(57)【要約】  α−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードする核酸配列の中に機能喪失型変異を含むゲノムを含むコーヒー植物。コーヒー豆からの固形分の抽出性を高める方法も提供される。加えて、ソリュブルコーヒーの製造方法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードする核酸配列の中に機能喪失型変異を含むゲノムを含むコーヒー植物。
【請求項２】
コーヒー豆からの固形分の抽出性を高める方法であって、
（ａ）コーヒー植物細胞を、α−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードする核酸配列に向けられたＤＮＡ編集剤に供し、前記α−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードする前記核酸配列の中に機能喪失型変異を生じる工程と、
（ｂ）前記植物細胞から植物を再生する工程と
を備える方法。
【請求項３】
前記植物から豆を収穫する工程をさらに備える請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記変異がホモ接合型である請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の植物又は方法。
【請求項５】
前記変異がヘテロ接合型である請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の植物又は方法。
【請求項６】
α−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードする前記ゲノム配列に向けられたＤＮＡ編集剤で処理された請求項１若しくは請求項４に記載の植物又はその祖先。
【請求項７】
前記変異が、欠失、挿入、挿入／欠失（インデル）及び置換からなる群から選択される請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の植物又は方法。
【請求項８】
前記コーヒー植物が種アラビカコーヒーノキに由来する請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の植物又は方法。
【請求項９】
前記コーヒー植物が種ロブスタコーヒーノキに由来する請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の植物又は方法。
【請求項１０】
前記供することが、前記ＤＮＡ編集剤をコードする核酸構築物に対して行われる請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記供することが、ＤＮＡフリーの送達方法による請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
植物プロモーターに動作可能に連結されたコーヒーα−Ｄ−ガラクトシダーゼに向けられたＤＮＡ編集剤をコードする核酸配列を含む核酸構築物。
【請求項１３】
前記ＤＮＡ編集剤が、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓからなる群から選択されるＤＮＡ編集システムのものである請求項２から請求項９のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ編集剤がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを含むＤＮＡ編集システムのものである請求項２から請求項９のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項１５】
α−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードする前記核酸配列が配列番号４に示されるものである請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項１６】
α−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードする前記核酸配列が配列番号２〜配列番号４からなる群から選択される請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項１７】
α−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードする前記核酸配列が配列番号２に示されるものである請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項１８】
α−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードする前記核酸配列が配列番号３に示されるものである請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項１９】
前記ＤＮＡ編集剤が、前記α−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードする核酸配列のエクソン１、２、３、４及び／又は５内の核酸座標に向けられている請求項２、請求項４から請求項９、請求項１３及び請求項１４のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項２０】
前記ＤＮＡ編集剤が、配列番号３８〜配列番号４１からなる群から選択される核酸配列に少なくとも９９％同一である核酸配列を含む請求項２、請求項４から請求項９、請求項１３から請求項１４及び請求項１９のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項２１】
前記ＤＮＡ編集剤が、配列番号９〜配列番号１１及び配列番号３７からなる群から選択される核酸配列に少なくとも９９％同一である核酸配列を含む請求項２、請求項４から請求項９、請求項１３から請求項１４及び請求項１９のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項２２】
前記ＤＮＡ編集剤が、配列番号３８〜配列番号４１からなる群から選択される核酸配列を含む請求項２、請求項４から請求項９、請求項１３から請求項１４及び請求項１９のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項２３】
前記ＤＮＡ編集剤が、配列番号９〜配列番号１１及び配列番号３７からなる群から選択される複数の核酸配列を含む請求項２、請求項４から請求項９、請求項１３から請求項１４及び請求項１９のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項２４】
前記ＤＮＡ編集剤が、複数のα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子に向けられている請求項２、請求項４から請求項９、請求項１３から請求項１４及び請求項１９のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項２５】
前記複数のα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子が配列番号２〜配列番号４からなる群から選択される請求項２４に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項２６】
前記複数のα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子が配列番号３〜配列番号４からなる群から選択される請求項２４に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項２７】
前記複数のα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子が配列番号１〜配列番号２からなる群から選択される請求項２４に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項２８】
前記複数のα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子が配列番号１及び配列番号３からなる群から選択される請求項２４に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項２９】
請求項１、請求項４から請求項９、請求項１３から請求項２１のいずれか一項に記載の植物の植物部分。
【請求項３０】
豆である請求項２９に記載の植物部分。
【請求項３１】
乾燥している請求項３０に記載の豆。
【請求項３２】
コーヒー豆の製造方法であって、
（ａ）請求項１、請求項４から請求項９及び請求項１３から請求項２８のいずれか一項に記載の植物を成長させる工程と、
（ｂ）前記植物から豆を収穫する工程と
を備える方法。
【請求項３３】
請求項３０に記載の豆を抽出、脱水及び任意に焙煎に供する工程を備えるソリュブルコーヒーの製造方法。
【請求項３４】
請求項３０又は請求項３１に記載の豆のソリュブルコーヒー。
【請求項３５】
粉末形態にある請求項３４に記載のソリュブルコーヒー。
【請求項３６】
粒状形態にある請求項３４に記載のソリュブルコーヒー。
【請求項３７】
カフェインが取り除かれている請求項３４から請求項３６のいずれか一項に記載のソリュブルコーヒー。
【請求項３８】
請求項３０又は請求項３１に記載の豆のＤＮＡを含む請求項３４から請求項３７のいずれか一項に記載のソリュブルコーヒー。
【請求項３９】
前記植物が非遺伝子組換えのものである請求項１から請求項３２のいずれか一項に記載の植物又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態では、コーヒー豆からの固形分の抽出性を高めるための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コーヒーは、非常に重要な農作物であり、７００万トン超の生豆が約１１００万ヘクタールで毎年生産されている。経済的重要性の点で、コーヒーは石油に次ぐ第２位である。
【０００３】
コーヒーのこれまでの育種は、栽培者の収入を増やすことを目指しており、この栽培者は主に小規模農家である。コーヒーの育種は、コーヒーの木のバイオリズムに起因して時間がかかる。１つの子孫から結果物の最初の作物を収穫するのに少なくとも３年はかかり、収量評価には５年が必要である。２つの主要な種、アラビカコーヒーノキ（自家受粉性、異質四倍体；２ｎ＝４４、全世界の生産量の６８％）及びロブスタコーヒーノキ（自家不稔性、二倍体２ｎ＝２２）は、すべての熱帯地域で栽培されている。アラビカ株は、従来から純粋な系統選択に基づいており、それゆえ様々な植物病に対して感受性がある。アラビカでは、エリート変種に導入するために望まれる形質は、主に病虫害耐性及び耐病性である。他方、ロブスタの育種は、異なる遺伝群の遺伝子型の間の雑種の作出又は改良されたクローンの選択によって収量、技術的品質及び官能特性を向上させることに、より明確に向けられている。
【０００４】
他の多年性の作物と同様に、コーヒーは幼齢期が長く、主に耐性又は品質に関連する新しい形質の導入のための従来の育種は、２５〜３５年かかる可能性がある。これがコーヒー改良についての主な欠点であり、それゆえ、遺伝子操作なら、有望的にこの期間を縮めることができよう。
【０００５】
しかしながら、遺伝子改変／組換え（ＧＭ）作物は、環境及び食品安全性への潜在的な関連リスクのため、消費者の受け入れついての不支持及び欠如の高まりに直面している。
【０００６】
さらなる背景技術としては以下が挙げられる。
欧州特許第１４３６４０２号明細書、
米国特許出願公開第２００４０１９９９４３号明細書、
米国特許第６，３２９，１９１号明細書、
Ｚｈｕ及びＧｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｇｅｎｅ  １４０（１９９４）、２２７−２３１、
米国特許第７，２３８，８５８号明細書、
Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ２０１７  ＰｌｏｓＯｎｅ  １２（２）：ｅ０１７２６３０、
Ｃｈｉａｎｇら、２０１６．ＳＰ１，２，３．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１６  Ａｐｒ  １５；６：２４３５６。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】欧州特許第１４３６４０２号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４０１９９９４３号明細書
【特許文献３】米国特許第６，３２９，１９１号明細書
【特許文献４】米国特許第７，２３８，８５８号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｚｈｕ及びＧｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｇｅｎｅ  １４０（１９９４）、２２７−２３１
【非特許文献２】Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ２０１７  ＰｌｏｓＯｎｅ  １２（２）：ｅ０１７２６３０
【非特許文献３】Ｃｈｉａｎｇら、２０１６．ＳＰ１，２，３．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１６  Ａｐｒ  １５；６：２４３５６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、α−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードする核酸配列の中に機能喪失型変異を含むゲノムを含むコーヒー植物が提供される。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、コーヒー豆からの固形分の抽出性を高める方法であって、
（ａ）コーヒー植物細胞を、α−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードする核酸配列に向けられたＤＮＡ編集剤に供し、このα−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードする核酸配列の中に機能喪失型変異を生じる工程と、
（ｂ）上記植物細胞から植物を再生する工程と
を備える方法が提供される。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、当該方法は、上記植物から豆を収穫する工程をさらに備える。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記変異はホモ接合型である。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記変異はヘテロ接合型である。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、α−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードするゲノム配列に向けられたＤＮＡ編集剤で処理された本明細書に記載される植物又はその祖先が提供される。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記変異は、欠失、挿入、挿入／欠失（インデル）及び置換からなる群から選択される。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記コーヒー植物は種アラビカコーヒーノキに由来する。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記コーヒー植物は種ロブスタコーヒーノキに由来する。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記供することは、上記ＤＮＡ編集剤をコードする核酸構築物に対して行われる。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記供することは、ＤＮＡフリーの送達方法による。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、植物プロモーターに動作可能に連結されたコーヒーα−Ｄ−ガラクトシダーゼに向けられたＤＮＡ編集剤をコードする核酸配列を含む核酸構築物が提供される。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓからなる群から選択されるＤＮＡ編集システムのものである。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを含むＤＮＡ編集システムのものである。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記α−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードする核酸配列は配列番号４に示されるものである。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記α−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードする核酸配列は配列番号２〜配列番号４からなる群から選択される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記α−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードする核酸配列は配列番号２に示されるものである。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記α−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードする核酸配列は配列番号３に示されるものである。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、上記α−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードする核酸配列のエクソン１、２、３、４及び／又は５内の核酸座標に向けられている。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、配列番号３８〜配列番号４１からなる群から選択される核酸配列に少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、配列番号９〜配列番号１１及び配列番号３７からなる群から選択される核酸配列に少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、配列番号３８〜配列番号４１からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、配列番号９〜配列番号１１及び配列番号３７からなる群から選択される複数の核酸配列を含む。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は複数のα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子に向けられている。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記複数のα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子は配列番号２〜配列番号４からなる群から選択される。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記複数のα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子は配列番号３〜配列番号４からなる群から選択される。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記複数のα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子は配列番号１〜配列番号２からなる群から選択される。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記複数のα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子は配列番号１及び配列番号３からなる群から選択される。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、本明細書に記載される植物の植物部分が提供される。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記植物部分は豆である。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記豆は乾燥している。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、コーヒー豆の製造方法であって、
（ａ）本明細書に記載される植物を成長させる工程と、
（ｂ）上記植物から豆を収穫する工程と
を備える方法が提供される。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、本明細書に記載される豆を抽出、脱水及び任意に焙煎に供する工程を備えるソリュブルコーヒーの製造方法が提供される。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、本明細書に記載される豆のソリュブルコーヒーが提供される。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、このソリュブルコーヒーは粉末形態にある。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、当該ソリュブルコーヒーは粒状形態にある。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、当該ソリュブルコーヒーはカフェインが取り除かれている。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、当該ソリュブルコーヒーは、上記豆のＤＮＡを含む。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記植物は非遺伝子組換えのものである。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、α−Ｄ−ガラクトシダーゼタンパク質をコードするゲノム核酸配列に導入された機能喪失型変異を含むコーヒー植物又はその部分であって、この変異が、この機能喪失型変異を欠くコーヒー植物と比べてこのタンパク質のレベルの低下又は活性の低下を生じるコーヒー植物又はその部分が提供される。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記植物又はその部分は、１以上のα−Ｄ−ガラクトシダーゼタンパク質をコードする１以上のゲノム核酸配列に導入された１以上の非天然の機能喪失型変異を含み、上記１以上の変異は各々、この機能喪失型変異を欠くコーヒー植物と比べてこのタンパク質のレベルの低下又は活性の低下を生じる。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記非天然の機能喪失型変異は、ＤＮＡ編集剤を用いて導入されたものである。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記植物は、上記ＤＮＡ編集剤をコードする導入遺伝子、選択マーカー若しくはレポーターをコードする導入遺伝子を含まないか、又は上記ＤＮＡ編集剤、選択マーカー若しくはレポーターのいずれをコードする導入遺伝子も含まない。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓからなる群から選択されるＤＮＡ編集システムを含んでいた。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓであった。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記変異はホモ接合性である。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記変異は、欠失、挿入、挿入／欠失（インデル）、及び置換からなる群から選択される。
