(57)【要約】  ここに開示されるのは、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を受ける被験体におけるサイトカイン放出症候群あるいはサイトカイン急増の発生を阻害するか減らすための組成物とその使用法、がんまたは腫瘍を処置する方法、腫瘍量を減少させる方法、がんまたは腫瘍の大きさまたは成長速度を小さくする方法、がんまたは腫瘍に罹った被験体の生存期間を延長する方法である。被験体にアポトーシス細胞又はアポトーシス細胞上清を含む組成物が投与される。組成物とその使用法はＣＡＲ−Ｔ細胞がん治療の効果を高めうる。サイトカイン放出症候群又はサイトカイン急増を患っている被験体におけるサイトカイン生成を低減するか阻害する組成物とその使用法も開示される。特定の例では、組成物は追加の化学療法薬又は免疫調節剤を含んでもよい。【選択図】図２１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体のがんもしくは腫瘍を治療もしくは予防し、がんもしくは腫瘍の成長を阻害し、病気の進行を遅らせ、腫瘍量を低減し、またはがんもしくは腫瘍の発生を低減する、もしくはそれらの任意の組み合わせを伴う方法であって、該方法は、初期アポトーシス細胞集団を含む組成物を前記被験体に投与する工程を含み、前記初期アポトーシス細胞集団を投与しない被験体と比べて、該方法は被験体のがんもしくは腫瘍を治療もしくは予防し、がんもしくは腫瘍の成長を阻害し、病気の進行を遅らせ、腫瘍量を減少し、またはがんもしくは腫瘍の発生を低減する、またはそれらの任意の組み合わせを伴う、方法。
【請求項２】
前記がんもしくは腫瘍の大きさ、またはそれらの成長速度、または大きさと成長速度の組み合わせが減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体の生存期間が延長される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記初期アポトーシス細胞集団は、
ａ．単核富化細胞集団、
ｂ．２４時間を超えて安定なアポトーシス集団、
ｃ．細胞凝集体を含まないアポトーシス集団、
ｄ．減少した活動中の非アポトーシス細胞、活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、もしくはそれらの組み合わせを含む単核アポトーシス細胞集団、または
それらの任意の集団の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記初期アポトーシス細胞集団は初期アポトーシス細胞のプール集団を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記被験体はヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記がんまたは腫瘍は固形腫瘍または非固形腫瘍を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記非固形がんまたは腫瘍は、造血器腫瘍、血液細胞がん、白血病、骨髄異形成症候群、リンパ腫、多発性骨髄腫（形質細胞性骨髄腫）、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、または形質細胞性白血病を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記固形腫瘍は、肉腫もしくは細胞腫、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、膵がんもしくは膵腫瘍、乳がんもしくは乳腫瘍、卵巣がんもしくは卵巣腫瘍、前立腺がんもしくは前立腺腫瘍、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭状腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝細胞がん、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性がん腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸がんもしくは頸部腫瘍、子宮がんもしくは子宮腫瘍、精巣がんもしくは精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、グリオーマ、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、シュワン腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、または網膜芽細胞腫を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記腫瘍またはがんは、腫瘍またはがんの転移を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記投与は前記初期アポトーシス細胞集団の単回注入を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記投与は前記アポトーシス細胞集団の複数回注入を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記被験体への追加の免疫療法、化学療法薬、免疫調節薬、またはそれらの組み合わせを投与する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記追加の免疫療法、化学療法薬、または免疫調節薬は、前記初期アポトーシス細胞の投与以前、投与と同時、または投与後に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記免疫療法はＣＡＲ−Ｔ細胞を投与する工程を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＣＡＲ−Ｔ細胞は投与されるが初期アポトーシス細胞は投与されない被験体と比べて、前記方法は前記ＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性を向上させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫調節薬は抗体またはその機能的断片を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体またはその機能的断片はリツキシマブ（ＲｔＸ）抗体またはその機能的断片を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法は第一選択療法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法は補助療法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法は微小残存病変を減らし、寛解を増大させ、寛解の期間を延長し、腫瘍の再発率を減らし、前記腫瘍もしくはがんの転移を予防し、前記腫瘍もしくはがんの転移率を減らし、またはそれらの任意の組み合わせの効果を持つ、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）小さな百分率の活動中の非アポトーシス生細胞、
（ｂ）活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、
（ｃ）増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、または
それらの任意の組み合わせを含む、
初期アポトーシス状態の単核細胞を含む単核アポトーシス細胞の集団。
【請求項２３】
前記活動中の非アポトーシス生細胞の前記小さな百分率は１０％未満である、請求項２２に記載の集団。
【請求項２４】
前記単核アポトーシス細胞の集団は非アポトーシス生細胞を含まない、請求項２２に記載の集団。
【請求項２５】
前記単核細胞集団はリンパ球、単球、樹状細胞、およびナチュラルキラー細胞からなる群から選択される、請求項２２に記載の集団。
【請求項２６】
前記単核アポトーシス細胞の集団は、初期アポトーシス細胞の生成後に照射されたものである、請求項２２に記載の集団。
【請求項２７】
前記照射はγ線照射または紫外線照射を含む、請求項２６に記載の集団。
【請求項２８】
前記照射された細胞集団は、非照射アポトーシス細胞集団と比べて小さな百分率の活動中の非アポトーシス細胞を含む、請求項２６に記載の集団。
【請求項２９】
請求項２２に記載の集団および医薬的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項３０】
小さな百分率の活動中の非アポトーシス生細胞、活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、またはそれらの任意の組み合わせの細胞を含む単核アポトーシス細胞の集団を生成する方法であって、該方法は：
（ａ）抹消血の単核富化細胞集団を取得する工程、
（ｂ）抗凝固薬を含む凍結培地中で前記単核富化細胞集団を凍結する工程、
（ｃ）前記単核富化細胞集団を解凍する工程、
（ｄ）最終濃度が約１０〜１００μｇ／ｍＬのメチルプレドニゾロンおよび抗凝固薬を含むアポトーシス誘導インキュベーション培地で前記単核富化細胞集団をインキュベートする工程、
（ｅ）投与培地に前記アポトーシス細胞集団を再懸濁する工程、および
（ｆ）前記工程（ｅ）に引き続き行われる前記単核富化集団を不活性化する工程を含み、
該方法は小さな百分率の活動中の非アポトーシス細胞、活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、またはそれらの細胞の任意の組み合わせ含む単核アポトーシス細胞の集団を生成する、方法。
【請求項３１】
前記不活性化工程は、前記単核アポトーシス細胞調製の範囲内で、活動中の非アポトーシス細胞の前記百分率を減少させる工程、任意の非アポトーシス生存細胞の活性化を抑制する工程、任意の非アポトーシス生存細胞の増殖を減らす工程、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記活動中の非アポトーシス細胞の前記百分率は約１０％に減じられる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記活動中の非アポトーシス細胞の前記百分率は約０％に減じられる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記単核富化細胞集団はリンパ球、単球、樹状細胞、およびナチュラルキラー細胞からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記インキュベートする工程は約２〜１２時間にわたる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記単核富化細胞集団を不活性化する工程（ｆ）は、免疫応答を抑制または排除する工程、細胞の交差反応性を抑制もしくは排除する工程、またはＴ細胞受容体活性を低下させるか排除する工程を含み、前記集団は小さな百分率の非アポトーシス生存細胞、活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、またはそれらの細胞の任意の組み合わせを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記不活性化工程（ｆ）は前記工程（ｅ）で生成される単核富化アポトーシス細胞集団を照射する工程を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記照射はγ線照射または紫外線照射を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記照射は約２５〜５０グレイ（Ｇｙ）を含む、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書ではＣＡＲ−Ｔ細胞（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔ−ｃｅｌｌ）癌療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ：ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）またはサイトカイン急増（ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｔｏｒｍ）の発生を阻害または低減させる組成物およびその方法を開示する。さらに、本明細書ではサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を患っている被験体のサイトカイン産生を低減または阻害する組成物およびその方法を開示する。さらに本明細書で開示する組成物を、被験体のがんもしくは腫瘍を治療し、予防し、その成長を阻害し、またはその発生を低減させるために使用してもよい。組成物をがんまたは腫瘍を患う被験体の生存期間を延長するために使用してもよい。使用する組成物を単独で投与してもよいし、その他の化学療法と組合せて投与してもよい。本明細書で開示する方法には、アポトーシス細胞もしくはアポトーシス細胞上清を含む組成物を単独で、またはアポトーシス細胞もしくはアポトーシス細胞上清を含む組成物をＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法と組合せて投与する工程を含む方法が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
がんの標準的な治療は、手術、化学療法および放射線療法であるが、標的免疫療法などの改良法の開発や検討が現在進行中である。期待される１つの技術では、養子細胞移植（ＡＣＴ：ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）を使用しており、この技術では、自らの腫瘍を認識し攻撃するように免疫細胞が改変されている。ＡＣＴの一例として、腫瘍細胞の表面に発現する腫瘍特異抗原を標的としたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ−Ｔ細胞）を発現するように被験体自らのまたはドナーの細胞傷害性Ｔ細胞を操作することが挙げられる。これらのＣＡＲ−Ｔ細胞は、これにより腫瘍特異抗原を発現する細胞のみに対し細胞傷害性となる。臨床試験により、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、進行した急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）およびリンパ腫等を制御する顕著な可能性を有することが示された。
【０００３】
しかし、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法およびその他の免疫療法を受けた被験体の一部は、注入され活性化されたＴ細胞が全身性炎症反応を引き起こし、急激かつ大量のサイトカインが血流に放出され、これにより危険な低血圧、高熱および悪寒を引き起こすサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）と呼ばれる危険で時には生命を脅かす副作用を経験することがある。
【０００４】
重症なＣＲＳの場合には、サイトカインと白血球との間に正のフィードバックループがあり、サイトカインの濃度が非常に高まるサイトカイン急増（別名、サイトカインカスケードまたは高サイトカイン血症）を被験体は経験する。これは、心臓の機能不全、成人呼吸窮迫症候群、神経毒性、腎臓不全および／または肝臓不全、肺水腫、播種性血管内凝固症候群を含む生命を脅かす危険のある合併症を引き起こす可能性がある。
【０００５】
例えば、Ｔ細胞表面のＣＤ２８受容体に結合するモノクローナル抗体ＴＧＮ１４１２を投与された最近のフェーズＩ治験での６人の被験体は、サイトカイン急増および多臓器不全という重篤な症例を示した。ＴＧＮ１４１２の投与量が動物で安全とされた量（Ｓｔ．  Ｃｌａｉｒ  ＥＷ：  Ｔｈｅ  ｃａｌｍ  ａｆｔｅｒ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｔｏｒｍ：  Ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＴＧＮ１４１２  ｔｒｉａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１８：  １３４４−１３４７，  ２００８を参照）の５００分の１未満であったにもかかわらず、このような症例が発生した。
【０００６】
現在のところ、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を受けた被験体のサイトカイン放出症候群を制御する副腎皮質ステロイド、抗ＩＬ６療法などの生物学的療法および抗炎症薬の評価が行われている。しかし、ステロイドはＣＡＲ−Ｔ細胞の活性および／または増殖に影響を及ぼし、被験体を敗血症および日和見感染症の危険に曝す可能性がある。抗炎症薬は、サイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を制御するのに有効ではない可能性があり、その理由はサイトカイン急増には非常に多数のサイトカインを含み、被験体に抗炎症薬を注入する能力が限定的となるためである。ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の潜在能力を確実にするためには、サイトカイン放出症候群および特にサイトカイン急増を制御するための新たな手段が必要となる。
【０００７】
サイトカイン急増は、他の感染性刺激の後および非感染性刺激の後でも問題となる。サイトカイン急増では、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−６，インターフェロンｇ（ｇ−ＩＦＮ）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）などの多数の炎症誘発性サイトカインが放出され、これにより低血圧症、出血、および最終的には多臓器不全を引き起こす。このサイトカイン急増は、１９１８年のＨ１Ｎ１インフルエンザの大流行および近々の鳥インフレエンザＨ５Ｎ１感染において、健全な免疫系を有していたと推定される若年者の致死率が比較的高かった原因でもある。この症候群はまた、重症な急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、エプスタイン−バーウイルス関連血球貧食性リンパ組織球症、グラム陰性菌性敗血症、マラリアおよびエボラ感染症を含む数多くのその他の感染症の進行期または終末期において発生することが既に知られていた。
【０００８】
サイトカイン急増はまた、急性膵炎、重症の火傷または外傷、または急性の呼吸促迫症候群などの非感染要因からも発生する可能性がある。したがって、サイトカイン放出症候群および特にサイトカイン急増を制御するための新たな手段が必要となる。
【０００９】
がんは、１つ以上の細胞集団が無制限に増殖し正常な生体機能を妨げる異常な状態のことである。増殖性変化は、通常低分化でより発生的に始原状態への復帰変異を含む細胞特性への他の変化を伴う。がんのインビトロ相関物は細胞形質転換と呼ばれる。一般的に形質転換した細胞は、いくつかまたはすべての特性、すなわち球状形態、胎児性抗原の発現、成長因子独立、接触阻止の欠如、足場非依存性、および高密度増殖を示す。
【００１０】
肺がんおよび皮膚がんなどの悪性疾患による致死の主因は、転移の拡大から起こる。がんは診断時までには転移していることが多く、またこのステージより前にがんと診断された場合であっても、いずれは転移を起こす能力を持つ初期病変組織を外科的に完全切除するかまたは破壊することが実現可能ではないために、多くの場合転移性疾患の発症を防ぐことはできない。転移性病変が小さいこと、および／または初期病変中の転移性病変の存在を確実に予知する信頼できるマーカーがないことから、転移性疾患を初期ステージで診断することが不可能である場合がある。その病変には到達しづらく、播種性で局在がはっきりしないので、その病変を切除法により治療することは困難あるいは不可能である。ある種の転移悪性腫瘍の治療として選択される現行法である化学療法や放射線療法には、しばしば効果がないか、あっても最適ではなく、特に有害な副作用および／または致死の可能性がある副作用に誘導するという重大な欠点がある。
【００１１】
抗原提示細胞（ＡＰＣ：ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）のワクチン接種などの免疫療法による癌治療法は、到達しづらく、播種性でかつ顕微鏡レベルの大きさで、再発性があり、および／または局在がはっきりしない癌病変を有効に治療するために最適である潜在能力を有している。免疫療法での期待される手段の一つとして、全身にわたる抗腫瘍免疫を誘発する樹状細胞（ＤＣ）などの特定のＡＰＣを使用することが含まれる。
【００１２】
樹状細胞は、抗原産生性であり、抗原物質を処理しかつ細胞表面で抗原物質を免疫システムのＴ細胞に提示する哺乳動物の免疫系細胞を提示し、それによりＴ細胞を新たな抗原およびリコール抗原の両方に対して感作させることができる。ＤＣは最も強力な抗原産生細胞であり、自然免疫系と適応免疫系の間のメッセンジャーの役割を果たしている。ＤＣ細胞を使用して、腫瘍を攻撃しかつ溶解するエフェクター細胞の産生により特異的抗腫瘍免疫に抗原刺激を与えることができる。
【００１３】
アポトーシス細胞は、認識、免疫応答および除去プロセスを含む一連の分子恒常性維持機構を誘発するアポトーシスを経由して、最も一般的に発生する生理学的細胞死の１つの経路を提示する。またアポトーシス細胞は、直接的および間接的に免疫寛容性を樹状細胞およびマクロファージに誘導する能力がある免疫調節性細胞である。アポトーシス細胞は、樹状細胞およびマクロファージを調節し、これらを免疫寛容誘発性にして、炎症誘発性サイトカインの分泌および共刺激分子の発現などの炎症誘発活性を阻害することが既に示されている。
【００１４】
被験体のがんまたは腫瘍を治療し、予防し、その成長を阻害し、またはその発生を低減させる組成物および方法に対する要求はまだ満たせていない。本明細書中で下記に説明されるアポトーシス細胞の調製物、組成物、およびそれらの使用は、被験体のがんまたは腫瘍を処置し、予防し、その成長を阻害し、またはその発生を低減させるために使用できる初期アポトーシス細胞の集団を提供することによって、この要求に応える。さらに、本明細書に記載された使用法は、がんまたは腫瘍の寛解度の増大を含み、がんおよび腫瘍を患っている被験体の生存期間を延ばす要求に応える。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｓｔ．  Ｃｌａｉｒ  ＥＷ：  Ｔｈｅ  ｃａｌｍ  ａｆｔｅｒ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｔｏｒｍ：  Ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＴＧＮ１４１２  ｔｒｉａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１８：  １３４４−１３４７，  ２００８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
一側面では、本明細書には、被験体のがんもしくは腫瘍を治療し、予防し、その成長を阻害し、病気の進行を遅らせ、腫瘍量を低減させ、またはその発生を低減させる、またはそれらの組合せを行う方法が開示され、この方法は、初期アポトーシス細胞集団を含む組成物を被験体に投与する工程を含み、前記方法は、この初期アポトーシス細胞集団を投与しない被験体と比べて、被験体のがんもしくは腫瘍を治療し、予防し、その成長を阻害し、病気の進行を遅らせ、腫瘍量を低減させ、またはその発生を低減させる、またはそれらの組合せを行う。
【００１７】
関連する一側面では、がんもしくは腫瘍の大きさ、またはそれらの成長速度、または大きさと成長速度の組合せが低減される。別の関連する一側面では、被験体の生存期間が延びる。
【００１８】
関連する一側面では、初期アポトーシス細胞集団は、単核富化細胞集団、２４時間以上安定なアポトーシス集団、細胞凝集体を含まないアポトーシス集団、アポトーシス誘導に引き続き照射を受けたアポトーシス集団、またはこれらの任意の組合せを含む。別の関連する一側面では、初期アポトーシス細胞集団は、初期アポトーシス細胞のプール集団を含む。
【００１９】
関連する一側面では、被験体はヒトである。
【００２０】
関連する一側面では、がんもしくは腫瘍は、固形腫瘍もしくは非固形腫瘍を含む。別の関連する一側面では、非固形がんもしくは腫瘍は、造血器腫瘍、血液細胞がん、白血病、骨髄異形成症候群、リンパ腫、多発性骨髄腫（形質細胞性骨髄腫）、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、または形質細胞性白血病を含む。別の関連する一側面では、固形腫瘍は、肉腫もしくは細胞腫、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、膵がんもしくは膵腫瘍、乳がんもしくは乳腫瘍、卵巣がんもしくは卵巣腫瘍、前立腺がんもしくは前立腺腫瘍、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭状腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝細胞がん、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性がん腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸がんもしくは頸部腫瘍、子宮がんもしくは子宮腫瘍、精巣がんもしくは精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、グリオーマ、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、シュワン腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、または網膜芽細胞腫を含む。別の関連する一側面では、腫瘍もしくはがんは、腫瘍またはがんの転移を含む。
【００２１】
関連する一側面では、投与は初期アポトーシス細胞集団の単回注入を含む。別の関連する一側面では、投与はアポトーシス細胞集団の複数回注入を含む。別の関連する一側面では、この方法は、追加の免疫療法、化学療法薬、免疫調節薬またはこれらの組合せを被験体に投与することをさらに含む。別の関連する一側面では、追加の免疫療法、化学療法薬または免疫調節薬を、初期アポトーシス細胞の投与前、投与と同時または投与後に投与する。別の関連する一側面では、免疫療法はＣＡＲ−Ｔ細胞を投与することを含む。別の関連する一側面では、免疫調節薬は抗体またはそれらの機能的断片を含む。別の関連する一側面では、抗体またはそれらの機能的断片は、リツキシマブ（ＲｔＸ）抗体またはそれの機能的断片を含む。
【００２２】
関連する一側面では、ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与するが初期アポトーシス細胞は投与されない被験体と比べて、この方法はＣＡＲ−Ｔ細胞の効力を向上させる。
【００２３】
関連する一側面では、この方法は第一選択療法を含む。
【００２４】
関連する一側面では、この方法は補助療法を含む。
【００２５】
関連する一側面では、この方法は、微小残存病変を低減させ、寛解を増大させ、寛解の期間を延長し、腫瘍の再発率を減らし、腫瘍もしくはがんの転移を防止し、または腫瘍もしくはがんの転移率を低減させ、またはこれらの組合せを含む。
【００２６】
一側面では、本明細書で開示されるのは、初期アポトーシス状態の単核細胞を含む単核アポトーシス細胞の集団であり、この単核アポトーシス細胞集団は、小さな百分率の活動中の非アポトーシス生細胞、活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、またはそれらの組合せを含む。
【００２７】
関連する一側面では、活動中の非アポトーシス生細胞の小さな百分率は１０％未満である。別の関連する一側面では、単核アポトーシス細胞集団は、非アポトーシス生細胞を含まない。
【００２８】
関連する一側面では、単核細胞集団は、リンパ球、単球、樹状細胞、およびナチュラルキラー細胞からなる群から選択される。
【００２９】
関連する一側面では、単核アポトーシス細胞の集団は、初期アポトーシス細胞の生成後に照射されたものである。別の関連する一側面では、照射はγ（ガンマ）線照射または紫外線照射を含む。別の関連する一側面では、この照射された細胞集団は、非照射アポトーシス細胞集団と比べて、集団当りで小さな百分率の活動中の非アポトーシス細胞を含む。
【００３０】
一側面では、本明細書で開示されるのは、初期アポトーシス状態の単核細胞を含む単核アポトーシス細胞の集団および医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物であり、前記単核アポトーシス細胞集団は、小さな百分率の活動中の非アポトーシス生細胞、活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、または増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、およびそれらの組合せを含む。
【００３１】
一側面では、本明細書には、小さな百分率の活動中の非アポトーシス生細胞、活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、またはそれらの任意の組合せを含む単核アポトーシス細胞の集団を生成する方法が開示され、前記方法は、
（ａ）抹消血の単核富化細胞集団を取得する工程、
（ｂ）抗凝固薬を含む凍結培地で前記単核富化細胞集団を凍結する工程、
（ｃ）前記単核富化細胞集団を解凍する工程、
（ｄ）最終濃度が約１０〜１００μｇ／ｍＬのメチルプレドニゾロンおよび抗凝固薬を含むアポトーシス誘導インキュベーション培地で前記単核富化細胞集団をインキュベートする工程、
（ｅ）投与培地で前記アポトーシス細胞集団を再懸濁する工程、および
（ｆ）工程（ｅ）に引き続き、前記単核富化集団を不活性化する工程を含み、
この方法は、小さな百分率の活動中の非アポトーシス細胞、活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、またはそれらの任意の組合せを含む単核アポトーシス細胞の集団を生成する。
【００３２】
関連する一側面では、不活性化工程は、前記単核アポトーシス細胞調製物内で、活動中の非アポトーシス細胞の百分率を低減させること、任意の非アポトーシス生存細胞の活性化を抑制すること、任意の非アポトーシス生存細胞の増殖を抑えること、またはそれらの任意の組合せを含む。別の関連する一側面では、活動中の非アポトーシス細胞の百分率は約１０％にまで低減される。別の関連する一側面では、活動中の非アポトーシス細胞の前記百分率は約０％にまで低減される。
【００３３】
関連する一側面では、単核富化細胞集団は、リンパ球、単球、樹状細胞およびナチュラルキラー細胞からなる群から選択される。
【００３４】
関連する一側面では、インキュベートする工程は約２〜１２時間にわたる。
【００３５】
関連する一側面では、前記単核富化細胞集団を不活性化する工程（ｆ）は、免疫応答を抑制または排除すること、細胞の交差反応性を抑制または排除すること、またはＴ細胞受容体活性を低下させるか排除することを含み、前記集団は、小さな百分率の非アポトーシス生細胞、活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、またはそれらの任意の組合せを含む。別の関連する一側面では、前記不活性化工程（ｆ）は、工程（ｅ）で生成される単核富化アポトーシス細胞集団を照射することを含む。別の関連する一側面では、この照射はγ線照射または紫外線照射を含む。別の関連する一側面では、この照射は約２５〜５０グレイ（Ｇｙ）を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
本明細書で開示される主題は、明細書の結び部分で具体的に指摘され、明確にクレームされている。しかしながら、作用の構成および方法ならびにそれらの目的、機能および利点に関する本明細書で開示する組成物および方法は、添付の図面とともに以下の詳細な説明を参照することによって理解するのが一番よい。
【００３７】
【図１Ａ】図１Ａは、標準的なＣＡＲ−Ｔ細胞療法を示す模式図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を生成させるために患者自らの細胞（自家性細胞）を使用した患者での安全で有効なＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法の方法の実施形態を示す模式図である。
【図２】図２は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を生成させるためにドナーの細胞を使用した患者での安全で有効なＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法の方法の実施形態を示す模式図である。
【図３】図３は、初期アポトーシス細胞集団の生成プロセスの一実施形態中の工程を示すフローチャートであり、抗凝固薬はこのプロセス内に含まれていた。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｊは、アポトーシス細胞（Ａｐｏｃｅｌｌ）が、癌環境でマクロファージ活性化症候群のＬＰＳ不稔モデル内に誘導されたサイトカイン急増のインビトロモデルでのサイトカイン急増を防止することを示している。図４Ａは、１：８および１：１６のマクロファージ／単球：Ａｐｏｃｅｌｌ比でアポトーシス細胞を投与した後の２つの期間（６時間および２４時間）で、がんの存在下でのマクロファージ活性化症候群モデルにおけるＬＰＳ誘導したＩＬ−１０濃度の低下を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｊは、アポトーシス細胞が、癌環境でマクロファージ活性化症候群のＬＰＳ不稔モデル内に誘導されたサイトカイン急増のインビトロモデルでのサイトカイン急増を防止することを示している。図４Ｂは、１：８および１：１６のマクロファージ／単球：Ａｐｏｃｅｌｌ比でアポトーシス細胞を投与した後の２つの期間（６時間および２４時間）で、がんおよびＣＡＲ−１９の存在下でのマクロファージ活性化症候群モデルにおけるＬＰＳ誘導したＩＬ−６濃度の低下を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｊは、アポトーシス細胞が、癌環境でマクロファージ活性化症候群のＬＰＳ不稔モデル内に誘導されたサイトカイン急増のインビトロモデルでのサイトカイン急増を防止することを示している。図４Ｃは、１：８および１：１６のマクロファージ／単球：Ａｐｏｃｅｌｌ比でアポトーシス細胞を投与した後の２つの期間（６時間および２４時間）で、がんおよびＣＡＲ−１９の存在下でのマクロファージ活性化症候群モデルにおけるＬＰＳ誘導したＭＩＰ−１α濃度の低下を示す。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｊは、アポトーシス細胞が、癌環境でマクロファージ活性化症候群のＬＰＳ不稔モデル内に誘導されたサイトカイン急増のインビトロモデルでのサイトカイン急増を防止することを示している。図４Ｄは、１：８および１：１６のマクロファージ／単球：Ａｐｏｃｅｌｌ比でアポトーシス細胞を投与した後の２つの期間（６時間および２４時間）で、がんおよびＣＡＲ−１９の存在下でのマクロファージ活性化症候群モデルにおけるＬＰＳ誘導したＩＬ−８濃度の低下を示す。
【図４Ｅ】図４Ａ〜４Ｊは、アポトーシス細胞が、癌環境でマクロファージ活性化症候群のＬＰＳ不稔モデル内に誘導されたサイトカイン急増のインビトロモデルでのサイトカイン急増を防止することを示している。図４Ｅは、１：８および１：１６のマクロファージ／単球：Ａｐｏｃｅｌｌ比でアポトーシス細胞を投与した後の２つの期間（６時間および２４時間）で、がんおよびＣＡＲ−１９の存在下でのマクロファージ活性化症候群モデルにおけるＬＰＳ誘導したＴＮＦ−α濃度の低下を示す。
【図４Ｆ】図４Ａ〜４Ｊは、アポトーシス細胞が、癌環境でマクロファージ活性化症候群のＬＰＳ不稔モデル内に誘導されたサイトカイン急増のインビトロモデルでのサイトカイン急増を防止することを示している。図４Ｆは、１：４、１：８、１：１６、１：３２および１：６４のマクロファージ／単球：Ａｐｏｃｅｌｌ比でアポトーシス細胞を投与した後の２４時間で、がんおよびＣＡＲ−１９の存在下でのマクロファージ活性化症候群モデルにおけるＬＰＳ誘導したＭＩＰ−１β濃度の低下を示す。
【図４Ｇ】図４Ａ〜４Ｊは、アポトーシス細胞が、癌環境でマクロファージ活性化症候群のＬＰＳ不稔モデル内に誘導されたサイトカイン急増のインビトロモデルでのサイトカイン急増を防止することを示している。図４Ｇは、１：４、１：８、１：１６、１：３２および１：６４のマクロファージ／単球：Ａｐｏｃｅｌｌ比でアポトーシス細胞を投与した後の２４時間で、がんおよびＣＡＲ−１９の存在下でのマクロファージ活性化症候群モデルにおけるＬＰＳ誘導したＭＣＰ−１濃度の低下を示す。
【図４Ｈ】図４Ａ〜４Ｊは、アポトーシス細胞が、癌環境でマクロファージ活性化症候群のＬＰＳ不稔モデル内に誘導されたサイトカイン急増のインビトロモデルでのサイトカイン急増を防止することを示している。図４Ｈは、１：８および１：１６のマクロファージ／単球：Ａｐｏｃｅｌｌ比でアポトーシス細胞を投与した後の２つの期間（６時間および２４時間）で、がんおよびＣＡＲ−１９の存在下でのマクロファージ活性化症候群モデルにおけるＬＰＳ誘導したＩＬ−９濃度の低下を示す。
【図４Ｉ】図４Ａ〜４Ｊは、アポトーシス細胞が、癌環境でマクロファージ活性化症候群のＬＰＳ不稔モデル内に誘導されたサイトカイン急増のインビトロモデルでのサイトカイン急増を防止することを示している。図４Ｉは、１：４、１：８、１：１６、１：３２および１：６４のマクロファージ／単球：Ａｐｏｃｅｌｌ比でアポトーシス細胞を投与した後の２４時間で、がんおよびＣＡＲ−１９の存在下でのマクロファージ活性化症候群モデルにおけるＬＰＳ誘導したＩＬ−２Ｒ濃度の増加を示す。
【図４Ｊ】図４Ａ〜４Ｊは、アポトーシス細胞が、癌環境でマクロファージ活性化症候群のＬＰＳ不稔モデル内に誘導されたサイトカイン急増のインビトロモデルでのサイトカイン急増を防止することを示している。図４Ｊは、アポトーシス細胞は細胞からのＩＬ−２放出を低減させないことを示す。アポトーシス細胞を、アポトーシス細胞の投与量を増加させて、がんおよびＣＡＲ−１９の存在下でマクロファージ／単球とともに２４時間インキュベートした（ｎ＝３）。白抜き棒（枠線のみ）はウェル当たり２．５×１０６個のアポトーシス細胞、黒塗り棒はウェル当たり５×１０６個のアポトーシス細胞、グレー塗り棒はウェル当たり１０×１０６個のアポトーシス細胞を示す。
【図５】図５は、形質導入されたＴ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を抗ＣＤ１２４分析したフローサイトメトリー（流動細胞計測）の結果を示すＴ細胞の形質導入の検証結果である。
【図６】図６は、Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ卵巣腺がん細胞の増殖を低減させたことを示す。細胞毒性試験の結果を棒グラフで示し、この試験では、単層のＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞は、非形質導入Ｔ細胞またはＴ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞のいずれかにより培養された。
【図７】図７は、アポトーシス細胞が、Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性を抑制しないことを示す。これらの結果は細胞毒性試験に基づいていて、この試験では、単層のＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞は、溶媒（Ｈａｒｔｍａｎｎ液）またはアポトーシス細胞（Ａｐｏｃｅｌｌ）またはアポトーシス細胞の上清（ＡｐｏＳｕｐ）またはアポトーシス細胞と単球／マクロファージの共培養の上清（ＡｐｏＭｏｎ  Ｓｕｐ）の存在下で、非形質導入Ｔ細胞またはＴ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞のいずれかにより培養された。
【図８】図８は、アポトーシス細胞が、細胞毒性中に高濃度で分泌されたＩＬ−６を低減させることを示す。これら結果は、ＳＫＯＶ３−ｌｕｃとヒトの単球／マクロファージとの共培養の効果を示し、それぞれアポトーシス細胞（Ａｐｏｃｅｌｌ）またはＡｐｏｃｅｌｌの上清（ＡｐｏＳｕｐ）またはアポトーシス細胞と単球／マクロファージとの共培養（ＡｐｏＭｏｎ  Ｓｕｐ）に曝露された。
【図９】図９は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法中にＬＰＳに曝露した後のアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞の上清またはアポトーシス細胞と単球との共培養の効果を示す。リポ多糖（ＬＰＳ）を細胞毒性試験に添加すると、ＩＬ−６の分泌が非常に高くなることが記録された。これら結果は、アポトーシス細胞（Ａｐｏｃｅｌｌ）またはアポトーシス細胞の上清（ＡｐｏＳｕｐ）またはアポトーシス細胞と単球／マクロファージとの共培養の上清（ＡｐｏＭｏｎ  Ｓｕｐ）への曝露が、ＩＬ−６を許容可能な濃度まで低下させたことを示している。
【図１０】図１０は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の臨床治療を模倣したＣＡＲ−Ｔ細胞療法中に、ＬＰＳに曝露した後のアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞の上清またはアポトーシス細胞と単球との共培養の効果を示す。リポ多糖（ＬＰＳ）を細胞毒性試験に添加すると、ＩＬ−６の分泌が非常に高くなることが記録された。これら結果は、アポトーシス細胞（Ａｐｏｃｅｌｌ）またはアポトーシス細胞の上清（ＡｐｏＳｕｐ）またはアポトーシス細胞と単球／マクロファージとの共培養の上清（ＡｐｏＭｏｎ  Ｓｕｐ）への曝露が、ＩＬ−６を許容可能な濃度まで低下させたことを示している。
【図１１Ａ】図１１Ａおよび１１Ｂは、選別時のマウスの体重および腫瘍の大きさを示す。図１１Ａは実験期間にわたる体重の変化を示す。青線は対照であり、４．５×１０６個のＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞は投与されなかった。赤線では０．５×１０６個のＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞が投与された。緑線では１．０×１０６個のＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞が投与された。紫線では４．５×１０６個のＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞が投与された。
【図１１Ｂ】図１１Ａおよび１１Ｂは、選別時のマウスの体重および腫瘍の大きさを示す。図１１Ｂは、４．５×１０６個のＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞が注入された後の３９日目のマウスの代表的なＳＫＯＶ３−ｌｕｃ腫瘍を示す。
【図１２】図１２は、ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ腫瘍の増殖を示す。生物発光撮像（ＢＬＩ）によって撮影されたＳＫＯＶ３−ｌｕｃ腫瘍を有するマウスでは、対照区（ＰＢＳ）とＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞をそれぞれ０．５×１０６個、１．０×１０６個および４．５×１０６個で接種した試験区との間の差異を示している。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｄは、ＳＫＯＶ３−ｌｕｃの腫瘍量を示す。インビボでのＳＫＯＶ３−ｌｕｃ腫瘍の生物発光撮像（ＢＬＩ）による定量化である（図１２参照）。製造者の指示通りに、光子計数６００をカットオフ値とした。図１３Ａは、０．５×１０６個のＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞を接種されたマウスの結果を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜１３Ｄは、ＳＫＯＶ３−ｌｕｃの腫瘍量を示す。インビボでのＳＫＯＶ３−ｌｕｃ腫瘍の生物発光撮像（ＢＬＩ）による定量化である（図１２参照）。製造者の指示通りに、光子計数６００をカットオフ値とした。図１３Ｂは、１×１０６個のＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞を接種されたマウスの結果を示す。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜１３Ｄは、ＳＫＯＶ３−ｌｕｃの腫瘍量を示す。インビボでのＳＫＯＶ３−ｌｕｃ腫瘍の生物発光撮像（ＢＬＩ）による定量化である（図１２参照）。製造者の指示通りに、光子計数６００をカットオフ値とした。図１３Ｃは、４．５×１０６個のＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞を接種されたマウスの結果を示す。
【図１３Ｄ】図１３Ａ〜１３Ｄは、ＳＫＯＶ３−ｌｕｃの腫瘍量を示す。インビボでのＳＫＯＶ３−ｌｕｃ腫瘍の生物発光撮像（ＢＬＩ）による定量化である（図１２参照）。製造者の指示通りに、光子計数６００をカットオフ値とした。図１３Ｄは、ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ腫瘍の増殖の平均値を示す。
【図１４】図１４は、Ｒａｊｉ  Ｂｕｒｋｉｔｔ（ラージ・バーキット）リンパ腫細胞の細胞毒性の較正を示す。Ｒａｊｉ細胞を様々な密度で播種し、細胞の溶解が起こった直後に遠心分離した。その結果を、Ｒａｊｉ細胞数（ｘ軸）対４９２ｎｍでの吸光度（ｙ軸）で示す。すべての溶解した細胞数は、対応する非溶解の細胞数に対して有意な読み取り値を示した。
【図１５】図１５は、初期アポトーシス細胞の添加がＣＡＲ−Ｔ細胞抗腫瘍活性に影響を与えないことを示す。Ｅ／Ｔ比は、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞：ＨｅＬａ細胞の比を示す。生存率は、ＣＤ１９＋腫瘍細胞の生存率である。黒丸はＣＤ１９＋ＨｅＬａ、白三角はＣＤ１９＋ＨｅＬａ＋ナイーブＴ細胞、黒三角はＣＤ１９＋ＨｅＬａ＋ＣＡＲ−Ｔ−ＣＤ１９、および白丸はＣＤ１９＋ＨｅＬａ＋ＣＡＲ−Ｔ−ＣＤ１９＋Ａｐｏｃｅｌｌである。
【図１６】図１６は、アポトーシス細胞の有無によるラージ・バーキットリンパ腫細胞のサイトカイン分析（ＧＭ−ＣＳＦ）を示す。棒グラフは、単球およびＬＰＳの存在下でインキュベートした後に、ナイーブＴ細胞（Ｒａｊｉ  ＋  ナイーブＴ）、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞（Ｒａｊｉ  ＋  ＣＡＲ  Ｔ）、ＣＡＲ−Ｔ細胞：Ａｐｏｃｅｌｌ比が１：８のＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞およびアポトーシス細胞（Ａｐｏｃｅｌｌ）（Ｒａｊｉ  ＋  ＣＡＲ  Ｔ＋ＡｐｏＣｅｌｌ  １：８）、ＣＡＲ−Ｔ細胞：Ａｐｏｃｅｌｌ比が１：３２のＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞およびアポトーシス細胞（Ａｐｏｃｅｌｌ）（Ｒａｊｉ  ＋  ＣＡＲ  Ｔ＋ＡｐｏＣｅｌｌ  １：３２）、ならびにＣＡＲ−Ｔ細胞：Ａｐｏｃｅｌｌ比が１：６４のＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞およびアポトーシス細胞（Ａｐｏｃｅｌｌ）（Ｒａｊｉ  ＋  ＣＡＲ  Ｔ＋ＡｐｏＣｅｌｌ  １：６４）を添加したＲａｊｉ細胞の培養上清に存在したサイトカインＧＭ−ＣＳＦ（ｐｇ／ｍＬ）の濃度計測値を示す。
【図１７】図１７は、アポトーシス細胞の有無によるラージ・バーキットリンパ腫細胞のサイトカイン分析（ＴＮＦ−α）を示す。棒グラフは、単球およびＬＰＳの存在下でインキュベートした後に、ナイーブＴ細胞（Ｒａｊｉ  ＋  ナイーブＴ）、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞（Ｒａｊｉ  ＋  ＣＡＲ  Ｔ）、ＣＡＲ−Ｔ細胞：Ａｐｏｃｅｌｌ比が１：８のＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞およびアポトーシス細胞（Ａｐｏｃｅｌｌ）（Ｒａｊｉ  ＋  ＣＡＲ  Ｔ＋ＡｐｏＣｅｌｌ  １：８）、ＣＡＲ−Ｔ細胞：Ａｐｏｃｅｌｌ比が１：３２のＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞およびアポトーシス細胞（Ａｐｏｃｅｌｌ）（Ｒａｊｉ  ＋  ＣＡＲ  Ｔ＋ＡｐｏＣｅｌｌ  １：３２）、ならびにＣＡＲ−Ｔ細胞：Ａｐｏｃｅｌｌ比が１：６４のＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞およびアポトーシス細胞（Ａｐｏｃｅｌｌ）（Ｒａｊｉ  ＋  ＣＡＲ  Ｔ＋ＡｐｏＣｅｌｌ  １：６４）を添加したＲａｊｉ細胞の培養上清に存在したサイトカインＴＮＦ−α（ｐｇ／ｍＬ）の濃度計測値を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａおよび１８Ｂは、実験計画を示す。図１８Ａは、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法に対するアポトーシス細胞の影響を分析する実験計画を示す。ＳＣＩＤマウスは、１日目にＲａｊｉ癌細胞を注入され、６日目にＣＡＲ−Ｔ−ＣＤ１９細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞療法）およびアポトーシス細胞を投与された。
【図１８Ｂ】図１８Ａおよび１８Ｂは、実験計画を示す。図１８Ｂは、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法がアポトーシス細胞の同時投与によって負の影響を受けなかったことを示す。生存率曲線では、ＳＣＩＤマウスにＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞を注入し、同時に初期アポトーシス細胞を添加したか、または添加しなかった。
【図１９Ａ】図１９Ａ、１９Ｂおよび１９Ｃは、固形腫瘍のインビボモデルでの腫瘍からの炎症誘発性サイトカイン放出の増加を示す。図１９Ａは、ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＳＣＩＤマウスの腹膜に存在する固形腫瘍から放出されたＩＬ−６が僅かに増加し、ＩＬ−６の放出は、Ｈｅｌａ＋ＣＡＲ−ＣＤ−１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の存在下で顕著に増加することを示している。
【図１９Ｂ】図１９Ａ、１９Ｂおよび１９Ｃは、固形腫瘍のインビボモデルでの腫瘍からの炎症誘発性サイトカイン放出の増加を示す。図１９Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＳＣＩＤマウスの腹膜に存在する固形腫瘍から放出されたＩＰ−１０が僅かに増加し、ＩＰ−１０の放出はＨｅｌａ＋ＣＡＲ−ＣＤ−１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の存在下で顕著に増加することを示している。
【図１９Ｃ】図１９Ａ、１９Ｂおよび１９Ｃは、固形腫瘍のインビボモデルでの腫瘍からの炎症誘発性サイトカイン放出の増加を示す。図１９Ｃは、驚いたことに、ＴＮＦ−αの放出でもＨｅｌａ＋ＣＡＲ−ＣＤ−１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の存在下で増加することを示している。
【図２０Ａ】図２０Ａおよび２０Ｂは、ＨｅＬａＣＤ１９（白血病）のＩＰモデルでのアポトーシス細胞の有無によるＣＤ−１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞の効力の試験結果を示す。ＨｅＬａ−ＣＤ１９は青色、ＨｅＬａＣＤ１９＋Ｍｏｃｋは緑色、ＨｅＬａＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔは紫色、およびＨｅＬａＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ＋Ａｐｏｃｅｌｌは橙色である。図２０Ａでは、ＣＡＲ−Ｔ陽性細胞は０．５×１０６個であった。
【図２０Ｂ】図２０Ａおよび２０Ｂは、ＨｅＬａＣＤ１９（白血病）のＩＰモデルでのアポトーシス細胞の有無によるＣＤ−１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞の効力の試験結果を示す。ＨｅＬａ−ＣＤ１９は青色、ＨｅＬａＣＤ１９＋Ｍｏｃｋは緑色、ＨｅＬａＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔは紫色、およびＨｅＬａＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ＋Ａｐｏｃｅｌｌは橙色である。図２０Ｂでは、ＣＡＲ−Ｔ陽性細胞は２．２×１０６個であった。
【図２１】図２１は、ＳＣＩＤマウスのインビボびまん性腫瘍モデルでの生存曲線である。曲線は、アポトーシス細胞を投与しなかったマウス（ＮＯ  ＡＰＯ、点線・・・・）と比べて、初期アポトーシス細胞を投与したマウス（ＡＰＯ、太破線−−−−）では生存率が延びたことを示す。なお対照ＳＣＩＤマウス（実線＿＿＿＿）の生存率は１００％であった。
【図２２Ａ】図２２Ａ〜２２Ｄは、アポトーシス細胞の注入によって白血病マウスの寿命が延長し、完全寛解に達するマウスの数が増加したことを示す。試験群として、白血病未発症区（対照であり、縦縞模様）、白血病発症＋初期アポトーシス細胞区（点模様）、および白血病発症区（灰色塗りつぶし）であり、総数はｎ＝５１である（ｐ＜０．００１）。図２２Ａは、アポトーシス細胞の注入によって白血病誘発後の予想寿命を通して生存したマウスの割合が増加したことを示す。
【図２２Ｂ】図２２Ａ〜２２Ｄは、アポトーシス細胞の注入によって白血病マウスの寿命が延長し、完全寛解に達するマウスの数が増加したことを示す。試験群として、白血病未発症区（対照であり、縦縞模様）、白血病発症＋初期アポトーシス細胞区（点模様）、および白血病発症区（灰色塗りつぶし）であり、総数はｎ＝５１である（ｐ＜０．００１）。図２２Ｂは、アポトーシス細胞の注入によって白血病誘発後の予想寿命の１２％まで長く生存したマウスの割合が増加したことを示す。
【図２２Ｃ】図２２Ａ〜２２Ｄは、アポトーシス細胞の注入によって白血病マウスの寿命が延長し、完全寛解に達するマウスの数が増加したことを示す。試験群として、白血病未発症区（対照であり、縦縞模様）、白血病発症＋初期アポトーシス細胞区（点模様）、および白血病発症区（灰色塗りつぶし）であり、総数はｎ＝５１である（ｐ＜０．００１）。図２２Ｃは、アポトーシス細胞の注入によって、白血病誘発後の予想寿命の３０％まで長く生存したマウスの割合が増加したことを示す。
【図２２Ｄ】図２２Ａ〜２２Ｄは、アポトーシス細胞の注入によって白血病マウスの寿命が延長し、完全寛解に達するマウスの数が増加したことを示す。試験群として、白血病未発症区（対照であり、縦縞模様）、白血病発症＋初期アポトーシス細胞区（点模様）、および白血病発症区（灰色塗りつぶし）であり、総数はｎ＝５１である（ｐ＜０．００１）。図２２Ｄは、アポトーシス細胞の注入によって、白血病誘発後の予想寿命の１００％まで長く生存し、完全寛解に達したマウスの割合が増加したことを示す。
【図２３Ａ】図２３Ａ〜２３Ｅは、アポトーシス細胞の注入によって、白血病マウスの寿命が延長し、完全寛解に達するマウスの数が増加し、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）療法の効果が増大したことを示す。試験群として、白血病発症区（灰色塗りつぶし）、白血病発症＋初期アポトーシス細胞区（縦縞模様）、白血病発症＋抗ＣＤ２０ｍＡｂ区（格子模様）、および白血病発症＋抗ＣＤ２０＋初期アポトーシス細胞区（点模様）であり、総数はｎ＝２８（ｐ＜０．００２）である。図２３Ａは、白血病をＲａｊｉ細胞により誘発した後のマウスの予測寿命を通して生存した割合（％）を示す。
【図２３Ｂ】図２３Ａ〜２３Ｅは、アポトーシス細胞の注入によって、白血病マウスの寿命が延長し、完全寛解に達するマウスの数が増加し、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）療法の効果が増大したことを示す。試験群として、白血病発症区（灰色塗りつぶし）、白血病発症＋初期アポトーシス細胞区（縦縞模様）、白血病発症＋抗ＣＤ２０ｍＡｂ区（格子模様）、および白血病発症＋抗ＣＤ２０＋初期アポトーシス細胞区（点模様）であり、総数はｎ＝２８（ｐ＜０．００２）である。図２３Ｂは、アポトーシス細胞の注入によって、白血病誘発後の予想寿命より２４％まで長く生存したマウスの割合が増加したことを示す。
【図２３Ｃ】図２３Ａ〜２３Ｅは、アポトーシス細胞の注入によって、白血病マウスの寿命が延長し、完全寛解に達するマウスの数が増加し、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）療法の効果が増大したことを示す。試験群として、白血病発症区（灰色塗りつぶし）、白血病発症＋初期アポトーシス細胞区（縦縞模様）、白血病発症＋抗ＣＤ２０ｍＡｂ区（格子模様）、および白血病発症＋抗ＣＤ２０＋初期アポトーシス細胞区（点模様）であり、総数はｎ＝２８（ｐ＜０．００２）である。図２３Ｃは、アポトーシス細胞の注入によって、白血病誘発後の予想寿命より５９％まで長く生存したマウスの割合が増加し、白血病マウスの寿命に対する抗ＣＤ２０ｍＡｂの効果が高まったことを示す。
【図２３Ｄ】図２３Ａ〜２３Ｅは、アポトーシス細胞の注入によって、白血病マウスの寿命が延長し、完全寛解に達するマウスの数が増加し、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）療法の効果が増大したことを示す。試験群として、白血病発症区（灰色塗りつぶし）、白血病発症＋初期アポトーシス細胞区（縦縞模様）、白血病発症＋抗ＣＤ２０ｍＡｂ区（格子模様）、および白血病発症＋抗ＣＤ２０＋初期アポトーシス細胞区（点模様）であり、総数はｎ＝２８（ｐ＜０．００２）である。図２３Ｄは、アポトーシス細胞の注入によって、白血病誘発後の予想寿命より７６％長く生存したマウスの割合が増加し、白血病マウスの寿命に対する抗ＣＤ２０ｍＡｂの効果が高まったことを示す。
【図２３Ｅ】図２３Ａ〜２３Ｅは、アポトーシス細胞の注入によって、白血病マウスの寿命が延長し、完全寛解に達するマウスの数が増加し、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）療法の効果が増大したことを示す。試験群として、白血病発症区（灰色塗りつぶし）、白血病発症＋初期アポトーシス細胞区（縦縞模様）、白血病発症＋抗ＣＤ２０ｍＡｂ区（格子模様）、および白血病発症＋抗ＣＤ２０＋初期アポトーシス細胞区（点模様）であり、総数はｎ＝２８（ｐ＜０．００２）である。図２３Ｅは、アポトーシス細胞の注入によって、完全寛解に達するマウスの割合が増加したことを示す。
【図２４】図２４は、アポトーシス細胞を注入したＲａｊｉ白血病／リンパ腫のＳＣＩＤ−Ｂｇマウスでのカプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）生存曲線である。ＲＰＭＩ群（ｎ＝１５）、Ｒａｊｉ群（ｎ＝２３）、およびＲａｊｉ＋ＡｐｏＣｅｌｌ群（ｎ＝２４）の結果を、ＲＰＭＩ（対照群）は黒色、Ｒａｊｉ群は橙色、およびＲａｊｉ＋ＡｐｏＣｅｌｌ群は青色で示す。
【図２５Ａ】図２５Ａ〜２５Ｃは、カプラン・マイヤー生存曲線である。図２５Ａは、７週齢のＳＣＩＤ−Ｂｇメスマウス（ＥＮＶＩＧＯ社製、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌ）に１個体あたり０．１×１０６個のＲａｊｉ細胞を静脈注射した研究データを示す（各群あたりｎ＝１０の３群で検討）。マウスに３回（５日目、８日目、１１日目）にわたって、１回あたり３０×１０６個のアポトーシス細胞を静脈投与した。（ＲＰＭＩ群は薄青色、Ｒａｊｉ群は橙色、Ｒａｊｉ＋ＡｐｏＣｅｌｌ群は濃青色）
【図２５Ｂ】図２５Ａ〜２５Ｃは、カプラン・マイヤー生存曲線である。図２５Ｂは、７週齢のＳＣＩＤ−Ｂｇメスマウス（ＥＮＶＩＧＯ社製、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌ）に１個体あたり０．１×１０６個のＲａｊｉ細胞を静脈注射した研究のデータを示す（各群あたりｎ＝１０の３群で検討）。マウスに３回（５日目、８日目、１１日目）にわたって、１回あたり３０×１０６個のアポトーシス細胞を静脈投与した。（ＲＰＭＩ群は黒色、Ｒａｊｉ群は橙色、Ｒａｊｉ＋ＡｐｏＣｅｌｌ群は濃青色）
【図２５Ｃ】図２５Ａ〜２５Ｃは、カプラン・マイヤー生存曲線である。図２５Ｃは、８〜９週齢のＳＣＩＤ−Ｂｇメスマウス（ＥＮＶＩＧＯ社製、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌ）に１個体あたり０．１×１０６個のＲａｊｉ細胞を静脈注射した研究のデータを示す（各群あたりｎ＝１０の２群で検討）。マウスに３回（５日目、８日目、１２日目）にわたって１回あたり３０×１０６個のアポトーシス細胞を静脈投与した。（Ｒａｊｉ群は橙色、Ｒａｊｉ＋ＡｐｏＣｅｌｌ群は濃青色）
【図２６】図２６は、ＲｔＸおよびアポトーシス細胞を注入したＲａｊｉ白血病／リンパ腫のＳＣＩＤ−Ｂｇマウスでのカプラン・マイヤー生存曲線である。（Ｒａｊｉ群は橙色、Ｒａｊｉ＋ＡｐｏＣｅｌｌは青色、Ｒａｊｉ＋ＲｔＸ  ２ｍｇ群は緑色、Ｒａｊｉ＋ＲｔＸ  ２ｍｇ＋ＡｐｏＣｅｌｌ群は黄色、Ｒａｊｉ＋ＲｔＸ  ５ｍｇ群は紫色、Ｒａｊｉ＋ＲｔＸ  ５ｍｇ＋ＡｐｏＣｅｌｌ群は灰色）
【図２７】図２７は、ＲｔＸおよびアポトーシス細胞を注入したＲａｊｉ白血病／リンパ腫のＳＣＩＤ−Ｂｇマウスでのカプラン・マイヤー生存曲線である。（Ｒａｊｉ群は橙色、Ｒａｊｉ＋ＡｐｏＣｅｌｌ群は青色、Ｒａｊｉ＋ＲｔＸ  ２ｍｇ群は緑色、Ｒａｊｉ＋ＲｔＸ  ２ｍｇ＋ＡｐｏＣｅｌｌ群は黄色）
【図２８】図２８は、プールされたアポトーシス細胞調製物の効果を示す。図２８は、複数の個体ドナー（青色）からのアポトーシス細胞調製物の単回注射による生存率への明確な効果（ｐ＜０．０１）を示すグラフである。このグラフは、複数の個体ドナーからの照射されたプールされたアポトーシス細胞調製物を単回投与で処理したＧｖＨＤマウスモデルでのカプラン・マイヤー生存曲線である。
【図２９】図２９は、プールされたアポトーシス細胞調製物の効果を示す。図２９は、複数の個体ドナー（青色）からのアポトーシス細胞調製物の単回注射による２つの比較群での体重減少の割合への明確な効果（ｐ＜０．０１）を示すグラフである。
【図３０】図３０は、単一ドナーのアポトーシス細胞調製物対プールされたアポトーシス細胞調製物の比較を示す。図３０は、誘発されたＧｖＨＤマウスモデルを使用した照射の有無による単一ドナーのアポトーシス細胞調製物の一回用量投与と複数のドナーのアポトーシス細胞調製物の一回用量投与間での生存率％への効果を比較したグラフを示す。
【図３１Ａ】図３１Ａおよび３１Ｂは、力価試験の結果である。図３１Ａおよび３１Ｂは、ＨＬＡ−ＤＲの発現を測定することによってアポトーシス細胞との相互作用後の樹状細胞（ＤＣ）の成熟が抑制されたことを示す力価試験の結果である。図３１Ａは、新たな最終産物ＡのＨＬＡ−ＤＲ平均蛍光度（ｔ０）を示す。
【図３１Ｂ】図３１Ａおよび３１Ｂは、力価試験の結果である。図３１Ａおよび３１Ｂは、ＨＬＡ−ＤＲの発現を測定することによってアポトーシス細胞との相互作用後の樹状細胞（ＤＣ）の成熟が抑制されたことを示す力価試験の結果である。図３１Ｂは、２〜８℃で２４時間経過後の最終産物ＡのＨＬＡ−ＤＲ平均蛍光度を示す。
【図３２Ａ】図３２Ａおよび３２Ｂは、力価試験の結果である。図３２Ａおよび３２Ｂは、ＣＤ８６の発現を測定することによってアポトーシス細胞との相互作用の後の樹状細胞（ＤＣ）の成熟が抑制されたことを示す力価試験の結果である。図３２Ａは、新たな最終産物ＡのＣＤ８６平均蛍光度（ｔ０）を示す。
【図３２Ｂ】図３２Ａおよび３２Ｂは、力価試験の結果である。図３２Ａおよび３２Ｂは、ＣＤ８６の発現を測定することによってアポトーシス細胞との相互作用の後の樹状細胞（ＤＣ）の成熟が抑制されたことを示す力価試験の結果である。図３２Ｂは、２〜８℃で２４時間経過後の最終産物ＡのＣＤ８６平均蛍光度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本明細書で開示する方法の理解を完全とするために、多数の具体的な詳細説明を以下に述べる。しかし、当然のことながら、当業者ならこれらの具体的な詳細がなくともこれらの方法を実践することができる。他の例では、本明細書で開示する方法を不明瞭にしないように、周知の方法、手順および構成要素を詳細には記載していない。
【００３９】
免疫細胞の遺伝子改変は、がんに対する免疫細胞療法向けの手段として周知である。これらの免疫細胞療法は、治療を要する被験体に対して自家性または同種異系の免疫細胞の操作および投与に基づいている。免疫細胞に基づく療法としては、ナチュラルキラー細胞療法、樹状細胞療法、ならびにナイーブＴ細胞、ヘルパーＴ細胞としても知られているエフェクターＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞（Ｔレグ）を含むＴ細胞免疫療法が挙げられる。
【００４０】
実施形態によっては、本明細書では遺伝子組換え免疫細胞を含む組成物を開示する。別の実施形態では、前記遺伝子組換え免疫細胞はＴ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞はナイーブＴ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞はナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞はナイーブＴ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞はナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、前記遺伝子組換え免疫細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。別の実施形態では、前記遺伝子組換え免疫細胞は樹状細胞である。さらに別の実施形態では、前記遺伝子組換えＴ細胞は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ細胞）である。別の実施形態では、前記遺伝子組換えＴ細胞は制御性Ｔ細胞（Ｔレグ）である。別の実施形態では、前記遺伝子組換えＴ細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である。別の実施形態では、前記遺伝子組換えＴ細胞は遺伝子組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）細胞である。
【００４１】
実施形態によっては、本明細書では遺伝子組換え免疫細胞およびアポトーシス細胞を含む組成物を開示する。別の実施形態では、本明細書では遺伝子組換え免疫細胞およびアポトーシス細胞の上清を含む組成物を開示する。別の実施形態では、前記遺伝子組換え免疫細胞はＴ細胞である。別の実施形態では、前記遺伝子組換え免疫細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。さらに別の実施形態では、前記遺伝子組換え免疫細胞は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ細胞）である。別の実施形態では、前記遺伝子組換え免疫細胞は制御性Ｔ細胞（Ｔレグ細胞）である。
【００４２】
実施形態によっては、本明細書ではキメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）癌療法中のＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖率を維持または増加させる方法を開示し、その方法はアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞の上清を含む組成物を前記被験体に投与する工程を含み、ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法を受けているが前記アポトーシス細胞または前記アポトーシス細胞の上清は投与されていない被験体と比べて、被験体での前記増殖率が維持されるかまたは増加する。
【００４３】
関連の実施形態では、前記方法によって前記ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法の効力は低下せず阻害もされない。関連の実施形態では、前記方法は前記ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法の効力を高める。別の関連の実施形態では、前記アポトーシス細胞または前記アポトーシス細胞の上清を投与されていない被験体と比べて、前記被験体のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカイン急増の発生は抑止または低減される。
【００４４】
実施形態によっては、ＣＲＳは自然発症する。別の実施形態では、ＣＲＳはＬＰＳに応答して発症する。別の実施形態では、ＣＲＳはＩＦＮ−γに応答して発症する。
【００４５】
実施形態によっては、本明細書ではキメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）癌療法の効力を増大させる方法を開示し、その方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞、それに加えてアポトーシス細胞、アポトーシス細胞の上清、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンもしくはこの断片もしくは類似体、テルル系化合物、もしくは免疫調節剤、またはこれらの任意の組合せを含む群から選択される追加の薬剤を投与する工程を含み、ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法を受けているが前記の追加の薬剤は投与されていない被験体と比べて、患者での前記ＣＡＲ−Ｔ細胞の効力は増加する。関連の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法は受けているが前記薬剤を含む組成物は投与されていない被験体の少なくとも１種の炎症誘発性サイトカイン濃度と比べて、前記炎症誘発性サイトカインの生成濃度は低い。別の関連の実施形態では、炎症誘発性サイトカインはＩＬ−６を含む。
【００４６】
関連の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞の上清を投与すると、ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法は受けているが前記アポトーシス細胞または前記アポトーシス細胞の上清は投与されていない被験体と比べて、前記方法により被験体中のＩＬ−２濃度は増加する。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞の上清を投与すると、ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法は受けているが前記アポトーシス細胞または前記アポトーシス細胞の上清は投与されていない被験体と比べて、前記方法により被験体のＩＬ−２濃度は維持される。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞の上清を投与すると、ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法は受けているが前記アポトーシス細胞または前記アポトーシス細胞の上清は投与されていない被験体と比べて、前記方法により被験体のＩＬ−２濃度は維持されるかまたは増加する。別の関連の実施形態では、前記追加の薬剤を投与されていない被験体と比べて、前記被験体のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカイン急増の発生は抑止されるか低減される。
【００４７】
関連の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞および前記追加の薬剤またはこれらの任意の組合せは、単一の組成物として構成されている。別の関連の実施形態では、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞および前記追加の薬剤またはこれらの任意の組合せは、少なくとも２つの組成物として構成されている。
【００４８】
実施形態によっては、本明細書では、被験体のがんまたは腫瘍を治療し、予防し、阻害し、その発生を低減させ、被験体のがんまたは腫瘍を寛解または緩和する方法を開示し、この方法は、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）および追加の薬剤を投与する工程を含み、前記追加の薬剤は、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞の上清もしくはＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンもしくはその断片もしくは類似体、テルル系化合物、または免疫調節剤、またはこれらの任意の組合せを含み、前記方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞は投与されているが前記追加の薬剤は投与されていない被験体と比べて、前記被験体のがんもしくは腫瘍の治療し、予防し、阻害し、その発生を低減させ、被験体のがんもしくは腫瘍を寛解または緩和する。
【００４９】
関連の実施形態では、前記方法によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞は投与されているが前記追加の薬剤は投与されていない被験体と比べて、前記被験体の前記がんもしくは前記腫瘍を治療し、予防し、阻害し、その発生を低減させ、前記被験体の前記がんもしくは前記腫瘍を寛解または緩和する効力が増大する。
【００５０】
別の関連の実施形態では、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞は投与されているが前記薬剤を含む組成物は投与されていない被験体の少なくとも１つの炎症誘発性サイトカイン濃度と比べて、前記炎症誘発性サイトカインの生成濃度は低減する。別の関連の実施形態では、前記炎症誘発性サイトカインはＩＬ−６を含む。別の関連の実施形態では、前記追加の薬剤は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞の上清を含み、前記方法によって、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞は投与されているが前記アポトーシス細胞または前記アポトーシス細胞の上清は投与されていない被験体と比べて、被験体中のＩＬ−２濃度は増加する。別の関連の実施形態では、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞および前記追加の薬剤またはこれらの任意の組合せは、単一の組成物として構成されている。さらに別の関連の実施形態では、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞および前記追加の薬剤またはこれらの任意の組合せは、少なくとも２つの組成物として構成されている。
【００５１】
関連の実施形態では、前記追加の薬剤の投与は、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与前、投与と同時、または投与後に行われる。別の関連の実施形態では、前記アポトーシス細胞は初期アポトーシス状態のアポトーシス細胞を含む。別の関連の実施形態では、前記アポトーシス細胞は、前記患者の自家性細胞であるか、またはプールされた第三者ドナー細胞である。
【００５２】
関連の実施形態では、前記アポトーシス細胞の上清は、（ａ）アポトーシス細胞を投入する工程、（ｂ）工程（ａ）の細胞を培養する工程、および（ｃ）細胞から上清を分離する工程を含む方法によって得られる。別の関連の実施形態では、前記アポトーシス細胞の上清は、アポトーシス細胞−白血球細胞の上清であり、かつ前記方法は（ｄ）白血球細胞を投入する工程、（ｅ）必要に応じてアポトーシス細胞および白血球細胞を洗浄する工程、ならびに（ｆ）アポトーシス細胞と白血球細胞を共培養する工程をさらに含み、工程（ｄ）〜（ｆ）は工程（ｂ）の代替となる。別の関連の実施形態では、投入される白血球は、食細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞からなる群から選択される。したがって、実施形態によっては、アポトーシス細胞の上清は、マクロファージによりアポトーシス細胞を培養して産生される上清を含み、このマクロファージはアポトーシス細胞を摂取し、この共培養により産生される上清が使用される。実施形態によっては、アポトーシス細胞の上清は、アポトーシス細胞を培養して産生される上清を含み、この上清はアポトーシス細胞が分泌した物質から産生される。
【００５３】
実施形態によっては、本明細書では初期アポトーシス細胞を含む組成物を開示する。実施形態によっては、本明細書では追加の薬剤と組合せた初期アポトーシス細胞を含む組成物を開示する。実施形態によっては、追加の薬剤はＣＡＲ−Ｔ細胞であってもよい。実施形態によっては、追加の薬剤は抗体であってもよい。実施形態によっては、抗体はリツキシマブまたはその機能的断片を含む。
【００５４】
実施形態によっては、初期アポトーシス細胞の組成物は、初期アポトーシス状態の単核細胞を含む単核アポトーシス細胞集団を含み、前記単核アポトーシス細胞集団は、小さな百分率の活動中の非アポトーシス生細胞、活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、またはそれらの任意の組合せを含む。
【００５５】
実施形態によっては、本明細書では遺伝子組換えＴ細胞およびアポトーシス細胞を含む組成物を開示する。別の実施形態では、本明細書では遺伝子組換えＴ細胞およびアポトーシス細胞の上清を含む組成物を開示する。別の実施形態では、遺伝子組換えＴ細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である。別の実施形態では、遺伝子組換えＴ細胞は遺伝子組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）細胞である。
【００５６】
実施形態によっては、本明細書ではＣＡＲ−Ｔ細胞およびアポトーシス細胞を含む組成物を開示する。別の実施形態では、本明細書では遺伝子組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）細胞およびアポトーシス細胞を含む組成物を開示する。別の実施形態では、本明細書ではＣＡＲ−Ｔ細胞およびアポトーシス細胞からの上清を含む組成物を開示する。別の実施形態では、本明細書では遺伝子組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）細胞およびアポトーシス細胞からの上清を含む組成物を開示する。
【００５７】
特定の実施形態では、遺伝子組換え免疫細胞およびアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞の上清は、単一の組成物として構成されている。他の実施形態では、遺伝子組換え免疫細胞およびアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞の上清は、異なる組成物として構成されている。
【００５８】
本開示は、実施形態によっては、初期アポトーシス状態の単核細胞を含むプールされた単核アポトーシス細胞調製物を提供し、前記プールされた単核アポトーシス細胞調製物はプールされた個々の単核細胞集団を含み、前記プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、小さな百分率の非アポトーシス生細胞、活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、またはそれらの任意の組合せを含む。別の実施形態では、単核アポトーシスプール細胞は照射されている。別の実施形態では、本開示は実施形態によっては、献血から得られた白血球（ＷＢＣ）断片を用いるプールされた単核アポトーシス細胞調製物を提供する。この白血球断片は、血液バンクで廃棄されるか研究目的に使用される場合が多い。
【００５９】
実施形態によっては、本明細書で開示される細胞集団は不活性化されている。別の実施形態では、不活性化は照射を含む。別の実施形態では、不活性化はＴ細胞受容体の不活性化を含む。別の実施形態では、不活性化はＴ細胞受容体の編集を含む。別の実施形態では、不活性化は前記調製物での免疫応答を抑制または排除することを含む。別の実施形態では、不活性化は調製物内に含まれる複数の個々の集団間の交差反応性を抑制または排除することを含む。他の実施形態では、不活性化は調製物内に含まれる複数の個々の集団間のＴ細胞受容体活性を低減するかまたは排除することを含む。別の実施形態では、不活性細胞調製物は、小さな百分率の非アポトーシス生細胞、活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、またはそれらの任意の組合せを含む。
【００６０】
別の実施形態では、不活性細胞調製物は、非照射細胞調製物と比べて少ない数の活動中の非アポトーシス細胞を含む。実施形態によっては、不活性細胞調製物は５０％の非アポトーシス生存細胞を含む。実施形態によっては、不活性細胞調製物は４０％の非アポトーシス生存細胞を含む。実施形態によっては、不活性細胞調製物は３０％の非アポトーシス生存細胞を含む。実施形態によっては、不活性細胞調製物は２０％の非アポトーシス生存細胞を含む。実施形態によっては、不活性細胞調製物は１００％の非アポトーシス生存細胞を含む。実施形態によっては、不活性細胞調製物は０％の非アポトーシス生存細胞を含む。
【００６１】
実施形態によっては、本明細書では不活性化された初期アポトーシス細胞集団を調製する方法を開示する。実施形態によっては、本明細書では、小さな百分率の活動中の非アポトーシス生細胞、活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、またはそれらの任意の組合せを含む単核アポトーシス細胞の集団を生成する方法を開示し、この方法は、
抹消血の単核富化細胞集団を取得する工程、
抗凝固薬を含む凍結培地で前記単核富化細胞集団を凍結する工程、
前記単核富化細胞集団を解凍する工程、
最終濃度が約１０〜１００μｇ／ｍＬのメチルプレドニゾロンおよび抗凝固薬を含むアポトーシス誘導インキュベーション培地で前記単核富化細胞集団をインキュベートする工程、
投与培地で前記アポトーシス細胞集団を再懸濁する工程、および
前記誘導に引き続いて前記単核富化集団を不活性化する工程を含み、
前記方法は、小さな百分率の活動中の非アポトーシス細胞、活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、またはそれらの任意の組合せを含む単核アポトーシス細胞集団を生成する。
【００６２】
別の実施形態では、照射はγ線照射または紫外線照射を含む。さらに別の実施形態では、照射された調製物は、非照射細胞調製物と比べて少ない数の活動中の非アポトーシス細胞を含む。
【００６３】
別の実施形態では、単核アポトーシスプール細胞では、Ｔ細胞受容体を不活性化させている。別の実施形態では、単核アポトーシスプール細胞では、Ｔ細胞受容体を編集している。
【００６４】
実施形態によっては、プール血液は、移植患者に対するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合源またはＨＬＡ非適合源からの第三者の血液を含む。
【００６５】
実施形態によっては、本明細書では、例えば限定はされないがＣＡＲ−Ｔ細胞である遺伝子組換え免疫細胞および追加の薬剤を含む組成物が開示され、この追加の薬剤は、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞の上清、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、テルル系化合物、または免疫調節剤、またはこれらの任意の組合せを含む群から選択される。
【００６６】
実施形態によっては、本開示は、初期アポトーシス状態の個々の単核細胞プール集団を含むプールされた単核アポトーシス細胞調製物を含む医薬組成物の製造方法を提供し、前記組成物は、小さな百分率の非アポトーシス生細胞、活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞を有する調製物、増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞を有する調製物、またはそれらの任意の組合せを含む。別の実施形態では、この方法は、初期アポトーシス状態の個々の単核細胞プール集団を含むプールされた単核アポトーシス細胞調製物を含む医薬組成物を提供し、前記組成物は小さな百分率の活動中の非アポトーシス生細胞を含む。
【００６７】
実施形態によっては、本明細書では被験体のがんもしくは腫瘍を治療し、予防し、その成長を阻害し、被験体のがんまたは腫瘍の発生を低減させ、またはこれらを任意に組合せる方法を開示し、この方法は、この被験体に初期アポトーシス細胞集団を投与する工程を含み、前記方法では、前記被験体のがんもしくは腫瘍を治療し、予防し、その成長を阻害し、前記被験体のがんまたは腫瘍の発生を低減させ、またはこれらの任意の組合せをもたらす。実施形態によっては、本明細書の方法は、被験体のがんもしくは腫瘍を治療し、予防し、その成長を阻害し、病気の進行を遅延させ、腫瘍の量を低減させ、被験体のがんもしくは腫瘍の発生を低減させ、またはそれらの任意の組合せを含み、この方法は、前記被験体に初期アポトーシス細胞集団を含む組成物を投与する工程を含む。実施形態によっては、この方法は、被験体に対してさらに追加の免疫療法、化学療法剤、または免疫調節薬、またはこれらの任意の組合せを投与することを含む。実施形態によっては、追加の免疫療法、化学療法剤、または免疫調節薬を、前記初期アポトーシス細胞の投与前に、投与と同時に、または投与後に投与する。
【００６８】
実施形態によっては、本明細書では、がんもしくは腫瘍を患う被験体の生存期間を延ばす方法を開示し、この方法は前記被験体へ初期アポトーシス細胞集団を投与する工程を含み、前記方法によって前記被験体の生存期間は延びる。実施形態によっては、この方法は前記被験体に、さらに追加の免疫療法、化学療法剤、免疫調節薬、またはこれらの任意の組合せを投与することを含む。実施形態によっては、追加の免疫療法、化学療法剤、または免疫調節薬を、前記初期アポトーシス細胞の投与前に、投与と同時に、または投与後に投与する。
【００６９】
実施形態によっては、本明細書では被験体のがんもしくは腫瘍の大きさまたは成長率が低減するか、またはその組合せの方法を開示し、この方法は、前記被験体へ初期アポトーシス細胞集団を投与する工程を含み、前記方法によって、大きさまたは成長率が低減する。実施形態によっては、前記方法は前記被験体に、さらに追加の免疫療法、化学療法剤、免疫調節薬、またはこれらの任意の組合せを投与する工程を含む。実施形態によっては、追加の免疫療法、化学療法剤、免疫調節薬を前記初期アポトーシス細胞の投与前、投与と同時、または投与後に投与する。
【００７０】
実施形態によっては、アポトーシス細胞を含む組成物の投与は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の効力に影響を与えないで、がんもしくは腫瘍を治療し、予防し、阻害し、またはその発生を低減させ、がんもしくは腫瘍を寛解させ、腫瘍の量を低減させ、またはがんもしくは腫瘍を緩和する。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物の投与は、約５％を超えてＣＡＲ−Ｔ細胞の効力を低減させないで、がんもしくは腫瘍を治療し、予防し、阻害し、またはその発生を低減させ、がんもしくは腫瘍を寛解させ、腫瘍の量を低減させ、またはがんもしくは腫瘍を緩和する。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物の投与は、約１０％を超えてＣＡＲ−Ｔ細胞の効力を低減させないで、がんもしくは腫瘍を治療し、予防し、阻害し、またはその発生を低減させ、がんもしくは腫瘍を寛解させ、腫瘍の量を低減させ、またはがんもしくは腫瘍を緩和する。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物の投与は、約１５％を超えてＣＡＲ−Ｔ細胞の効力を低減させないで、がんもしくは腫瘍を治療し、予防し、阻害し、またはその発生を低減させ、がんもしくは腫瘍を寛解させ、腫瘍の量を低減させ、またはがんもしくは腫瘍を緩和する。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物の投与は、約２０％を超えてＣＡＲ−Ｔ細胞の効力を低減させないで、がんもしくは腫瘍を治療し、予防し、阻害し、またはその発生を低減させ、がんもしくは腫瘍を寛解させ、腫瘍の量を低減させ、またはがんもしくは腫瘍を緩和する。
【００７１】
実施形態によっては、アポトーシス細胞の投与によってＣＡＲ−Ｔ細胞の効力は増加する。実施形態によっては、アポトーシス細胞の投与によってＣＡＲ−Ｔ細胞の効力は少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％または少なくとも５０％まで増加する。
【００７２】
別の実施形態では、アポトーシス細胞の上清を含む組成物の投与は、約５％を超えてＣＡＲ−Ｔ細胞の効力を低減させないで、がんもしくは腫瘍を治療し、予防し、阻害し、またはその発生を低減させ、がんもしくは腫瘍を寛解させ、またはがんもしくは腫瘍を緩和する。別の実施形態では、アポトーシス細胞の上清を含む組成物の投与は、約１０％を超えてＣＡＲ−Ｔ細胞の効力を低減させないで、がんもしくは腫瘍を治療し、予防し、阻害し、またはその発生を低減させ、がんもしくは腫瘍を寛解させ、またはがんもしくは腫瘍を緩和する。別の実施形態では、アポトーシス細胞の上清を含む組成物の投与は、約１５％を超えてＣＡＲ−Ｔ細胞の効力を低減させないで、がんもしくは腫瘍を治療し、予防し、阻害し、またはその発生を低減させ、がんもしくは腫瘍を寛解させ、またはがんもしくは腫瘍を緩和する。別の実施形態では、アポトーシス細胞の上清を含む組成物の投与は、約２０％を超えてＣＡＲ−Ｔ細胞の効力を低減させないで、がんもしくは腫瘍を治療し、予防し、阻害し、またはその発生を低減させ、がんもしくは腫瘍を寛解させ、またはがんもしくは腫瘍を緩和する。別の実施形態では、アポトーシス細胞の上清を含む組成物の投与は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の効力に影響を与えないで、がんもしくは腫瘍を治療し、予防し、阻害し、またはその発生を低減させ、がんもしくは腫瘍を寛解させ、またはがんもしくは腫瘍を緩和する。別の実施形態では、アポトーシス細胞の上清を含む組成物の投与は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の効力を低減しないで、がんもしくは腫瘍を治療し、予防し、阻害し、またはその発生を低減させ、がんもしくは腫瘍を寛解させ、またはがんもしくは腫瘍を緩和する。
