(57)【要約】  本開示は、いくつかの態様において、ヒストンデアセチラーゼ２（ＨＤＡＣ２）／Ｓｐ３インヒビターを使用して、対象において神経変性疾患を処置するための方法、および関連する組成物を提供し、前記インヒビターはＨＤＡＣ２のカルボキシル末端を含むペプチドインヒビターであり得る。
2020527558.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において神経変性疾患を処置するための方法であって、有効量のヒストンデアセチラーゼ２（ＨＤＡＣ２）／転写因子Ｓｐ３（Ｓｐ３）インヒビターを対象へ投与することを含み、ＨＤＡＣ２インヒビターが、転写因子Ｓｐ３（Ｓｐ３）に対するＨＤＡＣ２結合を低減して、神経変性疾患を処置する、前記方法。
【請求項２】
ＨＤＡＣ２／Ｓｐ３インヒビターがペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ペプチドＨＤＡＣ２／Ｓｐ３インヒビターが抗ＨＤＡＣ２抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＨＤＡＣ２／Ｓｐ３インヒビターが小分子インヒビターである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ペプチドが約２５〜１１０アミノ酸長である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ペプチドが配列番号１に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
神経変性疾患が、ＭＣＩ（軽度認知障害）、外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、アルツハイマー病、記憶喪失、アルツハイマー病に関連する注意欠陥兆候、アルツハイマー病に関連する神経変性、混合血管起源の認知症、変性起源の認知症、初老期認知症、老年認知症、パーキンソン病に関連する認知症、血管性認知症、進行性核上性麻痺または皮質基底変性からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＨＤＡＣ２／Ｓｐ３インヒビターの量が、シナプス機能不全を低減するのに有効である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＨＤＡＣ２／Ｓｐ３インヒビターの量が、ヒストン脱アセチル化を低減するのに有効である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＤＡＣ２／Ｓｐ３インヒビターが医薬組成物中に製剤化されており、該医薬組成物が薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
別の治療剤を対象へ投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
対象がヒト患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
有効量の転写因子Ｓｐ３（Ｓｐ３）発現インヒビターを対象へ投与して、神経変性疾患を処置するために対象におけるＳｐ３発現レベルを低減することを含む、対象において神経変性疾患を処置するための方法。
【請求項１４】
Ｓｐ３発現インヒビターがアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｓｐ３発現インヒビターがｓｉＲＮＡである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
対象において神経変性疾患を処置するための方法であって、有効量のヒストンデアセチラーゼ２（ＨＤＡＣ２）局在化インヒビターを対象へ投与することを含み、ＨＤＡＣ２局在化インヒビターがＨＤＡＣ２のクロマチンへの局在化を低減して、神経変性疾患を処置する、前記方法。
【請求項１７】
ＨＤＡＣ２局在化インヒビターがＨＤＡＣ２／Ｓｐ３インヒビターである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する２０〜１１０アミノ酸長のペプチドおよび薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
ペプチドが約８０〜１００アミノ酸長である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
ペプチドが、配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
ペプチドが、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
ペプチドが、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２３】
ペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２４】
ペプチドが配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２５】
薬学的に許容し得る担体が、ナノ粒子、静脈注射用流体、緩衝化医薬溶液、クリーム、エマルション、ゲル、リポソーム、または軟膏である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、および、配列番号１のＨＤＡＣ２ペプチドにおいて天然に存在しない少なくとも１のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、２０〜１１０アミノ酸長のペプチド。
【請求項２７】
配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２８】
配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のペプチド。
【請求項２９】
配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のペプチド。
【請求項３０】
（ｉ）有効量のヒストンデアセチラーゼ２（ＨＤＡＣ２）／転写因子Ｓｐ３（Ｓｐ３）インヒビター；および（ｉｉ）薬学的に許容し得る担体を含む、対象における神経変性疾患を処置するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、35 U.S.C.119 (e)の下で、２０１７年７月１３日に提出された米国仮特許出願、U.S.S.N. 62/532,026に対して優先権を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
中枢神経系の神経変性疾患は、しばしば、学習および記憶障害に関連しており、最終的には認知症につながる。ニューロン可塑性およびシナプス遺伝子発現を負に調節するヒストンデアセチラーゼＨＤＡＣ２は、アルツハイマー病（ＡＤ）患者およびマウスモデルの両方で上方調節されている。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本開示は、転写因子Ｓｐ３（Ｓｐ３）がシナプス可塑性関連遺伝子のプロモーターへのＨＤＡＣ２の動員を媒介したこと、および、ペプチドインヒビターなどのその相互作用を破壊するＨＤＡＣ２インヒビターが神経変性のマウスモデルにおけるシナプス機能不全および認知機能障害を首尾よく低減させたこと、という予想外の発見に少なくとも部分的に基づく。
結果的に、本開示の一側面は、有効量のヒストンデアセチラーゼ２（ＨＤＡＣ２）インヒビターを対象へ投与することを含む、対象において神経変性疾患を処置するための方法を提供し、ＨＤＡＣ２インヒビターは転写因子Ｓｐ３（Ｓｐ３）に対するＨＤＡＣ２結合を低減する。いくつかの態様において、ＨＤＡＣ２インヒビターは、抗ＨＤＡＣ２抗体、小分子インヒビター、またはペプチドインヒビターであり得る。
【０００４】
本明細書に記載の方法で処置される対象は、神経変性疾患を有する患者（例として、ヒト患者）であり得る。いくつかの例において、神経変性疾患は、ＭＣＩ（軽度認知障害）、外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、アルツハイマー病、記憶喪失、アルツハイマー病に関連する注意欠陥兆候、アルツハイマー病に関連する神経変性、混合血管起源の認知症、変性起源の認知症、初老期認知症、老年認知症、パーキンソン病に関連する認知症、血管性認知症、進行性核上性麻痺または皮質基底変性からなる群から選択される。
いくつかの態様において、ＨＤＡＣ２インヒビターの量は、シナプス機能不全を低減するのに有効である。代わりにまたは加えて、ＨＤＡＣ２インヒビターの量は、ヒストン脱アセチル化を低減するのに有効である。任意のＨＤＡＣ２インヒビターは、例として経腸ルートまたは非経口ルートを介して全身投与され得る。本明細書に記載の方法によって処置される任意の対象は、別の治療剤が投与されていてもよい。
【０００５】
他の側面において、本発明は、対象における神経変性疾患を処置するための医薬組成物であり、該組成物は、（ｉ）有効量のヒストンデアセチラーゼ２（ＨＤＡＣ２）インヒビター；および（ｉｉ）薬学的に許容し得る担体を含む。いくつかの態様において、医薬組成物は、転写因子Ｓｐ３（Ｓｐ３）に対するＨＤＡＣ２結合を低減するのに有効であるＨＤＡＣ２インヒビターの量を含む。
さらに他の側面において、本発明は、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドインヒビターである。いくつかの態様において、ペプチドインヒビターは、約２５〜１１０アミノ酸長である。他の態様において、ペプチドインヒビターは、配列番号１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ペプチドインヒビターは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ペプチドインヒビターは配列番号１のアミノ酸配列からなる。いくつかの態様において、ペプチドインヒビターは、薬学的に許容し得る担体をさらに含む医薬組成物中に製剤化される。
【０００６】
本発明の１以上の態様の詳細は、以下の説明に記載されている。本発明の他の特色または利点は、以下の図面およびいくつかの態様の詳細な説明から、および添付の特許請求の範囲からも明らかになるであろう。
図面の簡単な説明
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある側面をさらに実証するために含まれており、本明細書に提示される特定の態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１以上を参照することにより、よりよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｅは、Ｓｐ３がシナプス機能およびシナプス遺伝子発現を調節することを示す。図１Ａは、マウス皮質組織からの抗ＨＤＡＣ２抗体によるＳｐ３の共免疫沈降の代表的なウエスタンブロットを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、対照ｓｈＲＮＡ、ＨＤＡＣ２ ｓｈＲＮＡまたはＳｐ３ ｓｈＲＮＡ（ｎ＝６〜１２）で形質導入されたニューロンからの代表的なｍＥＰＳＣトレース（上）およびｍＥＰＳＣ振幅および周波数の定量化（下）を示す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１（ｆ検定の結果に依存する両側ウェルチまたはスチューデントｔ検定）。
【図１Ｃ】図１Ｃは、対照ｓｈＲＮＡ、Ｓｐ３ ｓｈＲＮＡまたはＳｐ３ ｓｈＲＮＡ（ｎ＝６〜８）と組み合わせたｓｈＲＮＡ耐性Ｓｐ３で形質導入されたニューロンにおけるｍＥＰＳＣ振幅および周波数の代表的なトレースを示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（ダネット検定）。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍである。
【図１Ｄ】図１Ｄは、初代皮質ニューロンにおけるＨＤＡＣ２ ｓｈＲＮＡまたはＳｐ３ ｓｈＲＮＡ発現後の差次的に発現された遺伝子の比較マトリックスを示す。Ｐ値はフィッシャー正確検定を使用して計算された。黒の遺伝子は発現に変化がないことを示し、濃い灰色は発現の減少を示し、薄い灰色はＨＤＡＣ２またはＳｐ３ ｓｈＲＮＡで処置した後の発現の増加を示す。ＨＤＡＣ２およびＳｐ３ ｓｈＲＮＡは両方とも、群１遺伝子の減少した発現および群２遺伝子の増加した発現を媒介する。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ＤＡＶＩＤを使用してＨＤＡＣ２ ｓｈＲＮＡおよびＳｐ３ ｓｈＲＮＡによって上方調節された遺伝子の遺伝子オントロジー分析を示す。
【０００８】
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、Ｓｐ３ノックダウンが標的遺伝子へのＨＤＡＣ２動員を減少させることを示す。図２Ａは、ＣｈＩＰ実験のためのニューロン選別の概略図を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、マウス皮質から選別されたニューロンのＲＮＡ−ｓｅｑによって同定された潜在的な標的遺伝子および対照遺伝子のプロモーターでのＨＤＡＣ２（上パネル）およびＳｐ３（下パネル）のＣｈＩＰ−ｑＰＣＲの結果を示す（ｎ＝３）。各遺伝子転写開始部位に対する増幅領域の場所が示されている。
【図２Ｃ】図２Ｃは、Ｓｐ３ ｓｈＲＮＡまたは対照ウイルスで形質導入された１次ニューロンの標的遺伝子のプロモーターでのＨＤＡＣ２（上パネル）およびアセチル化ヒストンＨ４（下パネル）のＣｈＩＰ−ｑＰＣＲの結果を示す（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（ダネット検定）。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍである。
【０００９】
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｅは、ＨＤＡＣ２およびＳｐ３発現がＡＤ患者で上昇しており、シナプス遺伝子発現と反相関していることを示す。図３Ａは、１３人の健康な対照および１０人のＡＤ患者からの死後海馬ＣＡ１組織におけるＨＤＡＣ２のｍＲＮＡレベルを示す。＊＊Ｐ＜０．０１（両側スチューデントｔ検定）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、１３人の健康な対照および１０人のＡＤ患者からの死後海馬ＣＡ１組織におけるＳｐ３のｍＲＮＡレベルを示す。＊＊Ｐ＜０．０１（両側スチューデントｔ検定）。
【図３Ｃ】図３Ｃは、１３人の対照および１０人のＡＤ患者のデータセットから生成された遺伝子樹状図および共発現モジュールを示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、モジュール間の関係の比較のための、識別されたモジュールからの固有遺伝子の発現の相関マトリックスを示す。各固有遺伝子は、特定のモジュールの標準化された発現データを最もよく表す遺伝子である。シナプス遺伝子が最も顕著に濃縮されるモジュールは「シナプスモジュール」とみなされ、他方、「ＨＤＡＣ２＆Ｓｐ３モジュール」はＨＤＡＣ２とＳｐ３の両方を含有する。シナプス遺伝子はＳｙｎＳｙｓＮｅｔによって定義された。シナプスモジュールを表す固有遺伝子の発現は、ＨＤＡＣ２／Ｓｐ３モジュールを表す固有遺伝子の発現と反相関している（黒い点線で強調表示）。左の白黒スケールは、Ｒでのフィッシャー正確検定によって生成されたシナプス遺伝子の濃縮の統計＝ｌｏｇ１０Ｐ値を示す。右の白黒スケールは、２つの固有遺伝子間の相関係数であるｒ値を示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ＨＤＡＣ２＆Ｓｐ３モジュール（左）およびシナプスモジュール（右）の遺伝子の発現レベルのヒートマップを示す。各ヒートマップの左側の１３カラムは対照ケースからのものであり、右側の１０カラムはＡＤ患者からのものである。
【００１０】
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｄは、ＣＫ−ｐ２５マウスのシナプス可塑性を損なうＳｐ３およびＨＤＡＣ２の上昇したレベルを示す。図４Ａは、対照およびＣＫ−ｐ２５マウスの皮質からのＳｐ３の代表的なウエスタンブロット画像および定量化を示す（ｎ＝３）。定量化は、β−チューブリンへの正規化後に行った。＊Ｐ＜０．０５（両側スチューデントｔ検定）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、対照およびＣＫ−ｐ２５マウスからの皮質組織からのＨＤＡＣ２と共ＩＰされたＳｐ３の代表的な免疫ブロットおよび定量化を示す（ｎ＝６）。ＩＰは、抗ＨＤＡＣ２抗体（ａｂ１２１６９）またはマウスＩｇＧ（陰性対照）で行われた。＊Ｐ＜０．０５（片側スチューデントｔ検定）。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍである。
【図４Ｃ】図４Ｃは、対照およびＣＫ−ｐ２５マウスの皮質から選別されたニューロンの標的遺伝子および対照遺伝子のプロモーターでのＨＤＡＣ２（上パネル）およびＳｐ３（下パネル）のＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ結果を示す（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（ダネット検定）。
【図４Ｄ】図４Ｄは、対照および対照またはＳｐ３ ｓｈＲＮＡを注射したＣＫ−ｐ２５マウスの海馬エリアＣＡ１における興奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰ）のスロープを示す。スロープは、２Ｘシータバースト刺激（ＴＢＳ）の前のスロープの平均によって正規化された（ｎ＝５〜９スライス）。＊Ｐ＜０．０５（反復測定２要因分散分析）。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍである。
【００１１】
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｅは、ＨＤＡＣ２のＣ末端領域がシナプス機能の調節に重要であることを示す。図５Ａは、様々なＨＤＡＣ２および１キメラコンストラクトの図を示す。＃のラベルが付いた領域はＨＤＡＣ１と２との間で同一である。灰色で塗りつぶされた領域はＨＤＡＣ２からのものであり、灰色の線で網掛けされたものはＨＤＡＣ１からのものである。双方向の矢印は、ＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ２の夫々について図５Ｂ〜５Ｃにおいて使用されたｑＰＣＲプライマーセットでのアンプリコンを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、示されたコンストラクトで形質導入された１次ニューロンからＨＤＡＣ１を検出するプライマーを使用した定量的ＲＴ−ｑＰＣＲを示す。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、示されたコンストラクトで形質導入された１次ニューロンからＨＤＡＣ２を検出するプライマーを使用した定量的ＲＴ−ｑＰＣＲを示す。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍである。
