(57)【要約】本明細書において、腫瘍抗原VGLL1特異的ペプチドが提供される。VGLL1特異的T細胞を作製する方法およびがんを治療するためのそれらの使用もまた本明細書に提供される。さらに、VGLL1特異的ペプチドはワクチンとして使用され得る。2020503840.tif 000011
2020503840.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:1に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、長さ35アミノ酸以下の単離されたVGLL1ペプチドであって、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を誘導することができる、ペプチド。
【請求項２】
SEQ ID NO:1に対して少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のペプチド。
【請求項３】
SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のペプチド。
【請求項４】
ヒトクラスI HLAタンパク質に結合する、請求項1または2に記載のペプチド。
【請求項５】
ヒトクラスI HLAタンパク質が、HLA-A1ファミリー、HLA-A29ファミリー、HLA-A30ファミリー、HLA-B18ファミリー、またはHLA-B44ファミリーに由来する、請求項4に記載のペプチド。
【請求項６】
ヒトクラスI HLAタンパク質がHLA-A1ファミリーに由来する、請求項4に記載のペプチド。
【請求項７】
ヒトクラスI HLAタンパク質が、HLA-A*0101、HLA-A*0102、HLA-A*0103、HLA-A*2902、HLA-A*3002、HLA-B*1801、またはHLA-B*4403である、請求項4に記載のペプチド。
【請求項８】
ヒトクラスI HLAタンパク質がHLA-A*0101である、請求項4に記載のペプチド。
【請求項９】
30アミノ酸以下の長さである、請求項1〜5のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１０】
25アミノ酸以下の長さである、請求項1〜5のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１１】
20アミノ酸以下の長さである、請求項1〜5のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１２】
15アミノ酸以下の長さである、請求項1〜5のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１３】
SEQ ID NO:1からなり、かつHLA-A*0101に選択的に結合する、請求項1に記載のペプチド。
【請求項１４】
請求項1〜13のいずれか一項に記載の単離されたペプチドと薬学的担体とを含有する、薬学的組成物。
【請求項１５】
非経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、吸入、または皮下注射用に製剤化される、請求項14に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ペプチドが、リポソーム、脂質含有ナノ粒子、または脂質ベースの担体中に含まれる、請求項14に記載の組成物。
【請求項１７】
薬学的調製物が、注射用または鼻腔スプレーとして吸入用に製剤化される、請求項14に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項1〜13のいずれか一項に記載のVGLL1ペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項１９】
請求項18に記載の核酸からなる連続した配列を含む、ベクター。
【請求項２０】
請求項1〜13のいずれか一項に記載のペプチドの有効量を対象に投与する段階を含み、
該ペプチドが該対象においてVGLL1特異的T細胞を誘導する、
対象における免疫応答を促進する方法。
【請求項２１】
前記対象ががんと診断されている、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記がんが、膵臓がん、卵巣がん、胃がん、または乳がんである、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象がヒトである、請求項20に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも第2の抗がん療法を施す段階をさらに含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２５】
第2の抗がん療法が、化学療法、放射線療法、免疫療法、または外科手術からなる群より選択される、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
免疫療法が免疫チェックポイント阻害剤である、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
免疫チェックポイント阻害剤が抗PD1モノクローナル抗体である、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
（a）T細胞の出発集団を取得する段階、および
（b）T細胞の出発集団を、請求項1〜13のいずれか一項に記載のVGLL1ペプチドと接触させ、それによりVGLL1特異的T細胞を生じさせる段階
を含む、VGLL1特異的T細胞を作製する方法。
【請求項２９】
接触が、T細胞の出発集団を抗原提示細胞（APC）と共培養することとしてさらに定義され、該APCがそれらの表面上に請求項1に記載のVGLL1ペプチドを提示する、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記APCが樹状細胞である、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
T細胞の出発集団がCD8+ T細胞である、請求項28に記載の方法。
【請求項３２】
前記T細胞が細胞傷害性Tリンパ球（CTL）である、請求項28に記載の方法。
【請求項３３】
取得が、末梢血単核細胞（PBMC）からT細胞の出発集団を分離することを含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３４】
請求項28〜33のいずれか一項に従って作製されたVGLL1特異的T細胞を含む、薬学的組成物。
【請求項３５】
請求項28〜33のいずれか一項に従って作製されたVGLL1特異的T細胞の有効量を対象に投与する段階を含む、対象におけるがんを治療する方法。
【請求項３６】
前記がんが、膵臓がん、卵巣がん、胃がん、または乳がんである、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
前記対象がヒトである、請求項35に記載の方法。
【請求項３８】
VGLL1特異的T細胞が自己由来である、請求項35に記載の方法。
【請求項３９】
VGLL1特異的T細胞の投与前に対象のリンパ球枯渇をさらに含む、請求項35に記載の方法。
【請求項４０】
リンパ球枯渇がシクロホスファミドおよび/またはフルダラビンの投与を含む、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも第2の治療薬を投与する段階をさらに含む、請求項35に記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも第2の治療薬が、化学療法、免疫療法、外科手術、放射線療法、または生物学的療法を含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
免疫療法が免疫チェックポイント阻害剤である、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
免疫チェックポイント阻害剤が抗PD1モノクローナル抗体である、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
VGLL1特異的T細胞および/または少なくとも第2の治療薬が、静脈内、腹腔内、気管内、腫瘍内、筋肉内、内視鏡的、病巣内、経皮的、皮下、局所的に、または直接注入もしくは灌流によって投与される、請求項41に記載の方法。
【請求項４６】
前記対象がVGLL1を発現するがん細胞を有すると判定されている、請求項35に記載の方法。
【請求項４７】
対象におけるがんを治療するための、請求項34に記載のVGLL1特異的T細胞の有効量を含む、組成物。
【請求項４８】
前記がんが、膵臓がん、卵巣がん、胃がん、または乳がんである、請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
前記対象がヒトである、請求項47に記載の方法。
【請求項５０】
VGLL1特異的T細胞が自己由来である、請求項47に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2016年10月7日に出願された米国仮特許出願第62/405,779号の恩典を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
2017年10月5日に作成された、1 KB（Microsoft Windowsで測定）の「UTFCP1307WO_ST25.txt」という名称のファイルに含まれる配列表は、電子申請により本明細書と共に提出され、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
1.  発明の分野
本発明は概して、免疫学および医学の分野に関する。より具体的には、本発明は、腫瘍抗原特異的ペプチドおよびがんの治療のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
2.  関連技術の説明
養子T細胞療法（ACT；「養子細胞移入」とも呼ばれる）は、メラノーマを治療するための方法として有望であることが示された；残念ながら、このアプローチはまた、非がん性組織に対する毒性などの制限によって妨げられてきた。ACTは、一般に、例えばがんを治療するために、多数の活性化された自己の腫瘍特異的T細胞を患者に注入することを含む。ACTは、メラノーマ患者において治療的臨床応答をもたらした（Yee 2002; Dudley 2002; Yee 2014）。一般に、効果的な抗腫瘍T細胞応答を生じさせるためには、通常、以下の3つの段階が必要である：抗原特異的T細胞のプライミングと活性化を行う段階、活性化されたT細胞を腫瘍部位に移動させる段階、および抗原特異的T細胞が腫瘍を認識して死滅させる段階。標的抗原の選択は、有効な抗原特異的T細胞の誘導にとって重要である。
【０００５】
いくつかの腫瘍関連抗原がメラノーマと他の一握りの悪性固形腫瘍について同定されているが、膵臓がん、卵巣がん、胃がん、肺がん、子宮頸がん、乳がん、および頭頸部がんのための免疫原性標的は少ない。したがって、これらの一般的なかつ治療が困難な悪性腫瘍に対する新規なエピトープおよび標的抗原の同定ならびに検証が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
いくつかの態様では、本開示は、VGLL1ペプチドおよび、例えば養子T細胞療法などの療法における、それらの使用方法を提供する。いくつかの態様では、該ペプチドを用いてVGLL1特異的T細胞をインビトロで増やすことができ、そのVGLL1特異的T細胞は、疾患（例えば、がん）を治療するためにヒト患者などの哺乳動物対象に投与される。さらなる態様では、該T細胞は、VGLL1に対する抗原特異性を有するT細胞受容体（TCR）を発現するように遺伝子操作される。他の態様では、該ペプチドを哺乳動物対象に投与して、該ペプチドに対する免疫応答を引き出すか、または該対象にワクチン接種をすることができる；そのような免疫応答は、がんなどの疾患を治療するか、または該疾患にかかる可能性もしくは該疾患を再発する可能性を低減するのに有用であり得る。
【０００７】
一態様では、本開示は、SEQ ID NO:1（LSELETPGKY）に対して少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、長さ35アミノ酸以下（例えば、34、33、32、31、または30アミノ酸）の単離されたVGLL1ペプチドを提供し、ここで、該ペプチドは細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を誘導することができる。いくつかの局面では、該ペプチドは、SEQ ID NO:1に対して少なくとも91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の局面では、該ペプチドは、長さが30アミノ酸以下、例えば、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、または10アミノ酸長である。
【０００８】
いくつかの局面では、該ペプチドはヒトクラスI HLAタンパク質に結合する。特定の局面では、ヒトクラスI HLAタンパク質は、HLA-A*0101またはHLA-A1ファミリーの他のメンバー、例えばHLA-A*0102およびHLA-A*0103である。他の局面では、クラスI HLAタンパク質は、HLA-A*2902もしくはHLA-A29ファミリーの他のメンバー、またはHLA-A*3002およびHLA-A30ファミリーの他のメンバーである。他の局面では、クラスI HLAタンパク質は、HLA-B*1801もしくはHLA-B18ファミリーの他のメンバー、またはHLA-B*4403もしくはHLA-B44ファミリーの他のメンバーである。
【０００９】
別の態様では、前記態様の単離されたVGLL1ペプチドおよび薬学的担体を含有する薬学的組成物が提供される。いくつかの局面では、薬学的組成物は、非経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、吸入、または皮下注射用に製剤化される。特定の局面では、該ペプチドはリポソーム、脂質含有ナノ粒子、または脂質ベースの担体中に含まれる。いくつかの局面では、薬学的調製物は注射用または鼻腔スプレーとして吸入用に製剤化される。
【００１０】
さらなる態様は、前記態様のVGLL1ペプチドをコードする単離された核酸を提供する。VGLL1ペプチドをコードする核酸からなる連続した配列を含むベクターも本明細書に提供される。
【００１１】
さらに別の態様では、対象における免疫応答を促進する方法であって、有効量の前記態様のVGLL1ペプチドを対象に投与することを含み、該ペプチドが該対象において抗原特異的T細胞を誘導する、方法が提供される。いくつかの局面では、該対象はがんと診断されている。特定の局面では、そのがんは膵臓がん、卵巣がん、胃がん、または乳がんである。特定の局面では、対象はヒトである。
【００１２】
さらなる局面では、前記方法は、少なくとも第2の抗がん療法を施すことをさらに含む。いくつかの局面では、第2の抗がん療法は化学療法、放射線療法、免疫療法、または外科手術からなる群より選択される。特定の局面では、免疫療法は免疫チェックポイント阻害剤である。ある特定の局面では、免疫チェックポイント阻害剤は抗PD1モノクローナル抗体である。
【００１３】
さらなる態様は、T細胞の出発集団を取得する段階、およびT細胞の出発集団を、前記態様のVGLL1ペプチド（例えば、SEQ ID NO:1のペプチド）と接触させ、それによりVGLL1特異的T細胞を生じさせる段階を含み、VGLL1特異的T細胞の作製方法を提供する。いくつかの局面では、接触段階は、T細胞の出発集団を抗原提示細胞（APC）と共培養する段階としてさらに定義され、該APCがそれらの表面上に前記態様のVGLL1ペプチドを提示する。特定の局面では、APCは樹状細胞である。いくつかの局面では、T細胞の出発集団はCD8+ T細胞である。特定の局面では、T細胞はCTLである。いくつかの局面では、取得段階は、末梢血単核細胞（PBMC）からT細胞の出発集団を分離する段階を含む。また、前記方法によって作製されたVGLL1特異的T細胞を含む薬学的組成物も本明細書に提供される。
【００１４】
なおもさらなる態様は、VGLL1に対する抗原特異性を有する、T細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）などの、抗原受容体を提供する。別の態様は、VGLL1特異的TCRまたはCARを発現するように操作されたT細胞を提供する。いくつかの局面では、VGLL1特異的キメラ抗原受容体は、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、および/または細胞外ドメインを含む。特定の局面では、該CARをコードするDNAは、細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの局面では、該CARの細胞外ドメインはVGLL1結合領域を含む。例えば、VGLL1結合領域は、F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、またはscFvであり得る。特定の局面では、該CARの細胞内シグナル伝達ドメインはTリンパ球活性化ドメインである。例えば、該CARの細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζ、CD28、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIγ、ICOS/CD278、ILRB/CD122、IL-2RG/CD132、DAP分子、CD70、サイトカイン受容体、CD40、またはそれらの組み合わせを含み得る。特定の局面では、該CARの膜貫通ドメインは、CD28膜貫通ドメイン、IgG4Fcヒンジ、Fc領域、CD4膜貫通ドメイン、CD3ζ膜貫通ドメイン、システイン変異型ヒトCD3ζドメイン、CD16膜貫通ドメイン、CD8膜貫通ドメイン、またはエリスロポエチン受容体膜貫通ドメインを含む。
【００１５】
別の態様は、有効量の前記態様のVGLL1特異的T細胞を対象に投与することを含む、対象におけるがんの治療方法を提供する。いくつかの局面では、がんは膵臓がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、または乳がんである。特定の局面では、対象はヒトである。いくつかの局面では、抗原特異的T細胞は自己由来のものである。いくつかの局面では、対象はVGLL1を発現するがん細胞があると判定されている。
【００１６】
特定の局面では、前記方法は、抗原特異的T細胞の投与前に対象のリンパ球枯渇（lymphodepletion）をさらに含む。いくつかの局面では、リンパ球枯渇はシクロホスファミドおよび/またはフルダラビンの投与を含む。
【００１７】
いくつかの局面では、前記方法は、少なくとも第2の治療薬を投与することをさらに含む。ある局面では、少なくとも第2の治療薬は、化学療法、免疫療法、外科手術、放射線療法、または生物学的療法を含む。特定の局面では、免疫療法は免疫チェックポイント阻害剤である。ある特定の局面では、免疫チェックポイント阻害剤は抗PD1モノクローナル抗体である。
【００１８】
ある局面では、VGLL1特異的T細胞および/または少なくとも第2の治療薬は、静脈内、腹腔内、気管内、腫瘍内、筋肉内、内視鏡的、病巣内、経皮的、皮下、局所的に、または直接注入もしくは灌流によって投与される。
【００１９】
