(57)【要約】  フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン抗体、ＦＮ３ドメイン抗体又は抗原結合フラグメントをコードすることができるポリヌクレオチド、ＦＮ３ドメイン抗体又は抗原結合フラグメントを発現する細胞、並びに関連ベクター及び検出可能に標識されたＦＮ３ドメイン抗体又は抗原結合フラグメントを使用して、ＦＮ３ドメイン標的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を遺伝子操作することができる。ＦＮ３ドメイン抗体、ＣＡＲ、及び遺伝子操作された免疫細胞を作製する方法、並びに遺伝子操作された免疫細胞を使用する方法は、がんを含む疾患の治療に適用できる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｂ．配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｃ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｄ．配列番号３５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号４６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｅ．配列番号３６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｆ．配列番号３７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｇ．配列番号３８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号５４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号５６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｈ．配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号５５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号５７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、若しくは
ｉ．配列番号４０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号５５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号５７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含む、請求項１に記載の単離抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３】
ｄ．前記抗体の前記可変重鎖は配列番号１４のアミノ酸配列を含み、前記抗体の前記可変軽鎖は配列番号１５のアミノ酸配列を含む、
ｅ．前記抗体の前記可変重鎖は配列番号７４のアミノ酸配列を含み、前記抗体の前記可変軽鎖は配列番号７５のアミノ酸配列を含む、若しくは
ｆ．前記抗体の前記可変重鎖は配列番号７８のアミノ酸配列を含み、前記抗体の前記可変軽鎖は配列番号７９のアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４】
ｅ．前記抗体の前記重鎖は配列番号１８のアミノ酸配列を含み、前記抗体の前記軽鎖は配列番号１９のアミノ酸配列を含む、
ｆ．前記抗体の前記重鎖は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、前記抗体の前記軽鎖は配列番号２１のアミノ酸配列を含む、
ｇ．前記抗体の前記重鎖は配列番号６２のアミノ酸配列を含み、前記抗体の前記軽鎖は配列番号６３のアミノ酸配列を含む、若しくは
ｈ．前記抗体の前記重鎖は配列番号６４のアミノ酸配列を含み、前記抗体の前記軽鎖は配列番号６５のアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ２フラグメント、又は一本鎖抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントはＩｇＧである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントをコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項９】
請求項７に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【請求項１０】
請求項８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離ポリヌクレオチドであって、
（ａ）ＦＮ３ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合するｓｃＦｖを含む細胞外ドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記ＣＡＲは、任意追加的に、前記細胞外ドメインと前記膜貫通ドメインとを連結するヒンジ領域を更に含む、
前記単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記コードされるＣＡＲは、
（ａ）配列番号６８〜７３のうちの１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを含む細胞外ドメインと、
（ｂ）配列番号２４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むヒンジ領域と、
（ｃ）配列番号２５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインと、
（ｄ）配列番号２６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する共刺激ドメインと、配列番号２７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインとを含む、細胞内シグナル伝達ドメインと
を含む、請求項１１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記コードされるＣＡＲは、
（ａ）配列番号６８〜７３のうちの１つのアミノ酸配列を含む細胞外ドメインと、
（ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むヒンジ領域と、
（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインと、
（ｄ）配列番号２６のアミノ酸配列及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む、細胞内シグナル伝達ドメインと
を含む、請求項１２に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１５】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１７】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
（ａ）ＦＮ３ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合するｓｃＦｖを含む細胞外ドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記ＣＡＲは、任意追加的に、前記細胞外ドメインと前記膜貫通ドメインとを連結するヒンジ領域を更に含む、
前記ＣＡＲ。
【請求項１８】
（ａ）配列番号６８〜７３のうちの１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを含む細胞外ドメインと、
（ｂ）配列番号２４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むヒンジ領域と、
（ｃ）配列番号２５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインと、
（ｄ）配列番号２６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する共刺激ドメインと、配列番号２７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインとを含む、細胞内シグナル伝達ドメインと
を含む、請求項１７に記載のＣＡＲ。
【請求項１９】
（ａ）前記細胞外ドメインは配列番号６８〜７３のうちの１つのアミノ酸配列を含み、
（ｂ）前記ヒンジ領域は配列番号２４のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）前記膜貫通ドメインは配列番号２５のアミノ酸配列を含み、
（ｄ）前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む、
請求項１８に記載のＣＡＲ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれている配列表を含む。当該ＡＳＣＩＩのコピーは、２０１８年６月２９日に作成され、ファイル名はＪＢＩ５０３２ＷＯＰＣＴＳＬ．ｔｘｔであり、そのサイズは８８，１２０バイトである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３ドメイン）に特異的に結合する抗体、並びに記載の抗体を産生及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
フィブロネクチン系スキャフォールドは、対象とする任意の化合物を結合するために進化可能なタンパク質ファミリーである。これらのタンパク質は、一般的に、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）又はＦＮ３様ドメインに由来するスキャフォールドを使用し、天然又は遺伝子操作された抗体（すなわち、ポリクローナル、モノクローナル、又は単鎖抗体）に特徴的な様式で機能し、更に構造的利点を有する。具体的には、これらの抗体模倣物の構造は、通常は抗体における構造及び機能の損失をもたらす条件下であっても、最適なフォールディング、安定性、及び溶解性を有するように設計されている。フィブロネクチン系スキャフォールドタンパク質の例は、Ｃｅｎｔｙｒｉｎ（商標）（Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７−１１７，２０１２；米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号）である。
【０００４】
フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の順にβ又はβ様鎖Ａ、ループＡＢ、β又はβ様鎖Ｂ、ループＢＣ、β又はβ様鎖Ｃ、ループＣＤ、β又はβ様鎖Ｄ、ループＤＥ、β又はβ様鎖Ｅ、ループＥＦ、β又はβ様鎖Ｆ、ループＦＧ、及びβ又はβ様鎖Ｇを含む。ループＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、及びＦＧのいずれか、又は全てが、標的結合に関与し得る。ＢＣ、ＤＥ、及びＦＧループは、免疫グロブリンからの相補性決定領域（ＣＤＲ）と構造的かつ機能的に類似している。
【０００５】
小さいサイズ、ジスルフィド結合の欠如、高安定性、及び原核生物宿主で発現する能力を考慮すると、ＦＮ３ドメインは、生物薬剤学的関心を得ている。ＦＮ３ドメインは、薬物／毒素に容易に共役され、組織に効率的に浸透し、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む多重特異的結合剤及び融合タンパク質に容易にフォーマットされ得る。
【０００６】
その汎用性にもかかわらず、現在、検出、アッセイ、又は生物薬剤学的目的のためにＦＮ３ドメインに特異的に結合する抗体は現在存在しない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの非ランダム化領域に結合する抗体及び抗原結合フラグメントを含む。また、提供されたＦＮ３抗体及び抗原結合フラグメントをコード可能な関連するポリヌクレオチド、提供された抗体及び抗原結合フラグメントを発現する細胞、並びに関連するベクター、並びに検出可能に標識されたＦＮ３ドメイン抗体及び抗原結合フラグメントもまた記載されている。抗体又はその抗原結合フラグメントは、実施例３に示す条件下でＥＬＩＳＡによって測定されるＦＮ３ドメインのランダム化領域に選択的に結合しない。
【０００８】
加えて、提供されたＦＮ３ドメイン抗体及び抗原結合フラグメントを使用する方法を記載する。記載のＦＮ３ドメイン抗体及び抗原結合フラグメントを使用して、ＦＮ３ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のＴ細胞表面発現を検出することができる。別の実施形態では、記載のＦＮ３ドメイン抗体及び抗原結合フラグメントを使用して、ＦＮ３ドメインを含む、ＣＡＲを発現するＴ細胞を活性化することができる。更に別の実施形態では、記載のＦＮ３ドメイン抗体又は抗原結合フラグメントを使用して、記載の抗原結合フラグメントを含むＣＡＲを生成することができる。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本発明は、単離抗体及び抗原結合フラグメントを含み、これらの抗体又は抗原結合フラグメントは、ＦＮ３ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合する。これらのＦＮ３ドメイン抗体、又はこれらの抗原結合フラグメントは、ＦＮ３ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のＴ細胞表面発現を検出し得る。いくつかの実施形態では、ＦＮ３ドメイン抗体又は抗原結合フラグメントは、ＦＮ３ドメインを含むＣＡＲを発現するＴ細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、ＦＮ３ドメイン抗体及び抗原結合フラグメントは、ループ領域において改変されたＦＮ３ドメインに結合する。表１は、本明細書に記載のＦＮ３ドメイン特異的抗体のＣＤＲ配列を提供する。
【００１０】
【表１】
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【００１１】
一部の実施形態では、ＦＮ３抗体又はその抗原結合フラグメントは、表１に記載のアミノ酸配列のうちいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖と、表１に記載のアミノ酸配列のうちいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖とを含む。本発明のＦＮ３ドメイン抗体は、配列番号１４の重鎖可変領域配列を含んでよく、配列番号１５の軽鎖可変領域配列を含んでよい。他の実施形態では、本発明のＦＮ３ドメイン抗体は、配列番号７４の重鎖可変領域配列を含んでよく、配列番号７５の軽鎖可変領域配列を含んでよい。他の実施形態では、本発明のＦＮ３ドメイン抗体は、配列番号７８の重鎖可変領域配列を含んでよく、配列番号７９の軽鎖可変領域配列を含んでよい。
【００１２】
本明細書に記載のＦＮ３ドメイン抗体は、ＩｇＧアイソタイプのいずれかとの組み合わせで、ＣＤＲ及び可変ドメインの記載の特徴を有する抗体を含む。同ＩｇＧアイソタイプは、Ｆｃ配列が異なるエフェクター機能をもたらすために改変されている改変版を含む。
【００１３】
記載のＦＮ３ドメイン抗体及び抗原結合フラグメントに加えて、ＦＮ３ドメイン抗体及び抗原結合フラグメントをコード可能なポリヌクレオチド配列もまた提供される。記載のポリヌクレオチドを含むベクターも提供され、同様に、ＦＮ３ドメイン抗体又は抗原結合フラグメントを発現する細胞も本明細書において提供される。また、開示されたベクターを発現可能な細胞も記載される。これらの細胞は、哺乳類細胞（例えば、２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）、酵母細胞、植物細胞、又は細菌細胞（例えば、大腸菌）であってよい。ＦＮ３ドメイン抗体又は抗原結合フラグメントを産生するためのプロセスもまた提供される。
【００１４】
本発明はまた、
（ａ）ＦＮ３ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合するｓｃＦｖを有する細胞外ドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、単離ポリペプチドを含む本発明のＣＡＲを含む。
ＣＡＲは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとを連結するヒンジ領域を更に含み得る。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ単離ポリペプチドは、
（ａ）配列番号６８〜７３のうちの１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号６８〜７３のうちの１つのアミノ酸配列を有するＦＮ３ドメインのような、本発明のＦＮ３ドメインを含む細胞外ドメインと、
（ｂ）配列番号２４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号２４のアミノ酸配列を有するヒンジ領域と、
（ｃ）配列番号２５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号２５のアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインと、
（ｄ）配列番号２６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号２６のアミノ酸配列を有する共刺激ドメインと、配列番号２７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号２７のアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインとを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。
【００１６】
本発明はまた、
（ａ）ＦＮ３ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合するｓｃＦｖを有する細胞外ドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、本発明のＣＡＲをコードする単離ポリヌクレオチドを含む。
ＣＡＲは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとを連結するヒンジ領域を更に含み得る。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする単離ポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号６８〜７３のうちの１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号６８〜７３のうちの１つのアミノ酸配列を有するＦＮ３ドメインのような、本発明のＦＮ３ドメインを含む細胞外ドメインと、
（ｂ）配列番号２４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号２４のアミノ酸配列を有するヒンジ領域と、
（ｃ）配列番号２５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号２５のアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインと、
（ｄ）配列番号２６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号２６のアミノ酸配列を有する共刺激ドメインと、配列番号２７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号２７のアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインとを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。
【００１８】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明のＣＡＲ、本発明のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、及び本発明のＣＡＲをコードするベクター又は単離ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。本発明はまた、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を、ＣＡＲを産生するための条件下で培養することと、ＣＡＲを回収することとを含む、本発明のＣＡＲを生産する方法にも関する。ＣＡＲは、宿主細胞又は宿主細胞から単離された細胞膜と関連付けることができる。
【００１９】
別の一般的な態様によれば、本発明は、本発明のＣＡＲを含む遺伝子操作された免疫細胞に関する。好ましくは、遺伝子操作された免疫細胞は、Ｔ細胞受容体ノックアウト免疫細胞である。好ましくは、遺伝子操作された免疫細胞は、ＨＬＡ  Ｉ／Ｂ２−ミクログロブリンノックアウト免疫細胞である。場合により、ＨＬＡ  Ｉ／Ｂ２−ミクログロブリンノックアウト免疫細胞は更に、宿主患者からの同種異系免疫応答を欠くＨＬＡ  ＩＩノックアウト免疫細胞であってもよい。遺伝子操作された免疫細胞は、ＦＮ３ドメインとは異なる標的に特異的に結合する細胞外ドメインを有する第２のＣＡＲを含むことができる。遺伝子操作された免疫細胞はまた、少なくとも１つの抗がん化学療法に対する耐性を有してもよい。
【００２０】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明の遺伝子操作された免疫細胞を含む医薬組成物に関する。
【００２１】
別の一般的な態様では、本発明は、治療有効量の本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む、Ｂ細胞に関連した病態の治療を要する対象における、Ｂ細胞に関連した病態を治療する方法に関する。好ましい実施形態では、Ｂ細胞に関連した病態は多発性骨髄腫である。
【００２２】
別の一般的な態様では、本発明は、免疫細胞を得ることと、本発明のＣＡＲをコードするポリペプチドを細胞内に導入することとを含む、本発明の免疫細胞を遺伝子操作する方法に関する。
【００２３】
別の一般的態様では、本発明は、本発明の遺伝子操作された免疫細胞を薬学的に許容される担体と組み合わせて医薬組成物を得ることを含む、医薬組成物の製造方法に関する。
【００２４】
本開示のＦＮ３ドメイン抗体又はその抗原結合フラグメントを含むキットは、本発明の範囲内である。記載のキットを使用して、本明細書で提供されたＦＮ３ドメイン抗体又は抗原結合フラグメントを使用する方法、又は当業者に既知の他の方法を行うことができる。いくつかの実施形態では、記載のキットは、本明細書に記載のＦＮ３ドメイン抗体又は抗原結合フラグメント、生体サンプル中のＦＮ３ドメインの存在を検出する際に用いられる試薬、任意追加的に、使用していないときにＦＮ３ドメイン抗体又はフラグメントを収容するための容器、ＦＮ３ドメイン抗体又はフラグメントの使用説明書、固体支持体に固定されているＦＮ３ドメイン抗体又はフラグメント、及び／又は検出可能に標識された形態のＦＮ３ドメイン抗体又はフラグメントを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】固定化されたＦＮ３ドメイン又は陰性対照タンパク質に結合する組み換えＡＳ７Ｂ９０及びＡＳ７Ｂ９１の試験、及び抗体ＣＥＮ２５−１０５−５に由来する元のウサギハイブリドーマとの比較を示す。標的特異性を有さないＴｅｎｃｏｎ２５の結合データを示す。
