(57)【要約】  本発明は、ＤＮＡアセンブリで使用するための核酸に関し、該核酸は少なくとも１つのメチル化保護可能な制限要素を含み、該メチル化保護可能な制限要素は：認識配列の外側で開裂する制限酵素によって認識される制限酵素認識配列と、ＤＮＡメチラーゼ認識配列とを含み、該制限酵素認識配列及びＤＮＡメチラーゼ認識配列は、ＤＮＡメチラーゼにより修飾された塩基が制限酵素認識配列内にあるようにオーバーラップしており、該ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、制限酵素認識配列と同一ではなく、又は制限酵素認識配列に囲まれておらず、該ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、制限酵素により生成されるオーバーハング末端配列を形成し得る配列とオーバーラップしない。本発明は更に、関連する方法及びキットに関する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡアセンブリで使用するための核酸であって、
前記核酸が、少なくとも１つのメチル化保護可能な制限要素を含み、前記メチル化保護可能な制限要素は：
−認識配列の外側を開裂する制限酵素によって認識される制限酵素認識配列；及び
−ＤＮＡメチラーゼ認識配列
を含み、
前記制限酵素認識配列及び前記ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、ＤＮＡメチラーゼにより修飾された塩基が前記制限酵素認識配列内にあるようにオーバーラップしており、
前記ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、前記制限酵素認識配列と同一ではなく、又は前記制限酵素認識配列に囲まれておらず、
前記ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、前記制限酵素により生成されるオーバーハング末端配列を形成し得る配列とオーバーラップしない、
ＤＮＡアセンブリで使用するための核酸。
【請求項２】
その認識配列の外側で切断する前記制限酵素がＩＩＳ型制限酵素である、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記核酸が少なくとも２つのメチル化保護可能な制限要素を含む、請求項１又は請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
前記核酸が、２つのメチル化保護可能な制限要素の切断部位の間に廃棄配列である核酸配列を含む、又は
前記核酸が各末端にメチル化保護可能な制限要素を有する直線化されたベクターである、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
前記廃棄配列が、選択マーカー、レポーター遺伝子、又は標識を含む、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
前記メチル化保護可能な制限要素の切断部位の反対側に、対向する保護不可能な制限酵素認識配列が提供される、請求項１に記載の核酸。
【請求項７】
前記対向する保護不可能な制限酵素認識配列が、その認識配列の外側で開裂する制限酵素、任意にＩＩＳ型制限酵素によって認識される、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
前記対向する保護不可能な制限酵素認識配列が、メチル化によって、保護されていない若しくは保護されるように配置されていない、又は前記メチル化保護可能な制限要素のメチラーゼ認識配列を認識するメチラーゼからのメチル化によって保護可能ではない可能性がある、請求項６に記載の核酸。
【請求項９】
前記メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列が、対向する保護不可能な制限酵素認識配列と同じ制限酵素種によって認識される、請求項６〜８のいずれかに記載の核酸。
【請求項１０】
前記メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列が、対向する保護不可能な制限酵素認識配列と同じ配列を含む又はそれからなる、請求項６〜９のいずれかに記載の核酸。
【請求項１１】
前記核酸が維持された複合要素を含み、前記対向する保護不可能な制限酵素認識配列が、同じオーバーハング／粘着末端が産生されるように、メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列と同じ部位で前記核酸を切断することを前記制限酵素に指示するように配置される、請求項６〜１０のいずれかに記載の核酸。
【請求項１２】
前記維持された複合要素から産生された前記オーバーハングが、前記対向する制限認識配列間の配列によって予め決定されている、請求項１１のいずれかに記載の核酸。
【請求項１３】
前記核酸が短縮複合要素を含み、前記対向する保護不可能な制限酵素認識配列が、前記メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列を認識する制限酵素の切断部位とオーバーラップしない部位で前記核酸を切断することを前記制限酵素に指示するように配置される、請求項６〜１２のいずれかに記載の核酸。
【請求項１４】
前記短縮複合要素中の対向する保護不可能な制限酵素認識配列の切断部位が、前記メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列の認識配列内、及び／又は前記メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列の切断部位と認識配列との間のヌクレオチド内にある、請求項１３に記載の核酸
【請求項１５】
前記核酸が挿入複合要素を含み、機能性配列インサートが前記メチル化保護可能な制限要素及び前記対向する保護不可能な制限酵素認識配列との間に提供される、請求項６〜１４のいずれかに記載の核酸。
【請求項１６】
前記核酸が、その間に廃棄配列を有する２つの維持された複合要素、又は廃棄配列が切り取られたその直線化バージョンを含む、請求項１１〜１４のいずれかに記載の核酸。
【請求項１７】
前記核酸が、維持された複合要素と、その間に廃棄配列を有する短縮複合要素若しくは前記廃棄配列が切り取られたその直線化バージョンとを含む、又は
前記核酸が、その間に廃棄配列を有する２つの短縮複合要素、若しくは前記廃棄配列が切り取られたその直線化バージョンを含む、請求項１３〜１４のいずれかに記載の核酸。
【請求項１８】
前記核酸が、挿入複合要素と、その間に廃棄配列を有する短縮複合要素、若しくは前記廃棄配列が切り取られたその直線化バージョンを含む、又は
前記核酸が、挿入複合要素と、その間に廃棄配列を有する維持された複合要素、若しくは前記廃棄配列が切り取られたその直線化バージョンを含む、又は
前記核酸が、その間に廃棄配列を有する２つの挿入複合要素を含む、若しくは前記廃棄配列が切り取られたその直線化バージョンを含む、
請求項１５に記載の核酸。
【請求項１９】
前記メチラーゼが、ＩＩ型ＤＮＡメチラーゼ又はＩ型ＤＮＡメチラーゼを含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の核酸。
【請求項２０】
各メチル化保護可能な制限要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列が同じメチラーゼによって認識される、請求項１〜１９のいずれかに記載の核酸。
【請求項２１】
前記核酸中の２つ以上のメチル化保護可能な制限要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列が、同じ配列を含む、又はそれからなる、請求項１〜２０のいずれかに記載の核酸。
【請求項２２】
前記メチル化保護可能な制限要素が、本明細書の表３で特定されるオーバーラップするメチル化／制限部位のいずれか１つによる配列を含む、又はそれからなる、請求項１〜２１のいずれかに記載の核酸
【請求項２３】
前記メチル化保護可能な制限要素が、配列ＧＡＣＮＮＧＧＴＣＴＣＮＮＮＮＮ（ＢｓａＩ／Ｍ．Ｏｓｐ８０７ＩＩ−配列番号：１）、若しくはＧＡＡＧＡＣＧＣＮＮＮＮＮＮ（ＢｐｉＩ／Ｍ２．ＮｍｅＭＣ５８ＩＩ−配列番号２）、若しくはＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＮＮＮＮ（ＬｇｕＩ／Ｍ．ＸｍｎＩ−配列番号３）を含む、又はそれからなる、請求項１〜２２のいずれかに記載の核酸。
【請求項２４】
前記メチル化保護可能及び／又は保護不可能な制限酵素認識配列が、本明細書の表３で特定される制限酵素認識配列のいずれか１つによる配列を含む、又はそれからなる、請求項１〜２３のいずれかに記載の核酸。
【請求項２５】
前記メチル化保護可能及び／又は保護不可能な制限酵素認識配列が、ＧＧＴＣＴＣ（ＢｓａＩ−配列番号４）、又はＧＡＡＧＡＣ（ＢｐｉＩ−配列番号５）、又はＧＣＴＣＴＴＣ（ＬｇｕＩ−配列番号６）を含む、又はそれからなる、請求項１〜２４のいずれかに記載の核酸。
【請求項２６】
前記ＤＮＡメチラーゼ認識配列が、本明細書の表３で特定されるＩＩ型ＤＮＡメチラーゼ認識配列のいずれか１つによる配列を含む、又はそれからなる、請求項１〜２５のいずれかに記載の核酸。
【請求項２７】
前記ＤＮＡメチラーゼ認識配列が、ＧＡＣＮＮＮＧＴＣ（Ｍ．Ｏｓｐ８０７ＩＩ−配列番号７）、もしくはＧＡＣＧＣ（Ｍ２．ＮｍｅＭＣ５８ＩＩ−配列番号８）、若しくは（Ｍ．ＸｍｎＩ−配列番号：９）を含む、又はそれからなる、請求項１〜２６のいずれかに記載の核酸。
【請求項２８】
前記メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列及び／又は前記対向する制限酵素認識配列を認識する制限酵素が、少なくとも２ｂｐのオーバーハング／粘着末端を残すように核酸を切断することが可能な、請求項１〜２７のいずれかに記載の核酸。
【請求項２９】
前記制限酵素及び前記ＤＮＡメチラーゼが、本明細書の表３で特定されるＩＩＳ型制限酵素及びＩＩ型ＤＮＡメチラーゼのいずれか１つの対を含む、又はそれからなる、請求項１〜２８のいずれかに記載の核酸。
【請求項３０】
前記核酸が、
ＧＡＣＮＮＧＧＴＣＴＣＮＮＮＮＮＮＧＡＧＡＣＣ（配列番号１０）；
ＧＡＡＧＡＣＧＣＮＮＮＮＮＮＧＴＣＴＴＣ（配列番号１１）；
ＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＮＮＮＮＮＧＡＡＧＡＧＣ（配列番号１２）；
ＧＡＣＮＮＧＧＴＣＴＣＮＮＮＮＮＮＧＡＧＡＣＣ（Ｎｘ）ＧＧＴＣＴＣＮＮＮＮＮＮＧＡＧＡＣＣＮＮＧＴＣ（配列番号１３）；
ＧＡＡＧＡＣＧＣＮＮＮＮＮＮＧＴＣＴＴＣ（Ｎｘ）ＧＡＡＧＡＣＮＮＮＮＮＮＧＣＧＣＣＴＴＣ（配列番号１４）；
ＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＮＮＮＮＮＧＡＡＧＡＧＣ（Ｎｘ）ＧＣＴＣＴＴＣＮＮＮＮＮＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣ（配列番号１５）；
ＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＮＮＮＮＮＧＡＡＧＡＧＣＴＣＴＴＣＮＮＮＮＮＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣ（配列番号１６）；
ＧＡＣＮＮＧＧＴＣＴＣＮＮＧＡＧＡＣＣ（配列番号１７）；
ＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＮＮＧＡＡＧＡＧＣ（配列番号１８）；
ＧＡＣＮＮＧＧＴＣＴＣＮＮＮＮＮＮＧＡＧＡＣＣ（Ｎｘ）ＧＧＴＣＴＣＮＮＧＡＧＡＣＣＮＮＧＴＣ（配列番号１９）；
ＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＮＮＮＮＮＧＡＡＧＡＧＣ（Ｎｘ）ＧＣＴＣＴＴＣＮＮＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣ（配列番号２０）；
ＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＮＮＮＮＮＧＡＡＧＡＧＣＴＣＴＴＣＮＮＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣ（配列番号２１）；
ＧＡＣＮＮＧＧＴＣＴＣＮＮＧＡＧＡＣＣ（Ｎｘ）ＧＧＴＣＴＣＮＮＮＮＮＮＧＡＧＡＣＣＮＮＧＴＣ（配列番号２２）；
ＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＮＮＧＡＡＧＡＧＣ（Ｎｘ）ＧＣＴＣＴＴＣＮＮＮＮＮＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣ（配列番号２３）；
ＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＮＮＧＡＡＧＡＧＣＴＣＴＴＣＮＮＮＮＮＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣ（配列番号２４）；
ＧＡＣＮＮＧＧＴＣＴＣＮＮＧＡＧＡＣＣ（Ｎｘ）ＧＧＴＣＴＣＮＮＧＡＧＡＣＣＮＮＧＴＣ（配列番号２５）；
ＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＮＮＧＡＡＧＡＧＣ（Ｎｘ）ＧＣＴＣＴＴＣＮＮＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣ（配列番号２６）；又は
ＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＮＮＧＡＡＧＡＧＣＴＣＴＴＣＮＮＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣ（配列番号２７）
の配列を含む、請求項１〜２９のいずれかに記載の核酸。
【請求項３１】
前記核酸がベクター、又はその直線化バージョンである、請求項１〜３０のいずれかに記載の核酸。
【請求項３２】
前記メチル化保護可能な制限要素がメチル化されている、請求項１〜３１のいずれかに記載の核酸。
【請求項３３】
ＤＮＡをアセンブルする方法であって：
前記メチル化保護可能な制限要素が前記ＤＮＡメチラーゼでメチル化されている、請求項１から３２のいずれかに記載の直線化されたメチル化核酸を提供すること；
前記直線化されたメチル化核酸とのアセンブリのため２つ以上の目的のＤＮＡ断片を提供すること、
ここで、第１のＤＮＡ断片が、直線化されたメチル化核酸の第１の末端とのライゲーションのための相補的なオーバーハングを含み、第２のＤＮＡ断片が、直線化されたメチル化核酸のもう一方の／第２の末端とのライゲーションのための相補的なオーバーハングを含み；並びに
（ｉ）前記第１及び第２のＤＮＡ断片が、互いにライゲーションするための相補的なオーバーハングを更に含み、又は
（ｉｉ）前記ＤＮＡ断片及び前記直線化されたメチル化核酸をＤＮＡリガーゼでライゲートすることが単一のアッセンブルされたＤＮＡ分子をもたらし得るように、前記第１及び第２のＤＮＡ断片が、相補的なオーバーハングを有する１つ以上の更なるＤＮＡ断片とのライゲーションのための相補的なオーバーハングを更に含み；
前記ＤＮＡ断片及び直線化されたメチル化核酸をリガーゼでライゲートして、前記メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列が両側に隣接するアセンブルされたＤＮＡ断片の配列を含む単一のアセンブルされたＤＮＡ分子を形成すること、
を含む、ＤＮＡをアセンブルする方法。
【請求項３４】
前記直線化された核酸が、２つのメチル化されたメチル化保護可能な制限要素及びその間の廃棄配列を含む環状デスティネーションベクターの形態で請求項１〜３２のいずれかに記載される核酸を提供することによって提供され、前記方法が、前記廃棄配列中の対向する保護不可能な制限酵素認識配列を認識する制限酵素で前記環状デスティネーションベクターを切断する工程を含み、それによって前記制限酵素により規定されるオーバーハングを有する直線化された核酸を残す、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記同じ制限酵素種が全ての制限に使用される、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記メチル化されたメチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列が、同じ配列を含む、又はそれからなる、請求項３３〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記メチル化されたメチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列、及び前記対向する保護不可能な制限酵素認識配列が、同じ配列を含む、又はそれからなる、請求項３３〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記環状若しくは直線化されたデスティネーションベクターが、前記メチル化保護可能な制限要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列を認識するＤＮＡメチラーゼを発現する細菌株から精製／単離される；又は
前記環状若しくは直線化されたデスティネーションベクターが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＮＡメチラーゼによってメチル化される、
請求項３３〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記核酸とのアセンブリのための２つ以上の目的のＤＮＡ断片が、環状供与ベクターの形態で提供され、前記方法が、前記環状供与ベクターを切断して目的のＤＮＡ断片を放出する工程を含む、請求項３３〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記ドナーベクターの切断が、前記直線化されたメチル化核酸とのライゲーションのために相補的オーバーハングを残す制限酵素によるものである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記環状供与ベクターを切断するための制限酵素がＩＩＳ型制限酵素を含む、請求項３９又は４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記方法が、単一のアセンブルされたＤＮＡ分子を、前記メチル化保護可能な制限要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列を認識するＤＮＡメチラーゼを発現しない細菌株に形質転換する工程を更に含む、請求項３３〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
第２ラウンドのＤＮＡアセンブリを更に含み、前記直線化されたメチル化核酸とのアセンブリのための前記目的のＤＮＡ断片が、請求項３３〜４２のいずれかによる第１／初期のＤＮＡアセンブリラウンドに由来するアセンブルされたＤＮＡを含んでもよい、請求項３３〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
ＤＮＡ断片の瘢痕のないＤＮＡアセンブリの方法であって：
（Ａ）一端に維持された複合要素を有し、もう一端に短縮複合要素を有する、請求項１〜３２のいずれかに記載の第１の直線化されたメチル化核酸を提供する工程であって、前記維持された複合要素及び短縮複合要素が、前記ＤＮＡメチラーゼでメチル化されている工程；
前記第１の直線化されたメチル化核酸のオーバーハング末端にライゲートするように適合されているオーバーハング末端を有するアセンブリのための第１のＤＮＡ断片を提供する工程；
前記アセンブリのための第１のＤＮＡ断片及び第１の直線化されたメチル化核酸を、リガーゼを用いてライゲートして、第１のメチル化中間ベクターを形成する工程；
前記第１のメチル化中間ベクターを、前記維持された複合要素及び短縮複合要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列（複数の場合もある）のいずれかを認識するＤＮＡメチラーゼ（複数の場合もある）を発現しない細菌株に形質転換し、それによりメチル化されていない第１の中間ベクターを形成する工程；
上記第１の中間ベクターを単離する工程；
（Ｂ）一端に維持された複合要素を有し、もう一端に短縮複合要素を有する、請求項１〜３２のいずれかに記載の第２の直線化されたメチル化核酸を提供する工程であって、前記維持された複合要素及び短縮複合要素が前記ＤＮＡメチラーゼでメチル化されており、前記第１の直線化されたメチル化核酸の維持された複合要素によって提供されるオーバーハングが、前記第２の直線化されたメチル化核酸のメチル化保護可能な制限要素によって提供されるオーバーハングと配列が異なる工程；
前記第２の直線化されたメチル化核酸のオーバーハング末端にライゲートするように適合されているオーバーハング末端を有するアセンブリのための第２のＤＮＡ断片を提供する工程；
前記アセンブリのための第２のＤＮＡ断片及び第２の直線化されたメチル化核酸を、リガーゼを用いてライゲートして、第２のメチル化中間ベクターを形成する工程；
前記第２のメチル化中間ベクターを、維持された複合要素及び短縮複合要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列（複数の場合もある）のいずれかを認識するＤＮＡメチラーゼ（複数の場合もある）を発現しない細菌株に形質転換し、それによりメチル化されていない第２の中間ベクターを形成する工程；
前記第２の中間ベクターを単離する工程；