【００７３】
実施形態によっては、本明細書では、ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカイン急増の発生を抑止または低減する方法が開示される。別の実施形態では、本明細書で開示される方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法を受けている被験体のサイトカイン産生を低減または防止し、それによって被験体のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカイン急増の発生を抑止または低減させる。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカイン急増の発生を抑止または低減させる本明細書で開示される方法は、その癌療法を受けている被験体にアポトーシス細胞を含む組成物を投与する工程を含む。さらに別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法を受けている被験体のサイトカイン産生を低減または抑止するための本明細書で開示される方法は、その癌療法を受けている被験体にアポトーシス細胞を含む組成物を投与する工程を含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物の投与は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の効力に影響を与えない。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞の上清を含む組成物の投与は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の効力を低減しない。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞の上清を含む組成物の投与によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の効力は約５％を超えて低下しない。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞の上清を含む組成物の投与によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の効力は約１０％を超えて低下しない。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞の上清を含む組成物の投与によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の効力は約１５％を超えて低下しない。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞の上清を含む組成物の投与によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の効力は約２０％を超えて低下しない。
【００７４】
実施形態によっては、本明細書では、サイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を患っていて、またはサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増に患い易い被験体のサイトカイン産生を低減または抑止する方法を開示し、この方法は本明細書で開示するアポトーシス細胞の上清またはアポトーシス細胞の上清を含む組成物を投与する工程を含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞の上清はアポトーシス細胞食細胞の上清を含む。
【００７５】
実施形態によっては、ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法を受けている被験体のサイトカイン産生を低減または抑止する本明細書に開示する方法は、その癌療法を受けている被験体にアポトーシス細胞の上清を含む組成物を投与する工程を含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞の上清を含む組成物の投与は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の効力に影響を与えない。別の実施形態では、アポトーシス細胞の上清を含む組成物の投与は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の効力を低下させない。
【００７６】
実施形態によっては、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）癌療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカイン急増の発生を抑止または低減させる方法は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞の上清を含む組成物を被験体に投与する工程を含む。別の実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）癌療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカイン急増の発生を抑止または低減させる方法によって、被験体の少なくとも１つの炎症誘発性サイトカインの産生が低減または抑止される。
【００７７】
別の実施形態では、本開示は、その治療を要する患者の免疫疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、サイトカイン急増、または不妊症を治療し、予防し、緩和し、阻害し、またはその発生を低減させるために、本明細書で開示される初期アポトーシス状態の単核細胞を含むプールされた単核アポトーシス細胞調製物を使用する方法を提供する。別の実施形態では、本明細書ではプールされた単核アポトーシス細胞調製物を開示し、特定の実施形態でのその細胞調製物の使用は、例えばＨＬＡ型判定のようなドナーとレシピエントの適合を必要としない。
【００７８】
遺伝子組換え免疫細胞
【００７９】
免疫細胞の遺伝子組換えは、がんに対する免疫細胞療法向けの手段として周知である。これらの免疫細胞療法は、治療を要する被験体に対して自家性または同種異系の免疫細胞の操作および投与に基づいている。免疫細胞に基づく療法としては、ナチュラルキラー細胞療法、樹状細胞療法、ならびにナイーブＴ細胞、ヘルパーＴ細胞としても知られるエフェクターＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞（Ｔレグ）を利用するＴ細胞免疫療法が挙げられる。
【００８０】
一実施形態では、本明細書では遺伝子組換え免疫細胞を含む組成物を開示する。別の実施形態では、遺伝子組換え免疫細胞はＴ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞はナイーブＴ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞はナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞はナイーブＴ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞はナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、遺伝子組換え免疫細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。別の実施形態では、遺伝子組換え免疫細胞は樹状細胞である。さらに別の実施形態では、遺伝子組換えＴ細胞は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ細胞）である。別の実施形態では、遺伝子組換えＴ細胞は制御性Ｔ細胞（Ｔレグ）である。別の実施形態では、遺伝子組換えＴ細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である。別の実施形態では、遺伝子組換えＴ細胞は遺伝子組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）細胞である。
【００８１】
一実施形態では、本明細書では遺伝子組換え免疫細胞、およびアポトーシス細胞、アポトーシス細胞の上清、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンもしくはこの断片もしくは類似体、テルル系化合物、もしくは免疫調節剤、またはこれらの任意の組合せを含む群から選択される追加の薬剤を含む組成物を開示する。別の実施形態では、本明細書では遺伝子組換え免疫細胞、アポトーシス細胞、およびＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンもしくはこの断片もしくは類似体、テルル系化合物、もしくは免疫調節剤、またはこれらの任意の組合せを含む群から選択される追加の薬剤を含む組成物を開示する。別の実施形態では、本明細書では遺伝子組換え免疫細胞、アポトーシス細胞の上清、およびＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンもしくはこの断片もしくは類似体、テルル系化合物、もしくは免疫調節剤、またはこれらの任意の組合せを含む群から選択される追加の薬剤を含む組成物を開示する。
【００８２】
一実施形態では、免疫細胞は細胞傷害性である。別の実施形態では、遺伝子組換えのための細胞傷害性細胞は、被験体（自己）またはドナー（同種異系）の骨髄から得ることができる。他の場合には、その細胞は幹細胞から得られる。例えば、細胞傷害性細胞はヒト胚性幹細胞、またはヒト人工多能性Ｔ細胞などのヒト多能性幹細胞由来であることができる。人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）の場合に、この多能性Ｔ細胞は、遺伝子組換え細胞傷害性細胞を投与される被験体からの体細胞を使用して得ることができる。一実施形態では、免疫細胞は静脈穿刺、成分分離法、白血球動員それに続く成分分離もしくは静脈穿刺、または骨髄穿刺によって細胞を回収することにより、被験体またはドナーから得ることができる。
【００８３】
一実施形態では、例えばＴ細胞などの免疫細胞は特定の因子の存在によってインビボで産生され増殖する。別の実施形態では、Ｔ細胞の産生および維持はインビボでサイトカインの影響を受ける。別の実施形態では、インビボでヘルパーＴ細胞の産生および維持に影響を及ぼすサイトカインは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、ＩＬ−３３、およびＴＧＦβを含む。別の実施形態では、Ｔレグ細胞はインビボでサイトカイン誘導によりナイーブＴ細胞から産生される。さらに別の実施形態では、ＴＧＦβおよび／またはＩＬ−２は、Ｔレグ細胞となるためのナイーブＴ細胞の分化に役立つ。
【００８４】
別の実施形態では、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、ＩＬ−３３およびＴＧＦβを含む群から選択されるサイトカインの存在は、インビボでのＴ細胞の増殖率を維持もしくは増加させる。別の実施形態では、サイトカインＩＬ−２および／またはＴＧＦβの存在は、インビボでのＴ細胞の増殖率を維持もしくは増加させる。別の実施形態では、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、ＩＬ−３３およびＴＧＦβを含む群から選択されるサイトカインの存在は、インビボでのＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖率を維持もしくは増加させる。別の実施形態では、サイトカインＩＬ−２および／またはＴＧＦβの存在は、インビボでのＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖率を維持もしくは増加させる。別の実施形態では、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、ＩＬ−３３およびＴＧＦβを含む群から選択されるサイトカインの存在は、インビボでのＴＣＲ−Ｔ細胞の増殖率を維持もしくは増加させる。別の実施形態では、サイトカインＩＬ−２および／またはＴＧＦβの存在は、インビボでのＴＣＲ−Ｔ細胞の増殖率を維持もしくは増加させる。別の実施形態では、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、ＩＬ−３３およびＴＧＦβを含む群から選択されるサイトカインの存在は、インビボでのＴレグ細胞の増殖率を維持もしくは増加させる。別の実施形態では、サイトカインＩＬ−２および／またはＴＧＦβの存在は、インビボでのＴレグ細胞の増殖率を維持もしくは増加させる。
【００８５】
一実施形態では、ＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質またはＢＡＣＨ２コード化タンパク質の発現もしくは形態が変化したＴ細胞は、長期間維持されるかもしくは増殖率を増加させ、または維持されかつ増加させる。別の実施形態では、前記の発現の変化はＳＴＡＴ５Ｂポリペプチドの発現を増加させる。別の実施形態では、前記の発現の変化はＢＡＣＨ２ポリペプチドの発現を増加させる。
【００８６】
別の実施形態では、発現が変化したＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボで長期間維持されるか、または増殖率を増加させる。別の実施形態では、発現が変化したＢＡＣＨ２コード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボで長期間維持されるか、またはインビボでの増殖率を増加させる。別の実施形態では、形態が変化したＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボで長期間維持されるか、またはインビボでの増殖率を増加させる。別の実施形態では、形態が変化したＢＡＣＨ２コード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボで長期間維持されるか、またはインビボでの増殖率を増加させる。
【００８７】
別の実施形態では、発現が変化したＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を１年以上維持または増加させる。別の実施形態では、発現が変化したＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を２年以上維持または増加させる。別の実施形態では、発現が変化したＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を３年以上維持または増加させる。別の実施形態では、発現が変化したＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を４年以上維持または増加させる。別の実施形態では、発現が変化したＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を５年以上維持または増加させる。別の実施形態では、発現が変化したＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を１０年以上維持または増加させる。別の実施形態では、発現が変化したＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を２０年以上維持または増加させる。
【００８８】
別の実施形態では、発現が変化したＢＡＣＨ２コード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を１年以上維持または増加させる。別の実施形態では、発現が変化したＢＡＣＨ２コード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を２年以上維持または増加させる。別の実施形態では、発現が変化したＢＡＣＨ２コード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を３年以上維持または増加させる。別の実施形態では、発現が変化したＢＡＣＨ２コード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を４年以上維持または増加させる。別の実施形態では、発現が変化したＢＡＣＨ２コード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を５年以上維持または増加させる。別の実施形態では、発現が変化したＢＡＣＨ２コード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を１０年以上維持または増加させる。別の実施形態では、発現が変化したＢＡＣＨ２コード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を２０年以上維持または増加させる。
【００８９】
別の実施形態では、形態が変化したＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を１年以上維持または増加させる。別の実施形態では、形態が変化したＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を２年以上維持または増加させる。別の実施形態では、形態が変化したＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を３年以上維持または増加させる。別の実施形態では、形態が変化したＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を４年以上維持または増加させる。別の実施形態では、形態が変化したＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を５年以上維持または増加させる。別の実施形態では、形態が変化したＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を１０年以上維持または増加させる。別の実施形態では、形態が変化したＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を２０年以上維持または増加させる。
【００９０】
別の実施形態では、形態が変化したＢＡＣＨ２コード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を１年以上維持または増加させる。別の実施形態では、形態が変化したＢＡＣＨ２コード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を２年以上維持または増加させる。別の実施形態では、形態が変化したＢＡＣＨ２コード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を３年以上維持または増加させる。別の実施形態では、形態が変化したＢＡＣＨ２コード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を４年以上維持または増加させる。別の実施形態では、形態が変化したＢＡＣＨ２コード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を５年以上維持または増加させる。別の実施形態では、形態が変化したＢＡＣＨ２コード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を１０年以上維持または増加させる。別の実施形態では、形態が変化したＢＡＣＨ２コード化タンパク質を有するＴ細胞は、インビボでの増殖率を２０年以上維持または増加させる。
【００９１】
別の実施形態では、発現が変化したＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質を有するＣＡＲ−Ｔ細胞は、インビボで長期間維持されるか、またはインビボでの増殖率を増加させる。別の実施形態では、発現が変化したＢＡＣＨ２コード化タンパク質を有するＣＡＲ−Ｔ細胞は、インビボで長期間維持されるか、またはインビボでの増殖率を増加させる。別の実施形態では、形態が変化したＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質を有するＣＡＲ−Ｔ細胞は、インビボで長期間維持されるか、またはインビボでの増殖率を増加させる。別の実施形態では、形態が変化したＢＡＣＨ２コード化タンパク質を有するＣＡＲ−Ｔ細胞は、インビボで長期間維持されるか、またはインビボでの増殖率を増加させる。
【００９２】
別の実施形態では、発現が変化したＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質を有するＴＣＲ−Ｔ細胞は、インビボで長期間維持されるか、またはインビボでの増殖率を増加させる。別の実施形態では、発現が変化したＢＡＣＨ２コード化タンパク質を有するＴＣＲ−Ｔ細胞は、インビボで長期間維持されるか、またはインビボでの増殖率を増加させる。別の実施形態では、形態が変化したＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質を有するＴＣＲ−Ｔ細胞は、インビボで長期間維持されるか、またはインビボでの増殖率を増加させる。別の実施形態では、形態が変化したＢＡＣＨ２コード化タンパク質を有するＴＣＲ−Ｔ細胞は、インビボで長期間維持されるか、またはインビボでの増殖率を増加させる。
【００９３】
別の実施形態では、発現が変化したＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質を有するＴレグ細胞は、インビボでの増殖率を維持するか増加させる。別の実施形態では、発現が変化したＢＡＣＨ２コード化タンパク質を有するＴレグ細胞は、インビボでの増殖率を維持するか増加させる。別の実施形態では、形態が変化したＳＴＡＴ５Ｂコード化タンパク質を有するＴレグ細胞は、インビボでの増殖率を維持するか増加させる。別の実施形態では、形態が変化したＢＡＣＨ２コード化タンパク質を有するＴレグ細胞は、インビボでの増殖率を維持するか増加させる。
【００９４】
一実施形態では、遺伝子組換え免疫細胞の増殖率を維持または増加させる方法を本明細書で開示し、この方法は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞の上清を投与する工程を含む。別の実施形態では、遺伝子組換え免疫細胞の効力を増加させる方法を本明細書で開示し、この方法は、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞の上清、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンもしくはこの断片もしくは類似体、テルル系化合物、もしくは免疫調節剤、またはこれらの任意の組合せを含む追加の薬剤を投与する工程を含む。別の実施形態では、がんもしくは腫瘍を処置、防止、阻害、その発生を低減させ、がんもしくは腫瘍を寛解または緩和するための本明細書で開示される方法は、遺伝子組換え免疫細胞および追加の薬剤を投与し、前記追加の薬剤は、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞の上清、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンもしくはこの断片もしくは類似体、テルル系化合物、もしくは免疫調節剤、またはこれらの任意の組合せを含む。
【００９５】
キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）
【００９６】
実施形態によっては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、モノクローナル抗体由来の細胞外腫瘍結合性部分、すなわち通常は単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）に融合した細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインから構成される一種の抗原標的受容体である。ＣＡＲは、ＭＨＣ依存性症状とは独立して細胞表面抗原を直接認識し、あらゆる被験体の任意の抗体に特異的な単一受容体構築物が使用可能になる。初期のＣＡＲでは、抗体認識ドメインをＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のＣＤ３ζ活性鎖に融合していた。これら第一世代のＣＡＲはインビトロでＴ細胞エフェクター機能を誘発していたが、これらＣＡＲは、インビボでは低抗腫瘍効力によって顕著に限定されていた。後続のＣＡＲ反復は、ＣＤ２８からの細胞内ドメイン、または４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）などの様々なＴＮＦ受容体ファミリー分子を含むＣＤ３ζを伴った二次性同時刺激シグナルを含んでいた。さらに第三世代の受容体は、ＣＤ３ζのほかに通常ＣＤ２８および４−１ＢＢからの２種の同時刺激シグナルを含む。第二および第三世代のＣＡＲでは抗腫瘍効力が劇的に向上し、場合によっては進行癌患者の完全寛解を誘導した。
【００９７】
実施形態によっては、ＣＡＲ−Ｔ細胞は抗原受容体を含む免疫応答性細胞であり、その受容体が抗原と結合すると活性化される。
【００９８】
実施形態によっては、本明細書で開示される組成物および方法で使用されるＣＡＲ−Ｔ細胞は、第一世代のＣＡＲ−Ｔ細胞である。別の実施形態では、本明細書で開示される組成物および方法で使用されるＣＡＲ−Ｔ細胞は、第二世代のＣＡＲ−Ｔ細胞である。別の実施形態では、本明細書で開示される組成物および方法で使用されるＣＡＲ−Ｔ細胞は、第三世代のＣＡＲ−Ｔ細胞である。別の実施形態では、本明細書で開示される組成物および方法で使用されるＣＡＲ−Ｔ細胞は、第四世代のＣＡＲ−Ｔ細胞である。実施形態によっては、各世代のＣＡＲ−Ｔ細胞はそれ以前の世代のものより効力が増している。
【００９９】
実施形態によっては、第一世代のＣＡＲは１つのシグナル伝達ドメイン、すなわち通常はＣＤ３−ＴＣＲζ鎖の細胞質シグナル伝達ドメインを有する。
【０１００】
別の実施形態では、本明細書で開示されるＣＡＲ−Ｔ細胞は第二世代のＣＡＲ−Ｔ細胞である。別の実施形態では、本明細書で開示されるＣＡＲ−Ｔ細胞は三要素キメラ受容体（ＴＰＣＲ）を含む。実施形態によっては、本明細書で開示されるＣＡＲ−Ｔ細胞は独立した共刺激によりナイーブＴ細胞を活性化する１つ以上のシグナル伝達部分を含む。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はさらに腫瘍壊死因子受容体ファミリーの１つ以上のメンバーをさらにコードし、その受容体は実施形態によっては、ＣＤ２７、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはＯＸ４０（ＣＤ１３４）またはそれらの組合せである。
【０１０１】
第三世代のＣＡＲ−Ｔ細胞では、２つの同時刺激ドメインが持つシグナル伝達能力が利用されていて、この同時刺激ドメインは、実施形態によっては、ＣＤ２８ドメインとそれに続く４−１ＢＢまたはＯＸ４０のいずれかのシグナル伝達ドメインである。別の実施形態では、本明細書で開示される組成物および方法にて使用されるＣＡＲ−Ｔ細胞はさらに共刺激シグナル伝達ドメインをコード化し、実施形態によっては、それはＣＤ２８である。別の実施形態では、シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζ鎖、ＣＤ９７、ＧＤＩ−ｌａ−ＣＤ１８、ＣＤ２、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１５４、ＣＤＳ、ＯＸ４０、４−１ＢＢならびにＣＤ２８の各シグナル伝達ドメイン、またはこれらの組合せである。
【０１０２】
実施形態によっては、テロメア長および複製能は養子移植されたＴ細胞系統の移植効率および抗腫瘍効率と関連している。実施形態によっては、ＣＤ２８の刺激によってＴ細胞のテロメア長が維持される。
【０１０３】
実施形態によっては、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞の効力は増殖性サイトカイン（すなわち、ＩＬ−１２）または共刺激リガンド（すなわち、４−１ＢＢＬ）などをコードするものなどの追加の遺伝子を導入することによりさらに増強され、その結果「武装化」第四世代ＣＡＲ修飾Ｔ細胞が産生される。実施形態によっては、「武装化ＣＡＲ−Ｔ細胞」とは抑制性腫瘍微小環境から守られるＣＡＲ−Ｔ細胞である。別の実施形態では、「武装化」ＣＡＲ技術では全身性副作用を最小にするために、可溶性シグナル伝達タンパク質の局所的分泌が組み込まれ、腫瘍微小環境の範囲内で免疫応答が増幅される。実施形態によっては、シグナル伝達タンパク質はＩＬ−１２であり、これはＴ細胞の活性化および動員を刺激できる。実施形態によっては、「武装化」ＣＡＲ技術は固形腫瘍の適応症に対して特に有用であり、その微小環境で強力な免疫抑制機構によって、堅牢な抗腫瘍応答をより攻撃的に確立する能力を発揮する。
【０１０４】
実施形態によっては、アポトーシスの防止、腫瘍微小環境の再構築、恒常性増殖の誘導および定方向Ｔ細胞のホーミングを促進するケモカイン受容体に関与する分子をコードするように、ＣＡＲ−Ｔ細胞は遺伝子組換えされる。
【０１０５】
別の実施形態では、本明細書で開示される組成物および方法で使用されるＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、サイトカイン導入遺伝子の発現、小分子阻害剤との組合せ療法またはモノクローナル抗体を使用することによって増強される。別の実施形態では、より限定的に腫瘍細胞を標的とするためにＣＡＲおよびケモカイン受容体の両方を使用することを含むＣＡＲ−Ｔ細胞療法の改善を目指した他の手段は、本明細書で開示されるようなＣＡＲ−Ｔ細胞およびＣＡＲ−Ｔ細胞療法の一部であると見做されるべきである。
【０１０６】
実施形態によっては、本明細書で開示される組成物および方法のＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞が有する正常細胞に対する癌細胞への特異性を増強させるために、抑制または増強されるシグナルを導くことができる第二の結合ドメインを含む。例えば、１つの標的タンパク質が存在するとＣＡＲ−Ｔ細胞はトリガーされるが第二のタンパク質が存在すると抑制されるように、ＣＡＲ−Ｔ細胞を操作することができる。またＣＡＲ−Ｔ細胞の活性を最大にするためには、２つの標的タンパク質が必要となるようにＣＡＲ−Ｔ細胞を操作することができる。これらの方法によって、ＣＡＲが有する正常細胞に対する腫瘍への特異性が増強できる。
【０１０７】
実施形態によっては、本明細書で開示される組成物および方法で使用されるＣＡＲ−Ｔ細胞は、チロシン系免疫受容体活性化モチーフからなるシグナル伝達モジュールをコードする抗体ベースの外部受容体構造およびサイトゾルドメインをコードする。
【０１０８】
実施形態によっては、ＣＡＲ−Ｔ細胞はさらに免疫抑制活性を有するポリペプチドに結合する単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）をコードする。別の実施形態では、免疫抑制活性を有するポリペプチドはＣＤ４７、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４またはこれらの組合せである。
【０１０９】
実施形態によっては、ＣＡＲ−Ｔ細胞はさらに免疫賦活活性を有するポリペプチドに結合する単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）をコードする。別の実施形態では、免疫賦活活性を有するポリペプチドはＣＤ２８、ＯＸ−４０、４−１ＢＢまたはこれらの組合せである。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はさらにＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）をコードし、実施形態によってはこのリガンドは抗原の免疫賦活活性を増強する。
【０１１０】
実施形態によっては、免疫細胞は細胞傷害性である。別の実施形態では、遺伝子組換えのための細胞傷害性細胞は被験体またはドナーの骨髄から得ることができる。他の場合に、その細胞は幹細胞から得られる。例えば、細胞傷害性細胞はヒト胚性幹細胞、ヒト人工多能性Ｔ細胞などのヒト多能性幹細胞由来であってもよい。人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）の場合に、このような多能性Ｔ細胞は、遺伝子組換え細胞傷害性細胞を投与される被験体からの体細胞を使用して得ることができる。実施形態によっては、免疫細胞は静脈穿刺、成分分離法、白血球動員に続いて成分分離もしくは静脈穿刺、または骨髄穿刺によって細胞を回収することにより、被験体またはドナーから得ることができる。
【０１１１】
実施形態によっては、本明細書で開示される方法は、被験体から免疫細胞を得ること、およびこの免疫細胞を遺伝子改変してキメラ抗原受容体を発現させることを含む。別の実施形態では、本明細書で開示される方法は、被験体から免疫細胞を得ること、この免疫細胞を遺伝子改変してキメラ抗原受容体を発現させること、およびアポトーシス細胞集団と組合せることを含み、その結果、被験体のサイトカイン産生は減少するが、アポトーシス細胞集団を投与していないＣＡＲを発現する免疫細胞に比較して細胞毒性は実質的に影響を受けない（図１Ａ、１Ｂおよび２）。別の実施形態では、本明細書で開示される方法は、被験体から免疫細胞を得ること、前記免疫細胞を遺伝子改変してキメラ抗原受容体を発現させること、およびアポトーシス細胞の上清またはその上清を含む組成物と組合せることを含み、その結果、被験体のサイトカイン産生は減少するが、アポトーシス細胞の上清を投与していないＣＡＲを発現する免疫細胞に比較して細胞毒性は実質的に影響を受けない。別の実施形態では、アポトーシス細胞集団またはアポトーシス細胞からの上清の投与によって、キメラ抗原受容体が発現している免疫細胞の効力は低下しない。
【０１１２】
一実施形態では、本明細書では免疫細胞を開示し、実施形態によってはＴ細胞が被験体に対して自家性であるＣＡＲ−Ｔ細胞を開示する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞が被験体に対して異種性である。実施形態によっては、ＣＡＲ−Ｔ細胞は同種異系である。実施形態によっては、ＣＡＲ−Ｔ細胞は汎用性を持つ同種異系のＣＡＲ−Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は自家性であっても、同種異系であっても、または操作された前駆体または幹細胞からインビトロで誘導されたものであってもよい。
【０１１３】
別の実施形態では、本明細書で開示されるＣＡＲ−Ｔ細胞およびアポトーシス細胞はいずれも同一の供給源由来である。別の実施形態では、本明細書で開示されるＣＡＲ−Ｔ細胞およびアポトーシス細胞はいずれも被験体由来である（図１）。別の実施形態では、本明細書で開示されるＣＡＲ−Ｔ細胞およびアポトーシス細胞は異なる供給源由来である。さらに別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は自家性であり、本明細書で開示されるアポトーシス細胞は同種異系である（図２）。当業者なら、同様に、アポトーシス細胞の上清をＣＡＲ−Ｔ細胞と同一の供給源由来の細胞、すなわち実施形態によっては自家性細胞であってもよい細胞から生成してもよく、あるいはアポトーシス細胞の上清をＣＡＲ−Ｔ細胞の供給源とは異なる供給源由来の細胞から生成してもよいことが分かっている。
【０１１４】
当業者なら、「異種」という用語は異なる生物由来の組織、細胞、核酸分子またはポリペプチドを包含してもよいことが分かっている。実施形態によっては、異種タンパク質とは、元々はレシピエントとは異なるＴ細胞型または種からクローン化されたか、またはそれに由来したタンパク質であり、かつ通常は細胞または細胞から得られる試料内には存在しないタンパク質である。
【０１１５】
従って、本明細書で開示される一実施形態は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、それによって自らの細胞傷害性機能を保持する細胞傷害性免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞）に関する。別の実施形態では、キメラ抗原受容体はＴ細胞に対して外来性である。別の実施形態では、ＣＡＲは組換えで発現する。別の実施形態では、ＣＡＲはベクターから発現する。
【０１１６】
実施形態によっては、ＣＡＲ−Ｔ細胞の産生に利用されるＴ細胞はナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞の産生に利用されるＴ細胞はナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞の産生に利用されるＴ細胞はエフェクターＴ細胞である。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞の産生に利用されるＴ細胞は制御性Ｔ細胞（Ｔレグ）である。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞の産生に利用されるＴ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞である。
【０１１７】
例えばＴ細胞などの遺伝子組換え免疫細胞の供給源は、文献に広く記載されている。例えばＴｈｅｍｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）  Ｎｅｗ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｕｒｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｄｏｐｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １６：  ３５７−３６６、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ＆  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ６：４７−５３、Ｗｉｌｋｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  ２８５（３３）：２５５３８−２５５４４、およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｔｅｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９１：  ４５８９−４５９８を参照。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓ社（米国ニューヨーク州）などの販売元から注文により入手可能であり、この販売元は、組換えアデノウィルスワクチンによってコードされた防御免疫を誘導できるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の委託構築および産生サービスを提供し、また予備産生したＣＡＲ構築物ストックを提供する。委託産生したＣＡＲ−Ｔ細胞は、特別に設計されたＣＡＲ−Ｔ細胞を供給可能なＰｒｏｍａｂ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（米国カリフォルニア州）からも得ることができる。
【０１１８】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）細胞
【０１１９】
実施形態によっては、本明細書で開示される組成物および方法では、ＣＡＲ−Ｔ細胞に加えて、またはＣＡＲ−Ｔ細胞の代わりにデザイナーＴ細胞受容体（ＴＣＲ）細胞が利用される。ＴＣＲはＴ細胞の抗原特異的な活性を媒介する複数のサブユニットを持つ膜貫通型の複合体である。ＴＣＲは２つの異なるポリペプチド鎖からなる。ＴＣＲは、例えば腫瘍または癌細胞などの標的細胞表面の抗原エピトープを認識して、Ｔ細胞に抗原特異性を付与する。腫瘍または癌細胞表面に存在する抗原と接触した後に、Ｔ細胞は増殖し、がんまたは腫瘍細胞を排除できる表現型および機能を得る。
【０１２０】
実施形態によっては、ＴＣＲ−Ｔ細胞療法は、目的タンパク質のエピトープに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をＴ細胞に導入することを含む。別の実施形態では、目的タンパク質は腫瘍関連抗原である。別の実施形態では、遺伝子操作されたＴＣＲは、Ｔ細胞活性化ドメインとともに腫瘍細胞表面の主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）によって提示された腫瘍抗原エピトープを認識する。別の実施形態では、Ｔ細胞受容体は細胞内局在か膜局在かにかかわらず抗原を認識する。別の実施形態では、ＴＣＲは細胞内で腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞を認識する。実施形態によっては、ＴＣＲは内部抗原を認識する。別の実施形態では、ＴＣＲは血管新生因子を認識する。別の実施形態では、血管新生因子は新たな血管の形成に関与する分子である。さまざまな遺伝子組換えＴ細胞受容体およびその産生方法は当技術分野で周知である。
【０１２１】
実施形態によっては、ＴＣＲ−Ｔ細胞療法は、がんもしくは腫瘍を治療、防止、阻害、寛解、その発生を低減させ、またはがんもしくは腫瘍を緩和するために使用される。一実施形態では、ＴＣＲ−Ｔ細胞療法は、血液腫瘍（リンパ腫および白血病）および固形腫瘍（難治性メラノーマ、肉腫）を含む進行転移性疾患を治療、防止、阻害、寛解、その発生を低減させ、またはこれら進行転移性疾患を緩和するために使用される。実施形態によっては、本明細書で開示される組成物および方法で使用されるＴＣＲ−Ｔ細胞療法は、Ｓａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２０１３  Ａｐｒ；  ３（４）：  ３８８−３９８）の表１に列記された悪性腫瘍を治療する。
【０１２２】
別の実施形態では、Ｔ細胞受容体はＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープに結合するように遺伝子組換えされており、ＴＣＲ操作Ｔ細胞は抗ＮＹ−ＥＳＯ−１である。別の実施形態では、Ｔ細胞受容体はＨＰＶ−１６−Ｅ６エピトープに結合するように遺伝子組換えされており、ＴＣＲ操作Ｔ細胞は抗ＨＰＶ−１６−Ｅ６である。別の実施形態では、Ｔ細胞受容体はＨＰＶ−１６−Ｅ７エピトープに結合するように遺伝子組換えされており、ＴＣＲ操作Ｔ細胞は抗ＨＰＶ−１６−Ｅ７である。別の実施形態では、Ｔ細胞受容体はＭＡＧＥ−Ａ３／Ａ６エピトープに結合するように遺伝子組換えされており、ＴＣＲ操作Ｔ細胞は抗ＭＡＧＥ−Ａ３／Ａ６である。別の実施形態では、Ｔ細胞受容体はＭＡＧＥ−Ａ３エピトープに結合するように遺伝子組換えされており、ＴＣＲ操作Ｔ細胞は抗ＭＡＧＥ−Ａ３である。別の実施形態では、Ｔ細胞受容体はＳＳＸ２エピトープに結合するように遺伝子組換えされており、ＴＣＲ操作Ｔ細胞は抗ＳＳＸ２である。別の実施形態では、Ｔ細胞受容体は本明細書で開示される標的抗原に結合するように遺伝子組換えされている。当技術分野で周知の手段を用いると、当業者なら、がんまたは腫瘍細胞表面に存在する標的抗原に結合するようにＴ細胞受容体を遺伝子組換えすることができ、ＴＣＲ操作Ｔ細胞は抗腫瘍細胞または抗癌細胞を含むことが分かる。
【０１２３】
一実施形態では、本明細書で開示される方法は、被験体から免疫細胞を得ること、およびその免疫細胞を遺伝子改変して組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現させることを含む。別の実施形態では、本明細書で開示される方法は、被験体から免疫細胞を得ること、その免疫細胞を遺伝子改変して組換えＴＣＲを発現させること、および追加の薬剤と組合せることを含み、前記追加の薬剤は、アポトーシス細胞集団、アポトーシス細胞の上清、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンもしくはこの断片もしくは類似体、テルル系化合物、もしくは免疫調節剤、またはこれらの任意の組合せを含む。
【０１２４】
一実施形態では、ＴＣＲ−Ｔ細胞の産生に利用されるＴ細胞はナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＴＣＲ−Ｔ細胞の産生に利用されるＴ細胞はナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＴＣＲ−Ｔ細胞の産生に利用されるＴ細胞はエフェクターＴ細胞である。別の実施形態では、ＴＣＲ−Ｔ細胞の産生に利用されるＴ細胞は制御性Ｔ細胞（Ｔレグ）である。別の実施形態では、ＴＣＲ−Ｔ細胞の産生に利用されるＴ細胞は細胞傷害性Ｔ細胞である。
【０１２５】
ＴＣＲ−Ｔ細胞は、文献に広く記載されている。例えばＳｈａｒｐｅ  ａｎｄ  Ｍｏｕｎｔ（２０１５）  ｉｂｉｄ．、Ｅｓｓａｎｄ  Ｍ，  Ｌｏｓｋｏｇ  ＡＳＩ（２０１３）  Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ（Ｒｅｖｉｅｗ）．  Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  ２７３、１６６−１８１、およびＫｅｒｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＆  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３：１−７を参照。
【０１２６】
抗原標的化
【０１２７】
実施形態によっては、ＣＡＲは抗原に特異的な抗体または抗体の断片によって抗原のエピトープに結合する。別の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。別の実施形態では、抗体はポリクローナル抗体である。別の実施形態では、抗体の断片は単鎖可変領域（ｓｃＦｖ）である。
【０１２８】
実施形態によっては、ＴＣＲは遺伝子組換えＴ細胞によって抗原のエピトープに結合する。
【０１２９】
別の実施形態では、本明細書で開示される組成物のＣＡＲ−Ｔ細胞は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する。別の実施形態では、前記腫瘍関連抗原は、ムチン−１すなわち細胞表面関連ムチン（ＭＵＣ１）または遺伝子多型上皮ムチン（ＰＥＭ）、腫瘍初期に変異した高アルギニンタンパク質（Ａｒｍｅｔ）、熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）、カルネキシン（ＣＡＮＸ）、メチレンテトラヒドロ葉酸脱水素酵素（ＮＡＤＰ＋依存性）２、メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ（ＭＴＨＦＤ２）、繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、マトリックスメタロペプチダーゼ（ＭＭＰ６）、Ｂメラノーマ抗原１（ＢＡＧＥ−１）、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶの異常転写物（ＧｎＴＶ）、Ｑ５Ｈ９４３、がん胎児抗原（ＣＥＡ）、Ｐｍｅｌ、カリクレイン−４、マンマグロビン−１、ＭＡＲＴ−１、ＧＰＲ１４３−ＯＡ１、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＴＲＰ１、チロシナーゼ、ＦＧＰ−５、ＮＥＵ癌原遺伝子、Ａｆｔ、ＭＭＰ−２、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、テロメラーゼ関連タンパク質−２、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ウロプラキンＩＩまたはプロテイナーゼ３である。
【０１３０】
別の実施形態では、白血病のようにＢ細胞を破壊したい場合に、ＣＡＲはＣＤ１９またはＣＤ２０に結合してＢ細胞を標的化する。ＣＤ１９は、プロＢ細胞から初期血漿細胞までの幅広いその発現により、Ｂ細胞悪性腫瘍の免疫療法にとって魅力的な標的となる特異的Ｂ細胞系列表面受容体である。別の実施形態では、ＣＡＲはＲＯＲ１、ＣＤ２２またはＧＤ２に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＮＹ−ＥＳＯ−１に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＭＥＧＡファミリータンパク質に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはメソテリンに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはｃ−ｅｒｂＢ２に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異およびＢＣＲ−ＡＢＬ転移などの腫瘍特異的な変異抗原に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＨＤ中のＥＢＶ、子宮頸がん中のＨＰＶ、およびメルケルがん中のポリオーマウイルスなどの腫瘍特異的なウイルス抗原に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＨｅｒ２／ｎｅｕに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する。
【０１３１】
実施形態によっては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞はＣＤ１９抗原に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＣＤ２２抗原に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはα葉酸受容体に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＣＡＩＸに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＣＤ２０に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＣＤ２３に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＣＤ２４に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＣＤ３０に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＣＤ３３に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＣＤ３８に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＣＤ４４ｖ６に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＣＤ４４ｖ７／８に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＣＤ１２３に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＣＤ１７１に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはがん胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＥＧＰ−２に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＥＧＰ−４０に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＥｐｈＡ２に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＥｒｂ−Ｂ２に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＥｒｂ−２，３，４に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＥｒｂ−Ｂ３／４に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＦＢＰに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは胎性アセチルコリン受容体に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＧＤ２に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＧＤ３に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＨＥＲ２に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＨＭＷ−ＭＡＡに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＩＬ−１１Ｒαに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＩＬ−１３Ｒα１に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＫＤＲに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはκ軽鎖に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはルイスＹに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＬ１細胞接着分子に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＭＡＧＥ−Ａ１に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはメソテリンに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＣＭＶ感染細胞に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＭＵＣ１に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＭＵＣ１６に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＮＫＧ２Ｄリガンドに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＮＹ−ＥＳＯ−１（アミノ酸１５７−１６５）に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはがん胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＰＳＣＡに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＰＳＭＡに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＲＯＲ１に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＴＡＧ−７２に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＶＥＧＦ−Ｒ２または他のＶＥＧＦ受容体に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＢ７−Ｈ６に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＣＡ９に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはαｖβ６インテグリンに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは８Ｈ９に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲはＮＣＡＭに結合する。別の実施形態では、ＣＡＲは胎性アセチルコリン受容体に結合する。
【０１３２】
別の実施形態では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞はＣＤ１９抗原を標的とし、Ｂ細胞悪性腫瘍、ＡＬＬ、濾胞性リンパ腫、ＣＬＬおよびリンパ腫を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＤ２２抗原を標的とし、Ｂ細胞悪性腫瘍を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はα葉酸受容体また葉酸受容体αを標的とし、卵巣がんまたは上皮がんを患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＡＩＸまたはＧ２５０／ＣＡＩＸを標的とし、腎細胞がんを患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＤ２０を標的とし、リンパ腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫および無痛性Ｂ細胞リンパ腫を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＤ２３を標的とし、ＣＬＬを患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＤ２４を標的とし、膵臓腺がんを患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＤ３０を標的とし、リンパ腫またはホジキンリンパ腫を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＤ３３を標的とし、ＡＭＬを患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＤ３８を標的とし、非ホジキンリンパ腫を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＤ４４ｖ６を標的とし、様々な悪性腫瘍を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＤ４４ｖ７／８を標的とし、子宮頸がんを患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＤ１２３を標的とし、骨髄悪性腫瘍を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＥＡを標的とし、結腸直腸がんを患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とし、神経膠芽腫を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＥＧＰ−２を標的とし、様々な悪性腫瘍を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＥＧＰ−４０を標的とし、大腸がんを患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＥｐｈＡ２を標的とし、神経膠芽腫を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＥｒｂ−Ｂ２またはＥｒｂＢ３／４を標的とし、乳がんおよびその他、前立腺がん、結腸がん、様々な腫瘍を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＥｒｂ−Ｂ２，３，４を標的とし、乳がんおよびその他を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＦＢＰを標的とし、卵巣がんを患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は胎性アセチルコリン受容体を標的とし、横紋筋肉腫を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＧＤ２を標的とし、神経芽繊維腫、メラノ��マ、またはユーイング肉腫を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＧＤ３を標的とし、メラノーマを患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＨＥＲ２を標的とし、髄芽腫、膵臓腺がん、神経膠芽腫、骨肉腫、または卵巣がんを患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＨＭＷ−ＭＡＡを標的とし、メラノーマを患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＩＬ−１１Ｒαを標的とし、骨肉腫を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＩＬ−１３Ｒα１を標的とし、神経膠腫、神経膠芽腫、または髄芽腫を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＩＬ−１３受容体α２を標的とし、様々な悪性腫瘍を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＫＤＲを標的とし、腫瘍新生血管を標的とすることによって腫瘍を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はκ軽鎖を標的とし、Ｂ細胞悪性腫瘍（Ｂ−ＮＨＬ、ＣＬＬ）を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はルイスＹを標的とし、様々な細胞腫または上皮由来腫瘍を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＬ１細胞接着分子を標的とし、神経芽細胞腫を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＭＡＧＥ−Ａ１またはＨＬＡ−Ａ１−ＭＡＧＥ−Ａ１を標的とし、メラノーマを患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はメソテリンを標的とし、中皮腫を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＭＶ感染細胞を標的とし、ＣＭＶを患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＭＵＣ１を標的とし、乳がんまたは卵巣がんを患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＭＵＣ１６を標的とし、卵巣がんを患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＮＫＧ２Ｄリガンドを標的とし、骨髄腫、卵巣またはその他の腫瘍を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＮＹ−ＥＳＯ−１（１５７−１６５）またはＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１を標的とし、多発性骨髄腫を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はがん胎児性抗原（ｈ５Ｔ４）を標的とし、様々な腫瘍を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＰＳＣＡを標的とし、前立腺がんを患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＰＳＭＡを標的とし、前立腺がん／血管系腫瘍を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＲＯＲ１を標的とし、Ｂ−ＣＬＬおよびマントル細胞リンパ腫を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＴＡＧ−７２を標的とし、腺がんおよび胃腸がんを患う被験体に対して治療効���を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＶＥＧＦ−Ｒ２または他のＶＥＧＦ受容体を標的とし、腫瘍新生血管を標的とすることによって、腫瘍を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＡ９を標的とし、腎細胞がんを患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＣＤ１７１を標的とし、腎臓神経芽細胞腫を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＮＣＡＭを標的とし、神経芽細胞腫を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は胎性アセチルコリン受容体を標的とし、横紋筋肉腫を患う被験体に対して治療効果を発揮する。別の実施形態では、ＣＡＲは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれているＳａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２０１３  Ａｐｒ；  ３（４）：  ３８８−３９８）の表１に列記された標的抗原の１種に結合する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は炭水化物構造または糖脂質構造に結合する。
【０１３３】
一実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は血管新生因子に結合し、それにより腫瘍血管系を標的とする。実施形態によっては、血管新生因子はＶＥＧＦＲ２である。別の実施形態では、血管新生因子はエンドグリンである。別の実施形態では、本明細書に開示される血管新生因子は、アンジオジェニン、アンジオポエチン−１、Ｄｅｌ−１、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／散乱因子（ＳＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、レプチン、ミッドカイン、胎盤成長因子、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、プレオトロフィン（ＰＴＮ）、プログラニュリン、プロリフェリン、形質転換成長因子α（ＴＧＦ−α）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）／血管透過性因子（ＶＰＦ）である。別の実施形態では、血管新生因子は血管新生タンパク質である。実施形態によっては、成長因子は血管新生タンパク質である。実施形態によっては、本明細書に開示される組成物および方法で使用される血管新生タンパク質は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲおよびニューロピリン１（ＮＲＰ−１）、アンジオポエチン１（Ａｎｇ１）およびＴｉｅ２、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ、ＢＢホモダイマー）およびＰＤＧＦＲ、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）、エンドグリンおよびＴＧＦ−β受容体、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、インテグリンαＶβ３、αＶβ５およびα５β１、ＶＥ−カドヘリンおよびＣＤ３１、エフリン、プラスミノーゲン活性化剤、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）およびＣＯＸ−２、ＡＣ１３３、またはＩｄ１／Ｉｄ３である。実施形態によっては、本明細書に開示される組成物および方法で使用される血管新生タンパク質はアンジオポエチンであり、これは実施形態によっては、アンジオポエチン１、アンジオポエチン３、アンジオポエチン４、またはアンジオポエチン６である。実施形態によっては、エンドグリンは、ＣＤ１０５、ＥＤＧ、ＨＨＴ１、ＯＲＷ、またはＯＲＷ１としても知られる。実施形態によっては、エンドグリンはＴＧＦβ共受容体である。
【０１３４】
別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、感染病源体に関連する抗原に結合する。実施形態によっては、感染病源体は結核菌である。実施形態によっては、前記結核菌関連抗原は、抗原８５Ｂ、リポタンパク質ＩｐｑＨ、ＡＴＰ依存性推定ヘリカーゼ、未特性タンパク質Ｒｖ０４７６／ＭＴＯ４９４１前駆体、または不特定タンパク質Ｒｖ１３３４／ＭＴ１３７６前駆体である。
【０１３５】
別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は抗体に結合する。実施形態によっては、ＣＡＲ−Ｔ細胞は「抗体結合Ｔ細胞受容体」（ＡＣＴＲ）である。この実施形態によれば、ＣＡＲ−Ｔ細胞はユニバーサルＣＡＲ−Ｔ細胞である。別の実施形態では、抗体受容体を持つＣＡＲ−Ｔ細胞は、抗体の投与前、投与後、または投与と同時に投与され、次いで抗体に結合してＴ細胞を腫瘍またはがんに近接させる。別の実施形態では、抗体は腫瘍細胞抗原に誘導される。別の実施形態では、抗体はＣＤ２０に誘導される。別の実施形態では、抗体はリツキシマブである。
【０１３６】
別の実施形態では、抗体はトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）：ヒト化ＩｇＧ１であり、これはＥＲＢＢ２に誘導される。別の実施形態では、抗体はベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ社）：ヒト化ＩｇＧ１であり、これはＶＥＧＦに誘導される。別の実施形態では、抗体はセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ社）：キメラヒト−マウスＩｇＧ１であり、これはＥＧＦＲに誘導される。別の実施形態では、抗体はパニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ；Ａｍｇｅｎ社）：ヒトＩｇＧ２であり、これはＥＧＦＲに誘導される。別の実施形態では、抗体はイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ社）：ＩｇＧ１であり、これはＣＴＬＡ４に誘導される。
【０１３７】
別の実施形態では、抗体は、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ；Ｇｅｎｚｙｍｅ社）：ヒト化ＩｇＧ１であり、これはＣＤ５２に誘導される。別の実施形態では、抗体は、オファツムマブ（Ａｒｚｅｒｒａ；Ｇｅｎｍａｂ社）：ヒトＩｇＧ１であり、これはＣＤ２０に誘導される。別の実施形態では、抗体はゲムツズマブオゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ；Ｗｙｅｔｈ社）：ヒト化ＩｇＧ４であり、これはＣＤ３３に誘導される。別の実施形態では、抗体は、ブレンツキシマブベドチン（Ａｄｃｅｔｒｉｓ；Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社）：キメラＩｇＧ１であり、これはＣＤ３０に誘導される。別の実施形態では、抗体は、９０Ｙ標識イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ；ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）：マウスＩｇＧ１であり、これはＣＤ２０に誘導される。別の実施形態では、抗体は、１３１Ｉ標識トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）：マウスＩｇＧ２であり、これはＣＤ２０に誘導される。
【０１３８】
別の実施形態では、抗体はラムシルマブであり、これは血管内皮増殖因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ−２）に誘導される。別の実施形態では、抗体は、ラムシルマブ（Ｃｙｒａｍｚａ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ社）、ブリナツモマブ（ＢＬＩＮＣＹＴＯ、Ａｍｇｅｎ社）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ  ＆  Ｄｏｈｍｅ社）、オビヌツズマブ（ＧＡＺＹＶＡ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社、以前はＧＡ１０１として公知）、ペルツズマブ注射（ＰＥＲＪＥＴＡ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）、またはデノスマブ（Ｘｇｅｖａ、Ａｍｇｅｎ社）である。別の実施形態では、抗体はバシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ；Ｎｏｖａｒｔｉｓ社）である。別の実施形態では、抗体はダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ；Ｒｏｃｈｅ社）である。
【０１３９】
別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞が結合する抗体は、本明細書に記載され、および／または当技術分野で公知の腫瘍または癌抗原もしくはその断片に誘導される。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞が結合する抗体は、腫瘍関連抗原に誘導される。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞が結合する抗体は、血管新生因子である腫瘍関連抗原またはその断片に誘導される。
【０１４０】
別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞が結合する抗体は、本明細書に記載され、および／または当技術分野で公知の腫瘍または癌抗原もしくはその断片に誘導される。
【０１４１】
実施形態によっては、本明細書に記載の抗体は、本明細書に記載の組成物、例えば、限定はされないが、ＣＡＲ−Ｔ細胞もしくは初期アポトーシス細胞、またはそれらの任意の組合せを含む組成物と組合せて使用してもよい。
【０１４２】
サイトカイン急増およびサイトカイン放出症候群
【０１４３】
一実施形態において、本明細書に開示される方法は、ＮＫ細胞、樹状細胞、ＴＣＲ−Ｔ細胞、または組換えキメラ抗原受容体（ＣＡＲ−Ｔ細胞）を含むＴ細胞などの免疫細胞を少なくとも１つの追加の薬剤とともに提供して、被験体が引き起こす可能性のある毒性サイトカイン放出または「サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）」または「重症サイトカイン放出症候群（ｓＣＲＳ）」または「サイトカイン急増」を低減することを含む。別の実施形態では、ＣＲＳ、ｓＣＲＳまたはサイトカイン急増は、免疫細胞の投与の結果として引き起こされる。別の実施形態では、ＣＲＳ、ｓＣＲＳまたはサイトカイン急増は、免疫細胞とは別個の刺激、条件、または症候の結果である（以下を参照）。別の実施形態では、サイトカイン急増、サイトカインカスケード、または高サイトカイン血症は、より深刻な形態のサイトカイン放出症候群である。
【０１４４】
一実施形態では、有害なサイトカイン放出を低減する追加の薬剤は、アポトーシス細胞または前記アポトーシス細胞を含む組成物を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を低減する追加の薬剤は、アポトーシス細胞の上清または前記上清を含む組成物を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を低減する追加の薬剤は、ＣＴＬＡ−４遮断薬を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を低減する追加の薬剤は、アポトーシス細胞もしくはアポトーシス細胞上清またはその組成物、およびＣＴＬＡ−４遮断薬を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を低減する追加の薬剤は、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくはその類似体を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を低減する追加の薬剤は、アポトーシス細胞もしくはアポトーシス細胞上清またはその組成物、およびα１アンチトリプシンまたはその断片もしくはその類似体を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を低減する追加の薬剤は、テルル系化合物を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を低減する追加の薬剤は、アポトーシス細胞もしくはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物、およびテルル系化合物を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を低減する追加の薬剤は、免疫調節剤を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を低減する追加の薬剤は、アポトーシス細胞もしくはアポトーシス細胞上清またはその組成物、および免疫調節剤を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を低減する追加の薬剤は、Ｔレグ細胞を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を低減する追加の薬剤は、アポトーシス細胞もしくはアポトーシス細胞上清またはその組成物、およびＴレグ細胞を含む。
【０１４５】
当業者なら、毒性サイトカイン放出または毒性サイトカイン濃度を低減することには、被験体の毒性サイトカイン濃度の産生を低減または阻害すること、または被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の発生を阻害または低減することを含むことが分かっている。別の実施形態では、毒性サイトカイン濃度は、ＣＲＳまたはサイトカイン急増の発生中に低減される。別の実施形態では、毒性サイトカイン濃度の産生を低減または阻害することは、ＣＲＳまたはサイトカイン急増を治療することを含む。別の実施形態では、毒性サイトカイン濃度の産生を低減または阻害することは、ＣＲＳまたはサイトカイン急増を予防することを含む。別の実施形態では、毒性サイトカイン濃度の産生を低減または阻害することは、ＣＲＳまたはサイトカイン急増を緩和することを含む。別の実施形態では、毒性サイトカイン濃度の産生を低減または阻害することは、ＣＲＳまたはサイトカイン急増を寛解することを含む。別の実施形態では、毒性サイトカインは炎症誘発性サイトカインを含む。別の実施形態では、炎症誘発性サイトカインはＩＬ−６を含む。別の実施形態では、炎症誘発性サイトカインはＩＬ−１βを含む。別の実施形態では、炎症誘発性サイトカインはＴＮＦ−αを含む。別の実施形態では、炎症誘発性サイトカインは、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、またはＴＮＦ−α、もしくはそれらの任意の組合せを含む。
【０１４６】
一実施形態では、サイトカイン放出症候群は、高濃度のいくつかの炎症性サイトカイン、および低血圧、高熱、悪寒などの被験体での有害な身体反応を特徴とする。別の実施形態では、炎症性サイトカインは、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、およびＴＮＦ−αを含む。別の実施形態では、ＣＲＳは、高濃度のＩＬ−６、ＩＬ−１β、またはＴＮＦ−α、またはそれらの任意の組合せを特徴とする。別の実施形態では、ＣＲＳは、高濃度のＩＬ−８、またはＩＬ−１３、またはそれらの任意の組合せを特徴とする。別の実施形態では、サイトカイン急増は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−５、フラクタルカイン、またはその組合せもしくはその部分が増大している場合を特徴とする。さらに別の実施形態では、ＩＬ−６は、ＣＲＳまたはサイトカイン急増のマーカーを含む。
【０１４７】
別の実施形態では、ヒトおよびマウスのＣＲＳまたはサイトカイン急増で増加したサイトカインは、以下の表１および表２に列記されたサイトカインの任意の組合せを含んでもよい。
【０１４８】
【表１（１）】
2020531515.tif 000003
【０１４９】
【表１（２）】
2020531515.tif 000004
【０１５０】
実施形態によっては、表１のサイトカインであるＦｌｔ−３Ｌ、フラクタルカイン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒα、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１３は、ＣＲＳまたはサイトカイン急増で有意であると見做される。別の実施形態では、表１のＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−１、およびＩＬ−１Ｒαは、ＣＲＳまたはサイトカイン急増で重要であると思われる。別の実施形態では、Ｍ−ＣＳＦの重要性は分からない。別の実施形態では、表１に列記される任意のサイトカインまたはそれらの組合せは、ＣＲＳまたはサイトカイン急増のマーカーとして使用されてもよい。
【０１５１】
【表２】
2020531515.tif 000005
【０１５２】
一実施形態では、表２のＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＴＮＦ−αは、ＣＲＳまたはサイトカイン急増で有意であると見做される。別の実施形態では、表２のＩＬ−２７、ＭＣＰ−３、ＰＧＥ２、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−αＲ１、およびＭＩＧは、ＣＲＳまたはサイトカイン急増で重要であると思われる。別の実施形態では、ＩＬ−２３およびＩＬ−２５の重要性は分からない。別の実施形態では、表２に列記される任意のサイトカインまたはそれらの組合せは、ＣＲＳまたはサイトカイン急増のマーカーとして使用されてもよい。別の実施形態では、マウスサイトカインであるＩＬ−１０、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＰ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＦＮα、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ７０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒ、およびＩＬ−７は、ＣＲＳまたはサイトカイン急増で重要であると思われる。
【０１５３】
当業者なら、「サイトカイン」という用語は、サイトカイン（例えば、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子α）、ケモカイン（例えば、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＲＡＮＴＥＳ）、および活性の酸素種や酸化窒素などの炎症のその他の可溶性媒介物を含むことが分かっている。
【０１５４】
一実施形態では、特定のサイトカイン放出の増加は、有意であるか、重要であるか、または重要性が不明であるかを問わず、特定のサイトカインがサイトカイン急増の一要因になると経験的には意味していない。一実施形態では、少なくとも１つのサイトカインの増加は、サイトカイン急増またはＣＲＳに起因するものではない。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、特定のサイトカインまたはサイトカイン群の濃度の増加の原因となる可能性がある。
【０１５５】
別の実施形態では、サイトカイン放出症候群は、以下の症状のいずれかまたはすべてを特徴とし、それら症状は、硬直、不快感、疲労、食欲不振、筋肉痛、関節痛、悪心、嘔吐、頭痛を伴うまたは伴わない発熱、皮膚発疹、悪寒、嘔吐、下痢、頻呼吸、低酸素血症、心血管性頻拍、脈圧の拡大、低血圧、心拍出量の（初期）増加、心拍出量の（後期）低下、Ｄダイマー上昇、出血を伴うまたは伴わない低フィブリノゲン血症、肝性高窒素血症、高トランスアミナーゼ血症、高ビリルビン血症、頭痛、精神状態の変化、錯乱、せん妄、換語困難または公然失語症、幻覚、振戦、吐き気、歩行の変化、および発作である。別の実施形態では、サイトカイン急増は、ＩＬ−２放出およびリンパ球増殖を特徴とする。別の実施形態では、サイトカイン急増は、ＣＡＲ−Ｔ細胞が放出するサイトカインの増加を特徴とする。別の実施形態では、サイトカイン急増は、ＣＡＲ−Ｔ細胞以外の細胞が放出するサイトカインの増加を特徴とする。
【０１５６】
別の実施形態では、サイトカイン急増は、心機能不全、成人呼吸困難症候群、神経毒性、腎不全および／または肝不全、ならびに播種性血管内凝固を含む潜在的に生命を脅かす合併症をもたらす。
【０１５７】
当業者なら、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカイン急増の特徴は、ＣＲＳまたはサイトカイン急増の開始の数日から数週間後に起こると考えられることが分かっている。一実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＲＳまたはサイトカイン急増の誘因となる。別の実施形態では、ＣＲＳまたはサイトカイン急増の誘因はＣＡＲ−Ｔ細胞ではない。
【０１５８】
一実施形態では、サイトカイン急増の指標としてのサイトカイン水準または濃度の測定値は、サイトカイン水準または濃度の倍数での増加、百分率（％）での増加、正味での増加、または変化率として表示してもよい。別の実施形態では、特定の水準または濃度を超えるサイトカイン水準または濃度の絶対値は、サイトカイン急増を患っているまたは患い易い被験体での指標であってもよい。別の実施形態では、特定の水準または濃度のサイトカインの絶対水準または絶対濃度、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞療法を受けていない対照被験体に通常見られる水準または濃度は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を受けている被験体でサイトカイン急増の発生を抑制または低減させる方法の指標となってもよい。
【０１５９】
当業者なら、「サイトカイン濃度」という用語は、濃度の測定値、倍率変化の測定値、百分率（％）変化の測定値、または比率変化の測定値を含んでもよいことが分かっている。さらに、血液、唾液、血清、尿、および血漿中のサイトカインの測定方法は、当技術分野で周知である。
【０１６０】
一実施形態では、サイトカイン急増は数種の炎症性サイトカインの上昇に関連しているという認識はあるが、ＩＬ−６濃度をサイトカイン急増の一般的な測定値として、および／またはサイトカイン急増の治療効力の一般的な測定値として使用してもよい。当業者なら、他のサイトカイン、例えばＴＮＦ−α、ＩＢ−１α、ＩＬ−８、ＩＬ−１３、またはＩＮＦ−γをサイトカイン急増のマーカーとして使用してもよいことは分かっている。さらに、サイトカインを測定するその分析方法は、当技術分野で周知である。当業者なら、サイトカイン急増に影響を及ぼす方法がサイトカイン放出症候群に同様に影響を及ぼす可能性があることを分かっている。
【０１６１】
一実施形態において、本明細書には、サイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を患っている被験体のサイトカイン産生を低減または阻害する方法を開示する。別の実施形態では、本明細書には、サイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を患い易い被験体のサイトカイン産生を低減または阻害する方法を開示する。別の実施形態では、本明細書に開示する方法は、サイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を患っている被験体のサイトカイン産生を低減または阻害し、表１および／または表２に列記される任意のサイトカインまたはサイトカイン群の産生が低減または阻害される。別の実施形態では、サイトカインＩＬ−６の産生が低減または阻害される。別の実施形態では、サイトカインＩＬ−β１の産生が低減または阻害される。別の実施形態では、サイトカインＩＬ−８の産生が低減または阻害される。別の実施形態では、サイトカインＩＬ−１３の産生が低減または阻害される。別の実施形態では、サイトカインＴＮＦ−αの産生が低減または阻害される。別の実施形態では、サイトカインＩＬ−６の産生、ＩＬ−１βの産生、またはＴＮＦ−αの産生、またはそれらの任意の組合せが低減または阻害される。
【０１６２】
一実施形態では、サイトカイン放出症候群は等級付けされる。別の実施形態では、第１等級は、症状が生命を脅かすものではなく、例えば発熱、悪心、疲労、頭痛、筋肉痛、不快感への対症療法のみを必要とするサイトカイン放出症候群である。別の実施形態では、第２等級の症状は、低血圧のために酸素、体液または昇圧剤などの中程度の介入を必要としそれに応答する。別の実施形態では、第３等級の症状は、積極的な介入を必要とし、それに応答する。別の実施形態では、第４等級の症状は生命を脅かす症状であり、人工呼吸器を必要とし患者は臓器毒性を示す。
【０１６３】
別の実施形態では、サイトカイン急増は、ＩＬ−６およびインターフェロンγ放出を特徴とする。別の実施形態では、サイトカイン急増は、表１および表２に列記される任意のサイトカインまたはその組合せの放出を特徴とする。別の実施形態では、サイトカイン急増は、当技術分野で公知の任意のサイトカインまたはその組合せの放出を特徴とする。
【０１６４】
一実施形態では、症状の発症は、注入開始後の数分から数時間後に開始する。別の実施形態では、症状はサイトカイン濃度のピークに一致する。
【０１６５】
一実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）もしくはサイトカイン急増の発生を阻害または低減する方法は、アポトーシス細胞集団もしくはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物を投与することを含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞集団もしくはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を促進できる。別の実施形態では、アポトーシス細胞集団もしくはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物は、ＣＲＳもしくはサイトカイン急増の発生の抑制または低減を促進できる。別の実施形態では、アポトーシス細胞集団もしくはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物は、ＣＲＳまたはサイトカイン急増の治療を促進できる。別の実施形態では、アポトーシス細胞集団もしくはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物は、ＣＲＳまたはサイトカイン急増の予防を促進できる。別の実施形態では、アポトーシス細胞集団もしくはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物は、ＣＲＳまたはサイトカイン急増の寛解を促進できる。別の実施形態では、アポトーシス細胞集団もしくはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物は、ＣＲＳまたはサイトカイン急増の緩和を促進できる。
