(57)【要約】  Ｆｏｘｐ３（Ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  Ｐ３）を発現する樹状細胞およびＣＤ８（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ８）を発現する調節Ｔ細胞からなる群より選択された１種以上の癌治療標的としての用途および／または癌診断マーカとしての用途が提供される。
2020518569.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤を含む、癌治療用薬学組成物。
【請求項２】
前記Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤は、抗体、細胞毒性薬物（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇｓ）、抗体−細胞毒性薬物接合体、および抗体−磁性粒子（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ）からなる群より選択された１種以上の阻害剤、または前記阻害剤を含むナノ伝達体（ｎａｎｏ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）の形態である、請求項１に記載の癌治療用薬学組成物。
【請求項３】
前記組成物は、その腫瘍組織または血液から、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞が検出される癌患者に投与するために使用される、請求項１または２に記載の癌治療用薬学組成物。
【請求項４】
Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤を含む、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞阻害用薬学組成物。
【請求項５】
前記Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤は、抗体、細胞毒性薬物（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇｓ）、抗体−細胞毒性薬物接合体、および抗体−磁性粒子からなる群より選択された１種以上の阻害剤、または前記阻害剤を含むナノ伝達体の形態である、請求項４に記載のＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞阻害用薬学組成物。
【請求項６】
前記組成物は、その腫瘍組織または血液から、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞が検出された癌患者に投与するために使用される、請求項４または５に記載のＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞阻害用薬学組成物。
【請求項７】
ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の阻害剤を、癌治療用の有効性分として含む、薬学組成物。
【請求項８】
前記ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の阻害剤は、抗体、細胞毒性薬物（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇｓ）、抗体−細胞毒性薬物接合体、および抗体−磁性粒子からなる群より選択された１種以上の阻害剤、または前記阻害剤を含むナノ伝達体の形態である、請求項７に記載の癌治療用薬学組成物。
【請求項９】
前記組成物は、その腫瘍組織または血液から、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞が検出される癌患者に投与するために使用される、請求項７または８に記載の癌治療用薬学組成物。
【請求項１０】
Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤を癌治療を必要とする患者に投与する段階を含む、癌治療方法。
【請求項１１】
前記Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤は、抗体、細胞毒性薬物（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇｓ）、抗体−細胞毒性薬物接合体、および抗体−磁性粒子からなる群より選択された１種以上の阻害剤、または前記阻害剤を含むナノ伝達体である、請求項１０に記載の癌治療方法。
【請求項１２】
前記患者は、腫瘍組織または血液からＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞が検出された癌患者である、請求項１０に記載の癌治療方法。
【請求項１３】
Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤を、必要とする患者に投与する段階を含む、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞を阻害する方法。
【請求項１４】
前記Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤は、抗体、細胞毒性薬物（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇｓ）、抗体−細胞毒性薬物接合体、および抗体−磁性粒子からなる群より選択された１種以上の阻害剤、または前記阻害剤を含むナノ伝達体の形態である、請求項１３に記載のＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞を阻害する方法。
【請求項１５】
前記患者は、その腫瘍組織または血液から、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞が検出される癌患者である、請求項１３に記載のＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞を阻害する方法。
【請求項１６】
ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の阻害剤を癌治療を必要とする患者に投与する段階を含む、癌治療方法。
【請求項１７】
前記ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の阻害剤は、抗体、細胞毒性薬物（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇｓ）、抗体−細胞毒性薬物接合体、および抗体−磁性粒子からなる群より選択された１種以上の阻害剤、または前記阻害剤を含むナノ伝達体である、請求項１６に記載の癌治療方法。
【請求項１８】
前記患者は、腫瘍組織または血液からＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞が検出された癌患者である、請求項１６に記載の癌治療方法。
【請求項１９】
候補化合物を、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞、またはこれらの両方と接触させる段階；
Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞、またはこれらの両方の水準を測定する段階；および
前記測定されたＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞、またはこれら両方の水準を、前記候補化合物での処理前に測定された水準と比較して減少した場合に、前記候補化合物を抗癌剤候補物質と決定する段階
を含む、抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項２０】
Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞とＣＤ８を発現するＴ細胞と共に培養する段階を含む、ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ細胞の製造方法。
【請求項２１】
患者から分離された生物学的試料から、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞、またはこれらの両方を検出する段階を含む、癌診断または癌予後確認のために情報を提供する方法。
【請求項２２】
患者から分離された生物学的試料から、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞を検出する段階を含む、抗癌治療の有効性のモニタリングに情報を提供する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
Ｆｏｘｐ３（Ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  Ｐ３）を発現する樹状細胞およびＣＤ８（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ８）を発現する調節Ｔ細胞からなる群より選択された１種以上の癌治療標的としての用途および／または癌診断マーカとしての用途が提供される。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ、ＤＣ）は哺乳動物の免疫系で先天的免疫と適応免疫の間に重要な連結環を提供する抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。
Ｆｏｘｐ３（Ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  Ｐ３）は調節Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ；Ｔｒｅｇ）の発達と機能に関与すると知られた転写調節因子である（Ｈｏｒｉ、Ｓ．、Ｎｏｍｕｒａ、Ｔ．＆  Ｓａｋａｇｕｃｈｉ、Ｓ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｆｏｘｐ３．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９、１０５７−１０６１、ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１０７９４９０（２００３））。
しかし、樹状細胞のようなＴ細胞以外の免疫細胞でのＦｏｘｐ３発現およびその医薬的有用性についてまだ知られていることがない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本明細書では、癌患者の生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ；例えば、血液、腫瘍組織など）でＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞を確認し、その癌の診断および／または治療および／または抗癌治療後予後モニタリングのための用途を提供する。
一例は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の癌治療ターゲットおよび／または癌診断マーカとしての用途を提供する。
他の例は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤を有効性分として含む癌治療用薬学組成物を提供する。前記癌治療用薬学組成物は、腫瘍組織または血液からＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞が検出された癌患者に投与するためのものであり得る。
他の例は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤の癌治療に使用するための用途を提供する。前記癌治療に使用するための用途は、腫瘍組織または血液からＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞が検出された癌患者に適用するためのものであり得る。
他の例は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤の薬学的有効量を癌患者に投与する段階を含む、癌治療方法を提供する。前記癌患者は、腫瘍組織または血液からＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞が検出された癌患者であり得る。
他の例は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤を有効性分として含むＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞（ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ）阻害用薬学組成物を提供する。他の例は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤のＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞阻害に使用するための用途を提供する。他の例は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤をＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞阻害を必要とする患者に投与する段階を含む、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞阻害方法を提供する。前記患者は、癌患者、例えば、腫瘍組織または血液からＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞が検出された癌患者であり得る。
他の例は、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞（ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ）の癌治療ターゲットとしての用途を提供する。
他の例は、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の阻害剤を有効性分として含む癌治療用薬学組成物を提供する。前記癌治療用薬学組成物は、腫瘍組織または血液からＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞が検出された癌患者に投与するためのものであり得る。
