(57)【要約】  本開示は、切断可能な部分を有するリンカーを介して重鎖または軽鎖にあるＣｙｓと結合する遮断部分を有するプロボディに関する。該遮断部分は抗体とその抗原との結合を阻害する。切断可能な部分が切断されると遮断部分が解放され、抗体のその抗原との結合能が復元する。抗ＣＴＬＡ４抗体を用いる適用を開示する。
2020531430.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
（ＢＭ−Ｌ）ｍ−Ａｂ            （Ｉ）
［式中
Ａｂは、その重鎖または軽鎖の可変領域において少なくとも１個のアミノ酸がＣｙｓで置換されている抗体であって、ここでその置換されるアミノ酸が（ａ）フレームワーク領域にあり；（ｂ）少なくと３０％の側鎖露出を有し；および（ｃ）ＣＤＲアミノ酸の１０Å、好ましくは５Åの範囲内にある、抗体であり；
ＢＭは、Ａｂのその抗原との結合を阻害する、遮断部分であり；
各Ｌは、独立して、ＢＭとＡｂとに結合するリンカー部分であり、Ｌは切断可能な部分を含み、上記したＣｙｓでＡｂと結合し；および
ｍは１、２、３または４である］
で示される、プロドラッグ化抗体。
【請求項２】
抗体Ａｂにある少なくとも１個の置換されるアミノ酸が、重鎖可変領域のＫａｂａｔ位置１、３、５、１９、２３、２５、４３、４６、６８、７２、７４、７５、７６、８２ａ、８２ｂ、８３、８４、８５または１０５にあるか、または軽鎖可変領域のＫａｂａｔ位置１、３、５、７、８、１８、２０、４５、５７、６０、６３、６５、６６、６７、６９、７７、または１００にある、請求項１に記載のプロドラッグ化抗体。
【請求項３】
抗体Ａｂにある少なくとも１個の置換されるアミノ酸が、重鎖のＫａｂａｔ位置２３にあるか、または軽鎖のＫａｂａｔ位置６７にある、請求項１に記載のプロドラッグ化抗体。
【請求項４】
抗体Ａｂにある少なくとも１個の置換されるアミノ酸が、重鎖のＫａｂａｔ位置２３にある、請求項１に記載のプロドラッグ化抗体。
【請求項５】
抗体Ａｂにある少なくとも１個の置換されるアミノ酸が、軽鎖のＫａｂａｔ位置６７にある、請求項１に記載のプロドラッグ化抗体。
【請求項６】
遮断部分ＢＭがポリ（エチレングリコール）である、請求項１に記載のプロドラッグ化抗体。
【請求項７】
ポリ（エチレングリコール）の分子量が少なくとも約２ｋＤａである、請求項５に記載のプロドラッグ化抗体。
【請求項８】
Ｌにある切断可能な部分が酵素により切断可能なペプチドである、請求項１に記載のプロドラッグ化抗体。
【請求項９】
酵素により切断可能なペプチドが、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ、ウロキナーゼ）、ＭＴ−ＳＰ１／マトリプターゼ、レグマイン、およびマトリックスメタロプロテアーゼからなる群より選択される少なくとも１つの酵素によって切断され得る、請求項８に記載のプロドラッグ化抗体。
【請求項１０】
酵素がマトリプターゼである、請求項９に記載のプロドラッグ化抗体。
【請求項１１】
酵素により切断可能なペプチドが、ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号：５）、ＬＳＧＸ（配列番号：１６）またはＬＳＧＫ（配列番号：１６）である、請求項８に記載のプロドラッグ化抗体。
【請求項１２】
式（ＩＩａ）〜（ＩＩｈ）：
【化１】
2020531430.tif 000048
【化２】
2020531430.tif 000049
【化３】
2020531430.tif 000050
で示される構造を有する、請求項１に記載のプロドラッグ化抗体。
【請求項１３】
軽鎖のＫａｂａｔ位置６７にＣｙｓを有する抗体。
【請求項１４】
抗ＣＴＬＡ４抗体である、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
抗ＣＴＬＡ４抗体が
（ａ）配列番号：１のアミノ酸３１−３５を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸５０−６６を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸９９−１０７を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸２４−３５を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：２のアミノ酸５１−５７を含む軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：２のアミノ酸９０−９８を含む軽鎖ＣＤＲ３
を有する、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
配列番号：１のアミノ酸１−１１８（ＸａａがＡｌａである場合）を含む重鎖可変領域および配列番号：２のアミノ酸１−１０８（ＸａａがＣｙｓである場合）を含む軽鎖可変領域を有する、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１７】
重鎖のＫａｂａｔ位置２３にＣｙｓがある抗体。
【請求項１８】
抗ＣＴＬＡ４抗体である、請求項１７に記載の抗体。
【請求項１９】
抗ＣＴＬＡ４抗体が
（ａ）配列番号：１のアミノ酸３１−３５を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸５０−６６を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸９９−１０７を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸２４−３５を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：２のアミノ酸５１−５７を含む軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：２のアミノ酸９０−９８を含む軽鎖ＣＤＲ３
を有する、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
配列番号：１のアミノ酸１−１１８（ＸａａがＣｙｓである場合）を含む重鎖可変領域および配列番号：２のアミノ酸１−１０８（ＸａａがＳｅｒである場合）を含む軽鎖可変領域を有する、請求項１８に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１７年８月１６日付け出願の米国仮特許出願番号６２／５４６,２５２の３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１９（ｅ）の下での利益を主張するものであり、その開示を出典明示により本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
（配列表）
本明細書に開示される核酸および／またはアミノ酸配列を包含する、配列番号：１〜配列番号：１６を含む、「170731_SEQT_13002WOPCT_YC.txt」で特定される配列表は、その内容のすべてが出典明示により本明細書の一部とされる。配列表はＥＦＳ−ウェブを介するＡＳＣＩＩテキストフォーマットにて提供され、かくしてそれは紙とコンピューターで読み取り可能な形態の両方で構成される。その配列表は２０１７年７月３１日にPatentIn 3.5を用いて最初に作成され、大きさはおよそ１７ＫＢであった。
【０００３】
本願は、プロドラッガブル抗体、そのプロドラッグ、ならびにかかる抗体およびそのプロドラッグを使用および製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
治療抗体は、種々の疾患、特にがんおよび炎症性症状を治療するのに使用され得る。規制当局から販売承認を受けている治療抗体の例として、イピリムマブ（YERVOY（登録商標））、ニボルマブ（OPDIVO（登録商標））、トラスツズマブ（HERCEPTIN（登録商標））、セツキシマブ（ERBITUX（登録商標））、リツキシマブ（RITUXAN（登録商標））、インフリキシマブ（REMICADE（登録商標））およびアダリムマブ（HUMIRA（登録商標））が挙げられる。一般に、治療抗体は、他の抗体と同様に、その分子標的（抗原）に対して高特異的に、および該標的と高アフィニティで結合することで作用し、その治療作用と関連付けられる細胞プロセスを開始する。
【０００５】
プロドラッグは治療剤の的外れな副作用を減少させるのに使用され得る。プロドラッグは、活性は低いが、標的組織または器官で、あるいはその近辺で活性な治療剤に変換され得る、一連の治療剤である。通常、プロドラッグ化は、治療剤にその活性を減少させる部分を共有結合させることで達成される。標的部位にある遮断部分をそこで見られる要因または作用因子−低ｐＨ、酵素、低酸素等で除去し、治療剤の活性を復元する。例えば：Trouetら、2004；Staglianoら、2013；Rodeckら、2010；およびLauermann、2014を参照のこと。
【０００６】
小分子薬物などの他の治療剤の場合と同様に、治療抗体の副作用は、疾患を治療するのに標的とされた組織または器官以外の組織または器官でその作用に干渉することによって弱められるか、または排除されることが望ましい。古典的には、抗体は、図１に示されるように、Ｙ型二量体タンパク質であり、二量体の半体は、各々、２本の鎖、重鎖と軽鎖とからなる。通常、二量体の２個の半体は同じであり、ジスルフィド結合によって相互に共有結合する。抗体のその抗原との結合相互作用は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を介して起こり、それには各重鎖および軽鎖のその可変領域にて３種の（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）が存在する。重鎖および軽鎖可変領域（各々、図１にてＶＨおよびＶＬと分類されている）は各タンパク質鎖のアミノ末端付近に位置付けられる。
【０００７】
抗体をプロドラッグ化する場合、ＶＨおよびＶＬ領域は、抗原との相互作用に関与するＣＤＲが存在することによって、遮断部分の結合する部位である可能性がある。例えば、PoluおよびLowmanは、２０１４年に、マスキングペプチドを抗体の軽鎖のＮ−末端に結合させることによって抗体のプロドラッグ化を開示する。抗体のプロドラッグ化に関する他の開示として、Staglianoら、2016；Williamsら、2015；Lowmanら、2014；Lowmanら、2015b；およびDaughertyら、2015が挙げられる。プロドラッグ化される特異抗体として、これらの抗原：ＥＧＦＲ（Desnoyersら、2013；Lowmanら、2015a；Lowmanら、2017）、ＪＡＧＧＥＤ  １／２（Westら、2015）、インターロイキン−６受容体（Westら、2016a）、組織因子経路阻害剤（Wangら、2016）、ＣＤ３（Dennisら、2016）、ＰＤＬ１（Westら、2016b）、ＣＤ１６６（Westら、2016c）、ＣＤ７１（Sagertら、2016b）、ＰＤ１（Tiptonら、2017）およびＩＴＧＡ３（Sagertら、2016a）に対する抗体が挙げられる。
【０００８】
本明細書において検討されたいくつかの刊行物を、最初に記載の著者または発明者と、公開年とによって引用する。それらの完全な書誌的引用をこの明細書の最終近くにある参考文献セクションにて列挙する。
【発明の概要】
【０００９】
この開示は、新規なプロドラッグ化抗体、ならびにそれらの製造および使用方法を提供する。簡単に言えば、重鎖または軽鎖可変領域のいずれかでアミノ酸をシステイン（Ｃｙｓ）との部位特異的置換に付すことにより抗体を修飾する。置換されて入るＣｙｓの側鎖にあるスルフヒドリル（ＳＨ）基は、抗体のその抗原との結合能を干渉する遮断部分（ＢＭ）を含むプロドラッグ化部分を取り付けるための化学的手段として供する。ＢＭは、抗体−抗原結合を立体的に阻害する基であってもよいが、そうでなければ抗体または抗原のいずれかと特異的に相互作用しない基であってもよい。あるいはまた、ＢＭは、例えば、静電力またはファン・デル・ワールス力によって抗体と相互作用し得る。プロドラッグ化部分はさらには切断基を有するリンカー部分を含み、抗体の意図する作用の部位で見つかる因子によるその切断は遮断部分を解放し、抗体はその抗原との結合能を復元し、その治療効果を発揮する。切断基は、好ましくは、意図する作用の部位でまたはその付近で見つかる因子（低ｐＨ、酵素、低酸素等；好ましくは酵素）により切断される；酵素による切断が好ましい。
【００１０】
ある場合には、ＢＭは、リンカー部分の切断によってそれが解放された後に、それ自体の薬理学的活性を有することができる。このようにして、本発明のプロドラッグ化抗体は、１回で、いうなれば２種の薬理学的に活性な剤：ＢＭおよび抗体を送達し得る。
【００１１】
Ｃｙｓ置換部位は、元のアミノ酸のＣｙｓとの置換が、抗体のその抗原との特異的かつ強固な結合能に悪影響を及ぼすことがないように選択される。さらには、プロドラッグ化部分を除去して、残りの化学基がＣｙｓと共有結合したまま残すこともできる。本発明者らは、予期せぬことに、この残基も抗原−抗体結合を阻まないことを見出した。
【００１２】
一の実施態様において、式（Ｉ）：
（ＢＭ−Ｌ）ｍ−Ａｂ            （Ｉ）
［式中
Ａｂは、その重鎖または軽鎖の可変領域において少なくとも１個のアミノ酸がＣｙｓで置換されている抗体であって、ここでその置換されるアミノ酸が（ａ）フレームワーク領域にあり；（ｂ）少なくと３０％の側鎖露出を有し；および（ｃ）ＣＤＲアミノ酸の１０Å、好ましくは５Åの範囲内にある、抗体であり；
ＢＭは、Ａｂのその抗原との結合を阻害する、遮断部分であり；
各Ｌは、独立して、ＢＭとＡｂとに結合するリンカー部分であり、Ｌは切断可能な部分を含み、上記したＣｙｓでＡｂと結合し；および
ｍは１、２、３または４である］
で示される、プロドラッグ化抗体が提供される。
【００１３】
好ましい実施態様において、抗体（Ａｂ）中の少なくとも一つの置換されるアミノ酸は、重鎖可変領域のＫａｂａｔ位置１、３、５、１９、２３、２５、４３、４６、６８、７２、７４、７５、７６、８２ａ、８２ｂ、８３、８４、８５または１０５にあるか、または軽鎖可変領域のＫａｂａｔ位置１、３、５、７、８、１８、２０、４５、５７、６０、６３、６５、６６、６７、６９、７７、または１００にある。