【０１６６】
一実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法を受け、かつアポトーシス細胞集団もしくはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物を投与されている被験体のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）もしくはサイトカイン急増の発生を阻害または低減する方法は、追加の薬剤を投与することを含む。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を促進できる。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＲＳもしくはサイトカイン急増の発生の抑制または低減を促進できる。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＲＳまたはサイトカイン急増の治療を促進できる。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＲＳまたはサイトカイン急増の予防を促進できる。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＲＳまたはサイトカイン急増の寛解を促進できる。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＲＳまたはサイトカイン急増の緩和を促進できる。
【０１６７】
一実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）もしくはサイトカイン急増の発生を阻害または低減する方法は、追加の薬剤を投与することを含む。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を促進できる。一実施形態では、ＴＣＲ−Ｔ細胞癌療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）もしくはサイトカイン急増の発生を阻害または低減する方法は、追加の薬剤を投与することを含む。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＴＣＲ−Ｔ細胞療法を促進できる。一実施形態において、を受けている被験体のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）もしくはサイトカイン急増の発生を阻害または低減する方法は、追加の薬剤を投与することを含む。別の実施形態では、追加の薬剤は、を促進できる。一実施形態では、ＮＫ細胞療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）もしくはサイトカイン急増の発生を阻害または低減する方法は、追加の薬剤を投与することを含む。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＮＫ細胞療法を促進できる。
【０１６８】
別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＲＳまたはサイトカイン急増の発生の阻害または低減を促進できる。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＲＳまたはサイトカイン急増の治療を促進できる。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＲＳまたはサイトカイン急増の予防を促進できる。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＲＳまたはサイトカイン急増の寛解を促進できる。別の実施形態では、追加の薬剤は、ＣＲＳまたはサイトカイン急増の緩和を促進できる。
【０１６９】
一実施形態では、有害なサイトカイン放出を低減する追加の薬剤は、アポトーシス細胞または前記アポトーシス細胞を含む組成物を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を低減する追加の薬剤は、アポトーシス細胞上清または前記上清を含む組成物を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を低減する追加の薬剤は、ＣＴＬＡ−４遮断薬を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を低減する追加の薬剤は、アポトーシス細胞もしくはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物、およびＣＴＬＡ−４遮断薬を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を低減する追加の薬剤は、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくはその類似体を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を低減する追加の薬剤は、アポトーシス細胞もしくはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物、およびα１アンチトリプシンまたはその断片もしくはその類似体を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を低減する追加の薬剤は、テルル系化合物を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を低減する追加の薬剤は、アポトーシス細胞もしくはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物、およびテルル系化合物を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を低減する追加の薬剤は、免疫調節剤を含む。別の実施形態では、有害なサイトカイン放出を低減する追加の薬剤は、アポトーシス細胞もしくはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物、および免疫調節剤を含む。
【０１７０】
別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞とイピリムマブなどの１つ以上のＣＴＬＡ−４遮断薬との併用療法を利用する。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、アポトーシス細胞、ＣＡＲ−Ｔ細胞、および１つ以上のＣＴＬＡ−４遮断薬を含む併用療法を利用する。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、ＴＣＲ−Ｔ細胞とイピリムマブなどの１つ以上のＣＴＬＡ−４遮断薬との併用療法を利用する。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、アポトーシス細胞、ＴＣＲ−Ｔ細胞、および１つ以上のＣＴＬＡ−４遮断薬を含む併用療法を利用する。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、樹状細胞とイピリムマブなどの１つ以上のＣＴＬＡ−４遮断薬との併用療法を利用する。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、アポトーシス細胞、樹状細胞、および１つ以上のＣＴＬＡ−４遮断薬を含む併用療法を利用する。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、ＮＫ細胞とイピリムマブなどの１つ以上のＣＴＬＡ−４遮断薬との併用療法を利用する。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法は、アポトーシス細胞、ＮＫ細胞、および１つ以上のＣＴＬＡ−４遮断薬を含む併用療法を利用する。
【０１７１】
別の実施形態では、ＣＴＬＡ−４は、自己寛容の維持を支援するＴ細胞活性化の強力な阻害剤である。別の実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４遮断薬の投与により、別の実施形態では抗体であるこの抗ＣＴＬＡ−４遮断薬の投与により、正味のＴ細胞活性化の効果が産まれる。
【０１７２】
別の実施形態では、本明細書で開示される組成物および方法によって治療、予防、阻害、寛解、発生率を低減または緩和することができる、ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＴＣＲ−Ｔ細胞、樹状細胞、またはＮＫ細胞の投与に起因するその他の毒性は、Ｂ細胞形成不全または腫瘍溶解症候群（ＴＬＳ）を含む。
【０１７３】
一実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）もしくはサイトカイン急増の発生を阻害または低減する方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の効力に影響を与えない。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法を受けている被験体のＣＲＳまたはサイトカイン急増の発生を阻害または低減する方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の効力を約５％以上低下させる。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法を受けている被験体のＣＲＳまたはサイトカイン急増の発生を阻害または低減する方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の効力を約１０％以上低下させる。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法を受けている被験体のＣＲＳまたはサイトカイン急増の発生を阻害または低減する方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の効力を約１５％以上低下させる。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法を受けている被験体のＣＲＳまたはサイトカイン急増の発生を阻害または低減する方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の効力を約２０％以上低下させる。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法を受けている被験体のＣＲＳまたはサイトカイン急増の発生を阻害または低減する方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の効力を約５％以上増加させる。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法を受けている被験体のＣＲＳまたはサイトカイン急増の発生を阻害または低減する方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の効力を約１０％以上増加させる。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法を受けている被験体のＣＲＳまたはサイトカイン急増の発生を阻害または低減する方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の効力を約１５％以上増加させる。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞癌療法を受けている被験体のＣＲＳまたはサイトカイン急増の発生を阻害または低減する方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の効力を約２０％以上増加させる。
【０１７４】
細胞毒性（傷害性）を定量化する任意の適切な方法を使用して、ＣＡＲを発現するように改変された免疫細胞の活性が実質的に変化しないままであるかどうかを判定できる。例えば、細胞毒性は、実施例に記載の細胞毒性測定などの細胞培養系測定を使用して定量できる。細胞毒性測定では、死細胞のＤＮＡを優先的に染色する色素を使用できる。その他の場合には、細胞集団内の生細胞と死細胞の相対数を測定する蛍光測定および発光測定を使用できる。その測定では、プロテアーゼ活性は細胞生存率と細胞毒性のマーカーとして機能し、標識された細胞透過性ペプチドは、試料中の生細胞の数に比例する蛍光シグナルを生成する。例えば、細胞毒性測定では、フローサイトメトリー分析で７−ＡＡＤを使用してもよい。種々の細胞毒性測定のキットは、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ａｂｃａｍ社、およびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社などの製造会社から市販されている。
【０１７５】
別の実施形態では、細胞毒性の測定法は定性的であってもよい。別の実施形態では、細胞毒性の測定法は定量的であってもよい。さらなる実施形態では、細胞傷害性の測定法は、細胞傷害性サイトカインの発現の変化に関連していてもよい。別の実施形態では、細胞毒性の測定法は、生存曲線ならびに骨髄および肝臓での腫瘍量によって判定されてもよい。
【０１７６】
一実施形態では、本明細書に開示される方法は、同種異系ドナー細胞の拒絶を打開するのに有用な追加の工程を含む。一実施形態では、この方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与の前に完全なまたは部分的なリンパ球除去の工程を含み、一実施形態では同種異系のＣＡＲ−Ｔ細胞であるＣＡＲ−Ｔ細胞の投与の前に完全なまたは部分的なリンパ球除去の工程を含む。別の実施形態では、リンパ球除去は、前記同種異系のＴ細胞がそれら細胞を誘導する腫瘍を攻撃するのには十分ではあるが骨髄移植によって宿主免疫系の救出を必要とするには不足な程度の時間で、宿主対移植片反応を遅延させるように調節される。別の実施形態では、２−アミノ−２−［２−（４−オクチルフェニル）エチル］プロパン−１，３−ジオール（ＦＴＹ７２０）、５−［４−フェニル−５−（トリフルオロメチル）チオフェン−２−イル］−３−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，２，４−オキサジアゾール（ＳＥＷ２８７１）、３−（２−（−ヘキシルフェニルアミノ）−２−オキソエチルアミノ）プロパン酸（Ｗ１２３）、リン酸水素２−アンモニオ−４−（２−クロロ−４−（３−フェノキシフェニルチオ）フェニル）−２−（ヒドロキシメチル）ブチル（ＫＲＰ−２０３リン酸塩）、または当技術分野で公知の他の薬剤などのリンパ節からの同種異系Ｔ細胞の退出を遅延させる薬剤は、本明細書に開示される組成物および方法の一部として使用されて、効力を有し移植片対宿主病を引き起こさない同種異系のＣＡＲ−Ｔ細胞の使用を可能にしてもよい。一実施形態では、同種異系Ｔ細胞によるＭＨＣ発現をサイレンシングして同種異系細胞の拒絶を低減させる。別の実施形態では、アポトーシス細胞は同種異系細胞の拒絶を防止する。
【０１７７】
ＣＡＲ−Ｔ細胞療法に関連するサイトカイン放出
【０１７８】
一実施形態では、サイトカイン放出は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法などの免疫療法の投与後数日から２週間の間に発生する。一実施形態では、低血圧および他の症状は、サイトカイン放出に続き、すなわち数日から数週間続く。したがって一実施形態において、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清は、予防としての免疫療法と同時に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜３日後に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の７日後に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１０日後に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１４日後に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜１４日後に被験体に投与される。
【０１７９】
別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清は、免疫療法の投与の２〜３時間後に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の７時間後に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１０時間後に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１４時間後に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜１４時間後に被験体に投与される。
【０１８０】
別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清は、予防として免疫療法の前に被験体に投与する。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１日前に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜３日前に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の７日前に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１０日前に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１４日前に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜１４日前に被験体に投与される。
【０１８１】
別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清は、免疫療法の投与の２〜３時間前に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の７時間前に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１０時間前に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１４時間前に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜１４時間前に被験体に投与される。
【０１８２】
別の実施形態では、サイトカイン放出症候群が発生すると、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を治療として投与できる。一実施形態では、サイトカイン放出症候群の開始に繋がり、またはサイトカイン放出症候群の開始の証拠となるサイトカイン放出が検出されると、アポトーシス細胞または上清を投与してもよい。一実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、サイトカイン濃度の増加またはサイトカイン放出症候群を終了させて、その後遺症を回避できる。
【０１８３】
別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を複数の時点で治療として投与できる。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を、本明細書に記載される２回以上の時点で投与する。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を、本明細書に記載される３回以上の時点で投与する。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を、ＣＲＳまたはサイトカイン急増に先立ち、およびサイトカイン放出症候群が発生した際に、ならびにそれらの任意の組合せで投与する。
【０１８４】
一実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法およびアポトーシス細胞または上清療法を併せて投与する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、アポトーシス細胞または上清療法の後に投与される。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、アポトーシス細胞または上清療法の前に投与される。この側面によれば、かつ一実施形態では、アポトーシス細胞または上清療法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の約２〜３週間後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清療法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の約６〜７週間後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清療法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の約９週間後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞療法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の数ヶ月後までに投与される。
【０１８５】
したがって、一実施形態において、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清は、予防として免疫療法と同時に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜３日後に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の７日後に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１０日後に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１４日後に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜１４日後に被験体に投与される。
【０１８６】
別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清は、免疫療法の投与の２〜３時間後に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の７時間後に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１０時間後に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１４時間後に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜１４時間後に被験体に投与される。
【０１８７】
別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清は、予防として免疫療法の前に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１日前に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜３日前に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の７日前に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１０日前に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１４日前に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜１４日前に被験体に投与される。
【０１８８】
別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清は、免疫療法の投与の２〜３時間前に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の７時間前に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１０時間前に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の１４時間前に被験体に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、免疫療法の投与の２〜１４時間前に被験体に投与される。
【０１８９】
別の実施形態では、サイトカイン放出症候群が発生すると、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を治療として投与できる。一実施形態では、サイトカイン放出症候群の開始に繋がり、またはサイトカイン放出症候群の開始の証拠となるサイトカイン放出が検出されると、アポトーシス細胞または上清を投与してもよい。一実施形態では、アポトーシス細胞または上清は、サイトカイン濃度の増加またはサイトカイン放出症候群を終了させて、その後遺症を回避できる。
【０１９０】
別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を複数の時点で治療として投与できる。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を、本明細書に記載される２回以上の時点で投与する。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を、本明細書に記載される３回以上の時点で投与する。別の実施形態では、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を、ＣＲＳまたはサイトカイン急増の前に、およびサイトカイン放出症候群が発生した際に、ならびにそれらの任意の組合せで投与する。
【０１９１】
一実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法およびアポトーシス細胞または上清療法を併せて投与する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、アポトーシス細胞療法または上清の後に投与される。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、アポトーシス細胞または上清療法の前に投与される。この側面によれば、かつ一実施形態では、アポトーシス細胞または上清療法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の約２〜３週間後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清療法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の約６〜７週間後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞または上清療法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の約９週間後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞療法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の数ヶ月後までに投与される。
【０１９２】
他の実施形態では、追加の薬剤が、予防として免疫療法と同時に被験体に投与される。一実施形態では、追加の薬剤は、アポトーシス細胞、アポトーシス上清、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくはその類似体、テルル系化合物、または免疫調節化合物、またはそれらの任意の組合せを含む。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の２〜３日後に被験体に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の７日後に被験体に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の１０日後に被験体に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の１４日後に被験体に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の２〜１４日後に被験体に投与される。
【０１９３】
別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の２〜３時間後に被験体に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の７時間後に被験体に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の１０時間後に被験体に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の１４時間後に被験体に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の２〜１４時間後に被験体に投与される。
【０１９４】
別の実施形態では、追加の薬剤は、予防として免疫療法の前に被験体に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の１日前に被験体に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の２〜３日前に被験体に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の７日前に被験体に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の１０日前に被験体に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の１４日前に被験体に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の２〜１４日前に被験体に投与される。
【０１９５】
別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の２〜３時間前に被験体に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の７時間前に被験体に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の１０時間前に被験体に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の１４時間前に被験体に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤は、免疫療法の投与の２〜１４時間前に被験体に投与される。
【０１９６】
別の実施形態では、サイトカイン放出症候群が発生すると、追加の薬剤が治療として投与される。一実施形態では、サイトカイン放出症候群の開始に導き、またはサイトカイン放出症候群の開始の証拠となるサイトカイン放出が検出されると、追加の薬剤を投与してもよい。一実施形態では、追加の薬剤は、サイトカイン濃度の増加またはサイトカイン放出症候群を終了させて、その後遺症を回避できる。
【０１９７】
別の実施形態では、追加の薬剤を複数の時点で治療として投与する。別の実施形態では、追加の薬剤を本明細書に記載される２回以上の時点で投与する。別の実施形態では、追加の薬剤を本明細書に記載される３回以上の時点で投与する。別の実施形態では、追加の薬剤をＣＲＳまたはサイトカイン急増の前に、およびサイトカイン放出症候群が発生した際に、ならびにそれらの任意の組合せで投与する。
【０１９８】
一実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法および追加の薬剤は併せて投与される。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法に追加の薬剤が投与される。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は追加の薬剤の前に投与される。この側面によれば、かつ一実施形態では、追加の薬剤はＣＡＲ−Ｔ細胞療法の約２〜３週間後に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤はＣＡＲ−Ｔ細胞療法の約６〜７週間後に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤はＣＡＲ−Ｔ細胞療法の約９週間後に投与される。別の実施形態では、追加の薬剤はＣＡＲ−Ｔ細胞療法の数ヶ月後に投与される。
【０１９９】
一実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は被験体に対して異種である。一実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、１人以上のドナーに由来する。一実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、１人以上の骨髄ドナーに由来する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、１つ以上の血液バンクの提供に由来する。一実施形態では、ドナーは適合ドナーである。一実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は普遍的な同種異系のＣＡＲ−Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は同系遺伝子のＣＡＲ−Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、不適合の第三者ドナーに由来する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、プールされた第三者ドナーＴ細胞に由来する。一実施形態では、ドナーは骨髄ドナーである。別の実施形態では、ドナーは血液バンクドナーである。一実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法のＣＡＲ−Ｔ細胞は、１つ以上のＭＨＣ非制限腫瘍指向性キメラ受容体を含む。一実施形態では、非自家性Ｔ細胞は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３０１５６７９４号に記載されるように、自己免疫反応を予防または最小化するために当技術分野で公知の手段に従って操作または投与されてもよい。
【０２００】
別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は被験体に対し自家性である。一実施形態では、患者自身の細胞が使用される。この実施形態では、患者自身の細胞が使用される場合には、アポトーシス細胞療法の後にＣＡＲ−Ｔ細胞療法が投与される。
【０２０１】
一実施形態では、アポトーシス細胞は被験体に対して異種である。一実施形態では、アポトーシス細胞は、１人以上のドナーに由来する。一実施形態では、アポトーシス細胞は、１人以上の骨髄ドナーに由来する。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、１つ以上の血液バンクの提供に由来する。一実施形態では、ドナーは適合ドナーである。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、不適合の第三者ドナーに由来する。一実施形態では、アポトーシス細胞は普遍的な同種異系アポトーシス細胞である。別の実施形態では、アポトーシス細胞は同系ドナー由来である。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、プールされた第三者ドナー細胞に由来する。一実施形態では、ドナーは骨髄ドナーである。別の実施形態では、ドナーは血液バンクドナーである。別の実施形態では、アポトーシス細胞は被験体に対して自家性である。この実施形態では、患者自身の細胞が使用される。
【０２０２】
実施形態によっては、本明細書に開示される治療用単核富化細胞調製物またはアポトーシス細胞上清は、被験体に全身投与される。別の実施形態では、投与は静脈内経路を経由する。あるいは、限定はされないが、非経口、腹腔内、関節内、筋肉内、および皮下経路を含む種々の他の経路に従って、治療用単核富化細胞または上清を被験体に投与してもよい。
【０２０３】
実施形態によっては、本明細書に開示される治療用単核富化細胞調製物または追加の薬剤は、被験体に全身投与される。別の実施形態では、投与は静脈内経路を経由する。あるいは、限定はされないが、非経口、腹腔内、関節内、筋肉内、および皮下経路を含む種々の他の経路に従って、治療用単核富化細胞または追加の薬剤を被験体に投与してもよい。
【０２０４】
一実施形態において、調製物は、例えば患者の身体の特定の領域への調製物の直接注射を経由して、全身にではなく局部に投与される。別の実施形態では、特定の領域は腫瘍またはがんを含む。
【０２０５】
別の実施形態では、治療用単核富化細胞または上清は、限定はされないが、生理食塩水、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなどの適切な生理的緩衝液に懸濁して被験体に投与される。また、懸濁媒体は、細胞の生存率の維持に役立つ補充物をさらに含んでもよい。別の実施形態では、追加の薬剤は、限定はされないが、生理食塩水、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなどの適切な生理的緩衝液に懸濁して被験体に投与される。
【０２０６】
実施形態によっては、医薬組成物は静脈内投与される。別の実施形態では、医薬組成物は単回用量で投与される。別の実施形態では、医薬組成物は複数回用量で投与される。別の実施形態では、医薬組成物は２回用量で投与される。別の実施形態では、医薬組成物は３回用量で投与される。別の実施形態では、医薬組成物は４回用量で投与される。別の実施形態では、医薬組成物は５回用量以上で投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は静脈内注射用に製剤化される。
【０２０７】
一実施形態では、改変されたＣＡＲ発現免疫細胞を被験体に提供する任意の適切な方法を、本明細書に記載の方法として使用できる。一実施形態では、細胞を被験体に提供する方法は、造血細胞移植（ＨＣＴ）、癌患者へのドナー由来ＮＫ細胞の注入、またはそれらの組合せを含む。
【０２０８】
別の実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の発生を阻害または低減する方法が本明細書に開示され、この方法は、アポトーシス細胞を含む組成物を前記被験体に投与する工程を含む。
【０２０９】
別の実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の発生を阻害または低減する方法が本明細書に開示され、この方法は、アポトーシス細胞食細胞上清などのアポトーシス細胞上清を前記被験体に投与する工程を含む。
【０２１０】
別の実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の発生を阻害または低減する方法が本明細書に開示され、この方法は、少なくとも１つの追加の薬剤を前記被験体に投与する工程を含む。
【０２１１】
特定の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞、およびアポトーシス細胞もしくはアポトーシス細胞上清のいずれか、または本明細書に開示される追加の薬剤もしくは追加の薬剤の組合せを含む本明細書に開示の組成物を投与することを含む。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む本明細書に開示の組成物、およびアポトーシス細胞もしくはアポトーシス細胞上清のいずれか、もしくは本明細書に開示される追加の薬剤またはそれらの組合せを含む組成物を投与することを含む。
【０２１２】
非ＣＡＲ−Ｔ細胞の適用に関連するサイトカイン放出
【０２１３】
一実施形態では、本明細書には、サイトカイン放出症候群もしくはサイトカイン急増を患っているまたはサイトカイン放出症候群もしくはサイトカイン急増を患い易い被験体のサイトカイン産生を低減または阻害する方法を開示し、この方法は、アポトーシス細胞またはアポトーシス上清を含む組成物を前記被験体に投与する工程を含み、前記投与は、前記被験体のサイトカイン産生を低減または阻害する。別の実施形態では、このサイトカイン産生は、サイトカイン放出症候群もしくはサイトカイン急増を患っているまたはサイトカイン放出症候群もしくはサイトカイン急増を患い易く、かつアポトーシス細胞またはアポトーシス上清を投与されていない被験体と比較して、低減または阻害される。別の実施形態では、サイトカイン産生を低減または阻害する方法は、炎症誘発性サイトカイン産生を低減または阻害する。別の実施形態では、サイトカイン産生を低減または阻害する方法は、少なくとも１つの炎症誘発性サイトカインの産生を低減または阻害する。別の実施形態では、サイトカイン産生を低減または阻害する方法は、少なくともサイトカインＩＬ−６の産生を低減または阻害する。別の実施形態では、サイトカイン産生を低減または阻害する方法は、少なくともサイトカインＩＬ−１βの産生を低減または阻害する。別の実施形態では、サイトカイン産生を低減または阻害する方法は、少なくともサイトカインＴＮＦ−αの産生を低減または阻害する。別の実施形態では、サイトカイン産生を低減または阻害する本明細書に開示される方法は、サイトカイン放出症候群もしくはサイトカイン急増を患っているまたはサイトカイン放出症候群もしくはサイトカイン急増を患い易く、かつアポトーシス細胞またはアポトーシス上清を投与されていない被験体と比較して、前記被験体のサイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１β、またはＴＮＦ−α、またはそれらの任意の組合せの産生の低減または阻害をもたらす。
【０２１４】
がんまたは腫瘍はまた、炎症誘発性サイトカインを含むサイトカインの絶対濃度に影響を及ぼす可能性がある。被験体の腫瘍量の水準は、サイトカイン濃度、特に炎症誘発性サイトカインに影響を及ぼす可能性がある。当業者なら、「低減または阻害」という語句またはその文法的な変形語句は、サイトカイン産生の倍率での低減もしくは阻害、またはサイトカイン産生の正味の低減もしくは阻害、または百分率（％）での低減もしくは阻害を含んでもよく、またはサイトカイン産生の低減もしくは阻害の変化率を含んでもよいことが分かっている。
【０２１５】
別の実施形態では、本明細書には、サイトカイン放出症候群もしくはサイトカイン急増を患っているまたはサイトカイン放出症候群もしくはサイトカイン急増を患い易い被験体のサイトカイン産生を低減または阻害する方法を開示し、この方法は、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞を含む組成物を前記被験体に投与する工程を含む。
【０２１６】
別の実施形態では、本明細書には、サイトカイン放出症候群もしくはサイトカイン急増を患っているまたはサイトカイン放出症候群もしくはサイトカイン急増を患い易い被験体のサイトカイン産生を低減または阻害する方法を開示し、この方法は、アポトーシス細胞食細胞上清などのアポトーシス細胞上清または前記上清を含む組成物を前記被験体に投与する工程を含む。
【０２１７】
別の実施形態では、本明細書には、サイトカイン放出症候群もしくはサイトカイン急増を患っているまたはサイトカイン放出症候群もしくはサイトカイン急増を患い易い被験体のサイトカイン産生を低減または阻害する方法を開示し、この方法は、アポトーシス細胞、アポトーシス上清、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンもしくはその断片もしくはその類似体、テルル系化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組合せを含む群から選択される追加の薬剤などのアポトーシス細胞上清、または前記上清を含む組成物を前記被験体に投与する工程を含む。
【０２１８】
一実施形態において、感染症は、被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を引き起こす。一実施形態では、感染症はインフルエンザ感染症である。一実施形態では、インフルエンザ感染症はＨ１Ｎ１である。別の実施形態では、インフルエンザ感染症はＨ５Ｎ１鳥インフルエンザである。別の実施形態では、感染症は重度の急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）である。別の実施形態では、被験体は、エプスタインバーウイルス関連血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）を有する。別の実施形態では、感染症は敗血症である。一実施形態では、敗血症はグラム陰性である。別の実施形態では、感染症はマラリアである。別の実施形態では、感染症はエボラウイルス感染症である。別の実施形態では、感染症は痘瘡ウイルスである。別の実施形態では、感染症は全身性グラム陰性細菌感染症である。別の実施形態では、感染症はヤーリシュ・ヘルクスハイマー症候群である。
【０２１９】
一実施形態では、被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の原因は、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）である。別の実施形態では、ＨＬＨは散発性ＨＬＨである。別の実施形態では、ＨＬＨはマクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）である。別の実施形態では、被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の原因はＭＡＳである。
【０２２０】
一実施形態では、被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の原因は慢性関節炎である。別の実施形態では、被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の原因は、スティル病としても知られる全身性若年性特発性関節炎（ｓＪＩＡ）である。
【０２２１】
一実施形態では、クリオピリン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）は、被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の原因となる。別の実施形態では、ＣＡＰＳは、家族性冷感じん麻疹（ＦＣＵ）としても知られる家族性冷感自己炎症症候群（ＦＣＡＳ）を含む。別の実施形態では、ＣＡＰＳはマックルウェル症候群（ＭＷＳ）を含む。別の実施形態では、ＣＡＰＳは慢性乳児神経皮膚および関節（ＣＩＮＣＡ）症候群を含む。さらに別の実施形態では、ＣＡＰＳは、ＦＣＡＳ、ＦＣＵ、ＭＷＳ、またはＣＩＮＣＡ症候群、またはそれらの任意の組合せを含む。別の実施形態では、ＦＣＡＳは被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の原因となる。別の実施形態では、ＦＣＵは験体でのサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の原因となる。別の実施形態では、ＭＷＳは被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の原因となる。別の実施形態では、ＣＩＮＣＡ症候群は被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の原因となる。さらに別の実施形態では、ＦＣＡＳ、ＦＣＵ、ＭＷＳ、またはＣＩＮＣＡ症候群、またはそれらの任意の組合せは、被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の原因となる。
【０２２２】
別の実施形態では、ＣＩＡＳＩ遺伝子としても知られるＮＬＲＰ３遺伝子に遺伝的または新たな機能獲得型の変異を含むクリオピロノパチーは、被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の原因となる。
【０２２３】
一実施形態では、遺伝性自己炎症性障害は、被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の原因となる。
【０２２４】
一実施形態では、炎症性サイトカインの放出の誘因は、リポ多糖（ＬＰＳ）、グラム陽性毒素、真菌毒素、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）、またはＲＩＧ−１遺伝子発現の調節である。
【０２２５】
別の実施形態では、サイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を患っている被験体は、感染症を患っていない。一実施形態では、被験体は急性膵炎を患っている。別の実施形態では、被験体は組織損傷を有し、これは一実施形態では重度の火傷または外傷である。別の実施形態では、被験体は急性呼吸窮迫症候群を患っている。別の実施形態では、被験体は、薬物使用に続発するサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を患っている。別の実施形態では、被験体は、毒素吸入に続発するサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を患っている。
【０２２６】
別の実施形態では、被験体は、免疫療法の受容に続発するサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を患い、この免疫療法は、一実施形態では超アゴニストＣＤ２８特異的モノクローナル抗体（ＣＤ２８ＳＡ）による免疫療法である。一実施形態では、ＣＤ２８ＳＡはＴＧＮ１４１２である。別の実施形態では、免疫療法はＣＡＲ−Ｔ細胞療法である。
【０２２７】
別の実施形態では、アポトーシス細胞もしくは上清またはＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンもしくはその断片もしくはその類似体、テルル系化合物、または免疫調節剤、またはそれらの任意の組合せは、医薬組成物の投与に起因するサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の制御に使用できる。一実施形態では、医薬組成物は、オキサリプラチン、シタラビン、レナリドマイド、またはそれらの組合せである。
【０２２８】
別の実施形態では、アポトーシス細胞もしくは上清またはＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンもしくはその断片もしくはその類似体、テルル系化合物、または免疫調節剤、またはその任意の組合せは、抗体の投与に起因するサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の制御に使用できる。一実施形態では、抗体はモノクローナルである。別の実施形態では、抗体はポリクローナルである。一実施形態では、抗体はリツキシマブである。別の実施形態では、抗体はオルソクロンＯＫＴ３（ムロモナブ−ＣＤ３）である。別の実施形態では、抗体はアレムツズマブ、トシツズマブ、ＣＰ−８７０，８９３、ＬＯ−ＣＤ２ａ／ＢＴＩ−３２２またはＴＧＮ１４１２である。
【０２２９】
別の実施形態では、炎症性サイトカイン産生の制御が有益となる疾患の例として、がん、アレルギー、任意の型の感染症、毒性ショック症候群、敗血症、任意の型の自己免疫疾患、関節炎、クローン病、ループス、乾癬、またはその特徴が被験体に有害な影響を与える毒性サイトカイン放出であるその他の疾患が挙げられる。
【０２３０】
α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）
【０２３１】
α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）は、主に肝臓により産生される循環５２ｋＤａ糖タンパク質である。ＡＡＴは主にセリンプロテアーゼ阻害剤として知られ、遺伝子ＳＥＲＰＩＮＡ１がコードしている。ＡＡＴは好中球エラスターゼを阻害し、循環ＡＡＴでの遺伝性欠乏は肺組織の悪化と肝疾患を引き起こす。健康時の個体の血清ＡＡＴ濃度は、炎症中には２倍に増大する。
【０２３２】
ＡＡＴ濃度といくつかの炎症性疾患の重症度との間には負の関連性がある。例えば、ＨＩＶ感染症、真性糖尿病、Ｃ型肝炎感染による慢性肝疾患、およびいくつかの型の血管炎の患者では、ＡＡＴの濃度または活性の低下が報告されている。
【０２３３】
ヒト血清由来α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）が炎症誘発性サイトカインの産生を低減させ、抗炎症性サイトカインを誘導し、かつ樹状細胞の成熟を妨害することが、多くの証拠により示されている。
【０２３４】
実際には、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）へのＡＡＴの添加は、ＬＰＳ誘導性のＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの放出を阻害するが、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）およびＩＬ−１０産生を増加させる。
【０２３５】
ＡＡＴはインビトロでＩＬ−１β媒介膵島毒性を低減し、ＡＡＴ単独療法は移植膵島細胞の生存を延ばし、マウスにおける抗原特異的免疫寛容を促進し、かつ非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスでの糖尿病の発症を遅延させる。ＡＡＴは、実験モデルでＬＰＳ誘導性の急性肺損傷を抑制することが示された。最近ＡＡＴは、急性心筋虚血再灌流障害のマウスモデルで、梗塞の大きさと心不全の重症度を低下させることが示された。
【０２３６】
臨床等級のヒトＡＡＴ（ｈＡＡＴ）による単剤療法は、循環炎症誘発性サイトカインを低減させ、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の重症度を低減させ、かつ実験的同種骨髄移植後の動物の生存率を延長した（Ｔａｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  ２０１２  Ｊａｎ  １０；１０９（２）：５６４−９）。この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。ＡＡＴ治療は、同種反応性Ｔエフェクター細胞の増殖を低減させたが、Ｔ制御性Ｔ細胞（Ｔレグ）の回復を促進し、それにより病理学的プロセスを減らすためにＴ調節細胞に対するドナーＴエフェクターの比率を変更した。インビトロで、ＡＡＴはＴＮＦ−αやＩＬ−１βなどの炎症誘発性サイトカインのＬＰＳ誘導性のインビトロ分泌を抑制し、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の産生を増強し、かつ宿主樹状細胞でのＮＦ−κＢ転座を阻害した。参照により本明細書に組み込まれたＭａｒｃｏｎｄｅｓ，  Ｂｌｏｏｄ．  ２０１４（Ｏｃｔ  ３０；１２４（１８）：２８８１−９１は、ＡＡＴによる治療がＧｖＨＤを寛解するだけでなく、移植片対白血病（ＧＶＬ）効果を保持しかつ増強する可能性があったことを示している。
【０２３７】
一実施形態では、本明細書にはキメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）およびα１アンチトリプシン（ＡＡＴ）を含む組成物が開示される。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞およびα１アンチトリプシン（ＡＡＴ）は別個の組成物中にある。別の実施形態では、ＡＡＴは全長ＡＡＴまたはその機能的断片を含む。別の実施形態では、ＡＡは、全長ＡＡＴの類似体またはその機能的断片を含む。別の実施形態では、ＡＡＴを含む組成物は、さらにアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を含む。
【０２３８】
別の実施形態では、本明細書には、被験体のがんもしくは腫瘍を治療、予防、阻害、その発生率の低減、寛解、または緩和する方法が開示され、この方法は、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）およびα１アンチトリプシン（ＡＡＴ）を含む組成物を前記被験体に投与する工程を含む。別の実施形態では、この方法はさらに、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を含む。
【０２３９】
別の実施形態では、本明細書には、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の発生を阻害または低減する方法が開示され、この方法は、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）を含む組成物を前記被験体に投与する工程を含む。別の実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を治療する方法は、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）を含む組成物を前記被験体に投与する工程を含む。別の実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を予防する方法は、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）を含む組成物を前記被験体に投与する工程を含む。別の実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を寛解する方法は、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）を含む組成物を前記被験体に投与する工程を含む。別の実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を緩和する方法は、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）を含む組成物を前記被験体に投与する工程を含む。
【０２４０】
別の実施形態では、本明細書には、サイトカイン放出症候群もしくはサイトカイン急増を患っているまたはサイトカイン放出症候群もしくはサイトカイン急増を患い易い被験体のサイトカイン産生を低減または阻害する方法を開示し、この方法は、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）を含む組成物を前記被験体に投与する工程を含む。
【０２４１】
一実施形態では、ＡＡＴはサイトカイン放出を制御するように単独で投与される。別の実施形態では、ＡＡＴ、およびアポトーシス細胞もしくはその組成物またはアポトーシス細胞上清もしくはその組成物の両方は、サイトカイン放出を制御するように投与される。
【０２４２】
免疫調節剤
【０２４３】
当業者なら、免疫調節剤は、細胞外媒介物、受容体、細胞内シグナル伝達経路の媒介物、翻訳および転写の調節因子、ならびに免疫細胞を含んでもよいことが分かる。一実施形態では、本明細書に開示される追加の薬剤は、当技術分野で公知の免疫調節剤である。別の実施形態では、免疫調節剤の本明細書に開示される方法での使用は、少なくとも１つのサイトカインの濃度を低下させる。別の実施形態では、免疫調節剤の本明細書に開示される方法での使用は、ＣＲＳまたはサイトカイン急増を低減または阻害する。実施形態によっては、免疫調節剤の本明細書に開示される方法は、治療、予防、成長の阻害、疾患進行の遅延、腫瘍量の低減、または腫瘍もしくはがんの発生の低減、またはそれらの任意の組合せのために使用される。実施形態によっては、免疫調節剤の使用は、本明細書に開示される別の組成物、例えば限定はされないが、初期アポトーシス細胞を含むかまたはＣＡＲ−Ｔ細胞を含む組成物と組合わせて使用される。
【０２４４】
一実施形態において、免疫調節剤は、サイトカインまたはケモカインの放出を遮断、阻害または低減する化合物を含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、ＩＬ−２１もしくはＩＬ−２３、またはそれらの組合せの放出を遮断、阻害または低減する化合物を含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、ケモカイン受容体−５（ＣＣＲ５）受容体拮抗薬クラスの抗レトロウイルス薬、例えばマラビロックを含む。別の実施形態では、免疫調節剤は抗ＤＮＡＭ−１抗体を含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、ヘパリン硫酸、ＡＴＰ、および尿酸、またはそれらの任意の組合せを含む群から選択される損傷／病原体関連分子（ＤＡＭＰ／ＰＡＭＰ）を含む。別の実施形態では、免疫調節剤はシアル酸結合Ｉｇ様レクチン（シグレック）を含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、耐性の細胞媒介物、例えば制御性ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（Ｔレグ）または不変ナチュラルキラーＴ細胞（ｉＮＫ−Ｔ細胞）を含む。別の実施形態では、免疫調節剤は樹状細胞を含む。別の実施形態では、免疫調節剤は単球を含む。別の実施形態では、免疫調節剤はマクロファージを含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、ルキソリチニブおよびトファシチニブを含む群から選択されるＪＡＫ２またはＪＡＫ３阻害剤を含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）の阻害剤、例えばフォスタマチニブを含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤ボリノスタットアセチル化ＳＴＡＴ３を含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、例えばＭＬＮ４９２４などのＮＥＤＤ化阻害剤を含む。別の実施形態では、免疫調節剤はｍｉＲ−１４２アンタゴニストを含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、シチジンの化学類似体、例えばアザシチジンを含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、ヒストンデアセチラーゼの阻害剤、例えばボリノスタットを含む。別の実施形態では、免疫調節剤は、ヒストンメチル化の阻害剤を含む。別の実施形態では、免疫調節剤は抗体を含む。別の実施形態では、抗体はリツキシマブ（ＲｔＸ）である
【０２４５】
テルル系化合物
【０２４６】
テルルは、人体内に検出される微量元素である。種々のテルル化合物は免疫調節特性を有し、様々な前臨床研究および臨床研究で有益な効果があることが示されている。テルル含有化合物の特に効果的なファミリーは、例えば、米国特許第４，７５２，６１４号、第４，７６１，４９０号、第４，７６４，４６１号および第４，９２９，７３９号に開示される。テルル含有化合物のこのファミリーの免疫調節特性は、例えば、米国特許第４，９６２，２０７号、第５，０９３，１３５号、第５，１０２，９０８号および第５，２１３，８９９号に記載されていて、これら特許はすべて本明細書に完全に明示されるように参照により組み込まれる。
【０２４７】
１つの有望な化合物は、トリクロロ（ジオキシエチレン−Ｏ，Ｏ’）テルル酸アンモニウムであり、本明細書および当技術分野ではＡＳ１０１とも呼ばれる。上記のテルル含有化合物のファミリーの代表例としてのＡＳ１０１は、抗ウイルス性（Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌ．  ７（３）：１６３−８，  １９８８；  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．  ８（５）：６１３−２３，  １９９２）および殺腫瘍活性（Ｎａｔｕｒｅ  ３３０（６１４４）：１７３−６，  １９８７；  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １３（９）：２３４２−５３，  １９９５；  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６１（７）：３５３６−４２，  １９９８）を示す。さらにＡＳ１０１は低毒性を特徴とする。
【０２４８】
一実施形態において、テルル含有免疫調節化合物を含む組成物は、本明細書に開示される方法で使用されてもよく、テルル系化合物は、免疫応答の先天的および後天的アームを刺激する。例えば、ＡＳ１０１はマウス（Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ８８（１８）：１２７６−８４，  １９９６）およびヒト（Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌ．  ９（３）：１８２−９０，  １９９０；  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７０（４）：４７３−７，  １９９０；  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ８８（１８）：１２７６−８４，  １９９６）でインターフェロン（ＩＦＮ）の強力な活性剤であることが示されている。
【０２４９】
別の実施形態では、テルル系化合物は、ＩＬ−１α、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αなどのサイトカインの一定範囲の分泌を誘導する。
【０２５０】
別の実施形態では、テルル系化合物は、免疫調節特性を持つことが当技術分野で公知であるテルル系化合物を含む。別の実施形態では、テルル系化合物は、トリクロロ（ジオキシエチレン−Ｏ，Ｏ’）テルル酸アンモニウムを含む。
【０２５１】
一実施形態では、テルル系化合物は、少なくとも１つのサイトカインの分泌を阻害する。別の実施形態では、テルル系化合物は、少なくとも１つのサイトカインの分泌を低減させる。別の実施形態では、テルル系化合物は、サイトカイン急増のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を阻害または低減する。
【０２５２】
一実施形態では、本明細書には、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）およびテルル系化合物を含む組成物が開示される。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞およびテルル系化合物は、別個の組成物中にある。別の実施形態では、ＡＡＴは全長ＡＡＴまたはその機能的断片を含む。別の実施形態では、ＡＡＴは全長ＡＡＴの類似体またはその機能的断片を含む。
【０２５３】
別の実施形態では、本明細書には、被験体のがんまたは腫瘍を治療、予防、阻害、その発生の低減、寛解、または緩和する方法が開示され、この方法は、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）およびテルル系化合物を含む組成物を前記被験体に投与する工程を含む。
【０２５４】
別の実施形態では、本明細書には、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の発生を阻害または低減する方法が開示され、この方法はテルル系化合物を含む組成物を前記被験体に投与する工程を含む。別の実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を治療する方法は、テルル系化合物を含む組成物を前記被験体に投与する工程を含む。別の実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を予防する方法は、テルル系化合物を含む組成物を前記被験体に投与する工程を含む。別の実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を寛解する方法は、テルル系化合物を含む組成物を前記被験体に投与する工程を含む。別の実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を緩和する方法は、テルル系化合物を含む組成物を前記被験体に投与する工程を含む。
【０２５５】
別の実施形態では、本明細書には、サイトカイン放出症候群もしくはサイトカイン急増を患っているまたはサイトカイン放出症候群もしくはサイトカイン急増を患い易い被験体のサイトカイン産生を低減または阻害する方法が開示され、この方法は、テルル系化合物を含む組成物を前記被験体に投与する工程を含む。
【０２５６】
一実施形態では、テルル系化合物は、サイトカイン放出を制御するように単独で投与される。別の実施形態では、サイトカイン放出を制御するように、テルル系化合物、およびアポトーシス細胞もしくはその組成物またはアポトーシス細胞上清もしくはその組成物の両方が投与される。
【０２５７】
樹状細胞
【０２５８】
一実施形態では、樹状細胞（ＤＣ）は、抗原物質を加工しそれを免疫系のＴ細胞に対する細胞表面に提示し、それによって新規抗原およびリコール抗原の両方にＴ細胞を感作できる哺乳動物免疫系の抗原産生細胞および提示細胞である。別の実施形態では、ＤＣは、最も強力な抗原産生細胞であり、自然免疫系と適応免疫系との間のメッセンジャーとして作用する。ＤＣ細胞は、一実施形態では、腫瘍を攻撃かつ溶解するエフェクター細胞の生成により特定の抗腫瘍免疫を刺激するように使用されてもよい。
【０２５９】
樹状細胞は、（ランゲルハンス細胞と呼ばれる特殊な樹状細胞型が存在する）皮膚、ならびに鼻、肺、胃および腸の内層などの外部環境と接触している組織内に存在する。これら細胞はまた、血液中に未成熟な状態で見出すことができる。活性化されると、これら細胞は、Ｔ細胞およびＢ細胞と相互作用して適応免疫応答を開始および形成するリンパ節に移動する。特定の生育段階では、その細胞は分岐突起を生育し、その細胞に樹状細胞の名称を付与することになる。樹状細胞は、特定の腫瘍抗原を発現するように操作されてもよい。
【０２６０】
Ｔ細胞活性化に必要な３つのシグナルは、（ｉ）自己ＭＨＣ分子中の同族抗原の提示、（ｉｉ）膜結合受容体−リガンド対による共刺激、およびｉｉｉ）後に続く免疫応答の分極を誘導する可溶性因子である。樹状細胞（ＤＣ）は、Ｔ細胞の活性化に必要な全ての３つのシグナルを提供し、優れた癌ワクチンプラットフォームを形成できる。
【０２６１】
したがって一実施形態では、本明細書には樹状細胞および追加の薬剤を含む組成物が開示され、前記追加の薬剤は、アポトーシス細胞、アポトーシス上清、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンもしくはその断片もしくはその類似体、テルル系化合物、もしくは免疫調節剤、またはそれらの任意の組合せを含む。
【０２６２】
別の実施形態では、本明細書には、被験体のがんまたは腫瘍を治療、予防、阻害、その発生の低減、寛解、または緩和する方法が開示され、この方法は、樹状細胞および追加の薬剤を含む組成物を前記被験体に投与する工程を含み、前記薬剤は、アポトーシス細胞、アポトーシス上清、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンもしくはその断片もしくはその類似体、テルル系化合物、もしくは免疫調節剤、またはその任意の組合せを含む。
【０２６３】
遺伝子改変
【０２６４】
実施形態によっては、Ｔ細胞、樹状細胞、および／またはアポトーシス細胞の遺伝子改変は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、組換えウイルス、またはそれらの組合せを使用して達成できる。実施形態によっては、γレトロウイルスまたはレンチウイルスに由来するベクターを、本明細書に開示される組成物および方法で使用する。別の実施形態では、これらベクターは、導入遺伝子の潜在的な永続発現を伴って宿主ゲノムに組み込まれ、固有の免疫原性を低くできる。別の実施形態では、宿主ゲノムに組み込まれおよび／または固有の免疫原性が低い異なるベクターを、本明細書に開示される組成物および方法に使用してもよい。別の実施形態では、非ウイルスベクター媒介スリーピング・ビューティ（ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ）トランスポゾン系を使用して、ＣＡＲおよび他の遺伝子をＴ細胞に挿入する。別の実施形態では、「自殺遺伝子（ｓｕｉｃｉｄｅ  ｇｅｎｅｓ）」はＴ細胞に組み込まれ、アポトーシス促進遺伝子の発現は、全身への送達薬物に応答する誘導性プロモーターにより制御される。
【０２６５】
実施形態によっては、遺伝子改変は一過性であってもよい。別の実施形態では、遺伝子改変はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を利用してもよい。別の実施形態では、多数の細胞がｍＲＮＡで形質導入したＴ細胞などの一過性に操作されたＴ細胞に複数回で注入されてもよい。別の実施形態では、インビトロで転写されたｍＲＮＡを使用したリンパ球のＲＮＡをベースとした電気穿孔法では、タンパク質の一過性の発現を約１週間媒介して、ウイルスベクターが組込まれる危険性を排除する。別の実施形態では、ｍＲＮＡ形質導入された樹状細胞またはｍＲＮＡ電気穿孔されたＴリンパ球およびＮＫリンパ球。
【０２６６】
遺伝子改変されたＴ細胞は、養子移入後の１０年以上にわたって副作用なしに継続できることが実証され、ヒトＴ細胞の遺伝子改変は基本的に安全であることを示している。
【０２６７】
別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法での遺伝子改変は、当技術分野で公知の任意の方法によってもよい。
【０２６８】
アポトーシス細胞
【０２６９】
本明細書に開示される組成物および方法で使用するアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）の生成は、参照によりその全体が本明細書に組込まれる国際公開第２０１４／０８７４０８号に記載され、以下の実施例１に簡潔に説明される。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法で使用されるアポトーシス細胞は、当技術分野で公知の任意の方法で生成される。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法で使用されるアポトーシス細胞は、治療を受けている被験体に対し自家性である。別の実施形態では、本明細書で開示される組成物および方法で使用されるアポトーシス細胞は、治療を受けている被験体に対し同種異系である。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む組成物は、本明細書に開示されまたは当技術分野で公知のアポトーシス細胞を含む。
【０２７０】
当業者なら、「自家性の」という用語は、ドナーとレシピエントが同一のヒトである組織、細胞、核酸分子またはポリペプチドを含んでもよいことが分かっている。
【０２７１】
当業者なら、「同種異系の」という用語は、同一種の異なる個体に由来する組織、細胞、核酸分子またはポリペプチドを含んでもよいことが分かっている。実施形態によっては、同種異系ドナー細胞は、レシピエントとは遺伝的に明確に異なる。
【０２７２】
実施形態によっては、本明細書に開示される生成方法による単核富化細胞組成物の取得は、白血球分離によって達成される。当業者なら、「白血球分離」という用語は、白血球がドナーの血液から分離される分離手順を含んでもよいことが分かっている。実施形態によっては、ドナーの血液は白血球分離療法を受け、それによって本明細書に開示される生成方法に従って単核富化細胞組成物が得られる。なお採取された細胞の凝固を防止するために、当技術分野で公知の白血球分離中に少なくとも１種の抗凝固剤の使用が必要である。
【０２７３】
実施形態によっては、白血球分離手順は、本明細書に開示される生成方法に従って単核富化細胞組成物の採取が可能なようになっている。実施形態によっては、白血球分離によって得られた細胞は、少なくとも６５％が採取される。他の実施形態では、本明細書に開示されるように、少なくとも７０％、または少なくとも８０％の単核細胞が採取される。実施形態によっては、細胞ドナーからの血漿は、本明細書に開示される生成方法で単核富化細胞組成物の取得に並行して採取される。実施形態によっては、細胞ドナーからの約３００〜６００ｍＬの血漿は、本明細書に開示される生成方法に従って単核富化細胞組成物の取得と並行して採取される。実施形態によっては、本明細書に開示される生成方法に従って単核富化細胞組成物の取得と並行して採取された血漿は、凍結培地および／またはインキュベーション培地の一部分として使用される。本明細書に開示される組成物および方法で使用するアポトーシス細胞富化集団のさらなる詳細な取得方法は、その全体が参照により本明細書に組込まれる国際公開第２０１４／０８７４０８号に見出すことができる。
【０２７４】
実施形態によっては、本明細書に開示される方法で使用する初期アポトーシス細胞は、少なくとも８５％の単核細胞を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される方法で使用する初期アポトーシス細胞は、少なくとも８５％の単核細胞、９０％の単核細胞、または９０％を超える単核細胞を含む。実施形態によっては、本明細書に開示される方法で使用する初期アポトーシス細胞は、少なくとも９０％の単核細胞を含む。実施形態によっては、本明細書に開示される方法で使用する初期アポトーシス細胞は、少なくとも９５％の単核細胞を含む。
【０２７５】
なお実施形態によっては、細胞採取時の単核富化細胞調製物は、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％の単核細胞を含んでいるが、本明細書に開示される方法で使用する初期アポトーシス細胞の生成方法後の最終的な医薬物集団には、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の単核細胞を含む。
【０２７６】
特定の実施形態では、本明細書に開示される方法で使用する初期アポトーシス細胞の組成物の生成に使用する単核富化細胞調製物は、細胞採取時には少なくとも５０％の単核細胞を含む。特定の実施形態では、本明細書には医薬物集団を生成する方法が開示され、この方法はドナーの末梢血から少なくとも５０％の単核細胞を含む単核富化細胞調製物を得る工程を含む。特定の実施形態では、本明細書には医薬物集団を生成する方法が開示され、この方法は少なくとも５０％の単核細胞を含む単核富化細胞調製物を凍結することを含む。
【０２７７】
実施形態によっては、細胞調製物は少なくとも８５％の単核細胞を含み、この調製物中の細胞の少なくとも４０％は初期アポトーシス状態にあり、この調製物中の細胞の少なくとも８５％は生細胞である。実施形態によっては、アポトーシス細胞調製物は、１５％以下のＣＤ１５ｈｉｇｈ発現細胞を含む。
【０２７８】
当業者なら、「初期アポトーシス状態」という用語は、アポトーシスの後期徴候を示さずにアポトーシスの初期徴候を示す細胞を含んでいることが分かっている。細胞でのアポトーシスの初期兆候の例として、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の曝露およびミトコンドリア膜電位の喪失が挙げられる。後期兆候の例として、細胞へのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の侵入および最終的なＤＮＡ切断が挙げられる。細胞が「初期アポトーシス」状態にあることを実証するために、実施形態によっては、アネキシン−ＶおよびＰＩ染色によるＰＳ曝露検出を使用して、ＰＩではなくアネキシン−Ｖで染色された細胞は「初期アポトーシス細胞」と見做される。別の実施形態では、アネキシン−Ｖ  ＦＩＴＣおよびＰＩの両方によって染色される細胞は、「後期アポトーシス細胞」と見做される。別の実施形態では、アネキシン−ＶまたはＰＩのいずれでも染色しない細胞は、非アポトーシス生細胞と見做される。
【０２７９】
当業者なら、実施形態によっては、「初期アポトーシス細胞」、「アポトーシス細胞」、および「ＡｐｏＣｅｌｌ」という用語ならびにそれらの文法的変形は、すべて同一の質と意味を持って互換的に使用されてもよいことが分かっている。当業者なら、実施形態によっては、本明細書に記載の組成物および方法は初期アポトーシス細胞を含むことが分かっている。
【０２８０】
実施形態によっては、アポトーシス細胞は初期アポトーシス状態の細胞を含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、前記細胞の少なくとも９０％が初期アポトーシス状態にある細胞を含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、前記細胞の少なくとも８０％が初期アポトーシス状態にある細胞を含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、少なくとも７０％の細胞が初期アポトーシス状態にある細胞を含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、前記細胞の少なくとも６０％が初期アポトーシス状態にある細胞を含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、前記細胞の少なくとも５０％が初期アポトーシス状態にある細胞を含む。
【０２８１】
実施形態によっては、アポトーシス細胞を含む組成物は、抗凝固剤をさらに含む。
【０２８２】
実施形態によっては、初期ポトーシス細胞は安定している。当業者なら、実施形態によっては、安定性は長期にわたって初期アポトーシス細胞特性を維持し、例えば約２〜８℃での貯蔵時に初期アポトーシス細胞特性を維持することを含むことが分かっている。実施形態によっては、この安定性は、凍結温度、例えば０℃以下の温度での貯蔵時に初期アポトーシス細胞特性を維持することを含む。
【０２８３】
実施形態によっては、本明細書に開示される方法で使用する初期アポトーシス細胞の生成方法に従って得られた単核富化細胞集団は、凍結培地内で凍結される。実施形態によっては、凍結は段階的である。実施形態によっては、採取後に細胞は凍結されるまで室温で維持される。実施形態によっては、細胞調製物は、細胞採取後かつ凍結前に洗浄媒体中で少なくとも１回の洗浄工程を受ける。
【０２８４】
本明細書で使用される「細胞の取得」および「細胞採取」という用語は、互換的に使用されてもよい。実施形態によっては、細胞調製物の細胞は採取後の３〜６時間以内に凍結される。実施形態によっては、細胞調製物は細胞採取後の最長６時間以内に凍結される。実施形態によっては、細胞調製物の細胞は、採取後の１、２、３、４、５、６、７、８時間以内に凍結される。他の実施形態では、細胞調製物の細胞は、採取後の最長８、１２、２４、４８、７２時間以内に凍結される。他の実施形態では、採取後に細胞は凍結されるまで２〜８℃に維持される。
【０２８５】
実施形態によっては、初期アポトーシス細胞集団の生成での凍結工程は、細胞調製物を約−１８℃〜−２５℃で凍結すること、続いて細胞調製物を約−８０℃で凍結すること、および最終的に解凍するまで液体窒素中で細胞調製物を凍結することを含む。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞集団の生成での凍結工程は、細胞調製物を約−１８℃〜−２５℃で少なくとも２時間凍結すること、細胞調製物を約−８０℃で少なくとも２時間凍結すること、および最終的に解凍するまで液体窒素で細胞調製物を凍結することを含む。実施形態によっては、細胞は、解凍前に少なくとも８、１０または１２時間液体窒素中に保持される。実施形態によっては、細胞調製物の細胞は、解凍およびアポトーシス誘導インキュベーション培地によるインキュベーションまで液体窒素中に保持される。実施形態によっては、細胞調製物の細胞は、造血幹細胞移植の日まで液体窒素中に保持される。非限定的な例であるが、細胞採取および凍結から最終集団の調製までの時間は、１〜５０日、あるいは６〜３０日であってもよい。別の実施形態では、細胞調製物は、少なくとも数ヶ月などのより長い期間にわたって液体窒素中に保持されてもよい。
【０２８６】
実施形態によっては、初期アポトーシス細胞集団の生成での凍結は、細胞調製物を約−１８℃〜−２５℃で少なくとも０．５、１、２、４時間凍結することを含む。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞集団の生成での凍結は、細胞調製物を約−１８℃〜−２５℃で約２時間凍結することを含む。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞集団の生成での凍結は、細胞調製物を約−８０℃で少なくとも０．５、１、２、４、１２時間凍結することを含む。
【０２８７】
実施形態によっては、単核富化細胞組成物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、２０ヶ月凍結されたままにしてもよい。実施形態によっては、単核富化細胞組成物は、少なくとも０．５、１、２、３、４、５年凍結されたままにしてもよい。特定の実施形態では、単核富化細胞組成物は、少なくとも２０ヶ月凍結されたままにしてもよい。
【０２８８】
実施形態によっては、単核富化細胞組成物は、少なくとも８、１０、１２、１８、２４時間凍結される。特定の実施形態では、単核富化細胞組成物の凍結は少なくとも８時間にわたる。実施形態によっては、単核富化細胞組成物は少なくとも約１０時間凍結される。実施形態によっては、単核富化細胞組成物は少なくとも約１２時間凍結される。実施形態によっては、単核富化細胞組成物は約１２時間凍結される。実施形態によっては、単核富化細胞組成物の総凍結時間は、（約−１８℃〜−２５℃、約−８０℃、かつ液体窒素中で）少なくとも８、１０、１２、１８、２４時間である。
【０２８９】
実施形態によっては、この凍結は、単核富化細胞組成物の細胞中で少なくとも部分的に初期アポトーシス状態を誘導する。実施形態によっては、凍結培地は、Ｌ−グルタミン、Ｈｅｐｅｓ、Ｈｅｓ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および血漿を含むＲＰＭＩ１６４０培地を含む。実施形態によっては、凍結培地中の血漿は、単核富化細胞集団を提供したドナーの自家性血漿である。実施形態によっては、凍結培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５％のＨｅｓ、１０％のジメチルスルホキシド、および２０％（ｖ／ｖ）の血漿を含むＲＰＭＩ１６４０培地を含む。
【０２９０】
実施形態によっては、凍結培地は抗凝固剤を含む。特定の実施形態では、初期アポトーシス細胞集団の生成中に使用される、凍結培地、インキュベーション培地および洗浄培地を含む少なくともいくつかの培地は、抗凝固剤を含む。特定の実施形態では、初期アポトーシス細胞集団の生成中に使用される抗凝固剤を含むすべての培地は、同一濃度の抗凝固剤を含む。実施形態によっては、抗凝固剤は細胞集団の最終懸濁培地には添加されない。
【０２９１】
実施形態によっては、少なくとも凍結培地への抗凝固剤の添加は、細胞調製物の収率を改善する。他の実施形態では、凍結培地への抗凝固剤の添加は、高濃度トリグリセリドの存在下で細胞調製物の収率を改善する。本明細書では、細胞調製物の収率の改善とは、凍結細胞からの生細胞の割合、生細胞からの初期状態のアポトーシス細胞の割合、およびそれらの組合せうちの少なくとも１つの改善に関する。
【０２９２】
実施形態によっては、初期アポトーシス細胞は少なくとも２４時間安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は２４時間安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は２４時間を超えて安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は少なくとも３６時間安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は４８時間安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は少なくとも３６時間安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は３６時間を超えて安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は少なくとも４８時間安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は４８時間安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は少なくとも４８時間安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は４８時間を超えて安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は少なくとも７２時間安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は７２時間安定である。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は７２時間を超えて安定である。
【０２９３】
当業者なら、「安定な」という用語は、非常に少ない割合のＰＩ陽性（ヨウ化プロピジウム陽性）のみとともにＰＳ陽性（ホスファチジルセリン陽性）が継続するアポトーシス細胞を含んでいることが分かっている。ＰＩ陽性細胞は膜安定性の指標となり、ＰＩ陽性細胞は細胞内への侵入が可能となり、膜の安定性が低くなることを示している。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞は、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、または少なくとも７２時間、初期アポトーシス状態で安定なままである。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は、２４時間、３６時間、４８時間、または７２時間、初期アポトーシス状態で安定なままである。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は、２４時間を超えて、３６時間を超えて、４８時間を超えて、または７２時間を超えて、初期アポトーシス状態で安定なままである。別の実施形態では、初期アポトーシス細胞は、長期間にわたってその状態で安定なままである。
【０２９４】