【図１Ｂ】固定化されたＦＮ３ドメイン又は陰性対照タンパク質に結合する組み換えＡＳ７Ｂ９０及びＡＳ７Ｂ９１の試験、及び抗体ＣＥＮ２５−１０５−５に由来する元のウサギハイブリドーマとの比較を示す。ヒトｃＭＥＴに特異的なＦＮ３ドメインであるＡ３の結合データを示す。
【図１Ｃ】固定化されたＦＮ３ドメイン又は陰性対照タンパク質に結合する組み換えＡＳ７Ｂ９０及びＡＳ７Ｂ９１の試験、及び抗体ＣＥＮ２５−１０５−５に由来する元のウサギハイブリドーマとの比較を示す。アルブミン結合ドメインを有するヒトＥＧＦＲに特異的なＦＮ３ドメインである８３ｖ２−ＡＢＤの結合データを示す。
【図２Ａ】Ａ７Ｂ９１が、Ｔ細胞の表面に発現した全てのＣＡＲＴｙｒｉｎを検出できたことを示す。
【図２Ｂ】Ａ７Ｂ９１が、Ｔ細胞の表面に発現した全てのＣＡＲＴｙｒｉｎを検出できたことを示す。
【図２Ｃ】Ａ７Ｂ９１が、Ｔ細胞の表面に発現した全てのＣＡＲＴｙｒｉｎを検出できたことを示す。
【図２Ｄ】Ａ７Ｂ９１が、Ｔ細胞の表面に発現した全てのＣＡＲＴｙｒｉｎを検出できたことを示す。
【図２Ｅ】Ａ７Ｂ９１が、Ｔ細胞の表面に発現した全てのＣＡＲＴｙｒｉｎを検出できたことを示す。
【図２Ｆ】Ａ７Ｂ９１が、Ｔ細胞の表面に発現した全てのＣＡＲＴｙｒｉｎを検出できたことを示す。
【図２Ｇ】Ａ７Ｂ９１が、Ｔ細胞の表面に発現した全てのＣＡＲＴｙｒｉｎを検出できたことを示す。
【図２Ｈ】Ａ７Ｂ９１が、Ｔ細胞の表面に発現した全てのＣＡＲＴｙｒｉｎを検出できたことを示す。
【図２Ｉ】Ａ７Ｂ９１が、Ｔ細胞の表面に発現した全てのＣＡＲＴｙｒｉｎを検出できたことを示す。
【図２Ｊ】Ａ７Ｂ９１が、Ｔ細胞の表面に発現した全てのＣＡＲＴｙｒｉｎを検出できたことを示す。
【図２Ｋ】Ａ７Ｂ９１が、Ｔ細胞の表面に発現した全てのＣＡＲＴｙｒｉｎを検出できたことを示す。
【図２Ｌ】Ａ７Ｂ９１が、Ｔ細胞の表面に発現した全てのＣＡＲＴｙｒｉｎを検出できたことを示す。
【図２Ｍ】Ａ７Ｂ９１が、Ｔ細胞の表面に発現した全てのＣＡＲＴｙｒｉｎを検出できたことを示す。
【図３】標識されたＴｅｎｃｏｎ２５を使用した、初代Ｔ細胞の表面でのＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲの発現の検出を示す。
【図４Ａ】ＢＣＭＡ発現標的細胞に応答した、ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ−ＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメインの脱顆粒を示す。Ｈ９２９（ＢＣＭＡ高発現細胞）を示す。異なるＦＮ３ドメインを、ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と共に５０ｎＭの濃度でインキュベートし、洗浄し、次いで、１：１比で標的細胞に添加した。ＢＡＲ−Ｔ変異体１＝ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  Ｌ−Ｈ  ＣＡＲ、ＢＡＲ−Ｔ変異体２＝ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  Ｈ−Ｌ  ＣＡＲ。
【図４Ｂ】ＢＣＭＡ発現標的細胞に応答した、ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ−ＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメインの脱顆粒を示すＡＲＨ７７（ＢＣＭＡ低発現細胞）を示す。異なるＦＮ３ドメインを、ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と共に５０ｎＭの濃度でインキュベートし、洗浄し、次いで、１：１比で標的細胞に添加した。ＢＡＲ−Ｔ変異体１＝ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  Ｌ−Ｈ  ＣＡＲ、ＢＡＲ−Ｔ変異体２＝ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  Ｈ−Ｌ  ＣＡＲ。
【図４Ｃ】ＢＣＭＡ発現標的細胞に応答した、ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ−ＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメインの脱顆粒を示すＫ５６２（ＢＣＭＡ陰性細胞）を示す。異なるＦＮ３ドメインを、ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と共に５０ｎＭの濃度でインキュベートし、洗浄し、次いで、１：１比で標的細胞に添加した。ＢＡＲ−Ｔ変異体１＝ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  Ｌ−Ｈ  ＣＡＲ、ＢＡＲ−Ｔ変異体２＝ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  Ｈ−Ｌ  ＣＡＲ。
【図５−１】ＢＣＭＡ発現標的細胞のＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ−ＢＣＭＡ殺傷を示す。Ｈ９２９、ＢＣＭＡ高発現細胞；ＡＲＨ７７、ＢＣＭＡ低発現細胞；Ｋ５６２、ＢＣＭＡ陰性細胞。異なるＦＮ３ドメインを、ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と共に２５ｎＭの濃度でインキュベートし、洗浄し、次いで、１：１比で標的細胞に添加した。ＢＡＲ−Ｔ変異体１＝ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  Ｌ−Ｈ  ＣＡＲ、ＢＡＲ−Ｔ変異体２＝ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  Ｈ−Ｌ  ＣＡＲ。
【図５−２】ＢＣＭＡ発現標的細胞のＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ−ＢＣＭＡ殺傷を示す。Ｈ９２９、ＢＣＭＡ高発現細胞；ＡＲＨ７７、ＢＣＭＡ低発現細胞；Ｋ５６２、ＢＣＭＡ陰性細胞。異なるＦＮ３ドメインを、ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と共に２５ｎＭの濃度でインキュベートし、洗浄し、次いで、１：１比で標的細胞に添加した。ＢＡＲ−Ｔ変異体１＝ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  Ｌ−Ｈ  ＣＡＲ、ＢＡＲ−Ｔ変異体２＝ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  Ｈ−Ｌ  ＣＡＲ。
【図５−３】ＢＣＭＡ発現標的細胞のＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ−ＢＣＭＡ殺傷を示す。Ｈ９２９、ＢＣＭＡ高発現細胞；ＡＲＨ７７、ＢＣＭＡ低発現細胞；Ｋ５６２、ＢＣＭＡ陰性細胞。異なるＦＮ３ドメインを、ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と共に２５ｎＭの濃度でインキュベートし、洗浄し、次いで、１：１比で標的細胞に添加した。ＢＡＲ−Ｔ変異体１＝ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  Ｌ−Ｈ  ＣＡＲ、ＢＡＲ−Ｔ変異体２＝ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  Ｈ−Ｌ  ＣＡＲ。
【図５−４】ＢＣＭＡ発現標的細胞のＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ−ＢＣＭＡ殺傷を示す。Ｈ９２９、ＢＣＭＡ高発現細胞；ＡＲＨ７７、ＢＣＭＡ低発現細胞；Ｋ５６２、ＢＣＭＡ陰性細胞。異なるＦＮ３ドメインを、ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と共に２５ｎＭの濃度でインキュベートし、洗浄し、次いで、１：１比で標的細胞に添加した。ＢＡＲ−Ｔ変異体１＝ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  Ｌ−Ｈ  ＣＡＲ、ＢＡＲ−Ｔ変異体２＝ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  Ｈ−Ｌ  ＣＡＲ。
【図５−５】ＢＣＭＡ発現標的細胞のＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ−ＢＣＭＡ殺傷を示す。Ｈ９２９、ＢＣＭＡ高発現細胞；ＡＲＨ７７、ＢＣＭＡ低発現細胞；Ｋ５６２、ＢＣＭＡ陰性細胞。異なるＦＮ３ドメインを、ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と共に２５ｎＭの濃度でインキュベートし、洗浄し、次いで、１：１比で標的細胞に添加した。ＢＡＲ−Ｔ変異体１＝ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  Ｌ−Ｈ  ＣＡＲ、ＢＡＲ−Ｔ変異体２＝ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  Ｈ−Ｌ  ＣＡＲ。
【図５−６】ＢＣＭＡ発現標的細胞のＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ−ＢＣＭＡ殺傷を示す。Ｈ９２９、ＢＣＭＡ高発現細胞；ＡＲＨ７７、ＢＣＭＡ低発現細胞；Ｋ５６２、ＢＣＭＡ陰性細胞。異なるＦＮ３ドメインを、ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ  Ｔ細胞と共に２５ｎＭの濃度でインキュベートし、洗浄し、次いで、１：１比で標的細胞に添加した。ＢＡＲ−Ｔ変異体１＝ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  Ｌ−Ｈ  ＣＡＲ、ＢＡＲ−Ｔ変異体２＝ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  Ｈ−Ｌ  ＣＡＲ。
【図６】Ｔ細胞上でのＡＳ７Ｂ１６  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトへの標識されたＴｅｎｃｏｎ２５の結合を示す。Ｌ２Ｈ、ＡＳ７Ｂ１６軽鎖−重鎖配向。Ｈ２Ｌ、ＡＳ７Ｂ１６重鎖−軽鎖配向。
【図７】Ｔ細胞上でのＡＳ７Ｂ１６  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトへの標識されたＥＧＦＲ  ８３ｖ２の結合を示す。Ｌ２Ｈ、ＡＳ７Ｂ１６軽鎖−重鎖配向。Ｈ２Ｌ、ＡＳ７Ｂ１６重鎖−軽鎖配向。
【図８】Ｔ細胞上でのＡＳ７Ｂ８２  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトへの標識されたＴｅｎｃｏｎ２５の結合を示す。Ｌ２Ｈ、ＡＳ７Ｂ８２軽鎖−重鎖配向。Ｈ２Ｌ、ＡＳ７Ｂ１６重鎖−軽鎖配向。
【図９】Ｔ細胞上でのＡＳ７Ｂ８２  ｓｃＦｖ  ＣＡＲコンストラクトへの標識されたＥＧＦＲ  ８３ｖ２の結合を示す。Ｌ２Ｈ、ＡＳ７Ｂ１６軽鎖−重鎖配向。Ｈ２Ｌ、ＡＳ７Ｂ１６重鎖−軽鎖配向。
【図１０−１】ＦｃｇＲ発現細胞株の生成。Ｌｅｎｔｉ−Ｐａｃ  ＨＩＶ発現パッケージング系を使用して、ヒトＦｃｇＲ（ＣＤ１６ａ、ＣＤ３２及びＣＤ６４）をコードする精製レンチウイルス発現プラスミドを、２９３Ｔ細胞のトランスフェクション用にパッケージングした。
【図１０−２】ＦｃｇＲ発現細胞株の生成。Ｌｅｎｔｉ−Ｐａｃ  ＨＩＶ発現パッケージング系を使用して、ヒトＦｃｇＲ（ＣＤ１６ａ、ＣＤ３２及びＣＤ６４）をコードする精製レンチウイルス発現プラスミドを、２９３Ｔ細胞のトランスフェクション用にパッケージングした。
【図１１Ａ】シトルリン化環状ペプチドのＴｅｎｃｏｎ２５センチリンへの共役化を、ソルターゼの化学的性質を用いた１：５比（センチリン対ペプチド）で行った。Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ）上での用手法により複合体を精製して、遊離ソルターゼ及びペプチドを除去した。精製後、複合体をＰＢＳへとバッファー交換し、濃縮した。複合体は、（ａ）質量分析（ＬＣ−ＭＳ）及び（ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５）によってＱＣを行い、滅菌濾過した。
【図１１Ｂ】シトルリン化環状ペプチドのＴｅｎｃｏｎ２５センチリンへの共役化を、ソルターゼの化学的性質を用いた１：５比（センチリン対ペプチド）で行った。Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ）上での用手法により複合体を精製して、遊離ソルターゼ及びペプチドを除去した。精製後、複合体をＰＢＳへとバッファー交換し、濃縮した。複合体は、（ａ）質量分析（ＬＣ−ＭＳ）及び（ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５）によってＱＣを行い、滅菌濾過した。
【図１２】センチリン−ＣＣＰ１ペプチド複合体への抗シトルリン化抗体の結合の検出。ＦｃｇＲ発現ＨＥＫ２９３細胞を、２００μｇ／ｍＬのヒト抗シトルリン化フィブリノーゲン抗体又はヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照と共にインキュベートした。フローサイトメトリーによって結合を評価した。
【図１３】ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、抗シトルリン化ｍＡｂ結合ＦｃＲ発現細胞の殺傷を媒介した。
【図１４Ａ】ＢＡＲ−Ｔプラットフォーム拡張のための複数の自己免疫疾患における潜在的なペプチド／抗体の組み合わせの評価。ａ）重症筋無力症（ＭＧ）、ｂ）多発性硬化症（ＭＳ）、及びｃ）全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に特異的なペプチドの、それぞれ抗ＡＣｈＲ、抗ＭＯＧ、又は抗ｄｓＤＮＡ抗体への結合能について試験した。出現順に配列番号８５〜８７をそれぞれ開示する。
【図１４Ｂ】ＢＡＲ−Ｔプラットフォーム拡張のための複数の自己免疫疾患における潜在的なペプチド／抗体の組み合わせの評価。ａ）重症筋無力症（ＭＧ）、ｂ）多発性硬化症（ＭＳ）、及びｃ）全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に特異的なペプチドの、それぞれ抗ＡＣｈＲ、抗ＭＯＧ、又は抗ｄｓＤＮＡ抗体への結合能について試験した。出現順に配列番号８８〜９０をそれぞれ開示する。
【図１４Ｃ】ＢＡＲ−Ｔプラットフォーム拡張のための複数の自己免疫疾患における潜在的なペプチド／抗体の組み合わせの評価。ａ）重症筋無力症（ＭＧ）、ｂ）多発性硬化症（ＭＳ）、及びｃ）全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に特異的なペプチドの、それぞれ抗ＡＣｈＲ、抗ＭＯＧ、又は抗ｄｓＤＮＡ抗体への結合能について試験した。出現順に配列番号９１〜９３をそれぞれ開示する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
定義
発明の背景において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載する。これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいかなる発明に対しても先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
【００２７】
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ以上の細胞の組み合わせ、及びこれに類するものなどが含まれる。
【００２８】
本明細書で使用されるとき、測定値、例えば、量、持続時間等に言及する場合の「約」という用語は、指定された値から最大±１０％の偏差を包含することを意味する。同様に、このような偏差は、開示された方法を行うのに適している。別途記載のない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用される、成分の量、並びに分子量及び反応条件等の特性を表わす全ての数字は、全ての事例において「約」という用語により修飾されていると理解されたい。したがって、そうではないと示されない限り、下記明細書及び添付の特許請求の範囲で説明された数値パラメータは、本発明により得ようとする所望の特性に応じて変動する場合がある近似値である。最低でも、特許請求の範囲の範囲に対して均等論の適用を制限することを試みてはならず、各数値パラメータは、報告された有効桁の数字を考慮し、通常の四捨五入の手法を適用することにより、少なくとも解釈されるべきである。
【００２９】
本発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータは近似値であるが、特定の実施例に記載された数値は、可能な限り正確に報告される。但し、任意の数値は、各試験測定において見出される標準偏差から必然的に生じる一定の誤差を本質的に含有する。
【００３０】
「単離された」とは、生物学的成分（例えば、核酸、ペプチド、又はタンパク質）が、これらの成分が本来存在する生物の他の生物学的成分、すなわち、他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ、並びにタンパク質から、実質的に分離され、同他の成分とは別に生成され、又は同他の成分から離して精製されていることを意味する。このため、「単離」された核酸、ペプチド、及びタンパク質は、標準的な精製法により精製された核酸及びタンパク質を含む。「単離された」核酸、ペプチド、及びタンパク質は、組成物の一部であることができ、このような組成物が核酸、ペプチド、又はタンパク質の本来の環境の一部ではない場合であっても単離されている。また、この用語は、宿主細胞中での組み換え発現により調製された核酸、ペプチド、及びタンパク質、並びに化学合成された核酸も包含する。本明細書で使用するとき、「単離」抗体又は抗原結合フラグメントは、種々の抗原特異性を有する他の抗体又は抗原結合フラグメントを実質的に含まない抗体又は抗原結合フラグメントを意味することを意図している（例えば、ＦＮ３ドメインに特異的に結合する単離抗体は、ＦＮ３ドメインに特異的ではない抗体を実質的に含まない）。
【００３１】
本明細書で使用するとき、「フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン」又は「ＦＮ３ドメイン」なる用語は、フィブロネクチン、テネイシン、細胞内細胞骨格タンパク質、サイトカイン受容体及び原核生物酵素を含むタンパク質にしばしば存在するドメイン（Ｂｏｒｋ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：８９９０−８９９４，１９９２；Ｍｅｉｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７５：１９１０−１９１８，１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５：１５６５９−１５６６５，１９９０）、又はこれらの誘導体を指す。例示的なＦＮ３ドメインとしては、ヒトテネイシンＣ中に存在する１５個の異なるＦＮ３ドメイン、ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）中に存在する１５個の異なるＦＮ３ドメイン、及び非天然の合成ＦＮ３ドメインがある（例えば米国特許第８２７８４１９号に記載される）。個々のＦＮ３ドメインは、ドメイン番号とタンパク質名で呼ばれる（例えばテネイシンの３番目のＦＮ３ドメイン（ＴＮ３）、又はフィブロネクチンの１０番目のＦＮ３ドメイン（ＦＮ１０））。
【００３２】
「抗体」は、特に断らない限り、免疫グロブリンの全てのアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＹ）を指し、種々の単量体、多量体、及びキメラ型を含む。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、及び抗体様ポリペプチド、例えば、キメラ抗体及びヒト化抗体が、「抗体」という用語に具体的に包含される。
【００３３】
「抗原結合フラグメント」は、特定の抗原に対して結合親和性を示し得る任意のタンパク質性構造体である。抗原結合フラグメントは、任意の既知の手法、例えば、酵素開裂、ペプチド合成、及び組み換え手法により提供されたものを含む。一部の抗原結合フラグメントは、親抗体分子の抗原結合特異性を保持しているインタクトな抗体の部分から構成される。例えば、抗原結合フラグメントは、特定の抗原に結合することが既知である抗体の、少なくとも１つの可変領域（重鎖若しくは軽鎖の可変領域のいずれか一方）、又は１つ若しくは２つ以上のＣＤＲを含んでもよい。適切な抗原結合フラグメントの例には、ディアボディ（diabodies）及び一本鎖分子、並びにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆａｂｃ、及びＦｖ分子、一本鎖（Ｓｃ）抗体、個々の抗体軽鎖、個々の抗体重鎖、抗体鎖若しくはＣＤＲと他のタンパク質との間でのキメラ融合体、タンパク質スキャフォールド、重鎖単量体若しくは二量体、軽鎖単量体若しくは二量体、１本の重鎖と１本の軽鎖とからなる二量体、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント、国際公開第２００７０５９７８２号に記載された一価抗体、ヒンジ領域においてジスルフィド結合により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、Ｖ．ｓｕｂ．Ｈ及びＣ．ｓｕｂ．Ｈ１ドメインから本質的になるＦｄフラグメント、抗体の１つのアームのＶＬ及びＶＨドメインから本質的になるＦｖフラグメント、ＶＨドメインから本質的になり、ドメイン抗体とも呼ばれる（Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３  Ｎｏｖ．；２１（１１）：４８４−９０）ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９））、ラクダ科動物抗体フラグメントつまりナノボディ（Ｒｅｖｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ；Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００５  Ｊａｎ．；５（１）：１１１−２４）、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）等が挙げられるが、これらに限定されない。全ての抗体アイソタイプが、抗原結合フラグメントを生成するのに使用されてもよい。加えて、抗原結合フラグメントは、対象となる所与の抗原に対する親和性を付与する方向にポリペプチドセグメントをうまく組み込み得る、抗体以外のタンパク質性フレームワーク、例えば、タンパク質スキャフォールドを含んでもよい。抗原結合フラグメントは、組み換えにより生成されてもよく、又はインタクトな抗体の酵素分解若しくは化学分解により生成されてもよい。「抗体又はその抗原結合フラグメント」という表現は、所与の抗原結合フラグメントが、この表現内で参照された抗体の１つ又は２つ以上のアミノ酸セグメントを組み込んでいることを示すために使用されてもよい。
【００３４】