【００１４】
もう一つ別の実施態様において、抗体（Ａｂ）中の少なくとも一つの置換されるアミノ酸は、重鎖のＫａｂａｔ位置２３にあるか、または軽鎖のＫａｂａｔ位置６７にある。
【００１５】
もう一つ別の実施態様において、軽鎖のＫａｂａｔ位置６７にてＣｙｓを有する抗体が提供される。該抗体は抗ＣＴＬＡ４抗体または抗ＣＤ１３７抗体であり得る。
【００１６】
もう一つ別の実施態様において、重鎖のＫａｂａｔ位置２３にてＣｙｓを有する抗体が提供される。該抗体は抗ＣＴＬＡ４抗体または抗ＣＤ１３７抗体であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本明細書において開示されるＣｙｓ置換がなされる、重鎖および軽鎖の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）の配置を含め、抗体の全体構造を示す。
【００１８】
【図２】本明細書において開示されるプロドラッグ化の概念を説明するのに使用される抗ＣＴＬＡ４抗体の重鎖の可変領域ＶＨのアミノ酸配列（配列番号：１）を示し、配列番号：１とＫａｂａｔ系とのアミノ酸の番号付けを相互に関連付け、Ｃｙｓ置換を行うための望ましい配置に印を付すように注記を付ける。
【００１９】
【図３】図２の抗ＣＴＬＡ４抗体の軽鎖の可変領域ＶＬのアミノ酸配列（配列番号：２）を示し、配列番号：２とＫａｂａｔ系とのアミノ酸の番号付けを相互に関連付け、Ｃｙｓ置換を行うための望ましい配置に印を付すように注記を付ける。
【００２０】
【図４】本明細書において開示されるプロドラッグ化の概念を説明するのに使用される抗ＣＤ１３７抗体の重鎖の可変領域ＶＨのアミノ酸配列（配列番号：３）を示し、配列番号：３とＫａｂａｔ系とのアミノ酸の番号付けを相互に関連付け、Ｃｙｓ置換を行うための望ましい配置に印を付すように注記を付ける。
【００２１】
【図５】図４の抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖の可変領域ＶＬのアミノ酸配列（配列番号：４）を示し、配列番号：４とＫａｂａｔ系とのアミノ酸の番号付けを相互に関連付け、Ｃｙｓ置換を行うための望ましい配置に印を付すように注記を付ける。
【００２２】
【図６】本発明の化合物のＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【図７】本発明の化合物のＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【図８】本発明の化合物のＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【図９】本発明の化合物のＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【００２３】
【図１０】図１０Ａおよび図１０Ｂは、３０％よりも大きな露出を有し、ＣＤＲアミノ酸の５（または１０）Åの範囲内にある、抗ＣＴＬＡ４抗体の重鎖および軽鎖中にあるＣｙｓ置換部位を示し、その部位はＫａｂａｔ番号付けを用いて同定されている。
【００２４】
【図１１】図１１Ａ、図１１Ｂ、図１１Ｃ、図１１Ｄおよび図１１Ｅは、重鎖および軽鎖の種々の位置でプロドラッグ化された抗ＣＴＬＡ４抗体による、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞との結合に関する、プロドラッグ化の効果を、およびその後のプロドラッグ化基の除去の効果を示す。
【００２５】
【図１２】図１２Ａ、図１２Ｂは、ＰＢＭＣ細胞によるＩＬ−２分泌についての、ＣＴＬＡ４抗体のプロドラッグ化および脱プロドラッグ化の効果を示す。
【図１３】図１３Ａ、図１３Ｂは、ＰＢＭＣ細胞によるＩＬ−２分泌についての、ＣＴＬＡ４抗体のプロドラッグ化および脱プロドラッグ化の効果を示す。
【００２６】
【図１４】ＣＤ１３７抗体の活性についてのプロドラッグ化の効果を示す。
【図１５】図１５Ａおよび図１５ＢはＣＤ１３７抗体の活性についてのプロドラッグ化の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
定義
「抗体」は、全抗体およびいずれかの抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合部分」）またはその一本鎖変種を意味する。全抗体は、ジスルフィド結合により相互に連結した、少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖とを含む、タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む、重鎖定常領域とを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬまたはＶＫ）と、１つの単ドメイン、ＣＬを含む、軽鎖定常領域とを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称され、複数の保存フレームワーク領域（ＦＲ）が組み入れられている、超可変性の領域にさらに細分類され得る。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲと、４つのＦＲとを含み、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４で配置される。可変領域は、抗原と相互に作用する、結合ドメインを含有する。定常領域は、抗体の宿主組織または因子（免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ））との結合を媒介し得る。仮に抗体が抗原Ｘと５ｘ１０−８Ｍ以下の、より好ましくは１ｘ１０−８Ｍ以下の、より好ましくは６ｘ１０−９Ｍ以下の、より好ましくは３ｘ１０−９Ｍ以下の、その上でより好ましくは２ｘ１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するならば、該抗体は抗原Ｘと「特異的に結合する」と称される。抗体は、キメラ、ヒト化、または好ましくはヒト抗体であり得る。重鎖定常領域は、糖鎖形成の型または程度に影響を及ぼすか、抗体の半減期を延ばすか、エフェクター細胞との相互作用または補体系を強化または軽減させるか、あるいはある別の特性を調節するように操作され得る。遺伝子操作は、１または複数のアミノ酸を置換、付加または欠失することにより、またはドメインを別のイムノグロブリン型からのドメインと置換することにより、あるいはそれらを組み合わせることにより達成され得る。
【００２８】
抗体の「抗原結合フラグメント」および「抗原結合部分」（あるいは簡単に「抗体部分」または「抗体フラグメント」）は、抗原と特異的に結合する能力を保持する抗体の１または複数のフラグメントを意味する。抗体の抗原結合機能は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結した２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）本質的にＦａｂをヒンジ領域の部分と一緒に含む、Ｆａｂ’フラグメント（例えば、Abbasら、Cellular and Molecular Immunology, 6th Ed., Saunders Elsevier 2007を参照のこと）；（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖｉ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂフラグメント（Wardら、（1989） Nature 341：544-546）；（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；および（ｖｉｉｉ）ナノボディ、単一の可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含有する重鎖可変領域などの、全長抗体のフラグメントによってなされ得ることが示された。好ましい抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２，Ｆａｂ’、ＦｖおよびＦｄフラグメントである。さらには、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え技法を用い、ＶＬおよびＶＨ領域が対となりそれらを単一のタンパク質鎖として製造されるようにする合成リンカーによって接合され、一価分子（一本鎖ＦｖまたはｓｃＦｖとして知られる）を形成し得る；例えば、Birdら（1988）Science 242：423-426；およびHustonら（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：5879-5883）を参照のこと。かかる一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」なる語にも包含される。
【００２９】
特記されない限り−例えば、配列番号：の配列表における番号付けに言及することで−抗体の重鎖または軽鎖可変領域（ＶＨまたはＶＬ）でのアミノ酸位置の番号付けに関しては、Ｋａｂａｔ系（Kabatら、「Sequences of proteins of immunological interest」、5th ed., Pub. No. 91-3242、U.S. Dept. Health & Human Services, NIH, Bethesda, Md., 1991、以下「Ｋａｂａｔ」という）に従い、そして抗体の重鎖または軽鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＬ）でのアミノ酸位置の番号付けについては、Ｋａｂａｔにおいて記載されている、ＥＵインデックスに従う。Lazarら、ＵＳ  ２００８／０２４８０２８  Ａ１を参照し、その開示は出典明示により本明細書に組み込まれ、例えば、そのような使用は本明細書の一部とされる。さらには、the ImMunoGeneTics Information System（ＩＭＧＴ）は、そのウェブサイトで、重鎖定常領域についてのそのナンバーリングシステム、ＥＵナンバーリング、およびＫａｂａｔナンバーリングの間の対応を示す、「IMGT Scientific Chart: Correspondence between C Numberings」を表題とする表を提供する。例えば、Lazarら、ＵＳ  ２００８／０２４８０２８Ａ１（２００８）を参照のこと。
【００３０】
「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない、抗体を意味する（例えば、抗原Ｘと特異的に結合する単離された抗体は、抗原Ｘ以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。抗原Ｘと特異的に結合する単離された抗体は、しかしながら、他の種から由来の抗原Ｘ分子のように、他の抗原との交差反応性を有してもよい。ある実施態様において、単離された抗体はヒト抗原Ｘと特異的に結合し、他の（ヒト以外の）抗原Ｘ抗原と交差反応しない。その上、単離された抗体は他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まないとすることができる。
【００３１】
「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性およびアフィニティを提示する、単一の分子構成の抗体分子の調製物を意味する。
【００３２】
「ヒト抗体」は、フレームワークおよびＣＤＲの両方の領域がヒト生殖系列イムノグロブリン配列より誘導される、可変領域（あるとすれば、定常領域）を有する抗体を意味する。ヒト抗体は、天然または合成修飾を含め、後の修飾を含んでもよい。ヒト抗体は、ヒト生殖系列イムノグロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロにてランダムまたは部位特異的変異生成により、またはインビボにて体細胞変異により導入される変異）を含んでもよい。しかしながら、「ヒト抗体」は、マウスなどの他の哺乳動物種の生殖系列より誘導されるＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に接合されている、抗体を包含しない。
【００３３】
「ヒトモノクローナル抗体」は、単一の結合特異性を提示し、フレームワークおよびＣＤＲの両方の領域がヒト生殖系列イムノグロブリン配列より誘導される、可変領域を有する抗体を意味する。１の実施態様において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、ヒト以外のトランスジェニック動物、例えば、トランスジェニックマウスより得られるＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【００３４】
「脂肪族」は、特定数の炭素原子を有する（例えば、「Ｃ３脂肪族」、「Ｃ１−５脂肪族」、「Ｃ１−Ｃ５脂肪族」または「Ｃ１〜Ｃ５脂肪族」などの場合、後者の３つの語は１〜５個の炭素原子を有する脂肪族部分であって、同意義である）か、または炭素数が明確に特定されていない場合、１ないし４個の炭素原子（不飽和脂肪族部分の場合には２ないし４個の炭素）を有する、直鎖または分岐鎖で、飽和または不飽和の、非芳香族炭化水素部を意味する。同じような理解が、Ｃ２−４アルケン、Ｃ４−Ｃ７シクロ脂肪族等の場合の別の型の炭素数にも適用される。同じように、「（ＣＨ２）１−３」などの語は、下付き文字が１、２または３である場合の省略表現として理解されるべきであり、その結果としてかかる語はＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２およびＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２を示す。
【００３５】
