(57)【要約】  開示されるのは、ＣＤ３３発現がんの標的治療のための組成物および方法である。具体的には、ＣＤ３３発現がんを標的とし殺傷するために養子細胞移入を用いて使用することのできる、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドが開示される。また開示されるのは、これらのＣＡＲを発現するように工学的に作製された免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などである。そのため、また開示されるのは、ＣＤ３３発現がんを有する対象において抗腫瘍免疫を付与する方法であって、この方法は、本開示のＣＡＲを発現するように工学的に作製された本開示の免疫エフェクター細胞の養子移入を含む。Ｔ細胞にＣＤ３３発現悪性細胞を破壊させることのできる多価抗体も開示される。
2020530768.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３３抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、および共刺激シグナル伝達領域を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド。
【請求項２】
前記ＣＤ３３抗原結合ドメインが、ＣＤ３３を特異的に結合する抗体の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖのＶＨドメインが、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖのＶＬドメインが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、または配列番号２８のアミノ酸配列を含む、請求項２または３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される共刺激分子の細胞質ドメインを含む、請求項１から４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ＣＡＲポリペプチドが、式：
ＳＰ−ＣＤ３３−ＨＧ−ＴＭ−ＣＳＲ−ＩＳＤ；または
ＳＰ−ＣＤ３３−ＨＧ−ＴＭ−ＩＳＤ−ＣＳＲ
により定義され、式中、
「ＳＰ」は、シグナルペプチドを表し、
「ＣＤ３３」は、ＣＤ３３結合領域を表し、
「ＨＧ」は、任意選択のヒンジドメインを表し、
「ＴＭ」は、膜貫通ドメインを表し、
「ＣＳＲ」は、共刺激シグナル伝達領域を表し、
「ＩＳＤ」は細胞内シグナル伝達ドメインを表し、
「−」は、二価のリンカーを表す、
請求項１から５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインを含む、請求項１から６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載の組換えポリペプチドをコードする単離された核酸配列。
【請求項９】
請求項８に記載の単離された核酸配列を含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１１】
前記細胞が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｂ細胞、自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ）、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、リンフォカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、調節性Ｔ細胞、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインがＣＤ３３に結合した際に、前記細胞が抗腫瘍免疫を発揮する、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記細胞は、ＣＤ３３抗原結合ドメインを含む第２のＣＡＲポリペプチドをさらに含み、前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインがＣＤ３３に結合し、かつ前記第２のＣＡＲの前記抗原結合ドメインがＣＤ１２３に結合した際に、前記細胞が抗腫瘍免疫を発揮する、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１４】
ＣＤ３３発現がんを有する対象において抗がん免疫を付与する方法であって、請求項１から７のいずれか１項に記載のＣＡＲポリペプチドを発現し、それによって哺乳動物において抗腫瘍免疫を付与するように遺伝子改変された有効な量の免疫エフェクター細胞を、前記対象に投与することを含む方法。
【請求項１５】
前記免疫エフェクター細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、および調節性Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
チェックポイント阻害剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、またはそれらの組合せを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記がんが、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、または混合表現型白血病を含む、請求項１４から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
以下の式：
ＶＬＩ−ＶＨＩ−ＶＬＴ−ＶＨＴ、
ＶＬＴ−ＶＨＴ−ＶＬＩ−ＶＨＩ、
ＶＨＴ−ＶＬＴ−ＶＨＩ−ＶＬＩ、
ＶＨＩ−ＶＬＩ−ＶＨＴ−ＶＬＴ、
ＶＬＩ−ＶＨＩ−ＶＨＴ−ＶＬＴ、
ＶＬＴ−ＶＨＴ−ＶＨＩ−ＶＬＩ、
を含み、式中、
「ＶＬＩ」は、免疫細胞抗原に特異的な軽鎖可変ドメインであり、
「ＶＨＴ」は、ＣＤ３３に特異的な重鎖可変ドメインであり、
「ＶＬＴ」は、ＣＤ３３に特異的な軽鎖可変ドメインであり、
「ＶＨＩ」は、免疫細胞抗原に特異的な重鎖可変ドメインであり、
「−」は、ペプチドリンカーまたはペプチド結合からなる、
融合ポリペプチド。
【請求項２０】
対象におけるがんを治療するための方法であって、医薬的に許容可能な担体中の治療的に有効な量の請求項１９に記載の融合ポリペプチドを前記対象に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、ここに本明細書に参照によりその全体を組み込まれる２０１７年７月２０日出願の米国仮特許出願第６２／５３４，９７７号、および２０１７年１１月２９日出願の第６２／５９２，１０７号の利益を請求するものである。
【背景技術】
【０００２】
外科手術、放射線療法、および化学療法は、白血病、固形腫瘍、および転移を含むがんの治療のための標準的に受け入れられているアプローチである。免疫療法（時として生物学的療法、生物療法、または生物学的応答改変療法とよばれる）は、身体の免疫系を用いて、直接的または間接的のどちらかでがんを縮小または根絶するものであり、従来のがん療法の補助法として長年にわたって研究されている。ヒトの免疫系は、がん療法のための未利用の資源であり、免疫系の構成成分を適正に活用すれば、有効な治療を開発できるものと考えられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＣＤ３３発現がんの標的治療のための組成物および方法が開示される。例えば、ＣＤ３３発現がんを選択的に結合することのできる抗ＣＤ３３抗体が、本明細書に開示される。そのため、これらの抗体に由来する抗原結合領域を含む組換え抗体および他のタンパク質も開示される。具体的には、ハイブリドーマ２７Ａ３、３３Ｇ３、３６Ｃ２、６Ａ１１、３５Ｄ５、および３８Ｇ５に由来する抗ＣＤ３３モノクローナル抗体が、本明細書に提供される。また開示されるのは、１つまたは複数のこれらの抗体の少なくとも抗原結合領域を含む、組換え抗体、ヒト化抗体、および／またはキメラ抗体である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
また開示されるのは、Ｔ細胞にＣＤ３３発現悪性細胞を破壊させることのできる多特異性の多価抗体である。例えば、この抗体は、二重特異性のＴ細胞エンゲージャーとすることができる。この抗体は、融合ポリペプチドから工学的に作製することができ、それは例えば、以下の式：
ＶＬＩ−ＶＨＩ−ＶＬＴ−ＶＨＴ、
ＶＬＴ−ＶＨＴ−ＶＬＩ−ＶＨＩ、
ＶＨＴ−ＶＬＴ−ＶＨＩ−ＶＬＩ、
ＶＨＩ−ＶＬＩ−ＶＨＴ−ＶＬＴ、
ＶＬＩ−ＶＨＩ−ＶＨＴ−ＶＬＴ、
ＶＬＴ−ＶＨＴ−ＶＨＩ−ＶＬＩ、
を有し、式中、
「ＶＬＩ」は、免疫細胞抗原に特異的な軽鎖可変ドメインであり、
「ＶＨＴ」は、ＣＤ３３に特異的な重鎖可変ドメインであり、
「ＶＬＴ」は、ＣＤ３３に特異的な軽鎖可変ドメインであり、
「ＶＨＩ」は、免疫細胞抗原に特異的な重鎖可変ドメインであり、
「−」は、ペプチドリンカーまたはペプチド結合からなる、
融合ポリペプチドなどである。
【０００５】
免疫細胞抗原は、ヒトのＮＫ細胞、Ｔ細胞、単球、マクロファージ、または顆粒球上に発現される細胞表面分子であることがある。例えば、細胞表面分子は、抗原ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ８９；ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０（ＫＬＲ−Ｆ１）、ＮＫＧ２Ｃ、またはＮＫＧ２Ｄであることがある。
【０００６】
また開示されるのは、本開示の融合ポリペプチドをコードする単離された核酸、ならびに発現制御配列に動作可能に連結されたこの単離された核酸を含有する核酸ベクターである。また開示されるのは、これらのベクターを用いてトランスフェクトされた細胞、および本開示の融合ポリペプチドを産生するためのこれらの細胞の使用である。
【０００７】
また開示されるのは、本明細書に開示される分子を医薬的に許容可能な担体に含む医薬組成物である。また開示されるのは、治療的に有効な量の本開示の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象でがんを治療するための方法である。場合によっては、がんは、任意のＣＤ３３発現悪性腫瘍であることがある。場合によっては、がんは、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、または混合表現型白血病を含む。
【０００８】
また開示されるのは、ＣＤ３３発現がんを標的とし殺傷するために養子細胞移入により使用することのできるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドである。本開示のＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ３３発現がん細胞を結合することのできる抗ＣＤ３３結合剤を外部ドメインに含有する。また開示されるのは、本開示のＣＡＲポリペプチドを発現するように遺伝子改変された免疫エフェクター細胞である。
【０００９】
抗ＣＤ３３結合剤は、実施形態によっては、ＣＤ３３を特異的に結合する抗体断片である。例えば、抗原結合ドメインは、ＣＤ３３を特異的に結合する抗体のＦａｂまたは単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であることがある。抗ＣＤ３３結合剤は、実施形態によっては、ＣＤ３３を特異的に結合するアプタマーである。例えば、抗ＣＤ３３結合剤は、そのＣＤ３３を結合する能力に基づき無作為配列プールから選択されるペプチドアプタマーであることがある。抗ＣＤ３３結合剤はまた、天然のＣＤ３３のリガンド、またはＣＤ３３に結合可能なそのバリアントおよび／もしくは断片であることがある。
【００１０】
実施形態によっては、本開示の抗体またはＣＡＲの抗ＣＤ３３領域は、ハイブリドーマ２７Ａ３、３３Ｇ３、３６Ｃ２、６Ａ１１、３５Ｄ５、３８Ｇ５、またはそれらの組合せに由来する。実施形態によっては、抗ＣＤ３３領域（例えばｓｃＦｖ）は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を有する可変重（ＶＨ）ドメインと、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を有する可変軽（ＶＬ）ドメインとを含むことがある。
【００１１】
例えば、実施形態によっては、ＶＨドメインのＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＧＦＴＦＳＮＹＧ（配列番号１）、ＧＹＴＦＴＳＹＷ（配列番号２）、またはＧＦＳＬＳＲＹＳ（配列番号３）を含み、その場合、ＶＨドメインのＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列ＩＳＳＧＧＧＤＴ（配列番号４）、ＩＨＰＳＤＳＥＴ（配列番号５）、またはＩＷＧＧＧＹＴ（配列番号６）を含み、ＶＨドメインのＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列ＡＲＤＹＧＧＴＷＤＹＦＤＹ（配列番号７）、ＡＲＥＥＧＱＬＧＨＧＧＡＭＤＹ（配列番号８）、またはＡＲＹＩＤＳＳＧＹＤＹ（配列番号９）を含み、ＶＬのＣＤＲ１配列は、アミノ酸配列ＱＤＩＳＫＹ（配列番号１０）、ＱＴＶＮＤＤ（配列番号１１）、ＳＳＶＳＹ（配列番号１２）、またはＥＮＩＹＳＹ（配列番号１３）を含み、ＶＬドメインのＣＤＲ２配列は、アミノ酸配列ＹＴＳｘ（配列番号１４）、ＹＶＳｘ（配列番号１５）、ＤＴＳｘ（配列番号１６）、またはＮＡＫｘ（配列番号１７）を含み、ＶＬドメインのＣＤＲ３配列は、アミノ酸配列ＱＱＧＤＴＦＰＷＴ（配列番号１８）、ＱＱＤＹＳＳＰＹＴ（配列番号１９）、ＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号２０）、もしくはＱＨＨＹＧＴＰＹＴ（配列番号２１）、またはそれらの任意の組合せを含む。
【００１２】
それゆえ、実施形態によっては、抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖ  ＶＨドメインは、アミノ酸配列ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＡＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＳＷＶＲＱＴＳＤＫＲＬＥＷＶＡＳＩＳＳＧＧＧＤＴＹＹＰＤＮＶＫＧＲＦＴＩＳＲＥＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＮＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＤＹＧＧＴＷＤＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号２２）、ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＲＰＧＶＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＨＰＳＤＳＥＴＲＬＮＱＫＦＫＤＫＡＩＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＰＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＥＧＱＬＧＨＧＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号２３）、またはＱＶＱＬＫＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＲＹＳＶＨＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＭＩＷＧＧＧＹＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＭＹＹＣＡＲＹＩＤＳＳＧＹＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号２４）を含む。
【００１３】
実施形態によっては、抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖ  ＶＬドメインは、アミノ酸配列ＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＤＴＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２５）、ＳＩＶＭＴＱＴＰＫＦＬＬＶＳＡＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＴＶＮＤＤＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＹＶＳＮＲＨＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＹＧＴＤＦＴＦＴＩＳＴＶＱＡＥＤＬＡＶＹＦＣＱＱＤＹＳＳＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２６）、ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号２７）、またはＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＱＧＫＳＰＱＬＬＶＹＮＡＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＦＳＬＫＩＮＳＬＱＰＥＤＦＧＳＹＹＣＱＨＨＹＧＴＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２８）を含む。
【００１４】
重鎖および軽鎖は、好ましくはリンカーによって隔てられている。ｓｃＦｖ抗体に適したリンカーは、当技術分野に公知である。実施形態によっては、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３９）を含む。
【００１５】
実施形態によっては、抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＡＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＧＭＳＷＶＲＱＴＳＤＫＲＬＥＷＶＡＳＩＳＳＧＧＧＤＴＹＹＰＤＮＶＫＧＲＦＴＩＳＲＥＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＮＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＤＹＧＧＴＷＤＹＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＤＴＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号２９、６Ａ１１ＨＣ１＿ＬＣ）を含む。
【００１６】
実施形態によっては、抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＬＶＲＰＧＶＳＶＫＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＭＩＨＰＳＤＳＥＴＲＬＮＱＫＦＫＤＫＡＩＬＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＰＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＥＧＱＬＧＨＧＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＤＴＦＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号３０、６Ａ１１ＨＣ２＿ＬＣ）を含む。
【００１７】
実施形態によっては、抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：ＱＶＱＬＫＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＲＹＳＶＨＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＭＩＷＧＧＧＹＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＭＹＹＣＡＲＹＩＤＳＳＧＹＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＳＩＶＭＴＱＴＰＫＦＬＬＶＳＡＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＴＶＮＤＤＶＡＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＹＶＳＮＲＨＴＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＹＧＴＤＦＴＦＴＩＳＴＶＱＡＥＤＬＡＶＹＦＣＱＱＤＹＳＳＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号３１、２７Ａ３ＨＣ＿ＬＣ１）を含む。
【００１８】
実施形態によっては、抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：ＱＶＱＬＫＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＲＹＳＶＨＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＭＩＷＧＧＧＹＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＭＹＹＣＡＲＹＩＤＳＳＧＹＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ（配列番号３２、２７Ａ３ＨＣ＿ＬＣ２）を含む。
【００１９】
実施形態によっては、抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖは、アミノ酸配列：ＱＶＱＬＫＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＲＹＳＶＨＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＭＩＷＧＧＧＹＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＬＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＭＹＹＣＡＲＹＩＤＳＳＧＹＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＡＷＹＱＱＫＱＧＫＳＰＱＬＬＶＹＮＡＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＦＳＬＫＩＮＳＬＱＰＥＤＦＧＳＹＹＣＱＨＨＹＧＴＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号３３、２７Ａ３ＨＣ＿ＬＣ３）を含む。
【００２０】
実施形態によっては、抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖは、核酸配列：