「ＣＤＲ」及びその複数形「ＣＤＲｓ」という用語は、相補性決定領域（ＣＤＲ）であって、そのうちの３つが軽鎖可変領域（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）の結合特性を構成し、３つが重鎖可変領域（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）の結合特性を構成する、相補性決定領域（ＣＤＲ）を意味する。ＣＤＲは、抗体分子の機能的活性に寄与し、スキャフォールド領域又はフレームワーク領域を含むアミノ酸配列によって分離される。正確な定義上のＣＤＲの境界及び長さは、様々な分類及び番号付けシステムによって異なる。したがって、ＣＤＲは、ＩＭＧＴ定義、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、又は任意の他の境界定義によって参照され得る。境界が異なるにもかかわらず、これらのシステムの各々は、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を構成する要素においてある程度のオーバーラップを有する。したがって、これらのシステムによるＣＤＲの定義は、隣接するフレームワーク領域についての長さ及び境界領域の点で異なることがある。例えば、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）；及びＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｃｏｎｔａｃｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ，」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２（１９９６））を参照のこと。
【００３５】
典型的には、ＣＤＲは、カノニカル構造として分類され得るループ構造を形成する。「カノニカル構造」という用語は、抗原結合（ＣＤＲ）ループによって採用される主鎖立体構造を意味する。比較構造の研究から、６つの抗原結合ループのうちの５つは利用可能な立体構造のレパートリーがごく限られていることが判明している。各カノニカル構造は、ポリペプチド主鎖のねじれ角によって特徴付けられ得る。したがって抗体間で対応するループは、それらのループの大部分において高度のアミノ酸配列可変性が見られるにもかかわらず、非常によく似た三次元構造を有し得る（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ，」Ｉ  ３４２：８７７（１９８９）；Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｉｎ  Ｌｏｏｐｓ  ｏｆ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，」  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００（１９９６））（当該文献のそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。更に、とられるループ構造とその周囲のアミノ酸配列との間には関係がある。特定のカノニカルクラスの立体構造は、ループの長さと、ループ内の重要な位置並びに保存されたフレームワーク（すなわち、ループの外側）内にあるアミノ酸残基とによって決定される。したがって、これらの重要なアミノ酸残基の存在に基づいて、特定のカノニカルクラスへの割り当てを行うことができる。
【００３６】
抗体又は抗体フラグメントの文脈において使用されるとき、「特異的に結合（Specifically binds）」若しくは「特異的に結合（binds specifically）」又はそれらの派生語は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによりコードされたドメインを介し、混合された様々な分子を含有するサンプル中で他の分子に優先的に結合することなく対象となるタンパク質の１つ又は２つ以上のエピトープに結合することを表わす。典型的には、抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイ又は細胞結合アッセイにより測定された場合、約１×１０−８Ｍ未満のＫｄで、同じ性質の抗原に結合する。好ましい実施形態では、結合特異性はバイオレイヤー干渉法を用いて測定される。「［抗原］特異的」抗体等の表現は、列挙された抗体が列挙された抗原に特異的に結合することを伝達することを意味する。
【００３７】
「ポリヌクレオチド」は、同義的に「核酸分子」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」と呼ばれ、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡでもよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖、又はより典型的には、二本鎖、又は一本鎖及び二本鎖の領域の混合物でもよい）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。用語、ポリヌクレオチドには、１つ以上の修飾塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性若しくは他の理由により修飾された主鎖を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含まれる。「修飾」塩基は、例えば、トリチル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含む。各種の修飾が、ＤＮＡ及びＲＮＡになされてもよい。したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的に天然に認められるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短い核酸鎖（多くの場合、オリゴヌクレオチドと呼ばれる）も包含する。
【００３８】
「ベクター」とは、セグメントの複製又は発現をもたらすように、別の核酸セグメントを操作可能に挿入できるレプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、又はウイルスのことである。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、「宿主細胞」という用語は、例えば、初代細胞、培養中の細胞、又は細胞株由来の細胞といった任意のタイプの細胞であってよい。特定の実施形態では、「宿主細胞」という用語は、核酸分子を遺伝子導入された細胞、及びそのような細胞の子孫又は潜在的子孫を指す。このような細胞の子孫は、核酸分子で遺伝子導入された親細胞とは、例えば、宿主細胞ゲノムへの核酸分子の後続の生成又は集積において生じ得る、変異又は環境からの影響により、同一ではないことがある。「発現」及び「生成」という用語は、本明細書において同義的に使用され、遺伝子産物の生合成を意味する。これらの用語は、遺伝子のＲＮＡへの転写を包含する。また、これらの用語は、ＲＮＡの１つ又は２つ以上のポリペプチドへの翻訳を包含し、全ての天然の転写後及び翻訳後修飾を更に包含する。抗体又はその抗原結合フラグメントの発現又は生成は、細胞の細胞質内、又は細胞外環境、例えば、細胞培養用の増殖培地内でもよい。「実質的に同じ」の意味は、この用語が使用される文脈に応じて異なる場合がある。重鎖及び軽鎖並びにこれらをコードする遺伝子中には天然の配列バリエーションが存在し得ることから、本明細書に記載されたアミノ酸配列又は抗体若しくは抗原結合フラグメントをコードする遺伝子内には、固有の結合特性（例えば、特異的及び親和性）にはほとんど影響しない、又は影響しない、ある程度のバリエーションが見られることが予測される。このような予測は、部分的には、遺伝暗号の縮重及び保存的アミノ酸配列バリエーションの進化的成功による。同バリエーションは、コードされたタンパク質の性質を認識され得るほどには改変させない。したがって、核酸配列の文脈において、「実質的に同じ」は、２つ以上の配列間での少なくとも６５％の同一性を意味する。好ましくは、この用語は、２つ以上の配列間での少なくとも７０％の同一性、より好ましくは、少なくとも７５％の同一性、より好ましくは、少なくとも８０％の同一性、より好ましくは、少なくとも８５％の同一性、より好ましくは、少なくとも９０％の同一性、より好ましくは、少なくとも９１％の同一性、より好ましくは、少なくとも９２％の同一性、より好ましくは、少なくとも９３％の同一性、より好ましくは、少なくとも９４％の同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の同一性、より好ましくは、少なくとも９６％の同一性、より好ましくは、少なくとも９７％の同一性、より好ましくは、少なくとも９８％の同一性、及びより好ましくは、少なくとも９９％以上の同一性を意味する。２つの配列間の同一性（％）は、ギャップ数及び各ギャップの長さを考慮して、配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、相同性の割合（％）＝同一位置数／位置の総数×１００）。同考慮は、２つの配列の最適なアライメントを導くのに必要である。２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の同一性パーセントは、例えば、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ  ４，１１−１７（１９８８）のアルゴリズムを使用して決定されてもよい。同アルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれており、ＰＡＭ１２０���み付け残基テーブル、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用する。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性（％）は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４４−４５３（１９７０）のアルゴリズムを使用して決定されてもよい。
【００４０】
タンパク質の機能に実質的な影響を有することなく、タンパク質のアミノ酸配列内に生じ得るバリエーションの度合いは、核酸配列のバリエーションの度合いより非常に小さい。これは、同じ縮重原理がアミノ酸配列には当てはまらないためである。したがって、抗体又は抗原結合フラグメントの文脈において、「実質的に同じ」は、記載された抗体又は抗原結合フラグメントに対して、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する抗体又は抗原結合フラグメントを意味する。他の実施形態は、本明細書に記載のＦＮ３ドメイン抗体及び抗原結合フラグメントと有意な同一性を共有しないが、１つ又は２つ以上のＣＤＲ又は結合性を付与するのに必要とされる他の配列を組み込む、フレームワーク、スキャフォールド、又は他の非結合領域を有し、本明細書に記載のかかる配列に対して、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である、ＦＮ３ドメイン抗体又は抗原結合フラグメントを含む。
【００４１】
本明細書で使用するところの「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）なる用語は、少なくとも、抗原又は標的に特異的に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内Ｔ細胞受容体活性化シグナル伝達ドメインとを含む組み換えポリペプチドを指す。ＣＡＲの細胞外ドメインと標的細胞の表面上の標的抗原との結合によって、ＣＡＲはクラスター化し、ＣＡＲ保有細胞に活性化刺激が与えられる。ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞の特異性を新たに方向付け、主要組織適合性（ＭＨＣ）とは独立した形で、標的抗原発現細胞の細胞死を媒介し得る増殖、サイトカイン産生、貪食作用、及び／又は分子の産生を誘導する。
【００４２】
本明細書で使用するところの「細胞外抗原結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、又は「細胞外リガンド結合ドメイン」なる用語は、細胞膜の外側に位置し、抗原、標的、又はリガンドに結合することができるＣＡＲの部分を指す。
【００４３】
本明細書で使用するところの「ヒンジ領域」なる用語は、ＣＡＲタンパク質の２つの隣接するドメイン、例えば、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとを連結するＣＡＲの部分を指す。
【００４４】
本明細書で使用するところの「膜貫通ドメイン」なる用語は、細胞膜を横切って延在し、ＣＡＲを細胞膜に固定するＣＡＲの部分を指す。
【００４５】
本明細書で使用するところの「細胞内Ｔ細胞受容体活性化シグナル伝達ドメイン」、「細胞質シグナル伝達ドメイン」、又は「細胞内シグナル伝達ドメイン」なる用語は、細胞膜の内側に位置し、エフェクター信号を伝達することができるＣＡＲの部分を指す。
【００４６】
本明細書で使用するところの「刺激分子」なる用語は、Ｔ細胞シグナル伝達経路の少なくとも一部の側面において、刺激によってＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の一次活性化を調節する一次細胞質シグナル伝達配列を与える、Ｔ細胞によって発現される分子を指す。刺激分子は、抗原依存的な一次活性化を開始する配列（「一次シグナル伝達ドメイン」と呼ばれる）と、抗原と独立して作用することで二次又は共刺激シグナルを与える配列（「共刺激シグナル伝達ドメイン」と呼ばれる）の２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列を含む。
【００４７】
本明細書で使用するところの「発現」なる用語は、遺伝子産物の生合成を指す。かかる用語には、遺伝子のＲＮＡへの転写が含まれる。また、かかる用語には、ＲＮＡの１つ以上のポリペプチドへの翻訳も含まれ、全ての天然に生じる転写後及び翻訳後修飾も更に含まれる。発現されるＦＮ３ドメイン又はＣＡＲは、宿主細胞の細胞質中、細胞培養の増殖培地などの細胞外環境中に存在し得るか、又は細胞膜に固定され得る。
【００４８】
本明細書で使用するところの「免疫細胞」又は「免疫エフェクター細胞」なる用語は、免疫応答、例えば免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞のことを指す。免疫細胞の例としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マスト細胞、及び骨髄由来食細胞が挙げられる。特定の実施形態によれば、遺伝子操作された免疫細胞はＴ細胞であり、本発明のＣＡＲを発現するように遺伝子操作されていることから、ＣＡＲ−Ｔ細胞と呼ばれる。
【００４９】
本明細書で使用するところの「遺伝子操作された免疫細胞」なる用語は、細胞の全遺伝物質にＤＮＡ又はＲＮＡの形の更なる遺伝物質を加えることによって遺伝子改変された免疫細胞（免疫エフェクター細胞とも呼ばれる）のことを指す。本明細書の実施形態によれば、遺伝子操作された免疫細胞は、本発明に基づくＦＮ３ドメイン標的化ＣＡＲを発現するように遺伝子改変されたものである。
【００５０】
本明細書で使用するところの「担体」なる用語は、あらゆる賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、バッファー、安定剤、可溶化剤、油、脂質、脂質含有小胞、ミクロスフェア、リポソーム封入体、又は医薬製剤で使用するための当該技術分野では公知の他の材料を指す。担体、賦形剤又は希釈剤の特性は、特定の用途の投与経路によって決まる点は理解されよう。本明細書で使用するころの「医薬上許容できる担体」なる用語は、本発明による組成物の効果又は本発明による組成物の生物活性を妨げない無毒性材料を指す。
【００５１】
本明細書で使用するところの「対象」なる用語は、動物、好ましくは哺乳動物を指す。特定の実施形態によれば、対象は、非霊長類（例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、ウサギ、モルモット又はマウス）、又は霊長類（例えば、サル、チンパンジー、又はヒト）を含む哺乳動物である。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【００５２】
本明細書で使用するところの「治療的有効量」なる用語は、対象に所望の生物学的又は薬理的応答を誘導する活性成分又は構成成分の量を指す。治療有効量は、記載される目的に対して経験的かつ一般的な方法で決定することができる。
【００５３】
本明細書で使用するところの「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」なる用語はいずれも、がん又は自己免疫に関連した少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善又は逆転を指すものであり、これは対象において必ずしも認識されるとは限らないが、対象において認識可能な場合もある。「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」なる用語はまた、疾患、障害、又は病態の退縮を生じる、その進行を防止する、又は少なくともその進行を遅らせることを指す場合もある。特定の実施形態では、「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、及び「治療（treatment）」は、腫瘍若しくはより好ましくはがんなどの疾患、障害、若しくは病態に関連する１つ以上の症状の緩和、進展若しくは発症の予防、又はその期間の短縮を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態の再発の防止を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、疾患、障害、又は病態を有する対象の生存率の向上を指す。特定の実施形態では、「治療する」、「治療する」、及び「治療」は、対象における疾患、障害、又は病態の消失を指す。
【００５４】
ＦＮ３ドメインライブラリ
Ｔｅｎｃｏｎは、ヒトテネイシンＣの１５個のＦＮ３ドメインのコンセンサス配列から設計された、天然には存在しないＦＮ３ドメインである（Ｊａｃｏｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５：１０７−１１７，２０１２、米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号）。Ｔｅｎｃｏｎの結晶構造は、ＦＮ３ドメインの特徴である、７個のβ鎖をつなぐ６個の表面露出ループを示し、β鎖は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧと呼ばれ、ループは、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、及びＦＧループと呼ばれている（Ｂｏｒｋ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：８９９０−８９９２，１９９２；米国特許第６，６７３，９０１号）。これらのループ又は各ループ内の選択された残基をランダム化することでＦＮ３ドメインのライブラリを構築することができ、このライブラリを用いて、特定の抗原に結合する新規分子を選択することができる。したがって、本明細書に記載のように、ＦＮ３ドメインの「非ランダム化」領域は、全てのＦＮ３ドメイン間で保存されるＦＮ３ドメイン内の領域を指す。表２は、Ｔｅｎｃｏｎ（配列番号３３）の各ループ及びβ鎖の位置及び配列を示す。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
したがって、テンコン配列に基づいて設計されたライブラリは、ループ又はストランドのうちの１つ以上にランダム化された配列を有することができる。例えば、テンコンに基づくライブラリは、ＡＢループ、ＢＣループ、ＣＤループ、ＤＥループ、ＥＦループ、及びＦＧループのうちの１つ以上にランダム化配列を有することができる。例えば、テンコンのＢＣループはアミノ酸７個の長さを有しており、したがって、１、２、３、４、５、６、又は７個のアミノ酸をテンコン配列に基づいたライブラリでランダム化し、ＢＣループで多様化させたライブラリとすることができる。テンコンのＣＤループはアミノ酸６個の長さを有しており、したがって、１、２、３、４、５、又は６個のアミノ酸をテンコン配列に基づいたライブラリでランダム化し、ＣＤループで多様化させたライブラリとすることができる。テンコンのＥＦループはアミノ酸５個の長さを有しており、したがって、１、２、３、４、又は５個のアミノ酸をテンコン配列に基づいたライブラリでランダム化し、ＥＦループで多様化させたライブラリとすることができる。テンコンのＦＧループはアミノ酸７個の長さを有しており、したがって、１、２、３、４、５、６、又は７個のアミノ酸をテンコン配列に基づいたライブラリでランダム化し、ＦＧループで多様化させたライブラリとすることができる。テンコンライブラリのループにおける更なる多様性を、ループでの残基の挿入及び／又は欠失によって得ることができる。例えば、ＢＣ、ＣＤ、ＥＦ及び／又はＦＧループをアミノ酸１〜２２個だけ伸長することができ、又はアミノ酸１〜３個だけ減少させることができる。ＴｅｎｃｏｎにおけるＦＧループは、長さがアミノ酸７個であり、抗体重鎖における対応するループは、残基４〜２８個の範囲である。最大の多様性を得るためには、残基４〜２８個の範囲の抗体ＣＤＲ３の長さに対応するように、ＦＧループの配列及び長さを多様化させることができる。例えば、更に１、２、３、４、又は５個のアミノ酸によってループを伸長することにより、ＦＧループの長さを更に多様化させることができる。
【００５７】
テンコン配列に基づいて設計されたライブラリはまた、ＦＮ３ドメインの側面を形成する、２個以上のβ鎖と少なくとも１つのループを含む、ランダム化された別の表面を有してもよい。そのような１つの代替表面は、Ｃ及びＦのβ鎖、並びにＣＤ及びＦＧループのアミノ酸によって形成される（Ｃ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面）。テンコンの別のＣ−ＣＤ−Ｆ−ＦＧ表面に基づいたライブラリの設計については、米国特許出願公開第２０１３／０２２６８３４号に記載されている。Ｔｅｎｃｏｎ配列に基づいて設計されたライブラリには、１１、１７、４６、及び／又は８６位（残基の番号付けは配列番号３３に対応する）の残基の置換を有し、熱安定性が向上したＴｅｎｃｏｎ変異体などのＴｅｎｃｏｎ変異体に基づいて設計されたライブラリが含まれる。例示的なＴｅｎｃｏｎ変異体が米国特許出願公開第２０１１／０２７４６２３号に記載されており、配列番号３３のＴｅｎｃｏｎと比較してＥ１１Ｒ、Ｌ１７Ａ、Ｎ４６Ｖ及びＥ８６Ｉの置換を有するＴｅｎｃｏｎ２７（配列番号３４）が含まれる。
【００５８】
テンコンライブラリ及び他のＦＮ３配列に基づくライブラリは、ランダムな又は既定のアミノ酸の組を用いて、選択された残基の位置でランダム化することができる。例えば、ライブラリにおいて無作為置換を有する変種を、天然に存在する２０個全てのアミノ酸をコードするＮＮＫコドンを用いて作製することができる。他の多様化スキームにおいて、アミノ酸Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、及びＣｙｓをコードするために、ＤＶＫコドンを使用することができる。あるいは、ＮＮＳコドンを用いて２０種全てのアミノ酸残基を生じさせると同時に終止コドンの頻度を低減することもできる。多様化させる位置で偏りのあるアミノ酸分布を有するＦＮ３ドメインのライブラリは、例えばＳｌｏｎｏｍｉｃｓ（登録商標）技術（ｈｔｔｐ：＿／／ｗｗｗ＿ｓｌｏｎｉｎｇ＿ｃｏｍ）を用いて合成することができる。この技術は、何千もの遺伝子合成プロセスにおいて充分な普遍的構成単位として機能する、既製の二本鎖トリプレットのライブラリを用いたものである。トリプレットのライブラリは、あらゆる所望のＤＮＡ分子を構築するのに必要な、全ての考えられる配列組合せを示す。コドン指定は、周知のＩＵＢコードによる。