（Ｃ）前記維持された複合要素の制限酵素認識配列を認識する制限酵素、及び前記短縮複合要素の制限酵素認識配列を認識する制限酵素で前記第１の中間ベクターを切断し、それにより前記維持された複合要素によって決定される維持されたオーバーハング配列、及びアセンブリのための前記第１のＤＮＡ断片のネイティブ配列によって決定される対向するネイティブオーバーハング配列を含む第１の適合ＤＮＡ断片インサートを形成する工程；
（Ｄ）前記維持された複合要素の制限酵素認識配列を認識する制限酵素、及び前記短縮複合要素の制限酵素認識配列を認識する制限酵素で前記第２の中間ベクターを切断し、それにより前記維持された複合要素によって決定される維持されたオーバーハング配列、及びアセンブリのための前記第２のＤＮＡ断片のネイティブ配列によって決定される対向するネイティブオーバーハング配列を含む第２の適合ＤＮＡ断片インサートを形成する工程；
を含み、
ここで
（ｉ）前記第１及び第２の適合ＤＮＡ断片は、それらが共にライゲートするため配列されるように、それらのネイティブオーバーハング配列が相補的である末端断片であり；又は
（ｉｉ）アセンブリのための１つ以上の中央ＤＮＡ断片が提供され、ここで、前記第１及び第２の適合ＤＮＡ断片は、前記アセンブリにおいて各末端断片であり、前記１つ以上の中央ＤＮＡ断片は、相補的なネイティブオーバーハング配列を介して、前記第１及び第２の適合ＤＮＡ断片の間にライゲートされるように配置され；
さらに、リガーゼで、前記第１及び第２の適合ＤＮＡ断片、又は前記第１及び第２の適合ＤＮＡ断片と１つ以上の中央ＤＮＡ断片と共にライゲートして、各末端に維持されたオーバーハングを有するアセンブルされたＤＮＡ断片を形成する工程を含む、
ＤＮＡ断片の瘢痕のないＤＮＡアセンブリの方法。
【請求項４５】
前記直線化された核酸が、２つのメチル化されたメチル化保護可能な制限要素及びその間の廃棄配列を含む環状デスティネーションベクターの形態で請求項１〜３２のいずれかに記載の核酸を提供することによって提供され、
前記方法が、前記廃棄配列中の対向する保護不可能な制限酵素認識配列を認識する制限酵素で前記環状デスティネーションベクターを切断する工程を含み、
それによって前記制限酵素により規定されるオーバーハングを有する直線化された核酸を残す、
請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記１つ以上の中央ＤＮＡ断片が、それらのネイティブ配列によって決定される両端のネイティブオーバーハング配列を含む、請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記中央ＤＮＡ断片が、前記第１の適合ＤＮＡ断片のネイティブオーバーハングに相補的な第１のネイティブオーバーハング配列と、前記第２の適合ＤＮＡ断片のネイティブオーバーハングに相補的な第２のネイティブオーバーハング配列とを含む、請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記方法が、アセンブリのために２つ以上の中央ＤＮＡ断片を含み、
前記中央ＤＮＡ断片が、それらが予め決められた順序で一緒にライゲートされ得るように、隣接する中央ＤＮＡ断片のネイティブオーバーハングに相補的なネイティブオーバーハング配列を含み、
前記配列中の最初と最後の中央ＤＮＡ断片が、相補的なネイティブオーバーハング配列を介して、それぞれの第１の適合ＤＮＡ断片及び第２の適合ＤＮＡ断片にライゲートするように配置される、請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４９】
アセンブリのための中央ＤＮＡ断片が、
請求項１〜３２のいずれかに記載の更なる直線化されたメチル化核酸を提供すること、
ここで、前記直線化されたメチル化核酸は、各末端に短縮複合要素を含み、前記短縮複合要素は前記ＤＮＡメチラーゼでメチル化されており；
前記直線化されたメチル化核酸のオーバーハング末端にライゲートするように適合されたオーバーハング末端を有するアセンブリのための適合中央ＤＮＡ断片を提供すること；
前記アセンブリのための適合中央ＤＮＡ断片及び直線化されたメチル化核酸を、リガーゼを用いてライゲートして、メチル化中間ベクターを形成すること；
前記メチル化中間ベクターを、短縮複合要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列（複数の場合もある）のいずれかを認識するＤＮＡメチラーゼ（複数の場合もある）を発現しない細菌株に形質転換し、それによりメチル化されていない中間ベクターを形成すること；
前記中間ベクターを単離すること；
前記中間ベクターを、短縮複合要素の制限酵素認識配列を認識する制限酵素で切断し、それにより、アセンブリのための中央ＤＮＡ断片のネイティブ配列によって決定される各末端のネイティブオーバーハング配列を含む中央ＤＮＡ断片インサートを形成すること、
によって提供される、
請求項４４〜４８のいずれかに記載の方法
【請求項５０】
アセンブリのための前記ＤＮＡ断片が、各末端にオーバーハング／スティック末端を含む二本鎖ＤＮＡを含む、請求項４４〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
アセンブリのための前記ＤＮＡ断片が、鋳型からのＰＣＲ、遺伝子合成、又は２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングによって調製される、請求項４４〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記アセンブルされたＤＮＡ断片の挿入のため直線化されたデスティネーションベクターを提供する工程を更に含む、請求項４４〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
前記直線化されたデスティネーションベクターが、維持された複合要素及び／又は短縮複合要素の制限酵素認識配列を認識する制限酵素（複数の場合もある）で環状デスティネーションベクターを切断することにより提供される、請求項４４〜５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
ＤＮＡメチラーゼを発現するように改変された改変細菌株であって、前記改変が、大腸菌ゲノムのａｒｓＢ遺伝子座へのメチラーゼ遺伝子の挿入を含む、改変細菌株。
【請求項５５】
請求項１〜３３のいずれかに記載の核酸分子を製造するための、ＤＮＡメチラーゼを発現するように改変された改変細菌株の使用。
【請求項５６】
請求項１〜３３のいずれかに記載の核酸を含む組成物。
【請求項５７】
請求項１〜３３のいずれかに記載の１つ以上の核酸を含むキット。
【請求項５８】
制限酵素及び／又はＴ４  ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを更に含む、請求項５６に記載のキット。
【請求項５９】
請求項１〜３３のいずれかに記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項６０】
任意に、前記使用がｉｎ  ｖｉｔｒｏである、目的のＤＮＡ断片をアセンブルするための請求項１〜３３のいずれかに記載の核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡアセンブリ方法及び関連する核酸材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学及びバイオテクノロジーの進歩は、大きなＤＮＡコンストラクトのアセンブリための様々な方法の開発をもたらした。既存の方法は、大きく２つのグループ：ギブソン・アセンブリ、及び酵母又はＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に基づくｉｎ  ｖｉｖｏ相同組み換えアプローチ等の断片間の長いオーバーラップする配列を利用してアセンブリの順序を指定する相同性に基づく方法、並びにＭｏｃｌｏ（Ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１５  Ｓｅｐ；１６（９）：５６８−７６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ４０１４（ＰＭＩＤ  ２６０８１６１）２及びＣｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７  Ｍａｙ；３７（３）：２７７−２８６．ｄｏｉ：１０．３１０９／０７３８８５５１．２０１６．１１４１３９４（ＰＭＩＤ  ２６８６３１５４）等の定義された酵素特異的配列を利用してアセンブリの順序を指定する制限酵素／リコンビナーゼに基づく方法に分けることができた。継続的な困難な課題は、アセンブルされたＤＮＡ中の禁止配列、及びアセンブリプロセスの間に導入される不要な瘢痕配列等の配列設計の制約を軽減することと、アセンブリモジュール性と部分再利用性を改善することのバランスを達成することである。
【０００３】
初期のＩＩＳ型制限酵素に基づくＤＮＡアセンブリシステムは、ゴールデンゲートアセンブリと名づけられた。ゴールデンゲートアセンブリシステムでは、インサートプラスミド内でアセンブルされるインサートＤＮＡ断片には、認識配列の外側を切断し、酵素認識配列に依存しない配列で任意の接着末端を生成するＩＩＳ型制限酵素の認識部位が両側に隣接している。ゴールデンゲートアセンブリ用のインサートプラスミドには、インサートに面するインサートベクター骨格内にＩＩＳ型制限部位が両側に隣接するインサートが含まれているため、一旦ＩＩＳ型制限酵素によってプラスミドからインサートが放出されると、それらのプラスミドは制限部位を含まなくなる。ゴールデンゲートアセンブリ用のアセンブリベクターには、ベクターに面する選択マーカーに位置するＩＩＳ型部位が両側に隣接するネガティブ選択マーカーが含まれているため、一旦ベクターから選択マーカーが放出されると、ベクター骨格にはＩＩＳ型制限部位が含まれない。これらの特別に設計されたプラスミドは、インサートプラスミド及びベクターをＩＩＳ型制限酵素及びＤＮＡリガーゼと共に混合することにより、複数のＤＮＡ断片の単純なワンポットアセンブリを可能にする。ゴールデンゲートアセンブリ反応では、インサート及びベクターの制限消化、並びにインサートとベクターとの間のライゲーションが同じ管で発生した。インサート及びアセンブリベクター骨格が適合性のある接着末端を有する場合、ワンポット反応中にライゲーション産物の混合物が生成される。これには、インサートとアセンブリベクター骨格との間の好都合なライゲーション産物、また同じくネガティブ選択マーカーとアセンブリベクター骨格との間、ネガティブ選択マーカーとインサートベクター骨格との間、インサートとインサートベクター骨格との間等の不都合なライゲーション産物が含まれる。ＩＩＳ型制限部位はネガティブ選択マーカー及びインサートベクター骨格に位置するため、全ての不都合なライゲーション産物はＩＩＳ型制限酵素による消化を受けやすいが、好都合なライゲーション産物は消化には抵抗性である。結果として、上記反応は、長期的にはインサートとアセンブリベクター骨格との間で正しくアセンブルされたライゲーション産物の生成を支持する。その後、アセンブリベクター骨格内のポジティブ抗生物質選択マーカー、及びアセンブリベクターインサート内のネガティブ選択マーカーを使用する選択が続いて、正しくアセンブルされたインサートを含むプラスミドを高効率に選択することができた。
【０００４】
Ｍｏｃｌｏに基づくシステムは、次段階のアセンブリ用にアセンブルされたＤＮＡを放出するため、アセンブリに使用される酵素とは異なる第２のペアのＩＩＳ型制限部位をアセンブリベクターに追加することにより、ゴールデンゲートアセンブリシステムから開発された。ゴールデンゲートアセンブリでは、インサート及びアセンブリプラスミドベクター骨格に使用されるＩＩＳ型制限酵素の認識配列がないため、アセンブルされたＤＮＡをアセンブリに使用されたのと同じ制限酵素によって放出することができなかった。ＩＩＳ型制限部位の異なるペアを追加してアセンブルされた断片を放出することにより、この第２の制限酵素及び異なる抗生物質選択マーカーを保持する異なるベクターを使用してゴールデンゲートアセンブリのプロセスを繰り返すことができた。２つの異なるＩＩＳ型制限酵素及び抗生物質選択マーカーの代替的な順次の使用は、ワンポット制限／ライゲーション反応による大きなＤＮＡ断片の階層型アセンブリを可能にする。
【０００５】
ＩＩＳ型酵素に基づくＤＮＡアセンブリの主な欠点は、アセンブリに使用されるＤＮＡパーツ内の内部ＩＩＳ型制限部位を除去する必要があることである。基本的な階層型アセンブリには少なくとも２つの酵素が必要であり、ＤＮＡパーツの多段線形付加等の他のスキームには３つの酵素が必要である。既知のＩＩＳ型制限酵素のほとんどは６ｂｐ以下の配列を認識するため、ほとんどのＭｏｃｌｏに基づくシステムは６ｂｐカッターを使用する。これは、ＤＮＡパーツに２つの６ｂｐ非対称配列がないことを必要とし、非対称配列は、ＧＣ含有率が５０％のランダムＤＮＡ配列の場合、１ｋｂに約１つの頻度で発生する。現在のＭｏｃｌｏシステムの改善可能性は、７ｂｐ以上の特異性を持つＩＩＳ型制限酵素を使用することであろう。しかしながら、この選択肢は、市販のＩＩＳ型制限酵素の入手可能性によって制限される。現在、２種類の７ｂｐのＩＩＳ型制限酵素：ＧＣＴＣＴＴＣを認識して３ｂｐの粘着末端を残すＬｇｕＩ／ＳａｐＩ、及びＣＡＣＣＴＧＣを認識して４ｂｐ粘着末端を残すＡａｒＩのみが商業的に入手可能である。また、ＡａｒＩは、完全な消化にオリゴヌクレオチドの添加を必要とし、これはＤＮＡアセンブリには望ましくない。
【０００６】
また、既存のＩＩＳ型制限酵素に基づくＤＮＡアセンブリシステムは、最終のアセンブルされたＤＮＡに不要な瘢痕配列を残すモジュール式ＤＮＡアセンブリ用に設計されており、これを、カスタムアセンブリベクターを作製せずに任意のＤＮＡ配列をアセンブルするため使用することができない。
【０００７】
米国特許出願公開第２０１６０００２６４４号は、ＤＮＡアセンブリのシステムを記載している。該公開公報は、２つの制限酵素ＬｇｕＩ及びＥａｒＩ、並びにＭ．ＴａｑＩの誘導性発現株を使用して、アセンブリベクター内のオーバーラップする制限部位をブロックする。Ｍ．ＴａｑＩ部位は、ＬｇｕＩ／ＥａｒＩによって生成される３ｂｐの接着末端配列とオーバーラップするため、アダプター配列の設計に厳しい制約を残す。
【発明の概要】
【０００８】
必要とされているのは、アダプター配列の選択及び設計の自由度の向上、瘢痕が最小限のアセンブリ、反応工程又は複雑さの減少、より大きな配列のＤＮＡをアセンブルする能力の１つ以上を提供する、改良されたＤＮＡアセンブリ方法である。したがって、本発明の目的は、改善されたＤＮＡアセンブリ方法及び関連材料を提供することである。
【０００９】
本発明の第１の態様によれば、ＤＮＡアセンブリで使用される核酸が提供され、該核酸は、少なくとも１つのメチル化保護可能な制限要素を含み、該メチル化保護可能な制限要素は：
−認識配列の外側を開裂する制限酵素によって認識される制限酵素認識配列；及び
−ＤＮＡメチラーゼ認識配列
を含み、
上記制限酵素認識配列及び上記ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、ＤＮＡメチラーゼにより修飾された塩基が制限酵素認識配列内にあるようにオーバーラップしており、
上記ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、制限酵素認識配列と同一ではなく、又は制限酵素認識配列に囲まれておらず、
上記ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、制限酵素により生成されるオーバーハング末端配列を形成し得る配列とオーバーラップしない。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】オーバーラップするメチル化／制限部位をブロックするメチラーゼの同定  Ａ．初期スクリーニングのためのオーバーラップするメチル化／制限部位の図。制限酵素の認識部位は実線で囲まれている。制限酵素によって生成される接着末端は、実線で示されている。メチル化酵素認識部位は破線で囲まれ、メチル化塩基は太字で示されている。列挙されている全てのメチラーゼは、それぞれＣ５−シトシン及びＮ４−シトシンを修飾するＭ．ＳａｃＩ及びＭ．ＡｓｐＪＨＬ３Ｉを除いて、Ｎ６−アデニンを修飾する。  Ｂ．ｉｎ  ｖｉｖｏメチル化によるオーバーラップメチル化／制限部位のブロックを試験するための実験計画。試験した各メチラーゼ／制限酵素の組み合わせについて、試験プラスミドには、１対１のオーバーラップするメチル化／制限部位とメチル化不可能な制限部位が含まれている。正常な株から調製された試験プラスミドの制限消化は、両方の部位で制限をもたらし、約４．３ｋｂのベクター骨格から約６００ｂｐの断片を放出し得る。メチラーゼ発現株から調製された試験プラスミドの制限消化は、ｉｎ  ｖｉｖｏメチル化によるオーバーラップするメチル化／制限部位のブロッキングにより、単一の約４．９ｋｂバンドを生じ得る。制限部位を実線で囲み、メチル化配列を破線で囲み、メチル化塩基を太字にして、各制限酵素に対する試験プラスミドの制限部位を示す。オーバーラップするメチル化／制限部位の１対１の配置は、同じアッセイでニッカーゼ活性をアッセイすることを可能とする。  Ｃ．正常株又はＤＮＡメチラーゼを発現する株で調製し、対応するＩＩＳ型制限酵素で消化した各オーバーラップするメチラーゼ／制限酵素の組み合わせの試験プラスミドのアガロースゲル電気泳動分析。試験した組み合わせは、試験プラスミドｐＭＯＰ＿ＢｓａＩＮＣを使用するＢｓａＩとＭ．Ｏｓｐ８０７ＩＩ（Ｍ．Ｏｓｐ）、試験プラスミドｐＭＯＰ＿ＢｐｉＩＮＣを使用するＢｐｉＩとＭ２．ＮｍｅＭＣ５８ＩＩ（Ｍ２．Ｎｍｅ）、及び試験プラスミドｐＭＯＰ＿ＬｇｕＩＮＣを使用するＬｇｕＩとＭ．ＸｍｎＩである。試験条件は、３７℃で１時間、１０μｌの反応で５Ｕ  ＢｓａＩ若しくはＢｐｉＩ、又は２．５Ｕ  ＬｇｕＩを使用して消化した６０ｆｍｏｌの試験プラスミドである。結果は、メチラーゼ認識部位が制限酵素部位とオーバーラップする場合、試験した各メチラーゼが、対応するＩＩＳ型制限酵素の制限部位のｉｎ  ｖｉｖｏメチル化を通してブロッキングの成功をもたらすことを示す。示されているデータは、３つの独立した実験の結果を表す。
【図２】ＢｓａＩ−Ｍ．Ｏｓｐ８０７ＩＩに基づくＭｅｔｃｌｏシステム  ドナープラスミドには、適合性のある接着末端（ａａａａ−ｅｅｅｅと標識される）を生成するＢｓａＩ部位が両側に隣接する、アセンブルされるＤＮＡ断片（Ｆｒａｇ  Ａ−Ｄ）が含まれている。ＢｓａＩ部位はＭ．Ｏｓｐ８０７ＩＩメチラーゼ認識配列とオーバーラップしている。ドナープラスミドを、Ｍ．Ｏｓｐ８０７ＩＩメチラーゼ活性を欠く正常株から調製した。その結果、ＢｓａＩ部位はメチル化されないため、インサートＤＮＡ断片はＢｓａＩ消化により放出され得る。アセンブリベクターは、１対１のＢｓａＩ部位が両側に隣接するＬａｃＺ選択マーカーを含む。ベクター骨格により近いＢｓａＩ部位の外側ペアはＭ．Ｏｓｐ８０７ＩＩメチル化配列とオーバーラップするが、内側ペアはオーバーラップしない。Ｍ．Ｏｓｐ８０７ＩＩを発現するＤＨ１０Ｂ株のアセンブリベクターの調製は、ＢｓａＩ部位の外側ペアの特異的なブロッキングをもたらす。ＬａｃＺ断片は、ＢｓａＩ部位の内側ペアに対する作用により、ＢｓａＩによってなおも放出される可能性がある。ＢｓａＩ及びＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用するワンポット反応の後、適合性のある接着末端間のライゲーションは、ＤＮＡ断片のアセンブリベクター骨格への規則正しいアセンブリをもたらす。アセンブルされたプラスミドのアセンブルされた断片には、ＢｓａＩ消化に抵抗性のブロックされたＢｓａＩ部位が両側に隣接している。Ｍ．Ｏｓｐ８０７ＩＩ活性を欠く正常株への形質転換後、両側に隣接する制限部位のメチル化が失われ、アセンブルされた断片は次の段階のアセンブリのためＢｓａＩによって放出される可能性がある。
【図３】メチル化保護可能な制限部位と保護不可能な制限部位との間に機能性ＤＮＡ要素を含むＭｅｔｃｌｏベクターを使用するＤＮＡアセンブリ。  Ａ．ベクターに予め埋め込まれたプロモーター要素（Ｐｒｏｍ）及びｐｏｌｙＡシグナル（ｐｏｌｙＡ）を含むＭｅｔｃｌｏベクターを使用する３つの異なるドメイン（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３）を有するタンパク質の発現のための転写ユニットのアセンブリを示す図。メチル化保護ＢｓａＩ部位を実線で囲み、機能性ＢｓａＩ部位は点線であり、メチル化塩基は太字である。ＸＸＸＸ及びＹＹＹＹは、ＤＮＡアセンブリの次のラウンドで放出され得る、アセンブルされたＤＮＡ断片（転写ユニット）の５’及び３’末端のアダプター配列を表す。それらのアダプター配列は、アセンブリ反応に関与しないため、内部アダプター配列（ＡＡＴＧ、ＡＣＴＡ、ＡＴＣＴ、ＧＣＴＴ）とは異なってもよく、又は異ならなくてもよい。  Ｂ．別々のインサートプラスミドで提供されるプロモーター要素及びポリＡシグナルを有するＭｅｔｃｌｏを使用する同じ転写ユニットのアセンブリを示す図。ＸＸＸＸ及びＹＹＹＹは、ＤＮＡアセンブリの次のラウンドで放出され得る、アセンブルされたＤＮＡ断片（転写ユニット）の５’及び３’末端のアダプター配列を表す。それらのアダプター配列は、内部アダプター配列とは異なる。
【図４】ユニバーサルクローニングベクターを使用する接着末端切り替えの原理  Ａ．３種類のユニバーサルアセンブリベクターの図。  Ｂ．例としてベクターＶＬを使用する、Ｍｅｔｃｌｏによるユニバーサルクローニングベクターの接着末端切り替えプロセスの詳細。機能性ＩＩＳ型制限部位を実線で囲み、ブロックされた制限部位を破線で囲み、メチル化塩基は太字である。  Ｃ．接着末端の切り替えプロセスを表す記号システム。ｕ及びｖは、それぞれユニバーサル接着末端ＣＴＣＣ及びＣＧＡＧを表す。ｘ及びｙは、配列によって定義されるユニバーサル接着末端内の４ｂｐ配列を表す。異なるベクタータイプを使用するアセンブリは、異なる接着末端の切り替えをもたらす。  Ｄ．複数の断片アセンブリに適用される接着末端の切り替えプロセス。
