(57)【要約】  本発明は、特定のトランスジェニックダイズ植物、植物材料および種子を提供し、これらの産物は、ダイズゲノムの特定の位置に特定のセンチュウ抵抗性および除草剤耐性形質転換イベントを保有することを特徴とする。生物学的試料中のイベントの迅速かつ明確な同定を可能にするツールもまた提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、３、もしくは５のいずれか１つの配列と、または配列番号２、４、もしくは６のいずれか１つの配列、または前記配列の相補体と本質的に類似したヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項２】
配列番号３、４、５、６、２４または２５のヌクレオチド配列またはその相補体と、少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項３】
配列番号１もしくは３または配列番号２もしくは４のいずれか１つのヌクレオチド配列、または前記配列の相補体を含む、または配列番号１もしくは３および配列番号２もしくは４のヌクレオチド配列またはその相補体を含む、請求項１または２に記載の核酸分子。
【請求項４】
配列番号７および９のヌクレオチド配列、またはその相補体も含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
ヌクレオチド位置１８８からヌクレオチド位置７３６８までの配列番号１１のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、もしくは少なくとも９９．５％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
配列番号５もしくは２４、および配列番号６もしくは２４のヌクレオチド配列、またはその相補体を含む、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
受託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託された種子から得ることができる核酸分子であって、前記核酸分子が、配列番号１、３、または５のいずれか１つのヌクレオチド配列、および配列番号２、４、または６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ダイズゲノムＤＮＡ。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ダイズ植物、細胞、植物部分、種子またはそれらの子孫。
【請求項１０】
配列番号３のヌクレオチド配列および配列番号４のヌクレオチド配列をそのゲノム中に含む、ダイズ植物、細胞、植物部分、種子またはその子孫。
【請求項１１】
配列番号５のヌクレオチド配列および配列番号６のヌクレオチド配列、または配列番号２４のヌクレオチド配列および配列番号２５のヌクレオチド配列をそのゲノム中に含む、ダイズ植物、細胞、植物部分、種子またはその子孫。
【請求項１２】
配列番号７および９のヌクレオチド配列、またはヌクレオチド位置１０５９からヌクレオチド位置８６６３までの配列番号２３のヌクレオチド配列も含む、請求項１０または１１に記載の植物、細胞、植物部分、種子または子孫。
【請求項１３】
それぞれがそのゲノム中にエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ植物、細胞、部分、または種子であって、寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託された参照種子に見られるように、前記エリートイベントが、ＨＰＰＤ−４タンパク質をコードするキメラ遺伝子およびＣｒｙ１４Ａｂ−１タンパク質をコードするキメラ遺伝子を含有する挿入Ｔ−ＤＮＡ、および前記挿入Ｔ−ＤＮＡを直接囲む５’および３’隣接配列を含む遺伝子座である、ダイズ植物、細胞、部分、または種子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の植物、細胞、植物部分または種子の、子孫植物、細胞、植物部分または種子であって、前記子孫植物、細胞、植物部分または種子が配列番号３のヌクレオチド配列および配列番号４のヌクレオチド配列を含む、子孫植物、細胞、植物部分または種子。
【請求項１５】
それぞれ配列番号１２および配列番号１３のヌクレオチド配列を含む２つのプライマーを用いてＰＣＲを使用して分析した場合、そのゲノムＤＮＡが１２６ｂｐのＤＮＡ断片を生じる、請求項１３に記載のダイズ植物、細胞、部分、種子または子孫。
【請求項１６】
イソキサフルトールまたはメソトリオンに耐性である、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の植物。
【請求項１７】
請求項９〜１６のいずれか一項に記載のダイズ植物、細胞、部分、種子または子孫から産生したダイズ産物。
【請求項１８】
ダイズミール、粉砕種子、ダイズ粉またはダイズフレークであるか、またはそれを含む、請求項１７に記載のダイズ産物。
【請求項１９】
請求項１７または１８に記載のダイズ産物であって、前記ダイズ産物が、イベントＥＥ−ＧＭ４につき診断的または特異的なアンプリコンを産生する核酸を含む、ダイズ産物。
【請求項２０】
請求項９〜１６のいずれか一項に記載のダイズ植物、細胞、部分、種子または子孫を得るステップ、およびそれからダイズ産物を産生するステップを含む、ダイズ産物の産生方法。
【請求項２１】
前記ダイズ産物が、ダイズミール、粉砕種子、ダイズ粉またはダイズフレークであるか、またはそれを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載の方法であって、前記ダイズ産物が、イベントＥＥ−ＧＭ４につき診断的または特異的なアンプリコンを産生する核酸を含む、方法。
【請求項２３】
ダイズ植物が発芽する前であるが種子が蒔かれた後に、請求項９〜１６のいずれか一項に記載のダイズ種子が蒔かれた圃場を、ＨＰＰＤ阻害除草剤で処理するステップを含む、雑草防除プロセス。
【請求項２４】
請求項９〜１６のいずれか一項に記載のダイズ植物を、植物の上からＨＰＰＤ阻害除草剤で処理することを含む、雑草防除プロセス。
【請求項２５】
ダイズ植物を植える圃場を、ダイズ植物を植える前または種を蒔く前に、ＨＰＰＤ阻害除草剤で処理し、続いて、前記前処理された圃場に前記ダイズ植物または種子を植えるまたは蒔くステップを含む、発芽中の請求項９〜１６のいずれか一項に記載のダイズ植物を雑草による競争から保護するための方法。
【請求項２６】
前記ＨＰＰＤ阻害除草剤が、イソキサフルトールまたはメソトリオンである、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２７】
Ｃｒｙ１４Ａｂ−１をコードする遺伝子を欠き、ＨＰＰＤ−４をコードする遺伝子を欠く第１のダイズ植物を、請求項９〜１６のいずれか一項に記載のダイズ植物と交雑することによって、ＳＣＮに対する抵抗性および／またはＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性をダイズ植物のゲノムに導入するステップ、およびＳＣＮに抵抗性かつ／またはＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性の子孫植物を選択するステップを含む、ＳＣＮに抵抗性かつ／またはＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性のダイズ植物の産生方法。
【請求項２８】
ダイズ種子を産生するための、前記植物、種子、部分、細胞もしくはそれらの子孫または請求項９〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
センチュウ抵抗性および／またはＨＰＰＤ阻害除草剤耐性植物を生育するための、請求項９〜１６のいずれか一項に記載のダイズ植物または種子の使用。
【請求項３０】
ダイズ産物が、粉砕ダイズ子実、ダイズ粉、ダイズミール、またはダイズフレークであるか、またはそれを含む、前記ダイズ産物を得るための、請求項９〜１６のいずれか一項に記載のダイズ種子の使用。
【請求項３１】
請求項９〜１６のいずれか一項に記載の植物を他のダイズ植物と交雑するステップ、および前記交雑から得たＥＥ−ＧＭ４を含む種子を植えるステップを含む、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ植物または種子の産生方法。
【請求項３２】
ヌクレオチド位置１３１からヌクレオチド位置７９４１までの配列番号１１のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記核酸分子が、殺センチュウ性Ｃｒｙ１４Ａｂタンパク質およびＨＰＰＤ阻害剤に耐性のＨＰＰＤタンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項３３】
配列番号８のタンパク質またはそれと少なくとも９９％同一のタンパク質、および配列番号１０のタンパク質またはそれと少なくとも９９％同一のタンパク質をコードする、請求項３２に記載の核酸分子。
【請求項３４】
ＥＥ−ＧＭ４中の５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域の一部およびそれと隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡの一部を含有する領域を特異的に認識する特異的プライマー対または特異的プローブを用いた、ＥＥ−ＧＭ４特異的領域の検出を含む、生物学的試料中のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を同定する方法。
【請求項３５】
最適化された検出条件下で、ＥＥ−ＧＭ４中の挿入Ｔ−ＤＮＡの５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域内の配列を特異的に認識する配列を含む第１のプライマー、および最適化された検出条件下で、前記５’または３’隣接領域と隣接するＥＥ−ＧＭ４中の挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を特異的に認識する配列を含む第２のプライマーを含む、ＥＥ−ＧＭ４特異的検出における使用に適したプライマー対であって、前記５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域がヌクレオチド１からヌクレオチド２２７までの配列番号５、もしくはヌクレオチド１からヌクレオチド１０５８までの配列番号２４のヌクレオチド配列を含み、前記３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域がヌクレオチド２５４からヌクレオチド５０１までの配列番号６の相補体のヌクレオチド配列、もしくはヌクレオチド２５４からヌクレオチド１３３９までの配列番号２５の相補体のヌクレオチド配列を含み、前記挿入Ｔ−ＤＮＡがヌクレオチド２２８からヌクレオチド３９８までの配列番号５のヌクレオチド配列の相補体、またはヌクレオチド１からヌクレオチド２５３までの配列番号６のヌクレオチド配列、またはヌクレオチド位置１７からヌクレオチド位置７６２１までの配列番号１１のヌクレオチド配列もしくはその相補体、またはヌクレオチド位置１０５９からヌクレオチド位置８６６３までの配列番号２３のヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む、プライマー対。
【請求項３６】
請求項３５に記載のプライマー対であって、前記第１のプライマーが、ヌクレオチド１からヌクレオチド２２７までの配列番号５、もしくはヌクレオチド１からヌクレオチド１０５８までの配列番号２４のヌクレオチド配列、またはその相補体から選択される連続した１７〜２００ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、またはヌクレオチド２５４からヌクレオチド５０１までの配列番号６のヌクレオチド配列、もしくはヌクレオチド２５４からヌクレオチド１３３９までの配列番号２５のヌクレオチド配列、またはその相補体から選択される連続した１７〜２００ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、かつ前記第２のプライマーが、ヌクレオチド２２８からヌクレオチド３９８までの配列番号５のヌクレオチド配列もしくはその相補体、またはヌクレオチド１からヌクレオチド２５３までの配列番号６のヌクレオチド配列もしくはその相補体、またはヌクレオチド位置１７からヌクレオチド位置７６２１までの配列番号１１のヌクレオチド配列もしくはその相補体、またはヌクレオチド位置１０５９からヌクレオチド位置８６６３までの配列番号２３のヌクレオチド配列もしくはその相補体から選択される連続した１７〜２００ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、プライマー対。
【請求項３７】
請求項３５に記載のプライマー対であって、前記第１のプライマーが、ヌクレオチド１からヌクレオチド２２７までの配列番号５、もしくはヌクレオチド１からヌクレオチド１０５８までの配列番号２４のヌクレオチド配列、またはその相補体から選択される連続した少なくとも１７ヌクレオチドのヌクレオチド配列をその３’末端に含み、またはヌクレオチド２５４からヌクレオチド５０１までの配列番号６のヌクレオチド配列、もしくはヌクレオチド２５４からヌクレオチド１３３９までの配列番号２５のヌクレオチド配列、またはその相補体から選択される連続した少なくとも１７ヌクレオチドのヌクレオチド配列をその３’末端に含み、かつ前記第２のプライマーが、ヌクレオチド２２８からヌクレオチド３９８までの配列番号５のヌクレオチド配列もしくはその相補体、またはヌクレオチド１からヌクレオチド２５３までの配列番号６のヌクレオチド配列もしくはその相補体、またはヌクレオチド位置１７からヌクレオチド位置７６２１までの配列番号１１のヌクレオチド配列もしくはその相補体、またはヌクレオチド位置１０５９からヌクレオチド位置８６６３までの配列番号２３のヌクレオチド配列もしくはその相補体から選択される連続した少なくとも１７ヌクレオチドをその３’末端に含む、プライマー対。
【請求項３８】
請求項３５に記載のプライマー対であって、それぞれ、前記第１のプライマーが配列番号１３もしくは配列番号２１のヌクレオチド配列を含む、または前記第２のプライマーが配列番号１２もしくは配列番号２０のヌクレオチド配列を含む、プライマー対。
【請求項３９】
配列番号１３のヌクレオチド配列もしくは配列番号２１のヌクレオチド配列をその３’末端に含む第１のプライマーを含む、または配列番号１２のヌクレオチド配列もしくは配列番号２０のヌクレオチド配列をその３’末端に含む第２のプライマーを含む、請求項３５に記載のプライマー対。
【請求項４０】
ＰＣＲを用いて１２６または９０ｂｐのＥＥ−ＧＭ４特異的断片を増幅する、請求項３８または３９に記載のプライマー対。
【請求項４１】
その３’末端に配列番号１３の配列を含む第１のプライマー、およびその３’末端に配列番号１２の配列を含む第２のプライマーを含む、またはその３’末端に配列番号２１の配列を含む第１のプライマー、およびその３’末端に配列番号２０の配列を含む第２のプライマーを含む、プライマー対。
【請求項４２】
生物学的試料中のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４の同定のための特異的プローブであって、前記プローブが、ＥＥ−ＧＭ４の５’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列の一部およびその下流に隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡ、その下流に隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡの一部を含む配列を特異的に認識する、またはＥＥ−ＧＭ４の３’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列の一部およびその上流に隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡの一部を含む配列、もしくはその相補体を特異的に認識する、プローブ。
【請求項４３】
５’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列の一部およびその下流に隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡの一部を含む配列、もしくはその相補体、またはＥＥ−ＧＭ４中の３’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列の一部およびその上流に隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡの一部を含む配列、もしくはその相補体を含む配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、生物学的試料中のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４の同定のための特異的プローブ。
【請求項４４】
配列番号１もしくは３の配列、または配列番号２もしくは４の配列、またはその相補体と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項４３に記載のプローブ。
【請求項４５】
配列番号１、３、もしくは５のいずれか１つの配列、または配列番号２、４、もしくは６のいずれか１つの配列、またはその相補体を含む、請求項４４に記載のプローブ。
【請求項４６】
配列番号３の配列または配列番号４の配列を含む、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項４７】
請求項３４に記載の方法であって、前記方法が、少なくとも２つのプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記生物学的試料中に存在する核酸からの５０〜１０００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅することを含み、前記少なくとも２つのプライマーが、請求項３５〜４１のいずれか一項に記載のプライマーである、方法。
【請求項４８】
前記少なくとも２つのプライマーを用いて増幅されたＤＮＡ断片に特異的なプローブをハイブリダイズするステップをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記プローブが５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域の一部およびそれに隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡの一部を認識する、または前記プローブが３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域の一部およびそれに隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡの一部を認識する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記プライマーがそれぞれ配列番号１２および配列番号１３の配列を含み、かつ前記プローブが配列番号１４の配列を含み、または前記プライマーがそれぞれ配列番号２０および配列番号２１の配列を含み、かつ前記プローブが配列番号２２の配列を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
請求項３５〜４１のいずれか一項に記載のプライマー対を含む、ＥＥ−ＧＭ４特異的検出における使用に適したキット。
【請求項５２】
前記プライマー対によって増幅されたＤＮＡ断片に特異的なプローブをさらに含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
前記プローブが５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域の一部およびそれに隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡの一部を認識する、または前記プローブが３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域の一部およびそれに隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡの一部を認識する、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
前記プライマーが配列番号１２および配列番号１３の配列を含み、かつ前記プローブが配列番号１４の配列を含み、または前記プライマーが配列番号２０および配列番号２１の配列を含み、かつ前記プローブが配列番号２２の配列を含む、請求項５２に記載のキット。
【請求項５５】
請求項４２〜４６のいずれか一項に記載のプローブを含む、ＥＥ−ＧＭ４特異的検出における使用に適したキット。
【請求項５６】
前記生物学的試料の核酸を請求項４２〜４６のいずれか一項に記載のプローブとハイブリダイズさせるステップを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項５７】
種子純度を確認するための方法、またはエリートイベントＥＥ−ＧＭ４の存在について種子をスクリーニングするための方法であって、前記方法が、前記種子の試料中の、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載のプライマー対または請求項４２〜４５のいずれか一項に記載のプローブを用いた、ＥＥ−ＧＭ４特異的領域の検出を含む、方法。
【請求項５８】
１２６ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するステップであって、前記プライマーがそれぞれ配列番号１２および配列番号１３の配列を含み、かつ前記プローブが配列番号１４の配列を含む、ステップ、または９０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するステップであって、前記プライマーがそれぞれ配列番号２０および配列番号２１の配列を含み、かつ前記プローブが配列番号２２の配列を含む、ステップを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
実質的に相補的な標識核酸プローブとのハイブリダイゼーションにより、生物学的試料中のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４の存在を検出する方法であって、プローブ：標的核酸比が、標的核酸配列の再利用により増幅され、前記方法が、
ａ）前記標的核酸配列を、ヌクレオチド位置２２８からヌクレオチド位置２４５までの配列番号５のヌクレオチド配列またはその相補体を含む第１の核酸オリゴヌクレオチド、またはヌクレオチド位置２３６からヌクレオチド位置２５３までの配列番号６のヌクレオチド配列またはその相補体を含む前記第１の核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるステップ；
ｂ）前記標的核酸配列を、ヌクレオチド２１０からヌクレオチド２２７までの配列番号５のヌクレオチド配列またはその相補体を含む第２の核酸オリゴヌクレオチド、またはヌクレオチド２５４からヌクレオチド２７１までの配列番号６のヌクレオチド配列またはその相補体を含む前記核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるステップであって、前記第１および第２のオリゴヌクレオチドが少なくとも１ヌクレオチド重複し、前記第１または第２のオリゴヌクレオチドのいずれかが前記標識核酸プローブとなるように標識される、ステップ；
ｃ）プローブ：標的核酸配列二本鎖内の標識プローブのみを、二本鎖の解離を生じる選択的プローブ切断を引き起こす酵素で、標的配列を無傷のまま残して切断するステップ；
ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を反復することにより標的核酸配列を再利用するステップ；および
ｅ）切断された標識プローブを検出し、それにより、前記標的核酸配列の存在を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項６０】
エリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含む、植物、植物材料または種子の接合性状態を決定する方法であって、前記方法が、少なくとも３つのプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記生物学的試料中に存在する核酸からの５０〜１０００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するステップであって、前記プライマーのうち２つが挿入前植物ＤＮＡを特異的に認識し、前記プライマーのうち第３のものが挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を認識する、ステップを含む、方法。
【請求項６１】
請求項６０に記載の方法であって、挿入前植物ＤＮＡを特異的に認識する前記２つのプライマーが、配列番号１８のヌクレオチド配列を含むプライマー、および配列番号１３のヌクレオチド配列を含むプライマーであり、挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を認識するプライマーが、配列番号１２のヌクレオチド配列を含むプライマーである、方法。
【請求項６２】
生物学的試料中のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４の存在を検出するための方法、またはＥＥ−ＧＭ４を含む、植物、植物材料または種子の接合性状態を決定するための方法であって、前記方法が、実施例２．１、２．２、または２．３のいずれか１つに記載のものである、方法。
【請求項６３】
１）エリート形質転換イベントＥＥ−ＧＭ４を含む植物または種子を得るステップ、および２）ダイズ植物または種子を植えるまたは蒔くステップを含む、ダイズ植物を植える圃場、特に、ＳＣＮ、ＲＫＮまたはネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）などのセンチュウもしくはセンチュウの卵またはニセフクロセンチュウもしくはその卵を含有する、含有していた、もしくは含有することが予想される圃場における収量損失を減少させる方法であって、前記エリートイベントを含む参照種子が、寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託されている、方法。
【請求項６４】
１）エリート形質転換イベントＥＥ−ＧＭ４を含む植物または種子を得るステップ、および２）ダイズ植物または種子を植えるまたは蒔くステップを含む、ＳＣＮ、ＲＫＮまたはネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）などのセンチュウもしくはセンチュウの卵またはニセフクロセンチュウもしくはその卵を含有する圃場に植えられた場合に、ダイズ植物の収量を増加させる方法であって、前記エリートイベントを含む参照種子が、寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託されている、方法。
【請求項６５】
エリートダイズ形質転換イベントＥＥ−ＧＭ４をダイズ植物または種子のゲノムに導入するステップ、および任意選択により、イソキサフルトールまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤で、前記植物または種子を処理するステップ、または任意選択により、イソキサフルトールまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤で、前記植物または種子が植えられる圃場を処理し、前記前処理された圃場に前記植物または種子を植えるステップを特徴とする、イソキサフルトールまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性のダイズ植物または種子を産生する方法、またはＳＣＮ、ＲＫＮまたはネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）などのセンチュウまたはニセフクロセンチュウに耐性のダイズ植物または種子を産生する方法、またはイソキサフルトールまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性の、またはＳＣＮ、ＲＫＮまたはネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）などのセンチュウまたはニセフクロセンチュウに耐性の、ダイズ植物または種子を産生する方法。
【請求項６６】
ダイズ植物ゲノムＤＮＡの一部およびその下流に隣接したＥＥ−ＧＭ４の挿入外来ＤＮＡの一部を含有する、配列番号１、３または５のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、またはＥＥ−ＧＭ４の挿入外来ＤＮＡの一部およびその下流に隣接したダイズ植物ゲノムＤＮＡの一部を含有する、配列番号２、４または６のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、ダイズエリート形質転換イベントＥＥ−ＧＭ４を特異的に特徴付ける核酸分子。
【請求項６７】
イソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害剤を、前記植物に生育するダイズ種子に、または前記種子が植えられる圃場に、または前記植物の上から、施用するステップを含む、請求項２７または３１に記載の方法。
【請求項６８】
突然死症候群に汚染されたＳＣＮ含有圃場またはダイズに鉄欠乏性クロロシスを引き起こすＳＣＮ含有圃場でダイズ植物の収量を増加させる、方法であって、前記方法が、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含む植物を植えるステップまたは種子を蒔くステップを含み、前記エリートイベントを含む参照種子が、寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託されている、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／４３７，８６２号明細書、２０１７年４月４日に出願された米国仮特許出願第６２／４８１，２８４号明細書、および２０１７年４月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／４８７，７０７号明細書の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ダイズゲノムの特定の位置に、特に、センチュウ抵抗性および除草剤耐性を付与する遺伝子の存在によって、特異的な形質転換イベントを保有することを特徴とする、新規核酸ならびにトランスジェニックダイズ植物、植物材料および種子に関する。本発明のダイズ植物は、センチュウ抵抗性および除草剤耐性表現型を、ＨＰＰＤ阻害除草剤またはセンチュウ汚染がない場合の、対応する非形質転換ダイズの遺伝的背景と同等の異なる遺伝的背景における、農業成績、遺伝的安定性および機能性と組み合わせる。本発明はさらに、生物学的試料中の形質転換イベントＥＥ−ＧＭ４を特異的に含む植物材料の存在を同定するための方法およびキットを提供する。
【背景技術】
【０００３】
植物における導入遺伝子の表現型発現は、１つまたは複数の遺伝子の構造、および植物ゲノムにおけるそのまたはそれらの位置、の両方によって決定される。同時に、ゲノム中の異なる位置における導入遺伝子または「挿入Ｔ−ＤＮＡ」の存在は、異なる方法で植物の全体的な表現型に影響を与える。遺伝子操作による植物への商業的に興味深い形質の農業的または工業的に成功した導入は、異なる要因に依存する冗長な手順であり得る。遺伝的に形質転換された植物の実際の形質転換および再生は、広範な遺伝的特徴付け、遺伝子移入、および圃場試験における評価を含む一連の選択ステップの最初のものにすぎず、最終的にはエリートイベントの選択につながる。
【０００４】
エリートイベントの明確な同定は、新規食品／飼料に関する議論、ＧＭＯと非ＧＭＯ製品の分離、および所有権材料の同定の観点から、ますます重要になっている。理想的には、そのような識別方法は、広範囲の実験室設定を必要としない、迅速かつ簡単なものである。さらに、この方法は、専門家の解釈なしにエリートイベントの明確な同定を可能にするが、必要であれば専門家の精査の下に耐える結果を提供するであろう。生物学的試料中のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４の同定において使用するための特定のツールは、本明細書に記載される。
【０００５】
本発明では、センチュウに対する抵抗性を付与する遺伝子と組み合わせた、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤耐性をコードする遺伝子（それぞれ植物発現プロモーターの制御下にある）を含むセンチュウ抵抗性ダイズ（ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ））の開発において、ＥＥ−ＧＭ４はトランスジェニックダイズ植物の集団からのエリートイベントとして同定されている。
【０００６】
センチュウ抵抗性および除草剤耐性ダイズＥＥ−ＧＭ４品種を植えることは、イソキサフルトール（ＩＦＴ）、トプラメゾンまたはメソトリオン（ＭＳＴ）除草剤などのＨＰＰＤ阻害除草剤を使用した、センチュウおよび雑草防除のための新しい選択肢を栽培者に提供する。ＨＰＰＤ阻害除草剤は、問題の雑草種を管理するのを助け、対策ツールの代替的手段として除草剤抵抗性雑草の蔓延を遅らせるのを助ける、ダイズ生産者のための代替的な雑草防除の選択肢を提供する。
【０００７】
ダイズシストセンチュウ（ＳＣＮ）ヘテロデラ・グリシネス（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ）は、ダイズ生産の世界的な課題であり、生産者にとって継続的な脅威である。ノースカロライナ州の１つの郡から１９５４年に米国で最初に検出されて以来、ＳＣＮは米国のほぼ全てのダイズ生産州に広がり、米国で年間１２億ドル以上の収量損失を引き起こしていると推定されており、これにより、米国で最も損害を与えるダイズ病原体となっている。ＳＣＮは１９９０年代初頭にブラジルで最初に検出され、それ以来南アメリカ中に広がり、これはブラジルで最も重要な病原体の１つであり、事実上全てのブラジルの栽培地域で損失を引き起こしている。同様に、ＳＣＮは中国のダイズ生産地域に広がり続け、１５の省で検出され、１億２０００万ドル以上の収量損失が推定される。ほぼ全てのＳＣＮ耐性ダイズ品種がＰＩ  ８８７８８由来のＳＣＮ耐性を含有する米国のアイオワ州での複数年にわたる研究（２００１〜２０１５）により、ＳＣＮ集団の病原性は年を追うごとに増加し、ＰＩ８８７８８源の抵抗性により、シーズン終了時のＳＣＮ集団密度が増加し、ＳＣＮ抵抗性ダイズ品種の収量が減少する結果となることが見出された（Ｍｉｔｃｈｕｍ（２０１６），Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １０６（１２）：１４４４−１４５０、Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｐｌａｎｔ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｇｒ．１８：１９−２７、Ａｒｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）ｗｗｗ．ｒｅｓｅａｒｃｈｇａｔｅ．ｎｅｔ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ／２６６９０７７０３＿ＲＥＳＩＳＴＡＮＣＥ＿ＴＯ＿ＳＯＹＢＥＡＮ＿ＣＹＳＴ＿ＮＥＭＡＴＯＤＥ＿ＧＥＮＥＴＩＣＳ＿ＡＮＤ＿ＢＲＥＥＤＩＮＧ＿ＩＮ＿ＢＲＡＺＩＬ；ＭｃＣａｒｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｐｌａｎｔ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  １８：１４６−１５５）。
【０００８】
ネグサレセンチュウであるパイナップルネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）は、ダイズのますます重要な病原体となっている。これは広い宿主域を有し、熱帯および亜熱帯地域、特にブラジル、アフリカ、およびアメリカ合衆国南部に広く分布している。パイナップルネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）は、ブラジルのセラード地域の綿およびダイズ生産者の間での懸念事項となっており、この地域のダイズの主要なセンチュウ病原体と考えられている。ダイズでは、このセンチュウは収量を３０〜５０％減少させる可能性があり、砂質土壌ではより大きな被害が観察される。抵抗性ダイズ品種の使用は、このセンチュウを防除するための最良の方法であろう。しかしながら、現在までにパイナップルネグサレセンチュウ（Ｐ．ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）抵抗性ダイズ品種は同定されていない。いくつかのダイズ遺伝子型がパイナップルネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）抵抗性について研究されており、いくつかの品種は耐性が増していると同定されているが、パイナップルネグサレセンチュウ（Ｐ．ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）に対する抵抗性品種の育種は、このセンチュウが多食性であり、その宿主との密接な相互作用を欠いているという事実のために困難である（Ｍａｃｈａｄｏ（２０１４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：２６−３５；Ａｎｔｏｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｏｉｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ｌｏｓｓｅｓ  ｉｎ  ａｒｅａ  ｉｎｆｅｓｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｎｅｍａｔｏｉｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｏｔ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｖｅｒａ，ＭＴ．Ｉｎ：Ｂｒａｚｉｌｉａｎ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｓｏｙ，６，２０１２，Ｃｕｉａｂａ．Ａｂｓｔｒａｃｔｓ．Ｌｏｎｄｒｉｎａ：Ｅｍｂｒａｐａ  Ｓｏｊａ，４ｐｐ；Ｒｉｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｃｉｅｎｃｉａ  Ｒｕｒａｌ  ４６：５８０−５８４；Ｌｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，本のＣｈａｐｔｅｒ  ６：Ｓｏｙｂｅａｎ  −  Ｔｈｅ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｙｉｅｌｄ，Ｂｉｏｍａｓｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ；Ｍｉｎｏｂｕ  Ｋａｓａｉ編，ＩＳＢＮ  ９７８−９５３−５１−３１１８−２，Ｐｒｉｎｔ  ＩＳＢＮ  ９７８−９５３−５１−３１１７−５，ＩｎＴｅｃｈ；Ｉｎｏｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｓｕｃｅｓｓａｏ  ｄｅ  ｃｕｌｔｕｒａｓ  ｓｏｂ  ｐｉｖｏ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｐａｒａ  ｃｏｎｔｒｏｌｅ  ｄｅ  ｆｉｔｏｎｅｍａｔｏｉｄｅｓ：ｖａｒｉａｃａｏ  ｐｏｐｕｌａｃｉｏｎａｌ，ｐａｔｏｇｅｎｉｃｉｄａｄｅ  ｅ  ｅｓｔｉｍａｔｉｖａ  ｄｅ  ｐｅｒｄａｓ．Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３６：１７８−１８５）。
【０００９】
ＳＣＮなどのセンチュウから植物を保護することは、植物が土壌組成／含有量、気象条件、病原体ストレス、除草剤施用などの他のストレスによりよく対処するのを助け得ることが知られている。特に、そのような他のストレスが、葉のクロロシス／黄化などの見えやすい表現型を与える場合、ＳＣＮ防除の効果はより見やすいが、そうでなければ多くの場合はＳＣＮの蔓延は育成者に「可視的」でない。例えば、ダイズ植物が突然死症候群（ＳＤＳ）または鉄欠乏性クロロシス（ＩＤＣ）を有する場合、ＳＣＮからの保護により、より環境に優しい、またはより重度でないＳＤＳ／ＩＤＣ症状を有する、植物が得られるであろう。広範な研究および品種選別の努力にもかかわらず、鉄欠乏は依然として米国中北部のダイズ生産地域における課題である。鉄欠乏、および作付システムの変化との可能な相互作用に感受性である土壌でのダイズ産生の拡大により、この問題の重要性が高まっている。鉄欠乏は高ｐＨおよび炭酸塩を有する土壌で発生するが、鉄欠乏の発現は、含水量、塩分、鉄の利用能、ならびにその他の微量栄養素および金属濃度などの空間的に変動する土壌特性との相互作用のために、空間において非常に変動しやすい。さらに、鉄欠乏性発現は、窒素固定、害虫、病害などの生物学的因子と、および除草剤施用などの管理誘発性ストレスと、相互作用する。品種選択は鉄欠乏を管理するための最も重要な手段であるが、品種選択はクロロシス耐性に関連する環境相互作用による大きな遺伝子型によって複雑なものとなっている（Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｓｏｉｌ  Ｓｃｉ．Ｐｌａｎｔ  Ｎｕｔｒ．５０（７）：９８３−９８７）
