(57)【要約】本開示は、ＭＶＡ−ＴＡＡ（腫瘍関連抗原を伴う改変ワクシニアアンカラウイルス）とともに、第２の抗体からなる併用療法、すなわち、がん患者の腫瘍体積を縮小させ、及び／または生存率を向上させるための方法に関するものである。その併用療法は、がん患者に、腫瘍関連抗原をコードする組み換えＭＶＡを静脈内投与すること、及び抗体を投与することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を向上させるのに用いる併用医薬であって、
ａ）第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸を含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、静脈内投与すると、異種ＴＡＡをコードする核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非静脈内投与によって誘導されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答及びＴ細胞応答と比べて、ＮＫ細胞応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方を誘導する前記ＭＶＡウイルスと、
ｂ）Ｆｃドメインを含むとともに、腫瘍細胞の細胞膜上に発現する抗原に特異的である抗体と、
を含み、
ａ）及びｂ）を前記がん患者に投与すると、単独でａ）を非ＩＶ投与するか、またはｂ）を投与する場合と比べて、前記がん患者の腫瘍サイズが縮小し、及び／または生存率が上昇する前記併用医薬。
【請求項２】
ＣＤ４０Ｌをさらに含む、請求項１に記載の用途用の併用医薬。
【請求項３】
前記ＣＤ４０Ｌが、前記組み換えＭＶＡウイルスによってコードされる、請求項１〜２のいずれか１項に記載の用途用の併用医薬。
【請求項４】
前記組み換えＭＶＡが、第２の異種ＴＡＡをコードする第２の核酸をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の用途用の併用医薬。
【請求項５】
前記第１及び／または第２のＴＡＡが、５−α−レダクターゼ、α−フェトプロテイン（「ＡＦＰ」）、ＡＭ−１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、Ｂメラノーマ抗原遺伝子（「ＢＡＧＥ」）、β−カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＣＡ−１２５、カスパーゼ−８（「ＣＡＳＰ−８」、「ＦＬＩＣＥ」としても知られている）、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１／補体受容体２（「ＣＲ２」）、ＣＤ２２／ＢＬ−ＣＡＭ、ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ３５／補体受容体１（「ＣＲ１」）、ＣＤ４４／ＰＧＰ−１、ＣＤ４５／白血球共通抗原（「ＬＣＡ」）、ＣＤ４６／メンブレンコファクタープロテイン（「ＭＣＰ」）、ＣＤ５２／ＣＡＭＰＡＴＨ−１、ＣＤ５５／崩壊促進因子（「ＤＡＦ」）、ＣＤ５９／プロテクチン、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ｃ−ｍｙｃ、シクロオキシゲナーゼ−２（「ｃｏｘ−２」）、大腸癌欠失遺伝子（「ＤＣＣ」）、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、線維芽細胞増殖因子−８ａ（「ＦＧＦ８ａ」）、線維芽細胞増殖因子−８ｂ（「ＦＧＦ８ｂ」）、ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、葉酸受容体、Ｇ２５０、Ｇメラノーマ抗原遺伝子ファミリー（「ＧＡＧＥファミリー」）、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ガングリオシド２（「ＧＤ２」）／ガングリオシド３（「ＧＤ３」）／ガングリオシド−モノシアル酸−２（「ＧＭ２」）、ゴナドトロピン放出ホルモン（「ＧｎＲＨ」）、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：Ｒ１Ｍａｎ（α１−６）Ｒ２［ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ（α１−６）］β１，６−Ｎ-−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（「ＧｎＴ  Ｖ」）、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ｇｐ−１００−ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／チロシン関連タンパク質−１（「ｇｐ７５／ＴＲＰ−１」）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（「ｈＣＧ」）、ヘパラナーゼ、ＨＥＲ２、ヒト乳癌ウイルス（「ＨＭＴＶ」）、７０キロダルトンの熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ７０」）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（「ｈＴＥＲＴ」）、インスリン様増殖因子受容体−１（「ＩＧＦＲ−１」）、インターロイキン−１３受容体（「ＩＬ−１３Ｒ」）、誘導型一酸化窒素合成酵素（「ｉＮＯＳ」）、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ−ＦＵＴ、メラノーマ抗原コード遺伝子１（「ＭＡＧＥ−１」）、メラノーマ抗原コード遺伝子２（「ＭＡＧＥ−２」）、メラノーマ抗原コード遺伝子３（「ＭＡＧＥ−３」）、メラノーマ抗原コード遺伝子４（「ＭＡＧＥ−４」）、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、Ｍｅｌａｎ−Ａ／Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原−１（「ＭＡＲＴ−１」）、メソセリン、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＭＴ−ＭＭＰ、ムチン、精巣特異的抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ−１、血小板由来増殖因子（「ＰＤＧＦ」）、μＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロゲニポイエチン、前立腺特異的抗原（「ＰＳＡ」）、前立腺特異的膜抗原（「ＰＳＭＡ」）、ＲＡＧＥ−１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ−１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ−７２、トランスフォーミング増殖因子−α（「ＴＧＦ−α」）、トランスフォーミング増殖因子−β（「ＴＧＦ−β」）、チモシン−β−１５、腫瘍壊死因子−α（「ＴＮＦ−α」）、ＴＰ１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）からなる群から選択されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の用途用の併用医薬。
【請求項６】
前記抗体が、前記第１及び／または第２のＴＡＡに結合するのを防ぐために、前記第１及び／または第２のＴＡＡが、１つ以上の変異を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の用途用の併用医薬。
【請求項７】
前記第１のＴＡＡが、ＨＥＲ２である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の用途用の併用医薬。
【請求項８】
ａ）前記ＨＥＲ２抗体が、前記ＨＥＲ２抗原に結合するのを防ぐために、ｂ）前記ＨＥＲ２抗原の細胞外での二量化を防ぐために、ｃ）前記ＨＥＲ２抗原のチロシンキナーゼ活性を防ぐために、及び／またはｄ）前記ＨＥＲ２抗原のリン酸化を防ぐために、前記ＨＥＲ２抗原が、少なくとも１つの変異を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の用途用の併用医薬。
【請求項９】
前記ＨＥＲ２抗原が、Ｅ５８０Ａ、Ｆ５９５Ａ、Ｋ６１５Ａ、Ｈ３１８Ａ、Ｌ３１７Ａ、Ｄ２７７Ｒ、Ｅ２８０Ｋ、Ｋ７５３Ｍ及びＹ１０２３Ａからなる群から選択した少なくとも１つの変異を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の用途用の併用医薬。
【請求項１０】
前記ＨＥＲ２抗原が、Ｅ５８０Ａ、Ｆ５９５Ａ、Ｋ６１５Ａ、Ｈ２６７Ａ、Ｆ２７９Ａ、Ｖ３０８Ａ、Ｓ３１０Ａ、Ｈ３１８Ａ、Ｌ３１７Ａ、Ｋ３３３Ａ、Ｐ３３７Ａ、Ｄ２７７Ｒ、Ｅ２８０Ｋ、Ｋ７５３Ｍ及びＹ１０２３Ａからなる群から選択した少なくとも１つの変異を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の用途用の併用医薬。
【請求項１１】
配列番号１との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％であるＨＥＲ２抗原を前記第１の核酸がコードする、請求項１〜８のいずれかに記載の用途用の併用医薬。
【請求項１２】
配列番号１３との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％であるＨＥＲ２抗原を前記第１の核酸がコードする、請求項１〜８のいずれかに記載の用途用の併用医薬。
【請求項１３】
前記第１の核酸が、配列番号１をコードする、請求項１〜８のいずれかに記載の用途用の併用医薬。
【請求項１４】
前記第１の核酸が、配列番号１３をコードする、請求項１〜８のいずれかに記載の用途用の併用医薬。
【請求項１５】
配列番号２との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％である核酸を前記第１の核酸が含む、請求項１〜８のいずれかに記載の用途用の併用医薬。
【請求項１６】
配列番号１４との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％である核酸を前記第１の核酸が含む、請求項１〜８のいずれかに記載の用途用の併用医薬。
【請求項１７】
前記第１の核酸が、配列番号２及び配列番号３から選択した核酸を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の用途用の併用医薬。
【請求項１８】
前記第１の核酸が、配列番号２を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の用途用の併用医薬。
【請求項１９】
前記第１の核酸が、配列番号１４を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の用途用の併用医薬。
【請求項２０】
前記第２のＴＡＡが、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙである、請求項１〜１９のいずれかに記載の用途用の併用医薬。
【請求項２１】
核局在化を防ぐために、前記Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗原が、１つ以上の変異を含む、請求項２０に記載の用途用の併用医薬。
【請求項２２】
配列番号３との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％であるＢｒａｃｈｙｕｒｙ抗原を前記第２の核酸がコードする、請求項２１のいずれかに記載の用途用の併用医薬。
【請求項２３】
配列番号３を含むＢｒａｃｈｙｕｒｙ抗原を前記第２の核酸がコードする、請求項２１〜２２のいずれかに記載の用途用の併用医薬。
【請求項２４】
配列番号４との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％である核酸を前記第２の核酸が含む、請求項２１〜２２のいずれかに記載の用途用の併用医薬。
【請求項２５】
前記第２の核酸が、配列番号４を含む、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の用途用の併用医薬。
【請求項２６】
前記抗体が、抗ＣＤ２０（例えば、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ）、抗ＣＤ５２（例えばアレムツズマブであるＣａｍｐａｔｈ）、抗ＥＧＦＲ（例えば、セツキシマブであるＥｒｂｉｔｕｘ、パニツムマブ）、抗ＣＤ２（例えばシプリズマブ）、抗ＣＤ３７（例えばＢＩ８３６８２６）、抗ＣＤ１２３（例えばＪＮＪ−５６０２２４７３）、抗ＣＤ３０（例えばＸｍＡｂ２５１３）、抗ＣＤ３８（例えばダラツムマブであるＤａｒｚａｌｅｘ）、抗ＰＤＬ１（例えば、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ）、抗ＧＤ２（例えば、３Ｆ８、ｃｈ１４．１８、ＫＷ−２８７１、ジヌツキシマブ）、抗ＣＥＡ、抗ＭＵＣ１、抗ＦＬＴ３、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ４０、抗ＳＬＡＭＦ７、抗ＣＣＲ４、抗Ｂ７−Ｈ３、抗ＩＣＡＭ１、抗ＣＳＦ１Ｒ、抗ＣＡ１２５（例えばオレゴボマブ）、抗ＦＲα（例えばＭＯｖ１８−ＩｇＧ１、ミルベツキシマブソラブタンシン（ＩＭＧＮ８５３）、ＭＯＲＡｂ−２０２）、抗メソセリン（例えばＭＯＲＡｂ−００９）及び抗ＨＥＲ２からなる群から選択されている、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の用途用の併用医薬。
【請求項２７】
前記抗体が、前記ＨＥＲ２抗原に特異的である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の用途用の併用医薬。
【請求項２８】
前記抗体が、ペルツズマブ、トラスツズマブ、Ｈｅｒｚｕｍａ、ＡＢＰ９８０及びアドトラスツズマブエムタンシンから選択されている、請求項１〜２７に記載の用途用の併用医薬。
【請求項２９】
前記ＭＶＡが、ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮの誘導体である、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の用途用の併用医薬。
【請求項３０】
ａ）をｂ）と同時に、またはｂ）の後に投与する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の用途用の併用医薬。
【請求項３１】
ａ）及びｂ）を前記がん患者にプライミング投与してから、ａ）及びｂ）のブースト投与を１回以上、前記がん患者に行う、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の用途用の併用医薬。
【請求項３２】
前記がん患者が、乳癌、肺癌、頭頸部癌、甲状腺、メラノーマ、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌もしくは大腸癌からなる群から選択したがんを罹患しており、及び／または前記がんと診断されている、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の用途用の併用医薬。
【請求項３３】
前記乳癌が、Ｈｅｒ−２を過剰発現する乳癌である、請求項３２に記載の用途用の併用医薬。
【請求項３４】
合成ＨＥＲ２ポリペプチドであって、前記ＨＥＲ２抗原が、ＨＥＲ２抗体に結合するのを防ぐために、前記ＨＥＲ２の１つ以上のアミノ酸が変異している、前記合成ＨＥＲ２ポリペプチド。
【請求項３５】
合成ＨＥＲ２ポリペプチドであって、前記ＨＥＲ２抗原の細胞外での二量化、チロシンキナーゼ活性及び／またはリン酸化を防ぐために、前記ＨＥＲ２の１つ以上のアミノ酸が変異している、前記合成ＨＥＲ２ポリペプチド。
【請求項３６】
ＨＥＲ２の膜近傍領域における３つのループの少なくとも１つに、１つ以上の変異が施されている、請求項３４〜３５のいずれか１項に記載の合成ＨＥＲ２ポリペプチド。
【請求項３７】
ＨＥＲ２の前記膜近傍領域の前記３つのループが、５７９〜５８３位のアミノ酸（ループ１）、５９２〜５９５位のアミノ酸（ループ２）及び６１５〜６２５位のアミノ酸（ループ３）から選択されている、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の合成ＨＥＲ２ポリペプチド。
【請求項３８】
前記ＨＥＲ２ポリペプチドが、Ｈ２６７、Ｙ２７４、Ｓ３１０、Ｌ３１７、Ｈ３１８、Ｋ３３３、Ｅ５８０、Ｄ５８２、Ｐ５９４、Ｆ５９５、Ｋ６１５及びＱ６２４のアミノ酸のうちの少なくとも１つに、少なくとも１つの変異を含む、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の合成ＨＥＲ２ポリペプチド。
【請求項３９】
前記ＨＥＲ２ポリペプチドが、Ｅ５８０Ａ、Ｆ５９５Ａ、Ｋ６１５Ａ、Ｈ２６７Ａ、Ｆ２７９Ａ、Ｖ３０８Ａ、Ｓ３１０Ａ、Ｈ３１８Ａ、Ｌ３１７Ａ、Ｋ３３３Ａ、Ｐ３３７Ａ、Ｄ２７７Ｒ、Ｅ２８０Ｋ、Ｋ７５３Ｍ及びＹ１０２３Ａからなる群から選択した少なくとも１つの変異を含む、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の合成ＨＥＲ２ポリペプチド。
【請求項４０】
前記ＨＥＲ２ポリペプチドが、１１３９〜１２４８位のアミノ酸に対する変異を少なくとも１つ含む、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の合成ＨＥＲ２ポリペプチド。
【請求項４１】
前記ＨＥＲ２ポリペプチドが、１１３９〜１２４８位のアミノ酸に欠失を少なくとも１つ含む、請求項３４〜４０のいずれか１項に記載の合成ＨＥＲ２ポリペプチド。
【請求項４２】
前記ＨＥＲ２ポリペプチドが、１１３９〜１２４８位のアミノ酸の欠失を含む、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の合成ＨＥＲ２ポリペプチド。
【請求項４３】
配列番号１との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％である合成ＨＥＲ２ポリペプチド。
【請求項４４】
配列番号１または配列番号１３を含む合成ＨＥＲ２ポリペプチド。
【請求項４５】
配列番号１または配列番号１３との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％であるアミノ酸配列を含むＨＥＲ２ポリペプチドをコードする合成核酸配列。
【請求項４６】
配列番号１または配列番号１３を含むＨＥＲ２ポリペプチドをコードする合成核酸配列。
【請求項４７】
配列番号２または配列番号１４との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％である合成核酸配列。
【請求項４８】
配列番号２または配列番号１３を含む合成核酸配列。
【請求項４９】
合成Ｂｒａｃｈｙｕｒｙポリペプチドであって、核局在化を防ぐために、１つ以上のアミノ酸が変異している前記合成Ｂｒａｃｈｙｕｒｙポリペプチド。
【請求項５０】
前記Ｂｒａｃｈｙｕｒｙが、その核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメインに対する変異を１つ以上含む、請求項４９に記載の合成Ｂｒａｃｈｙｕｒｙポリペプチド。
【請求項５１】
前記Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗原のＮＬＳドメインが欠失している、請求項４９〜５０のいずれか１項に記載の合成Ｂｒａｃｈｙｕｒｙポリペプチド。
【請求項５２】
前記Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗原のＮＬＳドメインが欠失している、請求項４９〜５１に記載の合成Ｂｒａｃｈｙｕｒｙポリペプチド。
【請求項５３】
配列番号３との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％であるアミノ酸配列を含む改変Ｂｒａｃｈｙｕｒｙポリペプチドをコードする合成核酸配列。
【請求項５４】
配列番号３を含む改変Ｂｒａｃｈｙｕｒｙポリペプチドをコードする合成核酸配列。
【請求項５５】
配列番号４との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％である合成核酸配列。
【請求項５６】
配列番号４を含む合成核酸配列。
【請求項５７】
請求項３４〜５６のいずれか１項に記載の合成核酸を含む組み換えポックスウイルス。
【請求項５８】
前記ポックスウイルスが、オルトポックスウイルス及びアビポックスウイルスから選択されている、請求項５７に記載の組み換えポックスウイルス。
【請求項５９】
前記オルトポックスウイルスが、ワクシニアウイルス、改変ワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ）、ＭＶＡ−ＢＮ及びＭＶＡ−ＢＮの誘導体から選択されている、請求項５８に記載の組み換えポックスウイルス。
【請求項６０】
前記アビポックスウイルスが、ニワトリポックスウイルスである、請求項５９に記載の組み換えポックスウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん治療のための併用療法に関するものであり、その併用薬には、静脈内投与する組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする核酸を含むＭＶＡウイルス、及び抗体が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
組み換えポックスウイルスは、感染性生物、及びより最近には腫瘍に対する免疫療法ワクチンとして用いられてきた。Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０００；１０５（８）：１０３１−１０３４。
【０００３】
感染症及びがんに対する免疫療法ワクチンとして有用であることが分かっているポックスウイルス株の１つは、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスである。ＭＶＡは、ワクシニアウイルスのアンカラ株（ＣＶＡ）をニワトリ胚線維芽細胞で５１６回連続継代することによって作製された（論評については、Ｍａｙｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３，６−１４（１９７５）を参照）。これらの長期継代の結果、得られたＭＶＡウイルスのゲノムは、そのゲノム配列の約３１キロベース分が欠失しているので、宿主細胞での複製が鳥類細胞に高度に制限されたものとして説明された（Ｍｅｙｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，１０３１−１０３８（１９９１））。得られたＭＶＡがかなり非病原性であることが様々な動物モデルで示された（Ｍａｙｒ，Ａ．  ＆  Ｄａｎｎｅｒ，Ｋ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．４１：２２５−３４（１９７８））。より安全な製品（ワクチンまたは医薬など）の開発用に、安全性プロファイルの向上したＭＶＡ株が説明されてきている。国際公開第２００２０４２４８０号を参照されたい（例えば、米国特許第６，７６１，８９３号及び同第６，９１３，７５２も参照されたい）（これらのいずれも、参照により、本明細書に援用される）。このようなバリアントは、ヒト以外の細胞及び細胞株、特にニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）では増殖的に複製できるが、ヒト細胞株（特には、ＨｅＬａ細胞株、ＨａＣａｔ細胞株及び１４３Ｂ細胞株を含む）では複製能力がない。また、このような株は、インビボにおいて、例えば、免疫が重度に低下しており、複製型ウイルスに対する感受性が高いトランスジェニックマウスモデルＡＧＲ１２９のような特定のマウス株において、増殖的に複製できない。米国特許第６，７６１，８９３号を参照されたい。このようなＭＶＡバリアント及びその誘導体（組み換え体を含む）は、「ＭＶＡ−ＢＮ」といい、説明されてきている。国際公開第２００２０４２４８０号を参照されたい（例えば、米国特許第６，７６１，８９３号及び同第６，９１３，７５２号も参照されたい）。
【０００４】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードするポックスウイルスベクターの使用によって、腫瘍サイズの縮小、及びがん患者の全生存率の向上に成功することが示されている。例えば、ＷＯ２０１４／０６２７７８を参照されたい。がん患者に、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、ＭＵＣ１及び／またはＢｒａｃｈｙｕｒｙのようなＴＡＡをコードするポックスウイルスベクターを投与すると、がんと闘うために、患者が強固かつ特異的なＴ細胞応答を起こすことが示されている（同上）。Ｇｕａｒｄｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）、Ｈｅｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）も参照されたい。
【０００５】
ＨＥＲ２は、ポックスウイルスベクターの一部としてコードさせると有効であることが示されているようなＴＡＡの１つである（同上）。ＨＥＲ２は、乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、胃癌及び尿路上皮癌のような異なるタイプのがんである一部の患者の特定のタイプの腫瘍細胞において過剰発現する腫瘍関連抗原である。この抗原を発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を惹起するために、ＨＥＲ２タンパク質の改変体を発現する組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（「ＭＶＡ」）ベクター（すなわちＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２）でのワクチン接種など、様々なＨＥＲ２ポリペプチドでの免疫が用いられてきている。例えば、Ｒｅｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：１５８８−１５９５（２００３）、Ｍｉｔｔｅｎｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  １０６：２３０９−２３１７（２００６）、Ｍａｎｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．６１（１）：１９−２９（２０１２）を参照されたい。
【０００６】
ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２を用いた過去の研究によって、ＭＶＡ−ＢＮ−ＨＥＲ２が、抗体及び細胞成分の両方を有するＴＨ１偏向の免疫応答を誘導することが示された。例えば、Ｍａｎｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２を参照されたい。何人かの研究者は、感染症との関連において、様々な病原体から保護するとともに、それらの病原体を除去する際には、バランスのとれた免疫応答（液性媒介性成分及び細胞媒介性成分の両方を含む）が重要であることを示している。例えば、Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：５９９−６０６（２００５）を参照されたい。
【０００７】
ＭＶＡのようなポックスウイルスは、ＴＡＡと併せたときのその有効性に加えて、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）のようなＣＤ４０アゴニストと組み合わせると、有効性が増大することが示されている。ＷＯ２０１４／０３７１２４を参照されたい。ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌは、腫瘍壊死因子受容体／腫瘍壊死因子（「ＴＮＦＲ／ＴＮＦ」）スーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ４０は、Ｂ細胞、マクロファージ及びＤＣを含む多くの種類の細胞で構成的に発現するが、そのリガンドＣＤ４０Ｌは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞で優勢に発現する［Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，“ＣＤ４０，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ＣＤ１５４，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂ−ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｐｒｉｍａｒｙ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１（１１）：５７０７−５７１７（２００２）、Ｄ．Ｙ．Ｍａ  ａｎｄ  Ｅ．Ａ．Ｃｌａｒｋ，“Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣＤ４０  ａｎｄ  ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，”Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１（５）：２６５−２７２（２００９）］。感染または免疫後の早い段階での、ＤＣ及びＣＤ４＋Ｔ細胞間の同族相互作用によって、ＤＣがＣＤ８＋Ｔ細胞応答をプライミングすることが「許可」される［Ｊ．Ｐ．Ｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｃａｎ  ｂｅ  ａ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｂｒｉｄｇｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａ  ＣＤ４＋  Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ  ａｎｄ  ａ  Ｔ−ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ，”Ｎａｔｕｒｅ  ３９３（６６８４）：４７４−４７８（１９９８）］。ＤＣへの許可によって、共刺激分子のアップレギュレーション、生存率の向上及びＤＣのクロスプレゼンテーション能の向上が生じる。このプロセスは主に、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌの相互作用に媒介される［Ｓ．Ｒ．Ｂｅｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｅｌｐ  ｆｏｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｏｉｎｓｅｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＣＤ４０  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ  ３９３（６６８４）：４７８−４８０（１９９８）、Ｓ．Ｐ．Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔ−ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐ  ｆｏｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  ３９３（６６８４）：４８０−４８３（１９９８）］が、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ非依存的な機序も存在する（ＣＤ７０、ＬＴ．ｂｅｔａ．Ｒ）。興味深いことに、ＤＣ上に発現するＣＤ４０Ｌと、ＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現するＣＤ４０との直接的な相互作用も提言されており、ヘルパー非依存的なＣＴＬ応答の惹起について、考え得る説明が示されている［Ｓ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｈｅｌｐｅｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｂｙ  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ＣＤ４０Ｌ  ｏｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，”Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３０（２）：２１８−２２７（２００９）］。
【０００８】
アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ワクチンアジュバントとして有用であり得ることがいくつかの研究で示されている。加えて、ＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＡｄＶ［Ｋ．Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ＣＤ４０−ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｂ−ｃｅｌｌｓ，”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１（５）：１１３３−１１４１（１９９８）］及びＶＶ［Ｂｅｒｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）ａｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ＣＤ４０Ｌ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ＣＤ４０Ｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｒａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，”Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．１１（１２）：８０８−８１８（２００４）］であって、インビトロ及びインビボにおいて、アジュバント非添加ウイルスと比べて優れた免疫原性を示すＡｄＶ及びＶＶが作製されてきた。
【０００９】
ＣＤ４０Ｌは、ＭＶＡの一部としてコードされると、疾患関連抗原に対する全体的なＴ細胞応答を誘導及び増強できることが示された（ＷＯ２０１４／０３７１２４）。ＷＯ２０１４／０３７１２４では、ＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡ及び異種抗原が、インビボにおいて、ＤＣの活性化を増強し、異種抗原に特異的なＴ細胞応答を増大させ、ＣＤ８  Ｔ細胞の質及び量を増大させることができることが示された（同上）。
【００１０】
この１０年で、がん治療のために抗体を使用することでも、かなり成果が見られた。例えば、Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２，２７８−２８７（２０１２）を参照されたい。ＦＤＡの承認を受けたとともに、様々な方法で腫瘍細胞を殺傷する抗体療法がいくつか存在する。例えば、抗体療法は、細胞表面上の腫瘍抗原に抗体が結合するなどの、抗体の直接的作用を通じて、腫瘍細胞を殺傷できる（同上）。Ｂｒｏｄｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）も参照されたい。これにより、腫瘍細胞のアポトーシス及び死滅、ならびに腫瘍受容体活性の阻害をもたらすことができる。受容体活性の阻止としては、腫瘍受容体の二量化の阻止、キナーゼ活性化の阻止、細胞外受容体の切断のブロック、受容体のインターナリゼーション及び下流シグナル伝達の誘導を挙げることができる。抗体療法による、腫瘍受容体活性の阻害によって、腫瘍の増殖を阻止できる（同上）。
【００１１】
加えて、抗体療法は、腫瘍細胞を攻撃するためのがん患者自身の免疫系（免疫媒介性殺腫瘍細胞作用という）を向上させることによって、腫瘍細胞を殺傷できる（同上）。免疫媒介性殺腫瘍細胞作用としては、食作用、補体活性化、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体による、腫瘍への遺伝子改変Ｔ細胞のターゲティング、及びＣＴＬＡ−４のようなＴ細胞抑制性受容体の阻害を挙げることができる（同上）。
【００１２】
ＡＤＣＣは、抗体療法が腫瘍細胞を攻撃及び破壊する作用のうち、特に重要である作用の１つである。ＡＤＣＣは、腫瘍細胞膜上の標的結合抗体と、患者の免疫系由来のエフェクター細胞との相互作用を通じて誘発される。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＫ  Ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ｖｏｌ．６（２０１５）。多くの抗体療法の抗腫瘍有効性は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞依存性であることが示されている（同上）。ヒトＮＫ細胞は、抗体のＦｃ部分に結合するタンパク質を発現できる。ＮＫ細胞は、結合して活性化すると、細胞傷害性顆粒のエクソサイトーシス、ＴＮＦファミリーデス受容体シグナル伝達、及びＩＦＮγのような炎症誘発性サイトカインの放出を含むいくつかの経路を通じて、殺腫瘍作用を媒介する（同上）。
【００１３】
がん患者が利用できる有効なポックスウイルスがん治療、化学療法、放射線療法及び抗体療法はあるが、腫瘍細胞が、これらの治療を回避及び／または減弱させるために利用する機序が数多く存在する。例えば、多くの腫瘍細胞は、患者の特異的な免疫系を回避するために、免疫系の特異的なＣＤ８  Ｔ細胞による検出を抑制及び／または回避する目的で、免疫チェックポイント分子及び／または特異的な主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）の発現の低下を利用する。Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）。加えて、腫瘍細胞は、腫瘍細胞表面上での腫瘍抗原の発現を修正または低減することによって、患者の自然免疫応答を回避して、それによって、抗体の結合、及びＮＫ細胞による殺腫瘍作用の両方を低減できることが示されている（同上）。
【００１４】
最近になって、腫瘍細胞が、がん患者の免疫系との平衡相に入ることによって、免疫系及びがん治療を回避できることが発見された。Ｂｈａｔｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｒｉｏｎｍｅｎｔ  ｖｏｌ．４：２０９−２１７（２０１１）を参照されたい。平衡相の少なくとも１つの局面では、腫瘍細胞は体内において、従来の形態学的認識または細胞遺伝学的認識の閾値未満に留まることができる（同上）。例えば、腫瘍細胞上での腫瘍抗原受容体の発現は変動し、多くの場合、免疫系が腫瘍細胞を認識できる閾値を下回る程度まで減少する（同上）。
【００１５】
がん及び腫瘍細胞が、がん治療及び患者の免疫系を能動的に回避する能力を踏まえると、免疫系を能動的に回避するこれらの腫瘍細胞を効果的に標的として殺傷するがん治療の開発に対する大きなニーズが存在する。加えて、平衡相を利用して、治療及び免疫系を回避する腫瘍及び腫瘍細胞を攻撃及び殺傷できるがん治療に対するニーズも存在する。少なくとも一態様では、本発明の各種実施形態は、免疫系を能動的に回避する腫瘍細胞の治療に伴う課題の克服に成功している。
【発明の概要】
【００１６】
本発明の各種実施形態では、組み換えＭＶＡは、腫瘍表面抗原に対する抗体と組み合わせて、患者に静脈内投与すると、がん患者の治療を増強し、より具体的には、腫瘍体積の縮小を増大させ、及び／またはがん患者の生存率を向上させることが明らかになった。
【００１７】
したがって、一実施形態では、本発明は、がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を向上させるのに用いる併用医薬であって、その併用医薬が、ａ）第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸を含む組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）であって、静脈内投与すると、がん患者において、異種の腫瘍関連抗原をコードする核酸を含む組み換えＭＶＡの非静脈内投与によって誘導されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答及びＴ細胞応答と比べて、ＮＫ細胞応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方を誘導する組み換えＭＶＡ、ならびにｂ）Ｆｃドメインを含むとともに、腫瘍細胞の細胞膜上に発現する抗原に特異的である抗体を含み、ａ）及びｂ）をがん患者に投与すると、ａ）またはｂ）のいずれかを単独で非静脈内投与した場合と比べて、そのがん患者の腫瘍サイズが縮小し、及び／または生存率が上昇する併用医薬を含む。追加的な実施形態では、その組み換えＭＶＡは、第２の異種ＴＡＡをコードする第２の核酸をさらに含む。
【００１８】
１つ以上の好ましい実施形態では、その併用医薬は、ＣＤ４０Ｌをさらに含む。最も好ましい実施形態では、そのＣＤ４０Ｌは、上記の組み換えＭＶＡによってコードされる。
【００１９】
各種実施形態では、その抗体は、がん患者の治療用に承認されている。１つ以上の特定の実施形態では、その抗体は、抗ＣＤ２０（例えば、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ）、抗ＣＤ５２（例えばアレムツズマブであるＣａｍｐａｔｈ）、抗ＥＧＦＲ（例えば、セツキシマブであるＥｒｂｉｔｕｘ、パニツムマブ）、抗ＣＤ２（例えばシプリズマブ）、抗ＣＤ３７（例えばＢＩ８３６８２６）、抗ＣＤ１２３（例えばＪＮＪ−５６０２２４７３）、抗ＣＤ３０（例えばＸｍＡｂ２５１３）、抗ＣＤ３８（例えばダラツムマブであるＤａｒｚａｌｅｘ）、抗ＰＤＬ１（例えば、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ）、ＣＴＬＡ−４（例えばイピリムマブ）、抗ＧＤ２（例えば、３Ｆ８、ｃｈ１４．１８、ＫＷ−２８７１、ジヌツキシマブ）、抗ＣＥＡ、抗ＭＵＣ１、抗ＦＬＴ３、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ４０、抗ＳＬＡＭＦ７、抗ＣＣＲ４、抗Ｂ７−Ｈ３、抗ＩＣＡＭ１、抗ＣＳＦ１Ｒ、抗ＣＡ１２５（例えばオレゴボマブ）、抗ＦＲα（例えば、ＭＯｖ１８−ＩｇＧ１、ミルベツキシマブソラブタンシン（ＩＭＧＮ８５３）、ＭＯＲＡｂ−２０２）、抗メソセリン（例えばＭＯＲＡｂ−００９）及び抗ＨＥＲ２からなる群から選択されている。より好ましい実施形態では、その抗体は、抗ＨＥＲ２抗体である。最も好ましい実施形態では、その抗体は、ペルツズマブ、トラスツズマブ、Ｈｅｒｚｕｍａ、ＡＢＰ９８０及びアドトラスツズマブエムタンシンから選択した抗ＨＥＲ２抗体である。
【００２０】
各種の追加的な実施形態では、その第１及び／または第２のＴＡＡが、その併用療法の抗体と結合及び／または相互作用するのを防ぐために、その第１及び／または第２のＴＡＡは、１つ以上の変異を含む。１つ以上の好ましい実施形態では、第１のＴＡＡは、ＨＥＲ２抗原である。より好ましい実施形態では、第１のＴＡＡが、抗ＨＥＲ２抗体に結合するのを防ぐために、そのＨＥＲ２抗原は、１つ以上の変異を含む。追加的な好ましい実施形態では、その第２のＴＡＡは、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗原である。より好ましい実施形態では、そのＢｒａｃｈｙｕｒｙ抗原は、核局在化シグナル伝達（ＮＬＳ）ドメインに対する変異を１つ以上含む。