【図５】ユニバーサルクローニングベクターを使用する瘢痕のないＤＮＡアセンブリ  Ａ．アセンブルされるＤＮＡ断片には、内部ＢｓａＩ制限部位がない。アセンブリプロセスの目的は、断片の末端によって定義される接着末端ｘ及びｙを保持する単一のアセンブルされた断片を生成することである。  Ｂ．配列を、最初に４ｂｐオーバーラップ（ａ〜ｈ）を持つ９つの異なる断片（断片Ａ〜断片Ｉ）にデジタル的に分割した。  Ｃ．次に、アダプター配列を断片にデジタル的に付加し、ＢｓａＩによってトリミングされてユニバーサル接着末端ｕ及びｖが両側に隣接する断片を生成し得るＤＮＡ断片をもたらした。  Ｄ．合成された二本鎖ＤＮＡ断片は、特定のユニバーサルアセンブリベクターに最初にクローン化され、次段階のアセンブリの断片の位置に応じて接着末端を切り替えた。  Ｅ．クローン化された断片を、１群当たり３つ、特定のユニバーサルアセンブリベクターにアセンブルし、ベクタータイプは、次段階のアセンブリでアセンブルされる断片の位置に依存する。  Ｆ．アセンブリの最終段階では、配列指定接着末端ｘ及びｙを持つ完全にアセンブリされた断片を生成する。
【図６】Ｍｏｃｌｏに基づくユニバーサルアセンブリと比較したＭｅｔｃｌｏに基づく瘢痕のないユニバーサルアセンブリの利点  ユニバーサルアセンブリベクターを使用する多段階アセンブリの場合、Ｍｏｃｌｏに基づくシステムは連続する段階に２つの異なる制限酵素（ＢｓａＩ及びＢｐｉＩ）を使用し、これは、所与のブロックに異なるユニバーサルアダプター（ＢｓａＩの場合はＣＴＣＣ、ＢｐｉＩの場合はＡＧＡＡ）を必要とする。種々の段階に由来する断片をユニバーサルアセンブリベクターにクローン化するため、各サブアセンブリの最初のブロックの５’末端及び最後のブロックの３’末端を、アセンブリに使用する酵素に応じて異なるアダプター配列間で切り替える必要がある。図は、アセンブリ反応の連続する３段階の間の最初のブロック（ブロックＡ）の５’アダプターの変化を示し、ＢｓａＩ部位は実線で囲まれ、ＢｐｉＩ部位は破線で囲まれている。アセンブリの種々の段階の間にアダプターの切り替えに対処するには、ブロックＡの５’末端に非常に長いアダプターを付加する必要がある。アダプターは、アセンブリの各段階の後の「チュウバックされる（ｃｈｅｗｅｄ  ｂａｃｋ）」４ｂｐであるため、アダプター配列の長さは段階の数に依存する。Ｍｅｔｃｌｏに基づく設計は、アセンブリの種々の段階で単一の酵素ＢｓａＩを使用することから、はるかに単純である。ここでは、メチル化不可能なＢｓａＩ部位を実線で囲み、メチル化によりブロックされるＢｓａＩ部位を破線で囲む。最初のブロック（ブロックＡ）の５’末端にあるユニバーサルアダプター配列ＣＴＣＣは、アセンブリの種々の段階で使用され得る。外側のブロックのアダプター配列を切り替える必要はない。その結果、初期配列のアダプター設計は、はるかに単純である。
【図７】Ｍｅｔｃｌｏを使用するＤＮＡアセンブリ。図は、単一のＩＩＳ型制限酵素を使用する２サイクルのＭｅｔｃｌｏによる４つのＤＮＡ断片（断片Ａ、断片Ｂ、断片Ｃ、及び断片Ｄ）の単一ＤＮＡ断片（断片ＡＢＣＤ）へのアセンブリを示す。段階１及び段階２は、次第に大きくなるインサートを用いる、実質的に同じプロセスである。段階１では、インサートドナープラスミドは、適合性のある接着末端を生成するメチル化可能なＩＩＳ型制限部位が両側に隣接するインサート断片（断片Ａ、断片Ｂ、断片Ｃ、又は断片Ｄ）を含む。適切な部位特異的メチラーゼを欠く正常な大腸菌株でのインサートプラスミドの調製は、ＩＩＳ型制限酵素により放出可能なインサート断片をもたらす。アセンブリベクターには、ＩＩＳ型制限部位の意図的に設計された１対１の構成が両側に隣接するネガティブ選択マーカーＬａｃＺαが含まれる。制限部位の内側ペアはメチル不化可能に設計されているが、外側ペアは制限酵素認識配列がメチラーゼ認識配列とオーバーラップするため、部位特異的メチラーゼによってメチル化可能である。対応するメチラーゼを発現する大腸菌株でアセンブリベクターを調製すると、メチル化可能な制限部位の外側ペアが選択的にメチル化され、ＩＩＳ型制限酵素による消化により、メチル化されたＩＩＳ型制限部位の外側ペアを維持するベクター骨格を生成する。インサート断片とベクター骨格とのライゲーションは、ＩＩＳ型制限酵素による制限に対して抵抗性の正しくアセンブルされたプラスミドを生成する。インサートプラスミドのベクター骨格及びアセンブリベクターに由来するＬａｃＺα断片を含む他の望ましくない断片はいずれも、酵素による制限に感受性の活性なＩＩＳ型制限部位を含む。このスキームは、反応が正しくアセンブルされたプラスミドの生成を促進するため、制限とライゲーションの工程を組み合わせたワンポットアセンブリ反応を可能にする。適切な部位特異的メチラーゼを欠く正常な大腸菌株へのアセンブリ反応物の形質転換は、アセンブルされたプラスミド中のアセンブルされた断片に隣接するメチル化ＩＩＳ型制限部位の脱メチル化を効果的にもたらす。段階２では、アセンブルされたインサート（断片ＡＢ及び断片ＣＤ）は、次に、より大きな断片（断片ＡＢＣＤ）へのＭｅｔｃｌｏアセンブリの後続のラウンドに使用され得る。
【図８】レベルジャンピング（ｌｅｖｅｌ  ｊｕｍｐｉｎｇ）：異なるレベルのアセンブリに由来する構成要素を使用してＤＮＡを修飾するスキーム。図は、標準Ｍｅｔｃｌｏスキームによる２つのＤＮＡ断片（断片Ａ及びＢ）のアセンブリと、その後の第３の断片（断片Ｃ）を使用するアセンブルされた断片（断片ＡＢ）の修飾に関するスキームを示す。使用される最初の断片（断片Ａ、断片Ｂ、断片Ｃ）は、同じ抗生物質選択マーカーを保持しているという意味で、アセンブリ階層において同一レベルである。修飾工程は、異なるレベルのアセンブリに由来する断片（断片Ｃ）を使用して既存の断片（断片ＡＢ）を修飾する、すなわち「レベルジャンピング」を行う。修飾された断片（断片ＡＢＣ）は、開始断片（断片ＡＢ）と同じ接着末端を保持し、レベル１及びレベル２の両方のブロック（Ｍ１及びＭ２）とは異なる抗生物質選択マーカー（Ｍ３）を保持する。したがって、新たな断片ＡＢＣを、断片ＡＢの代わりに選択マーカーＭ１を使用する次のレベルのＤＮＡアセンブリに使用することができる。修飾工程の間の接着末端の維持は、特殊な配置の１対１のＩＩＳ型制限部位（修飾工程の間のＬａｃＺα断片の右側）の使用により達成され、内側のメチル化不可能なＩＩＳ型制限部位は、挿入される修飾断片（断片Ｃ）と適合性のある接着末端を生成し、また外側のメチル化可能なＩＩＳ型制限部位は、修飾されるＤＮＡ断片の末端と同じ接着末端（図中の断片ＡＢの右側の末端）を生成する。連続するレベルのアセンブリに由来するＤＮＡ断片は、２つの異なる制限酵素によって放出される必要があり、それぞれの酵素は、修飾工程後の次のレベルのＤＮＡアセンブリに使用される酵素とは異なる必要があることから、２つのＩＩＳ型制限酵素を使用する標準Ｍｏｃｌｏアプローチでは、修飾工程は不可能である。レベルジャンピング修飾スキームは、既存の配列検証済みＤＮＡパーツの再利用性を最大化するため、より高いレベルのアセンブリ設計を変更しない、転写ユニット等の機能性遺伝要素の既存のアセンブリパイプラインへの挿入に有用である。
【図９】レベル挿入：中間アセンブリ段階によるＤＮＡのアセンブリのためのスキーム。図は、４つのＤＮＡ断片（断片Ａ、断片Ｂ、断片Ｃ、及び断片Ｄ）を、ＤＮＡアセンブリの中間段階を通して単一断片（断片ＡＢＣＤ）にアセンブリする（レベル挿入）ためのスキームを示す。１回の反応で４つの断片をアセンブルする標準Ｍｅｔｃｌｏアセンブリスキーム（図３）とは対照的に、このスキームには、レベル１のＤＮＡインサート（Ｍ１は断片Ａ、断片Ｂ、断片Ｃ、断片Ｄにより保持される）及びレベル２のアセンブルされたＤＮＡ断片（Ｍ２は断片ＡＢＣＤにより保持される）とは異なる選択マーカー（Ｍ３）を保持する中間アセンブリベクターへの、断片Ｂ及び断片Ｃのサブアセンブリによる中間アセンブリ段階が含まれる。レベル挿入サブアセンブリスキームは、ＤＮＡアセンブリの経路により多くの選択肢を提供し、中間のアセンブルされたＤＮＡ断片の再利用性を高める。
【図１０】線形付加：ＢｓａＩに基づくＭｅｔｃｌｏを使用するアセンブリベクター構築のためのスキーム。  この図は、既存の機能性遺伝要素（断片Ａ及び断片Ｄ）を保持するアセンブリベクターの構築のためのＤＮＡパーツの線形付加スキームを示す。メチル化不可能なＩＩＳ型制限部位が両側に隣接する非選択性スタッファーＤＮＡ断片を保持するアセンブリベクターから開始して、２つのＤＮＡ断片（断片Ａ及び断片Ｄ）がＬａｃＺα選択マーカーにより最初にこのベクターにアセンブルされる。ＬａｃＺα選択マーカーの両側には、内側部位はメチル化可能であり、外側部位はメチル化不可能であるように、ＩＩＳ制限部位の特別に設計された１対１の配置がある。対応するメチラーゼを発現する大腸菌株でのＬａｃＺαインサートプラスミドの調製は、メチル化可能なＩＩＳ型制限部位の内側ペアの選択的ブロックをもたらす。ＬａｃＺαインサートと正常な大腸菌株から調製された他のインサート（断片Ａ及び断片Ｄ）とのワンポットアセンブリは、ＤＮＡアセンブリに使用されるＩＩＳ型制限酵素による制限に抵抗性のアセンブルされたＤＮＡ断片を生じる。対応するメチラーゼ活性を欠く正常な大腸菌株へのアセンブルされたＤＮＡの形質転換は、ＬａｃＺα断片に隣接するメチル化可能なＩＩＳ型制限部位の脱メチル化をもたらす。その結果、次いで、アセンブルされたＤＮＡは、次のラウンドのＤＮＡアセンブリにおいてＬａｃＺα選択マーカーの代わりに、新たなＤＮＡ断片（断片Ｂ及び断片Ｃ）を付加するためのアセンブリベクターとして使用され得る。最終結果は、ＤＮＡ断片のアセンブリベクターへの線形付加（断片Ａ及び断片Ｄ、次いで断片Ｂ及び断片Ｃ）である。このスキームは、哺乳動物選択マーカー等の一般的な機能性遺伝要素を保持する最終段階のアセンブリベクターの構築に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において本発明は、有利には、ＤＮＡアセンブリの異なる段階を通して単一の制限酵素の使用を可能にすることができる。これにより、使用する制限酵素を含まないＤＮＡ断片の開始部分を調製するコスト及び複雑さが軽減される。メチラーゼ認識配列は、制限酵素によって生成されるオーバーハング末端配列を形成し得る配列とオーバーラップしないため、本発明は更に、ＤＮＡ断片アセンブリ用のアダプター（すなわちオーバーハング）を設計するより多くの自由度を提供する。本発明はまた、制限酵素に基づくアセンブリ方法を使用する最初の階層的な瘢痕のないＤＮＡアセンブリシステムを提供する。最終的にアセンブルされたＤＮＡに望ましくない瘢痕配列を残す既存のモジュール式ＤＮＡアセンブル方法とは異なり、本発明は、瘢痕を残すことなく大きな任意のＤＮＡ配列をアセンブルするために使用され得る。本発明とは対照的に、ギブソン・アセンブリ及び酵母相同組み換え等のいずれも相同性に基づくアセンブリ方法による既存の瘢痕のないアセンブリシステムは、反復ＤＮＡ配列を有する大きなＤＮＡコンストラクトをアセンブルすることができない。本発明の方法はまた、６個のプラスミドのユニバーサルセットを使用するＤＮＡの階層的な瘢痕のないアセンブリのための単純な設計を可能にする。
【００１２】
切断制御要素のメチル化は、オーバーラップする制限酵素認識部位をブロックする／損なう可能性がある。
【００１３】
一実施形態では、認識配列の外側で切断する制限酵素はＩＩＳ型制限酵素である。
【００１４】
一実施形態では、核酸は少なくとも２つのメチル化保護可能な制限要素を含む。別の実施形態では、核酸は２つのメチル化保護可能な制限要素を有する。２つのメチル化保護可能な制限要素を含む実施形態では、２つのメチル化保護可能な制限要素の切断部位間の核酸配列は、廃棄配列（すなわち、制限反応中に核酸から除去される不要な断片）であってもよい。代替の実施形態では、廃棄配列は先に除去されてもよい。例えば、核酸は、各末端にメチル化保護可能な制限要素を有する予め切断された直線化されたベクターであってもよい。
【００１５】
廃棄配列は、選択可能なマーカー、レポーター遺伝子、又は標識を含んでもよい。当業者は、ＤＮＡアセンブリ及びクローニングに使用される典型的なマーカー及びレポーター遺伝子に精通しているであろう。例えば、選択可能なマーカーは、抗生物質耐性、酵素活性、ルシフェラーゼ等をコードする遺伝子を含んでもよい。マーカーを、放射性標識等の標識としてもよい。一実施形態では、廃棄配列は、ｌａｃＺをレポーターとしてコードする。当業者は、本発明のプロセスがアセンブルされたＤＮＡの生成に好都合であるため、ベクター内のアセンブルされた配列によって置き換えられ得る廃棄配列が、機能性要素を全く含まなくてもよいことを認識するであろう。
【００１６】
廃棄配列に選択可能なマーカー、レポーター遺伝子、又は標識を提供することにより、有利には、目的の断片／配列による廃棄配列の除去又は置換に成功したクローンを選択することが可能になる。
【００１７】
一実施形態では、メチル化保護可能な制限要素の切断部位の反対側に、対向する保護不可能な制限酵素認識配列が提供される。例えば、廃棄配列を含む実施形態では、対向する保護不可能な制限酵素認識配列は廃棄配列に位置し得る。また、対向する保護不可能な制限酵素認識配列は、ＩＩＳ型制限酵素等のその認識配列の外側を切断する制限酵素によって認識されてもよい。対向する保護不可能な制限酵素認識配列は、メチル化によって、保護されない場合があり（若しくは保護されるように配置されない場合があり）、又は少なくともメチル化保護可能な制限要素のメチラーゼ認識配列を認識するメチラーゼからのメチル化によって保護されない場合がある。廃棄配列内のかかる対向する保護不可能な制限酵素認識配列は、他にも「内部制限酵素認識配列」と呼ばれることがあり、一方、メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列は「外部制限酵素認識配列」と呼ばれることがある。
【００１８】
メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列は、対向する保護不可能な制限酵素認識配列と同じ制限酵素種によって認識され得る。メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列は、対向する保護不可能な制限酵素認識配列と同じ配列を含んでもよい。
【００１９】
一実施形態では、核酸は、「維持された複合要素」を含んでもよく、対向する保護不可能な制限酵素認識配列は、同じオーバーハング／粘着末端が同じ位置に産生され得るように、メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列と同じ部位で核酸を切断することを制限酵素に指示するように配置され得る。これは、選択された制限酵素（複数の場合もある）によって提供される切断部位に応じて、特定の距離で制限酵素認識配列及び対向する保護不可能な制限酵素認識配列を提供することにより達成され得る。この実施形態では、廃棄配列の対向する保護不可能な制限酵素認識配列を認識する制限酵素による核酸の切断、及びＤＮＡ断片インサートとのその後ライゲーションの後、メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列に従って核酸を切断する制限酵素によって産生されるオーバーハングの配列が維持される。したがって、この実施形態は、「維持された複合要素」と呼ばれる場合があり、すなわち、維持された複合要素は、１対１の方向に配置された２つの制限配列を含み得る（その一方はメチル化保護可能要素の一部であり、他方は対向する保護不可能な制限酵素認識配列である）。維持された複合要素から産生されたオーバーハングは、対向する制限認識配列間の配列によって予め決定されてもよい。
【００２０】
維持された複合要素に対する代替の実施形態では、「短縮複合要素」が提供され、ここで、対向する保護不可能な制限酵素認識配列は、メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列を認識する制限酵素の切断部位とオーバーラップしない部位で核酸を切断することを制限酵素に指示するように配置され得る（すなわち、対向する切断部位によって作られた後続のオーバーハングの位置がオーバーラップせず、後続のオーバーハングの配列が異なる場合がある）ように、メチル化保護可能な制限要素と対向する保護不可能な制限酵素認識配列との間の距離を短くしてもよい。短縮複合要素中の対向する保護不可能な制限酵素認識配列の切断部位が、メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列の認識配列内、及び／又は切断部位とメチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列の認識配列との間のヌクレオチド内にあってもよい。一実施形態では、１つの切断部位の終わりの塩基対間の開裂点及び対向する切断部位の開始の塩基対間の開裂点は、近接する／隣接する塩基対の中にあってもよい（すなわち、切断部位は互いにすぐ隣にあってもよいが、オーバーラップはしない）。これは、選択された制限酵素（複数の場合もある）によって提供される切断部位に応じて、特定の距離でメチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列及び対向する保護不可能な制限酵素認識配列を提供することにより達成され得る。距離は、対向する保護不可能な制限酵素認識配列及び／又は認識配列と切断部位の間、又はその逆の間のヌクレオチドに切断をもたらすのに十分に近いであろう（すなわち、同等の／同じ選択された制限酵素（複数の場合もある）に対する「維持された複合要素」中の対向する制限酵素認識配列よりも近い）。この短縮複合要素の実施形態では、メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列に従って核酸を切断する制限酵素によって産生されるオーバーハングの配列は、廃棄配列の対向する保護不可能な制限酵素認識配列を認識する制限酵素で核酸を切断し、ＤＮＡ断片インサートとのその後のライゲーションの後、維持される場合と維持されない場合とがあり、これにより、ＤＮＡ断片インサートの配列がオーバーハングの配列を決定し得る（例えば、短縮複合要素から産生されたオーバーハングは、対向する制限酵素認識部位間の配列によって予め決定されなくてもよい）。
【００２１】
維持された複合要素及び短縮された複合要素の代替の実施形態では、「挿入複合要素」が提供され、配列インサートがメチル化保護可能な制限要素及び対向する保護不可能な制限酵素認識配列との間に提供される。配列インサートは、機能を提供するように機能性配列を含んでもよい。例えば、配列インサートは、プロモーター配列又はターミネーター配列を含んでもよい。挿入複合要素を含む実施形態では、メチル化保護可能な制限要素及び対向する保護不可能な制限酵素認識配列は、オーバーラップしなくてもよく、配列インサートによって離れていてもよい。配列インサートは、任意の適切な長さであってもよい。例えば、メチル化保護可能な制限要素と対向する保護不可能な制限酵素認識配列との間の距離は、機能性配列インサート等の配列インサートに必要な任意の数のヌクレオチドであってもよい。メチル化保護可能な制限要素内の制限酵素認識配列と対向する保護不可能な制限酵素認識配列との間の距離は、６ｂｐ〜３００ｋｂの範囲であってもよい。
【００２２】
有利には、ＤＮＡアセンブリに続いて、アセンブルされたＤＮＡの５’又は３’末端に機能性配列が付加されるであろう。この設計は、特殊化されたベクターを使用することにより、アセンブルされたプラスミドに共通の要素を追加するのに便利である（例えば、マルチパートコード領域遺伝子アセンブリ反応でプロモーター及びターミネーターを追加する）。
【００２３】
一実施形態では、「維持された複合要素」の場合、対向する保護不可能な制限酵素認識配列（ＢｓａＩ配列等）は、メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列（ＢｓａＩ配列等）から６塩基対離れていてもよい（すなわち、１つの認識配列の終了と対抗する認識配列の開始との間に６ｂｐのギャップ）。当業者は、かかる距離は選択される制限酵素（複数の場合もある）の特性によることを認識するであろう。例えば、酵素が認識配列からｘ個の塩基を切断し、ｙ個の塩基の接着末端／オーバーハングを生成すると仮定すると（例えば、ＢｓａＩの場合ｘ＝１及びｙ＝４）、維持された複合要素の対向する制限酵素認識配列間の塩基数に関する距離（ｄ）は、次の等式によって提供され得る：ｄ＝（２＊ｘ）＋ｙ（例えば、ＢｓａＩ場合ｄ＝６ｂｐ）。維持される複合要素の距離（ｄ）は、５ｂｐ（例えば、ＥａｒＩを使用する場合）〜２４ｂｐ（例えば、ＢｔｇＺＩを使用する場合）の範囲となり得る。一実施形態では、維持された複合要素の対向する制限酵素認識配列間の差はｄであり、ここで、ｄ＝（２＊ｘ）＋ｙであって、式中、ｘは、その認識配列から切断される所与の制限酵素の切断部位の塩基対の数であり、ｙは、制限酵素によって産生されるオーバーハングの長さである。
【００２４】