【００１０】
ダイズの突然死症候群（ＳＤＳ）は、１９７１年にアーカンソー州で最初に発見され、それ以来、アメリカのほとんどのダイズ生育地域で確認されている。ＳＤＳは、ダイズシストセンチュウ（ＳＣＮ）との複合病害でも発生する真菌性病害である。ＳＤＳは、米国におけるダイズの最も破滅的な土壌病害の１つである。この病害がＳＣＮの存在下で発生すると、症状はより早く発生し、より重度となる。ＳＤＳは、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）上種のグループ内の土壌真菌によって引き起こされる。北米では、以前はフザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）分化型グリシネス（ｇｌｙｃｉｎｅｓ）であった、フザリウム・ビルグリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｉｒｇｕｌｉｆｏｒｍｅ）が病原体である。南アメリカでは、Ｆ．ブラジリエンス（Ｆ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅ）、Ｆ．クネイロストラム（Ｆ．ｃｕｎｅｉｒｏｓｔｒｕｍ）、Ｆ．ツクマニアエ（Ｆ．ｔｕｃｕｍａｎｉａｅ）、およびＦ．ビルグリフォルメ（Ｆ．ｖｉｒｇｕｌｉｆｏｒｍｅ）がＳＤＳの症状を引き起こす。ＳＤＳに対する感受性がより低いダイズ品種が開発されているが、入手可能な高抵抗性品種はない。真菌は植えた後すぐにダイズの苗の根に感染し得るが、ＳＤＳの地上症状は、ダイズ植物が生殖ステージに達するまでめったに現れない。真菌は根で毒素を産生し、それが葉に移動する。ＳＤＳの最初の顕著な症状は、上葉の黄化および落葉である。病害が早期に発現した場合、花および若い鞘は発育しない。病害が後に発現すると、植物は鞘当たりの種子数がより少なくなるか、または種子がより小さくなる。早期に重度の病害が発現するほど、収量は減少する。ＳＤＳ菌は長期間土壌に残存する可能性があるため、圃場の大部分が影響を受けるまで、圃場のより広い領域では生育シーズンごとに病害の症状が現れる（Ｗｅｓｔｐｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｓｕｄｄｅｎ  Ｄｅａｔｈ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｏｆ  Ｓｏｙｂｅａｎ．Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｏｒ．ＤＯＩ：１０．１０９４／ＰＨＩ−Ｉ−２００８−０１０２−０１、ｗｗｗ．ａｐｓｎｅｔ．ｏｒｇ／ｅｄｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｔｒｏｐｐ／ｌｅｓｓｏｎｓ／ｆｕｎｇｉ／ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ／Ｐａｇｅｓ／ＳｕｄｄｅｎＤｅａｔｈ．ａｓｐｘ）。
【００１１】
現在、センチュウ抵抗性について遺伝子操作されたダイズ植物は商品化されていない。１つ以上の除草剤耐性遺伝子を含むダイズ植物は、当技術分野で開示されている。国際公開第２００６／１３０４３６号パンフレットは、ｅｐｓｐｓ遺伝子を含むグリホサート耐性ダイズイベントを記載し、国際公開第２０１１／０３４７０４号パンフレットは、ジカンバ耐性ダイズイベントを記載する。国際公開第２０１２／０８２５４８号パンフレットは、ｈｐｐｄおよびｐａｔ遺伝子の両方を含むダイズ植物について記載している。国際公開第２０１１／０６３４１１号パンフレットは、ＨＰＰＤ阻害剤およびグリホサートに対する耐性を有するダイズイベントを記載しており、一方、国際公開第２０１１／０６３４１３号パンフレットは、ＨＰＰＤ阻害剤、グルホシネートおよびグリホサートに対する耐性を有するダイズ植物について記載している。国際公開第２０１１／０６６３８４号パンフレットは、２，４−Ｄおよびグルホシネートに対する耐性を有するダイズイベントを記載しており、一方、国際公開第２０１２／０７５４２６号パンフレットは、２，４−Ｄ、グルホシネートおよびグリホサートに対する耐性を有するダイズイベントを記載し、国際公開第２０１７／０５９７９５号パンフレットは、グリホサートに対する耐性を有するダイズイベントを記載している。国際公開第２００９／０６４６５２号パンフレットは、鱗翅目昆虫に対する抵抗性を有するダイズイベントを記載しており、国際公開第２０１３／０１６５２７号パンフレットは、鱗翅目の昆虫に対する抵抗性およびグルホシネート耐性を有するダイズイベントを記載している。
【００１２】
ＨＰＰＤ阻害除草剤に対する改善した耐性を付与するＨＰＰＤ遺伝子およびタンパク質は、例えば、国際公開第２０１５１３８３９４号パンフレット、国際公開第２０１５１３５８８１号パンフレット、国際公開第２０１４０４３４３５号パンフレットに開示されており、Ｃｒｙタンパク質の殺センチュウ活性は、例えば、国際公開第２０１００２７８０５号パンフレット、国際公開第２０１００２７８０９号パンフレット、国際公開第２０１００２７８０４号パンフレット、国際公開第２０１００２７７９９号パンフレット、国際公開第２０１００２７８０８号パンフレットおよび国際公開第２００７１４７０２９号パンフレットに記載されている。
【００１３】
先行技術の開示はいずれも、センチュウ活性Ｃｒｙ遺伝子を含むダイズにおけるエリートイベントを教示も示唆もしておらず、もちろんＨＰＰＤ阻害剤に対する耐性を付与する遺伝子と組み合わされたセンチュウ活性Ｃｒｙ遺伝子を含むダイズにおけるエリートイベントを教示も示唆もしていない。
【００１４】
許容可能な農業成績を有するダイズ植物において商業的エリート形質転換イベントを得ることは決して簡単ではないことが当技術分野において公知である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、配列番号７のｃｒｙ１４Ａｂ−１．ｂコード配列などの、Ｃｒｙ１４Ａｂ−１タンパク質をコードする核酸、または配列番号７と少なくとも９５、９６、９７、９８、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、殺センチュウ性Ｃｒｙ１４Ａｂタンパク質をコードする配列を提供する。また、配列番号９のｈｐｐｄＰｆ−４Ｐａコード配列などの、ＨＰＰＤ−４タンパク質をコードする核酸、または配列番号９と少なくとも９５、９６、９７、９８、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列も本明細書に提供され、前記配列は、植物中で発現した場合にＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性を提供するＨＰＰＤタンパク質をコードする。また、ヌクレオチド位置１３１からヌクレオチド位置５２７６までの配列番号１１の配列、もしくはその相補体を含むｃｒｙ１４Ａｂ−１．ｂキメラ遺伝子、または植物発現プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド位置４１２からヌクレオチド位置３９６９までの配列番号１１の配列を含むｃｒｙ１４Ａｂ−１．ｂキメラ遺伝子、またはヌクレオチド位置１３１からヌクレオチド位置５２７６までの配列番号１１の配列もしくはその相補体、またはヌクレオチド位置４１２からヌクレオチド位置３９６９までの配列番号１１の配列（植物発現プロモーターに作動可能に連結されている場合）と、少なくとも９５、９６、９７、９８、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、殺センチュウ性Ｃｒｙ１４Ａｂタンパク質をコードする配列も本明細書に適用される。さらに、ヌクレオチド位置５３８２からヌクレオチド位置７６２１までの配列番号１１の配列、もしくはその相補体を含む、または植物発現プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド位置５５８９からヌクレオチド位置６６６５までの配列番号１１の配列、またはヌクレオチド位置５３８２からヌクレオチド位置７６２１までの配列番号１１の配列もしくはその相補体と、もしくはヌクレオチド位置５５８９からヌクレオチド位置６６６５までの配列番号１１の配列（植物発現プロモーターに作動可能に連結されている場合）と、少なくとも９５、９６、９７、９８、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む、ｈｐｐｄＰｆ−４Ｐａキメラ遺伝子が本明細書に提供される。前記配列は、植物中で発現した場合にＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性を提供するＨＰＰＤタンパク質、ならびに前記ｃｒｙ１４Ａｂ−１．ｂキメラおよび前記ｈｐｐｄＰｆ−４Ｐａキメラ遺伝子を含む核酸をコードする。これらの核酸または遺伝子は、ダイズ、綿、トウモロコシ、イネ、ナタネ、およびコムギなどの植物を、それらがセンチュウを防除しおよび／またはＨＰＰＤ阻害除草剤耐性を有するように形質転換するのに有用である。
【００１６】
また、ヌクレオチド位置１３１からヌクレオチド位置７９４１までの配列番号１１のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むキメラＤＮＡ分子も本明細書に提供される。一実施形態では、このＤＮＡ分子は、ＨＰＰＤ阻害剤に対して耐性のタンパク質、およびＳＣＮ、ＲＫＮまたはネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）種センチュウなどの植物病害センチュウに負の影響を与えるタンパク質をコードする。一実施形態では、このキメラＤＮＡ分子は、配列番号８のタンパク質またはそれと少なくとも９９％同一のセンチュウ防除タンパク質、および配列番号１０のタンパク質またはそれと少なくとも９９％同一のＨＰＰＤ阻害剤耐性タンパク質をコードする。また、そのようなＤＮＡ分子を含有するように形質転換されたダイズ植物、種子、または細胞などの植物、種子、または細胞、およびダイズ植物または種子などの植物または種子を、センチュウに対して抵抗性かつＨＰＰＤ阻害除草剤に対して耐性とするためのそのようなＤＮＡ分子の使用も提供される。
【００１７】
本発明は、ダイズシストセンチュウなどの植物寄生性センチュウに対する抵抗性、およびイソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性を提供する、そのゲノムに安定に組み込まれたｃｒｙ１４Ａｂ−１．ｂ遺伝子のコード配列を含む線虫抵抗性遺伝子およびｈｐｐｄＰｆ−４Ｐａ遺伝子のコード配列を含む除草剤耐性遺伝子を含む発現カセット（両方、本明細書の実施例１．１に記載され、それぞれ配列番号７および９に示される）を含む、トランスジェニックダイズ植物、植物部分、種子、細胞またはその組織に関する。ＨＰＰＤ阻害除草剤およびセンチュウのプレッシャーの不存在下で、そのようなダイズ植物は、非トランスジェニック同質遺伝子系統と実質的に同等の農業成績を有する。圃場で植物性能に影響を与えるダイズシストセンチュウ（ＳＣＮ）プレッシャーに遭遇すると、本発明の植物は、非トランスジェニック植物と比較して優れた農学的表現型を有するであろう。また、雑草の存在下で、耐性が与えられるＨＰＰＤ阻害除草剤の施用後、本発明の植物は、除草剤で処理されていない植物と比較して、優れた農学的表現型を有するであろう。
【００１８】
本発明によると、ダイズ植物またはその種子、細胞もしくは組織は、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含む。一実施形態では、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４は、配列番号１、３、５、もしくは２４のいずれか１つの配列、または配列番号２、４、６、もしくは２５のいずれか１つの配列を含む。一実施形態では、ＥＥ−ＧＭ４は、配列番号１、３、５、もしくは２４のいずれか１つの配列、および配列番号２、４、６、もしくは２５のいずれか１つの配列、ならびに配列番号７のｃｒｙ１４Ａｂ−１．ｂコード配列および配列番号９のｈｐｐｄＰｆ−４Ｐａコード配列を含む。一実施形態では、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４は、寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託された参照種子に含有される、ダイズゲノムの特定の位置に挿入された外のＤＮＡ（または挿入されたＴ−ＤＮＡ）である。一実施形態では、ＥＥ−ＧＭ４中のそのような挿入されたＴ−ＤＮＡは、キメラＣｒｙ１４Ａｂ−１をコードする遺伝子およびＨＰＰＤ−４をコードする遺伝子を含む。別の実施形態では、前記イベントは、配列番号１もしくは３の５’接合配列によって、または配列番号２もしくは４の３’接合配列によって；または配列番号１もしくは３の５’接合配列によって、および配列番号２もしくは４の３’接合配列によって、特徴付けられる。一実施形態では、ＥＥ−ＧＭ４含有ゲノムＤＮＡは、それぞれ配列番号１２および配列番号１３のヌクレオチド配列を含む２つのプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（本明細書で「ＰＣＲ」）を使用して分析した場合、１２６ｂｐのＤＮＡ断片を生じる。一実施形態では、ＥＥ−ＧＭ４含有ゲノムＤＮＡは、それぞれ配列番号２０および配列番号２１のヌクレオチド配列を含む２つのプライマーを用いてＰＣＲを使用して分析した場合、９０ｂｐのＤＮＡ断片を生じる。
【００１９】
本明細書の一実施形態では、それぞれがそのゲノム中にエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含み、前記イベントを含む参照種子が寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託されている、ダイズ植物、細胞、植物部分、種子またはその子孫が提供される。一実施形態では、ＥＥ−ＧＭ４を含む植物または種子は、寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託された種子から生育したダイズ植物の繁殖によって、および／またはそれを用いた育種によって得ることができる。
【００２０】
より具体的には、本発明は、トランスジェニックダイズ植物、植物部分、花粉、種子、細胞またはその組織に関し、そのゲノムＤＮＡは、本明細書に記載のようにＰＣＲで分析した場合、ＥＥ−ＧＭ４の５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域の一部および挿入Ｔ−ＤＮＡの一部によって形成される領域に指向された少なくとも２つのプライマーを使用して、イベントＥＥ−ＧＭ４に特異的な断片が増幅されるという事実によって特徴付けられる。プライマーは、配列番号６もしくは配列番号２５内の３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域、またはその下流に隣接するダイズ植物ゲノムＤＮＡ、およびその上流に隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡに指向されてもよい。プライマーはまた、配列番号５または配列番号２４内の５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域、またはその上流に隣接するダイズ植物ゲノムＤＮＡ、およびその下流に隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡに指向されてもよい。一実施形態では、そのようなプライマーは、それぞれ配列番号１２および配列番号１３、または配列番号２０および配列番号２１、または配列番号２６および配列番号２８、または配列番号２７および配列番号２９のヌクレオチド配列（例えば、その３’末端に配列番号１２のヌクレオチド配列を含有するプライマーおよびその３’末端に配列番号１３のヌクレオチド配列を含有するプライマーを含むプライマー対、またはその３’末端に配列番号２０のヌクレオチド配列を含むプライマーおよびその３’末端に配列番号２１のヌクレオチド配列を含有するプライマーを含むプライマー対、またはその３’末端に配列番号２６のヌクレオチド配列を含有するプライマーおよびその３’末端に配列番号２８のヌクレオチド配列を含有するプライマーを含むプライマー対、またはその３’末端に配列番号２７のヌクレオチド配列を含有するプライマーおよびその３’末端に配列番号２９のヌクレオチド配列を含有するプライマーを含むプライマー対）を含むか、または（本質的に）それからなり、１２６ｂｐまたは９０ｂｐの断片などの、５０〜１０００ｂｐのＤＮＡ断片を生成する。
【００２１】
本発明のエリートイベントを含む参照種子は、受託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託されている。本発明の一実施形態は、ダイズ植物に導入されると、センチュウに対する抵抗性および除草剤に対する耐性、特に、ダイズシストセンチュウ（ヘテロデラ・グリシネス（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ）、本明細書で「ＳＣＮ」）および／または病変センチュウ（本明細書中で使用される場合、病変センチュウは、パイナップルネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）を含むがこれに限定されない、ネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）種ダイズ病害センチュウを指す）に対する抵抗性およびイソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害剤に対する耐性を提供する、受託番号ＰＴＡ−１２３６２４で寄託された種子に含有されるエリートイベントＥＥ−ＧＭ４である。本発明のＥＥ−ＧＭ４を有する植物はまた、ネコブセンチュウ（本明細書中で使用される場合、ネコブセンチュウは、サツマイモネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）、アレナリアネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ａｒｅｎａｒｉａ）、キタネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｈａｐｌａ）、またはジャワネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｊａｖａｎｉｃａ）、またはその任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、ネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ）種ダイズ病害センチュウを指す）、ニセフクロセンチュウ（ナミニセフクロセンチュウ（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））、およびランスセンチュウ（Ｈ．コルムブス（Ｈ．ｃｏｌｕｍｂｕｓ）、Ｈ．ガレアツス（Ｈ．ｇａｌｅａｔｕｓ）、およびＨ．マグニスチルス（Ｈ．ｍａｇｎｉｓｔｙｌｕｓ）などのヤリセンチュウ（Ｈｏｐｌｏｌａｉｍｕｓ）種）を防除する。寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託された種子に含有される、ＥＥ−ＧＭ４のヌクレオチド配列と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する、ＨＰＰＤ阻害剤耐性およびＳＣＮセンチュウ抵抗性を有するダイズイベント、またはＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ−１２３６２４の寄託種子に含有されるＥＥ−ＧＭ４のヌクレオチド配列から１〜２００、１〜１５０、１〜１００、１〜７５、１〜５０、１〜３０、１〜２０、１〜１０、または１〜５ヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を有する、または以下の連続したヌクレオチド配列（５’から３’）：配列番号５または配列番号２４、ヌクレオチド位置１８８からヌクレオチド位置７３６８までの配列番号１１、および配列番号６または配列番号２５によって形成されたヌクレオチド配列から１〜２００、１〜１５０、１〜１００、１〜７５、１〜５０、１〜３０、１〜２０、１〜１０、または１〜５ヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を有する、ＨＰＰＤ阻害剤耐性およびＳＣＮセンチュウ抵抗性を有するダイズイベントなどの、このイベントの少しの変異型が本発明に含まれる。一実施形態では、ＥＥ−ＧＭ４は、以下の連続したヌ���レオチド配列（５’から３’）：配列番号５または２４、ヌクレオチド位置１８８からヌクレオチド位置７３６８までの配列番号１１、および配列番号６または２５によって形成されたヌクレオチド配列と、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。天然の遺伝的変異、単一ＤＮＡ塩基の相違、相同ＤＮＡ配列における小さな挿入および欠失（例えば、一塩基多型（ＳＮＰ））は、同種の植物によく見出される（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６３：１１２３−１１３４）。
【００２２】
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４の種子は、本発明のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４についてホモ接合性のトランスジェニック種子の純粋なシードロットであり、これはセンチュウ抵抗性植物へと生育し、それにより、植物はイソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害剤に対しても耐性である。寄託された種子から得ることができる種子または子孫種子（例えば、異なる遺伝的背景を有する他のダイズ植物と交雑した後）を蒔くことができ、生育する植物を、本明細書に記載のイソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害剤で処理することができる、または本発明のエリートイベントを含む植物を得るために、本明細書に記載されるようにＥＥ−ＧＭ４の存在について試験することができる。本発明はさらに、受託番号ＰＴＡ−１２３６２４を有するＡＴＣＣに寄託された種子から生育した本発明のエリートイベントを含む植物由来の細胞、種子、組織、子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）、および子孫（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）に関する。本発明はさらに、本発明のエリートイベントを含むダイズ植物から（例えば、その繁殖および／またはそれとの育種によって）得ることができる植物（受託番号ＰＴＡ−１２３６２４を有するＡＴＣＣに寄託された種子から生育した植物、または配列番号１、３または５の配列と配列番号２、４または６の配列との間に位置する配列番号９のｈｐｐｄＰｆ−４Ｐａコード配列および配列番号７のｃｒｙ１４Ａｂ−１．ｂコード配列を含む植物、または配列番号１、３、５、または２４の配列のいずれか１つと配列番号２、４、６、または２５の配列のいずれか１つとの間に位置する配列番号９のＨＰＰＤコード配列および配列番号７のｃｒｙ１４Ａｂ−１．ｂコード配列を含む植物など）に関する。本発明はまた、上記の植物または種子から得られた子孫植物および種子に関し、それは配列番号１の配列および配列番号２の配列、または配列番号３の配列および配列番号４の配列、または配列番号５の配列および配列番号６の配列、または配列番号２４の配列および配列番号２５の配列を含む。
【００２３】
本発明はさらに、その方法がトランスジェニック植物、細胞または組織中の特徴的なＤＮＡ配列またはそのようなＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸の存在の同定に基づくものである、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含む、トランスジェニック植物またはその細胞もしくは組織を同定する方法に関する。本発明の好ましい実施形態によれば、そのような特徴的なＤＮＡ配列は、イベントの挿入部位を含む、１５ｂｐまたは少なくとも１５ｂｐ、好ましくは２０ｂｐまたは少なくとも２０ｂｐ、最も好ましくは３０ｂｐ以上の配列、すなわち、ダイズ植物ゲノムへと伸長する、ＨＰＰＤ阻害剤およびセンチュウ抵抗性導入遺伝子を含有する挿入Ｔ−ＤＮＡの一部ならびにそれに隣接する５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域の一部の両方を含有する配列であり、これにより、エリートイベントの特異的同定が可能となる。本発明はまた、本明細書で同定されたイベントＥＥ−ＧＭ４を含む植物、種子および細胞に関する。
【００２４】
本発明はさらに、生物学的試料中のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を同定する方法に関し、その方法は、５’および／または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列およびそれに隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡを特異的に認識するプライマーまたはプローブに基づく。全体または部分（指向）ゲノム配列決定などの、ＥＥ−ＧＭ４を同定するための、例えば、その特定の特徴的配列を同定するための他の方法もまた、本明細書に含まれる。
【００２５】
より具体的には、本発明は、好ましくは５０〜１０００ｂｐのサイズのＤＮＡ断片を得るために、少なくとも２つのプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応または少なくとも２つのプライマーおよびプローブを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記生物学的試料中に存在する核酸の配列を増幅するステップであって、これらのプライマーのうち１つが、ＥＥ−ＧＭ４の５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識し、他方のプライマーが、前記５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域に隣接する、除草剤耐性およびセンチュウ抵抗性遺伝子を含む挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を認識する、ステップを含む、生物学的試料中のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を同定する方法に関する。一実施形態では、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４に特徴的なＤＮＡ断片を得るために、第１のプライマーが、ＥＥ−ＧＭ４の５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識し、第２のプライマーが、前記５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域の下流に隣接する除草剤耐性およびセンチュウ抵抗性遺伝子を含む挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を認識するか、または第１のプライマーが、ＥＥ−ＧＭ４の３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識し、第２のプライマーが、前記３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域の上流に隣接する除草剤耐性およびセンチュウ抵抗性遺伝子を含む挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を認識する。一実施形態では、前記ポリメラーゼ連鎖反応法は、前記プライマーによって産生された増幅産物を検出するため、前記プライマーによって増幅されたＤＮＡ、例えば、ＥＥ−ＧＭ４中の挿入Ｔ−ＤＮＡの一部および前記Ｔ−ＤＮＡに隣接するＤＮＡの一部を含む（場合に応じて、本明細書の配列番号１４または２２のヌクレオチド配列を含むプローブの、イベントの５’側または３’側のいずれかにおいて）接合ＤＮＡ、を認識するプローブの使用をさらに含む。プライマーは、それぞれ、ＥＥ−ＧＭ４の５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域内（ヌクレオチド位置１からヌクレオチド位置２２７までの配列番号５、またはヌクレオチド位置１からヌクレオチド位置１０５８までの配列番号２４）、またはＥＥ−ＧＭ４の３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域内（ヌクレオチド位置２５４からヌクレオチド位置５０１までの配列番号６の相補体、またはヌクレオチド位置２５４からヌクレオチド位置１３３９までの配列番号２５）の配列、および挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列（ヌクレオチド位置２２８から３９８までの配列番号５、またはヌクレオチド位置１からヌクレオチド位置２５３までの配列番号６、またはヌクレオチド位置１０５９からヌクレオチド位置８６６３までの配列番号２３、またはその相補体）を認識し得る。５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識するプライマーは、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２６または配列番号２７のヌクレオチド配列を含み得、挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を認識するプライマーは、本明細書に記載の配列番号１２、配列番号２０、配列番号２８または配列番号２９のヌクレオチド配列を含み得る。本発明はまた、当業者によって得ることができる、または商業的供給源から得ることができる、任意のイベント特異的プライマー対およびそのようなプライマー対を用いて増幅された特異的ＤＮＡに関する。
【００２６】
本発明は、より具体的には、１２６ｂｐのＤＮＡ断片を得るため、それぞれ配列番号１２および配列番号１３のヌクレオチド配列を含むかまたはそれから（本質的に）なる２つのプライマーを用いた、または９０ｂｐのＤＮＡ断片を得るため、それぞれ配列番号２０および配列番号２１のヌクレオチド配列を含むかまたはそれから（本質的に）なる、２つのプライマーを用いた、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて生物学的試料中に存在する核酸の配列を増幅するステップを含む、生物学的試料中のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を同定する方法に関する。このようにして同定されたエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含む植物も本発明に含まれる。
【００２７】
本発明はさらに、生物学的試料中のＥＥ−ＧＭ４についての特異的な同定方法を開発するために使用することができる、本明細書に記載のＥＥ−ＧＭ４の特定のＴ−ＤＮＡ隣接配列に関する。そのような特異的Ｔ−ＤＮＡ隣接配列は、同定アッセイにおいて参照対照物質としても使用され得る。より具体的には、本発明は、本明細書にさらに記載されるように、特異的プライマーおよびプローブの開発に使用することができる、ＥＥ−ＧＭ４の５’および／または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域に関する。また、配列番号１２および配列番号１３、または配列番号２０および配列番号２１のヌクレオチド配列を含むかまたはそれから（本質的に）なるプライマーによって増幅することができる配列を含む、好ましくは１５０〜８５０ｂｐの、核酸分子も、参照物質として適している。
【００２８】
本発明はさらに、そのような特異的プライマーまたはプローブの使用に基づく、生物学的試料中のＥＥ−ＧＭ４の存在の同定方法に関する。プライマーは、ヌクレオチド１からヌクレオチド２２７までの配列番号５、もしくはヌクレオチド１からヌクレオチド１０５８までの配列番号２４のヌクレオチド配列、またはヌクレオチド２５４からヌクレオチド５０１までの配列番号６のヌクレオチド配列の相補体、またはヌクレオチド２５４からヌクレオチド１３３９までの配列番号２５のヌクレオチド配列の相補体から選択される連続した１７〜約２００ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる、またはそれから本質的になり得、ヌクレオチド２２８からヌクレオチド３９８までの配列番号５のヌクレオチド配列、またはヌクレオチド１からヌクレオチド２５３までの配列番号６のヌクレオチド配列、もしくはその相補体、またはヌクレオチド位置１７からヌクレオチド位置７６２１までの配列番号１１のヌクレオチド配列、もしくはその相補体から選択される連続した１７〜約２００ヌクレオチドのヌクレオチド配列などの、ヌクレオチド１７からヌクレオチド７６２１までの配列番号１１、またはヌクレオチド位置１０５９からヌクレオチド位置８６６３までの配列番号２３のヌクレオチド配列から選択される連続した１７〜約２００ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる、またはそれから本質的になるプライマーと組み合わされる。プライマーは、それらの３’末端に位置するこれらのヌクレオチド配列も含み得、無関係の配列、または言及されたヌクレオチド配列に由来するがミスマッチを含む配列をさらに含み得る。一実施形態では、本明細書で使用されるプライマーはまた、標的ＤＮＡまたはその相補体と同一であってもよく、ここで、前記標的ＤＮＡは、異なる起源のヌクレオチド配列を含有するハイブリッドであり、天然ではそのような組み合わせでは発生しない。
【００２９】
本発明は、生物学的試料中のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を同定するためのキットに関し、前記キットは、５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を特異的に認識する少なくとも１つのプライマー対またはプローブを含み、挿入Ｔ−ＤＮＡは、それに隣接する除草剤耐性およびセンチュウ抵抗性遺伝子をＥＥ−ＧＭ４中に含む。
【００３０】
本発明のキットは、ＥＥ−ＧＭ４の５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を特異的に認識するプライマーに加えて、ＰＣＲ同定プロトコルにおける使用のための、ＥＥ−ＧＭ４のＨＰＰＤ阻害除草剤耐性およびセンチュウ抵抗性遺伝子を含む挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を特異的に認識する第２のプライマーを含み得る。本発明のキットは、少なくとも２つの特異的プライマーを含み得、そのうちの１つは、ＥＥ−ＧＭ４の５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域内の配列またはＥＥ−ＧＭ４の３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域内の配列を認識し、もう一方は、ＨＰＰＤ阻害除草剤耐性およびセンチュウ抵抗性遺伝子を含む挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を認識する。５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識するプライマーは、配列番号２１のヌクレオチド配列を含み得、かつ挿入Ｔ−ＤＮＡを認識するプライマーは、配列番号２０のヌクレオチド配列を含み得る、または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識するプライマーは、配列番号１３のヌクレオチド配列を含み得、かつ挿入Ｔ−ＤＮＡを認識するプライマーは、配列番号１２のヌクレオチド配列を含み得る、または本明細書に記載されている、他の任意のプライマーまたはプライマーの組み合わせである。キットは、配列番号１４の配列を含むプローブまたは配列番号２２の配列を含むプローブなどの、５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識するプライマーと挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を認識するプライマーとの間に配置された配列を認識する、または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識するプライマーと挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を認識するプライマーとの間の配列を認識する、プローブをさらに含み得る。
【００３１】
本発明は、生物学的試料中のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を同定するためのキットに関し、前記キットは、本明細書に記載のＥＥ−ＧＭ４  ＰＣＲプロトコルにおける使用のために、配列番号１２および配列番号１３のヌクレオチド配列、または配列番号２０および配列番号２１のヌクレオチド配列を含むかまたはそれから（本質的に）なるＰＣＲプライマーを含む。配列番号１２および配列番号１３のヌクレオチド配列を含むかまたはそれから（本質的に）なるプライマーを含む前記キットは、配列番号１４のヌクレオチド配列を含むかまたはそれから（本質的に）なるプローブをさらに含み得、配列番号２０および配列番号２１のヌクレオチド配列を含むかまたはそれから（本質的に）なるプライマーを含む前記キットは、配列番号２２のヌクレオチド配列を含むかまたはそれから（本質的に）なるプローブをさらに含み得る。前記キットは、緩衝剤ならびにｄＮＴＰ、（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２、安定剤、および任意選択により染料のいずれかまたはそれぞれなどの試薬をさらに含み得る。
【００３２】
本発明はまた、生物学的試料中のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を同定するためのキットに関し、このキットは、ＥＥ−ＧＭ４の特定の領域と８０％〜１００％の配列同一性を有する配列に対応する（または相補的である）配列を含むか、または（本質的に）それからなる特異的プローブを含み、そのような特定の領域は、ＥＥ−ＧＭ４の５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域の一部およびそれに隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡの一部を含む。一実施形態では、プローブの配列は、ＥＥ−ＧＭ４の５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域の一部およびそれに隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡの一部を含む特定の領域に対応する。最も好ましくは、特異的プローブは、配列番号１、３または５のいずれか１つの配列と８０％〜１００％の配列同一性を有する配列、または配列番号２、４または６のいずれか１つの配列と８０％〜１００％の配列同一性を有する配列を含む、またはそれから（本質的に）なる（またはそれと相補的である）か、または特異的プローブは、配列番号５の配列の連続した少なくとも５０ヌクレオチドの一部と８０％〜１００％の配列同一性を有する配列、または配列番号６の配列の連続した少なくとも５０ヌクレオチドの一部と８０％〜１００％の配列同一性を有する配列を含む、またはそれから（本質的に）なり（またはそれと相補的であり）、配列番号５または６の前記部分のそれぞれは、およそ等しい長さの挿入Ｔ−ＤＮＡおよびＴ−ＤＮＡ隣接配列の配列を含む。
【００３３】
本発明の別の態様によれば、ＥＥ−ＧＭ４の検出のためのプライマーまたはプローブとして有用であるように、またはイベントＥＥ−ＧＭ４を含む植物を特徴付けるために、Ｔ−ＤＮＡ隣接配列およびＥＥ−ＧＭ４の挿入Ｔ−ＤＮＡの両方の十分な長さのポリヌクレオチドを含むＤＮＡ分子が開示される。そのような配列は、接合部位の両側にそれぞれ、そしてＥＥ−ＧＭ４イベントの５’および３’接合部位のどちらかまたは両方に、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも３０ヌクレオチドのいずれか１つを含んでもよく、またはＴ−ＤＮＡ隣接配列の９、１０、１５、２０または３０ヌクレオチドのいずれか１つおよび同数のＥＥ−ＧＭ４の挿入Ｔ−ＤＮＡのヌクレオチドを含んでもよい。最も好ましくは、そのようなＤＮＡ分子は、配列番号１、３、もしくは５のいずれか１つの配列、または配列番号２、４、もしくは６のいずれか１つの配列を含む。一実施形態では、そのようなＤＮＡ分子は、配列番号２３、２４または２５の配列を含む。本発明の一態様では、そのような特異的ＤＮＡ分子を含むダイズ植物および種子が提供される。
【００３４】