実施形態によっては、アポトーシス細胞集団は細胞凝集体を含まない。実施形態によっては、アポトーシス細胞集団は大きな細胞凝集体を含まない。実施形態によっては、アポトーシス細胞集団では、ドナーからの細胞採取（白血球分離）以外の工程には抗凝固剤を添加せずに調製されたアポトーシス細胞集団と比較すると、細胞凝集体は少数である。実施形態によっては、アポトーシス細胞集団またはその組成物は、抗凝固剤を含む。
【０２９５】
実施形態によっては、アポトーシス細胞は細胞凝集体を含まず、前記アポトーシス細胞は、高血中トリグリセリドを有する被験体から得られた。実施形態によっては、被験体の血中トリグリセリド濃度は１５０ｍｇ／ｄＬを超える。実施形態によっては、アポトーシス細胞集団は細胞凝集体を含まず、前記アポトーシス細胞集団は、正常な血中トリグリセリドを有する被験体より得られた細胞から調製される。実施形態によっては、被験体の血中トリグリセリド濃度は１５０ｍｇ／ｄＬ以下である。実施形態によっては、細胞凝集体は、アポトーシス細胞生成方法中に細胞の損失を生じる。
【０２９６】
当業者なら、「凝集体」または「細胞凝集体」という用語には、低せん断力下または静止状態で血液細胞の可逆的な塊を含む可能性があることが分かっている。細胞凝集体は、アポトーシス細胞の生成のインキュベーション段階中に目で観察できる。細胞凝集は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば光学顕微鏡下でまたはフローサイトメトリーを使用して、試料を視覚的に撮影して測定できる。
【０２９７】
実施形態によっては、抗凝固剤は、ヘパリン、酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）処方Ａ、およびそれらの組合せを含む群から選択される。実施形態によっては、抗凝固剤は、ヘパリン、酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）処方Ａ、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【０２９８】
初期アポトーシス細胞集団およびその組成物を調製する方法の実施形態によっては、集団の調製中に使用される少なくとも１つの培地に抗凝固剤を添加する。実施形態によっては、集団の調製中に使用される少なくとも１つの培地は、凍結培地、洗浄培地、アポトーシス誘導インキュベーション培地、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【０２９９】
実施形態によっては、抗凝固剤は、ヘパリン、ＡＣＤ処方Ａ、およびそれらの組合せからなる群から選択される。なお限定はされないが、フォンダパリヌクス、ビバリルジンおよびアルガトロバンなどの当技術分野で公知の他の抗凝固剤を使用してもよい。
【０３００】
実施形態によっては、集団の調製中に使用される少なくとも１つの培地は、１０Ｕ／ｍＬのヘパリンを含む５％のＡＣＤ処方Ａ溶液を含む。実施形態によっては、抗凝固剤は細胞集団の最終懸濁培地に添加されない。本明細書で使用される「最終懸濁培地」および「投与培地」という用語は、すべて同一の質と意味を有して互換的に使用される。
【０３０１】
実施形態によっては、集団の調製中に使用される少なくとも１つの培地は、０．１〜２．５Ｕ／ｍＬの濃度のヘパリンを含む。実施形態によっては、集団の調製中に使用される少なくとも１つの培地は、１％〜１５％（ｖ／ｖ）の濃度のＡＣＤ処方Ａを含む。実施形態によっては、凍結培地は抗凝固剤を含む。実施形態によっては、インキュベーション培地は抗凝固剤を含む。実施形態によっては、凍結培地とインキュベーション培地の両方が抗凝固剤を含む。実施形態によっては、抗凝固剤は、ヘパリン、ＡＣＤ処方Ａ、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【０３０２】
実施形態によっては、凍結培地中のヘパリンは、０．１〜２．５Ｕ／ｍＬの濃度である。実施形態によっては、凍結培地中のＡＣＤ処方Ａは、１％〜１５％（ｖ／ｖ）の濃度である。実施形態によっては、インキュベーション培地中のヘパリンは０．１〜２．５Ｕ／ｍＬの濃度である。実施形態によっては、インキュベーション培地中のＡＣＤ処方Ａは、１％〜１５％（ｖ／ｖ）の濃度である。実施形態によっては、抗凝固剤は、酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）処方Ａの溶液である。実施形態によっては、集団の調製中に使用される少なくとも１つの培地に添加される抗凝固剤は、１０Ｕ／ｍＬの濃度のヘパリンを含むＡＣＤ処方Ａである。
【０３０３】
実施形態によっては、初期のアポトーシス細胞集団の生成に使用されるアポトーシス誘導インキュベーション培地は抗凝固剤を含む。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞集団の生成に使用される凍結培地およびアポトーシス誘導インキュベーション培地の両方が抗凝固剤を含む。いかなる理論やメカニズムにも縛られることを望まないが、細胞採取手段によらず、異なる細胞組成物で高くかつ安定した細胞収率を維持するために、実施形態によっては、抗凝固剤の添加は、アポトーシス細胞集団の生成中の凍結培地およびアポトーシス誘導インキュベーション培地の両方に抗凝固剤を添加することを含む。実施形態によっては、組成物中の高くかつ安定した細胞収率とは、アポトーシスの誘導に使用される初期細胞集団の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、典型的には少なくとも５０％の細胞収率を含む。
【０３０４】
実施形態によっては、凍結培地およびインキュベーション培地の両方が抗凝固剤を含む。実施形態によっては、インキュベーション培地および凍結培地の両方への抗凝固剤の添加は、限定はされないが、細胞採取中の抗凝固剤の添加タイミングおよび／または種類などの細胞採取条件によらずに、異なる集団の調製物に対し高くかつ安定した細胞収率をもたらす。実施形態によっては、インキュベーション培地および凍結培地の両方への抗凝固剤の添加は、白血球分離中の抗凝固剤の添加タイミングおよび／または種類によらず、細胞調製物の高くかつ安定した細胞調製物の収率をもたらす。実施形態によっては、高トリグリセリド濃度の存在下での細胞調製物の生成は、異なる調製物間で低くおよび／または不安定な細胞収率をもたらす。実施形態によっては、高トリグリセリド濃度のドナーの血液から細胞調製物を生成すると、細胞調製物の低くおよび／または不安定な細胞収率が生じる。実施形態によっては、「高トリグリセリド濃度」という用語は、同性および同年齢の健康な被験体の通常濃度を超えるトリグリセリド濃度を指す。実施形態によっては、「高トリグリセリド濃度」という用語は、約１．７ｍＭを超えるトリグリセリド濃度を指す。本明細書で使用される高くかつ安定した収率とは、被験体に投与されたときに治療効力を発揮する用量の調製物を可能とするのに十分である集団中での高い細胞収率を指す。実施形態によっては、治療効力とは、被験体の免疫疾患、自己免疫疾患または炎症性疾患を治療、予防または寛解する能力を指す。実施形態によっては、高くかつ安定した細胞収率とは、初期に凍結された細胞由来の集団中の細胞のうちの少なくとも３０％、可能性として少なくとも４０％、典型的には少なくとも５０％である細胞収率である。
【０３０５】
実施形態によっては、細胞調製物が高トリグリセリド濃度のドナーから得られる場合には、ドナーには、以下のような群から選択される少なくとも１つの対応を講じるが、これらの対応は、限定はされないが、スタチンおよび／またはベザフィブラートなどのトリグリセリド低下薬剤を献血前に服用させること、献血前に少なくとも８、１０、１２時間絶食させること、献血前の少なくとも２４、４８、７２時間での血中トリグリセリド濃度を低下させるように適切な食事を摂取させること、およびそれらの任意の組合せから選択される。
【０３０６】
実施形態によっては、集団における細胞収率は、アポトーシス誘導に供された細胞の初期数のうちの組成物中の細胞数に関連する。本明細書で使用される「初期アポトーシス状態の誘導」および「アポトーシスの誘導」という用語には互換性がある。
【０３０７】
実施形態によっては、単核富化細胞組成物は、凍結および解凍後にインキュベーション培地でインキュベートされる。実施形態によっては、解凍とインキュベーションとの間に少なくとも１回の洗浄工程が存在する。本明細書で使用される「インキュベーション培地」および「アポトーシス誘導インキュベーション培地」という用語は、交換可能に使用される。実施形態によっては、インキュベーション培地は、Ｌ−グルタミン、Ｈｅｐｅｓ、メチルプレドニゾロン、および血漿を補充したＲＰＭＩ１６４０培地を含む。実施形態によっては、洗浄培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、および１０％（ｖ／ｖ）血漿を含む。実施形態によっては、インキュベーション培地中の血漿は、細胞調製物の細胞が由来するのと同じドナーに由来する。実施形態によっては、血漿は、インキュベーションの当日にインキュベーション培地に添加される。実施形態によっては、インキュベーションは３７℃および５％ＣＯ２で実施される。
【０３０８】
実施形態によっては、インキュベーション培地はメチルプレドニゾロンを含む。実施形態によっては、インキュベーション培地内のメチルプレドニゾロンは、さらに、単核富化細胞組成物中の細胞が初期アポトーシス状態に入るように誘導する。実施形態によっては、単核富化細胞組成物中の細胞は、凍結することおよびメチルプレドニゾロンの存在下でインキュベートすることの両方によって初期アポトーシス状態に入るように誘導される。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞集団の生成により、実質的に壊死の誘導なしに初期アポトーシス状態が誘導され好都合であり、ここで細胞は調製後約２４時間、前記初期アポトーシス状態で安定のままである。
【０３０９】
実施形態によっては、インキュベーション培地は、メチルプレドニゾロンを約１０〜１００μｇ／ｍｌの濃度で含む。実施形態によっては、インキュベーション培地は、メチルプレドニゾロンを約４０〜６０μｇ／ｍｌ、あるいは約４５〜５５μｇ／ｍｌの濃度で含む。実施形態によっては、インキュベーション培地は、メチルプレドニゾロンを５０μｇ／ｍｌの濃度で含む。
【０３１０】
実施形態によっては、インキュベーションは、約２〜１２時間、場合により４〜８時間、典型的には約５〜７時間である。実施形態によっては、インキュベーションは約６時間である。実施形態によっては、インキュベーションは少なくとも６時間である。好ましい実施形態では、インキュベーションは６時間である。
【０３１１】
実施形態によっては、インキュベーション培地は抗凝固薬を含む。実施形態によっては、インキュベーション培地への抗凝固薬の添加は、細胞調製物の収率を改善させる。実施形態によっては、インキュベーション培地中の抗凝固薬は、凍結培地内と同じ濃度である。実施形態によっては、インキュベーション培地は、ヘパリン、ＡＣＤ処方Ａ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される抗凝固薬を含む。実施形態によっては、インキュベーション培地に使用される抗凝固薬は、ヘパリンを１０Ｕ／ｍｌの濃度で含有するＡＣＤ処方Ａである。
【０３１２】
実施形態によっては、インキュベーション培地はヘパリンを含む。実施形態によっては、インキュベーション培地中のヘパリンは、０．１〜２．５Ｕ／ｍｌの間の濃度である。実施形態によっては、インキュベーション培地中のヘパリンは、０．１〜２．５Ｕ／ｍｌの間、場合により０．３〜０．７Ｕ／ｍｌの間、典型的には約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。ある特定の実施形態では、インキュベーション培地中のヘパリンは、約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。
【０３１３】
実施形態によっては、インキュベーション培地はＡＣＤ処方Ａを含む。実施形態によっては、インキュベーション培地中のＡＣＤ処方Ａは、１％〜１５％（ｖ／ｖ）の間の濃度である。実施形態によっては、インキュベーション培地中のＡＣＤ処方Ａは、１％〜１５％（ｖ／ｖ）の間、場合により４％〜７％（ｖ／ｖ）の間、典型的には約５％（ｖ／ｖ）の濃度である。実施形態によっては、インキュベーション培地中のＡＣＤ処方Ａは、約５％（ｖ／ｖ）の濃度である。
【０３１４】
実施形態によっては、細胞調製物の収率の改善は、調製物が生成された凍結細胞の数に対する調製物の初期アポトーシス生細胞の数の改善を含む。
【０３１５】
実施形態によっては、凍結培地への抗凝固薬の添加は、医薬物集団の異なる調製物間の高くて安定な収率に寄与する。好適な実施形態では、少なくとも凍結培地およびインキュベーション培地へ抗凝固薬を添加すると、使用される細胞採取プロトコルに関係なく、結果として医薬組成物の異なる調製物間の高くて安定な収率が得られる。
【０３１６】
実施形態によっては、凍結培地は、ヘパリン、ＡＣＤ処方Ａ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される抗凝固薬を含む。実施形態によっては、凍結培地に使用される抗凝固薬は、ヘパリンを１０Ｕ／ｍｌの濃度で含有するＡＣＤ処方Ａである。実施形態によっては、凍結培地は、ヘパリンを１０Ｕ／ｍｌの濃度で含む５％（ｖ／ｖ）のＡＣＤ処方Ａ溶液を含む。
【０３１７】
実施形態によっては、凍結培地はヘパリンを含む。実施形態によっては、凍結培地中のヘパリンは、０．１〜２．５Ｕ／ｍｌの間の濃度である。実施形態によっては、凍結培地中のヘパリンは、０．１〜２．５Ｕ／ｍｌの間、場合により０．３〜０．７Ｕ／ｍｌの間、典型的には約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。ある特定の実施形態では、凍結培地中のヘパリンは、約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。
【０３１８】
実施形態によっては、凍結培地はＡＣＤ処方Ａを含む。実施形態によっては、凍結培地中のＡＣＤ処方Ａは、１％〜１５％（ｖ／ｖ）の間の濃度である。実施形態によっては、凍結培地中のＡＣＤ処方Ａは、１％〜１５％（ｖ／ｖ）の間、場合により４％〜７％（ｖ／ｖ）の間、典型的には約５％（ｖ／ｖ）の濃度である。実施形態によっては、凍結培地中のＡＣＤ処方Ａは、約５％（ｖ／ｖ）の濃度である。
【０３１９】
実施形態によっては、インキュベーション培地および／または凍結培地へ抗凝固薬を添加すると、ドナーの血液中のトリグリセリド濃度にかかわらず、結果として集団内における高くて安定な細胞収率が得られる。実施形態によっては、インキュベーション培地および／または凍結培地へ抗凝固薬を添加すると、正常または高いトリグリセリド濃度を有するドナーの血液から得られる場合、結果として本発明の組成物内における高くて安定な細胞収率が得られる。実施形態によっては、少なくともインキュベーション培地へ抗凝固薬を添加すると、ドナーの血液中のトリグリセリド濃度にかかわらず、結果として組成物内における高くて安定な細胞収率が得られる。実施形態によっては、凍結培地およびインキュベーション培地へ抗凝固薬を添加すると、ドナーの血液中のトリグリセリド濃度にかかわらず、結果として組成物内における高くて安定な細胞収率が得られる。
【０３２０】
実施形態によっては、凍結培地および／またはインキュベーション培地および／または洗浄培地は、ヘパリンを少なくとも０．１Ｕ／ｍｌ、場合により少なくとも０．３Ｕ／ｍｌ、典型的には少なくとも０．５Ｕ／ｍｌの濃度で含む。実施形態によっては、凍結培地および／またはインキュベーション培地および／または洗浄培地は、ＡＣＤ処方Ａを少なくとも１％（ｖ／ｖ）、場合により少なくとも３％（ｖ／ｖ）、典型的には少なくとも５％（ｖ／ｖ）の濃度で含む。
【０３２１】
実施形態によっては、単核富化細胞組成物は、細胞採取後、凍結培地に再懸濁され凍結される前に、少なくとも１回の洗浄工程を経る。実施形態によっては、単核富化細胞組成物は、凍結および解凍後に少なくとも１回の洗浄工程を経る。実施形態によっては、洗浄工程は、単核富化細胞組成物の遠心分離、それに続く上清抽出、および洗浄培地への再懸濁を含む。
【０３２２】
実施形態によっては、単核富化細胞組成物は、初期アポトーシス細胞集団の生成の各段階の間に、少なくとも１回の洗浄工程を経る。実施形態によっては、抗凝固薬は、初期アポトーシス細胞集団の生成中の各洗浄工程中に洗浄培地に添加される。実施形態によっては、単核富化細胞組成物は、インキュベーション後に少なくとも１回の洗浄工程を経る。実施形態によっては、単核富化細胞組成物は、インキュベーション後にＰＢＳを使用する少なくとも１回の洗浄工程を経る。実施形態によっては、抗凝固薬は、投与培地への細胞調製物の再懸濁前の最終洗浄工程には添加されない。実施形態によっては、抗凝固薬は、投与培地への細胞調製物の再懸濁前の最終洗浄工程に使用されるＰＢＳには添加されない。ある特定の実施形態では、抗凝固薬は、投与培地には添加されない。
【０３２３】
実施形態によっては、インキュベーション中の細胞濃度は、約５×１０６細胞／ｍｌである。
【０３２４】
実施形態によっては、単核富化細胞組成物は、凍結、解凍、およびインキュベーション後に投与培地に懸濁され、それによって医薬物集団が得られる。実施形態によっては、投与培地は好適な生理的緩衝液を含む。好適な生理的緩衝液の非限定的な例は、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、およびハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）等である。実施形態によっては、投与培地はＰＢＳを含む。実施形態によっては、投与培地は、細胞の生存を維持することに資する補助剤を含む。実施形態によっては、単核富化細胞組成物は投与前にろ過される。実施形態によっては、単核富化細胞組成物は、投与前に少なくとも２００μｍのろ紙でろ過される。
【０３２５】
実施形態によっては、単核富化細胞集団は、その結果得られる細胞調製物の最終体積が１００〜１０００ｍｌの間、場合により２００〜８００ｍｌの間、典型的には３００〜６００ｍｌの間となるように、投与培地に再懸濁される。
【０３２６】
実施形態によっては、細胞採取とは、単核富化細胞組成物を得ることを指す。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞集団の生成中に実施される各洗浄工程は洗浄培地で実施される。ある特定の実施形態では、初期アポトーシス細胞集団の生成のインキュベーション工程までに実施される各洗浄工程は、洗浄培地で実施される。実施形態によっては、洗浄培地は、Ｌ−グルタミンおよびＨｅｐｅｓを補充したＲＰＭＩ１６４０培地を含む。実施形態によっては、洗浄培地は、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１０ｍＭのＨｅｐｅｓを補充したＲＰＭＩ１６４０培地を含む。
【０３２７】
実施形態によっては、洗浄培地は抗凝固薬を含む。実施形態によっては、洗浄培地は、ヘパリン、ＡＣＤ処方Ａ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される抗凝固薬を含む。実施形態によっては、洗浄培地中の抗凝固薬の濃度は、凍結培地中と同じ濃度である。実施形態によっては、洗浄培地中の抗凝固薬の濃度は、インキュベーション培地中と同じ濃度である。実施形態によっては、洗浄培地に使用される抗凝固薬は、ヘパリンを１０Ｕ／ｍｌの濃度で含有するＡＣＤ処方Ａである。
【０３２８】
実施形態によっては、洗浄培地はヘパリンを含む。実施形態によっては、洗浄培地中のヘパリンは、０．１〜２．５Ｕ／ｍｌの間の濃度である。実施形態によっては、洗浄培地中のヘパリンは、０．１〜２．５Ｕ／ｍｌの間、場合により０．３〜０．７Ｕ／ｍｌの間、典型的には約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。ある特定の実施形態では、洗浄培地中のヘパリンは、約０．５Ｕ／ｍｌの濃度である。
【０３２９】
実施形態によっては、洗浄培地はＡＣＤ処方Ａを含む。実施形態によっては、洗浄培地中のＡＣＤ処方Ａは、１％〜１５％（ｖ／ｖ）の間の濃度である。実施形態によっては、洗浄培地中のＡＣＤ処方Ａは、１％〜１５％（ｖ／ｖ）の間、場合により４％〜７％（ｖ／ｖ）の間、典型的には約５％（ｖ／ｖ）の濃度である。実施形態によっては、洗浄培地中のＡＣＤ処方Ａは、約５％（ｖ／ｖ）の濃度である。
【０３３０】
実施形態によっては、単核富化細胞組成物は、被験体への集団の所期の投与の数時間前に解凍される。実施形態によっては、単核富化細胞組成物は、約３３℃〜３９℃で解凍される。実施形態によっては、単核富化細胞組成物は、約３０〜２４０秒間、好ましくは４０〜１８０秒間、最も好ましくは５０〜１２０秒間解凍される。
【０３３１】
実施形態によっては、単核富化細胞組成物は、集団の所期の投与の少なくとも１０時間前、あるいは集団の所期の投与の少なくとも２０、３０、４０、または５０時間前に解凍される。実施形態によっては、単核富化細胞組成物は、集団の所期の投与の少なくとも１５〜２４時間前に解凍される。実施形態によっては、単核富化細胞組成物は、集団の所期の投与の少なくとも約２４時間前に解凍される。実施形態によっては、単核富化細胞組成物は、集団の所期の投与の少なくとも２０時間前に解凍される。実施形態によっては、単核富化細胞組成物は、集団の所期の投与の３０時間前に解凍される。実施形態によっては、単核富化細胞組成物は、集団の所期の投与の少なくとも２４時間前に解凍される。実施形態によっては、単核富化細胞組成物は、解凍前および／または後に、洗浄培地で洗浄する工程を少なくとも１回経る。
【０３３２】
実施形態によっては、組成物はメチルプレドニゾロンをさらに含む。一部の実施形態において、メチルプレドニゾロンの濃度は３０μｇ／ｍｌを超えない。
【０３３３】
実施形態によっては、アポトーシス細胞は高用量で使用される。実施形態によっては、アポトーシス細胞は高濃度で使用される。実施形態によっては、ヒトアポトーシス多形核好中球（ＰＭＮ）が使用される。実施形態によっては、５０％がアポトーシス細胞である一群の細胞が使用される。実施形態によっては、アポトーシス細胞はメイギムザ染色細胞標本によって確かめられる。実施形態によっては、細胞の生存はトリパンブルー排除によって評価される。実施形態によっては、細胞のアポトーシスおよび壊死状況は、ＦＡＣＳによる検出を伴うアネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム染色によって確認される。
【０３３４】
実施形態によっては、本明細書に開示されるアポトーシス細胞は壊死細胞を含まない。実施形態によっては、本明細書に開示されるアポトーシス細胞は１％未満の壊死細胞を含む。実施形態によっては、本明細書に開示されるアポトーシス細胞は２％未満の壊死細胞を含む。実施形態によっては、本明細書に開示されるアポトーシス細胞は３％未満の壊死細胞を含む。実施形態によっては、本明細書に開示されるアポトーシス細胞は４％未満の壊死細胞を含む。実施形態によっては、本明細書に開示されるアポトーシス細胞は５％未満の壊死細胞を含む。
【０３３５】
実施形態によっては、約１４０×１０６〜２１０×１０６個の用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、約１０〜１００×１０６個の用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、約２０×１０６個の用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、約３０×１０６個の用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、約４０×１０６個の用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、約５０×１０６個の用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、６０×１０６個のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、約６０×１０６個の用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、約７０×１０６個の用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、約８０×１０６個の用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、約９０×１０６個の用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、約１〜１５×１０７個の用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、約１０×１０７個の用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、約１５×１０７個の用量のアポトーシス細胞が投与される。
【０３３６】
実施形態によっては、１０×１０６個の用量のアポトーシス細胞が投与される。別の実施形態では、１０×１０７個の用量のアポトーシス細胞が投与される。別の実施形態では、１０×１０８個の用量のアポトーシス細胞が投与される。別の実施形態では、１０×１０９個の用量のアポトーシス細胞が投与される。別の実施形態では、１０×１０１０個の用量のアポトーシス細胞が投与される。別の実施形態では、１０×１０１１個の用量のアポトーシス細胞が投与される。別の実施形態では、１０×１０１２個の用量のアポトーシス細胞が投与される。別の実施形態では、１０×１０５個の用量のアポトーシス細胞が投与される。別の実施形態では、１０×１０４個の用量のアポトーシス細胞が投与される。別の実施形態では、１０×１０３個の用量のアポトーシス細胞が投与される。別の実施形態では、１０×１０２個の用量のアポトーシス細胞が投与される。
【０３３７】
実施形態によっては、高用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、３５×１０６個の用量のアポトーシス細胞が投与される。別の実施形態では、２１０×１０６個の用量のアポトーシス細胞が投与される。別の実施形態では、７０×１０６個の用量のアポトーシス細胞が投与される。別の実施形態では、１４０×１０６個の用量のアポトーシス細胞が投与される。別の実施形態では、３５〜２１０×１０６個の用量のアポトーシス細胞が投与される。
【０３３８】
実施形態によっては、単回用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、複数回用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、２回用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、３回用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、４回用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、５回用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、６回用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、７回用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、８回用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、９回用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、９回を超える用量のアポトーシス細胞が投与される。実施形態によっては、複数回用量のアポトーシス細胞が投与される。
【０３３９】
実施形態によっては、アポトーシス細胞は、静脈内、皮下、結節内、腫瘍内、髄腔内、胸腔内、腹腔内、および胸腺への直接的投与を含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の方法によって投与することができる。
【０３４０】
実施形態によっては、アポトーシス細胞は、前記アポトーシス細胞を受ける被験体以外の被験体から得られた細胞から調製される。実施形態によっては、本明細書に開示される方法は、同種異系ドナー細胞の拒絶を克服するのに有用な追加の工程、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３０１５６７９４号に記載される１つまたは複数の工程を含む。実施形態によっては、方法は、完全または部分的なリンパ球枯渇の後にアポトーシス細胞、実施形態によっては同種異系アポトーシス細胞を投与する工程を含む。実施形態によっては、リンパ球枯渇は、同種異系アポトーシス細胞がサイトカイン放出を制御することを可能にするのに十分な期間、宿主対移植片反応を遅らせるように調整される。実施形態によっては、方法は、リンパ節からの同種異系アポトーシスＴ細胞の出現を遅らせる薬剤、例えば、２−アミノ−２−［２−（４−オクチルフェニル）エチル］プロパン−１，３−ジオール（ＦＴＹ７２０）、５−［４−フェニル−５−（トリフルオロメチル）チオフェン−２−イル］−３−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，２，４−オキサジアゾール（ＳＥＷ２８７１）、３−（２−（−ヘキシルフェニルアミノ）−２−オキソエチルアミノ）プロパン酸（Ｗ１２３）、リン酸水素２−アンモニオ−４−（２−クロロ−４−（３−フェノキシフェニルチオ）フェニル）−２−（ヒドロキシメチル）ブチル（ＫＲＰ−２０３リン酸塩）、または当技術分野で公知の他の薬剤を投与する工程を含み、本明細書に開示される組成物および方法の一部として使用してもよく、それにより有効性を有しかつ移植片対宿主病の開始を欠く同種異系アポトーシス細胞の使用が可能となる。別の実施形態では、同種異系アポトーシスＴ細胞によるＭＨＣ発現は停止されて、同種異系細胞の拒絶を低減する。
【０３４１】
実施形態によっては、方法は、小さな百分率の活動中の非アポトーシス生細胞、活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む単核アポトーシス細胞の集団を生成する工程を含み、前記方法は、末梢血の単核富化細胞集団を取得する工程、抗凝固薬を含む凍結培地中で前記単核富化細胞集団を凍結する工程、前記単核富化細胞集団を解凍する工程、最終濃度が約１０〜１００μｇ／ｍＬのメチルプレドニゾロンおよび抗凝固薬を含むアポトーシス誘導インキュベーション培地で前記単核富化細胞集団をインキュベートする工程、投与培地に前記アポトーシス細胞集団を再懸濁する工程、ならびにアポトーシス誘導に引き続き行われる前記単核富化集団を不活性化する工程を含み、前記方法は小さな百分率の活動中の非アポトーシス細胞、活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む単核アポトーシス細胞の集団を生成する。
【０３４２】
実施形態によっては、方法は、被験体に由来するアポトーシス細胞の集団を照射した後にアポトーシス細胞の集団を同じ被験体に投与する工程を含む（自家ＡｐｏＣｅｌｌ）。実施形態によっては、方法は、被験体に由来するアポトーシス細胞を照射した後にアポトーシス細胞の集団をレシピエントに投与する工程を含む（同種異系ＡｐｏＣｅｌｌ）。
【０３４３】
実施形態によっては、細胞は、アポトーシス細胞集団内の残存生細胞の増殖および／または活性化を減少させ得る手段で照射される。実施形態によっては、細胞は、集団中の非アポトーシス生細胞の百分率を低下させる手段で照射される。実施形態によっては、不活性化された初期アポトーシス細胞集団中の非アポトーシス生細胞の百分率は、集団の５０％未満に低下する。実施形態によっては、不活性化された初期アポトーシス細胞集団中の非アポトーシス生細胞の百分率は、集団の４０％未満に低下する。実施形態によっては、不活性化された初期アポトーシス細胞集団中の非アポトーシス生細胞の百分率は、集団の３０％未満に低下する。実施形態によっては、不活性化された初期アポトーシス細胞集団中の非アポトーシス生細胞の百分率は、集団の２０％未満に低下する。実施形態によっては、不活性化された初期アポトーシス細胞集団中の非アポトーシス生細胞の百分率は、集団の１０％未満に低下する。実施形態によっては、不活性化された初期アポトーシス細胞集団中の非アポトーシス生細胞の百分率は、集団の０％に低下する。
【０３４４】
別の実施形態では、照射アポトーシス細胞は、初期アポトーシス特性、免疫調節特性、安定性特性を全て保存する。別の実施形態では、照射工程は紫外線放射を使用する。別の実施形態では、放射工程はγ線放射を使用する。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、小さな百分率の非アポトーシス生存細胞を含むか、活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞がアポトーシス細胞調製物内に存在する調製物を含むか、増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞がアポトーシス細胞調製物内に存在する調製物を含むか、またはそれらの任意の組み合わせである。
【０３４５】
実施形態によっては、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比べて死細胞（ＰＩ＋）の集団を増加させない。実施形態によっては、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比べて約１％以上は死細胞（ＰＩ＋）の集団を増加させない。実施形態によっては、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比べて約２％以上は死細胞（ＰＩ＋）の集団を増加させない。実施形態によっては、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比べて約３％以上は死細胞（ＰＩ＋）の集団を増加させない。実施形態によっては、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比べて約４％以上は死細胞（ＰＩ＋）の集団を増加させない。実施形態によっては、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比べて約５％以上は死細胞（ＰＩ＋）の集団を増加させない。実施形態によっては、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比べて約６％以上は死細胞（ＰＩ＋）の集団を増加させない。実施形態によっては、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比べて約７％以上は死細胞（ＰＩ＋）の集団を増加させない。実施形態によっては、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比べて約８％以上は死細胞（ＰＩ＋）の集団を増加させない。実施形態によっては、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比べて約９％以上は死細胞（ＰＩ＋）の集団を増加させない。実施形態によっては、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比べて約１０％以上は死細胞（ＰＩ＋）の集団を増加させない。実施形態によっては、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比べて約１５％以上は死細胞（ＰＩ＋）の集団を増加させない。実施形態によっては、アポトーシス細胞の照射は、照射されていないアポトーシス細胞と比べて約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％以上は死細胞（ＰＩ＋）の集団を増加させない。
【０３４６】
実施形態によっては、非アポトーシス生存細胞が減少したかまたは存在しない画分を含む細胞集団は、一実施形態では生存／生細胞を一切有しない単核初期アポトーシス細胞集団を提供することができる。実施形態によっては、非アポトーシス生存細胞が減少したかまたは存在しない部分を含む細胞集団は、一実施形態ではレシピエントにおいてＧＶＨＤを誘発しない単核アポトーシス細胞集団をも提供することができる。
【０３４７】
実施形態によっては、照射アポトーシス細胞を使用すると、（ごく一部に生細胞を含む）アポトーシス集団の使用が引き起こすと考えられる移植片対白血病効果がなくなり、これは本明細書で実施例に示される効果（実施例８を参照のこと）が、アポトーシス細胞集団内に存在し細胞活性を有する増殖生細胞集団に起因するのではなく、アポトーシス細胞に起因するということを実証する。
【０３４８】
別の実施形態では、方法は、ドナーからのＷＢＣに由来するアポトーシス細胞を照射した後でレシピエントに投与する工程を含む。実施形態によっては、細胞は、アポトーシス細胞集団内の残存生細胞の増殖および／または活性化を回避し得る手段で照射される。別の実施形態では、照射アポトーシス細胞は、初期アポトーシス特性、免疫調節特性、安定性特性を全て保存する。別の実施形態では、照射工程は紫外線放射を使用する。別の実施形態では、放射工程はγ線放射を使用する。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、小さな百分率の非アポトーシス生存細胞を含むか、活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞がアポトーシス細胞調製物内に存在する調製物を含むか、増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞がアポトーシス細胞調製物内に存在する調製物を含むか、またはそれらの任意の組み合わせである。
【０３４９】
実施形態によっては、アポトーシス細胞はプールされた単核アポトーシス細胞調製物を含む。実施形態によっては、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、初期アポトーシス状態の単核細胞を含み、前記プールされた単核アポトーシス細胞は、小さな百分率の非アポトーシス生存細胞、活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞を有する調製物、増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞を有する調製物、またはそれらの任意の組み合わせを含む。別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞は照射されている。別の実施形態では、本明細書に開示されるのはプールされた単核アポトーシス細胞調製物であり、これは実施形態によっては、献血液から得られた白血球細胞分画（ＷＢＣ）に由来する。
【０３５０】
実施形態によっては、アポトーシス細胞調製物は照射される。別の実施形態では、前記照射はγ線照射または紫外線照射を含む。さらに別の実施形態では、照射された調製物は、非照射アポトーシス細胞調製物と比べて少ない数の非アポトーシス細胞を有する。別の実施形態では、照射された調製物は、非照射アポトーシス細胞調製物と比べて少ない数の増殖細胞を有する。別の実施形態では、照射された調製物は、非照射アポトーシス細胞集団と比べて少ない数の潜在的に免疫学活性のある細胞を有する。
【０３５１】
実施形態によっては、プール血液は、ドナーとレシピエントとの間で適合しない第三者血液を含む。
【０３５２】
当業者であれば、「プール」という用語が、複数のドナーから採取され、調製され、かつ場合により後の使用のために保管された血液を包含してもよいということを理解するだろう。この組み合わされた血液のプールを次いで加工して、プールされた単核アポトーシス細胞調製物を生成することができる。別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は、直ちに利用可能な供給量の単核アポトーシス細胞が確実に利用可能であるようにする。別の実施形態では、細胞は、アポトーシスが誘導されるインキュベーション工程の直前にプール（貯蔵）される。別の実施形態では、細胞は、インキュベーション工程後、再懸濁の工程でプールされる。別の実施形態では、細胞は照射工程の直前にプールされる。別の実施形態では、細胞は照射工程後にプールされる。別の実施形態では、細胞は調製方法の任意の工程でプールされる。
【０３５３】
実施形態によっては、プールされたアポトーシス細胞調製物は、約２から２５単位の間の血液中に存在する細胞に由来する。別の実施形態では、前記プールされたアポトーシス細胞調製物は、約２〜５、２〜１０、２〜１５、２〜２０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、６〜１３、または６〜２５単位の間の血液中に存在する細胞で構成される。別の実施形態では、前記プールされたアポトーシス細胞調製物は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５単位の血液中に存在する細胞で構成される。必要とされる血液の単位数は、血液からのＷＢＣ回収効率にも依存する。例えば、ＷＢＣ回収効率が低いと追加の単位が必要となる一方で、ＷＢＣ回収効率が高いと必要とされる単位がより少なくなるだろう。実施形態によっては、各単位は血液バッグである。別の実施形態では、プールされたアポトーシス細胞調製物は、少なくとも２５単位の血液、少なくとも５０単位の血液、または少なくとも１００単位の血液中に存在する細胞で構成される。
【０３５４】
実施形態によっては、血液の単位は、献血からの白血球細胞（ＷＢＣ）分画を含む。別の実施形態では、献血は血液センターまたは血液バンクからのものであってもよい。別の実施形態では、献血はプールされたアポトーシス細胞調製物の調製時に集められた病院内のドナーからのものであってもよい。別の実施形態では、複数のドナーからのＷＢＣを含む血液の単位は、本明細書に開示される組成物およびその方法のために創られた独立した血液バンクに蓄蔵され維持される。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物およびその方法のために創設された血液バンクは、複数のドナーからのＷＢＣを含む血液の単位を供給することができ、白血球除去ユニットを備える。
【０３５５】
実施形態によっては、プールＷＢＣの単位はＨＬＡ適合では制限されない。したがって、その結果得られるプールされたアポトーシス細胞調製物は、ＨＬＡ適合で制限されない細胞集団を含む。したがって、ある特定の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は同種異系細胞を含む。
【０３５６】
ＨＬＡ適合で制限されないプールＷＢＣに由来するプールされた単核アポトーシス細胞調製物の利点は、ＷＢＣの直ちに利用可能な供給源であるということ、およびＷＢＣを得る費用が削減されているということである。
【０３５７】
実施形態によっては、プール血液はＨＬＡ適合とは無関係な複数のドナーからの血液を含む。別の実施形態では、プール血液は、レシピエントとのＨＬＡ適合が考慮された、例えば、１つのＨＬＡアレル、２つのＨＬＡアレル、３つのＨＬＡアレル、４つのＨＬＡアレル、５つのＨＬＡアレル、６つのＨＬＡアレル、または７つのＨＬＡアレルがドナーとレシピエントとの間で適合している複数のドナーからの血液を含む。別の実施形態では、複数のドナーは部分的に適合する、例えば、一部のドナーがＨＬＡ適合しており、ここで１つのＨＬＡアレル、２つのＨＬＡアレル、３つのＨＬＡアレル、４つのＨＬＡアレル、５つのＨＬＡアレル、６つのＨＬＡアレル、または７つのＨＬＡアレルが一部のドナーとレシピエントとの間で適合している。各可能性は本明細書に開示される実施形態を含む。
【０３５８】
ある特定の実施形態では、一部の非アポトーシス生細胞（アポトーシス耐性）は、下記（実施例１）のアポトーシス工程の誘導後に残っていてもよい。これらの非アポトーシス生細胞の存在は、実施形態によっては、照射工程前に観察される。これらの非アポトーシス生細胞は、増殖しまたは活性化することができてもよい。実施形態によっては、複数のドナーに由来するプールされた単核アポトーシス細胞調製物は、宿主に対して活性化しても、互いに対して活性化しても、またはその両方であってもよい。
【０３５９】
実施形態によっては、本明細書に開示される照射された細胞調製物は、非照射細胞調製物と比べて細胞の活性化を抑制し、増殖を抑えている。別の実施形態では、照射はγ線照射または紫外線照射を含む。別の実施形態では、照射された細胞調製物は、非照射細胞調製物と比べて少ない数の非アポトーシス細胞を有する。別の実施形態では、照射は約１５グレイ（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は約２０グレイ（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は約２５グレイ（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は約３０グレイ（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は約３５グレイ（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は約４０グレイ（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は約４５グレイ（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は約５０グレイ（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は約５５グレイ（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は約６０グレイ（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は約６５グレイ（Ｇｙ）を含む。別の実施形態では、照射は最大２５００Ｇｙを含む。別の実施形態では、照射されたプールされたアポトーシス細胞調製物は、非照射のプールされたアポトーシス細胞調製物と同じまたは同等のアポトーシスプロファイル、すなわち安定性および有効性を維持する。
【０３６０】
実施形態によっては、本明細書に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物は最大２４時間安定である。別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は少なくとも２４時間安定である。別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は２４時間を超えて安定である。さらに別の実施形態では、本明細書に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物は最大３６時間安定である。さらに別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は少なくとも３６時間安定である。さらなる実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は３６時間を超えて安定である。別の実施形態では、本明細書に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物は最大４８時間安定である。別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は少なくとも４８時間安定である。別の実施形態では、プールされた単核アポトーシス細胞調製物は４８時間を超えて安定である。
【０３６１】
実施形態によっては、照射工程を含むプール細胞調製物を生成する方法は、単一適合ドナーに由来するアポトーシス調製物であって、細胞調製が照射工程を含まなくてもよいアポトーシス調製物において観察される初期アポトーシス特性、免疫調節特性、および安定性特性を保存する。別の実施形態では、本明細書に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）応答を誘発しない。
【０３６２】
細胞調製物の照射は、当技術分野では安全であると考えられている。照射手順は現在献血液に対して常法で実施され、ＷＢＣに対する反応を予防している。
【０３６３】
別の実施形態では、本明細書に開示されるプールされた単核アポトーシス細胞調製物中のアポトーシス細胞の百分率は１００％に近く、それによって細胞調製物中の非アポトーシス生存細胞の分率を減少させる。実施形態によっては、アポトーシス細胞の百分率は少なくとも４０％である。別の実施形態では、アポトーシス細胞の百分率は少なくとも５０％である。さらに別の実施形態では、アポトーシス細胞の百分率は少なくとも６０％である。さらに別の実施形態では、アポトーシス細胞の百分率は少なくとも７０％である。さらなる実施形態では、アポトーシス細胞の百分率は少なくとも８０％である。別の実施形態では、アポトーシス細胞の百分率は少なくとも９０％である。さらに別の実施形態では、アポトーシス細胞の百分率は少なくとも９９％である。したがって、非アポトーシス生存細胞が減少したかまたは存在しない部分を含む細胞調製物は、一実施形態ではレシピエントにおいてＧＶＨＤを誘発しないプールされた単核アポトーシス細胞調製物を提供することができる。各可能性は本明細書に開示される実施形態となる。
【０３６４】
あるいは、別の実施形態では、非アポトーシス生存ＷＢＣの割合は、生存細胞集団を特異的に除去することによって、例えば標的化された沈殿によって低下する。別の実施形態では、非アポトーシス生存細胞の百分率を、ホスファチジルセリンに結合する磁気ビーズを使用して下げてもよい。別の実施形態では、非アポトーシス生存細胞の百分率を、アポトーシス細胞ではなく非アポトーシス細胞の細胞表面のマーカーを結合させる磁気ビーズを使用して下げてもよい。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、非アポトーシス細胞ではなくアポトーシス細胞の細胞表面のマーカーに結合する磁気ビーズを使用して、さらなる調製のために選択してもよい。さらに別の実施形態では、非アポトーシス生存ＷＢＣの割合は、超音波の使用によって低下する。
【０３６５】
一実施形態では、アポトーシス細胞はプールされた第三者ドナーからのものである。
【０３６６】
実施形態によっては、プール細胞調製物は、リンパ球、単球、およびナチュラルキラー細胞からなる群から選択される少なくとも１つの細胞型を含む。別の実施形態では、プール細胞調製物は、単核細胞の富化集団を含む。実施形態によっては、プールされた単核は、リンパ球、単球、およびナチュラルキラー細胞からなる群から選択される細胞型を含む単核富化細胞調製物である。別の実施形態では、単核富化細胞調製物は、１５％以下、あるいは１０％以下、典型的には５％以下の、顆粒球（すなわち、好中球、好塩基球、および好酸球）としても公知の多形核白血球を含む。別の実施形態では、プールされた単核細胞調製物は顆粒球を含まない。
【０３６７】
別の実施形態では、プールされた単核富化細胞調製物は、１５％以下、あるいは１０％以下、典型的には５％以下のＣＤ１５ｈｉｇｈ発現細胞を含む。実施形態によっては、プールされたアポトーシス細胞調製物は１５％未満のＣＤ１５ｈｉｇｈ発現細胞を含む。
【０３６８】
実施形態によっては、本明細書に開示されるプールされた単核富化細胞調製物は、少なくとも８０％の単核細胞、少なくとも８５％の単核細胞、あるいは少なくとも９０％の単核細胞、または少なくとも９５％の単核細胞を含み、各可能性は本明細書に開示される別個の実施形態である。一部の実施形態によれば、本明細書に開示されるプールされた単核富化細胞調製物は少なくとも８５％の単核細胞を含む。
【０３６９】
別の実施形態では、単核細胞の最終プール百分率が少なくとも８０％である任意のプール細胞調製物は、本明細書に開示されるプールされた単核富化細胞調製物であると見なされる。したがって、多形核細胞（ＰＭＮ）を増加させた細胞調製物を、高単核細胞を有する細胞調製物と共にプールした結果得られる、少なくとも８０％の単核細胞を有する「プール」は、本明細書に開示される調製物を含む。一部の実施形態によれば、単核細胞はリンパ球および単球を含む。
【０３７０】
当業者であれば、「単核細胞」という用語が、分葉していない核（ｏｎｅ  ｌｏｂｅｄ  ｎｕｃｌｅｕｓ）を有する白血球を包含してもよいということを理解するだろう。別の実施形態では、本明細書に開示されるプールされたアポトーシス細胞調製物は、５％未満の多形核白血球を含む。
【０３７１】
実施形態によっては、アポトーシス細胞はＴ細胞である。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞と同じプールされた第三者ドナーＴ細胞に由来する。別の実施形態では、アポトーシス細胞はＣＡＲ−Ｔ細胞集団に由来する。
【０３７２】
意外にも、アポトーシス細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の効力が維持されていた間、サイトカイン急増に関連するサイトカイン（ＩＬ−６およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）（単独または組み合わせ）を含むがこれらに限定されない）の産生を低下させる（実施例２）。一実施形態では、アポトーシス細胞はマクロファージのサイトカイン発現レベルに影響を及ぼす。別の実施形態では、アポトーシス細胞はマクロファージのサイトカイン発現レベルを低下させる。一実施形態では、アポトーシス細胞はマクロファージのサイトカイン発現レベルを抑制する。一実施形態では、アポトーシス細胞はマクロファージのサイトカイン発現レベルを阻害する。一実施形態では、アポトーシス細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞投与前に存在する濃度に一致またはほぼ一致するＩＦＮ−γ濃度を維持する。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、マクロファージのサイトカイン発現レベルには影響を及ぼすが、ＣＡＲ−Ｔ細胞のサイトカイン発現レベルには影響を及ぼさない。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、ＤＣのサイトカイン発現レベルには影響を及ぼすが、ＣＡＲ−Ｔ細胞のサイトカイン発現レベルには影響を及ぼさない。したがって、アポトーシス細胞がＣＡＲ−Ｔ細胞療法の効力を維持するのに有用ということは予期せぬことであった。
【０３７３】
別の実施形態では、マクロファージ、ＤＣ、またはそれらの組み合わせのサイトカイン発現レベルに対するアポトーシス細胞の効果は、結果としてＣＲＳを軽減する。別の実施形態では、マクロファージ、ＤＣ、またはそれらの組み合わせのサイトカイン発現レベルに対するアポトーシス細胞の効果は、結果として重度のＣＲＳを軽減する。別の実施形態では、マクロファージ、ＤＣ、またはそれらの組み合わせのサイトカイン発現レベルに対するアポトーシス細胞の効果は、結果としてＣＲＳを抑制する。別の実施形態では、マクロファージ、ＤＣ、またはそれらの組み合わせのサイトカイン発現レベルに対するアポトーシス細胞の効果は、結果として重度のＣＲＳを抑制する。別の実施形態では、マクロファージ、ＤＣ、またはそれらの組み合わせのサイトカイン発現レベルに対するアポトーシス細胞の効果は、結果としてＣＲＳを阻害する。別の実施形態では、マクロファージ、ＤＣ、またはそれらの組み合わせのサイトカイン発現レベルに対するアポトーシス細胞の効果は、結果として重度のＣＲＳを阻害する。別の実施形態では、マクロファージ、ＤＣ、またはそれらの組み合わせのサイトカイン発現レベルに対するアポトーシス細胞の効果は、結果としてＣＲＳを予防する。別の実施形態では、マクロファージ、ＤＣ、またはそれらの組み合わせのサイトカイン発現レベルに対するアポトーシス細胞の効果は、結果として重度のＣＲＳを予防する。
【０３７４】
別の実施形態では、アポトーシス細胞はＴ細胞の死を惹起するが、サイトカイン発現レベルの変化を介さない。
【０３７５】
別の実施形態では、アポトーシス細胞はサイトカインを分泌するマクロファージおよび樹状細胞の初回刺激を弱める（そうなければマクロファージおよび樹状細胞はサイトカイン急増を加速させる）。別の実施形態では、アポトーシス細胞は、炎症応答を抑制するおよび／またはサイトカインの過剰な放出を予防するＴｒｅｇを増加させる。
【０３７６】
実施形態によっては、アポトーシス細胞の投与は、１種または複数種の炎症誘発性サイトカインを阻害する。実施形態によっては、炎症誘発性サイトカインは、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、もしくはＩＦＮ−γ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞の投与は、１種または複数種の抗炎症性サイトカインの分泌を促進する。実施形態によっては、抗炎症性サイトカインは、ＴＧＦ−β、ＩＬ１０、もしくはＰＧＥ２、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０３７７】
別の実施形態では、アポトーシス細胞の投与は、ＴＬＲリガンドへの曝露後の樹状細胞成熟を阻害する。別の実施形態では、アポトーシス細胞の投与により、潜在的に寛容原性の樹状細胞が創られ、樹状細胞は実施形態によっては遊走することができ、実施形態によっては遊走はＣＣＲ７によるものである。別の実施形態では、アポトーシス細胞の投与は、様々なシグナル伝達事象を誘発し、これは、一実施形態ではＴＡＭ受容体シグナル伝達（Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、およびＭｅｒ）であり、このＴＡＭ受容体シグナル伝達は、実施形態によっては抗原提示細胞の炎症を阻害する。
【０３７８】
実施形態によっては、Ｔｙｒｏ−３、Ａｘｌ、およびＭｅｒは、キナーゼドメインおよび接着分子様細胞外ドメイン内の保存配列を特徴とする受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のＴＡＭファミリーを構成する。別の実施形態では、アポトーシス細胞の投与は、ＭｅｒＴＫを介してシグナル伝達を活性化する。別の実施形態では、アポトーシス細胞の投与は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／ＡＫＴ経路を活性化し、実施形態によってはＮＦ−κＢを負に制御する。別の実施形態では、アポトーシス細胞の投与はインフラマソームを負に制御し、一実施形態では炎症誘発性サイトカイン分泌、ＤＣ成熟、またはそれらの組み合わせを阻害する。別の実施形態では、アポトーシス細胞の投与は、Ｎｒ４ａ、Ｔｈｂｓ１、またはそれらの組み合わせ等の抗炎症性遺伝子の発現を上方制御する。別の実施形態では、アポトーシス細胞の投与は、高濃度のＡＭＰを誘導し、これは、実施形態によってはパネキシン１依存的に蓄積される。別の実施形態では、アポトーシス細胞の投与は炎症を抑制する。
【０３７９】
実施形態によっては、本明細書に記載される初期アポトーシス細胞の使用方法には、抗体と組み合わせた初期アポトーシス細胞またはその組成物の使用が含まれる。実施形態によっては、抗体は腫瘍細胞抗原に対するものである。別の実施形態では、抗体はＣＤ２０に対するものである。別の実施形態では、抗体はリツキシマブ（Ｒｔｘ）である。
【０３８０】
実施形態によっては、初期アポトーシス細胞と抗体は同じ組成物中に含まれる。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞と抗体は異なる組成物中に含まれる。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞と抗体との組み合わせ、またはそれらの組成物の投与は同時である。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞と抗体との組み合わせ、またはそれらの組成物の投与は、抗体の投与前のアポトーシス細胞またはその組成物の投与を含む。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞と抗体との組み合わせ、またはそれらの組成物の投与は、抗体の投与後のアポトーシス細胞またはその組成物の投与を含む。
【０３８１】
別の実施形態では、抗体はヒト化ＩｇＧ１であるトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）であり、これはＥＲＢＢ２に対するものである。別の実施形態では、抗体はヒト化ＩｇＧ１であるベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）であり、これはＶＥＧＦに対するものである。別の実施形態では、抗体は、キメラヒト−マウスＩｇＧ１であるセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）であり、これはＥＧＦＲに対するものである。別の実施形態では、抗体はヒトＩｇＧ２であるパニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ；Ａｍｇｅｎ）であり、これはＥＧＦＲに対するものである。別の実施形態では、抗体はＩｇＧ１であるイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）であり、これはＣＴＬＡ４に対するものである。
【０３８２】
別の実施形態では、抗体はヒト化ＩｇＧ１であるアレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ；Ｇｅｎｚｙｍｅ）であり、これはＣＤ５２に対するものである。別の実施形態では、抗体はヒトＩｇＧ１であるオファツムマブ（Ａｒｚｅｒｒａ；Ｇｅｎｍａｂ）であり、これはＣＤ２０に対するものである。別の実施形態では、抗体はヒト化ＩｇＧ４であるゲムツズマブオゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ；Ｗｙｅｔｈ）であり、これはＣＤ３３に対するものである。別の実施形態では、抗体はキメラＩｇＧ１であるブレンツキシマブベドチン（Ａｄｃｅｔｒｉｓ；Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）であり、これはＣＤ３０に対するものである。別の実施形態では、抗体はマウスＩｇＧ１である９０Ｙ標識イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ；ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）であり、これはＣＤ２０に対するものである。別の実施形態では、抗体はマウスＩｇＧ２である１３１Ｉ標識トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）であり、これはＣＤ２０に対するものである。
【０３８３】
別の実施形態では、抗体はラムシルマブであり、これは血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ−２）に対するものである。別の実施形態では、抗体は、ラムシルマブ（Ｃｙｒａｍｚａ注射剤、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ブリナツモマブ（ＢＬＩＮＣＹＴＯ、Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．）、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ  ＆  Ｄｏｈｍｅ  Ｃｏｒｐ．）、オビヌツズマブ（ＧＡＺＹＶＡ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．；旧名はＧＡ１０１）、ペルツズマブ注射剤（ＰＥＲＪＥＴＡ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、またはデノスマブ（Ｘｇｅｖａ、Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．）である。別の実施形態では、抗体はバシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）である。別の実施形態では、抗体はダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ；Ｒｏｃｈｅ）である。
【０３８４】
別の実施形態では、アポトーシス細胞と組み合わせて投与される抗体は、本明細書に記載されるおよび／または当技術分野で公知の腫瘍もしくは癌抗原またはそれらの断片を対象とする。別の実施形態では、抗体は腫瘍関連抗原を対象とする。別の実施形態では、抗体は、血管新生因子である腫瘍関連抗原またはその断片を対象とする。
【０３８５】
実施形態によっては、本明細書に記載される抗体は、本明細書に記載される組成物、例えば、限定されないが、初期アポトーシス細胞を含む組成物と組み合わせて使用してもよい。
【０３８６】
アポトーシス細胞上清（ＡｐｏＳｕｐおよびＡｐｏＳｕｐ  Ｍｏｎ）
実施形態によっては、本明細書に開示される方法および治療に使用するための組成物は、本明細書に開示されるアポトーシス細胞上清を含む。
【０３８７】
実施形態によっては、アポトーシス細胞上清は、ａ）アポトーシス細胞を用意する工程、ｂ）工程ａ）のアポトーシス細胞を培養する工程、およびｃ）細胞から上清を分離する工程を含む方法によって得られる。
【０３８８】
実施形態によっては、本明細書に開示されるアポトーシス細胞上清を生成するのに使用するためのアポトーシス細胞は、療法を受ける被験体に対して自家である。別の実施形態では、本明細書に開示されるアポトーシス細胞上清を生成するのに使用するためのアポトーシス細胞は、療法を受ける被験体に対して同種異系である。
【０３８９】
アポトーシス細胞上清を得るための「アポトーシス細胞」は、当業者に公知のアポトーシスを誘導する方法に供される被験体の任意の細胞型、または任意の市販の細胞株から選択される細胞であってもよい。アポトーシスを誘導する方法は、低酸素、オゾン、熱、放射、化学物質、浸透圧、ｐＨシフト、Ｘ線照射、γ線照射、紫外線照射、血清除去、コルチコイド、もしくはそれらの組み合わせ、または本明細書に記載されるもしくは当技術分野で公知の任意の他の方法であってもよい。別の実施形態では、アポトーシスを誘導する方法は、初期アポトーシス状態のアポトーシス細胞を生成する。
【０３９０】
実施形態によっては、アポトーシス細胞は白血球である。
【０３９１】
ある実施形態では、前記アポトーシス白血球は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する。別の実施形態では、前記白血球はプールされた第三者ドナーからのものである。別の実施形態では、前記白血球は同種異系である。
【０３９２】
一部の実施形態によれば、アポトーシス細胞は、非接着白血球を選択し、それらに対しアポトーシス誘導とそれに続く培養培地での細胞培養工程とを行うことによって得られる。アポトーシス細胞−食細胞上清を生成するために使用される「白血球」は、樹状細胞、マクロファージ、肥満細胞（ｍａｓＴ−ｃｅｌｌ）、好塩基球、造血幹細胞、骨髄細胞、およびナチュラルキラー細胞等を含むがこれらに限定されない、免疫系および／または造血系の有核細胞の任意の系統または亜系統に由来することができる。白血球は、用途および目的、所望の白血球系統等に応じて、一般に実施されている様々な方法のいずれかに従った様々な好適な解剖学的区画のいずれに由来するものであっても、その区画のいずれかから様々な好適な手段のいずれかで得られたものであってもよい。実施形態によっては、原料白血球は初代白血球である。別の実施形態では、原料白血球は初代末梢血白血球である。
【０３９３】
初代リンパ球および単球は、好都合には末梢血に由来してもよい。末梢血白血球は７０〜９５パーセントのリンパ球と５〜２５パーセントの単球を含む。
【０３９４】
血液から原料白血球の特定の型を得る方法は慣例的に実施される。原料リンパ球および／または単球を得ることは、例えば、ヘパリンまたはクエン酸等の抗凝固薬の存在下で血液を収集することによって達成することができる。収集された血液は、次いでＦｉｃｏｌｌクッション上で遠心分離され、それにより勾配界面のリンパ球および単球、ならびにペレット中の好中球および赤血球を単離する。
【０３９５】
白血球は、特異的表面マーカーに従った標準的な免疫磁気選択もしくは免疫蛍光フローサイトメトリー技法を介して、または遠心溶出を介して互いに分離することができる。例えば、単球はＣＤ１４＋分画として選択することができ、Ｔリンパ球はＣＤ３＋分画として選択することができ、Ｂリンパ球はＣＤ１９＋分画として、マクロファージはＣＤ２０６＋分画として選択することができる。
【０３９６】
リンパ球および単球は、基質接着条件に供することによって、例えば組織培養処理培養レシピエントでの静置培養によって互いに単離することができ、その結果、リンパ球ではなく単球の、細胞接着基質への選択的接着が生じる。
【０３９７】
白血球は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得ることもでき、このＰＢＭＣは本明細書に記載されるように単離することができる。
【０３９８】
当業者は初代白血球を好適に培養して本明細書に開示される所望の量の培養原料白血球を発生させるのに必要な専門的知識を有し、またそのような培養方法を実施するための十分な手引きは当技術分野の文献において利用可能である。
【０３９９】
当業者はまた、アポトーシス白血球が由来する好適な樹立白血球細胞株を樹立させる、購入する、またはそうでなければ得るのに必要な専門的知識を有している。好適な白血球細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）等の商業的供給業者から得ることができる。原料白血球は、そのアポトーシス白血球を生成する能力に著しく干渉し得る技法を介して得るべきではないということは当業者には明白だろう。
【０４００】
別の実施形態では、アポトーシス細胞はアポトーシスリンパ球であってもよい。リンパ球、例えば初代リンパ球のアポトーシスは、初代リンパ球を血清除去、コルチコステロイド、または照射で処理することで誘導してもよい。別の実施形態では、コルチコステロイドによる処理を介する初代リンパ球のアポトーシスの誘導は、初代リンパ球をデキサメタゾンで処理することで達成される。別の実施形態では、約１マイクロモルの濃度のデキサメタゾンで誘導される。別の実施形態では、照射を介する初代リンパ球のアポトーシスの誘導は、初代リンパ球をγ線照射で処理することで達成される。別の実施形態では、約６６ラドの線量で誘導される。そのような処理の結果として、食細胞との共培養工程に好適なアポトーシスリンパ球が発生する。
【０４０１】
さらなる実施形態では、アポトーシス細胞は初代単球等のアポトーシス単球であってもよい。アポトーシス単球を発生させるために、単球は、血清除去条件下での基質／表面接着というインビトロ条件に供される。そのような処理の結果として、食細胞との共培養工程に好適な非炎症誘発性アポトーシス単球が発生する。
【０４０２】
他の実施形態では、アポトーシス細胞は、同種異系アポトーシス細胞、第三者アポトーシス細胞、およびアポトーシス細胞のプール等の本明細書に記載される任意のアポトーシス細胞であってもよい。
【０４０３】
他の実施形態では、アポトーシス細胞上清は、アポトーシス細胞と他の細胞との共培養により得てもよい。
【０４０４】
したがって、実施形態によっては、アポトーシス細胞上清は、ａ）アポトーシス細胞を用意する工程、ｂ）他の細胞を用意する工程、ｃ）必要に応じて工程ａ）およびｂ）からの細胞を洗浄する工程、ｄ）工程ａ）およびｂ）の細胞を共培養する工程、ならびに必要に応じてｅ）細胞から上清を分離する工程を含む方法によって得られるアポトーシス細胞上清である。
【０４０５】
実施形態によっては、アポトーシス細胞と共培養される他の細胞は白血球細胞である。
【０４０６】
したがって、実施形態によっては、アポトーシス細胞上清は、ａ）アポトーシス細胞を用意する工程、ｂ）白血球細胞を用意する工程、ｃ）必要に応じて工程ａ）およびｂ）からの細胞を洗浄する工程、ｄ）工程ａ）およびｂ）の細胞を共培養する工程、ならびに必要に応じてｅ）細胞から上清を分離する工程を含む方法によって得られるアポトーシス細胞−白血球細胞上清である。
【０４０７】
実施形態によっては、白血球細胞は、マクロファージ、単球、または樹状細胞等の食細胞であってもよい。
【０４０８】
実施形態によっては、白血球細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であってもよい。
【０４０９】
したがって、実施形態によっては、本明細書に開示される方法および治療に使用するための組成物は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４／１０６６６６号に記載されるアポトーシス細胞−食細胞上清を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法に使用するためのアポトーシス細胞−食細胞上清は、当技術分野で公知の任意の手段で生成される。
【０４１０】
実施形態によっては、アポトーシス細胞−食細胞上清は、食細胞とアポトーシス細胞との共培養から得られる。
【０４１１】
実施形態によっては、アポトーシス細胞−食細胞上清は、ａ）食細胞を用意する工程、ｂ）アポトーシス細胞を用意する工程、ｃ）必要に応じて工程ａ）およびｂ）からの細胞を洗浄する工程、ｄ）工程ａ）およびｂ）の細胞を共培養する工程、ならびに必要に応じてｅ）細胞から上清を分離する工程を含む方法によって得られる。
【０４１２】
「食細胞」という用語は、有害な外来粒子、細菌、および死細胞または瀕死の細胞を摂取（貪食）することによって身体を保護する細胞を表す。食細胞としては、例えば、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、およびマストＴ細胞と称される細胞、優先的には樹状細胞および単球／マクロファージが挙げられる。食細胞は、樹状細胞（ＣＤ４＋ＨＬＡ−ＤＲ＋系統ＢＤＣＡ１／ＢＤＣＡ３＋）、マクロファージ（ＣＤ１４＋ＣＤ２０６＋ＨＬＡ−ＤＲ＋）であってもよく、単球（ＣＤ１４＋）に由来してもよい。これらの異なる食細胞を区別する技法は当業者に公知である。
【０４１３】
ある実施形態では、単球はプラスチック接着工程によって得られる。望まないＢ細胞はＣＤ１９＋を発現し、Ｔ細胞はＣＤ３＋を発現するため、前記単球は、マーカーであるＣＤ１４＋によりＢおよびＴ細胞と区別することができる。マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）が成熟を誘導した後では、得られたマクロファージは、実施形態によっては、マーカーであるＣＤ１４＋、ＣＤ２０６＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋に対して陽性である。
【０４１４】
ある実施形態では、前記食細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来する。
【０４１５】
食細胞は、食細胞を得るための当技術分野で公知の任意の方法によって提供されてもよい。実施形態によっては、マクロファージまたは樹状細胞等の食細胞は、被験体から直接単離することも、成熟工程によって前駆細胞から導くこともできる。
【０４１６】
実施形態によっては、マクロファージは、被験体の腹膜腔から直接単離し、完全ＲＰＭＩ培地で培養してもよい。マクロファージは脾臓から単離することもできる。
【０４１７】
食細胞は末梢血単球からも取得可能である。前記例では、培養された場合の単球は、限定されないが、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を細胞培養培地へ添加すると単球由来マクロファージに分化する。
【０４１８】
例えば、食細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に由来してもよい。例えば、ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離により個体からの血球除去バッグから単離され、細胞接着工程において９０分間、完全ＲＰＭＩ培養培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）で播種（プレート）されてもよい。非接着Ｔ細胞はプラスチック接着工程で除去され、接着Ｔ細胞は組換えヒトＭ−ＣＳＦを補充した完全ＲＰＭＩ環境で培養される。培養期間後、単球由来マクロファージが得られる。
【０４１９】
食細胞は細胞接着工程によって選択することができる。前記「細胞接着工程」とは、表面、すなわち細胞接着表面（例えば組織培養皿、マトリックス、適切な種類のナイロンまたはプラスチックの袋またはバッグ）への培養細胞の接着が可能となる培養条件を介して食細胞または食細胞に成熟することができる細胞が選択されることを意味する。当業者であれば、「細胞接着表面」という用語が、親水性および負に帯電したものを包含してもよく、当技術分野で公知の様々な手段のいずれかで、別の実施形態では、例えばコロナ放電またはガスプラズマを使用してポリスチレン表面を改質することによって得てもよいということを理解するだろう。これらの過程は、表面が親水性となり負に帯電するように、表面ポリスチレン鎖にグラフトする極めて活発な酸素イオンを発生させる。そこへの細胞接着を容易にするために設計された培養レシピエントは様々な商業的供給業者（例えばＣｏｒｎｉｎｇ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｕｎｃ等）から入手可能である。
【０４２０】
Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞は、そのような細胞を得るための当技術分野で公知の任意の方法によって提供されてもよい。実施形態によっては、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞は、被験体から直接単離することも、成熟工程によって前駆細胞から導くこともできる。別の実施形態では、Ｂ、Ｔ、またはＮＫ細胞は、Ｂ、Ｔ、またはＮＫ細胞株からのものであってもよい。当業者は、好適な樹立Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞株を樹立させる、購入する、または別の方法で得るのに必要な専門的知識を有している。好適な細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）等の商業的供給業者から得ることができる。
【０４２１】
ある実施形態では、前記アポトーシス細胞、および前記白血球細胞、例えば食細胞、Ｂ、ＴまたはＮＫ細胞は、共培養工程ｄ）前に個々に培養される。
【０４２２】
食細胞の細胞成熟は、例えば培地への成熟因子の添加に起因して、細胞培養中に生じる。一実施形態では、前記成熟因子はＭ−ＣＳＦであり、これは、例えば単球由来マクロファージを得るために使用されてもよい。
【０４２３】
食細胞の成熟または選択のために使用される培養工程には数時間から数日かかってもよい。別の実施形態では、前記成熟前食細胞は、適切な培養培地で２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８時間培養される。
【０４２４】
食細胞のための培養培地は当業者に公知であり、例えば、限定されないが、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、Ｘ−ｖｉｖｏ、およびＵｌｔｒａｃｕｌｔｕｒｅ環境であってもよい。
【０４２５】
ある実施形態では、アポトーシス細胞と食細胞との共培養は生理的溶液で行われる。
【０４２６】
この「共培養」前に、細胞に対し洗浄工程を行ってもよい。実施形態によっては、白血球細胞（例えば食細胞）およびアポトーシス細胞は、共培養工程前に洗浄される。別の実施形態では、細胞はＰＢＳで洗浄される。
【０４２７】
前記共培養中、白血球細胞（例えばマクロファージ、単球、もしくは食細胞等の食細胞、またはＢ、Ｔ、もしくはＮＫ細胞）とアポトーシス細胞は、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、もしくは１：１の比で、または（白血球細胞：アポトーシス細胞が）１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、もしくは１：１０の比で混合されてもよい。一例では、白血球細胞とアポトーシス細胞の比は１：５である。
【０４２８】
細胞の共培養は数時間から数日であってもよい。実施形態によっては、前記アポトーシス細胞は、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２時間培養される。当業者は、抗炎症性化合物の存在、白血球細胞の生存量、およびそれまでに排除されていないアポトーシス細胞の量を測定することによって共培養の最適な時間を評価することができる。食細胞によるアポトーシス細胞の排除は、アポトーシス細胞が消滅するため、光学顕微鏡で観察可能である。
【０４２９】
実施形態によっては、アポトーシス細胞の培養、例えば白血球細胞（例えばマクロファージ、単球、もしくは食細胞等の食細胞、またはＢ、Ｔ、もしくはＮＫ細胞）との培養を伴う共培養は、培養培地で、および／または投与、例えば被験体への注射と適合性の生理的溶液で行われる。
【０４３０】
当業者であれば、「生理的溶液」が培養時間内に白血球細胞の死を引き起こさない溶液を包含してもよいということを理解するだろう。実施形態によっては、生理的溶液は、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２時間超、死を引き起こさない。他の実施形態では、４８時間または３０時間引き起こさない。
【０４３１】
実施形態によっては、白血球細胞（例えばマクロファージ、単球、もしくは食細胞等の食細胞、またはＢ、Ｔ、もしくはＮＫ細胞）およびアポトーシス細胞は、生理的溶液で少なくとも３０分間インキュベートされる。この培養時間により、貪食が開始され、サイトカインおよび他の有益な物質が分泌される。
【０４３２】
ある実施形態では、そのような生理的溶液は白血球由来マクロファージによるアポトーシス白血球排除を阻害しない。
【０４３３】
培養または共培養工程の終了時、上清は培養されたアポトーシス細胞または共培養された細胞から必要に応じて分離される。細胞から上清を分離する技法は当技術分野で公知である。例えば、上清を採取および／またはろ過および／または遠心分離して、細胞および残骸を排除することができる。例えば、前記上清は、３０００ｒｐｍで１５分間、室温で遠心分離して細胞から分離してもよい。
【０４３４】
上清は使用前に、例えば照射によって「不活性化」されてもよい。したがって、アポトーシス細胞上清を調製する方法は、任意選択の追加の照射工程ｆ）を含んでもよい。前記「照射」工程は、血液生成物を不活性化するために慣例的に実施されているような、微生物を死滅させるのに十分な速度のＸ線照射（２５〜４５Ｇｙ）を使用する殺菌方法と見なすことができる。
【０４３５】
上清の照射は、当技術分野では安全であると考えられている。照射手順は現在献血液に対して常法で実施され、ＷＢＣに対する反応を予防している。
【０４３６】
ある実施形態では、アポトーシス細胞上清は、本明細書に詳細に記載されるように、被験体への投与に好適な医薬組成物に製剤化される。
【０４３７】
実施形態によっては、最終生成物は＋４℃で保管される。別の実施形態では、最終生成物は、その後４８時間以内に使用されるためのものである。
【０４３８】
実施形態によっては、アポトーシス細胞−食細胞上清等のアポトーシス細胞上清、または上清を含む医薬組成物は、例えば−８０℃での保管のために凍結乾燥させてもよい。
【０４３９】
特定の一実施形態では、国際公開第２０１４／１０６６６６号の実施例１に記載されているように、アポトーシス細胞−食細胞上清は、胸腺細胞をアポトーシス細胞として用いて作製されてもよい。単離した胸腺細胞を照射（例えば３５グレイのＸ線照射）し、完全ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で例えば６時間培養し、アポトーシスを起こさせる。並行して、マクロファージを腹腔から単離し、洗浄して完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ、ペニ−ストレプト、ＥＡＡ、ヘペス、ＮａＰ、および２−メルカプトエタノール）で培養する。次いでマクロファージおよびアポトーシス細胞を洗浄し、フェノールを含まないＸ−ｖｉｖｏ培地で１：５のマクロファージ：アポトーシス細胞比でさらに４８時間、共培養する。次いで上清を回収し、遠心分離して細片を除去する。保存のために凍結または凍結乾燥させてもよい。ＦＡＣＳによってＦ４／８０での陽性染色を利用してマクロファージの濃縮を確認してもよい。ＦＡＣＳによってアネキシンＶでの陽性染色および７−ＡＡＤによる除去を利用してアポトーシスを確認してもよい。
【０４４０】
一実施形態では、アポトーシス細胞上清は、別個に培養されたマクロファージまたはアポトーシス細胞から得られた上清に比べて、活性状態および潜在状態のＴＧＦβのいずれにおいてもＴＧＦβ量が豊富である。一実施形態では、ＩＬ−１０量も単独で培養したマクロファージに比べて増加し、単独で培養したアポトーシス細胞に比べると劇的に増加する。別の実施形態では、ＩＬ−６などの炎症性サイトカインは検出されず、ＩＬ−１βおよびＴＮＦは全く検出されないかごくわずかにしか検出されない。
【０４４１】
一実施形態では、アポトーシス細胞上清は、単独で培養したマクロファージまたは単独で培養したアポトーシス細胞からの上清と比べると、ＩＬ−１ｒａ、ＴＩＭＰ−１、ＣＸＣＬ１／ＫＣ、およびＣＣＬ２／ＪＥ／ＭＣＰ１の量が多い。これらは、ＴＧＦβおよびＩＬ−１０に加えて、炎症を制御するための上清の免疫寛容誘発の役割に関与する可能性がある。
【０４４２】
別の特定の実施形態では、国際公開第２０１４／１０６６６６号の実施例３に記載されているように、ヒトアポトーシス細胞−食細胞上清は、末梢血単球核（ＰＢＭＣ）由来のマクロファージをアポトーシスＰＢＭＣと共に培養した共培養物から作製されてもよい。例えば、ＰＢＭＣを例えばフィコール勾配遠心分離によって健常者からの細胞吸着袋から単離する。次にＰＢＭＣを完全ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）で９０分間プレート培養する。次いで非接着Ｔ細胞を除去し、例えば３５Ｇｙの線量のＸ線照射によってアポトーシス細胞にし、完全ＲＰＭＩ環境で４日間培養する（培養して最初の４８時間後の細胞洗浄を含む）ことによってアポトーシスを起こす。並行して、接着したＴ細胞を、５０μｇ／ｍＬの組み換えヒトＭ−ＣＳＦを添加した完全ＲＰＭＩ環境で４日間培養する（最初の４８時間後の細胞洗浄を含む）。４日間の培養期間が終了すると、単球由来のマクロファージおよびアポトーシス細胞を洗浄し、Ｘ−ｖｉｖｏ培地で、１：５のマクロファージ：アポトーシス細胞比でさらに４８時間、共に培養する。次に、前述の培養液からの上清を回収し、遠心分離して細胞および細片を除去する。保存して後に使用するため、凍結または凍結乾燥してもよい。
【０４４３】
一実施形態では、国際公開第２０１４／１０６６６６号に記載されているように、ヒトアポトーシス細胞−食細胞上清は、６日以内に末梢血単球（ＰＢＭＣ）から得られてもよい。Ｍ−ＣＳＦを培養物に添加することによってＰＢＭＣ由来のマクロファージを得るための４日間と、ＰＢＭＣ由来のマクロファージをアポトーシス細胞（０日目に単離した非接着ＰＢＭＣに対応する）と共培養するための残り２日間である。
【０４４４】
一実施形態では、国際公開第２０１４／１０６６６６号に記載されているように、規格化されたヒトアポトーシス細胞−食細胞上清はＰＢＭＣの提供者または由来源（細胞吸着または軟膜）とは独立して得られてもよい。濃縮単球の有意な開始集団（プラスチック培養皿への接着後、２０〜９３％のＣＤ１４＋細胞）を得るにはプラスチック接着工程で十分である。また、このような接着Ｔ細胞はＢ細胞およびＴ細胞の存在が非常に少ないことを示す（１．０％のＣＤ１９＋Ｂ細胞、１２．８％のＣＤ３＋Ｔ細胞）。接着Ｔ細胞をＭ−ＣＳＦの存在下で４日間培養した後、単球由来マクロファージの割合は、０．１％からＣＤ１４＋ＣＤ２０６＋ＨＬＡ−ＤＲ＋マクロファージの７７．７％まで有意に増加した。その時点で、単球由来マクロファージを非接着アポトーシスＰＢＭＣ（アネキシンＶ染色および７−ＡＡＤによる除去で示されるように、４７．６％のアポトーシス）と共培養することによってアポトーシス細胞−食細胞上清を４８時間の間に作製してもよい。
【０４４５】
一実施形態では、回収したアポトーシス細胞−食細胞上清は、単球由来マクロファージ単独または炎症性条件（＋ＬＰＳ）で処置した単球由来マクロファージの培養上清よりも有意に多い潜在ＴＧＦを含み、ＩＬ−１βまたはＴＮＦなどの炎症性サイトカインを微量または少量しか含まない。
【０４４６】
実施形態によっては、アポトーシス細胞上清を含む組成物は抗凝固薬をさらに含む。実施形態によっては、この抗凝固薬は、ヘパリン、クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）製剤Ａ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０４４７】
別の実施形態では、抗凝固薬はアポトーシス細胞の製造工程中に添加される。別の実施形態では、添加される抗凝固薬はＡＣＤおよびヘパリン、またはそれらの任意の組み合わせを含む群より選択される。別の実施形態では、ＡＣＤの濃度は１％である。別の実施形態では、ＡＣＤの濃度は２％である。別の実施形態では、ＡＣＤの濃度は３％である。別の実施形態では、ＡＣＤの濃度は４％である。別の実施形態では、ＡＣＤの濃度は５％である。別の実施形態では、ＡＣＤの濃度は６％である。別の実施形態では、ＡＣＤの濃度は７％である。別の実施形態では、ＡＣＤの濃度は８％である。別の実施形態では、ＡＣＤの濃度は９％である。別の実施形態では、ＡＣＤの濃度は１０％である。別の実施形態では、ＡＣＤの濃度は約１〜１０％である。別の実施形態では、ＡＣＤの濃度は約２〜８％である。別の実施形態では、ＡＣＤの濃度は約３〜７％である。別の実施形態では、ＡＣＤの濃度は約１〜５％である。別の実施形態では、ＡＣＤの濃度は約５〜１０％である。別の実施形態では、ヘパリンの最終濃度は０．５Ｕ／ｍｌである。別の実施形態では、ヘパリンの最終濃度は約０．１Ｕ／ｍｌ〜１．０Ｕ／ｍｌである。別の実施形態では、ヘパリンの最終濃度は約０．２Ｕ／ｍｌ〜０．９Ｕ／ｍｌである。別の実施形態では、ヘパリンの最終濃度は約０．３Ｕ／ｍｌ〜０．７Ｕ／ｍｌである。別の実施形態では、ヘパリンの最終濃度は約０．１Ｕ／ｍｌ〜０．５Ｕ／ｍｌである。別の実施形態では、ヘパリンの最終濃度は約０．５Ｕ／ｍｌ〜１．０Ｕ／ｍｌである。別の実施形態では、ヘパリンの最終濃度は約０．０１Ｕ／ｍｌ〜１．０Ｕ／ｍｌである。別の実施形態では、ヘパリンの最終濃度は０．１Ｕ／ｍｌである。別の実施形態では、ヘパリンの最終濃度は０．２Ｕ／ｍｌである。別の実施形態では、ヘパリンの最終濃度は０．３Ｕ／ｍｌである。別の実施形態では、ヘパリンの最終濃度は０．４Ｕ／ｍｌである。別の実施形態では、ヘパリンの最終濃度は０．５Ｕ／ｍｌである。別の実施形態では、ヘパリンの最終濃度は０．６Ｕ／ｍｌである。別の実施形態では、ヘパリンの最終濃度は０．７Ｕ／ｍｌである。別の実施形態では、ヘパリンの最終濃度は０．８Ｕ／ｍｌである。別の実施形態では、ヘパリンの最終濃度は０．９Ｕ／ｍｌである。別の実施形態では、ヘパリンの最終濃度は１．０Ｕ／ｍｌである。別の実施形態では、ＡＣＤの濃度は５％であり、ヘパリンの最終濃度は０．５Ｕ／ｍｌである。
【０４４８】
実施形態によっては、アポトーシス細胞上清を含む組成物はメチルプレドニゾロンをさらに含む。実施形態によっては、メチルプレドニゾロンの濃度は３０μｇ／ｍｌを超えない。
【０４４９】
