(57)【要約】 CD96に結合するとT細胞の活性化及び/又は増殖を刺激することができるCD96結合剤が提供される。また、薬剤を産生する単離された核酸及び細胞、ならびにそれらの使用も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD96に結合するとT細胞の活性化及び/又は増殖を刺激することができる、CD96結合剤。
【請求項２】
前記CD96結合剤が、T細胞同時刺激剤及び/又はT細胞増殖剤と組み合わせてT細胞の活性化及び/又は増殖を刺激することができる、請求項1に記載のCD96結合剤。
【請求項３】
CD96結合剤が、CD96アゴニストである、請求項1又は2に記載のCD96結合剤。
【請求項４】
該結合剤のCD96への結合が、CD96の二量体化又は多量体化を誘導する、請求項１〜３のいずれか１に記載のCD96結合剤。
【請求項５】
CD96結合剤が、抗CD96抗体又はそのフラグメントである、請求項１〜４のいずれか１に記載のCD96結合剤。
【請求項６】
T細胞が、CD4+及び/又はCD8+細胞である、請求項１〜５のいずれか１に記載のCD96結合剤。
【請求項７】
該結合剤が、ヒトCD96、ヒトCD96変異体1(配列番号267)及び/又はヒトCD96変異体2(配列番号268)及び/又はアカゲザルCD96(配列番号272)に結合する、請求項１〜６のいずれか１に記載のCD96結合剤。
【請求項８】
該結合剤が、細胞外ドメインD1(配列番号269)、ドメインD2v1もしくはv2(配列番号270もしくは配列番号273)、又はドメインD3(配列番号271)中の少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する、請求項１〜７のいずれか１に記載のCD96結合剤。
【請求項９】
該結合剤が、ヒトCD96のドメインD1及びD2、ドメインD2及びD3、又はドメインD1、D2及びD3によって共有されるエピトープに特異的に結合する、請求項１〜８のいずれか１に記載のCD96結合剤。
【請求項１０】
50 nM未満、10 nM未満、若しくは1 nM未満の解離定数(KD)でヒトCD96に結合することができる、請求項１〜９のいずれか１に記載のCD96結合剤。
【請求項１１】
0.01〜50nM、0.1〜10nM、若しくは0.1〜1nMの解離定数(KD)でヒトCD96に結合することができる、請求項10に記載のCD96結合剤。
【請求項１２】
50 nM未満、10 nM未満、若しくは1 nM未満の解離定数(KD)でT細胞上で発現されるヒトCD96に結合することができる、請求項１〜１１のいずれか１に記載のCD96結合剤。
【請求項１３】
抗体が、キメラ、ヒト化又は完全ヒト抗体である、請求項5〜12のいずれか１に記載のCD96結合剤。
【請求項１４】
抗体が、抗体フラグメント、又は抗体フラグメントであるF(ab')2若しくはFabフラグメントである、請求項5〜13のいずれか1に記載のCD96結合剤。
【請求項１５】
抗体が、単一特異性抗体、二重特異性抗体又は多重特異性抗体である請求項5〜14のいずれか１に記載のCD96結合剤。
【請求項１６】
前記抗体が、配列番号1-3、13-15、61-63、73-75、85-87、109-111、145-147、157-159、169-171、181-183、193-195、205-207若しくは217-219(カバットアノテーション)又は配列番号4-6、16-18、64-66、76-78、88-90、112-114、148-150、160-162、172-174、184-186、196-198、208-210若しくは220-222(IMGTアノテーション)を有する３つのCDR配列を持つ重鎖を含み、及び/又は配列番号7-9、19-21、67-69、79-81、91-93、115-117、151-153、163-165、175-177、187-189、199-201、211-213若しくは223-225(カバットアノテーション)又は配列番号10-12、22-24、70-72、82-84、94-96、118-120、154-156、166-168、178-180、190-192、202-204、214-216若しくは226-228(IMGTアノテーション) を有する３つのCDR配列を持つ軽鎖を含む、請求項5〜15のいずれかに記載のCD96結合剤
【請求項１７】
前記抗体が、配列番号229〜244、247〜248、又は253〜266のいずれか1つに記載のアミノ酸配列である、重鎖可変ドメイン及び/又は軽鎖可変ドメインを含む、請求項16に記載のCD96結合剤。
【請求項１８】
該抗体が、Fc突然変異に対して増加したエフェクター機能若しくは増加したアゴニスト効果を有する、請求項5〜17のいずれか１に記載のCD96結合剤。