ＡＴＧＧＣＣＣＴＣＣＣＧＧＴＡＡＣＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＣＡＣＴＣＧＣＡＣＴＧＣＴＣＴＴＧＣＡＴＧＣＴＧＣＣＡＧＡＣＣＡＧＡＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＧＴＣＴＣＴＧＡＡＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＧＴＡＡＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧＴＣＴＴＧＧＧＴＴＣＧＣＣＡＧＡＣＴＴＣＡＧＡＣＡＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＧＣＡＴＣＣＡＴＴＡＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＡＣＣＴＡＣＴＡＴＣＣＡＧＡＣＡＡＴＧＴＡＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＧＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＧＴＡＧＴＣＴＧＡＡＣＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＴＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＡＣＴＡＴＧＧＴＧＧＴＡＣＴＴＧＧＧＡＣＴＡＣＴＴＴＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＣＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＣＴＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＴＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＧＡＣＡＴＴＡＧＣＡＡＧＴＡＴＴＴＡＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＴＧＴＴＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＡＣＴＣＡＧＧＡＧＴＣＣＣＡＴＣＧＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＣＡＧＡＴＴＡＴＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＣＡＣＴＴＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧＧＧＴＧＡＴＡＣＧＴＴＴＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＧ（配列番号３４、６Ａ１１ＨＣ１＿ＬＣ）によってコードされる。
【００２１】
実施形態によっては、抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖは、核酸配列：
ＡＴＧＧＣＣＣＴＣＣＣＧＧＴＡＡＣＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＣＡＣＴＣＧＣＡＣＴＧＣＴＣＴＴＧＣＡＴＧＣＴＧＣＣＡＧＡＣＣＡＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＴＴＣＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＡＴＧＡＴＴＣＡＴＣＣＴＴＣＣＧＡＴＡＧＴＧＡＡＡＣＴＡＧＧＴＴＡＡＡＴＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＴＡＴＴＧＡＣＴＧＴＡＧＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＣＣＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＧＧＡＣＡＧＣＴＣＧＧＧＣＡＣＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＣＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴＣＴＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＴＴＧＣＡＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡＧＧＡＣＡＴＴＡＧＣＡＡＧＴＡＴＴＴＡＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＴＧＴＴＡＡＡＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＡＣＡＣＡＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＡＣＴＣＡＧＧＡＧＴＣＣＣＡＴＣＧＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＣＡＧＡＴＴＡＴＴＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＴＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＣＡＣＴＴＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧＧＧＴＧＡＴＡＣＧＴＴＴＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＧ  （配列番号３５、６Ａ１１ＨＣ２＿ＬＣ）によってコードされる。
【００２２】
実施形態によっては、抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖは、核酸配列：
ＡＴＧＧＣＣＣＴＣＣＣＧＧＴＡＡＣＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＣＡＣＴＣＧＣＡＣＴＧＣＴＣＴＴＧＣＡＴＧＣＴＧＣＣＡＧＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＴＣＡＴＴＡＴＣＣＡＧＡＴＡＴＡＧＴＧＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＡＴＧＡＴＡＴＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＡＣＡＣＡＧＡＣＴＡＴＡＡＴＴＣＡＧＣＴＣＴＣＡＡＡＴＣＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＴＡＴＡＴＡＧＡＣＡＧＣＴＣＧＧＧＣＴＡＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＡＧＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＡＡＡＴＴＣＣＴＧＣＴＴＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＴＴＡＣＣＡＴＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＣＴＧＴＧＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＡＧＣＴＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＡＡＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＴＡＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＡＡＴＣＧＣＣＡＣＡＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＡＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＡＴＧＧＧＡＣＧＧＡＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＴＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＧＡＴＴＡＴＡＧＣＴＣＴＣＣＧＴＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＧ  （配列番号３６、２７Ａ３ＨＣ＿ＬＣ１）によってコードされる。
【００２３】
実施形態によっては、抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖは、核酸配列：
ＡＴＧＧＣＣＣＴＣＣＣＧＧＴＡＡＣＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＣＡＣＴＣＧＣＡＣＴＧＣＴＣＴＴＧＣＡＴＧＣＴＧＣＣＡＧＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＴＣＡＴＴＡＴＣＣＡＧＡＴＡＴＡＧＴＧＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＡＴＧＡＴＡＴＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＡＣＡＣＡＧＡＣＴＡＴＡＡＴＴＣＡＧＣＴＣＴＣＡＡＡＴＣＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＴＡＴＡＴＡＧＡＣＡＧＣＴＣＧＧＧＣＴＡＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣＡＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＴＣＣＡＡＡＣＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＣＴＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＴＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴＡＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴＣＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＣＧＧ  （配列番号３７、２７Ａ３ＨＣ＿ＬＣ２）によってコードされる。
【００２４】
実施形態によっては、抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖは、核酸配列：
ＡＴＧＧＣＣＣＴＣＣＣＧＧＴＡＡＣＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＣＣＡＣＴＣＧＣＡＣＴＧＣＴＣＴＴＧＣＡＴＧＣＴＧＣＣＡＧＡＣＣＡＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＣＡＣＧＧＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＴＣＡＴＴＡＴＣＣＡＧＡＴＡＴＡＧＴＧＴＡＣＡＣＴＧＧＧＴＴＣＧＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＡＴＧＡＴＡＴＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＡＣＡＣＡＧＡＣＴＡＴＡＡＴＴＣＡＧＣＴＣＴＣＡＡＡＴＣＣＡＧＡＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＴＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＡＧＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＣＡＧＡＴＡＴＡＴＡＧＡＣＡＧＣＴＣＧＧＧＣＴＡＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＡＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＧＧＧＡＧＡＡＡＣＴＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＣＧＡＧＣＡＡＧＴＧＡＧＡＡＴＡＴＴＴＡＣＡＧＴＴＡＴＴＴＡＧＣＡＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＡＧＧＧＡＡＡＡＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＴＣＴＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＡＡＣＣＴＴＡＧＣＡＧＡＡＧＧＴＧＴＧＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＡＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＴＣＡＡＣＡＧＴＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＧＡＧＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＴＣＡＴＴＡＴＧＧＴＡＣＴＣＣＧＴＡＣＡＣＧＴＴＣＧＧＡＧＧＧＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＧ  （配列番号３８、２７Ａ３ＨＣ＿ＬＣ３）によってコードされる。
【００２５】
他のＣＡＲと同様に、本開示のポリペプチドも、膜貫通ドメインと、免疫エフェクター細胞を活性化することの可能な内部ドメインとを含有することがある。例えば、この内部ドメインは、シグナル伝達ドメインと１つまたは複数の共刺激シグナル伝達領域とを含有することがある。
【００２６】
実施形態によっては、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインである。実施形態によっては、共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、またはそれらの組合せの細胞質ドメインを含む。場合によっては、共刺激シグナル伝達領域は、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達分子および／または共刺激分子の１個、２個、３個、または４個の細胞質ドメインを含有する。実施形態によっては、共刺激シグナル伝達領域は、シグナル伝達を亢進する１つまたは複数の変異を、ＣＤ２８および／または４−１ＢＢの細胞質ドメインに含有する。
【００２７】
実施形態によっては、ＣＡＲポリペプチドは、不完全な内部ドメインを含有する。例えば、ＣＡＲポリペプチドは、細胞内シグナル伝達ドメインのみまたは共刺激ドメインのみを含有しうるが、両方を含有し得ない。これらの実施形態では、それと、欠けたドメインを含有する第２のＣＡＲポリペプチド（または内在性Ｔ細胞受容体）との両方が、それらのそれぞれの抗原を結合しない限り、免疫エフェクター細胞は活性化されない。そのため、実施形態によっては、ＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインを含有するが、共刺激シグナル伝達領域（ＣＳＲ）を含有しない。他の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、またはそれらの組合せの細胞質ドメインを含有するが、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメイン（ＳＤ）を含有しない。
【００２８】
また開示されるのは、本開示のＣＡＲポリペプチドをコードする単離された核酸配列、これらの単離された核酸を含むベクター、およびこれらのベクターを含有する細胞である。例えば、この細胞は、アルファ−ベータＴ細胞、ガンマ−デルタＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｂ細胞、自然リンパ球系細胞（ＩＬＣ）、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、リンフォカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、および調節性Ｔ細胞からなる群から選択される免疫エフェクター細胞であることがある。実施形態によっては、ＣＡＲの抗原結合ドメインがＣＤ３３に結合する際に、この細胞は抗腫瘍免疫を発揮する。
【００２９】
実施形態によっては、この細胞は、第２の抗原結合ドメインを含む第２のＣＡＲポリペプチドをさらに含み、その場合、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインがＣＤ３３に結合し、かつ第２のＣＡＲの抗原結合ドメインがその抗原に結合した際に、本細胞は、抗腫瘍免疫を発揮する。これらの実施形態では、第１のＣＡＲポリペプチドおよび第２のＣＡＲポリペプチドのそれぞれは、不完全な内部ドメインを有することがある。実施形態によっては、第２のＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ１２３リガンド、ＴＩＭ３リガンド、ＣＬＥＣ１２Ａリガンド、ＣＤ９９リガンド、ＮＫＧ２Ｄリガンド、またはそれらの任意の組合せに結合する。
【００３０】
実施形態によっては、細胞は、移入された細胞集団を除去するための分子自殺スイッチシステムをさらに含む。例えば、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸を、アクセサリー遺伝子も含む発現カセットの一部分とすることができる。例えば、実施形態によっては、アクセサリー遺伝子は、切頭型ＥＧＦＲ遺伝子（ＥＧＦＲｔ）である。ＥＧＦＲｔは、非免疫原性の選択ツール（例えば、ＥＧＦＲｔ含有構築物をレンチウイルスにより形質導入されているＴ細胞を濃縮するための、ビオチン化セツキシマブを抗ビオチンマイクロビーズと組み合わせて用いる免疫磁性選択）、追跡用マーカー（例えば、Ｔ細胞の生着を追跡するためのフローサイトメトリー解析）、または自殺遺伝子［例えば、セツキシマブ／アービタックス（登録商標）により媒介される抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）経路を介する］として使用されることがある。本明細書に記載される実施形態に従って使用されうる切頭型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）遺伝子の一例は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５５３２９に記載されており、その主題は、本明細書に十分に明記されているかのようにここで参照により組み込まれている。他の実施形態では、アクセサリー遺伝子は、切頭型ＣＤ１９遺伝子（ＣＤ１９ｔ）である。実施形態によっては、アクセサリー遺伝子は、誘導性カスパーゼ−９遺伝子である。
【００３１】
また開示されるのは、ＣＤ３３発現がんの対象において抗腫瘍免疫を付与する方法であって、この方法は、開示されるＣＤ３３特異的なＣＡＲにより遺伝子改変された有効な量の免疫エフェクター細胞を、対象に投与することを含む。
【００３２】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細を、添付の図面および下記の記載に明記する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、記載および図面から、ならびに特許請求の範囲から、明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、ＥＬ４−ＣＤ３３＋細胞およびＥＬ４−ＣＤ１２３＋細胞をハイブリドーマ抗体と共にインキュベートした後、ラット抗マウスＩｇＧ蛍光抗体によりインキュベートすることによって達成された、抗ＣＤ３３抗体についての一次スクリーニングの結果を示す。次いで、これをフローサイトメトリーによって検出した。
【図２】図２は、機能抗体の二次スクリーニング方法を説明する。
【図３】図３は、ＥＬ４−ＣＤ１２３標的またはＥＬ４−ＣＤ３３標的と、ハイブリドーマ抗体と、ヒトの４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータにコンジュゲートされたＣＤ１６またはＣＤ３２のどちらかのＦｃ受容体を含むように改変されたＪｕｒｋａｔ細胞との培養物について、ＧＦＰのフローサイトメトリーによって測定されたＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の活性化を示す。
【図４】図４Ａから図４Ｅは、６Ａ１１ＨＣ１＿ＬＣ（図４Ａ）、６Ａ１１ＨＣ２＿ＬＣ（図４Ｂ）、２７Ａ３ＨＣ＿ＬＣ１（図４Ｃ）、２７Ａ３ＨＣ＿ＬＣ２（図４Ｄ）、および２７Ａ３ＨＣ＿ＬＣ３（図４Ｅ）のＣＤ３３  ＣＡＲの線図である。
【図５】図５は、Ｔ細胞内へのＣＤ３３遺伝子移入を示す棒グラフである。遺伝子移入を、生きたＴ細胞上のＣＤ３＋およびｍｃｈｅｒｒｙ＋の％として評価した。ビーズ脱離後、Ｔ細胞をＣＤ３、ＣＤ８、およびＣＤ４（モノクローナル抗体で染色し、フローサイトメーターを用いることによって解析した。
【図６】図６は、ＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性アッセイの結果を示すグラフである。活性化されたＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞またはモック形質導入Ｔ細胞を、標的ＣＨＯ  ＣＤ３３細胞と共培養し、細胞傷害性をリアルタイム細胞分析システムで測定した。２連のウェルについて経時的な正規化された細胞の指標の平均として、データを提示する。ＣＤ３３  ＣＨＯ細胞を１６時間、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  Ｅプレートに接着させた。ＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞または活性化されたモック形質導入Ｔ細胞を、Ｅプレートのウェルに、標的細胞と共にＥ：Ｔ比１０：１で６日間添加した。所与の時点での細胞の指標をＴ細胞添加の１日後の正規化時点での細胞の指標により除算したものとして、正規化された細胞の指標を計算した。
【図７】図７は、ＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を示すグラフである。活性化されたＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞を、標的ＣＨＯ  ＣＤ３３細胞と共培養した。標示された日にＣＡＲ  Ｔ細胞を計数した。