「アルキル」は、炭素原子の数を指定するのに同じ慣習が適用できる、飽和脂肪族部分を意味する。実例として、Ｃ１−Ｃ４アルキル部分は、限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチル、ｔ−ブチル、１−ブチル、２−ブチル等を包含する。「アルキレン」は、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、およびＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２などのアルキル基の二価の対応する基を意味する。
【００３６】
「アルケニル」は、炭素原子の数を指定するのに同じ慣習が適用できる、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を有する脂肪族部分を意味する。実例として、Ｃ２−Ｃ４アルケニル部分は、限定されないが、エテニル（ビニル）、２−プロぺニル（アリルまたはプロパ−２−エニル）、シス−１−プロぺニル、トランス−１−プロぺニル、Ｅ−（またはＺ−）２−ブテニル、３−ブテニル、１,３−ブタジエニル（ブタ−１,３−ジエニル）等を包含する。
【００３７】
「アルキニル」は、炭素原子の数を指定するのに同じ慣習が適用できる、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有する脂肪族部分を意味する。実例として、Ｃ２−Ｃ４アルキニル基は、エチニル（アセチレニル）、プロパルギル（プロパ−２−イニル）、１−プロピニル、ブタ−２−イニル等を包含する。
【００３８】
「シクロ脂肪族」は、飽和または不飽和の、非芳香族の１〜３個の環（各環は３ないし８個（好ましくは３ないし６個）の炭素原子を有する）を有する炭化水素部を意味する。「シクロアルキル」は、各環が飽和のシクロ脂肪族部分を意味する。「シクロアルケニル」は、少なくとも１個の環が少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を有する、シクロ脂肪族部分を意味する。「シクロアルキニル」は、少なくとも１個の環が少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有する、シクロ脂肪族部分を意味する。実例として、シクロ脂肪族部分は、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロオクチル、およびアダマンチルを包含する。好ましいシクロ脂肪族部分はシクロアルキル、特に、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルである。「シクロアルキレン」はシクロアルキル基の二価の対応する基を意味する。
【００３９】
「ヘテロシクロ脂肪族」はシクロ脂肪族部分を意味し、ここでその少なくとも１個の環において、３個まで（好ましくは１ないし２個）の炭素は、Ｎ、ＯまたはＳより独立して選択されるヘテロ原子で置換されており、そのＮおよびＳは所望により酸化されていてもよく、そのＮは所望により四級化されていてもよい。好ましいシクロ脂肪族部分は大きさが５ないし６員の１個の環からなる。同様に、「ヘテロシクロアルキル」、「ヘテロシクロアルケニル」および「ヘテロシクロアルキニル」は、各々、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはシクロアルキニル部分を意味し、ここで少なくとも１個のその環は上記のように修飾される。典型的なヘテロシクロ脂肪族部分は、
アジリジニル、アゼチジニル、１,３−ジオキサニル、オキセタニル、テトラヒドロフリル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロチオピラニルスルホン、モルホリニル、チオモルホリニル、チオモルホリニルスルホキシド、チオモルホリニルスルホン、１,３−ジオキソラニル、テトラヒドロ−１,１−ジオキソチエニル、１,４−ジオキサニル、チエニル等を包含する。「ヘテロシクロアルキレン」はヘテロシクロアルキル基の二価の対応する基を意味する。
【００４０】
「アルコキシ」、「アリールオキシ」、「アルキルチオ」および「アリールチオ」は、各々、−Ｏ（アルキル）、−Ｏ（アリール）、−Ｓ（アルキル）、および−Ｓ（アリール）を意味する。例として、各々、メトキシ、フェノキシ、メチルチオ、およびフェニルチオが挙げられる。
【００４１】
「ハロゲン」または「ハロ」は、より狭い意味で示されるのでない限り、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。
【００４２】
「アリール」は、単環、二環または三環式環系（好ましくは単環式）を有する炭化水素部分を意味し、ここで各環は３ないし７個の炭素原子を有し、少なくとも１個の環は芳香族である。該環系における環は（ナフチルにあるように）相互に縮合してもよく、あるいは（ビフェニルにあるように）相互に結合し、（インダニルまたはシクロヘキシルフェニルにあるように）非芳香族環と縮合しても、または結合してもよい。さらなる例として、アリール部分は、限定されないが、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、ビフェニル、フェナントリル、アントラセニル、およびアセナフチルを包含する。「アリーレン」は、アリール基の二価の対応する基、例えば、１,２−フェニレン、１,３−フェニレン、または１,４−フェニレンを意味する。
【００４３】
「ヘテロアリール」は、単環、二環または三環式環系（好ましくは５〜７員の単環式）を有する部分を意味し、ここで各環は３ないし７個の炭素原子を有し、少なくとも１個の環はＮ、ＯまたはＳより独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を含有する芳香族環であり、そのＮおよびＳは所望により酸化されていてもよく、そのＮは所望により四級化されていてもよい。そのような少なくとも１個のヘテロ原子を含有する芳香族環は、（ベンゾフラニルまたはテトラヒドロイソキノリルにあるように）別の型の環と縮合してもよく、または（フェニルピリジルまたは２−シクロペンチルピリジルにあるように）別の型の環に直接結合してもよい。さらなる例として、ヘテロアリール部分は、ピロリル、フラニル、チオフェニル（チエニル）、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、Ｎ−オキソピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、シンノリニル、キノザリニル、ナフチリジニル、ベンゾフラニル、インドリル、ベンゾチオフェニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、フェノチアゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ジベンゾフラニル、カルバゾリル、ジベンゾチオフェニル、アクリジニル等が挙げられる。「ヘテロアリーレン」は、ヘテロアリール基の二価の対応する基を意味する。
【００４４】
「置換されていないか、置換されているＣ１−Ｃ５アルキル」または「所望により置換されていてもよいヘテロアリール」にあるように、「置換されていないか、置換されている」または「所望により置換されていてもよい」なる語を用いることによるように、ある部分が置換されていてもよいと示唆される場合、かかる部分は、１または複数の独立して選択される置換基、好ましくは１〜５個の、より好ましくは１または２個の置換基を有してもよい。置換基および置換パターンは、置換基が結合する部分に注意して、当該分野の当業者によって選択され、化学的に安定し、当該分野にて公知の技法ならびに本明細書に記載の方法により合成され得る化合物を提供することができる。ある部分が「置換されていないか、置換されている」または「所望により置換されていてもよい」と同定される場合、好ましい実施態様では、かかる部分は置換されていない。
【００４５】
「アリールアルキル」、「（ヘテロシクロ脂肪族）アルキル」、「アリールアルケニル」、「アリールアルキニル」、「ビアリールアルキル」等は、場合によっては、アリール、ヘテロシクロ脂肪族、ビアリール等で置換されていてもよいアルキル、アルケニル、またはアルキニル部分を、場合によっては、例えば、ベンジル、フェネチル、Ｎ−イミダゾイルエチル、Ｎ−モルホリノエチル等のように、アルキル、アルケニル、またはアルキニル部分にオープンな（充足されていない）結合価のある基を意味する。反対に、「アルキルアリール」、「アルケニルシクロアルキル」等は、場合によっては、アルキル、アルケニル等で置換されてもよい、アリール、シクロアルキル等の部分を、場合によっては、例えば、メチルフェニル（トリル）またはアリルシクロヘキシルのような基を意味する。「ヒドロキシアルキル」、「ハロアルキル」、「アルキルアリール」、「シアノアリール」等は、場合によっては、１または複数の同定されている置換基（場合によっては、ヒドロキシル、ハロ等）で置換されてもよい、アルキルまたはアリール等の部分を意味する。
【００４６】
例えば、許容される置換基は、限定されないが、アルキル（特にメチルまたはエチル）、アルケニル（特にアリル）、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロ脂肪族、ヘテロシクロ−脂肪族、ハロ（特にフルオロ）、ハロアルキル（特にトリフルオロメチル）、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル（特にヒドロキシエチル）、シアノ、ニトロ、アルコキシ、−Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−Ｏ（ハロアルキル）（特に−ＯＣＦ３）、−Ｏ（シクロアルキル）、−Ｏ（ヘテロシクロアルキル）、−Ｏ（アリール）、アルキルチオ、アリールチオ、＝Ｏ、＝ＮＨ、＝Ｎ（アルキル）、＝ＮＯＨ、＝ＮＯ（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、−ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）（ヒドロキシアルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、アジド、−ＮＨ２、−ＮＨ（アルキル）、−Ｎ（アルキル）２、−ＮＨ（アリール）、−ＮＨ（ヒドロキシアルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＯＳＯ２（アルキル）、−ＳＨ、−Ｓ（アルキル）、−Ｓ（アリール）、−Ｓ（シクロアルキル）、−Ｓ（＝Ｏ）アルキル、−ＳＯ２（アルキル）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（アルキル）２等を包含する。
【００４７】
置換されている部分が脂肪族部分である場合、好ましい置換基はアリール、ヘテロアリール、シクロ脂肪族、ヘテロシクロ脂肪族、ハロ、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、−Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−Ｏ（ハロアルキル）、−Ｏ（シクロアルキル）、−Ｏ（ヘテロシクロアルキル）、−Ｏ（アリール）、アルキルチオ、アリールチオ、＝Ｏ、＝ＮＨ、＝Ｎ（アルキル）、＝ＮＯＨ、＝ＮＯ（アルキル）、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、−ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）（ヒドロキシアルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、アジド、−ＮＨ２、−ＮＨ（アルキル）、−Ｎ（アルキル）２、−ＮＨ（アリール）、−ＮＨ（ヒドロキシアルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＯＳＯ２（アルキル）、−ＳＨ、−Ｓ（アルキル）、−Ｓ（アリール）、−Ｓ（＝Ｏ）アルキル、−Ｓ（シクロアルキル）、−ＳＯ２（アルキル）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（アルキル）、および−ＳＯ２Ｎ（アルキル）２である。より好ましい置換基はハロ、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、−Ｏ（アリール）、＝Ｏ、＝ＮＯＨ、＝ＮＯ（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、アジド、−ＮＨ２、−ＮＨ（アルキル）、−Ｎ（アルキル）２、−ＮＨ（アリール）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、および−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２である。フェニル、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｏ（Ｃ２−Ｃ４アルキレン）ＯＨ、および−Ｏ（Ｃ２−Ｃ４アルキレン）ハロが特に好ましい。
【００４８】