【請求項１９】
請求項1〜18のいずれか1に記載のCD96結合剤のアミノ酸配列をコードする単離核酸。
【請求項２０】
請求項1〜18のいずれか1に記載のCD96結合剤を産生する単離細胞。
【請求項２１】
請求項1〜18のいずれか１に記載のCD96結合剤と、医薬的に許容される賦形剤又は担体とを含む医薬組成物。
【請求項２２】
患者の疾患の治療に使用するための、請求項1〜18のいずれか１に記載のCD96結合剤又は請求項21に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
疾患が癌又は感染性疾患である、請求項22に記載のCD96結合剤又は医薬組成物。
【請求項２４】
治療が単独療法である、請求項22又は23に記載のCD96結合剤又は医薬組成物。
【請求項２５】
治療が併用療法である、請求項22又は23に記載のCD96結合剤又は医薬組成物。
【請求項２６】
同時刺激剤若しくは免疫チェックポイント阻害剤、又はT細胞同時刺激剤若しくは免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用するためのもので請求項25に記載のCD96結合剤又は医薬組成物。
【請求項２７】
CD96に結合する際のT細胞の活性化及び/又は増殖の刺激用である、請求項1〜18又は22〜26のいずれか1に記載のCD96結合剤、又は請求項21〜26のいずれか1に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
CD96結合剤が、T細胞同時刺激剤及び/又はT細胞増殖剤と組み合わせてT細胞を増殖させることができる、請求項27に記載のCD96結合剤又は医薬組成物。
【請求項２９】
CD96結合剤がCD96アゴニストである、請求項27又は28に記載のCD96結合剤又は医薬組成物。
【請求項３０】
前記CD96結合剤のCD96への結合が、CD96の二量体化又は多量体化を誘導する、請求項27〜29のいずれか1に記載のCD96結合剤又は医薬組成物。
【請求項３１】
T細胞がCD4+及び/又はCD8+細胞である、請求項27〜30のいずれか1に記載のCD96結合剤又は医薬組成物。
【請求項３２】
予防又は治療用ワクチンにおけるアジュバントである、請求項1〜18のいずれかに記載のCD96結合剤又は請求項21に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫細胞機能を調節(増加又は阻害)する薬剤に関する。1つの態様において、この薬剤（CD96結合剤）はCD96に結合し、そしてT細胞の活性化及び/又は増殖を刺激する。この薬剤は、種々の治療方法、特に癌又は感染性疾患の処置における使用を見出し得る。1つの態様において、この薬剤は、CD96を介したシグナル伝達を活性化する抗体又はそのフラグメント(例えば、抗CD96アゴニスト抗体)である。本発明は、単離された抗体及びその誘導体及びフラグメント;1つ以上のマウス又はキメラ抗hCD96モノクローナル抗体を含む医薬製剤;ならびにこれらの組換えモノクローナル抗体を産生する細胞株を含む。
【背景技術】
【０００２】
CD96(T細胞活性化、後期発現の増加、のためのTACTILE)は、NK細胞及びT細胞の表面に位置する免疫グロブリンスーパーファミリー受容体に属する。Igスーパーファミリーは、また、CD226(DNAXアクセサリー分子-1のためのDNAM-1)(Shibuya,A.ら、DNAM-1、Tリンパ球の細胞溶解機能に関与する新規接着分子：Immunity4,573-581(1996))、TIGIT(T細胞免疫グロブリン及びITIMドメイン)(Yu, X.ら、表面タンパク質TIGITは成熟免疫調節樹状細胞の生成を促進することによってT細胞活性化を抑制する：Nature immunology 10,48-57(2009))及びCRTAM(クラスI制限T細胞関連分子)(Kennedy,J.ら、A molecular analysis ofNKT細胞:class-I restricted T細胞関連分子(CRTAM)の同定)を含む。Journalof leukocyte biology 67,725-734(2000))。
【０００３】
ヒトCD96は、T細胞上に存在し、B細胞、モノサイト、グランサイト、血球計数装置、赤血球によって発現されることはないとされてきた(Wangら：tactileの識別と分子クローニング, Ig遺伝子スーパーファミリーに属する新規ヒトT細胞活性化抗原: J. Immunology 148, 2600-2608(1992))。20年前にクローン化されたにもかかわらず(Wang,1992)、ヒトCD96免疫受容体の機能は議論の余地がある。
【０００４】
