(57)【要約】放射性標識された抗ＰＤ−Ｌ１抗体および免疫ＰＥＴイメージングにおけるそれらの使用が、本明細書に提供される。患者または試料中のＰＤ−Ｌ１タンパク質の存在を検出する方法が含まれる。免疫ＰＥＴイメージングにおける使用のための放射性標識された抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートが本開示に含まれる。一態様では、コンジュゲートは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片、キレート化部分、およびポジトロン放射体を含む。前記コンジュゲートを合成するためのプロセス、およびそれに有用である合成中間体も本明細書に提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単量体ヒトプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合する抗体またはその抗原結合性断片、キレート化部分、およびポジトロン放射体を含む、放射性標識された抗体コンジュゲート。
【請求項２】
前記コンジュゲートが、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含み、前記抗体またはその抗原結合性断片が、式（Ａ）：
−Ｌ−ＭＺ
（Ａ）
の１または複数の部分に共有結合的に結合し、式中、
Ｌはキレート化部分であり；Ｍはポジトロン放射体であり；ｚは出現毎に独立に０または１であり；ｚの少なくとも１つは１である、
請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記キレート化部分が、デスフェリオキサミンを含む、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
前記ポジトロン放射体が、８９Ｚｒである、請求項１から３のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項５】
−Ｌ−Ｍが、
【化６】
2020512281.tif 000033
である、請求項２から４のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項６】
抗体またはその抗原結合性断片が、式（Ａ）の１つ、２つ、または３つの部分に共有結合的に結合する、請求項１から５に記載の化合物。
【請求項７】
前記抗体が、以下：
（ａ）３７℃での表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定される、約３１０ｐＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）で、単量体ＰＤ−Ｌ１に結合すること；
（ｂ）２５℃での表面プラズモン共鳴アッセイにおいて、約１８０ｐＭ未満のＫＤで、単量体ヒトＰＤ−Ｌ１に結合すること；
（ｃ）３７℃での表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定される、約１５ｐＭ未満のＫＤで、二量体ヒトＰＤ−Ｌ１に結合すること；および
（ｄ）２５℃での表面プラズモン共鳴アッセイにおいて、約８ｐＭ未満のＫＤで、二量体ヒトＰＤ−Ｌ１に結合すること
からなる群より選択される、１または複数の特性を有する、請求項１から６のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項８】
前記抗体が、配列番号２、３４、５０、８２、９８、１４６、１６２、１７８、１８６、２３４、２５０、２６６、２９０、３０６、３１４、および３３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）における３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；ならびに配列番号１０、４２、５８、９０、１０６、１５４、１７０、１９４、２４２、２５８、および２７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）における３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む、請求項１から７のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項９】
前記抗体が、配列番号８２のＨＣＶＲにおける３つのＣＤＲ；および配列番号９０のＬＣＶＲにおける３つのＣＤＲを含む、請求項１から８のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
ＰＤ−Ｌ１を発現する組織を画像化する方法であって、請求項１から９のいずれか一項に記載の放射性標識された抗体コンジュゲートを前記組織に投与するステップ；およびＰＤ−Ｌ１発現をポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）イメージングにより可視化するステップを含む、方法。
【請求項１１】
（ａ）固形腫瘍を有する被験体を選択するステップ；
（ｂ）前記固形腫瘍が、ＰＤ−Ｌ１陽性であることを決定するステップ；および
（ｃ）１または複数の用量のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤をそれを必要とする前記被験体に投与するステップ
を含む、腫瘍を処置するための方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）が：
（ｉ）請求項１から９のいずれか一項に記載の放射性標識された抗体コンジュゲートをそれを必要とする前記被験体に投与すること；および
（ｉｉ）前記腫瘍内の前記放射性標識された抗体コンジュゲートの局在化をポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）イメージングにより画像化すること
を含み、前記腫瘍内の前記放射性標識された抗体コンジュゲートの存在が、前記腫瘍がＰＤ−Ｌ１陽性であることを指し示す、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記被験体が、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの前記放射性標識された抗体コンジュゲートを投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記放射性標識された抗体コンジュゲートが、前記被験体に対して皮下または静脈内に投与される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＥＴイメージングが、前記放射性標識された抗体コンジュゲートを投与してから２〜７日後に行われる、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｂ）が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤で前記被験体を処置する前に実行される、請求項１２から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）少なくとも１用量のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤で前記被験体を処置した後に前記放射性標識された抗体コンジュゲートを投与するステップ；および
（ｂ）前記腫瘍内の前記放射性標識された抗体コンジュゲートの局在化をＰＥＴイメージングにより画像化するステップ
をさらに含み、前記腫瘍内の前記放射性標識された抗体コンジュゲートの局在化領域のベースラインからの低下が、腫瘍退縮を指し示す、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記被験体が、前記ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤の投与から１〜２０週後に、前記放射性標識された抗体コンジュゲートを投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍が、血液がん、脳がん、腎細胞がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、乳がん、肝細胞癌、骨がん、結腸がん、非小細胞肺がん、頭頚部扁平上皮がん、結腸直腸がん、中皮腫、Ｂ細胞リンパ腫、およびメラノーマからなる群より選択される、請求項１１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合性断片である、請求項１１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブおよびＲＥＧＮ２８１０からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片である、請求項１１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、アテゾリズマブである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号８２の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）における３つの重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）；および配列番号９０の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）における３つの軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片が、３つのＨＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）ならびに３つのＬＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含み、前記ＨＣＤＲ１が、配列番号８４のアミノ酸配列を含み；前記ＨＣＤＲ２が、配列番号８６のアミノ酸配列を含み；前記ＨＣＤＲ３が、配列番号８８のアミノ酸配列を含み；前記ＬＣＤＲ１が、配列番号９２のアミノ酸配列を含み；前記ＬＣＤＲ２が、配列番号９４のアミノ酸配列を含み；および前記ＬＣＤＲ３が、配列番号９６のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
式（ＩＩＩ）：
【化７】
2020512281.tif 000034
の化合物であって、式中、Ａは、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり、ｋは１〜３０の整数である、化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、放射性標識された抗ＰＤ−Ｌ１抗体および免疫ＰＥＴイメージングにおけるそれらの使用に関する。
【０００２】
配列表
配列表の公式のコピーは、ファイル名「１０３０５ＷＯ０１＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」、作成日２０１７年１２月０１日および約１１７ＫＢのサイズのＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に本明細書と同時に提出される。このＡＳＣＩＩフォーマットの書類に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）（Ｂ７−Ｈ１またはＣＤ２７４ともまた呼ばれる）は、リンパ様および非リンパ様組織の両方、例えば、ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞、マクロファージ系統細胞、末梢組織並びに腫瘍細胞、およびウイルス感染細胞などに広く発現される２９０アミノ酸のタンパク質受容体リガンドである（Ｄｏｎｇら、１９９９年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．）。ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞共阻害性受容体のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原）／ＩＣＯＳ（誘導性共刺激因子（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ））ファミリーに属する受容体ＰＤ−１およびＢ７−１に結合し、Ｔ細胞活性化を阻害することにより免疫応答を弱める（Ｃｈｅｎら、２０１３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３巻：２２７〜２４２頁）。ＰＤ−１またはＢ７−１へのＰＤ−Ｌ１の結合は、がん、およびウイルス感染などの疾患における体液性および細胞性免疫応答を損なう、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン分泌の低下をもたらす。腫瘍細胞およびウイルス感染細胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現は、免疫応答を回避するため腫瘍および慢性ウイルス感染により活用される。ＰＤ−Ｌ１は多種多様な腫瘍上で発現されており、動物モデルにおける研究では、腫瘍上のＰＤ−Ｌ１が、Ｔ細胞活性化および腫瘍細胞の溶解を阻害し、腫瘍特異的なＴ細胞の死の増大をもたらすことが可能であることが示されている。慢性ウイルス感染では、ウイルス感染細胞上で発現するＰＤ−Ｌ１は、ウイルス特異的なＴ細胞上のＰＤ−１に結合し、これらのＴ細胞は、エフェクター機能および増殖能力の低減で「疲弊状態」になる（Ｆｒｅｅｍａｎ  ２００８年、ＰＮＡＳ  １０５巻：１０２７５〜１０２７６頁）。ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１系は、誘導性Ｔ調節性（Ｔｒｅｇ）細胞発生および持続したＴｒｅｇ機能にも重要な役割を果たす（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら、２０１０年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  ２３６巻：２１９〜２４２頁）。モノクローナル抗体を含むアンタゴニストによるＰＤ−Ｌ１の遮断は、がんおよび慢性ウイルス感染の処置において研究されている（Ｒｉｂａｓ  ２０１２年、ＮＥＪＭ  ３６６巻：２５１７〜２５１９頁；Ｆｒｅｅｍａｎ  ２００８年、ＰＮＡＳ  １０５巻：１０２７５〜１０２７６頁；Ｓｈｅｒｉｄａｎ  ２０１２年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０巻：７２９〜７３０頁）。
免疫ポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）は、ポジトロン放射体で標識されたモノクローナル抗体を活用して、抗体のターゲティング特性とポジトロン放射断層撮影カメラの感度とを組み合わせる診断的イメージングツールである。例えば、Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ、１２巻：１３７９頁（２００７年）；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５２巻（８号）：１１７１頁（２０１１年）を参照されたい。免疫ＰＥＴは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの、抗原の可視化および定量ならびに抗体蓄積を可能にし、それ自体で、診断および補完療法のための重要なツールとして機能することができる。例えば、免疫ＰＥＴは、特定の療法並びに処置のモニタリングの潜在的な患者候補の選択を援助することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｒｉｂａｓ、ＮＥＪＭ（２０１２年）３６６巻：２５１７〜２５１９頁
【非特許文献２】Ｆｒｅｅｍａｎ、ＰＮＡＳ２００８年）１０５巻：１０２７５〜１０２７６頁
【非特許文献３】Ｓｈｅｒｉｄａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１２年）３０巻：７２９〜７３０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＰＤ１およびＰＤ−Ｌ１の両方が免疫療法の標的として登場してきたので、とりわけ、前記療法の適切な患者候補の検出を可能とする診断ツールを含む、抗ＰＤ１および／または抗ＰＤ−Ｌ１療法のための診断ツールに対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
免疫ＰＥＴイメージングにおける使用のための放射性標識された抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートが本開示に含まれる。
【０００７】
一態様では、コンジュゲートは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合性断片、キレート化部分、およびポジトロン放射体を含む。
【０００８】
前記コンジュゲートを合成するためのプロセス、およびそれに有用である合成中間体も本明細書に提供される。
【０００９】
本明細書に記載される放射性標識された抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートを組織に投与するステップ；およびＰＤ−Ｌ１発現をポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）イメージングにより可視化するステップを含むＰＤ−Ｌ１を発現する組織を画像化する方法も本明細書に提供される。
【００１０】
本明細書に記載される放射性標識された抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートを組織に投与するステップ；およびＰＤ−Ｌ１発現をＰＥＴイメージングにより可視化するステップを含む組織内のＰＤ−Ｌ１を検出するための方法も本明細書に提供される。一実施形態では、組織は、ヒト被験体に存在する。ある特定の実施形態では、被験体は、非ヒト哺乳動物である。ある特定の実施形態では、被験体は、がん、炎症性疾患、または感染などの疾患もしくは障害を有する。
【００１１】
一部の態様では、被験体は、５ｍｇ、または１０ｍｇ、または２０ｍｇの用量の放射性標識された抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートを投与される。
【００１２】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤を含む抗腫瘍療法に適切な患者を同定するための方法であって、固形腫瘍を有する患者を選択するステップ、本明細書に記載される放射性標識された抗体コンジュゲートを投与するステップ、および腫瘍内の投与された放射性標識された抗体コンジュゲートをＰＥＴイメージングにより可視化するステップを含み、腫瘍内の放射性標識された抗体コンジュゲートの存在が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｘｉｓ）の阻害剤を含む抗腫瘍療法に適切であるとして患者を同定する、方法も本明細書に提供される。
【００１３】
固形腫瘍を有する被験体を選択するステップ；固形腫瘍が、ＰＤ−Ｌ１陽性であることを決定するステップ；および抗腫瘍療法をそれを必要とする被験体へと投与するステップを含む腫瘍を処置する方法も本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、抗腫瘍療法は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体）を含む。ある特定の実施形態では、被験体は、本明細書に記載される放射性標識された抗体コンジュゲートを投与され、放射性標識された抗体コンジュゲートの局在化をポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）イメージングを介して画像化して、腫瘍がＰＤ−Ｌ１陽性であるかどうかが決定される。
【００１４】
抗腫瘍療法で処置されている固形腫瘍を有する被験体を選択するステップ；本明細書に記載される放射性標識されたコンジュゲートを被験体に投与するステップ；腫瘍内の投与された放射性標識されたコンジュゲートの局在化をＰＥＴイメージングにより画像化するステップ；および腫瘍増殖を決定するステップを含み、コンジュゲートの取込みまたは放射性標識シグナルのベースラインからの低下が、腫瘍退縮および抗腫瘍療法の有効性を指し示す、被験体における抗腫瘍療法の有効性をモニタリングするための方法も本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、抗腫瘍療法は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体）を含む。
【００１５】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤を含む抗腫瘍療法に対する患者の応答を予測するための方法であって、固形腫瘍を有する患者を選択するステップ；および腫瘍が、ＰＤ−Ｌ１陽性であるかどうかを決定するステップを含み、腫瘍がＰＤ−Ｌ１陽性である場合、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤を含む抗腫瘍療法に対する患者の陽性応答を示す、方法も本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、腫瘍は、本開示の放射性標識された抗体コンジュゲートを投与するステップ、および腫瘍内の放射性標識された抗体コンジュゲートをＰＥＴイメージングにより局在化を決定するステップ（ここで、腫瘍内の放射性標識された抗体コンジュゲートの存在が、腫瘍が、ＰＤ−Ｌ１陽性であることを指し示す）により陽性と決定される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、未修飾抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＰＤ−Ｌ１  ＤＦＯ修飾抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣを示す。
【００１７】
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、研究１に関する８９Ｚｒ放射性標識後の放射性−ＳＥＣ−ＨＰＬＣを示す。
【００１８】
【図３】図３は、研究２に関する８９Ｚｒ放射性標識後のＤＦＯ−コンジュゲート（抗ＰＤ−Ｌ１）の放射性−ＳＥＣ−ＨＰＬＣを示す。
【００１９】
【図４】図４は、研究３に関する８９Ｚｒ放射性標識後の放射性−ＳＥＣ−ＨＰＬＣ  ＳＥＣを示す。
【００２０】
【図５】図５は、研究１に関する８９Ｚｒ放射性標識後のＵＶ２８０−ＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムおよび放射性−ｉＴＬＣトレースを示す。
【００２１】
【図６ＡＢ】図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、および６Ｄは、本明細書の実施例５に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、腫瘍細胞系ＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇ（図６Ａ）、ＬＯＸ−ＩＭＶＩ（図６Ｂ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図６Ｃ）、およびＳＫ−Ｂｒ−３（図６Ｄ）によるｈＰＤ−Ｌ１発現を示す。
【図６ＣＤ】図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、および６Ｄは、本明細書の実施例５に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、腫瘍細胞系ＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇ（図６Ａ）、ＬＯＸ−ＩＭＶＩ（図６Ｂ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図６Ｃ）、およびＳＫ−Ｂｒ−３（図６Ｄ）によるｈＰＤ−Ｌ１発現を示す。
【００２２】
【図７】図７は、本明細書の実施例５に記載されるように、第２の実験のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、インターフェロンガンマ処置を伴うかまたは伴わない、ＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１ＴｇおよびＬＯＸ−ＩＭＶＩ腫瘍細胞によるｈＰＤ−Ｌ１発現を示す。
【００２３】
【図８ＡＢ】図８は、Ａ、Ｂ、Ｄ、およびＥに示される研究に対する８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートならびにＣおよびＦに示される研究に対するアイソタイプ対照放射性免疫コンジュゲート８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ＩｇＧ４Ｐの放射性免疫コンジュゲート調製物からの試料を使用するＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により作成されたクロマトグラムを示す。２８０ｎｍでの吸光度に関するクロマトグラムはＡ〜Ｃに示され、γ放射の強度に関するラジオクロマトグラムはＤ〜Ｆに示される。Ａ〜Ｃでは、緩衝液成分の溶出も検出された。これらの試料緩衝液中の塩のピーク（保持時間＞２５分、アステリスク「＊」）は、ピーク面積の積分から除外された。ピークは、ＨＭＷ（高分子量）免疫コンジュゲート（「１」）、単量体免疫コンジュゲート（「２」）、組み込まれない８９Ｚｒ（「３」）、および試料緩衝液中の塩（「＊」）を指し示すため標識されている。略語：ｍＡＵ＝ミリ吸光度単位；ｃｐｓ＝１秒当たりカウント。
【図８ＣＤ】図８は、Ａ、Ｂ、Ｄ、およびＥに示される研究に対する８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートならびにＣおよびＦに示される研究に対するアイソタイプ対照放射性免疫コンジュゲート８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ＩｇＧ４Ｐの放射性免疫コンジュゲート調製物からの試料を使用するＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により作成されたクロマトグラムを示す。２８０ｎｍでの吸光度に関するクロマトグラムはＡ〜Ｃに示され、γ放射の強度に関するラジオクロマトグラムはＤ〜Ｆに示される。Ａ〜Ｃでは、緩衝液成分の溶出も検出された。これらの試料緩衝液中の塩のピーク（保持時間＞２５分、アステリスク「＊」）は、ピーク面積の積分から除外された。ピークは、ＨＭＷ（高分子量）免疫コンジュゲート（「１」）、単量体免疫コンジュゲート（「２」）、組み込まれない８９Ｚｒ（「３」）、および試料緩衝液中の塩（「＊」）を指し示すため標識されている。略語：ｍＡＵ＝ミリ吸光度単位；ｃｐｓ＝１秒当たりカウント。
【図８ＥＦ】図８は、Ａ、Ｂ、Ｄ、およびＥに示される研究に対する８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートならびにＣおよびＦに示される研究に対するアイソタイプ対照放射性免疫コンジュゲート８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ＩｇＧ４Ｐの放射性免疫コンジュゲート調製物からの試料を使用するＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析により作成されたクロマトグラムを示す。２８０ｎｍでの吸光度に関するクロマトグラムはＡ〜Ｃに示され、γ放射の強度に関するラジオクロマトグラムはＤ〜Ｆに示される。Ａ〜Ｃでは、緩衝液成分の溶出も検出された。これらの試料緩衝液中の塩のピーク（保持時間＞２５分、アステリスク「＊」）は、ピーク面積の積分から除外された。ピークは、ＨＭＷ（高分子量）免疫コンジュゲート（「１」）、単量体免疫コンジュゲート（「２」）、組み込まれない８９Ｚｒ（「３」）、および試料緩衝液中の塩（「＊」）を指し示すため標識されている。略語：ｍＡＵ＝ミリ吸光度単位；ｃｐｓ＝１秒当たりカウント。
【００２４】
【図９】図９は、ＰＤ−１ｈｕ／ｈｕ−ＰＤ−Ｌ１ｈｕ／ｈｕマウスにおける８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートに関するｅｘ  ｖｉｖｏでの生体内分布データを提供する。１６匹のマウス（各々８動物の２群）は、単一ＩＶ用量の５０μＣｉ（１ｍｇ／ｋｇ）の８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートを０日に投与され、投与後６日目（黒色カラム）または１０日目（灰色カラム）に屠殺された。心臓穿刺を介して回収された血液および指し示した採取された組織を秤量し、放射能を決定した。６または１０日目に回収された個体試料に関する１グラム当たりの注入用量のパーセント（％ＩＤ／ｇ）値を、注入物質（８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲート）からの線量標準の放射能および個体試料の重量と比較して計算した。データは、平均±ＳＤとしてプロットされている。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
Ｉ．定義