例えば、メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列によって産生されたオーバーハングが維持される場合又は維持されない場合の代替の短縮複合要素の実施形態では、対向する保護不可能な制限酵素認識配列（ＢｓａＩ等）は、メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列（ＢｓａＩ等）から２塩基対離れていてもよい。上述のように当業者は、かかる距離は選択される制限酵素（複数の場合もある）の特性によることを認識するであろう。例えば、酵素が認識配列からｘ個の塩基を切断し、ｙ個の塩基の接着末端を生成すると仮定して（ＢｓａＩの場合ｘ＝１及びｙ＝４）、短縮複合要素の対向する制限酵素認識配列間の塩基数に関する距離（ｄ）は、次の等式によって提供され得る：ｄ＝２＊ｘ（例えば、ＢｓａＩ場合ｄ＝２ｂｐ）。短縮複合要素の距離（ｄ）は、２ｂｐ（例えば、ＢｓａＩを使用する場合）〜２０ｂｐ（例えば、ＢｔｇＺＩを使用する場合）の範囲となり得る。一実施形態では、短縮複合要素の対向する制限酵素認識配列間の差はｄであり、ここで、ｄ＝２＊ｘであって、式中、ｘは、その認識配列から切断される所与の制限酵素の切断部位の塩基対の数である
【００２５】
有利には、維持された複合要素の提供はワンポットＤＮＡアセンブリを促進し、それによりＤＮＡの複数の断片が単一の制限酵素種を用いる単一のワンポット反応でアセンブルされ得る。有利には、短縮複合要素の提供は、瘢痕のないＤＮＡアセンブリを促進し、それにより、特定のＤＮＡ断片インサートのオーバーハング末端は、デスティネーションベクターへのライゲーションに適合するように予め決定され得るか、又は配列内の隣接する断片との接合のため目的のＤＮＡ断片のネイティブ配列に従って提供され得る。
【００２６】
一実施形態では、核酸は、間に廃棄配列を有する２つの維持された複合要素を含むベクター等の環状核酸を含んでもよく、又は廃棄配列が切り取られたその直線化バージョンを含んでもよい。別の実施形態では、核酸は、間に廃棄配列を有する維持された複合要素及び短縮複合要素を含むベクター等の環状核酸を含んでもよく、又は廃棄配列が切り取られたその直線化バージョンを含んでもよい。別の実施形態では、核酸は、間に廃棄配列を有する２つの短縮複合要素を含むベクター等の環状核酸を含んでもよく、又は廃棄配列が切り取られたその直線化バージョンを含んでもよい。別の実施形態では、核酸は、間に廃棄配列を有する挿入複合要素及び短縮複合要素を含むベクター等の環状核酸を含んでもよく、又は廃棄配列が切り取られたその直線化バージョンを含んでもよい。別の実施形態では、核酸は、間に廃棄配列を有する挿入複合要素及び維持された複合要素を含むベクター等の環状核酸を含んでもよく、又は廃棄配列が切り取られたその直線化バージョンを含んでもよい。別の実施形態では、核酸は、間に廃棄配列を有する２つの挿入複合要素を含むベクター等の環状核酸を含んでもよく、又は廃棄配列が切り取られたその直線化バージョンを含んでもよい。直線化された核酸の実施形態では、廃棄配列は、廃棄配列上に存在する対向する保護不可能な制限酵素配列（すなわち、内部制限酵素認識配列）を認識する制限酵素を用いる制限によって切り取られていてもよい。
【００２７】
２つの維持された複合要素を含む実施形態では、２つの維持された複合要素の制限酵素認識配列は同じであってもよく、及び／又は２つの維持された複合要素のメチラーゼ認識配列は同じであってもよい。２つの短縮された複合要素を含む実施形態では、２つの短縮された複合要素の制限酵素認識配列は同じであってもよく、及び／又は２つの短縮された複合要素のメチラーゼ認識配列は同じであってもよい。２つの挿入複合要素を含む実施形態では、２つの挿入複合要素の制限酵素認識配列は同じであってもよく、及び／又は２つの挿入複合要素のメチラーゼ認識配列は同じであってもよい。維持された複合要素及び短縮された複合要素を含む実施形態では、維持された及び短縮された複合要素の制限酵素認識配列は同じであってもよく、及び／又は維持された及び短縮された複合要素のメチラーゼ認識配列は同じであってもよい。維持された複合要素及び挿入複合要素を含む実施形態では、維持された及び挿入複合要素の制限酵素認識配列は同じであってもよく、及び／又は維持された及び挿入複合要素のメチラーゼ認識配列は同じであってもよい。短縮された複合要素及び挿入複合要素を含む実施形態では、短縮された及び挿入複合要素の制限酵素認識配列は同じであってもよく、及び／又は短縮された及び挿入複合要素のメチラーゼ認識配列は同じであってもよい。例えば、目的の廃棄配列又はＤＮＡ断片を除去するための核酸の消化は、同じ制限酵素によって行われてもよい。さらに、核酸中の全てのメチラーゼ保護可能な制限酵素認識部位を保護するための核酸のメチル化は、同じメチラーゼによって行われてもよい。
【００２８】
一実施形態では、メチラーゼはＩＩ型ＤＮＡメチラーゼを含む。別の実施形態では、メチラーゼはＩ型ＤＮＡメチラーゼを含む。一実施形態では、メチラーゼは、制限酵素活性のない単一ドメインメチラーゼ、又は非機能性制限酵素活性を有する改変メチラーゼを含む。例えば、改変は、メチルアデニンのＮ６位を改変することを含んでもよい。一実施形態では、ＤＮＡメチラーゼ認識配列は少なくとも４塩基対を含む。ＤＮＡメチラーゼは、活性であり得、例えば約３７℃で最適に活性である。
【００２９】
一実施形態では、対向する保護不可能な制限酵素認識配列は、メチル化保護可能な制限要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列を認識するメチラーゼによるメチル化によってブロックすることができない。一実施形態では、メチル化保護可能な制限要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列を認識するメチラーゼは、対向する保護不可能な制限酵素認識配列内又はそれとオーバーラップする配列を認識しなくてもよい。例えば、保護不可能な対向する制限酵素認識配列は、メチル化保護可能な制限要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列を認識するメチラーゼにより認識される配列とオーバーラップしなくてもよく、又はそれを含まなくてもよい。メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列は、例えばメチル化保護可能な制限要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列を認識するメチラーゼによりメチル化されてもよい。メチル化保護可能な制限要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列を認識するメチラーゼは、メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列の配列内のヌクレオチドをメチル化するように配置されてもよい。メチル化は、メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列を認識する制限酵素によるＤＮＡの切断をブロックできる可能性がある。一実施形態では、メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列は、配列中のヌクレオチドの少なくとも１つのメチル化の結果として機能しなくなる場合がある。一実施形態では、メチル化ヌクレオチドはアデニンであってもよく、又はメチル化されるように配置されたヌクレオチドはアデニンであってもよい。別の実施形態では、メチル化ヌクレオチドはシトシンであってもよく、又はメチル化されるように配置されたヌクレオチドはシトシンであってもよい。メチル化は、Ｎ４−メチルシトシン（ｍ４Ｃ）、Ｃ５−メチルシトシン（ｍ５Ｃ）又はＮ６−メチルアデニン（ｍ６Ａ）から選択されるメチル化タイプのいずれか１つであってもよい。当業者は、提供されるメチル化のタイプにより、オーバーラップする制限部位の機能がブロックされる／損なわれるはずであることを認識するであろう。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏメチル化の場合、メチラーゼの発現に使用される株は、Ｍｃｒ／Ｍｒｒファミリー制限酵素等のメチル化塩基を認識し得る改変依存型制限酵素が欠乏していてもよい。一実施形態において、メチル化タイプは、Ｎ６−メチルアデニン（ｍ６Ａ）を含んでもよい。
【００３０】
一実施形態では、メチラーゼは、制限酵素認識配列の最も外側の塩基をメチル化してもよく、又はメチル化しなくてもよい。例えば、６ｂｐの制限酵素認識配列では、塩基１又は６はメチル化されなくてもよい。一実施形態では、メチラーゼは制限酵素認識配列の２番目の塩基をメチル化してもよく、又はメチル化しなくてもよい。一実施形態では、メチラーゼは、６ｂｐ制限酵素認識部位の３位、４位、又は５位をメチル化してもよい。一実施形態では、メチラーゼは、制限酵素認識部位の３位、４位、５位又は６位をメチル化してもよい。
【００３１】
２つのメチル化保護可能な制限要素を含む実施形態では、各メチル化保護可能な制限要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列は、同じメチラーゼによって認識され得る。メチル化保護可能な制限要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列は、同じ配列を含むか、又はそれからなってもよい。
【００３２】
２つのメチル化保護可能な制限要素を含む実施形態では、各メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列は、同じ制限酵素種によって認識され得る。メチル化保護可能な制限要素の各制限酵素認識配列は、同じ配列を含むか、又はそれからなってもよい。２つのメチル化保護可能な制限要素は、同じ配列を含むか、又は同じ配列からなってもよい。
【００３３】
同じ制限酵素認識配列の使用は、有利には、単一の制限酵素種をＤＮＡアセンブリ反応で使用できることを提供する。反応中に更なる制限酵素種が存在すると、配列がランダムに／不注意に認識及び制限切断の部位を含む確率が大幅に増加して、クローニング処置の失敗を引き起こすことから、単一の制限酵素種の使用は、より複雑でないＤＮＡアセンブリの可能性をもたらす。
【００３４】
一実施形態では、前記メチル化保護可能な制限要素は、本明細書の表３で特定されるオーバーラップするメチル化／制限部位のいずれか１つによる配列を含む、又はそれからなる。代替の実施形態では、メチル化保護可能な制限要素は、制限配列の最初又は最後の塩基のメチル化を提供するものを除いて、本明細書の表３で特定されるオーバーラップするメチル化／制限部位のいずれか１つによる配列を含む、又はそれからなる。一実施形態では、メチル化保護可能な制限要素は、配列ＧＡＣＮＮＧＧＴＣＴＣＮＮＮＮＮ（ＢｓａＩ／Ｍ．Ｏｓｐ８０７ＩＩ−配列番号１）を含む、又はそれからなる。別の実施形態では、メチル化保護可能な制限要素は、配列ＧＡＡＧＡＣＧＣＮＮＮＮＮＮ（ＢｐｉＩ／Ｍ２．ＮｍｅＭＣ５８ＩＩ−配列番号２）を含む、又はそれからなる。別の実施形態では、メチル化保護可能な制限要素は、配列ＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＮＮＮＮ（ＬｇｕＩ／Ｍ．ＸｍｎＩ−配列番号３）を含む、又はそれからなる。
【００３５】
一実施形態では、メチル化保護可能及び／又は保護不可能な制限酵素認識配列は、本明細書の表３で特定される制限酵素認識配列のいずれか１つによる配列を含む、又はそれからなる。代替の実施形態では、メチル化保護可能及び／又は保護不可能な制限酵素認識配列は、制限配列の最初又は最後の塩基のメチル化を提供するものを除いて、本明細書の表３で特定される制限酵素認識配列のいずれか１つによる配列を含む、又はそれからなる。一実施形態では、メチル化保護可能及び／又は保護不可能な制限酵素認識配列は、配列ＧＧＴＣＴＣ（ＢｓａＩ−配列番号４）を含む、又はそれからなる。別の実施形態では、メチル化保護可能及び／又は保護不可能な制限酵素認識配列は、配列ＧＡＡＧＡＣ（ＢｐｉＩ−配列番号５）を含む、又はそれからなる。別の実施形態では、メチル化保護可能及び／又は保護不可能な制限酵素認識配列は、配列ＧＣＴＣＴＴＣ（ＬｇｕＩ−配列番号６）を含む、又はそれからなる
【００３６】
一実施形態では、ＤＮＡメチラーゼ認識配列が、本明細書の表３で特定されるＩＩ型ＤＮＡメチラーゼ認識配列のいずれか１つによる配列を含む、又はそれからなる。代替の実施形態では、ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、制限配列の最初又は最後の塩基のメチル化を提供するものを除いて、本明細書の表３で特定されるＩＩ型ＤＮＡメチラーゼ認識配列のいずれか１つによる配列を含む、又はそれからなる。一実施形態では、ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、配列ＧＡＣＮＮＮＧＴＣ（Ｍ．Ｏｓｐ８０７ＩＩ−配列番号７）を含む、又はそれからなる。別の実施形態では、ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、配列ＧＡＧＣＣ（Ｍ２．ＮｍｅＭＣ５８ＩＩ−配列番号８）を含む、又はそれからなる。別の実施形態において、ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、配列ＧＡＡＮＮＮＮＴＴＣ（Ｍ．ＸｍｎＩ−配列番号９）を含む、又はそれからなる。
【００３７】
メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列及び／又は対向する制限酵素認識配列を認識する制限酵素は、少なくとも２ｂｐのオーバーハング／粘着末端を残すように核酸を切断することが可能であってもよい。あるいは、メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列及び／又は対向する制限酵素認識配列を認識する制限酵素は、少なくとも３ｂｐのオーバーハング／粘着末端を残すように核酸を切断することが可能であってもよい。別の実施形態では、メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列及び／又は対向する制限酵素認識配列を認識する制限酵素は、３ｂｐのオーバーハング／粘着末端を残すように核酸を切断することが可能であってもよい。別の実施形態では、メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列及び／又は対向する制限酵素認識配列を認識する制限酵素は、４ｂｐのオーバーハング／粘着末端を残すように核酸を切断することが可能であってもよい。別の実施形態では、メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列及び／又は対向する制限酵素認識配列を認識する制限酵素は、２ｂｐ〜６ｂｐのオーバーハング／粘着末端を残すように核酸を切断することが可能であってもよい。別の実施形態では、メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列及び／又は対向する制限酵素認識配列を認識する制限酵素は、２ｂｐ〜５ｂｐのオーバーハング／粘着末端を残すように核酸を切断することが可能であってもよい。別の実施形態では、メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列及び／又は対向する制限酵素認識配列を認識する制限酵素は、３ｂｐ〜５ｂｐのオーバーハング／粘着末端を残すように核酸を切断することが可能であってもよい。別の実施形態では、メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列及び／又は対向する制限酵素認識配列を認識する制限酵素は、４ｂｐ〜５ｂｐのオーバーハング／粘着末端を残すように核酸を切断することが可能であってもよい。
【００３８】
一実施形態では、制限酵素は、本明細書の表３で特定されるいずれか１つのＩＩＳ型制限酵素を含む、又はそれからなる。別の実施形態では、ＩＩＳ型制限酵素は、ＢｓａＩ、ＢｐｉＩ、又はＬｇｕＩを含む、又はそれからなる。
【００３９】
一実施形態では、本明細書の表３で特定されるいずれか１つのＩＩ型ＤＮＡメチラーゼを含む、又はそれからなる。代替の実施形態では、ＤＮＡメチラーゼは、制限配列の最初又は最後の塩基のメチル化を提供するものを除いて、本明細書の表３で特定されるＩＩ型ＤＮＡメチラーゼのいずれか１つを含む、又はそれからなる。別の実施形態では、ＤＮＡメチラーゼは、Ｍ．Ｏｓｐ８０７ＩＩ、Ｍ２．ＮｍｅＭＣ５８ＩＩ、又はＭ．ＸｍｎＩを含む、又はそれからなる。
【００４０】
一実施形態では、制限酵素及びＤＮＡメチラーゼは、本明細書の表３で特定されるＩＩＳ型制限酵素及びＩＩ型ＤＮＡメチラーゼのいずれか１つの対を含む、又はそれからなる。一実施形態では、制限酵素及びＤＮＡメチラーゼは、ＢｓａＩ／Ｍ．Ｏｓｐ８０７ＩＩ、ＢｐｉＩ／Ｍ２．ＮｍｅＭＣ５８ＩＩ、又はＬｇｕＩ／Ｍ．ＸｍｎＩの対を含む、又はそれらからなる。
【００４１】
一実施形態では、制限酵素認識配列及びＤＮＡメチラーゼ認識配列は、本明細書の表３で特定されるＩＩＳ型制限酵素認識配列及びＩＩ型ＤＮＡメチラーゼ認識配列のいずれか１つの対を含む。又はそれからなる。代替の実施形態では、制限酵素認識配列及びＤＮＡメチラーゼ認識配列は、制限配列の最初又は最後の塩基のメチル化を提供するものを除いて、本明細書の表３で特定されるＩＩＳ型制限酵素認識配列及びＩＩ型ＤＮＡメチラーゼ認識配列のいずれか１つの対を含む、又はそれらからなる。
【００４２】
２つのメチル化保護可能な制限要素を含む（例えば、それらの間に廃棄配列を有する）実施形態では、第１のメチル化保護可能な制限要素において制限酵素で切断することにより産生されるオーバーハング／粘着末端は、第２のメチル化保護可能な制限要素において制限酵素で切断することにより産生されるオーバーハング／粘着末端と配列が異なってもよい。当業者は、指向性ＤＮＡアセンブリ／クローニングのために異なるオーバーハングを提供すること、又は核酸のどの末端が目的のインサート／断片にライゲートされるかを制御することに精通している。
【００４３】
維持された複合要素を含む一実施形態では、核酸は、ＧＡＣＮＮＧＧＴＣＴＣＮＮＮＮＮＮＧＡＧＡＣＣの配列（配列番号：１０）を含んでもよく、又はそれからなってもよい。維持された複合要素を含む別の実施形態では、核酸はＧＡＡＧＡＣＧＣＮＮＮＮＮＮＧＴＣＴＴＣの配列（配列番号：１１）を含んでもよく、又はそれからなってもよい。維持された複合要素を含む別の実施形態では、核酸は、ＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＮＮＮＮＮＧＡＡＧＡＧＣの配列（配列番号：１２）を含んでもよく、又はそれからなってもよい。ＮはＡ、Ｃ、Ｔ、又はＧを意味し得る。他の配列は、表３に示す制限酵素とメチラーゼ認識配列の組み合わせ／重複に従って提供されてもよく、ここで、一連のＮ個の塩基の後に、該配列は制限酵素認識配列のパリンドローム／逆相補配列を更に含む。
【００４４】
２つの維持された複合要素を含む一実施形態では、核酸はＧＡＣＮＮＧＧＴＣＴＣＮＮＮＮＮＮＧＡＧＡＣＣ（Ｎｘ）ＧＧＴＣＴＣＮＮＮＮＮＮＧＡＧＡＣＣＮＮＧＴＣの配列（配列番号：１３）を含んでもよく、又はそれからなってもよい。２つの維持された複合要素を含む別の実施形態では、核酸は、ＧＡＡＧＡＣＧＣＮＮＮＮＮＮＧＴＣＴＴＣ（Ｎｘ）ＧＡＡＧＡＣＮＮＮＮＮＮＧＣＧＴＣＴＴＣの配列（配列番号：１４）を含んでもよく、又はそれからなってもよい。２つの維持された複合要素を含む別の実施形態では、核酸は、ＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＮＮＮＮＮＧＡＡＧＡＧＣ（Ｎｘ）ＧＣＴＣＴＴＣＮＮＮＮＮＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣの配列（配列番号：１５）を含んでもよく、又はそれからなってもよい。ＮはＡ、Ｃ、Ｔ、又はＧを意味し得る。（Ｎｘ）は、任意の数のＡ、Ｃ、Ｔ若しくはＧ、又は０ｂｐ〜３００ｋｂｐのＡ、Ｃ、Ｔ、又はＧを意味し得る。
【００４５】
当業者は、ＬｇｕＩ等の幾つかの制限酵素認識配列について、２つの維持された複合要素間のヌクレオチド（Ｎｘ）の数は、マイナスとなる場合があり、２つの内部の保護不可能な制限酵素認識部位がオーバーラップしていることを理解するであろう。したがって、２つの維持された複合要素を含む別の実施形態では、核酸は
【化１Ａ】
2020518247.tif 000003
を含んでもよく、又はそれからなってもよい。
【００４６】
短縮された複合要素を含む一実施形態では、核酸はＧＡＣＮＮＧＧＴＣＴＣＮＮＧＡＧＡＣＣの配列（配列番号１７）を含んでもよく、又はそれからなってもよい。短縮された複合要素を含む一実施形態では、核酸はＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＮＮＧＡＡＧＡＧＣの配列（配列番号１８）を含んでもよく、又はそれからなってもよい。ＮはＡ、Ｃ、Ｔ又はＧを意味し得て、ＮはＡ、Ｃ、Ｔ又はＧを意味し得る。他の配列は、表３に示す制限酵素とメチラーゼ認識配列の組み合わせ／オーバーラップに従って提供されてもよく、ここで、一連のＮ塩基の後に、該配列は制限酵素認識配列のパリンドローム／逆相補配列を更に含み、制限認識配列間のＮ塩基の数は、選択された制限酵素によって産生されるオーバーハング塩基の数だけ減少する。
【００４７】
維持され及び短縮された複合要素を含む一実施形態では、核酸は、ＧＡＣＮＮＧＧＴＣＴＣＮＮＮＮＮＮＧＡＧＡＣＣ（Ｎｘ）ＧＧＴＣＴＣＮＮＧＡＧＡＣＣＮＮＧＴＣ（配列番号１９）の配列を含んでもよく、又はそれからなってもよい。維持され及び短縮された複合要素を含む一実施形態では、核酸は、ＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＮＮＮＮＮＧＡＡＧＡＧＣ（Ｎｘ）ＧＣＴＣＴＴＣＮＮＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣの配列（配列番号２０）の配列を含んでもよく、又はそれからなってもよい。ＮはＡ、Ｃ、Ｔ、又はＧを意味し得る。（Ｎｘ）は、任意の数のＡ、Ｃ、Ｔ若しくはＧ、又は０ｂｐ〜３００ｋｂｐのＡ、Ｃ、Ｔ、又はＧを意味し得る。
【００４８】