本発明に包含される方法およびキットは、植物、植物材料中、または植物材料を含むかまたはそれに由来する食品または飼料産物（新鮮または加工）などの、しかしこれらに限定されない産物中の、ＥＥ−ＧＭ４の存在を同定する、または（下限）閾値を決定するためなどの、しかしこれに限定されない、異なる目的に使用することができ、追加的または代替的に、本発明の方法およびキットは、トランスジェニック材料と非トランスジェニック材料との分離の目的でトランスジェニック植物材料を同定するために使用することができ、追加的または代替的に、本発明の方法およびキットは、ＥＥ−ＧＭ４を含む植物材料の質（すなわち、純粋な材料のパーセンテージ）を決定するために使用することができる。
【００３５】
本発明はさらに、ＥＥ−ＧＭ４の５’および／または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域、およびＥＥ−ＧＭ４の５’および／または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列から開発された特異的プライマーおよびプローブ、に関する。
【００３６】
本発明はまた、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含む植物から得られたゲノムＤＮＡ、特に、１つまたは両方のＥＥ−ＧＭ４接合配列（ＥＥ−ＧＭ４に特徴的な、Ｔ−ＤＮＡ隣接ＤＮＡの一部およびそれに隣接する挿入ＤＮＡを含有する）など、例えば、配列番号１、３、５、もしくは２４の配列のいずれか１つ、および／または配列番号２、４、６、もしくは２５の配列のいずれか１つの、ＥＥ−ＧＭ４イベント特異的配列を含むゲノムＤＮＡに関する。そのようなゲノムＤＮＡは、本明細書中に記載される同定アッセイにおいて参照対照材料として使用され得る。
【００３７】
それぞれ少なくとも１つのエリートイベントを含む、トランスジェニックセンチュウ抵抗性および除草剤耐性ダイズ植物、またはその細胞、部分、種子もしくは子孫も、本明細書に提供され、前記エリートイベントは、
ｉ）植物発現プロモーターおよび配列番号７のコード配列を含むキメラ遺伝子などの、植物発現プロモーターの制御下にあるＣｒｙ１４Ａｂ−１タンパク質をコードするバチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）由来のｃｒｙ１４Ａｂ−１．ｂ遺伝子を含む第１のキメラ遺伝子
ｉｉ）植物発現プロモーターおよび配列番号９のコード配列を含むキメラなどの、植物発現プロモーターの制御下にある、より耐性の高いＨＰＰＤ酵素をコードするシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）由来の改変型ｈｐｐｄＰｆ−４Ｐａ遺伝子を含む第２のキメラ遺伝子
を含む挿入Ｔ−ＤＮＡを含む。
【００３８】
一実施形態では、前記エリートイベントは、前記挿入Ｔ−ＤＮＡのすぐ上流に隣接する配列番号５のヌクレオチド１〜２２７または配列番号２４の１〜１０５８、および前記挿入Ｔ−ＤＮＡのすぐ下流に隣接する配列番号６のヌクレオチド２５４〜５０１または配列番号２５のヌクレオチド２５４〜１３３９を含む。
【００３９】
さらなる実施形態では、前記エリートイベントは、寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託されている前記イベントを含む参照種子から生育するダイズ植物との育種によって得ることができる。
【００４０】
別の実施形態では、前記ダイズ植物、またはその細胞、部分、種子もしくは子孫のゲノムＤＮＡは、それぞれ配列番号１２および配列番号１３のヌクレオチド配列を含む２つのプライマーを用いてＰＣＲを使用して分析した場合、１２６ｂｐのＤＮＡ断片を生じ、またはそれぞれ配列番号２０および配列番号２１のヌクレオチド配列を含む２つのプライマーを用いてＰＣＲを使用して分析した場合、９０ｂｐのＤＮＡ断片を生じる。
【００４１】
また、ＳＣＮおよび／またはネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）および／またはネコブおよび／またはニセフクロセンチュウ抵抗性などのセンチュウ抵抗性、および生物学的試料中のイソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性を有するトランスジェニックダイズ植物、またはその細胞、部分、種子もしくは子孫を同定する方法も本明細書に提供され、前記方法は、少なくとも２つのプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて生物学的試料中に存在する核酸からの５０〜１５０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅することを含み、前記プライマーのうち１つは、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４の５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識し、前記５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域がヌクレオチド１からヌクレオチド２２７までの配列番号５、もしくはヌクレオチド１からヌクレオチド１０５８までの配列番号２４のヌクレオチド配列を含み、または前記エリートイベントの３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識し、前記３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域がヌクレオチド２５４からヌクレオチド５０１までの配列番号６の相補体のヌクレオチド配列、もしくはヌクレオチド２５４からヌクレオチド１３３９までの配列番号２５の相補体のヌクレオチド配列を含み、前記プライマーのうち他方は、ヌクレオチド２２８からヌクレオチド３９８までの配列番号５の相補体のヌクレオチド配列、またはヌクレオチド１からヌクレオチド２５３までの配列番号６のヌクレオチド配列を含む、挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を認識し、または、前記挿入Ｔ−ＤＮＡは、ヌクレオチド位置１７からヌクレオチド位置７６２１までの配列番号１１のヌクレオチド配列、またはその相補体を含む。
【００４２】
また、生物学的試料において、センチュウ抵抗性およびＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性を有するトランスジェニックダイズ植物、またはその細胞、部分、種子もしくは子孫を同定するためのキットも本明細書に提供され、前記キットは、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４の５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識する１つのプライマーであって、前記５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域がヌクレオチド１からヌクレオチド２２７までの配列番号５のヌクレオチド配列、もしくはヌクレオチド１からヌクレオチド１０５８までの配列番号２４のヌクレオチド配列を含む、プライマー、または前記エリートイベントの３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識する１つのプライマーであって、前記３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域がヌクレオチド２５４からヌクレオチド５０１までの配列番号６の相補体のヌクレオチド配列、もしくはヌクレオチド２５４からヌクレオチド１３３９までの配列番号２５の相補体のヌクレオチド配列を含む、プライマー、および挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を認識する１つのプライマーであって、前記挿入Ｔ−ＤＮＡがヌクレオチド２２８からヌクレオチド３９８までの配列番号５の相補体のヌクレオチド配列、またはヌクレオチド１からヌクレオチド２５３までの配列番号６のヌクレオチド配列を含む、または、前記挿入Ｔ−ＤＮＡがヌクレオチド位置１７からヌクレオチド位置７６２１までの配列番号１１のヌクレオチド配列、またはその相補体を含む、プライマーを含む。
【００４３】
本発明の一実施形態では、本明細書で使用される、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４の挿入Ｔ−ＤＮＡは、ヌクレオチド２２８からヌクレオチド３９８までの配列番号５のヌクレオチド配列もしくはその相補体、またはヌクレオチド２５４からヌクレオチド５０１までの配列番号６のヌクレオチド配列もしくはその相補体を含むか、またはヌクレオチド位置１７からヌクレオチド位置７６２１までの配列番号１１のヌクレオチド配列と、少なくとも９５、９８、９９、９９．５、または９９．９％の配列同一性を有する配列、またはその相補体を含む。
【００４４】
また、配列番号１、３、５、もしくは２４のいずれか１つのヌクレオチド配列、またはそれと８０〜１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列および／または配列番号２、４、６、もしくは２５、またはそれと８０〜１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、およびヌクレオチド位置１８８からヌクレオチド位置７３６８までの配列番号１１のヌクレオチド配列またはその相補体と、少なくとも８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、９９．５、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子をそれらのゲノム中に含むダイズ植物、植物細胞、組織、または種子も本明細書で提供される。
【００４５】
本発明の一実施形態は、標準的ストリンジェンシー条件下で配列番号１、３、もしくは５のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補体にハイブリダイズする、または配列番号２、４もしくは６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補体にハイブリダイズする核酸分子をそれらのゲノム中に含むダイズ植物、植物細胞、組織、または種子を提供する。
【００４６】
また、配列番号１、３、５、もしくは２４のいずれか１つのヌクレオチド配列、またはその相補体と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するか、または配列番号２、４、６、もしくは２５のいずれか１つのヌクレオチド配列、またはその相補体と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離核酸分子、または標準的ストリンジェンシー条件下で配列番号１、３、５、もしくは２４のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補体に、または配列番号２、４、６、もしくは２５のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補体にハイブリダイズする核酸配列を含む単離核酸分子も本明細書に提供される。
【００４７】
また、配列番号７のヌクレオチド配列、またはその相補体と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離核酸分子、または標準的ストリンジェンシー条件下で配列番号７のヌクレオチド配列またはその相補体にハイブリダイズする核酸配列を含む単離核酸分子も本明細書に提供され、そのような核酸分子は、ヘテロデラ・グリシネス（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ）および／またはパイナップルネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）および／またはサツマイモネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）および／またはナミニセフクロセンチュウ（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）などの、シストセンチュウおよび／または病害センチュウおよび／またはネコブセンチュウおよび／またはニセフクロセンチュウに対して活性な殺センチュウ性毒素をコードする。一実施形態では、そのような核酸分子は、キメラ遺伝子を形成するように、（異種）植物発現性プロモーターを含む核酸分子に作動可能に連結されている。植物病原性センチュウを防除するための形質転換植物または種子における前記核酸分子の使用も本明細書で提供される。さらに、植物発現プロモーターの制御下で、Ｃｒｙ１４Ａｂタンパク質、またはＣｒｙ１４Ａｂタンパク質をコードするＤＮＡ、または前記ＤＮＡを含有する植物または種子を使用するステップを含むサツマイモネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）、アレナリアネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ａｒｅｎａｒｉａ）、キタネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｈａｐｌａ）、またはジャワネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｊａｖａｎｉｃａ）などのネコブセンチュウ、特に、サツマイモネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）を防除する方法が本明細書に提供され、前記Ｃｒｙ１４Ａｂタンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列を含むタンパク質、またはそれと少なくとも９６％もしくは少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質、またはアミノ酸位置１からアミノ酸位置７０６までの配列番号８のアミノ酸配列を含むタンパク質、またはそれと少なくとも９６％もしくは少なくとも９８もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質である。さらに、植物発現プロモーターの制御下で、Ｃｒｙ１４Ａｂタンパク質、またはＣｒｙ１４Ａｂタンパク質をコードするＤＮＡ、または前記ＤＮＡを含有する植物または種子を使用するステップを含む、ニセフクロセンチュウ（ナミニセフクロセンチュウ（Ｒｏｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））を防除する方法が本明細書に提供され、前記Ｃｒｙ１４Ａｂタンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列を含むタンパク質、またはそれと少なくとも９６％もしくは少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質、またはアミノ酸位置１からアミノ酸位置７０６までの配列番号８のアミノ酸配列を含むタンパク質、またはそれと少なくとも９６％もしくは少なくとも９８％もしくは少���くとも９９％の配列同一性を有するタンパク質である。
【００４８】
また、ヌクレオチド位置１３１からヌクレオチド位置７９４１までの配列番号１１のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記核酸分子が、殺センチュウ性Ｃｒｙ１４Ａｂタンパク質およびＨＰＰＤ阻害剤に耐性のＨＰＰＤタンパク質をコードする、核酸分子も本明細書に提供される。一実施形態では、その核酸分子は、配列番号８のタンパク質またはそれと少なくとも９９％同一のタンパク質、および配列番号１０のタンパク質またはそれと少なくとも９９％同一のタンパク質をコードする。
【００４９】
また、定義された遺伝子座における挿入Ｔ−ＤＮＡであるエリートイベントＥＥ−ＧＭ４をそのゲノム中に含むダイズ植物細胞であって、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４が、寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託された参照種子に含有されるものであり、前記挿入Ｔ−ＤＮＡが、Ｃｒｙ１４Ａｂ−１をコードするキメラ遺伝子およびＨＰＰＤ−４をコードするキメラ遺伝子を含み、前記エリートイベントが、配列番号１または３の５’接合配列および配列番号２または４の３’接合配列によって特徴付けられる、細胞；または種子細胞であるそのような細胞、もしくはそれぞれ配列番号１２および配列番号１３のヌクレオチド配列を含む２つのプライマーを用いてＰＣＲを使用して分析した場合、前記細胞のゲノムＤＮＡが１２６ｂｐのＤＮＡ断片を生じる、そのような細胞も本明細書に提供される。
【００５０】
本発明は、寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託された参照種子に含有されるエリートイベントＥＥ−ＧＭ４のヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供し、前記エリートイベントは、キメラＣｒｙ１４Ａｂ−１をコードする遺伝子およびＨＰＰＤ−４をコードする遺伝子を含み、配列番号１または３の配列および配列番号２または４の配列を含む。
【００５１】
本発明はまた、ヌクレオチド１８８からヌクレオチド７３６８までの配列番号１１のヌクレオチド配列と少なくとも９９．５％または少なくとも９９．９％同一である配列ｂ）を含む核酸分子などの、以下のヌクレオチド配列を順番に含む核酸分子を提供する：ａ）ヌクレオチド１から２２７までの配列番号５のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９９％同一の配列、ｂ）ヌクレオチド１８８からヌクレオチド７３６８までの配列番号１１のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９９％同一の配列、およびｃ）ヌクレオチド２５４からヌクレオチド５０１までの配列番号６のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９９％同一の配列。
【００５２】
本発明はまた、配列番号２３のヌクレオチド配列と少なくとも９９．５％または少なくとも９９．９％同一である配列ｂ）を含む核酸分子などの、以下のヌクレオチド配列を順番に含む核酸分子を提供する：ａ）ヌクレオチド１から１０５８までの配列番号２４のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９９％同一の配列、ｂ）ヌクレオチド位置１０５９からヌクレオチド位置８６６３までの配列番号２３のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９９％同一の配列、およびｃ）ヌクレオチド２５４からヌクレオチド１３３９までの配列番号２５のヌクレオチド配列またはそれと少なくとも９９％同一の配列。
【００５３】
本発明によれば、上記のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ種子を得るステップ、およびそれからダイズ産物を産生するステップを含む、ダイズ産物を産生する方法も提供される。一実施形態では、そのような方法におけるダイズ産物は、ダイズミール、粉砕種子、粉、またはフレーク、またはダイズ油、ダイズタンパク質、レシチン、豆乳、豆腐、マーガリン、バイオディーゼル、バイオコンポジット、接着剤、溶剤、潤滑剤、洗浄剤、フォーム、塗料、インク、キャンドル、またはダイズ油もしくはダイズタンパク質含有食品、または飼料製品であるか、またはそれを含む。別の実施形態では、そのようなダイズ産物はエリートイベントＥＥ−ＧＭ４に特異的な核酸を含む。一実施形態では、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４に特異的な前記核酸は、配列番号１もしくは３の配列、または配列番号２もしくは４の配列を含む。
【００５４】
また、上記のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含む種子から産生されたダイズ産物も本明細書に提供され、前記ダイズ産物は、ダイズミール、粉砕種子、粉、またはフレークであるか、またはそれを含み、かつエリートイベントＥＥ−ＧＭ４に特異的な核酸を含み、前記核酸は、本明細書に記載の方法を用いて検出可能である。一実施形態では、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４に特異的な前記核酸は、配列番号１もしくは３の配列、または配列番号２もしくは４の配列を含む。別の実施形態では、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４に特異的な前記核酸は、配列番号５もしくは２４の配列、または配列番号６もしくは２５の配列を含む。一実施形態では、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４に特異的な前記核酸は、配列番号５もしくは２４の配列、および配列番号６もしくは２５の配列を含む。
【００５５】
エリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ種子の、ダイズ産物を得るための使用も本明細書で提供され、前記エリートイベントは、配列番号１、３、５もしくは２４のいずれか１つの配列、および／または配列番号２、４、６、もしくは２５のいずれか１つの配列を含む。一実施形態では、そのような使用において、ダイズ産物は、ダイズミール、粉砕ダイズ種子、ダイズ粉またはダイズフレークのいずれか１つである。
【００５６】
さらに、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４を、同じダイズ植物／種子に発生する別のＳＣＮ耐性遺伝子座／遺伝子と組み合わせること、およびＥＥ−ＧＭ４と前記他のＳＣＮ抵抗性遺伝子座／遺伝子とを含む種子を植えることなどによって、別のＳＣＮ抵抗性遺伝子座／遺伝子と組み合わせたエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ植物または種子の産生方法が本明細書に提供される。一実施形態では、本発明の植物、細胞または種子は、本発明のダイズ植物、細胞または種子における異なるＳＣＮ抵抗性源の組み合わせを得るために、ダイズに発生する１つ以上の他のＳＣＮ耐性遺伝子座／遺伝子を含有する。いくつかのダイズＳＣＮ抵抗性遺伝子座または遺伝子が知られており、抵抗性供給源ＰＩ  ８８７８８、ＰＩ  ５４８４０２（Ｐｅｋｉｎｇ）、ＰＩ  ４３７６５４（ＨａｒｔｗｉｇまたはＣｙｓｔＸ（登録商標））由来のＳＣＮ抵抗性遺伝子／遺伝子座のいずれか１つ、またはその任意の組み合わせ、または１つ以上の天然ＳＣＮ耐性遺伝子座／遺伝子ｒｈｇ１、ｒｈｇ１−ｂ、ｒｈｇ２、ｒｈｇ３、Ｒｈｇ４、Ｒｈｇ５、ｑＳＣＮ１１、ｃｑＳＣＮ−００３、ｃｑＳＣＮ−００５、ｃｑＳＣＮ−００６、ｃｑＳＣＮ−００７、またはダイズ染色体１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のいずれか１つにつき同定されたＳＣＮ抵抗性遺伝子座のいずれか、またはその任意の組み合わせなどの、それらのうちの１つ以上は、同じ植物、細胞または種子中のＥＥ−ＧＭ４と組み合わせることができる（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１６，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２９（１２）：２２９５−２３１１；Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｄｉｅｒｓ  ２０１３，Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５３：７７５−７８５；Ｋａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１２０（３）：６３３−６４４；Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４４（３）：９３６−９４１；ｗｗｗ．ｓｏｙｂａｓｅ．ｏｒｇ；Ｃｏｎｃｉｂｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４４：１１２１−１１３１；Ｗｅｂｂ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．９１：５７４−５８１）。また、一実施形態では、本発明の植物または種子は、ＳＣＮ抵抗性供給源ＰＩ  ５４８３１６、ＰＩ  ５６７３０５、ＰＩ  ４３７６５４、ＰＩ  ９０７６３、ＰＩ  ４０４１９８Ｂ、ＰＩ  ８８７８８、ＰＩ  ４６８９１６、ＰＩ  ５６７５１６Ｃ、ＰＩ  ２０９３３２、ＰＩ  ４３８４８９Ｂ、ＰＩ  ８９７７２、Ｐｅｋｉｎｇ、ＰＩ  ５４８４０２、ＰＩ  ４０４１９８Ａ、ＰＩ  ５６１３８９Ｂ、ＰＩ  ６２９０１３、ＰＩ  ５０７４７１、ＰＩ  ６３３７３６、ＰＩ  ５０７３５４、ＰＩ  ４０４１６６、ＰＩ  ４３７６５５、ＰＩ  ４６７３１２、ＰＩ  ５６７３２８、ＰＩ  ２２８９７、またはＰＩ  ４９４１８２のいずれか１つから得られるダイズの１つ以上のＳＣＮ抵抗性遺伝子座と組み合わせた場合、ＥＥ−ＧＭ４を含有する。本明細書に含まれる表３は、ＳＣＮ耐性として報告されたダイズ系統種の包括的なリストを提供し、そのうちのＳＣＮ抵抗性遺伝子／遺伝子座（１つまたは複数）は、同じダイズ植物���細胞または種子において本発明のＥＥ−ＧＭ４と組み合わせることができる。
【００５７】
【表１】
2020503020.tif 000002
【００５８】
【表２】
2020503020.tif 000003
【００５９】
また、上記のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含有する種子が蒔かれた圃場を、ＨＰＰＤ阻害除草剤で処理するステップを含む、雑草による競争から発芽中のダイズ植物を保護するための方法であって、植物がＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性である、方法も、本明細書に提供される。一実施形態では、そのような方法では、ＨＰＰＤ阻害除草剤はイソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンである。
【００６０】
また、上記のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ植物を植える圃場を、ダイズ植物を植える前または種を蒔く前に、ＨＰＰＤ阻害除草剤で処理し、続いて、前記前処理された圃場に前記ダイズ植物または種子を植えるまたは蒔くステップを含む、雑草による競争から発芽中のダイズ植物を保護するための方法であって、植物がＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性である、方法も、本明細書に提供される。
【００６１】
また、圃場を有効量のＨＰＰＤ阻害除草剤で処理するステップを含む、上記のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ植物の前記圃場における雑草の防除方法であって、植物がそのような除草剤に耐性である、方法も、本明細書に適用される。
【００６２】
さらに、ダイズ圃場における雑草を防除するためのトランスジェニックダイズ植物、種子またはその子孫の使用も本明細書に提供され、前記植物、種子または子孫はそれぞれ、そのゲノム中にエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含み、ＥＥ−ＧＭ４は、寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託された参照種子に含有される、定義された遺伝子座にある挿入されたＴ−ＤＮＡであり、前記挿入されたＴ−ＤＮＡは、Ｃｒｙ１４Ａｂ−１をコードするキメラ遺伝子およびＨＰＰＤ−４をコードするキメラ遺伝子を含み、前記エリートイベントは、配列番号１または３の５’接合配列および配列番号２または４の３’接合配列によって特徴付けられる。一実施形態では、そのような使用において、トランスジェニックダイズ植物、種子またはその子孫は、センチュウに対して抵抗性であり、および／またはＨＰＰＤ阻害除草剤に対して耐性である。一実施形態では、前記Ｔ−ＤＮＡは、Ｃｒｙ１４Ａｂ−１をコードするキメラ遺伝子およびＨＰＰＤ−４をコードするキメラ遺伝子を含み、前記エリートイベントは、配列番号５の５’接合配列および配列番号６の３’接合配列によって特徴付けられる。
【００６３】
また、センチュウ抵抗性および／または除草剤耐性植物を生育するための、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４をそのゲノム中に含むダイズ植物または種子の使用も本明細書に提供され、前記エリートイベントＥＥ−ＧＭ４は、寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託された参照種子に含有される、定義された遺伝子座にある挿入Ｔ−ＤＮＡであり、前記挿入Ｔ−ＤＮＡが、Ｃｒｙ１４Ａｂ−１をコードするキメラ遺伝子およびＨＰＰＤ−４をコードするキメラ遺伝子を含み、前記エリートイベントは、配列番号１または３の５’接合配列および配列番号２または４の３’接合配列によって特徴付けられる。一実施形態では、そのような使用において、ダイズ植物または種子は、ＳＣＮセンチュウに対して抵抗性であり、および／またはＨＰＰＤ阻害除草剤に対して耐性である。一実施形態では、前記Ｔ−ＤＮＡは、Ｃｒｙ１４Ａｂ−１をコードするキメラ遺伝子およびＨＰＰＤ−４をコードするキメラ遺伝子を含み、前記エリートイベントは、配列番号５または２４の５’接合配列および配列番号６または２５の３’接合配列によって特徴付けられる。
【００６４】
エリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ種子の、ダイズ産物を得るための使用も本明細書で提供され、ここで、ＥＥ−ＧＭ４は上記の通りである。
【００６５】
ＥＥ−ＧＭ４を含む植物を他のダイズ植物と交雑するステップ、および前記交雑から得たＥＥ−ＧＭ４を含む種子を植えるステップを含む、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ植物または種子の産生方法も本明細書で提供される。一実施形態では、そのような方法は、前記種子または植物にＨＰＰＤ阻害除草剤を施用するステップを含む。
【００６６】
本発明によれば、上記のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ種子、およびダイズ圃場の雑草を防除するためのＨＰＰＤ阻害除草剤の使用、ならびにＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性のダイズを生育する方法における、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ種子の使用も提供され、ここで、前記種子は上記の通りである。
【００６７】
さらに、センチュウに対する抵抗性および／またはＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性をダイズ植物または種子に付与するための、上記のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４の使用、またはダイズを生育するための、ＨＰＰＤ阻害除草剤と組み合わせたエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ植物または種子の使用も本明細書に提供される。
【００６８】
ＥＥ−ＧＭ４に特異的なプライマー対、およびそのようなプライマー対を使用するキットまたは方法も本明細書に提供され、ここで、前記対のうち少なくとも１つのプライマーは（プライマーに加えられた検出可能またはスクリーニング可能部分などで）標識されており、前記プライマーのうち少なくとも１つの５’末端は、１つ以上のミスマッチ、またはＥＥ−ＧＭ４の５’または３’隣接配列と無関係であるか、もしくはＥＥ−ＧＭ４のＴ−ＤＮＡ配列と無関係であるヌクレオチド配列を含む；または前記プライマーの少なくとも１つは、Ｔ−ＤＮＡ隣接配列とＴ−ＤＮＡ配列との間の連結領域にまたがるヌクレオチド配列をそれらの３’末端に含み、前記結合領域は、配列番号５のヌクレオチド２２７〜２２８、配列番号２４のヌクレオチド１０５８〜１０５９、または配列番号６もしくは２５のヌクレオチド２５３〜２５４にあり、但し、３’末端の連続した１７ヌクレオチドは、配列番号５もしくは２４、または６もしくは２５のＴ−ＤＮＡまたはＴ−ＤＮＡ隣接配列のいずれかにのみ由来するものではない；または前記プライマーのうち少なくとも１つは、それぞれ、ＥＥ−ＧＭ４の５’もしくは３’隣接領域内またはＥＥ−ＧＭ４の挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列と８０〜１００％同一の配列を含み、前記プライマー配列は、前記５’もしくは３’隣接領域または前記Ｔ−ＤＮＡとの少なくとも１つのミスマッチを含み、但し、少なくとも１つのミスマッチは、最適化された検出条件（例えば、最適化されたＰＣＲ条件）下で、これらのプライマーによるエリートイベントＥＥ−ＧＭ４の特異的同定を依然として可能にする；または前記プライマーのうち少なくとも１つのヌクレオチド配列は、他の起源由来の核酸に融合した核酸のヌクレオチド配列、またはその相補体を含む。
【００６９】
本発明による他の実施形態は、以下の項に概括される。
１．  ＥＥ−ＧＭ４中の５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域（少なくとも一部）およびそれと隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡ（少なくとも一部）を特異的に認識する特異的プライマー対またはプローブを用いた、ＥＥ−ＧＭ４特異的領域の検出を含む、生物学的試料中のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を同定する方法。
【００７０】
２．  項１に記載の方法であって、前記方法が、少なくとも２つのプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記生物学的試料中に存在する核酸からの５０〜１０００ｂｐの間のＤＮＡ断片を増幅することを含み、前記プライマーのうち１つが、ＥＥ−ＧＭ４中の挿入Ｔ−ＤＮＡの５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識し、前記５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域がヌクレオチド１からヌクレオチド２２７までの配列番号５、もしくはヌクレオチド１からヌクレオチド１０５８までの配列番号２４のヌクレオチド配列を含むか、またはＥＥ−ＧＭ４中の挿入Ｔ−ＤＮＡの３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識し、前記３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域がヌクレオチド２５４からヌクレオチド５０１までの配列番号６の相補体のヌクレオチド配列、もしくはヌクレオチド２５４からヌクレオチド１３３９までの配列番号２５の相補体のヌクレオチド配列を含み、前記プライマーのうち他方のプライマーが、ヌクレオチド２２８からヌクレオチド３９８までの配列番号５のヌクレオチド配列もしくはその相補体、またはヌクレオチド１からヌクレオチド２５３までの配列番号６のヌクレオチド配列、またはヌクレオチド１７からヌクレオチド７６２１までの配列番号１１、もしくはヌクレオチド位置１０５９からヌクレオチド位置８６６３までの配列番号２３のヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を認識する、方法。
【００７１】
３．  項２に記載の方法であって、５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識する前記プライマーが、ヌクレオチド１からヌクレオチド２２７までの配列番号５、もしくはヌクレオチド１からヌクレオチド１０５８までの配列番号２４のヌクレオチド配列から選択される連続した１７〜２００ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、またはＥＥ−ＧＭ４の３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識する前記プライマーが、ヌクレオチド２５４からヌクレオチド５０１までの配列番号６の相補体のヌクレオチド配列、もしくはヌクレオチド２５４からヌクレオチド１３３９までの配列番号２５の相補体のヌクレオチド配列から選択される連続した１７〜２００ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、かつ挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を認識する前記プライマーが、ヌクレオチド２２８からヌクレオチド３９８までの配列番号５のヌクレオチド配列もしくはその相補体、またはヌクレオチド１からヌクレオチド２５３までの配列番号６のヌクレオチド配列もしくはその相補体、またはヌクレオチド１７からヌクレオチド７６２１までの配列番号１１のヌクレオチド配列、またはヌクレオチド位置１０５９からヌクレオチド位置８６６３までの配列番号２３のヌクレオチド配列もしくはその相補体から選択される連続した１７〜２００ヌクレオチドを含む、方法。
【００７２】
４．  項２に記載の方法であって、５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識する前記プライマーが、その３’末端に、ヌクレオチド１からヌクレオチド２２７までの配列番号５、もしくはヌクレオチド１からヌクレオチド１０５８までの配列番号２４のヌクレオチド配列から選択される連続した少なくとも１７ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、またはＥＥ−ＧＭ４の３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識する前記プライマーが、その３’末端に、ヌクレオチド２５４からヌクレオチド５０１までの配列番号６の相補体のヌクレオチド配列、もしくはヌクレオチド２５４からヌクレオチド１３３９までの配列番号２５の相補体のヌクレオチド配列から選択される連続した少なくとも１７ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、かつ挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を認識する前記プライマーが、その３’末端に、ヌクレオチド２２８からヌクレオチド３９８までの配列番号５のヌクレオチド配列の相補体、またはヌクレオチド１からヌクレオチド２５３までの配列番号６のヌクレオチド配列、またはヌクレオチド１７からヌクレオチド７６２１までの配列番号１１のヌクレオチド配列、またはヌクレオチド位置１０５９からヌクレオチド位置８６６３までの配列番号２３のヌクレオチド配列もしくはその相補体から選択される連続した少なくとも１７ヌクレオチドを含む、方法。
【００７３】
５．  前記プライマーが、それぞれ配列番号１２および配列番号１３の配列、またはそれぞれ配列番号２０および配列番号２１の配列を含む、項４に記載の方法。
【００７４】
６．  ＰＣＲを用いて１２６または９０ｂｐのＥＥ−ＧＭ４特異的断片を増幅するステップを含む、項５に記載の方法。
【００７５】
７．  前記少なくとも２つのプライマーを用いて増幅されたＤＮＡ断片に特異的なプローブをハイブリダイズするステップをさらに含む、項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【００７６】
８．  前記プローブが前記５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域の一部およびそれに隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡの一部を認識する、または前記プローブが前記３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域の一部およびそれに隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡの一部を認識する、もしくは前記５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域の一部およびそれに隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡの一部を認識する、例えば、前記プローブが配列番号１もしくは３または配列番号２もしくは４のヌクレオチド配列を含む、項７に記載の方法。
【００７７】
９．  前記プライマーがそれぞれ配列番号１２および配列番号１３の配列を含み、かつ前記プローブが配列番号１４の配列を含み、または前記プライマーがそれぞれ配列番号２０および配列番号２１の配列を含み、かつ前記プローブが配列番号２２の配列を含む、項８に記載の方法。
【００７８】
