(57)【要約】  本発明は、カチオン性脂質と、このような脂質を単独で又は他の脂質と組み合わせて含む脂質ナノ粒子製剤とを提供する。このような脂質ナノ粒子は、核酸と共に製剤化されインビトロ及び治療用途の両方でその細胞内送達を容易にすることができる。また、本発明は、このような脂質を化学合成する方法、脂質ナノ粒子調製物及び核酸を含む製剤も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の構造：
【化１】
2020512272.tif 000087
（式中、ＸとＹは各々独立してＯ、Ｎ又はＮＨであり、ＸとＹの両方がＯになることはなく、
Ｗは結合、Ｏ、ＮＨ又はＳであり、
ＴはＣ又はＳであり、
ｍは０又は１であり、
ｚは０又は２である）で表される官能基を含むカチオン性脂質であって、
前記官能基は少なくとも１種の飽和又は不飽和脂肪酸残基に結合している、カチオン性脂質。
【請求項２】
前記官能基に対称又は非対称に結合している２種の脂肪酸残基を含む、請求項１に記載のカチオン性脂質。
【請求項３】
式（Ｉ）：
【化２】
2020512272.tif 000088
（式中、
ＹはＯ又はＮＨであり、
ＴはＣ又はＳであり、
Ｗは結合、Ｏ、ＮＨ又はＳであり、
Ｒ１は、
（ａ）ＮＲ４Ｒ５（Ｒ４とＲ５は各々独立してＣ１−Ｃ４アルキルであるか、又はＲ４とＲ５はそれらが結合している窒素と共に５員若しくは６員の複素環若しくは芳香族複素環を形成し、必要に応じてＯ、Ｎ及びＳから成る群から選択される１種以上の更なるヘテロ原子を含むか、又はＮＲ４Ｒ５はグアニジン基（−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２）を表す）、
（ｂ）天然又は非天然アミノ酸の側鎖、及び
（ｃ）Ｏ、Ｎ及びＳから成る群から選択される１種以上のヘテロ原子を含む５員又は６員の複素環又は芳香族複素環から成る群から選択され、
Ｒ２とＲ３は、
（ａ）Ｃ１０−Ｃ２２アルキル、
（ｂ）Ｃ１０−Ｃ２２アルケニル、
（ｃ）Ｃ１０−Ｃ２２アルキニル、
（ｄ）Ｃ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルキル、及び
（ｅ）Ｃ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルケニルから成る群から選択され、
Ｚは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−であり、
ｎは０、１、２、３、４、５又は６であり、
ｍは０又は１であり、
ｐは０又は１であり、
ｚは０又は２である）の構造で表され、
その塩、水和物、溶媒和物、多形体、光学異性体、幾何異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー及びその混合物を含む、請求項１又は２に記載のカチオン性脂質。
【請求項４】
ｍは０である、請求項３に記載のカチオン性脂質。
【請求項５】
ｍは１である、請求項３に記載のカチオン性脂質。
【請求項６】
ｐは０である、請求項３に記載のカチオン性脂質。
【請求項７】
ｐは１である、請求項３に記載のカチオン性脂質。
【請求項８】
ｍは０であり、ｐは０である、請求項３に記載のカチオン性脂質。
【請求項９】
ｍは１であり、ｐは０である、請求項３に記載のカチオン性脂質。
【請求項１０】
ｚは０である、請求項３に記載のカチオン性脂質。
【請求項１１】
ｚは２である、請求項３に記載のカチオン性脂質。
【請求項１２】
ＴはＣである、請求項３に記載のカチオン性脂質。
【請求項１３】
Ｗは結合である、請求項３に記載のカチオン性脂質。
【請求項１４】
Ｒ１はＮＲ４Ｒ５である、請求項３に記載のカチオン性脂質。
【請求項１５】
ｐは０であり、Ｗは結合であり、ＴはＣであり、化合物は式（Ｉａ）：
【化３】
2020512272.tif 000089
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｙ、ｍ、ｎ及びｚは請求項３で定義した通りである）の構造で表される、請求項３に記載のカチオン性脂質。
【請求項１６】
ｍは０である、請求項１５に記載のカチオン性脂質。
【請求項１７】
ｍは１である、請求項１５に記載のカチオン性脂質。
【請求項１８】
ｚは０である、請求項１５に記載のカチオン性脂質。
【請求項１９】
Ｒ２とＲ３は各々独立してＣ１４−Ｃ２０アルキル又はＣ１４−Ｃ２０アルケニルである、請求項１５に記載のカチオン性脂質。
【請求項２０】
Ｒ２とＲ３は各々独立してＣ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルキル又はＣ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルケニルであり、Ｚは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−である、請求項１５に記載のカチオン性脂質。
【請求項２１】
ＹはＯである、請求項１５に記載のカチオン性脂質。
【請求項２２】
ＹはＮＨである、請求項１５に記載のカチオン性脂質。
【請求項２３】
Ｒ１はＮＲ４Ｒ５であり、化合物は式（Ｉａ−１）：
【化４】
2020512272.tif 000090
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｙ、ｍ、ｎ及びｚは請求項３で定義された通りである）の構造で表される、請求項１５に記載のカチオン性脂質。
【請求項２４】
Ｒ４とＲ５は各々ＣＨ３であるか、又はＲ４とＲ５はそれらが結合している窒素と共に、ピロリジニル、ピペリジニニル及びピペラジニルから成る群から選択される複素環を形成し、これらの各々は必要に応じてアルキルで置換されている、請求項２３に記載のカチオン性脂質。
【請求項２５】
式（ＩＩ）：
【化５】
2020512272.tif 000091
（式中、Ａは
【化６】
2020512272.tif 000092
又は
【化７】
2020512272.tif 000093
であり、
Ｘ’はＯ又はＮＨであり、
Ｙ’はＯ又はＮＨであり、
Ａが
【化８】
2020512272.tif 000094
の場合には、
Ｘ’とＹ’の両方がＯになることはなく、
ＴはＣ又はＳであり、
Ｗは結合、Ｏ、ＮＨ又はＳであり、
Ｒ１は、
（ａ）ＮＲ４Ｒ５（Ｒ４とＲ５は各々独立してＣ１−Ｃ４アルキルであるか、又はＲ４とＲ５はそれらが結合している窒素と共に５員若しくは６員の複素環若しくは芳香族複素環を形成し、必要に応じてＯ、Ｎ及びＳから成る群から選択される１種以上の更なるヘテロ原子を含むか、又はＮＲ４Ｒ５はグアニジン基（−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２）を表す）、
（ｂ）天然又は非天然アミノ酸の側鎖、及び
（ｃ）Ｏ、Ｎ及びＳから成る群から選択される１種以上のヘテロ原子を含む５員又は６員の複素環又は芳香族複素環から成る群から選択され、
Ｒ２とＲ３は、
（ａ）Ｃ１０−Ｃ２２アルキル、
（ｂ）Ｃ１０−Ｃ２２アルケニル、
（ｃ）Ｃ１０−Ｃ２２アルキニル、
（ｄ）Ｃ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルキル、及び
（ｅ）Ｃ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルケニルから成る群から選択され、
Ｚは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−であり、
ｎは０、１、２、３、４、５又は６であり、
ｍは０又は１であり、
ｐは０又は１であり、
ｚは０又は２である）の構造で表され、
その塩、水和物、溶媒和物、多形体、光学異性体、幾何異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー及びその混合物を含む、請求項１又は２に記載のカチオン性脂質。
【請求項２６】
ｍは０である、請求項２５に記載のカチオン性脂質。
【請求項２７】
ｍは１である、請求項２５に記載のカチオン性脂質。
【請求項２８】
ｚは０である、請求項２５に記載のカチオン性脂質。
【請求項２９】
ｚは２である、請求項２５に記載のカチオン性脂質。
【請求項３０】
ｐは０である、請求項２５に記載のカチオン性脂質。
【請求項３１】
式（ＩＩａ）：
【化９】
2020512272.tif 000095
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ’、Ｔ、Ｗ、ｎ、ｍ、ｐ及びｚは請求項２５で定義した通りである）の構造で表される、請求項２５に記載のカチオン性脂質。
【請求項３２】
ｐは０であり、Ｗは結合であり、ＴはＣであり、化合物は式（ＩＩａ−１）：
【化１０】
2020512272.tif 000096
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ’、ｎ、ｍ及びｚは請求項２５で定義した通りである）の構造で表される、請求項３１に記載のカチオン性脂質。
【請求項３３】
Ｒ１はＮＲ４Ｒ５であり、化合物は式（ＩＩａ−２）：
【化１１】
2020512272.tif 000097
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｘ’、ｎ、ｍ及びｚは請求項２５で定義した通りである）の構造で表される、請求項３２に記載のカチオン性脂質。
【請求項３４】
ｐは１であり、ｍは１であり、Ｗは結合であり、ＴはＣであり、化合物は式（ＩＩａ−３）：
【化１２】
2020512272.tif 000098
（式中、Ｒ１は天然又は非天然アミノ酸の側鎖であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ’、ｎ及びｚは請求項２５で定義した通りである）の構造で表される、請求項３１に記載のカチオン性脂質。
【請求項３５】
ｐは０であり、Ｒ１はＮＲ４Ｒ５であり、Ｗは結合であり、ｍは０であり、Ｘ’はＯであり、化合物は式（ＩＩａ−４）：
【化１３】
2020512272.tif 000099
の構造で表される、請求項３１に記載のカチオン性脂質。
【請求項３６】
式（ＩＩｂ）：
【化１４】
2020512272.tif 000100
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｔ、Ｗ、Ｘ’、Ｙ’、ｎ、ｍ、ｐ及びｚは請求項２５で定義した通りである）の構造で表される、請求項２５に記載のカチオン性脂質。
【請求項３７】
ｐは０であり、Ｗは結合であり、ＴはＣであり、Ｒ１はＮＲ４Ｒ５であり、化合物は式（ＩＩｂ−１）：
【化１５】
2020512272.tif 000101
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｘ’、Ｙ’、ｎ、ｍ及びｚは請求項２５で定義した通りである）の構造で表される、請求項３６に記載のカチオン性脂質。
【請求項３８】
Ｒ２とＲ３は各々独立してＣ１４−Ｃ２０アルキル又はＣ１４−Ｃ２０アルケニルである、請求項２５〜３７のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。
【請求項３９】
Ｒ２とＲ３は各々独立して（ａ）Ｃ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルキル又は（ｂ）Ｃ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルケニルであり、Ｚは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−である、請求項２５〜３７のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。
【請求項４０】
Ｘ’はＯである、請求項２５〜７のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。
【請求項４１】
Ｘ’はＮＨである、請求項２５〜３７のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。
【請求項４２】
Ｙ’はＮＨである、請求項２５〜３７のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。
【請求項４３】
Ｒ４とＲ５は各々ＣＨ３であるか、又はＲ４とＲ５はそれらが結合している窒素と共に、ピロリジニル、ピペリジニル及びピペラジニルから成る群から選択される複素環を形成し、これらの各々は必要に応じてアルキルで置換されている、請求項２５〜３７のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。
【請求項４４】
２−（１，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ヒドラジニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−１−アミン、
４−（１，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ヒドラジニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルブタン−１−アミン、
１−（４−（１，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ヒドラジニル）ブチル）ピロリジン、
Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−（（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）（（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）オキシ）アミノ）ブタン−１−アミン、
４−（ジメチルアミノ）−Ｎ’−（（Ｚ）−オクタデセ−９−エン−１−イル）−Ｎ−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ブタンヒドラジド、
４−（（ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）アミノ）オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルブタン−１−アミン、
１−（４−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ヒドラジニル）ブチル）ピロリジン、
４−（（（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル）アミノ）オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルブタン−１−アミン、
２−（（ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）アミノ）オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−オキソエタン−１−アミン、
４−（ジメチルアミノ）−Ｎ’，Ｎ’−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ブタンヒドラジド、
（Ｓ）−２−アミノ−６−（ジメチルアミノ）−Ｎ’，Ｎ’−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ヘキサンヒドラジド、
４−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ヒドラジニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルブタン−１−アミン、
１−（（Ｓ）−４−アミノ−５−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ヒドラジニル）−５−オキソペンチル）グアニジン、
４−（（ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）アミノ）オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−オキソブタン−１−アミン、
２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ヒドラジニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−１−アミン、
４−（ジメチルアミノ）−Ｎ−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）−Ｎ−（（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）オキシ）ブタンアミド、
Ｎ’，Ｎ’−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）−４−（ピロリジン−１−イル）ブタンヒドラジド、
（Ｓ）−２−アミノ−３−（１Ｈ−イミダゾル−４−イル）−Ｎ’，Ｎ’−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）プロパンヒドラジド、
Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（２−（（Ｚ）−オクタデセ−９−エン−１−イル）−１−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ヒドラジニル）エタン−１−アミン、
Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（１−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）−２−オクタデシルヒドラジニル）エタン−１−アミン、
４−（４−メチルピペラジン−１−イル）−Ｎ’，Ｎ’−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ブタンヒドラジド、
Ｏ−（４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ブタノイル）−Ｎ，Ｎ−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ヒドロキシルアミン、
ビス（２−ヘキシルデカン酸）（２−（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）ヒドラジン−１，１−ジイル）ビス（ヘキサン−６，１−ジイル）、
ビス（２−ヘキシルデカン酸）（１−（２−（ジメチルアミノ）エチル）ヒドラジン−１，２−ジイル）ビス（ヘキサン−６，１−ジイル）、
ビス（２−ヘキシルデカン酸）（１−（２−（ジメチルアミノ）エチル）ヒドラジン−１，２−ジイル）ビス（ノナン−９，１−ジイル）、
１０，１０’−（１−（２−（ジメチルアミノ）エチル）ヒドラジン−１，２−ジイル）ビス（デカン酸）ジ（トリデカン−７−イル）、
ビス（２−ヘキシルデカン酸）（２−（４−（ジメチルアミノ）ブチル）ヒドラジン−１，１−ジイル）ビス（ヘキサン−６，１−ジイル）、
ビス（２−ヘキシルデカン酸）（２−（４−（ジメチルアミノ）ブチル）ヒドラジン−１，１−ジイル）ビス（ノナン−９，１−ジイル）、
ビス（２−ヘキシルデカン酸）（（４−（ジメチルアミノ）ブトキシ）アザンジイル）ビス（ヘキサン−６，１−ジイル）、
ビス（２−ヘキシルデカン酸）（（４−（ジメチルアミノ）ブトキシ）アザンジイル）ビス（ノナン−９，１−ジイル）、
４−（２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ヒドラジニル）エチル）−１Ｈ−イミダゾール、
１−（２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ヒドラジニル）エチル）グアニジン、
Ｏ−（２−（１Ｈ−イミダゾル−４−イル）アセチル）−Ｎ，Ｎ−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ヒドロキシルアミン、
１−（２−（（ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）アミノ）オキシ）−２−オキソエチル）グアニジン、
２−（１Ｈ−イミダゾル−４−イル）酢酸２−（ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）アミノ）エチル、
カルバミミドイルグリシン酸２−（ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）アミノ）エチル、
ジメチルグリシン酸２−（ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）アミノ）エチル、
４−（ジメチルアミノ）ブタン酸２−（ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）アミノ）エチル、
Ｌ−ヒスチジン酸２−（ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）アミノ）エチル、
（４Ｚ，４’Ｚ）−ビス（２−ヘキシルデセ−４−エン酸）（１−（２−（ジメチルアミノ）エチル）ヒドラジン−１，２−ジイル）ビス（オクタン−８，１−ジイル）、
（３Ｚ，３’Ｚ）−ビス（ノン−３−エン酸）（１−（２−（ジメチルアミノ）エチル）ヒドラジン−１，２−ジイル）ビス（オクタン−８，１−ジイル）、
８，８’−（２−（２−（ジメチルアミノ）エチル）ヒドラジン−１，１−ジイル）ジオクタン酸ジ（（Ｚ）−ノン−３−エン−１−イル）、
８，８’−（２−（２−（ジメチルアミノ）エチル）ヒドラジン−１，１−ジイル）ジオクタン酸ジ（（Ｚ）−ペンタデセ−９−エン−７−イル）、
８，８’−（（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）アザンジイル）ジオクタン酸ジ（（Ｚ）−ペンタデセ−９−エン−７−イル）、
８，８’−（（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）アザンジイル）ジオクタン酸ジ（（Ｚ）−ノン−３−エン−１−イル）、
８，８’−（２−（（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）カルボニル）ヒドラジン−１，１−ジイル）ジオクタン酸ジ（（Ｚ）−ペンタデセ−９−エン−７−イル）、
８，８’−（２−（（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）カルボニル）ヒドラジン−１，１−ジイル）ジオクタン酸ジ（トリデカン−７−イル）、
（Ｚ）−ノン−３−エン酸８−（（（（２−（ジメチルアミノ）エチル）チオ）カルボニル）（（８−（（（Ｚ）−ノン−３−エノイル）オキシ）オクチル）オキシ）アミノ）オクチル、
８，８’−（（２−（（ジメチルグリシル）オキシ）エチル）アザンジイル）ジオクタン酸ジ（（Ｚ）−ペンタデセ−９−エン−７−イル）、
８，８’−（（２−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）エチル）アザンジイル）ジオクタン酸ジ（（Ｚ）−ノン−３−エン−１−イル）、
８，８’−（（２−（（カルバミミドイルグリシル）オキシ）エチル）アザンジイル）ジオクタン酸ジ（（Ｚ）−ノン−３−エン−１−イル）、
８，８’−（（２−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）エチル）アザンジイル）ジオクタン酸ジ（トリデカン−７−イル）、
（３Ｚ，３’Ｚ）−ビス（ノン−３−エン酸）（（２−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）エチル）アザンジイル）ビス（オクタン−８，１−ジイル）、
ビス（デカン酸）（（２−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）エチル）アザンジイル）ビス（ヘプタン−７，１−ジイル）、
４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ブタン酸２−（ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）アミノ）エチル、
６，６’−（２−（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）ヒドラジン−１，１−ジイル）ジヘキサン酸ジ（（Ｚ）−ノン−３−エン−１−イル）、
ビス（デカン酸）（２−（２−（ジメチルアミノ）エチル）ヒドラジン−１，１−ジイル）ビス（ヘプタン−７，１−ジイル）、
（９Ｚ，１２Ｚ）−Ｎ−（２−（４−（ジメチルアミノ）ブトキシ）エチル）−Ｎ−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）オクタデカ−９，１２−ジエン−１−アミン、
４−（ジメチルアミノ）−Ｎ’，Ｎ’−ビス（６−（（（Ｚ）−ノン−３−エン−１−イル）オキシ）ヘキシル）ブタンヒドラジド、
４−（ピロリジン−１−イル）ブタン酸２−（ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）アミノ）エチル、
Ｎ−（２−（４−（ジメチルアミノ）ブトキシ）エチル）−６−（（（Ｚ）−ノン−３−エン−１−イル）オキシ）−Ｎ−（６−（（（Ｚ）−ノン−３−エン−１−イル）オキシ）ヘキシル）ヘキサン−１−アミン、
ビス（デカン酸）（（２−（４−（ジメチルアミノ）ブトキシ）エチル）アザンジイル）ビス（ヘプタン−７，１−ジイル）、及び
６，６’−（（２−（４−（ジメチルアミノ）ブトキシ）エチル）アザンジイル）ジヘキサン酸ジ（（Ｚ）−ノン−３−エン−１−イル）から成る群から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載のカチオン性脂質。