そうでないことが本明細書に規定されない限りにおいて、本明細書で使用される技術用語および科学用語は全て、開示されている主題が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【００２６】
「ＰＤ−Ｌ１」という用語は、ＣＤ２７４およびＢ７Ｈ１としてもまた公知であるプログラム細胞死リガンド１を指す。全長ＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋで、受託番号ＮＰ＿０５４８６２．１として提供されている。「ＰＤ−Ｌ１」という用語はまた、ＰＤ−Ｌ１のタンパク質改変体も含む。「ＰＤ−Ｌ１」という用語は、組換えＰＤ−Ｌ１またはその断片を含む。用語はまた、例えば、ヒスチジンタグ、マウスＦｃもしくはヒトＦｃ、またはＲＯＲ１などのシグナル配列へとカップリングさせた、ＰＤ−Ｌ１またはその断片も包含する。例えば、用語は、Ｃ末端において、全長ＰＤ−Ｌ１（ＮＰ＿０５４８６２．１）のアミノ酸残基１９〜２３９へとカップリングさせた、マウスＦｃ（ｍＩｇＧ２ａ）またはヒトＦｃ（ｈＩｇＧ１）を含む配列を含む。タンパク質改変体は、Ｃ末端において、ＮＰ＿０５４８６２．１のアミノ酸残基１９〜２３９へとカップリングさせたヒスチジンタグを含む。非ヒト種に由来することが指定されない限りにおいて、「ＰＤ−Ｌ１」という用語は、ヒトＰＤ−Ｌ１を意味する。ＰＤ−Ｌ１は、細胞外ＩｇＶ様およびＩｇＣ様ドメイン（全長ＰＤ−Ｌ１のアミノ酸１９〜２３９）、膜貫通ドメインおよび約３０アミノ酸の細胞内ドメインを有する２９０アミノ酸のタンパク質である。ＰＤ−Ｌ１は、多くの細胞、例えば、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、およびＢ細胞）ならびに造血および非造血細胞（例えば、血管内皮細胞、膵島、および免疫特権の部位）に構成的に発現される。ＰＤ−Ｌ１は、多種多様な腫瘍、およびウイルス感染細胞にも発現し、免疫抑制環境の構成要素である（Ｒｉｂａｓ  ２０１２年、ＮＥＪＭ  ３６６巻：２５１７〜２５１９頁）。ＰＤ−Ｌ１は、２つのＴ細胞共阻害剤ＰＤ−１およびＢ７−１の１つに結合する。
【００２７】
「ＰＤ−１」という用語は、ＣＤ２７９としてもまた公知である、Ｔ細胞共阻害剤であるプログラム細胞死１タンパク質を指す。全長ＰＤ−１のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋで、受託番号ＮＰ＿００５００９．２として提供されている。用語はまた、例えば、ヒスチジンタグ、マウスＦｃもしくはヒトＦｃ、またはＲＯＲ１などのシグナル配列へとカップリングさせた、ＰＤ−１またはその断片も包含する。例えば、用語は、Ｃ末端において、Ｃ９３Ｓ変化を有するＮＰ＿００５００９．２のアミノ酸残基２５〜１７０へとカップリングさせた、マウスＦｃ（ｍＩｇＧ２ａ）またはヒトＦｃ（ｈＩｇＧ１）を含む配列を含む。ＰＤ−１は、Ｔ細胞共阻害剤のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４／ＩＣＯＳファミリーのメンバーである。ＰＤ−１は、ＩｇＶ様の細胞外Ｎ末端ドメイン、膜貫通ドメインならびに免疫受容抑制性チロシン（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）（ＩＴＩＭ）モチーフおよび免疫受容体チロシン依存性スイッチ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｓｗｉｔｃｈ）（ＩＴＳＭ）モチーフを含有する細胞内ドメインを有する２８８アミノ酸タンパク質である（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙら、２００９年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．）。ＰＤ−１受容体は、２つのリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を有する。
【００２８】
「Ｂ７−１」という用語は、共刺激因子ＣＤ８０としてもまた公知である、Ｔリンパ球活性化抗原を指す。Ｂ７−１は、ＩｇＶ様領域（ａａ  ３７〜１３８）およびＩｇＣ様領域（ａａ  １５４〜２３２）を含む細胞外Ｎ末端ドメイン、膜貫通ドメイン（ａａ  ２４３〜２６３）ならびにＣ末端細胞内領域（ａａ  ２６３〜２８８）を有する２８８アミノ酸の膜受容体である。全長Ｂ７−１のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋで、受託番号ＮＰ＿００５１８２．１として提供されている。
【００２９】
本明細書で使用される「Ｔ細胞共阻害剤」という用語は、Ｔ細胞の活性化または抑制を介して、免疫応答をモジュレートする、リガンドおよび／または受容体を指す。Ｔ細胞共シグナル伝達分子としてもまた公知である、「Ｔ細胞共阻害剤」という用語は、ＰＤ−１、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ−３、ＣＤ２２３としても公知）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエータ（Ｂ  ａｎｄ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｏｒ）（ＢＴＬＡ）、ＣＤ−２８、２Ｂ４、ＬＹ１０８、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチン３（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  ｍｕｃｉｎ  ３）（ＴＩＭ３）、免疫グロブリンおよびＩＴＩＭを有するＴ細胞免疫受容体（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  ＩＴＩＭ）（ＴＩＧＩＴ；ＶＳＩＧ９としてもまた公知である）、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １）（ＬＡＩＲ１；ＣＤ３０５としてもまた公知である）、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）（ＩＣＯＳ；ＣＤ２７８としてもまた公知である）、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、およびＣＤ１６０を含むがこれらに限定されない。
【００３０】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、ジスルフィド結合により相互接続された、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖である、４つのポリペプチド鎖から構成される免疫グロブリン分子（すなわち、「全長抗体分子」）、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）、またはそれらの抗原結合性断片を指すことを意図する。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）および重鎖定常領域（ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインから構成される）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲまたは「ＶＬ」）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する超可変性領域であって、フレームワーク領域（ＦＲ）と称する、より保存的な領域を散在させた領域へと、さらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端から、カルボキシ末端へと、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される、３つのＣＤＲと、４つのＦＲとから構成される。ある特定の実施形態では、抗体のＦＲ（またはそれらの抗原結合断片）は、ヒト生殖細胞系列の配列と同一の場合もあり、天然で修飾されている場合もあり、人工的に修飾される場合もある。アミノ酸のコンセンサス配列は、２つまたはこれを超えるＣＤＲの照合解析に基づき規定することができる。
【００３１】
１もしくは複数のＣＤＲ残基の置換、または１もしくは複数のＣＤＲの省略もまた可能である。科学文献では、結合のために、１つまたは２つのＣＤＲを可欠とした抗体について記載されている。Ｐａｄｌａｎら（１９９５年、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、９巻：１３３〜１３９頁）は、公表された結晶構造に基づき、抗体とそれらの抗原との接触領域について解析し、ＣＤＲ残基のうちで、実際に抗原に接触するのは、約５分の１〜３分の１だけであると結論付けた。Ｐａｄｌａｎはまた、１つまたは２つのＣＤＲが、抗原と接触するアミノ酸を有さない、多くの抗体も見出した（Ｖａｊｄｏｓら、２００２年、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３２０巻：４１５〜４２８頁もまた参照されたい）。  
【００３２】
抗原に接触しないＣＤＲ残基は、先行研究に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲの外部に存在するＫａｂａｔ  ＣＤＲの領域から、分子的モデル化および／または経験により同定することができる（例えば、ＣＤＲＨ２内の残基Ｈ６０〜Ｈ６５は、多くの場合、要求されない）。ＣＤＲまたはその残基を省略する場合は通例、別のヒト抗体配列内の対応する位置を占有するアミノ酸、またはこのような配列のコンセンサス配列で置換する。ＣＤＲ内の置換のための位置、および置換するアミノ酸もまた、経験的に選択することができる。経験的置換は、保存的置換の場合もあり、非保存的置換の場合もある。
【００３３】
本明細書で開示される完全ヒト抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域内および／またはＣＤＲ領域内に、対応する生殖細胞系列の配列と比較して、１または複数のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を含みうる。このような変異は、本明細書で開示されアミノ酸配列を、例えば、公表の抗体配列データベースから入手可能な生殖細胞系列の配列と比較することにより、たやすく確認することができる。本開示は、本明細書で開示されるアミノ酸配列のうちのいずれかに由来する、抗体およびそれらの抗原結合性断片を含むが、この場合、１または複数のフレームワーク領域内および／またはＣＤＲ領域内の、１または複数のアミノ酸を、抗体が由来した生殖細胞系列の配列の対応する残基、または別のヒト生殖細胞系列の配列の対応する残基、または対応する生殖細胞系列残基の保存的アミノ酸置換（本明細書では、このような配列変化をまとめて、「生殖細胞系列変異」と称する）に照らして変異させる。当業者は、本明細書で開示される、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列から始めて、１カ所または複数カ所の個々の生殖細胞系列変異またはそれらの組み合わせを含む、多数の抗体および抗原結合性断片を容易に作製することができる。ある特定の実施形態では、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワーク残基および／またはＣＤＲ残基の全てを、抗体が由来した、元の生殖細胞系列の配列内で見出される残基へと復帰変異させる。他の実施形態では、ある特定の残基だけを、元の生殖細胞系列の配列へと復帰変異させる、例えば、ＦＲ１の最初の８アミノ酸内、もしくはＦＲ４の最後の８アミノ酸内に見出される残基だけを変異させるか、またはＣＤＲ１内、ＣＤＲ２内、もしくはＣＤＲ３内に見出される残基だけを変異させる。他の実施形態では、フレームワーク残基および／またはＣＤＲ残基のうちの１または複数を、異なる生殖細胞系列の配列（すなわち、抗体が元来由来した生殖細胞系列の配列と異なる、生殖細胞系列の配列）の対応する残基に変異させる。さらに、本開示の抗体は、フレームワーク領域内および／またはＣＤＲ領域内の、２カ所またはこれを超える生殖細胞系列変異の任意の組み合わせを含有することが可能であり、この場合、例えば、ある特定の個々の残基を、特定の生殖細胞系列の配列の対応する残基に変異させる一方で、元の生殖細胞系列の配列と異なる、ある特定の他の残基を維持するか、または異なる生殖細胞系列の配列の対応する残基に変異させる。１カ所または複数カ所の生殖細胞系列変異を含有する抗体および抗原結合性断片が得られたら、これらを、結合特異性の改善、結合アフィニティーの増大、アンタゴニスト性またはアゴニスト性の生物学的特性（場合により）の改善または増強、免疫原性の低減など、１または複数の所望の特性について容易に調べることができる。この一般的な方式で得られた、抗体および抗原結合性断片は、本開示の中に包含される。
【００３４】
本開示はまた、本明細書で開示されるＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列であって、１カ所または複数カ所の保存的置換を有するアミノ酸配列のうちのいずれかの改変体を含む、完全ヒト抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体も含む。例えば、本開示は、本明細書で開示される、ＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかと比べて、例えば、１０カ所またはこれより少数、８カ所またはこれより少数、６カ所またはこれより少数、４カ所またはこれより少数などの数の保存的アミノ酸置換を伴う、ＨＣＶＲアミノ酸配列、ＬＣＶＲアミノ酸配列、および／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む。
【００３５】
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本開示のヒトｍＡｂは、例えば、ＣＤＲ内および特定のＣＤＲ３内に、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞変異により導入された変異）を含みうる。しかし、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列を、ヒトＦＲ配列へとグラフトしたｍＡｂを含むことを意図しない。
【００３６】
本明細書で使用される「多特異性の抗原結合性分子」という用語は、二特異性、三特異性、または多特異性の抗原結合性分子およびそれらの抗原結合性断片を指す。多特異性抗原結合性分子は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的な場合もあり、１つを超える標的ポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合性ドメインを含有する場合もある。多特異性の抗原結合性分子は、単一の多機能性ポリペプチドの場合もあり、２つまたはこれを超えるポリペプチドの多量体の複合体であって、互いと共有結合的または非共有結合的に会合する複合体の場合もある。「多特異性の抗原結合性分子」という用語は、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質へと連結する場合もあり、これと共発現させる場合もある、本開示の抗体を含む。例えば、抗体またはその断片は、第２の結合特異性を伴う、二特異性または多特異性の抗原結合性分子を作製するように、タンパク質またはその断片など、１または複数の他の分子的実体へと、機能的に連結する（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合によるか、または他の形で）ことができる。本開示に従い、「多特異性の抗原結合性分子」という用語はまた、二特異性抗体、三特異性抗体、もしくは多特異性抗体またはこれらの抗原結合性断片も含む。ある特定の実施形態では、本開示の抗体を、別の抗体またはその抗原結合性断片へと機能的に連結して、第２の結合特異性を伴う、二特異性抗体を作製する。本開示の二特異性抗体および多特異性抗体については、本明細書の別の箇所で記載する。
【００３７】
「〜に特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｓ）」または「〜に特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｔｏ）」などという用語は、抗体またはその抗原結合性断片が、生理学的条件下で、抗原と、比較的安定的な複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０−８Ｍまたはこれ未満の平衡解離定数（例えば、小さなＫＤは、緊密な結合を描示する）により特徴づけることができる。当技術分野では、２つの分子が特異的に結合するのかどうかを決定するための方法が周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などを含む。本明細書で記載される通り、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）により同定されている。さらに、ＰＤ−Ｌ１内の１つのドメインと、１または複数のさらなる抗原とに結合する多特異性抗体、またはＰＤ−Ｌ１の２つの異なる領域に結合する二特異性抗体は、そうであるにも拘らず、本明細書で使用される通り、「〜に特異的に結合する」抗体であると考えられる。
【００３８】
本明細書で使用される、抗体の「抗原結合性区分（ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｏｒｔｉｏｎ）」、抗体の「抗原結合性断片」などの用語は、任意の、天然に存在するか、酵素的に得られるか、合成であるか、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質であって、抗原に特異的に結合して、複合体を形成するポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。本明細書で使用される抗体の「抗原結合性断片」または「抗体断片」という用語は、ＰＤ−Ｌ１に結合する能力を保持する抗体の、１または複数の断片を指す。
【００３９】
本明細書で使用される「単離抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体（Ａｂ）を実質的に含まない抗体を指すことを意図する（例えば、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する単離抗体またはその断片は、ＰＤ−Ｌ１以外の抗原に特異的に結合するＡｂを実質的に含まない）。
【００４０】
本明細書で使用される「表面プラズモン共鳴」という用語は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用して、バイオセンサーマトリックス中のタンパク質濃度の変更を検出することにより、リアルタイムの生体分子の相互作用についての解析を可能とする光学現象を指す。
【００４１】
本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、特定の抗体−抗原間相互作用についての平衡解離定数を指すことを意図する。
【００４２】
「エピトープ」という用語は、パラトープとして公知の、抗体分子の可変領域内の特異的な抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、１つを超えるエピトープを有しうる。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域に結合する可能性があり、異なる生物学的効果を及ぼしうる。「エピトープ」という用語はまた、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位も指す。「エピトープ」という用語はまた、抗体が結合する抗原の領域も指す。エピトープは、構造的エピトープとして規定することもでき、機能的エピトープとして規定することもできる。機能的エピトープは一般に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用のアフィニティーに直接寄与する残基を有する。エピトープはまた、コンフォメーションエピトープ、すなわち、非線形アミノ酸から構成されるエピトープでもありうる。ある特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基など、化学的に活性の表面分子の群分けである決定基を含む場合があり、ある特定の実施形態では、特異的な三次元構造特徴、および／または特異的な電荷特徴を有しうる。
【００４３】
核酸またはその断片に言及する場合の、「実質的な同一性」または「実質的に同一な」という用語は、適切なヌクレオチドの挿入または欠失を伴って、別の核酸（またはその相補鎖）と、最適な形でアライメントされた場合に、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧＡＰなどの、配列同一性についての、任意の周知のアルゴリズムにより測定される通り、ヌクレオチド塩基のうちの少なくとも約９０％、そしてより好ましくは、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％においてヌクレオチド配列の同一性がすることを指し示す。
【００４４】
ポリペプチドに適用される場合の、「実質的な類似性」または「実質的に類似する」という用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトのギャップの重みを使用する、ＧＡＰプログラムまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムなどにより、最適な形でアライメントされた場合に、少なくとも９０％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも９５％、９８％、または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を、同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を伴う側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換する置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的な特性を実質的に変化させないであろう。２つまたはこれを超えるアミノ酸配列が、互いと、保存的置換により異なる場合は、置換の保存的性格について補正するように、類似性のパーセントまたは程度を、上方に調整することができる。当業者には、この補正を行うための手段が周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２４巻：３０７〜３３１頁を参照されたい。類似する化学的特性を伴う側鎖を有するアミノ酸の群の例は、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リシン、アルギニン、およびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンを含む。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。代替的に、保存的置きかえは、Ｇｏｎｎｅｔら（１９９２年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６巻：１４４３〜４５頁において開示されている、ＰＡＭ２５０対数尤度行列で、正の値を取る任意の変化である。「中程度に保存的な」置きかえとは、ＰＡＭ２５０対数尤度行列で、負でない値を取る任意の変化である。ポリペプチドの配列類似性は、配列解析ソフトウェアを使用して測定することが典型的である。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、多様な置換、欠失、および他の修飾へと割り当てられる、類似性の尺度を使用して、類似する配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物に由来する、相同なポリペプチドなど、近縁のポリペプチドの間の配列相同性もしくは配列同一性、または野生型タンパク質とその変異タンパク質との配列相同性もしくは配列同一性を決定するのに、デフォルトのパラメータで使用しうる、ＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１を参照されたい。ポリペプチド配列はまた、ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１内のプログラムであるＦＡＳＴＡを、デフォルトのパラメータまたは推奨されるパラメータで使用して比較することもできる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリー配列と、検索配列との最良の重複領域についての、アライメントおよび配列同一性パーセントを提示する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００年）、前出）。本開示の配列を、異なる生物に由来する多数の配列を含有するデータベースと比較する場合の、別の好ましいアルゴリズムは、コンピュータプログラムであるＢＬＡＳＴ、とりわけ、デフォルトのパラメータを使用するＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁；および（１９９７年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁を参照されたい。
【００４５】
「治療有効量」という語句は、投与に所望される効果をもたらす量を意味する。正確な量は、処置の目的に依存し、公知の技法を使用して、当業者に確認可能である（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９年）「Ｔｈｅ  Ａｒｔ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ」を参照されたい）。
【００４６】
本明細書で使用される「被験体」という用語は、慢性ウイルス感染、がんまたは自己免疫疾患など、疾患または障害の、好転、防止、および／または処置を必要とする動物、好ましくは哺乳動物を指す。
【００４７】
ＩＩ．免疫ＰＥＴイメージングのためのＰＤ−Ｌ１抗体の放射性標識された免疫コンジュゲート
プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合する放射性標識された抗原結合性タンパク質が、本明細書に提供される。一部の実施形態では、放射性標識された抗原結合性タンパク質は、ポジトロン放射体をキレート化することが可能な化学的な部分である、１または複数のキレート化部分へと共有結合的に連結された抗原結合性タンパク質を含む。
【００４８】
一部の実施形態では、抗体などのＰＤ−Ｌ１に結合する抗原結合性タンパク質が本明細書に提供され、ＰＤ−Ｌ１に結合する前記抗原結合性タンパク質は、以下の構造を有する１または複数の部分に共有結合的に結合される：
−Ｌ−ＭＺ
（式中、Ｌはキレート化部分であり；Ｍはポジトロン放射体であり；ｚは出現毎に独立に０または１であり；ｚの少なくとも１つは１である）。
【００４９】
一部の実施形態では、放射性標識された抗原結合性タンパク質は、式（Ｉ）の化合物である：
Ｍ−Ｌ−Ａ−［Ｌ−ＭＺ］ｋ
（Ｉ）
ＡはＰＤ−Ｌ１に結合するタンパク質であり；Ｌはキレート化部分であり；Ｍはポジトロン放射体であり；ｚは０または１であり；ｋは０〜３０の整数である。一部の実施形態では、ｋは１である。
【００５０】
ある特定の実施形態では、放射性標識された抗原結合性タンパク質は、式（ＩＩ）の化合物である：
Ａ−［Ｌ−Ｍ］ｋ
（ＩＩ）
（式中、ＡはＰＤ−Ｌ１に結合するタンパク質であり；Ｌはキレート化部分であり；Ｍはポジトロン放射体であり；ｋは１〜３０の整数である）。
【００５１】
一部の実施形態では、以下の構造を有するコンジュゲートを含む組成物が本明細書に提供される：
Ａ−Ｌｋ
（式中、ＡはＰＤ−Ｌ１に結合するタンパク質であり；Ｌはキレート化部分であり；ｋは１〜３０の整数であり；コンジュゲートは、臨床ＰＥＴイメージングに適切な比放射能を提供するのに十分な量のポジトロン放射体でキレート化される）。
【００５２】
適切な結合性タンパク質、キレート化部分、およびポジトロン放射体が、以下に提供される。
【００５３】
Ａ．  ＰＤ−Ｌ１結合性タンパク質
適切なＰＤ−Ｌ１結合性タンパク質は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許公開第ＵＳ２０１５−０２０３５８０Ａ１号に記載されているものを含む、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するタンパク質である。本開示の例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、米国特許公開第ＵＳ２０１５−０２０３５８０Ａ１号の表１に列挙され、以下にも提示される。
【表１】
2020512281.tif 000002
表１は、例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）、および軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別子を示す。
【００５４】
一部の実施形態では、結合タンパク質は、表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、あるいは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそれと実質的に類似するその配列を含むＨＣＶＲを含む抗体または抗原結合断片である。
【００５５】