１０．  ＥＥ−ＧＭ４中の挿入Ｔ−ＤＮＡの５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識する１つのプライマーであって、前記５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域がヌクレオチド１からヌクレオチド２２７までの配列番号５、もしくはヌクレオチド１からヌクレオチド１０５８までの配列番号２４のヌクレオチド配列を含む、プライマー、またはＥＥ−ＧＭ４中の挿入Ｔ−ＤＮＡの３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識する１つのプライマーであって、前記３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域がヌクレオチド２５４からヌクレオチド５０１までの配列番号６の相補体のヌクレオチド配列、もしくはヌクレオチド２５４からヌクレオチド１３３９までの配列番号２５の相補体のヌクレオチド配列を含む、プライマー、および挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を認識する１つのプライマーであって、前記挿入Ｔ−ＤＮＡがヌクレオチド２２８からヌクレオチド３９８までの配列番号５のヌクレオチド配列の相補体、またはヌクレオチド１からヌクレオチド２５３までの配列番号６のヌクレオチド配列、またはヌクレオチド１７からヌクレオチド７６２１までの配列番号１１、もしくはヌクレオチド位置１０５９からヌクレオチド位置８６６３までの配列番号２３のヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む、プライマーを含むキット。
【００７９】
１１．  項１０に記載のキットであって、５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識する前記プライマーが、ヌクレオチド１からヌクレオチド２２７までの配列番号５、もしくはヌクレオチド１からヌクレオチド１０５８までの配列番号２４のヌクレオチド配列から選択される連続した１７〜２００ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、またはＥＥ−ＧＭ４の３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識する前記プライマーが、ヌクレオチド２５４からヌクレオチド５０１までの配列番号６の相補体のヌクレオチド配列、もしくはヌクレオチド２５４からヌクレオチド１３３９までの配列番号２５の相補体のヌクレオチド配列から選択される連続した１７〜２００ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、かつ挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を認識する前記プライマーが、ヌクレオチド２２８からヌクレオチド３９８までの配列番号５のヌクレオチド配列の相補体、またはヌクレオチド１からヌクレオチド２５３までの配列番号６のヌクレオチド配列、またはヌクレオチド１７からヌクレオチド７６２１までの配列番号１１のヌクレオチド配列、またはヌクレオチド位置１０５９からヌクレオチド位置８６６３までの配列番号２３のヌクレオチド配列もしくはその相補体から選択される連続した１７〜２００ヌクレオチドを含む、キット。
【００８０】
１２．  項１０に記載のキットであって、５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識する前記プライマーが、その３’末端に、ヌクレオチド１からヌクレオチド２２７までの配列番号５、もしくはヌクレオチド１からヌクレオチド１０５８までの配列番号２４のヌクレオチド配列から選択される連続した少なくとも１７ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、またはＥＥ−ＧＭ４の３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識する前記プライマーが、その３’末端に、ヌクレオチド２５４からヌクレオチド５０１までの配列番号６の相補体のヌクレオチド配列、もしくはヌクレオチド２５４からヌクレオチド１３３９までの配列番号２５の相補体のヌクレオチド配列から選択される連続した少なくとも１７ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、かつ挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を認識する前記プライマーが、その３’末端に、ヌクレオチド２２８からヌクレオチド３９８までの配列番号５のヌクレオチド配列の相補体、またはヌクレオチド１からヌクレオチド２５３までの配列番号６のヌクレオチド配列、またはヌクレオチド１７からヌクレオチド７６２１までの配列番号１１のヌクレオチド配列、またはヌクレオチド位置１０５９からヌクレオチド位置８６６３までの配列番号２３のヌクレオチド配列もしくはその相補体から選択される連続した少なくとも１７ヌクレオチドを含む、方法。
【００８１】
１３．  配列番号１２の配列を含むプライマー、および配列番号１３の配列を含むプライマーを含む、または配列番号２０の配列を含むプライマー、および配列番号２１の配列を含むプライマーを含む、項１０に記載のキット。
【００８２】
１４．  ５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識するプライマーと挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を認識するプライマーとの間の配列を認識する、または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識するプライマーと挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を認識するプライマーとの間の配列を認識する、プローブをさらに含む、項１０に記載のキット。
【００８３】
１５．  前記プローブが前記５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域の一部およびそれに隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡの一部を認識する、または前記プローブが前記３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域の一部およびそれに隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡの一部を認識する、項１４に記載のキット。
【００８４】
１６．  前記プライマーが配列番号１２および配列番号１３の配列を含み、かつ前記プローブが配列番号１４の配列を含み、または前記プライマーが配列番号２０および配列番号２１の配列を含み、かつ前記プローブが配列番号２２の配列を含む、項１５に記載のキット。
【００８５】
１７．  最適化された検出条件下で、ＥＥ−ＧＭ４中の挿入Ｔ−ＤＮＡの５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域内の配列を特異的に認識する配列を含む第１のプライマー、および最適化された検出条件下で、前記５’または３’隣接領域と隣接するＥＥ−ＧＭ４中の挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を特異的に認識する配列を含む第２のプライマーを含む、ＥＥ−ＧＭ４特異的検出における使用に適したプライマー対であって、前記５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域がヌクレオチド１からヌクレオチド２２７までの配列番号５、もしくはヌクレオチド１からヌクレオチド１０５８までの配列番号２４のヌクレオチド配列を含み、前記３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域がヌクレオチド２５４からヌクレオチド５０１までの配列番号６の相補体のヌクレオチド配列、もしくはヌクレオチド２５４からヌクレオチド１３３９までの配列番号２５の相補体のヌクレオチド配列を含み、前記挿入Ｔ−ＤＮＡがヌクレオチド２２８からヌクレオチド３９８までの配列番号５のヌクレオチド配列、またはヌクレオチド１からヌクレオチド２５３までの配列番号６のヌクレオチド配列、またはヌクレオチド１７からヌクレオチド７６２１までの配列番号１１のヌクレオチド配列、またはヌクレオチド位置１０５９からヌクレオチド位置８６６３までの配列番号２３のヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む、プライマー対。
【００８６】
１８．  その３’末端に配列番号１２の配列、または配列番号１３の配列、または配列番号２０の配列、または配列番号２１の配列を含むプライマー。
【００８７】
１９．  その３’末端に配列番号１２の配列を含む第１のプライマー、およびその３’末端に配列番号１３の配列を含む第２のプライマーを含む、またはその３’末端に配列番号２０の配列を含む第１のプライマー、およびその３’末端に配列番号２１の配列を含む第２のプライマーを含む、プライマー対。
【００８８】
２０．  生物学的試料の核酸をＥＥ−ＧＭ４に対する特異的プローブとハイブリダイズさせるステップを含む、項１に記載の方法。
【００８９】
２１．  前記特異的プローブの配列が、ＥＥ−ＧＭ４の５’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列およびそれに隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡの配列の一部を含む配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する、項２０に記載の方法。
【００９０】
２２．  前記特異的プローブの配列が、配列番号１、３、もしくは５のいずれか１つの配列、または配列番号２、４、もしくは６のいずれか１つの配列、または前記配列の相補体と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、項２１に記載の方法。
【００９１】
２３．  前記プローブが、配列番号１もしくは３のいずれか１つの配列、または配列番号２もしくは４のいずれか１つの配列を含む、項２２に記載の方法。
【００９２】
２４．  生物学的試料中のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を同定するキットであって、前記キットが、ＥＥ−ＧＭ４の特定の領域に特異的にハイブリダイズすることができる特異的プローブを含む、キット。
【００９３】
２５．  前記特異的プローブの配列が、ＥＥ−ＧＭ４の５’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列の一部または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列の一部およびそれに隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡの配列の一部を含む配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する、項２４に記載のキット。
【００９４】
２６．  前記特異的プローブの配列が、配列番号１、３、もしくは５のいずれか１つ、または配列番号２、４、もしくは６のいずれか１つ、または前記配列の相補体と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項２５に記載のキット。
【００９５】
２７．  生物学的試料中のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４の同定のための特異的プローブ
【００９６】
２８．  ＥＥ−ＧＭ４の５’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列の一部または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列の一部およびそれに隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡの配列の一部を含む配列、またはその相補体と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項２７に記載のプローブ。
【００９７】
２９．  配列番号１、３、もしくは５のいずれか１つの配列、または配列番号２、４、もしくは６のいずれか１つの配列、または前記配列の相補体と少なくとも８０％の配列同一性を有する、項２８に記載のプローブ、または配列番号１、３、もしくは５のいずれか１つの配列、または配列番号２、４、もしくは６のいずれか１つの配列を含む、前記プローブ。
【００９８】
３０．  配列番号１、３、もしくは５のいずれか１つ、または配列番号２、４、もしくは６のいずれか１つ、または前記配列の相補体と、本質的に類似しているヌクレオチド配列を含む、特異的プローブ。
【００９９】
３１．  配列番号１もしくは３の配列または配列番号２もしくは４の配列を含む特異的プローブ。
【０１００】
３２．  種子試料におけるＥＥ−ＧＭ４中の５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域およびそれと隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡを特異的に認識する特異的プライマーまたはプローブを用いた、ＥＥ−ＧＭ４特異的領域の検出を含む、種子純度を確認するための方法。
【０１０１】
３３．  少なくとも２つのプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記生物学的試料中に存在する核酸からの５０〜１０００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するステップであって、前記プライマーのうち１つが、ＥＥ−ＧＭ４の挿入されたＴ−ＤＮＡの５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識し、前記５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域がヌクレオチド１からヌクレオチド２２７までの配列番号５、もしくはヌクレオチド１からヌクレオチド１０５８までの配列番号２４のヌクレオチド配列、またはＥＥ−ＧＭ４の挿入されたＴ−ＤＮＡの３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を含み、前記３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域がヌクレオチド２５４からヌクレオチド５０１までの配列番号６の相補体のヌクレオチド配列、もしくはヌクレオチド２５４からヌクレオチド１３３９までの配列番号２５の相補体のヌクレオチド配列を含み、前記プライマーのうち他方のプライマーが、ヌクレオチド２２８からヌクレオチド３９８までの配列番号５のヌクレオチド配列の相補体、またはヌクレオチド１からヌクレオチド２５３までの配列番号６のヌクレオチド配列を含む挿入Ｔ−ＤＮＡ内、またはヌクレオチド１７からヌクレオチド７６２１までの配列番号１１のヌクレオチド配列、またはヌクレオチド位置１０５９からヌクレオチド位置８６６３までの配列番号２３のヌクレオチド配列もしくはその相補体内の配列を認識する、ステップ、および前記少なくとも２つのプライマーを用いて増幅されたＤＮＡ断片に特異的なプローブをハイブリダイズするステップを含む、項３２に記載の方法。
【０１０２】
３４．  １２６ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するステップであって、前記プライマーがそれぞれ配列番号１２および配列番号１３の配列を含み、かつ前記プローブが配列番号１４の配列を含む、ステップ、または９０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するステップであって、前記プライマーがそれぞれ配列番号２０および配列番号２１の配列を含み、かつ前記プローブが配列番号２２の配列を含む、ステップを含む、項３３に記載の方法。
【０１０３】
３５．  シードロットの試料におけるＥＥ−ＧＭ４中の５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域およびそれと隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡを特異的に認識する特異的プライマー対またはプローブを用いた、ＥＥ−ＧＭ４特異的領域の検出を含む、種子をＥＥ−ＧＭ４の存在につきスクリーニングするための方法。
【０１０４】
３６．  少なくとも２つのプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記生物学的試料中に存在する核酸からの５０〜１０００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するステップであって、前記プライマーのうち１つが、ＥＥ−ＧＭ４中の挿入Ｔ−ＤＮＡの５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を認識し、前記５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域がヌクレオチド１からヌクレオチド２２７までの配列番号５、もしくはヌクレオチド１からヌクレオチド１０５８までの配列番号２４のヌクレオチド配列、またはＥＥ−ＧＭ４中の挿入Ｔ−ＤＮＡの３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を含み、前記３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域がヌクレオチド２５４からヌクレオチド５０１までの配列番号６の相補体のヌクレオチド配列、もしくはヌクレオチド２５４からヌクレオチド１３３９までの配列番号２５の相補体のヌクレオチド配列を含み、前記プライマーのうち他方のプライマーが、ヌクレオチド２２８からヌクレオチド３９８までの配列番号５のヌクレオチド配列の相補体、またはヌクレオチド１からヌクレオチド２５３までの配列番号６のヌクレオチド配列を含む、またはヌクレオチド１７からヌクレオチド７６２１までの配列番号１１のヌクレオチド配列、またはヌクレオチド位置１０５９からヌクレオチド位置８６６３までの配列番号２３のヌクレオチド配列もしくはその相補体を含む、挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を認識する、ステップ、および配列番号１もしくは３、または配列番号２もしくは４、またはその相補体の配列を含むプローブなどの、前記少なくとも２つのプライマーを用いて増幅されたＤＮＡ断片に特異的なプローブをハイブリダイズするステップを含む、項３５に記載の方法。
【０１０５】
３７．  ８５ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するステップであって、前記プライマーがそれぞれ配列番号１２および配列番号１３の配列を含み、かつ前記プローブが配列番号１４の配列を含む、ステップを含む、項３６に記載の方法。
【０１０６】
３８．  エリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含む、植物、植物材料または種子の接合性状態を決定する方法であって、前記方法が、少なくとも３つのプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を用いて前記生物学的試料中に存在する核酸からの５０〜１０００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するステップであって、前記プライマーのうち２つが、配列番号１８のヌクレオチド配列を含むプライマー、および配列番号１３のヌクレオチド配列を含むプライマーなどの挿入前植物ＤＮＡを特異的に認識し、前記プライマーのうち第３のものが、配列番号１２のヌクレオチド配列などの挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を認識する、ステップを含み、前記方法が、前記プライマーを用い、１２６および１０８ｂｐのＤＮＡ断片が増幅されるなどの、方法。
【０１０７】
３９．  実質的に相補的な標識核酸プローブとのハイブリダイゼーションにより、生物学的試料中のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４の存在を検出する方法であって、プローブ：標的核酸比が、標的核酸配列の再利用により増幅され、前記方法が、
ａ）前記標的核酸配列を、ヌクレオチド位置２２８からヌクレオチド位置２４５までの配列番号５のヌクレオチド配列またはその相補体を含む第１の核酸オリゴヌクレオチド、またはヌクレオチド位置２３６からヌクレオチド位置２５３までの配列番号６のヌクレオチド配列またはその相補体を含む前記第１の核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるステップ；
ｂ）前記標的核酸配列を、ヌクレオチド２１０からヌクレオチド２２７までの配列番号５のヌクレオチド配列またはその相補体を含む第２の核酸オリゴヌクレオチド、またはヌクレオチド２５４からヌクレオチド２７１までの配列番号６のヌクレオチド配列またはその相補体を含む前記核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるステップであって、前記第１および第２のオリゴヌクレオチドが少なくとも１ヌクレオチド重複し、前記第１または第２のオリゴヌクレオチドのいずれかが前記標識核酸プローブとなるように標識される、ステップ；
ｃ）プローブ：標的核酸配列二本鎖内の標識プローブのみを、二本鎖の解離を生じる選択的プローブ切断を引き起こす酵素で、標的配列を無傷のまま残して切断するステップ；
ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を反復することにより標的核酸配列を再利用するステップ；および
ｅ）切断された標識プローブを検出し、それにより、前記標的核酸配列の存在を決定し、前記生物学的試料中のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４の存在を検出するステップ
を含む、方法。
【０１０８】
４０．  それぞれがそのゲノム中にエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含み、前記イベントを含む参照種子が寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託されている、トランスジェニックダイズ植物、またはその細胞、部分、種子もしくは子孫。
【０１０９】
４１．  それぞれ配列番号１２および配列番号１３のヌクレオチド配列を含む２つのプライマーを用いてＥＥ−ＧＭ４につきＰＣＲを使用して分析した場合、そのゲノムＤＮＡが１２６ｂｐのＤＮＡ断片を生じる、項４０に記載のトランスジェニックダイズ植物、種子、細胞、部分または子孫。
【０１１０】
４２．  寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託された種子またはその誘導体に含有される、ダイズゲノムの特定の位置における挿入Ｔ−ＤＮＡである、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含む種子。
【０１１１】
４３．  項４２に記載の種子から取得可能である、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ植物、植物部分、細胞または組織、または種子。
【０１１２】
４４．  それぞれがそのゲノム中にエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含み、寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託された種子から生育したダイズ植物の繁殖によって、および／またはそれを用いた育種によって得ることができる、ダイズ植物またはその種子、細胞もしくは組織。
【０１１３】
４５．  エリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ種子であって、前記イベントを含む参照種子が寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託されている、ダイズ種子。
【０１１４】
４６．  項４５に記載の種子から取得可能である、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むトランスジェニックダイズ植物、細胞または組織。
【０１１５】
４７．  非繁殖植物細胞である、項４０、４１、４３、４４および４６のいずれか一項に記載のダイズ植物細胞。
【０１１６】
４８．  項４０、４１、４３、４４および４６のいずれか一項に記載の植物を他のダイズ植物と交雑するステップ、および前記交雑から得た種子を植えるステップを含む、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ植物または種子の産生方法。
【０１１７】
４９．  エリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズゲノムＤＮＡ。
【０１１８】
５０．  ダイズにＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性および／またはＳＣＮ抵抗性を付与する核酸分子などの、配列番号５または６のヌクレオチド配列、またはその相補体と、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子などの、配列番号１、３、もしくは５のいずれか１つの配列、または配列番号２、４、もしくは６のいずれか１つの配列、または前記配列の相補体と、本質的に類似したヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【０１１９】
５１．  配列番号７および９のヌクレオチド配列、もしくはそれと少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、もしくはその相補体も含む核酸分子、またはヌクレオチド位置１８８からヌクレオチド位置７３６８までの配列番号１１のヌクレオチド配列、もしくはそれと少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子などの、配列番号１もしくは３または配列番号２もしくは４のいずれか１つのヌクレオチド配列、または前記配列の相補体を含む、項５０に記載の核酸分子。
【０１２０】
５２．  Ｃｒｙ１４Ａｂ−１をコードするキメラ遺伝子およびＨＰＰＤ−４をコードするキメラ遺伝子、特に、それぞれ配列番号７および９のヌクレオチド配列を含むキメラ遺伝子も含むダイズ植物などの、配列番号１、３もしくは５のヌクレオチド配列または配列番号２、４もしくは６のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む、ダイズ植物、細胞、植物部分、種子またはその子孫、または配列番号３のヌクレオチド配列および配列番号４のヌクレオチド配列をそのゲノム中に含む、ダイズ植物、細胞、植物部分、種子またはその子孫、または配列番号５のヌクレオチド配列および配列番号６のヌクレオチド配列をそのゲノム中に含む、ダイズ植物、細胞、植物部分、種子またはその子孫、または配列番号２４のヌクレオチド配列および配列番号２５のヌクレオチド配列をそのゲノム中に含む、ダイズ植物、細胞、植物部分、種子またはその子孫などの、先の項のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ダイズ植物、細胞、植物部分、種子またはその子孫。
【０１２１】
５３．  配列番号５および配列番号６のヌクレオチド配列、またはその相補体を含む、核酸分子など、または配列番号２４および配列番号２５のヌクレオチド配列、またはその相補体を含む、核酸分子などの、配列番号１、３、もしくは５、または配列番号２、４、もしくは６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【０１２２】
５４．  配列番号１、３、５、もしくは２４のいずれか１つの配列、または配列番号２、４、６、もしくは２５のいずれか１つの配列、または前記配列の相補体と、本質的に類似したヌクレオチド配列を含む、核酸分子を特徴とし、ダイズ植物が、Ｃｒｙ１４Ａｂ−１をコードするキメラ遺伝子およびＨＰＰＤ−４をコードするキメラ遺伝子も含む、そのゲノムにイベントＥＥ−ＧＭ４を含む、トランスジェニックダイズ植物、植物細胞、組織、または種子。
【０１２３】
５５．  Ｃｒｙ１４Ａｂ−１をコードするキメラ遺伝子およびＨＰＰＤ−４をコードするキメラ遺伝子も含むダイズ植物、または配列番号２４または配列番号２５の配列と、少なくとも８０％、９０％、９５％または１００％の配列同一性を有する核酸配列をその細胞のゲノム中に含む、ダイズ植物、細胞、組織または種子などの、ＥＥ−ＧＭ４を含み、配列番号１、３、もしくは５のいずれか１つの配列、または配列番号２、４、もしくは６のいずれか１つの配列、または前記配列の相補体と、少なくとも８０％、９０％、９５％または１００％の配列同一性を有する核酸配列をその細胞のゲノム中に含む、ダイズ植物、細胞、組織または種子。
【０１２４】
５６．  配列番号５もしくは２４または配列番号６もしくは２５のヌクレオチド配列、またはその相補体と、少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子をそのゲノム中に含む、ダイズ植物、植物細胞、組織、または種子、または配列番号５もしくは２４および配列番号６もしくは２５のヌクレオチド配列、またはその相補体と、少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子をそのゲノム中に含む、ダイズ植物、植物細胞、組織、または種子。
【０１２５】
５７．  標準的ストリンジェンシー条件下で配列番号５もしくは６のヌクレオチド配列またはその相補体にハイブリダイズする核酸分子をそのゲノム中に含む、ダイズ植物、植物細胞、組織、または種子
【０１２６】
５８．  配列番号５または配列番号６のヌクレオチド配列、またはその相補体と、少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子などの、配列番号５もしくは２４または配列番号６もしくは２５のヌクレオチド配列、またはその相補体と、少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【０１２７】
５９．  標準的ストリンジェンシー条件下で配列番号５もしくは６のヌクレオチド配列またはその相補体にハイブリダイズする核酸配列を含む、核酸分子。
【０１２８】
６０．  配列番号７および９のヌクレオチド配列も含む、項５０、５１、５８および５９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【０１２９】
６１．  Ｔ−ＤＮＡ  ５’隣接領域、挿入Ｔ−ＤＮＡ、およびＴ−ＤＮＡ  ３’隣接領域を含む、キメラＤＮＡであって、前記挿入Ｔ−ＤＮＡの配列が、ヌクレオチド１８８からヌクレオチド７３６８までの配列番号１１の配列、またはそれと少なくとも９５、９６、９７、９８、９９、もしくは少なくとも９９．５％同一の配列を含むか、または前記挿入Ｔ−ＤＮＡの配列が、配列番号７および９の配列を含み、前記Ｔ−ＤＮＡ  ５’隣接領域が、前記挿入Ｔ−ＤＮＡのすぐ上流に隣接して位置し、ヌクレオチド１からヌクレオチド２２７までの配列番号５の配列、またはそれと少なくとも９５、９６、９７、９８、９９、もしくは少なくとも９９．５％同一の配列、またはヌクレオチド１からヌクレオチド１０５８までの配列番号２４の配列、またはそれと少なくとも９５、９６、９７、９８、９９、もしくは少なくとも９９．５％同一の配列を含み、前記Ｔ−ＤＮＡ  ３’隣接領域が、前記挿入Ｔ−ＤＮＡのすぐ下流に隣接して位置し、ヌクレオチド２５４からヌクレオチド５０１までの配列番号６の配列、またはそれと少なくとも９５、９６、９７、９８、９９、もしくは少なくとも９９．５％同一の配列、またはヌクレオチド２５４からヌクレオチド１３３９までの配列番号２５の相補体のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９５、９６、９７、９８、９９、もしくは少なくとも９９．５％同一の配列を含む、キメラＤＮＡ。
【０１３０】
６２．  ヌクレオチド１３１から５２７６までの配列番号１１のヌクレオチド配列、またはその相補体、または配列番号７またはヌクレオチド位置１３１からヌクレオチド位置５２７６までの配列番号１１の配列と、少なくとも９５、９６、９７、９８、または少なくとも９９％の配列同一性を有する、殺センチュウ性Ｃｒｙ１４Ａｂタンパク質をコードする配列、またはその相補体を含む、核酸分子などの、配列番号７のヌクレオチド配列などの配列番号７のヌクレオチド配列またはその相補体と、少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【０１３１】
６３．  ヌクレオチド５３８２から７６２１までの配列番号１１のヌクレオチド配列、またはその相補体、または配列番号９またはヌクレオチド位置５３８２からヌクレオチド位置７６２１までの配列番号１１の配列と、少なくとも９５、９６、９７、９８、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列、またはその相補体を含む、ＤＮＡ配列などの、配列番号９のヌクレオチド配列などの配列番号９のヌクレオチド配列またはその相補体と、少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子であって、前記配列が、植物中で発現した場合にＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性を提供するＨＰＰＤタンパク質をコードする、核酸分子。
【０１３２】
６４．  上記のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ種子を得るステップ、およびそれからダイズ産物を産生するステップを含む、ダイズ産物を産生する方法。
【０１３３】
６５．  ダイズ産物が、ダイズミール、粉砕種子、粉、またはフレークであるか、それを含む、項６４に記載の方法。
【０１３４】
６６．  配列番号１もしくは３の配列または配列番号２もしくは４の配列などの、イベントＥＥ−ＧＭ４に診断的または特異的なアンプリコンを産生する核酸を含む前記産物などの、前記ダイズ産物がエリートイベントＥＥ−ＧＭ４に特異的な核酸を含む、項４または６５に記載の方法。
【０１３５】
６７．  先の項のいずれか一項に記載のダイズ植物、細胞、部分、種子、または子孫から産生したダイズ産物などの、上記のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含む、ダイズ産物。
【０１３６】
６８．  ダイズ産物が、ダイズミール、粉砕種子、粉、またはフレークであるか、それを含む、項６７に記載のダイズ産物。
【０１３７】
６９．  配列番号１もしくは３の配列または配列番号２もしくは４の配列またはその相補体などの、イベントＥＥ−ＧＭ４に診断的または特異的なアンプリコンを産生する核酸を含む前記産物などの、前記ダイズ産物がエリートイベントＥＥ−ＧＭ４に特異的な核酸を含む、項６７または６８に記載のダイズ産物。
【０１３８】
７０．  先の項のいずれか一項に記載のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含有する種子が蒔かれた圃場を、ＨＰＰＤ阻害除草剤で処理するステップを含む、雑草による競争から発芽中のダイズ植物を保護するための方法であって、植物がＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性である、方法。
【０１３９】
７１．  上記のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ植物を植える圃場を、ダイズ植物を植える前または種を蒔く前に、ＨＰＰＤ阻害除草剤で処理し、続いて、前記前処理された圃場に前記ダイズ植物または種子を植えるまたは蒔くステップを含む、雑草による競争から発芽中のダイズ植物を保護するための方法であって、植物がＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性である、方法。
【０１４０】
７２．  圃場を有効量のＨＰＰＤ阻害除草剤で処理するステップを含む、上記のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ植物の前記圃場における雑草の防除方法であって、植物がＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性である、方法。
【０１４１】
７３．  前記ＨＰＰＤ阻害除草剤が、イソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンである、項７０〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【０１４２】
７４．  上記のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含む、トランスジェニックダイズ植物、種子またはその子孫の、ダイズ子実または種子を産生するための使用。
【０１４３】
７５．  センチュウ抵抗性および／またはＨＰＰＤ阻害除草剤耐性植物を生育するための、上記のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４をそのゲノム中に含むダイズ植物または種子の使用。
【０１４４】
７６．  ダイズ産物が、粉砕ダイズ子実、ダイズ粉、ダイズミール、またはダイズフレークであるか、またはそれを含むなどの、ダイズ産物を得るためのエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ種子の使用であって、ＥＥ−ＧＭ４が上記のものである、使用。
【０１４５】
７７．  ダイズの圃場を生育するための、またはダイズ作物を生育するための、上記で定義されたエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ植物または種子の、ＨＰＰＤ阻害除草剤と組み合わせた使用。
【０１４６】
７８．  受託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託された種子から得ることができる核酸分子であって、前記核酸分子が、配列番号１、３、または５のいずれか１つのヌクレオチド配列、および配列番号２、４、または６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【０１４７】
７９．  それぞれがそのゲノム中にエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ植物、細胞、部分、または種子であって、寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託された参照種子に見られるように、前記エリートイベントが、ＨＰＰＤ−４タンパク質をコードするキメラ遺伝子およびＣｒｙ１４Ａｂ−１タンパク質をコードするキメラ遺伝子を含有する挿入Ｔ−ＤＮＡ、および前記挿入Ｔ−ＤＮＡを直接囲む５’および３’隣接配列を含む遺伝子座である、ダイズ植物、細胞、部分、または種子。
【０１４８】
８０．  項７９に記載の植物、細胞、植物部分または種子の、子孫植物、細胞、植物部分または種子であって、前記子孫植物、細胞、植物部分または種子が配列番号３のヌクレオチド配列および配列番号４のヌクレオチド配列を含む、子孫植物、細胞、植物部分または種子。
【０１４９】
８１．  それぞれ配列番号１２および配列番号１３のヌクレオチド配列を含む２つのプライマーを用いてＰＣＲを使用して分析した場合、そのゲノムＤＮＡが１２６ｂｐのＤＮＡ断片を生じる、項７９に記載のダイズ植物、細胞、部分、種子または子孫。
【０１５０】
８２．  イソキサフルトール、トプラメゾンおよびメソトリオンに耐性の植物などの、イソキサフルトールおよび／またはトプラメゾンおよび／またはメソトリオンに耐性である、先の項のいずれか一項に記載の植物。
【０１５１】
８３．  Ｃｒｙ１４Ａｂ−１をコードする遺伝子を欠き、ＨＰＰＤ−４をコードする遺伝子を欠く第１のダイズ植物を、上記項のいずれか一項に記載のダイズ植物と交雑することによって、ＳＣＮに対する抵抗性およびＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性をダイズ植物のゲノムに導入するステップ、およびＳＣＮに抵抗性かつＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性の子孫植物を選択するステップを含む、ＳＣＮに抵抗性かつＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性のダイズ植物の産生方法。
【０１５２】
８４．  センチュウまたは突然死症候群に汚染された場合により収量の良いダイズ作物などの、ダイズ作物を得るための、上記で定義されたエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ植物または種子の使用。
【０１５３】
８５．  センチュウがＳＣＮまたはネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）種またはネコブセンチュウまたはニセフクロセンチュウ種であるなどの、（ａ）上記の項のいずれか一項に記載の種子を使用して圃場に植えるステップ；および（ｂ）前記種子から生育した植物で生産されたダイズ種子を収穫するステップ、および任意選択により、（ｃ）種子の発芽前または発芽後に前記種子を植えた圃場に、または前記ダイズ植物に、雑草を除草するのに十分であるが前記ダイズ種子または植物に耐容される１以上の用量のＨＰＰＤ阻害除草剤を施用するステップを含む、前記センチュウまたは突然死症候群に対する抵抗性が改善されたダイズ作物の産生方法。
