(57)【要約】  本発明は、モノネガウイルス目由来ウイルスをベースとしたベクター、詳細には、狂犬病ウイルスベクターに関する。さらに詳細には、本発明は、標的細胞をトランスフェクトして、複製可能な形態と複製不可能な形態との間の切換えが可能である狂犬病ウイルスベクターに関する。数ある適用のなかでも、特に、本発明は、狂犬病ウイルスをベースとした現行のベクターに附随する細胞傷害性を回避するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複製モジュレータータンパク質をコードする遺伝子を含む狂犬病ウイルスベクターゲノムであって、複製モジュレータータンパク質が、ウイルスゲノムの複製に必要なウイルスタンパク質部分を含み、複製モジュレータータンパク質が、デグロンを提示する標的化されている構成とデグロンを提示しない標的化されていない構成とをとることができ、ウイルスタンパク質部分が、Ｎ（核タンパク質）タンパク質である、狂犬病ウイルスベクターゲノム。
【請求項２】
ベクターゲノムによってコードされた複製モジュレータータンパク質が、ウイルスタンパク質部分およびレギュレーター部分を含む抑制モジュレーターであり、レギュレーター部分が、デグロンを含むまたはデグロンからなる、請求項１に記載のベクターゲノム。
【請求項３】
レギュレーター部分が、コグネート活性化剤と接触すると、標的化されていない構成へと切換え可能である、請求項２に記載のベクターゲノム。
【請求項４】
活性化剤が、レギュレーター部分をウイルスタンパク質部分から切断する、請求項３に記載のベクターゲノム。
【請求項５】
活性化剤がプロテアーゼである、請求項４に記載のベクターゲノム。
【請求項６】
レギュレーター部分が、ウイルスタンパク質部分とデグロンとの間に位置する、プロテアーゼの切断部位を含む、請求項５に記載のベクターゲノム。
【請求項７】
プロテアーゼが、ベクターゲノムによってコードされたその他のどのタンパク質にも作用しない、請求項５または請求項６に記載のベクターゲノム。
【請求項８】
プロテアーゼが、ウイルスプロテアーゼ、第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、またはトロンビンである、請求項５から７のいずれか一項に記載のベクターゲノム。
【請求項９】
デグロンがＰＥＳＴ配列である、請求項２から８のいずれか一項に記載のベクターゲノム。
【請求項１０】
モジュレータータンパク質が、第１のＮ末端残基を含み、第１のＮ末端残基より高い安定性を付与する第２のＮ末端残基を露出するようにコグネートプロテアーゼによって切断可能である、請求項２から９のいずれか一項に記載のベクターゲノム。
【請求項１１】
活性化剤がベクターゲノムによってコードされ、薬剤の発現または機能が誘導性である、請求項３から１０のいずれか一項に記載のベクターゲノム。
【請求項１２】
活性化剤が、レギュレーター部分のためのリガンドである、請求項３に記載のベクターゲノム。
【請求項１３】
デグロンがＤＤ−ＦＫＢＰ配列であり、活性化剤がそのためのリガンドである、請求項１２に記載のベクターゲノム。
【請求項１４】
ベクターゲノムによってコードされた複製モジュレータータンパク質が、コグネート抑制剤と接触すると、デグロンを提示する標的化されている構成へ切換え可能である、抑制可能モジュレータータンパク質である、請求項１に記載のベクターゲノム。
【請求項１５】
複製モジュレータータンパク質が、ウイルスタンパク質部分およびレギュレーター部分を含み、抑制剤が、レギュレーター部分をモジュレータータンパク質から切断して、デグロンを創出するまたは露わにする、請求項１４に記載のベクターゲノム。
【請求項１６】
活性化剤がプロテアーゼである、請求項１５に記載のベクターゲノム。
【請求項１７】
レギュレーター部分が、ウイルスタンパク質部分とデグロンとの間に位置する、プロテアーゼのための切断部位を含む、請求項１４に記載のベクターゲノム。
【請求項１８】
プロテアーゼが、ベクターゲノムによってコードされたその他のどのタンパク質にも作用しない、請求項１４または請求項１５に記載のベクターゲノム。
【請求項１９】
プロテアーゼが、ウイルスプロテアーゼ、第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、またはトロンビンである、請求項１６から１８のいずれか一項に記載のベクターゲノム。
【請求項２０】
モジュレータータンパク質が、第１のＮ末端残基を含み、第１のＮ末端残基より低い安定性を付与する第２のＮ末端残基を露出するようにプロテアーゼによって切断可能である、請求項１６から１９のいずれか一項に記載のベクターゲノム。
【請求項２１】
複製モジュレータータンパク質がウイルスタンパク質部分およびレギュレーター部分を含み、抑制剤がレギュレーター部分のためのリガンドであり、レギュレーター部分および抑制剤が誘導性デグロンシステムの成分である、請求項１４に記載のベクターゲノム。
【請求項２２】
レギュレーター部分がＨａｌｏＴａｇ配列を含み、抑制剤がそのためのリガンドである、請求項２１に記載のベクターゲノム。
【請求項２３】
レギュレーター部分がＬＩＤ−ＦＫＢＰ配列を含み、抑制剤がそのためのリガンドである、請求項２１に記載のベクターゲノム。
【請求項２４】
レギュレーター部分がオーキシン誘導デグロン配列を含み、抑制剤がそのためのリガンドである、請求項２１に記載のベクターゲノム。
【請求項２５】
抑制剤がベクターゲノムによってコードされ、該薬剤の発現または機能が誘導性である、請求項１４から２４のいずれか一項に記載のベクターゲノム。
【請求項２６】
ゲノムが、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、および／またはＬタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載のベクターゲノム。
【請求項２７】
ゲノムが、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載のベクターゲノム。
【請求項２８】
エンベロープタンパク質が、モノネガウイルスベクターに天然に存在するものである、請求項２７に記載のベクターゲノム。
【請求項２９】
エンベロープタンパク質が、シュードタイプ化エンベロープタンパク質である、請求項２７に記載のベクターゲノム。
【請求項３０】
ベクターゲノムが、エンベロープタンパク質をコードしていない、請求項１から２６のいずれか一項に記載のベクターゲノム。
【請求項３１】
ベクターゲノムが、１つまたは複数の異種遺伝子をさらに含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載のベクターゲノム。
【請求項３２】
異種遺伝子が、マーカータンパク質、免疫応答を引き起こす対象とすることが望ましいタンパク質、リコンビナーゼ、ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子、修復鋳型ＲＮＡ、または遺伝子発現の核酸モジュレーターをコードする、請求項３５に記載のベクターゲノム。
【請求項３３】
ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである、請求項３２に記載のベクターゲノム。
【請求項３４】
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子および／または修復鋳型ＲＮＡをコードする異種遺伝子をさらに含む、請求項３３に記載のベクターゲノム。
【請求項３５】
１つまたは複数のウイルスタンパク質とともに請求項１から３４のいずれか一項に記載のベクターゲノムを含むリボ核タンパク質複合体。
【請求項３６】
Ｎ、Ｐ、およびＬタンパク質とともにベクターゲノムを含む、請求項３５に記載のリボ核タンパク質複合体。
【請求項３７】
標的細胞の細胞質に導入されると転写を開始することができる機能性ウイルスヌクレオカプシドである、請求項３５または請求項３６に記載のリボ核タンパク質複合体。
【請求項３８】
請求項１から３８のいずれか一項に記載のウイルスベクターゲノムを含む狂犬病ウイルスベクタービリオン。
【請求項３９】
狂犬病ウイルスエンベロープタンパク質を含む、請求項３８に記載のベクタービリオン。
【請求項４０】
シュードタイプ化エンベロープタンパク質を含む、請求項３８に記載のベクタービリオン。
【請求項４１】
医学的処置の方法において使用される、請求項１から３４のいずれか一項に記載のベクターゲノム、請求項３５から３７のいずれか一項に記載のリボ核タンパク質複合体、または請求項３８から４０のいずれか一項に記載のベクタービリオン。
【請求項４２】
免疫賦活剤として使用される、請求項１から３４のいずれか一項に記載のベクターゲノム、請求項３５から３７のいずれか一項に記載のリボ核タンパク質複合体、または請求項３８から４０のいずれか一項に記載のベクタービリオン。
【請求項４３】
請求項１から３４のいずれか一項に記載のウイルスベクターゲノムをコードするプラス鎖核酸分子。
【請求項４４】
請求項１から３４のいずれか一項に記載のベクターゲノムをコードする核酸構築物を含み、請求項３８から４０のいずれか一項に記載のビリオンを産生することができる、パッケージング細胞。
【請求項４５】
標的細胞を、請求項３５から３７のいずれか一項に記載のリボ核タンパク質複合体または請求項３８から４０のいずれか一項に記載のビリオンと接触させるステップを含む、標的細胞への遺伝子送達の方法。
【請求項４６】
ベクターが抑制モジュレータータンパク質をコードし、方法が、細胞をコグネート活性化剤と接触させるステップを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
活性化剤がタンパク質であり、方法が、活性化剤が標的細胞において発現されるように、活性化剤をコードする遺伝子を含む核酸を標的細胞へ導入するステップを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ベクターが抑制可能モジュレータータンパク質をコードし、方法が、細胞をコグネート抑制剤と接触させるステップを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
抑制剤がタンパク質であり、方法が、抑制剤が標的細胞において発現されるように、抑制剤をコードする遺伝子を含む核酸を標的細胞へ導入するステップを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
薬剤の発現および／または機能が誘導性であり、方法が、標的細胞において薬剤の発現および／または機能を誘導するステップを含む、請求項４６から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
（ｉ）ベクターが抑制可能モジュレータータンパク質および活性化剤をコードしており、活性化剤の発現または機能が誘導性であり、方法が、標的細胞において活性化剤の発現および／または機能を誘導するステップを含む、または
（ｉｉ）ベクターが抑制可能モジュレータータンパク質および抑制剤をコードしており、抑制剤の発現または機能が誘導性であり、方法が、標的細胞において抑制剤の発現および／または機能を誘導するステップを含む、
請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
標的細胞をコグネートインデューサーと接触させるステップを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ベクターゲノムがエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含んでおらず、方法が、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含む核酸構築物を標的細胞へ導入するステップを含む、請求項４５から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
標的細胞が神経細胞である、請求項４５から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
請求項１から３４のいずれか一項に記載のベクターゲノム、請求項３５から３７のいずれか一項に記載のリボ核タンパク質複合体、または請求項３８から４０のいずれか一項に記載のビリオン、ならびに（ａ）コグネート活性化もしくは抑制剤またはコグネート活性化もしくは抑制剤をコードする核酸、および／または（ｂ）エンベロープタンパク質をコードする核酸を含むキット。
【請求項５６】
請求項３５から３７のいずれか一項に記載のリボ核タンパク質複合体または請求項３８から４０のいずれか一項に記載のビリオンを含み、所望により賦形剤または担体と混合されている組成物。
【請求項５７】
組成物が医薬組成物であり、担体が薬学的に許容される担体である、請求項５６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容および要素があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれ、２０１７年５月２日出願の英国特許出願第１７０６９４５．１号からの優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、ラブドウイルスなどのモノネガウイルス目（Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）由来ウイルスをベースとするベクター、詳細には、狂犬病ウイルスベクターに関する。さらに詳細には、本発明は、標的細胞をトランスフェクトして、複製可能な形態と複製不可能な形態との間の切換えが可能であるベクターに関する。数ある適用のなかでも、特に、本発明は、狂犬病ウイルスベクターなどのモノネガウイルス目をベースとした現行のベクターに附随する細胞傷害性を回避するものである。
【背景技術】
【０００３】
モノネガウイルス目のウイルスをベースとしたベクターは、様々な治療的、診断的、および研究的状況における大きな可能性を秘めている。これらのベクターは、トランスフェクトされた細胞から増殖することができず、または厳密に制御された方法でしか増殖することができないように操作されているにもかかわらず、その適用を制限する、トランスフェクトされた細胞に対する著しい細胞傷害性を依然として示す。
【０００４】
例えば、向神経性ウイルス、具体的には、Ｇ−欠損狂犬病（ΔＧ−Ｒａｂｉｅｓ）（１２、１３）は、回路に沿ってニューロンからニューロンへ伝播することにより、形態的に規定されたニューロンに遺伝子を到達させる有望なツールを提供する（１３〜１６）。
【０００５】
しかし、ΔＧ−Ｒａｂｉｅｓをベースとした手法が神経細胞の回路解剖学的研究に大きな変化をもたらしているにもかかわらず、狂犬病感染からの時間が５〜１５日後を超えると、ウイルスが誘導する細胞傷害性により、それらを使用したインビボでのネットワーク動態の追跡、または神経ネットワークの機能的特性の操作を妨げる（１７〜１９）。ウイルス細胞傷害性を排除する考えられる解決策の１つは、一次感染後のウイルスの転写を抑制することである。これは、ＣＲＥ−リコンビナーゼ依存的な方法でウイルスゲノムカセットを反転させることによって伝統的に達成されており、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのＤＮＡベースのウイルスを用いてゲノムカセットを反転させることでウイルスをオンまたはオフに効果的に切り換えるものである（２０）。そのような手法は、狂犬病ウイルスなどのＲＮＡベースのウイルスについては、信頼性の高いＲＮＡリコンビナーゼが存在しないという理由で、現在は除外されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、細胞傷害性の問題に対処する改良されたモノネガウイルスベクターが依然として必要とされている。
発明者らは、モノネガウイルス目のウイルスの転写と複製の一連の性質を考慮すると、ウイルスタンパク質安定性の条件的調節が、特定の条件が満たされるとウイルスをオンまたはオフにする、感染細胞内におけるウイルスの転写・複製サイクルのスイッチとして作用するのではないかと仮定した。
【０００７】
したがって、発明者らは、標的細胞をトランスフェクトすることができ（したがって遺伝子ペイロードを標的細胞へ送達することができ）、ウイルスタンパク質発現が可能な活性状態とウイルスタンパク質発現が抑制される不活性状態との切換えが可能であるウイルスベクターを設計した。不活性状態が持続すると、典型的には、ベクターは宿主細胞から排除されることとなる。
【０００８】
具体的には、ベクターは、ベクターゲノムの複製のために必要なモノネガウイルスタンパク質を含み、２種類の構成をとりうる「複製モジュレータータンパク質」をコードする。
【０００９】
複製モジュレータータンパク質の一部を形成するモノネガウイルスタンパク質は、ここでは「ウイルスタンパク質部分」と呼ばれる。
「標的化されている」構成と呼ばれる１つめの構成では、複製モジュレータータンパク質は、標的細胞において分解の標的とされる。したがって、「標的化されている」構成は、不安定である。複製モジュレータータンパク質が、この構成を維持している間、ベクターゲノムからの発現および／またはベクターゲノムの複製は、抑制され、または完全に抑圧される。
【００１０】
「標的化されていない」構成と呼ばれるモジュレータータンパク質の２つめの構成は、「標的化されている」構成より安定している。その結果、典型的には、ウイルスタンパク質部分は、標的化されている構成より高いレベルまで宿主細胞の細胞質ゾル中に蓄積するため、より高いレベルのベクターからの発現および／またはベクターゲノムの複製を支える。
【００１１】
本文脈における「安定性」への言及は、標的細胞における当該のタンパク質の半減期、および標的細胞のタンパク質分解経路によって分解されるそれらの傾向にのみ関する。標的化されている構成は、標的化されていない構成より半減期が短く、したがって、標的化されていない構成より安定性が低いと考えられる。
【００１２】
したがって、複製モジュレータータンパク質は、厳密に制御されたベクターからの発現ゲノムおよび／またはベクターゲノムの複製を可能にするスイッチを提供する。
典型的には、モジュレータータンパク質の「標的化されている」構成は、分解標的化シグナルまたは「デグロン」、すなわち、細胞内において分解を受けるタンパク質に印付けをする部分を提示する。「デグロン」および「分解標的化シグナル」という用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００１３】
モジュレータータンパク質の「標的化されていない」構成は、標的化されている構成の低い安定性に寄与するデグロンを含まないまたは提示しないという点において、標的化されている構成と異なる。結果として、標的化されていない構成は、典型的には、標的化されている構成より細胞内における半減期が長い。
【００１４】
本発明の関連において使用可能なデグロンは、下記にてさらに詳しく論じる。
複製モジュレータータンパク質のデフォルト状態は、標的化されている構成であってもよい。すなわち、標的化されている構成は、複製モジュレータータンパク質が、標的化されている構成で合成されるようにベクターゲノムによってコードされていてもよい。ベクター発現および／または複製を活性化するのに十分な機能的なタンパク質の産生を支えることから「活性化剤」または「安定化剤」と呼ばれ得る薬剤との接触によって、標的化されていない構成の適応は刺激される。その結果、標的化されていない構成は、細胞内でのベクターの残存または生存を継続させることができる。
【００１５】
デフォルト状態として標的化されている構成を有する複製モジュレータータンパク質は、そのようなモジュレータータンパク質をコードするベクターからの発現（またはそのようなベクターの複製）は、コグネート活性化剤が存在する場合を除いて抑制される傾向があるため、「抑制」複製モジュレータータンパク質と呼んでもよい。したがって、「抑制」モジュレータータンパク質は、構成的に不安定である。
【００１６】
デフォルトの標的化されている構成を有する複製モジュレータータンパク質をコードするベクターが最初に標的細胞に感染した時点では、タンパク質合成の開始レベルは、感染性子孫ビリオンの複製の期間および潜在的な産生を維持するのに十分である可能性がある（これは、ベクターのペイロード、および標的細胞によってトランスに供給されたその他のタンパク質に依存する）。その後、複製モジュレータータンパク質の不安定性によって、活性化剤の非存在下では複製は抑制され、または完全に抑圧される。
【００１７】
あるいは、複製モジュレータータンパク質のデフォルト状態は、標的化されていない構成であってもよい。すなわち、複製モジュレータータンパク質が、標的化されていない構成において合成されるように、複製モジュレーターの、標的化されていない構成はベクターゲノムによってコードされていてもよい。その存在がベクターからの発現および／またはベクターゲノムの複製が抑制または抑圧する傾向があるため「抑制剤」または「不安定化剤」と呼ばれ得る薬剤との接触によって、標的化されている構成の適応は刺激される。
【００１８】
デフォルト状態として標的化されていない構成を有する複製モジュレータータンパク質は、コグネート抑制剤が存在する場合を除いてそのようなモジュレータータンパク質を含むベクターからの発現は続行する傾向となるため、「抑制可能」複製モジュレータータンパク質と呼んでもよい。
【００１９】
多くの態様において、複製モジュレータータンパク質は、ウイルスタンパク質部分およびレギュレーター部分を含む。ウイルスタンパク質部分およびレギュレーター部分は、モジュレータータンパク質の、別個に折りたたまれたドメインを形成することもあるが、これは常に必要なわけではない可能性がある。ウイルスタンパク質部分は、典型的には、当該のウイルスタンパク質の天然型の生物学的機能をすべて発揮することができる。
【００２０】
レギュレーター部分（存在する場合）の性質および正体は、モジュレータータンパク質が抑制モジュレータータンパク質である（すなわち、ベクター発現または複製がコグネート活性化剤の非存在下で抑制される）か、抑制可能モジュレータータンパク質である（すなわち、ベクター発現または複製がコグネート抑制剤の非存在下で正常に続行する）かを決定する。
【００２１】