さらに、対象におけるがんを治療するための、有効量の前記態様のVGLL1特異的T細胞を含む組成物が本明細書に提供される。いくつかの局面では、がんは膵臓がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がん、または乳がんである。特定の局面では、対象はヒトである。いくつかの局面では、抗原特異的T細胞は自己由来のものである。いくつかの局面では、対象はVGLL1を発現するがん細胞を有すると判定されている。
【００２０】
さらに、がんを有する対象から得られたサンプル中のVGLL1の発現レベルを測定することを含む、該対象の予後を判定する方法が本明細書に提供され、この方法では、VGLL1レベルの上昇により予後不良の対象が同定される。いくつかの局面では、該サンプルは血液サンプルまたは組織サンプル、例えば腫瘍サンプルである。特定の局面では、そのがんは膵臓がんである。
【００２１】
本発明の他の目的、構成および効果は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい態様を示しているが、例示としてのみ与えられていることを理解すべきである。というのは、当業者であれば、本発明の精神および範囲内の様々な変更および修飾がこの詳細な説明から明らかとなるからである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の局面をさらに実証するために提供される。本発明は、本明細書に提示された具体的な態様の詳細な説明と併せて、これらの図面の1つ以上を参照することにより、よりよく理解することができる。
【図１Ａ】VGLL1由来の膵臓腫瘍関連抗原の質量分析に基づいた同定。（A）PDAC患者MP015由来の膵臓腫瘍オルガノイド細胞株（hMIA-2D）から単離された、HLAクラスI結合VGLL1ペプチド、LSELETPGKY（SEQ ID NO:1）のタンデム質量分析（MS）。上のパネルは、発見段階（discovery phase）タンデムMSからのオリジナルの溶出ペプチドのスペクトルを示す。中央および下のスペクトルは、同位体標識合成ペプチドLSELETPGKY（SEQ ID NO:1）（重いリジン残基には下線が引いてある）を腫瘍サンプルにスパイクし、天然ペプチドと同時溶出して、ペプチド同一性のゴールドスタンダード確認を実証する標的化MS実験を示す。
【図１Ｂ】VGLL1由来の膵臓腫瘍関連抗原の質量分析に基づいた同定。（B）（A）と同じ質量スペクトルであるが、重いリジン残基に対応する、同位体標識ペプチドの予想された8原子質量単位の質量シフトを強調するために「y」イオンを丸で囲んである。
【図１Ｃ】VGLL1由来の膵臓腫瘍関連抗原の質量分析に基づいた同定。（C）（A）と同じ質量スペクトルであるが、b9+イオンのみの予想された8原子質量単位の質量シフトを強調するために「b」イオンを丸で囲んであり、他の「b」イオンはシフトされない。
【図１Ｄ】VGLL1由来の膵臓腫瘍関連抗原の質量分析に基づいた同定。（D）天然VGLL1ペプチドLSELETPGKY（SEQ ID NO:1）および同位体標識VGLL1ペプチドLSELETPGKY（SEQ ID NO:1）の予想されたタンデムMSフラグメントイオン質量の分析。
【図２Ａ−１】VGLL1 mRNA転写産物は、正常組織と比較して、いくつか種類の腫瘍において過剰発現される。（A）GTex Portal正常組織（gtexportal.org）およびTCGA（cancergenome.nih.gov）腫瘍組織のデータベースから誘導されたRNAseq解析は、それぞれ、正常組織および様々ながんにおけるVGLL1転写産物の発現を示す。各点は、分析された1つのヒトサンプルの結果を表す。左の星印と矢印は、膀胱に見られるVGLL1転写産物の最も高い平均正常組織レベルを示す。右の星印と矢印は、VGLL1ペプチドが検出された、MP015患者由来のオルガノイド細胞株hMIA2DにおけるVGLL1転写産物のレベルを示す。ボックスは、VGLL1転写産物を過剰発現する5種類のがん、すなわち膵臓がん、卵巣がん、膀胱がん、乳がん、および胃がんを示す。TPM，100万個の転写産物あたりの個数（transcripts per million）。
【図２Ａ−２】図2A-1の続きの図である。
【図２Ｂ】（B）TCGAデータから誘導された5種類のがんにおけるVGLL1発現率。RNAseq発現で測定したとき、VGLL1 mRNA発現が＞3 TPMである場合には、腫瘍関連発現を陽性と見なした。
【図３】VGLL1発現の上昇はがんにおける予後不良因子である。TCGA RNAseqデータによって決定される、最も高い（黒線）、2番目に高い（濃い灰色）、3番目に高い（中間の灰色）、および最も低い（薄い灰色）VGLL1腫瘍転写産物発現の四分位数に分けられた膵臓がん患者の生存率分析。最も低いVGLL1発現は最も高い生存率と相関していた。
【図４Ａ】VGLL1ペプチド特異的細胞傷害性T細胞を、PDAC患者の末梢血から分離して増殖させ、治療のために注入した。（A）養子T細胞治療プロセスを示す概略図。
【図４Ｂ】（B）2ラウンドの四量体に基づくOWLソーティングおよび迅速な細胞増殖プロトコル（rapid expansion protocol：REP）の前に、HLA-A*0101陽性PDAC患者MP015由来の末梢血を自己由来のLSELETPGKY（SEQ ID NO:1）ペプチドパルス樹状細胞で2回刺激した。
【図４Ｃ】（C）VGLL1特異的CTLを約200憶個の細胞にまで増殖させて患者MP015に注入し、同時に3週間ごとに抗PD1で治療した。
【図４Ｄ】（D）CTL注入は、インビトロで強力な自己抗腫瘍活性を示したにもかかわらず、深刻な毒性も明らかな臨床上の利点も誘発しなかった。患者MP015からの複数の縦断的な腫瘍サンプルに対して実施された遺伝子発現分析は、元の腫瘍（オルガノイド細胞株hMIA-2Dの供給源）の採取とVGLL1特異的CTL注入との間に介在する数ヶ月の間にVGLL1抗原の欠損が生じたことを明らかにした。
【図５Ａ】VGLL1特異的CTLは、患者由来および同種異系のHLA-A*0101+膵臓がん細胞を認識して殺傷する。（A）増殖させたHLA-A*0101拘束性VGLL1特異的CD8+ T細胞を、標準的な51Cr放出アッセイにおいて、自己のPDAC患者MP015由来腫瘍株hMIA-2D、HLA-A*0101陽性PDAC細胞株Capan-1、またはHLA-A*0101陽性メラノーマ細胞株A375と共培養し、5：1および20：1のエフェクター対標的（E：T）細胞比で細胞傷害活性を測定した。
【図５Ｂ】（B）（A）と同じ細胞傷害アッセイであるが、VGLL1特異的CTL曝露の前に3つ全ての細胞株に1mMのコグネイトVGLL1ペプチド抗原をパルスして、洗浄した。
【図６Ａ】VGLL1特異的CTLは、膵臓がん、膀胱がん、卵巣がん、およびトリプルネガティブ乳がんに由来するHLA-A0101+腫瘍細胞株を殺傷する。（A）増殖させたHLA-A*0101拘束性VGLL1特異的CD8+ T細胞を、漸増量（titrated amounts）のコグネイトVGLL1ペプチドをパルスしたHLA-A*0101陽性Mel888メラノーマ細胞と一緒に、標準的な51Cr放出細胞傷害アッセイでエフェクター対標的（E：T）細胞比5：1にて共培養した。
【図６Ｂ】（B）4つのPDAC株（hMIA-2D、Capan-1、BXPC3、およびMP081）、トリプルネガティブ乳がん株（BT20）、および膀胱がん株（UBLC1）を含む6つのHLA-A*0101陽性細胞株に対してE：T細胞比5：1で試験したVGLL1特異的CTLの細胞傷害アッセイの結果。
【図６Ｃ】（C）事前にインターフェロンγ治療を行った場合と行わなかった場合の、2つの追加のHLA-A*0101陽性細胞株、トリプルネガティブ乳がん株（BT549）および卵巣がん株（OAW28）に対してE：T細胞比5：1で試験したVGLL1特異的CTLの細胞傷害アッセイの結果。
【図７Ａ】胃がん株MKN74は、HLA-A*0101形質導入後にVGLL1特異的CTLによって殺傷される。（A）親MKN74胃がん細胞およびHLA-A*0101を発現するようにレンチウイルスベクターで形質導入されたMKN74細胞のフローサイトメトリー分析。細胞をHLA-A*0101特異的mAbで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。MKN74形質導入細胞は右にシフトしている。
【図７Ｂ】（B）形質導入されていないHLA-A*0101陽性メラノサイト、またはVGLL1を発現するようにレンチウイルスで形質導入された同じメラノサイトに対してE：T細胞比5：1で試験したVGLL1特異的CTLの細胞傷害アッセイの結果。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
例示的な態様の説明
多くの異なる種類のがんを有する患者にとって、T細胞ベースの免疫療法は有効性が証明された有望なアプローチである。しかしながら、ほとんどの種類のがんに対する抗原特異的T細胞療法は、現在知られている腫瘍関連抗原の欠如のために実用性がなく、こうした欠如がそれらの臨床開発を遅らせている。本開示の研究は、質量分光測定法により膵臓細胞株および腫瘍標本のイムノペプチドーム（immunopeptidome）をプロファイリングし、正常組織と比較して膵臓がん、卵巣がん、胃がん、膀胱がんおよび乳がんにおいて実質的により高いレベルで発現される新規な腫瘍関連抗原VGLL1に由来するペプチドエピトープを同定した。これらのペプチドエピトープを使用して、抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を膵臓患者の末梢血単核細胞（PBMC）から作製した；こうした抗原特異的CTLは、HLAが適合する同種腫瘍細胞株上に内因的に提示された抗原を認識して、腫瘍細胞の殺傷をもたらした。したがって、本明細書に提供されるこれらの抗原特異的CTLは、固形がん（例えば、膵臓がん、卵巣がん、胃がん、乳がん）を標的とするために使用され得る。
【００２４】
したがって、本開示は、がん治療の免疫療法として使用するための、腫瘍抗原VGLL1のような、腫瘍抗原に特異的なペプチドを提供する。本研究は、膵臓溶出（pancreatic elution）から腫瘍関連抗原としてのVGLL1を同定した。このVGLL1ペプチドは51nMの予測されたHLA-A*0101親和性を有し、これは10〜20％の世界的頻度を有する。それゆえに、いくつかの態様では、VGLL1ペプチド（例えば、SEQ ID NO:1を含む）が本明細書に提供される。例えば、VGLL1特異的ペプチドをT細胞の集団と接触させるか、またはその集団を刺激するために用いて、VGLL1特異的ペプチドを認識するかまたはそれに結合するT細胞の増殖を誘導することができる。他の態様では、本開示のVGLL1特異的ペプチドをヒト患者などの対象に投与して、がんに対する対象の免疫応答を増強することができる。
【００２５】
VGLL1特異的ペプチドは能動免疫療法（例えば、がんワクチン）または受動免疫療法（例えば、養子免疫療法）に含めることができる。能動免疫療法は、精製した腫瘍抗原または免疫優性VGLL1特異的ペプチド（天然型または改変型）を用いて対象を免疫することを含む。あるいは、VGLL1特異的ペプチドでパルスした（または腫瘍抗原をコードする遺伝子でトランスフェクトした）抗原提示細胞（APC）を対象に投与することもできる。VGLL1特異的ペプチドは、改変されていてもよく、または置換突然変異などの1つ以上の突然変異を含んでいてもよい。受動免疫療法には養子免疫療法が含まれる。養子免疫療法は一般に細胞を対象に投与することを含み、この場合、該細胞（例えば、CTL）は、例えばインビトロでVGLL1エピトープをCTLに提示するAPCを用いることによって、VGLL1特異的ペプチドにインビトロで感作されている（例えば、US 7,910,109参照）。
【００２６】
本研究では、最低のVGLL1発現が最高の生存率と相関したので、生存率はVGLL1発現に対応していることが観察された。したがって、VGLL1は、がん患者、特に膵臓がん患者における予後マーカーとして使用することができる腫瘍マーカーである。
【００２７】
I.  定義
本明細書で使用するとき、特定の成分に関して「本質的に含まない」とは、特定成分がいずれも意図的に組成物に配合されていないおよび/または汚染物質としてまたは微量でのみ存在することを意味する。意図的でない組成物の汚染から生じる特定成分の合計量は、それゆえに、0.05％よりかなり低く、好ましくは0.01％より低い。最も好ましいのは、そのような特定成分の量を標準的な分析方法で検出することができない組成物である。
【００２８】
本明細書で使用する「a」または「an」は1つまたは複数を意味し得る。特許請求の範囲で使用する「a」または「an」という語は、「含む」（comprising）という語と一緒に使用される場合、1つまたは2つ以上を意味し得る。
【００２９】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、選択肢のみまたは相互に排他的な選択肢を指すように明示的に示されない限り、「および/または」を意味するために使用されるが、本開示は、選択肢のみと「および／または」を指す定義を支持する。本明細書で使用する「別の」は、少なくとも第2のまたはそれ以上を意味し得る。
【００３０】
本出願を通して、用語「約」は、ある値が、その値を決定するために使用される装置、方法の固有の誤差変動、または研究対象の間に存在する変動を含む、ことを示すために使用される。
【００３１】
「治療」および「治療する」は、疾患または健康関連状態の治療上の効果を得る目的で、対象に治療薬を投与もしくは適用すること、または対象に医療的手法もしくはモダリティを実施することを指す。例えば、治療はT細胞療法を施すことを含み得る。
【００３２】
「対象」および「患者」は、ヒトまたはヒト以外、例えば、霊長類、哺乳動物、脊椎動物などを指す。特定の態様では、対象はヒトである。
【００３３】
本出願を通して使用する用語「治療上の効果」または「治療上有効な」とは、その状態の医療処置に関して対象の健康な状態（well-being）を促進または増強するあらゆるものを指す。それには、限定するものではないが、疾患の徴候または症状の頻度もしくは重症度の低減が含まれる。例えば、がんの治療は、例えば、腫瘍サイズの縮小、腫瘍の侵襲性の減少、がんの増殖速度の低下、または転移の予防を含み得る。がんの治療はまた、がんを有する対象の生存期間を延長することを意味し得る。
【００３４】
「抗がん」剤は、例えば、がん細胞の殺傷を促進する、がん細胞にアポトーシスを誘導する、がん細胞の増殖速度を低下させる、転移の発生または数を減らす、腫瘍サイズを縮小する、腫瘍増殖を抑制する、腫瘍またはがん細胞への血液の供給を減らす、がん細胞または腫瘍に対する免疫応答を促進する、がんの進行を防止または阻止する、あるいはがんを有する対象の寿命を延ばすことによって、対象におけるがん細胞/腫瘍にマイナスの影響を与えることができる。
【００３５】
本明細書における用語「抗体」は最も広い意味で使用され、具体的には、それらが所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および抗体フラグメントを包含する。
【００３６】
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、例えば、その集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる可能性のある突然変異、例えば天然の突然変異、を除いて同一である。したがって、修飾語句「モノクローナル」は、離散的な別々の抗体の混合物ではないという抗体の性質を示している。ある態様では、そのようなモノクローナル抗体は通常、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、その標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含む方法によって得られたものである。例えば、選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えDNAクローンのプールのような、複数のクローンからのユニークなクローンの選択であり得る。選択された標的結合配列は、例えば、標的に対する親和性を向上させる、標的結合配列をヒト化する、細胞培養におけるその産生を改善する、インビボでのその免疫原性を低減させるなどのために、さらに改変することができ、改変された標的結合配列を含む抗体もまたモノクローナル抗体であることが理解されよう。ポリクローナル抗体調製物が典型的には種々の決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を含むのとは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して誘導されたものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、それが他の免疫グロブリンで通常汚染されていないという点で有利である。
【００３７】
「薬学的または薬理学的に許容される」という語句は、必要に応じてヒトなどの動物に投与したとき、副作用、アレルギー反応、または他の有害反応を生じさせない分子実体および組成物を指す。抗体または追加の活性成分を含む薬学的組成物の調製は、本開示に照らして当業者には公知であろう。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与の場合、調製物はFDA Office of Biological Standardsによって要求される無菌性、発熱原性、一般的安全性、および純度基準を満たすべきであることが理解されよう。
【００３８】
本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」は、ありとあらゆる水性溶媒（例えば、水、アルコール/水溶液、生理食塩水、非経口ビヒクル、例えば塩化ナトリウム、ブドウ糖リンゲル液など）、非水性溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、および注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルなど）、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば、抗菌剤または抗真菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス）、等張化剤、吸収遅延剤、塩類、薬物、薬物安定化剤、ゲル化剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、体液栄養補充剤、当業者に知られているような同様の材料およびそれらの組み合わせを含む。薬学的組成物中の様々な成分のpHおよび正確な濃度は、周知のパラメータに従って調整される。
【００３９】
用語「単位用量」または「投与量」は、対象において使用するのに適した物理的に離散した単位を指し、各単位は、その投与、すなわち適切な経路と治療計画、に関連して、上述した所望の応答を生じるように計算された、所定量の治療用組成物を含有する。治療の数と単位用量の両方に従って、投与される量は、期待される効果に依存する。患者または対象に投与される本態様の組成物の実際の投与量は、身体的および生理学的要因、例えば、対象の体重、年齢、健康状態、および性別、治療しようとする疾患の種類、疾患の侵入の程度、以前または同時の治療的介入、患者の突発性疾患、投与経路、ならびに特定の治療物質の効力、安定性、および毒性などによって決定され得る。例えば、用量はまた、投与あたり約1μg/kg/体重〜約1000mg/kg/体重（このような範囲は介在する用量を含む）またはそれ以上、およびその中で導き出される任意の範囲を含むことができる。本明細書に記載した数字から導き出される範囲の非限定的な例では、約5μg/kg/体重〜約100mg/kg/体重、約5μg/kg/体重〜約500mg/kg/体重などの範囲を投与することができる。いずれにしても、投与への責任を負っている医師が、組成物中の活性成分の濃度および個々の対象に適切な用量を決定するであろう。いくつかの態様では、抗原特異的T細胞注入の投与量は、約1億〜約300億個の細胞、例えば、100億、150億、または200億個の細胞を含み得る。
