(57)【要約】  本発明は心臓を損傷から保護する方法を提供し、該方法は、ＲＳＫ３とｍＡＫＡＰβとの相互作用、又はそれら分子の一方若しくは双方の発現若しくは活性を阻害する薬学的有効量の組成物を、そうした損傷のリスクを有する患者に投与することで行われる。この組成物は、好ましくは、ｍＡＫＡＰβの発現を阻害するｓｉＲＮＡ構築物、より好ましくはｓｈＲＮＡ構築物の形態である。【選択図】図７
2020527167.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトｍＡＫＡＰに対する低分子ヘアピンリボ核酸（「shRNA」）をコードするベクターを含む組成物。
【請求項２】
前記ｓｈＲＮＡはヒトＲＳＫ３とヒトｍＡＫＡＰとの相互作用を阻害する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
投与を必要とする患者に投与される治療有効量の前記組成物は前記患者を心臓損傷から保護する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ベクターはウイルスベクターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（AAV）である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ｓｈＲＮＡは、ヒトｍＡＫＡＰｍＲＮＡ配列のセンスコピー及びヒトｍＡＫＡＰｍＲＮＡ配列のアンチセンスコピーを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ヒトｍＡＫＡＰｍＲＮＡ配列の前記センスコピー及び前記アンチセンスコピーはループ配列によって分離されている、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記ヒトｍＡＫＡＰｍＲＮＡ配列の前記センスコピー及び前記アンチセンスコピーは１９ヌクレオチド長である、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
前記ベクターは、GGTTGAAGCTTTGAAGAAA（配列番号２５）、GCTAAGAGATACAGAGCTT（配列番号２６）又はGGAGGAAATAGCAAGGTTA（配列番号２７）のヌクレオチド配列の１つに実質的に相補的な配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ベクターは、GGTTGAAGCTTTGAAGAAA（配列番号２５）、GCTAAGAGATACAGAGCTT（配列番号２６）又はGGAGGAAATAGCAAGGTTA（配列番号２７）のヌクレオチド配列の１つを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ベクターは、GGAGGAAATAGCAAGGTTA（配列番号２７）のヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ウイルスベクターはヒトマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）−３０ａ配列を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ウイルスベクターは、５´末端の完全ＡＡＶ２末端逆位反復配列（ITR）及び３´末端の欠失ＡＡＶ２ＩＴＲに隣接するｓｈＲＮＡミニ遺伝子を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ウイルスベクターはトリ心筋トロポニンＴプロモーターを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ウイルスベクターはＳＶ４０ポリアデニル化部位を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＡＡＶはＡＡＶ血清型９である、請求項５に記載の組成物。
【請求項１７】
ヒトｍＡＫＡＰβの発現を阻害する方法であって、ｍＡＫＡＰβをコードするｍＲＮＡを請求項１に記載の組成物に接触させることを含む方法。
【請求項１８】
心臓を損傷から保護する方法であって、薬学的有効量の請求項１に記載の組成物を、そうした損傷のリスクを有する患者に投与することを含む方法。
【請求項１９】
心臓疾患を処置又は予防する方法であって、薬学的有効量の請求項１に記載の組成物を、処置又は予防を必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項２０】
心筋梗塞を処置又は予防する方法であって、薬学的有効量の請求項１に記載の組成物を、そうした損傷のリスクを有する患者に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０１７年７月６日に出願の米国仮特許出願第６２／５２９，２２４号の優先権を主張し、その全体が言及によって本願に援用される。
【０００２】
［政府支援についての記載］
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた契約番号ＲＯ１  ＨＬ  ０７５３９８のもと政府支援により実現した。政府は本発明の所定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
心臓は、多様な刺激に応答して肥大性拡張を許容することができる。肥大性拡張は、ランニング又は水泳などの身体トレーニングの結果として起こり得る。しかしながら、これは外傷の結果としても又は心臓疾患の多様な形態においても起こる。肥大は、心臓が心室壁のストレスを軽減させる主要な機構である。成長に腔寸法の増大が付随しない場合、これは求心性心肥大と呼ばれる。肥大は、タンパク質合成及び個々の筋細胞内の筋節の寸法及び組織の増大の結果として起こる。心臓リモデリング及び肥大のより充実した記載については、Ｋｅｈａｔ（2010）及びＨｉｌｌ（2008）のものが参照され、それぞれの全体が本明細書において言及により援用される。有力な見方は、心肥大が心不全に主要な役割を果たすというものである。心不全を処置する従来の方法は、罹患した患者における、後負荷軽減、βアドレナリン受容体（β-AR）の阻害、機械的サポートデバイスの使用を含む。しかしながら、この技術は、心肥大を予防又は処置するさらなる機構を必要としている。
【０００４】
ＡＫＡＰ及び心臓リモデリング
心室筋細胞肥大は、心筋が心筋梗塞、高血圧、及び先天性心疾患、又は神経液性活性化のためストレスを受けると心室壁張力を軽減する、主要な代償性機構である。これは、心筋細胞の非分裂成長、筋原線維組織化、及び胚性期時に通常発現される「胎児」遺伝子の特定のサブセットの上方調節（Frey 2004, Hill 2008）に関連する。同時的な異常心臓収縮、Ｃａ２＋ハンドリング、及び心筋エネルギーは、間質性線維症及び心筋細胞死を含むとともに、心不全及び悪性不整脈を発症するリスクを増加させる不適応性変化に関連する（Cappola 2008, Hill 2008）。心不全は、喫煙及び肥満などのリスク因子によって有病率が増加するので、約６百万の米国人に影響を及ぼすとともに年間発症率が高齢者の１％である症候群である（Roger 2011）。診断後５年生存率が未だ非常に低い（５０％より低い）ことから、この病理学的プロセスに関与する分子機構を定めるため、数年来研究が進められている。
【０００５】
心肥大は、Ｇタンパク質結合受容体、サイトカイン受容体、及び成長因子チロシンキナーゼ受容体を含むいくつかの受容体ファミリーを活性化させる多様な神経液性、パラクライン性、及びオートクライン性刺激によって誘発され得る（Brown 2006, Frey 2004）。この文脈において、Ａ−キナーゼアンカータンパク質（AKAP）が、これらの受容体から発する肥大経路を統合する多タンパク質複合体を会合させることができるということが徐々に明らかになっている。特に、近年の研究において、足場タンパク質として機能するとともにストレス信号によって活性化される肥大経路を組織化して調節するのに中心的な役割を果たすｍＡＫＡＰ及びＡＫＡＰ−Ｌｂｃ及びＤ−ＡＫＡＰ１を含むアンカータンパク質を現在特定している。
【０００６】
細胞内シグナル伝達ネットワークにおける「ノード」のまとめ役として、足場タンパク質は、可能性のある治療ターゲットとして興味の対象となっている（Negro 2008）。細胞において、足場タンパク質は、細胞内シグナル伝達における特異性及び有効性の要因となる重要な機構を構成する「シグナロソーム」と呼ばれる多分子複合体を組織化することができる（Scott及びPawson 2009）。第１に、多くのシグナル伝達酵素が広い基質特異性を有している。足場タンパク質は、これらの多面発現性酵素を個々の基質と共に局在化させて、基質の触媒を選択的に向上させるとともに、酵素の活性部位に固有でない特異度を与える（Scott及びPawson 2009）。第２に、一部のシグナル伝達酵素は低含量である。足場タンパク質は、希少酵素をその基質と共に局在化させることができ、シグナル伝達を動態学的に有利にする。第３に、多くの足場が多価であるので、足場結合は、個々の基質エフェクターの複数の酵素による共調節を組織化することができる。筋肉Ａ−キナーゼアンカータンパク質（AKAP6としても既知のmAKAP）は、広い基質特異性を有するタンパク質キナーゼＡ（PKA）及びＣａ２＋／カルモジュリン依存性ホスファターゼカルシニューリン（CaN）などのシグナル伝達酵素と、特に低含量であるｐ９０リボソームＳ６キナーゼ３（RSK3）などのシグナル伝達酵素との両方に結合する、心筋細胞及び骨格筋細胞並びにニューロンに発現される大きい足場である（図１及び図７）（Kapiloff 1999, Michel 2005, Pare 2005, Wang 2015）。ｍＡＫＡＰβは、筋細胞に発現される選択的スプライシングアイソフォームであり、細胞において、内在性膜タンパク質のネスプリン−１αを結合する核膜外膜に局在化される（Pare 2005）。
【０００７】
ｍＡＫＡＰβ「シグナロソーム」は、複数の機構によって心臓リモデリングを調節する（図１及び図７）（Passariello 2015）。一部は構成的に、一部はストレス関連刺激に応答して、多様なシグナル伝達分子一式を結合することで、ｍＡＫＡＰβは、ｃＡＭＰ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）、カルシウム、ホスホイノシチド、及び低酸素ストレスシグナルを伝達する複数のシグナル伝達モジュールを動的に組織化する（Marx 2000, Kapiloff 2001, Dodge-Kafka 2005, Wong 2008, Kapiloff2009, Li 2010, Vargas 2012, Kritzer 2014）。ｍＡＫＡＰは、もともとＰＫＡへの結合によって特定され、ｍＡＫＡＰβシグナロソームは、アデニリルシクラーゼ５、タイプ４Ｄ３ホスホジエステラーゼ（PDE4D3）を含むｃＡＭＰの合成、分解、及び機能に要求される機構のすべてを含み、ｃＡＭＰはタイプＩＩａＰＫＡ及びｃＡＭＰ−１活性化交換タンパク質（Epac1）を標的とする（Kapiloff 1999, Dodge 2001,Dodge-Kafka 2005, Kapiloff  2009）。特に、これらのシグナル伝達酵素のすべては筋細胞リモデリングに関与しており、ＰＫＡのｍＡＫＡＰβへの結合が筋細胞肥大にとって重要であることが示されている（Okumura 2003, Dodge-Kafka 2005, Lehnart 2005, Pare 2005）。さらに、ｍＡＫＡＰβは、ＭＥＫ５及びＥＲＫ５  ＭＡＰ−キナーゼ、３−ホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ−１（PDK1）、ＲＳＫ３、ホスホリパーゼＣε（PLCε）、タンパク質キナーゼＣε（PKCε）、タンパク質キナーゼＤ（PKD, PKCμ）、タンパク質ホスファターゼＣａＮ（Ａβアイソフォーム）及びＰＰ２Ａ、タイプ２リアノジン受容体（RyR2）、ナトリウム／カルシウム交換体ＮＣＸ１、ＨＩＦ１α調節に関与するユビキチンＥ３−リガーゼ、並びにミオポディン（myopodin）（Marx 2000, Kapiloff 2001, Schulze2003, Dodge-Kafka 2005, Michel 2005, Pare 2005, Pare 2005, Dodge-Kafka andKapiloff 2006, Faul 2007, Wong 2008, Kapiloff 2009, Zhang 2011, Vargas 2012, Li, Zhang 2013）など、筋細胞ストレス応答に重要な多種多様な他のタンパク質を結合する。これらのシグナル伝達分子は、ｍＡＫＡＰに結合して、転写因子の低酸素誘導因子１α（HIF1α）、筋細胞エンハンサー因子−２（MEF2）、及び活性化Ｔ細胞の核内因子（NFATc）、並びにタイプＩＩａヒストンデアセチラーゼ（HDAC4/5）（Wong 2008, Li 2010, Li 2013, Kritzer 2014）を共調節する。
【０００８】
心筋細胞におけるストレス関連シグナル伝達分子の足場タンパク質としてのその役割に対応して、インビトロにおけるラットの新生仔心室筋細胞におけるｍＡＫＡＰβ欠乏は、α-アドレナリン、β-アドレナリン、エンドセリン−１、アンジオテンシンＩＩ、及びロイシン阻害因子／ｇｐ１３０受容体シグナル伝達によって誘発される肥大を阻害した（Dodge-Kafka 2005, Pare 2005, Zhang 2011, Guo 2015）。インビボにおいて、短期圧負荷及び慢性β−アドレナリン刺激によって誘発される肥大を抑えるとともに、マウスにおけるｍＡＫＡＰ遺伝子ターゲティングは、長期圧負荷後の心不全の発症を阻害して、生存の恩恵があった（Kritzer 2014）。具体的に、ｍＡＫＡＰｆｌ／ｆｌにおけるｍＡＫＡＰ遺伝子欠失、タモキシフェン誘発性Ｔｇ（Myh6-cre/Esr1*）条件的ノックアウトマウスは、１６週間の大動脈縮窄による筋細胞アポトーシス、及び間質性線維症、左心房肥大、及び肺水腫（浮腫肺重量）を大きく阻害しながら、左心室肥大を低下させた（Kritzer 2014）。
【０００９】
また、ｍＡＫＡＰ遺伝子ターゲティングは、心筋梗塞後に有益である。マウスにおける左前下行枝（LAD）の永続的なライゲーションは、広範な筋細胞死、瘢痕形成、及びその後の左心室（LV）リモデリングを含む、心筋梗塞を起こす。ＬＡＤライゲーションの４週後、ｍＡＫＡＰ条件的ノックアウトマウスは、梗塞のコントロールコホートと比較すると、ＬＶの寸法及び機能を保持した。ｍＡＫＡＰ条件的ノックアウトマウスは、梗塞サイズの顕著な減少を示しながら、コントロールと比較してＬＶの駆出画分及び指標心房重量を保持した。
【００１０】
心筋細胞において、ｍＡＫＡＰβは、ネスプリン−１αとの相互作用によって核膜に局在化される（Pare 2007）。ｍＡＫＡＰβは、α１−アドレナリン受容体（α1- AR）及びβ−ＡＲ、エンドセリン−１受容体、及びｇｐ１３０／白血病阻害因子受容体（特許文献１の図４６Ａ）によって開始される肥大シグナルを統合する大きいシグナル伝達複合体を会合させる（Dodge-Kafka 2005, Pare 2005）。数年にわたり、ｍＡＫＡＰβが心筋細胞肥大を媒介する分子機構及びシグナル伝達経路が広範に研究されている。ｍＡＫＡＰβがホスファターゼカルシニューリンＡβ（CaNAβ）、及び肥大性転写因子の活性化Ｔ細胞核内因子ｃ３（NFATc3）を採用することが現在示されている（Li 2010）。アドレナリン受容体活性化に応答して、アンカーＣａＮＡβは、肥大遺伝子の転写を促進するＮＦＡＴｃ３を脱リン酸化して活性化させる（特許文献１の図４６Ａ）（Li 2010）。ｍＡＫＡＰβ複合体に結合するＣａＮＡβプールの活性化を調節する分子機構は現在のところ完全には解明されていないが、局在Ｃａ２＋貯蔵の動員を必要とすると考えられる。この文脈において、ｍＡＫＡＰはＲｙＲ２のＰＫＡ誘発リン酸化を促進させ（Kapiloff 2001）、これが、核周囲Ｃａ２＋放出の調節によってＣａＮＡβを活性化させ得るということが示されている（特許文献１の図４６Ａ）。この仮説によると、ｍＡＫＡＰβからＰＫＡアンカードメインを欠失させることでｍＡＫＡＰ媒介肥大応答を抑制するということが示されている（Pare 2005）。一方で、近年の発見により、ｍＡＫＡＰβはまたホスホリパーゼＣε（PLCε）を結合し、ラットの新生仔心室筋細胞における内在性ｍＡＫＡＰβ−ＰＬＣε複合体の崩壊がエンドセリン１誘発肥大を阻害するということが示されている（Zhang 2011）。このことは、ｍＡＫＡＰβによってＰＬＣεを核膜にアンカリングすることで肥大リモデリングを調節するということを提示する。ゆえに、核膜において、ＰＬＣεがイノシトール１、４、５−トリスフォスフェートの生成を促進し得、これが、局在Ｃａ２＋貯蔵の動員によって、ｍＡＫＡＰβに結合するＣａＮＡβ及びＮＦＡＴｃ３の活性化を促進し得るということも考えられる（特許文献１の図４６）。
【００１１】