抑制モジュレータータンパク質の場合、レギュレーター部分はデグロンを含み、またはデグロンからなり、モジュレータータンパク質のデフォルト状態では、このタンパク質が分解の標的とされるようにデグロンが提示される。したがって、コグネート活性化剤は、デグロンを除去し、遮断し、または例えば共有結合的もしくは非共有結合的修飾などの別の方法によって無効化するように作用することとなる。例えば、コグネート活性化剤は、ウイルスタンパク質部分からレギュレーター部分を切断してもよい。したがって、活性化剤は、モジュレータータンパク質に対して作用してレギュレーター部分をウイルスタンパク質部分から切断することができるプロテアーゼであってもよい。この機構は、複製モジュレータータンパク質の（またはウイルスタンパク質部分の）「切断誘導型安定化」と記述され得る。あるいは、活性化剤は、モジュレータータンパク質、例えばレギュレーター部分に結合してデグロンを遮蔽しても、別の方法によって不活性化してもよい。したがって、活性化剤は、モジュレータータンパク質のための、例えばモジュレータータンパク質のレギュレーター部分のためのリガンドであってもよい。この機構は、複製モジュレータータンパク質の（またはウイルスタンパク質部分の）「リガンド誘導型安定化」と記述され得る。
【００２２】
抑制可能モジュレータータンパク質の場合、レギュレーター部分は、そのデフォルト状態でデグロンを含まず、または提示しない。むしろ、コグネート抑制剤は、モジュレータータンパク質と相互作用して、典型的には、レギュレーター部分との共有結合的または非共有結合的相互作用によって、デグロンを創出し、または露わにすることとなる。したがって、ウイルスタンパク質部分においてデグロンを露わにし、または創出するために、コグネート抑制剤は、レギュレーター部分をウイルスタンパク質部分から切断してもよい。この機構は、複製モジュレータータンパク質の「切断誘導型不安定化」（または「切断誘導型分解」）と記述され得る。あるいは、抑制剤は、デグロンを露わにし、または創出するために、複製モジュレータータンパク質、例えばレギュレーター部分に結合してもよい。したがって、抑制剤は、モジュレータータンパク質のための、例えばモジュレータータンパク質のレギュレーター部分のためのリガンドであってもよい。この機構は、複製モジュレータータンパク質の「リガンド誘導型不安定化」（または「リガンド誘導型分解」）と記述され得る。したがって、レギュレーター部分および抑制剤は、それぞれ、誘導性デグロンシステムの第１および第２の成分であってもよく、第１および第２の成分は結合してデグロンを生成する。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
したがって、本発明は、複製モジュレータータンパク質をコードする遺伝子を含むモノネガウイルスベクターゲノムであって、複製モジュレータータンパク質が、ウイルスゲノムの複製のために必要なモノネガウイルスタンパク質部分を含み、複製モジュレータータンパク質が、デグロンを提示する標的化されている構成およびデグロンを提示しない標的化されていない構成をとることができる、モノネガウイルスベクターゲノムを提供する。
【００２４】
ベクターゲノムは、典型的には、マイナス鎖の一本鎖ＲＮＡ分子である。
上述のように、ベクターゲノムによってコードされた複製モジュレータータンパク質は、抑制モジュレーターであってもよい。これは、ウイルスタンパク質部分およびレギュレーター部分を含んでもよく、レギュレーター部分はデグロンを含むまたはデグロンからなる。
【００２５】
複製モジュレータータンパク質は、コグネート活性化剤と接触すると、標的化されていない構成へ切換え可能であり得る。幾つかの態様において、活性化剤は、モジュレータータンパク質からレギュレーター部分を切断してもよい。他の態様において、活性化剤は、モジュレータータンパク質のための、例えばレギュレーター部分のためのリガンドである。リガンドは、例えば、立体的にまたは立体構造の変化を介して、遮蔽または別の方法で不活性化してもよい。
【００２６】
あるいは、ベクターゲノムによってコードされた複製モジュレータータンパク質は、コグネート抑制剤と接触すると、デグロンを提示する標的化されている構成へと切換えが可能な、抑制可能モジュレーターであってもよい。これは、ウイルスタンパク質部分およびレギュレーター部分を含んでもよい。
【００２７】
幾つかの態様において、抑制剤は、モジュレータータンパク質からレギュレーター部分を切断してデグロンを創出し、または露わにすることができる。他の態様において、抑制剤は、レギュレーター部分のためのリガンドであり、レギュレーター部分へ結合してデグロンを創出し、または露わにする。
【００２８】
したがって、活性化剤または抑制剤は、それぞれ、適宜、デグロンを除去するまたは露わにするためにウイルスタンパク質部分からレギュレーター部分を切断することによって作用してもよい。そのような態様において、活性化剤または抑制剤は、典型的には、プロテアーゼである。そのような態様において、レギュレーター部分はプロテアーゼの切断部位を含む。
【００２９】
プロテアーゼは、標的細胞に対して直交性であってもよい。すなわち、プロテアーゼは、標的細胞のプロテオームにはみられない切断部位を認識するということであり、すなわち、この切断部位は、標的細胞によってコードされ標的細胞において発現される天然のタンパク質にはみられない。したがって、具体的なプロテアーゼは、標的細胞に応じて様々であり得る。好適なプロテアーゼの例としては、ウイルスのプロテアーゼ、特にモノネガウイルスではないウイルス由来のプロテアーゼ（例えば、タバコＥｔｃｈウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶｐ）およびヒトライノウイルス（ＨＲＶ）３Ｃプロテアーゼ）、第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、およびトロンビンが含まれる。標的細胞が神経細胞である場合、これらのいずれも好適であり得る。
【００３０】
好ましくは、選択されたプロテアーゼは、ベクターゲノムによってコードされたその他のどのタンパク質にも作用しない。例えば、ベクターゲノムによってコードされたタンパク質のうち、複製モジュレーターだけが当該のプロテアーゼによって認識される切断部位を含む。
【００３１】
活性化剤または抑制剤は、それ自体がベクターゲノムによってコードされていてもよい。そのような場合、この薬剤の発現または機能は、典型的にはベクターゲノムを含有する細胞を適切なインデューサーと接触させることによって誘導可能となる。例えば、ベクターは、機能的に不活性な形態で発現される１つまたは複数の薬剤をコードする遺伝子を含んでもよく、機能はインデューサーと接触すると、誘導される。
【００３２】
したがって、薬剤は、機能性形態へと集合するために機能性インデューサーの存在を必要とする２つ以上の別々のタンパク質部分として発現されてもよい。成分薬剤部分はそれぞれ、パートナータンパク質との融合体として発現されてもよく、ここで、パートナータンパク質は、機能性インデューサーと接触すると、集合する。
【００３３】
誘導性薬剤に関する詳細を下記に示す。
任意のモノネガウイルスを、記載したようなベクターのベースとして用いてもよい。非分節型ゲノムを有するモノネガウイルスは特に適切である。多くの適用のために、ウイルスは、哺乳動物細胞に感染し複製できることが望ましい場合がある。例えば、モノネガウイルスは、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスなどのリッサウイルス）またはベジクロウイルス（水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）など）であってもよい。
【００３４】
複製モジュレーターのウイルスタンパク質部分は、モノネガウイルスの大多数に共通のタンパク質のいずれか１つを含む、またはモノネガウイルスの大多数に共通のタンパク質のいずれか１つからなっていてもよい。これらには、ラージタンパク質（Ｌ）、核タンパク質（ＮまたはＮＰ）、リンタンパク質（Ｐ）、マトリックスタンパク質（Ｍ）、または糖タンパク質（Ｇ；単に「エンベロープ」タンパク質とも呼ばれる）が含まれる。この専門用語は、一般的にラブドウイルスについて使用され、本明細書では、その他のモノネガウイルスにおける機能または配列相同性によるそれらの等価物を指すためにも使用される。ただし、ウイルス複製の間中適切な制御を行う適切なウイルスタンパク質部分を同定することが必要である。
【００３５】
複製モジュレータータンパク質のウイルスタンパク質部分は、ウイルスゲノムからの発現のために（例えば、ウイルスゲノムからのｍＲＮＡの転写のために）、かつ／またはウイルスゲノムの複製のために必要なタンパク質である。したがって、ほとんどのモノネガウイルスでは、エンベロープタンパク質の非存在下で他のウイルスタンパク質およびゲノムの複製が進むため、ウイルスタンパク質部分は、典型的には、ウイルスエンベロープタンパク質（例えば、糖タンパク質またはＧタンパク質）ではない。
【００３６】
したがって、ラージタンパク質（Ｌ）、核タンパク質（ＮまたはＮＰ）、リンタンパク質（Ｐ）、またはマトリックスタンパク質（Ｍ）、例えば、ラージタンパク質（Ｌ）、核タンパク質（ＮまたはＮＰ）、またはリンタンパク質（Ｐ）が好ましい場合がある。
【００３７】
特に狂犬病ウイルスベクターなどのラブドウイルスベクターにおいて、核タンパク質（ＮまたはＮＰタンパク質）が特に好ましい場合がある。実際に、本発明者らは、Ｎタンパク質だけが、狂犬病ウイルスベースのベクターにおけるウイルス複製全般に、適切な制御を行うことを明らかにしている。
【００３８】
どんなモノネガウイルスタンパク質も複製モジュレータータンパク質のウイルスタンパク質部分を表し、ベクターゲノム中では、複製モジュレータータンパク質は該モノネガウイルスタンパク質の唯一のコピーであることが理解されるであろう。言い換えると、ベクターゲノムは、同じタンパク質の、標的化されていない構成だけに存在するバージョンをコードする遺伝子を含有しない。
【００３９】
したがって、ベクターゲノムは、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、およびＬタンパク質のうちの１つ、２つ、３つ、または４つすべてをコードする遺伝子を含んでもよく、これらのタンパク質のうちの１つが複製モジュレータータンパク質のウイルスタンパク質部分として提供される。
【００４０】
ベクターゲノムは、ウイルスタンパク質部分としてＮタンパク質を含む複製モジュレータータンパク質をコードする遺伝子を含んでもよく、所望により、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、およびＬタンパク質のうちの１つ、２つ、または３つをさらに含んでもよい。
【００４１】
ベクターゲノムは、
（ｉ）ウイルスタンパク質部分としてＮタンパク質を含む複製モジュレータータンパク質、
（ｉｉ）Ｐタンパク質、
（ｉｉｉ）Ｍタンパク質、および
（ｉｖ）Ｌタンパク質
をコードする遺伝子を含んでもよい。
【００４２】
ベクターゲノムはまた、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含んでもよい。エンベロープタンパク質は、モノネガウイルスベクターに天然に存在するものであってもよい。例えば、ベクターが狂犬病ウイルスである場合、エンベロープタンパク質は狂犬病ウイルスＧタンパク質であってもよい。あるいは、ベクターによって産生させたビリオンの感染力を調節するために、異なるエンベロープタンパク質を組み入れてもよい。代替のエンベロープタンパク質の組込みは、「シュードタイピング」と呼ばれることもある。そのような場合、エンベロープタンパク質は細胞内ドメインを含んでいてもよく、さらに所望により、ベクターに天然に存在するエンベロープタンパク質の膜貫通型ドメイン、および異種の、すなわち、細胞内ドメインと同じモノネガウイルスエンベロープタンパク質由来ではない、細胞外ドメインも含んでもよい。細胞外ドメインは、異なるウイルスエンベロープタンパク質由来（例えば、異なるモノネガウイルス種、科、もしくは属由来のエンベロープタンパク質由来、または異なるウイルス目由来のエンベロープタンパク質由来）であってもよく、またはエンベロープタンパク質がビリオンによる標的細胞の感染を依然として媒介することができる限りは、標的細胞の表面上に発現される受容体に結合することができるどんなタンパク質ドメインであってもよい。
【００４３】
例えば、狂犬病ウイルスベクターは、ＶＳＶエンベロープタンパク質、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）タイプＡエンベロープタンパク質、またはＡＳＬＶタイプＢエンベロープタンパク質由来の細胞外ドメインを少なくとも有するエンベロープタンパク質を含んでもよい。狂犬病ウイルスベクターは、ＶＳＶ、ＡＳＬＶタイプＡ、またはＡＳＬＶタイプＢ由来の完全なエンベロープタンパク質を含んでもよい。あるいは、狂犬病ウイルスベクターは、細胞内ドメイン、さらに所望により狂犬病ウイルスＧタンパク質由来の膜貫通型ドメインもまた含んでもよい。
【００４４】
幾つかの態様において、ベクターゲノムは、エンベロープタンパク質をコードしていない。そのようなビリオンは、特に、神経細胞における、いわゆる「単シナプストレーシング」のために有用である。
【００４５】
任意のシュードタイプ化エンベロープタンパク質に加えて、ベクターゲノムは、１つまたは複数の異種遺伝子、すなわち、ベクターゲノムに天然に存在しない発現産物（典型的には、タンパク質またはＲＮＡ分子）、すなわち、ベクターと同じウイルスタイプの野生型ウイルスによってコードされて存在することがない発現産物をコードする遺伝子を含んでもよい。異種遺伝子は、ベクターによって標的細胞に送達される「ペイロード」とみなされてもよい。したがって、異種遺伝子は、標的細胞において発現することが望まれる任意の発現産物（ＲＮＡまたはタンパク質）をコードしてもよい。したがって、異種遺伝子の正体および機能は、ベクターの意図された役割に依存することとなる。多くの態様において、異種遺伝子は、モノネガウイルス発現産物またはウイルス発現産物をコードしない。
【００４６】
異種遺伝子は、ベクターゲノム内の任意の好適な部位に位置してもよい。幾つかの態様において、異種遺伝子は、例えば、内因性Ｇタンパク質をコードする遺伝子を置換して、Ｍタンパク質をコードする遺伝子とＬタンパク質をコードする遺伝子との間に位置する。
【００４７】
異種遺伝子は、例えば、以下のうちの１つまたは複数をコードしていてもよい。
−  マーカータンパク質、例えば、蛍光タンパク質または抗生物質耐性を付与するタンパク質、
−  免疫応答を引き起こす対象とすることが望ましいタンパク質、
−  リコンビナーゼ、例えばＣＲＥリコンビナーゼ、例えば、標的細胞のゲノムがリコンビナーゼの認識部位を含有する場合、
−  ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９などのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ；
−  ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子、例えばＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼとともに使用する、
−  修復鋳型ＲＮＡ、例えばＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼとともに使用する、
−  遺伝子発現の核酸モジュレーター、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡ、またはリボザイムなど。
【００４８】
異種遺伝子は、転写イニシエーターおよびターミネーターシグナルなどのウイルスの転写制御配列の調節下にあることとなる。
２つ以上の異種遺伝子が含まれる場合、異種遺伝子は、典型的には、各々独自の関連した制御配列を有することとなる。異種遺伝子発現は、異種遺伝子によって用いられる転写開始部位、およびウイルスゲノムですぐ上流に位置する遺伝子の末端からの距離、すなわち、すぐ上流の遺伝子の末端と異種遺伝子の開始との間の遺伝子間領域（ＩＧＲ）の長さなどの因子による影響を受ける可能性がある。Ｎタンパク質は、狂犬病ウイルスの中で転写のレベルが最も高いため、異種遺伝子はＮタンパク質由来の転写開始部位を使うことが望ましい可能性がある。転写開始部位は、例えば、配列ＡＡＣＡＣＣＣＣＴ（例えば、株Ｂ１９およびＮ２Ｃでみられるように）またはＡＡＣＡＣＣＴＣＴを有してもよい。Ｆｉｎｋｅら（２０００年）は、遺伝子の上流のＩＧＲの長さがその発現に影響を与えること、また、ＩＧＲ配列の短縮が発現の上昇と相関することを実証している。したがって、異種遺伝子の上流のＩＧＲ配列は、５ヌクレオチド以下の長さ、例えば、２ヌクレオチドの長さであることが望ましい場合がある。ＩＧＲが２ヌクレオチドの長さである場合、その配列はＣＴであってもよい。
【００４９】
特に、異種遺伝子が相補的な機能を有する場合、２つ以上の異種遺伝子を含むことが望ましい場合がある。例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする異種遺伝子、該エンドヌクレアーゼのためのガイドＲＮＡ（エンドヌクレアーゼを標的細胞染色体の所望の部位へと導く）、さらに所望により、標的部位で成される特定の修飾を導く修復鋳型ＲＮＡも含むことが望ましい場合もある。異種遺伝子は、ウイルスゲノムにおいて互いに隣接していてもよい。異種遺伝子間のＩＧＲ配列は、例えば５ヌクレオチド以下の長さ、例えば２ヌクレオチドの長さであってもよい。各異種遺伝子が、Ｎタンパク質由来のＮタンパク質転写開始部位を使用することが望ましい場合もある。
【００５０】
エンドヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ｓａＣａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐＣａｓ９）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（ＮＭ  Ｃａｓ９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＳＴ  Ｃａｓ９）、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（ＴＤ  Ｃａｓ９）、またはＳｐＣａｓ９のＤ１１３５Ｅ、ＶＲＥＲ、ＥＱＲ、もしくはＶＱＲ変異体などそれらの変異体由来のＣａｓ９などの、Ｃａｓ９酵素であってもよい。比較的サイズが小さいことから、ｓａＣａｓ９およびその変異体が好ましい場合もある。
【００５１】
Ｃａｓ９という用語は、ここでは、Ｃａｓ９ニッカーゼおよびヌクレアーゼ・デッド型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）などのＣａｓ９エンドヌクレアーゼの機能性変異体を含んで使用される。
【００５２】
ベクターに組み込むことができる異種遺伝子のサイズは、ベクターのベースとなる具体的なウイルス、ビリオンのパッケージング能力、および（あれば）ベクターから削除された天然のウイルス遺伝子のサイズなど、様々な因子に依存することとなる。
【００５３】
例えば、Ｇ遺伝子が削除されている狂犬病ウイルスベクター中に、パッケージング効率に実質的な影響を与えることのない異種コード配列を、少なくとも３．７ｋｂ、さらに４．０ｋｂまで、４．５ｋｂまで、または５．０ｋｂまでも含むことが可能である。参考文献３２を参照されたい。
【００５４】
異種遺伝子はまた、標的細胞に対しても異種であってもよく、すなわち、標的細胞はその遺伝子の産物を自然ではコードせず、または発現しない。あるいは、標的細胞における遺伝子産物の発現パターンが異種遺伝子の導入によって調節されるような異なる調節制御下では、標的細胞はその遺伝子産物をコードすることができ、または発現することができる。
【００５５】
本発明は、１つまたは複数のウイルスタンパク質、例えば、Ｎ、Ｐ、およびＬタンパク質のうちの１つまたは複数を伴ったベクターゲノムを含む、リボ核タンパク質複合体をさらに提供する。ベクターゲノムは、Ｎ、Ｐ、およびＬタンパク質のすべてを伴ってもよい。リボ核タンパク質複合体は、標的細胞の細胞質へ導入して転写を開始できる機能性ウイルスヌクレオカプシドであってもよい。リボ核タンパク質複合体はＭタンパク質をさらに含んでもよい。
【００５６】
本発明は、本明細書に記載したようなモノネガウイルスベクターゲノムを含む、モノネガウイルスベクタービリオンをさらに提供する。ビリオンは、典型的には、Ｌタンパク質、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、およびＭタンパク質を含み、さらにエンベロープタンパク質も含む。エンベロープタンパク質は、天然のモノネガウイルスエンベロープタンパク質であってもよい。あるいは、ビリオンは、その感染力を調節するために、上述の異なるエンベロープタンパク質でシュードタイプ化されていてもよい。
【００５７】
ビリオンは、典型的には、エンベロープタンパク質を含有する膜エンベロープによって囲まれた（ゲノム、Ｌ、Ｎ、Ｍ、およびＰタンパク質を含む）リボ核タンパク質複合体の形態をとる。
【００５８】
ビリオンは、ゲノムを標的細胞へ送達することができ、ゲノムの転写を開始することができる。
疑義を避けるために明記すれば、ビリオンは、典型的には、複製モジュレータータンパク質を含有しない。すなわち、ビリオン中のタンパク質は、標的化されている構成と標的化されていない構成との間の切換えはできない。
【００５９】
本発明は、本明細書に記載したようなウイルスベクターゲノムをコードする、プラス鎖核酸分子をさらに提供する。プラス鎖核酸は、ＲＮＡ分子であってもＤＮＡ分子であってもよい。プラス鎖核酸は、ＤＮＡ分子である場合、ウイルスゲノム分子の合成を導くことができる転写制御配列を含む発現構築物の一部として提供されてもよい。発現構築物は、エピソーム（例えばプラスミド）の一部として提供されてもよく、または宿主細胞の染色体の中へ組み込まれていてもよい。
【００６０】
本発明は、ベクターゲノムをコードする核酸構築物を含み、本明細書に記載されたようなビリオンを産生できる、パッケージング細胞をさらに提供する。
したがって、パッケージング細胞は、Ｌ、Ｎ、Ｍ、およびＰタンパク質、ならびにエンベロープタンパク質を発現する。これらのタンパク質は、ベクターゲノムも含む感染性ビリオンを形成することができる。
【００６１】
ベクターゲノム自体の構造およびコードする内容に応じて、これらのタンパク質はベクターゲノムによってコードされてもよく、または細胞内の他の核酸構築物によってトランスに供給されてもよい。
【００６２】