【図８】図８Ａから図８Ｃは、ＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞のサイトカイン産生を示す棒グラフである。ＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞またはモック形質導入Ｔ細胞を、標的ＣＨＯ  ＣＤ３３細胞と２４時間共培養した。上清を採集し、Ｌｕｍｉｎｅｘを介してサイトカインＩＦＮ−γ（図８Ａ）、ＴＮＦ−α（図８Ｂ）、およびＩＬ−６（図８Ｃ）を分析した。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本明細書に開示されるのは、ＣＤ３３発現がん上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を特異的に認識することのできる組換え抗体、例えば二重特異性抗体およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などである。また開示されるのは、これらのＣＡＲを発現するように工学的に作製された免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などである。そのため、また開示されるのは、本開示の抗体および免疫エフェクター細胞を用いて、ＣＤ３３発現がんの対象において抗腫瘍免疫を付与するための方法である。
【００３５】
抗体
本開示の組成物および方法に使用できる抗体としては、任意のクラスのイムノグロブリン全体（すなわち無傷の抗体）、その断片、および少なくとも抗体の抗原結合可変ドメインを含有する合成タンパク質が挙げられる。可変ドメインは、抗体間で配列に差異があり、その具体的な抗原に対する具体的な各抗体の結合性および特異性に用いられる。しかし、可変性は通常、抗体の可変ドメインを介して均一に分配される。それは典型的には、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの両方にある相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域とよばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのうち高度に保存されている部分は、フレームワーク（ＦＲ）とよばれる。生得の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ４つのＦＲ領域を含み、それらの領域は、大部分がベータシート立体配置を採って３つのＣＤＲに接続され、ＣＤＲは、上記ベータシート構造を接続し場合によってはその一部を形成するループを形成する。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域に近接して共に把持され、他の鎖由来のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。
【００３６】
免疫時に内在性イムノグロブリン産生の不在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することの可能な、遺伝子導入動物（例えばマウス）を採用することができる。例えば、キメラマウスおよび生殖系列変異マウスにおいて抗体重鎖接合領域［Ｊ（Ｈ）］遺伝子のホモ接合性欠失が生じる結果、内在性の抗体産生が完全に阻害されることが記載されている。そのような生殖系列変異マウスにヒト生殖系列イムノグロブリン遺伝子アレイを移入すると、結果として抗原曝露時にヒト抗体が産生するものとなる［例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-255 (1993)；Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)を参照］。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーにおいても産生することができる［Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］。CoteらおよびBoernerらの手法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)］。
【００３７】
任意選択的に、抗体が他の種で生成され、ヒトにおける投与のために「ヒト化」される。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形態は、キメラのイムノグロブリン、イムノグロブリン鎖、または非ヒトイムノグロブリンに由来する最小限の配列を含有するその断片［例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくは抗体の他の抗原結合性サブ配列など］である。ヒト化抗体としては、ヒトイムノグロブリン（レシピエント抗体）であって、レシピエント抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性、または能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基に置き換えられたものが挙げられる。場合によっては、ヒトイムノグロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応の非ヒト残基によって置き換えられている。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体または持ち込みのＣＤＲもしくはフレームワーク配列のいずれにも見出されない残基を含んでいてよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むものとなり、このドメインでは、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒトイムノグロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒトイムノグロブリンのコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、任意選択的に、イムノグロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒトイムノグロブリンの少なくとも一部分［Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)；and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］も含むものとなる。
【００３８】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野に周知である。一般に、ヒト化抗体は、その中に、非ヒト供給源から１つまたは複数のアミノ酸残基を導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合「持ち込み」残基と称され、それは典型的には「持ち込み」可変ドメインから得られる。抗体ヒト化手法は、一般に、抗体分子の１つまたは複数のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作するための組換えＤＮＡ技術を含む。ヒト化は、本質的には、Winterとその共同研究者の方法［Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)］に従い、齧歯類の１つまたは複数のＣＤＲ配列をヒト抗体の対応の配列に代えて置換することによって実施することができる。したがって、非ヒト抗体（またはその断片）のヒト化形態は、キメラ抗体または断片（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、その場合、実質的に無傷ではないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応の配列に置換されている。実際には、ヒト化抗体とは、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基と可能性としていくつかのＦＲ残基とが齧歯類抗体の類似部位由来の残基に置換された、ヒト抗体である。
【００３９】
また開示されるのは、生物活性を有する抗体の断片である。その断片の活性が、非改変の抗体または抗体断片に比べて有意に変更されるかまたは損なわれないならば、この断片は、他の配列に付加されているかいないかに関わらず、具体的な領域または特異的なアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、または他の選択された改変を含む。
【００４０】
手法は、本願開示の抗原性タンパク質に特異的な単鎖抗体の産生に適応させることもできる。単鎖抗体の産生のための方法は、当業者に周知である。単鎖抗体は、短いペプチドリンカーを用いて重鎖および軽鎖の可変ドメインを合わせて融合し、それにより単一分子上の抗原結合部位を再構成することによって、作製することができる。一方の可変ドメインのＣ末端が１５から２５アミノ酸のペプチドまたはリンカーを介して他方の可変ドメインのＮ末端に繋がっている単鎖抗体の可変断片（ｓｃＦｖ）が、抗原結合性またはその結合の特異性を有意に破綻させることなく開発されている。このリンカーは、重鎖および軽鎖が共にそれらの適正な立体構造の配向で結合することが可能になるように選ばれる。
【００４１】
二価の単鎖可変断片（ｄｉ−ｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖを連結することによって、工学的に作製することができる。これは、２つのＶＨ領域と２つのＶＬ領域とを有した単一のペプチド鎖を産生し、タンデムのｓｃＦｖを生じることによって行うことができる。ｓｃＦｖは、リンカーペプチドを用いて設計することもでき、このリンカーペプチドは、２つの可変領域を畳み合わせるには短く（約５アミノ酸）、ｓｃＦｖを二量体化するよう作用する。このタイプは、ダイアボディとして公知である。ダイアボディは、対応のｓｃＦｖよりも最大４０倍低い解離定数を有することが示されており、このことは、標的に対しはるかに高い親和性を有することを意味する。さらに短いリンカー（１または２アミノ酸）は、三量体（トリアボディまたはトリボディ）の形成をもたらす。テトラボディも生産されている。それらは、標的に対しダイアボディよりもさらに高い親和性を発揮する。
【００４２】
ＣＤ３およびＣＤ３３に選択的に結合するように設計された二重特異性抗体は、非特異的なＴ細胞の活性化＆サイトカインストームを誘発するものとなりかねない。ＣＤ３およびＣＤ３３に選択的に結合するように設計された二重特異性のダイアボディは、腎クリアランスの閾値よりも小さな分子量（５５〜６０ｋＤ）を有するものとなり、結果として速やかに排除されるものとなりかねない。そのため、ダイアボディを、継続的な輸注によって投与しなければならない。本開示の四価の二重特異性抗体は、顕著なＰＫの延長を伴って、腎濾過の閾値よりも大きな分子量（例えば１０５〜１１０ｋＤ）を有することがある。
【００４３】
提供されるのは、Ｔ細胞にＣＤ３３発現悪性細胞を破壊させることのできる工学的に作製された多価抗体を形成することの可能な融合ポリペプチドである。この工学的に作製された抗体は、例えば、少なくとも１つのｓｃＦｖ、少なくとも１つのＦａｂ断片、少なくとも１つのＦｖ断片などを含むことがある。それは、二価、三価、四価などであることがある。この多価抗体は、任意の形態、例えばダイアボディ、トリアボディ、テトラボディなどであることがある。
【００４４】
二価および二重特異性の抗体は、抗体の可変ドメインのみを用いて構築することができる。かなり効率的で比較的簡素な方法は、互いに折り重なり結合することのできないような短さのリンカー配列を、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に作製することである。リンカー長を３〜１２残基に低減することによって、ｓｃＦｖ分子の単量体型立体配置が防止され、６０ｋＤａの非共有結合のｓｃＦｖ二量体「ダイアボディ」の形成を伴う分子間のＶＨ−ＶＬ対が有利となる。ダイアボディのフォーマットは、組換え二重特異性抗体の生成にも用いることができ、それらの抗体は、２つの単鎖融合産物の非共有結合的な会合によって得ることができ、この融合産物は、一方の抗体由来のＶＨドメインが短いリンカーによって別の抗体由来のＶＬドメインに接続されてなる。リンカー長をさらに３残基未満に低減することで、結果として三量体（「トリアボディ」、約９０ｋＤａ）または四量体（「テトラボディ」、約１２０ｋＤａ）を形成させることができる。工学的に作製された抗体、具体的には単一ドメイン断片を概観するために、Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23:1126-1136を参照されたい。そのような工学的に作製された抗体の全ては、本明細書に提供される融合ポリペプチドに用いることができる。四価のＴａｎｄａｂ（登録商標）は、実質的には、Ｔａｎｄａｂ（登録商標）分子を作製する方法の教示について参照により組み込まれるＷＯ１９９９０５７１５０Ａ３または米国特許出願公開公報第２００６０２３３７８７号に記載されているように、調製することができる。
【００４５】
工学的に作製された抗体の抗原認識部位または可変領域全体は、任意の目的の抗原（例えばＣＤ３３）を指向する１つまたは複数の親抗体に由来する場合がある。親抗体としては、天然に生じた抗体もしくは抗体断片、天然に生じた抗体から適応された抗体もしくは抗体断片、目的の抗原に特異的であることが知られている抗体もしくは抗体断片の配列を用いてｄｅ  ｎｏｖｏで構築された抗体を挙げることができる。親抗体に由来する場合のある配列は、重鎖および／または軽鎖の可変領域および／またはＣＤＲ、フレームワーク領域、もしくはそれらの他の部分を含む。
【００４６】
多価の多特異性抗体は、２つ以上の可変領域を含む重鎖および／または１つまたは複数の可変領域を含む軽鎖を含有する場合があり、可変領域のうち少なくとも２つは、同じ抗原上の異なるエピトープを認識する。
【００４７】
融合ポリペプチドに含むための工学的に作製された候補抗体、または融合ポリペプチド自体は、種々の公知のアッセイを用いて、活性についてスクリーニングされることがある。例えば、結合特異性を決定するためのスクリーニングアッセイは、周知であり、当技術分野で定型的に実践されている。そのようなアッセイに関する包括的な議論については、Harlow et al. (Eds.), ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, N.Y., 1988, Chapter 6を参照されたい。
【００４８】
医薬組成物
また開示されるのは、開示された分子を医薬的に許容可能な担体に含む医薬組成物である。医薬担体は、当業者に公知である。これらは、最も典型的には、薬剤をヒトに投与するための標準的な担体となるが、そのようなものとしては、滅菌水、生理食塩水、および生理的ｐＨの緩衝溶液などの溶液が挙げられる。例えば、適した担体およびそれらの配合は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21 ed.) ed. PP. Gerbino, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA. 2005に記載されている。典型的には、適切な量の医薬的に許容可能な塩を配合に使用して、その配合を等張にする。医薬的に許容可能な担体の例としては、以下に限定されないが、生理食塩水、リンゲル溶液、およびデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは、好ましくは約５から約８までであり、さらに好ましくは約７から約７．５までである。溶液は、ＲＮＡｓｅ不含とするべきである。さらに、担体は、持続放出製剤、例えば抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどを含み、このマトリックスは、造形品、例えばフィルム、リポソーム、または微粒子の形態である。例えば投与されている組成物の投与経路および濃度に応じて、ある特定の担体がさらに好ましい場合があることが、当業者には明らかになるものとなる。
【００４９】
医薬組成物は、選択された分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤などを含むことがある。医薬組成物は、１つまたは複数の活性成分、例えば抗微生物剤、抗炎症剤、麻酔剤なども含むことがある。
【００５０】
非経口投与のための製剤は、滅菌された水系または非水系の溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含む。非水系の溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油など、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルなどである。水系の担体としては、水、アルコール／水溶液、エマルジョン、または懸濁液が挙げられ、生理食塩水および緩衝媒質が含まれる。非経口的な媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油が挙げられる。静脈内媒体としては、体液および栄養補充物、電解質補充物（リンゲルデキストロースに基づくものなど）などが挙げられる。保存剤および他の添加剤も存在することがあり、そのようなものとしては、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどがある。
【００５１】
組成物のいくつかは、可能性として、医薬的に許容可能な酸付加塩または塩基付加塩として投与されることがあり、それらの塩は、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸など、ならびに有機酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸との反応によって、または無機塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、ならびに有機塩基、例えばモノアルキル、ジアルキル、トリアルキル、およびアリールアミン、ならびに置換エタノールアミンとの反応によって、形成される。
【００５２】
治療の方法
また開示されるのは、治療的に有効な量の本開示の医薬組成物を対象に投与することによって、対象でＣＤ３３発現がんを治療するための方法である。本方法は、化学療法を対象に投与することをさらに含むことがあり、そのような化学療法は、例えばフルダラビン、シタラビン、シクロホスファミド、イダルビシン、ダウノルビシン、または標的阻害剤、例えばイムブルビカ、ミドスタウリン、イデラリシブなど、または免疫剤、例えばＰＤ１阻害剤もしくはＰＤＬ１阻害剤などである。
【００５３】
医薬組成物を含む本開示の組成物は、局所治療が望まれるかまたは全身治療が望まれるかに応じて、および治療される範囲に応じて、複数の方法で投与されてよい。例えば、本開示の組成物は、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、腔内に、または経皮的に投与することができる。本組成物は、経口的に、非経口的に（例えば静脈内に）、筋肉内注射によって、腹腔内注射によって、経皮的に、体外で、眼科的に、経膣的に、直腸に、鼻腔内に、局所的になど、局所的鼻腔内投与または吸入による投与を含めて、投与されてよい。
【００５４】
本組成物の非経口投与は、使用する場合には、一般に注射であるという特徴がある。注射剤は、従来の形態で、すなわち液体溶液もしくは懸濁物のどちらかとして、注射前に液中懸濁物の溶液とするのに適した固形形態、またはエマルジョンとして、調製することができる。非経口投与に適した修正アプローチの１つは、一定の投薬量が維持されるような遅延放出系または持続放出系の使用を含む。
【００５５】
本明細書に開示された組成物は、ＣＤ３３発現がんのリスクにある患者または対象に予防的に投与されてよい。そのため、本方法は本明細書に開示された組成物の投与の前に、ＣＤ３３発現がんのリスクにある対象を特定することをさらに含むことがある。
【００５６】
必要な組成物の正確な量は、対象によって、対象の種、年齢、体重、および全身状態、治療されているアレルギー性障害の重症度、使用された具体的な核酸またはベクター、その投与様式などに応じて、変わるものとなる。そのため、組成物毎に正確な量を特定することはできない。しかし、適切な量は、本明細書に教示として示された定例の実験作業のみを用いて、当業者が決定することができる。例えば、組成物を投与するための有効な投薬量およびスケジュールは、経験的に決定されることがあり、そのような決定を行うことは、当技術分野の技能の範囲内にある。組成物の投与に用いる投薬量の幅は、症状障害に影響を及ぼす所望の効果を生じるのに十分に大きなものである。投薬量は、不都合な副作用、例えば不要な交差反応、アナフィラキシー反応などを引き起こすほどに多いものとするべきではない。一般に、投薬量は、患者の年齢、状態、性別、および疾患の程度、投与経路、または他の薬剤がレジメンに含まれているか否かによって変わるものとなり、当業者が決定することができる。投薬量は、いかなる禁忌の場合にも個々の医師が調整することができる。投薬量は変わることがあり、１つまたは複数の用量投与で１日または数日にわたって毎日投与されることがある。所与のクラスの医薬製品に関する適切な投薬量について、文献にガイダンスを見出すことができる。単独で使用される本開示の組成物の典型的な一日投薬量は、上述の要因に応じて、１日当たり約１μｇ／体重ｋｇから最大１００ｍｇ／体重ｋｇ以上に及ぶ可能性がある。
【００５７】
実施形態によっては、分子は、体重ｋｇ当たり約０．１ｎｇから約１００ｇ、体重ｋｇ当たり約１０ｎｇから約５０ｇ、体重ｋｇ当たり約１００ｎｇから約１ｇ、体重ｋｇ当たり約１μｇから約１００ｍｇまで、体重ｋｇ当たり約１μｇから約５０ｍｇまで、体重ｋｇ当たり約１ｍｇから約５００ｍｇまで；および体重ｋｇ当たり約１ｍｇから約５０ｍｇまでの非経口投与に等しい用量で投与される。あるいは、治療的に有効な用量を達成するために投与されるレナリドミドを含有する分子の用量は、体重ｋｇ当たり約０．１ｎｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１１ｍｇ、１２ｍｇ、１３ｍｇ、１４ｍｇ、１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、１９ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、またはそれを超える。
【００５８】
ＣＤ３３特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
ＣＡＲは、一般に、リンパ球の活性化に関与する膜貫通シグナル伝達モチーフと共に、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）由来の抗原認識ドメインを組み込んでいる（Sadelain M, et al. Nat Rev Cancer 2003 3:35-45）。本明細書に開示されるのは、免疫エフェクター細胞に発現されてＣＤ３３特異的なＣＡＲに対する抗腫瘍活性を亢進することのできる、ＣＤ３３特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
【００５９】
本開示のＣＡＲは、一般に、３つのドメイン：外部ドメイン、膜貫通ドメイン、および内部ドメインからなる。外部ドメインは、ＣＤ３３結合領域を含み、抗原認識に関与する。それはまた、任意選択的にシグナルペプチド（ＳＰ）を含有し、それゆえにＣＡＲは、グリコシル化され、免疫エフェクター細胞の細胞膜に係留されることが可能である。膜貫通ドメイン（ＴＤ）は、その名称が示唆する通りであり、外部ドメインを内部ドメインに接続し、細胞によって発現されると細胞膜内に位置する。内部ドメインは、抗原認識後に活性化シグナルを免疫エフェクター細胞に伝えるＣＡＲの先端部である。例えば、内部ドメインは、シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）および共刺激シグナル伝達領域（ＣＳＲ）を含有することがある。