【図５Ｄ】図５Ｄは、図５Ｅに示される条件に対応する代表的なｍＥＰＳＣトレースを示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、示されたコンストラクトによるＨＤＡＣ２−ノックダウンニューロンのレスキュー後のｍＥＰＳＣの振幅を示す（ｎ＝５〜１２）。塗りつぶされたカラムおよび縞模様のカラムは、夫々、レスキューなしと有意なレスキューを示す。＊＊Ｐ＜０．０１（ダネット検定）。
【００１２】
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｅは、ＨＤＡＣ２のＣ末端ドメインの外因性発現がＣＫ−ｐ２５マウスのシナプスおよび認知機能障害を改善することを示す。図６Ａは、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞におけるＳｐ３またはＳｉｎ３ＡとＨＤＡＣ２、フラグタグ付きｍＣｈｅｒｒｙ、１Ｃおよび２Ｃの共免疫沈降の代表的なウエスタンブロット画像を示す。矢印は、夫々、ｍＣｈｅｒｒｙ−１Ｃ、ｍＣｈｅｒｒｙ−２ＣおよびｍＣｈｅｒｒｙのバンドを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、対照（ｍＣｈｅｒｒｙ）または２Ｃ発現ウイルスで形質導入された１次ニューロンからのｍＥＰＳＣの振幅および周波数の代表的なトレースおよび定量化を示す（ｎ＝５〜８）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（両側ウェルチｔ検定）。
【図６Ｃ】図６Ｃ（上パネル）は、対照（ｍＣｈｅｒｒｙ）または２Ｃ発現ウイルスで形質導入された１次ニューロンにおける標的遺伝子および対照遺伝子のプロモーターでのＨＤＡＣ２のＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ結果を示す（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（片側スチューデントｔ検定）。図６Ｃ（下パネル）は、２Ｃで形質導入された１次ニューロンにおける標的遺伝子および対照遺伝子の定量的ＲＴ−ｑＰＣＲ結果を示す（ｎ＝４）。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍである。＊Ｐ＜０．０５（ホルム−シダック法により補正された独立ｔ検定）。
【図６Ｄ】図６Ｄは、対照または２Ｃ発現レンチウイルスを注射したＣＫ−ｐ２５マウスの海馬エリアＣＡ１からのｆＥＰＳＰスロープを示す。２ｘＴＢＳの前に、各スライスについてスロープはベースラインに対して正規化された（ｎ＝５〜６スライス）。＊＊Ｐ＜０．０１（反復測定２要因分散分析）。
【図６Ｅ】図６Ｅは、コンテキスト恐怖条件付けの２４時間後のＣＫ（対照マウス）および対照または２Ｃ発現ウイルスを注射したＣＫ−ｐ２５マウスの凍結応答を示す（ｎ＝１０匹のＣＫ−ｐ２５マウス、ｎ＝８匹のＣＫマウス）。＊Ｐ＜０．０５（ターキー検定）。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍである。
【００１３】
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｄは、加重遺伝子共発現ネットワーク分析を使用したＨＤＡＣ２相互作用パートナーのスクリーニングのスキームを示す。図７Ａは、グローバルな遺伝子発現パターンに基づいた高および低ＨＤＡＣ２発現個体の公平なクラスタリングが、２つの群を確実に分離することを示す。濃い灰色および薄い灰色は、夫々、高ＨＤＡＣ２発現および低ＨＤＡＣ２発現を有する個体を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、遺伝子樹状図および共発現モジュールを示す。各カラーは、高度に相関する発現を有する遺伝子を含有する別個のモジュールを示す（ＨＤＡＣ２含有モジュールは灰色で示される）。
【図７Ｃ】図７Ｃは、「抑制因子」の発現（ｘ軸）とＨＤＡＣ２モジュールにおけるすべての遺伝子（ｙ軸）との間のピアソン相関係数のヒートマップを示す。分類は「抑制因子」の遺伝子オントロジー分析に基づいた。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ＨＤＡＣ２とＴＤＰ２（ＨＤＡＣ２と相互作用することがこれまでに報告されたタンパク質）との間の結合を試験するために行われたＨＤＡＣ２抗体を使用したマウス皮質からの共免疫沈降の代表的なウエスタンブロット画像を示す。
【００１４】
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｄは、ＨＤＡＣ２および候補共抑制因子のノックダウン後のノックダウン効率およびｍＥＰＳＣ記録を示す。図８Ａは、Ｈｄａｃ２およびＳｐ３ ｓｈＲＮＡのノックダウン効率を示す（ｎ＝４）。
【図８Ｂ】図８Ｂは、Ｓａｐ３０およびＴｔｒａｐ ｓｈＲＮＡのノックダウン効率を示す（ｎ＝２）。
【図８Ｃ】図８Ｃは、Ｓａｐ３０またはＴｔｒａｐ（ＴＤＰ２）ｓｈＲＮＡで形質導入されたニューロンからの代表的なトレース、ｍＥＰＳＣ振幅および周波数を示す（ｎ＝６〜１０）。ｎ．ｓ．は有意ではないことを意味する（両側スチューデントｔ検定）。
【図８Ｄ】図８Ｄは、対照ｓｈＲＮＡ、Ｓｐ３ ｓｈＲＮＡまたはＳｐ３ ｓｈＲＮＡと組み合わせたｓｈＲＮＡ耐性Ｓｐ３で形質導入されたニューロンにおけるＳｐ３の発現レベルを示す（ｎ＝３）。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍである。
【００１５】
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｈは、ＨＤＡＣ２またはＳｐ３ ｓｈＲＮＡで処置されたニューロンのＲＮＡ−ｓｅｑ分析を示す。図９Ａ〜９Ｂは、関係のある転写産物の低減を示すＨＤＡＣ２での対照、ＨＤＡＣ２またはＳｐ３ ｓｈＲＮＡで処置されたニューロンからのＲＮＡ−ｓｅｑトレースファイルのスナップショットである。データは、各条件の生物学的デュプリケートからのものであった。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｂは、関係のある転写産物の低減を示すＨＤＡＣ２での対照、ＨＤＡＣ２またはＳｐ３ ｓｈＲＮＡで処置されたニューロンからのＲＮＡ−ｓｅｑトレースファイルのスナップショットである。データは、各条件の生物学的デュプリケートからのものであった。
【図９Ｃ】図９Ｃ〜９Ｄは、示されたｓｈＲＮＡで形質導入されたニューロンからのＨＤＡＣ２、Ｓｐ３およびアクチンの免疫ブロットを示す。
【図９Ｄ】図９Ｃ〜９Ｄは、示されたｓｈＲＮＡで形質導入されたニューロンからのＨＤＡＣ２、Ｓｐ３およびアクチンの免疫ブロットを示す。
【図９Ｅ】図９Ｅは、ＣｈＩＰ分析のために選択された「シナプス」遺伝子のリストを示す。各遺伝子の発現は、ＨＤＡＣ２およびＳｐ３の両方のノックダウンによって増加し、ＣＫ−ｐ２５マウスでは減少した。太字の遺伝子はＡＤ患者でも減少した。
【図９Ｆ】図９Ｆ〜９Ｇは、Ｓｐ３またはＨＤＡＣ２ ｓｈＲＮＡで形質導入された１次ニューロンにおける標的遺伝子のＲＴ−ｑＰＣＲ結果を示す（ｎ＝３〜７）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（片側スチューデントまたはウェルチｔ検定）。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍである。
【図９Ｇ】図９Ｆ〜９Ｇは、Ｓｐ３またはＨＤＡＣ２ ｓｈＲＮＡで形質導入された１次ニューロンにおける標的遺伝子のＲＴ−ｑＰＣＲ結果を示す（ｎ＝３〜７）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（片側スチューデントまたはウェルチｔ検定）。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍである。
【図９Ｈ】図９Ｈは、ＣＫ−ｐ２５マウスにおいて差次的に発現される遺伝子と、ＨＤＡＣ２およびＳｐ３により共調節される遺伝子との比較であるマトリックスを示す。Ｐ値はフィッシャー正確検定によって計算される。黒の遺伝子は発現に変化がないことを示し、濃い灰色は発現の減少を示し、薄い灰色は発現の増加を示す。
【００１６】
【図１０Ａ】図１０Ａ〜Ｃは、海馬と皮質との間のＳｐ３およびＨＤＡＣ２のＣｈＩＰシグナルの相関を示す。図１０Ａは、ＮｅｕＮ＋核の単離についてのＦＡＣＳプロットを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂ〜１０Ｃは、マウス海馬から選別されたニューロンにおける標的遺伝子および対照遺伝子のプロモーターまたは下流領域でのＨＤＡＣ２（図１０Ｂ）およびＳｐ３（図１０Ｃ）のＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ結果を示す（ｎ＝３）。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍである。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ＨＤＡＣ２（左パネル）、Ｓｐ３（中央パネル）およびＩｇＧ（右パネル）についての海馬と皮質との間のＣｈＩＰシグナルの相関を示す。
【００１７】
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｄは、ＣＫ−ｐ２５マウスにおけるＨＤＡＣ２およびＳｐ３の上昇したレベルを示す。図１１Ａ〜１１Ｂは、皮質におけるＨＤＡＣ２の代表的な免疫ブロットおよび定量化（図１１Ａ）、ならびに対照（ＣＫ）およびＣＫ−ｐ２５マウスの海馬におけるＨＤＡＣ２およびＳｐ３レベル（図１１Ｂ）を示す（ｎ＝３）。定量化は、β−チューブリンに対する正規化後に行った。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（両側スチューデントｔ検定）。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｂは、皮質におけるＨＤＡＣ２の代表的な免疫ブロットおよび定量化（図１１Ａ）、ならびに対照（ＣＫ）およびＣＫ−ｐ２５マウスの海馬におけるＨＤＡＣ２およびＳｐ３レベル（図１１Ｂ）を示す（ｎ＝３）。定量化は、β−チューブリンに対する正規化後に行った。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（両側スチューデントｔ検定）。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、対照およびＣＫ−ｐ２５マウスからの海馬組織からのＨＤＡＣ２と共ＩＰされたＳｐ３の代表的な免疫ブロットおよび定量化を示す（ｎ＝３）。ＩＰは、抗ＨＤＡＣ２抗体（ａｂ１２１６９）またはマウスＩｇＧ（陰性対照）によって行われた。＊＊Ｐ＜０．０１（片側スチューデントｔ検定）。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍである。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、ＣＫおよびＣＫ−ｐ２５マウスからのＮｅｕＮ＋核の単離についてのＦＡＣＳプロットを示す。
【００１８】
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｃは、in vivoでのＳｐ３のノックダウンを示す。図１２Ａは、対照ｓｈＲＮＡおよびＳｐ３ ｓｈＲＮＡを注射したマウスの海馬ＣＡ１におけるＳｐ３およびｃｏｐＧＦＰ（ｓｈＲＮＡと同じベクターの独立したプロモーターにより誘導される形質導入マーカー）の代表的な免疫組織化学画像を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、海馬ＣＡ１のｃｏｐＧＦＰ陽性領域におけるＨＤＡＣ２、Ｓｐ３および内部対照のウエスタンブロットを示す。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、対照またはＳｐ３ ｓｈＲＮＡを注射した対照（ＣＫ）およびＣＫ−ｐ２５マウスからの海馬スライスにおけるシェファー側枝経路の刺激後のインプット−アウトプット曲線を示す。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍである。
【００１９】
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｃは、ＨＤＡＣ２のＣ末端フラグメント（２Ｃ）の外因性発現の効果を示す。図１３Ａは、対照ｓｈＲＮＡ、ＨＤＡＣ２ ｓｈＲＮＡ、ＨＤＡＣ２＋ＨＤＡＣ１ ｓｈＲＮＡ、ｍＣｈｅｒｒｙ（２Ｃの対照）または２Ｃで形質導入されたＭＥＦの増殖比率を示す。＊＊Ｐ＜０．０１（ダネット検定）、ｎ．ｓ．；有意ではない（片側スチューデントｔ検定）。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、対照または２Ｃで形質導入されたＣＫ−ｐ２５からの海馬スライスにおけるシェファー側枝経路の刺激後のインプット−アウトプット曲線を示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、対照マウスおよび手がかり恐怖条件付けの４８時間後に測定された対照または２Ｃで形質導入されたＣＫ−ｐ２５マウスによる聴覚手がかりに対する凍結応答を示す（ｎ＝８または１０）。＊Ｐ＜０．０５（ターキー検定）。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍである。
【００２０】
詳細な記載
ヒストンのアセチル化などの後成的メカニズムは、多様な生物学的プロセスを調節する転写活性の重大なモジュレーターである。ヒストン修飾酵素の中で、ＨＤＡＣ２は哺乳動物の神経系における構造的および機能的可塑性の重大な負の調節因子である。ＨＤＡＣ２は、それがヒストン基質の局所的な脱アセチル化を促進する多数のシナプス可塑性関連遺伝子のプロモーターに局在する（Graff et al., 2012, Nature 483,p.222-226）。一貫して、ＨＤＡＣ２またはＨＤＡＣインヒビター処置の喪失は、シナプス遺伝子発現、長期シナプス可塑性および記憶プロセスを促進するが、ＨＤＡＣ２過剰発現は反対の効果を有する（Fischer et al., 2007, Nature 447, p. 178-182；Graff et al., 2014 Cell 156, p. 261-276；Graff et al., 2012, Nature 483, p.222-226；Guan et al., Nature, 2009）。
【００２１】
しかしながら、ＨＤＡＣ２を標的化することによる神経変性疾患の処置に対する主要な難関は、現在のＨＤＡＣインヒビター化合物の特異性の欠如である。これらの化合物はデアセチラーゼ触媒ドメインを標的とし、それらの多くはクラスＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ酵素よりもクラスＩ ＨＤＡＣ（ＨＤＡＣ １、２、３および８）について選択性を示すが、機能的ＨＤＡＣ２特異的インヒビターはまだ報告されていない。この特異性の欠如は、種々のＨＤＡＣ酵素の別個のおよびときには対立する機能を考えると、特に問題である（Dobbin et al., 2013 Nature Neuroscience, 16, p. 1008-1015；Wang et al., 2013, Cell, 138 p. 1019-1031）。さらに複雑なことは、ＨＤＡＣ酵素が関与できる多数の種々のクロマチン結合複合体である。実際、ＨＤＡＣ２および他のＨＤＡＣは、しばしば、種々の結合パートナーと相互作用し、細胞型、発生段階、および任意の数の他の内因性または外因性のシグナルに依存して遺伝子の別個のサブセットを調節する。
【００２２】
本発明によれば、ＨＤＡＣ２複合体を阻害して認知機能を増強することができ、利用可能な全ＨＤＡＣインヒビターの有害な副作用を回避することができるＨＤＡＣ２インヒビターのクラスが発見された。この群の化合物は、ＨＤＡＣ２の、シナプス可塑性関連遺伝子のプロモーターへのＨＤＡＣ２の動員に関与するＤＮＡ結合タンパク質（単数または複数）との相互作用を特異的に破壊することができる。本明細書において、転写因子Ｓｐ３のノックダウンは、シナプス伝達を促進する能力においてＨＤＡＣ２ノックダウンと同様であることが実証された。標的遺伝子へのＨＤＡＣ２の動員における役割と一致して、Ｓｐ３のノックダウンはＨＤＡＣ２占有率を低減させ、シナプス遺伝子プロモーターでのヒストンアセチル化を増加させ、ならびにシナプス遺伝子発現に拮抗することができた。また、ＨＤＡＣ２と同様に、ＡＤ様神経変性のマウスモデルの脳ならびにアルツハイマー病を有する患者においてＳｐ３発現が上昇していることがわかった。重要なことに、ＨＤＡＣ２−Ｓｐ３相互作用を破壊する本発明のＨＤＡＣ２インヒビターの外因性発現は、アルツハイマー様神経変性のマウスモデルに見られるシナプス可塑性および記憶欠損を打ち消すことができた。
【００２３】
よって、いくつかの側面において、本発明は、ＨＤＡＣ２−Ｓｐ３相互作用を破壊するための方法および組成物である。ＨＤＡＣ２は、転写因子Ｓｐ３によってシナプス可塑性遺伝子のプロモーターに動員されるヒストンデアセチラーゼである。本明細書で使用される用語「ＨＤＡＣ２」は、様々な種からのＨＤＡＣ２、例えばヒトＨＤＡＣ２を包含する。例として、ヒトＨＤＡＣ２のアミノ酸配列は、GenBankアクセッション番号NP_001518.3およびUniProtKB番号Q92769で提供される。
ＨＤＡＣ２特異的阻害は、哺乳動物ＨＤＡＣアイソフォーム間での活性部位の高度な保存のために問題がある。結果的に、現在のＨＤＡＣインヒビターは、ＨＤＡＣ２に対する特異性を欠いており、複数のＨＤＡＣを阻害するが、これは、身体全体のＨＤＡＣ酵素の多様な機能を考慮すると有害であり得る。例えば、ニューロン機能のコンテキストでは、ＨＤＡＣ２の喪失はシナプス遺伝子の発現および記憶プロセスを促進するが、造血中、ＨＤＡＣ１とＨＤＡＣ２の喪失は分化の欠陥および血小板減少症につながる。現在利用可能な全ＨＤＡＣインヒビターは細胞増殖を中断し、その結果として抗がん剤として使用されている。
【００２４】
本明細書で説明するように、シナプス遺伝子発現を制御するＨＤＡＣ２複合体内の特定のタンパク質が同定され、それにより、他のプロセスでＨＤＡＣ２機能を維持しながら、神経変性中のニューロン遺伝子のＨＤＡＣ２媒介抑制を緩和するための標的を提供する。
結果的に、本開示は、ＨＤＡＣ２のＳｐ３との相互作用を阻害できるＨＤＡＣ２／Ｓｐ３インヒビター、ＨＤＡＣ２のクロマチンへの局在化を低減または阻害できるＨＤＡＣ２局在化インヒビター、またはＨＤＡＣ２結合に利用可能なＳｐ３のレベルを低減させるＳｐ３発現インヒビターを含む阻害化合物の有効量を使用して、対象における神経変性疾患を処置する（例として、神経変性を緩和する、変性の開始を遅延させる、および／または変性を抑制する）方法を提供する。