【００５６】
特段の記載がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び／又は科学用語は、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と類似又は等価な方法及び材料を本発明の実施形態の実施又は試験で使用することができるが、例示的な方法及び／又は材料が以降で記載される。矛盾する場合、定義を含めこの特許明細書が優先することになる。加えて、材料、方法及び例は説明のためのものにすぎず、必ずしも限定を意図したものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態が、添付の図面を参照して、単なる例として本明細書に記載される。ここで図面を詳細に具体的に参照するにあたり、示される特定のものは、例として、そして本発明の実施形態の説明のための記述のために示されているということが強調される。これに関して、図面を参照した記載により、本発明の実施形態をどのように実施してよいかが当業者に明らかになる。
【００５８】
【図１】図１は、ゲノム編集イベントを含む細胞の選択方法の一実施形態のフロー図である。
【図２】図２は、図１に従う、レポーターセンサー及びＦＡＣＳを使用するコーヒープロトプラストにおけるゲノム編集活性の定量を示す。プロトプラストは、各々ＧＦＰ＋ｍＣｈｅｒｒｙ及びＧＦＰを標的とする異なるｓｇＲＮＡを発現する異なる種類のセンサー構築物（１〜４）を用いてトランスフェクションされた。このＧＦＰマーカーのポジティブ編集は、ｓｇＲＮＡを有しない対照と比べたＧＦＰシグナルの低下を測定することにより評価された。トランスフェクションから４日後に、細胞は、緑色プロトプラスト対赤色プロトプラストの比を測定することにより、効率的なゲノム編集について分析された。ＧＦＰセンサーのゲノム編集は、緑色／赤色プロトプラスト比の低下により測定された。ＧＦＰを標的とする特異的なｓｇＲＮＡを用いたすべてのセンサー構築物は、コーヒープロトプラスト中の対照プラスミドと比べて、緑色対赤色の低下を示した。
【図３】図３Ａ〜図３Ｃは、コーヒーにおけるターゲティングのためのα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子の特定を示す。コーヒーゲノム内のα  Ｄガラクトシダーゼ遺伝子は、Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉら、２００５、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００５  Ｏｃｔ−Ｎｏｖ；４３（１０−１１）：９０９−２０からの受入番号ＡＪ８８７７１２．１を有する遺伝子をｂｌａｓｔ検索することにより特定された。図３Ａは、ｂｌａｓｔ検索からの結果を示し、α  Ｄガラクトシダーゼの３つの完全な遺伝子がゲノム内に見出された（配列番号２〜配列番号４）。図３Ｂは、特定された遺伝子のＡＪ８８７７１２．１に対するパーセント同一性マトリクスを示す。図３Ｃは、コーヒーゲノムデータベースからの各遺伝子のＲＰＫＭデータを示す。
【図４】図４Ａ〜図４Ｅは、コーヒーの遺伝子α−Ｄ−ガラクトシダーゼＣｃ０４＿ｇ１４２８０の特性解析及びゲノム編集分析を示す。（図４Ａ）は、この遺伝子の主な特徴を説明するポンチ絵である。番号付けされた黄色のボックスはエクソンを示し、順方向及び逆方向の矢印は、標的領域の増幅のために使用されたプライマーを表し、ｓｇＲＮＡ１及びｓｇＲＮＡ２は、ｓｇＲＮＡが設計されたこの遺伝子に沿った部位を示す。（図４Ｂ）Ｃｃ０４＿ｇ１４２８０は、図４Ａに示すようにｓｇＲＮＡ１領域及びｓｇＲＮＡ２領域に隣接するプライマー「順方向」（ＴＣＣＡＧＴＣＣＴＡＣＴＴＴＡＴＧＡＴＴＧＡＡＡＡ、配列番号４２）及び「逆方向２」（ＴＴＴＣＣＴＴＧＧＧＧＣＴＴＡＴＧＴＴＧ、配列番号４３））を用いて、トランスフェクションの６日後にトランスフェクションされソートされたコーヒープロトプラストから抽出されたＤＮＡを鋳型として使用して増幅された（図４Ｂ）。試料は、以下のプラスミドを用いてトランスフェクションされた：（１）ｐＤＫ２０２９（対照、ｓｇＲＮＡなし）、（２）ｐＤＫ２０３０［図４Ａに示すとおりＣｃ０４＿ｇ１４２８０（配列番号４）を標的とするｓｇＲＮＡ１（配列番号９）及びｓｇＲＮＡ２（配列番号１０）］並びに（３）ＰＣＲ陰性対照（ＤＮＡなし）。このアガロースゲルは、約２５０ｂｐの標的遺伝子において欠失が起こったことを示す。（図４Ｃ）は、図４Ｂのカラム１及びカラム２のクローニングされたＰＣＲ産物の配列比較を示す。ＰＣＲ産物１からの配列はＷＴと同じであったが、ＰＣＲ産物２からのすべての５つのコロニーは、２つのｓｇＲＮＡ標的部位の間、ＰＡＭ部位から３ｂｐ上流に位置する２３９ｂｐの欠失を示した（赤色の楕円を指す青色矢印）。（図４Ｄ）は、クローン１（ターゲティングｓｇＲＮＡがないプラスミドｐＤＫ２０２９を用いてトランスフェクションされた試料由来）及び２（プラスミドｐＤＫ２０３０を用いてトランスフェクションされた試料由来）の６フレーム翻訳の最長ペプチド配列である。上記２３９ｂｐ欠失は、赤色のボックスで示すように早期終止コドンを誘導した。（図４Ｅ）は、２３９ｂｐ欠失を明確に示す図４Ｄの２つのペプチド配列のアミノ酸配列比較である。
【図５】図５Ａ〜図５Ｃは、コーヒーの推定上のα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子Ｃｃ０２＿ｇ０５４９０の特性解析及びゲノム編集分析を示す。（図５Ａ）は、この遺伝子の主な特徴を説明するポンチ絵である。黄色のボックスはエクソンを表し、水平方向矢印は、標的領域の増幅のために使用されたプライマーを表し、ｓｇＲＮＡ１７１及びｓｇＲＮＡ１７２は、ｓｇＲＮＡが設計されたこの遺伝子に沿った部位を示す。（図８Ｂ）ネステッドＰＣＲが使用され、図５Ａに示すようにｓｇＲＮＡ１７１領域及びｓｇＲＮＡ１７２領域に隣接するプライマー１１８〜１２１を用いて、トランスフェクションの６日後にトランスフェクションされソートされたコーヒープロトプラストから抽出されたＤＮＡを鋳型として使用してＣｃ０２＿ｇ０５４９０が増幅された。試料は、以下のプラスミドを用いてトランスフェクションされた：（１）ｐＤＫ２０３１（対照、Ｃｃ０４＿ｇ１４２８０をユニークに標的とするｓｇＲＮＡ）、（２）ｐＤＫ２０３２［図５Ａに示すとおりＣｃ０２＿ｇ０５４９０（配列番号３）を標的とするｓｇＲＮＡ１７１（配列番号１０）］、（３）ｐＤＫ２０３３［Ｃｃ０２＿ｇ０５４９０（配列番号３）を標的とするｓｇＲＮＡ１７２（配列番号４１）］及び（４）ＰＣＲ陰性対照（ＤＮＡなし）。このアガロースゲルは、標的領域の増幅を示す。（図５Ｃ）は、図５Ｂのカラム２及びカラム３のクローニングされたＰＣＲ産物の配列比較を示し、いくつかの小さいインデルが示されている。ｓｇＲＮＡの位置は緑色の楕円内に示されている。
【図６】図６Ａ〜Ｃは、コーヒーの推定上のα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子Ｃｃ１１＿ｇ００３３０の特性解析及びゲノム編集分析を示す。（図６Ａ）は、この遺伝子の主な特徴を説明するポンチ絵である。黄色のボックスはエクソンを表し、水平方向矢印は、標的領域の増幅のために使用されたプライマーを表し、ｓｇＲＮＡ１６９及びｓｇＲＮＡ１７０は、ｓｇＲＮＡが設計されたこの遺伝子に沿った部位を示す。（図４Ｂ）ネステッドＰＣＲが使用され、パネルＡに示すようにｓｇＲＮＡ１６９領域及びｓｇＲＮＡ１７０領域に隣接するプライマー１１４〜１１７を用いて、トランスフェクションの６日後にトランスフェクションされソートされたコーヒープロトプラストから抽出されたＤＮＡを鋳型として使用してＣｃ１１＿ｇ００３３０が増幅された。試料は、以下のプラスミドを用いてトランスフェクションされた：（１）ｐＤＫ２０３１（対照、Ｃｃ０４＿ｇ１４２８０をユニークに標的とするｓｇＲＮＡ）、（２）ｐＤＫ２０３２［図４Ａに示すとおりＣｃ１１＿ｇ００３３０（配列番号２）を標的とするｓｇＲＮＡ１６９（配列番号３８）］、（３）ｐＤＫ２０３３［Ｃｃ１１＿ｇ００３３０（配列番号２）を標的とするｓｇＲＮＡ１７０（配列番号３９）］及び（４）ＰＣＲ陰性対照（ＤＮＡなし）。このアガロースゲルは、標的領域の増幅を示す。（図６Ｃ）は、図６Ｂのカラム３のクローニングされたＰＣＲ産物の配列比較を示し、いくつかの小さいインデルが示されている。ｓｇＲＮＡの位置は緑色の楕円内に示されている。
【図７】図７Ａ〜Ｅ  コーヒープロトプラストの再生。図７Ａ。新しく単離したコーヒープロトプラスト；図７Ｂ。最初の細胞分裂がプロトプラスト単離の４８時間後に起こる；図７Ｃ。胚形成細胞（ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ）のマイクロカルスが２ヶ月後に発生する；図７Ｄ。１〜２ｍｍの胚発生カルスがマイクロカルスから発生する；図７Ｅ。胚形成細胞からの胚発生（赤色正方形）。
【図８】図８Ａ〜Ｂは、トランスフェクションされたコーヒープロトプラストの再生を示す。図８Ａ。トランスフェクションの３ヶ月後のトランスフェクションされたプロトプラストから得られた胚発生カルスが、ＭＳ塩及びビタミンを含有する再生培地に移された；図８Ｂ。最初の胚が３〜４週間後に再生された。
【図９Ａ】図９Ａは、本発明のいくつかの実施形態に係るα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子の配列、ｓｇＲＮＡ結合部位の配列及びｓｇＲＮＡ配列を示す。赤色のハイライトは、標的配列に沿ったｓｇＲＮＡの位置を表し、灰色のハイライトはＰＡＭ配列を表し、深緑色のハイライトは対立遺伝子の変化を表し、薄緑色の文字はエクソンを表す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に係るα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子の配列、ｓｇＲＮＡ結合部位の配列及びｓｇＲＮＡ配列を示す。赤色のハイライトは、標的配列に沿ったｓｇＲＮＡの位置を表し、灰色のハイライトはＰＡＭ配列を表し、深緑色のハイライトは対立遺伝子の変化を表し、薄緑色の文字はエクソンを表す
【図９Ｃ】図９Ｃは、本発明のいくつかの実施形態に係るα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子の配列、ｓｇＲＮＡ結合部位の配列及びｓｇＲＮＡ配列を示す。赤色のハイライトは、標的配列に沿ったｓｇＲＮＡの位置を表し、灰色のハイライトはＰＡＭ配列を表し、深緑色のハイライトは対立遺伝子の変化を表し、薄緑色の文字はエクソンを表す
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本発明は、そのいくつかの実施形態では、コーヒー豆からの固形分の抽出性を高めるための組成物及び方法に関する。
【００６０】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において以下の記載に示され又は実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されないということを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、又は種々のやり方で実行又は実施することができる。
【００６１】
コーヒー生豆では、多糖画分は総重量の半分を占める。これらの多糖の中で、マンナンが５０％を占める。マンナンはβ結合マンナン鎖からなり、このマンナン鎖はガラクトース残基で置換されてガラクトマンナンを与えることができる。ガラクトマンナンに対するマンナンの比は、このポリマーの水溶性に影響を及ぼす。マンナンに対してより多くのガラクトマンナンが存在するほど、そのポリマーはより可溶性である。コーヒー中の酵素α−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性は、ガラクトマンナンからガラクトース残基を除去してマンナンを形成し、ポリマーの水溶性を低下させることに関与すると報告されている。
【００６２】
本明細書に記載される実施形態は、コーヒー豆からの水溶部を増やすための、ゲノムレベルでのα−Ｄ−ガラクトシダーゼ発現の阻害に関する。それゆえ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子は、ゲノム編集システム、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるゲノム改変についての標的とされてきた。
【００６３】
本明細書中で説明されるように、本発明者らは、コーヒープロトプラストにおけるゲノム編集システム、及びコーヒー植物に効率的に再生されうる非遺伝子組換えのプロトプラストを生じるその後の選択を確立した（図１及び図２を参照）。本発明者らは、編集の標的としての３つのα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子をさらに特定し、それらのうちの２つは、Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉら、２００５、前出、由来のＡＪ８８７７１２．１に対して８０％未満の同一性の遠縁のホモログである。発現分析により、とりわけ、コーヒー豆中でのガラクトマンナンからのガラクトース残基の除去においてそれらの役割を強調するＣｃ０４＿ｇ１４２８０についての生物学的に関連する発現のパターンが明らかになった。すべての３つの遺伝子は、コーヒー豆におけるこれらの遺伝子の発現の喪失をもたらす非遺伝子組換えのゲノム編集（図４Ａ〜Ｅから図６Ａ〜Ｃを参照）を生じるために、個々に又は同時に標的とされた。これらのゲノム編集イベントを含むプロトプラストは、成長した植物を生じるように再生に供された。
【００６４】
よって、本結果は、コーヒーにおけるα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子の非遺伝子組換えのゲノム編集を初めて示し、これは、コーヒー豆からの水溶部を増大させるために利用することができる。
【００６５】
このように、本発明の一態様によれば、コーヒー植物細胞又はコーヒー植物のゲノムの改変方法であって、コーヒーのゲノムの中のα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子に機能喪失型変異（１又は複数）を誘導するように、コーヒーの細胞又は植物のゲノムをＤＮＡ編集剤に供する工程を備える方法が提供される。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「コーヒー」は、アカネ科、コーヒー属の植物を指す。多くのコーヒー種が存在する。本発明の実施形態は、２つの主要な商業的コーヒー種、アラビカコーヒーとして知られるアラビカコーヒーノキ（Ｃ．ａｒａｂｉｃａ）、及びロブスタコーヒー（Ｃ．ｒｏｂｕｓｔａ）として知られるロブスタコーヒーノキに言及する場合がある。世界のコーヒー豆市場の３％を構成するリベリカコーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ  ｌｉｂｅｒｉｃａ  Ｂｕｌｌ．ｅｘ  Ｈｉｅｒｎ）も本発明で想定されている。Ｃｏｆｆｅａ  ａｒｎｏｌｄｉａｎａ  Ｄｅ  Ｗｉｌｄ又はより一般的にはリベリアコーヒー（Ｌｉｂｅｒｉａｎ  ｃｏｆｆｅｅ）としても知られる。アラビカ種由来のコーヒーは一般に「ブラジル（Ｂｒａｚｉｌｓ）」とも呼ばれ、又はアラビカ種由来のコーヒーは「アザーマイルド（ｏｔｈｅｒ  ｍｉｌｄｓ）」に分類される。ブラジルコーヒーはブラジル原産であり、「アザーマイルド」は他の高級コーヒー生産国で栽培されており、この生産国は、コロンビア、グァテマラ、スマトラ、インドネシア、コスタリカ、メキシコ、米国（ハワイ）、エルサルバドル、ペルー、ケニア、エチオピア及びジャマイカを含むと一般に認識されている。ロブスタコーヒーノキ、すなわちロブスタは、通常、アラビカコーヒー用の低コストの増量剤として使用される。これらのロブスタコーヒーは、通常、西アフリカ及び中央アフリカ、インド、東南アジア、インドネシアの低地で、そしてブラジルでも栽培される。地理的領域は、コーヒー栽培プロセスが同一のコーヒー実生を利用し栽培環境が類似しているコーヒー栽培領域を指すということは、当業者はわかるであろう。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「植物」は、植物全体（１又は複数）、接ぎ木された植物（穂木）、これらの植物及び植物部分の祖先及び子孫を指し、種子、果実、苗条、茎、根（塊茎を含む）、台木、若枝、並びに植物の細胞、組織及び器官を含む。
【００６８】
特定の実施形態によれば、上記植物部分は豆である。
【００６９】
「子実」、「種子」、又は「豆」は、顕花植物の繁殖単位であって、別のそのような植物に発生することができる繁殖単位を指す。本明細書で、とりわけコーヒー植物に関して使用する場合、これらの用語は同意語として互換的に使用される。
【００７０】
特定の実施形態によれば、上記細胞は胚細胞である。
【００７１】
特定の実施形態によれば、上記細胞は体細胞である。
【００７２】
上記植物は、懸濁培養液、プロトプラスト、胚、成長点領域、カルス組織、葉、配偶体、胞子体、花粉、及び小胞子を含めたいずれの形態にあってもよい。
【００７３】
特定の実施形態によれば、上記植物部分はＤＮＡを含む。
【００７４】
特定の実施形態によれば、上記コーヒー植物は、コーヒー育種系統、より好ましくはエリート系統のものである。
【００７５】
特定の実施形態によれば、上記コーヒー植物はエリート系統のものである。
【００７６】
特定の実施形態によれば、上記コーヒー植物は純粋種系統のものである。
【００７７】
特定の実施形態によれば、上記コーヒー植物は、コーヒー変種又は育種対象の生殖質（ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｇｅｒｍｐｌａｓｍ）のものである。
【００７８】
用語「育種系統」は、本明細書で使用する場合、野生の変種又は在来種とは異なり、商業的に価値があるか又は農学的に望ましい特徴を有する、栽培されるコーヒーの系統を指す。この用語は、エリート育種系統又はエリート系統への言及を含み、このエリート育種系統又はエリート系統は、商業用のＦ１雑種を生産するために使用される実質的にホモ接合の系統の、通常近交系の植物を表す。エリート育種系統は、多数の農学的に望ましい形質を含むより優れた農学的性能のための育種及び選択により得られる。エリート植物は、エリート系統由来のあらゆる植物である。より優れた農学的性能は、本明細書中に規定される農学的に望ましい形質の所望の組み合わせを指し、その農学的に望ましい形質の大部分、好ましくはすべてが、非エリート育種系統と比べてエリート育種系統において向上していることが望ましい。エリート育種系統は、実質的にホモ接合性であり、好ましくは近交系である。
【００７９】
用語「エリート系統」は、本明細書で使用する場合、より優れた農学的性能のための育種及び選択から得られたあらゆる系統を指す。エリート系統は、好ましくは、複数の、好ましくは少なくとも３、４、５、６又はこれ以上の本明細書に規定される望ましい農学的形質（のための遺伝子）を有する系統である。
【００８０】
用語「栽培品種」及び「変種」は、本明細書中で互換的に使用され、商業化される目的、例えば、自身による消費用又は商業化用に農産物を生産するために農業者及び栽培者によって使用される目的で育種、例えば、交雑及び選択によって意図的に開発された植物を表す。用語「育種対象の生殖質」は、「野生」状態以外の生物の状態を有する植物を表し、この「野生」状態は、植物又は系統種の本来の栽培されていない状態、又は天然状態を意味する。
【００８１】
用語「育種対象の生殖質」としては、半自然、半野生、雑草、伝統的栽培品種、在来種、育種材料、研究材料、育種用系統、合成集団、雑種、創始株（ｆｏｕｎｄｅｒ  ｓｔｏｃｋ）／基礎集団、近交系（雑種栽培品種の親）、分離集団、変異体／遺伝材料（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｏｃｋ）、市場クラス及び後生的な／改良された栽培品種が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用する場合、用語「純粋種」、「純系」又は「近交系」は、互換的であり、反復的な自家受粉及び／又は戻し交配によって得られる実質的にホモ接合性の植物又は植物系統を指す。
【００８２】
包括的なものではないが、コーヒー変種のリストが本明細書に提示される。
【００８３】
ワイルドコーヒー（Ｗｉｌｄ  Ｃｏｆｆｅｅ）：これは、エチオピア原産のコーヒー種である「Ｃｏｆｆｅａ  ｒａｃｅｍｏｓａ  Ｌｏｕｒ」の一般名である。
【００８４】
バロンゴトーレッド（Ｂａｒｏｎ  Ｇｏｔｏ  Ｒｅｄ）：「カツアイ・レッド（Ｃａｔｕａｉ  Ｒｅｄ）」に非常に類似したコーヒー豆栽培品種。これは、ハワイのいくつかの場所で栽培されている。
【００８５】
ブルーマウンテン（Ｂｌｕｅ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ）：Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ  Ｌ．’Ｂｌｕｅ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ’。ジャマイカコーヒー（Ｊａｍａｉｃａｎ  ｃｏｆｆｅａ）又はケニアコーヒー（Ｋｅｎｙａｎ  ｃｏｆｆｅａ）としても一般に知られる。これは、ジャマイカ原産であるが、今ではハワイ、パプアニューギニア及びケニアで栽培されている有名なアラビカ栽培品種である。これは、高品質の風味（ｃｕｐ  ｆｌａｖｏｒ）を備えた最高のコーヒーである。これは、木の実のような芳香、さわやかな酸度及び独特のビーフブリオンのような香りを特徴とする。
【００８６】
ブルボン（Ｂｏｕｒｂｏｎ）：Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ  Ｌ．’Ｂｏｕｒｂｏｎ’。マダガスカル東方のインド洋に位置する、今ではレユニオンと呼ばれるフランス領のブルボン島で最初に栽培されたアラビカコーヒーノキの植物品種又は栽培品種。
【００８７】
ブラジルコーヒー（Ｂｒａｚｉｌｉａｎ  Ｃｏｆｆｅａ）：Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ  Ｌ．’Ｍｕｎｄｏ  Ｎｏｖｏ’。「ブルボン（Ｂｏｕｒｂｏｎ）」及び「ティピカ（Ｔｙｐｉｃａ）変種から交雑して作出されたコーヒー植物を特定するために使用される一般名。
【００８８】
カラコル（Ｃａｒａｃｏｌ）／カラコルリ（Ｃａｒａｃｏｌｉ）：「貝殻」を意味するスペイン語の「Ｃａｒａｃｏｌｉｌｌｏ」からとられ、ピーベリーコーヒー豆を指す。
