(57)【要約】本発明は、動物の肺組織抽出物を有効成分として含む火傷及び褥瘡の緩和及び治療用組成物に関する。本発明の組成物は、皮膚損傷に対する動物の肺組織抽出物及び／又はプロピオン酸の保護効果が、炎症の抑制のみならず、繊維組織の再生及び血管新生の促進にも関連があることを示唆し、皮膚創傷の治癒に関連する素材として有効性を示し、火傷及び褥瘡の治療に関連して産業的に利用可能な効果を示すので、これらの疾患の治療剤として使用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の肺組織抽出物を有効成分として含む、褥瘡治療用組成物。
【請求項２】
前記動物は豚であることを特徴とする、請求項１に記載の褥瘡治療用組成物。
【請求項３】
前記肺組織抽出物はリン脂質画分であることを特徴とする、請求項１に記載の褥瘡治療用組成物。
【請求項４】
前記組成物は、さらに有機酸又はその塩を含むことを特徴とする、請求項１に記載の褥瘡治療用組成物。
【請求項５】
前記有機酸はプロピオン酸であることを特徴とする、請求項４に記載の褥瘡治療用組成物。
【請求項６】
動物の肺組織抽出物を有効成分として含む、火傷治療用組成物。
【請求項７】
前記動物は豚であることを特徴とする、請求項６に記載の火傷治療用組成物。
【請求項８】
前記肺組織抽出物はリン脂質画分であることを特徴とする、請求項６に記載の火傷治療用組成物。
【請求項９】
前記組成物は、さらに有機酸又はその塩を含むことを特徴とする、請求項６に記載の火傷治療用組成物。
【請求項１０】
前記有機酸はプロピオン酸であることを特徴とする、請求項９に記載の火傷治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、火傷及び褥瘡の緩和及び治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
褥瘡とは、体の接触面から受ける圧迫により組織の末梢血管が閉塞し、組織の壊死を引き起こす病態であって、その治癒には長期間を要する場合が多い。
【０００３】
したがって、長期間、寝具の上に寝ている状態にある老人や長期療養患者は、褥瘡（ｂｅｄｓｏｒｅ、いわゆる圧迫潰瘍）が生じやすく、看護上の大きな問題となっている。また、褥瘡は、ヒト以外の動物にも発症する病気であって、例えば、馬の鞍ずれ（ｓａｄｄｌｅｓｏｒｅ）も褥瘡の一つである。
【０００４】
褥瘡の治療剤としては、ブロメライン（ｂｒｏｍｅｌａｉｎ）（診療と新薬、１９７１年、第８巻、ｐ．９６７）を含有する軟膏、ブクラデシンナトリウム（ｂｕｃｌａｄｅｓｉｎｅ  Ｎａ）［Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ＆  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ（バイオロジカル  アンド  ファーマシュティカル  ブレティン）、１９９５年、第１８巻、ｐ．１５３９−１５４３］を含有する軟膏などがあるが、前記の治療剤はいずれも、出血、疼痛などの副作用が知られている。
【０００５】
また、褥瘡用ベッド、マットレスなどを使用して褥瘡部位に風通しが円滑に行われるようにする製品を使用しているが、これは、予防のための用品に過ぎず、治療剤としては使用できないものである。
【０００６】
したがって、現在の褥瘡の治療は、ほとんど、患者の自然治癒力に依存して治療しており、より安全な方法の褥瘡の治療が求められている。
【０００７】
一方、火傷は、主に事故によって発生し、原因に応じて、熱による火傷、電流による火傷、化学物質による火傷、放射線による火傷などに分類することができる。火傷の重症度は、火傷を負った面積、深さ、火傷を誘発した物体の温度と接触時間、皮膚状態などによって、１度、２度、３度及び４度の火傷に分類され、２度の火傷からは傷跡が残り得るので、病院での治療を要する。
【０００８】
１度の火傷は、肌が赤くなり、ひりひりするなどの痛症を伴う。皮膚層における最も外層である表皮の損傷をもたらし、痛症と紅斑を伴いながら腫れ上がることもある。数日内に症状がなくなるが、その部位に軽い落屑と色素沈着が残る場合もある。回復後には瘢痕（傷跡）が残らない。日焼けによる火傷（ｓｕｎ  ｂｕｒｎ）は、最も一般的な１度の火傷の例である。
【０００９】
２度の火傷は、表皮と真皮の両方に影響を及ぼし、紅班、痛み、むくみ、そして、事故後２４時間内に水疱を生じさせる。この火傷はまた、汗腺や毛穴に影響を及ぼすこともある。自覚的には灼熱感と痛みがひどい。水泡が破れてびらん面を呈し、多量の分泌液が出る。火傷を負った面積が体表面積の約１５％以上に至る場合には、特に注意を要する。数週間以内に治癒するが、その部位に色素沈着や色素脱失が残ることが多い。２次感染を起こせば、局所症状はさらにひどくなり、経過も長くなる。
【００１０】
３度の火傷は、表皮、真皮、そして、下皮にまで影響を及ぼし、皮膚が黒くなったり半透明の白色になり、皮膚表面の真下の血管を凝固させる。１度の火傷は、肌が赤くなり、ひりひりするなどの痛症を伴う。皮膚層における最も外層である表皮の損傷をもたらし、痛症と紅斑を伴いながら腫れ上がったりする。この火傷部位は無感覚になることもあるが、患者は激しい痛みを感じ、皮膚組織と構造が壊死してしまい、治療に多くの時間がかかり、後に傷跡が残るようになる。事故後２週間が経過すると、かさぶたが剥がれて潰瘍面が現れる。分泌液が多く、出血しやすいが、次第に新しい組織が生じて表皮が再生し、傷跡が残って治癒される。皮膚壊死が深い場合、又は２次感染を起こした場合、治癒が遅れ、傷跡の表面が不規則になってケロイドができたり、変形や運動障害が残ったりすることもある。火傷を負った面積が体表面積の１０％以上に至る場合には、特に注意を要する。
【００１１】
４度の火傷は、火傷を負った部位の組織が炭化して黒く変化した場合であり、皮膚層の下に位置する脂肪層、靭帯、筋膜、筋肉、骨組織などに火傷を負った場合をいう。高圧電気火傷で主に発生し、場合によっては、深在性２〜３度の火傷で菌の感染が発生する場合に生じることがある。火傷の範囲が２０％以上である場合、全身的な身体反応が起こり得るが、過度の体液の損失による低血圧、ショック、急性腎臓機能不全などが発生することがあり、後で傷の感染や肺炎、敗血症、多臓器機能不全症候群などが発生することもある。
【００１２】
火傷の治療は、できるだけ早く、初期火傷の創傷を治癒したり、火傷部位を減らすことが重要である。初期火傷の患部ドレッシングにおいて感染及び炎症の調節、湿潤環境の維持、皮膚再生を助ける成長因子やサイトカインの投与、局所的なヘパリンの使用などによる、深部火傷への移行を防止する初期治療が強調されている。
【００１３】
このような火傷及び／又は褥瘡損傷の深刻性を考慮すると、火傷及び／又は褥瘡損傷の治療または予防に有用な治療剤が開発されれば、患者の治療、状態の改善及び傷跡の減少に大いに役に立つ。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】大韓民国公開特許第１０−２００８−００５８１２６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、上記の問題点を解決し、上記の必要性によって案出されたものであって、本発明の目的は、新規な褥瘡治療剤を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、新規な火傷治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記の目的を達成するために、本発明は、動物の肺組織抽出物を有効成分として含む褥瘡治療用組成物を提供する。
【００１８】
本発明の一具現例において、前記動物は豚であることが好ましいが、これに限定されない。
【００１９】
本発明の他の具現例において、前記肺組織抽出物はリン脂質画分であることが好ましいが、これに限定されない。
【００２０】
本発明の一実施例において、前記リン脂質画分は、図１に記載されたように、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）；１−パルミトイル−２−アラキドニホスファチジルコリン（１−Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ａｒａｃｈｉｄｏｎｙ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）；１−パルミトイル−２−リノレオイルホスファチジルコリン（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）；１−パルミトイル−２−パルミトレオニルホスファチジルコリン（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｐａｌｍｉｔｏｌｅｏｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）；１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）；ジパルミトイルホスファチジルコリン（ｄｉｐａｌｍｉｔｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）；ホスファチジルエタノールアミン（ｐｈｓｐｈａｔｙｌｅｔｈａｏｌａｍｉｎｅ）；スフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）からなる群から選択されたものであるか、又はこれらのリン脂質を全て含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００２１】