心筋細胞において、ｍＡＫＡＰ複合体内のＰＫＡ活性化の動態は、アンカータンパク質に直接的に結合するＡＣ５（Kapiloff 2009）及びＰＤＥ４Ｄ３（Dodge-Kafka 2005,Dodge 2001）によって厳密に調節されている。ｍＡＫＡＰ結合ＡＣ５及び上流β−ＡＲは、核膜に近接する横行小管内に局在化されている（Escobar 2011）。ｃＡＭＰレベルの上昇に応答して、ｍＡＫＡＰ結合ＰＫＡは、ＡＣ５及びＰＤＥ４Ｄ３の両方をリン酸化する（Dodge-Kafka 2005, Dodge 2001, Kapiloff 2009）。このことがＡＣ５不活性化とＰＤＥ４Ｄ３活性化を誘導し、ｃＡＭＰ濃度を局所的に低下させてアンカーＰＫＡの不活性化を誘導する（特許文献１の図４６Ａ）。ＰＤＥ４Ｄ３の脱リン酸化は、これもｍＡＫＡＰβに会合するホスファターゼＰＰ２Ａによって媒介される（特許文献１の図４６Ａ）（Dodge-Kafka 2010）。よって、これらの発見は、ｍＡＫＡＰ複合体がＰＫＡ活性の周期的パルスを生成し、仮説が生細胞イメージング研究によって実験的に裏付けられたということを提示する（Dodge-Kafka 2005）。
【００１２】
ＡＫＡＰ及び低酸素
心筋の酸素レベルは心機能を持続させるために限られたレベル内に維持する必要がある。虚血発作時に、酸素供給低下状態（低酸素と呼称される）に応答して、心筋細胞は、酸素低下に適応するために必要な広範囲の細胞応答を促進する転写因子である、低酸素誘導因子１α（HIF-1α）を動員する（Semenza 2007）。ＨＩＦ−１αによって活性化される転写応答は、細胞生存、酸素輸送、エネルギー代謝、及び血管形成を調節する（Semenza 2007）。正常酸素条件では、ＨＩＦ−１αは、プロリルヒドロキシラーゼドメインタンパク質（PHD）によって２つの特定のプロリン残基においてヒドロキシル化され、その後フォン・ヒッペル・リンドウタンパク質によって認識及びユビキチン化される（Jaakkola 2001, Maxwell 1999）。ユビキチン化されたＨＩＦ−１αは分解のためプロテアソームに標的化される。一方で、酸素濃度が下がると、ＰＨＤタンパク質の酵素活性が阻害される。さらに、ＰＨＤタンパク質は、「セブン・イン・アブセンシア・ホモログ２（Siah2）」と呼称されるＥ３リガーゼによってユビキチン化され、プロテアソーム分解に標的化される（Nakayama 2004）。これは、ＨＩＦ−１α分解を阻害し、低酸素への適応応答に必要とされる遺伝子転写を促進する核におけるタンパク質蓄積を可能にする。この発見によると、外来性ＨＩＦ−１αの送達により、心筋梗塞後の心機能が改善する（Shyu 2002）一方で、ＨＩＦ−１αの心臓での過剰発現が梗塞サイズを小さくし、毛細血管形成を促進する（Kido 2005）。
【００１３】
近年の発見では、ｍＡＫＡＰがＨＩＦ−１α、ＰＨＤ、フォン・ヒッペル・リンドウタンパク質、及びＳｉａｈ２を含むシグナル伝達複合体を会合させることが示されている（Wong 2008）。これにより、ＨＩＦ−１αをその上流制御因子に、及び核内のその作用部位に近接して配置する。この構成において、正常酸素条件において、ｍＡＫＡＰ複合体に会合する負制御因子がＨＩＦ−１α分解を促進する（Wong 2008）。一方で、低酸素時に、ｍＡＫＡＰ複合体内でのＳｉａｈ２の活性化はＨＩＦ−１α安定化を促進し、転写因子が転写誘導可能にする（Wong 2008）。ゆえに、ｍＡＫＡＰは、酸素濃度の変化に応答して心筋細胞におけるＨＩＦ−１αの分解又は安定化を促進可能な高分子複合体を会合させる。この文脈において、ｍＡＫＡＰは、冠血流が低下する又は妨げられるとき、心虚血時において心筋細胞保護に重要な役割を果たし得る。心筋細胞においてＨＩＦ−１α安定化を調節する分子経路を調整することで、ｍＡＫＡＰは、解糖誘導（低酸素条件下でＡＴＰ産生を最大化する）、ミトコンドリア呼吸の効率、及び虚血時の細胞生存を調節するＨＩＦ−１α媒介転写応答を促進し得る（Semenza 2009）。
【００１４】
ＲＳＫ及び心臓リモデリング
心筋細胞を非分裂成長させる筋原線維会合は、負荷増大に対する心臓の主要な応答である（Kehay 2010）。筋細胞肥大自体は、高血圧及び心筋梗塞などの疾患において代償的であり得るが、肥大シグナル伝達ネットワークの活性化はまた、遺伝子発現の変化（「胎児」）、及び細胞アポトーシスの増加、及び間質性線維症をもたらし、左心室肥大が心不全の主要なリスク因子であるというようになる。病的な肥大の現行の治療は、一般に、上流細胞膜受容体及びイオンチャンネルの阻害によるシグナル伝達経路の広範な下方調節に限られる（McKinsey 2007）。新規の薬剤ターゲットは、アイソフォーム特異性、又は特有の多分子シグナル伝達複合体との会合のため肥大シグナル伝達ネットワーク内で特徴的な経路を調節するシグナル伝達酵素の特定によって明らかにされ得る。
【００１５】
ｐ９０リボソームＳ６キナーゼ（RSK）は、多くの肥大刺激によって筋細胞で増大する活性を有する多面発現性細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）エフェクターである（Anjum 2008, Sadoshima 2005,Kodama 2000）。さらに、ＲＳＫ活性の増大は、末期拡張型心筋症の患者の外植した心臓で検出されている（Takeishi2002）。遍在的に発現され、基質特異性において重複する４つの哺乳動物ＲＳＫファミリーメンバーが存在する（Anjum2008）。ＲＳＫは、Ｎ末端キナーゼドメイン及びＣ末端キナーゼドメインの２つの触媒ドメインを含むという点で特有である（特許文献１の図４Ａ、Anjum 2008）。Ｎ末端キナーゼドメインはＲＳＫ基質をリン酸化し、それぞれＥＲＫ（ERK1,ERK2, 又はERK5）及び３´−ホスホイノシチド依存性キナーゼ１（ＰＤＫ１）によるＣ末端キナーゼドメイン及びＮ末端キナーゼドメインの連続的なリン酸化によって活性化される（Anjum 2008）。
【００１６】
ＲＳＫは、足場タンパク質を結合することで、細胞内コンパートメント内に特異的に局在化されて、足場タンパク質筋肉Ａ−キナーゼアンカータンパク質（mAKAP）に結合するときアイソフォーム特異的シグナル伝達様のものを与えることができる（Michael2005）。ＲＳＫのＰＤＫ１活性化は、組換え系においてｍＡＫＡＰ足場と共に発現させることで向上した。心筋細胞において、ｍＡＫＡＰβ（筋細胞において発現される選択的スプライシングフォーム）は、多様な酵素、イオンチャンネル、及び転写因子一式を結合することで、ｃＡＭＰ、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ、Ｃａ２＋、及び低酸素シグナルを伝達するシグナロソームを組織化する（Kritzer 2012）。
【００１７】
米国において、心不全は５．７百万人に影響を及ぼし、年間９１５，０００の新しい症例が診断されている（Writing Group 2016）。心不全の有病率及び発症率は増加しており、これは、主に寿命延長のためであるが、リスク因子（高血圧、糖尿病、脂質異常症、及び肥満）の有病率増加、及び他のタイプの心血管疾患（心筋梗塞［ＭＩ］及び不整脈）の生存率増加のためでもある（Heidenreich 2013）。心不全の患者の第一選択療法は、そうした患者の生存性及びクオリティ・オブ・ライフを向上するとともに、左心室機能障害を有する患者の死亡率を下げることができるアンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害剤及びβ−アドレナリン受容体遮断剤（β−遮断剤）を含む（Consensus1987）。その次の又は代替の療法は、アルドステロン及びアンジオテンシンＩＩ受容体遮断剤、ネプリライシン阻害剤、ループ利尿剤及びチアジド利尿剤、血管拡張剤、及びＩｆ電流遮断剤、並びにデバイス使用療法を含む（Ponikowski 2016）。それにもかかわらず、症候的心不全の５年死亡率は依然として５０％であり、ＭＩ後の４０％を超える死亡率を含む（Heidenreich 2013, Gerber 2016）。心不全の患者を処置するための新しく有効な治療の開発、並びに冠動脈疾患、高血圧、及び弁膜疾患など他の心血管疾患に関連するその発症の予防がまさに求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】米国特許第９，１３２，１７４号明細書
【発明の概要】
【００１９】
以下の簡単な概要は、本発明のすべての特徴及び態様を含むことを意図せず、本発明がこの概要に記載されるすべての特徴及び態様を含む必要があるということを示唆するものではない。
【００２０】
本発明者らは、特有のタンパク質とタンパク質との相互作用を標的とする薬剤を使用して個々のｍＡＫＡＰシグナル伝達複合体のシグナル特性を阻害することで、心臓病理学的プロセスを処置する方法を発見した。そうした治療方法は、規定の細胞応答の選択的阻害を可能にするため、従来の治療アプローチに対する利点を与える。
【００２１】
特に、本発明者らは、ｍＡＫＡＰ媒介のタンパク質とタンパク質との相互作用を阻害することが、心肥大をもたらすリモデリングプロセスを開始させる主要転写因子の活性化において中心的役割を果たす酵素の活性化を調節するｍＡＫＡＰの能力を阻害するために使用可能であるということを発見した。
【００２２】
具体的に、発明者らは、タイプ３リボソームＳ６キナーゼ（RSK3）とｍＡＫＡＰβとの結合相互作用を阻害することで、例えば圧負荷及び高レベルのカテコールアミンへの長期暴露など、種々の物理的ストレスによっておこる損傷から心臓を保護することができる。
【００２３】
このように、本発明は、所定の態様において、心臓を損傷から保護する方法を含み、該方法は、ＲＳＫ３とｍＡＫＡＰβとの相互作用を阻害する薬学的有効量の組成物を、そうした損傷のリスクを有する患者に投与することで行われる。
【００２４】
また、本発明は、ＲＳＫ３とｍＡＫＡＰβとの相互作用を阻害する薬学的有効量の組成物を患者に投与することで心疾患を処置する方法に関する。
【００２５】
また、本発明は、ＲＳＫ３とｍＡＫＡＰβとの相互作用を阻害する組成物に関する。
【００２６】
さらに他の実施形態において、阻害剤は、ＲＳＫ３及びｍＡＫＡＰβの発現又は活性を阻害する任意の分子を含む。
【００２７】
上述及び他の本発明の目的、特徴、及び利点は、同様の参照符号が種々の図面において同じ部分を指す添付の図面に示されるように、以下の本発明の好ましい実施形態のより具体的な記載から明らかになる。図面は、必ずしも正確な縮尺ではなく、代わりに本発明の原理を示すことに重点が置かれている。
【００２８】
本特許又は出願願書は、少なくとも１つの色付き図面を含む。色付き図面を含むこの特許又は特許出願公開公報の写しは、申請及び必要手数料支払いの上、特許庁から提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、ＲＳＫ３シグナル伝達のモデルを示す。α１−アドレナリン受容体（α1-AR）刺激及び可能性のある他の上流シグナルから誘発されたＭＡＰ−キナーゼシグナル伝達は、核周囲のｍＡＫＡＰβシグナロソームを含むアンカー部位においてＰＤＫ１と併せてアンカーＲＳＫ３を活性化させる。ＲＳＫ３のターゲットは、サイトゾルタンパク質及び核タンパク質、特に肥大遺伝子発現の調節に関与するものを含むことができる。
【図２】図２は、ヒトＲＳＫ３のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図３】図３は、ラットｍＡＫＡＰのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。この文書内では、ｍＡＫＡＰ配列の参照は、「ｍＡＫＡＰβ」又は「ｍＡＫＡＰ」と記載されていても、ｍＡＫＡＰβ全体に含まれるとともに、この図に示すように当初記載のｍＡＫＡＰ配列と同一である、ｍＡＫＡＰα選択的スプライシングフォームのナンバリングによるものである（Kapiloff 1999, Michel 2005）。また、「ｍＡＫＡＰ」は、引用データベース及び文献において「ＡＫＡＰ６」とも言及される。
【図４】図４は、ｃＤＮＡクローニング、インビトロ翻訳、及びイムノブロッティングによる内在性ＲＳＫ３の検出を示す。図４（ａ）は、全ヌクレオチド（配列番号２１）及びヒトＲＳＫ３の推定アミノ酸配列（配列番号２２）を示す。（Zhao 1995）配列は全長ｃＤＮＡクローンに由来する。推定ＲＳＫ３タンパク質配列は、７３３コドンオープンリーディングフレームに先行する第１のメチオニン残基で開始され、アスタリスクで終端する１文字のアミノ酸コードで示される。既知のタンパク質キナーゼのなかでも高保存アミノ酸残基は太字で示される。特有のＲＳＫ３のＮ末端領域（ＲＳＫ１又はＲＳＫ２に相同性を有しない）には下線を引いており、推定上の２つの核ターゲティングモチーフは括弧で示される。第１のメチオニン上流のフレーム内終止コドンが示されている（＊＊＊）。このヌクレオチド配列は、ＥＭＢＬ−ＧｅｎＢａｎｋデータライブラリーに寄託されて、受託番号Ｘ８５１０６を割り当てられている。図４（ｂ）は、ＲＳＫ３のインビトロ翻訳を示す。インビトロ転写物は、単独のベクターからＴ７ポリメラーゼで（レーン１）、又はＴ７ポリメラーゼ（レーン２、センス方向）若しくはＳｐ６ポリメラーゼ（レーン３、アンチセンス方向）を使用してＲＳＫ３挿入物を有するベクターから、生成された。その後のインビトロ翻訳を［３５Ｓ］メチオニンの存在下でウサギ網赤血球ライセートにおいて行った。そして、タンパク質をＳＤＳＰＡＧＥ（１０％ポリアクリルアミド）によって分解し、その後オートラジオグラフィーを行った。図４（ｃ）は、ＲＳＫ３特異的抗血清でのイムノブロッティングを示す。抗血清Ｎ６７をＲＳＫ３の特有のＮ末端領域（残基7〜20）由来ペプチド（KFA VRRFFSVYLRR）に対して起こした。この実施例では、ヒト皮膚線維芽細胞由来のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後のウエスタンイムノブロッティングによって分離した。ブロットを免疫前血清又はＮ−６７でプローブした。Ｎ−６７を使用するとき８３ｋＤａのバンドを検出した（Zhao 1995)。
【図５Ａ−Ｂ】図５Ａ−Ｂは、ヒトＲＳＫ３のヌクレオチド配列（配列番号２３）を示す。
【図６Ａ−Ｄ】図６Ａ−Ｄは、ラットｍＡＫＡＰのヌクレオチド配列（配列番号２４）を示す。
【図７】図７はｍＡＫＡＰシグナロソーム誘導病理学的リモデリングを示す。ＥＲＫ経路はストレスシグナル伝達によって活性化される。アンカーＲＳＫ３はＥＲＫ及び３’ホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ１（PDK1）触媒リン酸化によって活性化される（Martinez 2015）。ｍＡＫＡＰβ結合カルシニューリン（CaN）は、ＭＥＦ２Ｄ及びＮＦＡＴｃ転写因子の活性化に重要である（Li 2010, Li2013）。ｍＡＫＡＰβアンカータンパク質キナーゼＤ（PKD）はタイプＩＩａヒストンデアセチラーゼを脱リン酸化し、遺伝子発現を抑制解除する（Zhang 2013, Kritzer 2014）。これらの経路は共に病理学的遺伝子発現を促す。
【図８Ａ−Ｄ】図８Ａ−Ｄは、ｓｈＲＮＡ配列（#1-3）に印をつけた参考配列ＸＭ＿０１７０２１８０８．１である、ヒトｍＡＫＡＰ（AKAP6）ｍＲＮＡ配列を示す（配列番号２９）。ナンバリングはヌクレオチド配列のためのものである。コードされたアミノ酸は上述されている。
【図９】図９はｐｓｃＡ−ＴｎＴ−ｍＡＫＡＰ  ｓｈｒｎａ（#3）プラスミドのマップを示す。
【図１０Ａ−Ｂ】図１０Ａ−Ｂは、主要な特徴及び一部制限酵素部位が示されたｐｓｃＡ−ＴｎＴ−ｍＡＫＡＰ  ｓｈｒｎａ（#3）プラスミドのヌクレオチド配列（配列番号３０）を示す。
【図１１】図１１はｓｃＡＡＶ−ｍＡＫＡＰ−ｓｈＲＮＡ生物学的薬剤の設計を示す。Ａ．ｍＡＫＡＰ  ｍＲＮＡ配列はヒト（配列番号３１）、ブタ（配列番号３２）、マウス（配列番号３３）及びラット（配列番号３４）を構成する。ボックス内配列はｓｈＲＮＡターゲット＃３である。Ｂ．ＡＡＶ設計を示す。トランケートした右ＩＴＲは自己相補性を与える。ｃＴｎＴは心筋細胞特異的プロモーターである。Ｃ．５×１０１１ｖｇのｓｃＡＡＶ−ｍＡＫＡＰ−ｓｈＲＮＡ＃３又はｓｃＡＡＶ−コントロール−ｓｈＲＮＡ（ランダム配列を含む）を成体マウスに注射後３週間のｍＡＫＡＰβの心臓全抽出物におけるウエスタンブロットを示す。ＮＩは非注射コントロールを示す。
【図１２】図１２は、ＭＩ後のｍＡＫＡＰβの阻害がＣ５７ＢＬ／６マウスにおける左心室（LV）収縮期機能障害を改善することを示す。Ａ．実験設計を示す。左前壁冠動脈生存手術における永続的結紮によって心筋梗塞（MI）を誘発した。偽手術マウスは冠動脈結紮以外を受けた。ＡＡＶＩＶはＡＡＶバイオロジックの尾静脈注射を表す。Ｂ．ＭＩ後３日のｓｃＡＡＶ−ｍＡＫＡＰ−ｓｈＲＮＡ＃３（shR-mAKAP-MI）静脈内単一投与は、ＭＩ後２日目〜２、４、及び８週目の駆出画分（EF）の正常化によって示されるように、収縮期機能障害の改善をもたらした。一方、ｓｃＡＡＶ−コントロール−ｓｈＲＮＡ（shRNA-Ctrl-MI）で処置したマウスは、虚血傷害後ＥＦの進行的悪化を示した。ＭＩ後８週で、ｍＡＫＡＰ−ｓｈＲＮＡ−ＭＩのＥＦは、ｍＡＫＡＰ−及びコントロール−ｓｈＲＮＡ−注射偽手術動物と有意に相違するものではなかった（44.3±3.3 vs. 54.6±1.7& 54.5±2.0 %）が、コントロール−ｓｈＲＮＡ−ＭＩ動物のものより有意に大きかった（18.0±4.3%, P<0.0001）。
【図１３】図１３は、図１２の研究におけるマウスの死後の重量分析を示す。ｓｃＡＡＶ−ｍＡＫＡＰ−ｓｈＲＮＡ＃３処置は、心臓重量全体、両室重量、心房重量、及び浮腫肺重量を改善した。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