【００２１】
１つ以上の好ましい実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体である。
【００２２】
各種実施形態では、本発明は、がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を向上させる１つ以上の方法に対するものである。一実施形態では、ａ）第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸を含む組み換えＭＶＡであって、静脈内投与すると、がん患者において、異種の腫瘍関連抗原をコードする核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非静脈内投与によって誘導されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答及びＴ細胞応答と比べて、ＮＫ細胞応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方を誘導する組み換えＭＶＡをがん患者に静脈内投与すること、ならびにｂ）そのがん患者に抗体を投与することであって、その抗体が、Ｆｃドメインを含むとともに、腫瘍細胞の細胞膜上に発現する抗原に特異的であることを含む方法であって、ａ）及びｂ）をがん患者に行うと、ａ）またはｂ）のいずれかを単独で非静脈内投与で行う場合と比べて、がん患者の腫瘍サイズが縮小し、及び／またはがん患者の生存率が上昇する方法が存在する。
【００２３】
１つ以上の好ましい実施形態では、その方法は、ＣＤ４０Ｌをがん患者に静脈内投与することを含む。より好ましい実施形態では、そのＣＤ４０Ｌは、上記の組み換えＭＶＡによってコードされる。
【００２４】
別の実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、抗体と同時に、または抗体の投与後に投与する。より好ましい実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、抗体の後に投与する。
【００２５】
さらに別の実施形態では、本発明は、がん患者における抗体療法の増強方法であって、本発明の併用医薬をがん患者に投与することを含み、その併用医薬の投与によって、その抗体療法によって誘導される抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が、その抗体療法を単独で行った場合と比べて増強される方法を含む。
【００２６】
さらに別の実施形態では、がん患者において、自然免疫応答の増強及び適応免疫応答の増強の両方を誘導する方法であって、本開示の併用医薬を投与することを含み、その併用医薬の投与によって、その併用医薬またはその併用薬の要素単独を非静脈内投与した場合と比べて、そのがん患者の自然免疫応答及び適応免疫応答の両方が増強される方法が存在する。
【００２７】
さらに追加的な各種実施形態では、本発明は、１つ以上の合成ペプチド、及びその合成ペプチドをコードする核酸に対するものである。より具体的な実施形態では、合成ＨＥＲ２ペプチド及び核酸が存在する。より好ましい実施形態では、その合成ＨＥＲ２ペプチドは、そのＨＥＲ２ペプチドが、ＨＥＲ２抗体、好ましくは、ペルツズマブ、トラスツズマブ、Ｈｅｒｚｕｍａ、ＡＢＰ９８０及びアドトラスツズマブエムタンシンから選択した抗体と結合するのを防ぐ変異を１つ以上含む。追加的な好ましい実施形態では、その合成ＨＥＲ２ペプチドは、ＨＥＲ２抗原の細胞外での二量化、チロシンキナーゼ活性及び／またはリン酸化を防ぐ変異を１つ以上含む。
【００２８】
別のより具体的な実施形態では、１つ以上の合成Ｂｒａｃｈｙｕｒｙペプチド及び核酸が存在する。より好ましい実施形態では、その合成Ｂｒａｃｈｙｕｒｙポリペプチド及び核酸は、核局在化シグナル伝達（ＮＬＳ）ドメインに１つ以上の変異を含む。
【００２９】
本発明の追加の目的及び利点は、部分的には、下記の説明で示すことになり、部分的には、その説明から明らかとなるか、または本発明を実施することで認識し得る。本発明の目的及び利点は、添付の請求項に具体的に示されている要素及び組み合わせによって認識及び実現されることになる。
【００３０】
添付の図面は、本明細書に援用されるとともに、本明細書の一部をなすが、本発明の１つ以上の実施形態を例示するとともに、本明細書とともに、本発明の原理を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１Ａ〜１Ｇは、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）を静脈内（ＩＶ）投与すると、皮下（ＳＣ）投与した場合と比べて、ＮＫ細胞の全身的な活性化が強化されることを示している。ＭＶＡがＣＤ４０Ｌをコードすると（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）、ＮＫ細胞の活性化がさらに増強される。示されているのは、実施例１の結果であり、ＮＫ細胞の頻度及び発現（幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）として示した）を評価するために、ＮＫｐ４６＋ＣＤ３−細胞における、示されているタンパク質マーカー（Ａ）ＮＫｐ４６＋ＣＤ３−細胞、Ｂ）ＣＤ６９、Ｃ）ＮＫＧ２Ｄ、Ｄ）ＦａｓＬ、Ｅ）Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｆ）ＣＤ７０及びＧ）ＩＦＮ−γ）の染色を脾臓において評価した。
【図２】図２Ａ〜２Ｇは、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）をＩＶ投与すると、ＳＣ投与した場合と比べて、ＮＫ細胞の全身的な活性化が強化されることを示している。ＭＶＡが、ＣＤ４０Ｌをコードすると（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）、ＮＫ細胞の活性化は、さらに増強される。示されているのは、実施例１の結果であり、ＮＫ細胞の頻度及び発現（幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）として示した）を評価するために、ＮＫｐ４６＋ＣＤ３−細胞における、示されているタンパク質マーカー（Ａ）ＮＫｐ４６＋ＣＤ３−細胞、Ｂ）ＣＤ６９、Ｃ）ＮＫＧ２Ｄ、Ｄ）ＦａｓＬ、Ｅ）、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｆ）ＣＤ７０及びＧ）ＩＦＮ−γ）の染色を肝臓において評価した。
【図３】図３Ａ〜３Ｇは、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）をＩＶ投与すると、ＳＣ投与した場合と比べて、ＮＫ細胞の全身的な活性化が強化されることを示している。ＮＫ細胞の活性化は、ＭＶＡがＣＤ４０Ｌをコードすると（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）、さらに増強される。示されているのは、実施例１の結果であり、ＮＫ細胞の頻度及び発現（幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）として示した）を評価するために、ＮＫｐ４６＋ＣＤ３−細胞における、示されているタンパク質マーカー（Ａ）ＮＫｐ４６＋ＣＤ３−細胞、Ｂ）ＣＤ６９、Ｃ）ＮＫＧ２Ｄ、Ｄ）ＦａｓＬ、Ｅ）Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｆ）ＣＤ７０及びＧ）ＩＦＮ−γ）の染色を肺において評価した。
【図４】図４Ａ〜４Ｆは、ＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０Ｌを静脈内（ＩＶ）投与すると、皮下（ＳＣ）投与した場合と比べて、ＮＫ細胞の全身的な活性化が強化されることを示している。示されているのは、実施例１の結果であり、ＮＫ細胞の頻度及び発現（幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）として示した）を評価するために、ＮＫｐ４６＋ＣＤ３−細胞における、示されているタンパク質マーカー（Ａ）ＮＫｐ４６＋ＣＤ３−細胞、Ｂ）ＣＤ６９、Ｃ）ＦａｓＬ、Ｄ）、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｅ）ＣＤ７０及びＦ）ＩＦＮ−γ）の染色を脾臓において評価した。
【図５】図５Ａ〜５Ｆは、ＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０ＬをＩＶ投与すると、ＳＣ投与した場合と比べて、ＮＫ細胞の全身的な活性化が強化されることを示している。示されているのは、実施例１の結果であり、ＮＫ細胞の頻度及び発現（幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）として示した）を評価するために、ＮＫｐ４６＋ＣＤ３−細胞における示されているタンパク質マーカー（Ａ）ＮＫｐ４６＋ＣＤ３−細胞、Ｂ）ＣＤ６９、Ｃ）ＦａｓＬ、Ｄ）、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｅ）ＣＤ７０及びＦ）ＩＦＮ−γ）の染色を肝臓において評価した。
【図６】図６Ａ〜６Ｆは、ＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０ＬをＩＶ投与すると、ＳＣ投与した場合と比べて、ＮＫ細胞の全身的な活性化が強化されることを示している。示されているのは、実施例１の結果であり、ＮＫ細胞の頻度及び発現（幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）として示した）を評価するために、ＮＫｐ４６＋ＣＤ３−細胞における、示されているタンパク質マーカー（Ａ）ＮＫｐ４６＋ＣＤ３−細胞、Ｂ）ＣＤ６９、Ｃ）ＦａｓＬ、Ｄ）、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｅ）ＣＤ７０及びＦ）ＩＦＮ−γ）の染色を肺において評価した。
【図７】図７Ａ〜７Ｆは、ＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）をＩＶ投与すると、ＩＬ−１２ｐ７０及びＩＦＮ−γのレベルが上昇することを示している。示されているのは、実施例２の結果である。Ａ）ＩＦＮ−γの濃度は、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌの後、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）での免疫と比べて高かった。Ｂ）ＮＫ細胞活性化サイトカインＩＬ−１２ｐ７０は、ＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの免疫後にのみ検出可能であった。ＩＦＮ−γの血清中レベルが高いことは、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの免疫後、脾臓において、ＩＦＮ−γ＋ＮＫ細胞（図１Ｇ参照）及びＣＤ６９＋グランザイムＢ＋ＮＫ細胞（Ｃ）の頻度が高いことと整合している。ＮＨＰ（カニクイザル）において、ＭＶＡ−ＭＡＲＶ−ＧＰ−ｈｕＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）のＩＶ注射後、同様の応答が見られ、すなわち、ＭＶＡ−ＭＡＲＶ−ＧＰ（ｒＭＶＡ）と比べて、ＩＦＮ−γ（Ｄ）及びＩＬ−１２ｐ４０／７０（Ｅ）の血清中濃度が高く、（Ｋｉ６７＋）ＮＫ細胞の増殖（Ｆ）が増加した。
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、ＮＫ細胞の活性化及び増殖の経時変化を示している。示されているのは、実施例３の結果であり、ＮＫ細胞の頻度及び発現を評価するために、ＮＫｐ４６＋ＣＤ３−細胞における、示されているタンパク質マーカー（Ａ）ＣＤ３−ＣＤ１９−ＮＫｐ４６＋、Ｂ）ＮＫ細胞増殖マーカーＫｉ６７及びＣ）ＣＤ６９の発現（幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）として示した））の染色を脾臓、肝臓、肺及び血液において評価した。
【図９】図９は、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）及びＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）で全身免疫した場合の、エキソビボでのＮＫ細胞媒介性傷害作用の増強を示している。実施例４に記載されているように、脾臓ＮＫ細胞を精製し、標的殺傷アッセイにおいてエフェクターとして使用した。ＮＫ細胞と、ＣＦＳＥで標識したクラスＩ  ＭＨＣ欠損ＹＡＣ−１細胞を、示されている比率で、一晩培養した。フローサイトメトリーによって、非生存ＣＦＳＥ＋ＹＡＣ−１細胞を定量することによって、特異的殺傷率を評価した。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｅは、実施例５に示されているように、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）、ＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）及びＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０Ｌで全身免疫した場合の、インビボ及びエキソビボでの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増強を示している。Ａ）２５μｇの抗ＣＤ４、ｒＭＶＡ＋５μｇのラットＩｇＧ２ｂ、１μｇの抗ＣＤ４またはＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）＋１μｇの抗ＣＤ４のいずれかで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＩＶ処置した。肝臓におけるＣＤ４  Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）の枯渇を解析したが、これは、特異的殺傷率（％）として示されている。ＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性をエキソビボで評価するために、ＰＢＳ、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）のいずれかで、Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＣ）Ｂａｌｂ／ｃマウスをＩＶ免疫した。Ｅ）ＰＢＳまたはＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０Ｌのいずれかで、Ｂａｌｂ／ｃマウスをＩＶ免疫した。脾臓ＮＫ細胞を精製し、抗体依存性殺傷アッセイにおいてエフェクターとして使用した。Ｂ）Ｂ１６．Ｆ１０細胞をマウス抗ヒト／マウスＴｒｐ１  ｍＡｂ（クローンＴＡ９９）で被覆し、Ｃ）ＣＴ２６−ＨＥＲ２細胞をマウス抗ヒトＨＥＲ２  ｍＡｂ（クローン７．１６．４）で被覆した。抗体で被覆された標的細胞に、精製ＮＫ細胞をそれぞれ５：１及び４：１の比率で加えた。Ｄ）異なる濃度の抗ヒトＨＥＲ２とインキュベートしたＣＴ２６−ＨＥＲ２細胞は、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌで活性化されたＮＫ細胞によって、ｒＭＶＡで活性化されたＮＫ細胞よりも効率的に殺傷された。Ｅ）ＣＴ２６−ＨＥＲ２細胞を各種濃度のマウス抗ヒトＨＥＲ２  ｍＡｂ（クローン７．１６．４）で被覆した。抗体で被覆された標的細胞に、精製ＮＫ細胞を５：１の比率で加えた。
【図１１】ＩＶ免疫によって、ＳＣ免疫した場合と比べて強いＣＤ８  Ｔ細胞応答が誘導されることを示している。実施例６に記載されているように、０日目及び１５日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＭＶＡ−ＯＶＡによってＳＣまたはＩＶ免疫した。Ｈ−２Ｋｂ／ＯＶＡ２５７−２６４デキストラマーで染色後、血液におけるＯＶＡ特異的なＣＤ８  Ｔ細胞応答を評価した。
【図１２】ＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌによって、ＣＤ８  Ｔ細胞応答をさらに増強できることを示している。実施例７に記載されているように、０日目及び３５日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）でＩＶ免疫した。Ｈ−２Ｋｂ／ＯＶＡ２５７−２６４デキストラマーで染色後、血液におけるＯＶＡ特異的なＣＤ８  Ｔ細胞応答を評価した。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｂは、プライム／ブースト免疫後、ＮＫ細胞の活性化及び増殖が反復することを示している。実施例８に示されているように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、表１に示されているように、ＰＢＳ、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）のいずれかでＩＶ免疫した。２回目及び３回目の免疫後、１日目及び４日目に、ＮＫ細胞（ＮＫｐ４６＋ＣＤ３−）を血液において、フローサイトメトリーによって解析した。Ａ）は、ＣＤ６９のＧＭＦＩを示しており、Ｂ）は、Ｋｉ６７＋ＮＫ細胞の頻度を示している。
【図１４−１】図１４Ａ〜１４Ｍは、プライム／ブースト免疫後の全身性のサイトカイン応答を示している。実施例９に示されているように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、表１に示されているように、ＰＢＳ、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）のいずれかでＩＶ免疫した。免疫から６時間後の時点に、血清中サイトカインレベルを測定した。示されているのは、Ａ）ＩＬ−６、Ｂ）ＣＸＣＬ１０、Ｃ）ＩＦＮ−α、Ｄ）ＩＬ−２２、Ｅ）ＩＦＮ−γ、Ｆ）ＣＸＣＬ１、Ｇ）ＣＣＬ４、Ｈ）ＣＣＬ７）、Ｉ）ＣＣＬ２、Ｊ）ＣＣＬ５、Ｋ）ＴＮＦ−α、Ｌ）ＩＬ−１２ｐ７０及びＭ）ＩＬ−１８の結果である。
【図１４−２】図１４Ａ〜１４Ｍは、プライム／ブースト免疫後の全身性のサイトカイン応答を示している。実施例９に示されているように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、表１に示されているように、ＰＢＳ、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）のいずれかでＩＶ免疫した。免疫から６時間後の時点に、血清中サイトカインレベルを測定した。示されているのは、Ａ）ＩＬ−６、Ｂ）ＣＸＣＬ１０、Ｃ）ＩＦＮ−α、Ｄ）ＩＬ−２２、Ｅ）ＩＦＮ−γ、Ｆ）ＣＸＣＬ１、Ｇ）ＣＣＬ４、Ｈ）ＣＣＬ７）、Ｉ）ＣＣＬ２、Ｊ）ＣＣＬ５、Ｋ）ＴＮＦ−α、Ｌ）ＩＬ−１２ｐ７０及びＭ）ＩＬ−１８の結果である。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｄは、ＭＶＡ及びＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでのプライム／ブースト免疫後の強力な抗原特異的なＣＤ８  Ｔ細胞応答を示している。実施例１０に記載されているように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、表１に示されているように、ＰＢＳ、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）のいずれかでＩＶ免疫した。反復免疫後の抗原特異的なＣＤ８  Ｔ細胞応答の誘導を評価した。Ａ）ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度を評価し、Ｂ）Ｂ８特異的なＣＤ８  Ｔ細胞応答を評価し、Ｃ）導入遺伝子特異的な（ＯＶＡ）応答を評価し、Ｄ）ＯＶＡ／Ｂ８特異的なＣＤ８  Ｔ細胞の比率を評価した。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｂは、ＭＶＡ及びＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでのプライム／ブースト免疫後のＣＤ８及びＣＤ４エフェクターＴ細胞の誘導を示している。実施例１１に記載されているように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、表１に示されているように、ＰＢＳ、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）のいずれかでＩＶ免疫した。表現型的には、ＣＤ４４の発現及び表面ＣＤ６２Ｌの欠損によって、エフェクターＴ細胞を特定した。血液におけるＡ）ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８  Ｔ細胞及びＢ）ＣＤ４  Ｔ細胞をモニタリングした。
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｂは、メラノーマモデルにおいて、異種のプライムブーストスキームで、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０ＬによってＩＶ免疫した場合の抗腫瘍作用が優れていることを示している。実施例１２に記載されているように、触知可能なＢ１６．ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、ＰＢＳ、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）のいずれかで、ＳＣまたはＩＶプライミングした（点線）。プライミング後、７日目及び１４日目に、マウスに、その後のブーストをＦＰＶ−ＯＶＡで行った（破線）。腫瘍の成長を一定間隔で測定した。示されているのは、Ａ）腫瘍の平均体積及びＢ）腫瘍接種後４５日目までの、腫瘍を有するマウスの生存率である。
【図１８】ＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）で１回ＩＶ免疫した後の効率的な腫瘍制御を示している。実施例１３に記載されているように、触知可能なＢ１６．ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスをＩＶプライミングするか、またはＩＶでプライミング及びブーストを行うかした。腫瘍の成長を一定間隔で測定した。示されているのは、腫瘍の平均体積である。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｃは、ＣＤ８  Ｔ細胞が、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ媒介性腫瘍制御において不可欠な役割を果たすことを示している。実施例１４に記載されているように、触知可能なＢ１６．ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスをＰＢＳ、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）のいずれかでＩＶ免疫した。示されている場合、マウスに、２００μｇの抗ＣＤ８抗体を腹腔内（ＩＰ）投与した。Ａ）ＣＤ８  Ｔ細胞応答を測定した。Ｂ）ＯＶＡ特異的なＣＤ８  Ｔ細胞応答を測定した。Ｃ）全生存率を表している。
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｃは、２つのＴＡＡを同時に標的とすることが、１つのみを標的とするよりも効率的であることを示している。実施例１５に記載されているように、触知可能なＢ１６．ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスをＰＢＳ、ＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ、ＭＶＡ−ＯＶＡ−ＴＲＰ２またはＭＶＡ−ＯＶＡ−ＴＲＰ２−ＣＤ４０ＬのいずれかでＩＶ免疫した。腫瘍の成長を一定間隔で測定し、その成長は、Ａ）個々のマウスの平均直径及びＢ）平均体積として示されている。Ｃ）全生存率が示されている。
【図２１−１】図２１Ａ〜２１Ｇは、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの免疫後の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＴ細胞浸潤の増加を示している。実施例１６に記載されているように、触知可能なＢ１６．ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスをＰＢＳ、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）のいずれかでＩＶ免疫した。７日後、マウスを殺処分した。Ａ）は、脾臓、腫瘍流入リンパ節（ＴＤＬＮ）及び腫瘍組織におけるＣＤ４５＋白血球のうちのＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度であり、Ｂ）は、免疫後の異なる器官におけるＯＶＡ２５７−２６４特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の分布であり、Ｃ）は、ＯＶＡ２５７−２６４特異的な腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ−１及びＬａｇ３のＧＭＦＩであり、Ｄ）は、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の代表的なドットプロットであり、Ｋｉ６７及びＰＤ−１の発現を示しており、Ｅ）は、腫瘍浸潤Ｋｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度及びＰＤ−１のＧＭＦＩであり、Ｆ）は、ＣＤ４５＋白血球のうちの腫瘍浸潤調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の頻度であり、Ｇ）は、ＰＤ−１ｈｉｇｈ腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ及びＰＤ−１ｎｅｇ腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの頻度である。
【図２１−２】図２１Ａ〜２１Ｇは、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの免疫後の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＴ細胞浸潤の増加を示している。実施例１６に記載されているように、触知可能なＢ１６．ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスをＰＢＳ、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）のいずれかでＩＶ免疫した。７日後、マウスを殺処分した。Ａ）は、脾臓、腫瘍流入リンパ節（ＴＤＬＮ）及び腫瘍組織におけるＣＤ４５＋白血球のうちのＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度であり、Ｂ）は、免疫後の異なる器官におけるＯＶＡ２５７−２６４特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の分布であり、Ｃ）は、ＯＶＡ２５７−２６４特異的な腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ−１及びＬａｇ３のＧＭＦＩであり、Ｄ）は、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の代表的なドットプロットであり、Ｋｉ６７及びＰＤ−１の発現を示しており、Ｅ）は、腫瘍浸潤Ｋｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度及びＰＤ−１のＧＭＦＩであり、Ｆ）は、ＣＤ４５＋白血球のうちの腫瘍浸潤調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の頻度であり、Ｇ）は、ＰＤ−１ｈｉｇｈ腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ及びＰＤ−１ｎｅｇ腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの頻度である。
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｆは、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの免疫後、ＴＭＥにおける、疲弊の少ない表現型でのＴＡＡ特異的なＣＤ８  Ｔ細胞の持続性を示している。実施例１７に記載されているように、腫瘍が触知可能となったら、ＯＶＡ特異的な精製ＴＣＲトランスジェニックＣＤ８  Ｔ細胞（ＯＴ−Ｉ）をＢ１６．ＯＶＡ担腫瘍生体にＩＶ移入した。腫瘍の体積が少なくとも６０ｍｍ３に達したら、動物をＭＶＡ−ＢＮ、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）でＩＶ免疫した。１７日後、マウスを殺処分し、Ａ）腫瘍組織における白血球のうちのＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度、Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＬａｇ３＋ＰＤ１＋の頻度、Ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＥｏｍｅｓ＋ＰＤ１＋Ｔ細胞の頻度、Ｄ）免疫後のＴＭＥにおけるＯＴ−ＩトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞の存在、Ｅ）ＯＴ−Ｉ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＬａｇ３＋ＰＤ１＋疲弊Ｔ細胞の頻度及びＦ）ＯＴ−Ｉ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＥｏｍｅｓ＋ＰＤ１＋疲弊Ｔ細胞の頻度について解析した。
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｂは、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの免疫後、ＴＭＥにおける調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が長期的に減少することを示している。実施例１８に記載されているように、腫瘍が触知可能となったら、ＯＶＡ特異的な精製ＴＣＲトランスジェニックＣＤ８  Ｔ細胞（ＯＴ−Ｉ）をＢ１６．ＯＶＡ担腫瘍生体にＩＶ移入した。腫瘍の体積が少なくとも６０ｍｍ３に達したら、動物をＭＶＡ−ＢＮ、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）でＩＶ免疫した。１７日後、さらなる解析のために、マウスを殺処分した。Ａ）は、腫瘍組織におけるＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇの頻度であり、Ｂ）は、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇに対するＣＤ８＋ＣＤ４４＋エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の比率である。
【図２４】ｒＭＶＡ及びｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの免疫後、抗ＣＤ４０免疫グロブリンを注射した場合と比べて、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血清中レベルが低いことを示している。実施例１９におけるように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＰＢＳ、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）、ＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）または抗ＣＤ４０（ＦＧＫ４．５）をＩＶ注射した。毎回の免疫の１日後に、ＥＬＩＳＡによって、血清中ＡＬＴ濃度を解析した。
【図２５】図２５Ａ〜２５Ｂは、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０ＬでＩＶ免疫後、大腸癌モデルにおける生存期間が長くなったことを示している。実施例２０に記載されているように、触知可能なＣＴ２６．ＨＥＲ２腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスをＭＶＡ−ＡＨ１Ａ５−ｐ１５−Ｔｒｐ２−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）でＩＶ免疫するか、ＰＢＳを投与するかした。腫瘍の成長を一定間隔で測定した。示されているのは、Ａ）腫瘍の平均体積及びＢ）生存率である。
【図２６】図２６Ａ〜２６Ｂは、抗Ｔｒｐ１と組み合わせると、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌの抗腫瘍作用が増大することを示している。実施例２１に記載されているように、８日目に、触知可能なＢ１６．ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスをＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）でＩＶ免疫した。示されている場合、２００μｇの抗Ｔｒｐ１（クローンＴＡ９９）を週に２回、ＩＰ注射した（５日目に開始した）。示されているのは、Ａ）腫瘍の平均体積及びＢ）全生存率である。
【図２７】図２７Ａ〜２７Ｄは、ＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ−ＣＤ４０Ｌの導入遺伝子の発現を示している。実施例２３に記載されているように、ＨｅＬａ細胞を未処置のままにするか（モック、灰色に塗りつぶされた線）、ＭＶＡ−ＢＮに感染させるか（黒く塗りつぶされた線）、またはＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ−ＣＤ４０Ｌに感染させるかした（塗りつぶされていない黒色の線）。そして、フローサイトメトリーによって、Ａ）ＭＶＡ、Ｂ）ＨＥＲ２、Ｃ）Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及びＤ）ＣＤ４０Ｌのタンパク質発現を求めた（ヒストグラムを参照）。
【図２８】抗ＨＥＲ２抗体のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブとしても知られている）及びＰｅｒｊｅｔａ（ペルツズマブとしても知られている）が、実施例２４に記載されている改変ＨＥＲ２配列に結合しないことを示している。ＣＴ２６細胞をＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ−ＣＤ４０Ｌに、ＭＯＩ１で感染させた。２４時間後、細胞を５μｇ／ｍｌのＨＥＲ２抗体Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｐｅｒｊｅｔａまたは２４Ｄ２とインキュベートし、フローサイトメトリーによって解析した。
【図２９】図２９Ａ〜２９Ｄは、ＭＶＡ−ＨＥＲ２−ｂｒａｃｈｙｕｒｙ−ＣＤ４０Ｌによって、ＭＶＡ−ＨＥＲ２−ｂｒａｃｈｙｕｒｙと比べて、ヒトＤＣの活性化が用量依存的に増強されることを示している。実施例２５に記載されているように、ヒトＰＢＭＣからＣＤ１４＋単球を濃縮後、単球由来のＤＣを生成し、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で、７日間培養した。ＤＣをＭＶＡ−ＨＥＲ２−ｂｒａｃｈｙｕｒｙまたはＭＶＡ−ＨＥＲ２−ｂｒａｃｈｙｕｒｙ−ＣＤ４０Ｌで刺激した。Ａ）ＣＤ４０Ｌ、Ｂ）ＣＤ８６及びＣ）クラスＩＩ  ＭＨＣの発現をフローサイトメトリーによって測定した。Ｄ）ＩＬ−１２ｐ７０の濃度を定量した。
【図３０】図３０Ａ及び３０Ｂは、ＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０ＬでのＩＶ免疫では、ＨＥＲ２陽性大腸癌モデルにおいて、ＭＶＡ−ＣＤ４０ＬでＩＶ免疫した場合よりも、抗腫瘍作用が増強されることを示している。実施例２６に記載されているように、触知可能なＭＣ３８．ＨＥＲ２腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスをＰＢＳ、ＭＶＡ−ＣＤ４０ＬまたはＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０ＬのいずれかでＩＶ免疫した（点線）。腫瘍の成長を一定間隔で測定した。示されているのは、Ａ）腫瘍の平均体積及びＢ）全生存率である。
【図３１】図３１Ａ及び３１Ｂは、ＨＥＲ２陽性大腸癌モデルにおいて、ＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０ＬでのＩＶ免疫によって、ＭＶＡ−ＣＤ４０ＬでＩＶ免疫した場合よりも、抗腫瘍作用が増強されることを示している。実施例２６に記載されているように、触知可能なＣＴ２６．ＨＥＲ２腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスをＰＢＳ、ＭＶＡ−ＣＤ４０ＬまたはＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０ＬのいずれかでＩＶ免疫した（点線）。腫瘍の成長を一定間隔で測定した。示されているのは、Ａ）腫瘍の平均体積及びＢ）全生存率である。
【図３２】ＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０ＬでＩＶ免疫すると、腫瘍微小環境において、ＩＦＮ−γを産生するＨＥＲ２特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤が増加することを示している。実施例２７に記載されているように、触知可能なＣＴ２６．ＨＥＲ２腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスをＰＢＳまたはＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０ＬのいずれかでＩＶ免疫した。７日後、脾臓及び腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞を磁気細胞ソーティングによって単離し、ＨＥＲ２ペプチドをロードした樹状細胞の存在下で、５時間培養した。グラフは、ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４４＋ＩＦＮ−γ＋細胞の割合（％）を示している。
【図３３】図３３Ａ及び３３Ｂは、ＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０Ｌ及びトラスツズマブ（抗ＨＥＲ２）の抗腫瘍作用の増強を示している。実施例２８に記載されているように、１７日齢の大きい確立済みのＣＴ２６．ＨＥＲ２腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスをＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０ＬでＩＶ免疫した（点線）。示されている場合、５μｇの抗ＨＥＲ２またはｈｕＩｇＧ１をＩＰ注射した（破線）。示されているのは、Ａ）腫瘍の平均体積及びＢ）全生存率である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
上記の概要及び下記の詳細な説明はいずれも、例示及び説明に過ぎず、特許請求されているような本発明を制限するものではないことを理解されたい。
【００３３】
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、特異的抗体が結合した抗原または受容体を発現している標的細胞を免疫系が能動的に溶解及び殺傷できるようにする細胞媒介性免疫防御機構である。Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，１４８：７８５−７９４（１９８３）を参照されたい。ＡＤＣＣは、抗体と相互作用するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を利用して、標的細胞を溶解及び殺傷する（同上）。この点を考慮して、この１０年にわたり、腫瘍関連抗原を標的として、ＡＤＣＣ、ひいては殺腫瘍細胞能を増強するように機能する治療用モノクローナル抗体が開発されてきた。例えば、Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）及びＫｏｈｒｔ  ｅｔ  ａｌを参照されたい。抗体療法は、ＡＤＣＣを通じて、殺腫瘍細胞作用を増強する有効性を有することが示されているが、腫瘍細胞は、腫瘍抗原発現の不均一性（例えば、腫瘍細胞表面上での腫瘍抗原発現のダウンレギュレーション）、抗体の安定性、受容体に対する抗体の濃度の低さ、受容体の飽和、例えば調節性Ｔ細胞を介した免疫抑制、免疫逃避及びＮＫ細胞機能不全のような様々な機序を通じて、ＡＤＣＣ及び免疫系を回避できることが示されてきた（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２））。腫瘍細胞の回避のいくつかの局面は、腫瘍細胞が患者の免疫系との「平衡相」に入ることによって特徴付けられ、腫瘍細胞は体内に、従来の形態学的、細胞遺伝学的または免疫細胞認識の閾値未満で留まることができる（Ｂｈａｔｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【００３４】
相乗的な抗腫瘍応答を誘導するために、本発明の各種併用医薬を開発した。いくつかの態様では、その各種併用医薬は、ＡＤＣＣを通じて、腫瘍が発現する受容体に対する抗体で被覆された腫瘍細胞を殺傷できる、有効性の高い腫瘍特異的なキラーＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の両方を誘導する。好ましい態様では、本明細書に記載されているように、ＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡを静脈内注射すると、ＮＫ細胞の活性化の増強、及び抗体で被覆された腫瘍細胞の殺傷作用の大幅な増大が誘導される。このＮＫ細胞の活性化の増強は、ＭＶＡによって誘導されるキラーＴ細胞応答の増強と組み合わさると、治療用腫瘍ワクチンの接種の際に相乗的に作用することが示されている。
【００３５】
追加的な各種態様では、本発明の実施形態は、患者の免疫系を回避するそれらの腫瘍細胞及びがん細胞を標的として殺傷する能力が増強及び／または向上している免疫応答を誘導する。さらなる態様では、本発明の実施形態は、患者の自然免疫応答及び適応免疫応答の両方の有効性を増強及び／または増大させる免疫応答を誘導する。自然免疫応答及び適応免疫応答の両方を増強及び／または増大できるのは、特に有益である。本発明は、患者の適応免疫応答を回避及び／または抑制するそれらの腫瘍細胞、ならびに患者の自然免疫応答を回避及び／または抑制するそれらの腫瘍細胞を標的として殺傷できるからである。
【００３６】