【０１５４】
８６．  加工食品または飼料商品を調製するための、上記の項に記載のダイズ種子の使用であって、前記加工食品または飼料商品が、配列番号１および／または配列番号２のヌクレオチド配列、またはその相補体を含む、検出可能量の核酸を含む、使用。
【０１５５】
８７．  （ｉ）前記食品または前記飼料商品が、ダイズミール、ダイズ粉、ダイズフレーク、またはダイズ油を含む；（ｉｉ）前記核酸が、配列番号３および／または配列番号４のヌクレオチド配列、またはその相補体を含む；または（ｉｉｉ）前記核酸が、配列番号７および配列番号９に含有されるヌクレオチド配列をさらに含む、項８６に記載の使用。
【０１５６】
８８．  エリートイベントＥＥ−ＧＭ４をそのゲノム中に含むダイズ植物、種子または細胞であって、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４が、配列番号２３に記載の配列と少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含み、前記エリートイベントが、ＨＰＰＤ−４をコードするキメラ遺伝子およびＣｒｙ１４Ａｂ−１をコードするキメラ遺伝子を含み、前記植物、種子または細胞が、ＨＰＰＤ阻害除草剤に対して耐性であり、ＳＣＮ抵抗性を有する、ダイズ植物、種子または細胞。
【０１５７】
８９．  エリートイベントＥＥ−ＧＭ４が、配列番号２３に記載の配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む、項８８に記載の植物。
【０１５８】
９０．  エリートイベントＥＥ−ＧＭ４が、配列番号２３に記載の配列と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含む、項８８に記載の植物。
【０１５９】
９１．  ＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性および／またはセンチュウ抵抗性を付与する、配列番号２３のヌクレオチド配列、または配列番号２３と少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、核酸分子であって、前記センチュウがＳＣＮまたはネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）種またはネコブセンチュウまたはニセフクロセンチュウ種であるなどの、核酸分子。
【０１６０】
９２．  ヌクレオチド位置１３１からヌクレオチド位置７９４１までの配列番号１１のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【０１６１】
９３．  ＨＰＰＤ阻害剤に対して耐性のＨＰＰＤタンパク質、およびＳＣＮ、ＲＫＮまたはネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）種センチュウなどの植物病害センチュウに負の影響を与えるタンパク質をコードする、項９２に記載の核酸分子。
【０１６２】
９４．  配列番号８のタンパク質またはそれと少なくとも９９％同一のタンパク質、および配列番号１０のタンパク質またはそれと少なくとも９９％同一のタンパク質をコードする、項９３に記載の核酸分子。
【０１６３】
９５．  １）イソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤で前記圃場を処理するステップ、および２）上記のエリート形質転換イベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ植物または種子を、前記処理された圃場に植えるまたは蒔くステップを含む、ダイズ植物を植える圃場における雑草および／またはセンチュウを防除する方法であって、前記エリートイベントを含む参照種子が、寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託されている、方法。
【０１６４】
９６．  １）イソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性のダイズ植物または種子を圃場に植えるステップ、および２）イソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤を、前記植物もしくは種子を植える前の前記圃場に、または植えた後の前記ダイズ植物もしくは種子（種子発芽の前または後であり得る）に施用するステップを含むことを特徴とする、雑草防除方法であって、前記植物または種子が、それらのゲノム中にダイズエリート形質転換イベントＥＥ−ＧＭ４を含み、前記エリートイベントを含む参照種子が、寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託されている、方法。
【０１６５】
９７．  １）ダイズ植物を植える圃場またはダイズ種子を蒔く圃場を、ダイズ植物を植えるまたは種子を蒔く前に、イソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤で処理するステップ、および２）前記前処理された圃場に、ダイズエリート形質転換イベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ植物を植える、またはダイズエリート形質転換イベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ種子を蒔くステップを含むことを特徴とする、雑草防除プロセスであって、前記ダイズエリート形質転換イベントＥＥ−ＧＭ４を含む参照種子が、寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託されている、プロセス。
【０１６６】
９８．  １）上記のエリート形質転換イベントＥＥ−ＧＭ４を含む植物または種子を得るステップ、および２）ダイズ植物または種子を植えるまたは蒔くステップを含む、ダイズ植物を植える圃場、特に、ＳＣＮ、ＲＫＮまたはネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）などのセンチュウまたはニセフクロセンチュウまたはその組み合わせを含有する、もしくは含有することが予想される圃場における収量損失を減少させる方法であって、前記エリートイベントを含む参照種子が、寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託されている、方法。
【０１６７】
９９．  １）上記のエリート形質転換イベントＥＥ−ＧＭ４を含む植物または種子を得るステップ、および２）ダイズ植物または種子を植えるまたは蒔くステップを含む、ＳＣＮ、ＲＫＮまたはネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）などのセンチュウまたはニセフクロセンチュウまたはその組み合わせを含有する圃場に植えられた場合に、ダイズ植物の収量を増加させる方法であって、前記エリートイベントを含む参照種子が、寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託されている、方法。
【０１６８】
１００．  上記のエリートダイズ形質転換イベントＥＥ−ＧＭ４をダイズ植物または種子のゲノムに導入するステップ、および任意選択により、イソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤で、前記植物または種子を処理するステップ、または任意選択により、イソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤で、前記植物または種子が植えられる圃場を処理し、前記前処理された圃場に前記植物または種子を植えるステップを特徴とする、イソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性のダイズ植物または種子を産生する方法、またはＳＣＮ、ＲＫＮまたはネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）などのセンチュウまたはニセフクロセンチュウに耐性のダイズ植物または種子を産生する方法、またはイソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性の、またはＳＣＮ、ＲＫＮまたはネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）などのセンチュウまたはニセフクロセンチュウに耐性の、ダイズ植物または種子を産生する方法。
【０１６９】
１０１．  ダイズ植物ゲノムＤＮＡの一部およびその下流に隣接したＥＥ−ＧＭ４の挿入外来ＤＮＡの一部を含有する、配列番号１、３または５のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、および／またはＥＥ−ＧＭ４の挿入外来ＤＮＡの一部およびその下流に隣接したダイズ植物ゲノムＤＮＡの一部を含有する、配列番号２、４または６のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、ダイズエリート形質転換イベントＥＥ−ＧＭ４を特異的に特徴付ける核酸分子。
【０１７０】
１０２．  上記のＥＥ−ＧＭ４を含み、ダイズ抵抗性遺伝子座／遺伝子によって提供される、ＳＣＮ、ＲＫＮまたはネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）またはニセフクロセンチュウ、またはそれらの組み合わせに対する耐性または抵抗性も含む、植物または種子。
【０１７１】
１０３．  前記植物または種子が、ＥＥ−ＧＭ４と、ＰＩ  ５４８３１６、ＰＩ  ５６７３０５、ＰＩ  ４３７６５４、ＰＩ  ９０７６３、ＰＩ  ４０４１９８Ｂ、ＰＩ  ８８７８８、ＰＩ  ４６８９１６、ＰＩ  ５６７５１６Ｃ、ＰＩ  ２０９３３２、ＰＩ  ４３８４８９Ｂ、ＰＩ  ８９７７２、Ｐｅｋｉｎｇ、ＰＩ  ５４８４０２、ＰＩ  ４０４１９８Ａ、ＰＩ  ５６１３８９Ｂ、ＰＩ  ６２９０１３、ＰＩ  ５０７４７１、ＰＩ  ６３３７３６、ＰＩ  ５０７３５４、ＰＩ  ４０４１６６、ＰＩ  ４３７６５５、ＰＩ  ４６７３１２、ＰＩ  ５６７３２８、ＰＩ  ２２８９７、またはＰＩ  ４９４１８２のＳＣＮ抵抗性対立遺伝子／遺伝子座のいずれか１つまたはその組み合わせを含む、項１０２に記載の植物または種子。
【０１７２】
１０４．  上記のＥＥ−ＧＭ４を含み、グリホサート、グルホシネート、スルホニルウレア、イミダゾリノン、ＨＰＰＤ阻害剤、ジカンバ、２，４−Ｄ、またはＰＰＯ阻害剤、をベースとした除草剤、またはそれらの任意の組み合わせに耐性であるなどの、除草剤耐性遺伝子（天然または変異型のダイズ遺伝子または導入遺伝子）によって提供される、他の除草剤に対する耐性も含む、植物または種子。
【０１７３】
１０５．  項１０３に記載の植物または種子であって、前記植物または種子が、上記のＥＥ−ＧＭ４と、除草剤耐性を付与するダイズ形質転換イベントＭＳＴ−ＦＧφ７２−３、ＳＹＮ−φφφＨ２−５、ＤＡＳ−６８４１６−４、ＤＡＳ−４４４φ６−６、ＭＯＮ−８７７φ８−９、ＭＯＮ８９７８８、ＭＯＮ−φ４φ３２−６、ＡＣＳ−ＧＭφφ５−３、ＢＰＳ−ＣＶ１２７−９、ＡＣＳ−ＧＭφφ６−４、ＭＯＮ−８７７φ５−６、またはイベントＤＰ−３φ５４２３−１の１つ以上を含む、植物または種子。
【０１７４】
１０６．  ＳＣＮ汚染の存在下でのダイズ植物に対する突然死症候群または鉄欠乏性クロロシスの影響の重症度を軽減する、または突然死症候群に汚染されたＳＣＮ含有圃場またはダイズに鉄欠乏性クロロシスを引き起こすＳＣＮ含有圃場でダイズ植物の収量を増加させる、方法であって、前記方法が、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ植物を植えるステップまたはダイズ種子を蒔くステップを含み、前記エリートイベントを含む参照種子が、寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託されている、方法。
【０１７５】
以下の実施例は、記載された特定の実施形態に本発明を限定することを意図するものではなく、参照により本明細書に組み入れられる添付の図面と併せて理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】引用したヌクレオチド配列とプライマーとの間の関係の略図。黒バー：挿入Ｔ−ＤＮＡ；ストライプバー：Ｔ−ＤＮＡに隣接するＤＮＡ；黒矢印：オリゴヌクレオチドプライマー；チェック矢印（ａ）：ｃｒｙ１４Ａｂ−１．ｂキメラ遺伝子（キメラ遺伝子の組成につき表１を参照）；ストライプ矢印（ｂ）：ｈｐｐｄＰｆ−４Ｐａキメラ遺伝子（キメラ遺伝子の組成につき表１を参照）；黒矢印：オリゴヌクレオチドプライマー；（ｃ）は示されたヌクレオチド配列の相補体を指す；黒線：オリゴヌクレオチドプローブ（下の番号は代表的な配列番号）。配列番号５および６を表すバーの下の数字は、前記配列中の異なる要素のヌクレオチド位置である。注：スキームは一定の縮尺で描かれたものではない。
【図２】ＥＥ−ＧＭ４同一性分析のためのエンドポイント法。図２は、ＥＥ−ＧＭ４を含有する一連のダイズ試料および従来のダイズ試料に対する実施例２．１に記載の方法の結果の例を示す。各試料について、ＥＥ−ＧＭ４特異的反応および内因性反応の両方についてＳ／Ｂ比が表示される。この図において、「１−１５」と記された試料は、ＥＥ−ＧＭ４を含有するダイズ試料であり、「ＷＴ」と記された試料は、野生型ダイズ試料（ＥＥ−ＧＭ４を含有しない）であり、「ＮＴＣ」と記された試料は、テンプレートなし対照である。「ａ」と記された垂直（白）バーは、イベントＥＥ−ＧＭ４について得られたシグナルを示し、「ｂ」と記された垂直（濃）バーは、内因性ダイズ遺伝子について得られたシグナルを示す。「１」と記された水平線は、イベントＥＥ−ＧＭ４を検出するための最小のシグナル対バックグラウンド比であり、「２」と記された水平線は、内因性ダイズ配列を検出するための最小のシグナル対バックグラウンド比であり、「３」と記された水平線は、非標的（ＤＮＡなし）試料の最大のシグナル対バックグラウンド比（バックグラウンド蛍光）である。
【図３】ＥＥ−ＧＭ４同一性および接合性のためのエンドポイント法。図３は、一連のホモ接合状態のＥＥ−ＧＭ４を含有するダイズ試料、ヘミ接合状態のＥＥ−ＧＭ４を含有するダイズ試料および従来のダイズ試料に対する実施例２．２に記載の方法の結果の例を示す。この図において：−「ａ」と記された線内の試料：ホモ接合状態のＥＥ−ＧＭ４を含有するダイズ試料−「ｂ」と記された線内の試料：ヘミ接合状態のＥＥ−ＧＭ４を含有するダイズ試料−「ｃ」と記された線内の試料：ＥＥ−ＧＭ４を含有しないダイズ試料−「ｄ」と記された線によって形成されたボックス内の試料：不確定試料。
【図４】ＥＥ−ＧＭ４低レベル存在分析のためのリアルタイムＰＣＲ法。図４は、較正試料に対して実施した低レベル存在分析についての実施例２．３に記載のＲＴ−ＰＣＲ法の結果の例を示す。「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」、「ｅ」はそれぞれ、較正試料「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「Ｄ」、「Ｅ」のＣｔ値を示す。較正試料「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、「Ｄ」、「Ｅ」は、漸減量のＥＥ−ＧＭ４  ＤＮＡを有する。
【図５】除草剤処理の平均最大植物毒性結果。図５は、非形質転換／従来のダイズ植物（Ｔｈｏｒｎｅ）と比較した、イベントＥＥ−ＧＭ４を含有するダイズ植物についての、２年間にわたるいくつかの圃場試験において除草剤処理について記録された最大植物毒性データの平均を示す。処理の下の（）内の数字は、バーに含まれる試験の数を示し、各バーの上の数字は、その処理の平均最大植物毒性値を示す。適用した処理は以下の通りであった。ＩＦＴ＝イソキサフルトール、ＭＳＴ＝メソトリオン、ＰＥ＝発芽前、ＰＯ＝発芽後（Ｖ２−Ｖ３ステージで、除草剤活性を高めるためのアジュバント作物油濃縮物および硫酸アンモニウムと併用）。示された率は、グラム活性成分／ヘクタール（出現前において４倍用量、出現後において２倍容量）である。
【図６】ＳＣＮ汚染圃場におけるＴｈｏｒｎｅのＥＥ−ＧＭ４の子実収量。本来の形質転換体バックグラウンド（Ｔｈｏｒｎｅ）中のＥＥ−ＧＭ４を、２０１５年および２０１６年に、アイオワ州、イリノイ州、インディアナ州、ミズーリ州およびテネシー州を通した９つの異なる場所において、ＳＣＮ汚染圃場（低ＳＣＮから高ＳＣＮ汚染にわたる）で試験した。点は、各試験におけるホモ接合イベントの推定収量（ヌルに対するパーセント差として）であり、水平線は、ホモ接合イベントとヌル分離系との間のコントラストの９５％信頼限界を表す（ヌル分離系の１００パーセント収量で線が垂直線と重ならない場合、イベントはヌル分離系とは有意に異なっていた）。「Ａｃｒｏｓｓ  Ｌｏｃｓ」は、９つ全ての場所にわたる複合分析の推定収量である。
【図７】ＳＣＮ汚染圃場における感受性エリートバックグラウンドでのＥＥ−ＧＭ４の子実収量。ＥＥ−ＧＭ４は、ＳＣＮに感受性のエリートＭＧ  Ｉ（成熟度グループＩ）系統に遺伝子移入（ＢＣ２Ｆ３）され、２０１６年にミネソタ州の１ヶ所およびノースダコタ州の１ヶ所（それぞれ高ＳＣＮ汚染レベルを有する）で試験された。点は、各試験におけるホモ接合イベントの推定収量（ヌルに対するパーセント差として）であり、点近傍の水平線は、ホモ接合イベントとヌル分離体との間のコントラストの９５％信頼限界を表す（ヌル分離体の１００パーセント収量で線が垂直線と重ならない場合、イベントはヌル分離体とは有意に異なっていた）。「Ａｃｒｏｓｓ  Ｌｏｃｓ」は、両方の場所にわたる複合分析の推定収量である。
【図８】米国におけるネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）抵抗性温室アッセイ。ＥＥ−ＧＭ４を有するエリートダイズ植物は、米国の温室アッセイにおいてパイナップルネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）を防除する。ＥＥ−ＧＭ４を有する植物（「ＥＥ−ＧＭ４」）を他のエリートダイズ系統：１つのＳＣＮ感受性成熟度グループ（ＭＧ）３系統（「ＴＨＯＲＮＥ」）、１つのＭＧ３  ＳＣＮ感受性系統、１つのＭＧ６．２  ＳＣＮ感受性系統、および１つのＭＧ９  ＳＣＮ感受性系統（「Ｓｕｓｃ  ＷＴ」はこれら３系統の平均を示す）、１つのＭＧ３  ＳＣＮ抵抗性系統（ＰＩ８８７８８由来のｒｈｇ１抵抗性対立遺伝子を有する、「ＳＣＮ  Ｒｅｓ（ＰＩ８８７８８）」）、およびＰｅｋｉｎｇ由来のｒｈｇ１およびＲｈｇ４  ＳＣＮ抵抗性を有する１つのＭＧ６．２  ＳＣＮ抵抗性系統（「ＳＣＮ  Ｒｅｓ（Ｐｅｋｉｎｇ）」）と比較した。プロットされたものは汚染３０日後の根中のネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）の平均数（１エントリーにつき５植物）であり、（温室アッセイで典型的に見られるように）品種間で観察された変動も示している。結果は、ＥＥ−ＧＭ４系統にわたるネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）の約８５％の防除を示す。天然のＳＣＮ抵抗性（ＰｅｋｉｎｇまたはＰＩ８８７８８から）を有するダイズ系統は、パイナップルネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）を防除しない。
【図９】ブラジルにおけるネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）抵抗性温室アッセイ。ＥＥ−ＧＭ４のダイズ植物（「ＥＥ−ＧＭ４  ＨＨ」）は、ダイズの根においてパイナップルネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）有意に減少させる。パイナップルネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）はブラジルの地元の圃場から分離された。ＥＥ−ＧＭ４植物（２つの異なる米国エリート系統（両方成熟度グループ６．２、１つはＳＣＮ感受性で、１つはＰｅｋｉｎｇ  ＳＣＮ抵抗性を有する（「ＥＥ−ＧＭ４」））および制限されたネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）防除を有する５つのブラジルダイズ系統（「ブラジル系統」）、ネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）につき低Ｒｆ（生殖因子）として標識された１つのブラジル系統（「ＢＲＳ  ７３８０（低Ｒｆ）」）、ＳＣＮ感受性である１つの米国エリート系統（成熟度グループ６．２）（「ＳＣＮ  Ｓｕｓｃ」）およびＰｅｋｉｎｇ  ＳＣＮ抵抗性を有する１つの米国エリート系統（ＭＧ  ６．２）（「ＳＣＮ  Ｒｅｓ（Ｐｅｋｉｎｇ）」）を、ブラジルにおける温室アッセイでネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）防除につき評価した。プロットされたものはそれらのエントリーの平均であり、（温室アッセイで典型的に見られるように）品種間で観察された変動も示している。１つのブラジルダイズ系統（ＢＲＳ  ７３８０）は、ネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）の約８９％の減少を示した。ＥＥ−ＧＭ４系統は、ネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）を約７９％防除した。ＳＣＮに対するＰｅｋｉｎｇ天然抵抗性を保有するダイズ系統は、パイナップルネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）を防除しない。
【図１０】ヌルと比較したＥＥ−ＧＭ４植物の鉄欠乏性クロロシス（ＩＤＣ）スコア。図１０は、１ヶ所（高ＳＣＮ汚染を有する）における、ＥＥ−ＧＭ４を有するダイズ植物のＩＤＣスコアを示す。試験は、３つの異なるバックグラウンド（２つの感受性ダイズ系統および１つのＰＩ８８７８８由来のＳＣＮ抵抗性を有するもの）におけるイベントの影響を調べるスプリット・プロットデザイン（１エントリーにつき４プロット）であった。３つの遺伝的背景（１つのＳＣＮ抵抗性、１つのＳＣＮ感受性、およびＳＣＮ感受性Ｔｈｏｒｎｅバックグラウンド）にわたるイベントＥＥ−ＧＭ４（「ＥＥ−ＧＭ４」）および対応するヌル分離体（「Ｎｕｌｌ」、ＥＥ−ＧＭ４を欠く）を有する植物のＩＤＣスコアの平均が示されている。１つのバーは１２の合計プロットを表す。垂直線は標準誤差を示す（「ＳＥＭ」は平均の標準誤差である）。
【発明を実施するための形態】
【０１７７】
本発明では、センチュウに対する抵抗性を付与する遺伝子と組み合わせた、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）阻害剤耐性をコードする遺伝子（それぞれ植物発現プロモーターの制御下にある）を含むセンチュウ抵抗性ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）の開発において、ＥＥ−ＧＭ４はトランスジェニックダイズ植物の集団からのエリートイベントとして同定されている。生物学的試料中のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４の同定において使用するための特定のツールは本明細書に記載される。
【０１７８】
植物ゲノムへの組換えＤＮＡ分子の組込みは、典型的には細胞または組織の形質転換から生じる。特定の組込み部位は、通常、ランダム組込みによるものである。
【０１７９】
植物細胞または組織を組換えＤＮＡまたは「形質転換ＤＮＡ」で形質転換した結果として植物ゲノムに導入され、そのような形質転換ＤＮＡに由来するＤＮＡは、以下、１つ以上の「導入遺伝子」を含む「挿入Ｔ−ＤＮＡ」と称される。ＥＥ−ＧＭ４の導入遺伝子は、センチュウ抵抗性およびＨＰＰＤ阻害除草剤耐性遺伝子である。本発明の文脈における「植物ＤＮＡ」は、形質転換された植物に由来するＤＮＡを指す。植物ＤＮＡは通常、対応する野生型植物において同じ遺伝子座で見出される。挿入Ｔ−ＤＮＡは、植物ゲノム中の組換えＤＮＡ分子の組込み部位における位置および立体配置によって特徴付けることができる。組換えＤＮＡが挿入されている植物ゲノム中の部位は、「挿入部位」または「標的部位」とも称される。「挿入前植物ＤＮＡ」（または本明細書では「挿入前遺伝子座」と名付けられている）と称される植物ゲノムの領域への組換えＤＮＡの挿入は、「標的部位欠失」と称される植物ＤＮＡの欠失と関連し得る。本明細書で使用される「隣接領域」または「隣接配列」は、導入されたＴ−ＤＮＡとは異なる少なくとも１０ｂｐ、少なくとも２０ｂｐ、少なくとも５０ｂｐ、および５０００ｂｐまでのＤＮＡ、好ましくは、挿入Ｔ−ＤＮＡのすぐ上流に隣接して、またはすぐ下流に隣接して位置する植物ゲノム由来のＤＮＡの配列を指す。挿入Ｔ−ＤＮＡのランダム組込みをもたらす形質転換手順により、各形質転換体につき特徴的かつ独特である異なる隣接領域を有する形質転換体が生じるであろう。組換えＤＮＡが伝統的な交雑によって植物に導入される場合、植物ゲノム中のその挿入部位、またはその隣接領域は、一般的に変化しないであろう。
【０１８０】
本明細書で使用される「単離核酸（配列／分子）」または「単離ＤＮＡ（配列／分子）」は、それが単離された天然の環境にはもはや存在しない核酸またはＤＮＡ（配列／分子）、例えば、別の（細菌）宿主または植物ゲノム中の核酸配列、または（異種）植物発現プロモーターの制御下でキメラ遺伝子に含有される場合などの、別の起源のＤＮＡまたは核酸（配列／分子）に融合した核酸またはＤＮＡ（配列／分子）を指す。任意のプライマーを含む本発明の任意の核酸またはＤＮＡはまた、天然に存在する配列と同一であるが標識（天然に存在する対応物から欠けている）を有する配列を有する、または天然に存在するヌクレオチドと比較して、少なくとも１つのヌクレオチド付加もしくは置換または少なくとも１つの内部ヌクレオチド欠失を有する配列を有する、または天然に存在する核酸もしくはＤＮＡもしくはその断片と１００％未満（同一でない）の同一性を有する配列を有する核酸またはＤＮＡ、または天然には一緒に存在しない、異なる起源のヌクレオチド配列からなる配列を有する核酸またはＤＮＡ（キメラＤＮＡまたはハイブリッドＤＮＡ）、または天然の核酸もしくはＤＮＡもしくはその断片とは異なる配列を有する人工の合成核酸もしくはＤＮＡなどの、天然に存在しないものであり得る。
【０１８１】
イベントは、遺伝子操作の結果として、目的の遺伝子の少なくとも１つのコピーを含む挿入Ｔ−ＤＮＡまたは導入遺伝子を保有する（人工の）遺伝子座として定義される。イベントの典型的な対立遺伝子状態は、挿入Ｔ−ＤＮＡの有無である。イベントは、１つまたは複数の導入遺伝子の発現によって表現型的に特徴付けられる。遺伝的レベルでは、イベントは植物の遺伝子構成の一部である。分子レベルでは、イベントは、導入遺伝子の上流および／または下流の隣接配列、分子マーカーの位置および／または導入遺伝子の分子配置による制限地図によって（例えば、サザンブロッティングによって決定されるように）特徴付けることができる。通常、少なくとも１つの目的の遺伝子を含む形質転換ＤＮＡを用いた植物の形質転換は、それぞれが独特である多数の別個のイベントを含む形質転換体の集団をもたらす。イベントは、挿入Ｔ−ＤＮＡおよび少なくとも１つの隣接配列によって特徴付けられる。
【０１８２】
本明細書で使用される場合、エリートイベントは、最適な形質の有効性および優れた発現、導入遺伝子の安定性およびそれを含む植物の最適な農業特性とのその適合性に基づき、同じ形質転換ＤＮＡで形質転換することによって得られるイベントの群から選択されるイベントである。したがって、エリートイベント選択の基準は、１つ以上、好ましくは２つ以上、有利には以下の全てである。
ａ）形質の有効性；
ｂ）挿入Ｔ−ＤＮＡの存在が、農業成績または商品価値に関連するものなどの、植物の他の所望の特性を損なわないこと；
ｃ）安定して遺伝し、同定管理のための適切なツールを開発することのできる、明確に定義された分子構造によって、イベントが特徴付けられること；
ｄ）目的の遺伝子が、イベントを保有する植物が通常の農学的使用において晒される可能性がある範囲の環境条件において、商業的に許容されるレベルで、正確、適切かつ安定な空間的および時間的表現型発現を示すこと。
【０１８３】
挿入Ｔ−ＤＮＡは、所望の商業的遺伝的背景への容易な遺伝子移入を可能にする植物ゲノム中の位置と関連することが好ましい。
【０１８４】
エリートイベントとしてのイベントの状態は、異なる関連遺伝的背景におけるエリートイベントの遺伝子移入、および１つ、２つ、３つまたは全ての基準、例えば、上記ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）、への適合の観察によって確認される。
【０１８５】
したがって、「エリートイベント」は、挿入Ｔ−ＤＮＡを含む遺伝子座を指し、これは上記基準を満たす。植物、植物材料、または種子などの子孫は、そのゲノム中に１つ以上の異なるエリートイベントを含み得る。
【０１８６】
エリートイベント、またはエリートイベントを含む植物または植物材料、またはエリートイベントを含む植物材料を含む産物を同定するために開発されたツールは、挿入Ｔ−ＤＮＡ、分子マーカーまたは挿入Ｔ−ＤＮＡの隣接領域の配列を含むゲノム領域の特異的制限地図などの、エリートイベントの特定のゲノム特性に基づく。
【０１８７】
挿入Ｔ−ＤＮＡの隣接領域の一方または両方が配列決定されると、分子生物学的手法により、試料の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）中のこの（これらの）配列を特異的に認識するプライマーおよび／またはプローブを開発することができる。例えば、生物学的試料（植物、植物材料または植物材料を含む産物の試料など）におけるエリートイベントを同定するためにＰＣＲ法を開発することができる。そのようなＰＣＲは、少なくとも２つの特異的「プライマー」に基づき、１つはエリートイベントの５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域内の配列を認識し、他方は挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列を認識する。プライマーは、エリートイベントを含む核酸試料から特定の断片（「組込み断片」または識別用アンプリコン）が増幅されるように、最適化されたＰＣＲ条件下でエリートイベントの５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域内およびエリートイベントの挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列をそれぞれ「特異的に認識する」１５〜３５ヌクレオチドの配列を有することが好ましい。これは、標的化された組込み断片のみが、最適化されたＰＣＲ条件下で増幅され、植物ゲノムまたは挿入Ｔ−ＤＮＡ中の他の配列は増幅されないことを意味する。
【０１８８】
本発明に適したＰＣＲプライマーは以下のものであり得る。
−  ５’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列（ヌクレオチド１からヌクレオチド２２７までの配列番号５、またはヌクレオチド１からヌクレオチド１０５８までの配列番号２４、またはその上流に隣接する植物ゲノム配列）から選択される、連続した少なくとも１７ヌクレオチド、好ましくは連続した少なくとも２０ヌクレオチドのヌクレオチド配列をそれらの３’末端に含む、長さ１７ｎｔ〜約２００ｎｔの範囲のオリゴヌクレオチド（５’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列を認識するプライマー）；または
−  ３’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列（ヌクレオチド２５４からヌクレオチド５０１までの配列番号６の相補体、またはヌクレオチド２５４からヌクレオチド１３３９までの配列番号２５の相補体のヌクレオチド配列、またはその下流に隣接する植物ゲノム配列）から選択される、連続した少なくとも１７ヌクレオチド、好ましくは連続した少なくとも２０ヌクレオチドのヌクレオチド配列をそれらの３’末端に含む、長さ１７ｎｔ〜約２００ｎｔの範囲のオリゴヌクレオチド（３’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列を認識するプライマー）；または
−  挿入Ｔ−ＤＮＡ配列（ヌクレオチド２２８からヌクレオチド３９８までの配列番号５の相補体、またはヌクレオチド１からヌクレオチド２５３までの配列番号６の配列、またはヌクレオチド１７からヌクレオチド７６２１までの配列番号１１の配列、またはヌクレオチド位置１０５９からヌクレオチド位置８６６３までの配列番号２３の配列、またはその相補体）から選択される、連続した少なくとも１７ヌクレオチド、好ましくは連続した少なくとも２０ヌクレオチドのヌクレオチド配列をそれらの３’末端に含む、長さ１７ｎｔ〜約２００ｎｔの範囲のオリゴヌクレオチド（挿入Ｔ−ＤＮＡを認識するプライマー）。
【０１８９】
５’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列を認識するプライマーは、ヌクレオチド２２８からヌクレオチド３９８までの配列番号５の相補体、またはその下流に隣接するＴ−ＤＮＡ配列から選択される挿入Ｔ−ＤＮＡを認識するプライマーと共にＰＣＲ反応に使用することができ、一方、３’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列を認識するプライマーは、ヌクレオチド１からヌクレオチド２５３までの配列番号６の配列、またはその上流に隣接するＴ−ＤＮＡから選択される挿入Ｔ−ＤＮＡを認識するプライマーと共にＰＣＲ反応に使用することができることが理解されよう。挿入Ｔ−ＤＮＡを認識するプライマーはまた、ヌクレオチド１７からヌクレオチド７６２１までの配列番号１１の配列、またはヌクレオチド位置１０５９からヌクレオチド位置８６６３までの配列番号２３の配列、またはその相補体から選択され得る。
【０１９０】
プライマーは、当然のことであるが、言及された連続した１７ヌクレオチドより長くてもよく、例えば、２０、２１、３０、３５、５０、７５、１００、１５０、２００ｎｔ長またはさらにより長くてもよい。プライマーは、隣接配列および挿入Ｔ−ＤＮＡ配列の言及されたヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列から完全になり得る。しかしながら、それらの５’末端（すなわち、３’末端の連続した１７ヌクレオチドの外側）におけるプライマーのヌクレオチド配列はそれほど重要でない。したがって、プライマーの５’配列は、必要に応じて、隣接配列または挿入Ｔ−ＤＮＡから選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり得るが、Ｔ−ＤＮＡまたはＴ−ＤＮＡ隣接ＤＮＡと比較して、いくつか（例えば、１、２、５、または１０）のミスマッチを含有し得る。プライマーの５’配列は、完全に、例えば、１つ以上の制限酵素認識部位を表すヌクレオチド配列など、またはＦＲＥＴカセットなどの標識オリゴヌクレオチドなどの他のオリゴヌクレオチドを結合することができるヌクレオチド配列などの、隣接配列または挿入Ｔ−ＤＮＡと無関係のヌクレオチド配列であってもよい（ＬＧＣ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ；Ｓｅｍａｇｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ３３：１−１４、および米国特許第７６１５６２０号明細書を参照）。そのような無関係の配列またはミスマッチを有する隣接ＤＮＡ配列は、好ましくは１００以下、より好ましくは５０以下、または２５ヌクレオチドでさえあるべきである。プライマーは、蛍光標識などの標識で修飾することもできる。
【０１９１】
さらに、適切なプライマーは、５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域由来の配列と挿入Ｔ−ＤＮＡ配列との間の連結領域にまたがるヌクレオチド配列（配列番号５のヌクレオチド２２７および２２８ならびに配列番号６のヌクレオチド２５３および２５４、または配列番号２４のヌクレオチド１０５８および１０５９ならびに配列番号２５のヌクレオチド２５３および２５４に位置する）をそれらの３’末端に含み得るか、またはそれから（本質的に）なり、但し、上記の３’に位置する連続した１７ヌクレオチドは、配列番号５もしくは６、または２４もしくは２５の挿入Ｔ−ＤＮＡまたはＴ−ＤＮＡ隣接配列のいずれかにのみ由来するものではない。
【０１９２】
適切に選択されたＰＣＲプライマー対が互いに相補的な配列も含むべきではないことも当業者には直ちに明らかであろう。
【０１９３】
本発明の目的において、「配列番号Ｘに表されるヌクレオチド配列の相補体」は、シャルガフの法則（Ａ⇔Ｔ；Ｇ⇔Ｃ）に従って、ヌクレオチドをそれらの相補的ヌクレオチドと置き換えること、および５’から３’の方向、すなわち、表されたヌクレオチド配列の反対方向に配列を読み取ることによって、表されたヌクレオチド配列から誘導することができるヌクレオチド配列である。
【０１９４】
適切なプライマーの例は、配列番号１３または配列番号２１または配列番号２６または２７（３’または５’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列認識プライマー）、または配列番号１４または配列番号２０または配列番号２８または２９（３’または５’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列認識プライマーと共に使用するための挿入Ｔ−ＤＮＡ認識プライマー）のオリゴヌクレオチド配列である。
【０１９５】
好ましくは、増幅断片は、５０〜１５０ヌクレオチド長など、５０〜５００ヌクレオチド長を有する。特異的プライマーは、それぞれ、エリートイベントの５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域内およびエリートイベントの挿入Ｔ−ＤＮＡ内の配列と８０〜１００％同一の配列を有し得、但し、ミスマッチは、最適化されたＰＣＲ条件下で、これらのプライマーによるエリートイベントの特異的同定を依然として可能にする。しかしながら、許容可能なミスマッチの範囲は実験的に容易に決定することができ、当業者に知られている。
【０１９６】
組込み断片の検出は種々の方法、例えば、ゲル分析後のサイズ推定により、起こり得る。組込み断片は直接配列決定することもできる。増幅されたＤＮＡ断片を検出するための他の配列特異的方法もまた、当技術分野において公知である。増幅されたＤＮＡ断片はまた、標識された配列および標識の検出を用いて検出され得る。例えば、標識されたプローブは、増幅断片に特異的に結合する反応混合物に含まれ得る。一実施形態では、標識されたプローブ（ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ）は、ＦＲＥＴカセットがもはやクエンチされず、ＰＣＲ産物に結合したときに蛍光を発するように、蛍光標識およびクエンチャーを含み得る。あるいは、反応混合物中に使用されるプライマーの５’伸長部に指向されたＦＲＥＴカセットなどの、反応混合物中のプライマーの一つに特異的に結合する標識ＦＲＥＴカセット、すなわち蛍光標識およびクエンチャーで標識されたオリゴヌクレオチドを、反応混合物に含めることができる（例えば、Ｓｅｍａｇｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ３３：１−１４、および米国特許第７６１５６２０号明細書を参照）。蛍光は当技術分野において公知の方法を用いて測定することができる。蛍光はリアルタイムで、すなわちＰＣＲ反応の各サイクル中に測定することができる。蛍光はＰＣＲ反応の終了時にも測定することができる。
【０１９７】
プライマーの配列およびゲノム中のそれらの相対的位置はエリートイベントに特有であるため、組込み断片の増幅は、エリートイベント（の核酸）を含む生物学的試料においてのみ発生するであろう。好ましくは、未知の試料中のＥＥ−ＧＭ４の存在を同定するためにＰＣＲを実施する場合、イベントの植物種の「ハウスキーピング遺伝子」内の断片を増幅することができるプライマーのセットの対照が含まれる。ハウスキーピング遺伝子は、ほとんどの細胞型で発現され、全ての細胞に共通の基本的な代謝活性に関係している遺伝子である。好ましくは、ハウスキーピング遺伝子から増幅された断片は、増幅された組込み断片よりも大きい断片である。分析する試料に応じて、他の対照を含めることができる。
【０１９８】
標準的なＰＣＲプロトコルは、「ＰＣＲアプリケーションマニュアル」（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第２版、１９９９年、または第３版、２００６年）および他の参考文献に記載されている。特定のプライマーの配列を含むＰＣＲのための最適条件は、各エリートイベントについて「ＰＣＲ（またはポリメラーゼ連鎖反応）同定プロトコル」に規定されている。しかしながら、ＰＣＲ同定プロトコルにおけるいくつかのパラメータは特定の実験室条件に調整する必要がある可能性があり、同様の結果を得るためにわずかに修正され得ることが理解される。例えば、ＤＮＡの調製のための異なる方法の使用は、例えば、使用されるプライマーの量、ポリメラーゼおよびアニーリング条件の調整を必要とし得る。同様に、他のプライマーの選択は、ＰＣＲ同定プロトコルのための他の最適条件を決定し得る。しかしながら、これらの調整は当業者には明らかであり、上記で引用したものなどの現在のＰＣＲアプリケーションマニュアルにさらに詳述される。
【０１９９】
