に熱サイクリングする工程を含む、実施形態50の方法。
【００６３】
実施形態52:当該脱アミノ化された核酸を第2のマトリックス材料に接触させる当該工程が、DNA亜硫酸水素塩溶液を新鮮GTC-EtOHと混合する工程及び溶液を当該第2のマトリックス材料に分注する工程を含む、実施形態1〜51のいずれか1つに記載の方法。
【００６４】
実施形態53:当該第2のマトリックス材料中のDNAを新鮮GTC-EtOH、次に、リンス溶液で洗浄する工程を含む、実施形態52の方法。
【００６５】
実施形態54:当該リンス溶液がPEG200を含む、実施形態53の方法。
【００６６】
実施形態55:結合した脱アミノ化された核酸を脱スルホン化する当該工程が、DNAを当該第2のカラムから高pHの脱スルホン化バッファーで溶出する工程、及び当該溶液をインキュベーションする工程を含む、実施形態1〜54のいずれか1つに記載の方法。
【００６７】
実施形態56:当該インキュベート工程が、約1分間〜約1時間、又は約5分間〜約30分間、又は約10分間〜約20分間、又は約15分間の範囲にある期間である、実施形態55の方法。
【００６８】
実施形態57:当該高pHの脱スルホン化/溶出バッファーがKOHを含む、実施形態55〜56のいずれか1つに記載の方法。
【００６９】
実施形態58:当該インキュベート工程が、当該高pHの脱スルホン化バッファーを既に保持するチャンバー(例えば、チャンバー10)におけるものである、実施形態55〜57のいずれか1つに記載の方法。
【００７０】
実施形態59:亜硫酸水素イオンとのインキュベート後、温度制御チャネル又はチャンバーをバッファーで洗浄して、残りの亜硫酸水素塩を取り除き、pHを中性にする、実施形態1〜58のいずれか1つに記載の方法。
【００７１】
実施形態60:当該亜硫酸水素塩で変換された核酸上での高分解能融解解析(HRM)を行い、当該核酸のメチル化を決定する、実施形態1〜59のいずれか1つに記載の方法。
【００７２】
実施形態61:当該亜硫酸水素塩で変換された核酸の核酸配列決定を行い、当該核酸のメチル化を決定する、実施形態1〜60のいずれか1つに記載の方法。
【００７３】
実施形態62:メチル化特異的PCRを行い、標的核酸配列のメチル化を決定する、実施形態1〜60のいずれか1つに記載の方法。
【００７４】
実施形態63:当該メチル化特異的PCR(MSP)が、メチル化配列に特異的なプライマー及び/又は非メチル化配列に特異的なプライマーを使用して行われる、実施形態62の方法。
【００７５】
実施形態64:当該メチル化特異的PCRが、MethyLightプロトコールを含む、実施形態62の方法。
【００７６】
実施形態65:TaqManPCR反応が、亜硫酸水素塩で変換されたメチル化及び/又は非メチル化配列に特異的なプライマーで行われる、実施形態62に記載の方法。
【００７７】
実施形態66:当該MSPが、増幅されたメチル化配列についてのマーカーである1つ若しくは複数の蛍光プローブ及び/又は増幅された非メチル化配列についてのマーカーである1つ若しくは複数の蛍光プローブを利用する、実施形態62〜65のいずれか1つに記載の方法。
【００７８】
実施形態67:当該蛍光プローブが、プローブが、TaqDNAポリメラーゼの5'から3'へのヌクレアーゼ活性による切断の際にシグナルをもたらす蛍光レポーター色素及びクエンチャー色素を含む、実施形態66の方法。
【００７９】
実施形態68:メチル化シグナルが、目的の増幅された領域中の異なるメチル化領域にそれぞれ特異的な複数のプローブについての合わせたシグナルにより決定される、実施形態66〜67のいずれか1つに記載の方法。
【００８０】
実施形態69:メチル化シグナルが、目的の増幅された領域中の同じメチル化領域に特異的な複数のプローブにより決定される、実施形態66〜67のいずれか1つに記載の方法。
【００８１】
実施形態70:当該複数のプローブが、2、3、4、5、6、7、8、9、10個以上のプローブを含む、実施形態66〜67のいずれか1つに記載の方法。
【００８２】
実施形態71:メチル化シグナルが、目的の増幅された領域において単一のプローブにより決定される、実施形態66〜67のいずれか1つに記載の方法。
【００８３】
実施形態72:当該プローブについては、シンプレックス又はマルチプレックスで実験が行われる、実施形態66〜71のいずれか1つに記載の方法。
【００８４】
実施形態73:当該プローブについては、マルチプレックスフォーマットで実験が行われる、実施形態66〜71のいずれか1つに記載の方法。
【００８５】
実施形態74:当該プローブについては、ネステッドPCR反応として実験が行われる、実施形態66〜73のいずれか1つに記載の方法。
【００８６】
実施形態75:当該PCR反応が、亜硫酸水素塩が反応液に存在するなら、PCR中に亜硫酸水素塩により仲介される切断を経験する亜硫酸水素塩混入制御プローブを含む、実施形態66〜74のいずれか1つに記載の方法。
【００８７】
実施形態76:PCRが、1つ又は複数の変異遺伝子について行われる、実施形態1〜75のいずれか1つに記載の方法。
【００８８】
実施形態77:PCRが、対照としての変換されていないDNAについて行われる、実施形態1〜76のいずれか1つに記載の方法。
【００８９】
実施形態78:PCRが、対照としての変換されたDNAについて行われる、実施形態1〜77のいずれか1つに記載の方法。
【００９０】
実施形態79:PCRが、変換されていないDNAが当該方法の標的である変換されていないDNAについて行われる、実施形態77の方法。
【００９１】
実施形態80:亜硫酸水素塩反応及びPCR反応、又は脱スルホン化反応及びPCR反応、又は亜硫酸水素塩反応、脱スルホン化反応及びPCR反応が、全て同じ反応チューブ又はチャンバーにおいて行われる、実施形態1〜79のいずれか1つに記載の方法。
【００９２】
実施形態81:核酸を含む生物学的試料を第1のマトリックス材料に接触させる当該工程が、RNAを含有する試料を当該第1のマトリックス材料に接触させる工程を含み、当該マトリックス材料が、当該RNAに結合し、これにより、RNAを精製する、実施形態1〜80のいずれか1つに記載の方法。
【００９３】
実施形態82:DNAと実質的に独立して、当該RNAを当該マトリックス材料から溶出する工程を含む、実施形態81の方法。
【００９４】
実施形態83:RNAが、トリス緩衝化溶出を使用して当該第1のマトリックス材料から溶出される、実施形態82の方法。
【００９５】
実施形態84:当該RNAが、溶出され、チャンバーにおいて保存される、実施形態81〜83のいずれか1つに記載の方法。
【００９６】
実施形態85:逆転写(RT)を当該RNA上で行い、qRT-PCRを行い、標的RNA配列のレベルを決定する、実施形態81〜84のいずれか1つに記載の方法。
【００９７】
実施形態86:RNA分画を使用して、亜硫酸水素塩変換された核酸を当該第2のマトリックス材料から溶出し、亜硫酸水素塩で変換されたDNAと混合するか、又は溶出された亜硫酸水素塩で変換されたDNAと混合される、実施形態82〜85のいずれか1つに記載の方法。
【００９８】
実施形態87:RTが、亜硫酸水素塩で変換されたDNAと合わせる前又は後に当該RNA上で行われる、実施形態86の方法。
【００９９】
実施形態88:qRT-PCRを、混合物中のRT RNAについて行い、標的RNA配列のレベルを決定し、メチル化特異的PCRを、混合物上で行い、標的DNA配列のメチル化を決定する、実施形態86〜87のいずれか1つに記載の方法。
【０１００】
実施形態89:メチル化が、MGMT、RASSF1A、ADAMTS1、BNC1、HIST1H3C、HOXB4、RASGRF2、TM6SF1、及びAKR1B1からなる群から選択される遺伝子のプロモーター領域について決定される、実施形態1〜88のいずれか1つに記載の方法。
【０１０１】
実施形態90:RNAの発現レベルが、メチルトランスフェラーゼについて決定される、実施形態81〜89のいずれか1つに記載の方法。
【０１０２】
実施形態91:RNAの発現レベルが、DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B、及びTNMT3Lからなる群から選択されるメチルトランスフェラーゼについて決定される、実施形態90の方法。
【０１０３】
実施形態92:核酸のメチル化状態を決定するためのカートリッジであって、当該カートリッジが、第1のマトリックス材料を含むカラム、試料を受け取るチャンバー、温度制御チャネル若しくはチャンバー、試薬及び/又はバッファーを含有する複数のチャンバーを含み、使用時に、当該チャンバーの少なくとも1つが亜硫酸水素塩試薬を含有し、当該チャンバーの少なくとも1つが脱スルホン化/溶出バッファーを含有し、当該カートリッジが、場合により、当該第2のマトリックス材料を含む第2のカラムを含む、カートリッジ。
【０１０４】
実施形態93:使用時に、グアニジニウムチオシアネートエタノール(GTC-EtOH)を含む試薬を含有するチャンバーを含む、実施形態92のカートリッジ。
【０１０５】
実施形態94:当該第2のカラムが存在しない、実施形態92〜93のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１０６】
実施形態95:当該第2のカラムが存在する、実施形態92〜93のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１０７】
実施形態96:当該温度制御チャネル又はチャンバーが、熱サイクリングチャネル又はチャンバーである、実施形態92〜95のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１０８】
実施形態97:第2の加熱チャネル又はチャンバーを更に含む、実施形態92〜96のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１０９】
実施形態98:当該亜硫酸水素塩試薬が、亜硫酸水素アンモニウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素セシウム、及びDABSOからなる群から選択される化合物を含む、実施形態92〜97のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１１０】
実施形態99:当該亜硫酸水素塩試薬が、亜硫酸水素アンモニウムを含む、実施形態98のカートリッジ。
【０１１１】
実施形態100:当該亜硫酸水素塩が、亜硫酸酸化及び/又は触媒を妨げるためのスカベンジャーを含む試薬混合物において提供される、実施形態92〜99のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１１２】
実施形態101:当該亜硫酸水素塩が、Trolox及びヒドロキノンからなる群から選択されるスカベンジャーを含む試薬混合物において提供される、実施形態100のカートリッジ。
【０１１３】
実施形態102:当該亜硫酸水素塩が、ポリアミンを触媒として含む試薬混合物において提供される、実施形態100〜101のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１１４】
実施形態103:当該第1のマトリックス材料及び/又は当該第2のマトリックス材料が、存在する場合には、ガラス又はシリカ、イオン交換樹脂、及びヒドロキシアパタイトからなる群から選択される材料を含む、実施形態92〜102のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１１５】
実施形態104:メチル化特異的PCRプライマー、メチル化特異的PCRプローブ、PCR酵素、及びPCR反応バッファーからなる群から選択される1つ又は複数の試薬を含有する1つ又は複数のチャンバーを含む、実施形態92〜103のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１１６】
実施形態105:メチル化特異的PCRプライマー、メチル化特異的PCRプローブ、PCR酵素、及びPCR反応バッファーからなる群から選択される1つ又は複数の試薬を含有する少なくとも2つのチャンバーを含有する、実施形態104のカートリッジ。
【０１１７】
実施形態106:変換されたDNAのフォワード鎖のメチル化を検出するためのプライマー及びプローブを含有する少なくとも1つのチャンバーを含有する、実施形態92〜105のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１１８】
実施形態107:変換されたDNAのリバース鎖のメチル化を検出するためのプライマー及びプローブを含有する少なくとも1つのチャンバーを含有する、実施形態92〜106のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１１９】
実施形態108:当該PCRプライマー、及び/又はプローブ、及び/又は酵素が、ビーズとして提供される、実施形態104〜107のいずれかに記載のカートリッジ。
【０１２０】
実施形態109:当該試料を受け取るチャンバー、当該カラム、当該複数のチャンバー、及び当該温度制御された加熱チャネル又はチャンバーが、選択的に流体連通にある、実施形態92〜108のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１２１】
実施形態110:当該試料を受け取るチャンバー、当該カラム、当該複数のチャンバー、及び当該温度制御チャネル又はチャンバーが、マイクロ流体チャネル及びバルブにより選択的に流体連通にある、実施形態109のカートリッジ。
【０１２２】
実施形態111:当該試料を受け取るチャンバー、当該カラム、当該複数のチャンバー、及び当該温度制御チャネル若しくはチャンバー又は当該温度制御チャネル若しくはチャンバーへのポートが、中心バルブの周囲に設けられ、当該中心バルブ中のチャネルと選択的に流体連通にあり、当該中心バルブが、当該中心バルブと流体連通にあるチャンバーに又はそこから流体を引き出す能力があるプランジャーを収納する、実施形態109のカートリッジ。
【０１２３】
実施形態112:使用時に、
試料を含有する第1のチャンバー;
グアニジニウムチオ硫酸エタノール(GTC-EtOH)溶液を含有する第2のチャンバー;
亜硫酸水素塩試薬を含有する第3のチャンバー;
バッファーを含有する第4のチャンバー;
リンス溶液を含有する第5のチャンバー;及び
溶出/脱スルホン化試薬を含有する第6のチャンバー
を含むように構成される、実施形態92〜111のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１２４】
実施形態113:当該第1のチャンバーが、GTC-EtOH-Tween抽出/沈殿試薬において当該試料を含有する、実施形態112のカートリッジ。
【０１２５】
実施形態114:試料がカートリッジに入れられる時又はそれと近い時に、亜硫酸水素塩試薬がカートリッジに加えられるように構成される、実施形態92〜113のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１２６】
実施形態115:亜硫酸水素塩試薬が、カートリッジのコンポーネントとして提供される、実施形態92〜113のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１２７】
実施形態116:試料がカートリッジに入れられる時又はそれと近い時に、GTC-ETOH-Tweenバッファーが添加されるように構成される、実施形態92〜115のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１２８】
実施形態117:GTC-ETOH-Tweenバッファーが、カートリッジのコンポーネントとして提供される、実施形態92〜115のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１２９】
実施形態118:PCRプライマー及び/又はプローブ及び/又はPCR酵素を含有する第7のチャンバーを含む、実施形態92〜117のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１３０】
実施形態119:PCRプライマー及び/又はプローブ及び/又はPCR酵素を含有する第8のチャンバーも含む、実施形態92〜118のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１３１】
実施形態120:亜硫酸水素塩で変換されたメチル化及び/若しくは非メチル化配列に特異的なプライマーを含有する1つ又は複数のチャンバーを含む、実施形態92〜119のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１３２】
実施形態121:TaqManPCR反応用試薬を含有する1つ又は複数のチャンバーを含む、実施形態92〜120のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１３３】
実施形態122:増幅されたメチル化配列についてのマーカーである1つ若しくは複数の蛍光プローブ、及び/又は増幅された非メチル化配列についてのマーカーである1つ若しくは複数の蛍光プローブを含有する1つ或いは複数のチャンバーを含む、実施形態92〜121のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１３４】
実施形態123:当該プローブが、プローブが、TaqDNAポリメラーゼの5'から3'へのヌクレアーゼ活性による切断の際にシグナルをもたらす蛍光レポーター色素及びクエンチャー色素を含む、実施形態122のカートリッジ。
【０１３５】
実施形態124:目的の増幅された領域中の異なるメチル化領域にそれぞれ特異的な複数のプローブを含む、実施形態122〜123のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１３６】
実施形態125:目的の増幅された領域中のメチル化領域に特異的な単一プローブを含む、実施形態122〜123のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１３７】
実施形態126:目的の増幅された領域中の同じメチル化領域にそれぞれ特異的な複数のプローブを含む、実施形態122〜123のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１３８】
実施形態127:MGMT、RASSF1A、ADAMTS1、BNC1、HIST1H3C、HOXB4、RASGRF2、TM6SF1、及びAKR1B1からなる群から選択される遺伝子のプロモーター領域のメチル化を決定するためのプライマー並びに/又はプローブ含有する、実施形態92〜126のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１３９】
実施形態128:表5、9、若しくは10に示される1つ又は複数のプライマー、及び/或いは表5、9、若しくは10に示される1つ又は複数のプローブを含有する、実施形態92〜126のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１４０】
実施形態129:ネステッドPCR反応を使用してMGMTのメチル化を決定するための次のプローブ及びプライマー:
ヌクレオチド配列GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT(配列番号263)を含む外部フォワードプライマー(248b);
ヌクレオチド配列:AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC(配列番号265)を含む外部リバースプライマー(249b);
ヌクレオチド配列TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC(配列番号266)を含む内部フォワードプライマー(250);
ヌクレオチド配列GCACTCTTCCGAAAACGAAACG(配列番号267)を含む内部リバースプライマー(251);及び
ヌクレオチド配列  蛍光-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-ブロッカー(配列番号268)を含むプローブ(252a)
を含有する、実施形態128のカートリッジ。
実施形態130:ネステッドPCR反応を使用してACTB(例えば、対照として)のメチル化を決定するための次のプローブ及びプライマー:
ヌクレオチド配列:GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT(配列番号103)を含む外部フォワードプライマー(102);
ヌクレオチド配列:CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(配列番号104)を含む外部リバースプライマー(103);
ヌクレオチド配列:GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG(配列番号149)を含む内部フォワードプライマー(148);
ヌクレオチド配列:CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC(配列番号150)を含む内部リバースプライマー(149);及び
ヌクレオチド配列:蛍光-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-ブロッカー(配列番号179)を含むプローブ(178)
を含有する、実施形態128〜129のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１４１】
実施形態131:メチルトランスフェラーゼについてのRNAの発現レベルの決定用に構成される、実施形態92〜130のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１４２】
実施形態132:当該メチルトランスフェラーゼが、DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B、及びTNMT3Lからなる群から選択される、実施形態131のカートリッジ。
【０１４３】
実施形態133:生物学的試料において核酸のメチル化を決定するためのシステムであって:1つ又は複数の試料処理モジュールを含有するように構成されたエンクロージャーを含み、それぞれの試料処理モジュールが、実施形態92〜132のいずれか1つに記載の取り外し可能なカートリッジを保持するように構成され;試料処理モジュールを操作して、試料処理を行い、1つ又は複数の標的核酸のメチル化を決定する、及び場合により、対応する取り外し可能な試料カートリッジ内の1つ又は複数の標的DNA配列のレベルを決定するように構成され、対応する取り外し可能な試料カートリッジ内の試料上での当該処理が、実施形態1〜91のいずれか1つに記載の方法を行う、システム。
【０１４４】
実施形態134:1つの試料処理モジュールを含有するように構成される、実施形態133のシステム。
【０１４５】
実施形態135:少なくとも2個の試料処理モジュール、又は少なくとも4個の試料処理モジュール、又は少なくとも8個の試料処理モジュール、又は少なくとも12個の試料処理モジュール、又は少なくとも16個の試料処理モジュール、又は少なくとも20個の試料処理モジュール、又は少なくとも24個の試料処理モジュール、又は少なくとも28個の試料処理モジュール、又は少なくとも32個の試料処理モジュール、又は少なくとも64個の試料処理モジュール、又は少なくとも128個の試料処理モジュールを含有するように構成される、実施形態133のシステム。
【０１４６】
実施形態136:当該モジュールが、当該カートリッジ中の温度制御チャンバー若しくはチャネルを加熱するための1つ又は複数の加熱プレートを含む、実施形態133〜135のいずれか1つに記載のシステム。
【０１４７】
実施形態137:当該モジュールが、当該カートリッジ中の温度制御チャネル又はチャンバーを冷却するために構成されたファンを含む、実施形態133〜136のいずれか1つに記載のシステム。
【０１４８】
実施形態138:当該モジュールが、解析用コンピューターに情報(例えば、光情報)を渡すための電気回路を含む、実施形態133〜137のいずれか1つに記載のシステム。
【０１４９】
実施形態139:当該モジュールが、当該カートリッジにおいて反応により生成された1つ又は複数の光学シグナルの励起及び/又は検出をもたらすための光学ブロックを含む、実施形態133〜138のいずれか1つに記載のシステム。
【０１５０】
実施形態140:当該カートリッジを操作して、実施形態1〜91のいずれか1つに記載の方法を行うように構成される、実施形態133〜139のいずれか1つに記載のシステム。
【０１５１】
実施形態141:当該カートリッジを操作して、試料をカラムに結合させ;DNAをカラムから溶出し、当該DNAを変換試薬と合わせ;反応チャンバー若しくはチューブ中のDNA/変換試薬溶液を加熱して、変換されたDNAを生成し;変換されたDNAをカラムに結合させ;DNAを脱スルホン化して、カラムから溶出し;反応チャンバー又はチューブにおいて溶出された脱スルホン化DNA上でPCRを行うように構成される、実施形態133〜139のいずれか1つに記載のシステム。
【０１５２】
実施形態142:当該PCRが、DNA/変換試薬溶液が予め加熱された同じ反応チャンバー又はチューブにおいて行われる、実施形態141のシステム。
【０１５３】
実施形態143:試料調製用カートリッジであって、当該カートリッジが、DNAを結合する親和性マトリックスを含むチャネル又はチャンバー、中心バルブアセンブリの周囲に設けられ当該中心バルブアセンブリと選択的に流体連通にある複数のチャンバーを含み、、当該中心バルブアセンブリが、当該中心バルブと流体連通にあるチャンバーに又はそこから流体を引き出す能力があるプランジャーを収納するように構成されており、当該複数のチャンバーが、試料溶液最大約5ml又は最大約4mlを受け取るように構成されたチャンバー;PEGを含有するチャンバー;GTC-EtOHを含有するチャンバー;アルカリ溶液を含有するチャンバー;及びバッファーを含有するチャンバーを含む、カートリッジ。
【０１５４】
実施形態144:当該複数のチャンバーが、亜硫酸水素塩試薬を含有するチャンバーを更に含む、実施形態143のカートリッジ。
【０１５５】
実施形態145:当該複数のチャンバーが、GTC-エタノール洗浄溶液を含有するチャンバーを含む、実施形態143〜144のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１５６】
実施形態146:当該GTC-エタノール洗浄溶液が、1.25Mグアニジニウムチオシアネート、25mMトリスpH7.0、及び50%エタノールを含む、実施形態145のカートリッジ。
【０１５７】
実施形態147:当該PEGがPEG200を含む、実施形態143〜146のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１５８】
実施形態148:当該アルカリ溶液がKOHを含む、実施形態143〜147のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１５９】
実施形態149:当該バッファーがトリスを含む、実施形態143〜148のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１６０】
実施形態150:当該複数のチャンバーが、1つ若しくは複数のPCRプライマー及び/又はプローブを含むビーズを含有するチャンバーを含む、実施形態143〜149のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１６１】
実施形態151:PEGを含有する当該チャンバーが、PEG約1mlを含有する、実施形態143〜150のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１６２】
実施形態152:アルカリ溶液を含有する当該チャンバーが、溶液約500μLを含有する、実施形態143〜151のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１６３】
実施形態153:GTC-EtOHを含有する当該チャンバーが、GTC-EtOH約2mlを含有する、実施形態143〜152のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１６４】
実施形態154:バッファーを含有する当該チャンバーが、バッファー約2mLを含有する、実施形態143〜153のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１６５】
実施形態155:多量試料調製物(HVSP)用のカートリッジであって、当該カートリッジが、DNAを結合する親和性マトリックスを含むチャネル又はチャンバー、中心バルブアセンブリの周囲に設けられ当該中心バルブアセンブリと選択的に流体連通にある複数のチャンバーを含み、当該中心バルブアセンブリが、当該中心バルブと流体連通にあるチャンバーに又はそこから流体を引き出す能力があるプランジャーを収納するように構成されており、当該複数のチャンバーが、それぞれが、試料溶液最大約4.5mlを受け取るように構成された少なくとも2つの異なるチャンバー;PEGを含有するチャンバー;アルカリ溶液を含有するチャンバー;及びバッファーを含有するチャンバーを含む、カートリッジ。
【０１６６】
実施形態156:当該複数のチャンバーが、それぞれが試料溶液最大4mlを受け取るように構成された少なくとも3つの異なるチャンバーを含む、実施形態155のカートリッジ。
【０１６７】
実施形態157:当該PEGがPEG200を含む、実施形態155〜156のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１６８】
実施形態158:当該塩基性溶液がKOHを含む、実施形態155〜157のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１６９】
実施形態159:当該バッファーがトリスを含む、実施形態155〜158のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１７０】
実施形態160:当該複数のチャンバーが、洗浄溶液を含有するチャンバーを含む、実施形態155〜159のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１７１】
実施形態161:当該洗浄溶液が、1.25Mグアニジニウムチオシアネート、25mMトリスpH7.0、及び50%エタノールを含む、実施形態160のカートリッジ。
【０１７２】
実施形態162:処理された試料の除去用に構成されたチャンバーを含む、実施形態155〜161のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１７３】
実施形態163:当該試料チャンバーが、使用時に、試料溶液、GTC及びイソプロパノールを含有する、実施形態155〜162のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１７４】
実施形態164:当該試料チャンバーが、使用時に、試料溶液、GTC及びイソプロパノールを実質的に等しい体積で含有する、実施形態163のカートリッジ。
【０１７５】
実施形態165:使用時に、試料を受け取るように構成された当該チャンバーのそれぞれに配置された試料溶液4mlを含む、実施形態155〜164のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１７６】
実施形態166:試料の0.5mlから約4mlの間の試料体積に関して実質的に直線的なDNA又はRNA回収率をもたらす、実施形態155〜165のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１７７】
実施形態167:変換試薬を含有するか、又は受け取るように構成される、実施形態155〜166のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０１７８】
実施形態168:使用時に、DNAの亜硫酸水素塩変換を行う、実施形態167のカートリッジ。
【０１７９】
実施形態169:血清又は血漿からDNA試料を調製するための溶解溶液であって:GTC、バッファー、界面活性剤、及び場合により、消泡剤を含む、溶解溶液。
【０１８０】
実施形態170:血清又は血漿用の当該溶解溶液が、GTC、トリスpH7.0、Tween20、及び消泡剤SE15を含む、実施形態169の溶解溶液。
【０１８１】
実施形態171:血清又は血漿用の当該溶解溶液が、約4.5M GTC、約45mMトリスpH7.0、約1%Tween20、及び約0.01%消泡剤SE15を含む、実施形態170の溶解溶液。
【０１８２】
実施形態172:FFPE試料からDNA試料を調製するための溶解溶液。
【０１８３】
実施形態173:バッファー、界面活性剤、NaCl、MgCl2、キレート剤、消泡剤SE15、及びアジ化ナトリウムを含む、実施形態172の溶解溶液。
【０１８４】
実施形態174:約1%Tween20、約400mM NaCl、約25mM EDTA、約10mM MgCl2、約50mM HEPES pH7.2、約0.01%消泡剤SE15、及び約0.01%アジ化ナトリウムを含む、実施形態173の溶解溶液。
【０１８５】
実施形態175:DNAメチル化を決定するためのキットであって:実施形態92〜136のいずれか1つに記載の核酸のメチル化状態を決定するためのカートリッジを含有する容器を含むキット。
【０１８６】
実施形態176:溶解溶液を含有する容器を更に含む、実施形態175のキット。
【０１８７】
実施形態177:当該溶解溶液が、実施形態169〜171のいずれか1つに記載の血清又は血漿用の溶解溶液である、実施形態176のキット。
【０１８８】
実施形態178:当該溶解溶液が、実施形態172〜174のいずれか1つに記載のFFPE試料用の溶解溶液である、実施形態176のキット。
【０１８９】
実施形態179:プロテアーゼKを含有する容器を含む、実施形態175〜178のいずれか1つに記載のキット。
【０１９０】
実施形態180:当該カートリッジ又はカートリッジと離れた容器において変換試薬を含む、実施形態175〜179のいずれか1つに記載のキット。
【０１９１】
実施形態181:カートリッジと離れた容器において当該変換試薬を含む、実施形態180のキット。
【０１９２】
実施形態182:カートリッジのチャンバーにおいて提供される当該変換試薬を含む、実施形態180のキット。
【０１９３】
実施形態183:当該変換試薬が、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素セシウム、亜硫酸水素アンモニウム、及びDABSOからなる群から選択される化合物を含む、実施形態180〜182のいずれか1つに記載のキット。
【０１９４】
実施形態184:当該変換試薬が亜硫酸水素アンモニウムを含む、実施形態183に記載のキット。
【０１９５】
実施形態185:試料処理試薬を含有する容器を含む、実施形態175〜184のいずれか1つに記載のキット。
【０１９６】
実施形態186:当該試料処理試薬がグアニジウムチオシアネートを含む、実施形態185のキット。
【０１９７】
実施形態187:当該試料処理試薬がエタノールを含む、実施形態185〜186のいずれか1つに記載のキット。
【０１９８】
実施形態188:実施形態155〜166のいずれか1つに記載の試料調製のためのカートリッジを含有する容器を含む、実施形態175〜187のいずれか1つに記載のキット。
【０１９９】
実施形態189:DNAメチル化の決定のための当該カートリッジの使用を教示する教材を含有する、実施形態175〜188のいずれか1つに記載のキット。
【０２００】
実施形態190:癌のメチル化マーカーの検出のためのカートリッジであって、当該カートリッジが、複数のチャンバー及び熱サイクリングチャネル又はチャンバーを含み、当該複数のチャンバー及び当該熱サイクリングチャネル又はチャンバーへのポートが、中心バルブアセンブリの周囲に設けられ、当該中心バルブアセンブリと選択的に流体連通にあり、当該中心バルブアセンブリが、当該中心バルブと流体連通にあるチャンバー若しくはポートに又はそこから流体を引き出す能力があるプランジャーを収納するように構成されており、当該複数のチャンバーが:試料を受け取るチャンバー;亜硫酸水素塩試薬を含有するか若しくは受け取るように構成されたチャンバー;洗浄溶液を含有するチャンバー;トリスバッファーを含有するチャンバー;KOHを含むアルカリ溶液を含有するチャンバー;PCRマスターミックスをもたらすビーズを含有するチャンバー;並びにメチル化状態が癌についてのマーカーである1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有するチャンバーを含む、カートリッジ。
【０２０１】
実施形態191:当該複数のチャンバーが、廃液を受け取るように構成されたチャンバーを含む、実施形態190のカートリッジ。
【０２０２】
実施形態192:当該亜硫酸水素塩試薬が、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素セシウム、亜硫酸水素アンモニウム、及びDABSOからなる群から選択される化合物を含む、実施形態190〜191のいずれかに記載のカートリッジ。
【０２０３】
実施形態193:当該亜硫酸水素塩試薬が、亜硫酸水素アンモニウムを含む、実施形態192のカートリッジ。
【０２０４】
実施形態194:当該洗浄溶液が、1.25M GTC、25mMトリスpH7.0、及び50%エタノールを含む、実施形態190〜193のいずれかに記載のカートリッジ。
【０２０５】
実施形態195:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、メチル化状態が、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、脳癌、及び肺癌からなる群から選択される癌についてのマーカーである1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー並びにプローブをもたらすビーズを含む、実施形態190〜194のいずれかに記載のカートリッジ。
【０２０６】
実施形態196:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、ネステッドPCR反応用のPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態195のカートリッジ。