【請求項４５】
式（ＩＩＩ）：
【化１６】
2020512272.tif 000102
（式中、
ＸとＹは各々独立してＯ、Ｎ又はＮＨであり、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の各々は独立して存在しないか、又はＣ１０−Ｃ２２アルキル、Ｃ１０−Ｃ２２アルケニル若しくはＣ１０−Ｃ２２アルキニルであり、
ｎは１〜３０である）の構造で表され、
その塩、水和物、溶媒和物、多形体、光学異性体、幾何異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー及びその混合物を含む、請求項１又は２に記載のカチオン性脂質。
【請求項４６】
【化１７】
2020512272.tif 000103
【化１８】
2020512272.tif 000104
【化１９】
2020512272.tif 000105
及び
【化２０】
2020512272.tif 000106
から成る群から選択される、請求項４に記載のカチオン性脂質。
【請求項４７】
式（ＩＩＩＡ）：
【化２１】
2020512272.tif 000107
（式中、
ＸとＹは各々独立してＯ、Ｎ又はＮＨであり、ＸとＹの両方がＯになることはなく、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の各々は独立して存在しないか、又はＣ１０−Ｃ２２アルキル、Ｃ１０−Ｃ２２アルケニル若しくはＣ１０−Ｃ２２アルキニルであり、
ｎは１〜３０の整数であり、
ｘは０又は２である）の構造で表され、
その塩、水和物、溶媒和物、多形体、光学異性体、幾何異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー及びその混合物を含む、請求項１又は２に記載のカチオン性脂質。
【請求項４８】
先行する請求項のいずれか一項に記載のカチオン性脂質を含む組成物。
【請求項４９】
少なくとも１種の更なる中性脂質又はＰＥＧ修飾脂質を更に含む、請求項４８に記載のカチオン性脂質を含む組成物。
【請求項５０】
核酸を更に含む、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５１】
前記核酸は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボザイム、ｐＤＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ  ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ及び免疫刺激核酸から成る群から選択される、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
請求項５０又は５１に記載の組成物に細胞を接触させる工程を含む遺伝子サイレンシングの方法。
【請求項５３】
前記細胞は癌細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
中性脂質、荷電脂質、ステロイド及びポリマー結合脂質から成る群から選択される１種以上の成分を更に含む、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５５】
前記更なる成分は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、ＤＭＧ−ＰＥＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセリル−メトキシポリエチレングリコール）、及び１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）−ＰＥＧマレイミド（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ  Ｍａｌ）の内のいずれか１種以上である、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
治療剤を更に含む、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５７】
治療剤を投与するための方法であって、請求項１〜４７のいずれか一項に記載のカチオン性脂質と治療剤とを含む組成物を調製する工程と、前記組成物をそれを必要とする対象に投与する工程と、を含む、方法。
【請求項５８】
白血球関連病態を治療する方法であって、請求項５０、５１又は５５のいずれか一項に記載の組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法。
【請求項５９】
前記白血球関連病態は、癌、感染症、自己免疫疾患、神経変性疾患及び炎症から成る群から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
式（ＩＩａ−５）：
【化２２】
2020512272.tif 000108
（式中、
Ｒ２とＲ３は、
（ａ）Ｃ１０−Ｃ２２アルキル、
（ｂ）Ｃ１０−Ｃ２２アルケニル、
（ｃ）Ｃ１０−Ｃ２２アルキニル、
（ｄ）Ｃ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルキル、及び
（ｅ）Ｃ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルケニルから成る群から選択され、
ｚは０又は２である）の構造で表される中間体化合物。
【請求項６１】
２−（ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）アミノ）エタン−１−オール、６，６’−（（２−ヒドロキシエチル）アザンジイル）ジヘキサン酸ジ（（Ｚ）−ノン−３−エン−１−イル）、及びビス（デカン酸）（（２−ヒドロキシエチル）アザンジイル）ビス（ヘプタン−７，１−ジイル）から成る群から選択される、請求項６０に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カチオン性脂質と、このような脂質を単独で又は他の脂質と組み合わせて含む脂質ナノ粒子製剤とを提供する。このような脂質ナノ粒子は、核酸と共に製剤化してインビトロ及びインビボ治療用途の両方でその細胞内送達を容易にすることができる。また、本発明は、このような脂質を化学合成する方法、脂質ナノ粒子調製物及び核酸を含む製剤も提供する。
【背景技術】
【０００２】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボザイム、ｐＤＮＡ及び免疫刺激核酸等の治療用核酸は様々な機序を介して作用する。特定のタンパク質は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介してｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡによって下方制御されることがある。一般には白血球等の造血細胞、特に初代Ｔリンパ球及びＢ細胞は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）でトランスフェクトするのが難しいことで有名である。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて特定の遺伝子を下方制御することによってＴ細胞やＢ細胞等の免疫細胞機能を調節することは、癌、炎症、自己免疫及びウイルス感染を含む多くの免疫関連障害における標的治療を進める上で非常に大きな可能性を有する。ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ構築物は標的タンパク質に対する任意のヌクレオチド配列を用いて合成することができるので、ＲＮＡｉの治療的用途は非常に広い。現在まで、ｓｉＲＮＡ構築物はインビトロモデルとインビボモデルの両方において標的タンパク質を特にサイレンシングする能力を示している。これらは現在臨床試験で評価されている。
【０００３】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、ＤＮＡからリボソームへ遺伝情報を運ぶ大きなＲＮＡ分子のファミリーである。ｍＲＮＡやプラスミド等の一部の核酸を使用して特定の細胞産物の発現をもたらすことができる。このような核酸は、タンパク質又は酵素の欠損に関連する疾患の治療に有用であろう。しかし、治療的状況において核酸に関連する多くの問題がある。治療用核酸に関する主な問題の１つは、リン酸ジエステルのヌクレオチド間結合の安定性とヌクレアーゼに対するその感受性である。それとは別に、このような核酸は細胞膜を通過する能力が限られている。
【０００４】
カチオン性脂質は、遺伝子療法用途において様々な疾患を治療するのに優れた核酸担体であることが証明されている。カチオン性脂質と他の共脂質（例えば、コレステロール、ＤＳＰＣ及びＰＥＧ化脂質）から形成された脂質ナノ粒子は、それを分解から保護し、その細胞取込みを促進するオリゴヌクレオチドを封入した。しかし、当技術分野では、オリゴヌクレオチドを送達するのに適切且つ効率的な送達プラットフォームがまだ必要である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、脂質ナノ粒子調製物に使用することができる新規カチオン性脂質に関する。このような脂質ナノ粒子は核酸を分解、循環からの排除及び細胞内放出から保護する。更に、核酸封入脂質ナノ粒子は好都合なことには、十分に許容性があって且つ適切な治療指数を提供し、有効量の核酸による患者の治療が患者に対して容認できない毒性及び／又は危険性と関連しないようにする。また、本発明は、このような脂質の化学合成方法、脂質ナノ粒子調製物及び核酸を含む製剤も提供する。
【０００６】
ある実施形態では、本発明は、新規のカチオン性脂質、及びこのような脂質とｓｉＲＮＡ及びｐＤＮＡとの製剤に関する。このような脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）をＤＬＳによって更に特徴付けし、その様々な癌細胞株におけるインビトロ活性について評価した。
【０００７】
本発明の原理によれば、脂質構造は、脂肪酸残基Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）−、Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又はＲ−（ＲＣＯＯＨは、飽和であっても不飽和であってもよい対応する脂肪酸である）に直接又はリンカーを介して結合したヒドラジン、ヒドラジド又はヒドロキシルアミン等の官能基に基づく。脂質は、官能基、例えば、アミン、Ｎ含有複素環若しくはヘテロアリール、又はアミノ酸側鎖（例えば、ヒスチジン又はアルギニン側鎖）も含み、これはリンカー（例えば、アルキレン鎖）を介して結合している。ある態様では、脂質は非対称構造と高い電荷を特徴とし、従って、このような脂質は構造的不均衡に起因する結合の改善とエンドソームエスケープの改善（即ち、高い安定性）を示すと仮定される。本発明に係る他の脂質は、本明細書で更に記載されるように対称構造を有する。
【０００８】
従って、一実施形態では、本発明は、次の構造：
【化１】
2020512272.tif 000002
（式中、  ＸとＹは各々独立してＯ、Ｎ又はＮＨであり、ＸとＹが両方同時にＯになることはなく、
Ｗは結合、Ｏ、ＮＨ又はＳであり、
ＴはＣ又はＳであり、
ｍは０又は１であり、
ｚは０又は２である）で表される官能基を含むカチオン性脂質であって、
官能基は少なくとも１種の飽和又は不飽和脂肪酸残基に結合しているカチオン性脂質に関する。
【０００９】
ある実施形態では、カチオン性脂質は、上述の官能基に対称又は非対称に結合している２種の脂肪酸残基を含む。
【００１０】
本発明の一態様では、カチオン性脂質は、式（Ｉ）：
【化２】
2020512272.tif 000003
（式中、
ＹはＯ又はＮＨであり、
ＴはＣ又はＳであり、
Ｗは結合、Ｏ、ＮＨ又はＳであり、
Ｒ１は、
（ａ）ＮＲ４Ｒ５（Ｒ４とＲ５は各々独立してＣ１−Ｃ４アルキルであるか、又はＲ４とＲ５はそれらが結合している窒素と共に５員若しくは６員の複素環若しくは芳香族複素環を形成し、必要に応じてＯ、Ｎ及びＳから成る群から選択される１種以上の更なるヘテロ原子を含むか、又はＮＲ４Ｒ５はグアニジン基（−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２）を表す）、
（ｂ）天然又は非天然アミノ酸の側鎖、及び
（ｃ）Ｏ、Ｎ及びＳから成る群から選択される１種以上のヘテロ原子を含む５員又は６員の複素環又は芳香族複素環から成る群から選択され、
Ｒ２とＲ３は、
（ａ）Ｃ１０−Ｃ２２アルキル、
（ｂ）Ｃ１０−Ｃ２２アルケニル、
（ｃ）Ｃ１０−Ｃ２２アルキニル、
（ｄ）Ｃ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルキル、及び
（ｅ）Ｃ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルケニルから成る群から選択され、
Ｚは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−であり、
ｎは０、１、２、３、４、５又は６であり、
ｍは０又は１であり、
ｐは０又は１であり、
ｚは０又は２である）の構造で表され、
その塩、水和物、溶媒和物、多形体、光学異性体、幾何異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー及びその混合物を含む。
【００１１】
ある実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド、エタノールアミン及びエチレンジアミンから選択される官能基を含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００１２】
式（Ｉ）のある実施形態では、ｍは０である。式（Ｉ）の他の実施形態では、ｍは１である。式（Ｉ）の他の実施形態では、ｐは０である。式（Ｉ）の他の実施形態では、ｐは１である。式（Ｉ）の他の実施形態では、ｍは０であり、ｐは０である。式（Ｉ）の他の実施形態では、ｍは１であり、ｐは０である。式（Ｉ）の他の実施形態では、ｚは０である。式（Ｉ）の他の実施形態では、ｚは２である。式（Ｉ）の他の実施形態では、ＴはＣである。式（Ｉ）の他の実施形態では、Ｗは結合である。式（Ｉ）の他の実施形態では、Ｒ１はＮＲ４Ｒ５である。
【００１３】
式（Ｉ）のある代表的な実施形態では、ｐは０であり、Ｗは結合であり、ＴはＣであり、化合物は式（Ｉａ）の構造で表される。式（Ｉａ）のある代表的な実施形態では、Ｒ１はＮＲ４Ｒ５であり、化合物は式（Ｉａ−１）の構造で表される。式（Ｉａ）及び（Ｉａ−１）の構造は以下の詳細な説明で示す。
【００１４】
本発明の他の態様では、カチオン性脂質は、式（ＩＩ）：
【化３】
2020512272.tif 000004
（式中、Ａは
【化４】
2020512272.tif 000005
又は
【化５】
2020512272.tif 000006
であり、
Ｘ’はＯ又はＮＨであり、
Ｙ’はＯ又はＮＨであり、
Ａが
【化６】
2020512272.tif 000007
の場合には、
Ｘ’とＹ’が両方同時にＯになることはなく、
ＴはＣ又はＳであり、
Ｗは結合、Ｏ、ＮＨ又はＳであり、
Ｒ１は、
（ａ）ＮＲ４Ｒ５（Ｒ４とＲ５は各々独立してＣ１−Ｃ４アルキルであるか、又はＲ４とＲ５はそれらが結合している窒素と共に５員若しくは６員の複素環若しくは芳香族複素環を形成し、必要に応じてＯ、Ｎ及びＳから成る群から選択される１種以上の更なるヘテロ原子を含むか、又はＮＲ４Ｒ５はグアニジン基（−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２）を表す）、
（ｂ）天然又は非天然アミノ酸の側鎖、及び
（ｃ）Ｏ、Ｎ及びＳから成る群から選択される１種以上のヘテロ原子を含む５員又は６員の複素環又は芳香族複素環から成る群から選択され、
Ｒ２とＲ３は、
（ａ）Ｃ１０−Ｃ２２アルキル、
（ｂ）Ｃ１０−Ｃ２２アルケニル、
（ｃ）Ｃ１０−Ｃ２２アルキニル、
（ｄ）Ｃ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルキル、及び
（ｅ）Ｃ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルケニルから成る群から選択され、
Ｚは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−であり、
ｎは０、１、２、３、４、５又は６であり、
ｍは０又は１であり、
ｐは０又は１であり、
ｚは０又は２である）の構造で表され、
その塩、水和物、溶媒和物、多形体、光学異性体、幾何異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー及びその混合物を含む。
【００１５】
ある実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド、エタノールアミン及びエチレンジアミンから選択される官能基を含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００１６】
式（ＩＩ）のある実施形態では、ｍは０である。式（ＩＩ）の他の実施形態では、ｍは１である。式（ＩＩ）の他の実施形態では、ｍは１である。式（ＩＩ）の他の実施形態では、ｍは１であり、ｐは０である。式（ＩＩ）の他の実施形態では、ｚは０である。式（ＩＩ）の他の実施形態では、ｚは２である。式（ＩＩ）の他の実施形態では、ＴはＣである。式（ＩＩ）の他の実施形態では、Ｗは結合である。式（ＩＩ）のある実施形態では、ｍは０であり、ＷはＯである。
【００１７】
式（ＩＩ）のある代表的な実施形態では、カチオン性脂質は式（ＩＩａ）の構造で表される。式（ＩＩａ）のある代表的な実施形態では、カチオン性脂質は式（ＩＩａ−１）の構造で表される。式（ＩＩａ）の他の代表的な実施形態では、カチオン性脂質は式（ＩＩａ−２）の構造で表される。式（ＩＩａ）の他の代表的な実施形態では、カチオン性脂質は式（ＩＩａ−３）の構造で表される。式（ＩＩａ）の他の代表的な実施形態では、カチオン性脂質は式（ＩＩａ−４）の構造で表される。式（ＩＩ）の他の代表的な実施形態では、カチオン性脂質は式（ＩＩｂ）の構造で表される。式（ＩＩｂ）のある代表的な実施形態では、カチオン性脂質は式（ＩＩｂ−１）の構造で表される。
【００１８】
式（ＩＩａ）、（ＩＩａ−１）、（ＩＩａ−２）、（ＩＩａ−３）、（ＩＩａ−４）、（ＩＩｂ）及び（ＩＩｂ−１）の構造は以下の詳細な説明で示す。
【００１９】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ−１）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩａ−１）、（ＩＩａ−２）、（ＩＩａ−３）、（ＩＩａ−４）、（ＩＩｂ）及び（ＩＩｂ−１）の化合物の具体例は化合物１〜６６であり、その構造を詳細な説明において表１に示す。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００２０】
式（ＩＩａ−４）の化合物の調製に使用することができる式（ＩＩａ−５）の中間体は本発明の別個の実施形態を表す。
【００２１】
他の態様では、本発明のカチオン性脂質は、式（ＩＩＩ）：
【化７】
2020512272.tif 000008
（式中、
ＸとＹは各々独立してＯ、Ｎ又はＮＨであり、ＸとＹが両方同時にＯになることはなく、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の各々は独立して存在しないか、又はＣ１０−Ｃ２２アルキル、Ｃ１０−Ｃ２２アルケニル若しくはＣ１０−Ｃ２２アルキニルであり、
ｎは１〜３０の整数である）の構造で表され、
その塩、水和物、溶媒和物、多形体、光学異性体、幾何異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー及びその混合物を含む。
【００２２】
他の態様では、本発明のカチオン性脂質は、式（ＩＩＩＡ）：
【化８】
2020512272.tif 000009
（式中、
ＸとＹは各々独立してＯ、Ｎ又はＮＨであり、ＸとＹが両方同時にＯになることはなく、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の各々は独立して存在しないか、又はＣ１０−Ｃ２２アルキル、Ｃ１０−Ｃ２２アルケニル若しくはＣ１０−Ｃ２２アルキニルであり、
ｎは１〜３０の整数であり、
ｘは０又は２である）の構造で表され、
その塩、水和物、溶媒和物、多形体、光学異性体、幾何異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー及びその混合物を含む。
【００２３】
式（ＩＩＩ）の化合物の具体例は化合物６７〜７０であり、その構造は詳細な説明において表２に示す。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００２４】
他の態様では、本発明は、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ−１）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩａ−１）、（ＩＩａ−２）、（ＩＩａ−３）、（ＩＩａ−４）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｂ−１）及び（ＩＩＩ）のいずれか１つのカチオン性脂質を含み、少なくとも１種の更なる中性脂質又はＰＥＧ修飾脂質を更に含む組成物に関する。ある実施形態では、組成物は更に核酸を含むことができる。核酸の例としては、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボザイム、ｐＤＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ  ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ及び免疫刺激核酸が挙げられるが、これらに限定されない。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００２５】
他の態様では、本発明は、本発明に係る組成物に細胞を接触させる工程を含む遺伝子サイレンシングの方法に関する。ある実施形態では、細胞は癌細胞である。
【００２６】
他の実施形態では、本発明の組成物を送達系として使用し、治療剤を体内のその標的部位に投与することができる。従って、ある実施形態では、本発明は、治療剤を投与するための方法であって、本明細書に記載のカチオン性脂質と治療剤とを含む組成物を調製し、この組成物をそれを必要とする対象に投与して行う方法に関する。
【００２７】
本発明のカチオン性脂質は単独で、又は他の脂質成分、例えば、中性脂質、荷電脂質、ステロイド（例えば、ステロール等）及び／又はそれらの類似体、及び／又はポリマー結合脂質等と組み合わせて使用して、治療剤の送達のための脂質ナノ粒子を形成することができる。ある場合には、脂質ナノ粒子を使用して、様々な疾患又は病態、特に炎症及び／又は十分なタンパク質の欠如等の白血球関連病態の治療のために核酸を送達する。
【００２８】
従って、ある実施形態では、本発明は、白血球関連病態を治療する方法であって、本発明に係る組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法に関する。白血球関連病態は、癌、感染症、自己免疫疾患、神経変性疾患及び炎症から成る群から選択することができる。
【００２９】
本発明の更なる実施形態及び全適用範囲は、以下に記載の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、この詳細な説明から、本発明の精神及び範囲内の様々な変更や修正が当業者には明らかになるため、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、単なる一例として記載されていることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】脂質１のインビトロ遺伝子サイレンシング効果：ヒトＴ細胞ＳｕｐＴ１をｓｉＣＤ４５封入カチオン性脂質１からなる脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）で４８時間（Ａ）又は７２時間（Ｂ）、異なるｓｉＲＮＡ用量（０．４μＭ、０．２μＭ、０．１μＭ）で処理した。
【図２】薬剤耐性ヒト卵巣癌細胞（ＮＡＲ）をＬＮＰ−ｓｉＰＬＫ−１又はＬＮＰ−ｓｉＬｕｃナノ粒子のいずれかで７２時間処理し、ＰＬＫ−１発現をｑＰＣＲで測定した。
【図３】ＮＡＲ細胞における脂質１のインビトロ遺伝子サイレンシング効果：ヒト卵巣癌細胞（ＮＡＲ細胞）を脂質１／ｓｉＰＬＫ１ナノ粒子で４８時間、異なるｓｉＲＮＡ濃度（０．２μＭ及び０．１μＭ）で処理した。アポトーシス細胞をＰＩ／アネキシンを用いたＦＡＣＳにより解析した。
【図４】ＮＡＲ細胞における脂質１０及び１１のインビトロ遺伝子サイレンシング効果：ヒト卵巣癌細胞（ＮＡＲ細胞）を脂質１／ｓｉＰＬＫ１ナノ粒子で４８時間、異なるｓｉＲＮＡ濃度（０．１μＭ及び０．０５μＭ）で処理した。アポトーシス細胞をＰＩ／アネキシンを用いたＦＡＣＳにより解析した。
【図５】ヒト卵巣癌細胞（ＯＶＣＡＲ８）をＬＮＰ−ｓｉＰＬＫ−１又はＬＮＰ−ｓｉＬｕｃナノ粒子のいずれかで７２時間処理し、ＰＬＫ−１発現をｑＰＣＲによって測定した。
【図６】薬剤耐性ヒト卵巣癌細胞（ＮＡＲ）のスフェロイドを、ＬＮＰ−ｓｉＰＬＫ−１又はＬＮＰ−ｓｉＬｕｃナノ粒子のいずれかで７２時間処理し、ＰＬＫ−１発現をｑＰＣＲによって測定した。