あるいは、特異的プライマーを用いて、生物学的試料中のＥＥ−ＧＭ４を同定するための「特異的プローブ」として使用することができる組込み断片を増幅することができる。プローブと核酸中のその対応する断片とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、生物学的試料の核酸をプローブと接触させると、核酸／プローブハイブリッドの形成を生じる。このハイブリッドの形成は（例えば、核酸またはプローブの標識を介して）検出することができ、それにより、このハイブリッドの形成はＥＥ−ＧＭ４の存在を示す。特異的プローブとのハイブリダイゼーション（固相担体上または溶液中）に基づくそのような同定方法は、当技術分野において記載されている。特異的プローブは、好ましくは、最適化された条件下で、エリートイベントの５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域の一部およびそれに隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡの一部を含む領域（以下、「特異的領域」という）に特異的にハイブリダイズする配列である。好ましくは、特異的プローブは、ＥＥ−ＧＭ４の特定領域のヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、または８０〜８５％、または８５〜９０％、または９０〜９５％、または９５％〜１００％同一（または相補的）であるか、または同一（または相補的）である、５０〜５００ｂｐ、または１００〜３５０ｂｐの配列を含む。好ましくは、特異的プローブは、エリートイベントの特定の領域と同一（または相補的）である隣接した約１５〜約１００ヌクレオチドの配列を含むであろう。
【０２００】
エリートイベントＥＥ−ＧＭ４を検出するためのＰＣＲプライマーとして適切なオリゴヌクレオチドはまた、エリートイベントを含有する植物の接合性状態を決定するためのＰＣＲベースのプロトコルを開発するために使用することができる。この目的で、組込み前に野生型遺伝子座を認識する２つのプライマーは、それらが互いに指向され、挿入部位がプライマー間に位置するように設計されている。これらのプライマーは、ＥＥ−ＧＭ４の５’および／または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列を特異的に認識するプライマーを含有し得る。組込み前に野生型遺伝子座を認識するこのプライマーのセットは、形質転換ＤＮＡ配列（挿入Ｔ−ＤＮＡ）に相補的な第３のプライマーと共に、ＥＥ−ＧＭ４特異的遺伝子座ならびに野生型遺伝子座の同時診断的ＰＣＲ増幅を可能にする。植物がトランスジェニック遺伝子座または対応する野生型遺伝子座についてホモ接合性である場合、診断用ＰＣＲは、トランスジェニックまたは野生型遺伝子座のいずれかに典型的な、好ましくは長さにおいて典型的な、単一のＰＣＲ産物を生じるであろう。植物がトランスジェニック遺伝子座につきヘミ接合性である場合、トランスジェニックおよび野生型遺伝子座の両方の増幅を反映して、２つの遺伝子座特異的ＰＣＲ産物が現れる。
【０２０１】
あるいは、エリートイベントを含有する植物の接合性状態を決定するために、組込み前に野生型遺伝子座を認識する２つのプライマーは、それらが互いに指向されるように、および１つのプライマーが、配列番号５もしくは６、または配列番号２４もしくは２５に含有される５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列を特異的に認識するように、および１つのプライマーが、配列番号６もしくは５または配列番号２４もしくは２５内に含有される３’または５’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列を特異的に認識するか、または挿入前遺伝子座を特異的に認識するように、設計されている。本発明について、組込み前に野生型遺伝子座を認識する適切なプライマー対は、配列番号１８のヌクレオチド配列を含むかまたはそれから（本質的に）なる１つのプライマー、および配列番号１３のヌクレオチド配列を含むかまたはそれから（本質的に）なる１つのプライマーを含有するプライマー対である。このプライマーのセットは、形質転換ＤＮＡ配列（挿入Ｔ−ＤＮＡ）に相補的であるか、または形質転換ＤＮＡ配列およびそれに隣接する５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列に相補的である、第３のプライマーと共に、５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列を特異的に認識するプライマーに向かう方向に（配列番号１３のヌクレオチド配列を含むかまたはそれから（本質的に）なるプライマーに向かう方向にある、配列番号１２のヌクレオチド配列を含むかまたはそれから（本質的に）なるプライマーなど）、ＥＥ−ＧＭ４特異的遺伝子座および野生型遺伝子座の同時診断的ＰＣＲ増幅を可能にする。植物がトランスジェニック遺伝子座または対応する野生型遺伝子座についてホモ接合性である場合、診断用ＰＣＲは、トランスジェニックまたは野生型遺伝子座のいずれかに典型的な単一のＰＣＲ産物を生じるであろう。植物がトランスジェニック遺伝子座につきヘミ接合性である場合、トランスジェニックおよび野生型遺伝子座の両方の増幅を反映して、２つの遺伝子座特異的ＰＣＲ産物が現れる。
【０２０２】
野生型およびトランスジェニック遺伝子座に典型的なＰＣＲ産物の検出は、野生型およびトランスジェニック遺伝子座に典型的であり得るＰＣＲ産物の長さの決定に基づき得る。あるいは、野生型およびトランスジェニック遺伝子座に典型的なＰＣＲ産物の検出は、挿入前遺伝子座に特異的なプライマーの修飾によって、および挿入Ｔ−ＤＮＡに特異的なプライマーの修飾、および修飾されたプライマーのＰＣＲ産物への取り込みの検出によって実施することができる。例えば、挿入前遺伝子座に特異的なプライマーおよび挿入Ｔ−ＤＮＡに特異的なプライマーは、蛍光標識を用いて標識することができ、ここで、標識は２つのプライマーについて異なる。プライマーがＰＣＲ産物に組み込まれたときに蛍光を検出することができる。植物がトランスジェニック遺伝子座または対応する野生型遺伝子座についてホモ接合性である場合、挿入Ｔ−ＤＮＡに特異的なプライマーの標識のみ、または挿入前遺伝子座に特異的なプライマーの標識のみの蛍光を検出することができる。植物がトランスジェニック遺伝子座についてヘミ接合性である場合、トランスジェニックおよび野生型遺伝子座の両方の増幅を反映する、挿入Ｔ−ＤＮＡに特異的なプライマーの標識および挿入前遺伝子座に特異的なプライマーの標識の両方の蛍光を検出することができる。
【０２０３】
あるいは、挿入前遺伝子座に特異的なプライマーおよび挿入Ｔ−ＤＮＡに特異的なプライマーは、標識ＦＲＥＴカセットに特異的に結合する５’伸長部、すなわち蛍光標識およびクエンチャーで標識されたオリゴヌクレオチドを有し得、５’伸長部および対応するＦＲＥＴカセットは、２つのプライマーで異なる（例えば、Ｓｅｍａｇｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ３３：１−１４、および米国特許第７６１５６２０号明細書を参照）。プライマーがＰＣＲ産物に組み込まれ、続いて、ＦＲＥＴカセットがＰＣＲ産物に組み込まれると、蛍光を検出することができる。植物がトランスジェニック遺伝子座または対応する野生型遺伝子座についてホモ接合性である場合、挿入Ｔ−ＤＮＡに特異的なプライマーに特異的に結合するＦＲＥＴカセットのみ、または挿入前遺伝子座に特異的なプライマーに特異的に結合するＦＲＥＴカセットのみの蛍光を検出することができる。植物がトランスジェニック遺伝子座についてヘミ接合性である場合、トランスジェニックおよび野生型遺伝子座の両方の増幅を反映する、挿入Ｔ−ＤＮＡに特異的なプライマーに特異的に結合するＦＲＥＴカセット、および挿入前遺伝子座に特異的なプライマーに特異的に結合するＦＲＥＴカセットの両方の蛍光を検出することができる。
【０２０４】
植物がトランスジェニック遺伝子座または対応する野生型遺伝子座についてホモ接合性である場合、診断用ＰＣＲは、トランスジェニックまたは野生型遺伝子座のいずれかに典型的な、好ましくは長さにおいて典型的な、単一のＰＣＲ産物を生じるであろう。植物がトランスジェニック遺伝子座につきヘミ接合性である場合、トランスジェニックおよび野生型遺伝子座の両方の増幅を反映して、２つの遺伝子座特異的ＰＣＲ産物が現れる。
【０２０５】
あるいは、エリートイベントを含有する植物の接合性状態を決定するために、実施例に記載されるように定量的な方法で、ＰＣＲにおいてイベントの存在を決定することができる。この目的で、イベントＥＥ−ＧＭ４を認識する２つのプライマーは、それらが互いに指向されるように設計され、１つのプライマーは、配列番号５もしくは６内、または配列番号２４もしくは２５内に含有される５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列を特異的に認識し、１つのプライマーは、配列番号５もしくは６内、または配列番号２４もしくは２５内、または配列番号１１もしくは２３内の挿入Ｔ−ＤＮＡを特異的に認識する。この一組のプライマーは、ＥＥ−ＧＭ４特異的遺伝子座のＰＣＲ増幅を可能にする。増幅されたＤＮＡ断片は、増幅された断片に特異的に結合する反応混合物に含まれる標識プローブを用いて、定量的に検出することができる。標識プローブは、標識がもはやクエンチされず、ＰＣＲ産物に結合したときに蛍光を発するように、蛍光標識およびクエンチャーを含み得る。当技術分野で公知の方法を使用して、蛍光をリアルタイムで、すなわちＰＣＲ反応の各サイクル中に測定することができる。蛍光が特定の閾値レベルを超えるＰＣＲサイクルは、分析される生物学的試料中のＥＥ−ＧＭ４特異的遺伝子座の量の指標であり、接合性状態は、参照ホモ接合性およびヘテロ接合性試料に基づいて計算することができる。
【０２０６】
あるいは、ＥＥ−ＧＭ４を含む植物の接合性状態は、ＴａｑｍａｎケミストリーおよびリアルタイムＰＣＲの原理を使用して、コピー数分析に基づいて決定することもできる。代替的方法は、典型的には、ＥＥ−ＧＭ４コピー数を定量するためのＥＥ−ＧＭ４特異的反応、およびＥＥ−ＧＭ４コピー数の正規化のための内因性遺伝子特異的反応を含むであろう。ホモ接合状態のＥＥ−ＧＭ４イベントを含有する試料は、ヘミ接合試料よりも２倍高い相対コピー数を有するであろう。不対試料はそのような方法ではＥＥ−ＧＭ４配列を増幅しないであろう。
【０２０７】
さらに、ＰＣＲベースの増幅方法とは異なる、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４に特異的な検出方法もまた、本明細書に提供されるエリートイベント特異的配列情報を用いて開発することができる。そのような代替的な検出方法は、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）技術としても知られる、特定の核酸構造の侵襲的切断に基づく線形シグナル増幅検出方法を含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９８５，５５７号明細書「Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」第６，００１，５６７号「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｂｙ  Ｉｎｖａｄｅｒ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｃｌｅａｖａｇｅ」に記載されている）。この目的で、標的配列は、ヌクレオチド位置２２８からヌクレオチド位置２４５までの配列番号５のヌクレオチド配列またはその相補体を含む、またはヌクレオチド位置２３６からヌクレオチド位置２５３までの配列番号６のヌクレオチド配列またはその相補体を含む、標識された第１の核酸オリゴヌクレオチドによってハイブリダイズされ、ヌクレオチド２１０からヌクレオチド２２７までの配列番号５のヌクレオチド配列またはその相補体を含む第２の核酸オリゴヌクレオチド、またはヌクレオチド２５４からヌクレオチド２７１までの配列番号６のヌクレオチド配列またはその相補体を含む前記核酸オリゴヌクレオチドによってさらにハイブリダイズされ、前記第１および第２のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１ヌクレオチド重複する。このハイブリダイゼーションによって産生される二本鎖または三本鎖構造は、標的配列を無傷のまま残す酵素（Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標））による選択的プローブ切断を可能にする。切断された標識プローブは、その後、さらなるシグナル増幅をもたらす中間ステップを潜在的に介して検出される。
【０２０８】
一実施形態では、実質的に相補的な標識核酸プローブとのハイブリダイゼーションにより、生物学的試料中のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４の存在を検出する方法であって、プローブ：標的核酸比が、標的核酸配列の再利用により増幅され、前記方法が、
ａ）前記標的核酸配列を、ヌクレオチド位置２２８からヌクレオチド位置２４５までの配列番号５のヌクレオチド配列またはその相補体を含む第１の核酸オリゴヌクレオチド、またはヌクレオチド位置２３６からヌクレオチド位置２５３までの配列番号６のヌクレオチド配列またはその相補体を含む前記第１の核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるステップ；
ｂ）前記標的核酸配列を、ヌクレオチド２１０からヌクレオチド２２７までの配列番号５のヌクレオチド配列またはその相補体を含む第２の核酸オリゴヌクレオチド、またはヌクレオチド２５４からヌクレオチド２７１までの配列番号６のヌクレオチド配列またはその相補体を含む前記第２の核酸オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせるステップであって、前記第１および第２のオリゴヌクレオチドが少なくとも１ヌクレオチド重複し、前記第１または第２のオリゴヌクレオチドのいずれかが前記標識核酸プローブとなるように標識される、ステップ；
ｃ）プローブ：標的核酸配列二本鎖内の標識プローブのみを、二本鎖の解離を生じる選択的プローブ切断を引き起こす酵素で、標的配列を無傷のまま残して切断するステップ；
ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）を反復することにより標的核酸配列を再利用するステップ；および
ｅ）切断された標識プローブを検出し、それにより、前記標的核酸配列の存在を決定し、前記生物学的試料中のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４の存在を検出するステップ
を含む、方法が提供される。
【０２０９】
２つの核酸は、それらの配列が互いに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％相補的である場合など、（本明細書で定義されるように）互いの完全相補体ではない場合、本明細書で用いる「実質的に相補的」である。
【０２１０】
本明細書で使用される「キット」は、本発明の方法を実施する目的、より具体的には、生物学的試料中のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４の同定またはＥＥ−ＧＭ４含有植物材料の接合性状態の決定のための一組の試薬を指す。より具体的には、本発明のキットの好ましい実施形態は、エリートイベントの同定について上記した、少なくとも１つまたは２つの特異的プライマー、または接合性状態の決定について上記した、３つの特異的プライマー、または２つの特異的プライマーおよび１つの特異的プローブを含む。任意選択により、キットは、ＰＣＲ同定プロトコルにおいて本明細書に記載されている任意の他の試薬、またはＥＥ−ＧＭ４検出につき本明細書に記載されている任意の他のプロトコルをさらに含み得る。あるいは、本発明の別の実施形態によれば、キットは、上記のように、生物学的試料の核酸と特異的にハイブリダイズしてその中のＥＥ−ＧＭ４の存在を同定する特異的プローブを含み得る。任意選択により、キットは、特異的プローブを使用して、生物学的試料中のＥＥ−ＧＭ４を同定するための任意の他の試薬（ハイブリダイズ緩衝剤、標識など）をさらに含み得る。
【０２１１】
本発明のキットは、品質管理（例えばシードロットの純度）、植物材料または、植物材料を含むもしくはそれに由来する材料（限定されないが、食品または飼料または工業製品など）におけるエリートイベントの有無の検出の目的で、使用することができ、その成分は具体的に調整することができる。
【０２１２】
本明細書中で使用される場合、ヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に関する「配列同一性」は、２つの配列のうちの短い方のヌクレオチドの数で割った、同一のヌクレオチドを有する位置の数を指す。２つのヌクレオチド配列のアラインメントは、２０ヌクレオチドのウィンドウサイズ、４ヌクレオチドのワード長、および４のギャップペナルティーを使用して、ＷｉｌｂｕｒおよびＬｉｐｍａｎｎアルゴリズム（Ｗｉｌｂｕｒ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎｎ，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６）によって行われる。上記のような配列アラインメントを含む、配列データのコンピューター支援分析および解釈は、例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ）の配列分析ソフトウェアパッケージを用いて便宜的に実施することができる。そのような配列が少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％、または少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する場合、配列は、「本質的に類似」として示される。ＲＮＡ配列がＤＮＡ配列と本質的に類似しているか、またはある程度の配列同一性を有すると言われる場合、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）がＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）に等しいとみなされることは明らかである。また、小さな差異または突然変異が経時的にＤＮＡ配列に現れ得ること、および本発明のイベント特異的プライマーまたはプローブについていくつかのミスマッチが許容され得ることは明らかであり、任意の３’もしくは５’Ｔ−ＤＮＡ隣接ＤＮＡ、または任意の挿入物または挿入Ｔ−ＤＮＡについての本発明の任意の実施形態、または本発明の任意のプライマーもしくはプローブで本明細書中に示される任意のＤＮＡ配列は、任意の所与の配列から１〜２００、１〜１５０、１〜１００、１〜７５、１〜５０、１〜３０、１〜２０、１〜１０、１〜５、または１〜３ヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列などの、本発明の任意の３’もしくは５’Ｔ−ＤＮＡ隣接ＤＮＡ、任意のプライマーまたはプローブ、または任意の挿入物または挿入Ｔ−ＤＮＡにつき、与えられた配列にハイブリダイズする、またはそれと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列などの、本明細書に提供される配列と本質的に類似の配列も含む。
【０２１３】
本明細書で使用される「プライマー」という用語は、ＰＣＲなどのテンプレート依存的プロセスにおいて新生核酸の合成を開始することができる任意の核酸を包含する。典型的には、プライマーは１０〜３０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列も使用できる。一本鎖形態が好ましいが、プライマーは二本鎖形態で提供されてもよい。プローブはプライマーとして使用することができるが、標的ＤＮＡまたはＲＮＡに結合するように設計されており、増幅プロセスで使用する必要はない。
【０２１４】
特定のプライマーまたはプローブを指す場合に本明細書で使用される用語「認識」は、特定のプライマーまたはプローブが、方法に記載された条件（ＰＣＲ同定プロトコルの条件など）下でエリートイベント中の核酸配列に特異的にハイブリダイズし、これにより、特異性は、陽性および陰性対照の存在によって決定されるという事実を指す。
【０２１５】
本明細書で特異的プローブに言及する場合に使用される「ハイブリダイズする」という用語は、標準的ストリンジェンシー条件下で、そのプローブがエリートイベントの核酸配列中の特異的領域に結合するという事実を指す。本明細書で使用される標準的ストリンジェンシー条件は、本明細書に記載のハイブリダイゼーションの条件、またはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）により記載される従来のハイブリダイズ条件を指し、これは例えば、以下のステップ：１）植物ゲノムＤＮＡ断片をフィルター上に固定化するステップ、２）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、２×デンハート試薬および０．１％ＳＤＳ中、４２℃で１〜２時間、または６×ＳＳＣ、２×デンハート試薬および０．１％ＳＤＳ中、６８℃で１〜２時間、フィルターをプレハイブリダイズするステップ、３）標識されたハイブリダイゼーションプローブを添加するステップ、４）１６〜２４時間インキュベートするステップ、５）１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温でフィルターを２０分間洗浄するステップ、６）０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６８℃で、フィルターをそれぞれ２０分間３回洗浄するステップ、および７）増感紙を用いて、−７０℃で、フィルターをＸ線フィルムに２４〜４８時間露光するステップを含み得る。
【０２１６】
本明細書において使用される場合、生物学的試料は、植物、植物材料または植物材料を含む産物の試料である。用語「植物」は、任意の成熟の段階における、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）植物組織、および任意の種子、葉、茎、花、根、単一細胞、配偶子、細胞培養物、組織培養物、プロトプラストを含むがこれらに限定されない、任意のそのような植物から採取された、またはそれに由来する、任意の細胞、組織、または器官を包含することを意図している。本明細書で使用される「植物材料」は、植物から得られるかまたはそれに由来する材料を指す。植物材料を含む産物は、植物材料を使用して産生されるか、または植物材料によって汚染され得る、食品、飼料または他の産物に関する。本発明の文脈において、そのような生物学的試料は、試料中の核酸の存在を示唆する、ＥＥ−ＧＭ４に特異的な核酸の存在について試験されることが理解される。したがって、生物学的試料中のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を同定するために本明細書で言及される方法は、エリートイベントを含む核酸の生物学的試料中での同定に関する。
【０２１７】
本明細書で使用される場合、「含む」は、言及された記載の特徴、整数、ステップ、試薬または成分の存在を特定するものとして解釈されるべきであるが、１つ以上の特徴、整数、ステップまたは成分、またはその群の存在または追加を排除しない。したがって、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を含む核酸またはタンパク質は、実際に引用されたものよりも多くのヌクレオチドまたはアミノ酸を含み得、すなわち、より大きい核酸またはタンパク質に埋め込まれ得る。機能的または構造的に定義されたＤＮＡ配列を含むキメラ遺伝子は、プロモーター、リーダー、トレーラー、および／または転写終結配列などのさらなるＤＮＡ配列を含み得る（標的指向ペプチドまたは輸送ペプチドをコードするＤＮＡも含む可能性がある）。
【０２１８】
本発明はまた、このイベントを含むダイズ植物におけるエリートイベントＥＥ−ＧＭ４の開発、これらの植物から得られるエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含む子孫植物および種子、ならびにこのイベントを含む植物由来の植物材料にも関する。実施例に記載されるように、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含む植物を得ることができる。本発明はまた、寄託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託されたエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含む種子、またはエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含むその誘導体に関する。本明細書で使用される「（種子の）誘導体」は、そのような種子から生育し得る植物、自殖、交雑または戻し交雑に起因する子孫、ならびにその植物細胞、器官、部分、組織、細胞培養物、プロトプラスト、および植物材料を指す。
【０２１９】
ＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ植物または植物材料は、実施例２．１のＥＥ−ＧＭ４同一性分析のためのエンドポイント法、実施例２．２に記載のＥＥ−ＧＭ４同一性および接合性分析のためのエンドポイント法、実施例２．３に記載のＥＥ−ＧＭ４低レベル存在分析のためのリアルタイムＰＣＲ法を含む、実施例に記載のＥＥ−ＧＭ４のための同定プロトコルのうちのいずれかに従って同定することができる。簡潔には、生物学的試料中に存在するダイズゲノムＤＮＡは、配列番号１３または配列番号２１の配列を有するプライマーなどの、ＥＥ−ＧＭ４の５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列内の配列を特異的に認識するプライマー、および配列番号１２または配列番号２０の配列を有するプライマーなどの、挿入Ｔ−ＤＮＡ中の配列を認識するプライマーを使用して、またはＥＥ−ＧＭ４の５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列およびそれに隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡを認識するプライマーを用いて、ＰＣＲによって増幅される。内因性ダイズ配列の一部を増幅するＤＮＡプライマーをＰＣＲ増幅の陽性対照として使用する。ＰＣＲ増幅の際に、材料が予想されるサイズの断片を生成するか、または予想される蛍光標識の蛍光を引き起こす場合、材料は、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４を保有するダイズ植物由来の植物材料を含有する。
【０２２０】
ＥＥ−ＧＭ４を保有する植物は、それらのセンチュウ抵抗性、特に、ＳＣＮ、病害センチュウおよび／またはネコブ（「ＲＫＮ」）および／またはニセフクロセンチュウ抵抗性によって、ならびにそれらのイソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害剤に対する耐性によって特徴付けられる。ＥＥ−ＧＭ４を保有する異なる市販の品種のダイズ植物はまた、ＨＰＰＤ阻害除草剤施用およびＳＣＮ汚染の非存在下で、対応する非トランスジェニック同質遺伝子市販品種に匹敵する農業特性を有することによっても特徴付けられる。本明細書に記載のダイズ植物ゲノムの挿入領域における挿入Ｔ−ＤＮＡの存在は、このイベントを含む植物に対し、特に興味深い表現型および分子特性を付与することが観察されている。
【０２２１】
また、Ｃｒｙ１４Ａｂ−１をコードする遺伝子を欠き、ＨＰＰＤ−４をコードする遺伝子を欠く第１のダイズ植物を、ＥＥ−ＧＭ４含有ダイズ植物と交雑することによって、ＳＣＮに対する抵抗性およびＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性をダイズ植物のゲノムに導入するステップ、およびＳＣＮに抵抗性かつＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性の子孫植物を選択するステップを含む、ＳＣＮに抵抗性かつＨＰＰＤ阻害除草剤に耐性のダイズ植物の産生方法も本明細書に提供される。ＳＣＮに対する抵抗性は、標準的なＳＣＮ温室アッセイ、例えば、ｗｗｗ．ｐｌａｎｔｐａｔｈ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ｔｙｌｋａｌａｂ／ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ｓｃｒｅｅｎｉｎｇおよびｗｗｗ．ｐｌａｎｔｍａｎａｇｅｍｅｎｔｎｅｔｗｏｒｋ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｐｈｐ／ｒｅｖｉｅｗ／２００９／ｓｃｅ０８／を用いて測定することができる。
【０２２２】
本発明の一実施形態は、ダイズゲノム中の特定の位置に２つの導入遺伝子を挿入することによって得ることができるダイズ植物におけるエリートイベントであって、そのようなダイズ植物に、センチュウに対する抵抗性、およびイソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性を付与するエリートイベントを提供し、そのようなエリートイベントは、同質遺伝子系統と本質的に同様の農業成績を有する（本明細書で使用される場合、「同質遺伝子系統」または「近同質遺伝子系統」は、形質転換に使用された植物と同じ遺伝的背景を有する植物などの、同じ遺伝的背景を有するが導入遺伝子を欠くダイズ系統、または導入遺伝子を失った分離姉妹系統（「ヌル」）である）。特に、本発明は、ダイズ植物中のエリートイベントを提供し、そのようなダイズ植物のゲノム中の前記エリートイベントの挿入または存在は、病害に対する感受性の増加を引き起こさないようであり、収量の低下を引き起こさず、または同質遺伝子系統または市販のダイズ品種と比較して、倒伏の増加を引き起こさない。したがって、本発明は、ＥＥ−ＧＭ４と命名された、ダイズ植物中のエリートイベントを提供し、これは、同質遺伝子系統と比較して、前記ダイズ植物の収量に負の影響を及ぼすことなく、センチュウに対する抵抗性が改善され、イソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤の施用に耐えることができるダイズ植物をもたらし、これらのダイズ植物は、それらの病害感受性、または倒伏において、同質遺伝子ダイズ植物または市販ダイズ品種とは統計的に有意に異ならない。これらの特性により、本発明のエリートイベントは、センチュウ防除および雑草抵抗性管理プログラムにおける貴重なツールとなる。一実施形態では、イベントＥＥ−ＧＭ４は、イベントＥＥ−ＧＭ３（別名ＦＧ−０７２、ＭＳＴ−ＦＧφ７２−３、国際公開第２０１１０６３４１１号パンフレット、ＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  Ｐｅｔｉｔｉｏｎ０９−３２８−０１ｐに記載）、イベントＳＹＨＴ０Ｈ２（別名０Ｈ２、ＳＹＮ−φφφＨ２−５、国際公開第２０１２／０８２５４８号パンフレットおよび１２−２１５−０１ｐに記載）、イベントＤＡＳ−６８４１６−４（別名Ｅｎｌｉｓｔ  Ｓｏｙｂｅａｎ、国際公開第２０１１／０６６３８４号パンフレットおよび国際公開第２０１１／０６６３６０号パンフレット、ＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  Ｐｅｔｉｔｉｏｎ０９−３４９−０１ｐに記載）、イベントＤＡＳ−４４４０６−６（別名、Ｅｎｌｉｓｔ  Ｅ３、ＤＡＳ−４４４φ６−６、国際公開第２０１２／０７５４２６号パンフレットおよびＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  １１−２３４−０１ｐに記載）、イベントＭＯＮ８７７０８（Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  ２  Ｘｔｅｎｄ  Ｓｏｙｂｅａｎｓのジカンバ耐性イベント、国際公開第２０１１／０３４７０４号パンフレットおよびＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  Ｐｅｔｉｔｉｏｎ１０−１８８−０１ｐに記載、ＭＯＮ−８７７φ８−９）、イベントＭＯＮ８９７８８（別名Ｇｅｎｕｉｔｙ  Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  ２  Ｙｉｅｌｄ、国際公開第２００６／１３０４３６号パンフレットおよびＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  Ｐｅｔｉｔｉｏｎ０６−１７８−０１ｐに記載）、イベント４０−３−２（別名Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ、ＧＴＳ  ４０−３−２、ＭＯＮ−φ４φ３２−６、ＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  Ｐｅｔｉｔｉｏｎ９３−２５８−０１に記載）、イベントＡ２７０４−１２（別名ＬＬ２７、ＡＣＳ−ＧＭφ５−３、国際公開第２００６１０８６７４号パンフレットおよびＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  Ｐｅｔｉｔｉｏｎ９６−０６８−０１ｐに記載）、イベント１２７（別名ＢＰＳ−ＣＶ１２７−９、国際公開第２０１０／０８０８２９号パンフレットに記載）、イベントＡ５５４７−１２７（別名ＬＬ５５、ＡＣＳ−ＧＭφφ６−４、国際公開第２００６１０８６７５号パンフレットおよびＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  Ｐｅｔｉｔｉｏｎ９６−０６８−０１ｐに記載）、イベントＭＯＮ８７７０５（ＭＯＮ−８７７φ５−６、Ｖｉｓｔｉｖｅ  Ｇｏｌｄ、国際公開第２０１０／０３７０１６号パンフレット、ＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  Ｐｅｔｉｔｉｏｎ０９−２０１−０１ｐ）、もしくはイベントＤＰ３０５４２３（別名ＤＰ−３φ５４２３−１、国際公開第２００８／０５４７４７号パンフレット、ＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  Ｐｅｔｉｔｉｏｎ０６−３５４−０１ｐ）などの、グリホサート系、グルホシネート系、ＨＰＰＤ阻害剤系、スルホニルウレア系またはイミダゾリノン系、ＡＨＡＳもしくはＡＬＳ阻害および／またはオーキシン系（例えば、ジカンバ、２，４−Ｄ）除草剤のいずれか１つまたはその組み合わせに対する耐性を提供する１つ以上のダイズＧＭイベントと組み合わされるか、またはＥＥ−ＧＭ４は、以下のイベント：イベントＭＯＮ９８７８８  ｘ  ＭＯＮ８７７０８（別名Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  ２  Ｘｔｅｎｄ  Ｓｏｙｂｅａｎｓ、ＭＯＮ−８７７φ８−９  ｘ  ＭＯＮ−８９７８８−１）、イベントＨＯＳ  ｘ  イベント４０−３−２（別名Ｐｌｅｎｉｓｈ  Ｈｉｇｈ  Ｏｌｅｉｃ  Ｓｏｙｂｅａｎｓ  ｘ  Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙｂｅａｎｓ）、イベントＥＥ−ＧＭ３  ｘ  ＥＥ−ＧＭ２（別名ＦＧ−０７２ｘＬＬ５５、国際公開第２０１１０６３４１３号パンフレットに記載）、イベントＭＯＮ  ８７７０１  ｘ  ＭＯＮ  ８９７８８（別名Ｉｎｔａｃｔａ  ＲＲ２  Ｐｒｏ  Ｓｏｙｂｅａｎ、ＭＯＮ−８７７φ１−２  ×  ＭＯＮ−８９７８８−１）、ＤＡＳ−８１４１９−２  ｘ  ＤＡＳ−４４４０６−６（別名Ｃｏｎｋｅｓｔ（商標）Ｅｎｌｉｓｔ  Ｅ３（商標）Ｓｏｙｂｅａｎ、ＤＡＳ−８１４１９−２  ｘ  ＤＡＳ−４４４φ６−６）、イベントＤＡＳ−６８４１６−４  ｘ  イベントＭＯＮ  ８９７８８（別名Ｅｎｌｉｓｔ（商標）ＲｏｕｎｄＵｐ  Ｒｅａｄｙ（登録商標）２  Ｓｏｙｂｅａｎ、ＤＡＳ−６８４１６−４  Ｘ  ＭＯＮ−８９７８８−１）、イベントＭＯＮ−８７７６９−７  ×  イベントＭＯＮ−８９７８８−１（別名Ｏｍｅｇａ−３  Ｘ  Ｇｅｎｕｉｔｙ  Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  ２  Ｙｉｅｌｄ  Ｓｏｙｂｅａｎｓ）、イベントＭＯＮ  ８７７０５  ｘ  イベントＭＯＮ  ８９７８８（別名Ｖｉｓｔｉｖｅ  Ｇｏｌｄ、ＭＯＮ−８７７φ５−６  ｘ  ＭＯＮ−８９７８８−１）、もしくはイベントＭＯＮ８７７６９  ｘ  イベントＭＯＮ８９７８８（別名Ｏｍｅｇａ−３  ｘ  Ｇｅｎｕｉｔｙ  Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  ２  Ｙｉｅｌｄ  Ｓｏｙｂｅ��ｎｓ、ＭＯＮ−８７７６９−７  ｘ  ＭＯＮ−８９７８８−１）の組み合わせと組み合わされる。
【０２２３】
本明細書では、イベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ植物またはその一部も提供され、イベントＥＥ−ＧＭ４を含む代表的なダイズ種子は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３６２４で寄託されている。そのようなイベントを含むそのような植物の種子、およびそのような種子から産生されるダイズ産物が本明細書でさらに提供され、前記ダイズ産物はイベントＥＥ−ＧＭ４を含む。そのようなダイズ産物は、ダイズミール、粉砕ダイズ子実、ダイズフレーク、ダイズ粉、またはこれらの加工ダイズ産物のいずれかを含む産物であり得るか、またはそれらを含み得る。特に、そのようなダイズ産物は、イベントＥＥ−ＧＭ４につき診断的または特異的なアンプリコンを産生する核酸を含み、そのようなアンプリコンは、配列番号１もしくは３または配列番号２もしくは４のいずれか１つの配列を含む。イベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ種子または子実を得るステップ、およびそれからそのようなダイズ産物を産生するステップを含む、ダイズ産物を産生する方法も、本明細書で提供される。ダイズ油、ダイズタンパク質、レシチン、豆乳、豆腐、マーガリン、バイオディーゼル、バイオコンポジット、接着剤、溶剤、潤滑剤、洗浄剤、フォーム、塗料、インク、キャンドル、ダイズ油またはダイズタンパク質含有食品、または（動物）飼料製品などの、ダイズ子実に由来する加工食品、飼料、または工業製品を得る方法も本明細書に提供され、前記方法は、ＥＥ−ＧＭ４を含む子実を得るステップ、および前記子実から前記加工食品、飼料または工業製品を産生することを含む。一実施形態では、このプロセスはまた、イベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ種子または植物を得るステップ、前記種子または植物を圃場で生育するステップ、およびダイズ子実を収穫するステップを含み得る。任意選択により、この方法は、植える前、発芽前、発芽後、またはＥＥ−ＧＭ４を含む植物の上からの、ＩＦＴ、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤の施用を含む。一実施形態では、本明細書に記載の方法を用いてＥＥ−ＧＭ４イベント特異的アンプリコンを産生する、または配列番号１、３もしくは５から配列番号２、４もしくは６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む加工産物などの、上記のダイズ由来加工食品、飼料または工業製品が本発明に含まれる。
【０２２４】
また、配列番号１もしくは３の配列または配列番号２もしくは４の配列を含む上記ダイズ植物のいずれか１つの子孫植物または種子、または配列番号１もしくは３の配列および配列番号２もしくは４の配列を含む上記ダイズ植物のいずれか１つの子孫植物または種子、または配列番号５もしくは配列番号２４の配列または配列番号６もしくは配列番号２５の配列を含む上記ダイズ植物のいずれか１つの子孫植物または種子、または配列番号５もしくは配列番号２４の配列および配列番号６もしくは配列番号２５の配列を含む上記ダイズ植物のいずれか１つの子孫植物または種子などの、上記ダイズ植物のいずれかの子孫であり、イベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ植物も本明細書中に提供される。
【０２２５】
特に、イベントＥＥ−ＧＭ４を欠く第１のダイズ植物をＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ植物と交雑させることにより、イベントＥＥ−ＧＭ４をそのような植物のゲノムに導入するステップ、およびセンチュウに抵抗性であり、イソキサフルトールおよび／またはトプラメゾンおよび／またはメソトリオン除草剤に耐性である子孫植物を選択するステップを含む、センチュウに抵抗性であり、イソキサフルトールおよび／またはトプラメゾンおよび／またはメソトリオン除草剤に耐性であるダイズ植物の産生方法が本明細書でさらに提供される。
【０２２６】
また、Ｃｒｙ１４Ａｂ−１をコードする遺伝子およびＨＰＰＤ−４をコードする遺伝子を含み、イベントＥＥ−ＧＭ４の診断用アンプリコンを産生することができる、センチュウに抵抗性であり、イソキサフルトール、トプラメゾンまたはメソトリオン除草剤に耐性である、許容できる農業特性を有するダイズ植物も本明細書に提供される。また、本明細書に記載の特定の検出ツールを用いて得ることができる、そのような特定の単離されたアンプリコン（ＤＮＡ配列断片）、特に、５’または３’Ｔ−ＤＮＡ隣接ＤＮＡおよび本明細書で定義されるように形質転換によって植物ゲノムに挿入されたＤＮＡに由来するＤＮＡ断片をそれらの配列中に含むアンプリコンも本明細書に提供される。
【０２２７】