【００５９】
ＦＮ３ドメイン抗体及び抗原結合フラグメント
本明細書において、ＦＮ３ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントを記載する。抗体分子の全体的な構造は、抗原結合ドメインを含む。同ドメインは、重鎖及び軽鎖並びにＦｃドメインを含み、補体固定及び抗体の結合受容体（binding antibody receptors）を含む各種の機能を果たす。
【００６０】
記載のＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、全てのアイソタイプである、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、並びに４本鎖免疫グロブリン構造の合成多量体を含む。記載された抗体又は抗原結合フラグメントはまた、雌鳥又はシチメンチョウの血清及び雌鳥又はシチメンチョウの卵黄中に一般的に見出されるＩｇＹアイソタイプも含む。
【００６１】
ＦＮ３ドメイン特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、組み換え手法により任意の種から得ることができる。例えば、抗体又は抗原結合フラグメントは、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ブタ、ウシ、ニワトリ、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヒト、又はそれらのキメラ版でもよい。ヒトへの投与に使用するために、非ヒト由来の抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒト患者への投与時に、抗原性がより低くなるよう遺伝的に又は構造的に改変されてもよい。
【００６２】
一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントはキメラである。本明細書で使用されるとき、「キメラ」という用語は、抗体又はその抗原結合フラグメントであって、非ヒト哺乳類、げっ歯類、又は爬虫類の抗体アミノ酸配列に由来する少なくとも１つの可変ドメインの少なくともいくらかの部分を有するものの、それらの残りの部分はヒトに由来するものである、抗体又はその抗原結合フラグメントを指す。
【００６３】
一部の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最少配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖、又はフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又は抗体の他の抗原結合部分配列）であってもよい。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種、例えば、マウス、ラット、又はウサギのＣＤＲからの残基（ドナー抗体）により置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一般的には、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むこととなる。同可変ドメイン中、全て又は実質的に全てのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、全て又は実質的に全てのフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域である。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのＦｃのうち少なくとも一部分を含んでもよい。
【００６４】
本明細書に記載された抗体又は抗原結合フラグメントは、各種の形態で存在し得るが、表１に示された抗体ＣＤＲのうち１つ又は２つ以上を含むこととなる。
【００６５】
本明細書において、ＦＮ３ドメインに特異的に結合する単離抗体及び抗原結合フラグメントを記載する。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ウサギに由来する。本明細書に例示するＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ウサギ由来であるが、例示の抗体又は抗原結合フラグメントは、キメラ化されてもよい。
【００６６】
一部の実施形態では、表１に記載の抗体のうちいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖と、表１に記載の抗体のうちいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖と、を含む、ＦＮ３ドメイン特異的抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。
【００６７】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメイン特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号４を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号７を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号９を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、非ウサギフレームワーク配列を含んでよい。このＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ＦＮ３ドメインの非ランダム化領域に結合してよく、ＦＮ３ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のＴ細胞表面発現を検出することができ、ＦＮ３ドメインを含むＣＡＲを発現するＴ細胞を活性化してよい。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメイン特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１４と実質的に同じか又は同一の可変重鎖領域と、配列番号１５と実質的に同じか又は同一の可変軽鎖とを含む。記載のＦＮ３ドメイン抗体又は抗原結合フラグメントを使用して、記載の抗原結合フラグメントを含むＣＡＲを生成することができる。
【００６８】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメイン特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号２を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号８を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１０を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、非ウサギフレームワーク配列を含んでよい。このＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ＦＮ３ドメインの非ランダム化領域に結合してよく、ＦＮ３ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のＴ細胞表面発現を検出することができ、ＦＮ３ドメインを含むＣＡＲを発現するＴ細胞を活性化してよい。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメイン特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１４と実質的に同じか又は同一の可変重鎖領域と、配列番号１５と実質的に同じか又は同一の可変軽鎖とを含む。記載のＦＮ３ドメイン抗体又は抗原結合フラグメントを使用して、記載の抗原結合フラグメントを含むＣＡＲを生成することができる。
【００６９】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメイン特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号６を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号８を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号１０を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、非ウサギフレームワーク配列を含んでよい。このＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ＦＮ３ドメインの非ランダム化領域に結合してよく、ＦＮ３ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のＴ細胞表面発現を検出することができ、ＦＮ３ドメインを含むＣＡＲを発現するＴ細胞を活性化してよい。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメイン特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１４と実質的に同じか又は同一の可変重鎖領域と、配列番号１５と実質的に同じか又は同一の可変軽鎖とを含む。記載のＦＮ３ドメイン抗体又は抗原結合フラグメントを使用して、記載の抗原結合フラグメントを含むＣＡＲを生成することができる。
【００７０】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメイン特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号４６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、非マウスフレームワーク配列を含んでよい。このＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ＦＮ３ドメインの非ランダム化領域に結合してよく、ＦＮ３ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のＴ細胞表面発現を検出することができ、ＦＮ３ドメインを含むＣＡＲを発現するＴ細胞を活性化してよい。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメイン特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７４と実質的に同じか又は同一の可変重鎖領域と、配列番号７５と実質的に同じか又は同一の可変軽鎖とを含む。記載のＦＮ３ドメイン抗体又は抗原結合フラグメントを使用して、記載の抗原結合フラグメントを含むＣＡＲを生成することができる。
【００７１】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメイン特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、非マウスフレームワーク配列を含んでよい。このＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ＦＮ３ドメインの非ランダム化領域に結合してよく、ＦＮ３ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のＴ細胞表面発現を検出することができ、ＦＮ３ドメインを含むＣＡＲを発現するＴ細胞を活性化してよい。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメイン特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７４と実質的に同じか又は同一の可変重鎖領域と、配列番号７５と実質的に同じか又は同一の可変軽鎖とを含む。記載のＦＮ３ドメイン抗体又は抗原結合フラグメントを使用して、記載の抗原結合フラグメントを含むＣＡＲを生成することができる。
【００７２】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメイン特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、非マウスフレームワーク配列を含んでよい。このＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ＦＮ３ドメインの非ランダム化領域に結合してよく、ＦＮ３ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のＴ細胞表面発現を検出することができ、ＦＮ３ドメインを含むＣＡＲを発現するＴ細胞を活性化してよい。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメイン特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７４と実質的に同じか又は同一の可変重鎖領域と、配列番号７５と実質的に同じか又は同一の可変軽鎖とを含む。記載のＦＮ３ドメイン抗体又は抗原結合フラグメントを使用して、記載の抗原結合フラグメントを含むＣＡＲを生成することができる。
【００７３】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメイン特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号５４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号５６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、非マウスフレームワーク配列を含んでよい。このＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ＦＮ３ドメインの非ランダム化領域に結合してよく、ＦＮ３ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のＴ細胞表面発現を検出することができ、ＦＮ３ドメインを含むＣＡＲを発現するＴ細胞を活性化してよい。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメイン特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７８と実質的に同じか又は同一の可変重鎖領域と、配列番号７９と実質的に同じか又は同一の可変軽鎖とを含む。記載のＦＮ３ドメイン抗体又は抗原結合フラグメントを使用して、記載の抗原結合フラグメントを含むＣＡＲを生成することができる。
【００７４】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメイン特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号５５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号５７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、非マウスフレームワーク配列を含んでよい。このＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ＦＮ３ドメインの非ランダム化領域に結合してよく、ＦＮ３ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のＴ細胞表面発現を検出することができ、ＦＮ３ドメインを含むＣＡＲを発現するＴ細胞を活性化してよい。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメイン特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７８と実質的に同じか又は同一の可変重鎖領域と、配列番号７９と実質的に同じか又は同一の可変軽鎖とを含む。記載のＦＮ３ドメイン抗体又は抗原結合フラグメントを使用して、記載の抗原結合フラグメントを含むＣＡＲを生成することができる。
【００７５】
一部の実施形態では、ＦＮ３ドメイン特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号５５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号５７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、非マウスフレームワーク配列を含んでよい。このＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ＦＮ３ドメインの非ランダム化領域に結合してよく、ＦＮ３ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のＴ細胞表面発現を検出することができ、ＦＮ３ドメインを含むＣＡＲを発現するＴ細胞を活性化してよい。一部の実施形態では、ＦＮ３ドメイン特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号７８と実質的に同じか又は同一の可変重鎖領域と、配列番号７９と実質的に同じか又は同一の可変軽鎖とを含む。記載のＦＮ３ドメイン抗体又は抗原結合フラグメントを使用して、記載の抗原結合フラグメントを含むＣＡＲを生成することができる。
【００７６】
ＦＮ３ドメインに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントをコードする単離ポリヌクレオチドもまた開示される。本明細書で提供された可変ドメインセグメントをコード可能な単離されたポリヌクレオチドは、抗体又は抗原結合フラグメントを生成する同一の又は異なるベクターに含まれてもよい。
【００７７】
組み換え抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた、本開示の範囲内である。一部の実施形態では、記載されたポリヌクレオチド（及びこのポリヌクレオチドがコードするペプチド）は、リーダー配列を含む。当技術分野において既知の任意のリーダー配列を利用することができる。リーダー配列は、制限部位又は翻訳開始部位を含み得るがこれらに限定されない。
【００７８】
本明細書に記載のＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、記載のＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントの生物学的特性（例えば、結合親和性又は免疫エフェクター活性）を保持している、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有する多様体を含む。これらの多様体としては、（ａ）１つ又は２つ以上のアミノ酸残基が保存的又は非保存的アミノ酸により置換されている多様体、（ｂ）１つ又は２つ以上のアミノ酸がポリペプチドに付加され、又は同ポリペプチドから欠失している多様体、（ｃ）１つ又は２つ以上のアミノ酸が置換基を含む多様体、及び（ｄ）ポリペプチドが別のペプチド又はポリペプチド、例えば、融合パートナー、タンパク質タグ、又は他の化学部分と融合した多様体、を挙げることができる。これらは、ポリペプチドに有用な特性、例えば、抗体に対するエピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオチン部分等を付与してもよい。本明細書に記載された抗体又は抗原結合フラグメントは、保存的又は非保存的位置のいずれかにおいてある種からのアミノ酸残基が別の種における対応する残基に置換されている多様体を含んでもよい。他の実施形態では、非保存的位置におけるアミノ酸残基は、保存的又は非保存的残基により置換される。これらの多様体を得るための手法は、遺伝的（欠失、変異等）、化学的、及び酵素的手法を含めて、当業者に既知である。
【００７９】
本明細書に記載のＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、いくつかの抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを具現化することができる。いくつかの実施形態では、抗体アイソタイプはＩｇＧである。抗体又はその抗原結合フラグメントの特異性は、ＣＤＲのアミノ酸配列及び配置により主に決定される。したがって、あるアイソタイプのＣＤＲは、抗原特異性を変化させることなく、別のアイソタイプに変更することができる。あるいは、抗原特異性を変化させることなく、ハイブリドーマに、ある抗体アイソタイプを別のものにスイッチさせる技術（アイソタイプスイッチング）が確立されてきた。したがって、このような抗体アイソタイプは、記載された抗体又は抗原結合フラグメントの範囲内にある。
【００８０】
記載のＦＮ３ドメイン特異性抗体、又は抗原結合フラグメントの親和性は、表面プラズモン共鳴又はＥＬＩＳＡベースの方法など、当技術分野において既知の各種の方法によって決定されることができる。ＳＰＲにより親和性を測定するためのアッセイは、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００機器を使用して行われるアッセイを含む。この場合、このアッセイは、室温（例えば、２５℃又は２５℃付近）で行われる。ＦＮ３ドメインに結合可能な抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅセンサチップ上に、抗Ｆｃ抗体（例えば、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的抗体、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製品番号１０９−００５−０９８）により、７５ＲＵ付近のレベルで捕捉され、続けて、４０μＬ／分の流量において、会合及び解離データが収集される。
【００８１】
ＦＮ３ドメインを検出する方法
本明細書において、サンプルを、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させることにより、生体サンプル中のＦＮ３ドメインを検出するための方法が提供される。本明細書に記載されたように、サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織会合していない細胞（すなわち、遊離細胞）、組織（例えば、外科手術的に切除された腫瘍組織、微細針吸引を含む生検）、組織学的調製物等から得ることができる。一部の実施形態では、記載の方法は、サンプルを、本明細書に記載のＦＮ３ドメイン特異的抗体又はその抗原結合フラグメントのいずれかと接触させることにより、生体サンプル中のＦＮ３ドメインを検出することを含む。
【００８２】
一部の実施形態では、サンプルを、本明細書に記載のＦＮ３ドメイン特異的抗体又は抗原結合フラグメントの２つ以上と接触させてよい。例えば、サンプルを、第１のＦＮ３ドメイン特異的抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させ、次いで、第２のＦＮ３ドメイン特異的抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させてよく、この場合、第１の抗体又は抗原結合フラグメントと第２の抗体又は抗原結合フラグメントとは、同じ抗体又は抗原結合フラグメントではない。一部の実施形態では、第１の抗体又はその抗原結合フラグメントは、サンプルと接触させる前に、表面、例えば、マルチウェルプレート、チップ、又は類似する基材に固定されてもよい。他の実施形態では、第１の抗体又はその抗原結合フラグメントは、サンプルと接触させる前に、何にも固定されず又は付着されなくてもよい。