実施形態によっては、組成物は細胞吸着によって得られた約１４×１０９個のＣＤ４５＋細胞の共培養由来のアポトーシス細胞上清の、体重１キログラム当たり約２００，０００，０００個の細胞（７０ｋｇの被験体の場合）に相当する合計用量または分割量で用いられてもよい。一実施形態では、このような合計用量は、体重１キログラム当たり約１００，０００，０００個の細胞由来の上清の単位用量として投与され、かつ／または１週間の間隔で単位用量として投与され、別の実施形態ではその両方である。この実施形態による適切な合計用量としては、体重１キログラムあたり約１０，０００，０００個〜約４０億個の細胞由来の上清の合計用量が挙げられる。別の実施形態では、上清は体重１キログラムあたり約４０，０００，０００個〜約１０億個の細胞に由来する。さらに別の実施形態では、上清は体重１キログラムあたり約８０，０００，０００個〜約５００，０００，０００個の細胞に由来する。さらに別の実施形態では、上清は体重１キログラムあたり約１６０，０００，０００個〜約２５０，０００，０００個の細胞に由来する。この実施形態による適切な単位用量としては、体重１キログラムあたり約４，０００，０００個〜約４００，０００，０００個の細胞由来の上清の単位用量が挙げられる。別の実施形態では、上清は体重１キログラムあたり約８，０００，０００個〜約２００，０００，０００個の細胞に由来する。別の実施形態では、上清は体重１キログラムあたり約１６，０００，０００個〜約１００，０００，０００個の細胞に由来する。さらに別の実施形態では、上清は体重１キログラムあたり約３２，０００，０００個〜約５０，０００，０００個の細胞に由来する。
【０４５０】
別の実施形態では、約１０×１０６個のアポトーシス細胞の共培養由来するアポトーシス細胞上清の用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０７個のアポトーシス細胞由来の用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０８個のアポトーシス細胞由来の用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０９個のアポトーシス細胞由来の用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０１０個のアポトーシス細胞由来の用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０１１個のアポトーシス細胞由来の用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０１２個のアポトーシス細胞由来の用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０５個のアポトーシス細胞由来の用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０４個のアポトーシス細胞由来の用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０３個のアポトーシス細胞由来の用量が投与される。別の実施形態では、１０×１０２個のアポトーシス細胞由来の用量が投与される。
【０４５１】
実施形態によっては、３５×１０６個のアポトーシス細胞由来のアポトーシス細胞上清の用量が投与される。別の実施形態では、２１０×１０６個のアポトーシス細胞由来の用量が投与される。別の実施形態では、７０×１０６個のアポトーシス細胞由来の用量が投与される。別の実施形態では、１４０×１０６個のアポトーシス細胞由来の用量が投与される。別の実施形態では、３５〜２１０×１０６個のアポトーシス細胞由来の用量が投与される。
【０４５２】
実施形態によっては、アポトーシス細胞上清または前記アポトーシス細胞上清を含む組成物は当技術分野で公知の任意の方法で投与されてもよく、その例としては、本明細書で詳細に記載されるように静脈投与、皮下投与、リンパ節内投与、腫瘍内投与、髄腔内投与、胸膜内投与、腹腔内投与、胸腺への直接投与などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０４５３】
意外にも、アポトーシス細胞−食細胞上清などのアポトーシス細胞上清は、サイトカイン急増に関与するＩＬ−６などのサイトカインの生成を低減する。別のサイトカインＩＬ−２は樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージによって少量で分泌されるが、サイトカイン放出症候群に関与しない。しかし、ＩＬ−２はＣＡＲ−Ｔ細胞の生存と増殖に必要であり、主にこれらのＴ細胞によって生成される。予想外にも、アポトーシス細胞−食細胞上清などのアポトーシス細胞上清は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の生存に悪影響を与えるほどＩＬ−２量を低減しない。
【０４５４】
実施形態によっては、アポトーシス細胞−食細胞上清などのアポトーシス細胞上清はマクロファージおよびＤＣにおけるサイトカイン発現量に影響するが、Ｔ細胞自体のサイトカイン発現量には影響しない。したがって、アポトーシス細胞上清がＣＡＲ−Ｔ細胞療法または樹状細胞療法を強化するのに有用であるとは予想外であった。
【０４５５】
別の実施形態では、アポトーシス細胞上清はＴ細胞の死を誘発するがサイトカイン発現量の変化によってではない。
【０４５６】
別の実施形態では、アポトーシス細胞−食細胞上清などのアポトーシス細胞上清は、本来であればサイトカイン急増を増幅するサイトカインを分泌するマクロファージおよび樹状細胞のプライミングを弱める。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清は、炎症反応を抑制かつ／またはサイトカインの過剰放出を防止するＴｒｅｇを増大する。
【０４５７】
実施形態によっては、アポトーシス細胞−食細胞上清などのアポトーシス細胞上清の投与によって１種以上の炎症誘発性サイトカインが阻害される。実施形態によっては、この炎症誘発性サイトカインはＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、またはＩＦＮγ、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清の投与によって１種以上の抗炎症性サイトカインの分泌が促進される。実施形態によっては、この抗炎症性サイトカインはＴＧＦβ、ＩＬ−１０、またはＰＧＥ２、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０４５８】
別の実施形態では、アポトーシス細胞−食細胞上清などのアポトーシス細胞上清の投与によって、ＴＬＲリガンドへの曝露後の樹状細胞の成熟が阻害される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清の投与によって、潜在的に免疫寛容誘発性の樹状細胞が形成され、この細胞は実施形態によっては移動でき、実施形態によってはこの移動はＣＣＲ７による。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清の投与によって様々なシグナル伝達事象が引き起こされる。これは一実施形態ではＴＡＭ受容体シグナル伝達（Ｔｙｒｏ３、ＡｘｌおよびＭｅｒ）であり、実施形態によっては抗原提示細胞における炎症を阻害する。実施形態によっては、Ｔｙｒｏ−３、Ａｘｌ、およびＭｅｒは、キナーゼドメインおよび接着分子様細胞外ドメイン内の保存配列を特徴とする受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のＴＡＭファミリーを構成する。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清の投与によってＭｅｒＴＫによるシグナル伝達が活性化される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清の投与によって、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／ＡＫＴ経路（実施形態によってはＮＦ−κＢを負に制御する）が活性化される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清の投与によって、インフラマソーム（一実施形態では炎症誘発性サイトカインの分泌の阻害、ＤＣの成熟の阻害、またはそれらの組み合わせを引き起こす）が負に制御される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清の投与によってＮｒ４ａ、Ｔｈｂｓ１、またはそれらの組み合わせなどの抗炎症性遺伝子の発現が増加する。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清の投与によって高濃度のＡＭＰ（実施形態によってはパネキシン１依存的に蓄積される）が誘導される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清の投与によって炎症が抑制される。
【０４５９】
組成物
【０４６０】
本明細書で用いる「組成物」および「医薬組成物」という用語は、実施形態によっては、全く同じ質と意味をもって互換的に用いることができる。実施形態によっては、本明細書に記載の病気または疾患を治療するための医薬組成物が本明細書に開示されている。
【０４６１】
別の実施形態では、本明細書に開示されている医薬組成物は遺伝子改変免疫細胞の増殖率を維持または高くするためのものである。さらなる実施形態では、遺伝子改変免疫細胞の増殖率を維持または高くする方法は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカイン急増の発生の低減または阻害をさらに含む。別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞療法の有効性を上げるための医薬組成物を本明細書に開示する。別の実施形態では、免疫細胞療法の有効性を上げる方法に用いられる組成物は、ＣＲＳまたはサイトカイン急増の発生の低減または阻害をさらに含む。別の実施形態では、被験体のがんもしくは腫瘍の治療、予防、阻害、発生の低減、寛解、または緩和の方法のための組成物を本明細書に開示する。別の実施形態では、被験体のがんもしくは腫瘍の治療、予防、発生の低減、寛解、または緩和の方法に用いられる組成物は、ＣＲＳまたはサイトカイン急増の発生の低減または阻害をさらに含む。
【０４６２】
別の実施形態では、医薬組成物は遺伝子改変免疫細胞またはその遺伝子改変受容体を含む。別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞はＴ細胞を含む。別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞はキメラ抗原受容体ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞はキメラ抗原受容体ＴＣＲ−Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は細胞傷害性Ｔリンパ球を含む。別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は樹状細胞を含む。別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞はナチュラルキラー細胞を含む。別の実施形態では、遺伝子改変受容体は遺伝子改変Ｔ細胞受容体を含む。
【０４６３】
別の実施形態では、医薬組成物は初期アポトーシス細胞集団を含む。別の実施形態では、医薬組成物はアポトーシス上清を含む。
【０４６４】
さらに別の実施形態では、本明細書に記載の病気または疾患を治療するための医薬組成物は、有効量の本明細書に記載の遺伝子改変免疫細胞またはその遺伝子改変受容体を医薬的に許容される賦形剤内に含む。別の実施形態では、本明細書に記載の病気または疾患を治療するための医薬組成物は、有効量の本明細書に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞および医薬的に許容される賦形剤を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の病気または疾患を治療するための医薬組成物は、有効量の本明細書に記載のＴＣＲ−Ｔ細胞および医薬的に許容される賦形剤を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の病気または疾患を治療するための医薬組成物は、有効量の本明細書に記載の細胞傷害性Ｔ細胞および医薬的に許容される賦形剤を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の病気または疾患を治療するための医薬組成物は、有効量の本明細書に記載の遺伝子改変樹状細胞および医薬的に許容される賦形剤を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の病気または疾患を治療するための医薬組成物は、有効量の本明細書に記載の遺伝子改変ナチュラルキラー細胞および医薬的に許容される賦形剤を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の病気または疾患を治療するための医薬組成物は、有効量の本明細書に記載の遺伝子改変Ｔ細胞受容体および医薬的に許容される賦形剤を含む。さらに別の実施形態では、本明細書に記載の病気または疾患を治療するための医薬組成物は、有効量の本明細書に記載の初期アポトーシス細胞集団を医薬的に許容される賦形剤内に含む。さらに別の実施形態では、本明細書に記載の病気または疾患を治療するための医薬組成物は、有効量の本明細書に記載のアポトーシス上清を医薬的に許容される賦形剤内に含む。
【０４６５】
別の実施形態では、本明細書に記載の病気または疾患は腫瘍もしくはがんである。別の実施形態では、本明細書に記載の目的タンパク質またはペプチドに結合する遺伝子改変免疫細胞またはその受容体（例えばＣＡＲ−Ｔ細胞）を含む組成物を本明細書に開示する。別の実施形態では、本明細書に記載の目的タンパク質またはペプチドを認識し結合する遺伝子改変免疫細胞またはその受容体（例えばＴＣＲ−Ｔ細胞）を含む組成物を本明細書に開示する。別の実施形態では、目的タンパク質またはペプチドは腫瘍抗原またはその断片を含む。
【０４６６】
別の実施形態では、本明細書に開示され本明細書に開示の方法に用いられる組成物はアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清、および医薬的に許容される賦形剤を含む。実施形態によっては、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を含む組成物は、本明細書に開示の、例えば被験体のがんもしくは腫瘍の治療、予防、成長の阻害、疾患の進行の遅延、腫瘍量の減少、または発生の低減、あるいはこれらの任意の組み合わせを行う方法に用いられる。
【０４６７】
さらに別の実施形態では、有効量の遺伝子改変免疫細胞またはその遺伝子改変受容体を含む組成物は、アポトーシス細胞集団またはアポトーシス細胞上清を含む組成物と同じ組成物であってもよい。別の実施形態では、有効量のＣＡＲ−Ｔ細胞、またはＴＣＲ−Ｔ細胞、または細胞傷害性Ｔ細胞、または遺伝子改変樹状細胞、または遺伝子改変ナチュラルキラー細胞を含む組成物は、アポトーシス細胞集団またはアポトーシス細胞上清を含む組成物と同じ組成物であってもよい。さらに別の実施形態では、有効量の遺伝子改変Ｔ細胞受容体を含む組成物は、アポトーシス細胞集団またはアポトーシス細胞上清を含む組成物と同じ組成物であってもよい。さらに別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＴＣＲ−Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、または樹状細胞を含む群より選択される有効量の遺伝子改変免疫細胞を含む組成物は、アポトーシス細胞集団またはアポトーシス細胞上清を含む組成物と同じ組成物ではない。別の実施形態では、組成物はキメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清、および医薬的に許容される賦形剤を含む。別の実施形態では、組成物は遺伝子改変Ｔ細胞受容体発現Ｔ細胞（ＴＣＲ−Ｔ細胞）、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清、および医薬的に許容される賦形剤を含む。別の実施形態では、有効量の遺伝子改変Ｔ細胞受容体を含む組成物は、アポトーシス細胞集団またはアポトーシス細胞上清を含む組成物と同じ組成物ではない。
【０４６８】
別の実施形態では、組成物に含まれるアポトーシス細胞は初期アポトーシス状態のアポトーシス細胞を含む。別の実施形態では、組成物に含まれるアポトーシス細胞はプールされた第三者ドナー細胞である。別の実施形態では、本明細書に開示の組成物に含まれるアポトーシス細胞上清は初期アポトーシス細胞から回収される。別の実施形態では、本明細書に開示の組成物に含まれるアポトーシス細胞上清はプールされた第三者ドナー細胞から回収される。
【０４６９】
一実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（例えばＣＡＲ−Ｔ細胞）を含む組成物は、サイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の患者のサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するためのさらなる医薬組成物をさらに含む。別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（例えばＣＡＲ−Ｔ細胞）およびアポトーシス細胞を含む組成物は、サイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の患者のサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するためのさらなる医薬組成物をさらに含む。別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（例えばＣＡＲ−Ｔ細胞）およびアポトーシス細胞上清を含む組成物は、サイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の患者のサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するためのさらなる医薬組成物をさらに含む。
【０４７０】
一実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（例えばＴＣＲ−Ｔ細胞）を含む組成物は、サイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の患者のサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するためのさらなる医薬組成物をさらに含む。別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（例えばＴＣＲ−Ｔ細胞）およびアポトーシス細胞を含む組成物は、サイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の患者のサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するためのさらなる医薬組成物をさらに含む。別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（例えばＴＣＲ−Ｔ細胞）およびアポトーシス細胞上清を含む組成物は、サイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の患者のサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するためのさらなる医薬組成物をさらに含む。
【０４７１】
一実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（例えば樹状細胞）を含む組成物は、サイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の患者のサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するためのさらなる医薬組成物をさらに含む。別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（例えば樹状細胞）およびアポトーシス細胞を含む組成物は、サイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の患者のサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するためのさらなる医薬組成物をさらに含む。別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（例えば樹状細胞）およびアポトーシス細胞上清を含む組成物は、サイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の患者のサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するためのさらなる医薬組成物をさらに含む。
【０４７２】
一実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（例えばＮＫ細胞）を含む組成物は、サイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の患者のサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するためのさらなる医薬組成物をさらに含む。別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（例えばＮＫ細胞）およびアポトーシス細胞を含む組成物は、サイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の患者のサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するためのさらなる医薬組成物をさらに含む。別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（例えばＮＫ細胞）およびアポトーシス細胞上清を含む組成物は、サイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の患者のサイトカイン放出を予防、抑制、または調節するためのさらなる医薬組成物をさらに含む。
【０４７３】
一実施形態では、さらなる医薬組成物はＣＴＬＡ−４遮断薬を含み、一実施形態ではイピリムマブである。別の実施形態では、さらなる医薬組成物は本明細書に開示のα１アンチトリプシン、またはその断片もしくは類似体を含む。別の実施形態では、さらなる医薬組成物は本明細書に開示のテルル系化合物を含む。別の実施形態では、さらなる医薬組成物は本明細書に開示の免疫調節剤を含む。別の実施形態では、さらなる医薬組成物はＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、テルル系化合物、または免疫調節化合物、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０４７４】
一実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（例えばＣＡＲ−Ｔ細胞）を含む組成物と、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清、テルル系化合物、免疫調節剤のうちのいずれか１種を含む医薬組成物とは一つの組成物を構成する。別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（例えばＣＡＲ−Ｔ細胞）を含む組成物と、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清、テルル系化合物、免疫調節剤のうちのいずれか１種、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む医薬組成物とは複数の組成物を構成し、遺伝子改変免疫細胞（一実施形態ではＣＡＲ−Ｔ細胞）、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞上清、テルル系化合物、または免疫調節剤、あるいはそれらの任意の組み合わせはそれぞれ別の組成物に含まれる。さらに別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（一実施形態ではＣＡＲ−Ｔ細胞）を含む組成物と、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞上清、テルル系化合物、または免疫調節剤のいずれか１種、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む医薬組成物とは複数の組成物を構成し、遺伝子改変免疫細胞（一実施形態ではＣＡＲ−Ｔ細胞）、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、テルル系化合物、または免疫調節剤、あるいはそれらの任意の組み合わせは、遺伝子改変免疫細胞（例えばＣＡＲ−Ｔ細胞）組成物中に存在し、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清は別の組成物中に含まれる。
【０４７５】
一実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（例えばＴＣＲ−Ｔ細胞）を含む組成物と、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清、テルル系化合物、免疫調節剤のうちのいずれか１種を含む医薬組成物とは一つの組成物を構成する。別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（例えばＴＣＲ−Ｔ細胞）を含む組成物と、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清、テルル系化合物、免疫調節剤のうちのいずれか１種、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む医薬組成物とは複数の組成物を構成し、遺伝子改変免疫細胞（一実施形態ではＴＣＲ−Ｔ細胞）、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞上清、テルル系化合物、または免疫調節剤、あるいはそれらの任意の組み合わせはそれぞれ別の組成物に含まれる。さらに別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（一実施形態ではＴＣＲ−Ｔ細胞）を含む組成物と、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞上清、テルル系化合物、または免疫調節剤のうちのいずれか１種、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む医薬組成物とは複数の組成物を構成し、遺伝子改変免疫細胞（一実施形態ではＴＣＲ−Ｔ細胞）、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、テルル系化合物、または免疫調節剤、あるいはそれらの任意の組み合わせは、遺伝子改変免疫細胞（例えばＴＣＲ−Ｔ細胞）組成物中に存在し、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清は別の組成物中に含まれる。
【０４７６】
一実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（例えば樹状細胞）を含む組成物と、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清、テルル系化合物、免疫調節剤のうちのいずれか１種を含む医薬組成物とは一つの組成物を構成する。別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（例えば樹状細胞）を含む組成物と、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清、テルル系化合物、または免疫調節剤のいずれか１種、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む医薬組成物とは複数の組成物を構成し、遺伝子改変免疫細胞（一実施形態では樹状細胞）、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞上清、テルル系化合物、または免疫調節剤、あるいはそれらの任意の組み合わせはそれぞれ別の組成物に含まれる。さらに別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（一実施形態では樹状細胞）を含む組成物と、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞上清、テルル系化合物、または免疫調節剤のうちのいずれか１種、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む医薬組成物とは複数の組成物を構成し、遺伝子改変免疫細胞（一実施形態では樹状細胞）、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、テルル系化合物、または免疫調節剤、あるいはそれらの任意の組み合わせは、遺伝子改変免疫細胞（例えば樹状細胞）組成物中に存在し、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清は別の組成物中に含まれる。
【０４７７】
一実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（例えばＮＫ細胞）を含む組成物と、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清、テルル系化合物、免疫調節剤のうちのいずれか１種を含む医薬組成物とは一つの組成物を構成する。別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（例えばＮＫ細胞）を含む組成物と、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清、テルル系化合物、または免疫調節剤のいずれか１種、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む医薬組成物とは複数の組成物を構成し、遺伝子改変免疫細胞（一実施形態ではＮＫ細胞）、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞上清、テルル系化合物、または免疫調節剤、あるいはそれらの任意の組み合わせはそれぞれ別の組成物に含まれる。さらに別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（一実施形態ではＮＫ細胞）を含む組成物と、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞上清、テルル系化合物、または免疫調節剤のうちのいずれか１種、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む医薬組成物とは複数の組成物を構成し、遺伝子改変免疫細胞（一実施形態ではＮＫ胞）、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、テルル系化合物、または免疫調節剤、あるいはそれらの任意の組み合わせは、遺伝子改変免疫細胞（例えばＮＫ細胞）組成物中に存在し、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清は別の組成物中に含まれる。
【０４７８】
実施形態によっては、組成物はアポトーシス細胞およびさらなる薬剤を含む。実施形態によっては、組成物はアポトーシス細胞および抗体またはその機能性断片を含む。実施形態によっては、組成物はアポトーシス細胞およびＲｔＸ抗体またはその機能性断片を含む。実施形態によっては、アポトーシス細胞と抗体またはその機能性断片は別の組成物に含まれていてもよい。実施形態によっては、アポトーシス細胞と抗体またはその機能性断片は同一の組成物に含まれていてもよい。
【０４７９】
当業者は認識していることであるが、「医薬組成物」は本明細書に記載の有効成分のうちの１種以上と生理学的に適切な担体および賦形剤などのその他の化学成分の製剤を包含し得る。医薬組成物の目的は生物への化合物の投与を容易にすることである。
【０４８０】
実施形態によっては、がんもしくは腫瘍を治療もしくは予防し、がんもしくは腫瘍の成長を阻害し、またはがんもしくは腫瘍の発生を低減するための医薬組成物を本明細書に開示する。実施形態によっては、がんもしくは腫瘍を患っている被験体の生存期間を延長するための医薬組成物を本明細書に開示する。実施形態によっては、腫瘍もしくはがんを小さくするか成長速度を低下させるための医薬組成物を本明細書に開示する。実施形態によっては、がんもしくは腫瘍を患っている被験体の腫瘍量を低減するための医薬組成物を本明細書に開示する。実施形態によっては、がんもしくは腫瘍を患っている被験体の疾患の進行を遅延させるための医薬組成物を本明細書に開示する。実施形態によっては、がんもしくは腫瘍を患っている被験体のがんもしくは腫瘍の発生を低減するための医薬組成物を本明細書に開示する。実施形態によっては、がんもしくは腫瘍を患っている被験体のがんもしくは腫瘍を小さくするか成長速度を低下させるための医薬組成物を本明細書に開示する。
【０４８１】
実施形態によっては、医薬組成物は本明細書に記載の初期アポトーシス細胞集団を含む。実施形態によっては、医薬組成物は本明細書に記載の初期アポトーシス細胞集団および医薬的に許容される賦形剤を含む。
【０４８２】
当業者は認識していることであるが、「生理学的に許容される担体」、「医薬的に許容される担体」、「生理学的に許容される賦形剤」、および「医薬的に許容される賦形剤」という語句は互換的に用いることができ、生体に重大な刺激を起こさず、かつ投与された有効成分の生物活性および性質を抑制しない担体、賦形剤、または希釈剤を包含し得る。
【０４８３】
当業者は認識していることであるが、「賦形剤」は有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を包含し得る。実施形態によっては、賦形剤としては炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖類およびデンプン類、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ならびにポリエチレングリコールが挙げられる。
【０４８４】
薬物の製剤化および投与の手法は「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（レミントンの薬学）」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、ペンシルベニア州イーストン）の最新版に記載されている。この文献の内容を本明細書に援用する。
【０４８５】
実施形態によっては、各組成物は同時に投与される。代替的な実施形態では、各組成物は別の時に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む各組成物は遺伝子改変免疫細胞またはその受容体の注入の前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む各組成物はＣＡＲ−Ｔ細胞の注入の前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む各組成物は細胞傷害性Ｔ細胞の注入の前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む各組成物はナチュラルキラー細胞の注入の前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む各組成物は樹状細胞の注入の前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む各組成物は遺伝子改変Ｔ細胞受容体の注入の前に投与される。
【０４８６】
別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む各組成物は遺伝子改変免疫細胞またはその受容体の注入の前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む各組成物はＣＡＲ−Ｔ細胞の注入の前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む各組成物は細胞傷害性Ｔ細胞の注入の前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む各組成物はナチュラルキラー細胞の注入の前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む各組成物は樹状細胞の注入の前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む各組成物は遺伝子改変Ｔ細胞受容体の注入の前に投与される。
【０４８７】
別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む各組成物は遺伝子改変免疫細胞またはその受容体の注入の前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む各組成物は遺伝子改変免疫細胞またはその受容体の注入の約２４時間前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む各組成物は、ＣＡＲ−Ｔ細胞、または細胞傷害性Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞、または樹状細胞、または遺伝子改変Ｔ細胞受容体の注入の約２４時間前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む各組成物は、ＣＡＲ−Ｔ細胞、または細胞傷害性Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞、または樹状細胞、または遺伝子改変Ｔ細胞受容体の注入の約２４時間前に投与される。
【０４８８】
実施形態によっては、各組成物は同時に投与される。代替的な実施形態では、各組成物は別の時に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む各組成物は抗体またはその断片、あるいは抗体またはその断片を含む組成物の投与の前に投与される。
【０４８９】
別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む各組成物は抗体またはその断片、あるいは抗体またはその断片を含む組成物の約２時間前、４時間前、６時間前、８時間前、１０時間前、１２時間前、１４時間前、１６時間前、１８時間前、２０時間前、２２時間前、２４時間前、３６時間前、４８時間前、６０時間前、または７２時間前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む各組成物は抗体またはその断片、あるいは抗体またはその断片を含む組成物の約２時間前、４時間前、６時間前、８時間前、１０時間前、１２時間前、１４時間前、１６時間前、１８時間前、２０時間前、２２時間前、２４時間前、３６時間前、４８時間前、６０時間前、または７２時間前に投与される。
【０４９０】
別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む各組成物は抗体またはその断片、あるいは抗体またはその機能性断片を含む組成物の約１日前、２日前、３日前、４日前、５日前、６日前、７日前、８日前、９日前、１０日前、１１日前、１２日前、１３日前、１４日前、または１５日前に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む組成物は抗体またはその機能性断片、あるいは抗体またはその機能性断片を含む各組成物の約２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、７週間前、または８週間前に投与される。
【０４９１】
別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む各組成物は抗体またはその断片、あるいは抗体またはその断片を含む各組成物の注入の後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む各組成物は抗体またはその断片、あるいは抗体またはその断片を含む組成物の後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む各組成物は抗体またはその断片、あるいは抗体またはその断片を含む組成物の投与の後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む各組成物は抗体またはその断片、あるいは抗体またはその断片を含む組成物の投与後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む各組成物は抗体またはその断片、あるいは抗体またはその断片を含む組成物の約２４時間後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む各組成物は抗体またはその断片、あるいは抗体またはその断片を含む組成物の投与後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む各組成物は抗体またはその断片、あるいは抗体またはその断片を含む組成物の投与の約２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、１６時間後、１８時間後、２０時間後、２２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、または７２時間後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む各組成物は抗体またはその断片、あるいは抗体またはその断片を含む組成物の投与の約２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、１６時間後、１８時間後、２０時間後、２２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、または７２時間後に投与される。
【０４９２】
別の実施形態では、アポトーシス細胞を含む各組成物は抗体またはその断片、あるいは抗体またはその機能性断片を含む組成物の約１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後、１４日後、または１５日後に投与される。別の実施形態では、アポトーシス細胞上清を含む各組成物は抗体またはその機能性断片、あるいは抗体またはその機能性断片を含む組成物の約２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、または８週間後に投与される。
【０４９３】
実施形態によっては、アポトーシス細胞を含む組成物はＣＡＲ−Ｔ細胞とは独立に投与される。実施形態によっては、アポトーシス細胞を含む組成物はさらなる薬剤と組み合わせて投与される。実施形態によっては、このさらなる薬剤は抗体である。
【０４９４】
実施形態によっては、本明細書に開示されている組成物は治療組成物を含む。実施形態によっては、本明細書に開示されている組成物は治療有効性を含む。
【０４９５】
実施形態によっては、本明細書に開示されている組成物は１回投与される。別の実施形態では、この組成物は２回投与される。別の実施形態では、この組成物は３回投与される。別の実施形態では、この組成物は４回投与される。別の実施形態では、この組成物は少なくとも４回投与される。別の実施形態では、この組成物は５回以上投与される。
【０４９６】
実施形態によっては、本明細書に開示されているＣＡＲ−Ｔ細胞は１回投与される。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は２回投与される。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は３回投与される。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は４回投与される。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は少なくとも４回投与される。別の実施形態では、この組成物は５回以上投与される。
【０４９７】
実施形態によっては、本明細書に開示されている組成物は治療組成物である。別の実施形態では、本明細書に開示されている組成物は治療有効性を持つ。
【０４９８】
実施形態によっては、ＣＡＲ−Ｔ細胞を単独で含む組成物に比べて炎症性サイトカインまたはケモカインの放出が減るが、ＣＡＲ−Ｔ細胞を単独で含む組成物と同等の細胞傷害性を持つ組成物が本明細書に開示される。
【０４９９】
製剤
【０５００】
本明細書に開示されている初期アポトーシス細胞集団を含む医薬組成物は、無菌液剤（例えば等張水溶液）、懸濁剤、乳剤、分散剤、または粘性組成物として好都合に提供でき、これらは選択されたｐＨ値になるよう緩衝されてもよい。液剤は通常、ゲル剤、その他の粘性組成物、および固体組成物よりも調製しやすい。また、液体組成物は特に注射によって、いくらかより好都合に投与できる。一方、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間を提供するために、適切な粘度範囲内で製剤できる。液剤または粘性組成物は担体を含むことができ、担体は、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であってもよい。
【０５０１】
無菌注射溶液は、本明細書に記載され本明細書に開示されている方法の実施に用いられる初期アポトーシス細胞集団を所要量の適切な溶媒に様々な量のそれ以外の成分と共に必要に応じて組み込むことによって調製できる。このような組成物は適切な担体、希釈剤、または賦形剤（滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなど）と混合されてもよい。この組成物を凍結乾燥することもできる。この組成物は、所望の投与経路および製剤に応じて、湿潤剤、分散剤、または乳化剤（例えばメチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化または粘度増強添加剤、保存剤、香味剤、着色剤などの補助物質を含むことができる。「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥ（レミントンの薬学）」第１７版（１９８５年）などの標準のテキスト（本明細書に援用する）を参考にし、過度な実験を行うことなく適切な製剤を調製してもよい。
【０５０２】
抗菌保存剤、抗酸化剤、キレート剤、緩衝液など、組成物の安定性および無菌性を高める様々な添加剤を添加できる。様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって微生物の作用の予防を保証できる。吸収を遅らせる薬剤、例えば一ステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用により、注射用の医薬形態の持続的吸収をもたらすことができる。しかしながら、本明細書の開示によれば、使用される任意の溶媒、希釈剤、または添加物は、遺伝子改変免疫応答性細胞またはそれらの前駆体と適合する必要がある。
【０５０３】
本明細書に記載の組成物または製剤は等張性であってもよい。すなわち、それらは血液および涙液と同じ浸透圧を有してもよい。本明細書に開示される組成物の所望の等張性は、塩化ナトリウムあるいはその他の医薬的に許容される薬剤、例えばデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコールまたは他の無機もしくは有機溶質などを使いて達成できる。塩化ナトリウムがナトリウムイオンを含む緩衝液として特に好ましい。
【０５０４】
必要であれば、医薬的に許容される増粘剤を用いて組成物の粘度を選択されたレベルに維持することができる。メチルセルロースが好ましい、というのも入手しやすく経済的で扱いやすいからである。
【０５０５】
他の適切な増粘剤としては、例えばキサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが挙げられる。増粘剤の好ましい濃度は、選択された薬剤に依存する。重要な点は選択された粘度を達成する量を用いることである。当然ながら、適切な担体および他の添加剤の選択は厳密な投与経路および特定の剤形（例えば液状の剤形）の性質（例えば、組成物が溶液剤、懸濁剤、ゲル剤、または徐放形態もしくは液体入りの形態など別の液状形態に製剤されるかなど）に依存する。
【０５０６】
当業者は、本明細書に開示されている方法に使用するためには組成物または製剤の成分が化学的に不活性、かつ本明細書に記載の初期アポトーシス細胞集団の生存率または有効性に影響しないよう選択されるべきであることを認識している。このことは、化学および薬学の原理に秀でた当業者にとって何の問題もなく、あるいは、本開示および本明細書で引用した文書から、標準のテキストを参照するか単純な実験（過度の実験を伴わない）を行うことによって問題を容易に回避できる。
【０５０７】
本明細書に開示されている遺伝子改変免疫応答性細胞の治療用途に関する一つの検討事項は、最適な効果を達成するのに必要な細胞の量である。投与される細胞の量は治療を受ける被験体によって変動する。実施形態によっては、１０４〜１０１０個、１０５〜１０９個、または１０６〜１０８個の本明細書に開示されている遺伝子改変免疫応答性細胞をヒト被験体に投与する。より有効な細胞はさらに少ない数で投与されてもよい。実施形態によっては、少なくとも約１×１０８個、２×１０８個、３×１０８個、４×１０８個、および５×１０８個の本明細書に開示されている遺伝子改変免疫応答性細胞をヒト被験体に投与する。有効な用量だと考えられる内容の正確な決定は各被験体の個々の因子（大きさ、年齢、性別、体重、および特定の被験体の状態など）に基づいてもよい。投与量は本開示および当技術分野の知見から当業者によって容易に確認できる。
【０５０８】
当業者は、本明細書に開示されている組成物に入れたり方法において投与したりする細胞ならびに任意の添加剤、溶媒、および／または担体の量を容易に決定できる。一般に、任意の添加剤（有効な細胞および／または薬剤に加えられる）は、０．００１〜５０％（重量）リン酸緩衝生理食塩水溶液の量で存在し、有効成分はマイクログラム〜ミリグラムのオーダー、例えば約０．０００１〜約５重量％で存在する。別の実施形態では約０．０００１〜約１重量％である。さらに別の実施形態では約０．０００１〜約０．０５重量％または約０．００１〜約２０重量％である。さらなる実施形態では約０．０１〜約１０重量％である。別の実施形態では約０．０５〜約５重量％である。したがって、当然ながら、動物またはヒトに投与される任意の組成物について、また任意の特定の投与方法について、毒性（例えばマウスなどの齧歯類などの適切な動物モデルで致死量（ＬＤ）およびＬＤ５０を決定することによって）；ならびに適切な反応を引き起こす組成物の投与量、組成物に含まれる成分の濃度、および組成物の投与のタイミングを決定するのが好ましい。このような決定は当業者の知見、本開示および本明細書に引用する文書によれば過度の実験を要求するものではない。また、連続投与の時期も過度の実験を行うことなく確認できる。
【０５０９】
核酸配列、ベクター、細胞
【０５１０】
実施形態によっては、本明細書に開示されている組成物および方法に使用するための、本明細書に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸配列を本明細書に開示する。
【０５１１】
別の実施形態では、本明細書に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含むベクターを本明細書に開示する。
【０５１２】
実施形態によっては、本明細書に開示されている組成物および方法に使用するための、本明細書に記載の遺伝子改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする単離核酸配列を本明細書に開示する。別の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸配列を含むベクターを本明細書に開示する。
【０５１３】
免疫応答性細胞（例えばＴ細胞、ＣＴＬ細胞、ＮＫ細胞）の遺伝子改変は、実質的に均質な細胞組成物に組み換えＤＮＡ構築物を形質導入することによって達成できる。実施形態によっては、ＤＮＡ構築物を細胞に導入するためにレトロウイルスベクター（γレトロウイルスまたはレンチウイルス）を採用する。例えば、抗原（例えば腫瘍抗原、またはその多様体もしくは断片）に結合する受容体をコードするポリヌクレオチドをレトロウイルスベクターにクローン化することができ、その内因性プロモーター、レトロウイルスの末端反復配列、または目的の標的細胞種に特異的なプロモーターから発現を駆動することができる。非ウイルス性ベクターも用いてもよい。
【０５１４】
非ウイルス性の手法も細胞内でタンパク質を発現するために採用できる。例えば、リポフェクション（Ｆｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８４：７４１３，  １９８７；  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７：２５９，  １９９０；  Ｂｒｉｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  ２９８：２７８，  １９８９；  Ｓｔａｕｂｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：５１２，  １９８３）もしくはアシアロオロソムコイド−ポリリシン結合（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６３：  １４６２１，  １９８８；  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６４：１６９８５，  １９８９）の存在下で核酸を投与することにより、または手術条件で微量注入を行う（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：  １４６５，  １９９０）ことによって核酸分子を細胞に導入できる。他の非ウイルス性の遺伝子導入手段としては、リン酸カルシウムを用いたインビトロでのトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔、および原形質融合が挙げられる。リポソームも細胞へのＤＮＡの送達に潜在的に有益な可能性がある。正常な核酸を培養可能な細胞種に生体外（例えば自己または異種の初代細胞またはその子孫細胞）で移入した後にその細胞（またはその子孫細胞）を標的組織に注入するか全身注入することにより、被験体の罹患組織に正常遺伝子を移植することもできる。転移酵素または標的ヌクレアーゼ（亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥヌクレアーゼ）を用いて組み換え受容体を誘導または入手することもできる。ＲＮＡ電気穿孔によって一過性の発現を得てもよい。ポリヌクレオチド療法に使用されるｃＤＮＡ発現を任意の適切なプロモーター（例えばヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、またはメタロチオネインプロモーター）から導き、任意の適切な哺乳動物の制御配列またはイントロン（例えば伸長因子１αエンハンサー／プロモーター／イントロン構造）によって制御することができる。例えば、必要であれば、特定の細胞種で遺伝子発現を優先的に導くことが知られているエンハンサーを用いて核酸の発現を導くことができる。用いられるエンハンサーとしては、限定しないが、組織または細胞に特異的なエンハンサーとして特徴づけられるものを挙げることができる。あるいは、ゲノムクローンを治療用構築物として使用する場合、制御は同族の制御配列によって、または必要であれば上記のプロモーターまたは制御配列のいずれかを含む異種性の起源に由来する制御配列によって媒介されてもよい。
【０５１５】
別の実施形態では、本明細書に開示されているキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含むベクターを含む細胞を本明細書に開示する。
使用方法
【０５１６】
一実施形態では、本明細書に記載の組成物を投与する工程を含む、がんもしくは腫瘍の治療、予防、阻害、発生の低減、寛解、あるいは緩和の方法を本明細書に開示する。
【０５１７】
実施形態によっては、アポトーシス細胞を含む組成物を投与する工程を含む、被験体のがんもしくは腫瘍の治療、予防、阻害、発生の低減、寛解、あるいは緩和の方法を本明細書に開示する。実施形態によっては、被験体のがんもしくは腫瘍を治療もしくは予防し、がんもしくは腫瘍の成長を阻害し、病気の進行を遅らせ、腫瘍量を低減し、またはがんもしくは腫瘍の発生を低減する、あるいはそれらの任意の組み合わせを伴う方法を本明細書に開示する。実施形態によっては、本明細書に開示されている方法は、がんもしくは腫瘍を小さくし、かつ／または成長速度を低下させる。実施形態によっては、本明細書に開示されている方法は腫瘍もしくはがんを患っている被験体の生存期間を延ばす。実施形態によっては、アポトーシス細胞またはその組成物を用いることによって遺伝子改変免疫細胞療法（例えばＣＡＲ−Ｔ細胞療法であるがそれに限定されない）の有効性は向上する。
【０５１８】
別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞とさらなる薬剤を含む組成物とを投与する工程を含む、がんもしくは腫瘍の治療、予防、阻害、発生の低減、寛解、あるいは緩和の方法を本明細書に開示する。前記さらなる薬剤は、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞の上清、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、テルル系化合物、または免疫調節剤、あるいはそれらの任意の組み合わせを含み、前記方法は、前記遺伝子改変免疫細胞を投与されさらなる薬剤を投与されていない被験体に比べて前記被験体のがんもしくは腫瘍を治療、予防、阻害、発生を低減、寛解、または緩和する。別の実施形態では、前記遺伝子改変免疫細胞は遺伝子改変Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、エフェクターＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞を含む。
【０５１９】
別の実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）とさらなる薬剤を含む組成物とを投与する工程を含む、がんもしくは腫瘍の治療、予防、阻害、発生の低減、寛解、あるいは緩和の方法を本明細書に開示する。前記さらなる薬剤は、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞の上清、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、テルル系化合物、または免疫調節剤、あるいはそれらの任意の組み合わせを含み、前記方法は、前記遺伝子改変免疫細胞を投与されさらなる薬剤を投与されていない被験体に比べて前記被験体のがんもしくは腫瘍を治療、予防、阻害、発生を低減、寛解、または緩和する。
【０５２０】
別の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞受容体細胞（ＴＣＲ−Ｔ細胞）とさらなる薬剤を含む組成物とを投与する工程を含む、がんもしくは腫瘍の治療、予防、阻害、発生の低減、寛解、あるいは緩和の方法を本明細書に開示する。前記さらなる薬剤は、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞の上清、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、テルル系化合物、または免疫調節剤、あるいはそれらの任意の組み合わせを含み、前記方法は、前記遺伝子改変免疫細胞を投与されさらなる薬剤を投与されていない被験体に比べて前記被験体のがんもしくは腫瘍を治療、予防、阻害、発生を低減、寛解、または緩和する。
【０５２１】
別の実施形態では、アポトーシス細胞もしくはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物を投与しても、前記キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞の投与によるがんもしくは腫瘍の治療、予防、阻害、発生の低減、寛解、あるいは緩和の有効性は低下しない。別の実施形態では、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞の上清、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、テルル系化合物、免疫調節剤、あるいはそれらの任意の組み合わせを含むさらなる薬剤、あるいはそれらの組成物を投与しても、前記キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞の投与によるがんもしくは腫瘍の治療、予防、阻害、発生の低減、寛解、あるいは緩和の有効性は低下しない。
【０５２２】
別の実施形態では、アポトーシス細胞もしくはアポトーシス細胞上清またはそれらの組成物を投与することによって、前記キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞の投与によるがんもしくは腫瘍の治療、予防、阻害、発生の低減、寛解、あるいは緩和の有効性は高くなる。別の実施形態では、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞の上清、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、テルル系化合物、免疫調節剤、あるいはそれらの任意の組み合わせを含むさらなる薬剤、あるいはそれらの組成物を投与することによって、前記キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞の投与によるがんもしくは腫瘍の治療、予防、阻害、発生の低減、寛解、あるいは緩和の有効性は高くなる。
【０５２３】
一実施形態では、遺伝子改変免疫細胞がん療法の有効性高くする方法は、前記遺伝子改変免疫細胞と、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞の上清、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、テルル系化合物、免疫調節剤、あるいはそれらの任意の組み合わせを含むさらなる薬剤、あるいはそれらの組成物とを投与する工程を含み、その有効性は、前記さらなる薬剤を投与されていない被験体に比べて高くなる。別の実施形態では、前記遺伝子改変免疫細胞はＴ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞はナイーブＴ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞はナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞はナイーブＴ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞はナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞は樹状細胞である。さらに別の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ細胞）である。別の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。別の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である。別の実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞は遺伝子改変Ｔ細胞受容体細胞（ＴＣＲ−Ｔ細胞）である。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞がん療法の有効性を高くする方法は、前記遺伝子改変免疫細胞と、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞の上清、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、テルル系化合物、免疫調節剤、あるいはそれらの任意の組み合わせを含むさらなる薬剤、あるいはそれらの組成物とを投与する工程を含み、その有効性は、前記さらなる薬剤を投与されていない被験体に比べて高くなる。
【０５２４】
別の実施形態では、本明細書の方法は少なくとも１種の炎症誘発性サイトカインの生成量を、免疫がん療法を受けているがさらなる薬剤を投与されていない被験体の前記炎症誘発性サイトカインの量に比べて減少させる。別の実施形態では、本明細書の方法は遺伝子改変免疫細胞がん療法を受けているがさらなる薬剤を投与されていない被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の発生を阻害または低減する。
【０５２５】
別の実施形態では、本明細書に開示されている方法はＩＬ−６を減少させる。
【０５２６】
別の実施形態では、本明細書の方法は少なくとも１種のサイトカインの生成を、免疫がん療法を受けているがさらなる薬剤を投与されていない被験体の前記サイトカイン量に比べて増加させる。実施形態によっては、さらなる薬剤はアポトーシス細胞である。他の実施形態では、さらなる薬剤はアポトーシス細胞上清である。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法はＩＬ−２を増加させる。
【０５２７】
当業者は認識していることであるが、本明細書でサイトカインに関して用いる「生成」、「産生」という用語は、サイトカインの発現だけでなく細胞からのサイトカインの分泌も包含し得る。一実施形態では、サイトカインの生成が増加すると細胞からのサイトカインの分泌は増加する。代替的な実施形態では、サイトカインの生成が減少すると細胞からのサイトカインの分泌は減少する。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法は少なくとも１種のサイトカインの分泌を低減する。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法はＩＬ−６の分泌を低減する。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法は少なくとも１種のサイトカインの分泌を増加する。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法はＩＬ−２の分泌を増加する。
【０５２８】
別の実施形態では、少なくとも１種のサイトカインを分泌する細胞は腫瘍細胞である。別の実施形態では、少なくとも１種のサイトカインを分泌する細胞はＴ細胞である。別の実施形態では、少なくとも１種のサイトカインを分泌する細胞は免疫細胞である。別の実施形態では、少なくとも１種のサイトカインを分泌する細胞はマクロファージである。別の実施形態では、少なくとも１種のサイトカインを分泌する細胞はＢ細胞リンパ球である。別の実施形態では、少なくとも１種のサイトカインを分泌する細胞はマスト細胞である。別の実施形態では、少なくとも１種のサイトカインを分泌する細胞は内皮細胞である。別の実施形態では、少なくとも１種のサイトカインを分泌する細胞は線維芽細胞である。別の実施形態では、少なくとも１種のサイトカインを分泌する細胞は間質細胞である。当業者は認識していることであるが、サイトカインの量は細胞を取り巻く環境に応じてサイトカイン分泌細胞中で増減し得る。
【０５２９】
さらに別の実施形態では、本明細書に開示されている方法に用いられるさらなる薬剤は少なくとも１種のサイトカインの分泌を増加する。さらに別の実施形態では、本明細書に開示されている方法に用いられるさらなる薬剤は少なくとも１種のサイトカインの分泌を維持する。さらに別の実施形態では、本明細書に開示されている方法に用いられるさらなる薬剤は少なくとも１種のサイトカインの分泌を低減しない。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法に用いられるさらなる薬剤はＩＬ−２の分泌を増加する。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法に用いられるさらなる薬剤はＩＬ−２Ｒの分泌を増加する。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法に用いられるさらなる薬剤はＩＬ−２の分泌量を維持する。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法に用いられるさらなる薬剤はＩＬ−２Ｒの分泌量を維持する。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法に用いられるさらなる薬剤はＩＬ−２Ｒの分泌量を低減しない。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法に用いられるさらなる薬剤はＩＬ−２の分泌量を維持または増加する。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法に用いられるさらなる薬剤はＩＬ−２Ｒの分泌量を維持または増加する。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法に用いられるさらなる薬剤はＩＬ−２Ｒの分泌量を低減しない。
【０５３０】
さらなる実施形態では、本明細書に開示されている方法に用いられるさらなる薬剤はＩＬ−６の分泌を低減する。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法に用いられるさらなる薬剤はＩＬ−６の分泌を低減するがＩＬ−２の分泌量を維持するか、増加するか、あるいは減少しない。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法に用いられるさらなる薬剤はＩＬ−６の分泌を低減するがＩＬ−２Ｒの分泌量を維持するか、増加するか、あるいは低減しない。
【０５３１】
一実施形態では、本明細書に開示されているＣＡＲ−Ｔ細胞がん療法の有効性を高くする方法は、前記被験体のＩＬ−６の量を低減する工程を含み、前記方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞と、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞の上清、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、テルル系化合物、免疫調節剤、あるいはそれらの任意の組み合わせを含むさらなる薬剤、あるいはそれらの組成物とを投与する工程を含み、その有効性は、前記さらなる薬剤を投与されていない被験体に比べて高くなる。別の実施形態では、本明細書に開示されているＣＡＲ−Ｔ細胞がん療法の有効性を高くする方法は、前記被験体のＩＬ−２の量を増やす工程を含み、前記方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞と、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞の上清、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、テルル系化合物、免疫調節剤、あるいはそれらの任意の組み合わせを含むさらなる薬剤、あるいはそれらの組成物とを投与する工程を含み、その有効性は、前記さらなる薬剤を投与されていない被験体に比べて高くなる。別の実施形態では、本明細書に開示されているＣＡＲ−Ｔ細胞がん療法の有効性を高くする方法は、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を高める工程を含み、前記方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞と、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞の上清、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、テルル系化合物、免疫調節剤、あるいはそれらの任意の組み合わせを含むさらなる薬剤、あるいはそれらの組成物とを投与する工程を含み、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性および増殖は、前記さらなる薬剤を投与されていない被験体に比べて高くなる。
【０５３２】
一実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞がん療法の有効性を高くする方法は、被験体のサイトカインの生成を低減または阻害し、前記方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む組成物と、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、テルル系化合物、免疫調節剤、あるいはそれらの任意の組み合わせ、あるいはそれらの組成物とを投与する工程を含む。別の実施形態では、がんもしくは腫瘍の治療、予防、阻害、発生の低減、寛解、あるいは緩和の方法も被験体のサイトカインの生成を低減または阻害し、前記方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む組成物と、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、テルル系化合物、免疫調節剤、あるいはそれらの任意の組み合わせ、あるいはそれらの組成物とを投与する工程を含む。
【０５３３】
別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞がん療法を受けている患者のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を治療する方法を本明細書に開示する。
【０５３４】
別の実施形態では、がんもしくは腫瘍の治療、予防、阻害、発生の低減、寛解、あるいは緩和の方法は被験体のサイトカインの生成を低減または阻害し、前記方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む組成物と、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその断片もしくは類似体、テルル系化合物、免疫調節剤、あるいはそれらの任意の組み合わせ、あるいはそれらの組成物とを投与する工程を含む。
【０５３５】
別の実施形態では、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかを被験体に投与する工程を含む、前記被験体のがんもしくは腫瘍を治療する方法を本明細書に開示する。別の実施形態では、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかを被験体に投与する工程を含む、前記被験体のがんもしくは腫瘍を予防する方法を本明細書に開示する。別の実施形態では、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかを被験体に投与する工程を含む、前記被験体のがんもしくは腫瘍を阻害する方法を本明細書に開示する。別の実施形態では、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかを被験体に投与する工程を含む、前記被験体のがんもしくは腫瘍を低減する方法を本明細書に開示する。別の実施形態では、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかを被験体に投与する工程を含む、前記被験体のがんもしくは腫瘍を寛解する方法を本明細書に開示する。別の実施形態では、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかを被験体に投与する工程を含む、前記被験体のがんもしくは腫瘍を緩和する方法を本明細書に開示する。
【０５３６】
一実施形態では、免疫療法中にアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を含む組成物を投与する工程を含む、免疫療法中の遺伝子改変免疫細胞の増殖率を維持または高くする方法を本明細書に開示する。別の実施形態では、前記遺伝子改変免疫細胞はＴ細胞、ナイーブＴ細胞、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ細胞）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、または遺伝子改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｔ細胞を含む。別の実施形態では、免疫療法中にアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を含む組成物を投与する工程を含む、免疫療法中のＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖率を維持または高くする方法を本明細書に開示する。
【０５３７】
別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞の増殖率を維持または高くする方法は免疫療法の有効性を低下または阻害しない。例えば、別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖率を維持または高くする方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞がん療法の有効性を低下または阻害しない。別の実施形態では、遺伝子改変免疫細胞（例えばＣＡＲ−Ｔ細胞）の増殖率を維持または高くする方法は被験体のサイトカイン生成を低減または阻害する。
【０５３８】
別の実施形態では、本明細書に開示されている組成物および方法は本明細書に開示されているアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清、およびイピリムマブなどの１種以上のＣＴＬＡ−４遮断薬との併用療法を利用する。一実施形態では、ＣＴＬＡ−４は、自己寛容の維持を促すＴ細胞活性化の強力な阻害因子である。一実施形態では、抗ＣＴＬＡ−４遮断薬（別の実施形態では抗体）の投与により、Ｔ細胞活性化の正味の効果が生み出される。別の実施形態では、本明細書に開示されている組成物および方法は、アポトーシス細胞、ＣＡＲ−Ｔ細胞、および１種以上のＣＴＬＡ−４遮断薬を含む併用療法を利用する。
【０５３９】
場合によっては、本明細書のポリペプチドおよび本明細書に開示されている方法に用いられるポリペプチドは、未改変のアミノ酸配列に対し少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含む。このポリペプチドは非保存的アミノ酸置換を含む場合もある。このような場合、そのような改変を有するポリペプチドは、そのようなアミノ酸置換を含まないポリペプチドに対してより高い安定性すなわちより長い半減期を示す。
【０５４０】
実施形態によっては、「治療する」は治療的処置を含み、「予防する」は予防的処置を含み、その目的は上述した標的の病態または障害を予防または軽減することである。したがって、実施形態によっては、治療は、疾患、障害もしくは病気に対し直接的に影響を及ぼすか治癒させること、抑制すること、阻害すること、予防すること、重症度を低減すること、発症を遅らせること、その疾患、障害もしくは病気に関連する症状を軽減すること、あるいはそれらの組み合わせを包含し得る。したがって、実施形態によっては、「治療」、「寛解」、および「緩和」は特に、進行を遅らせること、寛解を促すこと、寛解を誘導すること、寛解を増強すること、回復を早めること、別の治療の有効性を高めるか別の治療への抵抗性を弱めること、あるいはそれらの組み合わせを意味する。実施形態によっては、「予防」は特に、症状の発症を遅らせること、疾患の再発を防ぐこと、再発の発症の回数または頻度を下げること、症状の発症の間の潜伏期を延ばすこと、あるいはそれらの組み合わせを意味する。実施形態によっては、「抑制」または「阻害」は特に、症状の重症度を低減すること、急性発症の重症度を低減すること、症状の回数を減らすこと、疾患に関連する症状の発生を低減すること、症状の潜伏を低減すること、症状を寛解すること、二次症状を低減すること、二次感染を低減すること、患者の生存期間を延ばすこと、あるいはそれらの組み合わせを意味する。
【０５４１】
当業者は認識していることであるが、「抗原認識受容体」という用語は、抗原結合に応じて免疫細胞（例えばＴ細胞）を活性化できる受容体を包含し得る。典型的な抗原認識受容体は、天然すなわち内因性のＴ細胞受容体、あるいは免疫細胞（例えばＴ細胞）を活性化できる細胞内シグナル伝達ドメインに腫瘍抗原結合ドメインが融合されたキメラ抗原受容体であってもよい。
【０５４２】
実施形態によっては、本明細書に記載の方法はがんもしくは腫瘍を患っている被験体の生存期間を延ばし、前記被験体に初期アポトーシス細胞集団を投与する工程を含み、この方法は被験体の生存期間を延ばす。
【０５４３】
当業者は認識していることであるが、「疾患」という用語は、細胞、組織、または器官の正常な機能を損なうか妨げる任意の病気または障害を包含し得る。疾患の例としては、腫瘍または細胞の病原感染が挙げられる。
【０５４４】
当業者は認識していることであるが、「有効量」という用語は治療効果を持つのに十分な量を包含し得る。実施形態によっては、「有効量」は新生物の継続的な増殖、成長、もしくは転移（例えば浸潤または移動）を抑制、寛解、または阻害するのに十分な量である。
【０５４５】
当業者は認識していることであるが、「新生物」という用語は細胞または組織が病的に増殖することとその後に他の組織または器官に移動または浸潤することを特徴とする疾患を包含し得る。新生物の成長は一般に制御されず進行性であり、正常細胞の増殖を起こさない条件、または正常細胞の増殖の休止を起こす条件で起こる。新生物は多様な細胞型、組織、または器官を冒す可能性がある。その例としては、膀胱、骨、脳、乳房、軟骨、膠細胞、食道、卵管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、泌尿生殖器、尿管、尿道、子宮、および膣からなる群より選択される器官、あるいはそれらの組織または細胞型が挙げられるがこれらに限定されない。新生物としては、肉腫、細胞腫、または形質細胞腫（形質細胞の悪性腫瘍）などのがんが挙げられる。
【０５４６】
当業者は認識していることであるが、「病原」という用語は疾患を引き起こすことのできるウイルス、細菌、真菌、寄生生物、または原生生物を包含し得る。
【０５４７】
当業者は認識していることであるが、「腫瘍抗原」または「腫瘍関連抗原」という用語は正常細胞または非ＩＳ新生物細胞に比べて腫瘍細胞において特有または差次的に発現する抗原（例えばポリペプチド）を包含し得る。本明細書に開示されている組成物および方法に関して、腫瘍抗原は、抗原認識受容体を介して免疫応答を活性化または誘導できる（例えば、ＣＤ１９、ＭＵＣＩ）、あるいは受容体−リガンド結合を介してまたは免疫応答を抑制できる（例えばＣＤ４７、ＰＤ−Ｌ１／Ｌ２、Ｂ７．１／２）、腫瘍により発現される任意のポリペプチドを含む。
【０５４８】
当業者は認識していることであるが、「ウイルス抗原」という用語は免疫反応を誘導できるウイルスによって発現されたポリペプチドを包含し得る。
【０５４９】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、米国特許法においてそれらが持つとされる広い意味を有することが意図されており、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味する可能性がある。同様に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語は、米国特許法においてそれらが持つとされる意味を有する。本明細書に開示されている組成物および方法は、有効成分または特定の工程を含むか、その有効成分または特定の工程からなるか、あるいはその有効成分または特定の工程から本質的になることが想定される。
【０５５０】
当業者は認識していることであるが、「治療」という用語は、治療される個体または細胞の疾患経過を変化させようとする臨床的介入を包含してもよく、予防のため、あるいは臨床病理の経過中に実施することができる。処置の治療効果としては、疾患の発生または再発を予防すること、症状を緩和すること、疾患の直接的または間接的な病理学的結果を低減すること、転移を予防すること、疾患の進行速度を低減すること、病状を寛解または緩和すること、および寛解することまたは予後を改善することが挙げられるが、これらに限定されない。疾患または障害の進行を予防することにより、治療は罹患しているか診断された被験体、あるいは障害を有する疑いのある被験体においてその障害による悪化を予防できるが、治療は、その障害のリスクがある被験体あるいはその障害を有する疑いのある被験体においてその障害の発症または障害の症状を予防してもよい。
【０５５１】
当業者は認識していることであるが、「被験体」という用語は脊椎動物（実施形態によっては哺乳動物であり、実施形態によってはヒトである）を包含し得る。被験体はまた、実施形態によっては、ウシ、ヒツジ、ウマ、ネコ、イヌなどの家畜、およびマウス、ラット、スナネズミ、ハムスターなどの実験動物を指す場合もある。
【０５５２】
実施形態によっては、ＣＡＲが目的ペプチドに向けられたＣＡＲ−Ｔ細胞を本明細書に開示する。実施形態によっては、このＣＡＲは目的ペプチドに結合する。別の実施形態では、このＣＡＲは目的ペプチドを標的とする。別の実施形態では、このＣＡＲは目的ペプチドを活性化する。別の実施形態では、このＣＡＲは目的ペプチドのリガンドである。別の実施形態では、目的のペプチドはこのＣＡＲのリガンドである。これらの実施形態のそれぞれは本明細書の開示の一部と考えられるものとする。
【０５５３】
実施形態によっては、本明細書に開示されている免疫細胞はＴ細胞ではない。別の実施形態では、本明細書に開示されている免疫細胞はＮＫ細胞ではない。別の実施形態では、本明細書に開示されている免疫細胞はＣＴＬではない。別の実施形態では、本明細書に開示されている免疫細胞は制御性Ｔ細胞ではない。別の実施形態では、免疫細胞はヒト胚性幹細胞ではない。別の実施形態では、免疫細胞はリンパ球細胞が分化し得る多能性幹細胞ではない。
【０５５４】
免疫療法の一つの手法は、患者自身の免疫細胞を操作して患者の腫瘍を認識し攻撃する遺伝子改変細胞を作製することを含む。本明細書に記載されているように、免疫細胞を採取し、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を細胞表面に生成するように遺伝子改変することにより、その免疫細胞（例えばＴ細胞）は腫瘍もしくは癌細胞の特異的タンパク質抗原を認識できる。次いで、増殖させた遺伝子改変免疫細胞（例えばＣＡＲ−Ｔ細胞）の集団を患者に投与する。実施形態によっては、投与された細胞は患者の体内で増殖し、その抗原を表面に持つがんおよび腫瘍細胞を認識し死滅させる。別の実施形態では、投与された細胞は患者の体内で増殖し、腫瘍関連抗原を認識し死滅させ、その結果がんおよび腫瘍細胞が死滅する。
【０５５５】
実施形態によっては、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を含む組成物を投与する工程を含む、ＣＡＲ−Ｔ細胞がん療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増の発生を阻害または低減する方法、およびサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を患っている被験体のサイトカイン生成を減少または阻害する方法を本明細書に開示する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞がん療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を治療する方法を本明細書に開示する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞がん療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を予防する方法を本明細書に開示する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞がん療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を緩和する方法を本明細書に開示する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞がん療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を寛解する方法を本明細書に開示する。別の実施形態では、アポトーシス細胞もしくはアポトーシス上清またはそれらの組成物を投与してもＣＡＲ−Ｔ細胞療法の有効性は低下しない。
【０５５６】
実施形態によっては、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を含む組成物、あるいはそれらの組成物を被験体に投与する工程を含む、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）がん療法を受けている被験体のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）もしくはサイトカイン急増の発生を阻害または低減する方法を本明細書に開示する。別の実施形態では、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカイン急増の発生の阻害または低減を、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞がん療法を受けアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を投与されている被験体のサイトカイン量を測定することによって確認する。別の実施形態では、測定したサイトカイン量をＣＡＲ−Ｔ細胞がん療法を受けていない被験体のサイトカイン量と比較する。別の実施形態では、測定したサイトカイン量をアポトーシス細胞またはアポトーシス上清を投与されていない被験体のサイトカイン量と比較する。さらに別の実施形態では、測定したサイトカイン量を対照被験体と比較する。
【０５５７】
別の実施形態では、被験体の炎症誘発性サイトカインの量はＣＡＲ−Ｔ細胞がん療法を受けているが前記アポトーシス細胞もしくは前記アポトーシス細胞上清またはそれらの組成物を投与されていない被験体に比べて少なくなる。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞がん療法を受けているが前記アポトーシス細胞もしくは前記アポトーシス細胞上清またはそれらの組成物を投与されていない被験体に比べて少なくとも１種の炎症誘発性サイトカインの産生量を低減または阻害する。
【０５５８】