本発明の更に他の具現例において、前記組成物は、さらに有機酸又はその塩を含むことが好ましく、前記有機酸はプロピオン酸であることがさらに好ましいが、これに限定されない。
【００２２】
また、本発明は、動物の肺組織抽出物を有効成分として含む火傷治療用組成物を提供する。
【００２３】
本発明の一具現例において、前記動物は豚であることが好ましいが、これに限定されない。
【００２４】
本発明の他の具現例において、前記肺組織抽出物はリン脂質画分であることが好ましいが、これに限定されない。
【００２５】
本発明の更に他の具現例において、前記組成物は、さらに有機酸又はその塩を含むことが好ましく、前記有機酸はプロピオン酸であることがさらに好ましいが、これに限定されない。
【００２６】
本発明に係る褥瘡の治療剤又は予防剤、火傷の治療剤における有効成分の濃度は適宜選択することができる。
【００２７】
本発明に係る褥瘡の治療剤又は予防剤、火傷の治療剤は、経口剤として投与することもできるが、外用剤として創傷、褥瘡又は火傷の患部に局所投与することが好ましい。
【００２８】
また、褥瘡の予防薬として、褥瘡になる可能性のある箇所に局所投与することにより、褥瘡にならない又はなりにくくすることも可能である。
【００２９】
外用剤としては、通常、外用剤として用いるものであれば、特に限定されるものではないが、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、塗布薬（ｌｉｎｉｍｅｎｔ）、パップ（ｐａｐ）剤、プラスター（ｐｌａｓｔｅｒ）剤、パッチ（ｐａｔｃｈ）剤、硬膏剤、ゲル（ｇｅｌ）剤、液剤、テープ剤などが挙げられる。
【００３０】
前記剤形が軟膏剤又はクリーム剤である場合には、基剤として、油脂性基剤又は乳剤性基剤を用いることができる。
【００３１】
前記油脂性基剤としては、例えば、炭化水素、高級アルコール、高級脂肪酸、高級脂肪酸エステル、グリコール類、植物油、動物油などが挙げられる。前記油脂性基剤は、通常、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００３２】
前記炭化水素としては、例えば、炭素数１２〜３２の炭化水素、様々な炭化水素の混合物である流動パラフィン、分岐状パラフィン、固形パラフィン、白色ワセリン、黄色ワセリン、スクアレン（ｓｑｕａｌｅｎｅ）、スクアラン、プラスチベースなどが挙げられる。これらの中でも、特に白色ワセリンが好適なものとして挙げられる。前記炭化水素は、通常、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００３３】
前記高級アルコールとしては、例えば、炭素数１２〜３０の脂肪族１価アルコールなどが挙げられる。このような脂肪族１価アルコールの具体例としては、例えば、ラウリルアルコール（ｌａｕｒｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）、トリデシルアルコール、ミリスチルアルコール（ｍｙｒｉｓｔｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）、ペンタデシルアルコール、セチルアルコール（セタノール（ｃｅｔａｎｏｌ））、ヘキサデシルアルコール、ヘプタデシルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール（ｏｌｅｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）、ノナデシルアルコール、エイコシルアルコール、セリルアルコール、メリシルアルコール（ｍｅｌｉｓｓｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）、セトステアリルアルコール（ｃｅｔｏｓｔｅａｒｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）などが挙げられる。これらの中で、ラウリルアルコール、セチルアルコール及びステアリルアルコールが好ましく、特にセチルアルコール及びステアリルアルコールが好ましい。前記高級アルコールは、通常、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００３４】
前記高級脂肪酸としては、例えば、炭素数６〜３２の飽和又は不飽和脂肪酸が挙げられる。具体的には、例えば、カプロン酸（ｃａｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、エナント酸（ｅｎａｎｔｈｉｃ  ａｃｉｄ）、カプリル酸（ｃａｐｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ペラルゴン酸（ｐｅｌａｒｇｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、カプリン酸（ｃａｐｒｉｃ  ａｃｉｄ）、ウンデシル酸、ラウリン酸（ｌａｕｒｉｃ  ａｃｉｄ）、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ヘプタデシル酸、ステアリン酸（ｓｔｅａｒｉｃ  ａｃｉｄ）、オレイン酸（ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ノナデカン酸、アラキン酸、アラキドン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、リノール酸、リノレン酸（ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ベヘン酸（ｂｅｈｅｎｉｃ  ａｉｃｄ）、リグノセリン酸（ｌｉｇｎｏｃｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）、セロチン酸（ｃｅｒｏｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ヘプタコサン酸、モンタン酸（ｍｏｎｔａｎｉｃ  ａｃｉｄ）、メリシン酸（ｍｅｌｉｓｓｉｃ  ａｃｉｄ）、ラクセル酸、エライジン酸（ｅｌａｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）、ブラシジン酸などが挙げられる。これらの中でも、特に、パルミチン酸及びステアリン酸が好ましい。前記高級脂肪酸は、通常、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００３５】
前記高級脂肪酸エステルとしては、例えば、パルミチン酸ミリスチル、ステアリン酸ステアリル、ミリスチン酸ミリスチル、リグノセリン酸セリル、セロチン酸ラクセリル、ラクセル酸ラクセリルなどの脂肪酸エステル；ラノリン（ｌａｎｏｌｉｎ）、ミツロウ（ｂｅｅｓｗａｘ）、クジラロウ、シェラック（ｓｈｅｌｌａｃ）ロウなどの動物からの天然ロウ、カルナウバロウ（ｃａｒｎａｕｂａ  ｗａｘ）、カンデリラロウ（ｃａｎｄｅｌｉｌａ  ｗａｘ）などの植物からの天然ロウ等の炭素数１０〜３２の脂肪酸と炭素数１４〜３２の脂肪族１価アルコールとのエステル；グリセリルモノラウリレート、グリセリルモノミリスチレート、グリセリルモノオレート、グリセリルモノステアレート、グリセリルジラウリレート、グリセリルジミリスチレート、グリセリルジステアレート、グリセリルトリラウリレート、グリセリルトリミリスチレート、グリセリルトリステアレートなどの炭素数１０〜２２の飽和又は不飽和脂肪酸とグリセリンとのエステル、又はそれらの水素添加物などが挙げられる。前記高級脂肪酸エステルは、通常、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００３６】
前記グリコール類としては、例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブタンジオール、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。これらは、単独で又は２種以上を混合して用いられる。また、本発明では、これらの中で、例えば、低重合度のポリエチレングリコールと高重合度のポリエチレングリコールとを混合して用いることが好ましい。前記グリコール類は、通常、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００３７】