【００８３】
記載のＦＮ３ドメイン特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、検出可能に標識されてよい。一部の実施形態では、標識された抗体及び抗原結合フラグメントは、本明細書に記載の方法により、ＦＮ３ドメインの検出を容易にし得る。多くのこのような標識が、当業者に容易に既知である。例えば、適切な標識としては、放射線標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、ＥＣＬ標識、又は酵素が挙げられるが、これらに限定されると考えられるべきではない。より詳細には、記載された標識には、ルテニウム、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ、１１１Ｉｎ−ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びベータガラクトシダーゼ、ポリヒスチジン（ＨＩＳタグ）、アクリジン染料、シアニン染料、フルオロン染料、オキサジン染料、フェナントリジン染料、ローダミン染料、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）染料などが挙げられる。
【００８４】
記載のＦＮ３ドメイン特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、生体サンプル中のＦＮ３ドメインを検出するための各種のアッセイに使用されてもよい。一部の適切なアッセイには、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、免疫蛍光測定法、免疫沈澱法、平衡透析法、免疫拡散法、電気化学発光（ＥＣＬ）イムノアッセイ、免疫組織化学法、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）又はＥＬＩＳＡアッセイが挙げられるが、これらに限定されると考えられるべきではない。
【００８５】
ＦＮ３ドメインを検出するためのキット
本明細書において、生体サンプル中のＦＮ３ドメインを検出するためのキットが提供される。これらのキットは、本明細書に記載のＦＮ３ドメイン特異的抗体又はその抗原結合フラグメントのうち１つ又は２つ以上と、このキットを使用するための使用説明書とを含む。
【００８６】
提供されたＦＮ３ドメイン抗体又は抗原結合フラグメントは、溶液の中に存在してもよく、凍結乾燥されていてもよく、基材、担体、又はプレートに固定されていてもよく、又は検出可能に標識化されていてもよい。
【００８７】
記載されたキットはまた、本明細書に記載された方法を行うのに有用な更なる構成要素を含んでもよい。例として、キットは、対象からサンプルを得るための手段、対照若しくは参照サンプル、例えば、ゆっくり進行するがんを有する対象及び／又はがんを有さない対象からのサンプル、１つ若しくは２つ以上のサンプル区画、及び／又は本発明の方法の実施について説明する指示材料、並びに組織特異的な対照若しくは基準物質を含んでもよい。
【００８８】
ＦＮ３ドメインのレベルを決定するための手段は、例えば、ＦＮ３ドメインのレベルを決定するためのアッセイに使用するための緩衝液又は他の試薬を更に含み得る。使用説明書は、例えば、アッセイを行うための印刷された使用説明書及び／又はＦＮ３ドメインの発現レベルを評価するための使用説明書であり得る。
【００８９】
記載されたキットはまた、対象からサンプルを単離するための手段を含んでもよい。これらの手段は、対象から流体又は組織を得るのに使用され得る機器又は試薬のうち１つ又は２つ以上の品目を含み得る。対象からサンプルを得るための手段はまた、血液サンプルから血液成分、例えば、血清を単離するための手段を含んでもよい。好ましくは、キットは、ヒト対象で使用するために設計されている。
【００９０】
ＦＮ３ドメイン標的化キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
他の一般的な態様では、本発明は、ＦＮ３ドメイン特異的ｓｃＦｖを含むＦＮ３ドメイン標的化ＣＡＲに関する。
【００９１】
一態様では、本発明は、
ａ．ＦＮ３ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合するｓｃＦｖを有する細胞外ドメインと、
ｂ．膜貫通ドメインと、
ｃ．細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、ＣＡＲに関する。
【００９２】
いくつかの実施形態では、新生ＣＡＲでは、細胞外ドメインの先にはＮ末端にシグナルペプチドが付いている。任意の適当なシグナルペプチドを本発明で使用することができる。シグナルペプチドは、天然、合成、半合成、又は組み換えられた供給源に由来するものとすることができる。
【００９３】
本発明の実施形態によると、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＦＮ３ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合するｓｃＦｖを含む。本明細書に記載のものを含むがそれらに限定されない、本発明の実施形態に基づく任意のＦＮ３ドメインを、ＣＡＲの細胞外ドメインに用いることができる。
【００９４】
本発明の実施形態によれば、ＣＡＲは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとを連結するヒンジ領域を更に含むことができる。ヒンジ領域は、遺伝子操作された免疫細胞の表面から離れるように細胞外ドメインを動かして、適切な細胞／細胞間の接触、標的又は抗原との結合、及び活性化を可能とする機能を有する（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：４１２−４１９）。任意の適当なヒンジ領域を本発明のＣＡＲに使用することができる。ヒンジ領域は、天然、合成、半合成、又は組み換えられた供給源に由来するものとすることができる。いくつかの実施形態によれば、ＣＡＲのヒンジ領域は、６ｘＧＳペプチド（配列番号８４）、若しくはそのフラグメント、若しくはＣＤ８タンパク質に由来するヒンジ領域、又はこれらの誘導体である。特定の実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号２４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号２４のアミノ酸配列を有する。
【００９５】
任意の適当な膜貫通ドメインを本発明のＣＡＲに使用することができる。膜貫通ドメインは、天然、合成、半合成、又は組み換えられた供給源に由来するものとすることができる。いくつかの実施形態によれば、膜貫通ドメインは、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ２、ＧＭＣＳＦＲなどの分子の膜貫通ドメインである。特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号２５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号２５のアミノ酸配列を有する。
【００９６】
任意の適当な細胞内シグナル伝達ドメインを本発明のＣＡＲに使用することができる。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメイン全体が用いられる。他の特定の実施形態では、エフェクターシグナルを伝達するシグナル伝達ドメインの切頭部分が用いられる。本発明の実施形態によれば、細胞内シグナル伝達ドメインは、これらに限定されるものではないが、増殖、活性化、及び／又は分化を含む、ＣＡＲ保有細胞、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。特定の実施形態では、シグナルは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞溶解活性、ヘルパー活性、及び／又はサイトカイン分泌を促進する。他の実施形態では、本発明のＣＡＲにおいて細胞内シグナル伝達ドメインは使用されず、本発明のＦＮ３ドメインに特異的に結合するｓｃＦｖを含むＣＡＲは、エフェクター細胞を標的細胞に標的化するためのＦＮ３ドメインと共に使用される。
【００９７】
いくつかの実施形態によれば、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１３４（ＴＮＦＲＳＦ４又はＯＸ−４０としても知られる）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳとしても知られる）、ＦｃεＲＩ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＩＴＡＭドメイン、又はＣＤ６６ｄなどに由来する機能性シグナル伝達ドメインを含む。
【００９８】
特定の実施形態によれば、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【００９９】
一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζ由来の機能性シグナル伝達ドメインを有する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態では、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号２７のアミノ酸配列を有する。
【０１００】
いくつかの実施形態によれば、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒト４−１ＢＢに由来する共刺激細胞内シグナル伝達ドメインを更に含む。特定の実施形態では、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号２６のアミノ酸配列を有する。
【０１０１】
一実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＣＡＲを発現する宿主細胞に付随する。
【０１０２】
別の実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＣＡＲを発現する宿主細胞の単離細胞膜中に存在する。
【０１０３】
更に別の実施形態では、本発明のＣＡＲは、ＣＡＲを発現する宿主細胞の他の構成成分から精製又は単離される。
【０１０４】
ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞
他の一般的な態様では、本発明は、本発明のＦＮ３ドメイン抗体又はＣＡＲをコードする単離ポリヌクレオチド及びベクター、並びにベクターを含有する組み換え細胞に関する。
【０１０５】
本明細書に開示される様々なタンパク質又はポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成するか又は本開示を考慮して当該技術分野における他の方法を用いて合成することができる。コドンの使用を選択することで、細胞における発現を改善することができる。このようなコドン使用は、選択される細胞のタイプに依存する。特化したコドンの使用パターンが、大腸菌及び他の細菌、並びに哺乳類細胞、植物細胞、酵母細胞、及び昆虫細胞用に開発されている。例えば、Ｍａｙｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．２００３  １００（２）：４３８−４２；Ｓｉｎｃｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．２００２（１）：９６−１０５；Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１（５）：４４６−９；Ｍａｋｒｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．１９９６  ６０（３）：５１２−３８；及びＳｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｙｅａｓｔ．１９９１  ７（７）：６５７−７８を参照されたい。
【０１０６】
核酸操作の一般的な技術は、当業者の技術の範囲内であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２  ｅｄ．，１９８９又はＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、及び定期的な最新報告にも記載されており、これらを参照により援用するものである。タンパク質をコードするＤＮＡは、哺乳類、ウイルス、又は昆虫遺伝子由来の適当な転写又は翻訳調節エレメントに機能的に連結される。このような調節エレメントとしては、転写プロモーター、転写を制御するための任意のオペレーター配列、適当なｍＲＮＡのリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の停止を制御する配列を挙げることができる。通常は複製起点によって与えられる、宿主内で複製する能力及び形質転換体の識別を容易とする選択遺伝子が、更に組み込まれる。適当な調節エレメントは、当該技術分野では周知のものである。
【０１０７】
当業者であれば、あるタンパク質のコード配列は、そのタンパク質のアミノ酸配列を変えずに変化させることができる点は理解されよう。したがって、本発明のＦＮ３ドメイン抗体又はＣＡＲをコードする核酸配列を、タンパク質のアミノ酸配列を変えずに変化させることができる点は当業者には理解されるであろう。
【０１０８】
一実施形態では、本発明は、本発明のＦＮ３ドメイン抗体又はＣＡＲをコードする単離核酸を含むベクターに関する。プラスミド、コスミド、ファージベクター、又はウイルスベクターなどの、本開示を考慮して当業者には周知のいずれのベクターも使用することができる。一実施形態では、ベクターは、プロモーター配列、場合により１つ以上の他の調節配列に操作可能に連結された本発明のＦＮ３ドメイン又はＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターである。
【０１０９】
別の実施形態では、本発明は、ＣＡＲをコードしたｍＲＮＡによる本発明のＣＡＲの一過性の発現に関する。一態様では、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡは、組み込まれない導入遺伝子の発現が数時間、数日間、又は数週間にわたって発現される一過性トランスフェクションの形態として免疫エフェクター細胞に導入されるが、その発現期間は、その遺伝子がゲノムに組み込まれるか又は宿主細胞内の安定的なプラスミドレプリコン内に含まれている場合の遺伝子の発現期間よりも短い。一態様では、ｍＲＮＡは、ＰＣＲで生成された鋳型を用いたインビトロ転写によって生成される。
【０１１０】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明のＦＮ３ドメイン抗体又はＣＡＲをコードする単離核酸を含む宿主細胞に関する。本発明の核酸分子を安定的又は一過的に宿主細胞にトランスフェクトすることができる。
【０１１１】
適当な宿主細胞としては、原核生物、酵母、哺乳類細胞、又は細菌細胞が挙げられる。適当な細菌としては、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば、大腸菌又はバチルス属の菌種が挙げられる。酵母、好ましくはＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）などのサッカロマイセス属の種の酵母を、ポリペプチドの産生に使用することもできる。様々な哺乳動物又は昆虫細胞の培養系を用いて組み換えタンパク質を発現させることもできる。昆虫細胞で異種タンパク質を産生するためのバキュロウイルス系については、Ｌｕｃｋｏｗ及びＳｕｍｍｅｒｓ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：４７，１９８８）により概説されている。場合によっては、グリコシル化を行う目的などで脊椎動物細胞内でタンパク質を産生することが望ましく、培養（組織培養）中の脊椎動物細胞の増殖は通常の手順となっている。適当な哺乳類宿主細胞株の例としては、内皮細胞、ＣＯＳ−７サル腎臓細胞、ＣＶ−１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胎児腎臓細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３Ｔ、及びＢＨＫ細胞株が挙げられる。
【０１１２】
本発明の宿主細胞は、下記に詳細に述べる、遺伝子操作されたＦＮ３ドメイン標的化免疫細胞とすることができる。
【０１１３】
タンパク質生産
別の一般的な態様では、本発明は、本発明のＦＮ３ドメイン抗体を産生する条件下でＦＮ３ドメイン抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、細胞又は細胞培養物から（例えば、上清から）ＦＮ３ドメイン抗体を回収することと、を含む、本発明のＦＮ３ドメイン抗体を産生する方法に関する。発現されたＦＮ３ドメイン抗体は、本開示を考慮して当該技術分野で周知の従来技術に従って、細胞又は細胞培養物から収穫し、精製することができる。
【０１１４】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明のＣＡＲを産生する条件下でＣＡＲをコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、ＣＡＲを回収することと、を含む、本発明のＣＡＲを生産する方法に関する。発現されたＣＡＲは、当該技術分野で周知の従来技術に従って、また、本明細書に記載されるように、細胞から収穫し、精製することができる。
【０１１５】
宿主細胞は、タンパク質産生用の発現又はクローニングベクターで形質転換され、例えば、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択する、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅する、などを目的として適宜改変された従来の栄養培地で培養される。
【０１１６】
本発明のタンパク質を生産するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養することができる。Ｈａｍ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ社）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ社）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ社）、及びダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ社）などの市販の培地が、宿主細胞の培養に適している。加えて、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）；Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）；米国特許第４７６７７０４号；米国特許第４６５７８６６号；米国特許第４９２７７６２号；米国特許第４５６０６５５号；米国特許第５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号又は米国再発行特許第３０９８５号に記載の培地のうちのいずれかは、宿主細胞の培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれも、必要に応じてホルモン及び／又は他の増殖因子（例えばインスリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子など）、塩類（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、バッファー（例えばＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（例えばアデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）剤など）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、及びグルコース又は同等のエネルギー源を添加することができる。他の任意の必要な添加物質が、当業者には周知の適当な濃度で含まれてもよい。温度、ｐＨといった培養条件は、発現用に選択される宿主細胞と共に以前より用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１１７】
本明細書に開示されるタンパク質は、インビトロの細胞翻訳系を利用して産生することもできる。かかる目的のため、タンパク質をコードする核酸は、インビトロでの転写を可能にしてｍＲＮＡを産生し、かつ、利用される特定の無細胞系におけるｍＲＮＡの無細胞翻訳を可能とするように改変する必要がある。真核細胞を含まない翻訳系の例としては、例えば、哺乳類又は酵母細胞を含まない翻訳系が挙げられ、原核細胞を含まない翻訳系の例としては、例えば、細菌細胞を含まない翻訳系が挙げられる。
【０１１８】
本明細書に開示されるタンパク質は、化学合成（例えば、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，１９８４，Ｔｈｅ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に記載の方法によって）により製造することもできる。タンパク質の修飾も、化学合成によって行うことができる。
【０１１９】
本明細書に開示されるタンパク質は、タンパク質化学分野で一般的に知られるタンパク質の単離／精製方法によって精製することができる。その非限定的な例としては、抽出、再結晶化、塩析（例えば、硫酸アンモニウム又は硫酸ナトリウムによる）、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、向流分配、又はこれらの任意の組み合わせが挙げられる。精製後、タンパク質は、異なるバッファー中に交換するか、かつ／又は、これらに限定されるものではないが、濾過及び透析を含む当該技術分野では周知の様々な方法のいずれかによって濃縮することができる。
【０１２０】
精製タンパク質は、好ましくは少なくとも純度８５％、より好ましくは少なくとも純度９５％、最も好ましくは少なくとも純度９８％である。
【０１２１】
遺伝子操作されたＦＮ３ドメイン標的化ＣＡＲ−Ｔ細胞、組成物及びその方法
別の一般的態様では、本発明は、本発明のＦＮ３ドメイン標的化ＣＡＲを含む遺伝子操作されたＦＮ３ドメイン標的化免疫細胞、遺伝子操作された免疫細胞を作製する方法、遺伝子操作された免疫細胞を含む組成物、及び多発性骨髄腫などの疾患を治療するために、遺伝子操作された免疫細胞を使用する方法に関する。
【０１２２】
一般的な一態様では、本発明は、本発明のＦＮ３ドメイン標的化ＣＡＲを含む遺伝子操作された免疫細胞に関する。
【０１２３】