ビリオン粒子自体のタンパク質は、典型的には、デグロンに連結してない。典型的には、パッケージング細胞は、デグロンを有せず、すべてのビリオンタンパク質の機能型をコードする（かつ発現することができる）ことになる。しかし、ビリオンタンパク質のうちの１つがここで記載したような抑制複製モジュレーターの関連においてのみ発現されるのであれば、次いで、パッケージング細胞は、ウイルス複製が続行できるようにコグネート活性化剤もまた含有（例えば発現）しなければならない。
【００６３】
トランスに供給される任意のタンパク質をコードする構築物は、典型的には、ＤＮＡ構築物であり、独立して染色体に組み込まれていても、プラスミドなどのエピソームとして存在していてもよい。
【００６４】
パッケージング細胞の性質は、具体的なウイルスベクターに依存するものであるが、霊長類またはげっ歯類の細胞などの哺乳動物細胞であってもよい。それは、線維芽細胞、またはＨＥＫ（ヒト胎児腎臓）２９３細胞もしくはＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞などのその他の好適な細胞タイプであってもよい。
【００６５】
狂犬病ウイルスベクターのためのパッケージング細胞の構築、およびウイルスベクター設計のその他の側面は、ＯｓａｋａｄａおよびＣａｌｌａｗａｙ（２０１３年）のＤｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ８（８）：１５８３〜１６０１頁に記載されている。Ｗｉｃｋｅｒｓｈａｍら（２０１０年）のＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｌｅｔｅｄ  ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｏｒ  ｍｏｎｏｓｙｎａｐｔｉｃ  ｔｒａｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｎｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ５（３）：５９５〜６０６頁もまた参照されたい。
【００６６】
本発明は、標的細胞を本発明のリボ核タンパク質複合体またはビリオンと接触させることを含む、標的細胞への遺伝子送達の方法をさらに提供する。
リボ核タンパク質複合体が用いられる場合、例えば、マイクロインジェクションによって、または細胞中への移行を促進するポリマーもしくは脂質などの担体とともに、リボ核タンパク質複合体を細胞細胞質ゾル中へ直接送達することが望ましい場合がある。
【００６７】
多くの態様において、標的細胞は、モジュレータータンパク質の、標的化されている構成と標的化されていない構成との間の切換えに寄与する薬剤を自然には発現しない。ベクターが抑制可能レプリケータータンパク質をコードする場合、最初の一次感染の後、ベクターの複製および増殖を継続するためには、活性化剤が必要である。したがって、さらなる複製および増殖が望ましい場合、ベクターは、大抵は活性化剤の送達システムまたは活性化剤自体と一緒に用いられることとなる。
【００６８】
ベクターが、抑制可能モジュレータータンパク質をコードする場合、抑制剤を供給することは必ずしも必要ではない。しかし、ベクターを抑制剤の送達システムまたは抑制剤自体と一緒に用いてもよい場合は、ベクター発現および複製を直ちに続行すべきでないことが望ましいこともある。
【００６９】
したがって、方法は、適宜、標的細胞をコグネート活性化剤または抑制剤と接触させるステップを含んでもよい。標的細胞は、無期限で、周期的に、例えば１日〜１カ月の間隔で、例えば１日〜１４日の間隔で、例えば５〜１０日の間隔で繰り返し、コグネート活性化剤と接触させてもよい。そのような周期的投与は、細胞に損傷を与えるのに十分な転写およびウイルス複製を許すことなく、標的細胞内で生存可能なベクターを維持するのに有用であり得る。
【００７０】
薬剤がタンパク質である場合、方法は、コグネート活性化剤または抑制剤が標的細胞において発現されるように、該薬剤をコードする遺伝子を含む核酸を標的細胞へ導入することをさらに含んでもよい。
【００７１】
薬剤は、ベクターの前に、ベクターと実質的に同時に、またはベクターの後に、標的細胞中へ導入されてもよい。薬剤は、ベクターの後に導入される場合、典型的には、ベクターの１カ月以内に、例えば、２週間以内に、１週間以内に、１日以内に、１２時間以内に、または１時間以内に導入されることとなる。無期限で、周期的に、例えば１日〜１カ月の間隔で、例えば１日〜１４日の間隔で、例えば５〜１０日の間隔で、繰り返して導入されてもよい。
【００７２】
薬剤の発現は、誘導性であってもよい。例えば、薬剤をコードする遺伝子は、薬剤の転写には細胞を転写インデューサーと接触させることが必要であるように誘導性プロモーターを含んでもよい。インデューサーは、例えば、ドキシサイクリンまたはテトラサイクリンなどの抗生物質であってもよい。そのような抗生物質に対して反応性である誘導性プロモーターは、当業者に公知である。
【００７３】
あるいは、薬剤は、機能を回復させるために細胞を機能性インデューサーと接触させることが必要である、機能的に不活性な形態で発現されてもよい。例えば、薬剤は、機能性形態へと集合するために機能性インデューサーの存在を必要とする２つ以上の別々のタンパク質部分として発現されてもよい。各々の成分薬剤部分は、パートナータンパク質との融合体として発現されてもよく、パートナータンパク質は、機能性インデューサーと接触すると、集合する。例えば、ＴＥＶプロテアーゼ（ＴＥＶｐ）は、それぞれ、ラパマイシンの存在下のみで集合する異種のタンパク質部分に融合した２つの別々のサブユニット（ＦＲＢおよびＦＫＢＰ）として発現され得る（いわゆる「ＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ」システム）（Ｇｒａｙら（２０１０年）Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  Ｃａｓｐａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ、Ｃｅｌｌ  １４２（４）：６３７〜６４６頁を参照されたい．）。融合パートナーのこの他の組合せもまた使用されてもよく、集合のための必要条件は様々である。
【００７４】
幾つかの態様において、薬剤は、ベクターゲノム自身によってまたは標的細胞のゲノム中にコードされていてもよい。したがって、ベクターゲノムと標的細胞のどちらかが、１つまたは複数の活性化剤または抑制剤をコードする遺伝子を含んでいてもよく、薬剤の発現または機能は、誘導性である。そのような環境では、方法は、標的細胞を活性化剤または抑制剤と接触させることは必要ではなく、単に標的細胞を（発現または機能の）インデューサーと接触させることを必要とする。
【００７５】
したがって、方法は、典型的には、標的細胞をインデューサーと接触させることによって、標的細胞中での薬剤の発現および／または機能を誘導するステップを含んでもよい。
標的細胞は、無期限で、周期的に、例えば１日〜１カ月の間隔で、例えば１日〜１４日の間隔で、例えば５〜１０日の間隔で繰り返して、インデューサーと接触させてもよい。
【００７６】
幾つかの態様において、ベクターゲノムは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含んでいない。したがって、方法は、エンベロープタンパク質が標的細胞中で発現され原形質膜に組み込まれるように、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含む核酸構築物を標的細胞へ導入するステップを（追加的にまたは代替的に）含んでもよい。エンベロープタンパク質は、ベクターの前に、ベクターと実質的に同時に、またはベクターの後に、標的細胞中へ導入されてもよい。エンベロープタンパク質は、ベクターの後に導入される場合、典型的には、ベクターの１カ月以内に、例えば、１４日以内に、７日以内に、１日以内に、１２時間以内に、または１時間以内に導入されることとなる。
【００７７】
エンベロープタンパク質の発現は、誘導性であってもよい。例えば、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子は、エンベロープタンパク質の転写には細胞を転写インデューサーと接触させることが必要であるように誘導性プロモーターを含んでもよい。
【００７８】
抑制もしくは活性化剤および／またはエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含有する核酸は、任意の適切な手段によって標的細胞に送達されてもよい。例えば、各核酸は、裸の核酸としてＤＮＡもしくはＲＮＡとして、ポリマーもしくは脂質などの担体とともに（例えば、担体との複合体として）、封入された形態で（例えばリポソーム中に封入されて）、またはウイルスベクターを介して、独立して導入されてもよい。好適なウイルスベクターには、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが含まれる。ＡＡＶベクターは特に好適であり得る。
【００７９】
薬剤およびエンベロープタンパク質をコードする遺伝子は、別々にまたは一緒に、例えば同じ核酸構築物の一部として、送達されてもよい。
抑制モジュレータータンパク質を有するウイルスベクターは、免疫賦活剤として、例えば、同じウイルスの天然型に対するワクチンとして特定の用途を提供してもよい。ベクターを受容体へ送達することによって、ウイルスは、活性化剤もまた投与された細胞中でのみ複製することになる。そのような感染細胞から、子孫ビリオンが形成され、放出され得る。しかし、ウイルスは、活性化剤を投与されてない細胞中ではさらに複製することはできなくなる。したがって、特定の選択された細胞へのベクターおよび活性化剤の同時投与は、ウイルスの複製と放出とのサイクルを短く調節し、免疫系を刺激し、免疫系にウイルスを認識する準備をさせる可能性がある。
【００８０】
ウイルスベクターは、レシピエントへのあらゆるリスクを低減するために、別の方法で弱毒化されてもよい。したがって、ウイルスベクターは、感染力または毒性を低減または排除する１つまたは複数のさらなる変異を含んでもよい。
【００８１】
子孫ビリオンの放出は、天然のウイルスに対する抗体反応をシミュレーションするのに有用であり得る。
子孫ビリオンを産生し、放出するためには、ウイルスベクターがエンベロープタンパク質をコードしなければならないか、ベクターがエンベロープタンパク質を欠いていれば、エンベロープタンパク質は感染細胞にトランスに個々に供給されなければならない。エンベロープタンパク質を欠くベクターの使用は、有用な安全性指標であり得る。
【００８２】
ベクターがエンベロープタンパク質を欠き、エンベロープタンパク質がトランスに供給されていなくても、活性化剤の存在下で、レシピエント細胞のＭＨＣ分子（特にＭＨＣ  Ｉ）を介してウイルス抗原が提示され、その結果、ウイルスに対するＴ細胞応答（特にＣＴＬ応答）が刺激されるのに十分に、タンパク質が発現される可能性がある。
【００８３】
それにもかかわらず、多くの環境において、エンベロープタンパク質をコードするベクターの使用が依然として望ましい場合がある。
本発明のベクターは、特に狂犬病ウイルスまたは水疱性口内炎ウイルスベースである場合、神経細胞への遺伝子送達における特定の用途を提供する。Ｇ欠損狂犬病ウイルスの使用は、中枢および末梢神経系の両方の単シナプス回路トレーシングに関してよく知られている。しかし、細胞内にウイルスタンパク質が蓄積するために標識された細胞の生存が典型的には１〜２週間にとどまることから、単シナプス回路トレーシングの現行方法では使用が限定されている。本ベクターは、生存率に影響を与えることなく、神経細胞を遺伝学的に標識する能力を示すものである。
【００８４】
本発明は、本発明のベクターゲノム、ならびに（ａ）コグネート活性化もしくは抑制剤またはコグネート活性化もしくは抑制剤をコードする核酸、および／または（ｂ）エンベロープタンパク質をコードする核酸、を含むキットをさらに提供する。
【００８５】
キットは、他の箇所で記載したようなベクターなどの、核酸の送達のためのシステムを含んでもよい。同じシステムを用いて、上記のようなコグネート生存因子およびエンベロープタンパク質の両方を送達してもよい。
【００８６】
本発明は、本発明のベクタービリオンを含み、所望により賦形剤または担体を混合した組成物をさらに提供する。組成物は医薬組成物であってもよく、担体は薬学的に許容される担体であってもよい。
【００８７】
モノネガウイルス目は、植物、昆虫、魚、および哺乳動物細胞を含む多様な種類の細胞に感染する。原理的には、モノネガウイルス目は、ゲノム構成が類似のパターンに適合し、類似する一連の転写および複製のシステムに依存しているため、本発明は、あらゆるタイプのモノネガウイルスに適用できると考えられる。ラブドウイルスは特に適切であり得る。
【００８８】
本発明のベクターは、哺乳動物細胞に感染するラブドウイルス属および種、特に、狂犬病ウイルス（Ｒａｂｉｅｓ  ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ；ＲＡＢＶ）などのリッサウイルス、および水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）などのベジクロウイルスにおいて特定の用途を提供してもよい。狂犬病ウイルスは、ニューロンに対する特別な指向性を有するため、神経組織への遺伝子送達のための有益な候補物質となる。
【００８９】
ベクターが狂犬病ウイルスをベースとする場合、ＣＶＳ（曝露用ウイルス標準株）およびＣＶＳ−Ｎ２ｃなどのそれらの変異体、ＰＶ４（パスツールウイルス）、ＰＭ（ピットマン・ムーア）、Ｆｌｕｒｙ−ＬＥＰ（低鶏卵継代数（ｌｏｗ  ｅｇｇ  ｐａｓｓａｇｅ））、Ｆｌｕｒｙ−ＨＥＰ（高鶏卵継代数（ｈｉｇｈ  ｅｇｇ  ｐａｓｓａｇｅ））、ＥＲＡ、ならびにＳＡＤ（ストリート・アラバマダファリン（Ｓｔｒｅｅｔ−Ａｌａｂａｍａ  Ｄｕｆｆｅｒｉｎ））を含む任意の適切な株が使用可能である。ＣＶＳ−Ｎ２ｃ株は、参考文献２５に記載されており、完全なゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＨＭ５３５７９０、バージョンＨＭ５３５７９０．１、２０１０年１２月２９日で得られる。
【００９０】
したがって、標的細胞タイプは、霊長類（例えば、旧世界ザル、新世界ザル、類人猿、またはヒト）、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、イヌ科（例えば、飼い犬）、ネコ科（例えば、飼い猫）、ウマ類（例えば、ウマ）、ウシ類（例えば、雌ウシ）、ヤギ類（例えば、ヤギ）、ヒツジ類（例えば、ヒツジ）またはウサギ目（例えば、ウサギ）由来であってもよい。
【００９１】
標的細胞タイプは、任意の所望の細胞タイプであってもよい。幾つかの例において、それは、神経細胞、例えば、ニューロンまたはグリア細胞であってもよい。神経細胞は、末梢または中枢神経系の一部であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】ウイルスタンパク質を体系的にプロテアソームで標的化した後の、ウイルス増幅効率のスクリーニングを示す図である。（Ａ）ＰＥＳＴドメイン標的化プロテアソームの媒介によるウイルスタンパク質の可逆的不安定化。（Ｂ）ＨＥＫＧＧおよびＨＥＫＴＧＧにおけるＴＥＶＰ依存性ウイルスの増幅。スケールバー：１００μｍ。（Ｃ〜Ｈ）すべての組換えＲａｂｉｅｓ構築物（マゼンタ）および対照Ｒａｂｉｅｓ（シアン）増幅効率の定量化（平均±ＳＤ；破線は閾値レベルを示す）。（Ｉ〜Ｋ）ＨＥＫＴＧＧ（シアン、＋ＴＥＶ）およびＨＥＧＧ（マゼンタ、−ＴＥＶ）における増幅効率の定量化。ｘ軸  トランスフェクション後（ｐ．ｔ．）の日数、ｙ軸  増幅効率。
【図２】インビボでの細胞傷害性がないことを示す図である。（Ａ）ＳｉＲの生活環。（Ｂ）ＳｉＲ発現カセットおよび実験手順。（Ｃ〜Ｅ”）ＳｉＲＣＲＥ−ｍＣｈｅｒｒｙを感染させ、ｐ．ｉ．１−３−８週間にイメージングしたＲｏｓａ−ＬｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ＬｏｘＰ−ＹＦＰマウスの海馬切片の共焦点画像。スケールバー：２５μｍ。（Ｆ）１週間時点に対して正規化した、１−２−３および８週間でのＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ陽性ニューロンの数（平均±ＳＥＭ）。（Ｇ）１週間のＲＮＡレベルに対して正規化した、ウイルスＲＮＡ（マゼンタ）および内因性ＹＦＰ発現（シアン）のレベル（平均±ＳＥＭ）。
【図３】ＳｉＲの経シナプス性および逆行性伝播を示す図である。（Ａ）ＡＡＶ−ＴＶＡｍＣｈｅｒｒｙ−ＧＬＹをＲｏｓａ−ＬｏｘＳＴＯＰＬｏｘ−ＹＦＰマウスのＣＡ１に注入し、２週間後、ＴＶＡ発現ニューロンをＥｎＶＡシュードタイプ化ＳｉＲＣＲＥで特異的に標的化した。ＹＦＰ発現により、（Ａ’）ＹＦＰＯＮ／ｍＣｈｅｒｒｙＯＮ注入部位において起点ニューロン（矢印）が検出され、（Ａ’’〜Ａ’’’）ＣＡ３および外側嗅内皮質（ＬＥＣ）においてニューロンを持続的に標識したＳｉＲウイルスの経シナプス性ジャンプが検出される。スケールバー：２５μｍ。（Ｂ〜Ｂ’’）ＡＡＶ−ＴＶＡｍＣｈｅｒｒｙ−ＧＬＹおよびＳｉＲＣＲＥを感染させたＣＡ１錐体ニューロンのｐ．ｉ．３週間の共焦点画像。スケールバー：１０μｍ。（Ｃ〜Ｃ’’）海馬のＣＡ１へのＳｉＲｍＣｈｅｒｒｙ注入による、ＣＡ３およびＬＥＣからＣＡ１へ投射するニューロンの逆行性トレーシング。（Ｄ）上丘（ＳＣ）の浅葉へのＳｉＲ注入によって感染したＶ１皮質ニューロン。スケールバー：２５μｍ。
【図４】ＳｉＲ感染が神経細胞の生理学に対して長期的な影響を与えないことを示す図である。（Ａ〜Ｂ）感染後（ｐ．ｉ．）１週間およびｐ．ｉ．８週間の、ＣＡ１錐体ニューロンの正および負電流ステップ処理に対する膜電位応答。（Ｃ）入力抵抗。（Ｄ）静止膜電位および活動電位（ＡＰ）閾値。（Ｅ）ＡＰ振幅および幅。（Ｆ）正電流を段階的に上昇させたニューロンにおける、ｐ．ｉ．１週間（ｎ＝１０、マゼンタ）およびｐ．ｉ．８週間（ｎ＝８、シアン）の発火周波数（平均±ＳＥＭ）。（Ｇ）（スパイク発生までの各掃引で１％；０％  明灰色、〜９％  黒色）強度を上昇した０．２ｍｓ青色光パルスに対する、ＳｉＲＣＲＥ−ｍＣｈｅｒｒｙを感染させたＣｈＲ２発現ＣＡ１ニューロンの（ｐ．ｉ．１週間）の膜電位応答。挿入図、各掃引に対するＬＥＤ出力。（Ｈ、Ｉ）同じニューロンから記録された、２０Ｈｚにて８００ｍｓの光パルス（２．１７ｍＷ）および４０回の１．５ｍｓの長い光パルスに対する膜電位応答。（Ｊ）周波数を上げながら４０回光刺激した後の、ｐ．ｉ．１週間（マゼンタ）および８週間（シアン）の活動電位成功率。（Ｋ）ＤＮＱＸ（２０μＭ）によって遮断された非ＣｈＲ２発現ニューロンにおいて記録された光誘発ＥＰＳＰ。両条件のトレースの平均を黒色で示す。＊Ｐ＜０．０５。
【図５】ＳｉＲでトレーシングしたＶ１ニューロンの方向チューニング応答に変化がないことを示す図である。（Ａ）ＳｉＲＣＲＥおよびＡＡＶ−ＧＣａＭＰ６ｓを、それぞれＲｏｓａ−ＬｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ＬｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏマウスのＶ２およびＶ１に注入した概略図。（Ｂ〜Ｂ’’）二光子による、ＳｉＲＣＲＥ注入後のＶ１ニューロンの最大投射。灰色はＧＣａＭＰ６ｓ発現ニューロン（Ｂ）、マゼンタはｔｄＴｏｍａｔｏ発現ニューロン（Ｂ’）、およびマージ色は両者を発現するニューロン（Ｂ’’、マージ）。スケールバー：５０μｍ。（Ｃ）視覚刺激セットアップの概略図。（Ｄ）パネルＢに示した同じ撮像視野から得た、活動中のＲＯＩの略図。（Ｅ）ＧＣａＭＰ６ｓ（シアン）およびＧＣａＭＰ６ｓ−ｔｄＴｏｍａｔｏ（マゼンタ）ニューロンの代表的なＣａ２＋トレーシング。スケールバー：２００秒、２０％ｄＦ／Ｆ０。（Ｆ）ＳｉＲ注入から４週間後の活性ニューロンの割合の平均（ｎ＝１２２  ＧＣａＭＰ６ニューロン（シアン）、ｎ＝５９  ＧＣａＭＰ６ｓおよびＧＣａＭＰ６ｓ−ｔｄＴｏｍａｔｏニューロン（マゼンタ））。（好適な方位の運動格子に対するＧ９各ニューロンの視覚応答を反映している、経時的な蛍光の変化。（Ｈ）Ｖ１感染ニューロンのチューニング曲線の例。スケールバー：５秒、１０％ｄＦ／Ｆ０。
【図６】インビトロおよびインビボでのΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ｍＣｈｅｒｒｙの細胞傷害性試験を示す図である。（Ａ）ｈＥＳＣ由来ニューロンにΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ｍＣｈｅｒｒｙを感染させ、１６日間にわたり長期的にイメージングした。感染後（ｐ．ｉ．）４〜１０および１６日にイメージングした。（Ｂ〜Ｂ”）ΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ｍＣｈｅｒｒｙ感染ｈＥＳＣ由来ニューロン、および（Ｃ〜Ｃ”）Ｂ１９ΔＧ−Ｒａｂｉｅｓ対照感染ｈＥＳＣ由来ニューロン。（Ｄ）４日時点に対して正規化した、ラパマイシンの存在下または非存在下でのＣＴＲΔＧ−ＲａｂｉｅｓまたはΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ｍＣｈｅｒｒｙの投与から４〜１０、および１６日後の感染細胞の割合（平均±ＳＥＭ）。（Ｅ）４日時点に対して正規化した、ΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ｍＣｈｅｒｒｙおよびΔＧ−Ｒａｂｉｅｓ感染ニューロンのｍＣｈｅｒｒｙシグナル強度（平均±ＳＥＭ．、スケールはＤと同じ）。スケールバー：５０μｍ。（Ｆ〜Ｇ”）ｐ．ｉ．１、２、または３週間の、インビボでΔＧ  Ｒａｂｉｅｓ（シアン）またはΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ＣＲＥ（マゼンタ、Ｇ〜Ｇ’）を感染させた海馬の切片。スケールバー：５０μｍ。（Ｈ）７日時点に対して正規化した、海馬におけるΔＧＲａｂｉｅｓ（黒色）またはΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ＣＲＥ（灰色）の、ｐ．ｉ．１、２、または３週間の感染ニューロンの割合（平均±ＳＥＭ）。