【００８９】
カティモー（Ｃａｔｉｍｏｒ）：カツーラ（Ｃａｔｕｒｒａ）及びヒブリド・デ・チモー（Ｈｉｂｒｉｄｏ  ｄｅ  Ｔｉｍｏｒ）の系統を交配して１９５９年にポルトガルで開発されたコーヒー豆栽培品種である。これは、コーヒー葉さび病（Ｈｅｍｉｌｅｉａ  ｖａｓｔａｔｒｉｘ）に抵抗力がある。より新しい栽培品種選択物は、生産量に優れているが平均的品質である。
【００９０】
カツアイ（Ｃａｔｕａｉ）：ムンド・ノボ（Ｍｕｎｄｏ  Ｎｏｖｏ）及びカツーラ・アラビカ（Ｃａｔｕｒｒａ  Ａｒａｂｉｃａ）栽培品種の交配種である。高生産量で知られており、黄色（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ  Ｌ．’Ｃａｔｕａｉ  Ａｍａｒｅｌｏ’）又は赤のサクランボ色（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ  Ｌ．’Ｃａｔｕａｉ  Ｖｅｒｍｅｌｈｏ’）を特徴とする。
【００９１】
カツーラ（Ｃａｔｕｒｒａ）：比較的最近開発されたアラビカコーヒーノキ種の亜種で、一般的に成熟が早く、より多くの生産量を与え、ブルボン（Ｂｏｕｒｂｏｎ）やティピカ（Ｔｙｐｉｃａ）のような伝統的な「古いアラビカ」の変種よりも、病気への耐性が強い。
【００９２】
コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａｎａ）：コロンビア原産の栽培品種。これは、生命力が強く、生産量は多いが、味わい（ｃｕｐ  ｑｕａｌｉｔｙ）は平均的である。
【００９３】
コンジェンシス（Ｃｏｎｇｅｎｃｉｓ）：Ｃｏｆｆｅａ  Ｃｏｎｇｅｎｃｉｓ  −  コンゴの貯蔵所に由来するコーヒー豆の栽培品種で、良質のコーヒーを生産するが、収量が低い。商業的な栽培には好適ではない。
【００９４】
デウェブレイルト（ＤｅｗｅｖｒｅｉＩｔ）：Ｃｏｆｆｅａ  ＤｅｗｅｖｒｅｉＩｔ。ベルギー領コンゴの森で自生している所を発見されたコーヒー豆の栽培品種。商業的な栽培に好適ではないと考えられる。
【００９５】
ディボウスキールト（ＤｙｂｏｗｓｋｉｉＩｔ）：Ｃｏｆｆｅａ  ＤｙｂｏｗｓｋｉｉＩｔ。このコーヒー豆栽培品種は、アフリカの熱帯収束帯のエウコフィア（Ｅｕｃｏｆｆｅａ）の群に由来する。商業的な栽培に好適ではないと考えられている。
【００９６】
エクセルサ（Ｅｘｃｅｌｓａ）：Ｃｏｆｆｅａ  Ｅｘｃｅｌｓａ  −  １９０４に発見されたコーヒー豆栽培品種。生来、病気への耐性があり、高収量をもたらす。成熟すると、アラビカ種に類似した香ばしく心地よい味わいを与えうる。
【００９７】
グアダルペ（Ｇｕａｄａｌｕｐｅ）：アラビカコーヒーノキの栽培品種で、現在ハワイで評価が行われている。
【００９８】
グァテマラ（Ｇｕａｔｅｍａｌａ（ｎ））：アラビカコーヒーノキの栽培品種で、ハワイの他の地域で評価が行われている。
【００９９】
ヒブリド・デ・チモール（Ｈｉｂｒｉｄｏ  ｄｅ  Ｔｉｍｏｒ）：これは、アラビカ及びロブスタの自然雑種である栽培品種である。４４の染色体を有している点で、アラビカコーヒーに似ている。
【０１００】
イカツ（Ｉｃａｔｕ）：「アラビカ＆ロブスタ交配種」をアラビカ栽培品種のモンド・ノボ（Ｍｕｎｄｏ  Ｎｏｖｏ）及びカツーラ（Ｃａｔｕｒｒａ）と交配した栽培品種。
【０１０１】
インタースペシフィックハイブリッド（Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｓ）：コーヒー植物種の雑種であり、次の種を含む：イカツ（ブラジル原産；ブルボン／ＭＮとロブスタの交配種）、Ｓ２８２８（インド原産；アラビカとリベリア（Ｌｉｂｅｒｉａ）の交配種）、アラブスタ（Ａｒａｂｕｓｔａ）（象牙海岸原産；アラビカとロブスタの交配種）。
【０１０２】
「Ｋ７」、「ＳＬ６」、「ＳＬ２６」、「Ｈ６６」、「ＫＰ５３２」：有望な新種の栽培品種で、ヘミレイア（Ｈｅｍｉｌｅｉａ）のようなコーヒー植物病の様々な変種に対してより耐性がある。
【０１０３】
ケント（Ｋｅｎｔ）：インドのマイソール（Ｍｙｓｏｒｅ）でもともと開発され、東アフリカで栽培されているアラビカコーヒー豆の栽培品種。高収量をもたらす植物であり、「コーヒーさび」病には耐性があるが、コーヒーの実の病気には非常に罹りやすい。より耐性がある栽培品種である「Ｓ．２８８」、「Ｓ．３３３」及び「Ｓ．７９５」によって徐々に置き換えられている。
【０１０４】
コウイロウ（Ｋｏｕｉｌｌｏｕ）：ロブスタコーヒーノキ（Ｒｏｂｕｓｔａ）の変種の名前で、この名前は、マダガスカルのガボンの川に由来する。
【０１０５】
ローリナ（Ｌａｕｒｉｎａ）：干ばつに耐性がある栽培品種で、良質の味わいを有しているが、収量は平均的なものにすぎない。
【０１０６】
マラゴジペ（Ｍａｒａｇｏｇｉｐｅ／Ｍａｒａｇｏｇｙｐｅ）：Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ  Ｌ．’Ｍａｒａｇｏｐｉｐｅ’。「象の豆」としても知られる。アラビカコーヒーノキ（ティピカ（Ｔｙｐｉｃａ））の突然変異種で、ブラジルのバイーア（Ｂａｈｉａ）州のマラゴジペ（Ｍａｒａｇｏｇｙｐｅ）郡で最初に発見された（１８８４）。
【０１０７】
モーリシアナ（Ｍａｕｒｉｔｉａｎａ）：Ｃｏｆｆｅａ  Ｍａｕｒｉｔｉａｎａ。苦い味わいを生み出すコーヒー豆栽培品種。商業的な栽培に好適ではないと考えられている。
【０１０８】
モンド・ノボ（Ｍｕｎｄｏ  Ｎｏｖｏ）：「アラビカ種」と「ブルボン種」との間の交配種としてブラジルで生まれた自然雑種。非常に生命力がある植物で、３，５００〜５，５００フィート（１，０７０ｍ〜１，５２５ｍ）でも十分に成長し、病気への耐性があり、生産量が多い。他の栽培品種よりも成長が遅い傾向がある。
【０１０９】
ネオ・アーノルディアナ（Ｎｅｏ−Ａｒｎｏｌｄｉａｎａ）：Ｃｏｆｆｅａ  Ｎｅｏ−Ａｒｎｏｌｄｉａｎａは、その高収量のためコンゴの数か所で栽培されているコーヒー豆栽培品種である。商業的な栽培に好適ではないと考えられている。
【０１１０】
ンガンダ（Ｎｇａｎｄａ）：Ｃｏｆｆｅａ  ｃａｎｅｐｈｏｒａ  Ｐｉｅｒｒｅ  ｅｘ  Ａ．Ｆｒｏｅｈｎｅｒ  ’Ｎｇａｎｄａ’。コーヒー植物カネフォラ種の真っ直ぐ立ったものがロブスタと呼ばれるのに対し、カネフォラ種の広がる型はンガンダ（Ｎｇａｎｄａ）又はコウイロウとしても知られている。
【０１１１】
パカ（Ｐａｃａ）：エルサルバドルの農学者によって開発されたもので、アラビカのこの栽培品種は、低木でブルボンよりも収穫量が多く、ラテンアメリカでは人気があるものの、多くの人が味わいの品質が劣ると考えている。
【０１１２】
パカマラ（Ｐａｃａｍａｒａ）：低収量で大型豆の品種マラゴジペと、より高収量のパカとの交配によって作出されたアラビカ栽培品種。１９６０年代にエルサルバドルで開発されたもので、この豆は平均的なコーヒー豆よりも約７５％大きい。
【０１１３】
パチェコリス（Ｐａｃｈｅ  Ｃｏｌｉｓ）：栽培品種カツーラとパチェコマムとの間の交配種であるアラビカ栽培品種。もともと、マタケスクインタ（Ｍａｔａｑｕｅｓｃｕｉｎｔｌａ）のグァテマラを育てる農場で成長しているのを発見された。
【０１１４】
パチェコマム（Ｐａｃｈｅ  Ｃｏｍｕｍ）：グァテマラのサンタローザで開発されたティピカ（アラビカ）の栽培品種の突然変異。適応力に優れ、口当たりがよく、多少風味に欠ける。
【０１１５】
プリーンガー（Ｐｒｅａｎｇｅｒ）：コーヒー植物栽培品種で、現在ハワイで評価が行われている。
【０１１６】
プレトリア（Ｐｒｅｔｏｒｉａ）：コーヒー植物栽培品種で、現在ハワイで評価が行われている。
【０１１７】
パーパレスント（Ｐｕｒｐｕｒｅｓｃｅｎｓ）：珍しい紫色の葉を特徴とするコーヒー植物栽培品種。
【０１１８】
ラセモサ（Ｒａｃｅｍｏｓａ）：Ｃｏｆｆｅａ  Ｒａｃｅｍｏｓａ  −  コーヒー豆栽培品種であり、乾季に葉を落とし、雨季の始まりに再び葉を付ける。一般的には味が劣ると評価されており、商業的な栽培に好適ではないと考えられている。
【０１１９】
ルイル（Ｒｕｉｒｕ）１１：新しい小粒の雑種で、ケニアのルイル（Ｒｕｉｒｕ）にあるコーヒー研究所（Ｃｏｆｆｅｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｔａｔｉｏｎ）で開発され、１９８５年から市場に出回っている。ルイル１１は、コーヒーの実の病気及びコーヒー葉さび病の両方に耐性がある。また、高収量で、通常の密度の２倍で栽培するのにも好適である。
【０１２０】
サンラモン（Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ）：Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ  Ｌ．’Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ’。アラビカ種ティピカの小型種。樹高は低く、風に強く、高収量で、干ばつに耐性がある。
【０１２１】
チコ（Ｔｉｃｏ）：中央アメリカで栽培されるアラビカコーヒーノキの栽培品種。
【０１２２】
チモールハイブリッド（Ｔｉｍｏｒ  Ｈｙｂｒｉｄ）：１９４０年代にチモールで発見されたコーヒーの木の変種で、アラビカ種とロブスタ種が自然状態で交配している。
【０１２３】
ティピカ（Ｔｙｐｉｃａ）：正確な植物名はＣｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ  Ｌ．’Ｔｙｐｉｃａ’。エチオピア原産のアラビカコーヒーノキのコーヒー品種である。Ｖａｒ  Ｔｙｐｉｃａは、すべてのコーヒー変種の中で最も古く、最もよく知られており、いまだ世界のコーヒー生産の大半を構成している。最良のラテンアメリカのコーヒーのうちのいくつかはティピカ材料から作られたものである。低収量生産という制約を、優れた味わいで埋め合わせている。
【０１２４】
ビラロボス（Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ）：アラビカコーヒーノキの栽培品種で、栽培品種「サンラモン」に由来し、コスタリカで移植に成功した。
【０１２５】
本明細書で使用する場合、「ゲノムを改変する（こと）」は、コーヒーのα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子に少なくとも１つの変異を導入することを指す。いくつかの実施形態によれば、改変（すること）は、コーヒーのα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子の各対立遺伝子に変異を導入することを指す。少なくともいくつかの実施形態によれば、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子の２つの対立遺伝子上の変異はホモ接合型である。
【０１２６】
いくつかの実施形態によれば、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子の２つの対立遺伝子上の変異は非相補的である。
【０１２７】
本明細書で使用する場合、「α−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子」は、ＥＣ３．２．１．２２に示されるα−Ｄ−ガラクトシダーゼ酵素をコードする遺伝子を指す。例えば、遺伝子Ｃｃ１１＿ｇ００３３０（配列番号２）、Ｃｃ０２＿ｇ０５４９０（配列番号３）及びＣｃ０４＿ｇ１４２８０（配列番号４）から産生される酵素は、受入番号ＡＪ８７７９１２（配列番号５）に類似のＣ．Ｃａｎｅｐｈｏｒａ及び受入番号ＡＪ８７７９１１（配列番号６）に類似のＣ．ａｒａｂｉｃａに存在する。
【０１２８】
特定の実施形態によれば、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子はＣｃ０４＿ｇ１４２８０（配列番号４）である。
【０１２９】
例示のｓｇＲＮＡ配列あるいはこれらの組み合わせが下記表Ａに提示される。
【０１３０】
【表１】
2020522279.tif 000002
【０１３１】
上記遺伝子のうちの各々のものの天然に存在する機能的ホモログであって、例えば、上記の遺伝子に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を提示し上で定義されたとおりのα−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を有するものも想定される。
【０１３２】
本明細書で使用する場合、「配列同一性」又は「同一性」又は２つの核酸配列若しくはポリペプチド配列に関して本明細書で使用する文字通りの等価物は、整列させた（配列比較した）ときに同じである２つの配列の中の残基への言及を含む。タンパク質に言及する際に配列同一性のパーセントが使用される場合、同一ではない残基位置は保存的アミノ酸置換によって異なっていることが多く、保存的アミノ酸置換ではアミノ酸残基が類似の化学特性（例えば電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基に置換され、それゆえ分子の機能的特性を変化させないということが認識される。配列が保存的置換において異なる場合、パーセント配列同一性は、置換の保存的性質について補正するために上向きに調整されてもよい。このような保存的置換によって異なる配列は「配列類似性」又は「類似性」を有すると考えられる。この調整を行うための手段は当業者にとって周知である。典型的には、これは保存的置換を完全ミスマッチよりはむしろ部分ミスマッチとして点数化し、これによりパーセント配列同一性を大きい値にすることを伴う。このように、例えば、同一のアミノ酸がスコア１を与えられ、非保存的置換がスコア０を与えられる場合、保存的置換は０と１の間のスコアが与えられる。保存的置換の点数化は、例えばＨｅｎｉｋｏｆｆ  Ｓ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ  ＪＧ．のアルゴリズム［Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９２、８９（２２）：１０９１５−９］に従って算出される。
【０１３３】
同一性は、例えば国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＮソフトウェアを含むいずれかの相同性比較ソフトウェアを使用して、例えばデフォルトパラメータを使用することにより決定することができる。
【０１３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記同一性は、全体的な同一性、すなわち、本発明の核酸配列全体にわたる同一性であり、その一部分にわたる同一性ではない。
【０１３５】
α−Ｄ−ガラクトシダーゼ酵素は、植物種子貯蔵組織又は成熟に貯蔵されたガラクトマンナンからα−１，６結合ガラクトース単位を放出することができる。換言すれば、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性は、ガラクトマンナン多糖にα−１，６結合しているガラクトース残基を除去する能力を有し、この除去はそのポリマーの溶解性の低下を引き起こす。
【０１３６】
特定の実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、標的配列α−Ｄ−ガラクトシダーゼを改変し、「オフターゲット」活性を欠く、すなわちコーヒーゲノムの中の他の配列を改変しない。
【０１３７】
特定の実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、コーヒーゲノム中の非必須遺伝子に対する「オフターゲット活性」を備える。
【０１３８】
非必須は、上記ＤＮＡ編集剤を用いて改変されたときに、農業的に価値ある態様（例えば、カフェイン含有量、香り、バイオマス、収量、生物的／非生物的なストレス耐性等）で標的ゲノムの表現型に影響を及ぼさない遺伝子を指す。
【０１３９】
オフターゲット作用は、当該技術分野で周知であり本明細書に記載される方法を使用してアッセイすることができる。
【０１４０】
本明細書で使用する場合、「機能喪失型」変異は、α−Ｄ−ガラクトシダーゼが不溶性マンナンからα−１，６結合ガラクトース単位を加水分解する能力の低下（すなわち、機能障害）又は加水分解できなくなることを生じるゲノム異常を指す。本明細書で使用する場合、「能力の低下」は、その機能喪失型変異を欠く野生型酵素のα−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性（すなわち、α−１，６結合ガラクトース単位、マンナン分岐の加水分解）と比べて低下したα−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を指す。特定の実施形態によれば、この活性の低下は、同じアッセイ条件下での野生型酵素の活性と比べて、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はこれ以上にもなる。α−Ｇａｌ活性は、基質ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｐＮＧＰ）を用いて分光光度法で検出することができる。特定の実施形態によれば、反応混合物は、１ｍｌ最終体積までのＭｃＩｌｖａｉｎバッファ（クエン酸１００ｍＭ−Ｎａ２ＨＰＯ４  ２００ｍＭ、ｐＨ６．５）中に２００μｌ  ｐＮＧＰ  １００ｍＭを含有し、必要に応じて酵素抽出物を伴う。反応物は２６℃に維持され、酵素の添加で開始される。一体積の反応混合物が４体積の停止液（Ｎａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３  １００ｍＭ、ｐＨ１０．２）に添加され、吸収がλ＝４０５ｎｍで読み取られる。ニトロフェニルの出現は、モル吸光係数ε＝１８３００（ｐＨ１０．２に特定的）を使用して算出され、ｎｋａｔ  ｍｇ−１タンパク質に変換される（Ｍａｒｒａｃｉｎｉら、２００５．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  α−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｃｏｆｆｅｅ  ｂｅａｎｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４３：９０９−９２０）
【０１４１】
特定の実施形態によれば、上記機能喪失型変異はα−Ｄ−ガラクトシダーゼのｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を生じない。
【０１４２】
特定の実施形態によれば、上記機能喪失型変異は、マンナン分岐を支持することができないα−Ｄ−ガラクトシダーゼタンパク質の発現を生じる。
【０１４３】
特定の実施形態によれば、上記機能喪失型変異は、欠失、挿入、挿入−欠失（インデル）、逆位、置換及びこれらの組み合わせ（例えば、欠失及び置換、例えば欠失及びＳＮＰ）からなる群から選択される。
【０１４４】
特定の実施形態によれば、上記機能喪失型変異は、１Ｋｂ未満又は０．１Ｋｂ未満である。
【０１４５】
特定の実施形態によれば、「機能喪失型」変異は、何らかの機能的α−Ｄ−ガラクトシダーゼペプチドの産生を妨害する、コード配列におけるフレームシフトを引き起こすように、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子の５’にあってもよい。あるいは、及び一例として、この変異は、上記タンパク質の発現を生じない未成熟終止コドン又はナンセンス変異を引き起こしてもよい。
【０１４６】
特定の実施形態によれば、この「機能喪失型」変異は、マンナン分岐を促進する（マンナン分岐に寄与する）ことができないままのα−Ｄ−ガラクトシダーゼ発現産物、すなわち、不活性タンパク質又は上記の触媒活性が低下したタンパク質、の産生を可能にするα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子の中のいずれか（例えば、第１エクソン）にある。この遺伝子の調節エレメント、例えばプロモーター、スプライス部位及び長い散在反復配列（ｔｈｅ  ｌｉｎｅ）における変異も本明細書に提示される。
【０１４７】
Ｃｃ０４＿ｇ１４２８０内の示唆される位置の例。
【０１４８】
ｓｇＲＮＡ  ペア１−エクソン１
ＧＧＴＧＡＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＡＧＧ（配列番号７）；
ＧＣＴＴＧＧＴＣＴＡＡＣＡＣＣＴＣＣＧＡＴＧＧ（配列番号８）；
ｓｇＲＮＡ  ペア２−エクソン２及びエクソン３にわたる
ＡＴＴＴＣＴＣＡＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＡＡＣＧＧ（エクソン２）（配列番号９。ｓｇＲＮＡ１２２とも呼ばれる）；
ＴＣＡＡＡＧＧＧＧＣＴＴＧＣＴＧＣＡＣＴＧＧＧ（エクソン３）（配列番号１０。ｓｇＲＮＡ１２３とも呼ばれる）；
ペア３−エクソン５
ＧＡＴＧＧＧＡＡＴＧＴＴＧＡＡＣＣＴＴＴＡＧＧ（配列番号１１。ｓｇＲＮＡ１２４とも呼ばれる）；
ＣＡＧＡＧＴＡＡＡＴＴＣＣＡＡＧＣＴＴＴＡＧＧ（配列番号１２）
【０１４９】
特定の実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０及び配列番号４１（１６９、１７０、１７１、１７２）からなる群から選択される核酸配列に少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。
【０１５０】
特定の実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０及び配列番号４１（１６９〜１７２）からなる群から選択される核酸配列に少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。
【０１５１】
特定の実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、配列番号９〜配列番号１１及び配列番号３７からなる群から選択される核酸配列に少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。
【０１５２】
特定の実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、配列番号３８〜配列番号４１からなる群から選択される核酸配列を含む。
【０１５３】
特定の実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、配列番号９〜配列番号１１及び配列番号３７からなる群から選択される複数の核酸配列を含む。
【０１５４】
上述のように、コーヒー植物は、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子に機能喪失型変異を含む。
【０１５５】
特定の実施形態によれば、上記変異はホモ接合性である。
【０１５６】
特定の実施形態によれば、上記変異はヘテロ接合性である。
【０１５７】
一態様によれば、コーヒー豆からの固形分の抽出性を高める方法であって、
（ａ）コーヒー植物細胞を、α−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードする核酸配列に向けられたＤＮＡ編集剤に供し、このα−Ｄ−ガラクトシダーゼをコードする核酸配列の中に機能低下型変異又は機能喪失型変異を生じる工程と、
（ｂ）上記植物細胞から植物を再生する工程と
を備える方法が提供される。
【０１５８】
特定の実施形態によれば、当該方法は、上記植物から豆を収穫する工程をさらに備える。
【０１５９】
本発明で想定される抽出可能な固形分の例は下記表１〜２に提示されており、そのうちのいくつかは水で抽出可能である。
【０１６０】
【表２】
2020522279.tif 000003
【０１６１】