当業者は、ＬｇｕＩ等の幾つかの制限酵素認識配列について、維持された及び短縮された複合要素間のヌクレオチド（Ｎｘ）の数は、マイナスとなる場合があり、２つの内部の保護不可能な制限酵素認識部位がオーバーラップしていることを理解するであろう。したがって、維持された及び短縮された複合要素を含む別の実施形態では、核酸は、
【化１Ｂ】
2020518247.tif 000004
の配列を含んでもよく、又はそれからなってもよい。
【００４９】
維持された及び短縮された複合要素を含む一実施形態では、核酸は、ＧＡＣＮＮＧＧＴＣＴＣＮＮＧＡＧＡＣＣ（Ｎｘ）ＧＧＴＣＴＣＮＮＮＮＮＮＧＡＧＡＣＣＮＮＧＴＣ（配列番号２２）の配列を含んでもよく、又はそれからなってもよい。維持された及び短縮された複合要素を含む一実施形態では、核酸は、ＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＮＮＧＡＡＧＡＧＣ（Ｎｘ）ＧＣＴＣＴＴＣＮＮＮＮＮＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣ（配列番号２３）の配列を含んでもよく、又はそれからなってもよい。ＮはＡ、Ｃ、Ｔ、又はＧを意味し得る。（Ｎｘ）は、任意の数のＡ、Ｃ、Ｔ若しくはＧ、又は０ｂｐ〜３００ｋｂｐのＡ、Ｃ、Ｔ、又はＧを意味し得る。維持された及び短縮された複合要素を含む別の実施形態では、核酸は
【化１Ｃ】
2020518247.tif 000005
の配列を含んでもよく、又はそれからなってもよい。
【００５０】
２つの短縮された複合要素を含む一実施形態では、核酸は、ＧＡＣＮＮＧＧＴＣＴＣＮＮＧＡＧＡＣＣ（Ｎｘ）ＧＧＴＣＴＣＮＮＧＡＧＡＣＣＮＮＧＴＣ（配列番号２５）の配列を含んでもよく、又はそれからなってもよい。２つの短縮された複合要素を含む一実施形態では、核酸はＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＮＮＧＡＡＧＡＧＣ（Ｎｘ）ＧＣＴＣＴＴＣＮＮＧＡＡＧＡＧＣＴＴＣの配列（配列番号２６）の配列を含んでもよく、又はそれからなってもよい。ＮはＡ、Ｃ、Ｔ、又はＧを意味し得る。（Ｎｘ）は、任意の数のＡ、Ｃ、Ｔ若しくはＧ、又は０ｂｐ〜３００ｋｂｐのＡ、Ｃ、Ｔ、又はＧを意味し得る。
【００５１】
当業者は、ＬｇｕＩ等の幾つかの制限酵素認識配列について、２つの短縮された複合要素間のヌクレオチド（Ｎｘ）の数は、マイナスとなる場合があり、２つの内部の保護不可能な制限酵素認識部位がオーバーラップしていることを理解するであろう。したがって、２つの短縮された複合要素を含む別の実施形態では、核酸は
【化１Ｄ】
2020518247.tif 000006
を含んでもよく、又はそれからなってもよい。
【００５２】
核酸は単離された核酸であってもよい。一実施形態では、核酸は合成であってもよい（すなわち、自然界には見られない）。一実施形態では、核酸は、メチル化保護可能な制限要素のメチラーゼ認識配列を認識（及びメチル化）するＤＮＡメチラーゼを発現する大腸菌等の細菌株から単離されてもよく、又はそれに由来してもよい。例えば、本明細書の表３で特定されるいずれか１つのＩＩ型ＤＮＡメチラーゼを発現する大腸菌等の細菌株。一実施形態では、核酸は、Ｍ．Ｏｓｐ８０７ＩＩ、Ｍ２．ＮｍｅＭＣ５８ＩＩ、又はＭ．ＸｍｎＩを発現する大腸菌等の細菌株から単離されてもよく、又はそれに由来してもよい。発現されたＤＮＡメチラーゼは機能性であってもよい。細菌株は、かかるＤＮＡメチラーゼを発現するように遺伝子改変／操作されてもよい。
【００５３】
核酸は、クローニングベクター等のベクターであってもよい。当業者は、例えば複製起点、選択可能なマーカー、レポーター遺伝子、発現要素、又はそれらの組み合わせを含んでもよい、様々なクローニングベクターに精通しているであろう。ベクターは、それを含むＤＮＡの複製を支持するＤＮＡ要素（例えば複製起点）及び選択マーカー（例えば抗生物質選択マーカー）を含む核酸を含んでもよい。ベクターは、高コピー数ベクターであってもよく、又は低コピー数ベクターでもあってもよい。一実施形態では、ベクターは高コピー数ベクターである。当業者は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．４ｔｈ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；２０１２に提供されるクローニング方法、及び材料／ベクターに精通しているであろう。
【００５４】
核酸の直線化された実施形態では、核酸は制限酵素認識配列の３つ以上のコピー／部位を含まなくてもよい。
【００５５】
本発明の別の態様によれば、ＤＮＡをアセンブルする方法であって：
メチル化保護可能な制限要素がＤＮＡメチラーゼでメチル化されている、本発明による直線化されたメチル化核酸を提供すること；
直線化されたメチル化核酸とのアセンブリのための２つ以上の目的のＤＮＡ断片を提供すること、ここで、第１のＤＮＡ断片が、直線化されたメチル化核酸の第１の末端とのライゲーションのための相補的なオーバーハングを含み、第２のＤＮＡ断片が、直線化されたメチル化核酸のもう一方の／第２の末端とのライゲーションのための相補的なオーバーハングを含み；並びに
（ｉ）第１及び第２のＤＮＡ断片が、互いにライゲーションするための相補的なオーバーハングを更に含み、又は
（ｉｉ）ＤＮＡ断片及び直線化されたメチル化核酸をＤＮＡリガーゼでライゲートすることが単一のアセンブルされたＤＮＡ分子をもたらすように、第１及び第２のＤＮＡ断片が、相補的なオーバーハングを有する１つ以上のＤＮＡ断片とのライゲーションのための相補的なオーバーハングを更に含み；
ＤＮＡ断片及び直線化されたメチル化核酸をリガーゼでライゲートして、メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列が両側に隣接するアセンブルされたＤＮＡ断片の配列を含む単一のアセンブルされたＤＮＡ分子を形成することを含む、ＤＮＡをアセンブルする方法が提供される。
【００５６】
単一のアセンブルされたＤＮＡ分子は、環状ＤＮＡベクター等の環状であってもよい。
【００５７】
有利には、メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列を認識する制限酵素による単一のアセンブルされたＤＮＡ分子の更なる切断は、制限酵素認識配列のメチル化によりブロックされる。
【００５８】
直線化された核酸が、２つのメチル化されたメチル化保護可能な制限要素及びその間の廃棄配列を含む環状デスティネーションベクターの形態で、本発明による核酸を提供することによって提供されてもよく、該方法は、前記廃棄配列内の対向する保護不可能な制限酵素認識配列を認識する制限酵素で環状デスティネーションベクターを切断する工程を含み、それによって前記制限酵素により規定されるオーバーハングを有する直線化された核酸を残す。制限酵素は同じ種であってもよい。メチル化されたメチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列は、同じ配列を含んでもよい。一実施形態において、メチル化されたメチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列及び対向する保護不可能な制限酵素認識配列は、同じ配列を含んでもよい。
【００５９】
本発明の方法で使用される制限酵素及びメチラーゼ（又はその認識配列）は、本明細書の本発明の核酸の態様に提供される制限酵素及びメチラーゼ（又はその認識配列）に従って選択され得る。
【００６０】
環状デスティネーションベクターは、メチル化保護可能な制限要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列を認識するＤＮＡメチラーゼを発現する細菌株から精製／単離され得る。別の実施形態では、環状若しくは直線化されたデスティネーションベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＮＡメチラーゼによってメチル化されてもよい。
【００６１】
核酸とのアセンブリのための２つ以上の目的のＤＮＡ断片は、環状供与ベクターで提供されてもよく、上記方法は、環状供与ベクターを切断して目的のＤＮＡ断片を放出する工程を含む。ドナーベクターの切断は、直線化されたメチル化核酸とのライゲーションのため相補的オーバーハングを残す制限酵素によるものであってもよい。ドナーベクターの切断は、直線化されたメチル化核酸とのライゲーションのための相補的オーバーハングを残す制限酵素によるものであってもよく、挿入のための目的の別のＤＮＡ断片によるものであってもよい。ドナーベクターの切断は、挿入のための目的の２つの他のＤＮＡ断片とのライゲーションのための相補的なオーバーハングを残す制限酵素によるものであってもよい。
【００６２】
環状供与ベクターを切断するための制限酵素は、ＩＩＳ型制限酵素を含んでもよい。環状供与ベクターを切断するための制限酵素は、環状デスティネーションベクターを切断するために使用される制限酵素と同じ制限酵素、又は同じ配列を認識する制限酵素を含んでもよい。直線化された核酸とのライゲーションのための目的のＤＮＡ断片の相補的なオーバーハングは、制限酵素によって規定され得る。
【００６３】
有利には、メチル化保護可能な制限要素に対する同じ制限酵素認識配列、廃棄配列上の対向する制限酵素認識配列、及びドナーベクター上の制限酵素認識配列の提供は、単一の種類の制限酵素を使用可能であることを提供する。これにより、除去される制限部位が少なくなるため、ＤＮＡパーツから内部ＩＩＳ型制限部位を除去する際のコスト／複雑さが軽減される。これにより、より長い配列のアセンブリがより容易になり、コストが削減される。さらに、本発明は、いわゆる「ワンポット」反応を可能にし、それによって制限及びライゲーションを単一の工程においてワンポットで実行することができる。
【００６４】
したがって、この方法は、制限とライゲーションの工程を組み合わせてもよい。特に、環状デスティネーションベクター、ドナーベクター、制限酵素及びリガーゼは同じ組成物で提供され得る。
【００６５】
単一のアセンブルされたＤＮＡ分子のアセンブリの後、上記方法は、単一のアセンブルされたＤＮＡ分子を、メチル化保護可能な制限要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列を認識するＤＮＡメチラーゼを発現しない細菌株に形質転換する工程を更に含む。
【００６６】
有利には、単一のアセンブルされたＤＮＡ分子を、メチル化保護可能な制限要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列を認識するＤＮＡメチラーゼを発現しない細菌株に形質転換すると、その後の制限反応を可能にする非メチル化（すなわち、ブロックされていない）制限酵素認識配列を含む、ベクター等の核酸配列のクローニング及び産生をもたらす。
【００６７】
上記方法は、より長い配列長のアセンブルされたＤＮＡ断片又はベクターを形成するため、多段階アセンブリプロセスを更に含んでもよい。例えば、本発明の方法の産物であるアセンブルされたＤＮＡは、より高次のアセンブリのために更に使用され得る。例えば、該方法は、本発明による第２ラウンドのＤＮＡアセンブリを含んでもよく、上記直線化されたメチル化核酸とのアセンブリのための目的のＤＮＡ断片は、本発明による第１の／より初期のＤＮＡアセンブリラウンドに由来するアセンブルされたＤＮＡを含んでもよい。
【００６８】
ＤＮＡのより大きな断片を形成するためのＤＮＡアセンブリの複数のラウンドの提供は、必要なアダプター／オーバーハング配列の数を減らす。また、ＤＮＡアセンブリの成功率が増加し、ＤＮＡ断片が少なくなる。さらに、１回の反応でアセンブルされる断片が少なく、アセンブルに成功したＤＮＡをより簡単にスクリーニングすることができる。
【００６９】
瘢痕のないＤＮＡアセンブリ法
本発明の別の態様によれば、以下：
（Ａ）一端に維持された複合要素を有し、もう一端に短縮複合要素を有する、本発明による第１の直線化されたメチル化核酸を提供する工程であって、前記維持された複合要素及び短縮複合要素が、ＤＮＡメチラーゼでメチル化されている工程；
第１の直線化されたメチル化核酸のオーバーハング末端にライゲートするように適合されているオーバーハング末端を有するアセンブリのための第１のＤＮＡ断片を提供する工程；
上記アセンブリのための第１のＤＮＡ断片及び第１の直線化されたメチル化核酸を、リガーゼを用いてライゲートして、第１のメチル化中間ベクターを形成する工程；
上記第１のメチル化中間体ベクターを、維持された複合要素及び短縮複合要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列（複数の場合もある）のいずれかを認識するＤＮＡメチラーゼ（複数の場合もある）を発現しない細菌株に形質転換し、それによりメチル化されていない第１の中間ベクターを形成する工程；
上記第１の中間ベクターを単離する工程；
（Ｂ）一端に維持された複合要素を有し、もう一端に短縮複合要素を有する、本発明による第２の直線化されたメチル化核酸を提供する工程であって、上記維持された複合要素及び短縮複合要素がＤＮＡメチラーゼでメチル化されており、前記第１の直線化されたメチル化核酸の維持された複合要素によって提供されるオーバーハングが、第２の直線化されたメチル化核酸のメチル化保護可能な制限要素によって提供されるオーバーハングと配列が異なる工程；
第２の直線化されたメチル化核酸のオーバーハング末端にライゲートするように適合されたオーバーハング末端を有するアセンブリのための第２のＤＮＡ断片を提供する工程；
上記アセンブリのための第２のＤＮＡ断片及び第２の直線化されたメチル化核酸を、リガーゼを用いてライゲートして、第２のメチル化中間ベクターを形成する工程；
上記第２のメチル化中間体ベクターを、維持された複合要素及び短縮複合要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列（複数の場合もある）のいずれかを認識するＤＮＡメチラーゼ（複数の場合もある）を発現しない細菌株に形質転換し、それによりメチル化されていない第２の中間ベクターを形成する工程；
上記第２の中間ベクターを単離する工程；
（Ｃ）上記維持された複合要素の制限酵素認識配列を認識する制限酵素、及び短縮複合要素の制限酵素認識配列を認識する制限酵素で第１の中間ベクターを切断し、それにより維持された複合要素によって決定される維持されるオーバーハング配列、及びアセンブリのための第１のＤＮＡ断片のネイティブ配列によって決定される対向するネイティブオーバーハング配列を含む第１の適合ＤＮＡ断片インサートを形成する工程；
（Ｄ）上記維持された複合要素の制限酵素認識配列を認識する制限酵素、及び短縮複合要素の制限酵素認識配列を認識する制限酵素で第２の中間ベクターを切断することにより、
維持された複合要素によって決定される維持されるオーバーハング配列、及びアセンブリのための第２のＤＮＡ断片のネイティブ配列によって決定される対向するネイティブオーバーハング配列を含む第２の適合ＤＮＡ断片インサートを形成する工程；
を含み、
ここで、
（ｉ）上記第１及び第２の適合ＤＮＡ断片は、それらが互いにライゲートするために配置されるように、それらのネイティブオーバーハング配列が相補的である末端断片である；又は
（ｉｉ）アセンブリのための１つ以上の中央ＤＮＡ断片が提供され、ここで、上記第１及び第２の適合ＤＮＡ断片は、アセンブリ内の各末端断片であり、上記１つ以上の中央ＤＮＡ断片が、相補的なネイティブオーバーハング配列を介して、上記第１及び第２の適合ＤＮＡ断片の間にライゲートされるように配置され；
さらに、リガーゼで、第１及び第２の適合ＤＮＡ断片、又は第１及び第２の適合ＤＮＡ断片と１つ以上の中央ＤＮＡ断片と共にライゲートして、各末端に維持されたオーバーハングを有するアセンブルされたＤＮＡ断片を形成する工程を含む、
ＤＮＡ断片の瘢痕のないＤＮＡアセンブリの方法が提供される。
【００７０】
１つ以上の中央ＤＮＡ断片は、それらのネイティブ配列によって決定される両端にネイティブオーバーハング配列を含んでもよい。アセンブリのため単一の中間ＤＮＡを含む或る実施形態では、中央ＤＮＡ断片が、上記第１の適合ＤＮＡ断片のネイティブオーバーハングに相補的な第１のネイティブオーバーハング配列と、前記第２の適合ＤＮＡ断片のネイティブオーバーハングに相補的な第２のネイティブオーバーハング配列とを含んでもよい。
【００７１】
アセンブリ用の２つ以上の中央ＤＮＡ断片を含む或る実施形態では、中央ＤＮＡ断片はそれぞれ、予め決定された順序でそれらが共にライゲートされ得るように、隣接する中央ＤＮＡ断片のネイティブオーバーハングに相補的なネイティブオーバーハング配列を含んでもよい。配列の最初と最後の中央のＤＮＡ断片は、相補的なネイティブオーバーハング配列を介して、それぞれの第１の適合ＤＮＡ断片及び第２の適合ＤＮＡ断片にライゲートするように配置される。
【００７２】
一実施形態では、アセンブリのための中央ＤＮＡ断片は、
本発明による更なる直線化されたメチル化核酸を提供することであって、該直線化されたメチル化核酸は、各末端に短縮複合要素を含み、該短縮複合要素はＤＮＡメチラーゼでメチル化されていること；
上記直線化されたメチル化核酸のオーバーハング末端にライゲートするように適合されたオーバーハング末端を有するアセンブリのための適合中央ＤＮＡ断片を提供すること；
上記アセンブリのための適合中央ＤＮＡ断片及び直線化されたメチル化核酸を、リガーゼを用いてライゲートして、メチル化中間ベクターを形成すること；
上記メチル化された中間ベクターを、短縮複合要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列（複数の場合もある）のいずれかを認識するＤＮＡメチラーゼ（複数の場合もある）を発現しない細菌株に形質転換し、それによりメチル化されていない中間ベクターを形成すること；
上記中間ベクターを単離すること；
上記中間ベクターを、短縮複合要素の制限酵素認識配列を認識する制限酵素で切断し、それにより、アセンブリのための中央ＤＮＡ断片のネイティブ配列によって決定される各末端にネイティブオーバーハング配列を含む中央ＤＮＡ断片インサートを形成すること、
によって提供される。
【００７３】
アセンブリ用の前記ＤＮＡ断片は、各末端にオーバーハング／スティック末端を含む二本鎖ＤＮＡを含んでもよい。アセンブリ用のＤＮＡ断片は、鋳型からのＰＣＲ、遺伝子合成、又は２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングによって調製され得る。かかるプロセス、例えばＰＣＲ又は遺伝子合成は平滑末端の二本鎖ＤＮＡを生成し得る。ＰＣＲ産物から開始するアセンブリの場合、制限部位を含む適切なアダプター配列をＰＣＲプライマーに含めてＤＮＡをトリミングし、中間ベクターにクローニングするためのオーバーハングを生成してもよい。アニーリングされたオリゴヌクレオチドの使用を含む実施形態については、より多くの選択肢がある。配列設計は、オーバーハングを生成するように制限酵素でトリミングするため、両端に制限部位を有するＰＣＲ／遺伝子合成の場合と同じであってもよい。あるいは、２つのアニールされたオリゴがオーバーハング自体を形成してもよい。
【００７４】
一実施形態では、アセンブリ用の第１のＤＮＡ断片、アセンブリ用の第２のＤＮＡ断片、及びアセンブリ用の１つ以上の適合した中央ＤＮＡ断片等のアセンブリ用のＤＮＡ断片は、鋳型配列からのＰＣＲによって提供され得る（すなわち、アセンブリ用のＤＮＡ断片はＰＣＲ産物であってもよい）。鋳型配列は、アセンブルされたＤＮＡ断片としてクローン化されることが望まれる全配列を提供し得る。アセンブリ用のＤＮＡ断片は、鋳型の異なるセクションから、例えばＰＣＲによって複製され、生成された隣接するＰＣＲ産物は配列が部分的にオーバーラップする場合がある（すなわち、１つのＰＣＲ産物の終わり近くの配列は、アセンブリ用の次のＰＣＲ産物の開始近くに同じ配列を含む場合がある）。オーバーラップは部分的であってもよいが、相補的な粘着末端を提供するには十分な長さである。一実施形態では、１つのＰＣＲ産物（アセンブリ用のＤＮＡ断片）内のオーバーラップ配列及び次の隣接するＰＣＲ産物（アセンブリ用のＤＮＡ断片）のオーバーラップは、少なくとも２塩基対の長さであってもよい。別の実施形態では、１つのＰＣＲ産物（アセンブリ用のＤＮＡ断片）内のオーバーラップ配列及び次の隣接するＰＣＲ産物（アセンブリ用のＤＮＡ断片）のオーバーラップは、少なくとも３塩基対の長さであってもよい。別の実施形態では、１つのＰＣＲ産物（アセンブリ用のＤＮＡ断片）内のオーバーラップ配列及び次の隣接するＰＣＲ産物（アセンブリ用のＤＮＡ断片）のオーバーラップは、３塩基対〜６塩基対の長さであってもよい。別の実施形態では、１つのＰＣＲ産物（アセンブリ用のＤＮＡ断片）内のオーバーラップ配列及び次の隣接するＰＣＲ産物（アセンブリ用のＤＮＡ断片）のオーバーラップは、３塩基対〜５塩基対の長さであってもよい。別の実施形態では、１つのＰＣＲ産物（アセンブリ用のＤＮＡ断片）内のオーバーラップ配列及び次の隣接するＰＣＲ産物（アセンブリ用のＤＮＡ断片）のオーバーラップは、４塩基対〜５塩基対の長さであってもよい。別の実施形態では、１つのＰＣＲ産物（アセンブリ用のＤＮＡ断片）内のオーバーラップ配列及び次の隣接するＰＣＲ産物（アセンブリ用のＤＮＡ断片）のオーバーラップは、３塩基対〜４塩基対の長さであってもよい。別の実施形態では、１つのＰＣＲ産物（アセンブリ用のＤＮＡ断片）内のオーバーラップ配列及び次の隣接するＰＣＲ産物（アセンブリ用のＤＮＡ断片）のオーバーラップは、４塩基対の長さであってもよい。
【００７５】