一実施形態では、本発明は、ａ）１つ以上の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする核酸を含む組み換えＭＶＡの静脈内（ＩＶ）投与、及びｂ）Ｆｃドメインを含むとともに、腫瘍細胞上に発現する抗原に対して特異的である抗体を含む併用療法である。別の実施形態では、その併用療法は、ＣＤ４０ＬのＩＶ投与をさらに含む。好ましい実施形態では、そのＣＤ４０Ｌは、本発明の組み換えＭＶＡによってコードされる。
【００３７】
本願で説明及び例示されているように、本発明の併用医薬及び／または療法は、がん患者の免疫応答の複数の局面を増強する。少なくとも１つの態様では、本発明の併用医薬は、自然免疫応答及び適応免疫応答の両方を相乗的に増強して、腫瘍体積を縮小するとともに、がん患者の生存率を向上させる。本発明の併用医薬及び／または療法の増強作用のうちの１つ以上が、下に概説されている。
【００３８】
組み換えＭＶＡのＩＶ投与によって、ＮＫ細胞応答が増強される。一態様では、本発明は、対象に静脈内投与する組み換えＭＶＡを含み、そのＩＶ投与によって、その対象において、その対象に組み換えＭＶＡを非ＩＶ投与することによって誘導されるＮＫ細胞応答と比べて、自然免疫応答の増強、より具体的には、ＮＫ細胞応答の増強が誘導される。図１〜９及び１３に示されているように、組み換えＭＶＡのＩＶ投与によって、単回ＩＶ投与した場合、及び同種のプライムブーストとして静脈内投与した場合の両方で、非ＩＶ投与した場合と比べて、いくつかの区画において、強固な全身性のＮＫ細胞応答が誘導された。
【００３９】
図１〜６に示されているように、非ＩＶ投与した場合と比べて、ＮＫ細胞応答の質が増強された。解析したすべての器官（脾臓、肝臓及び肺）で、活性化マーカーＣＤ６９が増加している。ＮＫ細胞の生存性を高める抗アポトーシスＢｃｌファミリーメンバーのＢｃｌ−ＸＬ、共刺激性ＣＤ７０及びエフェクターサイトカインＩＦＮ−γが、脾臓及び肺の両方で増加した。肝臓及び肺において、ＩＶ後、ＳＣ注射した場合と比べて、活性化ナチュラルキラーグループ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）受容体の発現が特に増強された。ＮＫＧ２Ｄは、腫瘍細胞上のリガンドに結合して、腫瘍細胞の排除を促す（Ｇａｒｃｉａ−Ｃｕｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｓｐｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３において論評）。
【００４０】
ＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡのＩＶ投与によって、ＮＫ細胞応答がさらに増強される。本発明の別の態様では、組み換えＭＶＡに加えて、ＣＤ４０Ｌ抗原をＩＶ投与することによって、組み換えＭＶＡを単独でＩＶ投与する場合と比べて、ＮＫ細胞応答がさらに増強されることが明らかになった。図１〜９及び１３に示されているように、ＣＤ４０Ｌ抗原をコードする組み換えＭＶＡは、単回投与した場合と、同種のプライムブーストとして投与した場合の両方において、ＣＤ４０Ｌを伴わない組み換えＭＶＡと比べて、強力なＮＫ細胞応答を誘導した。さらに、組み換えＭＶＡを単独でＩＶ投与した場合と比べて、ＮＫ細胞応答の質が増強された。解析したすべての器官（図１〜６、脾臓、肝臓、肺）において、ＮＫ細胞によるエフェクターサイトカインＩＦＮ−γの発現の増加が観察されたとともに、解析したすべての器官において、ＮＫ細胞によるＣＤ６９の発現も観察された（図５Ｃ）。さらに、図７には、マウス及びＮＨＰの両方において、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０ＬでのＩＶ免疫の６時間後に、組み換えＭＶＡの場合と比べて、ＩＦＮ−γと、さらに重要なことに、ＮＫ活性化サイトカインＩＬ−１２ｐ７０の血清中レベルが上昇したことが示されている。加えて、ＮＫ細胞の増殖（Ｋｉ６７の発現によって示されている）の増強が、マウスで全身的に観察された（図７Ｂ）のみならず、ＮＨＰの末梢血でも観察された（図６Ｆ）。これらの結果から、いくつかの動物研究モデルにおいて、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０ＬのＩＶ免疫によって、ｒＭＶＡの場合と比べてＮＫ細胞の質が向上することが示されている。
【００４１】
組み換えＭＶＡウイルスはこれまでも静脈内投与されてきたが（例えば、ＷＯ２００２／４２４８０、ＷＯ２０１４／０３７１２４を参照されたい）、組み換えＭＶＡによる投与及び治療が、ＣＤ８  Ｔ細胞応答のような適応免疫応答の増強と関連することが以前に分かった。例えば、ＷＯ２００２／４２４８０では、マウス１匹当たり１０７ｐｆｕのＭＶＡ−ＢＮをＩＶ投与するか、またはマウス１匹当たり１０７ｐｆｕもしくは１０８ｐｆｕのＭＶＡ−ＢＮを皮下投与するかのいずれかによって、ＭＶＡを用いた免疫を行った後に、ＣＴＬ応答を測定した。ＷＯ２０１４／０３７１２４では、マウスに、組み換えＭＶＡ、及びＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡを静脈内接種した。ＷＯ２０１４／０３７１２４を参照されたい。ＣＴＬ応答が増強され、宿主において、組み換えＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌの免疫原性の向上が、ＣＤ４＋Ｔ細胞に依存しないが、ＣＤ４０に依存することが明らかになった。
【００４２】
少なくとも１つの態様では、本発明によって見られるＮＫ細胞応答の増強は予想外である。当該技術分野においては、皮下免疫後、ＭＶＡによって誘導されるＮＫ細胞の活性化が、リンパ節に常在するＣＤ１６９陽性嚢下洞（ＳＣＳ）マクロファージに依存することが示されたと理解されていたからである（Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２０１２）。
【００４３】
組み換えＭＶＡのＩＶ投与によって、腫瘍細胞のＡＤＣＣが増強される。さらなる態様では、本発明は、１つ以上の異種抗原をコードする核酸を含む組み換えＭＶＡを含み、対象にＩＶ投与すると、その対象において、組み換えＭＶＡをその対象に非ＩＶ投与した場合に得られるＡＤＣＣ応答と比べて、ＡＤＣＣ応答が増強される。さらに具体的な態様では、組み換えＭＶＡのＩＶ投与に起因する、ＡＤＣＣ応答の増強は、ＮＫ細胞が、抗体で被覆された腫瘍細胞を標的として殺傷する能力の向上によって特徴付けられる。図１０Ａ〜１０Ｄに示されているように、ｒＭＶＡのＩＶ投与によって活性化したＮＫ細胞により、マウス抗ヒトＨＥＲ２  ｍＡｂまたはマウス抗ヒト／マウスＴｒｐ１  ｍＡｂを提示している腫瘍細胞の細胞溶解が増大した。腫瘍細胞の細胞溶解は、ＣＤ４０Ｌと併せた組み換えＭＶＡによって活性化したＮＫ細胞により、ＣＤ４０Ｌを伴わないｒＭＶＡの場合と比べてさらに増大した。
【００４４】
図１０Ｄ及び１０Ｅに示されているように、対象におけるＡＤＣＣ応答の増強はさらに、ＮＫ細胞応答の有効性を増大させて、腫瘍抗原に結合した抗体（抗体−腫瘍抗原）濃度が低めである腫瘍細胞をＮＫ細胞が標的として殺傷できるようにするものとして特徴付けられる。抗体で被覆された腫瘍抗原の濃度が低い腫瘍細胞を標的として殺傷できることは、特に有益である。腫瘍細胞が免疫系を回避することが示された機序の１つは、腫瘍抗原の発現のダウンレギュレーションによるものであり（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）を参照されたい）、このダウンレギュレーションによって、腫瘍細胞上の抗体−腫瘍抗原の濃度が低下するからである。
【００４５】
組み換えＭＶＡのＩＶ投与によって、ＭＨＣレベルの低い腫瘍細胞をＮＫ細胞が殺傷する作用が増強される。さらなる態様では、図９に示されているように、ＮＫ細胞の活性化及びＮＫ細胞応答が増強されると、ＭＨＣレベルの低い腫瘍細胞の殺傷作用が増強される。この態様は、特に有益である。ＭＨＣの低い腫瘍細胞をＮＫ細胞が殺傷する作用が、ＡＤＣＣに非依存的に生じることによって、その腫瘍細胞を攻撃する追加の経路が加わるからである。加えて、多くの腫瘍及び／またはがんは、患者の免疫応答を回避しようとして、ＭＨＣの発現レベルを低下させるので、この態様は有益である。
【００４６】
組み換えＭＶＡのＩＶ投与によって、ＮＫ細胞の活性化及び増殖が促進される。本発明の別の態様では、組み換えＭＶＡを複数回ブースト投与し、ＮＫ細胞の活性化及び増殖を増大させる（図１０Ａにおいて、ＣＤ６９の発現増強によって示されている）。図１３Ｂには、Ｋｉ６７の発現によって、ブーストＩＶ免疫の２４時間後に、非ＩＶ免疫の場合と比べて、血中ＮＫ細胞の増殖能が増大したことが示されている。この作用は、組み換えＭＶＡによるプライム免疫を組み換えＭＶＡによってブーストした場合、組み換えＭＶＡ−ＣＤ４０ＬをｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでブーストした場合、またはｒＭＶＡによるプライム免疫をｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでブーストした場合に観察された。
【００４７】
本発明の少なくとも１つの態様では、組み換えＭＶＡの反復ＩＶ投与及び組み換えＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌに起因する、ＮＫ細胞応答の増強は、予想外であった。ブーストＩＶ免疫の２４時間後に、ＩＦＮ−αの増加が見られない状態で、ＮＫ細胞の活性化及び増殖の増大が観察されることは予想外であった。さらに言えば、二次感染及びがんにおけるＮＫ細胞の活性化及びプライミングは、主にＩＦＮ−αによって駆動されることが分かった。例えば、Ｓｔａｃｋａｒｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２０１３  Ａｕｇ；１２（８）：８７５−８４及びＭｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１７）を参照されたい。予想外なことに、ｒＭＶＡ  ｈｏｍ、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ  ｈｏｍまたはｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ  ｈｅｔによるＩＶブースト免疫の６時間後には、ＩＦＮ−αの血清中レベルの上昇は観察されなかった（図１４Ｃ）。これらを勘案すると、１つ以上の異種抗原をコードする核酸を含むｒＭＶＡによる同種または異種の反復ＩＶ免疫によって、予想外にも、ＩＦＮ−αに依存せずに、ＮＫ細胞が活性化及び増殖した。
【００４８】
異種抗原をコードする組み換えＭＶＡのＩＶ投与によって、がん患者の適応免疫応答が増強される。本発明の別の態様では、１つ以上の異種抗原をコードする核酸を含む組み換えＭＶＡが存在し、対象にＩＶ投与すると、１つ以上の異種抗原に対する、対象の適応免疫応答が増強される。好ましい態様では、その組み換えＭＶＡはさらに、ＣＤ４０Ｌをコードする。図１１〜１２に示されているように、異種抗原を発現する組み換えＭＶＡをＩＶ投与すると、皮下（ＳＣ）投与した場合と比べて、強力なＣＴＬ応答が得られる。また、図に示されているように、組み換えＭＶＡの一部として、ＣＤ４０Ｌが含まれているときには、その組み換えＭＶＡ抗原をＩＶ投与すると、ＣＤ４０Ｌを含まない組み換えＭＶＡをＩＶ投与した場合と比べて、強力なＣＴＬ応答が得られる。
【００４９】
さらに、図１４〜１６に示されているように、異種抗原及びＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡを静脈内投与したところ、ＩＶブースト免疫後に、Ｔ細胞応答の質が向上した。図１５には、ＭＶＡ抗原の増加、Ｂ８（図１５Ｂ）及び異種抗原、ＯＶＡ（図１５Ｃ）特異的なＣＤ８  Ｔ細胞の増加が、ブーストＩＶ免疫によって増強されたことが示されている。この作用は、図１４で観察される、サイトカイン及びケモカインの発現パターンと連動しており、図１４では、ＩＶブースト後、血清において、Ｔ細胞活性化サイトカインのＣＸＣＬ１０、ＩＦＮ−γ、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ７、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ７０及びＩＬ−１８が定量されている。これと一致して、図１６Ａ及び１６Ｂには、ブーストＩＶ免疫後に、メモリーＴ細胞が増加すること（ワクチンの重要な特色である）が示されている。ＭＶＡ抗原特異的なＣＤ８  Ｔ細胞に対する、異種抗原特異的なＣＤ８  Ｔ細胞の比率は、免疫を行うごとに上昇した（図１５Ｄ）。
【００５０】
本発明以前に、組み換えＭＶＡによってコードされるＣＤ４０Ｌが、ＣＤ４  Ｔヘルパー細胞の代わりとなり得ることが分かった（Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。さらに、組み換えＭＶＡによってコードされるＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４  Ｔ細胞に作用を及ぼさないことが明らかになった。予想外なことに、プライム免疫の２５日後に、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の増加を我々は確認した（図１６Ｂ）（プライム免疫の２５日後は、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ  ｈｏｍ及びｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ  ｈｅｔ）によるブーストＩＶ免疫（２１日目、表１参照）の４日後と一致する）。この知見は、ＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ  ｈｏｍ及びＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ  ｈｅｔ群において、ブーストＩＶ免疫の６時間後に定量したＩＬ−２２の産生の増加（Ｔヘルパー細胞応答を示す重要なサイトカイン）によって裏付けられている（図１４Ｄ）。この予想外の観察結果は、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌによるメモリー応答の維持に関連している。さらに、ＣＤ４  Ｔ細胞は、腫瘍部位において腫瘍特異的なＣＤ８  Ｔ細胞を補助し、活性化誘導細胞の死滅を回避し、それ自体も細胞傷害性となることができる（Ｋｅｎｎｅｄｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｉｓ，２００８、Ｋｎｕｔｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｓｉｓ，２００５で論評されている）。これらの結果は予想外である。アデノウイルス及び単純ヘルペスウイルスのような他のウイルスベクターは、ブースト免疫時に、ワクチンによってコードされる抗原に対する免疫応答の誘導を妨げるベクター特異的免疫を誘導するからである（Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｐｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【００５１】
抗体の投与と同時に、または抗体の投与後に、組み換えＭＶＡをＩＶ投与すると、殺腫瘍細胞作用の有効性が増大する。さらなる態様では、本開示は、本発明の併用医薬を対象に投与するための１つ以上のレジメンを提供する。少なくとも１つの態様では、本発明のレジメンは、併用医薬及び／または療法の有効性を増大させて、ＡＤＣＣ媒介性の殺腫瘍細胞作用を増強する。一実施形態では、本発明の併用医薬の投与レジメンは、ａ）本明細書に記載されているような抗体を投与すること、及びｂ）抗体の投与と同時に、または抗体の投与後に、本発明の組み換えＭＶＡを対象に静脈内投与することを含む。
【００５２】
本発明の有益な一態様では、抗体と同時に、または抗体の後に、組み換えＭＶＡを投与することによって、組み換えＭＶＡの投与に起因して、ＮＫ細胞応答が増強されるのと同時に、または増強される前に、投与した抗体が腫瘍細胞と結合できるようにする。したがって、例示的な第１の工程では、抗体を投与し、その結果、抗体が腫瘍細胞または疾患感染細胞に結合する。例示的な第２の工程では、組み換えＭＶＡを静脈内投与し、それによって、本明細書に記載されているように、対象のＮＫ細胞応答を増強及び増大させる。そして、増強されたＮＫ細胞応答によって、抗体が結合している腫瘍細胞を攻撃的に標的として殺傷する。
【００５３】
別の態様では、本発明の併用医薬は、同種及び／または異種のプライムブーストレジメンの一部として投与する。図１１〜１６に示されているように、同種及び／または異種のプライムブーストレジメンは、増強されたＮＫ細胞応答を延長及び再活性化するとともに、対象の特異的なＣＤ８  Ｔ細胞応答及びＣＤ４  Ｔ細胞応答を増大させる。
【００５４】
組み換えＭＶＡのＩＶ投与によって、抗腫瘍作用が増強される。本発明の別の態様では、１つ以上の異種抗原をコードする核酸を含む組み換えＭＶＡが存在し、対象にＩＶ投与すると、非ＩＶ投与した場合と比べて、その対象の生存率が上昇し、総腫瘍体積が縮小する。好ましい態様では、その組み換えＭＶＡはさらに、ＣＤ４０Ｌをコードする。図１７及び１８に示されているように、その組み換えＭＶＡをＩＶ投与すると、ＳＣ投与した場合と比べて、全生存率が上昇し、腫瘍体積の縮小幅が大きくなるか、または腫瘍の成長に対する制御が延長される。これも図示されているように、組み換えＭＶＡの一部として含まれるＣＤ４０Ｌによって、ＣＤ４０Ｌを含まない組み換えＭＶＡをＩＶ投与した場合と比べて、全生存率が改善し、腫瘍が縮小する。図１９に示されているように、組み換えＭＶＡの一部として含まれるＣＤ４０Ｌによって、担腫瘍生体の末梢血において、ＣＤ４０Ｌを含まない組み換えＭＶＡをＩＶ投与した場合と比べて、ＣＤ８  Ｔ細胞及び抗原（ＯＶＡ）特異的なＴ細胞の総集積量が増加した。加えて、ＣＤ８  Ｔ細胞は、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌの抗腫瘍作用の重大なメディエーターである。抗体の媒介による、ＣＤ８細胞の枯渇によって、全生存期間が延長しなくなるからである。
【００５５】
２つの異種抗原をコードするＭＶＡをＩＶ投与すると、抗腫瘍有効性が増大する。本発明の別の態様では、図２９１に示されているように、２つの異種抗原（ＯＶＡ及びＴＲＰ２）をコードするＭＶＡを用いたＩＶ免疫によって、腫瘍の成長に対する制御の延長が誘導され、全生存率が上昇する。２つの異種抗原をコードする組み換えＭＶＡの一部として含まれるＣＤ４０Ｌによって、ＣＤ４０Ｌ及び１つのみの異種抗原を含む組み換えＭＶＡをＩＶ投与した場合と比べて、抗腫瘍応答が増強される。がんは、腫瘍抗原のダウンレギュレーションとして、多様な免疫逃避機序を利用するので（Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、ワクチンにおいて２つ以上の腫瘍抗原をコードすると、抗腫瘍免疫応答に対する逃避機序の発現が制限される。
【００５６】
ＭＶＡのＩＶ投与によって、腫瘍の免疫抑制作用が低下する。図２９及び３２に示されているように、異種抗原及び任意にＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡを静脈内投与すると、腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤が誘導され、免疫系を回避するために腫瘍が典型的に利用する複数の免疫抑制作用が低下した。ＣＤ４０Ｌによる攻撃を伴うかまたは伴わない組み換えＭＶＡによって、腫瘍内で内因性ＣＤ８＋細胞が増加したのに加えて、ＣＤ４０Ｌを含む組み換えＭＶＡのＩＶ投与によって、脾臓及び腫瘍において、ＣＤ４０Ｌを含まないＭＶＡの場合と比べて、抗原（ＯＶＡ）特異的Ｔ細胞が増加した。さらに、内因性Ｔ細胞（図２２Ｃ〜Ｅ、２３Ｂ）または移入した抗原（ＯＶＡ）特異的Ｔ細胞（図２１Ｄ）において調べたところ、腫瘍浸潤Ｔリンパ球の免疫抑制表面分子ＰＤ−１及びＬａｇ３の発現が減少し、腫瘍浸潤Ｔリンパ球が腫瘍微小環境において増殖していた。ｒＭＶＡ及びｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの免疫後の腫瘍浸潤Ｔ細胞上でのＰＤ−１の発現減少は、予想外であった。両方のベクターによって誘導されるＩ型及びＩＩ型インターフェロン（図１４Ｃ及びＥ）は、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１の発現の既知の誘導因子であるからである（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７によって論評）。予想外なことに、異種抗原及び任意にＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡを投与したところ、腫瘍微小環境における免疫抑制調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数は減少し（２２Ｆ、２３Ａ）、その結果、腫瘍微小環境において、Ｔｒｅｇに対するエフェクターＴ細胞の比率が上昇した（図２３Ｂ）。ＰＤ−１及びＬａｇ３のような免疫減衰分子の発現の減少、ならびに腫瘍組織におけるＴｒｅｇの数の減少は、ｒＭＶＡ及びｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌによる免疫後に見られる、抗腫瘍作用の増強と相関する。
【００５７】
本発明の併用医薬は、がん患者において、腫瘍量を減少させ、生存率を向上させる。各種実施形態では、本発明の医薬の併用は、ａ）異種ＴＡＡ及び任意にＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡのＩＶ投与、ならびにｂ）抗体の投与を含む。図２６及び３３に示されているように、本発明の併用医薬によって、腫瘍体積が縮小し、全生存率が上昇する。
【００５８】
少なくとも１つの態様では、本発明の併用医薬の抗腫瘍作用の増強（例えば、腫瘍体積の縮小及び／または生存率の向上）は、本明細書に記載されている自然Ｔ細胞応答及び適応Ｔ細胞応答の個別の増強が相乗的に組み合わさることによって行われる。例示的な一実施形態では、これらの個別の増強には、上に列挙した増強のうちの１つ以上、例えば、自然（例えばＮＫ細胞）応答の増強、ＡＤＣＣ媒介性の殺腫瘍細胞作用の増強、クラスＩ  ＭＨＣのレベルが低い腫瘍細胞をＮＫ細胞が殺傷する作用の増強、及び適応Ｔ細胞応答の増強が含まれる。さらに、本発明の１つ以上の投与レジメンはさらに、患者の免疫系を向上させ、ある期間にわたって、患者の免疫系が腫瘍細胞を殺傷できるようにする。
【００５９】
ＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及び抗ＨＥＲ２抗体のＩＶ投与。本発明の有益な一実施形態では、本発明の医薬の併用は、ａ）ＨＥＲ２及びＢｒａｃｈｙｕｒｙ抗原、ならびに任意にＣＤ４０Ｌをコードする組み換えＭＶＡの静脈内投与と、ｂ）抗ＨＥＲ２抗体の投与を含む。この実施形態は、本明細書に記載されている免疫応答の増強を誘導し、加えて、ＨＥＲ２及びＢｒａｃｈｙｕｒｙを発現する腫瘍細胞に、殺腫瘍細胞作用を集中させる。追加的な有益な態様では、ＨＥＲ２抗原は、本発明の併用療法の有効性をさらに増大させる改変を１つ以上含む。図２９に示されているように、ｒＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及びｒＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ−ＣＤ４０Ｌでは、樹状細胞（ＤＣ）の活性化が見られた。ＤＣの活性化は、ｒＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｂｒａｃｈｙｕｒｙよりも、ｒＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ−ＣＤ４０Ｌによって増強された。図３３に示されているように、本発明に記載されている併用医薬の投与によって、腫瘍の縮小及び対象の全生存率が有意に増大した。
【００６０】
具体的な一実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２結合抗体で治療するＨＥＲ２陽性乳癌またはＨＥＲ２陽性胃癌のように、ＨＥＲ２を発現する悪性腫瘍を有するがん患者の治療に対するものであるとともに、そのがん患者を治療するように適応されている。ＨＥＲ２をコードする組み換えＭＶＡは、ＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞に対する有効性の高いキラーＴ細胞を誘導する一方で、本発明の組み換えＭＶＡによってコードされるＢｒａｃｈｙｕｒｙ導入遺伝子は、転移性である可能性のあるＢｒａｃｈｙｕｒｙ腫瘍細胞に対する有効性の高いキラーＴ細胞を誘導する。
【００６１】
定義
本明細書で使用する場合、文脈によって明らかに別段に示されている場合を除き、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、複数の言及物が含まれる。したがって、例えば、「ａ」が付された「核酸」に言及している場合、１つ以上の核酸が含まれ、「ｔｈｅ」が付された「方法」に言及している場合には、当業者に知られている等価な工程及び方法であって、本明細書に記載されている方法を修正したり、本明細書に記載されている方法の代用としたりし得る工程及び方法への言及が含まれる。
【００６２】
別段に示されていない限り、一連の要素の前に付された「少なくとも」という用語は、それらの一連の要素のすべてを指すと理解するものとする。当業者は、常法に過ぎない実験を用いて、本明細書に記載されている本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識したり、または確認できたりする。このような均等物は、本発明に含まれるように意図されている。
【００６３】
本明細書及び後述の請求項の全体を通じて、文脈によって別段に求められない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形表現には、示されている整数もしくは工程、または整数群もしくは工程群が含まれることを示しているが、いずれかの他の整数もしくは工程、または整数群もしくは工程群は除外されないものと理解する。本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語と置換でき、あるいは、場合によっては、本明細書で使用する場合、「有する」という用語と置換できる。上記の用語（含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、有する）のいずれも、優先性には劣るが、本発明の態様または実施形態との関連で使用されている場合には常に、「〜からなる」という用語と置換できる。本明細書で使用する場合、「〜からなる」によって、請求する要素において示されていないあらゆる要素、工程または成分が除外される。本明細書で使用する場合、「〜から本質的になる」によっては、本発明の請求の基本的かつ新規な特徴に重大な影響を及ぼさない材料または工程は除外されない。
【００６４】
本明細書で使用する場合、示されている複数の要素の間にある「及び／または」という接続詞は、個々の選択肢及び選択肢を組み合わせたものの両方を含むものとして理解する。例えば、２つの要素が「及び／または」によって接続されている場合、第１の選択肢は、第２の要素を伴わずに、第１の要素を適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素を伴わずに、第２の要素を適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１の要素と第２の要素を併せて適用可能であることを指す。これらの選択肢のいずれか１つは、上記の意味の範囲内であり、すなわち、本明細書で使用する場合の「及び／または」という用語の要件を満たす。２つ以上の選択肢を同時に適用することも、上記の意味の範囲内であり、すなわち、「及び／または」という用語の要件を満たすものと理解する。
【００６５】
本明細書に記載されている「変異」とは、本明細書で定義されているように、欠失、付加、挿入及び／または置換など、核酸またはアミノ酸に対するいずれかの改変を指す。
【００６６】
「宿主細胞」とは、本明細書で使用する場合、外来の分子、ウイルスまたは微生物が導入されている細胞である。非限定的な例の１つでは、本明細書に記載されているように、好適な細胞培養物の細胞、例えばＣＥＦ細胞をポックスウイルスに、または別の代替的な実施形態では、外来もしくは異種の遺伝子を含むプラスミドベクターに感染させることができる。すなわち、好適な宿主細胞及び細胞培養物は、ポックスウイルス、及び／または外来もしくは異種の遺伝子に対する宿主として機能する。
【００６７】
本明細書に記載されている核酸配列に関する「配列相同性（％）または配列同一性（％）」は、参照配列（すなわち、由来元の核酸配列）と候補配列をアラインメントして、必要に応じて、最大配列同一性（％）を得られるようにギャップを導入した後に、参照配列内のヌクレオチドと同一である、候補配列内のヌクレオチドの割合（％）として定義する（いずれの保存的置換も、配列同一性の一部としてみなさない）。ヌクレオチド配列の同一性または相同性（％）を求めるためのアラインメントは、当該技術分野の技術の範囲内である様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）というソフトウェアのような公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを用いて行うことができる。当業者は、比較する配列の全長にわたって最大のアラインメントを得るために必要ないずれかのアルゴリズムを含め、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを定めることができる。
【００６８】
例えば、核酸配列の適切なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，（１９８１），Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９の局所相同性アルゴリズムによって行われる。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，５  ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，によって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ（１９８６），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３によって正規化されたスコアリングマトリックスを用いることによって、アミノ酸配列に適用できる。配列の同一性（％）を求めるためのこのアルゴリズムの例示的なインプリメンテーションは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によって、ユーティリティアプリケーション「ＢｅｓｔＦｉｔ」中に供給されている。この方法のデフォルトパラメーターは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から入手可能）に記載されている。本発明の関連で同一性（％）を定めるための好ましい方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈによって著作権が保護されており、Ｊｏｈｎ  Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ）によって頒布されているプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。この一連のパッケージから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを使用でき、その際には、デフォルトパラメーターをスコア表に使用する（例えば、ギャップオープンペナルティー１２、ギャップエクステンションペナルティー１、及びギャップ６）。生成されたデータから、「マッチ」値は、「配列同一性」を反映している。配列間の同一性または類似性（％）を算出するための他の好適なプログラムは概ね、当該技術分野において知られており、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターで用いるＢＬＡＳＴである。例えば、ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ、ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ、ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ、ｃｕｔｏｆｆ＝６０、ｅｘｐｅｃｔ＝１０、Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、ｓｏｒｔ  ｂｙ＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ、Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲというデフォルトパラメーターを用いて、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰを使用できる。これらのプログラムの詳細は、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／というインターネットアドレスで見るこ��ができる。
【００６９】
「プライムブーストワクチン接種」または「プライムブーストレジメン」という用語は、特異的抗原を標的とするワクチンを最初にプライミング注射してから、間隔を置いて、同じワクチンを１回以上ブースティング注射することを用いるワクチン接種策またはレジメンを指す。プライムブーストワクチン接種は、同種であっても異種であってもよい。同種のプライムブーストワクチン接種は、プライミング注射及び１回以上のブースティング注射の両方で、同じ抗原及びベクターを含むワクチンを使用する。異種のプライムブーストワクチン接種は、プライミング注射及び１回以上のブースティング注射で、同じ抗原を含むワクチンを使用するが、プライミング注射及び１回以上のブースティング注射で、異なるベクターを使用する。例えば、同種のプライムブーストワクチン接種は、プライミング注射には、１つ以上の抗原を発現する核酸を含む組み換えポックスウイルスを使用し、１回以上のブースティング注射には、１つ以上の抗原を発現する同じ組み換えポックスウイルスを使用してよい。これに対して、異種のプライムブーストワクチン接種は、プライミング注射には、１つ以上の抗原を発現する核酸を含む組み換えポックスウイルスを使用し、１回以上のブースティング注射に、１つ以上の抗原を発現する異なる組み換えポックスウイルスを使用してよい。
【００７０】
「組み換え」という用語は、天然では見られないか、または天然では見られない構成で別のポリヌクレオチドに連結されている半合成または合成由来のポリヌクレオチド、ウイルスまたはベクターを意味する。
【００７１】
本明細書で使用する場合、腫瘍体積を縮小することまたは腫瘍体積の縮小は、腫瘍体積及び／または腫瘍サイズの縮小として特徴付けることができるが、当該技術分野において理解されている臨床試験エンドポイントの観点で特徴付けることもできる。腫瘍体積及び／または腫瘍サイズの縮小と関連するいくつかの例示的な臨床試験エンドポイントとしては、奏効率（ＲＲ）、客観的奏効率（ＯＲＲ）などを挙げることができるが、これらに限らない。
【００７２】
本明細書で使用する場合、生存率の向上は、がん患者の生存率の向上として特徴付けることができるが、当該技術分野において理解されている臨床試験エンドポイントの観点で特徴付けることもできる。生存率の向上と関連するいくつかの例示的な臨床試験エンドポイントとしては、全生存率（ＯＲＲ）、無増悪生存率（ＰＦＳ）などが挙げられるが、これらに限らない。
【００７３】
本明細書で使用する場合、「導入遺伝子」または「異種」遺伝子は、野生型ポックスウイルスゲノム（例えば、ワクチニア、ニワトリポックスまたはＭＶＡ）に存在しない核酸配列またはアミノ酸配列であると理解する。「導入遺伝子」または「異種遺伝子」は、ワクシニアウイルスのようなポックスウイルスに存在する場合には、その組み換えポックスウイルスを宿主細胞に投与後、その遺伝子が、対応する異種遺伝子産物として、すなわち、「異種抗原」及び／または「異種タンパク質」として発現されるような形で、ポックスウイルスゲノムに導入されることになることを当業者は認識する。発現は通常、ポックスウイルス感染細胞で発現可能にする調節エレメントに、異種遺伝子を機能的に連結することによって実現させる。好ましくは、その調節エレメントは、天然または合成ポックスウイルスプロモーターを含む。
【００７４】
「ベクター」とは、異種ポリヌクレオチドを含むことができる組み換えＤＮＡまたはＲＮＡプラスミドまたはウイルスを指す。異種ポリヌクレオチドは、予防または治療のための該当する配列を含んでよいとともに、任意に、発現カセットの形態であってよい。本明細書で使用する場合、ベクターは、最終的な標的細胞または対象において複製できる必要はない。ベクターという用語には、クローニングベクター及びウイルスベクターが含まれる。
【００７５】
併用医薬及び方法
各種実施形態では、本発明は、がん患者において腫瘍体積を収縮させ、及び／または生存率を向上させることによって、がん患者を治療するための併用医薬を含む。その併用医薬は、第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸を含む組み換えＭＶＡであって、静脈内投与すると、異種の腫瘍関連抗原をコードする核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非静脈内投与によって誘導されるＮＫ細胞応答及びＴ細胞応答と比べて、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方を誘導する組み換えＭＶＡを含む。
【００７６】
ＮＫ細胞応答の増強
一態様では、本開示による、ＮＫ細胞応答の増強は、１）ＮＫ細胞頻度の上昇、２）ＮＫ細胞の活性化の増大及び／または３）ＮＫ細胞の増殖の増加の１つ以上によって特徴付けられる。したがって、ＮＫ細胞応答が、本開示に従って増強されるかは、ＮＫ細胞頻度の上昇、ＮＫ細胞の活性化の増大及び／またはＮＫ細胞の増殖の増加を示す１つ以上のサイトカインの発現を測定することによって判断できる。ＮＫ細胞の頻度及び／または活性の測定に有用である例示的なマーカーには、ＮＫｐ４６、ＩＦＮ−γ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＮＫＧ２Ｄ、ＦａｓＬ、グランザイムＢ、ＣＤ５６及び／またはＢｃｌ−ＸＬのうちの１つ以上が含まれる。ＮＫ細胞の活性化の測定に有用である例示的なマーカーには、ＩＦＮ−γ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＮＫＧ２Ｄ、ＦａｓＬ、グランザイムＢ及び／またはＢｃｌ−ＸＬのうちの１つ以上が含まれる。ＮＫ細胞の増殖の測定に有用である例示的なマーカーには、Ｋｉ６７が含まれる。これらの分子及びその測定は、当該技術分野において認識されている実証済みのアッセイであり、既知の技法に従って行うことができる。例えば、Ｂｏｒｒｅｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９９、Ｆｏｇｅｌｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３を参照されたい。加えて、それらの分子を測定するアッセイは、本開示の実施例１〜３及び９に見ることができる。少なくとも一態様では、１）ＮＫ細胞頻度の上昇は、治療前／ベースラインと比べて、ＣＤ３−ＮＫｐ４６＋細胞が少なくとも２倍増加することとして定義でき、２）ＮＫ細胞の活性化の増大は、治療前／ベースラインの発現と比べて、ＩＦＮ−γ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＮＫＧ２Ｄ、ＦａｓＬ、グランザイムＢ及び／またはＢｃｌ−ＸＬの発現が少なくとも２倍増加することとして定義でき、及び／または３）ＮＫ細胞の増殖の増加は、治療前／ベースラインの発現と比べて、Ｋｉ６７の発現が少なくとも１．５倍増加することとして定義する。
【００７７】
より好ましい態様では、「ＮＫ細胞応答の増強」は、本開示で使用する場合、ＮＫ細胞媒介性殺腫瘍細胞作用の増大によって特徴付けられる。ＮＫ細胞媒介性殺腫瘍細胞作用は、実施例５に示されているように、細胞培養培地への乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を測定することによって解析できる。したがって、本発明の関連では、併用医薬によって「ＮＫ細胞応答が増強される」か否かは、ＮＫ細胞媒介性殺腫瘍細胞作用の増大の存在によって特徴付けることができる。ＮＫ細胞媒介性殺腫瘍細胞作用は、実施例５に見られるように、乳酸脱水素酵素の放出を測定することによって解析できる。ＬＤＨ及びその測定と関連するアッセイは、当該技術分野において検証及び理解されている。少なくとも一態様では、ＮＫ細胞媒介性殺腫瘍細胞作用の増大は、殺腫瘍細胞作用が少なくとも２倍増大することとして定義できる。
【００７８】
ＡＤＣＣ応答の増強
少なくとも１つの態様では、本発明によって誘導されるＮＫ細胞応答の増強によって、ＡＤＣＣ応答が増強される。本発明による「ＡＤＣＣ応答の増強」は、自然免疫エフェクター細胞が、抗体によって被覆された腫瘍細胞を標的として殺傷する能力の向上によって特徴付けられる。本開示の関連では、自然免疫エフェクターとしては、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、肥満細胞、樹状細胞などを挙げることができるが、これらに限らない。より好ましい態様では、自然免疫エフェクターは、ＮＫ細胞である。エフェクター細胞が腫瘍細胞を殺傷する能力の測定に有用であるアッセイとしては、エキソビボエフェクター：標的殺傷アッセイが挙げられ、そのアッセイでは、「エフェクター」は、単離エフェクター細胞であり、「標的」は、抗体存在下の腫瘍細胞である。Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６及びＢｒｏｕｓｓａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）を参照されたい。エキソビボエフェクター：標的殺傷アッセイは、当該技術分野において検証及び理解されている。加えて、エフェクター細胞が腫瘍細胞を殺傷する能力を測定するためのアッセイは、実施例５に見ることもできる。したがって、一態様では、本願の関連では、ＮＫ細胞応答の増強を含め、自然免疫応答の増強によって、ＡＤＣＣが増強されるか否かは、１）被覆された標的細胞（抗体で被覆された腫瘍細胞）に対する比率が様々であるエフェクター細胞を用いること、ならびに２）一定の比率のエフェクター細胞、及び１つ以上の濃度の抗体を用いることの１つ以上を通じて、殺腫瘍細胞作用のレベルを測定することによって特徴付けることができ、例えば、低濃度の腫瘍抗原結合抗体を、高濃度における殺腫瘍細胞作用のレベルと比較する。
【００７９】
好ましい態様では、本開示による「ＡＤＣＣ応答の増強」は、ＮＫ細胞が、抗体によって被覆された腫瘍細胞を標的として殺傷する能力の向上によって特徴付けられる。ＮＫ細胞が腫瘍細胞を殺傷する能力の測定に有用であるアッセイとしては、エキソビボエフェクター：標的殺傷アッセイが挙げられ、そのアッセイでは、「エフェクター」は、単離ＮＫ細胞であり、「標的」は、抗体存在下の腫瘍細胞である。加えて、ＮＫ細胞が腫瘍細胞を殺傷する能力を測定するためのアッセイは、実施例５に見ることができる。したがって、一態様では、本願の関連では、ＮＫ細胞応答によって、ＡＤＣＣが増強されるか否かは、１）被覆された標的細胞（抗体で被覆された腫瘍細胞）に対する比率が様々であるＮＫ細胞を用いて、及び／または２）一定の比率のＮＫ細胞、及び１つ以上の濃度の抗体を用いて、殺腫瘍細胞作用のレベルを測定することによって特徴付けることができ、例えば、低濃度の腫瘍抗原結合抗体を、高濃度における殺腫瘍細胞作用のレベルと比較する。