上述のように、ＡＫＡＰ由来シグナル伝達複合体は、生理学的及び病理学的な心臓でのイベントの調節において中心的役割を果たす。ゆえに、本発明者らは、心臓病理学的プロセスを制限するためのアプローチとしてタンパク質とタンパク質との固有の相互作用を標的とする薬剤を使用して個々のＡＫＡＰシグナル伝達複合体のシグナル特性を阻害することを検討した。そうした治療方法は、規定の細胞応答の選択的阻害を可能にするため、従来の治療アプローチに対する利点を与える。
【００３１】
ｍＡＫＡＰを含むアンカータンパク質は、心肥大及び心不全の処置の治療ターゲットである。特に、本発明者らは、ＡＫＡＰ媒介のタンパク質とタンパク質との相互作用を阻害することが、心肥大をもたらすリモデリングプロセスを開始させる主要転写因子の活性化において中心的役割を果たす酵素の活性化を調節するｍＡＫＡＰの能力を阻害するために使用可能であるということを発見した。
【００３２】
特に、発明者らは、タイプ３リボソームＳ６キナーゼ（RSK3）が特有のＲＳＫ３のＮ末端ドメインを介してｍＡＫＡＰβを直接的に結合することを発見し、新しい酵素足場相互作用を規定した。発明者らは、アンカーＲＳＫ３が同心的な心筋細胞成長を調節することを発見し、病的な心肥大の治療介入のためのアイソフォーム特異的ターゲットを明らかにした。ＲＳＫ３−ｍＡＫＡＰβを阻害し得るそうしたペプチドの送達は、転写ペプチドのトランスアクチベーター及びポリアルギニンテイルなどの細胞透過性配列、又はステアレートなどの脂肪由来基とのコンジュゲーションの使用によって向上することができる。また、ペプチド模倣（すなわち、元の配列における構造的に変化を伴うペプチドは、ペプチドの構造的及び機能的特性に影響なくエキソプロテアーゼ及びエンドプロテアーゼに対して保護を与える）の使用によって、安定性を向上させることができる。あるいは、特許文献１の図４１に示すように、ペプチドは、ウイルス由来遺伝子治療ベクターによる細胞内発現によって送達され得る。
【００３３】
また、発明者らは、低分子ディスラプターがＡＫＡＰ由来複合体内の特定の相互作用を標的とするために使用可能であるということを発見した。低分子ディスラプターは、合理的設計とスクリーニング手法とを組み合わせて特定可能である。そうした化合物は、慢性心不全の処置のため、ＡＫＡＰの特定の結合面を標的とし、心筋細胞においてＡＫＡＰとＰＫＡとの相互作用を阻害し、正常な心臓の収縮を向上させるように設計可能である。
【００３４】
本発明は、ＲＳＫ３とｍＡＫＡＰβとの相互作用によって開始される任意の心臓病態を処置する方法に関する。そうした心臓機能障害は、息切れや倦怠感などの兆候及び症状をもたらし得、高血圧、冠動脈疾患、心筋梗塞、弁膜疾患、原発性心筋症、先天性心疾患、不整脈、肺疾患、糖尿病、貧血症、甲状腺機能亢進、及び他の全身性疾患を含むがこれらに限定されない種々の原因があり得る。
【００３５】
本発明において、本技術分野内の従来の分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技術が使用され得る。そうした技術は文献において十分に説明されている。例えば Sambrook et al, 「Molecular Cloning: A LaboratoryManual」(4th Ed., 2012)「CurrentProtocols in Molecular Biology」 Volumes I-III [Ausubel,R. M., ed. (1994)];「Cell Biology: A Laboratory Handbook」 Volumes I-III [J. E. Celis, 3rd ed. (2005))];「Current Protocols in Immunology」 VolumesI-III [Coligan, J. E., ed. (2005)];「OligonucleotideSynthesis」 (M.J. Gait ed. 1984);「Nucleic Acid Hybridization」 [B.D. Hames& S.J. Higgins eds. (1985)];「Transcription AndTranslation」 [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds.(1984)];「Animal Cell Culture」[R.I. Freshney, ed. (1986)];「Immobilized Cells AndEnzymes」 [IRL Press, (1986)];B. Perbal, 「A Practical Guide To Molecular Cloning」(1984);C. Machida, 「Viral Vectors for Gene Therapy:Methods and Protocols」 (2010);J. Reidhaar-Olson and C.Rondinone, 「Therapeutic Applications of RNAi: Methodsand Protocols」 (2009)が参照される。
【００３６】
以下の定義及び省略形が本明細書において使用される。
ANF  心房性ナトリウム利尿因子
CTKD  Ｃ末端キナーゼドメイン
ERK  細胞外シグナル調節キナーゼ
FBS  ウシ胎仔血清
GFP  緑色蛍光タンパク質
Iso  イソプロテレノール
LIF  白血病阻止因子
mAKAP  筋肉Ａ−キナーゼアンカータンパク質
MI  心筋梗塞
NTKD  Ｎ末端キナーゼドメイン
PDK1  ３´ホスホイノシチド依存性キナーゼ１
PE  フェニレフリン
RBD  ＲＳＫ結合ドメイン
RSK  ｐ９０リボソームＳ６キナーゼ
siRNA  低分子干渉ＲＮＡオリゴヌクレオチド
shRNA  短ヘアピンＲＮＡ
TAC  大動脈縮窄術
【００３７】
他に定義されなければ、本明細書に使用されるすべての技術的及び化学的用語は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似する又は同等の任意の方法及び材料が本発明の実施又は試験において使用可能であるが、好ましい方法及び材料が記載されている。一般的に、細胞及び分子生物学及び分子化学に関して使用される専門語、及びそれらの技術は、周知であり、本技術分野において通常使用されるものである。具体的に規定されていない特定の実験技術は、一般に、本技術分野において周知であるとともに、本明細書において引用及び記載されている種々の一般的でより具体的な参考文献に記載されるような従来の方法によって行われる。明確にするため、以下の用語は下記において定義される。
【００３８】
本発明は、心筋細胞肥大及び／又は機能障害をもたらす種々の細胞内シグナル及び経路をＲＳＫ３とｍＡＫＡＰβとの相互作用が媒介するということを認識する。このように、本発明者らは、心筋細胞肥大及び／又は機能障害を予防及び／又は処置するため、この相互作用を阻害する種々の方法を発見した。
【００３９】
このように、本発明は心臓を損傷から保護する方法を含み、該方法は、ＲＳＫ３とｍＡＫＡＰβとの相互作用を阻害する薬学的有効量の組成物を、そうした損傷のリスクを有する患者に投与することで行われる。「薬学的有効量」は、送達の方法に基づいて経験的に決定可能であり、送達の方法によって変わり得るということが理解される必要がある。
【００４０】
また、本発明は、ＲＳＫ３とｍＡＫＡＰβとの相互作用を阻害する薬学的有効量の組成物を患者に投与することで心疾患を処置する方法に関する。
【００４１】
また、本発明は、ＲＳＫ３とｍＡＫＡＰβとの相互作用を阻害する組成物に関する。特定の実施形態において、これらの阻害組成物又は「阻害剤」は、遺伝子治療送達を含む任意の既知の方法で投与可能なペプチド阻害剤を含む。他の実施形態において、阻害剤は低分子阻害剤であり得る。
【００４２】
具体的に、本発明は心臓を損傷から保護する方法及び組成物に関し、該方法は、（１）ＲＳＫ３とｍＡＫＡＰβとの相互作用を阻害する、（２）ＲＳＫ３とｍＡＫＡＰβとの活性を阻害する、又は（３）ＲＳＫ３とｍＡＫＡＰβとの発現を阻害する薬学的有効量の組成物を、そうした損傷のリスクを有する患者に投与することで行われる。
【００４３】
また、本発明は心臓を損傷から処置又は保護する方法に関し、該方法は、そのＮ末端ドメインによるＲＳＫ３アンカリングによって媒介される細胞プロセスを阻害する薬学的有効量の組成物を、そうした損傷のリスクを有する患者に投与することで行われる。
【００４４】
一実施形態において、組成物はＲＳＫ３ペプチドを含む。好ましい実施形態において、ＲＳＫ３ペプチドは、ＲＳＫ３アミノ酸配列のアミノ末端から得られる。好ましい実施形態において、ＲＳＫ３ペプチドは、ＲＳＫ３アミノ酸配列のアミノ酸１−４２である。
【００４５】
他の実施形態において、組成物は、ＲＳＫ３及びｍＡＫＡＰβのいずれか又は両方の発現を阻害する低分子干渉ＲＮＡのｓｉＲＮＡを含む。好ましい実施形態において、ｍＡＫＡＰβの発現を阻害するｓｉＲＮＡは、短ヘアピンＲＮＡ発現ベクター又は生物学的薬剤（shRNA）の投与後インビボにおいて生成される。
【００４６】
本発明の組成物は直接投与可能である、又はウイルスベクターを使用して投与可能である。好ましい実施形態において、ベクターはアデノ随伴ウイルス（AAV）である。
【００４７】
他の実施形態において、組成物は低分子阻害剤を含む。好ましい実施形態において、低分子はＳＬ０１０１又はＢＩ−Ｄ１８７０である。
【００４８】
他の実施形態において、組成物は、ｍＡＫＡＰβの結合、発現又は活性を阻害する分子を含む。好ましい実施形態において、分子はｍＡＫＡＰβペプチドである。分子は、アデノ随伴ウイルス（AAV）を含むウイルスベクターを使用して発現することができる。
【００４９】
さらに他の実施形態において、組成物は、ＲＳＫ３媒介細胞プロセスを妨害する分子を含む。好ましい実施形態において、分子は、そのＮ末端ドメインによるＲＳＫ３のアンカリングを妨害する。
【００５０】
また、本発明は、ＲＳＫ３とｍＡＫＡＰβとの結合相互作用が、直接的に、又はＲＳＫ３とｍＡＫＡＰβとの結合における下流での作用を測定することで、測定される、心臓疾患の傾向を判断するための診断アッセイに関する。また、本発明はそうしたアッセイのための試験キットを提供する。
【００５１】
さらに他の実施形態において、阻害剤は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、及びｓｈＲＮＡを含む低分子干渉ＲＮＡ（siRNA）を含む、ＲＳＫ３及びｍＡＫＡＰβの発現を阻害する任意の分子を含む。
【００５２】
また、本発明は、ＲＳＫ３及びｍＡＫＡＰβの発現及び／又は結合を阻害するために有効な、可能性のある薬剤のスクリーニングのためのアッセイ系を含む。一態様において、被験薬剤は、コントロールとの比較によって、ＲＳＫ３及びｍＡＫＡＰβの結合活性におけるその作用を測定するために、ＲＳＫ３及びｍＡＫＡＰβ、又はＲＳＫ３及びｍＡＫＡＰβを含有する抽出物を含む細胞サンプルに投与することができる。また、本発明はそうしたアッセイのための試験キットを提供する。
【００５３】
本発明のペプチド組成物の調製において、ＲＳＫ３（図２）又はｍＡＫＡＰβ（図３）のアミノ酸配列のすべて又は一部が使用可能である。一実施形態において、ＲＳＫ３タンパク質のアミノ末端領域は阻害剤として使用される。好ましくは、ＲＳＫ３アミノ末端の少なくとも１０個のアミノ酸が使用される。より好ましくは、ＲＳＫ３アミノ末端の約１８個のアミノ酸が使用される。最も好ましくは、ＲＳＫ３アミノ末端の約１−４２のアミノ酸が使用される。
【００５４】
他の実施形態において、ｍＡＫＡＰ配列の少なくとも１０個のアミノ酸が使用される。より好ましくは、ｍＡＫＡＰ配列の少なくとも２５個のアミノ酸が使用される。最も好ましくは、ｍＡＫＡＰのアミノ酸１６９４−１８３３のペプチド部分が使用される。
【００５５】
種々のアミノ酸置換、欠失、又は挿入も、ＲＳＫ３とｍＡＫＡＰβとの相互作用を阻害する阻害ペプチドの能力を向上させ得るということが理解される必要がある。このような置換突然変異は、非保存的な方法で（すなわち、特定のサイズ又は特性を有するアミノ酸群に属するアミノ酸を、他の群に属するアミノ酸に変えることによって）、又は保存的な方法で（すなわち、特定のサイズ又は特性を有するアミノ酸群に属するアミノ酸を、同じ群に属するアミノ酸に変えることによって）、得られたタンパク質のアミノ酸を変えるために行われ得る。そうして保存的に変えることは、一般的に、得られたタンパク質の構造及び機能において変化が少なくなる。非保存的に変えることは、得られたタンパク質の構造、活性、又は機能をより変化させやすい。本発明は、得られたタンパク質の活性又は結合特性を大きく変えるものではない保存的な変化を含む配列を含むと考える必要がある。
【００５６】
以下は、種々のアミノ酸群の一例である。
非極性Ｒ基のアミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン。
極性無電荷Ｒ基のアミノ酸：グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン。
極性電荷Ｒ基のアミノ酸（ｐＨ６．０で負電荷）：アスパラギン酸、グルタミン酸。
塩基性のアミノ酸（ｐＨ６．０で正電荷）：リジン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０におけるもの）。
【００５７】
他の群は、フェニル基を有するアミノ酸であり得る：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン。
【００５８】
他の群は、分子量によるもの（すなわちＲ基のサイズ）であり得る：グリシン（75）、アラニン（89）、セリン（105）、プロリン（115）、バリン（117）、スレオニン（119）、システイン（121）、ロイシン（131）、イソロイシン（131）、アスパラギン（132）、アスパラギン酸（133）、グルタミン（146）、リジン（146）、グルタミン酸（147）、メチオニン（149）、ヒスチジン（ｐＨ６．０におけるもの）（155）、フェニルアラニン（165）、アルギニン（174）、チロシン（181）、トリプトファン（204）。
【００５９】
特に好ましい置換は、
−  正電荷を維持可能であるように、Ａｒｇに対してＬｙｓ、及びその逆のもの、
−  負電荷を維持可能であるように、Ａｓｐに対してＧｌｕ、及びその逆のもの、
−  遊離−ＯＨを維持可能であるように、Ｔｈｒに対してＳｅｒ、
−  遊離ＮＨ２を維持可能であるように、Ａｓｎに対してＧｌｎ、である。
【００６０】
また、アミノ酸置換は、特に好ましい特性を有するアミノ酸を置換するために導入することができる。例として、Ｃｙｓは、他のＣｙｓとのジスルフィド架橋のための候補部位として導入することができる。Ｈｉｓは、特に「触媒の」部位として導入することができる（すなわち、Ｈｉｓは、酸又は塩基として作用し得、生化学的触媒における最も一般的なアミノ酸である）。Ｐｒｏは、タンパク質の構造においてβターンを誘発するその特に平面である構造のため、導入することができる。少なくとも約７０％の（好ましくは少なくとも約８０％の、最も好ましくは少なくとも約９０％又は９５％の）アミノ酸残基が同一である、又は保存的置換に相当するとき、２つのアミノ酸配列は「実質的に相同性」である。
【００６１】
同様に、本発明において使用されるヌクレオチド配列にはまた、置換、欠失、又は挿入を行うことができる。特定のアミノ酸をコードするコドンが変性すると、特定のアミノ酸をコードする任意のコドンを使用することができる。さらに、１つのアミノ酸を他のものに置換することが望まれると、既知の遺伝コードに従ってヌクレオチド配列を修飾することができる。
【００６２】
また、ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドを修飾することができる。特に修飾ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの記載のため、参照によってその全体が組み込まれる米国特許第７，８０７，８１６号は、例示の修飾を記載している。
【００６３】
少なくとも約７０％の（好ましくは少なくとも約８０％の、最も好ましくは少なくとも約９０％又は９５％の）ヌクレオチドが同一であるとき、２つのヌクレオチド配列は「実質的に相同」又は「実質的同一」である。
【００６４】
少なくとも約７０％の（好ましくは少なくとも約８０％の、最も好ましくは少なくとも約９０％又は９５％の）ヌクレオチドが同一であるとき、２つのヌクレオチド配列は「実質的に相補」である。
【００６５】
「標準ハイブリダイゼーション条件」という用語は、ハイブリダイゼーション及び洗浄の両方において５×ＳＳＣ及び６０Ｃと実質的に同等の塩条件及び温度条件を指す。しかしながら、当業者は、そうした「標準ハイブリダイゼーション条件」は、バッファーにおけるナトリウム及びマグネシウムの濃度、ヌクレオチド配列の長さ及び濃度、ミスマッチ率、及びホルムアミド率などを含む特定の条件に依存するということ理解するであろう。「標準ハイブリダイゼーション条件」の決定において重要であるのは、ハイブリダイゼーションする２つの配列がＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮ、又はＲＮＡ−ＤＮＡであるかである。そうした標準ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションが典型的に、望まれるならより高い厳密性の洗浄で、予想した又は決定したＴｍより１０〜２０Ｃ低い、周知の製法において当業者によって容易に決定される。
