(57)【要約】本発明は、とりわけ、ミトコンドリア機能障害及び／またはタンパク質凝集に関連する、及び／またはＣＸＣＲ４活性化により改善される、神経疾患及び神経損傷から選択される状態の治療または予防に使用するための、ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームであるタンパク質またはその機能的断片に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリア機能障害及び／またはタンパク質凝集に関連する、及び／またはＣＸＣＲ４活性化により改善される、神経疾患及び神経損傷から選択される状態の治療または予防に使用するための、ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームであるタンパク質またはその機能的断片。
【請求項２】
配列番号１の２２９位に対応する位置にバリン、配列番号１の２８１位に対応する位置にスレオニン、配列番号１の４８８位に対応する位置にフェニルアラニン、及び配列番号１の４９４位に対応する位置にスレオニンを含む、配列番号１に対して８５％の配列同一性を有するタンパク質を含み、配列番号１のタンパク質と機能的に同等であるか、またはその機能的断片である、請求項１に記載の使用のためのタンパク質。
【請求項３】
配列番号１の配列を有するタンパク質を含むか、またはその機能的断片である、請求項２に記載の使用のためのタンパク質。
【請求項４】
配列番号１の配列を有するタンパク質を含むか、またはその機能的断片であり、前記その断片が、配列番号１のアミノ酸７５〜４９４の範囲のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、特に、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ＳＣＡ１７、フリードライヒ運動失調症、ダウン症候群、ウォルフラム症候群、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作、シャルコー・マリー・トゥース２Ａ、クロイツフェルト・ヤコブ病またはプリオン病及び脊髄性筋萎縮症から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のためのタンパク質。
【請求項６】
前記状態が、ダウン症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び脊髄小脳失調症、好ましくはハンチントン病から選択される、請求項５に記載の使用のためのタンパク質。
【請求項７】
脊髄損傷の治療または予防における請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のためのタンパク質。
【請求項８】
ミトコンドリア機能障害及び／またはタンパク質凝集に関連する、及び／またはＣＸＣＲ４活性化により改善される、神経疾患及び神経損傷から選択される状態の治療または予防に使用するための、請求項１〜７のいずれか１項で定義されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２に対して８５％の配列同一性を有する配列を含み、前記コードされるタンパク質が、配列番号１のタンパク質と機能的に同等である、請求項８に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２に対して８５％の配列同一性を有する配列を含み、前記コードされるタンパク質が、配列番号１のタンパク質と機能的に同等である、請求項９に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号２の配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項９または請求項１０に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、特に、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ＳＣＡ１７、フリードライヒ運動失調症、ダウン症候群、ウォルフラム症候群、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作、シャルコー・マリー・トゥース２Ａ、クロイツフェルト・ヤコブ病またはプリオン病及び脊髄性筋萎縮症から選択される、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記状態が、ダウン症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び脊髄小脳失調症、好ましくはハンチントン病から選択される、請求項１２に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
【請求項１４】
脊髄損傷の治療または予防における、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の使用のためのポリヌクレオチド。
【請求項１５】
ミトコンドリア機能障害及び／またはタンパク質凝集に関連する、及び／またはＣＸＣＲ４活性化により改善される、神経疾患及び神経損傷から選択される状態の治療または予防に使用するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームであるタンパク質またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２に対して８５％の配列同一性を有する配列を含み、前記コードされるタンパク質が、配列番号１のタンパク質と機能的に同等である、請求項１５に記載の使用のためのベクター。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２に対して８５％の配列同一性を有する配列を含み、前記コードされるタンパク質が、配列番号１のタンパク質と機能的に同等である、請求項１６に記載の使用のためのベクター。
【請求項１８】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２の配列を含む、請求項１６または請求項１７に記載の使用のためのベクター。
【請求項１９】
前記状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、特に、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ＳＣＡ１７、フリードライヒ運動失調症、ダウン症候群、ウォルフラム症候群、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作、シャルコー・マリー・トゥース２Ａ、クロイツフェルト・ヤコブ病またはプリオン病及び脊髄性筋萎縮症から選択される、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の使用のためのベクター。
【請求項２０】
前記状態が、ダウン症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び脊髄小脳失調症、好ましくはハンチントン病から選択される、請求項１９に記載の使用のためのベクター。
【請求項２１】
脊髄損傷の治療または予防における、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の使用のためのベクター。
【請求項２２】
前記ベクターが、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、パルボウイルスベクター、及びレンチウイルスベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルスベクターから選択される、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の使用のためのベクター。
【請求項２３】
前記ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９、好ましくはＡＡＶ９から選択されるアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項２２に記載の使用のためのベクター。
【請求項２４】
ミトコンドリア機能障害及び／またはタンパク質凝集に関連する、及び／またはＣＸＣＲ４活性化により改善される、神経疾患及び神経損傷から選択される状態の治療または予防の方法であって、有効量の、ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームであるタンパク質またはその機能的断片を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２５】
ミトコンドリア機能障害及び／またはタンパク質凝集に関連する、及び／またはＣＸＣＲ４活性化により改善される、神経疾患及び神経損傷から選択される状態の治療または予防の方法であって、有効量の、ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームであるタンパク質またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２６】
ミトコンドリア機能障害及び／またはタンパク質凝集に関連する、及び／またはＣＸＣＲ４活性化により改善される、神経疾患及び神経損傷から選択される状態の治療または予防の方法であって、有効量の、ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームであるタンパク質またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、殺菌性／透過性増強タンパク質ファミリーＢ、メンバー４（ＢＰＩＦＢ４）タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームの新規な治療用途、特に、ミトコンドリア機能障害及び／またはタンパク質凝集に関連する、及び／またはＣＸＣＲ４活性化により改善される、神経疾患及び神経損傷から選択される状態の治療または予防に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者らは、細胞及び生物の恒常性にとって重要なプロセスに関与するマルチタスクタンパク質であり、ｅＮＯＳの調節におけるその役割が、ＶＴＦＴアイソフォーム（優勢なＩＮＬＩアイソフォーム（「野生型」）及びまれなＩＮＦＴアイソフォームと比較して、並外れた長寿命に関連していることが判明している遺伝的バリアント）によって強化される、ＢＰＩＦＢ４タンパク質の長寿命関連バリアントについて以前に報告した。Ｖｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）及びＷＯ２０１４１０２３４３（その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【０００３】
ＷＯ２０１４１０２３４３では、ＢＰＩＦＢ４のＶＴＦＴアイソフォームには様々な治療用途があることが教示される。Ｖｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）では、遺伝子治療ベクターの動脈内投与後、タンパク質が、例えば脳、大腿骨骨髄、脂肪組織、及び肝臓を含む、体内に広がることができることが示される。
【０００４】
ミトコンドリアは、動物及び高等植物の全ての真核細胞の細胞質に存在する。それらは非常に動的な細胞小器官であり、酸化的リン酸化、エネルギー産生、中間代謝、カルシウム緩衝、活性酸素種の生成及び解毒、ならびにアポトーシスの調節を含む必須の細胞機能に重要な多くの機能を果たす。
【０００５】
脳は高代謝性組織であり、心拍出量の１５％を受け取り、全身の酸素消費量の２０％を占める。このエネルギー所要量は、活動電位の生成に重要である細胞膜全体のイオン勾配を維持するためのニューロンのエネルギー需要によって大きく左右される。この強力なエネルギー所要量は連続的であり、短時間の酸素またはグルコース欠乏でも神経細胞死を引き起こす。
【０００６】
ニューロンの解糖能が限られていることから、ニューロンは、そのエネルギー需要に対して好気性酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）に強く依存するため、ミトコンドリアはニューロン機能に不可欠である（Ｐ．Ｇ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００９））。しかしながら、ＯＸＰＨＯＳは、通常の細胞呼吸の産物である過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ヒドロキシル（．ＯＨ）、及びスーパーオキシド（Ｏ２．−）ラジカルを含む、毒性の内因性フリーラジカルの主要な発生源である。
【０００７】
活性酸素種（ＲＯＳ）及び活性窒素種（ＲＮＳ）は、生物系にとって有害または有益であり得ることはよく認識されている。活性種の有益な効果は、低／中程度の濃度で発生し、有害物質に対する細胞応答における生理学的役割を伴う。生成されたフリーラジカル種の量が、それらを中和する細胞の能力を圧倒すると酸化ストレスが発生し、その後ミトコンドリア機能障害及び細胞損傷が生じる。
【０００８】
ミトコンドリアによって生成された活性種は、ミトコンドリアの成分自体（脂質、タンパク質、及びＤＮＡ）を含むいくつかの細胞標的を有する。ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）のヒストンの欠如、及びＤＮＡ修復能力の低下により、ミトコンドリアは酸化ストレス事象の脆弱な標的となる。
【０００９】
多数の証拠が、ミトコンドリアが加齢性神経疾患及び神経損傷において中心的な役割を有することを示唆する。
Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体４型（ＣＸＣＲ４）は、リガンド間質由来因子−１（ＳＤＦ−１、ＣＸＣＬ１２とも呼ばれる）のＧ共役受容体である。ＣＸＣＲ４のそのケモカインリガンドによる活性化は、内在性神経幹細胞の移動及び分化を含む、中枢神経系の様々な機能を調節する（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，（２００７））。ＣＸＣＲ４の細胞内発現レベルは正常組織では非常に低かったが、損傷したニューロンでは著しく増加する。ＡＭＤ３１００によるＣＸＣＲ４の阻害は、β−カテニンシグナル伝達経路を標的とすることにより損傷修復プロセスを低下させる（Ｊ−Ｍ．Ｌｉｕ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１７））。
【００１０】
ＣＸＣＲ４は、細胞骨格及びミトコンドリアの活性を調節し、双方が互いに影響を及ぼす、及びタンパク質が凝集するように密接に相互接続する（Ｂｏｌｄｏｇｈ．Ｉ．Ｒ．，Ｐｏｎ．Ｌ．Ａ．（２００６））。現在、タンパク質の恒常性の欠如が、多くの疾患の重要な共通点であることは明らかである（Ａ．Ｌ．Ｆｉｎｋ．，（１９９８））。タンパク質の恒常性は、ほとんどの場合、翻訳、タンパク質のフォールディング、及びタンパク質安定性などの高エネルギーを必要とするプロセスをサポートする利用可能エネルギーに依存しており、タンパク質凝集と高い相関がある。ミトコンドリア機能の障害はまた、過剰なタンパク質凝集をもたらし、その結果、細胞損傷をもたらす。したがって、ミトコンドリアは、さらに、ミスフォールドタンパク質または凝集したタンパク質の蓄積を制御（または場合によっては排除）することにより、細胞の健康を維持し、病理を緩和する上で重要な役割を果たすと考えられている。
【００１１】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、高齢者の認知症の主要な原因である。蓄積された証拠は、ミトコンドリア異常及び酸化的損傷がＡＤの初期事象であることを示す。酸化ストレスがＡＤの病態生理の初期事象であるという、疾患の動物モデルで収集された証拠（例えば、Ｍ．Ｍａｎｃｚａｋ，ｅｔ  ａｌ．，（２００６）を参照のこと）に加えて、死後のＡＤ脳及び線維芽細胞の観察が、３つのトリカルボン酸回路（ＴＣＡ）複合体、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、及びα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性障害の証拠を示す（Ｐ．Ｂｕｂｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（２００５））。同様に、複合体Ｉ、ＩＩＩ及びＩＶの呼吸鎖活性の低下は、ＡＤ患者及び死後脳組織の血小板及びリンパ球に見られる（Ｊ．Ｖａｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００６））。
【００１２】
パーキンソン病（ＰＤ）は、黒質の緻密部のドーパミン作動性ニューロンの変性及び死ならびにレビー小体の存在を特徴とする。黒質のドーパミン作動性ニューロンは、随意運動を制御する経路で作動する、すなわち、その死により運動が調整できなくなる。酸化ストレス及びミトコンドリア機能障害がＰＤのドーパミン作動性ニューロンの変性に関連していることは、十分に確立されている。
【００１３】