本明細書で使用する場合、「固形分の抽出性」は、当該技術分野で周知の方法（後述の実施例の節を参照）によってアッセイされる場合に、上記機能喪失型変異を含まない同じ遺伝的背景のコーヒー植物の固形分抽出性と比べて、ゲノムにその機能喪失型変異を有するコーヒー植物の豆からの固形分抽出性が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％又はさらには９５％、向上していることを指す。
【０１６２】
例えば、溶解性は、ガラクトマンナンを測定することにより決定することができる。ガラクトマンナン含有量の増加は、ガラクトマンナン対マンナン比の上昇、それゆえ溶解性の向上の指標である。ガラクトマンナンは、β−マンナナーゼ、α−ガラクトシダーゼ及びβ−ガラクトースデヒドロゲナーゼが関与する逐次的な酵素反応並びにＤ−ガラクトン酸及びＮＡＤＨの放出によって間接的に測定することができる。ＮＡＤＨの放出は、分光光度法により３４０ｎｍでアッセイされる。
【０１６３】
以降は、核酸変更を目的の遺伝子に導入するために使用される方法及びＤＮＡ編集剤、並びにそれを実行するために本開示の特定の実施形態に従って使用することができる薬剤の種々の非限定的な例の説明である。
【０１６４】
遺伝子操作されたエンドヌクレアーゼを使用するゲノム編集  −  このアプローチは、典型的にはゲノム中の所望の場所（１又は複数）で二本鎖を切断し、特定の二本鎖切断を作り出すために人工的に遺伝子操作されたヌクレアーゼを使用する逆遺伝学的方法を指し、この二本鎖切断は、次に相同組換え（ＨＲ）又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）等の細胞の内因的過程により修復される。ＮＨＥＪは二本鎖切断のＤＮＡ末端に直接結合するが、ＨＲは、失われたＤＮＡ配列を切断部位で再生するための鋳型（すなわち、Ｓ期の間に形成される姉妹染色分体）として相同的なドナー配列を利用する。特定のヌクレオチド改変をゲノムＤＮＡに導入するために、所望の配列を含有するドナーＤＮＡ修復鋳型がＨＲの際に存在する必要がある（外因的に提供される一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡ）。
【０１６５】
ゲノム編集は、従来からの制限エンドヌクレアーゼを使用して実施することができない。なぜなら、多くの制限酵素はＤＮＡ上の数個の塩基対をその標的として認識し、これらの配列がゲノムにわたって多くの場所で見出されることになることが多く、所望の場所に限定されない複数の切断部位を生じるからである。この課題を克服し部位特異的な単鎖切断又は二本鎖切断を作り出すために、いくつかの別個のクラスのヌクレアーゼがこれまでに発見され生物工学的に扱われてきた。これらとしては、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが挙げられる。
【０１６６】
メガヌクレアーゼ  −  メガヌクレアーゼは、一般に４つのファミリーに分類される：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスファミリー及びＨＮＨファミリー。これらのファミリーは、触媒活性及び認識配列に影響を及ぼす構造モチーフを特徴とする。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーは、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの１コピー又は２コピーのいずれかを有することを特徴とする。これら４ファミリーのメガヌクレアーゼは、保存された構造要素に関して、従ってＤＮＡ認識配列特異性及び触媒活性に関して互いに大きく隔てられている。メガヌクレアーゼは、微生物種において一般に見出され、非常に長い認識配列（＞１４ｂｐ）を有するというユニークな特性を有し、このためメガヌクレアーゼは、天然に、所望の場所での切断に非常に特異的なものになっている。
【０１６７】
これは、ゲノム編集において部位特異的二本鎖切断を行うために活用することができる。当業者はこれらの天然に存在するメガヌクレアーゼを使用することができるが、しかしながら、このような天然に存在するメガヌクレアーゼの数は限られている。この課題を克服するべく、ユニークな配列を認識するメガヌクレアーゼ変異体を作り出すために、変異生成及び高スループットスクリーニング方法が使用されてきた。例えば、種々のメガヌクレアーゼが融合され、新しい配列を認識するハイブリッド酵素が作り出されてきた。
【０１６８】
あるいは、メガヌクレアーゼのＤＮＡ相互作用性のアミノ酸を、配列特異的メガヌクレアーゼを設計するために変更することができる（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号明細書を参照）。メガヌクレアーゼは、例えば、Ｃｅｒｔｏ、ＭＴら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１２）９：０７３−９７５；米国特許第８，３０４，２２２号明細書；米国特許第８，０２１，８６７号明細書；米国特許第８，１１９，３８１号明細書；米国特許第８，１２４，３６９号明細書；米国特許第８，１２９，１３４号明細書；米国特許第８，１３３，６９７号明細書；米国特許第８，１４３，０１５号明細書；米国特許第８，１４３，０１６号明細書；米国特許第８，１４８，０９８号明細書；又は米国特許第８，１６３，５１４号明細書に記載されている方法を使用して設計することができ、これらの各々の内容は、参照によりその全体を本明細書に援用する。あるいは、部位特異的な切断特性を有するメガヌクレアーを、市販の技術、例えばプレシジョン・バイオサイエンシーズ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＤｉｒｅｃｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｅｄｉｔｏｒ（商標）ゲノム編集技術を使用して得ることができる。
【０１６９】
ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮ  −  遺伝子操作されたヌクレアーゼの２つの別個のクラス、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ともに、標的の二本鎖切断を生成することに有効であることが明らかになっている（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、２０１０；Ｋｉｍら、１９９６；Ｌｉら、２０１１；Ｍａｈｆｏｕｚら、２０１１；Ｍｉｌｌｅｒら、２０１０）。
【０１７０】
基本的に、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの制限エンドヌクレアーゼ技術は、特定のＤＮＡ結合ドメイン（それぞれ、一系列のジンクフィンガードメイン又はＴＡＬＥリピート）に連結されている非特異的なＤＮＡ切断酵素を利用する。典型的には、ＤＮＡ認識部位及び切断部位が互いに隔てられている制限酵素が選択される。切断性部分が分離され、次いでＤＮＡ結合ドメインに連結され、これにより所望の配列に対して非常に高い特異性を有するエンドヌクレアーゼが得られる。このような特性を有する例示的な制限酵素はＦｏｋＩである。加えて、ＦｏｋＩは、ヌクレアーゼ活性を有するには二量化を必要とするという利点を有し、これは、各ヌクレアーゼパートナーがユニークなＤＮＡ配列を認識するため特異性が劇的に増すことを意味する。この効果を増強するため、ヘテロ二量体として機能できるだけであり増大した触媒活性を有するＦｏｋＩヌクレアーゼが遺伝子操作された。ヘテロ二量体機能性のヌクレアーゼは、望ましくないホモ二量体活性の可能性を回避し、従って二本鎖切断の特異性を高める。
【０１７１】
このように、例えば特定部位を標的にするために、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮは、ヌクレアーゼ対として構築され、この対の各メンバーは、標的部位で隣接する配列に結合するように設計される。細胞における一過性発現の際に、ヌクレアーゼはその標的部位に結合し、ＦｏｋＩドメインはヘテロ二量化して二本鎖切断を作り出す。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路によるこれらの二本鎖切断の修復は、小さい欠失又は小さい配列挿入を生じることが多い。ＮＨＥＪによってなされる各修復はユニークであるので、単一のヌクレアーゼ対の使用により、標的部位に一定範囲の異なる欠失を有する対立遺伝子の系列を生成することができる。
【０１７２】
一般に、ＮＨＥＪは比較的正確であり（ヒトの細胞のＤＳＢの約８５％が検出から約３０分以内にＮＨＥＪによって修復される）、遺伝子編集では、ＮＨＥＪのエラーが頼られる。というのも、修復が正確であるとき、ヌクレアーゼは、修復産物が変異原性であり認識／切断部位／ＰＡＭモチーフが消失／変異されるまで、又は一過性に導入されたヌクレアーゼがもはや存在しなくなるまで切断を続けることになるからである。
【０１７３】
欠失は、典型的には長さが数塩基対〜数百塩基対のいずれの範囲にも及ぶが、より大きい欠失が、２対のヌクレアーゼを同時に使用することにより、細胞培養液中で成功裏に生成されている（Ｃａｒｌｓｏｎら、２０１２；Ｌｅｅら、２０１０）。加えて、標的の領域に対する相同性を有するＤＮＡの断片（フラグメント）が上記ヌクレアーゼ対と併用されて導入されるとき、上記二本鎖切断は相同組換え（ＨＲ）を経由して修復され、特定の改変が生成されうる（Ｌｉら、２０１１；Ｍｉｌｌｅｒら、２０１０；Ｕｒｎｏｖら、２００５）。
【０１７４】
ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの両方のヌクレアーゼ部分は類似の特性を有するが、これらの遺伝子操作されたヌクレアーゼの間の差は、それらのＤＮＡ認識ペプチドにある。ＺＦＮは、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーに依存し、ＴＡＬＥＮはＴＡＬＥに依存する。これらのＤＮＡ認識ペプチドドメインはともに、それらドメインが組み合わせでそれらのタンパク質に天然に見出されるという特徴を有する。Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーは、通常３ｂｐ離れたリピートで見出され、様々な核酸相互作用性のタンパク質で多様な組み合わせで見出される。他方、ＴＡＬＥは、リピートにおいて上記アミノ酸と認識されたヌクレオチド対との間の１対１の認識比で見出される。ジンクフィンガー及びＴＡＬＥはともに繰り返しパターンで起こるため、異なる組み合わせを試して、実に様々な配列特異性を作り出すことができる。部位特異的ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼを作製するためのアプローチとしては、例えば、とりわけ、モジュールアセンブリ（三塩基配列と関係づけられたジンクフィンガーが一列につなぎ合わされ、必要とされる配列をカバーするようにする）、ＯＰＥＮ（ペプチドドメイン対三塩基ヌクレオチドの低ストリンジェンシー選抜、及びその後の細菌系におけるペプチド組み合わせ対最終の標的の高ストリンジェンシー選抜）、及びジンクフィンガーライブラリーの細菌ワンハイブリッドスクリーニングが挙げられる。ＺＦＮは、例えばＳａｎｇａｍｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）（リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）、カリフォルニア州）から商業的に設計及び入手することもできる。
【０１７５】
ＴＡＬＥＮを設計及び入手するための方法は、例えばＲｅｙｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１２  Ｍａｙ；３０（５）：４６０−５；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１１）２９：１４３−１４８；Ｃｅｒｍａｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１）３９（１２）：ｅ８２及びＺｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１１）２９（２）：１４９−５３に記載されている。Ｍｏｊｏ  Ｈａｎｄと名付けられた最近開発されたウェブベースのプログラムが、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃによって、ゲノム編集への応用のためのＴＡＬ及びＴＡＬＥＮ構築物を設計するために導入された（ｗｗｗ．ｔａｌｅｎｄｅｓｉｇｎ．ｏｒｇによってアクセスすることができる）。ＴＡＬＥＮは、例えば、Ｓａｎｇａｍｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）（リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）、カリフォルニア州）から商業的に設計及び入手することもできる。
【０１７６】
Ｔ−ＧＥＥシステム（ＴａｒｇｅｔＧｅｎｅ’ｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  Ｅｎｇｉｎｅ）  −  ポリペプチド部分及び特異性付与核酸（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＳＣＮＡ）を含有する、インビボで、標的細胞中で会合し所定の標的核酸配列と相互作用することができるプログラム可能な核タンパク質分子複合体が提供されている。このプログラム可能な核タンパク質分子複合体は、標的核酸配列内の標的部位を特異的に改変及び／若しくは編集すること、並びに／又はその標的核酸配列の機能を改変することができる。核タンパク質組成物は、（ａ）キメラポリペプチドをコードし、（ｉ）標的部位を改変することができる機能ドメイン、及び（ｉｉ）特異性付与核酸と相互作用することができる連結ドメインを含むポリヌクレオチド分子と、（ｂ）（ｉ）標的部位に隣接している標的核酸の領域に相補的なヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）上記ポリペプチドの連結ドメインに特異的に結合することができる認識領域を含む特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）とを含む。この組成物は、特異性付与核酸及び標的核酸の塩基対形成を通しての標的核酸に対する分子複合体の高い特異性及び結合能力を用いて、所定の核酸配列標的を正確に、信頼性高くかつ費用効率よく改変することを可能にする。この組成物は、遺伝毒性がより低く、そのアセンブリがモジュール式であり、カスタマイズを要しない単一のプラットフォームを利用し、専門の中核施設の外での独立の使用にとって実用的であり、かつより短い開発期間及び低減されたコストを有する。
【０１７７】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム（本明細書で「ＣＲＩＳＰＲ」とも呼ばれる）  −  多くの細菌及び古細菌は、侵入するファージ及びプラスミドの核酸を分解することができる内在性のＲＮＡベースの適応免疫系を含有する。これらのシステムは、ＲＮＡ成分を産生するｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ：クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し）ヌクレオチド配列と、タンパク質成分をコードするＣＲＩＳＰＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）遺伝子とからなる。このＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、特定のウイルス及びプラスミドのＤＮＡに対して相同性を有する短鎖を含有し、Ｃａｓヌクレアーゼを対応する病原体の相補的核酸を分解するように導くガイドとして作用する。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿レンサ球菌）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの研究により、下記の３つの成分がＲＮＡ／タンパク質複合体を形成し、一緒になれば配列特異的ヌクレアーゼ活性には十分であることが示された：Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、標的配列に対して相同性を有する２０塩基対を含有するｃｒＲＮＡ、及びトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）（Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７：８１６−８２１）。
【０１７８】
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの融合物から構成される合成のキメラのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、Ｃａｓ９を、ｃｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ標的をインビトロで開裂させるように導くことができるということがさらに実証された。合成ｇＲＮＡと併用したＣａｓ９の一過性発現は、様々な異なる種において標的とされた二本鎖切断を生成するために使用することができるということも実証された（Ｃｈｏら、２０１３；Ｃｏｎｇら、２０１３；ＤｉＣａｒｌｏら、２０１３；Ｈｗａｎｇら、２０１３ａ，ｂ；Ｊｉｎｅｋら、２０１３；Ｍａｌｉら、２０１３）。
【０１７９】
ゲノム編集のためのＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓシステムは、２つの明確に異なる成分、ｇＲＮＡ及びエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９を含有する。
【０１８０】
ｇＲＮＡは、典型的には、標的相同配列（ｃｒＲＮＡ）と、ｃｒＲＮＡを単一のキメラ転写物の中でＣａｓ９ヌクレアーゼに連結する内在性の細菌ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との組み合わせをコードする２０ヌクレオチド配列である。このｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、ｇＲＮＡ配列と相補的ゲノムＤＮＡとの間の塩基対形成により標的配列に動員される。Ｃａｓ９の結合の成功のために、ゲノム標的配列は、標的配列直下に正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ  Ａｄｊａｃｅｎｔ  Ｍｏｔｉｆ：ＰＡＭ）配列も含有する必要がある。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の結合はＣａｓ９をゲノム標的配列に局在化させ、これによりＣａｓ９はＤＮＡの両方の鎖を切断して二本鎖切断を引き起こすことができる。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮを用いる場合のように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって生成されたこの二本鎖切断は、ＨＲ（相同組換え）又はＮＨＥＪ（非相同末端結合）により修復されることが可能で、ＤＮＡ修復の間の特異的配列改変を受けやすい。
【０１８１】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、２つの機能ドメイン、ＲｕｖＣ及びＨＮＨ、を有し、これらは各々異なるＤＮＡ鎖を切断する。これらのドメインの両方が活性であるとき、Ｃａｓ９は、ゲノムＤＮＡにおいて二本鎖切断を引き起こす。
【０１８２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの顕著な優位点は、合成ｇＲＮＡを簡単に作り出すことができることと合わせたこのシステムの高効率である。これは、異なるゲノム部位での改変物を標的にする、及び／又は同じ部位の異なる改変物を標的にするように容易に改変されることが可能なシステムを作り出す。加えて、複数の遺伝子の同時ターゲティングを可能にするプロトコルが確立されている。変異を有する細胞の大部分は、標的とされた遺伝子において二対立遺伝子変異を提示する。
【０１８３】
しかしながら、ｇＲＮＡ配列とゲノムＤＮＡ標的配列との間の塩基対形成相互作用におけるみかけの柔軟性により、標的配列に対する不完全なマッチもＣａｓ９によって切断されることが可能になる。
【０１８４】
単一の不活性触媒ドメイン、ＲｕｖＣドメイン又はＨＮＨドメイン、のいずれかを含有するＣａｓ９酵素の改変型は「ニッカーゼ」と呼ばれる。ただ１つの活性なヌクレアーゼドメインを有するため、Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的ＤＮＡの一本の鎖だけを切断し、単鎖切断又は「ニック」を生じる。単鎖切断、又はニック、は、ＰＡＲＰ（センサー）及びＸＲＣＣ１／ＬＩＧ  ＩＩＩ複合体（ライゲーション）等（これらに限定されない）のタンパク質が関与する単鎖切断修復機構によりたいてい修復される。単鎖切断（ＳＳＢ）がトポイソメラーゼＩ毒（ポイズン）により、又は天然に存在するＳＳＢでＰＡＲＰ１を捕捉する薬物により生成されれば、これらは存在し続けるであろうし、その細胞がＳ期に入り、複製フォークがそのようなＳＳＢに遭遇すれば、このようなＳＳＢは末端を１つしか持たないＤＳＢ（ｓｉｎｇｌｅ  ｅｎｄｅｄ  ＤＳＢ）になり、これはＨＲによって修復できるだけである。しかしながら、Ｃａｓ９ニッカーゼによって導入された２つの近接する反対鎖のニックは、「ダブルニック」ＣＲＩＳＰＲシステムと呼ばれることが多いものにおいて二本鎖切断として処理される。基本的に非平行ＤＳＢであるダブルニックは、他のＤＳＢのように、遺伝子標的に対する所望の効果、ドナー配列の存在、及び細胞周期の期（ＨＲは存在量が非常に低く、細胞周期のＳ期及びＧ２期においてのみ起こることができる）に応じてＨＲ又はＮＨＥＪによって修復されることが可能である。このように、特異性及び低下したオフターゲット作用が非常に重要である場合、ごく近傍にありゲノムＤＮＡの反対鎖上にある複数の標的配列を用いて２つのｇＲＮＡを設計することによりダブルニックを作り出すためにＣａｓ９ニッカーゼを使用することで、オフターゲット作用が低減されるであろう。というのも、いずれのｇＲＮＡ単独では、ゲノムＤＮＡを変えることが不可能ではないとしてもこれらのイベントの可能性が高くないニックを生じるであろうからである。
【０１８５】
２つの不活性触媒ドメインを含有するＣａｓ９酵素の改変型（ｄｅａｄ  Ｃａｓ９、又はｄＣａｓ９）は、ｇＲＮＡ特異性に基づいてＤＮＡに結合することはなお可能であるが、ヌクレアーゼ活性を有しない。このｄＣａｓ９は、ＤＮＡ転写制御因子が不活性酵素を既知の制御ドメインに融合することにより遺伝子発現を活性化又は抑制するためのプラットフォームとして利用することができる。例えば、ゲノムＤＮＡ中の標的配列にｄＣａｓ９単独で結合することで遺伝子転写を妨げることができる。
【０１８６】