【００６６】
「薬学的に許容される」という用語は、生理学的に許容可能であるとともに、ヒトに投与すると、胃の不調、及びめまいなどのアレルギー性の又類似の有害反応を通常は生じさせない分子実体及び組成物を指す。
【００６７】
「治療有効量」という用語は、心筋細胞の特徴における臨床的に有意な変化を、予防する、好ましくは、少なくとも約３０パ−セント、より好ましくは少なくとも５０パーセント、最も好ましくは少なくとも９０パーセント減少させるために十分な量を意味するように、本明細書において使用される。
【００６８】
有効成分としてポリペプチド、類似体、又は活性フラグメントを含む治療用組成物の調製は、本技術分野において十分に理解されている。典型的には、そうした組成物は、液剤又は懸濁剤としての注射剤として調製されるが、注射の前に液体内の溶解又は懸濁に適する固体形態も調製することができる。また、製剤は乳化させることができる。活性治療成分は、薬学的に許容されるとともに有効成分に適合する賦形剤としばしば混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、又はエタノールなど、及びそれらの組合せである。さらに、望まれるなら、組成物は、有効成分の効果を高める湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤どの少量の補助物質を含むことができる。
【００６９】
ポリペプチド、類似体、又は活性フラグメント、及び低分子阻害剤は、薬学的に許容される中和塩形態として治療用組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、例えば塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、及びマンデル酸などの有機酸とともに形成された、（ポリペプチド又は抗体分子の遊離アミノ基とともに形成された）酸付加塩を含む。また、遊離カルボキシル基から形成された塩は、例えばナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、若しくは水酸化第二鉄塩などの無機塩、又はイソプロピルアミン塩、トリメチルアミン塩、２−エチルアミノエタノール塩、ヒスチジン塩、及びプロカイン塩などの有機塩由来であってもよい。
【００７０】
本発明の治療用組成物は、例えば単位用量の注射によって、従来法で静脈内に投与される。本発明の治療用組成物に関して使用されるとき「単位用量」という用語は、ヒト用の単位投与量として適した物理的に個別のユニットに関し、各ユニットは、必要とされる希釈剤、すなわち担体又はビヒクルを伴って、望まれる治療的作用を生じるように計算された所定量の活性物質を含む。
【００７１】
組成物は、投与製剤に適合する方法において、治療有効量で投与される。投与される量は、処置される対象、有効成分を使用する対象の免疫系の能力、及び所望されるＲＳＫ３−ｍＡＫＡＰβ結合の阻害の程度に対応するものである。投与に必要とされる正確な有効成分量は、医師の判断に対応し、各個人に固有である。しかしながら、適切な投与量は、１日あたり、個人の体重キログラムあたり、約０．１〜２０、好ましくは約０．５〜約１０、及びより好ましくは１〜数ミリグラムの範囲の有効成分であり、投与経路に対応し得る。また、初期の投与及びブースター注射の適切な用法は変わり得るが、初期投与、及びその後の注射又は他の投与による１時間以上の間隔でのその後の再投与が典型とされる。あるいは、血液において１０ナノモル〜１０マイクロモルの濃度を維持するために十分な静脈内持続注入が考慮される。
【００７２】
阻害剤がサイトゾルに達する必要性があることから、本発明におけるペプチドは、細胞膜を横切るその移動を可能にするように修飾する必要があり得る、又はペプチド阻害剤をコードするベクターにより発現する必要があり得る。同様に、核酸阻害剤（ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びアンチセンスＲＮＡを含む）をベクターによって発現可能である。ターゲットとされる細胞に入ることができる任意のベクターを本発明において使用することができる。特に、ウイルスベクターは細胞に「感染」し、望まれるＲＮＡ又はペプチドを発現することができる。細胞に「感染」することができる任意のウイルスベクターを使用することができる。特に好ましいウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（AAV）である。
【００７３】
ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉と呼ばれるプロセスによってターゲットｍＲＮＡの転写を阻害する。ｓｉＲＮＡが、ターゲットｍＲＮＡに対して完全に相補正であるとき、ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ分解を促進することで作用する。ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの特別なタイプとして、オリゴヌクレオチドとして産生されるｓｉＲＮＡに対して所定の利点を有する。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、典型的に実験室おいて合成され、ｓｉＲＮＡを細胞質に送達する送達系を使用して細胞に送達される。対照的に、ｓｈＲＮＡは、ベクターによって細胞核に送達されるミニ遺伝子として発現され、ｓｈＲＮＡが、転写の後、ドローシャやダイサーなどの細胞酵素によって成熟ｓｉＲＮＡ種へとプロセスされる。ｓｉＲＮＡは通常４８時間後に９９％分解される一方、ｓｈＲＮＡは最大３年発現可能である。さらに、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡよりもはるかに少ないコピー数で送達可能であり（５コピー対低ｎＭ）、オフターゲット作用、免疫活性化、炎症、及び毒性を生じることははるかに少ない。ｓｉＲＮＡは、高用量が許容可能な急性疾患病態に適切であるが、ｓｈＲＮＡは、低用量が望まれる慢性の重篤な疾患又は障害に適切である（http://www.benitec.com/technology/sirna-vs-shrna）。
【００７４】
ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡの設計ガイドラインは、Ｅｌｂａｓｈｉｒ（2001）の文献、並びにhttps://www.thermofisher.com/us/en/home/references/ambion-tech-support/rnai-sirna/general-articles/-sirna-design-guidelines.html及びttp://www.invivogen.com/review-sirna-shrna-designを含む種々のウエブサイトにおいて見受けられ、そのすべての全体が参照によって本明細書に援用される。好ましくは、第１ヌクレオチドはＡ又はＧである。２５〜２９ヌクレオチドのｓｉＲＮＡは、より短いものよりも有効であるが、２本鎖長１９〜２１のｓｈＲＮＡは、より長いものほども有効であると考えられる。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、好ましくは１９〜２９ヌクレオチドである。ｓｈＲＮＡにおけるループ配列は３〜９ヌクレオチド長であり得、５、７又は９ヌクレオチドが好ましい。
【００７５】
低分子阻害剤に関して、ＲＳＫ３とｍＡＫＡＰβとの相互作用を阻害する任意の低分子を使用することができる。さらに、ＲＳＫ３及び／又はｍＡＫＡＰβの活性を阻害する任意の低分子を使用することができる。特に好ましい低分子は、エンゾライフサイエンスより入手可能なＢＩ−Ｄ１８７０を含み、
【化１】
2020527167.tif 000003
またミリポアより入手可能なＳＬ０１０１を含む。
【化２】
2020527167.tif 000004
【００７６】
類似の構造及び機能の低分子は、同様に合理性及びスクリーニング手法によって決定可能である。
【００７７】
同様に、ＲＳＫ３及び／又はｍＡＫＡＰβの発現を阻害する任意の低分子を使用することができる。
【００７８】
さらにまた詳細には、本発明は、その好ましい実施形態を示す以下の項によって記載される。
１．ヒトｍＡＫＡＰに対する低分子ヘアピンリボ核酸（「shRNA」）をコードするベクターを含む組成物。
２．ｓｈＲＮＡはヒトＲＳＫ３とヒトｍＡＫＡＰとの相互作用阻害する、項１に記載の組成物。
３．投与を必要とする患者に投与される治療有効量の該組成物は患者を心臓損傷から保護する、項１に記載の組成物。
４．ベクターはウイルスベクターである、項１に記載の組成物。
５．ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（AAV）である、項４に記載の組成物。
６．ｓｈＲＮＡは、ヒトｍＡＫＡＰｍＲＮＡ配列のセンスコピー及びヒトｍＡＫＡＰｍＲＮＡ配列のアンチセンスコピーを含む、項１に記載の組成物。
７．ヒトｍＡＫＡＰｍＲＮＡ配列のセンスコピー及びアンチセンスコピーはループ配列によって分離されている、項６に記載の組成物。
８．ヒトｍＡＫＡＰｍＲＮＡ配列のセンスコピー及びアンチセンスコピーは１９ヌクレオチド長である、項５に記載の組成物。
９．ベクターは、GGTTGAAGCTTTGAAGAAA（配列番号２５）、GCTAAGAGATACAGAGCTT（配列番号２６）、又はGGAGGAAATAGCAAGGTTA（配列番号２７）のヌクレオチド配列の１つに実質的に相補的な配列を含む、項１に記載の組成物。
１０．ベクターは、GGTTGAAGCTTTGAAGAAA（配列番号２５）、GCTAAGAGATACAGAGCTT（配列番号２６）、又はGGAGGAAATAGCAAGGTTA（配列番号２７）のヌクレオチド配列の１つを含む、項９に記載の組成物。
１１．ベクターは、GGAGGAAATAGCAAGGTTA（配列番号２７）のヌクレオチド配列を含む、項１０に記載の組成物。
１２．ウイルスベクターはヒトマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）−３０ａ配列を含む、項４に記載の組成物。
１３．ウイルスベクターは、５´末端の完全ＡＡＶ２末端逆位反復配列（ITR）及び３´末端の欠失ＡＡＶ２ＩＴＲに隣接するｓｈＲＮＡミニ遺伝子を含む、項４に記載の組成物。
１４．ウイルスベクターはトリ心筋トロポニンＴプロモーターを含む、項４に記載の組成物。
１５．ウイルスベクターはＳＶ４０ポリアデニル化部位を含む、項４に記載の組成物。
１６．ＡＡＶはＡＡＶ血清型９である、項５に記載の組成物。
１７．ヒトｍＡＫＡＰβの発現を阻害する方法であって、ｍＡＫＡＰβをコードするｍＲＮＡを項１に記載の組成物に接触させることを含む方法。
１８．心臓を損傷から保護する方法であって、薬学的有効量の項１に記載の組成物を、そうした損傷のリスクを有する患者に投与することを含む方法。
１９．心臓疾患を処置又は予防する方法であって、薬学的有効量の項１に記載の組成物を、処置又は予防を必要とする患者に投与することを含む方法。
２０．心筋梗塞を処置又は予防する方法であって、薬学的有効量の項１に記載の組成物を、そうした損傷のリスクを有する患者に投与することを含む方法。
【００７９】
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために示され、その厳密な範囲は添付の特許請求の範囲において示される。示される方法において、本発明の意図を外れることなく変形を行うことができるということが理解される。
【実施例】
【００８０】
本発明の組成物及びプロセスは、例示のみを意図するとともに本発明の範囲を限定するものではない以下の実施例に関してより十分に理解される。開示の実施形態に対する種々の変更及び変形は当業者に明らかであり、本発明のプロセス、製剤、及び／又は方法に関するものを含むがこれらに限定されないそうした変更及び変形は、本発明の意図及び添付の特許請求の範囲から外れることなくなされ得る。
【００８１】
［実施例１］
〔方法〕
＜試薬＞
市販の抗体及びオリゴヌクレオチドは特許文献１の図１９及び図２０に列挙されている。市販で入手可能なＲＳＫ３抗体は特異性が変わり得る（特許文献１の図２１）。さらなる試薬及び詳細な方法が提供される。
【００８２】
＜ＲＳＫ−／−マウス＞
動物に関わるすべての実験は、マイアミ大学において動物実験委員会により承認されたものである。構成的ＲＳＫ３ノックアウトマウスを１０世代にわたりＣ５７ＢＬ／６マウスに戻し交配した。すべての実験を、実験開始時に８〜１０週齢である同腹仔コントロール及びマウスで行った。以前に記載されたように（Rockman 1991）大動脈縮窄術を行って、イソプロテレノール注入をＡｌｚｅｔ２００２浸透圧ポンプ（Durect）によって行った。Ｖｅｖｏ７７０高解像度イメージングシステム（VisualSonics）において、イソフルラン麻酔下で心エコー法を行った。
【００８３】
＜ＲＮＡアッセイ＞
ｍＲＮＡ種は、単一の反応における複数の転写物を同定してカウントするために蛍光分子バーコード及び単一分子イメージングを使用する、増幅のない直接的かつ多重の遺伝子発現測定であるナノストリングテクノロジーを使用してアッセイを行った。１００ｎｇのＲＮＡを６５℃で一晩、ターゲット特異的コードセットに溶液内でハイブリダイゼーションし、個々のｍＲＮＡはナノストリングデジタルアナライザーを使用してカウントした。
【００８４】
＜統計＞
すべての実験について、ｎは個々のマウス又は個々の筋細胞調製物の数を指す。すべてのデータを平均値±標準誤差として表した。Ｐ値はスチューデントのｔ検定を使用して計算し、多重比較用に補正されていない。反復した記号は種々の桁のＰ値を示す（すなわち、P<0.05, P<0.005等）。また、Ｐ値が提供される多重比較に関わるすべてのデータセットはＡＮＯＶＡにおいて有意であった（α=0.05）。
【００８５】
〔結果〕
＜ｍＡＫＡＰβ：ＲＳＫの足場＞
本発明者らは、ＲＳＫタンパク質及び活性が、脳においてｍＡＫＡＰα複合体に関与するということを以前に記載している（Michel 2005）。本発明者らは、ＲＳＫがまた心筋細胞においてｍＡＫＡＰβとも関与するということをここで示す（特許文献１の図４Ｂ）。ｍＡＫＡＰが優先的に特定のＲＳＫアイソフォームを結合するか測定するため、ヘマグルチニン（ＨＡ）−タグ付きＲＳＫファミリーメンバーをＨＥＫ２９３細胞においてｍＡＫＡＰと共に発現させた。ＲＳＫ１及びＲＳＫ２と対照的に、ＲＳＫ３は、ｍＡＫＡＰαとｍＡＫＡＰβとの両方の共免疫沈降を強く媒介した（特許文献１の図４Ｃ）。ＲＳＫファミリーメンバーは、端部のＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメイン、及び疎水性モチーフ後の小領域を除いて、一次配列において類似する（特許文献１の図４Ａ）。ＲＳＫ３の足場への選択的結合に対応して、ＲＳＫ３のＮ末端ドメインはｍＡＫＡＰβを結合した（特許文献１の図４Ｄ）。
【００８６】
＜新生仔心筋細胞におけるＲＳＫ３機能＞
ＲＳＫファミリーメンバーは、大部分の細胞型において、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ又はｐ３８ではなくＥＲＫによって活性化することができる（Anjum 2008）。ＥＲＫリン酸化はＲＳＫのＮ末端キナーゼドメインのＰＤＫ１リン酸化を許容し、ＲＳＫ  Ｓ２１８のＰＤＫ１リン酸化が酵素の十分な活性化を示すようになる（特許文献１の図４Ａ）。ＥＲＫが心筋細胞においてＲＳＫを活性化させることを示すため、本発明者らは、種々の肥大アゴニスト及び分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ経路阻害剤で新生仔ラット心室筋細胞を処置し、ｐａｎ−ＲＳＫ  Ｓ２１８蛍光体特異性抗体を使用してＲＳＫ活性を検出した（特許文献１の図２１及び図２２）。フェニレフリン（PE）でのα−アドレナリン刺激は、ＭＥＫ１／２−依存性（ERK1/2を活性化）機構及びＭＥＫ５−依存性（ERK5を活性化）機構によってＲＳＫリン酸化を３倍誘発した（特許文献１の図２２）。さらに、ＭＥＫ１／２阻害はＲＳＫベースラインリン酸化を減少させる。ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼ及びｐ３８阻害はＰＥ活性化に影響せず、実際には、ベースラインＲＳＫリン酸化を一定ではなく増加させた。また、ウシ胎仔血清及び白血病阻止因子も活性化ＲＳＫレベルを増加させたが、ＥＲＫリン酸化のためよりもＲＳＫタンパク質総発現の増加のため、よりそのようになった。
【００８７】
類似の結果がＨＡタグ付きＲＳＫ３に見受けられた（特許文献１の図５Ａ）。短期ＰＥ処置は、ＭＥＫ１／２依存性シグナル伝達及びＭＥＫ５依存性シグナル伝達の両方によってＨＡ−ＲＳＫ３  ＥＲＫ（Ｓ３６０）及びＰＤＫ１（Ｓ２１８）部位のリン酸化を誘発した。これらの結果は共に、心筋細胞においてＥＲＫがＲＳＫ活性化の要因となるということを裏付ける。
【００８８】