蓄積された証拠は、ＰＤ関連遺伝子が直接的または間接的にミトコンドリアの完全性に影響し、それにより孤発性ＰＤで観察される病態生理学的変化へ関連づけられることを示す。ミトコンドリアは、ＰＤの発症機序において、α−シヌクレインの直接的な標的の１つであることが実証された（Ｌ．Ｄｅｖｉ，ｅｔ  ａｌ．，（２００８））。α−シヌクレインは、線条体のミトコンドリア及びＰＤ患者の黒質に蓄積し、ミトコンドリア複合体Ｉの活性を損ない、酸化ストレスを引き起こす。さらに、動物モデルでパーキンソニズムを誘発するために一般的に使用される神経毒素１−メチル−４−フェニルピリジウム（ＭＰＰ＋）は、ミトコンドリア複合体Ｉを阻害し、フリーラジカルを生成する。ミトコンドリアの変化は、細胞の酸化状態の不均衡を引き起こし、プロテアソームの調節解除を誘導する。これはタンパク質の凝集を悪化させ、結果として変性事象をもたらす可能性がある。
【００１４】
ハンチントン病（ＨＤ）は、ハンチントン（Ｈｔｔ）タンパク質のポリグルタミンリピートが異常に伸長することにより引き起こされる常染色体優性疾患であり、線条体及び皮質のニューロンの変性を引き起こす。多くの研究は、ミトコンドリア機能障害がＨＤの発症機序の中心であることを示す。複合体ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶの活性の低下はＨＤ患者の尾状核及び被殻で観察され、初期ＨＤ患者の線条体の酸素利用と比較してグルコース利用が増加する。チェン及び共同研究者（Ｃ．Ｍ．Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００７））は、ＨＤ患者の末梢血にミトコンドリア異常及び酸化的損傷も観察した。さらに、Ｌｉｍ及び同僚（Ｄ．Ｌｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，（２００８））は、変異体Ｈｔｔ発現がＰＴＰの開口及びミトコンドリアのＣａ２＋恒常性の破壊を誘発したことを報告した。変異体Ｈｔｔを発現する細胞から単離されたミトコンドリアでも同様の結果が得られ、このことはミトコンドリア機能障害がＨＤの発症機序において中心的な役割を果たすことを示唆している。
【００１５】
近年、ｍｔＤＮＡ損傷は、ＨＤ関連神経変性の初期のバイオマーカーであることが示唆され、このことはｍｔＤＮＡの損傷がＨＤで観察される発症原因となり得るという仮説を支持する。Ｏｒｒ及び同僚（Ａ．Ｌ．Ｏｒｒ，ｅｔ  ａｌ．，（２００８））は、特定のＮ末端変異体Ｈｔｔ断片が、凝集体を形成する前に、ミトコンドリア機能を直接損なうことを報告した。
【００１６】
ＡＬＳは、最も一般的な成人発症の運動ニューロン疾患であり、衰弱、麻痺、及びその後の死をもたらす。症例の９０％は孤発性であり、症例の１０％は家族性である。ＡＬＳの家族性症例の２０％では、運動ニューロンの損失は、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）遺伝子の突然変異に関連している。変異体ＳＯＤ１は、活性の損失ではなく機能の獲得を通じて有害な効果を発揮することが示されている。さらに、運動ニューロン内の変異体ＳＯＤ１の存在は、特にミトコンドリア複合体ＩＩ及びＩＶにおいて、ミトコンドリア呼吸鎖の変化を引き起こす。最近の研究では、ＳＯＤ１がミトコンドリアの脆弱性を高め、ＡＬＳのマウスモデルであるＳＯＤ１Ｇ９３ＡマウスのＣａ２＋恒常性を乱すことも示されている（Ｍ．Ｋ．Ｊａｉｓｗａｌ，Ｂ．Ｕ．Ｋｅｌｌｅｒ，（２００９））。さらに、アストロサイトを保持するＳＯＤ１Ｇ９３Ａのミトコンドリア機能障害は、運動ニューロンの変性を促進し、この効果はミトコンドリアを標的とする抗酸化剤によって阻止されていることが報告された。
【００１７】
ミトコンドリアの異常な構造及び数、ならびにＡＬＳ運動ニューロン及び骨格筋のミトコンドリア機能障害の証拠がある。これは、ＡＬＳ患者の脊髄及び運動皮質における呼吸鎖酵素活性の変化及びＣＮＳエネルギー代謝低下の発見によって裏付けられている。
【００１８】
脊髄小脳性運動失調（ＳＣＡ）は、多くの場合、手、会話、及び眼球運動の協調不良と関連する歩行協調のゆっくりとした進行性喪失を特徴とする遺伝性障害群の１つである。高頻度で、小脳の萎縮が発生する。
【００１９】
ＳＣＡ−１、ＳＣＡ−２、ＳＣＡ−３／マシャド・ジョセフ病（ＭＪＤ）、ＳＣＡ−６、ＳＣＡ−７、及びＳＣＡ−１７は、変異遺伝子のコーディング領域での病的なシトシン−アデニン−グアニン（ＣＡＧ）トリヌクレオチドリピート伸長（翻訳されたタンパク質には、異常に長いポリグルタミンストレッチが含まれている）によって引き起こされる「ポリグルタミン病」として分類される。それらの臨床的及び遺伝的不均一性にもかかわらず、脳の運動失調の原因となる損傷は、小脳皮質、歯状核、及び下オリーブ核の間の相互回路として定義される「小脳モジュール」に常に影響を与える。ポリグルタミン含有核内及び細胞質封入体の特定の役割は調査中であるが、タンパク質凝集は、それ以外はむしろ不均一な障害の発症機序における一般的なステップであり得る（Ｋｏｅｐｐｅｎ，Ａ．Ｈ．（２００５））。
【００２０】
脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）は、遍在的に発現するアタキシン−１タンパク質内の不安定なポリグルタミンの伸長により、プルキンエ細胞（ＰＣ）の早期変性を引き起こし、運動協調性を低下させ、診断から１０〜１５年以内の死を招く。現在、疾患の進行を遅らせるために利用可能な治療法はない。Ｓｃａ１１５４Ｑ／２Ｑマウスの症候性段階でのプロテオームプロファイリングにより、ミトコンドリアタンパク質における顕著な変化が明らかとなり、ミトコンドリアの形態における年齢依存性の変化が、電子伝達鎖複合体（ＥＴＣ）の障害及びＡＴＰアーゼ活性の低下と共に観察された。驚いたことに、ミトコンドリアを標的とした抗酸化剤ＭｉｔｏＱ処置により、発症前及び症状が明らかな場合の両方で、ミトコンドリアの形態が改善し、Ｓｃａ１１５４Ｑ／２ＱマウスのＥＴＣ複合体の活性が回復した。注目すべきは、ＭｉｔｏＱは、運動協調性の欠如などのＳＣＡ１関連神経病変の出現を遅くし、酸化ストレスによるＤＮＡ損傷を防ぐ（Ｆｅｒｒｏ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１７））。
【００２１】
フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）は、神経系及び筋肉のゆっくりとした進行性障害であり、随意筋運動を調整できなくなる（運動失調）。この状態は、脊髄の神経組織の変性、ならびに腕及び脚などの末梢領域に及ぶ神経の変性によって引き起こされる。ＦＡでは、９番染色体上の遺伝子に欠陥がある。この欠陥のために変化する対応するタンパク質は、フラタキシンと呼ばれ、減少した量で産生される。フラタキシンはミトコンドリアに含まれている。フラタキシンレベルが低い場合、細胞（特に脳、脊髄、及び筋肉細胞）は、エネルギーを適切に産生できず、有毒な副産物の蓄積が「酸化ストレス」を引き起こし、細胞を破壊する可能性がある（Ｓａｎｔｏｓ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｄａ．ｏｒｇ／ｄｉｓｅａｓｅ／ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈｓ−ａｔａｘｉａ／ｃａｕｓｅｓ−ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ、２０１７年８月１４日にアクセス）。
【００２２】
ダウン症候群（ＤＳ）は、低い筋緊張、低身長、吊り上がった目、及び手のひらの中心を横切る単一の深いしわを特徴とする。ＤＳ関連神経変性は、認知症へのＤＳの進行及びアルツハイマー病（ＡＤ）の臨床経過を連想させるアミロイド斑により、ＡＤの臨床経過と似ている。超微細構造異常及び生化学的異常は、ヒトＤＳ患者及びトリソミー１６（Ｔｓ１６）マウスのミトコンドリアで報告された。まとめると、ミトコンドリア機能のｉｎ  ｖｉｖｏ変化は、ＤＳの表現型の特徴としての酸化促進状態と一致している（Ｐａｇａｎｏ，Ｃａｓｔｅｌｌｏ，（２０１２））。
【００２３】
ウォルフラム症候群（ＷＳ）は、遺伝性障害である。脳の異常は、臨床症状の初期段階で発生し、ウォルフラム症候群が初期の脳の発達に顕著な影響を及ぼしていることを示唆する。ＷＳの臨床症状は、ミトコンドリア病の症状に似ており、ミトコンドリアの強い関与を示唆する（Ｃａｇａｌｉｎｅｃ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１６））。遺伝子ＷＦＳ１の欠損は、ＥＲストレスカスケードを引き起こし、これはＩＰ３受容体カルシウムチャネルの機能を損ない、カルシウム恒常性を変化させる。後者は、増強したマイトファジー（ミトコンドリアの選択的分解）を特徴とするミトコンドリアのダイナミクスの調節異常を引き起こし、ミトコンドリアの輸送及び融合を阻害し、これによりＡＴＰレベルが低下し、ニューロンの発達が阻害される。
【００２４】
ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作（ＭＥＬＡＳ）症候群は、最も頻繁に発生する母系遺伝性ミトコンドリア障害の１つである。この症候群はミトコンドリアＤＮＡの多くの点突然変異に関連しており、突然変異の８０％超がミトコンドリア転移ＲＮＡ（Ｌｅｕ（ＵＵＲ））［ｔＲＮＡ（Ｌｅｕ）（（ＵＵＲ））］遺伝子のジヒドロウリジンループで発生する。疾患の病態生理は完全には理解されていないが、この疾患の一因となるいくつかの異なるメカニズムが提案されている。これらにはミトコンドリアｔＲＮＡのアミノアシル化の減少が含まれ、これはミトコンドリアタンパク質合成の低下、カルシウム恒常性の変化、及び一酸化窒素代謝の変化をもたらす（Ｓｃａｇｌｉａ  Ｆ，Ｎｏｒｔｈｒｏｐ  ＪＬ．（２００６））。
【００２５】
シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）は、末梢神経に影響を与える障害群から構成される。ＣＭＴの最も一般的な軸索型であるＣＭＴ２Ａは、ミトコンドリア融合に関連するタンパク質であるミトフシン２の突然変異によって引き起こされる。ＣＭＴの治療法はないが、理学療法、作業療法、装具、他の整形外科用デバイス、そしてさらには整形外科手術も、この疾患の障害を引き起こす症状の対処に役立てることができる。
【００２６】
クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）またはプリオン病は、プリオンタンパク質として知られる細胞性糖タンパク質の異常なアイソフォームによって引き起こされる急速に進行する致命的な神経変性障害である。ほとんどのＣＪＤ患者では、脳脊髄液中の１４−３−３タンパク質の存在及び／または典型的な脳波（ＥＥＧ）パターン（両方ともＣＪＤの診断と見なされている）が報告されている。しかしながら、ＣＪＤの確定診断には、生検または剖検のいずれかで得られた脳組織の神経病理学的検査及び／または免疫診断検査が必要である。細胞骨格及びミトコンドリアは、プリオン病では機能障害である（Ｇｒｅｎｉｅｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（２００６））。実際、生細胞におけるプリオンタンパク質のトランスフェクションはアグリソームを生成し、中間径フィラメント及びミトコンドリアネットワークの主要な再編成を誘導した。
【００２７】
脊髄損傷（ＳＣＩ）は、神経系、血管系、免疫系に影響を与える。ＳＣＩは、患者の感覚神経、運動神経、自律神経の機能障害を引き起こす可能性がある。ＳＣＩの治療は、いくつかの二次的側面のみを改善できる一方で、脊髄細胞の損傷により患者の神経機能は回復できない。ＣＸＣＲ４の細胞内発現レベルは、健康なニューロンと比較して損傷したニューロンで著しく増加する。研究では、内在性神経幹細胞の増殖、移動、及び分化が、損傷した脊髄で検出されたことが見出されているが、このプロセスは限定的であり、神経機能を持つ神経細胞に分化できる幹細胞はごく少数である。したがって、ＣＸＣＲ４活性化によるＳＣＩ後の神経細胞の再生の促進は患者にとって重要である（Ｔｙｓｓｅｌｉｎｇ，Ｖ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（２０１１））。
【００２８】
種々の神経疾患には、例えばＡＤ、ＨＤ、ＳＣＡ、ＦＡなどのトリヌクレオチドリピート伸長疾患、プリオン病などのタンパク質凝集が含まれる（Ａ．Ｌ．Ｆｉｎｋ．，（１９９８））。したがって、可能な治療戦略は、ミトコンドリア機能の改善及びタンパク質凝集の減少を目的としている。
【００２９】
ミトコンドリア機能障害を特徴とする疾患の進行中の治療戦略は、ミトコンドリア機能障害に関連する損傷の主な原因であるミトコンドリアによるＲＯＳの過剰産生に対抗することに主に焦点を当てている。細胞エネルギー産生に関与し、いくつかの代謝酵素の補因子として作用する代謝抗酸化剤には、クレアチン、α−リポ酸、Ｎ−アセチル−カルニチン、及び補酵素Ｑ１０が含まれる。しかしながら、代謝抗酸化剤は、臨床試験で期待に反する結果を示している。
【００３０】
神経疾患及び神経損傷、ならびにミトコンドリア機能障害を特徴とする他の疾患の治療における抗酸化剤療法の主な制限は、ミトコンドリア内の抗酸化レベルを高めることができないことである。したがって、障害の進行を防ぎ、患者の生活の質を向上させる新たな治療法が必要とされている。
【００３１】
驚いたことに、本発明者らは、ＶＴＦＴ−ＢＰＩＦＢ４が、神経疾患及び神経損傷に関与する経路に関して、これまで説明されていなかった複数のレベルで作用することを発見した。本発明者らは、ＶＴＦＴ−ＢＰＩＦＢ４が、ミトコンドリア機能のエンハンサーとして、及び病的状態におけるタンパク質凝集のリデューサーとしての活性を有することを発見した。本発明者らはまた、ＶＴＦＴ−ＢＰＩＦＢ４の治療効果がＣＸＣＲ４を介して媒介され、ＶＴＦＴ−ＢＰＩＦＢ４がＣＸＣＲ４の活性化因子であると考えられることも発見した。タンパク質またはタンパク質をコードするベクターは、経口または非経口投与後に  ｉｎ  ｖｉｖｏで活性があるようである。
【発明の概要】
【００３２】
したがって、本発明は、ミトコンドリア機能障害及び／またはタンパク質凝集に関連する、及び／またはＣＸＣＲ４活性化により改善される、神経疾患及び神経損傷から選択される状態の治療または予防に使用するための、ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームであるタンパク質またはその機能的断片、該タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチド、及びベクターを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】酸素消費速度分析  図１Ａは、空のＡＡＶベクター（「ＥＶ」）またはＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するベクター（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ）プロファイリングである。図１Ｂは、空のＡＡＶベクターまたはＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するベクターをトランスフェクトした細胞の基本的な酸素消費速度を示すグラフである。図１Ｃは、空のＡＡＶベクターまたはＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するベクターをトランスフェクトした細胞の、ＡＴＰ関連酸素消費速度（基礎速度から、ＡＴＰブロッカーであるオリゴマイシンの添加後に測定された速度を引いたもの）を示すグラフである。
【図２】細胞外酸性化速度分析  図２Ａは、空のＡＡＶベクター（「ＥＶ」）またはＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するベクター（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）プロファイリングである。図２Ｂは、空のＡＡＶベクターまたはＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するベクターをトランスフェクトした細胞のＥＣＡＲの基礎速度を示すグラフである。図２Ｃは、空のＡＡＶベクターまたはＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するベクターをトランスフェクトした細胞の、最大解糖と解糖系阻害剤２ＤＧによる処置の差として評価された解糖細胞能力を示すグラフである。
【図３】ミトコンドリアの平均体積評価。ヒストグラムは、処置されていない（ＮＴ）、またはＩＮＬＩ−ｈＢＰＩＦＢ４（「ｈＢＰＩＦＢ４」）もしくはＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）精製組換えタンパク質で処置された、ヒト胎児線維芽細胞Ｃ１−Ｂｉｏ  ８６のミトコンドリア平均体積を示す。