【０２０７】
実施形態197:当該ネステッドPCRが、変換されたDNAに特異的な第1のPCR反応及びメチル化CpGに特異的な第2のPCR反応を含む、実施形態196に記載のカートリッジ。
【０２０８】
実施形態198:PCRプライマー及びプローブチャンバーをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、変換されたDNAのフォワード鎖のメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する、実施形態190〜197のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０２０９】
実施形態199:PCRプライマー及びプローブチャンバーをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、変換されたDNAのリバース鎖のメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する、実施形態190〜198のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０２１０】
実施形態200:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、RASSF1A、AKR1B1、HOXB4、HIST1H3C、RASGRF2、TM6SF1、BRCA1、BNC1、ADAMTS1、CDO1、SOX17、TAC1、HOXA7、及びMGMTからなる群から選択される1つ又は複数の遺伝子のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー並びにプローブをもたらすビーズを含む、実施形態190〜199のいずれかに記載のカートリッジ。
【０２１１】
実施形態201:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、メチル化状態が膵臓癌についてのマーカーである1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態190〜200のいずれかに記載のカートリッジ。
【０２１２】
実施形態202:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、ADAMTS1及び/又はBNC1のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー並びにプローブをもたらすビーズを含む、実施形態201のカートリッジ。
【０２１３】
実施形態203:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、ADAMTS1のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態202のカートリッジ。
【０２１４】
実施形態204:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、BNC1のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態202〜203のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０２１５】
実施形態205:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、表5若しくは表10に示されるADAMTS1及び/又はBNC1についての1つ又は複数のPCRプライマー並びに/或いはプローブをもたらすビーズを含む、実施形態202のカートリッジ。
【０２１６】
実施形態206:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、メチル化状態が乳癌についてのマーカーである1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態190〜200のいずれかに記載のカートリッジ。
【０２１７】
実施形態207:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、BRCA1、RASSF1A、AKR1B1、HOXB4、HIST1H3C、RASGRF2、及びTM6SF1からなる群から選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、又は全ての遺伝子のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー並びにプローブをもたらすビーズを含む、実施形態206のカートリッジ。
【０２１８】
実施形態208:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、BRCA1のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態207のカートリッジ。
【０２１９】
実施形態209:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、RASSF1Aのプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態207〜208のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０２２０】
実施形態210:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、AKR1B1のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態207〜209のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０２２１】
実施形態211:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、HOXB4のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態207〜210のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０２２２】
実施形態212:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、HIST1H3Cのプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態207〜211のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０２２３】
実施形態213:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、RASGRF2のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態207〜212のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０２２４】
実施形態214:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、TM6SF1のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態207〜213のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０２２５】
実施形態215:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、表5若しくは表9に示される1つ又は複数のPCRプライマー及び/或いは1つ又は複数のPCRプローブをもたらすビーズを含む、実施形態207〜214に記載のカートリッジ。
【０２２６】
実施形態216:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、BRCA1のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態206のカートリッジ。
【０２２７】
実施形態217:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、メチル化状態が肺癌についてのマーカーである1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態190〜200のいずれかに記載のカートリッジ。
【０２２８】
実施形態218:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、CDO1、SOX17、TAC1、及びHOXA7からなる群から選択される1つ、2つ、3つ、又は全ての遺伝子のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー並びにプローブをもたらすビーズを含む、実施形態217のカートリッジ。
【０２２９】
実施形態219:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、CDO1のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態218のカートリッジ。
【０２３０】
実施形態220:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、SOX17のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態218〜219のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０２３１】
実施形態221:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、TAC1のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態218〜220のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０２３２】
実施形態222:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、HOXA7のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態218〜221のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０２３３】
実施形態223:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、メチル化状態が脳癌についてのマーカーである1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態190〜200のいずれかに記載のカートリッジ。
【０２３４】
実施形態224:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、MGMTのプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態223のカートリッジ。
【０２３５】
実施形態225:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、表5若しくは表10に示されるMGMTについての1つ又は複数のPCRプライマー並びに/或いはプローブをもたらすビーズを含む、実施形態224のカートリッジ。
【０２３６】
実施形態226:ネステッドPCR反応を使用してMGMTのメチル化を決定するための次のプローブ及びプライマー:
ヌクレオチド配列GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT(配列番号263)を含む外部フォワードプライマー(248b);
ヌクレオチド配列AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC(配列番号265)を含む外部リバースプライマー(249b);
ヌクレオチド配列TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC(配列番号266)を含む内部フォワードプライマー(250);
ヌクレオチド配列GCACTCTTCCGAAAACGAAACG(配列番号267)を含む内部リバースプライマー(251);及び
ヌクレオチド配列  蛍光-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-ブロッカー(配列番号268)を含むプローブ(252a)
を含有する、実施形態225のカートリッジ。
【０２３７】
実施形態227:ネステッドPCR反応を使用してACTB(例えば、対照として)のメチル化を決定するための次のプローブ及びプライマー:
ヌクレオチド配列GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT(配列番号103)を含む外部フォワードプライマー(102);
ヌクレオチド配列CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(配列番号104)を含む外部リバースプライマー(103);
ヌクレオチド配列GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG(配列番号149)を含む内部フォワードプライマー(148);
ヌクレオチド配列CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC(配列番号150)を含む内部リバースプライマー(149);及び
ヌクレオチド配列  蛍光-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-ブロッカー(配列番号179)を含むプローブ(178)
を含有する、実施形態225〜226のいずれか1つに記載のカートリッジ。
【０２３８】
実施形態228:cfDNAの試料を血清又は血漿から調製する方法であって:
血清又は血漿のプロテアーゼKで処理した試料を実施形態169〜171のいずれか1つに記載の溶解溶液及びアルコールと合わせて、試料溶液を形成する工程;
当該試料溶液を実施形態143〜154のいずれか1つに記載のカートリッジ中の試料を受け取るチャンバー、又は実施形態155〜168のいずれか1つに記載のカートリッジ中の試料を受け取るチャンバーにロードする工程;並びに
当該カートリッジを操作して、当該試料中のDNAを当該親和性マトリックスに結合させ、次に、当該DNAを洗浄し、当該マトリックスから放出させる工程
を含む方法。
【０２３９】
実施形態229:血清又は血漿のプロテアーゼKで処理した試料を合わせる当該工程が、プロテアーゼKで処理した血清又は血漿約1.3ml、溶解溶液2.2mL;及びアルコール約1.5mlに対応する比率の当該試料、溶解溶液、並びにアルコールを合わせる工程を含む、実施形態228の方法。
【０２４０】
実施形態230:当該アルコールがイソプロパノールを含む、実施形態228〜229のいずれか1つに記載の方法。
【０２４１】
実施形態231:当該試料が血清を含む、実施形態228〜230のいずれか1つに記載の方法。
【０２４２】
実施形態232:当該試料が血漿を含む、実施形態228〜231のいずれか1つに記載の方法。
【０２４３】
実施形態233:当該試料が血清を含む、実施形態228〜232のいずれか1つに記載の方法。
【０２４４】
実施形態234:当該カートリッジを操作する工程が、実施形態133〜139のいずれか1つに記載のシステムにおいて当該カートリッジを試料処理モジュールに導入する工程を含む、実施形態228〜233のいずれか1つに記載の方法。
【０２４５】
実施形態235:当該カートリッジを操作して、メチル化検出のための当該DNAを変換する工程を更に含む、実施形態228〜234のいずれか1つに記載の方法。
【０２４６】
実施形態236:当該カートリッジを操作して、当該DNA若しくは変換されたDNAを鋳型として使用する1つ又は複数のPCR反応を行う工程を更に含む、実施形態228〜235のいずれか1つに記載の方法。
【０２４７】
実施形態237:当該ロードする工程が、当該試料溶液を、実施形態155〜165のいずれか1つに記載のカートリッジ中の1つ又は複数の試料を受け取るチャンバーにロードする工程を含む、実施形態228〜234のいずれか1つに記載の方法。
【０２４８】
実施形態238:放出されたDNAをメチル化検出及び/又はPCR用の第2のカートリッジに移す工程を更に含む、実施形態237の方法。
【０２４９】
実施形態239:当該第2のカートリッジが、実施形態92〜132のいずれか1つに記載のカートリッジである、実施形態238の方法。
【０２５０】
実施形態240:当該第2のカートリッジを操作して、当該DNAをメチル化検出のため変換する工程を更に含む、実施形態238〜239のいずれか1つに記載の方法。
【０２５１】
実施形態241:当該第2のカートリッジを操作して、当該DNA若しくは変換されたDNAを鋳型として使用する1つ又は複数のPCR反応を行う工程を更に含む、実施形態238〜240のいずれか1つに記載の方法。
【０２５２】
実施形態242:当該第2のカートリッジを操作する当該工程が、実施形態133〜139のいずれか1つに記載のシステムにおいて当該第2のカートリッジを試料処理モジュールに導入する工程を含む、実施形態238〜241のいずれか1つに記載の方法。
【０２５３】
実施形態243:DNAをFFPE試料から調製する方法であって:
ホルマリン固定したパラフィン包埋試料を実施形態172〜174のいずれか1つに記載の溶解溶液と合わせる工程;
当該試料を含有する当該溶解溶液を加熱する工程;アルコールを当該試料に加えて、試料溶液を形成する工程;当該試料溶液を実施形態143〜154のいずれか1つに記載のカートリッジ中の試料を受け取るチャンバー、又は実施形態155〜168のいずれか1つに記載のカートリッジ中の試料を受け取るチャンバーにロードする工程;並びに
当該カートリッジを操作して、当該試料中のDNAを当該親和性マトリックスに結合させ、次に、当該DNAを洗浄し、当該マトリックスから放出させる工程
を含む方法。
【０２５４】
実施形態244:当該加熱工程が、プロテアーゼKを当該試料に加える工程、及び当該試料を加熱する工程を含む、実施形態243の方法。
【０２５５】
実施形態245:当該加熱工程が、プロテアーゼK約50μLをFFPE試料を含有するFFPE溶解溶液約1.2mLに加える工程を含む、実施形態244の方法。
【０２５６】
実施形態246:当該加熱工程が、当該溶解溶液を約50℃〜約60℃の範囲にある温度まで加熱する工程を含む、実施形態243〜245のいずれか1つに記載の方法。
【０２５７】
実施形態247:当該加熱工程が、当該溶解溶液を約56℃の温度まで加熱する工程を含む、実施形態246に記載の方法。
【０２５８】
実施形態248:当該加熱工程が、最大約4時間、又は最大約5時間、又は最大約6時間の範囲にある期間である、実施形態243〜247のいずれか1つに記載の方法。
【０２５９】
実施形態249:当該加熱が約4時間である、実施形態248の方法。
【０２６０】
実施形態250:当該アルコールがエタノールを含む、実施形態243〜249のいずれか1つに記載の方法。
【０２６１】
実施形態251:約1:1の溶解溶液:アルコールの体積比のアルコールを当該溶解溶液に加える工程を含む、実施形態243〜250のいずれか1つに記載の方法。
【０２６２】
実施形態252:当該カートリッジを操作する工程が、実施形態133〜139のいずれか1つに記載のシステムにおいて当該カートリッジを試料処理モジュールに導入する工程を含む、実施形態243〜251のいずれか1つに記載の方法。
【０２６３】
実施形態253:当該カートリッジを操作して、メチル化検出のため当該DNAを変換する工程を更に含む、実施形態243〜252のいずれか1つに記載の方法。
【０２６４】
実施形態254:当該カートリッジを操作して、当該DNA若しくは変換されたDNAを鋳型として使用する1つ又は複数のPCR反応を行う工程を更に含む、実施形態243〜253のいずれか1つに記載の方法。
【０２６５】
実施形態255:当該ロードする工程が、当該試料溶液を、実施形態155〜165のいずれか1つに記載のカートリッジ中の1つ又は複数の試料を受け取るチャンバーにロードする工程を含む、実施形態243〜251のいずれか1つに記載の方法。
【０２６６】
実施形態256:放出されたDNAをメチル化検出及び/又はPCR用の第2のカートリッジに移す工程を更に含む、実施形態255の方法。
【０２６７】
実施形態257:当該第2のカートリッジが、実施形態92〜132のいずれか1つに記載のカートリッジである、実施形態256の方法。
【０２６８】
実施形態258:当該第2のカートリッジを操作して、当該DNAをメチル化検出のため変換する工程を更に含む、実施形態256〜257のいずれか1つに記載の方法。
【０２６９】
実施形態259:当該第2のカートリッジを操作して、当該DNA若しくは変換されたDNAを鋳型として使用する1つ又は複数のPCR反応を行う工程を更に含む、実施形態256〜258のいずれか1つに記載の方法。
【０２７０】
実施形態260:当該第2のカートリッジを操作する当該工程が、実施形態133〜139のいずれか1つに記載のシステムにおいて当該第2のカートリッジを試料処理モジュールに導入する工程を含む、実施形態256〜259のいずれか1つに記載の方法。
【０２７１】
実施形態261:対象において癌を検出する、及び/又は癌の進行度診断する、及び/又は癌の素因を検出する方法であって:
当該対象由来の生物学的試料を用意する工程であって、当該生物学的試料はDNAを含む、工程;
当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化における増大が、癌若しくは癌の素因の存在又は癌若しくは前癌の進行度の指標である場合、請求項190〜225のいずれか1項に記載のカートリッジを利用して、メチル化状態が癌のマーカーである当該DNA中の1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出する工程
を含む方法。
【０２７２】
実施形態262:当該対象がヒトである、実施形態261の方法。
【０２７３】
実施形態263:当該癌が、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、脳癌、肺癌、B細胞リンパ腫、気管支癌、結腸直腸の癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳又は中枢神経系の癌、末梢神経系の癌、食道癌、頸部の癌、メラノーマ、子宮又は子宮内膜癌、口腔又は咽頭の癌、肝臓癌、腎臓癌、胆道癌、小腸又は虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、脂肪肉腫、精巣癌、及び悪性線維性組織球腫からなる群から選択される癌である、実施形態261〜262のいずれか1つに記載の方法。
【０２７４】
実施形態264:当該癌が、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、脳癌、肺癌からなる群から選択される癌である、実施形態261〜262のいずれか1つに記載の方法。
【０２７５】
実施形態265:当該試料が、血清又は血漿からの試料を含む、実施形態261〜264のいずれか1つに記載の方法。
【０２７６】
実施形態266:当該試料がFFPE試料を含む、実施形態261〜264のいずれか1つに記載の方法。
【０２７７】
実施形態267:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、RASSF1A、AKR1B1、HOXB4、HIST1H3C、RASGRF2、TM6SF1、BRCA1、BNC1、ADAMTS1、CDO1、SOX17、TAC1、HOXA7、及びMGMTからなる群から選択される1つ又は複数の遺伝子のプロモーターを含む、実施形態261〜266のいずれか1つに記載の方法。
【０２７８】
実施形態268:当該癌が膵臓癌であり、当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、ADAMTS1、及びBNC1からなる群から選択される1つ、2つ、3つ、又は4つの遺伝子のプロモーターを含む、実施形態261〜266のいずれか1つに記載の方法。
【０２７９】
実施形態269:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、ADAMTS1のプロモーターを含む、実施形態268の方法。
【０２８０】
実施形態270:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、BNC1のプロモーターを含む、実施形態268〜269のいずれか1つに記載の方法。
【０２８１】
実施形態271:当該癌が乳癌であり、当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、BRCA1、RASSF1A、AKR1B1、HOXB4、HIST1H3C、RASGRF2、及びTM6SF1からなる群から選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は全ての遺伝子のプロモーターを含む、実施形態261〜266のいずれか1つに記載の方法。
【０２８２】
実施形態272:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、BRCA1のプロモーターを含む、実施形態271の方法。
【０２８３】
実施形態273:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、RASSF1Aのプロモーターを含む、実施形態271〜272のいずれか1つに記載の方法。
【０２８４】
実施形態274:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、AKR1B1のプロモーターを含む、実施形態271〜273のいずれか1つに記載の方法。
【０２８５】
実施形態275:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、HOXB4のプロモーターを含む、実施形態271〜274のいずれか1つに記載の方法。
【０２８６】
実施形態276:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、HIST1H3Cのプロモーターを含む、実施形態271〜275のいずれか1つに記載の方法。
【０２８７】
実施形態277:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、RASGRF2のプロモーターを含む、実施形態271〜276のいずれか1つに記載の方法。
【０２８８】
実施形態278:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、TM6SF1のプロモーターを含む、実施形態271〜277のいずれか1つに記載の方法。
【０２８９】
実施形態279:当該癌が乳癌であり、当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、BRCA1のプロモーターを含む、実施形態261〜266のいずれか1つに記載の方法。
【０２９０】
実施形態280:当該癌が肺癌であり、当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、CDO1、SOX17、TAC1、及びHOXA7からなる群から選択される1つ、2つ、3つ、又は全ての遺伝子のプロモーターを含む、実施形態261〜266のいずれか1つに記載の方法。
【０２９１】
実施形態281:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、CDO1のプロモーターを含む、実施形態280の方法。
【０２９２】
実施形態282:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、SOX17のプロモーターを含む、実施形態280〜281のいずれか1つに記載の方法。
【０２９３】
実施形態283:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、TAC1のプロモーターを含む、実施形態280〜282のいずれか1つに記載の方法。
【０２９４】
実施形態284:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、HOXA7のプロモーターを含む、実施形態280〜283のいずれか1つに記載の方法。
【０２９５】
実施形態285:当該癌が脳癌であり、当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、MGMTのプロモーターを含む、実施形態261〜266のいずれか1つに記載の方法。
【０２９６】
実施形態286: 5-メチルシトシン残基には実質的に影響を与えずに、DNA中のシトシン残基をウラシルに変換する方法であって:
DNAを含む試料をDABSOと接触させて、当該DNAを変換する工程;
変換されたDNAを脱スルホン化して、シトシン残基がウラシルに変換されるDNAを生成するが、5-メチルシトシン残基は実質的に影響されない、工程
を含む方法。
【０２９７】
実施形態287:当該接触工程が、当該DNAを約2M〜最大約5Mの範囲にある濃度のDABSOと接触させる工程を含む、実施形態286の方法。
【０２９８】
実施形態288:当該接触工程が、当該DNAを約2.5Mの濃度のDABSOと接触させる工程を含む、実施形態286の方法。
【０２９９】
実施形態289:当該DABSOが、アルカリ水溶液中に溶解される、実施形態286〜288のいずれか1つに記載の方法。
【０３００】
実施形態290:当該DABSOが、KOHを含む溶液中に溶解される、実施形態289の方法。
【０３０１】
実施形態291:当該接触工程が、DABSO/DNA溶液を約55℃〜約90℃の範囲にある温度まで加熱する工程を含む、実施形態286〜290のいずれか1つに記載の方法。
【０３０２】
実施形態292:当該DABSOが、DNAと約15分間〜最大約90分間の範囲にある期間反応する、実施形態286〜291のいずれか1つに記載の方法。
【０３０３】
実施形態293:当該脱スルホン化工程が、当該変換されたDNAをアルカリ試薬と接触させる工程を含む、実施形態286〜292のいずれか1つに記載の方法。
【０３０４】
実施形態294:当該アルカリ試薬がKOHを含む、実施形態293の方法。
【０３０５】
実施形態295:当該変換及び/又は脱スルホン化が、カラムに結合したDNA上で行われる、実施形態286〜294のいずれか1つに記載の方法。
【０３０６】
実施形態296:当該変換及び/又は脱スルホン化が、溶液中のDNA上で行われる、実施形態286〜294のいずれか1つに記載の方法。
【０３０７】
実施形態297:DNAメチル化を解析する方法であって:
DNA試料を用意する工程;
実施形態286〜296のいずれか1つの方法に記載の当該試料中のDNAを変換する工程;及び
変換された核酸上でメチル化特異的PCR及び/又は核酸配列決定、及び/又は高分解能融解解析(HRM)を行い、当該核酸のメチル化を決定する工程
を含む方法。
【０３０８】
実施形態298:DNA試料を用意する当該工程が、実施形態228〜234のいずれか1つに記載又は実施形態243〜252のいずれか1つに記載の試料を調製する工程を含む、実施形態297の方法。
【０３０９】
実施形態299:DNAのメチル化状態の検出用キットであって:
DABSOを含む変換試薬を含有する容器;及び
脱スルホン化試薬を含有する容器
を含むキット。
【０３１０】
実施形態300:親和性マトリックスを含むカラムを含む、実施形態299のキット。
【０３１１】
実施形態301:結合バッファーを含有する容器を含む、実施形態299〜300のいずれか1つに記載のキット。
【０３１２】
実施形態302:溶出バッファーを含有する容器を含む、実施形態299〜301のいずれか1つに記載のキット。
【０３１３】
実施形態303:洗浄バッファーを含有する容器を含む、実施形態299〜302のいずれか1つに記載のキット。
【０３１４】
実施形態304:実施形態169〜171のいずれか1つに記載の溶解溶液を含有する容器、及び/又は実施形態172〜174のいずれか1つに記載の溶解溶液を含有する容器を含む、実施形態299〜303のいずれか1つに記載のキット。
【０３１５】
実施形態305:実施形態143〜155のいずれか1つに記載のカートリッジ及び/又は実施形態155〜166のいずれか1つに記載のカートリッジを含む、実施形態299〜304のいずれか1つに記載のキット。
【０３１６】
実施形態306:当該核酸のメチル化状態の決定のため核酸を変換するための当該キットの使用を教示する教材を含む、実施形態299〜305のいずれか1つに記載のキット。
【０３１７】
実施形態307:ネステッドPCR反応を使用してMGMTのメチル化を決定するためのプライマー及びプローブのセットであって、次のプライマー及びプローブ:
ヌクレオチド配列GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT(配列番号263)を含む外部フォワードプライマー;
ヌクレオチド配列AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC(配列番号265)を含む外部リバースプライマー;
ヌクレオチド配列TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC(配列番号266)を含む内部フォワードプライマー;
ヌクレオチド配列GCACTCTTCCGAAAACGAAACG(配列番号267)を含む内部リバースプライマー;及び
ヌクレオチド配列  蛍光-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-ブロッカー(配列番号268)を含むプローブ
を含む、セット。
【０３１８】
実施形態308:ネステッドPCR反応を使用してACTB(例えば、対照として)のメチル化を決定するためのプライマー及びプローブのセットであって、次のプライマー及びプローブ:
ヌクレオチド配列GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT(配列番号103)を含む外部フォワードプライマー(102);
ヌクレオチド配列CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(配列番号104)を含む外部リバースプライマー(103);
ヌクレオチド配列GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG(配列番号149)を含む内部フォワードプライマー(148);
ヌクレオチド配列CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC(配列番号150)を含む内部リバースプライマー(149);及び
ヌクレオチド配列  蛍光-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-ブロッカー(配列番号179)を含むプローブ(178)
を含む、セット。
【０３１９】
実施形態309:実施形態307のプライマー及びプローブ、並びに実施形態308のプライマー及びプローブを含む、対照としてのACTBのメチル化の決定を伴う、ネステッドPCR反応を使用してMGMTのメチル化を決定するためのプライマー及びプローブのセット。
【０３２０】
実施形態310:メチル化特異的PCRを使用してMGMTのメチル化を決定する方法であって:
MGMT遺伝子のプロモーター領域を含有する変換された(例えば、亜硫酸水素塩変換された)DNAを用意する工程;
次のプライマー及びプローブ:
ヌクレオチド配列GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT(配列番号263)を含む外部フォワードプライマー;
ヌクレオチド配列AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC(配列番号265)を含む外部リバースプライマー;
ヌクレオチド配列TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC(配列番号266)を含む内部フォワードプライマー;
ヌクレオチド配列GCACTCTTCCGAAAACGAAACG(配列番号267)を含む内部リバースプライマー;及び
ヌクレオチド配列  蛍光-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-ブロッカー(配列番号268)を含むプローブ
を含むネステッドPCR反応を使用してMGMTメチル化についてメチル化特異的PCRを行う工程;並びに
PCR増幅産物を検出して及び/又は定量して、当該MGMT遺伝子のメチル化の決定をもたらす工程
を含む方法。
【０３２１】
実施形態311:
ACTB遺伝子(例えば、対照として)のプロモーター領域を含有する変換された(例えば、亜硫酸水素塩変換された)DNAを用意する工程;
次のプライマー及びプローブ:
ヌクレオチド配列GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT(配列番号103)を含む外部フォワードプライマー;
ヌクレオチド配列CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(配列番号104)を含む外部リバースプライマー;
ヌクレオチド配列GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG(配列番号149)を含む内部フォワードプライマー;
ヌクレオチド配列CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC(配列番号150)を含む内部リバースプライマー;並びに
ヌクレオチド配列  蛍光-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-ブロッカー(配列番号179)を含むプローブ