【００２５】
ＨＤＡＣ２インヒビターおよび医薬組成物
本発明に従う有用な化合物は、ＨＤＡＣ２活性の特異的インヒビターである。ＨＤＡＣ２活性の特異的インヒビターは、細胞増殖またはＨＤＡＣ１活性に影響を与えることなく、ＨＤＡＣ２活性を中断または干渉する化合物である。ＨＤＡＣ２活性の特異的インヒビターは、ＨＤＡＣ２／Ｓｐ３インヒビター、ＨＤＡＣ２局在化インヒビターおよびＳｐ３発現インヒビターを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるＨＤＡＣ２／Ｓｐ３インヒビターは、ＨＤＡＣ２とＳｐ３との間の結合相互作用を遮断、抑制、または低減する化合物を指す。ＨＤＡＣ２／Ｓｐ３インヒビターは、ＨＤＡＣ２がＳｐ３と相互作用することを妨げるＨＤＡＣ２に対する結合、および／または、Ｓｐ３がＨＤＡＣ２に結合することを妨げるＳｐ３に対する結合を含むが、これらに限定されない任意のメカニズムを通じてＨＤＡＣ２−Ｓｐ３の相互作用を低減または干渉し得る。
【００２６】
本明細書で使用されるＨＤＡＣ２局在化インヒビターは、ＨＤＡＣ２のクロマチンへの動員を遮断、抑制、または低減し、シナプス可塑性遺伝子のプロモーターへのＨＤＡＣ２の動員に干渉する化合物を指す。ＨＤＡＣ２局在化インヒビターは、ＨＤＡＣ２とＳｐ３などのクロマチン動員因子との結合相互作用を遮断、抑制、または低減する化合物が含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、ＨＤＡＣ２局在化インヒビターは、ＨＤＡＣ２／Ｓｐ３インヒビターを含む。
低減、干渉、阻害、および抑制という用語は、インヒビターの非存在に典型的な活性レベルと比べた活性レベルの部分的または完全な減少を指す。例えば、減少は、少なくとも２０％、５０％、７０％、８５％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、または５００％であり得、または１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１０００倍、または１０４倍であり得る。
【００２７】
いくつかの例において、本明細書に記載のＨＤＡＣ２／Ｓｐ３インヒビターは、ＨＤＡＣ２に結合し、ＨＤＡＣ２のＳｐ３への結合を阻害する薬剤であり得る。他の例において、ＨＤＡＣ２／Ｓｐ３インヒビターは、Ｓｐ３に結合し、ＨＤＡＣ２とＳｐ３との間の相互作用に干渉する薬剤であり得る。他の例において、ＨＤＡＣ２インヒビターは、ＨＤＡＣ２のＳｐ３との相互作用またはＨＤＡＣ２の発現を阻害するが、他のＨＤＡＣ酵素がＳｐ３と相互作用すること、または、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＨＤＡＣ１２、ＨＤＡＣ１３、ＨＤＡＣ１４、ＨＤＡＣ１５、ＨＤＡＣ１６、ＨＤＡＣ１７、またはＨＤＡＣ１８などの任意の他のＨＤＡＣ酵素の発現を顕著に阻害しない薬剤であり得る。
【００２８】
例示のＨＤＡＣ２／Ｓｐ３インヒビターおよびＨＤＡＣ２局在化インヒビターは、抗体などのペプチド、小分子化合物、およびＨＤＡＣ２／ＳＰ３相互作用を破壊し得る他の化合物を含むが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、ＨＤＡＣ２／Ｓｐ３インヒビターおよび／またはＨＤＡＣ２局在化インヒビターは、ＨＤＡＣ２またはその結合パートナー（例として、ＳＰ３）に結合し、それらの間の相互作用を破壊するペプチドインヒビターであり得る。とりわけ、本明細書では、ＨＤＡＣ２のＣ末端部分がＳｐ３との結合相互作用の原因であることが実証されている。ペプチドであるインヒビターは、Ｓｐ３結合に関与するＨＤＡＣ２分子の一部であるペプチド、ＨＤＡＣ２結合に関与するＳｐ３分子の一部、または、抗体またはそのフラグメントなどの、ＨＤＡＣ２またはＳｐ３のそれらの領域に結合して自然の結合相互作用を競合的に阻害または遮断し得る任意の他のペプチドであり得、または、ＨＤＡＣ２とＳｐ３の間の結合を破壊するであろう別の因子に結合し得る。
【００２９】
よって、いくつかの態様において、ペプチドはＨＤＡＣ２タンパク質の一部を含み、ここで、ペプチドは、Ｓｐ３に特異的に結合し、その全長ＨＤＡＣ２タンパク質との相互作用を遮断する。いくつかの態様において、本明細書に提供されるのは、ＨＤＡＣ２のＣ末端フラグメントを含むペプチドインヒビターである。本明細書で言及されるペプチドインヒビターは、任意の供給源に由来し得る。いくつかの態様において、ペプチドインヒビターは霊長目の動物または齧歯類の動物由来である。いくつかの態様において、ペプチドインヒビターはマウスまたはラットに由来する。いくつかの態様において、ペプチドインヒビターはヒト由来である。
いくつかの態様において、ペプチドインヒビターは、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸を有するＨＤＡＣ２のＣ末端フラグメントを含む。配列番号１におけるアミノ酸１〜９８は、ヒトＨＤＡＣ２配列の３９０〜４８８位に対応する。
【００３０】
いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して約５０％〜約９９％、約６０％〜約９９％、約７０％〜約９９％、約７５％〜約９９％、約８０％〜約９９％、約８５％〜約９９％、約９０％〜約９９％、約９５％〜約９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、ペプチドが天然に存在するペプチドのフラグメントではないように、配列番号１またはそのフラグメントからの１以上のアミノ酸置換を有する。
いくつかの態様において、ペプチドは、約２５〜１１０アミノ酸長である。いくつかの態様において、ペプチドは、約３５〜１１０、約４５〜１１０、約５５〜１１０、約６５〜１１０、約７５〜１１０、約８５〜１１０、約９５〜１１０、または約１００〜１１０アミノ酸長である。いくつかの態様において、ペプチドは、約２５〜１００、約２５〜９０、約２５〜８０、約２５〜７０、約２５〜６０、約２５〜５０、約２５〜４０、または約２５〜３０アミノ酸長である。
【００３１】
いくつかの態様において、ペプチドは、少なくとも１の非天然アミノ酸を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、１または２の非天然アミノ酸を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、少なくとも１のＤアミノ酸を含む。いくつかの態様において、ペプチドは１または２のＤアミノ酸を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、１〜５のＤアミノ酸を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、１〜１０のＤアミノ酸を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、すべてのＤアミノ酸を含む。いくつかの態様において、ペプチドは、少なくとも２０００Ｄａの分子量を含む．
【００３２】
本明細書に記載のペプチドは、Ｌアミノ酸、Ｄアミノ酸、またはそれらの組み合わせを含み得る。ある態様において、ペプチドにおけるすべての残基は、Ｌアミノ酸である。ある態様において、ペプチドにおけるすべての残基は、Ｄアミノ酸である。ある態様において、ペプチドにおける残基は、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸の組み合わせである。ある態様において、ペプチドはＤアミノ酸である１〜５の残基を含有する。ある態様において、少なくとも５％のペプチド配列は、Ｄアミノ酸を含む。ある態様において、少なくとも１０％のペプチド配列は、Ｄアミノ酸を含む。ある態様において、少なくとも２０％のペプチド配列は、Ｄアミノ酸を含む。ある態様において、最大でも１５％のペプチド配列は、Ｄアミノ酸を含む。ある態様において、最大でも２０％のペプチド配列は、Ｄアミノ酸を含む。ある態様において、最大でも５０％のペプチド配列は、Ｄアミノ酸を含む。ある態様において、最大でも６０％のペプチド配列は、Ｄアミノ酸を含む。ある態様において、最大でも８０％のペプチド配列は、Ｄアミノ酸を含む。ある態様において、最大でも９０％のペプチド配列は、Ｄアミノ酸を含む。ある態様において、約５〜１５％のペプチド配列は、Ｄアミノ酸を含む。ある態様において、約５〜２０％のペプチド配列は、Ｄアミノ酸を含む。ある態様において、約５〜５０％のペプチド配列は、Ｄアミノ酸を含む。
【００３３】
いくつかの態様において、ペプチドは、１、５、１０、１５、２０、または２５個のアミノ酸変化（例として、アミノ酸置換、欠失、および／または付加）を伴う配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、アミノ酸変化は、１、５、１０、１５、２０、または２５個のアミノ酸が別のアミノ酸に変異しているアミノ酸置換である。いくつかの態様において、アミノ酸変化は付加または欠失であり、ここで、付加または欠失は、野生型配列の突然変異点で最大１、５、１０、１５、２０、または２５残基の付加または欠失を含む。付加または欠失させられる残基は、連続または非連続の残基である。
ある態様において、ペプチドは、水溶液において最大約３０ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、または約１２０ｍｇ／ｍＬの可溶性を有する。
【００３４】
ある態様において、ペプチドは、Ｓｐ３に対するＨＤＡＣ２結合の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％の阻害を示す。ある態様において、ペプチドは、Ｓｐ３に対するＨＤＡＣ２結合の少なくとも７０％の阻害を示す。ある態様において、ペプチドは、Ｓｐ３に対するＨＤＡＣ２結合の少なくとも８０％の阻害を示す。阻害活性を測定するための様々な方法が知られている。例えば、インヒビター活性は、ペプチドインヒビターを発現する培養細胞、例として、本明細書に記載の例５を使用するクロマチン免疫沈降実験で測定され得る。遺伝子のプロモーターでのＨＤＡＣ２濃縮の低減は、インヒビター活性を示す。
【００３５】
ＨＤＡＣ２／Ｓｐ３インヒビターは、本明細書に記載の方法で使用され得る抗ＨＤＡＣ２および／または抗Ｓｐ３抗体などの抗体およびそのフラグメントを含む。いくつかの態様において、抗ＨＤＡＣ２抗体はＨＤＡＣ２に特異的に結合し、ＨＤＡＣ２とＳｐ３との間の相互作用を妨げる。いくつかの態様において、抗Ｓｐ３抗体はＳｐ３に特異的に結合し、ＨＤＡＣ２とＳｐ３との間の相互作用を妨げる。他の態様において、抗体は、ＨＤＡＣ２およびＳｐ３の両方に結合できる二機能性抗体である。
【００３６】
抗体（互換的に複数形で使用される）は、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド、等々などの標的に対して、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１の抗原認識部位を通じて特異的な結合が可能な免疫グロブリン分子である。
本明細書で使用されるとき、「抗体」という用語は、無傷の（すなわち、全長の）ポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、その抗原結合フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖（ｓｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、線形抗体、単鎖抗体、多重特異性抗体（例として、二重特異性抗体）、および抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、および共有結合修飾抗体を含む、必要な特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された立体配置も包含する。
抗体は、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などの任意のクラスの抗体を含み、抗体は特定のクラスである必要はない。重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは種々のクラスに割り当てられ得る。５つの主要なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例として、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分類され得る。免疫グロブリンの種々のクラスに対応する重鎖定常ドメインは、夫々、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの種々のクラスのサブユニット構造および三次元立体配置はよく知られている。
【００３７】
抗ＨＤＡＣ２抗体は、ＨＤＡＣ２に結合することができる抗体であり、Ｓｐ３に対するＨＤＡＣ２結合を低減し得る、および／またはＨＤＡＣ２の生物学的活性を阻害し得る。いくつかの例において、本明細書に記載の方法で使用される抗ＨＤＡＣ２抗体は、Ｓｐ３に対するＨＤＡＣ２結合を少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、または少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍低減させる。
抗Ｓｐ３抗体は、Ｓｐ３に結合できる抗体であり、Ｓｐ３に対するＨＤＡＣ２結合を低減させ得る、および／またはＳｐ３の生物学的活性を阻害し得る。いくつかの例において、本明細書に記載の方法で使用される抗Ｓｐ３抗体は、Ｓｐ３に対するＨＤＡＣ２結合を少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、または少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、または少なくとも１０００倍低減させる。
【００３８】
ＨＤＡＣ２またはＳｐ３（ヒトＨＤＡＣ２またはＳｐ３など）に対する抗ＨＤＡＣ２またはＳｐ３抗体の結合親和性は、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、または約５０ｐＭ〜約２ｐＭのいずれかのいずれか未満であり得る。結合親和性はＫＤまたは解離定数で表され得、結合親和性の増加はＫＤの減少に対応する。ＨＤＡＣ２またはＳｐ３に対する抗体の結合親和性を決定する１つの方法は、抗体のモノ機能性Ｆａｂフラグメントの結合親和性を測定することによる。モノ機能性Ｆａｂフラグメントを得るために、抗体（例えば、ＩｇＧ）はパパインで切断され得、または組み換えで発現され得る。抗体の抗ＨＤＡＣ２またはＳｐ３Ｆａｂフラグメントの親和性は、表面プラズモン共鳴（BIAcore3000（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム、BIAcore, INC, Piscaway N.J.）によって決定され得る。動的結合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）（一般に２５℃で測定）が得られ、平衡解離定数（ＫＤ）値はｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算される。
【００３９】
いくつかの態様において、抗体は、ヒトＨＤＡＣ２またはＳｐ３に結合し、別の哺乳動物種由来のＨＤＡＣ２またはＳｐ３には有意には結合しない。いくつかの態様において、抗体は、ヒトＨＤＡＣ２またはＳｐ３、ならびに別の哺乳動物種由来の１以上のＨＤＡＣ２またはＳｐ３に結合する。さらに他の態様において、抗体はＨＤＡＣ２に結合し、他のＨＤＡＣなどの他のタンパク質と有意に交差反応しない。抗体が結合するエピトープ（単数または複数）は連続または非連続であり得る。
本明細書に記載の方法で使用される抗ＨＤＡＣ２またはＳｐ３抗体は、マウス、ラット、ヒト、または任意の他の起源（キメラまたはヒト化抗体を含む）であり得る。いくつかの例において、抗体は、免疫学的に不活性である、例として、補体媒介溶解を引き起こさない、または、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を刺激しない、定常領域などの修飾された定常領域を含む。ＡＤＣＣ活性は、米国特許番号5,500,362に開示された方法を使用して評価され得る。他の態様において、定常領域は、Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624；PCT出願番号PCT/GB99/01441; および／または英国特許出願番号9809951.8に記載されるように修飾される。
本明細書に記載の抗体のいずれかは、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり得る。「モノクローナル抗体」は同種の抗体集団を指し、「ポリクローナル抗体」は異種の抗体集団を指す。これらの２つの用語は、抗体の供給源または製造方法を制限しない。
【００４０】
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法で使用される抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその抗原結合フラグメントである非ヒト（例として、マウス）抗体の形態を指す。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基で置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、インポートされたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られないが、抗体性能をさらに洗練および最適化するために含まれる残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、すべてまたは実質的にすべてのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、すべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものに対応する、少なくとも１、典型的には２の可変ドメインの実質的にすべてを含むだろう。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを最適に含むであろう。抗体は、WO 99/58572に記載されているように修飾されたＦｃ領域を有し得る。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に対して変更された１以上のＣＤＲ（１、２、３、４、５、６）を有し、元の抗体からの１以上のＣＤＲに「由来」する１以上のＣＤＲとも呼ばれる。ヒト化抗体は親和性成熟も含まれ得る。
【００４１】