【図４Ａ】ＶＴＦＴ−ＢＰＩＦＢ４の過剰発現により、ハンチントン病の進行が停止し、Ｒ６／２マウスの変異Ｈｔｔ凝集体面積が減少する。図４Ａは、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクター（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）またはＧＦＰを保持するベクター（「ビヒクル」）を投与したマウス（野生型（「ＷＴ」）またはＲ６／２）のマウスクラスピング表現型である。図４Ｂ及び図４Ｃは、未処置のＲ６／２マウス、ならびに年齢及び性別を一致させた野生型（ＷＴ）同腹仔の運動能力の水平ラダータスク分析及びロータロッド分析である。マウスを、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクター（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）、ＩＮＬＩ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するベクター（「ｈＢＰＩＦＢ４」）またはＧＦＰを保持するベクター（「ビヒクル」）で処置した。各データポイントは、各群６〜９匹のマウスの平均能力±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクターを注射したマウス対ＧＦＰを保持するベクターを注射したマウス）。§§§§ｐ＜０．０００１（ＧＦＰを保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス対ＧＦＰを保持するベクターを注射したＲ６／２マウス）。＃ｐ＜０．０５；＃＃ｐ＜０．００１（ＧＦＰを保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス対ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４を保持するベクターを注射したＲ６／２マウス）。＠＠ｐ＜０．００１（ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４を保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス対ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４を保持するベクターを注射したＲ６／２マウス）。図４Ｄは、全ての群のマウスの体重である。マウスを、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクター（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）またはＧＦＰを保持するベクター（「ビヒクル」）で処置した。各データポイントは、６〜９匹のマウスの平均体重±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクターを注射したマウス対ＧＦＰを保持するベクターを注射したマウス）。§ｐ＜０．０５；§§§§ｐ＜０．０００１（ＧＦＰを保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス対ＧＦＰを保持するベクターを注射したＲ６／２マウス）（ボンフェローニ事後検定を用いた２元配置分散分析）。図４Ｅは、ＥＭ４８特異抗体によって明らかになった変異Ｈｔｔ凝集体を有する線条体の代表的な顕微鏡写真（上段パネル）、患部の分析（下段グラフ）である。マウスを、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクター（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）またはＧＦＰを保持するベクター（「ビヒクル」）で処置した。
【図４Ｂ】ＶＴＦＴ−ＢＰＩＦＢ４の過剰発現により、ハンチントン病の進行が停止し、Ｒ６／２マウスの変異Ｈｔｔ凝集体面積が減少する。図４Ａは、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクター（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）またはＧＦＰを保持するベクター（「ビヒクル」）を投与したマウス（野生型（「ＷＴ」）またはＲ６／２）のマウスクラスピング表現型である。図４Ｂ及び図４Ｃは、未処置のＲ６／２マウス、ならびに年齢及び性別を一致させた野生型（ＷＴ）同腹仔の運動能力の水平ラダータスク分析及びロータロッド分析である。マウスを、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクター（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）、ＩＮＬＩ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するベクター（「ｈＢＰＩＦＢ４」）またはＧＦＰを保持するベクター（「ビヒクル」）で処置した。各データポイントは、各群６〜９匹のマウスの平均能力±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクターを注射したマウス対ＧＦＰを保持するベクターを注射したマウス）。§§§§ｐ＜０．０００１（ＧＦＰを保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス対ＧＦＰを保持するベクターを注射したＲ６／２マウス）。＃ｐ＜０．０５；＃＃ｐ＜０．００１（ＧＦＰを保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス対ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４を保持するベクターを注射したＲ６／２マウス）。＠＠ｐ＜０．００１（ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４を保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス対ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４を保持するベクターを注射したＲ６／２マウス）。図４Ｄは、全ての群のマウスの体重である。マウスを、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクター（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）またはＧＦＰを保持するベクター（「ビヒクル」）で処置した。各データポイントは、６〜９匹のマウスの平均体重±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクターを注射したマウス対ＧＦＰを保持するベクターを注射したマウス）。§ｐ＜０．０５；§§§§ｐ＜０．０００１（ＧＦＰを保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス対ＧＦＰを保持するベクターを注射したＲ６／２マウス）（ボンフェローニ事後検定を用いた２元配置分散分析）。図４Ｅは、ＥＭ４８特異抗体によって明らかになった変異Ｈｔｔ凝集体を有する線条体の代表的な顕微鏡写真（上段パネル）、患部の分析（下段グラフ）である。マウスを、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクター（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）またはＧＦＰを保持するベクター（「ビヒクル」）で処置した。
【図４Ｃ】ＶＴＦＴ−ＢＰＩＦＢ４の過剰発現により、ハンチントン病の進行が停止し、Ｒ６／２マウスの変異Ｈｔｔ凝集体面積が減少する。図４Ａは、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクター（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）またはＧＦＰを保持するベクター（「ビヒクル」）を投与したマウス（野生型（「ＷＴ」）またはＲ６／２）のマウスクラスピング表現型である。図４Ｂ及び図４Ｃは、未処置のＲ６／２マウス、ならびに年齢及び性別を一致させた野生型（ＷＴ）同腹仔の運動能力の水平ラダータスク分析及びロータロッド分析である。マウスを、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクター（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）、ＩＮＬＩ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するベクター（「ｈＢＰＩＦＢ４」）またはＧＦＰを保持するベクター（「ビヒクル」）で処置した。各データポイントは、各群６〜９匹のマウスの平均能力±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクターを注射したマウス対ＧＦＰを保持するベクターを注射したマウス）。§§§§ｐ＜０．０００１（ＧＦＰを保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス対ＧＦＰを保持するベクターを注射したＲ６／２マウス）。＃ｐ＜０．０５；＃＃ｐ＜０．００１（ＧＦＰを保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス対ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４を保持するベクターを注射したＲ６／２マウス）。＠＠ｐ＜０．００１（ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４を保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス対ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４を保持するベクターを注射したＲ６／２マウス）。図４Ｄは、全ての群のマウスの体重である。マウスを、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクター（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）またはＧＦＰを保持するベクター（「ビヒクル」）で処置した。各データポイントは、６〜９匹のマウスの平均体重±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクターを注射したマウス対ＧＦＰを保持するベクターを注射したマウス）。§ｐ＜０．０５；§§§§ｐ＜０．０００１（ＧＦＰを保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス対ＧＦＰを保持するベクターを注射したＲ６／２マウス）（ボンフェローニ事後検定を用いた２元配置分散分析）。図４Ｅは、ＥＭ４８特異抗体によって明らかになった変異Ｈｔｔ凝集体を有する線条体の代表的な顕微鏡写真（上段パネル）、患部の分析（下段グラフ）である。マウスを、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクター（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）またはＧＦＰを保持するベクター（「ビヒクル」）で処置した。
【図４Ｄ】ＶＴＦＴ−ＢＰＩＦＢ４の過剰発現により、ハンチントン病の進行が停止し、Ｒ６／２マウスの変異Ｈｔｔ凝集体面積が減少する。図４Ａは、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクター（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）またはＧＦＰを保持するベクター（「ビヒクル」）を投与したマウス（野生型（「ＷＴ」）またはＲ６／２）のマウスクラスピング表現型である。図４Ｂ及び図４Ｃは、未処置のＲ６／２マウス、ならびに年齢及び性別を一致させた野生型（ＷＴ）同腹仔の運動能力の水平ラダータスク分析及びロータロッド分析である。マウスを、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクター（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）、ＩＮＬＩ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するベクター（「ｈＢＰＩＦＢ４」）またはＧＦＰを保持するベクター（「ビヒクル」）で処置した。各データポイントは、各群６〜９匹のマウスの平均能力±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクターを注射したマウス対ＧＦＰを保持するベクターを注射したマウス）。§§§§ｐ＜０．０００１（ＧＦＰを保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス対ＧＦＰを保持するベクターを注射したＲ６／２マウス）。＃ｐ＜０．０５；＃＃ｐ＜０．００１（ＧＦＰを保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス対ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４を保持するベクターを注射したＲ６／２マウス）。＠＠ｐ＜０．００１（ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４を保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス対ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４を保持するベクターを注射したＲ６／２マウス）。図４Ｄは、全ての群のマウスの体重である。マウスを、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクター（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）またはＧＦＰを保持するベクター（「ビヒクル」）で処置した。各データポイントは、６〜９匹のマウスの平均体重±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクターを注射したマウス対ＧＦＰを保持するベクターを注射したマウス）。§ｐ＜０．０５；§§§§ｐ＜０．０００１（ＧＦＰを保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス対ＧＦＰを保持するベクターを注射したＲ６／２マウス）（ボンフェローニ事後検定を用いた２元配置分散分析）。図４Ｅは、ＥＭ４８特異抗体によって明らかになった変異Ｈｔｔ凝集体を有する線条体の代表的な顕微鏡写真（上段パネル）、患部の分析（下段グラフ）である。マウスを、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクター（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）またはＧＦＰを保持するベクター（「ビヒクル」）で処置した。
【図４Ｅ】ＶＴＦＴ−ＢＰＩＦＢ４の過剰発現により、ハンチントン病の進行が停止し、Ｒ６／２マウスの変異Ｈｔｔ凝集体面積が減少する。図４Ａは、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクター（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）またはＧＦＰを保持するベクター（「ビヒクル」）を投与したマウス（野生型（「ＷＴ」）またはＲ６／２）のマウスクラスピング表現型である。図４Ｂ及び図４Ｃは、未処置のＲ６／２マウス、ならびに年齢及び性別を一致させた野生型（ＷＴ）同腹仔の運動能力の水平ラダータスク分析及びロータロッド分析である。マウスを、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクター（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）、ＩＮＬＩ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するベクター（「ｈＢＰＩＦＢ４」）またはＧＦＰを保持するベクター（「ビヒクル」）で処置した。各データポイントは、各群６〜９匹のマウスの平均能力±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクターを注射したマウス対ＧＦＰを保持するベクターを注射したマウス）。§§§§ｐ＜０．０００１（ＧＦＰを保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス対ＧＦＰを保持するベクターを注射したＲ６／２マウス）。＃ｐ＜０．０５；＃＃ｐ＜０．００１（ＧＦＰを保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス対ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４を保持するベクターを注射したＲ６／２マウス）。＠＠ｐ＜０．００１（ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４を保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス対ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４を保持するベクターを注射したＲ６／２マウス）。図４Ｄは、全ての群のマウスの体重である。マウスを、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクター（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）またはＧＦＰを保持するベクター（「ビヒクル」）で処置した。各データポイントは、６〜９匹のマウスの平均体重±ＳＤを表す。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクターを注射したマウス対ＧＦＰを保持するベクターを注射したマウス）。§ｐ＜０．０５；§§§§ｐ＜０．０００１（ＧＦＰを保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス対ＧＦＰを保持するベクターを注射したＲ６／２マウス）（ボンフェローニ事後検定を用いた２元配置分散分析）。図４Ｅは、ＥＭ４８特異抗体によって明らかになった変異Ｈｔｔ凝集体を有する線条体の代表的な顕微鏡写真（上段パネル）、患部の分析（下段グラフ）である。マウスを、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクター（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）またはＧＦＰを保持するベクター（「ビヒクル」）で処置した。