他の例は、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の阻害剤の癌治療に使用するための用途を提供する。前記癌治療に使用するための用途は、腫瘍組織または血液からＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞が検出された癌患者に適用するためのものであり得る。
他の例は、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の阻害剤の薬学的有効量を癌患者に投与する段階を含む、癌治療方法を提供する。前記癌患者は、腫瘍組織または血液からＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞が検出された癌患者であり得る。
他の例は、候補化合物をＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞、またはこれら全てと接触させた後にＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞および／またはＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の水準が減少した場合、前記候補化合物を抗癌剤候補物質と決定する段階を含む、抗癌剤スクリーニング方法を提供する。
他の例は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の検出可能な製剤を含む癌診断または癌予後確認用組成物を提供する。他の例は、患者から分離された生物学的試料からＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞を検出する段階を含む、癌診断または癌予後確認方法または癌診断または癌予後確認に情報を提供する方法を提供する。前記癌診断方法は、前記検出する段階以後に前記生物学的試料からＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞が検出される場合（存在する場合）、前記患者を癌患者と決定する段階、またはＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞水準変化によって癌の進行程度を確認する段階を追加的に含むことができる。
他の例は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞とＣＤ８を発現するＴ細胞と共に培養する段階を含むＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞（ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ）の製造方法を提供する。
他の例は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞とＣＤ８を発現するＴ細胞を共培養して生成されたＣＤ８＋  Ｔｒｅｇの免疫抑制および／または自己免疫疾患または移植拒絶の予防および／または治療に使用するための用途を提供する。前記ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇは、先に説明したＣＤ８＋  Ｔｒｅｇの製造方法によって製造されたものであり得る。他の例は、前記製造方法によって製造されたＣＤ８＋  Ｔｒｅｇを有効性分として含む免疫抑制剤または自己免疫疾患または移植拒絶の予防および／または治療用組成物を提供する。他の例は、前記製造方法によって製造されたＣＤ８＋  Ｔｒｅｇを免疫抑制または自己免疫疾患または移植拒絶の予防および／または治療を必要とする個体に投与する段階を含む免疫抑制方法または自己免疫疾患または移植拒絶の予防および／または治療方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書は、腫瘍および腫瘍環境でＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞が誘導され、これによって腫瘍内ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇが誘導され、これら細胞の誘導によって腫瘍を除去するために寄り集まるＣＴＬの活性が抑制され腫瘍が持続的に成長するようになり、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞を除去する場合、ＣＴＬ活性を抑制するＣＴＬＡ４発現が減少し腫瘍特異的ＣＴＬ活性が抑制されず効果的な抗癌免疫を誘導し腫瘍成長を顕著に阻害することができるのを確認して、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の癌診断および／または治療における用途とＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞を除去することによって癌を治療する技術を提案する。
よって、一例は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の癌治療ターゲットとしての用途を提供する。
他の例は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤を有効性分として含む癌治療用薬学組成物を提供する。前記Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞は癌患者の腫瘍組織または血液に存在するものであり得、前記癌治療用薬学組成物は腫瘍組織または血液からＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞が検出された癌患者に投与するためのものであり得る。
他の例は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤の癌治療に使用するための用途を提供する。前記癌治療に使用するための用途は、腫瘍組織または血液からＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞が検出された癌患者に適用するためのものであり得る。
他の例は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤の薬学的有効量を癌患者に投与するか、前記患者（例えば、患者の血液および／または腫瘍組織など）からＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞を除去する段階を含む、癌治療方法を提供する。前記癌患者は、腫瘍組織または血液からＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞が検出された癌患者であり得る。
他の例は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤を有効性分として含むＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞（ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ）阻害用薬学組成物を提供する。他の例は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤のＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞阻害に使用するための用途を提供する。他の例は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤をＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞阻害を必要とする患者に投与するか、前記患者（例えば、患者の血液および／または腫瘍組織など）からＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞を除去する段階を含む、ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ阻害方法を提供する。前記ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞によって癌患者の血液内で誘導されるものであり得る。前記患者は、癌患者、例えば、腫瘍組織または血液からＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞が検出された癌患者または腫瘍組織または血液からＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞によってＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞が誘導された患者であり得る。
他の例は、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞（ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ）の癌治療ターゲットとしての用途を提供する。
他の例は、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の阻害剤を有効性分として含む癌治療用薬学組成物を提供する。前記癌治療用薬学組成物は、腫瘍組織または血液からＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞が検出された癌患者に投与するためのものであり得る。
他の例は、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の阻害剤の癌治療に使用するための用途を提供する。前記癌治療に使用するための用途は、腫瘍組織または血液からＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞が検出された癌患者に適用するためのものであり得る。
他の例は、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の阻害剤の薬学的有効量を癌患者に投与するか前記患者（例えば、患者の血液および／または腫瘍組織など）からＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞を除去する段階を含む、癌治療方法を提供する。前記癌患者は、腫瘍組織または血液からＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞が検出された癌患者であり得る。
【０００５】
他の例は、候補化合物をＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞、ＣＤ８＋  ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞、またはこれら全てと接触させた後にＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞および／またはＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の水準が減少した場合、前記候補化合物を抗癌剤候補物質と決定する段階を含む、抗癌剤スクリーニング方法を提供する。具体的に、前記スクリーニング方法は、（１）候補化合物をＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞、これら全て、またはこれらを含む生物学的試料（例えば、血液、血球、腫瘍組織など）と接触させる段階；および（２）Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞および／またはＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の水準を測定する段階を含むことができる。前記抗癌剤スクリーニング方法は、前記段階（２）以後に、段階（２）で測定されたＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞および／またはＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の水準を候補化合物処理前のＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞および／またはＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の水準と比較する段階（段階（３））を追加的に含むことができる。また前記抗癌剤スクリーニング方法は、前記段階（２）または段階（３）以後に、段階（２）で測定されたＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞および／またはＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の水準が候補化合物処理前のＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞および／またはＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の水準より減少した場合、前記候補化合物を抗癌剤候補物質と決定する段階（段階（４））を追加的に含むことができる。前記スクリーニング方法の各段階は、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で行われるものであってもよい。また、前記Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞および／またはＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞は、生体から分離された細胞であってもよい。
【０００６】
他の例は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の検出可能な製剤を含む癌診断用組成物を提供する。他の例は、患者から分離された生物学的試料からＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞を検出する段階を含む、癌の診断または予後確認方法または癌の診断または予後確認に情報を提供する方法を提供する。前記癌の診断または予後確認方法は、前記検出する段階以後に前記生物学的試料からＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞が検出される場合（存在する場合）、前記患者を癌患者と決定する段階、またはＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞水準変化によって癌の進行程度を確認する段階を追加的に含むことができる。前記癌診断方法において、生物学的試料は、癌の発生後予後の推定確認を必要とする人間などの哺乳動物から分離された血液、血球などを含むものであってもよい。一例で、前記癌診断方法は、前記癌患者と決定する段階以後に、前記癌患者と決定された患者にＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞阻害剤およびＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞阻害剤からなる群より選択された１種以上の薬学的有効量を投与する段階を追加的に含むことができる。