【図７】ヒト結腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）を対照ｓｉＲＮＡを有するＬＮＰ（ＭＣ３、脂質３８又は脂質５５を含む）と共に７２時間インキュベートした。細胞生存率をＸＴＴアッセイにより測定した。図１０は細胞増殖（未処理細胞の％）対ｓｉＰＬＫ１濃度を示す。
【図８】脂質３８又は５５のインビトロ遺伝子サイレンシング効果。ヒト多発性骨髄腫浮遊細胞（Ｕ２６６）をｓｉＰＬＫ１を異なる濃度で含むＬＮＰと共に４８時間インキュベートした。ＰＬＫ１発現はｑＰＣＲにより測定した。ＰＬＫ１−ｍＲＮＡレベルをＬＮＰ−対照ｓｉＲＮＡ処理細胞に対して正規化した。
【図９】細胞生存率に対するＰＬＫ１サイレンシングの効果。ヒト多発性骨髄腫浮遊細胞（Ｕ２６６）を、カチオン性脂質３８又は５５及びｓｉＰＬＫ１又は対照ｓｉＲＮＡを異なる濃度で含むＬＮＰと共に４８時間インキュベートした。ＰＬＫ１の下方制御によって誘導される細胞生存率をＸＴＴアッセイによって測定した。
【図１０】細胞生存率に対するＰＬＫ１サイレンシングの効果：ヒトＢ細胞リンパ腫浮遊細胞（ＲＰＭＩ−８２２６）を、カチオン性脂質３８又は５５及びｓｉＰＬＫ１又は対照ｓｉＲＮＡを異なる濃度で含むＬＮＰと共に４８時間インキュベートした。ＰＬＫ１の下方制御によって誘導される細胞生存率をＸＴＴアッセイによって測定した。
【図１１】細胞生存率に対するＰＬＫ１サイレンシングの効果。ヒト多発性骨髄腫浮遊細胞（ＭＭ１）を、カチオン性脂質３８又は５５及びｓｉＰＬＫ１又は対照ｓｉＲＮＡを異なる濃度で含むＬＮＰと共に４８時間インキュベートした。ＰＬＫ１の下方制御によって誘導される細胞生存率をＸＴＴアッセイによって測定した。
【図１２】ｐＤＮＡのインビトロ発現。ヒト結腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）をＬＮＰ−ＬＵＣ  ｐＤＮＡと共に異なる濃度で４８時間インキュベートした。ルシフェラーゼ発現はルミノメーターによって測定した。リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏ２０００）を陽性対照として使用した。ＬＮＰは、他の共脂質Ｃｈｏｌ及びＰＥＧ−ＤＭＧと共に、脂質３８及び異なる量のＤＯＰＥで製剤化した。
【図１３】ＨＥＫ２９３細胞をＬＮＰ−ＤＮＡナノ粒子（１０：１  Ｎ／Ｐ比、０．６ｎＭ  ＤＮＡ）で７２時間処理し、ｍＫＡＴＥ発現をフローサイトメトリーによって解析した。
【図１４】ＨＥＫ２９３細胞をＬＮＰ−ＤＮＡナノ粒子（１０：１  Ｎ／Ｐ比）（異なるＤＮＡ）で７２時間処理し、ｍＫＡＴＥ発現をフローサイトメトリーによって解析した。図１４Ａ：脂質１。図１４Ｂ：脂質１０。
【図１５】ｍＲＮＡのインビトロ送達。トランスフェクトしにくいマウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）を、カチオン性脂質３８又は５５及びルシフェラーゼｍＲＮＡ（異なるｍＲＮＡ濃度）を含むＬＮＰで１８時間処理した。ルシフェラーゼ発現をルミノメーターによって測定した。
【図１６】ｍＲＮＡのインビボ送達。カチオン性脂質３８又は５５及びルシフェラーゼｍＲＮＡを含むＬＮＰをＣ５７ＢＬ６／ｊマウスに１ｍｇ／ｋｇ体重で筋肉内投与した。ルシフェラーゼ発現は、生物発光画像化システムＢｉｏｓｐａｃｅによって（ａ）筋肉内投与から８時間後、（ｂ）２４時間後に測定した。
【図１７】ルシフェラーゼｍＲＮＡで製剤化された脂質５４又は脂質３８のいずれかからなるＬＮＰをＣ５７ＢＬ６／ｊマウスに１ｍｇ／ｋｇ体重で静脈内投与した。８時間後、ルシフェラーゼ発現を生物発光画像化システムＢｉｏｓｐａｃｅによって測定した。
【図１８】肝臓へのｍＲＮＡのインビボ送達。ルシフェラーゼｍＲＮＡで製剤化された脂質３８からなるＬＮＰをＣ５７ＢＬ６／ｊマウスに１ｍｇ／ｋｇ体重で静脈内投与した。投与から８時間及び２４時間後、ルシフェラーゼ発現を生物発光画像化システムＢｉｏｓｐａｃｅによって測定した。
【図１９】ＭＣ３と比較して非ヒト霊長類において肝臓毒性がない。カニクイザル（１群当たりｎ＝２、雄性）に対し、ｓｉＮＣ５を有するＭＣ３粒子（０．５ｍｇ／ｋｇ）及びｓｉＮＣ５を有する脂質３８ベースの粒子（０．５ｍｇ／ｋｇ）の単回静脈内投与（１ｍｇ／ｋｇ）を行った。投与から１時間後と２４時間に、血清を採取し、ＡＬＴ、ＡＳＴについて解析した。各データ点は２匹の平均±ＳＥＭである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、インビトロ及びインビボで活性剤を送達する脂質ナノ粒子の調製に有用なカチオン性脂質の発見に基づく。本発明のカチオン性脂質は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡ等の核酸の送達に有用である。
【００３２】
カチオン性脂質
ある実施形態では、本発明は、少なくとも１種の飽和又は不飽和脂肪酸残基に結合したヒドラジン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、エタノールアミン又はジエチレンジアミン部分を含むカチオン性脂質に関する。ある実施形態では、カチオン性脂質は、ヒドラジン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、エタノールアミン、またはジエチレンジアミン部分に非対称に結合した２種の脂肪酸残基を含む。
【００３３】
本明細書で企図されるように、本発明は、次の構造：
【化９】
2020512272.tif 000010
（式中、  ＸとＹは各々独立してＯ、Ｎ又はＮＨであり、ＸとＹの両方がＯになることはなく、
Ｗは結合、Ｏ、ＮＨ又はＳであり、
ＴはＣ又はＳであり、
ｍは０又は１であり、
ｚは０又は２である）で表される官能基を含むカチオン性脂質であって、
官能基は少なくとも１種の飽和又は不飽和脂肪酸残基に結合しているカチオン性脂質に関する。
【００３４】
ある実施形態では、ＸとＹは各々独立してＯ又はＮであり、ＸとＹの両方がＯになることはない。
【００３５】
ある実施形態では、カチオン性脂質は、上述の官能基に対称又は非対称に結合している２種の脂肪酸残基を含む。
【００３６】
本発明の一態様では、ＸはＮであり、カチオン性脂質は、式（Ｉ）：
【化１０】
2020512272.tif 000011
（式中、
ＹはＯ又はＮＨであり、
ＴはＣ又はＳであり、
Ｗは結合、Ｏ、ＮＨ又はＳであり、
Ｒ１は、
（ａ）ＮＲ４Ｒ５（Ｒ４とＲ５は各々独立してＣ１−Ｃ４アルキルであるか、又はＲ４とＲ５はそれらが結合している窒素と共に５員若しくは６員の複素環若しくは芳香族複素環を形成し、必要に応じてＯ、Ｎ及びＳから成る群から選択される１種以上の更なるヘテロ原子を含むか、又はＮＲ４Ｒ５はグアニジン基（−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２）を表す）、
（ｂ）天然又は非天然アミノ酸の側鎖、及び
（ｃ）Ｏ、Ｎ及びＳから成る群から選択される１種以上のヘテロ原子を含む５員又は６員の複素環又は芳香族複素環から成る群から選択され、
Ｒ２とＲ３は、
（ａ）Ｃ１０−Ｃ２２アルキル、
（ｂ）Ｃ１０−Ｃ２２アルケニル、
（ｃ）Ｃ１０−Ｃ２２アルキニル、
（ｄ）Ｃ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルキル、及び
（ｅ）Ｃ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルケニルから成る群から選択され、
Ｚは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−であり、
ｎは０、１、２、３、４、５又は６であり、
ｍは０又は１であり、
ｐは０又は１であり、
ｚは０又は２である）の構造で表され、
その塩、水和物、溶媒和物、多形体、光学異性体、幾何異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー及びその混合物を含む。
【００３７】
式（Ｉ）のある実施形態では、Ｒ２とＲ３は、（ａ）Ｃ１０−Ｃ２２アルキル、Ｃ１０−Ｃ２２アルケニル又はＣ１０−Ｃ２２アルキニル、及び（ｂ）Ｃ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルキル（Ｚは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−である）から成る群から選択される。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００３８】
式（Ｉ）のある実施形態では、Ｒ１はＮＲ４Ｒ５である。式（Ｉ）のある実施形態では、Ｒ１は天然又は非天然アミノ酸の側鎖である。式（Ｉ）のある実施形態では、Ｒ１はＯ、Ｎ及びＳから成る群から選択される１種以上のヘテロ原子を含む５員又は６員の複素環又は芳香族複素環である。
【００３９】
ある実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド、エタノールアミン及びエチレンジアミンから成る群から選択される官能基を含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００４０】
式（Ｉ）のある実施形態では、ｍは０である。式（Ｉ）の他の実施形態では、ｍは１である。式（Ｉ）の他の実施形態では、ｐは０である。式（Ｉ）の他の実施形態では、ｐは１である。式（Ｉ）の他の実施形態では、ｍは０であり、ｐは０である。式（Ｉ）の他の実施形態では、ｍは１であり、ｐは０である。式（Ｉ）の他の実施形態では、ｚは０である。式（Ｉ）の他の実施形態では、ｚは２である。式（Ｉ）の他の実施形態では、ＴはＣである。式（Ｉ）の他の実施形態では、Ｗは結合である。
【００４１】
式（Ｉ）のある代表的な実施形態では、ｐは０であり、Ｗは結合であり、ＴはＣであり、化合物は式（Ｉａ）：
【化１１】
2020512272.tif 000012
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｙ、ｍ、ｎ及びｚは式（Ｉ）で定義した通りである）の構造で表される。
【００４２】
式（Ｉａ）のある実施形態では、ｍは０である。式（Ｉａ）の他の実施形態では、ｍは１である。式（Ｉ）の他の実施形態では、ｚは０である。式（Ｉａ）の他の実施形態では、Ｒ２とＲ３は各々独立してＣ１４−Ｃ２０アルキル又はＣ１４−Ｃ２０アルケニルである。式（Ｉａ）の他の実施形態では、Ｒ２とＲ３は各々独立してＣ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルキル（Ｚは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−）である。式（ａ）の他の実施形態では、Ｒ２とＲ３は各々独立してＣ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルケニル（Ｚは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−）である。式（Ｉａ）の他の実施形態では、ＹはＯである。式（Ｉａ）の他の実施形態では、ＹはＮＨである。
【００４３】
式（Ｉ）の他の代表的な実施形態では、Ｒ１はＮＲ４Ｒ５であり、化合物は式（Ｉａ−１）：
【化１２】
2020512272.tif 000013
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｙ、ｍ、ｎ及びｚは式（Ｉ）で定義された通りである）の構造で表される。
【００４４】
式（Ｉａ−１）のある実施形態では、Ｒ４とＲ５は各々ＣＨ３である。式（Ｉａ−１）の他の実施形態では、Ｒ４とＲ５はそれらが結合している窒素と共に、ピロリジニル、ピペリジニニル及びピペラジニルから成る群から選択される複素環を形成し、これらの各々は必要に応じてアルキルで置換されている。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００４５】
本発明の他の態様では、カチオン性脂質は、式（ＩＩ）：
【化１３】
2020512272.tif 000014
（式中、Ａは
【化１４】
2020512272.tif 000015
又は
【化１５】
2020512272.tif 000016
であり、
Ｘ’はＯ又はＮＨであり、
Ｙ’はＯ又はＮＨであり、
Ａが
【化１６】
2020512272.tif 000017
の場合には、
Ｘ’とＹ’の両方がＯになることはなく、
ＴはＣ又はＳであり、
Ｗは結合、Ｏ、ＮＨ又はＳであり、
Ｒ１は、
（ａ）ＮＲ４Ｒ５（Ｒ４とＲ５は各々独立してＣ１−Ｃ４アルキルであるか、又はＲ４とＲ５はそれらが結合している窒素と共に５員若しくは６員の複素環若しくは芳香族複素環を形成し、必要に応じてＯ、Ｎ及びＳから成る群から選択される１種以上の更なるヘテロ原子を含むか、又はＮＲ４Ｒ５はグアニジン基（−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２）を表す）、
（ｂ）天然又は非天然アミノ酸の側鎖、及び
（ｃ）Ｏ、Ｎ及びＳから成る群から選択される１種以上のヘテロ原子を含む５員又は６員の複素環又は芳香族複素環から成る群から選択され、
Ｒ２とＲ３は、
（ａ）Ｃ１０−Ｃ２２アルキル、
（ｂ）Ｃ１０−Ｃ２２アルケニル、
（ｃ）Ｃ１０−Ｃ２２アルキニル、
（ｄ）Ｃ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルキル、及び
（ｅ）Ｃ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルケニルから成る群から選択され、
Ｚは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−であり、
ｎは０、１、２、３、４、５又は６であり、
ｍは０又は１であり、
ｐは０又は１であり、
ｚは０又は２である）の構造で表され、
その塩、水和物、溶媒和物、多形体、光学異性体、幾何異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー及びその混合物を含む。
【００４６】
式（ＩＩ）のある実施形態では、Ｒ２とＲ３は、（ａ）Ｃ１０−Ｃ２２アルキル、Ｃ１０−Ｃ２２アルケニル又はＣ１０−Ｃ２２アルキニル、及び（ｂ）Ｃ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルキル（Ｚは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−である）から成る群から選択される。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００４７】
式（ＩＩ）のある実施形態では、ｍは０である。式（ＩＩ）の他の実施形態では、ｍは１である。式（ＩＩ）の他の実施形態では、ｍは１である。式（ＩＩ）の他の実施形態では、ｍは１であり、ｐは０である。式（ＩＩ）の他の実施形態では、ｚは０である。式（ＩＩ）の他の実施形態では、ｚは２である。式（ＩＩ）の他の実施形態では、ＴはＣである。式（ＩＩ）の他の実施形態では、Ｗは結合である。式（ＩＩ）のある実施形態では、ｍは０であり、ＷはＯである。
【００４８】
式（ＩＩ）のある代表的な実施形態では、カチオン性脂質は式（ＩＩａ）：
【化１７】
2020512272.tif 000018
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ’、Ｔ、Ｗ、ｎ、ｍ、ｐ及びｚは式（ＩＩ）で定義した通りである）の構造で表される。
【００４９】
式（ＩＩａ）のある実施形態では、ｐは０であり、Ｗは結合であり、ＴはＣであり、化合物は式（ＩＩａ−１）：
【化１８】
2020512272.tif 000019
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ’、ｎ、ｍ及びｚは式（ＩＩ）で定義した通りである）の構造で表される。
【００５０】
式（ＩＩａ）の他の実施形態では、Ｒ１はＮＲ４Ｒ５であり、化合物は式（ＩＩａ−２）：
【化１９】
2020512272.tif 000020
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｘ’、ｎ、ｍ及びｚは式（ＩＩ）で定義した通りである）の構造で表される。
【００５１】
式（ＩＩａ）の更に他の実施形態では、ｐは１であり、ｍは１であり、Ｗは結合であり、ＴはＣであり、化合物は式（ＩＩａ−３）：
【化２０】
2020512272.tif 000021
（式中、Ｒ１は天然又は非天然アミノ酸の側鎖であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ’、ｎ及びｚは式（ＩＩ）で定義した通りである）の構造で表される。
【００５２】
式（ＩＩａ）のある実施形態では、ｐは０であり、Ｒ１はＮＲ４Ｒ５であり、Ｗは結合であり、ｍは０であり、Ｘ’はＯであり、化合物は式（ＩＩａ−４）：
【化２１】
2020512272.tif 000022
の構造で表される。
【００５３】
ある実施形態では、式（ＩＩａ−５）：
【化２２】
2020512272.tif 000023
（式中、Ｒ２とＲ３は式（ＩＩａ−４）で定義した通りである）の化合物は、式（ＩＩａ−４）の化合物を調製するための中間体として使用することができる。
【００５４】
式（ＩＩ）の他の代表的な実施形態では、カチオン性脂質は式（ＩＩｂ）：
【化２３】
2020512272.tif 000024
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｔ、Ｗ、Ｘ’、Ｙ’、ｎ、ｍ、ｐ及びｚは式（ＩＩ）で定義した通りである）の構造で表される。
【００５５】
式（ＩＩｂ）のある代表的な実施形態では、ｐは０であり、Ｗは結合であり、ＴはＣであり、Ｒ１はＮＲ４Ｒ５であり、化合物は式（ＩＩｂ−１）：
【化２４】
2020512272.tif 000025
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｘ’、Ｙ’、ｎ、ｍ及びｚは式（ＩＩ）で定義した通りである）の構造で表される。
【００５６】
式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩａ−１）、（ＩＩａ−２）、（ＩＩａ−３）、（ＩＩａ−４）、（ＩＩｂ）及び（ＩＩｂ−１）のいずれかの化合物のある実施形態では、Ｒ２とＲ３は各々独立してＣ１４−Ｃ２０アルキル又はＣ１４−Ｃ２０アルケニルである。
【００５７】
式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩａ−１）、（ＩＩａ−２）、（ＩＩａ−３）、（ＩＩａ−４）、（ＩＩｂ）及び（ＩＩｂ−１）のいずれかの化合物の他の実施形態では、Ｒ２とＲ３は各々独立してＣ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルキル（Ｚは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−）である。
【００５８】
式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩａ−１）、（ＩＩａ−２）、（ＩＩａ−３）、（ＩＩａ−４）、（ＩＩｂ）及び（ＩＩｂ−１）のいずれかの化合物の他の実施形態では、Ｒ２とＲ３は各々独立してＣ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルケニル（Ｚは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−）である。
【００５９】
式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩａ−１）、（ＩＩａ−２）、（ＩＩａ−３）、（ＩＩａ−４）、（ＩＩｂ）及び（ＩＩｂ−１）のいずれかの化合物の他の実施形態では、Ｘ’はＯである。
【００６０】
式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩａ−１）、（ＩＩａ−２）、（ＩＩａ−３）、（ＩＩａ−４）、（ＩＩｂ）及び（ＩＩｂ−１）のいずれかの化合物の他の実施形態では、Ｘ’はＮＨである。
【００６１】
式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩａ−１）、（ＩＩａ−２）、（ＩＩａ−３）、（ＩＩａ−４）、（ＩＩｂ）及び（ＩＩｂ−１）のいずれかの化合物の他の実施形態では、Ｙ’はＮＨである。
【００６２】
式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩａ−１）、（ＩＩａ−２）、（ＩＩａ−３）、（ＩＩａ−４）、（ＩＩｂ）及び（ＩＩｂ−１）のいずれかの化合物の他の実施形態では、Ｒ４とＲ５は各々ＣＨ３であるか、又はＲ４とＲ５はそれらが結合している窒素と共に、ピロリジニル、ピペリジニル及びピペラジニルから成る群から選択される複素環を形成し、これらの各々は必要に応じてアルキルで置換されている。
【００６３】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ−１）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩａ−１）、（ＩＩａ−２）、（ＩＩａ−３）、（ＩＩａ−４）、（ＩＩａ−５）、（ＩＩｂ）及び（ＩＩｂ−１）の化合物の具体例は化合物１〜６６であり、その構造を以下の表１に示す。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００６４】
【表１】
2020512272.tif 000026
2020512272.tif 000027
2020512272.tif 000028
2020512272.tif 000029
2020512272.tif 000030
2020512272.tif 000031
2020512272.tif 000032
2020512272.tif 000033
2020512272.tif 000034
2020512272.tif 000035
2020512272.tif 000036
2020512272.tif 000037
【００６５】
他の態様では、本発明のカチオン性脂質は、式（ＩＩＩ）：
【化２５】
2020512272.tif 000038
（式中、
ＸとＹは各々独立してＯ、Ｎ又はＮＨであり、ＸとＹの両方がＯになることはなく、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の各々は独立して存在しないか、又はＣ１０−Ｃ２２アルキル、Ｃ１０−Ｃ２２アルケニル若しくはＣ１０−Ｃ２２アルキニルであり、
ｎは１〜３０の整数である）の構造で表され、
その塩、水和物、溶媒和物、多形体、光学異性体、幾何異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー及びその混合物を含む。
【００６６】
他の態様では、本発明のカチオン性脂質は、式（ＩＩＩＡ）：
【化２６】
2020512272.tif 000039
（式中、
ＸとＹは各々独立してＯ、Ｎ又はＮＨであり、ＸとＹの両方がＯになることはなく、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の各々は独立して存在しないか、又はＣ１０−Ｃ２２アルキル、Ｃ１０−Ｃ２２アルケニル若しくはＣ１０−Ｃ２２アルキニルであり、
ｎは１〜３０の整数であり、
ｘは０又は２である）の構造で表され、
その塩、水和物、溶媒和物、多形体、光学異性体、幾何異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー及びその混合物を含む。
【００６７】
式（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩＡ）のある実施形態では、ＸとＹは各々独立してＯ及びＮから成る群から選択される。式（ＩＩＩ）の他の実施形態では、ＸとＹは各々独立してＯ、Ｎ及びＮＨから成る群から選択される。
【００６８】
式（ＩＩＩ）の化合物の具体例は化合物６７〜７０であり、その構造を表２に示す。
【００６９】
【表２】
2020512272.tif 000040
式中、ｎは式（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩＡ）について上で定義した通りである。
【００７０】
本発明の更なる実施形態
更なる実施形態では、本発明は、次の構造：
【化２７】
2020512272.tif 000041
（式中、  ＸとＹは各々独立してＯ又はＮであり、ＸとＹの両方がＯになることはなく、
Ｗは結合、Ｏ、ＮＨ又はＳであり、
ＴはＣ又はＳであり、
ｍは０又は１であり、
ｚは０又は２である）で表される官能基を含むカチオン性脂質であって、
官能基は少なくとも１種の飽和又は不飽和脂肪酸残基に結合しているカチオン性脂質に関する。
【００７１】
ある実施形態では、カチオン性脂質は、上述の官能基に対称又は非対称に結合している２種の脂肪酸残基を含む。
【００７２】
本発明の一態様では、カチオン性脂質は、式（Ｉ’）：
【化２８】
2020512272.tif 000042
（式中、
ＹはＯ又はＮＨであり、
ＴはＣ又はＳであり、
Ｗは結合、Ｏ、ＮＨ又はＳであり、
Ｒ１は、
（ａ）ＮＲ４Ｒ５（Ｒ４とＲ５は各々独立してＣ１−Ｃ４アルキルであるか、又はＲ４とＲ５はそれらが結合している窒素と共に５員若しくは６員の複素環若しくは芳香族複素環を形成し、必要に応じてＯ、Ｎ及びＳから選択される１種以上のヘテロ原子を含むか、又はＮＲ４Ｒ５はグアニジン基（−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２）を表す）、
（ｂ）天然又は非天然アミノ酸の側鎖、及び
（ｃ）Ｏ、Ｎ及びＳから選択される１種以上のヘテロ原子を含む５員又は６員の複素環又は芳香族複素環から成る群から選択され、
Ｒ２とＲ３は、
（ａ）Ｃ１０−Ｃ２２アルキル、Ｃ１０−Ｃ２２アルケニル又はＣ１０−Ｃ２２アルキニル、及び