【００８０】
ＮＫ細胞媒介性傷害作用の強化
追加的な態様では、ＮＫ細胞応答の増強によって、ＮＫ細胞のような自然免疫エフェクターが、ＭＨＣ発現レベルの低い腫瘍細胞を攻撃して殺傷する能力が向上する。一態様では、ＭＨＣレベルの低い腫瘍細胞の殺傷は、ＮＫ細胞媒介性傷害作用が強化された自然免疫エフェクター、例えばＮＫ細胞（ＮＫ細胞が、より効率的に腫瘍細胞を殺傷することを意味する）によって特徴付けることができる。ＮＫ細胞媒介性傷害作用が強化されたＮＫ細胞は、ＮＫ細胞ごとの殺腫瘍細胞数の増加によって測定できる。これは、エフェクター：標的殺傷アッセイの利用を通じて求めることができる。このようなアッセイは、当該技術分野において検証済み及び既知であり、本願では、少なくとも実施例４及び図９に示されている。
【００８１】
自然免疫エフェクター細胞の増強
追加的な態様では、本願の組み換えポックスウイルスをＩＶ投与すると、ＮＫ細胞応答が増強されるのみならず、自然免疫応答のすべての局面も増強される。自然免疫応答の増強は、自然エフェクター細胞の１）頻度の上昇、２）活性化の増大、及び／または３）増殖の増加として特徴付けることができる。自然エフェクター細胞としては、ＮＫ細胞、自然リンパ球細胞（ＩＬＣ）、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、肥満細胞、単球及び／または樹状細胞を挙げることができる。各種態様では、自然免疫応答が、本願に従って増強されるか否かは、自然応答の上記のエフェクター細胞と関連するサイトカイン及び／または活性化マーカーの発現の１つ以上を測定することによって判断できる。これらのサイトカイン及び活性化マーカー、ならびにそれらの測定は、当該技術分野において検証及び理解されており、既知の技法に従って行うことができる。例えば、Ｂｏｒｒｅｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９９、Ｆｏｇｅｌｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３を参照されたい。
【００８２】
Ｔ細胞応答の増強
本願によれば、「Ｔ細胞応答の増強」は、１）ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度の上昇、２）ＣＤ８  Ｔ細胞の活性化の増大及び／または３）ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖の増加の１つ以上によって特徴付けられる。したがって、Ｔ細胞応答が、本願に従って増強されるか否かは、１）ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度の上昇、２）ＣＤ８  Ｔ細胞の活性化の増大及び／または３）ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖の増加を示す１つ以上のサイトカインの発現を測定することによって判断できる。ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度、活性化及び増殖の測定に有用である例示的なマーカーとしてはそれぞれ、ＣＤ３、ＣＤ８、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＣＤ６９及び／またはＣＤ４４、ならびにＫｉ６７が挙げられる。抗原特異的Ｔ細胞の頻度は、図１１、１２、１５、１９及び２１に示されているように、ＥＬＩｓｐｏｔ、またはペンタマーもしくはデキストラマーのようなＭＨＣマルチマーによっても測定できる。このような測定及びアッセイは、当該技術分野において検証及び理解されている。
【００８３】
一態様では、ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度の上昇は、治療前／ベースラインと比べて、ＩＦＮ−γ及び／またはデキストラマー＋ＣＤ８  Ｔ細胞が少なくとも２倍増加することによって特徴付けられる。ＣＤ８  Ｔ細胞の活性化の増大は、治療前／ベースラインの発現と比べて、ＣＤ６９及び／またはＣＤ４４の発現が少なくとも２倍増加することとして特徴付けられる。ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖の増加は、治療前／ベースラインの発現と比べて、Ｋｉ６７の発現が少なくとも２倍増加することとして特徴付けられる。
【００８４】
代替的な態様では、Ｔ細胞応答の増強は、ＣＤ８  Ｔ細胞によるエフェクターサイトカインの発現の増加、及び／または細胞傷害性エフェクター機能の増大によって特徴付けられる。エフェクターサイトカインの発現の増加は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及び／またはＩＬ−２のうちの１つ以上の発現を治療前／ベースラインと比較したものによって測定できる。細胞傷害性エフェクター機能の増大は、ＣＤ１０７ａ、グランザイムＢ及び／またはパーフォリンのうちの１つ以上の発現、及び／または標的細胞の抗原特異的な殺傷によって測定できる。
【００８５】
本明細書に記載されているアッセイ、サイトカイン、マーカー及び分子、ならびにそれらの測定は、当該技術分野において検証及び理解されており、既知の技法に従って行うことができる。加えて、Ｔ細胞応答を測定するためのアッセイは、Ｔ細胞応答を解析した実施例６及び７に見ることができる。
【００８６】
本発明によって実現する、Ｔ細胞応答の増強は、ＮＫ細胞応答の増強と組み合わさると、特に有益である。がん患者において、初期の自然免疫応答を回避し、及び／または切り抜けたそれらの腫瘍細胞を、増強されたＴ細胞が効果的に標的として殺傷するからである。さらに、抗体治療は、クラスＩ  ＭＨＣによるＴＡＡの提示を増強でき、その結果、ＴＡＡ特異的Ｔ細胞による溶解に対するＴＡＡ発現腫瘍の感受性が向上する（Ｋｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００４）。
【００８７】
追加的な実施形態では、本発明の併用医薬はさらに抗体を含み、その抗体は、腫瘍細胞の細胞膜上、好ましくは、外側の細胞膜上に発現または過剰発現する抗原に特異的である。その抗体は、本開示によって記載されているようないずれかの抗体であり得ることが企図されている。好ましい実施形態では、その抗体は、Ｆｃドメインを含む。
【００８８】
追加的な実施形態では、腫瘍体積を縮小し、及び／またはがん患者の生存率を向上させる方法が存在する。その方法は、ａ）第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸を含む組み換えＭＶＡであって、静脈内投与すると、異種の腫瘍関連抗原をコードする核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非静脈内投与によって誘導される自然免疫応答及びＴ細胞応答と比べて、自然免疫応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方を誘導する組み換えＭＶＡをがん患者に静脈内投与すること、ならびにｂ）抗体をそのがん患者に投与することであって、その抗体が、Ｆｃドメインを含むとともに、腫瘍細胞の細胞膜上に発現する抗原に特異的であることを含み、ａ）及びｂ）をがん患者に投与すると、ａ）の非静脈内投与またはｂ）の投与を単独で行った場合と比べて、がん患者の腫瘍サイズが縮小し、及び／またはがん患者の生存率が上昇する。より好ましい実施形態では、自然免疫応答の増強は、本明細書に記載されているような、ＮＫ細胞応答の増強を含む。
【００８９】
別の実施形態では、患者において抗体療法を増強する方法であって、ａ）抗体をがん患者に投与することであって、その抗体が、Ｆｃドメインを含むとともに、腫瘍細胞の細胞膜上に発現する抗原に特異的であり、その抗体の投与によって、その患者においてＡＤＣＣを誘導すること、ならびにｂ）その患者において、第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸を含む組み換えＭＶＡであって、自然免疫応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方を誘導する組み換えＭＶＡをそのがん患者に静脈内投与することを含み、その自然免疫応答の増強によって、その患者において、ａ）及びｂ）を組み合わせたもの、またはａ）及びｂ）を単独で非静脈内投与した場合と比べて、ＡＤＣＣが増強される方法が存在する。より好ましい実施形態では、自然免疫応答の増強は、本明細書に記載されているような、ＮＫ細胞応答の増強を含む。
【００９０】
さらに別の実施形態では、がん患者における抗体療法の有効性を増大させる方法であって、本発明の併用医薬を投与することを含み、その併用薬をその患者に投与することによって、腫瘍細胞におけるＮＫ細胞媒介性傷害作用に必要な抗体濃度が低下する方法が存在する。少なくとも１つの有益な態様では、ＮＫ細胞媒介性傷害作用に必要な抗体濃度の低下によって、結合抗体の標的化による破壊を回避するために、細胞外抗原の発現が減少している腫瘍細胞を、増強されたＮＫ細胞応答によって殺傷可能になる。加えて、必要な抗体濃度の低下によって、抗体量の少ない治療を可能にし得る。
【００９１】
本願の関連では、ＮＫ細胞媒介性傷害作用に必要な抗体濃度の低下は、殺腫瘍細胞作用に必要な抗体濃度の低下として特徴付けることができる。殺腫瘍細胞作用に必要な抗体濃度の低下は、エキソビボエフェクター：標的殺傷アッセイによって測定でき、そのアッセイでは、「エフェクター」は、単離ＮＫ細胞であり、「標的」は、抗体存在下の腫瘍細胞である。加えて、測定するためのアッセイには、例えば、１）被覆された標的細胞（抗体で被覆された腫瘍細胞）に対する比率が様々であるＮＫ細胞を用いること、及び／または２）一定の比率のＮＫ細胞、及び１つ以上の濃度の抗体を用いて、殺腫瘍細胞作用のレベルを測定することが含まれる（例えば、低濃度の腫瘍抗原結合抗体を、高濃度における殺腫瘍細胞作用のレベルと比較する）。このようなアッセイは、当該技術分野において知られており、本書でも、本願の実施例５及び３１に記載されている。
【００９２】
さらに追加的な実施形態では、本明細書に記載されている併用医薬及び方法は、ヒトがん患者を治療するためのものである。好ましい実施形態では、そのがん患者は、乳癌、肺癌、頭頸部癌、甲状腺、メラノーマ、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、尿路上皮、子宮頸もしくは大腸癌からなる群から選択したがんを罹患しており、及び／またはそのがんと診断されている。
【００９３】
さらに追加的な好ましい実施形態では、本発明の併用医薬及び方法はそれぞれ、ＣＤ４０Ｌを含む。好ましくは、そのＣＤ４０Ｌは、本発明の組み換えＭＶＡによってコードされる。
【００９４】
例示的な腫瘍関連抗原
特定の好ましい実施形態では、第１及び／または第２の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）としては、ＨＥＲ２、ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１、サバイビン、ＴＹＲＰ１、ＴＹＲＰ２もしくはＢｒａｃｈｙｕｒｙ単独、またはこれらを組み合わせたものが挙げられるが、これらに限らない。このような例示的な組み合わせとしては、ＨＥＲ２及びＢｒａｃｈｙｕｒｙ、ＣＥＡ及びＭＵＣ−１、またはＰＡＰ及びＰＳＡを挙げてよい。
【００９５】
多くのＴＡＡが、当該技術分野において知られている。例示的なＴＡＡとしては、５αレダクターゼ、α−フェトプロテイン、ＡＭ−１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、ＢＡＧＥ、β−カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＣＡ−１２５、ＣＡＳＰ−８／ＦＬＩＣＥ、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３５、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、ｃ−ｍｙｃ、Ｃｏｘ−２、ＤＣＣ、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、ＦＧＦ８ｂ、ＦＧＦ８ａ、ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、葉酸受容体、Ｇ２５０、ＧＡＧＥファミリー、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ＧＤ２／ＧＤ３／ＧＭ２、ＧｎＲＨ、ＧｎＴＶ、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌ１７、ｇｐ−１００−ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／ＴＲＰ−１、ｈＣＧ、ヘパラナーゼ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＭＴＶ、Ｈｓｐ７０、ｈＴＥＲＴ、ＩＧＦＲ１、ＩＬ−１３Ｒ、ｉＮＯＳ、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ−ＦＵＴ、ＭＡＧＥファミリー、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、メソセリン、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＭＴ−ＭＭＰ、ムチン、ＮＹ−ＥＳＯ−１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ−１、ＰＤＧＦ、ｕＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロジェニポエチン、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ−１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ−１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ−７２、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、チモシン−β−１５、ＴＮＦ−α、ＴＹＲＰ−、ＴＹＲＰ−２、チロシナーゼ、ＶＥＧＦ、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限らない。
【００９６】
好ましいＰＳＡ抗原は、米国特許第７，２４７，６１５号（参照により、本明細書に援用される）に見られるように、１５５位に、イソロイシンのロイシンへのアミノ酸変化を含む。
【００９７】
本発明のより好ましい実施形態では、第１及び／または第２の異種ＴＡＡは、ＨＥＲ２及びＢｒａｃｈｙｕｒｙから選択する。さらに好ましい実施形態では、第１及び／または第２の異種ＴＡＡは、本明細書に記載されているような合成ＨＥＲ２及びＢｒａｃｈｙｕｒｙタンパク質から選択する。
【００９８】
追加的な好ましい実施形態では、第１及び／または第２の異種ＴＡＡは、１つ以上の変異を含む。少なくとも１つの実施形態では、その１つ以上の変異は、本開示の抗体が、第１及び／または第２の異種ＴＡＡに結合するのを防ぐ変異を含む。追加的な実施形態では、その１つ以上の変異は、第１及び／または第２のＴＡＡが、そのＴＡＡの１つ以上の通常の細胞機能を発揮するのを防ぐ変異を含む。その１つ以上の変異の例示的な実施形態は、本発明の合成ＨＥＲ２及び合成Ｂｒａｃｈｙｕｒｙタンパク質によって説明されている。
【００９９】
合成ＨＥＲ２タンパク質
本発明者は、本発明の開発により、本明細書に記載されているような、ＨＥＲ２抗原及び／またはＨＥＲ２抗原をコードする核酸の１つ以上の改変によって、本発明の併用療法の有効性が増大することを割り出した。
【０１００】
したがって、各種実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２ｖ１及びＨＥＲ２ｖ２から選択したＨＥＲ２抗原をコードする核酸を含む。ＨＥＲ２ｖ１は配列番号１を含み、ＨＥＲ２ｖ２は配列番号１３を含む。
【０１０１】
少なくとも１つの具体的な態様では、配列番号１及び／または１３によってコードされる核酸は、特に有益である。配列番号１及び／または１３は、本発明の併用療法の一部として投与したときに、ＨＥＲ２抗原に対する抗体と相乗的に機能するように構成されているからである。
【０１０２】
本発明の例示的な一実施形態では、本発明のＨＥＲ２抗体は、ＨＥＲ２発現がん、または、より具体的な実施形態では、ＨＥＲ２発現乳癌の治療用に承認されている抗体を含む。ＨＥＲ２を標的とする２つのヒト化モノクローナル抗体が、ＨＥＲ２発現乳癌の治療用に開発及び承認されている。いずれの抗体も、ＨＥＲ２の細胞外ドメインの異なる部位に結合する。トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎとして商標化されており、バイオ子ミラーとしてＨｅｒｚｕｍａ及びＡＢＰ９８０を有する）の結合によって、シグナル伝達がブロックされ、ＨＥＲ２の切断が阻止される。これに対して、ペルツズマブ（Ｐｅｒｊｅｔａ）は、ＨＥＲ２と他のＥＧＦ受容体との二量化を立体的にブロックし、リガンドが活性化するシグナル伝達をブロックする。トラスツズマブ及びペルツズマブの両方とも、ＨＥＲ２が駆動するシグナル伝達経路を二重ブロックし、加えて、乳癌に対するＡＤＣＣを媒介する能力を有する。したがって、本発明の各種の具体的な実施形態では、本発明の抗体は、トラスツズマブ、Ｈｅｒｚｕｍａ、ＡＢＰ９８０及び／またはペルツズマブを含む。
【０１０３】
合成ＨＥＲ２ｖ１
１つ以上の実施形態では、本発明の合成ＨＥＲ２タンパク質は、ＨＥＲ２ｖ１（配列番号１）である。本明細書で前述したように、本発明の併用療法の有効性を増強するために、本発明の組み換えＭＶＡによってコードされる導入遺伝子に変異を施して、その導入遺伝子と、投与する抗体とのいずれかの相互作用及び／または結合の可能性を最小限にする。したがって、トラスツズマブ及びペルツズマブのようなＨＥＲ２抗体の併用投与を伴う療法の有効性を増強するために、ＨＥＲ２抗原に１つ以上の変異を施した。より具体的には、ＨＥＲ２における該当する抗体結合部位を変異させた。すなわち、１つ以上の実施形態では、本発明の合成ＨＥＲ２タンパク質は、５７９〜６２５位（トラスツズマブ結合ドメイン）、２６７〜３３７位（ペルツズマブ結合ドメイン）、２７４〜２８８位（ＨＥＲ２二量化ドメイン）、７２１〜９８７位（キナーゼドメイン）及び１１３９〜１２４８位（リン酸化ドメイン）というアミノ酸ドメインに、１つ以上の変異を含む。本発明の１つ以上の例示的な実施形態では、本発明のＨＥＲ２抗原は、Ｅ５８０Ａ、Ｆ５９５Ａ、Ｋ６１５Ａ、Ｌ３１７Ａ、Ｈ３１８Ａ、Ｄ２７７Ｒ、Ｅ２８０Ｋ、Ｋ７５３Ｍ、Ｙ１０２３Ａという変異の１つ以上を含む。ＨＥＲ２ｖ１抗原に対する変異（ＨＥＲ２（ＮＰ＿００４４３９．２）に基づく）は、以下に示されている。
【０１０４】
【表１】
2020531524.tif 000002
【０１０５】
ＨＥＲ２ｖ１のアミノ酸配列：上に示した合成ＨＥＲは、ＨＥＲ２（ＮＰ＿００４４３９．２）に基づいている。変異したアミノ酸には、下線及び取り消し線が引かれている。５７９〜６２５位のアミノ酸は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎの結合部位である。２６７〜３３７位のアミノ酸は、Ｐｅｒｊｅｔａの結合部位である。２７４〜２８８位のアミノ酸は、二量化ドメインの残基である。７２１〜９８７位のアミノ酸は、キナーゼドメインの残基である。１１３９〜１２４８位のアミノ酸は、リン酸化ドメインの残基である。［配列番号１］
合成ＨＥＲ２ｖ２
１つ以上の実施形態では、本発明の合成ＨＥＲ２タンパク質は、ＨＥＲ２ｖ２（配列番号１３）である。本明細書で前述したように、本発明の併用療法の有効性を増強するために、組み換えＭＶＡによってコードされる導入遺伝子に変異を施して、その導入遺伝子と、投与する抗体とのいずれかの相互作用及び／または結合の可能性を最小限にする。したがって、トラスツズマブ及びペルツズマブのようなＨＥＲ２抗体の併用投与を伴う療法の有効性を増強するために、ＨＥＲ２抗原に１つ以上の変異を施した。より具体的には、ＨＥＲ２における該当する抗体結合部位を変異させた。したがって、１つ以上の実施形態では、本発明の合成ＨＥＲ２タンパク質は、５７９〜６２５位（トラスツズマブ結合ドメイン）、２６７〜３３７位（ペルツズマブ結合ドメイン）、２７４〜２８８位（ＨＥＲ２二量化ドメイン）、７２１〜９８７位（キナーゼドメイン）及び１１３９〜１２４８位（リン酸化ドメイン）というアミノ酸ドメインに１つ以上の変異を含む。本発明の１つ以上の例示的な実施形態では、ＨＥＲ２抗原は、Ｅ５８０Ａ、Ｆ５９５Ａ、Ｋ６１５Ａ、Ｌ３１７Ａ、Ｈ３１８Ａ、Ｄ２７７Ｒ、Ｅ２８０Ｋ、Ｋ７５３Ｍ、Ｙ１０２３Ａという変異の１つ以上を含む。
【０１０６】
少なくとも一態様では、上記の変異によって、本発明の併用療法が増強される。それらの変異は、ＭＶＡ−ＨＥＲ２抗原と、ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ及びペルツズマブとのいずれかの相互作用及び／または望ましくない結合を最小限にするように機能するからである。トラスツズマブとＨＥＲ２との相互作用には、ＨＥＲ２の膜近傍領域の３つのループ（５７９〜５８３位（ループ１）、５９２〜５９５位（ループ２）及び６１５〜６２５（ループ３）のアミノ酸によって形成される）が関与する［６］。例えば、Ｈ．Ｓ．Ｃｈｏ，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ＨＥＲ２  ａｌｏｎｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  Ｆａｂ，”Ｎａｔｕｒｅ，２００３を参照されたい。これらのループには、Ｅ５８０、Ｄ５８２、Ｐ５９４、Ｆ５９５、Ｋ６１５、Ｑ６２４Ｓを含め、ＨＥＲ２とトラスツズマブの結合に重要な残基がいくつか存在する。Ｓａｔｙａｎａｒａｙａｎａｊｏｉｓ，“Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  Ｄｏｃｋｉｎｇ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ＨＥＲ２−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ，”Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ，２００９。
【０１０７】
したがって、一実施形態では、本発明のＨＥＲ２抗原は、ＨＥＲ２抗原のトラスツズマブへの結合を妨げる残基への変異を１つ以上含む。いくつかの例示的な残基としては、Ｅ５８０、Ｄ５８２、Ｐ５９４、Ｆ５９５、Ｋ６１５及びＱ６２４が挙げられるが、これらに限らない。したがって、より特定的な実施形態では、本発明のＨＥＲ２抗原は、Ｅ５８０、Ｄ５８２、Ｐ５９４、Ｆ５９５、Ｋ６１５、Ｑ６２４及びこれらを組み合わせたものからなる群から選択した残基に対する変異を１つ以上含む。さらに具体的な実施形態では、本発明のＨＥＲ２抗原は、Ｅ５８０、Ｆ５９５及びＫ６１５から選択した残基に対する変異を１つ以上含む。さらに別の具体的な実施形態では、ＨＥＲ２抗原に対するその１つ以上の変異は、Ｅ５８０、Ｆ５９５及びＫ６１５に対するＡｌａ置換（例えば、Ｅ５８０Ａ、Ｆ５９５Ａ及びＫ６１５Ａ）を含む。
【０１０８】
別の例示的な実施形態では、本発明のＨＥＲ２抗原は、ペルツズマブ結合ドメインに対する変異を１つ以上含む。ペルツズマブは、ＨＥＲ２の二量化ドメイン（ドメインＩＩ）におけるループ（重要な残基Ｈ２６７、Ｙ２７４、Ｓ３１０、Ｌ３１７、Ｈ３１８及びＫ３３３を含む）の近くに結合する。結合界面の変異は、ＰｅｒｊｅｔａのＨＥＲ２への結合を著しく低下させる。Ｍ．Ｃ．Ｆｒａｎｋｌｉｎ，“Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ＥｒｂＢ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥｒｂＢ２−ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ  ｃｏｍｐｌｅｘ，”Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２００４。Ｆ２７９、Ｖ３０８及びＰ３３７を含め、この結合ドメインにおけるさらなるアミノ酸残基が、ペルツズマブとＨＥＲ２の相互作用に寄与する可能性がある。
【０１０９】
したがって、一実施形態では、本発明のＨＥＲ２抗原は、ＨＥＲ２抗原のペルツズマブへの結合を妨げる残基への変異を１つ以上含む。より具体的な実施形態では、本発明のＨＥＲ２抗原は、Ｈ２６７、Ｆ２７９、Ｖ３０８、Ｓ３１０、Ｌ３１７、Ｈ３１８、Ｋ３３３及びＰ３３７、ならびにこれらを組み合わせたものからなる群から選択した残基に対する変異を１つ以上含む。さらに別の具体的な実施形態では、ＨＥＲ２抗原に対する１つ以上の変異は、Ｈ２６７、Ｆ２７９、Ｖ３０８、Ｓ３１０、Ｌ３１７、Ｈ３１８、Ｋ３３３及びＰ３３７に対するＡｌａ置換（例えば、Ｈ２６７Ａ、Ｆ２７９Ａ、Ｖ３０８Ａ、Ｓ３１０Ａ、Ｌ３１７Ａ、Ｈ３１８Ａ、Ｋ３３３Ａ及びＰ３３７Ａ）を含む。
【０１１０】
本発明の少なくとも１つの態様では、ＨＥＲ２の二量化を最小限にすれば、ＭＶＡによってコードされるＨＥＲ２と、ＭＶＡでトランスダクションされた細胞によって発現されるＥＧＦＲ、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４のようなその他のＨＥＲファミリーメンバーとの相互作用及び結合が最小限となると仮定した。ＨＥＲの二量化を最小限にすれば、特に有益となる。ＨＥＲ２は、二量化によって開始される細胞内シグナル伝達を通じて、その発がん能を発揮するからである。したがって、一実施形態では、本発明のＨＥＲ２抗原は、ＨＥＲ２の二量化を妨げる残基への変異を１つ以上含む。いくつかの例示的な残基としては、Ｌ３１７、Ｈ３１８、Ｄ２７７及びＥ２８０が挙げられるが、これらに限らない。したがって、より具体的な実施形態では、本発明のＨＥＲ２抗原は、Ｌ３１７、Ｈ３１８、Ｄ２７７、Ｅ２８０及びこれらを組み合わせたものからなる群から選択した残基に対する変異を１つ以上含む。より具体的な実施形態では、本発明のＨＥＲ２抗原は、Ｄ２７７、Ｅ２８０から選択した残基への変異を１つ以上含む。さらに別の具体的な実施形態では、ＨＥＲ２抗原に対するその１つ以上の変異は、Ｄ２７７に対するＡｒｇ置換（Ｄ２７７Ｒ）及びＥ２８０に対するＬｙｓ置換（Ｅ２８０Ｋ）を含む。
【０１１１】
追加的な態様では、チロシンキナーゼ活性を最小限にすれば、細胞の増殖及び血管新生を誘導し得る細胞シグナルの下流での活性化が最小限となると仮定した。したがって、一実施形態では、本発明のＨＥＲ２抗原は、ＨＥＲ２のチロシンキナーゼ活性を妨げる残基への変異を１つ以上含む。例示的な残基としては、Ｋ７５３が挙げられるが、これに限らない。したがって、より具体的な実施形態では、本発明のＨＥＲ２抗原は、Ｋ７５３残基に対する変異を含む。より具体的な実施形態では、本発明のＨＥＲ２抗原は、残基Ｋ７５３に対するＭｅｔ置換（Ｋ７５３Ｍ）を含む。
【０１１２】
さらに追加的な態様では、潜在的なリン酸化部位を除去すれば、細胞の増殖及び血管新生を誘導し得る細胞シグナルの下流での活性化が最小限になると仮定した。したがって、一実施形態では、本発明のＨＥＲ２抗原は、ＨＥＲ２における潜在的なリン酸化部位を妨げる残基への変異を１つ以上含む。いくつかの例示的な残基としては、１１３９〜１２４８位のアミノ酸及びＹ１０２３が挙げられるが、これらに限らない。したがって、より具体的な実施形態では、本発明のＨＥＲ２抗原は、１１３９〜１２４８位のアミノ酸、Ｙ１０２３及びこれらを組み合わせたものから選択した残基に対する変異を１つ以上含む。より具体的な実施形態では、本発明のＨＥＲ２抗原は、１１３９〜１２４８位のアミノ酸の欠失、及び／またはＹ１０２３のＡｌａへの置換（Ｙ１０２３Ａ）を含む。
【０１１３】
好ましい一実施形態では、本発明のＨＥＲ２抗原は、ＨＥＲ２に見られるペルツズマブ結合ドメイン、トラスツズマブ結合ドメイン、二量化ドメイン、キナーゼドメイン及び／またはリン酸化ドメインに対する変異を１つ以上含む。前述のドメインにおける、ＨＥＲ２抗原に対する例示的な変異（ＮＰ＿００４４３９．２に基づく）は、合成ＨＥＲ２ｖ２として下に例示されている。
【０１１４】
【表２】
2020531524.tif 000003
【０１１５】
ＨＥＲ２＿ｖ２．（配列番号１３）のアミノ酸配列：上に示されている合成ＨＥＲ＿バージョン２は、ＨＥＲ２（ＮＰ＿００４４３９．２）に基づいている。変異したアミノ酸には、下線及び取り消し線が引かれている。５７９〜６２５位のアミノ酸は、トラスツズマブの結合部位である。２６７〜３３７位のアミノ酸は、ペルツズマブの結合部位である。２７４〜２８８位のアミノ酸は、二量化ドメインの残基である。７２１〜９８７位のアミノ酸は、キナーゼドメインの残基である。１１３９〜１２４８位のアミノ酸は、リン酸化ドメインにおける残基である。
【０１１６】
本発明における定義した利点によれば、各種実施形態では、本発明は、合成ＨＥＲ２抗原であって、そのＨＥＲ２抗原がＨＥＲ２抗体に結合するのを防ぐために、ＨＥＲ２の１つ以上のアミノ酸が変異されている合成ＨＥＲ２抗原を含む。より好ましい実施形態では、本発明の合成ＨＥＲ２抗原は、ペルツズマブ、トラスツズマブ及びアドトラスツズマブエムタンシンから選択した抗体の結合を防ぐために、変異されている。
【０１１７】
別の実施形態では、本発明の合成ＨＥＲ２抗原は、（ＨＥＲ２抗原をｒＭＶＡによって発現させたら、）そのＨＥＲ２抗原の細胞外での二量化、チロシンキナーゼ活性及び／またはリン酸化を防ぐために、１つ以上の変異を含む。さらなる具体的な実施形態では、本発明の合成ＨＥＲ２抗原は、ＨＥＲ２の膜近傍領域の３つのループの少なくとも１つに対する変異を１つ以上含む。
【０１１８】
各種のさらなる実施形態では、本発明は、配列番号１を含むＨＥＲ２抗原をコードする核酸を含む。追加的な実施形態では、本発明は、配列番号１との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％であるＨＥＲ２抗原をコードする核酸を含む。
【０１１９】
一実施形態では、本発明は、配列番号２を含む核酸であって、配列番号１のＨＥＲ２抗原をコードする核酸を含む。追加的な実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２抗原をコードする核酸であって、配列番号２との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％である核酸を含む。
【０１２０】
各種の追加的な実施形態では、本発明は、配列番号１３を含むＨＥＲ２抗原をコードする核酸を含む。追加的な実施形態では、本発明は、配列番号１３との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％であるＨＥＲ２抗原をコードする核酸を含む。
【０１２１】
一実施形態では、本発明は、配列番号１４を含む核酸であって、配列番号１３のＨＥＲ２抗原をコードする核酸を含む。追加的な実施形態では、本発明は、ＨＥＲ２抗原をコードする核酸であって、配列番号１４との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％である核酸を含む。
【０１２２】
合成Ｂｒａｃｈｙｕｒｙタンパク質
すでに例示したように、ＭＶＡによってコードされる第２の疾患／腫瘍関連抗原を追加したところ、本発明の併用療法の抗腫瘍応答／活性が増強された。これに従い、本発明の各種実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡはさらに、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗原をコードする。
【０１２３】
本発明者は、本明細書に記載されているように、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗原及び／またはＢｒａｃｈｙｕｒｙ抗原をコードする核酸の１つ以上の改変によって、併用療法の有効性が増大することを割り出した。より具体的には、宿主細胞によるＢｒａｃｈｙｕｒｙ抗原のいずれの核局在化も最小限にし、及び／または回避するために、１つ以上の変異を核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメインに施した。
【０１２４】
したがって、各種実施形態では、本発明の合成Ｂｒａｃｈｙｕｒｙポリペプチドは、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの核局在化を防ぐための変異を１つ以上含む。「核局在化」は、核への局在化及び／または輸送として定義できる。１つ以上の変異によって、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗原の核局在化が阻止されるかを判断するためのアッセイの実施は、当該技術分野の通常の技術の範囲内である。このようなアッセイとしては、免疫蛍光解析及び免疫蛍光顕微鏡法を挙げることができる。
【０１２５】
より具体的な実施形態では、本発明の合成Ｂｒａｃｈｙｕｒｙポリペプチドは、ＮＬＳドメインに１つ以上の変異を含む。より具体的かつ好ましい実施形態では、本発明の合成Ｂｒａｃｈｙｕｒｙポリペプチドでは、下に示されているように、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗原（ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＮＰ＿００３１７２．１）の２８６〜２９３位のアミノ酸が欠失されている。
【０１２６】
【表３】
2020531524.tif 000004
【０１２７】
例示的な改変Ｂｒａｃｈｙｕｒｙのアミノ酸配列：Ｂｒａｃｈｙｕｒｙの潜在的なＮＬＳにおける、保存されているコアモチーフ残基ＲＳＳＰＹＰＳＰを欠失させた（取り消し線によって示されている）［配列番号３］。
【０１２８】
より具体的な実施形態では、本発明は、配列番号３、配列番号５及び配列番号７からなる群から選択したＢｒａｃｈｙｕｒｙ抗原をコードする核酸を含む。好ましい態様では、本発明の各種実施形態は、配列番号３をコードする核酸を含む。
【０１２９】
少なくとも１つの具体的な態様では、配列番号３によってコードされる核酸は、特に有益である。配列番号３は、ＭＶＡによってコードされるＢｒａｃｈｙｕｒｙ抗原が核に局在化及び／または輸送されるのを防ぎ、及び／または最小限にするように構成されているからである（局在化及び／または輸送されると、望ましくない転写活性の可能性が生じ得る）。
【０１３０】
本発明の併用療法の、定義した利点によれば、各種態様では、本発明の実施形態は、配列番号３を含むＢｒａｃｈｙｕｒｙ抗原をコードする核酸を含む。追加的な態様では、本発明の実施形態は、配列番号３との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％であるＢｒａｃｈｙｕｒｙ抗原をコードする核酸を含む。
【０１３１】
さらなる態様では、本発明の実施形態は、配列番号４を含む核酸であって、配列番号３のＢｒａｃｈｙｕｒｙ抗原をコードする核酸を含む。追加的な態様では、本発明の実施形態は、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗原をコードする核酸であって、配列番号４との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％である核酸を含む。
【０１３２】
ＣＤ４０Ｌ
本開示によって例示されているように、本発明の併用医薬及び関連方法の一部としてＣＤ４０Ｌを含めると、本発明によって実現される、腫瘍体積の縮小、無増悪生存期間の延長及び生存率の向上がさらに進む。したがって、各種実施形態では、本発明の医薬の併用はさらに、がん患者にＣＤ４０Ｌを投与することを含む。
【０１３３】
ＣＤ４０は、Ｂ細胞、マクロファージ及び樹状細胞を含む多くの種類の細胞上に構成的に発現するが、そのリガンドＣＤ４０Ｌは、活性化Ｔヘルパー細胞上に優勢に発現する。感染または免疫後の早い段階での、樹状細胞及びＴヘルパー細胞間の同族相互作用によって、樹状細胞がＣＴＬ応答をプライミングすることが「許可される」。樹状細胞への許可によって、共刺激分子のアップレギュレーション、生存率の向上及びクロスプレゼンテーション能の向上が生じる。このプロセスは主に、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの相互作用に媒介される。しかしながら、膜結合型から可溶型まで（単量体型から三量体型まで）、ＡＰＣの活性化、増殖及び分化を誘導または抑制する多様な刺激を誘導する、ＣＤ４０Ｌの様々な構成が説明されている。
【０１３４】
実施例１９の結果によって示されているように、本発明のＭＶＡによってコードされるＣＤ４０Ｌは、がん患者にとって、安全性が格段に向上した代替手段である。ＭＶＡによってコードされるＣＤ４０Ｌは、可溶性のＣＤ４０アゴニストと比べて、毒性が低減されているからである。
【０１３５】
１つ以上の好ましい実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、本発明のＭＶＡによってコードされる。さらに好ましい実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、配列番号１１をコードする核酸を含む。さらに好ましい実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、配列番号１２との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％である核酸を含む。最も好ましい実施形態では、ＣＤ４０Ｌは、配列番号１２を含む。
【０１３６】
例示的な抗体
各種実施形態では、本発明の併用医薬及び関連方法は、腫瘍細胞の細胞膜上に発現する抗原に特異的な抗体を含む。当該技術分野においては、多くのがんにおいて、１つ以上の抗原が、腫瘍細胞膜上に発現または過剰発現することが認識されている。例えば、Ｄｕｒｉｇ  ｅｔ  ａ．２００２、Ｍｏｃｅｌｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ａｒｔｅａｇａ  ２０１７、Ｆｉｎ  ２０１７、Ｇｉｎａｌｄｉ  ｅｔ  ａｌ，１９９８を参照されたい。抗原が腫瘍細胞上に発現または過剰発現しているか判断するためのアッセイは、特定の抗原に対する抗体を作製する方法とともに、当該技術分野において容易に認識される（同上）。
【０１３７】
より具体的な実施形態では、本発明の併用医薬及び関連方法は、抗体を含み、その抗体は、ａ）腫瘍の細胞膜上に発現する抗原に特異的であり、ｂ）Ｆｃドメインを含む。少なくとも１つの態様では、その抗体の特徴（例えばａ）及びｂ））によって、その抗体は、ＮＫ細胞、マクロファージ、好塩基球、好中球、好酸球、単球、肥満細胞及び／または樹状細胞のようなエフェクター細胞に結合して、そのエフェクター細胞と相互作用できるようになるとともに、その抗体は、腫瘍細胞上に発現する腫瘍抗原に結合できるようになる。好ましい実施形態では、その抗体は、Ｆｃドメインを含む。追加的な好ましい実施形態では、その抗体は、ＮＫ細胞と結合して相互作用できる。
【０１３８】
本開示によって企図されている腫瘍細胞上に発現する抗原に対するいくつかの例示的な抗体としては、抗ＣＤ２０（例えば、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ）、抗ＣＤ５２（例えばアレムツズマブであるＣａｍｐａｔｈ）、抗ＥＧＦＲ（例えば、セツキシマブであるＥｒｂｉｔｕｘ、パニツムマブ）、抗ＣＤ２（例えばシプリズマブ）、抗ＣＤ３７（例えばＢＩ８３６８２６）、抗ＣＤ１２３（例えばＪＮＪ−５６０２２４７３）、抗ＣＤ３０（例えばＸｍＡｂ２５１３）、抗ＣＤ３８（例えばダラツムマブであるＤａｒｚａｌｅｘ）、抗ＰＤＬ１（例えば、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ）、抗ＧＤ２（例えば、３Ｆ８、ｃｈ１４．１８、ＫＷ−２８７１、ジヌツキシマブ）、抗ＣＥＡ、抗ＭＵＣ１、抗ＦＬＴ３、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ４０、抗ＳＬＡＭＦ７、抗ＣＣＲ４、抗Ｂ７−Ｈ３、抗ＩＣＡＭ１、抗ＣＳＦ１Ｒ、抗ＣＡ１２５（例えばオレゴボマブ）、抗ＦＲα（例えば、ＭＯｖ１８−ＩｇＧ１、ミルベツキシマブソラブタンシン（ＩＭＧＮ８５３）、ＭＯＲＡｂ−２０２）、抗メソセリン（例えばＭＯＲＡｂ−００９）及び抗ＨＥＲ２（例えば、トラスツズマブ、Ｈｅｒｚｕｍａ、ＡＢＰ９８０及び／またはペルツズマブ）が挙げられるが、これらに限らない。
【０１３９】
より好ましい実施形態では、本発明の一部として含まれる抗体としては、患者に投与すると、腫瘍細胞上の対応する抗原に結合して、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する抗体が挙げられる。さらに好ましい実施形態では、その抗体としては、がんの治療用に承認されているか、または承認前である抗体が挙げられる。
【０１４０】
さらに好ましい実施形態では、本発明の抗体は、抗ＨＥＲ２抗体である。最も好ましい実施形態では、抗体は、ペルツズマブ、トラスツズマブ、Ｈｅｒｚｕｍａ、ＡＢＰ９８０及びアドトラスツズマブエムタンシンから選択する。
【０１４１】
追加的な実施形態では、本発明の抗体は、１つ以上の抗体及び／または抗体断片の融合体を含む。例示的な融合抗体及び／または抗体断片としては、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）及び三重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）が挙げられるが、これらに限らない。Ｔａｙ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）によって示されているように、ＢｉＫＥ及びＴｒｉＫＥは、ＮＫ細胞の抗腫瘍作用を効果的に駆動し、ＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣを可能にすることが知られている。Ｔａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）を参照されたい。１６１５３３ＴｒｉＫＥ及び／または１６３３ＢｉＫＥを本発明において抗体として使用できることが企図されている。加えて、本発明の抗体は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、すなわちＢｉＴＥとして実施できることが企図されている。例えば、Ｈｕｅｈｌｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１５  Ｍａｒｃｈ，９３：２９０−２９６を参照されたい。
【０１４２】
組み換えポックスウイルス
本発明の１つ以上の態様では、本開示のヌクレオチド配列及びタンパク質配列を組み換えポックスウイルスに含めることができる。
【０１４３】
本開示の各種実施形態では、その組み換えポックスウイルスは好ましくは、ワクシニアウイルス、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルス、ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮの誘導体のような（ただし、これらに限らない）オルトポックスウイルスである。
【０１４４】
ワクシニアウイルス株の例は、天壇株、コペンハーゲン株、パリ株、ブダペスト株、大連株、Ｇａｍ株、ＭＲＩＶＰ株、Ｐｅｒ株、タシケント株、ＴＢＫ株、Ｔｏｍ株、ベルン株、パトワダナガー株、ＢＩＥＭ株、Ｂ−１５株、リスター株、ＥＭ−６３株、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｃｉｔｙ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ株、エルストリー株、イケダ株及びＷＲ株である。好ましいワクシニアウイルス（ＶＶ）株は、Ｗｙｅｔｈ（ＤＲＹＶＡＸ）株（米国特許第７，４１０，６４４号）である。