前記植物油としては、例えば、ツバキ油、ヒマシ油、オリーブ油、カカオ油、ヤシ油、パーム油、マカデミアナッツ油（ｍａｃａｄａｍｉａ  ｎｕｔ  ｏｉｌ）、大豆油、茶油（ｔｅａ  ｓｅｅｄ  ｏｉｌ）、ゴマ油、アーモンド油、サフラワー油（ｓａｆｆｌｏｗｅｒ  ｏｉｌ）、綿実油（ｃｏｔｔｏｎ  ｓｅｅｄ  ｏｉｌ）、テレピン油、これらの植物油に水素を添加した植物油脂類などが挙げられる。前記植物油は、通常、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００３８】
前記動物油としては、例えば、ミンク油、卵黄油、スクアラン、スクアレン（ｓｑｕａｌｅｎｅ）、ラノリン（ｌａｎｏｌｉｎｅ）、前記動物油の誘導体などが挙げられる。前記動物油は、通常、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００３９】
前記高級アルコールの一部は吸収促進剤としても使用できるものであって、このような高級アルコールを基剤として使用する場合には、吸収促進剤を特に添加する必要がない。
【００４０】
前記乳剤性基剤としては、例えば、水中油型（ｏｉｌ  ｉｎ  ｗａｔｅｒ、Ｏ／Ｗ）基剤、油中水型（ｗａｔｅｒ  ｉｎ  ｏｉｌ、Ｗ／Ｏ）基剤、懸濁型基剤などが挙げられる。
【００４１】
前記水中油型基剤としては、界面活性剤の存在下又は非存在下で、前記ラノリン、プロピレングリコール、ステアリルアルコール、ワセリン、シリコーン油、流動パラフィン、グリセリルモノステアレート、ポリエチレングリコールなどの成分を水相中に乳化（ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、分散させた基剤などが挙げられる。前記基剤は、クリームなどを調製する際に好適に使用できるものである。
【００４２】
前記油中水型基剤としては、ワセリン、高級脂肪族アルコール、流動パラフィンなどの成分に、非イオン性界面活性剤の存在下で水を加え、乳化、分散させた基剤などが挙げられる。
【００４３】
前記水中油型基剤及び油中水型基剤は、水を含有した剤形、例えば、水を含有する液剤、ローション剤、パップ（ｐａｐ）剤、軟膏剤などに使用することが好ましい。
【００４４】
前記懸濁性基剤としては、水に澱粉、グリセリン、高粘度カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、カルボキシビニルポリマー（ｃａｒｂｏｘｙ  ｖｉｎｙｌ  ｐｏｌｙｍｅｒ）などの懸濁化剤を加えてゲル状（ｇｅｌ  ｐｈａｓｅ）にした水性基剤などが挙げられる。
【００４５】
本発明に係る褥瘡の治療剤又は予防剤、火傷の治療剤の外用剤は、一般に採用されている外用剤の調製方法により製造することができる。例えば、前記軟膏剤又はクリーム剤は、それぞれの剤形に応じて基剤原料を混練（ｒｏｌｌ  ｍｉｘｉｎｇ  ｍｉｌｌｉｎｇ）、乳化又は懸濁させて基剤を調製した後、有効成分及び各種添加剤を加えて混合させることによって製造することができる。混合時にはスクリューミキサー（ｓｃｒｅｗ  ｍｉｘｅｒ）、ホモミキサー、混練機（ｋｎｅａｄｅｒ）、ロールミル（ｒｏｌｌ  ｍｉｌｌ）などのように一般に用いられている混合機を用いることができる。
【００４６】
前記剤形がローション剤である場合には、懸濁型、乳剤型及び溶液型のいずれのタイプであってもよい。
【００４７】
前記懸濁型ローションの基剤としては、アラビアゴム（ｇｕｍ  ａｒａｂｉｃ）、トラガカントゴム（ｇｕｍ  ｔｒａｇａｃａｎｔｈ）などのゴム類、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチル澱粉などのセルロース類、ベントナイト（ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ）、ビーガム（ｖｅｅｇｕｍ）ＨＶなどの粘土類の懸濁剤と水の混合物などが挙げられる。前記懸濁型ローションの基剤は、通常、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００４８】
前記乳剤型ローションの基剤としては、水とステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸などの脂肪酸、ステアリルアルコール、セタノール、ベヘニルアルコール（ｂｅｈｅｎｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）などの高級アルコール等の油性物質を乳化させた基剤などが挙げられる。前記乳剤型ローションの基剤は、通常、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００４９】
前記溶液型ローションの基剤としては、水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコールなどのアルコール等が挙げられる。前記溶液型ローションの基剤は、通常、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００５０】
前記ローション剤は、例えば、精製水に様々な基剤成分を添加して混合、撹拌（ａｇｉｔａｔｉｏｎ）した後、有効成分及び添加剤を加えて混合し、所望に応じて濾過を行うことによって製造することができる。
【００５１】
剤形が前記塗布薬（ｌｉｎｉｍｅｎｔ）である場合、その基剤としては、例えば、オリーブ油、ゴマ油、アーモンド油、綿実油（ｃｏｔｔｏｎ  ｓｅｅｄ  ｏｉｌ）、テレピン油などの植物油類、エタノール、プロパノール（ｐｒｏｐａｎｏｌ）、イソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）などのアルコール類、それらと水の混合物などが挙げられる。前記塗布薬の基剤は、通常、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００５２】
前記塗布薬は、基剤に有効成分を溶解させた後、所望の成分を加えて混合させることによって製造できる。
【００５３】
剤形が前記パップ剤である場合、その基剤として、例えば、ポリアクリル酸及びその塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどの水溶性高分子化合物、前記水溶性高分子化合物をミョウバン（ａｌｕｍ）などの多価金属塩で架橋させた基剤、前記水溶性高分子化合物に放射線照射のような物理的処理を施して架橋させた基剤などの架橋体などが挙げられる。前記パップ剤の基剤は、通常、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００５４】
前記パップ剤は、有効成分、基剤及び所望の添加物を混合し、加熱後に冷却させることによって製造できる。
【００５５】
前記プラスター（ｐｌａｓｔｅｒ）剤、パッチ（ｐａｔｃｈ）剤及び硬膏剤の場合、不織布などの支持体、天然ゴム、スチレン−ブタジエンゴム（ＳＢＲ）、ブチルゴム、ポリイソブチレン、ポリビニルアルキルエーテル、ポリウレタン、ジメチルポリシロキサン、スチレン−イソプレン−スチレンゴム、イソプレンゴムなどの弾性体、亜鉛華、酸化チタン、シリカなどの充填剤、弾性体との相溶性が良いテルペン（ｔｅｒｐｅｎｅ）樹脂、ロジン（ｒｏｓｉｎ）又はそのエステル、フェノール樹脂などの粘着付与剤、酢酸ビニル、シリコーン樹脂、ポリ塩化ビニルなどの剥離（ｅｘｆｏｌｉａｔｉｏｎ）処理剤、流動パラフィン、プロセスオイル（ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｉｌ）などの軟化剤、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）などの老化防止剤などが挙げられる。これらの成分は、単独で又は２種以上を混合して使用することができる。
【００５６】
前記プラスター剤、パッチ剤、硬膏剤などは、溶液法や熱圧法などの常法により製造することができる。
【００５７】
具体的には、例えば、熱圧式によるときは、有効成分及び各成分をロール機械などで均一に混練（ｒｏｌｌ  ｍｉｘｉｎｇ  ｍｉｌｌｉｎｇ）させ、熱及び圧力を加えたカレンダーを使用して離型紙（ｒｅｌｅａｓｅ  ｐａｐｅｒ）上に均一な厚さになるように塗布して薬物含有層を形成した後、これを支持体の表面に積層、密着させて製造することができる。
【００５８】
前記ゲル剤、液剤、テープ剤などの場合にも、その基剤は、通常の外用剤に使用されているものであればよく、特に限定されない。
【００５９】
以下、本発明を説明する。
【００６０】
本願発明の褥瘡及び火傷の治療のための組成物は、動物の肺組織を破砕して抽出した全リン脂質画分（ｔｏｔａｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）であって、ＤＰＰＣの含量が２５％以上（ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤを用いて濃度を測定した場合）であるものを主成分とし（図１）、ｍｉｃｒｏＭ濃度の有機酸を選択的に含有することを特徴とする。