別の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、さらなる薬剤の投与をさらに含んでもよい。あるいは、本明細書に開示されている方法はさらなる薬剤であってアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清ではない薬剤の投与を含んでもよい。さらなる実施形態では、さらなる薬剤はＣＡＲ−Ｔ細胞がん療法を強化もしくは改善またはそれらの組み合わせをもたらす化合物または組成物であってもよい。さらなる実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞がん療法を強化または改善するさらなる薬剤としては、ＣＴＬＡ−４遮断薬、α１アンチトリプシンまたはその機能性断片もしくは類似体、テルル系化合物、あるいは免疫調節剤、あるいはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。別の実施形態では、さらなる薬剤としてはアポトーシス細胞またはアポトーシス上清が挙げられる。別の実施形態では、本明細書に記載されているように、さらなる薬剤の投与は前記ＣＡＲ−Ｔ細胞がん療法の前または後、あるいは前記ＣＡＲ−Ｔ細胞がん療法と同時である。
【０５５９】
実施形態によっては、本明細書に開示されている組成物および方法と共にＩＬ−６受容体拮抗薬（一実施形態ではトシリズマブ）を用いる。
【０５６０】
実施形態によっては、養子移植されたＴ細胞はよりリンパ球が減少している宿主に生着しより効率的に増殖する。したがって、実施形態によっては、被験体のリンパ球を枯渇させてからＣＡＲ−Ｔ細胞または他の遺伝子改変免疫細胞を移植する。別の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞を受けた被験体はＴ細胞を支持するサイトカインを与えられる。
【０５６１】
実施形態によっては、Ｔ細胞はエフェクターＴ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞はナイーブＴ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞はセントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞はＴｈ１７細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞はＴステムメモリー細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞は高い複製能力を持つ。別の実施形態では、Ｔ細胞増殖は患者の体内で起こる。別の実施形態では、少数の細胞を患者に移植してもよい。別の実施形態では、Ｔ細胞増殖はインビトロで起こる。別の実施形態では、多数の細胞を患者に移植してもよく、細胞および／または上清を何度も患者に移植してもよく、それらを組み合わせてもよい。
【０５６２】
実施形態によっては、ＣＡＲ−Ｔ細胞の利点は、細胞表面分子に特異的であるため腫瘍組織適合複合体（ＭＨＣ）に限定されたＴＣＲ認識という制限を克服し、抗原提示またはヒト白血球抗原発現の障害による腫瘍のエスケープ（逸脱）を回避する点である。
【０５６３】
実施形態によっては、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかを被験体に投与する工程を含む、前記被験体の腫瘍負荷を低減する方法を本明細書に開示する。
【０５６４】
実施形態によっては、腫瘍負荷の低減は被験体の腫瘍細胞数の減少を包含する。別の実施形態では、腫瘍負荷の低減は被験体の腫瘍を小さくすることを包含する。別の実施形態では、腫瘍負荷の低減は被験体の腫瘍の根絶を包含する。
【０５６５】
別の実施形態では、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかを被験体に投与する工程を含む、前記被験体の腫瘍細胞死を誘導する方法を本明細書に開示する。別の実施形態では、本明細書に開示されている被験体の腫瘍細胞死を誘導する方法は、操作されたキメラ抗原受容体を含むＮＫ細胞またはＴ細胞などの免疫細胞を少なくとも１種のさらなる薬剤と共に投与することによって被験体の有毒なサイトカイン放出すなわち「サイトカイン放出症候群」（ＣＲＳ）もしくは「重症サイトカイン放出症候群」（ｓＣＲＳ）、または「サイトカイン急増」を低減する工程を含む。
【０５６６】
別の実施形態では、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかを被験体に投与する工程を含む、新生物を有する前記被験体の生存期間を延ばすか長くする方法を本明細書に開示する。別の実施形態では、被験体の生存期間を延ばすか長くする方法は、操作されたキメラ抗原受容体を含むＮＫ細胞またはＴ細胞などの免疫細胞を少なくとも１種のさらなる薬剤と共に投与することによって被験体の有毒なサイトカイン放出すなわち「サイトカイン放出症候群」（ＣＲＳ）もしくは「重症サイトカイン放出症候群」（ｓＣＲＳ）、または「サイトカイン急増」を低減する工程を含む。
【０５６７】
別の実施形態では、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかを被験体に投与する工程を含む、新生物を有する前記被験体の生存期間を延ばすか長くする方法を本明細書に開示する。
【０５６８】
実施形態によっては、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかまたは組成物の組み合わせを被験体に投与する工程を含む、被験体のがんの進行を遅らせる方法を本明細書に開示する。実施形態によっては、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかまたは組成物の組み合わせを被験体に投与する工程を含む、被験体の白血病もしくはリンパ腫の進行を遅らせる方法を本明細書に開示する。実施形態によっては、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかまたは組成物の組み合わせを被験体に投与する工程を含む、がんもしくは腫瘍を患っている被験体の生存期間を延ばす方法を本明細書に開示する。実施形態によっては、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかまたは組成物の組み合わせを被験体に投与する工程を含む、白血病もしくはリンパ腫を患っている被験体の生存期間を延ばす方法を本明細書に開示する。実施形態によっては、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかまたは組成物の組み合わせを被験体に投与する工程を含む、被験体の腫瘍細胞負荷を低減する方法を本明細書に開示する。実施形態によっては、肝臓および骨髄の腫瘍負荷が小さくなる。
【０５６９】
別の実施形態では、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかまたは組成物の組み合わせを被験体に投与する工程を含む、被験体の新生物を予防する方法を本明細書に開示する。実施形態によっては、この新生物は、血液がん、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫、リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、あるいはそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０５７０】
別の実施形態では、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかを被験体に投与する工程を含む、治療が必要な被験体の血液がんを治療する方法を本明細書に開示する。実施形態によっては、この血液がんはＢ細胞白血病、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病、および非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される。
【０５７１】
実施形態によっては、投与はＣＡＲ−Ｔ細胞を含む組成物の投与を含む。実施形態によっては、投与は初期アポトーシス細胞を含む組成物の投与を含む。実施形態によっては、投与は初期アポトーシス細胞から得た上清を含む組成物の投与を含む。実施形態によっては、投与は本明細書に記載の組成物の組み合わせの投与を含む。実施形態によっては、投与は、ＣＡＲ−Ｔ細胞とアポトーシス細胞を同一または別の組成物で投与することを含む。実施形態によっては、投与はＣＡＲ−Ｔ細胞を本明細書に記載のさらなる薬剤と併用投与することを含む。実施形態によっては、投与はアポトーシス細胞と抗体またはその断片を同一または別の組成物で投与することを含む。
【０５７２】
実施形態によっては、併用療法は相乗効果をもたらす。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞をＣＡＲ−Ｔ細胞と組み合わせて用いる方法により、ＣＡＲ−Ｔ細胞を単独で用いる場合に比べてＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性が高くなる。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞をＣＡＲ−Ｔ細胞と組み合わせて用いる方法により、ＣＡＲ−Ｔ細胞を単独で用いる場合に比べてがんもしくは腫瘍を患っている被験体の生存期間が延びる。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞をＣＡＲ−Ｔ細胞と組み合わせて用いる方法により、ＣＡＲ−Ｔ細胞を単独で用いる場合に比べてリンパ腫もしくは白血病を患っている被験体の生存期間が延びる。
【０５７３】
実施形態によっては、初期アポトーシス細胞を抗体またはその断片と組み合わせて用いる方法により、アポトーシス細胞または抗体を単独で用いる場合に比べてがんの発症もしくは腫瘍の出現が遅くなる。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞を抗体またはその断片と組み合わせて用いる方法により、アポトーシス細胞または抗体を単独で用いる場合に比べてがんの進行が遅くなる。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞を抗体またはその断片と組み合わせて用いる方法により、アポトーシス細胞または抗体を単独で用いる場合に比べて腫瘍の成長が遅くなる。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞を抗体またはその断片と組み合わせて用いる方法により、アポトーシス細胞または抗体を単独で用いる場合に比べてがんもしくは腫瘍を患っている被験体の生存期間が延びる。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞を抗体またはその断片と組み合わせて用いる方法により、アポトーシス細胞または抗体を単独で用いる場合に比べてリンパ腫もしくは白血病を患っている被験体の生存期間が延びる。
【０５７４】
実施形態によっては、初期アポトーシス細胞をＲｔＸを含む抗体またはその断片と組み合わせて投与する工程を含む使用方法により、アポトーシス細胞または抗体を単独で用いる場合に比べてがんの発症もしくは腫瘍の出現が遅くなる。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞をＲｔＸを含む抗体またはその断片と組み合わせて用いる方法により、アポトーシス細胞または抗体を単独で用いる場合に比べてがんの進行が遅くなる。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞をＲｔＸを含む抗体またはその断片と組み合わせて用いる方法により、アポトーシス細胞または抗体を単独で用いる場合に比べて腫瘍の成長が遅くなる。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞をＲｔＸを含む抗体またはその断片と組み合わせて用いる方法により、アポトーシス細胞または抗体を単独で用いる場合に比べてがんもしくは腫瘍を患っている被験体の生存期間が延びる。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞をＲｔＸを含む抗体またはその断片と組み合わせて用いる方法により、アポトーシス細胞または抗体を単独で用いる場合に比べてリンパ腫もしくは白血病を患っている被験体の生存期間が延びる。
【０５７５】
実施形態によっては、本明細書に記載の使用方法は腫瘍量を低減する。当業者は認識していることであるが、「腫瘍量」という用語は癌細胞の数、腫瘍の大きさ、または体内のがんの量を意味する場合がある。「腫瘍量」という用語は「腫瘍負荷」という用語と全く同じ意味と質をもって互換的に用いることができる。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞の投与を含む使用方法は、アポトーシス細胞を投与されていない被験体に比べて、被験体の癌細胞の数を減らす、被験体の腫瘍を小さくする、被験体の体内のがんの量を減らす、あるいはそれらの任意の組み合わせを達成する。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞を抗体またはその断片と組み合わせて投与する工程を含む使用方法は、アポトーシス細胞を投与されていない、抗体を投与されていない、あるいはそれらの組み合わせの被験体に比べて被験体の癌細胞の数を減らす、被験体の腫瘍を小さくする、被験体の体内のがんの量を減らす、あるいはそれらの任意の組み合わせを達成する。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞をＲｔＸ抗体またはその断片と組み合わせて投与する工程を含む使用方法は、アポトーシス細胞、ＲｔＸ抗体、またはそれらの組み合わせを投与されていない被験体に比べて、被験体の癌細胞の数を減らす、被験体の腫瘍を小さくする、被験体の体内のがんの量を減らす、またはそれらの任意の組み合わせを達成する。
【０５７６】
実施形態によっては、本明細書に開示されている、サイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を患っているかサイトカイン放出症候群またはサイトカイン急増を患い易い被験体のサイトカイン生成を低減または阻害する方法は、サイトカイン生成を低減または阻害する。別の実施形態では、この方法は炎症誘発性サイトカインの生成を低減または阻害する。さらなる実施形態では、この方法は少なくとも１種の炎症誘発性サイトカインを低減または阻害する。被験体がＣＡＲ−Ｔ細胞がん療法を受けている別の実施形態では、この方法はＣＡＲ−Ｔ細胞療法の有効性を損ねない。
【０５７７】
本明細書で提供される方法は、本明細書に開示されているＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＣＴＬ細胞を所望の効果を達成するための有効量で投与する工程を含み、所望の効果は既存の病気の緩和、または再発の予防である。治療について、投与される量は所望の効果を生み出すのに有効な量である。有効量は、一回の投与または一連の投与で提供できる。有効量は急速投与または連続潅流によって提供できる。
【０５７８】
当業者は認識していることであるが、「有効量」（または「治療に有効な量」）は、治療時に有益なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量を包含し得る。有効量は、１回以上の用量で被験体に投与できる。治療について、有効量は、疾患を緩和するか、寛解するか、安定化するか、疾患の進行を戻すか遅らせるか、そうでなければ疾患の病理学的結果を軽減するのに十分な量である。有効量は一般に、医師によって個別の基準で決定され、当業者の技能の範囲内である。有効量を達成するための適切な投与量を決定する際、一般にいくつかの要因が考慮される。これらの要因としては、被験体の年齢、性別、体重、治療される病気、病気の重症度、投与される抗原結合断片の形態および有効濃度が挙げられる。
【０５７９】
一実施形態では、本明細書に開示されている方法は、一つの組成物に含まれる、遺伝子改変細胞とさらなる薬剤またはそれらの組み合わせとを含む組成物を投与する工程を含む。別の実施形態では、方法は、一つの組成物に含まれる、ＣＡＲ−Ｔ細胞とさらなる薬剤またはそれらの組み合わせとを含む組成物を投与する工程を含む。別の実施形態では、方法は、一つの組成物に含まれる、ＴＣＲ−Ｔ細胞とさらなる薬剤またはそれらの組み合わせとを含む組成物を投与する工程を含む。
【０５８０】
一実施形態では、本明細書に開示されている方法は、少なくとも２つの組成物に含まれる、遺伝子改変細胞とさらなる薬剤またはそれらの組み合わせとを含む組成物を投与する工程を含む。別の実施形態では、方法は、少なくとも２つの組成物に含まれる、ＣＡＲ−Ｔ細胞とさらなる薬剤またはそれらの組み合わせとを含む組成物を投与する工程を含む。別の実施形態では、方法は、少なくとも２つの組成物に含まれる、ＴＣＲ−Ｔ細胞とさらなる薬剤またはそれらの組み合わせとを含む組成物を投与する工程を含む。
【０５８１】
抗原特異的Ｔ細胞（例えばＣＡＲ−Ｔ細胞）を用いる養子免疫療法については、一般に１０６個〜１０１０個の範囲（例えば１０９個）の細胞用量を注入する。宿主への遺伝子改変細胞の投与およびその後の分化の際、特定の抗原に特異的に向けられたＴ細胞が誘導される。Ｔ細胞の「誘導」は欠失またはアネルギーなどによる抗原特異的Ｔ細胞の不活化を含む場合がある。不活化は、自己免疫障害などの耐性を確立または再確立するのに特に有用である。改変細胞は、当技術分野で公知の任意の方法で投与でき、その例としては、静脈投与、皮下投与、リンパ節内投与、腫瘍内投与、髄腔内投与、胸膜内投与、腹腔内投与、胸腺への直接投与などが挙げられるがこれらに限定されない。実施形態によっては、Ｔ細胞は腹腔内投与されない。実施形態によっては、Ｔ細胞は腫瘍内投与される。
【０５８２】
本明細書に開示されている遺伝子改変免疫応答性細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｎ細胞、ＣＴＬ細胞、またはそれらの前駆細胞）を含む組成物は、新生物、病原感染、または感染症の治療のために被験体に全身投与または直接投与できる。実施形態によっては、本明細書に開示されている細胞は目的器官（例えば新生物に冒された器官）に直接注射される。あるいは、遺伝子改変免疫応答性細胞を含む組成物は、例えば循環系（例えば腫瘍脈管構造）に投与することによって、目的器官に間接的に提供される。増殖剤および分化剤を細胞の投与前、投与中、または投与後に提供して、インビトロまたはインビボでのＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＣＴＬ細胞の生成を増やすことができる。
【０５８３】
上記のとおり、本明細書に開示されている方法では、さらなる薬剤を含む組成物は遺伝子改変免疫細胞の投与の前、投与と同時、または投与の後に提供されてもよい。一実施形態では、本明細書に開示されている方法では、遺伝子改変免疫細胞（例えばＣＡＲ−Ｔ細胞）は本明細書に開示されているさらなる薬剤の前に投与される。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法では、遺伝子改変免疫細胞（例えばＣＡＲ−Ｔ細胞）は本明細書に開示されているさらなる薬剤と同時に投与される。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法では、遺伝子改変免疫細胞（例えばＣＡＲ−Ｔ細胞）はさらなる薬剤の投与の後に投与される。
【０５８４】
一実施形態では、本明細書に開示されている方法は、本明細書に開示されているアポトーシス細胞を含む組成物を投与する。別の実施形態では、本明細書に開示されている方法は、本明細書に開示されているアポトーシス細胞上清を含む組成物を投与する。
【０５８５】
改変細胞は、生理学的に許容される溶媒に溶かして通常は血管内投与できるが、細胞が再生および分化に適した部位（胸腺など）を見つけることができる骨または他の好都合な部位に導入することもできる。通常、少なくとも１×１０５個の細胞を投与し、最終的に１×１０１０個以上に達する。本明細書に開示されている遺伝子改変免疫応答性細胞は精製された細胞集団を含んでもよい。当業者は、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）など様々な周知の方法を用いて集団における遺伝子改変免疫応答性細胞の割合を容易に決定できる。実施形態によっては、遺伝子改変免疫応答性細胞を含む集団における純度の範囲は約５０〜約５５％、約５５〜約６０％、および約６５〜約７０％である。他の実施形態では、純度は約７０〜約７５％、約７５〜約８０％、約８０〜約８５％である。さらなる実施形態では、純度は約８５〜約９０％、約９０〜約９５％、および約９５〜約１００％である。投与量は当業者によって容易に調節できる（例えば、純度を下げると投与量を増やす必要がある可能性がある）。細胞は注射、カテーテルなどによって導入できる。必要であれば、因子も含むことができる。因子としてはインターロイキン（例えばＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−ＩＳ、ＩＬ−２１、および他のインターロイキン）、コロニー刺激因子（顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）など）、インターフェロン（例えばγインターフェロン）、ならびにエリスロポエチンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５８６】
組成物は、遺伝子改変免疫応答性細胞またはそれらの前駆細胞と医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を包含する。投与は、自家投与でも異種投与でもよい。例えば、免疫応答性細胞またはその前駆細胞を１体の被験体から得て同一の被験体または適合する別の被験体に投与できる。本明細書に開示されている末梢血由来の免疫応答性細胞またはその子孫細胞（例えばインビボ、エクスビボ、またはインビトロで得られたもの）はカテーテル投与などの局所注射、全身注射、局所注射、静脈注射、または非経口投与によって投与できる。本明細書に開示されている治療組成物（例えば遺伝子改変免疫応答性細胞を含む医薬組成物）を投与する場合、それは一般に単位服用量の注射剤形（溶液剤、懸濁剤、乳剤）で製剤される。
【０５８７】
別の実施形態では、本明細書に開示されているＣＡＲ−Ｔ細胞または他の免疫細胞とアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清とを含む組成物を製造する方法を本明細書に開示する。この方法は、目的抗原に結合するＣＡＲをコードする核酸配列をＴ細胞または免疫細胞に導入する工程を含む。代替的な実施形態では、本明細書に開示されているＣＡＲ−Ｔ細胞または他の免疫細胞を含む組成物は、アポトーシス細胞またはアポトーシス上清を含む組成物とは別である。
【０５８８】
一実施形態では、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）とアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清とを含む組成物を投与する工程を含む、悪性腫瘍の治療、予防、阻害、発生の低減、寛解、または緩和の方法を本明細書に開示する。
【０５８９】
当業者は認識していることであるが、遺伝子改変免疫細胞（例えばＣＡＲ改変Ｔ細胞）により誘発される抗腫瘍免疫応答は、能動的免疫応答であっても受動的免疫応答であってもよい。また、ＣＡＲによる免疫応答は、ＣＡＲ改変Ｔ細胞がＣＡＲの抗原結合部分に特異的な免疫応答を誘導する養子免疫療法の手法の一部であってもよい。
【０５９０】
当業者は認識していることであるが、免疫療法は、免疫エフェクター細胞および分子を使用して癌細胞を標的にして破壊することを包含し得る。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞表面のいくつかのマーカーに特異的な抗体であってもよい。抗体単独で治療のエフェクターとして機能してもよいし、他の細胞を動員することで実際に細胞殺傷を実行してもよい。抗体はさらに、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に結合されて単に標的化剤として機能してもよい。あるいは、エフェクターは腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を運ぶリンパ球であってもよい。様々なエフェクター細胞としては細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が挙げられる。
【０５９１】
実施形態によっては、本明細書に開示されている初期アポトーシス細胞およびその組成物は、当技術分野で公知の任意の血液腫瘍の治療、予防、成長の阻害、または発生の低減に用いられてもよい。実施形態によっては、本明細書に開示されている初期アポトーシス細胞およびその組成物は、当技術分野で公知の任意のびまん性がん（例えば、固形腫瘍が乳房に形成されないびまん性乳がんが挙げられるがこれに限定されない）の治療、予防、成長の阻害、または発生の低減に用いられてもよい。実施形態によっては、本明細書に開示されている初期アポトーシス細胞およびその組成物は、当技術分野で公知の任意の血液腫瘍の生存期間を延長するのに用いられてもよい。実施形態によっては、本明細書に開示されている初期アポトーシス細胞およびその組成物は、当技術分野で公知の任意のびまん性がん（例えば、固形腫瘍が乳房に形成されないびまん性乳がんが挙げられるがこれに限定されない）の生存期間を延長するのに用いられてもよい。
【０５９２】
実施形態によっては、本明細書に開示されている初期アポトーシス細胞およびその組成物は、当技術分野で公知の任意の血液腫瘍を患っている被験体の生存期間を延ばすのに用いられてもよい。実施形態によっては、本明細書に開示されている初期アポトーシス細胞およびその組成物は、当技術分野で公知の任意のびまん性がん（例えば、固形腫瘍が乳房に形成されないびまん性乳がんが挙げられるがこれに限定されない）を患っている被験体の生存期間を延ばすのに用いられてもよい。
【０５９３】
実施形態によっては、本明細書に開示されている初期アポトーシス細胞およびその組成物は、当技術分野で公知の任意の血液腫瘍の成長速度を低減するのに用いられてもよい。実施形態によっては、本明細書に開示されている初期アポトーシス細胞およびその組成物は、当技術分野で公知の任意のびまん性がん（例えば、固形腫瘍が乳房に形成されないびまん性乳がんが挙げられるがこれに限定されない）の成長速度を低減するのに用いられてもよい。
【０５９４】
実施形態によっては、治療される腫瘍もしくはがんは腫瘍もしくはがんの転移を包含する。実施形態によっては、本明細書の使用方法は腫瘍もしくはがんの転移を予防または低減する。実施形態によっては、本明細書の使用方法は、転移の成長を阻害するか転移の発生を低減する。
【０５９５】
実施形態によっては、被験体はヒト被験体である。実施形態によっては、被験体は小児である。実施形態によっては、被験体は成人である。実施形態によっては、被験体は哺乳動物である。
【０５９６】
実施形態によっては、本明細書に開示されている方法は、上で詳細に説明された単核富化細胞集団を含む初期アポトーシス細胞集団を投与する工程を含む。実施形態によっては、本明細書に開示されている方法は、安定な細胞集団を含む初期アポトーシス細胞集団を投与する工程を含み、前記細胞集団は２４時間よりも長く安定である。安定な初期アポトーシス細胞の集団については上で詳細に説明されている。実施形態によっては、本明細書に開示されている方法は、細胞凝集体のない細胞集団を含む初期アポトーシス細胞集団を投与する工程を含む。凝集体のない初期アポトーシス細胞集団およびそれらを作製する方法については上で詳細に説明されている。
【０５９７】
実施形態によっては、本明細書に開示されている方法は、必要な被験体に自己の（自家性の）初期アポトーシス細胞集団を投与する工程を含む。実施形態によっては、本明細書に開示されている方法は、必要な被験体に同種異系の初期アポトーシス細胞集団を投与する工程を含む。
【０５９８】
実施形態によっては、初期アポトーシス細胞集団またはその組成物の投与方法は、前記アポトーシス細胞集団またはその組成物の単回注入を投与する工程を含む。実施形態によっては、単回注入はがんもしくは腫瘍のリスクがあると予め判断された被験体に予防薬として投与されてもよい。実施形態によっては、単回注入はがんもしくは腫瘍を有する被験体に治療処置の一環として定期的に投与されてもよい。実施形態によっては、単回注入はがんもしくは腫瘍を有する被験体に、転移がんを予防し、転移がんのリスクを低減し、または転移がんの出現を遅らせるための予防薬として投与されてもよい。
【０５９９】
実施形態によっては、初期アポトーシス細胞集団またはその組成物の投与方法は、前記アポトーシス細胞集団またはその組成物の複数回注入を投与する工程を含む。実施形態によっては、複数回注入はがんもしくは腫瘍のリスクがあると予め判断された被験体に予防薬として投与されてもよい。実施形態によっては、複数回注入はがんもしくは腫瘍を有する被験体に治療処置の一環として定期的に投与されてもよい。実施形態によっては、複数回注入はがんもしくは腫瘍を有する被験体に、転移がんを予防し、転移がんのリスクを低減し、または転移がんの出現を遅らせるための予防薬として投与されてもよい。
【０６００】
実施形態によっては、複数回注入は少なくとも２回の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は２回の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は３回以上の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は少なくとも３回の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は３回の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は４回以上の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は少なくとも４回の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は４回の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は５回以上の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は少なくとも５回の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は５回の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は６回以上の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は少なくとも６回の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は６回の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は７回以上の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は少なくとも７回の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は７回の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は８回以上の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は少なくとも８回の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は８回の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は９回以上の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は少なくとも９回の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は９回の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は１０回以上の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は少なくとも１０回の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は１０回の注入を含む。実施形態によっては、複数回注入は１１回以上の注入を含む。
【０６０１】
実施形態によっては、複数回注入はより少量の初期アポトーシス細胞を含み、投与される細胞の総投与量は各注入の合計である。
【０６０２】
実施形態によっては、複数回注入は数時間かけて投与される。実施形態によっては、複数回注入は数日間かけて投与される。実施形態によっては、複数回注入は数時間かけて投与され、各注入の間に少なくとも１２時間ある。実施形態によっては、複数回注入は数時間かけて投与され、各注入の間に少なくとも２４時間ある。実施形態によっては、複数回注入は数時間かけて投与され、各注入の間に少なくとも１日ある。実施形態によっては、複数回注入は数時間かけて投与され、各注入の間に少なくとも２日間ある。実施形態によっては、複数回注入は数時間かけて投与され、各注入の間に少なくとも３日間ある。実施形態によっては、複数回注入は数時間かけて投与され、各注入の間に少なくとも４日間ある。実施形態によっては、複数回注入は数時間かけて投与され、各注入の間に少なくとも５日間ある。実施形態によっては、複数回注入は数時間かけて投与され、各注入の間に少なくとも６日間ある。実施形態によっては、複数回注入は数時間かけて投与され、各注入の間に少なくとも７日間ある。実施形態によっては、複数回注入は数時間かけて投与され、各注入の間に少なくとも１週間ある。実施形態によっては、複数回注入は数時間かけて投与され、各注入の間に少なくとも２週間ある。
【０６０３】
実施形態によっては、複数回注入に含まれる細胞の量はそれぞれ本質的に同じである。実施形態によっては、複数回注入に含まれる細胞の量はそれぞれ異なる。
【０６０４】
実施形態によっては、本明細書に記載の方法はさらなる化学療法剤または免疫調節剤を前記被験体に投与する工程をさらに含む。
【０６０５】
実施形態によっては、さらなる化学療法剤または免疫調節剤は初期アポトーシス細胞と同時または本質的に同時に投与される。実施形態によっては、さらなる化学療法剤または免疫調節剤は初期アポトーシス細胞と同一の組成物に含まれる。実施形態によっては、さらなる化学療法剤または免疫調節剤は初期アポトーシス細胞と別の組成物に含まれる。
【０６０６】
実施形態によっては、さらなる化学療法剤または免疫調節剤は初期アポトーシス細胞の投与の前に投与される。実施形態によっては、さらなる化学療法剤または免疫調節剤は初期アポトーシス細胞の投与の後に投与される。
【０６０７】
実施形態によっては、化学療法剤は、アルキル化剤、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、テトラジン、アジリジン、シスプラチンおよび誘導体、非古典的なアルキル化剤、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、ブスルファン、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチル尿素（ＭＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（ＭｅＣＣＮＵ）、フォテムスチン、ストレプトゾトシン、ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロミド、チオテパ、マイトマイシン、ジアジコン（ＡＺＱ）、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、代謝拮抗剤、葉酸代謝拮抗剤、メトトレキサート、ペメトレキセド、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、カペシタビン、デオキシヌクレオシド類似体、シタラビン、ゲムシタビン、デシタビン、アザシチジン、フルダラビン、ネララビン、クラドリビン、クロファラビン、およびペントスタチン、チオプリン、チオグアニン、メルカプトプリン、抗微小管剤、ビンカアルカロイド、タキサン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、準合成ビンカアルカロイド、ビノレルビン、ビンデシン、ビンフルニン、パクリタキセル、ドセタキセル、ポドフィロトキシン、エトポシド、テニポシド、トポイソメラーゼ阻害剤、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、エトポシド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、テニポシド、触媒阻害剤、ノボビオシン、メルバロン、アクラルビシン、細胞傷害性抗生物質、アントラサイクリン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、アクチノマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アントラサイクリン、ピラルビシン、アクラルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、マイトマイシン、標的治療、モノクローナル抗体、ネイキッドモノクローナル抗体、結合型モノクローナル抗体、化学標識抗体、二重特異性モノクローナル抗体、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０６０８】
実施形態によっては、免疫調節剤は抗体またはその機能性断片を包含する。実施形態によっては、抗体またはその機能性断片はモノクローナル抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、またはＦｖ断片を包含する。
【０６０９】
実施形態によっては、本明細書に開示されているポリペプチドまたはペプチドドメインのうちのいずれか１つの活性断片を本明細書に開示する。当業者は認識していることであるが、「断片」という用語は、少なくとも５、１０、１３、または１５個のアミノ酸を包含してもよい。他の実施形態では、断片は少なくとも２０個の連続したアミノ酸である。本明細書に開示されている断片は、当業者に公知の方法で生成でき、あるいは通常のタンパク質プロセシング（例えば生物活性に必要のない新生ポリペプチドからのアミノ酸の除去、あるいは選択的ｍＲＮＡスプライシングまたは選択的タンパク質プロセシングによるアミノ酸の除去）によって得られてもよい。
【０６１０】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、最も広い意味で互換的に用いられ、具体的には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または抗体の結合活性を保持するそれらの任意の断片を指す。特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体の使用を含む。
【０６１１】
実施形態によっては、「抗体」という用語は、本明細書に記載の所望の標的と特異的に相互作用できる、例えば食細胞に結合できる、未変化の分子およびその機能的断片（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖなど）を指す。実施形態によっては、抗体断片は以下を含む。
【０６１２】
（１）Ｆａｂ：抗体分子の一価の抗原結合断片を含む断片であり、抗体全体を酵素パパインで消化して未変化の軽鎖と１つの重鎖の一部を生成することによって生成される；
【０６１３】
（２）Ｆａｂ’：抗体全体をペプシンで処理した後、還元して未変化の軽鎖と重鎖の一部を生成することによって得られる抗体分子の断片であり、抗体１分子から２つのＦａｂ’断片が得られる；
【０６１４】
（３）（Ｆａｂ’）２：抗体全体を酵素ペプシンで処理した後に還元せずに得られる抗体の断片であり、Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって結合された２つのＦａｂ’断片の二量体である；
【０６１５】
（４）Ｆｖ：二本鎖として発現された軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む遺伝子操作された断片；および
【０６１６】
（５）単鎖抗体（「ＳＣＡ」）：軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む遺伝子操作された分子であり、適切なポリペプチドリンカーによって遺伝子融合された単鎖分子として連結されている。
【０６１７】
これらの断片を作製する方法は当技術分野で公知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８を参照のこと。同文献を本明細書に援用する）。
【０６１８】
実施形態によっては、抗体断片は抗体をタンパク質加水分解することで、あるいは、その断片をコードするＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞培養物または他のタンパク質発現系）で発現することで調製できる。
【０６１９】
抗体断片は、実施形態によっては、従来の方法で抗体全体をペプシンまたはパパインで消化することにより得られる。例えば、抗体断片はペプシンで抗体を酵素切断しＦ（ａｂ’）２と示される５Ｓ断片を得ることによって作製できる。この断片を、チオール還元剤、および必要に応じてジスルフィド結合の切断によって生じるスルフヒドリル基の保護基を用いてさらに切断することによって、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価断片を作製できる。あるいは、ペプシンを用いた酵素切断により、２つの一価のＦａｂ’断片とＦｃ断片を直接作製できる。これらの方法は、例えばＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，０３６，９４５号および４，３３１，６４７号、ならびにそれらの文献に含まれる参照文献に記載されている。これらの特許の全内容を本明細書に援用する。Ｐｏｒｔｅｒ，  Ｒ．Ｒ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ７３：  １１９−１２６，  １９５９も参照のこと。抗体を切断する他の方法、例えば重鎖を分離して一価の軽鎖−重鎖断片を形成すること、断片をさらに切断すること、または他の酵素的、化学的、もしくは遺伝的技術も、未変化の抗体によって認識される抗原に断片が結合する限り、用いることができる。
【０６２０】
Ｆｖ断片はＶＨ鎖とＶＬ鎖の結合を含む。Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ６９：２６５９−６２，  １９７２に記載されているように、この結合は非共有結合であってもよい。あるいは、可変鎖は分子間ジスルフィド結合によって結合されるか、グルタルアルデヒドなどの化学物質によって架橋される。好ましくは、Ｆｖ断片はペプチドリンカーによって接続されたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む。これらの一本鎖の抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって接続されたＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。この構造遺伝子を発現ベクターに挿入し、次いで大腸菌などの宿主細胞に導入する。この組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一のポリペプチド鎖を合成する。例えば、ｓＦｖを作成する方法は、例えばＷｈｉｔｌｏｗ  ａｎｄ  Ｆｉｌｐｕｌａ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２：  ９７−１０５，  １９９１；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，  １９８８；Ｐａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１−７７，  １９９３；およびＬａｄｎｅｒらによる米国特許第４，９４６，７７８号（全内容を本明細書に援用する）に記載されている。
【０６２１】
抗体断片の別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、目的抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって取得できる。このような遺伝子は、例えばポリメラーゼ連鎖反応を用いて抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｆｒｙ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２：１０６−１０，  １９９１を参照のこと。
【０６２２】
実施形態によっては、本明細書に記載の抗体または断片は抗体の「ヒト化形態」を包含してもよい。実施形態によっては、「抗体のヒト化形態」という用語は、ヒト以外の免疫グロブリン由来の最小配列を含む、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体のその他の抗原結合のサブ配列）のキメラ分子である非ヒト（例えばマウス）抗体を指す。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基を所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置き換えたものを包含する。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は対応する非ヒト残基によって置き換えられる。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見られない残基を含んでもよい。ヒト化抗体は一般に、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全体を含み、ＣＤＲ領域の全体または実質的に全体は非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全体または実質的に全体はヒト免疫グロブリン共通配列のＦＲ領域である。最適には、ヒト化抗体は免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（一般にヒト免疫グロブリンのＦｃ）の少なくとも一部も含む。［Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  ２：５９３−５９６（１９９２）］
【０６２３】
非ヒト抗体をヒト化する方法は当技術分野で周知である。一般にヒト化抗体は、ヒト以外である供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は移入残基と呼ばれることが多く、一般には移入可変ドメインから得られる。ヒト化は本質的にＷｉｎｔｅｒらの方法［Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］に従い、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置き換えることによって実行できる。したがって、このようなヒト化抗体は未変化のヒト可変ドメインよりも実質的に少ない部分を対応する非ヒト由来の配列で置き換えたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は一般に、ヒト抗体のいくつかのＣＤＲ残基とおそらくいくつかのＦＲ残基を齧歯類抗体の類似の部位由来の残基で置換したものである。
【０６２４】
ヒト抗体はまた、ファージ提示ライブラリ［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２７：３８１（１９９１）；  Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２：５８１（１９９１）］などの当技術分野で公知の様々な技術を用いて作製できる。ＣｏｌｅらおよびＢｏｅｒｎｅｒらの技術もヒトモノクローナル抗体の調製に利用できる［Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（モノクローナル抗体とがん治療），  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  ｐ．  ７７（１９８５）、およびＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４７（１）：８６−９５（１９９１）］。同様に、ヒトは、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を遺伝子導入動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子を部分的または完全に不活化したマウス）に導入することによって作製できる。誘発すると、ヒト抗体生成が観察されるが、これは遺伝子再構成、アセンブリ、抗体レパートリーなどのあらゆる点で、ヒトで見られるものと非常によく似ている。この手法は、例えば米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号、および以下の科学技術刊行物に記載されている：Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，  ７７９−７８３（１９９２）；  Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９（１９９４）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８１２−１３（１９９４）；  Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，  ８４５−５１（１９９６）；  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，  ８２６（１９９６）；  Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３  ６５−９３（１９９５）。
【０６２５】
実施形態によっては、免疫調節剤は抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を包含する。実施形態によっては、この抗ＣＤ２０モノクローナル抗体はリツキシマブである。リツキシマブは市販されており、リツキサン（登録商標）の名称でＢｉｏｇｅｎとＧｅｎｅｎｔｅｃｈ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．によって共同で販売されている。
【０６２６】
実施形態によっては、本明細書に開示されている方法は第一選択療法を包含する。
【０６２７】
当業者は認識していることであるが、「第一選択療法」という用語は疾患について行われる第一の治療を包含し得る。これは、多くの場合、手術とそれに続く化学療法および放射線療法などの標準的な一連の治療の一部である。単独で使用する場合、第一選択療法は最良の治療法として認められた治療である。疾患が治癒しない、または重篤な副作用が発生する場合、他の治療を追加してもよいし代わりに使用してもよい。導入療法、一次療法、一次治療とも呼ばれる。
【０６２８】
実施形態によっては、本明細書に開示されている方法は補助療法を包含する。
【０６２９】
当業者は認識していることであるが、「補助療法」という用語は、一次治療または初期治療に加えて行われる治療を包含し得る。実施形態によっては、補助療法はさらなる治療に備えて一次治療の前に行われるさらなるがん治療を含んでもよい。実施形態によっては、補助療法は、がんが再発するリスクを低減するために一次治療の後に行われるさらなるがん治療を含んでもよい。補助療法としては、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、標的療法、または生物学的療法を挙げることができる。
【０６３０】
実施形態によっては、本明細書に開示されている方法は微小残存病変を減らし、寛解を増大させ、寛解の期間を延長し、腫瘍の再発率を減らし、前記腫瘍を小さくし、前記腫瘍もしくはがんの成長速度を下げ、前記腫瘍もしくはがんの転移を防止し、前記腫瘍もしくはがんのまたは転移率を減らし、またはそれらの任意の組み合わせの効果を持つ。
【０６３１】
当業者は認識していることであるが、「微小残存病変」という用語は、患者が疾患の症状もしくは徴候を持たない治療中または治療後に患者の体内に残っている少数の癌細胞を包含し得る。
【０６３２】
さらに、「寛解」という用語は、がんは体内にまだ存在するかもしれないが、がんの徴候および症状が減るかなくなることを包含し得る。実施形態によっては、寛解はがんの徴候および症状の全部ではなく一部がなくなった部分寛解を包含してもよい。実施形態によっては、寛解は、がんはまだ体内に存在するかもしれないが、がんの徴候および症状がすべてなくなった完全寛解を包含する。実施形態によっては、本明細書に開示されている方法は、初期アポトーシス細胞またはその組成物による初期療法によってがんの徴候または症状が減るかなくなる、寛解導入療法を包含してもよい。
【０６３３】
当業者は認識していることであるが、「再発」という用語は疾患または疾患の徴候および症状が好転期の後に再び現れることを包含し得る。実施形態によっては、本明細書で用いられる方法によって無再発生存期間が得られる。無再発生存期間は、がんの一次治療が終了した後に患者がそのがんの徴候または症状なしに生存できる期間を包含する。
【０６３４】
当業者は認識していることであるが、「転移」という用語は、癌細胞が最初に形成された場所から体の別の部分に広がることを包含する。転移では、癌細胞は元の（原発）腫瘍から離れ、血液系またはリンパ系経由で移動し、体の他の器官または組織に新たな腫瘍を形成する。実施形態によっては、新たな転移腫瘍は原発腫瘍と同種のがんである。例えば、乳がんが肺に広がった場合、肺にある癌細胞は乳がん細胞であり肺がん細胞ではない。
【０６３５】
悪性腫瘍
【０６３６】
実施形態によっては、がんもしくは腫瘍の治療、予防、阻害、発生の低減、寛解、または緩和の方法にはＣＡＲ−Ｔ細胞が用いられ、この方法はキメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）を投与する工程を含む。本明細書に開示されているように、これらの方法は、ＣＲＳまたはサイトカイン急増の発生を阻害または低減するためにさらなる薬剤を投与する工程をさらに含んでもよい。
【０６３７】
実施形態によっては、本明細書に開示されている方法は被験体の生存期間を延長する。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞集団を被験体に投与する工程を含む、びまん性がんを有する前記被験体の生存期間を延ばすか長くする方法を本明細書に開示する。この方法は被験体の生存期間を延ばす。
【０６３８】
実施形態によっては、がんはＢ細胞悪性腫瘍である。実施形態によっては、Ｂ細胞悪性腫瘍は白血病である。別の実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）である。別の実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は慢性リンパ性白血病である。
【０６３９】
実施形態によっては、がんは白血病である。実施形態によっては、がんはリンパ腫である。実施形態によっては、リンパ腫は大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。
【０６４０】
実施形態によっては、本明細書に記載の方法は、がんもしくは腫瘍を小さくするか成長速度を下げ、初期アポトーシス細胞集団を前記被験体に投与する工程を含み、この方法はがんもしくは腫瘍の大きさまたは成長速度を小さくする。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞集団を前記被験体に投与する工程を含む、びまん性がんの成長速度を下げる方法を本明細書に開示する。この方法はがんの成長速度を下げる。実施形態によっては、初期アポトーシス細胞集団を被験体に投与する工程を含む、固形がんもしくは固形腫瘍を小さくするか成長速度を下げる方法を本明細書に開示する。この方法は、固形がんもしくは固形腫瘍の大きさを小さくするか成長速度を下げる。
【０６４１】
実施形態によっては、がんは固形腫瘍を包含してもよい。実施形態によっては、固形腫瘍は、通常は嚢胞すなわち液状の領域を含まない異常な組織塊を包含する。固形腫瘍は良性（がんではない）であっても悪性腫瘍（がん）であってもよい。様々な種類の固形腫瘍はそれらを形成する細胞の種類に由来して名づけられている。固形腫瘍の例は、肉腫、細胞腫、およびリンパ腫である。白血病（血液のがん）は一般に固形腫瘍を形成しない。実施形態によっては、固形腫瘍は肉腫または細胞腫を包含する。
【０６４２】
実施形態によっては、固形腫瘍は、血液、骨髄、またはリンパ細胞以外の体組織細胞の異常な成長によって形成された新生物（細胞の新生）あるいは病変（解剖学的構造の損傷または生理機能の障害）である。実施形態によっては、固形腫瘍は異常な細胞塊からなり、肝臓、結腸、乳房、または肺などの様々な組織種に由来してもよく、最初はその細胞起源の器官で成長する。しかし、このようながんは、疾患の進行期には転移腫瘍の成長によって他の器官に広がる可能性がある。
【０６４３】
実施形態によっては、固形腫瘍の例は、肉腫、細胞腫、およびリンパ腫を包含する。実施形態によっては、固形腫瘍は肉腫または細胞腫を包含する。実施形態によっては、固形腫瘍は腹腔内腫瘍である。
【０６４４】
実施形態によっては、固形腫瘍は肺がん、乳がん、卵巣がん、胃がん、食道がん、子宮頚がん、頭頚部がん、膀胱がん、肝臓がん、および皮膚がんを包含するが、これらに限定されない。実施形態によっては、固形腫瘍は線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、膵がんまたは膵腫瘍、乳がんもしくは乳腺腫瘍、卵巣がんもしくは卵巣腫瘍、前立腺がんもしくは前立腺腫瘍、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭状腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝細胞がん、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性がん腫、ウィルムス腫瘍、子宮頚がんまたは頚部腫瘍、子宮がんもしくは子宮腫瘍、精巣がんもしくは精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、グリオーマ、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、シュワン腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫を含む。
【０６４５】
実施形態によっては、固形腫瘍は副腎皮質腫瘍（腺腫および細胞腫）、細胞腫、大腸がん、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、ユーイング肉腫、胚細胞性腫瘍、肝芽腫、肝細胞がん、メラノーマ、神経芽腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、横紋筋肉腫以外の軟部組織肉腫、およびウィルムス腫瘍を包含する。実施形態によっては、固形腫瘍は乳腺腫瘍である。別の実施形態では、固形腫瘍は前立腺がんである。別の実施形態では、固形腫瘍は結腸がんである。実施形態によっては、腫瘍は脳腫瘍である。別の実施形態では、腫瘍は膵腫瘍である。別の実施形態では、腫瘍は大腸腫瘍である。
【０６４６】
実施形態によっては、本明細書に開示されている初期アポトーシス細胞またはその組成物は、がんもしくは腫瘍、例えば肉腫および細胞腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭状腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝細胞がん、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性がん腫、ウィルムス腫瘍、子宮頚がん、子宮がん、精巣がん、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、グリオーマ、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、シュワン腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）に対し治療および／または予防上の有効性を持つ。
【０６４７】
実施形態によっては、本明細書に開示されている初期アポトーシス細胞およびその組成物は、当技術分野で公知の任意の固形腫瘍を治療し、固形腫瘍を予防し、固形腫瘍の成長を阻害し、あるいは固形腫瘍の発生を低減するために用いられてもよい。
【０６４８】
実施形態によっては、本明細書に開示されている初期アポトーシス細胞およびその組成物は、本明細書に開示されている、あるいは当技術分野で公知の任意の固形腫瘍を患っている被験体の生存期間を延ばすために用いられてもよい。
【０６４９】
実施形態によっては、本明細書に開示されている初期アポトーシス細胞およびその組成物は、本明細書に開示されている、あるいは当技術分野で公知の任意の固形腫瘍を小さくするか成長速度を下げるために用いられてもよい。
【０６５０】
実施形態によっては、がんはびまん性がんであってもよく、このがんは広範囲に広がっており、局在または限局していない。実施形態によっては、びまん性がんは非固形腫瘍を含んでもよい。びまん性がんの例としては白血病が挙げられる。白血病は骨髄などの造血組織に発生し、異常な血球が大量に生成されて血流に入るがんを含む。
【０６５１】
実施形態によっては、びまん性がんはＢ細胞悪性腫瘍を含む。実施形態によっては、びまん性がんは白血病を含む。実施形態によっては、がんはリンパ腫である。実施形態によっては、リンパ腫は大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。
【０６５２】
実施形態によっては、びまん性がんもしくは腫瘍は血液腫瘍を包含する。実施形態によっては、血液腫瘍は血液、骨髄、およびリンパ節を冒すがんの種類である。血液腫瘍は２つの主な血液細胞系列、すなわち骨髄およびリンパ球の細胞株のいずれに由来してもよい。骨髄系細胞株は通常、顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージ、およびマスト細胞を生成するが、リンパ系細胞株はＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、および形質細胞を産生する。リンパ腫（ホジキンリンパ腫など）、リンパ性白血病、および骨髄腫はリンパ系に由来するが、急性および慢性骨髄性白血病（ＡＭＬ、ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群、および骨髄増殖性疾患は骨髄起源である。
【０６５３】
実施形態によっては、非固形（びまん性）がんもしくは腫瘍は、造血器腫瘍、血液細胞がん、白血病、骨髄異形成症候群、リンパ腫、多発性骨髄腫（形質細胞性骨髄腫）、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、または形質細胞性白血病を含む。
【０６５４】
別の実施形態では、本明細書に開示されている初期アポトーシス細胞およびその組成物は、びまん性がんに対し治療上および／または予防上の有効性を持つ。びまん性がんは、例えば白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ワルデンストレーム高γグロブリン血症、重鎖病であるが、これらに限定されない。
【０６５５】
本明細書に開示される組成物および方法は、当技術分野で公知の任意の血液腫瘍の治療、予防、阻害、寛解、発生率の低減、または緩和に使用されてもよい。
【０６５６】
当業者は認識していることであるが、全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語の使用は、特定の実施形態では「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語の使用に置き換えられてもよい。当業者は認識していることであるが、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、その系は記載された構成要素を含むが他の任意であってもよい構成要素を排除しないことを意味するよう意図されている。例えば、組成物は初期アポトーシス細胞を含むが、この細胞集団に限定されない。さらに、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語は、記載された構成要素（例えば、初期アポトーシス細胞から本質的になる組成物）を含む方法を包含してもよいが、その方法の実行に本質的な有意な効果を持ち得る他の構成要素を排除する。したがって、このような組成物はさらに、がんの治療において本質的な活性を構成しない医薬的に許容される賦形剤を含んでもよい。さらに、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は微量のその他の構成要素以外を排除することを包含する。したがって、初期アポトーシス細胞からなる組成物は、本明細書に開示されている微量のその他の構成要素以外を含まない。
【０６５７】
実施形態によっては、本明細書に開示されている方法は、本明細書に記載の様々な治療および予防目的のための本明細書に記載の組成物の使用として、あるいは、本明細書に記載の様々な治療目的および予防目的のための医薬品または治療組成物または組成物の調製における本明細書に記載の組成物の使用として表されてもよい。
【０６５８】
実施形態によっては、本明細書に開示されている組成物および方法は様々な成分または工程を含む。しかし、別の実施形態では、本明細書に開示されている組成物および方法は様々な成分または工程から本質的になり、他の成分または工程が含まれてもよい。別の実施形態では、本明細書に開示されている組成物および方法は様々な成分または工程からなる。
【０６５９】
実施形態によっては、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、当技術分野で公知であってもよく組成物の有効性に影響する、組成物のその他の成分を含む。実施形態によっては、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語は、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）とアポトーシス細胞または任意のアポトーシス細胞上清とを有する組成物を包含する。しかし、組成物の有用性に直接関与しないその他の成分が含まれてもよい。実施形態によっては、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）という用語は、本明細書に開示されているキメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）とアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を本明細書に記載の任意の形態または実施形態で有する組成物を包含する。
【０６６０】
当業者は認識していることであるが、「約」という用語は、示された数値または数値範囲から０．０００１〜５％の逸脱を包含し得る。さらに、それは示された数値または数値範囲から１〜１０％の逸脱を包含し得る。また、それは示された数値または数値範囲から２５％までの逸脱を包含し得る。
【０６６１】
当業者は認識していることであるが、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈から明らかにそうではないと示されない限り、複数形の言及を含む。例えば、「薬剤（ａｎ  ａｇｅｎｔ）」または「少なくとも１種の薬剤（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ａｎ  ａｇｅｎｔ）」という用語は、複数の薬剤（それらの混合物を含む）を含んでもよい。
【０６６２】
本願全体を通して、本明細書に開示される様々な実施形態は、範囲形式で示される場合がある。なお、範囲形式での説明は、単に便宜および簡潔さのためであり、本開示の範囲に対する柔軟性のない限定と解釈されるべきではない。したがって、範囲の記載は、その範囲内の可能性のあるすべての小範囲および個々の数値を具体的に開示したと見なされるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの小範囲と、その範囲内の個々の数値、例えば１、２、３、４、５、６を具体的に開示したと見なされる。このことは範囲の幅に関係なくあてはまる。
本明細書で数値範囲が示される場合は常に、示された範囲内の任意の引用された数字（分数または整数）を含むことを意味する。第１の示された数「〜」第２の示された数、および第１の示された数「から」第２の示された数「まで」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、第１および第２の示された数、ならびにその間のすべての分数および整数の数字を含むことを意味する。
【０６６３】
以下の実施例は、本明細書に開示される実施形態をより完全に例示するために提示される。しかしながら、それらは、本開示の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０６６４】
実施例１：アポトーシス細胞作製
目的：初期アポトーシス細胞の作製
【０６６５】
方法：初期アポトーシス細胞の集団を作製する方法は国際公開第２０１４／０８７４０８号および米国特許出願公開第２０１５／０２７５１７５号（Ａ１）に記載されている。例えば、実施例に先行する「方法」の項の「Ｅａｒｌｙ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ（初期アポトーシス細胞集団の調製）」および「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ（アポトーシス細胞の生成）」（段落［０２２３］〜［０２８８］）、ならびに実施例１１、１２、１３、および１４を参照のこと。これらの文献の全内容を本明細書に援用する）。
【０６６６】
図１に示すフロー図は、解凍およびアポトーシス誘導の工程に抗凝固薬を含んだ、初期アポトーシス細胞の集団を作製する方法に用いられる工程の一実施形態の概要を示す。国際公開第２０１４／０８７４０８号および米国特許出願公開第２０１５／０２７５１７５号（Ａ１）の実施例１４に詳細に記載されているように、凍結の際またはインキュベーションの際、あるいは凍結の際とインキュベーションの際に抗凝固薬を添加して初期アポトーシス細胞集団を調製した。使用した抗凝固薬はクエン酸デキストロースであった。ＮＩＨ  Ｆｏｒｍｕｌａ  Ａ（ＡＣＤ製剤Ａ）に１０Ｕ／ｍｌのヘパリンを添加して、最終濃度が総容量のうちＡＣＤ５％、ヘパリン０．５Ｕ／ｍｌになるようにした。
【０６６７】
要約：細胞を回収し、５％クエン酸デキストロース抗凝固性製剤Ａと１０Ｕ／ｍｌのヘパリン（ＡＣＤｈｅｐ）を凍結培地に添加して凍結した。解凍、５％ＡＣＤｈｅｐを含むアポトーシス誘導培地でのインキュベーション、および最終生成物の調製は閉鎖系で行った。
【０６６８】
アポトーシスおよび生存率の分析、効力検定、および細胞集団の特性評価を各実験で行った。初期アポトーシス細胞生成物の作製において一貫性を確立するため、アポトーシス細胞の初期のバッチの最終生成物（ＦＰ）を２〜８℃で保存し、ｔ０、ｔ２４時間、ｔ４８時間、およびｔ７２時間に試験した。各時点でアポトーシス分析、短時間効力検定（出願人のＣＤ１４＋凍結細胞）、トリパンブルー測定および細胞集団の特性評価を行った。ＦＰの細胞数について試験することによって保存中の平均細胞減少、アポトーシス、生存率分析を評価した。
【０６６９】
国際公開第２０１４／０８７４０８号および米国特許出願公開第２０１５／０２７５１７５（Ａ１）号の上で引用した方法の項、ならびに実施例１１には、抗凝固薬なしでアポトーシス細胞集団のその他の実施形態の調製方法が詳細に記載されており、これらの文献全体を本明細書に援用する。
【０６７０】
照射アポトーシス細胞を調製する方法：類似の方法を用いて、不活化されたアポトーシス細胞集団を調製した。ここで、単核の初期アポトーシス細胞集団は、小さな百分率の活動中の非アポトーシス細胞、細胞活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞の細胞集団、または増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞の集団、あるいはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０６７１】
簡潔に言えば、単核富化細胞画分を健康で適格なドナーから白血球除去法によって採取した。血液成分分離が完了した後、細胞を洗浄し、５％クエン酸デキストロース抗凝固薬溶液製剤Ａ（ＡＣＤ−Ａ）と０．５Ｕ／ｍｌのヘパリンを含む凍結培地で再懸濁した。次いで細胞を徐々に凍結し、長期保存のため液体窒素に移した。
【０６７２】
照射アポトーシス細胞を調製するため、凍結保存された細胞を解凍し、洗浄し、５％のＡＣＤ−Ａ、０．５Ｕ／ｍｌのヘパリンナトリウム、および５０μｇ／ｍｌのメチルプレドニゾロンを含むアポトーシス誘導培地で再懸濁した。次いで細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で６時間インキュベートした。インキュベーションが終わると細胞を回収し、洗浄し、細胞処理システム（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｋａｂｉ、ドイツ）を用いてハルトマン液で再懸濁した。作製が完了した後、放射線治療装置Ｈａｄａｓｓａｈ  Ｅｉｎ  Ｋｅｒｅｍのγカメラを用いてアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）を４０００ｃＧｙで照射した。フローサイトメーターによってアネキシンＶおよびＰＩ（ＭＢＬ、米国マサチューセッツ州）染色（それぞれ４０％以上１５％以下）を用いてアポトーシス細胞のアポトーシスと生存率を決定した。ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを用いて結果を分析した。この照射アポトーシス細胞集団には初期アポトーシス細胞が含まれると考えられ、存在する生存細胞はすべて細胞活性が抑制され、増殖能力が低下するか、増殖能力がなくなる。特定の場合には、アポトーシス細胞集団は非アポトーシス生存細胞を持たない。
（結果）
【０６７３】
凍結およびインキュベーション（アポトーシス誘導）の際に抗凝固薬を含んで作製され、次いで２〜８℃で保存されたＦＰの安定性を以下の表３に示す。
【０６７４】
【表３】
2020531515.tif 000006
【０６７５】
誘導培地に抗凝固薬を含まずに細胞を作製した場合、細胞は２４時間安定であり、その後は安定性が低下した。表３に示すように、抗凝固薬を使用すると、予想外にもアポトーシス細胞集団の安定性は少なくとも７２時間に延びた。
【０６７６】
【表４】
2020531515.tif 000007
【０６７７】
表４の結果は、ＦＰの生存率は少なくとも７２時間は高いままであったことを示す。
【０６７８】
【表５】
2020531515.tif 000008
【０６７９】
表５の結果は、初期アポトーシス細胞の割合と同様に、アポトーシス細胞対壊死細胞の割合がより長い期間、細胞の調製後少なくとも７２時間にわたって維持されたことを示している。
【０６８０】
凍結時とアポトーシス誘導時の両方で抗凝固薬を含むことにより、安定な初期アポトーシス細胞の収率が最も一貫して高くなった（初期アポトーシス細胞の平均収率は６１．３±２．６％対４８．４±５．０％であり、１００％の収率は、凍結時の細胞数に基づく）。この高い収率は、２〜８℃で２４時間保存した後でも維持された。
【０６８１】
次に、抗凝固薬を凍結時もしくは解凍時、またはその両方で含んだ場合を比較し、回収率（％）および安定性を測定した。すべての集団のアポトーシスインキュベーション混合物に抗凝固薬を含ませた。表６はこれらの試験の結果を示す。
【０６８２】
【表６】
2020531515.tif 000009
【０６８３】
抗凝固薬を添加した場合としなかった場合で調製された初期アポトーシス細胞集団（細胞のバッチ）の集団分析をさらに比較すると、これらの結果が一貫していることがわかる。
【０６８４】
【表７（１）】
2020531515.tif 000010
【０６８５】
【表７（２）】
2020531515.tif 000011
【０６８６】
抗凝固薬の存在下または非存在下での最終生成物細胞の割合（収率）：上記の表３に示した結果と同様に、表６に示したデータは、抗凝固薬の存在下で凍結した細胞から作製された初期アポトーシス細胞が、抗凝固薬なしで凍結した細胞と比較して新鮮な最終生成物（ＦＰ  ｔ０）の平均収量に有益な影響を及ぼしたことを示している。有益な効果は、凍結時のみ抗凝固薬を使用した場合（６１．３±２．６％対４８．４±５．０％）、または凍結時と解凍時の両方で抗凝固薬を使用した場合（５６．５±５．２％対４８．４±５．０％）に見られた。解凍にのみ抗凝固薬を使用した場合、有益な効果はさほど有意ではなかった（４４．０±８．５％対４８．４±５．０％）。これらは高トリグリセリドではない試料であった。
【０６８７】
凝集に対する抗凝固薬の効果：高トリグリセリドでないこれらの３種の試料、または２１種の追加試料（データ示さず）では細胞凝集は見られなかった。しかし、抗凝固薬なしで作製された他の４１種の高トリグリセリドでない試料（データ示さず）では、１０種（２４．４％）に軽度の凝集体、５種（１２．２％）に重度の凝集体が見られた。したがって、抗凝固薬は完全に細胞凝集を回避する。
【０６８８】
安定性に対する抗凝固薬の効果：抗凝固薬ありまたはなしで作製された新鮮なＦＰを２〜８℃で２４時間保存し、作製手順にＡＣＤｈｅｐを添加するとＦＰの安定性が損なわれるかどうかを確認した。２４時間保存した後に細胞を試料採取し、細胞数で収率を計算した。長時間（最大７２時間）について表３に示した結果と同様に、表６は、凍結時のみ抗凝固薬を使用した場合（５９．８±２．１％対４７．５±４．７％）または凍結と解凍の両方に抗凝固薬を使用した場合（５６．４±５．３％対４７．５±４．７％）に有益な効果が維持され観察されたことを示している。解凍時にのみ抗凝固薬を添加した場合、有益な効果はさほど有意ではなかった（４２．４±６．１％対４７．５±４．７％）。これらはすべて高トリグリセリドではない試料であった。これらの結果は、いずれの処理の場合にもＦＰを２４時間保存した後の細胞減少が最小限であり、凍結と解凍の両方で抗凝固薬処理された細胞には有意な利益があることを示している。凍結時のみ抗凝固薬処理された細胞の減少の平均は、抗凝固薬なしの場合の１．９±３．３％に対して２．３±３．２％、解凍時のみの場合は抗凝固薬なしの場合の１．９±３．３％に対して３．０±４．７、凍結も解凍もＡＣＤｈｅｐと共に行った場合は抗凝固薬なしの場合の１．９±３．３％に対して０．２±０．４％であった。要約すると、抗凝固薬の収率に対する有益な効果は少なくとも２４時間維持された。
【０６８９】
ＦＰの代表的な細胞集団の特性を以下の表８に示す。
【０６９０】
【表８】
2020531515.tif 000012
【０６９１】
表８の結果は、凍結時および解凍時に抗凝固薬ありまたはなしで作製された最終生成物（ＦＰ）の細胞特性を示す。バッチを試料採取し、単核マーカーを染色し、フローサイトメトリーで分析して各試料の細胞分布を確認し、抗凝固薬の添加が細胞集団に影響を与えたかどうかを調べた。表７に示すように、凍結時または解凍時に抗凝固薬を使用して、または使用せずに作製された細胞集団では有意差は検出されなかった。新鮮なＦＰの平均Ｔ細胞集団（ＣＤ３＋細胞）は、凍結前が６２．９±１．１％であるのに対して、処理の間では６２．３±１．２％であった。平均Ｂ細胞集団（ＣＤ１９＋細胞）は、凍結前が３．１±０．８％であるのに対して、処理の間では８．３±２．５％であった。平均ナチュラルキラー細胞集団（ＣＤ５６＋細胞）は、凍結前が１２．９±０．５％であるのに対して、処理の間では９．５±０．７％であった。平均単球細胞集団（ＣＤ１４＋細胞）は、凍結前が１７．５±０．３％であるのに対して、処理の間では１３．８±０．５％であった。平均顆粒球集団（ＣＤ１５＋細胞）は、凍結時が０．３５±０．２％であるのに対して、新鮮なＦＰでは０．０％であった。
【０６９２】
初期アポトーシス集団の効力についても試験した。
【０６９３】
【表９】
2020531515.tif 000013
【０６９４】
表９に示される結果は、刺激（ＬＰＳ）後の未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）における各最終生成物の免疫寛容誘発状態を増強する能力を確認するために行われた効力検定によるものである。初期アポトーシス細胞集団との相互作用、およびＬＰＳを増加する様々な処理の後にｉＤＣでの共刺激分子ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８６発現の減少を評価することで、免疫寛容誘発効果を確認した。分析はＤＣｓｉｇｎ＋細胞で実行した。結果は、初期アポトーシス細胞集団との相互作用の後にＬＰＳを添加した場合の、ＬＰＳで誘発された成熟に対する成熟遅延率を表す。実験では、抗凝固薬ありまたはなしで作製された新鮮なＦＰ（ｔ０）の効力を試験した。表９に示す結果は、抗凝固薬ありまたはなしで作製されたアポトーシス細胞が、両方の共刺激マーカーの耐性効果を用量依存的に増強することを示す。
【０６９５】
本発明で生成された初期アポトーシス細胞は、高トリグリセリドではない試料から得たものであった。安定な初期アポトーシス細胞のこの一貫して高い収率は、ドナー血漿のトリグリセリドが高い場合でも得られた（例えば、国際公開第２０１４／０８７４０８号ならびに米国特許出願公開第２０１５／０２７５１７５号（Ａ１）の実施例１２および１３を参照のこと）。なお、注入用の最終的な初期アポトーシス細胞用量の製剤に用いるＰＢＳ培地には抗凝固薬を添加しなかった。
【０６９６】
要約
【０６９７】
この研究の目的は、安定かつ高収率の初期アポトーシス細胞集団を生成することであった。抗凝固薬を使用する合理的な理由は、高トリグリセリドの患者で最初に凝集体が見られたが、その後、他の患者のかなりの部分に見られたということであった。ここでの懸念は、抗凝固薬の使用が細胞アポトーシスを防止したという米国特許第６，４８９，３１１号の開示であった。
【０６９８】
要するに、抗凝固薬を添加した場合、細胞の組成、生存率、安定性、およびアポトーシスの性質に対する影響は最小限であり、最終生成物で回収された細胞数（収率）に少なくとも１０〜２０％の有意な改善があった。この研究では最大１３％の収率の増加が示されており、これは制御された条件では収率の２６．８％の増加を表すが、実際のＧＭＰ条件では３３％まで増加し、一度の回収でより多くの細胞数の増加を得ることができる。ドナーからの２回目の血液成分分離（アフェレーシス）の必要性を回避できるため、この効果は非常に重要である。
【０６９９】
この効果は驚くべきものであった、というのも、期待される影響は穏やかな凝集体の溶解だと予想されていたからである。抗凝固薬と共に細胞を解凍すると凝集体の量が減少するという仮説が立てられていた。これらの凝集体は、形成されると最終的に大量の細胞減少につながる。抗凝固薬なしで回収され凍結された細胞は、洗浄直後の解凍時に凝集体形成を示した。また、抗凝固薬なしで凍結し、抗凝固薬を含む培地で再懸濁した細胞でも高レベルの凝集体が検出された。抗凝固薬を含む培地で凍結も再懸濁も行った細胞では凝集体は見られなかった。まとめると、凍結およびアポトーシス誘導中の抗凝固薬の添加は非常に重要であり、細胞集団の初期アポトーシスの誘導に悪影響を与えないようだと結論付けられた。
【０７００】
初期アポトーシス細胞の回収について、例えば安定させるため２〜８℃で２４時間保存した（このとき、作製条件に関係なく３〜４．７％の平均細胞減少が測定された）後にさらに試験したところ、抗凝固薬を含む培地で凍結も解凍も行った細胞に好ましい結果が得られ（ＦＰを２４時間保存した後の細胞減少が０．２±０．４％であった）、抗凝固薬の添加が凍結および解凍時に重要であることが示唆されたが、最終的に製剤されると初期アポトーシス細胞集団は安定である。長時間の試験では、この安定性は少なくとも７２時間まで持続した。
【０７０１】
ＦＰのアポトーシスおよび生存率、ならびに細胞組成は、凍結および／または解凍の段階で抗凝固薬を添加しても有意な影響を受けなかった。様々な特性から測定された値は類似しており、ＡＣＤｈｅｐが初期アポトーシス細胞の特性を変化させず、最終生成物が４０％以上のアポトーシス細胞という許容基準を満たしたことを示している。
【０７０２】
アポトーシス細胞の効力を試験するのに用いた検定は、未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）、すなわち貪食、抗原提示、およびサイトカイン生成などの機能を特徴とするＤＣに基づいていた。
【０７０３】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）の免疫寛容誘発効果を検出するためのマーカーとしてＨＬＡ−ＤＲ（ＭＨＣクラスＩＩ）膜分子および共刺激分子ＣＤ８６を選択した。フローサイトメトリーを使用して、ＬＰＳでの刺激後と、抗凝固薬ありまたはなしで作製された初期アポトーシス細胞集団の存在下でＬＰＳで刺激された場合のｉＤＣにおけるＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８６の発現の変化を測定した。初期アポトーシス細胞集団をＤＣに提供した。ｉＤＣ：初期アポトーシス細胞集団の比率は昇順で１：２、１：４、および１：８とした。表６に示すように、初期アポトーシス細胞集団は、刺激されたＤＣに対して免疫寛容誘発効果を用量依存的に増強し、凍結およびアポトーシス誘導の両方で抗凝固薬を用いて作製された初期アポトーシス細胞集団の方がわずかに良い結果を示した。
【０７０４】
まとめると、凍結培地およびアポトーシス培地の両方に抗凝固薬を添加することは、細胞回収を増やし、凝集体による大量の細胞減少を回避し、多くの場合ドナーからの２回目の血液成分分離を回避するために非常に重要であると結論付けられた。すべての細胞は検証されたＦＰの承認基準を満たしていることが示され、抗凝固薬の添加がＦＰを損なわないことを示している。
【０７０５】
実施例２：インビトロでのサイトカイン急増モデルにおけるアポトーシス細胞のサイトカイン放出に及ぼす影響
目的：マクロファージ活性化症候群のＬＰＳ殺菌モデルで誘導されたサイトカイン急増におけるサイトカイン急増マーカー（サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＭＩＰ−１α、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、およびＩＬ−９）の量に及ぼすアポトーシス細胞の影響を試験する。
【０７０６】
方法：
【０７０７】
細胞株および培養試薬
【０７０８】
ヒトリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ（ｅＣＡＣＣ、英国、アクセス番号８５０１１４２９）、ヒト頸部腺がん細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ、米国、番号：ＣＣＬ−２）、およびＨｅＬａ−ＣＤ１９（ＰｒｏＭａｂ、米国、カタログ番号ＰＭ−ＨｅＬａ−ＣＤ１９）を１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｔｉｆｉｃ、Ｓｏｕｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ、カタログ番号１２６５７−０２９）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国、カタログ番号３５０５０−０３８）、および１００Ｕ／ｍｌのペニシリンと１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国、カタログ番号１５１４０−１２２）で栄養補給したＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国、カタログ番号３１８７０−０２５）（以後、「完全培地」と言う）中で培養した。標準培養時にＨｅＬａ−ＣＤ１９培地を、選択可能な抗生物質として１μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国、カタログ番号Ｐ９６２０）でさらに栄養補給した。
【０７０９】
すべての細胞を準集密条件で保持した。Ｒａｊｉ細胞を０．３×１０６〜２×１０６細胞／ｍｌの濃度範囲で維持した。容器が９０％集密まで一杯になったらＨｅＬａ細胞およびＨｅＬａ−ＣＤ１９細胞を継代した。
【０７１０】
初代単球を献血軟膜（Ｓｈｅｂａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、イスラエル）から単離した。まず、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ密度勾配液（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国、カタログ番号１７−１４４０−０３）で単離した。遠心分離（８００×ｇ、２〜８℃、２０分、ブレーク０）時に、ＰＢＭＣを含む中間相を新しい試験管に移して、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ、スイス、カタログ番号ＢＥ１７−６０５Ｅ）および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｌｏｎｚａ、スイス、カタログ番号ＢＥ１７−７３７Ｂ）で栄養補給したＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｏｎｚａ、スイス、カタログ番号ＢＥ１２−９１８Ｆ）（以後、「洗浄培地」と言う）で洗浄し、遠心分離した（６５０×ｇ、２〜８℃、１０分）。ペレット状の細胞を１５×１０６細胞／ｍｌの濃度まで「洗浄培地」に再懸濁させた。３５ｍｍのプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国、カタログ番号４３０１６５）の中心に０．９ｍｌの液滴として細胞を播種した。プレートを加湿したインキュベーターで１．５時間インキュベートして（３７℃、５％のＣＯ２）、単球を付着させ、次いで、予温ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ、スイス、カタログ番号ＢＥ１７−５１６Ｆ）で３回洗浄して他の細胞種を除去した。洗浄後、細胞を、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｔｉｆｉｃ，  Ｓｏｕｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ、カタログ番号１２６５７−０２９）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国、カタログ番号３５０５０−０３８）、および１００Ｕ／ｍｌのペニシリンと１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国、カタログ番号１５１４０−１２２）で栄養補充した２ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０  （Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国、カタログ番号３１８７０−０２５）（「完全培地」として知られている）中で培養した。
【０７１１】
すべての細胞株を５％のＣＯ２を含む３７℃の加湿したインキュベーターで培養した。
【０７１２】