【００４０】
用語「免疫チェックポイント」は、免疫反応のバランスをとるためにその成分に抑制シグナルを提供する、免疫系におけるタンパク質などの分子を指す。公知の免疫チェックポイントタンパク質は、CTLA-4、PD-1とそのリガンドPD-L1およびPD-L2、さらにLAG-3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3、KIRを含む。LAG-3、BTLA、B7H3、B7H4、TIM3、およびKIRを含む経路は、CTLA-4およびPD-l依存性経路と同様の免疫チェックポイント経路を構成することが当技術分野で認識されている（例えば、Pardoll, 2012. Nature Rev Cancer 12:252-264; Mellman et al., 2011. Nature 480:480-489を参照されたい）。
【００４１】
「免疫チェックポイント阻害剤」は、免疫チェックポイントタンパク質の機能を阻害する任意の化合物を指す。阻害には機能の低下および完全な遮断が含まれる。特に免疫チェックポイントタンパク質は、ヒト免疫チェックポイントタンパク質である。したがって、免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、特にヒト免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤である。
【００４２】
本明細書で使用する「防御免疫応答」とは、哺乳動物宿主の免疫系によるがんに対する応答を指す。防御免疫応答はがんの治療に治療上の効果をもたらすことができ、例えば、腫瘍サイズの縮小または生存期間の延長をもたらす。
【００４３】
本明細書で使用する用語「抗原」は、抗体またはT細胞受容体によって結合され得る分子である。抗原は一般に、Bリンパ球および/またはTリンパ球の産生につながる体液性免疫応答および/または細胞性免疫応答を誘導するために使用され得る。
【００４４】
「腫瘍関連抗原」、「腫瘍抗原」および「がん細胞抗原」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。それぞれの場合において、この用語はがん細胞によって特異的にまたは優先的に発現されるタンパク質、糖タンパク質または炭水化物を指す。
【００４５】
本明細書で使用する用語「キメラ抗原受容体（CAR）」は、例えば、人工T細胞受容体、キメラT細胞受容体、またはキメラ免疫受容体を指すことができ、特定の免疫エフェクター細胞に人工的な特異性をグラフトする、工学的に作製された人工の受容体を包含する。CARを用いると、T細胞上にモノクローナル抗体の特異性を付与することができ、それによって、例えば養子細胞療法で使用するための、多数の特異的T細胞を作製することが可能である。特定の態様では、CARは、その細胞の特異性を、例えば腫瘍関連抗原に向かわせる。いくつかの態様では、CARは、細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインを含み、細胞外ドメインが腫瘍関連抗原結合領域を含む。特定の局面では、CARは、CD3ζ膜貫通ドメインおよびエンドドメインに融合された、モノクローナル抗体由来の単鎖可変フラグメント（scFv）の融合体を含む。他のCAR設計の特異性は、受容体のリガンド（例えばペプチド）から、またはDectinのようなパターン認識受容体から誘導することができる。ある場合には、活性化誘導細胞死（activation-induced cell death）を減少させるために抗原認識ドメインの間隔を改変してもよい。ある場合には、CARは、CD3ζ、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP10、および/またはOX40などの、さらなる共刺激シグナル伝達のためのドメインを含む。場合によっては、共刺激分子、イメージング用（例えば、ポジトロン放出断層撮影用）のレポーター遺伝子、プロドラッグの添加時に条件付きでT細胞を除去する遺伝子産物、ホーミング受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、およびサイトカイン受容体を含めた分子をCARと共発現させることができる。
【００４６】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドまたはポリペプチド領域）が別の配列に対してある割合（例えば、80％、85％、90％、または95％）の「配列同一性」または「相同性」を有するとは、アライメントしたときに、その割合の塩基（またはアミノ酸）が2つの配列を比較して同じであることを意味する。このアライメントおよび相同性または配列同一性パーセントは、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えばCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubelら編, 1987) Supplement 30, セクション7.7.18, 表7.7.1に記載されるものを用いて、決定することができる。好ましくは、アライメントにはデフォルトパラメータが使用される。好適なアライメントプログラムは、デフォルトパラメータを用いるBLASTである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトパラメータを用いるBLASTNおよびBLASTPである：遺伝コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ値＝60；期待値＝10；マトリックス＝BLOSUM62；記載＝50配列；ソート＝ハイスコア；データベース＝非冗長（non-redundant）、GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB＋GenBank CDS翻訳＋SwissProtein＋SPupdate＋PIR。
【００４７】
II.  VGLL1ペプチド
本開示のある態様は、VGLL1腫瘍抗原のような、腫瘍抗原に特異的なペプチドに関する。特定の態様では、腫瘍抗原特異的ペプチドは、VGLL1ペプチドのアミノ酸配列（LSELETPGKY: SEQ ID NO:1）を有する。腫瘍抗原特異的ペプチドは、SEQ ID NO:1のペプチド配列に対して少なくとも80、85、90、95、96、97、98、99、または100パーセントの配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
【００４８】
本明細書で使用する用語「ペプチド」は、長さ7〜35アミノ酸、好ましくは8〜35アミノ酸残基、さらにより好ましくは8〜25アミノ酸、または7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、もしくは35アミノ酸、またはそこから導き出される任意の範囲を含むアミノ酸鎖を包含する。例えば、本開示のVGLL1ペプチドは、いくつかの態様において、SEQ ID NO:1のVGLL1ペプチドを含むか、またはそれからなる。本明細書で使用する「抗原性ペプチド」とは、脊椎動物に導入したとき、その脊椎動物において抗体の産生を刺激し得る、すなわち抗原性である、ペプチドのことであり、該抗体は選択的にその抗原性ペプチドを認識しかつ/またはそれに結合することができる。抗原性ペプチドは、免疫反応性VGLL1ペプチドを含むことができ、追加の配列を含んでもよい。追加の配列は、天然の抗原に由来しても、異種であってもよく、そうした配列は免疫原性であり得るが、必ずしもそうである必要はない。いくつかの態様では、腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）は、HLA-A*0101と選択的に結合することができる。ある態様では、VGLL1ペプチドは、長さが8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、もしくは35アミノ酸、またはそこから導き出される任意の範囲である。好ましくは、腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）は、長さが8〜35アミノ酸である。いくつかの態様では、腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）は、長さが8〜10アミノ酸である。
【００４９】
当業者には理解されるように、MHC分子は様々なサイズのペプチドに結合することができるが、一般的に全長タンパク質には結合できない。MHCクラスI分子は8〜11アミノ酸長のペプチドに結合すると伝統的に記載されているが、長さ15アミノ酸のペプチドは、結合部位の中央に突き出るか、またはMHCクラスI結合溝の外に延びることによって、MHCクラスI分子に結合できることが示されている（Guo et al., 1992; Burrows et al., 2006; Samino et al., 2006; Stryhn et al., 2000; Collins et al., 1994; Blanchard and Shastri, 2008）。さらに、最近の研究はまた、より長いペプチドがより効率的にエンドサイトーシスで取り込まれ、プロセシングされて、抗原提示細胞によって提示され得ることを実証した（Zwaveling et al., 2002; Bijker et al., 2007; Melief and van der Burg, 2008; Quintarelli et al., 2011）。Zwaveling et al. (2002)に示されるように、長さ35アミノ酸までのペプチドは、クラスII MHCに選択的に結合させるために使用されて、有効である。当業者には直ちに理解されるように、VGLL1などの天然の全長腫瘍抗原は、それがエンドサイトーシスされてT細胞の増殖をもたらすように、クラスII MHCに選択的に結合させるのに有益ではないだろう。一般的に、天然の全長腫瘍抗原タンパク質はこれらの特徴を提示しないので、こうした免疫療法の目的には役に立たない。
【００５０】
ある態様において、腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）は免疫原性または抗原性である。以下の実施例に示すように、本開示の腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）はT細胞の増殖を促進することができる。そのようなペプチドを使用して、ある程度の防御免疫を誘導することができると期待される。
【００５１】
腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）は、組換えペプチド、合成ペプチド、精製ペプチド、固定化ペプチド、検出可能に標識されたペプチド、封入ペプチド、またはベクターにより発現されるペプチド（例えば、核酸に機能的に連結された異種プロモーターを含むベクター中の該核酸によってコードされるペプチド）であり得る。いくつかの態様では、合成の腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）は、対象において免疫応答を誘導するために、ヒト患者などの対象に投与することができる。合成ペプチドは、組換え的に発現されたペプチドと比較して、細菌汚染の危険性が少ないなどの、いくつかの利点を示し得る。腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）はまた、哺乳動物またはヒト対象への投与のために製剤化される、例えばワクチン組成物のような、薬学的組成物中に含めることができる。
【００５２】
A.  細胞透過性ペプチド
いくつかの態様では、免疫療法は、リポソームまたは細胞透過性ペプチド（cell penetrating peptide：CPP）などの細胞ペネトレータと会合した本開示の腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）を利用し得る。ペプチドでパルスした抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）は、抗腫瘍免疫を増強するために使用され得る（Celluzzi et al., 1996; Young et al., 1996）。リポソームおよびCPPについては、以下でさらに詳細に説明する。いくつかの態様では、免疫療法は、本開示の腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）をコードする核酸を利用してもよく、その場合に該核酸は、例えばウイルスベクターまたは非ウイルスベクターで、送達される。
【００５３】
腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）はまた、細胞透過性ペプチド（CPP）と会合されるか、またはそれに共有結合され得る。腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）に共有結合され得る細胞透過性ペプチドには、例えば、HIV Tat、ヘルペスウイルスVP22、ショウジョウバエのアンテナペディア（Antennapedia）ホメオボックス遺伝子産物、シグナル配列、融合配列、またはプロテグリンIが含まれる。ペプチドをCPPに共有結合させると、樹状細胞によるペプチドの提示を引き延ばし、それによって抗腫瘍免疫を増強することができる（Wang and Wang, 2002）。いくつかの態様では、本開示の腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）（例えば、ペプチドまたはポリエピトープストリング内に含まれる）をCPPに（例えば、ペプチド結合を介して）共有結合させると、融合タンパク質が得られる。他の態様では、腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）または腫瘍抗原特異的ペプチドをコードする核酸を、多重膜リポソーム、小胞リポソーム、または多重小胞リポソームなどのリポソーム内に封入したり、またはそのようなリポソームと会合させたりすることもできる。
【００５４】
本明細書で使用する「会合」とは、物理的会合、化学的会合、またはその両方を意味する。例えば、会合は共有結合、疎水性相互作用、封入、表面吸着などを含み得る。
【００５５】
本明細書で使用する「細胞ペネトレータ」（cell penetrator）とは、抗原提示細胞へのペプチド/ポリエピトープストリングの細胞内送達を高める組成物または化合物を指す。例えば、細胞ペネトレータは、ペプチドと会合したとき、原形質膜を通過するその能力を高める脂質であり得る。あるいは、細胞ペネトレータはペプチドであり得る。細胞透過性ペプチド（CPP）は当技術分野で公知であり、例えば、HIVのTatタンパク質（Frankel and Pabo, 1988）、HSVのVP22タンパク質（Elliott and O'Hare, 1997）および線維芽細胞増殖因子（Lin et al., 1995）を含む。
【００５６】
細胞透過性ペプチド（または「タンパク質形質導入ドメイン」）は、ショウジョウバエのアンテナペディアホメオボックス遺伝子（Antp）の3番目のヘリックス、HIV Tat、およびヘルペスウイルスVP22から同定されており、それらの全てがアルギニン残基とリジン残基に富んだ正に荷電したドメインを含む（Schwarze et al., 2000; Schwarze et al., 1999）。また、シグナル配列に由来する疎水性ペプチドも細胞透過性ペプチドとして同定されている（Rojas et al., 1996; Rojas et al., 1998; Du et al., 1998）。これらのペプチドをβ-ガラクトシダーゼのようなマーカータンパク質にカップリングさせると、該マーカータンパク質の細胞内への効率的な内在化をもたらすことが示されており、これらのペプチドを含むキメラなインフレーム融合タンパク質は、インビトロとインビボの両方で広範囲の種類の細胞にタンパク質を送達するために使用されている（Drin et al., 2002）。本開示による腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）へのこれらの細胞透過性ペプチドの融合は、該ポリペプチドの細胞内取り込みを増強し得る。
【００５７】
いくつかの態様では、細胞内取り込みは、ステアリン酸またはミリスチル酸などの脂質をポリペプチドに結合することによって促進される。脂質化はペプチドの細胞内への移行を高めることが示されている。脂質部分の結合は、細胞によるポリペプチドの取り込みを増加させる本開示の別の方法である。細胞内取り込みについては、以下でさらに説明する。
【００５８】
本開示の腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）は、リポソームワクチン組成物に含めることができる。例えば、リポソーム組成物はプロテオリポソーム組成物であるか、またはそれを含み得る。本開示と共に使用できるプロテオリポソーム組成物を作製する方法は、例えば、Neelapu et al. (2007)およびPopescu et al. (2007)に記載されている。いくつかの態様では、プロテオリポソーム組成物を用いてメラノーマを治療することができる。
【００５９】
腫瘍抗原特異的ポリペプチドの取り込みを高めることによって、治療に必要なタンパク質またはペプチドの量を減らすことが可能であり得る。これにより、治療コストを大幅に削減し、治療薬の供給を増やすことができる。より低い投与量はまた、ペプチドの潜在的な免疫原性を最小限に抑え、かつ毒性の副作用を制限し得る。
【００６０】
いくつかの態様では、腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）をナノ粒子と会合させて、ナノ粒子-ポリペプチド複合体を形成することができる。いくつかの態様では、ナノ粒子はリポソームであるか、または他の脂質ベースのナノ粒子、例えば脂質ベースの小胞（例えば、DOTAP：コレステロール小胞）である。他の態様では、ナノ粒子は酸化鉄ベースの超常磁性ナノ粒子である。直径が約10〜100nmの範囲の超常磁性ナノ粒子は、脾臓による貯留（sequestering）を回避するには十分に小さいが、肝臓によるクリアランスを回避するには十分に大きい。このサイズの粒子は非常に小さな毛細血管内に入り込むことができ、そして体内組織に効率よく分布することができる。超常磁性ナノ粒子-ポリペプチド複合体は、腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）を取り込んだ細胞を同定して追跡するためのMRI造影剤として使用可能である。いくつかの態様では、該ナノ粒子は半導体ナノ結晶または半導体量子ドットであり、その両方とも光学イメージングに使用することができる。さらなる態様では、ナノ粒子は、シリカの芯を金の層で覆ったナノシェルであり得る。ナノシェルの1つの利点は、標準的な化学を用いてポリペプチドを金層にコンジュゲートできることである。他の態様では、ナノ粒子はフラーレンまたはナノチューブであり得る（Gupta et al., 2005）。