本発明者らは、ｍＡＫＡＰβ複合体が培養筋細胞肥大に要求されるということを以前に示した（Li 2010, Pare 2005, Dodge-Kafka 2005）。ゆえに、本発明者らは、ＲＳＫシグナル伝達が心筋細胞成長の主要な決定要因であるという仮説を提示した。新生仔筋細胞に、ＲＳＫ３ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルが７５％を超えて低下する低分子干渉ＲＮＡオリゴヌクレオチド（siRNA）を遺伝子導入した（特許文献１の図５Ｂ）。ＲＳＫ３ｓｉＲＮＡは、血清の非存在下又は存在下のいずれで培養した筋細胞のアポトーシスも誘発しなかった（特許文献１の図５Ｃ）。重要な点は、α−アドレナリン刺激の存在下で、ＲＳＫ３ｓｉＲＮＡは形態学的肥大を３４％、及び心房性ナトリウム利尿因子発現を完全に阻害したということである（特許文献１の図５Ｄ〜図５Ｆ及び図２３）。さらに、ＲＳＫ３ｓｉＲＮＡは、白血病阻止因子及びウシ胎仔血清刺激肥大において、より小さいが検出可能な作用を有した。ＲＳＫ３ＲＮＡ干渉により得られた結果は、第２の別のＲＳＫ３ｓｉＲＮＡで確認された。
【００８９】
内在性のＲＳＫ３タンパク質は、他のＲＳＫファミリーメンバーと比較して心筋細胞において比較的低レベルで発現され、長期ＰＥ処置によって発現が誘発される（特許文献１の図２４Ｃ）。結果として、ＲＳＫ３ＲＮＡ干渉は、筋細胞における全ＲＮＡのレベルに影響せず、特異的ＲＳＫ３抗体での免疫沈降後に検出されたＲＳＫを減少させるのみである（特許文献１の図５Ｂ及び図２４Ｃ）。コントロール実験において、ＲＳＫ３ｓｉＲＮＡによるＰＥ誘発肥大の阻害は、不活性化ＨＡ−ＲＳＫ３  Ｓ２１８Ａ突然変異体によってではなく組換えＨＡタグ付きヒトＲＳＫ３の発現によって得られた（特許文献１の図２４Ａ及び図２４Ｂ）。特に、これらの実験において、未刺激筋細胞の断面積は、全ＲＳＫレベルに影響することなくＰＥ処置細胞における内在性ＲＳＫものと同等のレベルで野生型ＨＡ−ＲＳＫ３酵素のアデノウイルスによる発現によって増加した。最後に、ＲＳＫ活性が新生仔筋細胞肥大に重要であることを確認するため、発明者らは、ｐａｎ−ＲＳＫ阻害剤ＢＩ−Ｄ１８７０（特許文献１の図６及び図２５）及びＳＬ０１０１（特許文献１の図２６）（Smith 2005, Sapkota 2007, Malone 2005）を使用し、ＲＳＫ３ｓｉＲＮＡのように、これらの化合物がアゴニスト誘発筋細胞肥大を阻害することを見い出した。
【００９０】
＜ｍＡＫＡＰにおける高親和性ＲＳＫ３結合ドメイン＞
発明者らは、筋細胞肥大におけるＲＳＫ３の要求がＲＳＫ３の特異的シグナル伝達複合体との会合に起因すると考えた。この仮説を検証するため、発明者らは、ＲＳＫ結合の要因であるｍＡＫＡＰドメインを規定した。ＨＡタグ付きＲＳＫ３を異種細胞においてｍｙｃタグ付きｍＡＫＡＰβフラグメントと共に発現させ、ｍｙｃタグ抗体を使用して共免疫沈降させた（特許文献１の図７Ａ及び７Ｂ）。ＲＳＫは優先的にｍＡＫＡＰアミノ酸残基１２８６〜１８３３に会合する一方、ｍＡＫＡＰ２４５〜５８７及び５２５〜１２８６にも弱く会合した。この結果に対応して、残基１２５７〜１８８６を内部欠失させて全長ｍＡＫＡＰβタンパク質に結合するＲＳＫ３は、８５％を超えて減少した。さらなるマッピングにより、ｍＡＫＡＰの主要なＲＳＫ３結合ドメイン（ＲＢＤ）は残基１６９４〜１８３３を含むフラグメントにマッピングされるということが示された（特許文献１の図７Ｃ）。ゆえに、ＲＳＫ３は、残基１７０１〜１８００を内部欠失させた全長ｍＡＫＡＰβタンパク質に不十分に結合した（特許文献１の図７Ｄ）。示されるように、固有のＲＳＫ３のＮ末端ドメインは全長ｍＡＫＡＰβを結合した（特許文献１の図４Ｄ）。ｍＡＫＡＰ  ＲＢＤはまた、Ｎ末端トランケートＲＳＫ３突然変異体（HA-RSK3 DN30）又はＨＡ−タグ付き全長ＲＳＫ２（特許文献１の図７Ｆ）ではなく、ＨＡ−ＲＳＫ３の１〜４２（特許文献１の図７Ｅ）に結合した。この結果は、ｍＡＫＡＰ  ＲＢＤがＲＳＫ３のｍＡＫＡＰへの選択的結合の要因であるということを示唆する。
【００９１】
次に、発明者らは、ｍＡＫＡＰ−ＲＳＫ３結合が直接的であるか試験した（特許文献１の図７Ｇ）。細菌に発現させたＨｉｓ−タグ付きｍＡＫＡＰ１２８６〜１８３３と全長ＲＳＫ３との結合を表面プラズモン共鳴法によって分析した。結合は直接的で高親和性のものであった（ナノモルＫＤ）。発明者らは、活性化させると、ＲＳＫ３は細胞においてｍＡＫＡＰαをさほど結合しない、ということを以前報告した（Michele 2005）。興味深いことに、ＥＲＫ又はＥＲＫとＰＤＫ１と両方のいずれかによる前のＲＳＫ３リン酸化は、会合速度定数の減少により、ｍＡＫＡＰへのＲＳＫ３結合親和性をそれぞれ１／５及び１／８倍減少させた。
【００９２】
＜ＲＳＫ３アンカリングの阻害は新生仔筋細胞肥大を阻害する＞
高親和性ｍＡＫＡＰ  ＲＢＤの特定により、ＲＳＫ３のアンカリングがその機能に重要であるかを試験する機会を得た。緑色蛍光タンパク質−ｍＡＫＡＰ  ＲＢＤ融合タンパク質は、新生仔筋細胞に発現されるとき、内在性ＲＳＫ３及びｍＡＫＡＰβの会合と競合した（特許文献１の図８Ａ）。緑色蛍光タンパク質−ｍＡＫＡＰ  ＲＢＤ融合タンパク質の発現は、ＲＳＫ３  ｓｉＲＮＡと同様に（特許文献１の図５）、ＰＥ誘発肥大を大きく阻害した（特許文献１の図８Ｂ〜５Ｄ）。これらの結果は共に、その固有のＮ末端ドメインによって足場にアンカリングしたＲＳＫ３が培養筋細胞の肥大に要求されるということを示唆する。
【００９３】
＜インビボにおける心肥大でのＲＳＫ３の役割＞
インビトロで得られた結果は、活性ＲＳＫ３が病的な筋細胞肥大の発症に寄与するということを示唆するものであった。新しいＲＳＫ３ノックアウトマウスを使用して、この仮説を裏付けるさらなる証拠を得た。相同組換えによって、終止コドンを、Ｎ末端キナーゼドメインのＡＴＰ結合モチーフをコードするＲＳＫ３（Rps6ka2）遺伝子の第２エクソンに挿入し（Hanks 1988）、ホモ接合ヌルマウスにおいてＲＳＫ３タンパク質の構成的欠失を得た（特許文献１の図２７）。一般に、ＲＳＫ３−／−マウスは形態学的に正常に見え、メンデルの遺伝学にしたがって繁殖させ（特許文献１の図１２）、最大６か月齢まで超過死亡数を示さなかった。任意のストレスの前に、ＲＳＫ３−／−マウスは、一般に正常な心機能を有しており、野生型同腹仔との測定可能な唯一の違いは、心エコー法にて検出される左心室内寸のわずかな増加である（特許文献１の図１３及び図２８）。
【００９４】
本発明者らは、ＲＳＫ３−／−マウスに２週間圧負荷をかけてＲＳＫ３が代償性心肥大に要求されるか試験した（特許文献１の図９Ａ）。心エコー法において、大動脈縮窄術（TAC）によって野生型マウスにおいて後壁厚の３６％の増加を誘発したが、ＲＳＫ３−／−マウスにおいては１６％の増加のみを誘発した（特許文献１の図１０及び図２８）。肥大の減少は、収縮性の変化を伴わなかった（短縮率）。死後の重量分析により、ＴＡＣ後の両室重量の対応する増加はノックアウトマウスにおいて同様に減少することを示した（ＲＳＫ３＋／＋マウスの４８％対ＲＳＫ３−／−マウスの２６％、特許文献１の図１４）。ＴＡＣは主に心筋細胞の求心性成長を誘発する。
【００９５】
小麦胚芽アグルチニン染色心臓切片の検査により、これらの結果に対応して、ＲＳＫ３ノックアウトが筋細胞横断面積のＴＡＣ誘発増加を約４６％抑えるということを明らかにした（特許文献１の図９Ｂ及び図９Ｃ）。ＴＡＣマウスから単離した成体心筋細胞の形態計測分析によって、比例する結果を得た（特許文献１の図９Ｄ〜図９Ｇ）。
【００９６】
ＲＳＫ３−／−心臓表現型を分子レベルで特徴づけるため、発明者らは、心臓リモデリング又は肥大シグナル伝達に関与するタンパク質をコードする３０遺伝子の心臓における発現の違いについて調査した（特許文献１の図１１）。このグループの約２／３の遺伝子がＴＡＣによる発現において有意に増加又は減少した。一般に、発現における変化はＲＳＫ３ノックアウトによって抑えられた。例えば、ＴＡＣ誘発心房性ナトリウム利尿因子発現は、ＰＥ処置新生仔筋細胞で得られた結果に対応して、ＲＳＫ３−／−マウスにおいて大きく阻害された。２週の圧負荷後、野生型マウスにおいて組織学的検査によって検出可能な細胞アポトーシス及び間質性線維症の軽微な増加は、偽手術コントロールと比較して有意に達さず、これらのリモデリングの徴候は、ノックアウトマウスにおいてより少ない傾向がある（野生型及びＲＳＫ３−／−ＴＡＣ心臓においてそれぞれ、8.2±2.0対4.2±1.0×10-4タネル陽性核、及び0.49%±0.18%対0.29%±0.11%コラーゲン染色）。興味深いことに、ＴＡＣ野生型マウスに有意に誘発される線維症の２つの遺伝子マーカー、トランスフォーミング増殖因子β２及びコラーゲンＶＩα１（Yang 2012）は、ＲＳＫノックアウトによって発現が抑えられた（特許文献１の図１１）。
【００９７】
心肥大におけるＲＳＫ３の役割をさらに調査するため、発明者らは、皮下浸透圧ポンプによるイソプロテレノール（Iso）長期注入である第２のインビボ病理学的ストレッサー、及び水泳による長期運動である生理学的ストレッサーを使用した。Ｉｓｏ注入は、心エコー法において心室壁厚の軽微な増加をもたらす（特許文献１の図１５）が、細胞レベルでは、Ｉｓｏは、組織学的検査によって筋細胞単離後に測定されるようにＲＳＫ３依存的に幅方向の筋細胞成長を有意に誘発した（特許文献１の図２９）。ＴＡＣとは異なり、Ｉｓｏ注入はまた、心エコー法における筋細胞長増加と心室拡張によって証拠付けられるように、偏心性成長を誘発した（特許文献１の図１５及び図１６）。この偏心性成長はＲＳＫ３ノックアウトによって阻害されない。ＴＡＣデータと共に、これらの結果は、ＲＳＫ３が病的状態における求心性筋細胞肥大の誘発に寄与するということを示す。
【００９８】
最後に、ＲＳＫ３−／−マウスを水泳で運動させた。予期されるように（Perrino 200）、水泳後、野生型マウスは、（身体状態の向上に対応して）安静時心拍数が減少し、左心室内寸が増加した（特許文献１の図１７及び図２８）。運動後、ＲＳＫ３ノックアウトと野生型マウスとの間に心エコー法で検出可能な有意な違いは存在せず、コホートは体重で重み付けした両室重量の同様の増加を示した（それぞれ6%及び7%、特許文献１の図１８）。
【００９９】
〔詳細な方法〕
＜試薬＞
市販の抗体は特許文献１の図１９に列挙されている。二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲートロバ二次抗体（Jackson ImmunoResearch）及びＡｌｅｘａ色素コンジュゲートロバ二次抗体（Invitrogen）を含むものであった。モノクローナル２１１、ポリクローナルＶＯ５４、ＶＯ５６、及びＯＲ０１０ｍＡＫＡＰ抗体は以前に記載されており、Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓより入手可能である（Kehat 2010）。ＯＲ４２及びＯＲ４３ウサギ抗ＲＳＫ３抗血清を、細菌で発現させたＨｉｓタグ付きＲＳＫ３（全長）を使用して作製し、抗原結合Ａｆｆｉｇｅｌレジン（Biorad）を使用してアフィニティー精製した。ＦＬ０９９及びＦＬ１００ウサギ抗ｍＡＫＡＰ抗血清を、細菌で発現させたＧＳＴタグ付きｍＡＫＡＰ２４５−３４０を使用して作製した。オリゴヌクレオチドは特許文献１の図２０に列挙されている。他の試薬は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＢＩＸ０２１８９、ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．のＰＤ０３２５９０１、ＳＢ１０３５８０、ＳＬ０１０１、及びＳＰ６００１２５を含むものであった。
【０１００】
すべてのアデノウイルスをｐＴＲＥシャトルベクター及びＡｄｅｎｏ−Ｘ  Ｔｅｔ−ｏｆｆシステム（Clontech）を使用して構築し、Ｖｉｖａｐｕｒｅ  ＡｄｅｎｏＰＡＣＫキット（SartoriusStedim）を使用して増幅後に精製した。これらのアデノウイルスは、テトラサイクリントランスアクチベーター発現ウイルスに共に感染させると（tet-offの場合はアデノ-tTA又はtet-onの場合は逆tTA）、条件的に組換えタンパク質を発現する。Ｄａｒｉｏ  Ａｌｅｓｓｉ及びＪｏｈｎ  Ｂｌｅｎｉｓから取得したＨＡタグ付きＲＳＫ及びＭＳＫ２発現プラスミド（McKinsey 2007, Anjum 2008, Sadoshima 1995）並びにｍｙｃタグ付きｍＡＫＡＰ哺乳動物発現ベクター（pCDNA3.1 (-) myc-his）並びにアデノウイルスは以前に記載されている（Kodama2000, Takeishi 2002）。ＧＦＰ−ＲＢＤはｐＥＧＦＰ系プラスミドを使用して発現した。ｍＡＫＡＰ及びＲＳＫ３の細菌発現ベクターはｐＥＴ３０及びｐＧＥＸ−４Ｔ親ベクターを使用して構築し、タンパク質をＨｉｓ−ｂｉｎｄ（Novagen）及びグルタチオンＵｎｉｆｌｏｗレジン（Clontech）を使用して精製した。
【０１０１】
＜新生仔ラット筋細胞の単離及び培養＞
生後１〜３日のスプラーグドーリーラットを断頭し、切除した心臓を１×ＡＤＳバッファーに置いた（116 mmol/L NaCl, 20 mmol/L HEPES, 1 mmol/L NaH2PO4, 5.5 mmol/L グルコース, 5.4 mmol/L KCl, 0.8 mmol/L MgSO4, pH 7.35）。心房を慎重に取り除き、血液を洗浄して除いた。心室を細かく刻み、８０ＲＰＭで振とうしながら、３．３ｍｇのタイプＩＩコラゲナーゼ（Worthington, 230 U/mg）及び９ｍｇのパンクレアチン（Sigma）を含む１５ｍＬの１×ＡＤＳバッファーにおいて３７℃でインキュベートした。１５分後、ほぐした心筋細胞を５０×ｇで１分間遠心分離によって分離し、４ｍＬのウマ血清に再懸濁して、時折かく拌しながら３７℃でインキュベートした。収量を最大にするため、筋細胞の酵素消化及び単離のステップを１０〜１２回繰り返した。筋細胞をプールし、５０×ｇで２分間再び遠心沈殿し、１０％ウマ血清及び５％ウシ胎仔血清を添加したメンテナンス培地（DMEM:M199, 4:1）に再懸濁した。任意の混入線維芽細胞を取り除くため、ゼラチン被膜組織培養プラスチック容器にプレーティングする前に、細胞を１時間プリプレーティングした。この作業により、９０％より多い純粋な心筋細胞を産生した。培養の翌日、培地を０．１ｍｍｏｌ／Ｌのブロモデオキシウリジンを含むメンテナンス培地に変えて線維芽細胞成長を抑えた。
【０１０２】
筋細胞単離の翌日に実験を開始した。培地にアデノウイルスを添加することによってアデノウイルス感染を行った（感染多重度＝5-50）。４％ウマ血清を添加したメンテナンス培地で培養した細胞を使用して、製造者によって推奨されるように、プラスミド及びｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドをそれぞれＴｒａｎｓｆａｓｔ（Promega）及びＤｈａｒｍａｆｅｃｔ（Thermofisher）を使用して遺伝子導入した。遺伝子形質導入の翌日から開始して、各実験にて示されるように細胞を２日間ほども処理した。
【０１０３】
＜免疫沈降＞
ＨＥＫ２９３及びＣＯＳ−７細胞にリポフェクタミン２０００（Invitrogen）又はポリエチレンイミン「Ｍａｘ」（Polysciences）で遺伝子導入した。細胞（筋細胞を含む）をバッファー（20 mmol/L HEPES, pH 7.4, 150 mmol/L NaCl, 5 mmol/L EDTA, 0.5%Triton, 50 mmol/L NaF, 1 mmol/L オルトバナジン酸ナトリウム, 1 mmol/LDTT, 及びプロテアーゼ阻害剤）内で溶解した。１０，０００×ｇで４℃における１０分間の遠心分離後、清澄化した抽出物を、３時間〜一晩４℃で適切な抗体（10 μg精製抗体又は1-5 μL全血清）及び２０μＬタンパク質Ｇセファロース（Millipore, Fastflow）を使用する免疫沈降に使用した。ビーズを溶解バッファーで３〜５回洗浄し、免疫沈降したタンパク質をウエスタンブロット用に１×レムリバッファーで溶出した。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートロバ２次抗体、スーパーシグナルウエストケミルミネッセント基質（Thermo Scientific）、及びＸ線フィルム又は富士フィルムＬＡＳ−３０００イメージングシステムを使用してウエスタンブロットを現像した。
【０１０４】
＜免疫細胞化学＞
プラスチックカバースリップ上の培養した新生仔心筋細胞をＰＢＳ内の３．７％ホルムアルデヒドにおいて固定し、ＰＢＳ内の０．３％トリトンＸ−１００で透過処理し、０．２％ＢＳＡ及び１％ウマ血清を含むＰＢＳで１時間遮断した。そして、スライドを、ブロッキングバッファーに希釈した一次抗体及びＡｌｅｘａ蛍光色素コンジュゲート特異的２次抗体（Invitrogen, 1:1000）で１時間連続的にインキュベートした。スリップをブロッキングバッファーで３回洗浄した。１μｇ／ｍＬのヘキスト３３２５８を最後の洗浄に含ませ、核標識を停止させた。蛍光顕微鏡観察のためＳｌｏｗＦａｄｅ  Ｇｏｌｄ退色防止バッファー（Invitrogen）内でスライドを封止した。ライカＤＭＩ６０００顕微鏡を使用して広視野イメージを得た。
【０１０５】
＜表面プラズモン共鳴法＞
ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００を使用してＳＰＲ分析を行った。２００の共振ユニットのＨｉｓタグ付きｍＡＫＡＰ１２８６〜１８３３を、センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅタイプＣＭ５）表面に、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド）及びＥＤＣ［１−エチル−３−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）カルボジイミド］（Ｂｉａｃｏｒｅアミン結合キット）を使用して共有結合的に固定化した。ＨＢＳバッファー（10 mmol/L Hepes, pH 7.4, 150 mmol/L NaCl, 及び0.005%界面活性剤 P20）内のＨｉｓ−ＲＳＫ３分析物（6.25 -200 nmol/L）を３０μＬ／ｍｉｎの流量で５分間、その後バッファー単独でさらに５分間注入した。センサーグラムをＢＩＡｃｏｒｅＴ１００評価ソフトウエアで処理した。
【０１０６】
リン酸化Ｈｉｓ−ＲＳＫ３について、２０μｇのＨｉｓ−ＲＳＫ３を２μｇのＥＲＫ（Millipore, 14-550）及び／又はＰＤＫ１（Sigma, P7498）で、０．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＡＴＰを含むキナーゼバッファー（20 mmol/L MOPS, pH 7.2, 25 mmol/L β-グリセロールリン酸, 5 mmol/L EGTA, 1 mmol/L オルトバナジン酸ナトリウム, 1mmol/L DTT）において５時間リン酸化した。ホスホ−Ｈｉｓ−ＲＳＫ３はＨｉｓ結合ビーズを使用して精製し、使用前に濃縮した。
【０１０７】
＜ＲＳＫ−／−マウスの作製＞
動物に関わるすべての実験は、マイアミ大学において動物実験委員会により承認されたものである。構成的ノックアウトマウスを、ｌｏｘｐ部位に隣接するネオマイシン耐性遺伝子（PGKneo）をエクソン２に挿入するターゲットベクターを使用して作製した（特許文献１の図２７）。ターゲット１２９ＳｖＪ  ＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊの胚盤胞に注入した。突然変異体マウスをＢ６．Ｃ−Ｔｇ（ＣＭＶ−ｃｒｅ）１Ｃｇｎ／Ｊ（The Jackson Laboratory）と交配することでＰＧＫｎｅｏを取り除いた。ＲＳＫ＋／−マウスをｃｒｅ導入遺伝子の欠失に関して選択し、１０世代にわたりＣ５７ＢＬ／６マウスに戻し交配した。すべての実験を、８〜１２週齢である同腹仔コントロール及びマウスで行った。各コホートのマウス数は種々の表及び図に列挙されている。
【０１０８】
＜イソプロテレノール注入＞
Ａｌｚｅｔ２００２浸透圧ポンプ（Durect）に２００μＬの生理食塩水又は生理食塩水及びイソプロテレノールを滅菌下で装填して、１４日間６０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを送達した。８週齢のマウスを麻酔して、除毛した背中に肩甲骨内横切開によって滅菌下でポンプを皮下挿入した。創傷を外科用ステープルで閉鎖し、ベータダイン液剤で覆った。手術後にマウスを個別に飼育した。
【０１０９】
＜大動脈縮窄術＞
すべてのツールをＧｅｒｍｉｎａｔｏｒ５００乾燥滅菌器及びベータダイン液剤（10% ポビドン−ヨウ素局所用液剤）で滅菌した。麻酔を５％イソフルランで誘導し、ＳｕｒｇｉＶｅｔ流量調節器を使用してノーズコーンを介して１．５Ｌ／ｍｉｎの流量の２％イソフルラン及び１００％酸素で維持した。意識喪失は足指をつまんで確認した。左胸及び胸骨の上のマウスの毛を水酸化カルシウムローション剤（例えばNair）で取り除いて、手術部位をベータダインで滅菌した。皮膚を切開して、胸筋及び第２左肋間腔を露出した。胸筋及び第２肋骨を鈍的剥離して牽引し、縦隔内の胸腺を露出させた。胸腺の葉を牽引して、横断大動脈弓、並びに右無名動脈及び左総頸動脈を露出した。２つの動脈同士の間で大動脈の下の結合組織の鈍的剥離により、変形結紮補助具（Fine Science Tools 18062-12）を使用する６−０シルクの経路をつくった。２７ゲージ針を大動脈上部に配置し、６−０シルクを針に結んだ。針を取り除いて、大動脈を収縮させた状態にした。胸を５−０Ｐｏｌｙｓｏｒｂ縫合糸で２層において閉鎖した。イソフルラン投与を終了し、意識が戻るまでマウスをノーズコーンによる１００％酸素で維持した。手術直後に、ブプレノルフィン（0.05-0.1 mg/kg s.c.）を投与し、必要に応じて１２時間毎に行う。マウスを機敏で活発になるまで熱ランプの下で回復させた。大動脈結紮糸配置以外のすべてを行った偽手術マウスはコントロールとしての役割をする。
【０１１０】
＜水泳＞
８〜１０週齢のマウスを４週間毎日強制的に水槽で泳がせた。水泳槽は２２５ｃｍ２より大きい大きさであり、１５ｃｍの深さ、３０〜３２℃の水温である。マウスが溺れることのないように継続的に観察した。訓練の第１日目は、少なくとも４時間離れた２回の１０分間セッションからなるものであった。９０分間セッションに達するまで、セッションを各日に１０分増加させた。さらなるコホートを運動無しで通常どおり飼育して、「偽水泳」コントロール群としての役割をさせた。食物及び水をすべてのマウスに１月の期間適宜提供した。
【０１１１】
＜心エコー法＞
１〜２％のイソフルランで最小限の麻酔をかけたマウスを高解像度イメージングシステム（VisualSonics）のＶｅｖｏ７７０（登録商標）を使用して研究した。ＴＡＣ後の圧較差を、Ｐ＝４ｖ２（Ｐ＝誘導圧較差（mmHg）及びｖ＝縮窄部における速度（m/s）のように結紮点の脈波ドプラ速度から計算した。
【０１１２】
＜ランゲンドルフ灌流による生体マウス筋細胞単離＞
マウスを腹腔内にケタミン（80-100 mg/kg）及びキシラジン（5-10 mg/kg）を使用して麻酔をかけ、その後腹腔内に２００Ｕヘパリン及び心臓切除を行う。心臓を９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２で平衡化した灌流バッファー（NaCl 120 mmol/L, KCl 5.4 mmol/L, Na2HPO4 ・7H2O 1.2 mmol/L, NaHCO3 20.0 mmol/L, MgCl2.6H2O1.6 mmol/L, タウリン 5 mmol/L, グルコース 5.6 mmol/L）内に直ちに配置した。心臓をハーバードランゲンドルフ装置のコンデンサー出口に大動脈を介して取り付けた。Ｃａ２＋を含まない灌流を３７℃において２．２ｍＬ／ｍｉｎの一定速度で５分間続けた。心臓を２５ｍｇのタイプＩＩコラゲナーゼ（Worthington, 315 U/mg）及び１．３ｍｇのプロテアーゼ（Sigmatype XIV）を含む２５ｍＬバッファーでの連続的な灌流によって消化させる。心房を取り除いた後、心室を小片に切り出すとともに大口径ピペットを通過させることでほぐすために５ｍＬの同じ酵素溶液に浸漬した。細胞スラリーを１５０〜２００μｍナイロンメッシュでろ過して、筋細胞を１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣＬを含む灌流バッファーにおいて１０分間のインキュベーションによって弛緩させた。細胞は３.７％ホルムアルデヒドを含む灌流バッファー内の懸濁剤において固定した後、光学顕微鏡検査によって形態計測分析を行った。
【０１１３】
＜組織化学＞
心臓組織を３．７％ホルムアルデヒドにおいて固定した。脱パラフィンした５μｍの組織切片を、製造者によって推奨されるようにピクロシリウスレッド染色キット（Polysciences）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５小麦胚芽アグルチニンコンジュゲート（Invitrogen）を使用して染色した。左心室の３より多い個別の領域における１５０より多い筋細胞の断面積は小麦胚芽アグルチニン切片を使用して心臓毎に測定した。コラーゲン含有量をピクロシリウスレッド染色切片及び心臓ごとに３つより多い５×対物レンズフィールドにおいて偏光顕微鏡を使用してアッセイした。固定細胞及び組織切片の両方に対するタネル染色を、原位置細胞死検出キットのＴＭＲレッド（Roche）を使用して行った。形態計測及びコラーゲン含有量はＩＰＬａｂ顕微鏡ソフトウエア（BD Biosciences）を使用して測定した。
【０１１４】
＜形態計測＞
形態計測データはＩＰＬａｂソフトウエアを使用して取得した。新生仔筋細胞について、それぞれ１００より多い細胞を含む少なくとも６つの個別のイメージを、実験を繰り返す毎に、条件毎に断面積及び核周囲プリプロＡＮＦ染色に対してアッセイした。生体マウスの心筋細胞に対して、筋原線維に垂直（幅）又は平行（長さ）の最大長を、心臓毎に１００より多い新しくほぐした筋細胞において測定した。
【０１１５】
＜ＲＮＡアッセイ＞
全ＲＮＡをＮａｎｏｄｒｏｐ８０００分光光度計（Thermo Scientific）で定量化し、バイオアナライザー２１００及びＲＮＡ６０００ナノキット（Agilent）を使用して質的管理をした。ＳＹＢＲグリーンを使用してｑＰＴ−ＰＣＲを行った。
【０１１６】
ナノストリングアッセイは、単一の反応における複数の転写物を同定してカウントするために蛍光分子バーコード及び単一分子イメージングを使用する、増幅のない直接的かつ多重の遺伝子発現測定に基づく。ナノストリングアッセイのため、１００ｎｇの全ＲＮＡを、６５℃で一晩、ターゲット特異的コードセットに溶液内でハイブリダイゼーションした。コードセットは、３０遺伝子のグループに対する、２重の隣接して配置される５０ｂｐオリゴヌクレオチドプローブを含み、一方のセットのプローブが蛍光性のバーコードを有し、他方がビオチン標識される。ハイブリダイゼーション反応物をナノストリングプレップステーションにロードし、ナノストリングプレップステーションは過剰なオリゴヌクレオチドを取り除くとともにハイブリダイゼーションしたｍＲＮＡをストレプトアビジン被膜カートリッジ表面に結合させる。カートリッジをナノストリングデジタルアナライザーにロードし、１１５５の視野を蛍光でスキャンして、ビオチン標識されるとともに蛍光性バーコードを有するプローブに結合する個々のｍＲＮＡのみをカウントした。各ＲＮＡサンプルのデータセットはバックグラウンド除去を行い、Ｇａｐｄｈを使用してノーマライズした。検証アッセイにおいて、ナノストリングカウントは、ｑＲＴ−ＰＣＲで得られたｍＲＮＡレベルに対して３桁を超えて正比例し、同様の最小検出レベルであった。
【０１１７】
＜統計＞
すべての実験について、ｎは個々のマウス又は個々の筋細胞調製物の数を指す。すべてのデータを平均値±標準誤差として表した。Ｐ値は、必要に応じて対応がある又は対応がない、両側スチューデントのｔ検定を使用して計算し、多重比較用に補正されていない。反復した記号は、例えば、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５等、種々の桁のＰ値を示す。また、Ｐ値が提供される多重比較に関わるすべてのデータセットは、α０．０５のＡＮＯＶＡにおいて有意であった。
【０１１８】
〔検討〕
ＲＳＫ活性は神経系、免疫、筋肉、及びがんの機能に関連する（Anjum 2008）。ヒトＲＳＫ２突然変異は、精神及び成長の遅延並びに骨格及び顔貌の異常を含むが、心臓異常はまれである、Ｘ連鎖性コフィン・ローリー症候群を引き起こす。心臓において、ＲＳＫ１及びＲＳＫ２は、Ｎａ＋／Ｈ＋交換体ＮＨＥ１を活性化することができ、α−アドレナリン誘発ＮＨＥ１リン酸化は、ＲＳＫ３を除くすべてのＲＳＫを阻害するｆｍｋによって遮断される（Cuello 2007）。本発明者らは、心血管系、病理学的筋細胞肥大の調節におけるＲＳＫ３の役割を本明細書において明らかにした。
【０１１９】
心筋細胞は、幅及び長さの両方で成長し得、それぞれ求心性肥大及び偏心性肥大と呼ばれる（Kehat 2010）。求心性筋細胞肥大は、収縮ユニット（筋節）の並行集合体に関連し、潜在的筋細胞緊張及び壁厚を増大させる。対照的に、偏心性筋細胞肥大は、収縮の軸に沿う筋節の連続集合体に関連し、主に心室壁領域の増加に寄与する。発明者らは、ＲＳＫ３が、インビボで幅方向においてＴＡＣ誘発求心性心肥大に、及びＩｓｏ誘発筋細胞成長に要求されることを見い出した。これらの違いはインビトロでモデル化できる。白血病阻止因子及びカルディオトロフィン−１などのインターロイキン−６サイトカインは、ＰＥによって刺激される対称的成長とは対照的に、培養新生仔筋細胞に細長く偏心性の表現型を誘発する（Wollert 1996）。興味深いことに、培養筋細胞の成長は、白血病阻止因子によってよりもα−アドレナリン刺激によって誘発されるときによりＲＳＫ３に依存する傾向があった（特許文献１の図５及び図６）。ＰＥ誘発形態学的肥大がより阻害されることは、白血病阻止因子よりもＰＥによるＲＳＫのより強い活性（特許文献１の図２２）、及びインビボにおいて得られた結果に対応するものであった。
【０１２０】
ＲＳＫ３は、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、及びＥＲＫ５によって筋細胞で活性化された（特許文献１の図５Ａ）。ＲＳＫ３が心臓に関する文献では見受けられないにもかかわらず、ＥＲＫシグナル伝達はヒト疾患及び動物モデルの両方において十分に研究されている。常染色体優性ヒト症候群のヌーナン症候群、コステロ症候群、心臓・顔・皮膚症候群、及びレオパード症候群は、ＥＲＫ１／２シグナル伝達を活性化するＰＴＰＮ１１、ＨＲＡＳ、ＲＡＦ１、ＢＲＡＦ、ＭＥＫ１、及びＭＥＫ２の突然変異からもたらされる（Wu 2011）。これらのラスオパシーは、発達遅延、異形的特徴、及び肥大性表現型を含むことがある複数の器官系の異常を特徴とする（Gelb 2011）。マウスにおいて、左心室肥大は、構成的に活性のＨ−Ｒａｓ及びＭＥＫ１の心筋細胞特異的発現、及びＲａｓシグナル伝達を阻害するＲａｓＧＴＰアーゼ活性化タンパク質ニューロフィブロミンの心臓特異的欠失によって誘発されている（Rose 2010, Xu 2009）。一方、ドミナントネガティブＲａｆ１のトランスジェニック発現は圧負荷による肥大を阻害した。
【０１２１】
近年、研究者らは、４つすべてのＥＲＫ１／２アレルの心筋細胞特異的ノックアウトが、筋細胞死を増加することなく重度の致死的拡張型心筋症を引き起こすということを示した（Kehat 2011）。ＥＲＫ１／２−ヌル筋細胞はコントロール動物のものより長く細いものであった。また、ＥＲＫ１／２活性化を減少させるＰＴＰＮ１１（Shp2）ノックアウトは、細長い筋細胞形態及び拡張型心筋症をもたらした（Kontaridis2008）。
【０１２２】
一方、構成的に活性のＭＥＫ１トランスジェニックマウスの筋細胞はより短く幅広いものであった（Kehat 2011）。ＥＲＫ１／２及びＳｈｐ２ノックアウトマウスと対照的に、発明者らは、ＴＡＣ及びＩｓｏ注入後にのみ顕著な求心性成長の欠損を伴い、下流エフェクターＲＳＫ３の欠失がより適度な表現型をもたらすことを見い出した。これらの知見は共に、ＲＳＫ３を介したＥＲＫ１／２シグナル伝達が、偏心性肥大を調節する他のシグナル伝達経路に依存せずに心筋細胞のストレス誘発求心性成長を促すという仮説に対応するものである。
【０１２３】
発明者らは、ＥＲＫ１／２だけでなくＥＲＫ５によっても筋細胞においてＲＳＫ３が活性化されることを見い出した。ＭＥＫ５−ＥＲＫ５シグナル伝達は主に偏心性筋細胞肥大を誘発する（Nicol 2001）が、ＥＲＫ５はまた求心性成長に寄与することがある（Kimura2010）、という証拠がある。
【０１２４】
ＲＳＫノックアウトマウスを使用して得られたデータは、病理学リモデリングにおけるＲＳＫ３の機能を示す。特定の理論に縛られるものではないが、ＲＳＫ３が生理学的肥大に役割を持つことも考えられる。例えば、非ストレスＲＳＫ３−／−マウスから単離した筋細胞は幅及び長さの両方においてより小さい傾向がある（特許文献１の図９及び図２９）。さらに、水泳後、ＲＳＫ３−／−両室重量は、野生型マウスのものよりも少なかったが、体重によるノーマライズ後には顕著ではない（特許文献１の図１８）。
【０１２５】
ＲＳＫ３は筋細胞において全ＲＳＫの少数派をなすが（特許文献１の図２４及び図３０）、ＲＳＫ３活性はそれにもかかわらず筋細胞成長に要求されるということは重要性のあることである。足場タンパク質によるＲＳＫ３の特異的アンカリングは、ＲＳＫ３がインビボで特異的に機能し得る機構を与える。足場は、低含量であるとともに広く固有の基質特異性を有するＲＳＫ３などの酵素に最も重要であると考えらえる。ＲＳＫタンパク質キナーゼＲｘＲｘｘ（Ｓ／Ｔ）部位を触媒し、他のＡＧＣキナーゼと特異性において重複する（Anjum 2008）。酵素を共に局在化させることで、その上流アクチベーター、及び基質エフェクター、足場が、シグナル伝達の動態を促進し、応答を増幅して、酵素触媒における特異性を増加させ、シグナル伝達を特定の細胞内コンパートメントに送り出すことができる（Good 2011）。先行技術では、細胞におけるＲＳＫコンパートメント化又は多分子シグナル伝達複合体の関与に関するガイダンスは限定的である。マイトジェン刺激において、サイトゾルＲＳＫ１（及び他のＲＳＫアイソエンザイムの可能性がある）は、一時的に形質膜に移動可能であるが、活性化ＲＳＫは核において富化される傾向がある（Anjum 2008）。ニューロンにおいて、ＲＳＫは、その保存的Ｃ末端ＳＴｘＬペプチドを介してＰＤＺドメイン含有タンパク質を結合して、キナーゼをシナプス伝達に関与する基質に送り出す（Thomas 2005）。他の機構によって、ＲＳＫ１は、タイプ１タンパク質キナーゼＡ及びミトコンドリア局在化足場のＤ−ＡＫＡＰ−１を結合する（Chaturvedi 2006, Huang 1997）。発明者らがＲＫＳ３を免疫沈降後に筋細胞において検出可能であるのみであるということに対応して、発明者らは、免疫細胞化学によって内在性ＲＳＫ３タンパク質を検出できていない。ＨＡ−ＲＳＫ３は、低レベルで過剰発現するとき、心筋細胞におけるｍＡＫＡＰβの主な位置である核膜で富化された（Pare 2005）。特有のＲＳＫのＮ末端とｍＡＫＡＰβとのタンパク質−タンパク質相互作用を詳細に特徴づけることによって、本発明者らは、種々のシグナル伝達コンパートメントを標的とし得る１以上の足場によってＲＳＫ３が特異的にアンカリング可能である新しい機構を特定した。