置換されている部分が、シクロ脂肪族、ヘテロシクロ脂肪族、アリール、またはヘテロアリール部分である場合、好ましい置換基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、−Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−Ｏ（ハロアルキル）、−Ｏ（アリール）、−Ｏ（シクロアルキル）、−Ｏ（ヘテロシクロアルキル）、アルキルチオ、アリールチオ、−Ｃ（＝Ｏ）（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、−ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）（ヒドロキシアルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、アジド、−ＮＨ２、−ＮＨ（アルキル）、−Ｎ（アルキル）２、−ＮＨ（アリール）、−ＮＨ（ヒドロキシアルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＯＳＯ２（アルキル）、−ＳＨ、−Ｓ（アルキル）、−Ｓ（アリール）、−Ｓ（シクロアルキル）、−Ｓ（＝Ｏ）アルキル、−ＳＯ２（アルキル）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（アルキル）、および−ＳＯ２Ｎ（アルキル）２である。より好ましい置換基は、アルキル、アルケニル、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、−Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、−ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）（ヒドロキシアルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、−ＮＨ２、−ＮＨ（アルキル）、−Ｎ（アルキル）２、−ＮＨ（アリール）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、および−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２である。Ｃ１−Ｃ４アルキル、シアノ、ニトロ、ハロ、およびＣ１−Ｃ４アルコキシが特に好ましい。
【００４９】
「Ｃ１−Ｃ５アルキル」または「５〜１０％」のように、一定の範囲が示される場合、かかる範囲は、第１の例におけるＣ１およびＣ５のように、および第２の例での５％および１０％のように、その範囲の終点を含む。
【００５０】
特定の立体異性体が（例えば、構造式にて関連する立体中心で太字または破線の結合により、構造式にて二重結合をＥまたはＺ配置を有するとして描写することにより、または立体化学指定命名法を用いることによって）具体的に示されない限り、あらゆる立体異性体が、純粋な化合物として、ならびにその混合物として本発明の範囲内に含まれる。特記されない限り、個々のエナンチオマー、ジアステレオマー、幾何異性体、ならびにその組み合わせおよび混合物はすべて本発明の範囲内にある。
【００５１】
当業者にとって、化合物が、本明細書にて使用される構造式において描写される形態と均等である、互変異性体の形態（例えば、ケトおよびエノール形態）、共鳴形態、および双性イオン形態を有してもよいこと、およびその構造式がかかる互変異性体、共鳴体または双性イオン形態を包含することは明らかであろう。
【００５２】
「医薬的に許容されるエステル」は、インビボにて（例えば、ヒト体内にて）加水分解して親化合物またはその塩を生成するエステルを、あるいはその自体が親化合物の活性と同様の活性を有することを意味する。適切なエステルとして、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルケニルまたはＣ２−Ｃ５アルキニルエステル、特にメチル、エチルまたはｎ−プロピルが挙げられる。
【００５３】
「医薬的に許容される塩」は、医薬組成物に適する化合物の塩を意味する。化合物が１または複数の塩基性基を有する場合、該塩は、サルフェート、ヒドロブロミド、タートレート、メシレート、マレエート、シトレート、ホスフェート、アセテート、パーモエート（エンボネート）、ヒドロヨーダイド、ニトレート、ヒドロクロリド、ラクテート、メチルサルフェート、フマレート、ベンゾエート、スクシネート、メシレート、ラクトビオネート、スベレート、トシレート等などの酸付加塩とすることができる。化合物が１または複数の酸性基を有する場合、該塩は、カルシウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、メグルミン塩、アンモニウム塩、亜鉛塩、ピペラジン塩、トロメタミン塩、リチウム塩、コリン塩、ジエチルアミン塩、４−フェニルシクロヘキシルアミン塩、ベンザチン塩、テトラメチルアンモニウム塩等とすることができる。多形結晶形態および溶媒和物も本発明の範囲内に含まれる。
【００５４】
本明細書の式中で、結合と交差する波線
【化１】
2020531430.tif 000003
または結合の末端にある星印（＊）は、共有結合部位を示す。例えば、式：
【化２】
2020531430.tif 000004
において、Ｒが
【化３】
2020531430.tif 000005
であるか、またはＲが
【化４】
2020531430.tif 000006
であるとの記載は
【化５】
2020531430.tif 000007
を意味する。
【００５５】
本明細書の式において、芳香族環の２個の炭素の間で該環と交差する結合は、該結合と接合した基が芳香族環の利用可能ないずれの位置に置かれてもよいことを意味する。実例として、式：
【化６】
2020531430.tif 000008
は
【化７】
2020531430.tif 000009
を示す。
【００５６】
実施態様
配列番号：１（ＸａａがＡｌａである場合）および配列番号：２（ＸａａがＳｅｒである場合）は、本明細書に開示のプロドラッグ化の概念を説明するのにＶＨまたはＶＬ領域においてＣｙｓ置換がなされ得る、ヒト抗ＣＴＬＡ４抗体（以下、「ＣＴＬＡ４Ａｂ」という）の、各々、全長の重鎖および軽鎖（カッパ）アミノ酸配列を提供する。その重および軽可変鎖の可変領域が、各々、図２および図３に、アミノ酸の配列番号とＫａｂａｔナンバーリングを相関付け、Ｃｙｓ置換の望ましい位置を示す、注記を添えて図示される。ＣＴＬＡ４Ａｂにおいて、２本の重鎖は相互に同じであり、２本の軽鎖は相互に同じである。
【００５７】
配列番号：３および配列番号：４は、本明細書に開示のプロドラッグ化の概念を説明するのにＶＨまたはＶＬ領域においてＣｙｓ置換がなされ得る、抗ＣＤ１３７抗体（以下、「ＣＤ１３７Ａｂ」という）の、各々、全長の重鎖および軽鎖（カッパ）アミノ酸配列を提供する。その重および軽可変鎖の可変領域が、各々、図４および図５に、アミノ酸の配列番号とＫａｂａｔナンバーリングを相関付け、Ｃｙｓ置換の望ましい位置を示す、注記を添えて図示される。ＣＤ１３７Ａｂにおいて、２本の重鎖は相互に同じであり、２本の軽鎖は相互に同じである。ＣＤ１３７Ａｂは、ラット可変重鎖領域および軽鎖領域と、マウスＩｇＧ１重鎖定常領域とを有する、キメラ抗体である。
【００５８】
本発明のプロドラッグ化抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体と、好ましくはモノクローナル抗体とすることができる。本発明のプロドラッグ化抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体と、好ましくはヒト抗体とすることができる。
【００５９】
Ｃｙｓと置換するのに適する、重鎖および軽鎖可変領域にあるアミノ酸は、置換で入るＣｙｓが遮断部分ＢＭの接合のために接触可能であるように、その側鎖が溶媒露出されている、好ましくは少なくとも３０％露出されている、フレームワークアミノ酸である。置換で出ていくアミノ酸は、ＢＭが抗体−抗原結合を効果的に干渉し得るように、ＣＤＲアミノ酸の近くにあることも重要である。１０Å未満の距離が好ましく、さらに好ましくは５Å未満である。
【００６０】
Ｃｙｓ置換に適する好ましい位置は、Ｋａｂａｔによる番号付けで、重鎖可変領域の位置２３、および軽鎖可変領域の位置６７を包含する。両位置は個々の可変領域のフレームワーク領域内にある。Ｃｙｓは当該分野にて周知の部位特異的置換技法によりこれらの位置に置換され得る。第１部位での置換は、簡単な表記法を用い、ＶＬ  Ｘ６７Ｃで表すことができ、ここでＸは置換で出ていくアミノ酸を意味する。自然抗体では、この部位は高度に保存されており、Ｓｅｒであることが多い。第２部位での置換は同様にしてＶＨ  Ｘ２３Ｃで表すことができる。
【００６１】
本発明のプロドラッグ化抗体は、ＶＨ領域か、またはＶＬ領域のいずれか、あるいはその両方で置換され得る。抗体がこれらの置換のうち１つだけを有するならば、結合し得る遮断部分−リンカー化合物の最大数は、理論上、２であるが、プロドラッガブル抗体の調製物は、結合プロセスにおける化学的非効率性を反映して、統計的により低い数を示すかもしれない。抗体が両方で置換されるならば、その理論的最大数は４である。
【００６２】
本発明は、古典的な配置の抗体（すなわち、２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖の抗体）で説明されるが、重鎖および軽鎖が異なる２種の対を有する、二重特異性抗体にも適用され得る。かくして、本発明のプロドラッグ化抗体は、１つの重鎖／軽鎖の対だけがプロドラッグ化されている二重特異性抗体であるか、あるいは重鎖／軽鎖の両方の対がプロドラッグ化されている二重特異性抗体とすることができる。
【００６３】
接合に適するスルフヒドリル側鎖を導入することを目的として、抗体−薬物のコンジュゲートを製造するのに、マレイミド付加化学反応のよって、ＶＨまたはＶＬ領域にあるアミノ酸をＣｙｓと置換することも知られている。例えば、Eigenbrotら、2007およびBhaktaら、2016を参照のこと。
【００６４】
１の実施態様において、プロドラッグ化され得る能力を有する抗体、およびそれより製造され、軽鎖のＫａｂａｔ位置６７にＣｙｓを有するプロドラッグ化抗体は、好ましくは、
（ａ）配列番号：１のアミノ酸３１−３５を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸５０−６６を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸９９−１０７を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸２４−３５を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：２のアミノ酸５１−５７を含む軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：２のアミノ酸９０−９８を含む軽鎖ＣＤＲ３
を有する、抗ＣＴＬＡ４抗体である。より好ましくは、抗ＣＴＬＡ４抗体は、配列番号：１のアミノ酸１−１１８（ＸａａがＡｌａである場合）を含む重鎖可変領域、および配列番号：２のアミノ酸１−１０８（ＸａａがＣｙｓである場合）を含む軽鎖可変領域を有する。
【００６５】
もう一つ別の実施態様において、プロドラッグ化され得る能力を有する抗体、およびそれより製造され、重鎖のＫａｂａｔ位置２３にＣｙｓを有するプロドラッグ化抗体は、好ましくは、
（ａ）配列番号：１のアミノ酸３１−３５を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸５０−６６を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸９９−１０７を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸２４−３５を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：２のアミノ酸５１−５７を含む軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：２のアミノ酸９０−９８を含む軽鎖ＣＤＲ３
を有する、抗ＣＴＬＡ４抗体である。より好ましくは、抗ＣＴＬＡ４抗体は、配列番号：１のアミノ酸１−１１８（ＸａａがＣｙｓである場合）を含む重鎖可変領域、および配列番号：２のアミノ酸１−１０８（ＸａａがＳｅｒである場合）を含む軽鎖可変領域を有する。
【００６６】
１の実施態様において、プロドラッグ化可能な抗ＣＴＬＡ４抗体、およびそれより製造されるプロドラッグ化抗体は、ＩｇＧ１イソタイプの抗体である。好ましくは、それはＲ２１４（ＥＵインデックスナンバーリング；配列番号：１のアミノ酸２１５）、Ｅ３５６（ＥＵインデックスナンバーリング；配列番号：１のアミノ酸３５７）、およびＭ３５８（ＥＵインデックスナンバーリング；配列番号：１のアミノ酸３５９）のアロタイプの組み合わせであり、該組み合わせは白色人種では一般的である。
【００６７】
１の実施態様において、リンカーは、健康な組織または器官と比べて、罹患した組織または器官で独自に発現するか、または過剰発現する、酵素（プロテアーゼ）によって切断可能なポリペプチド、すなわち、その酵素に対する基質を含む。酵素は罹患した組織または器官の細胞外環境において見られるのが好ましい。かかるプロテアーゼの例として、アスパルテートプロテアーゼ（例えば、レニン）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、アスパラギン酸カテプシン（例えば、カテプシンＤ、カスパーゼ１、カスパーゼ２等）、システインカテプシン（例えば、カテプシンＢ）、システインプロテアーゼ（例えば、レグマイン）、ジスインテグリン／メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ、例えば、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９）、トロンボスポンジンモチーフを含むジスインテグリン／メタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ、例えば、ＡＤＡＭＴＳ１）、膜内在性セリンプロテアーゼ（例えば、マトリプターゼ２、ＭＴ−ＳＰ１／マトリプターゼ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４）、カリクレイン関連性ペプチダーゼ（ＫＬＫ、例えばＫＬＫ４、ＫＬＫ５）、マトリクスメタロプロテアーゼ（例えば、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９）、およびセリンプロテアーゼ（例えば、カテプシンＡ、凝固因子プロテアーゼ、例えば、エラスターゼ、プラスミン、トロンビン、ＰＳＡ、ｕＰＡ、ＶＩＩａ因子、Ｘａ因子、およびＨＣＶ  ＮＳ３／４）が挙げられる。好ましくは、該プロテアーゼは、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化剤（ｕＰＡ、ウロキナーゼ）、ＭＴ−ＳＰ１／マトリプターゼ、レグマイン、またはマトリクスメタロプロテアーゼ（特にＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、およびＭＭＰ−９）である。当業者であれば、酵素および対応する切断可能なペプチドの選択は、治療すべき疾患に、罹患した組織または器官により発現されるプロテアーゼに依存することが分かるであろう。