一部の実施形態では、結合タンパク質は、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、あるいは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するそれと実質的に類似するその配列を含むＬＣＶＲを含む抗体または抗原結合断片である。
【００５６】
一部の実施形態では、結合タンパク質は、表１に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかと対となる表１に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列対（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む抗体または抗原結合断片である。ある特定の実施形態に従うと、本開示は、表１に列挙される例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれかに含まれるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２、１３０／１３８、１４６／１５４、１６２／１７０、１７８／１７０、１８６／１９４、２０２／２１０、２１８／２２６、２３４／２４２、２５０／２５８、２６６／２７４、２８２／２７４、２９０／２７４、２９８／２７４、３０６／２７４、３１４／２７４、３２２／２７４、３３０／２７４、および３３８／２７４からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号８２／９０（例えば、Ｈ２Ｍ８３１４Ｎ）、１６２／１７０（例えば、Ｈ２Ｍ８７１８Ｎ）、３０６／２７４（例えば、Ｈ１Ｈ９３６４Ｐ２）、および３１４／２７４（例えば、Ｈ１Ｈ９３７３Ｐ２）のうちの１つから選択される。ある特定の実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対は、配列番号９８／１０６（例えば、Ｈ２Ｍ８３１６Ｎ）、１４６／１５４（例えば、Ｈ２Ｍ８３２３Ｎ）、２９０／２７４（例えば、Ｈ１Ｈ９３５１Ｐ２）、および３３０／２７４（例えば、Ｈ１Ｈ９３８７Ｐ２）のうちの１つから選択される。
【００５７】
一部の実施形態では、結合タンパク質は、表１に列挙されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、あるいは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似するその配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む抗体または抗原結合断片である。
【００５８】
一部の実施形態では、結合タンパク質は、表１に列挙されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、あるいは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似するその配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む抗体または抗原結合断片である。
【００５９】
一部の実施形態では、結合タンパク質は、表１に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、あるいは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似するその配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む抗体または抗原結合断片である。
【００６０】
一部の実施形態では、結合タンパク質は、表１に列挙されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、あるいは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似するその配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む抗体または抗原結合断片である。
【００６１】
一部の実施形態では、結合タンパク質は、表１に列挙されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、あるいは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似するその配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む抗体または抗原結合断片である。
【００６２】
一部の実施形態では、結合タンパク質は、表１に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、あるいは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する実質的に類似するその配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む抗体または抗原結合断片である。
【００６３】
一部の実施形態では、結合タンパク質は、表１に列挙されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかと対となる表１に列挙されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列対（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む抗体または抗原結合断片である。ある特定の実施形態に従うと、本開示は、表１に列挙される例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれかに含まれるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対を含む抗体またはその抗原結合断片を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、配列番号８８／９６（例えば、Ｈ２Ｍ８３１４Ｎ）、１６８／１７６（例えば、Ｈ２Ｍ８７１８Ｎ）、３１２／２８０（例えば、Ｈ１Ｈ９３６４Ｐ２）、および３２０／２８０（例えば、Ｈ１Ｈ９３７３Ｐ２）からなる群から選択される。ある特定の別の実施形態では、ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列対は、配列番号１０４／１１２（例えば、Ｈ２Ｍ８３１６Ｎ）、１５２／１６０（例えば、Ｈ２Ｍ８３２３Ｎ）、２９６／２８０（例えば、Ｈ１Ｈ９３５１Ｐ２）、および３３６／２８０（例えば、Ｈ１Ｈ９３８７Ｐ２）からなる群から選択される。
【００６４】
一部の実施形態では、結合タンパク質は、表１に列挙される例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれかに含まれる６つのＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）のセットを含む抗体または抗原結合断片である。ある特定の実施形態では、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、配列番号８４−８６−８８−９２−９４−９６（例えば、Ｈ２Ｍ８３１４Ｎ）；１６４−１６６−１６８−１７２−１７４−１７６（例えば、Ｈ２Ｍ８７１８Ｎ）；３０８−３１０−３１２−２７６−２７８−２８０（例えば、Ｈ１Ｈ９３６４Ｐ２）；および３１６−３１８−３２０−２７６−２７８−２８０（例えば、Ｈ１Ｈ９３７３Ｐ２）からなる群から選択される。ある特定の別の実施形態では、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、配列番号１００−１０２−１０４−１０８−１１０−１１２（例えば、Ｈ２Ｍ８３１６Ｎ）；１４８−１５０−１５２−１５６−１５８−１６０（例えば、Ｈ２Ｍ８３２３Ｎ）；２９２−２９４−２９６−２７６−２７８−２８０（例えば、Ｈ１Ｈ９３５１Ｐ２）；および３３２−３３４−３３６−２７６−２７８−２８０（例えば、Ｈ１Ｈ９３８７Ｐ２）からなる群から選択される。
【００６５】
一部の実施形態では、結合タンパク質は、表１に列挙した、例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体のうちのいずれかにより規定される、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲのアミノ酸配列対内に含有される、６つのＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含む、抗体または抗原結合性断片である。一部の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号８２／９０（例えば、Ｈ２Ｍ８３１４Ｎ）、９８／１０６（例えば、Ｈ２Ｍ８３１６Ｎ）、１４６／１５４（例えば、Ｈ２Ｍ８３２３Ｎ）、１６２／１７０（例えば、Ｈ２Ｍ８７１８Ｎ）、２９０／２７４（例えば、Ｈ１Ｈ９３５１Ｐ２）、３０６／２７４（例えば、Ｈ１Ｈ９３６４Ｐ２）、３１４／２７４（例えば、Ｈ１Ｈ９３７３Ｐ２）および３３０／２７４（例えば、Ｈ１Ｈ９３８７Ｐ２）からなる群より選択される、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲのアミノ酸配列対内に含有されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列のセットを含む、抗体またはそれらの抗原結合性断片を含む。当技術分野では、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲのアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法および技法が周知であり、本明細書で開示される、指定されたＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲのアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するのに使用することができる。ＣＤＲの境界を同定するのに使用しうる、例示的な常套手段は、例えば、Ｋａｂａｔによる定義、Ｃｈｏｔｈｉａによる定義、およびＡｂＭによる定義を含む。一般に、Ｋａｂａｔによる定義という用語は、配列可変性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａによる定義という用語は、構造的なループ領域の位置に基づき、ＡｂＭ定義とは、Ｋａｂａｔ法とＣｈｏｔｈｉａ法との折衷である。例えば、Ｋａｂａｔ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２７３巻：９２７〜９４８頁（１９９７年）；およびＭａｒｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８６巻：９２６８〜９２７２頁（１９８９年）を参照されたい。公表のデータベースもまた、抗体内のＣＤＲ配列を同定するために利用可能である。
【００６６】
一部の実施形態では、結合性タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１への特異的結合について、ＨＣＶＲのＣＤＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含む抗体またはその抗原結合性断片であって、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの各々が、表１に列挙したＨＣＶＲ配列およびＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する抗体またはその抗原結合性断片と競合する抗体およびそれらの抗原結合性断片である。
【００６７】
一部の実施形態では、結合性タンパク質は、ＰＤ−１またはＢ７−１へのＰＤ−Ｌ１結合を遮断する単離抗体およびそれらの抗原結合性断片である。一部の実施形態では、ＰＤ−１またはＢ７−１へのＰＤ−Ｌ１結合を遮断する抗体またはその抗原結合性断片は、ＰＤ−Ｌ１においてＰＤ−１／Ｂ７−１と同じエピトープに結合しうる、あるいはＰＤ−Ｌ１においてＰＤ−１／Ｂ７−１と異なるエピトープに結合しうる。ある特定の実施形態では、ＰＤ−１またはＢ７−１へのＰＤ−Ｌ１結合を遮断する本開示の抗体は、表１に列挙したＨＣＶＲ配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲのＣＤＲ；および表１に列挙したＬＣＶＲ配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲのＣＤＲを含む。
【００６８】
代替的な実施形態では、本開示は、ＰＤ−１またはＢ７−１へのＰＤ−Ｌ１結合を遮断しない抗体およびその抗原結合断片を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、ＰＤ−Ｌ１に結合する単離抗体またはその抗原結合断片を提供し、ここで、抗体またはその抗原結合断片は、ＰＤ−１またはＢ７−１へのＰＤ−Ｌ１結合を増強する。一部の実施形態では、ＰＤ−１／Ｂ７−１へのＰＤ−Ｌ１結合を増強する単離抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１８、６６、１１４、１３０、２０２、２１８、２６６、２８２、２９８、３２２および３３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲのＣＤＲ；ならびに配列番号２６、７４、１２２、１３８、２１０、２２６、および２７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、単離抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１８／２６（例えば、Ｈ２Ｍ８３０７Ｎ）、６６／７４（例えば、Ｈ２Ｍ８３１２Ｎ）、１１４／１２２（例えば、Ｈ２Ｍ８３１７Ｎ）、１３０／１３８（例えば、Ｈ２Ｍ８３２１Ｎ）、２０２／２１０（例えば、Ｈ１Ｈ９３２３Ｐ）、２１８／２２６（例えば、Ｈ１Ｈ９３２７Ｐ）、２６６／２７４（例えば、Ｈ１Ｈ９３４４Ｐ２）、２８２／２７４（例えば、Ｈ１Ｈ９３４５Ｐ２）、２９８／２７４（例えば、Ｈ１Ｈ９３５４Ｐ２）、３２２／２７４（例えば、Ｈ１Ｈ９３８２Ｐ２）、および３３８／２７４（例えば、Ｈ１Ｈ９３９６Ｐ２）からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
【００６９】
一部の実施形態では、結合性タンパク質は、ヒトまたは他の種に由来するＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合性断片である。ある特定の実施形態では、抗体は、ヒトＰＤ−Ｌ１および／またはカニクイザルＰＤ−Ｌ１に結合しうる。
【００７０】
一部の実施形態では、結合性タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１への結合について、ＨＣＶＲのＣＤＲおよびＬＣＶＲのＣＤＲを含む基準抗体またはその抗原結合性断片であって、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの各々が、表１に列挙したＨＣＶＲ配列およびＬＣＶＲ配列から選択されるアミノ酸配列を有する基準抗体またはその抗原結合性断片と交差競合する抗体およびそれらの抗原結合性断片である。
【００７１】
一実施形態では、結合性タンパク質は、以下の特徴のうちの１または複数を有する単離抗体または抗原結合性断片である：（ａ）ＰＤ−１またはＢ７−１へのＰＤ−Ｌ１の結合を遮断する；（ｂ）ヒトＰＤ−Ｌ１および／またはカニクイザルＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する；（ｃ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいてＴ細胞増殖を阻害する；および（ｄ）ＭＬＲアッセイにおいてＩＬ−２および／またはインターフェロンガンマ分泌を増大させる。
【００７２】
一部の実施形態では、結合性タンパク質は、アゴニスト様式で、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合しうる、すなわち、ＰＤ−Ｌ１の結合および／または活性を増強するか、または刺激することが可能な抗体またはその抗原結合性断片である；他の実施形態では、抗体は、アンタゴニスト様式で、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合することができる、すなわち、抗体は、ＰＤ−Ｌ１が、その受容体に結合することを遮断する。
【００７３】
ある特定の実施形態では、抗体または抗原結合性断片は、ＰＤ−Ｌ１への第１の結合特異性と、第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性とを含む二特異性である。第２の標的エピトープは、ＰＤ−Ｌ１または異なるタンパク質、例えばＴ細胞共阻害剤における別のエピトープでありうる。ある特定の実施形態では、標的エピトープは、例えば、異なるＴ細胞、Ｂ細胞、腫瘍細胞、自己免疫組織細胞またはウイルス感染細胞を含む、異なる細胞上のエピトープでありうる。
【００７４】
一部の実施形態では、抗体および抗体の抗原結合性断片は、例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１５−０２０３５８０Ａ１号の実施例３に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似するアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴により測定される、約３１８ｐＭ未満のＫＤで、単量体ＰＤ−Ｌ１と結合する（例えば、２５℃または３７℃で）。ある特定の実施形態では、抗体またはそれらの抗原結合性断片は、例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１５−０２０３５８０Ａ１号の実施例３で規定されるアッセイフォーマット、または実質的に類似するアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴により測定される、約３００ｐＭ未満、約２５０ｐＭ未満、約１５０ｐＭ未満、約１００ｐＭ未満、または約５０ｐＭ未満のＫＤで、単量体ＰＤ−Ｌ１に結合する。
【００７５】
一部の実施形態では、抗体およびそれらの抗原結合性断片は、例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１５−０２０３５８０Ａ１号の実施例３に規定されるアッセイフォーマットまたは実質的に類似するアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴により測定される、約１５ｐＭ未満のＫＤで、二量体ＰＤ−Ｌ１と結合する（例えば、２５℃または３７℃で）。ある特定の実施形態では、抗体またはそれらの抗原結合性断片は、例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１５−０２０３５８０Ａ１号の実施例３で規定されるアッセイフォーマット、または実質的に類似するアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴により測定される、約１２ｐＭ未満、約１０ｐＭ未満、約８ｐＭ未満、または約５ｐＭ未満のＫＤで、二量体ＰＤ−Ｌ１に結合する。
【００７６】
一部の実施形態では、抗体またはそれらの抗原結合性断片は、例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１５−０２０３５８０Ａ１号の実施例３に規定されるアッセイフォーマットを使用して、表面プラズモン共鳴により測定される、約２８ｎＭ未満のＫＤで、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＰＤ−Ｌ１と結合する（例えば、２５℃または３７℃で）。ある特定の実施形態では、抗体またはそれらの抗原結合性断片は、例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１５−０２０３５８０Ａ１号の実施例３で規定されるアッセイフォーマット、または実質的に類似するアッセイを使用して、表面プラズモン共鳴により測定される、約２５ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、または約５ｎＭ未満のＫＤで、カニクイザルＰＤ−Ｌ１に結合する。
【００７７】
一部の実施形態では、抗体およびそれらの抗原結合性断片は、例えば、米国特許公開ＵＳ  ２０１５−０２０３５８０  Ａ１の実施例３で規定されるアッセイフォーマット、または実質的に類似するアッセイを使用して、２５℃または３７℃で、表面プラズモン共鳴により測定される通り、約１分間を超える解離半減期（ｔ１／２）で、ＰＤ−Ｌ１に結合する。ある特定の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性断片は、例えば、米国特許公開ＵＳ  ２０１５−０２０３５８０  Ａ１の実施例３で規定されるアッセイフォーマット（例えば、ｍＡｂ捕捉または抗原捕捉フォーマット）、または実質的に類似するアッセイを使用して、２５℃または３７℃で、表面プラズモン共鳴により測定される通り、約５分間を超える、約１０分間を超える、約３０分間を超える、約５０分間を超える、約６０分間を超える、約７０分間を超える、約８０分間を超える、約９０分間を超える、約１００分間を超える、約２００分間を超える、約３００分間を超える、約４００分間を超える、約５００分間を超える、約６００分間を超える、約７００分間を超える、または約８００分間を超えるｔ１／２で、ＰＤ−Ｌ１に結合する。
【００７８】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、例えば、米国特許公開２０１５−０２０３５８０  Ａ１の実施例４に示されるようなＥＬＩＳＡベースの免疫アッセイアッセイ、または実質的に類似するアッセイを使用して決定した場合に約７７０ｐＭ未満のＩＣ５０でＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１結合を遮断する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、例えば、米国特許公開２０１５−０２０３５８０  Ａ１の実施例４に示されるようなＥＬＩＳＡベースの免疫アッセイアッセイ、または実質的に類似するアッセイを使用して決定した場合に約１０ｎＭ未満のＩＣ５０でＢ７−１へのＰＤ−Ｌ１結合を遮断する。一部の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片は、ＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１またはＢ７−１への結合を増強する。
【００７９】
一部の実施形態では、抗体は、ＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインまたはドメインの断片に結合する。一部の実施形態では、抗体は、１つよりも多いドメインに結合する（交差反応性抗体）。ある特定の実施形態では、抗体は、ＮＰ＿０５４８６２．１のアミノ酸残基１９〜２３９を含む細胞外ドメインに位置するエピトープに結合する。
【００８０】
ある特定の実施形態では、抗体は、全長タンパク質の任意の他の領域または断片への結合を介して、ＰＤ−Ｌ１と関連するＰＤ−１結合またはＢ７−１結合活性を遮断または阻害することにより機能する。ある特定の実施形態では、抗体は、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１／Ｂ７−１との間の相互作用を弱めるまたはモジュレートする。
【００８１】
ある特定の実施形態では、抗体は、二特異性抗体である。二特異性抗体は、ＰＤ−Ｌ１の１つのドメインにおいて１つのエピトープに結合することができ、ＰＤ−Ｌ１の異なるドメインにおいて第２のエピトープにも結合することができる。ある特定の実施形態では、二特異性抗体は、同じドメインにおいて２つの異なるエピトープに結合する。一実施形態では、多特異性抗原結合分子は、第１の抗原結合特異性を含み、第１の結合特異性は、ＰＤ−１の細胞外ドメインまたはそれらの断片を含む；および第２の抗原結合特異性は、ＰＤ−Ｌ１の別のエピトープに対する。別の実施形態では、多特異性抗原結合分子は、第１の抗原結合特異性を含み、第１の結合特異性は、Ｂ７−１の細胞外ドメインまたはそれらの断片を含む；および第２の抗原結合特異性は、ＰＤ−Ｌ１の別のエピトープに対する。
【００８２】
一実施形態では、抗体またはその断片は、以下の特徴：（ｉ）配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４、１３０、１４６、１６２、１７８、１８６、２０２、２１８、２３４、２５０、２５８、２６６、２７４、２８２、２９０、２９８、３０６、３１４、３２２、３３０および３３８からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それと実質的に類似する配列を有するＨＣＶＲを含むこと；（ｉｉ）配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２、１３８、１５４、１７０、１９４、２１０、２２６、２４２、２５８および２７４からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それと実質的に類似する配列を有するＬＣＶＲを含むこと；（ｉｉｉ）配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８０、２８８、２９６、３０４、３１２、３２０、３２８、３３６および３４４からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それと実質的に類似する配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；ならびに配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、２００、２１６、２３２、２４８、２６４および２８０からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それと実質的に類似する配列を有するＬＣＤＲ３ドメインを含むこと；（ｉｖ）配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１８８、２０４、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、２９２、３００、３０８、３１６、３２４、３３２および３４０からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それと実質的に類似する配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、２９４、３０２、３１０、３１８、３２６、３３４および３４２からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それと実質的に類似する配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０および２７６からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それと実質的に類似する配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；ならびに配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２および２７８からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それと実質的に類似する配列を有するＬＣＤＲ２ドメインを含むこと；（ｖ）ＰＤ−Ｌ１に対する第１の結合特異性と、ＰＤ−Ｌ１、腫瘍特異的な抗原、ウイルス感染細胞抗原およびＴ細胞共阻害剤からなる群より選択される抗原に対する第２の結合特異性とを含む多特異性の抗原結合分子であること；（ｖｉ）約４ｐＭ〜約６４５ｎＭのＫＤでヒトＰＤ−Ｌ１に結合すること；（ｖｉｉ）約７０ｐＭ〜約４００ｎＭのＫＤでカニクイザルＰＤ−Ｌ１に結合すること；（ｖｉｉｉ）ＩＣ５０≦７７０ｐＭでＰＤ−１のＰＤ−１への結合を遮断または増強すること；（ｉｘ）ＩＣ５０≦１０ｎＭでＰＤ−Ｌ１のＢ７−１への結合を遮断または増強すること；（ｘ）Ｔ細胞／ＡＰＣルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、ＰＤ−１誘導性Ｔ細胞下方制御を遮断し、かつ／またはＴ細胞シグナル伝達をレスキューすること；（ｘｉ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいてＴ細胞増殖および活性を刺激すること；（ｘｉｉ）ＭＬＲアッセイにおいてＩＬ−２および／またはＩＦＮγ産生を誘導すること；（ｘｉｉｉ）がんを伴う被験体における腫瘍の増殖を抑制し、生存を延長することのうちの１または複数を呈示する、ＰＤ−Ｌ１に結合する完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である。
【００８３】