を含むネステッドPCR反応を使用してACTBメチル化についてメチル化特異的PCRを行う工程;並びに
PCR増幅産物を検出して、及び/又は定量して、当該ACTB遺伝子のメチル化の決定をもたらす工程
を更に含む、実施形態310の方法。
【０３２２】
実施形態312:MGMTメチル化についての当該メチル化特異的PCR、及びACTBメチル化についての当該メチル化特異的PCRが、単一のマルチプレックスPCR反応において行われる、実施形態310〜311のいずれか1つに記載の方法。
【０３２３】
実施形態313:当該メチル化特異的PCRが、実施形態92〜132のいずれか1つに記載のカートリッジを使用して行われる、実施形態310〜312のいずれか1つに記載の方法。
【０３２４】
実施形態314:MGMT遺伝子のプロモーター領域を含有する変換されたDNAを用意する当該工程が、MGMT遺伝子のプロモーター領域を含有する変換されていないDNAを当該カートリッジに導入する工程、及び当該カートリッジを操作して、変換試薬を使用して当該カートリッジ中の当該DNAを変換する工程を含み;並びに/又はACTB遺伝子のプロモーター領域を含有する変換されたDNAを用意する当該工程が、ACTB遺伝子のプロモーター領域を含有する変換されていないDNAを当該カートリッジに導入する工程、及び当該カートリッジを操作して、変換試薬を使用して当該カートリッジ中の当該DNAを変換する工程を含む、実施形態313の方法。
【０３２５】
実施形態315:当該変換試薬が、亜硫酸水素アンモニウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素セシウム、及びDABSOからなる群から選択される化合物を含む、実施形態314の方法。
【０３２６】
実施形態316:当該カートリッジを操作する当該工程が、当該DNA及び当該変換試薬を、当該ネステッドPCR反応を行うために後に使用される熱サイクリングチャネル又はチャンバーにおいて加熱する工程を含む、実施形態313〜315のいずれか1つに記載の方法。
【０３２７】
実施形態317:核酸のメチル化状態を決定するためのカートリッジのセットであって:
試料を受け取るチャンバー;
第1のマトリックス材料を含むカラム;
温度制御チャネル又はチャンバー;
試料除去チャンバー;並びに
試薬及び/又はバッファーを含有する複数のチャンバー
を含む第1のカートリッジであって、使用時に、当該チャンバーの少なくとも1つが、亜硫酸水素塩試薬を含有する、第1のカートリッジ;並びに
試料を受け取るチャンバー;
第2のマトリックス材料を含むカラム;
温度制御チャネル又はチャンバー;並びに
試薬及び/又はバッファーを含有する複数のチャンバー
を含む第2のカートリッジであって、使用時に、当該チャンバーの少なくとも1つが、脱スルホン化及び/又は溶出試薬を含有する、第2のカートリッジ
を含む、カートリッジのセット。
【０３２８】
実施形態318:当該第1のカートリッジ中の温度制御チャネル又はチャンバーが、熱サイクリングチャネル又はチャンバーである、実施形態317のカートリッジのセット。
【０３２９】
実施形態319:当該第2のカートリッジ中の温度制御チャネル又はチャンバーが、熱サイクリングチャネル又はチャンバーである、実施形態317〜318のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３３０】
実施形態320:当該亜硫酸水素塩試薬が、亜硫酸水素アンモニウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素セシウム、及びDABSOからなる群から選択される化合物を含む、実施形態317〜319のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３３１】
実施形態321:当該亜硫酸水素塩試薬が、亜硫酸水素アンモニウムを含む、実施形態320に記載のカートリッジのセット。
【０３３２】
実施形態322:当該亜硫酸水素塩が、亜硫酸酸化を防ぐためのスカベンジャー及び/又は触媒を含む試薬混合物において提供される、実施形態317〜321のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３３３】
実施形態323:当該亜硫酸水素塩が、Trolox及びヒドロキノンからなる群から選択されるスカベンジャーを含む試薬混合物において提供される、実施形態322のカートリッジのセット。
【０３３４】
実施形態324:当該亜硫酸水素塩が、ポリアミンを触媒として含む試薬混合物において提供される、実施形態322〜323のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３３５】
実施形態325:当該第1のカートリッジが、試料がカートリッジに入れられる時又はそれと近い時に亜硫酸水素塩試薬が加えられるように構成されている、実施形態317〜324のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３３６】
実施形態326:亜硫酸水素塩試薬が、当該第1のカートリッジ中の当該複数のチャンバーの1つにおいてコンポーネントとして提供される、実施形態317〜325のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３３７】
実施形態327:当該第1のマトリックス材料及び/又は当該第2のマトリックス材料が、独立して、ガラス又はシリカ、イオン交換樹脂、及びヒドロキシアパタイトからなる群から選択される材料を含む、実施形態317〜326のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３３８】
実施形態328:当該第1のマトリックス材料が、ガラス繊維を含む、実施形態327のカートリッジのセット。
【０３３９】
実施形態329:当該第2のマトリックス材料がガラス繊維を含む、実施形態327〜328のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３４０】
実施形態330:当該第1のカートリッジが、2つの試料を受け取るチャンバーを含む、実施形態317〜329のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３４１】
実施形態331:当該第2のカートリッジ中の複数のチャンバーを含む少なくとも1つのチャンバーが、PCRプライマー、及び/又はPCRプローブ、及び/又はPCRマスターミックスを含有する、実施形態317〜330のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３４２】
実施形態332:当該カートリッジが使用中のとき、当該第1のカートリッジ中の複数のチャンバーを含むチャンバーが、バッファー中にGTC-EtOHを含有する、実施形態317〜331のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３４３】
実施形態333:当該カートリッジが使用中のとき、当該第2のカートリッジ中の複数のチャンバーを含むチャンバーが、バッファー中のGTC-EtOHを含有する、実施形態317〜332のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３４４】
実施形態334:第1のカートリッジが、試料がカートリッジに入れられる時又はそれと近い時に、バッファー中のGTC-ETOHが添加されるように構成される、実施形態332〜333のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３４５】
実施形態335:バッファー中のGTC-ETOHが、第1のカートリッジの複数のチャンバーを含むチャンバーにおいてコンポーネントとして提供される、実施形態332〜333のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３４６】
実施形態336:第2のカートリッジが、試料がカートリッジに入れられる時又はそれと近い時に、バッファー中のGTC-ETOHが添加されるように構成される、実施形態332〜335のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３４７】
実施形態337:バッファー中のGTC-ETOHが、第2のカートリッジの複数のチャンバーを含むチャンバーにおいてコンポーネントとして提供される、実施形態332〜336のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３４８】
実施形態338:当該第2のカートリッジが、メチル化特異的PCRプライマー、メチル化特異的PCRプローブ、PCR酵素、及びPCR反応バッファーからなる群から選択される1つ又は複数の試薬を含有する1つ又は複数のチャンバーを含む、実施形態317〜337のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３４９】
実施形態339:当該第2のカートリッジが、メチル化特異的PCRプライマー、メチル化特異的PCRプローブ、PCR酵素、及びPCR反応バッファーからなる群から選択される1つ又は複数の試薬を含有する少なくとも2つのチャンバーを含有する、実施形態338のカートリッジのセット。
【０３５０】
実施形態340:当該第2のカートリッジが、変換されたDNAのフォワード鎖のメチル化の検出のためのプライマー及びプローブを含有する少なくとも1つのチャンバーを含有する、実施形態317〜339のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３５１】
実施形態341:当該第2のカートリッジが、変換されたDNAのリバース鎖のメチル化の検出のためのプライマー及びプローブを含有する少なくとも1つのチャンバーを含有する、実施形態317〜340のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３５２】
実施形態342:当該PCRプライマー、及び/又はプローブ、及び/又は酵素が、ビーズとして提供される、実施形態338〜341のいずれかに記載のカートリッジのセット。
【０３５３】
実施形態343:
当該第1のカートリッジにおいて、当該試料を受け取るチャンバー、当該カラム、当該複数のチャンバー、当該試料除去チャンバー、及び当該温度制御された加熱チャネル若しくはチャンバーが、選択的に流体連通にあり;並びに/又は
当該第2のカートリッジにおいて、当該試料を受け取るチャンバー、当該カラム、当該複数のチャンバー、及び当該温度制御された加熱チャネル若しくはチャンバーが、選択的に流体連通にある、
実施形態317〜342のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３５４】
実施形態344:
当該第1のカートリッジにおいて、当該試料を受け取るチャンバー、当該カラム、当該複数のチャンバー、当該試料除去チャンバー、及び当該温度制御チャネル若しくはチャンバーが、マイクロ流体チャネル及びバルブにより選択的に流体連通にあり;並びに/又は
当該第2のカートリッジにおいて、当該試料を受け取るチャンバー、当該カラム、当該複数のチャンバー、及び当該温度制御チャネル若しくはチャンバーが、マイクロ流体チャネル及びバルブにより選択的に流体連通にある
、実施形態343のカートリッジのセット。
【０３５５】
実施形態345:
当該第1のカートリッジにおいて、当該試料を受け取るチャンバー、当該カラム、当該複数のチャンバー、当該試料除去チャンバー、及び当該温度制御チャネル若しくはチャンバー又は当該温度制御チャネル若しくはチャンバーへのポートが、中心バルブの周囲に設けられ、当該中心バルブ中のチャネルと選択的に流体連通にあり、当該中心バルブが、当該中心バルブと流体連通にあるチャンバーに又はそこから流体を引き出す能力があるプランジャーを収納する;並びに/或いは
当該第2のカートリッジにおいて、当該試料を受け取るチャンバー、当該カラム、当該複数のチャンバー、及び当該温度制御チャネル若しくはチャンバー又は当該温度制御チャネル若しくはチャンバーへのポートが、中心バルブの周囲に設けられ、当該中心バルブ中のチャネルと選択的に流体連通にあり、当該中心バルブが、当該中心バルブと流体連通にあるチャンバーに又はそこから流体を引き出す能力があるプランジャーを収納する
、実施形態343のカートリッジのセット。
【０３５６】
実施形態346:使用時に、当該第1のカートリッジが:
試料を含有する第1のチャンバー;
グアニジニウムチオ硫酸エタノール(GTC-EtOH)溶液を含有する第2のチャンバー;
亜硫酸水素塩試薬を含有する第3のチャンバー;
トリスバッファーを含有する第4のチャンバー;
ポリエチレングリコール(PEG)を含有する第5のチャンバー;及び
KOHを含有する第6のチャンバー
を含むように、当該第1のカートリッジが構成される、実施形態317〜345のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３５７】
実施形態347:当該第1のカートリッジ中の当該第1のチャンバーが、GTC-EtOH-Tween抽出/沈殿試薬において当該試料を含有する、実施形態346のカートリッジのセット。
【０３５８】
実施形態348:グアニジニウムチオ硫酸塩-エタノール(GTC-EtOH)溶液を含有する当該第2のチャンバーが、GTC-トリス(pH7)、エタノールを含有する、実施形態346〜347のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３５９】
実施形態349:使用時に、当該第2のカートリッジが:
試料を含有する第1のチャンバー;
グアニジニウムチオ硫酸エタノール(GTC-EtOH)溶液を含有する第2のチャンバー;
トリスバッファーを含有する第3のチャンバー;
ポリエチレングリコール(PEG)を含有する第4のチャンバー;
KOHを含有する第5のチャンバー;及び
PCR酵素ビーズを含有する第6のチャンバー
を含むように構成される、実施形態317〜336のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３６０】
実施形態350:当該第2のカートリッジが、トリスビーズ、及び酵素ビーズを含有する第7のチャンバーを含む、実施形態349のカートリッジのセット。
【０３６１】
実施形態351:グアニジニウムチオ硫酸塩-エタノール(GTC-EtOH)溶液を含有する当該第2のチャンバーが、GTC-トリス(pH7)、エタノールを含有する、実施形態349〜350のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３６２】
実施形態352:当該第2のカートリッジが、PCRプライマー及び/又はプローブ及び/又はPCR酵素を含有するチャンバーを含む、実施形態317〜351のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３６３】
実施形態353:当該第2のカートリッジが、PCRプライマー及び/又はプローブ及び/又はPCR酵素も含有する第8のチャンバーを含む、実施形態317〜352のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３６４】
実施形態354:当該第2のカートリッジが、亜硫酸水素塩で変換されたメチル化及び/若しくは非メチル化配列に特異的なプライマーを含有する1つ又は複数のチャンバーを含む、実施形態317〜353のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３６５】
実施形態355:当該第2のカートリッジが、TaqManPCR反応用試薬を含有する1つ又は複数のチャンバーを含む、実施形態317〜354のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３６６】
実施形態356:当該第2のカートリッジが、増幅されたメチル化配列についてのマーカーである1つ若しくは複数の蛍光プローブ、及び/又は増幅された非メチル化配列についてのマーカーである1つ若しくは複数の蛍光プローブを含有する1つ或いは複数のチャンバーを含む、実施形態317〜355のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３６７】
実施形態357:当該プローブが、プローブが、TaqDNAポリメラーゼの5'から3'へのヌクレアーゼ活性による切断の際にシグナルをもたらす、蛍光レポーター色素及びクエンチャー色素を含む、実施形態356のカートリッジのセット。
【０３６８】
実施形態358:第2のカートリッジが、目的の増幅された領域中の異なるメチル化領域にそれぞれ特異的な複数のプローブを含む、実施形態356〜357のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３６９】
実施形態359:当該第2のカートリッジが、目的の増幅された領域中のメチル化領域に特異的な単一プローブを含む、実施形態356〜357のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３７０】
実施形態360:当該第2のカートリッジが、目的の増幅された領域中の同じメチル化領域にそれぞれ特異的な複数のプローブを含む、実施形態356〜357のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３７１】
実施形態361:当該第2のカートリッジが、MGMT、RASSF1A、ADAMTS1、BNC1、HIST1H3C、HOXB4、RASGRF2、TM6SF1、及びAKR1B1からなる群から選択される遺伝子のプロモーター領域のメチル化を決定するためのプライマー並びに/又はプローブ含有する、実施形態317〜360のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３７２】
実施形態362:当該第2のカートリッジが、表5、表9、若しくは表10に示される1つ又は複数のプライマー、及び/或いは表5、表9、若しくは表10に示される1つ又は複数のプローブを含有する、実施形態317〜360のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３７３】
実施形態363:当該第2のカートリッジが、ネステッドPCR反応を使用してMGMTのメチル化を決定するための次のプローブ及びプライマー:
ヌクレオチド配列GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT(配列番号263)を含む外部フォワードプライマー(248b);
ヌクレオチド配列:AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC(配列番号265)を含む外部リバースプライマー(249b);
ヌクレオチド配列TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC(配列番号266)を含む内部フォワードプライマー(250);
ヌクレオチド配列GCACTCTTCCGAAAACGAAACG(配列番号267)を含む内部リバースプライマー(251);及び
ヌクレオチド配列  蛍光-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-ブロッカー(配列番号268)を含むプローブ(252a)
を含有する、実施形態362のカートリッジのセット。
【０３７４】
実施形態364:当該第2のカートリッジが、ネステッドPCR反応を使用してACTB(例えば、対照として)のメチル化を決定するための次のプローブ及びプライマー:
ヌクレオチド配列GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT(配列番号103)を含む外部フォワードプライマー(102);
ヌクレオチド配列CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(配列番号104)を含む外部リバースプライマー(103);
ヌクレオチド配列GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG(配列番号149)を含む内部フォワードプライマー(148);
ヌクレオチド配列CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC(配列番号150)を含む内部リバースプライマー(149);及び
ヌクレオチド配列  蛍光-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-ブロッカー(配列番号179)を含むプローブ(178)
を含有する、実施形態362〜363のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３７５】
実施形態365:当該第2のカートリッジが、1つ若しくは複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する1つ又は複数のチャンバーを含む、実施形態317〜360のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３７６】
実施形態366:当該第2のカートリッジが、メチル化状態が、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、脳癌、及び肺癌からなる群から選択される癌についてのマーカーである1つ若しくは複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー並びにプローブをもたらすビーズを含有する1つ又は複数のチャンバーを含む、実施形態365のカートリッジのセット。
【０３７７】
実施形態367:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、メチル化状態が、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、脳癌、及び肺癌からなる群から選択される癌についてのマーカーである1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー並びにプローブをもたらすビーズを含む、実施形態365〜366のいずれかに記載のカートリッジのセット。
【０３７８】
実施形態368:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、ネステッドPCR反応用のPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態367のカートリッジのセット。
【０３７９】
実施形態369:当該ネステッドPCRが、変換されたDNAに特異的な第1のPCR反応及びメチル化CpGに特異的な第2のPCR反応を含む、実施形態368のカートリッジのセット。
【０３８０】
実施形態370:PCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、変換されたDNAのフォワード鎖のメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する、実施形態349〜369のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３８１】
実施形態371:PCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、変換されたDNAのリバース鎖のメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する、実施形態349〜370のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３８２】
実施形態372:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、RASSF1A、AKR1B1、HOXB4、HIST1H3C、RASGRF2、TM6SF1、BRCA1、BNC1、ADAMTS1、CDO1、SOX17、TAC1、HOXA7、及びMGMTからなる群から選択される1つ又は複数の遺伝子のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー並びにプローブをもたらすビーズを含む、実施形態349〜371のいずれかに記載のカートリッジのセット。
【０３８３】
実施形態373:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、メチル化状態が膵臓癌についてのマーカーである1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態349〜372のいずれかに記載のカートリッジのセット。
【０３８４】
実施形態374:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、ADAMTS1及び/又はBNC1のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー並びにプローブをもたらすビーズを含む、実施形態373のカートリッジのセット。
【０３８５】
実施形態375:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、ADAMTS1のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態374のカートリッジのセット。
【０３８６】
実施形態376:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、BNC1のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態374〜375のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３８７】
実施形態377:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、表5若しくは表10に示されるADAMTS1及び/又はBNC1についての1つ又は複数のPCRプライマー並びに/或いはプローブをもたらすビーズを含む、実施形態374のカートリッジのセット。
【０３８８】
実施形態378:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、メチル化状態が乳癌についてのマーカーである1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態349〜372のいずれかに記載のカートリッジのセット。
【０３８９】
実施形態379:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、BRCA1、RASSF1A、AKR1B1、HOXB4、HIST1H3C、RASGRF2、及びTM6SF1からなる群から選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、又は全ての遺伝子のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー並びにプローブをもたらすビーズを含む、実施形態378のカートリッジのセット。
【０３９０】
実施形態380:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、BRCA1のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態379のカートリッジのセット。
【０３９１】
実施形態381:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、RASSF1Aのプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態379〜380のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３９２】
実施形態382:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、AKR1B1のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態379〜381のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３９３】
実施形態383:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、HOXB4のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態379〜382のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３９４】
実施形態384:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、HIST1H3Cのプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態379〜383のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３９５】
実施形態385:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、RASGRF2のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態379〜384のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３９６】
実施形態386:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、TM6SF1のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態379〜385のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０３９７】
実施形態387:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、表5若しくは表9に示される1つ又は複数のPCRプライマー及び/或いは1つ又は複数のPCRプローブをもたらすビーズを含む、実施形態379〜386に記載のカートリッジのセット。
【０３９８】
実施形態388:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、BRCA1のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態378のカートリッジのセット。
【０３９９】
実施形態389:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、メチル化状態が肺癌についてのマーカーである1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態349〜372のいずれかに記載のカートリッジのセット。
【０４００】
実施形態390:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、CDO1、SOX17、TAC1、及びHOXA7からなる群から選択される1つ、2つ、3つ、又は全ての遺伝子のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー並びにプローブをもたらすビーズを含む、実施形態389のカートリッジのセット。
【０４０１】
実施形態391:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、CDO1のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態390のカートリッジのセット。
【０４０２】
実施形態392:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、SOX17のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態390〜391のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０４０３】
実施形態393:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、TAC1のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態390〜392のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０４０４】
実施形態394:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、HOXA7のプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態390〜393のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０４０５】
実施形態395:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、メチル化状態が脳癌についてのマーカーである1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態349〜372のいずれかに記載のカートリッジのセット。
【０４０６】
実施形態396:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、MGMTのプロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含む、実施形態395のカートリッジのセット。
【０４０７】
実施形態397:1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化を検出するためのPCRプライマー及びプローブをもたらすビーズを含有する当該チャンバーが、表5若しくは表10に示されるMGMTについての1つ又は複数のPCRプライマー並びに/或いはプローブをもたらすビーズを含む、実施形態396のカートリッジのセット。
【０４０８】
実施形態398:当該カートリッジが、ネステッドPCR反応を使用してMGMTのメチル化を決定するための次のプローブ及びプライマー:
ヌクレオチド配列GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT(配列番号263)を含む外部フォワードプライマー(248b);
ヌクレオチド配列AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC(配列番号265)を含む外部リバースプライマー(249b);
ヌクレオチド配列TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC(配列番号266)を含む内部フォワードプライマー(250);
ヌクレオチド配列GCACTCTTCCGAAAACGAAACG(配列番号267)を含む内部リバースプライマー(251);及び
ヌクレオチド配列  蛍光-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-ブロッカー(配列番号268)を含むプローブ(252a)
を含有する、実施形態397のカートリッジのセット。
【０４０９】
実施形態399:ネステッドPCR反応を使用してACTB(例えば、対照として)のメチル化を決定するための次のプローブ及びプライマー:
ヌクレオチド配列GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT(配列番号103)を含む外部フォワードプライマー(102);
ヌクレオチド配列CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(配列番号104)を含む外部リバースプライマー(103);
ヌクレオチド配列GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG(配列番号149)を含む内部フォワードプライマー(148);
ヌクレオチド配列CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC(配列番号150)を含む内部リバースプライマー(149);及び
ヌクレオチド配列:蛍光-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-ブロッカー(配列番号179)を含むプローブ(178)
を含有する、実施形態397〜398のいずれか1つに記載のカートリッジのセット。
【０４１０】
実施形態400:生物学的試料において核酸のメチル化を決定するためのシステムであって:
1つ又は複数の試料処理モジュールを含有するように構成されたエンクロージャーを含み、それぞれの試料処理モジュールが、実施形態317〜399のいずれか1つに記載のカートリッジの当該セットの、取り外し可能なカートリッジである第1のカートリッジ及び/又は第2のカートリッジを保持するように構成され;
当該システムが、カートリッジの当該セットの第1のカートリッジを操作して、当該第1のカートリッジに導入された試料において核酸の亜硫酸水素塩変換を行うために、試料処理モジュールを操作して試料処理を行うよう;並びに/又は
対応する取り外し可能な試料カートリッジ内の1つ又は複数の標的核酸の脱スルホン化を行うよう、及びメチル化を決定するよう
構成される、システム。
【０４１１】
実施形態401:1つの試料処理モジュールを含有するように構成される、実施形態400のシステム。
【０４１２】
実施形態402:少なくとも2個の試料処理モジュール、又は少なくとも4個の試料処理モジュール、又は少なくとも8個の試料処理モジュール、又は少なくとも12個の試料処理モジュール、又は少なくとも16個の試料処理モジュール、又は少なくとも20個の試料処理モジュール、又は少なくとも24個の試料処理モジュール、又は少なくとも28個の試料処理モジュール、又は少なくとも32個の試料処理モジュール、又は少なくとも64個の試料処理モジュール、又は少なくとも128個の試料処理モジュールを含有するように構成される、実施形態400のシステム。