【００６１】
ペプチドは腎臓によって循環系から急速に取り除かれ、かつ血清中のプロテアーゼによる分解に感受性である。腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）をナノ粒子と会合させることによって、本開示のナノ粒子-ポリペプチド複合体は、分解を防止しかつ/または腎臓によるクリアランスを減らす可能性がある。これはポリペプチドの血清半減期を増加させ、それによって有効な治療に必要とされるポリペプチドの用量を減らすことができる。さらに、これは治療コストを削減し、かつ治療の免疫学的問題および毒性反応を最小限にし得る。
【００６２】
B.  ポリエピトープストリング
いくつかの態様では、腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）は、ポリエピトープストリングに含まれる。ポリエピトープストリングは、互いに連結された、1つ以上の抗原に由来する複数の抗原性エピトープを含むペプチドまたはポリペプチドである。ポリエピトープストリングを用いて、ヒト対象などの対象において免疫応答を誘導することができる。ポリエピトープストリングは、マラリアおよび他の病原体を標的とするために以前に使用されたことがある（Baraldo et al., 2005; Moorthy et al., 2004; Baird et al., 2004）。ポリエピトープストリングは、核酸（例えば、VGLL1ペプチドを含む複数の抗原をコードする核酸）またはペプチドもしくはポリペプチド（例えば、VGLL1ペプチドを含む複数の抗原を含む）を指すことができる。ポリエピトープストリングをがんワクチン組成物に含めることが可能である。
【００６３】
C.  生物学的機能等価物
本開示の腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）は、HLA-A*0101などのHLAクラスタンパク質の結合領域とのそれぞれの相互作用を変えないアミノ酸の置換、挿入および/または欠失を含むように改変することができる。腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）のそのような生物学的機能等価物は、同様の、さもなければ望ましい特徴、例えばHLA-A*0101の結合、を有する分子であり得る。非限定的な例として、HLA-A*0101へのペプチド結合が検出可能に変化しないことにより実証されるように、相互作用能力の明らかな喪失なしに、本明細書に開示される腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）中のアミノ酸を適切なアミノ酸で置き換えることができる。いくつかの態様では、腫瘍抗原特異的ペプチドはアンカー残基に置換変異を有し、例えば、次の位置のうちの1つ、2つまたは全部の位置に置換変異を有する：1（P1）、2（P2）、および/または9（P9）。したがって、配列および/または構造が改変されているが、生物学的有用性または活性が変化していない本明細書に開示される腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）（またはそのようなペプチドをコードする核酸）は、依然として本明細書に開示される組成物および方法の範囲内であると考えられる。
【００６４】
また、当業者には十分理解されるように、生物学的機能等価ペプチドの定義には、許容可能なレベルの等価な生物学的活性をなおも維持しながら、その分子の特定部分において行われ得る変化の数には制限があるという概念がもともと内在している。かくして、生物学的機能等価ペプチドは、本明細書では、アミノ酸の、大部分または全部ではなく、いくつかが置換されていてもよいペプチドとして定義される。当然ながら、異なる置換を有する複数の異なるペプチドを、本開示に従って容易に作製および使用することができる。
【００６５】
当業者はまた、特定のエピトープ中の残基のように、いくつかの残基がペプチドの生物学的または構造的性質にとって特に重要であることが示されている場合、そのような残基は一般に交換され得ないことを認識している。このことは本開示にも当てはまりそうである。というのは、本明細書に開示された腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）の突然変異は、種特異性の喪失をもたらし、ひいては本開示の方法で使用するための得られたペプチドの有用性を低下させる可能性があるからである。したがって、抗原性であり（例えば、HLA-A*0101に特異的に結合し）かつ保存的アミノ酸置換を含むペプチドは、本開示に含まれると理解される。保存的置換は、タンパク質の活性を劇的に変化させることが最もありそうにない。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸を化学的に類似するアミノ酸で置換することを指し、すなわち、非極性アミノ酸の他の非極性アミノ酸による置換、極性アミノ酸の他の極性アミノ酸による置換、酸性残基の他の酸性アミノ酸による置換などを指す。
【００６６】
アミノ酸置換、例えば本明細書に開示される腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）を改変する際に使用され得るアミノ酸置換は、一般に、アミノ酸の側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいている。アミノ酸側鎖置換基のサイズ、形状および種類の分析は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンがすべて正電荷を帯びた残基であり、アラニン、グリシンおよびセリンがすべて同様のサイズであり、そしてフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンがすべて一般に類似した形状を有することを明らかにする。したがって、これらの考慮事項に基づいて、アルギニン、リジンおよびヒスチジン；アラニン、グリシンおよびセリン；ならびにフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、本明細書では生物学的機能等価物として定義される。いくつかの態様では、該突然変異はTCR-pMHC相互作用および/またはペプチド-MHC結合を増強し得る。
【００６７】
本開示はまた、本明細書に開示された腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）のアイソフォームを企図している。アイソフォームは本開示のペプチドと同じ数および種類のアミノ酸を含むが、異なる分子構造を有する。本開示によって企図されるアイソフォームは、本明細書に記載される本開示のペプチドと同じ特性を有するものである。
【００６８】
非標準アミノ酸を、既存のアミノ酸の化学的修飾によって、または本明細書に開示されるペプチドのデノボ合成によって、タンパク質に組み込むことができる。非標準アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされる20種の標準アミノ酸とは化学構造が異なるアミノ酸を指す。
【００６９】
選択された態様では、本開示は、本明細書に開示された腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）の化学的誘導体を企図している。「化学的誘導体」とは、官能性側基の反応によって化学的に誘導体化された残基を1個以上有し、かつ生物学的活性および有用性を保持しているペプチドを指す。そのような誘導体化ペプチドには、例えば、遊離アミノ基が、特定の塩を形成するように誘導体化されているか、またはアルキル化および/もしくはアシル化、とりわけ、p-トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、ホルミルもしくはアセチル基により誘導体化されているものが含まれる。遊離カルボキシル基は、有機もしくは無機塩、メチルおよびエチルエステルもしくは他の種類のエステル、またはヒドラジド、好ましくはアミド（一級または二級）を形成するように誘導体化され得る。化学的誘導体は、20種の標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体を1個以上含むペプチドを含み得る。例えば、4-ヒドロキシプロリンをセリンの代わり用いてもよい；また、オルニチンをリジンの代わりに用いてもよい。
【００７０】
全てのアミノ酸残基配列は、本明細書では、左から右への向きがアミノ末端からカルボキシ末端への従来型の方向である式によって表されることに留意されたい。さらに、アミノ酸残基配列の最初または最後のダッシュは、1個以上のアミノ酸残基のさらなる配列へのペプチド結合を示すことに留意されたい。本明細書に記載のアミノ酸は、「L」異性体であることが好ましい。しかしながら、本明細書に記載される所望の機能特性がタンパク質によって保持される限り、「D」異性体の残基をL-アミノ酸残基の代わりに使用することができる。
【００７１】
好ましい腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）またはその類似体は、好ましくは、特異的にまたは優先的にHLA-A*0101に結合する。特定の腫瘍抗原特異的ペプチドもしくは標識ペプチド、またはそれらの類似体が、HLA-A*0101に結合できるかどうか、またはどの程度まで結合できるかを決定することは、例えば以下のような、インビトロアッセイを用いて評価することができる：酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、免疫ブロット法、免疫沈降法、ラジオイムノアッセイ（RIA）、免疫染色法、ラテックス凝集法、間接血球凝集アッセイ（IHA）、補体結合反応、間接免疫蛍光法（FA）、比濁法、フローサイトメトリー法、化学発光法、ラテラルフローイムノアッセイ、u-キャプチャーアッセイ、質量分析法、粒子ベースのアッセイ、阻害アッセイおよび/またはアビディティー（avidity）アッセイ。
【００７２】
D.  腫瘍抗原特異的ペプチドをコードする核酸
いくつかの局面では、本開示は、SEQ ID NO:1に対して少なくとも約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する配列を含む、単離された抗原特異的ペプチドをコードする核酸を提供する；または該ペプチドはSEQ ID NO:1と比較して1、2、3または4つの点変異（例えば、置換変異）を有し得る。上記のように、このような腫瘍抗原特異的ペプチドは、例えば、長さが8〜35アミノ酸、またはそこから導き出される任意の範囲であり得る。いくつかの態様では、腫瘍抗原特異的ペプチドは腫瘍抗原タンパク質（例えば、VGLL1: NP_057351.1）の一部に対応する。用語「核酸」は、DNAおよびRNAを含むことが意図され、二本鎖または一本鎖のいずれかであり得る。
【００７３】
本開示のいくつかの態様は、HLA-A*0101に特異的に結合できる、組換えにより産生された腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）を提供する。したがって、腫瘍抗原特異的ペプチドをコードする核酸は発現ベクターに機能的に連結され得る；そして該ペプチドは分子生物学分野で周知の方法を用いて適切な発現系において産生される。本明細書に開示される腫瘍抗原特異的ペプチドをコードする核酸は、該ペプチドの良好な発現を確実にする任意の発現ベクターに組み込むことができる。可能な発現ベクターとしては、そのベクターが宿主細胞の形質転換に適している限り、コスミド、プラスミド、または改変ウイルス（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
「宿主細胞の形質転換に適している」組換え発現ベクターとは、その発現ベクターが本開示の核酸分子と、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択された調節配列とを含み、そのような調節配列が該核酸分子に機能的に連結されている、ことを意味する。用語「機能的に連結された」または「機能するように連結された」は、交換可能に使用され、核酸がその核酸の発現を可能にする方法で調節配列に連結されることを意味するものとする。
【００７５】
したがって、本開示は、腫瘍抗原特異的ペプチドをコードする核酸と、挿入されたタンパク質配列の転写および翻訳に必要な調節配列とを含む、組換え発現ベクターを提供する。適切な調節配列は、細菌、真菌、またはウイルスの遺伝子を含めて、様々な供給源に由来し得る（例えば、Goeddel (1990)に記載される調節配列を参照のこと）。
【００７６】
適切な調節配列の選択は、一般に、選択された宿主細胞に依存しており、当業者が容易に行うことができる。そのような調節配列の例には、転写プロモーターおよびエンハンサーまたはRNAポリメラーゼ結合配列、リボソーム結合配列、例えば翻訳開始シグナル、が含まれる。さらに、選択した宿主細胞および使用するベクターに応じて、複製起点、追加のDNA制限部位、エンハンサー、および転写誘導性を付与する配列などの、他の配列を発現ベクターに組み込むこともできる。また、必要な調節配列は天然タンパク質および/またはその隣接領域によって供給され得ることも理解されよう。
【００７７】
組換え発現ベクターはまた、本明細書に開示された組換え腫瘍抗原特異的ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞の選択を容易にする選択マーカー遺伝子を含み得る。選択マーカー遺伝子の例は、G418およびハイグロマイシンなどの、特定の薬物に対する耐性を付与するタンパク質、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子である。選択マーカー遺伝子の転写は、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、またはホタルルシフェラーゼなどの選択マーカータンパク質の濃度変化によってモニターされる。選択マーカー遺伝子がネオマイシン耐性などの抗生物質耐性を付与するタンパク質をコードする場合には、G418を用いて形質転換細胞を選択することができる。選択マーカー遺伝子を組み込んでいる細胞は生存するが、他の細胞は死滅する。これによって、組換え発現ベクターの発現を可視化して、その発現をアッセイすること、特に、変異が発現および表現型に及ぼす影響を調べることが、可能になる。選択マーカーは、関心対象の核酸とは別のベクターに導入され得ることが理解されよう。
【００７８】
組換え発現ベクターを宿主細胞に導入して、形質転換宿主細胞を作製することができる。用語「形質転換宿主細胞」は、本開示の組換え発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされている原核細胞および真核細胞を含むことが意図される。「で形質転換された」、「でトランスフェクトされた」、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、当技術分野において公知の多くの可能な技術のうちの1つによる細胞への核酸（例えば、ベクター）の導入を包含するものである。適切な宿主細胞には、多種多様な原核および真核宿主細胞が含まれる。例えば、本開示のタンパク質は、大腸菌（E. coli）などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルスを使用）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現させることができる。
【００７９】
本開示の核酸分子はまた、標準的な技術を用いて化学的に合成され得る。ポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成する様々な方法が知られており、これには、ペプチド合成と同様に、市販のDNA合成機で完全自動化された固相合成が含まれる（例えば、米国特許第4,598,049号；第4,458,066号；第4,401,796号；および第4,373,071号参照）。
【００８０】
III.  養子T細胞療法
本開示の特定の態様は、T細胞を取得して、それを対象にがん細胞を標的とするための免疫療法として投与することに関する。特に、T細胞は抗原特異的T細胞（例えば、VGLL1特異的T細胞）である。機能的な抗腫瘍エフェクターT細胞の誘導、活性化および増殖のためのいくつかの基本的なアプローチがこの20年の間に記載されてきた。これらには以下が含まれる：自己細胞、例えば腫瘍浸潤リンパ球（TIL）；自己由来のDC、リンパ球、人工抗原提示細胞（APC）、またはT細胞リガンドと活性化抗体をコーティングしたビーズ、または標的細胞膜の捕捉によって分離された細胞を用いて、エクスビボで活性化されたT細胞；抗宿主腫瘍T細胞受容体（TCR）を天然に発現する同種細胞；ならびに「Tボディ」として知られる、抗体様の腫瘍認識能力を示す腫瘍反応性TCRまたはキメラTCR分子を発現するように遺伝的に再プログラム化または「リダイレクト」（redirected）された非腫瘍特異的自己または同種細胞。これらのアプローチは、本明細書に記載の方法において使用できるT細胞調製および免疫化のための多数のプロトコルをもたらした。
【００８１】
A.  T細胞調製
いくつかの態様では、T細胞は血液、骨髄、リンパ、またはリンパ系器官に由来する。いくつかの局面において、該細胞はヒト細胞である。該細胞は、典型的には、対象から直接分離されたもの、および/または対象から分離されて凍結されたものなどの、初代細胞である。いくつかの態様では、該細胞は、T細胞の1つ以上のサブセットまたは他の細胞タイプ、例えば、全T細胞集団、CD4＋細胞、CD8＋細胞、およびそれらのサブ集団、例えば、機能、活性化状態、成熟度、分化の可能性、増殖、再循環、局在性、持続能力、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の器官もしくは区画内での存在、マーカーもしくはサイトカインの分泌プロファイル、および/または分化の程度によって特定されたものを含む。治療される対象に関して、該細胞は同種異系および/または自己由来であり得る。いくつかの局面において、例えば容易に手に入る技術では、該細胞は多能性および/または多分化能性であり、例えば、人工多能性幹細胞（iPSC）などの幹細胞である。いくつかの態様では、その方法は、対象から細胞を分離し、それらを調製し、処理し、培養し、かつ/または本明細書に記載されるように遺伝子操作し、そして凍結保存の前または後に同じ患者にそれらを再導入することを含む。
【００８２】
T細胞のサブタイプおよびサブ集団（例えば、CD4＋および/またはCD8＋ T細胞）の中には以下の細胞がある：ナイーブT（TN）細胞、エフェクターT細胞（TEFF）、メモリーT細胞およびそれらのサブタイプ、例えば幹細胞メモリーT（TSCM）、セントラルメモリーT（TCM）、エフェクターメモリーT（TEM）、もしくは最終分化したエフェクターメモリーT細胞、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、未熟T細胞、成熟T細胞、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、粘膜関連インバリアントT（MAIT）細胞、天然型および適応型の制御性T（Treg）細胞、ヘルパーT細胞、例えば、TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾胞性ヘルパーT細胞、アルファ/ベータT細胞、およびデルタ/ガンマT細胞。