一実施形態では、抗体またはその断片は、以下の特徴：（ｉ）配列番号８２、９８、１４６、１６２、２９０、３０６、３１４および３３０からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それと実質的に類似する配列を有するＨＣＶＲを含むこと；（ｉｉ）配列番号９０、１０６、１５４、１７０および２７４からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それと実質的に類似する配列を有するＬＣＶＲを含むこと；（ｉｉｉ）配列番号８８、１０４、１５２、１６８、２９６、３１２、３２０および３３６からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それと実質的に類似する配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；ならびに配列番号９６、１１２、１６０、１７６および２８０からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それと実質的に類似する配列を有するＬＣＤＲ３ドメインを含むこと；（ｉｖ）配列番号８４、１００、１４８、１６４、２９２、３０８、３１６および３３２からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それと実質的に類似する配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；配列番号８６、１０２、１５０、１６６、２９４、３１０、３１８および３３４からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それと実質的に類似する配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；配列番号９２、１０８、１５６、１７２および２７６からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それと実質的に類似する配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；ならびに配列番号９４、１１０、１５８、１７４および２７８からなる群より選択されるアミノ酸配列、または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、それと実質的に類似する配列を有するＬＣＤＲ２ドメインを含むこと；（ｖ）ＰＤ−Ｌ１に対する第１の結合特異性と、ＰＤ−Ｌ１の異なるエピトープ、腫瘍特異的な抗原、ウイルス感染細胞抗原およびＴ細胞共阻害剤からなる群より選択される抗原に対する第２の結合特異性とを含む多特異性の抗原結合分子であること；（ｖｉ）ＫＤ≦１０−１０ＭでヒトＰＤ−Ｌ１に結合すること；（ｖｉｉ）ＫＤ≦１０−７ＭでカニクイザルＰＤ−Ｌ１に結合すること；（ｖｉｉｉ）ＰＤ−１のＰＤ−１またはＢ７−１への結合を遮断すること；（ｉｘ）Ｔ細胞／ＡＰＣルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、ＰＤ−１誘導性Ｔ細胞下方制御を遮断し、かつ／またはＴ細胞シグナル伝達をレスキューすること；（ｘｉ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいてＴ細胞増殖および活性を刺激すること；（ｘｉｉ）ＭＬＲアッセイにおいてＩＬ−２および／またはＩＦＮγ産生を誘導すること；（ｘｉｉｉ）がんを伴う被験体における腫瘍の増殖を抑制し、生存を延長することのうちの１または複数を呈示する、ＰＤ−１またはＢ７−１へのＰＤ−Ｌ１結合を遮断する完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である。
【００８４】
ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはそれらの抗原結合性断片は、ＰＤ−Ｌ１内の、例示される領域のうちの任意の１または複数の中のエピトープであって、天然形態のエピトープ、組換えにより作製されたエピトープ、またはこれらの断片に結合する。一部の実施形態では、本開示の抗体は、ＰＤ−Ｌ１のアミノ酸残基１９〜２３９からなる群より選択される、１または複数のアミノ酸を含む細胞外領域に結合する。一部の実施形態では、本開示の抗体は、カニクイザルＰＤ−Ｌ１のアミノ酸残基１〜２２１からなる群より選択される、１または複数のアミノ酸を含む領域に結合する。
【００８５】
ある特定の実施形態では、表１に示される、本開示の抗体は、ＰＤ−Ｌ１の約１９位から約１３０位の範囲のアミノ酸残基；またはＰＤ−Ｌ１の約１３０位から約１５３位の範囲のアミノ酸残基；またはＰＤ−Ｌ１の約１５３位から約２１０位の範囲のアミノ酸残基；またはＰＤ−Ｌ１の約２１０位から約２３９位の範囲のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列と相互作用する。
【００８６】
一部の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書の表１で記載される、特定の例示的な抗体のうちのいずれか、または表１で記載された例示的な抗体のうちのいずれかのＣＤＲ配列を有する抗体と同じエピトープ、またはエピトープの区分に結合する。同様に、適切な抗体はまた、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ１断片への結合について、本明細書の表１で記載される、特定の例示的な抗体のうちのいずれか、または表１で記載された例示的な抗体のうちのいずれかのＣＤＲ配列を有する抗体と競合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体も含む。例えば、適切な抗体は、ＰＤ−Ｌ１への結合について、本明細書の実施例６で規定される１または複数の抗体（例えば、Ｈ２ａＭ８３０９Ｎ、Ｈ１Ｈ９３２９Ｐ、Ｈ１Ｈ９３３６Ｐ、Ｈ２ａＭ８３１４Ｎ、Ｈ２ａＭ８３１６Ｎ、Ｈ２ＡＭ８７１８Ｎ、Ｈ１Ｈ９３８７Ｐ２、Ｈ１Ｈ９３５１Ｐ２、Ｈ１Ｈ９３６４Ｐ２、Ｈ１Ｈ９３７３Ｐ２、およびＨ２ａＭ８３０６Ｎ）と交差競合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む。本開示は、ＰＤ−Ｌ１への結合について、米国特許公開第ＵＳ２０１５−０２０３５８０Ａ１号の実施例６で規定される１または複数の抗体（例えば、Ｈ１Ｈ９３９６Ｐ２、Ｈ２ａＭ８３１７Ｎ、Ｈ２ａＭ８３２１Ｎ、Ｈ１Ｈ９３２３Ｐ、Ｈ１Ｈ９３８２Ｐ２、Ｈ１Ｈ９３４４Ｐ２、Ｈ１Ｈ９３４５Ｐ２およびＨ１Ｈ９３５４Ｐ２）と交差競合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体も含む。
【００８７】
本明細書に記載される抗体および抗原結合性断片は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１またはＢ７−１との相互作用をモジュレートする。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１に、高アフィニティーで結合する場合もあり、低アフィニティーで結合する場合もある。ある特定の実施形態では、抗体は、遮断抗体であり、ＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１またはＢ７−１との相互作用を遮断する。一部の実施形態では、本開示の遮断抗体は、ＰＤ−Ｌ１の、ＰＤ−１またはＢ７−１への結合を遮断し、かつ／またはＴ細胞活性化を刺激もしくは増強する。一部の実施形態では、遮断抗体は、免疫応答を刺激もしくは増強し、かつ／またはがんもしくは慢性ウイルス感染を患う被験体を処置するのに有用でありうる。抗体は、それを必要とする被験体へと投与されると、被験体におけるＨＩＶ、ＬＣＭＶ、またはＨＢＶなどのウイルスによる慢性感染を低減しうる。抗体を使用して、被験体における腫瘍細胞の増殖を阻害することができる。抗体は、単独で使用することもでき、がんまたはウイルス感染を処置するための、当技術分野で公知の、他の治療用部分または治療モダリティーを伴う補助治療として使用することもできる。ある特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１に低アフィニティーで結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、多特異性の抗原結合分子として使用され、ここで、第１の結合特異性が、ＰＤ−Ｌ１に低アフィニティーで結合し、第２の結合特異性が、ＰＤ−Ｌ１の異なるエピトープ、Ｔ細胞共阻害剤、例えばＰＤ−１、腫瘍特異的な抗原および感染細胞特異的な抗原からなる群より選択される抗原に結合する。
【００８８】
ある特定の実施形態では、本開示の抗体は、アゴニスト抗体であり、ＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１／Ｂ７−１との相互作用を増強する。一部の実施形態では、活性化抗体は、ＰＤ−Ｌ１の、ＰＤ−１またはＢ７−１への結合を増強し、かつ／またはＴ細胞活性化を阻害もしくは抑制する。本開示の活性化抗体は、被験体における免疫応答を阻害することにおよび／または自己免疫疾患を処置することに有用でありうる。
【００８９】
ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、多特異性の抗原結合性分子であり、ＰＤ−Ｌ１に対する第１の結合特異性と、ＰＤ−Ｌ１の異なるエピトープ、Ｔ細胞共阻害剤（例えば、ＰＤ−１）、腫瘍特異的な抗原および感染細胞特異的な抗原からなる群より選択される抗原に対する第２の結合特異性とを含む。ある特定の実施形態では、第１の結合特異性は、ＰＤ−Ｌ１に、１０−８Ｍ、１０−７Ｍまたはそれよりも大きいＫＤなどの低アフィニティーで結合する。
【００９０】
本開示のある特定の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにより決定される通り、ＰＤ−Ｌ１に結合し、その活性を中和することが可能である。本開示の抗体が、ＰＤ−Ｌ１に結合し、その活性を中和する能力は、当業者に公知の、任意の標準的な方法であって、本明細書で記載される結合アッセイまたは活性アッセイを含む方法を使用して測定することができる。
【００９１】
結合活性を測定するための、非限定的な、例示的ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、米国特許公開第ＵＳ２０１５−０２０３５８０Ａ１号の実施例３に例示される。実施例３では、ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体の、ヒトＰＤ−Ｌ１およびカニクイザルＰＤ−Ｌ１に対する結合アフィニティーおよび反応速度定数を、表面プラズモン共鳴により決定し、測定を、Ｔ２００  Ｂｉａｃｏｒｅ機器上で行った。米国特許公開第ＵＳ２０１５−０２０３５８０Ａ１号の実施例４および５では、遮断アッセイを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、ＰＤ−１のまたはＢ７−１へのＰＤ−Ｌ１結合能力を遮断する抗ＰＤ−Ｌ１抗体の能力を決定した。米国特許公開第ＵＳ２０１５−０２０３５８０Ａ１号の実施例６では、遮断アッセイを使用して、異なる抗ＰＤ−Ｌ１抗体の間の交差競合を決定した。米国特許公開第ＵＳ２０１５−０２０３５８０Ａ１号の実施例７では、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現する細胞に対する抗体の結合が記載されている。ＵＳ２０１５−０２０３５８０Ａ１号の実施例８では、ルシフェラーゼアッセイを使用して、抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、Ｔ細胞内の、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達をアンタゴナイズする能力を決定した。
【００９２】
そうでないことが具体的に指し示されない限りにおいて、本明細書で使用される「抗体」という用語は、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖を含む抗体分子（すなわち、「全長抗体分子」）ならびにこれらの抗原結合性断片を包含すると理解されるものとする。本明細書で使用される、抗体の「抗原結合性区分」、抗体の「抗原結合性断片」などの用語は、任意の、天然に存在するか、酵素的に得られるか、合成であるか、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質であって、抗原に特異的に結合して、複合体を形成するポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。本明細書で使用される、抗体の「抗原結合性断片」または「抗体断片」という用語は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１または複数の断片を指す。抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、ＣＤＲを含有する断片、または単離ＣＤＲを含みうる。ある特定の実施形態では、「抗原結合性断片」という用語は、多特異性の抗原結合性分子のポリペプチドまたはその断片を指す。このような実施形態では、「抗原結合性断片」という用語は、例えば、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、ＰＤ−１の細胞外ドメインを含む。抗体の抗原結合性断片は、例えば、タンパク質分解性消化、または抗体の可変ドメインおよび（任意選択で）定常ドメインをコードするＤＮＡの操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）および発現を伴う、組換え遺伝子操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）法など、任意の適切な標準的技法を使用して、全長抗体分子から導出することができる。このようなＤＮＡは、公知であり、かつ／もしくは、例えば、市販の供給源である、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む）からたやすく入手可能であるか、または合成することができる。ＤＮＡは、シーケンシングし、化学的に操作することもでき、分子生物学的技術を使用して、例えば、１または複数の可変ドメインおよび／または定常ドメインを、適切な構成へと配置するか、またはコドンを導入するか、システイン残基を創出するか、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失させることなどにより操作することもできる。
【００９３】
抗原結合性断片の非限定的な例は、（ｉ）Ｆａｂ断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片；（ｉｖ）Ｆｖ断片；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂ断片；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる、最小限の認識単位（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離相補性決定領域（ＣＤＲ））、または拘束ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドを含む。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、低分子免疫医薬（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなど、他の操作分子もまた、本明細書で使用される「抗原結合性断片」という表現の中に包含される。
【００９４】
抗体の抗原結合性断片は典型的に、少なくとも１つの可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成であることが可能であり、一般に、１または複数のフレームワーク配列と隣接するか、またはこれらとインフレームにある、少なくとも１つのＣＤＲを含むであろう。ＶＬドメインと会合するＶＨドメインを有する抗原結合性断片内では、ＶＨドメインと、ＶＬドメインとを、互いと比べて、任意の適切な配置に置くことができる。例えば、可変領域は、二量体であることが可能であり、ＶＨ−ＶＨ二量体、ＶＨ−ＶＬ二量体、またはＶＬ−ＶＬ二量体を含有しうる。代替的に、抗体の抗原結合性断片は、単量体のＶＨドメインまたはＶＬドメインを含有しうる。
【００９５】
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合性断片は、少なくとも１つの定常ドメインへと共有結合的に連結された、少なくとも１つの可変ドメインを含有しうる。本開示の抗体の抗原結合性断片内で見出されうる、可変ドメインおよび定常ドメインの、非限定的な例示的構成は、（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３；および（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬを含む。可変ドメインおよび定常ドメインの任意の構成であって、上記で列挙した例示的な構成のうちのいずれかを含む構成では、可変ドメインおよび定常ドメインを、互いと直接連結することもでき、完全なヒンジ領域もしくはリンカー領域または部分的なヒンジ領域もしくはリンカー領域により連結することもできる。ヒンジ領域は、少なくとも２つの（例えば、５つ、１０、１５、２０、４０、６０、またはこれを超える）アミノ酸からなることが可能であり、単一のポリペプチド分子内の、隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメインの間の、可撓性または半可撓性の連結を結果としてもたらす。さらに、本開示の抗体の抗原結合性断片は、上記で列挙した、可変ドメインおよび定常ドメインの構成であって、互いと、かつ／または１または複数の単量体のＶＨドメインまたはＶＬドメインと非共有結合的に会合させた（例えば、ジスルフィド結合による）構成のうちのいずれかの、ホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含みうる。
【００９６】
全長抗体分子と同様に、抗原結合性断片は、単一特異性の場合もあり、多特異性（例えば、二特異性）の場合もある。抗体の多特異性抗原結合性断片は典型的に、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、この場合、各可変ドメインは、別個の抗原または同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することが可能であろう。本明細書で開示される、例示的な二特異性抗体フォーマットを含む、任意の多特異性抗体フォーマットは、当技術分野で利用可能な慣用的な技法を使用して、本開示の抗体の抗原結合性断片の文脈における使用に適合させることができる。
【００９７】
本開示の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗体断片は、記載される抗体のアミノ酸配列から変動するが、ＰＤ−Ｌ１に結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。このような改変体の抗体および抗体断片は、１カ所または複数カ所の、アミノ酸の付加、欠失、または置換であって、親配列と比較した場合、記載される抗体の生物学的活性と本質的に同等の生物学的活性を呈示する付加、欠失、または置換を含む。同様に、本開示の抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示される配列と比較して、１カ所または複数カ所の、ヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含むが、本開示の抗体または抗体断片と、本質的に生物学的に同等である抗体または抗体断片をコードする配列を包含する。
【００９８】
２つの抗原結合性タンパク質または抗体は、例えば、単回用量であれ、複数回用量であれ、同様の実験条件下、同じモル用量で投与された場合に、それらの吸収の速度および程度が有意差を示さない、医薬同等物または医薬代替物であれば、生物学的に同等であると考えられる。一部の抗体は、それらの吸収の程度において同等であるが、それらの吸収の速度において同等でないが、このような吸収速度の差違が、意図的なものであり、例えば、長期使用時において、有効な体内薬物濃度を達成するのに必須ではなく、表示に反映されており、研究される特定の薬物製品にとって、医学的に重要でないと考えられるため、生物学的に同等であると考えうるならば、同等物または医薬代替物と考えられる。
【００９９】
一実施形態では、２つの抗原結合性タンパク質は、それらの安全性、純度、または効力において、臨床的に有意義な差違が見られない場合、生物学的に同等である。
【０１００】
一実施形態では、２つの抗原結合性タンパク質は、患者を、基準生成物と、生物学的生成物との間で、そのような切換えを伴わずに治療を持続させた場合と比較した、予測される有害作用の危険性の増大であって、免疫原性の臨床的に有意な変化、または有効性の減殺を含む有害作用の危険性の増大を伴わずに、１回または複数回にわたり切り換えうる場合、生物学的に同等である。
【０１０１】
一実施形態では、２つの抗原結合性タンパク質は、それらのいずれもが、そのような機構が公知である程度において、１または複数の使用条件に対する、１または複数の共通の作用機構により作用する場合、生物学的に同等である。
【０１０２】
生物学的等価性は、ｉｎ  ｖｉｖｏ法により裏付けることもでき、かつ／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ法により裏付けることもできる。生物学的等価性の尺度は、例えば、（ａ）ヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏ試験であって、抗体またはその代謝物の濃度を、血液中、血漿中、血清中、または他の生物学的流体中で、時間の関数として測定するｉｎ  ｖｉｖｏ試験；（ｂ）ヒトのｉｎ  ｖｉｖｏにおけるバイオアベイラビリティーデータと相関しており、その妥当な予測であるｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験；（ｃ）ヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏ試験であって、抗体（またはその標的）の適切な短期的薬理学効果を時間の関数として測定するｉｎ  ｖｉｖｏ試験；および（ｄ）十分にコントロールされた臨床試験であって、抗体の安全性、有効性、もしくはバイオアベイラビリティー、または生物学的等価性を確立する臨床試験を含む。
【０１０３】
本開示の抗体の生物学的に同等な改変体は、例えば、残基または配列の多様な置換を施すことにより構築することもでき、生物学的活性に必要とされない、末端または内部の残基または配列を欠失させることにより構築することもできる。例えば、生物学的活性に必須でないシステイン残基は、復元時における、不要であるかまたは不適正な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するように、欠失させるか、または他のアミノ酸で置きかえることができる。他の文脈では、生物学的に同等な抗体は、抗体のグリコシル化特徴を修飾するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を消失させるかまたは除去する変異を含む抗体改変体を含みうる。
【０１０４】
本開示のある特定の実施形態に従い、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、例えば、中性のｐＨと比較して、酸性のｐＨにおいて、抗体の、ＦｃＲｎ受容体への結合を増強または減殺する、１カ所または複数カ所の変異を含むＦｃドメインを含む。例えば、本開示は、Ｆｃドメインの、ＣＨ２領域内またはＣＨ３領域内に変異を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含み、この場合、変異は、酸性環境（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０の範囲である、エンドソーム内）で、Ｆｃドメインの、ＦｃＲｎへのアフィニティーを増大させる。このような変異は、動物へと投与されると、抗体の血清半減期の延長を結果としてもたらしうる。このようなＦｃ修飾の非限定的な例は、例えば、２５０位（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８位（例えば、ＬまたはＦ）；２５２位（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）、ならびに２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）における修飾；または４２８および／もしくは４３３位（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）、および／もしくは４３４位（例えば、Ａ、Ｗ、Ｈ、ＦまたはＹ［Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４Ｆ、またはＮ４３４Ｙ］）における修飾；または２５０および／または４２８位における修飾；または３０７位もしくは３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）および４３４位における修飾を含む。一実施形態では、修飾は、４２８Ｌ修飾（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ修飾（例えば、Ｎ４３４Ｓ）；４２８Ｌ修飾、２５９Ｉ修飾（例えば、Ｖ２５９Ｉ）、および３０８Ｆ修飾（例えば、Ｖ３０８Ｆ）；４３３Ｋ修飾（例えば、Ｈ４３３Ｋ）、および４３４位の修飾（例えば、４３４Ｙ）；２５２、２５４、および２５６位の修飾（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ）；２５０Ｑ修飾および４２８Ｌ修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８修飾（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。さらに別の実施形態では、修飾は、２６５Ａ修飾（例えば、Ｄ２６５Ａ）および／または２９７Ａ修飾（例えば、Ｎ２９７Ａ）を含む。
【０１０５】
例えば、本開示は、２５０Ｑおよび２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔ、および２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌおよび４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）；２５７Ｉおよび３１１Ｉ（例えば、Ｐ２５７ＩおよびＱ３１１Ｉ）；２５７Ｉおよび４３４Ｈ（例えば、Ｐ２５７ＩおよびＮ４３４Ｈ）；３７６Ｖおよび４３４Ｈ（例えば、Ｄ３７６ＶおよびＮ４３４Ｈ）；３０７Ａ、３８０Ａ、および４３４Ａ（例えば、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、およびＮ４３４Ａ）；ならびに４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）からなる群より選択される、変異の１または複数の対または群を含むＦｃドメインを含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む。一実施形態では、本開示は、二量体の安定化を促進するように、ＩｇＧ４のヒンジ領域内にＳ１０８Ｐ変異を含むＦｃドメインを含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む。前出のＦｃドメイン変異、および本明細書で開示される抗体可変ドメイン内の他の変異の全ての可能な組み合わせは、本開示の範囲内にあることが想定される。
【０１０６】
本開示はまた、キメラ重鎖定常（ＣＨ）領域を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体も含むが、この場合、キメラＣＨ領域は、１つを超える免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ領域に由来するセグメントを含む。例えば、本開示の抗体は、ヒトＩｇＧ１分子、ヒトＩｇＧ２分子、またはヒトＩｇＧ４分子に由来する、ＣＨ２ドメインの一部または全部であって、ヒトＩｇＧ１分子、ヒトＩｇＧ２分子、またはヒトＩｇＧ４分子に由来する、ＣＨ３ドメインの一部または全部と組み合わされた、ＣＨ２ドメインの一部または全部を含むキメラＣＨ領域を含みうる。ある特定の実施形態に従い、本開示の抗体は、キメラヒンジ領域を有する、キメラＣＨ領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４のヒンジ領域に由来する、「上方ヒンジ」のアミノ酸配列（ＥＵ番号付けに従い、２１６〜２２７位に由来するアミノ酸残基）であって、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４のヒンジ領域に由来する「下方ヒンジ」の配列（ＥＵ番号付けに従い、２２８〜２３６位に由来するアミノ酸残基）と組み合わされたアミノ酸配列を含みうる。ある特定の実施形態に従い、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４の上方ヒンジに由来するアミノ酸残基と、ヒトＩｇＧ２の下方ヒンジに由来するアミノ酸残基とを含む。ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるキメラＣＨ領域を含む抗体は、抗体の治療特性または薬物動態特性に有害な影響を及ぼさずに、Ｆｃエフェクター機能の修飾を呈示する（例えば、その開示が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、２０１４年１月３１日に出願されたＵＳＳＮ１４／１７０，１６６を参照されたい）。