手短に言えば、製造者のガイドラインに従って、標的細胞（ＨｅＬａまたはＨｅＬａ−ＣＤ１９）を単独で、あるいは単球と共に培養した。標的細胞が（６時間から一晩で）プレートに付着した後、培養物を１時間、ｙ×１０６個のアポトーシス細胞に曝露し、その後、これらの細胞をＲＰＭＩで４、５回洗浄した。アポトーシス細胞が除去されたことを光学顕微鏡で目視により確認した。１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国、カタログ番号Ｌ４３９１）を共培養物に導入して、１時間インキュベートした。インキュベーション後、ＬＰＳをＲＰＭＩにより３〜５サイクルの洗浄で除去した。生存能力のあるＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞またはナイーブＴ細胞を指定されたＥ／Ｔ比で加えて、４時間インキュベートした。培地を回収して、プレートを２５０×ｇ、２〜２５℃で４分間遠心分離して（遠心分離器５８１０  Ｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ）細胞を沈殿させた。各ウェルの５０μｌの上清培地を新しい平底９６ウェルマイクロプレートのウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国、カタログ番号３５９６）に移し、５０μｌのＣｙｔｏＴｏｘ  ９６試薬を各ウェルに加えた。プレートを暗室にて室温で３０分間インキュベートして、その後、１ウェルあたり５０μｌの停止液を加えて反応を止めた。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ５０（Ｔｅｃａｎ、スイス）を用いて吸光度を４９２ｎｍで読取り、Ｍａｇｅｌｌａｎ  Ｆ５０ソフトウェアを用いて取り込んだ。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）  ２０１０を用いてデータ分析とグラフの作成を行った。
【０７１３】
アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞由来の上清を用いるインキュベーションの後、Ｌｉｍｉｎｅｘ技術を用いてサイトカイン放出について分析した。
【０７１４】
結果：図４Ａ〜図４Ｈから、マクロファージ活性化症候群のインビトロモデルでＬＰＳにより誘導されたサイトカイン急増マーカーＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＭＩＰ−１α、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、およびＩＬ−９の量が有意に低下したことが示された。マクロファージ：アポトーシス細胞の比が１：８になるようにアポトーシス細胞を投与すると、培地に放出されるＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＭＩＰ−１α、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、およびＩＬ−９のいずれの量も有意に低下したが（図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄ、４Ｅ、４Ｆ、４Ｇ、４Ｈ）、マクロファージ：アポトーシス細胞の比が１：１６になるようにアポトーシス細胞を投与すると、このモデルでのサイトカインＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＭＩＰ−１α、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、およびＩＬ−９の放出が実質的にすなわちほとんど阻害された。
【０７１５】
アポトーシス細胞を加えると、活性化しているマクロファージで誘導された少なくとも２０種の炎症誘発性サイトカインおよびケモカインが阻害された。その結果のサンプルが図４Ａ〜図４Ｈに示されている。炎症誘発性サイトカインおよびケモカイン放出の共通する反応機構はＮＦ−κＢの阻害である。
【０７１６】
炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの放出の阻害は特異的であるように思われる。というのは、同じような条件でサイトカインＩＬ−２Ｒ（ＩＬ−２受容体）の量を調べてみると、放出されるＩＬ−２Ｒ量は、炎症誘発性サイトカインと同様に影響されないことが判明したからでる（図４Ｉ）。アポトーシス細胞を加えると、１：４および１：８の比でＩＬ−２Ｒの放出が増加した。さらに、図４Ｊから、アポトーシス細胞は、２４時間を超えてＩＬ−２の放出に影響を及ぼさないことが判明した。ＩＬ−２受容体の活性化は、寛容を含む免疫系の主要な機能において重要な役割を持つと考えられている。
【０７１７】
結論：がんおよびＣＡＲ−１９の存在下でマクロファージ活性化症候群のサイトカイン急増モデルに初期アポトーシス細胞を加えると、炎症誘発性サイトカイン、例えば、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＭＩＰ−１α、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、およびＩＬ−９を有意に減少させ、また図らずもこれらを防ぎさえするが、サイトカインＩＬ−２Ｒの量は増加する、あるいは影響を受けなかった。従って、これらの結果から、炎症誘発性サイトカインはアポトーシス細胞とのインキュベーションにより減少するが、ＩＬ−２とＩＬ−２Ｒは初期アポトーシス細胞とのインキュベーションによっても同じような影響を受けないことが示された。従って、Ｔ細胞関連サイトカインは、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法＋アポトーシス細胞によって影響を受けないが、自然免疫サイトカイン、例えば、単球、マクロファージ、および樹状細胞から放出されるものは影響を受ける。
【０７１８】
実施例３：ＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性に悪影響を及ぼさない、アポトーシス細胞のサイトカイン急増に及ぼす影響
【０７１９】
目的：サイトカイン急増マーカーサイトカインに及ぼすアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞由来の上清の影響および腫瘍細胞に及ぼすＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性の影響を試験する。
【０７２０】
方法：
【０７２１】
Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞
【０７２２】
固形腫瘍モデル（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｔｅｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３、同上）には、マウスでのサイトカイン急増の誘導を利用したことが報告されている。このモデルでは、Ｔ細胞を、特定のＥｒｂＢ二量体を標的するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いて遺伝子操作した（Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞）。これらは、特異的な固形腫瘍（例えば、頭部および頸部の腫瘍や卵巣がん）で非常に上方調節されることが多い。ＣＤ３マイクロビーズを用いて、末梢血から分離したＰＢＭＣからＴ細胞を単離した。キメラＴ４＋受容体を含むベクターを構築して、単離したＴ細胞に形質導入してＴ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を得た。本明細書で行った実験では、Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓ（米国ニューヨーク州）またはＰｒｏｍａｂ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国カリフォルニア州）から購入した。図５は、抗ＣＤ１２４モノクローナル抗体（Ｗｉｌｋｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、同上）を用いてＴ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞表面に４αβキメラ受容体を表面発現させたことを確認したフローサイトメトリー曲線を示す。また、ＰＣＲ手順を行って、形質導入されたＴ細胞にベクターが存在することを確認した。
【０７２３】
ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞
【０７２４】
ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ卵巣腺がん組織培養物細胞は、Ｃｅｌｌ  ＢｉｏＬａｂｓ（カタログ＃ＡＫＲ−２３２）から購入した。ＳＫＯＶ３−ｌｕｃはＥｒｂＢ受容体を多く発現し、Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の標的である（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｔｅｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３、同上）。これらの細胞をさらに操作して、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を構成的に発現させて、インビトロでの細胞増殖およびインビボでの腫瘍の成長および退行を追跡した。
【０７２５】
アポトーシス細胞
【０７２６】
アポトーシス細胞を実施例１と同様に調製した。
【０７２７】
アポトーシス細胞上清
【０７２８】
１２ウェルプレートで１ウェルあたり８百万個のアポトーシス細胞を播種した。２４時間後に細胞を遠心分離した（２９０ｇ、４℃、１０分間）。上清を回収して、使用するまで小分けして−８０℃で冷凍した。異なる数の細胞を用いて上清を作製した。いくつかの一定分量は、濃縮した上清を含んでいる。
【０７２９】
単球の単離
【０７３０】
Ｆｉｃｏｌｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国）を用いて、健康な適格なドナーから得た末梢血軟膜からＰＢＭＣを単離した。細胞をＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州）中１５×１０６細胞／ｍｌの濃度にして、０．９ｍｌの液滴として３５ｍｍのプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国ニューヨーク州）の中心部に播種した。次いで、プレートを３７℃、５％のＣＯ２で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル、ベイト・ヘメク）で３回洗浄し、光学顕微鏡を用いて密着性を決定した。次いで、細胞を完全培地（ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％の熱不活性化ＦＢＳ＋１％のＧｌｕｔａｍａｘ＋１％のＰｅｎＳｔｒｅｐ、すべてＧｉｂｃｏから入手）を用いてインキュベートした。
【０７３１】
また、単球を単離する別の方法を用いた。ヒト単核細胞を密度勾配遠心分離法によりヘパリン化した末梢血から単離した。次いで、単離した単核細胞を、磁性ビーズ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ．、米国カリフォルニア州オーバーン）により単球をＣＤ１４＋画分として陽性選択し、Ｂ細胞をＣＤ２２＋画分として陽性選択し、Ｔ細胞をＣＤ１４−ＣＤ２２画分として陰性選択することにより単球集団、Ｂ細胞集団、およびＴ細胞集団に分離した。単球の純度は９５パーセントを超えていた。
【０７３２】
マクロファージ分化のため、密着が完了後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いでＲＰＭＩ１６４０と１％のＧｌｕｔａｍａｘと１％のＰｅｎＳｔｒｅｐと１０％の熱不活性化ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州）でインキュベートした。細胞を３７℃、５％で７〜９日間インキュベートし、３日目と６日目に培地を交換した。光学顕微鏡により分化を形態観察によって決定した。
【０７３３】
アポトーシス細胞＋単球由来の上清
【０７３４】
ＣＤ１４＋単球を、上記で作製したアポトーシス細胞と共に１：１６の比で２４時間培養した。単球の数は、１２ウェルプレートの１ウェルあたり５０万個であり、アポトーシス細胞の数は、１２ウェルプレートの１ウェルあたり８００万個であった。２４時間のインキュベーション後、細胞を遠心分離した（２９０ｇ、４℃、１０分間）。上清を回収して、使用するまで小分けして−８０℃で冷凍した。同様の手順を単球：アポトーシス細胞の比を変えて、および／または他の細胞源（例えば、マクロファージおよび樹状細胞）を用いて行った。
【０７３５】
インビトロでの培養条件
【０７３６】
以下のように最初の実験を行った。ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ癌細胞とアポトーシス細胞またはアポトーシス上清を１時間インキュベートして、Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞（±単球−マクロファージ）と４８時間共培養した。
【０７３７】
インビボでの条件を模倣するため、１×１０５個のＴＨＰ−１細胞／ｍｌ（ＨＴＣＣ、米国）、単球、マクロファージ、または樹状細胞を７２時間２００ｎＭ（１２３．４ｎｇ／ｍｌ）の酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）で分化させて、次いで、ＰＭＡを含まない完全培地でさらに２４時間培養する。さらに、癌または腫瘍細胞、例えば、ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞を分化したＴＨＰ−１細胞に対して５×１０５個のＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞／ウェルで２４ウェルプレートに播種する。癌細胞または腫瘍細胞の初期培養後、４×１０５〜８×１０５個のアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）を培養物に１〜３時間加えて、免疫寛容環境を誘導する。癌細胞のアポトーシス細胞に対する比を各細胞種に対して最適にする。洗浄後、共培養物を１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳで処理して、その後、１×１０６個のＴ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞（あるいはエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比のグラフにより決定した量）を加える。各腫瘍細胞種または癌細胞種に対してエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比のグラフを作成するため、腫瘍細胞とＴ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の比を変える。
【０７３８】
ＳＫＯＶ３癌細胞の細胞毒性について検定するため、溶解物を作製して、４８時間インキュベートした後のルシフェラーゼ活性を決定した。さらなる実験を行って他の癌細胞種の癌細胞または腫瘍細胞の細胞毒性について４８時間のインキュベーションの間に間隔を空けて検定する。あるいは、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＣｙｔｏＴｏｘ  ９６非放射性活性細胞毒性検定（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ＃Ｇ１７８０）を用いる。
【０７３９】
溶解物の作製
【０７４０】
ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞溶解物を以下のようにして作製した。ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ単層をＰＢＳで洗浄して血清残渣を除去し、（２４ウェルプレートにつき）７０μｌのＣＣＬＲ溶解緩衝液×１／ウェルを加えた。ウェル底部を物理的にこそげて剥離をさらに高めた。次いで、１５秒間ボルテックスして、溶解物を１２，０００ｇ、４℃で２分間遠心分離した。上清を回収して−８０℃で保存した。
【０７４１】
インビトロでのルシフェラーゼ活性
【０７４２】
培養物中のＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞のルシフェラーゼ活性を検出するのにルシフェラーゼ・検定システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ＃Ｅ１５０１）を用いた。このキットと照度計読取り器（Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｅｉｎ  Ｋｅｒｅｍ、エルサレム・ヘブライ大学）の較正は、ＱｕａｎｔｉＬｕｍ組み換えルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ＃Ｅ１７０Ａ）を用いて行った。６１２ａｇ〜６１．２μｇ（１０−２０〜１０−９モル）を用いて製造者のガイドラインに従って検出範囲を決定した。手短に言えば、各ルシフェラーゼ含量の試料（体積２０μｌ）を黒色９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェルに入れた。各含量の試料を３つ作成した。１００μｌのＬＡＲ（ルシフェラーゼ・検定システム・キット由来のルシフェリン基質）を各ウェルに加えて、１０秒間曝露後に直ちに読み取った。
【０７４３】
ルシフェラーゼ活性の読取りでは、溶解物を氷上で解凍し、２０μｌの試料を黒色９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に入れた。同じ２つの試料で各試料を読み取った。１００μｌのＬＡＲを加えて、１０秒間曝露後に２．５分ごとに２５分間、その後の１０分間は４０秒ごとに発光を読み取った。
【０７４４】
サイトカイン分析
【０７４５】
ＩＬ−２、ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）、ＩＬ−６、ＩＬ−１α、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αの初期検定を行った。ＩＬ−２、ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）、ＩＬ−６、ＩＬ−１α、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、および他のサイトカインのサイトカイン放出の低減を検定するため、上清を回収して、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ＭａｇＰｉｘ読み取り機およびＥＬＩＳＡ検定を用いて選択したサイトカインについて調べた。
【０７４６】
結果：
【０７４７】
ＳＫＯＶ３−ｌｕｃの増殖
【０７４８】
指示手段としてルシフェラーゼ活性を用いてＳＫＯＶ３−ｌｕｃの増殖を追跡して、将来の実験での標的ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞数を決定した。３．８×１０４〜３．８×１０５個のＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞／ウェルを２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、ルシフェラーゼ活性を３日間毎日監視した。播種した１．９×１０５細胞／ウェルまたはそれ以上の数の細胞は集密になり、播種の２日後にルシフェラーゼ活性によって示される増殖飽和を示す（図６）。なお、３．８×１０４〜１．１×１０５個のＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞／ウェルは、播種の３日後でも線形的あるいは指数関数的な増殖相にあった（図６、橙色、青色、および紫色のプロット）。陰性対照（ＬＡＲ基質を含まない３．８×１０５個のＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞）は背景レベルの読取りを示し、ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞からの生物発光読取りはルシフェラーゼ活性に由来するものであることが示された。
【０７４９】
ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ腫瘍細胞に対するＴ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性の確認
【０７５０】
Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞活性を裏付けるため、単層のＳＫＯＶ３−ｌｕｃを１，０００，０００（１００万）個のＴ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞または１，０００，０００（１００万）個の非形質導入Ｔ細胞のいずれかに曝露した。２４時間のインキュベーション後、非形質導入Ｔ細胞対照に比べてＴ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞はＳＫＯＶ３−ｌｕｃの増殖を３０％低減（図７）しており、Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性が判明した。
【０７５１】
Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞のみのＳＫＯＶ３−ｌｕｃ腫瘍細胞に対する活性をアポトーシス細胞に曝露した後の活性と比べた。
【０７５２】
アポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）およびアポトーシス細胞上清（ＡｐｏＳｕｐおよびＡｐｏＭｏｎ  Ｓｕｐ）を試験して、それらがＴ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞抗腫瘍活性を干渉するか否かを決定した。ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ腫瘍細胞をアポトーシス細胞と共に１時間インキュベートして、次いでＴ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞（５００，０００、５０万）またはＴ４＋非形質導入Ｔ細胞（５００，０００、５０万）を加えた（Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞のアポトーシス細胞に対する比が１：２）。さらに、腫瘍細胞／アポトーシス細胞／Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を４８時間共培養した。対照のＳＫＯＶ３−ｌｕｃ腫瘍細胞を、アポトーシス細胞を加えず、Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞とＨａｒｔｍａｎ溶液（アポトーシス細胞の培地）を用いて４８時間共培養した。
【０７５３】
これらの結果から、４８時間のインキュベーション後に、Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性は、非形質導入Ｔ細胞でインキュベーションした場合に比べて高かったことが判明した。同様のインキュベーションをアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を用いて行った。意外にも、Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性はアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清に曝露した場合もそうでない場合も同等であった（図８）。
【０７５４】
ＣＡＲ−Ｔ治療から得られたサイトカイン急増の向上、低減、または阻害に及ぼすアポトーシス細胞の影響
【０７５５】
次にアポトーシス細胞のサイトカイン急増を低減する効果を調べた。ＩＬ−６は、サイトカイン急増で放出される原型炎症誘発性サイトカインであり（Ｌｅｅ  ＤＷ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）  Ｂｌｏｏｄ  １２４（２）：  １８８−１９５）、サイトカイン急増応答のマーカーとしてしばしば用いられる。
【０７５６】
インビボでのＣＡＲ−Ｔ細胞療法環境を模倣するように培養物を樹立した。ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ腫瘍細胞をヒト単球−マクロファージおよびＴ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の存在下で培養した。培養培地で測定したＩＬ−６の濃度は約５００〜６００ｐｇ／ｍｌであった。このＩＬ−６の濃度はサイトカイン急増を表す。
【０７５７】
予想外にも、アポトーシス細胞と共に１時間（Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞のアポトーシス細胞に対する比が１：２）事前培養したＳＫＯＶ３−ｌｕｃ腫瘍細胞、ヒト単球−マクロファージ、Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の培養培地で測定したＩＬ−６量は劇的に低減した。同様に、アポトーシス細胞上清と共に事前に１時間インキュベートしたＳＫＯＶ３−ｌｕｃ腫瘍細胞、ヒト単球−マクロファージ、Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の培養培地で測定したＩＬ−６量もまた劇的に低減した。ＩＬ−６濃度のこの低減はサイトカイン急増の低下を示している（図９）。
【０７５８】
予想外にも、アポトーシス細胞とアポトーシス細胞上清はＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍細胞増殖に及ぼす影響を無効にせず、同時に病的状態につながる主要なサイトカインとして記載されているＩＬ−６などの炎症誘発性サイトカインを下方調節すると結論づけられた。
【０７５９】
広範囲のサイトカインを用いた分析
【０７６０】
実験手順時に生成されないがヒトのサイトカイン急増時に臨床設定で現れ得る広い範囲および量のサイトカインに及ぼす影響をさらに評価するため、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を上記のＳＫＯＶ３−ｌｕｃ培養物条件に加えた。ＬＰＳを加えるとサイトカイン急増量が指数関数的に増加することが予測される。予測されたように、ＬＰＳを加えるとサイトカイン急増効果が高まり、その結果ＩＬ−６量が約３０，０００ｐｇ／ｍｌまで増加した。サイトカイン急増時に高濃度で発現することが知られている他のサイトカインは、例えば、ＴＮＦ−α（２５０〜３００ｐｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１０（２００−３００ｐｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１α（４０〜５０ｐｇ／ｍｌ）、およびＩＬ−１８（４〜５ｐｇ／ｍｌ）のように量の増加を示した。図１０では、サイトカイン急増の指数関数的な状態であってもアポトーシス細胞への曝露は、臨床設定で見られ得るがＣＡＲ−Ｔ細胞を用いた実験手順では必ずしも見られないほとんど正常な量までＩＬ−６量を大きく低減させた。この効果は、他の炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−１８に亘って同様であり、これらは２０〜９０％の低下を示した。アポトーシス細胞の代わりにアポトーシス細胞上清を用いた場合でも同様の結果が見られた。
【０７６１】
アポトーシス細胞のＩＬ−２およびＩＬ−２Ｒに及ぼす影響
【０７６２】
Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞と共にＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞をインキュベートした後で培養物上清中で測定したＩＬ−２の濃度は１０８４ｐｇ／ｍｌであった。ＳＫＯＣ３−ｌｕｃ細胞をまずアポトーシス細胞と共にインキュベートし、次いでＴ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞と共にインキュベートすると、意外にもＩＬ−２の濃度は増加して１１９０ｐｇ／ｍｌになった。同様に、Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞と共にＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞をインキュベートした後で培養物上清中で測定したＩＬ−２Ｒの濃度は、３８１７ｐｇ／ｍｌであった。ＳＫＯＣ３−ｌｕｃ細胞をまずアポトーシス細胞と共にインキュベートし、次いでＴ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞とインキュベートすると、意外にもＩＬ−２Ｒの濃度は増加して４５８０ｐｇ／ｍｌになった。ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ単独では、Ｉｌ−２の濃度は３．２ｐｇ／ｍｌであり、アポトーシス細胞を加えると濃度は１０．６ｐｇ／ｍｌであった。ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ単独では、ＩＬ−２Ｒの濃度は２６．３ｐｇ／ｍｌであり、アポトーシス細胞を加えると濃度は２４．７ｐｇ／ｍｌであった。
【０７６３】
結論
【０７６４】
ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、有意数の患者でサイトカイン急増を起こすと報告されている。これらの結果から、アポトーシス細胞とアポトーシス細胞上清は、意外にも、ＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍細胞に対する有効性に影響を及ぼすことなくサイトカイン急増サイトカインマーカーを低減させたことが判明した。また、アポトーシス細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞増殖を維持または増加させることでＣＡＲ−Ｔ細胞療法時に増加することがあるサイトカインＩＬ−２を増加させると思われる。
【０７６５】
実施例４：ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を行ったマウスでアポトーシス細胞療法がサイトカイン急増を防ぐ
目的：Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性とサイトカイン急増マーカーサイトカインの量の決定するため、固形腫瘍モデル（ＳＫＯＶ３卵巣腺がん）でのアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清のインビボでの影響を試験する。
【０７６６】
材料および方法
【０７６７】
インビトロでの研究
【０７６８】
ＥｒｂＢ標的抗原を認識するＴ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞（本明細書では「Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞」と言う）、ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞上清、単球、マクロファージの使用に適切な作製法、培養法、および上記結果を分析する方法を含むインビトロでの方法、および様々な検定を上の実施例１に記載した。ここでは、同じ方法を用いた。
【０７６９】
インビボでの研究
【０７７０】
マウス
【０７７１】
７〜８週齢のＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスとＮＳＧＳマウスをＨａｒｌａｎ（イスラエル）から購入し、シャレット研究所のＳＰＦ動物施設で飼育した。
【０７７２】
ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ腫瘍細胞（１×１０６または２×１０６）をＰＢＳ溶液の腹腔内投与または２００ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）での皮下投与によりＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスまたはＮＳＧＳマウスに接種する。注射の約１４〜１８日後に腫瘍の正着を生物発光画像処理（ＢＬＩ）により確認し、Ｔ細胞の投与前に信号強度の類似度によりマウスを分類する。
【０７７３】
Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与の２４時間前、またはＴ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞（１０〜３０×１０６個のＴ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞）の投与と同時のいずれかにマウスに３０×１０６個のアポトーシス細胞を与える。生物発光画像処理（ＢＬＩ）により腫瘍の増殖を追跡して、循環するサイトカイン量をＬｕｍｉｎｅｘにより決定する。
【０７７４】
インビボでのルシフェラーゼ検定
【０７７５】
ホタルルシフェラーゼ活性により細胞の増殖を週単位で監視した。手短に言うと、３ｍｇのＤ−ルシフェリン（Ｅ１６０５．  Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）／マウス（１００μｌの３０ｍｇ／ｍｌのＤ−ルシフェリン）をイソフルレンで麻酔したマウスに腹腔内に注射して、ＩＶＩＳ画像処理システムおよびＬｉｖｅ  Ｉｍａｇｅ画像取得ソフトウェア（いずれもＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、米国）を用いて注射の１０分後に腹部画像を得た。
【０７７６】
「自動」を選択しＤ−ルシフェリン注射の５分後に０．５×１０６個のＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞／マウスを投与したマウスを画像処理することにより、各画像セッションでの画像取得パラメータを選択した。２４倍レンズを用いて取得パラメータをビニングを４、Ｆ／ストップを１．２、および曝露２〜４分に設定した。Ｌｉｖｅ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを用いてデータ分析および定量を行い、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔのＥｘｃｅｌプログラムを用いてグラフを作成した。
【０７７７】
インビボ細胞毒性
【０７７８】
Ｔ細胞のインビボ毒性を評価するため、マウスから器官を採取し、ホルマリン固定して、組織病理学的分析を行った。
【０７７９】
サイトカイン分析
【０７８０】
Ｌｕｍｉｎｅｘ  ＭａｇＰｉｘ読み取り器および／またはＥＬＩＳＡキット、細胞測定基準ビーズアレイ（Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７；  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造者の説明に従って用いて上清と血清を分析した。例えば、分析は、炎症誘発性サイトカイン（存在する場合はＩＬ−６）であってもよいが、ここで、実施形態によっては、表１および表２に示されているサイトカインまたは当該分野で知られているサイトカインのうちのいずれかを分析してもよい。
【０７８１】
結果
【０７８２】
インビボでＳＫＯＶ３−ｌｕｃ腫瘍を較正する
【０７８３】
０．５×１０６、１×１０６、または４．５×１０６個のＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞をＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスに腹腔注射して、「方法」の項に記載したように腫瘍の増殖を追跡するため生物発光画像処理（ＢＬＩ）を週単位で行った（データは図示せず）。
【０７８４】
マウスの臨床スコア
【０７８５】
最初の４週間、マウスは臨床的症状を示さなかった。しかしながら、ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ注射の２８日後、投与量が多かったマウス（４．５×１０６；紫色の線）は、徐々に体重が減り始めた（図１１Ａ）。また、マウス全体の外観が悪くなり、無気力、異常歩調、および一般的な活動性の消失を示すようになった。３９日目にこの群を選択して、腹部解剖を行い、腫瘍の外観と大きさが見えるようにした（図１１Ｂ）。ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ腫瘍は、大きい固形で、新生血管ができており、白っぽく輝く複合体であった。１つの大きな腫瘍は、腹腔の尾側または口側の注射した側（左）で優勢であった。この腫瘍は腹腔の約２５〜７５％を取り囲んでおり、明らかに腸を圧迫して阻害していた。また小さい病巣も腹腔内の様々な場所で観察された。腫瘍は腹腔内に含まれており、それ以外の腫瘍はどのマウスの体の他のどの部分にも見られなかった。少ない投与量（０．５×１０６）または中程度の投与量（１×１０６）でＳＫＯＶ３−ｌｕｃを投与されたマウスは、ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ注射の４０日後に重量増加が止まり、徐々に体重が減り始めた。ＳＫＯＶ３−ｌｕｃを注射した５０日後に実験を終了した。
【０７８６】
ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ腫瘍動態
【０７８７】
ＰＢＳをＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞の対照に注射したところ、これらのマウスは実験中にルシフェラーゼ活性を示さなかった（図１２、左パネル）。腫瘍の検出と増殖は投与量に依存していた。投与量が少ない（０．５×１０６個のＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞）と、注射の２５日後に腫瘍が現れ始めた（５匹中４匹）。中程度の投与量（１×１０６）を注射した場合、注射の１８日後に腫瘍が現れた（５匹中４匹）が、投与量が多いと（４．５×１０６）腫瘍は５匹中３匹で注射の１１日後という早い時期に現れた。また１８日目までにすべての動物はよく樹立された腫瘍を示した（図１２および図１３Ａ〜図１３Ｄ）。
【０７８８】
ＣＡＲ−Ｔ細胞療法はサイトカイン放出症候群を誘発する
【０７８９】
３つの群の腫瘍のないマウスと３つの群の腫瘍のあるマウスに、投与量を増加させながら（３×１０６、１０×１０６、または３０×１０６）Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を（腹腔内投与または腫瘍に直接）投与した。投与量が最も多い場合で、腫瘍のないマウスと腫瘍のあるマウスは、２４時間以内に不活発な挙動、立毛、および可動性の低下を示し、急速な体重減少を伴い、４８時間以内に死亡した。最も多い投与量のＣＡＲ−Ｔ細胞を与えたマウス由来の血液試料では少なくともヒトインターフェロン−γとマウスＩＬ−６が検出可能である。異なる腫瘍抗原に向けられた投与量の多いＣＡＲ−Ｔ細胞を投与された動物は、体重減少や挙動の変化を示さない。
【０７９０】
アポトーシス細胞の投与は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法によって誘導されたサイトカイン放出症候群の発生を阻害または低減する
【０７９１】
最も多い投与量のＣＡＲ−Ｔ細胞を与えたマウスの１群にそれと共に、それまでに安全で有効な投与量であることが示されていた２．１０×１０８／ｋｇ個のアポトーシス細胞を投与する。ヒトＣＡＲ−Ｔ＋アポトーシス細胞を投与されたマウスは、マウスＩＬ−６の量が有意に低減し、体重減少も少なくなり、死亡率も低下した。
【０７９２】
実施例５：インビトロびまん性腫瘍モデルに及ぼす組み合わせ免疫治療の影響
目的：癌細胞に対するＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性とサイトカイン急増マーカーサイトカインの量を決定するため、全身に局所的でも限定的でもなく広がっているびまん性腫瘍モデルにおけるアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞由来の上清の影響を試験する。
【０７９３】
方法：
【０７９４】
ＣＤ１９＋Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞（「ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞」）
【０７９５】
ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞をＰｒｏＭａｂ（ロット＃０１２９１６）から購入した。Ｔ細胞は、ＣＡＲに対して３０％陽性であった（製造者のＦＡＣＳデータに従って、Ｆａｂ染色）。手短に言うと、細胞をＡｉｍＶ＋５％の熱不活性化したＦＢＳに入れて解凍し、遠心分離し（３００ｇ、５分、室温）、ＡｉｍＶに再懸濁した。実験の６日目に１匹のマウスあたり２０×１０６個の細胞を静脈注射した（７０％のアネキシンＰＩ陰性でそのうちの３０％がＣＡＲ陽性）。
【０７９６】
ＣＤ１９を発現している組み換えＨｅＬａ細胞を、細胞表面にＣＤ１９を発現している対照細胞種として用いる。
【０７９７】
ＣＤ１２３＋ＣＡＲ−Ｔ細胞
【０７９８】
また、Ｔ４＋ＣＡＲ−Ｔ細胞をＣＤ１２３エピトープを標的するＣＡＲと共に遺伝子操作する（ここでは、「ＣＤ１２３＋ＣＡＲ−Ｔ細胞」と言う）。
【０７９９】
Ｒａｊｉ細胞、ＣＤ１９発現ＨｅＬａ細胞、およびＣＤ１２３発現白血病細胞
【０８００】
Ｒａｊｉ細胞：Ｒａｊｉ細胞をＥＣＡＣＣ（カタログ＃：  ８５０１１４２９）から購入し、完全培地（１０％のＨ．Ｉ．  ＦＢＳ、１％のＧｌｕｔａｍａｘ、１％のペニシリン／ストレプトマイシンで栄養補給したＲＰＭＩ−１６４０）で定法により培養し、３×１０５〜３×１０６細胞／ｍｌの濃度で維持した。実験の１日目にマウス１匹あたり０．１×１０６個の細胞を静脈注射した。
【０８０１】
同様に、ＣＤ１９発現ＨｅＬａ細胞を実験室で作製して、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の標的として用いる。ＣＤ１２３発現白血病細胞をＣＤ１２３＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の標的として用いる。また、原発癌細胞をＣＡＲ−Ｔ細胞の標的として用いる。
【０８０２】
当該分野で知られている方法を用いてＣＤ１９を発現しているＨｅＬａ細胞を作製した。細胞を当該分野でよく知られているように培養する。
【０８０３】
ＣＤ１２３は膜生体指標であり、血液悪性腫瘍の治療標的である。ＣＤ１２３発現白血病細胞、例えば、白血病性芽球および白血病性幹細胞を当該分野で知られているように培養する。
【０８０４】
アポトーシス細胞、アポトーシス細胞上清、および単球の単離物を実施例１で記載したように作製する。作製した初期のアポトーシス細胞は少なくとも５０％がアネキシンＶ陽性であり、５％未満がＰＩ陽性細胞であった。
【０８０５】
マクロファージ。付着によりＣＤ１４陽性細胞から作製した。
【０８０６】
樹状細胞。ＩＬ４とＧＭＣＳＦの存在下で成長させたものに由来するＣＤ１４であった。
【０８０７】
フローサイトメトリー。以下の抗体を用いた：ｈＣＤ１９−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ＃１２−０１９８−４２）；  ｍＩｇＧ１−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ＃１２−０１９８−４２）；  ｈＣＤ３−ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ＃１１−００３７−４２）；  ｍＩｇＧ２ａ−ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ＃１１−４７２４−８２）。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）を用いて獲得を行った。
【０８０８】
ナイーブＴ細胞。磁性ビーズ（ＢＤ）を用いて軟膜からナイーブＴ細胞を単離し、９０％のヒトＡＢ血清と１０％のＤＭＳＯ中で凍結保存した。ＣＡＲ−Ｔ細胞と同様に解凍し、注射した。
【０８０９】
インビトロでの培養条件
【０８１０】
細胞株および培養試薬
【０８１１】
ヒトリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ（ｅＣＡＣＣ、英国、アクセス番号８５０１１４２９）、ヒト頸部腺がん細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ、米国、番号：ＣＣＬ−２）、およびＨｅＬａ−ＣＤ１９（ＰｒｏＭａｂ、米国、カタログ番号ＰＭ−ＨｅＬａ−ＣＤ１９）を１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｔｉｆｉｃ，  Ｓｏｕｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ、カタログ番号１２６５７−０２９）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国、カタログ番号３５０５０−０３８）、および１００Ｕ／ｍｌのペニシリン＋１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国、カタログ番号１５１４０−１２２）で栄養補給したＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国、カタログ番号３１８７０−０２５）（ここでは「完全培地」と言う）で培養した。標準培養中、選択可能な抗生物質として１μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国、カタログ番号Ｐ９６２０）をＨｅＬａ−ＣＤ１９培地にさらに補充した。
【０８１２】
すべての細胞を準集密条件で保った。Ｒａｊｉ細胞を０．３×１０６〜２×１０６細胞／ｍｌの濃度範囲で維持した。容器が９０％集密まで一杯になったらＨｅＬａ細胞およびＨｅＬａ−ＣＤ１９細胞を継代した。
【０８１３】
初代単球を献血軟膜（Ｓｈｅｂａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、イスラエル）から単離した。まず、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ密度勾配液（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国、カタログ番号１７−１４４０−０３）で単離した。遠心分離（８００×ｇ、２〜８℃、２０分、ブレーク０）時に、ＰＢＭＣを含む中間相を新しい試験管に移して、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ、スイス、カタログ番号ＢＥ１７−６０５Ｅ）および１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（Ｌｏｎｚａ、スイス、カタログ番号ＢＥ１７−７３７Ｂ）で栄養補給したＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｏｎｚａ、スイス、カタログ番号ＢＥ１２−９１８Ｆ）（以後、「洗浄培地」と言う）で洗浄し、遠心分離した（６５０×ｇ、２〜８℃、１０分）。ペレット状の細胞を１５×１０６細胞／ｍｌの濃度まで「洗浄培地」に再懸濁させた。３５ｍｍのプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国、カタログ番号４３０１６５）の中心に０．９ｍｌの液滴として細胞を播種した。プレートを加湿したインキュベーターで１．５時間インキュベートして（３７℃、５％のＣＯ２）、単球を付着させ、次いで、予め温めたＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ、スイス、カタログ番号ＢＥ１７−５１６Ｆ）で３回洗浄して他の細胞種を除去した。洗浄後、細胞を、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｔｉｆｉｃ，  Ｓｏｕｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ、カタログ番号１２６５７−０２９）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国、カタログ番号３５０５０−０３８）、および１００Ｕ／ｍｌのペニシリンと１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国、カタログ番号１５１４０−１２２）で栄養補充した２ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国、カタログ番号３１８７０−０２５）（「完全培地」として知られている）中で培養した。
【０８１４】
すべての細胞株を、５％のＣＯ２を含む３７℃の加湿したインキュベーターで培養した。
【０８１５】
ＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＰｒｏＭａｂ、米国、カタログ番号ＦＭＣ６３）をＡＩＭ−Ｖ培地に分配した、あるいは冷凍した。実験日に、インビトロでの実験用に冷凍保存したＣＡＲ−Ｔ細胞を３５〜３８℃の浴で解凍し、５％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｓｏｕｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ、カタログ番号１２６５７−０２９）で栄養補充して予め温めたＡＩＭ−Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国、カタログ番号１２０５５−０９１）に直ちに浸した。細胞を遠心分離して（３００×ｇ、室温、５分）、予め温めたＡＩＭ−Ｖ培地に再懸濁させてＤＭＳＯを除去した。ＣＤ１９−ＣＡＲ＋細胞集団の濃度および生存率を抗ＦＬＡＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、米国、カタログ番号６３７３１０）染色と、アネキシンＶおよびＰＩ染色（ＭＥＢＣＹＴＯアポトーシスキット、ＭＢＬ、米国、カタログ番号４７００）し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ、米国）で読み取って決定した。
【０８１６】
ナイーブＴ細胞の単離では、Ｈａｄａｓｓａｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｅｉｎ  Ｋｅｒｅｍ  Ｃａｍｐｕｓ、イスラエル、エルサレム）で同意を得た適格ドナーからＣｏｂｅ  ＳｐｅｃｔｒａＴＭ血液成分分離装置（Ｇａｍｂｒｏ  ＢＣＴ、米国）を用いて白血球除去輸血部の操作手順書に従って回収した白血球分離画分から、あるいはＦｉｃｏｌｌ密度勾配液に加えて８００×ｇ、２〜８℃で２０分間遠心分離した軟膜（Ｓｈｅｂａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、イスラエル）からＰＢＭＣを抽出した。製造者のガイドラインに従って、ＭａｇｎｉＳｏｒｔヒトＣＤ３陽性選択キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国、カタログ番号８８０２−６８３０−７４）を用いて陽性部分からＴ細胞を単離した。さらなる２０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｔｉｆｉｃ，  Ｓｏｕｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ、カタログ番号１２６５７−０２９）と５％のＤＭＳＯ（ＣｒｙｏＳｕｒｅ−ＤＭＳＯ、ＷＡＫ−Ｃｈｅｍｉｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＧｍｂＨ、ドイツ、カタログ番号ＷＡＫ−ＤＭＳＯ−７０）を含む（上で規定した）「完全培地」中でＴ細胞を凍結保存し、実験日にＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞と並行して解凍した。
【０８１７】
ＬＤＨ細胞毒性検定
【０８１８】
安定した細胞質酵素である乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は、溶解を受ける細胞によって相関するように放出される。従って、培地中のＬＤＨ量を用いて細胞毒性活性を定量してもよい。ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６非放射性活性細胞毒性検定（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国、カタログ番号Ｇ１７８０）は、培地中のＬＤＨ量を定量する比色分析検定である。テトラゾリウム塩基質（ヨードニトロテトラゾリウム紫、ＩＮＴ）を過剰の培地に導入すると、ＬＤＨが基質を赤色のホルマザン生成物に変換する。得られた赤色の量は、溶解した細胞の数に正比例する。
【０８１９】
手短に言うと、製造者のガイドラインに従って、標的細胞（ＨｅＬａまたはＨｅＬａ−ＣＤ１９）を単独で、あるいは単球と共に培養した。標的細胞が（６時間から一晩で）プレートに付着した後、培養物を１時間、ｙ×１０６個のアポトーシス細胞に曝露し、その後、これらの細胞をＲＰＭＩで４、５回洗浄した。アポトーシス細胞が除去されたことを光学顕微鏡で目視により確認した。１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国、カタログ番号Ｌ４３９１）を共培養物に導入して、１時間インキュベートした。インキュベーション後、ＬＰＳをＲＰＭＩにより３〜５サイクルの洗浄で除去した。生存能力のあるＣＤ１９−ＣＡＲ  Ｔ細胞またはナイーブＴ細胞を指定されたＥ／Ｔ比で加えて、４時間インキュベートした。培地を回収して、プレートを２５０×ｇ、２〜２５℃で４分間遠心分離して（遠心分離器５８１０  Ｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ）細胞を沈殿させた。各ウェルの５０μｌの上清培地を新しい平底９６ウェルマイクロプレートのウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国、カタログ番号３５９６）に移し、５０μｌのＣｙｔｏＴｏｘ  ９６試薬を各ウェルに加えた。プレートを暗室にて室温で３０分間インキュベートして、その後、１ウェルあたり５０μｌの停止液を加えて反応を止めた。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｆ５０（Ｔｅｃａｎ、スイス）を用いて吸光度を４９２ｎｍで読取り、Ｍａｇｅｌｌａｎ  Ｆ５０ソフトウェアを用いて取り込んだ。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１０を用いてデータ分析とグラフの作成を行った。
【０８２０】
フローサイトメトリー細胞毒性検定
【０８２１】
ＨｅＬａ−ＣＤ１９（標的）細胞およびＨｅＬａ（対照）細胞を５μＭのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国、カタログ番号Ｃ１１５７）で予め染色し、混合して、新しいプレートまたは単離した初代単球が生息しているプレートのいずれかに播種した。標的細胞を（６時間から一晩）プレートに付着させた後、培養物をｙ×１０６個のアポトーシス細胞に１時間曝露した。プレートをＲＰＭＩで３〜５回洗浄し、懸濁させたアポトーシス細胞が洗い流されたことを目視で確認した。１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを共培養物に導入して、１時間インキュベートした。その後、ＬＰＳをＲＰＭＩで３〜５サイクルの洗浄により除去した。次いで、生存能力のあるＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞を特定のＥ／Ｔ比により示されるように共培養物に加えて、４時間インキュベートした。インキュベーション後、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル、カタログ番号０３−０５２−１Ｂ）を加えて３７℃で４分間インキュベートすることにより細胞を収穫した。酵素活性を止めるため、２倍または４倍体積の「完全培地」を加えた。細胞を回収して、２００×ｇ、室温で５分間遠心分離し、１００μｌのＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国、カタログ番号１５１４０−１２２）に再懸濁させた。まず、抗ＣＤ１９（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国、カタログ番号１２−０１９８−４２）について染色して、室温の暗室で３０分間インキュベートした。遠心分離（２９０×ｇ、１分、２〜８℃）して３００μｌのＲＰＭＩに再懸濁させた後、細胞を抗７ＡＡＤ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国、カタログ番号００−６９９３−５０）に対して染色した。分析は７ＡＤＤ−陰性細胞（生きている細胞）でゲートし、生きている標的細胞（ＨｅＬａ−ＣＤ１９）と生きている対照細胞（ＨｅＬａ）を算出した。生きている標的細胞（％）を生きている対照細胞（％）で除して生存の百分率を算出した。開始時の細胞数と標的細胞の自然死の変動について修正するため、エフェクター細胞（ＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞）なしで培養した標的細胞（％）の対照細胞（％）に対する比で生存の百分率を除した。最後に、修正した生存の百分率を１００％２から減じて細胞毒性の百分率を決定した。
【０８２２】
ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の標的Ｒａｊｉ癌細胞に対する最適な比を決定するため、Ｒａｊｉ癌細胞をＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞（±単球−マクロファージ）で４８時間インキュベートして最初の実験を行った。９６ウェルプレートで５×１０４個のＲａｊｉ細胞／ウェルから始めた。この結果に基づきエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比のプレートを構築する。
【０８２３】
Ｒａｊｉ癌細胞をアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清と共に１時間インキュベートした後、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞（±単球−マクロファージ）と４８時間共培養することで組み合わせ免疫療法の実験を行う。
【０８２４】
インビボ条件を模倣するため、１×１０５個のＴＨＰ−１細胞／ｍｌを２００ｎＭ（１２３．４ｎｇ／ｍｌ）の酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）で７２時間分化させて、次いで、ＰＭＡを含まない完全培地でさらに２４時間培養する。次いで、Ｒａｊｉ癌細胞を５×１０５個のＲａｊｉ細胞／ウェルで２４ウェルプレートの分化させたＴＨＰ−１細胞に播種する。
【０８２５】
Ｒａｊｉ癌細胞の初期培養後、４×１０５〜８×１０５個のアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）を１〜３時間培養物に加えて免疫寛容環境を誘導する。癌細胞のアポトーシス細胞に対する比を細胞種ごとに最適にする。洗浄後、Ｅ／Ｔ比のグラフに基づいて共培養物を所定数のＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞で処理する。特定の実験では、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を加える前に１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを培養培地に加える。他の実験では、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を加える前にインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を培養培地に加える。ＬＰＳまたはＩＦＮ−γを加えると、サイトカイン急増量が指数関数的に増加することが予測される。
【０８２６】
Ｒａｊｉ癌細胞細胞毒性を検定するため、溶解物を作製して、４８時間インキュベーションした後に生存率を決定する。さらなる実験を行って、４８時間のインキュベーションの間にＲａｊｉ細胞細胞毒性について間隔を開けて検定する。あるいは、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＣｙｔｏＴｏｘ  ９６非放射性活性細胞毒性検定（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ＃Ｇ１７８０）を用いる。
【０８２７】
ＣＤ１９発現ＨｅＬａ細胞とＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を用いて同様の実験を行う。
【０８２８】
ＣＤ１２３発現白血病細胞とＣＤ１２３＋ＣＡＲ−Ｔ細胞とを用いて同様の実験を行う。
【０８２９】
サイトカイン分析
【０８３０】
初期サイトカイン検定で、培養物上清中のＭＩＰ１ａ、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＮＦ−γ、ＧＭＣＳＦ、ＴＮＦ−αの量を調べる。
【０８３１】
さらなるサイトカイン検定で、サイトカインＩＬ−１０、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＰ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＦＮα、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ７０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−７、またはこれらの任意の組み合わせの量を調べる。
【０８３２】
インビボでのＣＡＲ−Ｔ細胞療法環境を模倣するため、培養物を樹立した。アポトーシス細胞を加えて、あるいは加えずに、ヒト単球−マクロファージ、ＬＰＳ、およびＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の存在下でＲａｊｉバーキットリンパ腫細胞を培養した。
【０８３３】
Ｒａｊｉ細胞を単球およびＬＰＳの存在下でインキュベートし、ナイーブＴ細胞（Ｒａｊｉ  ＋  ナイーブＴ）、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞（Ｒａｊｉ＋ＣＡＲ  Ｔ）、ＣＡＲ−Ｔ細胞：ＡｐｏＣｅｌｌの比が１：８のＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞とアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）（Ｒａｊｉ＋ＣＡＲ  Ｔ＋ＡｐｏＣｅｌｌ＝１：８）、ＣＡＲ−Ｔ細胞：ＡｐｏＣｅｌｌの比が１：３２のＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞とアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）（Ｒａｊｉ＋ＣＡＲ  Ｔ＋ＡｐｏＣｅｌｌ＝１：３２）、およびＣＡＲ−Ｔ細胞：ＡｐｏＣｅｌｌの比が１：６４のＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞とアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）（Ｒａｊｉ＋ＣＡＲ  Ｔ＋ＡｐｏＣｅｌｌ＝１：６４）を加えた。濃度、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＴＮＦ−α（ＴＮＦ−ａ）を測定した。
【０８３４】
ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＩＬ−１３、ならびに他のサイトカインのサイトカイン放出の低減について検定するため、上清を回収して、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ＭａｇＰｉｘ読み取り器とＥＬＩＳＡ検定を用いて選択したサイトカインについて調べた。ＭＡＰＩＸシステム分析器（Ｍｅｒｅｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とＭＩＬＩＰＬＥＸ分析ソフトウェア（Ｍｅｒｅｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＬｕｍｉｎｅｘ技術によりサイトカイン（マウスまたはヒト）を評価してもよい。マウスＩＬ−６Ｒα、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、およびＴＧＦ−β１をＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）により評価した。
【０８３５】
組織分析
【０８３６】
フローサイトメトリーと免疫組織化学検査を用いて骨髄と肝臓を評価した。組織病理学的分析のため、殺処理して肝臓と骨髄を回収した。組織を室温４８時間、４％のホルマリンで固定し、処理のためヘブライ大学の動物施設に提出した。骨は処理の前に脱灰した。パラフィン切片をヘマトキシリン、エオシン、およびＣＤ１９に対して染色した。
【０８３７】
ＩＦＮ−γの影響
【０８３８】
ＩＦＮ−γの影響を、ＳＴＡＴ１リン酸化反応および生物学的生成物の両方で評価した。
【０８３９】
結果
【０８４０】
細胞毒性検定のための細胞数の較正
【０８４１】
インビトロモデルで用いるＲａｊｉ細胞の数を決定するため、細胞毒性検定の感度限界を評価した。９６ウェルプレートに５×１０４〜２０×１０４個のＲａｊｉ細胞／ウェルを播種した試料を４組作製した。４組の試料のうちの１組に対して溶解を行い、まだ完全に生存能力のある細胞と比較した。溶解は瞬間的なもので、遠心分離の直前に溶解溶液を加えて部分的な細胞毒性を模倣した。実際、すべての細胞の量は、生存能力のある細胞よりも高い読取り値を示し、５×１０４個の細胞数で最も高い相対読取り値が得られた（図１４；データの外挿）。従って、特に実験の設計上必要がなければ、続く実験でこの細胞数を初期値として用いる。
【０８４２】
Ｒａｊｉバーキットリンパ腫細胞に対するＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞活性の確認
【０８４３】
ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞活性を裏付けるため、単層のＲａｊｉ癌細胞を１，０００，０００（１００万）個のＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞または１，０００，０００（１００万）個の非形質導入Ｔ細胞に曝露させた。２４時間のインキュベーション後、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞はＲａｊｉ癌細胞の増殖を低減させ、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示した。
【０８４４】
ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞単独のＲａｊｉバーキットリンパ腫細胞に対する活性をアポトーシス細胞に曝露後の活性と比較した。
【０８４５】
アポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）とアポトーシス細胞上清（ＡｐｏＳｕｐおよびＡｐｏＭｏｎ  Ｓｕｐ）を試験して、これらがＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞抗腫瘍活性を干渉するか否かを決定する。Ｒａｊｉバーキットリンパ腫細胞をアポトーシス細胞と共に１時間インキュベートして、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞（５００，０００、５０万個）またはＣＤ１９＋非形質導入Ｔ細胞（５００，０００、５０万個）（ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞のアポトーシス細胞に対する比が１：２）を加える。次いで、腫瘍細胞／アポトーシス細胞／ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を４８時間共培養する。対照Ｒａｊｉバーキットリンパ腫細胞をアポトーシス細胞なしで、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞およびＨａｒｔｍａｎ溶液（アポトーシス細胞の培地）と共培養する。
【０８４６】
これらの結果から、４８時間のインキュベーション後、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞抗腫瘍活性は、非形質導入Ｔ細胞とのインキュベーションよりも優れていることが判明した。アポトーシス細胞上清について同様のインキュベーションを行った。意外にも、アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清への曝露の有無に関わらず、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞抗腫瘍活性は同等であった。
【０８４７】
いずれもインビトロでＣＤ１９に対する改変ＣＡＲ−Ｔ細胞に及ぼすアポトーシス細胞の負の影響は見られず、アポトーシス細胞があってもなくてもＣＡＲ−ＴのＥ／Ｔ比は同等の結果を示した。
【０８４８】
ＨｅＬａ白血病細胞に対するＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞活性の確認
【０８４９】
ＨｅＬａ細胞は、特定のＣＤ１９発現細胞であり、このため、ＨｅＬａ細胞はＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞活性の影響を受けやすいものになる。また、非付着性細胞株であるＲａｊｉ細胞に対して、ＨｅＬａ細胞は付着性である。
【０８５０】
ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞活性を裏付けるため、単層のＨｅＬａ癌細胞を１，０００，０００（１００万）個のＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞または１，０００，０００（１００万）個の非形質導入Ｔ細胞に曝露させた。２４時間のインキュベーション後、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞はＨｅＬａ癌細胞の増殖を低減させ、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍活性を示した（図１５のＣＤ１９＋＋ＲＰＭＩおよびＣＤ１９＋＋ＣＡＲ  Ｔ−１９細胞）。
【０８５１】
ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞単独のＣＤ１９＋ＨｅＬａ細胞に対する活性をアポトーシス細胞に曝露後の活性と比較した。
【０８５２】
アポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）を試験して、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞抗腫瘍活性を干渉するか否かを決定した。ＨｅＬａ細胞をアポトーシス細胞と共に１時間インキュベートして、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞（５００，０００、５０万個）またはＣＤ１９＋非形質導入Ｔ細胞（ナイーブＴ細胞；５００，０００、５０万個）（ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞のアポトーシス細胞に対する比が１：２）を加えた。次いで、腫瘍細胞／アポトーシス細胞／ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を４８時間共培養した。対照ＨｅＬａ細胞をアポトーシス細胞なしで、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞およびＲＰＭＩ（アポトーシス細胞の培地）と共に４８時間共培養した。ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞：ＨｅＬａ細胞の比（Ｅ／Ｔ比）は５〜２０の範囲であった（図１５）。
【０８５３】
図１５は、４８時間のインキュベーション後、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞抗腫瘍活性は非形質導入Ｔ細胞（ナイーブ細胞）と共にインキュベートした場合、あるいは緩衝液単独とインキュベートした場合よりも優れていることが判明した。アポトーシス細胞について同様のインキュベーションを行った。意外にも、アポトーシス細胞への曝露の有無に関わらず、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞抗腫瘍活性は同等であった。アポトーシス細胞上清を用いて同様の実験を行う。図１５は、アポトーシス細胞を加えた場合または加えない場合のＣＡＲ−Ｔ−ＣＤ１９療法のインビトロでの細胞毒性効果が同じであることを示している
【０８５４】
ＣＤ１９＋ＨｅＬａ細胞に対する改変ＣＡＲ−Ｔ細胞に及ぼすアポトーシス細胞の負の影響は見られず、アポトーシス細胞があってもなくてもＥ／Ｔ比は同等であった。
【０８５５】
このように、初期アポトーシス細胞を加えても加えなくても、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロでの細胞毒性効果が同じであることが観察された。
【０８５６】
アポトーシス細胞の、ＣＡＲ−Ｔ治療から得られたサイトカイン急増の向上、低減、または阻害に及ぼす影響
【０８５７】
ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を加える前後に培養培地でサイトカインＩＬ−８およびＩＬ−１３を測定し、濃度がサイトカイン急増と一貫していることを示す。アポトーシス細胞またはアポトーシス細胞上清を加えると、培地中のＩＬ−８およびＩＬ−１３の濃度が低下することが示される。
【０８５８】
広範囲のサイトカインを用いた分析
【０８５９】
実験手順時に生成されないがヒトのサイトカイン急増時に臨床設定で現れる可能な広い範囲および量のサイトカインに及ぼす効果をさらに評価するため、がんおよびＣＡＲ−１９の存在下でＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を上記のＲａｊｉ細胞培養物条件に加えた。ＬＰＳを加えるとサイトカイン急増量が指数関数的に増加することが予測された。アポトーシス細胞への曝露により、サイトカインの量が劇的に低減する。図１６および図１７に示された結果から、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を加えると培養培地中のＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αのサイトカイン濃度（ｐｇ／ｍｌ）が大きく増加するが、アポトーシス細胞の存在下でＧＭ−ＣＳＦとＴＮＦ−αの両方が有意に低減することが判明した。サイトカイン濃度の低下は、ＣＡＲ−Ｔ細胞のアポトーシス細胞に対するアポトーシス細胞比について投与量依存性がある。
【０８６０】
結論
【０８６１】
アポトーシス細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞臨床手順に関連したサイトカイン急増のサイトカインマーカーを下方調節することができた。アポトーシス細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍活性には有意な影響を及ぼさなかった。アポトーシス細胞は、自然免疫に由来する炎症誘発性サイトカインを低減し、有害な量のＩＦＮ−γとＣＡＲ−Ｔ細胞毒性がなく、ＩＦＮ−γ効果を阻害した。
【０８６２】
実施例６：アポトーシス細胞療法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を行ったびまん性がんインビボモデルにおいてサイトカイン急増を防ぐ
目的：癌細胞に対するＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性とサイトカイン急増マーカーサイトカインの量を決定するため、びまん性腫瘍モデルでアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞由来の上清のインビボでの効果を試験する。
【０８６３】
材料および方法
【０８６４】
インビトロでの研究
【０８６５】
インビトロで研究については実施例５に記載の方法を参照のこと。
【０８６６】
細胞および細胞培養物
【０８６７】
Ｒａｊｉバーキットリンパ腫細胞（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ＃８５０１１４２９）を製造者のガイドラインに従って培養した。ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞、細胞培養物、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞上清、単球の単離およびインビトロでの測定は上記の実施例と同様である。生成した初期アポトーシス細胞は、少なくとも５０％がアネキシンＶ陽性であり、５％未満がＰＩ陽性細胞であった。
【０８６８】
インビボでの研究
【０８６９】
マウス
【０８７０】
７〜８週齢のＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスをＥｎｖｉｇｏ（以前はＨａｒｌａｎとして知られていた）から購入した。マウスを（ある特定の微生物および寄生虫に感染していない）ＳＰＦ動物施設でＩＡＣＵＣガイドラインに準拠して飼育した。実験の過程で、マウスを毎日監視し、週３回体重を測定した。後肢の麻痺を示すマウスを殺処理した。殺処理した際、ＦＡＣＳ分析と組織学的処理用に骨髄、肝臓を回収して、サイトカイン分析用に血清を−８０℃で冷凍した。
インビボでの実験
【０８７１】
エルサレム・ヘブライ大学（アイン・カレム・キャンパス、イスラエル）のＡｕｔｈｏｒｉｔｙ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ（ＡＡＦ）、次いで国際実験動物管理公認協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ））でＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウス（Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＨｓｄ−Ｐｒｋｄｃ−ＳＣＩＤ−Ｌｙｓｔ−ｂｇ、ハーラン、イスラエル）をＳＰＦ条件で飼育した。研究はヘブライ大学動物実験倫理委員会により承認され、動物の苦痛を最小限にした。
【０８７２】
（図１８Ａ）普及している腫瘍モデルについて、７〜８週齢のメスＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスに１匹あたり１×１０５個のＲａｊｉ細胞（２００μｌのＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国、カタログ番号１５１４０−１２２）に懸濁）を静脈注射した（１日目）。６日目に適当な群のマウスに、１匹あたり２００μｌのＨａｒｔｍａｎｎ液（乳酸リンゲル液、Ｔｅｖａ  Ｍｅｄｉｃａｌ、イスラエル、カタログ番号ＡＷＮ２３２４）  中に３０×１０６個のアポトーシス細胞を静脈注射で接種した。６日目に適当な群のマウスに１匹あたり２００μｌのＡＩＭ  Ｖ中に１０×１０６個の生存能力のあるＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞またはナイーブＴ細胞を静脈注射で接種した。それぞれの処理で対照マウスにも同じ体積のＲＰＭＩを与えた。
【０８７３】
マウスの臨床的な兆候を調べ、週２回体重を測定した。後肢麻痺があるものを殺処理した。骨と肝臓の病理試料をエルサレム・ヘブライ大学の動物施設で作製し、ヒトＣＤ２０（Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ、米国、クローンＬ２６、カタログ番号１２０Ｍ−８４）に対して染色してＲａｊｉ細胞を検出し、ヒトＣＤ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国、カタログ番号８５０６１）に対して染色してヒトＴ細胞を検出した。
【０８７４】
特定の実験では、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を加える前にＬＰＳを動物被験体に投与する。他の実験では、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を加える前にインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を投与する。ＬＰＳまたはＩＦＮ−γを加えるとサイトカイン急増量が指数関数的に増加することが予測される。
【０８７５】
サイトカイン検定では、これらに限定されないが、ＩＬ−１０、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＰ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＦＮα、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２ｐ７０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−７、またはこれらの任意の組み合わせを含むサイトカインの量を調べる。ＭＡＰＩＸシステム分析器（Ｍｅｒｅｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とＭＩＬＩＰＬＥＸ分析ソフトウェア（Ｍｅｒｅｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＬｕｍｉｎｅｘ技術によりサイトカイン（マウスまたはヒト）を評価する。マウスＩＬ−６Ｒα、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、およびＴＧＦ−β１をＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）により評価する。
【０８７６】
組織分析
【０８７７】
フローサイトメトリーと免疫組織化学を用いて骨髄と肝臓を評価する。殺処理の際に骨髄と肝臓を組織病理学分析用に回収した。組織を室温で４８時間４％のホルマリン中で固定し、処理のためにヘブライ大学の動物施設に提出した。処理の前に骨を脱灰した。パラフィン切片をヘマトキシリン、エオシン、およびＣＤ１９に対して染色した。
【０８７８】
ＩＦＮ−γの影響
【０８７９】
ＩＦＮ−γの影響をＳＴＡＴ１リン酸化反応および生物学的生成物の両方により評価した。
【０８８０】
結果
【０８８１】
ＣＡＲ−Ｔ細胞療法はサイトカイン放出症候群を誘導する
【０８８２】
腫瘍のないマウスの３つの群と腫瘍のあるマウスの３つの群に、投与量を増加させながら（３×１０６、１０×１０６、または３０×１０６）ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を（腹腔内投与または腫瘍に直接）投与した。投与量が最も多い場合で、腫瘍のないマウスと腫瘍のあるマウスは、２４時間以内に不活発な挙動、立毛、および可動性の低下を示し、急速な体重減少を伴い、４８時間以内に死亡した。最も多い投与量のＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を与えたマウス由来の血液試料ではヒトインターフェロン−γ、マウスＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＩＬ−１３が検出可能である。異なる腫瘍抗原に向けられた多い投与量のＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与された動物は、体重減少や挙動の変化を示さない。
【０８８３】
アポトーシス細胞の投与は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法によって誘導されたサイトカイン放出症候群の発生を阻害または低減する
【０８８４】
最も多い投与量のＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を与えたマウスの１群にそれと共に、それまでに安全で有効な投与量であることが示されていた２．１０×１０８／ｋｇ個のアポトーシス細胞を投与する。ヒトＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ＋アポトーシス細胞を与えたマウスは、少なくとも１種のマウス炎症誘発性サイトカインが有意に低減し、体重減少も少なくなり、死亡率も低下した。
【０８８５】
ＣＡＲ−Ｔ細胞投与と組み合わせたアポトーシス細胞の投与はＣＡＲ−Ｔ細胞抗腫瘍活性に影響を及ぼさなかった
【０８８６】
図１８Ｂは、ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与せずにＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞を注射したＳＣＩＤマウスの予定死亡は１８〜２１日であったことを示している。ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与されたマウスの４０パーセント（４０％）は少なくとも３０日目まで生きていた（図１８の一点鎖線および二点破線）。生存マウスの百分率は、アポトーシス細胞を加えたこととは独立していた（図１８）。生存しているマウスを３０日目に殺処理した。
【０８８７】
結論：生存率は同等で有り、インビボでのＣＤ１９に対する改変ＣＡＲ−Ｔ細胞に及ぼすアポトーシス細胞の負の影響はなかった。
【０８８８】
ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＴＮＦ−ａ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βを含む炎症誘発性サイトカインの有意な下方調節（ｐ＜０．０１）が報告された。ＩＦＮ−γは下方調節されなかったが、そのマクロファージおよび樹状細胞に及ぼす影響は、リン酸化ＳＴＡＴ１の量およびＣＸＣＬ１０とＣＸＣＬ９のＩＦＮ−γ誘導発現の両方で阻害された。
【０８８９】
結論
【０８９０】
アポトーシス細胞は、自然免疫に由来する炎症誘発性サイトカインを低減し、有害な量のＩＦＮ−γとＣＡＲ−Ｔ細胞毒性がなく、ＩＦＮ−γ効果を阻害する。
【０８９１】
実施例７：アポトーシス細胞療法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を施した固形腫瘍がんインビボモデルでサイトカイン急増を防ぐ
目的：癌細胞に対するＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性とサイトカイン急増マーカーサイトカインの量を決定するため、固形腫瘍モデルでのアポトーシス細胞またはアポトーシス細胞由来の上清のインビボでの効果を試験する。
【０８９２】
材料および方法
【０８９３】
インビトロでの研究
【０８９４】
細胞および細胞培養物
【０８９５】
ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＴＭＣＤ２８を含む第二代ＣＡＲ−Ｔ−ＣＤ１９細胞を用いて、細胞培養物、アポトーシス細胞、アポトーシス細胞上清、単球の単離およびインビトロでの測定を実施例２、４、および６の通り行った。生成した初期アポトーシス細胞は、実施例１に詳細に記載したように少なくとも５０％がアネキシンＶ陽性であり、５％未満がＰＩ陽性細胞であった。
【０８９６】
インビボでの研究
【０８９７】
マウス
【０８９８】
７〜８週齢のＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスとＮＳＧＳマウスをＨａｒｌａｎ（イスラエル）から購入して、シャレット研究所のＳＰＦ動物施設で飼育した。
【０８９９】
固形腹腔内腫瘍を形成するため、ＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスまたはＮＳＧＳマウスに、腹膜に付着することができるＣＤ１９を発現するＨｅＬａ細胞を接種した。Ｔ細胞投与の前にマウスを群に分けた。
【０９００】
静脈注射による接種の６日後、５日目に前処理したアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）と共に、あるいはそれなしに１０×１０６個のＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞をマウスに投与した。前処理を受けたマウスに５×１０６または３０×１０６個のアポトーシス細胞を投与した。腫瘍を週単位で検査して、循環サイトカイン量を週単位で監視し、Ｌｕｍｉｎｅｘシステムで決定した。Ｌｕｍｉｎｅｘ技術を用いて２５種のマウスサイトカインと３２種のヒトサイトカインを評価した。実験の終了時にマウスを選別して、腫瘍の有無／大きさについて器官（骨髄、肝臓、および脾臓）を（ＦＡＣＳおよび免疫組織化学により）調べた。
【０９０１】
サイトカイン検定では、これらに限定されないが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１α、ＴＮＦα、ＭＩＰ−１β、ＩＦＮα、およびＩＰ−１０を含むサイトカインの量を調べた。ＭＡＰＩＸシステム分析器（Ｍｅｒｅｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とＭＩＬＩＰＬＥＸ分析ソフトウェア（Ｍｅｒｅｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＬｕｍｉｎｅｘ技術によりサイトカイン（マウスまたはヒト）を評価した。マウスＩＬ−６Ｒα、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、およびＴＧＦ−β１をＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）により評価した。
【０９０２】
組織分析
【０９０３】
フローサイトメトリーおよび免疫組織化学を用いて骨髄と肝臓を評価する。