【図７】ＨＥＫ細胞における、ラパマイシンで誘導されるＳｐｌｉｔ  ＴＥＶ再構成、およびＰＥＳＴドメインの切断を示す図である。（Ａ）タグ付けしたウイルスタンパク質の薬理学的安定化のための戦略。ラパマイシンは、デグロンドメインを切断するＳｐｌｉｔ  ＴＥＶタンパク質の二量体化を誘導し、ウイルスタンパク質をレスキューする。（Ｂ）ＨＥＫにおけるＳｐｌｉｔ  ＴＥＶのラパマイシン用量反応性。ＴＥＶレポーターのＴＥＶ依存性切断は、ラパマイシンの濃度の漸増（０〜１０〜５０ｎＭ）に伴って増加する。（Ｃ）Ｓｐｌｉｔ  ＴＥＶカセットを、Ｒａｂｉｅｓゲノム中の糖タンパク質座位にクローニングした。Ｓｐｉｔ  ＴＥＶ発現Ｒａｂｉｅｓを感染させ、ＴＥＶレポーターをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔでは、明瞭なラパマイシン依存性ＴＥＶ活性が観察された。
【図８】インビボでの短期間のＳｉＲｍＣｈｅｒｒｙ動態を示す図である。（Ａ）ＳｉＲｍＣｈｅｒｒｙカセット設計。（Ｂ）Ｒｏｓａ−ＬｏｘＳＴＯＰＬｏｘ−ＹＦＰマウスのＣＡ１でのＳｉＲ  ｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＲＥ注入。（Ｃ〜Ｅ”）ＳｉＲｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＲＥを感染させたＣＡ１錐体ニューロンの、ｐ．ｉ．３−６および９日の共焦点画像。スケールバー：２５μｍ。（Ｆ〜Ｆ’’）ｐ．ｉ．３−６および９日の、ＹＦＰＯＮ、ｍＣｈｅｒｒｙＯＮおよびＹＦＰＯＮｍＣｈｅｒｒｙＯＮニューロンの割合。
【図９】ＳｉＲの薬理学的再活性化を示す図である。（Ａ）ドキシサイクリン誘導性ＡＡＶの設計。ｒＴＴＡトランス活性化因子は、ウイルスによって構成的に発現され、ドキシサイクリンの存在下でＴＥＶプロテアーゼ発現を促進する。（Ｂ）Ｒｏｓａ−ＬｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ＬｏｘＰ−ＹＦＰマウスの海馬への、ＡＡＶ−ＴＲＥ−ＴＥＶ注入して１週間後の、同じ領域へのＳｉＲＣＲＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ、およびドキシサイクリン投与の概略図。（Ｃ〜Ｆ）ＳｉＲおよびＡＡＶ−ＴＲＥ−ＴＥＶを感染させドキシサイクリンで再活性化させた、ｐ．ｉ．２または３週間の海馬錐体ニューロン。スケールバー：５０μｍ。（Ｇ）ＹＦＰＯＮ感染ニューロン全体のｍＣｈｅｒｒｙＯＮニューロンの定量化。
【図１０】皮質および海馬における、ΔＧ−Ｒａｂｉｅｓが誘導した細胞死を示す図である。（Ａ〜Ａ’’）ΔＧ−ＲａｂｉｅｓＧＦＰを感染させた皮質ニューロンの、ｐ．ｉ．１、２および３週間の共焦点画像。（Ｂ〜Ｂ’’）ΔＧ−ＲａｂｉｅｓＧＦＰを感染させたＣＡ１錐体ニューロンの、ｐ．ｉ．１、２および３週間の共焦点画像。スケールバー：５０μｍ。（Ｃ）１週間時点に対して正規化した、ｐ．ｉ．１、２または３週間の、皮質（黒色）または海馬（灰色）におけるΔＧ  Ｒａｂｉｅｓの感染ニューロンの割合（平均±ＳＥＭ）（海馬、２週間で９２±３％細胞死、１時点当たりｎ＝３、一元配置分散分析、Ｆ＝１０１、Ｐ＝２．４×１０−５；皮質、３週間で８５±２％細胞死、１時点当たりｎ＝３、一元配置分散分析、Ｆ＝１７、Ｐ＝３．２×１０−３）。
【図１１−１】（Ａ）ＳｉＲ  ＣＲＥ−ｍＣｈｅｒｒｙＰＥＳＴベクターゲノムをコードするプラスミドの地図である。（Ｂ）（Ａ）に示すプラスミドの配列である。Ｔ７プロモーター配列は二重下線で示す。オープンリーディングフレームは一本下線で示し、Ｎ−ＴＥＶ−ＰＥＳＴ、Ｐ、Ｍ、ｉＣＲＥ−２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙＰＥＳ、およびＬタンパク質を順に表している。
【図１１−２】（Ａ）ＳｉＲ  ＣＲＥ−ｍＣｈｅｒｒｙＰＥＳＴベクターゲノムをコードするプラスミドの地図である。（Ｂ）（Ａ）に示すプラスミドの配列である。Ｔ７プロモーター配列は二重下線で示す。オープンリーディングフレームは一本下線で示し、Ｎ−ＴＥＶ−ＰＥＳＴ、Ｐ、Ｍ、ｉＣＲＥ−２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙＰＥＳ、およびＬタンパク質を順に表している。
【図１１−３】（Ａ）ＳｉＲ  ＣＲＥ−ｍＣｈｅｒｒｙＰＥＳＴベクターゲノムをコードするプラスミドの地図である。（Ｂ）（Ａ）に示すプラスミドの配列である。Ｔ７プロモーター配列は二重下線で示す。オープンリーディングフレームは一本下線で示し、Ｎ−ＴＥＶ−ＰＥＳＴ、Ｐ、Ｍ、ｉＣＲＥ−２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙＰＥＳ、およびＬタンパク質を順に表している。
【図１１−４】（Ａ）ＳｉＲ  ＣＲＥ−ｍＣｈｅｒｒｙＰＥＳＴベクターゲノムをコードするプラスミドの地図である。（Ｂ）（Ａ）に示すプラスミドの配列である。Ｔ７プロモーター配列は二重下線で示す。オープンリーディングフレームは一本下線で示し、Ｎ−ＴＥＶ−ＰＥＳＴ、Ｐ、Ｍ、ｉＣＲＥ−２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙＰＥＳ、およびＬタンパク質を順に表している。
【図１１−５】（Ａ）ＳｉＲ  ＣＲＥ−ｍＣｈｅｒｒｙＰＥＳＴベクターゲノムをコードするプラスミドの地図である。（Ｂ）（Ａ）に示すプラスミドの配列である。Ｔ７プロモーター配列は二重下線で示す。オープンリーディングフレームは一本下線で示し、Ｎ−ＴＥＶ−ＰＥＳＴ、Ｐ、Ｍ、ｉＣＲＥ−２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙＰＥＳ、およびＬタンパク質を順に表している。
【図１１−６】（Ａ）ＳｉＲ  ＣＲＥ−ｍＣｈｅｒｒｙＰＥＳＴベクターゲノムをコードするプラスミドの地図である。（Ｂ）（Ａ）に示すプラスミドの配列である。Ｔ７プロモーター配列は二重下線で示す。オープンリーディングフレームは一本下線で示し、Ｎ−ＴＥＶ−ＰＥＳＴ、Ｐ、Ｍ、ｉＣＲＥ−２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙＰＥＳ、およびＬタンパク質を順に表している。
【図１１−７】（Ａ）ＳｉＲ  ＣＲＥ−ｍＣｈｅｒｒｙＰＥＳＴベクターゲノムをコードするプラスミドの地図である。（Ｂ）（Ａ）に示すプラスミドの配列である。Ｔ７プロモーター配列は二重下線で示す。オープンリーディングフレームは一本下線で示し、Ｎ−ＴＥＶ−ＰＥＳＴ、Ｐ、Ｍ、ｉＣＲＥ−２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙＰＥＳ、およびＬタンパク質を順に表している。
【図１２】エンベロープ（Ｇ）タンパク質の遺伝子に代わってマルチクローニングサイトを有するＳｉＲベクターをコードするプラスミドの地図である。
【図１３−１】図１２に例示したプラスミドの全長配列である。骨格プラスミド（すなわち、非ＳｉＲ）配列は陰影付けした大文字で示す。ベクターのオープンリーディングフレームは、Ｎ−ＴＥＶ−ＰＥＳＴタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、Ｌタンパク質の順に（５’から３’へ）下線を引いている。マルチクローニングサイト（ＳｂｆＩ、ＮｈｅＩ、およびＰａｃＩ−ＡｓｃＩ）は、イタリック体の大文字で示す。Ｎ−ＴＥＶ−ＰＥＳＴタンパク質内では、Ｎ配列は小文字の標準書体で、ＴＥＶ切断部位は大文字のイタリック体で、ＰＥＳＴ配列は二重下線を引いた大文字で、リンカーペプチド配列は小文字のイタリック体で示す。
【図１３−２】図１２に例示したプラスミドの全長配列である。骨格プラスミド（すなわち、非ＳｉＲ）配列は陰影付けした大文字で示す。ベクターのオープンリーディングフレームは、Ｎ−ＴＥＶ−ＰＥＳＴタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、Ｌタンパク質の順に（５’から３’へ）下線を引いている。マルチクローニングサイト（ＳｂｆＩ、ＮｈｅＩ、およびＰａｃＩ−ＡｓｃＩ）は、イタリック体の大文字で示す。Ｎ−ＴＥＶ−ＰＥＳＴタンパク質内では、Ｎ配列は小文字の標準書体で、ＴＥＶ切断部位は大文字のイタリック体で、ＰＥＳＴ配列は二重下線を引いた大文字で、リンカーペプチド配列は小文字のイタリック体で示す。
【図１３−３】図１２に例示したプラスミドの全長配列である。骨格プラスミド（すなわち、非ＳｉＲ）配列は陰影付けした大文字で示す。ベクターのオープンリーディングフレームは、Ｎ−ＴＥＶ−ＰＥＳＴタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、Ｌタンパク質の順に（５’から３’へ）下線を引いている。マルチクローニングサイト（ＳｂｆＩ、ＮｈｅＩ、およびＰａｃＩ−ＡｓｃＩ）は、イタリック体の大文字で示す。Ｎ−ＴＥＶ−ＰＥＳＴタンパク質内では、Ｎ配列は小文字の標準書体で、ＴＥＶ切断部位は大文字のイタリック体で、ＰＥＳＴ配列は二重下線を引いた大文字で、リンカーペプチド配列は小文字のイタリック体で示す。
【図１３−４】図１２に例示したプラスミドの全長配列である。骨格プラスミド（すなわち、非ＳｉＲ）配列は陰影付けした大文字で示す。ベクターのオープンリーディングフレームは、Ｎ−ＴＥＶ−ＰＥＳＴタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、Ｌタンパク質の順に（５’から３’へ）下線を引いている。マルチクローニングサイト（ＳｂｆＩ、ＮｈｅＩ、およびＰａｃＩ−ＡｓｃＩ）は、イタリック体の大文字で示す。Ｎ−ＴＥＶ−ＰＥＳＴタンパク質内では、Ｎ配列は小文字の標準書体で、ＴＥＶ切断部位は大文字のイタリック体で、ＰＥＳＴ配列は二重下線を引いた大文字で、リンカーペプチド配列は小文字のイタリック体で示す。
【図１３−５】図１２に例示したプラスミドの全長配列である。骨格プラスミド（すなわち、非ＳｉＲ）配列は陰影付けした大文字で示す。ベクターのオープンリーディングフレームは、Ｎ−ＴＥＶ−ＰＥＳＴタンパク質、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、Ｌタンパク質の順に（５’から３’へ）下線を引いている。マルチクローニングサイト（ＳｂｆＩ、ＮｈｅＩ、およびＰａｃＩ−ＡｓｃＩ）は、イタリック体の大文字で示す。Ｎ−ＴＥＶ−ＰＥＳＴタンパク質内では、Ｎ配列は小文字の標準書体で、ＴＥＶ切断部位は大文字のイタリック体で、ＰＥＳＴ配列は二重下線を引いた大文字で、リンカーペプチド配列は小文字のイタリック体で示す。
【図１４−１】図１２および１３に例示したプラスミドからの転写によって得られたマイナス鎖ベクターＲＮＡゲノムの配列である。
【図１４−２】図１２および１３に例示したプラスミドからの転写によって得られたマイナス鎖ベクターＲＮＡゲノムの配列である。
【図１４−３】図１２および１３に例示したプラスミドからの転写によって得られたマイナス鎖ベクターＲＮＡゲノムの配列である。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
モノネガウイルス目
モノネガウイルス目には、ボルナウイルス科（Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、ミモナウイルス科（Ｍｙｍｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ニヤミウイルス科（Ｎｙａｍｉｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、ニューモウイルス科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、およびスンウイルス科（Ｓｕｎｖｉｒｉｄａｅ）、ならびに未分類の５つの属、アンフェウイルス（Ａｎｐｈｅｖｉｒｕｓ）、アルリウイルス（Ａｒｌｉｖｉｒｕｓ）、チェンチウイルス（Ｃｈｅｎｇｔｉｖｉｒｕｓ）、クルスタウイルス（Ｃｒｕｓｔａｖｉｒｕｓ）、およびワストリウイルス（Ｗａｓｔｒｉｖｉｒｕｓ）が含まれる。これらの科の属および種を、下記の表に示す。下記表中のアスタリスク「＊」は、基準種を意味する。
【００９４】
【表１−１】
2020518265.tif 000002
【００９５】
【表１−２】
2020518265.tif 000003
【００９６】
【表１−３】
2020518265.tif 000004
【００９７】
【表１−４】
2020518265.tif 000005
【００９８】
【表１−５】
2020518265.tif 000006
【００９９】
【表１−６】
2020518265.tif 000007
【０１００】
【表１−７】
2020518265.tif 000008
【０１０１】
【表１−８】
2020518265.tif 000009
【０１０２】
【表１−９】
2020518265.tif 000010
【０１０３】
【表１−１０】
2020518265.tif 000011
【０１０４】
【表１−１１】
2020518265.tif 000012
【０１０５】
【表１−１２】
2020518265.tif 000013
【０１０６】
詳述については、「Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｒｄｅｒ  Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ：ｕｐｄａｔｅ  ２０１６」、Ａｆｏｎｓｏら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．（２０１６年）１６１：２３５１〜２３６０頁を参照されたい。
【０１０７】
モノネガウイルス目のウイルス（ここでは「モノネガウイルス」と呼ばれる）は、非感染性の直鎖状一本鎖マイナス鎖ＲＮＡのゲノムを保有するエンベロープウイルスである。
モノネガウイルスの大多数は、非分節型ゲノムを有する。いかなる理論にも拘泥するものではないが、本明細書に記載した方法および組成物は、分節型ウイルスより非分節型ウイルスに適用性があると考えられる。
【０１０８】
ゲノムは、逆相補的な３’および５’末端を有し、どのタンパク質とも共有結合していない。
ゲノムは、一般的に、３’ＵＴＲ（非翻訳領域）−コアタンパク質コード遺伝子−エンベロープタンパク質コード遺伝子−ポリメラーゼコード遺伝子−５’ＵＴＲの順で、コードおよび非コードエレメントの配置を保存する。
【０１０９】
ゲノムによってコードされるコアタンパク質には、核タンパク質（「Ｎ」または「ＮＰ」と表わされることが多い）、リン酸化されていることが多いためリンタンパク質と呼ばれるタンパク質（「Ｐ」と表わされる）、およびマトリックスタンパク質（「Ｍ」）が含まれる。
【０１１０】
ポリメラーゼは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、多くの場合、ウイルスによってコードされた最も大きなタンパク質であり、そのため、ラージ（または「Ｌ」）タンパク質と呼ばれることもある。ポリメラーゼは、モノネガウイルス目の中では比較的高度に保存されている。Ｐタンパク質は、Ｌタンパク質の共因子である可能性があり、すなわち、Ｌタンパク質とＰタンパク質は、ポリメラーゼ活性のために一緒に存在することが必要である可能性がある。
【０１１１】
Ｎ（またはＮＰ）、Ｐ、Ｍ、およびＬタンパク質という用語は、それらの正規の名称にかかわらず、本明細書では、モノネガウイルスでの類似の役割を果たすあらゆるタンパク質を指すのに使用される。
【０１１２】
エンベロープタンパク質は、グリコシル化されていることがある膜貫通型タンパク質である。したがって、一部のモノネガウイルスでは、エンベロープタンパク質は、糖タンパク質（または「Ｇ」タンパク質）と呼ばれる。
【０１１３】
ビリオンは、ゲノムがＮ、Ｐ、およびＬタンパク質と結合しているらせん状のリボ核タンパク質ヌクレオカプシドを含む。このヌクレオカプシドは、基質および膜エンベロープ層によって取り囲まれている。
【０１１４】
宿主細胞に感染すると、ウイルスヌクレオカプシドは細胞質ゾル中へ放出され、そこで、転写および複製されるがＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを媒介して行われる。
転写はすべて、ゲノムの３’末端の１つのプロモーターから開始する。ポリメラーゼは、各遺伝子の転写の後、転写を終結し、または下流の隣の遺伝子へと継続し、これらの遺伝子がゲノムの３’末端の最も近くで最大コピー数で転写され、５’末端に向かうにしたがって遺伝子の転写物の産生が減少するｍＲＮＡ産生の勾配を生み出す。典型的には、各ウイルスは５〜１０個の様々なｍＲＮＡを産生する。核タンパク質（「Ｎ」または「ＮＰ」と表わされることが多い）のレベルは、ｍＲＮＡ生成とゲノム複製との間の切換えのタイミングを決定する。複製には、ポリメラーゼによる全長プラス鎖アンチゲノムの産生が必要であり、全長プラス鎖アンチゲノムは、ビリオンへのパッケージングのために、続いて全長マイナス鎖ゲノムコピーへと転写される。
【０１１５】
本明細書における「遺伝子」という用語は、発現産物をコードするベクターゲノム中の配列、および典型的にはベクターのプロモーターの調節下で自身の発現産物の発現を導くベクターゲノム中の配列を指すのに使用される。最終的な発現産物は、ＲＮＡ（発現がベクターゲノムからの転写だけでよい場合）であっても、タンパク質（発現が、ウイルスタンパク質によるｍＲＮＡへの転写に続き、タンパク質への翻訳を必要とする場合）であってもよい。
【０１１６】
ラブドウイルス、具体的には狂犬病ウイルスの特徴を、モノネガウイルスの生物学の例示として下記にて詳述する。
ラブドウイルスは、典型的には、約１１〜１５ｋｂの長さのゲノムを有する。それらは、脊椎動物（哺乳動物および魚を含む）、昆虫、および植物体に様々に感染する。
【０１１７】
狂犬病ゲノムは、その末端に、３’リーダー（ｌｅ）および５’トレーラー（ｔｒ）と呼ばれる短い非コード領域を有し、これらは、それぞれゲノムの転写および複製を、開始し、終結する。３’および５’最末端は逆相補的である。これらの末端にはまた、転写および複製のためのプロモーター配列、ならびにゲノムＲＮＡのカプシド形成のためのプロモーター配列も含有されている。
【０１１８】
５つの構造遺伝子は、（３’から５’へ）Ｎ（核タンパク質）、Ｐ（リンタンパク質）、Ｍ（マトリックス）、Ｇ（糖タンパク質）、およびＬ（ラージ）の順序で、短い非コード遺伝子間領域（ＩＧＲ）を含んで配置されている。各構造遺伝子は、３’転写開始シグナル（ＴＩＳ）（コンセンサス配列３’−Ｕ−Ｕ−Ｇ−Ｕ−Ｒ−Ｒ−ｎ−Ｇ−Ａ−５’と５’転写終結ポリアデニル化（ＴＴＰ）シグナル（コンセンサス配列３’Ａ／Ｕ−Ｃ−Ｕ−Ｕ−Ｕ−Ｕ−Ｕ−Ｕ−Ｕ−Ｇ−５’）とにはさまれたコード領域を含む。
【０１１９】
感染は、Ｇタンパク質が標的細胞の表面のその受容体へ結合することによって媒介される。次いで、ウイルスは、細胞のエンドソーム輸送経路を経て内在化する。エンドソームの低いｐＨによって、またＧタンパク質も媒介して、（エンドソーム膜とウイルスエンベロープとの）膜融合が誘導され、リボ核タンパク質複合体が細胞質中へと放出される。
【０１２０】
次いで、ウイルスのポリメラーゼ（ＰおよびＬタンパク質を含む）の媒介によって、ウイルスタンパク質をコードするｍＲＮＡの転写が開始する。転写は、ゲノムの３’末端から開始し、５’末端に向かって進行し、リーダーＲＮＡから順次、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、およびＬ遺伝子の６個の連続的な転写物をそれぞれ産生する、ストップ・スタート機構によって続行されると考えられる。ポリメラーゼは、各停止シグナルで鋳型から解離し、次の開始シグナルではほとんど再開しないと考えられる。その結果、ｍＲＮＡ産生の勾配は、リーダー転写物の量が最大で、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、およびＬ転写物と続く。
【０１２１】
感染の後期に、ポリメラーゼは、ｍＲＮＡ産生からウイルスゲノムの複製へと切り換わるが、これは、全長プラス鎖ＲＮＡ中間生成物を経て進む。プラス鎖中間生成物と子孫マイナス鎖ウイルスゲノムの両者は、タンパク質Ｎによりパッケージングされて、核タンパク質複合体を形成する。Ｍタンパク質は、ＲＮＰヌクレオカプシドの宿主細胞原形質膜への動員、糖タンパク質Ｇとの結合、および細胞からの子孫ビリオン粒子の出芽に関与するだけでなく、転写と複製との間の切換えのタイミングの決定において調節的役割も果たす。
【０１２２】
個々のタンパク質の役割および機能にも関する詳細を含む総説として、Ａｌｂｅｒｔｉｎｉら、Ｒａｂｉｅｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７９、２０１１年１２月（ＩＳＳＮ  ００６５−３５２７；ＤＯＩ：１０．１０１６／Ｂ９７８−０−１２−３８７０４０−７．００００１−９）を参照されたい。
【０１２３】
狂犬病Ｎタンパク質の例示的配列は、以下の通りである。
【０１２４】
【化１】
2020518265.tif 000014
【０１２５】
狂犬病Ｐタンパク質の例示的配列は、以下の通りである。
【０１２６】
【化２】
2020518265.tif 000015
【０１２７】
狂犬病Ｍタンパク質の例示的配列は、以下の通りである。
【０１２８】
【化３】
2020518265.tif 000016
【０１２９】
狂犬病Ｌタンパク質の例示的配列は、以下の通りである。
【０１３０】
【化４】
2020518265.tif 000017
【０１３１】
したがって、本発明のベクターにおいて使用される場合、狂犬病Ｎタンパク質は、上記に示した配列を有してもよく、またはそれに対して少なくとも７０％同一性、例えば、それ対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一性を有してもよい。
【０１３２】
狂犬病Ｐタンパク質は、上記に示した配列を有してもよく、またはそれに対して少なくとも７０％同一性、例えば、それに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一性を有してもよい。
【０１３３】
狂犬病Ｍタンパク質は、上記に示した配列を有してもよく、またはそれに対して少なくとも７０％同一性、例えば、それ対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一性を有してもよい。
【０１３４】
狂犬病Ｌタンパク質は、上記に示した配列を有してもよく、またはそれに対して少なくとも７０％同一性、例えば、それ対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一性を有してもよい。
【０１３５】
狂犬病Ｇタンパク質（株Ｂ１９Ｇ）の例示的配列は、以下の通りである。