【００８３】
いくつかの態様では、T細胞集団の1つ以上は、表面マーカーなどの特定のマーカーに対して陽性であるか、または特定のマーカーに対して陰性である細胞について濃縮されるか、または枯渇される。ある場合には、そのようなマーカーは、特定のT細胞集団（例えば、非メモリー細胞）には存在しないかまたは比較的低いレベルで発現されるが、他の特定のT細胞集団（例えば、メモリー細胞）には存在するかまたは比較的高いレベルで発現されるものである。
【００８４】
いくつかの態様では、T細胞は、B細胞、単球または他の白血球などの非T細胞上に発現されるマーカー、例えばCD14、の陰性選択によってPBMCサンプルから分離される。いくつかの局面では、CD4＋またはCD8＋選択過程は、CD4＋ヘルパーT細胞とCD8＋細胞傷害性T細胞を分離するために使用される。そのようなCD4＋およびCD8＋集団は、1つ以上のナイーブ、メモリーおよび/またはエフェクターT細胞サブ集団に発現されるかまたは比較的高度に発現されるマーカーについての陽性または陰性選択によって、下位集団にさらに分類することができる。
【００８５】
いくつかの態様では、CD8＋ T細胞は、ナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリー、および/またはセントラルメモリー幹細胞について、例えばそれぞれのサブ集団に関連する表面抗原に基づく陽性または陰性選択によって、さらに濃縮されるか、または枯渇される。いくつかの態様では、セントラルメモリーT（TCM）細胞の濃縮は、有効性を高めるために、例えば、投与後の長期生存、増殖および/または生着（いくつかの局面では、そのようなサブ集団において特に安定している）を改善するために、行われる。Terakura et al. (2012) Blood. 1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701参照。
【００８６】
いくつかの態様では、T細胞は自己T細胞である。この方法では、腫瘍サンプルを患者から採取して、単細胞懸濁液を得る。単細胞懸濁液は任意の適切な方法で得られ、例えば、機械的（例えばgentleMACS（商標）Dissociator (Miltenyi Biotec社, Auburn, Calif.)を用いて、腫瘍を解離させる）または酵素的（例えば、コラゲナーゼまたはDNase）に得ることができる。腫瘍酵素消化物の単細胞懸濁液はインターロイキン-2（IL-2）中で培養される。該細胞をコンフルエントになるまで（例えば、約2×106個のリンパ球）、例えば約5〜約21日、好ましくは約10〜約14日培養する。例えば、該細胞を5日、5.5日または5.8日から21日、21.5日または21.8日まで、例えば、10日、10.5日または10.8日から14日、14.5日または14.8日まで、培養することができる。
【００８７】
培養したT細胞をプールして、急速に増殖させることができる。急速な増殖は、約10〜約14日間で少なくとも約50倍（例えば、50、60、70、80、90、100倍、またはそれ以上）の抗原特異的T細胞数の増加をもたらす。より好ましくは、急速な増殖は、約10〜約14日間で少なくとも約200倍（例えば、200、300、400、500、600、700、800、900倍、またはそれ以上）の増加をもたらす。
【００８８】
増殖は、当技術分野で知られるように、多くの方法のいずれかによって達成することができる。例えば、T細胞は、フィーダーリンパ球とインターロイキン-2（IL-2）またはインターロイキン-15（IL-15）のいずれかの存在下に（IL-2が好ましい）、非特異的T細胞受容体刺激を用いて、急速に増殖させることができる。非特異的T細胞受容体刺激は、マウスモノクローナル抗CD3抗体である、約30ng/mlのOKT3（Ortho-McNeil（登録商標）社, Raritan, NJから入手可能）を含み得る。あるいは、T細胞は、任意でベクターから発現され得る、がんの1つ以上の抗原（その抗原性部分、例えばエピトープ、または細胞を含む）、例えばヒト白血球抗原A1（HLA-A1）結合ペプチドを用いて、300IU/mlのIL-2またはIL-15などのT細胞増殖因子の存在下に（IL-2が好ましい）、末梢血単核細胞（PBMC）をインビトロで刺激することによって、急速に増殖させることができる。インビトロで誘導されたT細胞は、HLA-A1を発現する抗原提示細胞にパルスされた同じがん抗原（複数可）を用いて再刺激することによって急速に増殖される。あるいは、T細胞は、例えば、照射した自己リンパ球を用いて、または照射したHLA-A1+ 同種リンパ球とIL-2を用いて、再刺激することができる。
【００８９】
自己T細胞は、自己T細胞の増殖および活性化を促進するT細胞増殖因子を発現するように改変され得る。適切なT細胞増殖因子としては、例えば、インターロイキン（IL）-2、IL-7、IL-15、およびIL-12が挙げられる。適切な改変方法は当技術分野で公知である。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001；およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994を参照されたい。特定の局面では、改変型自己T細胞はT細胞増殖因子を高レベルで発現する。T細胞増殖因子のコード配列、例えばIL-12のコード配列は、当技術分野で容易に入手可能であり、プロモーターも同様である；T細胞増殖因子コード配列へのプロモーターの機能的な連結は高レベルの発現を促進する。
【００９０】
B.  遺伝子改変された抗原受容体
T細胞は、改変されたTCRおよび/またはCARなどの抗原受容体を発現するように遺伝子操作され得る。例えば、自己T細胞はがん抗原に対する抗原特異性を有するTCRを発現するように改変される。特定の態様では、その抗原受容体はVGLL1に対する抗原特異性を有する。適切な改変方法は当技術分野で公知である。例えば、SambrookおよびAusubelを参照されたい。例えば、Heemskerk et al. Hum Gene Ther. 19:496-510 (2008)およびJohnson et al. Blood 114:535-46 (2009)に記載される形質導入技術を用いて、T細胞に、がん抗原に対する抗原特異性を有するT細胞受容体（TCR）を発現するように形質導入することができる。
【００９１】
いくつかの態様では、T細胞は、遺伝子操作によって導入された、1つ以上の抗原受容体をコードする1つ以上の核酸、およびそのような核酸の遺伝子改変産物を含む。いくつかの態様では、該核酸は、異種であり、すなわち、細胞内またはその細胞から得られるサンプル中には通常存在せず、例えば別の生物または細胞から得られるものである；該核酸は、例えば、遺伝子操作される細胞および/またはそのような細胞の起源となる生物には通常見いだされない。いくつかの態様では、該核酸は天然には存在せず、例えば、自然界に見られない核酸（例えば、キメラ）である。
【００９２】
いくつかの態様では、CARは抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインを含む。いくつかの態様では、該抗原は細胞の表面に発現されるタンパク質である。いくつかの態様では、CARはTCR様CARであり、該抗原はプロセシングされたペプチド抗原、例えば細胞内タンパク質のペプチド抗原であって、TCRのように、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子との関連で細胞表面上で認識される。
【００９３】
CARおよび組換えTCRを含めた例示的な抗原受容体、ならびに該受容体を遺伝子操作してそれを細胞内に導入するための方法は、例えば、以下に記載される方法がある：国際特許出願公開番号WO200014257；WO2013126726；WO2012/129514；WO2014031687；WO2013/166321；WO2013/071154；WO2013/123061；米国特許出願公開番号US2002131960；US2013287748；US20130149337；米国特許番号6,451,995；7,446,190；8,252,592；8,339,645；8,398,282；7,446,179；6,410,319；7,070,995；7,265,209；7,354,762；7,446,191；8,324,353；8,479,118；および欧州特許出願番号EP2537416；ならびに/またはSadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398；Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338；Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39；Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75に記載される方法。いくつかの局面では、遺伝子改変抗原受容体は、米国特許第7,446,190号に記載のCAR、および国際特許出願公開第WO/2014055668 Al号に記載のものを含む。
【００９４】
1.  キメラ抗原受容体
いくつかの態様では、遺伝子改変された抗原受容体は、CAR、例えば、活性化もしくは刺激性CAR、共刺激性CAR（WO2014/055668参照）、および/または抑制性CAR（iCAR、Fedorov et al., 2013参照）を含む。CARは概して、いくつかの局面ではリンカーおよび/または膜貫通ドメインを介して、1つ以上の細胞内シグナル伝達成分に連結された細胞外抗原（またはリガンド）結合ドメインを含む。そのような分子は、典型的には、天然の抗原受容体を介するシグナル、共刺激受容体と共にそのような受容体を介するシグナル、および/または共刺激受容体のみを介するシグナルを模倣するか、またはそれに近似する。
【００９５】
いくつかの態様では、CARは、例えば、養子療法によって標的とされる特定の細胞型に発現される抗原（例えば、がんマーカー）、および/または抑制応答（dampening response）を誘導することを目的とした抗原（例えば、正常または非疾患細胞型に発現される抗原）などの、特定の抗原（またはマーカーもしくはリガンド）に対する特異性を示すように構築される。したがって、CARは、典型的には、その細胞外部分に、1つ以上の抗原結合分子、例えば、1つ以上の抗原結合フラグメント、ドメイン、もしくは部分、1つ以上の抗体可変ドメイン、および/または抗体分子を含む。いくつかの態様では、CARは、抗体分子の抗原結合部分（複数可）、例えば、モノクローナル抗体（mAb）の可変重鎖（VH）および可変軽鎖（VL）に由来する単鎖抗体フラグメント（scFv）を含む。
【００９６】
いくつかの局面では、抗原特異的な結合成分または認識成分は、1つ以上の膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。いくつかの態様では、CARは、CARの細胞外ドメインに融合された膜貫通ドメインを含む。一態様では、CAR内のドメインの1つと天然で会合している膜貫通ドメインが使用される。場合によっては、膜貫通ドメインは、そのようなドメインが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合するのを回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるように選択されるか、またはアミノ酸置換によって改変される。
【００９７】
いくつかの態様における膜貫通ドメインは、天然の供給源または合成の供給源のいずれかに由来する。その供給源が天然である場合、いくつかの局面における該ドメインは、任意の膜結合型または膜貫通型タンパク質に由来する。膜貫通領域は、T細胞受容体のα鎖、β鎖またはζ鎖、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154に由来するものを含む（すなわち、少なくともその膜貫通領域（複数可）を含む）。あるいは、いくつかの態様における膜貫通ドメインは合成である。いくつかの局面では、合成の膜貫通ドメインは、主にロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含む。いくつかの局面では、フェニルアラニンとトリプトファンとバリンのトリプレットが合成の膜貫通ドメインの各末端に見出されるであろう。
【００９８】
CARは概して、少なくとも1つの細胞内シグナル伝達成分を含む。いくつかの態様では、CARは、T細胞の活性化および細胞傷害性を媒介するTCR CD3＋鎖などのTCR複合体の細胞内成分、例えばCD3ζ鎖を含む。したがって、いくつかの局面では、抗原結合分子は1つ以上の細胞シグナル伝達モジュールに連結される。いくつかの態様では、細胞シグナル伝達モジュールは、CD3膜貫通ドメイン、CD3細胞内シグナル伝達ドメイン、および/または他のCD膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様では、CARはさらに、Fc受容体γ、CD8、CD4、CD25、またはCD16などの、1つ以上のの追加の分子の一部を含む。例えば、いくつかの局面では、CARはCD3-ζ、CD3-QまたはFc受容体γとCD8、CD4、CD25またはCD16の間のキメラ分子を含む。
【００９９】
2.  T細胞受容体（TCR）
いくつかの態様では、遺伝子改変された抗原受容体は、組換えTCRおよび/または天然に存在するT細胞からクローン化されたTCRを含む。「T細胞受容体」または「TCR」は、可変α鎖およびβ鎖（それぞれTCRαおよびTCRpとしても知られる）または可変γ鎖およびδ鎖（それぞれTCRyおよびTCR5としても知られる）を含み、かつMHC受容体に結合した抗原ペプチドに特異的に結合することができる分子を指す。いくつかの態様では、TCRはαβ型である。典型的には、αβ型およびγδ型で存在するTCRは構造がほぼ類似しているが、それらを発現するT細胞は異なる解剖学的部位または機能を有し得る。TCRは細胞の表面上に、または可溶性形態で見出すことができる。一般的に、TCRはT細胞（またはTリンパ球）の表面上に見出され、そこで、それは一般に主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子に結合した抗原を認識することに関与している。いくつかの態様では、TCRはまた、定常ドメイン、膜貫通ドメインおよび/または短い細胞質尾部を含むこともできる（例えば、Janeway et al, 1997参照）。例えば、いくつかの局面では、TCRの各鎖は、1つのN末端免疫グロブリン可変ドメイン、1つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびC末端の短い細胞質尾部を保有し得る。いくつかの態様では、TCRはシグナル伝達を媒介することに関与しているCD3複合体の不変タンパク質と会合される。特に明記しない限り、用語「TCR」はその機能的なTCR断片を包含することが理解されよう。この用語はまた、αβ型またはγδ型のTCRを含めて、インタクトまたは全長のTCRを包含する。
【０１００】
したがって、本明細書において、TCRへの言及は、任意のTCRまたは機能的な断片、例えば、MHC分子に結合した特定の抗原性ペプチド、すなわちMHC-ペプチド複合体、に結合するTCRの抗原結合部分を含む。TCRの「抗原結合部分」または「抗原結合断片」は、交換可能に使用することができ、TCRの構造ドメインの一部を含み、それでも全長TCRが結合する抗原（例えば、MHC-ペプチド複合体）に結合する分子を指す。場合によっては、抗原結合部分は、特定のMHC-ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するのに十分な、TCRの可変α鎖と可変β鎖などの、TCRの可変ドメインを含む（例えば、その場合、一般的に各鎖は3つの相補性決定領域を含む）。
【０１０１】
いくつかの態様では、TCR鎖の可変ドメインは会合してループを形成するか、または免疫グロブリンに類似した相補性決定領域（CDR）を形成し、これは、抗原認識をもたらし、かつTCR分子の結合部位を形成することによってペプチド特異性を決定する。典型的には、免疫グロブリンのように、CDRはフレームワーク領域（FR）によって分離されている（例えば、Chothia et al., 1988参照）。いくつかの態様では、CDR3はプロセシングされた抗原の認識に関与する主なCDRであるが、α鎖のCDR1も抗原性ペプチドのN末端部分と相互作用することが示されており、一方β鎖のCDR1は該ペプチドのC末端部分と相互作用する。CDR2はMHC分子を認識すると考えられている。いくつかの態様では、β鎖の可変領域はさらなる超可変性（HV4）領域を含み得る。
【０１０２】
いくつかの態様では、TCR鎖は定常ドメインを含む。例えば、免疫グロブリンのように、TCR鎖（例えば、α鎖、β鎖）の細胞外部分は、2つの免疫グロブリンドメインである、N末端の可変ドメイン（例えば、VaまたはVp；典型的にはKabatナンバリング（Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 第5版）に基づいてアミノ酸1-116）、および細胞膜に隣接する1つの定常ドメイン（例えば、α鎖定常ドメインまたはCa、典型的にはKabatに基づいてアミノ酸117-259、β鎖定常ドメインまたはCp、典型的にはKabatに基づいてアミノ酸117-259）を含み得る。例えば、場合によっては、2本の鎖によって形成されたTCRの細胞外部分は、2つの膜近位定常ドメインおよび2つのCDR含有膜遠位可変ドメインを含む。TCRドメインの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成して2本の鎖の間に連結を形成する短い連結配列を含む。いくつかの態様では、TCRが定常ドメイン中に2つのジスルフィド結合を含むように、TCRはα鎖とβ鎖のそれぞれに追加のシステイン残基を有し得る。
【０１０３】
いくつかの態様では、TCR鎖は膜貫通ドメインを含み得る。いくつかの態様では、膜貫通ドメインは正に帯電している。場合によっては、TCR鎖は細胞質尾部を含む。いくつかの場合には、その構造はTCRがCD3のような他の分子と会合することを可能にする。例えば、膜貫通領域と共に定常ドメインを含むTCRは、そのタンパク質を細胞膜につなぎとめて、CD3シグナル伝達装置または複合体の不変サブユニットと会合することができる。
【０１０４】
一般に、CD3は、哺乳動物では3つの異なる鎖（γ、δ、およびε）およびζ鎖を保有することができる多タンパク質複合体である。例えば、哺乳動物では、この複合体は1本のCD3γ鎖、1本のCD3δ鎖、2本のCD3ε鎖、およびCD3ζ鎖のホモ二量体を含み得る。CD3γ、CD3δ、およびCD3ε鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連した細胞表面タンパク質である。CD3γ、CD3δ、およびCD3ε鎖の膜貫通領域は負に帯電しており、この特性によって、これらの鎖は正に帯電したT細胞受容体鎖と会合することが可能である。CD3γ、CD3δ、およびCD3ε鎖の細胞内尾部は、それぞれ、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）またはITAMとして知られる単一の保存モチーフを含むが、各CD3ζ鎖にはITAMが3つ存在する。一般に、ITAMはTCR複合体のシグナル伝達能力に関与している。これらのアクセサリー分子は、負に帯電した膜貫通領域を有しており、TCRから細胞にシグナルを伝える役割を果たしている。CD3鎖およびζ鎖は、TCRと一緒になって、T細胞受容体複合体として知られるものを形成する。