相補的なオーバーハングを含み得るアセンブリ用のＤＮＡ断片を形成するため、鋳型ＤＮＡの部分的にオーバーラップするセクションを増幅するようにＰＣＲプライマーを配置してもよい。ＰＣＲ反応は、制限認識配列を含むアダプター配列（すなわち、ユニバーサルアダプター配列、例えば制限酵素認識配列は、維持された複合要素及び／又は短縮複合要素の制限酵素認識配列と同じ配列を含んでもよい）、加えて、アセンブリのための隣接／連続断片のオーバーハングに相補的となり得るオーバーハングの配列を追加し得る。連続／隣接断片間で、例えば４ｂｐオーバーラップする配列を含むオーバーハングは、制限酵素による消化の後に形成される場合がある（すなわち、ＰＣＲ産物間のオーバーラップは、制限酵素認識配列を含むアダプター配列全体内の例えば４ｂｐの配列を指す）。
【００７６】
ＰＣＲプライマーは、ＤＮＡ断片のアダプター配列を更に提供し得て、これは、直線化メチル化核酸（第１の直線化メチル化核酸、第２の直線化メチル化核酸、又は更なる直線化メチル化核酸等）とのライゲーション及び中間ベクターの形成のための相補的なオーバーハングを形成する。ＰＣＲプライマーは、制限酵素がＰＣＲ産物を切断してアダプター配列を形成することを指示するように配置された制限酵素認識配列を更に提供し得る。ＰＣＲプライマーにより提供される制限酵素認識配列は、制限酵素認識配列であってもよい。制限酵素認識配列は、維持された複合要素及び／又は短縮複合要素の制限酵素認識配列と同じ配列を含んでもよい。
【００７７】
一実施形態では、適合された中央ＤＮＡ断片は、ライゲーションが意図される連続／隣接ＤＮＡ断片で提供されるネイティブオーバーハング配列と同じ配列であるオーバーラップするネイティブ配列の領域を含む。例えば、互いとのアセンブリのための隣接／連続ＤＮＡ断片が鋳型からコードされている場合、それらは各々、鋳型のオーバーラップ／同一配列領域を含んでもよく、これは、その後のライゲーションにおいて２つの隣接／連続配列間の相補的なネイティブオーバーハングを形成し得る。一実施形態では、適合された中央ＤＮＡ断片は、認識制限酵素によって一旦切断されると、中央のＤＮＡ断片のネイティブオーバーハングを形成するように配置されている、オーバーラップするネイティブ配列の２つの領域を含む。
【００７８】
上記方法は、アセンブルされたＤＮＡ断片の挿入のため直線化されたデスティネーションベクターを提供する工程を更に含んでもよい。直線化されたデスティネーションベクターは、アセンブルされたＤＮＡ断片の維持されたオーバーハングに相補的なそれぞれのオーバーハング配列を含んでもよい。直線化されたデスティネーションベクターのオーバーハング配列は、第１の適合ＤＮＡ断片の維持されたオーバーハング配列に相補的な第１オーバーハング、及び第２の適合ＤＮＡ断片の第２の維持されたオーバーハング配列に相補的な第２のオーバーハングを含んでもよい。
【００７９】
直線化されたデスティネーションベクターは、アセンブルされたＤＮＡ断片と同じ相補的オーバーハングを提供するように配置された制限酵素（複数の場合もある）で環状デスティネーションベクターを切断することにより提供され得る。例えば、直線化されたデスティネーションベクターは、維持された及び／又は短縮複合要素の制限酵素認識配列を認識する制限酵素（複数の場合もある）で環状デスティネーションベクターを切断することにより提供され得る。直線化されたデスティネーションベクターは、クローニングベクターであってもよい。
【００８０】
一実施形態では、維持された複合要素は、維持された複合要素を含む全ての中間ベクターに同じ配列を含む。一実施形態では、短縮された複合要素は、全ての中間ベクターに同じ配列を含む。一実施形態では、維持された複合要素は、短縮された複合要素と同じ制限酵素認識配列を含む。一実施形態では、中間ベクターの維持された複合要素及び／又は短縮された複合要素の制限酵素認識配列は同じである。特に、同じ制限酵素種を、中間ベクター、及び任意にデスティネーションベクターの制限に使用してもよい。
【００８１】
本発明の瘢痕のないアセンブリ方法で使用されるベクターは、高コピー数ベクターであってもよい。例えば、第１及び／又は第２の直線化メチル化核酸は、直線化メチル化高コピー数ベクターを含んでもよい。
【００８２】
一実施形態では、本発明のＤＮＡアセンブリ方法は、単一の組成物で実行される（すなわち、いわゆる「ワンポット」プロセス）。例えば、ＤＮＡアセンブリプロセス（制限酵素による消化とライゲーションを含む）は、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを含む単一の組成物において、環状インサートプラスミド又は直線化インサート断片、並びに環状中間ベクター及び／又はデスティネーションベクターを使用して、又はその直線化バージョンを使用して行われ得る。
【００８３】
一実施形態では、核酸のメチル化は、メチラーゼ認識配列を認識するメチラーゼを発現するように改変された細菌株で実施される。一実施形態では、核酸のメチル化はｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。
【００８４】
本発明の別の態様によれば、本明細書に記載のＤＮＡメチラーゼを発現するように改変された改変細菌株が提供される。
【００８５】
ＤＮＡメチラーゼを発現するように改変された改変細菌株は、大腸菌株であってもよい。改変は、大腸菌ゲノムのａｒｓＢ遺伝子座へのメチラーゼ遺伝子の挿入を含んでもよい。ＤＮＡメチラーゼを発現するように改変された改変細菌株は、ベクターと、メチラーゼ発現カセットと、それに続くゼオシン抗生物質選択カセット等の抗生物質選択カセットとのアセンブリにより形成され得て、大腸菌のａｒｓｂ遺伝子に由来する相同配列が両側に隣接してもよく、その後、これを鋳型として使用してＰＣＲを実行し、上記の要素を含む直鎖ＤＮＡを生成して、この断片と再度組み換えを行い、その後、ゼオシン等の抗生物質で選択して、大腸菌ゲノムのａｒｓＢ遺伝子座に安定的に挿入されたメチラーゼ発現カセット及び選択マーカーを含む細菌株を生成する。
【００８６】
本発明の別の態様によれば、本発明による核酸分子を製造するための、本明細書に記載されるＤＮＡメチラーゼを発現するように改変された改変細菌株の使用が提供される。
【００８７】
改変された細菌株は大腸菌であってもよい。
【００８８】
本発明の別の態様によれば、本発明による核酸を含む組成物が提供される。該組成物はバッファーを含んでもよい。
【００８９】
本発明の別の態様によれば、本明細書の本発明による１つ以上の核酸を含むキットが提供される。
【００９０】
上記キットは、制限酵素及び／又はＴ４  ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを更に備えてもよい。追加又は代替として、該キットは、本明細書の本発明によるＤＮＡメチラーゼを発現するように改変されている改変細菌株及び／又はＤＮＡメチラーゼを含んでもよい。
【００９１】
追加又は代替として、上記キットは１つ以上のバッファー溶液を含んでもよい。追加又は代替として、上記キットは、クローン選択のための抗生物質を含んでもよい。
【００９２】
核酸、バッファー、細菌株、制限酵素、リガーゼ、及びメチラーゼの１つ以上、又は全てをエッペンドルフチューブ等の容器に入れて提供してもよい。
【００９３】
本発明の別の態様によれば、本発明による核酸を含む宿主細胞が提供される。
【００９４】
本発明の別の態様によれば、目的のＤＮＡ断片をアセンブルするための本発明による核酸の使用が提供され、任意に、該使用はｉｎ  ｖｉｔｒｏである。
【００９５】
本明細書において「瘢痕のない」又は「瘢痕のないアセンブリ」という用語に対する言及は、複数の配列からアセンブルされたＤＮＡの配列を指すことを意図し、配列間の接合部がＤＮＡアセンブリプロセスの制限及びライゲーションの望ましくない塩基対等のアーチファクトを含まない。例えば、ＤＮＡの瘢痕のないアセンブリは、アセンブルされたＤＮＡ断片に追加の配列を導入しない。一部の文献では、シームレスＤＮＡアセンブリとも呼ばれている。一例では、相補的な粘着末端を提供してＤＮＡ断片の接合を促進するように設計されたアダプター配列は、接合された配列間の「瘢痕」とみなされる場合がある。
【００９６】
本明細書において「アダプター」という用語に対する言及は、相補的な粘着末端を提供してＤＮＡ断片の接合を促進するように設計された配列を指すことを意図している。
【００９７】
オーバーラップする認識配列の文脈における「オーバーラップ」又は「オーバーラップする」という用語に対する言及は、別の酵素の認識配列を指定するヌクレオチド配列の或る位置にある、１つの酵素の認識配列の少なくとも一部（例えば、認識配列内のＮ以外の任意のヌクレオチド）を指すことを意図している（すなわち、オーバーラップする配列は、少なくとも幾つかの共通のヌクレオチドを共有する）。
【００９８】
オーバーハング／粘着末端配列の文脈における「ネイティブ」という用語に対する言及は、核酸に挿入又は接合される目的のＤＮＡ断片の天然の非適合配列を指すことを意図している。例えば、目的の鋳型ＤＮＡの配列に対して配列が設計又は補正されることはない。これは、ＤＮＡアセンブリを促進するためにベクター配列によって決定されるオーバーハングとは対照的に、アセンブルされた配列に瘢痕として導入される可能性がある。
【００９９】
「単一のアセンブルされたＤＮＡ分子」に対する言及は、単一の種類の分子を指すことを意図しており、同じ分子のコピー数を指すことを意図していない。特に、任意の所与の反応又は組成物において、単一のアセンブルされたＤＮＡ分子の複数のコピーがあってもよい。
【０１００】
「高コピー数」プラスミド／ベクターに対する言及は、プラスミドであるｐＵＣプラスミドに由来する１．変異ｐＭＢ１複製起点（Ｖｉｅｉｒａ  ａｎｄ  Ｍｅｓｓｉｎｇ  １９８２．Ｇｅｎｅ  １９：２５９−２６８；Ｖｉｅｉｒａ  ａｎｄ  Ｍｅｓｓｉｎｇ  １９８７．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：３−１１；Ｍｅｓｓｉｎｇ  １９８３．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：２０−７８；Ｌｉｎ−Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：３３８５−３３９３、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）、及び２．ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドに由来するＣｏｌＥ１由来の複製起点（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ−ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／ｐｄｆ／ｓｔｒａｔａ／２１２２０５．ｐｄｆ−ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｐｈａｇｅｍｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃａｔａｌｏｇ  ＃２１２２０５，＃２１２２０６．＃２１２２０７及び＃２１２２０８，Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ａ．０１、参照により本明細書に組み込まれる）等の複製起点を有するプラスミドを含むがそれらに限定されない、１細胞当たり１００コピー以上のコピー数を有するものを指す場合がある。ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔによって保持される複製起点は、単一のヌクレオチド変異を有するｐＵＣに由来する。低コピー及び高コピーのプラスミド／ベクター制御に関する特定の指針は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１），Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｗ  Ｒｕｓｓｅｌｌの第１巻、第１．４頁、表１−１及び第１巻、第４．２頁、表４−１で見ることができる。
【０１０１】
「低コピー数」プラスミド／ベクターに対する言及は、１細胞当たり１００コピー未満のコピー数を有するものを指してもよく、限定されないが、１．ｐＡＣＹＣプラスミドに由来するｐ１５Ａ複製起点（Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ  １９７８．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４：１１４１−１１５６、参照により本明細書に組み込まれる）；２．ｐＳＣ１０１プラスミドに由来するｐＳＣ１０１複製起点（Ｓｔｏｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８２．Ｇｅｎｅ  １８：３３５−３４１、参照により本明細書に組み込まれる）；３．Ｆプラスミドに由来するＦ複製起点（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３４：２１３−２１８；Ａｓａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｇｅｎｅ  １９１：６９−７９、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる）；４．ｐＢＲ３２２プラスミドに由来するｐＭＢ１複製起点（Ｂｏｌｉｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．１９７７．Ｇｅｎｅ  ２：９５−１１３、参照により本明細書に組み込まれる）、５．ＣｏｌＥ１プラスミドに由来するＣｏｌＥ１複製起点（Ｋａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．１９７９．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：２６８−２８０、参照により本明細書に組み込まれる）等の複製起点を有するプラスミドが挙げられる。
【０１０２】
当業者は、本発明の一実施形態又は態様の任意の特徴が、必要に応じて、本発明の他の実施形態又は態様に適用可能であり得ることを理解するであろう。
【０１０３】
ここで、本発明の実施形態を、単なる例示として、添付の図面を参照してより詳細に説明する。
【０１０４】
実施例１−単一の制限酵素を使用するメチル化支援モジュールアセンブリ（ＭｅｔＣｌｏ）
【０１０５】
緒言
Ｍｅｔｃｌｏの概要
本発明者らは、ここに、Ｍｅｔｃｌｏという名称の改良されたＩＩＳ型制限酵素に基づく階層型アセンブリ方法を開発し、これにより、使用する制限酵素の数を１つに削減する。本発明者らは、アセンブリに使用されるのと同じ酵素に対して特異的な一対のＩＩＳ型制限部位をアセンブリベクターに付加し、ＤＮＡメチル化によって選択的にブロックされるようにして、これを達成した。特定のメチラーゼを欠く正常な株へのアセンブルされたＤＮＡの形質転換は、隣接する制限部位のブロックを解除し、同じＩＩＳ型制限酵素を使用して放出され得て、次いでＤＮＡアセンブリのその後のラウンドに使用され得る、アセンブルされた断片を保持するプラスミドをもたらす。本発明者らは、一般的に使用されている３つの市販のＩＩＳ型酵素、ＢｓａＩ、ＢｐｉＩ、及びＬｇｕＩのオーバーラップするメチル化／制限部位をブロックする能力について多くのメチラーゼを試験し、それぞれに適したメチラーゼ、すなわちＭ．Ｏｓｐ８０７ＩＩ（ＢｓａIの場合、オーバーラップ配列ＧＡＣＮＮＧＧＴＣＴＣＮ＾ＮＮＮＮを持つ）、Ｍ２．ＮｍｅＭＣ５８ＩＩ（ＢｐｉＩの場合、
【化１Ｅ】
2020518247.tif 000007
を同定した（メチル化塩基又は反対側の塩基に下線を引き、メチラーゼ活性を指定するのに必要な追加の塩基は太字、制限酵素認識配列を斜体、３つの修飾は全てｍ６Ａ  Ｎ６−メチルアデニンである）。本発明者らは、これらのメチラーゼの構成的発現のための発現カセットの染色体コピーを保持する大腸菌株を開発し、これらの株で増殖したＤＮＡが、制限部位が対応するメチラーゼ認識配列とオーバーラップする場合に制限酵素による消化に抵抗性であることを示した。次に、本発明者らは、メチラーゼ／制限酵素の各ペアに対して４つの断片を、同じ制限酵素によって放出され得る単一の断片にアセンブルするための原理実証Ｍｅｔｃｌｏシステムを構築した。最後に、本発明者らは、ＢｓａＩを使用する２段階の２８×７．７ｋｂ  ＤＮＡから２１８ｋｂ  ＤＮＡの階層型アセンブリのためのＭ．Ｏｓｐ８０７ＩＩ／ＢｓａＩに基づくＭｅｔｃｌｏシステムの有用性を示した。
【０１０６】
材料及び方法
プラスミド構築
プラスミドは、標準的な制限酵素及びライゲーションに基づくクローニング技術によって構築された。クローニング用のＤＮＡ断片は、ＰＣＲ又は遺伝子合成（ＩＤＴ又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって生成された。４つの断片に由来する約１ｋｂ  ＤＮＡのモジュール式アセンブリの原理の証明のため、モジュール式アセンブリアクセプターベクター骨格はアンピシリン耐性ＭｏｃｌｏベクターｐＩＣＨ４７７３２（Ａｄｄｇｅｎｅから入手可能であり、多重遺伝子コンストラクトの標準化されたアセンブリ用のモジュール式クローニングシステムで説明されている。Ｗｅｂｅｒ  Ｅ，Ｅｎｇｌｅｒ  Ｃ，Ｇｒｕｅｔｚｎｅｒ  Ｒ，Ｗｅｒｎｅｒ  Ｓ，Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ  Ｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１１  Ｆｅｂ  １８；６（２）：ｅ１６７６５．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１６７６５）に基づき、ドナープラスミド骨格は、ｐＩＣＨ４７７３２のアンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子で置き換えることにより構築されたカナマイシン耐性ベクターに基づく。２８個の断片に由来する２００ｋｂ  ＤＮＡの階層型アセンブリの場合、モジュール式アセンブリアクセプターベクターはＦ複製起点を含むゲンタマイシン又はカナマイシンに耐性の低コピーＢＡＣベクター骨格に基づき、ドナープラスミド骨格は、ｐ１５Ａ又はＦの複製起点を含むカナマイシン耐性の低コピーベクター骨格に基づく。メチラーゼ過剰発現用のプラスミドは、Ｆ複製起点を含むカナマイシン耐性の低コピーＢＡＣベクター骨格に基づいて構築される。メチラーゼ遺伝子はＪ２３１００合成プロモーターの制御下にあり、組み換えによる大腸菌ゲノムへの安定した統合を促進するため、ゼオシン選択カセットと並んでａｒｓＢ遺伝子座の相同配列が両側に隣接する。メチラーゼアッセイ用の鋳型プラスミドは、アンピリシリン耐性ｐＩＣＨ４７７３２に基づく。
【０１０７】
メチラーゼ発現株の生成
特定のメチラーゼの安定した発現を伴う大腸菌株を、組み換えによって生成した。簡潔に言えば、メチラーゼ遺伝子と、ゼオシン選択マーカーと、隣接するａｒｓＢ相同配列とを含むＤＮＡ断片を、対応するメチラーゼ発現ＢＡＣプラスミドを鋳型として使用するＰＣＲによって生成した。上記断片を、ＤＨ１０Ｂ細胞でのラムダレッド（ｌａｍｂｄａ  ｒｅｄ）の組み換えに使用し、続いてゼオシン選択によりメチラーゼ発現カセットをａｒｓＢ遺伝子座に挿入した。正しい染色体挿入を有するクローンを、ＰＣＲ及びシーケンシングによって検証した。メチラーゼ発現株は、抗生物質を選択せずに安定的に維持され得る。
【０１０８】
モジュール式アセンブリ
４つの断片に由来する約１ｋｂ  ＤＮＡのモジュール式アセンブリの原理を証明するため、ＤＨ５アルファ細胞から調製した各ドナープラスミド６０ｆｍｏｌ、適合性メチラーゼを発現するＤＨ１０Ｂ株から調製したアセンブリベクター６０ｆｍｏｌ、１０００Ｕ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）、及び１×Ｔ４リガーゼバッファー（ＮＥＢ）２０μｌ中の５Ｕ  ＢｓａＩ（ＮＥＢ）又はＢｐｉＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）又は２．５Ｕ  ＬｇｕＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用して、アセンブリ反応を設定した。反応条件は以下の通りであった：３７℃で１５分間、続いて３７℃で２分間＋１６℃で５分間を４５サイクル、その後３７℃で２０分間、及び８０℃で５分間。アセンブルしたサンプルをＤＨ５アルファ化学コンピテント細胞に形質転換し、ＡＩＸ選択（アンピシリン１００ｕｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧ  １００μＭ、Ｘ−Ｇａｌ  ５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレートに３７℃で一晩播種した。白色コロニーを増殖させ、ＤＮＡシーケンシングによりスクリーニングした。
【０１０９】
２８個の断片に由来する約２００ｋｂのＤＮＡの階層型アセンブリの場合、アセンブリを２段階で実行した。段階１で、ＤＨ１０Ｂ細胞から調製した各ドナープラスミド１５ｆｍｏｌ、ＤＨ１０Ｂ−Ｍ．Ｏｓｐ８０７ＩＩ細胞から調製したアセンブリベクター１５ｆｍｏｌ、１０００Ｕ  Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ）、及び１×Ｔ４リガーゼバッファー（ＮＥＢ）２０μｌ中の５Ｕ  ＢｓａＩ（ＮＥＢ）を使用して、１群当たり７つの断片をアセンブルした。反応条件は上記と同じであった。次に、０．０５ｕｍセルロースフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、室温で１時間、５０ｍｌのｄＨ２Ｏに対してアセンブルしたサンプルを滴下透析した（ｄｒｏｐ−ｄｉａｌｙｚｅｄ）。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ及び１ｍｍエレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、０．９ｋＶ  １００Ωでのエレクトロポレーションにより、透析サンプル５μｌをＮＥＢ−１０ベータエレクトロコンピテント細胞２５μｌに形質転換した。エレクトロポレーション後、１ｍｌのＬＢ培地を添加して細胞を回復させ、３７℃、２２０ｒｐｍで１時間インキュベートした。細胞を、３７℃で一晩、ＧＩＸ選択（ゲンタマイシン２．５μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧ１００μＭ、Ｘ−ｇａｌ５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレートに播種した。ＸｈｏＩを使用する制限消化により、白色コロニーを増殖させ、スクリーニングした。