【０１３６】
【化５】
2020518265.tif 000018
【０１３７】
細胞外ドメインは標準書体で、膜貫通ドメインは下線で、細胞内ドメインはイタリック体で示されている。
Ｂ１９株の細胞内ドメインを有するが、それと異なる株由来の細胞外ドメインを有する、代替の、いわゆる「最適化された」Ｇタンパク質は、次の配列を有する。
【０１３８】
【化６】
2020518265.tif 000019
【０１３９】
細胞外ドメインは標準書体で、膜貫通ドメインは下線で、細胞内ドメインはイタリック体で示されている。
狂犬病Ｇタンパク質は、上記に示した配列のいずれかを有してもよく、またはそれに対して少なくとも７０％同一性、例えば、それに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一性を有してもよい。
【０１４０】
狂犬病ウイルスベースのベクターとともに使用するシュードタイプ化エンベロープタンパク質は、細胞内ドメインと、所望により上記のＧタンパク質配列のいずれかに由来する膜貫通ドメインとを有してもよく、またはそれらに対して少なくとも７０％同一性、例えば、それに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一性を有してもよい。細胞外ドメインは、上記の細胞外ドメイン配列のうちの１つに対して少なくとも７０％同一性、例えば、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一性を有してもよく、またはベクターの標的とされる細胞に応じて選択されてもよい。
【０１４１】
ベクターによってコードされた各遺伝子（またはオープンリーディングフレーム）は、典型的には、発現（すなわち転写および翻訳）を確実にする適切な調節シグナルと結合している。このことは、ベクターによって運ばれるあらゆる異種遺伝子、ならびに複製モジュレータータンパク質および他のウイルスタンパク質をコードする遺伝子についても当てはまることである。したがって、各遺伝子は、転写開始シグナルおよび転写停止シグナルを含んでいてもよい。転写開始シグナルは、典型的には、ＡＣＡＴＣＣＣＴおよびＡＣＡＣＣＣＣＴなどの約８塩基の長さのＣリッチ配列である。停止シグナルは、典型的には、ＡＡＡＡＡＡＡなどのポリ（Ａ）のひと続きである。各遺伝子はまた、適切な転写開始を確実にするコザック配列を含んでいてもよい。特に任意の１つまたは複数の異種遺伝子について、所望のレベル遺伝子発現を確実にするために、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）などの非モノネガウイルスのエレメントを含む追加的な制御配列も存在してもよい。
【０１４２】
参照配列に対するパーセント（％）アミノ酸配列相同性は、配列をアラインメントし、必要に応じて、最大パーセント配列同一性を得るためにギャップを導入し、保存的置換はすべて配列同一性の一部とみなさないとした後の、参照配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合と定義される。％同一性の値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって決定してもよい（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６６：４６０〜４８０頁（１９９６年））。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２では、幾つかの検索パラメーターを使用するが、そのほとんどは初期値に設定される。調整可能なパラメーターは、以下の値で設定される：重複範囲＝１、重複率＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１。Ａ％アミノ酸配列相同性の値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって決定されたマッチする同一残基数を、参照配列の残基の総数（無視されるアラインメントスコアを最大化するために、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって参照配列にギャップを導入）で割り、１００を掛けることによって決定される。
単シナプス回路トレーシング
機能性糖タンパク質Ｇを欠くＲａｂｉｅｓウイルスベクターは、ニューロン間のシナプス接続の地図作成に関してよく知られている。例えば、米国特許第８，３３４，０９５号を参照されたい。
【０１４３】
Ｒａｂｉｅｓウイルスは、選択的にシナプスで連結したニューロン間を（一部の感覚ニューロンを除き）もっぱら逆行方向に伝播する。Ｇ糖タンパク質を欠くＲａｂｉｅｓウイルスは、感染細胞の表面から出芽することができない。したがって、Ｇ遺伝子が削除されたまたは不活性化された狂犬病ウイルスをベースとしたベクター（ΔＧ−ＲａｂｉｅｓまたはＲＶｄＧ）は、Ｇ糖タンパク質をコードする遺伝子（または別のシュードタイプ化エンベロープタンパク質）が、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのヘルパーウイルスによって、トランスに供給されれば、隣接する細胞に対してのみ増殖することができる。ΔＧ−Ｒａｂｉｅｓベクターとヘルパーウイルスとが同じ細胞へと慎重に標的化されれば、狂犬病ウイルスは、シナプスに隣接する細胞まで増殖できるが、（隣接細胞は、さらなる増殖に必要なエンベロープタンパク質を発現しないため）それ以上は増殖できない。したがって、これによって、例えばΔＧ−Ｒａｂｉｅｓベクターによって運ばれる蛍光マーカータンパク質を介して、シナプス接続を可視化し、地図にすることが可能となる。
【０１４４】
基本の標識方法の変形は数多く知られている。哺乳動物を使用する一部の例において、ΔＧ−Ｒａｂｉｅｓは、それぞれ受容体ＴＶＡおよびＴＶＢに特異的である、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）タイプＡまたはＢ（ＥｎｖＡ、ＥｎｖＢ）由来のエンベロープタンパク質でシュードタイプ化されている。これらのタンパク質は、哺乳動物では天然に発現されないため、当該のシュードタイプ化ベクターによる形質導入は、ＴＶＡまたはＴＶＢを発現するように特別に操作された細胞に限定され得る。
【０１４５】
シナプスの地図作成のための幾つかの手法は、狂犬病ベクターまたはヘルパーウイルスゲノム中の認識部位を標的とすることができるウイルスリコンビナーゼを発現するように操作された動物モデルを使用する。レシピエント動物中のリコンビナーゼ遺伝子を誘導性プロモーターの転写制御下に置くことによって、さらなるレベルの制御が得られる。あるいは、レシピエント動物は、リコンビナーゼタンパク質をコードするベクターによる形質導入の後、細胞ゲノムの組換え事象が起こるように、そのようなリコンビナーゼのためのゲノムの認識部位を保有するように操作されてもよい。
【０１４６】
一般的に、リコンビナーゼおよび認識部位の組合せは、ＣＲＥリコンビナーゼがＬｏｘ認識部位に作用するＣｒｅ−Ｌｏｘが使用される。
しかし、Ｇ糖タンパク質の欠失または不活性化は、レシピエント細胞内におけるウイルスによるコアの転写、タンパク質合成、および複製の通常のプロセスを妨害しない。細胞内のウイルスＲＮＡおよびタンパク質の蓄積は、細胞生存率がウイルスタンパク質、感染細胞に対する免疫応答、または他の機構によって直接損なわれ、その結果として、標識細胞は典型的には１〜２週間しか生存できないという影響を及ぼす。
切換え可能ベクター
本発明のベクターは、モノネガウイルスの転写と複製との一連の性質を利用して、感染細胞内でのウイルスの転写・複製サイクルの切換えを提供し、特定の活性化剤または抑制剤の存在（および活性）に応じてウイルスをオンまたはオフにする。
【０１４７】
既に説明したように、このベクターは複製モジュレータータンパク質をコードしており、複製モジュレータータンパク質は、複製モジュレータータンパク質を（例えば、プロテアソームによる）分解の標的とさせるデグロンを提示する構成と該デグロンを提示しないためより安定である構成との間の切換えが可能である。複製モジュレータータンパク質のこれらの構成は、デグロンの有無を反映するために「標的化されている」および「標的化されていない」と表される。
【０１４８】
したがって、複製モジュレータータンパク質が主として標的化されている構成で存在する間、ウイルスは、有意な量の機能性形態の当該のタンパク質を蓄積することができない。一次感染直後に、ウイルスの転写および複製は短期間起こり得るものの、その後、ウイルスの転写および複製は失速することとなる。この構成が十分な時間維持されれば、その他のウイルスタンパク質およびＲＮＡゲノム自体も細胞の通常の機構によって分解されるため、ウイルスは最終的に細胞から除去されることとなる。
【０１４９】
標的化されている構成の感染細胞中でウイルスが残存する時間の長さは、具体的な当該細胞およびウイルスに応じて異なることとなる。しかし、一般的には、狂犬病ウイルスをベースとしたこの種のベクターは、約２週間〜１カ月の期間内に神経細胞から除去されることになりそうである。
【０１５０】
一般的に、構成間の切換えは、必要に応じて、レギュレーター部分と活性化剤または抑制剤とが相互作用することによって起こる。相互作用は、レギュレーター部分の共有結合的または非共有結合的修飾を含んでもよい。
【０１５１】
共有結合的修飾は、酵素作用によってなされてもよく、すなわち、活性化剤または抑制剤は酵素であり、レギュレーター部分は該酵素のための基質である。共有結合的修飾の一例は、タンパク質切断である。
【０１５２】
非共有結合的修飾は、活性化剤または抑制剤のレギュレーター部分への結合によってなされてもよく、すなわち、活性化剤または抑制剤は、レギュレーター部分のためのリガンドであってもよい。
【０１５３】
したがって、活性化剤は、「切断誘導型安定化」または「リガンド誘導型安定化」によって複製モジュレータータンパク質を安定化させてもよい。逆に、抑制剤は、「切断誘導型不安定化」または「リガンド誘導型不安定化」によって複製モジュレータータンパク質を不安定化させてもよい。（これらはまた、「切断誘導型分解」または「リガンド誘導型分解」と呼んでもよい。）他の機構が可能な場合もある。
【０１５４】
標的化されている構成と標的化されていない構成との間の切換えは、複製モジュレータータンパク質および活性化剤または抑制剤の性質に応じて可逆的または不可逆的であり得ることが明らかとなろう。例えば、活性化剤または抑制剤がモジュレータータンパク質のためのリガンドである場合、２つの構成間の切換えは可逆的であり得る。構成間の切換えがタンパク質分解などの共有結合的修飾によって媒介される場合、切換えは不可逆的となりそうである。
【０１５５】
本発明の関連において、デグロンは、例えば、分解を受けるタンパク質に印付けをすることによって、タンパク質に特に短い半減期を付与する性質であれば何であってもよい。多様な種類のデグロンが既知である。ユビキチン化を受けるタンパク質に印付けをすることによって作用するものもあれば（ユビキチン依存性デグロン）、ユビキチン非依存性のものもある。
【０１５６】
デグロンは、ＰＥＳＴ配列であってもよい。ＰＥＳＴ配列はペプチド配列モチーフであり、典型的には、少なくとも１２アミノ酸の長さで、親水性であり、プロリン、グルタミン酸、セリン、およびスレオニンに富んでいる。Ｌｉら（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８年；２７３（５２）：３４９７０〜５頁）が、不安定化活性も有する、マウスオルニチンデカルボキシラーゼの配列ＨＧＦＰＰＥＶＥＥＱＤＤＧＴＬＰＭＳＣＡＱＥＳＧＭＤＲＨを有する残基４２３〜４５０のＰＥＳＴ配列およびそれらの変異体について記述している。このタンパク質の残基４２２から４６１までの領域（「ｍＯＤＣ（４２２〜４６１）」）は、下記の実施例で用いられており、配列ＳＨＧＦＰＰＥＶＥＥＱＤＤＧＴＬＰＭＳＣＡＱＥＳＧＭＤＲＨＰＡＡＣＡＳＡＲＩＮＶを有する。
【０１５７】
ＮＰＤＣ−１（神経増殖分化制御タンパク質−１（Ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１））のＣ末端領域もまた、配列ＫＥＬＤＴＡＳＳＤＥＥＮＥＤＧＤＦＴＶＹＥＣＰＧＬＡＰＴＧＥＭＥＶＲを有するＰＥＳＴモチーフを有する。（ＮＰＤＣ−１，ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，Ｉｓ  Ｄｅｇｒａｄｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ／Ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ＰＥＳＴ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  Ｍｏｔｉｆ、Ｓｐｅｎｃｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４年；２７９、３７０６９〜３７０７８頁）を参照されたい
したがって、複製モジュレータータンパク質は、ＰＥＳＴ配列を含んでいてもよい。ＰＥＳＴ配列を含む複製モジュレータータンパク質は、ＰＥＳＴ配列が除去されるまで分解されることとなるため、典型的には、抑制モジュレータータンパク質となる。
【０１５８】
ＰＥＳＴ配列は、多くの場合、ウイルスタンパク質部分のＣ末端、例えば、モジュレータータンパク質のＣ末端に位置することとなる。
したがって、複製モジュレータータンパク質は、典型的には、ウイルスタンパク質部分のＣ末端に位置するウイルスタンパク質部分およびレギュレーター部分を含むこととなり、レギュレーター部分は、プロテアーゼ切断部位およびＰＥＳＴ配列を含む。
【０１５９】
下記のアミノ酸配列は、ウイルスタンパク質部分として狂犬病ウイルスＮタンパク質を含む複製モジュレータータンパク質、ならびにＴＥＶプロテアーゼ切断部位およびＰＥＳＴ配列（「Ｎ−ＴＥＶ−ＰＥＳＴ」）を含むレギュレーター部分の一例である。
【０１６０】
【化７】
2020518265.tif 000020
【０１６１】
Ｎタンパク質ウイルスタンパク質部分は標準書体で、レギュレーター部分はイタリック体で、ＴＥＶ配列は一本下線で、ＰＥＳＴ配列は二重下線で示されている。
デグロンは、Ｎ末端アミノ酸または短いＮ末端配列モチーフであってもよい。それらのＮ末端にＭｅｔ、Ｇｌｙ、またはＶａｌ以外の残基を有するタンパク質がＭｅｔ、Ｇｌｙ、またはＶａｌを有するタンパク質より安定性が低い傾向をもつことは、十分に証明されている。これはＮ末端則と呼ばれる。例えば、Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ、Ａ．（２０１１年）「Ｔｈｅ  Ｎ−ｅｎｄ  ｒｕｌｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ」；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０：１２９８〜１３４５頁を参照されたい。
【０１６２】
様々な機構が、Ｎ末端を介してタンパク質の安定性の決定付けに関与しており、いわゆるＡｒｇ／Ｎ末端則経路（タンパク質基質のＮ末端アルギニル化を伴う）およびＡｃ／Ｎ末端則経路（Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＣｙｓを有する一部のタンパク質の同時翻訳的なＮ末端アセチル化を伴う）が含まれる。場合によって、タンパク質の本来のＮ末端は、内因性の細胞酵素（例えばＭｅｔ−アミノペプチダーゼ）によってプロセシングを受けることとなる。そのような場合、プロセシング後に存在するＮ末端残基がデグロンとなってもよい。
【０１６３】
ガイドラインによると、哺乳動物細胞における安定性の順序（最も安定性が低い／最短半減期から、最も安定性が高い／最長半減期へ）は、概ねＧｌｎ（Ｑ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｖａｌ（Ｖ）である。
【０１６４】
様々な選択肢を任意の所与のタンパク質について試験して、切断前後にＮ末端で提示される残基の好適な組合せを特定し、タンパク質安定性に必要な差異を得てもよい。
したがって、モジュレータータンパク質は、Ｎ末端レギュレーター部分、およびレギュレーター部分下流のウイルスタンパク質部分を含んでもよく、レギュレーター部分は、そのＮ末端の第１の残基とコグネートプロテアーゼのための切断部位とを含み、ウイルスタンパク質部分は、コグネートプロテアーゼによる切断後、そのＮ末端に第１の残基とは異なる半減期を付与する第２の残基を有する。
【０１６５】
したがって、抑制モジュレータータンパク質は、第１のＮ末端残基を含み、第１のＮ末端残基より高い安定性を付与する第２のＮ末端残基を露出するために（例えばプロテアーゼによって）切断可能であってもよい。例えば、第１のＮ末端残基はＡｒｇまたはＬｙｓ（または配列Ａｒｇ−Ｌｙｓ）であってもよく、第２のＮ末端残基はＶａｌであってもよい。
【０１６６】
反対に、抑制可能モジュレータータンパク質は、第１のＮ末端残基を含んで発現され、第１のＮ末端残基より低い安定性を付与する第２のＮ末端残基を露出させるために（例えばプロテアーゼによって）切断可能であってもよい。例えば、第１のＮ末端残基はＭｅｔもしくはＶａｌまたは配列Ｍｅｔ−Ｖａｌであってもよく、第２のＮ末端残基はＡｒｇまたはＬｙｓ（または配列Ａｒｇ−Ｌｙｓであってもよい。
【０１６７】
いずれの場合も、レギュレーター部分は、分子のＮ末端に位置することとなり、選択された第２のＮ末端残基のすぐ上流にコグネートプロテアーゼのための切断部位を含んでもよい。
【０１６８】
典型的には、モジュレータータンパク質は、ユビキチン化のための部位として働く、表面に露出した１つまたは複数のＬｙｓ残基を含むこととなる。
上記のデグロン技術は、切断誘導型安定化および切断誘導型不安定化の例を示すものである。
【０１６９】
その他の条件的デグロン技術は、Ｋａｎｅｍａｋｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２０１３年）４６５：４１９〜４２５頁およびそこで引用された参考文献中に記載されており、これらの技術の幾つかの詳細を下記に示す。
【０１７０】
リガンド誘導型不安定化の一例は、オーキシン誘導デグロン法である。これは、分解のための標的化を誘導するのにオーキシンを利用する。植物タンパク質ＴＩＲ１（ＳＣＦと表されるユビキチンリガーゼの成分）へのオーキシン（インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）または１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）など）の結合によって、ＴＩＲ１がＡＵＸ／ＩＡＡファミリーのタンパク質と相互作用することが可能になり、ＡＵＸ／ＩＡＡタンパク質のユビキチン化と、それに続くプロテアソームによる分解とがもたらされる。ＳＣＦユビキチンリガーゼのその他の成分は、ほとんどの真核生物でよく保存されている。したがって、ＩＡＡ１７などのＡＵＸ／ＩＡＡタンパク質を、ＴＩＲ１を発現する細胞（例えば、ＴＩＲ１を発現するように操作された真核生物の非植物細胞）中でレギュレーター部分として用いてもよい。細胞へオーキシンを加えると、次いで、ＡＵＸ／ＩＡＡ部分を含むタンパク質がすべて分解される。したがって、抑制可能なレギュレーター部分は、ＡＵＸ／ＩＡＡタンパク質を含んでもよい。
【０１７１】
ＤＤ−ＦＫＢＰおよびＬＩＤ−ＦＫＢＰデグロンシステムは、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）に基づいており、それぞれ、リガンド誘導型安定化およびリガンド誘導型不安定化の例を示すものである。
【０１７２】
ＦＫＢＰ１２の不安定化ドメイン（「ＤＤ−ＦＫＢＰ」）は絶えず分解されるが、ラパマイシンの細胞透過型類似体である「Ｓｈｉｅｌｄ−１」と呼ばれるリガンドの存在によって安定化される。（Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉら、Ｃｅｌｌ．２００６年９月８；１２６（５）：９９５〜１００４頁を参照されたい。）したがって、ＤＤ−ＦＫＢＰは、抑制レギュレーター部分として使用することができ、Ｓｈｉｅｌｄ−１の導入によって安定化させることができる。ＤＤ−ＦＫＢＰ部分は、モジュレータータンパク質のウイルスタンパク質部分のＮ末端またはＣ末端のいずれかに配置することができる。
【０１７３】
ＬＩＤ−ＦＫＢＰシステムは、配列ＴＲＧＶＥＥＶＡＥＧＶＶＬＬＲＲＲＧＮを有する合成された１９アミノ酸デグロンがＦＫＢＰ１２タンパク質（またはＦＫＢＰ１２Ｆ３６Ｖと表されるそれらのＰｈｅ３６Ｖａｌ変異体）のＣ末端に融合されている、リガンド誘導型不安定化（または分解）システムである。このペプチドは、ＦＫＢＰ１２のリガンド結合ポケットに結合してＦＫＢＰ１２を封鎖する。Ｓｈｉｅｌｄ−１などの、同じ結合部位に対する別のリガンドの添加によって、デグロンペプチドの解放および曝露が誘導され、その結果、分解を受けるタンパク質全体が印付けされる。したがって、レギュレーター部分は、ＬＩＤ−ＦＫＢＰ部分を含んでもよい。ＬＩＤ−ＦＫＢＰ部分を含むレギュレーター部分は、典型的には、複製モジュレータータンパク質のウイルスタンパク質部分のＣ末端に、理論的には、モジュレータータンパク質のＣ末端に、位置するはずである。
【０１７４】
またレギュレーター部分への疎水性リガンドの結合を使用して、分解を受けるタンパク質を印付けてもよい。例えば、いわゆる「ＨａｌｏＴａｇ」システムは、改変型ハロアルカンデヒドロゲナーゼ（ＨａｌｏＴａｇ）と、改変型ハロアルカンデヒドロゲナーゼの活性部位に共有結合で結合する低分子疎水性リガンド（例えばＨｙＴ１３）とを使用するものである。タンパク質へのリガンドの結合が、プロテアソームによって分解を受けるタンパク質を印付けるようである。したがって、抑制可能レギュレーター部分は、ＨａｌｏＴａｇを含んでもよく、ウイルスタンパク質部分のＮ末端とＣ末端のどちらに位置してもよい。
【０１７５】
複製モジュレータータンパク質の、標的化されている構成から標的化されていない構成への切換え（または逆も同様）が、ウイルスタンパク質部分からのレギュレーター部分の切断によって実施され得ることは、上記の考察から明らかとなるであろう。これは、典型的には、プロテアーゼによって成し遂げられる。そのような場合、レギュレーター部分は、典型的には、デグロンとプロテアーゼの切断部位とを含み、このプロテアーゼ切断部位は、ウイルスタンパク質部分とデグロンとの間に位置する。複製モジュレータータンパク質は、ウイルスタンパク質部分とレギュレーター部分との間に位置するリンカーペプチドを含んでもよい。追加的にまたは代替的に、レギュレーター部分は、プロテアーゼ切断部位とデグロンとの間にリンカーペプチドを含んでもよい。