【０４１３】
実施形態403:当該モジュールが、当該カートリッジ中の温度制御されたチャンバー若しくはチャネルを加熱するための1つ又は複数の加熱プレートを含む、実施形態400〜402のいずれか1つに記載のシステム。
【０４１４】
実施形態404:当該モジュールが、当該カートリッジ中の温度制御チャネル又はチャンバーを冷却するように構成されたファンを含む、実施形態400〜403のいずれか1つに記載のシステム。
【０４１５】
実施形態405:当該モジュールが、情報(例えば、光情報)を解析用コンピューターに渡すための電気回路を含む、実施形態400〜404のいずれか1つに記載のシステム。
【０４１６】
実施形態406:当該モジュールが、当該カートリッジにおける反応により生み出された1つ又は複数の光学シグナルの励起及び/又は検出をもたらすための光学ブロックを含む、実施形態400〜405のいずれか1つに記載のシステム。
【０４１７】
実施形態407:カートリッジの当該セットの当該第1のカートリッジを操作して、
試料をカラムに結合させ;
DNAをカラムから溶出し、当該DNAを変換試薬と合わせ;
反応チャンバー又はチューブにおいてDNA/変換試薬溶液を加熱して、変換されたDNAを生成し;及び
変換されたDNAを第1のカートリッジ中の試料除去チャンバーに運ぶ
ように構成されている、実施形態400〜406のいずれか1つに記載のシステム。
【０４１８】
実施形態408:カートリッジの当該セットにおける当該第2のカートリッジを操作して、
変換されたDNAをカラムに結合させ;
変換されたDNAを洗浄し、すすぎ、溶出し;
DNAをカラムから溶出し;
変換されたDNAを脱スルホン化する
ように構成されている、実施形態400〜407のいずれか1つに記載のシステム。
【０４１９】
実施形態409:カートリッジの当該セットにおける当該第2のカートリッジを操作して、反応チャンバー又はチューブにおいて溶出された脱スルホン化DNA上でPCRを行うように構成されている、実施形態408のシステム。
【０４２０】
実施形態410:核酸のメチル化状態を決定する方法であって:実施形態317〜399のいずれか1つに記載のカートリッジのセットにおける第1のカートリッジの試料チャンバーにおいて生物学的試料を用意する工程;及び当該第1のカートリッジを操作して:
当該試料中のDNAを当該第1のマトリックス材料に結合させ;
結合したDNAを洗浄し;マトリックス材料から結合したDNAを溶出させ;溶出されたDNAを当該亜硫酸水素塩試薬と合わせ;
当該温度制御チャネル又はチャンバーにおいてDNAと亜硫酸水素塩試薬の混合物を加熱して、当該DNAの亜硫酸水素塩変換を行い;亜硫酸水素塩で変換されたDNAを当該第1のカートリッジの試料除去チャンバーに移す
工程を含む方法。
【０４２１】
実施形態411:
実施形態317〜399のいずれか1つに記載のカートリッジのセットにおける第2のカートリッジの試料チャンバーにおいて亜硫酸水素塩変換されたDNAを用意する工程;及び
当該第2のカートリッジを操作して:
当該亜硫酸水素塩変換されたDNAを当該第2のマトリックス材料に結合させ;
結合した亜硫酸水素塩で変換されたDNAを洗浄し;
洗浄された亜硫酸水素塩で変換されたDNAを当該第2のマトリックス材料から溶出し;
亜硫酸水素塩変換されたDNAを脱スルホン化する
工程を更に含む、実施形態410の方法。
【０４２２】
実施形態412:当該第2のカートリッジが、脱スルホン化前に、亜硫酸水素塩で変換されたDNAを当該第2のマトリックス材料から溶出するよう操作される、実施形態411の方法。
【０４２３】
実施形態413:当該第2のカートリッジが、脱スルホン化後又はその最中に、亜硫酸水素塩で変換されたDNAを当該第2のマトリックス材料から溶出するよう操作される、実施形態411の方法。
【０４２４】
実施形態414:当該第2のカートリッジを操作して、当該変換された核酸上でメチル化特異的PCR及び/又は核酸配列決定、及び/又は高分解能融解解析(HRM)を行い、当該核酸のメチル化を決定する工程を含む、実施形態411〜413のいずれか1つに記載の方法。
【０４２５】
実施形態415:当該試料が、細胞、組織、及び核酸を含有する生体体液からなる群から選択される1つ又は複数の試料を含む、実施形態410〜414のいずれか1つに記載の方法。
【０４２６】
実施形態416:当該生物学的試料が、全血、血漿、血清、唾液、粘液、尿、痰、膵液、及び脳脊髄液からなる群から選択される生体体液を含む、実施形態415の方法。
【０４２７】
実施形態417:当該生物学的試料が、組織試料、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織、新鮮凍結組織、穿刺吸引(FNA)、及びコア生検からなる群から選択される試料を含む、実施形態415の方法。
【０４２８】
実施形態418:当該生物学的試料を溶解溶液と接触させる工程を含む、実施形態410〜417のいずれか1つに記載の方法。
【０４２９】
実施形態419:当該第1のカートリッジを操作する工程が、実施形態400〜409のいずれか1つに記載のシステムにおいて当該第1のカートリッジを試料処理モジュールに導入する工程を含む、実施形態410〜418のいずれか1つに記載の方法。
【０４３０】
実施形態420:当該第2のカートリッジを操作する工程が、実施形態400〜409のいずれか1つに記載のシステムにおいて当該第2のカートリッジを試料処理モジュールに導入する工程を含む、実施形態410〜419のいずれか1つに記載の方法。
【０４３１】
実施形態421:第1のカートリッジの試料チャンバーにおいて生物学的試料を用意する当該工程が、試料を、当該第1のカートリッジ中の1つ又は複数の試料を受け取るチャンバーにロードする工程を含む、実施形態410〜420のいずれか1つに記載の方法。
【０４３２】
実施形態422:第2のカートリッジの試料チャンバーにおいて亜硫酸水素塩変換されたDNAを用意する当該工程が、亜硫酸水素塩で変換されたDNAを当該第1のカートリッジ中の試料除去チャンバーから当該第2のカートリッジの試料を受け取るチャンバーに移す工程を含む、実施形態410〜421のいずれか1つに記載の方法。
【０４３３】
実施形態423:当該第1のカートリッジ中の結合したDNAを溶出する当該工程が、低濃度の水酸化カリウム又は他の塩基を使用して当該DNAを溶出し、変性する工程を含む、実施形態410〜422のいずれか1つに記載の方法。
【０４３４】
実施形態424:当該第1のカートリッジ中の結合したDNAを溶出する当該工程が、当該DNAを約pH10.5より高いpHを有するアルカリ溶液で溶出し、変性する工程を含む、実施形態423の方法。
【０４３５】
実施形態425:当該第1のカートリッジ中の結合したDNAを溶出する当該工程が、当該DNAをpH約12より高いpHを有するアルカリ溶液で溶出し、変性する工程を含む、実施形態423の方法。
【０４３６】
実施形態426:当該アルカリ溶液が、10〜15mM KOH溶液である、実施形態424〜425に記載の方法。
【０４３７】
実施形態427:当該第1のカートリッジにおいて溶出されたDNAを亜硫酸水素塩試薬と合わせる当該工程が、約6M〜約7Mの範囲にある濃度を有する亜硫酸水素アンモニウム溶液においてDNAをインキュベーションする工程を含む、実施形態410〜426のいずれか1つに記載の方法。
【０４３８】
実施形態428:当該第1のカートリッジにおいて溶出されたDNAを亜硫酸水素塩試薬と合わせる当該工程が、約6.5Mの濃度を有する亜硫酸水素アンモニウム溶液においてDNAをインキュベーションする工程を含む、実施形態427の方法。
【０４３９】
実施形態429:当該第1のカートリッジにおいて溶出されたDNAを亜硫酸水素塩試薬と合わせる当該工程が、濃亜硫酸水素塩溶液中のDNAを当該第1のカートリッジ中の温度制御チャネル又はチャンバーに移す工程、及び当該混合物を加熱する工程を含む、実施形態428の方法。
【０４４０】
実施形態430:当該インキュベーション工程が、濃亜硫酸水素塩溶液を約60℃〜約95℃の温度に熱サイクリングする工程を含む、実施形態429の方法。
【０４４１】
実施形態431:亜硫酸水素塩変換されたDNAを第2のマトリックス材料に結合させる当該工程が、当該第2のカラムにおいてDNA亜硫酸水素塩溶液を新鮮GTC-EtOHと混合する工程、及び溶液を当該第2のマトリックス材料に分注する工程を含む、実施形態411〜430のいずれか1つに記載の方法。
【０４４２】
実施形態432:当該第2のマトリックス材料中のDNAを新鮮GTC-EtOHで、次に、リンス溶液で洗浄する工程を含む、実施形態431の方法。
【０４４３】
実施形態433:当該リンス溶液がPEG200を含む、実施形態432の方法。
【０４４４】
実施形態434:変換されたDNAを脱スルホン化する当該工程が、高pHの脱スルホン化バッファーでDNAを当該第2のマトリックス材料から溶出する工程、及び当該溶液をインキュベートする工程を含む、実施形態411〜433のいずれか1つに記載の方法。
【０４４５】
実施形態435:当該インキュベーショトが、約1分間〜約1時間、又は約5分間〜約30分間、又は約10分間〜約20分間、又は約15分間の範囲にある期間である、実施形態434の方法。
【０４４６】
実施形態436:当該高pH脱スルホン化/溶出バッファーがKOHを含む、実施形態434〜435に記載の方法。
【０４４７】
実施形態437:当該第2のカートリッジを操作して、当該変換されたDNAを鋳型として使用して1つ又は複数のPCR反応を行う工程を含む、実施形態411〜436のいずれか1つに記載の方法。
【０４４８】
実施形態438:メチル化特異的PCRを行い、標的核酸配列のメチル化を決定する、実施形態437の方法。
【０４４９】
実施形態439:当該メチル化特異的PCR(MSP)が、メチル化配列に特異的なプライマー及び/又は非メチル化配列に特異的なプライマーを使用して行われる、実施形態438の方法。
【０４５０】
実施形態440:当該メチル化特異的PCRが、MethyLightプロトコールを含む、実施形態438の方法。
【０４５１】
実施形態441:TaqManPCR反応が、亜硫酸水素塩で変換されたメチル化及び/又は非メチル化配列に特異的なプライマーで行われる、実施形態438の方法。
【０４５２】
実施形態442:当該メチル化特異的PCR(MSP)が、増幅されたメチル化配列についてのマーカーである1つ若しくは複数の蛍光プローブ及び/又は増幅された非メチル化配列についてのマーカーである1つ若しくは複数の蛍光プローブを利用する、実施形態438〜当該441のいずれか1つに記載の方法。
【０４５３】
実施形態443:当該蛍光プローブが、プローブが、TaqDNAポリメラーゼの5'から3'へのヌクレアーゼ活性による切断の際にシグナルをもたらす、蛍光レポーター色素及びクエンチャー色素を含む、実施形態442の方法。
【０４５４】
実施形態444:メチル化シグナルが、目的の増幅された領域中の異なるメチル化領域にそれぞれ特異的な複数のプローブについての合わせたシグナルにより決定される、実施形態442〜443のいずれか1つに記載の方法。
【０４５５】
実施形態445:メチル化シグナルが、目的の増幅された領域中の同じメチル化領域に特異的な複数のプローブにより決定される、実施形態442〜443のいずれか1つに記載の方法。
【０４５６】
実施形態446:当該複数のプローブが、2、3、4、5、6、7、8、9、10個以上のプローブを含む、実施形態442〜443のいずれか1つに記載の方法。
【０４５７】
実施形態447:メチル化シグナルが、目的の増幅された領域中の単一のプローブにより決定される、実施形態442〜443のいずれか1つに記載の方法。
【０４５８】
実施形態448:当該プローブが、シンプレックス又はマルチプレックスで実行される、実施形態442〜447のいずれか1つに記載の方法。
【０４５９】
実施形態449:当該プローブが、マルチプレックスフォーマットで実行される、実施形態442〜447のいずれか1つに記載の方法。
【０４６０】
実施形態450:当該プローブが、ネステッドPCR反応として実行される、実施形態442〜449のいずれか1つに記載の方法。
【０４６１】
実施形態451:当該PCR反応が、亜硫酸水素塩が反応液に存在するなら、PCR中に亜硫酸水素塩介在性切断を受ける亜硫酸水素塩混入制御プローブを含む、実施形態442〜450のいずれか1つに記載の方法。
【０４６２】
実施形態452:PCRが、1つ又は複数の変異遺伝子について行われる、実施形態411〜451のいずれか1つに記載の方法。
【０４６３】
実施形態453:PCRが、対照として変換されていないDNAについて行われる、実施形態411〜452のいずれか1つに記載の方法。
【０４６４】
実施形態454:PCRが、対照として変換されたDNAについて行われる、実施形態411〜453のいずれか1つに記載の方法。
【０４６５】
実施形態455:PCRが、変換されていないDNAが当該方法の標的である変換されていないDNAについて行われる、実施形態453の方法。
【０４６６】
実施形態456:メチル化が、MGMT、RASSF1A、ADAMTS1、BNC1、HIST1H3C、HOXB4、RASGRF2、TM6SF1、及びAKR1B1からなる群から選択される遺伝子のプロモーター領域について決定される、実施形態410〜455のいずれか1つに記載の方法。
【０４６７】
実施形態457:対象において癌又は癌の素因を検出する方法であって:
当該対象由来の生物学的試料を用意する工程であって、当該生物学的試料がDNAを含む、工程;
実施形態317〜399のいずれか1つに記載のカートリッジのセットを利用する工程を含み、カートリッジの当該セットの当該第1のカートリッジを使用して、当該DNAの亜硫酸水素塩変換が行われ;カートリッジの当該セットの当該第2のカートリッジを使用して、変換されたDNAが脱スルホン化され、メチル化状態が癌についてのマーカーである当該DNAにおける1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化が検出され、当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化における増大が、癌若しくは癌の素因の存在又は癌若しくは前癌の段階の指標である、方法。
【０４６８】
実施形態458:当該対象がヒトである、実施形態457の方法。
【０４６９】
実施形態459:当該癌が、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、脳癌、肺癌、B細胞リンパ腫、気管支癌、結腸直腸の癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳又は中枢神経系の癌、末梢神経系の癌、食道癌、頸部の癌、メラノーマ、子宮又は子宮内膜癌、口腔又は咽頭の癌、肝臓癌、腎臓癌、胆道癌、小腸又は虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、脂肪肉腫、精巣癌、及び悪性線維性組織球腫からなる群から選択される癌である、実施形態457〜458のいずれか1つに記載の方法。
【０４７０】
実施形態460:当該癌が、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、脳癌、肺癌からなる群から選択される癌である、実施形態457〜458のいずれか1つに記載の方法。
【０４７１】
実施形態461:当該試料が、血清又は血漿からの試料を含む、実施形態457〜460のいずれか1つに記載の方法。
【０４７２】
実施形態462:当該試料がFFPE試料を含む、実施形態457〜460のいずれか1つに記載の方法。
【０４７３】
実施形態463:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、RASSF1A、AKR1B1、HOXB4、HIST1H3C、RASGRF2、TM6SF1、BRCA1、BNC1、ADAMTS1、CDO1、SOX17、TAC1、HOXA7、及びMGMTからなる群から選択される1つ又は複数の遺伝子のプロモーターを含む、実施形態457〜462のいずれか1つに記載の方法。
【０４７４】
実施形態464:当該癌が膵臓癌であり、当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、ADAMTS1、及びBNC1からなる群から選択される1つ、2つ、3つ、又は4つの遺伝子のプロモーターを含む、実施形態457〜462のいずれか1つに記載の方法。
【０４７５】
実施形態465:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、ADAMTS1のプロモーターを含む、実施形態464の方法。
【０４７６】
実施形態466:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、BNC1のプロモーターを含む、実施形態464〜465のいずれか1つに記載の方法。
【０４７７】
実施形態467:当該癌が乳癌であり、当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、BRCA1、RASSF1A、AKR1B1、HOXB4、HIST1H3C、RASGRF2、及びTM6SF1からなる群から選択される1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は全ての遺伝子のプロモーターを含む、実施形態457〜462のいずれか1つに記載の方法。
【０４７８】
実施形態468:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、BRCA1のプロモーターを含む、実施形態467の方法。
【０４７９】
実施形態469:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、RASSF1Aのプロモーターを含む、実施形態467〜468のいずれか1つに記載の方法。
【０４８０】
実施形態470:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、AKR1B1のプロモーターを含む、実施形態467〜469のいずれか1つに記載の方法。
【０４８１】
実施形態471:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、HOXB4のプロモーターを含む、実施形態467〜470のいずれか1つに記載の方法。
【０４８２】
実施形態472:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、HIST1H3Cのプロモーターを含む、実施形態467〜471のいずれか1つに記載の方法。
【０４８３】
実施形態473:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、RASGRF2のプロモーターを含む、実施形態467〜472のいずれか1つに記載の方法。
【０４８４】
実施形態474:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、TM6SF1のプロモーターを含む、実施形態467〜473のいずれか1つに記載の方法。
【０４８５】
実施形態475:当該癌が乳癌であり、当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、BRCA1のプロモーターを含む、実施形態457〜462のいずれか1つに記載の方法。
【０４８６】
実施形態476:当該癌が肺癌であり、当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、CDO1、SOX17、TAC1、及びHOXA7からなる群から選択される1つ、2つ、3つ、又は4つの遺伝子のプロモーターを含む、実施形態457〜462のいずれか1つに記載の方法。
【０４８７】
実施形態477:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、CDO1のプロモーターを含む、実施形態476の方法。
【０４８８】
実施形態478:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、SOX17のプロモーターを含む、実施形態476〜477のいずれか1つに記載の方法。
【０４８９】
実施形態479:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、TAC1のプロモーターを含む、実施形態476〜478のいずれか1つに記載の方法。
【０４９０】
実施形態480:当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、HOXA7のプロモーターを含む、実施形態476〜479のいずれか1つに記載の方法。
【０４９１】
実施形態481:当該癌が脳癌であり、当該1つ又は複数の遺伝子プロモーターが、MGMTのプロモーターを含む、実施形態457〜462のいずれか1つに記載の方法。
【０４９２】
実施形態482:DNAメチル化を決定するためのキットであって:実施形態317〜399のいずれか1つに記載のカートリッジのセットの第1のカートリッジ及び/又は第2のカートリッジを含有する容器を含むキット。
【０４９３】
実施形態483:当該第1のカートリッジ及び当該第2のカートリッジが、同じ容器において含有される、実施形態482のキット。
【０４９４】
実施形態484:当該第1のカートリッジ及び当該第2のカートリッジが、別々の容器内にある、実施形態482のキット。
【０４９５】
実施形態485:溶解溶液を含有する容器を更に含む、実施形態482のキット。
【０４９６】
実施形態486:当該溶解溶液が、血清又は血漿用の溶解溶液である、実施形態485のキット。
【０４９７】
実施形態487:当該溶解溶液が、FFPE試料用の溶解溶液である、実施形態485に記載のキット。
【０４９８】
実施形態488:プロテアーゼKを含有する容器を含む、実施形態482〜487のいずれか1つに記載のキット。
【０４９９】
実施形態489:当該カートリッジ又はカートリッジと離れた容器において変換試薬を含む、実施形態482〜488のいずれか1つに記載のキット。
【０５００】
実施形態490:カートリッジと離れた容器において当該変換試薬を含む、実施形態489のキット。
【０５０１】
実施形態491:カートリッジのチャンバーにおいて提供される当該変換試薬を含む、実施形態489のキット。
【０５０２】
実施形態492:当該変換試薬が、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素セシウム、亜硫酸水素アンモニウム、及びDABSOからなる群から選択される化合物を含む、実施形態489〜491のいずれか1つに記載のキット。
【０５０３】
実施形態493:当該変換試薬が亜硫酸水素アンモニウムを含む、実施形態492のキット。
【０５０４】
実施形態494:試料処理試薬を含有する容器を含む、実施形態482〜493のいずれか1つに記載のキット。
【０５０５】
実施形態495:当該試料処理試薬がグアニジウムチオシアネートを含む、実施形態494のキット。
【０５０６】
実施形態496:当該試料処理試薬がエタノールを含む、実施形態494〜495のいずれか1つに記載のキット。
【０５０７】
実施形態497:DNAメチル化の決定のための当該カートリッジの使用を教示する教材を含有する、実施形態482〜496のいずれか1つに記載のキット。
【０５０８】
ある特定の実施形態において、方法及び/又はカートリッジは、磁性ガラス、磁性ヒドロキシアパタイト、及び磁性マトリックス材料を含む磁性材料を明確に除外する。ある特定の実施形態において、方法及び/又はカートリッジは、DNA単離のための磁性材料を明確に除外する。
【図面の簡単な説明】
【０５０９】
【図１Ａ】本明細書に記載する方法での使用に適したカートリッジ(例えば、GENEXPERT(登録商標)カートリッジ)の主要なコンポーネントを説明する図である。
【図１Ｂ】中心バルブの周囲に設けられたチャンバーを説明する上面図である。
【図１Ｃ】反応カートリッジを利用したDNAメチル化の決定についての例示なワークフローである。
【図２】パネルA〜Cは、本明細書に記載するDNAメチル化の検出に適したGENEXPERT(登録商標)カートリッジの1つの実施形態を説明する図である。
【図３Ａ】モジュール、及びDNAメチル化の決定のためのシステム(例えば、処理ユニット)の例示的だが、非限定的な実施形態を示す図である。GENEXPERT(登録商標)カートリッジの操作用モジュールを説明する図である。
【図３Ｂ】モジュール、及びDNAメチル化の決定のためのシステム(例えば、処理ユニット)の例示的だが、非限定的な実施形態を示す図である。DNAメチル化の解析用カートリッジの操作用モジュールの1つの実施形態のいくつかのコンポーネントを説明する図である。
【図３Ｃ】モジュール、及びDNAメチル化の決定のためのシステム(例えば、処理ユニット)の例示的だが、非限定的な実施形態を示す図である。複数のモジュールを組込んだシステム(例えば、処理ユニット)を説明する図である。
【図４Ａ】DNAリン酸化を検出/定量するためのMethyLightプロトコールの使用についての様々なストラテジーを説明する図である。Eadsら、(92000)、Nucleic Acids. Res.、28(8):e32から改変した図であり、MethyLightテクノロジーを模式的に説明する。メチル化されたシトシン残基(黒色の円により示す位置)をシトシンとして保持しながら、メチル化されていないシトシン残基(白色の円により示す位置)をウラシルに変換することにより、例えば、CpGジヌクレオチドにおいてメチル化依存性配列相違を生じる亜硫酸水素ナトリウムにより、DNAを修飾する。次に、蛍光ベースのPCRを、メチル化部位と重複するプライマーか、又はメチル化部位と重複しないプライマーのいずれかで行う。配列識別は、PCR増幅プロセスのレベル(パネルD)若しくはプローブハイブリダイゼーションプロセスのレベル(パネルB)のいずれかで、又は両方で(パネルD)生じ得る。PCR増幅レベルでの配列識別は、可能性のあるメチル化部位(例えば、CpGジヌクレオチド)と重複するプライマー及びプローブ(パネルD)、又はプライマーのみ(パネルC)を利用する。多くの理論的なメチル化パーミュテーションのうちの2つのみ(完全なメチル化(M)及び完全な非メチル化(U))を示す。配列識別が、PCR増幅レベルで生じないように、MethyLightアッセイをまた設計することができる。プライマーもプローブも、メチル化の部位(例えば、CpGジヌクレオチド)と重複しないなら(パネルA)、メチル化依存性配列識別は、PCR増幅又はプローブハイブリダイゼーションレベルでは生じない。この反応は、メチル化状態に対するバイアスなしの変換されたゲノムDNAの増幅を表し、それは、インプットDNAの量についての対照として働き得る。プローブのみが、メチル化部位と重複するなら(パネルB)、配列識別は、プローブハイブリダイゼーションによって生じ得る。
【図４Ｂ】DNAリン酸化を検出/定量するためのMethyLightプロトコールの使用についての様々なストラテジーを説明する図である。メチル化特異的なフォワード(FW)及びリバース(RV)プライマーと共に単一の、例えば、メチル化特異的な、プローブ(PR3)を使用するMethyLightアプローチを説明する。
【図４Ｃ】DNAリン酸化を検出/定量するためのMethyLightプロトコールの使用についての様々なストラテジーを説明する図である。それぞれが異なる領域を標的にする複数のプローブ(PR1...PR5)を使用するMethyLightアプローチを説明する。
【図４Ｄ】DNAリン酸化を検出/定量するためのMethyLightプロトコールの使用についての様々なストラテジーを説明する図である。それぞれが同じ領域を標的にするが、異なるメチル化パターンについてのシグナルをもたらす複数のプローブ(PR1...PR5)を使用するMethyLightアプローチを説明する。
【図５】ACTB qPCR曲線及びHMBS qPCR曲線を示す、HGDNA300ngからの代表的なGeneXpertの結果を説明する図である。
【図６Ａ】15サイクルのネステッドqPCRにおけるヒトゲノムDNA(hgDNA)を使用した亜硫酸水素塩で変換したACTBについてのタイトレーションの結果を説明する図である。
【図６Ｂ】20サイクルのネステッドqPCRにおけるヒトゲノムDNA(hgDNA)を使用した亜硫酸水素塩で変換したACTBについてのタイトレーションの結果を説明する図である。
【図７Ａ】6種のメチル化標的(AKR1B1、HOXB4、TM6SF1、RAASGRF2、及びRASSF1A)についての20サイクルのネステッドqPCR(カートリッジにおける)の結果を示す図である。亜硫酸水素塩変換なしのHSDNA25ng又は細胞5000個についての結果を示す。
【図７Ｂ】6種のメチル化標的(AKR1B1、HOXB4、TM6SF1、RAASGRF2、及びRASSF1A)についての20サイクルのネステッドqPCR(カートリッジにおける)の結果を示す図である。MBA-453細胞からのDNAを使用した亜硫酸水素塩で変換したメチル化標的についての20サイクルのネステッドqPCRの結果を示す。
【図７Ｃ】6種のメチル化標的(AKR1B1、HOXB4、TM6SF1、RAASGRF2、及びRASSF1A)についての20サイクルのネステッドqPCR(カートリッジにおける)の結果を示す図である。キャリアにおけるMBA-453細胞由来のDNA(SS 1μg及びHS DNA10ng)を使用した亜硫酸水素塩で変換したメチル化標的についてのネステッドqPCRの20サイクルの結果を示す。降下は、25〜50コピー辺り又は細胞100個辺りで生じる。
【図８】変換効率の決定の結果を説明する図である。変換効率は、変換していないHMBSと変換したACTBの間で約66%(約1Ct)の相違である。
【図９】ネステッドqPCRにより生成した変換したDNAについての特異性における増大を説明する図である。
【図１０】メチル化カートリッジの特異性を説明する図である。HIST1H3Cを除き、変換していないDNA(上部のパネル)又はメチル化していないDNA(下部のパネル)のプライミングは存在しない。
【図１１】カートリッジ(例えば、GENEXPERT(登録商標)カートリッジ)を使用したメチル化の解析についての例示的だが、非限定的なワークフローを示す図である。上部は、血清又は血漿試料におけるDNAメチル化の解析についての1つのワークフローを説明する。下部は、組織切片(例えば、凍結又はホルマリン固定したパラフィン包埋(FFPE)切片)におけるDNAメチル化の解析についての1つのワークフローを説明する。
【図１２】変換したALU(一番左の曲線)及びメチル化RASSF1A(一番右の曲線)についてのFFPE細胞ボタンの結果を説明する図である。
【図１３Ａ】実施例4において使用するカートリッジのレイアウトを説明する図である。
【図１３Ｂ】実施例4において使用するプロトコールのフローチャートを説明する図である。
【図１４】いくつかの試料が、亜硫酸水素塩混入物を含有する実行を説明する図である。
【図１５Ａ】亜硫酸水素塩変換を有するMBA-453細胞1000個の結果(最大のシグナルを生じるHOXB4を含む)を説明する図である。
【図１５Ｂ】HS DNA対照25ngの結果(HIST1H3Cのみが検出可能なシグナルを示す)を説明する図である。
【図１６】DABSO(1,4-ジアゾニアビシクロ[2.2.2]オクタン-1,4-ジスルフィネート)の構造を説明する図である。
【図１７】cfDNA試料調製カートリッジの1つの実施形態を説明する図である。カートリッジは、DNAとRNA単離の両方に有効である。カートリッジは、3種のGTCエタノール洗浄液(GTCエタノール洗浄液は、典型的には、1.25Mグアニジニウムチオシアネート、25mMトリスpH7.0、50%エタノールである)、PEG200リンス、及び15mM KOH溶出液をもたらす。
【図１８】cfDNA抽出についての対照を説明する図である。
【図１９Ａ】標準的チューブ充填(すなわち、チューブベースのキット)調製と比較した本明細書に記載する試料調製カートリッジを使用したcfDNA調製の比較を示す図である(一番左の曲線)。カートリッジ調製の収量は、チューブ充填法を使用して得たものと正に同等である(一番右の曲線)。
【図１９Ｂ】標準的チューブ充填と比較したカートリッジベースのDNA精製を使用して検出した抽出したDNAの量の比較をDNA量の関数として示す図である。控えめに評価して、カートリッジベースの方法はチューブ充填法の1Ct以内であり、より高いDNA濃度でより近くなると考えられる。
【図２０Ａ】qPCRカートリッジ及び/又はメチル化検出カートリッジと共に使用することができる大きな体積(例えば、最大12ml)の試料調製(HVSP)カートリッジの1つの実施形態を説明する図である。
【図２０Ｂ】qPCRカートリッジと組合せて使用して、メチル化解析を行ったときの、HVSPカートリッジにおけるワークフローの1つのバリエーションを模式的に説明する図である。
【図２１】少ない試料体積をもたらす単一のPCR解析カートリッジに適用した試料を使用した検出と比較した、大きな体積のカートリッジからPCR解析カートリッジに試料を移す、大きな体積の試料調製カートリッジ(例えば、図20を参照)を使用する2つのカートリッジの精製を使用したHBMS又はβ-グロビンの検出を説明する図である。
【図２２】単一の加熱工程(上部のパネル)と比較した、複数の加熱工程(最下部のパネル)を使用した亜硫酸水素塩変換の結果を説明する図である。
【図２３Ａ】本明細書に記載のメチル化解析カートリッジを使用したメチル化解析と比較した、Zymo DNAメチル化キットと組合せた標準的Qiagen DNA精製キットを使用したメチル化解析についての工程及び作業時間を説明する図である(右)。
【図２３Ｂ】2つの異なるプロトコールを使用して得た結果の比較を示す図である。
【図２４】Zymo亜硫酸水素塩変換試薬を使用したDNA変換と比較した、DABSOを変換試薬として使用したDNA変換の比較を示す図である。
【図２５】パネルA及びパネルBは、メチル化したDNAの検出感度を説明する図である。パネルAは、メチル化したDNA(MGMT)の連続希釈を示す(曲線は、左側の最高濃度から右側の最低濃度に移動する)。パネルBは、メチル化した膵臓癌マーカーの検出感度を説明する。
【図２６】両方の標準についての逆相補マルチプレックスアッセイについての結果を説明する図である(最大から最小の蛍光の曲線:上部パネル-BNC1_2、BNC1_2、BG、ADAMTS1_1/ADAMTS1_2;下部パネル-BNC1_2、BNC1_2、ADAMTS1_1/ADAMTS1_2、BG、ADAMTS1_1/ADAMTS1_2)。
【図２７Ａ】同じカートリッジにおけるメチル化したDNAと変異両方の検出を説明する図である。上部のパネルは、1つのカートリッジにおけるメチル化したDNA及びKras G12D変異の検出を説明し、一方、下部のパネルは、1つのカートリッジにおけるメチル化されたDNA及び野生型Krasの検出を説明する。
【図２７Ｂ】2種の膵臓癌細胞株:PANC-1細胞(最上部のパネル)及びMIA-PaCa細胞(最下部のパネル)において同じカートリッジでのメチル化したDNA及び変異Iの検出を説明する図である。
【図２８】亜硫酸水素塩で変換したDNAのフォワード鎖(上部)及びリバース鎖(下部)のADAMTS1並びにBNC1のマルチプレックスメチル化解析のための温度最適化を説明する図である。
【図２９】BNC1、ADAMTS1、及び対照遺伝子ACTBについてのMSPプライマーとプローブのセットをマルチプレックスする能力を説明する図である。好ましい条件に基づき2つのセットにプローブを組合せた。
【図３０】MGMTメチル化の検出のため使用したプライマーとプローブの1つのセットを説明する図である。内部フォワード22150(配列番号266);外部フォワード22422(配列番号263);プローブ22419(配列番号268)、内部リバース22151(配列番号267);外部リバース22423(配列番号265);鋳型(配列番号1)。
【図３１】亜硫酸水素塩パイロシークエンシングと抽出したDNA(上部)及びFFPET試料(下部)用MGMTメチル化カートリッジの間の比較の結果を示す図である。
【図３２】メチル化した変換したDNAとメチル化していない変換したDNAの間のΔCtのBRCA1プライマーとプローブセット最適化を説明する図である。
【図３３】ACTB対照遺伝子で試験したBRCA1メチル化についての1つの標的アッセイを説明する図である。示す通り、8種の異なる細胞株を試験し、NH4の添加効果を比較した。
【図３４】メチル化が、正常血漿のバックグラウンド及び3種の異なる肺癌細胞株において肺癌と関連する遺伝子(SOX17、CD01、TAC1)についての3種の標的メチル化アッセイの結果を説明する図である。
【図３５】BNC1及びACTBの2つのカートリッジでのメチル化解析の結果を示す図である。
【図３６】正常尿試料の亜硫酸水素塩変換解析の結果を示す図である。
【図３７】正常及び癌痰試料のメチル化解析の結果を示す図である。
【０５１０】
定義
本発明の理解を促進するために、多数の用語及び語句が以下で定義される。
【０５１１】
本明細書において使用される、用語「検出する」、「検出すること」又は「検出」は、検出可能に標識された組成物の発見又は識別又は特定の観察であるいずれかの一般的な行為を説明し得る。
【０５１２】
本明細書において使用される、用語「検出可能に異なる」又は「スペクトル的に区別可能な」は、検出され、同時に区別され得る標識(例えば、色素/フルオロフォア)のセットを指す。
【０５１３】
DNAメチル化は、典型的には、ジヌクレオチド5'-CpG-3'における塩基シトシン(C)への共有的なメチル基(CH3)の付加を指す。用語CpGは、DNAヌクレオチド配列において塩基グアニン(G)に結合したリン酸塩により結び付けられた塩基シトシン(C)を指す。
【０５１４】
用語「変換試薬」は、5-MeCには本質的に影響を与えずに、1本鎖DNAにおいてシトシンをウラシルに脱アミノ化する試薬を指す。例示的な変換試薬は、亜硫酸水素塩(例えば、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素セシウム、亜硫酸水素アンモニウム等)及び/又は適当な反応条件下で亜硫酸水素塩を生成し得る化合物(例えば、DABSO)を含む。
【０５１５】
語句「遺伝子のメチル化を検出すること」は、一般的に、遺伝子のプロモーター領域における、典型的には、CPGアイランド中のシトシンのメチル化の検出を指す。
【０５１６】