【０１１０】
段階２では、以下の変更を加えた段階１と同様のプロトコルを使用して、約２００ｋｂのＤＮＡをアセンブルした：３０ｆｍｏｌの各ドナープラスミド及び１５ｆｍｏｌのアセンブリベクターをアセンブリ反応に使用した；モジュール式アセンブリの後、滴下透析工程の前に、３７°Ｃで４５分間インキュベートするために１０Ｕ  ＢｓａＩをアセンブリ反応液に添加し、その後８０°Ｃで５分間熱失活させた。形質転換された細胞をＫＩＸ選択（カナマイシン３０μｇ／ｍｌ、ＩＰＴＧ１００μＭ、Ｘ−ｇａｌ５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレートに播種した。２番目と３番目の５４ｋｂ断片（ＴＡＣＣＣＡＣＧＴＧＡＴＴＣＡＣＧＣＴＧ及びＡＴＣＣＴＡＣＡＧＡＣＴＣＧＣＴＧＴＧＧ）間の接合部を検出するプライマーを使用するＰＣＲにより、白色コロニーをスクリーニングした。選択したＰＣＲ陽性クローンを、パルスフィールド電気泳動を用いて、ＸｈｏＩ又はＢｓａＩを使用する制限消化によりスクリーニングした。
【０１１１】
結果
Ｍｅｔｃｌｏシステムは、標準ＩＩＳ型制限酵素に基づくワンポットＤＮＡアセンブリシステムによるものであり、次の段階のアセンブリでアセンブルされたＤＮＡを放出するためアセンブリベクター骨格にＩＩＳ型制限部位の追加ペアを付加した。アセンブリプロセスで使用されるＩＩＳ型酵素とは異なる制限部位を使用するＭｏｃｌｏシステムとは異なり、Ｍｅｔｃｌｏは同じ酵素に対する制限部位を使用する。アセンブルされたプラスミドがワンポットアセンブリ反応でこの酵素によって切断されるのを防ぐため、Ｍｅｔｃｌｏは特定のメチラーゼを使用してメチラーゼ認識配列とオーバーラップするＩＩＳ型制限部位をメチル化し、ベクター骨格のこれらのＩＩＳ型制限部位をブロックする。アセンブルされたプラスミドが特定のメチラーゼを欠く大腸菌株に形質転換されるとメチル化が失われるため、アセンブリ反応で使用されるのと同じＩＩＳ型制限酵素によってアセンブルされたプラスミドからのアセンブルされた断片の放出が可能になる。したがって、得られるＭｅｔｃｌｏシステムは、様々な用途の中で、単一のＩＩＳ型制限酵素を用いるワンポット反応を使用する、ＤＮＡ断片の階層型アセンブリを可能にする。
【０１１２】
Ｍｅｔｃｌｏシステムの鍵は、ベクター骨格中のメチラーゼ認識配列とオーバーラップするＩＩＳ型制限部位をブロックする好適なメチラーゼの同定である。適切なメチラーゼの選択には幾つかの基準がある。まず第１に、オーバーラップするメチル化／制限部位のメチル化は、ＩＩＳ型制限酵素の作用をブロックしなければならない。メチル化プロセスは、精製ベクタープラスミドのｉｎ  ｖｉｔｒｏメチル化によって、又はｉｎ  ｖｉｖｏでメチラーゼを発現する株でベクタープラスミドを増殖させることによって起こり得る。ベクター調製プロセスのコスト及び時間が削減されるため、ｉｎ  ｖｉｖｏメチル化が好ましい。第２に、メチラーゼ認識配列は、ＩＩＳ型制限部位と同一であったり、完全に囲まれていてはならず、オーバーラップするメチル化／制限部位に対するメチラーゼの作用を指定するには、追加の塩基対がなくてはならない。この要件の理由は、アセンブリベクター内の同じ酵素に対して２組のＩＩＳ型制限部位があるためである。ベクター骨格内の１つのペアはメチラーゼによってブロックされる必要があるが、ネガティブ選択マーカーインサート内の他のペアはブロックされてはならない。メチラーゼ認識配列がＩＩＳ型制限部位と同一であるか、ＩＩＳ制限部位に囲まれている場合、ネガティブ選択マーカーインサート内のペアを含めて、この特定のＩＩ型制限酵素に対するアセンブリベクター内の全ての制限部位が、メチル化によってブロックされ；得られるメチル化アセンブリベクターは、ＩＩＳ型酵素によって全く切断されないため、ＤＮＡアセンブリには使用不可能である。第３に、メチラーゼ活性を指定するための追加の塩基対は、ＩＩＳ型制限酵素によって生成される接着末端配列とオーバーラップしてはならない。これは、ＤＮＡアセンブリ用のアダプター配列の設計において最大限の柔軟性を維持する。
【０１１３】
本発明者らは、ＩＩＳ型制限酵素ＢｓａＩ、ＢｐｉＩ、及びＬｇｕＩの制限部位をブロックする予測された能力を有するメチラーゼを探索した。これらは、ＩＩＳ型に基づくアセンブリシステムで使用される一般的なＩＩＳ型制限酵素である。本発明者らは、上に列挙されるものに加えて幾つかの追加基準を使用し、試験用の候補メチラーゼを選択した。本発明者らは、メチラーゼが理想的には大腸菌の増殖温度で活性となるよう、ｉｎ  ｖｉｖｏメチル化によりメチル化プラスミドを生成することを目的とした。また、本発明者らは、認識配列が長くなると、大腸菌宿主ゲノム及びアセンブリベクター骨格のより少ない塩基が、偶然にメチル化基質となり得ることから、より長い配列（５ｂｐ〜６ｂｐ）を認識するメチラーゼを選んだ。これにより、メチル化の効率が潜在的に向上し、異種ＤＮＡメチル化が宿主遺伝子機能に及ぼす悪影響の可能性を減少する。さらに、本発明者らは、ベクター構築工程の間の潜在的な制限の課題を回避するため、非メチル化配列に対する制限活性を欠くＩＩ型制限／修飾システムに由来する単一サブユニットメチラーゼを選んだ。最後に、メチル化がオーバーラップするメチル化／制限部位をブロックする可能性を高めるため、本発明者らは、制限部位の中央近くの塩基を修飾するメチラーゼを選んだ。
【０１１４】
これらの基準に基づいて、本発明者らは試験のため以下のメチラーゼを選択した：
【化１Ｆ】
2020518247.tif 000008
本発明者らは、低コピーＢＡＣベクター（Ｆ複製起点を有する低コピーＢＡＣベクター骨格）からのＪ２３１００構成的合成プロモーターのもとで対応するメチラーゼを発現するＤＨ１０Ｂ細胞においてオーバーラップするメチル化／制限部位を保持するＣｏｌＥに基づく（すなわち、ＣｏｌＥ由来の）高コピー鋳型プラスミドを調製することにより、メチラーゼ活性をスクリーニングした。これにより、Ｍ．Ｏｓｐ８０７ＩＩ（ＢｓａＩの場合）、Ｍ２．ＮｍｅＭＣ５８ＩＩ（ＢｐｉＩの場合）、及びＭ．ＸｍｎＩ（ＬｇｕＩの場合）が更なる分析に適した候補として同定された（図１Ａ）。本発明者らは、次に、ゼオシン選択マーカーを含むメチラーゼ発現カセットを、ラムダレッド組み換えを使用してａｒｓＢ遺伝子座に統合し、染色体コピーからメチラーゼを過剰発現する安定株を生成し（Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．２０１３  Ｊｕｎ  ２４；１２：６０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７５−２８５９−１２−６０（ＰＭＩＤ  ２３７９９９５５））、これらのメチラーゼがｉｎ  ｖｉｖｏでオーバーラップするメチル化／制限部位をブロックする能力を試験した。試験ベクターには、メチル化配列とオーバーラップしないため野生型及びメチラーゼ発現株の両方において制限を許容することができる制限部位が１つ、並びに２つの１対１のＩＩＳ型制限部位を持つ１つの部位があり、それらの両方が対応するメチル化配列とオーバーラップしていることから、メチラーゼを発現する株でブロックされ得る。１対１の配置により、同じアッセイでニッカーゼ活性と並んで二本鎖制限活性を評価することができる（図１Ｂ）。３７℃にて５Ｕ（ＢｓａＩ、ＢｐｉＩ）又は２．５Ｕ（ＬｇｕＩ）の酵素を使用して１０μｌ反応液中で６０ｆｍｏｌ試験プラスミド（ｐＭＯＰ＿ＢｓａＩＮＣ、ｐＭＯＰ＿ＢｐｉＩＮＣ及びｐＭＯＰ＿ＬｇｕＩＮＣ）を１時間消化した後、ＥｔＢｒ染色によるアガロースゲル電気泳動によってＤＮＡを分析した。結果は、約６００ｂｐの断片の生成の欠如によって実証されるように、試験条件下で、３つのメチラーゼがオーバーラップする部位の制限をブロックすることを示す（図１Ｃ）。
【０１１５】
次に、本発明者らは、これらのメチラーゼをワンポットＤＮＡアセンブリに使用して、原理証明のＭｅｔｃｌｏ  ＤＮＡアセンブリシステムを開発した（図２は例としてＢｓａＩ−ＭＯｓｐ８０７ＩＩを示す）。これらのシステムでは、オーバーラップするメチル化／制限部位がアセンブルされるドナーＤＮＡインサートの両側に隣接する。アセンブルされるＤＮＡインサートを含むドナープラスミドは、対応するメチラーゼを欠く通常の大腸菌株で調製されるため、制限部位はブロックされず、アセンブリ反応において酵素によりドナーインサートが放出され得る。アセンブリベクターは、ドナープラスミドとは異なる選択マーカーと、１対１ＩＩＳ型制限部位が両側に隣接するＬａｃＺ選択マーカーを保持している。各１対１部位について、２つのＩＩＳ型制限部位は同じ接着末端を生成する。ベクター骨格に近い外側の部位は、メチル化配列とオーバーラップするが、ＬａｃＺインサートに近い内側の部位はオーバーラップしない。デスティネーションベクターは、対応するメチラーゼを発現する大腸菌株から調製される。その結果、内側のＩＩＳ型部位のみがアセンブリ反応で機能した。反応中、ＬａｃＺインサートは、内側のＩＩＳ型部位に対する酵素の作用によりベクター骨格から放出され；デスティネーションベクターとのドナーインサートのライゲーションにより、デスティネーションベクターの骨格内に由来するメチル化によってブロックされるＩＩＳ型制限部位が生じ；解放されたＬａｃＺインサートのデスティネーションベクターの骨格との再ライゲーションは、内側の部位がブロックされていないため制限に感受性である１対１ＩＩＳ型部位の再生をもたらす。その結果、この反応は、ドナー断片のデスティネーションベクター骨格に対するライゲーションに好都合である。次いで、ｍｏｃｌｏ反応物を、ＩＰＴＧ及びＸ−Ｇａｌを含有するＬＢプレートを使用するＬａｃＺ発現のスクリーニングのため、特定のメチラーゼ活性を欠く正常大腸菌株へと形質転換する。ＬａｃＺ活性を欠く白色コロニーには、アセンブルに成功したプラスミドが含まれているはずである。アセンブルされたＤＮＡ断片には、ドナーベクターと同じく、メチラーゼ認識配列とオーバーラップする、隣接するＩＩＳ型制限部位がある。その結果、これによって、必要に応じて複数のラウンドで同じ制限酵素等を使用して、次のレベルのモジュール式アセンブリの更なるラウンドが可能になる。
【０１１６】
本発明者らは、４つの断片からのアセンブリのため３つの酵素のシステムを試験した（表１）。ドナーベクターはカナマイシン耐性であり、デスティネーションベクターはアンピシリン耐性である。デスティネーションベクターは、対応するメチラーゼ発現株から調製された。選択後、ミニプレップ用に８つの白色コロニーを選び、サンガーシーケンシングで分析した。シーケンシングの結果は、３つのＭｅｔｃｌｏシステムのそれぞれでクローンの１００％（８／８）が正しいことを示す（表１）。これにより、ＢｓａＩ、ＢｐｉＩ、ＬｇｕＩ等の単一の制限酵素を使用するモジュール式アセンブリに対するＭｅｔｃｌｏの有用性が確認された。
【０１１７】
大きなＤＮＡコンストラクトの階層型アセンブリのためのＭｅｔｃｌｏの有用性を更に調べるため、本発明者らは、ＢｓａＩ制限酵素を２段階で使用して２８×７．７ｋｂ断片から２１８ｋｂ  ＤＮＡ断片をアセンブルした。段階１では、ＢｓａＩに基づくＭｅｔｃｌｏシステムを使用して、ＢｓａＩ部位を含まない７．７ｋｂの２８個のＤＮＡ断片を、１群当たり７個で、４片の５４ｋｂ断片へとアセンブルした。段階２では、４片の５４ｋｂ断片が単一の２１８ｋｂ断片へとアセンブルされた。最終の２１８ｋｂ断片は、ＧＣ含有量が約４８％の非反復配列で構成されている。制限消化は、段階１のアセンブリで約５０％の成功率（２／４〜３／４クローンが正しい）、段階２のアセンブリで約２０％の成功率（２７個のうち１４個をＰＣＲで検証し、その８個うち３個を制限消化によって検証した）（表２）。これにより、Ｍｅｔｃｌｏシステムは、単一のＩＩＳ型制限酵素を使用する大きなＤＮＡコンストラクトの階層型アセンブリに使用され得ることが確認された。
【０１１８】
考察
本発明者らは、ここに、同じ制限酵素によって放出可能なアセンブルされたＤＮＡを生成するＢｓａＩ、ＢｐｉＩ、ＬｇｕＩ等の一般的なＩＩＳ型制限酵素を使用するＤＮＡのワンポットアセンブリのためのＩＩＳ型制限酵素に基づく改変型ＤＮＡアセンブリシステムであるＭｅｔｃｌｏを提示する。これにより、単一のＩＩＳ型制限酵素を使用する、大きなＤＮＡコンストラクトの階層型アセンブリが可能になる。該システムは、オーバーラップするメチル化／制限部位のｉｎ  ｖｉｖｏメチル化のためのベクター調製工程中にメチラーゼ過剰発現株を使用して、ベクターの選択的制限部位をブロックする。アセンブリプロセスは、ワンポット反応を使用するＩＩＳ型ＤＮＡアセンブリシステムと同じであるため、既存のシステムの単純さを維持する。パーツの調製及び形質転換の工程は、標準Ｍｏｃｌｏシステムと同様に正常株を利用し、現在のＩＩＳ型アセンブリシステムに類似する、ＤＮＡアセンブリに通例のクローニング株の使用を可能にする。
【０１１９】
Ｍｅｔｃｌｏシステムには、既存のＩＩＳ型制限酵素に基づく階層型ＤＮＡアセンブリシステムよりも多くの利点がある。第１に、Ｍｅｔｃｌｏアプローチは、コンポーネントパーツの構築中に内部制限部位を除去する負担を軽減する。２つ以上の酵素を使用する標準Ｍｏｃｌｏシステムと比較して、ＢｓａＩ及びＢｐｉＩに基づく単一酵素Ｍｅｔｃｌｏシステムは、ＧＣ含有率が５０％のランダムＤＮＡの場合、禁止制限部位の頻度を１ｋｂ当たりに１つから２ｋｂあたり１つに減らす６ｂｐカッターを使用し、ＬｇｕＩに基づくＭｅｔｃｌｏシステムは、頻度を約８ｋｂ当たり１つに更に減らす７ｂｐカッターを使用する。
【０１２０】
Ｍｅｔｃｌｏは、階層型ＩＩＳアセンブリシステムの柔軟性を向上させる。アダプターの適切な設計と抗生物質耐性ベクターの選択により、アセンブリの異なる段階に由来するアセンブルされたＤＮＡ断片を同じ制限酵素によって放出することができるため、既存のシステムを使用しては達成できない幾つかのアセンブリスキームの設計を潜在的に可能にする。これらには、レベルジャンピング−すなわち、アセンブリの異なる段階のパーツを使用するＤＮＡのアセンブリ−及びレベル挿入−すなわち、中間アセンブリ段階によるＤＮＡ断片のアセンブリ−が含まれる。これらのスキームは、既存のパーツを使用する大きなＤＮＡコンストラクトの修飾、及び追加の再利用性を高めるためのマルチパーツオープンリーディングフレーム（ｍｕｌｔｉ−ｐａｒｔ  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）等の複雑なパーツのサブアセンブリに有用である。
【０１２１】
アセンブリプロセス中のＤＮＡパーツの線形付加のための追加のスキームも考案され得る。例えば、内部メチル化ブロックＩＩＳ型制限部位が両側に隣接した選択マーカーを含むＤＮＡパーツが、ＤＮＡアセンブリの間使用され得る。アセンブルされたプラスミドは、その後、次の段階のアセンブリにおける選択マーカーの代わりに、追加のＤＮＡパーツを挿入するためのアセンブリベクターとして使用され得る。これは、機能性モジュールを含む一般的なアセンブリベクターの構築に特に有用である。
【０１２２】
Ｍｅｔｃｌｏはまた、異なるアセンブリ基準からのパーツの交換可能性を高める。パーツライブラリ及びアセンブリ基準の独立した開発は、異なるＩＩＳ型制限酵素を使用するアセンブリシステムに結び付く。例えば、植物生物学の場合、ＭｏｃｌｏはＢｓａＩ／ＢｐｉＩ（及びＥｓｐ３Ｉ）を使用し、ＧｏｌｄｅｎｂｒａｉｄはＢｓａＩ及びＢｓｍＢＩ（及びＢｔｇＺＩ）を使用し；大腸菌の場合、ＥｃｏｆｌｅｘはＢｓａＩ／ＢｓｍＢＩを使用し、ＣＩＤＡＲはＢｓａＩ／ＢｐｉＩを使用する。これは、異なるコレクション間でのパーツの交換可能性に制約を課す。単一のＩＩＳ型制限酵素を使用するＭｅｔｃｌｏシステムは、その制限酵素を使用する任意のシステムと適合性である。特に、ＢｓａＩに基づくシステムは、ＢｓａＩを使用する既存の全てのシステムと適合性である。これまで、ＢｓａＩがほとんどのＩＩＳ型制限酵素に基づく階層型モジュール式アセンブリシステムで使用されてきたことを考慮すると（ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．２０１６  Ｏｃｔ  ２１；５（１０）：１０５９−１０６９（ＰＭＩＤ  ２７０９６７１６）；ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．２０１６  Ｊａｎ  １５；５（１）：９９−１０３．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｓｙｎｂｉｏ．５ｂ００１２４（ＰＭＩＤ  ２６４７９６８８；ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ．２０１５  Ｓｅｐ  １８；４（９）：９７５−８６．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｓｂ５００３６６ｖ（ＰＭＩＤ  ２５８７１４０５）；及びＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１１  Ｆｅｂ  １８；６（２）：ｅ１６７６５．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１６７６５（ＰＭＩＤ  ２１３６４７３８）、ＢｓａＩに基づくＭｅｔｃｌｏシステムは、既存のほとんどのパーツライブラリと適合性のあるモジュール式アセンブリの基準として使用される可能性がある。
【０１２３】
ＤＮＡメチル化を使用して、アセンブリプロセスの間に内部ＩＩＳ型制限部位をブロックするＤＮＡアセンブリシステムが存在する。例えば、ＴＮＴアセンブリシステム（Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１６  Ｊａｎ  １３；６：１９２７８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１９２７８（ＰＭＩＤ  ２６７５８９４０））は、Ｍ．ＴａｑＩを使用して、オーバーラップするＥａｒＩ認識サイトをメチル化し、これにより、いずれも３ｂｐの粘着末端を与える７ｂｐカッターＬｇｕＩ（ＧＣＴＣＴＴＣＮ＾ＮＮＮ）及び６ｂｐカッターＥａｒＩ（ＣＴＣＴＴＣＮ＾ＮＮＮ）を使用するアセンブリシステムをもたらすため、ＤＮＡパーツに由来する単一の６ｂｐ配列（ＣＴＣＴＴＣ）を除去する必要がある。しかしながら、ＥａｒＩ制限部位とオーバーラップするＭ．ＴａｑＩ認識配列（ＴＣＧＡ）は接着末端配列（ＣＴＣＴＴＣＧ＾ＡＮＮ）に侵入するため、上記システムはアダプターの設計に制限を設け、一度に３つの断片しかアセンブルすることができず、またＬｇｕＩのみのアセンブリシステムに拡張することができなかった。別の例として、ＧｒｅｅｎｇａｔｅはＤＮＡアセンブリプロセス中にメチル化リンカーＤＮＡをパーツとして使用して、後続のアセンブリラウンドに新しいＢｓａＩ部位を導入した。しかしながら、得られるシステムは、ＤＮＡパーツの線形加算にのみ使用され得るため、該システムの使用は少数の転写ユニットを含むＤＮＡコンストラクトの構築に限定された。これらのシステムと比較して、Ｍｅｔｃｌｏシステムは、アダプター配列の外側のオーバーラップするメチル化／制限部位のｉｎ  ｖｉｖｏメチル化を使用して、Ｍｏｃｌｏシステムの階層型乗算アセンブリ（ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｖｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）スキームの利点を保持し、ＤＮＡアセンブリ用のアダプター配列の選択の自由を維持する。実際には、アセンブリプロセス中に最初及び最後のパーツとしてメチル化リンカーＤＮＡを付加することにより、同様の結果が達成され得る。しかしながら、これにより、アセンブリ内のパーツの数が２増加し、Ｍｅｔｃｌｏシステムでのｉｎ  ｖｉｖｏベクターメチル化アプローチと比較して、アセンブリの成功率は低下した。
【０１２４】
要約すると、Ｍｅｔｃｌｏシステムは、ｉｎ  ｖｉｖｏメチル化を使用してアセンブリベクター内の特定のＩＩＳ型制限部位をブロックすることにより、単一のＩＩＳ型制限酵素を使用する大きなＤＮＡ断片の階層型アセンブリを可能にする。該システムは、既存のＩＩＳ型制限酵素に基づくアセンブリ法を簡素化し、アセンブリスキームの設計の柔軟性を高める。特に、ＢｓａＩに基づくＭｅｔｃｌｏシステムは、ＢｓａＩを使用する既存の全てのパーツライブラリと適合性があり、標準ＩＩＳ型に基づくアセンブリシステムとして使用され得る。
【表１】
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【表２】
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【０１２５】
挿入複合要素の例
別のシナリオでは、より長いＤＮＡ配列を、ＤＮＡアセンブリ後にこれらの配列がアセンブルされたＤＮＡプラスミドの５’又は３’末端に付加されるように、アセンブリベクターのメチル化保護可能な制限部位と対向する保護不可能な制限部位との間に含めてもよい。この設計は、特殊化されたベクターを使用して、アセンブルされたプラスミドに共通要素を追加するのに便利である。