【００６１】
本発明では、全リン脂質画分（Ｔｏｔａｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎ、ＴＰＦ）は、豚の肺から抽出して精製したリン脂質画分であって、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）（ＤＰＰＣ）をはじめとする肺胞に存在するリン脂質界面活性体は、強い極性を帯びた頭部位（ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）を有しているので、水と容易に混合することができ、分子内に短い飽和脂肪酸２個を有していることにより、洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）のような役割を果たすことができる。
【００６２】
すなわち、タンパク質を凝集させる疎水性結合及び極性結合などを同時に妨げることで、褥瘡患部に累積して互いに凝集している血漿タンパク質を解離させ、より小さな単量体にし、これらのタンパク質の血管への再吸収、細胞による分解及び外部への排出を容易にすることができ、同時に、表面に極性の脂肪膜を形成するようにして水分の蒸発を減少させる役割を期待することができる。
【００６３】
さらに、カルボキシル基（ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｇｒｏｕｐ）を有する短い炭素鎖の有機酸であるプロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ、Ｐｉ）は、血漿に含有されて滲出したカルシウムのような様々な２価カチオンの双方向イオン結合を介してタンパク質の凝集現象をより効果的に妨げることができる。
【００６４】
本発明の実験例では、褥瘡治療の候補物質であるＴＰＦとＰｉを用いて、マウス動物モデルの非臨床評価を用いて褥瘡治療の改善及びそのメカニズムを記載した。
【００６５】
本発明では、ＴＰＦと共にＰｉが添加されたＴＰＦの処理が、I／Ｒ後に潰瘍の形成を有意に抑制していることを示した。ＴＰＦのドレッシングによって傷部位の回復速度が増加し、皮膚水分損失量は一部のＴＰＦによって改善され、炎症の抑制、アポトーシスの抑制、繊維組織、血管の回復及び皮膚障壁の改善において、既存の褥瘡の治療に広く使用されるスルファジアジン銀（ｓｉｌｖｅｒ  ｓｕｌｆａｄｉａｚｉｎｅ）とさらに類似あるいはさらに効果的であることを示した。特に、低濃度（２％）ＴＰＦ＋Ｐｉが高濃度（４％）ＴＰＦの効果とほぼ同一であり、炎症の抑制とアポトーシスを減少させるのにさらに良い効果を奏することを示した。
【発明の効果】
【００６６】
本発明の組成物は、火傷及び褥瘡の治療に対して、下記のような効果を示す。
【００６７】
本発明は、皮膚I／Ｒ損傷のＴＰＦ及びＰｉパラメータの保護メカニズムを確認した。本発明の結果は、ＴＰＦの処理が、Ｍ１マクロファージの浸潤を抑制し、Ｍ１マクロファージの前炎症性メディエータ（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ）によって誘導された皮膚炎症を抑制することを示す。また、低濃度ＴＰＦの処理も、Ｐｉの追加により高濃度ＴＰＦと類似の効果を示すことができることを確認した。
【００６８】
本発明は、ＴＰＦ及びＰｉの処理が、I／Ｒで誘導されたアポトーシス細胞の数が減少することを示した。このような結果は、皮膚I／Ｒ後、アポトーシス細胞のｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ及びｃｌｅａｒａｎｃｅを増加させて、これらが蓄積することを防いでいるが、これは、I／Ｒ褥瘡部位での細胞の死滅及び壊死の抑制、及び圧迫潰瘍からＴＰＦ及びＰｉの保護効果を示す。
【００６９】
本発明では、高濃度ＴＰＦ及び低濃度ＴＰＦ＋Ｐｉの処理によって、褥瘡部位の傷の回復が促進されると共に、コラーゲンの含量が増加することを確認した。また、真皮内のコラーゲンｔｙｐｅI／IIIの生成比率を確認して、ＴＰＦ及びＰｉの処理が、I／Ｒ後の皮膚の褥瘡部位の正常組織の回復に重要な役割をしていることを確認した。また、I／Ｒ褥瘡部位の血管分布を評価し、I／Ｒ領域の血管周囲細胞の数が対照群のマウスよりも有意に多いということを見出した。本発明は、皮膚I／Ｒ損傷に対するＴＰＦ及びＰｉの保護効果が、炎症の抑制のみならず、繊維組織の再生及び血管新生の促進にも関連があることを示唆している。
【００７０】
前記の結果を総合的に見ると、本発明は、ＴＰＦが褥瘡治癒の速度を加速化すると同時に、抗炎症、コラーゲン生成誘導、血管の生成及び皮膚障壁の回復を通じた組織再生活性に寄与して、皮膚I／Ｒ損傷により誘発された圧迫潰瘍の形成を抑制すると結論付けている。また、Ｐｉの追加時に、低濃度のＴＰＦでも高濃度のＴＰＦと類似の効果を示すことができることを証明した。ＴＰＦの持続的な治療は、褥瘡（ｄｅｃｕｂｉｔｕｓ）潰瘍及び他の虚血性潰瘍を含め、皮膚創傷の治癒に関連する素材として有効性を示し、産業上の利用が可能であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】豚の肺組織から抽出したリン脂質画分を示す図であって、精製されたリン脂質分画は、ＨＰＬＣ−ＥＬＳＤシステム（Ｗａｔｅｒｓ  ｅ２６９５  Ｗａｔｅｒｓ  ２４２４（ＥＬＳＤ））を用いて分析した。カラムは、ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  ｃｏｌｕｍｎ  Ｃ１８  ５．０μｍ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）を用いた。＃１，ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ；＃２，１−Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ａｒａｃｈｉｄｏｎｙ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；＃３，１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；＃４，１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｐａｌｍｉｔｏｌｅｏｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；＃５，１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；＃６，ｄｉｐａｌｍｉｔｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；＃７＆＃８，ｐｈｓｐｈａｔｙｌｅｔｈａｏｌａｍｉｎｅ；＃９，ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ．
【図２Ａ−２Ｅ】皮膚I／Ｒ後、圧迫潰瘍の形成に対するＴＰＦとプロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）の効果を示した図、（Ａ）傷治癒モデルの概略図。マウスの背中側の皮膚を剃り、I／Ｒサイクルを２回実施した後、対照群（ＰＢＳ）と試験物質（ＳＳ、４％ＴＰＦ、２％ＴＰＦ＋Ｐｉ）を１日２回ドレッシングして、褥瘡の治癒に対して２０日間評価した。（Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるI／Ｒ損傷後の褥瘡部位の写真。（Ｃ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるI／Ｒ損傷後の褥瘡面積のサイズの変化。I／Ｒ誘導後のマウスの潰瘍のサイズを１００％値として指定した。（Ｄ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるI／Ｒ損傷後の傷部位のＴＥＷＬ。（Ｅ）試験物質の処理後のマウスの重量の変化。
【図３Ａ−３Ｂ】皮膚I／Ｒによる傷部位の炎症反応に対するＴＰＦとプロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）の効果を示した図、（Ａ及びＢ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるI／Ｒ損傷４日後の傷部位の組織写真。（Ｒｅｄ  ａｒｒｏｗ：ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ）、Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ、１００μｍ。