【００６０】
「シグナル伝達ドメイン（ＳＤ）」は、一般に、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有し、このモチーフは、ＩＴＡＭがリン酸化されるとシグナル伝達カスケードを活性化する。用語「共刺激シグナル伝達領域（ＣＳＲ）」とは、Ｔ細胞受容体によりＴ細胞の活性化を亢進することのできる共刺激タンパク質受容体、例えばＣＤ２８、４１ＢＢ、およびＩＣＯＳなどに由来する、細胞内シグナル伝達ドメインを指す。
【００６１】
また開示されるのは、異なるリガンド結合標的を有する、本開示のＣＤ３３特異的なＣＡＲと少なくとも１つの他のＣＡＲとを含有する、二重ＣＡＲ  Ｔ細胞である。これらの実施形態では、１つのＣＡＲは、ＣＤ３ζドメインのみを含み、他のＣＡＲは、共刺激ドメインのみを含むことがある。これらの実施形態では、二重ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化は、標的細胞上に双方の標的の共発現を必要とするものとなる。
【００６２】
そのため、実施形態によっては、本開示のＣＤ３３特異的なＣＡＲポリペプチドは、不完全な内部ドメインを含有する。例えば、ＣＡＲポリペプチドは、細胞内シグナル伝達ドメインまたは共刺激ドメインのみを含有しうるが、両方を含有し得ない。これらの実施形態では、それと、欠けたドメインを含有する第２のＣＡＲポリペプチド（または内在性Ｔ細胞受容体）との両方が、それぞれの標的に結合しない限り、免疫エフェクター細胞は活性化されない。それゆえ、実施形態によっては、ＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインを含有するが、共刺激シグナル伝達領域（ＣＳＲ）を含有しない。他の実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、またはそれらの組合せの細胞質ドメインを含有するが、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメイン（ＳＤ）を含有しない。
【００６３】
本開示の二重ＣＡＲ  Ｔ細胞は、本開示のＣＤ３３特異的なＣＡＲと、異なるリガンド結合標的、例えばＣＤ１２３、ＴＩＭ３、またはＣＬＥＣ１２Ａなどを有する少なくとも１つの他のＣＡＲとを、含有することがある。ＣＡＲは、一般に、リンパ球の活性化に関与する膜貫通シグナル伝達モチーフと共に、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）由来の抗原認識ドメインを組み込んでいる（Sadelain M, et al. Nat Rev Cancer 2003 3:35-45）。これらの追加的なＣＡＲは、それゆえ、第２の標的、例えばＣＤ１２３、ＴＩＭ３、またはＣＬＥＣ１２Ａなどを結合する抗体を含有することがある。
【００６４】
実施形態によっては、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインである。実施形態によっては、共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、またはそれらの組合せの細胞質ドメインを含む。場合によっては、共刺激シグナル伝達領域は、１つまたは複数の細胞内シグナル伝達分子および／または共刺激分子の１個、２個、３個、または４個の細胞質ドメインを含有する。実施形態によっては、共刺激シグナル伝達領域は、シグナル伝達を亢進する、ＣＤ２８および／または４−１ＢＢの細胞質ドメイン中の１つまたは複数の変異を含有する。
【００６５】
実施形態によっては、本開示のＣＡＲは、Ｙ２０６および／またはＹ２１８でのリン酸化が変更されたＣＤ２８の細胞質ドメインの変異形態を含む、共刺激シグナル伝達領域を含む。実施形態によっては、本開示のＣＡＲは、Ｙ２０６に減衰の変異を含み、それによりＣＡＲの活性が低減するものとなる。実施形態によっては、本開示のＣＡＲは、Ｙ２１８に減衰の変異を含み、それによりＣＡＲの発現が低減するものとなる。任意のアミノ酸残基、例えばアラニンまたはフェニルアラニンを、チロシンの代わりに置換し、減衰を達成することができる。実施形態によっては、Ｙ２０６および／またはＹ２１８のチロシンは、リン酸化模倣残基により置換される。実施形態によっては、本開示のリン酸化模倣残基によるＹ２０６のＣＡＲ置換、それによりＣＡＲの活性が増加するものとなる。実施形態によっては、本開示のＣＡＲは、リン酸化模倣残基によるＹ２１８の置換を含み、それによりＣＡＲの発現が増加するものとなる。例えば、リン酸化模倣残基は、リン酸化チロシンとすることができる。実施形態によっては、ＣＡＲは、同じＣＡＲの異なる残基中に、リン酸化模倣アミノ酸とリン酸化不能アミノ酸による置換との組合せを含有することがある。例として、ＣＡＲは、Ｙ２０９および／またはＹ１９１におけるアラニンまたはフェニルアラニンの置換に加えて、Ｙ２０６および／またはＹ２１８におけるリン酸化模倣置換を含有することがある。
【００６６】
実施形態によっては、本開示のＣＡＲは、特異的なＴＲＡＦタンパク質、例えばＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、またはそれらの任意の組合せなどとの結合を亢進する変異を有する、１つまたは複数の４１ＢＢドメインを含む。場合によっては、この４１ＢＢの変異は、Ｔ細胞のＴＲＡＦ１依存的および／またはＴＲＡＦ２依存的な増殖および生存を、例えばＮＦ−ｋＢを介して亢進する。場合によっては、４１ＢＢの変異は、ＴＲＡＦ３依存的な抗腫瘍効能を、例えばＩＲＦ７／ＩＮＦβを介して亢進する。場合によっては、４１ＢＢの細胞質ドメインは、アミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号４０）を含み、上記配列中、ＴＲＡＦ結合に応答性のあるこのドメインの領域は下線を付されている。それゆえ、本開示のＣＡＲは、ＴＲＡＦ結合を亢進するおよび／またはＮＦκＢシグナル伝達を亢進する少なくとも１つの変異をこれらの下線部配列に有する、４１ＢＢの細胞質ドメインを含むことがある。
【００６７】
また本明細書に開示されるように、ＴＲＡＦタンパク質は、場合によっては、ＮＦκＢおよび４１ＢＢとは独立したＣＡＲ  Ｔ細胞の機能を亢進することがある。例えば、ＴＲＡＦタンパク質は、場合によっては、Ｔ細胞におけるＣＤ２８の共刺激を亢進することがある。そのため、また本明細書に開示されるのは、１つまたは複数のＴＲＡＦタンパク質、例えばＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、またはそれらの任意の組合せと併せてＣＡＲを共発現する、免疫エフェクター細胞である。場合によっては、ＣＡＲは、腫瘍抗原を標的とする任意のＣＡＲである。例えば、第１世代のＣＡＲは、典型的にはＣＤ３ζ鎖由来の細胞内ドメインを有していたのに対して、第２世代のＣＡＲは、追加的なシグナルをＴ細胞にもたらすように、様々な共刺激タンパク質受容体（例えばＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳ）由来の細胞内シグナル伝達ドメインをＣＡＲの内部ドメインに追加していた。場合によっては、そのＣＡＲは、４１ＢＢの活性化が亢進された本開示のＣＡＲである。
【００６８】
実施形態によっては、本開示のＣＡＲは、以下の式：
ＳＰ−ＣＤ３３−ＨＧ−ＴＭ−ＣＳＲ−ＳＤ；または
ＳＰ−ＣＤ３３−ＨＧ−ＴＭ−ＳＤ−ＣＳＲ；
により定義され、式中、
「ＳＰ」は、任意選択的なシグナルペプチドを表し、
「ＣＤ３３」は、ＣＤ３３結合領域を表し、
「ＨＧ」は、任意選択的なヒンジドメインを表し、
「ＴＭ」は、膜貫通ドメインを表し、
「ＣＳＲ」は、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達領域を表し、
「ＳＤ」は細胞内シグナル伝達ドメインを表し、
「−」は、ペプチド結合またはリンカーを表す。
【００６９】
追加的なＣＡＲ構築物は、例えば、これらのＣＡＲモデルの教示について参照によりその全体を組み込まれる、Fresnak AD, et al. Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2016 Aug 23;16(9):566-81に記載されている。
【００７０】
例えば、ＣＡＲは、ＴＲＵＣＫ、汎用性ＣＡＲ（Universal CAR）、自己駆動性ＣＡＲ（Self-driving CAR）、装甲ＣＡＲ（Armored CAR）、自己破壊性ＣＡＲ（Self-destruct CAR）、条件的ＣＡＲ（Conditional CAR）、標示ＣＡＲ（Marked CAR）、ＴｅｎＣＡＲ、二重ＣＡＲ（Dual CAR）、またはｓＣＡＲとすることができる。
【００７１】
ＴＲＵＣＫ（汎用的なサイトカインによる殺傷のために再指向されたＴ細胞）は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と抗腫瘍性サイトカインとを共発現する。サイトカインの発現は、恒常的であることもＴ細胞の活性化により誘導されることもある。ＣＡＲ特異性により標的とされると、炎症促進性サイトカインの局所的な産生によって、内在性免疫細胞が腫瘍部位にリクルートされ、抗腫瘍応答を増強することがある。
【００７２】
汎用性の同種異系ＣＡＲ  Ｔ細胞は、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／または主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子を以降発現しないものとし、それにより移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）または拒絶をそれぞれ防止するように、工学的に作製される。
【００７３】
自己駆動性ＣＡＲは、ＣＡＲとケモカイン受容体とを共発現するものであるが、それらは腫瘍リガンドに結合し、それによって腫瘍のホーミングを亢進する。
【００７４】
免疫抑制に抵抗性であるように工学的に作製されたＣＡＲ  Ｔ細胞（装甲ＣＡＲ）は、免疫チェックポイントスイッチ受容体を用いて、様々な免疫チェックポイント分子［例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）またはプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）］を以降発現しないように遺伝子改変されるか、または、免疫チェックポイントシグナル伝達を遮断するモノクローナル抗体と共に投与されることがある。
【００７５】
ＣＡＲをコードするようにエレクトロポレーションによって送達されるＲＮＡを用いた自己破壊性ＣＡＲが、設計されることがある。あるいは、遺伝子改変リンパ球におけるチミジンキナーゼとのガンシクロビルの結合、またはごく最近に記載された小分子二量体化因子によるヒトカスパーゼ９の活性化の系に基づき、Ｔ細胞の誘導性アポトーシスが達成されることがある。
【００７６】
条件的ＣＡＲ  Ｔ細胞は、回路を完成させるために小分子が添加されるまで、デフォルトでは応答しないかまたはスイッチ「オフ」されているが、この回路は、シグナル１およびシグナル２の両方の完全な伝達を可能とし、それによってＣＡＲ  Ｔ細胞を活性化する。あるいは、Ｔ細胞は、以降に投与される標的抗原を指向する二次抗体に対し親和性を有するアダプター特異的な受容体を発現するように、工学的に作製されることがある。
【００７７】
標示ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＡＲに加えて、既存のモノクローナル抗体剤が結合する腫瘍エピトープを発現する。耐え難い有害作用に際し、モノクローナル抗体を投与することにより、追加的な腫瘍外作用を生じることなく、ＣＡＲ  Ｔ細胞が一掃され、症状が軽減される。
【００７８】
タンデムＣＡＲ（ＴａｎＣＡＲ）Ｔ細胞は、細胞内共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインに融合された異なる親和性を有する２つの連結された単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる、単一のＣＡＲを発現する。ＴａｎＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化は、標的細胞が双方の標的を共発現する際にのみ達成される。
【００７９】
二重ＣＡＲ  Ｔ細胞は、異なるリガンド結合標的を有する２つの別々のＣＡＲを発現し；一方のＣＡＲはＣＤ３ζドメインのみを含み、他方のＣＡＲは共刺激ドメインのみを含む。二重ＣＡＲ  Ｔ細胞の活性化は、腫瘍上での両方の標的の共発現を必要とする。
【００８０】
安全性ＣＡＲ（ｓＣＡＲ）は、細胞内阻害ドメインに融合された細胞外ｓｃＦｖからなる。標準的なＣＡＲを共発現するｓＣＡＲ  Ｔ細胞は、標準的なＣＡＲ標的を有するがｓＣＡＲ標的を欠いた標的細胞に遭遇した場合にのみ、活性化されてゆく。
【００８１】
本開示のＣＡＲの抗原認識ドメインは、通常はｓｃＦｖである。しかし、数多くの代替物がある。生得のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ単鎖およびベータ単鎖由来の抗原認識ドメインは、単純な外部ドメイン（例えば、ＨＩＶ感染細胞を認識するためのＣＤ４外部ドメイン）と、より特異な認識構成成分、例えば連結されたサイトカイン（サイトカイン受容体を有する細胞の認識に繋がる）などとを有するものとして、記載されている。実際には、高い親和性で所与の標的に結合するほぼすべてのものを、抗原認識領域として使用することができる。
【００８２】
内部ドメインは、抗原認識後にシグナルを免疫エフェクター細胞に伝えるＣＡＲの先端部であり、このシグナルは、免疫エフェクター細胞の正常なエフェクター機能のうち少なくとも１つを活性化する。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含めて、細胞溶解活性であってもヘルパー活性であってもよい。それゆえ、内部ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および任意選択的な共受容体の「細胞内シグナル伝達ドメイン」を含むことがある。通常は細胞内シグナル伝達ドメイン全体が採用されうるが、一方で多くの場合、鎖全体を用いる必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切頭部分を用いる場合、そのような切頭部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、無傷の鎖の代わりに用いられることがある。
【００８３】
刺激性の様式で作用するＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する細胞質内シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを含有することがある。ＩＴＡＭを含有する細胞質内シグナル伝達配列の例としては、ＣＤ８、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ３２（ＦｃガンマＲＩＩａ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃγＲＩγ、ＦｃγＲＩＩＩγ、ＦｃεＲＩβ（ＦＣＥＲＩＢ）、およびＦｃεＲＩγ（ＦＣＥＲＩＧ）に由来するものが挙げられる。
【００８４】
具体的な実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）（ＴＣＲゼータ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４．１）に由来する。Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖またはＣＤ２４７（分化抗原群２４７）としても知られるＴ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖は、ヒトでＣＤ２４７遺伝子によってコードされるタンパク質である。
【００８５】
第１世代ＣＡＲは、典型的には、内在性ＴＣＲ由来のシグナルの一次トランスミッターであるＣＤ３ζ鎖由来の細胞内ドメインを有していた。第２世代のＣＡＲは、様々な共刺激タンパク質受容体（例えばＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳ）由来の細胞内シグナル伝達ドメインを、ＣＡＲの内部ドメインに追加して、追加的なシグナルをＴ細胞にもたらす。前臨床研究では、第２世代のＣＡＲの設計が、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を向上することが示されている。さらに最近では、第３世代のＣＡＲが、複数のシグナル伝達ドメインを組み合わせて強度をさらに増大させている。これらのＣＡＲを移植されたＴ細胞は、共刺激受容体／リガンド相互作用とは独立した、拡大、活性化、持続性、および腫瘍根絶効率の向上を実証している（Imai C, et al. Leukemia 2004 18:676-84; Maher J, et al. Nat Biotechnol 2002 20:70-5）。
【００８６】
例えば、ＣＡＲの内部ドメインは、それ自体でＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むように設計されるか、または本発明のＣＡＲのコンテクストで有用な任意の他の所望の細胞質ドメインと組み合わされることがある。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζ鎖部分および共刺激シグナル伝達領域を含むことがある。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含む、ＣＡＲの一部を指す。共刺激分子とは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要な抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、ＣＤ８、ＣＤ４、ｂ２ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＭｙＤ８８、ＢＴＮＬ３、およびＮＫＧ２Ｄが挙げられる。それゆえ、本ＣＡＲは、共刺激シグナル伝達因子として主にＣＤ２８にて例示されるが、他の共刺激因子が、単独でまたは他の共刺激シグナル伝達因子と組み合わせて用いられることがある。
【００８７】
実施形態によっては、ＣＡＲは、ヒンジ配列を含む。ヒンジ配列は、抗体の可撓性を促進するアミノ酸の短い配列である［例えば、Woof et al., Nat. Rev. Immunol., 4(2): 89-99 (2004)を参照］。ヒンジ配列は、抗原認識部分（例えば抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖ）と膜貫通ドメインとの間に配置されることがある。ヒンジ配列は、任意の適した分子に由来するかまたはそこから得られる、任意の適した配列とすることができる。実施形態によっては、例えば、ヒンジ配列は、ＣＤ８ａ分子またはＣＤ２８分子に由来する。
【００８８】
膜貫通ドメインは、天然の供給源または合成の供給源のどちらを由来としてもよい。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合型または膜貫通型のタンパク質を由来としてもよい。例えば、膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８（例えばＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ）、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、およびＰＡＧ／Ｃｂｐを由来とする（すなわち、少なくともその膜貫通領域を含む）ことがある。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であることがあり、その場合、大部分に疎水性の残基、例えばロイシンおよびバリンなどを含むものとなる。場合によっては、合成の膜貫通ドメインの各終端に、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが見出されるものとなる。２アミノ酸と１０アミノ酸の間の長さなどの短いオリゴまたはポリペプチドリンカーは、ＣＡＲの膜貫通ドメインと内質ドメインとの間に連結部を形成することがある。
【００８９】
実施形態によっては、ＣＡＲは、１つを超える膜貫通ドメインを有し、それらは、同じ膜貫通ドメインの繰り返しであることがあるか、または異なる膜貫通ドメインであることがある。
【００９０】
実施形態によっては、ＣＡＲは、この教示について参照により組み込まれるＷＯ２０１５／０３９５２３に記載されるような、複数鎖のＣＡＲである。複数鎖のＣＡＲは、異なる膜貫通ポリペプチドに、別々の細胞外リガンド結合ドメインとシグナル伝達ドメインとを含むことがある。シグナル伝達ドメインは、膜近傍の位置に集合するように設計されることがあり、このようなドメインは、最適なシグナル伝達をもたらす可撓性のある構造体を、天然の受容体にさらに近付いて形成する。例えば、複数鎖のＣＡＲは、ＦＣＥＲＩアルファ鎖の一部分とＦＣＥＲＩベータ鎖の一部分とを含むことがあるが、それによりＦＣＥＲＩ鎖が自然に共に二量体化してＣＡＲを形成する。
【００９１】
下記の表１、表２、および表３は、本開示のＣＡＲに生じる可能性のあるＣＤ３３結合領域、共刺激シグナル伝達領域、および細胞内シグナル伝達ドメインの組合せのいくつかの例を示す。
【００９２】
【表１】
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【００９３】
【表２】
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【００９４】
【表３】
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【００９５】
【表４】
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【００９６】
【表５】
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【００９７】
【表６】
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【００９８】
実施形態によっては、抗ＣＤ３３結合剤は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体である。抗ＣＤ３３  ｓｃＦｖの親和性／特異性は、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）内の特異的な配列によって、大部分が推進される。各ＶＨおよびＶＬ配列は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を有するものとなる。
【００９９】