（ｂ）Ｃ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルキル（Ｚは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏである）から成る群から選択され、
ｎは０、１、２、３、４、５又は６であり、
ｍは０又は１であり、
ｐは０又は１であり、
ｚは０又は２である）の構造で表され、
その塩、水和物、溶媒和物、多形体、光学異性体、幾何異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー及びその混合物を含む。
【００７３】
ある実施形態では、式（Ｉ’）の化合物は、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン及びヒドラジドから選択される官能基を含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００７４】
式（Ｉ’）のある実施形態では、ｍは０である。式（Ｉ’）の他の実施形態では、ｍは１である。式（Ｉ’）の他の実施形態では、ｐは０である。式（Ｉ’）の他の実施形態では、ｐは１である。式（Ｉ’）の他の実施形態では、ｍは０であり、ｐは０である。式（Ｉ’）の他の実施形態では、ｍは１であり、ｐは０である。式（Ｉ’）の他の実施形態では、ｚは０である。式（Ｉ’）の他の実施形態では、ｚは２である。式（Ｉ’）の他の実施形態では、ＴはＣである。式（Ｉ’）の他の実施形態では、Ｗは結合である。式（Ｉ’）の他の実施形態では、Ｒ１はＮＲ４Ｒ５である。
【００７５】
式（Ｉ’）のある代表的な実施形態では、ｐは０であり、Ｗは結合であり、ＴはＣであり、化合物は式（Ｉａ’）：
【化２９】
2020512272.tif 000043
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｙ、ｍ、ｎ及びｚは式（Ｉ’）で定義した通りである）の構造で表される。式（Ｉａ’）のある実施形態では、ｍは０である。式（Ｉａ’）の他の実施形態では、ｍは１である。式（Ｉａ’）の他の実施形態では、ｚは０である。式（Ｉａ’）の他の実施形態では、Ｒ２とＲ３は各々独立してＣ１４−Ｃ２０アルキル又はＣ１４−Ｃ２０アルケニルである。式（Ｉａ’）の他の実施形態では、Ｒ２とＲ３は各々独立してＣ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルキル（Ｚは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）である。式（Ｉａ）の他の実施形態では、ＹはＯである。式（Ｉａ’）の他の実施形態では、ＹはＮＨである。
【００７６】
式（Ｉ’）の他の代表的な実施形態では、Ｒ１はＮＲ４Ｒ５であり、化合物は式（Ｉａ−１’）：
【化３０】
2020512272.tif 000044
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｙ、ｍ、ｎ及びｚは式（Ｉ）で定義された通りである）の構造で表される。式（Ｉａ−１’）のある実施形態では、Ｒ４とＲ５は各々ＣＨ３である。式（Ｉａ−１’）の他の実施形態では、Ｒ４とＲ５はそれらが結合している窒素と共に、ピロリジニル、ピペリジニニル及びピペラジニルから選択される複素環を形成し、これらの各々は必要に応じてアルキルで置換されている。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。本発明の他の態様では、カチオン性脂質は、式（ＩＩ’）：
【化３１】
2020512272.tif 000045
（式中、Ａは
【化３２】
2020512272.tif 000046
又は
【化３３】
2020512272.tif 000047
であり、
Ｘ’はＯ又はＮＨであり、
Ｙ’はＯ又はＮＨであり、
Ａが
【化３４】
2020512272.tif 000048
の場合には、
Ｘ’とＹ’の両方がＯになることはなく、
ＴはＣ又はＳであり、
Ｗは結合、Ｏ、ＮＨ又はＳであり、
Ｒ１は、
（ａ）ＮＲ４Ｒ５（Ｒ４とＲ５は各々独立してＣ１−Ｃ４アルキルであるか、又はＲ４とＲ５はそれらが結合している窒素と共に５員若しくは６員の複素環若しくは芳香族複素環を形成し、必要に応じてＯ、Ｎ及びＳから選択される１種以上のヘテロ原子を含むか、又はＮＲ４Ｒ５はグアニジン基（−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２）を表す）、
（ｂ）天然又は非天然アミノ酸の側鎖、及び
（ｃ）Ｏ、Ｎ及びＳから選択される１種以上のヘテロ原子を含む５員又は６員の複素環又は芳香族複素環から成る群から選択され、
Ｒ２とＲ３は、
（ａ）Ｃ１０−Ｃ２２アルキル、Ｃ１０−Ｃ２２アルケニル又はＣ１０−Ｃ２２アルキニル、及び
（ｂ）Ｃ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルキル（Ｚは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ）から成る群から選択され、
ｎは０、１、２、３、４、５又は６であり、
ｍは０又は１であり、
ｐは０又は１であり、
ｚは０又は２である）の構造で表され、
その塩、水和物、溶媒和物、多形体、光学異性体、幾何異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー及びその混合物を含む。
【００７７】
ある実施形態では、式（ＩＩ’）の化合物は、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン及びヒドラジドから選択される官能基を含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【００７８】
式（ＩＩ’）のある実施形態では、ｍは０である。式（Ｉ）の他の実施形態では、ｍは１である。式（ＩＩ’）の他の実施形態では、ｍは１である。式（Ｉ）の他の実施形態では、ｍは１であり、ｐは０である。式（ＩＩ’）の他の実施形態では、ｚは０である。式（ＩＩ’）の他の実施形態では、ｚは２である。式（ＩＩ’）の他の実施形態では、ＴはＣである。式（ＩＩ’）の他の実施形態では、Ｗは結合である。
【００７９】
式（ＩＩ’）のある代表的な実施形態では、カチオン性脂質は式（ＩＩａ）’：
【化３５】
2020512272.tif 000049
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ’、Ｔ、Ｗ、ｎ、ｍ、ｐ及びｚは式（ＩＩ’）で定義した通りである）の構造で表される。
【００８０】
式（ＩＩａ’）のある実施形態では、ｐは０であり、Ｗは結合であり、ＴはＣであり、化合物は式（ＩＩａ−１’）：
【化３６】
2020512272.tif 000050
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ’、ｎ、ｍ及びｚは式（ＩＩ）で定義した通りである）の構造で表される。
【００８１】
式（ＩＩａ’）の他の実施形態では、Ｒ１はＮＲ４Ｒ５であり、化合物は式（ＩＩａ−２’）：
【化３７】
2020512272.tif 000051
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｘ’、ｎ、ｍ及びｚは式（ＩＩ’）で定義した通りである）の構造で表される。
【００８２】
式（ＩＩａ’）の更に他の実施形態では、ｐは１であり、ｍは１であり、Ｗは結合であり、ＴはＣであり、化合物は式（ＩＩａ−３’）：
【化３８】
2020512272.tif 000052
（式中、Ｒ１は天然又は非天然アミノ酸の側鎖であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ’、ｎ及びｚは式（ＩＩ）で定義した通りである）の構造で表される。
【００８３】
式（ＩＩ’）の他の代表的な実施形態では、カチオン性脂質は式（ＩＩｂ’）：
【化３９】
2020512272.tif 000053
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｔ、Ｗ、Ｘ’、Ｙ’、ｎ、ｍ、ｐ及びｚは式（ＩＩ’）で定義した通りである）の構造で表される。
【００８４】
式（ＩＩｂ’）のある代表的な実施形態では、ｐは０であり、Ｗは結合であり、ＴはＣであり、Ｒ１はＮＲ４Ｒ５であり、化合物は式（ＩＩｂ−１’）：
【化４０】
2020512272.tif 000054
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｘ’、Ｙ’、ｎ、ｍ及びｚは式（ＩＩ’）で定義した通りである）の構造で表される。
【００８５】
式（ＩＩ’）、（ＩＩａ’）、（ＩＩａ−１’）、（ＩＩａ−２’）、（ＩＩａ−３’）、（ＩＩｂ’）及び（ＩＩｂ−１’）のいずれかの化合物のある実施形態では、Ｒ２とＲ３は各々独立してＣ１４−Ｃ２０アルキル又はＣ１４−Ｃ２０アルケニルである。
【００８６】
式（ＩＩ’）、（ＩＩａ’）、（ＩＩａ−１’）、（ＩＩａ−２’）、（ＩＩａ−３’）、（ＩＩｂ’）及び（ＩＩｂ−１’）のいずれかの化合物の他の実施形態では、Ｒ２とＲ３は各々独立してＣ４−Ｃ１０アルキレン−Ｚ−Ｃ４−Ｃ２２アルキル（Ｚは−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）である。
【００８７】
式（ＩＩ’）、（ＩＩａ’）、（ＩＩａ−１’）、（ＩＩａ−２’）、（ＩＩａ−３’）、（ＩＩｂ’）及び（ＩＩｂ−１’）のいずれかの化合物の他の実施形態では、Ｘ’はＯである。
【００８８】
式（ＩＩ’）、（ＩＩａ’）、（ＩＩａ−１’）、（ＩＩａ−２’）、（ＩＩａ−３’）、（ＩＩｂ’）及び（ＩＩｂ−１’）のいずれかの化合物の他の実施形態では、Ｘ’はＮＨである。
【００８９】
式（ＩＩ’）、（ＩＩａ’）、（ＩＩａ−１’）、（ＩＩａ−２’）、（ＩＩａ−３’）、（ＩＩｂ’）及び（ＩＩｂ−１’）のいずれかの化合物の他の実施形態では、Ｙ’はＮＨである。
【００９０】
式（ＩＩ’）、（ＩＩａ’）、（ＩＩａ−１’）、（ＩＩａ−２’）、（ＩＩａ−３’）、（ＩＩｂ’）及び（ＩＩｂ−１’）のいずれかの化合物の他の実施形態では、Ｒ４とＲ５は各々ＣＨ３であるか、又はＲ４とＲ５はそれらが結合している窒素と共に、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニルから選択される複素環を形成し、これらの各々は必要に応じてアルキルで置換されている。
【００９１】
他の態様では、本発明のカチオン性脂質は、式（ＩＩＩ’）：
【化４１】
2020512272.tif 000055
（式中、
ＸとＹは各々独立してＯ又はＮであり、
Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の各々は独立して存在しないか、又はＣ１０−Ｃ２２アルキル、Ｃ１０−Ｃ２２アルケニル若しくはＣ１０−Ｃ２２アルキニルであり、
ｎは１〜３０である）の構造で表され、
その塩、水和物、溶媒和物、多形体、光学異性体、幾何異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー及びその混合物を含む。
【００９２】
化学的定義
「アルキル」基は、直鎖及び分岐鎖アルキル基等の任意の飽和脂肪族炭化水素を意味する。一実施形態では、アルキル基は１〜４個の炭素を有し、本明細書ではＣ１−Ｃ４アルキルと称される。他の実施形態では、アルキル基は１０〜２２個の炭素を有し、本明細書ではＣ１０−Ｃ２２アルキルと称される。他の実施形態では、アルキル基は４〜１０個の炭素を有し、本明細書ではＣ４−Ｃ１０アルキルと称される。他の実施形態では、アルキル基は４〜２２個の炭素を有し、本明細書ではＣ４−Ｃ２２アルキルと称される。アルキル基は置換されていなくてもよく、或いはハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシカルボニル、アミド、アルキルアミド、ジアルキルアミド、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシル、チオ及びチオアルキルから選択される１種以上の基で置換されていてもよい。
【００９３】
「アルケニル」基は、直鎖、分岐鎖及び環状アルケニル基等の少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含む脂肪族炭化水素基を意味する。一実施形態では、アルケニル基は１０〜２２個の炭素を有し、本明細書ではＣ１０−Ｃ２２アルケニルと称される。他の実施形態では、アルケニル基は４〜１０個の炭素を有し、本明細書ではＣ４−Ｃ１０アルケニルと称される。他の実施形態では、アルケニル基は４〜２２個の炭素を有し、本明細書ではＣ４−Ｃ２２アルケニルと称される。アルケニル基の例としては、エテニル、プロペニル、ｎ−ブテニル、ｉ−ブテニル、３−メチルブト−２−エニル、ｎ−ペンテニル、ヘプテニル、オクテニル、シクロヘキシル−ブテニル及びデセニルが挙げられる。アルケニル基は、置換されていなくてもよく、或いは、利用可能な炭素原子を介し、アルキルに関して上で定義された１種以上の基で置換されていてもよい。
【００９４】
「アルキニル」基は、直鎖及び分岐鎖を含む少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を含む脂肪族炭化水素基を意味する。一実施形態では、アルキニル基は１０〜２２個の炭素を有し、本明細書ではＣ１０−Ｃ２２アルキニルと称される。他の実施形態では、アルキニル基は４〜１０個の炭素を有し、本明細書ではＣ４−Ｃ１０アルキニルと称される。他の実施形態では、アルキニル基は４〜２２個の炭素を有し、本明細書ではＣ４−Ｃ２２アルキニルと称される。アルキニル基の例としては、エチニル、プロピニル、ｎ−ブチニル、２−ブチニル、３−メチルブチニル、ｎ−ペンチニル、ヘプチニル、オクチニル及びデシニルが挙げられる。アルキニル基は、置換されていなくてもよく、或いは、利用可能な炭素原子を介し、アルキルに関して上で定義された１種以上の基で置換されていてもよい。
【００９５】
単独で又は別の基の一部として本明細書で使用される「ヘテロアリール」という用語は、原子が窒素、硫黄及び酸素から選択される少なくとも１個のヘテロ原子環を含む複素環式芳香族系を意味する。ヘテロアリールは５個以上の環原子を含む。ヘテロアリール基は、単環式、二環式、三環式等とすることができる。この定義にはベンゾ複素環も含まれる。窒素が環原子である場合、本発明は窒素含有ヘテロアリールのＮ−オキシドも企図する。ヘテロアリール部分の非限定的な例としては、チエニル、ベンゾチエニル、１−ナフトチエニル、チアントレニル、フリル、ベンゾフリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、プリニル、イソキノリル、キノリル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、カルボリニル、チアゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル等が挙げられる。ヘテロアリール基は、置換されていなくてもよく、或いは、利用可能な原子を介し、アルキルに関して上で定義された１種以上の基で置換されていてもよい。
【００９６】
単独で又は別の基の一部として本明細書で使用される「複素環」又は「ヘテロシクリル」という用語は、１〜４個のヘテロ原子（例えば、酸素、硫黄及び／又は窒素、特に窒素を単独で、或いは硫黄又は酸素環原子と共に）を有する５員〜８員環を意味する。このような５員〜８員環は、飽和、完全不飽和又は部分不飽和であってもよいが、完全飽和環が好ましい。好ましい複素環部分としては、ピペリジニル、ピロリジニル、ピペラジニル、ピロリニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピラニル、チオピラニル、インドリニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオフェニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロチアゾリル等が挙げられる。ある実施形態では、環式基はピロリジニルである。他の実施形態では、ヘテロアリール又はヘテロシクリル基はピペリジニルである。他の実施形態では、ヘテロシクリル基はピペリジンである。ヘテロシクリル基は、置換されていなくてもよく、或いは、利用可能な原子を介し、アルキルに関して上で定義された１種以上の基で置換されていてもよい。
【００９７】
本明細書中及び以下の特許請求の範囲の中で使用される「アミノ酸」又は「アミノ酸（複数）」という用語は、２０個の天然に存在するアミノ酸、即ち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンを包含すると理解されたい。各々の可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。他の実施形態によれば、アミノ酸という用語は、非天然アミノ酸又は合成アミノ酸を意味する。
【００９８】
更に、「アミノ酸」という用語は、Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の両方を包含する。本発明の原理によれば、「アミノ酸側鎖」という用語は、式Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｒ）−ＣＯＯＨのアミノ酸の基「Ｒ」を意味する。
【００９９】
「ヒドラジン」部分という用語は、基「−ＮＨ−ＮＨ−」を意味する。
【０１００】
本明細書で使用される「ヒドロキシルアミン」部分という用語は、基「−ＮＨ−Ｏ−」を意味する。
【０１０１】
本明細書で使用される「ヒドラジド」部分という用語は、基「−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ−Ｎ」を意味する。
【０１０２】
本明細書で使用される「ヒドロキシルアミン」部分という用語は、基「−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−」又は「−Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−」を意味する。
【０１０３】
本明細書で使用される「エチレンジアミン」部分という用語は、基「−Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−」又は「−Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−」を意味する。
【０１０４】
本明細書で使用される「グアニジン」という用語は、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２基を意味する。
【０１０５】
本明細書で使用される「脱離基」という用語は、別の部分によって容易に置換される任意の不安定な脱離基を意味する。ある実施形態では、脱離基は、ハロゲン、スルホニルオキシ及び−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’（Ｒ’はアルキル、アリール又はアルキルアリールである）から成る群から選択される。ある好ましい実施形態では、脱離基は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、メシレート（ＯＭｓ）、トリフレート（ＯＴｒ）及びトシレート（ＯＴｓ）から成る群から選択される。現在好ましい実施形態では、脱離基ＸはＢｒである。各々の可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０６】
「保護基」という用語は、化学合成中に反応部位をブロックするのに使用する化学残基を意味し、これによって、多官能性化合物中の１個の反応部位で化学反応を選択的に行わせ、他の反応部位を一時的にブロックしなければならない。このような反応部位をブロックするのに使用する残基を保護基と称する。
【０１０７】
本明細書で互換的に使用される「窒素保護基」又は「Ｎ保護基」又は「アミノ保護基」という用語は、アミノ基に結合した容易に切断可能な基を意味する。アミノ保護基の例としては、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル、アセチル、フェニルカルボニル、又はシリル基が挙げられ、これはアルキル（トリアルキルシリル）、アリール（トリアリールシリル）又はそれらの組み合わせ（例えば、ジアルキルフェニルシリル）で置換することができる（例えば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）又はｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）。ヒドロキシ保護基の他の例としては、例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル等）、−ＣＨ２Ｐｈ（ベンジル又はｂｚｌ）、アリル（Ａｌｌ）、（アリル）−ＣＯ−（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＳＯ２−（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−ＳＯ２−アリール、−ＣＯ−Ａｒ（Ａｒは上で定義したアリール基である）、及び−ＣＯ−（Ｃ１−Ｃ６アルキル）Ａｒ（例えば、カルボキシベンジル（Ｂｚ）基）が挙げられる。ヒドロキシ保護基の他の例としては、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、メトキシメチル（ＭＯＭ）、トリフェニルメチル（トリチル）及びジメトキシトリチル（ＤＭＴ）等の酸感受性保護基が挙げられる。各々の可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。保護基は、当技術分野で公知のように脱保護剤を用いて除去することができる。組込み方法及び脱保護方法は、Ｃ．Ｂ．Ｒｅｅｓｅ及びＥ．Ｈａｓｌａｍ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｊ．Ｇ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，Ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９７３，それぞれＣｈａｐｔｅｒｓ３及び４，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ及びＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，”２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９１及びＡ．Ｊ．Ｐｅａｒｓｏｎ及びＷ．Ｒ．Ｒｏｕｓｈ，Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９９）に記載されており、これらの各々の内容は全て参照によって本明細書に組み込まれる。ある実施形態によれば、薬学的に許容し得る塩は、酸又は塩基の生物学的有効性を保持する「酸」及び「塩基」付加塩の両方を含む。
【０１０８】
本発明のカチオン性脂質の１種以上は塩として存在することができる。「塩」という用語は、塩基付加塩と酸付加塩の両方を包含し、カルボン酸塩又はアミン窒素との塩を含むがこれらに限定されず、以下に記載の有機及び無機のアニオン及びカチオンと共に形成される塩を包含する。更に、この用語は、塩基性基（アミノ基等）及び有機酸又は無機酸との標準的な酸−塩基反応によって形成する塩を包含する。このような酸としては、塩酸、フッ化水素酸、トリフルオロ酢酸、硫酸、リン酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、乳酸、マレイン酸、フマル酸、パルミチン酸、コール酸、パモン酸、粘液酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−ショウノウ酸、グルタル酸、フタル酸、酒石酸、ラウリン酸、ステアリン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ソルビン酸、ピクリン酸、安息香酸、ケイ皮酸等の酸が挙げられる。各々の可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０９】
「有機又は無機カチオン」という用語は、塩のアニオンに対する対イオンを意味する。対イオンとしては、アルカリ金属及びアルカリ土類金属（リチウム、ナトリウム、カリウム、バリウム、アルミニウム及びカルシウム等）；アンモニウム及びモノ、ジ及びトリアルキルアミン、例えば、トリメチルアミン、シクロヘキシルアミン；及び有機カチオン、例えば、ジベンジルアンモニウム、ベンジルアンモニウム、２−ヒドロキシエチルアンモニウム、ビス（２−ヒドロキシエチル）アンモニウム、フェニルエチルベンジルアンモニウム、ジベンジルエチレンジアンモニウム等のカチオンが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｂｅｒｇｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（１９７７），６６：１−１９を参照（この文献は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１１０】
組成物及び治療的用途
ある態様では、本発明は、式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉａ−１）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩａ−１）、（ＩＩａ−２）、（ＩＩａ−３）、（ＩＩａ−４）、（ＩＩｂ）及び（ＩＩｂ−１）のいずれか１つに係るカチオン性脂質、例えば、化合物１〜６６のいずれか１つと、薬学的に許容し得る賦形剤とを含む組成物を提供する。組成物は、少なくとも１種の更なる中性脂質又はＰＥＧ修飾脂質を更に含むことができる。