前記癌の予後確認方法において、生物学的試料は、癌の予後（進行状態）を確認（モニタリング）しようとする癌患者から分離された血液、血球、腫瘍組織などからなる群より選択された１種以上であってもよい。前記癌の予後確認方法で、癌患者から分離された生物学的試料でのＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞水準を互いに異なる２以上の時点で測定して、ある一時点で測定したＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞水準が以前時点で測定された水準より高い場合、前記癌患者で癌が悪化するか癌進行が速くなっていると確認することができ、ある一時点で測定したＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞水準が以前時点で測定された水準より低い場合、前記癌患者で癌が緩和されるか癌進行が遅くなっていると確認することができる。前記癌予後確認方法は、（１）癌患者から分離された生物学的試料でのＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞水準を互いに異なる２以上の時点で測定する段階、および（２）ある一時点で測定したＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞水準が以前時点で測定された水準より高い場合、前記癌患者で癌が悪化するか癌進行が速くなっていると確認するか、ある一時点で測定したＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞水準が以前時点で測定された水準より低い場合、前記癌患者で癌が緩和されるか癌進行が遅くなっていると確認する段階を含むものであり得る。
【０００７】
前記癌予後の確認方法は、抗癌治療（例えば、抗癌剤投与）中の癌患者での抗癌治療効能モニタリング（抗癌治療後予後モニタリング）に適用できる。よって、本発明の他の例は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の検出可能な製剤を含む抗癌治療効能確認（モニタリング）用組成物を提供する。他の例は、患者から分離された生物学的試料からＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞を検出する段階を含む、抗癌治療効能確認（モニタリング）方法または抗癌治療効能確認（モニタリング）に情報を提供する方法を提供する。前記抗癌治療効能確認（モニタリング）方法において、前記患者は抗癌治療を受けた患者であってもよく、前記抗癌治療は抗癌剤投与のような化学的療法、遺伝子治療などの生物学的療法、放射線治療などの物理学的療法、外科的手術などからなる全ての通常の抗癌治療の中から選択された一つまたは二つ以上の複合療法であってもよく、生物学的試料は抗癌治療効能を確認しようとする癌患者から分離された血液、血球、腫瘍組織などからなる群より選択された１種以上であってもよい。前記抗癌治療効能確認方法で、抗癌治療を受けた癌患者から分離された生物学的試料でのＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞水準を測定して、前記抗癌治療を受ける前より増加した場合、前記抗癌治療が前記癌患者で抗癌効果がないと確認することができ、前記抗癌治療を受ける前より減少した場合、前記抗癌治療が前記癌患者で抗癌効果があると確認することができる。前記抗癌治療効能確認方法は、（１）癌患者から分離された生物学的試料でのＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞水準を前記癌患者に抗癌治療を行う前と後に測定する段階、および（２）抗癌治療後に測定したＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞水準が抗癌治療前に測定された水準より高い場合、前記抗癌治療が前記癌患者で効果がないと確認するか、抗癌治療後に測定したＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞水準が抗癌治療前に測定された水準より低い場合、前記抗癌治療が前記癌患者で効果があると確認する段階を含むものであり得る。前記Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞水準を測定する時期としての“抗癌治療後”は、抗癌治療直後から二カ月までの期間（例えば、抗癌治療直後〜８週間、抗癌治療直後〜７週間、抗癌治療直後〜６週間、抗癌治療直後〜５週間、抗癌治療直後〜４週間、抗癌治療直後〜３週間、抗癌治療直後〜２週間、または抗癌治療直後〜１週間）の中から一つ以上選択された任意の時点であってもよい。前記抗癌治療効能確認方法は、前記段階（３）以後に、（４）抗癌治療後に測定したＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞水準が抗癌治療前に測定された水準より高い場合（前記抗癌治療が前記癌患者で効果がないと確認される場合）、前記癌患者に抗癌治療を中断するか他の抗癌治療を適用するか、抗癌治療後に測定したＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞水準が抗癌治療前に測定された水準より低い場合（前記抗癌治療が前記癌患者で効果があると確認される場合）、前記抗癌治療を維持するか強化する段階を追加的に含むことができる。前記抗癌効果は、癌細胞死滅または増殖抑制、癌組織消滅または大きさ減少、癌転移抑制などの癌の症状を除去または緩和（好転）させる全てのｅｖｅｎｔであり得る。
【０００８】
他の例は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞とＣＤ８を発現するＴ細胞を共に培養する段階を含むＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞（ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ）の製造方法を提供する。前記培養する段階は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞とＣＤ８を発現するＴ細胞を、細胞数基準で、１：０．１〜１０、１：０．１〜８、１：０．１〜６、１：０．１〜４、１：０．１〜２、１：０．１〜１、１：０．３〜１０、１：０．３〜８、１：０．３〜６、１：０．３〜４、１：０．３〜２、１：０．３〜１、１：０．５〜１０、１：０．５〜８、１：０．５〜６、１：０．５〜４、１：０．５〜２、１：０．５〜１、１：０．８〜１０、１：０．８〜８、１：０．８〜６、１：０．８〜４、１：０．８〜２、１：０．〜１、１：１〜１０、１：１〜８、１：１〜６、１：１〜４、または１：１〜２（Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の数：ＣＤ８を発現するＴ細胞の数）の比率で共に培養して行うことができる。
他の例は、前記Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞とＣＤ８を発現するＴ細胞を共培養して生成されたＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞を提供する。前記ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞は、先に説明したＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の製造方法によって製造されたものであってもよい。
他の例は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞とＣＤ８を発現するＴ細胞を共培養して生成されたＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の免疫抑制および／または自己免疫疾患または移植拒絶の予防および／または治療に使用するための用途を提供する。前記ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞は、先に説明したＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の製造方法によって製造されたものであってもよい。他の例は、前記製造方法によって製造されたＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞を有効性分として含む免疫抑制剤または自己免疫疾患または移植拒絶の予防および／または治療用組成物を提供する。他の例は、前記製造方法によって製造されたＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞を免疫抑制または自己免疫疾患または移植拒否の予防および／または治療を必要とする個体に投与する段階を含む免疫抑制方法または自己免疫疾患または移植拒絶の予防および／または治療方法を提供する。前記自己免疫疾患は、リウマチ、ループス病、自己免疫性肝炎、自己免疫性溶血性疾患などから選択されたものであり得る。
【０００９】
以下、本発明をより詳しく説明する。
Ｆｏｘｐ３（Ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ  Ｐ３、ｓｃｕｒｆｉｎとも呼ばれる）は、免疫系反応に関与する蛋白質であって、調節Ｔ細胞の発達および機能の調節経路の主要調節因子としての機能を果たす。Ｆｏｘｐ３は、人間、猿などの霊長類、ラット、マウスなどのげっ歯類を含む哺乳動物に由来するものであってもよく、例えば、人間Ｆｏｘｐ３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００１１０７８４９．１（遺伝子（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００１１１４３７７．１）、ＮＰ＿０５４７２８．２（遺伝子（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０１４００９．３）など）、マウスＦｏｘｐ３（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００１１８６２７６．１（遺伝子（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００１１９９３４７．１）、ＮＰ＿００１１８６２７７．１（遺伝子（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００１１９９３４８．１）、ＮＰ＿４７３３８０．１（遺伝子（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０５４０３９．２）など）であってもよい。一例で、Ｆｏｘｐ３は、配列番号１のアミノ酸配列（ＭＰＮＰＲＰＡＫＰＭＡＰＳＬＡＬＧＰＳＰＧＶＬＰＳＷＫＴＡＰＫＧＳＥＬＬＧＴＲＧＳＧＧＰＦＱＧＲＤＬＲＳＧＡＨＴＳＳＳＬＮＰＬＰＰＳＱＬＱＬＰＴＶＰＬＶＭＶＡＰＳＧＡＲＬＧＰＳＰＨＬＱＡＬＬＱＤＲＰＨＦＭＨＱＬＳＴＶＤＡＨＡＱＴＰＶＬＱＶＲＰＬＤＮＰＡＭＩＳＬＰＰＰＳＡＡＴＧＶＦＳＬＫＡＲＰＧＬＰＰＧＩＮＶＡＳＬＥＷＶＳＲＥＰＡＬＬＣＴＦＰＲＳＧＴＰＲＫＤＳＮＬＬＡＡＰＱＧＳＹＰＬＬＡＮＧＶＣＫＷＰＧＣＥＫＶＦＥＥＰＥＥＦＬＫＨＣＱＡＤＨＬＬＤＥＫＧＫＡＱＣＬＬＱＲＥＶＶＱＳＬＥＱＱＬＥＬＥＫＥＫＬＧＡＭＱＡＨＬＡＧＫＭＡＬＡＫＡＰＳＶＡＳＭＤＫＳＳＣＣＩＶＡＴＳＴＱＧＳＶＬＰＡＷＳＡＰＲＥＡＰＤＧＧＬＦＡＶＲＲＨＬＷＧＳＨＧＮＳＳＦＰＥＦＦＨＮＭＤＹＦＫＹＨＮＭＲＰＰＦＴＹＡＴＬＩＲＷＡＩＬＥＡＰＥＲＱＲＴＬＮＥＩＹＨＷＦＴＲＭＦＡＹＦＲＮＨＰＡＴＷＫＮＡＩＲＨＮＬＳＬＨＫＣＦＶＲＶＥＳＥＫＧＡＶＷＴＶＤＥＦＥＦＲＫＫＲＳＱＲＰＮＫＣＳＮＰＣＰ）を含むものであってもよいが、これに制限されるのではない。
【００１０】
樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ；ＤＣ）は、哺乳類の免疫系を構成する免疫細胞であって、抗原伝達細胞として機能する。本明細書で、樹状細胞は、人間、猿などの霊長類、ラット、マウスなどのげっ歯類を含む哺乳動物に由来するものであってもよく、一例で、哺乳動物、例えば、人間（例えば、癌患者）の血液（または血球）に由来（分離）されたものであってもよい。
Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤は、投与対象（患者の体内（例えば、癌患者生体内血液および／または腫瘍組織）、患者から分離された生物学的試料（例えば、分離された血液および／または腫瘍組織））でＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞の水準を低めるか、死滅させるか、除去することができる全ての製剤の中から選択でき、例えば、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞に特異的な抗体、細胞毒性薬物（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇｓ）、抗体−細胞毒性薬物接合体、抗体−磁性粒子複合体などからなる群より選択された１種以上の阻害剤、または前記阻害剤を含むナノ伝達体（ｎａｎｏ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。前記ナノ伝達体は、前記阻害剤を封入または伝達することができるナノサイズ（例えば、１−１０００ｎｍ）の粒子を意味するものであって、その材質は蛋白質、脂質、およびその他の生体適合性または生分解性高分子からなる群より選択された１種以上であってもよく、形態には制限がない。