【０１２６】
発明者らは、筋細胞肥大を阻害する競合結合ペプチド（mAKAPβ RBD）を用いてこのＲＳＫ３アンカリングの機能的重要性を示した。
【０１２７】
ＲＳＫ１／２によるＮＨＥ１の調節は、心臓疾患を処置するためのＲＳＫ阻害剤の使用に対する近年における関心を触発した（Avkiram 2008）。発明者らは、ＲＳＫ３ノックアウトが心臓機能を低下させることなく病理学的リモデリングの遺伝子マーカーの発現を阻害しながら、ＴＡＣ誘発肥大を減少させることを示す。ＲＳＫ阻害は、後高血圧（圧負荷）などの後天性疾患における及び上述のラスオパシーの処置のためのその使用を含む、複数の用途があり得る。近年、ヌーナン症候群マウスモデル（Raf1L613Vノックイン）マウスをＰＤ０３２５９０１で処置し、心肥大心筋症及び他のヌーナンの特徴の進行を抑えた（Wu 2011）。ＲＳＫ３のターゲティングは、全体的なＥＲＫ経路阻害のいくつかの有害な副作用を避けるため他の手法を提供する。活性部位を競合的に結合する又はアンカリングを阻害するＲＳＫ３阻害剤の使用は、新しい心臓治療として提供される。
【０１２８】
［実施例２］
細胞外マトリックスのリモデリング及び心筋間質性線維症の誘発は、心臓疾患における心不全の発症に寄与する重要な因子である（Spinale 2013, Edgley 2012）。線維性コラーゲンの蓄積増加及び心筋の正常細胞構成の崩壊により、コンプライアンスの低下、拡張期及び収縮期両方の機能障害、並びに電気伝導系への干渉による不整脈をもたらし得る。ｐ９０リボソームＳ６キナーゼ（RSK）は、多くのストレス関連刺激に応答して筋細胞において活性化される多面発現性タンパク質キナーゼである（Anjum 2008, Sadoshima 2005, Kodama 2000）。発明者らは、タイプ３ＲＳＫ（RSK3）は、圧負荷を受けたマウスにおける求心性筋細胞肥大の誘発に要求されることを示した（Li 2013）。ＲＳＫ３は、細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）及び３´−ホスホイノシチド依存性キナーゼ１による連続的リン酸化によって活性化され、心臓に発現される４つのＲＳＫファミリーメンバーの１つである（Anjum 2008）。特に、ＲＳＫ３が心臓筋細胞におけるＲＳＫ酵素の少数派をなすものの、ＲＳＫ３は肥大に要求される（Li 2013）。病理学的肥大におけるその役割から、発明者らは、ＲＳＫ３ターゲティングが心不全の予防に有益であり得ることを提案した。しかしながら、知る限り、先行技術はＲＳＫファミリーメンバーもまた心臓線維症を調節するかを示すことに不十分なものある。この研究において、本発明者らは、本明細書において、肥大性シグナル伝達におけるその機能に依存しない間質性線維症におけるＲＳＫ３の役割を示す。
【０１２９】
肥大性心筋症（HCM）は、最も多く遺伝する心臓異常であり（５００人に１人）、若年アスリートの突然死の３６％を占める、子供の突然死の主要な要因となっている（Maron 2013）。ＨＣＭは、典型的に筋細胞肥大及び乱れ並びに間質性線維症を誘発する筋節タンパク質における優性突然変異によって引き起こされる。しかしながら、ＨＣＭ突然変異からもたらされる表現型及び臨床経過は、左心室肥大のない遺伝子型ポジティブの患者が心筋線維症、拡張期機能障害、及びＥＣＧ異常を示し得るというように変化し得るものである（Maron 2013）。また、トランスジェニックマウスを使用する研究は、ＨＣＭ突然変異の表現型が遺伝的背景に依存するものであることを示す（Prabhakar 2001, Michele 2002）。以下に記載するように、Ｃ５７ＢＬ／６；ＦＶＢ／Ｎ混合バックグラウンドのマウスにおける細いフィラメントのタンパク質α−トロポミオシン（TM180）のＨＣＭ突然変異Ｇｌｕ１８０Ｇｌｙアミノ酸置換の発現により、間質性線維症を伴って左心室が小さくなる。発明者らは、ＲＳＫ３がこの非肥大性ＨＣＭモデルにおいて間質性線維症の発症及び左側心不全の徴候に要求されることを示す。
【０１３０】
〔方法〕
＜追加材料＞
＜試薬＞
一次抗体は、すべてのＲＳＫファミリーメンバーを検出するマウス１Ｆ６モノクローナル抗ＲＳＫ３（Abnova, cat# H00006196-M01）（Li 2013）、ＯＲ４３ウサギ抗ＲＳＫ３、及びＮ−１６ヤギ抗−ＲＳＫ３（(Santa Cruz Biotechnology）を含むものであった。二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲートロバ二次抗体（Jackson ImmunoResearch）を含むものであった。上述のようにＲＳＫ３免疫沈降を行った（Li 2013）。
【０１３１】
＜マウス＞
動物に関わるすべての実験は、マイアミ大学において動物実験委員会により承認されたものである。ＲＳＫ３−／−Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＴＭ１８０トランスジェニックＦＶＢ／Ｎマウスと交配させた（Li 2013, Prahakar 2001）。研究したすべてのマウスは、バックグラウンド系統が５０：５０のＣ５７ＢＬ／６；ＦＶＢ／Ｎとなるように、ＲＳＫ３−／＋×ＴＭ１８０；ＲＳＫ３−／＋育種の同腹仔であった。４つすべての遺伝子型は、通常のメンデル比で存在した。特定されない限り、すべての実験を生後１６週のマウスで行った。遺伝子型判定は、上述のように尾の生体組織検査サンプルを使用してＰＣＲによって離乳時に行った（Li 2013, Prahakar 2001）。
【０１３２】
＜心エコー法＞
ＲＭＶ  ７０７Ｂ「ハイフレーム」スキャンヘッドを含むＶｅｖｏ７７０（登録商標）高解像度インビボイメージングシステム（VisualSonics）をイメージングに使用した。Ｂモード及びＭモードイメージングの両方においてマウスに１．５％イソフルランで麻酔をかけた。
【０１３３】
＜組織化学＞
心臓組織を３．７％ホルムアルデヒドにおいて固定した。脱パラフィンした５μｍの組織切片を、製造者によって推奨されるようにピクロシリウスレッド染色キット（Polysciences）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５小麦胚芽アグルチニンコンジュゲート（Invitrogen）を使用して染色した。左心室の３より多い個別の領域における１５０より多い筋細胞の断面積は小麦胚芽アグルチニン切片を使用して心臓毎に測定した。コラーゲン含有量をピクロシリウスレッド染色切片及び心臓ごとに3つより多い４×対物レンズフィールドにおいて直線偏光顕微鏡を使用してアッセイした。直線偏光顕微鏡が線維性コラーゲンに対して特に特異的なアッセイであるが、得られた値は全コラーゲン含有量より少ないということが特に言及される。固定細胞及び組織切片の両方のタネル染色を、原位置細胞死検出キットのＴＭＲレッド（Roche）を使用して行った。形態計測及びコラーゲン含有量はＩＰＬａｂ顕微鏡ソフトウエア（BD Biosciences）を使用して測定した。すべての分析を盲検で研究者が行った。
【０１３４】
＜ＲＮＡアッセイ＞
全ＲＮＡをＮａｎｏｄｒｏｐ８０００分光光度計（Thermo Scientific）で定量化し、バイオアナライザー2100及びＲＮＡ６０００ナノキット（Agilent）を使用して質的管理をした。ナノストリングアッセイは、単一の反応における複数の転写物を同定してカウントするために蛍光分子バーコード及び単一分子イメージングを使用する、増幅のない直接的かつ多重の遺伝子発現測定に基づく。簡潔にすると、１００ｎｇの全ＲＮＡを、６５℃で一晩、ターゲット特異的コードセットに溶液内でハイブリダイゼーションした。コードセットは、全遺伝子のグループに対する、２重の隣接して配置される５０ｂｐオリゴヌクレオチドプローブを含み、一方のセットのプローブが蛍光性のバーコードを有し、他方がビオチン標識される。ハイブリダイゼーション反応物をナノストリングプレップステーションにロードし、ナノストリングプレップステーションは過剰なオリゴヌクレオチドを取り除くとともにハイブリダイゼーションしたｍＲＮＡをストレプトアビジン被膜カートリッジ表面に結合させる。カートリッジをナノストリングデジタルアナライザーにロードし、１１５０の視野を蛍光でスキャンして、ビオチン標識されるとともに蛍光性バーコードを有するプローブに結合する個々のｍＲＮＡのみをカウントした。各ＲＮＡサンプルのデータセットはインターナルポジティブコントロールに対してノーマライズし、バックグラウンド除去を行った。プローブ配列は要請により入手可能である。
【０１３５】
＜統計＞
すべての実験について、ｎは個々のマウスの数を指す。すべてのデータを平均値±標準誤差として表した。Ｐ値は、必要に応じて対応がある又は対応がない、両側スチューデントのｔ検定を使用して計算し、多重比較用に補正されていない。反復した記号は、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５の、種々の桁のＰ値を示す。
【０１３６】
〔結果〕
ＦＶＢ／Ｎ  ＴＭ１８０トランスジェニックマウスをＣ５７ＢＬ／６  ＲＳＫ３ノックアウトマウスと交配させ、すべてのマウスが５０：５０の混合バックグラウンドのものであるようにした。ＲＳＫ３発現は、ＴＭ１８０マウスにおいてわずかに多いが（約25%, p = 0.12）、ＲＳＫ３−／−マウスでは存在せず、他のＲＳＫファミリーメンバーの発現における代償性変化の証拠はなかった（特許文献１の図３２）。ＴＭ１８０導入遺伝子の発現は、全タンパク質染色によって検出されるα−トロポミオシンバンドにおける予想された変化により明らかであった（Prabhakar 2001）。これらの混合系統マウスにおいて、ＴＭ１８０導入遺伝子は、両室重量の減少（２１％）及び比例して小さい断面積を有する左心室筋細胞を含む小さい心臓表現型を誘発した（特許文献１の図３２及び図３４）。心エコー法から、ＴＭ１８０マウスは左心室内寸が減少したが、収縮性が増加した、すなわちＭモードにおける短縮率が増加し、Ｂモードにおける心内膜面積縮小率が増加した（特許文献１の図３１及び図３６）。ＴＭ１８０左心室の変化の病理学的な重要性は、軽度肺水腫及び左側心不全の存在に対応して、心房重量の増加、及び浮腫肺重量の顕著だが小さい（１２％）増加の両方によって示唆された（特許文献１の図３２Ｄ及び図３４）。
【０１３７】
ＲＳＫ３ノックアウトは、ＴＭ１８０導入遺伝子なしでは心臓にほとんど影響しなかった。ＲＳＫ３ノックアウトがＴＭ１８０マウスの小さい心臓表現型を回復せず、心房拡張を防ぐものでもなかったが（特許文献１の図３２Ｂ及び図３２Ｃ及び図３４）、ＴＭ１８０；ＲＳＫ３−／−マウスの心臓機能はより野生型マウスに近いものであり、心エコー法による短軸寸法における２９％少ない減少を含む（特許文献１の図３１及び図３６）。特に、ＴＭ１８０導入遺伝子による短縮率及び心内膜面積縮小率の増加は、ＲＳＫノックアウトによって約５０％抑えられた。ＴＭ１８０；ＲＳＫ３−／−マウスのより「正常な」心臓機能の生理学的な重要性は、浮腫肺重量がＲＳＫ３ノックアウト後には増加することがないという知見によって示唆された（特許文献１の図３２Ｄ及び図３４）。
【０１３８】
１６週齢におけるＴＭ１８０導入遺伝子に関連する細胞死の増加は存在しなかった（すべてのコホートにおいて約10-4タネル陽性核、データは示さず）。しかしながら、ＴＭ１８０心臓のトリクロム染色は、ＲＳＫ３がないことで大きく減少する野生型マウスには存在しない心筋における斑状の間質性線維症を明らかにした（特許文献１の図３３Ａ及び図３３Ｂ）。同様に、ピクロシリウスレッド染色は、線維性コラーゲン含有量がＲＳＫ３の存在下のみでＴＭ１８０導入遺伝子によって増加することを示した（特許文献１の図３３Ｃ）。これらの結果は、心臓機能及びリモデリングに関与する遺伝子の発現アッセイによって確証された（特許文献１の図３５）。特に、それぞれコラーゲンタイプα１及びペリオスチンをコードするＣｏｌ８ａ１及び  Ｐｏｓｔｎを含む心臓線維症に関与する遺伝子（Oka 2007）は、ＲＳＫ３依存的にＴＭ１８０導入遺伝子によって誘発された（特許文献１の図３３Ｄ及び図３３Ｅ）。
【０１３９】
〔検討〕
ＨＣＭ  ＴＭ１８０突然変異は、ＦＶＢ／Ｎマウスで発現されると、求心性左心室肥大、広範な線維症、心房拡張、及び５か月以内の死をもたらす（Prabhakar 2001）。一方、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＴＭ１８０突然変異の発現は、心室肥大又は線維症及び心臓重量低下をもたらさなかった（Michele 2002）。発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６；ＦＶＢ／Ｎ混合バックグラウンドにおいて、ＴＭ１８０導入遺伝子が、心エコー法によって心室重量の減少及び心房重量の増加、心室筋細胞の縮小、間質性線維症、並びに収縮性増加を含む中間表現型を誘導することを見い出した。ＴＭ１８０突然変異は、Ｃａ２＋感受性増加及びＴＭ１８０フィラメントの最大張力生成増加の結果として心筋症を誘発すると考えらえる（Prabhakar 2001）。従って、ホスホランバン及び筋小胞体網状組織Ｃａ２＋−ＡＴＰアーゼ２Ａ（SERCA2A）の操作によるＣａ２＋再取込増加により、ＴＭ１８０ＦＶＢ／Ｎ表現型を改善することができる（Gaffin 2011）。発明者らは、ＴＭ１８０トランスジェニックマウスを使用して、心臓線維症におけるＲＳＫ３の役割を調査した。発明者ら及び他の研究者は、全心臓ＥＲＫ１／２が、ＴＭ１８０  ＦＶＢ／Ｎマウスにおいて活性化されることを見い出したが（Gaffin 2011）、混合バックグラウンドマウスにおいて、全ＥＲＫ１／２及びＲＳＫリン酸化が増加しなかった。そうではなく、発明者らは、ＲＳＫ３タンパク質レベルのわずかな増加を示すのみであった（特許文献１の図３２Ａ）。重要な点は、ＲＳＫノックアウトが線維性遺伝子発現及び間質性線維症のＴＭ１８０関連誘発を阻害し、心エコー結果と浮腫肺重量との両方に関して心臓機能を改善するということである。これらの結果は、ＲＳＫ３が病理学的心肥大に特異的に要求されるという本明細書の以前の知見を捕捉するものである。特定の理論に縛られるものではないが、発明者らは、その特有のＮ末端ドメインを介するｍＡＫＡＰ（筋肉Ａ−キナーゼアンカータンパク質）などの足場タンパク質へのＲＳＫ３アンカリングのため、ＲＳＫ３が、他のＲＳＫアイソエンザイムの高レベルの発現にも関わらず心臓において特有の機能を担うということを提案する。ＣＥＢＰ／βのＲＳＫリン酸化が肝臓及び肺の病理学的線維症に関与するという報告があるが、心臓のＲＳＫファミリーメンバーに関するデータの記載はない。発明者らは、本明細書において特異的ＲＳＫ３阻害が肥大性及び線維性の心臓疾患における治療ターゲットとしてより幅広く考えられる必要があるということを提案する。
【０１４０】
［実施例３］
〔条件的ｍＡＫＡＰアレルのｍＡＫＡＰ遺伝子構造及び方法〕
ｍＡＫＡＰ遺伝子は１２の共通エクソン（水色）及び３つの選択的スプライシングエクソンを含む（ベージュ及び黄色）。ネガティブ（tk）及びポジティブ（neo）選択マーカーを含むターゲティングベクターは、共通エクソン９を条件的に欠失させるように設計された。発明者らは、サザンブロットで示すように６つのターゲットＥＳ細胞クローンを取得した。ターケットマウスの繁殖後、ネオカセットをＦＬＰリコンビナーゼトランスジェニックと交配させることで欠失させた。ｃｒｅリコンビナーゼを発現するマウスと交配することで、エクソン９を欠失させ（KOアレル）、フレームシフト及びエクソン１０における終止コドン（赤色）の導入を行った。マウスの遺伝子型判定は、プライマー４４及び４５でゲノムＤＮＡのＰＣＲによって行われている（特許文献１の図３９）。ウエスタンブロットにおいて、ｍＡＫＡＰ  Ｅｘ９ｆｌ／ｆｌ；Ｔｇ（Ｍｙｈ６−ｃｒｅ／Ｅｓｒ１）マウス（レーン２及び３）並びにｍＡＫＡＰ  Ｅｘ９ｆｌ／ｆｌ（レーン１）及びＴｇ（Ｍｙｈ６−ｃｒｅ／Ｅｓｒ１）（レーン４）コントロールマウスに一週間５００ｍｇタモキシフェン／ｋｇの乾燥飼料を与えた後、心臓を採取して全ＲＮＡ及びタンパク質抽出物を調製した。野生型（及びｌｏｘｐが導入された）ｍＲＮＡでは１０２２ｂｐ及び、エクソン９を欠いたｍＡＫＡＰｍＲＮＡ種では９０１ｂｐ生成物を産生するｍＡＫＡＰエクソン４及び１１内に位置するプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＴを行った。コントロールβ−アクチンｍＲＮＡはすべてのサンプルにおいて同様に検出された（下部パネル）が、ＣＫＯマウス心臓では、コントロール心臓（レーン１及び４）で観察されたものと比較して９０％より少ないＰＣＴ生成物を得た（上部パネル、レーン２及び３）。ＶＯ５４ｍＡＫＡＰ特異的抗体を使用してウエスタンブロットを行った。ＣＫＯマウスから調製した心臓抽出物ではｍＡＫＡＰタンパク質は検出できなかった（レーン２及び３、上部パネル）。ポンソー全タンパク質染色によって同等のローディングを測定した（下部パネル）。