【０１７６】
タンパク質の成分のうちの１つが何らかの特異的な機能的必要条件をもたない限り、複製モジュレーターの部分は任意の適切な配向にあってよい。例えば、間にリンカー（存在する場合）をはさんで、ウイルスタンパク質はレギュレーター部分のＮ末端に位置してもよく、またはレギュレーター部分はウイルスタンパク質のＮ末端に位置してもよい。ただし、一部のデグロン配列は、タンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置することがやはり必要条件である。
【０１７７】
ペプチドリンカーは、典型的には、分子の水溶解度を損なうことなく必要な柔軟性を示す、小さな親水性のアミノ酸残基（例えば、グリシンおよびセリン）の割合が高い３個から３０個の間の長さのアミノ酸である。ペプチドリンカーはまた、プロテアーゼが作用する切断部位を含有してもよい。切断部位以外の残基（およびプロテアーゼによる認識に必要な他の配列）は、少なくとも５０％グリシンおよびセリン残基、少なくとも６０％グリシンおよびセリン残基、少なくとも７０％グリシンおよびセリン残基、少なくとも８０％グリシンおよびセリン残基、または少なくとも９０％グリシンおよびセリン残基を含んでもよい。
プロテアーゼ
プロテアーゼは、標的細胞に対して直交であってもよく、すなわち、プロテアーゼは、標的細胞によってコードされ、標的細胞において（すなわち、標的細胞のプロテオームで）発現される天然のタンパク質にみられない切断部位を認識する。
【０１７８】
したがって、具体的なプロテアーゼは、ベクターが送達されようとする所期の標的細胞に応じて様々であってもよい。標的細胞は、典型的にはニューロンとされ、この場合、プロテアーゼは、ニューロン内で発現されるどの天然の細胞タンパク質にも作用すべきではない。
【０１７９】
選択されたプロテアーゼは、ベクターによってコードされたその他のタンパク質にも作用するべきではないことも、また明らかとなるであろう。
好適なプロテアーゼの例としては、
−  ウイルスプロテアーゼ、例えば、タバコＥｔｃｈウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶｐ）およびヒトライノウイルス（ＨＲＶ）３Ｃプロテアーゼ、
−  第Ｘａ因子、
−  エンテロキナーゼ、
−  グランザイムＢ、
−  トロンビン
が挙げられる。
【０１８０】
これらのプロテアーゼのコンセンサスな切断部位は以下の通りであり、「＼」は切断されるペプチド結合の位置を示す。
【０１８１】
【表２】
2020518265.tif 000021
【０１８２】
医薬組成物および処置の方法
本明細書に記載の薬剤は、医薬組成物中で配合され得る。これらの組成物は、上記物質のうちの１つに加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、またはその他の当業者に周知の物質を含んでもよい。そのような物質は、非毒性であるべきであり、活性成分の有効性を妨げるべきではない。担体またはその他の物質の詳細な性質は、投与経路に依存してもよく、投与経路は、任意の好適な経路によるものであってもよく、経口または非経口であってもよい。ペプチド剤は、経口送達では苦痛を感じるため、非経口投与が最も好適であると示すこともある。好適な非経口経路には、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮膚、皮下、経皮的経路、ならびに頬側、直腸、および膣経路などのその他の粘膜経路が含まれるが、これらだけに限定されない。好適な組成物および投与の方法の例が、ＥｓｓｅｋｕおよびＡｄｅｙｅｙｅ（２０１１年）ならびにＶａｎ  ｄｅｎ  Ｍｏｏｔｅｒ  Ｇ．（２００６年）に示されている。
【０１８３】
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、または液剤であってもよい。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体を含んでもよい。液体医薬組成物は、一般的に、水、石油、動物性もしくは植物性油、鉱油、または合成油などの液体担体を含む。生理的食塩水、デキストロースもしくはその他のサッカライド溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなどのグリコール類を含んでもよい。
【０１８４】
静脈内、皮膚、または皮下注射のためには、活性成分は、パイロジェンフリーであり、好適なｐＨ、等張性、および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態とする。当業者であれば、例えば、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、乳酸加リンゲル液注射剤などの等張ビヒクルを使用して好適な溶液を調製することは十分に可能である。必要に応じて、防腐剤、安定剤、緩衝液、酸化防止剤、および／またはその他の添加剤を含んでもよい。
【０１８５】
個人に与えられる活性剤の性質が何であれ（例えば、本発明による、ビリオン、封入された核酸分子、またはその他の薬学的に有用な薬剤）、投与は、好ましくは、個人に治療上の効果を与えるのに十分な「予防的有効量」または「治療的有効量」（この場合、予防的処置が治療とみなされてもよいが）で行われる。実際の投与量、ならびに投与の速度およびタイムコースは、処置されているものの性質および重症度に依存することとなる。処置の処方、例えば、用量などに関する判断は、一般開業医および他の医師の責任の範囲にあり、典型的には、処置されようとする疾患、個々の患者の条件、送達の部位、投与の方法、および開業医が知るその他の因子を考慮に入れる。上記の技術およびプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、２０００年、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ出版の中でみつけることができる。
【実施例】
【０１８６】
Ｒａｂｉｅｓウイルスをプロテアソームへと標的化するために、プロテアソーム標的化ドメインをＲａｂｉｅｓウイルスの各タンパク質と（別々にまたは組み合わせて）融合させた（図１Ａ〜Ｂ、表１の構築物の全リスト）。ウイルスタンパク質安定性に対するレベル条件的制御を実施するために、タバコＥｔｃｈウイルス切断部位（ＴＥＶｓ）を、ウイルスタンパク質とプロテアソーム標的化ドメインとの間に挿入した。タバコＥｔｃｈウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶｐ）は、選択的にＴＥＶｓリンカーを切断し、プロテアソーム標的化ドメインを形成するウイルスタンパク質を分断し、ウイルスタンパク質を分解から免れさせる（図１Ａ）。ＴＥＶｐおよびＴＥＶｓによって構成されるこの二成分系は、ウイルス産生の間、またインビボにおいて、薬ウイルスタンパク質分解の程度および時間的ウインドウを調節するために理学的に制御することができる。すなわち、ウイルスは、ＴＥＶｐが存在する場合にのみ転写し、複製することができ、これによって、ＴＥＶｐが供給されなければウイルスの転写および複製が構成的にオフである系が生じる。
【０１８７】
生成したウイルス構築物すべてについて、ウイルス産生に対する適合性およびＴＥＶ依存度をスクリーニングした（図１）。スクリーニングの結果は、条件的不安定化がＴＥＶｐ依存的にウイルスの転写・複製サイクルを可逆的に抑制するのに十分であるウイルスタンパク質は、Ｎタンパク質だけであることを指し示している（図１Ｆ、Ｋ）。その他のすべてのウイルスタンパク質の不安定化は、単独でまたは組合せで、インビトロで増幅できないウイルスまたはＴＥＶｐ存在下でも非存在下でも増幅するウイルスを生じる（図１）。ウイルスカセット設計をさらに改良した後（補足文、図６、７）、所望のＴＥＶ依存性オン・オフ動態を有するＮタンパク質不安定化Ｒａｂｉｅｓカセットをベースとした自己不活性化Ｒａｂｉｅｓ（ＳｉＲ）を産生することができた。
【０１８８】
次いで、ＣＲＥリコンビナーゼおよびｍＣｈｅｒｒｙＰＥＳＴをコードするＳｉＲを生成した（ＳｉＲＣＲＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ、図２Ｂ）。Ｒｏｓａ−ＬｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ＬｏｘＰ−ＹＦＰマウスのＣＡ１錐体層にＳｉＲＣＲＥ−ｍＣｈｅｒｒｙを注入することによって、インビボでのＳｉＲ転写・複製動態および細胞傷害性を試験した（図２Ｂ）。ＳｉＲによって促進されるＣＲＥリコンビナーゼの一過的発現は、Ｒｏｓａ座位の永続的な組換えおよびＹＦＰ発現を、ウイルスが完全に転写を停止した後もなお確実にするはずである（図２Ａ）。実際に、感染後（ｐ．ｉ．）３日では、ウイルスによってコードされたｍＣｈｅｒｒｙだけが検出できたのに対し（図８Ｃ〜Ｃ”）、感染後６日までに既に、ウイルスにコードされたＣＲＥリコンビナーゼは、すべての感染ニューロンで条件的マウスレポーターカセットの組換えおよびＹＦＰの発現を誘導している（図８Ｄ〜Ｄ”）。ｍＣｈｅｒｒｙＰＥＳＴが不安定化されているので、高い時間分解能で（半減期が約２時間）活性ウイルスの存在が印付けされる（２１）。
【０１８９】
次いで、ＳｉＲＣＲＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ感染ＣＡ１錐体ニューロン（その後、８週間にわたりＹＦＰＯＮニューロンとなる）の生存を評価し、ウイルスの転写・複製サイクルの代わりとして、感染ニューロンにおいてｍＣｈｅｒｒｙがオフに切り換わるのをモニタリングする。感染後１週間で、ＳｉＲＣＲＥ−ｍＣｈｅｒｒｙは、感染ニューロンの画分においてオフの切換えを開始する（２９±３％ｍＣｈｅｒｒｙＯＦＦＹＦＰＯＮ、図２Ｃ〜Ｃ”’、Ｆ）。感染後３週間までに、事実上、すべてのＹＦＰＯＮニューロンがウイルスにコードされたｍＣｈｅｒｒｙを発現してないことを示しているため、移行は完了している（９８±２％ＹＦＰＯＮｍＣｈｅｒｒｙＯＦＦ、図２Ｅ〜Ｅ”’、Ｆ、Ｎ＝３）。さらに重要なことには、８週間の観察期間の間、ＳｉＲ感染後のニューロンの有意な損失を検出しなかった（８週間にわたりＹＦＰＯＮニューロンの有意な減少はない、一元配置分散分析、Ｆ＝０．１９、Ｐ＝０．９０、１時点当たりＮ＝３、図２Ｅ〜Ｅ”、Ｆ）。反対に、ΔＧ−Ｒａｂｉｅｓ感染では、海馬の感染ニューロンの大多数は、一次感染から２週間以内に死んでいる（海馬、２週間での細胞死  ９２±３％、１時点当たりｎ＝３、一元配置分散分析、Ｆ＝１０１、Ｐ＝２．４×１０−５、図９２±３％）。ｍＣｈｅｒｒｙＰＥＳＴタンパク質半減期に注意を払うことなく、ウイルスの転写・複製サイクルのより高い時間分解能を獲得するために、感染後１、２、３、および８週間に、感染動物の脳抽出物に対して、リアルタイムＰＣＲによってウイルスＲＮＡ力価を測定した。ｍＣｈｅｒｒｙ発現の結果に一致して、ウイルス力価は、感染後２週間までにほぼバックグラウンドレベルまで低下する（図２Ｇ）。全般的に、これらの結果は、ＳｉＲＣＲＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ転写・複製動態は、ウイルスが消失する前に早期にＣＲＥ組換え事象を起こすために、十分に時間があることを示しており（図８Ｄ〜Ｄ’’’）（図２Ｇ）、これは、ニューロンの生存に影響を与えることなく感染ニューロンへの永続的な遺伝学的アクセスを確実にするものである（図２Ｆ）。
【０１９０】
インビトロでの実験は、条件的プロテアソーム分解によるウイルス安定性の調節が、ウイルスの転写・複製サイクルを調節するのに十分であることを示している。ウイルスタンパク質分解の間、インビボで条件的制御を達成することができるかどうかを評価するために、ドキシサイクリン誘導性プロモーター下でＴＥＶｐを発現するＡＡＶウイルス（ＡＡＶＴＲＥ：：ＴＥＶｐ、図７Ａ）を設計した（２２）。これは、インビボでのＴＥＶｐ発現に対する薬理学的制御の手段を提供し、したがって、ウイルスの転写・複製サイクルに対する薬理学的制御の手段を提供する。
【０１９１】
ドキシサイクリン投与によってＳｉＲが再活性化され得るのかどうか、また、感染後、どの段階までドキシサイクリン投与によってＳｉＲが再活性化され得るのかを検討するために、海馬のＣＡ１ニューロンに、ＡＡＶＴＲＥ：：ＴＥＶｐを注入した後、１週間後にＳｉＲＣＲＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ感染させた。１週間後または２週間後の２時点で２日間、ドキシサイクリン（１００ｍｇ／Ｋｇ）を胃管栄養によって投与した（図９Ｂ）。ＲＮＡ解析に一致して、ＳｉＲ感染の１週間後にウイルスが転写的に活性である時点でドキシ投与した場合、ＹＦＰＯＮｍＣｈｅｒｒｙＯＮニューロンの割合が倍増したのに対し（ｍＣｈｅｒｒｙＯＮＹＦＰＯＮ  −ドキシ  ２２±３％、＋ドキシ  ３８±２、Ｐ＝０．０２、図９Ｇ）、感染後２週間でのドキシ投与では、影響は認められなかった（ｍＣｈｅｒｒｙＯＮＹＦＰＯＮ  −ドキシ  １±１％、＋ドキシ  １±１％、図９Ｇ）。
【０１９２】
ＳｉＲＣＲＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ生活環が短いことを考慮して、ウイルスが、オフに切り換わる前に、一次感染したニューロンから経シナプス的に伝播する能力を保持するかどうかを検討した。これを試験するために、まずＲｏｓａ−ＬｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ＬｏｘＰ−ＹＦＰマウスのＣＡ１錐体層にＴＶＡおよびＢ１９−Ｇを発現するＡＡＶを注入し、続いてＥｎｖＡシュードタイプ化ＳｉＲウイルスを感染させた。ＣＡ１とＣＡ３との間の既知の解剖学的結合性から予想された通り、ＣＡ３の錐体層においてＳｉＲで標識されたニューロンが確認され（図３Ａ〜Ａ’’）、これは、特異的な経シナプス性伝播を示すものである。シナプス前ニューロンもまた、嗅内皮質で確認された（図３Ａ’’’）。さらに重要なことには、ＳｉＲ感染したＴＶＡおよびＧ発現起点細胞は、感染期間を通して生存可能であった（図３Ｂ〜Ｂ’’）。さらに、ＳｉＲは、最近開発された最適化Ｒａｂｉｅｓ糖タンパク質（ｏＧ）でシュードタイプ化した場合（１７）、非常に効果的な逆行性（非経シナプス性）トレーサーとしても機能する（図３Ｃ、Ｄ）。
【０１９３】
ＳｉＲがニューロン生理学に対して長期的影響を及ぼさないことを確認するために、Ｒｏｓａ−ＬｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ＬｏｘＰ−ＣｈＲ２ＹＦＰのＣＡ１の錐体層にＳｉＲＣＲＥ−ｍＣｈｅｒｒｙを注入した。次いで、感染後１週間および２カ月に、感染ニューロンの電気生理学的特性を比較した。ＣＡ１のＹＦＰＯＮニューロンを、海馬急性スライスにおいてホールセルパッチクランプ法で記録した。記録された錐体ＣＡ１ニューロンはすべて、規則的なスパイク発生プロファイルを示し（図４Ａ、Ｂ）、入力抵抗に有意差はなかった（ｐ．ｉ．１週間での２２６±１３ＭΩ、ｎ＝１０に対して、２カ月では２５１±１８ＭΩ、ｎ＝８；図４Ｃ）、静止膜電位（−５７．０±１．９ｍＶに対して５６．７±１．９ｍＶ；図４Ｄ）、活動電位振幅（９６．４±３．６ｍＶに対して９４．２±２．９ｍＶ）、および活動電位半値幅（２．４±０．１ｍｓに対して２．４±０．１ｍｓ；図４Ｅ）。注入閾値では軽微な差のみ認められた（−４６．０±１．０ｍＶに対して−４１．３±２．０ｍＶ、Ｐ＝０．０３９４；両側２標本スチューデントのｔ検定、図４Ｄ）。ただし、この差は瞬間発火周波数に影響を与えていない（図４Ｆ）。ＣｈＲ２は、ＳｉＲＣＲＥ−ｍＣｈｅｒｒｙで形質導入されたニューロンでうまく発現されている（図４Ｇ〜Ｉ）。ニューロンは、感染後１週間でも２カ月間にわたっても、同じ信頼性を有して多様な周波数で活性化され得る（図４Ｊ）。重要な知見は、感染後２カ月に、ＳｉＲＣＲＥ−ｍＣｈｅｒｒｙ感染ニューロンの光活性化が、それらのシナプス後パートナーにおいてＤＮＱＸ感受性興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）を誘発するということであり（図４Ｋ）、これは、機能的結合性が持続されており、シナプス機能に対して有害な影響を及ぼさなかったことを示している。
【０１９４】
細胞傷害性がなく、電気生理学的応答に変化がないことは、ＳｉＲが長期の回路操作のために使用できることを裏付けている。ＳｉＲ感染ニューロン間の機能的結合性があり、シナプス機能に対する有害な影響がないこともまた、ＳｉＲ感染中、ネットワーク機能が保存されている可能性を示している。ネットワーク依存性計算がＳｉＲ地図回路の中で実際に影響を受けないかどうかを直接試験するために、ネットワーク依存性計算のプロトタイプ例として、ＳｉＲを用いてＶ２へと投射するＶ１ニューロンを追跡し、それらの方向チューニング優先性の特徴付けを行った（１８）。まず、Ｒｏｓａ−ＬｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ＬｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏマウスにｏＧシュードタイプ化ＳｉＲＣＲＥを注入して、Ｖ２投射ニューロンを標的化した。同時に、ＡＡＶ：：ＧｃＡＭＰ６を同側のＶ１に注入した。ＳｉＲＣＲＥの逆行性伝播は、Ｖ２へと投射するＶ１ニューロン（Ｖ１＞Ｖ２）を持続的に標識する、Ｒｏｓａ座位の組換えを誘導する（図５Ｂ−Ｂ’’）。次いで、インビボでのＳｉＲ感染Ｖ１＞Ｖ２ニューロンのＣａ２＋動態を、二光子顕微鏡下で、ｐ．ｉ．４週間、モニタリングし、一方で、麻酔をかけた動物に視野を横断する様々な方向に動く格子を見せた（図５Ｃ）（１９）。感染Ｖ１ニューロンは、特定の格子方向で蛍光の有意な増加を示し、方位または方向選択性を示すチューニング曲線が得られた（図５Ｇ、Ｈ）。特に、記録されたＣａ２＋応答、および活性ニューロンの割合は、ＳｉＲでトレーシングしたニューロン（ＧＣａＭＰ６ｓＯＮ−ｔｄＴｏｍａｔｏＯＮ）と隣接した非ＳｉＲ  Ｖ１ニューロン（ＧＣａＭＰ６ｓＯＮ−ｔｄＴｏｍａｔｏＯＦＦ）との間で同様であった（図５Ｅ、Ｆ）。これらのデータは、ＳｉＲでトレーシングしたネットワークは不変の計算特性を維持すること、また、ＳｉＲをＧＣａＭＰ６ｓと組み合わせて使用して、光学的試験に関する時間的ウインドウの上限なくＣａ２＋動態のモニタリングができることを示している。
【０１９５】
単シナプスに制限されるＲａｂｉｅｓウイルスの開発は、神経回路の研究に大きな変化をもたらす役割を担ってきた。しかし、現在まで、Ｒａｂｉｅｓウイルス感染に附随する細胞の細胞傷害性が、事実上、神経回路の解剖学的地図の作成に対するその使用を概して制限してきた。誘導される細胞傷害性は、ウイルス複製を維持するために、細胞の転写装置の転写活動を乗っ取るウイルスの転写活動に関連する（２４）。したがって、複製可能なＲａｂｉｅｓウイルスはすべて、最終的に細胞の生理学を損なわせることとなる。この制限を克服し、形態的に規定されたネットワーク要素への一生続く遺伝学的および機能的アクセスを獲得するために、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来ニューロンでも（補足的結果、図６）マウスにおけるインビボでも、ＴＥＶｐ依存的に、一次感染の後に転写をオフに切り換える自己不活性化Ｒａｂｉｅｓウイルスを開発した。ウイルスの完全な転写サイレンシングと同調して、感染後数カ月間、感染ニューロンの電気生理学的サインに変化がないこと、またシナプス機能および回路完全性が維持していることを観察しており、これは、生理学的研究および行動研究のために重要なことである。さらに重要なことには、移動刺激に対する方向チューニングなどの、感染ニューロンのより高いレベルの回路依存的計算が、ウイルス感染後数カ月間、インビボで影響を受けないままであることも示されている。
【０１９６】
これはまた、同様に、ＳｉＲを用いて、カルシウムイメージングを使用してインビボでのネットワーク活性をモニタリングできることも示している。古典的なＢ１９ΔＧ−Ｒａｂｉｅｓを用いた場合、ニューロンの光学イメージングのための最適な時間的ウインドウは、典型的には、Ｒａｂｉｅｓ感染から５〜７日後である（１７）。最近紹介されたΔＧ−Ｒａｂｉｅｓ株変異体ＣＶＳ−Ｎ２ｃΔＧを使用した場合、イメージングのために有用な時間的ウインドウはさらに感染から１７日後まで延長することができる（２５）。ＳｉＲを用いた場合、ネットワーク要素の光学的研究のための時間的ウインドウに対する上限はない。これらの属性によって、ＳｉＲは、神経回路の機能的および遺伝学的操作のためだけでなく、神経ネットワーク活性の長期モニタリングのためにも最も有益な解決策となる（２６〜２９）。さらに、ＳｉＲのユニークな一過的複製の性質は、例えば神経変性状態の間または外傷性脳損傷に伴う学習に関する、生理学的または病理学的な構造的可塑性に伴う回路再構築を追跡することの実現性を提供し、これによって、そのような場合におけるネットワークレベルでの機能的介入が可能となり得る。
【０１９７】
概して、自己不活性化ΔＧ−Ｒａｂｉｅｓの開発は、初めて、ニューロンの生理機能および回路機能への有害な影響がない、形態的に規定されたネットワーク要素への永続的な遺伝学的アクセスを提供する。
補足文
第一世代ΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓ。細胞傷害性のインビトロおよびインビボ試験
ウイルスタンパク質安定性の条件的調節を獲得するために、ＳＰＬＩＴ−ＴＥＶカセット（３０）を各ウイルスタンパク質のＣ末端に付加した（ΔＧ−ＶＰＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ｍＣｈｅｒｒｙ）。さらに、タンパク質発現レベルをモニタリングするために、タグ（ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、またはＶ５）を各ウイルスタンパク質のＮ末端に融合させた。このＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ二量体プロテアーゼは、ラパマイシンの存在下でのみ活性があり、インビボでウイルスタンパク質が産生される間の安定性を外因的に調節するツールを提供できる可能性がある。まず、プラスミドによって発現されたＳＰＬＩＴ−ＴＥＶがＨＥＫ細胞中でＴＥＶ活性レポーターを切断する能力を試験し（図６Ｂ）、次いで、ウイルスによって発現されたカセットがＴＥＶ活性レポーターを切断する能力を試験した（図６Ｃ）。