【００６８】
ポリペプチド基質−酵素の対の例を表Ｉに示す。
【表１】
2020531430.tif 000010
【００６９】
好ましくは、切断可能なペプチドは、ＬＳＧＲＳＤＮＨ（配列番号：５）、ＬＳＧＸ（配列番号：１６）またはＬＳＧＫ（配列番号：１６）である。
【００７０】
適切なプロテアーゼおよび／またはその基質の開示として、Desnoyersら、2013；Staglianoら、2013；Staglianoら、2014；Waldmannら、2013；Lauermannら、2014；Lowmanら、2014；Daughertyら、2015；Lowmanら、2015a；Lowmanら、2015b；Mooreら、2015；Westら、2016a；Wangら、2016；Mooreら、2016；Mooreら、2017；およびDennisら、2016が挙げられ、それらの開示を出典明示により本明細書の一部とする。
【００７１】
プロドラッグ化抗体のその抗原との活性に干渉するか、または遮断するのに用いることのできる遮断部分ＢＭは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン結合ポリペプチド、アドネクチン、ペプチド、およびアルブミンまたはフィブリノーゲンなどの可溶性球状タンパク質を包含する。
【００７２】
１の実施態様において、ＢＭは、分子量が少なくとも約２ｋＤａのＰＥＧであり、２ｋＤａでは約４５個の−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−反復単位を有するＰＥＧに相当し、好ましくは少なくとも約５ｋＤａの分子量を有し、５ｋＤａでは約１１５個の−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−反復単位を有するＰＥＧに相当する。
【００７３】
４８個の−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−反復単位を有するアミン末端のＰＥＧ（ＣＡＳ  Ｒｅｇ．Ｎｏ．３２１３０−２７−１）はQuanta Biodesign Ltdより入手可能である。名目分子量が５ｋＤａのアミン末端のＰＥＧはNOF America Corp.（ＣＡＳ  Ｒｅｇ．Ｎｏ．１１６１６４−５３−５）より入手可能である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析法を用い、本発明者らは、その分子量分布が、約１００個と約１５５個の−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−反復単位に相当する、約４.４ｋＤａと約６.６ｋＤａの間にあると決定した。名目分子量が１０ｋＤａのアミン末端のＰＥＧはNOF America Corp.（ＣＡＳ  Ｒｅｇ．Ｎｏ．は１１６１６４−５３−５でもある）より入手可能である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析法を用い、本発明者らは、その分子量分布が、約２０５個と約２７５個の−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−反復単位に相当する、約９.０ｋＤａと約１２.０ｋＤａの間にあると決定した。該末端アミン基はリンカー部分と結合するための化学的官能性を提供する。
【００７４】
これらの遮断部分、および他の遮断部分ＢＭの開示として、Tomasiら、1988；Trouetら、2004；Waldmannら、2014；Lauermannら、2014；Lowmanら、2014；Daughertyら、2015；Lowmanら、2015a；Westら、2016a；およびWangら、2016が挙げられ、その開示を出典明示により本明細書の一部とする。
【００７５】
上記されるように、Ｃｙｓを有する抗体は、マレイミド末端基を有する遮断部分−リンカー部分の化合物と、下記のように、Ｃｙｓスルフヒドリル（ＳＨ）のマイケル付加反応によりコンジュゲートされ得る。かかる接合の操作は当該分野にて周知である。例えば、Shepardら、ＷＯ  ２０１７／１１２６２４Ａ１（２０１７）を参照のこと。
【化８】
2020531430.tif 000011
【００７６】
そのようにプロドラッグ化するのに用いることのできるマレイミド末端遮断部分−リンカー化合物の例が、式（Ｉａ）−（Ｉｈ）で示される化合物を包含し、その各々はマトリプターゼ酵素により切断可能なペプチドを含む。
【化９】
2020531430.tif 000012
【化１０】
2020531430.tif 000013
【化１１】
2020531430.tif 000014
【００７７】
抗体と、上記の遮断部分−リンカー化合物（Ｉａ）−（Ｉｈ）との接合により、各々、式（ＩＩａ）−（ＩＩｈ）（式中、Ａｂは上記される抗体であり、ｍは１、２、３または４である）で示されるプロドラッグ化抗体が提供される。
【化１２】
2020531430.tif 000015
【化１３】
2020531430.tif 000016
【化１４】
2020531430.tif 000017
【００７８】
当業者は、経時的に、チオールをマレイミド基に付加することによりスクシンイミド構造物が最初に形成されて得られ、次に加水分解により開環されてセコ形態となってもよく、そのスクシンイミドとセコ形態が機能的に均等であることが分かるであろう。
【化１５】
2020531430.tif 000018
【００７９】
上記したいくつかの構造より理解され得るように、酵素により切断可能なペプチドは自己犠牲基（self immolating group）と組み合わせて使用され得る。簡単に言えば、自己犠牲基の機能は、ペプチドと、抗体、リンカーまたは遮断部分の別の部分との間に分離を設け、それらのいずれかが切断酵素の作用に干渉しないようにすることである。切断された後に、自己犠牲基は自己脱離反応に供される。自己犠牲基の使用および構造はZhangら、ＵＳ  ９,５２７,８７１Ｂ２（２０１６）に記載されており、その開示を出典明示により本明細書の一部とする。
【００８０】
好ましい自己犠牲基は、その構造が下記に示される、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）基である。
【化１６】
2020531430.tif 000019
その作用モードは下記の反応式にて説明される：
【化１７】
2020531430.tif 000020
【００８１】
上記した反応式から認識され得るように、ペプチドの切断は、Ｃｙｓの遮断部分−リンカーとの結合がそれと接合したスクシンイミド残基（またはその開環誘導体）と共に残るという意味で、抗体Ａｂをその原構造に復元しない。このことは自己犠牲基が使用されていようがいまいが関係なく適用される。本発明者らは、予期せぬことに、スクシンイミド残基が抗体の抗原結合活性の復元を妨げないことを見出した。
【実施例】
【００８２】
本発明の実施は、実例としてであり、限定するものではない、次の実施例を参考にしてさらに理解され得る。
【００８３】
実施例１−化合物（Ｉａ）
標準Ｆｍｏｃ化学に従い、Protein Technologies’ PRELUDE（登録商標）ペプチド合成装置を用いて直鎖先駆体を製造した。
【００８４】
【化１８】
2020531430.tif 000021
樹脂ローディング：
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（３.３４ミリモル、１.５６７ｇ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、８.３６ミリモル、１.４５７ｍＬ）／ジクロロメタン（ＤＣＭ、１８.５８ｍＬ）を、バイオラッド製（Biorad）分取カラム中の２−クロロトリチル樹脂（１.５ミリモル／ｇ、２.７９ミリモル、１.８１ｇ、ＤＣＭで予め膨潤させた）に加えた。該樹脂を室温（ＲＴ）で１８時間振盪した。溶媒を濾過で除去し、その固形樹脂をＤＣＭ（５ｘ１０ｍＬ）で洗浄し、次に真空下で乾燥させて樹脂１（２.７１３ｇ、ローディング  ０.８１ミリモル／ｇ）を得た。
【００８５】
【化１９】
2020531430.tif 000022
プレリュード（PRELUDE）（登録商標）装置での標準的アミノ酸カップリング：
トップ・ウォッシュ・ファンクション（Top Wash function）を介して該樹脂をＤＭＦで膨潤させ（８ｍＬｘ１０分間）、３０秒毎に緩やかなＮ２の流れで混合した。溶媒を排出し、樹脂をピペリジンのＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド中２０％溶液（ＤＭＦ、洗浄毎に５分間にわたって１０ｍＬｘ２）で洗浄し、３０秒毎に緩やかなＮ２の流れで混合した。該樹脂をＤＭＦ（洗浄毎に６０秒間にわたって１５ｍＬｘ６）で洗浄した。Ｆｍｏｃ保護のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−ＡＡ、ＤＭＦ中０.１Ｍ溶液、３当量）を該樹脂に加え、つづいてＨＡＴＵ（ＤＭＦ中０.２Ｍ溶液、３当量）およびＮ−メチルモルホリン（ＤＭＦ中０.８Ｍ、５当量）を添加した。次に該反応混合物を６０分間にわたって緩やかな窒素の流れでかき混ぜた。
【００８６】
この標準的操作をＰ４−Ｐ１カップリングに用いた。最終のＰ１アミノ酸をカップリングし、つづいてＦｍｏｃ基を除去した後で、該樹脂を無水酢酸／ＤＩＰＥＡ／ＤＭＦの溶液（１：１：３、５ｍＬｘ２、１０分間）で蓋をした。樹脂−Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（Ｐ５）−Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｙ−ＯＨ（Ｐ４）−Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（トリチル）−ＯＨ（Ｐ３）−Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ（Ｐ２）−Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＡｌｌ（Ｐ１）
【００８７】
【化２０】
2020531430.tif 000023
化合物３：
樹脂２（０.９５６ｇ、１.０ミリモル）をＤＣＭ（１６ｍｌ）および１,１,１,３,３,３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＰ、４ｍｌ）の混合液で処理し、室温で１０分間振盪した。混合物を濾過し、濾液を真空下で濃縮した。該樹脂をさらなるＤＣＭ（１６ｍｌ）およびＨＦＰ（４ｍＬ）で処理し、１０分間振盪した。該混合物を濾過した。濾液を合わせ、真空下で濃縮した。この材料をＤＣＭに溶かし、真空下で濃縮し（４ｘ）、Ｎ２−Ｎ−（（（Ｓ）−４−アセトアミド−５−（アリルオキシ）−５−オキソペンタノイル）−Ｌ−ロイシル）−Ｏ−トリチル−Ｌ−セリルグリシル−Ｎ６−（tert−ブトキシカルボニル）−Ｌ−リシンを得た。ＭＳ（ＥＳＩ＋）（Ｍ＋Ｈ）＋  ９５７.８
【００８８】
【化２１】
2020531430.tif 000024
化合物４：
ペプチド３のＤＭＦ（２.５ｍｌ）中溶液に、２,４,６−コリジン（１９８μｌ、１.５ミリモル）を、つづいて（４−アミノフェニル）メタノール（１４８ｍｇ、１.２ミリモル）およびＨＡＴＵ（４５６ｍｇ、１.２ミリモル）を添加した。透き通った橙色の溶液を室温で２０分間撹拌した。次に該反応物を撹拌したＨ２Ｏ（５０ｍＬ）のフラスコに加え、得られた沈殿物を真空濾過で集めた（３ｘ１０ｍＬ  Ｈ２Ｏで洗浄した）。フリットで風乾させた後、その固体をＥｔ２Ｏ（３ｘ１０ｍＬ）で洗浄した。次に該固体をＤＣＭとＭｅＯＨの混合液（合計で約１００ｍＬ）に溶かし、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮してアリル  Ｎ２−アセチル−Ｎ５−（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（２−（（（Ｓ）−６−（（tert−ブトキシカルボニル）アミノ）−１−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−１−オキソヘキサン−２−イル）アミノ）−２−オキソエチル）アミノ）−１−オキソ−３−（トリチルオキシ）プロパン−２−イル）アミノ）−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）−Ｌ−グルタミネート（７８５ｍｇ、０.７３９ミリモル、収率７３.９％）を褐色の固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  １０６１.８（Ｍ＋Ｈ）＋
【００８９】
【化２２】
2020531430.tif 000025
化合物５：
中間体４（７８５ｍｇ、０.７３９ミリモル）のＤＭＦ（３６９５μｌ）中溶液に、ビス（４−ニトロフェニル）カルボネート（３３７ｍｇ、１.１０８ミリモル）およびＤＩＰＥＡ（１９３μｌ、１.１０８ミリモル）を添加した。反応物を室温で１.５時間撹拌した。次に該混合物に、１−（２−アミノエチル）−１Ｈ−ピロール−２,５−ジオン・塩酸塩（２６１ｍｇ、１.４７８ミリモル）およびＤＩＰＥＡ（３８６μＬ、２.２１７ミリモル）を添加した。得られた溶液を室温で３０分間撹拌し、それをＥｔ２Ｏ（５０ｍＬ）に加えた。得られた沈殿物を真空濾過で集め、Ｅｔ２Ｏ（２ｘ５ｍＬ）で洗浄し、アリル  Ｎ２−アセチル−Ｎ５−（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（２−（（（Ｓ）−６−（（tert−ブトキシカルボニル）アミノ）−１−（（４−（（（（２−（２,５−ジオキソ−２,５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソヘキサン−２−イル）アミノ）−２−オキソエチル）アミノ）−１−オキソ−３−（トリチルオキシ）プロパン−２−イル）アミノ）−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）−Ｌ−グルタミネート（１.１ｇ）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  １２２８.７（Ｍ＋Ｈ）＋