【０１４１】
８週齢のｍＡＫＡＰ  Ｅｘ９ｆｌ／ｆｌ；Ｔｇ（Ｍｙｈ６−ｃｒｅ／Ｅｓｒ１）マウス（fl/fl;MCMTg）及びＴｇ（Ｍｙｈ６−ｃｒｅ／Ｅｓｒ１）（MCM Tg）に、タモキシフェン含有飼料を１週間与え、１週間休ませ、そして２週の大動脈縮窄術を受けさせた後、分析した（特許文献１の図４０）。ｍＡＫＡＰ遺伝子欠失は、圧負荷に応答した求心性心肥大の発症を阻害した。その後の研究は、ｍＡＫＡＰ遺伝子欠失が長期圧負荷に応答した心不全の発症を防ぎ、心臓リモデリングを阻害して、生存の恩恵を得ることを示した（Kritzer 2014）。
【０１４２】
＜大動脈縮窄術＞
すべてのツールをＧｅｒｍｉｎａｔｏｒ５００乾燥滅菌器及びベータダイン液剤（10% ポビドン−ヨウ素局所用液剤）で滅菌した。麻酔を５％イソフルランで誘導し、ＳｕｒｇｉＶｅｔ流量調節器を使用してノーズコーンを介して１．５Ｌ／ｍｉｎの流量の２％イソフルラン及び１００％酸素で維持した。意識喪失は足指をつまんで確認した。左胸及び胸骨の上のマウスの毛を水酸化カルシウムローション剤（例えばNair）で取り除いて、手術部位をベータダインで滅菌した。皮膚を切開して、胸筋及び第２左肋間腔を露出した。胸筋及び第２肋骨を鈍的剥離して牽引し、縦隔内の胸腺を露出させた。胸腺の葉を牽引して、横断大動脈弓、並びに右無名動脈及び左総頸動脈を露出した。２つの動脈同士の間で大動脈の下の結合組織の鈍的剥離により、変形結紮補助具（Fine Science Tools 18062-12）を使用する６−０シルクの経路をつくった。２７ゲージ針を大動脈上部に配置し、６−０シルクを針に結んだ。針を取り除いて、大動脈を収縮させた状態にした。胸を５−０Ｐｏｌｙｓｏｒｂ縫合糸で２層において閉鎖した。イソフルラン投与を終了し、意識が戻るまでマウスをノーズコーンによる１００％酸素で維持した。手術直後に、ブプレノルフィン（0.05-0.1 mg/kg s.c.）を投与し、必要に応じて１２時間毎に行う。マウスを機敏で活発になるまで熱ランプの下で回復させた。大動脈結紮糸配置以外のすべてを行った偽手術マウスはコントロールとしての役割をする。
【０１４３】
＜心エコー法＞
１〜２％のイソフルランで最小限の麻酔をかけたマウスを高解像度イメージングシステム（VisualSonics）のＶｅｖｏ７７０（登録商標）を使用して研究した。ＴＡＣ後の圧較差を、Ｐ＝４ｖ２（Ｐ＝誘導圧較差（mmHg）及びｖ＝縮窄部における速度（m/s）のように結紮点の脈波ドプラ速度から計算した。（特許文献１の図３９）
【０１４４】
［実施例４］
〔ＲＳＫ３アンカリングはラットの心室筋細胞肥大に重要である〕
特許文献１の図８Ａは、ｍＡＫＡＰβ複合体が、ｍｙｃ−ＧＦＰ又はｍｙｃ−ＧＦＰ−ＲＢＤ（mAKAP 1694-1833）を発現するＰＥ処置したアデノウイルス感染新生仔ラット心室筋細胞からのＦＬ１００ｍＡＫＡＰ抗血清を使用して免疫沈降し、ｐａｎ−ＲＳＫ１Ｆ６及びｍＡＫＡＰ２１１抗体で検出されたことを示す。Ｂ．ＧＦＰ又はＧＦＰ−ＲＢＤ（緑色）を発現する遺伝子導入筋細胞は、α−アクチン（青色）及びＡＮＦ（赤色）抗体で染色した。横線＝２０μｍ。Ｃ．筋細胞の断面積。ｎ＝５。Ｄ．ＡＮＦを発現する筋細胞の画分。ｎ＝３。＊ｐ値：ＧＦＰ発現サンプルと比較した。†ｐ値：アゴニストなしコントロールとの比較。Ｅ及びＦ．ＧＦＰ又はＨＡタグ付きＲＳＫ３  １−４２を発現する筋細胞を除きＣ及びＤと同様。
【０１４５】
新生仔ラット筋細胞の単離及び培養  生後１〜３日のスプラーグドーリーラットを断頭し、切除した心臓を１×ＡＤＳバッファーに置いた（116 mmol/L NaCl, 20 mmol/L HEPES, 1 mmol/L NaH2PO4, 5.5 mmol/L グルコース, 5.4 mmol/L KCl, 0.8 mmol/L MgSO4, pH 7.35）。心房を慎重に取り除き、血液を洗浄して除いた。心室を細かく刻み、８０ＲＰＭで振とうしながら、３．３ｍｇのタイプＩＩコラゲナーゼ（Worthington, 230 U/mg）及び９ｍｇのパンクレアチン（Sigma）を含む１５ｍＬの１×ＡＤＳバッファーにおいて３７℃でインキュベートした。１５分後、ほぐした心筋細胞を５０×ｇで１分間遠心分離によって分離し、４ｍＬのウマ血清に再懸濁して、時折かく拌しながら３７℃でインキュベートした。収量を最大にするため、筋細胞の酵素消化及び単離のステップを１０〜１２回繰り返した。筋細胞をプールし、５０×ｇで２分間再び遠心沈殿し、１０％ウマ血清及び５％ウシ胎仔血清を添加したメンテナンス培地（DMEM:M199, 4:1）に再懸濁した。任意の混入線維芽細胞を取り除くため、ゼラチン被膜組織培養プラスチック容器にプレーティングする前に、細胞を１時間プリプレーティングした。この作業により、９０％より多い純粋な心筋細胞を産生した。培養の翌日、培地を０．１ｍｍｏｌ／Ｌのブロモデオキシウリジンを含むメンテナンス培地に変えて線維芽細胞成長を抑えた。
【０１４６】
筋細胞単離の翌日に実験を開始した。培地にアデノウイルスを添加することによってアデノウイルス感染を行った（感染多重度＝5-50）。４％ウマ血清を添加したメンテナンス培地で培養した細胞を使用して、製造者によって推奨されるように、プラスミド及びｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドをそれぞれＴｒａｎｓｆａｓｔ（Promega）及びＤｈａｒｍａｆｅｃｔ（Thermofisher）を使用して遺伝子導入した。遺伝子形質導入の翌日から開始して、各実験にて示されるように細胞を２日間ほども処理した。
【０１４７】
＜免疫細胞化学＞
プラスチックカバースリップ上の培養新生仔心筋細胞をＰＢＳ内の３．７％ホルムアルデヒドにおいて固定し、ＰＢＳ内の０．３％トリトンＸ−１００で透過処理し、０．２％ＢＳＡ及び１％ウマ血清を含むＰＢＳで１時間遮断した。そして、スライドを、ブロッキングバッファーに希釈した一次抗体及びＡｌｅｘａ蛍光色素コンジュゲート特異的２次抗体（Invitrogen, 1:1000）で１時間連続的にインキュベートした。スリップをブロッキングバッファーで３回洗浄した。１μｇ／ｍＬのヘキスト３３２５８を最後の洗浄に含ませ、核標識を停止させた。蛍光顕微鏡観察のためＳｌｏｗＦａｄｅ  Ｇｏｌｄ退色防止バッファー（Invitrogen）内でスライドを封止した。ライカＤＭＩ６０００顕微鏡を使用して広視野イメージを得た。
【０１４８】
ｍｙｃ−ＧＦＰ−ｍＡＫＡＰ１６９４−１８３３をコードする示されるＣＩＳプラスミドを含むＡＡＶ９を新生仔野生型マウスに注射した。２週のＴＡＣを行って、８週齢で上述のように分析した。（特許文献１の図４１〜図４２）ｍｙｃ−ＧＦＰ−ｍＡＫＡＰ１６９４−１８３３の発現は成体心臓におけるインビボの求心性心肥大を阻害した。
【０１４９】
［実施例５］
本発明は、ヒト患者に有用なインビボの心筋細胞におけるｍＡＫＡＰ  ＲＮＡｉの新しい生物学的薬剤を提供する。
【０１５０】
ｍＡＫＡＰシグナロソームは、（１）シグナル伝達酵素の足場との会合を阻害するアンカリングディスラプターペプチドの発現（Kapiloff 2009, Dodge-Kafka 2010, Vargas 2012, Li 2013, Li 2013）、（２）ｍＡＫＡＰ（ＡＫＡＰ６）遺伝子ノックアウトによるもの（Kritzer 2014）、並びに（３）低分子干渉ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）又はウイルス及びプラスミドベクター発現は低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用するｍＡＫＡＰ発現のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によるもの（Pare 2005, Wong 2008）を含む多様な技術を使用して研究されている。 
【０１５１】
ｍＡＫＡＰに対してｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡによって標的化された以前に公開されている配列は、ラット特異的であり、ヒト遺伝子に存在しない。
【表１】
2020527167.tif 000005
【０１５２】
ヒトにおけるｍＡＫＡＰ発現を標的とし得るバイオロジックを得るため、３つの１９塩基対配列をヒトＡＫＡＰ６転写物変異体Ｘ１ｍＲＮＡのＮＣＢＩ参考配列ＸＭ＿０１７０２１８０８．１から選択した（図８）。
【表２】
2020527167.tif 000006
【０１５３】
これらの配列を、インビボでの心筋細胞特異的ｓｈＲＮＡ発現をさせることができる自己相補的アデノ随伴ウイルス（AAV）の新しいカスタム設計シャトルプラスミドに組み込んだ。「ｐｓｃＡ−ＴｎＴ−ｍＡＫＡＰ  ｓｈＲＮＡ」プラスミドを以下のように設計した（図９及び図１０）。
１）  効率的にｓｈＲＮＡ発現させるためｃＤＮＡカセットをヒトｍｉｒ−３０ａ配列を使用して作製した。構築物は、以前に記載のカセット（２ミスマッチを含む１２８ｂｐのヒトｍｉｒ３０ａ５’配列-２ｂｐ（CG）−センス方向のＡＫＡＰ６配列-１９ｂｐループ配列−アンチセンス方向ＡＫＡＰ６配列-２ｂｐ（CT）−１ミスマッチを含む１３０ｂｐのヒトｍｉｒ３０配列）と類似するが同一ではない（Silva2005）。
２）  ｃＤＮＡカセットは３’から心筋細胞特異的発現をさせるトリ心筋トロポニンＴプロモーターフラグメントに（Prasad 2011）、及び５’からＳＶ４０由来ポリアデニル化配列（SV40ゲノムbp2599-2769）に配置された。
３）全ｓｈＲＮＡミニ遺伝子は、自己相補的ＡＡＶ（scAAV）バイオロジックの生成を目的とするため、ＡＡＶ２ＩＴＲ配列に隣接させた（５‘末端におけるアンチセンス方向のNC_001401.2 bp 4489-4664及び３‘末端におけるbp4559-4662）（Wang 2003）。
【０１５４】
培養ラット新生仔ラット心室筋細胞の試験によって、これらのプラスミドでの遺伝子導入が程度の差はあるがｍＡＫＡＰβの発現を低下させることを明らかにし、ターゲット＃３のプラスミドがｍＡＫＡＰβの除去に最も有効であった（データは示さず）。ゆえに、ｐｓｃＡ−ＴｎＴ−ｍＡＫＡＰ  ｓｈＲＮＡ＃３を、インビボでの実験のために心臓作用性の血清型９カプシドタンパク質を含むｓｃＡＡＶ粒子を作製するために使用した。ｓｃＡＡＶを、国立心臓・肺・血液研究所遺伝子治療リソースプログラムによるサポートのもとペンシルバニア大学ベクターコアによって作製した。ｓｃＡＶＶウイルスを成体マウスへの尾静脈注射によって試験した注射の３週後、心臓を採取して、ウエスタンブロットにて分析した。ｍＡＫＡＰβ発現は、ｓｃＡＡＶコントロールｓｈＲＮＡウイルス注射マウス又は非注射コントロールと比較したとき５×１０１１ウイルスゲノム（ｖｇ）のｓｃＡＡＶ−ｍＡＫＡＰｓｈＲＮＡ＃３の静脈内（ＩＶ）単一用量で９０％を超えて抑えられた（図１１）。
【０１５５】
［実施例６］
冠動脈心疾患は、心不全の主要な要因であり（Writing Group 2016）、単一用量ｓｃＡＡＶ−ｍＡＫＡＰｓｈＲＮＡで虚血性疾患における心不全を抑制する能力は望ましいものである。マウスにおいて、左冠動脈結紮は、心室拡張及び残りの心室のリモデリングを伴う、大きく瘢痕を伴う貫壁性梗塞（心室中隔温存）をもたらす（Kumar 2005）。ＭＩ後８週で、コントロールのマウスは低駆出画分及び低拍出量（収縮期機能障害）、心房肥大、及び肺水腫（浮腫肺重量増加）を伴う心不全に陥ることが予想される。
【０１５６】
８週齢Ｃ５７ＢＬ／６ＷＴマウスは、以下の方法を使用して、永続的な左冠動脈結紮又は偽開胸術を受けさせ、生存手術後８週で安楽死させるまで（図１２Ａ）連続的な心エコー法で研究した。
【０１５７】
＜左冠動脈結紮の方法＞
マウスに誘導するための５％イソフルラン及び維持するための２．５〜３％イソフルランで麻酔をかけた。１６Ｇカテーテルを使用して経口気管内挿管を行い、そしてミニベントベンチレーターを使用してマウスを機械的に人工呼吸した。左側開胸術部位上の皮膚を、ポビドンヨード１０％溶液を使用して滅菌する方法で前処理をしてドレープをかけた。熱喪失を防ぐように手技時にマウスを保温しておくために加熱パッド使用した。角膜乾燥を防ぐため、外科的滅菌性非薬用眼軟膏剤を手術前に目に塗布した。顕微鏡視野下で生存手術を行った。適切な鎮静作用が得られると、第４肋間腔において左側開胸術によって開胸した。筋肉出血がある場合、熱焼灼装置（例えばファインティップ、Bovie）を使用して止血を行った。肋骨を切り離すために３ｍｍの開創器を使用した。心膜切開術後、前壁ＭＩを得るため左冠動脈を８−０プロリーン縫合糸で結紮した。５−０吸収性縫合糸（筋肉）、７−０（肋骨の２結紮）、及び皮膚には６−０で３層において胸を閉鎖した。７２時間疼痛を抑えるため手術後直ちに単一用量で皮下の０．５〜１ｍｇ／ｋｇブプレノルフィン徐放（Bup-SR-LAB）を投与した。手術後直ちに必要であれば補液も投与した（例えば滅菌生理食塩水０．９、腹腔内）。マウスを機敏で活発になるまで回復させた。冠動脈結紮糸配置以外のすべてを行った偽手術マウスはコントロールとしての役割をする。
【０１５８】
＜心エコー法＞
１〜２％のイソフルランで最小限の麻酔をかけたマウスを高解像度イメージングシステム（VisualSonics）のＶｅｖｏ２１００（登録商標）を使用して研究した。種々の時点において麻酔下のマウスでＢモード及びＭモードイメージを得た。後壁及び前壁の拡張期及び収縮期の厚さ及び左心室腔の拡張終期の直径（LVEDD）及び収縮終期の直径（LVESD）を測定し、ＬＶ容積、短縮率、及び駆出画分の推定を行った。
【０１５９】
左冠動脈生存手術の結紮の２日後に駆出画分減少（EF ≦40%）を確認する（MIコホート）と、マウスをランダム化し、翌日に５×１０１１ｖｇのｓｃＡＡＶ−ｍＡＫＡＰ−ｓｈＲＮＡ＃３又はｓｃＡＡＶ−コントロール−ｓｈＲＮＡのいずれかの静脈内注射をした。処置前のＭＩコホートの平均ＥＦは、それぞれｍＡＫＡＰ及びコントロールｓｈＲＮＡコホートでは３１．６６％及び３２．７９％であった。ｓｃＡＡＶ処置後、コホートは、ｍＡＫＡＰ−ｓｈＲＮＡ−ＭＩ（n=10）、コントロール−ｓｈＲＮＡ−ＭＩ（n=6）、ｍＡＫＡＰ−ｓｈＲＮＡ−偽（n=4）、コントロール−ｓｈＲＮＡ−偽（n=5）であった。ＭＩ後のｍＡＫＡＰ−ｓｈＲＮＡ投与は、ＭＩ後２日目〜２、４、及び８週目のＥＦの正常化によって示されるように、収縮期機能障害の改善をもたらす一方、コントロール−ｓｈＲＮＡ−ＭＩ動物は虚血傷害後のＥＦの進行的悪化を示した（図１２Ｂ）。ＭＩ後８週で、ｍＡＫＡＰ−ｓｈＲＮＡ−ＭＩのＥＦは、ｍＡＫＡＰ−及びコントロール−ｓｈＲＮＡ−偽動物と有意に相違するものではなかった（44.3±3.3 % vs. 54.6±1.7% & 54.5±2.0 %）が、コントロール−ｓｈＲＮＡ−ＭＩ動物のものより大きかった（18.0±4.3%, P<0.0001）。さらに、冠動脈結紮後８週で、ｍＡＫＡＰ−ｓｈＲＮＡ−ＭＩマウスは、コントロール-ｓｈＲＮＡ−ＭＩマウスより、収縮期の厚い左心室（LV）前壁（0.9±0.1 mm vs. 0.5±0.1mm（コントロール-shRNA-MI）, P<0.05）、及び小さいＬＶ収縮終期容積（72.1±8.6 μL vs. 137.3±26.3μL（コントロール-shRNA-MI）; P<0.01）を示した。ゆえに、死後の肺水腫分析は、ｓｃＡＡＶ−ｍＡＫＡＰ−ｓｈＲＮＡ＃３での処置が心不全の発症を抑え（図１３）、ｍＡＫＡＰ−ｓｈＲＮＡ−ＭＩの浮腫肺重量が有意にコントロール−ｓｈＲＮＡ−ＭＩコホートのもの未満であるというようになる（7.7±0.2 vs. 10.6±1.2mg/mm 脛側長, P<0.01）ことを示した。
【０１６０】
これらの結果は、心筋梗塞後の処置として新しいｓｃＡＡＶ−ｍＡＫＡＰ−ｓｈＲＮＡ＃３生物学的製剤を使用するｍＡＫＡＰβ発現の阻害が心臓機能障害を改善し、マウスにおいて心臓構造を保持させるとともに心不全の発症を防ぐということを示す。
【０１６１】
本明細書において参照される特許文献及び科学文献は当業者が入手可能な知見を提示するものである。本明細書に引用されるすべての米国特許、及び公開又は未公開の米国特許出願は言及によって援用される。本明細書に引用されるすべての外国公開特許及び特許出願は言及によって本明細書に援用される。本明細書に引用されるすべての他の公開参考文献、文献、文書、及び科学文献は、言及によって本明細書に援用され、すべての引例は特許文献１に見受けられる。本発明はその好ましい実施形態に関して特に示されて記載されているが、当業者には、添付の特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲から外れることなく態様や詳細に種々の変更を行い得るということが認識される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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