【０９０４】
ＩＦＮ−γの影響
【０９０５】
ＩＦＮ−γの影響をＳＴＡＴ１リン酸化反応および生物学的生成物の両方により評価した。
【０９０６】
結果
【０９０７】
ＣＡＲ−Ｔ細胞療法はサイトカイン放出症候群を誘導する
【０９０８】
腫瘍のないマウスの３つの群と腫瘍のあるマウスの３つの群に、投与量を増加させながら（３×１０６、１０×１０６、または３０×１０６）ＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を（腹腔内投与または腫瘍に直接）投与した。投与量が最も多い場合で、腫瘍のないマウスと腫瘍のあるマウスは、２４時間以内に不活発な挙動、立毛、および可動性の低下を示し、急速な体重減少を伴い、４８時間以内に死亡した。
【０９０９】
図１９Ａ〜図１９Ｃのグラフから、ＣＡＲ−Ｔ細胞が存在する前でも腫瘍からのＩＬ−６、ＩＰ−１０、および意外なことにＴＮＦ−αサイトカイン放出量が増加していることが分かった。図１９Ａ〜図１９Ｃから、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法をせずとも癌細胞の存在により予期せずＩＬ−６、ＩＰ−１０、およびＴＮＦ−αが増加したことが分かる。ＣＡＲ−Ｔ細胞療法（ＨｅＬａ−ＣＡＲ−Ｔ細胞ＣＤ−１９）の存在下でサイトカイン放出は有意に増加した。これらの結果から、腫瘍自体が炎症誘発性サイトカインを放出することが判明した。
【０９１０】
初期アポトーシス細胞を加える利点を評価するため、サイトカインＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＭＩＰ−１α、ＴＮＦα、ＭＩＰ−１β、ＩＦＮα、およびＩＰ−１０を３つの実験で測定した。その結果から、マクロファージ関連サイトカインはアポトーシス細胞投与の存在下で下方調節されたが、Ｔ細胞関連サイトカイン量は有意な変化はしないことが判明した（表１０）。
【０９１１】
【表１０】
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【０９１２】
表１０は、±ＡｐｏＣｅｌｌでのＣＡＲ−Ｔ細胞投与の２４時間後のサイトカイン測定を示す。ＣＡＲ−Ｔ細胞療法から得られた細胞毒性は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−６、ＭＩＰ−１α、ＴＮＦα、ＭＩＰ−１β、およびＩＰ−１０を含むサイトカインを増加させ、その量はアポトーシス細胞の存在下で有意に下方調節された（ｐ＜０．０５〜０．０００１）。これらのサイトカインは主にマクロファージに関連づけられる。これに対して、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、およびＩＬ１５などのＴ細胞に関連づけられたサイトカインの量は有意なほどには変化しなかった。
【０９１３】
図１９Ａ〜図１９Ｃおよび表１０に示す結果から、がんおよびＣＡＲの文脈でのサイトカイン放出症候群は、サイトカインを分泌することができる腫瘍、腫瘍、ＣＡＲ、および他の因子に反応する自然免疫、および自然免疫に影響を及ぼす死の原因となるサイトカインを分泌するＣＡＲ−Ｔ細胞などいくつかの成分を有していることが分かる。アポトーシス細胞は、Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞と相互作用せずに自然免疫、主にマクロファージ、単球、および樹状細胞と相互作用して、これらマクロファージ、単球、および樹状細胞の応答を下方調節する。
【０９１４】
異なる腫瘍抗原に向けられた高い投与量のＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与された動物は、体重減少や挙動の変化を示さない。
【０９１５】
アポトーシス細胞の投与は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法によって誘導されたサイトカイン放出症候群の発生を阻害または低減する
【０９１６】
最も多い投与量のＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ細胞を与えたマウスの１群にそれと共にそれまでに安全で有効な投与量であることが示されていた２．１０×１０８／ｋｇ個のアポトーシス細胞を投与した。アポトーシス細胞は、ＣＤ１９に対する特異性を持つ改変ＣＡＲ−Ｔ細胞に及ぼすインビトロまたはインビボで負の影響を示さなかった。インビトロでのアポトーシス細胞の有無でＣＡＲ−Ｔ細胞のＥ／Ｔ比は同等であり、インビボでの生存曲線も同等であった（データ示さず）。
【０９１７】
ヒトＣＤ１９＋ＣＡＲ−Ｔ＋アポトーシス細胞を投与されたマウスは、少なくとも１種のマウス炎症誘発性サイトカインの量が有意に低減し、体重減少も少なくなり、死亡率も低下した。
【０９１８】
インビボでのＣＤ１９に対する改変ＣＡＲ−Ｔ細胞に及ぼすアポトーシス細胞の負の影響は見られず、アポトーシス細胞の有無に関わらずＣＡＲ−ＴのＥ／Ｔ比の結果は同等であり、インビボでの生存曲線も同等であった。
【０９１９】
ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＴＮＦ−ａ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βを含む炎症誘発性サイトカインの有意な下方調節（ｐ＜０．０１）が報告された（データ示さず）。ＩＦＮ−γは下方調節されなかったが、そのマクロファージおよび樹状細胞に及ぼす影響は、リン酸化ＳＴＡＴ１の量およびＣＸＣＬ１０とＣＸＣＬ９のＩＦＮ−γ誘導発現の両方で阻害された（データ示さず）。
【０９２０】
結論
【０９２１】
サイトカイン放出症候群は、腫瘍生物学、単球／マクロファージ／樹状細胞の相互作用、およびＣＡＲ−Ｔ細胞効果に対する応答と増殖などのいくつかの因子から発達する。アポトーシス細胞は、自然免疫に由来する炎症誘発性サイトカインを低減し、有害な量のＩＦＮ−γまたはＣＡＲ−Ｔ細胞毒性がなく、ＩＦＮ−ｇの単球／マクロファージ／樹状細胞に及ぼす影響を阻害した。このように、アポトーシス細胞は、自然免疫に由来する炎症誘発性サイトカインを低減し、有害な量のＩＦＮ−γとＣＡＲ−Ｔ細胞毒性がなく、ＩＦＮ−γ効果を阻害した。これらの結果は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法を用いた臨床研究におけるサイトカイン放出症候群の予防におけるアポトーシス細胞の安全な使用を裏付けるものである。
【０９２２】
実施例８：アポトーシス細胞はサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を下方調節し、ＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性を高める
目的：長期間に亘るサイトカインとＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞毒性に及ぼす初期アポトーシス細胞の影響を試験する。ＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビボでの有効性を示す。初期アポトーシス細胞とＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞の相乗効果を示す。
【０９２３】
方法：ＣＤ１９を発現しているＨｅＬａ細胞（ＰｒｏＭａｂ）を単独で、あるいはヒトマクロファージと共インキュベーション後にインビトロの実験およびマウスの腹腔内実験に用いた。白血病を誘導するため、Ｒａｊｉをインビボで用いた。ＬＰＳとＩＦＮ−ｇを用いてさらなるサイトカイン放出を誘導した。ＣＤ１９保有細胞に対する抗腫瘍効果について、第二世代のＣＤ２８保有ＣＤ１９特異的改変ＣＡＲ細胞を用いた（ＰｒｏＭａｂ、あるいはレトロネクチン製造プロコトルまたはポリブレン製造プロコトルを用いて作製したもののいずれか）。細胞毒性検定をインビボ（７−ＡＡＤフローサイトメトリー）とインビトロで行った（生存曲線；骨髄および肝臓に入れた腫瘍、フローサイトメトリーおよび免疫組織化学）。サイトカイン放出症候群は自発的、あるいはＬＰＳとＩＦＮ−ｇに応答して起こった。マウスＩＬ−１０、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＰ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＦＮ−ａ、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１２ｐ７０、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−ａ、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−７、および３２種のヒトサイトカインを評価した（Ｌｕｍｉｎｅｘ技術、ＭＡＰＩＸシステム；ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ  Ａｎａｌｙｓｔ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。マウスＩＬ−６Ｒａ、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、およびＴＧＦ−β１を評価した（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）。ＩＦＮ−γの影響を評価した（ＳＴＡＴ１リン酸化反応、生物学的生成物）。ヒトマクロファージおよび樹状細胞を単球から生成した。初期アポトーシス細胞を一般に実施例１に示したように作製した。細胞の４０％以上はアネキシンＶ陽性であり、１５％以下はＰＩ陽性であった。
【０９２４】
マウス：実験の１日目と２日目にＳＣＩＤ−Ｂｇマウス（メス、７〜８週齢）に０．２５×１０６個のＨｅＬａ−ＣＤ１９細胞の投与量を２回連続で腹腔内（ｉ．ｐ）投与した。９日目に、マウスに１０×１０６個の４０００ｒａｄ（ｃＧｙ）照射アポトーシス細胞（細胞処理システムを用いて）を腹腔内投与し、翌日、０．５×１０６個のＣＡＲ−Ｔ陽性細胞または２．２×１０６個のＣＡＲ−Ｔ陽性細胞を含む１０×１０６個のＣＡＲ−Ｔ細胞の集団の腹腔内投与量を投与した。対照として、マウスに１０×１０６個の活性化単核細胞または偽（擬似）Ｔ細胞を投与した。ＩＡＣＵＣガイドラインに準拠してマウスをＳＰＦ動物施設で飼育した。マウスの体重を週２回測定して、臨床的兆候と腹膜炎について毎日監視した。終点を、腹部肥大および緊張、不活発、可動性の低下、または呼吸困難として現れた重篤な腹膜炎と規定した。カプラン＝マイヤー法に従って生存分析を行った。
【０９２５】
結果：ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＴＮＦ−ａ、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１βを含む炎症誘発性サイトカインの有意な下方調節（ｐ＜０．０１）が報告された（データ示さず）。ＩＦＮ−ｇは下方調節されなかったが、そのマクロファージおよび樹状細胞に及ぼす効果はリン酸化ＳＴＡＴ１の量で阻害された（データ示さず）。マクロファージでのＣＸＣＬ１０およびＣＸＣＬ９のＩＦＮ−γ誘導発現は低減された（データ示さず）。
【０９２６】
０．５×１０６個のＣＡＲ−Ｔ陽性細胞を用いた実験で、１７日目と２１日目に１群につき２匹のマウスを殺処分した。ＨｅＬａ−ＣＤ１９で治療したマウスは、腹膜での血液貯留、脾臓肥大、および腫瘍部位として現れた腹膜炎を示した（データ示さず）。対照のＭＮＣで治療したマウスは腹膜の血液と腫瘍部位がいずれもわずかに少なかった。ＣＡＲ−Ｔ、またはＣＡＲ−Ｔとアポトーシス細胞で治療したマウスは腹膜炎の兆候がなかった。この観察は図２０Ａに示す生存曲線と相関していた。
【０９２７】
２．２×１０６個のＣＡＲ−Ｔ陽性細胞を用いた実験では、ＣＡＲ−Ｔ細胞で見られた効果（１／４以下）と同様のパターンが観察された（図２０Ｂ）。ＣＡＲ−Ｔでの治療では、腹膜ＨｅＬａ−ＣＤ１９を持つマウスの生存日数が長くなった（ｐ＝０．０００２）。この効果は本実験でより有意であったが、おそらく注入したＣＡＲ−Ｔ細胞の数が多かった（２．２×１０６個と０．５×１０６個のＣＡＲ−Ｔ陽性細胞）ためであろう。より有意で長く続く効果により、これらの初期アポトーシス細胞は相乗効果と長い生存日数が見られた（ｐ＝０．００３２）。ＣＡＲ−ＴについてのＥ／Ｔ比はインビトロでアポトーシス細胞があってもなくても同等であった。意外にも、アポトーシス細胞の存在下で行ったＣＡＲ−Ｔ細胞療法により、マウスの生存日数は改善され、ＣＡＲ治療のみの場合と比べて少なくとも１２日と有意かつ再現性を持って増加した（ｐ＜０．００３２、図２０Ａおよび図２０Ｂ）。
【０９２８】
結論：ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、腹膜ＨｅＬａ−ＣＤ１９細胞を持つマウスの生存日数を長くした。ＣＡＲ−Ｔの１日前に照射初期アポトーシス細胞を投与すると、相乗効果が見られ、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法のみの場合と比べてマウスが１０日を超えて長く生存した（ｐ＜０．０４４、ログランク検定）。
【０９２９】
照射アポトーシス細胞の輸液は、ＳＣＩＤマウスのＣＤ１９保有ＨｅＬａ細胞の治療においてＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞に対して劇的な相乗効果を示した。この例では、実施例５および６に示された結果と同様の結果が観察された。本実施例で照射アポトーシス細胞を用いることにより、実施例５および６と比べて「移植片対白血病効果」の可能性が取り除かれた。従って、この意外な相乗効果は、作製した照射アポトーシス細胞により媒介されたと思われる。
【０９３０】
サイトカイン放出症候群は、腫瘍生物学、単球／マクロファージ／樹状細胞の相互作用、およびＣＡＲ−Ｔ細胞効果に対する応答と増殖などのいくつかの因子から発達する。アポトーシス細胞は、自然免疫に由来する炎症誘発性サイトカインを低減し、有害な量のＩＦＮ−γまたはＣＡＲ−Ｔ細胞毒性がなく、単球／マクロファージ／樹状細胞に及ぼすＩＦＮ−γ効果を阻害し、ＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性を有意に高める。予期せず、照射アポトーシス細胞による治療はＣＡＲ−Ｔ細胞療法を補完し、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の抗癌効果を有効に持続させる。
【０９３１】
実施例９：非固形腫瘍モデルに及ぼすアポトーシス細胞療法の影響
目的：局所的あるいは限定的ではなく広がっているがんの生存に及ぼすアポトーシス細胞の有効性を決定するため、非固形腫瘍モデルに及ぼすアポトーシス細胞の影響を試験する。
【０９３２】
方法
【０９３３】
Ｒａｊｉ細胞
【０９３４】
Ｒａｊｉ細胞をＥＣＡＣＣ（カタログ＃：８５０１１４２９）から購入して、完全培地（１０％のＨ．Ｉ．  ＦＢＳ、１％のＧｌｕｔａｍａｘ、１％のペニシリン／ストレプトマイシンで栄養補充したＲＰＭＩ−１６４０）で定法により培養し、３×１０５〜３×１０６細胞／ｍｌの濃度に保った。
【０９３５】
アポトーシス細胞を実施例１に記載のように作製した。作製した初期アポトーシス細胞は少なくとも５０％がアネキシンＶ陽性であり、５％未満がＰＩ陽性細胞であった。
【０９３６】
非固形（びまん性）腫瘍モデル
【０９３７】
実験の１日目にＳＣＩＤマウスに１０５個のＲａｊｉ細胞を単回の静脈注射で投与した。ＳＣＩＤマウスの対照群に生理食塩水溶液を単回の静脈注射で投与した（３群を試験した。Ｒａｊｉ細胞を用いて２群で白血病を誘導し、１群を対照として維持した）。
【０９３８】
固形腫瘍モデル
【０９３９】
実験の１日目にＳＣＩＤマウスに１０５個のＲａｊｉ細胞を単回の静脈注射で投与し、対照群に生理食塩水の単回の静脈注射で投与する。
【０９４０】
アポトーシス細胞療法
【０９４１】
予備検討で、Ｒａｊｉ細胞輸液の６日後に初期アポトーシス細胞の輸液をマウスに投与した。その後の研究で、Ｒａｊｉ細胞輸液の６日後に始めて初期アポトーシス細胞（３０×１０６個の細胞）の輸液を３回上記白血病群のうちの１匹のマウスに投与した。
【０９４２】
結果
【０９４３】
ＳＣＩＤマウスはＴ細胞を持たず、従って、治療せずに白血病から回復する能力をもたない。
【０９４４】
意外にも、予備検討と図２１に示すように、アポトーシス細胞輸液を投与していないマウス（ＮＯ  ＡＰＯ）に比べて、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉを注射されたＳＣＩＤではＲａｊｉ輸液の６日後のアポトーシス細胞輸液（ＡＰＯ）により無腫瘍死亡日数が有意に長くなっていた。
【０９４５】
白血病（ＮＯ  ＡＰＯ）群では、Ｒａｊｉ細胞を投与されたマウスの７０％が寿命を全うしたが、これに比べてＲａｊｉ細胞とアポトーシス細胞の両方を投与されたマウスでは９４％であった（ｎ＝計５１匹の動物、ｐ＜０．００１）。予測したように、対照マウスの１００％は平均余命を全うした（図２２Ａ）。白血病群では、アポトーシス細胞なしでＲａｊｉ細胞を投与したマウスの９％は平均余命より１２％まで長く生きたが、これに比べて、Ｒａｊｉ細胞とアポトーシス細胞の両方を投与したマウスの４７％が平均余命より１２％まで長く生きた（図２２Ｂ）。アポトーシス細胞なしでＲａｊｉ細胞を投与したマウスで平均余命の３０％より長く生きたものはいなかったが、これに対してＲａｊｉ細胞とアポトーシス細胞の両方を投与したマウスの４１％が平均余命の３０％より長く生きた（図２２Ｃ）。アポトーシス細胞なしでＲａｊｉ細胞を投与したマウスでは完全な寛解に至ったものはいなかったが、これに対してＲａｊｉ細胞とアポトーシス細胞の両方を投与したマウスの１０％が完全に寛解した（図２２Ｄ）。
【０９４６】
結論
【０９４７】
アポトーシス細胞輸液を投与すると、白血病マウスの寿命が維持された、あるいは長くなった。特定の例では、初期アポトーシス細胞を投与されたマウスは完全な寛解に至った（図２および図３Ａ〜図３Ｄ）。
【０９４８】
実施例１０：アポトーシス細胞と抗ＣＤ２０  ｍＡｂの併用治療のびまん性腫瘍モデルに及ぼす影響
目的：初期アポトーシス細胞と抗ＣＤ２０  ｍＡｂの組み合わせを投与する療法の生存に対する有効性を決定するため、局所的あるいは限定的ではなく広がっているびまん性（非固形）腫瘍モデルに及ぼすこの併用療法の効果を試験する。
【０９４９】
Ｒａｊｉ細胞、アポトーシス細胞、非固形（びまん性）腫瘍モデル、固形腫瘍モデル、およびアポトーシス細胞療法は上記の実施例１および９に記載したのと同様であった。
【０９５０】
抗ＣＤ２０  ｍＡｂ
【０９５１】
市販の抗ＣＤ２０  ｍＡｂをＲｏｃｈｅから得た。
【０９５２】
抗ＣＤ２０  ｍＡｂ治療
【０９５３】
マウスに５ｍｇの抗ＣＤ２０  ｍＡｂ輸液を静脈注射で投与した。
【０９５４】
アポトーシス細胞と抗ＣＤ２０  ｍＡｂの併用治療
【０９５５】
Ｒａｊｉ細胞の投与の６日目に始めて、その後、各３０×１０６個のアポトーシス細胞の輸液を３回マウスに静脈注射で投与した。また、マウスに５ｍｇの抗ＣＤ２０  ｍＡｂ輸液を静脈注射で投与した。
【０９５６】
結果
【０９５７】
Ｒａｊｉ細胞、Ｒａｊｉ細胞＋抗ＣＤ２０  ｍＡｂ、およびＲａｊｉ細胞＋抗ＣＤ２０＋アポトーシス細胞を投与したマウスの１００％が白血病マウスの平均余命まで生存したが、これに比べてＲａｊｉ細胞とアポトーシス細胞の両方を投与したマウスでは８６％であった（ｎ＝計２８匹の動物、ｐ＜０．０００２）（図２３Ａ）。Ｒａｊｉ細胞を投与したマウスでは平均余命より２４％以上長く生存したものはいなかったが、これに比べてＲａｊｉ細胞＋アポトーシス細胞の両方を投与したマウスの２９％、Ｒａｊｉ細胞＋抗ＣＤ２０  ｍＡｂまたはＲａｊｉ細胞＋抗ＣＤ２０＋アポトーシス細胞の何れかを投与したマウスの１００％が平均余命より２４％以上長く生存した（図２３Ｂ）。Ｒａｊｉ細胞を投与したマウスでは平均余命より５９％以上長く生存したものはいなかったが、これに比べてＲａｊｉ細胞＋アポトーシス細胞の両方を投与したマウスの２９％、Ｒａｊｉ細胞＋抗ＣＤ２０  ｍＡｂを投与したマウスの５７％、およびＲａｊｉ細胞＋抗ＣＤ２０＋アポトーシス細胞を投与したマウスの１００％が平均余命より５９％以上長く生存した（図２３Ｃ）。Ｒａｊｉ細胞を投与したマウスでは平均余命より７６％以上長く生存したものはいなかったが、これに比べてＲａｊｉ細胞＋アポトーシス細胞の両方を投与したマウスの２９％、Ｒａｊｉ細胞＋抗ＣＤ２０  ｍＡｂを投与したマウスの１４％、およびＲａｊｉ細胞＋抗ＣＤ２０＋アポトーシス細胞を投与したマウスの８５％が平均余命より７６％以上長く生存した（図２３Ｄ）。Ｒａｊｉ細胞またはＲａｊｉ細胞＋抗ＣＤ２０  ｍＡｂの何れかを投与したマウスではマウスの平均余命より１００％以上長く生存したものはいなかったが、これに対してＲａｊｉ細胞＋アポトーシス細胞またはＲａｊｉ細胞＋抗ＣＤ２０＋アポトーシス細胞の何れかを投与したマウスの２９％は平均余命より１００％以上長く生存した（図２３Ｅ）。
【０９５８】
結論
【０９５９】
アポトーシス細胞輸液は白血病マウスの寿命を延ばし、完全な寛解に達するマウスの数を増加させ、抗ＣＤ２０  ｍＡｂの治療効果を高めた（図２３Ａ〜図２３Ｅ）。
【０９６０】
実施例１１：ＡｐｏＣｅｌｌ（初期アポトーシス細胞）の白血病／リンパ腫に及ぼす影響
目的：ここで示す研究には以下の３つの主な目標があった。（１）病気の発症、進行、およびその後の死亡について白血病／リンパ腫マウスモデルでのアポトーシス細胞の影響を評価する。（２）アポトーシス細胞での治療後に白血病／リンパ腫マウスモデルでの腫瘍細胞の分布を評価する。（３）ＳＣＩＤ−Ｂｇマウスでの白血病／リンパ腫の治療におけるアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）とリツキシマブ（ＲｔＸ）の起こりうる相乗効果を評価する。これらの目的を満たす研究の一部として、アポトーシス細胞の投与後に白血病マウスの生存日数を測定した。同様に、アポトーシス細胞での治療後に腫瘍細胞の分布を測定した。
【０９６１】
方法：
【０９６２】
マウス。７週齢のメスＳＣＩＤ−Ｂｇマウス（ＥＮＶＩＧＯ、イスラエル、エルサレム）に１匹あたり０．１×１０６個のＲａｊｉ細胞を静脈内注射した。実験の５日目、８日目、および１１日目にマウスに３０×１０６個のアポトーシス細胞の投与量を３回静脈内投与した。併用治療として、アポトーシス細胞の投与１．５時間後にマウスに１回の投与量（８日目）のＲｔＸ（２または５ｍｇ／ｋｇ；Ｍａｂｔｈｅｒａ、Ｒｏｃｈｅ、スイス、バーゼル）を投与した。
【０９６３】
マウスを毎日追跡し、週に２回体重を測定した。終点は、死亡または対麻痺（下半身の麻痺）、マウスの開始時の重量からの２０％減少、不活発、可動性の低下、もしくは呼吸困難という症状の何れかを発生したことによる殺処分で規定した。
【０９６４】
カプラン＝マイヤー法に従って生存分析を行った。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）ガイドラインに準拠して特定の病原体のない（ＳＰＦ）動物施設でマウスを飼育した。
【０９６５】
Ｒａｊｉ細胞株。このヒトバーキットリンパ腫細胞株をＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ、カタログ＃：８５０１１４２９）から購入して、完全培地（１０％の熱不活性化ＦＢＳ、１％のＧｌｕｔａｍａｘ、１％のペニシリン／ストレプトマイシンで栄養補充したＲＰＭＩ−１６４０）で定法により培養した。
【０９６６】
アポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）。本質的には実施例１に記載された通りであった。手短に言うと、単核細胞富化画分を白血球分離により健康な適格ドナーから回収した。血液成分分離が終わった後、細胞を洗浄して、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ（ｐＨ７．４）、５％のヒト血清アルブミン、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５％の抗凝血剤クエン酸デキストロース溶液Ａ（ＡＣＤ−Ａ）、および０．５Ｕ／ｍｌのヘパリンからなる凍結用培地に再懸濁した。次いで、細胞を徐々に冷凍して、長期保存のため液体窒素に移した。
【０９６７】
アポトーシス細胞の調製のため、凍結保存した細胞を解凍し、洗浄し、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのｈｅｐｅｓ、１０％の自己血漿、５％のＡＣＤ−Ａ、０．５Ｕ／ｍｌのヘパリンナトリウム、および５０μｇ／ｍｌのメチルプレドニゾロンで栄養補充したＲＰＭＩ  １６４０からなるアポトーシス誘導培地に再懸濁した。次いで、細胞を３７℃、５％のＣＯ２中で６時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、細胞処理システムを用いて細胞を回収して、洗浄し、Ｈａｒｔｍａｎｎ溶液に再懸濁した。アポトーシス細胞を２９０ｇ、２〜８℃で１０分間遠心分離して、注射用にＨａｒｔｍａｎｎ溶液に再懸濁した。ＦＣＳ  ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを用いてアネキシンＶとヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｍｅｄｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、日本、名古屋）によりアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）のアポトーシスと生存率を決定した。
【０９６８】
フローサイトメトリー。（上で規定した臨床的兆候の悪化後）殺処分したマウスからマウスの脾臓、肝臓、および骨髄を回収し、Ｒａｊｉ腫瘍（抗ＣＤ２０）の存在についてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、米国ニュージャージー州）により分析した。
【０９６９】
結果：
【０９７０】
パートＡ：アポトーシス細胞は白血病マウスで病気の発症とその後の死亡を遅らせる
【０９７１】
図２４は３つの個々の実験（ＲＰＭＩ群、ｎ＝１５；Ｒａｊｉ群、ｎ＝２３；Ｒａｊｉ＋ＡｐｏＣｅｌｌ群、ｎ＝２４）を示すカプラン＝マイヤー法による生存プロットである。各実験では、メスＳＣＩＤ−Ｂｇマウス（７〜８週齢）に０．１×１０６個のＲａｊｉ細胞を静脈内注射し、対照群にＲＰＭＩを注射した。その後、５日目、８日目、および１１日目に、マウスに３０×１０６個の投与量のアポトーシス細胞を３回静脈内投与（ＩＶ）した。マウスを毎日追跡し、週に２回体重を測定した。終点は、死亡または対麻痺（下半身の麻痺）、マウスの開始時の重量からの２０％減少、不活発、可動性の低下、もしくは呼吸困難という症状の何れかを発生したことによる殺処分で規定した。表１１に実験の詳細を示す。アポトーシス細胞による有益な効果が有意に見られた（ｐ＝０．００２、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ（マンテル−コックス））検定）。
【０９７２】
【表１１】
2020531515.tif 000015
【０９７３】
個々の研究データを図２５Ａ〜図２５Ｃに示す。
【０９７４】
上で示したように、未治療のマウスに比べて、Ｒａｊｉ細胞の投与後に３回の投与量のアポトーシス細胞で治療したマウスは、病気の進行が遅く、死亡も有意に後になった（ｐ＝０．００２０）。
【０９７５】
未治療の対照マウスに比べて、アポトーシス細胞で治療した白血病マウスは、症状の発症が有意に遅れ、病気の進行が遅く、死亡も後になった。興味深いのは、Ｒａｊｉ細胞とアポトーシス細胞を投与したマウスの約１０パーセントは、この白血病／リンパ腫モデルで予測される症状の特徴のいずれも発生せず、実験の終わり（５３日目または６０日目）まで健康であった。
【０９７６】
アポトーシス細胞は白血病マウスの腫瘍量を低減する
【０９７７】
殺処分時に、上記の臨床的兆候の悪化後に対象の器官、すなわち、肝臓、脾臓、および骨髄を分析のために回収した。これら標的器官の細胞をヒト腫瘍細胞（Ｒａｊｉ細胞はＣＤ２０について陽性）の有無についてフローサイトメトリーにより分析した。
【０９７８】
以下のデータ（表１２）は、上記の３つの実験から殺処分したマウスの標的器官における細胞集団の平均百分率を示しており、各実験の個々のマウスの値が以下の表１３〜表１８に示されている。
【０９７９】
【表１２】
2020531515.tif 000016
【０９８０】
インビボでの実験０１１
【０９８１】
骨髄、脾臓、および肝臓でのＣＤ２０＋細胞のＦＡＣＳ分析：
【０９８２】
アポトーシス細胞の３回の投与量を投与した１匹のマウスは６０日目の殺処分時点で健康であった。
【０９８３】
肝臓、脾臓、および骨髄細胞を回収して、ヒトＣＤ２０−ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ＃３０２２０６）とｍＩｇＧ１−ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ＃４００１１０）の有無についてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ）で分析した。
【０９８４】
インビボでの実験０１９
【０９８５】
骨髄、脾臓、および肝臓での腫瘍細胞のＦＡＣＳ分析：
【０９８６】
上記の方法で規定したように臨床的な悪化の後に殺処分したマウスから肝臓、脾臓、および骨髄細胞を回収し、ヒトＣＤ２０（ＦＩＴＣ）の有無についてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ）で分析した。
【０９８７】
脾臓、骨髄、および肝臓の分析結果を以下の表１３〜表１５に示す。
【０９８８】
【表１３】
2020531515.tif 000017
【０９８９】
【表１４】
2020531515.tif 000018
【０９９０】
【表１５】
2020531515.tif 000019
【０９９１】
インビボでの実験０２３
【０９９２】
フローサイトメトリーで決定した脾臓、骨髄、および肝臓中のＣＤ２０腫瘍細胞の発現率（％）。（上記の方法で規定したように臨床的な悪化の後）殺処分したマウスの脾臓、肝臓、および骨髄を回収して、ヒトＣＤ２０（ＦＩＴＣ）の有無についてフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ）で分析した。個々のマウスの脾臓、骨髄、および肝臓の結果を以下の表１６〜１８に示す。
【０９９３】
【表１６】
2020531515.tif 000020
【０９９４】
【表１７】
2020531515.tif 000021
【０９９５】
【表１８】
2020531515.tif 000022
【０９９６】
予備的結論：結論として、マウスの器官での腫瘍分布は、生存プロットに見られる有益な効果と相関し、治療したマウスの骨髄と肝臓では有意に低下していた。
【０９９７】
パートＢ：白血病／リンパ腫の治療におけるアポトーシス細胞（ＡｐｏＣｅｌｌ）とリツキシマブ（ＲｔＸ）の相乗効果
【０９９８】
次いで、２つの実験で白血病マウスに及ぼすＲｔＸとアポトーシス細胞の併用効果を評価することでＡｐｏＣｅｌｌ治療が白血病／リンパ腫の他の従来の治療と相乗効果があるか否かを調べた。
【０９９９】
目的：ＲｔＸとアポトーシス細胞の投与後の白血病マウスの生存日数を測定すること、および白血病マウスの骨髄、肝臓、脾臓中の腫瘍細胞を検出すること。
【１０００】
方法：以下の研究は、併用療法実験（ＡｐｏＣｅｌｌとｒｔｘ）で得られた結果の代表的な記載である。手短に言うと、メスＳＣＩＤ−Ｂｅｉｇｅマウスに０．１×１０６個のＲａｊｉ細胞を注射により静脈内投与した（すべての群でｎ＝７）。５日目、８日目、および１２日目と３回、３０×１０６個の投与量のアポトーシス細胞をマウスに静脈内投与した。８日目に、アポトーシス細胞を注射した１．５時間後、マウスに２または５ｍｇ／ｋｇの単回投与量のＲｔＸを静脈内投与した。マウスを毎日追跡して、週に２回体重を測定した。終点は、死亡または対麻痺（下半身の麻痺）、マウスの開始時の重量からの２０％減少、不活発、可動性の低下、もしくは呼吸困難という症状のうち１つ以上を発生したことによる殺処分で規定した。
【１００１】
結果：
【１００２】
図２６に示すように、アポトーシス細胞は図２４に示した結果を裏付ける有益な効果があった。Ｒｉｔｕｘａｎ（ＲｔＸ）単独では、２ｍｇおよび５ｍｇの投与量のいずれでもアポトーシス細胞より優れた効果があった。ＡｐｏＣｅｌｌとＲｉｔｕｘａｎの組み合わせは２ｍｇ（ｐ＝０．１０４）および５ｍｇの投与量の両方で相乗効果があったが、５ｍｇで見られた相乗効果は統計的な有意には達していなかった。マウスの臓器での腫瘍分布は、この有益な効果を裏付けた（表１９）。
【１００３】
【表１９】
2020531515.tif 000023
【１００４】
実験の終わり：５７日目
【１００５】
１匹のマウス（Ｒａｊｉ＋ＲｔＸ（２ｍｇ）／ｋｇ＋ＡｐｏＣｅｌｌ）は実験終了時に無病と宣言された。
【１００６】
ＲｔＸの１回で２ｍｇの投与量での相乗効果をさらなる実験で測定した。この実験ではっきりと示されたように（図２７）、アポトーシス細胞とＲｔＸの相乗効果が再度有意であると確認された（ｐ＝０．０１）。
【１００７】
表２０に示すように、脾臓には腫瘍細胞が存在せず（０．１〜０．３は背景染色を示す）、対照として用いた。これに対して、骨髄と肝臓は腫瘍標的であった。アポトーシス細胞とＲｔＸで別々に治療した後、骨髄と肝臓には小さくなった腫瘍集団（Ｒａｊｉ細胞、ＣＤ２０マーカーを用いて測定）があった。これら２つが以下のような組み合わせのとき、効果が高まった：Ｒａｊｉ＋ｒｔｘ（２ｍｇ／Ｋｇ）＋ＡｐｏＣｅｌｌでｐ＝０．００３４（＊＊）およびＲａｊｉ＋ｒｔｘ（５ｍｇ／Ｋｇ）＋ＡｐｏＣｅｌｌで０．００３１（＊＊）（Ｔ検定）。予測したように、ＲｔＸは、白血病マウスの標的臓器で腫瘍負荷を有意に低減した。興味深いことに、アポトーシス細胞単独での治療は、従来のＲｔＸ治療よる処理と同程度までこれら臓器の腫瘍細胞を低減した。
【１００８】
【表２０】
2020531515.tif 000024
【１００９】
結論：要約すれば、生存プロット（図２４、図２６、および図２７）から、アポトーシス細胞およびＲｔｘの有益な効果、さらにはアポトーシス細胞とＲｔＸの組み合わせの相乗効果がはっきりと示された。なお、従来のＲｔＸ治療をアポトーシス細胞と併用すると、ＲｔＸの投与量に関わらず生存時間が有意に増加した。これは上記２つの治療法の強い相乗効果を示すものである。裏付けとなる臨床観察は骨髄および肝臓における腫瘍細胞集団の減少であった（表１２）。
【１０１０】
意外にも、アポトーシス細胞の調製物は、任意の他の治療とは無関係に、白血病マウスモデルで病気の進行および生存に対して顕著に有益な効果をおよぼした。マウスの１０〜２０％は、カプラン＝マイヤー分析で生存日数が長くなり（図２４、図２６、および図２７）、肝臓と骨髄で腫瘍細胞負荷が低減した。さらに、アポトーシス細胞とＲｔＸを組み合わせて投与した場合に顕著な相乗効果があり、さらに病気の発症と進行を遅らせ、生存を向上させた。
【１０１１】
実施例１２：ＧＶＨＤ白血病／リンパ腫モデルでのプールされたアポトーシス細胞調製物の使用
以下の予備研究において、ＧｖＨＤ白血病／リンパ腫モデルにおける同じ輸液の影響を調べた。骨髄移植（ＢＭＴ）を受けたマウスの急性ＧｖＨＤを予防するため、複数のドナー由来の照射した単一アポトーシス細胞輸液（プールされた照射単核アポトーシス細胞調製物）の安全性と有効性を調べた。このモデルでは、ＢＭＴにより照射マウスが救われた（８０〜１００％）。
【１０１２】
高悪性度のａＧｖＨＤを回避する可能性のある治療成功例のすべてで移植片対白血病（ＧｖＬ）効果が失われる可能性に関する疑問が生じる。というのは、この効果はＧｖＨＤの重症度と相関することが分かっているからである。
【１０１３】
方法
【１０１４】
現在の実験で調製を４匹のドナーから同時に行ったことを除き、上記の実施例１のようにアポトーシス細胞を作製した。４匹のドナーからの調製後、細胞調製液を最後の工程（照射の前）で混合し、その後直ちに照射して、照射直後に注射した。照射は２５Ｇｙで行った。
【１０１５】
結果
【１０１６】
図２８および２９に示す２つのグラフから、複数の個々のドナー（点線）由来のアポトーシス細胞の単回注射の生存および体重減少の両方に及ぼす明らかな効果が示された（ｐ＜０．０１）。図２８は、複数の個々のドナー由来の単回投与量の照射アポトーシス細胞で治療したＧｖＨＤマウスモデルのカプラン＝マイヤー生存曲線である。ここで、生存は有意に改善された。図２９は、２つの比較群の体重減少の百分率であり、図２８の知見と一致し、相関している。
【１０１７】
要するに、複数のドナー由来の照射アポトーシス細胞の単回輸液は、ＧｖＨＤのマウスモデルにおいて平均余命の向上に有意に成功した。
【１０１８】
実施例１３：複数のドナー由来のアポトーシス細胞に対する安定性基準
本研究の目的は、非照射ＨＬＡ適合アポトーシス細胞との比較研究（Ｍｅｖｏｒａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２０（１）：  ５８−６５；  Ｍｅｖｏｒａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２１（２）：  Ｓ３３９−Ｓ３４０）により複数の個々のドナー由来のアポトーシス細胞に対する安定性基準を開発することである。
【１０１９】
アポトーシス細胞最終生成物調製液を、各時点で採取した際の細胞数、生存率、アポトーシス表現型、および２〜８℃で８、２４、４８、および６０時間保存後の能力について評価する。標準操作手順（ＳＯＰ）（実施例１；実施例５）およびバッチ記録（ＢＲ；すなわち、特定の製造手順）に従って、アポトーシス細胞最終生成物のロットを調製する。能力評価については、未成熟樹状細胞（時点０〜２４時間）または単球（時点０〜６）に対するＭＨＣ−ＩＩ発現のリポ多糖（ＬＰＳ）誘導上方調節の阻害について初期アポトーシス細胞調製最終生成物ロットの試料を試験する。試験はＳＯＰに従って行い、ＢＲに記録する。これら一連の試験を、それぞれ、複数の個々のドナーおよび単一のドナーに由来する調製液中のプールおよび非プール生成物に対して行う。
【１０２０】
また、ＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ１４（単球）、ＣＤ１５ｈｉｇｈ（顆粒球）、およびＣＤ５６（ＮＫ細胞）のフローサイトメトリー分析を報告する。これらの研究の目的は、狭い範囲の結果での一貫性を示すことである。予備結果は、これらの目標と一貫しており、ＳＯＰから逸脱することなく、技術的な問題も報告されていない。しかしながら、有効な治療の範囲と安定性を結論づけるためにさらなる研究が必要である。予備結果はこれらすべてのパラメータで同等であることを示している。さらに、単一のドナーの安定性についての研究から、少なくとも４８時間を通して安定性が示された（実施例１を参照のこと）。
【１０２１】
実施例１４：急性移植片対宿主病の予防としての複数ドナー由来の照射アポトーシス細胞の安全性および有効性
目的：ヒト白血球抗原適合、血縁者間および非血縁者間の同種異系ＨＬＡ適合造血幹細胞移植を受けた患者において、造血悪性腫瘍の移植片対宿主病の予防のため、複数の不適合ドナーに由来する照射アポトーシス細胞の単回投与量投与の安全性、耐容性、および予備有効性を評価するフェーズ１／２ａ多施設非盲検検討。
【１０２２】
主な目的：複数のドナー由来の照射アポトーシス細胞療法の安全性と耐容性を決定すること。
【１０２３】
二次的な目的：造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）を受けることになっている造血悪性腫瘍を持つ患者において急性ＧｖＨＤ（ａＧｖＨＤ）の予防手段として複数の個々のドナー由来の照射アポトーシス細胞の有効性を決定する。本研究の目的のため、ＨＳＣＴは骨髄移植（ＢＭＴ）または末梢血幹細胞移植（ＰＢＳＣＴ）のいずれであってもよい。
【１０２４】
治療指標：血縁者間および非血縁者間ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合患者における造血悪性腫瘍での移植後の移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）
【１０２５】
研究設計：これは、完全骨髄破壊的または強度滅弱骨髄破壊的前処理投薬計画後にＨＬＡ適合である血縁者または非血縁者のドナーからＨＳＣＴ（骨髄移植または末梢血幹細胞移植のいずれか）を受けることになっている造血悪性腫瘍と診断された患者におけるフェーズ１／２ａ多施設非盲検検討である。
【１０２６】
レシピエントである患者から同意の署名、ドナーの選別期間、および前処理投薬計画前の細胞の採取の後、適格なレシピエントである患者が割り当てられる（予防的な治療により階層化される）血縁者の移植ドナーと非血縁者の移植ドナーが１：１の比でＨＳＣＴ移植の１２〜３６時間前に注射で静脈内投与（ＩＶ）される。
【１０２７】
調査に用いた薬剤：単回投与量が複数の個々のドナーに由来する細胞１４０×１０６±２０％個／ｋｇである照射初期アポトーシス細胞／ｋｇ（体重）のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）。
【１０２８】
また、すべての患者を施設の標準治療（ＳＯＣ）の免疫抑制投薬計画で治療する：完全骨髄破壊の場合はシクロスポリン／メトトレキサートまたはタクロリムス／メトトレキサートで、強度滅弱骨髄破壊の場合はミコフェノレート／シクロスポリンまたはミコフェノレート／タクロリムス。患者は、医学的な指示に従って入院する。
【１０２９】
副次的有効性評価項目については１８０日間、一次安全性と三次有効性終点については１年間、患者を追跡する。本研究に参加した患者の訪問数は、その症状の患者の習慣的な訪問数と同等である。ドナーの場合、研究に特定した訪問は、選別期間の血液成分分離手順のためである。
【１０３０】
これらの患者は多くの基礎疾患を有し、ａＧｖＨＤと互換性がある症状を患っているかもしれないので、毒性がアポトーシス細胞と関連するか否かを絶対的に決定するのは難しい場合があるが、ＧｖＨＤ予防にアポトーシス細胞を用いた前のフェーズ１−２ａ検討からの基礎データが存在する（Ｍｅｖｏｒａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２０（１）：  ５８−６５）  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｏｎｏｒ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｅａｒｌｙ  Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  ａｓ  Ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ  ｆｏｒ  Ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ  ＨＬＡ−Ｍａｔｃｈｅｄ  Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：  Ａ  Ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩａ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌ．  ＢＢＭＴ  ２０（１）５８−６５）。
【１０３１】
データ安全性評価委員会（ＤＳＭＢ）は、事前に安全性の問題がないと仮定して、予定された中間分析の時（１８０日）を含め、ＤＳＭＢ認可証に規定するように集まる。
【１０３２】
検討手順：
【１０３３】
本検討は、選別、治療、および追跡の期間を含む。
【１０３４】
１．選別期間（−６０日目から−２日目）
【１０３５】
可能性のあるレシピエント患者は、任意の検討に関連した手順の前に同意の署名をする。選別期間中にドナーのために移植センターにより認可前の標準的な査定が行われる。これは、一般的に、人口統計データ、病歴、ＨＬＡ適合状態の確認（一致は必要ではない）、身体検査、身長および体重、生命兆候、妊娠試験（すべての女性）、血液学、血液化学、伝染病のスクリーニング、ＥＣＧ、および尿検査を含む。
【１０３６】
レシピエント（検討対象の患者）は、選別期間中に以下の査定をうける：人口統計、病歴、カルノフスキー・パフォーマンス・ステータス、ＨＬＡ適合状態の確認、身体検査、身長および体重、生命兆候、妊娠試験（すべての女性）、ＥＣＧ、肺機能試験、血液学、血液化学、凝固マーカー、伝染病スクリーニング、および尿検査。
【１０３７】
初期の選別評価の後、レシピエントが検討に参加するのに適格である場合、レシピエントの患者を前処理投薬計画の１日目に割り当てて、複数のドナー由来のアポトーシス細胞を１４０×１０６±２０％細胞／ｋｇの単回静脈注射輸液を投与する。前処理投薬計画は、検討の−１日目に予定されたアポトーシス細胞輸液の前日あるいは当日に完了する。
【１０３８】
アポトーシス細胞の投与量をレシピエントの患者ごとに算出して、それに従って推定される血液成分分離回収の数とドナー数を決定する。
【１０３９】
末梢血幹細胞移植のドナーの場合、−６日目から−１日目にドナーはＧ−ＣＳＦの注射を１日１回以上受けて前駆細胞を動員し、０日目に血液成分分離を受けて移植用のドナー造血血液幹細胞を作製する。骨髄移植用の造血血液幹細胞の作成は、熟練した病院スタッフによってセンターの標準的な実務に従って行われる。ＨＳＣＴ用の造血血液幹細胞は、投与の前に操作またはＴ細胞消耗していない。
【１０４０】
骨髄移植ドナーの場合、センターの標準的な実務により骨髄を採取して調製し、それ以外の操作を行っていない。
【１０４１】
２．治療日（−１日目）
【１０４２】
−１日目（ＨＳＣＴの１２〜３６時間前）、適格患者に複数の個々のドナー由来の照射初期アポトーシス細胞を１４０×１０６±２０％細胞／ｋｇの単回静脈注射輸液として投与する。輸液の間、生命兆候を１時間ごとに監視し、その後の２４時間の間は４時間ごとに監視する。治療に関連した有害事象について輸液直後に評価する。
【１０４３】
０日目に、地域医療機関のガイドラインに従って患者は造血幹細胞移植を受ける。
【１０４４】
３．短期追跡期間（０日目から１８０日目）
【１０４５】
検討１８０日目に患者は一次有効性終点の安全性と耐容性、二次および三次終点の悪性度ＩＩ−ＩＶのａＧｖＨＤの累積発生数（Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａらに基づく「改変Ｇｌｕｃｋｓｂｅｒｇ」同意、任意の悪性度および高悪性度のａＧｖＨＤの累積発生数、すなわち、悪性度ＩＩ−ＩＶのａＧｖＨＤの発症する時間、ＧｖＨＤの任意の全身性治療、およびｃＧｖＨＤの発症）の評価について追跡される。
【１０４６】
移植の場合は入院して（通常、少なくとも−１日目から＋１４日目以上）短期追跡調査のための訪問は毎日行い、退院後は最初の７週間の間毎週訪問する（＋７日目、＋１４日目、＋２１日目、＋２８日目、＋３５日目、＋４２日目、その後６０日目、１００日目、１４０日目、および１８０日目）。（最初の７週間）毎週の訪問での訪問時間帯は±５日で、続く１８０日目までの観察期間で２週間あるいはそれ以上に１回の場合は±５日間である。
【１０４７】
１日目、３日目、７日目、＋７日目、＋２８日目、＋４２日目、６０日目、１００日目、１４０日目、および１８０日目に血液試料を得て、正着、免疫回復、血漿および血清生体指標（「Ｍｉｃｈｉｇａｎ」）、および細胞部分集団の報告のために検査する。
【１０４８】
４．長期追跡期間（１８１日目〜３６５日目／１年）
【１０４９】
長期の副次的有効性評価項目（非再発死亡率および全生存（ＯＳ）、再発発生数、無白血病生存（ＬＦＳ）、および慢性ＧｖＨＤ）についてＨＳＣＴ後１年間患者を追跡する。少なくとも２回の長期追跡のための訪問があり、最後の１回はＨＳＣＴの１２±１ヶ月後である。
【１０５０】
検討期間：本検討に参加した各患者に対して、以下のように１４ヶ月までである。
選別：６０日まで（２ヶ月）
治療：１日
追跡：３６５日（１２ヶ月）で以下からなる
短期：１８０日
長期：＋１８０日
【１０５１】
検討集団：センターの標準的な実務につき、血液悪性腫瘍と診断され、骨髄破壊的または強度滅弱骨髄破壊前処理投薬計画の後、少なくとも１５人の非血縁者ドナーによるＨＳＣＴ（骨髄移植または末梢血幹細胞移植のいずれか）を受けることになっていた合計２５人の患者が本検討に含まれており、歴史的対照と比較される。
【１０５２】
採用／除外基準：
【１０５３】
レシピエントの患者の除外基準
【１０５４】
１．以下の悪性腫瘍について同種異系ＨＳＣＴ適格である１８歳超の患者：
完全な寛解（何らかの寛解）の急性骨髄性白血病、未分化白血病、または混合型白血病、あるいは骨髄の形態で５％未満の芽球がある。
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）から進化した場合の完全な寛解の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）（急性骨髄性白血病の診断の少なくとも３ヶ月前にＭＤＳの診断が報告されていなければならない）。または真性多血症あるいは本態性血小板血症から発達した場合。
骨髄の形態で５％未満の芽球がある、完全な寛解（何らかの寛解）の急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）。
慢性期または加速期の慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）。
骨髄異形成症候群：多系統形成異常（ＲＣＭＤ）を伴う難治性血球減少、ＲＡ（不応性貧血）、環状鉄芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ；すべて５％未満の芽球）、過剰芽球を伴うＲＡ（ＲＡＥＢ；５〜２０％の芽球）。
【１０５５】
移植ドナーとレシピエントの患者は、ＨＬＡのＡ、Ｂ、Ｃ、ＤＱ、およびＤＲ座位で少なくとも８／８ＨＬＡ適合でなければならず、抗原またはアレルの不一致があってはいけない。しかしながら、アポトーシス細胞形成用の白血球のドナーは、ＨＬＡ適合に限定されない。
【１０５６】
選別のための訪問時にパフォーマンス・ステータス・スコアが少なくとも７０％（大人ではカルノフスキースコア、１６歳未満のレシピエントではランスキースコア）。
【１０５７】
前処理開始の４週間以内に大人で心臓の左心室の駆出率が４０％以上；アントラサイクリン曝露または心臓病の履歴がある場合はマルチゲート収集（ＭＵＧＡ）スキャンまたは心エコーが必要である。
【１０５８】
ＤＬＣＯ（肺の一酸化炭素拡散能）、ＦＥＶ１（努力呼気量）、およびＦＶＣ（努力肺活量）による肺機能試験で予測の６０％以上。
【１０５９】
酸素飽和度が室内の空気で少なくとも９０％。
【１０６０】
患者は、以下に規定された適切な臓器の機能を有していなければならない。
ＡＳＴ（ＳＧＯＴ）／ＡＬＴ（ＳＧＰＴ）が正常値の上限（ＵＬＮ）の３倍未満。
血清クレアチニンが２．０ｍｇ／ｄＬ未満（大人、１６歳超）あるいは０．８未満（１〜２歳）、１未満（３〜４歳）、１．２未満（５〜９歳）、１．６未満（１０〜１３歳）、および１．８（１４〜１５歳）。
ジルベール病または溶血によるものでなければ、血清ビリルビンが３ｍｇ／ｄＬ未満。
【１０６１】
患者または未成年の場合は保護者により、本研究に参加するための同意書に独立して署名すること。
【１０６２】
本検討の要件に従う能力。
【１０６３】
（−１日目から）４週間の間、男性、女性とも以下のことに同意いなければならない：
ＢＭＴに関連した制限がある場合は最初の１ヶ月またはそれ以上の間、容認可能な産児制限の方法を使用する、あるいは外科的に不妊にすること。
妊娠の能力に関わらず、妊娠試験で陰性であること。
【１０６４】
レシピエントの患者に対する除外基準：
【１０６５】
採用基準に規定されていないＨＳＣＴに適格なすべての病気。
【１０６６】
選別のための訪問の３０日以内の介入治験に参加すること。
【１０６７】
進行性または制御されていない悪性腫瘍を有すること。
【１０６８】
ＢＭＴ計画がＴ細胞消耗同種移植片を含む場合。
【１０６９】
移植後のＧｖＨＤ予防のため、ＢＭＴ計画が免疫抑制投薬計画または高投与量のシクロホスファミド治療の一部として抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）またはアレムツズマブを含む場合。
【１０７０】
選別のための訪問から２週間以内の未制御の感染（敗血症、低酸素血症を伴う肺炎、持続性菌血症、または髄膜炎を含む）。
【１０７１】
ＨＢＶまたはＨＣＶによる活性急性または慢性感染が現在分かっている。
【１０７２】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染が分かっている。
【１０７３】
重篤あるいは拘束性あるいは閉塞性の症状がある肺疾患または呼吸不全があり、人工呼吸器による補助が必要な患者。
【１０７４】
本検討への参加を見合わせるような他の重篤および／または未制御の病状（すなわち、活動性感染、未制御の糖尿病、未制御の高血圧症、鬱血性心不全、不安定狭心症、心室不整脈、活動性虚血性心疾患、６ヶ月以内の心筋梗塞、慢性肝臓または腎臓疾患、活動性上部消化管潰瘍）が同時にある患者。
【１０７５】
治験生成物の効果の評価を妨げやすい何らかの慢性または急性状態。
【１０７６】
治験責任医師の意見で、本検討の遂行を妨げやすい任意の形態の物質の濫用（薬物またはアルコールの濫用を含む）、精神障害、または何らかの慢性状態。
【１０７７】
臓器同種移植または幹細胞移植（同種異系のみ）の既往歴。
【１０７８】
妊娠の可能性がある女性の授乳。
【１０７９】
本研究中に従わないまたは非協力的である可能性のある患者。
【１０８０】
治験生成物の投与経路および投与形態
【１０８１】
ＨＳＣＴの１２〜３６時間前に、アポトーシス細胞を１４０×１０６＋２０％細胞／ｋｇの静脈注射輸液として複数のドナー由来の照射アポトーシス細胞生成物を投与する。
【１０８２】
アポトーシス細胞は、複数の個々のドナーに由来するアポトーシス細胞からなる細胞に基づく治療薬である。この生成物は、少なくとも４０％の初期アポトーシス細胞を含む液体懸濁液の形態で同種異系ドナーに由来する単核富化細胞を含む。ＧＭＰ規約に従い、この懸濁液をＰＢＳ溶液と共に複数の個々のドナーから調製し、輸液まで２〜８℃で保存しなければならない。最終生成物は不透明な輸送パックに入れて総容積が３００〜６００ｍＬであり、調製後に２５Ｇｙで照射される。治験生成物は、製造過程の終了の４８時間以内に患者に投与されていなければならない。
【１０８３】
安全性の結果／有効性終点／結果の測定値
【１０８４】
一次：
【１０８５】
安全性および耐容性終点は、正着までの時間、および１８０日目と３６０日目（１年）での有害事象、併用薬、および安全性実験室を決定するための身体検査を含む。さらに、プールされた照射アポトーシス細胞調製物は、インビトロおよびインビボでの細胞増殖がなく、インビボでの活性化もないことが予測される。これらは、プールされたアポトーシス細胞調製物を使用しても安全であることを示すものである。
【１０８６】
二次：
（Ｒｏｗｌｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７）  ＩＢＭＴＲ  Ｓｅｖｅｒｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ  ｆｏｒ  ｇｒａｄｉｎｇ  ａｃｕｔｅ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｇｌｕｃｋｓｂｅｒｇ  ｇｒａｄｅ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  １９９７  Ｊｕｎ；９７（４）：８５５−６４）に基づく「改変Ｇｌｕｃｋｓｂｅｒｇ」同意を用いた１８０日目の悪性度ＩＩ〜ＩＶのａＧｖＨＤの累積発生数。
１年間の非再発性死亡率および全生存率（ＯＳ）。
１年間の再発発生数。
１年間の無白血病生存率（ＬＦＳ）。
最初の１８０日間以内のａＧＶＨＤの最大悪性度。
悪性度ＩＩＩ−ＩＶのａＧＶＨＤの累積発生数
１８０日目および３６０日目（１年）における、（Ｊａｇａｓｉａら、２０１５）に従う慢性ＧＶＨＤの発生。
２０日目〜１８０日目における、ａＧｖＨＤの治療のためのコルチコステロイド（使用または非使用および累積投薬量の両方）を含む何らかの「全身治療」。
＋２８日目、１００日目、１８０日目、および３６０日目（１年）における、Ｔ、Ｂ、ＮＫ、および単球に関連する免疫再構築および機能。
１８０日目〜１年目における主要な感染率（肺浸潤物、ＣＭＶ再活性化、および入院を要する任意の他の感染を含む）。
【１０８７】
三次／探索的：
危険がある総日数または退院して生存している総日数に対する総入院日数の百分率。または、移植後の最初の退院までの総入院日数。
臓器特異的ＧｖＨＤ
１８０日目のＴレグ、ＣＤ４  Ｔｃｏｎ、ＣＤ８、ＮＫ、およびＢ細胞の量
【１０８８】
統計分析：
【１０８９】
検討結果を、同等のベースライン特性を持つ個体による歴史的対照と比較する。
【１０９０】
記述統計を用いて、測定結果とベースライン特性をまとめる。この分析では、すべての利用可能なデータを任意の欠けているデータを補完せずに示す。被験体は、離脱または研究完了または死亡の時点まで利用可能なデータに寄与する。平均、中心値、標準偏差、最小値、および最大値などの記述統計を用いて連続変数をまとめる。アポトーシス細胞輸液を投与されたすべての被験体が安全性分析に含まれる。またＨＳＣＴを投与された被験体も有効性分析に含まれる。この検討は予備的な性格のものなので、その場その場で分析が計画される。
【１０９１】
試料の大きさについての検討
【１０９２】
合計２５人の患者が含まれ、少なくとも１５人の非血縁者適格患者が登録される。アポトーシス細胞（活性）を全員に投与し、ＧｖＨＤ予防投薬計画および血縁者移植ドナー対非血縁者移植ドナーについて階層化する。
【１０９３】
集団分析の規定
【１０９４】
すべての有効性分析は、包括解析（ＩＴＴ）集団について、また適切な歴史的対照と比較して行われる。安全性集団は、投与量の治験薬物を投与されたすべての患者として規定される。
【１０９５】
統計方法
【１０９６】
必要に応じて、頻度および百分率または中心値（範囲）を用いて患者、病気、および移植特性を記載する。
【１０９７】
安全性分析
【１０９８】
記述統計を用いて、検討治療輸液とＨＳＣＴ手順（２４〜３０時間枠）の間に報告された有害事象に注目して安全性の結果をまとめる。ＤＳＭＢの考察の結果として、検討の遂行において試料の大きさの調節を含むいかなる変更も開始しない。従って、中間解析の結果としての第１種の過誤全体において罰則調整は必要としない。
【１０９９】
二次終点分析
【１１００】
ａＧｖＨＤ前の死亡を競合事象として、累積発生数推定器を用いて悪性度ＩＩ−ＩＶのａＧｖＨＤを記載する。
【１１０１】
ＴＲＭでは再発を競合事象として、他のすべてでは死亡を競合事象として、累積発生数を用いて好中球および血小板の回収、悪性度ＩＩＩ−ＩＶのａＧｖＨＤ、慢性ＧｖＨＤ、感染、再発、および移植関連死亡率を記載する。カプラン＝マイヤー推定器を用いて全体の生存率と無白血病生存率を記載する。最初の１８０日以内のａＧｖＨＤの最大悪性度と、１８０日間のステロイドの必要をそれぞれ、マン・ホイットニーＵ検定とカイ二乗検定を用いて頻度および百分率で記載する。中心値および範囲マン・ホイットニー検定を用いて各時点での各細胞亜集団の免疫回復とＴＲＥＧを記載する。
【１１０２】
実施例１５：ＧｖＨＤ白血病／リンパ腫モデルにおけるプールされたアポトーシス細胞調製物と単一ドナーアポトーシス細胞調製物の比較
目的：マウスモデルのＧｖＨＤにおける単一ドナーから得たヒト初期アポトーシス細胞のＧｖＨＤ重症度に及ぼす有益な臨床効果と、もしあれば、マウスモデルのＧｖＨＤにおける複数の個々のドナーから得たヒト初期アポトーシス細胞のＧｖＨＤの重症度に及ぼす臨床効果とを比較する。ここで、複数の個々のドナーはＨＬＡ不適合異種ドナーを表す。
【１１０３】
上記の実施例１２は、複数の個々のドナーからプールされた照射アポトーシス細胞の有益な効果を示す。図２８と図２９に示す結果は意外であった。というのは、当業者には自明だが、複数源の不適合細胞は細胞の抗原性の多様性を増加させ、従って臨床効果を劇的に低減させることが予測されるからである。予想外にも、ＧｖＨＤ重症度の低減、従って、死亡までの日数の延長に及ぼす初期アポトーシス細胞の既知の有益な効果もまた、プールされた不適合初期アポトーシス細胞により損なわれた（図２８）。これは、プールされた複数の不適合源細胞により抗原性が増加したためと思われる。
【１１０４】
さらなる目的は、照射初期アポトーシス細胞と非照射アポトーシス細胞の使用の違いがあるか否かを理解することであった。
【１１０５】
当業者には自明だが、不適合照射細胞は、ＡＰＣ機構と宿主のＴ細胞（宿主に注入されている）により認識されるように、それら細胞の抗原的特徴を保っている。従って、細胞の異種不適合集団をプールする際に懸念されたことは、プールされている個別の集団間の交差反応性、プールされた集団の混合細胞リンパ球反応、細胞を低減もしくは排除し得るプールされた集団間のＴ細胞免疫反応、またはそれらの任意の組み合わせであった。
【１１０６】
方法
【１１０７】
マウスモデル：不適合ＧｖＨＤモデルにおいてメスの７〜９週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２ｄ）をレシピエントとして用いて、メス８〜９週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２ｂ）をドナーとして用いた。骨髄移植および脾細胞移植の２４時間前に、レシピエントの全身を８５０ｃＧｙで照射した。ドナーの骨髄細胞を骨髄再構築に用いた。ＲＰＭＩ  １６４０を用いて大腿骨と脛骨から骨髄細胞を抽出した。赤血球を溶解して、細胞を洗浄し、ＰＢＳで再懸濁した。トリパンブルー染料排除を用いて生存能力を評価した（９０％超の生存率）。ＧｖＨＤの誘導にドナーの脾細胞を用いた。脾臓を除去して、均一にし、単一細胞懸濁液を得た。赤血球を溶解し、脾細胞をＰＢＳで再懸濁した。トリパンブルー染料を用いて少なくとも９０％の生存細胞を評価した。
【１１０８】
初期アポトーシス細胞：実施例１と同様に、健康なドナー由来の単球富化細胞画分血液成分分離からアポトーシス細胞を作製した。手短に言うと、
【１１０９】
白血球分離手順により健康な適格ドナーから単核細胞（ＭＮＣ）の富化画分を得た。Ｓｐｅｃｔｒａ  ＯＰＴＩＡ（登録商標）血液成分分離システムにより細胞を１２リットルの血液と４００〜６００ｍｌの自己血漿から回収した。ドナー由来の富化単核細胞画分の推定収率は約１．２〜１．５×１０１０個の細胞と予想された。白血球分離手順の前に、ドナーを試験して、以下のウイルスベクターに陰性であることを確認した。
１．１型および２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
２．Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
３．Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）
４．サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）
５．梅毒トレポネーマ（梅毒）
６．ＩおよびＩＩ型ヒトＴ−リンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）
【１１１０】
細胞回収後、細胞をＲＰＭＩで洗浄し、以下のように冷凍した。凍結製剤は、ｐＨ７．４の注射用ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ、１０％のＤＭＳＯ、５％のヒト血清アルブミン、および１０Ｕ／ｍｌのヘパリンを植菌した５％の抗凝固剤クエン酸デキストロース溶液からなっていた。
【１１１１】
凍結媒体（培地）を袋内で調製し、ｃＧＭＰ条件下で凍結手順を閉鎖系で実施した。
【１１１２】
白血球分離手順が完了した後、富化ＭＮＣ画分をＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａで洗浄し、氷冷した凍結培地で５０〜６５×１０６細胞／ｍｌの濃度まで再懸濁した。次いで、細胞を冷凍袋に移して、袋を予め冷却してあったアルミニウムカセットに移した。カセットを直ちに−１８℃〜−２５℃に移して２時間置いた。
【１１１３】
２時間経過後、カセットを−８０℃に移してさらに２時間置き、さらに液体窒素中で長期保存した（＞−１３５℃）。
【１１１４】
自己血漿を５０ｇｒの部分に分割した。血漿部分を−８０℃に移してさらに２時間置き、さらに−１８℃〜−２５℃で長期保存した。
【１１１５】
アポトーシス誘発のため、細胞を解凍し、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、２ｍＭのＬ−グルタミン、および１０Ｕ／ｍｌのヘパリンを植菌した５％の抗凝固剤クエン酸デキストロース溶液を含有する予熱したＲＰＭＩ  １６４０で洗浄した。上清を抽出後、細胞を、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０％の自己血漿、５０μｇ／ｍｌのメチルプレドニゾロン、および１０Ｕ／ｍｌのヘパリンを植菌した５％の抗凝固剤クエン酸デキストロース溶液で栄養補充したＲＰＭＩ  １６４０に最終濃度５×１０６／ｍｌで再懸濁した。次いで、細胞を細胞培養袋に移し、加湿したインキュベーターで３７℃、５％のＣＯ２にて６時間インキュベートし、アポトーシスを安定させた。
【１１１６】
インキュベーション後、細胞を採取して、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。
【１１１７】
初期アポトーシス細胞生成物を一匹の単一ドナー、あるいは１０匹の異なる個々のドナーのものを混合して作製した。後者の場合、細胞は照射の直前に混合した。複数のドナー由来の生成物の成分同士で、例えば、生きている非アポトーシス性細胞同士で干渉が起こることがあるので、初期アポトーシス細胞生成物を分割して、インビボで試験する初期アポトーシス細胞試料を投与の前に２５００ｃＧｙで照射し（以下の試料Ｆ）、投与まで２〜８℃で保存した。以下の実施例６の表３は、アネキシンＶ陽性／ヨウ化プロピジウム陰性の比と初期アポトーシス細胞生成物の細胞表面マーカーの詳細を示しており、マウスに投与されたアポトーシス細胞の一貫性が維持されていることが立証された。最終生成物は２〜８℃で４８時間安定であった。
【１１１８】
以下の実験設計に従い、移植の日に、マウスに５×１０６個の骨髄細胞、３×１０６個の脾細胞、および３０×１０６個の単一または複数のドナー由来の初期アポトーシス細胞生成物を投与した。
照射対照
再構築対照  −  照射＋骨髄移植（ＢＭ）
ＧＶＨＤ対照  −  照射＋骨髄および脾細胞移植
単一ドナー、照射  −  照射＋骨髄および脾細胞移植＋単一ドナーに由来する照射初期アポトーシス細胞生成物
単一ドナー、非照射  −  照射＋骨髄および脾細胞移植＋単一ドナーに由来する非照射初期アポトーシス細胞生成物
複数ドナー、照射  −  照射＋骨髄および脾細胞移植＋複数ドナーに由来する照射初期アポトーシス細胞生成物
複数ドナー、非照射  −  照射＋骨髄および脾細胞移植＋複数の個々のドナーに由来する非照射初期アポトーシス細胞生成物．
【１１１９】
監視：移植したマウスにタグをつけて、生存を監視した。実験の最初の２週間は２日に１回、その後は毎日体重を評価した。初期の体重から３５％減少したら、一次終点と判定して、マウスを殺処分し、それに従って生存曲線を更新した。体重の結果は実施例１２の図２９で観察されたものと同等であった。
【１１２０】
体重減少、姿勢（背中の丸まり）、活性、毛皮の手触り、および皮膚の完全性という５つの臨床パラメータを組み込んだ公知の採点システム（Ｃｏｏｋｅ  ＫＲ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｆｔｅｒ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｉ．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｍｉｎｏｒ  Ｈ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ．  Ｂｌｏｏｄ．１９９６；  ８：３２３０−３２３９）を用いてＧｖＨＤの重症度を評価した。マウスを評価して、各基準について０〜２で採点した。５つの臨床スコアの総和により、臨床指標値を生成した（指標数はＧｖＨＤの重症度に伴って増加する）。
【１１２１】
結果
【１１２２】
異なる集団のマウスの生存率（％）を図３０のグラフに示す。骨髄再構築を受けていないマウスから予測されるように、照射のみの対照マウスは、８日目〜１２日目で死亡した（ｎ＝１３）。ＧＶＨＤ対照マウス（骨髄および脾臓を受けた）の大多数は、６〜２７日目に死亡した。１匹のマウスは死亡しなかった（ｎ＝１８）。骨髄再構築対照群（ＢＭ）では、７匹のマウスのうち３匹が６〜８日目に死亡した。残りのマウスにおいては、ドナーの骨髄によって骨髄が再構築され、マウスは生存したままであった（＞５０日間）。
【１１２３】
単一ドナーの非照射の治療を受けたマウスは、１５〜３６日目に死亡した。従って、先に示した通り、単一ドナー由来の非照射初期アポトーシス細胞は有益な効果を有し、生存が延長された（ｐ＜０．０１）。
【１１２４】
単一ドナー由来の照射されたマウスは、７〜３５日目に死亡し、１匹のマウスは無病生存のままであった（＞５０日間）。これは、単一ドナー由来の照射アポトーシス細胞もまた、ＧＶＨＤに関して有益な効果をもたらすことを示したものである。従って、照射は、初期アポトーシス細胞の免疫調節効果を損なわなかった。ＧＶＨＤ対照と比較して、すべて、ＧＶＨＤマウスモデルにける生存に有益な効果を及ぼした（ｐ＜０．０１）。
【１１２５】
未照射の複数ドナー治療は、ＧＶＨＤ対照と比較して有益な効果をもたらさなかった（ｎ＝１１）。生存パターンはＧＶＨＤ対照に類似しており、マウスは６〜２８日目に死亡した（ｐ＝ＮＳ−有意差なし）。意外にも、非照射アポトーシス細胞とは対照的に、複数の個々のドナー由来の照射アポトーシス細胞（治療Ｆ）（ｎ＝１０）は、ＧｖＨＤ対照と比較して単一ドナー治療と同様の有益な効果があった。ＧｖＨＤ症状は、その後有意に現れ、マウスは１８日目〜３４日目に死亡した（ｐ＜０．０１）。
【１１２６】
照射複数の個々のドナー（ｎ＝１０）、照射単一ドナー（ｎ＝１０）、および非照射単一ドナー治療（ｎ＝１０）は同様の生存パターンを持ち、これら３つの治療群で生存に及ぼす効果に有意な差は観察されなかった。
【１１２７】
これらの実験から、ＧｖＨＤ誘導マウスにおけるアポトーシス細胞輸液の明らかな効果が示された。複数の個々のドナー由来の照射アポトーシス細胞と単一ドナー由来の照射および非照射アポトーシス細胞の治療について生存期間が有意に延長されたという効果があった。
【１１２８】
複数ドナー治療は、照射されない場合にマウスの生存を延長しなかったが、マウスへの投与前のアポトーシス細胞生成物の照射は結果を改善し、治療は単一ドナー治療に近い生存パターンを示した。
【１１２９】
上記のように、図３０から、（１）単一不適合ドナーから得た非照射アポトーシス細胞、（２）単一不適合ドナーから得た照射アポトーシス細胞、および（３）複数の不適合ドナーから得た照射アポトーシス細胞と比べて、複数の不適合ドナーから得た非照射アポトーシス細胞はＧｖＨＤおよび死亡率（％生存）の低減に及ぼす有意に低い正の臨床効果があることが示された。また、これら３つの群（非照射初期アポトーシス細胞、単一ドナー；照射初期アポトーシス細胞、単一ドナー；および照射初期アポトーシス細胞、複数の個々のドナー）すべては同様の効果を有する。
【１１３０】
このデータは意外であった。というのは、複数の個々のドナーから得た非照射アポトーシス細胞の抗原性は複数の個々のドナーから得た照射アポトーシス細胞のものと同様であることが予測されていたからである。なぜ、どちらも、移植された骨髄と同様の敵対的抗原反応を示さないのか？なぜ、どちらも、ＧｖＨＤと死亡率を低減することができないのか？
【１１３１】
ここで、抗原性が主要な問題であるならば、単一ドナーから得た非照射アポトーシス細胞の臨床効果と単一ドナーから得た照射アポトーシス細胞の臨床効果に違いが見られることが予測された。しかしながら、データはこの違いを示さなかった。
【１１３２】
１つは、複数の個々のドナーから調製されたプールされた非照射アポトーシス細胞調製物の有効性の欠如が、プールされた調製液に存在する個々の単核集団間の交差相互作用によるものだという可能性である。これらの相互作用は、宿主に対する抗原性に直接寄与しないと思われる。というのは、照射細胞はその抗原性を維持しているが、有効性は非照射細胞とは有意に異なっていたからである。従って、プールされた照射初期アポトーシス細胞調製物での交差相互作用は、予期せず排除され、宿主が細胞の投与によく反応したと思われる。
【１１３３】
示したように、プールされた照射ドナーは、単一の非照射ドナーと本質的に同じ効果を持っていた。
【１１３４】
実施例１６：最終アポトーシス細胞に及ぼす照射の影響
アポトーシス細胞は、その本来備わっている免疫調節特性および抗炎症性特性のために、新規な治療方針に使用されることが増えてきている。初期アポトーシス細胞調製物は、最大で２０〜４０％の生存細胞（ＰＳ曝露の欠如とＰＩ無侵入により測定；アネキシンＶ陰性かつヨウ化プロピジウム陰性）を含んでいてもよい。そのあるものは輸液に用いられた後にアポトーシスとなることがあるが、またあるものは生存したままである。適合ドナーからの骨髄移植の場合、生存細胞は臨床的問題を示していない。というのは、レシピエントはすでに多くのより生存能力のある細胞を実際の移植でもらっているからである。しかしながら、第三者輸液の場合（またはプールされた単核アポトーシス細胞調製物で表れているように第四者以上の場合）、生存細胞を含むアポトーシス細胞集団は、第二のＧｖＨＤ誘導剤を導入することがある。さらに、初期アポトーシス細胞の潜在的免疫調節力における照射の含意は、現在のところ評価されていない。当業者であれば自明であるが、初期アポトーシス細胞集団にさらなる照射をすると、細胞がアポトーシスまたは壊死の後期段階に進む場合がある。これは、臨床用途に関して特に関わりのある疑問と思われるため、以下に示す実験は、この問題に対処するように設計されており、少なくとも１つの目標は、機能的なアポトーシス細胞の生体安全性を改善することであった。
【１１３５】
従って、本目的は、アポトーシス細胞の効力が移植された細胞の生着よりもバイスタンダー効果に依存し得る、多数の兆候に対してアポトーシス細胞の臨床利用を容易にすることであった。
【１１３６】
目的：初期アポトーシス細胞に及ぼす照射の効果を調べる。ここでは、照射はアポトーシスの誘発後に生じる。
【１１３７】
方法（手短に記す）：実施例５に従って細胞を回収し、本質的に実施例５に記載されるように初期アポトーシス細胞を調製した。
【１１３８】
３つの別個の初期アポトーシス細胞バッチを異なる日に調製した（収集物４０４−１、００４４−１、および００４３−１）。
【１１３９】
各最終生成物を３つの群に分けた：
【１１４０】
未処理
【１１４１】
２５００ｒａｄ
【１１４２】
４０００ｒａｄ
【１１４３】
照射後直ちに、初期アポトーシス細胞を、細胞数、アネキシンＶ陽性−ＰＩ陰性染色、細胞表面マーカー（異なる細胞型集団の％）、および効力（樹状細胞（ＤＣ））について試験した（ｔ０）。ｔ０における調査の後、初期アポトーシス細胞を２〜８℃で２４時間保存し、同じ試験パネルを使用して次の日に調査した（ｔ２４ｈ）（細胞数、アネキシンＶ陽性−ＰＩ陰性染色、細胞表面マーカー、および効力）。
【１１４４】
これまでに、放出後効力検定が開発されている。これは耐性を誘発するドナー由来の単核初期アポトーシス細胞（初期アポトーシス細胞）の能力を評価するものである（Ｍｅｖｏｒａｃｈ  ｅｔ  ａｌ，  ＢＢＭＴ  ２０１４  同上）。この検定は、ＬＰＳへの曝露後のｉＤＣ膜表面のＭＨＣクラスＩＩ分子（ＨＬＡ−ＤＲ）および共刺激分子（ＣＤ８６）の発現のフローサイトメトリー評価の使用に基づく。これまでに繰り返し示されているように、寛容原性ＤＣは、アポトーシス細胞との相互作用時に生産され得る（Ｖｅｒｂｏｖｅｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００２，Ｋｒｉｓｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００６）。ＬＰＳで処理されたＤＣの成熟の阻害（ＤＲおよびＣＤ８６発現の阻害）は、投与量に依存して生じる。
【１１４５】
初期アポトーシス細胞臨床研究のフェーズ１／２ａ中に、放出後効力検定を各初期アポトーシス細胞バッチに対して行い、耐性を誘発する各バッチの能力を評価した（全体の結果はｎ＝１３）（結果は図１に示される。Ｍｅｖｏｒａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２０（１）：  ５８−６５）。
【１１４６】
未知の非血縁の健康なドナーから収集された新鮮な軟膜からの各初期アポトーシス細胞バッチについて、ＤＣを生産し、異なる比率で初期アポトーシス細胞と組み合わせた（それぞれ、ＤＣ：初期アポトーシス細胞が１：２、１：４、および１：８の）。初期アポトーシス細胞とのインキュベーションとＬＰＳへの曝露の後、１以上のＤＣの初期アポトーシス細胞に対する比におけるＨＬＡ  ＤＲまたはＣＤ８６のいずれかのＤＣ膜発現の下方調節に基づいて効力を決定した。１３の検定すべてにおいて、初期アポトーシス細胞は寛容原性効果を示した。これは、最も高いＤＣに対する初期アポトーシス細胞の比を持つ調製物で、両マーカーに関して投与量に依存して認められた。
【１１４７】
単球取得した未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）を健康なドナーの末梢血液ＰＢＭＣから作製し、１％の自己血漿、Ｇ−ＣＳＦ、およびＩＬ−４の存在下で培養した。次いで、ｉＤＣを新たに調製した最終生成物か、または２〜８℃で２４時間保存した最終生成物かのいずれかのアポトーシス細胞と共に、１：２、１：４、および１：８の比で２時間予備インキュベートした。保存がアポトーシス細胞の効力に影響を及ぼすか否かを決定するため、２つの最終生成物を同時に調べた。インキュベーション後、ＬＰＳを指定のウェルに加えて、さらに２４時間置いた。インキュベーションの終了時に、ｉＤＣＳを収集し、洗浄し、ＤＣ兆候およびＨＬＡ−ＤＲまたはＣＤ８６の両方で染色して、発現の変化を決定した。フローサイトメーターを使用して細胞を分析し、ＦＣＳ−ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用してＤＣ兆候陽性細胞ゲートから分析を実施して、ＤＣのみの分析を確実にした。
【１１４８】
図３１Ａ、図３１Ｂ、図３２Ａ、および図３２Ｂは、単一ドナー由来の非照射細胞と比べた、プールされた照射アポトーシス細胞の効力の試験を示している。
【１１４９】
結果：
【１１５０】
単一ドナーの調製物
【１１５１】
表２１は、非照射アポトーシス細胞と照射アポトーシス細胞の比較結果を示す：２４時間での平均細胞損失（％）；０時間および２４時間でのアネキシン陽性（＋）ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性（−）％（初期アポトーシス細胞の％）；０時間および２４時間でのアネキシン陽性（＋）ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陽性（＋）％（後期アポトーシス細胞の％）；０時間および２４時間での細胞表面抗原ＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ５６（ＮＫ細胞）、ＣＤ１４（単球）、およびＣＤ１５ｈｉｇｈ（顆粒球）の存在。
【１１５２】
【表２１】
2020531515.tif 000025
【１１５３】
表２１の結果から、非照射アポトーシス細胞と照射アポトーシス細胞の両方が初期（２行目および３行目）および後期（４行目および５行目）のアポトーシス細胞に相当する百分率を有していたことを示す。従って、２５または４０Ｇｙの照射は、この高レベルのγ線照射の前に誘発されたアポトーシスまたはネクローシス過程を加速しなかった。さらに、細胞種に関しては照射細胞集団と対照の非照射集団で一貫していた。
【１１５４】
図３１Ａ〜図３１Ｂ（ＨＬＡ−ＤＲ発現）および図３２Ａ〜図３２Ｂ（ＣＤ８６発現）に示す効力検定の結果から、非照射アポトーシス細胞と比べて、新しい照射アポトーシス細胞（図３２Ａ、図３２Ａ）と２４時間保存した照射アポトーシス細胞（図３１Ｂおよび図３２Ｂ）の免疫調節能には変化がないことが判明した。
【１１５５】
図３１Ａ〜図３１Ｂと図３２Ａ〜図３２Ｂの両方で、成熟剤ＬＰＳに曝露後ＨＬＡ−ＤＲとＣＤ８６発現の両方に明らかな上方調節がある。両方の共刺激マーカーの有意な（ｐ＜０．０１）投与量依存性の下方調節が、単一ドナーまたは照射されたプールされたドナーに由来する新たに調製されたアポトーシス細胞の存在下で観察された。また、投与量依存性の下方調節は、２〜８℃で２４時間保存されたアポトーシス細胞の存在下で両方のマーカーで維持された。これは、２４時間の保存後の最終生成物の安定性と効力を示すものである。
【１１５６】
樹状細胞に及ぼす効果。アポトーシス細胞の免疫調節能を試験するため、放出後効力検定を用いた（Ｍｅｖｏｒａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）  ＢＢＭＴ、同上）。樹状細胞の免疫調節検定では変化は観察されなかった（データ示さず）。
【１１５７】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）に及ぼす効果。さらに免疫調節効果を試験するため、標準化されたＭＬＲ検定を確立した。ここで、刺激因子および応答細胞の共培養、すなわちＭＬＲは、強くかつ信頼性の高い増殖をもたらした。未照射アポトーシス細胞をＭＬＲに添加すると、リンパ球増殖は有意に１／５以下に低減し、増殖の細胞阻害が明白に示された。照射アポトーシス細胞により媒介されたＭＬＲでのリンパ球増殖の阻害は完全に同等であった（データ示さず）。
【１１５８】
次の手順は、完全不適合マウスモデルで照射アポトーシス細胞および未照射アポトーシス細胞をインビボで評価することであった。図２８および図２９に示すように、照射初期アポトーシス細胞調製物と非照射初期アポトーシス細胞調製物は同等の有益なインビボ効果を持っていた。
【１１５９】
単一ドナー調製物の結論：
【１１６０】
結論として、２５Ｇｙまたは４０Ｇｙの照射は、アポトーシス細胞の集団において、アポトーシスまたは誘発されたネクローシスを有意には加速しなかった。意義深いことに、これらの集団は、インビトロおよびインビボの両方でアポトーシス細胞の免疫調節効果を維持した。
【１１６１】
複数のドナーの調製物
【１１６２】
次に、単一ドナーの第三者調製物にて観察された現象が複数の第三者ドナーに関しても当てはまることを検証するために、実験を実施した。予期せぬことに、プールされた個別のドナーのアポトーシス細胞調製物を使用したときに、単一不適合ドナーの有益な効果は失われた（図３０）。各ドナーの有益な効果は別々に維持されていたため、これはＧｖＨＤに起因するものではなかった（試験結果は示されていない）。１つの可能性は、初期アポトーシス細胞調製物の有益な効果が、個々のドナー細胞のそれらの間の相互作用によって失われたということである。さらに、異なるドナーのこの可能な相互作用がγ線照射によって回避され得るか否かを調べた。
【１１６３】
図３０に示すように、単一ドナーの有益な効果は、γ線照射の後に完全に回復しており、照射された複数のドナー調製物と単一ドナーの調製物（照射または非照射）は同様の生存パターンを示した。
【１１６４】
結論：
【１１６５】
意外にも、照射（および、おそらくＴ細胞受容体の阻害を導く任意の方法）により、Ｔ細胞の意図しない増殖および活性化を回避するだけでなく、複数のドナーからの第三者アポトーシス細胞の調製物を使用した際にも免疫調節の有益な効果を見込めることが、今回初めて示された。
【１１６６】
本明細書で開示される特定の特徴が本明細書で例示され、記載されたが、多くの改良、置換、変更、およびそれらの均等物は当業者には自明である。従って、自明であるが、添付の請求項は本明細書で開示される真の精神を逸脱することなく、そのようなすべての改良や変更を含むように意図されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月23日(2020.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体のがんもしくは腫瘍を治療もしくは予防し、がんもしくは腫瘍の成長を阻害し、病気の進行を遅らせ、腫瘍量を低減し、もしくはがんもしくは腫瘍の発生を低減する、またはそれらの任意の組み合わせを行うための医薬品の調製のための初期アポトーシス細胞集団を含む組成物の使用であって、前記初期アポトーシス細胞集団は、
（ａ）単核富化細胞集団を含むか、
（ｂ）２４時間を超えて安定であるか、
（ｃ）細胞凝集体を含まないか、
（ｄ）減少した活動中の非アポトーシス細胞、活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、もしくはそれらの組み合わせを含むか、または
（ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせを示す、使用。
【請求項２】
前記がんもしくは腫瘍の大きさ、もしくはそれらの成長速度、もしくは大きさと成長速度の組み合わせが減少するか、前記被験体の生存期間が延長されるか、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記初期アポトーシス細胞集団は初期アポトーシス細胞のプール集団を含む、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記がんまたは腫瘍は固形腫瘍または非固形腫瘍を含み、
（ａ）前記非固形がんまたは腫瘍は、造血器腫瘍、血液細胞がん、白血病、骨髄異形成症候群、リンパ腫、多発性骨髄腫（形質細胞性骨髄腫）、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、または形質細胞性白血病を含み、
（ｂ）前記固形腫瘍は、肉腫もしくは細胞腫、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、膵がんもしくは膵腫瘍、乳がんもしくは乳腫瘍、卵巣がんもしくは卵巣腫瘍、前立腺がんもしくは前立腺腫瘍、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭状腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝細胞がん、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性がん腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸がんもしくは頸部腫瘍、子宮がんもしくは子宮腫瘍、精巣がんもしくは精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、グリオーマ、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、シュワン腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、または網膜芽細胞腫を含む、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記腫瘍またはがんは、腫瘍またはがんの転移を含む、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記組成物は、
（ａ）前記初期アポトーシス細胞集団の前記組成物の単回注入としての投与、
（ｂ）前記初期アポトーシス細胞集団の前記組成物の複数回注入としての投与、
（ｃ）前記被験体への追加の免疫療法、化学療法薬、免疫調節薬、もしくはそれらの組み合わせとの投与、または
（ｄ）それらの任意の組み合わせ
のために製剤化されている、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
（ａ）前記追加の免疫療法、化学療法薬、もしくは免疫調節薬は、前記初期アポトーシス細胞の投与以前、投与と同時、もしくは投与後に投与されるか、
（ｂ）前記免疫療法はＣＡＲ−Ｔ細胞の投与を含むか、
（ｃ）前記免疫調節薬は抗体もしくはその機能的断片を含むか、または
（ｄ）それらの組み合わせである、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記免疫療法がＣＡＲ−Ｔ細胞の投与を含む場合、ＣＡＲ−Ｔ細胞は投与されるが初期アポトーシス細胞を含む組成物は投与されない被験体と比べて、前記初期アポトーシス細胞集団を含む組成物の使用は、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性を向上させる、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記抗体またはその機能的断片はリツキシマブ（ＲｔＸ）抗体またはその機能的断片を含む、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
前記方法は第一選択療法または補助療法を含む、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記使用は微小残存病変を減らし、寛解を増大させ、寛解の期間を延長し、腫瘍の再発率を減らし、前記腫瘍もしくはがんの転移を予防し、前記腫瘍もしくはがんの転移率を減らし、またはそれらの任意の組み合わせの効果を持つ、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
初期アポトーシス状態の単核細胞を含む単核アポトーシス細胞の集団であって、前記単核アポトーシス細胞の集団は、前記細胞集団における初期アポトーシスの誘導後に照射されたものであり、前記集団は、
（ａ）非照射アポトーシス細胞集団と比べて小さな百分率の活動中の非アポトーシス生細胞、
（ｂ）活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、
（ｃ）増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、または
それらの任意の組み合わせを含む、集団。
【請求項１３】
（ａ）前記活動中の非アポトーシス生細胞の前記小さな百分率は１０％未満であるか、
（ｂ）前記単核アポトーシス細胞の集団は非アポトーシス生細胞を含まないか、
（ｃ）前記単核細胞はリンパ球、単球、樹状細胞、およびナチュラルキラー細胞からなる群から選択されるか、または
（ｄ）それらの任意の組み合わせである、請求項１２に記載の集団。
【請求項１４】
請求項１２に記載の集団および医薬的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
小さな百分率の活動中の非アポトーシス生細胞、活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、またはそれらの任意の組み合わせの細胞を含む単核アポトーシス細胞の集団を生成する方法であって、該方法は：
（ａ）抹消血の単核富化細胞集団を取得する工程、
（ｂ）抗凝固薬を含む凍結培地中で前記単核富化細胞集団を凍結する工程、
（ｃ）前記単核富化細胞集団を解凍する工程、
（ｄ）最終濃度が約１０〜１００μｇ／ｍＬのメチルプレドニゾロンおよび抗凝固薬を含むアポトーシス誘導インキュベーション培地で前記単核富化細胞集団をインキュベートする工程、
（ｅ）投与培地に前記アポトーシス細胞集団を再懸濁する工程、および
（ｆ）前記工程（ｅ）に引き続き行われる前記単核富化細胞集団を不活性化する工程を含み、
該方法は小さな百分率の活動中の非アポトーシス細胞、活性化が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、増殖が抑制された任意の非アポトーシス生存細胞、またはそれらの細胞の任意の組み合わせ含む単核アポトーシス細胞の集団を生成し、前記不活性化工程（ｆ）は前記工程（ｅ）で生成される単核富化アポトーシス細胞集団を照射する工程を含む、方法。
【請求項１６】
前記照射は、
（ａ）γ線照射または紫外線照射を含むか、
（ｂ）約２５〜５０グレイ（Ｇｙ）を含むか、または
（ｃ）それらの組み合わせである、請求項１５に記載の方法。
【国際調査報告】
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