標的配列を選択及び／又は設計するのを支援するために利用できるツール、並びに様々な種の様々な遺伝子について生物情報学的に決定されたユニークなｇＲＮＡのリストがいくつか公開されており、例えばＦｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ研究室のＴａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒ、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂｏｕｔｒｏｓ研究室のＴａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒ（Ｅ−ＣＲＩＳＰ）、ＲＧＥＮ  Ｔｏｏｌｓ：Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒ、ＣａｓＦｉｎｄｅｒ：ゲノム中の特定のＣａｓ９標的を特定するためのＦｌｅｘｉｂｌｅアルゴリズム、及びＣＲＩＳＰＲ  Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒがある。
【０１８７】
本開示において使用することができるｇＲＮＡの非限定的な例としては、後述する実施例の節に記載されるものが挙げられる。
【０１８８】
ＣＲＩＳＰＲシステムを使用するためには、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９の両方が標的細胞の中に存在するか、又はリボ核タンパク質複合体として送達される必要がある。挿入ベクターが単一のプラスミドに両方のカセットを含有してもよいし、又はそれらのカセットは２つの別個のプラスミドから発現される。ＣＲＩＳＰＲプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅからのｐｘ３３０プラスミド等、市販されている。また、植物ゲノムを改変するための、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）−ガイドＲＮＡ技術及びＣａｓエンドヌクレアーゼの使用は、Ｓｖｉｔａｓｈｅｖら、２０１５、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１６９（２）：９３１−９４５；Ｋｕｍａｒ及びＪａｉｎ、２０１５、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔ  ６６：４７−５７により、並びに米国特許出願公開第２０１５００８２４７８号に少なくとも開示されており、これらは個々に参照によりその全体を本明細書に援用される。
【０１８９】
「ヒットエンドラン（ｈｉｔ  ａｎｄ  ｒｕｎ）」又は「インアウト（ｉｎ−ｏｕｔ）」  −  は２工程組換え手順を伴う。第１工程では、正／負二重選択マーカーカセットを含有する挿入型ベクターが使用され、所望の配列変更が導入される。この挿入ベクターは、標的座位に対して相同性を有する単一の連続領域を含有し、目的の変異を保有するように改変される。このターゲティング構築物は、相同性を有する領域内の１つの部位で制限酵素を用いて線状化され、細胞に導入され、正の選択が実施されて、相同組換えイベントが単離される。相同配列を保有するＤＮＡは、プラスミド、一本鎖又は二本鎖のオリゴとして提供されてもよい。これらの相同的な組換え体は、選択カセットを含めた介在するベクター配列によって隔てられている局所的な重複を含有する。第２工程では、標的クローンが、重複した配列間の染色体内組換えにより選択カセットを失った細胞を特定するための負の選択に供される。この局所的な組換えイベントは上記重複を除去し、組換えの部位に応じて、対立遺伝子は導入された変異を保持するか、又は野生型に復帰するかする。最終結果は、何らの外来性配列の保持もない所望の改変の導入である。
【０１９０】
「二重置換（ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」又は「タグ及び交換（ｔａｇ  ａｎｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）」戦略  −  は、上記ヒットエンドランアプローチに類似した２工程選択手順を伴うが、２つの異なるターゲティング構築物の使用を必要とする。第１工程では、変異が導入されるべき場所の近くに正／負二重選択カセットを挿入するために、３’及び５’相同性アームを有する標準的なターゲティングベクターが使用される。上記システム成分が細胞に導入されて正の選択がかけられた後で、ＨＲイベントを特定することができよう。次に、所望の変異に相同性を有する領域を含有する第２ターゲティングベクターが標的クローンに導入され、負の選択がかけられ、上記選択カセットが除去され、変異が導入される。最終の対立遺伝子は、望まれない外来性配列を解消しつつ所望の変異を含有する。
【０１９１】
部位特異的リコンビナーゼ  −  Ｐ１バクテリオファージ由来のＣｒｅリコンビナーゼ及び酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（出芽酵母）由来のＦｌｐリコンビナーゼは、各々ユニークな３４塩基対ＤＮＡ配列（それぞれ「Ｌｏｘ」及び「ＦＲＴ」と呼ばれる）を認識する部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼであり、Ｌｏｘ部位又はＦＲＴ部位のいずれかに隣接している配列は、それぞれＣｒｅリコンビナーゼ又はＦｌｐリコンビナーゼの発現の後に、部位特異的組換えにより容易に除去されることが可能である。例えば、Ｌｏｘ配列は、１３塩基対逆方向リピートに隣接する非対称の８塩基対スペーサ領域から構成される。Ｃｒｅは、この１３塩基対逆方向リピートに結合してスペーサ領域内の鎖切断及び再連結を触媒することにより、上記３４塩基対ｌｏｘ  ＤＮＡ配列を組換える。スペーサ領域でＣｒｅによってなされる突出型（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）ＤＮＡ切断は６塩基対によって隔てられ、同じオーバーラップ領域を有する組換え部位だけが再結合することを確実にするための相同性センサーとして作用するオーバーラップ領域を与える。
【０１９２】
基本的に、部位特異的リコンビナーゼシステムは、相同組換えイベントの後の選択カセットの除去のための手段を与える。このシステムは、時間的に又は組織特異的に不活性化又は活性化されうる条件付きの変更された対立遺伝子の生成も可能にする。なお、Ｃｒｅリコンビナーゼ及びＦｌｐリコンビナーゼは、３４塩基対のＬｏｘ又はＦＲＴの「傷痕」を残す。残るＬｏｘ又はＦＲＴ部位は、通常、改変された遺伝子座のイントロン又は３’ＵＴＲに残され、現在の証左は、これらの部位は、通常遺伝子機能を顕著には妨げないということを示唆する。
【０１９３】
このように、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ及びＦｌｐ／ＦＲＴ組換えは、目的の変異、２つのＬｏｘ又はＦＲＴ配列及び典型的には２つのＬｏｘ又はＦＲＴ配列の間に置かれた選択カセットを含有する３’及び５’相同性アームを持つターゲティングベクターの導入を伴う。正の選択がかけられ、目的の変異を含有する相同組換えイベントが特定される。負の選択と併用したＣｒｅ又はＦｌｐの一過性発現は、選択カセットの切除を生じ、カセットが失われた細胞を選択する。最終の目的の対立遺伝子は外来性の配列のＬｏｘ又はＦＲＴ傷痕を含有する。
【０１９４】
特定の実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９である。
【０１９５】
例示のｇＲＮＡ配列は以下に提供される。
Ｃｃ０４＿ｇ１４２８０
ＧＧＴＧＡＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧ（配列番号１３）；
ＧＣＴＴＧＧＴＣＴＡＡＣＡＣＣＴＣＣＧＡ（配列番号１４）；
【０１９６】
上記ＤＮＡ編集剤は、通常、発現ベクターを使用して植物細胞に導入される。
【０１９７】
このように、本発明の一態様によれば、コーヒーのα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子にハイブリダイズし、上記α−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子の編集を容易にすることができるＤＮＡ編集剤をコードする核酸配列を含む核酸構築物であって、この核酸配列が、上記ＤＮＡ編集剤をコーヒーの細胞において発現するためのシス作用性調節エレメントに動作可能に連結されている核酸構築物が提供される。
【０１９８】
本教示が、ｍＲＮＡ＋ｇＲＮＡトランスフェクション又はＲＮＰトランスフェクション等のＤＮＡフリーの方法を使用する上記ＤＮＡ編集剤の導入にも関するということは分かるであろう。
【０１９９】
本発明の実施形態は、上記のもの等のあらゆるＤＮＡ編集剤に関する。
【０２００】
特定の実施形態によれば、ゲノム編集剤は、エンドヌクレアーゼを含み、このエンドヌクレアーゼはＤＮＡターゲティングモジュールの補助ユニット（例えば、ｓｇＲＮＡ、又は本明細書中で「ｇＲＮＡ」とも呼ばれる）を含んでも又は有してもよい。
【０２０１】
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡである。
【０２０２】
特定の実施形態によれば、ＤＮＡ編集剤はＴＡＬＥＮである。
【０２０３】
例えば、α−Ｄ−ガラクトシダーゼを標的にするためのＴＡＬエフェクターを設計するために、ＴＡＬ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔａｒｇｅｔｅｒ（ＴＡＬＥ−ＮＴ）スイート（ｔａｌｅ−ｎｔ．ｃａｃ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ）の一部としてのウェブベースのツールである、ＴＡＬ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｔａｒｇｅｔｅｒ  ２．０が使用される。α−Ｄ−ガラクトシダーゼを標的にするＴＡＬＥＮの特異性プロファイリングの例はＣｃ０４＿ｇ１４２８０である。配列は理想的に提供されており、そのためＴＡＬＥＮは、その意図された標的配列だけを特異的に結合しオフターゲット活性を有さず、従って、単一の配列、例えば全ゲノムという意味での遺伝子のＣｃ０４＿ｇ１４２８０対立遺伝子、だけの標的とされた開裂を可能にすることになろう。以下は、本発明の実施形態に係る遺伝子を標的とするために使用することができるＴａｌｅｎ配列の非限定的な例である。
【０２０４】
【表３】
2020522279.tif 000004
【０２０５】
Ｋｏｐｉｓｃｈｋｅ  Ｓ，Ｓｃｈｕｅｓｓｌｅｒ  Ｅ，Ａｌｔｈｏｆｆ  Ｆ，Ｚａｃｈｇｏ  Ｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７  Ｍａｒ  ２９；１３：２０；
Ｚｈａｎｇ  Ｋ，Ｒａｂｏａｎａｔａｈｉｒｙ  Ｎ，Ｚｈｕ  Ｂ，Ｌｉ  Ｍ．Ｆｒｏｎｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．２０１７  Ｆｅｂ  １４；８：１７７；
Ｊｕｎｇ  ＪＨ，Ａｌｔｐｅｔｅｒ  Ｆ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１６  Ｓｅｐ；９２（１−２）：１３１−４２；
Ｌｉ  Ｔ，Ｌｉｕ  Ｂ，Ｃｈｅｎ  ＣＹ，Ｙａｎｇ  Ｂ．Ｊ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１６  Ｍａｙ  ２０；４３（５）：２９７−３０５；
Ｂｌａｎｖｉｌｌａｉｎ−Ｂａｕｆｕｍｅ  Ｓ，Ｒｅｓｃｈｋｅ  Ｍ，Ｓｏｌｅ  Ｍ，Ａｕｇｕｙ  Ｆ，Ｄｏｕｃｏｕｒｅ  Ｈ，Ｓｚｕｒｅｋ  Ｂ，Ｍｅｙｎａｒｄ  Ｄ，Ｐｏｒｔｅｆａｉｘ  Ｍ，Ｃｕｎｎａｃ  Ｓ，Ｇｕｉｄｅｒｄｏｎｉ  Ｅ，Ｂｏｃｈ  Ｊ，Ｋｏｅｂｎｉｋ  Ｒ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．２０１７  Ｍａｒ；１５（３）：３０６−３１７）。
【０２０６】
特定の実施形態によれば、当該核酸構築物は、ＤＮＡ編集剤のエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９又は上記のエンドヌクレアーゼ）をコードする核酸配列をさらに含む。
【０２０７】
別の特定の実施形態によれば、上記エンドヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡは異なる構築物からコードされ、これにより各々が、植物細胞において活性なシス作用性調節エレメント（例えば、プロモーター）に動作可能に連結される。
【０２０８】
本発明のいくつかの実施形態の特定の実施形態では、調節配列は植物で発現可能なプロモーターである。
【０２０９】
いくつかの実施形態に係る方法において有用な構築物は、当業者にとっては周知である組換えＤＮＡ技術を使用して構築されてよい。このような構築物は、市販され、植物への形質転換に好適であり、形質転換細胞（トランスフォーム細胞）における目的の遺伝子の発現に好適である可能性がある。
【０２１０】
本明細書で使用する場合、句「植物で発現可能」は、加えられるか又は含有される何らかの付加的な調節エレメントを含めたプロモーター配列が、植物の細胞、組織又は器官、好ましくは単子葉植物又は双子葉植物の細胞、組織若しくは器官における発現を少なくとも誘導、付与、活性化又は増強することができることを指す。本発明のいくつかの実施形態の方法に有用なプロモーターの例としては、Ａｃｔｉｎ、ＣＡＮＶ３５Ｓ、ＣａＭＶ１９Ｓ、ＧＯＳ２が挙げられるが、これらに限定されない。種々の組織、又は発生段階で活性であるプロモーターも使用できる。
【０２１１】
本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドの核酸配列は、植物発現のために最適化されてもよい。このような配列改変の例としては、目的の植物種において通常見出されるＧ／Ｃ含有量により近づくための変更されたＧ／Ｃ含有量、及びコドン最適化と一般に呼ばれる、植物種において変則的に見出されるコドンの除去が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１２】
植物細胞は、本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物を用いて安定に又は一過性に形質転換されてもよい。安定的な形質転換では、本発明のいくつかの実施形態の核酸分子は植物ゲノムに組み込まれ、従ってその植物は、安定な及び遺伝性の形質を表す。一過性の形質転換では、核酸分子は形質転換された細胞によって発現されるが、ゲノムに組み込まれず、従ってその植物は、一過性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを表す。
【０２１３】
特定の実施形態によれば、上記植物は、ＤＮＡ編集剤を用いて一過性にトランスフェクションされる。
【０２１４】
特定の実施形態によれば、上記核酸構築物中のプロモーターは、Ｐｏｌ３プロモーターを含む。Ｐｏｌ３プロモーターの例としては、ＡｔＵ６−２９、ＡｔＵ６２６、ＡｔＵ３Ｂ、ＡｔＵ３ｄ、ＴａＵ６が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１５】
特定の実施形態によれば、上記核酸構築物中のプロモーターは、Ｐｏｌ２プロモーターを含む。Ｐｏｌ２プロモーターの例としては、ＣａＭＶ３５Ｓ、ＣａＭＶ１９Ｓ、ユビキチン、ＣＶＭＶが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１６】
特定の実施形態によれば、上記核酸構築物中のプロモーターは３５Ｓプロモーターを含む。
【０２１７】
特定の実施形態によれば、上記核酸構築物中のプロモーターは、Ｕ６プロモーターを含む。
【０２１８】
特定の実施形態によれば、上記核酸構築物中のプロモーターは、少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸剤に動作可能に連結されたＰｏｌ３（例えば、Ｕ６）プロモーター及び／又は上記ゲノム編集剤をコードする核酸配列若しくは蛍光レポーター（後述の特定の実施形態に記載されているとおり）をコードする核酸配列に動作可能に連結されたＰｏｌ２（例えば、ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモーターを含む。
【０２１９】
特定の実施形態によれば、上記構築物は一過性発現に有用である（Ｈｅｌｅｎｓら、２００５、Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １：１３）。一過性形質転換の方法は本明細書中にさらに記載される。
【０２２０】
特定の実施形態によれば、上記構築物に含まれる核酸配列は、上記植物ゲノムへの組み込みを回避するよう、上記植物細胞のゲノムに相同的な配列を欠く。
【０２２１】
ある実施形態では、上記核酸構築物は非組み込み性構築物であり、好ましくは上記蛍光レポーターをコードする核酸配列も非組み込み性である。本明細書で使用する場合、「非組み込み性」は、目的の植物のゲノムへの組み込みを促進するように積極的には設計されていない構築物又は配列を指す。例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介の遺伝子形質転換用の機能的Ｔ−ＤＮＡベクターシステムは非組み込み性ベクターシステムではない。というのも、このシステムは、植物ゲノムに組み込まれるように積極的に設計されているからである。同様に、目的の植物のゲノムへの蛍光レポーター遺伝子配列又は選択マーカー配列の相同組換えを促進するための、目的の植物のゲノムに相同的な隣接配列を有するその蛍光レポーター遺伝子配列又は選択マーカー配列は、非組み込み性の蛍光レポーター遺伝子配列又は選択マーカー配列ではないであろう。
【０２２２】
種々のクローニングキットを、本発明のいくつかの実施形態の教示に従って使用することができる。
【０２２３】
特定の実施形態によれば、上記核酸構築物はバイナリーベクターである。バイナリーベクターの例は、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢｉｎＡＲ、ｐＧＰＴＶ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＢＩＢ−ＨＹＧ、ｐＢｅｃｋｓ、ｐＧｒｅｅｎ又はｐＰＺＰ（Ｈａｊｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５，９８９（１９９４）、及びＨｅｌｌｅｎｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５，４４６（２０００））である。
【０２２４】
ＤＮＡ送達の他の方法（例えばトランスフェクション、電気穿孔、撃ち込み（ボンバードメント）、ウイルス接種）で使用されることができる他のベクターの例は、ｐＧＥ−ｓｇＲＮＡ（Ｚｈａｎｇら  Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ．２０１６  ７：１２６９７）、ｐＪＩＴ１６３−Ｕｂｉ−Ｃａｓ９（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００４  ３２、９４７−９５１）、ｐＩＣＨ４７７４２：：２ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲ−ｈＣａｓ９（ＳＴＯＰ）−ＮＯＳＴ（Ｂｅｌｈａｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１３  １１；９（１）：３９）である。
【０２２５】
本明細書に記載される実施形態は、ゲノム編集イベントを含む細胞の選択方法であって、
（ａ）コーヒー植物の細胞を、ゲノム編集剤（上記のとおり）及び蛍光レポーターを含む核酸構築物で形質転換する工程と、
（ｂ）フローサイトメトリ又は撮像を使用して、蛍光レポーターによって発せられる蛍光を呈する形質転換細胞を選択する工程と、
（ｃ）上記ＤＮＡ編集剤によって生成されたゲノム編集イベントを含むが上記ＤＮＡ編集剤をコードするＤＮＡを欠く細胞を得るために、上記ＤＮＡ編集剤によるゲノム編集イベントを含む形質転換細胞を、上記ＤＮＡ編集剤の発現を失うのに十分な時間のあいだ培養する工程と
を備える方法にも関する。
【０２２６】
いくつかの実施形態によれば、当該方法は、工程（ｃ）後に、上記形質転換細胞において、上記蛍光レポーターの発現の喪失を検証する工程をさらに備える。
【０２２７】
いくつかの実施形態によれば、当該方法は、工程（ｃ）後に、上記形質転換細胞において、上記ＤＮＡ編集剤の発現／出現の喪失を検証する工程ことをさらに含む。
【０２２８】
当該方法の非限定的な実施形態は、図１のフロー図に記載されている。
【０２２９】
特定の実施形態によれば、上記植物は、植物細胞、例えば胚細胞懸濁液中の植物細胞である。
【０２３０】
特定の実施形態によれば、この植物細胞はプロトプラストである。
【０２３１】
このプロトプラストはいずれかの植物組織、例えば根、葉、胚細胞懸濁液、カルス又は実生組織に由来する。
【０２３２】
植物細胞に、例えばプロトプラストを使用してＤＮＡを導入する方法はいくつかあり、当業者はどれを選択するべきかを知っているであろう。
【０２３３】
核酸の送達は、本発明の実施形態では、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド及び／若しくはタンパク質又は核酸及びペプチドの組み合わせを植物細胞に送達するための方法において当業者にとって公知であるいずれの方法によって植物細胞に導入されてもよく、その方法としては、例えば以下が挙げられるが、これらに限定されない：プロトプラストの形質転換による（例えば、米国特許第５，５０８，１８４号明細書を参照）；乾燥／阻害媒介ＤＮＡ取り込みによる（例えば、Ｐｏｔｒｙｋｕｓら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１８３−８を参照）；電気穿孔による（例えば、米国特許第５，３８４，２５３号明細書を参照）；炭化ケイ素繊維を用いたかき混ぜによる（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号明細書及び米国特許第５，４６４，７６５号明細書を参照）；アグロバクテリウム媒介の形質転換による（例えば、米国特許第５，５６３，０５５号明細書、米国特許第５，５９１，６１６号明細書、米国特許第５，６９３，５１２号明細書、米国特許第５，８２４，８７７号明細書、米国特許第５，９８１，８４０号明細書及び米国特許第６，３８４，３０１号明細書を参照）；ＤＮＡ被覆粒子の加速による（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号明細書、米国特許第５，５５０，３１８号明細書、米国特許第５，５３８，８８０号明細書、米国特許第６，１６０，２０８号明細書、米国特許第６，３９９，８６１号明細書及び米国特許第６，４０３，８６５号明細書を参照）並びにナノ粒子、ナノ担体及び細胞膜透過ペプチドによる（国際公開第２０１１２６６４４Ａ２号パンフレット；国際公開第２００９０４６３８４Ａ１号パンフレット；国際公開第２００８１４８２２３Ａ１号パンフレット）。
【０２３４】
トランスフェクション（形質移入）の他の方法としては、トランスフェクション試薬の使用（例えばＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（サーモフィッシャー））、デンドリマー（Ｋｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏ，Ｊ．Ｆ．ら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３、４８９７−９０２）、細胞膜透過ペプチド（Ｍａｅら、２００５、Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １６６９（２）：１０１−７）又はポリアミン（Ｚｈａｎｇ及びＶｉｎｏｇｒａｄｏｖ、２０１０、Ｓｈｏｒｔ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１４３（３）：３５９−３６６）が挙げられる。