【０１１１】
ある実施形態では、組成物は更に核酸を含むことができる。核酸の例としては、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボザイム、ｐＤＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ  ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ及び免疫刺激核酸が挙げられる。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１２】
ある実施形態では、本発明は、本発明のカチオン性脂質を含む組成物に細胞を接触させる工程を含む遺伝子サイレンシングの方法を提供する。ある実施形態では、細胞は癌細胞である。
【０１１３】
他の実施形態では、組成物は、中性脂質、荷電脂質、ステロイド及びポリマー結合脂質から成る群から選択される１種以上の成分を更に含む。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１４】
他の実施形態では、本発明の組成物を送達系として使用し、治療剤を体内のその標的部位に投与することができる。従って、ある実施形態では、本発明は、治療剤を投与するための方法であって、本明細書に記載のカチオン性脂質と治療剤とを含む組成物を調製し、この組成物をそれを必要とする対象に投与して行う方法に関する。
【０１１５】
特定の実施形態では、本発明は、ＩＶＴ−ｍＲＮＡ及び／又は他のオリゴヌクレオチドのインビトロ及びインビボ送達のための改良組成物の製剤化を可能にする新規カチオン性脂質を提供する。
【０１１６】
ある実施形態では、このような脂質ナノ粒子組成物は、ｍＲＮＡによってコードされているタンパク質の発現に有用である。
【０１１７】
他の実施形態では、このような改良脂質ナノ粒子組成物は、１種の標的ｍＲＮＡ又は数種のｍＲＮＡを調節するｍｉＲＮＡの群又は１種の特定のｍｉＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡ阻害剤を送達することによる内在性タンパク質発現の上方制御に有用である。
【０１１８】
他の実施形態では、このような改良脂質ナノ粒子組成物は、標的遺伝子のタンパク質レベル及び／又はｍＲＮＡレベルを下方制御（例えば、サイレンシング）するのに有用である。
【０１１９】
ある他の実施形態では、脂質ナノ粒子は、導入遺伝子の発現のためのｍＲＮＡ及びプラスミドの送達にも有用である。
【０１２０】
更に他の実施形態では、脂質ナノ粒子組成物は、タンパク質の発現に起因する薬理学的効果、例えば、適切なエリスロポエチンｍＲＮＡの送達による赤血球産生の増加、又は適切な抗体をコードするｍＲＮＡの送達による感染に対する保護を誘導するのに有用である。
【０１２１】
ある実施形態によれば、カチオン性脂質はナノ粒子の形態とすることができ、そのまま投与することができる。ある実施形態では、ナノ粒子を溶液として投与することができる。ある実施形態では、ナノ粒子は、任意の所望の投与経路で投与するのに適した医薬組成物に製剤化することができる。投与経路の例としては、局所投与、経口投与又は非経口投与等の経路が挙げられるが、これらに限定されない。所期の投与方法に応じて、使用する組成物は、例えば、錠剤、坐剤、丸剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤等の固体、半固体又は液体剤形の形態とすることができるが、好ましくは、正確な投与量の単回投与に適した単位投与形態である。医薬組成物は、カチオン性粒子、薬学的に許容し得る賦形剤を含むことができ、必要に応じて、他の薬剤、医薬品、担体、アジュバント等を含むことができる。薬学的に許容し得る担体は、粒子内に封入された核酸に対して不活性であり、使用条件下で有害な副作用又は毒性を有さないものであることが好ましい。ある実施形態では、投与は局所的である。ある実施形態では、投与は全身的である。
【０１２２】
ある実施形態では、非経口投与用の注射用製剤は、液状の溶液剤又は懸濁剤、注射前の液状の溶液剤又は懸濁剤に適した固体形態、又は乳剤として調製することができる。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等である。更に、必要に応じて、投与する医薬組成物は、例えば、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン等の湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤等の少量の無毒性補助物質を含むこともできる。また、水性注射懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、及び／又はデキストラン等の懸濁液の粘度を増加させる物質を含むこともできる。必要に応じて、懸濁液は安定剤を含むこともできる。非経口製剤は、アンプルやバイアル等の単位用量又は複数用量の密封容器中に存在させることができ、例えば、使用直前の注射用水等の無菌液状担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存することができる。ある実施形態では、非経口投与は静脈内投与を含む。
【０１２３】
他の実施形態では、経口投与の場合、薬学的に許容し得る無毒性の組成物は、例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、クロスカルメロースナトリウム、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウム等の通常使用される賦形剤のいずれかを組み込むことによって形成することができる。このような組成物としては、液剤、懸濁剤、錠剤、分散錠、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放製剤等が挙げられる。経口投与に適した製剤は、水、生理食塩水又はオレンジジュース等の希釈剤に溶解した有効量の化合物（複数可）の液状溶液、所定量の活性成分を固形物又は顆粒として含むサシェ剤、ロゼンジ剤、及びトローチ剤、散剤、適切な液体中の懸濁剤、適切な乳剤で構成することができる。液体製剤は、水やアルコール（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、及びポリエチレンアルコール）等の希釈剤を含むことができ、薬学的に許容し得る界面活性剤、懸濁剤又は乳化剤を添加しても添加しなくてもよい。
【０１２４】
投与する粒子の投与量を決定する際に、投与量及び投与頻度は、粒子内に封入される特定の核酸の薬理学的特性に関連させて選択することができる。
【０１２５】
ある代表的な実施形態では、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等の核酸を含む粒子を、核酸、特異的標的白血球等の同一性に応じて様々な白血球関連病態の治療に使用することができる。ある実施形態では、粒子内に封入される核酸は、標的遺伝子のサイレンシングを誘導することができる核酸とすることができる。ある実施形態では、標的遺伝子は任意の遺伝子とすることができ、その発現は治療対象の病態に関連する。ある実施形態では、標的遺伝子は、増殖因子（ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ等）、血管形成経路に関連する遺伝子（ＶＥＧＦ、インテグリン等）、細胞内シグナル伝達経路及び細胞周期調節に関与する遺伝子（ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫ、ＰＤＫ１、ＣＨＫ１、ＰＬＫ１、サイクリン等）から選択される遺伝子とすることができるが、これらに限定されない。ある実施形態では、各々が１種以上の標的を有する核酸の組み合わせを粒子内に封入することができる。
【０１２６】
ある実施形態によれば、標的粒子によって治療可能な白血球関連病態の例としては、様々な種類の癌、様々な感染症（例えば、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染等）、自己免疫疾患、神経変性疾患、炎症等から選択され得るが、これらに限定されない。
【０１２７】
ある代表的な実施形態では、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等）を含む標的粒子を癌の治療に使用することができる。
【０１２８】
ある実施形態では、癌は、細胞の集団が様々な程度で、通常の増殖や分化を制御する機序に応答しなくなった障害である。ある実施形態では、癌は血液癌である。血液癌の非限定的な例は、リンパ腫、白血病及び骨髄腫である。リンパ腫は、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫の２種のカテゴリーに分類される。殆どの非ホジキンリンパ腫はＢ細胞リンパ腫であり、急速に（高悪性度）又はゆっくり（低悪性度）と成長する。１４種類のＢ細胞非ホジキンリンパ腫が存在する。他はＴ細胞リンパ腫である。
【０１２９】
ある代表的な実施形態では、癌の治療に使用することができる核酸は、細胞周期の調節に関与する標的遺伝子に対するものである。ある代表的な実施形態では、標的遺伝子は、ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ）、サイクリンＤ１、ＣＨＫ１、Ｎｏｔｃｈ経路遺伝子とすることができる。
【０１３０】
ある例示的な実施形態によれば、脂質粒子の複数の脂質は天然又は合成起源のものとすることができ、カチオン性脂質、ホスファチジルエタノールアミン、イオン化脂質、膜安定化脂質、リン脂質等、又はこれらの組み合わせから選択することができるが、これらに限定されない。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３１】
ある実施形態では、膜安定化脂質は、コレステロール、リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロール）、セファリン、スフィンゴ脂質（スフィンゴミエリン及びスフィンゴ糖脂質）、グリセロ糖脂質、及びこれらの組み合わせから選択することができるが、これらに限定されない。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３２】
ある実施形態では、ホスファチジルエタノールアミンは、１，２−ジラウロイル−Ｌ−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈＰＥ）、１，３−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−２−ホスホエタノールアミン（１，３−ＤＰＰＥ）、１−パルミトイル−３−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−２−ホスホエタノールアミン（１，３−ＰＯＰＥ）、ビオチン−ホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）又はこれらの組み合わせから選択することができるが、これらに限定されない。ある実施形態では、ホスファチジルエタノールアミンは、ＰＥＧ−アミン誘導体に結合することができる。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３３】
ある実施形態によれば、「中性脂質」とは、生理学的ｐＨで非荷電又は中性双性イオン形態として存在する複数の脂質種のいずれかを意味し、このような脂質としては、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）等のホスホチジルコリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）等のホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、セラミド、ステロール及びその誘導体等のステロイドが挙げられるが、これらに限定されない。中性脂質は合成又は天然由来とすることができる。
【０１３４】
ある実施形態によれば、粒子（その脂質相）は１種以上のＰＥＧ誘導体を更に含むことができる。ある実施形態では、脂質等の１種以上の更なる分子にＰＥＧ誘導体を結合することができる。ある実施形態では、ＰＥＧ誘導体は、ＰＥＧ−ＤＭＧ  ３−Ｎ−（−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル−１，２−ジミリシルグリセロール、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ  ３−Ｎ−（−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル−１，２−ジミリスチルオキシ−プロピルアミン、ＰＥＧ−ｃＤＳＡ、３−Ｎ−（−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル−１，２−ジステアリルオキシ−プロピルアミン、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＰＥＧ−マレイミド、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マレイミド、又はこれらの組み合わせから選択されるが、これらに限定されない。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３５】
ある実施形態では、マレイミド誘導体／部分は、ＰＥＧ誘導体に結合、接合、又は連結していてもよく、それ自体で脂質に結合、連結及び／又は接合していてもよい。
【０１３６】
ある実施形態によれば、粒子中の様々な脂質間の比率は変動し得る。ある実施形態では、比率はモル比である。ある実施形態では、比率は重量比である。ある実施形態では、脂質基の各々は、約１％〜９９％のモル比／重量比となり得る。
【０１３７】
ある実施形態によれば、核酸と脂質混合物との重量比を調整して、核酸による標的部位への生物学的効果が最大となるようにすることができる。ある実施形態では、核酸と脂質相との比率は１：１とすることができる。例えば、核酸と脂質相との重量比は１：２とすることができる。例えば、核酸と脂質相との重量比は１：５とすることができる。例えば、核酸と脂質相との重量比は１：１０とすることができる。例えば、核酸と脂質相との重量比は１：１６とすることができる。例えば、核酸と脂質相との重量比は１：２０とすることができる。ある実施形態では、核酸と脂質相との重量比は、約１：１〜１：２０（ｗ：ｗ）である。
【０１３８】
ある実施形態では、粒子はナノ粒子である。ある実施形態では、粒子（内部に封入された核酸を含む）及び表面粒子上の標的部分は、約１０〜約５００ｎｍの範囲の粒径（直径）を有する。ある実施形態では、粒子は粒径（直径）が約１０〜約３５０ｎｍの範囲である。ある実施形態では、粒子は粒径（直径）が約５０〜約２５０ｎｍの範囲である。ある実施形態では、粒子は粒径（直径）が約１０〜約２００ｎｍの範囲である。ある実施形態では、粒子は粒径（直径）が約２０〜約２００ｎｍの範囲である。ある実施形態では、粒子は粒径（直径）が約５０〜約２００ｎｍの範囲である。ある実施形態では、粒子は粒径（直径）が約７５〜約２００ｎｍの範囲である。ある実施形態では、粒子は粒径（直径）が約９０〜約２００ｎｍの範囲である。ある実施形態では、粒子は粒径（直径）が約１００〜約２００ｎｍの範囲である。ある実施形態では、粒子は粒径（直径）が約１２０〜約２００ｎｍの範囲である。ある実施形態では、粒子は粒径（直径）が約１５０〜約２００ｎｍの範囲である。ある実施形態では、粒子は粒径（直径）が約５０〜約１５０ｎｍの範囲である。ある実施形態では、粒子は粒径（直径）が約１０ｎｍを超える範囲である。ある実施形態では、粒子は粒径（直径）が約２０ｎｍを超える。ある実施形態では、粒子は粒径（直径）が約３０ｎｍを超える。ある実施形態では、粒子は粒径（直径）が約４０ｎｍを超える。ある実施形態では、粒子は粒径（直径）が約５０ｎｍを超える。ある実施形態では、粒子は粒径（直径）が約６０ｎｍを超える。ある実施形態では、粒子は粒径（直径）が約７０ｎｍを超える。ある実施形態では、粒子は粒径（直径）が約８０ｎｍを超える。ある実施形態では、粒子は粒径（直径）が約９０ｎｍを超える。ある実施形態では、粒子は粒径（直径）が約１００ｎｍを超える。ある実施形態では、粒子は粒径（直径）が約２００ｎｍを超える。ある実施形態では、粒子は粒径（直径）が約５００ｎｍ以下である。ある実施形態では、粒子（内部に封入された核酸を含む）は粒径（直径）が約５〜約２００ｎｍの範囲である。ある実施形態では、粒子（内部に封入された核酸を含む）は粒径（直径）が約５０〜約６０ｎｍの範囲である。ある実施形態では、粒子（内部に封入された核酸を含む）は粒径（直径）が約５５〜約５８ｎｍの範囲である。ある実施形態では、粒径は流体力学的直径である。
【０１３９】
例示的な実施形態によれば、粒子は、カチオン性脂質（表１又は表２に示される化合物等）、コレステロール、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、ＰＥＧ誘導体（ＤＭＧ−ＰＥＧ等）及び脂質に結合したＰＥＧ−マレイミド（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マレイミド等）を様々なモル：モル比で含むことができ、更に標的部分に結合し、標的部分は、マレイミド部分に結合、連結、接合している。例えば、脂質相は、カチオン性脂質（ＤＬｉｎＭＣ３）／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マレイミド（モル／モル  ５０：１０：３８：１．５：０．５）からなり得る。例えば、脂質相は、ＤＬｉｎＭＣ３−ＤＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＤＳＰＣ／ＤＭＧ−ＰＥＧ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マレイミド（モル／モル  ５０：３８：１０：１．９５：０．０５）からなり得る。
【０１４０】
ある実施形態によれば、脂質相は約３０〜６０％（モル）のカチオン性脂質を含むことができる。例えば、カチオン性脂質（複数可）は脂質相の約４０〜５０％（モル）を構成することができる。
【０１４１】
ある実施形態によれば、脂質相は約２０〜７０％（モル）の膜安定化脂質を含むことができる。例えば、膜安定化脂質は脂質相の約４０〜６０％を構成することができる。ある実施形態では、２種以上の膜安定化脂質を脂質相に使用することができる。例えば、膜安定化脂質は、コレステロール（脂質相の約３０〜５０％（モル）である）と、脂質相の約５〜１５％（モル）となり得るリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ等）とを含むことができる。
【０１４２】
ある実施形態によれば、脂質相は約０．０１〜３％（モル：モル）のＰＥＧ−マレイミド（必要に応じて脂質に結合している）を含むことができる。例えば、ＰＥＧ−マレイミドは脂質混合物の約０．０５〜０．６％を構成することができる。
【０１４３】
ある実施形態によれば、更なるＰＥＧ誘導体（脂質に結合）は脂質相組成物の約０．５〜１０％を構成することができる。
【０１４４】
ある例示的な実施形態によれば、白血球への核酸の送達のための標的粒子を調製する方法が提供され、この方法は次の工程：
ａ）本発明に係るカチオン性脂質、膜安定化脂質、及びリン脂質に結合したＰＥＧ−マレイミドを含む複数の脂質を有機溶媒中で所望の比率で混合する工程、
ｂ）適切な溶液中の混合物に核酸を所望の比率で添加する工程、
ｃ）マイクロ流体マイクロミキサー内で脂質混合物と核酸とを混合して粒子を形成する工程、
ｄ）粒子を透析して望ましくない溶媒を除去する工程、
ｅ）粒子を還元型標的抗体と共にインキュベートして標的化粒子を生成する工程、
ｆ）必要に応じてゲル濾過によって非結合抗体を除去する工程、
ｇ）核酸分子を封入している再構成ｔ−結合粒子を濾過する工程の一つ以上を含む。
【０１４５】
ある実施形態では、脂質はエタノール等の酸性水性緩衝液に懸濁している。ある実施形態では、核酸は酢酸緩衝液中にある。
【０１４６】
ある実施形態では、核酸をマイクロフルイダイザーミキサーで脂質混合物と混合して、核酸を封入／担持している粒子を形成することができる。
【０１４７】
定義
本発明の理解を円滑化するため、幾つかの用語及び表現を以下に定義する。このような用語及び表現は説明を目的としており、限定を目的とするものではなく、本明細書の用語又は語法は、本明細書に提示された教示や指針に鑑み、当業者の知識と組み合わせて当業者が解釈することが理解されるべきである。
【０１４８】
本明細書で使用される用語「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」及び「ヌクレオチド」は、本明細書では互換的に使用され得る。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）及びその修飾型のポリマーの別々の断片の形態、又はより大きな構築物、直鎖又は分岐鎖、一本鎖、二本鎖、三本鎖又はそれらのハイブリッドの構成要素としての形態に関する。この用語はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドも包含する。ポリヌクレオチドは、センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はＤＮＡ又はＲＮＡのポリヌクレオチド配列を包含し得る。ＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、組換えＤＮＡ、又はそのハイブリッド、又はｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等のＲＮＡ分子を挙げることができるが、これらに限定されない。各々の可能性は本発明の別個の実施形態を表す。これらの用語は更に、天然に存在する塩基、糖、及び共有ヌクレオシド間結合から成るオリゴヌクレオチド、並びにそれぞれの天然に存在する部分と同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを包含する。
【０１４９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は本明細書中で互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを意味する。これらの用語は、１種以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的類似体であるアミノ酸ポリマー、及び天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。
【０１５０】
本明細書で使用される「構築物」という用語は、１種以上の核酸配列を含み得る人工的に組み立てられた又は単離された核酸分子を意味し、この場合、核酸配列はコード配列（即ち、最終産物をコードする配列）、調節配列、非コード配列、又はそれらの任意の組み合わせを包含し得る。構築物という用語は、例えば、ベクターを包含するが、それに限定されると見なされるべきではない。
【０１５１】
「発現ベクター」とは、外来細胞中に異種核酸断片（例えば、ＤＮＡ等）を組み込んで発現する能力を有する構築物を意味する。換言すれば、発現ベクターは転写され得る核酸配列／断片（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等）を含む。多くの原核生物及び真核生物の発現ベクターが既知及び／又は市販されている。適切な発現ベクターの選択は当業者の知識の範囲内である。ある代表的な実施形態では、発現ベクターは標的部位内の二本鎖ＲＮＡ分子をコードすることができる。
【０１５２】
本明細書で使用される「発現」という用語は、標的細胞での所望の最終産物分子の産生を意味する。最終産物分子は、例えば、ＲＮＡ分子、ペプチド又はタンパク質等、又はその組み合わせを含むことができる。
【０１５３】
本明細書で使用される「導入する」及び「トランスフェクション」という用語は互換的に使用することができ、例えば、核酸、ポリヌクレオチド分子、ベクター等の分子を標的細胞（複数可）へ導入すること、より具体的には、標的細胞（複数可）の膜で囲まれた空間の内部へ導入することを意味する。分子は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）（この文献の内容は参照によって本明細書に組み込まれる）によって教示されているように、当業者に既知の任意の手段で標的細胞（複数可）に「導入」することができる。細胞に分子を「導入する」手段としては、例えば、熱ショック、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＰＥＩトランスフェクション、電気穿孔、リポフェクション、トランスフェクション試薬（複数可）、ウイルス媒介導入等、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。細胞のトランスフェクションは、例えば、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、ウイルス細胞等の任意の起源の任意の種類の細胞に対して実施することができる。細胞は、単離細胞、組織培養細胞、細胞株、生体内に存在する細胞等から選択することができる。
【０１５４】
本明細書で使用される「治療する」及び「治療」という用語は、疾患又は病態の進行を抑制する、阻害する、遅らせる又は逆転させる、疾患又は病態の臨床症状を改善する、或いは疾患又は病態の臨床症状の出現を予防することを意味する。「予防する」という用語は、本明細書では、対象が障害又は疾患又は病態を獲得することを妨げることとして定義される。
【０１５５】