CD96は、DNAM-I及びTIGITとCD155リガンドを共有する(Seth S.ら、マウス pan T細胞マーカーCD96は、CD155及びネクチン-1に対する接着受容体である：Biochemical and biophysical researchcommunications 364,959-965(2007))。CD96は、マウスにおいてCD111(ネクチン-1)と相互作用し、NK及びT細胞接着を促進する役割を果たすことも報告されている(Fuchs et al. Cuttingedge: CD96(tactile)は、ポリオウイルス受容体(CD155)と相互作用することによってNK細胞-標的細胞接着を促進する： J.Immunol172,3994-3998(2004))。マウスにおいて、CD96はCD155への結合についてCD226と競合するNK細胞の負の免疫調節因子として記載されている(Chanら、受容体CD96及びCD226は、ナチュラルキラー細胞機能の調節において互いに対抗する：Nature Immunology, (2014))。逆にヒトでは、CD96は、NK細胞の弱い(共)アクチベーターとして(Fuchs, 2004、Stanietskyら：TIGITとPVR及びPVRL2との相互作用はヒトNK細胞の細胞毒性を阻害する：Proc Natl AcadSci USA. 106(42): 17858-17863(2009))又はCD155との相互作用によりIFN-γ産生を阻害するNK細胞の阻害剤として(WO 2015024060、Blakeら、Molecular Pathways: Targeting CD96及びTIGIT forCancer Immunotherapy、Clin Cancer Res. 22(21):5183-5188(2016))のいずれかで記載されている。マウス及びヒトT細胞活性の調節(阻害又は活性化)に対するCD96の役割に関するデータは公表されていない。したがって、ヒトCD96の生物学はあまり記載されていないので、この受容体の作用のいくつかのメカニズムが検討されており、ヒトCD96がヒトT細胞上の同時活性化受容体であることが同定されている。
【０００５】
マウスにおいて、CD96は、主にNK細胞に対する負の免疫調節因子として、そして主にCD155相互作用についてCD226結合と競合することによって記載される(Chan,2014; Blake,2016)。CD96の阻害は、異なる癌モデルにおいて腫瘍増殖、転移を減少させ、マウスを保護する(Chan,2014; Blake,2016)。CD96の記載された効果は主にNK細胞、IFN-γ産生に対するものであり、CD226の機能に依存する。CD226は、TCRαβ+T細胞、TCRγδ+T細胞、NK細胞、単球及びB細胞のサブセット上で発現されるが、顆粒球及び赤血球上では発現されないことが記載されている(Shibuya, 1996)。
【０００６】
逆に、ヒトにおいて、CD96は、接着分子として、及びNK細胞細胞毒性の弱い同時活性化因子として記載されている(Wang, 1992; Fuchs, 2004)。Smythのグループは、CD96がヒトNK細胞によるCD155誘発型IFNγ分泌の弱い阻害因子として作用する可能性があることを示した(WO2015024060)。
【０００７】
CD96のマウス及びヒトT細胞に対する役割に関するデータは公表されていないが、CD155発現細胞を介するT細胞接着及び移行を支持するmCD96の役割、ならびに移行におけるmCD96の役割に関するデータは公表されていない(Seth, 2007)。したがって、ヒトCD96の生物学は議論の余地があり、あまり記載されていない。したがって、疾患の治療に使用するための、CD96を標的とする改善された薬剤及び方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、治療用途のために免疫細胞活性化を調節することができるCD96結合剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明はヒトCD96がT細胞上の同時刺激レセプターとして機能し得ることを初めて開示し、そしてT細胞活性及び/又は増殖を刺激し得る初めてCD96結合剤(例えば、抗CD96抗体)の同定を開示する。従って、1つの態様において、本発明はアゴニスト性抗CD96抗体(例えば、CD96結合の際にT細胞における細胞内シグナル伝達を活性化し得る抗体)を提供する。本発明によるCD96アゴニストは細胞(例えば、T細胞)を間接的又は直接的に刺激し、及び/又は細胞(例えば、T細胞)の増殖を間接的又は直接的に誘導するアゴニストである。
【００１０】
1つの態様において、本発明はCD96結合剤を提供し、ここで、この薬剤は、CD96に結合すると、T細胞の活性化及び/又は増殖を刺激し得る。