【０１４５】
組み換えＭＶＡ
本発明の好ましい実施形態では、本明細書に開示されている１つ以上のタンパク質及びヌクレオチドが、組み換えＭＶＡに含まれている。本開示によって説明及び例示されているように、本開示の組み換えＭＶＡの静脈内投与によって、各種態様で、がん患者において免疫応答の増強が誘導される。したがって、１つ以上の好ましい実施形態では、本発明は、本明細書に記載されているＨＥＲ２、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及び／またはＣＤ４０Ｌをコードする１つ以上の核酸を含む組み換えＭＶＡを含む。より好ましい実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、本明細書に記載されている合成ＨＥＲ２及び合成Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗原をコードする１つ以上の核酸を含む。別のより好ましい実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、本明細書に記載されている合成ＨＥＲ２及び合成Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ抗原、ならびにＣＤ４０Ｌをコードする１つ以上の核酸を含む。さらに別のより好ましい実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、配列番号１または配列番号１３（Ｈｅｒ２）、及び配列番号３（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）をコードする１つ以上の核酸を含む。さらに別の好ましい実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、配列番号１または配列番号１３、配列番号３及びＣＤ４０Ｌをコードする１つ以上の核酸を含む。より好ましい実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、配列番号１、配列番号３、配列番号１１及び／または配列番号１３をコードする１つ以上の核酸を含む。最も好ましい実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、配列番号１３、配列番号３及び配列番号１１をコードする１つ以上の核酸を含む。
【０１４６】
追加的な実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、配列番号２、配列番号４及び／または配列番号１４からなる群から選択した１つ以上の核酸を含む。別のより好ましい実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、配列番号２、配列番号４及びＣＤ４０Ｌからなる群から選択した１つ以上の核酸を含む。さらに別の好ましい実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、配列番号２、配列番号４及び配列番号１２からなる群から選択した１つ以上の核酸を含む。より好ましい実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、配列番号２、配列番号４及び配列番号１２を含む。最も好ましい実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、配列番号１４、配列番号４及び配列番号１２を含む。
【０１４７】
本発明の実施の際に有用であるとともに、ブダペスト条約の要件に従って寄託されたＭＶＡウイルス株の例は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ），Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ＳＰ４  ０ＪＧ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍに、寄託番号ＥＣＡＣＣ９４０１２７０７で、１９９４年１月２７日に寄託されたＭＶＡ５７２株、及びＥＣＡＣＣ００１２０７０７で、２０００年１２月７日に寄託されたＭＶＡ５７５株であり、２０００年８月３０日に、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に、Ｖ０００８３００８の番号で寄託されたＭＶＡ−ＢＮ及びその誘導体が、追加の例示的な株である。
【０１４８】
ＭＶＡ−ＢＮの「誘導体」とは、本明細書に記載されているような、ＭＶＡ−ＢＮと本質的に同じ複製特性を示すが、そのゲノムの１つ以上の部分が異なるウイルスを指す。ＭＶＡ−ＢＮ及びその誘導体は、複製能力がなく、すなわち、インビボ及びインビトロにおいて、増殖的に複製できないことを意味する。より具体的には、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体は、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）では増殖的に複製できるが、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａｔ（Ｂｏｕｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ（１９８８），Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０６：７６１−７７１）、ヒト骨肉腫細胞株１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ受託番号９１１１２５０２）、ヒト胚腎臓細胞株２９３（ＥＣＡＣＣ受託番号８５１２０６０２）及びヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−２）では増殖的に複製できないものとして説明されている。加えて、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体は、Ｈｅｌａ細胞及びＨａＣａＴ細胞株におけるウイルス増殖倍率が、ＭＶＡ−５７５の少なくとも２分の１、より好ましくは３分の１である。ＭＶＡ−ＢＮ及びその誘導体のこれらの特性に関する試験及びアッセイは、ＷＯ０２／４２４８０（米国特許出願公開第２００３／０２０６９２６号）及びＷＯ０３／０４８１８４（米国特許出願公開第２００６／０１５９６９９号）に記載されている。
【０１４９】
上の段落に記載されているように、ヒト細胞株において、インビトロで「増殖的に複製できない」または「増殖的複製能がない」という用語は、例えばＷＯ０２／４２４８０に説明されており、その特許には、上述のような所望の特性を有するＭＶＡを得る方法も教示されている。この用語は、ＷＯ０２／４２４８０または米国特許第６，７６１，８９３号に記載されているアッセイを用いると、ウイルス増殖倍率が、インビトロにおいて、感染の４日後に、１未満であるウイルスに適用される。
【０１５０】
「増殖的に複製できない」という用語は、ウイルス増殖倍率が、上の段落に記載されているように、ヒト細胞株において、インビトロで、感染の４日後に、１未満であるウイルスを指す。ウイルス増殖倍率を求めるには、ＷＯ０２／４２４８０または米国特許第６，７６１，８９３号に記載されているアッセイが適用可能である。
【０１５１】
上の段落に記載されているような、ヒト細胞株におけるインビトロでのウイルスの増幅または複製は通常、最初に細胞を感染させる目的で元々使用した量（投入量）に対する、感染細胞から産生されるウイルス（産生量）の比率（「増殖倍率」という）として表される。増殖倍率「１」は、感染細胞から産生されるウイルスの量が、細胞を感染させる目的で最初に使用した量と同じである増幅状態を定めるものであり、感染細胞が、ウイルスの感染及び複製に対する許容性を有することを意味する。これに対して、増殖倍率が１未満、すなわち、投入レベルよりも産生量が少ないことは、増殖的複製が見られず、すなわち、ウイルスが減弱していることを示す。
【０１５２】
別の実施形態では、本発明の合成ヌクレオチド及びタンパク質を含む組み換えポックスウイルスは、ニワトリポックスウイルス（ただし、これに限らない）のようなアビポックスウイルスで実施できる。
【０１５３】
「アビポックスウイルス」という用語は、ニワトリポックスウイルス、カナリアポックスウイルス、ユキヒメドリポックスウイルス、キュウカンチョウポックスウイルス、ハトポックスウイルス、オウムポックスウイルス、ウズラポックスウイルス、クジャクポックスウイルス、ペンギンポックスウイルス、スズメポックスウイルス、ムクドリポックスウイルス及びシチメンチョウポックスウイルスのようないずれかのアビポックスウイルスを指す。好ましいアビポックスウイルスは、カナリアポックスウイルス及びニワトリポックスウイルスである。
【０１５４】
カナリアポックスウイルスの例は、Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ株である。ＡＬＶＡＣというプラーク純化カナリアポックス株（米国特許第５，７６６，５９８号）が、ブダペスト条約の条件下で、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託された（受託番号ＶＲ−２５４７）。別のカナリアポックス株は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｅｒｉｅｕｘ，Ｉｎｃ．から入手可能なＬＦ２  ＣＥＰ  ５２４  ２４  １０  ７５という市販のカナリアポックスワクチン株である。
【０１５５】
ニワトリポックスウイルスの例は、ＦＰ−１株、ＦＰ−５株、ＴＲＯＶＡＣ株（米国特許第５，７６６，５９８号）、ＰＯＸＶＡＣ−ＴＣ株（米国特許第７，４１０，６４４号）、ＴＢＣ−ＦＰＶ株（Ｔｈｅｒｉｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ−ＦＰＶ）であり、ＦＰ−１は、１日齢のニワトリでワクチンとして使用するために改変されたＤｕｖｅｔｔｅ株である。その株は、ＯＤＣＥＰ２５／ＣＥＰ６７／２３０９  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９８０という市販のニワトリポックスウイルスワクチン株であり、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｅｒｉｅｕｘ，Ｉｎｃから入手可能である。ＦＰ−５は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．の部門）Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ（獣医師免許番号１６５、シリアル番号３０３２１）から入手可能な、ニワトリ胚由来の市販のニワトリポックスウイルスワクチン株である。
【０１５６】
発現カセット／制御配列
各種態様では、本明細書に記載されている１つ以上の核酸は、その１つ以上の核酸が、発現制御配列に機能的に連結されている１つ以上の発現カセットで実現させる。「機能的に連結された」とは、記載されている成分が、意図されている形で機能できる（例えば、プロモーターによって、発現させる核酸を転写可能になる）関係にあることを意味する。コード配列に機能的に連結された発現制御配列は、その発現制御配列と適合する条件下で、コード配列の発現が行われるようにつながっている。発現制御配列としては、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの最初にある開始コドン、イントロンのスプライシングシグナル及びフレーム内終止コドンが挙げられるが、これらに限らない。好適なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、レトロウイルスＬＴＲ、アデノウイルス主要後期プロモーター、ヒトＣＭＶ前初期Ｉプロモーター及び各種のポックスウイルスプロモーター（３０Ｋプロモーター、Ｉ３プロモーター、ＰｒＳプロモーター、ＰｒＳ５Ｅプロモーター、Ｐｒ７．５Ｋ、ＰｒＨｙｂプロモーター、Ｐｒ１３．５ロングプロモーター、４０Ｋプロモーター、ＭＶＡ−４０Ｋプロモーター、ＦＰＶ  ４０Ｋプロモーター、３０ｋプロモーター、ＰｒＳｙｎＩＩｍプロモーター、ＰｒＬＥ１プロモーター及びＰＲ１２３８プロモーターといったワクシニアウイルスまたはＭＶＡ由来及びＦＰＶ由来プロモーターが挙げられるがこれらに限らない）が挙げられるが、これらに限らない。追加のプロモーターはさらに、ＷＯ２０１０／０６０６３２、ＷＯ２０１０／１０２８２２、ＷＯ２０１３／１８９６１１、ＷＯ２０１４／０６３８３２及びＷＯ２０１７／０２１７７６に記載されており、これらの特許は、参照により、すべてが本明細書に援用される。
【０１５７】
追加の発現制御配列としては、リーダー配列、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、ならびに所望の宿主系において、所望の組み換えタンパク質（例えば、ＨＥＲ２、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及び／またはＣＤ４０Ｌ）をコードする核酸配列の適切な転写及びそれに続く翻訳に必要ないずれかの他の配列が挙げられるが、これらに限らない。本発明のポックスウイルスベクターは、所望の宿主系において、核酸配列を含む発現ベクターの移転及びそれに続く複製に必要な追加の要素も含んでよい。当業者はさらに、従来の方法を使用すれば、このようなベクターが容易に構築されるとともに（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）ｉｎ“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．）、市販されていることを認識するであろう。
【０１５８】
特定の実施形態では、本開示の１つ以上の組み換えＭＶＡは、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αもしくはＩＦＮ−γのような１つ以上のサイトカイン、ＧＭ−ＣＳＦもしくはＧ−ＣＳＦのような１つ以上の増殖因子、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、Ｂ７−１、Ｂ７−２もしくはその他のＢ７関連分子のような１つ以上の共刺激分子、ＣＤ７０、ＯＸ−４０Ｌもしくは４−１ＢＢＬのような１つ以上の分子、またはこれらの分子を含み合わせたものを生物学的アジュバントとして使用できる（例えば、Ｓａｌｇａｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６８（２）：１２２−３８、Ｌｏｔｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｓｃｉ．Ａｍ．６（Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ６１−６、Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １６（Ｓｕｐｐｌ  １）：２５１−６０、Ｋｕｉｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４６５：３８１−９０）。これらの分子は、宿主に全身（または局所）投与できる。いくつかの例では、ＩＬ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ７０、ＯＸ−４０Ｌ、４−１ＢＢＬ及びＩＣＡＭ−１を投与する。
【０１５９】
本発明の併用医薬を投与するための方法及び投与レジメン
さらなる態様では、本開示は、本発明の併用医薬を投与するための１つ以上のレジメン及び／または方法を提供する。少なくとも１つの態様では、本発明のレジメンは、本発明の併用医薬及び／または療法の有効性を増大させて、腫瘍体積を縮小させ、がん患者の生存率を向上させる。
【０１６０】
したがって、一実施形態では、がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を向上させる併用医薬及び／または方法であって、そのがん患者に、本開示の併用医薬を投与することを含み、本発明の組み換えＭＶＡを抗体の投与と同時に、または抗体の投与後に投与する併用医薬及び／または方法が存在する。
【０１６１】
ある１つの具体的な例示的実施形態では、がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を向上させる併用医薬及び／または方法であって、ａ）そのがん患者に抗体を投与することであって、その抗体が、Ｆｃドメインを含むとともに、腫瘍細胞の細胞膜上に発現する抗原に特異的であること、ならびにｂ）第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸を含む組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）であって、静脈内投与すると、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答の増強及び細胞傷害性Ｔ細胞応答の増強の両方を誘導する組み換えＭＶＡをそのがん患者に静脈内投与することを含み、ｂ）をａ）と同時に、またはａ）の後に行う併用医薬及び／または方法が存在する。
【０１６２】
いくつかの具体的な実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、抗体と同時に投与できる。別の具体的な実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、抗体の投与後、または抗体の投与に続いて投与する。各種実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、抗体から１〜６日後以内に投与する。より好ましい実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、抗体の投与から０〜５日、０〜４日、０〜３日または０〜２日後以内に投与する。最も好ましい実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、抗体を投与してから０〜３日後に投与する。
【０１６３】
各種の追加的な実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、抗体から１〜６日後以内に投与する。より好ましい実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、抗体の投与から１〜５日、１〜４日、１〜３日または１〜２日後以内に投与する。最も好ましい実施形態では、本発明の組み換えＭＶＡは、抗体を投与してから１〜３日後に投与する。
【０１６４】
本発明の有益な一態様では、抗体と同時に、または抗体の後に、組み換えＭＶＡを投与することによって、組み換えＭＶＡの投与に起因して、ＮＫ細胞応答が増強されるのと同時に、または増強される前に、投与した抗体が腫瘍細胞に結合可能になる。したがって、例示的な第１の工程では、抗体を投与し、その結果、１つ以上の腫瘍細胞の表面上の抗原に、抗体が結合する。例示的な第２の工程では、組み換えＭＶＡを静脈内投与し、それによって、本明細書に記載されているように、対象の自然免疫応答（例えばＮＫ細胞応答）及びＴ細胞応答の両方を増強及び／または増大させる。自然免疫応答の増強によって、抗体が結合している腫瘍細胞を攻撃的に標的として殺傷する。
【０１６５】
別の有益な態様では、本発明のレジメンは、対象の自然免疫応答及び適応免疫応答の両方によって、腫瘍を効果的に攻撃するように設計されている。例示的な一態様では、本発明の併用医薬は、抗体の投与と同時に、または抗体の投与後に組み換えＭＶＡを静脈内投与するように設計されており、その組み換えＭＶＡは、抗体が結合しているそれらの腫瘍細胞を攻撃して殺傷するＮＫ応答及び自然免疫応答の増強を誘導する。自然免疫応答が、抗体で被覆された腫瘍細胞を殺傷している期間中、本発明の組み換えＭＶＡは、患者において、特異的Ｔ細胞応答（ＣＤ８  Ｔ細胞及びＣＤ４  Ｔ細胞の両方を含む）も誘導している。開示されているレジメンは、自然免疫応答、例えば、ＮＫ細胞が天然において低下している場合に、特異的ＣＤ８／ＣＤ４  Ｔ細胞応答の増強によって、腫瘍細胞が殺傷されるように設計されている。設計されたそのレジメンは特に有益である。特異的ＣＤ８／ＣＤ４  Ｔ細胞応答の増強によって、患者の自然免疫応答及び／または非特異的な免疫応答を回避した可能性のある腫瘍細胞を殺傷できるからである。
【０１６６】
別の態様では、本発明の併用医薬は、同種及び／または異種のプライムブーストレジメンの一部として投与する。図８〜１３に例示されているように、同種及び／または異種のプライムブーストレジメンは、ＮＫ細胞応答の増強を延長して再活性化するとともに、対象の特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答及びＣＤ４  Ｔ細胞応答を増大させる。したがって、１つ以上の実施形態において、がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を向上させる併用医薬及び／または方法であって、そのがん患者に、本開示の併用医薬を投与することを含み、その併用医薬を同種または異種のプライムブーストレジメンの一部として投与する併用医薬及び／または方法が存在する。プライムブーストレジメンのより好ましい態様では、抗体の投与と同時に、または抗体の投与後に、本発明の組み換えＭＶＡを静脈内投与する。
【０１６７】
導入遺伝子を含む組み換えＭＶＡウイルスの作製
本発明で提供する組み換えＭＶＡウイルスは、当該技術分野において知られている常法によって作製できる。組み換えポックスウイルスを得るか、または外来コード配列をポックスウイルスゲノムに挿入する方法は、当業者に周知である。例えば、ＤＮＡのクローニング、ＤＮＡ及びＲＮＡの単離、ウェスタンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ、ならびにＰＣＲ増幅技法のような標準的な分子生物学的技法の方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄ．）［Ｊ．Ｓａｍｂ  ｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）］に記載されており、ウイルスの取り扱い及び操作を行う技法は、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ［Ｂ．Ｗ．Ｊ．Ｍａｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）］に記載されている。同様に、ＭＶＡの取り扱い、操作及び遺伝子操作を行う技法及びノウハウは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ［Ａ．Ｊ．Ｄａｖｉｓｏｎ  ＆  Ｒ．Ｍ．Ｅｌｌｉｏｔｔ（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ（１９９３）（例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ  ９：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓを参照）］及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．（１９９８）（例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ  １６，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＩＶ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒを参照）］に記載されている。
【０１６８】
本明細書に開示されている各種の組み換えＭＶＡウイルスの作製には、異なる方法を適用可能であり得る。ウイルスに挿入するＤＮＡ配列は、ポックスウイルスのＤＮＡの一部と相同であるＤＮＡが挿入されているＥ．ｃｏｌｉプラスミドコンストラクトに入れることができる。別個に、挿入するＤＮＡ配列は、プロモーターにライゲーションできる。そのプロモーターと遺伝子の連結体は、プラスミドコンストラクトにおいて、非必須遺伝子座を含むポックスウイルスＤＮＡ領域に隣接するＤＮＡ配列と相同なＤＮＡによって両側が挟まれるように配置できる。得られたプラスミドコンストラクトは、細菌のＥ．ｃｏｌｉ内で増殖させることによって増幅して、単離することができる。挿入するＤＮＡ遺伝子配列を含む単離プラスミドは、例えばニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦｓ）の細胞培養物にトランスフェクションでき、同時に、その培養物をＭＶＡウイルスに感染させる。プラスミド及びウイルスゲノムにおける相同なＭＶＡウイルスＤＮＡ間での組み換えによって、外来のＤＮＡ配列の存在によって改変されたポックスウイルスを作製できる。
【０１６９】
好ましい実施形態によれば、好適な細胞培養物の細胞、例えばＣＥＦ細胞をＭＶＡウイルスに感染させることができる。続いて、その感染細胞に、好ましくはポックスウイルス発現調節エレメントの転写調節下で、１つまたは複数の外来または異種の遺伝子（本開示に示されている核酸のうちの１つ以上など）を含む第１のプラスミドベクターをトランスフェクションできる。上で説明したように、そのプラスミドベクターは、ＭＶＡウイルスゲノムの所定部分への外来配列の挿入を誘導できる配列も含む。任意に、そのプラスミドベクターは、ポックスウイルスプロモーターに機能的に連結されたマーカー及び／または選択遺伝子を含むカセットも含む。好適なマーカーまたは選択遺伝子は、例えば、緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシン−ホスホリボシルトランスフェラーゼまたはその他のマーカーをコードする遺伝子である。選択またはマーカーカセットの使用によって、作製された組み換えポックスウイルスの同定及び単離が簡素化される。しかしながら、組み換えポックスウイルスは、ＰＣＲ技法によっても同定できる。続いて、さらなる細胞を、上記のようにして得られた組み換えポックスウイルスに感染させて、その細胞に、１つまたは複数の第２の外来または異種の遺伝子を含む第２のベクターをトランスフェクションできる。念のため、この遺伝子は、ポックスウイルスゲノムの異なる挿入部位に導入するものとし、第２のベクターは、ポックスウイルスのゲノムへの１つまたは複数の第２の外来遺伝子の導入を誘導するポックスウイルス相同配列も異なる。相同組み換えが行われた後、２つ以上の外来または異種の遺伝子を含む組み換えウイルスを単離することができる。追加の外来遺伝子を組み換えウイルスに導入するために、前の感染工程で単離した組み換えウイルスを用いるとともに、トランスフェクション用の１つまたは複数のさらなる外来遺伝子を含むさらなるベクターを用いることによって、感染及びトランスフェクションの工程を繰り返すことができる。
【０１７０】
あるいは、上記のような感染及びトランスフェクションの工程は、置き換え可能であり、すなわち、最初に、外来遺伝子を含むプラスミドベクターによって、好適な細胞にトランスフェクションを行ってから、その細胞をポックスウイルスに感染させることができる。さらなる代替策では、各外来遺伝子を異なるウイルスに導入して、細胞を、得られたすべての組み換えウイルスに共感染させて、すべての外来遺伝子を含む組み換え体に関してスクリーニングすることも可能である。第３の代替策は、ＤＮＡゲノムと外来配列をインビトロでライゲーションして、ヘルパーウイルスを用いて、組み換えワクシニアウイルスのＤＮＡゲノムを再構成することである。第４の代替策は、Ｅ．ｃｏｌｉまたは別の細菌種において、細菌人工染色体（ＢＡＣ）としてクローニングしたＭＶＡウイルスゲノムと、ＭＶＡウイルスゲノムにおける所望の導入部位と隣接する配列と相同なＤＮＡ配列と隣接する直線状の外来配列との間で相同組み換えを行うことである。
【０１７１】
本開示の１つ以上の核酸は、ＭＶＡウイルスまたはＭＶＡウイルスベクターのいずれかの好適な部分に挿入し得る。ＭＶＡウイルスの好適な部分は、ＭＶＡゲノムの非必須部分である。ＭＶＡゲノムの非必須部分は、ＭＶＡゲノムの遺伝子間領域または既知の欠失部位１〜６であってよい。この代わりに、またはこれに加えて、組み換えＭＶＡの非必須部分は、ＭＶＡゲノムのコード領域のうち、ウイルスの増殖には必須ではないコード領域であることができる。しかしながら、挿入部位は、ＭＶＡゲノムにおけるこれらの好ましい挿入部位に制限されない。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ細胞）のような少なくとも１つの細胞培養系において増幅及び増殖できる組み換え体を得ることが可能である限りは、本発明の核酸（例えば、ＨＥＲ２、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及びＣＤ４０Ｌ）、ならびに本明細書に記載されているようないずれかの付随のプロモーターをウイルスゲノムのいずれかの位置に挿入し得ることは、本発明の範囲内であるからである。
【０１７２】
好ましくは、本発明の核酸は、ＭＶＡウイルスの１つ以上の遺伝子間領域（ＩＧＲ）に挿入し得る。「遺伝子間領域」という用語は好ましくは、ＭＶＡウイルスゲノムの２つの隣接するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の間、好ましくは、ＭＶＡウイルスゲノムの２つの必須ＯＲＦの間に位置するウイルスゲノム部分を指す。ＭＶＡにおいては、特定の実施形態では、ＩＧＲは、ＩＧＲ０７／０８、ＩＧＲ４４／４５、ＩＧＲ６４／６５、ＩＧＲ８８／８９、ＩＧＲ１３６／１３７及びＩＧＲ１４８／１４９から選択する。
【０１７３】
ＭＶＡウイルスでは、ヌクレオチド配列は、上記に加えてまたは上記の代わりに、ＭＶＡゲノムの既知の欠失部位、すなわち欠失部位Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩのうちの１つ以上に挿入し得る。「既知の欠失部位」という用語は、例えばＭｅｉｓｉｎｇｅｒ−Ｈｅｎｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８８：３２４９−３２５９に記載されているように、ＣＥＦ細胞での連続継代を通じて欠失されたＭＶＡゲノム部分であって、本発明のＭＶＡの由来元である親ウイルス、特には、親漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラ（ＣＶＡ）のゲノムを基準に、５１６継代目に特徴付けられた部分を指す。
【０１７４】
ワクチン
特定の実施形態では、本開示の組み換えＭＶＡは、ワクチンの一部として調合できる。ワクチンの調製の際に、そのＭＶＡウイルスは、生理学的に許容可能な形態に変換できる。特定の実施形態では、このような調製法は、例えばＳｔｉｃｋｌ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｔｓｃｈ．ｍｅｄ．Ｗｓｃｈｒ．９９，２３８６−２３９２（１９７４）に記載されているように、天然痘に対するワクチン接種で用いるポックスウイルスワクチンを調製した際の経験に基づいている。
【０１７５】
例示的な調製法は、以下のとおりである。５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価で、１０ｍＭのトリス、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中で調合した精製ウイルスを−８０℃で保存する。ワクチン注射剤の調製の際に、例えば、１×１０８〜１×１０９個の粒子のウイルスをアンプル、好ましくはガラスアンプル内で、２％ペプトン及び１％ヒトアルブミンの存在下で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で凍結乾燥できる。あるいは、ワクチン注射剤は、調合物中でウイルスを段階凍結乾燥することによって調製できる。特定の実施形態では、その調合物は、インビボ投与に適するマンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトース、ポリビニルピロリドンのような追加の添加剤、または抗酸化剤、不活性ガスもしくは安定剤のような（ただしこれらに限らない）他の添加剤、あるいは組み換えタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）を含む。続いて、そのアンプルを密閉し、好適な温度、例えば４℃〜室温で、数カ月間保存できる。しかしながら、必要がない限りは、アンプルは、好ましくは−２０℃未満、好ましくは約−８０℃の温度で保存する。
【０１７６】
ワクチン接種または療法を伴う各種実施形態では、その凍結乾燥体を０．１〜０．５ｍｌの水性溶液、好ましくは、生理食塩水、または１０ｍＭのトリス、１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．７）のようなトリス緩衝液に溶解する。本開示の組み換えＭＶＡ、ワクチンまたは医薬組成物を１０４〜１０１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０５〜５×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ、１０６〜１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌまたは１０７〜１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの濃度範囲で、溶液に調合できることが企図されている。ヒトに対する好ましい用量は、１０６〜１０１０ＴＣＩＤ５０を含み、１０６ＴＣＩＤ５０、１０７ＴＣＩＤ５０、１０８ＴＣＩＤ５０、５×１０８ＴＣＩＤ５０、１０９ＴＣＩＤ５０、５×１０９ＴＣＩＤ５０または１０１０ＴＣＩＤ５０の用量を含む。用量及び投与数の最適化は、当業者の技術及び知識の範囲内である。
【０１７７】
１つ以上の好ましい実施形態では、本明細書に定められているように、本発明の組み換えＭＶＡは、がん患者に静脈内投与する。
【０１７８】
追加的な実施形態では、本発明の抗体は、全身投与または局所投与、すなわち、腹腔内投与、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、皮内または熟練施術者に知られているいずれかの他の投与経路による投与を行うことができる。
【０１７９】
キット、組成物及び使用方法
各種実施形態では、本発明は、ａ）本明細書に記載されている核酸を含む組み換えＭＶＡ、及びｂ）本明細書に記載されている１つ以上の抗体を含むキット、併用医薬、医薬組成物及び／または免疫原性組成物を含む。
【０１８０】
そのキット及び／または組成物は、本開示の組み換えポックスウイルスの入った１つまたは複数の容器またはバイアル、本開示の抗体の入った１つ以上の容器またはバイアルとともに、その組み換えＭＶＡ及び抗体の投与に関する説明を含み得ることが企図されている。より特定的な実施形態では、そのキットは、その組み換えＭＶＡ及び抗体を最初にプライミング投与してから、その後に、組み換えＭＶＡ及び抗体を１回以上ブースト投与することに関する説明を含み得ることが企図されている。
【０１８１】
本発明で提供するキット及び／または組成物は概ね、製薬学的許容可能であり及び／または承認された１つ以上の担体、添加剤、抗生物質、保存剤、アジュバント、希釈剤及び／または安定剤を含んでよい。このような補助物質は、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝物質などであることができる。好適な担体は典型的には、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質集合体などのように、ゆっくり代謝される大きな分子である。
【０１８２】
特定の例示的な実施形態
実施形態１は、がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を向上させる方法であって、ａ）第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸を含む組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）であって、静脈内投与すると、第１の異種のがん関連抗原をコードする第１の核酸を含む組み換えＭＶＡの非静脈内投与によって誘導されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答及びＴ細胞応答と比べて、ＮＫ細胞応答の増強及び細胞傷害性Ｔ細胞応答の増強の両方を誘導するＭＶＡをそのがん患者に静脈内投与すること、ならびにｂ）そのがん患者に抗体を投与することであって、その抗体が、Ｆｃドメインを含むとともに、腫瘍細胞の細胞膜上に発現または過剰発現する抗原に特異的であることを含み、そのａ）及びｂ）をそのがん患者に行うと、単独でａ）を非静脈内投与で行うか、またはｂ）を行う場合と比べて、そのがん患者の腫瘍サイズが縮小し、及び／またはそのがん患者の生存率が上昇する方法である。
【０１８３】
実施形態２は、がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を向上させる方法であって、ａ）そのがん患者に抗体を投与することであって、その抗体が、Ｆｃドメインを含むとともに、腫瘍細胞の細胞膜上に発現する抗原に特異的であること、ならびにｂ）第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸を含む組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）であって、静脈内投与すると、第１の異種のがん関連抗原をコードする第１の核酸を含む組み換えＭＶＡの非静脈内投与によって誘導されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答及びＴ細胞応答と比べて、ＮＫ細胞応答の増強及び細胞傷害性Ｔ細胞応答の増強の両方を誘導するＭＶＡをそのがん患者に静脈内投与することを含み、そのａ）及びｂ）をがん患者に行うと、単独でａ）を非静脈内投与で行うか、またはｂ）を行う場合と比べて、そのがん患者の腫瘍サイズが縮小し、及び／またはそのがん患者の生存率が上昇する方法である。
【０１８４】
実施形態３は、がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を向上させる方法であって、ａ）そのがん患者に抗体を投与することであって、その抗体が、Ｆｃドメインを含むとともに、腫瘍細胞の細胞膜の外面上に発現する抗原に特異的であり、投与すると、そのがん患者においてＡＤＣＣを誘導すること、ならびにｂ）第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸を含む組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）であって、静脈内投与すると、第１の異種のがん関連抗原をコードする第１の核酸を含む組み換えＭＶＡの非静脈内投与によって誘導されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答及びＴ細胞応答と比べて、ＮＫ細胞応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方を誘導するＭＶＡをそのがん患者に静脈内投与することを含み、そのａ）及びｂ）をそのがん患者に行うと、単独でａ）を非静脈内投与で行うか、またはｂ）を行う場合と比べて、がん患者の腫瘍サイズが縮小し、及び／またはがん患者の生存率が上昇する方法である。
【０１８５】
実施形態４は、その抗体が、腫瘍細胞の細胞膜上に過剰発現する抗原に特異的である、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法である。
【０１８６】
実施形態５は、ＣＤ４０Ｌをそのがん患者に静脈内投与することをさらに含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法である。
【０１８７】
実施形態６は、そのＣＤ４０Ｌが、そのＭＶＡによってコードされる、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の方法である。
【０１８８】
実施形態７は、ＮＫ細胞応答の増強を誘導することが、ａ）ＡＤＣＣ応答の増強を誘導すること、及びｂ）ＮＫ細胞が、ＭＨＣ発現の低い腫瘍細胞を標的として殺傷するのを誘導することのうちの少なくとも１つを含む、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の方法である。
【０１８９】
実施形態８は、ＮＫ細胞応答の増強を誘導することが、ＡＤＣＣ応答の増強を誘導することを含む、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の方法である。
【０１９０】
実施形態９は、その組み換えＭＶＡを抗体と同時に、または抗体の後に投与する、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の方法である。
【０１９１】
実施形態１０は、その組み換えＭＶＡを抗体の後に投与する、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の方法である。
【０１９２】
実施形態１１は、そのＭＶＡが、第２の異種ＴＡＡをコードする第２の核酸をさらに含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の方法である。
【０１９３】