「癌の治療」という用語は、癌の増殖速度の低下（即ち、癌は依然として増殖するが遅い速度で増殖する）、癌性増殖の停止（即ち、腫瘍増殖の停滞）、及び腫瘍のサイズの減少又は縮小の内の１つ以上を包含するものとする。また、この用語は、転移数の減少、新たに形成された転移数の減少、ある段階から他の段階への癌の進行の遅延、及び癌によって誘発される血管新生の減少も包含する。最も好ましい場合では、腫瘍は完全に除去されている。この用語に更に包含されるのは、治療を受けている対象の生存期間の延長、疾患進行の期間の延長、腫瘍縮小等である。ある実施形態では、癌は血液癌である。
【０１５６】
「白血球」という用語は、骨髄中の多能性の造血幹細胞から産生し、それに由来する白血球細胞（ＷＢＣ）に関する。白血球細胞は核を有し、白血球細胞の種類は、機能的又は物理的特性に基づいて５つの主な種類、即ち、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、及び単球等に分類することができる。主な種類はサブタイプに分類することができる。例えば、リンパ球としては、Ｂ細胞、Ｔ細胞及びＮＫ細胞が挙げられる。Ｂ細胞は、例えば、抗体を放出し、Ｔ細胞の活性化を支援する。Ｔ細胞は、例えば、幾つかのサブタイプに分類することができ、その例としては、Ｔ細胞及びＢ細胞を活性化し調節するＴヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔｈ）、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を標的として殺すことができる細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋）、自然免疫応答と適応免疫応答との間を橋渡しして食作用に関与することができるガンマ−デルタＴ細胞（γδＴ細胞）、免疫系を調節し、自己抗原に対する寛容性を維持し、自己免疫状態を抑制する調節性（サプレッサー）Ｔ細胞等が挙げられる。
【０１５７】
合成方法
本発明の化合物は、以下の一般的な合成方法に従って調製することができる。
【化４２】
2020512272.tif 000056
【化４３】
2020512272.tif 000057
【化４４】
2020512272.tif 000058
【０１５８】
上述した関連技術の例及びそれに関連する限定は例示的であり、排他的ではないことが意図される。関連技術の他の限定は、本明細書を読み、図面を検討することによって当業者には明らかになるであろう。
【０１５９】
本明細書に引用された全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６０】
実施例１：材料及び方法：
材料
脂質：ＬＮＰの製造に使用される全ての脂質（コレステロール、ＤＳＰＣ及びＤＳＰＥ  ＰＥＧ−Ｍａｌ）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  ｌｉｐｉｄｓ（米国）から購入した。
モノクローナル抗体：抗ＣＤ４５  ＡＦ６４７、アネキシン−６４７はＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。
ヨウ化プロポデウムはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
ｓｉＲＮＡ分子は、Ａｌｎｙｌａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（米国）によって設計及びスクリーニングされた。
化学修飾ｓｉＲＮＡ配列：
ＣＤ４５  ｓｉＲＮＡ：
センス鎖：ｃｕＧＧｃｕＧＡＡｕｕｕｃＡＧＡＧｃＡｄＴｓｄＴ（配列番号：１）
アンチセンス鎖：ＵＧＣＵＣＵＧＡＡＡＵＵｃＡＧＣｃＡＧｄＴｓｄＴ（配列番号：２）
ＮＣ５  ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＣ５又は対照ｓｉＲＮＡ）：
センス鎖：ＣＡＵＡＵＵＧＣＧＣＧＵＡＵＡＧＵＣＧＣＧＵＵＡＧ
アンチセンス鎖：ＵＧＧＵＡＵＡＡＣＧＣＧＣＡＵＡＵＣＡＧＣＧＣＡＡＵＣ
Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ（ｓｉＬｕｃ）：
センス鎖：ｃｕｕＡｃＧｃｕＧＡＧｕＡｃｕｕｃＧＡｄＴｓｄＴ（配列番号：３）
アンチセンス鎖：ＵＣＧＡＡＧｕＡＣＵｃＡＧＣＧｕＡＡＧｄＴｓｄＴ（配列番号：４）
Ａｌｅｘａ−６４７標識ｓｉＲＮＡはｓｉＬｕｃと同じ配列を有していた。２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドは小文字で示し、ホスホロチオエート結合は「ｓ」によって表す。
ＰＬＫ１  ｓｉＲＮＡ（ＰＬＫ１）
センス鎖：ＧＣＵＵＡＡＵＧＡＣＧＡＧＵＵＣＵＵＵＡＣＵＵＣＴ
アンチセンス鎖：ＧＡＣＧＡＡＵＵＡＣＵＧＣＵＣＡＡＧＡＡＡＵＧＡＡＧＡ
細胞株：
ＳｕｐＴ１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＡＲ細胞及びＯＶＣＡＲ−８細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入し、推奨通りに培養した。
【０１６１】
ｓｉＲＮＡ封入脂質ベースのナノ粒子（ＬＮＰ）の調製
ＬＮＰは、Ｃｏｈｅｎらによって記載されているように、マイクロ流体マイクロ混合物（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ、カナダ、ブリティッシュコロンビア州、バンクーバー）を使用して調製した。エタノール中１倍容量の脂質混合物（カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、Ｃｈｏｌ、ＤＭＧ−ＰＥＧ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ  Ｍａｌ、５０：１０：３８：１．５：０．５モル比、９．６４ｎＭ総脂質濃度）と酢酸緩衝溶液を含む３倍容量のｓｉＲＮＡ（１：１６ｗ／ｗ  ｓｉＲＮＡ：脂質）をマイクロミキサーを介して２ｍＬ／分の複合流速（エタノール：０．５ｍＬ／分及び水性緩衝液：１．５ｍＬ／分）で注入した。標識ＬＮＰについては、１０％のＡｌｅｘａ−６４７標識ｓｉＲＮＡを組み込んだ。Ｃｙ５標識粒子については、１０％Ｃｙ５標識非標的ｓｉＲＮＡを使用した。得られた混合物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して１６時間透析してエタノールを除去した。
【０１６２】
αＣＤ３８−ＬＮＰ−ｓｉＲＮＡの径、ζ電位及び超微細構造解析
ＬＮＰ径分布及びζ電位は、ＭａｌｖｅｒｎナノＺＳζサイザー（Ｍａｌｖｅｒｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国）を使用して動的光散乱によって測定した。径測定のために、ＬＮＰをＰＢＳで１：２０に希釈した。利用した全てのサンプルは０．２より低い多分散指数（ＰＤＩ）を示した。ζ電位測定のために、ＬＮＰをＤＤＷで１：２００に希釈した。ある場合では、以下に示すように、径測定とゼータ電位測定を水中で行った。
【０１６３】
定量的リアルタイムＰＣＲ
細胞中のポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ１遺伝子）のｍＲＮＡレベルを、トランスフェクションから４８時間後又は７２時間後にリアルタイムＰＣＲによって定量した。全ＲＮＡをＥ−Ｚ  ＲＮＡ精製キット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）を使用して単離し、各サンプル由来の１μｇのＲＮＡをＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）を使用してｃＤＮＡに逆転写し、ｃＤＮＡの定量化（合計５ｎｇ）はｓｙｂｅｒ  ｇｒｅｅｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｓｔｅｐ  ｏｎｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）で行った。ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として選択した。
リアルタイムＰＣＲのために以下のプライマーを選択した。
ＰＬＫ１用のプライマー：
順方向：ＡＣＣＡＧＣＡＣＧＴＣＧＴＡＧＧＡＴＴＣ
逆方向：ＣＡＡＧＣＡＣＡＡＴＴＴＧＣＣＧＴＡＧＧ
ＧＡＰＤＨ用のプライマー：
順方向：ＴＣＡ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＡＴＴ  ＴＧＧ  ＣＡ
逆方向：ＧＡＧ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＴＣＧ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＣＡ
【０１６４】
インビトロ遺伝子サイレンシング
Ｓｕｐｔ１又はＮＡＲ又はＯＶＣＡＲ細胞を、１ｍＬの完全培地と共に１×１０５細胞の密度で組織培養１２ウェルプレートに入れた。様々なｓｉＲＮＡ（ｓｉＰＬＫ１又はｓｉＣＤ４５又はｓｉＬＵＣ）を含有するＬＮＰをウェルに添加し、濃度を図に記載した。図に記載の様々な時間間隔で細胞を単離し、フローサイトメトリー（ｓｉＣＤ４５ノックダウン用）又はＰＬＫ１サイレンシング解析用のｑＰＣＲのいずれかによって解析した。ｓｉＰＬＫ１誘導細胞死の場合には、ＰＩ／アネキシンを用いたアポトーシスアッセイをフローサイトメトリーによって解析した。
【０１６５】
細胞周期研究：
トランスフェクトした細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、７０％エタノールで１時間固定した。次に、細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、１０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、２．５μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅフリーＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ、米国）及び０．０１％トリトン−Ｘと共に２５０μＬのＰＢＳ中、３７℃で１０分間インキュベートした。ＰＩ蛍光はフローサイトメトリーによって評価した。ＦｌｏｗＪｏ（商標）による解析は、ＦＬ２−面積／ＦＬ２−幅チャンネルに基づいて、デブリ及び細胞二重線をゲートアウトした後、試料１個当たり少なくとも９０００個の細胞に対して行った。細胞周期分布は、１．５〜２．５の範囲のＲＭＳスコアでゲート細胞にディーン・ジェット・フォックスモデルを適用することによって得た。
【０１６６】
実施例２：脂質の合成：
一般的な調製方法（スキーム１〜３の例示的実施形態）。
【化４５】
2020512272.tif 000059
【化４６】
2020512272.tif 000060
【化４７】
2020512272.tif 000061
【０１６７】
方法Ａ：
化合物（ｉ）又は上で定義したアミン官能性化合物を標準的なＥＤＣ／ＮＨＣカップリング法によって脂肪酸に結合させて化合物（ｉｉ）を得る。水素化アルミニウムリチウム（ＬＡＨ）で更に還元した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して所望の最終化合物（ｉｉｉ）を得る。
【０１６８】
方法Ｂ：
化合物（ｉ）及び／又はアミン官能性化合物とアルキル／アルケニル脂肪鎖対応アルデヒドをアルゴン下、室温で２時間撹拌した後、ＮａＣＮＢＨ４又はトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムで還元し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して所望の最終化合物を得る。
【０１６９】
方法Ｃ：
化合物（ｉ）又は上で定義したアミン官能性化合物を対応する臭化アルキル／アルケニル（上で定義した他のもの）と共に一晩加熱した後、カラムクロマトグラフィーで精製して所望の最終化合物（ｉｉ）を得る。
【０１７０】
方法Ｄ：
トリエチルアミンの存在下でジヒドロキシル化合物を脂肪酸塩化物と反応させて化合物（ｉｉ）を得る。化合物（ｉｉ）をクロロクロム酸ピリジニウム（ＰＣＣ）で更に酸化した後、アミン官能性化合物と反応させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して所望の化合物（ｉｖ）を得る。
【０１７１】
脂質１の合成（方法Ａ）：
【化４８】
2020512272.tif 000062
リノール酸（０．８８ｍｇ、３．１４ｍｍｏｌ）とＥＤＣＩ（０．９ｍｇ、４．７１ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのフラスコに入れ、乾燥ＤＣＭに溶解した後、ジメチルアミノエチルヒドラジン塩酸塩（０．２ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．１ｍｌ）を添加した。反応混合物を２４時間撹拌し、水とブライン溶液で洗浄した。粗化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３（４：９６））で精製して０．８ｇの純粋な化合物（９Ｚ，１２Ｚ）−Ｎ’−（２−（ジメチルアミノ）エチル）−Ｎ’−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノイル）オクタデカ−９，１２−ジエンヒドラジドを得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ５．２２−５．４５  （８Ｈ，  ｍ）；  ３．７−３．８  （１Ｈ，  ｔ）；  ３．２−３．３  （１Ｈ，  ｍ）；  ２．８  （４Ｈ，  ｔ），  ２．６  （２Ｈ，  ｔ），  ２．３  （６Ｈ，  ｓ）；  ２．２  （４Ｈ，  ｍ）；  ２．０  （８Ｈ，  ｑ）；  １．２−１．４  （３２Ｈ，  ｍ），  ０．９  （６Ｈ，  ｔ）．
ＥＳＩ−ＭＳ：    ６２８．６  （Ｍ＋１）
【０１７２】
上述の化合物（０．８ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ）を５０ｍＬの丸底（ＲＢ）フラスコに入れ、５ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解した後、１ＮのＬＡＨ  ＴＨＦ溶液（６ｍＬ、６．３６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を２４時間還流した。反応を０℃の飽和塩化アンモニウムで停止させた後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３（２：９８））で精製して０．３ｇの純粋な化合物２−（１，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ））−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ヒドラジニル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタン−１−アミンを淡黄色液体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ＮＭＲ：  ５．２２−５．４５  （８Ｈ，ｍ）；  ３．２  （２Ｈ，ｔ）；  ３．１  （２Ｈ，  ｔ）；  ２．８  （４Ｈ，  ｔ），  ２．５  （２Ｈ，  ｍ）；  ２．４  （６Ｈ，  ｓ）；  ２．３  （１Ｈ，  ｍ）；  ２．０  （１２Ｈ，  ｑ）；  １．５  （４Ｈ，  ｍ）；  １．２−１．４  （３２Ｈ，  ｍ），  ０．９  （６Ｈ，  ｔ）．
ＥＳＩ−ＭＳ：    ６００．６  （Ｍ＋１）
【０１７３】
脂質１０＆１２の合成：
【化４９】
2020512272.tif 000063
リノールアルコール（１．７ｇ、６．３ｍｍｏｌ）をアルゴン下で乾燥ＤＣＭに溶解し、モレキュラーシーブを反応混合物に添加した。ＰＣＣ（２ｇ、９．５ｍｍｏｌ）を１０分間に亘って反応混合物に少しずつ添加した。反応混合物を１時間撹拌し、シリカパッドを通して濾過してＰＣＣを除去した後、溶媒を蒸発させて１．５ｇの粗リノールアルデヒドを得た。粗アルデヒド（１．５ｇ、５．６ｍｍｏｌ）とＢｏｃ−ヒドラジド（０．６ｇ、４．５ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＣＭに溶解し、次いでトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（４．７ｇ、２２．６ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、室温で２４時間撹拌した。反応を水酸化ナトリウム溶液で停止させ、ＤＣＭ（３×５０ｍＬ）で抽出した後、水とブライン溶液で洗浄した。溶媒を蒸発させ、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（５：９５））で精製して１．３ｇの純粋な化合物Ｎ，Ｎ−ジリノレイル−ｂｏｃヒドラジドを得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ５．２２−５．４５  （８Ｈ，  ｍ）；  ２．８  （４Ｈ，  ｔ），  ２．６  （３Ｈ，  ｂｓ），  ２．０−２．１  （８Ｈ，  ｑ）；  １．５−１．８  （６Ｈ，  ｍ）；  １．４−１．５  （１２Ｈ，  ｓ），  １．２−１．４  （３２Ｈ，  ｍ），  ０．９  （６Ｈ，  ｔ）
ＥＳＩ−ＭＳ：    ６２９．６  （Ｍ＋１）＋
【０１７４】
Ｎ，Ｎ−ジリノレイル−ｂｏｃヒドラジド（１．３ｇ、２．０７ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＣＭに溶解した。反応混合物を０℃に冷却し、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（２ｍＬ）を滴下して３時間撹拌した。ＴＬＣ解析によって反応が完了した際、反応混合物を重炭酸ナトリウムで洗浄した後、ブライン溶液で洗浄した。溶媒を蒸発させ、粗反応混合物（０．４ｇ、０．７６ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ酪酸（０．１９ｇ、１．３ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（０．４３ｇ、２．２６ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＣＭに溶解した。トリエチルアミンを添加し、反応物を２４時間撹拌した。反応混合物を水で洗浄した後、重炭酸ナトリウムとブライン溶液で洗浄した。溶媒を蒸発させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３（２：９８））で精製して０．３ｇの純粋な脂質１０を無色の液体として得た。  
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ５．２２−５．４５  （８Ｈ，ｍ）；  ２．８  （４Ｈ，ｔ），  ２．６  （３Ｈ，ｍ），  ２．３−２．５  （４Ｈ，ｍ）；  ２．２  （６Ｈ，ｓ）；  ２．０（８Ｈ，ｑ）；  １．６−１．８  （８Ｈ，  ｍ）；  １．２−１．５  （３６Ｈ，ｍ），  ０．９  （６Ｈ，ｔ）
ＥＳＩ−ＭＳ：    ６４２．６  （Ｍ＋１）＋
【０１７５】
化合物２を乾燥ＴＨＦ中に溶解し、１ＭのＬＡＨ  ＴＨＦ溶液を反応混合物に添加し、１２時間還流した。反応を塩化アンモニウム溶液で停止させた後、溶媒を蒸発させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して純粋な脂質１２を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ＮＭＲ：  ５．２２−５．４５  （８Ｈ，  ｍ）；  ２．８  （４Ｈ，  ｔ），  ２．６  （２Ｈ，  ｍ），  ２．４−２．５  （６Ｈ，  ｍ）；  ２．２  （６Ｈ，  ｓ）；  ２．０（８Ｈ，  ｑ）；  １．６−１．８  （８Ｈ，  ｍ）；  １．２−１．５  （３６Ｈ，  ｍ），  ０．９  （６Ｈ，  ｔ）
ＥＳＩ−ＭＳ：    ６２９．１  （Ｍ＋１）＋
【０１７６】
脂質１１の合成：
【化５０】
2020512272.tif 000064
Ｎ，Ｎ−ジリノレイルヒドラジン（３００ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）、Ｎε，Ｎεジメチル−Ｎαｂｏｃ  Ｌ−リジン（１８０ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）及びＥＤＣＩ（３２０ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのＲＢフラスコに入れ、アルゴン下で１０ｍＬの乾燥ＤＣＭに溶解した。反応混合物を２４時間撹拌し、次いで反応混合物を水で洗浄した後、重炭酸ナトリウムとブライン溶液で洗浄した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３；３：９７）で精製して２００ｍｇの純粋な化合物を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ５．２２−５．４５  （８Ｈ，  ｍ）；  ３．８−４．０  （１Ｈ，  ｍ）；  ２．８  （４Ｈ，  ｔ），  ２．６−２．７  （４Ｈ，  ｔ），  ２．４  （２Ｈ，  ｍ）；    ２．２  （６Ｈ，  ｓ），  ２．０  （８Ｈ，  ｍ），  １．５−１．８  （６Ｈ，  ｍ）；  １．４  （９Ｈ，  ｓ），    １．２−１．４  （３４Ｈ，  ｍ），  ０．９  （６Ｈ，  ｔ）．
ＥＳＩ−ＭＳ：    ７８５．６  （Ｍ＋１）＋
【０１７７】
上述の化合物（２００ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのＲＢフラスコに入れ、アルゴン雰囲気下で４ｍＬの乾燥ＤＣＭに溶解した。トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を０℃で滴下した。反応混合物を３時間撹拌した。溶媒を重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した後、ブラインで洗浄した。クロロホルムとメタノールの溶媒系（９５：５）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって反応混合物を精製して、１２０ｍｇの純粋な化合物１１（２−アミノ−６−（ジメチルアミノ）−Ｎ’，Ｎ’−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ヘキサンヒドラジド）を半固形物として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ５．２２−５．４５  （８Ｈ，  ｍ）；  ３．４  （１Ｈ，  ｍ），  ２．８  （４Ｈ，  ｔ），  ２．７  （４Ｈ，  ｔ），  ２．５  （２Ｈ，  ｔ），  ２．４  （６Ｈ，  ｓ），  ２．０  （ｍ），  １．６  （２Ｈ，  ｍ），  １．４−１．５  （６Ｈ，  ｍ），  １．２−１．４  （３４Ｈ，  ｍ），  ０．９  （６Ｈ，  ｔ）
ＥＳＩ−ＭＳ：    ６８６．６  （Ｍ＋１）＋
【０１７８】
脂質１４の合成：
【化５１】
2020512272.tif 000065
リノレイルアルデヒド（２．６４ｇ、１０．０ｍｍｏｌ、２当量）とヒドロキシルアミン塩酸塩（０．３４ｇ、５．０ｍｍｏｌ、１．０当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＣＭに溶解し、次いでトリメチルアミン（０．７ｍｌ、５．０ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加した。化合物を溶解した後、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（３．１ｇ、１５．０ｍｍｏｌ、３当量）を反応混合物に添加し、室温で２４時間撹拌した。反応を水酸化ナトリウム溶液で停止させた後、水とブライン溶液で洗浄した。溶媒を蒸発させ、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（５：９５））で精製して、１．５ｇ（５５％）の純粋な白色化合物Ｎ，Ｎ−ジリノレイル−ヒドロキシルアミンを得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ５．２７−５．３９  （８Ｈ，  ｍ）；  ２．７７  （４Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．８４  Ｈｚ），  ２．５７−２．６８  （４Ｈ，  ｍ），  ２．０５  （８Ｈ，  ｑ，  Ｊ  ＝  ６．８０，  ６．８７  Ｈｚ）；  １．５０−１．６５  （４Ｈ，  ｍ）；  １．２２−１．４２  （３２Ｈ，  ｍ），  ０．８９  （６Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．８６  Ｈｚ）．
ＥＳＩ−ＭＳ：    ５３０  ［Ｍ＋１］＋
【０１７９】