【図５】水平ラダータスクにおけるＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４の経口投与効果。  １μｇまたは３μｇのＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４組換えタンパク質で経口処置したＲ６／２マウスの水平ラダータスク値である。タンパク質の注入は、７週齢の動物から３日ごとに強制給餌によって行った。値は平均±ＳＥＭである。＃ｐ＜０．０５  Ｒ６／２  １μｇ対Ｒ６／２  ３μｇ。
【図６Ａ】Ｒ６／２マウスでのＶＴＦＴ−ＢＰＩＦＢ４による運動機能の改善は、ＣＸＣＲ４の阻害によって鈍化する。図６Ａ及び図６Ｂは、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクターまたはＣＸＣＲ４阻害剤ＡＤＭ３１００を含むかまたは含まないＧＦＰを保持するベクター（「ビヒクル」）を注射したＲ６／２マウスの運動能力の水平ラダータスク分析及びロータロッド分析である。各データポイントは、各群３〜４匹のマウスの平均能力±ＳＤを表す。対応のないｔ検定：＊ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４を保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス対ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４＋ＡＭＤ３１００を保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス）。図６Ｃは、全ての群のマウスの体重である。各データポイントは、３〜４匹のマウスの体重の平均±ＳＤを表す。
【図６Ｂ】Ｒ６／２マウスでのＶＴＦＴ−ＢＰＩＦＢ４による運動機能の改善は、ＣＸＣＲ４の阻害によって鈍化する。図６Ａ及び図６Ｂは、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクターまたはＣＸＣＲ４阻害剤ＡＤＭ３１００を含むかまたは含まないＧＦＰを保持するベクター（「ビヒクル」）を注射したＲ６／２マウスの運動能力の水平ラダータスク分析及びロータロッド分析である。各データポイントは、各群３〜４匹のマウスの平均能力±ＳＤを表す。対応のないｔ検定：＊ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４を保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス対ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４＋ＡＭＤ３１００を保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス）。図６Ｃは、全ての群のマウスの体重である。各データポイントは、３〜４匹のマウスの体重の平均±ＳＤを表す。
【図６Ｃ】Ｒ６／２マウスでのＶＴＦＴ−ＢＰＩＦＢ４による運動機能の改善は、ＣＸＣＲ４の阻害によって鈍化する。図６Ａ及び図６Ｂは、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４  ＤＮＡを保持するＡＡＶベクターまたはＣＸＣＲ４阻害剤ＡＤＭ３１００を含むかまたは含まないＧＦＰを保持するベクター（「ビヒクル」）を注射したＲ６／２マウスの運動能力の水平ラダータスク分析及びロータロッド分析である。各データポイントは、各群３〜４匹のマウスの平均能力±ＳＤを表す。対応のないｔ検定：＊ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４を保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス対ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４＋ＡＭＤ３１００を保持するＡＡＶベクターを注射したＷＴマウス）。図６Ｃは、全ての群のマウスの体重である。各データポイントは、３〜４匹のマウスの体重の平均±ＳＤを表す。
【図７】ｐＡＡＶ２．１  ＴＢＧプラスミドベクターマップである。  ＮｏｔＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位の間にクローニングされたｈＢＰＩＦＢ４配列を持つｐＡＡＶ２．１  ＴＢＧベクターのマップ。
【図８】ｐＲＫ５プラスミドベクターマップである。  実施例１で使用した構築物の調製に使用したｐＲＫ５プラスミドベクターのマップ。
【図９Ａ】単球由来樹状細胞の生成に対するＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４の効果の評価。ビヒクルのみ（「ビヒクル」）（図９の最初のパネル）、ＩＮＬＩ−ｈＢＰＩＦＢ４（「ｈＢＰＩＦＢ４」）（図９の２番目のパネル）またはＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）（図９の３番目のパネル）の存在下で、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４と共に培養した未成熟単球由来樹状細胞（ｉＤＣ）のＦＡＣＳ分析。６〜８日後、細胞をＬＰＳで最終分化させ、フローサイトメトリーによる分析の前に、ＣＤ１４、ＣＤ１ａ、ＣＤ８６、及びＣＸＣＲ４に対するコンジュゲートｍＡｂで染色した。正規化された結果は、図９の下の３番目のパネルに示されている。
【図９Ｂ】単球由来樹状細胞の生成に対するＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４の効果の評価。ビヒクルのみ（「ビヒクル」）（図９の最初のパネル）、ＩＮＬＩ−ｈＢＰＩＦＢ４（「ｈＢＰＩＦＢ４」）（図９の２番目のパネル）またはＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）（図９の３番目のパネル）の存在下で、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４と共に培養した未成熟単球由来樹状細胞（ｉＤＣ）のＦＡＣＳ分析。６〜８日後、細胞をＬＰＳで最終分化させ、フローサイトメトリーによる分析の前に、ＣＤ１４、ＣＤ１ａ、ＣＤ８６、及びＣＸＣＲ４に対するコンジュゲートｍＡｂで染色した。正規化された結果は、図９の下の３番目のパネルに示されている。
【図９Ｃ】単球由来樹状細胞の生成に対するＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４の効果の評価。ビヒクルのみ（「ビヒクル」）（図９の最初のパネル）、ＩＮＬＩ−ｈＢＰＩＦＢ４（「ｈＢＰＩＦＢ４」）（図９の２番目のパネル）またはＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４（「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」）（図９の３番目のパネル）の存在下で、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４と共に培養した未成熟単球由来樹状細胞（ｉＤＣ）のＦＡＣＳ分析。６〜８日後、細胞をＬＰＳで最終分化させ、フローサイトメトリーによる分析の前に、ＣＤ１４、ＣＤ１ａ、ＣＤ８６、及びＣＸＣＲ４に対するコンジュゲートｍＡｂで染色した。正規化された結果は、図９の下の３番目のパネルに示されている。
【００３４】
配列表の配列の簡単な説明
配列番号１：ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームのアミノ酸配列。
配列番号２：配列番号１のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列。
【００３５】
定義
「ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」は、２２９、２８１、４８８及び４９４位がそれぞれＶＴＦＴである配列番号１のタンパク質を指す。「ＡＡＶ−ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４」は、ＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４をコードするプラスミドベクターである（実施例を参照）。
【００３６】
「ＩＮＬＩ−ｈＢＰＩＦＢ４」は、配列番号１のタンパク質（受託番号ＮＰ−５９８２７．２）に対応するタンパク質であって、２２９、２８１、４８８及び４９４位がそれぞれＩＮＬＩであるタンパク質を指す。これは、ヒト集団におけるｈＢＰＩＦＢ４の主要なアイソフォームである。
【００３７】
「ＢＰＩＦＢ４タンパク質」とは、配列番号１のタンパク質及びそのホモログ及びそのアイソフォーム、ならびにその機能的に等価なバリアントを指す。
「ＧＦＰ」は緑色蛍光タンパク質を意味する。
【００３８】
本明細書で使用される「ホモログ」という用語は、ホモサピエンスで同定された公知のＢＰＩＦＢ４タンパク質のアミノ酸配列（受託番号ＮＰ−８７２３２５．２、配列番号１のアイソフォームよりも長いアイソフォームに対応）、及び以下：Ｆｅｌｉｓ  Ｃａｔｕｓ（受託番号ＸＰ００３９８３６６５．１）；Ｐａｎ  Ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（受託番号ＸＰ５２５３０３）；Ｓａｍｉｒｉ  ｂｏｌｉｖｉｅｎｓｉｓ  ｂｏｌｉｖｉｅｎｓｉｓ（受託番号ＸＰ−００３９３２１１３．１）；Ｍａｃａｃａ  Ｍｕｌａｔｔａ（受託番号ＮＰ−００１２３０１９２．１）；Ｐａｎ  ｐａｎｉｓｃｕｓ（受託番号ＸＰ−００３８１４７７６．１）；Ｏｔｏｌｅｍｕｒ  ｇａｒｎｅｔｔｉｉ（受託番号ＸＰ＿００３７８８１４８．１）；Ｐｏｎｇｏ  ａｂｅｌｉｉ（受託番号ＸＰ−００３７８０６４９．１．）；Ｓａｒｃｏｐｈｉｌｕｓ  ｈａｒｒｉｓｉｉ（受託番号ＸＰ−００３７５８９８７．１）；Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（受託番号ＮＰ−００１１０２６７９．２）；Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ（受託番号ＸＰ−００３７３２８４１．１）；Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（受託番号ＮＰ−００１０３００４７．２）；Ｂｏｓｔａｕｒｕｓ（受託番号ＸＰ−００３５８６８６１．１）；Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（受託番号ＸＰ−５３４３８３．３）；Ｓｕｓｓｃｒｏｆａ（受託番号ＸＰ−００３１３４４４８．３）；Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ（受託番号ＸＰ−４２５７１８），Ｄｉｄｅｌｐｈｉｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ（ＬＯＣ１０００３２８８０及びＸｅｎｏｐｕｓ（ＬＯＣ１００４８５７７６）を含むがこれらに限定されない他の動物種の配列番号１と相同な配列を指す。
【００３９】
「ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォーム」は、配列番号１の２２９位に対応する位置にバリン残基、配列番号１の２８１位に対応する位置にスレオニン残基、配列番号１の４８８位に対応する位置にフェニルアラニン残基、及び配列番号１の４９４位に対応する位置にスレオニン残基を有するＢＰＩＦＢ４タンパク質を意味する。
【００４０】
配列番号１のタンパク質のバリアントまたはそのホモログを指す「機能的に同等」という用語は、アミノ酸の付加、欠失、置換の存在により配列番号１のアミノ酸配列またはそのホモログとは異なり得、類似の生物活性を保持するアミノ酸配列を指す。典型的には、そのような生物学的活性は、ミトコンドリア機能の増加、タンパク質凝集の減少、及びＣＸＣＲ４活性の増加という活性から選択される活性である。アミノ酸置換は、保存されたアミノ酸による置換であることが好ましい。「保存されたアミノ酸」によって、それは元のアミノ酸のものと同等の機能上物理化学的特性を有するアミノ酸を意味する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野において周知である。一般に、このような保存的置換は、以下に指定するアミノ酸群の１つに該当するが、状況によっては、抗原の免疫特性に実質的に影響を与えずに他の置換が可能になる場合がある。次の８つの群には、互いに典型的な保存的置換であるアミノ酸：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １９８４を参照）がそれぞれ含まれている。
【００４１】
本明細書で使用される「機能的断片」という用語は、ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームの配列全体よりもアミノ酸が少なく、機能的に同等である、すなわち類似の生物活性を保持する、アミノ酸配列を指す。本発明の機能的断片は、少なくとも、配列番号１の７５位〜４９４位に対応するアミノ酸に及ぶ最小活性配列を含む。機能的断片は、例えば４１９残基、例えば４３０残基、例えば４５０残基、例えば４６０残基、例えば５００残基、例えば５５０残基を含み得る（すなわち、少なくともこれらの長さである）。
【００４２】
「疾患」という用語は、その最も広い理解を意味し、疾患、障害、状態、及び症候群を包含する。
「治療」という用語は、疾患または疾患の症状の緩和を意味する。遺伝性障害（ダウン症候群など）の治療の場合、「治療」とは状態の症状の緩和を指すことが理解されるだろう。治療には、単独での治療または他の治療との併用が含まれる。治療には、疾患もしくはその症状の改善または疾患もしくはその症状の進行速度の低下につながる治療が含まれる。
【００４３】
「予防」という用語は、病気または病気の症状の予防を意味し、他の点では「治療」と解釈される。
「有効量」という用語は、所望の治療（または予防）結果を達成するのに必要な投与量及び期間において有効な量を指し、その場合、薬剤の毒性または有害作用よりも治療的または予防的に有益な効果が上回る。有効投与量は、レシピエントの年齢、性別、健康、及び体重、同時治療の種類、もしあれば、治療の頻度、及び所望の効果の性質に依存することが理解される。過度の実験を行うことなく、当業者によって理解され決定されるように、最も好ましい投与量は個々の対象に合わせて調整される。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「対象」とは、疾患に関連する少なくとも１つの症状を示す、疾患と診断されている、または疾患を発症するリスクがある、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びウマなどの家畜、ネコ、イヌ、ウサギなどの飼育動物、マウス、ラット、及びモルモットなどの実験動物を含むがこれらに限定されない任意の哺乳動物である。該用語は、特定の年齢または性別を示さない。好適には、対象は、ヒト対象である。
【００４５】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「同一」または「パーセント同一性」という用語は、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、もしくは手動アライメント及び目視検査によって測定される比較ウィンドウまたは指定領域における最大一致について比較及びアライメントした場合の、２つ以上の同じ配列もしくは部分配列、または特定の割合の同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチド（すなわち、特定の領域で８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性）を指す。そのような配列は、「実質的に同一」と言われる。本定義は、試験配列の相補体も指す。任意で、同一性は、長さが少なくとも約２５〜約５０のアミノ酸またはヌクレオチドである領域にわたって、または任意で長さが７５〜１００のアミノ酸またはヌクレオチドである領域にわたって存在する。好適には、比較は、参照配列の全長に対応するウィンドウで実行される。