実施形態によっては、抗ＣＤ３３結合剤は、天然の抗体、例えばモノクローナル抗体などに由来する。場合によっては、抗体は、ヒトである。場合によっては、抗体は、ヒトに投与される際に免疫原性が少なくなるように変更を施される。例えば、この変更は、キメラ化、ヒト化、ＣＤＲ移植、脱免疫化、および最も近いヒト生殖系列配列に対応するフレームワークアミノ酸の変異からなる群から選択される、１つまたは複数の手法を含む。
【０１００】
また開示されるのは、ＣＤ３３と少なくとも１つの追加的な腫瘍抗原とを標的とする二重特異性ＣＡＲである。また開示されるのは、腫瘍抗原などの異なる抗原を結合する別のＣＡＲと併用した際にのみ動作するように設計されたＣＡＲである。例えば、これらの実施形態では、本開示のＣＡＲの内部ドメインは、シグナル伝達ドメイン（ＳＤ）または共刺激シグナル伝達領域（ＣＳＲ）のみを含有しうるが、両方を含有し得ない。第２のＣＡＲ（または内在性Ｔ細胞）は、活性化された場合に、欠けたシグナルをもたらす。例えば、本開示のＣＡＲがＳＤを含有するがＣＳＲを含有しないならば、このＣＡＲを含有する免疫エフェクター細胞は、ＣＳＲを含有する別のＣＡＲ（またはＴ細胞）がその個別の抗原を結合する場合にのみ、活性化される。同様に、本開示のＣＡＲがＣＳＲを含有するがＳＤを含有しないならば、このＣＡＲを含有する免疫エフェクター細胞は、ＳＤを含有する別のＣＡＲ（またはＴ細胞）がその個別の抗原を結合する場合にのみ、活性化される。
【０１０１】
腫瘍抗原とは、免疫応答を、具体的にはＴ細胞媒介性の免疫応答を惹起する、腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。上記の追加的な抗原結合ドメインは、腫瘍抗原の抗体または天然のリガンドであることがある。上記の追加的な抗原結合ドメインの選択は、治療される具体的ながんのタイプに依存するものとなる。腫瘍抗原は、当技術分野に周知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＩＬ−ｌｌＲａ、ＩＬ−１３Ｒａ、ＥＧＦＲ、ＦＡＰ、Ｂ７Ｈ３、Ｋｉｔ、ＣＡ  ＬＸ、ＣＳ−１、ＭＵＣ１、ＢＣＭＡ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ＨＥＲ２、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）、ＡＬＫ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、サイクリンＢｌ、レクチン反応性ＡＦＰ、Ｆｏｓ関連抗原１、ＡＤＲＢ３、サイログロブリン、ＥｐｈＡ２、ＲＡＧＥ−１、ＲＵｌ、ＲＵ２、ＳＳＸ２、ＡＫＡＰ−４、ＬＣＫ、ＯＹ−ＴＥＳｌ、ＰＡＸ５、ＳＡＲＴ３、ＣＬＬ−１、フコシルＧＭ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ＥＰＣＡＭ、ＥＶＴ６−ＡＭＬ、ＴＧＳ５、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、プリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＲＵｌ、ＲＵ２（ＡＳ）、腸管カルボキシルエステラーゼ、ルイスＹ、ｓＬｅ、ＬＹ６Ｋ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰＩＢＩ、ＢＯＲＩＳ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＸ３、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ＬＭＰ２、ＮＣＡＭ、ｐ５３、ｐ５３変異体、Ｒａｓ変異体、ｇｐｌＯＯ、プロステイン、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＡＮＸ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、ＨＭＷＭＡＡ、ＨＡＶＣＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲベータ、サバイビンおよびテロメラーゼ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、精子タンパク質１７、ＳＳＥＡ−４、チロシナーゼ、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、前立腺癌腫腫瘍抗原１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＬ−ＩＡＰ、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｍｅｌａｎ  Ａ／ＭＡＲＴ  １、ＸＡＧＥ１、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、好中球エラスターゼ、肉腫の転座切断点、ＮＹ−ＢＲ−１、ｅｐｈｎｎＢ２、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＴＩＭ３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ９７、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、アンドロゲン受容体、ＦＡＰ、インスリン成長因子（ＩＧＦ）Ｉ、ＩＧＦＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＧＤ２、ｏ−アセチル−ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ３、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧＰＲ２０、ＣＸＯＲＦ６１、葉酸受容体（ＦＲａ）、葉酸受容体ベータ、ＲＯＲ１、Ｆｌｔ３、ＴＡＧ７２、ＴＮ  Ａｇ、Ｔｉｅ２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＵＰＫ２、およびメソテリンが挙げられる。好適な実施形態では、腫瘍抗原は、葉酸受容体（ＦＲａ）、メソテリン、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＩＬ−１３Ｒａ、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＴＩＭ３、ＢＣＭＡ、ＧＤ２、ＣＬＬ−１、ＣＡ−ＩＸ、ＭＵＣｌ、ＨＥＲ２、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
【０１０２】
腫瘍抗原の非限定的な例としては、以下：分化抗原、例えばチロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２など、および腫瘍特異的多系列抗原、例えばＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐｉ  ５など；過剰発現された胚性抗原、例えばＣＥＡなど；過剰発現された癌遺伝子および変異型腫瘍抑制遺伝子、例えばｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕなど；染色体転座の結果として生じるユニークな腫瘍抗原、例えばＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲなど；ならびにウイルス性抗原、例えばエプスタインバーウイルス抗原ＥＢＶＡならびにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７が挙げられる。他の大きなタンパク質ベースの抗原としては、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ベータカテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファフェトタンパク質、ベータＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳｌ、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ会合タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ、ＧＰＣ３、ＭＵＣ１６、ＬＭＰ１、ＥＢＭＡ−１、ＢＡＲＦ−１、ＣＳ１、ＣＤ３１９、ＨＥＲ１、Ｂ７Ｈ６、Ｌ１ＣＡＭ、ＩＬ６、およびＭＥＴが挙げられる。
【０１０３】
核酸およびベクター
また開示されるのは、本開示の免疫エフェクター細胞でＣＤ３３特異的なＣＡＲの発現を可能にする、本開示のＣＤ３３特異的なＣＡＲをコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドベクターである。
【０１０４】
本開示のＣＡＲ、およびその領域をコードする核酸配列は、当技術分野に公知の組換え方法を使用して、例えば、標準的な手法を用いて、遺伝子を発現する細胞由来のスクリーニングライブラリーによって、同じものを含むことが公知であるベクターから遺伝子を取り出すことによって、または同じものを含有する細胞および組織から直接的に単離することによって、得ることができる。あるいは、目的の遺伝子は、クローニングよりもむしろ合成によって産生することができる。
【０１０５】
ＣＡＲをコードする核酸の発現は、典型的には、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸をプロモーターに動作可能に連結し、構築物を発現ベクター内に組み込むことによって達成される。典型的なクローニングベクターは、転写および翻訳の終結因子、開始配列、ならびに所望の核酸配列の発現を調節するために有用なプロモーターを含有する。
【０１０６】
本開示の核酸は、数多くのタイプのベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、以下に限定されないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドを含むベクターにクローニングすることができる。具体的な目的のベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、およびシークエンシングベクターが挙げられる
【０１０７】
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に与えられてもよい。ウイルスベクター技術は、当技術分野に周知であり、例えばSambrook et al.（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）ならびに他のウイルス学および分子生物学の手引き書に記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、以下に限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスが挙げられる。一般に、適したベクターは、少なくとも１種の生物で機能性のある複製起点、プロモーター配列、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つまたは複数の選択マーカーを含有する。実施形態によっては、ポリヌクレオチドベクターは、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである。
【０１０８】
数多くのウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子移入に用いるために開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための簡便なプラットフォームをもたらした。選択された遺伝子は、当技術分野に公知の手法を用いて、ベクターに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次いで、組換えウイルスを単離し、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏのどちらかで対象の細胞に送達することができる。
【０１０９】
適したプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに動作可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することが可能な、強力な恒常的プロモーター配列である。適したプロモーターの別の例は、伸長成長因子１α（ＥＦ−１α）である。しかし、他の恒常的プロモーター配列も使用されることがあり、そのようなものとしては、以下に限定されないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、ＭＮＤ（骨髄増殖性肉腫ウイルス）プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長鎖末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えば以下に限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターが挙げられる。プロモーターは代替的に、誘導性プロモーターとすることができる。誘導性プロモーターの例としては、以下に限定されないが、メタロチオニン（metallothionine）プロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。
【０１１０】
追加的なプロモーター因子、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、尤も、数多くのプロモーターが同様に、開始部位の下流に機能因子を含有することが示されている。因子が互いに対し逆転または移動される際にプロモーター機能が保たれるように、プロモーター因子間の間隔は柔軟であることが多い。
【０１１１】
ＣＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞内に導入される発現ベクターはまた、選択マーカー遺伝子もしくレポーター遺伝子のどちらかまたは両方を含有して、ウイルスベクターによりトランスフェクトまたは感染させようとした細胞の集団からの発現細胞の特定および選択を容易にすることができる。他の態様では、選択マーカーは、別々の一片のＤＮＡに担持されてコトランスフェクションの手順に使用されることがある。選択マーカーおよびレポーター遺伝子の両方には、その側面に適切な調節配列が位置し、宿主細胞での発現を可能にする。有用な選択マーカーとしては、例えば抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【０１１２】
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性がある細胞を特定するために、および調節配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエントの生体または組織に存在しないかまたは発現されず、いくらか容易に検出可能な性質、例えば酵素活性によってその発現が顕在化するポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後、適した時間にアッセイされる。適したレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子が挙げられうる。適した発現系は、周知であり、公知の手法を用いて調製されるかまたは商業的に取得されることがある。一般に、最も高いレベルのレポーター遺伝子の発現を示す最小限の５’フランキング領域を有する構築物が、プロモーターとして特定される。そのようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され、プロモーター駆動性の転写を調整する能力について薬剤を評価するために用いられることがある。
【０１１３】
遺伝子を細胞に導入し発現する方法は、当技術分野に公知である。発現ベクターのコンテクストでは、ベクターは、当技術分野の任意の方法によって、宿主細胞に、例えば哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫の細胞に、容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的な手段によって、宿主細胞内に移入することができる。
【０１１４】
ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための物理的な方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子照射、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクターおよび／または外来性の核酸を含む細胞を産生するための方法は、当技術分野に周知である。例えば、Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）を参照されたい。
【０１１５】
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための生物学的な方法としては、ＤＮＡベクターおよびＲＮＡベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、そして特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞内に遺伝子を挿入するための最も広く使用される方法となりつつある。
【０１１６】
ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための化学的手段としては、コロイド分散系、例えば巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および脂質ベース系などが挙げられ、脂質ベース系としては、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームが挙げられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの送達媒体として使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば人工膜小胞）である。
【０１１７】
非ウイルス送達系が利用される場合、例示的な送達媒体は、リポソームである。別の態様では、核酸が、脂質に会合されていることがある。脂質に会合された核酸は、リポソームの水性内部に被包されるか、リポソームの脂質二重層内に散在するか、リポソームとオリゴヌクレオチドとの両方に会合している連結分子を介してリポソームに付加するか、リポソーム内に捕らえられるか、リポソームと合わせて複合体となるか、脂質を含有する溶液中に分散するか、脂質と混合されるか、脂質と組み合わされるか、脂質中に懸濁物として含有されるか、ミセルと共に含有されるかもしくは複合体となるか、またはその他脂質と会合されることがある。脂質、脂質／ＤＮＡ、または脂質／発現ベクターにより会合された組成物は、溶液中の任意の具体的な構造に限定されない。例えば、それらは、二重層構造に、ミセルとして、または「崩壊した」構造で、存在することがある。それらはまた、単に溶液中に散在していることがあり、サイズまたは形状が均一でない凝集塊を形成している可能性がある。脂質は、天然に生じることも合成の脂質であることもある脂肪性物質である。例えば、脂質としては、細胞質に天然に生じる脂肪小滴、ならびに長鎖の脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体を含有する化合物のクラス、例えば脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドなどが挙げられる。使用に適した脂質は、商業的供給源から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、シグマ、セントルイス、ミズーリ州から入手することができ；リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、Ｋ＆Ｋラボラトリーズ（プレインビュー、ニューヨーク州）から入手することができ；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、カルビオケム−ベーリングから入手することができ；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、アバンティポーラリピッド社（バーミンガム、アラバマ州）から入手されることがある。
【０１１８】
免疫エフェクター細胞
また開示されるのは、本開示のＣＡＲ（本明細書に「ＣＡＲ−Ｔ細胞」としても称されるを発現するように、工学的に作製された免疫エフェクター細胞である。これらの細胞は、好ましくは治療される対象から取得される（すなわち自家性である）。しかし、実施形態によっては、免疫エフェクター細胞株またはドナーエフェクター細胞（同種異系）が用いられる。免疫エフェクター細胞は、数多くの供給源から取得することができ、そのような供給源としては、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍が挙げられる。免疫エフェクター細胞は、対象から採集された血液から、当業者に公知の任意の数の手法、例えばＦｉｃｏｌｌ（商標）分離などを用いて取得することができる。例えば、個体の循環血液由来の細胞が、アフェレーシスによって取得されることがある。実施形態によっては、免疫エフェクター細胞は、赤血球を溶解することおよび単球を枯渇させることによって、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を介した遠心分離によって、または対向流遠心溶出法によって、末梢血リンパ球から単離される。免疫エフェクター細胞の特異的な部分集団は、陽性選抜または陰性選抜の手法によってさらに単離することができる。例えば、免疫エフェクター細胞は、陽性選択細胞にユニークな表面マーカーを指向する抗体の組合せを用いて、例えば、所望の免疫エフェクター細胞の陽性選択に十分な時間の間、抗体コンジュゲートビーズと共にインキュベートすることによって、単離することができる。あるいは、免疫エフェクター細胞集団の濃縮は、陰性選択細胞にユニークな表面マーカーを指向する抗体の組合せを用いた陰性選抜によって、達成することができる。
【０１１９】
実施形態によっては、免疫エフェクター細胞は、感染症および外来性物質に対する身体の防御に関与する任意の白血球を含む。例えば、免疫エフェクター細胞は、リンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、マスト細胞、好中球、好塩基球、好酸球、またはそれらの任意の組合せを含みうる。例えば、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球を含みうる。
【０１２０】
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞表面のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって、他のリンパ球、例えばＢ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などから識別することができる。それらは、（扁桃腺中でも成熟するものもあるとはいえ）胸腺で成熟することから、Ｔ細胞とよばれる。それぞれが別個の機能を有するいくつかのＴ細胞のサブセットがある。