【０１０７】
Ｂ．ポジトロン放射体およびキレート化部分
適切なポジトロン放射体は、キレート化部分と安定な複合体を形成し、免疫ＰＥＴメージングの目的に適切な物理的半減期を有するものを含むが、これらに限定されない。例示的なポジトロン放射体は、８９Ｚｒ、６８Ｇａ、６４Ｃｕ、４４Ｓｃ、および８６Ｙを含むが、これらに限定されない。適切なポジトロン放射体は、７６Ｂｒおよび１２４Ｉを含むが、これらに限定されない、ＰＤ−Ｌ１結合性タンパク質に直接的に結合するもの、ならびに補欠分子族、例えば１８Ｆを介して導入されるものも含む。
【０１０８】
本明細書に記載されるキレート化部分は、ＰＤ−Ｌ１結合性タンパク質、例えば抗ＰＤ−Ｌ１抗体に共有結合的に連結された化学的な部分であり、ポジトロン放射体をキレート化することが可能な、すなわち、ポジトロン放射体と反応して配位キレート複合体を形成することが可能な区分を含む。適切な部分は、特定の金属の効率的な負荷を可能とし、ｉｎ  ｖｉｖｏで、免疫ＰＥＴイメージングなどの診断的使用のため十分に安定な金属キレーター複合体を形成するものを含む。例示的なキレート化部分は、ポジトロン放射体の解離および骨ミネラル（ｍｉｎｅｒａｌ  ｂｏｎｅ）、血漿タンパク質、および／または骨髄への蓄積を最小化し、診断的使用に適切な程度に沈着するものを含む。
【０１０９】
キレート化部分の例は、ポジトロン放射体８９Ｚｒ、６８Ｇａ、６４Ｃｕ、４４Ｓｃ、および／または８６Ｙとの安定な複合体を形成するものを含むが、これらに限定されない。例示的なキレート化部分は、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、５巻（４号）：７３９頁、２０１０年；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、２６巻（１２号）：２５７９頁（２０１５年）；Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ  （Ｃａｍｂ）、５１巻（１２号）：２３０１頁（２０１５年）；Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、１２巻：２１４２頁（２０１５年）；Ｍｏｌ．  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｂｉｏｌ．、１８巻：３４４頁（２０１５年）；Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｍｏｌ．  Ｉｍａｇｉｎｇ、３７巻：２５０頁（２０１０年）；Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｍｏｌ．  Ｉｍａｇｉｎｇ  （２０１６年）、ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２５９−０１６−３４９９−ｘ；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、２６巻（１２号）：２５７９頁（２０１５年）；ＷＯ２０１５／１４０２１２Ａ１；およびＵＳ５，６３９，８７９（参照によりその全体が本願に組み込まれる）に記載されているものを含むが、これらに限定されない。
【０１１０】
例示的なキレート化部分は、デスフェリオキサミン（ＤＦＯ）、１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ（メチレンホスホン）酸（ＤＯＴＰ）、１Ｒ，４Ｒ，７Ｒ，１０Ｒ）−□’□’’□’’’−テトラメチル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＭＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）、Ｈ４ｏｃｔａｐａ、Ｈ６ｐｈｏｓｐａ、Ｈ２ｄｅｄｐａ、Ｈ５ｄｅｃａｐａ、Ｈ２ａｚａｐａ、ＨＯＰＯ、ＤＯ２Ａ、１，４，７，１０−テトラキス（カルバモイルメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（ＤＯＴＡＭ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，７，１０−テトラキス（カルバモイルメチル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（ＤＯＴＡＭ）、１，４，８，１１−テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカン−４，１１−ジセト酸（ｄｉｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（ＣＢ−ＴＥ２Ａ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（Ｃｙｃｌｅｎ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（Ｃｙｃｌａｍ）、八座キレーター（ｏｃｔａｄｅｎｔａｔｅ  ｃｈｅｌａｔｏｒ）、六座キレーター（ｈｅｘａｄｅｎｔａｔｅ  ｃｈｅｌａｔｏｒ）、ホスホネートベースのキレーター、大環状キレーター、大環状テレフタルアミドリガンドを含むキレーター、二機能性キレーター、フサリニンＣおよびフサリニンＣ誘導体キレーター、トリアセチルフサリニンＣ（ＴＡＦＣ）、フェリオキサミンＥ（ＦＯＸＥ）、フェリオキサミンＢ（ＦＯＸＢ）、フェリクロームＡ（ＦＣＨＡ）等を含むものも含むが、これらに限定されない。
【０１１１】
一部の実施形態では、キレート化部分は、キレート化部分のキレート化区分を共有結合的に結合性タンパク質に付加する、リンカー部分を介して、ＰＤ−Ｌ１結合性タンパク質、例えば抗体またはその抗原結合性断片に共有結合的に結合させる。一部の実施形態では、これらのリンカー部分は、抗体のシステインまたはリシンなどのＰＤ−Ｌ１結合性タンパク質の反応性部分と、ｐ−イソチオシアナトベンジル（ｐ−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｏｂｅｎｙｌ）基などを含む、キレーターに付加された反応性部分と、以下のコンジュゲーション方法に提供される反応性部分との間の反応から形成される。加えて、このようなリンカー部分は、任意選択で、極性、溶解度、立体的な相互作用、剛性、および／またはキレート化区分とＰＤ−Ｌ１結合性タンパク質との間の長さを調整する目的のため使用される化学基を含む。
【０１１２】
Ｃ．放射性標識された抗ＰＤ−Ｌ１コンジュゲートの調製
放射性標識された抗ＰＤ−Ｌ１タンパク質コンジュゲートは、（１）ＰＤ−Ｌ１結合性タンパク質、例えば抗体を、ポジトロン放射体キレーターを含む分子およびＰＤ−Ｌ１結合性タンパク質の望ましいコンジュゲーション部位に反応性の部分と反応させること、ならびに（２）望ましいポジトロン放射体を負荷させることにより調製することができる。
【０１１３】
適切なコンジュゲーション部位は、リシンおよびシステインを含むが、これらに限定されず、その両方は、例えば、天然または操作されている場合もあり、例えば、抗体の重鎖または軽鎖に存在する場合もある。システインコンジュゲーション部位は、抗体ジスルフィド結合の変異、挿入、または還元から得られるものを含むが、これらに限定されない。システイン操作抗体を作る方法は、ＷＯ２０１１／０５６９８３に開示されているものを含むが、これらに限定されない。部位特異的なコンジュゲーション方法を使用して、コンジュゲーション反応を抗体の特異的な部位に方向づけて、望ましい化学量論および／または望ましい薬物対抗体（ＤＡＲ）比を達成することもできる。このようなコンジュゲーション方法は、当業者に公知であり、グルタミンコンジュゲーション、Ｑ２９５コンジュゲーション、およびトランスグルタミナーゼ媒介コンジュゲーション、並びに参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３６巻：１００頁（２０１６年）に記載されているものを含むが、これらに限定されない、システイン操作ならびに酵素および化学酵素法を含むが、これらに限定されない。望ましいコンジュゲーション部位に反応性の適切な部分は、一般に、ＰＤ−Ｌ１結合性タンパク質、例えば抗体およびポジトロン放射体キレーターの効率的および容易なカップリングを可能とする。リシンおよびシステイン部位に反応性の部分は、求電子基を含み、これは当業者に公知である。ある特定の態様では、所望のコンジュゲーション部位がリシンである場合、反応性の部分は、イソチオシアネート、例えばｐ−イソチオシアナトベンジル基または反応性エステルである。ある特定の態様では、所望のコンジュゲーション部位がシステインである場合、反応性の部分はマレイミドである。
【０１１４】
キレーターがデスフェリオキサミン（ＤＦＯ）である場合、適切な反応性の部分は、イソチオシアナトベンジル基（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎｔａｔｏｂｅｎｚｙｌ  ｇｒｏｕｐ）、ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル，２，３，５，６テトラフルオロフェノールエステル（ｔｅｔｒａｆｌｕｒｏｒｐｈｅｎｏｌ  ｅｓｔｅｒ）、ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート、および参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＢｉｏＭｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、２０１４巻、Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ２０３６０１に記載されているものを含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１結合性タンパク質は、抗体およびポジトロン放射体キレーターを含む分子であり、コンジュゲーション部位に反応性の部分は、ｐ−イソチオシアナトベンジル−デスフェリオキサミン（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＦＯ）である：
【化１】
2020512281.tif 000003
【０１１５】
ポジトロン放射体負荷は、例えば、本明細書に提供される実施例に記載される方法、または実質的に類似する方法を実施することにより、ＰＤ−Ｌ１結合性タンパク質キレーターコンジュゲートとポジトロン放射体を、キレーターに対する前記ポジトロン放射体の配位を可能とするため十分な時間で、インキュベートすることにより達成される。
【０１１６】
Ｄ．コンジュゲートの例示的な実施形態
ヒトプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合する抗体またはその抗原結合性断片、キレート化部分、およびポジトロン放射体を含む、放射性標識された抗体コンジュゲートが、本開示に含まれる。
【０１１７】
一部の実施形態では、キレート化部分は、８９Ｚｒと複合体を形成することが可能なキレーターを含む。ある特定の実施形態では、キレート化部分は、デスフェリオキサミンを含む。ある特定の実施形態では、キレート化部分は、ｐ−イソチオシアナトベンジル−デスフェリオキサミンである。
【０１１８】
一部の実施形態では、ポジトロン放射体は、８９Ｚｒである。
【０１１９】
一部の実施形態では、コンジュゲートのキレート化部分対抗体比は、１から２である。
【０１２０】
特定の実施形態では、キレート化部分は、ｐ−イソチオシアナトベンジル−デスフェリオキサミンであり、ポジトロン放射体は８９Ｚｒである。別の特定の実施形態では、キレート化部分は、ｐ−イソチオシアナトベンジル−デスフェリオキサミンであり、ポジトロン放射体は８９Ｚｒであり、コンジュゲートのキレート化部分対抗体比は、１から２である。
【０１２１】
一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗原結合性タンパク質が本明細書に提供され、ＰＤ−Ｌ１に結合する前記抗原結合性タンパク質は、以下の構造を有する１または複数の部分に共有結合的に結合される：
−Ｌ−ＭＺ
（式中、Ｌはキレート化部分であり；Ｍはポジトロン放射体であり；ｚは出現毎に独立に０または１であり；ｚの少なくとも１つは１である）。ある特定の実施形態では、放射性標識された抗原結合性タンパク質は、式（Ｉ）の化合物である：
Ｍ−Ｌ−Ａ−［Ｌ−ＭＺ］ｋ
（Ｉ）
ＡはＰＤ−Ｌ１に結合するタンパク質であり；Ｌはキレート化部分であり；Ｍはポジトロン放射体であり；ｚは０または１であり；ｋは０〜３０の整数である。一部の実施形態では、ｋは１である。
【０１２２】
一部の実施形態では、Ｌは：
【化２】
2020512281.tif 000004
である。
【０１２３】
一部の実施形態では、Ｍは８９Ｚｒである。
【０１２４】
一部の実施形態では、ｋは１から２の整数である。一部の実施形態では、ｋは１である。
【０１２５】
一部の実施形態では、−Ｌ−Ｍは、
【化３】
2020512281.tif 000005
である。
【０１２６】
本開示には、放射性標識された抗体コンジュゲートを合成する方法であって、式（ＩＩＩ）の化合物：
【化４】
2020512281.tif 000006
を、８９Ｚｒと接触させることを含み、式中、Ａは、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体またはその抗原結合性断片である方法も含まれる。ある特定の実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体またはその抗原結合性断片をｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＦＯと接触させることにより合成される。
【０１２７】
式（ＩＩＩ）の化合物と８９Ｚｒとの間の反応の産物も本明細書に提供される。
【０１２８】
式（ＩＩＩ）：
【化５】
2020512281.tif 000007
の化合物が、本明細書に提供され、式中、Ａは、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり、ｋは１〜３０の整数である。一部の実施形態では、ｋは１または２である。
【０１２９】
一部の実施形態では、以下の構造を有するコンジュゲートを含む組成物が本明細書に提供される：
Ａ−Ｌｋ
（式中、ＡはＰＤ−Ｌ１に結合するタンパク質であり；Ｌはキレート化部分であり；ｋは１〜３０の整数であり；コンジュゲートは、臨床ＰＥＴイメージングに適切な比放射能を提供するのに十分な量のポジトロン放射体でキレート化される）。一部の実施形態では、キレート化されたポジトロン放射体の量は、１〜５０ｍｇのＰＤ−Ｌ１に結合するタンパク質当たり１〜３ｍＣｉの比放射能を提供するのに十分な量である。
【０１３０】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、３７℃での表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定される、約３１０ｐＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）で、単量体ヒトプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合する。
【０１３１】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、２５℃での表面プラズモン共鳴アッセイにおいて約１８０ｐＭ未満のＫＤで単量体ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する。
【０１３２】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、３７℃での表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定される、約１５ｐＭ未満のＫＤで二量体ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する。
【０１３３】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、２５℃での表面プラズモン共鳴アッセイにおいて約８ｐＭ未満のＫＤで二量体ヒトＰＤ−Ｌ１に結合する。
【０１３４】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、表１に列挙されるＨＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲの相補性決定領域（ＣＤＲ）；および表１に列挙されるＬＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲのＣＤＲを含む基準抗体とヒトＰＤ−Ｌ１への結合について競合する。一部の実施形態では、基準抗体またはその抗原結合断片は、表１に示されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。一部の実施形態では、基準抗体は、配列番号８２／９０、９８／１０６、１４６／１５４、１６２／１７０、２９０／２７４、３０６／２７４、３１４／２７４および３３０／２７４からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
【０１３５】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＰＤ−１またはＢ７−１の一方へのＰＤ−Ｌ１結合を増強する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＰＤ−１および／またはＢ７−１へのＰＤ−Ｌ１結合を遮断する。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、そのリガンドへのＰＤ−Ｌ１結合を増大も減少もさせない。
【０１３６】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１８、６６、１１４、１３０、２０２、２１８、２６６、２８２、２９８、３２２、および３３８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲの相補性決定領域（ＣＤＲ）；および配列番号２６、７４、１２２、１３８、２１０、２２６、および２７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲのＣＤＲを含む。ある特定の実施形態では、単離抗体は、配列番号１８／２６、６６／７４、１１４／１２２、１３０／１３８、２０２／２１０、２１８／２２６、２６６／２７４、２８２／２７４、２９８／２７４、３２２／２７４、および３３８／２７４からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
【０１３７】
一部の実施形態では、抗体は、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であり、ここで、抗体またはその抗原結合断片は、表１に列挙されるＨＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む。
【０１３８】
一部の実施形態では、抗体は、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であり、ここで、抗体またはその抗原結合断片は、表１に列挙されるＬＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。
【０１３９】
一部の実施形態では、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片において、抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）表１に列挙されるＨＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲ；および（ｂ）表１に列挙されるＬＣＶＲ配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む。
【０１４０】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、表１に列挙される重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）配列のいずれか１つに含まれる３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）；および表１に列挙される軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）配列のいずれか１つに含まれる３つの軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含む。
【０１４１】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号４、２０、３６、５２、６８、８４、１００、１１６、１３２、１４８、１６４、１８０、１８８、２０４、２２０、２３６、２５２、２６８、２８４、２９２、３００、３０８、３１６、３２４、３３２、および３４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１ドメイン；
（ｂ）配列番号６、２２、３８、５４、７０、８６、１０２、１１８、１３４、１５０、１６６、１８２、１９０、２０６、２２２、２３８、２５４、２７０、２８６、２９４、３０２、３１０、３１８、３２６、３３４、および３４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２ドメイン；
（ｃ）配列番号８、２４、４０、５６、７２、８８、１０４、１２０、１３６、１５２、１６８、１８４、１９２、２０８、２２４、２４０、２５６、２７２、２８８、２９６、３０４、３１２、３２０、３２８、３３６、および３４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３ドメイン；
（ｄ）配列番号１２、２８、４４、６０、７６、９２、１０８、１２４、１４０、１５６、１７２、１９６、２１２、２２８、２４４、２６０、および２７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１ドメイン；
（ｅ）配列番号１４、３０、４６、６２、７８、９４、１１０、１２６、１４２、１５８、１７４、１９８、２１４、２３０、２４６、２６２、および２７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２ドメイン；および
（ｆ）配列番号１６、３２、４８、６４、８０、９６、１１２、１２８、１４４、１６０、１７６、２００、２１６、２３２、２４８、２６４、および２８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３ドメイン、を含む。
【０１４２】
一部の実施形態では、抗体または抗原結合断片は、配列番号８２／９０、９８／１０６、１４６／１５４、１６２／１７０、２９０／２７４、３０６／２７４、３１４／２７４および３３０／２７４からなる群から選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対を含む。
【０１４３】
一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２、３４、５０、８２、９８、１４６、１６２、１７８、１８６、２３４、２５０、２９０、３０６、３１４、および３３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲのＣＤＲ；および配列番号１０、４２、５８、９０、１０６、１５４、１７０、１９４、２４２、２５８、および２７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲのＣＤＲを含む。
【０１４４】
Ｅ．抗ＰＤ−Ｌ１抗体キレーターコンジュゲートの産生のための、スケールを拡大した製造
キレーターへとコンジュゲートさせた抗ＰＤ−Ｌ１抗体の産生のための拡大製造プロセスが、本開示に含まれる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体キレーターコンジュゲートは、放射性標識に適切な形態にある。
【０１４５】
良好な製造プロセスは、無菌環境を維持すること、無菌的な手順を実行すること、全てのプロセスの記録を保持すること、ならびに産物の質、純度、強度および同一性およびそこからのあらゆる偏差を記録することを含む、産生の全ての態様において順守される。
【０１４６】
一部の実施形態では、拡大製造プロセスは、研究および開発のための製造プロセスよりもはるかに速い。一部の実施形態では、拡大製造プロセスは、１２時間未満、または１０時間未満、または８時間未満、または６時間未満、または４時間未満、または２時間未満もしくは約２時間かかる場合がある。
【０１４７】
一部の実施形態では、第１のステップは、コンジュゲーションプロセスを阻害する賦形剤、コンジュゲーション干渉種、および塩を除去するための、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の、３０〜５０ｋＤａ膜を使用する、限外濾過およびダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）を含む。例示的な膜ポリマーは、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、セルロースアセテート（ＣＡ）、および再生セルロース（ＲＣ）を含む。このステップでは、抗体は、低いイオン強度および非干渉緩衝液中で緩衝液交換される。緩衝液ｐＨは、約４．５から約６、または約５から約６、または約５．３から約５．７の間、または約５．５の場合もある。本明細書に有用であるとして想定される緩衝系は、一級アミンを欠く任意の緩衝系を含む。例示的な緩衝液は、酢酸、リン酸、またはクエン酸緩衝液を含む。緩衝液は、コンジュゲーション前の加工処理の間のタンパク質安定性を提供する。プロセス容量をさらに低減して、抗体を濃縮し、次いで濾過滅菌することができる。
【０１４８】
コンジュゲーション前のＵＦＤＦ後、濃縮および濾過された抗体は、アミン不含炭酸緩衝系へと移す場合もある。炭酸緩衝系は、約８．５から約９．６、または約９．０から約９．６、または約９．２から約９．４、または約９．４から約９．６の範囲、または約９．４のｐＨのｐＨを有することができる。
【０１４９】
溶媒中のＤＦＯなどのキレーターは標的濃度まで抗体を含有する緩衝系へと添加され、追加の溶媒は所望のパーセンテージまで溶液へと添加することができる。キレーターは、モル濃度過剰で抗体、例えば、３．５〜５：１のキレーター対抗体で添加することができる。総反応容量は、５Ｌまでの場合もある。
【０１５０】
反応温度および反応時間は、逆相関する。例えば、反応温度がより高い場合、反応時間はより短い。反応温度がより低い場合、反応時間はより長い。例示的に、約１８℃よりも高い温度で、反応は２時間未満かかる場合がある；１８℃未満の温度で、反応は２時間よりも長くかかる場合がある。
【０１５１】
コンジュゲーション反応は、例えば、酢酸の添加により、クェンチングすることにより停止することができる。
【０１５２】
一部の実施形態では、抗体とデフェロキサミンのコンジュゲーションを実施して、ＤＦＯ−ｍＡｂコンジュゲートを作製する。一部の実施形態では、抗体とｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−デフェロキサミンのコンジュゲーションを実施して、ＤＦＯ−ｍＡｂコンジュゲートを作製する。
【０１５３】
キレーターのための例示的な溶媒は、ＤＭＳＯおよびＤＭＡを含む。その後のＵＦＤＦステップは、膜を利用し、膜は、コンジュゲーションステップで使用される溶媒系に基づき選択される。例えば、ＤＭＡは、ＰＥＳ膜を溶解し、そのため、これら２つは、同じ系で使用できない。
【０１５４】
炭酸緩衝液は、長期貯蔵期間中のコンジュゲートの安定性には好ましくない。したがって、抗体キレーターコンジュゲートが形成されたら、それらは、長期貯蔵および安定性に関して特に選択された緩衝液へと緩衝液交換することができる。例示的な緩衝液は、クエン酸、酢酸、リン酸、アルギニン、およびヒスチジン緩衝液を含む。さらなるＵＦＤＦステップを実施して、残留する塩を除去し、コンジュゲートモノクローナル抗体の適切な濃度、賦形剤レベル、およびｐＨを提供することができる。結果として得られる抗体−キレーターコンジュゲートは、濾過滅菌され、その後の製剤化のため保存されうる。
【０１５５】
ＩＩＩ．放射性標識された免疫コンジュゲートを使用する方法
ある特定の態様では、本開示は、本開示の放射性標識された抗体コンジュゲートの使用の診断法および治療法を提供する。
【０１５６】
一態様に従い、組織内のＰＤ−Ｌ１を検出する方法であって本明細書に提供される放射性標識された抗体コンジュゲートを組織に投与するステップ；およびＰＤ−Ｌ１発現をポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）イメージングにより可視化するステップを含む方法が本開示に提供される。ある特定の実施形態では、組織は、細胞または細胞系を含む。ある特定の実施形態では、組織は被験体に存在し、被験体は哺乳動物である。ある特定の実施形態では、被験体は、ヒト被験体である。ある特定の実施形態では、被験体は、がん、感染症および炎症性疾患からなる群より選択される疾患または障害を有する。一実施形態では、被験体は、がんを有する。ある特定の実施形態では、感染症は、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、および結核菌により引き起こされる、細菌またはウイルス感染である。