Ｎ，Ｎ−ジリノレイル−ヒドロキシルアミン（０．４８ｇ、０．９０ｍｍｏｌ、１当量）Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（０．３０ｇ、１．８ｍｍｏｌ、２当量）、ＥＤＣＩ（０．３４ｇ、１．８ｍｍｏｌ、２当量）及びＤＭＡＰ（０．０１ｇ、０．０９ｍｍｏｌ、０．１当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＣＭに溶解した。次にトリメチルアミン（０．２５ｍｌ、１．８ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、反応物を２４時間撹拌した。反応混合物を水で洗浄した後、重炭酸ナトリウムとブライン溶液で洗浄した。溶媒を蒸発させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３（３：９７））で精製して、０．６ｇ（８５％）の純粋な脂質１４を無色の液体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ５．２２−５．４５  （８Ｈ，  ｍ）；  ２．７１−２．８７  （８Ｈ，  ｍ），  ２．２４−２．３６  （４Ｈ，ｍ）；  ２．２１  （６Ｈ，  ｓ）；  １．９３−２．１２  （８Ｈ，  ｍ）；  １．７４−１．８１  （２Ｈ，  ｍ）；    １．４２−１．５８  （４Ｈ，  ｍ）；  １．６−１．８  （８Ｈ，  ｍ）；  １．２０−１．４０  （３２Ｈ，  ｍ），  ０．８９  （６Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝    ６．９０  Ｈｚ）．
Ｍａｓｓ：  ６４３．１  ［Ｍ］＋；  ６４４．１  ［Ｍ＋１］＋
【０１８０】
脂質１５の合成：
【化５２】
2020512272.tif 000066
リノレイルアルデヒド（１．７ｇ、６．０６ｍｍｏｌ、２当量）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルヒドラジン塩酸塩（０．５３ｇ、３．０３ｍｍｏｌ、１当量）及びトリメチルアミン（０．８４ｍｌ、６．０６ｍｍｏｌ、２当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＣＭに溶解し、次にトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（１．９１ｇ、９．０９ｍｍｏｌ、３当量）を添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。反応を水酸化ナトリウム溶液で停止させた後、水とブライン溶液で洗浄した。溶媒を蒸発させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３（３：９７））によって精製して、１．０８ｇ（６０％）の純粋な脂質１５を無色の液体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ６．７７  （１Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ５．５５  Ｈｚ  ），    ５．３４−５．４８  （８Ｈ，  ｍ）；  ３．１３  （２Ｈ，  ｍ），  ３．００−３．０５  （２Ｈ，  ｍ），  ２．７７  （４Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．４４  Ｈｚ），  ２．４１−２．４８  （４Ｈ，  ｍ），  ２．２２−２．３４  （２Ｈ，  ｍ），  ２．２８  （ｓ，  ６Ｈ）；  １．４６−１．５１  （４Ｈ，  ｍ）；  １．３２−１．４０  （３２Ｈ，  ｍ），    ０．８９  （６Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．９０  Ｈｚ）．
ＥＳＩ−ＭＳ  ：  ５９９  （［Ｍ］＋），  ６００  （［Ｍ＋１］＋）．
【０１８１】
脂質２２の合成：
【化５３】
2020512272.tif 000067
Ｎ，Ｎ−ジリノレイル−ヒドロキシルアミン（０．２０ｇ、０．３７ｍｍｏｌ、１当量）Ｎ−メチルピペリジンプロパン酸（０．１２ｇ、０．７４ｍｍｏｌ、２当量）、ＥＤＣＩ（０．１３ｇ、０．７４ｍｍｏｌ、２当量）及びＤＭＡＰ（５ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ、０．１当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＣＭに溶解した。次にトリメチルアミン（０．１ｍｌ、０．７４ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、反応物を２４時間撹拌した。反応混合物を水で洗浄した後、重炭酸ナトリウムとブライン溶液で洗浄した。溶媒を蒸発させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３（５：９５））で精製して、０．２１ｇ（７６％）の純粋な脂質を無色の液体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ５．２１−５．４５  （８Ｈ，  ｍ）；  ２．７５−２．８７  （８Ｈ，  ｍ），  ２．７０  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７．２８  Ｈｚ  ）；  ２．４７  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７．２５  Ｈｚ  ）；  ２．２７  （３Ｈ，  ｓ）；  １．９８−２．１０  （８Ｈ，  ｍ）；  １．４４−１．５７  （４Ｈ，  ｍ）；  １．１５−１．４０  （３２Ｈ，  ｍ），  ０．８８  （６Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝    ６．８１  Ｈｚ）．
Ｍａｓｓ：  ６８４．８  ［Ｍ＋１］＋
【０１８２】
脂質３８の合成：
【化５４】
2020512272.tif 000068
リノレイルアルデヒド（２．６４ｇ、１０．０ｍｍｏｌ、２当量）とエタノールアミン（０．３０ｇ、５．０ｍｍｏｌ、１当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＣＭに溶解し、次いでトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（３．１ｇ、１５．０ｍｍｏｌ、３当量）を添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。反応を水酸化ナトリウム溶液で停止させた後、水とブライン溶液で洗浄した。溶媒を蒸発させ、残渣をカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３（２：９８））で精製して、２．３ｇ（８５％）の純粋な黄色の化合物Ｎ，Ｎ−ジリノレイル−アミノエタノールを得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ５．３５−５．４６  （８Ｈ，  ｍ）；  ３．５２  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ５．３８  Ｈｚ  ）；  ２．７７  （４Ｈ，ｔ，  Ｊ  ＝  ６．３７  Ｈｚ），  ２．５７  （２Ｈ，ｔ，  Ｊ  ＝  ５．３８  Ｈｚ），  ２．４３−２．４９  （４Ｈ，  ｍ），  ２．０５  （８Ｈ，  ｑ，  Ｊ  ＝  ６．７３，  ６．７５  Ｈｚ），  １．４３−１．４８  （４Ｈ，  ｍ），  １．３２−１．３８  （３２Ｈ，  ｍ），  ０．８９  （６Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．８５  Ｈｚ）
ＥＳＩ−ＭＳ：  ５５８  ［Ｍ＋１］＋
【０１８３】
Ｎ，Ｎ−ジリノレイル−アミノエタノール（０．５５ｇ、１．０ｍｍｏｌ、１当量）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ酪酸（０．３３ｇ、２．０ｍｍｏｌ、２当量）、ＥＤＣＩ（０．３８ｇ、２．０ｍｍｏｌ、２当量）及びＤＭＡＰ（０．０１ｇ、０．０１ｍｍｏｌ、０．１当量）をアルゴン雰囲気下で乾燥ＤＣＭに溶解した。トリメチルアミン（０．２８ｍｌ、２．００ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、反応混合物を２４時間撹拌した。反応混合物を水で洗浄した後、重炭酸ナトリウムとブライン溶液で洗浄した。溶媒を蒸発させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３（３：９７））で精製して、０．４６ｇ（７０％）の純粋な脂質３８を無色の液体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ５．２７−５．４５  （８Ｈ，  ｍ）；  ４．１２  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．３３  Ｈｚ  ）；  ２．７７  （４Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．３７  Ｈｚ  ）；  ２．６７  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．３４  Ｈｚ  ）；  ２．３８−２．４９  （４Ｈ，  ｍ），    ２．１９−２．３８（４Ｈ，  ｍ）；  ２．２１  （６Ｈ，ｓ）；  ２．０５  （８Ｈ，  ｑ，  Ｊ  ＝  ６．８２，  ６．８４  Ｈｚ  ）；  １．７０−１．８５  （４Ｈ，  ｍ）；  １．２０−１．５０  （３６Ｈ，  ｍ），  ０．９  （６Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．８５  Ｈｚ  ）．
ＥＳＩ−ＭＳ：    ６７１  （［Ｍ］＋），  ６７２  （［Ｍ＋１］＋）．
【０１８４】
脂質５４及び５７の合成：
【化５５】
2020512272.tif 000069
【０１８５】
デカン酸７−オキソヘプチル：
【化５６】
2020512272.tif 000070
１，７−ヘプタンジオール（５ｇ、３７ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのフラスコに入れ、乾燥ＤＣＭ中に溶解した後、ＰＣＣ（８．９ｇ、４１．６ｍｍｏｌ）を１５分間に亘って少しずつゆっくりと添加した。次に、反応混合物を室温で２時間撹拌した。粗反応混合物をシリカゲルパッドを通して濾過し、ＤＣＭ（２×５０ｍＬ）で洗浄した。有機溶媒をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去した。得られた粗ヒドロキシルアルデヒドを更に精製せずに直接使用した。
【０１８６】
粗ヒドロキシアルデヒド（１．３ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、デカン酸（２．０ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（２．８ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）を１００ｍＬフラスコに入れ、乾燥ＤＣＭに溶解し、０℃でＤＭＡＰ（触媒）を添加した。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。次に反応混合物を水で洗浄した後、ブライン溶液で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。粗混合物をシリカカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（０５：９５））で精製して、無色油状物を収率９０％（２．４ｇ）で得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ９．７６  （１Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  １．９１  Ｈｚ  ）；  ４．０５  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．７６  Ｈｚ），  ２．４３  （２Ｈ，  ｄｔ，  Ｊ  ＝  ７．４８，  ５．７０  Ｈｚ  ）；  ２．２８（２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７．６８  Ｈｚ  ）；  １．７８−  １．５２  （８Ｈ，  ｍ）；  １．４４−１．３３  （４Ｈ，  ｍ）；  １．３２−１．２０  （１２Ｈ，  ｍ），  ０．８７  （３Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝    ６．６２  Ｈｚ）．
Ｍａｓｓ：  ２８５．８  ［Ｍ＋１］＋，  ２８３．８  ［Ｍ−１］＋
【０１８７】
ビス（デカン酸）（２−（２−（ジメチルアミノ）エチル）ヒドラジン−１，１−ジイル）ビス（ヘプタン−７，１−ジイル）（脂質５７）：
【化５７】
2020512272.tif 000071
デカン酸７−オキソヘプチル（０．６ｇ、２．２ｍｍｏｌ）とジメチルアミノエチルヒドラジン塩酸塩（０．１８ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭに溶解した後、トリメチルアミン（０．１ｍｌ）を添加した。トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（０．６ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、室温で２４時間撹拌した。反応混合物をＮａＨＣＯ３溶液で洗浄した後、ブライン溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。粗混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３（５：９５））で精製して、７３％（０．５１ｇ）の純粋なビス（デカン酸）（２−（２−（ジメチルアミノ）エチル）ヒドラジン−１，１−ジイル）ビス（ヘプタン−７，１−ジイル）を淡黄色の液体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ９．２８  （１Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ５．５５  Ｈｚ  ）；  ４．０１  （１Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．６０  Ｈｚ），    ３．７０  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７．７０  Ｈｚ），  ３．３０−３．２０  （３Ｈ，  ｍ），  ２．５４  （３Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７．５５  Ｈｚ），  ２．３３−２．２１  （６Ｈ，  ｍ），  ２．２０  （ｓ，  ６Ｈ）；  １．８０−１．７０  （４Ｈ，  ｍ）；  １．３７−１．１７  （２４Ｈ，  ｍ），    ０．８３  （６Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．９０  Ｈｚ）．
ＥＳＩ−ＭＳ：  ６４０  （［Ｍ＋１］＋）．
【０１８８】
ビス（デカン酸）（（２−ヒドロキシエチル）アザンジイル）ビス（ヘプタン−７，１−ジイル）：
【化５８】
2020512272.tif 000072
デカン酸７−オキソヘプチル（１．０ｇ、３．７ｍｍｏｌ）とエタノールアミン（０．１１ｇ、１．８５ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭに溶解した後、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（１．１ｇ、５．５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した後、ブライン溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。粗混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３（２：９７））で精製して、８５％（０．９１ｇ）の純粋なビス（デカン酸）（（２−ヒドロキシエチル）アザンジイル）ビス（ヘプタン−７，１−ジイル）を淡色液体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ４．０５  （４Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．９８  Ｈｚ）；  ３．６０  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ５．３１  Ｈｚ  ）；  ２．６６  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ５．３１  Ｈｚ  ）；  ２．５４  （  ４Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７．５８  Ｈｚ）；  ２．２８  （４Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７．５８  Ｈｚ）；  １．６８−１．５４  （８Ｈ，  ｍ  ）；  １．５３−１．４１  （４Ｈ，  ｍ  ）；  １．２０−１．４０  （３２Ｈ，  ｍ），  ０．８９  （６Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．８０  Ｈｚ  ）．
ＥＳＩ−ＭＳ：  ５９８  （［Ｍ＋１］＋）．
【０１８９】
ビス（デカン酸）（（２−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）エチル）アザンジイル）ビス（ヘプタン−７，１−ジイル）（脂質５４）：
【化５９】
2020512272.tif 000073
ビス（デカン酸）（（２−ヒドロキシエチル）アザンジイル）ビス（ヘプタン−７，１−ジイル）（０．４ｇ、０．７ｍｍｏｌ）と４−（ジメチルアミノ）ブタン酸（０．１７ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を１００ｍＬフラスコに入れて、乾燥ＤＣＭに溶解させた。次いで、ＥＤＣＩ（０．２７ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加した後、ＤＭＡＰ（触媒）を添加し、それを一晩撹拌した。反応混合物を水で洗浄した後、ブライン溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。粗混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３（２：９８））で精製して、７５％（０．３７ｇ）の純粋なビス（デカン酸）（（２−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）エチル）アザンジイル）ビス（ヘプタン−７，１−ジイル）を淡色液体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ４．１１  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５１  Ｈｚ）；  ４．０４  （４Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．７８  Ｈｚ）；  ２．６６  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５１  Ｈｚ  ）；  ２．４３（４Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７．７３  Ｈｚ  ）；  ２．３３  （  ２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７．５８  Ｈｚ）；  ２．２８  （４Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７．５８  Ｈｚ）；  ２．２１  （６Ｈ，  ｓ）；  １．６８−１．５４  （６Ｈ，  ｍ  ）；  １．６７−１．５２  （８Ｈ，  ｍ  ）；  １．４６−１．３６  （４Ｈ，  ｍ  ）；  １．２０−１．４０  （３２Ｈ，  ｍ），  ０．８７  （６Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．８０  Ｈｚ  ）．
ＥＳＩ−ＭＳ：  ７１１  （［Ｍ＋１］＋）．
【０１９０】
脂質２４の合成
【化６０】
2020512272.tif 000074
【０１９１】
２−ヘキシルデカン酸：
【化６１】
2020512272.tif 000075
新たに調製したＬＤＡ（９．０ｍＬ、ＴＨＦ中２Ｍ、１８．０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３０ｍＬ）溶液をデカン酸（２．６ｇ、１５．３ｍｍｏｌ）とＮａＨ（６０ｗ／ｗ％鉱油懸濁液、６９０ｍｇ、１８．０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１９ｍＬ）溶液に０℃でゆっくりと添加し、室温で３０分間撹拌した。ｎ−Ｃ６Ｈ１３Ｉ（２．６ｍＬ、１８．０ｍｍｏｌ）を添加した後、反応混合物を４５℃で６時間撹拌し、次いで室温で１ＮのＨＣｌで反応停止させた。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュシリカカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：Ｈｅｘ（１０：９０））で精製して（３．７ｇ、６５％）を無色の液体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ２．３８−２．２８  （１Ｈ，  ｍ）；  １．６９−１．５３  （２Ｈ，  ｍ）；  １．５０−１．４０  （２Ｈ，  ｍ）；  １．３６−１．２０  （２０Ｈ，  ｍ）；  ０．８７  （６Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．８７  Ｈｚ）．
Ｍａｓｓ：  ２５５  ［Ｍ−１］＋
【０１９２】
６，６’−（１−（２−（ジメチルアミノ）エチル）ヒドラジン−１，２−ジイル）ビス（６−オキソヘキサン酸）ジメチル：
【化６２】
2020512272.tif 000076
アジピン酸メチル（１．６ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノエチルヒドラジン（０．８８ｇ、５．０ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（２．８ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＣＭに溶解した後、トリエチルアミンを添加した。反応混合物を一晩撹拌した。反応混合物を水で洗浄した後、ブライン溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。粗混合物をカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３（５：９５））で精製して、淡黄色の液体を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ３．６６  （３Ｈ，  ｓ）；  ３．６４  （３Ｈ，  ｓ）；  ２．２６−２．４１（６Ｈ，  ｍ）；  ２．１５−２．２６  （１２Ｈ，  ｓ）；  １．６５−  １．５４  （４Ｈ，  ｍ）；  １．６５−１．５５  （４Ｈ，  ｍ）．  
Ｍａｓｓ：  ３８８  ［Ｍ＋１］＋
【０１９３】
６，６’−（１−（２−（ジメチルアミノ）エチル）ヒドラジン−１，２−ジイル）ビス（ヘキサン−１−オール）：
【化６３】
2020512272.tif 000077
６，６’−（１−（２−（ジメチルアミノ）エチル）ヒドラジン−１，２−ジイル）ビス（６−オキソヘキサン酸）ジメチル（０．７７ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦに溶解した後、過剰のＬＡＨ（１０．０ｍＬ、ＴＨＦ中２Ｍ、２０．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２４時間還流し、Ｈ２Ｏをゆっくり添加して反応を停止させ、濾過し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、９０％（０．５ｇ）の純粋な６，６’−（１−（２−（ジメチルアミノ）エチル）ヒドラジン−１，２−ジイル）ビス（ヘキサン−１−オール）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ３．６２  （４Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．７０  Ｈｚ）；  ２．７０  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．８７  Ｈｚ  ）；  ２．６５（２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７．１０  Ｈｚ  ）；  ２．５０−２．６０  （  ４Ｈ，  ｍ，）；  ２．４４  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．９１  Ｈｚ）；  ２．２９  （６Ｈ，  ｓ）；  １．６５−１．４５  （６Ｈ，  ｍ  ）；  １．４４−１．２５  （８Ｈ，  ｍ  ）．
ＥＳＩ−ＭＳ：  ３０４  （［Ｍ＋１］＋）．
【０１９４】