いくつかの実施形態によれば、免疫細胞は、例えば国際公開第２０１３／１７６９１５号に記載されるようなＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の１つ以上の構成要素を発現する少なくとも１つの遺伝子の不活性化を、ＨＬＡ  Ｉ／Ｂ２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）タンパク質をコードするか又はその発現を調節する遺伝子の不活性化と組み合わせることができることによって、同種性をより低めることができる。したがって、移植片対宿主症候群及び移植片拒絶のリスクが大幅に低くなる。「ＴＣＲノックアウト（TCR knockout）」又は「ＴＣＲノックアウト（TCR-KO）」細胞と呼ばれる機能性ＴＣＲを欠くＴ細胞は、その表面に機能性ＴＣＲをいっさい発現しないように遺伝子操作するか、機能性ＴＣＲを構成する１つ以上のサブユニットを発現しないように遺伝子操作する（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＴＣＲε、及び／又はＴＣＲζを発現しない（又はその発現が低減される）ように遺伝子操作する）か、又はその表面上にごくわずかな機能性ＴＣＲを生成するように遺伝子操作することができる。あるいは、Ｔ細胞は、例えばＴＣＲのサブユニットの１つ以上の突然変異型又は切断型を発現させることによって、実質的に機能不全のＴＣＲ（すなわち、宿主に有害な免疫反応を誘発しないＴＣＲ）を発現することもできる。機能性ＴＣＲ及び／又はＢ２Ｍを発現しない改変Ｔ細胞は、ＴＣＲ及び／又はＢ２Ｍの１つ以上のサブユニットのノックアウト又はノックダウンを含む任意の適当な手段によって得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）（クラスター化された一定間隔で配置された短い回文配列リピート）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｍｅｇａＴＡＬ、メガヌクレアーゼ、又はジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いたＴＣＲ及び／又はＢ２Ｍのノックダウンを有することができる。
【０１２４】
特定の実施形態では、本発明のＦＮ３ドメイン標的化ＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、又はＮＫ細胞、好ましくはヒトＴ細胞又はヒトＮＫ細胞、より好ましくはＴＣＲノックアウト細胞、最も好ましくはヒトＴＣＲノックアウト細胞及び／又はＨＬＡ  Ｉ／Ｂ２Ｍノックアウト細胞である。他の実施形態では、本発明のＦＮ３ドメイン標的化ＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞は、ＴＡＬＬ−１０４Ｔ細胞株（すなわち、ＣＤ８及びＣＤ３を発現するがＣＤ１６は発現しないＩＬ−２依存性ヒト非制限細胞毒性Ｔ細胞株）などの遺伝子操作されたＴ細胞である。
【０１２５】
本発明の免疫エフェクター細胞は、自家（すなわち、「自己」、例えば自己原性）又は非自家（すなわち、「非自己」、例えば同種、同系、異種）であってよい。自家とは、その物質が後で再導入される個体と同じ個体に由来する任意の物質を指す。非自家とは、その物質が後で再導入される個体と同じ種の異なる個体に由来する任意の物質を指す
【０１２６】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明のＦＮ３ドメイン標的化ＣＡＲを含む遺伝子操作されたＦＮ３ドメイン標的化免疫細胞の作製方法に関する。ＣＡＲをコードするベクターは、免疫細胞に直接形質導入することができる。あるいは、ＣＡＲをコードするインビトロで転写されたＲＮＡ又は合成ＲＮＡを免疫細胞に導入することもできる。
【０１２７】
特定の実施形態によれば、遺伝子操作されたＦＮ３ドメイン標的化免疫細胞を作製する方法は、免疫エフェクター細胞が本発明の実施形態に基づく１つ以上のＣＡＲを発現するように、個体から単離された免疫エフェクター細胞にトランスフェクト又は形質導入することを含む。免疫治療用の免疫細胞の調製方法は、例えば、参照により本明細書に援用するところの国際公開第２０１４／１３０６３５号、同第２０１３／１７６９１６号、及び同第２０１３／１７６９１５号に記載されている。遺伝子操作された免疫細胞を調製するために使用することが可能な個々の工程は、例えば、参照によって本明細書に援用するところの国際公開第２０１４／０３９５２３号、同第２０１４／１８４７４１号、同第２０１４／１９１１２８号、同第２０１４／１８４７４４号、及び同第２０１４／１８４１４３号に開示されている。
【０１２８】
特定の実施形態では、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、本発明のＣＡＲにより遺伝子改変された（例えば、ＣＡＲをコードする核酸を含むウイルスベクターにより形質導入された）後、インビトロで活性化及び増殖される。様々な実施形態では、Ｔ細胞は、例えば、参照によって本明細書に援用するところの米国特許第６３５２６９４号、同第６５３４０５５号、同第６９０５６８０号、同第６６９２９６４号、同第５８５８３５８号、同第６８８７４６６号、同第６９０５６８１号、同第７１４４５７５号、同第７０６７３１８号、同第７１７２８６９号、同第７２３２５６６号、同第７１７５８４３号、同第５８８３２２３号、同第６９０５８７４号、同第６７９７５１４号、同第６８６７０４１号、米国特許出願公開第２００６／１２１００５号に記載される方法を用いて、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変される前又は後で活性化及び増殖させることができる。Ｔ細胞は、インビトロ又はインビボで増殖させることができる。一般的に、本発明のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを結合させた表面と接触させることによって増殖させることができる。非限定的な例として、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載されるように、例えば、抗ＣＤ３抗体、若しくはその抗原結合フラグメント、又は表面上に固定化された抗ＣＤ２抗体との接触によって、又はタンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触とカルシウムイオノフォアとの組み合わせによって、又はＣＡＲ自体の活性化などによって、刺激することができる。Ｔ細胞の表面のアクセサリ分子を共刺激するには、アクセサリ分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞集団を、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適した条件下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。Ｔ細胞培養に適した条件としては、例えば、血清（例えば、ウシ胎児又はヒト血清）、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及び／若しくＩＬ−２１、インスリン、ＩＦＮ−ｇ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦｂ、並びに／又は当業者には周知の細胞の増殖用の他の任意の添加物質を含む、増殖及び生存に必要な因子を含有し得る適当な培地（例えば、最小必須培地又はＲＰＭＩ培地１６４０又は、Ｘ−ｖｉｖｏ５（Ｌｏｎｚａ社））が挙げられる。他の実施形態では、Ｔ細胞は、参照によって本明細書に援用するところの米国特許第６０４０１７７号、同第５８２７６４２号、及び国際公開第２０１２１２９５１４号に記載される方法などの方法を用いて、フィーダー細胞及び適当な抗体及びサイトカインによって活性化及び刺激して増殖させることができる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲ発現細胞は、同じ標的又は異なる標的に特異的に結合する細胞外ドメインを有する第２のＣＡＲを更に含むことができる。好ましくは、免疫細胞は、２つの異なる標的に特異的に結合する２種類のＣＡＲを発現する、又は免疫細胞は、２つの異なる標的、すなわち、ＦＮ３ドメイン及び対象疾患に関連する別の標的に特異的に結合する２つのＦＮ３ドメインを含むＣＡＲなど二重特異性受容体を発現する。例えば、他の標的はまた、がんの種類に関連し得る。より好ましくは、２種類のＣＡＲもまた、異なる細胞内シグナル伝達ドメインを有し、例えば、第１のＣＡＲが共刺激シグナル伝達ドメインを有するが一次シグナル伝達ドメインは有さず、第２のＣＡＲは一次シグナル伝達ドメインを有するが共刺激シグナル伝達ドメインは有さない、又はその逆である。４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７  ＩＣＯＳ、又はＯＸ−４０に由来するものなどの共刺激シグナル伝達ドメインを一方のＣＡＲに配置し、ＣＤ３ζに由来するものなどの一次シグナル伝達ドメインを他方のＣＡＲに配置することにより、両方の標的が発現される細胞にＣＡＲ活性を制限することで、例えば特異性を高めることができる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲ発現細胞は、Ｔ細胞に基づいた治療を制限し、腫瘍外毒性（off-tumor toxicity）を回避するための自己調節式の安全スイッチとしての阻害性ＣＡＲを更に含むことができる。例えば、阻害性ＣＡＲは、正常細胞に見られる標的に特異的に結合するが、標的癌細胞に見られる標的には結合しない細胞外ドメインを含むことができる。阻害性ＣＡＲには、これらに限定されるものではないが、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えばＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３及び／又はＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４又はＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＧＡＬ９、アデノシン、及びＴＧＦＲβを含む阻害性分子の細胞内ドメインなどの阻害性受容体シグナル伝達ドメインを有する細胞内ドメインも含まれる。ＦＮ３ドメイン標的化ＣＡＲ及び阻害性ＣＡＲを発現している細胞は、正常細胞に出合うと抑制されるが、正常細胞の標的を発現していない腫瘍細胞に出合うと活性化される。
【０１３１】
他のいくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲ発現細胞の活性を高める薬剤を更に含むことができる。例えば、かかる薬剤は、本明細書に記載されるものなどの阻害性分子の宿主細胞中での活性を阻害することができる。
【０１３２】
特定の実施形態によれば、遺伝子操作された免疫ＣＡＲ発現細胞は、化学療法抵抗性を示すように更に遺伝子操作される。この化学療法抵抗性は、対象のＦＮ３ドメインを選択的に標的化しつつ、遺伝子操作された免疫細胞が薬剤の存在下で生存することを可能にするものである。
【０１３３】
いくつかの実施形態によれば、薬剤耐性は、少なくとも１つの薬剤耐性遺伝子を発現するようにＣＡＲ発現細胞を遺伝子操作することによって、ＣＡＲ発現細胞に与えることができる。本発明の薬剤耐性遺伝子は、代謝拮抗物質、メトトレキサート、ビンブラスチン、シスプラチン、アルキル化剤、アントラサイクリン、細胞毒性抗生物質、抗イムノフィリン、それらの類似体又は誘導体などに対する耐性をコードすることができる。本発明の遺伝子操作された免疫ＣＡＲ発現細胞に対する薬物耐性を付与するために使用することができるいくつかの薬剤耐性遺伝子が同定されている。例えば、Ｔａｋｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００１  Ｊａｎ；３（１）：８８−９６．；Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．２００３  Ｍａｙ；５（５）：３６６−７６；Ｚｉｅｌｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００３  Ｎｏｖ；１１２（１０）：１５６１−７０；Ｎｉｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００４  Ｆｅｂ；５３（２）：１０７−１５；Ｂａｒｄｅｎｈｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２００５  Ｄｅｃ；１９（１２）：２２８１−８；Ｋｕｓｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．２００７  Ｊａｎ；２８（１）：２０７−１４を参照されたい。細胞で発現させることができる薬剤耐性遺伝子の例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の変異体又は修飾型、イノシン−５’−一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＰＤＨ２）の変異体又は修飾型、多剤耐性タンパク質１（ＭＤＲ１）、カルシニューリン、メチルグアニントランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−２１、抗生物質耐性遺伝子であるｂｌｅ及びｍｃｒＡなどが挙げられる。特定の実施形態によれば、当該薬剤耐性遺伝子は、例えば、少なくとも１つのベクターによってコードされた導入遺伝子を細胞に導入することなど任意の好適な手段によって細胞で発現させることができる。
【０１３４】
抗がん化学療法に対する耐性も、例えば、薬剤に対する細胞の感受性をもたらす遺伝子を不活性化することによって付与することができる。細胞に対する薬物耐性を付与するために不活性化され得る遺伝子の例としては、例えば、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体、ＣＤ３、ヒトヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ヒトデオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）などが挙げられる。抗がん薬に対する細胞の感度に関与する遺伝子は、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、又はＺＦＮを使用して、遺伝子のノックアウト又はノックダウンなど任意の好適な手段によって不活性化され得る。
【０１３５】
別の一般的な態様において、本発明は、本発明の遺伝子操作されたＦＮ３ドメイン標的化免疫細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。本開示を考慮すると、ＣＡＲ−Ｔの医薬組成物での使用に適したいずれの薬学的に許容される担体も本発明で使用することができる。
【０１３６】
別の一般的な態様では、本発明は、治療有効量の本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む、がんの治療を要する対象における、がんを治療する方法に関する。
【０１３７】
本発明の実施形態によると、治療有効量の医薬組成物は、それを必要とする対象における免疫応答を刺激し、好ましくは、疾患、障害、若しくは状態の治療をもたらし、疾患、障害、若しくは状態の進行を阻止若しくは遅延させ、又は免疫疾患、障害、若しくは状態に関連する症状を軽減若しくは完全に緩和する。
【０１３８】
特定の実施形態によれば、治療される疾患、障害又は病態は、過剰増殖性疾患である。他の特定の実施形態によれば、治療される疾患、障害又は病態は、がん若しくは腫瘍、又は悪性過増殖性疾患であり、好ましくは固体腫瘍、血液がん、膀胱がん、胆管がん、脳腫瘍、乳がん、結腸がん、食道がん、胃がん、神経膠腫、頭部がん、白血病、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、多発性骨髄腫、頸部がん、卵巣がん、黒色腫、膵臓がん、腎臓がん、唾液腺がん、胃がん、胸腺上皮がん、及び甲状腺がんからなる群から選択されるがんである。
【０１３９】
特定の実施形態によれば、治療有効量のＦＮ３ドメイン標的化免疫細胞組成物は、治療を要する対象において、以下の効果のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上を実現するうえで充分である。すなわち、（ｉ）治療される疾患、障害若しくは病態又はそれに関連する症状の重症度を低減又は改善すること、（ｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の期間を短縮すること、（ｉｉｉ）治療される疾患、障害若しくは病態、又はそれに関連する症状の進行を防止すること、（ｉｖ）治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれに関連する症状の退縮を生じさせること、（ｖ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状の進展又は発症を予防すること、（ｖｉ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状の再発を防止すること、（ｖｉｉ）治療される疾患、障害、若しくは状態、又はそれに関連する症状を有する対象の入院を減少させること、（ｖｉｉｉ）治療される疾患、障害若しくは状態、又はそれに関連する症状を有する対象の入院期間を短縮させること、（ｉｘ）治療される疾患、障害又は病態、又はそれに関連する症状を有する対象の生存率を高めること、（ｘｉ）治療される対象の疾患、障害若しくは状態、又はそれに関連する症状を阻害又は軽減すること、及び／又は（ｘｉｉ）別の治療の予防又は治療効果を強化又は改善すること。特定の実施形態では、治療有効量とは、以下の効果のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上を実現するうえで充分な治療薬の量を指す。すなわち、（ｉ）腫瘍体積を減少させること、（ｉｉ）腫瘍細胞の数を減少させること、（ｉｉｉ）転移の回数を減少させること、（ｉｖ）余命を延ばすこと、（ｖ）腫瘍細胞の増殖を低下させること、（ｖｉ）腫瘍細胞の生存率を低下させること、（ｖｉｉ）がん状態に関連する生理学的症状を改善すること、及び／又は（ｖｉｉｉ）腫瘍の発生を予防すること。
【０１４０】
治療有効量又は用量は、治療される疾患、障害又は病態、投与手段、標的部位、対象の生理学的状態（例えば、年齢、体重、健康状態を含む）、対象がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、及び、治療が予防的なものであるか治療的なものであるか、などの様々な因子によって異なり得る。治療用量は、安全性及び効能を最適化するために最適に漸増される。正確な用量は、周知の技術を用いて当業者により確認することができる。一般に、ＦＮ３ドメイン標的化免疫細胞は、体重１ｋｇ当たり約１０５〜１０８個の細胞の用量で投与される。いくつかの実施形態によれば、細胞の総用量は、分割投与、例えば、１回、２回、３回、又はそれ以上の別々の部分用量の投与によって対象に投与することができる。
【０１４１】
特定の実施形態によれば、本明細書に記載される組成物は、対象への想定される投与経路に適した形で製剤化される。例えば、本明細書に記載される組成物は、静脈内投与、皮下投与、又は筋肉内投与に適した形で製剤化することができる。
【０１４２】
特定の実施形態によれば、がんの治療に使用される組成物は、これらに限定されるものではないが、化学療法、リンパ球枯渇療法、放射線治療、他のがん免疫療法剤、標的化療法、がんワクチン、又は他の抗がん剤を含む別の治療と併用することができる。
【０１４３】
本明細書で使用するところの「併用される」なる用語は、対象への２種以上の治療薬の投与との関連において、複数の治療の使用を指す。「併用される」なる用語の使用は、治療が対象に投与される順序を限定しない。例えば、第１の治療（例えば、本明細書に記載される組成物）を、対象への第２の治療の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間前）、同時に、又はその後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、又は１２週間後）に投与することができる。
【０１４４】
別の一般的な態様では、本発明は、免疫細胞を新たに方向付けて、治療を要する対象におけるＦＮ３ドメイン結合細胞の殺傷を標的とする方法であって、本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法に関する。
【０１４５】
別の一般的な態様では、本発明は、本発明のＦＮ３ドメイン標的化免疫細胞を含む医薬組成物を製造する方法であって、ＦＮ３ドメイン標的化免疫細胞と、薬学的に許容される担体とを組み合わせて医薬組成物を得ることを含む、方法に関する。
【０１４６】
本発明は以下の非限定的な実施形態も提供する。
【０１４７】
実施形態
１．フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
【０１４８】
２．
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｂ．配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｃ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｄ．配列番号３５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号４４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号４６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｅ．配列番号３６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｆ．配列番号３７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号４５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号４７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｇ．配列番号３８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号５４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号５６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｈ．配列番号３９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号５５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号５７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、若しくは
ｉ．配列番号４０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号５５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号５７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む、実施形態１に記載の単離抗体又は抗原結合フラグメント。
【０１４９】
３．
ａ．抗体の可変重鎖は配列番号１４のアミノ酸配列を含み、抗体の可変軽鎖は配列番号１５のアミノ酸配列を含む、
ｂ．抗体の可変重鎖は配列番号７４のアミノ酸配列を含み、抗体の可変軽鎖は配列番号７５のアミノ酸配列を含む、若しくは
ｃ．抗体の可変重鎖は配列番号７８のアミノ酸配列を含み、抗体の可変軽鎖は配列番号７９のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【０１５０】
４．
ａ．抗体の重鎖は配列番号１８のアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖は配列番号１９のアミノ酸配列を含む、
ｂ．抗体の重鎖は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖は配列番号２１のアミノ酸配列を含む、