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体はキメラ抗体であり、ヒト抗体由来の重定常領域および軽定常領域を含み得る。キメラ抗体は、第１種からの可変領域または可変領域の一部と、第２種からの定常領域を有する抗体を指す。典型的には、これらのキメラ抗体では、軽鎖と重鎖の両方の可変領域は、ある種の哺乳動物（例として、マウス、ウサギ、およびラットなどの非ヒト哺乳動物）に由来する抗体の可変領域を模倣するが、定常部分は、ヒトなどの別の哺乳動物に由来する抗体の配列と相同である。いくつかの態様において、可変領域および／または定常領域でアミノ酸修飾がなされ得る。
【００４２】
いくつかの例において、本明細書に開示される抗体は、ヒトＨＤＡＣ２またはＳｐ３などの標的抗原に特異的に結合する。標的またはエピトープに「特異的に結合する」（本明細書で互換的に使用される）抗体は、当該技術分野でよく理解されている用語であり、かかる特異的結合を決定する方法も当該技術分野で周知である。分子は、他の標的よりも、より頻繁に、より迅速に、より長い期間および／またはより高い親和性で特定の標的抗原と反応または会合する場合、「特異的結合」を示すと言われる。抗体は、他の物質に結合するよりも大きな親和性、結合力、より容易に、および／またはより長い期間で結合する場合、標的抗原に「特異的に結合する」。例えば、ＨＤＡＣ２またはＳｐ３エピトープに特異的に（または優先的に）結合する抗体は、他のＨＤＡＣ２またはＳｐ３エピトープまたは非ＨＤＡＣ２またはＳｐ３エピトープに結合するよりも、より高い親和性、結合力、より容易に、および／またはよりも長い期間でこのＨＤＡＣ２またはＳｐ３エピトープに結合する抗体である。この定義を読むことにより、例えば、第１の標的抗原に特異的に結合する抗体は、第２の標的抗原に特異的または優先的に結合してもしなくてもよいことも理解される。そのため、「特異的結合」または「優先的結合」は必ずしも排他的結合を必要とするわけではない（含めることはできるが）。一般に、必ずというわけではないが、結合への言及は優先結合を意味する。
【００４３】
Ｓｐ３に対するＨＤＡＣ２結合を低減させることができる抗体は、ＨＤＡＣ２またはＳｐ３（例として、ヒトＨＤＡＣ２またはＳｐ３）に結合し、ＨＤＡＣ２の生物学的活性および／またはＳｐ３を介したＨＤＡＣ２の遺伝子のプロモーターへの動員を阻害する抗体であり得る。本明細書に記載のＨＤＡＣ２のＳｐ３への結合を低減させることができる抗体（例として、抗ＨＤＡＣ２またはＳｐ３抗体）は、当該技術分野で公知の任意の方法によって作製され得る。
【００４４】
本発明の方法に従って、ＨＤＡＣ２またはＳｐ３に結合し、機能する抗体またはそのフラグメントの能力は、本明細書に記載されるものなどの既知の結合または活性アッセイを使用してアッセイされ得る。代わりに、同じ抗原に結合することが知られている他の抗体を使用して競合アッセイを実行し、抗体が他の抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定し得る。競合アッセイは、当業者に周知である。
ＨＤＡＣ２／Ｓｐ３インヒビターは、Ｓｐ３に対するＨＤＡＣ２結合を直接阻害する小分子インヒビター、または結合相互作用を阻害する他の薬剤も含む。
【００４５】
本発明のＨＤＡＣ２／Ｓｐ３阻害化合物は、以下の特徴のうちのいずれか１以上を示し得る：（ａ）Ｓｐ３に対するＨＤＡＣ２結合を低減させる；（ｂ）神経変性疾患のあらゆる側面を予防、改善、または処置する；（ｃ）シナプス機能不全を低減させる；（ｄ）認知機能障害を低減させる；（ｅ）ヒストン脱アセチル化を低減させる；（ｆ）ＨＤＡＣ２の遺伝子のプロモーターへの動員を低減させる。当業者は、本明細書で提供される指針を使用して、かかる阻害化合物を調製することができる。
【００４６】
他の態様において、本明細書に記載のＨＤＡＣ２阻害化合物は、約１００〜２０，０００ダルトン、５００〜１５，０００ダルトン、または１０００〜１０，０００ダルトンのいずれかの分子量を有し得る小分子である。小分子のライブラリは市販されている。小分子は、吸入、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、髄腔内、脳室内、経口、経腸、非経口、鼻腔内、または経皮を含む、当該技術分野で公知の任意の手段を使用して投与され得る。一般に、本発明に従うＨＤＡＣ２インヒビターが小分子である場合、１〜３またはそれ以上の用量に分割された、患者の体重の０．１〜３００ｍｇ／ｋｇの割合で投与されるだろう。通常の体重の成人患者については、１用量あたり１ｍｇ〜５ｇの範囲の用量が投与され得る。
【００４７】
上記の小分子は、化合物ライブラリから得ることができる。ライブラリは、空間的にアドレス可能な並列固相または液相ライブラリにすることができる。例としてZuckermann et al. J. Med .Chem. 37, 2678-2685, 1994；およびLam Anticancer Drug Des. 12:145, 1997を参照。化合物ライブラリの合成方法は、当該技術分野で周知である。例として、DeWitt et al. PNAS USA 90:6909, 1993；Erb et al. PNAS USA 91:11422, 1994；Zuckermann et al. J. Med. Chem. 37:2678, 1994；Cho et al. Science 261:1303, 1993；Carrell et al.  Angew Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059, 1994；Carell et al. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061, 1994；およびGallop et al. J. Med. Chem. 37:1233, 1994。化合物のライブラリは溶液（例として、Houghten Biotechniques 13:412-421, 1992）、またはビーズ（Lam Nature 354:82-84, 1991）、チップ（Fodor Nature 364:555-556, 1993）、微生物（米国特許番号5,223,409）、スポア（米国特許番号5,223,409）、プラスミド（Cull et al. PNAS USA 89:1865-1869, 1992）、またはファージ（Scott and Smith Science 249:386-390, 1990；Devlin Science 249:404-406, 1990；Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382, 1990；Felici J. Mol. Biol. 222:301-310, 1991；および米国特許番号5,223,409）で提供され得る。
【００４８】
代わりに、本明細書に記載のインヒビターは、Ｓｐ３発現を減少させるＳｐ３発現インヒビター、例えば、モルホリノオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ）、アンチセンス核酸、またはリボザイムであり得る。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ｄｓＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡの相同配列特異的分解を指示するプロセスである。哺乳動物細胞では、ＲＮＡｉは、宿主インターフェロン応答を活性化することなく、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の２１ヌクレオチド二重鎖によってトリガーされ得る。本明細書に開示の方法で使用されるｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（２つの別個の相補的ＲＮＡ鎖を含む）または短いヘアピンＲＮＡ（すなわち、タイトなヘアピン構造を形成するＲＮＡ鎖）であり得、両方ともが標的遺伝子の配列に基づいて設計され得る。
任意に、上記の本明細書に記載の方法で使用される核酸分子（例として、アンチセンス核酸、低分子干渉ＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡ）は、非天然の核酸塩基、糖、またはヌクレオシド間共有結合（骨格）を含む。かかる修飾オリゴヌクレオチドは、増強された細胞取り込み、標的核酸への改善された親和性、および増加したin vivo安定性などの所望の特性を付与する。
【００４９】
一例において、核酸は、修飾骨格を有し、リン原子を保持するもの（例として、米国特許3,687,808；4,469,863；5,321,131；5,399,676；および5,625,050を参照）およびリン原子を有しないもの（例として、米国特許5,034,506；5,166,315；および5,792,608を参照）を含む。リン含有修飾骨格の例は、ホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホナート（３’−アルキレンホスホナート、５’−アルキレンホスホナートおよびキラルホスホナートを含む）、ホスフィナート、ホスホルアミダート（３’−アミノホスホルアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートを含む）、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスファート、および３’−５’結合、または２’−５’結合を有するボラノホスファートを含むが、これらに限定されない。かかる骨格は、逆極性、すなわち、３’〜３’、５’〜５’または２’〜２’の結合を有するものも含む。リン原子を含まない修飾骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１以上の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される。かかる骨格は、モルホリノ結合を有するもの（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファマート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸およびスルホンアミド骨格；アミド骨格；混合したＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２構成要素部分を有する他のものを含む。
【００５０】
別の例において、開示された方法で使用される核酸は、１以上の置換糖部分を含む。かかる置換糖部分は、それらの２’位に以下の基の１つを含み得る：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル、およびＯ−アルキル−Ｏ−アルキル。これらの基において、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。それらはまた、それらの２’位にヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性の改善のための基を含み得る。好ましい置換糖部分は、２’−メトキシエトキシ、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシを有するものを含む。Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504を参照。
【００５１】
さらに別の例において、核酸は、１以上の修飾された天然の核酸塩基（すなわち、アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）を含む。修飾された核酸塩基は、米国特許U.S. Patent 3,687,808、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 858-859頁, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, およびSanghvi, Y. S., 15章, Antisense Research and Applications, 289-302頁, CRC Press, 1993に記載のものを含む。これらの特定の核酸塩基は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのその標的核酸への結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン（例として、２−アミノプロピル−アデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン）を含む。Sanghvi, et al., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278を参照。
【００５２】
任意の核酸が当該技術分野において知られている方法によって合成され得る。例として、Caruthers et al., 1992, Methods in Enzymology 211, 3-19、Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684、Wincott et al., 1997, Methods Mol. Bio. 74, 59、Brennan et al., 1998, Biotechnol Bioeng., 61, 33-45、およびBrennan, U.S. Pat. No. 6,001,311を参照。また、それは標準的な技法を使用して発現ベクターから転写され、単離され得る。
本明細書に記載のインヒビターは、当該技術分野において知られている方法を使用して同定または特徴付けされ得、それにより、Ｓｐ３に対するＨＤＡＣ２結合の低減、改善、または中和が検出および／または測定される。例えば、ＥＬＩＳＡ型アッセイは、Ｓｐ３に対するＨＤＡＣ２結合の定性的または定量的測定に好適であり得る。
ＨＤＡＣ２／Ｓｐ３インヒビターは、候補薬剤をＨＤＡＣ２とインキュベートし、以下の特徴の１以上をモニタリングすることによっても同定され得る：（ａ）ＨＤＡＣ２に対する結合；（ｂ）Ｓｐ３に対するＨＤＡＣ２結合の低減；（ｃ）神経変性疾患の任意の側面の予防、改善、または処置；（ｄ）認知機能の保持（ｅ）ヒストンアセチル化の保持；（ｆ）ＨＤＡＣ２の遺伝子のプロモーターへの動員の低減；（ｇ）ＨＤＡＣ２の合成、生産、または放出の阻害（低減）。
【００５３】
いくつかの態様において、ＨＤＡＣ２／Ｓｐ３インヒビターは、候補薬剤をＨＤＡＣ２とインキュベートし、結合およびＳｐ３に対する結合の付随する低減または中和をモニタリングすることにより同定される。結合アッセイは、精製されたＨＤＡＣ２ポリペプチド（単数または複数）を用いて、またはＨＤＡＣ２ポリペプチド（単数または複数）を自然に発現する細胞、または発現するようにトランスフェクトされた細胞を用いて行われ得る。一態様において、結合アッセイは競合的結合アッセイであり、候補抗体がＨＤＡＣ２結合について既知のＨＤＡＣ２インヒビターと競合する能力が評価される。アッセイは、ＥＬＩＳＡ形式を含む様々な形式でなされ得る。他の態様において、ＨＤＡＣ２インヒビターは、候補薬剤をＨＤＡＣ２とインキュベートし、ＨＤＡＣ２／Ｓｐ３複合体形成の付随する阻害をモニタリングすることにより同定される。最初の同定後、ＨＤＡＣ２インヒビター候補の活性は、標的生物活性を試験することが知られているバイオアッセイによってさらに確認および改良され得る。代わりに、バイオアッセイを使用して候補を直接スクリーニングし得る。
【００５４】
以下に提供される例は、候補ＨＤＡＣ２／Ｓｐ３インヒビターをスクリーニングするために使用され得る数多のアッセイを提供する。バイオアッセイは、ＨＤＡＣ２インヒビターの存在下でのアッセイ、認知機能の保存、および／または遺伝子プロモーターでのヒストンアセチル化を含むが、これらに限定されない。加えて、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、Ｓｐ３発現を直接測定し得る。
さらに、好適なＨＤＡＣ２インヒビターは、当該技術分野において知られているおよび／または本明細書に記載のアッセイ方法のいずれかを使用して、組み合わせ化合物ライブラリからスクリーニングされ得る。
【００５５】
医薬組成物
本明細書に記載の１以上のＨＤＡＣ２インヒビターは、バッファーを含む薬学的に許容し得る担体（賦形剤）と混合して、Ｓｐ３に対するＨＤＡＣ２結合を低減する際に使用する医薬組成物を形成し得る。「許容し得る」は、担体が組成物の活性成分と適合性があり（かつ、好ましくは活性成分を安定化できる）、処置対象に有害であってはならないことを意味する。本明細書で使用されるとき、薬学的に許容し得る担体は水を含まず、水などの天然に存在する担体よりも多い。いくつかの態様において、薬学的に許容し得る担体は、製剤化されたバッファー、ナノ担体、ＩＶ溶液等々である。
バッファーを含む薬学的に許容し得る賦形剤（担体）は、当該技術分野において周知である。例として、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hooverを参照。例えば、本明細書に記載の医薬組成物は、標的抗原の種々のエピトープを認識する ペプチドインヒビターなどの１以上のＨＤＡＣ２／Ｓｐ３インヒビターを含む。
【００５６】
本方法で使用される医薬組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含み得る。（Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover）。許容し得る担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストランを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例として、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはTWEEN（商標）（ポリソルベート）、PLURONICS（商標）（ポロキサマー）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含み得る。薬学的に許容し得る賦形剤は、本明細書でさらに説明されている。
【００５７】
いくつかの例において、本明細書に記載の医薬組成物は、ＨＤＡＣ２／Ｓｐ３インヒビターを含むリポソームを含み、これは、Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)；Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)；および米国特許番号4,485,045および4,544,545に記載されるように当該技術分野において知られている方法により調製され得る。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許番号5,013,556に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法により生成され得る。所望の直径を有するリポソームを得るために、リポソームは規定された孔径のフィルターを通して押し出される。
【００５８】