【００４６】
配列比較のため、通常、１つの配列が参照配列として機能し、試験配列と比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用しても、代替パラメータを指定してもよい。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
【００４７】
本明細書で使用される「比較ウィンドウ」は、２つの配列が最適にアラインメントされた後、配列が同数の連続的な位置の参照配列と比較され得るセグメントを指す。比較のための配列のアラインメント法は、当技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局地的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似探索手法、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピューターによる実施、または手動アラインメント及び目視検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．１９９５  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照）により実施することができる。
【００４８】
有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ・ペアワイズアラインメントを使用して、関連配列群から複数の配列アラインメントを作成して、関係性及びパーセント配列同一性を示す。また、アラインメントを作成するために使用されるクラスタリング関係を示すツリーまたはデンドログラムをプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０（１９８７）のプログレッシブアライメント手法の簡略化を使用する。使用される方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３（１９８９）で説明されている方法に類似している。このプログラムは、最大長がそれぞれ５，０００ヌクレオチドまたは５，０００アミノ酸である最大３００配列をアラインメントすることができる。マルチプルアラインメント手順は、２つの最も類似した配列のペアワイズアラインメントから始まり、２つのアラインメントされた配列のクラスターを生成する。このクラスターは、次に最も関連する配列またはアラインメントされた配列のクラスターにアラインメントされる。配列の２つのクラスターは、２つの個々の配列のペアワイズアラインメントの単純な拡張によってアラインメントされる。最終的なアラインメントは、一連のプログレッシブ・ペアワイズアラインメントによって達成される。プログラムは、特定の配列、及び配列比較領域のそれらのアミノ酸またはヌクレオチド座標を指定する、ならびにプログラムパラメータを指定することにより実行される。ＰＩＬＥＵＰを使用して、参照配列を他の試験配列と比較し、以下のパラメータ：デフォルトギャップウェイト（３．００）、デフォルトギャップ長ウェイト（０．１０）、及び重み付きエンドギャップ、を使用してパーセント配列同一性の関係性を決定する。ＰＩＬＥＵＰは、ＧＣＧ配列解析ソフトウェアパッケージ、例えばバージョン７．０から入手できる（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５（１９８４）。
【００４９】
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９７７）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）（ウェブサイトｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に利用可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントした際に、一致するかまたは任意の正値の閾値スコアＴを満たすクエリー配列中の長さＷの短いワードを確認することによって、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、上記）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含む、より長いＨＳＰを見つける検索を開始するためのシードとして機能する。ワードヒットを、それぞれの配列に沿って、累積アラインメントスコアが増加し得る限り両方向に伸長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関して、パラメータＭ（一対の一致する残基の報酬スコア；常に０を超える）及びＮ（不一致の残基のペナルティースコア；常に０未満）を使用して計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアが計算される。各方向のワードヒットの伸長は、以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ減少した；１以上の負スコアの残基アラインメントが蓄積して、累積スコアがゼロ以下になった；またはいずれの配列も末端に到達した。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸはアラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）または１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。
【００５０】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈で別段明確に指示されない限り、複数形の言及を含むことに留意すべきである。したがって、例えば、「剤形」とは、単一の剤形だけでなく、２つ以上の異なる剤形の組み合わせも指し、「活性剤」とは、活性剤の組み合わせ及び単一の活性剤などを指す。
【００５１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」、「例えば（ｆｏｒ  ｉｎｓｔａｎｃｅ）」、「など」、「含む」などの用語は、より一般的な主題をさらに明確にする例を紹介することを意図している。別記しない限り、これらの例は、本発明を理解するための補助としてのみ提供されており、いかなる形であれ限定することを意図するものではない。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本発明は、ミトコンドリア機能障害及び／またはタンパク質凝集に関連する、及び／またはＣＸＣＲ４活性化により改善される、神経疾患及び神経損傷から選択される状態の治療または予防に使用するための、ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームであるタンパク質またはその機能的断片に関する。
【００５３】
一実施形態では、タンパク質は、配列番号１の２２９位に対応する位置にバリン、配列番号１の２８１位に対応する位置にスレオニン、配列番号１の４８８位に対応する位置にフェニルアラニン、及び配列番号１の４９４位に対応する位置にスレオニンを含む、配列番号１に対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列、またはそのホモログ（特に配列番号１）を含むか、またはそれからなり、配列番号１のタンパク質と機能的に同等であるか、またはその機能的断片である。
【００５４】
一実施形態では、ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームは、配列番号１の配列に対して５０、４０、３０、２０、１５、１０、５、２、または１のアミノ酸の付加、欠失、または置換を有する（配列番号１の２２９、２８１、４８８、及び４９４位に対応する位置での付加、欠失、または置換ではない）。好ましくは、置換は、保存的置換である。好ましくは、配列番号１の７５位及び９２位（それぞれセリン及びセリン）に対応する位置には、付加、欠失、または置換はない。
【００５５】
好適には、本発明のＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、例えばそれからなる。
別の実施形態では、本発明のＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームは、配列番号１の２２９、２８１、４８８、及び４９４位とは異なる位置にある１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のアミノ酸が異なるアミノ酸、特に保存されたアミノ酸によって置換されている、配列番号１の配列に対応するアミノ酸配列を有する。
【００５６】
一実施形態では、本発明のＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームは、配列番号１の７５、８２、２２９、２８１、４８８及び４９４位とは異なる位置にある１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のアミノ酸が異なるアミノ酸、特に保存されたアミノ酸によって置換されている、配列番号１の配列に対応するアミノ酸配列を有する。
【００５７】
本発明のＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームの機能的断片は、配列番号１の残基７５〜４９４または前の２段落に記載のアミノ酸置換を有する配列を含み得る。
一実施形態では、ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームまたはその機能的断片は、例えば、ＯＣＲ及び／またはミトコンドリア体積を増加させる活性を有することから示されるように、ミトコンドリア機能を増加させる機能を持つ。ＯＣＲ及び／またはミトコンドリア体積は、実施例１の説明のように測定することができる。
【００５８】
一実施形態では、ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームまたはその機能的断片は、タンパク質凝集を減少させる活性を有する機能を持つ。タンパク質凝集の減少は、実施例２に記載のように免疫組織化学により測定することができる。
【００５９】
一実施形態では、ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームまたはその機能的断片は、ＣＸＣＲ４活性を増加させる機能を持つ（例えば、細胞質膜へのＣＸＣＲ４の局在化を改善することによる）。ＣＸＣＲ４活性の増加は、蛍光イメージングなどの手法によって細胞膜レベルでその存在を測定することにより測定することができる（例えば、Ｅ．Ｂｅｌｅｔｋａｉａ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）を参照）。
【００６０】
本発明の一態様によれば、ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームまたはその機能的断片は、組換えタンパク質として投与される。
本発明はさらに、ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチド及びベクター、好ましくは発現制御配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む遺伝子治療ベクターを提供する。
【００６１】
タンパク質配列の発現は、サイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターなどの適切なプロモーターによって駆動され得る。
したがって、ミトコンドリア機能障害及び／またはタンパク質凝集に関連する、及び／またはＣＸＣＲ４活性化により改善される、神経疾患及び神経損傷から選択される状態の治療または予防に使用するための、上述のＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームまたはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００６２】
好ましい実施形態によると、該ポリヌクレオチドは、配列番号２の配列を含むか、またはそれから構成される。
したがって、ミトコンドリア機能障害及び／またはタンパク質凝集に関連する、及び／またはＣＸＣＲ４活性化により改善される、神経疾患及び神経損傷から選択される状態の治療または予防に使用するための、上述のＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームであるタンパク質またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含むベクターがさらに提供される。
【００６３】
本発明のさらなる態様は、ミトコンドリア機能障害及び／またはタンパク質凝集に関連する、及び／またはＣＸＣＲ４活性化により改善される、神経疾患及び神経損傷から選択される状態の治療または予防の方法であって、有効量の、ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームであるタンパク質またはその機能的断片を、それを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。
【００６４】
ミトコンドリア機能障害及び／またはタンパク質凝集に関連する、及び／またはＣＸＣＲ４活性化により改善される、神経疾患及び神経損傷から選択される状態の治療または予防の方法であって、有効量の、ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームであるタンパク質またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与することを含む方法もまた提供される。
【００６５】
ミトコンドリア機能障害及び／またはタンパク質凝集に関連する、及び／またはＣＸＣＲ４活性化により改善される、神経疾患及び神経損傷から選択される状態の治療または予防の方法であって、有効量の、ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームであるタンパク質またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む方法もまた提供される。
【００６６】
本発明は、本発明のタンパク質もしくは機能的断片または本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを１つ以上の薬学的に許容可能な担体及び賦形剤と組み合わせて含む薬学的組成物を提供する。
【００６７】
本発明のタンパク質もしくは機能的断片または本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターはまた、１つ以上の他の有効成分、例えば本明細書に記載の状態の治療に適した活性成分と組み合わせて投与してもよい。例えば、可能性のある有効成分としては、以下のものが挙げられる：
カルビドパまたはレボドパ、プラミペキソール、ロピニロール、ロチゴチンまたはアポモルフィンなどのドーパミン作動薬、セレギリンまたはラサギリンなどのＭＡＯ−Ｂ阻害剤、エンタカポンなどのカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害剤、ベンズトロピンまたはトリヘキシフェニジルなどの抗コリン薬、またはアマンタジンなどのパーキンソン病用医薬。
【００６８】
ドネペジル、ガランタミン、またはリバスチグミンなどのコリンエステラーゼ阻害剤、メマンチン、ソラネズマブなどのモノクローナル抗体、サラカチニブなどのＦｙｎ阻害剤、Ｔａｕ凝集阻害剤、ピオグリタゾンなどの抗炎症薬などのアルツハイマー病用医薬。
【００６９】
テトラベナジンなどの運動障害のための薬物、ハロペリドール、クロルプロマジン、リスペリドン、オランザピン、リスペリドンまたはクエチアピンなどのなどの抗精神病薬、アマンタジン、レベチラセタム、クロナゼパム、シタロプラム、エスシタロプラム、フルオキセチンまたはセルトラリンなどの抗うつ剤、バルプロ酸、カルバマゼピンまたはラモトリジンなどの抗痙攣薬を含む気分安定薬、補酵素Ｑ１０またはイデベノンなどの栄養補助食品などのハンチントン病用医薬。
【００７０】
リルゾール及びエダラボンを含む筋萎縮性側索硬化症用医薬。
一実施形態では、有効成分の組み合わせは共製剤化される。
一実施形態では、有効成分の組み合わせは、逐次的に、または同時に共投与される。
【００７１】
一実施形態では、
（Ａ）本発明のタンパク質もしくは機能的断片または本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクター、及び
（Ｂ）さらなる有効成分（上記のとおり）
を含む組み合わせ生成物であって、
該成分（Ａ）及び（Ｂ）のそれぞれが、薬学的に許容可能な希釈剤または担体と混合して製剤化される、組み合わせ生成物が提供される。組み合わせは、追加の関連する賦形剤を任意に含んでもよい。
【００７２】
一実施形態では、１つ以上のさらなる有効成分（上記のとおり）と組み合わせて投与される医薬として使用するための、本発明のタンパク質もしくは機能的断片または本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターが提供される。
【００７３】