ＣＤ８（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ８）は、Ｔ細胞受容体（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＣＲ）に対してｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ役割を果たす膜貫通糖蛋白質であって、ＭＨＣ（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）分子に結合し、ｃｌａｓｓ  Ｉ  ＭＨＣ蛋白質に特異的である。ＣＤ８は、人間、猿などの霊長類、ラット、マウスなどのげっ歯類を含む哺乳動物に由来するものであってもよく、例えば、人間ＣＤ８（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００１１３９３４５．１（遺伝子（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００１１４５８７３．１）、ＮＰ＿００１７５９．３（遺伝子（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００１７６８．６）、ＮＰ＿７４１９６９．１（遺伝子（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿１７１８２７．３）、ＮＰ＿００１１７１５７１．１（遺伝子（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００１１７８１００．１）、ＮＰ＿００４９２２．１（遺伝子（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００４９３１．４）、ＮＰ＿７４２０９９．１（遺伝子（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿１７２１０１．３）、ＮＰ＿７４２１００．１（遺伝子（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿１７２１０２．３）、ＮＰ＿７５７３６２．１（遺伝子（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿１７２２１３．３）など）であってもよい。
【００１１】
Ｔ細胞は、抗原特異的な適応免疫を主管するリンパ球の一種である。調節Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ；Ｔｒｅｇ）は、免疫系を調節するＴ細胞のうちの一集団であって、自己抗原に対する寛容を維持し自己免疫病気を抑制すると知られている。本明細書で、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ８＋調節Ｔ細胞は、人間、猿などの霊長類、ラット、マウスなどのげっ歯類を含む哺乳動物に由来するものであってもよく、一例で、哺乳動物、例えば、人間（例えば、癌患者）の血液に由来（分離）されたものであってもよい。
ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の阻害剤は、投与対象（患者の体内（例えば、癌患者生体内血液および／または腫瘍組織）、患者から分離された生物学的試料（例えば、分離された血液および／または腫瘍組織））でＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の水準を低めるか除去することができる全ての製剤の中から選択でき、例えば、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞に特異的な抗体、細胞毒性薬物、抗体−細胞毒性薬物接合体、抗体−磁性粒子複合体などからなる群より選択された１種以上が阻害剤、または前記阻害剤を含むナノ伝達体などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるのではない。前記ナノ伝達体は、前記阻害剤を封入または伝達することができるナノサイズ（例えば、１−１０００ｎｍ）の粒子を意味するものであって、その材質は蛋白質、脂質、およびその他の生体適合性または生分解性高分子からなる群より選択された１種以上であってもよく、形態には制限がない。
本明細書に使用されたものとして、患者は、人間、猿などの霊長類、マウス、ラットなどのげっ歯類などを含む哺乳動物、または前記哺乳動物から分離された細胞または組織（例えば、血液、血球、腫瘍組織）であり得る。一例で、前記患者は、癌患者または癌患者から分離された細胞または組織（例えば、血液、血球、腫瘍組織）であり得る。例えば、前記患者は、腫瘍組織または血液からＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞、またはこれら全てが検出された癌患者であり得る。
また、癌診断に使用される生物試料は、患者（人間、猿などの霊長類、マウス、ラットなどのげっ歯類などを含む哺乳動物の中から選択）から分離された細胞、組織、体液（例えば、血液、血球、腫瘍組織など）などであり得る。
【００１２】
本発明の治療および／または診断の適用が可能な癌は、全ての固形癌および血液癌の中から選択できる。例えば、前記癌は、扁平上皮細胞癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌 など）、腹膜癌、皮膚癌、直膓癌、肛門付近癌、食道癌、小腸癌 、内分泌腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、慢性または急性白血病、リンパ腫、肝癌、胃癌、すい臓癌、頸部癌、卵巣癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜癌、子宮癌、唾液腺癌、前立腺癌、陰門癌、甲状腺癌、頭頸部癌、脳癌、骨肉腫、などからなる群より選択された１種以上であり得るが、これに制限されるのではない。一例で、前記癌は、大腸癌、胃癌、肺癌、すい臓癌、乳癌などの固形癌、および／またはリンパ腫、白血病などの血液癌でであり得る。前記癌は、原発性癌または転移性癌であり得る。
本明細書での癌治療は、癌細胞の成長を抑制または癌細胞を消滅（除去）させる効果だけでなく、癌細胞の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、浸湿（ｉｎｖａｓｉｏｎ）、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）などを抑制してこれによる癌の悪化を抑制する効果も含む。
前記Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の検出可能な製剤は、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞と特異的に結合可能な全ての化合物（例えば、小分子化合物、抗体など）の中から選択でき、例えば、樹状細胞内でＦｏｘｐ３に特異的に結合する小分子化合物、抗体の中から選択された１種以上およびＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞の表面蛋白質に特異的に結合する小分子化合物、抗体、またはこれら（抗体および／または小分子化合物）を含むナノ伝達体の中からり選択された１種以上の組み合わせであってもよい。
前記ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の検出可能な製剤は、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞と特異的に結合可能な全ての化合物（例えば、小分子化合物、抗体、ナノ伝達体など）の中から選択でき、例えば、ＣＤ８調節Ｔ細胞の表面蛋白質に特異的に結合する小分子化合物、抗体の中から選択された１種以上の組み合わせであってもよい。
前記Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の検出可能な製剤および／またはＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の検出可能な製剤は、通常の方法（例えば、酵素反応、蛍光、発光および／または放射線検出など）で探知可能な通常の標識物質で標識されたものであってもよい。例えば、前記標識物質は、蛍光物質（例えば、蛍光化学染料、蛍光蛋白質など）、発光物質、放射性同位元素などからなる群より選択された１種以上であり得るが、これに制限されるのではない。一例で、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の検出および／またはＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の検出は、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）、免疫クロマトグラフィー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着分析（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）、酵素免疫分析（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、蛍光免疫分析（Ｆｌｏｒｅｓｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＦＩＡ）、発光免疫分析（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＬＩＡ）、ウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）などから選択された方法を使用して行うことができるが、これに制限されるのではない。
前記抗癌剤スクリーニング方法において、候補化合物は、各種化合物、例えば、小分子化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、蛋白質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、植物または動物の抽出物などからなる群より選択されたものであり得る。
【発明の効果】
【００１３】
腫瘍または腫瘍環境（例えば、癌患者の血液）内のＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞および／またはこれによって誘導されたＣＤ８＋  Ｔｒｅｇの癌診断マーカおよび／または癌治療ターゲットとしての用途が提供され、これは癌の診断、治療および抗癌剤研究、抗癌治療後予後モニタリングなどの多様な分野に有用に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】腫瘍成長中の腫瘍マウスモデルの血液内Ｆｏｘｐ３発現樹状細胞（ｆｘＤＣ）の比率（％  ｏｆ  ｆｘＤＣ／ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ）を示すグラフである（Ｐａｉｒｅｄ  ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）。
【図２ａ】正常人と癌患者の血液でｆｘＤＣ分布（％  ｏｆ  ｆｘＤＣ／ｂ−ＤＣ）を示すグラフである（ｎ＝３０  ｈｕｍａｎ  ｓａｍｐｌｅｓ、ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）。
【図２ｂ】様々なマウス腫瘍モデル血液でｆｘＤＣの分布を示すグラフである（ＥＬ４；ｌｙｍｐｈｏｍａ、Ｂ１６；ｍｅｌａｎｏｍａ、ＬＬＣ；Ｌｅｗｉｓ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、２６６−６；ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ、ＣＴ−２６；ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ、４Ｔ−１；ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ、ＲＥＮＣＡ；ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）。ｎ＝５  ｔｏ  ７  ｍｉｃｅ  ｐｅｒ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ、ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）。
【図３】樹状細胞特異的Ｆｏｘｐ３除去マウス（ＣＤ１１ｃ−Ｃｒｅ  ｘ  Ｆｏｘｐ３ｆｌ／ｆｌ：以下、Ｆｏｘｐ３ｃＫＯマウス）およびｆｌｏｘｅｄ  ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅｓ（Ｆｏｘｐ３ｆｌ／ｆｌ）の血液内のＦｘＤＣｓ分布を示す結果である。
【図４】ＷＴマウス（Ｆｏｘｐ３ｆｌ／ｆｌ）とＦｏｘｐ３ｃＫＯマウスで腫瘍体積変化を示すグラフ（左）および腫瘍重量を示すグラフ（右）である（ｎ＝５  ｍｉｃｅ  ｅａｃｈ、ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｏｎｅ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）。
【図５】ＷＴマウスとＦｏｘｐ３ｃＫＯマウス腫瘍組織内ｆｘＤＣ確認結果を示す（Ｅ＝５、ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｏｎｅ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ．  ＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図６】ＷＴマウスとＦｏｘｐ３ｃＫＯマウスでの多様な固形癌の腫瘍体積変化を示すグラフである。
【図７】Ｆｏｘｐ３ｃＫＯマウスの腫瘍組織内ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ＣＤ８＋  Ｔ−細胞の比率を示すグラフである（ｎ＝３、ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｏｎｅ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）。
【図８】Ｆｏｘｐ３ｃＫＯマウスの腫瘍組織内ＣＤ８＋  Ｔ−ｃｅｌｌの腫瘍細胞に対する細胞毒性をＣＴＬ（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）の活性で確認した結果を示すグラフである（ｎ＝３、ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｏｎｅ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）。
【図９】ＷＴマウスとＦｏｘｐ３ｃＫＯマウスの腫瘍組織内ＣＤ８＋  Ｔ細胞でＣＴＬＡ４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４）発現水準を示す結果である。