【００９０】
【化２３】
2020531430.tif 000026
化合物６：
中間体５（９３８ｍｇ、０.７６４ミリモル）のＭｅＣＮ（６１０９μｌ）およびＨ２Ｏ（１５２７μｌ）の混合液中の脱気処理に付した溶液に、酢酸（２１８μｌ、３.８２ミリモル）および４−メチルモルホリン（３３７μｌ、３.０５ミリモル）を、つづいて酢酸パラジウム（ＩＩ）（８６ｍｇ、０.３８２ミリモル）およびトリフェニルホスフィン−３,３’,３’’−トリスルホン酸トリナトリウム塩（４３４ｍｇ、０.７６４ミリモル）を添加した。該反応物を室温で１６時間撹拌した。該反応物を濾過し、逆相フラッシュクロマトグラフィー（５０ｇ RediSep Gold Ｃ１８カラム；２４分間にわたって２０−１００％Ｂ−Ａの線形勾配とする；Ａ＝５％ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏｗ／０.０５％ｖ／ｖ  ＴＦＡ；Ｂ＝５％Ｈ２Ｏ−ＭｅＣＮｗ／０.０５％ｖ／ｖ  ＴＦＡ）に付して精製し、Ｎ２−アセチル−Ｎ５−（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−１−（（２−（（（Ｓ）−６−（（tert−ブトキシカルボニル）アミノ）−１−（（４−（（（（２−（２,５−ジオキソ−２,５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エチル）カルバモイル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−１−オキソヘキサン−２−イル）アミノ）−２−オキソエチル）アミノ）−１−オキソ−３−（トリチルオキシ）プロパン−２−イル）アミノ）−４−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）−Ｌ−グルタミン（２８６ｍｇ）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  １１８７.６（Ｍ＋Ｈ）＋
【００９１】
【化２４】
2020531430.tif 000027
化合物７：
中間体６（２８６ｍｇ、０.２４１ミリモル）のＤＭＦ（３００８μｌ）中溶液に、ＨＡＴＵ（１０１ｍｇ、０.２６５ミリモル）を、つづいてｍ−ｄＰＥＧ４８−アミン（Quanta Biodesign、ＣＡＳ番号３２１３０−２７１、５６８ｍｇ、０.２６５ミリモル）およびＤＩＰＥＡ（８４μｌ、０.４８１ミリモル）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した。逆相フラッシュクロマトグラフィー（５０ｇ RediSep Gold Ｃ１８カラム；１０−１００％Ｂ−Ａの線形勾配とする；Ａ＝５％ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ＋０.０５％ｖ／ｖ  ＴＦＡ；Ｂ＝９５％ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ＋０.０５％ｖ／ｖ  ＴＦＡ）に付して精製し、化合物７（５０９ｍｇ）を得た。
【００９２】
【化２５】
2020531430.tif 000028
化合物（Ｉａ）：
化合物７（１５０ｍｇ、０.０４５ミリモル）のＤＣＭ（７２４μｌ）中溶液に、ＴＦＡ（１８１μｌ）を、つづいてトリイソプロピルシラン（１３.９４μｌ、０.０６８ミリモル）を添加した。反応物を室温で１.５時間撹拌した。次に反応物を濃縮し、分取ＨＰＬＣ（フェノメネックス・ルナ（Phenomenex Luna）Ｃ１８  ３０ｘ１００ｍｍカラムｍｍカラム；２５分間にわたって１０−９０％Ｂ−Ａの線形勾配とする；Ａ＝５％ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ＋０.１％ｖ／ｖ  ＴＦＡ；Ｂ＝９５％ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ＋０.１％ｖ／ｖ  ＴＦＡ；３０ｍＬ／分；２５４ｎｍ検出）に付して精製し、化合物（Ｉａ）（８６ｍｇ）を白色の固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  ９９１.２（Ｍ／３＋Ｈ）＋
【００９３】
実施例２−化合物（Ｉｂ）
【化２６】
2020531430.tif 000029
化合物１０：
中間体６（２０ｍｇ、０.０１７ミリモル）のＤＭＦ（４００μｌ）中溶液に、ＨＡＴＵ（８.３２ｍｇ、０.０２２ミリモル）を添加した。該混合物を室温で５分間撹拌し、メトキシ−ＰＥＧ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２（ＮＯＦ、カタログ番号  SUNBRIGHT（登録商標）ＭＥＰＡ−５０Ｈ、ＣＡＳ番号：１１６１６４−５３−５、１６８ｍｇ、０.０３４ミリモル）のＤＭＦ（４００μｌ）中溶液を添加した。該混合物を室温で７時間撹拌し、それをＭｅＯＨにて希釈し、分取ＨＰＬＣ（フェノメネックス・ルナ  Ｃ１８  ３０ｘ１００ｍｍカラム；２５分間にわたって５−８０％Ｂ−Ａの線形勾配とする；Ａ＝５％ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ＋０.１％ｖ／ｖ  ＴＦＡ；Ｂ＝９５％ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ＋０.１％ｖ／ｖ  ＴＦＡ；３０ｍＬ／分；２２０ｎｍ検出）に付して精製し、化合物１０（３９.１ｍｇ、６.３４マイクロモル、収率３７.６％）を得た。
【００９４】
【化２７】
2020531430.tif 000030
化合物（Ｉｂ）：
化合物１０（３９.１ｍｇ、５.８３ マイクロモル）のアセトニトリル（０.１ｍＬ）中溶液に、ＤＣＭ（０.５ｍＬ）中２０％ＴＦＡを添加した。次に該反応物を室温で1時間撹拌し、それを真空下で濃縮した。分取ＨＰＬＣ（フェノメネックス・ルナ  Ｃ１８ ３０ｘ１００ｍｍカラム；２５分間にわたって０−８０％Ｂ−Ａの線形勾配とする；Ａ＝５％ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ＋０.１％ｖ／ｖ  ＴＦＡ；Ｂ＝９５％ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ＋０.１％ｖ／ｖ  ＴＦＡ；３０ｍＬ／分；２２０ｎｍ検出）に付して精製し、化合物（Ｉｂ）（１３.５ｍｇ）を得た。ＭＡＬＤＩ質量スペクトルは、ΔＭＳが８２６の、５ｋ  ＰＥＧ化合物の正確な修正を示した（図６）。
【００９５】
実施例３−化合物（Ｉｃ）
【化２８】
2020531430.tif 000031
ペプチド１１は、中間体３を製造するのに用いた化学反応と同様にして、Protein Technologiesのプレリュードペプチド合成装置で、標準的Ｆｍｏｃ化学を用いて製造された。樹脂−Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ）２−ＯＨ（Ｐ５）−Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｙ−ＯＨ（Ｐ４）−Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（トリチル）−ＯＨ（Ｐ３）−Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ（Ｐ２）−ｍ−ｄＰＥＧ８−酸（Quanta Biodesign、ＣＡＳ番号１０９３６４７−４１−６）（Ｐ１）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  １２６９.６（Ｍ＋Ｈ）＋
【００９６】
【化２９】
2020531430.tif 000032
化合物１２：
中間体１１（８９ｍｇ、０.０７ミリモル）のＤＭＦ（１７５μｌ）中溶液に、（４−アミノフェニル）メタノール（１０.３５ｍｇ、０.０８４ミリモル）を、つづいてＨＡＴＵ（３１.９ｍｇ、０.０８４ミリモル）および２,４,６−コリジン（１３.８８μｌ、０.１０５ミリモル）を添加した。透き通った橙色の溶液を室温で３０分間撹拌し、撹拌したＨ２Ｏ（４ｍＬ）のバイアルに加えた。得られた沈殿物を真空濾過で集めた（２ｘ１ｍＬ  Ｈ２Ｏで洗浄した）。フリットで風乾させた後、その固体をＥｔ２Ｏ（３ｘ５ｍＬ）で洗浄した。該固体を真空下で乾燥させ、化合物１２（６９ｍｇ、７２％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  １３７２.６（Ｍ＋Ｈ）＋
【００９７】
【化３０】
2020531430.tif 000033
化合物１３：
中間体１２（６９ｍｇ、０.０５０ミリモル）のＤＭＦ（２５１μｌ）中溶液に、ビス（４−ニトロフェニル）カルボネート（２２.９２ｍｇ、０.０７５ミリモル）およびＤＩＰＥＡ（１３.１２μｌ、０.０７５ミリモル）を添加した。反応物を室温で1時間撹拌し、１−（２−アミノエチル）−１Ｈ−ピロール−２,５−ジオン・塩酸塩（１７.７４ｍｇ、０.１００ミリモル）およびＤＩＰＥＡ（２６.２μｌ、０.１５１ミリモル）を添加した。得られた混合物を室温でさらに1時間撹拌し、次にＥｔ２Ｏ（１５ｍＬ）のバイアルに滴下して加えた。得られた沈殿物を真空濾過で集め、Ｅｔ２Ｏ（３ｘ３ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥させて化合物１３（６０ｍｇ、７８％）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  １５３９.８（Ｍ＋Ｈ）＋
【００９８】
【化３１】
2020531430.tif 000034
化合物（Ｉｃ）：
中間体１３（６０ｍｇ、０.０３９ミリモル）のＤＣＭ（２７３μｌ）中溶液に、ＴＦＡ（１１７μｌ）を、つづいてトリイソプロピルシラン（１６.０１μｌ、０.０７８ミリモル）を添加した。反応物を室温で２時間撹拌し、それを真空下で濃縮した。粗材料を分取ＨＰＬＣ（フェノメネックス・ルナ  Ｃ１８  ３０ｘ１００ｍｍカラム；２０分間にわたって１０−９０％Ｂ−Ａの線形勾配とする；Ａ＝５％ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ＋０.１％ｖ／ｖ  ＴＦＡ；Ｂ＝９５％ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ＋０.１％ｖ／ｖ  ＴＦＡ；３０ｍＬ／分；２５４ｎｍ検出）に付して精製し、化合物（Ｉｃ）（４.２ｍｇ、収率８.９％）を白色の固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  １０９６.９（Ｍ＋Ｈ）＋
【００９９】
実施例４−化合物（Ｉｄ）
【化３２】
2020531430.tif 000035
樹脂１７は、樹脂２について記載されるのと同様の化学反応に従って、適切な出発材料から、Protein Technologiesのプレリュード（登録商標）ペプチド合成装置で、標準的Ｆｍｏｃ化学を用いて製造された。樹脂−Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｙ−ＯＨ（Ｐ９）−Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｈｉｓ（トリチル）−ＯＨ（Ｐ８）−Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（トリチル）−ＯＨ（Ｐ７）−Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−ＯＨ（Ｐ６）−Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（Ｐ５）−Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（Ｐ４）−Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｙ−ＯＨ（Ｐ３）−Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（Ｐ２）−Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ（Ｐ１）
【０１００】
【化３３】
2020531430.tif 000036
化合物１８：
樹脂１７（１５８ｍｇ、０.７５ミリモル／ｇ）に、６−マレイミドカプロン酸（４７.０ｍｇ、０.２２２ミリモル）およびＨＡＴＵ（５２.０ｍｇ、０.１３７ミリモル）のＤＭＦ（０.５ｍＬ）中溶液を、つづいて２,４,６−コリジン（０.３９２ｍＬ、０.３５９ミリモル）を添加した。得られた混合物を２時間振盪し、その後で溶媒を排出させた。樹脂をＤＭＦ（６ｍＬｘ３）およびＤＣＭ（６ｍＬｘ２）で洗浄し、次にＤＣＭ中２０％ＨＥＰ（８ｍＬ）で１５分間処理した。混合物を濾過し、濾液を真空下で濃縮し、Ｎａ−（Ｎ２−（（Ｓ）−４−（tert−ブトキシ）−２−（（Ｓ）−３−（tert−ブトキシ）−２−（（Ｓ）−２−（２−（（Ｓ）−３−（tert−ブトキシ）−２−（（Ｓ）−２−（６−（２,５−ジオキソ−２,５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサンアミド）−４−メチルペンタンアミド）プロパンアミド）アセトアミド）−５−（３−（（２,２,４,６,７−ペンタメチル−２,３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル）スルホニル）グアニジノ）ペンタンアミド）プロパンアミド）−４−オキソブタノイル）−Ｎ４−トリチル−Ｌ−アスパラギニル）−Ｎｔ−トリチル−Ｌ−ヒスチジルグリシン（３３.８ｍｇ、収率１９.３７％）を得た。