【図４Ａ−４Ｅ】I／Ｒ皮膚損傷後、浸潤するマクロファージの抑制に対するＴＰＦとプロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）の効果を示した図、（Ａ）I／Ｒ皮膚損傷後４日目に浸潤する好中球とマクロファージをＭＰＯ及びＣＤ６８抗体で染色した皮膚褥瘡部位の組織写真。（Ｂ）ｉＮＯＳ（Ｍ１マクロファージ）、Ａｒｇ−１（Ｍ２マクロファージ）抗体で染色した皮膚褥瘡部位の組織写真。（Ｃ）I／Ｒ後４日目にｉＮＯＳ及びａｒｇｉｎａｓｅ−１の発現レベルをＲＴ−ＰＣＲと免疫ブロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）で定量。（Ｄ）I／Ｒ後４日目にＭＣＰ−１、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦαのｍＲＮＡの発現レベルを定量。Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ、１００μｍ。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１
【図５Ａ−５Ｃ】I／Ｒ皮膚損傷後、アポトーシスの抑制に対するＴＰＦとプロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）の効果を示した図、（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるI／Ｒ損傷４日後、Ｈ＆Ｅ、ＴＵＮＥＬ染色を用いた皮膚の褥瘡部位の組織写真。（Ｂ）I／Ｒ損傷４日後、皮膚の褥瘡部位のアポトーシス細胞の数。（Ｃ）I／Ｒ後４日目にＢａｘ及びｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３の発現レベルをｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔで定量。Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ、１００μｍ。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１
【図６Ａ−６Ｂ】I／Ｒ皮膚損傷後、繊維組織の回復に対するＴＰＦとプロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）の効果を示した図、（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるI／Ｒ損傷１２日後、Ｈ＆Ｅ、ｍａｓｓｏｎ’ｓ  ｔｒｉｃｈｏｍｅ、ｐｉｃｒｏ−ｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ、αＳＭＡ抗体の染色を用いた皮膚の褥瘡部位の組織写真。（Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるI／Ｒ損傷１６日後、Ｈ＆Ｅ、ｐｉｃｒｏ−ｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ染色を用いた皮膚の褥瘡部位の組織写真。Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ、１００μｍ。
【図７】I／Ｒ皮膚損傷後、皮膚障壁の改善に対するＴＰＦとプロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）の効果を示した図、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるI／Ｒ損傷１６日後、Ｈ＆Ｅ、ｆｉｌａｇｇｒｉｎ、ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ抗体の染色を用いた皮膚の褥瘡部位の組織写真。Ｓｃａｌｅ  ｂａｒ、１００μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
以下、非限定的な実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明を例示するための目的で記載されたものであって、本発明の範囲は、下記の実施例によって制限されるものと解釈されない。
【００７３】
実施例１：豚の肺からリン脂質画分の精製
抽出方法は、Ｍｏｏｎ  ｅｔ．ａｌ（Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐ．２０１２  ３９：４２３７−４２４７）が記述した方法を用いた。
【００７４】
簡単に述べると、新鮮な豚の肺組織に食塩水を添加してミキサーで破砕した後、ＣａＣｌ２を５ｍＭの濃度になるように添加して、水溶性破砕液中でリン脂質の沈殿を促進した。破砕した試料を遠心分離して沈殿物を得た後、沈殿物をクロロホルム：メタノール（１：２）有機溶媒に溶解して、全脂質画分（ｔｏｔａｌ  ｌｉｐｉｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）を得た。得られた全脂質画分をシリカオープンカラムに適用して、脂肪酸及び中性脂肪などを溶出させて除去し、リン脂質画分（ｔｏｔａｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎ、ＴＰＦ）を別々に集めて得た。精製されたリン脂質画分は、真空回転蒸発器を用いて濃縮した後、摂氏−７０℃で凍結乾燥した。試料は、使用前まで−２０℃で保管した。
【００７５】
抽出工程において、リン脂質を容易に沈殿させるためにＣａＣｌ２溶液を適用したので、最終リン脂質画分中の残存カルシウムの含量の有無を調べた。Ｃａ２＋の検出は、ＱｕａｎｔｉｃｈｒｏｍＴＭ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＤＩＣＡ−５００、ＢｉｏＡｓｓｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＵＳＡ）を用い、有機溶媒の抽出過程でＣａ２＋イオンが全て除去されたことを確認した。
【００７６】
実施例２：組成物の製造
前記精製された豚肺抽出リン脂質画分（ＴＰＦ）を１０ｍｉｃｒｏＭ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ／ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ｐＨ５．８）溶液に混濁させて使用した。ＴＰＦの最終濃度は２０ｍｇ／ｍｌになるように製造した。
【００７７】
実験例：
【００７８】
１）試験材料
−全リン脂質画分（Ｔｏｔａｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎ、ＴＰＦ）、Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、Ｐｉ）
【００７９】
２）実験方法
試験動物
種及び系統：Ｃ５７ＢＬ／６（Ｆｅｍａｌｅ）
【００８０】
供給源及び生産者：マウスは、（株）中央実験動物（ソウル、韓国）によって生産された品種の供給を受けた。
【００８１】
入手及び試験物質の処理：６週齢に入手して７日間適応させた後、マグネット（ｍａｇｎｅｔ）を用いた褥瘡を誘導する。その後、試験物質（ｓｉｌｖｅｒ  ｓｕｌｆａｄｉａｚｉｎｅ、４％ＴＰＦ、２％ＴＰＦ＋Ｐｉ）をドレッシング（ｄｒｅｓｓｉｎｇ）で１日に２回、３週間処理する。
【００８２】
群の構成及び試験デザイン
【００８３】
2020526585.tif 000003
【００８４】
表１は、群の構成及び処理容量の設定を示す。
試験評価項目
褥瘡誘導部位の回復レベルの評価：目視評価、ＴＥＷＬ、体重の変化、ｗｏｕｎｄ  ｓｉｚｅ
【００８５】
炎症反応改善の評価：マスト細胞（ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ）、好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）、マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）の浸潤
【００８６】
繊維組織回復の評価：コラーゲンの形成及びI／IIIの構成比率
【００８７】
血管生成の程度の評価：αＳＭＡ発現の確認
【００８８】
皮膚障壁改善の評価：フィラグリン（ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）、インボルクリン（ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）発現の確認
【００８９】
アポトーシス予防の評価：アポトーシス細胞（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ）の確認
【００９０】
褥瘡類似損傷の誘発
Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐｌａｔｅ  Ｉｓｃｈｅｍｉａ／Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ（I／Ｒ）。