【０２３５】
特定の実施形態によれば、植物細胞（例えば、プロトプラスト）へのＤＮＡの導入は電気穿孔によって行われる。
【０２３６】
特定の実施形態によれば、植物細胞（例えば、プロトプラスト）へのＤＮＡの導入は撃ち込み／微粒子銃によって行われる。
【０２３７】
特定の実施形態によれば、ＤＮＡをプロトプラストに導入するために、当該方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に媒介されるＤＮＡ取り込みを含む。さらなる詳細については、Ｋａｒｅｓｃｈら（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．９：５７５−５７８；Ｍａｔｈｕｒら（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１４：２２１−２２６；Ｎｅｇｒｕｔｉｕら（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：３６３−３７３を参照。次に、プロトプラストは、プロトプラストが細胞壁を発達させ、分裂を開始してカルスを形成し、シュートを及び根を発達させ、植物全体を再生することを可能にする条件下で培養される。
【０２３８】
一過性形質転換は、改変植物ウイルスを使用するウイルス感染によっても行うことができる。
【０２３９】
植物宿主の形質転換に有用であることが示されたウイルスとしては、ＣａＭＶ、ＴＭＶ、ＴＲＶ及びＢＶが挙げられる。植物ウイルスを使用する植物の形質転換は、米国特許第４，８５５，２３７号明細書（ＢＧＶ）、欧州特許出願公開第６７，５５３号明細書（ＴＭＶ）、特開昭６３−１４６９３号公報（ＴＭＶ）、欧州特許出願公開第１９４，８０９号明細書（ＢＶ）、欧州特許出願公開第２７８，６６７号明細書（ＢＶ）；及びＧｌｕｚｍａｎ，Ｙ．ら、Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１７２−１８９頁（１９８８）に記載されている。外来ＤＮＡを、植物を含めた多くの宿主で発現することにおいて使用するための偽ウイルス粒子は国際公開第８７／０６２６１号パンフレットに記載されている。
【０２４０】
植物における非ウイルス性の外来性核酸配列の導入及び発現のための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上述の参考文献並びにＤａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｏ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７２：２８５−２９２；Ｔａｋａｍａｔｓｕら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８７）６：３０７−３１１；Ｆｒｅｎｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３１：１２９４−１２９７；及びＴａｋａｍａｔｓｕら。ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９０）２６９：７３−７６によって実証されている。
【０２４１】
ウイルスがＤＮＡウイルスである場合、好適な改変はウイルス自体に対して行うことができる。あるいは、外来ＤＮＡを有する所望のウイルスベクターを構築することの簡単さのため、ウイルスＤＮＡは最初に細菌プラスミドにクローニングされてもよい。この後、このウイルスＤＮＡは、上記プラスミドから取り出すことができる。ウイルスがＤＮＡウイルスであれば、細菌の複製開始点がウイルスＤＮＡに結合していることが可能で、ウイルスＤＮＡは、次にその細菌によって複製される。このＤＮＡの転写及び翻訳は、ウイルスＤＮＡを包むことになるコートタンパク質をもたらす。ウイルスがＲＮＡウイルスであれば、そのウイルスは、一般にｃＤＮＡとしてクローニングされ、プラスミドに挿入される。次に、このプラスミドが上記構築物のすべてを作製するために使用される。ＲＮＡウイルスが、ウイルスＲＮＡを包むコートタンパク質（１又は複数）をもたらすための、プラスミドのウイルス配列の転写及びウイルス遺伝子の翻訳によって産生される。
【０２４２】
本発明のいくつかの実施形態の構築物に含まれるもの等の非ウイルス性の外来性核酸配列の導入及び植物における発現のための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上記の参考文献及び米国特許第５，３１６，９３１号明細書によって実証されている。
【０２４３】
１つの実施形態では、天然のコートタンパク質コード配列がウイルス核酸から欠失しており、非天然の植物ウイルス性コートタンパク質コード配列、並びに植物宿主中で発現し、組換え植物ウイルス核酸をパッケージ化すること、及び上記組換え植物ウイルス核酸による宿主の全身感染を確実にすることができる非天然のプロモーター、好ましくは上記非天然のコートタンパク質コード配列のサブゲノムプロモーターが挿入されている植物ウイルス核酸が提供される。あるいは、タンパク質が産生されるように、コートタンパク質遺伝子は、非天然の核酸配列をその内部に挿入することにより不活性化されてもよい。この組換え植物ウイルス核酸は、１以上のさらなる非天然のサブゲノムプロモーターを含有してもよい。各非天然のサブゲノムプロモーターは、隣接する遺伝子又は核酸配列を植物宿主中で転写又は発現することができ、互いに及び天然のサブゲノムプロモーターと組み換わることができない。複数の核酸配列が含まれる場合には、非天然の（外来の）核酸配列が、上記天然の植物ウイルスサブゲノムプロモーター又は上記天然及び非天然の植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接して挿入されてもよい。この非天然の核酸配列は宿主植物中で、上記サブゲノムプロモーターの制御下で転写又は発現され、所望の産物が産生される。
【０２４４】
第２実施形態では、上記天然のコートタンパク質コード配列が非天然のコートタンパク質コード配列の代わりに非天然のコートタンパク質サブゲノムプロモーターのうちの１つに隣接して置かれていることを除いて第１実施形態のように組換え植物ウイルス核酸が提供される。
【０２４５】
第３実施形態では、上記天然のコートタンパク質遺伝子がそのサブゲノムプロモーターに隣接しており、１以上の非天然のサブゲノムプロモーターがウイルス核酸に挿入されている組換え植物ウイルス核酸が提供される。この挿入された非天然のサブゲノムプロモーターは、隣接する遺伝子を植物宿主中で転写又は発現することができ、互いに及び天然のサブゲノムプロモーターと組み換わることができない。上記配列が宿主植物中で、上記サブゲノムプロモーターの制御下で転写又は発現され、所望の産物が産生されるように、非天然の核酸配列がこの非天然のサブゲノム植物ウイルスプロモーターに隣接して挿入されてもよい。
【０２４６】
第４実施形態では、上記天然のコートタンパク質コード配列が非天然のコートタンパク質コード配列によって置き換えられていることを除いて上記第３実施形態のように組換え植物ウイルス核酸が提供される。
【０２４７】
上記ウイルスベクターは、組換え植物ウイルスを産生するための組換え植物ウイルス核酸によってコードされるコートタンパク質によって包まれている。この組換え植物ウイルス核酸又は組換え植物ウイルスは、適切な宿主植物を感染させるために使用される。この組換え植物ウイルス核酸は、所望のタンパク質を産生するための、宿主中での複製、宿主の全身への広がり、及び宿主中での外来の遺伝子（１又は複数）（単離された核酸）の転写又は発現が可能である。
【０２４８】
用いられる形質転換／感染方法にかかわらず、本教示は、本明細書に記載される核酸構築物（１若しくは複数）を含む任意の細胞、例えば植物細胞（例えば、プロトプラスト）又はバクテリア細胞にさらに関する。
【０２４９】
形質転換の後、細胞は、蛍光レポーター（すなわち、蛍光タンパク質）によって発せられる蛍光を呈する形質転換細胞を選択するために、フローサイトメトリに供される。
【０２５０】
本明細書で使用する場合、「蛍光タンパク質」は、蛍光を発し、通常はフローサイトメトリ又は撮像により検出可能であり、それゆえそのようなタンパク質を発現する細胞の選択の基礎として使用することができるポリペプチドを指す。
【０２５１】
レポーターとして使用することができる蛍光タンパク質の例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）及び赤色蛍光タンパク質ｄｓＲｅｄである。蛍光レポーター又は他のレポーターの非限定的な一覧は、ルミネセンスにより検出可能なタンパク質（例えばルシフェラーゼ）又は比色分析により検出可能なタンパク質（例えばＧＵＳ）を含む。特定の実施形態によれば、蛍光レポーターはＤｓＲｅｄ又はＧＦＰである。
【０２５２】
この分析は、通常は形質転換後、２４〜７２時間以内、例えば４８〜７２時間以内、２４〜２８時間以内に行われる。一過性発現を確実にするために、抗生物性選択、例えば選択マーカーに対する抗生物質は用いられない。この培養物はなお抗生物質を含んでよいが、それは選択マーカーに対するものではない。
【０２５３】
植物細胞のフローサイトメトリは、通常、蛍光活性化セルソーティング（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）によって実施される。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）は細胞を含めた粒子をその粒子の蛍光特性に基づいて分離するための周知の方法である（例えばＫａｍａｒｃｈ、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５１：１５０−１６５を参照）。
【０２５４】
例えば、ＧＦＰ陽性細胞のＦＡＣＳは、４８８ｎｍレーザーによって励起されたプロトプラストの緑色対赤色の発光スペクトルの可視化を利用する。ＧＦＰ陽性プロトプラストは、赤色発光に対する緑色発光の比の上昇によって区別することができる。
【０２５５】
以下は、Ｂａｓｔｉａａｎら、Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．２０１０；（３６）：１６７３から改変した非結合プロトコルである。この文献は、参照により本明細書に援用される。ＦＡＣＳ装置は市販されており、例えばＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙ（ＢＤ）、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ）がある。
【０２５６】
１００μｍノズル及び２０ｐｓｉ（約０．１３８ＭＰａ）シース圧を用いてフローストリームが設定される。細胞密度及び試料注入速度は、最良の収率又は達成可能な最も大きい速度、例えば１０，０００，０００細胞／ｍｌ以下が望まれるか否かに基づいて、特定の実験に対して調整することができる。プロトプラストの沈降を防ぐために、試料はＦＡＣＳ上で撹拌される。ＦＡＣＳの詰まりが問題になれば、３つの可能なトラブルシューティング工程がある：１．試料ラインの逆流を実施する、２．密度を下げるためにプロトプラスト懸濁液を希釈する、３．遠心分離及び再懸濁後に濾過工程を繰り返すことによりプロトプラスト溶液を清浄にする。この装置は、４８８ｎｍレーザーによる励起後の前方散乱光（ＦＳＣ）、側方散乱光（ＳＳＣ）、並びにＧＦＰについて５３０／３０ｎｍ及び赤色スペクトル自己蛍光（ＲＳＡ）について６１０／２０ｎｍの発光を測定するように準備されている。これらは、実質的に、ＧＦＰ陽性プロトプラストを単離するために使用される唯一のパラメータである。以下の電圧設定値が使用できる：ＦＳＣ  −６０Ｖ、ＳＳＣ  ２５０Ｖ、ＧＦＰ  ３５０Ｖ及びＲＳＡ  ３３５Ｖ。なお、最適の電圧設定値は、ＦＡＣＳごとに異なり、セルソーターの耐用期間全体にわたってなお調整される必要がある。
【０２５７】
プロセスは、前方散乱光対側方散乱光についてのドットプロットを組み立てることにより開始される。測定されるイベントがプロットの中心にくるように電圧設定値が印加される。次に、緑色蛍光シグナル対赤色蛍光シグナルのドットプロットが作成される。野生型（非ＧＦＰ）プロトプラスト懸濁液を見るときに、測定されるイベントがプロットで中央に集まった対角線上の集団を与えるように電圧設定値が印加される。ＧＦＰマーカーラインに由来するプロトプラスト懸濁液は、野生型試料では決して見られない緑色蛍光イベントの明確な集団を生成することになる。ＧＦＰとＲＳＡとの間のスペクトルのオーバーラップを調整するために、コンペンセーション制約が設定される。適正なコンペンセーション制約設定値は、非ＧＦＰプロトプラスト及びデブリからのＧＦＰ陽性プロトプラストのより良好な分離を可能にすることになる。本願で使用する制約は以下のとおりである：ＲＳＡ、マイナス１７．９１％ＧＦＰ。ゲートはＧＦＰ陽性イベントを特定するように設定され、非ＧＦＰプロトプラストの陰性対照が、ゲート境界を画定することを支援するために使用される必要がある。小さいデブリを分析から外すために前方散乱光カットオフが実行される。カットオフの配置を決定するのを助けるためにＧＦＰ陽性イベントがＦＳＣ対ＳＳＣプロットで可視化される。例えば、カットオフは５，０００に設定される。なお、ＦＡＣＳは、デブリをソートイベントとしてカウントすることになり、高レベルのデブリを有する試料は、予測とは異なるＧＦＰ陽性イベントパーセントを有する可能性がある。これは必ずしも問題ではない。しかしながら、試料中にデブリが多いほど、ソートに長い時間がかかることになる。実験に応じて及び分析する対象の細胞型の存在量に応じて、ＦＡＣＳの精度モードはソートされた細胞の最適収率又は最適純度のいずれかを求めて設定される。
【０２５８】
ＦＡＣＳソーティングの後、蛍光マーカーを提示する形質転換された植物細胞（例えば、プロトプラスト）の正に選択されたプールが集められ、そしてアリコート（一定分量）がこのＤＮＡ編集イベントを試験する（任意の工程。図１を参照）ために使用されてもよい。あるいは（又は任意の検証する工程に続いて）、クローンがコロニー、すなわちクローン（少なくとも２８日）及びマイクロカルスへと発生するまで、クローンが選択（例えば、選択マーカーに対する抗生物質）の不存在下で培養される。培養下の少なくとも６０〜１００日間（例えば、少なくとも７０日、少なくとも８０日）の後、カルスの細胞の一部が、ＤＮＡ編集イベント及びＤＮＡ編集剤の存在、つまりそのＤＮＡ編集剤をコードするＤＮＡ配列の喪失（これは当該方法の一過性を指摘する）について分析（検証）される。
【０２５９】
このように、クローンは、求められる編集の種類、例えば、挿入、欠失、挿入−欠失（インデル）、逆位、置換及びこれらの組み合わせに応じて本明細書中で「変異」又は「編集」とも呼ばれるＤＮＡ編集イベントの存在について検証される。
【０２６０】
特定の実施形態によれば、ゲノム編集イベントは、これがなければ従来の育種によって目的の植物に導入されることが可能な欠失、一塩基対置換、又は第２植物由来の遺伝子材料の挿入を含む。
【０２６１】
特定の実施形態によれば、ゲノム編集イベントは、従来の育種を通しては導入できないと思われる目的の植物のゲノムへの外来ＤＮＡの導入を含まない。
【０２６２】
配列変更の検出方法は当該技術分野で周知であり、その例としては、ＤＮＡシークエンシング（例えば、次世代シークエンシング）、電気泳動、酵素ベースのミスマッチ検出アッセイ、並びにＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅプロテクション、インサイツハイブリダイゼーション、プライマー伸長法、サザンブロット、ノーザンブロット及びドットブロット解析等のハイブリダイゼーションアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。一塩基多型（ＳＮＰ）の検出のために使用される種々の方法、例えばＰＣＲを伴うＴ７エンドヌクレアーゼ、ヘテロ二本鎖及びＳａｎｇｅｒシークエンシングも使用することができる。
【０２６３】
ＤＮＡ編集イベント、例えばインデルの存在の別の検証方法は、ミスマッチのＤＮＡを認識してこれを切断する構造選択的な酵素（例えば、ｍエンドヌクレアーゼ）を利用するミスマッチ切断アッセイを含む。
【０２６４】
ミスマッチ切断アッセイは、インデルの検出について簡便で費用効率が高い方法であり、それゆえゲノム編集により誘導された変異を検出するための代表的な手順である。このアッセイは、ミスマッチ部分及び複数のヌクレオチドによって形成される追加らせんループ（ｅｘｔｒａｈｅｌｉｃａｌ  ｌｏｏｐ）でヘテロ二本鎖ＤＮＡを切断し、２以上のより小さい断片を与える酵素を使用する。得られた断片がサイズで類似しておらず従来のゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により簡単に分離できるように、予測されるヌクレアーゼ切断部位を外して約３００〜１０００ｂｐのＰＣＲ産物が生成される。末端標識された消化産物も自動のゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動によって分析できる。遺伝子座のインデルの頻度は、ＰＣＲ増幅産物及び切断されたＤＮＡバンドの積分強度を測定することにより推定することができる。消化工程には１５〜６０分かかり、ＤＮＡ調製工程及びＰＣＲ工程が加えられるときには、アッセイ全体は３時間未満で完了することができる。
【０２６５】
２つの択一的な酵素が、通常、このアッセイで使用される。Ｔ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７Ｅ１）は、ミスマッチの上流にある第１、第２又は第３のホスホジエステル結合で不完全マッチのＤＮＡを認識して切断するリゾルバーゼである。Ｔ７Ｅ１ベースのアッセイの感度は０．５〜５％である。対照的に、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ  Ｉｎｃ．、オマハ（Ｏｍａｈａ）、ネブラスカ州、米国）は、オランダミツバ由来のミスマッチ特異的ヌクレアーゼのＣＥＬファミリーのメンバーである。これは、一塩基多型（ＳＮＰ）又は小さいインデルの存在に起因するミスマッチ部分を認識して切断し、ミスマッチの下流の両方のＤＮＡ鎖を切断する。このヌクレアーゼは、１２ｎｔまでのインデルを検出することができ、約３％、すなわち３２コピーに１つという低い頻度で存在する変異に感受性がある。
【０２６６】
編集イベントの存在のさらに別の検証方法は、高分解能融解曲線分析を含む。
【０２６７】
高分解能融解曲線分析（ＨＲＭＡ）は、ゲノム標的（９０〜２００ｂｐ）にまたがるＤＮＡ配列を、蛍光染料を組み込んでリアルタイムＰＣＲにより増幅すること、及びこれに続く増幅産物の融解曲線分析を伴う。ＨＲＭＡは、挿入染料が熱変性の間に二本鎖ＤＮＡから放出されるときの蛍光の喪失に基づく。この分析は、増幅産物の温度依存的変性プロファイルを記録し、融解プロセスが１又は複数の分子種を伴うかを検出する。
【０２６８】
さらに別の方法はヘテロ二本鎖移動度アッセイである。変異も、再ハイブリダイズしたＰＣＲ断片を直接未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分析することにより、検出することができる。この方法は、ポリアクリルアミドゲル中でのヘテロ二本鎖ＤＮＡ及びホモ二本鎖ＤＮＡの泳動の差を利用する。インデルによって引き起こされるマッチＤＮＡ鎖とミスマッチＤＮＡ鎖との間の角度は、未変性条件下ではヘテロ二本鎖ＤＮＡがホモ二本鎖ＤＮＡよりも著しく小さい速度で泳動し、それらは移動度に基づいて簡単に区別できるということを意味する。１４０〜１７０ｂｐの断片は１５％ポリアクリルアミドゲル中で分離できる。そのようなアッセイの感度は、最適条件下では０．５％に近づくことができ、これはＴ７Ｅ１に近い。ＰＣＲ産物の再アニール後、このアッセイの電気泳動部分には約２時間を要する。
【０２６９】
編集イベントの存在の他の検証方法は、Ｚｉｓｃｈｅｗｓｋｉ  ２０１７  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  １（１）：９５−１０４に詳しく記載されている。
【０２７０】
陽性クローンは、ＤＮＡ編集イベントについてホモ接合性であってもよく又はヘテロ接合性であってもよいということは分かるであろう。当業者は、目的の用途に従ってクローンをさらなる培養／再生のために選択する。
【０２７１】
所望のＤＮＡ編集イベントの存在を提示するクローンは、ＤＮＡ編集剤の存在、つまりＤＮＡ編集剤をコードするＤＮＡ配列の喪失（これは当該方法の一過性を指摘する）についてさらに分析される。
【０２７２】
これは、例えば、ＧＦＰの蛍光検出又はｑ−ＰＣＲによりＤＮＡ編集剤の発現（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質での）を分析することにより行うことができる。
【０２７３】
あるいは又は加えて、細胞は、本明細書に記載される核酸構築物又はその部分、例えばレポーターポリペプチド又はＤＮＡ編集剤をコードする核酸配列の存在について分析される。
【０２７４】
蛍光レポーター又はＤＮＡ編集剤をコードするＤＮＡ（例えば、蛍光顕微鏡法、ｑ−ＰＣＲ及び／又はサザンブロット、ＰＣＲ、シークエンシング等のいずれかの他の方法によって確認される）を示さないが、所望のＤＮＡ編集イベント（１又は複数）［変異（１又は複数）］を含むクローンが、さらなる処理のために単離される。
【０２７５】
それゆえ、これらのクローンは保存することができる（例えば、凍結保存される）。
【０２７６】
あるいは、細胞（例えば、プロトプラスト）は、カルスへと発生する一群の植物細胞へとまず成長し、次いで植物組織培養方法を使用してそのカルスからシュートを再生すること（不定芽形成（ｃａｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ））により植物全体へと再生されてもよい。カルスへのプロトプラストの成長及びシュートの再生は、植物の種それぞれについて誂えられる必要がある組織培地中での植物成長調節物質の適正なバランスを必要とする。
【０２７７】
プロトプラストも、プロトプラスト融合と呼ばれる技術を使用する植物育種のために使用されてよい。異なる種に由来するプロトプラストは、電場又はポリエチレングリコールの溶液を使用することにより融合するように誘導される。この技術は、組織培養において体細胞雑種を生成するために使用されてもよい。
【０２７８】
プロトプラスト再生の方法は当該技術分野で周知である。いくつかのファクター、つまり遺伝子型、ドナー組織及びその前処理、プロトプラスト単離のための酵素処理、プロトプラスト培養の方法、培養、培地、及び物理的環境が、プロトプラストの単離、培養、及び再生に影響を及ぼす。詳細な総説のために、Ｍａｈｅｓｈｗａｒｉら、１９８６、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  ａｎｄ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌｓ：３−３６．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎを参照。
【０２７９】
再生された植物は、当業者が適切と考える場合には、さらなる育種及び選択に供されてもよい。
【０２８０】
最終系統、植物又は中間育種産物の表現型は、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子の配列、ｍＲＮＡ若しくはタンパク質のレベルでのその発現、そのタンパク質の活性を決定すること、及び／又はコーヒー豆の特性（溶解性）を分析すること等により、分析することができる。