実施形態１２は、その第１及び／または第２のＴＡＡが、５−α−レダクターゼ、α−フェトプロテイン（「ＡＦＰ」）、ＡＭ−１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、Ｂメラノーマ抗原遺伝子（「ＢＡＧＥ」）、β−カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＣＡ−１２５、カスパーゼ−８（「ＣＡＳＰ−８」、「ＦＬＩＣＥ」としても知られている）、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１／補体受容体２（「ＣＲ２」）、ＣＤ２２／ＢＬ−ＣＡＭ、ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ３５／補体受容体１（「ＣＲ１」）、ＣＤ４４／ＰＧＰ−１、ＣＤ４５／白血球共通抗原（「ＬＣＡ」）、ＣＤ４６／メンブレンコファクタープロテイン（「ＭＣＰ」）、ＣＤ５２／ＣＡＭＰＡＴＨ−１、ＣＤ５５／崩壊促進因子（「ＤＡＦ」）、ＣＤ５９／プロテクチン、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ｃ−ｍｙｃ、シクロオキシゲナーゼ−２（「ｃｏｘ−２」）、大腸癌欠失遺伝子（「ＤＣＣ」）、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、線維芽細胞増殖因子−８ａ（「ＦＧＦ８ａ」）、線維芽細胞増殖因子−８ｂ（「ＦＧＦ８ｂ」）、ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、葉酸受容体、Ｇ２５０、Ｇメラノーマ抗原遺伝子ファミリー（「ＧＡＧＥファミリー」）、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ガングリオシド２（「ＧＤ２」）／ガングリオシド３（「ＧＤ３」）／ガングリオシド−モノシアル酸−２（「ＧＭ２」）、ゴナドトロピン放出ホルモン（「ＧｎＲＨ」）、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：Ｒ１Ｍａｎ（α１−６）Ｒ２［ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ（α１−６）］β１，６−Ｎ-−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（「ＧｎＴ  Ｖ」）、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ｇｐ−１００−ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／チロシン関連タンパク質−１（「ｇｐ７５／ＴＲＰ−１」）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（「ｈＣＧ」）、ヘパラナーゼ、ＨＥＲ２、ヒト乳癌ウイルス（「ＨＭＴＶ」）、７０キロダルトンの熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ７０」）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（「ｈＴＥＲＴ」）、インスリン様増殖因子受容体−１（「ＩＧＦＲ−１」）、インターロイキン−１３受容体（「ＩＬ−１３Ｒ」）、誘導型一酸化窒素合成酵素（「ｉＮＯＳ」）、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ−ＦＵＴ、メラノーマ抗原コード遺伝子１（「ＭＡＧＥ−１」）、メラノーマ抗原コード遺伝子２（「ＭＡＧＥ−２」）、メラノーマ抗原コード遺伝子３（「ＭＡＧＥ−３」）、メラノーマ抗原コード遺伝子４（「ＭＡＧＥ−４」）、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、Ｍｅｌａｎ−Ａ／Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原−１（「ＭＡＲＴ−１」）、メソセリン、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＭＴ−ＭＭＰ、ムチン、精巣特異的抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ−１、血小板由来増殖因子（「ＰＤＧＦ」）、μＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロゲニポイエチン、前立腺特異的抗原（「ＰＳＡ」）、前立腺特異的膜抗原（「ＰＳＭＡ」）、ＲＡＧＥ−１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ−１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ−７２、トランスフォーミング増殖因子−α（「ＴＧＦ−α」）、トランスフォーミング増殖因子−β（「ＴＧＦ−β」）、チモシン−β−１５、腫瘍壊死因子−α（「ＴＮＦ−α」）、ＴＰ１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）からなる群から選択される、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の方法である。
【０１９４】
実施形態１３は、その抗体が、がん患者の治療用に承認されている抗体である、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の方法である。
【０１９５】
実施形態１４は、その抗体が、抗ＣＤ２０（例えば、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ）、抗ＣＤ５２（例えばアレムツズマブであるＣａｍｐａｔｈ）、抗ＥＧＦＲ（例えば、セツキシマブであるＥｒｂｉｔｕｘ、パニツムマブ）、抗ＣＤ２（例えばシプリズマブ）、抗ＣＤ３７（例えばＢＩ８３６８２６）、抗ＣＤ１２３（例えばＪＮＪ−５６０２２４７３）、抗ＣＤ３０（例えばＸｍＡｂ２５１３）、抗ＣＤ３８（例えばダラツムマブであるＤａｒｚａｌｅｘ）、抗ＰＤＬ１（例えば、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ）、ＣＴＬＡ−４（例えばイピリムマブ）、抗ＧＤ２（例えば、３Ｆ８、ｃｈ１４．１８、ＫＷ−２８７１、ジヌツキシマブ）、抗ＣＥＡ、抗ＭＵＣ１、抗ＦＬＴ３、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ４０、抗ＳＬＡＭＦ７、抗ＣＣＲ４、抗Ｂ７−Ｈ３、抗ＩＣＡＭ１、抗ＣＳＦ１Ｒ、抗ＣＡ１２５（例えばオレゴボマブ）、抗ＦＲα（例えばＭＯｖ１８−ＩｇＧ１、ミルベツキシマブソラブタンシン（ＩＭＧＮ８５３）、ＭＯＲＡｂ−２０２）、抗メソセリン（例えばＭＯＲＡｂ−００９）及び抗ＨＥＲ２からなる群から選択される、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の方法である。
【０１９６】
実施形態１５は、その抗体が、ＨＥＲ２抗原に特異的である、実施形態１〜１４のいずれか１つに記載の方法である。
【０１９７】
実施形態１６は、その抗体が、ペルツズマブ、トラスツズマブ、Ｈｅｒｚｕｍａ、ＡＢＰ９８０及びアドトラスツズマブエムタンシンから選択される、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の方法である。
【０１９８】
実施形態１７は、その抗体がその第１及び／または第２のＴＡＡに結合するのを防ぐために、その第１及び／または第２のＴＡＡが改変されている、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の方法である。
【０１９９】
実施形態１８は、その第１のＴＡＡがＨＥＲ２である、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の方法である。
【０２００】
実施形態１９は、そのＨＥＲ２抗体がそのＨＥＲ２抗原に結合するのを防ぐために、そのＨＥＲ２の１つ以上のアミノ酸が変異している、実施形態１８に記載の方法である。
【０２０１】
実施形態２０は、そのＨＥＲ２ポリペプチド及び／または抗原の細胞外での二量化、チロシンキナーゼ活性及び／またはリン酸化を防ぐために、そのＨＥＲ２の１つ以上のアミノ酸が変異している、実施形態１８〜１９のいずれか１つに記載の方法である。
【０２０２】
実施形態２１は、ＨＥＲ２の膜近傍領域における３つのループの少なくとも１つに、１つ以上の変異が施されている、実施形態１８〜２０のいずれか１つに記載の方法である。
【０２０３】
実施形態２２は、ＨＥＲ２の膜近傍領域のその３つのループが、５７９〜５８３位のアミノ酸（ループ１）、５９２〜５９５位のアミノ酸（ループ２）及び６１５〜６２５位のアミノ酸（ループ３）から選択される、１８〜２１のいずれか１つに記載の方法である。
【０２０４】
実施形態２３は、そのＨＥＲ２抗原が、Ｈ２６７、Ｙ２７４、Ｓ３１０、Ｌ３１７、Ｈ３１８、Ｋ３３３、Ｅ５８０、Ｄ５８２、Ｐ５９４、Ｆ５９５、Ｋ６１５及びＱ６２４のアミノ酸のうちの少なくとも１つに、少なくとも１つの変異を含む、実施形態１８〜２２のいずれか１つに記載の方法である。
【０２０５】
実施形態２４は、そのＨＥＲ２抗原が、Ｅ５８０Ａ、Ｆ５９５Ａ、Ｋ６１５Ａ、Ｓ３１０Ａ、Ｈ３１８Ａ、Ｌ３１７Ａ、Ｄ２７７Ｒ、Ｅ２８０Ｋ、Ｋ５７３Ｍ及びＹ１０２３Ａからなる群から選択した少なくとも１つの変異を含む、実施形態１８〜２３のいずれか１つに記載の方法である。
【０２０６】
実施形態２５は、そのＨＥＲ２抗原が、１１３９〜１２４８位のアミノ酸に対する変異を少なくとも１つ含む、実施形態１８〜２４のいずれか１つに記載の方法である。
【０２０７】
実施形態２６は、そのＨＥＲ２抗原が、１１３９〜１２４８位のアミノ酸に、少なくとも１つの欠失を含む、実施形態１８〜２５のいずれか１つに記載の方法である。
【０２０８】
実施形態２７は、そのＨＥＲ２抗原が、１１３９〜１２４８位のアミノ酸の欠失を含む、実施形態１８〜２６のいずれか１つに記載の方法である。
【０２０９】
実施形態２８は、配列番号１との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％であるＨＥＲ２抗原をその第１の核酸がコードする、実施形態１８〜２７のいずれか１つに記載の方法である。
【０２１０】
実施形態２９は、その第１の核酸が、配列番号１を含むＨＥＲ２抗原をコードする、実施形態１８〜２８のいずれか１つに記載の方法である。
【０２１１】
実施形態３０は、その第１の核酸が、ＨＥＲ２抗原をコードし、その第１の核酸の配列番号２との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％である、実施形態１８〜２９のいずれか１つに記載の方法である。
【０２１２】
実施形態３１は、その第１の核酸が、配列番号２を含む、実施形態１８〜３０のいずれか１つに記載の方法である。
【０２１３】
実施形態３２は、そのＭＶＡが、その第１のＴＡＡとは異なる第２の異種ＴＡＡをコードする第２の核酸を含む、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載の方法である。
【０２１４】
実施形態３３は、その第２のＴＡＡがＢｒａｃｈｙｕｒｙである、実施形態３２に記載の方法である。
【０２１５】
実施形態３４は、そのＢｒａｃｈｙｕｒｙ抗原が、そのＢｒａｃｈｙｕｒｙ抗原の核局在化を防ぐ１つ以上の変異を含む、実施形態３３に記載の方法である。
【０２１６】
実施形態３５は、そのＢｒａｃｈｙｕｒｙ抗原が、核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメインに対する変異を１つ以上含む、実施形態３３〜３４のいずれか１つに記載の方法である。
【０２１７】
実施形態３６は、そのＢｒａｃｈｙｕｒｙ抗原のＮＬＳドメインが欠失している、実施形態３３〜３５のいずれか１つに記載の方法である。
【０２１８】
実施形態３７は、配列番号３との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％であるＢｒａｃｈｙｕｒｙ抗原をその第２の核酸が含む、実施形態３３〜３６のいずれか１つに記載の方法である。
【０２１９】
実施形態３８は、その第２の核酸が配列番号３を含む、実施形態３３〜３７のいずれか１つに記載の方法である。
【０２２０】
実施形態３９は、その第２の核酸がＢｒａｃｈｙｕｒｙ抗原をコードし、その第２の核酸の配列番号４との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％である、実施形態３３〜３８のいずれか１つに記載の方法である。
【０２２１】
実施形態４０は、その第２の核酸が配列番号４を含む、実施形態３３〜３９のいずれか１つに記載の方法である。
【０２２２】
実施形態４１は、その抗体が、抗ＣＤ２０（リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ）、抗ＣＤ５２（アレムツズマブであるＣａｍｐａｔｈ）、抗ＥＧＦＲ（セツキシマブであるＥｒｂｉｔｕｘ、パニツムマブ）、抗ＣＤ３８（ダラツムマブであるＤａｒｚａｌｅｘ）、抗ＰＤＬ１（アベルマブ）、抗ＣＴＬＡ４（イピリムマブ）、抗ＧＤ２（３Ｆ８、ｃｈ１４．１８、ＫＷ−２８７１、ジヌツキシマブ）、抗ＣＥＡ、抗ＭＵＣ１、抗ＦＬＴ３Ｌ、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ４０、抗ＳＬＡＭＦ７、抗ＣＣＲ４、抗Ｂ７−Ｈ３、抗ＩＣＡＭ１、抗ＣＳＦ１Ｒ及び抗ＨＥＲ２からなる群から選択される、実施形態１〜４０のいずれか１つに記載の方法である。
【０２２３】
実施形態４２は、その抗体が、ＨＥＲ２抗原に特異的である、実施形態１〜４１のいずれか１つに記載の方法である。
【０２２４】
実施形態４３は、その抗ＨＥＲ２抗体が、ペルツズマブ、トラスツズマブ及びアドトラスツズマブエムタンシンから選択される、実施形態４２に記載の方法である。
【０２２５】
実施形態４４は、その抗体及びそのＭＶＡを同種のプライムブーストレジメンとして投与する、実施形態１〜４３のいずれか１つに記載の方法である。
【０２２６】
実施形態４５は、そのＭＶＡが、ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮの誘導体である、実施形態１〜４４のいずれか１つに記載の方法である。
【０２２７】
実施形態４６は、そのがん患者が、乳癌、肺癌、頭頸部癌、甲状腺、メラノーマ、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌もしくは大腸癌からなる群から選択したがんを罹患しており、及び／またはそのがんと診断されている、実施形態１〜４５のいずれか１つに記載の方法である。
【０２２８】
実施形態４７は、がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を向上させるのに用いる併用医薬であって、ａ）第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸を含む組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）であって、静脈内投与すると、異種ＴＡＡをコードする核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非静脈内投与によって誘導されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答及びＴ細胞応答と比べて、ＮＫ細胞応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方を誘導するＭＶＡ、ならびにｂ）Ｆｃドメインを含むとともに、腫瘍細胞の細胞膜上に発現する抗原に特異的である抗体を含み、そのａ）及びｂ）をがん患者に投与すると、単独でａ）を非ＩＶ投与するか、またはｂ）を投与する場合と比べて、そのがん患者の腫瘍サイズが縮小し、及び／または生存率が上昇する併用医薬である。
【０２２９】
実施形態４８は、がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を向上させるのに用いる併用医薬であって、ａ）第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸を含む組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）であって、静脈内投与すると、異種ＴＡＡをコードする核酸を含む組み換えＭＶＡの非静脈内投与によって誘導されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答及びＴ細胞応答と比べて、ＮＫ細胞応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方を誘導するＭＶＡ、ならびにｂ）Ｆｃドメインを含むとともに、腫瘍細胞の細胞膜上に発現する抗原に特異的である抗体であって、その抗体を投与すると、その抗体が、そのヒトがん患者における腫瘍細胞上の抗原に結合して、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する抗体を含み、そのａ）及びｂ）をがん患者に投与すると、単独でａ）を非ＩＶ投与するか、またはｂ）を投与する場合と比べて、そのがん患者の腫瘍サイズが縮小し、及び／または生存率が上昇する併用医薬である。
【０２３０】
実施形態４９は、そのＣＤ４０Ｌが、その組み換えＭＶＡによってコードされる、実施形態４７〜４８のいずれか１つに記載の併用医薬である。
【０２３１】
実施形態５０は、その組み換えＭＶＡが、第２の異種ＴＡＡをコードする第２の核酸をさらに含む、実施形態４７〜４９のいずれか１つに記載の併用医薬である。
【０２３２】
実施形態５１は、その第１及び／または第２のＴＡＡが、５−α−レダクターゼ、α−フェトプロテイン（「ＡＦＰ」）、ＡＭ−１、ＡＰＣ、Ａｐｒｉｌ、Ｂメラノーマ抗原遺伝子（「ＢＡＧＥ」）、β−カテニン、Ｂｃｌ１２、ｂｃｒ−ａｂｌ、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＣＡ−１２５、カスパーゼ−８（「ＣＡＳＰ−８」、「ＦＬＩＣＥ」としても知られている）、カテプシン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１／補体受容体２（「ＣＲ２」）、ＣＤ２２／ＢＬ−ＣＡＭ、ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ、ＣＤ３３、ＣＤ３５／補体受容体１（「ＣＲ１」）、ＣＤ４４／ＰＧＰ−１、ＣＤ４５／白血球共通抗原（「ＬＣＡ」）、ＣＤ４６／メンブレンコファクタープロテイン（「ＭＣＰ」）、ＣＤ５２／ＣＡＭＰＡＴＨ−１、ＣＤ５５／崩壊促進因子（「ＤＡＦ」）、ＣＤ５９／プロテクチン、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、癌胎児性抗原（「ＣＥＡ」）、ｃ−ｍｙｃ、シクロオキシゲナーゼ−２（「ｃｏｘ−２」）、大腸癌欠失遺伝子（「ＤＣＣ」）、ＤｃＲ３、Ｅ６／Ｅ７、ＣＧＦＲ、ＥＭＢＰ、Ｄｎａ７８、ファルネシルトランスフェラーゼ、線維芽細胞増殖因子−８ａ（「ＦＧＦ８ａ」）、線維芽細胞増殖因子−８ｂ（「ＦＧＦ８ｂ」）、ＦＬＫ−１／ＫＤＲ、葉酸受容体、Ｇ２５０、Ｇメラノーマ抗原遺伝子ファミリー（「ＧＡＧＥファミリー」）、ガストリン１７、ガストリン放出ホルモン、ガングリオシド２（「ＧＤ２」）／ガングリオシド３（「ＧＤ３」）／ガングリオシド−モノシアル酸−２（「ＧＭ２」）、ゴナドトロピン放出ホルモン（「ＧｎＲＨ」）、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：Ｒ１Ｍａｎ（α１−６）Ｒ２［ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ（α１−６）］β１，６−Ｎ-−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（「ＧｎＴ  Ｖ」）、ＧＰ１、ｇｐ１００／Ｐｍｅ１１７、ｇｐ−１００−ｉｎ４、ｇｐ１５、ｇｐ７５／チロシン関連タンパク質−１（「ｇｐ７５／ＴＲＰ−１」）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（「ｈＣＧ」）、ヘパラナーゼ、ＨＥＲ２、ヒト乳癌ウイルス（「ＨＭＴＶ」）、７０キロダルトンの熱ショックタンパク質（「ＨＳＰ７０」）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（「ｈＴＥＲＴ」）、インスリン様増殖因子受容体−１（「ＩＧＦＲ−１」）、インターロイキン−１３受容体（「ＩＬ−１３Ｒ」）、誘導型一酸化窒素合成酵素（「ｉＮＯＳ」）、Ｋｉ６７、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−ｒａｓ、Ｈ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ＫＳＡ、ＬＫＬＲ−ＦＵＴ、メラノーマ抗原コード遺伝子１（「ＭＡＧＥ−１」）、メラノーマ抗原コード遺伝子２（「ＭＡＧＥ−２」）、メラノーマ抗原コード遺伝子３（「ＭＡＧＥ−３」）、メラノーマ抗原コード遺伝子４（「ＭＡＧＥ−４」）、マンマグロビン、ＭＡＰ１７、Ｍｅｌａｎ−Ａ／Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原−１（「ＭＡＲＴ−１」）、メソセリン、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＭＴ−ＭＭＰ、ムチン、精巣特異的抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１、オステオネクチン、ｐ１５、Ｐ１７０／ＭＤＲ１、ｐ５３、ｐ９７／メラノトランスフェリン、ＰＡＩ−１、血小板由来増殖因子（「ＰＤＧＦ」）、μＰＡ、ＰＲＡＭＥ、プロバシン、プロゲニポイエチン、前立腺特異的抗原（「ＰＳＡ」）、前立腺特異的膜抗原（「ＰＳＭＡ」）、ＲＡＧＥ−１、Ｒｂ、ＲＣＡＳ１、ＳＡＲＴ−１、ＳＳＸファミリー、ＳＴＡＴ３、ＳＴｎ、ＴＡＧ−７２、トランスフォーミング増殖因子−α（「ＴＧＦ−α」）、トランスフォーミング増殖因子−β（「ＴＧＦ−β」）、チモシン−β−１５、腫瘍壊死因子−α（「ＴＮＦ−α」）、ＴＰ１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ、血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）、ＺＡＧ、ｐ１６ＩＮＫ４及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（「ＧＳＴ」）からなる群から選択されている、実施形態４７〜５０のいずれか１つに記載の併用医薬である。
【０２３３】
実施形態５２は、その第１のＴＡＡがＨＥＲ２である、実施形態４７〜５１のいずれか１つに記載の併用医薬である。
【０２３４】
実施形態５３は、そのＨＥＲ２抗原が、Ｅ５８０Ａ、Ｆ５９５Ａ、Ｋ６１５Ａ、Ｓ３１０Ａ、Ｈ３１８Ａ、Ｌ３１７Ａ、Ｄ２７７Ｒ、Ｅ２８０Ｋ、Ｋ５７３Ｍ及びＹ１０２３Ａからなる群から選択した少なくとも１つの変異を含む、実施形態５２に記載の併用医薬である。
【０２３５】
実施形態５４は、配列番号１との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％であるＨＥＲ２抗原をその第１の核酸が含む、実施形態５２〜５３のいずれか１つに記載の併用医薬である。
【０２３６】
実施形態５５は、その第１の核酸が、配列番号１を含む、実施形態５２〜５４のいずれか１つに記載の併用医薬である。
【０２３７】
実施形態５６は、その第１の核酸が、ＨＥＲ２抗原をコードし、その第１の核酸の配列番号２との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％である、実施形態５２〜５５のいずれか１つに記載の併用医薬である。
【０２３８】
実施形態５７は、その第１の核酸が、配列番号２を含む、実施形態５２〜５６のいずれか１つに記載の併用医薬である。
【０２３９】
実施形態５８は、そのＭＶＡが、その第１のＴＡＡとは異なる第２の異種ＴＡＡをコードする第２の核酸を含む、実施形態４７〜５７のいずれか１つに記載の併用医薬である。
【０２４０】
実施形態５９は、その第２のＴＡＡがＢｒａｃｈｙｕｒｙである、実施形態５８に記載の併用医薬である。
【０２４１】
実施形態６０は、配列番号３との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％であるＢｒａｃｈｙｕｒｙ抗原をその第２の核酸が含む、実施形態５９に記載の併用医薬である。
【０２４２】
実施形態６１は、その第２の核酸が、配列番号３を含む抗原をコードする、実施形態５９〜６０のいずれか１つに記載の併用医薬である。
【０２４３】
実施形態６２は、その第２の核酸がＢｒａｃｈｙｕｒｙ抗原をコードし、その第２の核酸の配列番号４との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％である、実施形態５９〜６１のいずれか１つに記載の併用医薬である。
【０２４４】
実施形態６３は、その第２の核酸が配列番号４を含む、実施形態５９〜６２のいずれか１つに記載の併用医薬である。
【０２４５】
実施形態６４は、その抗体が、抗ＣＤ２０（例えば、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ）、抗ＣＤ５２（例えばアレムツズマブであるＣａｍｐａｔｈ）、抗ＥＧＦＲ（例えば、セツキシマブであるＥｒｂｉｔｕｘ、パニツムマブ）、抗ＣＤ２（例えばシプリズマブ）、抗ＣＤ３７（例えばＢＩ８３６８２６）、抗ＣＤ１２３（例えばＪＮＪ−５６０２２４７３）、抗ＣＤ３０（例えばＸｍＡｂ２５１３）、抗ＣＤ３８（例えばダラツムマブであるＤａｒｚａｌｅｘ）、抗ＰＤＬ１（例えば、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ）、ＣＴＬＡ−４（例えばイピリムマブ）、抗ＧＤ２（例えば、３Ｆ８、ｃｈ１４．１８、ＫＷ−２８７１、ジヌツキシマブ）、抗ＣＥＡ、抗ＭＵＣ１、抗ＦＬＴ３、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ４０、抗ＳＬＡＭＦ７、抗ＣＣＲ４、抗Ｂ７−Ｈ３、抗ＩＣＡＭ１、抗ＣＳＦ１Ｒ、抗ＣＡ１２５（例えばオレゴボマブ）、抗ＦＲα（例えばＭＯｖ１８−ＩｇＧ１、ミルベツキシマブソラブタンシン（ＩＭＧＮ８５３）、ＭＯＲＡｂ−２０２）、抗メソセリン（例えばＭＯＲＡｂ−００９）及び抗ＨＥＲ２からなる群から選択されている、実施形態４７〜６３のいずれか１つに記載の併用医薬である。
【０２４６】
実施形態６５は、その抗体が、ＨＥＲ２抗原に特異的である、実施形態４７〜６４のいずれか１つに記載の併用医薬である。
【０２４７】
実施形態６６は、その抗体が、ペルツズマブ、トラスツズマブ、Ｈｅｒｚｕｍａ、ＡＢＰ９８０及びアドトラスツズマブエムタンシンから選択されている、実施形態６５に記載の併用医薬である。
【０２４８】
実施形態６７は、そのＭＶＡが、ＭＶＡ−ＢＮまたはＭＶＡ−ＢＮの誘導体である、実施形態４７〜６６のいずれか１つに記載の併用医薬である。
【０２４９】
実施形態６８は、がん患者においてナチュラルキラー（ＮＫ）応答の増強を誘導する方法であって、実施形態４７〜６６のいずれか１つに記載の併用医薬を投与することを含み、その併用医薬を投与することによって、単独でａ）の併用医薬を非静脈内投与するか、または単独でｂ）を投与する場合と比べて、そのがん患者のＮＫ細胞応答が増強される方法である。
【０２５０】
実施形態６９は、がん患者において自然免疫応答の増強及び適応免疫応答の増強の両方を誘導する方法であって、実施形態４７〜６７のいずれか１つに記載の併用医薬を投与することを含み、その併用医薬を投与することによって、単独でａ）の併用医薬を非静脈内投与するか、またはｂ）を投与する場合と比べて、そのがん患者のＮＫ細胞応答が増強される方法である。
【０２５１】
実施形態７０は、その適応免疫応答の増強が、Ｔ細胞応答の増強を含む、実施形態６９に記載の方法である。
【０２５２】
実施形態７１は、そのＴ細胞応答の増強が、ＣＤ８  Ｔ細胞応答の増強及びＣＤ４  Ｔ細胞応答の増強を含む、実施形態７０に記載の方法である。
【０２５３】
実施形態７２は、がん患者における抗体療法の増強方法であって、実施形態４７〜６７のいずれか１つに記載の併用医薬を投与することを含み、その併用医薬を投与すると、その抗体療法を単独で行った場合と比べて、その抗体療法抗体によって誘導される依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が増強される方法である。
【０２５４】
実施形態７３は、がん患者において、ＭＨＣレベルが低下している腫瘍細胞を殺傷する作用の増強方法であって、実施形態４７〜６７のいずれか１つに記載の併用医薬を投与することを含み、その併用医薬を投与することによって、ｂ）を単独で投与する場合と比べて、ＭＨＣレベルが低下している腫瘍細胞を殺傷する作用が増強される方法である。
【０２５５】
実施形態７４は、ヒトがん患者の治療方法であって、実施形態４７〜６７のいずれか１つに記載の併用医薬をそのがん患者に投与することを含む方法である。
【０２５６】
実施形態７５は、その組み換えＭＶＡを抗体と同時にまたは抗体の後に投与する、実施形態６８〜７４のいずれか１つに記載の方法である。
【０２５７】
実施形態７６は、その組み換えＭＶＡを抗体の後に投与する、実施形態６８〜７４のいずれか１つに記載の方法である。
【０２５８】
実施形態７７は、その組み換えＭＶＡを抗体の０〜８日後、０〜７日後、０〜６日後、０〜５日後、０〜４日後、０〜３日後、０〜２日後または０〜１日後に投与する、実施形態６８〜７５のいずれか１つに記載の方法である。
【０２５９】
実施形態７８は、その組み換えＭＶＡを抗体の１〜８日後、１〜７日後、１〜６日後、１〜５日後、１〜４日後、１〜３日後、１〜２日後または１日後に投与する、実施形態６８〜７５のいずれか１つに記載の方法である。
【０２６０】
実施形態７９は、その組み換えＭＶＡを抗体の０〜３日後、０〜２日後、０〜１日後に投与する、実施形態６８〜７７のいずれか１つに記載の方法である。
【０２６１】
実施形態８０は、その組み換えＭＶＡを抗体の０〜３日後に投与する、実施形態７９に記載の方法である。
【０２６２】
実施形態８１は、その抗体及びそのＭＶＡを同種または異種のプライムブーストレジメンの一部として投与する、実施形態６８〜８０のいずれか１つに記載の方法である。
【０２６３】
実施形態８２は、その抗体及びそのＭＶＡを同種のプライムブーストレジメンの一部として投与する、実施形態６８〜８０のいずれか１つに記載の方法である。
【０２６４】
実施形態８３は、そのがん患者が、乳癌、肺癌、頭頸部癌、甲状腺、メラノーマ、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌もしくは大腸癌からなる群から選択されるがんを罹患しており、及び／またはそのがんと診断されている、実施形態１〜４５及び６８〜８２のいずれか１つに記載の方法である。
【０２６５】
実施形態８４は、がん患者の腫瘍体積を縮小させ、及び／または生存率を向上させるのに用いる併用医薬であって、実施形態４７〜６７のいずれか１つに記載の併用医薬を含み、その併用医薬を投与することによって、単独でａ）の併用医薬を非静脈内投与するか、またはｂ）を投与する場合と比べて、患者の腫瘍体積が縮小し、及び／または生存率が上昇する併用医薬である。
【０２６６】
実施形態８５は、がん患者の腫瘍体積を縮小させ、及び／または生存率を向上させる方法において、実施形態４７〜６７のいずれか１つに記載の併用医薬を使用することである。
【０２６７】
実施形態８６は、がん患者の腫瘍体積を縮小させ、及び／または生存率を向上させるための医薬または薬剤の調製に、実施形態４７〜６７のいずれか１つに記載の併用医薬を使用することである。
【０２６８】
実施形態８７は、がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を向上させる方法であって、ａ）第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸を含む組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）であって、静脈内投与すると、第１の異種のがん関連抗原をコードする第１の核酸を含む組み換えＭＶＡの非静脈内投与によって誘導される自然免疫応答及びＴ細胞応答と比べて、自然免疫応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方を誘導するＭＶＡをそのがん患者に静脈内投与すること、ならびにｂ）そのがん患者に抗体を投与することであって、その抗体が、Ｆｃドメインを含むとともに、腫瘍細胞の細胞膜上に発現する抗原に特異的であることを含み、そのａ）及びｂ）をがん患者に行うと、単独でａ）を非静脈内投与で行うか、またはｂ）を行う場合と比べて、がん患者の腫瘍サイズが縮小し、及び／またはそのがん患者の生存率が上昇する方法である。
【０２６９】
実施形態８８は、その自然免疫応答の増強が、ＮＫ細胞応答の増強、マクロファージ応答の増強、単球応答の増強、好中球応答の増強、好塩基球応答の増強、好酸球応答の増強、肥満細胞応答の増強及び樹状細胞応答の増強のうちの少なくとも１つを含む、実施形態８７に記載の方法である。
【０２７０】
実施形態８９は、その組み換えＭＶＡがさらにＣＤ４０Ｌをコードする、実施形態８７〜８８のいずれか１つに記載の方法である。
【０２７１】
実施形態９０は、ＮＫ細胞応答の増強を誘導することが、ａ）ＡＤＣＣ応答の増強を誘導すること、及びｂ）ＮＫ細胞が、ＭＨＣ発現の低い腫瘍細胞を標的として殺傷するように誘導することのうちの少なくとも１つを含む、実施形態８８〜８９のいずれか１つに記載の方法である。
【０２７２】
実施形態９１は、その組み換えＭＶＡを抗体と同時に、または抗体の後に投与する、実施形態８７〜９０のいずれか１つに記載の方法である。
【０２７３】
実施形態９２は、その組み換えＭＶＡを抗体の後に投与する、実施形態８７〜９１のいずれか１つに記載の方法である。
【０２７４】
実施形態９３は、そのＭＶＡが、実施形態５１〜６３のいずれか１つに記載の第１及び／または第２の異種ＴＡＡをコードする第１及び／または第２の核酸を含む、実施形態８７〜９２のいずれか１つに記載の方法である。
【０２７５】
実施形態９４は、その抗体が、実施形態６４〜６６のいずれか１つに記載の抗体を含む、実施形態８７〜９３のいずれか１つに記載の方法である。
【０２７６】
実施形態９５は、がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を向上させるための併用医薬であって、ａ）第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸を含む組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）であって、静脈内投与すると、異種ＴＡＡをコードする核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非静脈内投与によって誘導される自然免疫応答及びＴ細胞応答と比べて、自然免疫応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方を誘導するＭＶＡ、ならびにｂ）Ｆｃドメインを含むとともに、腫瘍細胞の細胞膜上に発現する抗原に特異的である抗体を含み、そのａ）及びｂ）をがん患者に投与すると、単独でａ）を非ＩＶ投与するか、またはｂ）を投与する場合と比べて、そのがん患者の腫瘍サイズが縮小し、及び／または生存率が上昇する併用医薬である。
【０２７７】
実施形態９６は、その組み換えＭＶＡがさらにＣＤ４０Ｌをコードする、実施形態９５に記載の併用医薬である。
【０２７８】
実施形態９７は、その自然免疫応答の増強が、ＮＫ細胞応答の増強、マクロファージ応答の増強、好中球応答の増強、好塩基球応答、好酸球応答の増強、肥満細胞応答の増強及び樹状細胞応答の増強のうちの少なくとも１つを含む、実施形態９５〜９６のいずれか１つに記載の併用医薬である。
【０２７９】
実施形態９８は、ＮＫ細胞応答の増強を誘導することが、ａ）ＡＤＣＣ応答の増強を誘導すること、及びｂ）ＮＫ細胞が、ＭＨＣ発現の低い腫瘍細胞を標的として殺傷するように誘導することのうちの少なくとも１つを含む、実施形態９５〜９７のいずれか１つに記載の併用医薬である。
【０２８０】
実施形態９９は、そのＭＶＡが、実施形態５１〜６３のいずれか１つに記載の第１及び／または第２の異種ＴＡＡをコードする第１及び／または第２の核酸を含む、実施形態９５〜９８のいずれか１つに記載の併用医薬である。
【０２８１】
実施形態１００は、その抗体が、実施形態６４〜６６のいずれか１つに記載の抗体を含む、実施形態９５〜９９のいずれか１つに記載の併用医薬である。
【０２８２】
実施形態１０１は、がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を向上させるための併用医薬であって、ａ）第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸を含む組み換えポックスウイルスであって、静脈内投与すると、異種ＴＡＡをコードする核酸を含む組み換えポックスウイルスの非静脈内投与によって誘導されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答及びＴ細胞応答と比べて、ＮＫ細胞応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方を誘導する組み換えポックスウイルスと、ｂ）Ｆｃドメインを含むとともに、腫瘍細胞の細胞膜上に発現する抗原に特異的である抗体を含み、そのａ）及びｂ）をがん患者に投与すると、単独でａ）を非ＩＶ投与するか、またはｂ）を投与する場合と比べて、そのがん患者の腫瘍サイズが縮小し、及び／または生存率が上昇する併用医薬である。
【０２８３】
実施形態１０２は、その組み換えポックスウイルスがさらにＣＤ４０Ｌをコードする、実施形態１０１に記載の併用医薬である。
【０２８４】
実施形態１０３は、そのＭＶＡが、実施形態５１〜６３のいずれか１つに記載の第１及び／または第２の異種ＴＡＡをコードする第１及び／または第２の核酸を含む、実施形態１０１〜１０２のいずれか１つに記載の併用医薬である。
【０２８５】
実施形態１０４は、その抗体が、実施形態６４〜６６のいずれか１つに記載の抗体を含む、実施形態１０１〜１０３のいずれか１つに記載の併用医薬である。
【０２８６】
実施形態１０５は、がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を向上させる方法であって、ａ）第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸を含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）であって、静脈内投与すると、異種の腫瘍関連抗原をコードする核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非静脈内投与によって誘導されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答及びＴ細胞応答と比べて、ＮＫ細胞応答の増強及びＴ細胞応答の増強の両方を誘導するＭＶＡをそのがん患者に静脈内投与すること、ならびにｂ）そのがん患者に抗体を投与することであって、その抗体が、腫瘍細胞の細胞膜上に発現する抗原に特異的であることを含み、そのａ）及びｂ）をがん患者に行うと、単独でａ）を非静脈内投与で行うか、またはｂ）を行う場合と比べて、そのがん患者の腫瘍サイズが縮小し、及び／またはそのがん患者の生存率が上昇する方法である。
【０２８７】
実施形態１０６は、がん患者において腫瘍サイズを縮小させ、及び／または生存率を向上させるための併用医薬であって、ａ）Ｆｃドメインを含むとともに、腫瘍細胞の細胞膜上に発現する抗原に特異的である抗体であって、その患者に投与すると、その患者においてＡＤＣＣを誘導する抗体、ならびにｂ）第１の異種の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする第１の核酸を含む組み換え改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスであって、その患者に静脈内投与すると、異種の腫瘍関連抗原をコードする核酸を含む組み換えＭＶＡウイルスの非静脈内投与によって誘導されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞応答及びＴ細胞応答と比べて、そのＭＶＡが、その患者においてＡＤＣＣを増強するとともに、ＮＫ細胞媒介性傷害作用を増強するＮＫ細胞応答の増強を誘導し、そのＭＶＡが、Ｔ細胞応答の増強を誘導するＭＶＡを含み、そのａ）及びｂ）をがん患者に投与すると、単独でａ）を非ＩＶ投与するか、またはｂ）を投与する場合と比べて、そのがん患者の腫瘍サイズが縮小し、及び／または生存率が上昇する併用医薬である。
【０２８８】
実施形態１０７は、その組み換えＭＶＡが、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸をさらに含む、実施形態１０６に記載の併用医薬である。
【０２８９】
実施形態１０８は、そのＭＶＡが、実施形態５１〜６３のいずれか１つに記載の第１及び／または第２の異種ＴＡＡをコードする第１及び／または第２の核酸を含む、実施形態１０６〜１０７のいずれか１つに記載の併用医薬である。
【０２９０】
実施形態１０９は、がん患者において腫瘍体積を縮小させ、及び／または生存率を向上させる方法であって、実施形態１０６〜１０８のいずれか１つに記載の併用医薬を投与することを含む方法である。
【０２９１】
実施形態１１０は、がん患者の腫瘍体積を縮小させ、及び／または生存率を向上させるのに用いる併用医薬であって、実施形態１０６〜１０８のいずれか１つに記載の併用医薬を含み、その併用医薬を投与すると、単独でａ）を投与するか、またはｂ）を非静脈内投与する場合と比べて、その患者の腫瘍体積が縮小し、及び／または生存率が上昇する併用医薬である。
【０２９２】
実施形態１１１は、がん患者の腫瘍体積を縮小させ、及び／または生存率を向上させる方法において、実施形態１０６〜１０８のいずれか１つに記載の併用医薬を使用することである。
【０２９３】
実施形態１１２は、がん患者の腫瘍体積を縮小させ、及び／または生存率を向上させるための医薬または薬剤の調製に、実施形態１０６〜１０８のいずれか１つに記載の併用医薬を使用することである。
【０２９４】
実施形態１１３は、がん患者において、抗体療法の有効性を増大させる方法であって、実施形態４７〜６７及び１０６〜１０８のいずれか１つに記載の併用医薬を投与することを含み、その併用医薬をその患者に投与すると、腫瘍細胞におけるＮＫ細胞媒介性傷害作用に必要な抗体濃度が低下する方法である。
【０２９５】
実施形態１１４は、その組み換えＭＶＡが、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸を含み、そのＣＤ４０Ｌが、配列番号１１を含む、実施形態４７〜６７及び１０６〜１０８のいずれか１つに記載の併用医薬である。
【０２９６】
実施形態１１５は、ＣＤ４０Ｌをコードするその核酸が、配列番号１２との同一性が少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％である配列を有する核酸である、実施形態１１４に記載の併用医薬である。
【０２９７】
実施形態１１６は、その組み換えＭＶＡが、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸を含み、そのＣＤ４０Ｌが、配列番号１１を含む、実施形態１〜４６のいずれか１つに記載の方法である。
【０２９８】
実施形態１１７は、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸が、配列番号１２との同一性が少なくとも９５％、９８％、９９％または１００％である配列を有する核酸である、実施形態１１６に記載の方法である。
【０２９９】
実施形態１１８は、その乳癌が、ＨＥＲ２を過剰発現する乳癌である、実施形態８３に記載の方法である。
【０３００】
実施形態１１９は、その組み換えＭＶＡによってＨＥＲ２ポリペプチド及び／または抗原が発現されたときに、そのＨＥＲ２ポリペプチド及び／または抗原の細胞外での二量化、チロシンキナーゼ活性及び／またはリン酸化を防ぐために、ＨＥＲ２の１つ以上のアミノ酸が変異している、実施形態１８〜１９のいずれか１つに記載の方法である。
【０３０１】
実施形態１２０は、そのＨＥＲ２抗体が、その組み換えＭＶＡによって発現されたＨＥＲ２抗原に結合するのを防ぐための１つ以上の変異をそのＨＥＲ抗原が含む、実施形態１８〜１９のいずれか１つに記載の方法である。
【０３０２】
実施形態１２１は、その抗体がその第１及び／または第２のＴＡＡに結合するのを防ぐために、その第１及び／または第２のＴＡＡが、１つ以上の変異を含む、実施形態５０〜６３のいずれか１つの使用のための併用医薬である。
【０３０３】
実施形態１２２は、ＨＥＲ２の膜近傍領域における３つのループの少なくとも１つに、１つ以上の変異が施されている、実施形態１８〜２０のいずれか１つに記載の方法である。
【０３０４】
実施形態１２３は、ＨＥＲ２の膜近傍領域のその３つのループが、５７９〜５８３位のアミノ酸（ループ１）、５９２〜５９５位のアミノ酸（ループ２）及び６１５〜６２５位のアミノ酸（ループ３）から選択される、１８〜２１のいずれか１つに記載の方法である。
【０３０５】
実施形態１２４は、そのＨＥＲ２抗原が、Ｅ５８０Ａ、Ｆ５９５Ａ、Ｋ６１５Ａ、Ｈ２６７Ａ、Ｆ２７９Ａ、Ｖ３０８Ａ、Ｓ３１０Ａ、Ｌ３１７Ａ、Ｈ３１８Ａ、Ｋ３３３Ａ、Ｐ３３７Ａのアミノ酸のうちの少なくとも１つに、少なくとも１つの変異を含む、実施形態１８〜２２のいずれか１つに記載の方法である。
【０３０６】
実施形態１２５は、そのＨＥＲ２抗原が、Ｅ５８０Ａ、Ｆ５９５Ａ、Ｋ６１５Ａ、Ｈ２６７Ａ、Ｆ２７９Ａ、Ｖ３０８Ａ、Ｓ３１０Ａ、Ｌ３１７Ａ、Ｈ３１８Ａ、Ｋ３３３Ａ、Ｐ３３７Ａ、Ｄ２７７Ｒ、Ｅ２８０Ｋ、Ｋ７５３Ｍ及びＹ１０２３Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む、実施形態１８〜２３のいずれか１つに記載の方法である。
【０３０７】