イソキサフルトール系またはトプラメゾン系またはメソトリオン系除草剤などのＨＰＰＤ阻害除草剤の有効量で圃場を処理するステップを含む、イベントＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ植物の圃場、またはそのようなダイズ植物が植えられる圃場（前記植物は処理後に前記圃場に植えられる）の雑草の防除方法が本明細書でさらに提供され、ここで、そのような植物は、そのような除草剤に対して耐性である。
【０２２８】
配列番号５もしくは６の配列またはそれと本質的に類似の配列を含むＤＮＡ、およびＥＥ−ＧＭ４を含む植物、細胞、組織または種子などの、そのようなＤＮＡ配列を含む、特にダイズの、任意の植物、細胞、組織または種子が本明細書でさらに提供される。また、配列番号５または６のＤＮＡ配列（従来のダイズ植物、種子、組織または細胞に対して異種または外来）を含む、または配列番号５もしくは２４または配列番号６もしくは２５の配列に対して少なくとも９９％または９９．５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む任意のダイズ植物、細胞、組織または種子も本明細書に含まれる。
【０２２９】
また、挿入Ｔ−ＤＮＡを含むキメラＤＮＡも記載され、前記挿入Ｔ−ＤＮＡの配列は、ヌクレオチド１７からヌクレオチド７６２１までの配列番号１１、もしくはヌクレオチド位置１０５９からヌクレオチド位置８６６３までの配列番号２３、またはそれと少なくとも９７、９８、９９、９９．５または少なくとも９９．９％の配列同一性を有し、５’および３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域が隣接する配列を含み、前記挿入Ｔ−ＤＮＡのすぐ上流に隣接する５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域は、ヌクレオチド１からヌクレオチド２２７までの配列番号５、もしくはヌクレオチド１からヌクレオチド１０５８までの配列番号２４の配列を含む配列によって特徴付けられ、前記挿入Ｔ−ＤＮＡのすぐ下流に隣接する３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域は、ヌクレオチド２５４からヌクレオチド５０１までの配列番号６の配列、またはヌクレオチド２５４からヌクレオチド１３３９までの配列番号２５の相補体のヌクレオチド配列を含む配列によって特徴付けられる。一実施形態では、前記挿入Ｔ−ＤＮＡの配列は、ヌクレオチド１７からヌクレオチド７６２１までの配列番号１１、もしくはヌクレオチド位置１０５９からヌクレオチド位置８６６３までの配列番号２３、またはそれと少なくとも９７、９８、９９、９９．５または少なくとも９９．９％の配列同一性を有し、５’および３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域の一部が隣接する配列からなり、前記挿入Ｔ−ＤＮＡのすぐ上流に隣接する５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域の一部は、ヌクレオチド１からヌクレオチド２２７までの配列番号５、もしくはヌクレオチド１からヌクレオチド１０５８までの配列番号２４の配列、またはそれと少なくとも９７、９８、９９、９９．５または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列からなる配列によって特徴付けられ、前記挿入Ｔ−ＤＮＡのすぐ下流に隣接する３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域の一部は、ヌクレオチド２５４からヌクレオチド５０１までの配列番号６の配列、またはヌクレオチド２５４からヌクレオチド１３３９までの配列番号２５の相補体のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも９７、９８、９９、９９．５または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列からなる配列によって特徴付けられる。
【０２３０】
キメラＤＮＡは、天然には一緒に見られない調節配列およびコード配列を含むＤＮＡ配列を指す。したがって、キメラＤＮＡは、異なる供給源に由来するか、または天然に見出されるものとは異なる様式で配置されている、互いに隣接するＤＮＡ領域を含み得る。キメラＤＮＡの例は、配列番号５または６の配列である。
【０２３１】
また、配列番号１または３に本質的に類似するヌクレオチド配列を含む核酸分子、および配列番号２または４に本質的に類似するヌクレオチド配列または前記配列の相補体を含む核酸分子によって特徴付けられるイベントＥＥ−ＧＭ４をそれらのゲノム中に含む、トランスジェニックダイズ植物、植物細胞、組織、または種子、ならびに配列番号５もしくは２４および配列番号６もしくは２５に本質的に類似するヌクレオチド配列または前記配列の相補体を含む核酸分子によって特徴付けられるイベントＥＥ−ＧＭ４をそれらのゲノム中に含む、ダイズ植物、植物細胞、組織、または種子も本明細書に提供される。
【０２３２】
さらに、配列番号１、３、５または２４のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する核酸配列、および配列番号２、４、６、または２５のいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する核酸配列、または前記配列の相補体をその細胞のゲノム中に含むことによって特徴付けられる、ＥＥ−ＧＭ４を含むダイズ植物、細胞、組織または種子も本明細書に提供される。
【０２３３】
「イソキサフルトール」という用語は、本明細書で使用される場合、除草剤イソキサフルトール［すなわち、（５−シクロプロピル−４−イソオキサゾリル）［２−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）フェニル］メタノン］、その活性代謝物、ジケトニトリル、および前記化合物を含む任意の混合物または溶液を指す。本発明における施用に有用なＨＰＰＤ阻害除草剤は、ジケトニトリル、例えば、２−シアノ−３−シクロプロピル−１−（２−メチルスルホニル−４−トリフルオロメチルフェニル）−プロパン−１，３−ジオンおよび２−シアノ−１−［４−（メチルスルホニル）−２−トリフルオロメチルフェニル］−３−（１−メチルシクロプロピル）プロパン−１，３−フィオン；他のイソオキサゾール；およびピラゾリネート、例えば、トプラメゾン［すなわち、［３−（４，５−ジヒドロ−３−イソオキサゾリル）−２−メチル−４−（メチルスルホニル）フェニル］（５−ヒドロキシ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メタノン］、およびピラスルホトール［（５−ヒドロキシ−１，３−ジメチルピラゾール−４−イル（２−メシル−４−トリフルアロ（ｔｒｉｆｌｕａｒｏ）メチルフェニル）メタノン）］；またはメソトリオン［２−［４−（メチルスルホニル）−２−ニトロベンゾイル］シクロヘキサン−１，３−ジオン］；または２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド］；または２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド；またはピラゾフェン［２−［４−（２，４−ジクロロベンゾイル）−１，３−ジメチルピラゾール−５−イルオキシ］アセトフェノン］である。
【０２３４】
本発明の一実施形態では、ＥＥ−ＧＭ４イベントを含有するダイズ植物を植える圃場は、イソキサフルトール（「ＩＦＴ」）、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤で、またはダイズが蒔かれる前に、ＨＰＰＤ阻害除草剤およびグリホサートの両方で処理することができ、これは、ＨＰＰＤ阻害剤および／またはグリホサートによって死滅される圃場の雑草を除去し、不耕起方法において、その後、前処理された同じ圃場にダイズを植える、または蒔くことを許容する（ＨＰＰＤ阻害除草剤を使用した焼払い施用）。ＩＦＴの残留活性はまた、生育ステージの早い段階での雑草による競争から発芽および生育中のダイズ植物を保護するであろう。ダイズ植物がある程度のサイズになり、雑草が再発する傾向になると、ＨＰＰＤ阻害剤もしくはＨＰＰＤ阻害剤と選択的（従来の）ダイズ除草剤との混合物、またはＨＰＰＤ阻害剤と、ダイズにおいて非選択的である除草剤（例えば、グリホサートまたはグルホシネート）との混合物であるが、植物が耐性遺伝子／遺伝子座を含有するため、前記植物が前記除草剤に対して耐性であるものを、植物の上から発芽後除草剤として施用することができる。
【０２３５】
本発明の別の実施形態では、ＥＥ−ＧＭ４イベントを含有する種子が蒔かれた圃場をダイズ植物が発芽する前であるが種子が蒔かれた後に、ＩＦＴ、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤で処置することができ（耕起、またはチゼル耕起または苗床作製などの従来の耕作方法を含む、他の方法を用いて、蒔く前に圃場を雑草のない状態にすることができる）、ここで、残存活性が除草剤によって死滅された雑草のない状態に圃場を保つため、発芽および生育しているダイズ植物は雑草による競合を有しないであろう（ＨＰＰＤ阻害除草剤の発芽前施用）。ダイズ植物がある程度のサイズになり、雑草が再発する傾向になると、ＨＰＰＤ阻害剤またはＨＰＰＤ阻害剤−ダイズ選択的（従来の）除草剤混合物、またはＨＰＰＤ阻害剤と、ダイズにおいて非選択的である除草剤（例えば、グリホサートまたはグルホシネート）との混合物であるが、植物が耐性遺伝子／遺伝子座を含有するため、前記植物が前記除草剤に対して耐性であるものを、植物の上から発芽後除草剤として施用することができる。本発明の一実施形態では、ＥＥ−ＧＭ４含有ダイズ種子を圃場に蒔くステップ、および植物が前記種子から発芽する前であるが種子が蒔かれた後に、前記圃場をＨＰＰＤ阻害除草剤で処理するステップを含む、雑草防除プロセスが提供される。
【０２３６】
本発明の別の実施形態では、ＥＥ−ＧＭ４イベントを含有する植物は、ＩＦＴ、トプラメゾンまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤で、蒔かれた種子から発芽したダイズ植物の上から処理することができ、これは、ＨＰＰＤ阻害剤によって死滅される圃場の雑草を除去し、その施用は、選択的ダイズ発芽後除草剤、またはダイズにおいて非選択的である除草剤（例えば、グリホサートまたはグルホシネート）であって、植物が耐性遺伝子／遺伝子座を含有するため、前記植物が前記除草剤に対して耐性である、除草剤による、植物の上からの処理と共に（例えば、スプレータンク混合物中で）、またはその前に、またはその後に行うことができる（ＨＰＰＤ阻害除草剤の発芽後施用（前記ダイズ選択的または非選択的除草剤を伴うまたは伴わない））。
【０２３７】
また、本発明によれば、ＥＥ−ＧＭ４（本明細書に記載されるような別の除草剤耐性ダイズイベント／形質も含有し得る）を保有するダイズ植物は、ダイズ殺虫剤、除草剤または殺菌剤で処理され得る、またはＥＥ−ＧＭ４を保有するダイズ種子は、ダイズ殺虫剤、除草剤または殺菌剤で被覆され得る。
【０２３８】
以下の実施例では、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４の開発および同定、このイベントを含む異なるダイズ系統の開発、および生物学的試料中のエリートイベントＥＥ−ＧＭ４の特異的同定のためのツールの開発について説明する。
【０２３９】
実施例において別段の記載がない限り、全ての組換え技術は、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＤＷ（ｅｄｓ．）（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ」および「Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＡ，Ｂｒｅｎｔ  Ｒ，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ  ＲＥ，Ｍｏｏｒｅ  ＤＤ，Ｓｅｉｄｍａｎ  ＪＧ，Ｓｍｉｔｈ  ＪＡ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｈｌ  Ｋ（ｅｄｓ．）（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ」に記載されるような標準的なプロトコルに従って行われる。
【０２４０】
標準的な材料および参照は、「Ｃｒｏｙ  ＲＤＤ（ｅｄ．）（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＬａｂＦａｘ，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ」および「Ｂｒｏｗｎ  ＴＡ，（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＬａｂＦａｘ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ」に記載される。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための標準的な材料および方法は、「ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ＭＪ  ａｎｄ  Ｍφｌｌｅｒ  ＳＧ（２０００）ＰＣＲ（Ｔｈｅ  Ｂａｓｉｃｓ），ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ」および「ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００６），Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ｏｒ  ｗｗｗ．ｒｏｃｈｅ−ａｐｐｌｉｅｄ−ｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ」に見出すことができる。
【０２４１】
以下の実施例中のＰＣＲプロトコルなどの任意の実験プロトコルにおけるいくつかのパラメータは、特定の実験室条件に調整する必要がある可能性があり、同様の結果を得るためにわずかに修正され得ることが理解されるべきである。例えば、ＰＣＲ法におけるＤＮＡの調製または他のプライマーの選択のための異なる方法の使用は、ＰＣＲプロトコルのための他の最適条件を決定し得る。しかしながら、これらの調整は当業者には明らかであり、現在のＰＣＲアプリケーションマニュアルにさらに詳述される。
【０２４２】
説明および実施例において、添付の配列表の以下の配列を参照する。
配列番号１：５’接合ＥＥ−ＧＭ４
配列番号２：３’接合ＥＥ−ＧＭ４
配列番号３：ＥＥ−ＧＭ４  ５’接合
配列番号４：ＥＥ−ＧＭ４  ３’接合
配列番号５：ＥＥ−ＧＭ４  ５’領域
配列番号６：ＥＥ−ＧＭ４  ３’領域
配列番号７：ｃｒｙ１４Ａｂ−１．ｂコード配列
配列番号８：Ｃｒｙ１４Ａｂ−１タンパク質アミノ酸配列
配列番号９：ｈｐｐｄＰｆ−４Ｐａコード配列
配列番号１０：ＨＰＰＤ−４タンパク質アミノ酸配列
配列番号１１：形質転換プラスミドｐＳＺ８８３２−Ｔ−ＤＮＡボーダー間の配列
配列番号１２：プライマーＰＲＩＭ０９３７
配列番号１３：プライマーＰＲＩＭ０９３８
配列番号１４：プローブＴＭ１７３４
配列番号１５：プライマーＳＨＡ０７１
配列番号１６：プライマーＳＨＡ０７２
配列番号１７：プローブＴＭ１４２８
配列番号１８：プライマーＰＲＩＭ１６５２
配列番号１９：プローブＴＭ２０８４
配列番号２０：プライマーＰＲＩＭ０９３９
配列番号２１：プライマーＰＲＩＭ０９４０
配列番号２２：プローブＴＭ１７３５
配列番号２３：ダイズイベントＥＥ−ＧＭ４
配列番号２４：ＥＥ−ＧＭ４  ５’接合配列
配列番号２５：ＥＥ−ＧＭ４  ３’接合配列
配列番号２６：プライマーＧＬＰＢ１７３
配列番号２７：プライマーＧＬＰＢ１７５
配列番号２８：プライマーＧＬＰＢ１６７
配列番号２９：プライマーＧＬＰＢ１７０
配列番号３０：挿入前遺伝子座配列
【実施例】
【０２４３】
１．センチュウ抵抗性および除草剤耐性遺伝子でのダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）の形質転換
１．１．ｃｒｙ１４Ａｂ−１．ｂおよびｈｐｐｄＰｆ−４Ｐａキメラ遺伝子を含む挿入Ｔ−ＤＮＡの説明
以下のｈｐｐｄＰｆ−４Ｐａおよびｃｒｙ１４Ａｂ−１．ｂ発現カセットを含有するベクターｐＳＺ８８３２を用いたアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換により、ＥＥ−ＧＭ４ダイズを開発した。
（ｉ）ＨＰＰＤ−４タンパク質をコードする変異型ｈｐｐｄＰｆ−４Ｐａ遺伝子。ｈｐｐｄＰｆ−４Ｐａコード配列は、位置３３５（ＰｒｏによるＧｌｕの置換）、位置３３６（ＴｒｐによるＧｌｙの置換）、位置３３９（ＡｌａによるＬｙｓの置換）および位置３４０（ＧｌｎによるＡｌａの置換）に点変異をシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）株Ａ３２由来のＨＰＰＤタンパク質をコードするＤＮＡ中に導入することによって発現された。ＨＰＰＤ−４タンパク質の発現は、イソキサフルトールまたはメソトリオンなどのＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性を付与する。
（ｉｉ）ｃｒｙ１４Ａｂ−１．ｂ遺伝子は、Ｃｒｙ１４Ａｂ−１タンパク質をコードする。Ｃｒｙ１４Ａｂ−１タンパク質の発現は、ダイズシストセンチュウのヘテロデラ・グリシネス（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ）などのセンチュウに対する抵抗性を付与する。
【０２４４】
プラスミドｐＳＺ８８３２は、右Ｔ−ＤＮＡ境界（ＲＢ）と左Ｔ−ＤＮＡ境界（ＬＢ）との間に位置するｃｒｙ１４Ａｂ−１．ｂキメラ遺伝子およびｈｐｐｄＰｆ−４Ｐａキメラ遺伝子を含有する植物形質転換ベクターである。右と左のＴ−ＤＮＡ境界の間のＴ−ＤＮＡに含まれる遺伝要素の説明を以下の表１に示す。このプラスミドの（Ｔ−ＤＮＡ境界間の）Ｔ−ＤＮＡの確認的配列決定により、配列番号１１の配列が得られた。ｃｒｙ１４Ａｂ−１．ｂおよびｈｐｐｄＰｆ−４Ｐａコード配列（コード鎖を示す）のヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号７および９に表されている。
【０２４５】
【表３】
2020503020.tif 000004
【０２４６】
【表４】
2020503020.tif 000005
【０２４７】
１．２．イベントＥＥ−ＧＭ４
Ｔ−ＤＮＡベクターｐＳＺ８８３２をアグロバクテリウム・ツメフアシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入し、形質転換ダイズ植物（変種Ｔｈｏｒｎｅ）を当技術分野で公知の方法に従ってＨＰＰＤ阻害剤耐性を用いて選択した。生存している植物を自家受粉させてＴ１種子を生成した。その後の世代は自家受粉によって、または他のダイズの生殖質への交雑によって産生された。
【０２４８】
１．２．１  エリートイベントＥＥ−ＧＭ４の同定
エリートイベントＥＥ−ＧＭ４は、広範な選択手順に基づき（温室および圃場における形質有効性、分子特性、および農業特性を含むがこれらに限定されないパラメータに基づき）、同じキメラ遺伝子を用いて得られた広範囲の異なる形質転換イベントから選択された。ＥＥ−ＧＭ４を含有するダイズ植物は、ダイズ植物ゲノム中の単一遺伝子座に導入遺伝子の挿入を有すること、形質転換に使用された親植物と同様の総合的農学を有すること、形質転換ＤＮＡの挿入による収量の不利益を引き起こさないこと（導入遺伝子が分離した形質転換植物から得られた「ヌル」植物系統などの、イベントを有しない対応する同質遺伝子系統と比較して）、標準的なＳＣＮ温室アッセイにおいて根を汚染する雌成虫の有意な減少をもたらすこと、およびＥＥ−ＧＭ４を含有しない同遺伝子型ヌル系統と比較して、圃場におけるＳＣＮセンチュウプレッシャー下で改善された収量を有することが見出された。さらに、ＨＰＰＤ阻害除草剤の施用に対する耐性が圃場試験で測定されたが、除草剤耐性はエリートイベント選択の選択基準ではなかった。
【０２４９】
１．２．１．１  イベントの分子分析
サザンブロットの結果は、ＥＥ−ＧＭ４が、ｃｒｙ１４Ａｂ−１．ｂキメラ遺伝子の単一コピーおよびｈｐｐｄＰｆ−４Ｐａキメラ遺伝子の単一コピーを含有する、単一のトランスジェニック遺伝子座を含有することを示した。ＥＥ−ＧＭ４は、ｈｐｐｄＰｆ−４Ｐａキメラ遺伝子の３５Ｓプロモーターの一部を欠いている（これは、形質転換中に配列番号１１の全Ｔ−ＤＮＡがダイズゲノムに挿入されたわけではないことを示す）。Ｔ−ＤＮＡの左右の境界およびａａｄＡ配列に隣接するベクター骨格配列を標的とするプライマーを用いたＰＣＲ分析ではＰＣＲ断片は得られなかった。また、複数世代のＥＥ−ＧＭ４における同一のＥＥ−ＧＭ４組込み断片の存在は、イベントの構造的安定性を実証する。
【０２５０】
１．２．１．２  イベントの遺伝
ＰＣＲ分析によりｈｐｐｄＰｆ−４Ｐａおよびｃｒｙ１４Ａｂ−１．ｂ遺伝子の遺伝子型を試験することによる、後継世代における挿入Ｔ−ＤＮＡ挿入物の遺伝は、ＥＥ−ＧＭ４挿入物内に含有されるｈｐｐｄＰｆ−４Ｐａおよびｃｒｙ１４Ａｂ−１．ｂ遺伝子は、予測可能な方法で、かつ単一の挿入について予想されるように遺伝することを示す。これらのデータはメンデルの原理と一致しており、ＥＥ−ＧＭ４イベントがダイズ核ゲノム内の単一の染色体遺伝子座に組み込まれた単一の挿入物からなるという結論をサポートする。
【０２５１】
また、５つの優良ダイズ系統へのＥＥ−ＧＭ４の遺伝子移入による後継世代におけるＥＥ−ＧＭ４の分離パターンの分析により、正常なメンデル分離が確認された。表２は、異なる分離集団において観察されたＥＥ−ＧＭ４の分離を示す。
【０２５２】
【表５】
2020503020.tif 000006
【０２５３】
表２において、「ＨＨ」はホモ接合性植物を表し、「Ｈｅｍｉ」はヘミ接合植物を表し、「ｎｕｌｌ」はＥＥ−ＧＭ４を失ったヌル分離体を表し、「ｎｓ」は統計的に有意でないことを意味する（正常な／予測される分離からの任意の変動について）。これらの試験において、親１は、Ｒｈｇ１およびＲｈｇ４ＳＣＮ抵抗性を有するＭＧ  ＶＩ系統であり、親２は、ＳＣＮに感受性のＭＧ  ＶＩ系統であり、親３は、ＳＣＮに感受性のＭＧ  ＩＸ系統であり、親４は、Ｒｈｇ１ＳＣＮ抵抗性を有するＭＧ  ＩＩＩ系統であり、親５は、ＳＣＮに感受性のＭＧ  Ｉ系統であった。
【０２５４】
１．２．１．３  タンパク質発現の安定性
温室生育植物におけるＨＰＰＤ−４およびＣｒｙ１４Ａｂ−１タンパク質のタンパク質発現レベルは、ＥＥ−ＧＭ４ダイズの異なる世代（例えば、Ｔ４、Ｔ６およびＢＣ２Ｆ３）から収集された葉、根および種子試料中のサンドイッチ酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。ＨＰＰＤ−４およびＣｒｙ１４Ａｂ−１タンパク質は、試験した全ての世代にわたって、葉、根および種子において同様の平均発現レベルを示す。Ｃｒｙ１４Ａｂ−１およびＨＰＰＤ−４濃度において観察されたいかなる差異も、天然の植物間可変性に起因するものであった。
【０２５５】
１．２．１．４  農業成績およびＨＰＰＤ阻害除草剤に対する耐性
農学的等価性試験において、本来の形質転換バックグラウンド（Ｔｈｏｒｎｅ）中にＥＥ−ＧＭ４を含む植物を、ＳＣＮの非存在下で生育した場合の分離ヌル（ＥＥ−ＧＭ４を欠く）および野生型Ｔｈｏｒｎｅ植物と比較した。試験区はＨＰＰＤ除草剤で処理されなかったが、従来の除草剤の使用および必要に応じて手作業での除草によって、雑草がないように維持された。異なる場所での比較試験において生育した場合、花の色、鞘の色、種子の色および柔毛などの定性的植物特性について、および収量、全高、倒伏、植分、成熟までの日数などの定量的特性について検査すると、イベント含有する植物と分離ヌル（ＥＥ−ＧＭ４を欠く）との間で生物学的に有意な方法で農業成績に影響する差異は観察されなかった。したがって、ＥＥ−ＧＭ４を含む植物は、対応する非トランスジェニック植物に匹敵する正常な農業特性を示した。
【０２５６】
本来のＴｈｏｒｎｅ形質転換バックグラウンドでＥＥ−ＧＭ４を用いたさらなる試験が２０１７年に実施された。ＥＥ−ＧＭ４がエリートＭＧ１およびＭＧ３の遺伝的背景にある予備試験もまた、限られた数の場所で２０１７年に構築された。花の色、鞘の色、種子の色および柔毛などの定性的植物特性について、ならびに収量、全高、倒伏、植分、試験重量、および成熟までの日数などの定量的特性について検査すると、ＥＥ−ＧＭ４を有する植物では成熟にわずかな遅れ（０．８日）が見られたが、３つの遺伝的背景のいずれにおいてもイベントを含有する植物と分離ヌル（ＥＥ−ＧＭ４を欠く）との間に農学的に有意義な違いは観察されず、これにより、ＥＥ−ＧＭ４を含む植物が正常な農業特性を示すことが確認された。
【０２５７】
ＨＰＰＤ阻害除草剤に対するＥＥ−ＧＭ４を含む植物の耐性は、２年間にわたって圃場の異なる場所で試験された。これらの試験では、発芽後に施用した場合、ＥＥ−ＧＭ４を有する植物はイソキサフルトール（ＩＦＴ）に対して商業的に適切な耐性を有していたが、ＩＦＴ発芽前施用の作物損害は少し高かったことが見出された。これらの試験はまた、発芽後に施用した場合または発芽後に施用した場合に、イベントＥＥ−ＧＭ４を含有する植物がメソトリオン（ＭＳＴ）に対して商業的に適切な耐性を有することを示した。全ての発芽後処理は、除草剤活性を高めるためにアジュバント作物油濃縮物および硫酸アンモニウムと共に、Ｖ２−Ｖ３ステージで行われた。
【０２５８】
図５は、非形質転換／従来のダイズ植物と比較した、イベントＥＥ−ＧＭ４を含有するダイズ植物についての、２年間にわたるいくつかの圃場試験において除草剤処理について記録された最大植物毒性データ（植物損傷）の平均を示す。対照の非形質転換Ｔｈｏｒｎｅ植物は、これらの同じ試験において約８０〜９０％の平均最大植物毒性値を示し、これは、これらのＨＰＰＤ阻害除草剤が（非ＧＭ）ダイズによって耐容されないことを示している。本明細書で使用される「最大植物毒性」は、試験期間中の任意の観察（１試験あたり３〜４回の観察）において記録された最も高い植物毒性評価である。既存の雑草防除施用では、発芽前または発芽後施用におけるイソキサフルトール（ＩＦＴ）および発芽後施用におけるＭＳＴの通常（１ｘ）用量は１０５ｇｒ／ｈａであり、発芽前施用におけるメソトリオンの通常（１ｘ）用量は２１０ｇｒ／ｈａである。したがって、図５で報告されたこれらの試験では、図５において発芽前に用いられた施用（ＩＦＴにつき４２０ｇｒ／ｈａ、メソトリオンにつき８４０ｇｒ／ｈａ）は通常用量の４倍であり、発芽後（ＩＦＴおよびメソトリオンの各々について２１０ｇｒ／ｈａ）では通常用量の２倍であった。
【０２５９】
また、２年間にわたるいくつかの圃場試験で、イベントＥＥ−ＧＭ４を有するダイズ植物は、それぞれ発芽前に４００ｇｒ  ａｉ／ｈａで、または発芽後に２００ｇｒ  ａｉ／ｈａで施用した場合、ＨＰＰＤ阻害剤試験化合物２−メチル−Ｎ−（５−メチル−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル）−３−（メチルスルホニル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（米国特許第９１０１１４１号明細書）に対して良好な耐性を有していた（各処理の平均最大植物毒性値は２０％未満であった）。これらの試験では、イベントＥＥ−ＧＭ４を有するダイズ植物は、発芽後に１００〜１５０ｇｒ  ａｉ／ｈａで施用した場合、試験化合物２−クロロ−３−（メチルスルファニル）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−テトラゾール−５−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（米国特許第８４８１７４９号明細書）に対して耐性を示したが、３０％の平均最大植物毒性は、他のＨＰＰＤ阻害剤よりも幾分高かった。全ての発芽後処理は、除草剤活性を高めるためにアジュバント作物油濃縮物および硫酸アンモニウムと共に、Ｖ２−Ｖ３ステージで行われた。
【０２６０】
除草剤耐性圃場試験の第３シーズンから得られたデータを追加し、ＥＥ−ＧＭ４に対し、前または後にイソキサフルトール除草剤を同じ投与量で、しかし別の地理的位置で、適用した場合、図５に記載のものと同じまたは非常に類似した平均最大植物毒性評価がＩＦＴについて得られた。
【０２６１】
１．２．１．５  センチュウ抵抗性
温室内の標準的なＳＣＮアッセイは、Ｔｈｏｒｎｅ野生型ダイズ植物と比較した場合、ＥＥ−ＧＭ４を含有する植物の根のＳＣＮシストの有意な減少を示した。さらに、温室内で雌性指数を測定する標準的なＳＣＮアッセイでも、イベントＥＥ−ＧＭ４および天然ＳＣＮ抵抗性を含有するダイズ植物は、ＥＥ−ＧＭ４を含まないＳＣＮ抵抗性エリートダイズ系統と比較して、根におけるＳＣＮシストの有意な減少を示すことが示された。ＥＥ−ＧＭ４を、ＰＩ８８７８８ダイズ抵抗性を有するエリートダイズ系統（成熟度群３）またはＰｅｋｉｎｇダイズ抵抗性を有するエリートダイズ系統（成熟度群６．２）に遺伝子移入した場合、根において、天然の抵抗性のみを有する根と比較して、一貫してＳＣＮシスト数の減少が見られた。
【０２６２】
いくつかの場所での２年間にわたる圃場試験では、ＥＥ−ＧＭ４を含有するダイズ植物は、ＳＣＮ汚染圃場において同質遺伝子ヌル分離体と比較して有意な収量増加を与えた。図６は、２０１５年および２０１６年に、アイオワ州、イリノイ州、インディアナ州、ミズーリ州およびテネシー州を通した９つの異なる場所において、ＳＣＮ汚染圃場（低ＳＣＮから高ＳＣＮ汚染にわたる）で試験した、本来の形質転換体バックグラウンド（Ｔｈｏｒｎｅ）中のＥＥ−ＧＭ４の子実収量を示す。本来の形質転換体バックグラウンド（Ｔｈｏｒｎｅ）でＥＥ−ＧＭ４を用いた追加試験が２０１７年にＳＣＮプレッシャーを変えて合計１２ヶ所で実施された。これら１２の試験の全てにわたって、ＥＥ−ＧＭ４を含有する植物は、ＥＥ−ＧＭ４を欠くヌル分離体よりも平均で８％高い収量を産生した（ｐ＝０．０２）。図７は、ＳＣＮに感受性のエリートＭＧ  Ｉ（成熟度グループＩ）系統に遺伝子移入（ＢＣ２Ｆ３）され、２０１６年にミネソタ州の１ヶ所およびノースダコタ州の１ヶ所（それぞれ高ＳＣＮ汚染レベルを有する）で試験された場合のＥＥ−ＧＭ４の子実収量を示す。同じＭＧ  Ｉ系統を、同じ２ヶ所（再度それぞれ高ＳＣＮ汚染を有する）およびウィスコンシン州の追加施設（後者は中程度のＳＣＮプレッシャーを有する）で試験し、ＥＥ−ＧＭ４を含有する植物の子実収量は、ＥＥ−ＧＭ４を欠いている、対応するヌル分離体よりも一貫して高かった。最後に、２０１７年の遅い時期に植えられた試験における中程度から高いＳＣＮプレッシャーを有するブラジルの３ヶ所にわたる予備的研究は、分離ヌル（ＥＥ−ＧＭ４を欠く）と比較した場合、ＥＥ−ＧＭ４を有する植物のエリート感受性系統において２９％の有意な平均増加を示した（ｐ＝０．００２）。遅い時期に植えたことから、これらのブラジルの予備試験の全体収量は低くなる傾向にあり、１つの試験内の変動は比較的大きく、これは収量増加の規模に影響を及ぼした可能性があるが、明らかに有意かつ視覚的に観測可能な収量増加がＥＥ−ＧＭ４を有する植物につき見出された。したがって、イベントＥＥ−ＧＭ４は、ＳＣＮ汚染圃場においてダイズ植物に有意な収量増加を与える。
【０２６３】
天然のＳＣＮ抵抗性と組み合わされた場合のイベントＥＥ−ＧＭ４の収量に対する影響を評価するための予備研究において、一連のＦ３集団が、ＰＩ８８７８８由来のｒｈｇ１抵抗性遺伝子を保有する従来のエリートＭＧ  ＩＩＩ系統とのＥＥ−ＧＭ４の単一交雑から開発された。Ｆ３集団では、イベントＥＥ−ＧＭ４およびｒｈｇ１対立遺伝子の両方についてホモ接合性である１つの「スタック」集団が、ｒｈｇ１対立遺伝子だけでホモ接合性である集団（ＥＥ−ＧＭ４を欠いている）と比較された。２０１６年には中から高のＳＣＮの汚染を有する３ヶ所で、これらの集団を用いて予備収量試験が構築された。３ヶ所全てにわたって、「スタック」集団（ＥＥ−ＧＭ４イベントおよびｒｈｇ１対立遺伝子についてホモ接合性の植物）は、ｒｈｇ１対立遺伝子のみを保有する集団よりも８％高い収率を産生した（ｐ＝０．０５）。これらの結果は、従来のＳＣＮ抵抗性を有する品種にイベントを追加することで、中から高レベルのＳＣＮプレッシャー下での収量を改善できるという、予備的な示唆を提供する。
【０２６４】
中等度から高度のＳＣＮ汚染下で収量試験を実施することは、結果に影響を与える多くの要因のために困難である。圃場内のＳＣＮ集団密度は本質的に変動し得るため、収量に対するＳＣＮの全体的な影響も１つの試験区から隣の試験区で異なり得る（例えば、ｗｗｗ．ｐｌａｎｔｍａｎａｇｅｍｅｎｔｎｅｔｗｏｒｋ．ｏｒｇ／ｐｕｂ／ｐｈｐ／ｒｅｖｉｅｗ／２００９／ｓｃｅ０８／を参照）。好ましい土壌タイプ、良好な肥沃度、および十分な降雨量は、ダイズ植物に対するＳＣＮ汚染の影響を軽減することができ、高ＳＣＮ集団の下であっても収量への影響を最小限にすることができる。非常に高いＳＣＮ集団を有する多くの圃場は、不良な土壌を有する傾向にあり、その結果としてより低い収量可能性を有する傾向にあり、これにより収量に対する統計的に有意な影響を判別することが困難となっている。したがって、ＳＣＮ圃場試験の収量データは非常に変動しやすい可能性があり、高ＳＣＮ集団の全ての試験で収量の有意な改善が見られるとは予測されないであろう。試験間の全体的な傾向は、イベントの性能を判断するための最も関連性のある基準である。
【０２６５】
ＥＥ−ＧＭ４を含有する植物を用いて行われたＳＣＮ圃場試験は、天然のＳＣＮ汚染を有する野外で構築された。実験単位は、０．７６ｍ間隔で３．８〜９．１ｍの範囲の２〜４列を含有する圃場試験区からなっていた。試験区あたりの列数と試験区の長さは、圃場サイズと装置構成に基づいて場所によって異なる。試験区は１メートル当たり種子２６個で播種されたので、各実験単位は２００〜９６０個の種子を含有していた。スプリット・プロットまたはスプリット・スプリット・プロットデザインを使用して、プロットをフィールド内でランダム化した。スプリット・プロットデザインは、土壌の種類またはＳＣＮ汚染圃場で一般的なＳＣＮ集団の変動が大きいことによる影響を最小限に抑えるのを助けるのによく適している。ＳＣＮ圃場試験では、ＥＥ−ＧＭ４を含む植物を、分離したヌル植物（ＥＥ−ＧＭ４なし）を含有する、付随するサブプロットの隣の、または非常に近いサブプロットに植えた。２つのプロットが近接していると、イベントＥＥ−ＧＭ４を有するまたは有しない植物間の差の推定値に対する（ＳＣＮ）圃場変動の影響を最小限に抑えるのに役立つ。ほとんどの試験は４回繰り返されたが、少数は３回繰り返され、少数５回または６回繰り返された。
【０２６６】
２０１６年にはＥＥ−ＧＭ４を有する植物の試験が行われた２ヶ所（インディアナ州およびアイオワ州）で突然死症候群（ＳＤＳ）の中等度から重度の汚染が観察された。これら２つの場所でのプロットは、ＳＤＳ症状の発生率および重症度について評価され、ＳＤＳ病害指数（ＤＸ）は、「ＳＤＳスコアリングのＳＩＵＣ法」（ｗｗｗ．ｓｃｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｉｎｆｏ／４６２．ｐｄｆ）を用いて計算された。イベントＥＥ−ＧＭ４についてホモ接合性の植物のＤＸ評価は、感受性ヌル分離系（ＥＥ−ＧＭ４を欠く）よりも、インディアナ州では４３％低く、アイオワ州では３３％低く、イベントがＳＤＳ感染に対する防御を提供していたことを示している。ＳＤＳとＳＣＮはしばしば圃場で密接に関連しており、植物においていくつかの相互作用を示すだろう（例えば、ｗｗｗ．ｓｏｙｂｅａｎｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｆｏ．ｃｏｍ／ｐｄｆ＿ｄｏｃｓ／ｓｄｓｕｐｄａｔｅ．ｐｄｆ、およびｗｗｗ．ａｐｓｎｅｔ．ｏｒｇ／ｅｄｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｔｒｏｐｐ／ｌｅｓｓｏｎｓ／ｆｕｎｇｉ／ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ／ｐａｇｅｓ／ｓｕｄｄｅｎｄｅａｔｈ．ａｓｐｘを参照）。
【０２６７】
２０１７年に、鉄欠乏性クロロシス（ＩＤＣ）症状が観察された米国の１つの試験場所（高ＳＣＮ汚染を有する）で、ＥＥ−ＧＭ４（およびそれらのヌル分離体）を有する植物についてＩＤＣスコアが収集された。試験は、３つの異なるバックグラウンドにおけるイベントの影響を検討するスプリット・プロットデザインであった。ＩＤＣ評価は、Ｃｉａｎｚｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９：６４４−６４６によって記述されたように行われた。図１０は、３つの遺伝的背景（１つのＳＣＮ抵抗性（ＰＩ８８７８８抵抗性）、１つのＳＣＮ感受性、およびＳＣＮ感受性Ｔｈｏｒｎｅバックグラウンド）にわたるイベントＥＥ−ＧＭ４を有する植物のＩＤＣスコア、および対応するヌル分離体（ＥＥ−ＧＭ４を欠く）のＩＤＣスコアの平均を示す。それらのヌル分離体と比較して、低いＩＤＣスコアが、ＥＥ−ＧＭ４を含有する植物について見出された。したがって、ダイズ植物がＳＣＮおよびＩＤＣの両方に曝露された圃場試験において、ＥＥ−ＧＭ４はＩＤＣの葉の重症度を減少させ得る。
【０２６８】
また、非形質転換ＴｈｏｒｎｅおよびＥＥ−ＧＭ４種子を発芽させ、温室内に植え、病害センチュウのパイナップルネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）の防除を調べた。２週齢のときに、パイナップルネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）（１５００匹／植物、異なる生育ステージ）を植物に施用した。施用の３０日後に、ネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）を根から抽出し、計数した。ＥＥ−ＧＭ４を含有する植物の根に見出されるセンチュウの平均数を、野生型Ｔｈｏｒｎｅ植物の根に見られるネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）の平均数と比較した。Ｔｈｏｒｎｅ対照根と比較して、平均約８０〜９０％少ないネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）がＥＥ−ＧＭ４を含有する植物の根で見出され、これは、ダイズイベントＥＥ−ＧＭ４による病害センチュウの有意な防除を示している。
【０２６９】
図８は、５つのエリートダイズ系統におけるＥＥ−ＧＭ４を有するエリート系統をＳＣＮ感受性およびＳＣＮ抵抗性の米国ダイズ系統と比較した、米国におけるパイナップルネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）温室アッセイの結果を示す（１つのＳＣＮ感受性（ＭＧ  １）、１つのＳＣＮ抵抗性（ＰＩ８８７８８、ＭＧ  ３）、１つのＳＣＮ感受性（ＭＧ  ６．２）、１つのＳＣＮ抵抗性（Ｐｅｋｉｎｇ、ＭＧ  ６．２）、および１つのＳＣＮ感受性（ＭＧ  ９））。ダイズ植物を小さな円錐形の鉢で栽培し、２５〜３２℃の間で変動する温度で温室内に保った。サウスカロライナ州の圃場から得られ、温室内で増加したパイナップルネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）を、Ｖ２−Ｖ３生育ステージで植物に接種するために使用した。植物あたり約１５００個の卵＋成体を接種し、各エントリーは５つの植物を有していた。汚染の３０日後、センチュウおよび卵を根から抽出し、計数した。各エントリーは２つの独立した実験で実行された。ＳＣＮ感受性およびＳＣＮ抵抗性の米国ダイズ系統はネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）の防除を示さなかったが、ＥＥ−ＧＭ４を有する植物は、ネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）の約８５％の防除を示した。
【０２７０】
図９は、ブラジルにおけるパイナップルネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）温室アッセイの結果を示し、ＥＥ−ＧＭ４を有するダイズ植物と、抵抗性を有しないブラジルダイズ系統および１つの低Ｒｆ系統、ならびにＳＣＮ感受性およびＳＣＮ抵抗性植物とを比較している。ダイズ系統を小さな円錐形の鉢で栽培し、２５〜３２℃の間で変動する温度で温室内に保った。ブラジルの圃場から得られ、温室内で増加したパイナップルネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）を、Ｖ２−Ｖ３生育ステージで植物に接種するために使用した。植物あたり約１０００個の卵＋成体を接種し、各エントリーは５つの植物を有していた。汚染の３０日後、センチュウおよび卵を根から抽出し、計数した。示された結果は単一の実験からのものである。ネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）の低生殖因子を有すると分類された１つのブラジルダイズ系統（ＢＲＳ  ７３８０）は、ネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）の約８９％の減少を示した。ＥＥ−ＧＭ４を有する植物は、ネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）を約９７％防除した。ＳＣＮ（ｒｈｇ１＋ｒｈｇ４）に対する天然の抵抗性を保有するダイズ系統は、パイナップルネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｕｒｕｓ）を防除しない。
【０２７１】
また、ＥＥ−ＧＭ４を含有する植物は、サツマイモネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）などのネコブセンチュウ（ＲＫＮ）を防除するために使用することができる。サツマイモネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）の集団がＴｈｏｒｎｅ野生型ダイズをあまりよく汚染しないにもかかわらず、ＥＥ−ＧＭ４を有するＴｈｏｒｎｅ植物は、非形質転換Ｔｈｏｒｎｅ植物と比較して、平均でＲＫＮ卵数／根量の更なる減少を示す。