ｃ．抗体の重鎖は配列番号６２のアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖は配列番号６３のアミノ酸配列を含む、若しくは
ｄ．抗体の重鎖は配列番号６４のアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖は配列番号６５のアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【０１５１】
５．抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ２フラグメント、又は一本鎖抗体である、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の抗原結合フラグメント。
【０１５２】
６．抗体又はその抗原結合フラグメントはＩｇＧである、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【０１５３】
７．実施形態１〜６のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合フラグメントをコードする単離ポリヌクレオチド。
【０１５４】
８．実施形態７に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【０１５５】
９．実施形態７に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【０１５６】
１０．実施形態８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【０１５７】
１１．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離ポリヌクレオチドであって、
（ａ）ＦＮ３ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合するｓｃＦｖを含む細胞外ドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
ＣＡＲは、任意追加的に、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとを連結するヒンジ領域を更に含む、単離ポリヌクレオチド。
【０１５８】
１２．ＣＡＲは、
（ａ）配列番号６８〜７３のうちの１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを含む細胞外ドメインと、
（ｂ）配列番号２４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むヒンジ領域と、
（ｃ）配列番号２５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインと、
（ｄ）配列番号２６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する共刺激ドメインと、配列番号２７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインとを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、実施形態１１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【０１５９】
１３．
（ａ）細胞外ドメインは、配列番号６８〜７３のうちの１つのアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ヒンジ領域は配列番号２４のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）膜貫通ドメインは配列番号２５のアミノ酸配列を含み、
（ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む、実施形態１２に記載の単離ポリヌクレオチド。
【０１６０】
１４．実施形態１１〜１３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【０１６１】
１５．実施形態１１〜１３のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【０１６２】
１６．実施形態１４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【０１６３】
１７．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、
（ａ）ＦＮ３ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合するｓｃＦｖを含む細胞外ドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
ＣＡＲは、任意追加的に、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとを連結するヒンジ領域を更に含む、ＣＡＲ。
【０１６４】
１８．
（ａ）配列番号６８〜７３のうちの１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するｓｃＦｖを含む細胞外ドメインと、
（ｂ）配列番号２４と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むヒンジ領域と、
（ｃ）配列番号２５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインと、
（ｄ）配列番号２６と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する共刺激ドメインと、配列番号２７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインとを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、実施形態１６に記載のＣＡＲ。
【０１６５】
１９．
（ａ）細胞外ドメインは、配列番号６８〜７３のうちの１つのアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ヒンジ領域は配列番号２４のアミノ酸配列を含み、
（ｃ）膜貫通ドメインは配列番号２５のアミノ酸配列を含み、
（ｄ）細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む、施形態１７に記載のＣＡＲ。
【実施例】
【０１６６】
下記実施例は、先の開示を補い、本明細書に記載された主題のより良好な理解を提供するために提供される。これらの実施例は、記載された主題を限定すると解釈されるべきでない。本明細書に記載された実施例及び実施形態は例示のみを目的とするものであり、それらを考慮した種々の改変又は変更は、当業者に明らかであり、また、本発明の真の範囲内に含まれ、かつ本発明の真の範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。
【０１６７】
実施例１：抗ＦＮ３ドメイン抗体を生成するためのウサギの免疫化
Ｔｅｎｃｏｎ２５抗原（配列番号２８）を使用して、ウサギモノクローナル抗体の生成を行った。
ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＡＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＶＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＩＦＴＴ
【０１６８】
動物：３ヶ月齢のニュージーランド白色ウサギ（ＩＤ  Ｅ４８３１及びＥ４８３２）、免疫化を行った。
【０１６９】
免疫化プロトコル：
ウサギは、標準的なプロトコル（５回の注射及びウサギ当たり２回の試験採血）を用いて免疫化した。各注射時に抗原アリコートを解凍し、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（初回注射用）又は不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）（以降の注射用）と組み合わせた。注入経路は皮下（ＳＣ）であった。免疫化の詳細を表３に要約する。
【０１７０】
【表３】
2020530766.tif 000005
【０１７１】
ＥＬＩＳＡ力価検査：
試験採血１及び２を用いて、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ、Ｉｎｃ．標準プロトコルでＴｅｎｃｏｎ２５並びにカウンタースクリーニング抗原Ｔｅｎｃｏｎ２８（配列番号２９）及びＰ１１４−８３（配列番号３０）に対する血清力価を評価した。結論として、両ウサギとも、免疫原に対して良好な免疫応答を有し、脾臓摘出の標準的なカットオフ値を満たした（１：６４Ｋ希釈でＯ．Ｄ．＞０．３）。脾臓摘出及びモノクローナル融合の候補としてウサギＥ４８３２を選択した。
【０１７２】
脾臓摘出：
ＩＶブーストをウサギＥ４８３２に投与し、続いて脾臓を摘出した。
【０１７３】
脾臓を摘出し、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓの標準手順に従って脾細胞を単離した（表３）。
【０１７４】
【表４】
2020530766.tif 000006
【０１７５】
融合：
２億個のリンパ球細胞を１億個の融合パートナー細胞と融合させ、２０Ｘ９６ウェルプレート上にそれぞれ播種した（表４）。標準条件下でプレートを組織培養インキュベータ内に保持した。
【０１７６】
【表５】
2020530766.tif 000007
【０１７７】
融合の２〜３週間後に細胞増殖を調べ、増殖を示したウェルの数を、調べたウェルの総数で除算して融合効率を計算した。融合ごとに、最低でも２枚のプレートを調べた。
【０１７８】
スクリーニングプロセスを以下に要約する。
・プレスクリーニング：プレート番号５及び２５；
・一次スクリーニング：残りの３８枚のプレート；
・スクリーニング方法：標準的なＥＬＩＳＡ、５０ｎｇのＴｅｎｃｏｎ２５／ウェルでプレートをコーティングした；
・陽性対照：１：１０Ｋ希釈のＥ４８３２の採血２；
・結果：０．５超のＯ．Ｄ．を有する１５８個のクローンは陽性と推定し、２４ウェルのプレートに更に増殖させた。
・確認スクリーニング：５０ｎｇのＴｅｎｃｏｎ２５／ウェルで、又は５０ｎｇのＴｅｎｃｏｎ２８又はＰ１１４−８３でプレートをコーティングした。
・結果：Ｔｅｎｃｏｎ２５に対して１５１個のクローンが陽性であると確認した。これらの中でも、７８個はＴｅｎｃｏｎ２８陰性であるため、Ｔｅｎｃｏｎ２５に特異的であった。
【０１７９】
実施例２：抗ＦＮ３ドメイン抗体の選択
作製：
全てのセンチリンへの結合についてクローン上清を評価した。陰性対照タンパク質への結合は見られなかった。この評価から、作製用に１個のクローン（ＥＮ−２５−１０５−５）を採取した。ハイブリドーマ細胞を培養し、無血清培地に適合させ、１Ｌのインテグラフラスコに接種した。採取後、プロテインＡ樹脂を用いて抗体を精製し、ＱＣを行った。ＣＥＮ−２５−１０５−５の収量は、２０ｍｇであった。
【０１８０】
【表６】
2020530766.tif 000008
【０１８１】
ＣＥＮ−２５−１０５−５のＶＨ及びＶＬを以下の表７に示す。
【０１８２】
【表７】
2020530766.tif 000009
発現及び特性評価のために、ＣＥＮ−２５−１０５−５の重鎖及び軽鎖の可変領域をラット及びマウスＩｇＧＫ発現ベクターにクローニングした。ここで、ＣＥＮ−２５−１０５−５は、マウスＩｇＧ２ａ  κ抗体としてＡＳ７Ｂ９１と称し、ラットＩｇＧ１  κ抗体としてＡＳ７Ｂ９０と称する。ＡＳ７Ｂ１６及びＡＳ７Ｂ８２もまた、それぞれマウス及びウサギＶ領域から生成した。表８及び９は、Ａ７Ｂ１６及びＡＳ７Ｂ８２のＣＤＲ及びＶ領域の配列を示す。全ての抗体の重鎖及び軽鎖配列を以下の表１０に示す。
【０１８３】
【表８】
2020530766.tif 000010
【０１８４】
【表９】
2020530766.tif 000011
【０１８５】
【表１０】
2020530766.tif 000012
【０１８６】
【表１１−１】
2020530766.tif 000013
【０１８７】
【表１１−２】
2020530766.tif 000014
【０１８８】
実施例３：元のＣＥＮ−２５−１０５−５ウサギ抗体と比較した、組み換えＡＳ７Ｂ９０及びＡＳ７Ｂ９１のＦＮ３ドメインへの結合
ＥＬＩＳＡによって、組み換えＦＮ３ドメインへの結合能について、それぞれＣＥＮ−２５−１０５−５のラット及びマウスキメラであるＡＳ７Ｂ９０及びＡＳ７Ｂ９１の上清を評価した。ヒトｃＭＥＴに特異的なＦＮ３ドメインＡ３（配列番号３１）、アルブミン結合ドメインを有するヒトＥＧＦＲに特異的な８３ｖ２−ＡＢＤ（配列番号３２）、特異性を有さないＴｅｎｃｏｎ２５（配列番号２８）、又は陰性対照タンパク質の用量反応曲線で、３枚のプレートをコーティングした（全て５０ｍＭのＰＢＳ中５０μＬ／ウェル）。プレートを一晩、４℃でインキュベートした。プレートから上清を捨て、２００μＬ／ウェルのＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋを添加して、ＲＴで１時間プレートをブロッキングした。プレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ中１μｇ／ｍＬで上清及びＣＥＮ２５−１０５−５を調製し、プレートに添加した。プレートをＲＴで１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。二次抗体（ＨＲＰ−ヤギ抗ウサギ、ラット又はマウス）をＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ中１：１０，０００で調製し、プレートに添加した。プレートをＲＴで１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。５０μＬ／ウェルのＰＯＤ試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製造業者の取扱説明書に従って調製し、使用前にＲＴで少なくとも３０分間暗所でインキュベートした）をプレートに添加した。３〜５分間のインキュベート後、遮光し、Ｍ５を用いて発光を読み取った。Ｌｏｇ／Ｌｏｇ変換、次いで４パラメータの曲線当て嵌めを使用して、Ｐｒｉｓｍで結果をプロットした（図１Ａ〜Ｃ）。図１Ａ〜Ｃに示すように、ＡＳ７Ｂ９０及びＡＳ７Ｂ９１の両方が３つの異なるＦＮ３ドメインに対する特異性を示し、これらの抗ＦＮ３ドメイン抗体の結合エピトープは、その保存されたフレームワーク領域に特異的であり、ＦＮ３ドメイン特異性を付与する可変ループではないことを確認した。陰性対照抗体に対する非特異的結合は存在しなかったことに留意されたい。抗体のマウスバージョンであるＡＳ７Ｂ９１は、元のウサギハイブリドーマ抗体により近い結合特性を有するように見えた。
【０１８９】
実施例４：初代Ｔ細胞の表面に発現した抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴｙｒｉｎの検出のためのＡＳ７Ｂ９１の試験。
ウェル当たり１００μＬの１×１０６の抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴｙｒｉｎ  Ｔ細胞／ｍＬを播種した。ウェルをＰＢＳで２回洗浄した。ＬＩＶＥ−ＤＥＡＤサンプル染色のために１：２０００の最終濃度でｅｆｌｏｕｒ  ５０６  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅをサンプルに添加し、４℃で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で染色反応をクエンチし、ＦＡＣＳ緩衝液でサンプルを２回洗浄した。Ｆｃブロックを室温で１０分間添加した（３３μＬのＦＣ／ｍＬ  ＦＡＣＳ）。１００μＬの一次ＡＳ７Ｂ９１、ＦＡＣＳ緩衝液、又はアイソタイプ対照を添加し、氷上で２０分間インキュベートした。次いで、ＦＡＣＳ緩衝液でサンプルを１回洗浄した。二次抗体を添加し、氷上で２０分間インキュベートした（１０μｇ／ｍＬの最終濃度を得るために抗マウスＩｇＧ−ＡＦ６４７を１：５０で使用した）。二次抗体のインキュベーション後、ウェルをＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、続いてＰＢＳで１回洗浄した。洗浄後、室温で、試料を２％ＰＦＡに１０分間固定した。サンプルを洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁させた。
【０１９０】
図２に示すように、組み換えＡＳ７Ｂ９１は、初代Ｔ細胞の表面でのＣＡＲＴｙｒｉｎの発現を検出することができ、したがって、一般的なＣＡＲＴｙｒｉｎ検出試薬として使用することができる。ＣＡＲＴｙｒｉｎ発現Ｔ細胞の均質集団では、Ａ７Ｂ９１抗体を使用して、細胞表面のＣＡＲＴｙｒｉｎの数を定量化することができる。
【０１９１】
実施例５：ＣＡＲＴｙｒｉｎ発現Ｔ細胞を活性化するためのＡＳ７Ｂ９１の使用
ＣＡＲＴｙｒｉｎはＴ細胞シグナル伝達ドメインに結合しているため、ＡＳ７Ｂ９１抗体によるこれらのＣＡＲＴｙｒｉｎの結合及びクラスター化は、それらのシグナル伝達ドメインの活性化、及びそれらを発現するＴ細胞の活性化をもたらし得る。これを試験するために、ＣＡＲＴｙｒｉｎｓを発現する初代Ｔ細胞を、活性化を誘発することが知られているＡＳ７Ｂ９１又は抗ＣＤ３抗体と共にインキュベートした。簡潔には、ＥＣＭ  ８３０  Ｓｑｕａｒｅ  Ｗａｖｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＴＸ社）を用いて、正常なヒト血液（Ｎｏｒｍａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｄｏｎｏｒ  Ｓｅｒｖｉｃｅ−ＴＳＲＩ）に由来する初代汎Ｔ細胞に１２個の異なるＢＣＭＡ  ＲＮＡ発現ＣＡＲＴｙｒｉｎｍクローンをエレクトロポレートした。５×１０６個の汎Ｔ細胞に、１０μｇのＢＣＭＡ標的化ＣＡＲ  ｍＲＮＡの存在下又は非存在下で、製造者のプロトコルに従って単一の電気パルス（５００Ｖ、７５０μ秒）を与えた。ポリクローナル抗ＦＮ３ドメイン抗体を用いて、ＣＡＲの表面発現を２４時間後に評価した。可溶性抗ＣＤ２８抗体（２μｇ／ｍＬ）の存在下で、ＡＳ７Ｂ９１又は抗ＣＤ３抗体をいずれも５μｇ／ｍＬで播種した。細胞及び上清を、刺激後２日目及び６日目に採取した。Ｔ細胞サブセットマーカー（ＣＤ４、８）、活性化マーカー（ＣＤ２５、６９、７１、１３７、ＨＬＡ−ＤＲ）及びＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅについて細胞を染色した。活性化マーカーの発現について個々に、生（ＦＶＤ陰性）とゲーティングされた細胞−＞ダブレット排除−＞ＣＤ４又はＣＤ８の単陽性＞ＣＤ４及びＣＤ８を評価した。ＬＳＲ電圧は、抗体結合ビーズ及び単色対照に基づいて設定した。ゲートは、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｎｕｓ  Ｏｎｅ（ＦＭＯ）及びアイソタイプ対照に基づいて設定した。
【０１９２】
表１１に見られるように、ＡＳ７Ｂ９１モノクローナル抗ＦＮ３ドメイン抗体は、ＣＤ２８を介した共刺激の存在下でＣＡＲＴｙｒｉｎ＋初代ｐａｎＴ細胞を刺激することができる（抗ＣＤ３／ＣＤ２８処置に類似）。この活性化はＣＡＲＴｙｒｉｎ発現に依存し、抗ＣＤ３で観察されるように、ロバストでも、長くもない。加えて、ＡＳ７Ｂ９１及び抗ＣＤ２８による処理は、非刺激細胞と比較して、細胞数の１１倍の増加をもたらす。要約すると、抗ＦＮ３ドメイン抗体は、Ｔ細胞増殖及びＣＡＲＴｙｒｉｎを発現する細胞の活性化を誘導することができる。
【０１９３】
【表１２】
2020530766.tif 000015
【０１９４】
実施例６：ＡＳ７Ｂ９１のｓｃＦｖキメラ抗原受容体への遺伝子操作：
ＡＳ７Ｂ９１、ＡＳ７Ｂ１６、及びＡＳ７Ｂ８２抗体のＣＡＲコンストラクトを生成するために、可変領域をｓｃＦｖｓ内に構築した。ＡＳ７Ｂ９１については、ｓｃＦｖｓを２つの異なる配向（ＨＣｖ−ＬＣｖ又はＬＣＶ−ＨＣｖ）で生成した。
ＡＳ７Ｂ９１  Ｈ−Ｌ  ｓｃＦｖ（配列番号２２）
ＭＥＴＧＬＲＷＬＬＬＶＡＶＬＫＧＶＱＣＱＳＬＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＧＩＤＬＳＴＳＶＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＳＩＧＦＩＹＴＮＶＮＴＹＹＡＳＷＡＫＧＲＦＴＩＳＲＴＳＴＴＶＤＬＫＩＴＳＰＴＴＧＤＴＡＴＹＦＣＡＲＡＶＹＡＧＡＭＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＴＰＡＳＶＳＧＰＶＧＧＴＶＴＩＫＣＱＡＳＥＲＩＹＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＫＡＳＴＬＡＳＧＶＳＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＲＤＬＥＣＡＤＡＡＴＹＳＣＱＹＴＳＹＧＳＧＹＶＧＴＦＧＧＧＴＥＶＶＶＥＧ
ＡＳ７Ｂ９１  Ｌ−Ｈ  ｓｃＦｖ（配列番号２３）
ＭＤＴＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣＤＶＶＭＴＱＴＰＡＳＶＳＧＰＶＧＧＴＶＴＩＫＣＱＡＳＥＲＩＹＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＫＡＳＴＬＡＳＧＶＳＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＲＤＬＥＣＡＤＡＡＴＹＳＣＱＹＴＳＹＧＳＧＹＶＧＴＦＧＧＧＴＥＶＶＶＥＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＧＩＤＬＳＴＳＶＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＳＩＧＦＩＹＴＮＶＮＴＹＹＡＳＷＡＫＧＲＦＴＩＳＲＴＳＴＴＶＤＬＫＩＴＳＰＴＴＧＤＴＡＴＹＦＣＡＲＡＶＹＡＧＡＭＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＡＳ７Ｂ１６  Ｈ−Ｌ  ｓｃＦｖ（配列番号６６）
ＱＶＴＬＫＥＳＧＰＧＩＬＱＰＳＱＴＬＳＬＴＣＳＦＳＧＦＳＬＮＴＳＧＴＧＶＧＷＩＲＱＰＳＧＫＧＬＥＷＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＧＹＮＰＡＬＫＳＲＬＴＩＳＫＮＴＳＳＮＬＶＦＬＫＩＡＳＶＤＴＡＤＴＡＴＹＹＣＶＲＩＫＧＲＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＮＩＭＭＴＱＳＰＳＳＬＡＶＳＡＧＥＫＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＶＬＦＧＳＫＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＩＬＴＩＳＮＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＨＱＹＬＳＬＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ
ＡＳ７Ｂ１６  Ｌ−Ｈ  ｓｃＦｖ（配列番号８２）
ＮＩＭＭＴＱＳＰＳＳＬＡＶＳＡＧＥＫＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＶＬＦＧＳＫＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＩＬＴＩＳＮＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＨＱＹＬＳＬＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＴＬＫＥＳＧＰＧＩＬＱＰＳＱＴＬＳＬＴＣＳＦＳＧＦＳＬＮＴＳＧＴＧＶＧＷＩＲＱＰＳＧＫＧＬＥＷＬＡＨＩＷＷＤＤＤＫＧＹＮＰＡＬＫＳＲＬＴＩＳＫＮＴＳＳＮＬＶＦＬＫＩＡＳＶＤＴＡＤＴＡＴＹＹＣＶＲＩＫＧＲＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