実施形態１２６は、がん患者の腫瘍体積を縮小させ、及び／または生存率を向上させることによる療法で用いる併用医薬（好ましくは、そのがん患者は、乳癌、肺癌、頭頸部癌、甲状腺、メラノーマ、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌もしくは大腸癌からなる群から選択したがんを罹患しており、及び／またはそのがんと診断されている）であって、実施形態４７〜６７のいずれか１つに記載の併用医薬を含み、その併用医薬を投与すると、単独でａ）の併用医薬を非静脈内投与するか、またはｂ）を投与する場合と比べて、その患者の腫瘍体積が縮小し、及び／または生存率が上昇する併用医薬である。
【０３０８】
実施形態１２７は、がん患者の腫瘍体積を縮小させ、及び／または生存率を向上させるための医薬または薬剤の調製に、実施形態４７〜６７のいずれか１つに記載の併用医薬を使用することであって、好ましくは、そのがん患者が、乳癌、肺癌、頭頸部癌、甲状腺、メラノーマ、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌もしくは大腸癌からなる群から選択したがんを罹患しており、及び／またはそのがんと診断されている使用である。
【０３０９】
実施形態１２８は、配列番号１３との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％であるＨＥＲ２抗原をその第１の核酸がコードする、実施形態１８〜２７のいずれか１つに記載の方法である。
【０３１０】
実施形態１２９は、その第１の核酸が、配列番号１３を含むＨＥＲ２抗原をコードする、実施形態１８〜２８のいずれか１つに記載の方法である。
【０３１１】
実施形態１３０は、その第１の核酸がＨＥＲ２抗原をコードし、その第１の核酸の配列番号１４との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％である、実施形態１８〜２９のいずれか１つに記載の方法である。
【０３１２】
実施形態１３１は、その第１の核酸が配列番号１４を含む、実施形態１８〜３０のいずれか１つに記載の方法である。
【０３１３】
実施形態１３２は、配列番号１３の全長との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％であるＨＥＲ２抗原をその第１の核酸がコードする、実施形態１８〜２７のいずれか１つに記載の方法である。
【０３１４】
実施形態１３３は、その第１の核酸がＨＥＲ２抗原をコードし、その第１の核酸の、配列番号１４の全長との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％である、実施形態１８〜２９のいずれか１つに記載の方法である。
【０３１５】
実施形態１３４は、配列番号１の全長との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％であるＨＥＲ２抗原をその第１の核酸がコードする、実施形態１８〜２７のいずれか１つに記載の方法である。
【０３１６】
実施形態１３５は、その第１の核酸がＨＥＲ２抗原をコードし、その第１の核酸の、配列番号２の全長との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％である、実施形態１８〜２９のいずれか１つに記載の方法である。
【０３１７】
実施形態１３６は、配列番号３の全長との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％であるＨＥＲ２抗原をその第１の核酸がコードする、実施形態３４〜３６のいずれか１つに記載の方法である。
【０３１８】
実施形態１３７は、その第１の核酸がＨＥＲ２抗原をコードし、その第１の核酸の、配列番号４の全長との同一性が少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％である、実施形態１８〜２９のいずれか１つに記載の方法である。
【実施例】
【０３１９】
下記の実施例は、本発明を例示するものであるが、いかなる形でも、請求項の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【０３２０】
実施例１：組み換えＭＶＡの静脈内投与によって、ＮＫ細胞の活性化が強化される。
【０３２１】
５×１０７ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡとして示されている）またはＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌとして示されている）で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを皮下（ＳＣ）または静脈内（ＩＶ）免疫した。ＰＢＳをＳＣ注射した。１日後、フローサイトメトリーを用いて、脾臓（図１Ａ〜１Ｇに示されている）、肝臓（図２Ａ〜２Ｇに示されている）及び肺（図３Ａ〜３Ｇに示されている）において、Ａ）ＮＫｐ４６＋ＣＤ３−細胞、Ｂ）ＣＤ６９、Ｃ）ＮＫＧ２Ｄ、Ｄ）ＦａｓＬ、Ｅ）Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｆ）ＣＤ７０及びＧ）ＩＦＮ−γに対して染色することによって、ＮＫ細胞の頻度及びタンパク質の発現（幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）として示した）を評価した。
【０３２２】
加えて、ＨＥＲ２、ＴＷＩＳＴ及びＣＤ４０Ｌ抗原をコードする５×１０７ＴＣＩＤ５０の組み換えＭＶＡ（ＭＶＡ−ＨＥＲ２−ＴＷＩＳＴ−ＣＤ４０Ｌとして示されている）で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを皮下（ＳＣ）または静脈内（ＩＶ）免疫した。ＰＢＳをＳＣ注射した。１日後、フローサイトメトリーを用いて、脾臓（図４Ａ〜４Ｆに示されている）、肝臓（図５Ａ〜５Ｆに示されている）及び肺（図６Ａ〜６Ｆに示されている）において、Ａ）ＮＫｐ４６＋ＣＤ３−細胞、Ｂ）ＣＤ６９、Ｃ）ＦａｓＬ、Ｄ）、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｅ）ＣＤ７０及びＦ）ＩＦＮ−γに対して染色することによって、ＮＫ細胞の頻度及びタンパク質の発現（幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）として示した）を評価した。
【０３２３】
図に示されているように、脾臓のＮＫ細胞の頻度は、ｒＭＶＡ、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ−ＨＥＲ２−ＴＷＩＳＴ−ＣＤ４０Ｌの注射後、適用経路にかかわらず、低下したかまたは維持された。Ａ）では、ｒＭＶＡのＩＶ適用によって、肝臓及び肺において、ＳＣ適用の場合と比べて、ＮＫ細胞の頻度が上昇した。Ｂ）では、ＣＤ６９は、ＮＫ細胞の刺激受容体であり（Ｂｏｒｒｅｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９９）、ｒＭＶＡ、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ−ＨＥＲ２−ＴＷＩＳＴ−ＣＤ４０ＬのＩＶ注射後には、強力にアップレギュレートするが、ＳＣ注射後にはアップレギュレートしない。ＣＤ６９の最も高い発現は、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０ＬのＩＶ適用によって誘導された。図１〜３Ｃ）では、活性化Ｃ型レクチン様受容体ＮＫＧ２Ｄは、ｒＭＶＡ及びｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの免疫後、ＰＢＳで処置した場合と比べて、ＮＫ細胞上でアップレギュレートする。図１〜３（Ｄ）及び図４〜６（Ｃ）では、アポトーシス誘導因子ＦａｓＬ（ＣＤ９５Ｌ）は、ｒＭＶＡ及びｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの免疫後、ＰＢＳで処置した場合と比べて、ＮＫ細胞上でアップレギュレートする。図１〜３（Ｄ）及び図４〜６（Ｃ）の脾臓及び肺では、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ−ＨＥＲ２−ＴＷＩＳＴ−ＣＤ４０ＬのＩＶ注射後に、ＦａｓＬの発現が最も高かった。図１〜３（Ｅ）及び４〜６（Ｄ）では、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ−ＨＥＲ２−ＴＷＩＳＴ−ＣＤ４０ＬでＩＶ免疫したところ、ＳＣ免疫と比べて、抗アポトーシスＢｃｌファミリーメンバーのＢｃｌ−ｘＬの発現も高かった。図１〜３（Ｆ）及び４〜６（Ｅ）では、ｒＭＶＡ、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ−ＨＥＲ２−ＴＷＩＳＴ−ＣＤ４０ＬのＩＶ注射によって、特に脾臓ＮＫ細胞上で、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのメンバーである共刺激分子ＣＤ７０のアップレギュレーションが誘導される。図１〜３（Ｇ）及び４〜６（Ｆ）では、重要なことに、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０ＬまたはＭＶＡ−ＨＥＲ２−ＴＷＩＳＴ−ＣＤ４０ＬでのＩＶ免疫後、脾臓、肺及び肝臓において、エフェクターサイトカインＩＦＮ−γが最も強力に発現する。これらのデータから、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０ＬまたはＭＶＡ−ＨＥＲ２−ＴＷＩＳＴ−ＣＤ４０ＬのいずれかでのＩＶ免疫によって、全身性のＮＫ細胞が強力に活性化されるが、ＳＣ免疫によっては活性化されないことが示されている。
【０３２４】
実施例２：組み換えＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌの静脈内投与によって、ＮＫ細胞の全身的な活性化が強化される。
【０３２５】
５×１０７ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）、ＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）またはＰＢＳでＣ５７ＢＬ／６マウスをＩＶ免疫した。図７Ａ〜７Ｆに示されているように、注射の６時間後、ビーズアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）（Ａ及びＢ）、ならびにフローサイトメトリー（Ｃ）によって、血清中サイトカインレベル（（Ａ）ＩＦＮ−γ、（Ｂ）ＩＬ−１２ｐ７０及び（Ｃ）ＣＤ６９＋グランザイムＢ＋）を定量した。ＮＫ細胞活性化サイトカインＩＬ−１２ｐ７０は、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの免疫後にのみ検出可能であった。ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ後、ｒＭＶＡで免疫した場合と比べて、ＩＦＮ−γの濃度が高かった。ＩＦＮ−γの血清中レベルの上昇は、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの免疫の４８時間後に、ＮＫ細胞のＩＦＮ−γのＧＭＦＩが高いこと（図１Ｇとの比較）及び脾臓ＣＤ６９＋グランザイムＢ＋ＮＫ細胞の頻度が高いことと整合している。
【０３２６】
ＮＨＰ（カニクイザル）において、ＭＶＡ−ＭＡＲＶ−ＧＰ−ｈｕＣＤ４０ＬのＩＶ注射後、同様の応答が見られ、すなわち、ＭＶＡ−ＭＡＲＶ−ＧＰと比べて、ＩＦＮ−γ（Ｄ）及びＩＬ−１２ｐ４０／７０（Ｅ）の血清中濃度が高く、（Ｋｉ６７＋）ＮＫ細胞の増殖（Ｆ）が増加していた。これらのデータによって、ＣＤ４０ＬをコードするＭＶＡワクチンが、マウス及びＮＨＰにおいて、同等の免疫学的特性を有することが示されている。
【０３２７】
実施例３：静脈内投与によって、経時的に、ＮＫ細胞の活性化及び増殖が強化される。
【０３２８】
５×１０７ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）、ＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）またはＰＢＳで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＩＶ免疫した。（Ａ）ＣＤ３−ＣＤ１９−ＮＫｐ４６＋、（Ｂ）Ｋｉ６７及び（Ｃ）ＣＤ６９について、脾臓、肝臓及び肺において、免疫後、１日目及び４日目に、ＮＫ細胞の活性化及び増殖を測定した。その結果は、図８に示されている。
【０３２９】
図８Ａ）に示されているように、脾臓ＮＫ細胞の頻度（ＣＤ３−ＣＤ１９−ＮＫｐ４６＋として定義されている）は、実施例１で見られたように、ｒＭＶＡ及びｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの免疫後、１日目までに、一時的に低下したが、４日目までに、ＰＢＳの場合と比べて上昇した。肝臓及び肺では、いずれのベクターも、１日目までにすでに、ＮＫ細胞頻度の上昇を誘導した。予想外にも、４日目に、肝臓におけるＮＫ細胞頻度は、ＰＢＳの場合と比べて、ｒＭＶＡ後、２．４倍高く、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの免疫後には、４倍高かった。同様に、肺及び血液におけるＮＫ細胞頻度は、８Ａに示されているように、免疫後、４日目に大きく上昇した。８Ｂにおいて、増殖マーカーＫｉ６７の発現によって示されているように、全身的なＮＫ細胞の増加と整合して、ｒＭＶＡ及びｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの免疫後、４日目の全ＮＫ細胞の８０％超が、増殖段階にあった。解析したすべての器官及び血液におけるＣＤ６９の発現ピーク（幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）として示した）は、１日目であった。免疫後、４日目までに、ＣＤ６９の発現は、基底レベルに戻った（図８Ｃ）。
【０３３０】
実施例４：組み換えＭＶＡの静脈内投与によって、ＮＫ細胞媒介性傷害作用が強化される。
【０３３１】
５×１０７ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）、ＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）またはＰＢＳで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＩＶ免疫した。２４時間後、マウスを殺処分し、脾臓ＮＫ細胞を磁気細胞ソーティングによって精製し、エフェクター：標的殺傷アッセイにおいて、エフェクターとして使用した。簡潔に述べると、ＮＫ細胞と、ＣＦＳＥで標識したクラスＩ  ＭＨＣ欠損ＹＡＣ−１細胞を、図９に示されている比率で培養した。フローサイトメトリーによって非生存ＣＦＳＥ＋ＹＡＣ−１細胞を定量することによって、特異的殺傷率を評価した。その結果、ＩＶ免疫後、ｒＭＶＡ及びｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌによって活性化されたＮＫ細胞は、クラスＩ  ＭＨＣ欠損標的細胞の強力なキラーである。
【０３３２】
実施例５：組み換えＭＶＡの静脈内投与によって、ＡＤＣＣが増強される。
【０３３３】
図１０Ａに示されているように、２５μｇの抗ＣＤ４（クローンＧＫ１．５）、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）＋５μｇのラットＩｇＧ２ｂもしくは１μｇの抗ＣＤ４、またはＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）＋１μｇの抗ＣＤ４のいずれかで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＩＶ処置した。２４時間後、マウスを殺処分し、肝臓におけるＣＤ４  Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）の枯渇をフローサイトメトリーによって解析した。２５μｇの抗ＣＤ４を特異的殺傷率１００％とした。ｒＭＶＡ＋ＩｇＧ２ｂ（特異的殺傷率０％とした）と比べて、１μｇの抗ＣＤ４は、全肝臓ＣＤ４  Ｔ細胞の６１％を枯渇させた。ｒＭＶＡ＋１μｇの抗ＣＤ４という組み合わせでは、９３％のＣＤ４  Ｔ細胞が枯渇され、これは、２５μｇの抗ＣＤ４とほぼ同程度の効率性である。したがって、ｒＭＶＡと枯渇抗体を組み合わせることによって、インビボにおいて、相乗的な標的細胞殺傷作用が得られる。
【０３３４】
図１０Ｂ及び１０Ｃに示されているように、ＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性をエキソビボで評価するために、ＰＢＳ、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）のいずれかで、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂ）またはＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃ）をＩＶ免疫した。２４時間後、マウスを殺処分し、脾臓ＮＫ細胞を磁気細胞ソーティングによって精製し、抗体依存性エフェクター：標的殺傷アッセイにおいて、エフェクターとして使用した。（Ｂ）標的のＢ１６．Ｆ１０細胞をマウス抗ヒト／マウスＴｒｐ１  ｍＡｂ（クローンＴＡ９９）で被覆し、（Ｃ）標的のＣＴ２６−ＨＥＲ２細胞をマウス抗ヒトＨＥＲ２  ｍＡｂ（クローン７．１６．４）で被覆した。抗体で被覆した標的細胞に、精製ＮＫ細胞をそれぞれ５：１及び４：１の比率で加えた。細胞培養培地への乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を測定することによって、細胞死を判断した。いずれのアッセイにおいても、ＮＫ細胞をインビボでｒＭＶＡまたはｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌによって活性化したところ、ＰＢＳの場合と比べて、標的細胞の溶解が強かった。ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌによって活性化した場合に、溶解活性が最も高かった。異なる濃度の抗ヒトＨＥＲ２（０．１〜１０μｇ／ｍｌの抗ＨＥＲ２）とインキュベートしたＣＴ２６−ＨＥＲ２細胞も、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌで活性化したＮＫ細胞による方が、ｒＭＶＡで活性化したＮＫ細胞と比べて効率的に殺傷された（Ｄに示されている）。
【０３３５】
図１０Ｅに示されているように、ＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０Ｌを用いて、エキソビボでのＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性を解析した。ＰＢＳまたはＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０Ｌのいずれかで、Ｂａｌｂ／ｃマウスをＩＶ免疫した。ＣＴ２６−ＨＥＲ２細胞を５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ及び０．０５μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＨＥＲ２  ｍＡｂ（クローン７．１６．４）で被覆した。抗体で被覆された標的細胞に、精製ＮＫ細胞を５：１の比率で加えた。細胞培養培地への乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を測定することによって、細胞死を判断した。標的細胞の溶解は、ＮＫ細胞をインビボでＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０Ｌによって活性化した場合に、ＰＢＳの場合よりも強かった。
【０３３６】
したがって、関連するヒト腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞のＡＤＣＣ媒介性殺傷作用は、ｒＭＶＡ、特にｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０Ｌ媒介性のＮＫ細胞の活性化によって増強できる。さらに、ｒＭＶＡ、特にｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ及びＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０Ｌによる、ＡＤＣＣ活性の増強は、広範な用量範囲の抗体で観察される。
【０３３７】
実施例６：組み換えＭＶＡの静脈内投与によって、強力なＣＤ８  Ｔ細胞応答が誘導される。
【０３３８】
０日目及び１６日目に、５×１０７ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＯＶＡで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＩＶまたはＳＣ免疫した。７日目及び２２日目に、Ｈ−２Ｋｂ／ＯＶＡ２５７−２６４デキストラマーで染色後、フローサイトメトリーによって、血液におけるＯＶＡ特異的なＣＤ８  Ｔ細胞応答を評価した。図１１に示されているように、７日目においては、ＯＶＡ特異的なＣＤ８  Ｔ細胞の頻度は、ＳＣ注射の場合と比べて９倍高かった。２２日目においては、ＯＶＡ−特異的Ｔ細胞は、ＳＣ注射後よりも４倍高かった。
【０３３９】
実施例７：組み換えＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌの静脈内投与によって、ＣＤ８  Ｔ細胞応答がさらに増強される。
【０３４０】
図１２に示されているように、０日目及び３５日目に、５×１０７ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＯＶＡまたはＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを静脈内免疫した。Ｈ−２Ｋｂ／ＯＶＡ２５７−２６４デキストラマーで染色後、フローサイトメトリーによって、血液におけるＯＶＡ特異的なＣＤ８  Ｔ細胞応答を評価した。ＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ後、ＭＶＡ−ＯＶＡでの免疫と比べて、一次応答のピーク（７日目）及び二次応答のピーク（３９日目）に、ＯＶＡ特異的なＣＤ８  Ｔ細胞の頻度がそれぞれ４倍及び２倍増強された（Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。
【０３４１】
実施例８：プライムブースト免疫によって、ＮＫ細胞の活性化及び増殖の反復が見られる。
【０３４２】
【表４】
2020531524.tif 000005
【０３４３】
表１に示されているように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＩＶ免疫した（組み換えＭＶＡの用量は、５×１０７ＴＣＩＤ５０であった）。２回目及び３回目の免疫から１日後及び４日後に、ＮＫ細胞（ＣＤ３−ＮＫｐ４６＋）を血液において、フローサイトメトリーによって解析した。図１３Ａ及び１３Ｂに示されているのは、ＣＤ６９のＧＭＦＩ（Ａ）及びＫｉ６７＋ＮＫ細胞の頻度（Ｂ）である。図１３Ａ及び１３Ｂには、抗ベクター免疫の存在にもかかわらず、毎回の免疫によって、ＮＫ細胞が活性化されることが示されている。この予想外の知見によって、抗体療法とブースト免疫を組み合わせると、ＮＫ細胞が活性化されるとみられることが裏付けられている。したがって、がん患者を組み換えＭＶＡで複数回処置して、抗ベクター応答が起きると、ＮＫ細胞の活性化が低下しない。対照的に、処置するごとに、新たにＮＫ細胞が活性化される。
【０３４４】
実施例９：プライムブースト免疫によって、ＣＤ４  Ｔヘルパー細胞の誘導の強化が見られる。
【０３４５】
表１に示されているように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫した（組み換えＭＶＡの用量は、５×１０７ＴＣＩＤ５０であった）。免疫の６時間後に、マルチプレックスビーズアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）によって、血清中サイトカインレベルを定量した。示されているのは、指定のサイトカイン（１４Ａ）ＩＬ−６、１４Ｂ）ＣＸＣＬ１０、１４Ｃ）ＩＦＮ−α、１４Ｄ）ＩＬ−２２、１４Ｅ）ＩＦＮ−γ、１４Ｆ）ＣＸＣＬ１、１４Ｇ）ＣＣＬ４、１４Ｈ）ＣＣＬ７、１４Ｉ）ＣＣＬ２、１４Ｊ）ＣＣＬ５、１４Ｋ）ＴＮＦ−α、１４Ｌ）ＩＬ−１２ｐ７０及び１４Ｍ）ＩＬ−１８）の発現の結果である。
【０３４６】
図１４Ａ〜１４Ｍに示されているように、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ  ｈｏｍで処置したマウスでは、ｒＭＶＡでプライミングして、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでブーストしたマウス（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ  ｈｅｔ）と同様のサイトカインプロファイルが見られた。ｒＭＶＡ  ｈｏｍで処置したマウスでは、１回目及び２回目の免疫後、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでプライミングしたマウスと比べて、ＩＬ−６、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＬ−２２、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＣＣＬ２、ＣＣＬ５及びＣＸＣＬ１のレベルが低かった。プライミング後には見られなかったが、２回目及び３回目の免疫後に高度に産生されたサイトカインは、ＩＬ−２２であった。ＩＬ−２２は主に、エフェクターＴヘルパー細胞及び自然リンパ球細胞のサブ集団によって産生される。したがって、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ  ｈｅｔまたはｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ  ｈｏｍで処置したマウスにおける方が、ＩＬ−２２の発現が高いことによって、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの免疫によるＣＤ４  Ｔヘルパー応答の誘導が強力であることが示されている。総合すると、ｒＭＶＡ及びｒＭＶＡ−ＣＤ４０ＬでのＩＶ免疫によって、高度な全身性のサイトカイン応答が誘導され、その応答は、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでプライミングしたマウスにおいて最も高い。
【０３４７】
実施例１０：プライムブースト免疫によって、抗原特異的なＣＤ８  Ｔ細胞応答の強化が見られる。
【０３４８】
表１に示されているように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＩＶ免疫した（組み換えＭＶＡの用量は、５×１０７ＴＣＩＤ５０であった）。ＮＫ細胞と同様に、反復免疫後の抗原特異的なＣＤ８  Ｔ細胞応答の誘導を評価した。図１５に示されているように、ｒＭＶＡ及びｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの２回目及び３回目の免疫後、ＣＤ８  Ｔ細胞頻度は大きく上昇した。留意すべきことに、２回目の免疫後、全ＰＢＬの約８０％が、ＣＤ８  Ｔ細胞であった（Ａ）。ベクター特異的な（Ｂ８）ＣＤ８  Ｔ細胞応答は、２回目の免疫後にピークに達した（Ｂ）一方で、導入遺伝子特異的な（ＯＶＡ）応答は、３回目の免疫でさらにブーストできた（Ｃ）。この結果、ＯＶＡ／Ｂ８特異的なＣＤ８  Ｔ細胞の比率が上昇し（Ｄ）、免疫が、導入遺伝子に向けられることが示されている。重要なことに、これらの結果から、ＩＶ免疫によって、抗ベクター免疫の存在下で、抗原特異的なＴ細胞応答をブーストできることが示されている。したがって、がん患者において、複数回の処置によって、腫瘍−抗原特異的なＣＤ８  Ｔ細胞応答を強化し得る。
【０３４９】
実施例１１：プライムブースト免疫によって、メモリーＣＤ８  Ｔ細胞応答及びＣＤ４  Ｔ細胞応答の強化が見られる。
【０３５０】
表１に示されているように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＩＶ免疫した。結果は、図１６に示されている。表現型的に、ＣＤ４４の発現及び表面ＣＤ６２Ｌの欠損によって、エフェクター及びエフェクターメモリーＴ細胞を特定できる。血液におけるＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ８Ｔ細胞（Ａ）及びＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４Ｔ細胞（Ｂ）のモニタリングによって、反復ＩＶ免疫を行うと、エフェクター及びエフェクターメモリーＴ細胞の増加が誘導されることが示された。興味深いことに、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ  ｈｏｍまたはｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ  ｈｅｔのいずれかを投与したマウスでは、循環エフェクターＣＤ４  Ｔ細胞が、ｒＭＶＡでプライミングしたマウスよりも、約２．５倍多かった（Ｂ、２５日目）。これによって、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの全身プライミングによって、ｒＭＶＡよりも強いＣＤ４  Ｔ細胞応答が誘導されることが示されている
実施例１２：組み換えＭＶＡの静脈内投与によって、メラノーマの治療の際に、強力な抗腫瘍作用が得られる。
【０３５１】
ＰＢＳ、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）によって、触知可能なＢ１６．ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスをＩＶまたはＳＣのいずれかでプライミングした（点線）（組み換えＭＶＡの用量は、５×１０７ＴＣＩＤ５０であった）。プライム免疫後、７日目及び１４日目に、そのマウスに、その後のブーストを５×１０７ＴＣＩＤ５０のＦＰＶ−ＯＶＡで行った（破線）。腫瘍の成長を一定間隔で測定した。図１７に示されているのは、腫瘍の平均体積（Ａ）、及び腫瘍接種後、４５日目までの、腫瘍を有するマウスの生存率（Ｂ）である。すなわち、Ｂ１６．ＯＶＡ腫瘍を有するマウスをｒＭＶＡ−ＣＤ４０ＬによってＩＶでプライミングすると、ＳＣでのｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ、またはＳＣもしくはＩＶでのｒＭＶＡの両方と比べて、抗腫瘍作用が強化される。
【０３５２】
実施例１３：組み換えＭＶＡを１回静脈内投与すると、抗腫瘍作用が強化される。
【０３５３】
表２に示されているように、触知可能なＢ１６．ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスに、ワクチンをＩＶ接種した。腫瘍の成長を一定間隔で測定した。図１８に示されているのは、腫瘍の平均体積である。その結果から、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌで治療的免疫を１回行うことは、同種または異種のプライム／ブースト免疫と同程度の強度を有することが示されている。重要なことに、これらのデータによって、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌの強力な抗腫瘍活性が強調されている。
【０３５４】
【表５】
2020531524.tif 000006
【０３５５】
実施例１４：ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌの媒介による腫瘍制御には、ＣＤ８  Ｔ細胞が重要である。
【０３５６】
ＰＢＳ、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）の静脈内投与によって、触知可能なＢ１６．ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫した（組み換えＭＶＡの用量は、５×１０７ＴＣＩＤ５０であった）。示されている場合、マウスに２００μｇの抗ＣＤ８抗体を腹腔内注射した。図１９に示されているように、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの免疫によって、ｒＭＶＡと比べて、全体的なＣＤ８  Ｔ細胞応答の強化（Ａ）、及びネオ抗原（ＯＶＡ）特異的なＣＤ８  Ｔ細胞応答の強化（Ｂ）が誘導された。Ｃ）は、全生存率を示している。これらのデータから、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌが、腫瘍環境において優れたＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導すること、及び治療的免疫後に見られる抗腫瘍作用には、ＣＤ８  Ｔ細胞応答の誘導が重要であることが示されている。
【０３５７】
実施例１５：少なくとも２つのＴＡＡをコードする組み換えＭＶＡのＩＶ投与は、さらに有効である。
【０３５８】
ＰＢＳ、ＭＶＡ−ＯＶＡ−ＴＲＰ２、ＭＶＡ−ＯＶＡ−ＴＲＰ２−ＣＤ４０ＬまたはＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌのいずれかで、触知可能なＢ１６．ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスをＩＶ免疫した。図２０に示されているように、腫瘍の成長を一定間隔で測定し、その成長は、個々のマウスの平均直径（Ａ）及び平均体積（Ｂ）として示されている。生存率は、（Ｃ）に示されている。これらのデータから、２つのＴＡＡをコードするｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌで治療的免疫を１回行うことは、１つのＴＡＡのみをコードするｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの免疫よりも効率的であることが示されている。
【０３５９】
実施例１６：組み換えＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌの静脈内投与によって、腫瘍微小環境において、Ｔ細胞浸潤が増加する。
【０３６０】
ＰＢＳ、ｒＭＶＡ（ＭＶＡ−ＯＶＡ）またはｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）によって、触知可能なＢ１６．ＯＶＡ腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを静脈内免疫した（組み換えＭＶＡの用量は、５×１０７ＴＣＩＤ５０であった）。７日後、マウスを殺処分した。図２１Ａ及び２１Ｂに示されているように、脾臓、腫瘍流入リンパ節（ＴＤＬＮ）及び腫瘍組織における白血球のうち、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＯＶＡ２５７−２６４特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度及び分布を解析した。図２１Ｃでは、ＯＶＡ２５７−２６４特異的な腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ−１及びＬａｇ３の幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）を解析し、図２１Ｄには、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞のＫｉ６７及びＰＤ−１の発現の代表的なドットプロットが示されている。図２１Ｅには、腫瘍浸潤Ｋｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度及びＰＤ−１のＧＭＦＩが示されており、図２１Ｆには、白血球のうちの腫瘍浸潤調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の頻度が例示されている。図２１Ｇには、ＰＤ−１ｈｉｇｈ腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ及びＰＤ−１ｎｅｇ腫瘍浸潤Ｔｒｅｇの頻度が示されている。勘案すると、これらのデータから、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの免疫によって、ＰＢＳ及びｒＭＶＡでの免疫と比べて、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）へのＴＡＡ特異的なＣＤ８  Ｔ細胞の浸潤がさらに顕著になること、及びこれらのＣＤ８  Ｔ細胞が、「免疫疲弊」と関連するマーカーを発現する量が減少することが示されている。さらに、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの免疫によって、ＰＢＳの場合と比べて、ＴＭＥにおいて、抑制性の高いＴｒｅｇが減少する。
【０３６１】
実施例１７：組み換えＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌの静脈内投与によって、腫瘍微小環境のＴ細胞浸潤の継続時間が長くなる。
【０３６２】
腫瘍が触知可能となったら、Ｂ１６．ＯＶＡ担腫瘍生体に、ＯＶＡ特異的なＴＣＲトランスジェニックＣＤ８  Ｔ細胞（ＯＴ−Ｉ）を静脈内移入した。腫瘍の体積が少なくとも６０ｍｍ３に達したら、ＭＶＡ−ＢＮ、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）で動物を免疫した（組み換えＭＶＡの用量は、５×１０７ＴＣＩＤ５０であった）。１７日後、マウスを殺処分し、Ａ）腫瘍組織における白血球のうちのＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度、Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＬａｇ３＋ＰＤ１＋の頻度、Ｃ）ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＥｏｍｅｓ＋ＰＤ１＋Ｔ細胞の頻度、Ｄ）免疫後のＴＭＥにおけるＯＴ−ＩトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞の存在、Ｅ）ＯＴ−Ｉ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＬａｇ３＋ＰＤ１＋疲弊Ｔ細胞の頻度及びＦ）ＯＴ−Ｉ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＥｏｍｅｓ＋ＰＤ１＋疲弊Ｔ細胞の頻度について解析した。その結果は、図２２に示されている。これらのデータから、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの免疫により、ＴＭＥに動員されるＴＡＡ特異的なＣＤ８  Ｔ細胞では、ＴＭＥへの長期暴露後でも、コントロールでの処置（ＴＡＡがコードされないＭＶＡ−ＢＮ）またはｒＭＶＡで免疫した場合よりも、免疫疲弊の徴候が小さいことが示されている。
【０３６３】
実施例１８：組み換えＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌの静脈内投与によって、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇのレベルが低下した。
【０３６４】
腫瘍が触知可能となったら、Ｂ１６．ＯＶＡ担腫瘍生体に、ＯＶＡ特異的な精製ＴＣＲトランスジェニックＣＤ８  Ｔ細胞（ＯＴ−Ｉ）を静脈内移入した。腫瘍の体積が少なくとも６０ｍｍ３に達したら、ＭＶＡ−ＢＮ、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）またはＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）で動物を免疫した（組み換えＭＶＡの用量は、５×１０７ＴＣＩＤ５０であった）。１７日後、マウスを殺処分し、Ａ）腫瘍組織におけるＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇの頻度及びＢ）Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇに対するＣＤ８＋ＣＤ４４＋エフェクターＴ細胞の比率について解析した。その結果は、図２３に示されている。勘案すると、これらのデータから、ＴＭＥへの長期暴露後でも、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌで１回免疫すると、コントロールでの処置（ＴＡＡがコードされないＭＶＡ−ＢＮ）またはｒＭＶＡでの免疫の場合と比べて、Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇ比が上昇することが示されている。
【０３６５】
実施例１９：ＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌは、アゴニストのＣＤ４０ｍＡｂと比べて、ヒトにとって安全である。
【０３６６】
【表６】
2020531524.tif 000007
【０３６７】
表３に示されているように、ＰＢＳ、ＭＶＡ−ＯＶＡ（ｒＭＶＡ）、ＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）または抗ＣＤ４０（ＦＧＫ４．５）のいずれかをＣ５７ＢＬ／６マウスにＩＶ注射した（組み換えＭＶＡの用量は、５×１０７ＴＣＩＤ５０であり、抗ＣＤ４０の用量は、１００μｇであった）。毎回の免疫の１日後に、ＥＬＩＳＡによって、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血清中濃度を定量した。図２４に示されているように、ＡＬＴレベルは、抗ＣＤ４０の１回目の注射後に最も高かった。ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの１回目の免疫後のＡＬＴ濃度は、抗ＣＤ４０での処置後の２分の１であった。重要なことに、ｒＭＶＡ及びｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの反復免疫後の血清中ＡＬＴレベルは、上昇しなかった。抗ＣＤ４０抗体の反復注射によっても、ＡＬＴレベルは上昇しなかったが、この群では、４匹のマウスのうち、３匹が死亡した（ＦＤ＝死亡が認められた）。また、図２１に示されているように、ｒＭＶＡ及びｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌでの免疫後、抗ＣＤ４０免疫グロブリンを注射した場合と比べて、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血清中レベルの低下が見られた。したがって、アゴニストの抗ＣＤ４０で肝臓毒性が説明されたのとは対照的に（Ｍｅｄｉｎａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、ｒＭＶＡ及びｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌの反復ＩＶ注射後には、肝臓毒性は観察されなかった。
【０３６８】
実施例２０：ｒＭＶＡ−ＣＤ４０ＬをＩＶ投与した際の全生存率の向上及び腫瘍の縮小