【０１２１】
Ｔヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、形質細胞およびメモリーＢ細胞へのＢ細胞の成熟と、細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化とを含む免疫学的過程で、他の白血球を支援する。これらの細胞は、その表面にＣＤ４糖タンパク質を発現することから、ＣＤ４＋Ｔ細胞としても知られる。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原を提示されると、活性化されてゆく。それらは活性化されると、速やかに分裂し、小さなタンパク質を分泌するが、このタンパク質はサイトカインとよばれ、能動免疫応答を調節または支援する。これらの細胞は、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨ９、またはＴＦＨを含む複数のサブタイプのうちの１つに分化することができ、そのようなサブタイプは、異なるサイトカインを分泌して、異なるタイプの免疫応答を促進する。
【０１２２】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶にも関与する。これらの細胞は、その表面にＣＤ８糖タンパク質を発現することから、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られる。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩ分子に会合する、抗原に結合することによって、標的を認識する。調節性Ｔ細胞によって分泌されるＩＬ−１０、アデノシン、および他の分子を介して、ＣＤ８＋細胞は、自己免疫疾患を防ぐアネルギー状態に不活性化されることがある。
【０１２３】
メモリーＴ細胞は、感染が解消した後に長期間持続する、抗原特異的なＴ細胞のサブセットである。それらは、同起源の抗原に再度曝露されると多数のエフェクターＴ細胞に急速に拡大し、それゆえ過去の感染に対する「記憶」を免疫系に付与する。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のどちらかであることがある。メモリーＴ細胞は、典型的には、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
【０１２４】
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、かつては抑制性Ｔ細胞として知られたものであり、免疫寛容の維持に極めて重要である。これらの主要な役割は、免疫反応の終了に向けてＴ細胞媒介性免疫を停止させること、および胸腺における陰性選抜の過程を逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。２つの主要なクラスのＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞―天然に生じたＴｒｅｇ細胞および適応性Ｔｒｅｇ細胞―が記載されている。
【０１２５】
ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞［ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と混同しないこと］は、適応免疫系を先天免疫系に橋渡しする。主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子によって提示されたペプチド抗原を認識する従来のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄとよばれる分子により提示された糖脂質抗原を認識する。
【０１２６】
実施形態によっては、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋細胞の混合物を含む。他の実施形態では、Ｔ細胞は、細胞表面の発現に基づき、１つまたは複数のサブセットに濃縮される。例えば、場合によっては、Ｔが含むのは、細胞傷害性のＣＤ８＋Ｔリンパ球である。実施形態によっては、Ｔ細胞は、γδＴ細胞を含むが、このＴ細胞は、α鎖とβ鎖の代わりに１つのγ鎖と１つのδ鎖とを有する別個のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。
【０１２７】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ウイルス感染細胞および形質転換細胞を殺傷することができるＣＤ５６＋ＣＤ３−大型顆粒リンパ球であり、先天免疫系の決定的に重要な細胞サブセットを構成する（Godfrey J, et al. Leuk Lymphoma 2012 53:1666-1676）。細胞傷害性のＣＤ８＋Ｔリンパ球とは異なり、ＮＫ細胞は、事前の感作を必要とすることなく、腫瘍細胞に対する細胞傷害性を発動し、ＭＨＣ−Ｉ陰性細胞を根絶することもできる（Narni-Mancinelli E, et al. Int Immunol 2011 23:427-431）。ＮＫ細胞は、サイトカインストームの潜在的な致死的合併症（Morgan RA, et al. Mol Ther 2010 18:843-851）、腫瘍崩壊性症候群（Porter DL, et al. N Engl J Med 2011 365:725-733）、および標的外、腫瘍外効果を回避することがあるという点で、より安全なエフェクター細胞である。ＮＫ細胞ががん細胞のキラーとして周知の役割を有し、かつＮＫ細胞の機能障害がＭＭの進行に極めて重要であることが広く文書に記載されているとはいえ（Godfrey J, et al. Leuk Lymphoma 2012 53:1666-1676; Fauriat C, et al. Leukemia 2006 20:732-733）、ＮＫ細胞媒介性の抗ＭＭ活性を亢進する可能性をもたらす手段は、本開示のＣＡＲに先立ち殆ど探究されていなかった。
【０１２８】
治療方法
本開示のＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、ＣＤ３３発現がん細胞に対する抗腫瘍免疫応答を惹起することができる。本開示のＣＡＲ改変型免疫エフェクター細胞によって惹起された抗腫瘍免疫応答は、能動的な免疫応答でも受動的な免疫応答でもありうる。さらに、ＣＡＲ媒介性免疫応答は、ＣＡＲ改変型免疫エフェクター細胞がＣＤ３３に特異的な免疫応答を誘導する、養子免疫療法アプローチの一部であることがある。
【０１２９】
キメラ抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞の養子移入は、将来性のある抗がん療法である。患者の免疫エフェクター細胞の採集後、細胞は、本開示のＣＤ３３特異的なＣＡＲを発現するように遺伝子工学的に作製され、次いで患者に注入されて戻されることがある。
【０１３０】
本開示のＣＡＲ改変型免疫エフェクター細胞は、単独で、または希釈剤および／もしくは他の構成成分、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１５、もしくは他のサイトカイン、もしくは細胞集団と組み合わされた医薬組成物としてのどちらかで、投与されることがある。端的に述べれば、医薬組成物は、本明細書に記載されるような標的細胞集団を、１つまたは複数の医薬的にまたは生理的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含むことがある。そのような組成物は、緩衝剤、例えば中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水など；炭水化物、例えばグルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン、マンニトールなど；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシンなど；抗酸化剤；キレート剤、例えばＥＤＴＡまたはグルタチオンなど；アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）；および保存剤を含むことがある。本開示の方法における使用の際の組成物は、実施形態によっては、静脈内投与のために製剤化される。医薬組成物は、ＭＭを治療するのに適切な任意の方法で投与されてよい。適切な投薬量は臨床試験により決定される可能性があるとはいえ、投与の量および頻度は、患者の状態、および患者の疾患の重症度などの要因によって決定されるものとなる。
【０１３１】
「免疫学的に有効な量」、「抗腫瘍性の有効な量」、「腫瘍阻害性の有効な量」または「治療量」が標示される際には、投与される本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および患者（対象）の状態の個体差を考慮して、医師が決定することができる。本明細書に記載されるＴ細胞を含む医薬組成物は、１０４から１０９細胞個／体重ｋｇの、例えば１０５から１０６細胞個／体重ｋｇなどの、およびこれらの範囲内にある全ての整数値を含めた投薬量で投与されうることを、一般的に述べることができる。Ｔ細胞組成物は、これらの投薬量で複数回投与されることもある。細胞は、免疫療法においてよく知られる注入手法（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988を参照）を用いることによって、投与することができる。具体的な患者に用いる最適の投薬量および治療処方計画は、医療分野の当業者により、疾患の徴候について患者をモニタリングして相応に治療を調整することによって、容易に決定することができる。
【０１３２】
ある実施形態では、活性化されたＴ細胞を対象に投与し、次いで、続いて再度採血し（またはアフェレーシスを実施し）、本開示の方法に従ってそこからＴ細胞を活性化し、これらの活性化され拡大されたＴ細胞を患者に再度注入することが望ましい場合がある。この過程は、複数回、数週毎に実施することができる。ある実施形態では、Ｔ細胞は、１０ｃｃから４００ｃｃまでの採取血液から活性化することができる。ある実施形態では、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、または１００ｃｃの採取血液から活性化される。この複数回血液採取／複数回再注入のプロトコールの使用は、ある特定のＴ細胞集団を選び出すのに役立つことがある。
【０１３３】
本開示の組成物の投与は、注射、輸液、または移植によることを含めた任意の簡便な方法で実施されてよい。本明細書に記載される組成物は、皮下で、皮内で、腫瘍内で、結節内で、髄内で、筋肉内で、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、または腹腔内で、患者に投与されることがある。実施形態によっては、本開示の組成物は、皮内または皮下の注射によって患者に投与される。実施形態によっては、本開示の組成物は、ｉ．ｖ．注射によって投与される。組成物はまた、腫瘍内、リンパ節内、または感染部位内に直接的に注射されることがある。
【０１３４】
ある実施形態では、本開示のＣＡＲ改変型免疫エフェクター細胞は、任意の数の関連の治療法と併用して（例えば前に、同時に、もしくは続いて）、患者に投与され、そのような治療法としては、以下に限定されないが、サリドマイド、デキサメタゾン、ボルテゾミブ、およびレナリドミドが挙げられる。さらに別の実施形態では、ＣＡＲ改変型免疫エフェクター細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸エステル、およびＦＫ５０６など、抗体または他の免疫アブレーション剤、例えばＣＡＭ  ＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、もしくは他の抗体療法など、サイトキシン（cytoxin）、フルダリビン（fludaribin）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、ならびに放射線照射と組み合わせて使用されることがある。実施形態によっては、ＣＡＲ改変型免疫エフェクター細胞は、骨髄移植；フルダラビンなどの化学療法剤、体外放射線照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨなどの抗体のうちいずれかを用いたＴ細胞アブレーション療法と併用して（例えば前に、同時に、もしくは続いて）、患者に投与される。別の実施形態では、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０に反応する薬剤、例えばリツキサンなどのＢ細胞アブレーション療法に続いて投与される。例えば、実施形態によっては、対象は、高用量の化学療法を用いた標準治療とその後に末梢血幹細胞の移植とを受けることがある。ある実施形態では、移植に続いて、対象は、拡大された本発明の免疫細胞の注入を受ける。追加的な実施形態では、拡大された細胞が、外科手術の前または後に投与される。
【０１３５】
本開示の方法のがんは、無制御の成長、浸潤、または転移を起こしている対象における任意のＣＤ３３発現細胞とすることができる。ＣＤ３３を発現するがんとしては、前立腺がん、卵巣がん、肺の腺癌、乳がん、子宮内膜がん、胃がん、大腸がん、および膵臓がんが挙げられる。ＣＤ３３は、Ｊｕｒｋａｔ細胞上にも見出されている。態様によっては、がんは、胆嚢がん、外分泌腺癌、またはアポクリン腺癌である。場合によっては、がんは、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、または混合表現型白血病を含む。
【０１３６】
態様によっては、がんは、放射線療法が現在用いられている任意の新生物または腫瘍とすることができる。あるいは、がんは、標準的な方法を用いた放射線療法に対して十分な感受性のない新生物または腫瘍とすることができる。そのため、がんは、肉腫、リンパ腫、白血病、癌腫、芽腫、または生殖細胞腫瘍とすることができる。本開示の組成物を治療に用いることのできる、代表的ではあるが非限定的ながんの一覧には、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉症、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱がん、脳がん、神経系がん、頭頸部がん、頭頸部の扁平上皮癌、腎臓がん、肺がん、例えば小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんなど、神経芽腫／神経膠芽腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、肝臓がん、黒色腫、口腔、咽喉、咽頭、および肺の扁平上皮癌、子宮内膜がん、子宮頸がん、子宮頸癌、乳がん、上皮がん、腎がん、尿生殖器がん、肺がん、食道癌、頭頸部癌、大腸がん、造血器がん；精巣がん；結腸がんおよび直腸がん、前立腺がん、ならびに膵臓がんが挙げられる。
【０１３７】
本開示のＣＡＲは、細胞傷害性作用または細胞分裂停止作用を有する任意の化合物、部分、または基と組み合わせて使用することができる。薬剤部分としては、化学療法剤があげられ、これらは、マイクロチューブリン阻害剤、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはＤＮＡ挿入剤として機能することがあり、具体的にはがん療法に用いられるものである。
【０１３８】
本開示のＣＡＲは、チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用することができる。公知の２つの阻害性チェックポイント経路が、細胞傷害性Ｔ−リンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）受容体およびプログラム死１（ＰＤ−１）受容体を介したシグナル伝達に関与する。これらのタンパク質は、Ｔ細胞の機能の全ての段階を通じて重要な役割を果たす共シグナル伝達分子であるＣＤ２８−Ｂ７ファミリーのメンバーである。ＰＤ−１受容体（ＣＤ２７９としても知られる）は、活性化されたＴ細胞の表面に発現される。そのリガンドであるＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１；ＣＤ２７４）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ；ＣＤ２７３）は、樹状細胞やマクロファージなどのＡＰＣの表面に発現される。ＰＤ−Ｌ１は、最も優勢なリガンドであり、一方、ＰＤ−Ｌ２は、それよりもはるかに制限された発現パターンを有する。リガンドがＰＤ−１に結合すると、阻害性シグナルがＴ細胞に伝えられ、それによってサイトカイン産生が低減し、Ｔ細胞の増殖が抑制される。チェックポイント阻害剤としては、以下に限定されないが、ＰＤ−１［ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８またはＭＤＸ１１０６）、ＣＴ−０１１、ＭＫ−３４７５］、ＰＤ−Ｌ１［ＭＤＸ−１１０５（ＢＭＳ−９３６５５９）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ］、ＰＤ−Ｌ２（ｒＨＩｇＭ１２Ｂ７）、ＣＴＬＡ−４［イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０）、トレメリブマブ（ＣＰ−６７５，２０６）］、ＩＤＯ、Ｂ７−Ｈ３（ＭＧＡ２７１）、Ｂ７−Ｈ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ−３（ＢＭＳ−９８６０１６）を遮断する抗体が挙げられる。
【０１３９】
プログラム死１（ＰＤ−１）に対するヒトモノクローナル抗体、および抗ＰＤ−１抗体を単独でまたは他の免疫療法薬と組み合わせて用いてがんを治療するための方法は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第８，００８，４４９号に記載されている。抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびその使用は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第８，５５２，１５４号に記載されている。抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む抗がん剤は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第８，６１７，５４６号に記載されている。
【０１４０】
実施形態によっては、ＰＤＬ１阻害剤は、ＰＤＬ１を特異的に結合する抗体、例えばＢＭＳ−９３６５５９（ブリストルマイヤーズスクイブ）またはＭＰＤＬ３２８０Ａ（ロシュ）などを含む。実施形態によっては、ＰＤ１阻害剤は、ＰＤ１を特異的に結合する抗体、例えばランブロリズマブ（メルク）、ニボルマブ（ブリストルマイヤーズスクイブ）、またはＭＥＤＩ４７３６（アストラゼネカ）などを含む。ＰＤ−１に対するヒトモノクローナル抗体、および抗ＰＤ−１抗体を単独でまたは他の免疫療法薬と組み合わせて用いてがんを治療するための方法は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第８，００８，４４９号に記載されている。抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびその使用は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第８，５５２，１５４号に記載されている。抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む抗がん剤は、これらの抗体について参照により組み込まれる米国特許第８，６１７，５４６号に記載されている。
【０１４１】
本開示のＣＡＲは、他のがん免疫療法と組み合わせて使用することができる。２つの異なるタイプの免疫療法がある。受動免疫療法は、必ずしも患者において免疫応答を開始させる必要はなく、免疫系の構成成分を用いて、がん細胞に対し標的化された細胞傷害活性を向けるのに対して、能動免疫療法は、内在性の免疫応答を能動的に誘発する。受動型ストラテジーは、特異的な抗原に応答してＢ細胞によって産生されるモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の使用を含む。１９７０年代にハイブリドーマ技術が発達したこと、および腫瘍特異的な抗原が特定されたことにより、免疫系による破壊のために腫瘍細胞を特異的に標的とすることのできるｍＡｂの医薬開発が可能になった。今までのところ、ｍＡｂは、免疫療法の最大の成功事例となっており、２０１２年の抗がん薬のベストセラーのトップ３はｍＡｂであった。それらの中には、リツキシマブ（リツキサン、ジェネンテック）があり、これは、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）などのＢ細胞悪性腫瘍の表面に高発現されているＣＤ２０タンパク質に結合する。リツキシマブは、化学療法と組み合わされたＮＨＬおよび慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の治療のために、ＦＤＡにより認可されている。別の重要なｍＡｂは、トラスツズマブ（ハーセプチン；ジェネンテック）であり、これは、ＨＥＲ２（ヒト上皮成長因子受容体２）の発現を標的とすることによって、ＨＥＲ２陽性乳がんの治療を一変させた。
【０１４２】
最適な「キラー」ＣＤ８  Ｔ細胞の応答の生成にはまた、Ｔ細胞受容体の活性化に加えて共刺激が必要であり、共刺激は、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）を含めた腫瘍壊死因子受容体ファミリーのメンバーの連結を介してもたらされることがある。活性化（アゴニスト）抗ＯＸ４０  ｍＡｂを用いた治療が、Ｔ細胞の分化および細胞溶解機能を増大させ、種々の腫瘍に対する抗腫瘍免疫の亢進に繋がるという点で、ＯＸ４０は特に興味深い。
【０１４３】
実施形態によっては、そのような追加的な治療剤は、抗代謝剤、例えばメトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン（decarbazine）、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、またはクラドリビンなどから選択されることがある。
【０１４４】
実施形態によっては、そのような追加的な治療剤は、アルキル化剤、例えばメクロレタミン、チオエパ（thioepa）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、および他の白金誘導体、例えばカルボプラチンなどから選択されることがある。
【０１４５】
実施形態によっては、そのような追加的な治療剤は、標的化剤、例えばイブルチニブまたはイデラリシブなどである。
【０１４６】
実施形態によっては、そのような追加的な治療剤は、エピジェネティクス改変剤、例えばアザシチジンまたはビダーザなどである。
【０１４７】
実施形態によっては、そのような追加的な治療剤は、抗有糸分裂剤、例えばタキサン類など、例としてドセタキセルおよびパクリタキセル、ならびにビンカアルカロイド類、例としてビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびビノレルビンから選択されることがある。