本明細書において使用される、用語「患者」及び「対象」は、典型的には、ヒトを指すために互換的に使用される。ある実施形態において、本明細書に記載される方法は、非ヒト動物、例えば、非ヒト霊長類、イヌ、ウマ、ネコ、ブタ、ウシ、ウサギ等由来の試料上で使用され得る。
【０５１７】
本明細書において使用される、用語「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」等は、DNAを含むが、これに限定されない核酸を含有する分子を指す。用語は、4-アセチルシトシン、8-ヒドロキシ-N6-メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルアデニン、1-メチルプソイドウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチル-グアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノ-メチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルクエオシン、5'-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、N-ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、プソイドウラシル、クエオシン、2-チオシトシン、及び2,6-ジアミノプリンを含むが、これらに限定されないDNA並びにRNAの公知の塩基類似体のいずれかを含む配列を包含する。
【０５１８】
本明細書において使用される、用語「オリゴヌクレオチド」は、典型的には500個より少ないヌクレオチドを有する1本鎖ポリヌクレオチドを指す。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは、8〜200、8〜100、12〜200、12〜100、12〜75、又は12〜50ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、それらの長さにより言及されてもよく、例えば、24残基のオリゴヌクレオチドは、「24-mer」として言及されてもよい。
【０５１９】
本明細書において使用される、用語、標的遺伝子(若しくはその標的領域)に「相補的な」、及び標的遺伝子配列に対するプローブ配列の「相補性」のパーセンテージは、標的遺伝子の配列又は標的遺伝子の配列の相補鎖に対するパーセンテージ「同一性」である。本明細書に記載される組成物において使用されるプローブ(又はその領域)と、本明細書において開示されるもののような、標的遺伝子の間での「相補性」の程度を決定する際に、「相補性」の程度は、プローブ(又はその領域)の配列と標的遺伝子の配列又はそれと最も整列した、標的遺伝子の配列の相補鎖の間のパーセンテージ同一性として表される。2つの配列間と同一である、整列された塩基の数を数え、プローブ中の連続ヌクレオチドの総数で割り、100を掛けることにより、パーセンテージは計算される。用語「相補的な」が使用されるとき、対象のオリゴヌクレオチドは、別段示されない限り、標的分子と少なくとも90%相補的である。ある実施形態において、対象のオリゴヌクレオチドは、標的分子に少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%相補的である。
【０５２０】
本明細書において使用される「プライマー」又は「プローブ」は、標的遺伝子のような、標的核酸分子の少なくとも8個の連続するヌクレオチドの配列に相補的である領域を含むオリゴヌクレオチドを指す。ある実施形態において、プライマー又はプローブは、標的分子の少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも29、少なくとも30、少なくとも319、少なくとも32、少なくとも33、少なくとも34、少なくとも35、少なくとも36、少なくとも37、少なくとも38、少なくとも39、又は少なくとも40個の連続するヌクレオチドの配列に相補的である領域を含む。プライマー又はプローブが、「標的分子の少なくともx個の連続するヌクレオチドに相補的」である領域を含むとき、プライマー又はプローブは、標的分子の少なくともx個の連続するヌクレオチドに少なくとも95%相補的である。ある実施形態において、プライマー又はプローブは、標的分子に少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%相補的である。
【０５２１】
用語「核酸増幅」は、少なくとも1つの標的核酸の少なくとも一部が、典型的には、核酸配列を直線的又は指数関数的のいずれかで増幅する広範囲の技術を含むが、これらに限定されない、鋳型依存性の様式で再生成される任意の手段を包含する。増幅工程を行う典型的な手段は、マルチプレックスバージョン、及びその組合せ、例えば、非限定的に、OLA/PCR、PCR/OLA、LDR/PCR、PCR/PCR/LDR、PCR/LDR、LCR/PCR、PCR/LCR(組合せ連鎖反応--CCRとしても知られる)、デジタル増幅等を含む、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、リガーゼ検出反応(LDR)、マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅(MLPA)、ライゲーション、続いて、Qレプリカーゼ増幅、プライマー伸長、鎖置換増幅(SDA)、高分枝鎖置換増幅、多置換増幅(MDA)、核酸鎖ベースの増幅(NASBA)、2ステップマルチプレックス増幅、ローリングサークル増幅(RCA)等を含む。かかる技術の記載は、他のソースのうち、Ausbelら;PCR Primer:A Laboratory Manual、Diffenbach編、Cold Spring Harbor Press(1995);The Electronic Prtorocol Book、Chang Bioscience(2002);Msuihら、J. Clin. Micro. 34:501〜07頁(1996);The Nucleic Acid Protocols Handbook、R. Rapley編、Humana Press、Totowa、N.J.(2002);Abramsonら、Curr Opin Biotechnol.1993年2月;4(1):41〜7頁、米国特許第6,027,998号;米国特許第6,605,451号、Baranyら、PCT公開公報第WO97/31256号;Wenzら、PCT公開公報第WO01/92579;Dayら、Genomics、29(1):152〜162頁、(1995)、Ehrlichら、Science252:1643〜50頁(1991);Innisら、PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications、Academic Press(1990);Favisら、Nature Biotechnology18:561〜64(2000);及びRabenauら、Infection28:97〜102頁(2000);Belgrader、Barany、及びLubin、Development of a Multiplex Ligation Detection Reaction DNA Typing Assay、Sixth International Symposium on Human Identification、1995(ワールド・ワイド・ウェブ:promega.com/geneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html);LCRキット指示マニュアル、カタログ番号200520、Rev. #050002、Stratagene、2002;Barany、Proc. Natl. Acad. Sci.USA88:188〜93頁(1991年); Bi及びSambrook、Nucl. Acids Res.25:2924〜2951頁(1997年);Zirviら、Nucl. Acid Res. 27:e40i-viii頁(1999年);Deanら、Proc Natl Acad Sci USA99:5261〜66頁(2002年);Barany及びGelfand、Gene109:1〜11頁(1991);Walkerら、Nucl. Acid Res.20:1691〜96頁(1992);Polstraら、BMC Inf. Dis.2:18〜(2002);Lageら、Genome Res. 2003年2月;13(2):294〜307頁、及びLandegrenら、Science 241:1077〜80頁(1988)、Demidov、V.、Expert Rev Mol Diagn.2002年11月;2(6):542〜8頁、Cookら、J Microbiol Methods.2003年5月;53(2):165〜74頁、Schweitzerら、Curr Opin Biotechnol.2001年2月;12(1):21〜7頁、米国特許第5,830,711号、米国特許第6,027,889号、米国特許第5,686,243号、PCT国際公開第W00056927A3号、及びPCT国際公開第W09803673A1号において見ることができる。
【０５２２】
ある実施形態において、増幅は:少なくとも1つのプライマーを少なくとも1つの標的核酸中の相補的又は実質的に相補的な配列とアニーリングさせる工程;ポリメラーゼを使用した鋳型依存性の方法でヌクレオチドの少なくとも1つの鎖を合成する工程;及び新たに形成された核酸2本鎖を変性して、鎖を分ける工程の連続する手法の少なくとも1つのサイクルを含む。サイクルは、繰り返されても又はされなくてもよい。増幅は、熱サイクリングを含み得るか、又は、ある特定の実施形態において、等温で行われ得る。
【０５２３】
本明細書において典型的に使用される用語「ハイブリダイズする」は、ある実施形態において、ストリンジェントな条件下で、優先的に、特定のヌクレオチド配列に核酸分子を結合させるか、2本鎖形成するか、又はハイブリダイズすることである、「特異的なハイブリダイゼーション」を指す。用語「ストリンジェントな条件」は、プローブが、優先的にその標的配列にハイブリダイズし、他の配列により少ない程度でハイブリダイズするか、又はハイブリダイズしない条件を指す。核酸ハイブリダイゼーションの文脈において「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存性であり、異なる環境パラメーター下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションの広範な手引書は、例えば、Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes第I部、第2章、「Overview of principles of hybridization and strategy of nucleic acid probe assays」、Elsevier、N.Y.(「Tijssen」)において見られる。一般に、所定のイオン強度及びpHで特定の配列についての融点(Tm)より約5℃低い、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション及びフィルターハイブリダイゼーションの洗浄条件が、選択される。Tmは、標的配列の50%が、完全に一致したプローブにハイブリダイズする温度(所定のイオン強度及びpH下で)である。ある特定の実施形態において、特定のプローブについてのTmと等しい、非常にストリンジェントな条件が、選択される。バッファー組成、温度、及びプローブの長さに対するハイブリダイゼーションストリンジェンシーの依存性は、当業者に周知である(例えば、Sambrook及びRussell(2001)、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第3編)、第1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Press、NYを参照)。
【０５２４】
本明細書において使用される、「試料」は、一般に、生体体液(例えば、血液若しくは血液分画、血清、血漿、膵液、脳脊髄液、口腔液、リンパ液、眼内液等)並びに/又は乳房組織、子宮頸管内組織、膣組織、結腸/直腸組織、咽頭組織を含むが、これらに限定されない、様々な組織由来の、生検試料、凍結組織試料、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料、並びに血液、便、及び生検試料のような他の種類のヒト試料を含む、組織試料を含む生物学的試料を指す。用語試料はまた、上記の試料の希釈及び/又はバッファー形態、例えば、拭き取り試料が入れられたバッファー、バッファーが加えられた尿試料等を含む。
【０５２５】
本明細書において使用される、語句「癌又は癌の素因の存在の指標である」は、特定の結果が、癌が存在すること、及び/又は前癌状態が存在するか、又は恐らく存在することを示す傾向にあることを意味する。この語句は、状態が存在するという最終的な決断を暗に示さない。最終的な決断は、医師が適当であるとみなすさらなる検査又は試験に基づきなされ得る。更に、この語句は、特定の結果にのみ基づいて、どの状態が存在し得るかに関して決定が下されることを要求しない。むしろ、他の検査又はテキスト結果に照らして陽性の結果を考慮して、異なった診断に達すると考えられる。
【０５２６】
用語「チューブ充填手法」は、カセット上よりむしろ(例えば、GENEXPERT(登録商標)、又は本明細書に記載される改変GENEXPERT(登録商標)カートリッジを使用するよりむしろ)標準的な実験装置を使用して実行される手法を指す。
【発明を実施するための形態】
【０５２７】
様々な実施形態において、DNA試料におけるメチル化の迅速な検出及び/又は特徴付けを促進する装置並びに方法が提供される。ある特定の実施形態において、自動化反応カートリッジが提供され、また、DNA試料のメチル化の解析を促進し、場合により、DNAメチル化の決定と共にmRNAレベルを測定するために自動化反応カートリッジを利用する方法も提供される。様々な実施形態において、DNAメチル化は、亜硫酸水素塩変換、及び亜硫酸水素塩で変換されたDNAの解析(例えば、メチル化特異的PCR、核酸配列決定、融点解析等を介する)により決定される。ある特定の実施形態において、カートリッジは、DNAの亜硫酸水素塩変換の全て又は一部及び亜硫酸水素塩で変換されたDNAの解析の全て又は一部を行う。ある特定の実施形態において、カートリッジは、亜硫酸水素塩変換及び亜硫酸水素塩で変換されたDNAの解析の全て又は一部に関与する工程の全てを行う。ある特定の実施形態において、カートリッジは、亜硫酸水素塩変換及び亜硫酸水素塩で変換されたDNAの解析の全てに関与する工程の全てを行う。ある特定の実施形態において、カートリッジは、解析されるべきDNAの単離及び精製を追加で行う。
【０５２８】
例えば、全体的な処理時間における低減、効率における改善、減少したユーザーエラー及びばらつき、工程間での喪失の最小化、及びより少量の試料を使用する改善された能力を含む、メチル化解析を自動化するいくつかの利点が存在する。本明細書に記載される、カートリッジベースのプロセスにより、複数の試料種類の迅速かつ容易な試験だけでなく、乳癌、結腸直腸の癌、前立腺癌、及び肺癌を含むが、これらに限定されない、いくつかの異なる種類の癌において観察されるメチル化変化を評価することが可能になる。
本明細書において記載されるカートリッジベースの方法は、同じ試料からもたらされたmRNAの測定を追加で可能にする。DNAメチル化に関与する対応する上流及び/又は下流のmRNAの測定は、エピジェネティック修飾の機序及び活性を理解するのに重要であり得る。例えば、DNAメチルトランスフェラーゼ(DNMT)mRNAの測定は、いくつかの癌についてのDNAメチル化と共に研究されている(Table 1(表1)を参照)。
【０５２９】
【表１】
2020503858.tif 000002
【０５３０】
大抵、DNA又はRNAの別々の独立した抽出が、遺伝子及び転写産物を研究し、測定するために使用される。同じ試料調製物からの同時検出は、試料調製、アッセイ間、試料間、及び細胞間の変異性を最小にするのに理想である。
【０５３１】
DNAのカートリッジベースの亜硫酸水素塩変換
ある特定の実施形態において、DNAの抽出、亜硫酸水素塩変換、及びメチル化特異的PCRは、全て、カートリッジにおいて行われる。1つの例示的な実施形態において、使用者は、試料を溶解/結合試薬に加え、次に、試薬を簡単に混合/ボルテックスし、次に、試料をカートリッジ中の試料ポート又はチャンバーに加える。例示的だが、非限定的な溶解試薬(FFPE切片に特に十分に適した試薬を含む)が、PCT特許公開第WO/2014/052551号(PCT/US2013/061863)に記載され、そこに記載される試薬は、参照により本明細書に組込まれる。
【０５３２】
血清又は血漿用及びホルマリン固定したパラフィン包埋(FFPE)試料用の追加の例示的な溶解試薬が、実施例において示される(それぞれ、Table 13(表13)及びTable 14(表14))。
【０５３３】
ある特定の実施形態において、カートリッジが、処理モジュールに入れられ、処理モジュールを制御するソフトウエア内のセレクションのセットをクリック・スルーすることにより、アッセイが開始される(例えば、図11A及び図11Bを参照)。次に、カートリッジは、亜硫酸水素塩変換プロセス及び亜硫酸水素塩で変換されたDNAの解析を行う。ある特定の実施形態において、mRNAも決定される。ある特定の実施形態において、操作の全てが、カートリッジにおいて行われる一方、他の実施形態において、様々な操作のサブセットが、以下に記載される通り、カートリッジにおいて行われる。
【０５３４】
試料は、メチル化状態が評価されるべきDNAを含有する任意の生物学的試料を含み得る。例示的な試料は、単離されたDNA及び/又は単離されたトータルの核酸、細胞、組織、核酸を含有する生体体液等を含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、生物学的試料は、血漿、血清、羊水、唾液、粘液、尿、膵液、及び脳脊髄液からなる群から選択される生体体液を含む。ある特定の実施形態において、試料は、健常組織由来の組織試料、又は疾患試料の組織試料を含む。ある特定の実施形態において、組織試料は、胎児、新生児、小児、青年、又は大人由来である。ある特定の実施形態において、組織試料は、腫瘍細胞を含み、及び/又は腫瘍(例えば、乳癌、前立腺癌、脳癌、頸部の癌、卵巣癌、膵臓癌、大腸癌、胃癌、肝細胞癌等)の生検からもたらされる。ある特定の実施形態において、試料は、固定した組織、例えば、ホルマリン固定した組織試料を含む。ある特定の実施形態において、試料は、包埋組織試料(例えば、ホルマリン固定したパラフィン包埋(FFPE)組織試料)を含む。
【０５３５】
DNAの亜硫酸水素塩変換は、典型的には、4工程:
1)DNA精製;
2)DNA変性;
3)DNA変換(例えば、亜硫酸水素塩脱アミノ);及び
4)アルカリ脱スルホン化
を含む。
【０５３６】
典型的には、DNA変換(例えば、亜硫酸水素塩のような変換試薬を使用する)は:1)スルホン化:シトシンの5〜6個の2重結合への重硫酸塩の付加;及び2)加水分解脱アミノ:生じたシトシン-重硫酸塩誘導体の加水分解脱アミノにより、ウラシル-重硫酸塩誘導体を得ることを含む。これに、アルカリ脱スルホン化:アルカリ処理によるスルホン酸基の除去により、上で示されたウラシルを得ることが続く。
【０５３７】
上で示した通り、ある特定の実施形態において、DNA精製は、試料をカートリッジに入れるのに先立ち、行われるか、又は或いは、カートリッジ自体により行われる。したがって、ある特定の実施形態において、試料は、反応カートリッジに直接加えられ、一方、他の実施形態において、試料は、1つ又は複数の試薬と混合される。ある特定の実施形態において、DNA調製は、典型的には、実質的に単離されたDNAを調製することを含む。これは、細胞を溶解してDNAを放出させること、粒子及び細胞デブリを除去すること、及び/又はタンパク質成分を除去して、実質的に純粋な核酸(例えば、実質的に純粋なDNA及び/又はDNAとRNAの実質的に純粋な組合せ)を含む試料をもたらすことを含んでもよい。1つの例示的だが、非限定的な実施形態において、試料(例えば、組織試料)は、溶解試薬に加えられ、撹拌され、次に、さらなる処理のため、カートリッジに挿入される。
【０５３８】
ある特定の実施形態において、DNAの亜硫酸水素塩変換を行うのに必要な試薬の全てが、カートリッジにおいて提供される。ある特定の実施形態において、カートリッジにおける経時的な試薬の分解を回避するために、ある特定の試薬が、使用の直前にカートリッジに加えられる。したがって、例えば、ある特定の実施形態において、カートリッジは、試料がカートリッジにロードされるとき又はおよそその時に、変換試薬(例えば、亜硫酸水素塩試薬)及び/又はグアニジウムチオシアネート試薬(例えば、GTC-EtOH-Tween)がロードされると考えられる。ある特定の実施形態において、グアニジニウムチオシアネート試薬(例えば、GTC-EtOH-Tween)は、試料と合わせられ、試料を受け取るチャンバー中のカートリッジ(例えば、GENEXPERT(登録商標)カートリッジ中のチャンバー2)に加えられる。
【０５３９】
ある特定の実施形態において、反応カートリッジ(例えば、GENEXPERT(登録商標)カートリッジ)を使用して、DNAの亜硫酸水素塩変換を行うとき、方法は、
i)核酸を含む生物学的試料を第1のカラム又はフィルターを含む第1のマトリックス材料に接触させる工程であって、当該マトリックス材料が、当該試料中の核酸と結合及び/又は濾過し、これにより、DNAを精製する、工程;
ii)結合したDNAを第1のマトリックス材料から(例えば、アルカリ溶液を使用して)溶出し、DNAを変性して、溶出された変性したDNAを生成する工程;
iii)溶出されたDNAを変換試薬(例えば、亜硫酸水素イオンをもたらす試薬)の存在下で加熱して、変換された(例えば、脱アミノ化した)核酸を生成する工程;
iv)変換された核酸を第2のマトリックス材料を含む第2のカラムに接触させ、当該脱アミノ化した核酸を当該第2のマトリックス材料に結合させる工程(ある特定の実施形態において、第2のカラムは、第1のカラムと異なり得るか、又は他の実施形態において、同じカラムが二度使用され得ることに注意);
v)脱アミノ化された核酸をアルカリ溶液と接触させて、変換された(例えば、亜硫酸水素塩で変換された)核酸を生成することにより、結合した脱アミノ化された核酸を脱スルホン化する工程及び/又は核酸を同時に溶出し、脱スルホン化する工程;並びに
vi)変換された核酸を当該第2のマトリックス材料から溶出する工程
を含み、少なくとも工程iv)〜vi)が、1つの反応カートリッジにおいて行われる。
【０５４０】
ある特定の実施形態において、方法は、変換されたDNAの解析を更に含む。したがって、ある特定の実施形態において、方法は:
vii)変換された核酸上でメチル化特異的PCR及び/又は核酸配列決定、及び/又は高分解能融解解析(HRM)を行い、核酸のメチル化を決定する工程
を更に含み、少なくとも工程iv)〜vi)が、単一の反応カートリッジにおいて行われる。
【０５４１】
ある特定の実施形態において、少なくとも工程iii)〜vi)は、1つの反応カートリッジにおいて行われる。
【０５４２】
ある特定の実施形態において、少なくとも工程ii)〜vi)は、1つの反応カートリッジにおいて行われる。
【０５４３】
ある特定の実施形態において、少なくとも工程i)〜vi)は、1つの反応カートリッジにおいて行われる。
【０５４４】
ある特定の実施形態において、少なくとも工程i)〜vii)は、1つの反応カートリッジにおいて行われる。
【０５４５】
第1のカラム、及び、存在する場合、第2のカラムが、別々のカラムを指すことに注意されたい。しかしながら、特に、反応カートリッジに組込まれたとき、「カラム」は、単に、カートリッジ中のチャンバー又はチャネルに配置されたマトリックス材料であり得る。様々な実施形態において、「カラム」は、核酸を結合するフィルター及び/又は親和性カラムとして機能を果たす。したがって、ある特定の実施形態において、カラムは、核酸(例えば、DNA及び/又はRNA)を結合するマトリックス材料を含有する。例示的なマトリックス材料は、ガラス(シリカ)、イオン交換樹脂、ヒドロキシアパタイト等を含むが、これらに限定されない。マトリックス材料は、多数の形態をとることができることは理解される。したがって、ある特定の実施形態において、マトリックス材料は、繊維材料、粒子材料(例えば、マイクロビーズ、ナノビーズ等)、構造物質(例えば、多孔質「バッフル」システム、蛇行チャネル等)を含む。ある特定の実施形態において、第1のカラム及び第2のカラムは、異なるカラム(チャンバー又はチャネル)である。他の実施形態において、第1のカラム及び第2のカラムは、2回(例えば、1度目及び2度目)使用される同じカラム(チャンバー又はチャネル)である。
【０５４６】
ある特定の実施形態において、第1のマトリックス材料と接触させるのに先立ち、例えば、最初の試料を精製するための1つ又は複数の追加のフィルターが、考慮される。したがって、例えば、ある特定の実施形態において、フィルターマトリックス(例えば、ポリカーボネートフィルター、ナイロンフィルター、ポリプロピレンフィルター、ポリエステルフィルター、ナイロンフィルター、セラミックフィルター、ポリテトラフルオロエチレンフィルター等)が、試料を受け取るチャンバー又は試料を受け取るチャンバーの「下流」かつ第1の「カラム」の前に配置される。ある特定の実施形態において、試料は、試料を受け取るチャンバーへの蓄積に先立ち、溶解され、及び/又は濾過され得る。
【０５４７】
ある特定の例示的だが、非限定的な実施形態において、本明細書において記載される方法は、GENEXPERT(登録商標)カートリッジ(Cepheid、Inc社、Sunnyvale、CA)又はその異形を使用して行われ得る。様々な実施形態において、試料抽出、及び/又は増幅、及び/又はDNA変換、及び/又は検出は、全て、この自己完結型の「カートリッジ中の実験室」内で行われ得る(例えば、米国特許第5,958,349号、6,403,037号、6,440,725号、6,783,736号、及び6,818,185号を参照、それぞれが、全体が、参照により本明細書に組込まれる)。様々な実施形態において、カートリッジのコンポーネントは、試薬を含有する処理チャンバー、フィルター、及び標的核酸を抽出し、精製し、増幅するのに有用な捕捉テクノロジーを含み得るが、これらに限定されない。バルブにより、チャンバーからチャンバーへの流体移動が可能になり、核酸溶解及び濾過コンポーネントを含有する。光学ウィンドウにより、(例えば、PCR増幅産物の)リアルタイムの光学的検出が可能になる。非常に迅速な加熱及び/又は熱サイクリングを可能にする反応チューブが提供され得る。
【０５４８】
ある特定の実施形態において、例示的なGENEXPERT(登録商標)カートリッジは、中心バルブアセンブリの周囲に設けられ中心バルブアセンブリと選択的に流体連通にある複数のチャンバーを含み、中心バルブアセンブリが、中心バルブと流体連通にあるチャンバーに又はそこから流体を引き出す能力があるプランジャーを収納する。バルブアセンブリの回転により、どのチャンバーが中心バルブと流体連通にあるかを決定する。1つの例示的なGENEXPERT(登録商標)カートリッジが、図1Aに説明され、それは、カートリッジ、処理/試薬チャンバー、反応チューブ(例えば、加熱及び/又は熱サイクリングチューブ)、任意選択の光学ウィンドウ、及びチャンバーからチャンバーへの流体の移動を促進するバルブを示す。
【０５４９】
カートリッジの例示的なレイアウトが、図1Bに示され、それは、カートリッジの上面図であり、数字により様々なチャンバーを同定している。1つの代表的だが、非限定的な実施形態において、カートリッジを含むチャンバーのコンポーネントは、Table 2(表2)に挙げられる通りである。試薬及びチャンバーのこの配置は、代表的だが、非限定的であることは理解される。本明細書において提供される教示を使用して、他の試薬の配置及び/又は他のチャンバーの構造は、当業者にとって入手可能である。
【０５５０】
【表２】
2020503858.tif 000003
【０５５１】
かかるカートリッジを利用したDNAチル化の決定についての工程毎のワークフローの1つの実施形態が、図1Cに示される。このカートリッジ構成において、使用時に(例えば、カートリッジを操作して、DNAメチル化を決定するとき)、試薬及びバッファーを保持する5つのチャンバー(例えば、チャンバー3、4、5、8、及び10)、使用者により加えられる試料を保持する1つのチャンバー(例えば、チャンバー2)、並びに解析試薬(例えば、酵素反応、鋳型特異的反応、及び/若しくは200mMトリスpH7.0のようなMSP試薬を、例えば、ビーズとして)保持する1つ又は2つの(若しくはそれ以上の)チャンバー(例えば、チャンバー9及びチャンバー11)が存在する。ある特定の実施形態において、試薬(例えば、ポリメラーゼ、逆転写酵素、プライマー、プローブ)は、溶液において提供される。ある特定の実施形態において、試薬は、凍結乾燥粉末として提供される。ある特定の実施形態において、試薬は、凍結乾燥ビーズとして提供される。ビーズは、試薬安定性及び/又は活性を改善する剤を更に含み得る(例えば、米国特許公開第2006/0068399号を参照し、それは、ビーズ、ビーズ分画、及びそこに記載されるビーズ製剤について、参照により本明細書に組込まれる)。
【０５５２】
ある特定の実施形態において、カートリッジを実行するのに必要な試薬の全て、及び試料(例えば、バッファー/溶解/沈殿溶液中の試料)のみを含有するとして提供されるカートリッジが、カートリッジに加えられる。ある特定の実施形態において、カートリッジは、GTC-EtOH及び/又は亜硫酸水素塩試薬なしで提供され、一方又は両方が、使用時に加えられる。したがって、ある特定の実施形態において、GTC-EtOH試薬は、使用時に、カートリッジに加えられ、ある特定の実施形態において、亜硫酸水素塩試薬(試料に加えて)は、使用時に、チャンバーに加えられ、ある特定の実施形態において、GTC-EtOHと亜硫酸水素塩試薬(試料に加えて)の両方は、使用時に、カートリッジに加えられる。ある特定の実施形態において、これらの試薬は、所望のチャンバーに直接加えられる(例えば、Table 2(表2)を参照)。ある特定の実施形態において、ポートは、試薬をロードするため提供され、ポートは、所望のチャンバーに試薬を運ぶために構成される。
【０５５３】
アッセイの開始時に、カートリッジは、試料を、例えば、チャンバー2からカートリッジ中のガラス繊維カラム(例えば、第1のカラム)上に分注する。DNAは、カラムから溶出され、チャンバー10のアルカリ溶液、例えば、低濃度の水酸化カリウムからチャンバー4中の濃亜硫酸水素塩試薬(例えば、濃亜硫酸水素アンモニウム)により、同時に変性される。ある特定の実施形態において、DNAは、約10.5より低いpH、又は約pH12より高いpHを有するKOHのアルカリ溶液で溶出される。ある特定の実施形態において、DNAは、10〜15mM KOHで溶出される。
【０５５４】
上で示した通り、DNAは、(場合により、超音波処理のバーストで)亜硫酸水素塩試薬に溶出される。様々な実施形態において、変換試薬(例えば、亜硫酸水素塩試薬)は、約4M〜約10M又は約5M〜約8Mの範囲、又は約6M又は約7Mの濃度で存在する。ある特定の実施形態において、亜硫酸水素塩溶液は、メタ重亜硫酸ナトリウム、又は亜硫酸水素カリウム、又は亜硫酸水素アンモニウム、又は亜硫酸水素セシウム、又はDABSO(1,4-ジアゾニアビシクロ[2.2.2]オクタン-1,4-ジスルフィネート、例えば、図16を参照)を含む。ある特定の実施形態において、変換試薬(例えば、亜硫酸水素塩試薬)は、硫酸塩への亜硫酸酸化を防ぐための1つ若しくは複数の化学物質(TROLOX及びヒドロキノン)を含むが、これらに限定されないラジカルスカベンジャー、及び/又は触媒(ポリアミン)を含有する。
【０５５５】
次に、DNA-亜硫酸水素塩(DNA/変換試薬)混合物が、温度制御されたチャンバー又はチャネルに導入され、約40℃〜約95℃の範囲にある温度でインキュベーションされる。ある特定の実施形態において、混合物は、一定温度でインキュベーションされ、一方、他の実施形態において、例えば、温度制御されたチャンバー又はチャネルが、熱サイクリングチャンバー又はチャネル(例えば、カートリッジの後ろのスマートサイクラーチューブ)である場合、混合物は、熱サイクルされる(例えば、60℃から95℃の間)。混合物は、DNAが変換される(例えば、脱アミノ化される)まで、インキュベーションされる。ある特定の実施形態において、インキュベーションは、約5分間〜最大約4時間、又は好ましくは、約15分間〜最大約45分の範囲にある期間である。
【０５５６】
インキュベーション後、DNA/変換試薬(例えば、DNA-亜硫酸水素塩)溶液は、例えば、チャンバー3の新鮮グアニジニウムチオシアネート-EtOHと混合され、マトリックス材料に分注される。ある特定の実施形態において、1つのみのカラムが存在し、第2のカラム及び第1のカラムが同じであるため、第1のカラムはすすがれる。ある特定の実施形態において、第2のカラムは、第1のカラムと異なる別々のカラムである。
【０５５７】
第2のカラムマトリックス材料に結合したDNAは、新鮮GTC-EtOH(例えば、チャンバー3の)で洗浄され、すすがれる(例えば、チャンバー8の例えば、PEG200リンスで)。次に、DNAは、カラム上で脱スルホン化されるか、又は脱アミノ化した核酸をアルカリ溶液(例えば、チャンバー10のKOH)と接触させて、亜硫酸水素塩で変換された核酸を生成することにより、同時に溶出され、脱スルホン化される。ある特定の実施形態において、インキュベーションは、約1分間〜約1時間、又は約5分間〜約30分間、又は約10分間〜約20分間の範囲にある、又は約15分間の期間である。
【０５５８】
最初のインキュベーションが、更に使用されるべきである熱サイクリングチャンバーにおけるものであった場合、熱サイクリングチャンバー又はチャネルをバッファーで洗浄して、残りの亜硫酸水素塩が取り除かれ、pHが中和される。変換試薬(例えば、亜硫酸水素塩試薬)とのインキュベーション及び/又は脱スルホン化は、後のPCR反応と実質的に干渉する亜硫酸水素塩混入を起こすことなく、PCRのため後に使用されるチャネル又はチャンバーにおいて行われ得ることは、驚くべき発見であった。
【０５５９】
溶出された脱スルホン化された亜硫酸水素塩で変換されたDNAは、適当なバッファーと混合され、メチル化について解析され得る。ある特定の実施形態において、変換されたDNAは、チャンバー9及びチャンバー11において、濃トリス、酵素反応液、並びに鋳型特異的ビーズ(例えば、PCR若しくはネステッドPCR反応のためのプライマー及び/又はプローブを含むビーズ)と混合され、最終混合物が、メチル化特異的定量的PCR反応のための熱サイクリングチューブ又はチャンバーに吸引される。
【０５６０】
qPCR工程中の亜硫酸水素塩混入は、メチル化カートリッジの基本的な失敗様式であり得る。残りの亜硫酸水素塩は、PCR反応チューブの直接的混入(例えば、亜硫酸水素塩変換工程中)又は間接的混入(例えば、チャンバー間の亜硫酸水素塩の流体移動中の混入に渡る)のいずれかから生じ得る。残りの亜硫酸水素塩混入は、存在するなら、典型的には、バックグラウンドの減算のため使用される早期のqPCRサイクル(サイクル1〜10)中に蛍光における増大をもたらす、qPCR工程中に亜硫酸水素塩介在性プローブ切断により測定され得る。したがって、ある特定の実施形態において、カートリッジは、亜硫酸水素塩が存在するなら、PCR中に切断可能である1つ又は複数のプローブをもたらすビーズを含む。亜硫酸水素塩混入を含有する実行の結果は、図14に示される。
【０５６１】
上の方法(及び実施例4における、例えば、図13Aを参照)は、GENEXPERT(登録商標)カートリッジ中の特定のチャンバーに関して記載される一方、特定の試薬/チャンバーの割当は、適用されるメチル化解析プロトコールの詳細に依存して変動され得る。
【０５６２】
したがって、例えば、メチル化解析カートリッジ(例えば、GENEXPERT(登録商標)カートリッジ)の操作は、一般的に、フローチャートにより記載され得る(例えば、図1C及び図13Bを参照)。図13Bに示される、代表的だが、非限定的な実施形態において、DNA試料は、結合バッファー(例えば、GTC-EtoHを含むバッファー、ある特定の実施形態において、試料が、プロテアーゼK及び/又は溶解溶液で処置された後)において提供される。ある特定の実施形態において、試料は、本明細書に記載される試料調製カートリッジから得られる(例えば、図20を参照)。
【０５６３】
結合バッファー中の試料は、カートリッジの試料を受け取るチャンバーに導入される。操作において、カートリッジを操作して、試料溶液がDNAを結合するマトリックス(「カラム」)に運ばれる。次に、結合したDNAは、亜硫酸水素塩試薬と合わせたアルカリ試薬(例えば、KOH溶液)を使用してカラムから溶出され、亜硫酸水素塩反応が進む(例えば、この例示的なプロトコールにおいて、約50℃又は約60℃〜約90℃で約45分間(若しくは最大約90分間))カートリッジ中の加熱チューブ(典型的には、PCR反応チューブ)に移動される。反応したDNAは、結合バッファー(例えば、2.25Mグアニジンチオシアネート、22.5mMトリスpH7.0、0.5%Tween20、50%エタノール、及び0.005%SE-15消泡剤(10%活性化ケイ素消泡剤と非イオン性乳化剤のエマルジョン))と合わされ、同じカラム、又は異なるカラムに再度戻され、そこで、それがカラムマトリックスに再度結合する。反応したDNAは、GTC-EtOHで洗浄され、PEG(例えば、PEG200)ですすがれ、DNAを脱スルホン化もするアルカリ試薬(例えば、KOH)を使用して、カラムから再度溶出される。DNAを脱スルホン化しながら、反応チューブ(例えば、PCR反応チューブ)を加熱し、すすぎ(例えば、10×リンス)、亜硫酸水素塩試薬が取り除かれ得る。溶出されたDNA(又はその一部)は、PCR及び/又はネステッドPCR用の反応チューブに移動され得る。
【０５６４】
これらの操作が、全試料上又はDNA試料の一部上で行われ得ることは、十分理解されるだろう。後者の場合において、試料の一部は、1つ又は複数のチャンバーにおいて保存され、対照として使用されるか、又は異なる解析/プロトコールの対象にされ得る。
【０５６５】
RNA発現とDNAメチル化両方の同時精製及び検出
ある特定の実施形態において、カートリッジベースのアッセイ(例えば、GENEXPERT(登録商標)カートリッジを利用する)におけるDNAメチル化(MSP)と共に遺伝子の変化したRNA発現両方の同時精製及び検出の方法が提供される。ある特定の実施形態において、これらのアッセイは、例えば、同じ試料調製物由来の腫瘍特異的メチル化と相関するDNMTの変化した発現を同定する。ある特定の実施形態において、これらのアッセイを使用して、発現及びメチル化状況を検証することができる。