【０２８１】
例えば、植物材料が液体窒素中で粉砕され、１００μｌあたり２０ｍｇの適切な比の氷冷した酵素抽出緩衝液（グリセロール１０％ｖ／ｖ、メタ重亜硫酸ナトリウム１０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ５ｍＭ、ＭＯＰＳ（ＮａＯＨ）  ４０ｍＭ、ｐＨ６．５）に抽出される。この混合物は氷上で２０分間撹拌され、遠心分離（１２，０００ｇ×３０分）に供され、小分けされ、使用まで−８５℃で保存される。α−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性は、基質ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｐＮＧＰ）を用いて分光光度法で検出される。
【０２８２】
反応混合物は、１ｍｌの最終体積までのＭｃＩｌｖａｉｎバッファ（クエン酸１００ｍＭ  −  Ｎａ２ＨＰＯ４  ２００ｍＭ  ｐＨ６．５）中に２００μｌ  ｐＮＧＰ  １００ｍＭを含有し、酵素抽出物を伴う。反応は２６℃に維持され、酵素の添加で開始され、４体積の停止液（Ｎａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３  １００ｍＭ  ｐＨ１０．２）の添加により停止される。吸収が４０５ｎｍで読み取られる。ニトロフェニルの放出は、モル吸光係数ε＝１８３００（ｐＨ１０．２に特定的）を使用して算出され、ｍｍｏｌ  ｍｉｎ−１  ｍｇ  タンパク質−１に変換される。全タンパク質が、水性緩衝液に抽出された試料中でＢｒａｄｆｏｒｄの方法により測定される（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７２（１９７６）、２４８−２５４）。活性の発現について、各試料が抽出されて小分けされ、アッセイが三重に実施され、結果は平均として表される。
【０２８３】
本明細書及び後述の実施例の中で説明されるように、本発明者らは、安定な遺伝子組換えを回避しつつコーヒーを形質転換することができた。
【０２８４】
従って、本発明の方法論は、選択可能又はスクリーニング可能なレポーターの組み込みを伴わないゲノム編集を可能にする。
【０２８５】
このように、本発明の実施形態は、非遺伝子組換えの植物、非遺伝子組換えの植物細胞及び本発明の教示に従って生成された遺伝子編集イベント（１又は複数）を含む植物の加工産物さらに関する。
【０２８６】
このように、本発明の教示は、本明細書に記載される植物の一部分又はその加工産物にも関する。
【０２８７】
いくつかの実施形態によれば、ソリュブルコーヒーの製造方法であって、本明細書に記載されるコーヒーの豆を抽出、脱水及び任意に焙煎に供する工程を備える方法が提供される。
【０２８８】
特定の実施形態によれば、上記植物の加工産物は、向上した溶解性をもたらす変異したα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡを含む。
【０２８９】
いくつかの実施形態の加工コーヒー組成物は、抽出され若しくは煎じられるべきコーヒー粉末又はソリュブルコーヒー粉末の形態であってもよい。このように、当該加工コーヒー組成物は、粗挽きコーヒー、フィルターコーヒー又はインスタントコーヒーであってもよい。他方、本発明のコーヒー組成物は、焙煎したコーヒー豆全体を含むこともできる。本発明のさらなる実施形態は、当該コーヒー組成物及び水を含むコーヒー飲料に関する。このようなコーヒー飲料は、当業者に公知の方法、例えば本発明のコーヒー組成物を水で抽出すること、本発明のコーヒー組成物を水で煎じることにより、又は本発明のコーヒー組成物を水に浸漬することにより調製することができる。本発明のコーヒー飲料は、天然又は人工の香味料、乳製品、アルコール、発泡剤、天然又は人工の甘味剤等の他の物質も含むことができる。
【０２９０】
本願から成立した特許の有効期間の間に、多くの関連するＤＮＡ編集剤が開発されることが予想され、用語ＤＮＡ編集剤の範囲は、すべてのこのような新しい技術を事前に含むことが意図されている。
【０２９１】
本明細書で使用する場合、用語「約」は±１０％を指す。
【０２９２】
用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（…を含む、…を備える」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（…を含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｈａｖｉｎｇ（…を有する）」及びこれらの接合語は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ（含む（備える）が、これらに限定されない）」を意味する。
【０２９３】
用語「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（…からなる）」は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ（…を含み、かつ…に限定される）」を意味する。
【０２９４】
用語「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（…から実質的になる）」は、組成物、方法又は構造は、追加の原料、工程及び／又は部品を含んでもよいが、それは、その追加の原料、工程及び／又は部品が請求項に係る組成物、方法又は構造の基本で新規な特徴を実質的に変えない場合に限られるということを意味する。
【０２９５】
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈と明らかに矛盾する場合を除いて複数の指示対象を含む。例えば、用語「ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ（化合物）」又は「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ（少なくとも１つの化合物）」は、ａ  ｐｌｕｒａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（複数の化合物）、及びこれらのｍｉｘｔｕｒｅｓ（混合物）を含んでもよい。
【０２９６】
本願全体にわたって、本発明の種々の実施形態は、範囲形式で提示されてもよい。範囲形式での記載は単に便宜及び簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する変更できない限定と解釈されるべきではないということを理解されたい。従って、範囲の記載は、すべての可能な部分範囲及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと考えられるべきである。例えば、１〜６等の範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等の部分範囲、並びにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５、及び６を具体的に開示したと考えられるべきである。これは、範囲の広さにかかわらず当てはまる。
【０２９７】
本明細書中で数値範囲が示されている場合にはいつでも、その数値範囲は、示された範囲内のあらゆる引用された数値（分数又は整数）を含むことが意図されている。句、第１の示された数と第２の示された数との間「にわたる／の範囲」、及び第１の示された数から第２の示された数まで（第１の示された数〜第２の示された数）「にわたる／の範囲」は、本明細書中で互換的に使用され、その第１及び第２の示された数並びにそれらの間のすべての分数及び整数を含むことが意図されている。
【０２９８】
本明細書で使用する場合、用語「方法」は、与えられた課題を成し遂げるためのやり方、手段、技法及び手順を指し、それらには、化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の分野の当業者に公知であるか、又は化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の分野の当業者によって公知のやり方、手段、技法及び手順から容易に開発されるやり方、手段、技法及び手順が含まれるが、これらに限定されない。
【０２９９】
特定の配列表に言及されるとき、そのような言及は、その相補的配列に実質的に対応する配列、例えば、シークエンシングエラー、クローニングエラーから生じるわずかな配列変化、又は塩基置換、塩基欠失若しくは塩基付加を生じる他の変更を含む配列も包含すると理解されたい。ただし、そのような変化の頻度は、５０ヌクレオチドに１未満、あるいは１００ヌクレオチドに１未満、あるいは２００ヌクレオチドに１未満、あるいは５００ヌクレオチドに１未満、あるいは１０００ヌクレオチドに１未満、あるいは５，０００ヌクレオチドに１未満、あるいは１０，０００ヌクレオチドに１未満である。
【０３００】
本願に開示されるあらゆる配列番号は、その配列番号がＤＮＡ配列フォーマット又はＲＮＡ配列フォーマットでのみ表されている場合であっても、配列番号が言及される文脈に応じて、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列のいずれかを指すことができるということは理解される。例えば、ある与えられた配列番号はＤＮＡ配列フォーマットで表される（例えば、チミンについてＴと書かれている）が、それは、与えられた核酸配列に対応するＤＮＡ配列、又はＲＮＡ分子核酸配列のＲＮＡ配列のいずれかを指すことができる。同様に、いくつかの配列は、記載される分子の現実の種類に応じて、ＲＮＡ配列フォーマットで表されている（例えば、ウラシルについてＵと書かれている）が、それは、ｄｓＲＮＡを含むＲＮＡ分子の配列、又は示されたＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ分子の配列のいずれかを指すことができる。いずれにせよ、いずれかの置換を有して開示された配列を有するＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子の両方が想定される。
【０３０１】
明確性のために、別個の実施形態に関して記載される本発明の特定の特徴が、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔さのために、単一の実施形態に関して記載される本発明の種々の特徴が、別個に若しくはいずれかの好適なサブコンビネーションにおいて、又は適宜本発明のいずれかの他の記載された実施形態において提供されてもよい。種々の実施形態に関して記載される特定の特徴は、それらの要素がなければその実施形態が動作不能である場合を除き、それらの実施形態の必須の特徴と考えられるべきではない。
【０３０２】
本明細書中でこれまで記載された及び添付の特許請求の範囲でクレームされる本発明の種々の実施形態及び態様は、以下の実施例で実験的にサポートされる。
【０３０３】
本明細書で使用する場合、用語「約」は±１０％を指す。
【０３０４】
用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（…を含む、…を備える」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（…を含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｈａｖｉｎｇ（…を有する）」及びこれらの接合語は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ（含む（備える）が、これらに限定されない）」を意味する。
【０３０５】
用語「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（…からなる）」は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ（…を含み、かつ…に限定される）」を意味する。
【０３０６】
用語「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（…から実質的になる）」は、組成物、方法又は構造は、追加の原料、工程及び／又は部品を含んでもよいが、それは、その追加の原料、工程及び／又は部品が請求項に係る組成物、方法又は構造の基本で新規な特徴を実質的に変えない場合に限られるということを意味する。
【０３０７】
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈と明らかに矛盾する場合を除いて複数の指示対象を含む。例えば、用語「ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ（化合物）」又は「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ（少なくとも１つの化合物）」は、ａ  ｐｌｕｒａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（複数の化合物）、及びこれらのｍｉｘｔｕｒｅｓ（混合物）を含んでもよい。
【０３０８】
本願全体にわたって、本発明の種々の実施形態は、範囲形式で提示されてもよい。範囲形式での記載は単に便宜及び簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する変更できない限定と解釈されるべきではないということを理解されたい。従って、範囲の記載は、すべての可能な部分範囲及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと考えられるべきである。例えば、１〜６等の範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等の部分範囲、並びにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５、及び６を具体的に開示したと考えられるべきである。これは、範囲の広さにかかわらず当てはまる。
【０３０９】
本明細書中で数値範囲が示されている場合にはいつでも、その数値範囲は、示された範囲内のあらゆる引用された数値（分数又は整数）を含むことが意図されている。句、第１の示された数と第２の示された数との間「にわたる／の範囲」、及び第１の示された数から第２の示された数まで（第１の示された数〜第２の示された数）「にわたる／の範囲」は、本明細書中で互換的に使用され、その第１及び第２の示された数並びにそれらの間のすべての分数及び整数を含むことが意図されている。
【０３１０】
本明細書で使用する場合、用語「方法」は、与えられた課題を成し遂げるためのやり方、手段、技法及び手順を指し、それらには、化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の分野の当業者に公知であるか、又は化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の分野の当業者によって公知のやり方、手段、技法及び手順から容易に開発されるやり方、手段、技法及び手順が含まれるが、これらに限定されない。
【０３１１】
本明細書で使用する場合、用語「処置すること」は、状態の進行を排除すること、実質的に阻害すること、緩慢化すること若しくは逆転させること、状態の臨床症候若しくは美的症候を実質的に改善すること、又は状態の臨床症候若しくは美的症候の外観を実質的に予防することを含む。
【０３１２】
特定の配列表に言及されるとき、そのような言及は、その相補的配列に実質的に対応する配列、例えば、シークエンシングエラー、クローニングエラーから生じるわずかな配列変化、又は塩基置換、塩基欠失若しくは塩基付加を生じる他の変更を含む配列も包含すると理解されたい。ただし、そのような変化の頻度は、５０ヌクレオチドに１未満、あるいは１００ヌクレオチドに１未満、あるいは２００ヌクレオチドに１未満、あるいは５００ヌクレオチドに１未満、あるいは１０００ヌクレオチドに１未満、あるいは５，０００ヌクレオチドに１未満、あるいは１０，０００ヌクレオチドに１未満である。
【０３１３】
本願に開示されるあらゆる配列番号は、その配列番号がＤＮＡ配列フォーマット又はＲＮＡ配列フォーマットでのみ表されている場合であっても、その配列番号が言及される文脈に応じて、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列のいずれかを指すことができるということは理解される。例えば、ある与えられた配列番号はＤＮＡ配列フォーマットで表される（例えば、チミンについてＴと書かれている）が、それは、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ分子核酸配列のＲＮＡ配列のいずれかを指すことができる。同様に、いくつかの配列は、記載される分子の現実の種類に応じて、ＲＮＡ配列フォーマットで表されている（例えば、ウラシルについてＵと書かれている）が、それは、ｄｓＲＮＡを含むＲＮＡ分子の配列、又は示されたＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ分子の配列のいずれかを指すことができる。いずれにせよ、いずれかの置換を有して開示された配列を有するＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子の両方が想定される。
【０３１４】
明確性のために、別個の実施形態に関して記載される本発明の特定の特徴が、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔さのために、単一の実施形態に関して記載される本発明の種々の特徴が、別個に若しくはいずれかの好適なサブコンビネーションにおいて、又は適宜本発明のいずれかの他の記載された実施形態において提供されてもよい。種々の実施形態に関して記載される特定の特徴は、それらの要素がなければその実施形態が動作不能である場合を除き、それらの実施形態の必須の特徴と考えられるべきではない。
【０３１５】
本明細書中でこれまで記載された及び添付の特許請求の範囲でクレームされる本発明の種々の実施形態及び態様は、以下の実施例で実験的にサポートされる。
【実施例】
【０３１６】
これより以下の実施例が参照されるが、この実施例は、上記の記載と一緒になって、本発明のいくつかの実施形態を限定せずに説明する。
【０３１７】
全般的に、本明細書で使用される命名法及び本発明で利用する実験室手順は、分子技法、生化学的技法、微生物学的技法及び組換えＤＮＡ技法を含む。このような技法は、文献に十分に説明されている。例えば下記を参照。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ボルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、メリーランド州（Ｍａｒｙｌａｎｄ）（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｂｉｒｒｅｎら（編）「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」、１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号明細書；米国特許第４，６８３，２０２号明細書；米国特許第４，８０１，５３１号明細書；米国特許第５，１９２，６５９号明細書及び米国特許第５，２７２，０５７号明細書に示される方法論；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓによる「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  −  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｎ．Ｙ．（１９９４）、第３版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら（編）、「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）、コネチカット州（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ及びＳｈｉｉｇｉ（編）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９８０）；利用可能なイムノアッセイは、特許文献及び科学文献に詳細に記載されている。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号明細書；米国特許第３，８３９，１５３号明細書；米国特許第３，８５０，７５２号明細書；米国特許第３，８５０，５７８号明細書；米国特許第３，８５３，９８７号明細書；米国特許第３，８６７，５１７号明細書；米国特許第３，８７９，２６２号明細書；米国特許第３，９０１，６５４号明細書；米国特許第３，９３５，０７４号明細書；米国特許第３，９８４，５３３号明細書；米国特許第３，９９６，３４５号明細書；米国特��第４，０３４，０７４号明細書；米国特許第４，０９８，８７６号明細書；米国特許第４，８７９，２１９号明細書；米国特許第５，０１１，７７１号明細書及び米国特許第５，２８１，５２１号明細書を参照；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．、及びＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．、及びＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．、（１９８４）及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらのすべては、参照により、本明細書中にすべて示されているが如く援用される。他の一般的な参考文献は、本明細書全体にわたって提供されている。これらの文献の中にある手順は当該技術分野で周知であると考えられるが、読者の便宜のために提供されている。上記文献に含まれるすべての情報は、参照により本明細書に援用される。
【０３１８】
実施例１
材料及び方法
胚カルスからのプロトプラスト単離
胚カルスをこれまでに記載されたようにして得る［Ｅｔｉｅｎｎｅ，Ｈ．、Ｓｏｍａｔｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ：ｃｏｆｆｅｅ（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ  Ｌ．  ａｎｄ  Ｃ．  ｃａｎｅｐｈｏｒａ  Ｐ．）、Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｗｏｏｄｙ  ｐｌａｎｔｓ．２００５，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ所収、１６７−１７９５頁］。手短に言えば、コーヒーの若葉を表面殺菌し、１ｃｍ２片に切断し、２．２６μＭ  ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、４．９２μＭ  インドール−３−酪酸（ＩＢＡ）及び９．８４μＭ  イソペンテニルアデニン（ｉＰ）を添加した半分量半固体ＭＳ培地に１ヶ月間置く。次いで、外植片を４．５２μＭ  ２，４−Ｄ及び１７．７６μＭ  ６−ベンジルアミノプリン（６−ＢＡＰ）を含有する半分量半固体ＭＳ培地に、胚発生カルスの再生まで６〜８月間移す。胚発生カルスを、５μＭ  ６−ＢＡＰを添加したＭＳ培地で維持する。
【０３１９】