【００９１】
I／Ｒサイクルモデルは、以前に報告されている。マウスに麻酔をした後、背中を剃り、皮膚をやさしく引っ張って、平均重量が２．４ｇ及び１，０００Ｇ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｆｏｒｃｅ（直径、１２ｍｍ；厚さ、５ｍｍ）であるセラミック磁石の間に位置させる。筋肉を除いた経皮、真皮組織は、磁石プレートの間に位置して、平均圧力２，０００ｍｍＨｇを受けることができるようにする。１２時間の間隔で虚血と灌流を繰り返して２回繰り返すことができるようにし、各実験の日程に合わせて評価を行う。
【００９２】
ドレッシング
褥瘡の誘発後、褥瘡の発生を目視で確認した後、実験群と対照群の両方とも、褥瘡部位をまず生理食塩水で洗浄した。試験物質で湿らせたガーゼドレッシングで褥瘡部位を覆った後、ＴｅｇａｄｅｒｍＴＭ（３Ｍ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ，ＵＳＡ）を用いて縫合した。固定のために、ＶｅｔＷｒａｐＴＭ（３Ｍ）でさらにラップした。ドレッシングの交換は、１日に２回（午前／夕方）、３週間実施した。
【００９３】
皮膚病変の目視観察評価
虚血で損傷した皮膚組織の様子を評価し、数値化した。観察期間による病変部位の回復を面積で評価した。褥瘡の面積は、近距離目視写真撮影（ＤＳＬＲ、Ｄｅｒｍａｓｃｏｐｅ）を行って測定した。実験群と対照群の両方とも、褥瘡誘発２日目に目視で褥瘡の発生を確認した後、３週間、計１０回にわたって写真撮影を行った。写真が一部消失したもの及び目視で確認しにくいマウスは除いて、８匹の資料を分析に使用した。撮影された褥瘡発生部位は、ｉｍａｇｅＪ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ１．４４（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＵＳＡ）を用いてその面積を計算した。
【００９４】
組織病理学的評価（Ｈ＆Ｅ，Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ  ｂｌｕｅ，Ｍａｓｓｏｎ’ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ，Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ）
組織損傷の発生による様々な皮膚組織の回復を観察するために、褥瘡の誘導後４日、８日、１２日、１６日目にマウスから皮膚組織を分離した後、１０％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定させた後、パラフィンワックスに挿入した。組織切片を、ミクロトームによって５μｍの直列横断面で切断した。切削された組織は、ガラススライド（Ｐｒｏｂｅ  Ｏｎ  ＰｌｕｓＴＭ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＰＡ，ＵＳＡ）に移されて脱脂、脱水を経てＨ＆Ｅ（皮膚組織の変化）、Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ  ｂｌｕｅ（ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、Ｍａｓｓｏｎ’ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ＆Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ（繊維組織の回復）染色を用いて、組織学的分析を実施した。各染色法によって、試験物質が炎症反応及び細胞浸潤の減少と繊維組織の回復に関与するかを評価した。
【００９５】
免疫組織化学染色法
皮膚組織に浸潤した炎症細胞を分別し、皮膚障壁の改善を確認するための特定の抗体を用いて、浸潤した細胞の性質を区別し、皮膚の変化を確認した。炎症反応の改善（ＭＰＯ、ＣＤ６８、ｉＮＯＳ、Ａｒｇ−１）、皮膚障壁の改善（Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ、Ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）、血管の生成（αＳＭＡ）、アポトーシス（ＴＵＮＥＬ）など、虚血損傷の誘発に関与するタンパク質を、特定のマーカーを用いて免疫組織化学染色を実施した後、観察して比較分析した。蛍光イメージは、共焦点レーザー顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）（ＬＳＭ７００，ＺＥＩＳＳ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して取得した。
【００９６】
免疫ブロットアッセイ（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）
分離された皮膚組織をＰＲＯ−ＰＲＥＰ（ｉＮｔＲＯＮ，Ｓｅｏｎｇｎａｍ，Ｋｏｒｅａ）に溶解させた後、１４，０００ｇで２０分間遠心分離して、上層液を実験に使用した。タンパク質の濃度は、ＢＣＡ  ｋｉｔ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ，ＵＳＡ）を使用して定量した。分離された上層液（総タンパク質量３０μｇ）を８〜１２％ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて電気泳動で分離されたタンパク質はＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）にトランスファ（ｔｒａｎｓｆｅｒ）した。トランスファされたＰＶＤＦ  ｍｅｍｂｒａｎｅを５％脱脂粉乳に１時間ｂｌｏｃｋｉｎｇした後、１次抗体（Ｂａｘ，Ｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３，ＧＡＰＤＨ）をｍｅｍｂｒａｎｅと４℃で１２時間反応させ、ＴＢＳＴで洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）した後、１次抗体に対する特異的２次抗体を室温で１時間反応させた。Ｍｅｍｂｒａｎｅの洗浄後、ＥＣＬ溶液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で発色後、ＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ  ＸＲＳ＋Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて測定した。
【００９７】
褥瘡の治癒時に発現する炎症性サイトカインの変化の観察
傷治癒過程に関与する炎症サイトカイン（ＭＣＰ−１、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα）の遺伝子発現変化を、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を用いて比較分析した。総ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して分離された皮膚組織から抽出した。全ＲＮＡ鋳型から一本鎖ｃＤＮＡの合成は、Ｐｒｉｍｅ  ＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＲＴマスターミックス（Ｔａｋａｒａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で行った。生成されたｃＤＮＡを、ＣＦＸ−９６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）と共にｑＰＣＲ  ２ｘ  ＰｒｅＭＩＸ  ＳＹＢＲ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）を使用してリアルタイムＰＣＲを実施した。全ての遺伝子を増幅するのに使用されたＰＣＲは、９５℃で１０分間変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）過程を経た後、４０サイクル（９５℃１０秒、６０℃１５秒、７２℃３０秒）の条件で行われた。発現データは、ΔＣｔ定量化方法を用いてサイクル閾値（Ｃｔ）値で計算した。ＧＡＰＤＨを用いて定量化した。
【００９８】
統計学的有意性の検証
本発明のデータは“（平均±標準偏差）”で表し、各データの統計分析は、正規性分析に従ってｔ−検定を実施した。グループ間で比較してｐ＜０．０５のレベルで有意性を判断した。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）
【００９９】
前記実験例の結果は、下記の通りである。