【０１０５】
いくつかの態様では、TCRは、2本の鎖αおよびβ（または任意でγおよびδ）のヘテロ二量体であり得るか、または単鎖TCR構築物であり得る。いくつかの態様では、TCRは、1つまたは複数のジスルフィド結合などによって連結された、2本の別々の鎖（α鎖とβ鎖またはγ鎖とδ鎖）を含むヘテロ二量体である。いくつかの態様では、標的抗原（例えば、がん抗原）に対するTCRが同定されて、細胞に導入される。いくつかの態様では、TCRをコードする核酸は、例えば、公表されているTCR DNA配列のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅によって、様々な供給源から得ることができる。いくつかの態様では、TCRは、生物学的供給源から、例えば、T細胞（例：細胞傷害性T細胞）のような細胞、T細胞ハイブリドーマまたは他の公的に入手可能な供給源から得られる。いくつかの態様では、T細胞はインビボ分離された細胞から得ることができる。いくつかの態様では、高親和性T細胞クローンを患者から分離して、TCRを分離することができる。いくつかの態様では、T細胞は培養したT細胞ハイブリドーマまたはクローンであり得る。いくつかの態様では、標的抗原に対するTCRクローンは、ヒト免疫系遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原系、つまりHLA）により操作されたトランスジェニックマウスにおいて作製されている。例えば、腫瘍抗原を参照されたい（例えば、Parkhurst et al., 2009およびCohen et al., 2005参照）。いくつかの態様では、標的抗原に対するTCRを単離するために、ファージディスプレイが使用される（例えば、Varela-Rohena et al., 2008およびLi, 2005参照）。いくつかの態様では、TCRまたはその抗原結合部分は、TCRの配列の知識から合成的に得ることができる。
【０１０６】
3.  抗原提示細胞
マクロファージ、Bリンパ球および樹状細胞を含む抗原提示細胞は、特定のMHC分子のその発現によって区別される。APCは抗原を内在化して、その抗原の一部をMHC分子と共にその細胞外膜上に再発現する。主要組織適合遺伝子複合体（MHC）は、複数の座位を有する大きな遺伝子複合体である。MHC座位は、クラスI MHCおよびクラスII MHCと呼ばれる、2つの主要なクラスのMHC膜分子をコードする。Tヘルパーリンパ球は一般にMHCクラスII分子と会合した抗原を認識し、そしてT細胞傷害性リンパ球はMHCクラスI分子と会合した抗原を認識する。ヒトではMHCはHLA複合体と呼ばれ、マウスではH-2複合体と呼ばれる。
【０１０７】
いくつかの場合には、aAPCは、前記態様の治療用組成物および細胞療法製品を調製するのに有用である。抗原提示システムの調製および使用に関する一般的なガイドラインとしては、例えば、米国特許第6,225,042号、第6,355,479号、第6,362,001号および第6,790,662号；米国特許出願公開第2009/0017000号および第2009/0004142号；ならびに国際公開番号WO2007/103009を参照されたい。
【０１０８】
aAPCシステムは、少なくとも1つの外因性補助分子を含み得る。適切であれば、どのような数および組み合わせの補助分子を使用してもよい。補助分子は、共刺激分子および接着分子などの補助分子から選択することができる。例示的な共刺激分子には、CD86、CD64（FcγRI）、41BBリガンド、およびIL-21が含まれる。接着分子には、セレクチンのような炭水化物結合糖タンパク質、インテグリンのような膜貫通結合糖タンパク質、カドヘリンのようなカルシウム依存性タンパク質、ならびに、例えば細胞と細胞または細胞と基質の接触を促進する、細胞間接着分子（ICAM）のような、1回膜貫通免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリータンパク質が含まれる。例示的な接着分子としては、LFA-3およびICAM、例えばICAM-1がある。共刺激分子および接着分子を含めて、例示的な補助分子の選択、クローニング、調製、および発現に有用な技術、方法、および試薬は、例えば、米国特許第6,225,042号、第6,355,479号、および第6,362,001号に例示されている。
【０１０９】
IV.  治療方法
さらに本明細書では、個体に有効量の抗原特異的T細胞療法、例えばVGLL1特異的T細胞療法を施すことを含む、該個体におけるがんを治療するかまたはその進行を遅らせるための方法が提供される。遺伝子改変TCRを形質導入されたT細胞（他の生体反応性タンパク質（例：抗CD3）へのコンジュゲートTCR）を用いた養子T細胞療法もまた本明細書に提供される。さらなる態様では、精製した腫瘍抗原または免疫優性腫瘍抗原特異的ペプチドで対象を免疫することを含む、がんの治療方法が提供される。
【０１１０】
治療が考えられるがんの例には、以下が含まれる：肺がん、頭頸部がん、乳がん、膵臓がん、前立腺がん、腎臓がん、骨がん、精巣がん、子宮頸がん、胃腸がん、リンパ腫、肺の前腫瘍性病変、大腸がん、メラノーマ、および膀胱がん。さらなる例示的ながんとしては、限定するものではないが、以下が挙げられる：肺がん、頭頸部がん、乳がん、膵臓がん、前立腺がん、腎臓がん、骨がん、精巣がん、子宮頸がん、胃腸がん、リンパ腫、肺の前腫瘍性病変、大腸がん、メラノーマ、および膀胱がん。がんのさらなる例には、以下が含まれる：メラノーマ、悪性メラノーマ、大腸がん、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、腎臓がん、胃腸腫瘍、神経膠腫、前立腺腫瘍、膀胱がん、直腸腫瘍、胃がん、食道がん、膵臓がん、肝臓がん、乳がん、子宮がん、子宮頸がん、急性骨髄性白血病（AML）、急性リンパ性白血病（ALL）、慢性骨髄性白血病（CML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、白血病、肝がん、種々のウイルス誘発腫瘍、例えば、パピローマウイルス誘発がん（例：子宮頸がん）、腺がん、ヘルペスウイルス誘発腫瘍（例：バーキットリンパ腫、EBV誘発B細胞リンパ腫）、B型肝炎誘発腫瘍（肝細胞がん）、HTLV-1およびHTLV-2誘発リンパ腫、聴神経腫、肺がん、小細胞肺がん、咽頭がん、肛門がん、膠芽腫、直腸がん、星状細胞腫、脳腫瘍、網膜芽細胞腫、基底細胞腫、転移性脳腫瘍、髄芽腫、膣がん、膵臓がん、精巣がん、ホジキン症候群、髄膜腫、シュネーベルガー病（Schneeberger disease）、下垂体腫瘍、菌状息肉腫、カルチノイド、神経鞘腫、脊髄腫、バーキットリンパ腫、喉頭がん、腎臓がん、胸腺腫、子宮体がん、骨がん、非ホジキンリンパ腫、尿道がん、CUP症候群、頭頸部腫瘍、乏突起膠腫、外陰がん、腸管がん、結腸がん、食道がん、いぼ病変（wart involvement）、小腸の腫瘍、頭蓋咽頭腫、卵巣がん、生殖器の腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、子宮内膜がん、肝転移、陰茎がん、舌がん、胆嚢がん、白血病、形質細胞腫、眼瞼腫瘍、および前立腺がん。
【０１１１】
いくつかの態様では、T細胞は自己由来である。しかしながら、該細胞は同種異系であってもよい。いくつかの態様では、T細胞は患者自身から分離され、それゆえに該細胞は自己由来である。T細胞が同種異系である場合には、T細胞を複数のドナーからプールすることができる。該細胞は、治療される疾患の症状および徴候を抑制、軽減、または排除するのに十分な量で、対象となる患者に投与される。
【０１１２】
いくつかの態様では、T細胞療法の前に骨髄非破壊的なリンパ球除去化学療法を対象に施すことができる。骨髄非破壊的なリンパ球除去化学療法は、適切な経路で投与することができる、どのような適切な療法であってもよい。骨髄非破壊的なリンパ球除去化学療法は、特にがんが転移性のメラノーマである場合、例えば、シクロホスファミドとフルダラビンの投与を含むことができる。シクロホスファミドとフルダラビンを投与する例示的な経路は静脈内である。同様に、シクロホスファミドとフルダラビンの任意の適切な用量が投与され得る。特定の局面では、約60mg/kgのシクロホスファミドを2日間投与し、その後に約25mg/m2のフルダラビンを5日間投与する。
【０１１３】
ある態様では、自己T細胞の増殖および活性化を促進するT細胞増殖因子が、自己T細胞と同時に、または自己T細胞に続いて、対象に投与される。T細胞増殖因子は、自己T細胞の増殖および活性化を促進する、どのような適切な増殖因子であってもよい。適切なT細胞増殖因子の例には、インターロイキン(IL)-2、IL-7、IL-15、およびIL-12が含まれ、これらは単独で、またはIL-2とIL-7、IL-2とIL-15、IL-7とIL-15、IL-2とIL-7とIL-15、IL-12とIL-7、IL-12とIL-15、IL-12とIL-2などの様々な組み合わせで使用することができる。IL-12が好ましいT細胞増殖因子である。
【０１１４】
T細胞は、静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口、経皮、腹腔内、眼窩内に、移植によって、吸入によって、髄腔内、脳室内、または鼻腔内に投与することができる。T細胞療法の適切な投与量は、治療される疾患の種類、疾患の重症度および経過、個体の臨床状態、個体の病歴および治療への応答、ならびに主治医の裁量に基づいて決定され得る。
【０１１５】
腫瘍内注入または腫瘍血管系への注入は、接近可能な孤立型の固形腫瘍に対して特に企図される。局所的、部位的または全身的投与も適切であり得る。4cmを超える腫瘍の場合、投与される量は約4〜10ml（特に10ml）であり、4cm未満の腫瘍の場合は約1〜3ml（特に3ml）の量が使用される。単回投与として送達される頻回注入は、約0.1〜約0.5mlの量を含む。
【０１１６】
A.  薬学的組成物
本明細書では、抗原特異的T細胞療法および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物ならびに製剤も提供される。対象への薬学的使用のためのワクチン組成物は、本明細書に開示される腫瘍抗原ペプチド（例えば、VGLL1）組成物および薬学的に許容される担体を含み得る。
【０１１７】
本明細書に記載の薬学的組成物および製剤は、望ましい純度を有する活性成分（例えば、抗体またはポリペプチド）を1種以上の任意の薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences 第22版, 2012）と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製され得る。薬学的に許容される担体は、一般に、採用される投与量および濃度でレシピエントに無毒であり、限定するものではないが、以下を含む：緩衝剤、例えば、リン酸、クエン酸、その他の有機酸；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸、メチオニン；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノール、およびm-クレゾール）；低分子量（約10残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン；単糖類、二糖類、および他の多糖類、例えば、グルコース、マンノース、デキストリン；キレート剤、例えばEDTA；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えばZn-タンパク質錯体）；および/または非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（PEG）。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体には、さらに、間質薬物分散剤、例えば、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（sHASEGP）、例えば、rHuPH20（HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.）などのヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質が含まれる。rHuPH20をはじめとする、いくつかの例示的なsHASEGPおよび使用方法は、米国特許公開第2005/0260186号および第2006/0104968号に記載されている。一局面では、sHASEGPは、1種以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと組み合わされる。
【０１１８】
B.  併用療法
特定の態様では、本態様の組成物および方法は、少なくとも1つの追加の療法と組み合わせた抗原ペプチドまたは抗原特異的T細胞集団を含む。追加の療法は、放射線療法、外科手術（例えば、乳腺腫瘤摘出術および乳房切除術）、化学療法、遺伝子治療、DNA療法、ウイルス療法、RNA療法、免疫療法、骨髄移植、ナノ治療（nanotherapy）、モノクローナル抗体療法、またはこれらの組み合わせであり得る。追加の療法は補助療法または術前補助療法の形をとることができる。
【０１１９】
ある態様では、追加の療法は小分子酵素阻害剤または抗転移剤の投与である。ある態様では、追加の療法は副作用制限剤（例えば、治療の副作用の発生および/または重症度を軽減することを目的とした薬剤、例えば制吐剤など）の投与である。ある態様では、追加の療法は放射線療法である。ある態様では、追加の療法は外科手術である。ある態様では、追加の療法は放射線療法と外科手術の組み合わせである。ある態様では、追加の療法はガンマ線照射である。ある態様では、追加の療法は、PBK/AKT/mTOR経路を標的とする療法、HSP90阻害剤、チューブリン阻害剤、アポトーシス阻害剤、および/または化学予防剤である。追加の療法は、当技術分野で公知の化学療法剤の1つ以上であり得る。
【０１２０】
T細胞療法は、免疫チェックポイント療法などの追加のがん療法に対して、その前、その間、その後に、または様々な組み合わせで投与することができる。そうした投与は、同時から数分、数日、数週間までの範囲の間隔であり得る。T細胞療法が追加の治療薬とは別に患者に提供される態様では、一般に、2つの化合物が依然として患者に有利な複合効果を発揮することができるように、各送達時間の間に有効期限切れにならないことを確認する必要があろう。そのような場合、抗体療法と抗がん療法を互いに約12〜24または72時間以内、特に互いに約6〜12時間以内に、患者に提供することが考えられる。いくつかの状況では、それぞれの投与の間に数日（2、3、4、5、6または7日）から数週間（1、2、3、4、5、6、7または8週）が経過する場合、治療期間を大幅に延長することが望ましい場合もある。
【０１２１】
様々な組み合わせを採用することができる。以下の例では、抗原ペプチドまたは抗原特異的T細胞療法が「A」であり、抗がん療法が「B」である：
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【０１２２】
本態様の任意の化合物または療法の患者への投与は、薬剤の、もしあれば、毒性を考慮に入れて、そのような化合物を投与するための一般的なプロトコルに従うであろう。したがって、いくつかの態様では、併用療法に起因する毒性をモニタリングする段階が存在する。
【０１２３】
1.  化学療法
本態様に従って、多種多様な化学療法剤を使用することができる。用語「化学療法」は、がんを治療するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、がんの治療において投与される化合物または組成物を意味するために使用される。これらの薬剤または薬物は、細胞内でのそれらの活性の様式、例えばそれらが細胞周期に影響を与えるかどうか、またどの段階で影響を与えるか、によって分類される。あるいは、薬剤は、DNAを直接架橋する能力、DNAにインターカレートする能力、または核酸合成に影響を及ぼすことによって染色体および有糸分裂の異常を誘発する能力に基づいて、特徴付けることができる。
【０１２４】
化学療法剤の例としては、以下が挙げられる：アルキル化剤、例えば、チオテパ、シクロホスファミド；アルキルスルホネート類、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン；アジリジン類、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、ウレドーパ；エチレンイミン類およびメチルメラミン類、例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、トリメチロールメラミン；アセトゲニン類（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；CC-1065（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン類（特にクリプトフィシン1およびクリプトフィシン8）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、KW-2189およびCB1-TM1を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア類、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えばエンジイン系抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマlIおよびカリケアマイシンオメガI1）；ダイネミシン、例えばダイネミシンA；ビスホスホネート類、例えばクロドロネート；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン類、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン類、例えばマイトマイシンC、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン類、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、ケラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、およびゾルビシン；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサート、5-フルオロウラシル（5-FU）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン類、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピ���オスタン、テストラクトン；抗副腎薬、例えば、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えばフォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート ；デホファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルミチン；酢酸エリプチニウムア；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド類、例えば、メイタンシン、アンサマイトシン類；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（mopidanmol）；ニトラエリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；2,2',2”-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（特にT-2トキシン、ベラクリンA、ロリジンAおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；タキソイド類、例えばパクリタキセルおよびドセタキセルゲムシタビン；6-チオグアニン；メルカプトプリン；白金配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（VP-16）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例：CPT-11）；トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000；ジフルオロメチルオルニチン（DMFO）；レチノイド類、例えばレチノイン酸；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス-白金、および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体。