【０１９８】
タンパク質の不安定化がニューロンの生存に及ぼす影響を厳密に調べるために、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来ニューロンにΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ｍＣｈｅｒｒｙを感染させた。感染ニューロンの生存を長期間的に追った研究を実施し、対照ΔＧ  Ｒａｂｉｅｓと生存率を比較した。ニューロンを感染させ、長期的に追って４−１０−１６日にイメージングして細胞死を評価した（図７Ａ、Ｂ〜Ｃ”）。操作が長期化し、イメージングセッションが夜通し繰り返されるため、細胞死を説明するために、ＧＦＰ発現レンチウイルスを使用して感染率を正規化した。感染後１６日に依然として検出できた対照ΔＧ−Ｒａｂｉｅｓ感染ニューロンは、２６±４％に過ぎなかった（各条件について、Ｎ＝３、ｎ＝７８１；図７Ｃ−Ｃ’’、Ｄ）。これに反して、ΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ｍＣｈｅｒｒｙウイルスは、１６日後では有意な細胞損失はみられず９４±６％であり（各条件についてＮ＝３、ｎ＝９１７、図４Ｂ〜Ｂ”、Ｃ）、ΔＧ−Ｒａｂｉｅｓ対照と比較して細胞生存は有意な増加を示した（Ｐ＝３．２×１０−５；対応のある両側スチューデントのｔ検定）。
【０１９９】
ΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ｍＣｈｅｒｒｙの細胞傷害性の低減がウイルス転写の低減と関連するかどうかを理解するために、同じ発現カセットを共有する、対照ΔＧ−ＲａｂｉｅｓおよびΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ｍＣｈｅｒｒｙウイルスを感染させたニューロンで発現したレポーターの強度をモニタリングした（図７Ｅ）。経時的には、ΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ｍＣｈｅｒｒｙ感染細胞のｍＣｈｅｒｒｙシグナルの平均は、対照より有意に低いという結果であった（１０日のｍＣｈｅｒｒｙ強度、ΔＧ−Ｒａｂｉｅｓ  １３８±３％、ΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ｍＣｈｅｒｒｙ  ８７±７％、各条件についてＰ＝０．０１；Ｎ＝３、ｎ＝５８４；対応のある両側スチューデントのｔ検定）。
【０２００】
次いで、インビボでΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ｍＣｈｅｒｒｙウイルスの性能を試験した。
ΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ｍＣｈｅｒｒｙウイルス中のｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を、ＣＲＥリコンビナーゼ（ΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ＣＲＥ）で置換した。これによって、ウイルスの転写活動が完全に停止した後も、確実に感染ニューロンを持続的に標識できるようになり、ウイルスのサイレンシングと細胞死とを識別が可能となる。ΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ＣＲＥを、海馬のＣＡ１に、Ｒｏｓａ−ＬｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ＬｏｘＰ−ｔｄｔｏｍａｔｏレポーターマウス系統のＣＡ１に注入した。ΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ＣＲＥ感染に対するニューロンの生存は、対照ΔＧ  Ｒａｂｉｅｓによる感染で観察されたニューロンの生存と比較して有意な増加が観察された（ΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ＣＲＥでは２週間で２５±２％、ΔＧ  Ｒａｂｉｅｓでは２週間では８±３％、Ｐ＝７×１０−３、図７Ｈ）。しかし、ΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ＣＲＥ感染では、顕著なニューロンの損失が依然として認められた（３週間で７６±３％、Ｐ＝９×１０−４）。
【０２０１】
ΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ＣＲＥで残存する細胞傷害性は、ＳＰＬＩＴ−ＴＥＶカセットの二量体化および活性の基礎量が構成的に低いことに関連していると考えられ、転写的に活性なウイルス粒子を生じ得る。この仮説と整合することに、ラパマイシンの存在または非存在下で、ニューロンの生存およびｍＣｈｅｒｒｙ発現レベルへの有意な影響がないことが観察されており（ｐ．ｉ．１０日のｍＣｈｅｒｒｙ発現、ΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ＲＡＰ  ８７±７％、ΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ＋ＲＡＰ  ８５±６％、Ｐ＝０．２１；各条件についてＮ＝３、ｎ＝７９３；対応のある両側スチューデントのｔ検定；図７Ｅ）、ｈＥＳＣ由来ニューロンでは、細胞生存への有意な影響がないことはラパマイシン投与と関連していた（１６日；ΔＧ−Ｒａｂｉｅｓ＋ＲＡＰ  ２６±４％、ΔＧ−Ｒａｂｉｅｓ−ＲＡＰ  ３０±７％、Ｐ＝０．６９；ΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ＋ＲＡＰ  ８８％±１１％、ΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ−ＲＡＰ  ９４％±６％、各条件についてＰ＝０．７９；Ｎ＝３、ｎ＝８３３；対応のある両側スチューデントのｔ検定、図７Ｄ）。さらに、ラパマイシン非存在下のＨＥＫ細胞では、構成的に低いレベルのＴＥＶ活性が観察され、これは、ラパマイシン非依存性ＳＰＬＩＴ−ＴＥＶ二量体化の基礎レベルを示すものである（図６Ｂ、ライン２）。全体として、これらの結果は、ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶは、ｈＥＳＣ由来ニューロンおよびインビボにおいて、ΔＧ−ΔＧ−Ｒａｂｉｅｓと比較して細胞傷害性を低減したことを示している。しかし、ΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓＳＰＬＩＴ−ＴＥＶは、感染後、完全にオフに切り換えることができず、これによって著しい遅延が生じ、ニューロンの細胞傷害性およびニューロンの損失を依然として呈する。これらの理由により、漏出するＳＰＬＩＴ−ＴＥＶを除去し、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＲＥカセットで置換することによって、ΔＧ−ＮＰＥＳＴＲａｂｉｅｓの第二世代を生成し、ＳＰＬＩＴ−ＴＥＶを所望のオン・オフおよびＴＥＶ依存性動態を有する自己不活性化Ｒａｂｉｅｓウイルス（ＳｉＲ）を得た（本文）。
材料および方法
【０２０２】
【表３】
2020518265.tif 000022
【０２０３】
動物系統
Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）マウスおよび以下のトランスジェニック系統を使用した：Ｒｏｓａ−ＬｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ＬｏｘＰ−ｔｄｔｏｍａｔｏ（Ｊａｃｋｓｏｎ：Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１４（ＣＡＧ  ｔｄＴｏｍａｔｏ、Ｒｏｓａ−ＬｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ＬｏｘＰ−ＹＦＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ：Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒ＜ｔｍ１（ＥＹＦＰ）Ｃｏｓ＞）。すべての手順は、ＵＫ  Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ  １９８６およびＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅに従って実施した。動物は、食物と水を自由摂取させ、１２時間光／暗周期で収容した。
ΔＧ  Ｒａｂｉｅｓおよびレンチウイルスプラスミドの設計および生成
表１に列記した弱毒化Ｒａｂｉｅｓプラスミドはすべて、出発物質としてｐＳＡＤ−ΔＧ−Ｆ３プラスミド（２１）を使用して、ギブソンクローニングによって生成した。簡潔に述べると、Ｒａｂｉｅｓゲノムは、タグ付けされる予定のタンパク質から開始して、２つの断片でＰＣＲ増幅した。次いで、これらの断片を、アニーリングするオリゴヌクレオチドによって得られたタグおよび／またはＰＥＳＴドメインと混合し、ギブソンマスターミックス（ＮＥＢ）を使用して連結した。
【０２０４】
パッケージング細胞を生成するのに使用したレンチウイルスベクターは、第三世代レンチウイルス遺伝子導入用ベクターから得た（ｐＣＣＬ−ＳＩＮ−１８ＰＰＴ．Ｐｇｋ．ＥＧＦＰ−ＷＰＲＥ由来「３６１ポリリンカー」、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｈａｓｔｉｎｇｓから寄贈）。レンチウイルスベクターはすべてギブソンアセンブリーによって生成し、ＸｂａＩおよびＫｐｎＩによる消化によって主鎖を開き、ＣＭＶプロモーターおよび様々な挿入断片をＰＣＲ増幅した。
細胞株
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＢＨＫは、ＡＴＴＣから購入した。Ｒａｂｉｅｓ糖タンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔパッケージング細胞（ＨＥＫ−ＧＧ）は、Ｌｅｎｔｉ−Ｈ２ＢＧＦＰ−２Ａ−ＧｌｙＳＡＤ（表１）を用いてレンチウイルス感染させ、３回継代した後、ＧＦＰ発現細胞の蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を行うことによって生成した。Ｒａｂｉｅｓ糖タンパク質およびＴＥＶプロテアーゼを発現するＨＥＫ２９３Ｔパッケージング細胞（ＨＥＫ−ＴＧＧ）は、ＨＥＫ−ＧＧを、Ｌｅｎｔｉ−ｐｕｒｏ−２Ａ−ＴＥＶを用いてレンチウイルス感染させ、３回継代した後、１μｇ／ｍＬのピューロマイシンを付加した培地にて１週間培養して選択して生成した。
【０２０５】
最適化Ｇを有するシュードタイプ化Ｒａｂｉｅｓウイルス用のＢＨＫパッケージング細胞（ＢＨＫ−ＴＧｏＧ）は、まず、ｐＬｅｎｔｉ−Ｈ２ＢＧＦＰ−２Ａ−ｏＧを感染させ、次いでｐＬｅｎｔｉ−ｐｕｒｏ−２Ａ−ＴＥＶを感染させる、同じ手順で生成した。ＥｎＶＡ受容体を有するシュードタイプ化Ｒａｂｉｅｓウイルス用のＢＨＫパッケージング細胞（ＢＨＫ−Ｔ−ＥｎＶＡ）は、ＢＨＫ−ＥｎＶＡにＬｅｎｔｉ−ｐｕｒｏ−２Ａ−ＴＥＶを感染させ、ピューロマイシンで選択することによって得た。
ウイルススクリーニング
弱毒化ΔＧ−Ｒａｂｉｅｓウイルスのスクリーニングのために、ＨＥＫ−ＧＧまたはＨＥＫ−ＴＧＧ細胞に、狂犬病ゲノムベクター、ｐｃＤＮＡ−Ｔ７、ｐｃＤＮＡ−ＳＡＤＢ１９Ｎ、ｐｃＤＮＡ−ＳＡＤＢ１９Ｐ、ｐｃＤＮＡ−ＳＡＤＢ１９Ｌ、およびｐｃＤＮＡ−ＳＡＤＢ１９Ｇを同時導入し（２１）、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）および１００ｕ／ｍｌペニシリン・ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で、加湿雰囲気下５％ＣＯ２中、３７℃で維持した。トランスフェクションから１日後、さらにそれ以降は３日毎に、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．０５％トリプシンで処理し、新しいディッシュに１：３比で再播種した。細胞は、分割した後、５％ＣＯ２中３７℃で１日、次いで３％ＣＯ２中３５℃で２日間、維持した。３日毎に細胞を固定し、ｍＣｈｅｒｒｙ発現について細胞をＦＡＣＳで選別することによって、ウイルス伝播を評価した。
ウイルス産生
高力価のΔＧ−Ｒａｂｉｅｓを回収するために、ＨＥＫ−ＧＧまたはＨＥＫ−ＴＧＧに、それぞれ対照または弱毒化Ｒａｂｉｅｓについて、ウイルススクリーニングの節に記載したようにして得たウイルスの上清１ｍｌを、７０〜８０％コンフルエントの１０ｃｍディッシュ中で感染させた。感染して１日後、細胞を分割し、５％ＣＯ２中３７℃で、１日または２日間維持し、毎日ウイルスの伝播を確認した。細胞の７０〜８０％がウイルスマーカーを発現した時点で、培地を２％ＦＢＳ  ＤＭＥＭと交換し、３５℃、３％ＣＯ２で、２日間維持した。次いで、２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、０．４５μｍフィルターを用いたろ過によってウイルス上清を収集し、細胞破片を除去し、次いで、前述のようにショ糖クッションを用いる超遠心分離法によってウイルスを濃縮した（２２）。
【０２０６】
ｏＧでシュードタイプ化したＲａｂｉｅｓウイルスは、ウイルス上清１ｍｌを含む１０ｃｍディッシュ中でＢＨＫ−Ｔ−ｏＧ細胞を感染させることにより産生させた。感染して１日後、細胞を分割し、５％中３７℃で、１日または２日間維持し、毎日ウイルスの伝播を確認した。細胞の７０〜８０％がウイルスマーカーを発現した時点で、培地を２％ＦＢＳ  ＤＭＥＭと交換し、３％ＣＯ２中３５℃で、２〜３日間維持した。次いで、既述されているように、上清を収集し、処理した（２０）。
【０２０７】
ＥｎＶＡでシュードタイプ化したＲａｂｉｅｓウイルスは、ＢＨＫ−ＥｎＶＡ細胞の代わりにＢＨＫ−Ｔ−ＥｎＶＡ細胞を使用して、既述されているように産生させた（２２）。
インビトロでの細胞傷害性分析
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）由来ニューロンは、Ｒｉｃｋ  Ｌｉｖｅｓｅｙ博士のご厚意により提供いただいた。細胞を２４ウェルガラス底プレートに播種し、同等のＭＯＩの弱毒化または対照ΔＧ−Ｒａｂｉｅｓウイルス上清を一晩感染させて、約５％の感染細胞を得た。細胞は、Ｈｉｂｅｒｎａｔｅ（登録商標）−Ａ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、３７℃に加温されたＬｅｉｃａ  ＳＰ８共焦点顕鏡の下で、一晩感染させた後４日毎に、各ウェルにつき無作為に５領域をイメージングした。細胞生存は、各条件について、同じ条件でイメージングし処理した対照レンチウイルス−ＧＦＰ感染ｈＥＳＣ由来ニューロンの致死率に対して正規化して算出した。
ウイルス注入
生きた動物を使用するすべての手順は、Ｈｏｍｅ  ＯｆｆｉｃｅおよびＬＭＢ  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ委員会によって承認された。すべての実験で、６〜１２週齢のマウスを使用した。マウスは、イソフルランを、初期導入では流量２Ｌ／分の酸素中３％で送達し、次いで、２Ｌ／分の酸素中１〜２％で維持して麻酔した。麻酔下の動物を定位固定装置（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に置き、リマダイル（２ｍｇ／ｋｇ体重）を抗炎症剤として皮下（ｓ．ｃ．）投与した。小さい孔（直径５００μｍ）を開け、ハミルトンニューロシリンジを使用してウイルスを注入した。シリンジは、脳内に５分間放置した後、引き抜いた。ウイルスは、以下の力価で注入した：Ｒａｂｉｅｓウイルスは３×１０８感染単位／ｍｌ、ＡＡＶは２×１０１２ゲノムコピー／ｍｌ、レンチウイルスは３×１０８感染単位／ｍｌ。最大４００ｎｌ体積までのウイルスを以下の脳領域に注入した：ＣＡ１（ブレグマから、ＡＰ：２．３ｍｍ、ＭＬ：１．６５ｍｍ、およびＤＶ：１．４５ｍｍ）、Ｖ１（ブレグマから、ＡＰ：２．３ｍｍ、ＭＬ：１．６５ｍｍ、およびＤＶ：１．４５ｍｍ）、Ｖ２（ブレグマから、ＡＰ：３．６ｍｍ、ＭＬ：１．２ｍｍ、ＤＶ：０．６ｍｍ）。
インビボでの細胞傷害性分析
インビボでウイルスの細胞傷害性を試験するために、４００ｎｌの同じ力価（３×１０８感染単位／ｍｌ）の弱毒化および対照ΔＧ−Ｒａｂｉｅｓを、２つの半球の対側の海馬ＣＡ１に注入した。ｐ．ｉ．１−２−３、または８週間に、クリオスタットで脳を切片化した（３５μｍ）。感染ニューロンを、１０倍率（０．４５ＮＡ）ドライタイプ対物レンズを備えたロボット支援Ｎｉｋｏｎ  ＨＣＡ顕微鏡を使用して、海馬全体をサンプリング（４切片毎に１つ取得）して、イメージングし、蛍光の海馬ニューロンを、Ｎｉｋｏｎ  ＨＣＡ解析ソフトウエアを使用してカウントした。弱毒化および対照ΔＧ−Ｒａｂｉｅｓの細胞生存は、同じ注入プロトコールを使用した対照レンチウイルス−ＧＦＰ感染海馬の致死率に対して各時点を正規化して算出した。
インビボでの薬物に誘導されるＳｉＲウイルスの再活性化
Ｒｏｓａ−ＬｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ＬｏｘＰ−ＹＦＰ動物の海馬のＣＡ１に、ドキシサイクリン誘導性プロモーターの調節下でｒＴＴＡおよびＴＥＶプロテアーゼを構成的に発現するＡＡＶを注入した（表１）。ｐ．ｉ．１週間、同じ領域にＳｉＲｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＲＥを再注入し、ＳｉＲ注入の１または２週間後に、ドキシサイクリン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１００ｍｇ／Ｋｇ）を投与した。薬物投与して１週間後、脳を採取し、クリオスタット（３５μｍ）で切片化した。感染ニューロンを、ロボット支援Ｎｉｋｏｎ  ＨＣＡ顕微鏡を使用して、海馬全体をサンプリング（４切片毎に１つ取得）して、イメージング、カウントした。
インビボでのＳｉＲゲノムコピーの解析
経時的に感染動物中のＳｉＲウイルスのゲノムコピー数を求めるために、ＳｉＲｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＲＥを、Ｒｏｓａ−ＬｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ＬｏｘＰ−ＹＦＰ動物の海馬のＣＡ１領域に注入した。１、２、３、または８週間後、マウスを選別した後、直ちに、注入された海馬を手作業で切除した。Ｔｉｓｓｕｅｌｙｓｅｒ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して海馬をホモジナイズし、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使ってメーカーの使用説明書に従って処理して全ＲＮＡを抽出した。海馬当たり５００ｎｇのＲＮＡを、ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＶキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写（ｒｅｔｒｏｔｒａｓｃｒｉｂｅ）させ、定量的ＰＣＲ（ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ  ｓｙｂｒ−グリーン）によってＧＡＤＰＨ、ＹＦＰ、およびｍＣｈｅｒｒｙ発現を解析した。定量化にはＬｉｖａｋ法を適用した。ＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙの発現は、ＧＡＤＰＨハウスキーピング遺伝子の発現（ＤＣＴ＝ＣＴｇｅｎｅ−ＣＴＧＡＤＰＨ）に対して正規化した。また、１週間時点に対する変化倍率（２−ＤＤＣＴ）としての経時的変動（ＤＤＣＴ＝ＤＣＴＴｉｍｅｐｏｉｎｔ−ＤＣＴ１ｗｅｅｋ）。
電気生理学
電気生理学的記録のために、１カ月齢のＲｏｓａ−ＬｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ＬｏｘＰ−ＣｈＲ２ＹＦＰマウスのＣＡ１の両側に、ＳｉＲｍＣｈｅｒｒｙ−ＣＲＥを注入した。記録は、ｐ．ｉ．１週間または２〜３カ月間行った。
【０２０８】
海馬冠状スライス（３５０μｍ）は、氷冷した、以下の組成物（ｍＭ）：ＫＣｌ  ３、ＮａＨ２ＰＯ４  １．２５、ＭｇＳＯ４  ２、ＭｇＣｌ２  １、ＣａＣｌ２  １、ＮａＨＣＯ３  ２６．４、グルコース  １０、ショ糖  ２０６、アスコルビン酸  ０．４０、キヌレン酸  １を含む、カルボゲンガス（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）で酸素化したショ糖ベースの切削溶液中で、振動ミクロトーム（７０００ｓｍｚ−２、Ｃａｍｐｄｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＬＴＤ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）を使用して調製した。スライスは、モル浸透圧濃度を２８０〜３００ｍＯｓｍ／Ｌに調整した酸素化人工脳脊髄液（ａＣＳＦ；ｍＭ：ＮａＣｌ  １２６、ＫＣｌ  ３、ＮａＨ２ＰＯ４  １．２５、ＭｇＳＯ４  ２、ＣａＣｌ２  ２、ＮａＨＣＯ３  ２６．４、グルコース  １０）が入った水浸式保持チャンバー内で、３７℃で３０分間インキュベートし、その後、同じ保持チャンバー内で、室温で少なくとも１時間保管した。次いで、スライスを個別に記録チャンバーに移し、酸素化ａＣＳＦを室温で約２ｍｌ／分の流速で灌流した。
【０２０９】