【図１０】野生型マウスとＦｏｘｐ３ｃＫＯマウスの腫瘍組織でのＣＤ８＋  Ｔ細胞中のＣＴＬＡ４発現ＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＣＴＬＡ４＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞）の比率を示すグラフである（ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｏｎｅ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ、＊＊ｐ＜０．０１  ａｎｄ  ＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１１】ＥＬ４腫瘍から分離されたＣＴＬＡ４＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞とＣＴＬＡ４−  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の腫瘍細胞（ＥＬ４）を標的とするＣＴＬ活性を示すグラフである（ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｏｎｅ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）。
【図１２】ｆｘＤＣとＣＤ８＋Ｔ細胞の共培養後のＦｏｘｐ３＋  ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ分布を示す結果である（ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｏｎｅ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）。
【図１３】ｆｘＤＣとｆｏｘｐ３が除去されたＤＣのＣＤ４／８  Ｔｒｅｇ誘導能確認  ａ．Ｐｒｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｆｏｘｐ３ＧＦＰ  ｍｉｃｅ  ｗｅｒｅ  ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｐｌｅｎｉｃ  ＤＣｓ（ｓｐＤＣ）、ｂｌｏｏｄ  ＤＣｓ（ｂＤＣ）  ａｎｄ  ｆｘＤＣ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ（ＤＴ−ｔｒｅａｔｅｄ）  ｂＤＣｓ（ｂＤＣ／ＤＴ）  ｏｆ  ＴＢ  Ｆｏｘｐ３ＤＴＲ  ｍｉｃｅ（ｐ３／Ｅ、ｆｏｒ  ｂ−ＤＣｓ）、ａｎｄ  ｅｘａｍｉｎｅｄ  ｔｈｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｘｐ３＋  ＣＤ４＋  ａｎｄ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ。Ｅ＝３、ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ。
【図１４】ＴＢマウスの血液内のｆｘＤＣおよびＣＤ８＋  Ｔｒｅｇｓ細胞比率を示すグラフである（ｎ＝２７）。
【図１５】野生型マウスとＦｏｘｐ３ｃＫＯマウス腫瘍組織内ＣＤ４＋／ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ分布を示す結果である（ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ）。
【図１６】Ｔ細胞とＣＤ８＋／ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞の共培養後のＴ細胞増殖程度を示す。
【図１７】Ｔ細胞とＣＤ８＋／ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞の共培養後のＩＦＮ−ｇａｍｍａ＋  Ｔ細胞水準を示す結果である（ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図１８】ＣＤ８＋  ＴｒｅｇとＣＤ８＋  Ｔ細胞の共培養後のＣＴＬＡ４発現Ｔ細胞水準を示す結果である（ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｏｎｅ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１９】野生型ＣＤ８＋  Ｔ細胞をＤＴ−処理ｔｕ−ＣＤ８＋  Ｔ−細胞またはＰＢＳ−処理ｔｕ−ＣＤ８＋  Ｔ−細胞と共培養した後のＣＴＬＡ４＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞水準を測定した結果を示す（ｎ＝３、ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｏｎｅ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これは例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を制限しようとするのでない。以下に記載された実施例は発明の本質的な要旨を逸脱しない範囲で変形可能であるのは当業者に自明である。
【実施例】
【００１６】
参考例
１．マウス準備
７−１０週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ６およびＢＡＬＢ／ｃマウス、および遺伝子変形されたＣ５７ＢＬ６−ＯＴ−１、Ｃ５７ＢＬ６−Ｆｏｘｐ３ＧＦＰ［Ｆｏｘｐ３＋細胞でＦｏｘｐ３−緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）融合蛋白質を発現するＦｏｘｐ３−ＧＦＰレポーターマウス］、Ｃ５７ＢＬ６−Ｆｏｘｐ３ＤＴＲ［Ｆｏｘｐ３プロモーターの調節下でＦｏｘｐ３−暗号化エクソンに代わってジフテリア毒素受容体（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＤＴＲ）を発現するＦｏｘｐ３−ＤＴＲ形質転換（Ｔｇ）マウス］、Ｃ５７ＢＬ６−Ｆｏｘｐ３ＤＴＲ−ＧＦＰ（Ｃ５７ＢＬ６−Ｆｏｘｐ３ＤＴＲマウスをＣ５７ＢＬ６−Ｆｏｘｐ３ＧＦＰマウスと３世代の間に逆交配して製作する）、Ｃ５７ＢＬ６−Ｆｏｘｐ３−ｆｌｏｘｅｄ（Ｆｏｘｐ３ｆｌ／ｆｌ）、ＣＤ１１ｃ−Ｆｏｘｐ３ｃＫＯ（ＣＤ１１ｃ−ｃｒｅマウスとＦｏｘｐ３ｆｌ／ｆｌマウスを交配して製作されたＣ５７ＢＬ６−Ｆｏｘｐ３ｃＫＯマウス）、Ｃ５７ＢＬ６−Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ（ＲＡＧ１−／−)、およびＣＤ１１ｃ−ｃｒｅマウスを下記試験に使用した。Ｃ５７ＢＬ６−ＯＴ−１、Ｆｏｘｐ３ＧＦＰ、Ｆｏｘｐ３ＤＴＲ、Ｒａｇ１−／−、およびＣＤ１１ｃ−ｃｒｅマウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）で購入した。Ｆｏｘｐ３−ｆｌｏｘｅｄ（Ｃ５７ＢＬ６−Ｆｏｘｐ３ｆｌ／ｆｌ）マウスは、“Ａ．Ｒｕｄｅｎｓｋｙ、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、ＮＹ”から提供を受けた。全てのマウスは、“Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ”によってＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ）動物保護施設（成均館大学校）で維持管理され、本実験のために別途のａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ｃｈａｍｂｅｒに移して同一条件でｃｏ−ｈｏｕｓｉｎｇして使用した。ＤＴＲマウスには、従来に報告された方法でジフテリア毒素（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ；ＤＴ）を処理した（参照文献：“Ｋｉｍ、Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｔｔｉｎｇ  ｅｄｇｅ：ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｘｐ３＋  ｃｅｌｌｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８３、７６３１−７６３４、ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．０８０４３０８（２００９）”および“Ｐｅｎａｌｏｚａ−ＭａｃＭａｓｔｅｒ、Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｐｌａｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ＰＤ−１  ｉｎ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖｉｒａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ＬＣＭＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２１１、１９０５−１９１８、ｄｏｉ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２０１３２５７７（２０１４）”）。簡略に説明すれば、ＤＴをＰＢＳに溶かした後、血���採取前連続３日間（ｄａｙ−３、ｄａｙ−２およびｄａｙ−１）Ｆｏｘｐ３ＤＴＲまたはＦｏｘｐ３ＤＴＲ−ＧＦＰマウスに適切な容量（５０μｇ／ｋｇ）２００μｌをｉ．ｐ．注射した後、前記ＤＴ処理マウスの血液または腫瘍からＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ＋樹状細胞（ＤＣ）を分離し、下記試験に使用した。
【００１７】
２．マウス細胞株および人間ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌｓの準備
ＥＬ４（Ｃ５７ＢＬ／６  ｍｏｕｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、ＥＧ７（ＯＶＡ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＥＬ４）、Ｂ１６／Ｆ１０（Ｃ５７ＢＬ／６  ｍｏｕｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｋｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ）、２６６−６（Ｃ５７ＢＬ／６  ｍｏｕｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｃｉｎａｒ  ｃｅｌｌ  ｔｕｍｏｒ）、ＣＴ２６（ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｏｕｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、４Ｔ−１（ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｏｕｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｍｍａｒｙ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、およびＲＥＮＣＡ（ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｏｕｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｒｅｎａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。三星医療院ＩＲＢ（＃ＳＭＣ  ２０１６−０４−０５７）の承認を受けたプロトコルによって悪性腫瘍患者（膠芽腫（ＧＢＭ、ｓｔａｇｅｓ  ３および４）、結腸癌（ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ；ＣＣ、ｓｔａｇｅ  ２（ＣＣ２）、３（ＣＣ３）および４（ＣＣ４））および胃癌（ＧＣ、ｓｔａｇｅ  ２（ＧＣ２）、３（ＧＣ３）および４（ＧＣ４））と健康な寄贈者からヒト末梢血単核細胞（Ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ；ｈＰＢＭＣｓ）を採取した。
【００１８】
３．マウス腫瘍モデルの準備
野生型（ｗｔ）マウス（Ｃ５７ＢＬ６、ＢＡＬＢ／ｃ）および遺伝的変形マウス［Ｃ５７ＢＬ６−Ｆｏｘｐ３ＧＦＰ、Ｃ５７ＢＬ６−Ｆｏｘｐ３ＤＴＲ、Ｃ５７ＢＬ６−Ｆｏｘｐ３ｃＫＯ（Ｆｏｘｐ３ｆｌ／ｆｌｘＣＤ１１ｃ−ｃｒｅ）］の右側横腹部位にＥＬ４／ＥＧ７、Ｂ１６／Ｆ１０、ＬＬＣ、２６６−６、ＣＴ−２６、４Ｔ−１およびＲＥＮＣＡ細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓの量で注入して、マウス腫瘍モデルを準備した。
【００１９】
３．一次免疫細胞（ｐｒｉｍａｒｙ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ）の分離
Ｆｉｃｏｌｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）およびＰｅｒｃｏｌｌ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）密度勾配遠心分離によって、ＴＢマウスの血液および腫瘍組織からマウスＰＢＭＣｓおよび腫瘍浸潤白血球（ｔｕｍｏｒ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ；ＴＩＬｓ）を分離した。ｌｉｎｅａｇｅ＋（ＣＤ３＋／ＣＤ１４＋／ＣＤ１９＋）細胞の枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）後、ＣＤ１１ｃ−ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してＦｏｘｐ３ＧＦＰマウスのＴＩＬｓまたはＰＢＭＣｓから樹状細胞を分離した。Ｆｏｘｐ３ｃＫＯマウスの腫瘍大きさが小さくて、正常化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）後に単一試験用として５〜１０匹のＴＢ  Ｆｏｘｐ３ｃＫＯマウスから分離したＴＩＬｓをプーリング（ｐｏｏｌｉｎｇ）した（ｐ５／Ｅまたはｐ１０／Ｅと表示）。ＭＤＳＣｓ（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ）ｓｕｂｓｅｔｓをＭＤＳＣ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＴＢ  Ｆｏｘｐ３ＧＦＰマウスまたは対照群Ｆｏｘｐ３ＧＦＰマウスの血液から分離した。Ｆｏｘｐ３＋  ｆｘＤＣｓ、ｃＤＣｓ、ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ、ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇｓ、ＣＴＬＡ４＋／ＣＴＬＡ４−Ｔ−細胞およびＣＣＲ２＋／ＣＣＲ２−細胞はＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭＩＩを使用してＦｏｘｐ３ＧＦＰマウスの血液または腫瘍組織から分離した。全てのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験およびａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＡＴ）試験は分離された細胞の正常化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）後に行った。