ＡＳ７Ｂ８２  Ｈ−Ｌ  ｓｃＦｖ（配列番号６７）
ＱＥＱＱＫＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＡＳＬＴＬＴＣＴＡＳＧＩＤＦＳＳＶＡＹＭＣＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＡＣＩＹＡＧＳＳＳＳＩＹＹＡＳＷＡＫＧＲＦＴＶＳＲＴＳＳＴＴＶＴＬＱＭＴＳＬＴＡＡＤＴＡＴＹＦＣＡＲＧＬＦＴＳＧＳＧＹＹＩＤＭＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＶＶＭＴＱＴＰＳＳＶＥＶＡＶＧＧＴＶＴＩＫＣＱＡＳＱＳＩＧＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＲＰＫＬＬＩＹＧＡＳＮＬＡＡＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＤＶＥＣＡＤＡＡＴＹＹＣＱＲＧＹＩＳＳＡＶＤＦＦＶＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＧ
ＡＳ７Ｂ８２  Ｌ−Ｈ  ｓｃＦｖ（配列番号８３）
ＤＶＶＭＴＱＴＰＳＳＶＥＶＡＶＧＧＴＶＴＩＫＣＱＡＳＱＳＩＧＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＲＰＫＬＬＩＹＧＡＳＮＬＡＡＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＤＶＥＣＡＤＡＡＴＹＹＣＱＲＧＹＩＳＳＡＶＤＦＦＶＦＧＧＧＴＥＶＶＶＫＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＥＱＱＫＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＡＳＬＴＬＴＣＴＡＳＧＩＤＦＳＳＶＡＹＭＣＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＡＣＩＹＡＧＳＳＳＳＩＹＹＡＳＷＡＫＧＲＦＴＶＳＲＴＳＳＴＴＶＴＬＱＭＴＳＬＴＡＡＤＴＡＴＹＦＣＡＲＧＬＦＴＳＧＳＧＹＹＩＤＭＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０１９５】
異なるｓｃＦｖ配列のアミノ酸配列を逆翻訳し、ヒンジ配列、ＴＭドメイン、及びシグナル伝達ドメインを用いて遺伝子操作した。市販のｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ（登録商標）Ｔ７  ＵＬＴＲＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して、完成したコンストラクトをＴ７インビトロ転写ベクターにクローニングしてｍＲＮＡを生成した。ＣＡＲコンストラクトの各構成要素のアミノ酸配列は、表１２に示すとおりであった。
【０１９６】
【表１３−１】
2020530766.tif 000016
【０１９７】
【表１３−２】
2020530766.tif 000017
【０１９８】
実施例７：ＡＳ７Ｂ９１、ＡＳ７Ｂ１６、及びＡＳ７Ｂ８２  ＣＡＲを発現する遺伝子操作した免疫細胞の作製及び分析
ｍＲＮＡを、正常なヒト血液（正常血液ドナーサービス−ＴＳＲＩ）に由来するｐａｎ  Ｔ細胞に、ＥＣＭ  ８３０  Ｓｑｕａｒｅ  Ｗａｖｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＴＸ社）を用いてエレクトロポレートした。５×１０６個の汎Ｔ細胞に、１０μｇのＡＳ７Ｂ９１  ＣＡＲ  ｍＲＮＡの存在下又は非存在下で、製造者のプロトコルに従って単一の電気パルス（５００Ｖ、７５０μ秒）を与えた。ポリクローナル抗ＦＮ３ドメイン抗体を用いて、ＣＡＲの表面発現を２４時間後に評価した。結果を図３に示す。
【０１９９】
ＦＮ３ドメインへの結合能についてＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ細胞の機能性を試験し、標的細胞へのＦＮ３ドメイン結合に応答してＴ細胞殺傷を誘発した。これはまず、ＢＣＭＡｈｉ（Ｈ９２９細胞）、ＢＣＭＡｌｏ（Ｄ０ＨＨ−２細胞）ＢＣＭＡｎｅｇ（ＥＸＰＩ２９３細胞）標的細胞と共にＢＣＭＡＩ特異的ＦＮ３ドメインを使用した脱顆粒アッセイで、次いで殺傷アッセイで測定した。
【０２００】
脱顆粒アッセイ（ＣＤ１０７ａ動員）では、Ｔ細胞を９６ウェルプレートで、１：１又は１：１０量のＢＣＭＡタンパク質を発現している、又は発現していない細胞と共にインキュベートした。共培養は、１：１５００のＧｏｌｇｉ  Ｓｔｏｐ（ＢＤ）及び１：１３００の抗ＣＤ１０７ａ  ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を含有する、最終体積のＯｐＴｍｉｚｅｒ「完全」培地に、３７℃で４時間維持した。４時間のインキュベーション期間後、細胞をＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ（ｅＦｌｕｏｒ  ７８０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び蛍光色素共役抗ＣＤ８（ＰＥ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ、Ｂｉｏｌｏｇｅｎｄ）で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。脱顆粒活性は、ＣＤ８＋細胞間でのＣＤ１０７ａ染色に対する平均蛍光強度シグナル（ＭＦＩ）を測定することによって測定した。ｍＲＮＡトランスフェクション２４時間後に、脱顆粒アッセイを実施した。図４に見られるように、抗ＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメインを添加すると、ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ及びＡＳ７Ｂ９１に特異的に脱顆粒された。これらのデータは、ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲが、標的特異的ＦＮ３ドメインに応答して結合し、シグナルを伝達する能力において機能的であることを示す（標的は、他の細胞の表面に発現する）。
【０２０１】
ＣＦＳＥ標識ＢＣＭＡｈｉ（Ｕ−２９３２細胞）、ＢＣＭＡｌｏ（Ｄ０ＨＨ−２細胞）ＢＣＭＡｎｅｇ（ＥＸＰＩ２９３細胞）標的細胞と共にＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメインに応答したＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ−Ｔ細胞殺傷を評価した。ＢＣＭＡ標的細胞との４８時間のインキュベーションの前に、ＣＡＲ−Ｔ／疑似Ｔ細胞を、ＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメインと共に、３７℃で１時間プレインキュベートした（Ｅ：Ｔ比は０〜１の範囲である）。実験の最後に、死細胞をＣＦＳＥ−ＦＬ１、ＳＹＴＯＸ−ｒｅｄ−ＦＬ４で標識した。細胞死の割合をフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）により分析し、データをＦｌｏｗＪｏ  ｖ  １０．で分析した。図５に見られるように、ＢＣＭＡ特異的ＦＮ３ドメインを添加すると、ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡＦＮ３ドメイン及びＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲに特異的にＢＣＭＡ発現標的細胞を殺傷した。これらのデータは、ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲが、標的特異的ＦＮ３ドメインに応答して結合し、シグナルを伝達する能力において機能的であることを示す（標的は、他の細胞の表面に発現する）。
【０２０２】
ＡＳ７Ｂ１６及びＡＳ７Ｂ８２について、フローサイトメトリーを用いて結合を評価した。簡潔には、エレクトロポレーションから２４時間後、細胞を１００ｘｇで１０分間遠心分離し、ＦＡＣＳ染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号５５４６５７）中で２回洗浄した。細胞を、５０ｎＭの最終濃度のＡＰＣ標識抗Ｔｅｎｃｏｎ−２５又はＡＦ６４７標識抗ＥＧＦＲ  ８３ｖ２  ＦＮ３ドメインのいずれかと共に、４℃で１時間インキュベートした。標識細胞をＦＡＣＳ染色緩衝液中で２回洗浄し、２００ｕＬの同じ緩衝液に再懸濁させた。ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用してデータを収集し、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用して分析を行った。データを図６〜図９に示す。全てのＣＡＲＴを試験し、ＡＳ７Ｂ１６、ＡＳ７Ｂ８２、及びＡＳ７Ｂ９１は、試験した両ＦＮ３ドメイン、Ｔｅｎｃｏｎ−Ｔ２５、及びＥＧＦＲ  ８３ｖ２に結合する。ＣＡＲＴの結合は、ＡＳＳ７Ｂ９１＞ＡＳ７Ｂ８２＞ＡＳ７Ｂ１６の順に生じる。
【０２０３】
実施例８：環状シトルリン化ペプチドに結合したＦＮ３ドメインと予め複合化された、ａｓ７ｂ９１  ｓｃＦＶ  ＣＡＲ−Ｔにより媒介される抗シトルリン化タンパク質抗体発現細胞のインビトロ殺傷
自己免疫疾患は、自己抗原に対する抗体（自己抗体）の調節不全産生を特徴とする。これらの自己抗体は、タンパク質及び核酸を含むがこれらに限定されない様々な分子に対するものであり得る。タンパク質の場合、これらの自己抗体は、翻訳後改変された抗原を認識することが多い。以下に、環状シトルリン化ペプチド（ＣＣＰ−１）に結合したセンチリンと予め複合化された、Ａ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ−Ｔ細胞によって媒介される、抗シトルリン化タンパク質抗体（ＡＣＰＡ）発現細胞（「ＢＡＲ−Ｔ」細胞）のインビトロ殺傷を示す。この所見は、自己抗原が、ＢＡＲ−Ｔ細胞と係合するためにＴｅｎｃｏｎ２５センチリンに結合して、抗原特異的な自己反応性Ｂ細胞の標的排除をもたらし得ることを示唆する。
【０２０４】
ＦｃｇＲ発現細胞株の生成
Ｌｅｎｔｉ−Ｐａｃ  ＨＩＶ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ）を使用して、ヒトＦｃｇＲ（ＣＤ１６ａ、ＣＤ３２及びＣＤ６４）をコードする精製レンチウイルス発現プラスミドを、２９３Ｔ細胞のトランスフェクション用にパッケージングした。トランスフェクションの７２時間後に、レンチ含有上清を採取し、ＨＥＫ２９３細胞の形質導入に使用した。培地に、ポリブレン（最終濃度８ｕｇ／ｍＬ）を添加した。翌日、ポリブレン含有培地を、１０％ウシ胎児血清を補添加したＲＰＭＩ培地１６４０と置き換えた。形質導入の７２時間後に細胞を採取し、ＦｃｇＲ発現のために染色した。次いで、ＦｃｇＲ発現に基づいて細胞を選別した（ＳＨ８００Ｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ−Ｓｏｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。高発現細胞を培養し、将来の研究のために標的細胞として使用した。
【０２０５】
シトルリン化環状ペプチドのＴｅｎｃｏｎ２５センチリンへの結合
グリシンで標識された（ＧＧＧ−）シトルリン化環状ペプチド−１（ＣＣＰ−１−Ｃｉｔ）及びアルギニン対照ペプチド（ＣＣＰ−１−Ａｒｇ）を、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから得た。ソルターゼ−ｖ５で標識されたＴｅｎｃｏｎ２５（Ｔｅｎｃｏｎ２５＿ｓｏｒｔ＿ｖ５）をＴＢＳ内で脱塩し、結合前に濃縮した。各ペプチドを、ソルターゼの化学的性質を用いて１：５比（ＦＮ３ドメイン対ペプチド）で結合させた。Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ）上での用手法により複合体を精製して、遊離ソルターゼ及びペプチドを除去した。精製後、複合体をＰＢＳへとバッファー交換し、濃縮した。複合体は、（ａ）質量分析（ＬＣ−ＭＳ）及び（ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５）によってＱＣを行い、滅菌濾過した。
【０２０６】
センチリン−ＣＣＰ１ペプチド複合体への抗シトルリン化抗体の結合の検出
ＦｃｇＲ発現ＨＥＫ２９３細胞を、２００μｇ／ｍＬのヒト抗シトルリン化フィブリノーゲン抗体（クローン１Ｆ１１−Ｍｏｄｉｑｕｅｓｔ）又はヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（Ａｂｃａｍ）と共に３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した後、センチリン−ＣＣＰ１−Ｃｉｔ複合体（５７６ｎＭ）と共に氷上で１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで、ＰＥ標識抗センチリン（ＡＳ７Ｂ９１）抗体と共に氷上で３０分間インキュベートした。フローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ）によって結合を評価し、ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ  ６．１．３ソフトウェアで分析した。
【０２０７】
ＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ−Ｔ細胞による抗シトルリン化ｍＡｂ結合ＦｃＲ発現細胞の殺傷
電気穿孔済み疑似Ｔ細胞（疑似）又はＡＳ７Ｂ９１  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ−Ｔ細胞（「ＢＡＲ−Ｔ」）をセンチリン結合ＣＣＰ１（ｃｉｔ−ＣＣＰ）と予め複合化した。ＣＤ１６ａ又はＣＤ６４を発現しているＨＥＫ２９３細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ（ＣＴＧ）染料（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識し、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照又は抗シトルリン化フィブリノーゲン抗体（抗ＣＣＰ  Ａｂ）のいずれかと予め複合化した。次いで、ＢＡＲ−Ｔ及びＨＥＫ２９３細胞を、１：１又は５：１比で約１８時間播種した。実験の最後に、Ｚｏｍｂｉｅ  Ｄｙｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で細胞を染色した。死細胞は、フローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ）によって評価されたようにＣＴＧ＋／Ｚｏｍｂｉｅ＋細胞と見なした。ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ  ６．１．３及びＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアでデータを分析した。疑似Ｔ細胞又はアイソタイプ対照抗体とのインキュベーションに対して、センチリン−ＣＣＰ−１−ｃｉｔと予め複合化したＢＡＲ−Ｔ細胞と共にインキュベートしたとき、抗シトルリン化抗体に結合した標的細胞の細胞死は倍増した。
【０２０８】
ＢＡＲ−Ｔのプラットフォーム増殖のための複数の自己免疫疾患における潜在的なペプチド／抗体の組み合わせの評価
ａ）重症筋無力症（ＭＧ）、ｂ）多発性硬化症（ＭＳ）、及びｃ）全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に特異的なペプチドの、それぞれ抗ＡＣｈＲ、抗ＭＯＧ、又は抗ｄｓＤＮＡ抗体への結合能について試験した。３枚の高親和性結合ニュートラアビジンプレートを、１０ｕｇ／ｍＬの示されたペプチドでコーティングした。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、２×Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して室温で２時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、１００μｇ／ｍＬの示された抗体を室温で１時間添加した。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、適切な二次抗体を室温で１時間添加した。Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の添加前に、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを５〜８分間添加した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ３４０ＰＣ機器を使用して吸光度を読み取り、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを使用してデータを分析した。結合結果は、更に評価するために、疾患適応ごとに１つの潜在的なリードペプチド／抗体の組み合わせを同定した。
【０２０９】
【表１４−１】
2020530766.tif 000018
【０２１０】
【表１４−２】
2020530766.tif 000019
【０２１１】
【表１４−３】
2020530766.tif 000020
【０２１２】
【表１４−４】
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【０２１３】
【表１４−５】
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【０２１４】
【表１４−６】
2020530766.tif 000023
【０２１５】
【表１４−７】
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【０２１６】
【表１４−８】
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【０２１７】
参照文献
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Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４４−４５３（１９７０）
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Ｓｉｎｃｌａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．２００２（１）：９６−１０５  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，１９８４，Ｔｈｅ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ
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米国特許出願公開第２０１０／０２１６７０８号
米国特許出願公開第２０１３／０２２６８３４号
米国特許出願公開第２０１１／０２７４６２３号
米国特許第４７６７７０４号
米国特許第４６５７８６６号
米国特許第４９２７７６２号
米国特許第４５６０６５５号
米国特許第５１２２４６９号
国際公開第９０／０３４３０号
国際公開第８７／００１９５号
米国再発行特許第３０９８５号
国際公開第２０１３／１７６９１５号
国際公開第２０１４／１３０６３５号
国際公開第２０１３／１７６９１６号
国際公開第２０１３／１７６９１５号
国際公開第２０１４／０３９５２３号
国際公開第２０１４／１８４７４１号
国際公開第２０１４／１９１１２８号
国際公開第２０１４／１８４７４４号
国際公開第２０１４／１８４１４３号
米国特許第６３５２６９４号
米国特許第６５３４０５５号
米国特許第６９０５６８０号
米国特許第６６９２９６４号
米国特許第５８５８３５８号
米国特許第６８８７４６６号
米国特許第６９０５６８１号
米国特許第７１４４５７５号
米国特許第７０６７３１８号
米国特許第７１７２８６９号
米国特許第７２３２５６６号
米国特許第７１７５８４３号
米国特許第５８８３２２３号
米国特許第６９０５８７４号
米国特許第６７９７５１４号
米国特許第６８６７０４１号
米国特許出願公開第２００６／１２１００５号
米国特許第６０４０１７７号
米国特許第５８２７６４２号
国際公開第２０１２１２９５１４号
【図１Ａ】
2020530766.tif 000026
【図１Ｂ】
2020530766.tif 000027
【図１Ｃ】
2020530766.tif 000028
【図２Ａ】
2020530766.tif 000029
【図２Ｂ】
2020530766.tif 000030
【図２Ｃ】
2020530766.tif 000031
【図２Ｄ】
2020530766.tif 000032
【図２Ｅ】
2020530766.tif 000033
【図２Ｆ】
2020530766.tif 000034
【図２Ｇ】
2020530766.tif 000035
【図２Ｈ】
2020530766.tif 000036
【図２Ｉ】
2020530766.tif 000037
【図２Ｊ】
2020530766.tif 000038
【図２Ｋ】
2020530766.tif 000039
【図２Ｌ】
2020530766.tif 000040
【図２Ｍ】
2020530766.tif 000041
【図３】
2020530766.tif 000042
【図４Ａ】
2020530766.tif 000043
【図４Ｂ】
2020530766.tif 000044
【図４Ｃ】
2020530766.tif 000045
【図５−１】
2020530766.tif 000046
【図５−２】
2020530766.tif 000047
【図５−３】
2020530766.tif 000048
【図５−４】
2020530766.tif 000049
【図５−５】
2020530766.tif 000050
【図５−６】
2020530766.tif 000051
【図６】
2020530766.tif 000052
【図７】
2020530766.tif 000053
【図８】
2020530766.tif 000054
【図９】
2020530766.tif 000055
【図１０−１】
2020530766.tif 000056
【図１０−２】
2020530766.tif 000057
【図１１Ａ】
2020530766.tif 000058
【図１１Ｂ】
2020530766.tif 000059
【図１２】
2020530766.tif 000060
【図１３】
2020530766.tif 000061
【図１４Ａ】
2020530766.tif 000062
【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【配列表】
2020530766000001.app
【国際調査報告】
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2020530766.tif 000066
2020530766.tif 000067
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