ホールセルの電流クランプ記録は、ホウケイ酸ガラスキャピラリー（１．５ｍｍ  ＯＤ×０．８６ｍｍ  ＩＤ）を引き延ばした６〜９ＭΩピペットを使用して、ＣＡ１ニューロンから得た。ピペットには、（ｍＭで）Ｋ−グルコン酸  １５０、ＨＥＰＥＳ  １０、ＮａＣｌ  ４、ＡＴＰ−Ｍｇ  ４、ＧＴＰ−Ｎａ  ０．３、およびＥＧＴＡ  ０．２を含有し、ｐＨ７．２およびモル浸透圧濃度２７０〜２９０ｍＯｓｍ／Ｌに調整された人工細胞内液を満たした。データは、Ａｘｏｎ  Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ  ７００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して記録し、シグナルは、ｐＣｌａｍｐを実行するＰＣ上でデジタイザー（Ａｘｏｎ  Ｄｉｇｉｄａｔａ  １５５０Ａ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、２ｋＨのローパスフィルターでカットし、５ｋＨｚで獲得した。ＳｉＲウイルス感染ニューロンからの光誘発反応は、４０倍率水浸対物レンズ（０．８ＮＡ）を通して、４５０〜４９０ｎｍのＬＥＤ光（ｐＥ−３００  ｃｏｏｌＬＥＤ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａ  Ｌｔｄ、Ｕｃｋｆｉｅｌｄ、ＵＫ）を使用して誘発した。
薬理学
ＳｉＲウイルス感染ニューロンと近傍ニューロンとの間のシナプス結合性を徹底的に調べるために、電気生理学的記録の一部において、ＡＭＰＡ受容体拮抗剤ＤＮＱＸ（２０μＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）を使用した。
インビボ二光子イメージング
ウイルス注入済みＲｏｓａ−ＬｏｘＰ−ＳＴＯＰ−ＬｏｘＰ−ｔｄＴｏｍａｔｏマウス（ウイルス注入の節を参照されたい）に、２％イソフルランで麻酔をかけた。動物にピンチ刺激を与えて引っ込み反射および眼瞼反射を試験して、麻酔深度をアッセイした。抗炎症剤としてリマダイル（２ｍｇ／ｋｇ体重）を皮下に注入した。実験中、角膜の乾燥防止のために、両眼を眼軟膏で覆った。動物は、頭部を固定し、メタルヘッドポストを頭蓋骨にセメント接着した。Ｖ１皮質の上部に直径４ｍｍの穴を開けて開頭した。頭蓋骨を除去した後、皮質表面を、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、および２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有しｐＨ７．３に調整された皮質緩衝液で湿った状態に保った。次いで、皮質を特注のプラグカバーガラスで覆い（２３）、Ｓｕｐｅｒ  Ｇｌｕｅおよび歯科用セメントでシールした。マウスに２％イソフルランで麻酔をかけ、９２０ｎｍに同調させたＴｉ：モード同期サファイアレーザー（Ｍａｉ  Ｔａｉ−Ｓｅｒｉｅｓ、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｈｙｓｉｃｓ）を備えた二光子レーザースキャニング顕微鏡（Ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａ  Ｌｔｄ．、Ｕｃｋｆｉｅｌｄ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）の下に載せた。イメージングは、それぞれ３９０×３９０μｍおよび１９５×１９５μｍの撮像視野が得られるズームレンズ２または４と共に、２５６×２５６画ピクセルの解像度で水浸レンズ（Ｎｉｋｏｎ、１６×、０．８ＮＡ）によって実施した。データは３．５Ｈｚで取得した。対物レンズは、ヘッドプレート上に固定したプラスチック製ｏリングで取り付けた円錐形の黒布で遮蔽した（２４）。視覚刺激は、（ＰｓｙｃｈｏＰｙツールボックスをベースとした）Ｐｙｔｈｏｎで特注のＧＵＩを使用して調節し、マウスの左眼から１５ｃｍに配置したＬＥＤスクリーンを用いて実施した。１ステップ３０度で１２方位に移動する矩形波格子を呈示し、フォトダイオードを使用して各刺激の開始および終了時間を検出した。各格子方位は、ブランク条件と交互に、無作為の順序で５回呈示した。格子の空間周波数は視角１度当たりの周期数（ｃｐｄ）が０．０４であり、時間周波数は１Ｈｚであった。イメージングおよび視覚刺激は、Ａｒｄｕｉｎｏマイクロコントローラーボードを使用して一緒に起動させた。イメージングセッションは２時間まで継続し、試料での出力は３０〜４０ｍＷの範囲に調節した。データ解析はＩｍａｇｅＪおよびＭａｔｌａｂで実施し、細胞体に限定した。対象領域（ＲＯＩ）の検出は、Ｓｕｉｔｅ２ｐを用いて実施した。蛍光の相対的変化は、ｄＦ／Ｆ０＝（Ｆ（ｔ）−Ｆ０）／（Ｆ０）として算出した。方向チューニング曲線は、刺激期間全般の各方向への応答の平均をとって作成した。応答振幅は、刺激前のベースラインと比較した刺激期間中の蛍光の相対的変化として示す（ｄＦ／Ｆ）。データはすべて、平均±ＳＥＭとして示す。
＊＊＊
本発明は、上述の典型的な態様に関連して説明してきたが、本開示を考慮すると、多くの等価の改変および変形が当業者に明らかとなるであろう。したがって、記載の本発明の典型的な態様は、例示的であって限定的なものではないとみなされる。本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、記載した態様に対する様々な変更を行ってもよい。本明細書に引用されたすべての文書は、明らかに参照により組み込まれる。
【０２１０】
特許出願および登録特許を含む、本出願におけるすべての参考文献の教示は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。本出願が優先権を主張する特許出願はいずれも、刊行物および参考文献について本明細書で説明したように、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【０２１１】
疑義を避けるために明記すれば、本明細書において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、発明者らによって、あらゆる場合において、それぞれ、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」、および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」という用語と所望により代替可能であるものとされる。すべての数値の「約」（または「およそ」）という用語は、５％の変動を見込み、すなわち、約１．２５％の値は、１．１９％〜１．３１％の間を意味することになる。
【０２１２】
本明細書に記載の特定の態様は、例示として示されており、本発明を限定するものではないことが理解されよう。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な態様において用いることができる。当業者であれば、本明細書に記載された具体的な手順に対する数多くの均等物を、通常の試験の使用程度で認識または確認することができるであろう。そのような均等物は、本発明の範囲内にあるとみなされ、特許請求の範囲に包含される。本明細書で言及したすべての刊行物および特許出願は、本発明が属する分野の当業者の技術レベルを示すものである。すべての刊行物および特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが指摘された場合と同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１３】
「ａ」または「ａｎ」という単語の使用は、特許請求の範囲および／または本明細書において「含む」という用語に関連して使用される場合、「１つの」を意味し得るが、「１つ以上の」、「少なくとも１つの」、および「１つまたは複数の」の意味とも一致する。特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すことが明確に指摘されていない限り、または代替物が相互に排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみ、および「および／または」を指す定義を支持する。本出願を通して、「約」という用語は、値が、測定、その値を決定するために用いられる方法の誤差の固有変動または研究対象間に存在するばらつきを含むことを示すために使用される。
【０２１４】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態），「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」などの有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形態）、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形態）という単語は、包括的または非制限的であり、引用されていない要素または方法工程の追加を除外するものではない。
【０２１５】
本明細書で使用される「またはそれらの組合せ」という用語は、その用語に先行して列挙された項目のすべての順列および組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの組合せは、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣの少なくとも１つを含むことが意図され、特定の状況において順序が重要であれば、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、またはＣＡＢもまた含むことが意図される。この例を続けると、１つまたは複数の項目または用語の反復を含有する組合せ、例えばＢＢ、ＡＡＡ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどが明らかに含まれる。特に文脈から明白でない限り、当業者は、典型的には、任意の組合せのなかで、項目または用語の数に関し制限がないことを理解するであろう。
【０２１６】
本明細書において開示され主張された組成物および／または方法のすべては、本開示に照らして、必要以上の実験をすることなく作製し、実行することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい態様に関して説明されているが、当業者には、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物および／または方法ならびに工程または方法の工程の順序に変更を加えてもよいことは明らかとなろう。当業者に明らかなそのような同様の置換および改変はすべて、添付の特許請求の範囲によって定義されているような本発明の趣旨、範囲、および概念のうちであるとみなされる。
参考文献
【０２１７】
【表４−１】
2020518265.tif 000023
【０２１８】
【表４−２】
2020518265.tif 000024
【０２１９】
【表４−３】
2020518265.tif 000025
【０２２０】
【表４−４】
2020518265.tif 000026
【０２２１】
本発明の側面
以下の番号付けされた条項は、本明細書において開示した創意に富む技術的特徴の広範囲の組合せについての記述を含む。
１．複製モジュレータータンパク質をコードする遺伝子を含むモノネガウイルスベクターゲノムであって、複製モジュレータータンパク質が、ウイルスゲノムの複製のために必要なモノネガウイルスタンパク質部分を含み、複製モジュレータータンパク質が、デグロンを提示する標的化されている構成とデグロンを提示しない標的化されていない構成とをとることができる、モノネガウイルスベクターゲノム。
２．ベクターゲノムによってコードされた複製モジュレータータンパク質が、ウイルスタンパク質部分およびレギュレーター部分を含む抑制モジュレーターであり、レギュレーター部分が、デグロンを含むまたはデグロンからなる、条項１に記載のベクターゲノム。
３．レギュレーター部分が、コグネート活性化剤と接触すると、標的化されていない構成へと切換え可能である、条項２に記載のベクターゲノム。
４．活性化剤が、レギュレーター部分をウイルスタンパク質部分から切断する、条項３に記載のベクターゲノム。
５．活性化剤がプロテアーゼである、条項４に記載のベクターゲノム。
６．レギュレーター部分が、ウイルスタンパク質部分とデグロンとの間に位置する、プロテアーゼの切断部位を含む、条項５に記載のベクターゲノム。
７．プロテアーゼが、ベクターゲノムによってコードされたその他のどのタンパク質にも作用しない、条項５または条項６に記載のベクターゲノム。
８．プロテアーゼが、ウイルスプロテアーゼ、第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、またはトロンビンである、条項５から７のいずれか一項に記載のベクターゲノム。
９．デグロンがＰＥＳＴ配列である、条項２から８のいずれか一項に記載のベクターゲノム。
１０．モジュレータータンパク質が、第１のＮ末端残基を含み、第１のＮ末端残基より高い安定性を付与する第２のＮ末端残基を露出するようにコグネートプロテアーゼによって切断可能である、条項２から９のいずれか一項に記載のベクターゲノム。
１１．活性化剤がベクターゲノムによってコードされ、薬剤の発現または機能が誘導性である、条項３から１０のいずれか一項に記載のベクターゲノム。
１２．活性化剤が、レギュレーター部分のためのリガンドである、条項３に記載のベクターゲノム。
１３．デグロンがＤＤ−ＦＫＢＰ配列であり、活性化剤がそのためのリガンドである、条項１２に記載のベクターゲノム。
１４．ベクターゲノムによってコードされた複製モジュレータータンパク質が、コグネート抑制剤と接触すると、デグロンを提示する標的化されている構成へ切換え可能である、抑制可能モジュレータータンパク質である、条項１に記載のベクターゲノム。
１５．複製モジュレータータンパク質が、ウイルスタンパク質部分およびレギュレーター部分を含み、抑制剤が、レギュレーター部分をモジュレータータンパク質から切断して、デグロンを創出するまたは露わにする、条項１４に記載のベクターゲノム。
１６．活性化剤がプロテアーゼである、条項１５に記載のベクターゲノム。
１７．レギュレーター部分が、ウイルスタンパク質部分とデグロンとの間に位置する、プロテアーゼのための切断部位を含む、条項１４に記載のベクターゲノム。
１８．プロテアーゼが、ベクターゲノムによってコードされたその他のどのタンパク質にも作用しない、条項１４または条項１５に記載のベクターゲノム。
１９．プロテアーゼが、ウイルスプロテアーゼ、第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、またはトロンビンである、条項１６から１８のいずれか一項に記載のベクターゲノム。
２０．モジュレータータンパク質が、第１のＮ末端残基を含み、第１のＮ末端残基より低い安定性を付与する第２のＮ末端残基を露出するようにプロテアーゼによって切断可能である、条項１６から１９のいずれか一項に記載のベクターゲノム。
２１．複製モジュレータータンパク質がウイルスタンパク質部分およびレギュレーター部分を含み、抑制剤がレギュレーター部分のためのリガンドであり、レギュレーター部分および抑制剤が誘導性デグロンシステムの成分である、条項１４に記載のベクターゲノム。
２２．レギュレーター部分がＨａｌｏＴａｇ配列を含み、抑制剤がそのためのリガンドである、条項２１に記載のベクターゲノム。
２３．レギュレーター部分がＬＩＤ−ＦＫＢＰ配列を含み、抑制剤がそのためのリガンドである、条項２１に記載のベクターゲノム。
２４．レギュレーター部分がオーキシン誘導デグロン配列を含み、抑制剤がそのためのリガンドである、条項２１に記載のベクターゲノム。
２５．抑制剤がベクターゲノムによってコードされ、該薬剤の発現または機能が誘導性である、条項１４から２４のいずれか一項に記載のベクターゲノム。
２６．ラブドウイルスベクターゲノムである、条項１から２５のいずれか一項に記載のベクターゲノム。
２７．ベクターゲノムが、リッサウイルスベクターゲノムまたはベジクロウイルスベクターゲノムである、条項２６に記載のベクターゲノム。
２８．リッサウイルスベクターゲノムが狂犬病ウイルスベクターゲノムであり、またはベジクロウイルスベクターゲノムが水疱性口内炎ウイルスベクターゲノムである、条項２７に記載のベクターゲノム。
２９．複製モジュレーターのウイルスタンパク質部分が、モノネガウイルスＮ（核タンパク質）タンパク質を含むまたはモノネガウイルスＮ（核タンパク質）タンパク質からなる、条項１から２８のいずれか一項に記載のベクターゲノム。
３０．ゲノムが、Ｐタンパク質、Ｍタンパク質、および／またはＬタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、条項２９に記載のベクターゲノム。
３１．ゲノムが、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む、条項１から３０のいずれか一項に記載のベクターゲノム。
３２．エンベロープタンパク質が、モノネガウイルスベクターに天然に存在するものである、条項３１に記載のベクターゲノム。
３３．エンベロープタンパク質が、シュードタイプ化エンベロープタンパク質である、条項３１に記載のベクターゲノム。
３４．ベクターゲノムが、エンベロープタンパク質をコードしていない、条項１から３０のいずれか一項に記載のベクターゲノム。
３５．ベクターゲノムが、１つまたは複数の異種遺伝子をさらに含む、条項１から３４のいずれか一項に記載のベクターゲノム。
３６．異種遺伝子が、マーカータンパク質、免疫応答を引き起こす対象とすることが望ましいタンパク質、リコンビナーゼ、ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子、修復鋳型ＲＮＡ、または遺伝子発現の核酸モジュレーターをコードする、条項３５に記載のベクターゲノム。
３７．ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである、条項３６に記載のベクターゲノム。
３８．ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子および／または修復鋳型ＲＮＡとをコードする異種遺伝子を含む、条項３７に記載のベクターゲノム。
３９．１つまたは複数のウイルスタンパク質とともに条項１から３８のいずれか一項に記載のベクターゲノムを含むリボ核タンパク質複合体。
４０．Ｎ、Ｐ、およびＬタンパク質とともにベクターゲノムを含む、条項３９に記載のリボ核タンパク質複合体。
４１．標的細胞の細胞質に導入されると転写を開始することができる機能性ウイルスヌクレオカプシドである、条項３９または条項４０に記載のリボ核タンパク質複合体。
４２．条項１から３８のいずれか一項に記載のモノネガウイルスベクターゲノムを含む、モノネガウイルスベクタービリオン。
４３．天然のモノネガウイルスエンベロープタンパク質を含む、条項４２に記載のベクターゲノム。
４４．シュードタイプ化エンベロープタンパク質を含む、条項４２に記載のベクタービリオン。
４５．医学的処置の方法において使用される、条項１から３８のいずれか一項に記載のベクターゲノム、条項３９から４１のいずれか一項に記載のリボ核タンパク質複合体、または条項４２から４４のいずれか一項に記載のベクタービリオン。
４６．免疫賦活剤として使用される、条項１から３８のいずれか一項に記載のベクターゲノム、条項３９から４１のいずれか一項に記載のリボ核タンパク質複合体、または条項４２から４４のいずれか一項に記載のベクタービリオン。
４７．条項１から３８のいずれか一項に記載のウイルスベクターゲノムをコードするプラス鎖核酸分子。
４８．条項１から３８のいずれか一項に記載のベクターゲノムをコードする核酸構築物を含み、条項４２から４４のいずれか一項に記載のビリオン産生することができる、パッケージング細胞。
４９．標的細胞を、条項３９から４１のいずれか一項に記載のリボ核タンパク質複合体または条項４２から４４のいずれか一項に記載のビリオンと接触させるステップを含む、標的細胞への遺伝子送達の方法。
５０．ベクターが抑制モジュレータータンパク質をコードし、方法が、細胞をコグネート活性化剤と接触させるステップを含む、条項４９に記載の方法。
５１．活性化剤がタンパク質であり、方法が、活性化剤が標的細胞において発現されるように、活性化剤をコードする遺伝子を含む核酸を標的細胞へ導入するステップを含む、条項５０に記載の方法。
５２．ベクターが抑制可能モジュレータータンパク質をコードし、方法が、細胞をコグネート抑制剤と接触させるステップを含む、条項４９に記載の方法。
５３．抑制剤がタンパク質であり、方法が、抑制剤が標的細胞において発現されるように、抑制剤をコードする遺伝子を含む核酸を標的細胞へ導入するステップを含む、条項５２に記載の方法。
５４．薬剤の発現および／または機能が誘導性であり、方法が、標的細胞において薬剤の発現および／または機能を誘導するステップを含む、条項５０から５３のいずれか一項に記載の方法。
５５．（ｉ）ベクターが抑制可能モジュレータータンパク質および活性化剤をコードしており、活性化剤の発現または機能が誘導性であり、方法が、標的細胞において活性化剤の発現および／または機能を誘導するステップを含む、または
（ｉｉ）ベクターが抑制可能モジュレータータンパク質および抑制剤をコードしており、抑制剤の発現または機能が誘導性であり、方法が、標的細胞において抑制剤の発現および／または機能を誘導するステップを含む、
条項４９に記載の方法。
５６．標的細胞をコグネートインデューサーと接触させるステップを含む、条項５５に記載の方法。
５７．ベクターゲノムがエンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含んでおらず、方法が、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を含む核酸構築物を標的細胞へ導入するステップを含む、条項４９から５６のいずれか一項に記載の方法。
５８．標的細胞が神経細胞である、条項４９から５７のいずれか一項に記載の方法。
５９．条項１から３８のいずれか一項に記載のベクターゲノム、条項３９から４１のいずれか一項に記載のリボ核タンパク質複合体、または条項４２から４４のいずれか一項に記載のビリオン、ならびに（ａ）コグネート活性化もしくは抑制剤またはコグネート活性化もしくは抑制剤をコードする核酸、および／または（ｂ）エンベロープタンパク質をコードする核酸を含むキット。
６０．条項３９から４１のいずれか一項に記載のリボ核タンパク質複合体または条項４２から４４のいずれか一項に記載のビリオンを含み、所望により賦形剤または担体と混合されている組成物。
６１．組成物が医薬組成物であり、担体が薬学的に許容される担体である、条項６０に記載の組成物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１１−７】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【国際調査報告】
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