【０１２５】
2.  放射線療法
DNA損傷を引き起こしかつ広く使用されてきた他の要因には、γ線、X線、および/または腫瘍細胞への放射性同位体の定方向送達として一般に知られているものが含まれる。DNA損傷因子の他の形態も考えられ、例えば、マイクロ波、陽子線照射（米国特許第5,760,395号および第4,870,287号）、およびUV照射などである。これらの要因の全ては、DNA、DNAの前駆体、DNAの複製と修復、および染色体の組み立てと維持に広範囲の損傷を与える可能性がきわめて高い。X線の線量範囲は、長期間（3〜4週間）にわたる50〜200レントゲンの1日線量から2000〜6000レントゲンの単回線量までの範囲である。放射性同位体の線量範囲は大きく異なり、同位体の半減期、放出される放射線の強度と種類、および腫瘍性細胞による取り込みに依存する。
【０１２６】
3.  免疫療法
当業者であれば、追加の免疫療法を前記態様の方法と組み合わせてまたは併せて使用できることを理解するであろう。がん治療との関連において、免疫療法は一般に、がん細胞を標的として破壊するための免疫エフェクター細胞と分子の使用に依存している。リツキシマブ（RITUXAN（登録商標））がそのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上の何らかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体は、単独で治療のエフェクターとしての役割を果たすか、または他の細胞を動員して実際に細胞殺傷に影響を及ぼすことができる。また、抗体を薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンA鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）にコンジュゲートして、標的化剤として使用することもできる。あるいは、該エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を担持するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞には細胞傷害性T細胞およびNK細胞が含まれる。
【０１２７】
抗体-薬物コンジュゲートは、がん治療薬の開発への画期的なアプローチとして浮上してきている。がんは世界中で主たる死亡原因の一つである。抗体-薬物コンジュゲート（ADC）は、殺細胞薬に共有結合で連結されたモノクローナル抗体（MAb）を含む。このアプローチは、標的抗原に対するMAbの高い特異性を、非常に強力な細胞毒性薬と組み合わせるものであり、結果的に、標的抗原レベルが豊富な腫瘍細胞にペイロード（薬物）を送達する「武装した」Mabをもたらす。薬物の標的化送達はまた、正常組織へのその曝露を最小限にとどめ、結果として毒性の低下および治療指数の改善をもたらす。FDAによる2011年のアドセトリス（ADCETRIS（登録商標）：ブレンツキシマブベドチン）および2013年のカドサイラ（KADCYLA（登録商標）：トラスツズマブエムタンシンまたはT-DM1）の2種類のADC薬の承認は、このアプローチの正当性を立証した。現在、30種類を上回るADC薬物候補ががん治療のための臨床試験の様々な段階にある（Leal et al., 2014）。抗体工学およびリンカー-ペイロードの最適化がますます成熟してきているので、新しいADCの発見および開発は、このアプローチに適した新しい標的の同定と検証、およびターゲティングMAbの作製への依存が高まっている。ADC標的の2つの基準は、腫瘍細胞におけるアップレギュレートされた/高い発現レベル、および確固たる（robust）インターナリゼーション（内在化）である。
【０１２８】
免疫療法の一局面では、腫瘍細胞は、ターゲティングに適している、すなわち大部分の他の細胞には存在しない、何らかのマーカーを保有しなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在しており、それらのいずれも本態様との関係においてターゲティングに適切であり得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、CD20、がん胎児性抗原、チロシナーゼ（p97）、gp68、TAG-72、HMFG、シアリルルイス（Sialyl Lewis）抗原、MucA、MucB、PLAP、ラミニン受容体、erb B、およびp155が挙げられる。免疫療法の別の局面は、抗がん効果と免疫刺激効果とを組み合わせることである。免疫刺激分子もまた存在しており、例えば、IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFNなどのサイトカイン、MIP-1、MCP-1、IL-8などのケモカイン、およびFLT3リガンドなどの増殖因子が存在する。
【０１２９】
現在研究中であるか、または使用されている免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えば、ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、ジニトロクロロベンゼン、および芳香族化合物（米国特許第5,801,005号および第5,739,169号；Hui and Hashimoto, 1998；Christodoulides et al., 1998）；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β、γ、IL-1、GM-CSF、およびTNF（Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998）；遺伝子治療、例えば、TNF、IL-1、IL-2、およびp53（Qin et al., 1998; Austin-Ward and Villaseca, 1998; 米国特許第5,830,880号および第5,846,945号）；ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗CD20、抗ガングリオシドGM2、および抗p185（Hollander, 2012; Hanibuchi et al., 1998; 米国特許第5,824,311号）である。1つ以上の抗がん療法を本明細書に記載の抗体療法と共に使用することができると考えられる。
【０１３０】
いくつかの態様では、免疫療法は免疫チェックポイント阻害剤であり得る。免疫チェックポイントはシグナル（例えば、共刺激分子）を上げるか、シグナルを下げるかのいずれかである。免疫チェックポイント遮断の標的となり得る抑制性免疫チェックポイントには、以下が含まれる：アデノシンA2A受容体（A2AR）、B7-H3（CD276としても知られる）、BおよびTリンパ球アテニュエーター（BTLA）、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA-4、CD152としても知られる）、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）、キラー細胞免疫グロブリン（KIR）、リンパ球活性化遺伝子3（LAG3）、プログラム細胞死1（PD-1）、T細胞免疫グロブリンドメイン・ムチンドメイン3（TIM-3）、ならびにT細胞活性化のVドメインIgサプレッサー（VISTA）。特に、免疫チェックポイント阻害剤はPD-1軸および/またはCTLA-4を標的とする。
【０１３１】
免疫チェックポイント阻害剤は、小分子のような薬物、組換え型のリガンドもしくは受容体、または特にヒト抗体などの抗体であり得る（例えば、国際特許公開WO2015016718; Pardoll, 2012；両方とも参照により本明細書に組み入れられる）。免疫チェックポイントタンパク質またはその類似体の公知の阻害剤を使用することができ、特にキメラ化、ヒト化またはヒト型抗体が使用される。当業者は理解しているように、本開示で言及される特定の抗体については、代替名および/または同等名が使用されている可能性がある。そのような代替名および/または同等名は、本開示の文脈においては交換可能である。例えば、ランブロリズマブ（lambrolizumab）がMK-3475およびペンブロリズマブ（pembrolizumab）の代替名および同等名でも知られていることは公知である。
【０１３２】
いくつかの態様では、PD-1結合アンタゴニストは、PD-1のそのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の局面において、PD-1リガンド結合パートナーはPDL1および/またはPDL2である。別の態様では、PDL1結合アンタゴニストは、PDL1のその結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の局面において、PDL1結合パートナーはPD-1および/またはB7-1である。別の態様では、PDL2結合アンタゴニストは、PDL2のその結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の局面において、PDL2結合パートナーはPD-1である。該アンタゴニストは、抗体、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドであり得る。例示的な抗体は、米国特許番号US8735553、US8354509、およびUS8008449に記載されており、これらの全てが参照により本明細書に組み入れられる。本明細書に記載の方法において使用するための他のPD-1軸アンタゴニストは、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許出願番号US20140294898、US2014022021、およびUS20110008369に記載されており、これらの全てが参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３３】
いくつかの態様では、PD-1結合アンタゴニストは抗PD-1抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）である。いくつかの態様では、抗PD-1抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびCT-011からなる群より選択される。いくつかの態様では、PD-1結合アンタゴニストはイムノアドヘシン（例えば、定常領域（例：免疫グロブリン配列のFc領域）に融合されたPDL1またはPDL2の細胞外またはPD-1結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの態様では、PD-1結合アンタゴニストはAMP-224である。ニボルマブは、MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558、およびオプジーボ（OPDIVO（登録商標））の別名でも知られており、WO2006/121168に記載される抗PD-1抗体である。ペンブロリズマブは、MK-3475、Merck 3475、ランブロリズマブ、キイトルーダ（KEYTRUDA（登録商標））、およびSCH-900475の別名でも知られており、WO2009/114335に記載される抗PD-1抗体である。CT-011は、hBATまたはhBAT-1の別名でも知られており、WO2009/101611に記載される抗PD-1抗体である。AMP-224は、別名をB7-DCIgといい、WO2010/027827およびWO2011/066342に記載されるPDL2-Fc融合可溶性受容体である。
【０１３４】
本明細書に記載の方法で標的とされ得る別の免疫チェックポイントは、CD152としても知られる、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA-4）である。ヒトCTLA-4の完全なcDNA配列は、Genbankアクセッション番号L15006を有する。CTLA-4はT細胞の表面に存在し、抗原提示細胞の表面上のCD80またはCD86に結合すると「オフ」スイッチとして機能する。CTLA4は、ヘルパーT細胞の表面に発現されて抑制シグナルをT細胞に伝達する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。CTLA4は、T細胞共刺激タンパク質CD28に類似しており、両方の分子は、抗原提示細胞上の、それぞれB7-1およびB7-2とも呼ばれる、CD80およびCD86に結合する。CTLA4は抑制シグナルをT細胞に伝達し、一方CD28は刺激シグナルを伝達する。細胞内CTLA4は制御性T細胞にも見られ、それらの機能にとって重要であり得る。T細胞受容体とCD28を介するT細胞活性化は、B7分子に対する抑制性受容体であるCTLA-4の発現増加をもたらす。
【０１３５】
いくつかの態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗CTLA-4抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。
【０１３６】
本方法で使用するのに適した抗ヒトCTLA-4抗体（またはそれに由来するVHおよび/またはVLドメイン）は、当技術分野で周知の方法を用いて作製することができる。あるいは、当技術分野で承認されている抗CTLA-4抗体を使用することができる。例えば、抗CTLA-4抗体は、US 8,119,129；WO 01/14424；WO 98/42752；WO 00/37504（CP675,206、別名をトレメリムマブという；以前はチシリムマブ）；米国特許第6,207,156号；Hurwitz et al.,1998；Camacho et al., 2004；およびMokyr et al., 1998に開示されており、本明細書に記載の方法において使用することができる。前述の刊行物の各々の教示は、参照により本明細書に組み入れられる。CTLA-4への結合についてこれらの当技術分野で承認されている抗体のいずれかと競合する抗体も使用することができる。例えば、ヒト化CTLA-4抗体は、国際特許出願番号WO2001014424、WO2000037504、および米国特許番号US8017114に記載されており、これらの全てが参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３７】
例示的な抗CTLA-4抗体は、イピリムマブ（10D1、MDX-010、MDX- 101、およびヤーボイ（Yervoy（登録商標））としても知られる）またはその抗原結合フラグメントおよび変異体である（例えば、WO 01/14424参照）。他の態様では、該抗体は、イピリムマブの重鎖および軽鎖のCDRまたはVRを含む。したがって、一態様では、該抗体は、イピリムマブのVH領域のCDR1、CDR2、およびCDR3ドメインと、イピリムマブのVL領域のCDR1、CDR2、およびCDR3ドメインを含む。他の態様では、該抗体は、上述の抗体と結合について競合し、かつ/または上述の抗体と同じCTLA-4のエピトープに結合する。別の態様では、該抗体は、上述の抗体に対して少なくとも約90％の可変領域アミノ酸配列同一性（例えば、イピリムマブに対して少なくとも約90％、95％、または99％の可変領域同一性）を有する。
【０１３８】
CTLA-4をモジュレートするための他の分子には、例えば、米国特許番号US5844905、US5885796、および国際特許出願番号WO1995001994、WO1998042752（全て参照により本明細書に組み入れられる）に記載されるようなCTLA-4リガンドおよび受容体、ならびに米国特許番号US8329867（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されるようなイムノアドヘシンが含まれる。
【０１３９】
4.  外科手術
がん患者の約60％は、予防的、診断的または病期分類的、根治的、および緩和的手術を含む何らかのタイプの手術を受けている。根治目的の手術は、がん性組織の全部または一部を物理的に除去、切除、および/または破壊する切除術を含み、本態様の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法、および/または代替療法などの他の療法と併用することができる。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍切除に加えて、外科手術による治療には、レーザー手術、凍結手術、電気外科療法、および顕微鏡下外科手術（モース術）が含まれる。
【０１４０】
がん性細胞、組織、または腫瘍の一部または全部を切除すると、体に空洞が形成されることがある。治療は、追加の抗がん療法を用いた該エリアの灌流、直接注入、または局所適用によって達成され得る。そのような治療は、例えば、1、2、3、4、5、6、もしくは7日ごとに、または1、2、3、4、もしくは5週ごとに、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12ヶ月ごとに繰り返すことができる。こうした治療は、同様に様々な投与量のものであり得る。
【０１４１】
5.  他の薬剤
治療効果を改善するために、本態様の特定の局面と組み合わせて他の薬剤を使用できると考えられる。こうした追加の薬剤には、細胞表面受容体およびギャップ結合（GAP junction）のアップレギュレーションに影響を与える薬剤、細胞増殖抑制剤および分化剤、細胞接着阻害剤、アポトーシス誘導剤に対する過剰増殖性細胞の感受性を高める薬剤、または他の生物学的薬剤が含まれる。ギャップ結合の数を増やすことによる細胞間シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増大させるであろう。他の態様では、細胞増殖抑制剤または分化剤を本態様の特定の局面と組み合わせて使用して、治療の抗過剰増殖効果を改善することができる。細胞接着阻害剤は本態様の有効性を改善すると考えられる。細胞接着阻害剤の例は、フォーカルアドヒージョンキナーゼ（focal adhesion kinase: FAK）阻害剤およびロバスタチンである。さらに、アポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を高める他の薬剤、例えば抗体c225を、本態様の特定の局面と組み合わせて使用して、治療の有効性を向上させることができると考えられる。