【０１２６】
ＢｓａＩに基づくＭｅｔｃｌｏを使用する３つの個別のドメインＤ１、ドメインＤ２、及びドメインＤ３を含むインサートプラスミドから開始して、３つの異なるドメインを有するタンパク質の発現のための転写ユニットのアセンブリの例を図３に示す。図Ａは、ＬａｃＺの５’のメチル化保護可能な制限部位と保護不可能な制限部位との間にプロモーター（廃棄配列）を含み、３’にポリＡ要素（「事前埋め込みベクター」）を含む、特殊なＭｅｔｃｌｏベクターを使用したＭｅｔｃｌｏアセンブリを示す。この特別な事前埋め込みベクターを使用するＭｅｔｃｌｏは、３つのインサートプラスミドからワンポット反応で３つのドメインの転写ユニットへのアセンブリを可能とし、アセンブルされた転写ユニットはプロモーターと、コード領域（Ｄ１、Ｄ２及びＤ３）と、Ｍｅｔｃｌｏアセンブリの次のラウンドでアセンブルされたプラスミドから放出され得るｐｏｌｙＡシグナルとからなる。これは、「維持された複合要素」を使用する標準Ｍｅｔｃｌｏとは対照的であるが、転写ユニットは５つの異なるインサートプラスミドからアセンブルされなければならない（図Ｂ）。図では、ＸＸＸＸ及びＹＹＹＹは、次のラウンドのＤＮＡアセンブリで放出され得るアセンブルされたＤＮＡ断片（転写ユニット）の５’及び３’末端のアダプター配列を表す。「事前埋め込みベクター」を使用するＤＮＡアセンブリの場合、これらの２つのアダプター配列は、ワンポットの３断片アセンブリに関与しないため、内部アダプター配列と同じになる可能性がある。ただし、標準Ｍｅｔｃｌｏベクターを使用するＤＮＡアセンブリの場合、ＸＸＸＸ及びＹＹＹＹのアダプター配列は、内部アダプター配列（ＡＡＴＧ、ＡＣＴＡ、ＡＴＣＴ及びＧＣＴＴ）とは異なっていなければならない。さらに、事前埋め込みベクターを使用する方法（図Ａ）には、１回の反応でアセンブルされる必要があるＤＮＡパーツの数が少ないという利点があり、成功率が向上する。欠点は、特殊化されたベクターの調製はより難しいことである。
【０１２７】
実施例２−瘢痕のないＤＮＡアセンブリ（瘢痕のないＭｅｔｃｌｏ）
Ｍｅｔｃｌｏの独特な適用は、ユニバーサルクローニングベクターの限られたセットを使用する、大きなＤＮＡコンストラクトの瘢痕のない階層型アセンブリのためのシステムである。ユニバーサルベクターを使用するＩＩＳ型に基づくＤＮＡアセンブリは、クローン化された断片の接着末端を変更するアセンブリベクター中の１対１のＩＩＳ型制限部位の特定の配置に依拠する。瘢痕のないアセンブリは、その後のアセンブリラウンド用のＤＮＡ断片によって規定される接着末端（瘢痕）を有するアセンブルされたＤＮＡ断片を生成するためのこれらのユニバーサルベクターを使用して実現され、これは、アセンブリの瘢痕をアセンブルされた配列に埋め込んだ。Ｍｅｔｃｌｏシステムを使用すると、階層型アセンブリの異なる段階で外側断片に対して同じユニバーサル接着末端を維持できる。これら３つの特徴を組み合わせることで、普遍的な瘢痕のないアセンブリシステムをもたらす。
【０１２８】
本発明者らは、ここに、ＢｓａＩ制限酵素を使用する瘢痕のないＭｅｔｃｌｏアセンブリシステムの原理について説明する。該システムは、クローン化された断片の接着末端を変更する３種類のユニバーサルクローニングベクターのセットに依拠する（図４Ａ）。３つのベクタータイプには、ＶＬ、ＶＭ、ＶＲという名称が付されている。ベクターは、それらのベクターにクローン化され得る、５’末端に接着末端ＣＴＣＣ及び３’末端にＣＧＡＧがあるＤＮＡ断片をクローン化するように設計されている。クローン化された断片は、ＢｓａＩによって一旦ベクターから放出されると、使用するベクターに応じて異なる接着末端を持つようになる。ベクターＶＬは、５’接着末端を保持し、３’接着末端を３’ＣＧＡＧ配列内の４つの塩基に変更する；ベクターＶＲは、３’接着末端を保持し、５’接着末端を５’ＣＴＣＣ配列内の４つの塩基に変更する；ベクターＶＭは両末端を内側の４つの塩基に変更するように設計されている。このようにして、ユニバーサルベクターのセットを使用して、インサート配列によって規定される接着末端を有するＤＮＡ断片を生成することができた。
【０１２９】
例として、ベクターＶＬを使用する接着末端の切り替えプロセスの詳細を図４Ｂで説明する。ベクターをメチラーゼ発現コンピテント細胞で調製すると、メチラーゼ認識配列のオーバーラップによるアデニンのメチル化（太字）により、外側ＢｓａＩ部位（点線で囲まれる）のブロッキングがもたらされ、この場合、内側ＢｓａＩ部位（実線で囲まれる）はＬａｃＺインサートの除去に使用可能である。ベクターＶＬの左腕は標準Ｍｅｔｃｌｏに類似し、外側と内側の両方のＢｓａＩ部位が同じ接着末端ＣＴＣＣを生じることに注目されたい。しかしながら、ＶＬの右腕は、内側ＢｓａＩ部位によって生成された接着末端ＣＧＡＧが外側ＢｓａＩ部位とオーバーラップしている点で異なる。ドナーＤＮＡは、適合性のあるユニバーサル接着末端ＣＴＣＣ及びＣＧＡＧを有する隣接するＢｓａＩ部位により放出され得るインサートを保持する。二本鎖インサートは、ユニバーサル接着末端内の５’末端に４ｂｐ配列ＸＸＸＸを、３’末端にＹＹＹＹを保持する。ドナーＤＮＡのベクターＶＬへのＭｅｔｃｌｏアセンブリの後、得られたプラスミドは、ベクター内の隣接するＢｓａＩ部位（実線で囲まれる）によって放出され得る対応するインサートを保持する。放出された断片は、クローニングに使用されたものと同一の５’接着末端ＣＴＣＣを保有するが、３’接着末端はインサート配列によって規定されるＹＹＹＹであり、ユニバーサル３’接着末端ＣＧＡＧとは異なる場合がある。このようにして、ベクターＶＬは、クローン化された断片の右側の接着末端をユニバーサル接着末端ＣＧＡＧから配列が規定された接着末端ＹＹＹＹに切り替える。
【０１３０】
３種類のユニバーサルクローニングベクターを使用する変換プロセスを、単純な記号提示システムを使用して説明することができた（図４１Ｃ）。本発明者らは、ここでは、文字ｕを使用して５’ユニバーサル接着末端ＣＴＣＣを表し、文字ｖを使用して３’ユニバーサル接着末端ＣＧＡＧを表す。ｘ及びｙは、ユニバーサル接着末端内のインサート断片の５’及び３’末端の４ｂｐ配列を表す。インサート（ｕ、ｖ）は、接着末端ｕ及びｖを生成するＢｓａＩ部位が両側に隣接するインサート断片を保持するプラスミドを表す。異なるベクターとのアセンブリ反応は、変換される異なる接着末端をもたらす。
【０１３１】
最初の断片の５’末端と最後の断片の３’末端にユニバーサル接着末端ｕ及びｖがある限り、同じユニバーサルベクターのセットを使用して、適合性のある接着末端を有する複数の断片をアセンブルすることができた（図４Ｄ）。アセンブルされた断片は、使用されるアセンブリベクターのタイプに応じて、異なる接着末端を保持する。ベクターＶＬへの断片のアセンブリは、５’ユニバーサル接着末端を保持したまま、３’末端を内部４ｂｐに変換する。ベクターＶＭへのアセンブリは両方の末端を変換し、ベクターＶＲへのアセンブリは５’末端を変換して３’ユニバーサル接着末端は保持したままである。ベクターＶＬにアセンブルされた断片は、５’ユニバーサル接着端ｕのみを保持する点で断片Ａに類似し；ベクターＶＭにアセンブルされた断片は、断片Ｂに類似し；ベクターＶＲにアセンブルされた断片は断片Ｃに類似する。したがって、上記プロセスは、アセンブリの順序で断片の位置に応じて、同じ原理を使用する次のラウンドＤＮＡアセンブリにアセンブルされた断片が使用され得るように、自己相似的である。これにより、ユニバーサルクローニングベクターを使用する、大きなＤＮＡコンストラクトの階層的な瘢痕のないアセンブリが可能になる。
【０１３２】
例として、２段階において９つの断片に由来するＤＮＡアセンブリを使用する、ＤＮＡの階層的な瘢痕のないアセンブリのプロセス全体を図２に示す。ｘという名前の５’末端及びｙという名前の３’末端の４ｂｐを有する、内部ＢｓａＩ部位のないＤＮＡ配列で開始して、目的は、接着末端ｘ及びｙを保持するアセンブルされたプラスミドから一旦放出された単一の断片に９つの断片に由来するＤＮＡをアセンブルすることである（図５Ａ）。ＤＮＡ配列は、最初に、Ａ〜Ｉという名前の９個の４ｂｐオーバーラップ配列を有する断片に分割され、オーバーラップ配列はａ〜ｈという名前である（図５Ｂ）。４ｂｐオーバーラップの位置は、ユニバーサル接着末端ｕ及びｖ、並びに各サブアセンブリ反応内で互いに異なる限り、自由に選択することができた。現在の設定では、４ｂｐオーバーラップの次のペアは各ペア（ａ、ｂ）、（ｄ、ｅ）、（ｇ、ｈ）及び（ｃ、ｆ）内で異なっていなければならない。断片Ａ〜断片Ｉの配列の末端に適切なアダプター配列を付加し、ＢｓａＩによる制限消化後に二本鎖ＤＮＡがユニバーサル接着末端ｕ及びｖを保持する断片Ａ〜断片Ｉへとトリミングされ得るように、遺伝子合成又はＰＣＲによって二重ＤＮＡを合成した（図５Ｃ）。次いで、これらの二本鎖合成ＤＮＡ断片を適切なタイプのユニバーサルクローニングベクターにクローニングし、次の段階のアセンブリで断片の位置に応じて断片の接着末端を変更することができた（図５Ｄ）。アセンブリの次のラウンドで５’末端位置に配置される断片Ａ、断片Ｄ、及び断片ＧはベクタータイプＶＬへとクローン化され；次のラウンドで中央の位置にあるＢ、Ｅ、ＨはベクタータイプＶＭにクローン化され；３’末端位置のＣ、Ｆ、ＩをベクタータイプＶＲにクローン化する。この段階でクローン化された断片を配列決定して、遺伝子合成又はＰＣＲのエラーを確認することができた。その後、これらの断片を新しいアセンブリラウンドに使用することができ、繰り返すが、使用するアセンブリベクターのタイプは、次のラウンドＤＮＡアセンブリのアセンブルされた断片の位置によって異なる（図５Ｅ）。アセンブルされた断片ＡＢＣが次のラウンドアセンブリで５’断片として使用されることから、断片Ａ、断片Ｂ、断片ＣをベクターＶＬにアセンブルし；断片Ｄ、断片Ｅ、断片ＦをベクターＶＭにアセンブルし、断片Ｇ、断片Ｈ、断片ＩをベクターＶＲにアセンブルした。工程２の３つのアセンブルされた断片を更にベクターＶＭにアセンブルするように、最終工程も同様であり、これは、初期配列の末端により規定される接着末端ｘ及びｙを保持する完全にアセンブルされた断片を生成する（図５Ｆ）。
【０１３３】
階層型アセンブリには、３つのタイプ（ＶＬ、ＶＭ、ＶＲ）を表す少なくとも６つのユニバーサルクローニングベクターと２つの抗生物質選択マーカーとのセットが必要である。アセンブリの種々の段階で種々のサイズのＤＮＡ断片に対処するには、理想的には２つの異なるコピー数を表す１２個のベクターが最適である。同様のシステムをＬｇｕＩに基づくＭｅｔｃｌｏ用に開発することができたが、瘢痕のないシステムではユニバーサルアダプターｕとｖが異なる必要があるため、ＢｐｉＩ用には開発できなかった。ＢｓａＩ及びＳａｐＩの場合、酵素によって生成される酵素認識配列と接着末端との間の塩基は柔軟であるため、異なるアダプターｕ及びｖを設計することが可能である。しかしながら、ＢｐｉＩの場合、Ｂｐｉｌに基づくＭｅｔｃｌｏでメチラーゼ認識配列を指定するには２つの塩基の両方が必要であるため、これらの塩基は固定されている。さらに、ＢｐｉＩに基づくＭｅｔｃｌｏのメチル化塩基は、制限部位の上鎖に位置する。接着末端の切り替えのためのＢｐｉＩ部位の１対１の配置は、必然的に、ＢｐｉＩ消化後にアセンブリベクター骨格ではなく、ＬａｃＺ選択マーカーによって保持されているメチル化塩基をもたらし、ワンポットゴールデンゲートアセンブリを不可能にした。
【０１３４】
瘢痕のないＭｅｔｃｌｏとＭｅｔｃｌｏの関係
Ｍｅｔｃｌｏは、大きなＤＮＡコンストラクトのＩＩＳ型制限酵素に基づく階層型アセンブリに単一の制限酵素を使用する課題を解決するために発明された。瘢痕のないＭｅｔｃｌｏは、ユニバーサルアセンブリベクターのセットを使用する、大きなＤＮＡコンストラクトの瘢痕のない階層型アセンブリを達成するためにＭｅｔｃｌｏシステムの主要な構成要素（メチラーゼ発現株、オーバーラップするメチル化／制限部位）を利用するＭｅｔｃｌｏの更なる発展である。
【０１３５】
瘢痕のないＭｅｔｃｌｏは、ＩＩＳ型に基づくアセンブリシステムの幾つか異なる概念の組み合わせに基づく：
１．Ｍｏｃｌｏシステムで「レベル−１」ユニバーサルクローニングベクター設計に使用されている、接着末端切り替え用の１対１型ＩＩＳ制限部位の特殊な設計。Ｍｏｃｌｏ「レベル−１」ベクター設計は、ＢｐｉＩ−ＢｓａＩの１対１制限部位を使用し、これは、ＭｅｔｃｌｏのＢｓａＩのみの１対１設計とは異なるが、接着末端切り替えの概念はＭｏｃｌｏ「レベル−１」ベクター設計に基づく。
２．アセンブルされたＤＮＡ配列の周りに瘢痕配列を設計することによる、アセンブリ瘢痕の除去。これは、ＩＩＳ型に基づく階層型アセンブリではこれまで実証されていない。
３．アセンブリの各段階でＤＮＡ断片の外側ブロックに同じ接着末端配列を維持するためのＭｅｔｃｌｏシステムの使用。
【０１３６】
Ｍｅｔｃｌｏシステムの使用は、同じユニバーサル接着末端配列を使用する多段階の階層型アセンブリを達成するための鍵である。最初の２つの概念だけでも、ユニバーサルアセンブリベクターを使用するＤＮＡの瘢痕のない単一段階アセンブリに十分である。しかしながら、従来のＭｏｃｌｏシステムを使用する単一段階の瘢痕のないアセンブリシステムは、異なる酵素に対してベクター設計を切り替える接着末端のユニバーサルアダプター配列が異なるため（ＢｓａＩはＣＴＣＮ及びＮＧＡＧ、ＢｐｉＩはＡＣＮＮ及びＮＮＧＴとなる）、多段階の階層型アセンブリに簡単に適合させることができなかった。これは、２つの酵素に基づくＭｏｃｌｏを使用する階層的な瘢痕のないアセンブリを達成するために、アセンブリの段階数に応じて、非常に長い反復アダプター配列を外側ブロックの端に付加する必要があり、これは、アセンブリの各段階の後に「チュウバック」される（図６）。Ｍｅｔｃｌｏシステムは、アセンブリの異なる段階で単一の酵素を使用することから、アセンブリの異なる段階で外側ブロックに対して同じユニバーサルアダプター配列を使用することができ、これにより、アセンブリプロセスの設計が大幅に簡素化される。
【０１３７】
実施例３−同定されたメチラーゼとＩＩＳ型制限酵素の組み合わせ
表３には、既知の全てのＩＩＳ型制限酵素（１９種類の特異性を表す７８個の酵素）のオーバーラップするメチル化／制限部位のブロッキングをもたらす可能性があるメチラーゼ／制限酵素の組み合わせの一覧が含まれる。
【０１３８】
この一覧は、Ｒｅｂａｓｅ（ＰＭＩＤ  ２５３７８３０８（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１５  ４３：Ｄ２９８−９）による既知のＩＩＳ型制限酵素の一覧と既知のＩＩ型ＤＮＡメチラーゼの一覧に基づくカスタムＰｅｒｌスクリプトを使用して生成された。
【０１３９】
収載されているメチラーゼは、少なくとも４ｂｐの認識配列を持ち、メチル化塩基の位置がわかっているＩＩ型制限／修飾システムのメチラーゼに限定される。同じタンパク質にメチラーゼと制限酵素の両方の活性を含むＩＩＧ型制限／修飾システムのメチラーゼは除外される。制限酵素認識配列に加えて、オーバーラップするメチル化／制限部位に対するメチラーゼ活性を指定するには、更に塩基が必要である。認識配列が制限部位と同一又はそれにより囲まれているあらゆるメチラーゼを除く。さらに、メチル化配列は、ＩＩＳ型制限酵素によって生成された接着末端配列に侵入してはならない。
【０１４０】
ＤＮＡ配列は、ＩＵＰＡＣ  Ａｍｂｉｇｕｉｔｙ  Ｃｏｄｅｓを使用して収載される。ＭはＡ又はＣを表す；ＲはＡ又はＧを表す；ＷはＡ又はＴを表す；ＳはＣ又はＧを表す；ＹはＣ又はＴを表す；ＫはＧ又はＴを表す；ＶはＡ又はＣ又はＧを表す；ＨはＡ又はＣ又はＴを表す；ＤはＡ又はＧ又はＴを表す；ＢはＣ又はＧ又はＴを表す；ＮはＡ又はＴ又はＣ又はＧを表す。
【０１４１】
「制限酵素」には、ＩＩＳ型制限酵素の名称が収載されている。同じ配列を認識する制限酵素は共にグループ化される。
【０１４２】
「制限部位」には、制限酵素の認識配列が収載されている。
【０１４３】
「メチラーゼ」には、オーバーラップするメチル化／制限部位をブロックし得るメチラーゼの名前が収載されている。同じ配列を認識し、同じメチル化パターンを生成するメチラーゼは共にグループ化される。
【０１４４】
「メチル化配列」には、メチラーゼの認識配列が収載されている。
【０１４５】
「メチル化塩基の位置」には、メチラーゼ認識配列におけるメチル化塩基又は対向する塩基の位置が収載されている。
【０１４６】
「メチル化のタイプ」には、メチル化塩基のメチル化のタイプが、前の列に収載されたメチル化塩基の位置の順に収載される。ｍ６ＡはＮ６−メチルアデニンを表す；ｍ５ＣはＣ５−メチルシトシンを表す；ｍ４ＣはＮ４−メチルシトシンを表す；「不明」は、不明なメチル化のタイプを表す。
【０１４７】
「オーバーラップするメチル化／制限部位」には、オーバーラップするメチル化／制限部位の配列が収載されており、収載されたメチラーゼによるメチル化によって収載された制限酵素の作用のブロッキングをもたらす可能性がある。制限酵素／メチラーゼの組み合わせの幾つかのペアについて、選択される幾つかの異なるオーバーラップするメチル化／制限部位がある。「［］」で囲まれた塩基は、制限酵素によって生成された接着末端を表す。
【表３】
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【０１４８】
他のタイプのメチルトランスフェラーゼの使用
実施例では、ＩＩ型ＤＮＡメチル化酵素を使用しているが、Ｉ型制限修飾酵素も検討され得る。Ｉ型制限修飾酵素は、メチルトランスフェラーゼと制限エンドヌクレアーゼの両方の活性を持つマルチサブユニット酵素である。それのＩ型制限修飾酵素は通常、３つの異なる遺伝子：メチル化サブユニット、制限サブユニット、ＤＮＡ配列認識サブユニット（特異性サブユニット）によってコードされる３つのタイプのサブユニットで構成される。メチル化サブユニットと特異性サブユニットの両方がメチルトランスフェラーゼ活性に必要である。
【０１４９】
例えば、
【化１Ｇ】
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メチル化サブユニットＭ．ＥｃｏＣＩ５Ｉと特異性サブユニットＳ．ＥｃｏＣＩ５Ｉの両方を発現するＥ．コリ株は、メチル化保護されたＢｓａＩ部位をブロックし得る切断制御要素の対応する塩基をメチル化できる可能性がある。
【０１５０】
表４は、本発明に従って提供され得る制限酵素及びＩ型制限修飾酵素の組み合わせ、又はその認識配列の幾つかの更なる例を提供する。当業者は、これらが例であり、特許請求の範囲に包含され得る組み合わせの網羅的な一覧ではないことを理解するであろう。
【表４】
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【０１５１】
ベクター配列の例
瘢痕のないＭｅｔｃｌｏのプラスミドの配列を以下にｆａｓｔａ形式で収載する。下線付き配列は、ＬａｃＺ選択断片及び高コピーベクターＤＮＡ調製用の複製起点を含む「廃棄配列」である。四角で囲まれた配列は、アダプターの切り替えに適した距離で１対１に配置される「メチル化保護可能な要素」及び「保護不可能な要素」を含む「劣勢／短縮複合要素」である。残りの配列は、低コピー複製起点（ｐ１５Ａベース）及び選択マーカー（カナマイシン又はスペクチノマイシンのいずれか）を含むベクター骨格である。
【０１５２】
ＢｓａＩ／Ｍ．Ｏｓｐ８０７ＩＩに基づく瘢痕のないＭｅｔｃｌｏの場合、プラスミドは以下の通りである：
ｐＭＸＬＫ＿ＶＬ、ｐＭＸＬＫ＿ＶＭ、ｐＭＸＬＫ＿ＶＲ（カナマイシン）
ｐＭＸＬＳ＿ＶＬ、ｐＭＸＬＳ＿ＶＭ、ｐＭＸＬＳ＿ＶＲ（スペクチノマイシン）
【０１５３】
ＬｇｕＩ／Ｍ．ＸｍｎＩに基づく瘢痕のないＭｅｔｃｌｏの場合、プラスミドは以下の通りである：
ｐＭＺＬＫ＿ＶＬ、ｐＭＺＬＫ＿ＶＭ、ｐＭＺＬＫ＿ＶＲ（カナマイシン）
ｐＭＺＬＳ＿ＶＬ、ｐＭＺＬＳ＿ＶＭ、ｐＭＺＬＳ＿ＶＲ（スペクチノマイシン）
【０１５４】
１ｋｂ  ＤＮＡの標準的な４つの断片のアセンブリ及び２８個の断片に由来する約２００ｋｂ  ＤＮＡの２段階アセンブリ用のプラスミド配列も同じくｆａｓｔａ形式で収載する。１ｋｂアセンブリベクターの下線付き配列には、ＬａｃＺ選択マーカーが含まれる。２００ｋｂアセンブリベクターの下線付き配列には、ＬａｃＺ選択マーカー、及び高コピーベクターＤＮＡ調製用の複製起点が含まれる。残りの配列はベクターの骨格である。
【０１５５】
１ｋｂアセンブリの場合、プラスミドは以下の通りである：
ｐＭＸＰ＿Ａ４Ｅ、ｐＭＹＰ＿Ａ５Ｅ、ｐＭＺＰ＿Ｐ６Ｔ
【０１５６】
２００ｋｂアセンブリの場合、プラスミドは以下の通りである：
ｐＭＸＢＧ＿Ａ７Ｉ、ｐＭＸＢＧ＿Ｉ７Ｇ、ｐＭＸＢＧ＿Ｇ７Ｆ、ｐＭＸＢＧ＿Ｆ７Ｅ、ｐＭＸＢＫ＿Ａ７Ｅ
【０１５７】
かかるベクター配列は、本発明の例のベクターに適用可能であり、特定の短縮、維持、又は挿入の複合要素が適宜交換される。分子クローニングに精通した当業者は、商業的に入手可能なＭｏｃｌｏキットからＰＣＲにより本明細書のベクターを再構築することができる。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【化１５】
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【化１６】
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【化１７】
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【化１８】
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【化１９】
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【化２０】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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