【０５６６】
本発明者らは、トリスバッファー溶出液を使用して、核酸の一部をカラム上に保持するカラムから核酸を溶出することができることを示した。1つの例示的な実施形態において、RNA分画は、トリス溶液を使用して、溶出され、例えば、カートリッジ中のチャンバーにおいて保持される。
【０５６７】
RNA分画を保存後、NaOH又はKOH溶出液は、カラムをむき出しにし、DNAを溶出し、変性し、それを、上で記載された変換用亜硫酸水素塩に移す。次に、RNA溶出分画を使用して、亜硫酸水素塩変換されたDNAをカラムから溶出すること、又はKOH溶出液混合液を使用して、2つの分画(RNA及び変換されたDNA産物)が、RNAプラス亜硫酸水素塩変換されたqRT-PCRのため混合される。これは、同じ試料由来の同じチューブにおいてRNAプラスMSPのための逆転写(RT)工程(又は他の解析方法)を組込むことを含む。代替の方法は、qPCRのためのDNA(cDNA及びDNAを合わせる)との混合に先立ち、独立してRT工程を行うことを含むが、これらに限定されず、又はDNA若しくはRT RNA用のPCRは、1つの熱サイクリングチューブ/チャンバーを使用して独立して/連続して、又はカートリッジ中の複数の熱サイクリングチューブ/チャンバーを使用して同時に行われ得る。
【０５６８】
変換されたDNAの解析
多数の解析方法を、カートリッジにおいて行い、DNAメチル化が評価され得る。或いは、ある特定の実施形態において、カートリッジは、変換された(例えば、亜硫酸水素塩若しくはDABSOで変換された)DNAのさらなる解析のための別の装置及び/又はシステムに連結され得る。例示的な方法は、メチル化特異的PCR(MSP)、直接的配列決定、高分解能融解解析(HRM)、パイロシークエンシング(追加の配列決定)、塩基特異的な切断解析(例えば、塩基特異的MALDI-TOF)等を含むが、これらに限定されない。
【０５６９】
メチル化特異的PCR(MSP)
様々な実施形態において、メチル化特異的PCRを使用して、標的DNAのメチル化状態を評価することができる。MSPは、変換されていない5-メチルシトシンのみに相補的である配列を含むことにより、「メチル化特異的」、又は逆に、メチル化されていないシトシンから変換されたチミンに相補的である、「非メチル化特異的」であるよう設計されたプライマー及び/又はプローブセットを利用した。次に、メチル化は、増幅を達成する特異的なプライマーの能力により決定される。増幅されるべき標的内の増大した数の変換されていないメチルシトシンは、PCRの特異性を増大するので、この方法は、高いメチル化密度の領域におけるCpGアイランドを調べるのに特に有効である。ある特定の実施形態において、プライマーの3'末端にCpG対を入れることも、特異性を改善する。
【０５７０】
ある特定の実施形態において、メチル化は、MethyLight方法を使用して評価される。MethyLight方法は、MSPに基づくが、定量的PCRを使用して定量的解析をもたらす(例えば、Eadesら、(2000)、Nucleic Acids Res.、28(8):E32. doi:10.1093/nar/28.8.e32を参照)。メチル化特異的プライマーが使用され、増幅された領域にアニーリングするメチル化特異的蛍光レポータープローブも使用される。代替の様式において、含まれる配列内のCpG対間での識別が必要とされるなら、メチル化特異性を有しないプライマー又はプローブが設計され得る。メチル化された参照DNAに関して、定量が成され得る。首尾よく亜硫酸水素塩で変換されたDNA(ConLight-MSP)についてPCRの特異性を増大するためのこのプロトコールへのある修飾は、亜硫酸水素塩で変換されていないDNAに対する追加のプローブを使用して、この非特異的な増幅を定量する(例えば、Randら、(2002)Methods 27(2):114〜120頁を参照)。
【０５７１】
様々な実施形態において、MethyLight方法は、TAQMAN(登録商標)テクノロジーを利用し、それは、PCR増幅中のTaqポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性による二重標識された蛍光性ハイブリダイゼーションプローブの切断に基づく(Eadsら、(1999年)Cancer Res.、59:2302〜2306頁;Livakら、(1995)、PCR Meth. Appl.、4:357〜362頁;Leeら、(1993) Nucleic Acids Res.、21:3761〜3766頁;Finkら、(1998)Nat. Med.、4:1329〜1333頁)。TAQMAN(登録商標)テクノロジーにおける3種の異なるオリゴヌクレオチド(フォワード及びリバースのPCRプライマー並びに蛍光性ハイブリダイゼーションプローブ)の使用は、いくつかの配列検出ストラテジーの機会を提供する。
【０５７２】
例えば、配列の識別は、PCR増幅プロセスのレベルで(例えば、図4A、パネルCを参照)及び/又は蛍光性プローブハイブリダイゼーションのレベルで(例えば、図4A、パネルBを参照)で生じ得る。両方の工程において、識別は、完全に一致したオリゴヌクレオチド対ミスマッチオリゴヌクレオチドの異なるアニーリングに基づく。MethyLightテクノロジーにおいて、PCR増幅レベルでの配列の識別は、DNAメチル化の可能性のある部位(例えば、CpGジヌクレオチド)と重複するようにプライマー及びプローブ又はプライマーのみ若しくはプローブのみを設計することにより、生じる。1つのアプローチは、単に、MSP技術の蛍光ベースのバージョンである(Hermanら、(1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93:9821〜9826頁)。それぞれのオリゴヌクレオチド(プライマー及びプローブ)は、0から複数のCpGジヌクレオチドまでのどこでもカバーすることができる。それぞれのCpGジヌクレオチドは、特定の部位がメチル化されている(mCpG)か、又はメチル化されていない(UpG)かどうかに依存して、亜硫酸水素塩変換後に2つの異なる配列バリエーションを生じ得る。例えば、オリゴヌクレオチドが、2つのCpGジヌクレオチドと重複するなら、そのオリゴヌクレオチドによりカバーされる領域内のゲノムDNAにおける可能性のある配列バリアントの数は、2×2=4である。プライマーとプローブの両方がそれぞれ、2つのCpGと重複するなら、オリゴヌクレオチドによりカバーされる配列内に含有されるバリアントの総数は、4×4×4=64である。理論では、これらの可能性のある64種の配列バリアントのそれぞれの相対量を解析するための別々のPCR反応を設計することができる。しかしながら、2つの最も極端な配列バリアントをこの仮想例として表す、完全にメチル化された分子と完全にメチル化されていない分子についての反応を設計することにより、有意なメチル化情報が、ずっと少数のバリアントの解析からもたらされ得る。これらの2つの反応間の比、又はメチル化反応と対照反応との間の比は、この遺伝子座でのメチル化された分子の出現率の測定をもたらす。
【０５７３】
MethyLightテクノロジーをまた改変して、PCR増幅レベルでの配列の識別が回避され得る。プライマーもプローブもCpGジヌクレオチドと重ならないなら、反応は、公平な増幅を表し、インプットDNAの量の対照として働き得る。1つの例示的な有用な対照反応は、全増幅産物が、変換されていないゲノム配列中のCpGジヌクレオチドを欠くものである。プローブのみが、CpGジヌクレオチドをカバーするように設計されるなら、配列の識別は、プローブハイブリダイゼーションのレベルで専ら生じる。このバージョンにおいて、亜硫酸水素ナトリウム変換工程から生じる全ての配列バリアントは、増幅のバイアスが存在しない限り、等しい効率で増幅される(例えば、Wameckeら、(1997)、Nucleic Aciss Res.、25:4422〜1426頁を参照)。この場合には、特定のメチル化パターンと関連する異なる配列バリアントのそれぞれについての別々のプローブ(2つのCpGの場合には、2×2=4プローブ)の設計により、PCR産物の混ざったプロトコールにおいてそれぞれの配列パーミュテーションの相対的出現率の定量的決定を可能にする。
【０５７４】
ある特定の実施形態において、解析方法はまた、変換されていないDNAに特異的なPCRをもたらす。このPCRは、SNP、変異、及び/又は転座等を調べてもよい。この関連で、単一のカートリッジにおける変異及びメチル化の検出が、実施例12において説明されることに注意されたい(例えば、図27A及び図27Bを参照)。SNP、変異、転座等の検出は、これらの標的の検出に特異的なプライマー及びプローブセットを含むことにより容易に成され得る。
【０５７５】
ネステッドPCR及びマルチプレックスPCRアッセイ
ある特定の実施形態において、メチル化されたDNAは、当業者に周知のPCR方法を使用して検出され得る。ある特定の実施形態において、ネステッドPCR反応を使用して、メチル化標的が検出される。1つの代表的だが、非限定的な実施形態(例えば、実施例4を参照)において、ネステッドPCRプロトコールが使用され、ここで、第1の15〜20サイクルのPCR反応は、メチル化に特異的ではないが、変換されたDNA配列にのみ特異的である(すなわち、それらは、CpGに渡らないか、又はそれらが、R=プリン又はY=ピリミジンである場合、メチル化された鋳型配列とメチル化されていない鋳型配列の両方を捕捉するため使用される)。第2のqPCR反応(例えば、45サイクルのqPCR反応)は、典型的な2〜3個のメチル化されたCpGに特異的であるプライマーとプローブの両方を含有し得る。
【０５７６】
ある特定の実施形態において、MethyLight解析は、単一のプローブを使用して行われることに注意される(例えば、図4Bを参照)。このアプローチにおいて、メチル化特異的フォワード(FW)及びリバース(RV)プライマーと共に単一の、例えば、メチル化特異的プローブ(PR3)を使用して、プローブ(PR3)についてのメチル化特異的PCRは、FW、RV及びPR3配列について、メチル化並びに亜硫酸水素塩変換に依存するシグナルをもたらす。
【０５７７】
様々な実施形態において、マルチプレックスPCRアッセイが考慮される。説明の目的で、図4Cは、それぞれが異なる領域を標的にする複数のプローブ(PR1、PR2、...PR5)を使用するMethyLightアプローチを説明する。全てのプローブ(PR1、PR2、PR3、PR4、及びPR5)からの合わせたシグナルは、メチル化の量/程度の測定を生じる。ある特定の実施形態において、それぞれのプローブは、それが、独立して他のプローブを検出可能であるよう、それ自体の特異的な色素/蛍光を有する。したがって、1つの標的がメチル化されない場合でさえ、シグナルは依然として検出され得、例えば、PR3がメチル化されないなら、残るプローブからのシグナルが全く存在しないか、わずかのシグナルが存在する。図4Dは、それぞれが同じ領域を標的にするが、異なるメチル化パターンについてのシグナルをもたらす複数のプローブ(PR1...PR5)を使用するMethyLightアプローチを説明する。図4Cにおいて説明されるアプローチは、より大きな領域からの検出をもたらす一方、単一のより小さい領域でのこの複数プローブアプローチは、亜硫酸水素塩変換後の特異的な配列に渡るメチル化の程度を調べる配列特異的なプライマー又はプローブで成され得る。
【０５７８】
ある特定の実施形態において、両方の鎖についての逆相補的なマルチプレックスアッセイが使用され得る(例えば、図26を参照)。亜硫酸水素塩変換後、両方の鎖は、それらの相補性を失う。したがって、プライマー及びプローブセットは、一方の鎖又は他方について設計され、固有の増幅産物をもたらし得る。検出の機会をよりもたらすことに加えて、このアプローチは、感度に役立つ(LODで、一方の鎖のみ又は他方の鎖がチューブに留まってしまう場合、このアプローチは、シグナルが取り上げられることを確実にする)。このアプローチは、マルチプレックスアッセイが、同じプロモーター部位で異なるCpGを検出するまで拡大されることを可能にする。逆相補的なマルチプレックスは、標的メチル化を検出し、不均一なメチル化を取り上げるより多くの機会をもたらす。
【０５７９】
前述の方法は、説明であり、限定するものではない。本明細書において提供される教示を使用し、MSP及び/又はMethyLight解析の多数のバリエーションが、当業者にとって入手可能であり、例えば、本明細書に記載される反応カートリッジ上で実行可能である。
【０５８０】
直接的な配列決定
ある特定の実施形態において、DNAのメチル化状態は、直接的な配列決定方法を使用して決定され得る。ある特定の実施形態において、方法は、亜硫酸水素塩変換に抵抗性のヌクレオチドを直接決定するためのPCR及び標準的ジデオキシヌクレオチドDNA配列決定を利用することができる(例えば、Frommerら、(1992)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89(5):1827〜1831頁を参照)。様々な実施形態において、目的のメチル化部位に隣接する(が、含まない)、鎖特異的並びに亜硫酸水素塩特異的であるプライマー(例えば、それらが、亜硫酸水素塩で処理されていないDNAに相補的でないように、非CpGシトシンを含有するプライマー)が、設計される。それ故、それは、メチル化特異的PCRと対照的に、メチル化された配列とメチル化されていない配列の両方を増幅する。メチル化されていないシトシンの全ての部位は、センス鎖の生じた増幅された配列中のチミンとして、及び増幅されたアンチセンス鎖中のアデニンとして提示される。ある特定の実施形態において、ネステッドPCR方法を使用して、配列決定のため産物が増強され得る。
【０５８１】
ある特定の実施形態において、配列決定は、カートリッジにおいて行われ得る。他の実施形態において、カートリッジを配列決定マシーンに連結して(例えば、流体連結して)、配列決定解析がもたらされ得る。或いは、ある特定の実施形態において、増幅産物は、カートリッジから配列決定システムに手動で移され得る。
【０５８２】
高分解能融解解析(HRM)
ある特定の実施形態において、高分解能融解解析(HRM)を使用して、変換されていない亜硫酸水素塩で処理されたDNAから変換されたものが区別され得る。HRMは、PCR増幅産物が、温度ランピング、及び融解中に挿入蛍光色素の生じた遊離により直接解析される定量的PCR技術である(例えば、Wojdacz及びDobrovic、(2007)、Nucleic Acids Res.、35(6):e41を参照)。増幅産物におけるTに対するCの含有量により表される、メチル化の程度は、融解の速度及び結果として生じる色素の放出を決定する。この方法により、直接的な定量を可能になるが、特異的なCpG部位でよりむしろ全体として増幅された領域におけるメチル化を評価することを可能になる。
【０５８３】
パイロシークエンシング
ある特定の実施形態において、パイロシークエンシング(合成による配列決定)を使用して、メチル化特異的PCRを使用することなく、亜硫酸水素塩で処理されたDNAが解析され得る(例えば、Colellaら、(2003)、BioTechniques35(1):146〜150頁;Tostら、(2003)、BioTechniques35(1):152〜156頁;等を参照)。合成による配列決定は、ジデオキシヌクレオチドでの連鎖停止反応よりむしろ、ヌクレオチド取り込み上でのリン酸塩放出の検出を利用するサンガー配列決定と異なる。DNA配列は、典型的には、可能性のあるA/T/C/Gヌクレオチドの4つのうち1つのみが、加えられ、1文字のみが、1本鎖の鋳型(決定されるべき配列である)上で取り込まれ得る時に入手可能であるという事実により、次の相補的なヌクレオチドの取り込みの際に放出される光により決定することができる。
【０５８４】
目的の領域のPCR増幅後、パイロシークエンシングを使用して、特定の領域(例えば、CpG部位)の亜硫酸水素塩で変換された配列が決定され得る。ある特定の実施形態において、個々の部位でのTに対するCの比は、配列伸長中のC及びT取り込みの量に基づき定量的に決定され得る。
【０５８５】
この技術の改変は、一塩基多型(SNP)を配列決定プライマーの配列に取り込み、これにより、母系及び父系の対立遺伝子の別々の解析を可能にする対立遺伝子特異的なプライマーを利用し得る(例えば、Wongら、(2006)、BioTechniques41(6):734〜739頁を参照)。この改変は、ゲノムインプリンティング解析に特に役に立つ。
【０５８６】
塩基特異的な切断解析
ある特定の実施形態において、塩基特異的な切断/MALDI-TOFは、塩基特異的な切断工程を加えて、ヌクレオチド変化から得られた情報を増強することにより、亜硫酸水素塩変換を利用する(Ehrichら、(2005)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、102(44):15785〜15790頁)。まず、目的の領域のRNAへのインビトロ転写を使用することにより(最初の増幅産物においてRNAポリメラーゼプロモーター部位をPCRプライマーに加えることにより)、RNase Aを使用して、塩基特異的な部位でのRNA転写産物が切断され得る。RNase Aは、シトシン及びウラシルリボヌクレオチドで特異的にRNAを切断し、シトシン特異的な(C特異的な)切断が所望されるとき、取り込まれる切断抵抗性dTTPを、ウラシル特異的な(U特異的な)切断が所望されるとき、取り込まれるdCTPを加えることにより、塩基特異性が達成される。次に、切断されたフラグメントは、MALDI-TOF又は他の方法により解析され得る。亜硫酸水素塩処理は、CからUへの変換による切断部位の導入/除去、又は増幅されたリバースの鎖におけるGからAへの変換によるフラグメント質量におけるシフトのいずれかをもたらす。C特異的な切断は、全てのメチル化されたCpG部位で特異的に切断する。得られたフラグメントのサイズを(例えば、MALDI-TOF、キャピラリー電気泳動、マイクロチップ電気泳動等を使用して)解析することにより、全体としての領域のメチル化の程度を決定することよりむしろ、領域内のCpG部位のDNAメチル化の特定のパターンを決定すること可能である。
【０５８７】
メチル化感受性1本鎖立体構造解析(MS-SSCA)
メチル化感受性1本鎖立体構造解析(MS-SSCA)は、一塩基多型(SNP)解析のため開発された1本鎖立体構造多型解析(SSCA)方法に基づく(Biancoら、(1999)、Hum. Mutat.14(4):289〜293頁)。SSCAは、非変性電気泳動における異なる泳動に基づき、同一のサイズだが、異なる配列の1本鎖DNAフラグメント間を区別する。MS-SSCAにおいて、これを使用して、目的のCpG部位を含有する亜硫酸水素塩で処理されたPCR増幅された領域間を区別する。単一のみのヌクレオチドの相違が存在するとき、SSCAは感度を欠くが、亜硫酸水素塩処理は、目的の大部分の領域において多数のCからTへの変換を生じ、得られた感度は高くなり得る。ある特定の実施形態において、MS-SSCAはまた、バンド強度の比に基づきDNAメチル化の程度の半定量的な解析をもたらし得る。しかしながら、典型的には、MS-SSCAは、個々のメチル化部位よりむしろ、目的の領域中の全体として全てのCpG部位を評価する。
【０５８８】
メチル化標的
上で示された通り、DNAメチル化は、広範な数の文脈において関心の対象である。ある特定の実施形態において、DNAメチル化の量は、特に腫瘍学において臨床上の関心の対象である。異常なDNAメチル化パターン(正常組織と比較して過剰メチル化及び低メチル化)は、多数のヒト悪性腫瘍と関連している。過剰メチル化は、典型的には、プロモーター領域中のCpGアイランドで生じ、遺伝子不活性化と関連する。より低レベルの白血球DNAメチル化は、多くの種類の癌と関連する(Zhangら、(2011)、Epigenetics、6(3):293〜299頁)。全体的な低メチル化はまた、異なる機序を通じて癌の発生及び進行に関与する。典型的には、腫瘍抑制遺伝子の過剰メチル化及び癌遺伝子の低メチル化が存在する(例えば、Lundら、(2004)、J. Biol. Chem.279(28):29147〜29154頁を参照)。
【０５８９】
この関連で、DNAメチル化が、ステージIの非小細胞肺癌(NSCLC)の予後の指標をもたらすことが知られている。特に、5つの遺伝子の過剰メチル化が、ステージIのNSCLCにおけるより短い無再発生存期間(RFS)と関連することが発見された:HIST1H4F、PCDHGB6、NPBWR1、ALX1、及びHOXA9。多数の低メチル化現象に基づく特性は、高いリスクと低いリスクのステージIのNSCLCを有する患者を区別した(例えば、Sandovalら、(2013)、J. Clin. Oncol.、4140〜4147頁を参照)。
【０５９０】
同様に、悪性グリオーマが、そのプロモーター領域のメチル化に起因して不活性化されたMGMT遺伝子を有し得ることが観察された。現在の研究により生み出された予測は、MGMT遺伝子のメチル化により、化学療法への良好な応答が生じ得ることである(腫瘍は、アルキル化剤により誘導されるDNA損傷を修復するための手段を有さないため)。グリオーマにおいて、MGMTプロモーターのメチル化は、放射線又は化学療法のいずれかの設定において好ましい予後マーカーである(例えば、//neurosurgery.ucsd.edu/brain-tumor-research-mgmt/を参照)。
【０５９１】
さらなる説明の目的で、Table 3(表3)は、ある特定の癌において過剰メチル化されている様々な遺伝子を説明する。
【０５９２】
【表３】
2020503858.tif 000004
【０５９３】
様々な例示的だが、非限定的な実施形態において、次の遺伝子のプロモーターのいずれか1つ又は複数のメチル化の測定が、考慮される:APC、ARF、CDKN2B、CDKN2A、BRCA1、VLH、hMLH1、MGMT、RASSF1A、ADAMTS1、BNC1、HIST1H3C、HOXB4、RASGRF2、TM6SF1、AKR1B1、HIST1H4F、PCDHGB6、NPBWR1、ALX1、及びHOXA9。
【０５９４】
膵臓癌
ある特定の実施形態において、メチル化状態は、メチル化状態が、膵臓癌の存在及び/又は予後のマーカーである1つ又は複数のプロモーターについて決定される。ADAMTS1、又はBNC1の1つ又は複数のメチル化の頻度を使用して、膵臓癌が検出及び/又は段階分けされ得ることが決定された。したがって、膵臓癌の例示的だが、非限定的なメチル化マーカーは、ADAMTS1及び/又はBNC1を含むが、これらに限定されない。これらの遺伝子のプロモーターでのメチル化の検出のための例示的なプライマー及びプローブが、以下のTable 4(表4)(特定の配列についてTable 5(表5)を参照)、及び実施例4のTable 12(表12)に示される。ある特定の実施形態において、プライマー及びプローブは、変換されたDNAのフォワード鎖におけるメチル化及び/又は変換されたDNAのリバース鎖におけるメチル化の検出のため提供される。
【０５９５】
乳癌
ある特定の実施形態において、メチル化状態は、メチル化状態が、乳癌の存在及び/又は予後のマーカーである1つ又は複数のプロモーターについて決定される。乳癌の例示的なメチル化マーカーは、ASSF1A、及び/又はAKR1B1、及び/又はHOXB4、及び/又はHIST1H3C、及び/又はRASGRF2、及び/又はTM6SF1を含むが、これらに限定されない。これらの遺伝子のプロモーターでのメチル化の検出のための例示的なプライマー及びプローブが、以下のTable 4(表4)(特定の配列についてTable 5(表5)を参照)、及び実施例4のTable 11(表11)に示される。
【０５９６】
ある特定の実施形態において、メチル化状態は、メチル化状態が、肺癌の存在又は可能性のマーカーである1つ又は複数のプロモーターについて決定される。肺癌の例示的なメチル化マーカーは、CDO1、SOX17、TAC1、及び/又はHOXA7を含むが、これらに限定されない。
【０５９７】
本明細書において記載される方法は、これらの遺伝子のプロモーターのメチル化に限定されない。本明細書において記載される方法を使用し、目的の本質的に任意の標的のメチル化が可能である。
【０５９８】
しかしながら、DNAメチル化の測定は、プロモーター中のCPGアイランドでのメチル化の測定に限定されることを必要としないことが知られている。例えば、遺伝子体のメチル化がまた、遺伝子発現を変化させ、癌における治療標的をもたらし得ることが示されている(例えば、Yangら、(2014)、Cancer Cell、26(4):577〜590頁を参照)。
【０５９９】
加えて、DNAメチル化の測定は、癌以外の病理の予後/治療適用を有する。例えば、染色体13、18、21、X、及びY上の領域での異常なメチル化を使用して、ダウン症候群が診断され得る(例えば、Patsalisら、(2012)、Exp. Opin. Biol. Ther.12(Suppl.1):S155〜S161頁を参照)。胎児DNA及び母親のDNAは、異なってメチル化され、母親の血漿中の細胞フリーDNAは、胎児DNAの供給源をもたらし得、非侵襲的に得られ、それを利用して、前述の染色体(又は他の染色体若しくは遺伝子)のメチル化状態が評価され得る。
【０６００】
上で示された通り、ある特定の実施形態において、本明細書において記載されるカートリッジ及び方法を使用して、mRNAレベルも決定され、例えば、様々なメチルトランスフェラーゼの発現が決定される。ある特定の実施形態において、RNAの発現レベルは、DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B、及びTNMT3Lからなる群から選択されるメチルトランスフェラーゼについて決定される。
【０６０１】
プライマー/プローブ及びマルチプレックス解析
様々な実施形態において、本明細書に記載される方法は、ネステッドPCR反応を含み得、本明細書に記載されるカートリッジは、かかるネステッドPCR反応のための試薬(例えば、プライマー及びプローブ)を含有し得る。例えば、ある特定の実施形態において、メチル化は、1、2、3、4、5、又は6つの遺伝子(遺伝子プロモーター)について検出される。DNAの亜硫酸水素塩変換は、シトシン残基をウラシルに変えるが、5-メチルシトシン残基には影響を与えないので、変換された(亜硫酸水素塩で変換された)DNAのフォワード及びリバース鎖は、もはや相補的でない。したがって、フォワード及びリバース鎖を独立して(例えば、マルチプレックスPCR反応において)調べて、メチル化検出に対する追加の特異性及び感度をもたらすことが可能である。かかる場合では、単一の標的のアッセイは、2-プレックスのマルチプレックスアッセイを含み得、一方、2、3、4、5、又は6つの標的遺伝子のアッセイは、4-プレックス、6-プレックス、8-プレックス、10-プレックス、又は12-プレックスのマルチプレックスアッセイを含み得る。ある特定の実施形態において、アッセイを、2つのマルチプレックス反応液に分けて、例えば、フォワード及びリバース鎖を独立してアッセイし得る。しかしながら、複数のマルチプレックスアッセイに分けるとき、アッセイのグループ化は、フォワード又はリバースによるものであることを必要とせず、単に特定のPCR反応条件に最も適合するプライマー/プローブセットを含み得ることは、理解される。
【０６０２】
上で示される通り、メチル化(又はその欠如)が癌と関連する遺伝子プロモーターのフォワード及び/又はリバース鎖上でのメチル化状態の検出/特徴付けにより、多数の癌が、同定され、及び/又は段階分けされ得、及び/又はそれについての予後が、決定され得る。様々な癌と関連する例示的な遺伝子(プロモーター)標的が、上で記載され、以下でTable 4(表4)に示される。それぞれの癌についてTable 4(表4)に示される遺伝子の1つ又は複数のメチル化(フォワード鎖及び/若しくはリバース鎖)を決定して、示した癌を同定し、及び/又は段階分けし、及び/又は予後をもたらし得ることは、理解される。ある特定の実施形態において、特定の癌について示された遺伝子(フォワード及び/又はリバース鎖)の全てのメチル化状態が、単一のマルチプレックスPCR反応において決定され得る。
【０６０３】
【表４Ａ】
2020503858.tif 000005
【０６０４】
【表４Ｂ】
2020503858.tif 000006
【０６０５】
様々な遺伝子のプロモーターでのメチル化の検出のための例示的なプライマー及びプローブが、以下のTable 5(表5)、並びに実施例4におけるTable 11(表11)及びTable 12(表12)に示される。ある特定の実施形態において、これらのプライマー及び/又はプローブは、マルチプレックス増幅における使用に特に適している。
【０６０６】
【表５Ａ】
2020503858.tif 000007
【０６０７】
【表５Ｂ】
2020503858.tif 000008
【０６０８】
【表５Ｃ】
2020503858.tif 000009
【０６０９】
【表５Ｄ】
2020503858.tif 000010
【０６１０】
【表５Ｅ】
2020503858.tif 000011
【０６１１】
【表５Ｆ】
2020503858.tif 000012
【０６１２】
【表５Ｇ】
2020503858.tif 000013
【０６１３】
【表５Ｈ】
2020503858.tif 000014
【０６１４】
【表５Ｉ】
2020503858.tif 000015
【０６１５】
【表５Ｊ】
2020503858.tif 000016
【０６１６】
【表５Ｋ】
2020503858.tif 000017
【０６１７】
【表５Ｌ】
2020503858.tif 000018
【０６１８】
【表５Ｍ】
2020503858.tif 000019
【０６１９】
【表５Ｎ】
2020503858.tif 000020
【０６２０】
【表５Ｏ】
2020503858.tif 000021
【０６２１】
【表５Ｐ】
2020503858.tif 000022
【０６２２】
【表５Ｑ】
2020503858.tif 000023
【０６２３】
【表５Ｒ】
2020503858.tif 000024
【０６２４】
これらのプライマー及びプローブが、様々なフルオロフォア及びクエンチャーの位置を特定することが分かる。しかしながら、特定のフルオロフォア及びクエンチャーは、代表であり、限定するものではなく、多数の増幅及び/又は検出ストラテジーが、本明細書に記載されるカートリッジにおいて利用され得ることは、理解される。したがって、様々な実施形態において、本明細書に記載される方法及び装置は、多くの異なる核酸ハイブリダイゼーションプローブを利用し得る。典型的には、シグナル生成のため、プローブは、フルオロフォアと相互作用する分子若しくは部分の間の距離を変化させることによりもたらされる別の分子又は部分とのその相互作用における変化に起因するフルオロフォアの蛍光における変化を利用する。或いは、放射性標識プローブの使用を含むが、これに限定されない、試料中のポリヌクレオチドを検出する他の方法が考慮される。
【０６２５】
蛍光ベースのアッセイは、典型的には、蛍光における変化が、別のフルオロフォア又はクエンチャーのいずれかである相互作用する応答エネルギーのアクセプターから第1のフルオロフォアを分ける距離における変化により引き起こされることによる、蛍光共鳴エネルギー移動、又は「FRET」でのシグナル生成に頼る。フルオロフォアと、クエンチャー分子若しくは部分を含む、相互作用する分子又は部分との組合せは、「FRET対」として知られている。FRET対相互作用の機序は、典型的には、対の1つのメンバーの吸収スペクトルが、他のメンバーである第1のフルオロフォアの発光スペクトルと重複することを要求する。相互作用する分子又は部分が、クエンチャーであるなら、その吸収スペクトルは、典型的には、フルオロフォアの発光スペクトルと重複する(例えば、Stryer、(1978)、Ann. Rev. Biochem.47:819〜846頁;Selvin、(1995)、Meth. Enzymol.246:300〜335頁;等を参照)。効率的なFRET相互作用は、典型的には、対の吸収及び発光スペクトルが、大きな程度の重複を有するとき、達成される。FRET相互作用の効率は、その重複と直線的に比例する。典型的には、非常に大きなシグナル(すなわち、高い程度の重複)が所望される。それ故、フルオロフォアとクエンチャーの対を含む、FRET対は、典型的には、その原理に基づき選ばれる。
【０６２６】
様々な標識された核酸ハイブリダイゼーションプローブ並びにFRET及びFRET対を利用する検出アッセイが公知である。1つのかかるスキームが、Cardulloら、(1988)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、85:8790〜8794頁、及びHellerら、欧州特許第0070685号により記載される。それは、標的DNA鎖の連続する領域に相補的なオリゴデオキシヌクレオチドの対を含むプローブを使用する。1つのプローブ分子は、その5'末端上に蛍光標識、フルオロフォアを含有し、他のプローブ分子は、その3'末端上に異なる蛍光標識、フルオロフォアも含有する。プローブが、標的配列にハイブリダイズされるとき、2つの標識は、互いに非常に密接してもたらされる。試料が、適当な頻度の光により刺激されるとき、一方の標識から他方への蛍光共鳴エネルギー移動が生じる。FRETは、標識からのスペクトル応答における測定可能な変化を生じ、それが、標的の存在のシグナルとなる。1つの標識は、とりわけ、加熱するにつれ、受け取ったエネルギーを放出する相互作用部分(又は分子)であり得る「クエンチャー」であり得る。
【０６２７】
FRET対を利用する別の種類の核酸ハイブリダイゼーションプローブアッセイは、Gelfandら、米国特許第5,210,015号、及びLivakら、米国特許第5,538,848号に記載される「TaqMan(登録商標)」アッセイである。プローブは、典型的には、FRET対で標識された1本鎖オリゴヌクレオチドである。TaqMan(登録商標)アッセイにおいて、DNAポリメラーゼは、それが標的の鎖にハイブリダイズするとき、オリゴヌクレオチドプローブの切断により単一又は複数のヌクレオチドを放出する。その放出は、FRET対のクエンチャー標識及びフルオロフォア標識を分ける方法をもたらす。
【０６２８】
ある特定の実施形態において、例えば、Tyagiら、米国特許第6,150,097号に記載されるもののような、非FRET蛍光プローブも使用され得る。例えば、Tiyagiらの特許は、どのように、標識対の吸収スペクトルにおける変化が、蛍光における変化の代替として、検出可能なシグナルとして使用され得るかを記載する。吸収における変化が利用されるとき、標識対は、任意の2つの発色団、すなわち、フルオロフォア、クエンチャー、及び他の発色団を含んでもよい。標識対は、同一の発色団でありさえする。
【０６２９】
ある実施形態において、クエンチャーのような、色素及び他の部分が、本明細書に記載される方法及びカートリッジにおいて使用されるプライマー並びに/又はプローブに導入される。ある特定の実施形態において、かかる色素及びクエンチャーは、FRETプローブとしての使用に適した色素(フルオロ)を含むが、これに限定されない。ある特定の実施形態において、色素及び/又はクエンチャーは、修飾されたヌクレオチドを含む。「修飾されたヌクレオチド」は、化学的に修飾されているが、依然として、ヌクレオチドとして機能するヌクレオチドを指す。ある実施形態において、修飾されたヌクレオチドは、共有結合した、色素又はクエンチャーのような、化学部分を有し、例えば、ポリヌクレオチドの固相合成により、ポリヌクレオチドに導入され得る。ある実施形態において、修飾されたヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドが核酸に取り込まれる前、最中、若しくは後に、色素又はクエンチャーと反応し得る1つ或いは複数の反応基を含む。ある実施形態において、修飾されたヌクレオチドは、アミン修飾されたヌクレオチド、すなわち、反応性アミン基を有するよう修飾されたヌクレオチドである。ある実施形態において、修飾されたヌクレオチドは、ウリジン、アデノシン、グアノシン及び/又はシトシンのような、修飾された塩基部分を含む。ある実施形態において、アミン修飾されたヌクレオチドは、5-(3-アミノアリル)-UTP;8-[(4-アミノ)ブチル]-アミノ-ATP、及び8-[(6-アミノ)ブチル]-アミノ-ATP;N6-(4-アミノ)ブチル-ATP、N6-(6-アミノ)ブチル-ATP、N4-[2,2-オキシ-ビス-(エチルアミン)]-CTP;N6-(6-アミノ)ヘキシル-ATP;8-[(6-アミノ)ヘキシル]-アミノ-ATP;5-プロパルギルアミノ-CTP、5-プロパルギルアミノ-UTPから選択される。ある実施形態において、異なる核酸塩基部分を有するヌクレオチドは、同様に修飾され、例えば、5-(3-アミノアリル)-UTPの代わりの5-(3-アミノアリル)-GTPである。多くのアミン修飾されたヌクレオチドは、例えば、Applied Biosystems社、Sigma社、Jena Bioscience社及びTriLink社から市販されている。適当なフルオロの例示的だが、非限定的なリストが、Table 6(表6)において示される。
【０６３０】
【表６Ａ】
2020503858.tif 000025
【０６３１】
【表６Ｂ】
2020503858.tif 000026
【０６３２】
アッセイが、1つの標的DNA配列を検出するよう設計され、次に、1つのみの蛍光ハイブリダイゼーションプローブが、使用される必要があるなら、ある特定の実施形態において、FAM、TET、又はHEX(若しくはTable 7(表7)に挙げられるそれらの代替の1つ)が、プローブを標識するための良好なフルオロフォアである。これらのフルオロフォアは、容易に励起され、様々な分光蛍光熱サイクラーにおいて検出され得る。加えて、これらのフルオロフォアのホスホルアミダート誘導体が利用可能であり、クエンチャー結合制御多孔性ガラスカラムが利用可能であるため、これらの標識を有する蛍光ハイブリダイゼーションプローブは、プローブ製造が比較的安価かつあまり人手を要しないことを利点として、自動DNA合成プロセスにおいて完全に合成され得る。
【０６３３】
【表７】
2020503858.tif 000027
【０６３４】
ある特定の実施形態において、複数の標的遺伝子は、単一のマルチプレックス反応において検出される。ある実施形態において、異なる遺伝子に標的化されるそれぞれのプローブは、マルチプレックス反応において利用される他のプローブからスペクトルで区別可能である(検出可能に異なる)。マルチプレックス検出に適したプローブの組合せは、当業者に公知である。例えば、4つの標的マルチプレックスシステムにおいて検出可能に異なるフルオロフォアの例示的な組合せは:
1)FAM、TMR、Texas red、及びCy5;
2)FAM、TET、TMR、及びTexas Red;
3)FAM、HEX、Texas red、及びCy5;並びに
4)FAM、Cy3、Texas red、及びCy5
を含むが、これらに限定されない。
【０６３５】
5つの標的マルチプレックスシステムにおいて検出可能に異なるフルオロフォアの例示的な組合せは、FAM、TET、TMR、Texas Red、及びCy5である。6つの標的マルチプレックスシステムにおいて検出可能に異なるフルオロフォアの例示的な組合せは:
1)FAM、TET、HEX、TMR、ROX、及びTexas red;並びに
2)FAM、HEX、LC red 610、LC red 640、LC red 670、及びLC red 705
を含むが、これらに限定されない。
【０６３６】
フルオロフォアのこれらの組合せは、例示的であり、限定するものではなく、多数の他のフルオロフォアが、当業者にとって入手可能であることは、理解される。
【０６３７】
上で示された通り、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を利用する蛍光ハイブリダイゼーションプローブの設計のため、十分なスペクトルの重複を有するフルオロフォアとクエンチャーの対が、選ばれるべきである。FAM、TET及びHEXのような、発光極大500〜550nmを有するフルオロフォアは、ダブシル、BHQ-1等のような、吸収極大450〜550nmを有するクエンチャーにより最もよくクエンチされる(例えば、例示的なクエンチャー標識についてTable 8(表8)を参照)。ローダミン(TMR、ROX及びTexas redを含む)並びにCy色素(Cy3及びCy5を含む)のような、550nmより上の発光極大を有するフルオロフォアは、550nmより上の吸収極大を有するクエンチャー(BHQ-2を含む)により有効にクエンチされる。
【０６３８】
接触クエンチングを利用する蛍光ハイブリダイゼーションプローブの設計のため、任意の非蛍光クエンチャーは、フルオロフォアからのエネルギーの良好なアクセプターとして働き得る。例えば、Cy3及びCy5は、BHQ-1及びBHQ-2クエンチャーにより有効にクエンチされる。
【０６３９】
【表８】
2020503858.tif 000028
【０６４０】
ある特定の実施形態において、ヌクレオチドは、フルオロフォアの蛍光を、最も効率的なクエンチャーであるグアノシン、続いて、アデノシン、シチジン及びチミジンでクエンチし得る。一般に、励起波長500から550nmの間を有するフルオロフォアは、より長い励起波長を有するフルオロフォアよりヌクレオチドにより効率的にクエンチされる。蛍光ハイブリダイゼーションプローブの設計において、グアノシンの直ぐ次にフルオロフォア標識を置くことを回避して、フルオロフォアからのより大きな蛍光シグナルを確実にすることが望まれ得る。
【０６４１】
接触クエンチングにより相互作用するいくつかのフルオロフォアとクエンチャー対の安定効果は、ハイブリダイゼーションプローブの設計についての重大な結果を有し得る(例えば、Marrasら、(2002)、Nucleic Acids Res. 30:e122;Johanssonら、(2002)、J. Am. Chem. Soc.124:6950〜6956頁を参照)。例えば、BHQ-1又はBHQ-2のいずれかによりクエンチされたフルオロフォアで標識されたハイブリダイゼーションプローブが、同じプローブ配列を有するが、ダブシルによりクエンチされたフルオロフォアで標識されたハイブリダイゼーションプローブと比較して、約4℃のハイブリッド融解温度において増大を示すことが、観察された。強い親和性が、Cy標識、Cy3及びCy5とBlack HoleクエンチャーBHQ-1及びBHQ-2の間で観察されることは、知られている。
【０６４２】
前述及び実施例、並びに本明細書において提供される教示を考慮して、多数のプライマー/プローブの組合せが、本明細書に記載される方法及びカートリッジでの使用に利用可能である。
【０６４３】
DNAメチル化解析のためのカートリッジ、モジュール及びシステム
ある特定の実施形態において、カートリッジは、本明細書において記載される方法を行うために提供される(例えば、DNAメチル化、及び場合により、RNA発現の決定)。ある特定の実施形態において、カートリッジは、第1のマトリックス材料を含むカラム、試料を受け取るチャンバー、温度制御チャネル又はチャンバー、試薬及び/又はバッファーを含有する複数のチャンバーを含み、使用時には、当該チャンバーの少なくとも1つが、DNA変換試薬(例えば、DABSO及び/又は亜硫酸水素塩試薬)を含有し、脱スルホン化/溶出バッファーを含有し、当該カートリッジは、場合により、当該第2のマトリックス材料を含む第2のカラムを含む。ある特定の実施形態において、カートリッジは、使用時に、カートリッジが、グアニジニウムチオシアネートエタノール(GTC-EtOH)を含む試薬を含有するチャンバーを含むように、構成される。ある特定の実施形態において、第2のカラムは、存在せず、一方、他の実施形態において、第2のカラムは、存在する。ある特定の実施形態において、温度制御チャネル又はチャンバーは、単に、加熱チャネル又はチャンバーであり得るか、又はそれは、熱サイクリングチャネル又はチャンバーであり得る。ある特定の実施形態において、カートリッジは、第2の加熱チャネル又はチャンバー(例えば、第2の熱サイクリングチャネル若しくはチャンバー)を更に含む。ある特定の実施形態において、カートリッジは、DNA変換工程(例えば、亜硫酸水素塩インキュベーション)及び/又は脱スルホン化工程が、1つ若しくは複数のPCR反応が後に行われる同じ反応チューブ又はチャンバーにおいて生じるように、構成される。
【０６４４】
ある特定の実施形態において、亜硫酸水素塩試薬は、カートリッジのコンポーネントとして提供される。ある特定の他の実施形態において、カートリッジは、試料がカートリッジに入れられる時又はそれと近い時に亜硫酸水素塩試薬がカートリッジに加えられるように構成される。ある特定の場合には、亜硫酸水素塩試薬は、カートリッジ中のチャンバーに直接加えられ、一方、他の実施形態において、亜硫酸水素塩試薬は、カートリッジ上のローディングポート(例えば、注入ポート)に導入され、亜硫酸水素塩試薬がカートリッジに導入される。ある特定の実施形態において、亜硫酸水素塩試薬は、カートリッジを操作するシステム(例えば、処理モジュール)により、カートリッジに導入され、一方、カートリッジを操作して、DNAメチル化が決定される。
【０６４５】
ある特定の実施形態において、グアニジニウムチオシアネート(例えば、GTC-EtOH)を含む試薬は、カートリッジのコンポーネントとして提供される。ある特定の他の実施形態において、カートリッジは、試料がカートリッジに入れられる時又はそれと近い時にグアニジニウムチオシアネートを含む試薬がカートリッジに加えられるように構成される。ある特定の場合には、グアニジニウムチオシアネートを含む試薬は、カートリッジ中のチャンバーに直接加えられ、一方、他の実施形態において、グアニジニウムチオシアネートを含む試薬は、カートリッジ上のロードポート(例えば、注入ポート)に導入され、亜硫酸水素塩試薬がカートリッジに導入される。ある特定の実施形態において、グアニジニウムチオシアネートを含む試薬は、カートリッジを操作するシステム(例えば、処理モジュール)により、カートリッジに導入され、一方、カートリッジを操作して、DNAメチル化が決定される。
【０６４６】
様々な例示的だが、非限定的な実施形態において、変換試薬(例えば、亜硫酸水素塩試薬)は、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素セシウム、DABSO、及び亜硫酸水素アンモニウムからなる群から選択される化合物を含む。ある特定の実施形態において、亜硫酸水素塩は、亜硫酸酸化を防ぐためのスカベンジャー(例えば、Trolox、ヒドロキノン等)及び/又は触媒を含む試薬混合物において提供される。ある特定の実施形態において、亜硫酸水素塩は、ポリアミンを触媒として含む試薬混合物において提供される。
【０６４７】
様々な実施形態において、第1のマトリックス材料及び/又は当該第2のマトリックス材料は、存在する場合には、ガラス又はシリカ、イオン交換樹脂、及びヒドロキシアパタイトからなる群から選択される材料を含む。
【０６４８】
様々な実施形態において、カートリッジは、それぞれが、メチル化特異的PCRプライマー、メチル化特異的PCRプローブ、PCR酵素(例えば、ポリメラーゼ)、逆転写酵素、及びPCR反応バッファーからなる群から選択される1つ又は複数の試薬を含有する、1つ或いは複数のチャンバー(例えば、1つのチャンバー、2つのチャンバー、3つのチャンバー、4つのチャンバー等)を含む。
【０６４９】
ある特定の実施形態において、カートリッジは、亜硫酸水素塩で変換されたメチル化された及び/若しくはメチル化されていない配列に特異的なプライマーを含有する1つ又は複数のチャンバーを含有する。ある特定の実施形態において、カートリッジは、MethyLightPCRプロトコール用のプライマー及びプローブを含有する1つ又は複数のチャンバーを含む。ある特定の実施形態において、カートリッジは、TaqManPCR反応用の試薬を含有する1つ又は複数のチャンバーを含む。ある特定の実施形態において、カートリッジは、増幅されたメチル化配列についてのマーカーである1つ若しくは複数の蛍光プローブ、及び/又は増幅された非メチル化配列についてのマーカーである1つ若しくは複数の蛍光プローブを含有する1つ或いは複数のチャンバーを含む。ある特定の実施形態において、プローブは、プローブが、TaqDNAポリメラーゼの5'から3'へのヌクレアーゼ活性による切断の際にシグナルをもたらす蛍光レポーター色素及びクエンチャー色素を含む。ある特定の実施形態において、カートリッジは、それぞれが、目的の増幅された領域中の異なるメチル化された領域に特異的な複数のプローブを含む。ある特定の実施形態において、カートリッジは、目的の増幅された領域中のメチル化された領域に特異的な単一のプローブを含む。ある特定の実施形態において、カートリッジは、それぞれが、目的の増幅された領域中の同じメチル化された領域に特異的な複数のプローブを含む。
【０６５０】
例示的なプライマー及びプローブは、APC、ARF、CDKN2B、CDKN2A、BRCA1、VLH、hMLH1、MGMT、RASSF1A、ADAMTS1、BNC1、HIST1H3C、HOXB4、RASGRF2、TM6SF1、AKR1B1、HIST1H4F、PCDHGB6、NPBWR1、ALX1、及びHOXA9からなる群から選択される遺伝子のプロモーター領域のメチル化を決定するためのプライマー並びに/又はプローブを含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、プライマー及び/又はプローブは、MGMT、RASSF1A、ADAMTS1、BNC1、HIST1H3C、HOXB4、RASGRF2、TM6SF1、及びAKR1B1からなる群から選択される遺伝子のプロモーター領域のメチル化を決定するために選択される。様々な実施形態において、PCRプライマー、及び/又はプローブ、及び/又は酵素は、例えば、米国特許公開第2006/0068399号において記載されるビーズとして提供され、それは、そこに記載されるビーズ及びビーズ製剤について参照により本明細書に組込まれる。
【０６５１】
様々な実施形態において、カートリッジは、試料を受け取るチャンバー、当該カラム、複数のチャンバー、及び温度制御チャネル又はチャンバーが、選択的に流体連通にあるように、構成される。ある特定の実施形態において、選択的な流体連通は、マイクロ流体チャネル及びバルブによりもたらされる。ある特定の実施形態において、選択的な流体連通は、中心バルブの周囲に設けられ、当該中心バルブ中のチャネルと選択的に流体連通にある、試料を受け取るチャンバー、当該カラム、当該複数のチャンバー、加熱チャネル若しくはチャンバー又は加熱チャネル若しくはチャンバーへのポートを提供することにより、提供される。
【０６５２】
ある特定の実施形態において、カートリッジは、使用時に、カートリッジが:試料を含有する第1のチャンバー;グアニジニウムチオ硫酸塩-エタノール(GTC-EtOH)溶液を含有する第2のチャンバー;亜硫酸水素塩試薬含有する第3のチャンバー;第4のバッファーを含有するチャンバー;洗浄溶液を含有する第5のチャンバー;及び溶出/脱スルホン化試薬を含有する第6のチャンバーを含むように、構成される。ある特定の実施形態において、カートリッジは、PCRプライマー及び/又はプローブ及び/又はPCR酵素を含有する第7のチャンバーを含む。ある特定の実施形態において、カートリッジは、PCRプライマー及び/又はプローブ及び/又はPCR酵素を含有する第8のチャンバーも含む。
【０６５３】
図1A、図1B及び図2は、本明細書に記載される方法の実施の適した1つのカートリッジを説明する。説明されるカートリッジは、GENEXPERT(登録商標)カートリッジ(Cepheid、Inc社、Sunnyvale、CA)ベースである。図2に示される通り、パネルAのカートリッジ200は、複数の試薬及び/又はバッファーチャンバー208を含有するカートリッジボディ202を含む。チャンバーは、バルブボディ210と流体連通にあり(パネルB及び図1B)、ガスケット204で密封される、中心のシリンジバレル206の周囲に設けられる。バルブボディ210は、キャップ212を含み、全カートリッジボディは、カートリッジベース226上に支持され得る。示されていない「プランジャー」を操作して、シリンジバレル206に流体を引き出すことができ、シリンジバレル206の回転及び関連するバルブボディ212は、チャンバー208と本明細書に記載されるマトリックス材料を含有するキャビティ214の間での選択的流体連通をもたらし、カラムとして機能する。様々な実施形態において、カートリッジは、ある特定の実施形態において、熱サイクリングチャンバーとして機能し得る1つ若しくは複数の温度制御チャネル又はチャンバー216を更に含む。温度制御チャネル又はチャンバーはまた、キャビティ214及び/又はチャンバー208と選択的に流体連通にある。図1Aに示される通り、ある特定の実施形態において、カートリッジは、例えば、増幅産物、配列決定操作における塩基同一性等のリアルタイム検出をもたらすための光学ウィンドウを提供する。
【０６５４】
ある特定の実施形態において、カートリッジ200は、例えば、図3Aに示される、反応モジュール300への挿入用に構成される。図3Bにおいて説明される通り、モジュールは、カートリッジ200を受けるように構成される。ある特定の実施形態において、反応モジュールは、温度制御されたチャンバー又はチャネルを加熱するための加熱プレート308を提供する。モジュールは、場合により、追加で、温度制御チャネル又はチャンバーが、熱サイクリングチャネル又はチャンバーである場合、冷却をもたらすためのファン304を備える。電気回路302は、解析のためコンピューター上部で情報(例えば、光情報)を渡すために提供され得る。ある特定の実施形態において、モジュールは、1種又は複数の(例えば、1、2、3、4種若しくはそれ以上の)例えば、様々な核酸標的を表す光学シグナルの励起及び/或いは検出をもたらすための光学ブロック306を含有し得る。様々な実施形態において、電気コネクタ312は、システム(例えば、システムコントローラー)と又は離散解析/コントローラーユニットとインターフェースで接続するため提供され得る。図3Bにおいて説明される通り、試料は、ピペット310を使用してカートリッジに導入され得る。
【０６５５】
ある特定の実施形態において、モジュールはまた、シリンジバレル中のプランジャー及びバルブボディの回転を操作するコントローラーを含有する。
【０６５６】
ある特定の実施形態において、システム(例えば、処理ユニット)が提供される。1つの例示的だが、非限定的な実施形態が、図3Cに示される。ある特定の実施形態において、処理ユニットは、それぞれの処理モジュールが、本明細書に記載される取り外し可能なカートリッジを保持し、操作するように構成された1つ又は複数の試料処理モジュールを含有するように構成されたエンクロージャーを含む。ある特定の実施形態において、システムは、試料処理モジュールを操作して、試料処理を行い、対応する取り外し可能な試料カートリッジ内での1つ又は複数の標的核酸のメチル化を決定し、及び場合により、1つ又は複数の標的RNA/DNA配列のレベルを決定するように構成され、対応する取り外し可能な試料カートリッジ内での試料上での処理は、本明細書に記載される方法を行う。ある特定の実施形態において、システムは、1つの試料処理モジュールを含有するように構成される。ある特定の実施形態において、システムは、少なくとも2個の試料処理モジュール、又は少なくとも4個の試料処理モジュール、又は少なくとも8個の試料処理モジュール、又は少なくとも12個の試料処理モジュール、又は少なくとも16個の試料処理モジュール、又は少なくとも20個の試料処理モジュール、又は少なくとも24個の試料処理モジュール、又は少なくとも28個の試料処理モジュール、又は少なくとも32個の試料処理モジュール、又は少なくとも64個の試料処理モジュール、又は少なくとも128個の試料処理モジュールを含有するように構成される。ある特定の実施形態において、システムは、使用者が、操作指示をインプットし、及び/又はカートリッジの操作をモニターし、DNAメチル化を決定することを可能にするユーザー・インターフェースを提供する。
【０６５７】
本明細書に記載される方法は、Cepheid Inc社(Sunnyvale、CA)によるGENEXPERT(登録商標)カートリッジ(例えば、図1Aを参照)を参照して主に記載される一方、教示を考慮して、本明細書において提供される方法は、他のカートリッジ/マイクロ流体システム上で実行され得ることは、理解される。かかるカートリッジ/マイクロ流体システムは、例えば、ソフトリソグラフィーを使用して実行されるマイクロ流体システム、ハードリソグラフィーを使用して実行されるマイクロ/ナノ製造されたマイクロ流体システム等を含み得る。
【０６５８】
多量試料調製物(HVSP)カートリッジ
様々な実施形態において、カートリッジは、大きな試料体積の調製のため提供される。ある特定の実施形態において、試料調製カートリッジは、多量試料調製のため改変されたGENEXPERT(登録商標)カートリッジを含む(例えば、図20に示される通り)。ある特定の実施形態において、例えば、カートリッジが、GENEXPERT(登録商標)ベースであるとき、カートリッジは、DNAを結合する親和性マトリックスを含む1つ若しくは複数のチャネル又はチャンバー、中心バルブアセンブリの周囲に設けられ中心バルブと選択的に流体連通にある複数のチャンバーを含み、当該中心バルブアセンブリが、中心バルブと流体連通にあるチャンバーに又はそこから流体を引き出す能力があるプランジャーを収納するように構成されており、当該複数のチャンバーは、それぞれが、最大約4ml(又は最大約5ml)の試料溶液を受け取るように構成された少なくとも2つの異なるチャンバー(ある特定の実施形態において、チャンバー2は、約4mlの最大体積を有し、一方、チャンバー3は、約4.5mlの最大体積を有する)、PEG(例えば、PEG200)を含有するチャンバー、アルカリ溶液(例えば、KOH溶液)を含有するチャンバー、及びバッファー(例えば、トリス)を含有するチャンバーを含む。ある特定の実施形態において、複数のチャンバーは、それぞれが、最大約4ml(又は最大約5ml)の試料溶液を受け取るように構成された少なくとも3つの異なるチャンバーを含む。ある特定の実施形態において、複数のチャンバーは、洗浄溶液(例えば、典型的には、1.25Mグアニジニウムチオシアネート、25mMトリスpH7.0、50%エタノールであるGTCエタノール洗浄溶液)を含有するチャンバーを含む。ある特定の実施形態において、カートリッジは、処理された試料の除去用に構成されたチャンバーを含む。ある特定の実施形態において、試料チャンバーは、使用時に、試料溶液、GTC及びアルコール(例えば、イソプロパノール)を含有する。ある特定の実施形態において、試料チャンバーは、使用時に、試料溶液、GTC及びアルコールを実施的に等しい体積で含有する。ある特定の実施形態において、カートリッジは、使用時に、試料を受け取るように構成された当該チャンバーのそれぞれに配置された、試料溶液4ml、GTC及びイソプロパノ
ールを含む。ある特定の実施形態において、カートリッジは、試料の試料体積0.5mlから約4mlの間と実質的に相関するDNA又はRNA回収率をもたらす。
【０６５９】
ある特定の実施形態において、HVSPカートリッジは、DNA変換(例えば、亜硫酸水素塩変換)を行い、メチル化解析を提供するように構成される。したがって、ある特定の実施形態において、HVSPカートリッジは、変換試薬(例えば、亜硫酸水素塩試薬、DABSO等)の使用の直後若しくは直前に含有するか、又は受け取るように構成される。ある特定の実施形態において、HVSPカートリッジは、変換されたDNAの脱スルホン化をもたらすための試薬も含有するように構成され得る。或いは、ある特定の実施形態において、変換は、HSVPカートリッジにおいて行われ、一方、脱スルホン化及びメチル化解析(例えば、PCR)は、第2のカートリッジにおいて行われる(例えば、図20Bに示されるワークフローにおいて説明される)。
【０６６０】
2つのカートリッジのメチル化解析
様々な実施形態において、本明細書に記載されるメチル化解析方法は、例えば、図20Bに説明される、2つのカートリッジシステム(「第1の」カートリッジ(例えば、多量試料調製カートリッジ)、及び「第2の」カートリッジ(例えば、qPCRカートリッジ)のような2つのカートリッジ)を使用して行われる。この図において説明される通り、ある特定の実施形態において、試料調製及び亜硫酸水素塩変換は、第1のカートリッジにおいて行われ得る。次に、変換されたDNAは、第2のカートリッジに移され、そこで、洗浄され、脱スルホン化される。ある特定の実施形態において、第2のカートリッジを加えて利用し、例えば、PCR(例えば、メチル化特異的PCR)を介して変換された(又は変換されていない)DNAを解析する。
【０６６１】
ある特定の実施形態において、第1のカートリッジは、試料調製カートリッジが、本明細書に記載される亜硫酸水素塩変換試薬を含有する、上で記載された多量試料カートリッジであり得る。ある特定の実施形態において、多量カートリッジは、より多量のDNAの精製及び変換を可能にするためのより大きな試料チャンバー又は複数の試料チャンバーを提供する。
【０６６２】
ある特定の実施形態において、2つのカートリッジセットの第1のカートリッジは、試料を受け取るチャンバー、第1のマトリックス材料を含む「カラム」、温度制御チャネル又はチャンバー、試料除去チャンバー、並びに試薬及び/又はバッファーを含有する複数のチャンバーを含む。典型的には、使用時に、チャンバーの少なくとも1つは、亜硫酸水素塩試薬(例えば、本明細書に記載される)を含有する。ある特定の実施形態において、2つのカートリッジセットの第2のカートリッジは、試料を受け取るチャンバー、マトリックス材料を含む「カラム」、温度制御チャネル又はチャンバー、試薬及び/又はバッファーを含有する複数のチャンバーを含む。典型的には、使用時に、第2のカートリッジ中の複数のチャンバーの少なくとも1つは、脱スルホン化及び/又は溶出試薬を含有する。ある特定の実施形態において、第2のカートリッジは、PCR増幅(例えば、メチル化特異的PCR)及び増幅産物の検出用試薬を含有する。
【０６６３】
ある特定の実施形態、例示的だが、非限定的な実施形態において、第1のカートリッジを試料調製(例えば、DNAの第1のマトリックス材料(例えば、ガラス繊維)への結合、結合したDNAの洗浄及び溶出)、及び洗浄されたDNAの亜硫酸水素塩変換のため使用される。ある特定の実施形態において、亜硫酸水素塩変換は、洗浄されたDNAを亜硫酸水素塩試薬と合わせること、及び温度制御チャネル又はチャンバーにおいて混合物を加熱することを含む。次に、得られた変換されたDNAは、洗浄バッファー(例えば、1.25M GTC、25mMトリスpH7.0、50%エタノール)で洗浄され、試料除去チャンバー(例えば、チャンバー2)に移され、そこで、それは、除去され得る(例えば、ピペット、シリンジ又はシリンジポンプ等を使用して除去される)。
【０６６４】
ある特定の実施形態において、洗浄バッファー中の亜硫酸水素塩変換されたDNAは、第2のカートリッジの試料を受け取るチャンバーに導入される。第2のカートリッジを操作して、DNAを第2のマトリックス材料(例えば、ガラス繊維「カラム」)に結合させ、結合したDNAを洗浄し、溶出し、DNAを脱スルホン化する。ある特定の実施形態において、DNAは、カラム上で脱スルホン化されるか、又は第2のマトリックス材料から溶出される。ある特定の実施形態において、DNAは、第2のマトリックス材料からの除去後、脱スルホン化される。ある特定の実施形態において、次に、脱スルホン化されたDNAは、例えば、第2のカートリッジでのPCRのため酵素及びプライマー/プローブビーズと混合される。ある特定の実施形態において、脱スルホン化されたDNAは、除去され、さらなる解析(例えば、配列決定)のための第3のカートリッジ又は他の反応システムに導入され得る。
【０６６５】
ある特定の実施形態において、第1のカートリッジにおいて、試料を受け取るチャンバー、カラム、複数のチャンバー、試料除去チャンバー、及び温度制御された加熱チャネル又はチャンバーは、選択的に流体連通にあり(例えば、マイクロ流体チャネル及び/又はバルブにより);及び/又は、第2のカートリッジにおいて、試料を受け取るチャンバー、カラム、複数のチャンバー、及び温度制御された加熱チャネル又はチャンバーは、選択的に流体連通にある(例えば、マイクロ流体チャネル及び/又はバルブにより)。
【０６６６】
ある特定の実施形態において、第1のカートリッジにおいて、試料を受け取るチャンバー、カラム、複数のチャンバー、試料除去チャンバー、及び温度制御チャネル若しくはチャンバー又は温度制御チャネル若しくはチャンバーへのポートは、中心バルブの周囲に設けられ、中心バルブ中の1つ又は複数のチャネルと選択的に流体連通にある。中心バルブは、中心バルブと流体連通にあるチャンバーに又はそこから流体を引き出す能力があるプランジャーを収納し得る。ある特定の実施形態において、第2のカートリッジにおいて、試料を受け取るチャンバー、カラム、複数のチャンバー、及び温度制御チャネル若しくはチャンバー又は温度制御チャネル若しくはチャンバーへのポートは、中心バルブの周囲に設けられ、中心バルブ中の1つ又は複数のチャネルと選択的に流体連通にある。ある特定の実施形態において、中心バルブは、中心バルブと流体連通にある1つ若しくは複数のチャンバーに又はそこから流体を引き出す能力があるプランジャーを収納する。
【０６６７】
ある特定の実施形態において、第1のカートリッジ及び/又は第2のカートリッジは、GENEXPERT(登録商標)カートリッジ、又は改変されたGENEXPERT(登録商標)カートリッジ(例えば、図1A、図1B、図2、図13A、図17、及び図20Aにおいて説明される)である。ある特定の、例示的だが、非限定的な実施形態において、第1のカートリッジは、Table 9(表9)に示される通り、構成される。ある特定の実施形態において、チャンバーの番号は、図1Bに説明されるチャンバーに対応する。
【０６６８】
【表９】
2020503858.tif 000029
【０６６９】
ある特定の、例示的だが、非限定的な実施形態において、第2のカートリッジは、Table 10(表10)に示される通り、構成される。ある特定の実施形態において、チャンバーの番号は、図1Bに説明されるチャンバーに対応する。
【０６７０】
【表１０】
2020503858.tif 000030
【０６７１】
ある特定の実施形態において、第2のカートリッジは、次の遺伝子の1つ又は複数を対照遺伝子:MYOD1、COL2A1、NONO、及び/又はTUBBとして使用するように構成される。
【０６７２】
ある特定の実施形態において、2つのカートリッジフォーマットの使用は、とりわけ、第2のカートリッジにおいて非ネステッドPCR反応又はメチル化特異的プリアンプを実行することを可能にする。
【０６７３】
前述の配置は、説明であり、限定するものではない。本明細書において提供される教示を使用し、多数の他の2つのカートリッジフォーマットは、当業者にとって入手可能である。
【０６７４】
説明の目的で、尿及び痰試料の2つのカートリッジ解析の結果を示すデータが、図35、図36、及び図37に示される。特に、図35は、BNC1及びACTBの2つのカートリッジメチル化解析を示す。0、25、50、及び100コピーの100%メチル化対照DNAが、血清に混ぜられ、第1の試料調製カートリッジにおいて処理され(例えば、Table 9(表9)を参照)、次に、qPCRが、メチル化されたBNC1プロモーターについてのプライマー及びプローブセット並びにACTBプロモーターについてのメチル化された独立したプライマー及びプローブセットを含有する第2のカートリッジ(例えば、Table 10(表10)を参照)において抽出され、変換されたDNA試料上で行われる。
【０６７５】
図36は、正常尿試料の亜硫酸水素塩変換解析の結果を示す。正常な尿2.0mLは、条件番号6において溶解バッファー[4.5M GTC、1%Tween20]1.5mL及びエタノール0.5mLと混合された。正常な尿1.5mLは、条件番号7において溶解バッファー1.25mL及びエタノール1.25mLと混合された。試料4.0mLは、メチル化解析カートリッジ2のチャンバー2にピペッティングされ、変換されたACTB(右)及び変換されていないHMBS(左)について解析された。
【０６７６】
図37は、正常及び癌痰試料のメチル化解析の結果を示す。7種の痰試料は、GENEXPERT(登録商標)メチル化カートリッジ(C)及び比較アッセイ(M)を使用して、SOX17、TAC1、及びHOXA7メチル化について試験された。未処理のCtとデルタCt(ACTBに対する)の両方が、この図において報告される。
【０６７７】
前述の配置は、説明であり、限定するものではない。本明細書において提供される教示を使用し、多数の他の2つのカートリッジフォーマットは、当業者にとって入手可能である。
【０６７８】
cfDNA試料調製カートリッジ
ある特定の実施形態において、提供される血漿又は血清由来の核酸の調製(及び場合により、解析)に十分に適した関節である試料の調製カートリッジが、提供される。1つの例示的だが、非限定的な実施形態が、図17に示される。そこで説明される通り、ある特定の実施形態において、カートリッジは、DNAを結合する親和性マトリックスを含むチャネル又はチャンバー、中心バルブアセンブリの周囲に設けられ中心バルブアセンブリと選択的に流体連通にある複数のチャンバーを含み、中心バルブアセンブリが、中心バルブと流体連通にあるチャンバーに又はそこから流体を引き出す能力があるプランジャーを収納するように構成されており、複数のチャンバーが:試料溶液最大約5ml又は最大約4mlを受け取るように構成されたチャンバー;PEG(例えば、PEG200)を含有するチャンバー;GTC-EtOHを含有するチャンバー;アルカリ溶液(例えば、KOH)を含有するチャンバー;及びバッファー(例えば、トリス)を含有するチャンバーを含む。ある特定の実施形態において、複数のチャンバーは、変換試薬(例えば、亜硫酸水素塩試薬)を含有するチャンバーを更に含む。ある特定の実施形態において、複数のチャンバーは、洗浄溶液(例えば、GTCエタノール洗浄液(典型的には、1.25Mグアニジニウムチオシアネート、25mMトリスpH7.0、50%エタノール))を含有するチャンバーを含む。ある特定の実施形態において、複数のチャンバーは、1つ若しくは複数のPCRプライマー及び/又はプローブを含むビーズを含有するチャンバーを含む。ある特定の実施形態において、PEGを含有するチャンバーは、PEG約1mlを含有する。ある特定の実施形態において、アルカリ溶液を含有するチャンバーは、溶液約500μLを含有する。ある特定の実施形態において、GTC-EtOHを含有するチャンバーは、GTC-EtOH約2mlを含有する。ある特定の実施形態において、バッファーを含有するチャンバーは、バッファー約2mLを含有する。
【０６７９】
この配置は、例示的であり、本明細書において提供される教示を使用して、多数の他の調製カートリッジ配置が、当業者にとって入手可能であることは、理解される。
【０６８０】
亜硫酸水素塩の代替としてのDABSOの使用
DABSOを使用して、DNAの変換及びメチル化の検出のための亜硫酸水素塩の使用と類似する方法で、DNAの変換を行い得ることは、驚くべき発見であった。したがって、ある特定の実施形態において、5-メチルシトシン残基には実質的に影響を与えずに、DNA中のシトシン残基をウラシルに変換するためDABSOを利用する方法が、提供される。ある特定の実施形態において、方法は、DNAを含む試料をDABSOと接触させて、DNAを変換する工程、及び変換されたDNAを脱スルホン化して、DNAを生成する工程であって、シトシン残基が、ウラシルに変換されるが、5-メチルシトシン残基は実質的に影響されない、工程を含む。ある特定の実施形態において、DABSOは、約2M〜最大約5Mの範囲にある濃度で提供される。ある特定の実施形態において、DABSOは、約2.5Mの濃度で提供される。ある特定の実施形態において、DABSOは、アルカリ水溶液(例えば、KOH溶液)において溶解される。ある特定の実施形態において、DABSOを含む試薬は、KOHを含む溶液において溶解されたDABSOを含む。
【０６８１】
ある特定の実施形態において、方法は、DABSO/DNA溶液を約55℃〜約90℃の範囲にある温度まで加熱する工程を含む。ある特定の実施形態において、DABSOは、DNAと、約15分〜最大約90分の範囲にある期間反応させる。DNAが変換された後、それは、脱スルホン化される(例えば、変換されたDNAをアルカリ試薬(例えば、KOH溶液)と接触させることにより)。ある特定の実施形態において、変換及び/又は脱スルホン化は、カラムに結合したDNA上で行われ、一方、他の実施形態において、変換及び/又は脱スルホン化は、溶液中のDNA上で行われる。
【０６８２】
DNAメチル化を解析する方法も提供され、方法は、DNA試料を用意する工程、例えば、上で記載された、DABSO試薬を使用して、試料中のDNAを変換する工程、並びに変換された核酸上でメチル化特異的PCR及び/又は核酸配列決定、及び/又は高分解能融解解析(HRM)を行い、当該核酸のメチル化を決定する工程を含む。ある特定の実施形態において、DNA試料を用意する工程は、本明細書に記載される試料を(例えば、溶解溶液を使用する)用意する工程及び/又は本明細書に記載される調製カートリッジを調製する工程を含む。
【０６８３】
キット
メチル化検出用のキット
ある特定の実施形態において、本明細書において記載される方法を行うためのキットが提供される。1つの例示的な実施形態において、キットは、本明細書に記載される反応カートリッジを含有する容器、本明細書に記載される試料処理試薬を含有する容器、及び本明細書に記載される変換試薬(例えば、亜硫酸水素塩試薬)を含有する容器を含む。ある特定の実施形態において、亜硫酸水素塩試薬は、カートリッジのチャンバーにおいて提供される。ある特定の実施形態において、亜硫酸水素塩試薬は、カートリッジと別の容器において提供される。ある特定の実施形態において、試料処理試薬は、カートリッジのチャンバーにおいて提供される。ある特定の実施形態において、具体的には、試料処理試薬が、グアニジニウムチオシアネートを含む場合、試料処理試薬は、カートリッジと別の容器において提供される。
【０６８４】
ある特定の実施形態において、キットは、本明細書に記載される2つのカートリッジセット用のカートリッジを含有し得る。したがって、ある特定の実施形態において、キットは、試料を調製し、試料中のDNAの亜硫酸水素塩変換を行うように構成された試料調製カートリッジである「第1の」カートリッジ(例えば、図20B、左パネルを参照)、及び変換されたDNAを脱スルホン化するように構成された「第2の」カートリッジを含有し得、ある特定の実施形態において、その後、解析(例えば、メチル化特異的PCR)を行う(例えば、図20B、右パネルを参照)。ある特定の実施形態において、第1のカートリッジ及び第2のカートリッジは、キット中の別々の容器において提供され、一方、他の実施形態において、第1のカートリッジ及び第2のカートリッジは、同じ容器において提供される。ある特定の実施形態において、2つのカートリッジキットは、第1のカートリッジの試料除去チャンバーから第2のカートリッジの試料を受け取るチャンバーへの試料の移動を促進するための装置(例えば、じょうご、ピペットチップ等)を含有し得る。
【０６８５】
加えて、キットは、場合により、標識すること、並びに/又はDNAメチル化、及び場合により、RNA発現を決定するための本明細書に記載されるカートリッジの使用についての指示(すなわち、プロトコール)をもたらす教材を含む。
【０６８６】
ある特定の実施形態において、DNAメチル化の決定のためのキットが提供され、キットは、本明細書に記載される核酸のメチル化状態を決定するためのカートリッジを含有する容器を含む。ある特定の実施形態において、キットは、本明細書に記載される溶解溶液(例えば、Table 13(表13)に記載される、例えば、血清若しくは血漿用の溶解溶液、及び/又は例えば、Table 14(表14)に記載される、FFPE試料用の溶解溶液)を更に含む。ある特定の実施形態において、キットは、プロテアーゼKを含有する容器を含む。ある特定の実施形態において、キットは、カートリッジ中又はカートリッジと離れた容器中の変換試薬(例えば、亜硫酸水素塩試薬)を含有する。ある特定の実施形態において、別々の容器は、カートリッジの1回の「実行」に適した、予め測定された体積の変換試薬を含有し得る。ある特定の実施形態において、変換試薬は、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素セシウム、亜硫酸水素アンモニウム、及びDABSOからなる群から選択される化合物を含む。ある特定の実施形態において、キットは、試料処理試薬を含有する容器を含む。ある特定の実施形態において、試料処理試薬は、グアニジウムチオシアネート及び/又はエタノールを含む。
【０６８７】
様々な実施形態において、キットは、追加で、本明細書に記載される試料調製用カートリッジを含有し得る(例えば、図20において説明される)。
【０６８８】