ビス（２−ヘキシルデカン酸）（１−（２−（ジメチルアミノ）エチル）ヒドラジン−１，２−ジイル）ビス（ヘキサン−６，１−ジイル）（脂質２４）：
【化６４】
2020512272.tif 000078
６，６’−（１−（２−（ジメチルアミノ）エチル）ヒドラジン−１，２−ジイル）ビス（ヘキサン−１−オール）（０．３０ｇ、１．０ｍｍｏｌ）と２−ヘキシル−デカン酸（０．５０ｇ、２．２ｍｍｏｌ、２当量）を５０ｍＬフラスコに入れ、乾燥ＤＣＭに溶解した。次いで、ＥＤＣ（０．２７ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加した後、ＤＭＡＰ（触媒）を添加し、反応物を一晩撹拌した。反応混合物を水で洗浄した後、ブライン溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。粗混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３（５：９５））で精製して、６５％（０．４９ｇ）の純粋な化合物を淡色液体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ３．７２  （４Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ５．６５  Ｈｚ）；  ３．２０−３．３４  （４Ｈ，  ｍ）；  ２．３１  （４Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．７１  Ｈｚ  ）；  ２．２１  （６Ｈ，  ｓ）；  １．７１−１．８５  （４Ｈ，  ｍ）；  １．６８−１．５０  （６Ｈ，  ｍ  ）；  １．５０−１．３６  （６Ｈ，  ｍ  ）；  １．３２−１．１７  （５０Ｈ，  ｍ），  ０．８４  （１２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．９１  Ｈｚ  ）．
ＥＳＩ−ＭＳ：  ７８０  （［Ｍ＋１］＋）．
【０１９５】
脂質５６の合成
【化６５】
2020512272.tif 000079
【０１９６】
６−ヒドロキシヘキサン酸：
【化６６】
2020512272.tif 000080
ε−カプロラクトン（２．２ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）をジオキサン６ｍＬに溶解し、３ＭのＮａＯＨ溶液５０ｍＬを添加した。混合物を室温で一晩撹拌した。溶液を酢酸エチルで洗浄して一部の有機不純物を除去した。水層を３７％濃ＨＣｌでｐＨ３〜４に酸性化し、次いで酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を飽和ＮａＣｌ（２×５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。有機層を真空下で濃縮して、＞９０％（２．０ｇ）を無色油状物として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ３．６２  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．３０  Ｈｚ）；  ２．３３（２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７．４５  Ｈｚ）；  １．６３  （２Ｈ，  ｐｅｎｔ）；  １．５５  （２Ｈ，  ｑ，  Ｊ  ＝  ７．４５  Ｈｚ）；  １．４２−１．３２  （２Ｈ，  ｍ）．
【０１９７】
７−オキソヘプタン酸：
【化６７】
2020512272.tif 000081
６−ヒドロキシヘキサン酸（０．６０ｇ、４．５ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（１０ｍＬ）溶液にＩＢＸ（１．０ｇ、３．５ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加した。混合物を６時間撹拌し、水を添加して反応を停止させた。沈殿物を濾過によって除去した。酢酸エチル（２×５０ｍｌ）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、溶媒を真空下で除去して、ほぼ純粋なオキソ酸を収量０．４６ｇ（７８％）で無色油状物として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ９．４８  （１Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  １．５７  Ｈｚ）；  ２．３３  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７．４５  Ｈｚ）；  ２．２０  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７．２０  Ｈｚ）；  ２．１０−１．９５  （２Ｈ，  ｍ），  １．４５−１．３２  （２Ｈ，  ｍ）．
【０１９８】
６−オキソヘキサン酸（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル：
【化６８】
2020512272.tif 000082
７−オキソヘプタン酸（０．２６ｇ、２．０ｍｍｏｌ）とシス−２−ノネン−１−オール（０．２８ｇ、２．０ｍｍｏｌ、１当量）を５０ｍＬのフラスコに入れ、乾燥ＤＣＭに溶解し、ＥＤＣＩ（０．２７ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加した後、ＤＭＡＰ（触媒）を添加して一晩撹拌した。反応混合物を水で洗浄した後、ブライン溶液で洗浄し、亜硫酸ナトリウムで乾燥させた。粗混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（５：９５））で精製して、８５％（０．４４ｇ）の純粋な化合物を液体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ９．７４  （１Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  １．６９  Ｈｚ），  ５．６８−５．５８  （１Ｈ，  ｍ）；  ５．５４−５．４４  （１Ｈ，  ｍ）；  ４．６０  （２Ｈ，  ｄ，  Ｊ  ＝  ７．２０  Ｈｚ）；  ２．４０−２．５０  （２Ｈ，  ｍ）；  ２．３８−２．２８  （２Ｈ，  ｍ）；  ２．０８  （２Ｈ，  ｑ，  Ｊ  ＝  ７．７０，  ６．９０  Ｈｚ）；  １．７０−１．６０  （４Ｈ，  ｍ）；  １．４０−１．２０  （８Ｈ，  ｍ  ）；  ０．８６（６Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．９５  Ｈｚ  ）．
ＥＳＩ−ＭＳ：  ２７７  （［Ｍ＋Ｎａ］＋）．
【０１９９】
６，６’−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジン−１，１−ジイル）ジヘキサン酸ジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）：
【化６９】
2020512272.tif 000083
６−オキソヘキサン酸（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル（０．２５ｇ、１．０ｍｍｏｌ、２当量）とＢｏｃ−ヒドラジン（０．０６ｇ、０．５ｍｍｏｌ、１．０当量）を窒素雰囲気下で乾燥ＤＣＭに溶解し、次いでトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（０．６３ｇ、３．０ｍｍｏｌ、３．０当量）を反応混合物に添加し、室温で１２時間撹拌した。
反応を重炭酸ナトリウム溶液で停止させ、ＤＣＭで抽出した後、水とブライン溶液で洗浄した。溶媒を蒸発させ、カラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１０：９０））で精製して、０．２１ｇ（７８％）の純粋な脂質を無色の液体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ５．６０−５．５０  （２Ｈ，  ｍ）；  ５．４７−５．３７  （２Ｈ，  ｍ）；  ５．２５  （ｂｒ  ｓ，  １Ｈ），  ４．５３  （２Ｈ，  ｓ），  ４．５１（２Ｈ，  ｓ），  ２．６５−２．４２  （４Ｈ，  ｍ），  ２．２１  （４Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７．５０  Ｈｚ），  ２．００  （４Ｈ，  ｑ，  Ｊ  ＝  ７．９０，  ７．１１  Ｈｚ），  １．５４  （４Ｈ，  ｐｅｎｔ）；  １．３２−１．４５  （１５Ｈ，  ｍ），  １．３０−１．０９  （１８Ｈ，  ｍ），      ０．７９  （６Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．７５  Ｈｚ）．
ＥＳＩ−ＭＳ：  ６０９  （［Ｍ＋１］＋），  ５５３  （［Ｍ−ｔ−Ｂｕ］＋）．
【０２００】
６，６’−（ヒドラジン−１，１−ジイル）ジヘキサン酸ジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）：
【化７０】
2020512272.tif 000084
上述のＢｏｃ保護ヒドラジン化合物（０．２５ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下、室温で２時間ＴＦＡ／ＤＣＭ（２：８）１０ｍＬに溶解した。反応を重炭酸ナトリウム溶液で停止させ、ＤＣＭで抽出した後、水とブライン溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、更に精製を行わずに０．２０ｇ（９９％）の純粋なヒドラジンを淡黄色の液体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ５．７０−５．５８  （２Ｈ，  ｍ）；  ５．５６−５．４２  （２Ｈ，  ｍ）；  ４．６２  （２Ｈ，  ｓ），  ４．６０  （２Ｈ，  ｓ）；  ２．４４  （４Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７．５２  Ｈｚ）；  ２．３１  （４Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７．５２  Ｈｚ）；  ２．０９  （４Ｈ，  ｑ，  Ｊ  ＝  ７．５２，  ７．１５  Ｈｚ）；  １．６４  （４Ｈ，  ｐｅｎｔ）；  １．５５  （４Ｈ，  ｐｅｎｔ）；  １．４３−１．２０  （１８Ｈ，  ｍ）；  ０．８７  （６Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７．１５  Ｈｚ）．
ＥＳＩ−ＭＳ：  ５０９  （［Ｍ＋１］＋）
【０２０１】
６，６’−（２−（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）ヒドラジン−１，１−ジイル）ジヘキサン酸ジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）（脂質５６）：
【化７１】
2020512272.tif 000085
６，６’−（ヒドラジン−１，１−ジイル）ジヘキサン酸ジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）（０．２０ｇ、０．４ｍｍｏｌ、１当量）、Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（０．１０ｇ、０．６ｍｍｏｌ、１．５当量）、ＥＤＣ（０．１５ｇ、０．８ｍｍｏｌ、２．０当量）及びＤＭＡＰ（触媒）を窒素雰囲気下で乾燥ＤＣＭに溶解した。次にトリメチルアミン（０．２８ｍｌ、２．００ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、反応物を１２時間撹拌した。反応混合物に重炭酸ナトリウムを添加し、混合物を水で洗浄した後、ブライン溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、反応混合物をシリカカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ３（５：９５））で精製して、８５％（０．２０ｇ）の純粋な脂質を淡黄色の液体として得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＣＤＣｌ３）：  δ  ５．６７−５．５７  （４Ｈ，  ｍ）；  ５．５７−５．４４  （４Ｈ，  ｍ）；  ４．６１  （４Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ５．５２  Ｈｚ）；  ２．６６  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ８．１６  Ｈｚ  ）；  ２．４５  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７．４７  Ｈｚ  ）；  ２．４０  （２Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ７．７５  Ｈｚ）；    ２．３４−２．２０  （４Ｈ，  ｍ）；  ２．２８  （６Ｈ，  ｓ）；  ２．０８  （４Ｈ，  ｑ，  Ｊ  ＝  ７．８０  Ｈｚ  ）；  ２．００−１．９０  （４Ｈ，  ｍ）；  １．８６−１．７６  （２Ｈ，  ｍ）；    １．７０−１．５５  （４Ｈ，  ｍ），  １．５４−１．４０  （４Ｈ，  ｍ），  １．３８−１．２０  （１４Ｈ，  ｍ），  ０．８７  （６Ｈ，  ｔ，  Ｊ  ＝  ６．９２  Ｈｚ  ）．  
ＥＳＩ−ＭＳ：    ６２２  （［Ｍ＋１］＋）．
【０２０２】
実施例３：物理化学的特徴付け
【表３】
2020512272.tif 000086
【０２０３】
実施例４：生物学的結果
実施例１に記載のようにインビトロ遺伝子サイレンシングを行った。
【０２０４】
図１は、脂質１のインビトロ遺伝子サイレンシング効果を示す：ヒトＴ細胞ＳｕｐＴ１をｓｉＣＤ４５封入カチオン性脂質１からなる脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）で４８時間（Ａ）又は７２時間（Ｂ）、異なるｓｉＲＮＡ用量（０．４μＭ、０．２μＭ、０．１μＭ）で処理した。この結果から、トランスフェクトしにくいＴ細胞においてＣＤ４５遺伝子を下方制御する脂質１の効率が分かる。
【０２０５】
薬剤耐性ヒト卵巣癌細胞（ＮＡＲ）をＬＮＰ−ｓｉＰＬＫ−１又はＬＮＰ−ｓｉＬｕｃナノ粒子のいずれか（脂質１のＬＮＰ（Ａ）、脂質１０＆１１のＬＮＰ（Ｂ））で７２時間処理し、ＰＬＫ−１発現を実施例１に記載のようにｑＰＣＲで測定した。図２Ａに示すように、脂質１含有ＬＮＰは癌原遺伝子ＰＬＫ１を効率的に下方制御し、これは癌細胞においてアポトーシスを誘導することができる。高用量の対照ＬＵＣ−ｓｉＲＮＡでは、脂質１を有するＬＮＰはｐｌｋ１発現に影響を及ぼさなかった。更に図２Ｂに示すように、脂質１０＆１１含有ＬＮＰ−ｓｉＰＬＫ１も異なる用量でｐｌｋ１遺伝子を効率的に下方調節するが、ｓｉＬＵＣ  ＬＮＰはｐｌｋ１発現に影響を及ぼさない。
【０２０６】
ＮＡＲ細胞における脂質１のインビトロ遺伝子サイレンシング効果：ヒト卵巣癌細胞（ＮＡＲ細胞）を脂質１／ｓｉＰＬＫ１ナノ粒子で４８時間、異なるｓｉＲＮＡ濃度（０．２μＭ及び０．１μＭ）で処理した。アポトーシス細胞をＰＩ／アネキシンを用いたＦＡＣＳにより解析した。図３に示すように、脂質１を有するｓｉＰＬＫ１−ＬＮＰは、癌原遺伝子ｐｌｋ１の下方制御に起因して癌細胞においてアポトーシスを誘導する。初期アポトーシス細胞の割合は、０．２μＭ用量のｓｉＰＬＫ１のｓｉＰＬＫ１−ＬＮＰで処理した細胞において高かった。ｓｉＬＵＣ−ＬＮＰで処理した細胞では細胞周期に影響がなかったことから、ＮＡＲ細胞へのｓｉＰＬＫ１の効率的な送達が示された。
【０２０７】
ＮＡＲ細胞における脂質１０及び１１のインビトロ遺伝子サイレンシング効果：ヒト卵巣癌細胞（ＮＡＲ細胞）を脂質１０又は脂質１１のいずれかの／ｓｉＰＬＫ１ナノ粒子で４８時間、異なるｓｉＲＮＡ濃度（０．１μＭ及び０．０５μＭ）で処理した。ｓｉＬＵＣ−ＬＮＰを陰性対照として用いた。アポトーシス細胞をＰＩ／アネキシンを用いたＦＡＣＳにより解析した。図４に示すように、脂質１０又は脂質１１のいずれかからなるｓｉＰＬＫ１−ＬＮＰは、効率的にＰＬＫ１遺伝子を下方制御した後、ＮＡＲ細胞においてアポトーシスを誘導する。
【０２０８】
ヒト卵巣癌細胞（ＯＶＣＡＲ８）をｓｉＰＬＫ１又はｓｉＬＵＣのいずれかと共に脂質１含有ＬＮＰで７２時間処理し、ＰＬＫ−１発現をｑＰＣＲによって測定した。図５に示すように、脂質１含有ｓｉＰＬＫ１−ＬＮＰは、ｄｌｉｎ−ｍｃ３−ｄｍａ含有ＬＮＰと比較して、ＰＬＫ１遺伝子を効率的に下方制御する。
【０２０９】
薬剤耐性ヒト卵巣癌細胞（ＮＡＲ）のスフェロイドを、脂質１からなるＬＮＰとｓｉＰＬＫ−１又はｓｉＬｕｃのいずれかで７２時間処理し、ＰＬＫ−１発現をｑＰＣＲによって測定した。スフェロイドはインビボ腫瘍を模倣する腫瘍細胞の３Ｄ培養物である。図６に示すように、脂質１含有ｓｉＰＬＫ１−ＬＮＰは、ｓｉＬＵＣ−ＬＮＰと比較してＰＬＫ１遺伝子を有意に下方制御しており、これはｓｉＲＮＡをＮＡＲスフェロイドに送達するための脂質１の効率を示している。
【０２１０】
ヒト結腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）を対照ｓｉＲＮＡ（方法を参照）を有するＬＮＰと共に７２時間インキュベートした。細胞生存率をＸＴＴアッセイにより測定した。脂質３８又は脂質５５のいずれかからなるＬＮＰの毒性を、Ｄｌｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡからなる至適基準ＬＮＰと比較する。図７に示すように、脂質３８又は脂質５５のいずれかからなるＬＮＰは、Ｄｌｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡからなるＬＮＰよりも用量依存的に毒性が低い。
【０２１１】
脂質３８及び５５のインビトロ遺伝子サイレンシング効果。ヒト多発性骨髄腫浮遊細胞（Ｕ２６６）をｓｉＰＬＫ１を異なる濃度で含むＬＮＰと共に４８時間インキュベートした。ＰＬＫ１発現はｑＰＣＲにより測定した。ＰＬＫ１−ｍＲＮＡレベルをＬＮＰ−対照ｓｉＲＮＡ処理細胞に対して正規化した。図８に示すように、ＰＬＫ１遺伝子は、Ｄｌｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ  ＬＮＰと比較して、脂質３８又は脂質５５のいずれかからなるｓｉＰＬＫ１−ＬＮＰで処理された細胞において効率的に下方制御された。
【０２１２】
多発性骨髄腫細胞の生存に対するＰＬＫ１の下方制御の効果：ヒト多発性骨髄腫浮遊細胞（Ｕ２６６）を、脂質３８又は５５のいずれかからなるｓｉＰＬＫ１−ＬＮＰ又はｓｉＣｔｌ−ＬＮＰと共に異なる濃度で４８時間インキュベートした。ＰＬＫ１の下方制御によって影響を受ける細胞生存率をＸＴＴアッセイによって測定した。図９に示すように、脂質３８又は脂質５５のいずれかからなるｓｉＰＬＫ１−ＬＮＰは、ＰＬＫ１遺伝子の効率的な下方制御に起因して、Ｄｌｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ  ＬＮＰと比較して細胞生存率に対して大きな影響を及ぼすが、ｓｉＣｔｌ−ＬＮＰは新しい脂質の安全な使用を示す細胞生存率に対して影響を及ぼさない。
【０２１３】
Ｂ細胞リンパ腫生存率に対するＰＬＫ１サイレンシングの効果：ヒトＢ細胞リンパ腫浮遊細胞（ＲＰＭＩ−８２２６）を、脂質３８又は５５のいずれかからなるｓｉＰＬＫ１−ＬＮＰ又はｓｉＣｔｌ−ＬＮＰと共に異なる濃度で４８時間インキュベートした。ＰＬＫ１の下方制御によって影響を受ける細胞生存率をＸＴＴアッセイによって測定した。図１０に示すように、脂質３８又は脂質５５のいずれかからなるｓｉＰＬＫ１−ＬＮＰはＰＬＫ１遺伝子の効率的な下方制御に起因してＢ細胞リンパ腫癌細胞の生存率に対して用量依存的な効果を示すが、ｓｉＣｔｌ−ＬＮＰは細胞生存率に影響を及ぼさない。
【０２１４】
細胞生存率に対するＰＬＫ１サイレンシングの効果：ヒト多発性骨髄腫浮遊細胞（ＭＭ１）を、脂質３８又は５５のいずれかからなるｓｉＰＬＫ１−ＬＮＰ又はｓｉＣｔｌ−ＬＮＰと共に異なる濃度で４８時間インキュベートした。ＰＬＫ１の下方制御によって影響を受ける細胞生存率をＸＴＴアッセイによって測定した。図１１に示すように、脂質３８又は脂質５５のいずれかからなるｓｉＰＬＫ１−ＬＮＰは、ＰＬＫ１の下方制御に起因して多発性骨髄腫癌細胞の生存率に対して用量依存的な効果を示すが、ｓｉＣｔｌ−ＬＮＰは細胞生存率に影響を及ぼさない。
【０２１５】
ｐＤＮＡのインビトロ発現：ヒト結腸癌細胞（ＨＣＴ１１６）をＬＮＰ−ＬＵＣ  ｐＤＮＡと共に異なる濃度で４８時間インキュベートした。ルシフェラーゼ発現はルミノメーターによって測定した。リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏ２０００）を陽性対照として使用した。ＬＮＰは、Ｃｈｏｌ、ＰＥＧ−ＤＭＧ等の他の共脂質と共に、脂質３８及び異なる量の共脂質ＤＯＰＥで構成されていた。図１２に示すように、脂質３８からなるＬＮＰ−ｐＤＮＡはｐＤＮＡを核に効率的に送達する。ルシフェラーゼ発現量は陽性対照ｌｉｐｏ２０００と同程度であった。
【０２１６】
ＨＥＫ２９３細胞におけるｐＤＮＡのインビトロ発現：ＨＥＫ細胞を、０．６ｎＭのｐＤＮＡ濃度でｍＫＡＴＥ−ｐＤＮＡが封入された脂質１又は脂質１０のいずれかからなるＬＮＰで処理した。７２時間後、ｍＫＡＴＥ発現をフローサイトメトリーによって解析した。図１３に示すように、脂質１又は脂質１０のいずれかからなるＬＮＰはｐＤＮＡを核に効率的に送達し、ｍＫＡＴＥ発現が観察されたが、Ｄｌｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ  ＬＮＰはｍＫＡＴＥ発現に対して如何なる効果も示さなかった。
【０２１７】
ＨＥＫ２９３細胞におけるｐＤＮＡの用量依存的発現：ＨＥＫ細胞を、異なる量のｐＤＮＡでｍＫＡＴＥ−ｐＤＮＡが封入された脂質１又は脂質１０のいずれかからなるＬＮＰで処理した。７２時間後、ｍＫＡＴＥ発現をフローサイトメトリーによって解析した。図１４Ａに示すように、脂質１からなるＬＮＰ−ｐＤＮＡは用量依存的な発現を示さなかったが、図１４Ｂに示すように、脂質１０含有ＬＮＰは用量依存的なｍＫＡＴＥの発現を示した。
【０２１８】
ｍＲＮＡのインビトロ送達：トランスフェクトしにくいマウスマクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）を、脂質３８又は脂質５４のいずれかで構成され、ｍＲＮＡの量が異なるルシフェラーゼｍＲＮＡで製剤化されたＬＮＰで処理した。１８時間後、ルシフェラーゼ発現をルミノメーターによって測定した。図１５に示すように、ルシフェラーゼ発現は、脂質５４−ＬＮＰと比較して脂質３８−ＬＮＰで効率的に処理された細胞において観察され、更に用量依存的発現が脂質３８含有ＬＮＰで観察された。
【０２１９】
筋細胞へのｍＲＮＡのインビボ送達：ルシフェラーゼｍＲＮＡで製剤化された脂質５４又は脂質３８のいずれかからなるＬＮＰをＣ５７ＢＬ６／ｊマウスに１ｍｇ／ｋｇ体重で筋肉内投与した。ルシフェラーゼ発現は、生物発光画像化システムＢｉｏｓｐａｃｅによって（ａ）筋肉内投与から８時間後、（ｂ）２４時間後に測定した。図１６に示すように、脂質３８又は脂質５４のいずれかからなる両方のＬＮＰについて、投与８時間後に有意な量のルシフェラーゼが観察された。ＬＮＰ投与２４時間後でも発現は依然として高く、これは、インビボでのｍＲＮＡの送達におけるこれらの脂質の効率を示す。
【０２２０】
肝臓へのｍＲＮＡのインビボ送達：ルシフェラーゼｍＲＮＡで製剤化された脂質５４又は脂質３８のいずれかからなるＬＮＰをＣ５７ＢＬ６／ｊマウスに１ｍｇ／ｋｇ体重で静脈内投与した。８時間後、ルシフェラーゼ発現を生物発光画像化システムＢｉｏｓｐａｃｅによって測定した。図１７に示すように、脂質５４からなるＬＮＰと比較して、脂質３８及びｍＲＮＡからなるＬＮＰで処理したマウスでは、有意な量のルシフェラーゼがマウス肝臓において示される。
【０２２１】
肝臓へのｍＲＮＡのインビボ送達：ルシフェラーゼｍＲＮＡで製剤化された脂質３８からなるＬＮＰをＣ５７ＢＬ６／ｊマウスに１ｍｇ／ｋｇ体重で静脈内投与した。投与から８時間及び２４時間後、ルシフェラーゼ発現を生物発光画像化システムＢｉｏｓｐａｃｅによって測定した。図１８に示すように、有意な量のルシフェラーゼ発現が肝臓において観察された。更に、ルシフェラーゼ発現は、２４時間後と比較して８時間後に高かった。
【０２２２】
図１９は、ＭＣ３と比較して非ヒト霊長類において肝臓毒性がないことを示す。カニクイザル（１群当たりｎ＝２、雄性）に対し、ｓｉＮＣ５を有するＭＣ３粒子（０．５ｍｇ／ｋｇ）及びｓｉＮＣ５を有する脂質３８ベースの粒子（０．５ｍｇ／ｋｇ）の単回静脈内投与（１ｍｇ／ｋｇ）を行った。投与から１時間後と２４時間に、血清を採取し、ＡＬＴ、ＡＳＴについて解析した（Ｒｏｃｈ  Ｃｏｂｒａ  Ａｕｔｏアナライザーによる）。各データ点は２匹の平均±ＳＥＭである。
【０２２３】
本発明を詳細に説明してきたが、当業者であれば多くの変更や修正が可能であることを理解するであろう。従って、本発明は詳細に説明された実施形態に限定されると解釈されるべきではなく、本発明の範囲及び概念は、添付の特許請求の範囲を参照することによってより容易に理解されるであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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