【０２７２】
１．２．２  エリートイベントＥＥ−ＧＭ４の隣接領域および挿入Ｔ−ＤＮＡの同定
ＥＥ−ＧＭ４エリートイベントに含有される、挿入Ｔ−ＤＮＡおよびそれに隣接するＴ−ＤＮＡに隣接する領域の配列を、添付の配列表に示す。
【０２７３】
１．２．２．１  ５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域
ＥＥ−ＧＭ４の５’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を含むと同定された断片を配列決定し、そのヌクレオチド配列を配列番号５、ヌクレオチド１〜２２７に表す。この５’−Ｔ−ＤＮＡ隣接領域は、挿入前遺伝子座配列（配列番号５、ヌクレオチド１〜２２７）に対応するダイズゲノム配列で構成されている。挿入Ｔ−ＤＮＡ配列の一部およびそれに隣接するＴ−ＤＮＡ  ５’隣接配列の一部を含む５’接合領域は、配列番号１および３に表される。
【０２７４】
１．２．２．２  ３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域
ＥＥ−ＧＭ４の３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域を含むと同定された断片を配列決定し、そのヌクレオチド配列を配列番号６、ヌクレオチド２５４〜５０１に表す。この３’Ｔ−ＤＮＡ隣接領域は、挿入前遺伝子座配列に対応するダイズゲノム配列（配列番号６、ヌクレオチド２５４〜５０１）から構成される。挿入Ｔ−ＤＮＡ配列の一部およびそれに隣接するＴ−ＤＮＡ  ３’隣接配列の一部を含む３’接合領域は、配列番号２および４に表される。
【０２７５】
１．２．２．３  ＥＥ−ＧＭ４の挿入Ｔ−ＤＮＡ
上記の５’−Ｔ−ＤＮＡ隣接配列に隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡを配列決定し、そのヌクレオチド配列を配列番号５、ヌクレオチド２２８〜３９８に表す。また、上記の３’−Ｔ−ＤＮＡ隣接配列に隣接する挿入Ｔ−ＤＮＡを配列決定し、そのヌクレオチド配列を配列番号６、ヌクレオチド１〜２５３に表す。形質転換の間に、９７０ｂｐのゲノムＤＮＡが挿入前遺伝子座配列において欠失され、これらは挿入Ｔ−ＤＮＡによって置換された。
【０２７６】
形質転換プラスミドｐＳＺ８８３２中のＴ−ＤＮＡ領域（Ｔ−ＤＮＡ境界の間の部分）の配列決定により、配列番号１１に報告された配列が得られた。キメラｃｒｙ１４Ａｂ−１．ｂ遺伝子配列（Ｕｂｉ１０プロモーターおよび３５Ｓ  ３’非翻訳領域を含む）は、ヌクレオチド１３１〜５２７６（反時計回り）の配列番号１１に表されている。配列番号５の５’隣接領域における挿入Ｔ−ＤＮＡ配列（ヌクレオチド２２８〜３９８）は、ヌクレオチド１７からヌクレオチド１８７までの配列番号１１のヌクレオチド配列と同一であり、配列番号６の３’隣接領域における挿入Ｔ−ＤＮＡ配列（ヌクレオチド１〜２５３）は、ヌクレオチド７３６９からヌクレオチド７６２１までの配列番号１１のヌクレオチド配列と同一である。したがって、ＥＥ−ＧＭ４中に挿入されたＴ−ＤＮＡの５’末端は、配列番号１１の形質転換プラスミド配列中のヌクレオチド１７に対応し、したがって、ＥＥ−ＧＭ４中に挿入されたＴ−ＤＮＡの３’末端は、配列番号１１の形質転換プラスミド配列中のヌクレオチド７６２１に対応する。配列番号５の配列と配列番号６の配列との間のＥＥ−ＧＭ４中に挿入されたＴ−ＤＮＡは、受託番号ＰＴＡ−１２３６２４でＡＴＣＣに寄託された種子に含有され、ヌクレオチド１８８からヌクレオチド７３６８までの配列番号１１の配列と本質的に類似または同一の配列を有する。
【０２７７】
イベントＥＥ−ＧＭ４の挿入前遺伝子座は野生型ダイズ変種から決定することができる。当技術分野で公知の方法による、本明細書に提供される５’および３’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列（ｎｔ１からｎｔ２２７までの配列番号５およびｎｔ２５４からｎｔ５０１までの配列番号６）に基づくＴｈｏｒｎｅ。ダイズゲノム中の挿入前遺伝子座配列は、以下の配列に順に対応する：配列番号５のヌクレオチド位置１からヌクレオチド位置２２７、９７０ｎｔ欠失、および配列番号６のヌクレオチド位置２５４からヌクレオチド位置５０１。完全な挿入前遺伝子座配列は、配列番号３０に与えられており、ここで、ｎｔ１〜１０００は５’隣接ゲノム配列、ｎｔ１００１〜１９７０は標的部位欠失、１９７１〜２９７０は３’隣接ゲノム配列である。
【０２７８】
１．２．３  エリートイベントＥＥ−ＧＭ４の隣接領域および挿入Ｔ−ＤＮＡの確認
挿入Ｔ−ＤＮＡの上流および下流の植物ＤＮＡならびにＥＥ−ＧＭ４中の挿入Ｔ−ＤＮＡを標的とするプライマーを用いたＰＣＲ増幅は、ＥＥ−ＧＭ４の５’および３’隣接配列を確認および伸長した。
【０２７９】
１．２．３．１．  ５’接合配列ＥＥ−ＧＭ４特異的反応
ＧＬＰＢ１７３およびＧＬＰＢ１６７の２つのプライマーは、イベントＥＥ−ＧＭ４のＴ−ＤＮＡ挿入断片との５’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列の接合領域にわたるおよそ５０５９ｂｐのアンプリコンを増幅するように設計された。プライマーＧＬＰＢ１７３の配列はダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ８２．ａ２．ｖ１のダイズ参照配列に由来する。
【０２８０】
ＥＥ−ＧＭ４  Ｔ−ＤＮＡ  ５’隣接配列を標的とするフォワードプライマー：
ＧＬＰＢ１７３  ５’−ＣＴＴＣＡＴＣＴＣＣＣＣｇＴＴＡＡＡｇＴｇ−３’（配列番号２６）
【０２８１】
ＥＥ−ＧＭ４挿入Ｔ−ＤＮＡ配列を標的とするリバースプライマー：
ＧＬＰＢ１６７  ５’−ＴＡＣＡＡＣｇＴｇＣＴＣｇＣＴＡＴＴＣＣ−３’（配列番号２８）
【０２８２】
５’接合配列反応の反応混合物の組成：
５μｌ  ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（商標）ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
２μｌ  フォワードプライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）
２μｌ  リバースプライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）
０．７５μｌ  ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（２Ｕ／μＬ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
５０ｎｇ  テンプレートＤＮＡ
５０μｌまで水
【０２８３】
５’接合配列反応のサーモサイクリング条件：
【０２８４】
【表６】
2020503020.tif 000007
【０２８５】
配列番号５に示される挿入Ｔ−ＤＮＡの一部の上流に隣接する、得られた伸長Ｔ−ＤＮＡ  ５’隣接配列の配列を配列番号２４に示す。
【０２８６】
１．２．３．２．  ３’接合配列ＥＥ−ＧＭ４特異的反応
ＧＬＰＢ１７０およびＧＬＰＢ１７５の２つのプライマーは、３’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列とのイベントＥＥ−ＧＭ４のＴ−ＤＮＡ挿入断片の接合領域にわたるおよそ５１４１ｂｐのアンプリコンを増幅するように設計された。プライマーＧＬＰＢ１７５の配列はダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ８２．ａ２．ｖ１の参照配列に由来する。
【０２８７】
ＥＥ−ＧＭ４挿入Ｔ−ＤＮＡ配列を標的とするフォワードプライマー：
ＧＬＰＢ１７０  ５’−ＴＣＴＣｇｇＴＡＴＣＡｇＣｇＴＴＣＴＴｇ−３’（配列番号２９）
【０２８８】
ＥＥ−ＧＭ４  Ｔ−ＤＮＡ  ３’隣接配列を標的とするリバースプライマー：
ＧＬＰＢ１７５  ５’−ｇＴＴｇＴＣＡＡＣＡＡＴｇＡＣＣＡｇＡＡｇ−３’（配列番号２７）
【０２８９】
３’接合配列反応の反応混合物の組成：
５μｌ  ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（商標）ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
２μｌ  フォワードプライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）
２μｌ  リバースプライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）
０．７５μｌ  ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（商標）Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（２Ｕ／μＬ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
５０ｎｇ  テンプレートＤＮＡ
５０μｌまで水
【０２９０】
３’接合配列反応のサーモサイクリング条件：
【０２９１】
【表７】
2020503020.tif 000008
【０２９２】
配列番号６に示される挿入Ｔ−ＤＮＡの一部の下流に隣接する、得られた伸長Ｔ−ＤＮＡ  ３’隣接配列の配列を配列番号２５に示す。
【０２９３】
上記２つの反応で得られたアンプリコンは重複していたため、これは、ＥＥ−ＧＭ４挿入Ｔ−ＤＮＡの配列および配列番号２３に示される伸長された５’および３’隣接配列の再構築を可能にした。配列番号２３の５’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列は、ヌクレオチド位置１からヌクレオチド位置１０５８までであり（挿入前遺伝子座ゲノム配列に対応する）、挿入Ｔ−ＤＮＡ配列は、ヌクレオチド位置１０５９からヌクレオチド位置８６６３までであり、配列番号２３の３’Ｔ−ＤＮＡ隣接配列は、ヌクレオチド位置８６６４からヌクレオチド位置９７４９までである（挿入前遺伝子座ゲノム配列に対応する）。
【０２９４】
２．ＥＥ−ＧＭ４同定プロトコルの開発
２．１．ＥＥ−ＧＭ４同一性分析のためのエンドポイント法
この方法は、標準的なＤＮＡ抽出手順を用いて植物材料（例えば、葉または種子）などの生物学的試料から得られたＤＮＡ試料中のイベントＥＥ−ＧＭ４特異的ＤＮＡ配列の存在を分析するためのポリメラーゼ連鎖反応検出法を説明する。方法の説明は、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ配列を含む方法設計、反応混合物の組成、反応を実施するのに必要とされるサーモサイクリング条件、ならびにアンプリコン検出に適切であると見出された蛍光リーダー設定を概説する。また、これは対照試料の性質および使用に関する一般的な推奨事項も提供する。さらに、防除物質の使用に関する推奨事項およびデータ分析のための指針を考慮した、方法の結果の例を含む、データ分析および解釈のための指針が提供される。
【０２９５】
２．１．１．方法設計
この方法は、Ｔａｑｍａｎケミストリーを使用して２つの標的配列を増幅および検出する：ＥＥ−ＧＭ４特異的反応がイベントの存在を決定し、タクソン特異的反応がイベント特異的反応についての否定的な結果を検証する。
【０２９６】
２．１．１．１．ＥＥ−ＧＭ４特異的反応
ＰＲＩＭ０９３７およびＰＲＩＭ０９３８の２つのプライマーは、イベントＥＥ−ＧＭ４のＴ−ＤＮＡ挿入断片との３’隣接配列の接合領域にわたる１２６ｂｐのアンプリコンを増幅するように設計された。
【０２９７】
蛍光標識としてＦＡＭを使用し、クエンチャーとしてＢＨＱ１を使用したプローブ、ＴＭ１７３４は、増幅配列を検出するように設計された。
【０２９８】
ＥＥ−ＧＭ４  Ｔ−ＤＮＡ配列を標的とするフォワードプライマー：
ＰＲＩＭ０９３７  ５’−ｇＡｇＡＣＴｇＴＡＴＣＴＴＴｇＡＴＡＴＴＴＴＴｇｇＡｇＴＡｇＡ−３’（配列番号１２）
【０２９９】
ＥＥ−ＧＭ４  Ｔ−ＤＮＡ  ３’隣接配列を標的とするリバースプライマー：
ＰＲＩＭ０９３８  ５’−ＣＴｇＡｇＴＣｇＡＴＣＡＡＡＡＣＣＡＡＴＣＡＡＴ−３’（配列番号１３）
【０３００】
ＥＥ−ＧＭ４  Ｔ−ＤＮＡとその３’隣接配列との接合部を標的としたプローブ：
ＴＭ１７３４  ＦＡＭ  ５’−ＡＡｇＴｇＴｇＴＣｇＴｇＣＴＣＣＡＣＣＡｇＴＴＡＴＣＡＣＡ−３’ＢＨＱ１（配列番号１４）
【０３０１】
２．１．１．２．タクソン特異的反応
２つのプライマー、ＳＨＡ０７１およびＳＨＡ０７２は、ダイズ内因性レクチン１遺伝子配列の７４ｂｐのアンプリコンを増幅するように設計された。
【０３０２】
蛍光標識としてＪＯＥを使用し、ＢＨＱ１を使用したプローブ、ＴＭ１４２８は、増幅配列を検出するように設計された。
【０３０３】
内因性レクチン１遺伝子配列を標的とするフォワードプライマー：
ＳＨＡ０７１  ５’−ＣＣＡｇＣＴＴＣｇＣＣｇＣＴＴＣＣＴＴＣ−３’（配列番号１５）
【０３０４】
内因性レクチン１遺伝子配列を標的とするリバースプライマー：
ＳＨＡ０７２  ５’−ｇＡＡｇｇＣＡＡｇＣＣＣＡＴＣＴｇＣＡＡｇＣＣ−３’（配列番号１６）
【０３０５】
内因性レクチン１遺伝子配列を標的とするプローブ：
ＴＭ１４２８  ＪＯＥ  ５’−ＣＴＴＣＡＣＣＴＴＣＴＡＴｇＣＣＣＣＴｇＡＣＡＣ−３’ＢＨＱ１（配列番号１７）
【０３０６】
２．１．２．反応混合物の組成
５．０μｌ  ２ｘ  ＰｅｒｆｅＣｔａ  ｑＰＣＲ  ＦａｓｔＭｉｘ  ＩＩ，ＲＯＸ
０．５μｌ  ＰＲＩＭ０９３７［１０ｐｍｏｌ／μｌ］
０．５μｌ  ＰＲＩＭ０９３８［１０ｐｍｏｌ／μｌ］
０．５μｌ  ＳＨＡ０７１［１０ｐｍｏｌ／μｌ］
０．５μｌ  ＳＨＡ０７２［１０ｐｍｏｌ／μｌ］
０．１μｌ  ＴＭ１７３４［１０ｐｍｏｌ／μｌ］
０．１μｌ  ＴＭ１４２８［１０ｐｍｏｌ／μｌ］
ｘμｌ  テンプレートＤＮＡ（２０ｎｇ＊）
１０μｌまで水
注：
●  ２ｘ  ＰｅｒｆｅＣｔａ  ｑＰＣＲ  ＦａｓｔＭｉｘ  ＩＩ，ＲＯＸは、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって供給された。他の酵素緩衝液を使用してもよいが、性能を検証すべきである
●  プライマーおよび標識プローブはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで注文した
●  ＊反応あたりのテンプレートＤＮＡの量は異なり得るが、確認すべきである
【０３０７】
２．１．３．サーモサイクリング条件
【０３０８】
【表８】
2020503020.tif 000009
【０３０９】
２．１．４．波長および帯域幅の設定
【０３１０】
【表９】
2020503020.tif 000010
【０３１１】
２．１．５．対照試料
試験試料の結果を検証するために、以下の対照試料を実験に含めるべきである。
●  陽性対照：標的および内因性配列を含有するＤＮＡ試料
●  陰性対照：内因性配列のみを含有するＤＮＡ試料
●  テンプレートなし対照：水試料（ＤＮＡなし）
【０３１２】
２．１．６．データ分析
●  全ての試料について、バックグラウンドに対する蛍光シグナルの比率（Ｓ／Ｂ）は、標的および内因性反応の両方に対して計算される。
●  対照試料は予測される結果を与えるべきであり、すなわち、
○  陽性対照は「検出」と評価されるべきである
○  陰性対照は「検出なし」と評価されるべきである
○  テンプレートなし対照は蛍光バックグラウンドレベルのみを示すべきである
●  試料は以下の通り評価される。
○  検出：標的Ｓ／Ｂおよび内因性Ｓ／Ｂが許容される閾値比（例えば、２）を超える
○  検出なし：標的Ｓ／Ｂが許容される閾値比（例えば、１．３）未満であり、さらに、内因性Ｓ／Ｂが許容される閾値比（例えば、２）を超える。
○  不確定：標的および内因性Ｓ／Ｂが、許容される閾値（例えば、１．３）未満である
【０３１３】
図２は、ＥＥ−ＧＭ４を含有する一連のダイズ試料および従来のダイズ試料に対する方法の結果の例を示す。各試料について、ＥＥ−ＧＭ４特異的反応および内因性反応の両方についてＳ／Ｂ比が表示される。
【０３１４】
２．２．ＥＥ−ＧＭ４同一性および接合性分析のためのエンドポイント法
この方法は、標準的なＤＮＡ抽出手順を用いて植物材料（例えば、葉または種子）などの生物学的試料から得られたＤＮＡ試料中のイベントＥＥ−ＧＭ４特異的ＤＮＡ配列の存在および接合性状態を分析するためのポリメラーゼ連鎖反応検出法を説明する。
【０３１５】
方法の説明は、反応試薬、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ配列、反応を実施するのに必要とされるサーモサイクリング条件、ならびにアンプリコン検出に適切であると見出された蛍光リーダー設定を概説する。また、これは対照試料の性質および使用に関する一般的な推奨事項も提供する。さらに、防除物質の使用に関する推奨事項およびデータ分析のための指針を考慮した、方法の結果の例を含む、データ分析および解釈のための指針が提供される。
【０３１６】
接合性分析（下記のオプション１）の方法性能は、挿入前遺伝子座配列の性質のために様々に依存し得ることに留意されたい。そのため、イベントが遺伝子移入される品種ごとに性能の検証が必要である。性能が不十分な場合は、コピー数分析に基づく代替的リアルタイムＰＣＲ法を用いることができる。例えば、そのようなコピー数分析は、ＥＥ−ＧＭ４特異的配列の相対コピー数を定量するためにＴａｑｍａｎケミストリーおよびリアルタイムＰＣＲの原理を用いることができる。代替的方法は、典型的には、ＥＥ−ＧＭ４コピー数を定量するためのＥＥ−ＧＭ４特異的反応、およびＥＥ−ＧＭ４コピー数の正規化のためのタクソン特異的反応を含むであろう。ホモ接合状態のＥＥ−ＧＭ４挿入配列を含有する試料は、ヘミ接合試料よりも２倍高い相対コピー数を有するであろう。不対試料はそのような方法ではＥＥ−ＧＭ４配列を増幅しないであろう。
【０３１７】
２．２．１．方法設計
この方法は、Ｔａｑｍａｎケミストリーを使用して２つの標的配列を増幅および検出する：ＥＥ−ＧＭ４特異的反応がイベントの存在を決定し、挿入前遺伝子座特異的反応が、イベントの挿入前遺伝子座の存在を決定する。ＥＥ−ＧＭ４特異的配列のみの検出は、ホモ接合性状態におけるイベントＥＥ−ＧＭ４の存在を示す。ＥＥ−ＧＭ４特異的および挿入前遺伝子座特異的配列の検出は、ヘミ接合性状態におけるイベントＥＥ−ＧＭ４の存在を示す。挿入前遺伝子座特異的配列のみの検出は、イベントＥＥ−ＧＭ４の不在を示す。
【０３１８】
２．２．１．１．ＥＥ−ＧＭ４特異的反応
ＰＲＩＭ０９３７およびＰＲＩＭ０９３８の２つのプライマーは、イベントＥＥ−ＧＭ４のＴ−ＤＮＡ挿入断片とのＴ−ＤＮＡ  ３’隣接配列の接合領域にわたる１２６ｂｐのアンプリコンを増幅するように設計された。
【０３１９】
蛍光標識としてＦＡＭを使用し、クエンチャーとしてＢＨＱ１を使用したプローブ、ＴＭ１７３４は、増幅配列を検出するように設計された。
【０３２０】
ＥＥ−ＧＭ４  Ｔ−ＤＮＡ配列を標的とするフォワードプライマー：
ＰＲＩＭ０９３７  ５’−ｇＡｇＡＣＴｇＴＡＴＣＴＴＴｇＡＴＡＴＴＴＴＴｇｇＡｇＴＡｇＡ−３’（配列番号１２）
【０３２１】
ＥＥ−ＧＭ４  Ｔ−ＤＮＡ  ３’隣接配列を標的とするリバースプライマー：
ＰＲＩＭ０９３８  ５’−ＣＴｇＡｇＴＣｇＡＴＣＡＡＡＡＣＣＡＡＴＣＡＡＴ−３’（配列番号１３）
【０３２２】
ＥＥ−ＧＭ４  Ｔ−ＤＮＡとその３’隣接配列との接合部を標的とするプローブ：
ＴＭ１７３４  ＦＡＭ  ５’−ＡＡｇＴｇＴｇＴＣｇＴｇＣＴＣＣＡＣＣＡｇＴＴＡＴＣＡＣＡ−３’ＢＨＱ１（配列番号１４）
【０３２３】
２．２．１．２．挿入前遺伝子座特異的反応
ＰＲＩＭ１６５２およびＰＲＩＭ０９３８の２つのプライマーは、挿入前遺伝子座とＥＥ−ＧＭ４挿入前遺伝子座の３’隣接配列との接合部にわたる１０８ｂｐのアンプリコンを増幅するように設計されている。
【０３２４】
蛍光標識としてＶＩＣを使用し、クエンチャーとしてＭＧＢ−ＮＦＱを使用したＭＧＢプローブ、ＴＭ２０８４は、増幅配列を検出するように設計された。
【０３２５】
ＥＥ−ＧＭ４挿入前遺伝子座配列を標的とするフォワードプライマー：
ＰＲＩＭ１６５２  ５’−ｇＡｇＡＡｇＴＴＴＣＡＡＴＡＣＴＡＡＴＡｇＴＡＴＣＡＡＴＡＣＴＣＡｇＡＡＴ−３’（配列番号１８）
【０３２６】
ＥＥ−ＧＭ４  Ｔ−ＤＮＡ  ３’隣接配列を標的とするリバースプライマー：
ＰＲＩＭ０９３８  ５’−ＣＴｇＡｇＴＣｇＡＴＣＡＡＡＡＣＣＡＡＴＣＡＡＴ−３’（配列番号１３）
【０３２７】
挿入前遺伝子座と３’隣接配列との接合部を標的とする野生型プローブ：
ＴＭ２０８４  ＶＩＣ  ５’−ＣｇＡｇＴＡＴＴＡｇＣＣＡＴＡＴＴＴＡ−３’ＭＧＢ−ＮＦＱ（配列番号１９）
【０３２８】
２．２．２．反応混合物の組成
５．０μｌ  ２ｘ  ＰｅｒｆｅＣｔａ  ｑＰＣＲ  ＦａｓｔＭｉｘ  ＩＩ，ＲＯＸ
０．４μｌ  ＰＲＩＭ１６５２［１０ｐｍｏｌ／μｌ］
０．４μｌ  ＰＲＩＭ０９３８［１０ｐｍｏｌ／μｌ］
０．１μｌ  ＰＲＩＭ０９３７［１０ｐｍｏｌ／μｌ］
０．２μｌ  ＴＭ２０８４［１０ｐｍｏｌ／μｌ］
０．０５μｌ  ＴＭ１７３４［１０ｐｍｏｌ／μｌ］
ｘμｌ  テンプレートＤＮＡ（２０ｎｇ＊）
１０μｌまで水
注：
●  ２ｘ  ＰｅｒｆｅＣｔａ  ｑＰＣＲ  ＦａｓｔＭｉｘ  ＩＩ，ＲＯＸは、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって供給された。他の酵素緩衝液を使用してもよいが、性能を検証すべきである
●  プライマーおよび標識プローブはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで注文した
●  ＊反応あたりのテンプレートＤＮＡの量は異なり得るが、確認すべきである
【０３２９】
２．２．３．サーモサイクリング条件
【０３３０】
【表１０】
2020503020.tif 000011
【０３３１】
２．２．４．波長および帯域幅の設定
【０３３２】
【表１１】
2020503020.tif 000012
【０３３３】
２．２．５．対照試料
試験試料の結果を検証するために、以下の対照試料を実験に含めるべきである。
●  ホモ接合対照：ホモ接合状態の標的配列を含有するＤＮＡ試料
●  ヘミ接合対照：ヘミ接合状態の標的配列を含有するＤＮＡ試料
●  野生型対照：標的配列を含有しないＤＮＡ試料
●  テンプレートなし対照：水試料
【０３３４】
２．２．６．データ分析
●  全ての試料について、バックグラウンドに対する蛍光シグナルの比率（Ｓ／Ｂ）は、標的および挿入前遺伝子座反応の両方に対して計算される。
●  対照試料は予測される結果を与えるべきであり、すなわち、
○  ホモ接合対照は「ホモ接合」と評価されるべきである
○  ヘミ接合対照は「ヘミ接合」と評価されるべきである
○  野生型対照は「野生型」と評価されるべきである
○  テンプレートなし対照は蛍光バックグラウンドレベルのみを示すべきである
●  試料は以下の通り評価される。
○  ホモ接合：標的Ｓ／Ｂが許容される閾値比（例えば、２）を超え、挿入前遺伝子座Ｓ／Ｂが許容される閾値比（例えば、１）未満である。
○  ヘミ接合：標的および挿入前遺伝子座Ｓ／Ｂの両方が許容される閾値比（例えば、２）を超える
○  野生型：標的Ｓ／Ｂが許容される閾値比（例えば、１）未満であり、挿入前遺伝子座Ｓ／Ｂが許容される閾値比（例えば、２）を超える。
○  不確定：標的および挿入前遺伝子座Ｓ／Ｂが、許容される閾値（例えば、１）未満である
【０３３５】
図３は、一連のホモ接合状態のＥＥ−ＧＭ４を含有するダイズ試料、ヘミ接合状態のＥＥ−ＧＭ４を含有するダイズ試料および従来のダイズ試料に対する方法の結果の例を示す。
【０３３６】
２．３．ＥＥ−ＧＭ４低レベル存在分析のためのリアルタイムＰＣＲ法
この方法は、標準的なＤＮＡ抽出手順を使用して、バルク植物材料（例えば、葉または種子）または加工材料（例えば、ＥＥ−ＧＭ４  ＤＮＡを含有する加工ダイズ子実から産生される食品または飼料産物）から得られるイベントＥＥ−ＧＭ４  ＤＮＡ配列の低レベル存在を分析する検出方法を説明する。
【０３３７】
方法の説明は、反応試薬、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ配列、ならびに反応を実施するのに必要とされるサーモサイクリング条件を概説する。これは、データ分析および結果解釈をサポートするタクソン特異的方法の同時使用に関する一般的な推奨事項も提供する。さらに、対照試料の性質および使用に関する推奨事項も提供される。
【０３３８】
デジタルドロップレットＰＣＲ法を含むがこれに限定されない代替方法が、意図された目的のために利用可能であり得ることに留意されたい。デジタルドロップレットＰＣＲ法は、抽出されたＤＮＡ試料に対するサブサンプリングの原理と組み合わせて、セクション１．１に記載されているように、イベント同一性分析のためにエンドポイント法を使用する。この方法では、イベントの低レベルの存在は、イベント配列について陽性および陰性であると認められたＤＮＡサブサンプルの比率に基づいて決定される。
【０３３９】
２．３．１  方法設計
この方法は、ＴａｑｍａｎケミストリーおよびリアルタイムＰＣＲの原理を使用して、ＤＮＡ試料中の低レベルのＥＥ−ＧＭ４を検出または定量する。ＰＲＩＭ０９３９およびＰＲＩＭ０９４０の２つのプライマーは、イベントＥＥ−ＧＭ４のＴ−ＤＮＡ挿入断片とのＴ−ＤＮＡ５’隣接配列の接合領域にわたる９０ｂｐのアンプリコンを増幅するように設計されている。
【０３４０】
蛍光標識としてＦＡＭを使用し、クエンチャーとしてＢＨＱ１を使用したプローブ、ＴＭ１７３５は、増幅配列を定量するように設計される。
【０３４１】
ＥＥ−ＧＭ４  Ｔ−ＤＮＡ配列を標的とするフォワードプライマー：
ＰＲＩＭ０９３９  ５’−ＣＣＡＴＴｇＴｇＣＴｇＡＡＴＡｇｇＴＴＴＡＴＡｇＣＴ−３’（配列番号２０）
【０３４２】
ＥＥ−ＧＭ４  Ｔ−ＤＮＡ  ５’隣接配列を標的とするリバースプライマー：
ＰＲＩＭ０９４０  ５’−ｇＡＣＡＡＡＴＡＣＴＡＣＴＴＴｇＴＴＡＡｇＴＴＴＡｇＡＣＣＣＣ−３’（配列番号２１）
【０３４３】
ＥＥ−ＧＭ４  Ｔ−ＤＮＡとその５’隣接配列との接合部を標的とするプローブ：
ＴＭ１７３５  ＦＡＭ  ５’−ＴｇＡＴＡｇＡｇＣｇＣＣＴｇｇｇＣＣＴＡＡＣＴＴＴＣＴＡＡＡ−３’ＢＨＱ−１（配列番号２２）
【０３４４】
２．３．２．反応混合物の組成
１０．０μｌ  ２ｘ  ＰｅｒｆｅＣｔａ  ｑＰＣＲ  Ｆａｓｔｍｉｘ  ＩＩ，Ｌｏｗ  ＲＯＸ
０．５μｌ  ＰＲＩＭ０９３９［１０ｐｍｏｌ／μｌ］
０．５μｌ  ＰＲＩＭ０９４０［１０ｐｍｏｌ／μｌ］
０．５μｌ  ＴＭ１７３５［１０ｐｍｏｌ／μｌ］
ｘμｌ  テンプレートＤＮＡ（２００ｎｇ＊）
２０μｌまで水
注：
・  ２×ＰｅｒｆｅＣｔａ  ｑＰＣＲ  ＦａｓｔＭｉｘ  ＩＩ，ＬＯＷ  ＲＯＸは、Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって供給された。他の酵素緩衝液を使用してもよいが、性能を検証すべきである
・  プライマーおよび標識プローブはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで注文した
・  ＊反応あたりのテンプレートＤＮＡの量は異なり得るが、確認すべきである。
【０３４５】
２．３．３．サーモサイクリング条件
【０３４６】
【表１２】
2020503020.tif 000013
【０３４７】
２．３．４  タクソン特異的方法
内因性配列を標的とするリアルタイムＰＣＲ検出法は、標的特異的リアルタイムＰＣＲ法で使用されるのと同じ量のテンプレートＤＮＡで同時に行われるべきである。タクソン特異的方法の結果は、データ分析および解釈をサポートするために、すなわち、入力ＤＮＡの量を正規化するため、および標的特異的反応についての任意の否定的な結果を検証するために、使用すべきである。
【０３４８】
２．３．５  試験試料、較正試料および対照試料
●  全ての試験試料を二重に分析することが推奨される。
●  標的およびタクソン特異的方法の両方について標準曲線を生成する較正試料のセットは実験に含まれる。
●  さらに、以下の対照試料が含まれる。
○  陽性対照：検出限界のレベルで標的配列を含有するＤＮＡ試料。
○  陰性対照：内因性配列のみを含有するＤＮＡ試料（ＥＥ−ＧＭ４なし）
○  テンプレートなし対照：水試料
【０３４９】
２．３．６  データ分析
●  全ての試料について、閾値サイクル値（すなわち、Ｃｔ値）は、標的およびタクソン特異的方法の両方について決定される。閾値サイクルは、所与の試料の増幅プロットが定義されたシグナル閾値に達するサイクル数として定義される（下図参照）。
●  較正試料のＣｔ値およびゲノムコピー量を用いて、標的およびタクソン特異的方法の両方について標準曲線式が計算される。
●  標準曲線パラメータは、勾配および線形性（Ｒ２）の許容基準、例えば、以下のものを満たすべきである。
○  −３．２＜勾配＜−３．６
○  Ｒ２＞０．９８
●  全ての試料について、標的および内因性方法のゲノムコピー数は線形回帰分析を用いて計算される。
●  タクソン特異的ＤＮＡの総量に対する低レベルの存在量は、標的およびタクソン特異的方法についてゲノムコピー数の％比を計算することによって決定される。
●  対照試料は予測される結果を与えるべきであり、すなわち、
○  陽性対照は「検出」と評価されるべきである
○  陰性対照は「検出なし」と評価されるべきである
○  テンプレートなし対照は蛍光バックグラウンドレベルのみを示すべきである
●  試料は以下の通り評価される。
○  検出：方法の測定値の不確実性を考慮して、低レベルの存在が全ての反復測定の検出限界を超えている
○  検出なし：方法の測定値の不確実性を考慮して、低レベルの存在が全ての反復測定の検出限界未満である
○  不確定：複製された試料は一貫性のないスコアを与える
【０３５０】
図４は、較正試料に対して実施した方法の結果の例を示す。
【０３５１】
３．好ましい品種へのＥＥ−ＧＭ４の遺伝子移入
エリートイベントＥＥ−ＧＭ４は、６つの異なるエリートダイズ系統への反復戻し交雑により導入された。系統は一定の範囲の成熟度を表すように選択された：ＭＧ  Ｉから２系統、ＭＧ  ＩＩＩから１系統、ＭＧ  ＶＩから２系統およびＭＧ  ＩＸから１系統。ＭＧ  Ｉ系統の１つおよびＭＧ  ＩＩＩ系統は、ＰＩ８８７８８由来のＲｈｇ１天然抵抗性対立遺伝子を含有し、ＭＧ  ＶＩ系統の１つは、ＰＩ４３７６５４由来のＲｈｇ１およびＲｈｇ４天然抵抗性対立遺伝子を保有していた。他の３系統はＳＣＮに感受性であった。
【０３５２】
また、初期試験では、いくつかの実験において、温室生育植物の葉で測定されたＣｒｙ１４Ａｂ−１またはＨＰＰＤ−４タンパク質発現レベルについて生物学的に有意な差は観察されず（ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットで測定した場合（通常のアッセイ変化のみが見られた））、イベントＥＥ−ＧＭ４がＴｈｏｒｎｅバックグラウンドから他のダイズ生殖質バックグラウンドに遺伝子移入された場合（異なる成熟度、異なる遺伝子移入ステージで）、Ｔｈｏｒｎｅバックグラウンドで見出されたものと比較して、標準的な温室ＳＣＮアッセイの結果に有意な差は見られなかった（Ｔｈｏｒｎｅ対照に対するＳＣＮシストの減少％を測定）。初期実験の間、成熟度９．１のＢＣ２Ｆ３ダイズ植物バックグラウンドにおけるＥＥ−ＧＭ４イベントは、Ｃｒｙ１４Ａｂ−１タンパク質のより低い発現を示し、この実験をより多数のこの成熟度の植物で反復した場合、ＴｈｏｒｎｅバックグラウンドにおけるＥＥ−ＧＭ４については、Ｃｒｙ１４Ａｂ−１タンパク質発現の生物学的に有意な差は見出されなかった。
【０３５３】
エリートイベントＥＥ−ＧＭ４の他のダイズ品種への遺伝子移入は、これらの品種の望ましい表現型または農業特性のいずれにも有意な影響を与えず（リンケージドラッグがない）、一方で、導入遺伝子の発現は商業的に許容できるレベルを満たす。これは、イベントＥＥ−ＧＭ４の状態がエリートイベントであることを確認するものである。
【０３５４】
さらに、エリートイベントＥＥ−ＧＭ４は他のダイズエリート形質転換イベントと有利に組み合わされる。本発明による特に有用な植物は、イベントＭＯＮ８７７５１（国際公開第２０１４２０１２３５号パンフレットおよびＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  Ｐｅｔｉｔｉｏｎ  １３−３３７−０１ｐに記載）、イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１（国際公開第２０１３０１００９４号パンフレットに記載）、イベントＤＡＳ−８１４１９−２（別名Ｃｏｎｋｅｓｔａ（商標）Ｓｏｙｂｅａｎ、国際公開第２０１３０１６５２７号パンフレットおよびＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  Ｐｅｔｉｔｉｏｎ  １２−２７２−０１ｐに記載）、イベントＥＥ−ＧＭ３（別名ＦＧ−０７２、ＭＳＴ−ＦＧ０７２−３、国際公開第２０１１０６３４１１号パンフレット、ＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  Ｐｅｔｉｔｉｏｎ０９−３２８−０１ｐに記載）、イベントＳＹＨＴ０Ｈ２（別名０Ｈ２、ＳＹＮ−φφφＨ２−５、国際公開第２０１２／０８２５４８号パンフレットおよび１２−２１５−０１ｐに記載）、イベントＤＡＳ−６８４１６−４（別名Ｅｎｌｉｓｔ  Ｓｏｙｂｅａｎ、国際公開第２０１１／０６６３８４号パンフレットおよび国際公開第２０１１／０６６３６０号パンフレット、ＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  Ｐｅｔｉｔｉｏｎ０９−３４９−０１ｐに記載）、イベントＤＡＳ−８１６１５−９（国際公開第２０１４００４４５８に記載）、イベントＤＡＳ−４４４０６−６（別名、Ｅｎｌｉｓｔ  Ｅ３、ＤＡＳ−４４４φ６−６、国際公開第２０１２／０７５４２６号パンフレットおよびＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  １１−２３４−０１ｐに記載）、イベントＭＯＮ８７７０８（Ｘｔｅｎｄ  Ｓｏｙｂｅａｎｓ、国際公開第２０１１／０３４７０４号パンフレットおよびＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  Ｐｅｔｉｔｉｏｎ  １０−１８８−０１ｐに記載）、イベントＭＯＮ８９７８８（別名Ｇｅｎｕｉｔｙ  Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  ２  Ｙｉｅｌｄ、国際公開第２００６／１３０４３６号パンフレットおよびＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  Ｐｅｔｉｔｉｏｎ０６−１７８−０１ｐに記載）、イベントＤＡＳ−１４５３６−７（国際公開第２０１２／０７５４２９号パンフレットに記載）、イベント４０−３−２（別名ＲｏｕｎｄＵｐ  Ｒｅａｄｙ、ＭＯＮ−φ４φ３２−６、ＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  Ｐｅｔｉｔｉｏｎ９３−２５８−０１に記載）、イベントＡ２７０４−１２（別名ＬＬ２７、ＡＣＳ−ＧＭφφ５−３、国際公開第２００６１０８６７４号パンフレットおよびＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  Ｐｅｔｉｔｉｏｎ９６−０６８−０１ｐに記載）、イベント１２７（別名ＢＰＳ−ＣＶ１２７−９、国際公開第２０１０／０８０８２９号パンフレットに記載）、イベントＡ５５４７−１２７（別名ＬＬ５５、ＡＣＳ−ＧＭφφ６−４、国際公開第２００６１０８６７５号パンフレットおよびＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  Ｐｅｔｉｔｉｏｎ９６−０６８−０１ｐに記載）、イベントＭＯＮ８７７５４（別名Ｖｉｓｔｉｖｅ  ＩＩＩ、ＭＯＮ−８７７５４−１、国際公開第２０１０／０２４９７６号パンフレットに記載）、イベントＨＯＳ（別名ＤＰ−３φ５４２３−１、Ｐｌｅｎｉｓｈ  Ｈｉｇｈ  Ｏｌｅｉｃ  Ｓｏｙｂｅａｎ、国際公開第２００８０５４７４７号パンフレットに記載）、イベントＭＯＮ８７７０１（別名ＭＯＮ−８７７φ１−２、国際公開第２００９０６４６５２号パンフレットおよびＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  Ｐｅｔｉｔｉｏｎ  ０９−０８２−０１ｐに記載）、イベントＭＯＮ  ８７７０５（別名ＭＯＮ−８７７φ５−６、国際公開第２０１０／０３７０１６号パンフレットおよびＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  Ｐｅｔｉｔｉｏｎ  ０９−２０１−０１ｐに記載）、イベントＭＯＮ８７７１２（別名ＭＯＮ−８７７１２−４、国際公開第２０１２／０５１１９９号パンフレットに記載）、イベントｐＤＡＢ４４７２−１６０６（別名イベント１６０６、国際公開第２０１２／０３３７９４号パンフレットに記載）、イベント３５６０．４．３．５（別名ＤＰ−３５６０４３−５、国際公開第２００８／００２８７２号パンフレットに記載）、イベントＭＯＮ８７７６９（別名ＭＯＮ−８７７６９−７、国際公開第２００９１０２８７３号パンフレットおよびＵＳＤＡ−ＡＰＨＩＳ  Ｐｅｔｉｔｉｏｎ  ０９−１８３−０１ｐに記載）を含むがこれらに限定されない、様々な国内または地域の規制当局のデータベースに挙げられているものなどの、別のダイズ形質転換イベントと組み合わせたＥＥ−ＧＭ４、または２つ以上の他のダイズ形質転換イベントの組合せ、または以下の組合せ：イベントＭＯＮ９８７８８  ｘ  ＭＯＮ８７７０８（別名Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  ２  Ｘｔｅｎｄ  Ｓｏｙｂｅａｎｓ、ＭＯＮ−８７７φ８−９  ｘ  ＭＯＮ−８９７８８−１）、イベントＨＯＳ  ｘ  イベント４０−３−２（別名Ｐｌｅｎｉｓｈ  Ｈｉｇｈ  Ｏｌｅｉｃ  Ｓｏｙｂｅａｎｓ  ｘ  Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｏｙｂｅａｎｓ）、イベントＥＥ−ＧＭ３  ｘ  ＥＥ−ＧＭ２（別名ＦＧ−０７２ｘＬＬ５５、国際公開第２０１１０６３４１３号パンフレットに記載）、イベントＭＯＮ  ８７７０１  ｘ  ＭＯＮ  ８９７８８（別名Ｉｎｔａｃｔａ  ＲＲ２  Ｐｒｏ  Ｓｏｙｂｅａｎ、ＭＯＮ−８７７φ１−２  ×  ＭＯＮ−８９７８８−１）、ＤＡＳ−８１４１９−２  ｘ  ＤＡＳ−４４４０６−６（別名Ｃｏｎｋｅｓｔ（商標）Ｅｎｌｉｓｔ  Ｅ３（商標）Ｓｏｙｂｅａｎ、ＤＡＳ−８１４１９−２  ｘ  ＤＡＳ−４４４φ６−６）、イベントＤＡＳ−８１４１９−２  ｘ  イベントＤＡＳ−６８４１６−４（国際公開第２０１３０１６５１６号パンフレットに記載）、イベントＤＡＳ−６８４１６−４  ｘ  イベントＭＯＮ  ８９７８８（別名Ｅｎｌｉｓｔ（商標）ＲｏｕｎｄＵｐ  Ｒｅａｄｙ（登録商標）２  Ｓｏｙｂｅａｎ、ＤＡＳ−６８４１６−４  Ｘ  ＭＯＮ−８９７８８−１）、イベントＭＯＮ−８７７６９−７  ×  イベントＭＯＮ−８９７８８−１（別名Ｏｍｅｇａ−３  Ｘ  Ｇｅｎｕｉｔｙ  Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  ２  Ｙｉｅｌｄ  Ｓｏｙｂｅａｎｓ）、ＭＯＮ  ８７７０５  ｘ  ＭＯＮ  ８９７８８（別名Ｖｉｓｔｉｖｅ  Ｇｏｌｄ、ＭＯＮ−８７７φ５−６  ｘ  ＭＯＮ−８９７８８−１）、もしくはＭＯＮ８７７６９  ｘ  ＭＯＮ８９７８８（別名Ｏｍｅｇａ−３  ｘ  Ｇｅｎｕｉｔｙ  Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ  ２  Ｙｉｅｌｄ  Ｓｏｙｂｅａｎｓ、ＭＯＮ−８７７６９−７  ｘ  ＭＯＮ−８９７８８−１）のいずれか１つとのＥＥ−ＧＭ４の組合せなどの、これらの他のトランスジェニックダイズイベントのいくつかとのＥＥ−ＧＭ４の任意の組合せを含有する植物である。
【０３５５】
以下の特許請求の範囲で使用されるように、他に明確に示されない限り、用語「植物」は、任意の成熟の段階における、植物組織、および任意の種子、葉、茎、花、根、単一細胞、配偶子、細胞培養物、組織培養物、プロトプラストを含むがこれらに限定されない、任意のそのような植物から採取された、またはそれに由来する、任意の細胞、組織、または器官を包含することを意図している。
【０３５６】
２０１６年１１月９日にエリートイベントＥＥ−ＧＭ４を含む参照種子をＡＴＣＣ（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９）にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３６２４で寄託し、その発芽力が確認された。ＥＥ−ＧＭ４の代替名称は、イベントＧＭＢ４７１またはＢＣＳ−ＧＭ４７１−２である。
【０３５７】
本発明の上記説明は例示的であることを意図しており、限定的なものではない。
【０３５８】
記載された実施形態における様々な変更または修正が当業者に想起されるであろう。これらは本発明の精神または範囲から逸脱することなく行うことができる。
【図１】
2020503020.tif 000014
【図２】
2020503020.tif 000015
【図３】
2020503020.tif 000016
【図４】
2020503020.tif 000017
【図５】
2020503020.tif 000018
【図６】
2020503020.tif 000019
【図７】
2020503020.tif 000020
【図８】
2020503020.tif 000021
【図９】
2020503020.tif 000022
【図１０】
2020503020.tif 000023
【配列表】
2020503020000001.app
【国際調査報告】
2020503020.tif 000024
2020503020.tif 000025
2020503020.tif 000026
2020503020.tif 000027