【０１５７】
一態様に従い、ＰＤ−Ｌ１を発現する組織のイメージングの方法が本開示に提供され、該方法は、本開示の放射性標識された抗体コンジュゲートを組織に投与するステップ；およびＰＤ−Ｌ１発現をポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）イメージングにより可視化するステップを含む。一実施形態では、組織は、腫瘍に含まれる。一実施形態では、組織は、腫瘍細胞培養物または腫瘍細胞系に含まれる。一実施形態では、組織は、被験体における腫瘍病変に含まれる。
【０１５８】
一態様に従い、療法への応答が、炎症を測定することにより測定される、療法への応答を測定するための方法が本開示に提供される。本態様に従い、方法は、本明細書に提供される放射性標識された抗体コンジュゲートをそれを必要とする被験体へと投与するステップおよびＰＤ−Ｌ１発現をポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）イメージングにより可視化するステップを含む。ある特定の実施形態では、炎症は、被験体における腫瘍に存在する。ある特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１発現における増加は、腫瘍中の炎症における増加と相関する。
【０１５９】
一態様に従い、患者がＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤を含む抗腫瘍療法好適かどうかを決定するための方法であって、固形腫瘍を有する患者を選択するステップ、本開示の放射性標識された抗体コンジュゲートを投与するステップ、および腫瘍内の投与された放射性標識された抗体コンジュゲートをＰＥＴイメージングにより局在化を決定する（ｌｏｃａｌｉｚｉｎｇ）ステップを含み、腫瘍内の放射性標識された抗体コンジュゲートの存在が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤を含む抗腫瘍療法に適切であるとして患者を同定する方法が本開示に提供される。
【０１６０】
一態様に従い、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤を含む抗腫瘍療法に関する候補を同定するための方法であって、固形腫瘍を有する患者を選択するステップ、本開示の放射性標識された抗体コンジュゲートを投与するステップ、および腫瘍内の投与された放射性標識された抗体コンジュゲートをＰＥＴイメージングにより局在化を決定する（ｌｏｃａｌｉｚｉｎｇ）ステップを含み、腫瘍内の放射性標識された抗体コンジュゲートの存在が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤を含む抗腫瘍療法に適切であるとして患者を同定する方法が本開示に提供される。
【０１６１】
一態様に従い、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤を含む抗腫瘍療法に対する患者の応答を予測するための方法であって、固形腫瘍を有する患者を選択するステップ、腫瘍が、ＰＤ−Ｌ１陽性であるかどうかを決定するステップを含み、腫瘍がＰＤ−Ｌ１陽性である場合、患者の陽性応答が予測される、方法が本開示に提供される。ある特定の実施形態では、腫瘍は、本開示の放射性標識された抗体コンジュゲートを投与するステップ、および腫瘍内の放射性標識された抗体コンジュゲートをＰＥＴイメージングにより局在化を決定するステップ（ここで、腫瘍内の放射性標識された抗体コンジュゲートの存在が、腫瘍が、ＰＤ−Ｌ１陽性であることを指し示す）により陽性と決定される。
【０１６２】
一態様に従い、被験体におけるＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍を検出するための方法が本開示に提供される。本態様に従い、方法は、固形腫瘍を有する被験体を選択するステップ；本開示の放射性標識された抗体コンジュゲートを被験体に投与するステップ；および放射性標識された抗体コンジュゲートの局在化をＰＥＴイメージングにより決定するステップ（ここで、腫瘍内の放射性標識された抗体コンジュゲートの存在が、腫瘍が、ＰＤ−Ｌ１陽性であることを指し示す）を含む。
【０１６３】
本明細書で使用される「それを必要とする被験体」という表現は、固形腫瘍を含む、がんの１または複数の症状または適応症を呈示するおよび／またはがんと診断されているおよびそれを処置する必要がある、ヒトまたは非ヒト哺乳動物を意味する。多くの実施形態では、「被験体」という用語は、「患者」という用語と互換的に使用されうる。例えば、ヒト被験体は、未解明の重量減少、全般的な衰弱（ｇｅｎｅｒａｌ  ｗｅａｋｎｅｓｓ）、持続性疲労、食欲不振、発熱、寝汗、骨痛、息切れ、腹部腫大、胸痛／圧力、脾臓の肥大、およびがん関連バイオマーカー（例えば、ＣＡ１２５）のレベルの上昇を含むが、これらに限定されない、原発性もしくは転移性腫瘍および／または１または複数の症状もしくは適応症と診断されうる。表現は、原発性または確立された腫瘍を有する被験体を含む。具体的な実施形態では、表現は、固形腫瘍、例えば、結腸がん、乳がん、肺がん、前立腺がん、皮膚がん、肝臓がん、骨がん、卵巣がん、子宮頚がん、膵臓がん、頭頚部がん、および脳がんを有する、および／または、それらの処置を必要とするヒト被験体を含む。用語は、原発性または転移性腫瘍（進行した悪性疾患）を有する被験体を含む。ある特定の実施形態では、「それを必要とする被験体」という表現は、以前の治療（例えば、抗がん剤による処置）に対して耐性もしくは不応性であるまたは不適切に管理された固形腫瘍を有する患者を含む。例えば、表現は、１または複数の系統の以前の治療、例えば、化学療法による処置（例えば、カルボプラチンまたはドセタキセル）で処置されている被験体を含む。ある特定の実施形態では、「それを必要とする被験体」という表現は、１または複数の系統の以前の治療で処置されているが、その後、再発または転移した固形腫瘍を有する患者を含む。ある特定の実施形態では、用語は、がん、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、歯周炎、枯草熱、心臓疾患、冠動脈疾患、感染症、気管支炎、皮膚炎、髄膜炎、喘息、結核、潰瘍性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、肝炎、副鼻腔炎、乾癬、アレルギー、線維症、ループス、血管炎（ｖａｓｉｃｕｌｉｔｉｓ）、強直性脊椎炎、グレーブス病、セリアック病、線維筋痛、および移植拒絶を含むが、これらに限定されない、炎症性疾患または障害を有する被験体を含む。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、固形腫瘍を有する被験体に使用される。「腫瘍」、「がん」および「悪性疾患」という用語は、本明細書において互換的に使用される。本明細書で使用される「固形腫瘍」という用語は、嚢胞も液体領域も通常含有しない組織の異常な塊を指す。固形腫瘍は、良性（がんではない）または悪性（がん）でありうる。本開示の目的に関して、「固形腫瘍」という用語は、悪性の固形腫瘍を意味する。用語は、それらを形成する細胞型、すなわち肉腫、癌腫およびリンパ腫と名付けられている異なる型の固形腫瘍を含む。ある特定の実施形態では、「固形腫瘍」という用語は、結腸直腸がん、卵巣がん、前立腺がん、乳がん、脳がん、子宮頸がん、膀胱がん、肛門がん、子宮がん、結腸がん、肝臓がん、膵臓がん、肺がん、子宮内膜がん、骨がん、精巣がん、皮膚がん、腎臓がん、胃がん、食道がん、頭頚部がん、唾液腺がん、および骨髄腫を含むが、これらに限定されない、がんを含む。
【０１６５】
一態様に従い、被験体における腫瘍を処置する方法が本開示に提供される。本態様に従い、方法は、固形腫瘍を有する被験体を選択するステップ；腫瘍が、ＰＤ−Ｌ１陽性であることを決定するステップ；およびＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤の１または複数の用量を投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、腫瘍は、本開示の放射性標識された抗体コンジュゲートを被験体に投与するステップ；および腫瘍内の放射性標識された抗体コンジュゲートをＰＥＴイメージングにより可視化するステップ（ここで、腫瘍内の放射性標識された抗体コンジュゲートの存在が、腫瘍が、ＰＤ−Ｌ１陽性であることを指し示す）によりＰＤ−Ｌ１陽性であると決定される。
【０１６６】
本明細書で使用される「処置」、「処置すること」などの用語は、一時的または永続的な基準で、症状を軽減すること、症状の原因を消失させること、腫瘍増殖を遅延もしくは阻害すること、腫瘍細胞負荷もしくは腫瘍負担を低減すること、腫瘍退縮を促進すること、腫瘍の縮小、ネクローシスおよび／もしくは消失を引き起こすこと、腫瘍の再発を防止すること、転移を防止もしくは阻害すること、転移性腫瘍増殖を阻害すること、ならびに／または被験体の生存の持続期間を増加させることを意味する。
【０１６７】
一態様に従うと、本開示は、抗腫瘍療法で処置されている固形腫瘍を有する被験体を選択するステップ；本開示の放射性標識された抗体コンジュゲートを被験体に投与するステップ；腫瘍内の投与された放射性標識されたコンジュゲートの局在化をＰＥＴイメージングにより画像化するステップ；および腫瘍増殖を決定するステップを含み、放射性標識シグナルのベースラインからの低下が、腫瘍退縮および抗腫瘍療法の有効性を指し示す、被験体における抗腫瘍療法の有効性をモニタリングするための方法を提供する。ある特定の実施形態では、抗腫瘍療法は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体）を含む。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、本開示は、抗腫瘍療法で処置されている固形腫瘍を有する被験体を選択するステップ；本明細書に提供される放射性標識された抗体コンジュゲートを被験体に投与するステップ；および腫瘍内の投与された放射性標識されたコンジュゲートの局在化をＰＥＴイメージングにより画像化するステップを含み、放射性標識シグナルのベースラインからの増大が、炎症の増大および抗腫瘍療法の有効性を指し示す、腫瘍の炎症状態における変化を評価する方法を提供する。ある特定の実施形態では、抗腫瘍療法は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体）を含む。
【０１６９】
本明細書で使用される「ベースライン」という用語は、腫瘍内のＰＤ−Ｌ１発現に関して、抗腫瘍療法のある用量の投与前または投与時の、被験体に対する放射性標識されたコンジュゲートの取り込みの数値を意味する。放射性標識されたコンジュゲートの取り込みは、当技術分野において公知の方法（例えば、Ｏｏｓｔｉｎｇら、２０１５年、Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ５６巻：６３〜６９頁を参照されたい）を使用して決定される。ある特定の実施形態では、抗腫瘍療法は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤を含む。
【０１７０】
腫瘍退縮が存在するかどうかを決定するために、放射性標識されたコンジュゲートの取り込みが、ベースラインおよびＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸（例えば、抗ＰＤ−１抗体）の阻害剤の投与後の１または複数の時点で定量される。例えば、投与された放射性標識された抗体コンジュゲート（例えば、放射性標識された抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲート）の取り込みは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸（例えば、抗ＰＤ−１抗体）の阻害剤による初期処置後、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１４日目、１５日目、２２日目、２５日目、２９日目、３６日目、４３日目、５０日目、５７日目、６４日目、７１日目、８５日目；または１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週、１３週、１４週、１５週、１６週、１７週、１８週、１９週、２０週、２１週、２２週、２３週、２４週、またはそれよりも長い週数の終わりに測定されてもよい。処置の開始後の特定の時点での取り込みの値とベースラインでの取り込みの値との間の差を使用して、腫瘍組織（腫瘍退縮または進行）の量の差が存在しているかどうかが確立される。例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤の少なくとも１用量による処置時の取り込みのベースラインからの低下は、腫瘍退縮を意味し、抗腫瘍療法の有効性が指し示される。
【０１７１】
ある特定の実施形態では、放射性標識された抗体コンジュゲートは、被験体に対して静脈内または皮下に投与される。ある特定の実施形態では、放射性標識された抗体コンジュゲートは、腫瘍内に投与される。投与時に、放射性標識された抗体コンジュゲートは、腫瘍に局在化する。局在化した放射性標識された抗体コンジュゲートは、ＰＥＴイメージングにより画像化され、腫瘍による放射性標識された抗体コンジュゲートの取り込みは、当技術分野において公知の方法により測定される。ある特定の実施形態では、イメージングは、放射性標識されたコンジュゲートの投与１、２、３、４、５、６または７日後に実行される。ある特定の実施形態では、イメージングは、放射性標識された抗体コンジュゲートの投与と同日に実行される。
【０１７２】
ある特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号２、３４、５０、８２、９８、１４６、１６２、１７８、１８６、２３４、２５０、２９０、３０６、３１４、および３３０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＶＲのＣＤＲ；および配列番号１０、４２、５８、９０、１０６、１５４、１７０、１９４、２４２、２５８、および２７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＶＲのＣＤＲを含む。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤は、ＰＤ−１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブおよびＲＥＧＮ２８１０からなる群より選択される。ある特定の他の実施形態では、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む。一実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブである。一実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号８２のＨＣＶＲおよび配列番号９０のＬＣＶＲを含む。
【実施例】
【０１７４】
ＩＶ．実施例
本開示のある特定の実施形態は、以下の非限定的な実施例により例示される。
【０１７５】
（実施例１：ＰＤ−Ｌ１に対するヒト抗体の作出）
表１に列挙されるものを含む、ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許公開第ＵＳ２０１５−０２０３５８０Ａ１号に記載されるように、調製および特徴づけた。簡潔に述べると、ＰＤ−Ｌ１に対するヒト抗体を、ＰＤ−Ｌ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０５４８６２．１）のアミノ酸約１９〜２３９の範囲のＰＤ−Ｌ１の断片を使用して作出した。免疫原は直接、免疫応答を刺激するアジュバントと共に、ヒト免疫グロブリンの重鎖可変領域およびカッパ軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスへと投与した。抗体の免疫応答は、ＰＤ−Ｌ１特異的イムノアッセイによりモニタリングした。所望の免疫応答を達成したら、脾臓細胞を採取し、それらの生存度を保存し、ハイブリドーマ細胞系を形成するように、マウス骨髄腫細胞と融合させた。ＰＤ−Ｌ１特異的抗体を産生する細胞系を同定するように、ハイブリドーマ細胞系をスクリーニングおよび選択した。この技法および上記で記載した免疫原を使用して、いくつかの抗ＰＤ−Ｌ１キメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインと、マウス定常ドメインとを保有する抗体）を得、このようにして、作出した例示的な抗体を、Ｈ２Ｍ８３０６Ｎ、Ｈ２Ｍ８３０７Ｎ、Ｈ２Ｍ８３０９Ｎ、Ｈ２Ｍ８３１０Ｎ、Ｈ２Ｍ８３１２Ｎ、Ｈ２Ｍ８３１４Ｎ、Ｈ２Ｍ８３１６Ｎ、Ｈ２Ｍ８３１７Ｎ、Ｈ２Ｍ８３２１Ｎ、Ｈ２Ｍ８３２３Ｎ、Ｈ２Ｍ８７１８Ｎ、Ｈ２Ｍ８７１８Ｎ２およびＨ２Ｍ８７１９Ｎと命名した。
【０１７６】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体はまた、参照によりその全体において本明細書に具体的に組み込まれるＵ．Ｓ．２００７／０２８０９４５Ａ１において記載されている通り、骨髄腫細胞への融合を伴わずに、抗原陽性Ｂ細胞からも直接単離した。この方法を使用して、いくつかの完全ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体（すなわち、ヒト可変ドメインと、ヒト定常ドメインとを保有する抗体）を得、この方式で作出した例示的な抗体を、以下：Ｈ１Ｈ９３２３Ｐ、Ｈ１Ｈ９３２７Ｐ、Ｈ１Ｈ９３２９Ｐ、Ｈ１Ｈ９３３６Ｐ、Ｈ１Ｈ９３４４Ｐ２、Ｈ１Ｈ９３４５Ｐ２、Ｈ１Ｈ９３５１Ｐ２、Ｈ１Ｈ９３５４Ｐ２、Ｈ１Ｈ９３６４Ｐ２、Ｈ１Ｈ９３７３Ｐ２、Ｈ１Ｈ９３８２Ｐ２、Ｈ１Ｈ９３８７Ｐ２およびＨ１Ｈ９３９６Ｐ２の通りに命名した。
【０１７７】
（実施例２：抗ＰＤ−Ｌ１抗体Ｈ４Ｈ８３１４Ｎとｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＦＯとのコンジュゲーション）
親抗ＰＤ−Ｌ１抗体Ｈ４Ｈ８３１４Ｎおよび放射性標識を有する免疫ＰＥＴ研究に適切なアイソタイプ対照抗体を修飾するために、キレーター、ｐ−ＳＣＮ−ｂｎ−デフェロキサミン（ＤＦＯ；  Ｍａｃｒｏｃｙｌｉｃｓ、型番Ｂ−７０５）を、抗体に付加した。
【０１７８】
修飾のために、Ｈ４Ｈ８３１４Ｎを、最初に、４℃で一晩にわたる透析（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセットＧ２  １０ｋ  ＭＷＣＯ；ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、ヒスチジン緩衝液からＰＢＳ、ｐＨ７．２に緩衝液交換し、次いで、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、型番１７−０８５１−０１）を使用して５０ｍＭ炭酸緩衝液，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ９．０から構成される緩衝液（コンジュゲーション緩衝液）へと再度緩衝液交換した。緩衝液交換後の濃度を決定するために、試料を、１．４６ｇ／Ｌの吸光率に基づきＭａｃＶｅｃｔｏｒシークエンスを使用してＮａｎｏｄｒｏｐ  ２０００  ＵＶ／ＶＩＳ分光計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において測定した（表２を参照されたい）。１５ｍＬポリプロピレンチューブ中に、７７３．９ｕＬのＨ４Ｈ８３１４Ｎ（１２．５ｍｇ）を、１６７６．１ｕＬのコンジュゲーション緩衝液に添加した。別個のバイアル中に、２９．３ｕＬのＤＭＳＯを、２０．７ｕＬのＤＦＯに添加した。４分の１の増分で、このＤＦＯ溶液を、Ｈ１Ｈ８３１４Ｎ溶液に添加し、各時点で、上下に静かにピペッティングすることにより混合した。最終的な溶液は、ＤＦＯの６倍モル過剰でのコンジュゲーション緩衝液、２％ＤＭＳＯ中に５ｍｇ／ｍＬのＨ４Ｈ８３１４Ｎであった。この溶液を、追加の撹拌なしで３７℃ウォーターバス中でインキュベートした。
【０１７９】
３７℃で３０分間後、溶液を、２５０ｍＭ  ＮａＡｃＯ、ｐＨ５．４（製剤化緩衝液）を含有する緩衝液であらかじめ平衡化されたＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、型番１７−０８５１−０１）に迅速に通した。最終的な溶液を、シリンジフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ  １３ｍｍシリンジフィルター、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、型番４６０２）を介して濾過滅菌した。濃度およびＤＦＯ対抗体比（ＤＡＲ）を、その後、ＵＶ／ＶＩＳ分光学により測定した。吸光度測定に関して、ＤＦＯ−コンジュゲート抗体を、製剤化緩衝液に対し、２５２ｎｍ（Ａ２５２）、２８０ｎｍ（Ａ２８０）および６００ｎｍ（Ａ６００）で測定した。計算に関して、バックグラウンドを、以下の方程式を使用して各吸光度値を補正した：
Ａ’λ＝Ａλ−Ａ６００
【０１８０】
抗体コンジュゲートを、ＰＢＳ移動相（０．７５ｍＬ／分）で２８０ｎｍでモニタリングしたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、型番１７−５１７５−０１）に注入した２５ｕｇの試料で、ＳＥＣクロマトグラフィーを使用して凝集について試験した。抗体の完全性を、２ｕｇの試料をロードして、４〜２０％Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙプレキャストゲル（Ｎｏｖｅｘ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。ゲルは、図１に示される。抗体濃度、コンジュゲート濃度、およびＤＡＲを、以下の方程式を使用して計算した：
抗体濃度計算
【数１】
2020512281.tif 000008
コンジュゲート濃度計算
【数２】
2020512281.tif 000009
ＤＡＲ計算
【数３】
2020512281.tif 000010
【表２】
2020512281.tif 000011
【表３】
2020512281.tif 000012
【０１８１】
（実施例３：ＤＦＯコンジュゲートモノクローナル抗体の８９Ｚｒキレート化）
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究での免疫ＰＥＴにおける使用に関して、ＤＦＯ−コンジュゲート抗ＰＤ−Ｌ１抗体、Ｈ４Ｈ８３１４Ｎ、およびＤＦＯ−コンジュゲートアイソタイプ対照抗体を、８９Ｚｒで放射性標識した。
【０１８２】
ＤＦＯ−コンジュゲート抗体（２５０または７５０ｕｇ）を、最初に１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２中で１．２５ｍｇ／ｍＬにした。各研究についてのＤＦＯ−Ａｂコンジュゲート溶液のレシピは、表４に列挙される。個別に、８９Ｚｒ溶液を、表５に示される各対応する研究についてのレシピを使用して調製した。ストック８９Ｚｒシュウ酸溶液を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒまたは３Ｄイメージングから得た。ストック溶液の放射能濃度が低い場合（表５を参照されたい）、中和ステップを１Ｍボラート、ｐＨ９．０で実施した。溶液の最終的な放射能を、最初にＣａｐｉｎｔｅｃ  ＣＲＣ−２５Ｒ線量キャリブレーター（Ｃａｐｉｎｔｅｃ  ＃５２０）を使用して確認し、次いで、ＤＦＯ−Ａｂコンジュゲート溶液に直ちに組み合わせ、静かに混合（上下にピペッティング）し、その後、４５分間、室温でインキュベートした。
【０１８３】
インキュベーション後、各反応混合物の小試料を、ｉＴＬＣ（即時薄層液体クロマトグラフィー）にかけて、放射性標識反応の収量を決定し、残りの反応混合物を、重力送りでの脱塩のために、２５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．４であらかじめ平衡化されたＰＤ−１０カラム（Ｖｅｎｄｏｒ）へと移した。各ＰＤ−１０カラムは、１．２ｍＬ以下の反応混合物をかけた（さもなければ複数のカラムを使用した）。反応の内容物がカラムベッドに入った後、１．６ｍＬの２５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．４（製剤化緩衝液）を添加し；フロースルーを廃棄した。追加の１．８ｍＬの製剤化緩衝液を、カラムに添加し、溶出液を各カラムから回収した。次に、約５００ｕＬの各溶液を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して解析した。最終的なＡｂ濃度を、以下の方程式を使用して適切な吸光率および２８０ｎｍでの吸収を使用して計算した：
ｍｇ／ｍＬでの濃度＝２８０ｎｍでの吸収÷２８０ｎｍでの吸光率（表６に見出される）
【０１８４】
グラムで測定した最終的な質量を、表４に記録した。次いで、放射能を、線量キャリブレーターを使用して測定し、表５に報告した。ＰＤ−１０カラム処置前の材料と共に最終的な材料を、次いで、ｉＴＬＣにより解析した。このアッセイに関して、１ｕＬの各溶液を、シリカゲル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、型番ＳＧ１０００１）を含浸させたｉＴＬＣ−ＳＧ−Ｇｌａｓｓマイクロファイバークロマトグラフィーペーパーに添加し、ＴＬＣチャンバー中で２０ｍＭクエン酸緩衝液で展開した。最終的な材料はまた、ＵＶ２８０および放射性同位元素検出器を直列に接続したＳＥＣ−ＨＰＬＣ（Ｌａｂｌｏｇｉｃ  Ｒａｄｉｏ−ＴＬＣ／ＨＰＬＣ検出器、ＳＣＡＮ−ＲＡＭ付きのＡｇｉｌｅｎｔ１２６０）を使用して、流量０．７５ｍＬ／分でのＰＢＳ移動相によるＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを使用して解析した。放射性トレーサー（ｒａｄｉｏｔｒａｃｅ）を、タンパク質ピーク（約１０から１６分）および遊離８９Ｚｒピーク（約２５分）の積分と比較することにより放射化学的純度を決定するため使用した。単量体純度を、オリゴマーピーク（１０分から約１５分）と単量体（約１６分）との積分を比較することにより決定した。
【０１８５】
各放射性標識されたコンジュゲートの比放射能およびタンパク質回収（％）を、以下の方程式を使用して決定した：
ａ．  ｍｇでのコンジュゲートの質量＝ｍｇ／ｍＬでの濃度×グラムでの溶液の質量
ｂ．  ｍＣｉ／ｍｇでの比放射能＝ｍＣｉでのバイアルの放射能÷ｍｇでのコンジュゲートの質量
ｃ．  タンパク質回収＝開始コンジュゲート質量（ｍｇ）÷ｍｇでのコンジュゲートの質量
【０１８６】
最終的に、外観を注記し、表７に記録した。ＵＶ２８０およびｉＴＬＣトレースの両方を精製した産物に対して行った。
【０１８７】
結果は、表７に集約される。放射性−ＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、図２〜４に示される。ＵＶ２８０  ＨＰＬＣ  ＳＥＣクロマトグラムおよび放射性−ｉＴＬＣの実施例は、研究１、８９Ｚｒ放射性標識に関する図５に示される。ＵＶ２８０−ＨＰＬＣ  ＳＥＣクロマトグラムによって、高度に単量体の産物（９９％）が確認される。放射性−ｉＴＬＣトレースを、７点の二項式スムージング機能（ｂｉｎｏｍｉａｌ  ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）で加工した。起点および溶媒先端は、それぞれ、約１６および１００ｍｍであった。検出可能な８９Ｚｒは、２２ｍｍを超えては観察されず、図２Ｂにおいて放射性−ＳＥＣ−ＨＰＬＣ  ＳＥＣにより決定された放射化学的純度を補強する。
【表４】
2020512281.tif 000013
【表５】
2020512281.tif 000014
【表６】
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【表７】
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【０１８８】
（実施例４：免疫反応性）
放射性標識された抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびアイソタイプ対照抗体の免疫反応性（ＩＲ）を、以下の通りに測定した。初期の研究に関して、ＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇ細胞を使用して、その後、ＬＯＸ−ＩＭＶＩ細胞（実施例５における細胞系の詳細な記載を参照されたい）も、後期の研究において使用した。これらのアッセイでは、２０ｎｇのそれぞれの８９Ｚｒ標識した抗体を、１ｍＬの最終容量で、１５×１０６個のＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇまたは３０×１０６個のＬＯＸ−ＩＭＶＩ細胞に添加した。試料を、連続的に混合しながら４５分間インキュベートし、その後、培地で３回洗浄して、あらゆる結合しなかった抗体を除去した。被験細胞ペレットの放射能を、次いで、同じく２０ｎｇの８９Ｚｒ標識抗体を含有する２つの参照標準に対して自動ガンマカウンター（Ｗｉｚａｒｄ  ２４７０、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）においてカウントした。免疫反応性のパーセンテージを、総放射能の尺度として標準の平均を使用して、試料について決定した。
【０１８９】
表８に見られるように、８９Ｚｒ標識抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、研究を通じて８８から９８％の範囲の％ＩＲで、コンジュゲーションおよび放射性標識後に免疫反応性を保持した。結合の特異性は、１％未満のバックグラウンド％ＩＲを有する対照抗体において明らかである。