活性成分（例として、ＨＤＡＣ２インヒビター）は、例えば、コアセルベーション技法または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルションにおけるヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタシラート）マイクロカプセルに夫々捕捉され得る。かかる技法は当該技術分野において知られている。例として、Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)を参照。
【００５９】
他の例において、本明細書に記載の医薬組成物は、徐放形式で製剤化され得る。徐放性調製物の好適な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、このマトリックスは、造形品、例としてフィルム、またはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリラート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許番号3,773,919）、Ｌ−グルタミン酸および７エチル−Ｌ−グルタミン酸、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドで構成された注射可能なマイクロスフィア）、酢酸イソ酪酸スクロース、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。
in vivo投与に使用される医薬組成物は滅菌されていなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜を通じた濾過により容易に達成される。治療用抗体組成物は、一般に、滅菌されたアクセスポートを有する容器、例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針で貫通可能なストッパーを有するバイアルに入れられる。
【００６０】
本明細書に記載の医薬組成物は、経口、非経口または直腸投与、または吸入または吹送による投与のために、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、顆粒、溶液または懸濁液、または坐剤などの単位剤形であり得る。
錠剤などの固体組成物を調製するために、主要な活性成分は、医薬担体、例として、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはゴムなどの従来の錠剤化成分、および他の医薬希釈剤、例として、本発明の化合物またはその非毒性の薬学的に許容し得る塩の均一混合物を含む固体予備製剤組成物を形成するための水と混合され得る。これらの予備製剤組成物を均質と呼ぶ場合、活性成分は組成物全体に均等に分散され、組成物が錠剤、丸薬およびカプセルなどの同等に有効な単位剤形に容易に細分され得ることを意味する。次いで、この固体予備製剤組成物は、本発明の活性成分０．１〜約５００ｍｇを含有する上記タイプの単位剤形に細分される。新規組成物の錠剤または丸剤は、コーティングされ得るか、そうでなければ配合されて、長期作用の利点を与える剤形を提供し得る。例えば、錠剤または丸剤は、内部投薬量および外部投薬量の構成要素を含み得、後者は前者を覆うエンベロープの形態である。２つの構成要素は、胃での崩壊に抵抗し、内部構成要素を無傷で十二指腸に通過させるか、放出を遅らせる腸溶性層によって分離され得る。かかる腸溶性層またはコーティングには、数多のポリマー酸、およびシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースなどの材料とポリマー酸の混合物を含む、様々な材料が使用され得る。
【００６１】
好適な界面活性剤は、とりわけ、ポリオキシエチレンソルビタン（例として、TWEEN（商標）２０、４０、６０、８０または８５）および他のソルビタン（例として、SPAN（商標）２０、４０、６０、８０または８５）などの非イオン性薬剤を含む。界面活性剤を有する組成物は、好都合には０．０５と５％との間の界面活性剤を含むだろうし、０．１と２．５％との間であり得る。必要に応じて、他の成分、例えばマンニトールまたは他の薬学的に許容し得るビヒクルが加えられ得ることが理解されるだろう。
好適なエマルションは、INTRALIPID（商標）、LIPOSYN（商標）、INFONUTROL（商標）、LIPOFUNDIN（商標）およびLIPIPHYSAN（商標）などの市販の脂肪エマルションを使用して調製され得る。活性成分は、予め混合されたエマルション組成物に溶解され得るか、または代わりに油（例として、大豆油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、コーン油またはアーモンド油）に溶解され得、リン脂質（例として、卵リン脂質、大豆リン脂質または大豆レシチン）および水との混合時にエマルションが形成される。エマルションの張度を調整するために、他の成分、例えばグリセロールまたはグルコースを加えてもよいことが理解されるだろう。好適なエマルションは、典型的には、最大で２０％、例えば５と２０％との間の油を含むだろう。脂肪エマルションは、０．１と１．０．ｉｍとの間、特に０．１と０．５．ｉｍとの間の脂肪滴を含み得、５．５〜８．０の範囲のｐＨを有し得る。
【００６２】
エマルション組成物は、ＨＤＡＣ２インヒビターをIntralipid（商標）（脂質エマルション）またはその構成要素（大豆油、卵リン脂質、グリセロールおよび水）と混合することにより調製されたものであり得る。
吸入または吹送用の医薬組成物は、薬学的に許容し得る水性または有機溶媒、またはそれらの混合物中の溶液および懸濁液、および粉末を含む。液体または固体組成物は、上記の好適な薬学的に許容し得る賦形剤を含み得る。いくつかの態様において、組成物は、局所または全身効果のために経口または経鼻呼吸ルートにより投与される。
好ましくは滅菌された薬学的に許容し得る溶媒中の組成物は、ガスの使用により噴霧され得る。噴霧された溶液は、噴霧デバイスから直接呼吸してもよく、または、噴霧デバイスはフェイスマスク、テント、または間欠的陽圧呼吸器に取り付けてもよい。溶液、懸濁液または粉末組成物は、適切な方法で製剤を送達するデバイスから、好ましくは経口または経鼻で投与され得る。
【００６３】
神経変性疾患を処置するためのＨＤＡＣ２インヒビターの使用
本明細書に開示の方法を行うために、上記の医薬組成物の有効量は、好適なルート（例として、静脈内投与）を介して処置を必要とする対象（例として、ヒト）に投与され得る。
本明細書に記載の方法により処置される対象は、神経変性疾患を有し得る、有する疑いがある、またはそのリスクがあるヒト患者であり得る。神経変性疾患の例は、ＭＣＩ（軽度認知障害）、外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、アルツハイマー病、記憶喪失、アルツハイマー病に関連する注意欠陥兆候、アルツハイマー病に関連する神経変性、混合血管起源の認知症、変性起源の認知症、初老期認知症、老年認知症、パーキンソン病に関連する認知症、血管性認知症、進行性核上性麻痺または皮質基底変性を含むが、これらに限定されない。
【００６４】
本明細書に記載の方法により処置される対象は、哺乳動物、より好ましくはヒトであり得る。哺乳動物は、家畜、スポーツ動物、ペット、霊長目の動物、ウマ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットを含むが、これらに限定されない。処置を必要とするヒト対象は、神経変性疾患（例として、ＭＣＩ）を有する、そのリスクがある、または有する疑いのあるヒト患者であり得る。神経変性疾患を有する対象は、定期的な医療検査、例として、臨床検査、病歴、実験室試験、ＭＲＩスキャン、ＣＴスキャン、または認知査定によって特定され得る。神経変性疾患の疑いがある対象は、障害の１以上の兆候、例として、記憶喪失、混乱、うつ病、短期記憶の変化、および／または言語、コミュニケーション、焦点および推論の障害を示し得る。神経変性疾患のリスクがある対象は、その障害のリスク因子の１以上を有する対象であり得る。例えば、神経変性疾患に関連するリスク因子は、（ａ）年齢、（ｂ）家族歴、（ｃ）遺伝学、（ｄ）頭部傷害、および（ｅ）心疾患を含む。
【００６５】
本明細書に使用されるとき、「有効量」は、単独でまたは１以上の他の活性剤と組み合わせて、対象に治療効果を与えるのに必要な各活性剤の量を指す。当業者によって認識されるように、有効量は、処置される特定の状態、状態の重症度、年齢、身体状態、サイズ、性別および体重を含む個々の患者パラメータ、処置期間、並行療法の性質（もしあれば）、特定の投与ルート、および医療従事者の知識および専門知識内の同様の因子に依存して変化する。これらの因子は、当業者に周知であり、日常的な実験法のみで対処され得る。一般に、個々の構成要素またはそれらの組み合わせの最大用量、すなわち健全な医学的判断による最高の安全用量が使用されることが好ましい。しかしながら、医学的理由、心理的理由、または事実上任意の他の理由で、患者が低用量または耐容用量を主張し得ることは、当業者には理解されるだろう。
【００６６】
半減期などの経験的な考慮事項は、一般に投薬量の決定に貢献するだろう。例えば、ヒト化抗体または完全ヒト抗体などのヒト免疫系に適合性のある抗体を使用して、抗体の半減期を延長し、抗体が宿主の免疫系に攻撃されるのを防ぎ得る。投与の頻度は、治療の過程にわたって決定および調整され得、必ずしもではないが一般に、神経変性疾患の処置および／または抑制および／または改善および／または遅延に基づいている。代わりに、ＨＤＡＣ２インヒビターの持続的持続放出製剤が適切であり得る。持続放出を達成するための様々な製剤およびデバイスが当該技術分野において知られている。
一例において、本明細書に記載のＨＤＡＣ２インヒビターの投薬量は、ＨＤＡＣ２インヒビターの１以上の投与（単数または複数）を与えられた個体において経験的に決定され得る。個体は、インヒビターの漸増投薬量を与えられる。インヒビターの有効性を査定するために、神経変性疾患（認知機能など）の指標が追跡され得る。
【００６７】
一般に、本明細書に記載のペプチドインヒビターのいずれかの投与については、初期候補投薬量は約２ｍｇ／ｋｇであり得る。本開示の目的のために、典型的な１日投薬量は、上記の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜３μｇ／ｋｇ〜３０μｇ／ｋｇ〜３００μｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ、〜３０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であり得る。数日以上の繰り返し投与については、状態に依存して、兆候の所望される抑制が起こるまで、または神経変性疾患またはその兆候を緩和するのに充分な治療レベルが達成されるまで、処置が持続する。例示の投薬レジメンは、約２ｍｇ／ｋｇの初期用量を投与し、その後、抗体の約１ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量が続くか、または隔週で約１ｍｇ／ｋｇの維持用量が続くことを含む。しかしながら、開業医が達成したい薬物動態の減衰のパターンに依存して、他の投薬量レジメンが有用であり得る。例えば、週に１〜４回の投与が考えられる。いくつかの態様において、約３μｇ／ｍｇ〜約２ｍｇ／ｋｇの範囲（約３μｇ／ｍｇ、約１０μｇ／ｍｇ、約３０μｇ／ｍｇ、約１００μｇ／ｍｇ、約３００μｇ／ｍｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、および約２ｍｇ／ｋｇなど）の投薬が使用され得る。いくつかの態様において、投薬頻度は、毎週１回、２週間ごと、４週間ごと、５週間ごと、６週間ごと、７週間ごと、８週間ごと、９週間ごと、または１０週間ごと；または、１か月に１回、２か月ごと、または３か月ごと、またはそれ以上である。この治療法の進歩は、従来の技法およびアッセイによって容易にモニタリングされる。投薬レジメン（使用するペプチドインヒビターを含む）は、時間とともに変化し得る。
【００６８】
ＨＤＡＣ２インヒビターがペプチドインヒビターではないとき、それは約０．１〜３００ｍｇ／患者の体重１ｋｇの割合で、１〜３回の用量に分けて、または本明細書に開示されているように投与され得る。いくつかの態様において、正常体重の成人患者に対して、約０．３〜５．００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量が投与され得る。特定の投薬量レジメン、すなわち、用量、タイミングおよび反復は、特定の個体およびその個体の病歴、ならびに個々の薬剤の特性（薬剤の半減期、および当該技術分野において周知である他の考慮事項など）に依存するだろう。
【００６９】
本開示の目的のために、ＨＤＡＣ２インヒビターの適切な投薬量は、用いられる特定のＨＤＡＣ２インヒビター（単数または複数）（またはその組成物）、神経変性疾患のタイプおよび重症度、インヒビターが予防目的または治療目的のいずれで投与されるか、以前の治療、患者の病歴およびインヒビターに対する応答、および担当医の裁量に依存するだろう。典型的には、臨床医は、所望の結果を達成する投薬量に達するまで、ＨＤＡＣ２のＣ末端を含むペプチドインヒビターなどのＨＤＡＣ２インヒビターを投与するだろう。ＨＤＡＣ２インヒビターの投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的または予防的であるかどうか、および熟練した開業医に知られている他の因子に依存して、連続的または断続的であり得る。ＨＤＡＣ２インヒビターの投与（例えば、ＨＤＡＣ２インヒビターがペプチドインヒビターである場合）は、事前に選択した期間にわたって本質的に連続的であり得るか、または神経変性疾患の発症前、発症中、または発症後の一連の間隔を空けた用量であり得る。
【００７０】
本明細書に使用されるとき、「処置する」という用語は、障害、疾患の兆候、または神経変性疾患に対する素因を治療、治癒、緩和、開放、変化、治療、改善、改善、またはこれに影響を与える目的で、神経変性疾患、神経変性疾患の兆候、または神経変性疾患に対する素因を有する対象への１以上の活性剤を含む組成物の適用または投与を指す。
神経変性疾患の緩和は、疾患の発症または進行の遅延、または疾患の重症度の軽減を含む。疾患を緩和することは必ずしも治癒的な結果を必要としない。そこで使用されているように、疾患（ＭＣＩなど）の発症を「遅らせる」は、疾患の進行を延期、妨害、減速、遅延、安定化、および／または延期することを意味する。この遅延は、疾患の履歴および／または処置されている個体に依存して、様々な時間の長さであり得る。疾患の発症を「遅延」または緩和する方法、または疾患の発症を遅延させる方法は、方法を使用しない場合と比較して、所定の時間枠において疾患の１以上の兆候を発症する可能性を低減し、および／または所定の時間枠において兆候の程度を低減する方法である。かかる比較は典型的には、臨床研究に基づいており、統計的に有意な結果を得るのに充分な数の対象を使用する。
【００７１】
疾患の「発症」または「進行」は、疾患の初期症状および／またはその後の進行を意味する。疾患の発症は、当該技術分野において周知である標準的な臨床技法を使用して検出可能であり得、査定され得る。しかしながら、開発は、検出できない進行も指す。本開示の目的のために、発症または進行は、兆候の生物学的経過を指す。「発症」は、発生、再発、徴候を含む。本明細書に使用されるとき、神経変性疾患の「発症」または「発生」は、初期発症および／または再発を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のＨＤＡＣ２インヒビター（例として、ＨＤＡＣ２ペプチドインヒビター）は、Ｓｐ３に対するＨＤＡＣ２結合を少なくとも２０％（例として、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％以上）低減するのに充分な量で処置を必要とする対象に投与される。他の態様において、ＨＤＡＣ２インヒビターは、遺伝子プロモーターでのヒストンアセチル化を保存するのに有効な量で投与される。代わりに、ＨＤＡＣ２インヒビターは、ＨＤＡＣ２の遺伝子プロモーターへの動員を低減するのに有効な量で投与される。
【００７２】
いくつかの態様において、ＨＤＡＣ２インヒビターは、シナプス記憶機能を少なくとも２０％（例として、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％以上）増強するのに充分な量で処置を必要とする対象に投与される。シナプス機能は、電気または化学シグナルを別の細胞（例として、ニューロン）に渡す細胞（例として、ニューロン）のシナプスの能力を指す。シナプス機能は、従来のアッセイまたは本明細書に記載のアッセイにより決定され得る（例を参照）。
医学の当業者に知られている従来の方法を使用して、処置する疾患の種類または疾患の部位に依存して、対象に医薬組成物が投与され得る。この組成物は、他の従来のルート、例として、経口、非経口、吸入スプレー、局所、直腸、鼻、頬、膣、または埋め込み型リザーバーによっても投与され得る。本明細書に使用されるとき、「非経口」という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、病巣内、および頭蓋内注射または注入技法を含む。加えて、１、３、または６ヶ月のデポ注射または生分解性材料および方法を使用するなど、それは注射可能なデポ投与ルートを介して対象に投与され得る。
【００７３】
注射可能な組成物は、植物油、ジメチルアクタミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、およびポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、等）などの様々な担体を含み得る。静脈内注射については、水溶性抗体は点滴法で投与され得、それにより抗体および薬学的に許容し得る賦形剤を含む医薬製剤が注入される。薬学的に許容し得る賦形剤は、例えば、５％デキストロース、０．９％生理食塩水、リンゲル液または他の好適な賦形剤を含み得る。筋肉内調製物、例として、抗体の好適な可溶性塩形態の滅菌製剤は、注射用水、０．９％生理食塩水、または５％グルコース溶液などの医薬賦形剤に溶解および投与され得る。
一態様において、ＨＤＡＣ２インヒビターは、部位特異的または標的局所送達技法を介して投与される。部位特異的または標的局所送達技法の例は、ＨＤＡＣ２インヒビターの様々な移植可能なデポ供給源、または輸液カテーテル、留置カテーテル、または針カテーテルなどの局所送達カテーテル、合成移植片、外膜ラップ、シャントおよびステントまたは他の移植可能デバイス、部位特異的担体、直接注射、または直接適用を含む。例として、PCT公開番号WO 00/53211および米国特許番号5,981,568を参照。
【００７４】