【００２０】
４．フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）
表現型分析のために、免疫蛍光染色法を行った。細胞を４℃で２０分間ＦＡＣＳ  ｂｕｆｆｅｒで適切な抗体で染色した。ＦＩＴＣ−標識された抗−マウス抗体［Ｌｙ６ｇ（１Ａ８）、ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）、Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ（Ｍ５／１１４．１５．２）、ＣＤ３（１７Ａ２）およびＢ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）］はＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ−ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）から入手し、抗−マウスＣＤ１４（Ｓａ１４−２）抗体はＢｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手した。ＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）−標識された抗−マウスＦｏｘｐ３抗体（１５０Ｄ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗−マウスｚｂｔｂ４６抗体（Ｕ４−１３７４、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、およびＰＥ−標識された抗−マウス抗体［Ｌｙ６ｃ（ＨＫ１．４）、ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）、ＣＤ３１７（ＢＳＴ２、９２７）、ｋｉ−６７（ＳｏｌＡ１５）およびＣＤ２５（ＰＣ６１．５）］をＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ−ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した。ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５−標識された抗−マウス抗体［ＣＤ１１ｂ、Ｇｒ−１（ＲＢ６−８Ｃ５）、ＣＤ４４（ＩＭ７）、Ｆｏｘｐ３（ＦＪＫ−１６ｓ）、Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ２５（ＰＣ６１．５）］、ＰＥ−Ｃｙ７−標識された抗−マウス抗体［ＣＤ４（ＧＫ１．５）、ＣＤ８ａ（５３−６．７）、Ｆ４／８０（ＢＭ８）、ＣＤ１６／ＣＤ３２（９３）、Ｆｏｘｐ３（ＦＪＫ−１６ｓ）およびＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）］、ＡＰＣ−標識された抗−マウス抗体［ＣＤ３（１７Ａ２）、ＣＤ１４（ＳＡ１４−２）、ＣＤ１９（１Ｄ３／ＣＤ１９）、Ｆｏｘｐ３（ＦＪＫ−１６ｓ）、ＣＣＲ２（４７５３０１）、ＣＴＬＡ４（ＵＣ１０−４Ｂ９）  ａｎｄ  ＣＤ４４（ＩＭ７）］およびＰａｃｉｆｉｃ  ｂｌｕｅ−標識された抗−マウス抗体［ＣＤ４（ＧＫ１．５）、ＣＤ８ａ（５３−６．７）、ＣＤ３（１７Ａ２）およびＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４）］をＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ−ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手した。全ての試料はまた、イソ型対照抗体で染色した。洗浄後、細胞をＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＦＡＣＳ  ＤＩＶＡ  ｓｏｆｔｗａｒｅで分析した。Ｆｏｘｐ３、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ（ＸＭＧ１．２）、ｐｅｒｆｏｒｉｎおよびＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂに対する抗体はＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ−ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手し、製造者プロトコルによって細胞内染色を行った。
【００２１】
５．Ｆｏｘｐ３発現樹状細胞（ｆｘＤＣｓ）に対するＦＡＣＳ  ｇａｔｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙ
ＴＢマウスの腫瘍および血液からマウスＰＢＭＣｓおよびＴＩＬ（ｔｕｍｏｒ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）を分離した。分離された細胞は、適切な抗体を使用して細胞染色バッファー内で染色した。フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）の検出チャンネルによってそれぞれのｇａｔｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙに合うように抗体パネルを最適化して設計し構築した。ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔａｉｎｅｄ  ＵｌｔｒａＣｏｍｐ  ｅＢｅａｄｓ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）または細胞を使用して補正（Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）を行った。全てのチャンネルに対して、陽性細胞および陰性細胞をＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｎｕｓ  Ｏｎｅｃｏｎｔｒｏｌｓ（ＦＭＯｓ）およびＩｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ基準でゲーティングし、Ｆｏｘｐ３＋はＦｏｘｐ３ＧＦＰマウスの場合、ＧＦＰ  ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ  ｃｏｎｔｒｏｌを使用してゲーティングし、ｗｔ  ＴＢマウスの場合、Ｆｏｘｐ３＋細胞の細胞内染色を行った。ＦｘＤＣゲーティングは、次のように行った；ＦＶＤ＋（Ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ）、ＣＤ４５＋、Ｌｉｎｅａｇｅ（ＣＤ３／ＣＤ１９／ＣＤ１４；Ｔ−ｃｅｌｌｓ、Ｂ−ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）−ｎｅｇａｔｉｖｅ、ＣＤ１１ｃ＋、ＭＨＣ  ＩＩ＋およびＦｏｘｐ３＋．ｆｘＤＣｓの全ての表現型パネルは前記のようなｔｈｅ  ｇａｔｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙを通じて行われた。ＦＶＤ：Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ。
【００２２】
６．ＤＣ／Ｔ−細胞の共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）
ＴＢ  Ｆｏｐｘ３ＧＦＰマウスの脾臓からＴ細胞を分離して精製した。ＴＢ  Ｆｏｐｘ３ＧＦＰマウスの脾臓をＲＰＭＩ培地で均質化させ、７０μｍのｎｙｌｏｎ  ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）を通過させた後、ＡＣＫ溶解バッファー（Ｌｏｎｚａ）で処理してＴ細胞を分離した。前記分離されたＴ細胞をマウス  ＣＤ４  ａｎｄ  ＣＤ８  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して精製した後、３７℃で１ｍＭの５，６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ（ＣＦＳＥ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）（ａｔ  １ｍＭ  ｆｏｒ  １０ｍｉｎ）、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ａｔ  １０ｕＭ  ｆｏｒ  １５ｍｉｎ）、または４−ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ  ｓａｌｔ（ＤｉＤ、Ｔｈｅｒｍｏ  ｆｉｓｈｅｒ）（ａｔ  ５ｕＭ  ｆｏｒ  １５ｍｉｎ）で標識した。ＣＦＳＥ／ＣＴＶ−標識されたＴ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体（アルファ−ＣＤ３  １０μｇ／ｍｌ、アルファ−ＣＤ２８  ４μｇ／ｍｌ）と１日間インキュベーティングした後、５×１０５個のＴ細胞をｆｘＤＣｓまたは他のＤＣ  ｓｕｂｓｅｔｓと共に１：５（ＤＣ：Ｔ）の比率で３日間共培養した。細胞増殖は、フローサイトメトリー（参考例４参照）で測定した。ＯＴ−１（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ、ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）Ｔ細胞と共に共培養した場合、脾臓ＯＴ−１  Ｔ細胞はＯＴ−１マウスから準備し、前記のように標識した。追加刺激無く、ＣＦＳＥ−標識された５×１０５ｎａｉｖｅ  ＯＴ−１  Ｔ−細胞をＦｏｘｐ３ＤＴＲ腫瘍マウスから分離してＤＴ−処理した（ｆｘＤＣ−枯渇）ｂＤＣｓ、またはＰＢＳ−処理（ｆｘＤＣ−含有）ｂＤＣ、またはｓｐ−ＤＣｓと共に１：５（ＤＣ：Ｔ）比率で共培養した。
【００２３】
７．ＣＴＬ（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）分析
腫瘍移植後２１日目にＦｏｘｐ３ｆｌ／ｆｌまたはＦｏｘｐ３ｃＫＯＴＢマウスの腫瘍組織から分離したＣＤ８＋  Ｔ−細胞をＣＴＶ−標識された標的細胞（１×１０５  ＥＬ４  ｃｅｌｌｓ）と共に相異なる比率で２４時間共培養した。ＰＩ染色後、前記参考例４を参照してフローサイトメトリーを行ってＣＴＬ活性を分析した。２１日目にＦｏｘｐｆｌ／ｆｌまたはＦｏｘｐ３ｃＫＯＴＢマウスの腫瘍から分離されたｔｕ−ＤＣｓをｓｐｌｅｎｉｃ  ＣＤ８＋  Ｔ−細胞と１：５（ＤＣ：Ｔ）比率で３日間共培養してＣＴＬｓを生成させた後、ＣＴＬ活性を測定した。ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭＩＩを使用してＴＢ  Ｆｏｘｐ３ＧＦＰマウスの腫瘍からＣＴＬＡ４＋またはＣＴＬＡ４−  ＣＤ８＋  Ｔ−細胞を分離し、これらのＣＴＬ活性を調査した。
【００２４】
８．Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＡＴ）試験
ＭＤＳＣ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＴＢ  Ｆｏｘｐ３ＧＦＰマウスの脾臓または血液から分離したＭ−ＭＤＳＣｓ（１×１０６  ｃｅｌｌｓ）を対照群（腫瘍の移植を受けないｔｕｍｏｒ−ｆｒｅｅマウス）またはＴＢマウスに尾静脈を通じて伝達した（Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＡＴ）。ＡＴ３日後、前記ＡＴ受けたマウス（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）でｆｘＤＣを分析した。
ＣＤ８＋  Ｔ細胞のＡＴを行うために、ＣＤ８＋  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してｔｕｍｏｒ−ｆｒｅｅマウスまたはＯＴ−１マウスの脾臓、またはＴＢ  Ｆｏｘｐ３ｆｌ／ｆｌおよびＦｏｘｐ３ｃｋｏマウスの血液または腫瘍組織から細胞を分離した後、前記分離された細胞をＣＴＶ（１０ｕＭ）またはＤｉＤ（１０ｕＭ）で３７℃で１５分間標識し、標識された細胞（１×１０６）を先に説明した方法でマウスに伝達（ＡＴ）した。
統計分析
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  ５．０  ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して行い、Ｐ＜０．０５（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）の場合に有意性があると決定した。全ての試験結果は、少なくとも３つ以上の試料に対して少なくとも３回以上の独立的な試験（３Ｅ）から得た。統計データは、ｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍで示した。
【００２５】
実施例１．腫瘍患者血液内のｆｘＤＣ測定
ＥＬ４  ｌｙｍｐｈｏｍａをマウスに注入して準備されたマウス腫瘍モデル（参考例２参照）で、腫瘍細胞注入後、７日目から３日間隔で眼窩採血（眼球静脈採血）して血液内Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞（ｆｘＤＣまたはＦｏｘｐ３＋  ＤＣと表示）を測定して（参考例４および５参照）、その結果を図１に示した。図１は腫瘍成長の間のＦｏｘｐ３ＧＦＰマウスの血液内のｆｘＤＣ個体群（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）モニタリング結果を示すものであって、ｆｘＤＣは各グループのマウス（ｎ＝３０匹のマウス；３グループ、グループ当り１０匹のマウス）の眼球静脈から採血された血液に対して各時点で評価した。図１に示されているように、腫瘍マウスモデルの血液内のｆｘＤＣが腫瘍成長に比例してその比率が増加することが分かる。