ある特定の実施形態において、キットは、DNAメチル化の決定のためのカートリッジの使用を教示する教材を含有する。試料調製カートリッジが、キットに含まれる場合、キットは、追加で、使用及び試料調製カートリッジの操作を教示する教材を含有し得る。
【０６８９】
DABSO DNA変換及びメチル化検出用キット
ある特定の実施形態において、キットは、例えば、DNAのメチル化状態の検出において、変換試薬としてのDABSOの使用のため提供される。ある特定の実施形態において、キットは、DABSOを含む変換試薬を含有する容器、及び脱スルホン化試薬を含有する容器を含む。ある特定の実施形態において、キットは、親和性マトリックス(例えば、シリカマトリックス材料)を含むカラムを含む。ある特定の実施形態において、キットは、結合バッファーを含有する容器及び/又は溶出バッファーを含有する容器を含む。ある特定の実施形態において、キットは、洗浄バッファーを含有する容器を含む。
【０６９０】
ある特定の実施形態において、キットは、本明細書に記載される溶解溶液(例えば、Table 13(表13)に記載される、例えば、血清若しくは血漿用の溶解溶液、及び/又は例えば、Table 14(表14)に記載される、FFPE試料用の溶解溶液)を更に含む。ある特定の実施形態において、キットは、プロテアーゼKを含有する容器を含む。
【０６９１】
様々な実施形態において、キットは、追加で、本明細書に記載される試料調製用カートリッジを含有し得る(例えば、図20において説明される)。
【０６９２】
ある特定の実施形態において、キットは、核酸のメチル化状態の決定のため核酸を変換するためのキットの使用を教示する教材を含有する。
【０６９３】
上で記載されたキット中の教材は、典型的には、書かれた又は印刷された材料を含む一方、それらは、かかるものに限定されない。かかる指示を保存し、それらをエンドユーザーと結び付ける能力がある任意の媒体が、本発明により考慮される。かかる媒体は、電気保存媒体(例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ)、光学媒体(例えば、CD ROM)等を含むが、これらに限定されない。かかる媒体は、かかる教材を提供するインターネットサイトへのアドレスを含んでもよい。
【実施例】
【０６９４】
以下の実施例は、請求される発明を説明するために提供され、限定するために提供されない。
【０６９５】
(実施例1)
方法を立証するために、ヒトゲノムDNA(HGDNA)を開始試料として使用して、Cepheid GENEXPERT(登録商標)カートリッジにおける試料調製、亜硫酸水素塩変換、試料精製、及びメチル化特異的qPCRをモニターした。亜硫酸水素塩変換効率を測定するために、亜硫酸水素塩変換工程中に50μLのカートリッジチューブにおいて、DNAと亜硫酸水素塩の混合物の半分をロードし、加熱した。それ故、最適な変換条件下で、HGDNAのおよそ半分を変換し、他の半分を変換しないままにした。
【０６９６】
qPCR工程用のプライマー及びTaqmanプローブを、1つの変換していない遺伝子(HMBS(ヒドロキシメチルビラン合成酵素ハウスキーピング遺伝子))及び1つの変換した遺伝子(ACTB(ベータアクチン))について設計し、次に、サイクル閾値(Ct)の比較により、変換効率を定量化した。ACTBとHMBSの両方を、単一又は小コピー参照遺伝子として一般に使用し、したがって、本発明者らは、HGDNA1ng当たり類似のコピー数を予測する。
【０６９７】
HGDNA300ngの代表的なGENEXPERT(登録商標)実行を、以下の図5において示し、これは、緑色のACTB qPCR曲線及び青色のHMBS qPCR曲線を含む。96℃5秒間、60℃15秒間、及び72℃15秒間の3種の温度サイクルを含む45サイクルの間、qPCR反応を実行した。20蛍光単位の手動閾値設定で、本発明者らは、変換したACTB遺伝子についてCt31.7、及び変換していないHMBS遺伝子についてCt32.7を観察した。重要なことに、この結果は、FFPE組織切片及び血漿/血清試料において見られるDNAの生理学的相対濃度で、本発明者らのカートリッジにおけるHGDNAのほぼ最適な亜硫酸水素塩変換効率を達成し得ることを示す。ネステッドqPCR反応を通じて、又は完全な試料を加熱することにより、完全に変換した配列についてさらなる特異性を達成し得る。しかしながら、プライマー及びプローブセットを、変換した配列のみを増幅するよう設計するので、いずれのオプションも、GENEXPERT(登録商標)においてメチル化特異的qPCRを全く必要としない。したがって、残る変換していないDNA配列は、キャリアDNAとして役目を果たし、特に、亜硫酸水素塩変換、DNA単離、及びPCR方法中に頻繁に加えられる。
【０６９８】
(実施例2)
図6A及び図6Bは、変換したACTBの直線性を示す。特に、図6Aは、hgDNAを使用した、ACTBについての15サイクルのネステッドqPCRの結果を示す。右のパネルから見ることができる通り、シグナル(Ct値)は、約25,000コピーから約100コピーの間で実質的に直線である。図6Bは、hgDNAを使用した、ACTBについての20サイクルのネステッドqPCRの結果を示す。これらのプロットは、hgDNAについてのカートリッジの感度を示す。ドロップアウトは、約25コピーの変換したDNAの感度で20〜50コピー辺りで生じ始めた。
【０６９９】
図7A、図7B、及び図7Cは、6種のメチル化された標的(AKR1B1、HOXB4、TM6SF1、RASGRF2、及びRASSF1A)についてのqPCRの結果を示す。図7Aは、対照(HSDNA25ng、及びDNAを亜硫酸水素塩で変換していないMBA-453細胞5000個)についての20サイクルのネステッドqPCRの結果を示す。図7Bは、亜硫酸水素塩で変換したMBA-453細胞由来のDNAを使用した6種のメチル化標的についての20サイクルのネステッドqPCRの結果を示す。全ての標的について、強いシグナルを示す。HIST1H3Cは確実には検出されなかった。図7Cは、亜硫酸水素塩で変換し、SS1μg及びHS DNA10ngを含むキャリアにある、MBA-453細胞からのDNAを使用した6種のメチル化標的についての20サイクルのネステッドqPCRの結果を示す。細胞約100個以下で、ドロップアウトを観察し、しかしながら、キャリアでは、有意に小さなドロップアウトが存在した。
【０７００】
(実施例3)
図8は、変換効率の決定の結果を説明する。変換効率は、変換していないHMBSと変換したACTBの間で約66%(約1Ct)の相違である。100%結合/溶出、100%変換、及び100%結合溶出での理想的なCtは、約24〜25である。実験は、10分の1の低減及びCt約27について50%結合/溶出、50〜66%変換、及び50%結合/溶出を示すように思われる。
【０７０１】
図9は、ネステッドqPCRにより生成した変換したDNAについての特異性における増大を説明する。ネステッドPCRは、変換したDNAについての特異性を増大し、メチル化したDNAについての特異性を増大し、混入の問題を低減するように思われる。
【０７０２】
図10は、メチル化カートリッジの特異性を説明する。HIST1H3Cを除き、変換していないDNA(上部のパネル)又はメチル化していないDNA(下部のパネル)についての特異性は示されない。
【０７０３】
図11A及び図11Bは、カートリッジ(例えば、GENEXPERT(登録商標)カートリッジ)を使用したメチル化の解析についての例示的だが、非限定的なワークフローを示す。図11Aは、血清試料におけるDNAメチル化の解析についての1つのワークフローを説明する。このワークフローにおいて説明する通り、血清を溶解試薬バイアルに加え、混合/ボルテックスする。次に、試料をカートリッジ中の試料ポートに分注する。解析のためのシステムに、カートリッジを入れる。
【０７０４】
図11Aは、組織切片(例えば、凍結又はホルマリン固定したパラフィン包埋(FFPE)切片)におけるDNAメチル化の解析についての1つのワークフローを説明する。そこに示す通り、1つの実施形態において、組織切片(例えば、4μmのFFPE切片)を提供する。FFPE溶解試薬を加え(例えば、PCT/US2013/061863(例示的な溶解試薬についてWO/2014/052551を参照)、混合物を加熱し得る。エタノールを加え、混合物をボルテックスし得る。次に、試料をカートリッジ中の試料ポートに分注する。解析のためのシステムに、カートリッジを入れる。
【０７０５】
図12は、変換したALU及びメチル化RASSF1AについてのFFPE細胞ボタンの結果を説明する。
【０７０６】
(実施例4)
乳癌モニタリングのためのマーカーの検出
材料及び方法:
MBA-453細胞1000個又はヒト血清(HS)DNA25ngを、結合バッファー(2.25Mグアニジンチオシアネート、22.5mMトリスpH7.0、0.5%Tween20、50%エタノール、及び0.005%SE-15消泡剤)2.5mLに加えた。細胞又はDNA溶液2.5mLを、Cepheidメチル化カートリッジのチャンバー2に加えた(図13Aの配置)。メチル化カートリッジ中の残るチャンバーを以下の通り充填した:チャンバー3-洗浄バッファー(1.25Mグアニジンチオシアネート、25mMトリスpH7.0、50%エタノール)3.2mL、チャンバー4-7M亜硫酸水素アンモニウム90μL、チャンバー5-50mMトリスpH8.5 4mL、チャンバー8-PEG200リンス1mL、チャンバー9-EZR(Taq)及びTSR(RASSF1A、AKR1B1、HOXB4、HIST1H3C、RASGRF2、TM6SF1についての6種の標的乳癌マルチプレックス、以下のTable 11(表11)を参照)を含む定量的PCRビーズ、チャンバー10-15mM KOH500μL、並びにチャンバー11-EZR(Taq)及びTSR(RASSF1A、AKR1B1、HOXB4、HIST1H3C、RASGRF2、TM6SF1についての6種の標的乳癌マルチプレックス、以下のTable 11(表11)を参照)を含むネステッドビーズ。次に、メチル化カートリッジを、Cepheid GeneXpertにロードし、メチル化アッセイの全体を、GeneXpert-第1のDNA試料調製、亜硫酸水素塩変換、第2の変換後DNA試料調製、脱スルホン化、並びに20サイクルのネステッド及び定量的PCR反応により完了した。
【０７０７】
メチル化プロトコールを説明するフローチャートを、図13Bに示す。PEG200を廃液チャンバー8に充填し、アッセイ開始後、PEG200をチャンバー1に分注することが分かる。PEG200は、より小さなチャンバー1に容易に直接ロードすることができない粘性の液体である。加えて、PEG200チャンバーになる前に、カートリッジにまずロードするとき、チャンバー1は、空気チャンバーとして役目を果たす。したがって、アッセイは、チャンバー1=空気、及びチャンバー8=PEG200で開始し、カートリッジにロード後、直ぐにチャンバー1=PEG200、及びチャンバー8=廃液にスイッチする。
【０７０８】
図13Aの「開始体積」カラムに示す数は、単に、液体の体積を指す。この場合、チャンバー11中に単に2×ビーズ-1×TSRビーズ(6種の標的についてのプライマー及びプローブ)並びに1×EZRビーズ(Phoenix Taq)が存在する。これらのビーズは、最終qPCR反応のためのものである。同様に、チャンバー9中に3×ビーズ-1×TSRビーズ(6種の標的についてのプライマー)、1×トリスビーズ(KOHをクエンチするため)、及び1×EZRビーズ(Phoenix Taq)が存在する。これらのビーズは、第1の15〜20サイクルのPCR反応のためのものである。
【０７０９】
チャンバー6は、アッセイ全体を通じて空気チャンバーであり、決して充填されないことも分かる。チャンバー7を、カートリッジの後ろのPCRチューブへの出入口の性質として使用する。それは、アッセイを開始するまで充填しないが、チューブへのロード前、3つの場合でのアッセイ中に充填する、つまり、1)変換のためチューブにおいて加熱するDNAと亜硫酸水素塩混合物、2)15〜20サイクルのPCR反応液、及び3)最終qPCR反応液である。
【０７１０】
提供するTable 11(表11)に示すプライマーは、それぞれの遺伝子について5種類の配列-2種の伸長プライマー、それぞれのネステッド増幅のための2種のqPCRプライマー、及び1種のプローブを示す。第1の15〜20サイクルのPCR反応は、メチル化特異的ではないが、変換したDNA配列のみに特異的である(すなわち、それらは、CpGと交差せず、それらが交差する一対の場合で、本発明者らは、メチル化と非メチル化の両方をキャッチするためにR=プリン又はY=ピリミジンを使用する)。第2の45サイクルのqPCR反応は、典型的な2〜3個のメチル化したCpGに特異的であるプライマーとプローブの両方を含有する。
【０７１１】
結果:
亜硫酸水素塩あり及びなしでのMBA-453細胞1000個(図15A〜図15B)、並びにHIST1H3Cを除き、それぞれの遺伝子プロモーターで主にメチル化していない亜硫酸水素塩ありのHS DNA25ng(図15C)を使用して、メチル化カートリッジを実行した。亜硫酸水素塩なし又はメチル化していないHS DNA対照反応(図15A、図15C)のどちらかにおいて、標的のいずれかのわずかな増幅が存在したか、又は存在しなかった。亜硫酸水素塩の添加で、メチル化カートリッジは、MBA-453細胞1000個由来の複数の遺伝子プロモーター、具体的には、AKR1B1、RASSF1A、HOXB4、及びRASGRF2での高レベルのメチル化を取り上げた。
【０７１２】
【表１１Ａ】
2020503858.tif 000031
【０７１３】
【表１１Ｂ】
2020503858.tif 000032
【０７１４】
Table 11(表11)に示すプライマーは、例示的なものであり、限定するものではない。多数の他のプライマー及びネステッドプライマーセットは、当業者にとって入手可能である。例示の目的で、膵臓癌と関連するADAMTS1及びBNC1遺伝子のメチル化の検出のため、並びにグリオーマと関連するMGMT遺伝子のメチル化の検出のための例示的なプライマーを、Table 12(表12)に示す。
【０７１５】
【表１２】
2020503858.tif 000033
【０７１６】
(実施例5)
血漿及びFFPE試料についての試料調製
図17は、PCR及び/又はメチル化検出のためDNA試料を調製するため使用することができるカートリッジの1つの配置を説明する。血清若しくは血漿から得た試料、又はFFPE試料を、単に、カートリッジの試料チャンバー(例えば、チャンバー3)に導入し得、本明細書において提供するカートリッジの操作が、PCR及び/又はメチル化検出する準備が整った試料をもたらす。
【０７１７】
試料調製
1つの例示的だが、非限定的な実施形態において、血清又は血漿をプロテアーゼKで処理することにより、血清又は血漿試料を調製する(例えば、cfDNAの解析のため)。次に、プロテアーゼKで処理した血清/血漿を、グアニジニウムチオシアネート(GTC)、バッファー(例えば、トリスpH7.0)、界面活性剤(例えば、Tween20)、及び場合により、消泡剤(例えば、消泡剤SE15)を含む溶解溶液と混合する。アルコール(例えば、イソプロパノール)を溶液に加え、次に、それを、試料処理用カートリッジに導入する。1つの実施形態において、溶解溶液を、Table 13(表13)に示す通り製剤する。プロテアーゼKで処理した血清/血漿1.3mL、溶解溶液2.2mL、及びアルコール1.5mlに対応する割合で、プロテアーゼKで処理した血清/血漿を、溶解溶液及びアルコールと混合し得る。ある特定の実施形態において、血清/血漿試料を、プロテアーゼKで約15分間処理する。溶解溶液を加え、約10分間、冷却し、保持/混合する。次に、イソプロパノールを、混合物に加え、次に、それを処理用カートリッジにロードする。
【０７１８】
上で示した通り、血清/血漿について、アルコール(例えば、イソプロパノール)沈殿を、典型的には、RTで行い、特に典型的には、「塩」溶液では行わない。ある特定の実施形態において、より長い室温での沈殿時間を用い得る。
【０７１９】
【表１３】
2020503858.tif 000034
【０７２０】
別の例示的だが、非限定的な実施形態において、FFPE試料をプロテアーゼK、バッファー(例えば、HEPES)を含む溶解溶液、キレート剤(例えば、EDTA)、NaCl、MgCl2、並びに場合により、アジ化ナトリウム及び/又は消泡剤と合わせることにより、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)試料を調製する。溶液を(例えば、70℃〜90℃で)、例えば、約10分〜最大約4時間の範囲にある期間、加熱する。アルコールを溶液に加え、次に、溶液を試料処理用カートリッジに導入する。1つの実施形態において、溶解溶液を、Table 14(表14)に示す通り製剤する。1つの例示的だが、非限定的な実施形態において、Table 14(表14)に示す溶解溶液1.2mLをFFPE切片に加える。プロテアーゼKを加え、混合物を、例えば、80℃で約15分間加熱する。ある特定の実施形態において、加熱を、56℃で2時間、続いて、90℃で30分間行う。次に、エタノール1.2mLを混合物に加え、混合物を、試料チャンバーの処理用カートリッジにロードする。
【０７２１】
【表１４】
2020503858.tif 000035
【０７２２】
カートリッジ操作及び抽出性能
cfDNAを調製するとき、ある特定の実施形態において、DNA調製の質をモニタリングすることを可能にする抽出対照を含むことが可能になる。図18において説明する通り、2種の異なるビーズセットが存在する。一方のビーズセットは、SAC(試料アッセイ対照)についての内在性HMBSプライマー及びプローブセット、並びにSPC(試料調製対照)についての外在性BGプライマー及びプローブセットを含有する。他方は、SAC(並びにBG SPC)についての内在性ベータ-グロビンPPセットを含有する。
【０７２３】
とりわけ、カートリッジでのGTCの使用が、血漿試料より血清にとってあまり重要でないことを発見した。特定の理論により結び付けられることなく、これは、血清がタンパク質をほとんど含有しないという事実に起因し得ると考えられている。したがって、ある特定の実施形態において、カートリッジは、GTCをほとんど含有しないか、又はGTCを除去し得る。
【０７２４】
図19A及び図19Bは、従来の「チューブ充填」手法を使用して得た結果と比較した、本明細書に記載するカートリッジを使用して行うcfDNA調製の結果の比較を示す。図19Aに示すqPCR結果において説明する通り、カートリッジを使用して得た結合及び溶出効率は、チューブ充填プロトコールを使用して得たものと非常に近接する(1Ct以内)。図19Bにおいて説明する通り、試料濃度のタイトレーションは、控えめに評価して、カートリッジ調製が、約10pgまで試料濃度を下げてもチューブ充填調製の1Ct以内であることを示す。カートリッジ調製物は、より高い試料濃度でチューブ充填プロトコールに更に近くなると考えられている。
【０７２５】
(実施例6)
多量試料調製カートリッジの試験
ある特定の実施形態において、多量試料調製(HSVP)カートリッジを、多量の試料(例えば、最大約12ml〜15ml)の調製のため提供する。これは、試料が、低濃度のDNA(例えば、血清又は血漿中のcfDNA)を含有する場合、特に有用である。1つのかかるカートリッジを図20Aにおいて模式的に説明する。そこで示す通り、カートリッジは、試料を受け取るため使用し得る3つのチャンバー(チャンバー2、3、及び5)を提供する。説明した実施形態において、これらのチャンバーのそれぞれは、試料約4mLを受け取ることができ、ある特定の実施形態において、試料は、GTC4mL、及びアルコール(例えば、イソプロパノール)4mLと合わせた血漿/血清4mLを含む。
【０７２６】
試料をこれらのチャンバーに導入し、カートリッジを本明細書に記載する通り操作して、PCR及び/又はメチル化解析用の試料を調製する。説明の目的で、ある特定の実施形態において、このカートリッジの操作は、DNAを親和性カラムに結合させること(例えば、精製のため)、及びDNAを溶出することを含み得る。メチル化解析が行われるべきある特定の実施形態において、カートリッジの操作は、DNAを変換試薬(例えば、本明細書に記載する亜硫酸水素塩)と合わせること、及び混合物を加熱して、DNAを変換することを更に含み得る。ある特定の実施形態において、HSVPカートリッジはまた、変換したDNAを脱スルホン化するため構成し得る。他の実施形態において、図20Bにおいて模式的に説明する通り、DNAを第2の(例えば、qPCR)カートリッジにおいて脱スルホン化し得る。第2のカートリッジはまた、メチル化解析(例えば、qPCR解析)を行い得る。
【０７２７】
図21は、HMBS又はβ-グロビンプライマー及びプローブセットを使用する1つのカートリッジと2つのカートリッジプロトコールの間での、血漿並びに血清由来のDNAの試料調製の結果の比較を示す。そこに示す通り、血清又は血漿0.5mLから4mLの間でDNA回収率において直線的に増加した。更に、調製及び解析のため別々のカートリッジを使用するとき、調製並びに解析用の1つのカートリッジを使用するとき、わずかな喪失が存在するか、全く存在しない。
【０７２８】
(実施例7)
亜硫酸水素塩変換の最適化
ある特定の実施形態において、本明細書に記載するメチル化解析用のカートリッジを使用するとき、1つの潜在的な問題は、可能性のある最も小さい体積を使用して溶出効率を最適化することである。小さな溶出体積は、スピンカラムを使用して扱うのをより容易にする。より大きな試料体積を処理するための複数の加熱工程を使用することにより、この問題に取り組むことができる。
【０７２９】
第2の技術的な関心事は、より小さな(例えば、50μL)加熱チューブ又はチャンバーを使用するときに大きな試料(例えば、最小100μL)を加熱するとき、生じる。ある特定の場合には、加熱工程間の加圧状態は、体積吸引物及び分注物を再現可能な方法で占めることを困難にし得る。第2に、加圧状態が存在しないと、本質的により高い温度で体積の変化及び気泡を導き得る。第3に、加熱工程間でのポート変化中の加熱した試料と加熱した試料の間の空気を取り上げることが可能である。
【０７３０】
これらを調べるために、単一及び2回の加熱工程を使用して、50μLのチューブにおける亜硫酸水素塩変換の最適化を調べた。この実験を次の通り:
亜硫酸水素塩-DNA 75〜80μLを引き抜き;95℃で10秒間、65℃で300秒間×8加熱し;
残り+5〜10μLを引き抜き;加圧し;95℃で480秒間、65℃で1800秒間×1加熱する
行った。
【０７３１】
血清0.5mLについての結果を、図22に示し、ここで、上部のパネルは、1×加熱(変換33.0、未変換34.4)N=4であり、下部のパネルは、2×加熱(変換31.9、未変換36.1)N=4である。
【０７３２】
1×加熱から2×加熱まで移るとき、変換したACTBシグナルにおいて約1Ctの増加が存在する。これは、DNAのほぼ全てを変換することを示唆する。これは、変換していないHMBSシグナルにおける約2Ctの喪失も存在するという事実により、支持される。本発明者らは、DNA-亜硫酸水素塩試料の加熱50/100μLから100/100μLに移るので、1Ctの増加は理論的である。
【０７３３】
(実施例8)
チューブベースの市販のキットとのDNAメチル化カートリッジの比較
図23Aは、市販のキット(QIAamp MinElute Virus Spin Kit(Qiagen、Inc社)及びEZ DNA Methylation-Lightning(商標)Kit(Zymo Research, Inc社))を使用して、同じ解析を行うときに要求される工程と比較して、本明細書に記載するカートリッジを使用してメチル化解析を行うとき(左)要求されるユーザー工程の比較を示す。容易に分かるように、カートリッジベースのメチル化解析は、ずっと少ないユーザー工程を要求し、これは、キットを使用して要求される労働時間2〜3時間と比較して、労働時間約5分間を伴う。
【０７３４】
異なる方法により生じた結果を比較するために、Qiagenキットを使用して、血清200μLを精製した。Zymoキットを使用してDNAを変換し、第2のスピンカラムで精製し、10μLで溶出した。変換したメチル化していないACTBプライマー及びプローブ(TSR)を使用して、全10μLを実行する。比較において、本明細書に記載するメチル化カートリッジにおいて血清200μLを実行した。図23Bにおいて、結果を示す。容易に明らかである通り、カートリッジ方法は、市販のキットを使用して得たものと極めて同等な結果を生じた。しかしながら、ずっと少ない労働と時間でこれを成し遂げた。
【０７３５】
(実施例9)
DNA変換のためのDABSOの使用
これは、H2O5mLにおいてDABSO5gを溶解する初めての試みであった。最後に、10M KOH数mL及び水1mLを加え、加熱して、DABSOを溶解し、推定最終DABSO濃度約2.5Mで約pH5からpH5.5の間の最大pHまで上昇させた。
【０７３６】
図24は、DABSO又はZymo変換試薬を使用して変換したDNA750ngのチューブ充填のグラフを示す。熱サイクラーにおいて、材料を場外加熱し(1μg)、スピンカラムで精製し、チューブ充填として実行した。3種の異なる実験:
1)DABSO120μL/DNA30μL;
2)Zymo120μL/DNA30μL;及び
3)Zymo70μL/DNA30μL(カートリッジにおける現在の比)
であった。
【０７３７】
図24に示す通り、DABSOは、Zymo試薬を使用して得たものとほぼ同等の良好な変換をもたらした。
【０７３８】
(実施例10)
メチル化したDNAの検出感度
DNAメチル化の検出感度を評価するために、変換したACTB遺伝子プロモーターを、本明細書に記載するカートリッジを使用したコピー数の関数として検出した。目標は、25コピーより少ない、変換し、メチル化していないDNAを検出することであった。既に示した通り、約10〜50コピーで降下を観察した(それぞれ1回の降下)。血清バックグラウンドにおいて、メチル化DNA標的について、同様の感度を観察した。
【０７３９】
図25、パネルAは、連続希釈のメチル化DNAの検出を説明する(MGMT(O-6-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼ遺伝子))。そこで示す通り、78pgのレベルまで落として、MGMTを検出した。
【０７４０】
MBA-453細胞におけるメチル化した乳癌マーカーRASSF1A及びAKR1B1の検出を、図25、パネルBにおいて示す。そこで示す通り、細胞100個まで落として、乳癌マーカーを検出した。
【０７４１】
連続希釈のメチル化した膵臓癌マーカーACTB、BNC1、及びADAMTS1を、図25、パネルCにおいて示す。そこで示す通り、25コピーまで落として、膵臓マーカーを検出した。
【０７４２】
以下のTable 15(表15)は、濃度の関数としての膵臓癌マーカーBNC1及びADAMTS1のヒット率を示す。そこで示す通り、120pg未満で、これらのマーカーを検出し得る。正の「ヒット率」は、複製のためのいずれかの遺伝子における増幅であることに注意。
【０７４３】
【表１５】
2020503858.tif 000036
【０７４４】
(実施例11)
両方の鎖についての逆相補マルチプレックスアッセイ
図26は、両方のDNA鎖についての逆相補マルチプレックスアッセイについての結果を説明する。亜硫酸水素塩変換後、両方の鎖は、それらの相補性を失う。したがって、プライマー及びプローブセットは、一方の鎖又は他方について設計し、固有の増幅産物をもたらさなければならない。「より多くの機会」をよりもたらすことに加えて、このアプローチは、感度に役立ち得る(LODで、一方の鎖のみ又は他方の鎖がチューブに留まってしまう場合、このアプローチは、シグナルが取り上げられることを確実にする)。
【０７４５】
このマルチプレックスアッセイは、マルチプレックスが、同じプロモーター部位で異なるCpGを検出することを可能にする。逆相補マルチプレックスは、標的に対するより多くのクエリー、及び不均一なメチル化を取り上げるより多くの機会をもたらす。
【０７４６】
(実施例12)
単一のカートリッジにおけるDNAメチル化及び変異の検出
ある特定の実施形態において、マルチプレックスPCR反応は、同じカートリッジでのメチル化に加えて変異の検出を可能にするプライマー及びプローブを含有し得る。図27Aは、対照BGと共にKRAS G12D変異と共にメチル化したBNC1及びADAMTS1の検出(上部のパネル)、並びに対照BGと共にKRAS野生型と共にメチル化したBNC1及びADAMTS1の検出(下部のパネル)を説明する。
【０７４７】
図27Bは、KRAS G12D変異と共に、PANC-1細胞(上部のパネル)及びMIA-PaCa細胞(下部のパネル)におけるBNC1及びADAMTS1メチル化の同時検出を説明する。
【０７４８】
(実施例13)
膵臓癌のマルチプレックス最適化
ADAMTS1、BNC1、(及びある特定の他の遺伝子)のメチル化解析が、膵臓癌の検出及び/又は段階分けを可能にすると決定した。したがって、BNC1及びADAMTS1についての最終マルチプレックスアッセイを最適化して、他の遺伝子についてのプローブの取り込みを促進した。このアッセイを最適化するために、温度勾配を、フォワード/リバース亜硫酸水素塩で変換した鎖についての外部及び内部PCRにおいて実行した。シングルプレックス(それぞれの遺伝子についてフォワード/リバース)を、外部温度56℃、58℃、及び60℃並びに内部温度64℃、66℃、及び68℃で実行した(例えば、図28を参照)。ある特定の実施形態において、BNC1及びADAMTS1並びに2つの他の遺伝子について2つの4-プレックス、フォワード鎖のメチル化解析について1つの4-プレックス、並びにリバース鎖のメチル化解析について1つの4-プレックスとして、アッセイを開発した。
【０７４９】
好ましい反応条件(塩条件40mM(LS)、60mM(MS)、80mM(HS)KCl、15mM NH4SO4)に基づき、特異性について最適化した2つのセット(図29を参照)に合わせた。マルチプレックス1についての最終的な最適化塩条件は、80mM KCl、5mM MgCl2、20mMトリスpH8.5、及び10mM NH4であり、マルチプレックス2については、62mM KCl、4mM MgCl2、20mMトリスpH8.5、及び10mM NH4であった。
【０７５０】
(実施例14)
MGMTメチル化の検出
O(6)-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT)遺伝子は、テモゾロミドのようなアルキル化化学療法の効果を抑制し得るDNA修復酵素をコードする。MGMT遺伝子が活性であるなら、損傷は容易に修復される。悪性グリオーマが、そのプロモーター領域のメチル化に起因して不活性化されたMGMT遺伝子を有し得ると考えられる。メチル化したMGMT遺伝子は、化学療法に応答したBETTER応答の予想指標である(腫瘍は、アルキル化剤により誘導されたDNA損傷を修復するための手段を有しないので)。
【０７５１】
図30において説明し、以下のTable 16(表16)において概説するMGMTメチル化の検出のため、プライマー及びプローブを開発した。特に、図30は、灰色で示すCPG(パイロシークエンシングから決定した)を有する変換した鋳型を説明する。説明した通り、亜硫酸水素塩変換後、フォワード及びリバース鎖は、もはや相補性ではなく、それぞれの鎖の別々の解析が可能になる。
【０７５２】
【表１６】
2020503858.tif 000037
【０７５３】
検出感度を評価するために、ACTBを対照として使用して、MGMT連続希釈液(HS DNA20ngのバックグラウンドにおいてMGMT DNA5ng〜78pg)を評価した。例示的な実験において、メチル化したMGMT DNA78pgは、メチル化していないHS DNAのみのCtと離れて、約10サイクルのみであった。
【０７５４】
図31に示す通り、MGMTメチル化の検出のための本明細書に記載のメチル化カートリッジを使用して生じた結果を、抽出したDNA(図31、上部)について、及びFFPE試料(図31、下部)についてパイロシークエンシングにより生じた結果と比較した。パイロシークエンシングは、典型的には、10〜15%のカットオフを使用して、患者層別化を決定する。本発明者らは、12.5(ACTBとMGMTの間)の任意のカットオフを使用して、できるだけ近接するパイロシークエンシングの結果と一致した。したがって、この実施例において、デルタCt=12.5にカットオフを設定し、>15%メチル化で一致を計算した。抽出したDNAのカートリッジ解析は、感度90%、及び特異性86%を示し、一方、FFPE試料のカートリッジ解析は、感度88%及び特異性95%を示した。
【０７５５】
以下の2つの方法で特異性を改善し得ることが分かる:1)62℃のアニーリング温度はむしろ低かったので、アニーリング温度を増大させることができる。加えて、3つ(又はそれ以上)のCpGをカバーするメチル化プローブを利用し得る。
【０７５６】
(実施例15)
BRCA1メチル化の検出
BRCA1は、DNAを修復するのに関与するケアテイカー遺伝子である。BRCA1は、相同組換え、非相同な末端結合、及びヌクレオチド除去修復に関与すると考えられる。異常BRCA1遺伝子を有する女性は、乳癌を発症する80%の確率を有する。
【０７５７】
特定の理論と結び付けられることなく、BRCA1メチル化が、トリプルネガティブなBC患者において化学療法への応答の可能性のある予想マーカーであると考えられる。 シスプラチンで処置した患者のNSCLCの研究は、低BRCA1発現を有する患者で生存率が改善したことを示した。 高いレベルは、癌細胞に引き起こされた損傷を修復することにより、化学療法の有効性を低減した。
【０７５８】
これら及び他の観察を考慮して、BRCA1メチル化の検出のため、カートリッジ及び使用方法を開発した。特に、PCR条件を次の通り最適化した:1)外部温度を、56〜62℃に上昇させ、本発明者らは、3つの工程の56℃のアニーリングPCRプロトコールを決定した;2)内部温度を、64℃〜70℃に上昇させ、本発明者らは、2つの工程の68℃のアニーリングPCRプロトコールを決定した。図32に、結果を示す。
【０７５９】
BRCA1について、ACTB対照遺伝子で1つの標的アッセイを試験した。8種の異なる細胞株を試験し、NH4の添加効果を比較した(図33を参照)。BRCA1メチル化を3199細胞株において観察すると予測した。
【０７６０】
(実施例16)
肺癌と関連する遺伝子メチル化の検出
メチル化が肺癌と関連する遺伝子(SOX17、CD01、TAC1)について3つの標的メチル化アッセイを、ACTB対照遺伝子と共に試験した。図34に示すデータは、予想通り、3つの標的は、正常血漿のバックグラウンドにおいて出現しないが、3種の異なる肺癌細胞株においてある程度まで存在することを示す。
【０７６１】
本明細書に記載される実施例及び実施形態は、説明の目的のみであること、並びにそれを考慮して、様々な改変又は変形が、当業者に示唆され、本出願の精神及び範囲並びに添付の請求の範囲内に含まれ得るべきであることは、理解される。本明細書において引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、全ての目的のためそれらの全体が参照により本明細書に取り込まれる。
【図１Ａ】
2020503858.tif 000038
【図１Ｂ】
2020503858.tif 000039
【図１Ｃ】
2020503858.tif 000040
【図２】
2020503858.tif 000041
【図３Ａ】
2020503858.tif 000042
【図３Ｂ】
2020503858.tif 000043
【図３Ｃ】
2020503858.tif 000044
【図４Ａ】
2020503858.tif 000045
【図４Ｂ】
2020503858.tif 000046
【図４Ｃ】
2020503858.tif 000047
【図４Ｄ】
2020503858.tif 000048
【図５】
2020503858.tif 000049
【図６Ａ】
2020503858.tif 000050
【図６Ｂ】
2020503858.tif 000051
【図７Ａ】
2020503858.tif 000052
【図７Ｂ】
2020503858.tif 000053
【図７Ｃ】
2020503858.tif 000054
【図８】
2020503858.tif 000055
【図９】
2020503858.tif 000056
【図１０】
2020503858.tif 000057
【図１１】
2020503858.tif 000058
【図１２】
2020503858.tif 000059
【図１３Ａ】
2020503858.tif 000060
【図１３Ｂ】
2020503858.tif 000061
【図１４】
2020503858.tif 000062
【図１５Ａ】
2020503858.tif 000063
【図１５Ｂ】
2020503858.tif 000064
【図１６】
2020503858.tif 000065
【図１７】
2020503858.tif 000066
【図１８】
2020503858.tif 000067
【図１９Ａ】
2020503858.tif 000068
【図１９Ｂ】
2020503858.tif 000069
【図２０Ａ】
2020503858.tif 000070
【図２０Ｂ】
2020503858.tif 000071
【図２１】
2020503858.tif 000072
【図２２】
2020503858.tif 000073
【図２３Ａ】
2020503858.tif 000074
【図２３Ｂ】
2020503858.tif 000075
【図２４】
2020503858.tif 000076
【図２５】
2020503858.tif 000077
【図２６】
2020503858.tif 000078
【図２７Ａ】
2020503858.tif 000079
【図２７Ｂ】
2020503858.tif 000080
【図２８】
2020503858.tif 000081
【図２９】
2020503858.tif 000082
【図３０】
2020503858.tif 000083
【図３１】
2020503858.tif 000084
【図３２】
2020503858.tif 000085
【図３３】
2020503858.tif 000086
【図３４】
2020503858.tif 000087
【図３５】
2020503858.tif 000088
【図３６】
2020503858.tif 000089
【図３７】
2020503858.tif 000090
【配列表】
2020503858000001.app
【国際調査報告】
2020503858.tif 000091
2020503858.tif 000092
2020503858.tif 000093