【表８】
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【０１９０】
（実施例５：腫瘍細胞系におけるヒトＰＤ−Ｌ１発現のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ特徴づけ）
雄性ＮＣｒヌード（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ  ＮＹ）マウスまたはＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ（登録商標）技術（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３年、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２１巻：６５２〜６５９頁；米国特許出願公開第ＵＳ２０１６／０１５７４６９号）を使用して７５％Ｃ５７／Ｂｌ６／２５％１２９系統バックグラウンドにおいてマウスＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインに代えて、ヒトＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインの発現に関してホモ接合性となるように操作されたマウス（ＰＤ−Ｌ１  ＨｕｍＩｎマウス）のいずれかにおける、ｉｎ  ｖｉｖｏでの、腫瘍により内因的に発現されたヒトＰＤ−Ｌ１の検出を目的として、いくつかの腫瘍細胞系を研究してヒトＰＤ−Ｌ１の発現レベルを評価した。
【０１９１】
これらの研究に使用された細胞系は、以下を含む：１）マウス結腸癌腫細胞系ＭＣ３８（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤのＮＣＩ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙから得た）、これは、マウスＰＤ−Ｌ１がノックアウトされているが、全長ヒトＰＤ−Ｌ１およびｅＧＦＰと融合させた全長ニワトリ卵白アルブミンを過剰発現するように所内で操作されており、したがって、ここでは、ＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇと称される；２）いくつかのヒト腫瘍細胞系：ヒトメラノーマ細胞系ＬＯＸ−ＩＭＶＩ（ＮＣＩ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ、Ｔｕｍｏｒ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙから得た、内因的ＰＤ−Ｌ１陽性細胞系）、ヒト乳がん細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（内因的ＰＤ−Ｌ１陽性細胞系）およびＳＫ−Ｂｒ−３（ＰＤ−Ｌ１陰性細胞系）（両方ともＡＴＣＣから得た）。一部の場合では、ヒトＰＤ−Ｌ１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、何ら誘導させることなく直接的に評価した；一部の場合では、ヒトＰＤ−Ｌ１発現は、一晩のマウスまたはヒトＩＦＮγ（１００ｎｇ／ｍｌ）処置（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈから得た）で評価した；一部の場合では、ヒトＰＤ−Ｌ１を、腫瘍保有ヌードマウスまたはヒト化マウスから抽出された酵素的に解離させた腫瘍細胞においてｅｘ  ｖｉｖｏで評価した。ヒトＰＤ−Ｌ１の全ての表面染色を、標準プロトコールに従い実施した。略述すると、腫瘍細胞を、ＰＢＳで一回洗浄し、氷冷染色緩衝液で一回洗浄し、染色緩衝液中の市販の利用可能な蛍光色素を直接的にコンジュゲートさせた抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＭＩＨ１）で３０分間、氷上で暗所で染色し、次いで、２ｍＬのＰＢＳで再度一回洗浄した。定着性色素ｅＦｌｕｏｒ５０６も、製造者のプロトコール（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、型番１７−５９８３）に従い含めた。試料を、ＤＩＶＡ  ｖ８を装備したＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（商標）ＩＶＤ１０で収集した。データを、ＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０．０．６または上記でさらに解析した。
【０１９２】
ヌードマウスにおける植込み前および植込み７日後のＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇ細胞によるＰＤ−Ｌ１発現は、表９に示される。
【表９】
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【０１９３】
植込み前、非常に大多数のＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇ細胞が、アイソタイプ対照染色と比較して、ヒトＰＤ−Ｌ１陽性であった。ヌードマウスにおける植込み７日後および腫瘍解離のための酵素的および機械的加工処理時、約７０％のＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇ細胞が、依然としてヒトＰＤ−Ｌ１陽性であった。
【０１９４】
ＰＤ−Ｌ１ヒト化マウスにおける植込み前および植込み１４日後のＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇ細胞によるＰＤ−Ｌ１発現は、表１０に示される。
【表１０】
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【０１９５】
植込み前、非常に大多数のＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇ細胞が、アイソタイプ対照染色と比較して、ヒトＰＤ−Ｌ１陽性であった。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１二重ヒト化マウスにおける植込み１４日後および腫瘍解離のための酵素的および機械的加工処理時、約５０％のＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇ細胞が、依然としてヒトＰＤ−Ｌ１陽性であった。
【０１９６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで複数の腫瘍細胞系によるＰＤ−Ｌ１発現は、図６に示される。操作された細胞系（ＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇ）および他のヒト腫瘍細胞系（ＬＯＸ−ＩＭＶＩメラノーマ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞、およびＳＫ−Ｂｒ−３乳がん細胞）によるＰＤ−Ｌ１の発現レベルが、どの程度同等であるかを評価するために、抗ＰＤ−Ｌ１抗体染色の用量滴定を実施した。図６は、ＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇが、最高レベルのヒトＰＤ−Ｌ１発現を有し（図６Ａ）ならびにＳＫ−Ｂｒ−３が、検出可能なＰＤ−Ｌ１のない最低発現を有した（図６Ｄ）のに対し、ＬＯＸ−ＩＭＶＩおよびＭＤＡ−ＭＢ−２３１によるＰＤ−Ｌ１発現が、中等度（ＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇの約５分の１）（図６Ｂおよび６Ｃ）であったことを例示する。
【０１９７】
第２の実験では、ＬＯＸ−ＩＭＶＩとＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇとの間のさらなる比較を、それぞれ、一晩の１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＦＮγ／ｍＩＦＮγによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ処置を伴うかまたは伴わずに行った。図７は、ＰＤ−Ｌ１の蛍光強度中央値が、染色で使用された約１５０ｎＭの抗ＰＤ−Ｌ１抗体でプラトーに達することを例示した。ベースラインで、ＬＯＸ−ＩＭＶＩによるＰＤ−Ｌ１発現は、中等度（ＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇの約６〜７分の１）であった。ｍＩＦＮγでの処置時、ＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１ＴｇにおいてＰＤ−Ｌ１染色に関して変化は存在しないのに対し、ｈＩＦＮγでの処置後、ＬＯＸ−ＩＭＶＩにヒトＰＤ−Ｌ１染色の３倍の増加が見られた。
【０１９８】
ヌードマウスにおける植込み約３週後のＬＯＸ−ＩＭＶＩおよびＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇ細胞によるｅｘ  ｖｉｖｏでのＰＤ−Ｌ１発現は、表１１および１２に示された。
【表１１】
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【表１２】
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【０１９９】
腫瘍解離を可能とする酵素的および機械的加工処理時、細胞を、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（２０μｇ／ｍＬ）で染色した。ＬＯＸ−ＩＭＶＩにおけるＰＤ−Ｌ１発現レベルは、ＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇ腫瘍細胞におけるものの約５分の１であった。
【０２００】
（実施例６：ヌードマウスにおけるｈＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍に対する放射性標識された抗ＰＤ−Ｌ１抗体の選択的な局在化）
抗ＰＤ−Ｌ１抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ局在化を決定するために、ジルコニウム−８９標識ＤＦＯ−抗体コンジュゲートをＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍保有ヌードマウスの静脈内に投与した。
【０２０１】
研究で使用された腫瘍系は、ＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇと称されるマウス結腸癌腫細胞系であり、これは、野生型ＭＣ３８のマウスＰＤ−Ｌ１がノックアウトされているが、全長ヒトＰＤ−Ｌ１およびｅＧＦＰと融合させた全長ニワトリ卵白アルブミンを過剰発現するように操作されている。ヒトＰＤ−Ｌ１の内因的発現を伴う腫瘍の第２の研究に関して、ヒトメラノーマ細胞系ＬＯＸ−ＩＭＶＩを使用して、その後の抗ＰＤ−Ｌ１抗体局在化研究のためにｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍を確立した。
【０２０２】
この研究で使用される例示的な放射性標識された抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｈ１Ｈ８３１４Ｎであり、配列番号８２／９０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含んだ。
【０２０３】
第１の研究に関して、１×１０６個のＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇ細胞を、雄性８〜１０週齡ＮＣｒヌードマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ  ＮＹ）の左脇腹の皮下に移植した。ＬＯＸ−ＩＭＶＩ腫瘍に関して、１×１０６個の細胞を、雄性８〜１０週齡ＮＣｒヌードマウスの左脇腹の皮下に移植した。腫瘍が５０〜１５０ｍｍ３（約７〜１０日目）の平均容量に達したら、マウスを群に無作為化し、８９Ｚｒ標識抗ＰＤ−Ｌ１ＤＦＯ−抗体コンジュゲート（Ｈ１Ｈ８３１４Ｎ）または８９Ｚｒ標識非結合性アイソタイプ対照ＤＦＯ−抗体コンジュゲートのいずれかを投与した。ＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇ腫瘍保有ヌードマウスは、タンパク質用量約０．６ｍｇ／ｋｇで５０±１ｕＣｉの８９Ｚｒ標識抗体を施された。ＬＯＸ−ＩＭＶＩ腫瘍保有マウスを使用する研究では、マウスは、最終抗体用量０．３または１ｍｇ／ｋｇで３５±１ｕＣｉの８９Ｚｒ標識抗体を施された。
【０２０４】
抗体局在化のＰＥＴイメージングを、抗体の投与６日後に評価した。Ｓｏｆｉｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｇ８  ＰＥＴ／ＣＴ（Ｓｏｆｉｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用してイメージを収集した。測定器を、イメージ収集前に８９Ｚｒの検出のために、あらかじめ較正した。エネルギーウィンドウは、１５０から６５０ｋｅＶの範囲であり、視野の中心で１．４ｍｍの再構成された解像度を有していた。マウスは、イソフルランを使用して導入麻酔を受け、イメージングの間にイソフルランの連続フロー下に保持された。静的な１０分間のイメージを、Ｇ８収集ソフトウェアを使用して収集し、その後、あらかじめ構成された設定を使用して再構成した。イメージデータを、減衰および他のパラメータについて補正した。ＣＴイメージを、ＰＥＴ収集後に収集し、後にＰＥＴイメージと共に登録した。イメージを、ＶｉｖｏＱｕａｎｔ加工処理後ソフトウェア（ｉｎｖｉＣＲＯ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）を使用して調製した。
【０２０５】
生体内分布に関して、マウスを最終時点（投与５〜６日後）で安楽死させ、血液を心臓穿刺を介して回収した。腫瘍および正常組織を、次いで、切除し、カウントチューブに設置した。各試料についての重量を、測定し、記録した。ＣＰＭでの８９Ｚｒについてのカウントデータを、次いで、自動ガンマカウンター（Ｗｉｚａｒｄ  ２４７０、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）における試料を測定することにより回収した。１グラム当たりの注入用量のパーセント（％ＩＤ／ｇ）を、注入物質から調製した標準を使用して各試料について計算した。
【０２０６】
各抗体についての平均％ＩＤ／ｇは、表１３に提示される。
【表１３】
2020512281.tif 000022
【０２０７】
これから、他の正常組織に対して、ＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇ腫瘍中の明瞭に高い取り込みが、明らかであり、５５．３％ＩＤ／ｇの腫瘍の取り込みは、胸腺中で観察された５．３％ＩＤ／ｇの次に高い取り込みよりも有意に高かった。腫瘍の取り込みは、それぞれ、血液および肝臓中の放射能よりも７．３倍および１７．８倍高かった。腫瘍への抗ＰＤ−Ｌ１の取り込み（５５．３％ＩＤ／ｇ）の特異性は、非結合性のアイソタイプ対照抗体について観察された３％の有意に低減した腫瘍の取り込みと比較して明らかであった。ここで実施されたパイロットＰＥＴイメージングは、ＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇ腫瘍への８９Ｚｒ標識抗ＰＤ−Ｌ１  ＤＦＯ−抗体コンジュゲートの明瞭な局在化を裏付けた。わずかなバックグラウンドシグナルが、この投与後６日目時点で動物において観察された。抗ＰＤ−Ｌ１抗体を使用して明らかであった明瞭な腫瘍局在化とは対照的に、わずかなバックグラウンド放射能のみが、このモデルの対照抗体のイメージングにおいて明らかであった。イメージングは、ヒトＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍における抗ＰＤ−Ｌ１抗体の明瞭に高く特異的な取り込みを示し、ＮＣｒヌードマウスにおけるＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇ腫瘍への８９Ｚｒ放射性標識された抗ＰＤ−Ｌ１抗体の局在化を示した。
【０２０８】
第２の研究では、ヒトＰＤ−Ｌ１抗原の内因的レベルを発現する腫瘍を選択的にターゲティングする抗ＰＤ−Ｌ１抗体の能力を評価した。ここでは、ヒトＬＯＸ−ＩＭＶＩメラノーマ腫瘍保有マウスは、０．３および１ｍｇ／ｋｇの用量で８９Ｚｒ標識抗体を施された。再び、血液、腫瘍および組織を注射後６日目にとり、試料に関する％ＩＤ／ｇを計算した。各抗体についての平均％ＩＤ／ｇは、表１４に提示される。
【表１４】
2020512281.tif 000023
【０２０９】
より低い０．３ｍｇ／ｋｇ用量で、正常組織よりも腫瘍へと明確にターゲティングすることが、観察され、ＬＯＸ−ＩＭＶＩ腫瘍において２０．６％ＩＤ／ｇが観察された。マウスがより高い１ｍｇ／ｋｇ用量を施された場合、１０．６％ＩＤ／ｇの低減した腫瘍の取り込みが０．３ｍｇ／ｋｇレベルと比較して観察された。これは、非標識抗体のより高いタンパク質用量およびおそらくその後のより高い割合が、８９Ｚｒ標識抗ＰＤ−Ｌ１抗体による腫瘍の取り込みの遮断を導いたことを示唆する。これに一致して、ＰＥＴイメージングが、生体内分布研究直前に行われ、１ｍｇ／ｋｇ用量での抗ＰＤ−Ｌ１抗体の取り込みが、対照抗体のものとおよそ同等であることも示された。より低い用量の０．３ｍｇ／ｋｇで、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の腫瘍局在化における明瞭な増加が、対照抗体と比較して明らかであった。全体では、ＰＥＴイメージおよび生体内分布データは、０．３ｍｇ／ｋｇ用量の抗ＰＤ−Ｌ１抗体で、ＬＯＸ−ＩＭＶＩ腫瘍の特異的なターゲティングを裏付ける。
【０２１０】
（実施例７：マウスにおけるｈＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍に対する放射性標識された抗ＰＤ−Ｌ１抗体の選択的な局在化）
この実施例は、ＰＤ−Ｌ１に関してヒト化されたマウスにおける、ジルコニウム−８９標識ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏ局在化を記載する。この実施例で使用される例示的な抗体は、Ｈ１Ｈ８３１４Ｎであり、配列番号８２／９０のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲを含んだ。
【０２１１】
ＰＤ−Ｌ１に関してヒト化されたマウスは、ＶｅｌｏｃｉＧｅｎｅ（登録商標）技術（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、２００３年、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２１巻：６５２〜６５９頁；米国特許出願公開ＵＳ２０１６／０１５７４６９）を使用して操作された。
【０２１２】
使用された腫瘍系は、ｅＧＦＰと融合させた全長ニワトリ卵白アルブミンを発現し、野生型ＭＣ３８のマウスＰＤ−Ｌ１がノックアウトされているが、全長ヒトＰＤ−Ｌ１を過剰発現するように所内で操作されている、ＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇと称されるマウス結腸癌腫細胞系であった。
【０２１３】
１×１０６個のＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇの細胞を、雄性ヒト化ＰＤ−Ｌ１マウスの左脇腹の皮下に移植した。腫瘍が５０〜１５０ｍｍ３（約７日目）の平均容量に達したら、マウスを群に無作為化し、８９Ｚｒ標識抗ＰＤ−Ｌ１ＤＦＯ−抗体コンジュゲートまたは８９Ｚｒ標識非結合性アイソタイプ対照ＤＦＯ−抗体コンジュゲートのいずれかを投与した。マウスは、最終タンパク質用量１または３ｍｇ／ｋｇで５０±１ｕＣｉの８９Ｚｒ標識抗体を施された。
【０２１４】
抗体局在化のＰＥＴイメージングを、抗体の投与６日後に評価した。Ｓｏｆｉｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｇ８  ＰＥＴ／ＣＴ（Ｓｏｆｉｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用してイメージを収集した。測定器を、イメージ収集前に８９Ｚｒの検出のために、あらかじめ較正した。エネルギーウィンドウは、１５０から６５０ｋｅＶの範囲であり、視野の中心で１．４ｍｍの再構成された解像度を有していた。マウスは、イソフルランを使用して導入麻酔を受け、イメージングの間にイソフルランの連続フロー下に保持された。静的な１０分間のイメージを、Ｇ８収集ソフトウェアを使用して収集し、その後、あらかじめ構成された設定を使用して再構成した。イメージデータを、減衰および他のパラメータについて補正した。ＣＴイメージを、ＰＥＴ収集後に収集し、後にＰＥＴイメージと共に登録した。イメージを、ＶｉｖｏＱｕａｎｔ加工処理後ソフトウェア（ｉｎｖｉＣＲＯ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）を使用して調製した。
【０２１５】
生体内分布に関して、マウスを最終時点（投与５〜６日後）で安楽死させ、血液を心臓穿刺を介して回収した。腫瘍および正常組織を、次いで、切除し、カウントチューブに設置した。各試料についての重量を、測定し、記録した。ＣＰＭでの８９Ｚｒについてのカウントデータを、次いで、自動ガンマカウンター（Ｗｉｚａｒｄ  ２４７０、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）における試料を測定することにより回収した。１グラム当たりの注入用量のパーセント（％ＩＤ／ｇ）を、注入物質から調製した標準を使用して各試料について計算した。
【０２１６】
結果
ＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇ腫瘍保有ヒト化ＰＤ−Ｌ１マウスは、最終抗体用量１または３ｍｇ／ｋｇで８９Ｚｒ標識抗ＰＤ−Ｌ１  ＤＦＯ−抗体コンジュゲートを施された。血液、腫瘍および組織を注射後６日目にとり、秤量し、試料に関する％ＩＤ／ｇを各試料からのカウントに基づき計算した。１および３ｍｇ／ｋｇでの用量についての平均％ＩＤ／ｇは、それぞれ、表１５および表１６に提示される。
【表１５】
2020512281.tif 000024
【０２１７】
１ｍｇ／ｋｇ用量レベルで、ＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇ腫瘍の明瞭な腫瘍ターゲティングは、これらのヒト化マウスの正常組織におけるＰＤ−Ｌ１の発現にもかかわらず、３４．１％の％ＩＤ／ｇで明らかである。この用量で、８９Ｚｒ標識抗ＰＤ−Ｌ１抗体の一部の局在化は、脾臓において明らかであり、ここで１４．１％ＩＤ／ｇの抗体の取り込みが観察された。このような取り込みは、脾臓中のヒトＰＤ−Ｌ１のマウスＰＤ−Ｌ１発現に代えてヒトＰＤ−Ｌ１の正常発現が理由で予測される。３ｍｇ／ｋｇ抗体用量で、脾臓への８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートの局在化は、取り込みが、ここで、この抗体用量を施されたマウスにおいて平均９．７％ＩＤ／ｇであるように、低減した（表１６）。
【表１６】
2020512281.tif 000025
【０２１８】
明瞭な腫瘍ターゲティングは、依然として３ｍｇ／ｋｇ用量で観察され、ＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇ腫瘍により平均２８．７％ＩＤ／ｇで取り込まれる。したがって、低減した正常組織局在化が、３ｍｇ／ｋｇ用量のイメージングに明らかであったが、ＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇ腫瘍への抗ＰＤ−Ｌ１標識抗体の明瞭な局在化は、この用量で明瞭のままであった。全体では、これらの結果は、ＭＣ３８−ｃＯＶＡ／ｅＧＦＰ−ｍＰＤ−Ｌ１−／−ｈＰＤ−Ｌ１Ｔｇ腫瘍の明瞭なターゲティングが、正常組織発現の通常の部位にＰＤ−Ｌ１を発現するマウスにおいて可能であったことを指し示す。
【０２１９】
ここで実施された研究からの結果は、８９Ｚｒで標識された抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、腫瘍に有意にかつ特異的に局在化することができることを明瞭に裏付ける。抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、その後の、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の阻害剤での処置のためにＰＤ−Ｌ１陽性腫瘍を有する患者の選択に使用されるとのシナリオが認識されうる。
【０２２０】
（実施例８：ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートの産生のための拡大製造プロセス）
この実施例は、本明細書に記載される抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ｍＡｂ、Ｈ４Ｈ８３１４Ｎ）にｐ−ＳＣＮ−ｂｎ−デフェロキサミン（ＤＦＯ）を付加することにより、放射性標識に適切な抗ＰＤ−Ｌ１抗体を調製するための拡大製造プロセスを詳細に記載する：（１）ｍＡｂコンジュゲーション前の限外濾過およびダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）プロセスは、コンジュゲーションプロセスを阻害する賦形剤を除去する；（２）コンジュゲーション前のＵＦＤＦ後、ｍＡｂとｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−デフェロキサミンのコンジュゲーションを実施して、ＤＦＯ−ｍＡｂコンジュゲートを作製する；および（３）残留する塩を除去するためのコンジュゲーション後のＵＦＤＦは、コンジュゲートモノクローナル抗体の適切な濃度、賦形剤レベル、およびｐＨを提供する。結果として得られるＤＦＯ−ｍＡｂコンジュゲートは、次いで、その後の製剤化のため改善された安定性を有する緩衝された状態で提供される。
【０２２１】
（１）コンジュゲーション前の限外濾過およびダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）
１００ｇの抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、コンジュゲーション前に残留する塩を除去するため、Ｓｉｕｓ  Ｐｒｏｓｔｒｅａｍ（ＴａｎｇｅｎＸ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）膜（≦５００ｇ／ｍ２の膜容量）を使用して、５．５０のｐＨを有する５ｍＭ酢酸緩衝液に緩衝液交換した。プロセス容量を低減させ、抗体をさらに濃縮し、次いで、抗体を０．４５／０．２μｍ（非均質ＰＥＳ二重層）または同等の孔サイズを有するＳａｒｔｏｐｏｒｅ  ２（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）膜を使用して濾過滅菌した。酢酸緩衝液温度を、２０±５℃の標的温度に保持した。溶液を、よく混合した。
【０２２２】
（２）コンジュゲーション
濃縮および濾過された抗体（２０ｇ）を、アミン不含炭酸緩衝系（５６ｍＭ炭酸塩、１６７ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ９．４０）を含有するコンジュゲーション容器へと移したところ、結果として残留する酢酸塩は無視できるレベルになった。ＤＦＯ（２５ｍＭ  ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−デフェロキサミン）を、ＤＭＳＯに溶解し、追加のＤＭＳＯと共にコンジュゲーション容器に添加して、ＤＭＳＯを５％の最終量で存在させた。ＤＦＯを、ＤＦＯのｍＡｂに対する比を４．５：１のモル過剰で添加した。総反応容量は、２．０Ｌに等しかった。緩衝系を、反応成分を添加する間ずっと、および反応時間全体にわたって混合した。
【０２２３】
反応温度を、温度を反応時間と関係づける方程式を使用することにより特定の時間で制御した。この例では、反応温度を、１８℃で１２０分間保持した。反応を、２Ｍ酢酸（２３ｍＬ／Ｌ）の添加によりクェンチングし、結果として溶液は６のｐＨを有した。
【０２２４】
（３）コンジュゲーション後のＵＦＤＦ
コンジュゲーションステップ後、クェンチングしたＤＦＯ−ｍＡｂコンジュゲーション溶液を、残留するプロセス塩、ＤＭＳＯ、および未反応のＤＦＯを除去するため、ヒスチジン緩衝液（１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ５．５０と剪断保護剤として添加した０．０００５％（ｗ／ｖ）超精製ポリソルベート（ｓｕｐｅｒ  ｒｅｆｉｎｅｄ  ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）８０）に緩衝液交換した。ダイアフィルトレーションしたら、溶液を、次いで、濃縮し、その後、製剤化した。ヒスチジン緩衝液を−８０℃でのタンパク質の長期貯蔵のため選択した。ステップ（１）で言及された同じＳｉｕｓ  Ｐｒｏｓｔｒｅａｍ膜を、最終的なＵＦＤＦステップで使用した。結果として得られる濃縮されたＤＦＯ−ｍＡｂコンジュゲート溶液を、上記で言及されたＳａｒｔｏｐｏｒｅ  ２フィルターを使用して濾過滅菌した。
【０２２５】
ＵＶ−ＤＡＲ（１．５の標的）およびタンパク質濃度決定を、実施例２に記載されるように実施した。