【０１０１】
【化３４】
2020531430.tif 000037
化合物１９：
中間体１８（３８.３ｍｇ、０.０１９ミリモル）のＤＭＦ（２００μｌ）中溶液に、ＨＡＴＵ（１０.７１ｍｇ、０.０２８ミリモル）を添加した。該混合物を室温で１０分間撹拌し、ｍ−ｄＰＥＧ４８−アミン（７２.５ｍｇ、０.０３４ミリモル）およびＤＩＰＥＡ（３.２８μｌ、０.０１９ミリモル）を添加した。反応物を室温でさらに１０分間撹拌し、次に分取ＨＰＬＣ（フェノメネックス・ルナ  Ｃ１８ ３０ｘ１００ｍｍカラム；１５分間にわたって２５−１００％Ｂ−Ａの線形勾配とする；Ａ＝５％ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ＋０.１％ｖ／ｖ  ＴＦＡ；Ｂ＝９５％ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ＋０.１％ｖ／ｖ  ＴＦＡ；３０ｍＬ／分；２２０ｎｍ検出）に付して精製し、化合物１９を白色の固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  １３８９.０（Ｍ／３＋Ｈ）＋（１４ｍｇ、収率１７.９％）
【０１０２】
【化３５】
2020531430.tif 000038
化合物（Ｉｄ）：
バイアルに、中間体１９（１４ｍｇ、３.３６マイクロモル）を、つづいてＴＦＡ（５０μＬ、０.６４９ミリモル）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌し、その後でそれをアセトニトリルで希釈し、分取ＨＰＬＣ（フェノメネックス・ルナ  Ｃ１８  ３０ｘ１００ｍｍカラム；１５分間にわたって５−８５％Ｂ−Ａの線形勾配とする；Ａ＝５％ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ＋０.１％ｖ／ｖ  ＴＦＡ；Ｂ＝９５％ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ＋０.１％ｖ／ｖ  ＴＦＡ；３０ｍＬ／分；２２０ｎｍ検出）に付して精製し、化合物（Ｉｄ）を白色の固体として得た。ＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  １０８７.８.０（Ｍ／３＋Ｈ）＋（２.８ｍｇ、収率２３.５％）
【０１０３】
実施例５−化合物（Ｉｅ）
【化３６】
2020531430.tif 000039
中間体１８（２１ｍｇ、０.０１ミリモル）のＤＭＦ（２００μｌ）中溶液に、ＨＡＴＵ（４.７ｍｇ、０.０１２ミリモル）を添加した。混合物を室温で１０分間撹拌し、その後でメトキシ−ＰＥＧ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２（ＮＯＦ、カタログ番号SUNBRIGHT（登録商標）ＭＥＰＡ−５０Ｈ、ＣＡＳ番号：１１６１６４−５３−５、５１.５ｍｇ、０.０３４ミリモル）のＤＭＦ（０.３ｍＬ）中溶液を、つづいてＤＩＰＥＡ（３.６μｌ、０.０２１ミリモル）を添加した。反応物を室温で４時間撹拌し、分取ＨＰＬＣ（フェノメネックス・ルナ  Ｃ１８  ３０ｘ１００ｍｍカラム；１５分間にわたって２５−１００％Ｂ−Ａの線形勾配とする；Ａ＝５％ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ＋０.１％ｖ／ｖ  ＴＦＡ；Ｂ＝９５％ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ＋０.１％ｖ／ｖ  ＴＦＡ；３０ｍＬ／分；２２０ｎｍ検出）に付して精製し、化合物２０（２８ｍｇ、収率３８.７％）を白色の固体として得た。
【０１０４】
【化３７】
2020531430.tif 000040
化合物（Ｉｅ）：
バイアルに、中間体２０（２８ｍｇ）を、つづいてＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（９７：３、１ｍＬ）を添加した。反応物を室温で６０分間撹拌し、その後でそれを真空下で濃縮した。次に残渣を水（２ｍＬ）に溶かし、滅菌フィルター（０.４５μｍ）を通して濾過した。濾液を凍結乾燥させ、リンカー６を白色の固体として得た（２０ｍｇ、収率７８％）。ＭＡＬＤＩ質量スペクトルは５ｋ  ＰＥＧ化合物の正確な修正を示した（図７）。
【０１０５】
実施例６−化合物（Ｉｆ）
【化３８】
2020531430.tif 000041
化合物２２：
樹脂１７（６００ｍｇ、０.６ミリモル／ｇ）に、（Ｓ）−３−（（tert−ブトキシカルボニル）アミノ）−２−（２,５−ジオキソ−２,５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパン酸（１８５ｍｇ、０.６５０ミリモル）（Nat. Biotech. 2014, 1059-1062）およびＨＡＴＵ（１８５ｍｇ、０.４８７ミリモル）のＤＭＦ（０.５ｍＬ）中溶液を、つづいて２,４,６−コリジン（１.２４０ｍＬ、１.１３７ミリモル）を添加した。反応物を３時間振盪させ、その後でそれを取り出した。樹脂をＤＭＦ（８ｍＬｘ３）、ＤＣＭ（８ｍＬｘ２）で洗浄した。次に該樹脂をＤＣＭ中２０％１,１,１,３,３,３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（８ｍＬ）で１５分間処理した。混合物を濾過し、濾液を真空下で濃縮し、化合物２２（１３６ｍｇ）を得た；ＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  １０５７.０［Ｍ／２＋Ｈ］＋
【０１０６】
【化３９】
2020531430.tif 000042
化合物２３：
中間体２２（１３４.２ｍｇ、０.０６３ミリモル）のＤＭＦ（０.３ｍＬ）中の撹拌した溶液に、ＨＡＴＵ（２９.０ｍｇ、０.０７６ミリモル）を添加した。混合物を室温で３０分間撹拌し、その後でｍ−ｄＰＥＧ４８−アミン（１３６ｍｇ、０.０６３ミリモル）のＤＭＦ（０.４ｍＬ）中溶液を、つづいてＤＩＰＥＡ（０.０３３ｍＬ、０.１９０ミリモル）を添加した。得られた反応物を室温で２時間撹拌し、次に分取ＨＰＬＣ（フェノメネックス・ルナ  Ｃ１８  ３０ｘ１００ｍｍカラム；１５分間にわたって３０−１００％Ｂ−Ａの線形勾配とする；Ａ＝５％ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ＋０.１％ｖ／ｖ  ＴＦＡ；Ｂ＝９５％ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ＋０.１％ｖ／ｖ  ＴＦＡ；３０ｍＬ／分；２２０ｎｍ検出）に付して精製し、化合物２３（４５.１ｍｇ、収率１６.７５％）を得た；ＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  １４１３.８［Ｍ／３＋Ｈ］＋
【０１０７】
【化４０】
2020531430.tif 000043
化合物（Ｉｆ）：
バイアルに、中間体２３（４６.５ｍｇ、１０.９６マイクロモル）を、つづいてＴＦＡ（５００μＬ、６.４９ミリモル）を添加した。混合物を室温で1時間撹拌し、その後でそれを真空下で濃縮し、次に分取ＨＰＬＣ（フェノメネックス・ルナ  Ｃ１８  ３０ｘ１００ｍｍカラム；１５分間にわたって０−８０％Ｂ−Ａの線形勾配とする；Ａ＝５％ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ＋０.１％ｖ／ｖ  ＴＦＡ；Ｂ＝９５％ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ＋０.１％ｖ／ｖ  ＴＦＡ；３０ｍＬ／分；２２０ｎｍ検出）に付して精製し、化合物（１５.３ｍｇ、収率３８.３％）を得た；ＭＳ（ＥＳＩ＋）  ｍ／ｚ  １０７８.６［Ｍ／３＋Ｈ］＋
【０１０８】
実施例７−化合物（Ｉｇ）
【化４１】
2020531430.tif 000044
化合物（Ｉｇ）は、化合物（Ｉｆ）を製造するのに使用された同様の化学反応に従って、中間体２２およびメトキシ−ＰＥＧ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２（ＮＯＦ、カタログ番号SUNBRIGHT（登録商標）ＭＥＰＡ−５０Ｈ、ＣＡＳ番号：１１６１６４−５３−５）より製造された。ＭＡＬＤＩ質量スペクトルは、５ｋ  ＰＥＧ化合物の正確な修正を示した（図８）。
【０１０９】
実施例８−化合物（Ｉｈ）
【化４２】
2020531430.tif 000045
化合物（Ｉｈ）は、化合物（Ｉｇ）を製造するのに使用された同様の化学反応に従って、中間体２２およびメトキシ−ＰＥＧ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２（ＮＯＦ、カタログ番号SUNBRIGHT（登録商標）ＭＥＰＡ−１０Ｔ、ＣＡＳ番号：１１６１６４−５３−５）より製造された。ＭＡＬＤＩ質量スペクトルは、１０ｋ  ＰＥＧ化合物の正確な修正を示した（図９）。
【０１１０】
実施例９−露出およびＣＤＲアミノ酸からの距離の計算
抗体可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）の構造またはモデルを用い、すべてのアミノ酸側鎖についてその接触可能表面積（accessible surface area、ＡＳＡ）を計算した。ＡＳＡは、LeeおよびRichardsが最初に開発した解決手段（LeeおよびRichards 1971）を用い、水分子を構造または分子モデルの表面を隈なく転がした場合に、半径が１.４Åのその球体の中心がトレースする表面積として定義される。残基Ｘの側鎖露出を、拡張構造の主鎖を有するＧｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙのトリペプチドより決定される理想とする表面積と比較した（Millerら、1987）。次にそのＡＳＡを、Millerら、1987によって報告されるように、所定のアミノ酸型について最大となるＡＳＡで割ることにより、その露出を正規化した。側鎖露出は、側鎖露出＝残基ＡＳＡ／最大ＡＳＡのパーセンテージとして報告される。
【０１１１】
所定の抗体についてのＣＥＲ残基のリストを同定するために、本発明者らは抗体のＦｖ領域の構造（例えば、抗体またはＦＡＢなどの抗体フラグメントのＸ線構造）またはその対応モデルを用いた。あらゆるアミノ酸について、側鎖露出を上記のように測定した。側鎖露出を最も近いＣＤＲ残基までの距離と合わせ、所定の抗体に対して好ましいＣＥＲ残基のリストを作成した。接触可能表面積、ＣＤＲ配置および残基と最も近いＣＤＲとの距離計算を含むあらゆる計算は、Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａおよびＩＭＧＴのＣＤＲディフィニションの結合体である、ＣＣＧ  ＣＤＲディフィニションを用いて、ＭＯＥ  ２０１５を介して実施された。
【０１１２】
Ｋａｂａｔスキーム（Kabatら、1991）は、同型のドメインの配列間で配列高多様性領域を配置することを基礎として開発された。それは抗体の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ、ＶκおよびＶλ）可変ドメインを番号付けする。Ｃｈｏｔｈｉａスキーム（Al-Lazikani、1997）は、Ｋａｂａｔと類似するが、構造ループと一致するように、第１のＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）の周りでインサーションにて注記を付けることで修正する。本発明者らはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲディフィニションを組み合わせることによりＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲを規制にする。
【０１１３】
図１０Ａおよび１０Ｂは、望ましい側鎖露出およびＣＤＲアミノ酸との近接性を有する、ＣＴＬＡ４Ａｂ残基を列挙する表を示す。かくして、１の実施態様において、Ｃｙｓ置換部位は、図１０Ａに示されるように、重鎖のＫａｂａｔ番号１、３、２５、４６、６８、７２、７６、８２ａ、または８３での、または軽鎖のＫａｂａｔ番号１、３、５、７、８、４５、５７、６０、６３、６５、６６、６７、および６９での置換である。もう一つ別の実施態様において、Ｃｙｓ置換部位は、図１０Ｂに示されるように、重鎖のＫａｂａｔ番号５、１９、２３、４３、７４、７５、８２ｂ、８４、８５、または１０５での、または軽鎖のＫａｂａｔ番号１８、２０、７７、または１００での置換である。
【０１１４】
実施例１０−接合
選択してＣｙｓ置換された抗体をＥｘｐｉ−ＣＨＯ細胞にて一時的に発現させ、タンパク質Ａクロマトグラフィーの標準プロトコルを用いて精製した。精製された抗体を、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する緩衝水溶液（ｐＨ７.２）中、過剰量（１０モル当量）の還元剤ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）で３７℃で１−３時間処理した。還元された変種抗体をセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５またはイオン交換カラムに通すことによりＴＣＥＰを除去した。抗体の還元は分析逆相ＨＰＬＣ系で確認された。精製された還元抗体を過剰量の、ｄｈＡＡ（デヒドロアスコルビン酸）、ＣｕＳＯ４（硫酸銅（ＩＩ））、空気、Ｈ２Ｏ２（過酸化水素）、Ｎ−ＣＳ（Ｎ−クロロスクシンイミド）またはＯ２（酸素分子）などのジスルフィド再酸化試薬（１０モル当量）で緩衝水溶液（ｐＨ７.０）中にて４℃または室温で０.５−２４時間処理した。抗体当たりの遊離チオールの割合は、タンパク質溶液の２８０ｎｍでの吸収からタンパク質濃度を、および該タンパク質とＤＴＤＰ（ジチオジピリジン）との反応からのチオール濃度を測定することにより推定された。抗体の再酸化は分析逆相ＨＰＬＣで、および凝集レベルは分析サイズ排除カラムでモニター観察された。