アンチセンスポリヌクレオチド、発現ベクター、またはサブゲノムのポリヌクレオチドを含む治療組成物の標的化送達も使用され得る。受容体媒介ＤＮＡ送達技法は、例えば、Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202；Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J. A. Wolff, ed.) (1994)；Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621；Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542；Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655；Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338に記載されている。ポリヌクレオチドを含む治療組成物は、遺伝子治療プロトコルにおける局所投与のために約１００ｎｇ〜約２００ｍｇの範囲のＤＮＡで投与される。いくつかの態様において、約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇまたはそれ以上の濃度範囲のＤＮＡもまた遺伝子治療プロトコル中に使用され得る。
本明細書に記載の治療用ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して送達され得る。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス起源または非ウイルス起源のものであり得る。（一般に、Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51；Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845；Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185；およびKaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148を参照）。かかるコード配列の発現は、内因性の哺乳動物または異種のプロモーターおよび／またはエンハンサーを使用して誘導され得る。コード配列の発現は、構成的または調節的であり得る。
【００７５】
所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞における発現のためのウイルスベースのベクターは、当該技術分野において周知である。例示のウイルスベースのビヒクルは、組み換えレトロウイルス（例として、PCT公開番号WO 90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；WO 93/11230；WO 93/10218；WO 91/02805；米国特許番号5,219,740および4,777,127；GB特許番号2,200,651；およびEP特許番号0 345 242を参照）、アルファウイルスベースのベクター（例として、シンドビスウイルスベクター、セムリキフォレストウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）およびベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ １２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２））、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例として、PCT公開番号WO 94/12649, WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984およびWO 95/00655を参照）を含むが、これに限定されない。Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147に記載されているように、殺されたアデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与も用いられ得る。
【００７６】
非ウイルスの送達ビヒクルおよび方法も用いられ得、これは、殺されたアデノウイルス単独に連結されたまたは連結されていないポリカチオン性凝縮ＤＮＡ（例として、Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147を参照)；リガンド結合ＤＮＡ(例として、Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985を参照)；真核細胞送達ビヒクル細胞（例として、米国特許番号5,814,482；PCT公開番号WO 95/07994；WO 96/17072；WO 95/30763；およびWO 97/42338を参照）および細胞膜との核電荷中和または融合を含むが、これらに限定されない。裸のＤＮＡも用いられ得る。例示の裸のＤＮＡ導入方法は、PCT公開番号WO 90/11092および米国特許番号5,580,859に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして機能し得るリポソームは、米国特許番号5,422,120；PCT公開番号 WO 95/13796；WO 94/23697；WO 91/14445；およびEP特許番号0524968に記載されている。追加のアプローチは、Philip, Mol. Cell. Biol. (1994) 14:2411、およびWoffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581に記載されている。
【００７７】
また、発現ベクターを使用して、本明細書に記載の任意のタンパク質ベースのＨＤＡＣ２インヒビター（例として、ペプチドインヒビター）の発現を指示し得ることも明らかである。例えば、ＨＤＡＣ２および／またはＨＤＡＣ２生物学的活性を遮断（部分的から完全な遮断まで）することができる他のＨＤＡＣ２インヒビターは、当該技術分野において知られている。
本明細書に記載の方法で使用される特定の投薬量レジメン、すなわち、用量、タイミングおよび反復は、特定の対象およびその対象の病歴に依存するだろう。
【００７８】
いくつかの態様において、抗体および小分子ＨＤＡＣ２阻害化合物などの２以上のＨＤＡＣ２インヒビターは、処置を必要とする対象に投与され得る。インヒビターは同じタイプでも、互いに異なっていてもよい。少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５の異なるＨＤＡＣ２インヒビターは同時投与され得る。一般に、これらのＨＤＡＣ２インヒビターは、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する。ＨＤＡＣ２インヒビターは、薬剤の有効性を増強および／または補完するのに役立つ他の薬剤と組み合わせて使用され得る。
処置の有効性は、当該技術分野において周知である方法、例として、処置を受ける患者のシナプス機能または記憶喪失をモニタリングすることにより査定され得る。例として、例５を参照。
【００７９】
組み合わせ治療
また、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の任意のＨＤＡＣ２インヒビターおよび本明細書に記載のものなどの別の抗神経変性疾患治療剤を使用する併用療法である。本明細書に使用されるとき、組み合わせ治療という用語は、これらの薬剤（例として、ＨＤＡＣ２インヒビターおよび抗神経変性疾患治療剤）の逐次的な投与、すなわち、各治療剤が異なる時間に投与されること、ならびにこれらの治療剤、または少なくとも２の薬剤の、実質的な同時方式での投与を包含する。
各薬剤の連続的または実質的に同時の投与は、経口ルート、静脈内ルート、筋肉内、皮下ルート、および粘膜組織を通じた直接吸収を含むがこれらに限定されない任意の適切なルートによって影響を受け得る。薬剤は、同じルートまたは異なるルートで投与され得る。例えば、第１の薬剤（例として、ＨＤＡＣ２インヒビター）は経口投与され得、第２の薬剤（例として、抗神経変性疾患剤）は静脈内投与され得る。
【００８０】
本明細書に使用されるとき、「連続」という用語は、別様に指定がない限り、規則的な順序または順番によって特徴付けられることを意味し、例として、投薬量レジメンがＨＤＡＣ２インヒビターおよび抗神経変性疾患剤の投与を含む場合、連続投薬量レジメンは抗神経変性疾患剤の投与前、同時、実質的に同時、または投与後のＨＤＡＣ２インヒビターの投与を含み得るが、両方の薬剤は規則的な順序または順番で投与されるだろう。「分離する」という用語は、別様に指定がない限り、互いに区別することを意味する。「同時に」という用語は、別様に指定がない限り、同時に起こるか、または同時に行われること、すなわち、本発明の薬剤が同時に投与されることを意味する。「実質的に同時に」という用語は、薬剤が互いに数分以内に（例として、互いに１０分以内に）投与されることを意味し、共同投与および連続投与を包含することを意図しているが、投与が連続する場合、短期間のみ時間的に分離される（例として、開業医が２つの薬剤を個別に投与するのにかかる時間）。本明細書に使用されるとき、同時投与および実質的に同時投与は互換的に使用される。逐次投与は、本明細書に記載の薬剤の一時的に分離された投与を指す。
組み合わせ治療は、他の生物学的活性成分（例として、異なる抗神経変性疾患剤）および非薬物療法（例として、作業治療）とさらに組み合わせて、本明細書に記載の薬剤（例として、ＨＤＡＣ２インヒビターおよび抗神経変性疾患剤）の投与も包含し得る。
【００８１】
ＨＤＡＣ２インヒビターおよび別の抗神経変性疾患剤（例として、抗神経変性疾患抗体）の任意の組み合わせが、神経変性疾患を処置するための任意のシーケンスで使用され得ることを理解されたい。本明細書に記載の組み合わせは、ＨＤＡＣ２の阻害、認知機能の維持、記憶喪失の低減、シナプス機能の低減、および／または神経変性疾患に関連する少なくとも１の兆候の緩和の有効性、または組み合わせの別の薬剤の副作用の軽減の有効性を含むが、これらに限定されない数多の因子に基づいて選択され得る。例えば、本明細書に記載の併用治療は、組み合わせの各個々のメンバーに関連する副作用のいずれか、例えば、抗神経変性疾患剤に関連する副作用を低減し得る。
いくつかの態様において、別の抗神経変性疾患剤は、薬物治療、外科治療、および／または代替治療である。薬物治療の例は、コリンエステラーゼインヒビター（例として、ベンズトロピンおよびトリヘキシフェニジル）、レボドパ、メマンチン、ドーパミンアンタゴニスト（例として、プラミペキソール、ロピニロール、ロチゴチン、およびアポモルフィン）、およびＭＡＯ−Ｂインヒビター（例として、セレギリンとラサギリン）を含むが、これらに限定されない。外科治療の例は、脳深部刺激、視床切開、淡蒼球破壊術、および視床下切開を含むが、これらに限定されない。代替治療の例は、音楽治療、ペット治療、芸術治療、作業治療、運動、および作業治療を含むが、これらに限定されない。
【００８２】
神経変性疾患の処置に使用するためのキット
本開示はまた、神経変性疾患の緩和に使用するためのキットを提供する。かかるキットは、ＨＤＡＣ２インヒビター（例として、ペプチドインヒビター）を含む１以上の容器を含み得る。いくつかの態様において、ＨＤＡＣ２インヒビターは、本明細書に記載のＳｐ３に対するＨＤＡＣ２結合を低減させることができる任意の薬剤である。他の態様において、キットは、小分子インヒビターであるＨＤＡＣ２インヒビター、抗ＨＤＡＣ２抗体、またはＨＤＡＣ２の発現を阻害する薬剤を含む。
いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載の方法のいずれかに従って使用するための指示書を含み得る。含まれる指示書は、本明細書に記載の方法のいずれかに従って神経変性疾患を処置、発症遅延、または緩和するためのＨＤＡＣ２インヒビターの投与の説明を含み得る。キットはさらに、その個体が神経変性疾患を有するかどうかを識別することに基づいて、処置に好適な個体を選択する説明を含み得る。さらに他の態様において、指示書は、神経変性疾患を有する、有する疑いがある、または神経変性疾患のリスクがある個体にＨＤＡＣ２インヒビターを投与することの説明を含む。
【００８３】
ＨＤＡＣ２インヒビターの使用に関する指示書は、一般に、意図する処置の投薬量、投薬スケジュール、および投与のルートに関する情報を含む。容器は、単位用量、バルク包装（例として、複数用量の包装）またはサブ単位用量であり得る。本発明のキットで供給される指示書は、典型的には、ラベルまたは添付文書に記載された指示書（例として、キットに含まれる紙シート）であるが、機械読み取り可能な指示書（例として、磁気または光学記憶ディスクに記載された指示書）も許容され得る。
ラベルまたは添付文書は、組成物が神経変性疾患の処置、発症の遅延、および／または緩和に使用されることを示す。本明細書に記載の方法のいずれかを実施するための指示書が提供され得る。
【００８４】
本発明のキットは好適な包装に入っている。好適な包装は、バイアル、瓶、ジャー、柔軟な包装（例として、密封されたマイラーまたはビニル袋）等を含むが、これらに限定されない。また、吸入器、経鼻投与デバイス（例として、アトマイザー）などの特定のデバイスまたはミニポンプなどの注入デバイスと組み合わせて使用するための包装も考えられる。キットは、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、または皮下注射針で貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。容器はまた、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針で貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１の活性剤は、ペプチドインヒビターなどのＨＤＡＣ２インヒビターである。
【００８５】
キットは、任意で、バッファーおよび解釈情報などの追加の構成要素を提供し得る。通常、キットは、容器および容器上または容器に関連するラベルまたは添付文書（単数または複数）を含む。いくつかの態様において、本発明は、上記のキットの内容物を含む製品を提供する。
さらに詳述することなく、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用できると考えられる。したがって、以下の特定の態様は、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる形であれ本開示の残りの部分を限定するものではないものと解釈されるべきである。本明細書で引用されるすべての刊行物は、本明細書で参照される目的または主題のために参照により組み込まれる。
【００８６】
一般的な技法
本発明の実施は、別様に示されない限り、分子生物学（組み換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技法を用い、これらは当該技術分野の技術の範囲内である。かかる技法は、以下の文献などで完全に説明されている：Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987)；Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)；Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)。
【００８７】
例
本明細書に記載の本発明がより完全に理解され得るために、以下の例が示される。本出願に記載される例は、本明細書で提供される方法、組成物、および系を例示するために提供され、決してそれらの範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
材料および方法
動物モデル
すべてのマウス研究は、マサチューセッツ工科大学の比較医学部門の動物管理委員会によって承認された。オスのＣＫ−ｐ２５マウスをメスのＣＫまたはｐ２５マウスと交配させて、ＷＴ、ＣＫ、ｐ２５および二重トランスジェニックＣＫ−ｐ２５マウスを得た。ＣＫまたはｐ２５マウスを陰性対照として使用した。２．５〜３．５ヶ月齢の二重トランスジェニックＣＫ−ｐ２５マウス（およびその同腹子）を使用して、ドキシサイクリンを含む食物ペレットをドキシサイクリンのないものに変更することにより、ｐ２５の発現を誘導した。すべての挙動実験およびex vivoのＬＴＰ記録を、ｐ２５誘導の６〜８週間（認知障害が強く観察される時間）に行った。
【００８８】
挙動試験
挙動実験は盲検で行った。恐怖条件付け試験：恐怖条件付けのために、マウスを３分間条件付けチャンバー（ＴＳＥ系）に入れ、その後３０秒間の聴覚キュー（３ｋＨｚ、８０ｄＢ）を加え、その後２秒間の一定の足衝撃（０．８ｍＡ）を適用した。２４時間後、マウスを３分間トレーニングコンテキストに再暴露し、凍結挙動を記憶獲得について記録した。４８時間後、マウスを新しいコンテキストに２分間慣れさせ、その後、トレーニングに使用する聴覚キュー（３ｋＨｚ、８０ｄＢ）に２分間曝露し、凍結挙動を記憶獲得について記録した。
【００８９】
プラスミド構築
ｓｈＲＮＡプラスミドについては、Ｕ６プロモーターおよびｓｈＲＮＡ配列を、ＣＭＶプロモーターが欠失させられたｐＣＤＨベクター（System Biosciences, CD511B-1）に導入した。ｓｈＲＮＡ配列およびループ配列を表１に列挙する。ＨＤＡＣ２およびＳｐ３ ｃＤＮＡクローンをTransOMICから購入し、Gibson Assembly Master Mix（NEB, E2611S）を使用してタグ付きタンパク質またはキメラタンパク質を発現するｐＣＤＨベクターにサブクローニングした。ｓｈＲＮＡ耐性突然変異体は、QuikChange II部位特異的変異誘発キット（Agilent Technologies）を使用して生成した。変異誘発に使用したプライマーを表２に列挙する。これらのｐＣＤＨプラスミドは、共免疫沈降およびレンチウイルス調製用のＮｅｕｒｏ２Ａ細胞での発現に使用した。
【００９０】
表１．ｓｈＲＮＡ配列のリスト。
【表１】
2020527558.tif 000003
表２．変異誘発用プライマーのリスト。
【表２】
2020527558.tif 000004
【００９１】
レンチウイルスの構築
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に、製造業者のプロトコルに従ってLipofectamine 2000（Life Technologies）を使用して、７．５μｇのレンチウイルスプラスミド、２．５μｇのＶＳＶ−Ｇ、１．９μｇのｐＲＳＶ−Ｒｅｖおよび５．０μｇのｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥをトランスフェクトした。翌日、培地を、２０％ＦＢＳを含む新鮮な培地と交換した。４８時間後、上清を収集し、３００ｇで５分間遠心分離し、０．４５μｍフィルターで滅菌濾過し、次いで４℃で１９，５００ｒｐｍで２時間遠心分離し（Optima I-90K超遠心分離機、SW41 Tiローター）、廃棄した。ペレットを冷たいダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（DPBS, Life Technologies）に４℃で終夜再懸濁し、次いで一定分量にして−８０℃で保存した。ウイルス力価は、Lentivirus qPCR Titer kit（ABM Inc）で推定した。
【００９２】
初代培養ニューロン