本発明の実施は、特に指示がない限り、分子生物学、微生物学、ウイルス学、及び当業者の技能範囲内の組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する。そのような技術は、文献内に完全に説明されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）；ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｐ．Ｔｉｊｅｓｓｅｎ，ｅｄ．）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．）を参照のこと）。
【００７４】
特に指示がない限り、本発明は、特定の投与量、製剤または使用方法に限定されず、変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないこともまた理解されたい。
【００７５】
治療または予防すべき疾患
「神経疾患」という用語は、神経系を構成する脳、脊髄、及び神経が関与し、「神経変性疾患」及び「神経筋疾患」を含む疾患を示す。神経疾患は、欠陥のある遺伝子が原因である場合もあれば、神経細胞が損傷または死ぬ変性疾患の場合もある。神経疾患の例には、ダウン症候群（ＤＳ）及びウォルフラム症候群（ＷＳ）が含まれる。
【００７６】
「神経変性疾患」という用語は、対象における正常な神経機能の障害もしくは欠如、または異常な神経機能の存在を指す。例えば、神経変性疾患は、疾患、損傷、及び／または加齢の結果であり得る。また、神経細胞または神経細胞の集団の形態学的異常及び／または機能的異常を引き起こす神経変性も含まれる。形態学的異常及び機能的異常の非限定的な例には、神経細胞の物理的劣化及び／または死、神経細胞の異常な成長パターン、神経細胞間の物理的接続の異常、神経細胞による、物質（複数可）、例えば神経伝達物質の不足または過剰産生、神経細胞が通常産生する物質（複数可）の産生の失敗、物質、例えば神経伝達物質の産生の失敗、及び／または異常パターンまたは異常時の電気インパルスの伝達が挙げられる。神経変性は、対象の脳の任意の領域で発生する可能性があり、例えば、多発性硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病またはプリオン病を含む多くの障害と共に見られる。
【００７７】
スクレイピーは、特に異常なタンパク質凝集を伴うヒツジ及びヤギに特に影響を与える神経変性疾患の例である。ウシ海綿状脳炎もまた特に異常なタンパク質凝集を伴うウシに影響を与える神経変性疾患である。
【００７８】
「神経筋疾患」という用語は、筋肉及び／またはそれらの直接的な神経系制御に影響を与える疾患を示し、中枢神経制御の問題は、その問題の場所及び性質に応じて痙縮またはある程度の麻痺（下位及び上位運動ニューロン障害の両方による）を引き起こす可能性がある。中枢障害のいくつかの例には、脳血管障害、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作（ＭＥＬＡＳ）、シャルコー・マリー・トゥース２Ａ（ＣＭＴ  ２Ａ）及び脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）が挙げられる。脊髄性筋萎縮症は下位運動ニューロンの障害である一方、筋萎縮性側索硬化症は上位運動ニューロン及び下位運動ニューロンの混合状態である。
【００７９】
好適には、状態は、多発性硬化症、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、特にＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３（ＭＪＤ）、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ＳＣＡ１７、フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）、ダウン症候群（ＤＳ）、ウォルフラム症候群（ＷＳ）、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作（ＭＥＬＡＳ）、シャルコー・マリー・トゥース２Ａ（ＣＭＴ  ２Ａ）及びクロイツフェルト・ヤコブ病またはプリオン病から選択される。
【００８０】
好適には、状態は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）である。
「神経損傷」という用語は、外傷性損傷、例えば脊髄損傷を含む脳及び／または中枢神経系及びそのニューロンへの損傷を意味する。脊髄損傷などの神経損傷に関連して、ＣＸＣＲ４活性の増加におけるＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームまたはその機能的断片の役割は、特に重要であると考えられている（ミトコンドリア機能の増強またはタンパク質凝集の減少よりも）。
【００８１】
ハンチントン病、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病、及びプリオン病などのタンパク質凝集に関連する状態は、本発明の文脈において特に興味深い。
好ましい実施形態では、本発明の状態は、ダウン症候群、ハンチントン病、ＡＬＳ、ＰＤ、ＡＤ及びＳＣＡから選択される。
【００８２】
特に好ましい実施形態では、状態は、ハンチントン病である。
一実施形態では、ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームまたはその機能的断片は、遺伝子治療を通じて、それを必要とする対象に投与され、該バリアントまたはその断片をコードするヌクレオチド配列は、ベクターに挿入される。
【００８３】
好適には、ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、パルボウイルスベクター、及びレンチウイルスベクター、好ましくは、アデノ随伴ウイルスベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルスベクターである。
【００８４】
好適には、ベクターは、ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームをコードする配列番号２のヌクレオチド配列またはその断片を含む（例えば、それからなる）。
好適には、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターには、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、好ましくはＡＡＶ９が含まれるが、これらに限定されない。
【００８５】
別の実施形態では、配列番号１の組換えタンパク質またはその機能的断片は、それを必要とする対象に投与される。
本発明のタンパク質は、ヒト及び他の哺乳動物（飼育動物、ならびにウシ、ヒツジ及びヤギなどの家畜を含む）、特にヒトの治療に有用である。
【００８６】
デリバリーシステム及び投与方法
第１の態様によると、本発明のポリペプチドは遺伝子治療法により送達される。
本発明の一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ウイルス、例えばアデノ随伴ウイルスを介して送達される。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、ウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルスベクターに組み込まれる。
【００８７】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、１４５ｂｐの逆方向反復配列（ＩＴＲ）を含む長さ約４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡを持つ複製欠損パルボウイルスである。ＩＴＲには、ウイルス複製（ｒｅｐ）、カプシド形成、及びパッケージング、及び宿主細胞の組み込みを指示するシス作用性配列が含まれている。３つのＡＡＶプロモーター（ｐ５、ｐ２９、ｐ４０）は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードするオープンリーディングフレームの発現を駆動する。
【００８８】
ＡＡＶは、遺伝子治療において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの外来ＤＮＡの細胞への送達に最適化する独自の機能を備えている。培養中の細胞のＡＡＶ感染は非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は無症候性であり、無症状である。さらに、ＡＡＶは多くの哺乳動物細胞型に感染するため、ｉｎ  ｖｉｖｏで異なる組織を標的にする可能性がある。さらに、ＡＡＶは、ゆっくりと分裂する細胞または非分裂細胞を形質導入し、転写活性の核エピソーム、例えば、過剰な染色体要素として感染細胞の寿命の間持続することができる。
【００８９】
したがって、一態様では、本発明は、組換えＡＡＶ（「ｒＡＡＶ」）ゲノムを提供する。ｒＡＡＶゲノムは、転写制御ＤＮＡ、例えばプロモーターＤＮＡ、遺伝子カセットを形成するポリアデニル化シグナル配列ＤＮＡに作動可能に連結された本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに隣接する１つ以上のＩＴＲを含む。遺伝子カセットは、哺乳動物細胞で発現された場合にＲＮＡ転写物の処理を促進するイントロン配列を含んでもよい。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターのゲノムは一本鎖ゲノムであり、別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターのゲノムは自己相補型ゲノムであり、該コード領域は、分子内二本鎖ＤＮＡテンプレートを形成するように設計されており、感染すると、自己相補型ＡＡＶの２つの相補的な半分が結合して、すぐに複製及び転写が可能な１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成する。
【００９１】
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１などの異なる組織向性を持つ、ＡＡＶウイルスの複数の血清型が利用可能である。
【００９２】
ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当技術分野において周知である。例えば、ＡＡＶ−１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７で提供されている；ＡＡＶ−２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ  ００１４０１で提供されている；ＡＡＶ−３の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿１８２９で提供されている；ＡＡＶ−４の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９で提供されている；ＡＡＶ−５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６で提供されている；ＡＡＶ−６の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８６２で提供されている；ＡＡＶ−７及びＡＡＶ−８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９で提供されている；ＡＡＶ−９ゲノムは、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ，（２００４）及び米国特許第７，１９８，９５１号（参照により本明細書に組み込まれる）で提供されている；ＡＡＶ−１０ゲノムは、Ｄｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＭｏＩ．Ｔｈｅｒ．，（２００６）１３（１）：６７−７６で提供されている；ならびに、ＡＡＶ−１１ゲノムは、Ｍｏｒｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，（２００４）３３０（２）：３７５−３８３で提供されている。
【００９３】
別の態様では、本発明は、本発明のｒＡＡＶゲノムを含むＤＮＡプラスミドを提供する。ＤＮＡプラスミドは、ｒＡＡＶゲノムを感染性ウイルス粒子に組み立てるために、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）による感染が許容される細胞に移される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供されるｒＡＡＶ粒子を作製する技術は、当技術分野において標準的である。ｒＡＡＶの作製には、以下の成分：ｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別の（つまり、ｒＡＡＶゲノムにない）ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能、が単一細胞（本明細書ではパッケージング細胞と表す）内に存在する必要がある。ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子は、これらに限定されないが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、ＡＡＶ−１０及びＡＡＶ−１１を含む、組換えウイルスを誘導することができる任意のＡＡＶ血清型に由来し得、ｒＡＡＶゲノムＩＴＲとは異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。組換えベクターの送達を強化するために、ＡＡＶカプシドタンパク質を修飾してもよい。カプシドタンパク質への修飾は、一般的に当技術分野において周知である。
【００９４】
パッケージング細胞の生成方法は、ＡＡＶ粒子の作製に必要な全ての成分を安定して発現する細胞株を樹立することである。例えば、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠くｒＡＡＶゲノム、ｒＡＡＶゲノムとは別のＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにネオマイシン耐性遺伝子などの選択マーカーを含むプラスミド（または複数のプラスミド）が細胞のゲノムに組み込まれている。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加などの手順によって、または直接的な平滑末端ライゲーションによって細菌プラスミドに導入されている。次に、パッケージング細胞株をアデノウイルスなどのヘルパーウイルスにより感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模な作製に適していることである。適切な方法の他の例では、プラスミドではなくアデノウイルスまたはバキュロウイルスを使用して、ｒＡＡＶゲノム及び／またはｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入する。
【００９５】
本発明のポリヌクレオチドを保持するｒＡＡＶの送達は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏであり得、薬学的に適切なキャリアを伴う。
ベクターは、例えば腰椎穿刺により脳脊髄液にベクターを注射することにより、ＣＮＳの広領域にわたって分布させることができる。
【００９６】
あるいは、脳の特定部位へのベクターの正確な送達は、定位マイクロ注射技術を使用して実施することができる。好ましい投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。一実施形態では、ベクターは、静脈内注入または注射によって投与される。別の実施形態では、ベクターは、筋肉内または皮下注射により投与される。別の実施形態では、ベクターは、経口投与される。最も好ましい実施形態では、ベクターは、定位送達を使用して特定の場所に送達される。
【００９７】
ＡＡＶウイルスの骨格筋及び心筋への送達は、全身または筋肉内注射により可能である。
中枢神経系内へのＡＡＶウイルスの送達には、外科的な実質内注射が必要である。しかしながら、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１００７１８３２に詳述されているように、ｒＡＡＶ９ベクターは、血液脳関門にアクセスして全身に送達できる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、脳に送達される。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、脊髄に送達される。さらに他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ニューロン、運動ニューロン、及び／またはグリア細胞に送達される。いくつかの態様では、グリア細胞は、ミクログリア細胞、希突起膠細胞、またはアストロサイトである。他の態様では、ポリヌクレオチドは、シュワン細胞に送達される。
【００９９】
本発明の好適な実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ｒＡＡＶ９ウイルスに組み込まれている。特に好ましい実施形態では、ベクターの配列は、図７に示すとおりである。