【０１００】
マウスにおける虚血性皮膚損傷（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ−I／Ｒ）後、褥瘡の形成に対するＴＰＦとプロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）の保護効果の評価
【０１０１】
全リン脂質画分（ＴＰＦ）の褥瘡及び皮膚圧迫潰瘍（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｕｌｃｅｒ）に及ぼす影響を確認した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにI／Ｒ損傷後に形成された褥瘡部位に、生理食塩水、スルファジアジン銀（ｓｉｌｖｅｒ  ｓｕｌｆａｄｉａｚｉｎｅ）（ＳＳ）、４％ＴＰＦ、２％ＴＰＦ＋プロピオン酸（Ｐｉ）をドレッシングした後、傷の面積を比較した。本発明では、簡単で、再現性があり、非侵襲性である実験用マウスモデルを用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで、I／Ｒによる皮膚圧迫潰瘍の発病メカニズムを評価した（図２Ａ）。４％ＴＰＦを追加した試験物質のドレッシング処理は、I／Ｒ後に皮膚圧迫潰瘍の形成を有意に抑制していることを確認した。また、さらに低い濃度である２％ＴＰＦにＰｉを添加した試験物質の処理もまた、４％ＴＰＦと類似のレベルで皮膚圧迫潰瘍の形成を抑制した。I／Ｒによって誘発された褥瘡部位の初期の褥瘡面積の差があるかを比較した結果、実験群（ＳＳ、４％ＴＰＦ、２％ＴＰＦ＋Ｐｉ）と対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）がいずれも、面積がほぼ同一に形成されて、実験前の褥瘡のサイズは同質であることを確認した（図２Ｂ）。ドレッシング処置４日後、４％ＴＰＦ、２％ＴＰＦ＋Ｐｉ処理マウスの褥瘡面積は、対照群マウスの褥瘡面積の約７０〜８５％のレベルで、回復がさらに早く進行していることを示した（図２Ｂ及び図２Ｃ；ＳＳ：９３％、４％ＴＰＦ：７５％、２％ＴＰＦ＋Ｐｉ：８５％）。ただし、初期の褥瘡面積の減少は、２％ＴＰＦ＋Ｐｉを処理した群で多少低い割合を示したが、６日（各２５％、２６％）以降は減少の割合がほぼ同一になる傾向を示した。４％ＴＰＦでドレッシングしたマウスの褥瘡面積のサイズは、ドレッシング後、４日以降に著しく減少し、２％ＴＰＦ＋Ｐｉでドレッシングしたマウスは、６日以降に褥瘡面積が大幅に減少した反面、対照群マウスの傷縫合（ｗｏｕｎｄ  ｃｌｏｓｕｒｅ）時間は、ＴＰＦ処理後の傷縫合時間よりも長く、褥瘡の回復速度に有意差があるものと示された。次に、傷部位の皮膚の水分蒸発に対する皮膚水分損失量（Ｔｒａｎｓｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｗａｔｅｒ  ｌｏｓｓ、ＴＥＷＬ）を測定した（図２Ｄ）。褥瘡や火傷の場合、角質の機能が損傷しているか、又は角質が全てなくなった状態で、水分蒸発が増加するようになる。ＴＥＷＬを測定した結果、ドレッシングの初期には、その差は発見できなかったが、傷のサイズが約５０％以上回復した６日以降には、皮膚水分損失量が、対照群に比べて、ＴＰＦをドレッシングしたグループで全般的に減少する傾向を示した。特に、４％ＴＰＦと２％ＴＰＦ＋Ｐｉとの間の効果差は観察されなかった。また、各試験物質に対する有害性を確認するために、マウスの重量を測定した結果、異常点は見られなかった（図２Ｅ）。本実験の結果は、ＴＰＦが、I／Ｒ後に部分的に皮膚圧迫潰瘍の形成を保護することを示す。中でも、褥瘡の初期回復速度において高濃度（４％）ＴＰＦがさらに良い効果を示したが、その後、低濃度（２％）ＴＰＦにＰｉが添加された試験物質も類似の回復速度を示し、２つの試験物質がいずれも、ＳＳよりもさらに良い効果があることを示した。
【０１０２】
マウスにおけるI／Ｒ損傷後、傷部位の炎症反応に対するＴＰＦとプロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）の効果
【０１０３】
I／Ｒ損傷４日後、炎症細胞の浸潤を観察するために組織学的変化を観察した。治癒しにくい圧迫潰瘍のような条件では、ＲＯＳと様々な酵素を有している好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）の浸潤が固着化しながら慢性炎症状態に至るようになるが、このような潰瘍の治癒は、炎症が制御された後に進行する。また、異常な治癒過程は、繊維症（ｆｉｂｒｏｓｉｓ）を誘発することもあるが、時々、このような繊維性病変は、肥満細胞（ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ）の増加が関与することもある。一般に肥満細胞は、傷治癒過程中に増加し、酵素、ヒスタミン及び様々な活性アミン（ａｍｉｎｅ）で充填された顆粒を放出して炎症を引き起こす。肥満細胞から放出される活性アミンは、周辺血管が漏れる原因となり、したがって、単核細胞が損傷部位に迅速に移動できるようにする。本実験では、トルイジン青（ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ  ｂｌｕｅ）染色を用いて褥瘡形成部位の肥満細胞の浸潤の程度を測定して、炎症反応の程度を観察した（図３）。対照群の場合、I／Ｒによる皮膚損傷時、肥満細胞の浸潤が非常に増加した。しかし、ＳＳ、４％ＴＰＦ及び２％ＴＰＦ＋Ｐｉを処理したグループでは、肥満細胞の浸潤の程度が非常に減少したことを確認できる（図３Ａ及び図３Ｂ）。そして、統計的に、２％ＴＰＦ＋Ｐｉを処理したグループが、肥満細胞の浸潤の抑制に最も良い効果を示している。これらの結果は、ＴＰＦが、炎症反応を媒介する脂肪細胞の浸潤の減少を誘導することによって炎症反応を減少させていることを示し、Ｐｉの添加により、その効果が増加していることを示唆している。
【０１０４】
マウスにおけるI／Ｒ損傷後、傷部位のマクロファージの浸潤に対するＴＰＦとプロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）の効果
【０１０５】
好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）及びマクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）は、炎症及び血管新生を調節してI／Ｒ損傷に関与する。本実験では、皮膚I／Ｒ損傷後、好中球及びマクロファージの浸潤及び活性に対するＴＰＦ及びＰｉの影響を分析した。I／Ｒ損傷後、ドレッシング４日後、真皮のむくみと皮下腺での炎症細胞の浸潤が組織学的に観察された（図４）。そして、ＭＰＯとＣＤ６８抗体を用いて、I／Ｒ後の好中球とマクロファージの浸潤を確認した結果、試験群（ＳＳ、４％ＴＰＦ及び２％ＴＰＦ＋Ｐｉ）を処理したグループでは、好中球とマクロファージの数が、対照群と比較して有意に減少した。これは、ＴＰＦが、好中球及びマクロファージの蓄積又は機能を調節できることを示唆し、低濃度（２％）のＴＰＦと共にＰｉの処理は、高濃度（４％）のＴＰＦとほぼ同一又はそれ以上の効果があることを示している（図４Ａ及び図４Ｃ）。皮膚内の局所微環境は、古典的活性化マクロファージ（ｃｌａｓｓｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）（Ｍ１マクロファージ）と選択的活性化マクロファージ（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）（Ｍ２マクロファージ）の発達を促進させる。Ｍ１マクロファージは、初期の組織損傷反応で観察され、ＭＣＰ−１、ＮＯ、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１２及びＴＮＦαを含む前炎症性媒介体の分泌による炎症を誘導する。その一方で、Ｍ２マクロファージは、初期及び中間段階において必須の役割をするが、炎症の解消を誘導し、組織の復旧を促進する。したがって、本実験は、I／Ｒ部位でＭ１及びＭ２マクロファージの変化を調べた。我々は、まず、各グループ別にｉＮＯＳ（Ｍ１  ｍａｒｋｅｒ）とＡｒｇ−１（Ｍ２  ｍａｒｋｅｒ）  ｍＲＮＡの発現を確認した（図４Ｃ）。I／Ｒ誘導後に増加したｉＮＯＳ  ｍＲＮＡのレベルは、ＳＳ、４％ＴＰＦ及び２％ＴＰＦ＋Ｐｉを処理したグループで有意に減少した。しかし、Ａｒｇ−１のｍＲＮＡのレベルは若干減少する傾向を示したが、統計的に有意ではなかった。免疫ブロットアッセイ（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ）で確認したｉＮＯＳ及びＡｒｇ−１の発現の変化もほぼ同一の傾向を示した（図４Ｃ）。次いで、組織蛍光染色で組織内の浸潤を確認した。I／Ｒ損傷の初期に、Ｍ１及びＭ２マクロファージは非常に増加している。その一方で、ＳＳ、４％ＴＰＦ、及び２％ＴＰＦ＋Ｐｉを処理したとき、総ｉＮＯＳ＋  Ｍ１マクロファージの数は有意に減少し、Ａｒｇ−１＋  Ｍ２マクロファージは若干減少した（図４Ｂ）。ただし、ｉＮＯＳ及びＡｒｇ−１の発現量の変化を比較したとき、褥瘡の初期のＴＰＦによるマクロファージの減少量が、Ｍ１マクロファージにさらに集中している。次に、リアルタイムＰＣＲを用いて、I／Ｒ損傷部位でＭ１マクロファージによって分泌され得る前炎症性サイトカイン及びケモカインＭＣＰ−１、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦαのｍＲＮＡのレベルに対するＴＰＦ及びＰｉの効果を調べた。ＳＳ、４％ＴＰＦ、及び２％ＴＰＦ＋Ｐｉのドレッシングは、I／Ｒ損傷により増加した炎症誘発性サイトカイン及びケモカインのｍＲＮＡのレベルを有意に抑制した（図４Ｄ）。ただし、４％ＴＰＦと２％ＴＰＦ＋��ｉとの間に有意差は示されなかった。本実験によって、４％ＴＰＦ及び２％ＴＰＦ＋Ｐｉが、I／Ｒ後に誘導される好中球及びマクロファージの組織内の浸潤を減少させ、皮膚炎症を緩和させることができることを示唆し、低濃度（２％）のＴＰＦにＰｉの添加は、高濃度（４％）のＴＰＦとほぼ同一の効果を示すことができることを示唆している。