初代皮質ニューロンは、E15-16 Swiss-Webster胚から分離した。ニューロンを、ラウンドカバースリップ（ｍＥＰＳＣ記録用）、６ｃｍディッシュ（ＲＮＡ−ｓｅｑ用）、または１０ｃｍディッシュ（ＣｈＩＰ用）を含む２４ウェルプレート（ＲＴ−ＰＣＲ用）に播種し、すべてＰＤＬ（３０μｇ／ｍＬ、Sigma；P6407）およびマウスラミニン（２μｇ／ｍＬ、Corning；354232）でコートした。細胞の密度は、２４ウェルプレートで１ｘ１０＾５細胞／ｍＬ／ウェル、６ｃｍディッシュで１．５ｘ１０＾６細胞／８ｍＬ／ディッシュ、１０ｃｍディッシュで４ｘ１０＾６細胞／１５ｍＬ／ディッシュであった。ニューロンを、Ｂ２７、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびGlutamax（Life Technologies）を補充した神経基礎培地で維持し、グリア細胞を最小限に抑えるためにＤＩＶ５で１μＭ ＡｒａＣで処置した。培地の半分は、２〜３日ごとに新しい培地に交換した。すべての実験は、ＤＩＶ１７〜２２のニューロンを使用して行った。
【００９３】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）
Ｓｐ３およびアセチル化ヒストンについて、室温で１％ホルムアルデヒドを用いて架橋を行った。ＨＤＡＣ２ ＣｈＩＰについては、２ｍＭグルタミン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＧ）との追加の架橋を３５分間行い、続いてホルムアルデヒド（最終１％）を添加し、さらに１０分間インキュベートした。１２５ｍＭグリシンで反応を停止させた。初代培養ニューロンについては、細胞ペレットを５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．５％ＮＰ−４０、０．２５％TritonX-100、プロテアーゼインヒビターカクテルで１０分間溶解した。４℃で１０００ｒｐｍで５分間回転させることにより、核をペレット化した。ペレットを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ ＮａＣｌで再懸濁し、室温で１０分間振盪し、続いて４℃で１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られたペレットは、ＣｈＩＰ実験用の核画分であった。脳組織については、架橋後にニューロン核の単離を行った。単離した核は、Alexa488結合抗ＮｅｕＮ抗体（Millipore, MAB 477X）で染色した後、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）に供した。精製したＮｅｕＮ陽性核または初代ニューロンの核画分を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩でBioruptorを使用して超音波処理した（高で設定、３０秒オンおよび３０秒オフの４０サイクル）。せん断したクロマチンは、ＨＤＡＣ２（Abcam；ab12169）、Ｓｐ３（Santa cruz；sc-644 X）、またはアセチル化ヒストンＨ４（Active motif；39925）に対する抗体で免疫沈降させた。免疫沈降したＤＮＡをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、エタノール沈殿で精製し、アッセイした遺伝子のプロモーター領域に特異的なプライマーを使用した定量的ＰＣＲに供した（プライマー配列については表３を参照）。増幅したＤＮＡの蛍光シグナル（SYBR green, BioRad）をインプットに対して正規化した。
【００９４】
表３．ＣｈＩＰ実験で使用したプライマーのリスト。遺伝子名の後の数字は、ＴＳＳからの各プライマーの３’末端の位置を示す。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【００９５】
遺伝子発現分析
RNeasy Plus Mini kit（QIAGEN）を使用してＲＮＡを抽出した。逆転写（ＲＴ）およびＰＣＲ反応の定量性を確保するために、RNA to cDNA ECODRY（商標）Premix (double primed)（Clontech）との各ＲＴ反応に８〜１６ｎｇのＲＮＡを使用し、２８ｓ ｒＲＮＡのＰＣＲを除く各ＰＣＲ反応にＲＴ産物の４０分の１を使用した。これは、ＰＣＲ鋳型としてＲＴ反応の１／２４０を使用して行った。ＲＮＡの相対量は、希釈した対照試料の標準曲線に基づいて計算し、２８ｓ ｒＲＮＡまたはＨＰＲＴのものに対して正規化した。プライマーの包括的なリストを表３に示す。ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）については、TrueSeq total RNA Sample Prep Kit（Illumina）を使用して、３００〜５００ｎｇの全ＲＮＡを使用してライブラリを調製した。バーコード化されたライブラリの配列決定は、Illumina Hi-Seq 2000を使用して行った。遺伝子オントロジー分析は、DAVID Functional Annotation Toolを使用して行った。
【００９６】
表４．ＲＴ−ｑＰＣＲ実験において使用されたプライマーのリスト。
【表４】
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【００９７】
免疫ブロッティング
Dounceタイトホモジナイザーを使用して、脳組織または細胞ペレットを５０ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、およびcomplete protease inhibitor cocktail（Roche）に２０ストロークで溶解した。１００００ｘｇで１０分間２回遠心分離した後、上清を共免疫沈降またはウエスタンブロット分析（Bio-rad）に供した。２マイクログラムの抗ＨＤＡＣ２抗体（ab12169）または１５μＬのanti-Flag M2 affinity gels（Sigma）を免疫沈降に使用した。免疫ブロッティングに使用した抗体は、抗ＨＤＡＣ２（１μｇ／ｍＬ、ab12169）、抗Ｓｐ３（１μｇ／ｍＬ、sc-644 X）、抗Ｓｉｎ３Ａ（１μｇ／ｍＬ、Abcam；ab3479）、および抗γ）−チューブリン（１：５００、Sigma；F2043）であった。
【００９８】
免疫組織化学
マウスをイソフルランで麻酔し、４％パラホルムアルデヒドで経心臓的に灌流した。脳を４０μｍでビブラトーム（Leica）を用いて冠状に切断した。切片を抗Ｓｐ３（１：１０００、sc-644 X）抗体で染色した。ｃｏｐＧＦＰシグナルを染色なしで検出した。
【００９９】
定位注射
ｓｈＲＮＡまたはｍＣｈｅｒｒｙ融合タンパク質コンストラクトのいずれかを発現する１マイクロリットルのレンチウイルスを、０．１μＬ／分で両方の半球の背側海馬エリアＣＡ１に定位注射した。ウイルスの均一な分布を確保するために、注射の２分前および５分後に注射針を置いた。注射をＬＴＰ記録または挙動試験の４週間前に行った。ＬＴＰ記録の注射部位の座標は、前後位置（ＡＰ）−２．３ｍｍ、ブレグマから内側外側位置（ＭＬ）±１．３５ｍｍ、皮質表面から背腹（ＤＶ）−１．３５ｍｍであった。行動試験では、上記の部位に加えて、背側海馬ＣＡ１エリア全体をカバーするために、２つより多い部位、ＡＰ：−１．７０ｍｍ、ＭＬ：±１．６６ｍｍ、ＤＶ：−１．２７ｍｍにウイルスを注射した。すべての注入手術は、マサチューセッツ工科大学の比較医学部のガイドラインに従って、無菌条件および麻酔（ケタミン／キシラジン）の下で行った。
【０１００】
電気生理学
ウイルス注射の４週間後、レンチウイルスを注射したマウスから急性海馬スライスを調製した。マウスをイソフルランで麻酔し、断頭した。実験者は、どのウイルスが注射されたかについて知らされていなかった。Leica VT1000S vibratome（Leica）を使用して、横海馬スライス（厚さ４００μｍ）を氷冷解剖バッファー（２１１ｍＭスクロース、３．３ｍＭ ＫＣｌ、１．３ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３および１１ｍＭグルコース）において調製した。スライスを、１２４ｍＭ ＮａＣｌ、３．３ｍＭ ＫＣｌ、１．３ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３および１１ｍＭグルコースからなる９５％Ｏ２／５％ＣＯ２飽和人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）の浸漬チャンバーにおいて２８〜３０℃で１時間回収した。各スライスに同数のウイルス形質導入細胞が存在することを確認するために、ＧＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞の数を定量化した。細胞外記録のために、双極電極を用いたシェファー側枝刺激によって誘発されたＣＡ１電場電位を３０秒ごとに測定した。１５分間ベースラインを記録した後、繰り返し（２回）シータバースト刺激（ＴＢＳ、１００Ｈｚの４つのパルスで構成される１０の短いバーストを含む）によってＬＴＰを誘導した。ｆＥＰＳＰのスロープを測定して、シナプス伝達の強度を定量化した。HEKA機器（ＥＰＣ１０）をデータ収集に使用し、データをpClamp10（Axon Instruments）で分析した。インプット−アウトプット曲線は、刺激強度（ｍＡ）に対してｆＥＰＳＰのスロープをプロットすることにより得た。初代皮質ニューロン（ＤＩＶ１７〜２２）のｍＥＰＳＣ記録については、外部溶液は、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、および１０ｍＭグルコース（ＮａＯＨでｐＨ７．３）、３１５ｍＯｓｍからなるものであった。内部溶液は、１４５ｍＭ ＣｓＣｌ、５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、４ｍＭ Ｍｇ−ＡＴＰ、および０．３ｍＭ Ｎａ２−ＧＴＰ（ＣｓＯＨでｐＨ７．３）、３０５ｍＯｓｍを含んでいた。外部溶液は、１μＭ ＴＴＸ、１０μＭビククリンも含んでいた。直列抵抗を補償した。各細胞の膜電位を記録中に−７０ｍＶでパッチした。記録を室温で得た。Axopatch 200Bアンプを使用してデータを取得し、pClamp10 software（Molecular Devices）で分析した。
【０１０１】
バイオインフォマティクス
利用可能なＲパッケージ（labs.genetics.ucla.edu/horvath/CoexpressionNetwork/、labs.genetics.ucla.edu/horvath/CoexpressionNetwork/Rpackages//#technicalReports）を使用して重み付き遺伝子共発現ネットワーク分析を行った。１８７人の健常者の大脳皮質からの遺伝子発現のデータセットを、Gene Expression Omnibus（GEO；ncbi.nlm.nih.gov/geo/）のGSE15222から引き出した。ＡＤ患者および対照における海馬の遺伝子発現のデータセットはGSE5281からのものであった。ＲＮＡ−Ｓｅｑデータについては、Tophat2を使用して、シングルエンド配列決定リードをマウスゲノムアセンブリ（mm9）にマッピングした。CufflinksのCuffdiffモジュールを使用して、差次的発現分析を行った。有意に変化した遺伝子は、２つの群間で０．０５未満の調整されたＰ値を有する遺伝子であった。ＨＤＡＣ２およびＳｐ３遺伝子座のＲＮＡ−Ｓｅｑシグナルを、IGVブラウザーを使用して視覚化した。シナプス遺伝子を、SynSysNet（bioinformatics.charite.de/synsysnet/）から得た。遺伝子オントロジーを、DAVIDウェブサーバーを使用して査定した。アルツハイマーのマウスモデルであるＣＫ−ｐ２５のＲＮＡ−Ｓｅｑデータセットも、オーバーラップ分析に使用した。ソフトウェアＲは、指定がない限り、プロットの生成に使用した。各遺伝子の摂動（ＨＤＡＣ２またはＳｐ３ ＫＤ）に続いて、遺伝子を３つの群に分類した：上方調節、下方調節、および変更なし。所与の２つの群（ＨＤＡＣ２ ＫＤから1つ、Ｓｐ３ ＫＤから1つ）について、オーバーラップカウントを計算し、Ｒのフィッシャー正確検定によって統計Ｐ値を生成した。
統計
スチューデントまたはウェルチt検定を、f検定後の２つの群の統計的比較に使用した。別様に記載がない限り、複数の比較をダネット検定を用いて行った。ＲＮＡ−ｓｅｑデータのオーバーラップの重要性を調べるために、フィッシャー正確検定を使用した。
【０１０２】
例１：WGCNAを通じた潜在的なＨＤＡＣ２共調節因子の同定
ＨＤＡＣ２を含むＨＤＡＣは、数多の種々のクロマチン修飾複合体と結合し、その各々が細胞内の複数のプロセスを調節する。特定のプロセスに関与する遺伝子へのＨＤＡＣ２動員に不可欠な結合パートナーを決定するために、古典的な免疫沈降（ＩＰ）に続く質量分析（mass spec）以外の技法を検討した。IP-mass specは、ＨＤＡＣ２に結合したすべてのタンパク質を無差別に同定し、シナプス可塑性に関与する遺伝子へのＨＤＡＣ２の動員を媒介する特定のタンパク質を正確に特定することには限界がある。これらの警告のため、重み付け遺伝子共発現ネットワーク分析（WGCNA）を利用した。同様の発現パターンを有する遺伝子は、相互作用するタンパク質または同様の細胞プロセスに関与するタンパク質の群をしばしばコードするという仮説の下で、WGCNAを１８７人の健康なヒトの死後脳からの一般公開された遺伝子発現データに適用した。
【０１０３】
パイロット研究として、「高」ＨＤＡＣ２発現（平均より１標準偏差を超えて上）の２８人および「低」ＨＤＡＣ２発現（平均より１標準偏差を超えて下）の３５人のサブセットを抽出し、次いで全体的な遺伝子発現の偏りのないクラスタリングを行った（図７Ａ）。わずかな例外を除いて、この分析は「高」と「低」のＨＤＡＣ２発現個体を確実に区別し、遺伝子発現サインがＨＤＡＣ２レベルに関連付けられ得ることを示した。
次に、ＨＤＡＣ２遺伝子発現のこの自然なバリエーションを用いて、シナプス可塑性に関与するＨＤＡＣ２結合パートナーを同定できるかどうかを試験した。したがって、WGCNAをデータセット全体に対して行い（ＨＤＡＣ２レベルに関係なく）、遺伝子発現に基づいてＨＤＡＣ２と最も密接に相関または反相関した遺伝子を同定した（図７Ｂ）。この分析は、既知のＨＤＡＣ２結合タンパク質をコードする多くの遺伝子を含む２，２８２遺伝子のＨＤＡＣ２含有モジュールを明らかにした。遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析に基づいて、潜在的なＨＤＡＣ２共調節因子のリストを、転写抑制因子（ＧＯ用語「ヒストンデアセチラーゼ結合」、「転写共抑制因子活性」、「ヒストンデアセチラーゼ活性」および「転写抑制因子活性」で定義される）にさらに絞り込んだ。最後に、ＨＤＡＣ２と同じ相関の方向を示す推定ＨＤＡＣ２共調節因子を見つけるために、転写抑制因子（ＨＤＡＣ２を含む）とＨＤＡＣ２モジュールの遺伝子との間のペアワイズ相関を計算した（図７Ｃ）。２２の候補の結果リストは、ＤＮＡ結合タンパク質、Ｓｐ３、Ｔｄｐ２およびＳａｐ３０などのこれまでに報告されたＨＤＡＣ２結合タンパク質をコードするいくつかの遺伝子を含んでいた。ＨＤＡＣ２に対するＳｐ３およびＴｄｐ２の物理的な相互作用は、ＨＤＡＣ２の免疫沈降と、それに続く抗Ｓｐ３および抗Ｔｄｐ２抗体を使用したウエスタンブロッティングを通じて確認した（図１Ａおよび７Ｄ）。
【０１０４】
例２：Ｓｐ３はシナプス機能を負に調節する
ＨＤＡＣ２を含むＨＤＡＣはＤＮＡに直接結合できないため、その後の努力は、ＤＮＡに結合できるＨＤＡＣ２相互作用タンパク質（Ｓｐ３、Ｓａｐ３０およびＴｔｒａｐ／Ｔｄｐ２）の特定に集中した。これら３つのタンパク質がシナプス遺伝子へのＨＤＡＣ２の動員に必要かどうかの特定を支援するために、シナプス機能の調節における各タンパク質の役割を査定した。ＨＤＡＣ２、Ｓｐ３、Ｓａｐ３０またはＴｔｒａｐを標的とするｓｈＲＮＡで形質導入された培養マウス初代ニューロンから、ミニチュア興奮性シナプス後電流（ｍＥＰＳＣ）を測定した（各ｓｈＲＮＡでの形質導入はｍＲＮＡの５０％超の低減をもたらした；図８Ａ〜８Ｂ）。予想どおり、ＨＤＡＣ２のノックダウンは、ｍＥＰＳＣの増加した振幅および周波数をもたらした（図１Ｂ）。興味深いことに、Ｓｐ３のノックダウンは平均ｍＥＰＳＣの振幅および周波数を増加させたが（図１Ｂ）、Ｓａｐ３０またはＴｔｒａｐのノックダウンはいずれのパラメータも有意に変化させなかった（図８Ｃ）。Ｓｐ３ノックダウンによるｍＥＰＳＣのこの促進は、Ｓｐ３のｓｈＲＮＡ耐性形態の発現によって完全に逆転し、効果の特異性を確認した（図１Ｃおよび８Ｄ）。
【０１０５】
例３：Ｓｐ３はＨＤＡＣ２の動員を介してシナプス遺伝子の発現を抑制する
Ｓｐ３はＨＤＡＣ２に結合し、マウス初代ニューロンからのＳｐ３の欠乏がｍＥＰＳＣに対するＨＤＡＣ２ノックダウンの効果を再現したため、Ｓｐ３およびＨＤＡＣ２がニューロンのシナプス遺伝子発現を共調節するかどうかを決定した。そのために、対照、ＨＤＡＣ２またはＳｐ３ ｓｈＲＮＡで形質導入された初代ニューロンからのＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）を通じたトランスクリプトーム分析（各タンパク質の＞５０％の低減；図９Ａ〜９Ｄ）を行った。ＨＤＡＣ２またはＳｐ３のノックダウンにより変化した遺伝子の統計的に有意なオーバーラップが、ＨＤＡＣ２およびＳｐ３が機能的に同様であることを裏付けることを見出した（図１Ｄ）。興味深いことに、シナプス伝達およびニューロン活性に関与する遺伝子は、ＨＤＡＣ２またはＳｐ３のいずれかのノックダウン後に上方調節された遺伝子間で有意に濃縮された（図１Ｅ）。遺伝子発現の数多のこれらの変化は、逆転写、これに続くカリウムチャネル、ナトリウムチャネル、シナプス膜タンパク質および受容体のサブユニットの発現の変化を含む定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によって検証した（図９Ｅ〜９Ｇ）。
【０１０６】
ＨＤＡＣ２およびＳｐ３によって共調節される遺伝子が病態下で変化するかどうかを調べるために、ＨＤＡＣ２またはＳｐ３ノックダウンによって変化するオーバーラップ遺伝子を、海馬でＨＤＡＣ２の上昇したレベルを示す神経変性のＣＫ−ｐ２５マウスモデルで調節不全になる遺伝子と比較した。加えて、これらのマウスは、ドキシサイクリンを撤回することによるｐ２５の６週間の誘導後、記憶障害およびニューロン喪失、タウの過剰リン酸化、タウ凝集、増加したアミロイド負荷、および低減したシナプス密度などのいくつかのＡＤ関連の病状を示す。ｐ３５の短縮バージョンであるｐ２５は、サイクリン依存性キナーゼ５（ＣＤＫ５）の活性化因子であり、ＡＤに関係する。ｐ２５生成の阻害は、ＡＤモデルマウスにおけるＡＤ表現型の発現を妨げ、ｐ２５の蓄積がＡＤの引き金となりうるという考えを支持する。結果的に、ｐ２５誘導後のＣＫ−ｐ２５マウスの遺伝子発現およびエピゲノムサインは、ヒトＡＤ患者のものと相関する。
【０１０７】