【０１００】
さらなる実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、高分子錯体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベースシステムを含むコロイド分散系などの非ウイルス性送達により送達される。
【０１０１】
あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、送達のための担体、好ましくはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）及びヒト血清アルブミンと適切に結合される。他のキャリアには、ＩＮＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−８、及びその他などの様々なリンホカイン及びアジュバントが含まれ得る。ペプチドを担体タンパク質にコンジュゲートさせる手段は、当技術分野において周知であり、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド、及びビス−ビアゾ化ベンジジンが含まれる。
【０１０２】
本発明の第２の態様によれば、本発明のポリペプチドは組換えタンパク質として送達される。組換えタンパク質は、髄腔内、腹腔内、静脈内、動脈内または経口的に適切に投与される。
【０１０３】
脳ターゲティングのいくつかの重要なアプローチには、吸着介在型トランスサイトーシス、能動的排出ポンプの阻害、受容体介在型輸送、細胞介在型エンドサイトーシス、ペプチドベクターの使用などの生理学的輸送メカニズムが含まれる。薬物送達アプローチは、マイクロスフェア、生分解性ウェハ、及びコロイド状薬物担体システム（例えば、リポソーム、ナノ粒子、ナノゲル、デンドリマー、ミセル、ナノエマルション、ポリマーソーム、エクソソーム、及び量子ドット）からの送達を含む。吸着介在型トランスサイトーシス（ＡＭＴ）は、リガンドとして作用するポリカチオン性ペプチドまたはタンパク質と、内皮細胞の管腔側に存在するマイクロアニオン部分との静電結合を伴う。ＡＭＴはＲＭＴよりも結合親和性が低いが、より高い結合能力を可能にする。カチオン化アルブミンは、アルツハイマー病の鉄キレート剤であるデフェラシロクスとコンジュゲートすることが報告されているそのようなリガンドの例であり；カチオン化ウシ血清アルブミンは、開発されたシステムのＨＮＧＣ−１細胞株への最大のトランスサイトーシスを示す、抗がん剤ドキソルビシンを含む人工固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）にコンジュゲートし、ｉｎ  ｖｉｖｏシステムを使用して薬物動態が改善される。ＧＭ１は、内皮表面に遍在するスフィンゴ糖脂質であり、コレラ毒素Ｂのトランスサイトーシス受容体であるガングリオシドＰ−ｇｐＰ−糖タンパク質として作用することができる。
【０１０４】
さらなる実施形態
本発明のさらなる実施形態によれば、以下が提供される。
ミトコンドリア機能障害及び／またはタンパク質凝集に関連している神経疾患及び神経損傷から選択される状態の治療または予防に使用するための、ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームであるタンパク質またはその機能的断片。そのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びそのようなポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供される。
【０１０５】
アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、特にＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ＳＣＡ１７、フリードライヒ運動失調症、ダウン症候群、ウォルフラム症候群、ミトコンドリア脳筋症・乳酸アシドーシス・脳卒中様発作、シャルコー・マリー・トゥース２Ａ、クロイツフェルト・ヤコブ病、またはプリオン病及び脊髄性筋萎縮症から選択され、特に、ダウン症候群、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び脊髄小脳失調症、好ましくはハンチントン病から選択され、特に、ハンチントン病である、状態の治療または予防に使用するための、ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームであるタンパク質またはその機能的断片。そのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びそのようなポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供される。
【０１０６】
脊髄損傷の治療または予防に使用するための、ＢＰＩＦＢ４タンパク質のＶＴＦＴアイソフォームまたはその機能的断片であるタンパク質。そのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチド及びそのようなポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供される。
【実施例】
【０１０７】
以後、本発明は、実施例を参照してより詳細かつ具体的に説明されるが、これらは本発明を限定することを意図するものではない。
材料
実施例においてＡＡＶ−ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４について言及する場合、これは図７に示すように構築される。ＡＡＶ−ＧＦＰについて言及する場合、これは、ｈＢＰＩＦＢ４配列をＧＦＰ配列に置き換えた図７に示すように構築される。
【０１０８】
ｐＲＫ５空のベクター（ＥＶ）は、Ｋｐｎ１（１１７３）制限部位の後にＧＦＰ配列が挿入された図８に示すプラスミドベクターから構築される。
ｐＲＫ５  ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４ベクターは、ＨｉｎｄＩＩＩ（９５４）及びＫｐｎ１（１１７３）制限部位間にＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４配列が挿入され、Ｋｐｎ１（１１７３）制限部位の後にＧＦＰ配列が挿入された図８に示すプラスミドベクターから構築される。
【０１０９】
実施例１−細胞代謝におけるＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４ベクターの効果
ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４が細胞代謝にどのように影響するかを確かめるために、ｐＲＫ５空のベクター（ＥＶ）またはｐＲＫ５  ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４（ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４）をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の生体エネルギープロファイルを測定した。
【０１１０】
ＥＶまたはＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４をコードするｐＲＫ５プラスミドをトランスフェクションしてから７２時間後に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で代謝プロファイルを評価した。
ミトコンドリア呼吸機能の指標は、ＯＣＲプロファイル：基礎ＯＣＲ（オリゴマイシンの添加前）及びＡＴＰ関連ＯＣＲ（基礎ＯＣＲ速度とオリゴマイシン誘発ＯＣＲ速度の差として計算）から計算した。
【０１１１】
解糖系活性化の指標は、ＥＣＡＲプロファイル：基礎ＥＣＡＲ（グルコースの添加後）及び解糖能（オリゴマイシン誘発ＥＣＡＲと２−ＤＧ誘発ＥＣＡＲの差として計算）から計算した。
【０１１２】
データは、２つの別々の実験からの平均値±標準誤差で表される。試料ごとにｎ＝５反復。統計分析には、両側独立ｔ検定（ｔｗｏ  ｔａｉｌｅｄ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）を使用した。
【０１１３】
代謝アッセイ：酸素消費速度（ＯＣＲ）及び細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）
ＯＣＲ及びＥＣＡＲは、ＸＦ培地（１０ｍＭ  グルコース、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムを含む非緩衝ＲＰＭＩ培地１６４０）中、基本条件下で、５μＭオリゴマイシンまたは１ｍＭの２−ＤＧに応答して、ＸＦ−２４またはＸＦ−９６細胞外フラックスアナライザー（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｒｔｈ  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して測定した。
【０１１４】
データは、２つの別々の実験からの平均値±標準誤差で表される。試料ごとにｎ＝５反復。統計分析には、対応のない両側ｔ検定を使用する。
ミトコンドリア体積の評価
細胞を、１ウェルあたり５０，０００細胞の密度で２５ｍｍのガラスカバースリップに播種し、２４時間増殖させた後、アデノウイルスベクターに挿入されたミトコンドリアを標的としたＧＦＰに感染させた（Ａｄ−ｍｔＧＦＰ  Ｅｘ／Ｅｍ：４９５／５１５）。次に、ｈＢＰＩＦＢ４、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４の存在下、または単独で７２時間、タンパク質発現させた。カバースリップは、温度、ＣＯ２、及び湿度を制御したインキュベーションチャンバーに入れた。ＣＦＩ  Ｐｌａｎ  Ａｐｏ  ＶＣ６０ＸＨ対物レンズ、及びＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ３．２によって制御されるＡｎｄｏｒ  ＤＵ８８５  ＥＭ−ＣＣＤカメラを装備したＮｉｋｏｎ Ｓｗｅｐｔ  Ｆｉｅｌｄ Ｃｏｎｆｏｃａｌ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）を使用して、単一細胞を撮像した。１３３×１３３×２００ｎｍ（Ｘ×Ｙ×Ｚ）のボクセル寸法で５１面のｚスタックを得た。ミトコンドリアネットワークは、次いで、ソフトウェアＦｉｊｉで利用可能な３Ｄ  Ｏｂｊｅｃｔ  Ｃｏｕｎｔｅｒを使用して、オブジェクトの数、総体積、及びオブジェクト体積で記述された。
【０１１５】
結果
Ｏ２消費速度（ＯＣＲ、図１Ａ）は、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）（細胞が酵素を使用して栄養素を酸化し、それによりＡＴＰを再形成するために使用されるエネルギーを放出する代謝経路の活性）及び細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ、図２Ａ）の指標、好気的解糖の指標である。
【０１１６】
図１に示すように、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４は、ＥＶと比較してＯＸＰＨＯＳを促進及び維持する能力が高い。図１Ｂは、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４をトランスフェクトした細胞が、ＥＶをトランスフェクトした細胞よりも有意に高い基礎ＯＣＲレベルを有することを示す。図１Ｃは、ＡＴＰ関連速度を示しており、これは、基礎速度から、ＡＴＰ合成をブロックする化合物であるオリゴマイシンの添加後に測定された速度を引いたものである。この値は、ＡＴＰ産生専用のＯＣＲの量が、ＥＶをトランスフェクトした細胞よりもＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４をトランスフェクトした細胞の方が多いことを示す。総合すると、これらの結果は、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４は、未処理の細胞から細胞を生体エネルギー的により活性化させることを示す。
【０１１７】
したがって、基礎ＥＣＡＲ（図２Ｂ）及び解糖能（図２Ｃ）（最大解糖と解糖系阻害剤２ＤＧによる処置の差として評価）は、ＥＶをトランスフェクトした細胞と比較した場合、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４をトランスフェクトした細胞において統計的に増加した。
【０１１８】
結論として、ＯＣＲ及びＥＣＡＲが高いＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４トランスフェクト細胞は、対照細胞よりも代謝的により活性である。ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４は、細胞の代謝機構の調節において役割を果たす。
【０１１９】
このデータを補完的なアプローチにより確認するため、ヒト胎児線維芽細胞Ｃ１−Ｂｉｏ  ８６をｈＢＰＩＦＢ４及びＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４組換えタンパク質バリアントによって処置し、ミトコンドリアの体積を測定した。図３に示すように、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４で処理した線維芽細胞のミトコンドリアの平均体積は、未処理の線維芽細胞のミトコンドリア体積より大きく、ｈＢＰＩＦＢ４で処理した線維芽細胞のミトコンドリア体積よりも大幅に大きくなる。本発明者らの発見と一致して、ミトコンドリアの体積は細胞の生体エネルギー活性に比例することが報告されている。
【０１２０】
実施例２−ハンチントン病モデル
ＡＡＶ−ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４の治療可能性を、ハンチントン病（ＨＤ）のトランスジェニックマウスモデルで調査した。ＨＤは、ハンチントンタンパク質（Ｈｔｔ）のＮ末端領域のポリＣＡＧによってコードされるポリグルタミン鎖の伸長によって引き起こされる。Ｒ６／２マウスモデルは、Ｈｔｔ遺伝子のエクソン１に１１５〜１５０反復のポリＣＡＧ伸長を持つトランスジェニックマウスである。これは、人体病理学で最も使用され、最も特徴づけられたモデルであり、認知機能及び運動機能の進行性の喪失を特徴とし、分子レベルでも、変異体Ｈｔｔの類似の毒性凝集を伴う、ヒトの状態との様々な程度での類似性を示し、臨床環境でも、ヒトの状態に明らかに似た運動障害を示す。
【０１２１】
運動行動の分析
前述のように、十分に検証された運動試験を使用して、細かい運動能力及び運動協調性を測定した。全ての試験は、明暗サイクルの明期に行った。実験群ごとに６〜９匹のマウスを各試験で使用した。全てのマウスは、運動行動測定を実行する前に、各機器及びタスクで２日間連続してトレーニングを受けた。トレーニング及び試験の前に、マウスは、試験室及び装置への馴化期間を経た。運動協調性及びバランスは、ロータロッド装置（Ｕｇｏ  ＢａｓｉｌｅＳｒｌ）で試験した。マウスは、ロータロッドで１分間、固定速度（２０ｒｐｍ）で試験した。各マウスは、それぞれ１分間３回の連続した試行で試験され、試行間の休憩は１分間であった。転倒までの時間を各試行について記録し、平均してロータロッドに費やした全体の時間を求めた。
【０１２２】
高度な歩行、手足の配置、及び手足の協調性は全て、水平ラダータスクによって評価した。マウスが、はしごの段が不定かつ不規則な間隔の水平はしごに沿って自発的に歩行するところをビデオカメラで記録した。各試験セッションで、マウスの能力は、はしごの段上の前肢及び後肢の配置の定性的及び定量的評価を可能にする確立された足取りスコアリングシステムを使用して評価した。
【０１２３】
ＨＤ症状を示す７週齢のＲ６／２マウス及び野生型対照マウスに、ＡＡＶ−ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４、ＡＡＶ−ＩＮＬＩ−ｈＢＰＩＦＢ４、またはＡＡＶ−ＧＦＰのいずれかの動脈内注射を１回行った。
【０１２４】
協調性及び姿勢の維持を妨げる異常な不随意運動の典型的なマーカーであるクラスピング動作の進行を観察した。全ての試験は、７週齢から１１週齢まで週に１回実施した。
運動能力の分析と同時に、動物の体重も測定した。全てのマウスを毎日検査して、疾患の進行及び全体的な健康を判定した。
【０１２５】
変異Ｈｔｔ凝集体の免疫組織化学
野生型及びＲ６／２マウスを頚椎脱臼によって屠殺した。嗅球及び脊髄を除去することにより、脳を除去し、トリミングした。残りの脳の重量を量り、処理し、パラフィンワックスに包埋し、ＲＭ  ２２４５ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で１０ｍｍの冠状断に切断した。１群あたり６匹のマウスを使用し、脳の前後に広がる４つの冠状断（２００〜３００μｍの断面間距離）をスキャンした。変異Ｈｔｔ凝集体の免疫染色は、ＥＭ４８抗体（１：１００）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して実施した。各マウス脳の断面ごとの線条体の変異Ｈｔｔ凝集体の平均面積をＩｍａｇｅＪソフトウェアで定量化し、凝集体面積（μｍ２）として報告した。
【０１２６】
結果