【０１４８】
実施形態によっては、そのような追加的な治療剤は、トポイソメラーゼ阻害剤、例えばトポテカンもしくはイリノテカンなど、または細胞分裂阻害薬、例えばエトポシドおよびテニポシドなどから選択されることがある。
【０１４９】
実施形態によっては、そのような追加的な治療剤は、成長因子阻害剤、例えばＥｒｂＢｌ（ＥＧＦＲ）の阻害剤（ＥＧＦＲ抗体、例えばザルツムマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、もしくはニモツズマブなど、または他のＥＧＦＲ阻害剤、例えばゲフィチニブまたはエルロチニブなど）、別のＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）の阻害剤（ＨＥＲ２抗体、例えばトラスツズマブ、トラスツズマブ−ＤＭｌ、またはペルツズマブなど）、またはＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の両方の阻害剤、例えばラパチニブなど）などから選択されることがある。
【０１５０】
実施形態によっては、そのような追加的な治療剤は、チロシンキナーゼ阻害剤、例えばイマニチブ（グリベック、グリーベックＳＴＩ５７１）またはラパチニブなどから選択されることがある。
【０１５１】
そのため、実施形態によっては、開示された抗体は、オファツムマブ、ザノリムマブ、ダラツムマブ、ラニビズマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、ｈｕ８０６、ダクリズマブ（ゼナパックス）、バシリキシマブ（シムレクト）、インフリキシマブ（レミケード）、アダリムマブ（ヒュミラ）、ナタリズマブ（タイサブリ）、オマリズマブ（ゾレア）、エファリズマブ（ラプティバ）、および／またはリツキシマブと組み合わせて使用される。
【０１５２】
実施形態によっては、上記に記載されたような障害を治療するためのＣＡＲと組み合わせた使用のための治療剤は、抗がん性のサイトカイン、ケモカイン、またはそれらの組合せであることがある。適したサイトカインおよび成長因子の例としては、ＩＦＮｙ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８ａ、ＩＬ−２８ｂ、ＩＬ−２９、ＫＧＦ、ＩＦＮａ（例えばＩＮＦａ２ｂ）、ＩＦＮ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、Ｆｌｔ３リガンド、幹細胞因子、アンセスチム、およびＴＮＦａが挙げられる。適したケモカインとしては、Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＥＬＲ）陰性のケモカイン、例えばヒトＣＸＣおよびＣ−Ｃケモカインファミリー由来のＩＰ−１０、ＭＣＰ−３、ＭＩＧ、およびＳＤＦ−ｌａなどが挙げられうる。適したサイトカインとしては、サイトカイン誘導体、サイトカインバリアント、サイトカイン断片、およびサイトカイン融合タンパク質が挙げられる。
【０１５３】
実施形態によっては、上記に記載されたような障害を治療するための、ＣＡＲと組み合わせた使用のための治療剤は、細胞周期制御／アポトーシス調節物質（または「調節剤」）であることがある。細胞周期制御／アポトーシス調節物質としては、細胞周期制御／アポトーシス調節物質を標的とし調節する分子、例えば（ｉ）ｃｄｃ−２５（例えばＮＳＣ６６３２８４など）、（ｉｉ）細胞周期を過剰に刺激するサイクリン依存的キナーゼ［例えばフラボピリドール（Ｌ８６８２７５、ＨＭＲ１２７５）、７−ヒドロキシスタウロスポリン（ＵＣＮ−０１、ＫＷ−２４０１）、およびロスコビチン（Ｒ−ロスコビチン、ＣＹＣ２０２）など］、ならびに（ｉｉｉ）テロメラーゼ調整物質（例えばＢＩＢＲ１５３２、ＳＯＴ−０９５、ＧＲＮ１６３、および例として米国特許第６，４４０，７３５号および米国特許第６，７１３，０５５号に記載の組成物）が挙げられうる。アポトーシス経路に干渉する分子の非限定的な例としては、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）／アポトーシス２リガンド（Ａｐｏ−２Ｌ）、ＴＲＡＩＬ受容体を活性化する抗体、ＩＦＮ、およびアンチセンスＢｃｌ−２が挙げられる。
【０１５４】
実施形態によっては、上記に記載されたような障害を治療するための、ＣＡＲと組み合わせた使用のための治療剤は、ホルモン性調節剤、例えば、抗アンドロゲンおよび抗エストロゲン療法に有用な薬剤などであることがある。そのようなホルモン性調節剤の例は、タモキシフェン、イドキシフェン、フルベストラント、ドロロキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール／エスチニル、抗アンドロゲン剤（例えばフルタミンデ（flutaminde）／ユーレキシン）、プロゲスチン（例えば例えばヒドロキシプロゲステロンカプロン酸エステル、メドロキシプロゲステロン／プロベラ、酢酸メゲステロール／メゲース）、副腎皮質ステロイド（例えばヒドロコルチゾン、プレドニゾン）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（およびその類似体ならびに他のＬＨＲＨアゴニスト、例えばブセレリンおよびゴセレリンなど）、アロマターゼ阻害剤（例えばアナストラゾール／アリミデックス、アミノグルテチミド／シトラデン（cytraden）、エキセメスタン）、またはホルモン阻害剤（例えばオクトレオチド／サンドスタチン）である。
【０１５５】
実施形態によっては、上記に記載されたような障害を治療するための、ＣＡＲと組み合わせた使用のための治療剤は、抗がん性の核酸または抗がん性の阻害性ＲＮＡ分子であることがある。
【０１５６】
上記に記載されるような併用投与は、同時であっても、別々であっても、連続的であってもよい。同時投与のために、薬剤は、必要に応じて、１つの組成物としても別々の組成物としても投与されてよい。
【０１５７】
実施形態によっては、本開示のＣＡＲは、放射線療法と組み合わせて投与される。放射線療法は、患者への放射線または関連する放射性医薬品の投与が行われることを含むことがある。放射線の供給源は、治療されている患者の体外としても体内としてもよい［放射線治療は、例えば、体外放射線照射療法（ＥＢＲＴ）の形態でも近接照射療法（ＢＴ）の形態でもよい］。そのような方法を実践する際に使用されることがある放射活性因子としては、例えば、ラジウム、セシウム−１３７、イリジウム−１９２、アメリシウム−２４１、金−１９８、コバルト−５７、銅−６７、テクネチウム−９９、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、およびインジウム−１１１が挙げられる。
【０１５８】
実施形態によっては、本開示のＣＡＲは、外科手術と組み合わせて投与される。
【０１５９】
ＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍細胞傷害性と特異性とを亢進し、腫瘍の免疫抑制を逃れ、宿主拒絶を回避し、それらの治療半減期を延長する、いくつかの方法で設計されることがある。ＴＲＵＣＫ（汎用的なサイトカインによる殺傷を再指向されたＴ細胞）Ｔ細胞は、例えば、ＣＡＲを有するが、また、腫瘍の殺傷を促進するＩＬ−１２などのサイトカインを放出するように工学的に作製される。これらの細胞は、腫瘍環境に局在化されると、ＣＡＲの活性化の際に分子ペイロードを放出するように設計されることから、これらのＣＡＲ−Ｔ細胞はまた、時には「装甲ＣＡＲ」とも称される。がん療法としてのいくつかのサイトカインが、前臨床と臨床との両方で検討されており、ＣＡＲ−Ｔ療法のＴＲＵＣＫ形態に同様に組み込まれた際に有用であることが判明することもある。これらの中には、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ、ＦＬＴ３リガンド、リンホタクチン、およびＴＧＦ−βが含まれる（Ｄｒａｎｏｆｆ  ２００４）。「自己駆動性」または「ホーミング」ＣＡＲ−Ｔ細胞は、それらのＣＡＲに加えてケモカイン受容体を発現するように工学的に作製される。ある特定のケモカインを腫瘍内で上方制御できることから、ケモカイン受容体の組み込みは、養子Ｔ細胞への腫瘍内輸送および養子Ｔ細胞による浸潤を支援し、それによってＣＡＲ−Ｔの特異性と機能性との両方が亢進される（Ｍｏｏｎ  ２０１１）。汎用性ＣＡＲ−Ｔ細胞もＣＡＲを有するが、それらが内在性ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）またはＭＨＣ（主要組織適合抗原複合体）タンパク質を発現しないように、工学的に作製される。これらの２つのタンパク質を養子Ｔ細胞療法のシグナル伝達レパートリーから除去することにより、移植片対宿主病および拒絶がそれぞれ防止される。装甲ＣＡＲ−Ｔ細胞は、さらに、腫瘍の免疫抑制と腫瘍誘導性のＣＡＲ−Ｔ機能低下とを逃れる能力でよく知られる。これらの具体的なＣＡＲ−Ｔは、ＣＡＲを有し、チェックポイント阻害物質を発現しないように工学的に作製されることがある。あるいは、これらのＣＡＲ−Ｔは、チェックポイントシグナル伝達を遮断するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と共投与することができる。抗ＰＤＬ１抗体の投与によって、ＣＡＲ  ＴＩＬ（腫瘍浸潤性リンパ球）の殺傷能は有意に回復した。ＰＤ１−ＰＤＬ１シグナル伝達経路およびＣＴＬＡ−４−ＣＤ８０／ＣＤ８６シグナル伝達経路が検討されているが、その一方で、ＬＡＧ−３、Ｔｉｍ−３、ＩＤＯ−１、２Ｂ４、およびＫＩＲを含む装甲ＣＡＲ−Ｔの設計において他の免疫チェックポイントシグナル伝達分子を標的とすることが可能である。ＴＩＬの他の細胞内阻害物質としては、ホスファターゼ（ＳＨＰ１）、ユビキチンリガーゼ（すなわちｃｂｌ−ｂ）、およびキナーゼ（すなわちジアシルグリセロールキナーゼ）が挙げられる。装甲ＣＡＲ−Ｔはまた、腫瘍分泌性サイトカインの作用に対しそれらを保護するかまたは抵抗性にするタンパク質または受容体を発現するように、工学的に作製されることがある。例えば、ＴＧＦ−β受容体の二重陰性��を形質導入されたＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）は、リンパ腫分泌性ＴＧＦ−βによる免疫抑制に対し抵抗性である。これらの形質導入細胞は、対照のカウンターパートに比べて、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性の著しい増加を示した。
【０１６０】
タンデムＣＡＲ−Ｔ細胞および二重ＣＡＲ−Ｔ細胞は、２つの別個の抗原結合ドメインを有するという点でユニークである。タンデムＣＡＲは、細胞内共刺激ドメインおよび細胞内刺激ドメインに接続された、細胞外環境に面する２つの連続的な抗原結合ドメインを含有する。二重ＣＡＲは、一方の細胞外抗原結合ドメインが細胞内共刺激ドメインに接続され、かつ第２の別個の細胞外抗原結合ドメインが細胞内刺激ドメインに接続されるように、工学的に作製される。刺激ドメインおよび共刺激ドメインが、２つの別々の抗原結合ドメインの間を分断することから、二重ＣＡＲは「分断ＣＡＲ」とも称される。タンデムＣＡＲと二重ＣＡＲの両方の設計では、双方の抗原結合ドメインの結合が、Ｔ細胞におけるＣＡＲ回路のシグナル伝達を可能にするのに必要である。これらの２つのＣＡＲの設計は、異なる別個の抗原に対する結合親和性を有することから、「二重特異性」ＣＡＲとも称される。
【０１６１】
「生きた治療薬」の形態としてのＣＡＲ−Ｔ細胞に伴う主要な懸念の１つは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの操作性と、それらの免疫刺激性副作用の可能性である。ＣＡＲ−Ｔ療法をより良く制御し、望まない副作用を防止するために、オフスイッチ、安全性機構、および条件的制御機構を含む種々の特徴が工学的に作製されている。例えば、自己破壊性ＣＡＲ−Ｔ細胞と標示／タグ付ＣＡＲ−Ｔ細胞の両方は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞のクリアランスを促進する「オフスイッチ」を有するように、工学的に作製される。自己破壊性ＣＡＲ−Ｔは、ＣＡＲを含有するが、また、アポトーシス促進性自殺遺伝子、または外来性分子を投与すると誘発することの可能な「排除遺伝子」を発現するように、工学的に作製される。種々の自殺遺伝子がこの目的のために採用されることがあり、そのようなものとしては、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ）、Ｆａｓ、ｉＣａｓｐ９（誘導性カスパーゼ９）、ＣＤ２０、ＭＹＣ  ＴＡＧ、および切頭型ＥＧＦＲ（内皮成長因子受容体）が挙げられる。例えば、ＨＳＫは、プロドラッグであるガンシクロビル（ＧＣＶ）を、複製ＤＮＡ内にそれ自体を取り込むＧＣＶ三リン酸に変換して、最終的には細胞死に繋げるものとなる。ｉＣａｓｐ９は、ＦＫ５０６結合タンパク質の構成成分を含有するキメラタンパク質であり、ＦＫ５０６結合タンパク質は、小分子ＡＰ１９０３を結合し、カスパーゼ９の二量体化およびアポトーシスに導く。ところが、標示／タグ付ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲを有するもののまた、選択マーカーを発現するように工学的に作製される。この選択マーカーに対するｍＡｂの投与によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞のクリアランスが促進されるものとなる。切頭型ＥＧＦＲは、そのような抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂによる標的化の可能な抗原の１つであり、セツキシマブの投与は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の排除を促進するように動作する。これらの特徴を有するように作製されたＣＡＲは、「スイッチ可能なＣＡＲ」のｓＣＡＲ、および「調節可能なＣＡＲ」のＲＣＡＲとも称される。「安全性ＣＡＲ」は、「阻害性ＣＡＲ”（ｉＣＡＲ）」としても知られ、２つの抗原結合ドメインを発現するように工学的に作製される。これらの細胞外ドメインの１つは、腫瘍関連抗原に対し指向されており、細胞内共刺激および刺激ドメインに結合されている。しかし、第２の細胞外抗原結合ドメインは、正常組織に特異的であり、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、またはＣＤ４５などの細胞内チェックポイントドメインに結合されている。複数の細胞内阻害性ドメインをｉＣＡＲに組み込むことも可能である。これらの阻害性ドメインを与えうるいくつかの阻害性分子としては、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−１、ＣＤ１６０、ＰＩＨ、２Ｂ４、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、およびＴＧＦβ−Ｒが挙げられる。正常組織の存在下では、この第２の抗原結合ドメインの刺激は、ＣＡＲを阻害するように動作するものとなる。この二重抗原特異性があるために、ｉＣＡＲは二重特異性ＣＡＲ−Ｔ細胞の形態でもあることに留意するべきである。安全性ＣＡＲ−Ｔの工学は、腫瘍組織に対するＣＡＲ−Ｔ細胞の特異���を亢進し、標準的なＣＡＲでは標的外作用に繋がりかねない極めて低いレベルの腫瘍関連抗原を特定の正常組織が発現しうる状況では有利である（Ｍｏｒｇａｎ  ２０１０）。条件的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、細胞内共刺激ドメインと別の細胞内共刺激因子とに接続された細胞外抗原結合ドメインを発現する。共刺激ドメイン配列および刺激ドメイン配列は、外来性分子を投与すると、結果として生じるタンパク質が細胞内で一体となりＣＡＲ回路を完成させるように、工学的に作製される。このようにして、ＣＡＲ−Ｔの活性化は、調整が可能であり、特定の患者に「微調整」または個人仕様とさえできる可能性がある。二重ＣＡＲの設計と同様に、刺激ドメインおよび共刺激ドメインは、条件的ＣＡＲで不活性である際には物理的に隔てられている。この理由から、これらはまた、「分断ＣＡＲ」とも称される。
【０１６２】
実施形態によっては、これらの工学的に作製された特徴のうち２つ以上を組み合わせて、亢進された多機能性ＣＡＲ−Ｔを作製することがある。例えば、二重または条件的のどちらかのＣＡＲの設計を用いて、ＴＲＵＣＫのようにサイトカインも放出するＣＡＲ−Ｔ細胞を作製することが可能である。実施形態によっては、二重の条件的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、２つのＣＡＲを発現するように作ることができ、それらのＣＡＲは、２つの別個のがん抗原に対する２つの別々の抗原結合ドメインを有し、各ドメインはそれらのそれぞれの共刺激ドメインに結合する。共刺激ドメインは、活性化分子が投与された後に、刺激ドメインと共に機能的になってゆくのみとなる。このＣＡＲ−Ｔ細胞を有効にするためには、がんは両方のがん抗原を発現するものでなければならず、活性化分子が患者に投与されなければならない。それによりこの設計は、二重ＣＡＲ−Ｔ細胞と条件的ＣＡＲ−Ｔ細胞との両方の特徴を組み込んでいる。
【０１６３】
典型的には、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、α−βＴ細胞を用いて作製されるが、γ−δＴ細胞も使用されることがある。実施形態によっては、ＣＡＲ−Ｔ細胞を生成するのに用いられる、記載されたＣＡＲ構築物、ドメイン、および工学的に作製される特徴は、他のタイプのＣＡＲ発現免疫細胞を生成する際に同様に採用することができ、そのような免疫細胞としては、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、骨髄由来の貪食細胞、およびＮＫＴ細胞が挙げられる。あるいは、ＣＡＲ発現細胞は、Ｔ細胞とＮＫ細胞との両方の性質を有するように作製されることがある。追加的な実施形態では、ＣＡＲの形質導入は、自家性であっても同種異系であってよい。
【０１６４】
ＣＡＲ発現のためのいくつかの異なる方法が使用されることがあり、そのようなものとしては、レトロウイルス形質導入（γ−レトロウイルスを含む）、レンチウイルス形質導入、トランスポゾン／トランスポザーゼ（スリーピングビューティー系およびＰｉｇｇｙＢａｃ系）、ならびにメッセンジャーＲＮＡの移送により媒介される遺伝子発現が挙げられる。さらに、遺伝子編集（遺伝子挿入または遺伝子欠失／破壊）は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を工学的に作製する可能性について重要性が増しつつある。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）系、およびＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）系は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を生成しうる３つの潜在的な方法である。
【０１６５】
定義
用語「アミノ酸配列」とは、アミノ酸残基を表す略語、字、文字、または語の一覧を指す。本明細書に使用されるアミノ酸の略語は、従来のアミノ酸の一字コードであり、以下のように表現される：Ａ、アラニン；Ｂ、アスパラギンまたはアスパラギン酸；Ｃ、システイン；Ｄ  アスパラギン酸；Ｅ、グルタミン酸塩、グルタミン酸；Ｆ、フェニルアラニン；Ｇ、グリシン；Ｈ  ヒスチジン；Ｉ  イソロイシン；Ｋ、リジン；Ｌ、ロイシン；Ｍ、メチオニン；Ｎ、アスパラギン；Ｐ、プロリン；Ｑ、グルタミン；Ｒ、アルギニン；Ｓ、セリン；Ｔ、スレオニン；Ｖ、バリン；Ｗ、トリプトファン；Ｙ、チロシン；Ｚ、グルタミンまたはグルタミン酸。
【０１６６】
用語「抗体」とは、イムノグロブリン、特異的な結合能を維持するその誘導体、およびイムノグロブリン結合ドメインに相同なまたは大部分が相同な結合ドメインを有するタンパク質を指す。これらのタンパク質は、天然の供給源に由来することもあれば、部分的または全体的に合成により生産されることもある。抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよい。抗体は、任意の種由来の任意のイムノグロブリンクラスのメンバーであってよく、そのようなものとしては、任意のヒトのクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥが挙げられる。例示的な実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物に使用される抗体は、ＩｇＧクラスの誘導体である。無傷のイムノグロブリン分子に加えて、用語「抗体」にさらに含まれるのは、それらのイムノグロブリン分子の断片またはポリマー、および標的抗原を選択的に結合するイムノグロブリン分子のヒトバージョンまたはヒト化バージョンである。
【０１６７】
用語「抗体断片」とは、全長よりも小さな抗体の任意の誘導体を指す。例示的な実施形態では、抗体断片は、全長抗体の特異的な結合能のうち少なくとも重要な一部分を保持する。抗体断片の例としては、以下に限定されないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ断片、Ｆｃ断片、およびＦｄ断片が挙げられる。抗体断片は、任意の手段で産生されてよい。例として、抗体断片は、酵素的または化学的に、無傷の抗体を断片化することによって生産されてもよく、部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換えにより生産されてもよく、全体的または部分的に合成により生産されてもよい。抗体断片は、任意選択的に、単鎖の抗体断片であることがある。あるいは、断片は、例えばジスルフィド結合により、共に連結された複数の鎖を含むことがある。断片はまた、任意選択的に、多分子複合体であることがある。機能的な抗体断片は、典型的には少なくとも約５０アミノ酸を含むものとなり、さらに典型的には少なくとも約２００アミノ酸を含むものとなる。
【０１６８】
用語「抗原結合部位」とは、抗原上のエピトープを特異的に結合する抗体の領域を指す。
【０１６９】
用語「アプタマー」とは、特異的な標的分子に結合するオリゴ核酸分子またはペプチド分子を指す。これらの分子は、一般に、ランダム配列プールから選択される。選択されたアプタマーは、ユニークな三次構造を適応させ、高い親和性および特異性を伴い標的分子を認識することが可能である。「核酸アプタマー」は、その立体構造を介して標的分子に結合し、それによって当該分子の機能を阻害または抑制する、ＤＮＡまたはＲＮＡのオリゴ核酸である。核酸アプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその組合せによって構成されることがある。「ペプチドアプタマー」は、定常スキャフォールドタンパク質内に挿入された可変ペプチド配列を有する、コンビナトリアルなタンパク質分子である。ペプチドアプタマーの特定は、典型的には、ストリンジェントな酵母ジハイブリッド条件下で実施され、この条件により、選択されたペプチドアプタマーが細胞内の状況で安定的に発現されて正しく折り畳まれる確率が高まる。
【０１７０】
用語「担体」とは、化合物または組成物に組み合わせた際に、意図される使用または目的のための化合物または組成物の調製、保存、投与、送達、有効性、選択性、または任意の他の特徴を支援または促進する、化合物、組成物、物質、または構造を意味する。例えば、活性成分の任意の分解を最小限にするために、および対象における任意の有害な副作用を最小限にするために、担体を選択することができる。