【０１４２】
V.  製品またはキット
抗原特異的T細胞もしくは抗原ペプチド（例えば、VGLL1ペプチド）を含む製品またはキットもまた本明細書に提供される。該製品またはキットは、抗原特異的T細胞を使用して個体におけるがんの進行を治療もしくは遅延させるための、またはがんを有する個体の免疫機能を増強するための説明書を含む添付文書をさらに含むことができる。本明細書に記載の抗原特異的T細胞のどれを該製品またはキットに含めてもよい。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、バッグおよび注射器が含まれる。その容器は、ガラス、プラスチック（例えば、ポリ塩化ビニルまたはポリオレフィン）、または金属合金（例えば、ステンレス鋼またはハステロイ）などの様々な材料から形成することができる。いくつかの態様では、該容器が製剤を保持し、容器上のまたは容器に付随するラベルが使用法を示し得る。該製品またはキットは、商業的およびユーザーの観点から望ましい他の材料、例えば、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、注射器、使用説明書を含む添付文書など、をさらに含んでもよい。いくつかの態様では、該製品は、1つ以上の他の薬剤（例えば、化学療法剤および抗腫瘍剤）をさらに含む。1つ以上の薬剤に適した容器には、例えば、ボトル、バイアル、バッグおよび注射器などがある。
【実施例】
【０１４３】
VI.  実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために提供される。当業者には理解されるように、以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者らによって発見された技術を表しており、したがってその実施のための好ましい形態を構成しているとみなすことができる。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示された具体的な態様に多くの変更を加えることができ、それでもなお本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果が得られる、ことを理解するであろう。
【０１４４】
実施例1 - 腫瘍抗原特異的ペプチドの同定と特性評価
膵臓腫瘍におけるHLA拘束性ペプチドを同定するために、膵臓患者由来の腫瘍オルガノイド細胞株（hMIA-2d）を取得した（Cold Spring Harbor Laboratories）。HLAクラスIを免疫沈降させ、ペプチドを酸溶出して、タンデム質量分析により解析した。この腫瘍細胞株から約1800のペプチドが検出され、それらのうち10のペプチドが潜在的に標的化可能であった（すなわち、基本的に正常な組織では低発現または発現の欠如を示した）。膵臓がん患者MP015由来のトップの溶出ペプチドはVGLL1であり（表1）、これは複数のHLAクラスIアロタイプに結合すると予測される（表2）。同じペプチドが、異なる患者MP081に由来する第2のHLA-A*0101陽性膵臓オルガノイド腫瘍細胞株においても検出された（表1）。VGLL1ペプチドの同一性は、天然ペプチドと同位体標識（すなわち、重いリジン、C15＋N13）ペプチドの質量スペクトルを比較する標的質量分析検出によって確認された（図1A〜1D）。
【０１４５】
（表１）VGLL1由来ペプチドは2名のHLA-A*0101陽性患者からのPDAC腫瘍オルガノイドサンプルにおいてMSにより検出された。
2020503840.tif 000004
【０１４６】
（表２）VGLL1由来ペプチドは複数のHLAクラスIアロタイプに結合すると予測される。
2020503840.tif 000005
【０１４７】
VGLL1遺伝子の発現を、RNA配列決定を用いて正常組織と腫瘍細胞株において評価した（図2A）。Cancer Genome Atlasによれば、大多数の正常組織は実質的にVGLL1を発現しておらず、一方腫瘍細胞、特に膵臓がん、膀胱がん、卵巣がん、子宮がん、乳がんおよび子宮頸がんはVGLL1の発現が上昇している。これらのTGCAがんにおけるVGLL1過剰発現の頻度を図2Bにまとめてある。したがって、VGLL1は腫瘍関連の同時転写（co-transcriptional）アクチベーターであり、正常組織では発現が制限されている。
【０１４８】
臨床グレードのペプチドおよびペプチド-HLA-A*0101四量体を合成し、VGLL1特異的CTLを作製するために使用した（図4A）。VGLL1特異的CD8+ T細胞は、患者の自己PBMCを、IL-21で処理したVGLL1ペプチドパルス樹状細胞を用いて刺激することによって作製した。四量体ベースのソーティングを用いてCD8+ T細胞を選別し、迅速な細胞増殖プロトコル（Rapid Expansion Protocol：REP）によって増殖させて約107×100万個のT細胞を作製した；そのうちの91.7％はCD8および四量体陽性であった（図4B）。
【０１４９】
VGLL1発現細胞を認識して殺傷するVGLL1特異的CD8+ T細胞の能力を調べるために、HLA-A*0101陽性膵臓腫瘍細胞株を用いて標準的な51Cr放出アッセイを行った。VGLL1増殖T細胞は、51Cr放出アッセイにより、患者の腫瘍細胞株hMIA-2Dの約70％の死滅、および1つの他のHLA-A1+膵臓がん細胞株Capan-1のわずかにより低い死滅を示した（図5）。これにより、VGLL1特異的CD8+ T細胞は膵臓細胞によって内因的にプロセシングされたVGLL1エピトープを認識し得ることが示された。対照として、VGLL1発現について陰性のHLA-A*0101陽性メラノーマ細胞（A375）を使用した。
【０１５０】
さらに、他の種類のがん細胞をVGLL1特異的CTLと共に培養し、細胞毒性をクロム放出アッセイによって測定した。VGLL1特異的CTLは、乳がん、卵巣がん、および膀胱がん細胞株を含む複数のHLA-A*0101陽性腫瘍細胞型を認識して殺傷する能力がある、ことが観察された（図6）。HLA-A*0101陰性胃がん細胞株はVGLL1特異的T細胞によって認識されなかったが、HLA-A*0101を発現するように形質導入すると、該細胞株は認識されて殺傷された。これは、胃がん細胞もまたVGLL1を発現しており、CTL特異的殺傷がインターフェロンγでの前処置によってさらに増強され得ることを示した（図7）。
【０１５１】
さらなるT細胞増殖の後（図4B）、膵臓がん患者MP015に、3週間ごとの抗PD1抗体ペムブロリズマブおよび低用量の皮下IL-2（250,000U/m2、12時間ごと)と共に、198億個の増殖させたVGLL1特異的T細胞を注入した（図4C）。臨床応答はVGLL1抗原欠損のために観察されず（図4D）、該患者は治療に関係した毒性をほとんどまたはまったく経験しなかった。重要なことは、細胞注入に関連した有害事象がまったく観察されなかったことである。
【０１５２】
標的抗原について95％超の四量体陽性である選別されたT細胞産物のT細胞受容体分析は、99％のTCR配列が21のクローン型に制限され、優性クローンが全配列の43％に相当することを明らかにした。末梢血サンプルのHTTCSトラッキングは、PBMC中の全T細胞の1.7％の累積度数（全21のクローン型を表す）を明らかにし、優性クローン型が全T細胞の1％超を占めていた。1ヶ月後、注入された抗原特異的T細胞は非常に低いが検出可能なレベル（0.03％）で末梢に存在していた；しかしながら、それらは胸水生検材料中に貯留していた（0.37％）。肺腫瘍組織への浸潤は検出されなかった。
【０１５３】
全体として、これらの結果から、関係する腫瘍関連抗原エピトープは患者の腫瘍サンプルから同定することができ、かつ自己膵臓腫瘍反応性の抗原特異的T細胞を患者の末梢血から引き出すのに十分な免疫原性をもつ、ことが示唆される。養子移入のためのそのようなT細胞の単離および増殖は実現可能であり、移入されたT細胞は、胸水における明らかな濃縮を伴って（胸水ではそれらが1ヶ月以上後に高頻度で検出された）、末梢血中で比較的高い頻度を達成した。したがって、同定された抗原特異的ペプチド、例えばVGLL1は、膵臓がんおよび他の種類のがんなどの固形がんの治療における養子T細胞移入用の抗原特異的T細胞を作製するために使用され得る。
【０１５４】
さらに、Cancer Genome Atlasデータベースを用いて、VGLL1転写産物の発現に基づいた膵臓がん患者の生存率（図3）ならびに他のがんを相関させる分析を行った。最も高いVGLL1発現（上位4分の1）を有する患者は全生存率が最悪であったので、全生存率はVGLL1発現と有意に相関することが観察された。逆に、最も低いVGLL1発現（下位4分の1）を有する患者は、最も長い全生存期間を示した。したがって、VGLL1は、がん患者、特に膵臓がん患者における予後マーカーとして使用できる腫瘍マーカーである。
【０１５５】
実施例2 - 材料および方法
細胞株：
hMIA-2d細胞を、4mM L-グルタミン、1mM非必須アミノ酸、10mMピルビン酸ナトリウム、50U/mlペニシリン、50mg/mlストレプトマイシンおよび10％FBS（TCB社）を含有するRPMI 1640中で維持した。LCLをフィーダー細胞として使用し、10％FBS、50U/mlペニシリン、50mg/mlストレプトマイシンを含有するRPMI 1640で培養した。T細胞培養用のCTL培地は、10％FBS、2mM L-グルタミン、β-メルカプトエタノール、50U/mlペニシリンおよび50mg/mlストレプトマイシンを含有していた。
【０１５６】
MP015患者由来の腫瘍細胞（hMIA-2d）を約10E8細胞（10×10cmコンフルエントプレート）に増殖させ、その後Triton X-100を用いて溶解した。細胞溶解物を、タンパク質10mgごとに1μgのHLA-A,B,C特異的mAb W6/32と共に穏やかに撹拌しながら4℃で一晩インキュベートした。プロテインA/G Ultralink樹脂ビーズを用いてHLA分子を免疫沈降させ、次いでHLA分子を5回連続した1mL溶出液中の0.1N酢酸を用いて腫瘍関連ペプチドと共に直接溶出させた。HLAの精製をウエスタンブロット分析により確認し、HLA陽性溶出液をプールして、タンデム質量分析（MS/MS）により解析した。
【０１５７】
質量分析：
発見段階タンデム質量分析（MS/MS）のために、溶出されたMHCクラスI結合ペプチドを高感度HPLCシステム（Dionex 3000 RSLC）に注入し、1.8ミクロンC18（Agilent Technologies社）の逆相クロマトグラフィーで0.1％ギ酸水-アセトニトリルにより分離し、データ依存型解析法（data-dependent acquisition）を用いてOrbitrap Elite質量分析計（Thermo Scientific社）で解析した。Mascotアルゴリズムは、10ppmの親質量許容誤差、0.8dのフラグメントイオン許容誤差、Met酸化、酵素選択性なしを用いて、得られたMS/MSスペクトルをSwissProt完全ヒトタンパク質データベースに対して検索した。NetMHC 3.4を用いて、検索結果と適切なMHC結合特異性との相互参照を行った。約1800のペプチドが発見段階MS/MSで検出され、全てがヒトプロテオーム内のタンパク質にマッチする野生型配列に対応した。
【０１５８】
発見段階MS/MSの結果、全エクソームシーケンシング、正常組織（GTex RNAseqデータベース）とヒト膵臓腫瘍（TCGA RNAseqデータベース）における標的遺伝子の発現を考慮したバイオインフォマティクス解析、および患者自身のRNAseq解析に基づいて、11の関心対象の同位体標識した高信頼性のペプチド（8つの変異型および3つの非変異型）を合成して、より高感度の標的化MS/MS分析における標準として使用した。この分析では、関心対象の合成ペプチド標準についての保持時間ウィンドウ（retention-time window）を合成ペプチドのMS分析によって事前に決定してから、腫瘍関連ペプチドを検索するための標的化方法を、各m/zあたりに3Daの質量ウィンドウ（mass window）を用いて構築した。標的化MS/MS実験は3つ全ての非変異型ペプチドの存在を実証したが、説得力のあるMS証拠は、予測された変異型ペプチドのいずれについても見つからなかった。
【０１５９】
VGLL1特異的CD8 T細胞の作製と増殖：
腫瘍抗原特異的CTLを、以前に記載された方法で作製した（Li, 2005）。HLA-A*0101陽性の白血球アフェレーシス（leukapheresis）PBMCを、腫瘍抗原ペプチドをパルスした自己DCにより刺激した。樹状細胞の誘導のために、付着PBMCをAIM-V培地（Invitrogen Life Technologies社）中でGM-CSFおよびIL-4と共に6日間培養し、次いで成熟のためにIL1b、IL-6、TNF-αおよびPGE2を添加した。1日後、成熟DCに、1％ヒト血清アルブミン(HAS)/PBSのmlあたり2×106細胞で3μg/mlのβ-ミクログロブリンの存在下に、40μg/mlのペプチドを室温で4時間パルスした。1％HSA/PBSで洗浄した後、DCを48ウェルプレートにおいて1.5×106細胞/ml/ウェルでPBMCと混合した。IL-21（30ng/ml）を最初に加え、培養の3〜4日後にも加えた。2次刺激の1日後にIL-2とIL-7を加えて、活性化された抗原特異的T細胞を増殖させた。
【０１６０】
2次刺激の6日後、細胞をVGLL1ペプチド/MHC-PEコンジュゲート四量体およびCD8-APC抗体で染色し、次にCD8および四量体陽性細胞をOWLソーティングによって選別した。選別されたVGLL1特異的CD8 T細胞を、IL-21の存在下でPBLおよびLCLのフィーダー細胞を用いて迅速な細胞増殖プロトコル（REP）によって増殖させた。
【０１６１】
ペプチド-MHC四量体染色：
VGLL1特異的CD8 T細胞を、VGLL1ペプチド/HLA A*0101の四量体で染色することによって確認した。CD8 T細胞をPEコンジュゲート四量体と20分間インキュベートし、洗浄した後、APCコンジュゲートCD8抗体により室温で15分間染色した。洗浄後、細胞をフローサイトメトリー（LSRFortessa X-20アナライザー）により分析した。
【０１６２】
51クロム放出アッセイ：
VGLL1特異的CD8 T細胞を、標準51クロム（51Cr）放出アッセイを用いて、VGLL1を発現するまたは発現しない標的の特異的溶解についてアッセイした。標的を100μCiの51Crで2時間標識し、3回洗浄した後、標識した標的を3つ組のウェルに2000標的/ウェルでプレーティングした。エフェクター細胞を様々なエフェクター：標的（E：T）比として標的とインキュベートした。4時間後、各ウェルから30μlの上清を回収し、51Crをガンマカウンターで測定した。特異的溶解の割合を算出した。
【０１６３】
RNAseq解析：
全トランスクリプトームSeq（RNA-Seq）は、Ribo-Zero Goldを備えたIllumina TruSeq Stranded Total RNAキットを用いて、腫瘍サンプルに対してAveraヒト遺伝学研究所（Avera Institute for Human Genetics）にて実施した。各腫瘍RNAサンプルについて、約2億のペアエンドリード（Paired-End reads）を使用した。BCL（Illumina HigSeqの生出力）ファイルを、逆多重化（demultiplexing）およびFASTQフォーマットへの変換のためにISIS v2.4.60を用いて処理した。FASTQファイルおよび配列リードは、特定のランに適したパラメータ（例えば、51塩基の配列決定ランでは3箇所のミスマッチ；2箇所は最初の40シード領域にある）を使用したBWAを用いて、ゲノム（Hg19）にアライメントさせた。次に、アライメントされたBAMファイルを、下流解析の前に、PicardおよびGATKプログラムを使用して、マーク重複（mark duplication）、リアライメント、およびリキャリブレーションにかけた。RNASeqデータを、TopHat、TopHat-Fusion、およびCufflinksアルゴリズムを用いて処理した。
【０１６４】
統計分析：
データ解析はGraphPadプリズムのバージョン6.0eを用いて行った。正規分布データを、パラメトリック検定（Anovaまたは対応のないt検定）を用いて解析した。p値が＜0.05であれば、統計的検定の差を有意と見なした。
【０１６５】
本明細書に開示され、特許請求の範囲に記載された方法の全ては、本開示に照らして、過度の実験を行うことなく構成および実施することが可能である。本発明の組成物および方法は好ましい態様に関して記載されているが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された方法および該方法の工程または工程の順序に様々な変形を適用し得ることが、当業者には明らかであろう。より具体的には、本明細書に記載された薬剤の代わりに、化学的にも生理学的にも関連するある種の薬剤を使用することができるが、同じまたは同様の結果が達成され得ることは明らかであろう。当業者に明らかな、そのような類似の置換および改変はすべて、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念内にあると見なされる。
【０１６６】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載されたものを補足する例示的な手順または他の詳細を提供する程度に、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
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2020503840.tif 000009
2020503840.tif 000010
【図１Ａ】
2020503840.tif 000012
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
2020503840.tif 000014
【図１Ｄ】
2020503840.tif 000015
【図２Ａ−１】
2020503840.tif 000016
【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
2020503840.tif 000024
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月11日(2019.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
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【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ｂ】
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【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ｃ】
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【国際調査報告】
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