【０１０６】
マウスにおけるI／Ｒ損傷後、アポトーシスの抑制に対するＴＰＦとプロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）の効果
【０１０７】
I／Ｒによって発生した活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）は、皮膚細胞のアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導することができ、２次壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）によって誘発された炎症反応を引き起こすことができる。I／Ｒ誘導で損傷した皮膚のアポトーシスに対するＴＰＦ及びＰｉの効果を確認するために、皮膚組織にＴＵＮＥＬ染色を行った。４日目の皮膚組織のI／Ｒ誘導部位において、４％ＴＰＦ及び２％ＴＰＦ＋Ｐｉをドレッシングしたグループの死滅した細胞数が、対照群マウスと比較して減少したことが確認された（図５Ａ及び図５Ｂ）。さらに、アポトーシスに関与するタンパク質の変化を確認した。Ｂａｘ及びｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３は、アポトーシスが発生したときに活性化されるタンパク質であって、アポトーシスマーカーとして使用される。４％ＴＰＦ及び２％ＴＰＦ＋Ｐｉの処理は、I／Ｒ損傷時に誘導されたＢａｘ及びｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３の活性を減少させた（図５Ｃ）。ただし、２つのグループ間の有意差は発見されなかったが、低濃度（２％）にＰｉの添加で高濃度（４％）ＴＰＦの効果を奏することができることを示した。このような結果は、４％ＴＰＦ、２％ＴＰＦ＋Ｐｉが、皮膚I／Ｒ損傷によって誘導されたアポトーシス細胞の形成及び蓄積を抑制できることを示唆している。
【０１０８】
マウスにおけるI／Ｒ損傷後、傷部位の繊維組織の回復及び血管の生成に対するＴＰＦとプロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）の効果
【０１０９】
皮膚I／Ｒ損傷後、１２日、１６日目に繊維組織の回復に対するＴＰＦ及びＰｉの効果を調べた。１２日目に表皮の再生は、ＴＰＦを処理した全てのグループで完了したが、対照群及びＳＳを処理したグループでは一部進行中であり、むくみ及び出血はほとんど回復した（図６Ａ）。Ｍａｓｓｏｎ’ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅとｐｉｃｒｏ−ｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄによって、真皮内のコラーゲンの含有の程度を比較し、これにより、繊維組織の回復の程度を把握した。対照群に比べて、ＳＳ、４％ＴＰＦ及び２％ＴＰＦ＋Ｐｉを処理した全てのグループで真皮の繊維化された組織が増加したことを確認した。正常真皮は、約８０％のｔｙｐｅIコラーゲンと２０％のｔｙｐｅIIIコラーゲンを含む。一般に創傷後２４時間が経過すると、浸透した線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）がｔｙｐｅIとｔｙｐｅIIIコラーゲンを合成、分泌して新しい基質（ｍａｔｒｉｘ）を形成し始める。肉芽組織（ｇｒａｎｕｌｏｍａ  ｔｉｓｓｕｅ）は、正常な組織よりはｔｙｐｅIIIコラーゲンが著しく増加するが、それでも、ｔｙｐｅIコラーゲンが主な成分をなし、正常組織に近づくほど、ｔｙｐｅIコラーゲンの比率が増加するようになる。我々は、I／Ｒ誘導後、真皮内のコラーゲンの生成比率を見るために、１６日目にｐｉｃｒｏ−ｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄで染色した（図６Ｂ）。I／Ｒ誘導後、ＰＢＳのみを処理した対照群では、真皮上層部に薄く、緑色及び黄色を帯びたｔｙｐｅIIIコラーゲンの比率が相対的に高いことを確認できる。しかし、ＳＳ、４％ＴＰＦ及び２％ＴＰＦ＋Ｐｉをドレッシングした試験群では、深部で見られるように、交差構成を示す、より一層厚く、成熟した赤色、赤黄色のｔｙｐｅIコラーゲン繊維が形成されている。これは、I／Ｒによる皮膚圧迫潰瘍の治癒過程の後半に、組織再構築（ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）を促進しながら、正常な皮膚への早い回復を誘導していることを示唆している。ただし、４％ＴＰＦと２％ＴＰＦ＋Ｐｉとの間の有意差は確認されなかったが、低濃度（２％）のＴＰＦにＰｉの添加で高濃度（４％）ＴＰＦの処理とほぼ同一の効能を示すことができることを示唆している。
【０１１０】
追加的に、皮膚再生過程で微細血管の密度を共に観察するために、αＳＭＡ免疫染色をした結果、微細血管は、主に褥瘡部位の近くに位置した真皮乳頭層と深部に出現した（図６Ａ）。αＳＭＡ−陽性の微細血管の密度は、対照群に比べて試験群で有意に増加し、４％ＴＰＦと２％ＴＰＦ＋Ｐｉとの間の有意差は見られない。
【０１１１】
マウスにおけるI／Ｒ損傷後、皮膚障壁の改善に対するＴＰＦとプロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）の効果
【０１１２】
表皮層の再生は、I／Ｒ損傷後１６日目に全ての群において、完全ではなかったが、ほとんど、上皮の再形成がなされた。I／Ｒ誘導後に回復した上皮の構成及び状態の確認のために、免疫組織化学染色を実施した。図７から確認できるように、Ｓ．Ｓ．、４％ＴＰＦ及び２％ＴＰＦ＋Ｐｉの処理は、上皮細胞の分化の指標であるフィラグリン（ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）とインボルクリン（ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）の発現が対照群に比べて増加した。角質形成細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）は、有棘層（ｓｐｉｎｏｕｓ  ｌａｙｅｒ）の細胞が顆粒層（ｇｒａｎｕｌａｒ  ｌａｙｅｒ）から角質層に最終分化することによって、その形態と生化学的特性を根本的に変化させるもので、表皮の保護膜の機能を獲得する。不溶性角化型ケラチン（Ｋ１、Ｋ１０）がフィラグリンの活動によって凝集し、ケラチンパターンと呼ばれる層状で膜状の構造を形成して、角質層の水分の維持を有効にする機能することもある。細胞膜では、インボルクリン（ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）、ロリクリン（ｌｏｒｉｃｒｉｎ）などの後期角質化過程に有効なタンパク質が、カルシウム依存性トランスグルタミナーゼ（ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）などの多数の酵素活性によって細胞膜の内側に架橋されて不溶性の辺縁帯を形成した後、角質形成細胞を剥がれにくい強靭な層状の構造物に再構成し、保護膜としての機能を完成させるので、表皮層の再生後の分化を通じたこれらの発現は、正常な表皮の構成に重要である。本研究では、I／Ｒ損傷後、高濃度（４％）ＴＰＦ、低濃度（２％）ＴＰＦ＋Ｐｉのドレッシングが、表皮層の早い再生と共に角質形成細胞の分化を誘導して皮膚障壁を改善することによって、正常な皮膚に回復させるのに効果があることを確認した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【国際調査報告】
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