図４Ａは、ビヒクルに感染したＷＴマウス（左パネル）、ビヒクルに感染したＲ６／２マウス（中央パネル）、及びＡＡＶ−ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４に感染したＲ６／２マウス（右パネル）におけるマウスクラスピング表現型試験を示す。この試験は、ＡＡＶ−ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４がＲ６／２マウスモデルにおいて通常のクラスピング動作を回復する能力を明らかに証明する。
【０１２７】
図４Ｂ及びＣは、ＡＡＶ−ＧＦＰまたはＡＡＶ−ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４に感染したＷＴまたはＲ６／２マウスにおいて２つの異なる試験による運動障害進行の分析を示す。水平ラダータスク試験は、一連の金属製の段の道のりを完走する動物の能力の評価で構成される。ロータロッド試験は、回転速度を上げながら回転バーの上を動物が歩くことができる時間を測定する。水平ラダータスク試験及びロータロッド試験の両方で、ＡＡＶ−ＧＦＰまたはＡＡＶ−ＩＮＬＩ−ｈＢＰＩＦＢ４で処置したＷＴマウス及びＲ６／２マウスと比較してＡＡＶ−ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４で処置したＲ６／２マウスの運動能力のほぼ完全な回復が実証された。
【０１２８】
図４Ｄに示すように、ヒトの病変の一般的かつ多くの場合、衰弱させる特徴である体重減少は、大幅に軽減された。ＡＡＶ−ＧＦＰに感染したＲ６／２マウスは、体重のゆっくりとした減少を示した。これに反して、ＡＡＶ−ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４は、ＷＴマウスと同様の体重を維持する。驚いたことに、保存された運動機能は、処置したＨＤマウスの線条体の変異Ｈｔｔ凝集体面積の劇的な減少と関連していた：図４Ｅは、Ｎ末端Ｈｔｔ断片を認識し、封入体に非常に特異的なＥＭ４８抗体を用いて行った線条体の免疫組織化学分析を示す。変異Ｈｔｔの凝集体の可視化により、それらの面積の測定が可能になる。これらのデータで実行された統計分析は、ＡＡＶ−ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４に感染したＲ６／２マウスのＨｔｔ凝集体が、ＡＡＶ−ＧＦＰに感染したＲ６／２マウスと比較して面積が小さいことを示す。
【０１２９】
ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４の過剰発現は、ハンチントン病の進行を停止させ、Ｒ６／２マウスの変異Ｈｔｔ凝集体面積を減少させる。
実施例３−ハンチントン病モデル：ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４組換えタンパク質の経口投与
組換えＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４−Ｈｉｓタンパク質のクローニング及び精製
ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４コーディング配列をＰＣＲ増幅し、ＥＦ−１プロモーター下のｐＣＤＨクローニング及び発現ベクター中でＨｉｓタグと融合してクローニングした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＣａＣｌ２及びＨＢＳ法を使用して適切なベクターをトランスフェクトした。ＢＰＩＦＢ４−Ｈｉｓタンパク質を発現する細胞を、トランスフェクションから４８時間後に回収し、溶解緩衝液／結合緩衝液（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８．０）で希釈した。細胞抽出物を、ＤＮａｓｉＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化し、超音波処理した。組換えタンパク質は、ネイティブ条件下でアフィニティーＮｕｖｉａ  ＩＭＡＣ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して精製し、洗浄して溶出緩衝液（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５０〜２００ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ８．０）によってカラムから溶出した。ＢＰＩＦＢ４−Ｈｉｓ組換えタンパク質の品質及び純度は、クマシー染色、及び抗ＢＰＩＦＢ４（Ａｂｃａｍ）及び抗Ｈｉｓタグ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）抗体を用いたウエスタンブロットで確認した。
【０１３０】
運動行動の分析
実施例２に記載のように、水平ラダータスクを使用した。
ＨＤ症状を示す７週齢のＲ６／２マウス及び野生型対照マウスを、１μｇまたは３μｇのＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４組換えタンパク質で経口処置した。タンパク質の注入は、７週齢の動物から３日ごとに強制給餌によって行った。
【０１３１】
協調性及び姿勢の維持を妨げる異常な不随意運動の典型的なマーカーであるクラスピング動作の進行を観察した。全ての試験は、７週齢から１１週齢まで週に１回実施した。
全てのマウスを毎日検査して、疾患の進行及び全体的な健康を判定した。
【０１３２】
結果
図５は、水平ラダータスク試験による運動障害の進行の分析を示す。３μｇ投与群のマウスの試験での能力は研究期間（７〜９週齢）にわたって低下しなかったが、１μｇ投与群のマウスでの試験の能力は低下した。これらの結果は、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４が経口経路で投与された場合に有益な効果を発揮できることを示す。
【０１３３】
実施例４−運動機能に対するＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４の治療効果はＣＸＣＲ４によって媒介される
ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４の運動機能に対するｉｎ  ｖｉｖｏ治療効果がＣＸＣＲ４によって媒介されるかどうかを試験するために、Ｒ６／２ハンチントン病マウスモデル及び運動行動試験を実施例２のように利用した。マウスには４つの群があり、１つの群はＡＡＶ−ＧＦＰのみを動脈内に注射し（Ｎ＝３）、１つの群はＡＡＶ−ＧＦＰとＣＸＣＲ４阻害剤であるＡＭＤ３１００を動脈内に注射し（Ｎ＝３）、１つの群はＡＡＶ−ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４のみを動脈内に注射し（Ｎ＝４）、１つの群はＡＡＶ−ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４とＡＭＤ３１００を動脈内に注射した（Ｎ＝４）。ＡＭＤ３１００は、ＡＡＶ注射後に毎日腹腔内に投与した。
【０１３４】
結果
本発明者らは、Ｒ６／２マウスへのＡＡＶ−ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４の投与により、ハンチントン病の進行が停止し、変異Ｈｔｔ凝集体面積が減少することを発見した。図６Ａ及びＢは、Ｒ６／２マウスがＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４に感染していると運動障害の進行が妨げられ、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４感染Ｒ６／２マウスをＣＸＣＲ４阻害剤であるＡＭＤ３１００で処置すると、この有益な効果が鈍化することを示している。
【０１３５】
水平ラダータスク及びロータロッドの両方の試験では、ＡＡＶ−ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４に感染したＲ６／２マウスの運動能力の回復は、ＡＭＤ３１００で処置したＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４感染Ｒ６／２マウスでは発生しなかった。それらは、対照（ＡＡＶ−ＧＦＰ注射マウスまたはＡＡＶ−ＧＦＰ＋ＡＭＤ３１００処置マウス）と同様の実験値を有していた。
【０１３６】
図６Ｃは、ＡＡＶ−ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４＋ＡＭＤ３１００で処置したマウスまたは対照と比較して、ＡＡＶ−ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４に感染したＲ６／２マウスでは、ヒトの病変の特徴である体重減少がそれほど顕著ではなかったことを示す。
【０１３７】
実施例５−単球由来樹状細胞の生成に対するＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４の効果の評価
ＤＣは、微小環境からの信号を処理及び統合することができる可塑性系統である。炎症誘発性条件下では、刺激性ＤＣは、Ｔ細胞増殖を刺激し、ＴＨ１、ＴＨ２、またはＴＨ１７表現型に対するＴ細胞応答を形成することにより、効果的な免疫応答を促進する。この重要な役割により、免疫系は病原体及び異常なタンパク質を除去し、形質転換細胞を抑制し続けることができる（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２））。
【０１３８】
ヒト単球由来樹状細胞（ＤＣ）がＣＸＣＲ４を発現するとの報告がある。その関与により、ＤＣの成熟及び生存が強化され、効果的な後天性免疫応答が開始される（Ｄｅｌｇａｄｏ  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１），Ｋａｂａｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７））。
【０１３９】
単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）の生成及び細胞蛍光分析
健常ドナーの末梢血単核細胞を、フィコール・ハイパック勾配（リンパ球分離培地；ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ，ＵＳＡ）で分離した。未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）を生成するために、ＣＤ１４＋単球を、免疫磁気手法（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｃａｌｄｅｒａｒａ  ｄｉ  Ｒｅｎｏ，Ｉｔａｌｙ）によりＰＢＭＣからポジティブ選択した。次に、１８ｎｇ／ｍｌのＩＮＬＩ−ｈＢＰＩＦＢ４またはあるいは１８ｎｇ／ｍｌのＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４の存在下または非存在下で、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、及び１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４中でＣＤ１４＋細胞を１０６細胞／ｍｌで培養することにより、未成熟ＭＤＤＣを得た。培養６〜８日後のこれらのＦＡＣＳ分析は、ｉＤＣを徹底的に洗浄してＩＮＬＩ−ｈＢＰＩＦＢ４またはＶＴＦＴ−ＢＰＩＦＢ４を除去し、１μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と２４時間インキュベートすることにより最終分化させた。全ての細胞培養は、加湿した５％のＣＯ２雰囲気で３７℃で実施した。細胞のＦＡＣＳ分析を行い、各群のＣＤ８６＋及びＣＸＣＲ４＋成熟ＤＣの割合を決定した。
【０１４０】
フローサイトメトリー
ＣＤ１４、ＣＤ１ａ、ＣＤ８６、ＣＸＣＲ４に対するコンジュゲートモノクローナル抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。細胞を収集し、示された抗体によって４℃で２０分間染色した。ＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）を使用してデータを収集及び分析した。
【０１４１】
結果
結果を図９に示し、一部を以下に要約する。
【０１４２】
【表１】
2020531047.tif 000003
【０１４３】
検討
組換えＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４の存在下で生成されたＬＰＳ成熟ＤＣは、その表面でのＣＸＣＲ４発現陽性細胞の割合の増加を示す。したがって、共刺激分子ＣＤ８６もまた上方制御される。これらの発見は、ＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４がＤＣの成熟及び生存を促進し、後天性免疫応答を開始することを示唆する。前駆細胞のＤＣへの分化は、ミトコンドリアの活性に依存している（Ｚａｃｃａｇｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２））。分化すると、ＤＣは、ＣＮＳにおいて免疫応答を調節し得る（Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２））。そして、他の細胞に関しては、ＤＣは、ＣＸＣＲ４レベルにおいてＶＴＦＴ−ｈＢＰＩＦＢ４によって修飾され、これはミトコンドリアの活性及び神経保護免疫表現型に対応すると予想され得る活性化状態を示す。
【０１４４】
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Ｐ．Ｇ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ．１６（２００９）７４１−７６１
Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ（２００７）４２６，６９−７４
Ｔｙｓｓｅｌｉｎｇ，Ｖ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ（２０１１）８，１６
Ｊ．Ｖａｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｎ  ６（２００６）３２３−３３０
Ｖｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．（２０１５）３１；１１７（４）：３３３−４５
Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｓ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１２）；４：３，２７４
Ｄｅｌｇａｄｏ−Ｍａｒｔｉｎ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１１），２８６：４３，３７２２２−３７２３６
Ｋａｂａｓｈｉｍａ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２００７），３６１：４，１０１２−１０１６
Ｚａｃｃａｇｎｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２０１２），４４：１１，１９６２−１９６９
Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ（２０１２），９４６，３０９−３３３
明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、文脈上別段の定めがない限り、「含む」という単語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのバリエーションは、指定された整数、ステップ、整数のグループ、またはステップのグループを含むことを意味するが、他の整数、ステップ、整数のグループ、またはステップのグループを除外するものではないと理解される。
【０１４５】
本明細書で言及される全ての特許及び特許出願は、その全体が参照により組み込まれる。
【図１】
2020531047.tif 000004
【図２】
2020531047.tif 000005
【図３】
2020531047.tif 000006
【図４Ａ】
2020531047.tif 000007
【図４Ｂ】
2020531047.tif 000008
【図４Ｃ】
2020531047.tif 000009
【図４Ｄ】
2020531047.tif 000010
【図４Ｅ】
2020531047.tif 000011
【図５】
2020531047.tif 000012
【図６Ａ】
2020531047.tif 000013
【図６Ｂ】
2020531047.tif 000014
【図６Ｃ】
2020531047.tif 000015
【図７】
2020531047.tif 000016
【図８】
2020531047.tif 000017
【図９Ａ】
2020531047.tif 000018
【図９Ｂ】
2020531047.tif 000019
【図９Ｃ】
2020531047.tif 000020
【配列表】
2020531047000001.app
【国際調査報告】
2020531047.tif 000021
2020531047.tif 000022
2020531047.tif 000023