【０１１５】
上記されるように還元および再酸化に付した後、抗体を緩衝水溶液（ｐＨ７）中にて抗体のチオールに付き３モル当量のシステイン−反応性官能基（マレイミド、ヨードアセトアミドまたは同様の反応物）を含有するＢＭ−リンカーで処理した。ＢＭリンカーを、典型的には脱イオン水に溶かし、該反応混合物に加えた。室温で２時間または４℃で一夜にわたって反応を進行させた。その後で、タンパク質Ａ、イオン交換、サイズ排除、または複数の型のクロマトグラフィーを組み合わせることにより該コンジュゲートを精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタン・ブロット、ＨＩＣ、逆相ＨＰＬＣおよび質量分析法などの分析試験を行って、改変位置でのＢＭリンカーの結合を確かめた。
【０１１６】
実施例１１−リンカー部分のマトリプターゼ切断
リンカー部分がマトリプターゼで切断可能なペプチド配列を有する、プロドラッグ化抗体のマトリプターゼ切断についてアッセイするのに次の操作を用いた。
【０１１７】
プロドラッグ化抗体（４０μｇ）を１.３μｇのヒトマトリプターゼ（３０：１、Ｒ＆Ｄ系、３９４６−ＳＥ−０１０）と一緒に１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.６）中にて３７℃でインキュベートした。各時点で、１０μＬの試料を１０μＬのクエンチ緩衝液（１００ｍＭリン酸緩衝液＋４Ｍ  ＧｄｎＣｌおよび０.４Ｍ  ＴＣＥＰ、ｐＨ２.５）と混合し、同時に、酵素を失活させ、プロドラッグ化抗体を還元させた。クエンチさせた試料をＬＣ／ＭＳ分析に供した。
【０１１８】
実施例１２−活性化ＣＤ４＋  Ｔ細胞との結合
プロドラッグ化および脱プロドラッグ化（すなわち、リンカー部分を切断した）抗体を連続的希釈に付して試験し、ＡＰＣ標識の抗ヒトＩｇＧ第２抗体によって結合を検出した。フローサイトメトリーによる分析をCanto製フローサイトメーターを用いて行い、幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）をFlowJo製分析ソフトウェアを用いて測定した。両方の被験物質の結合を、配列番号：１および配列番号：２の非プロドラッグ化ＣＴＬＡ４Ａｂの結合と比較した。
【０１１９】
図１１Ａおよび１１Ｂにて実例となる結果を提供する。図１１Ａにて、「ＣＴＬＡ４」で標識される結合曲線は、配列番号：１の、いずれのＣｙｓ置換もない、自然ＣＴＬＡ４Ａｂに関するものである。「Ｓ６７Ｃ  ＣＴＬＡ４−未切断」で標識される結合曲線は、ＶＬ  Ｓ６７Ｃ置換に付し、次に５ｋＤａ  ＰＥＧを含む、遮断／リンカー部分（Ｉｅ）でプロドラッグ化された、ＣＴＬＡ４Ａｂに関するものである。曲線から分かるように、ＣＤ４＋  Ｔ細胞との結合は実質的に阻害される。最後に、「Ｓ６７Ｃ  ＣＴＬＡ４−切断」曲線は、遮断／リンカー部分のマトリプターゼを用いる切断で結合が本質的に完全に復元され、５ｋＤａ  ＰＥＧが解放されていることを示す。
【０１２０】
図１１Ｂは、ＣＴＬＡ４ＡｂがＶＨ  Ａ２３Ｃでプロドラッグ化されている、類似する実験についての結果を示す。また、プロドラッグ化で結合を失い、リンカーの切断で結合が復元しているのは明らかである。
【０１２１】
さらなる結合グラフを図１１Ｃ〜１１Ｅに示す。
【０１２２】
実施例１３−ＩＬ−２分泌アッセイ
プロドラッグ化および脱プロドラッグ化抗体の活性は、スタフィロコッカスエンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を用いる、インビトロ機能アッセイにより特徴付けられる。ＳＥＢは、Ｔ細胞を強く活性化し、サイトカイン分泌を刺激する、超抗原である。新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を健康な二人のドナーから単離し、数種類の濃度のプロドラッグ化および脱プロドラッグ化抗体で処理した。同時に、準最適濃度（８５ｎｇ／ｍＬ）のＳＥＢを加え、細胞を刺激した。Ｔ−細胞活性化をモニター観察しながら、インキュベーション／処理の３日目から、サイトカインＩＬ−２の分泌が測定された。
【０１２３】
次の操作を用いた：スタンフォード・ブラッド・センター（Stanford Blood Center）で健康な二人のドナー（ドナー１およびドナー２、各々、図１２Ａ／Ｂおよび図１３Ａ／Ｂ）から２つの軟膜を集めた。１５ｍＬのフィコール（Ficoll）を２０ｍＬの軟膜の下に置き、２０００ｒｐｍで２０分間、ブレーキなしで回転させる、標準的Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ分離方法を用いて軟膜から全ＰＢＭＣを単離した。白色の接触面を注意して分離し、ＰＢＳで数回洗浄し、余分なフィコールおよび血小板を取り除いた。次に細胞をＴ細胞アッセイ用媒体に再懸濁させた。陽性対照の抗体（ＣＴＬＡ４Ａｂ）について４０μｇ／ｍＬから０.０１μｇ／ｍＬまで、プロドラッグ化および脱プロドラッグ化抗体について８μｇ／ｍＬから０.０１μｇ／ｍｌまでの連続希釈を行い、９６ウェルの底がフラットな組織培養プレートにトリプリケートにて置いた。単離したＰＢＭＣを該プレートに１ｘ１０５細胞／ウェルで加え、８５ｎｇ／ｍＬ（ＳＥＢで滴定し、Ｔ−細胞増殖に関する刺激を観察することにより測定されるＳＥＢの最適下濃度）の超抗原ＳＥＢで刺激した。該細胞を３７℃のインキュベーター中で３日間インキュベートした。上清中のＩＬ−２濃度を均一系時間分解蛍光測定（ＨＴＲＦ）により測定した。ＨＴＲＦデータはソフトマックス・プロ（Softmax Pro）を用いて分析され、グラフパッド・プリズム（GraphPad Prism）ソフトウェアを用いてグラフ化された。
【０１２４】
その結果を、ドナー１については図１２Ａおよび図１２Ｂに、ドナー２については図１３Ａおよび図１３Ｂに示す。各々の場合で、ＣＴＬＡ４ＡｂのＶＬ  Ｓ６７ＣまたはＶＨ  Ａ２３Ｃのいずれかでのプロドラッグ化はＩＬ−２の誘導の減少をもたらし、脱プロドラッグ化はＩＬ−２誘導を復元することが分かる。図１２Ａ／Ｂおよび１３Ａ／Ｂでの、対照、プロドラッグ化および脱プロドラッグ化抗ＣＴＬＡ４抗体は、前記のＣＤ４＋Ｔ細胞の例および図１１Ａ／Ｂにて記載されるのと同じであった。
【０１２５】
本発明者らは、イソ型抗−ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）対照抗体により惹起されるＩＬ−２分泌と比較した場合に、該抗体が異なるドナーにて用量依存活性を示すことを観察した。ＣＴＬＡ４Ａｂと比べた時、そのプロドラッグ化抗体は機能活性の減少を示した。脱プロドラッグ化では、ＣＴＬＡ４Ａｂの陽性対照と同様に、脱プロドラッグ化抗体の最高濃度で、およそ３倍のＩＬ−２分泌の増加があった。この結果から、遮断部分を取り付けることによる抗体の結合の減少が機能性Ｔ細胞アッセイにて活性を減少させること、およびかかる活性が遮断部分の除去で復元されることを確認する。
【０１２６】
実施例１４−ＣＤ１３７抗体のプロドラッグ化
４種の異なるＣＤ１３７抗体：（ａ）ＣＤ１３７Ａｂプロパー（配列番号：３およびＮＯ：４）；（ｂ）置換で入るＣｙｓのＶＬ  Ｓ６７Ｃを介して遮断部分−リンカー（Ｉｆ）（２ｋＤａのＰＥＧを有する）にコンジュゲートしたＣＤ１３７Ａｂ；（ｃ）置換で入るＣｙｓのＶＬ  Ｓ６７Ｃを介して遮断部分−リンカー（Ｉｈ）（１０ｋＤａのＰＥＧを有する）にコンジュゲートしたＣＤ１３７Ａｂ；および（ｄ）置換で入るＣｙｓのＶＬ  Ｓ６７Ｃを介してリンカー（ＩＩＩ）（以下の構造）（遮断部分を有さず、「ペプチド対照」として供する）にコンジュゲートしたＣＤ１３７Ａｂが、この実施例にて使用された。
【化４３】
2020531430.tif 000046
【０１２７】
２種類の異なるアッセイを行った。第１のアッセイにて、ＣＤ１３７Ａｂおよびその変種（ａ）−（ｄ）と、ＣＤ８＋  ＣｏｎＡ活性化した脾型細胞（splenotype）との結合を、フローサイトメトリーによる平均蛍光装置を用い、第２アレキサ（Alexa）４８８コンジュゲートしたヤギ抗ヒト抗体との結合と比較した。結果を図１４に示す。該結果はＣＤ１３７Ａｂおよび変種（ｄ）は効果的に結合するが、変種（ｂ）および（ｃ）は結合しないことを示す（Invitrogenマウスイソ型対照抗体、カタログ番号ＭＡ１−１０４０６をイソ型対照として供した）。かくして、（ＩＩＩ）などの小ペプチドの付着は、ＶＬ  Ｓ６７Ｃ部位がＣＤＲアミノ酸に近接しているにもかかわらず、結合を効果的に阻害するのに十分ではない。しかしながら、２ｋＤａまたは１０ｋＤａなどの十分な大きさの遮断部分の存在は阻害において結果をもたらす。
【０１２８】
第２アッセイは機能アッセイであった。第１の態様において、図１５Ａに示されるように、ＩＦＮｇ（インターフェロン−ガンマ）の活性化ＣＤ８Ｔ細胞からの分泌が測定された。ＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞のＳＩＩＱＦＥＫＬペプチド活性化した脾細胞との結合した結果と同様に、ＣＤ１３７Ａｂおよび変種（ｄ）は、それらの活性の阻害を説明するのに効果的であったが、変種（ｂ）および（ｃ）は効果的でなかった。第２の態様を図１５Ｂに示す。Ｑ４ペプチドをＯＴ−１細胞に加え、ＣＤ１３７受容体の細胞表面での発現を誘発した。次にＣＤ１３７をその受容体と結合させ、ＣＤ８Ｔ細胞増殖を誘発させる。加えて、ＣＤ１３７Ａｂおよび変種（ｄ）は抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞増殖を誘発したが、変種（ｃ）および（ｄ）は誘発しなかった。抗ＫＬＨ抗体、カタログ番号：ＭＡ１−１０４０６ｂ、「ペプチドなし」およびＱ４シングルポイント（single points）は陰性対照であった。
【０１２９】
上記した本発明の詳細な記載は、本発明の特定の部分または態様と主にまたは排他的に関連付けられる、パッセージを包含する。これは明瞭および便宜のためであって、特定の特徴がその開示されているパッセージだけに関連付けられるのではなく、本明細書の開示が別のパッセージにて見られる情報の適切なあらゆる組み合わせをも包含するものと理解すべきである。同様に、本明細書の種々の数値および記載は本発明の特定の実施態様と関連するが、特定の特性は特定の数値または実施態様に照らして開示されており、かかる特性もまた、もう一つ別の数値または実施態様に照らして、もう一つ別の数値と組み合わせて、あるいは一般に本発明において、適宜拡張して使用され得ることを理解すべきである。
【０１３０】
さらには、本発明は、特定の好ましい実施態様の観点から、個々に記載されているが、本発明はかかる好ましい実施態様に限定されるものではない。むしろ、本発明の範囲は添付した特許請求の範囲により定められる。
【０１３１】
参考文献
本明細書において最初に記載される著者（または発明者）および先の日付による、省略された方式にて引用される以下の参考文献についての完全な引用部を以下に示す。これらの参考文献は、各々、あらゆる目的のために、出典明示により本明細書の一部とする。
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Sagertら、US 2016/0355592 A1 (2016) [2016a].
Sagertら、US 2016/0355599 A1 (2016) [2016b].
Staglianoら、US 8,399,219 B2 (2013)
Staglianoら、US 9,453,078 B2 (2016)
Tiptonら、US 2017/0044259 A1 (2017)
Tomasiら、US 4,732,863 (1988)
Trouetら、US 2004/0014652 A1 (2004)
Waldmannら、US 2013/0028893 A1 (2013)
Waldmannら、US 8,623,357 B2 (2014)
Wangら、US 2016/0009817 A1 (2016)
Westら、US 9,127,053 B2 (2015)
Westら、US 9,487,590 B2 (2016) [2016a]
Westら、US 2016/0311903 A1 (2016) [2016b]
Westら、US 2016/0355587 A1 (2016) [2016c]
Williamsら、US 9,193,791 B2 (2015)
【０１３２】
配列表の表
次の表は本明細書に記載の配列を要約する。
【表２】
2020531430.tif 000047
【図１】
2020531430.tif 000051
【図２】
2020531430.tif 000052
【図３】
2020531430.tif 000053
【図４】
2020531430.tif 000054
【図５】
2020531430.tif 000055
【図６】
2020531430.tif 000056
【図７】
2020531430.tif 000057
【図８】
2020531430.tif 000058
【図９】
2020531430.tif 000059
【図１０Ａ】
2020531430.tif 000060
【図１０Ｂ】
2020531430.tif 000061
【図１１Ａ】
2020531430.tif 000062
【図１１Ｂ】
2020531430.tif 000063
【図１１Ｃ】
2020531430.tif 000064
【図１１Ｄ】
2020531430.tif 000065
【図１１Ｅ】
2020531430.tif 000066
【図１２Ａ】
2020531430.tif 000067
【図１２Ｂ】
2020531430.tif 000068
【図１３Ａ】
2020531430.tif 000069
【図１３Ｂ】
2020531430.tif 000070
【図１４】
2020531430.tif 000071
【図１５Ａ】
2020531430.tif 000072
【図１５Ｂ】
2020531430.tif 000073
【配列表】
2020531430000001.app
【国際調査報告】
2020531430.tif 000074
2020531430.tif 000075
2020531430.tif 000076
2020531430.tif 000077