ＭＶＡ−ＡＨ１Ａ５−ｐ１５−ＴＲＰ２−ＣＤ４０Ｌ（ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ）で、触知可能なＣＴ２６．ＨＥＲ２腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスをＩＶ免疫するか、またはＰＢＳを投与するかした。腫瘍の成長を一定間隔で測定した。図２５に示されているのは、腫瘍の平均体積（Ａ）及び生存率（Ｂ）である。これらのデータから、大腸癌モデルにおいて、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌで治療的免疫を１回行うことは、生存期間を効率的に延長することが示されている。
【０３６９】
実施例２１：ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ＋抗Ｔｒｐ１をＩＶ投与した際の全生存率の向上及び腫瘍の縮小
８日目に、５×１０７ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＯＶＡ−ＣＤ４０Ｌ（ｍＢＮｂｃ１１５）で、触知可能なＢ１６．ＯＶＡ腫瘍（少なくとも体積６０ｍｍ３）を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを静脈内免疫した。マウスに２００μｇの抗Ｔｒｐ１（クローンＴＡ９９）を週に２回、腹腔内注射した（５日目に開始した）。結果は、腫瘍の平均体積については図２６Ａに、全生存率については図２６Ｂに示されている。図に示されているように、ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ及び抗Ｔｒｐ１  ｍＡｂの組み合わせによって、抗Ｔｒｐ１  ｍＡｂ単独及びｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ単独の場合と比べて、腫瘍体積の全体的な縮小及び全生存率の向上が見られた。したがって、腫瘍特異的抗体及びｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌを組み合わせたものを静脈内投与すると、単独でｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌを非ＩＶ投与するかまたは抗体を投与する場合と比べて、抗腫瘍活性が有意に向上した。
【０３７０】
実施例２２：組み換えＭＶＡウイルスＭＶＡ−ｍＢＮ４４５、ＭＶＡ−ｍＢＮ４５１、ＭＶＡ−ｍＢＮｂｃ１９７、ＭＶＡ−ｍＢＮｂｃ１９５、ＭＶＡ−ｍＢＮｂｃ３８８、ＭＶＡ−ｍＢＮ  ｂｃ３８９及びＭＶＡ−ｍＢＮ４８４の構築
本発明の併用療法の要素（例えば、ＭＶＡ−ｍＢＮ４４５、ＭＶＡ−ｍＢＮ４５１及びＭＶＡ−ｍＢＮ４８４）を具体化する組み換えＭＶＡウイルスの作製は、示されている導入遺伝子を、そのプロモーターとともに、ベクターＭＶＡ−ＢＮに挿入することによって行った。導入遺伝子は、その導入遺伝子及び選択カセット、ならびにＭＶＡ−ＢＮ内の標的遺伝子座と相同な配列を含む組み換えプラスミドを用いて挿入した。ウイルスゲノムと組み換えプラスミドの間の相同組み換えは、ＭＶＡ−ＢＮに感染したＣＥＦ細胞に組み換えプラスミドをトランスフェクションすることによって行った。続いて、第２の工程の際に、ＣＲＥ−リコンビナーゼ（選択カセットに隣接するｌｏｘＰ部位を特異的に標的として、それによって、その介在配列を切り出す）を発現するプラスミドの助けを借りて、その選択カセットを除去した。
【０３７１】
ＭＶＡ−ＢＮ  ｍＢＮｂｃ１９７及びＭＶＡ−ＢＮ  ｍＢＮｂｃ１９５の構築の際には、ｍＢＮｂｃ１９７（ＭＶＡ−ＯＶＡ−ＴＲＰ２）では２個の導入遺伝子、ｍＢＮｂｃ１９５（ＭＶＡ−ＯＶＡ−ＴＲＰ２−ＣＤ４０Ｌ）では３個の導入遺伝子に対して、組み換えプラスミドを使用した。プラスミドには、ＭＶＡにも存在するインサート配列を含めた。ＭＶＡウイルスゲノムでの相同組み換えが行われるように、ＯＶＡ、ならびにＴＲＰ２及び／またはＣＤ４０Ｌ抗原をコードするヌクレオチド配列は、ＭＶＡインサート配列の間に位置していた。したがって、コンストラクトごとに、ＯＶＡ、ならびにＴＲＰ２及び／またはＣＤ４０Ｌのコード配列を、それぞれプロモーターの下流に含むプラスミドを構築した。
【０３７２】
ｍＢＮ４５１の構築の際には、組み換えプラスミドに、ＨＥＲ２ｖ１（配列番号１）及びＢｒａｃｈｙｕｒｙ（配列番号３）という２つの導入遺伝子を含め、ウイルスゲノムでの相同組み換えが行われるように、それらの遺伝子の前にはそれぞれ、プロモーター配列と、ＭＶＡ−ＢＮ内の標的挿入部位と同一である配列を配置した。ＨＥＲ２のコード配列（すなわちヌクレオチド配列）は、配列番号２であり、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙのコード配列は、配列番号４である。
【０３７３】
ｍＢＮ４４５の構築の際には、組み換えプラスミドに、ＨＥＲ２ｖ１（配列番号１）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（配列番号３）及びＣＤ４０Ｌ（配列番号１１）という３つの導入遺伝子を含め、ウイルスゲノムでの相同組み換えが行われるように、それらの遺伝子の前にはそれぞれ、プロモーター配列と、ＭＶＡ−ＢＮ内の標的挿入部位と同一である配列を配置した。ＨＥＲ２のコード配列（すなわちヌクレオチド配列）は、配列番号２であり、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙのコード配列は、配列番号４であり、ＣＤ４０Ｌのコード配列は、配列番号１２である。
【０３７４】
ｍＢＮｂｃ３８８の構築の際には、組み換えプラスミドに、ＨＥＲ２ｖ１（配列番号１）、Ｔｗｉｓｔ（配列番号１５）及びＣＤ４０Ｌ（配列番号１７）という３つの導入遺伝子を含め、それらの遺伝子の前にはそれぞれ、ウイルスゲノムでの相同組み換えが行われるように、プロモーター配列と、ＭＶＡ−ＢＮ内の標的挿入部位と同一である配列を配置した。ＨＥＲ２ｖ１のコード配列（すなわちヌクレオチド配列）は、配列番号２であり、Ｔｗｉｓｔのコード配列は、配列番号１６であり、ＣＤ４０Ｌのコード配列は、配列番号１８である。
【０３７５】
ｍＢＮｂｃ３８９の構築の際には、組み換えプラスミドに、ＨＥＲ２ｖ１（配列番号１）及びＴｗｉｓｔ（配列番号１５）という２つの導入遺伝子を含め、ウイルスゲノムでの相同組み換えが行われるように、それらの遺伝子の前にはそれぞれ、プロモーター配列と、ＭＶＡ−ＢＮ内の標的挿入部位と同一である配列を配置した。ＨＥＲ２のコード配列（すなわちヌクレオチド配列）は、配列番号２であり、Ｔｗｉｓｔのコード配列は、配列番号１６である。
【０３７６】
ｍＢＮ４８４の構築の際には、組み換えプラスミドに、ＨＥＲ２ｖ．２（配列番号１３）、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（配列番号３）及びＣＤ４０Ｌ（配列番号１１）という３つの導入遺伝子を含め、ウイルスゲノムでの相同組み換えが行われるように、それらの遺伝子の前にはそれぞれ、プロモーター配列と、ＭＶＡ−ＢＮ内の標的挿入部位と同一である配列を配置した。ＨＥＲ２ｖ．２のコード配列（すなわちヌクレオチド配列）は、配列番号１４であり、Ｔｗｉｓｔのコード配列は、配列番号４であり、ＣＤ４０Ｌのコード配列は、配列番号１２である。
【０３７７】
上記のｍＢＮ  ＭＶＡ（例えば、ｍＢＮ４４５、ｍＢＮ４５１及びｍＢＮ４８４）の作製の際には、ＣＥＦ細胞培養物にそれぞれ、ＭＶＡ−ＢＮを接種し、それぞれ、対応する組み換えプラスミドをトランスフェクションした。そして、選択圧を誘導する薬剤を含む培地中で、これらの細胞培養液由来の試料をＣＥＦ培養物に接種し、プラーク純化によって、蛍光発現ウイルスクローンを単離した。これらのウイルスクローンから、蛍光タンパク質を含む選択カセットを喪失させることは、第２の工程において、各コンストラクト内の選択カセットに隣接する２つのｌｏｘＰ部位を伴うＣＲＥ媒介性組み換えによって媒介させた。第２の組み換え工程後、ＭＶＡ−ＢＮの標的遺伝子座に挿入されたプロモーターとともに、導入遺伝子配列のみ（例えば、ＨＥＲ２、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ及び／またはＣＤ４０Ｌ）が保持されていた。プラーク純化したウイルスであって、選択カセットを欠損したウイルスのストックが調製された。
【０３７８】
続いて、記載されているコンストラクトを接種した細胞において、特定した導入遺伝子の発現が示された（例えば、図２７を参照）。
【０３７９】
細菌人工染色体（ＢＡＣ）におけるクローン化型のＭＶＡ−ＢＮを用いることによって、ＭＶＡ−ｍＢＮｂｃ１９７、ｍＢＮｂｃ１９５、ｍＢＮｂｃ３８８及びｍＢＮｂｃ３８９を作製した。ｍＢＮｂｃ１９７（ＭＶＡ−Ｏｖａ−Ｔｒｐ２）、ｍＢＮｂｃ１９５（ＭＶＡ−Ｏｖａ−Ｔｒｐ２−ＣＤ４０Ｌ）、ｍＢＮｂｃ３８８及びｍＢＮｂｃ３８９に対して、異なる導入遺伝子を含む組み換えプラスミドを使用した。プラスミドには、ＭＶＡにも存在する配列を含めたので、組み込み部位を特異的に標的にできるようになる。ＯＶＡ、Ｈｅｒ２ｖ１、ＴｗｉｓｔＴｒｐ２及び／またはＣＤ４０Ｌ抗原をコードするヌクレオチド配列は、ＭＶＡウイルスゲノムでの組み換えを可能にするＭＶＡ配列間に置いた。すなわち、コンストラクトごとに、それぞれプロモーターの下流に、ＯＶＡ、Ｈｅｒ２ｖ１、Ｔｗｉｓｔ、Ｔｒｐ２及び／またはＣＤ４０Ｌのコード配列を含むプラスミドを構築した。簡潔に述べると、ＢＡＣ  ＤＮＡをＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションして、それらの細胞を、ヘルパーウイルスとしてのショープ線維腫ウイルスに重感染させることによって、感染性ウイルスをＢＡＣから再構成した。ＣＥＦ細胞培養物上で３回、追加継代後、ヘルパーウイルスを含まないＭＶＡ−ｍＢＮｂｃ１９７、ＭＶＡ−ｍＢＮｂｃ１９５、ＭＶＡ−ｍＢＮｂｃ３８８及びＭＶＡ−ｍＢＮｂｃ３８９を得た。ＭＶＡの例示的な作製法は、Ｂａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ  ｂｒｅａｋｓ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｓｔｒｏｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂ８Ｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ＣＤ８  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，”／．Ｖｉｒｏｌ．８４（１７）：８７４３−５２（２０１０）にも見られる。
【０３８０】
実施例２３：ＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ−ＣＤ４０Ｌの異種発現
ＨｅＬａ細胞を未処置のままにするか（モック）、またはＭＶＡ−ＢＮもしくはＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ−ＣＤ４０Ｌ（ＭＶＡ−ｍＢＮ４４５）に感染させるかした。一晩培養後、細胞を抗ＨＥＲ２−ＡＰＣ（クローン２４Ｄ２）、抗Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（ウサギポリクローナル）＋抗ウサギＩｇＧ−ＰＥ及び抗ＣＤ４０Ｌ−ＡＰＣ（クローンＴＲＡＰ１）で染色した。図２７Ａ〜２７Ｄに示されているように、フローサイトメトリー解析によって、３つのすべての導入遺伝子の発現が明らかになった。
【０３８１】
実施例２４：合成ＨＥＲ２タンパク質は、トラスツズマブ及びペルツズマブの結合を防ぐ。
【０３８２】
マウス大腸癌ＣＴ２６細胞をＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ−ＣＤ４０Ｌ（ＭＶＡ−ｍＢＮ４８４）に、ＭＯＩ１で感染させた。２４時間後、細胞を５μｇ／ｍｌのＨＥＲ２抗体トラスツズマブ、ペルツズマブまたは２４Ｄ２とインキュベートした。図に、クローン２４Ｄ２のＨＥＲ２染色に対して正規化したＨＥＲ２発現レベルが示されている。データは、平均±ＳＥＭとして表されており、２つの独立した実験を代表するものである。結果は、図２８に示されている。
【０３８３】
実施例２５：ＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ−ＣＤ４０ＬによるヒトＤＣの活性化の増強
プロトコール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，ＭＯ−ＤＣ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｔｏｏｌ  Ｂｏｘ）に従って、ヒトＰＢＭＣからＣＤ１４＋単球を濃縮後、単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を生成し、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で、７日間培養した。ＤＣをＭＶＡ−ＨＥＲ２−ＢｒａｃｈｙｕｒｙまたはＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ−ＣＤ４０Ｌで刺激した。図２９に示されているように、Ａ）ＣＤ４０Ｌ、Ｂ）ＣＤ８６及びＣ）クラスＩＩ  ＭＨＣの発現をフローサイトメトリーによって解析した。一晩培養後、Ｄ）に示されているように、上清中のＩＬ−１２ｐ７０の濃度をＬｕｍｉｎｅｘによって定量した。
【０３８４】
この実験によって、ｒＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ−ＣＤ４０ＬがヒトＤＣを刺激して、ＤＣの活性化を誘導し、すなわち、ＤＣが抗原を提示する能力を増強することが示されている。刺激されたヒトＤＣによるＴｈ１分極化及びＮＫ細胞活性化サイトカインＩＬ−１２ｐ７０の産生によって、ＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ−ＣＤ４０Ｌが、炎症誘発性表現型に対して、ヒトＤＣを活性化することが示されている。
【０３８５】
実施例２６：ｍＢＮｂｃ３８８及びｍＢＮｂｃ３８９を静脈内投与した際の全生存率の向上及び腫瘍の縮小
ＨＥＲ２を発現するマウス大腸癌ＭＣ３８細胞（ＭＣ３８．ＨＥＲ２）をＣ５７ＢＬ／６マウスにｓ．ｃ．注射した。ＨＥＲ２を発現するマウス大腸癌ＣＴ２６細胞（ＣＴ２６．ＨＥＲ２）をＢａｌｂ／ｃマウスにｓ．ｃ．注射した。いずれのマウス群においても、腫瘍が５０ｍｍ３を上回ったら、ＰＢＳ、ＭＶＡ−ＣＤ４０ＬまたはＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０Ｌのいずれかで、ＭＣ３８．ＨＥＲ２腫瘍を有するマウス（図３０Ａ及び３０Ｂ）、ならびにＣＴ２６．ＨＥＲ２腫瘍を有するマウス（図３１Ａ及び図３１Ｂ）をＩＶ免疫した（点線）。腫瘍の成長を一定間隔で測定した。Ａ）では、腫瘍の平均体積を測定し、Ｂ）では、腫瘍を有するマウスの、腫瘍接種後６０日目までの全生存率を測定した。
【０３８６】
Ｂｒａｃｈｙｕｒｙのマウスホモログは、正常なマウス組織において高度には発現せず、マウス腫瘍組織でも優勢には発現しないので、マウスモデル系においては、能動免疫療法の標的としてのＢｒａｃｈｙｕｒｙの有効性を効果的には調べることができない。ＷＯ２０１４／０４３５３５（参照により、本明細書に援用される）を参照されたい。ヒトＢｒａｃｈｙｕｒｙのマウスホモログであるＴｗｉｓｔがマウスモデルでは用いられており、ヒトにおけるＢｒａｃｈｙｕｒｙの機能の予測モデルである。このことは、ＷＯ２０１４／０４３５３５で実証された。Ｂｒａｃｈｙｕｒｙと同様に、ＥＭＴ調節因子Ｔｗｉｓｔのマウスホモログは、発生の際に、Ｅ−カドヘリン媒介性の細胞間接着をダウンレギュレートするとともに、間葉系マーカーをアップレギュレートすることによって、ＥＭＴを促し、マウス腫瘍組織において優勢に発現する。例えば、ＷＯ２０１４／０４３５３５の図５及び実施例８を参照されたい。したがって、マウスにおけるＴｗｉｓｔ特異的ながんワクチンの研究では、ヒトにおけるＢｒａｃｈｙｕｒｙ特異的ながんワクチンの有効性に関する強力な予測値が得られる可能性が非常に高い（同上）。
【０３８７】
実施例２７：ＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０Ｌ（ｍＢＮｂｃ３８８）の静脈内投与によって、ＨＥＲ２特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍への浸潤が増強される。
【０３８８】
ＣＴ２６．ＨＥＲ２腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスに、ＰＢＳまたは５ｘ１０７ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０Ｌを静脈内投与した。７日後、マウスを殺処分し、磁気細胞ソーティングによって、脾臓及び腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、ＨＥＲ２ペプチドをロードした樹状細胞の存在下で、５時間培養した。グラフには、ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのＣＤ４４＋ＩＦＮγ＋細胞の割合（％）が示されている。結果は、平均±ＳＥＭとして示されている。図３２に示されている結果から、本発明の各種実施形態が、腫瘍特異的であることが示されている。
【０３８９】
実施例２８：トラスツズマブと組み合わせて、ｍＢＮｂｃ３８８及びｍＢＮｂｃ３８９を静脈内投与した際の全生存率の向上及び腫瘍の縮小
平均体積が１００ｍｍ３を上回るＣＴ２６．ＨＥＲ２腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスに、ヒトＩｇＧ１またはトラスツズマブのいずれかを５μｇ、腫瘍接種後、１５日目に腹腔内投与した。図３１に示されているように、ヒトＩｇＧ１またはトラスツズマブの１回目の注射の２日後、マウスに、ＰＢＳまたは５ｘ１０７ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０Ｌを静脈内投与した。この実施例では、ヒトＩｇＧ１を、トラスツズマブに対する実験コントロールとして使用した。トラスツズマブがＨＥＲ２に結合するのに対して、ＩｇＧ１は、ＨＥＲ２に結合しないからである。腫瘍の成長及び全生存期間を一定間隔で測定した。（Ａ）は、腫瘍の平均体積であり、（Ｂ）は、経時的なマウス生存率である。
【０３９０】
図３３（Ａ）及び（Ｂ）に示されているように、ＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０Ｌをトラスツズマブと組み合わせることは、抗体の用量を低減した場合でも、実施例２１と比べて、大きめの腫瘍の縮小、及びこれらの大きい腫瘍を有するマウスの全生存率の向上に特に有効であった。
【０３９１】
実施例２９：同所乳癌モデルにおいて、ＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０ＬをＩＶ投与した際の全生存率及び腫瘍の縮小
５×１０７ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ（ｍＢＮｂｃ３８９）及び／またはＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０Ｌ（ｍＢＮｂｃ３８８）によって、同所４Ｔ１．ＨＥＲ２腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスをＩＶでプライミングする。腫瘍の成長を一定間隔で測定し、全生存率を記録することになる。
【０３９２】
実施例３０：ＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０Ｌ＋抗ＨＥＲ２のＩＶ投与による強力なＮＫ細胞媒介性傷害作用
５×１０７ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ、ＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔとともに、抗Ｈｅｒ２またはＰＢＳで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＩＶ免疫する。２４時間後、マウスを殺処分し、脾臓ＮＫ細胞を磁気細胞ソーティングによって精製し、エフェクター：標的殺傷アッセイにおいて、エフェクターとして使用することになる。簡潔に述べると、ＣＦＳＥで標識したクラスＩ  ＭＣＨ欠損ＹＡＣ−１細胞とともに、実施例４で示した比率で、ＮＫ細胞を培養する。フローサイトメトリーによって、非生存ＣＦＳＥ＋ＹＡＣ−１細胞を定量することによって、特異的殺傷率を評価する。
【０３９３】
実施例３１：ＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０Ｌ＋抗ＨＥＲ２のＩＶ投与によって、ＡＤＣＣが増強される。
【０３９４】
２５μｇの抗ＣＤ４、ＭＶＡ−ＨＥＲ２−ＴＷＩＳＴ−ＣＤ４０Ｌ＋５μｇのラットＩｇＧ２ｂもしくは１μｇの抗ＣＤ４、またはＭＶＡ−ＨＥＲ２−ＴＷＩＳＴ−ＣＤ４０Ｌ＋１μｇの抗ＣＤ４のいずれかで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＩＶ処置した。２４時間後、マウスを殺処分し、肝臓におけるＣＤ４  Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）の枯渇をフローサイトメトリーによって解析する。２５μｇの抗ＣＤ４を特異的殺傷率１００％とした。
【０３９５】
ＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性をエキソビボで評価するために、ＰＢＳ、ＭＶＡ−ＨＥＲ２−ＴＷＩＳＴまたはＭＶＡ−ＨＥＲ２−ＴＷＩＳＴ−ＣＤ４０Ｌのいずれかで、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｂ）またはＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃ）をＩＶ免疫する。２４時間後、マウスを殺処分し、脾臓ＮＫ細胞を磁気細胞ソーティングによって精製し、抗体依存性エフェクター：標的殺傷アッセイにおいて、エフェクターとして使用する。（Ｂ）標的のＭＣ３８−ＨＥＲ２細胞をマウス抗ヒト／マウスＨＥＲ２ｍＡｂで被覆する。標的のＣＴ２６−ＨＥＲ２細胞をマウス抗ヒトＨＥＲ２ｍＡｂで被覆する。抗体で被覆された標的細胞に、それぞれ５：１及び４：１の比率で、精製ＮＫ細胞を加える。細胞培養培地への乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を測定することによって、細胞死を判断する。
【０３９６】
実施例３２：ｒＭＶＡ−ＣＤ４０＋抗ＨＥＲ２（漸減濃度のＨＥＲ２抗体）をＩＶ投与した際の全生存率の向上及び腫瘍の縮小
８日目に、５×１０７ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＨＥＲ２−Ｔｗｉｓｔ−ＣＤ４０Ｌで、触知可能なＣＴ２６−ＨＥＲ２腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスをＩＶ免疫する。マウスに漸減用量の抗ＨＥＲ２（２００ｕｇ、１００ｕｇ、２５ｕｇ）を週に２回、腹腔内注射した（５日目に開始した）。２００μｇの抗ＨＥＲ２抗体のみを注射したマウス、及びＭＶＡ−ＨＥＲ２−ＴＷＩＳＴ−ＣＤ４０Ｌのみを注射したマウスと比較して、腫瘍の平均体積及び全生存率を解析する。
【０３９７】
実施例３３：ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ＋抗ＣＤ５２抗体をＩＶ投与した際の全生存率の向上及び腫瘍の縮小
腫瘍接種後、ＣＴ２６．ＣＤ５２腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスに、ヒトＩｇＧ１または抗ＣＤ５２（アレムツズマブ）のいずれかを５μｇ、腹腔内投与する。ヒトＩｇＧ１またはアレムツズマブの１回目の注射後、マウスに、ＰＢＳまたは５×１０７ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＣＤ５２−ＣＤ４０Ｌを静脈内投与する。腫瘍の成長及び全生存率を一定間隔で測定する。（Ａ）は、腫瘍の平均体積であり、（Ｂ）は、経時的なマウス生存率である。
【０３９８】
実施例３４：ｒＭＶＡ−ＣＤ４０Ｌ＋抗ＥＧＦＲ抗体をＩＶ投与した場合の全生存率の向上及び腫瘍の縮小
腫瘍接種後、ＣＴ２６．ＥＧＦＲ腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスに、ヒトＩｇＧ１または抗ＥＧＦＲ（セツキシマブ）のいずれかを５μｇ、腹腔内投与する。ヒトＩｇＧ１またはセツキシマブの１回目の注射後、マウスに、ＰＢＳまたは５×１０７ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ−ＥＧＦＲ−ＣＤ４０Ｌを静脈内投与する。腫瘍の成長及び全生存率を一定間隔で測定する。（Ａ）は、腫瘍の平均体積であり、（Ｂ）は、経時的なマウス生存率である。
【０３９９】
本明細書に記載されている方法または組成物の正確な詳細は、記載されている本発明の趣旨から逸脱せずに、変更または修正し得ることは明らかであろう。我々は、下記の請求項の範囲及び趣旨の範囲内であるこのような修正形態及び変更形態のすべてを特許請求する。
【０４００】
配列表
付随の配列表に列挙されている核酸配列及びアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基の標準的な略記及びアミノ酸の１文字の略号または３文字の略号のいずれかを用いて、米国特許法施行規則１．８２２に定義されているようにして示されている。各核酸配列の一本鎖のみが示されているが、示されている鎖に言及することによって、相補鎖が含まれるものとして理解する。
【０４０１】
配列番号１
合成Ｈｅｒ２ｖ１のアミノ酸配列（１，１４５アミノ酸）：
【０４０２】
【表７】
2020531524.tif 000008
【０４０３】
配列番号２
合成Ｈｅｒ２ｖ１のヌクレオチド配列（３４４１ヌクレオチド）：
【０４０４】
【表８】
2020531524.tif 000009
2020531524.tif 000010
【０４０５】
配列番号３
合成Ｂｒａｃｈｙｕｒｙのアミノ酸配列（４２７アミノ酸ヌクレオチド）：
【０４０６】
【表９】
2020531524.tif 000011
2020531524.tif 000012
【０４０７】
配列番号４
合成Ｂｒａｃｈｙｕｒｙのヌクレオチド配列（１，２８７ヌクレオチド）：
【０４０８】
【表１０】
2020531524.tif 000013
【０４０９】
配列番号５（４３５アミノ酸）
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｏ１５１７８．１のＢｒａｃｈｙｕｒｙタンパク質アイソフォーム１
【０４１０】
【表１１】
2020531524.tif 000014
【０４１１】
配列番号６（１３０８ヌクレオチド）
Ｂｒａｃｈｙｕｒｙタンパク質アイソフォーム１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｏ１５１７８．１）のコード配列
【０４１２】
【表１２】
2020531524.tif 000015
2020531524.tif 000016
【０４１３】
配列番号７（４３５アミノ酸）
Ｂｒａｃｈｙｕｒｙタンパク質アイソフォーム１（Ｌ２５４Ｖ）
【０４１４】
【表１３】
2020531524.tif 000017
【０４１５】
配列番号８（１３０８ヌクレオチド）
Ｌ２５４Ｖを有するＢｒａｃｈｙｕｒｙタンパク質アイソフォーム１をコードするコード配列
【０４１６】
【表１４】
2020531524.tif 000018
【０４１７】
配列番号９（４４９アミノ酸）
Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ−Ｉ３融合タンパク質
【０４１８】
【表１５】
2020531524.tif 000019
2020531524.tif 000020
【０４１９】
配列番号１０（１３５０ヌクレオチド）
配列番号９のＩ３  Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ融合タンパク質をコードするコード配列
【０４２０】
【表１６】
2020531524.tif 000021
【０４２１】
配列番号１１
ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００００６５．１のｈＣＤ４０Ｌ（２６１アミノ酸）
【０４２２】
【表１７】
2020531524.tif 000022
【０４２３】
配列番号１２
ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＰ＿００００６５．１のｈＣＤ４０Ｌのヌクレオチド配列（７８９ヌクレオチド）：
【０４２４】
【表１８】
2020531524.tif 000023
2020531524.tif 000024
【０４２５】
配列番号１３
合成Ｈｅｒ２ｖ２のアミノ酸配列（１，１４５アミノ酸）：
【０４２６】
【表１９】
2020531524.tif 000025
【０４２７】
配列番号１４
合成Ｈｅｒ２ｖ２のヌクレオチド配列（３４４１ヌクレオチド）：
【０４２８】
【表２０】
2020531524.tif 000026
2020531524.tif 000027
【０４２９】
配列番号１５
合成Ｔｗｉｓｔのアミノ酸配列（２０５アミノ酸）：
【０４３０】
【表２１】
2020531524.tif 000028
【０４３１】
配列番号１６
合成Ｔｗｉｓｔのヌクレオチド配列（６１８ヌクレオチド）：
【０４３２】
【表２２】
2020531524.tif 000029
【０４３３】
配列番号１７
合成マウスＣＤ４０Ｌのアミノ酸配列（２６０アミノ酸）：
【０４３４】
【表２３】
2020531524.tif 000030
【０４３５】
配列番号１８
合成マウスＣＤ４０Ｌのヌクレオチド配列（７８６ヌクレオチド）：
【０４３６】
【表２４】
2020531524.tif 000031
【０４３７】
参照文献
下に列挙されているものに加えて、本開示の一部として含まれる参照文献は、その全体が、参照により本明細書に援用される。
【０４３８】
［１］Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ，Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  ｒｅｐｏｒｔ，２０１３．
［２］Ｌ．Ａ．Ｔｏｒｒｅ，，，Ｇｌｏｂａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，“ＣＡ：Ａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ，２０１２．
［３］Ｊ．Ｓ．Ｒｏｓｓ，，，Ｔｈｅ  Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ２００３：ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｙ．，“Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，２００３．
［４］Ｃ．Ｐａｌｅｎａ，，，Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｂｏｘ  ｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ  ｉｓ  ａ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  Ｔ−ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，“Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００７．
［５］Ｎ．Ｅ．Ｈｙｎｅｓ  ｕｎｄ  Ｈ．Ａ．Ｌａｎｅ，，，ＥＲＢＢ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ：ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，“Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，２００５．
［６］Ｈ．Ｓ．Ｃｈｏ，，，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ＨＥＲ２  ａｌｏｎｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  Ｆａｂ，“Ｎａｔｕｒｅ，２００３．
［７］Ｓ．Ｓａｔｙａｎａｒａｙａｎａｊｏｉｓ，，，Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  Ｄｏｃｋｉｎｇ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ＨＥＲ２−Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ，“Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ，２００９．
［８］Ｍ．Ｃ．Ｆｒａｎｋｌｉｎ，，，Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ＥｒｂＢ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥｒｂＢ２−ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ  ｃｏｍｐｌｅｘ，“Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２００４．
［９］Ｒ．Ｙａｎｇ，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  ＥＲＢＢ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ａｌｌ  Ｔｈｅｓｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｓ（ＥＴＤｓ）．Ｐａｐｅｒ  ３９１，２００９．
［１０］Ｍ．Ｔａｎ，，，ＥｒｂＢ２  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｓｒｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ｎｏｖｅｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｓｒｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｆｅｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，“Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２００５．
［１１］Ｒ．Ｊ．Ｒｏｓｋｏｓｋｉ，，，ＥｒｂＢ／ＨＥＲ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，“Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｓ，２０１４．
［１２］Ｍ．Ｒｏｓｅｌｌｉ，，，Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ，ａ  ｄｒｉｖｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ｉｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ：ａｎ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ，“Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１２．
［１３］Ｊ．Ｚ．Ｓｔｏｌｌｅｒ  ｕｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｅｐｓｔｅｉｎ，，，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｉｎ  Ｔｂｘ１  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｉｎ  ＤｉＧｅｏｒｇｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｈａｒｂｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  １２２３ｄｅｌＣ  ｍｕｔａｔｉｏｎ，“Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ，２００５．
［１４］Ｈ．Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ，，，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｄｊｕｖａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＭＶＡ  ｗｉｔｈ  ＣＤ４０Ｌ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ  ＣＤ８  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，“Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１３．
［１５］Ａ．Ｇｕａｒｄｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｐｈａｓｅ  Ｉ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  ＭＶＡ−ＢＮ（Ｒ）−ＨＥＲ２  ｉｎ  ＨＥＲ−２  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，６９（２４  Ｓｕｐｐ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ｎｒ  ５０８９（２００９）．
［１６］Ｃ．Ｈｅｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｓｅ  Ｉ，ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ，ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ＭＶＡ−Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ−ＴＲＩＣＯＭ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｂｒａｃｈｙｕｒｙ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ，３：（Ｓｕｐｐｌ  ２）Ｐ１３２（２０１５）．
［１７］Ｂｒｏｄｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉ−Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｆｒｏｍ  ｐ５３  ｓｔａｔｕｓ，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ（２００１）．
［１８］Ｓｔａｃｋａｒｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．１２（８）：８７５−８４  （２０１３  Ａｕｇ）．
［１９］Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ  ａｎｄ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：３０４（２０１７）．
［２０］  Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｅｖａｌｕｌａｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ  ６（Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ  １９７７２）；（Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１６）．
［２１］Ｂｒｏｕｓｓａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＬＤＨ）ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，９８８：３０５−３１７（２０１３）．
［２２］Ｔａｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＴｒｉＫＥｓ  ａｎｄ  ＢｉＫＥｓ  ｊｏｉｎ  ＣＡＲｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｈｉｇｈｗａｙ，Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｖｏｌ  １２：２７９０−２７９６（２０１６）．
［２３］Ｋｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｃｌａｓｓ  Ｉ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １０：２５３８−２５４４（Ａｐｒｉｌ  ２００４）．
【図１】
2020531524.tif 000032
【図２】
2020531524.tif 000033
【図３】
2020531524.tif 000034
【図４】
2020531524.tif 000035
【図５】
2020531524.tif 000036
【図６】
2020531524.tif 000037
【図７】
2020531524.tif 000038
【図８】
2020531524.tif 000039
【図９】
2020531524.tif 000040
【図１０】
2020531524.tif 000041
【図１１】
2020531524.tif 000042
【図１２】
2020531524.tif 000043
【図１３】
2020531524.tif 000044
【図１４−１】
2020531524.tif 000045
【図１４−２】
2020531524.tif 000046
【図１５】
2020531524.tif 000047
【図１６】
2020531524.tif 000048
【図１７】
2020531524.tif 000049
【図１８】
2020531524.tif 000050
【図１９】
2020531524.tif 000051
【図２０】
2020531524.tif 000052
【図２１−１】
2020531524.tif 000053
【図２１−２】
2020531524.tif 000054
【図２２】
2020531524.tif 000055
【図２３】
2020531524.tif 000056
【図２４】
2020531524.tif 000057
【図２５】
2020531524.tif 000058
【図２６】
2020531524.tif 000059
【図２７】
2020531524.tif 000060
【図２８】
2020531524.tif 000061
【図２９】
2020531524.tif 000062
【図３０】
2020531524.tif 000063
【図３１】
2020531524.tif 000064
【図３２】
2020531524.tif 000065
【図３３】
2020531524.tif 000066
【配列表】
2020531524000001.app
【国際調査報告】
2020531524.tif 000067
2020531524.tif 000068
2020531524.tif 000069
2020531524.tif 000070
2020531524.tif 000071