【表１７】
2020512281.tif 000026
【０２２６】
（実施例９：８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートのＩＶ用量を施されたヒト被験体における放射能の予測された全身および組織曝露）
以下の実験の目的は、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートの静脈内（ＩＶ）用量によってヒト被験体において放射能に対する予測された全身および組織曝露を推定することであった。放射性標識されたコンジュゲートで使用される例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｈ４Ｈ８３１４Ｎであった。
【０２２７】
放射性免疫コンジュゲートの特徴づけ
抗ＰＤ−Ｌ１免疫コンジュゲート（ＤＦＯ−Ａｂ）およびアイソタイプ対照免疫コンジュゲート（ＤＦＯ−ＩｇＧ４Ｐ対照）を、放射性標識し、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングおよび生体内分布研究の使用のために精製した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析およびＭＣ３８／ｍＰＤ−Ｌ１−／−／ｈＰＤ−Ｌ１（マウスＰＤ−Ｌ１がノックアウトされ、ヒトＰＤ−Ｌ１を安定に発現するように操作されているマウスＭＣ３８結腸腺癌細胞）細胞ベースｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを実施して、結果として生じた放射性免疫コンジュゲートを特徴づけした。
【０２２８】
単量体および放射化学的純度
ＵＶおよびγ放射検出器を使用するＳＥＣ−ＨＰＬＣを実施して、単量体および放射化学的純度を評価した。８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートおよびアイソタイプ対照放射性免疫コンジュゲート８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ＩｇＧ４Ｐの放射性免疫コンジュゲート調製物についての結果は、図８に示される。
【０２２９】
２８０ｎｍでの吸収に関するクロマトグラムの分析を実施して、放射性免疫コンジュゲート調製物中の高分子量（ＨＭＷ）および単量体タンパク質の相対量を評価した。表１８にまとめられたように、単量体ピーク（単量体純度のリードアウト）は、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートおよびアイソタイプ対照８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ＩｇＧ４Ｐの調製物についての総タンパク質ピーク面積の、それぞれ、９９．６、９９．２、および９８．６％を構成する；低レベルのＨＭＷ種（それぞれ０．４、０．８、および１．４％）も検出された。低分子量（ＬＭＷ）種は、被験試料のいずれについても観察されなかった。
【０２３０】
γ放射についての放射性クロマトグラムの分析を実施して、組み込まれない８９Ｚｒ（例えば、遊離８９Ｚｒまたは遊離ＤＦＯ誘導体でキレート化された８９Ｚｒ）と比べて、放射性免疫コンジュゲートに組み込まれた８９Ｚｒの相対量を評価した。表１８にまとめたように、組み込まれない８９Ｚｒについてのピークは、総γ放射ピーク面積の≦１．１％を構成するが、放射性標識された単量体およびＨＭＷ種についての組み合わせたピーク（放射化学的純度のリードアウト）は、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートおよびアイソタイプ対照８９Ｚｒ−ＤＦＯ−ＩｇＧ４Ｐの調製物についての総γ放射ピーク面積の、それぞれ、９８．９、９９．５、および９９．５％を構成する。
【表１８】
2020512281.tif 000027
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析についての数値は、図８においてグラフで表示する。ＵＶクロマトグラムは、２８０ｎｍでの吸収についてのクロマトグラムを指し示し、放射性クロマトグラムは、γ放射の強度についてのクロマトグラムを指し示す。ＨＭＷ：  高分子量；  ｎ／ａ：  適用なし。
【０２３１】
免疫反応性
免疫反応性（その抗原を結合することが可能な、放射性標識され、コンジュゲートされた抗体のパーセントの尺度）を、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートをＭＣ３８／ｍＰＤ−Ｌ１−／−／ｈＰＤ−Ｌ１細胞とインキュベートすることにより決定した。８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートの２つの被験ロットは、ＭＣ３８／ｍＰＤ−Ｌ１−／−／ｈＰＤ−Ｌ１細胞における８４．５および８８．８％の免疫反応性を裏付けた（表１９）。バックグラウンドの８．８％の非特異的な免疫反応性が、アイソタイプ対照放射性免疫コンジュゲートについて観察された。
【表１９】
2020512281.tif 000028
【０２３２】
結論として、２つの別個のロットの８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートは、高い免疫反応性、単量体のパーセンテージ、および放射化学的純度を示した。
【０２３３】
マウス中の８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１生体内分布
本実験は、抗ヒトＰＤ−Ｌ１放射性免疫コンジュゲート、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートの生体内分布を、単一の５０μＣｉ（１ｍｇ／ｋｇ）静脈内（ＩＶ）用量をＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１−ヒト化マウス（ＰＤ−１ｈｕ／ｈｕＰＤ−Ｌ１ｈｕ／ｈｕ）に投与後に経時的に評価した。Ｈ４Ｈ８３１４ＮはマウスＰＤ−Ｌ１に結合しないので、ＰＤ−Ｌ１エクトドメインをコードするマウスＰＤ−Ｌ１遺伝子の区分を、ＰＤ−１ｈｕ／ｈｕ−ＰＤ−Ｌ１ｈｕ／ｈｕマウス中の対応するヒト配列で置きかえた。この系統では、マウスＰＤ−１のエクトドメインが、同様にヒト化された。これらのマウスは、免疫／炎症チャレンジにかけられず、したがって、免疫細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現の未刺激レベルを有することが予測される。各８動物の二群を、投与６日（１４４時間）または１０日（２４０時間）後に屠殺し、血液を回収し、以下の組織を採取した：心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓、胃、小腸、盲腸、大腸、骨（大腿骨）、胸腺、筋肉、膀胱、および脳。特定の組織または血液に局在化する総注射線量（％ＩＤ）の放射能のパーセンテージを、決定し、組織の１グラム当たりの平均％ＩＤ（％ＩＤ／ｇ）として報告した。屠殺に先立って、免疫ＰＥＴ／コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）イメージを、同じ動物から投与後１、２４、４８、７２、１４４、１９２（１０日群のみ）、および２４０（１０日群のみ）時間に収集した。
【０２３４】
血液中の８９Ｚｒレベルと比較して、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートの特定の組織への取り込みは、ｅｘ  ｖｉｖｏ組織分析（表２０および図９）およびｉｎ  ｖｉｖｏイメージングにより評価されたように、１０日間の研究期間の全体にわたって無視できるものであった。血液（９．４±２．２％ＩＤ／ｇ）と比べて、脾臓を除く全ての採取された組織は、投与後６日目により低い８９Ｚｒレベル（≦６．７％ＩＤ／ｇ）を裏付けた。低い程度の標的により媒介される８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲート取り込み（１０．２±１．９％ＩＤ／ｇ）は、フローサイトメトリーにより裏付けられたように、脾細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現と一致して、脾臓で観察された。投与１０日後に、血液中の８９Ｚｒレベルは、投与後６日目と比較して７．８分の１に低下し、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートレベルに影響を及ぼすマウス抗ヒト抗体（ＭＡＨＡ）応答が示唆される。この観察されたＭＡＨＡ応答は、標的であるＰＤ−Ｌ１が、抗原提示細胞に発現され（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、２０１０年）、マウス免疫系に対するヒト抗体の提示、その後のＭＡＨＡ形成をもたらすとの事実によってである可能性が高い。並行して、肝臓中の８９Ｚｒレベルは、おそらくＭＡＨＡ／８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲート免疫複合体（ＩＣ）形成およびその後の肝臓により媒介されるＩＣクリアランス（Ｒｏｊｋｏ、２０１４年）の結果として、投与後６日目と比べて１０日目に４．１倍増大した。全動物ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＰＥＴイメージングは、上記の脾臓についての低いシグナルおよび肝臓中のＭＡＨＡにより媒介される蓄積を超えた８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートの著しい組織特異的な取り込みを明らかにしなかった。
【０２３５】
まとめると、血液中の８９Ｚｒレベルよりも多い、特定の組織への８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートの著しい標的により媒介される取り込みは、１ｍｇ／ｋｇ（５０μＣｉ）の８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートの単一のＩＶ用量を投与されたＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１−ヒト化マウスにおいて６日間観察されなかったが、但し、脾細胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現が裏付けられたことに一致して、低い程度の標的により媒介される取り込みが観察された脾臓は例外である。投与後１０日目での研究の終了時まで６日目を超えて回収されたデータは、ＭＡＨＡ応答により影響を受けた。
【表２０】
2020512281.tif 000029
【０２３６】
ヒトにおいて放射能への全身および組織曝露の推定値
本実験は、５０μＣｉ（１ｍｇ／ｋｇ）の８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートの単一ＩＶ投与後１、２４、４８、７２、１４４、１９２、および２４０時間で画像化した４匹のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１−ヒト化雄性マウスおよび４匹のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１−ヒト化雌性マウスについてのＰＥＴ／ＣＴイメージデータを使用した。この臨床的に関連のある用量の投与により作成されたデータを、放射能へのヒト曝露の推定値を計算することに使用した。組織濃度データを、関心領域（ｖｏｌｕｍｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ：ＶＯＩ）分析を使用して決定した。
【０２３７】
放射線量測定推定に関して、平均滞留時間を、以下の領域について決定した：脳、胃内容物、心臓内容物、腎臓、肝臓、肺、筋肉、赤色骨髄、脾臓、膀胱内容物、および体の残部。これらの平均滞留時間値は、ヒトにおける平均吸収組織線量および有効線量を推定するため、ＯＬＩＮＤＡ／ＥＸＭ  １．１ソフトウェアプログラムへの入力として使用された。
【０２３８】
８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートについて有効なヒト用量は、成体雄において０．５１３ｍＳｖ／ＭＢｑ（ミリシーベルト／メガベクレル）および成体雌において０．６２２ｍＳｖ／ＭＢｑであると推定された。ヒトにおいて最高吸収線量を有することが予測された器官は、脾臓および肝臓であった。脾臓中の推定吸収線量は、成体雄において０．８５６ｍＳｖ／ＭＢｑおよび成体雌において１．１２ｍＳｖ／ＭＢｑであった。肝臓中の推定吸収線量は、成体雄において０．７６４ｍＳｖ／ＭＢｑおよび成体雌において０．９７４ｍＳｖ／ＭＢｑであった。
【０２３９】
各ＶＯＩに関する雄性および雌性マウス（ｎ＝４雄、ｎ＝４雌）についての１ｍＬ当たりの注射線量の平均減衰補正パーセント（ＤＣ％ＩＤ／ｍＬ）値は、表２１にまとめられた。
【表２１】
2020512281.tif 000030
【０２４０】
推定ヒト平均滞留時間（ＭＲＴ）値は、供給源の器官の各々について表２２に提供される。体の残部におけるＭＲＴは、全ての供給源の器官滞留時間の和を８９Ｚｒ減衰定数の逆数から減算することにより得られた（Ｈｕａｎｇら、Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ、ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｄｏｓｉｍｅｔｒｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  ４−［１８Ｆ］−ＡＤＡＭ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｋｅｙｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ、２０１０年；３７巻：５４５〜５５５頁）。これは、累積的な組織放射能の保守的な推定を表示する。
【表２２】
2020512281.tif 000031
【０２４１】
ＯＬＩＮＤＡ／ＥＸＭ１．１の成体雄および成体雌ファントムに関する全ての標的器官についての推定吸収組織線量は、表２３に提供される。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ（ＩＣＲＰ）（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．１９９０年  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．ＩＣＲＰ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ６０巻、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年）により規定される有効線量は、確率的リスク荷重係数による所与の器官に対する吸収線量を乗じることおよび加重した線量を一緒に加えることにより計算される量である。推定有効線量は、表２３の終わりに提供される。これらの値は、放射能吸収線量の保守的な推定を表示する。
【表２３】
2020512281.tif 000032
【０２４２】
物理的減衰および二重指数関数フィット法（ｂｉｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｆｉｔ  ｍｅｔｈｏｄ）からの推定ヒト組織吸収線量および有効なヒト用量（表２３）は、類似していた。物理的減衰法を選択して、このマウスモデルにおける見掛けのＭＡＨＡ応答に起因する、最終セットの推定ヒト組織吸収線量および有効線量を作製した。したがって、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートについて有効なヒト用量は、成体雄において０．５１３ｍＳｖ／ＭＢｑおよび成体雌において０．６２２ｍＳｖ／ＭＢｑであると推定された。ヒトにおいて最高吸収線量を有することが予測された器官は、脾臓および肝臓である。脾臓中の推定吸収線量は、成体雄において０．８５６ｍＳｖ／ＭＢｑおよび成体雌において１．１２ｍＳｖ／ＭＢｑであった。肝臓中の推定吸収線量は、成体雄において０．７６４ｍＳｖ／ＭＢｑおよび成体雌において０．９７４ｍＳｖ／ＭＢｑであった。
【０２４３】
（実施例１０：進行した胸部悪性疾患を有する患者における８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートを使用する腫瘍中のＰＤ−Ｌ１の免疫ＰＥＴイメージング）
この研究の第１の課題は、放射性標識されたコンジュゲートで使用される抗ＰＤ−Ｌ１抗体がＨ４Ｈ８３１４Ｎである、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートの安全性および忍容性を決定することである。研究の第２の課題は、以下である：
・  研究パートＡのみ：トレーサー注入後のイメージングおよび採血により評価されるような、適切な質量用量（ｍａｓｓ  ｄｏｓｅ）の８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートおよび最適な注入後イメージング時間を確立すること。
・  研究パートＢのみ：パートＡにより決定される、最適な質量用量およびイメージング時点での２つの別個のトレーサー注入において評価されるような、ＰＥＴ測定の信頼性試験／再試験を確立すること。
・  トレーサー血漿放射能濃度に基づき８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１抗体コンジュゲートの薬物動態（ＰＫ）プロファイルを特徴づけること。
【０２４４】
これは、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１の安全性および忍容性を評価するためにデザインされた、オープンラベル、２パート研究である。研究パートＡは、適切な質量用量および放射能線量の８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１および最適な注入後イメージング時間を確立する。８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１の試験／再試験変動性は、パートＢで評価される。
【０２４５】
全ての患者は、スクリーニング手順を経る。適格性基準を満たす患者は、病変の生存度、位置、および寸法を評価するため１８Ｆフルオロデオキシグルコース（１８Ｆ−ＦＤＧ）ＰＥＴ／コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）および診断ＣＴスキャンを経る。８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１の予測された第１の用量の２８日内に収集された、適切な品質のイメージが利用可能である場合、これらのスキャンは要求されない。
【０２４６】
パートＡ
３種の逐次的な用量コホートは、５ｍｇ、１０ｍｇ、または２０ｍｇの８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１でオープンラベルで処置するように計画される。
【０２４７】
８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１を注入後、患者は、１日目、４日目±１および７日日±１に８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１  ＰＥＴ／ＣＴスキャンを経る。追加のイメージングは、１０日目まで実施されうる。患者は、安全性評価を経て、血液学、化学、免疫安全性アッセイ、薬物動態、抗薬物抗体分析、およびバイオマーカー分析のための試料を提供する。
【０２４８】
患者は、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１トレーサーの注入後２１日目まで、身体検査、バイタルサイン、および有害事象（ＡＥ）の記録を含む安全性評価を継続して経る。
【０２４９】
適切な用量を同定する用量漸増決定は、下記で記載される、安全性および忍容性データならびに免疫ポジトロン放射断層撮影（ｉＰＥＴ）陽性およびトレーサー血漿放射能濃度の評価により情報を提供される。
【０２５０】
パートＡにおける用量コホート
３上昇質量用量までのコホートが、計画される。各質量用量コホートに関して、最初の２患者が、各患者の投与の間に最小で４８時間のインターバルで投与される。所与の質量用量での第２の患者に対する７日目±１日のＰＥＴ／ＣＴスキャンの完了時、全ての利用可能なイメージング、トレーサー血漿放射能濃度、臨床線量測定、および安全性データが再検討される。この再検討に基づき、決定は、以下のようになされる：
・  腫瘍対血液比＞１により規定される、少なくとも１患者における腫瘍の取り込み陽性／腫瘍局在化が存在する場合、コホートを６患者に拡大する
・  最適イメージング時点で１から５の血液の標準摂取率（ＳＵＶ）範囲により適切に規定される、不十分な腫瘍の取り込みおよび血漿トレーサー放射能濃度が存在する場合、次の質量用量コホートに上昇する
・  不十分な腫瘍の取り込みおよび適切な血漿トレーサー放射能濃度に基づき、より低い質量用量で、次の質量用量コホートで進める。
【０２５１】
腫瘍局在化が、全ての３つの提案された質量用量レベルで少なくとも２患者において不十分であり、かつ、これが、低いイメージシグナル対ノイズによるものであると決定される場合、放射能線量は、以前に試験された質量用量コホートのさらなる拡大のため最大１８５ＭＢｑまで増大される。
【０２５２】
パートＢ
研究パートＢは、適切な８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１用量で一度始め、最適なイメージング時間はパートＡにおいて決定されている。パートＢの１日目に、患者は、トレーサー質量用量を施される。トレーサーを施された後、患者は、パートＡで同定された最適な時間でのスキャンを経る。パートＢにおいて患者は、第２のトレーサー用量を施され、１４から２８日間の用量間インターバルの後にスキャンされる。インターバル後の第２のトレーサー用量の実際のタイミングは、パートＡからの結果に基づいて決定される。
【０２５３】
患者は、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１トレーサーが投与される、来院の間および後、身体検査、バイタルサイン、および有害事象（ＡＥ）の記録を含む安全性評価を経る。これらの来院の間、患者は、ＰＫ、血液学、化学、免疫安全性アッセイ、のための試料を提供する。
【０２５４】
パートＡおよびパートＢの両方に関して、患者は、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１トレーサーの最後の注入後２１日間まで、身体検査、バイタルサイン、およびＡＥの記録を含む安全性評価を継続して経る。
【０２５５】
研究持続期間
パートＡに関して、患者は、トレーサー用量の注入後、２８日間（４週間）までのスクリーニング期間および２１日間（約３週間）までの追跡期間を有する。研究パートＡの持続期間は、スクリーニング期間を含む、約７週間である。
【０２５６】
パートＢに関して、患者は、２８日間（４週間）までのスクリーニング期間、２８日間（４週間）までの注入間インターバル、および第２のスキャン期間を含む２１日間（３週間）の安全性追跡期間を有する。各患者についての研究の総持続期間は、スクリーニング期間を含む、１１週間までである。
【０２５７】
本研究に関する研究の終わりは、最終患者の最終来院として規定される。
【０２５８】
研究パートＡに関して、各々６患者までの３種の逐次的な用量レベルは、全体で１８患者までについて、計画される３コホートで、１コホート当たり計画される。研究パートＢに関して、１０患者までが、登録される。単一の研究施設中で最大２８患者の登録が、研究全体に関して計画される。
【０２５９】
患者標的集団
標的集団は、進行した胸部悪性疾患および診断上のまたはその後のバイオプシーの≧１％のＰＤ−Ｌ１  ＩＨＣスコア（２２Ｃ３  ＰｈａｒｍＤｘアッセイ、Ｄａｋｏ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．による陽性ＰＤ−Ｌ１  ＩＨＣスコア）を有する１８歳またはそれよりも年長の患者からなる。
・  パートＡに関して、胸部悪性疾患は、ＮＳＣＬＣ、胃−食道接合部腺癌、および胃がんに限定され、ＩＨＣによるＰＤ−Ｌ１スコアが≧１％である。
・  パートＢに関して、進行した胸部悪性疾患およびＩＨＣによるＰＤ−Ｌ１スコア≧１％を有する全ての患者が、適格である。患者は、２つの最新のイメージング研究の間でＲＥＣＩＳＴ  １．１に従う安定病態も有さなければならない。
【０２６０】
療法を要求する全ての患者は、標準療法を受けなければならない。
【０２６１】
処置
８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１は、二機能性キレーター（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＦＯ）をＨ４Ｈ８３１４Ｎ（抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体）に共有結合的にコンジュゲートすることおよび本化合物を８９Ｚｒで放射性標識することにより形成される放射性免疫コンジュゲートである。８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１は、水性緩衝ビヒクル中にて供給される。
【０２６２】
パートＡに関して、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１は、１日目（ベースライン）にＩＶ投与される。パートＢに関して、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１は、１日目および７日目±３にＩＶ投与される。パートＢにおける第２の用量の実際のタイミングは、パートＡにおける結果から決定される。
【０２６３】
８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１トレーサーは、ＰＫモデルに基づいてヒトにおける推定累積曝露レベルを十分下回り、かつ現在利用可能な抗ＰＤ−１剤が抗がん処置で使用されるレベルより低い用量レベルで投与される。この研究は、標的に関する競合を回避するために、抗ＰＤ−Ｌ１で現在処置される患者を排除する。
【０２６４】
エンドポイント
研究における主要エンドポイントは、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１を投与した胸部悪性疾患を有する患者における最終用量のトレーサー注入から２１日目までの、治療下で発現した有害事象（ＴＥＡＥ）の発生率および重症度である。
【０２６５】
パートＡのみに関して、研究は、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１の適切な質量用量および放射能線量ならびに最適な注入後イメージング時間を確立する、以下は、トレーサー注入後１、４、および７日目での採血およびイメージングを介して決定される：
・  血液プール中の８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１の標準摂取率と、その後のイメージングの時間での腫瘍対血液比の計算
・  ＰＥＴイメージ収集データおよび血液中のトレーサー放射能濃度から計算される、吸収線量および有効な組織放射線に基づく臨床線量測定
・  目的の腫瘍領域（ＲＯＩ）にわたる標準摂取率（ＳＵＶ）
・  腫瘍ＲＯＩ内の最大ＳＵＶ（ＳＵＶｍａｘ）
・  ７日目までの曲線下面積（ＡＵＣ０−７）の計算で、ＳＵＶとして表現される、血漿トレーサー放射能濃度
【０２６６】
パートＢのみに関して、研究は、８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１  ＰＥＴ測定の信頼性試験／再試験を確立する、以下は、パートＡから決定される、適切な質量用量および最適なイメージング時点での、２つの別個のトレーサー注入の測定から決定される：
・  血液プールＳＵＶと、その後の腫瘍対血液比の計算
・  腫瘍ＲＯＩにわたるＳＵＶ
・  腫瘍ＲＯＩ内のＳＵＶｍａｘ
・  ８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１の生体内分布
【０２６７】
結果として得られるデータは、ヒトにおける８９Ｚｒ−ＤＦＯ−抗ＰＤ−Ｌ１の安全性および忍容性の指標である。
【０２６８】
上記の実施形態および実施例は、単なる例示であり、非限定的であることが意図される。当業者は、通常の実験方法のみを使用して、具体的な化合物、物質および手順の多数の均等物を認識し、または確認しうる。全てのそのような均等物は、付属の特許請求の範囲内であり、包含されると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ＡＢ】
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【図６ＣＤ】
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【図７】
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【図８ＡＢ】
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【図８ＣＤ】
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【図８ＥＦ】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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