細胞懸濁培養液をこれまでに記載されたようにして胚発生カルスから生成する［Ａｃｕｎａ，Ｊ．Ｒ．及びＭ．ｄｅ  Ｐｅｎａ、Ｐｌａｎｔ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ  Ｌ．  ｃｖ．  ｃａｔｕｒｒａ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、１９９１．１０（６）：３４５−３４８頁］。胚発生カルス（３０ｇ／ｌ）を、１３．３２μＭ  ６−ＢＡＰを添加した液体ＭＳ培地に置く。フラスコを２８℃の振盪培養器（１１０ｒｐｍ）の中に置く。この細胞懸濁液を、十分に樹立するまで、２〜４週間ごとに継代培養／継代する。細胞懸濁培養液を、４．４４μＭ  ６−ＢＡＰを有する液体ＭＳ培地中で維持する。プロトプラストをこれまでに記載されたようにして生成する［Ａｃｕｎａ，Ｊ．Ｒ．及びＭ．ｄｅ  Ｐｅｎａ、Ｐｌａｎｔ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ  Ｌ．ｃｖ．ｃａｔｕｒｒａ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、１９９１．１０（６）：３４５−３４８頁；Ｙａｍａｄａ，Ｙ．、Ｚ．Ｑ．Ｙａｎｇ、及びＤ．Ｔ．Ｔａｎｇ、Ｐｌａｎｔ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃａｌｌｕｓ  ｏｆ  ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ、１９８６．５（２）：８５−８頁］及び総説として［Ｄａｖｅｙ，Ｍ．Ｒ．ら、Ｐｌａｎｔ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ：ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ，２００５．２３（２）：１３１−７１頁］を参照。手短に言えば、およそ０．５グラムの細胞を５〜６日齢の懸濁培養液から収集し、プロトプラスト培地（マンニトール０．４Ｍ、ＮａＣｌ、１５４ｍＭ；ＣａＣｌ２、１２５ｍＭ；ＫＣｌ、５ｍＭ；ＭＥＳ−Ｋ、２ｍＭ）に溶解したＣｅｌｌｕｌａｓｅ  Ｏｎｏｚｕｋａ  Ｒ−１０（２％）、Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ  Ｙ−２３（０．２％）及びＤｒｉｓｅｌａｓｅ（０．２％）を含有するカルチャー中で４〜６時間、ゆっくりと撹拌しながらインキュベーションする。プロトプラストを洗浄し、濾過（７０ミクロン（７０μｍ））及びその後の４０％  Ｐｅｒｃｏｌｌ（ｓｉｇｍａ）又は２０％スクロースのクッションでの浮選により精製する。細胞密度を、血球計算器を使用して決定し、プロトプラストの生存率を０．０１％（ｗ／ｖ）二酢酸フルオレセイン（ＦＤＡ）を用いる染色及び蛍光顕微鏡での観察によって決定する。
【０３２０】
標的遺伝子
栽培品種ロブスタ（Ｃ．ｃａｎｅｐｈｏｒａ）における標的遺伝子はα−Ｄ−ガラクトシダーゼ＞ｃｈｒ４  ｃｈｒ４：２０９６９０５６．．２０９７８２１８（＋鎖）クラス＝遺伝子長さ＝９１６３（配列番号４  Ｃｃ０４＿ｇ１４２８０）である。
【０３２１】
ｓｇＲＮＡ設計
ｓｇＲＮＡを、Ｐａｒｋ，Ｊ．、Ｓ．Ｂａｅ、及びＪ．−Ｓ．Ｋｉｍ、Ｃａｓ−Ｄｅｓｉｇｎｅｒ：ａ  ｗｅｂ−ｂａｓｅｄ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｈｏｉｃｅ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０１５．３１（２４）：４０１４−４０１６頁由来の公開されているｓｇＲＮＡ設計ツールを使用して設計する。２つのｓｇＲＮＡを、標的遺伝子の機能喪失を生じることができると考えられるＤＳＢの機会を増やすためにα−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子に対して設計する。
【０３２２】
Ｃｃ０４＿ｇ１４２８０
ＧＧＴＧＡＡＧＴＣＴＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧ（配列番号１３）；
ＧＣＴＴＧＧＴＣＴＡＡＣＡＣＣＴＣＣＧＡ（配列番号１４）；
Ｃｃ０４＿ｇ１４２８０、Ｃｃ１１＿ｇ００３３０及びＣｃ０２＿ｇ０５４９０についての図９Ａ〜ＣにあるｓｇＲＮＡも参照。
【０３２３】
ｓｇＲＮＡクローニング
利用したトランスフェクションプラスミドは、１、Ｇ７終結配列によって終結したＣａＭＶ３５ｓプロモーターによって駆動されるｅＧＦＰ；２、Ｍａｓ終結配列によって終結したＣａＭＶ３５ｓプロモーターによって駆動されるＣａｓ９（ヒトコドンに最適化済み）；３、ガイド１のためにｓｇＲＮＡを駆動するＡｔＵ６プロモーター；４、ガイド２のためにｓｇＲＮＡを駆動するＡｔＵ６プロモーターを含む４つのモジュールから構成した。ｐＣＡＭＢＩＡ又はｐＲＩ−２０１−ＡＮ  ＤＮＡ等のバイナリーベクターを使用することができる。
【０３２４】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介プラスミドトランスフェクション。コーヒー及びバナナのプロトプラストのＰＥＧ−トランスフェクションを、Ｗａｎｇら（２０１５）［Ｗａｎｇ，Ｈ．ら、Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＰＥＧ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｇｒａｐｅ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉａ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ、２０１５．１９１：８２−８９頁］によって報告された戦略の改変版を使用して行った。プロトプラストをＭＭｇ溶液中で２〜５×１０６プロトプラスト／ｍｌの密度に再懸濁した。１００〜２００μｌのプロトプラスト懸濁液を、プラスミドが入っているチューブに加えた。プラスミド：プロトプラスト比は、形質転換効率に大きく影響を及ぼし、それゆえプロトプラスト懸濁液中のプラスミド濃度の範囲、５〜３００μｇ／μｌをアッセイした。ＰＥＧ溶液（１００〜２００μｌ）をこの混合物に加え、１０〜６０分の範囲の種々の長さの時間にわたり２３℃でインキュベーションした。ＰＥＧ４０００濃度を最適化し、２００〜４００ｍＭマンニトール、１００〜５００ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液中の２０〜８０％  ＰＥＧ４０００の範囲をアッセイした。次いで、このプロトプラストをＷ５中で洗浄し、８０ｇで３分間遠心分離し、予め１ｍｌ  Ｗ５に再懸濁し、暗所で２３℃でインキュベーションした。２４〜７２時間のインキュベーション後、蛍光を顕微鏡法により検出した。
【０３２５】
電気穿孔
関連する遺伝子を標的とするＰｏｌ２駆動ＧＦＰ／ＲＦＰ、Ｐｏｌ２駆動ＮＬＳ−Ｃａｓ９及びＰｏｌ３駆動ｓｇＲＮＡを含有するプラスミドを、電気穿孔（ＢＩＯＲＡＤ−ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩ；Ｍｉａｏ及びＪｉａｎ  ２００７  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２（１０）：２３４８−２３５３）を使用して上記細胞に導入した。５００μｌのプロトプラストを電気穿孔キュベットに移し、１００μｌのプラスミド（１０〜４０μｇ  ＤＮＡ）と混合した。プロトプラストを１３０Ｖ及び１，０００Ｆで電気穿孔にかけ、室温で３０分間インキュベーションした。１ｍｌのプロトプラスト培地を各キュベットに加え、このプロトプラスト懸濁液を小さいペトリ皿の中へと注ぎ込んだ。２４〜４８時間のインキュベーションの後、蛍光を顕微鏡法により検出した。
【０３２６】
蛍光タンパク質発現細胞のＦＡＣＳソーティング
プラスミド／ＲＮＡ送達から４８時間後に、細胞を収集し、そしてＧＦＰ／編集剤発現細胞について濃縮するためにフローサイトメーターを使用して蛍光タンパク質発現についてソートした［Ｃｈｉａｎｇ，Ｔ．Ｗ．ら、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ）  ｎｉｃｋａｓｅ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ，２０１６．６：２４３５６頁］。この濃縮工程により、マーカー（例えば、抗生物質）選択を省略して、蛍光タンパク質、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡを一過性に発現する細胞だけを収集することが可能になった。これらの細胞は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による標的遺伝子の編集及び対応する遺伝子発現の喪失についてさらに試験することができる。
【０３２７】
コロニー形成
蛍光タンパク質陽性細胞を一部サンプリングし、ＤＮＡ抽出及びゲノム編集（ＧＥ）試験のために使用し、一部は液体媒体中において高希釈でプレーティングし、２８〜３５日間コロニー形成させた。コロニーを採集し、成長させ、２つのアリコートに分けた。１つのアリコートをＤＮＡ抽出及びゲノム編集（ＧＥ）試験並びにＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡフリー試験（下記参照）のために使用し、他方をその状態が検証されるまで培養液中で保った。ＧＥ及びＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡフリーであることを明確に示すものだけを次の段階へと選択した。
【０３２８】
暗所で２０日後（ＧＥ分析のために分けてから、すなわち６０日目から。従って全体で８０日目）、グルコース（０．４６Ｍ）及び０．４％アガロースに減らしたこと以外は同じ培地にコロニーを移し、低照度でインキュベーションした。６週間後、アガロースをスライスし、０．３１Ｍグルコース及び０．２％ゲルライト（登録商標）を含むプロトプラスト培地に置いた。１ヶ月後、プロトコロニー（すなわちカルス）を再生培地（半分量ＭＳ＋Ｂ５ビタミン、２０ｇ／ｌスクロース）へと継代培養した。再生された栄養分体を低照度で２８℃の固体培地（０．８％寒天）に置いた。２ヶ月後、栄養分体を土壌に移し、８０〜１００％湿度の温室の中に置いた。
【０３２９】
遺伝子改変について及びＣＲＩＳＰＲシステムＤＮＡの不存在についてのスクリーニング
各コロニーから、ＤＮＡを、ＧＦＰソートしたプロトプラスト（任意の工程）のアリコートから、及びプロトプラスト由来のコロニーから抽出し、標的とした遺伝子に隣接しているプライマーを用いてＰＣＲ反応を実施した。陽性コロニーを植物を再生するために使用することになるため、コロニーをサンプリングするために測定を行う。Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡを用いないこと以外は同じ方法に供したプロトプラスト由来の対照反応物を含め、これを野生型（ＷＴ）と考える。ＰＣＲ産物を、次に、ＷＴと比べて産物サイズの何らかの変化を検出するためにアガロースゲルで分離した。ＷＴ産物とは異なるＰＣＲ反応産物をｐＢＬＵＮＴ又はＰＣＲ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングした。あるいは、シークエンシングを使用して、上記編集イベントを検証した。得られたコロニーを採集し、プラスミドを単離し、変異の性質を判定するために配列決定した。ＣＲＩＳＰＲシステムＤＮＡ／ＲＮＡを含まないことを検証するために、及びゲノムＤＮＡレベルで変異を検出するために、対応するタンパク質のドメイン変更又は完全な喪失を生じると予測される変異を有するクローン（コロニー又はカルス）を全ゲノムシークエンシング用に選んだ。
【０３３０】
所望のＧＥを提示する陽性クローンを最初に顕微鏡法分析により（ＷＴと比べて）ＧＦＰ発現について試験した。次に、ＧＦＰ陰性植物を、Ｃａｓ９配列又はその発現カセットのいずれかの他の配列に特異的な（又は次世代シークエンシング、ＮＧＳ）プライマーを使用するＰＣＲによってＣａｓ９カセットの存在について試験した。上記構築物の他の領域も、もとの構築物の何もゲノムの中にはないことを確認するために試験できる。
【０３３１】
植物再生
配列決定し、標的遺伝子の発現を失ったと予測し、かつＣＲＩＳＰＲシステムＤＮＡ／ＲＮＡを含まないことが判明したクローンを大量に再生するために繁殖させ、並行して実生を生成するために分化させた。この実生から、所望の形質を試験するために機能アッセイを実施する。
【０３３２】
溶解性アッセイ
ガラクトマンナンを測定することにより溶解性を判定する。ガラクトマンナン含有量の増加は、ガラクトマンナン対マンナン比の上昇、それゆえ溶解性の向上の指標である。ガラクトマンナンは、β−マンナナーゼ、α−ガラクトシダーゼ及びβ−ガラクトースデヒドロゲナーゼが関与する逐次的な酵素反応並びにＤ−ガラクトン酸及びＮＡＤＨの放出によって間接的に測定することができる。ＮＡＤＨの放出は、分光光度法により３４０ｎｍでアッセイされる（ＭｃＣｌｅａｒｙ  Ｂ．Ｖ．，１９８１、Ａｎ  Ｅｎｚｙｍｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇａｌａｃｔｏｍａｎｎａｎｓ  ｉｎ  Ｇｕａｒ  Ｓｅｅｄｓ、Ｌｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌ−Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ，１４，５６−５９）。
【０３３３】
【表４】
2020522279.tif 000005
【０３３４】
実施例２
非遺伝子組換えのゲノム編集プロトプラストのＦＡＣＳ濃縮及び単離
コーヒープロトプラストにトランスフェクションされるときＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体及びｓｇＲＮＡが機能的であることを評価するために、１つのベクターの中の赤色蛍光マーカー（ｄｓＲｅｄ）、Ｃａｓ９、ＧＦＰ蛍光マーカー及びＧＦＰを標的とするｓｇＲＮＡからなる４レポーター−センサープラスミドを調製した（図２を参照）。センサー１及びセンサー３は、同じｓｇＲＮＡを有するが異なるＵ６プロモーターを有し、センサー２及びセンサー４は、同じｓｇＲＮＡを有するが異なるＵ６プロモーターを有する。すべての４つのプラスミドを、ロブスタコーヒーノキ由来のプロトプラストに独立に送達し（図２）、ＦＡＣＳを使用して緑色プロトプラスト対赤色プロトプラストの比を測定することによりこれらのプロトプラストにおけるＣａｓ９活性を確認した。ＧＦＰマーカーのゲノム編集の根拠は、ｓｇＲＮＡを欠くだけの対照プラスミドと比べたときの緑色対赤色比の低下として示される。図２に示すように、すべての種類のレポーター−センサープラスミドは、Ｃａｓ９がコーヒーにおいて活性であり、ポジティブな編集につながり、これによりＧＦＰマーカーのシグナルをはっきりと低下させることを示す。
【０３３５】
次に、コーヒーゲノム内のα  Ｄガラクトシダーゼ遺伝子を、Ｍａｒｒａｃｃｉｎｉら、２００５、前出、により提出され記載されている受入番号ＡＪ８８７７１２．１を有する配列をクエリとして使用して、ｂｌａｓｔｎにより特定した。図３Ａで見られるように、ロブスタコーヒーノキの公開されているゲノムの中のα  Ｄガラクトシダーゼに対応する３つの遺伝子が検索された。９９．２％という同一性のパーセンテージは、Ｃｃ０４＿ｇ１４２８０が、コーヒー豆の中のα  Ｄガラクトシダーゼとして生化学的及び分子的に特徴づけられているＡＪ８８７７１２．１のホモログであることを示す（図３Ｂ）。さらなる２つの配列は、６０〜６５％のより低い類似性を提示する（図３Ｂ）。
【０３３６】
これらの遺伝子の役割に関するいくらかの見通しを得るために、公開されている発現データをこれらの３つの候補遺伝子（Ｃｃ０４＿ｇ１４２８０、Ｃｃ１１＿ｇ００３３０、及びＣｃ０２＿ｇ０５４９０）について検索した（図３Ｃ）。コーヒーゲノムデータベースからの各遺伝子のＲＰＫＭデータは、Ｃｃ０４＿ｇ１４２８０が胚乳において強く発現されることを示し、これはコーヒー豆の溶解性におけるその重要性を強調する（図３Ｃ）。しかしながら、他の２つの遺伝子がいまだ胚乳においてだけでなく他の組織においても中程度の発現を示すことをふまえて、すべての遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを設計することとした。Ｃｃ０４＿ｇ１４２８０を、図４Ａに示すようにエクソン２及びエクソン３にある一対のユニークで特異的なｓｇＲＮＡを用いて標的にした。この領域はＰＡＭモチーフを特定することができた５’ＵＴＲに最も近接しているため、この領域を選択した。ｓｇＲＮＡ対を設計するために、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＧＥＮ  Ｔｏｏｌ（ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／）を使用した。ＣＲＩＳＰＲ  ＲＧＥＮは、ｓｇＲＮＡ配列を、与えられたゲノムにおけるそれら配列の品質及びオフターゲット活性の欠如に従って設計するアルゴリズムを採用する（図９Ａ〜図９Ｃ）。示した２つのｓｇＲＮＡを、ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｃａｓ９、及びＵ６  Ｐｏｌ３プロモーターによって駆動される２つのｓｇＲＮＡを含有するプラスミドにクローニングした。同様にして、２つのさらなる候補遺伝子Ｃｃ０２＿ｇ０５４９０及びＣｃ１１＿ｇ００３３０について、ｓｇＲＮＡを設計し、プロトプラストトランスフェクションのためにプラスミドにクローニングした（図５Ａ〜図５Ｃ；図６Ａ〜図６Ｃ）。
【０３３７】
次に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体及び遺伝子Ｃｃ０４＿ｇ１４２８０を標的にするｓｇＲＮＡをコーヒープロトプラスト系統ＦＲＴ０６に形質転換し（上記のとおりＰＥＧを使用して）、そのような複合体を保有する細胞を蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により濃縮した。ｍＣｈｅｒｒｙマーカーを使用して、トランスフェクション後３日目（３ｄｐｔ）に、上記蛍光タンパク質、Ｃａｓ９及び上記ｓｇＲＮＡを一過性に発現するトランスフェクションしたコーヒー細胞を分離し、ソートし、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性コーヒープロトプラストを収集した。６ｄｐｔに、５０００個のソートしたプロトプラストからＤＮＡを抽出した（Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｎ  Ｄｎｅａｓｙ抽出キット）。図４Ａに示すプライマーを使用して感度向上のためにネステッドＰＣＲを実施した。ＰＣＲ１は、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ、２μｌ  ＤＮＡ鋳型、順方向及び逆方向１プライマーを使用する６０度のアニーリング温度及び６０秒の伸長時間の２０サイクルで構成されていた。キットで供給されたＨＦ緩衝液以外には添加剤は加えなかった。ＰＣＲ２を、１μｌのＰＣＲ１からのＤＮＡ鋳型及び順方向及び逆方向２プライマーを用いる２０サイクルを使用して実施した。このアガロースゲルは、標的遺伝子において約２５０ｂｐの欠失が起こったことを示す（図４Ｂ）。
【０３３８】
ＰＣＲ産物１及び２（図４Ｂ）を製造者の手順書に従ってｐＧＥＭ−Ｔにクローニングした。各ライゲーションの５つの別個のコロニーをシークエンシングによってスクリーニングした。ベクターＮＴＩ  ａｌｉｇｎ  Ｘプログラムを使用して配列比較を実施した。図４Ｃに示すように、ＰＣＲ産物１からの配列はＷＴと同じであったが、ＰＣＲ産物２からのすべての５つのコロニーは、２つのｓｇＲＮＡ標的部位の間、ＰＡＭ部位から３ｂｐ上流に位置する２３９ｂｐの欠失を示した。配列決定したクローンを用いて、本発明者らは、レーン１（非ターゲティングｓｇＲＮＡプラスミドｐＤＫ２０２９）及びレーン２（Ｃｃ０４＿ｇ１４２８０を標的とするｓｇＲＮＡ、プラスミドｐＤＫ２０３０）から両方のクローンについて最長のペプチド配列を予測した。この２３９ｂｐの欠失は、赤色のボックスで示すように早期終止コドンを誘導した（図４Ｄ〜図４Ｅ）。
【０３３９】
候補遺伝子Ｃｃ０４＿ｇ１４２８０について上記した手順と同じ手順に従い、２つのさらなる候補遺伝子Ｃｃ０２＿ｇ０５４９０及びＣｃ１１＿ｇ００３３０を、それぞれ図５Ａ及び図６Ａに示すように、特異的ｓｇＲＮＡを用いて標的にした。両方の遺伝子、Ｃｃ０２＿ｇ０５４９０及びＣｃ１１＿ｇ００３３０について、各遺伝子を標的とする１つだけのｓｇＲＮＡをトランスフェクションベクターにクローニングした。それゆえ、何らの遺伝子編集イベントもアガロースゲルでは見えないと予想した。図５Ｂ及び図６Ｂは、それぞれ遺伝子Ｃｃ０２＿ｇ０５４９０及びＣｃ１１＿ｇ００３３０についての標的領域の増幅を示す。図５Ｂ及び図６Ｂに示すバンドをｐＧＥＭ−Ｔにクローニングし、配列決定した。ベクターＮＴＩ  ａｌｉｇｎ  Ｘプログラムを用いて実施した野生型配列との配列比較は、それぞれ図５Ｃ及び図６Ｃにある候補遺伝子Ｃｃ０２＿ｇ０５４９０及びＣｃ１１＿ｇ００３３０に沿ったインデルの存在を示した。
【０３４０】
並行して、プロトプラスト再生パイプラインを進んでいたさらなるｍＣｈｅｒｒｙプロトプラストをソートした。手短に言えば、ソートしたプロトプラストを液体媒体中において高希釈でプレーティングし、２８〜３５日間コロニー形成させた。コロニーを採集し、成長させ、２つのアリコートに分けた。１つのアリコートをＤＮＡ抽出及びゲノム編集（ＧＥ）試験並びにＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡフリー試験のために使用し、他方をその状態が検証されるまで培養液中で保った。ＧＥ及びＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡフリーであることを明確に示すものだけを次の段階へと選択した。
【０３４１】
暗所で２０日後（ＧＥ分析のために分けてから、すなわち６０日目から。従って全体で８０日目）、グルコース（０．４６Ｍ）及び０．４％アガロースに減らしたこと以外は同じ培地にコロニーを移し、低照度でインキュベーションした。６週間後、アガロースをスライスし、０．３１Ｍグルコース及び０．２％ゲルライト（登録商標）を含むプロトプラスト培地に置いた。１ヶ月後、プロトコロニー（すなわちカルス）を再生培地（半分量ＭＳ＋Ｂ５ビタミン、２０ｇ／ｌスクロース）へと継代培養した。（図７Ａ〜図７Ｅ；図８Ａ〜図８Ｂ）。
【０３４２】
図９Ａ〜図９Ｃに示すｓｇＲＮＡ配列及び構築物を使用する。
【０３４３】
本発明がその特定の実施形態と併せて説明されたが、多くの代替、改変及び変更が当業者に明らかであろうことは明白である。従って、添付の特許請求の範囲の趣旨及び幅広い範囲に入るすべてのそのような代替、改変及び変更を包含することが意図されている。
【０３４４】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許又は特許出願がそれぞれ具体的に及び個々に参照により本明細書に援用されると示されているのと同じ程度に、参照によりその全体が本明細書に援用される。加えて、本願でのあらゆる参考文献の引用又は特定は、そのような参考文献は本発明の先行技術として利用できるということの自白とは解釈されないものとする。節の見出しが使われているところでは、それらは、必ずしも限定するものではないと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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