【０１７１】
用語「キメラ分子」とは、生得の状態では別々に存在する２つ以上の分子を接合することによって作製される、単一の分子を指す。単一のキメラ分子は、全てのその成分分子の所望の機能性を有する。キメラ分子のタイプの１つは、融合タンパク質である。
【０１７２】
用語「工学的に作製された抗体」とは、少なくとも抗体の重鎖および／または軽鎖の可変ドメインに由来する抗原結合部位を含む抗体断片を含む、組換え分子を指し、任意選択的に、Ｉｇクラス（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＹ）のいずれかに由来する抗体の可変ドメインおよび／または定常ドメインの全体または一部を含むことがある。
【０１７３】
用語「エピトープ」とは、抗体が選好的におよび特異的に結合する抗原の領域を指す。モノクローナル抗体は、分子的に画定することのできる分子の単一の特異的なエピトープに、選好的に結合する。本発明では、複数のエピトープを、多特異性抗体によって認識することができる。
【０１７４】
用語「融合タンパク質」とは、一方のポリペプチドのアミノ末端と別のポリペプチドのカルボキシル末端との間に形成されるペプチド結合を介した２つ以上のポリペプチドの接合によって形成される、ポリペプチドを指す。融合タンパク質は、成分ポリペプチドの化学カップリングによって形成することができるか、または単一の連続した融合タンパク質をコードする核酸配列由来の単一のポリペプチドとして発現することができる。単鎖の融合タンパク質は、単一の連続したポリペプチド骨格を有する融合タンパク質である。融合タンパク質は、２つの遺伝子を単一の核酸内へインフレームで接合して、次いで、融合タンパク質を産生する条件下、適切な宿主細胞内で核酸を発現するための、分子生物学の従来の手法を用いて調製することができる。
【０１７５】
用語「Ｆａｂ断片」とは、酵素パパインによる抗体の切断によって生成される、抗原結合部位を含む抗体の断片を指し、上記酵素は、ヒンジ領域において、Ｈ鎖間ジスルフィド結合に対しＮ末端側で切断して、１つの抗体分子から２つのＦａｂ断片を生成する。
【０１７６】
用語「Ｆ（ａｂ’）２断片」とは、酵素ペプシンによる抗体分子の切断によって生成される、２つの抗原結合部位を含有する抗体の断片を指し、上記酵素は、ヒンジ領域において、Ｈ鎖間ジスルフィド結合に対しＣ末端側で切断する。
【０１７７】
用語「Ｆｃ断片」とは、その重鎖の定常ドメインを含む抗体の断片を指す。
【０１７８】
用語「Ｆｖ断片」とは、その重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む抗体の断片を指す。
【０１７９】
「遺伝子構築物」とは、ベクター、プラスミド、ウイルスゲノムなどの核酸を指し、この核酸は、ポリペプチドの「コード配列」を含むか、またはその他生物学的に活性のＲＮＡ（例えばアンチセンス、デコイ、リボザイムなど）に転写可能であり、細胞内に、例えばある特定の実施形態では哺乳動物細胞内に、トランスフェクトされることがあり、この構築物を用いてトランスフェクトされた細胞にコード配列の発現を引き起こすことがある。遺伝子構築物は、コード配列に動作可能に連結された１つまたは複数の調節因子、ならびにイントロン配列、ポリアデニル化部位、複製起点、マーカー遺伝子などを含むことがある。
【０１８０】
用語「同一性」とは、２つの核酸分子またはポリペプチドの間の配列同一性を指す。同一性は、比較の目的でアラインメントされうる各配列における位置を比較することによって決定することができる。比較された配列における位置が同じ塩基によって占められている場合は、分子はその位置で同一である。核酸配列またはアミノ酸配列の間の類似性または同一性の程度は、核酸配列により共有される位置で一致または合致しているヌクレオチドの数の関数である。様々なアラインメントアルゴリズムおよび／またはプログラムが、２つの配列の間の同一性を計算するために用いられることがあり、そのようなものとしてはＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴが挙げられ、それらは、ＧＣＧ配列解析パッケージ（ウィスコンシン大学、マディソン、ウィスコンシン州）の一部として利用可能であり、例えばデフォルト設定を用いて使用することができる。例えば、本明細書に記載される特異的なポリペプチドに少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有し、好ましくは実質的に同じ機能を発揮するポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが想定される。別段に標示のない限り、類似性スコアは、ＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づくものとなる。ＢＬＡＳＴＰが使用される場合、パーセント類似性は、ＢＬＡＳＴＰ陽性スコアに基づき、パーセント配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰの「同一性」とは、同一の高スコアの配列対における総残基の数と割合を示し；ＢＬＡＳＴＰの「陽性」とは、アラインメントスコアが正の値を有しており、互いに類似している残基の数と割合を示す。本明細書に開示されるアミノ酸配列に対しこれらの程度の同一性もしくは類似性、または任意の中間の程度の類似性の同一性を有するアミノ酸配列が、この開示によって想定および包含されている。類似のポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝コードを用いて推定され、従来の手段によって、具体的には遺伝コードを用いてそのアミノ酸配列を逆翻訳することによって、取得されることがある。
【０１８１】
用語「リンカー」は、当技術分野に認識されており、２つの化合物、例えば２つのポリペプチドを接続する分子または分子の基を指す。リンカーは、単一の連結分子から構成されていても、連結分子とスペーサー分子とを含んでいてもよく、スペーサー分子は、連結分子と化合物とを特定の距離により隔てることを意図される。
【０１８２】
用語「多価抗体」とは、１つを超える抗原認識部位を含む抗体または工学的に作製された抗体を指す。例えば、「二価の」抗体は、２つの抗原認識部位を有するのに対し、「四価の」抗体は、４つの抗原認識部位を有する。用語「単一特異性の」、「二重特異性の」、「三重特異性の」、「四重特異性の」などは、多価抗体に存在する異なる抗原認識部位の特異性の数を（抗原認識部位の数に対立するものとして）指す。例えば、「単一特異性の」抗体の抗原認識部位は全て、同じエピトープを結合する。「二重特異性の」抗体は、第１のエピトープを結合する少なくとも１つの抗原認識部位と、第１のエピトープとは異なる第２のエピトープを結合する少なくとも１つの抗原認識部位とを有する。「多価の単一特異性の」抗体は、全てが同じエピトープを結合する複数の抗原認識部位を有する。「多価の二重特異性の」抗体は、複数の抗原認識部位を有し、そのうち第１のエピトープを結合するものもあれば、第１のエピトープとは異なる第２のエピトープを結合するものもある。
【０１８３】
用語「核酸」とは、単一のヌクレオチド、または一方のヌクレオチドの３’位で別のヌクレオチドの５’端にリン酸基によって連結された２つ以上のヌクレオチドを含む、天然または合成の分子を指す。核酸は、長さにより限定されず、それゆえに核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含みうる。
【０１８４】
用語「に動作可能に連結された」とは、核酸と別の核酸配列との機能的な関係を指す。プロモーター、エンハンサー、転写終止部位および翻訳終止部位、ならびに他のシグナル配列は、他の配列に動作可能に連結された核酸配列の例である。例えば、転写制御因子へのＤＮＡの動作可能な連結とは、ＤＮＡとプロモーターとの間の物理的および機能的な関係を指し、それにより、そのようなＤＮＡの転写が、ＤＮＡを特異的に認識し結合し転写するＲＮＡポリメラーゼによって、プロモーターから開始される。
【０１８５】
用語「ペプチド」、「タンパク質」、および「ポリペプチド」は、一方のアミノ酸のカルボキシル基を別のもののアルファアミノ基に連結された２つ以上のアミノ酸を含む天然または合成の分子を指すために、互換的に使用される。
【０１８６】
用語「医薬的に許容可能な」とは、合理的なベネフィット／リスク比に相応して過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、健全な医学的判断の範囲内でヒトおよび動物の組織と接触させる際の使用に適した、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。
【０１８７】
具体的なポリペプチドを参照して使用される際の用語「ポリペプチド断片」または「断片」とは、参照ポリペプチド自体に比べてアミノ酸残基が欠失されているが、残りのアミノ酸配列が参照ポリペプチドのものに通常は同一である、ポリペプチドを指す。そのような欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に、あるいは両方に、発生することがある。断片は、典型的には、少なくとも約５、６、８、もしくは１０アミノ酸の長さであるか、少なくとも約１４アミノ酸の長さであるか、少なくとも約２０、３０、４０、または５０アミノ酸の長さであるか、少なくとも約７５アミノ酸の長さであるか、または少なくとも約１００、１５０、２００、３００、５００、またはそれを超えるアミノ酸の長さである。断片は、参照ポリペプチドの１つまたは複数の生物活性を保持することができる。様々な実施形態では、断片は、参照ポリペプチドの酵素活性および／または相互作用部位を含むことがある。別の実施形態では、断片は、免疫原性を有することがある。
【０１８８】
用語「タンパク質ドメイン」とは、構造的な完全性を示す、タンパク質の一部分、タンパク質の複数部分、またはタンパク質全体を指す。そして、この決定は、タンパク質の一部分、タンパク質の複数部分、またはタンパク質全体のアミノ酸組成に基づくことがある。
【０１８９】
用語「単鎖可変断片またはｓｃＦｖ」とは、重鎖ドメインと軽鎖ドメインとが連結されたＦｖ断片を指す。１つまたは複数のｓｃＦｖ断片が、他の抗体断片（例えば、重鎖または軽鎖の定常ドメイン）に連結されて、１つまたは複数の抗原認識部位を有する抗体構築物を形成することがある。
【０１９０】
本明細書に使用される際の「スペーサー」とは、融合タンパク質を含むタンパク質を接合するペプチドを指す。一般に、スペーサーは、タンパク質を接合するか、またタンパク質の間にいくらかの最低限の距離もしくはその他の空間的な関係を保つこと以外に、特有の生物活性を持たない。しかし、スペーサーの成分アミノ酸は、分子のいくらかの性質、例えば分子のフォールディング、正味電荷、または疎水性などに影響を与えるように、選択されることがある。
【０１９１】
本明細書に使用される際の用語「特異的に結合する」とは、ポリペプチド（抗体を含む）または受容体を参照する場合、不均一なタンパク質または他の生物学的物質の集団における当該タンパク質またはポリペプチドまたは受容体の存在の決定因である、結合反応を指す。そのため、指定された条件（例えば、抗体の場合の免疫アッセイ条件）下では、所定のリガンドまたは抗体は、試料中に存在する他のタンパク質、またはリガンドもしくは抗体が生体中で接触することがある他のタンパク質に、有意な量で結合しない際に、その具体的な「標的」に「特異的に結合する」（例えば、抗体は内皮抗原に特異的に結合する）。概して、第２の分子を「特異的に結合する」第１の分子は、その第２の分子との約１０５Ｍ−１を超える（例えば、１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、および１０１２Ｍ−１またはそれを超える）親和性定数（Ｋａ）を有する。
【０１９２】
本明細書に使用される際の用語「特異的に送達する」とは、具体的な標的分子またはマーカーを有する細胞または組織との分子の選好的な会合であって、その標的分子を欠いた細胞または組織とにはない会合を指す。勿論、分子と非標的の細胞または組織との間には、ある程度の非特異的な相互作用が発生する場合があることが認識される。しかしながら、特異的な送達は、標的分子の特異的な認識を通して媒介される際には区別されることがある。典型的には、特異的な送達の結果として、送達された分子と標的分子を有する細胞との間には、送達された分子とを標的分子を欠いた細胞との間よりもはるかに強力な会合が生じる。
【０１９３】
用語「対象」とは、投与または治療の標的である任意の個体を指す。対象は、脊椎動物、例えば哺乳動物とすることができる。そのため、対象は、ヒトまたは獣医学上の患者とすることができる。用語「患者」とは、臨床医学者、例えば医師の治療下にある対象を指す。
【０１９４】
用語「治療的に有効な」とは、疾患または障害の１つまたは複数の原因または症状を寛解させるのに十分な量の使用される組成物の量を指す。そのような寛解は、低減または変更を必要とするに過ぎず、必ずしも排除を必要とはしない。
【０１９５】
用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、核酸、例えば発現ベクターのレシピエント細胞内への導入を意味し、そのようなものとしては、前記細胞の染色体ＤＮＡへの核酸の導入が挙げられる。
【０１９６】
用語「治療」とは、疾患、病態、または障害を治癒、寛解、安定化、または予防することを意図されている、患者の医療的な管理を指す。この用語は、能動的な治療、すなわち、疾患、病態、または障害の改善を特に指向する治療を含み、また、原因治療、すなわち、関連の疾患、病態、または障害の原因の除去を指向する治療も含む。さらに、この用語は、対症治療、すなわち、疾患、病態、または障害の治癒というよりも症状の緩和のために設計された治療；予防治療、すなわち、関連の疾患、病態、または障害の発達を最小限にするかまたは部分的もしくは完全に阻害することを指向する治療；および支持療法、すなわち、関連の疾患、病態、または障害の改善を指向された別の特有の療法を補うために採用される治療を含む。
【０１９７】
用語「バリアント」とは、保存されたアミノ酸置換、保存されていないアミノ酸置換（すなわち縮重バリアント）、アミノ酸をコードする各コドン（すなわちＤＮＡおよびＲＮＡ）のゆらぎ位置内の置換、ペプチドのＣ末端に添加されたアミノ酸、または参照配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するペプチドを有する、アミノ酸またはペプチドの配列を指す。
【０１９８】
用語「ベクター」とは、ベクター配列が連結されている別の核酸を細胞内に輸送することができる、核酸配列を指す。用語「発現ベクター」は、細胞による発現に適した形態の（例えば、転写制御因子に連結された）遺伝子構築物を含有する任意のベクター（例えばプラスミド、コスミド、またはファージ染色体）を含む。
【０１９９】
数多くの本発明の実施形態が記載されてきた。しかしながら、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく様々な改変が行われうることが、認識されるものとなる。したがって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範疇にある。
【実施例】
【０２００】
実施例１：抗ＡＭＬ抗体のスクリーニング
免疫原または無関係の抗原を発現するＥＬ４マウスリンパ腫細胞を、抗ＡＭＬ抗体の結合についてスクリーニングした。図１に示されるように、ＥＬ４−空細胞、ＥＬ４−ＣＤ１２３細胞、およびＥＬ４−ＣＤ３３細胞を、９６ウェルプレートの各ウェル中で共にインキュベートした。さらに、抗ＣＤ１２３  ＰＥ抗体と、推定上の抗Ｃ３３反応性を有するハイブリドーマ抗体とを、培養に含めた。抗体と細胞とを共にインキュベートし、洗浄し、ラット抗マウスＩｇＧ  ＡＰＣで染色した。陽性結合をフローサイトメトリーにより抗ＣＤ３３／ＡＰＣ＋および抗ＣＤ１２３／ＰＥ−として明示した。
【０２０１】
図２に図示されるように、抗体および標的細胞に対するＣＡＲドッキングプラットフォームを発現するＪｕｒｋａｔ細胞を用いて、選ばれた抗体を二次の機能スクリーニングに供した。これらの抗体を、Ｔ細胞の活性化についてスクリーニングした。ＥＬ４の結合に基づき、２４クローンを選択した。ＥＬ４  ＣＤ３３（標的）およびＥＬ４−ＣＤ１２３（陰性対照）を、ｍＣＤ１６またはｍＣＤ３２とそのＮＦＫＢ／ＲＥ  ＧＦＰレポーターを有するＪｕｒｋａｔと共にインキュベートした。表７を参照されたい。
【０２０２】
【表７】
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【０２０３】
１×１０４個のＥＬ４−ＣＤ１２３細胞またはＥＬ４−ＣＤ３３細胞を、９６ウェルプレートのウェル内で培養した。推定上の抗ＡＭＬ抗体を含むハイブリドーマ上清を培地に添加した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ヒトの４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータにコンジュゲートされたＣＤ１６またはＣＤ３２のどちらかのＦｃ受容体を含むように改変した。さらに、これらのＪｕｒｋａｔ細胞は、ＮＦＫＢ応答性因子によって制御される導入遺伝子ＧＦＰを有する。ＥＬ４標的、ハイブリドーマ抗体、および１×１０４個のＪｕｒｋａｔ細胞を一晩インキュベートし、ＧＦＰのフローサイトメトリーによって抗体の連結およびＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の活性化を測定した（図３）。
【０２０４】
フローサイトメトリーによって、ＥＬ４  ＣＤ３３（標的）およびＣＤ１２３（陰性対照）、ならびに抗ＩｇＧ／ＡＰＣ抗体を用いて、同じ２４クローンをスクリーニングして（表８）結合を再検証した。結果について表９を参照されたい。
【０２０５】
【表８】
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【０２０６】
【表９】
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【０２０７】
ＥＬ４結合およびＪｕｒｋａｔ活性化のスクリーニングの後、６つのＣＤ３３クローンを選択した（表１０）。
【表１０】
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【０２０８】
図４Ａから図４Ｄは、６Ａ１１ＨＣ１＿ＬＣ（図４Ａ）、６Ａ１１ＨＣ２＿ＬＣ（図４Ｂ）、２７Ａ３ＨＣ＿ＬＣ１（図４Ｃ）、２７Ａ３ＨＣ＿ＬＣ２（図４Ｄ）、および２７Ａ３ＨＣ＿ＬＣ３（図４Ｅ）のＣＤ３３  ＣＡＲの線図である。
【０２０９】
実施例２：ＣＤ３３標的化ＣＡＲ−Ｔ細胞
ＣＤ３３標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞を、記載されるように生成した。簡単に述べれば、Ｔ細胞を、密度勾配遠心分離およびそれに続いてＴ細胞単離キット（幹細胞）によって単離し、組換えヒトＩＬ−２を含むＲＰＭＩ中で抗ＣＤ３ビーズおよび抗ＣＤ２８ビーズを用いて刺激した。Ｈ２９およびＲＤ１１４のパッケージング細胞から調製された抗ＣＤ３３  ＣＡＲレトロウイルスを用いて、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ被覆プレート上で、活性化Ｔ細胞を形質導入した。およそ７日後にＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞をビーズから脱離し、実験に使用する前に遺伝子移入について評価した。モック形質導入Ｔ細胞（ＵＮ）を対照として使用した。
【０２１０】
図５は、Ｔ細胞サブセットへのＣＤ３３遺伝子移入を示す棒グラフである。遺伝子移入を、生きたＴ細胞上のＣＤ３＋およびｍｃｈｅｒｒｙ＋の％として評価した。ビーズ脱離後、Ｔ細胞をＣＤ３、ＣＤ８、およびＣＤ４（モノクローナル抗体で染色し、フローサイトメーターを用いることにより解析した。
【０２１１】
図６は、ＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性アッセイの結果を示すグラフである。活性化されたＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞またはモック形質導入Ｔ細胞を、標的ＣＨＯ  ＣＤ３３細胞と共培養し、細胞傷害性をリアルタイム細胞分析システムで測定した。２連のウェルについて経時的な正規化された細胞の指標の平均として、データを提示する。ＣＤ３３  ＣＨＯ細胞を１６時間、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  Ｅプレートに接着させた。ＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞または活性化されたモック形質導入Ｔ細胞を、Ｅプレートのウェルに、標的細胞と共にＥ：Ｔ比１０：１で６日間添加した。所与の時点での細胞の指標をＴ細胞添加の１日後の正規化時点での細胞の指標により除算したものとして、正規化された細胞指標を計算した。
【０２１２】
図７は、ＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を示すグラフである。活性化されたＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞または非形質導入Ｔ細胞を、標的ＣＨＯ  ＣＤ３３細胞と共培養した。標示された日にＣＡＲ  Ｔ細胞を計数した。
【０２１３】
図８Ａから図８Ｃは、ＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞のサイトカイン産生を示す棒グラフである。ＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞またはモック形質導入Ｔ細胞を、標的ＣＨＯ  ＣＤ３３細胞と２４時間共培養した。上清を採集し、Ｌｕｍｉｎｅｘを介してサイトカインＩＦＮ−γ（図８Ａ）、ＴＮＦ−α（図８Ｂ）、およびＩＬ−６（図８Ｃ）を分析した。
【０２１４】
別段に定義のない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、開示される発明の属する分野の当業者が通例理解するものと同じ意味を有する。本明細書に引用された刊行物およびそれらに引用された資料は、参照により具体的に組み込まれる。
【０２１５】
当業者は、定例の実験作業を超えない手段で、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の数多くの等価物を認識するか、または確認することができるものとなる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることを意図されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
2020530768.tif 000111
【図７】
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【図８Ａ】
2020530768.tif 000113
【図８Ｂ】
2020530768.tif 000114
【図８Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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