また、健康な供与者（ｈｅａｌｔｈｙ  ｄｏｎｏｒｓ；ＨＤ）および癌患者（膠芽腫（ＧＢＭ、ｓｔａｇｅｓ  ３および４）、大腸癌（Ｃｏｌｏｒｅｃｔａ  ｃａｎｃｅｒ；ＣＣ、ｓｔａｇｅ２（ＣＣ２）、３（ＣＣ３）および４（ＣＣ４））および胃癌（ＧＣ、ｓｔａｇｅ２（ＧＣ２）、３（ＧＣ３）および４（ＧＣ４））（参考例２参照）の血液内のＤＣ（ｂ（ｂｌｏｏｄ）−ＤＣ）中のｆｘＤＣを測定して（参考例４および５参照）、その結果を図２ａに示した。図２ａに示されているように、マウス腫瘍モデルと同様に、人間癌患者の血液でも癌進行程度によってｆｘＤＣ分布が比例して増加することを確認した。
また先に説明した方法で多様な腫瘍（ＥＬ４；リンパ腫瘍、ＬＬＣ；ルイス肺癌、２６６−６；すい臓癌、ＣＴ−２６；大腸癌、４Ｔ−１；乳癌）が移植された５−７匹の腫瘍マウスを作り、血液内のｆｘＤＣ分布を調査して、その結果を図２ｂに示した。図２ｂに示されているように、腫瘍マウス血液でｆｘＤＣが多量発見された。
【００２６】
実施例２．ｆｘＤＣ阻害による腫瘍成長阻害試験
ｆｘＤＣが腫瘍成長に与える影響を試験するために、まず、樹状細胞特異的にＦｏｘｐ３発現を除去したマウス（ＣＤ１１ｃ−Ｃｒｅ  ｘ  Ｆｏｘｐ３ｆｌ／ｆｌ：以下、Ｆｏｘｐ３ｃＫＯマウス）を製作して（参考例１参照）、ここに腫瘍細胞を投与して腫瘍マウスを作った後、血液内のｆｘＤＣを測定した（参考例４および５参照）。前記得られた結果を図３に示した。図３のように、Ｆｏｘｐ３ｃＫＯマウスの血液からｆｘＤＣが除去されるのを確認することができる。
野生型マウス（Ｆｏｘｐ３ｆｌ／ｆｌ；Ｆｏｘｐ３が除去（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）されないＴＢマウス）とＦｏｘｐ３ｃＫＯマウスにＥＬ４  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ（５×１０５  ｃｅｌｌｓ）を注入し、７日後から３日間隔で腫瘍成長をモニタリングした結果を図４に示した。図４の左側は腫瘍体積変化を示すグラフであり、右側は腫瘍移植後２３日目の腫瘍重量を示すグラフである。図４に示されているように、野生型マウス（Ｆｏｘｐ３ｆｌ／ｆｌ）では腫瘍大きさが持続的に増加する反面、ｆｘＤＣが除去されたＦｏｘｐ３ｃＫＯマウス（ｆｘＤＣ除去は図３の結果参照）では１７日まで腫瘍が小幅成長し３０日以後は完全に無くなるのを確認することができる。このような結果は、樹状細胞特異的にＦｏｘｐ３を除去するかｆｘＤＣを除去することによって、腫瘍治療効果を得ることができるのを示す。
前記図４で腫瘍成長が抑制されたと確認されたＦｏｘｐ３ｃＫＯマウスの腫瘍注入後、１７日目の腫瘍組織内ｆｘＤＣ分布を測定して（参考例４および５参照）、図５に示した。図５に示されているように、実際に腫瘍成長が抑制されたＦｏｘｐ３ｃＫＯマウスでｆｘＤＣが大部分無くなるのを確認することができる。
また、ＥＬ４  ｌｙｍｐｈｏｍａだけでなく、多様な固形癌（２６６−６：ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ、ＬＬＣ：Ｌｅｗｉｓ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＥＧ７：ＯＶＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＥＬ４  ｌｙｍｐｈｏｍａ）に対して同一な試験を行って腫瘍体積を測定して図６に示した。図６に示されているように、ＥＬ４  ｌｙｍｐｈｏｍａだけでなく、多様な固形癌でも、ＥＬ４  ｌｙｍｐｈｏｍａの場合と同様に、ｆｘＤＣが除去されたマウスでの腫瘍抑制効果が野生型マウスより顕著に優れていることが分かった。
【００２７】
実施例３．ｆｘＤＣ阻害によるＣＤ８＋  Ｔ細胞増加および腫瘍細胞に対する細胞毒性増加試験
ＣＤ８＋  Ｔ（Ｔｃ１）細胞は実際Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙに重要な役割を果たす細胞であって、直接的に腫瘍細胞の死滅を誘導する（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ＣＤ８＋Ｔ−ｃｅｌｌ）。ｆｘＤＣが除去されたＦｏｘｐ３ｃＫＯマウスで腫瘍内のＣＤ８＋  Ｔ細胞の比率が約３５．６％であって、野生型マウス（Ｆｏｘｐ３ｆｌ／ｆｌ）でのＣＤ８＋  Ｔ細胞の比率（約１６．３％）より大きく増加したことを確認した。ｆｘＤＣが除去されたＦｏｘｐ３ｃＫＯマウス腫瘍組織でのＣＤ８＋  Ｔ細胞中でＩＦＮ−ｇａｍｍａを発現するＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＦＮ−ｇａｍｍａ＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞；ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ＣＤ８＋  Ｔ−細胞）の比率を測定して図７に示した。図７に示されているように、野生型マウス（Ｆｏｘｐ３ｆｌ／ｆｌ）と比較して、ｆｘＤＣが除去されたＦｏｘｐ３ｃＫＯマウスでｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ＣＤ８＋Ｔ−細胞の比率が約２．５倍増加されていることを確認した。このような結果は、ｆｘＤＣによるｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ＣＤ８＋Ｔ−細胞の調節効果（ｆｘＤＣ除去によってｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ＣＤ８＋Ｔ−細胞が上向調節される）を提案する。
腫瘍組織内ＣＤ８＋  Ｔ細胞が直接的に腫瘍の増殖抑制（腫瘍細胞の死滅）を誘導するか確認するために、野生型マウス（Ｆｏｘｐ３ｆｌ／ｆｌ）とｆｘＤＣが除去されたＦｏｘｐ３ｃＫＯマウスの腫瘍組織内ＣＤ８＋  Ｔ細胞を分離した後、腫瘍細胞と共培養して、腫瘍細胞に対する細胞毒性効果を測定した。細胞毒性は、ＣＴＬ（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）の活性試験（参考例７参照）で測定した。前記得られた結果を図８に示した。図８のように、Ｆｏｘｐ３ｃＫＯマウスから分離したＣＤ８＋  Ｔ細胞が野生型マウスのＣＤ８＋  Ｔ細胞より腫瘍細胞に対する細胞毒性が顕著に高いことが分かり、このような結果は、Ｆｏｘｐ３の除去（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）によってＣＤ８＋  Ｔ細胞生成が誘導され、これを通じて腫瘍細胞の死滅率が増加して腫瘍抑制効果が得られるのを示す。
ｆｘＤＣ除去マウスのＣＤ８＋  Ｔ−細胞によるＣＴＬ活性（細胞毒性）が向上される機序を確認するために、多様な細胞表面免疫活性／抑制分子の発現を調査した。この中で、ｆｘＤＣが除去されたＴＢマウスの腫瘍組織のＣＤ８＋  Ｔ細胞でのＣＴＬＡ４（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ４）発現水準を野生型マウス（ＴＢ）と比較して図９に示した。図９に示されているように、ｆｘＤＣが除去されたＴＢマウスの腫瘍組織のＣＤ８＋  Ｔ細胞でＣＴＬＡ４発現水準（約８．９２％）が野生型ＴＢマウスでのＣＴＬＡ４発現水準（約７９．５％）と比較して大きく減少することを確認した。
ｆｘＤＣがＣＤ８＋  Ｔ細胞のＣＴＬＡ４発現を調節する機作を確認するために、正常マウス（腫瘍が移植されない）のＣＤ８＋  Ｔ細胞（Ｄｏｎｏｒ  Ｔ細胞：ＤｉＤ  ｓｔａｉｎｅｄ）を腫瘍が移植された野生型マウスとＦｏｘｐ３ｃＫＯマウスにそれぞれ尾静脈を通じてａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＡＴ）（参考例８参照）した後、３日後に、腫瘍組織内Ｄｏｎｏｒ  Ｔ細胞（ＤｉＤ＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞）中でＣＴＬＡ４発現ＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＣＴＬＡ４＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞）を測定して、その結果を図１０に示した。図１０に示されているように、ｆｘＤＣが除去されたマウスではＤｏｎｏｒ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞でＣＴＬＡ４発現が大きく減少されるのを確認することができる。
ＣＤ８＋  Ｔ細胞でのＣＴＬＡ４発現が抗癌免疫の核心になるＣＴＬ反応（腫瘍細胞に対する細胞毒性）を調節するか確認するために、ＥＬ４  ＴＢマウスのＥＬ４腫瘍からＣＴＬＡ４＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞とＣＴＬＡ４−  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を分離した後、腫瘍細胞（ＥＬ４）を標的細胞にしてＣＴＬ活性を試験して、その結果を図１１に示した。図１１に示されているように、ＣＴＬＡ４を発現するＣＴＬＡ４＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞はＣＴＬＡ４を発現しないＣＴＬＡ４−  ＣＤ８＋  Ｔ細胞よりＣＴＬ活性が顕著に減少するのを確認することができる。
前記結果は、腫瘍および腫瘍環境によって誘導されるｆｘＤＣが腫瘍内ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇを誘導し（下記実施例５参照）、この細胞が腫瘍を除去するために寄り集まるＣＴＬの活性を抑制して腫瘍の持続的な成長に関与し、ｆｘＤＣを除去する場合、ＣＴＬ活性を抑制するＣＴＬＡ４発現が減少し腫瘍特異的ＣＴＬ活性が抑制されなくて効果的な抗癌免疫を誘導することによって腫瘍成長を顕著に阻害することができるのを示す。したがって、腫瘍患者からｆｘＤＣを除去すれば、効果的な抗癌免疫を誘導して優れた癌成長抑制効果および／または癌治療効果を得ることができると期待される。
前記結果は、ｆｘＤＣによって誘導されるＣＤ８＋  ＴｒｅｇがＴ細胞増殖を抑制し抗癌免疫を主管するＣＴＬ活性を減少させるのを示すものであって、ｆｘＤＣの除去によってＴ細胞免疫および／または抗癌免疫が強化できるのを提案する。
【００２８】
実施例４．ｆｘＤＣとＣＤ８＋  Ｔ細胞との共培養によるＣＤ８＋  Ｔｒｅｇの製造
野生型正常マウスにＥＬ４腫瘍細胞を５×１０５ｃｅｌｌの量でｓ．ｃ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎした。１４日後、前記マウスの血液からＰＢＭＣを分離した後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．＃１７−５４４２−０２）１ｍｌを１５ｍｌ  ｃｏｎｉｃａｌ  ｔｕｂｅ（Ｈｙｕｎｄａｉ  ｍｉｃｒｏ、Ｃａｔ．＃Ｈ２００５０）に満たし、同量の血液またはｂｕｄｄｙ  ｃｏａｔをＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ｔｕｂｅに混ざらないようにｏｖｅｒｌａｙさせた。多目的遠心分離機（Ｇｙｒｏｚｅｎ、Ｃａｔ．＃１５８０ＭＧＲ）の加速力を１、減速力（ＤＣＣ）を０と設定し、２５００ｒｐｍで３０分間濃度勾配遠心分離を施行した。遠心分離後、最上層の血漿と中間の単核球層を分離し、分離された単核球からＣＤ１１ｃ−Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓを使用してＣＤ１１ｃ＋樹状細胞を分離した。
正常マウスの脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）を摘出した後、ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒを使用して単一細胞に分離し、ＲＢＣ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを使用して前記分離された単一細胞から全ての赤血球を除去した後、Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓを使用してＣＤ８＋  Ｔ細胞を分離した。分離されたＣＤ８＋  Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングされた９６ウェルプレート（Ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に２．５×１０５  ｃｅｌｌずつ分注した。
前記ＣＤ８＋  Ｔ細胞が含まれている９６ウェルプレート（ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に先に血液から分離された樹状細胞を分注してＣＤ８＋  Ｔ細胞と３日間共培養した後、ＣＤ８＋  Ｔ細胞を回収して以下の実施例５および実施例６分離および分析に用いた。
前記のようにｆｘＤＣとＣＤ８＋  Ｔ細胞の共培養によってＣＤ８＋  Ｔｒｅｇが誘導されるのを確認するために、Ｆｏｘｐ３ＧＦＰ  ＴＢマウスから分離して抗−ＣＤ３／２８抗体で予備活性化（ｐｒｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）させたＣＴＶ−標識ＣＤ８＋  Ｔ細胞をＦｏｘｐ３ＧＦＰ  ＴＢマウスの血液から分離したＤＣと共培養し、Ｆｏｘｐ３＋  ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ分布を測定した。前記結果を図１２に示し、前記結果からｆｘＤＣとＣＤ８＋  Ｔ細胞の共培養によってＣＤ８＋  Ｔｒｅｇが誘導されるのを確認することができる。
【００２９】
実施例５．ｆｘＤＣによるＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ誘導試験
ｆｘＤＣによってＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ（ＣＤ８＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ）が誘導されるかどうかを試験するために、脾臓ＤＣ（ｓｐＤＣ）またはｆｘＤＣが含まれている血液ＤＣ（ｂＤＣ）とｆｘＤＣが除去された血液ＤＣ（Ｆｏｘｐ３−ＤＴＲマウスにＤｉｐｈｔｈｅｒｉａ  Ｔｏｘｉｎ（ＤＴ）を処理すれば、標的細胞が除去される；ｆｘＤＣ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ（ＤＴ−ｔｒｅａｔｅｄ）ｂＤＣｓ（ｂＤＣ／ＤＴ））と抗−ＣＤ３／２８抗体で予め活性化（ｐｒｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）させたＴ細胞を共培養して、全体Ｔ細胞に対するＦｏｘｐ３＋  ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞比率を測定して、図１３に示した。図１３に示されているように、ｆｘＤＣが除去された血液ＤＣはＣＤ８＋  Ｔｒｅｇを全く誘導しないのを確認することができる。
ｆｘＤＣによって誘導されるＣＤ８＋  Ｔｒｅｇが腫瘍成長といかなる関連性があるか試験するために、ＥＬ４細胞を２７匹のＦｏｘｐ３ＧＦＰマウスに同時接種してＴＢマウスを製作した後、一日に一匹ずつ犠牲にして分析した。前記ＴＢマウスの血液内のｆｘＤＣおよびＣＤ８＋  Ｔｒｅｇを測定して、血液ＤＣ中のｆｘＤＣ比率（％）をｘ軸にし、血液内のＣＤ８＋  Ｔｒｅｇの比率（％  ｏｆ  ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇｓ／ＣＤ８＋  Ｔ−ｃｅｌｌ）をｙ軸にして、図１４に示した。図１４に示されているように、ＴＢマウスの血液で腫瘍成長によって増加するｆｘＤＣと比例してＣＤ８＋  Ｔｒｅｇが増加するのを確認した。
ｆｘＤＣが除去されたマウスで腫瘍が成長して一定時間後に無くなる結果（図４参照）を基礎にして、Ｆｏｘｐ３ｃＫＯＴＢマウスと野生型ＴＢマウスの腫瘍組織でのＦｏｘｐ３＋  ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔｒｅｇの分布を測定して図１５に示した。図１５に示されているように、ｆｘＤＣが除去されたマウスの腫瘍組織でＣＤ８＋  Ｔｒｅｇが野生型マウスに比べて大きく減少する反面、ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞はｆｘＤＣ存在有無による影響を受けないのを確認した。
【００３０】
実施例６．ＣＤ８＋  ＴｒｅｇのＴ細胞増殖抑制および腫瘍増殖促進効果試験
ｆｘＤＣによって誘導されるＣＤ８＋  ＴｒｅｇのＴ細胞免疫および抗癌免疫に及ぼす効果を試験するために、脾臓ＣＤ８＋  Ｔ−細胞を抗−ＣＤ３／２８抗体で刺激した後、Ｆｏｘｐ３ＧＦＰＴＢマウスの腫瘍から分離した腫瘍−ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ（ｔｕ−ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ）細胞および腫瘍−ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ（ｔｕ−ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ）細胞と共に３日間共培養した後、ＣＤ８＋  Ｔ細胞増殖程度およびＩＦＮ−ｇａｍｍａ＋細胞を測定した（参考例５および６参照）。
図１６はＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ（ｔｕ−ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ）細胞およびＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ（ｔｕ−ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ）細胞の増殖を測定した結果を示すものであって、抗−ＣＤ３／２８抗体が処理された（ｐｒｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）Ｔ細胞とＣＤ８＋／ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞の共培養時、ＣＤ８＋  ＴｒｅｇがＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞より高い水準にＴ細胞増殖を抑制するのを示す。
図１７は抗−ＣＤ３／２８抗体が処理された（ｐｒｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）Ｔ細胞とＣＤ８＋／ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞の共培養時、ＩＦＮ−ｇａｍｍａ＋  Ｔ細胞水準を示す結果であって、抗−ＣＤ３／２８抗体が処理された（ｐｒｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）Ｔ細胞とＣＤ８＋／ＣＤ４＋  Ｔｒｅｇ細胞の共培養時、ＩＦＮ−ｇａｍｍａを発現するＣＴＬ（ＣＤ８＋  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ＋  Ｔ細胞）の水準が大きく減少するのを示す。
前述の実施例で確認されたように、ＣＴＬＡ４＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞でＣＴＬ活性が無くなる（図１０参照）。よって、ＣＤ８＋  ＴｒｅｇがＣＴＬＡ４＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を直接的に誘導するかどうかを試験した。このために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｆｘＤＣによって誘導されたＣＤ８＋  Ｔｒｅｇを正常マウスのＣＤ８＋  Ｔ細胞と共培養した後、ＣＴＬＡ４＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞水準を測定した。より具体的に、野生型（正常）マウスから分離されたＣＤ８＋  Ｔ−細胞を抗−ＣＤ３／２８抗体で刺激した後、Ｆｏｘｐ３ｆ／ｆおよびＦｏｘｐ３ｃＫＯＴＢマウス腫瘍から分離したｔｕ−ＤＣと共に３日間共培養した後、ｔｕ−ＤＣ誘導ＣＤ８＋  Ｔ細胞を精製し、ＤｉＤ−標識された野生型ＣＤ８＋  Ｔ−細胞と共に３日間共培養した後、ＣＤ８＋  Ｔ−細胞内のＣＴＬＡ−４発現を測定した。前記得られた結果を図１８に示した。図１８に示されているように、Ｆｏｘｐ３ｃＫＯＴＢマウスでのＣＴＬＡ４＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞水準が野生型ＴＢマウスと比較して顕著に減少するのを確認することができる。このような結果は、ｆｘＤＣによって誘導されたＣＤ８＋  Ｔｒｅｇが直接的にＣＴＬＡ４＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を誘導するのを示す。
野生型ＣＤ８＋  Ｔ細胞をＤｉＤで標識し、抗−ＣＤ３／２８抗体で刺激した後、Ｆｏｘｐ３ＤＴＲ  ＴＢマウスの腫瘍から分離されたＤＴ−処理ｔｕ−ＣＤ８＋  Ｔ−細胞（ＣＤ８  Ｔｒｅｇ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ）またはＰＢＳ−処理ｔｕ−ＣＤ８＋  Ｔ−細胞と共に３日間共培養した後、ＣＴＬＡ４＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞水準を測定して図１９に示した。図１９に示されているように、ＤＴ−処理によってＣＤ８＋  Ｔｒｅｇを全て除去した場合、ＣＴＬＡ４＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞が全く誘導されないのを確認した。
前記結果を総合すれば、ｆｘＤＣによって誘導されるＣＤ８＋  Ｔｒｅｇは癌細胞を直接攻撃するＣＴＬでのＣＴＬＡ４発現を誘導してＣＴＬ活性を抑制するのを確認することができ、このような結果から、ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇを除去することによって抗癌免疫を強化させてより効果的な癌治療が可能になるのを示唆し、抗癌剤開発においてＣＤ８＋  Ｔｒｅｇの抗癌治療ターゲットとしての有用性を提供する。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年11月13日(2019.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤を含む、癌治療用薬学組成物。
【請求項２】
前記Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤は、抗体、細胞毒性薬物（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇｓ）、抗体−細胞毒性薬物接合体、および抗体−磁性粒子（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ）からなる群より選択された１種以上の阻害剤、または前記阻害剤を含むナノ伝達体（ｎａｎｏ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）の形態である、請求項１に記載の癌治療用薬学組成物。
【請求項３】
前記組成物は、その腫瘍組織または血液から、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞が検出される癌患者に投与するために使用される、請求項１または２に記載の癌治療用薬学組成物。
【請求項４】
Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤を含む、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞阻害用薬学組成物。
【請求項５】
前記Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤は、抗体、細胞毒性薬物（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇｓ）、抗体−細胞毒性薬物接合体、および抗体−磁性粒子からなる群より選択された１種以上の阻害剤、または前記阻害剤を含むナノ伝達体の形態である、請求項４に記載のＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞阻害用薬学組成物。
【請求項６】
前記組成物は、その腫瘍組織または血液から、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞が検出された癌患者に投与するために使用される、請求項４または５に記載のＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞阻害用薬学組成物。
【請求項７】
ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の阻害剤を、癌治療用の有効性分として含む、薬学組成物。
【請求項８】
前記ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞の阻害剤は、抗体、細胞毒性薬物（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇｓ）、抗体−細胞毒性薬物接合体、および抗体−磁性粒子からなる群より選択された１種以上の阻害剤、または前記阻害剤を含むナノ伝達体の形態である、請求項７に記載の癌治療用薬学組成物。
【請求項９】
前記組成物は、その腫瘍組織または血液から、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞が検出される癌患者に投与するために使用される、請求項７または８に記載の癌治療用薬学組成物。
【請求項１０】
Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤を、必要とする患者に投与する段階を含む、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞を阻害する方法。
【請求項１１】
前記Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞の阻害剤は、抗体、細胞毒性薬物（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇｓ）、抗体−細胞毒性薬物接合体、および抗体−磁性粒子からなる群より選択された１種以上の阻害剤、または前記阻害剤を含むナノ伝達体の形態である、請求項１０に記載のＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞を阻害する方法。
【請求項１２】
前記患者は、その腫瘍組織または血液から、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞が検出される癌患者である、請求項１０に記載のＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞を阻害する方法。
【請求項１３】
候補化合物を、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞、またはこれらの両方と接触させる段階；
Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞、またはこれらの両方の水準を測定する段階；および
前記測定されたＦｏｘｐ３を発現する樹状細胞、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞、またはこれら両方の水準を、前記候補化合物での処理前に測定された水準と比較して減少した場合に、前記候補化合物を抗癌剤候補物質と決定する段階
を含む、抗癌剤のスクリーニング方法。
【請求項１４】
Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞とＣＤ８を発現するＴ細胞と共に培養する段階を含む、ＣＤ８＋  Ｔｒｅｇ細胞の製造方法。
【請求項１５】
患者から分離された生物学的試料から、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞、ＣＤ８を発現する調節Ｔ細胞、またはこれらの両方を検出する段階を含む、癌診断または癌予後確認のために情報を提供する方法。
【請求項１６】
患者から分離された生物学的試料から、Ｆｏｘｐ３を発現する樹状細胞を検出する段階を含む、抗癌治療の有効性のモニタリングに情報を提供する方法。
【国際調査報告】
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