興味深いことに、ＨＤＡＣ２またはＳｐ３ノックダウンによって上方調節される遺伝子は、ＣＫ−ｐ２５マウスで下方調節される遺伝子（図９Ｈ）と、ならびにＡＤ患者の脳で下方調節される遺伝子（表５）との有意なオーバーラップを示した。具体的には、Ｄｌｇａｐ１、Ｇａｂｂｒ２、Ｓｃｎ３ｂ、およびＳｙｎｇｒ３のようなシナプス遺伝子は、ＣＫ−ｐ２５マウスおよびＡＤ患者の両方で下方調節され、ＨＤＡＣ２およびＳｐ３によって負に共調節される。概して、ゲノムワイドな発現分析は、Ｓｐ３およびＨＤＡＣ２がシナプス機能に関連する遺伝子のオーバーラップセットの発現を負に調節するという証拠を提供した。
【０１０８】
表５．ＣＧＰデータベースの用語について、ＨＤＡＣ２／Ｓｐ３ノックダウンにより上方調節される遺伝子の濃縮（broadinstitute.org/gsea/msigdb/annotate.jsp.）
【表５】
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【０１０９】
まとめると、これらの知見は、ＤＮＡ結合タンパク質Ｓｐ３がシナプス機能に関与する遺伝子のプロモーターにＨＤＡＣ２を動員するのに役立ち得るという考えを支持する。この仮説に対処するため、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）に続くｑＰＣＲ（ＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ）を利用して、ＨＤＡＣ２およびＳｐ３が、ＨＤＡＣ２またはＳｐ３ノックダウン後に上方調節されたシナプス遺伝子のプロモーターに直接結合するかどうかを決定した（図９Ｅ）。プライマーペアを、転写開始部位（ＴＳＳ）の上流および下流の両方でプロモーターの領域を増幅するように設計した。追加のプライマーは、ＴＳＳの約４ｋｂ下流の領域を増幅し、これらのタンパク質がプロモーター領域に局在することが以前に示されているため、ＨＤＡＣ２およびＳｐ３濃縮の陰性対照として機能する。シナプス遺伝子のプロモーターおよびニューロン機能におけるＨＤＡＣ２およびＳｐ３の役割に関心があるため、マウス脳からのニューロンを単離し、直接プローブした。ニューロン核の単離は、ニューロンマーカー、ＮｅｕＮの染色、それに続くＮｅｕＮグリア集団をＮｅｕＮ＋ニューロンから分離するための蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を通じて達成した（図２Ａおよび１０Ａ）。抗ＨＤＡＣ２および抗Ｓｐ３抗体を有する野生型マウスの皮質ニューロン（ＮｅｕＮ＋）核に由来するクロマチンを使用したＣｈＩＰ−ｑＰＣＲは、ＨＤＡＣ２およびＳｐ３がシナプス遺伝子のプロモーターに共局在し、ＩｇＧ対照に比べて明確に濃縮されていることを実証した（図２Ｂ〜２Ｃ）。海馬組織由来のＮｅｕＮ＋核を使用したＣｈＩＰ−ｑＰＣＲ実験では、シナプス遺伝子プロモーターでのＨＤＡＣ２およびＳｐ３の濃縮および分布は皮質ニューロンで観察されたものと同様であり、この現象は脳領域全体で保存されていることを示唆した（図１０Ｂ〜１０Ｃ）。
【０１１０】
次に、Ｓｐ３がＳｐ３およびＨＤＡＣ２によって共調節されるシナプス遺伝子のプロモーターへのＨＤＡＣ２の動員を媒介するかどうかを試験した。この疑問に対処するために、初代ニューロンのシナプス遺伝子プロモーターでのＨＤＡＣ２濃縮に対するＳｐ３ノックダウンの効果を調べた。興味深いことに、ＣｈＩＰ実験は、Ｓｐ３単独のノックダウンがこれらの遺伝子のプロモーターへのＨＤＡＣ２の動員を有意に低減させるのに充分であることを明らかにした（図２Ｄ）。重要なことに、ＨＤＡＣ２またはＳｐ３のノックダウン後の発現の変化の欠如によって定義される対照遺伝子（Ｃｄ８１、Ｍｋｒｎ１、Ｆａｍ１７１ｂ、Ｔａｎｃ２、Ｅｎｇａｓｅ）でのＨＤＡＣ２濃縮は、Ｓｐ３の喪失による影響を受けなかった（図２Ｄ）。共調節されたシナプス遺伝子プロモーターでのヒストンＨ４アセチル化が、これらの部位へのＨＤＡＣ２の動員が低減した場合に予想されるように、Ｓｐ３ノックダウンによって変化するかどうかを試験した。実際、Ｓｐ３のノックダウンによるＨＤＡＣ２結合の減少は、Ｇｒｉｋ２、Ｌｉｎ７ａ、Ｎｌｇｎ１、Ｓｙｎｇｒ３およびＳｙｎｐｒを含むいくつかの遺伝子のプロモーターでの増加したヒストンＨ４アセチル化を伴った（図２Ｅ）。これらの知見は、Ｓｐ３がＨＤＡＣ２をシナプス遺伝子のプロモーターに動員し、次いでＨＤＡＣ２がヒストンの脱アセチル化を媒介して遺伝子発現を調節するという考えと一致する。
【０１１１】
例４：ＨＤＡＣ２およびＳｐ３の発現はＡＤで調節解除される
遺伝子発現プロファイリングは、ＨＤＡＣ２およびＳｐ３がシナプス遺伝子のサブセットを共調節することを示し、その多くはＡＤの病的状態のコンテキストで調節解除もされている。これらの所見は、ＨＤＡＣ２タンパク質レベルがＡＤ患者および神経変性のマウスモデルで増加したという以前の知見とともに、Ｓｐ３発現もＡＤで上方調節されるかどうかの試験を促した。最初に、１３人の健康な対照および１０人のＡＤ患者からの海馬ＣＡ１錐体ニューロンから収集された公開された遺伝子発現データを調べ、ＡＤ患者におけるＨＤＡＣ２およびＳｐ３の両方の発現の有意な増加が見つかった（図３Ａ〜３Ｂおよび表６）。さらにまた、WGCNAをデータセットに適用して、ＡＤ患者の遺伝子発現ネットワークの変化を調査した。健康な対照およびＡＤ患者を組み合わせたこのデータセットでさえ、ＨＤＡＣ２およびＳｐ３が同じ遺伝子発現モジュールに分離することを観察した（図３Ｃ）。その上、ＨＤＡＣ２／Ｓｐ３モジュールにおける遺伝子の発現は、対照と比較してＡＤ患者においてより高く、シナプス機能が最も濃縮されたモジュールにおける遺伝子の発現と負の相関があった（図３Ｄ〜３Ｅ）。
【０１１２】
表６．対照対象およびＡＤ患者についてのヒト組織情報。
【表６】
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【０１１３】
次に、ＣＫ−ｐ２５マウスのＳｐ３レベルを調べた。ＨＤＡＣ２の発現は、６週間誘導されたＣＫ−ｐ２５マウスの皮質および海馬で上昇した（図１１Ａ〜１１Ｂ）。興味深いことに、Ｓｐ３タンパク質レベルは、６週間誘導されたＣＫ−ｐ２５マウスの皮質（図４Ａ）および海馬（図１１Ｂ）でも上昇していた。同様に、抗ＨＤＡＣ２抗体との共免疫沈降によって査定されるＨＤＡＣ２およびＳｐ３の複合体は、ＣＫ−ｐ２５マウスで増加した（図４Ｂおよび１１Ｃ）。重要なことに、６週間誘導されたＣＫ−ｐ２５マウスで下方調節されたシナプス遺伝子のプロモーターに結合したＨＤＡＣ２およびＳｐ３のレベルを査定した。ＨＤＡＣ２−Ｓｐ３複合体がこれらのマウスのシナプス遺伝子発現に拮抗するという考えと一致して、ＣＫ対照と比較してＣＫ−ｐ２５ ＮｅｕＮ＋ニューロン核のこれらの遺伝子座の多くで増加したＨＤＡＣ２およびＳｐ３結合が見られた（図４Ｃおよび４Ｄおよび１１Ｄ）。
【０１１４】
ＡＤ関連の病的状態に対する上昇したＳｐ３レベルの重要性を試験するために、ＣＫ−ｐ２５マウスの海馬のＳｐ３を標的とするｓｈＲＮＡを発現させた（図１２Ａ〜１２Ｂ）。以前の実験は、ＣＫ−ｐ２５マウスのＨＤＡＣ２レベルを正常化するＨＤＡＣ２ ｓｈＲＮＡの発現は、長期のシナプス可塑性の欠損を逆転するのに充分であることを示した。ＣＡ３−ＣＡ１シェファー側枝経路の長期増強（ＬＴＰ）は、対照ｓｈＲＮＡを注射したＣＫ−ｐ２５マウスでは著しく損なわれたが、Ｓｐ３ ｓｈＲＮＡを注射したＣＫ−ｐ２５マウスは、対照マウスに匹敵する堅牢なＬＴＰを示した（図４Ｅ）。Ｓｐ３ノックダウンは、ＣＫ−ｐ２５マウスの基底シナプス伝達に有意に影響を及ぼさなかった（図１２Ｃ）。
まとめると、これらの結果は、ＨＤＡＣ２およびＳｐ３の両方がＣＫ−ｐ２５モデルマウスおよび死後ＡＤ海馬組織で上方調節されていることを示す。さらに、これらの結果は、ＨＤＡＣ２と同様に、Ｓｐ３発現の下方調節がＣＫ−ｐ２５マウスのシナプス可塑性の欠損を改善したことを示す。
【０１１５】
例５：ＨＤＡＣ２−Ｓｐ３複合体を阻害することはシナプス機能を増強する
本明細書で提供される実験データは、Ｓｐ３がシナプス遺伝子のプロモーターへのＨＤＡＣ２の動員において重要な役割を果たし、このメカニズムがアルツハイマー病で調節解除されることを実証する。ＨＤＡＣ２とは異なり、ＨＤＡＣ１はシナプス遺伝子の発現および認知機能を抑制しないが、２つのタンパク質は８０％のアミノ酸相同性を共有し、カルボキシル末端（Ｃ末端）で最大の相違がある。代わりに、ＨＤＡＣ１の喪失は、二本鎖ＤＮＡ切断、細胞周期への異常な再入、およびニューロンの死をもたらす。ＨＤＡＣ１の機能獲得は神経保護的である。
【０１１６】
ＨＤＡＣ２−Ｓｐ３の相互作用をさらに特徴付けるために、シナプス機能の調節およびＳｐ３に対する結合に関与するＨＤＡＣ２の領域をマッピングした。ＨＤＡＣ２および密接に関連するＨＤＡＣ１の３つのキメラは、各々高度に保存されたＨＤＡＣ２触媒ドメインおよび核局在化シグナルを含み、生成された（図５Ａ）。キメラＡについては、ＨＤＡＣ２のアミノ末端（アミノ酸１〜１２１）をＨＤＡＣ１のもの（アミノ酸１〜１２０）に置き換えた。キメラＢでは、ＨＤＡＣ２の中間ドメイン（アミノ酸２２７〜３５７）をＨＤＡＣ１のもの（アミノ酸２２６〜３５６）に置き換えた。キメラＣでは、ＨＤＡＣ２の分岐したＣ末端（アミノ酸３９１〜４８８）をＨＤＡＣ１のもの（アミノ酸３９０〜４８２）に置き換えた。これらのキメラの各々を、培養した初代ニューロンで発現させ、発現のレベルを、ＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ２に相補的なプライマー（図５Ａの矢印でマークしたプライマー結合領域）を使用して決定した。培養したニューロンにおけるＨＤＡＣ２のノックダウン後、キメラＢのみが、全長ＨＤＡＣ１と同じレベルでＨＤＡＣ１の中間部分を発現した（図５Ｂ）。さらにまた、キメラＡ、Ｂ、およびＣは、全長ＨＤＡＣ１とは異なり、アミノ酸１２０〜２２６の間のＨＤＡＣ２の領域を同様のレベルで発現し、後続の実験で見られる任意の差次的効果はコンストラクトの可変発現によるものではないことを示唆した（図５Ｂ〜５Ｃ）。
【０１１７】
次いで、各コンストラクトを、培養した初代ニューロンのＨＤＡＣ２ノックダウンによって引き起こされる増加したｍＥＰＳＣ振幅を減衰させるその能力について試験した。特に、全長ＨＤＡＣ１またはキメラＣ（ＨＤＡＣ１のＣ末端を有するＨＤＡＣ２）の発現は、ｍＥＰＳＣに対するＨＤＡＣ２ノックダウンの効果を打ち消さなかった（図５Ｄ〜５Ｅ）。対照的に、キメラＡおよびキメラＢ、ならびに全長ＨＤＡＣ２は、ＨＤＡＣ２のノックダウンを有意にレスキューした（図５Ｄ〜５Ｅ）。これらのデータは、ＨＤＡＣ２の分岐したＣ末端がシナプス機能の調節に重要であることを示唆する。
ＨＤＡＣ２の分岐したＣ末端単独がＳｐ３に対して結合できる場合、ＨＤＡＣ２−Ｓｐ３の相互作用はこのドメインの過剰発現を通じて潜在的に阻害され得る。これを試験するために、ｍＣｈｅｒｒｙと融合したＨＤＡＣ２（２Ｃと呼ばれる）またはＨＤＡＣ１（１Ｃと呼ばれる）のいずれかまたはｍＣｈｅｒｒｙ単独のＣ末端ドメインをニューロンＮ２Ａ細胞にトランスフェクトした。ｃｏ−ＩＰ実験を使用すると、１ＣまたはｍＣｈｅｒｒｙ単独ではなく、２Ｃが内因性Ｓｐ３に強固に結合することが示された（図６Ａ）。重要なことに、細胞周期の進行を制御するＨＤＡＣ１／２複合体のよく特徴付けられたパートナーであるＳｉｎ３Ａに対する２Ｃの結合は検出されなかった。この結果は、Ｓｉｎ３ＡがＨＤＡＣ２の異なる領域に結合することを示唆する。
【０１１８】
次に、シナプス機能が２Ｃの発現によって影響を受けるかどうかを調べた。結果は、培養初代ニューロンにおける２Ｃの発現が、ＨＤＡＣ２またはＳｐ３ノックダウンのいずれかを連想させるｍＥＰＳＣ振幅および周波数を促進することを示した（図６Ｂ）。シナプス遺伝子に対するＨＤＡＣ２の動員が、Ｓｐ３のノックダウンによるように、２Ｃの発現によって乱されたかどうかも試験した（図２Ｄ）。一貫して、シナプス伝達に関与する遺伝子のプロモーターでのＨＤＡＣ２濃縮は、２Ｃの発現後に有意に低減した（図６Ｃ）。さらに、２Ｃの発現を観察した後に試験したシナプス遺伝子の大部分の増加した発現を観察した（図６Ｄ）。一緒に、これらのデータは、ＨＤＡＣ２のＣ末端ドメインの過剰発現が、おそらく関係のあるゲノム遺伝子座からのＨＤＡＣ２の排除を通じて、ＨＤＡＣ２およびＳｐ３ノックダウンがシナプス機能、遺伝子発現およびＤＮＡ全体のＨＤＡＣ２局在に対する効果を模倣することを示した。
【０１１９】
次に、２Ｃの過剰発現を介したシナプス遺伝子のプロモーターに対するＨＤＡＣ２動員の阻害が細胞増殖に影響するかどうかを調べた。現在利用可能な全ＨＤＡＣインヒビターは、細胞周期の進行を遮断し、望ましくない効果を引き出し得る。したがって、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）の増殖が２Ｃの過剰発現によって影響を受けるかどうかを試験した。ＭＥＦの増殖の速度は、ＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ２の同時ノックダウンにより有意に減少したが、ｍＣｈｅｒｒｙ対照と比較した増殖に対する２Ｃ発現の効果は観察されなかった（図１３Ａ）。これらの結果は、ＨＤＡＣ２のＣ末端ドメインを標的とすることで、細胞増殖に対する有害な効果を回避しながら、シナプス機能の選択的操作が可能になることを示唆する。
【０１２０】
２Ｃの発現を通じてＨＤＡＣ２−Ｓｐ３複合体を標的とする治療の可能性の検証として、神経変性のＣＫ−ｐ２５モデルを使用したＣＡ３−ＣＡ１シェファー側枝ＬＴＰおよび記憶機能に対する２Ｃ発現の効果を試験しました。ＣＫ−ｐ２５マウスの海馬における対照ウイルスではなく２Ｃのレンチウイルス発現は、基底シナプス伝達に対して効果を有しなかったが、これらのマウスではＬＴＰを増強した（図６Ｅおよび１３Ｂ）。コンテキストおよび手がかり恐怖条件付けアッセイによって評価される海馬依存性の記憶形成も、６週間誘導ＣＫ−ｐ２５マウスで著しく損なわれている。重要なことに、海馬における２Ｃの過剰発現は、コンテキスト依存性および手がかり恐怖学習障害の両方を改善することができた（図６Ｆおよび１３Ｃ）。よって、２Ｃの過剰発現は、神経変性のマウスモデルにおけるシナプスおよび認知障害を打ち消し得る。まとめると、我々の知見は、ＨＤＡＣ２のＣ末端を標的とすることは、ＨＤＡＣ２−Ｓｐ３複合体を阻害し、記憶障害に関連する神経学的障害を処置するためのもっともらしい特定の戦略を構成することを示す。
【０１２１】
配列
配列番号１−ＨＤＡＣ２ペプチドインヒビター（ヒトＨＤＡＣ２、UniProt ID番号：Q92769、アミノ酸３９０〜４８８）
ＶＨＥＤＳＧＤＥＤＧＥＤＰＤＫＲＩＳＩＲＡＳＤＫＲＩＡＣＤＥＥＦＳＤＳＥＤＥＧＥＧＧＲＲＮＶＡＤＨＫＫＧＡＫＫＡＲＩＥＥＤＫＫＥＴＥＤＫＫＴＤＶＫＥＥＤＫＳＫＤＮＳＧＥＫＴＤＴＫＧＴＫＳＥＱＬＳＮＰ
【０１２２】
他の態様
本明細書に開示されているすべての特色は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書で開示される各特色は、同じ、同等の、または同様の目的を果たす代替特色に置き換えることができる。したがって、別様に明記しない限り、開示された各特色は、同等または同様の特色の一般的なシリーズの例にすぎない。上記の説明から、当業者は本開示の不可欠な特徴を容易に確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、本開示の様々な変更および改変を行って様々な用途および条件に適合させることができる。したがって、他の態様も特許請求の範囲内にある。
【０１２３】
均等物および範囲
当業者は、本明細書に記載の本開示の特定の態様に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験法のみを使用して確認することができるであろう。本開示の範囲は、上記の説明に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に記載されているものである。請求項において、「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、逆に指示されない限り、または文脈から別様に明白でない限り、１以上を意味し得る。群の１以上のメンバー間の「または」を含むクレームまたは説明は、群のメンバーの１つ、１つよりも多く、または全てが、逆に指示されない限り、または文脈から別様に明白でない限り、所与のものまたはプロセスに存在する、用いられる、または別様に関係する場合に満足するものとされる。本開示は、群の正確に１のメンバーが、所与のものまたはプロセスに存在する、用いられる、または別様に関係する態様を含む。本開示は、群のメンバーの１つよりも多くまたはすべてが、所与のものまたはプロセスに存在する、用いられる、または別様に関係する態様を含む。
【０１２４】
さらに、本開示は、列挙された請求項の１以上からの１以上の限定、要素、条項、および説明用語が別の請求項に導入される、すべてのバリエーション、組み合わせ、および順列を包含する。例えば、別のクレームに従属する任意のクレームを修正して、同じ基本クレームに従属する任意の他のクレームに見られる１以上の限定を含めることができる。要素がリストとして表示されている場合、例として、マーカッシュ群形式では、要素の各サブ群も開示されており、任意の要素（単数または複数）が群から除去され得る。一般に、本開示または本開示の側面が特定の要素および／または特色を含むと言われる場合、本開示のある態様または本開示の側面は、かかる要素および／または特色からなるか、または本質的になると理解されるべきである。簡単にするために、それらの態様は、本明細書ではこれらの言葉で具体的に記載されていない。「含む」および「含有する」という用語は、オープンであることを意図しており、追加の要素またはステップの包含を許可することにも留意されたい。範囲が指定されている場合、エンドポイントが含まれる。さらに、別様に示されないか、または当業者の文脈および理解から別様に明白でない限り、範囲として表される値は、文脈が明確に別様に指示していない限り、範囲の下限の１０分の１の単位まで、本開示の種々の態様において記載された範囲内の任意の特定の値またはサブ範囲をとることができる。
【０１２５】
本出願は、様々な交付済み特許、公開された特許出願、雑誌記事、および他の刊行物を参照し、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。組み込まれた参考文献のいずれかと本明細書との間に矛盾がある場合、明細書が支配するものとする。加えて、先行技術内に含まれる本開示の任意の特定の態様は、請求項のいずれか１以上から明示的に除外されてもよい。かかる態様は、当業者に知られているとみなされるため、除外が本明細書に明示的に記載されていなくても、除外されてもよい。本開示の特定の態様は、先行技術の存在に関係するかどうかにかかわらず、任意の理由で、任意の請求項から除外され得る。
当業者は、本明細書に記載の特定の態様に対する多くの均等物を日常的な実験法のみを使用して認識または確認することができるであろう。本明細書に記載の本態様の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲に記載されるものである。当業者は、以下の特許請求の範囲で定義されるように、本開示の精神または範囲から逸脱することなく、この説明に対する様々な変更および修正を行うことができることを理解するであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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