【００１１】
一実施形態では、CD96結合剤がT細胞同時刺激剤と組み合わせてT細胞の活性化及び/又は増殖を刺激することができる。好ましくは、CD96結合剤はCD96アゴニストである。一実施形態では、薬剤のCD96への結合がCD96の二量体化又は多量体化を誘導する。好ましくは、T細胞はCD4+又はCD8+細胞である。別の実施形態では、CD96結合剤がヒトにおけるT細胞の活性化及び/又は増殖を刺激することができる。
【００１２】
好ましくは、本発明のCD96結合剤が、ヒトCD96、より好ましくはヒトCD96変異体1(配列番号267)及び/又はヒトCD96変異体2(配列番号268)及び/又はアカゲザルCD96(配列番号272)に結合する。一実施形態では、薬剤がヒトCD96の細胞外ドメインD1(配列番号269)、ドメインD2v1又はv2アイソフォーム(配列番号270又は273)、ドメインD3(配列番号271)又はドメインD4(配列番号274)中の少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する。例えば、薬剤は、ヒトCD96のドメインD1及びD2、又はドメインD2及びD3によって共有されるエピトープに特異的に結合し得る。
【００１３】
好ましい実施形態では、CD96結合剤が50 nM未満、好ましくは10 nM未満、最も好ましくは1 nM未満の解離定数(KD)でヒトCD96に結合することができる。例えば、CD96結合剤は、0.01〜50nM、好ましくは0.1〜10nM、最も好ましくは0.1〜1nMの解離定数(KD)でヒトCD96に結合することができる。
【００１４】
別の実施形態では、CD96結合剤が、CD155へのCD96の結合を少なくとも部分的に阻害する。例えば、CD96結合剤は、ヒトCD155へのヒトCD96の結合を、50nM未満、好ましくは25 nM未満、最も好ましくは10 nM未満のIC50値で阻害し得る。より好ましくは、CD96結合剤が、0.01〜50nM、好ましくは0.1〜25nM、最も好ましくは1〜10nMのIC50値でヒトCD155へのヒトCD96の結合を阻害する。
【００１５】
代替の実施形態では、CD96結合剤はCD155へのCD96の結合を阻害しないか、又はCD96結合剤はCD155へのCD96の結合を弱くのみ阻害する。例えば、一実施形態では、CD96結合剤がヒトCD155へのヒトCD96の結合の阻害について、50 nM以上、好ましくは100 nM以上、最も好ましくは200 nM以上のIC50値を有する。
【００１６】
一態様では、CD96結合剤が抗体、抗体フラグメント、抗体模倣物、抗体模倣物フラグメント、ナノボディ又は小分子阻害剤を含むリストから選択される。
【００１７】
特定の局面において、CD96結合剤は、抗体又はその抗体フラグメントである。さらなる態様において、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体である。別の実施形態では抗体は抗体フラグメントであり、好ましくは、抗体フラグメントはF(ab')2又はFabフラグメントである。別の実施形態では、抗体が単一特異性抗体、二重特異性抗体、又は多重特異性抗体である。
【００１８】
別の態様では、CD96結合剤が抗体模倣物又はその抗体模倣フラグメントである。特に、前記抗体模倣体は、アフィボディ分子、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、DARPin、フィノマー、モノボディ、アプタマー、ベータヘアピン模倣体、非免疫グロブリンスカフォールド、又は融合タンパク質を含む群から選択される。
【００１９】
さらに別の態様では、CD96結合剤はナノボディである。別のさらなる実施形態において、CD96結合剤は、抗体-薬物抱合体である。別のさらなる態様では、CD96結合剤が抗体足場融合フォーマット、例えば、Mabfilin又はFabfilinである。
【００２０】
好ましい実施形態において、抗体は、配列番号1-3、13-15、61-63、73-75、85-87、109-111、145-147、157-159、169-171、181-183、193-195、205-207又は217-219(Kabat注釈)又は配列番号4-6、16-18、64-66、76-78、88-90、112-114、148-150、160-162、172-174、184-186、196-198、208-210又は220-222(IMGT注釈)に記載される3つのCDR配列を有する重鎖、及び/又は配列番号7-9、19-21、67-69、79-81、91-93、115-117、151-153、163-165、175-177、187-189、199-201、211-213又は223-225(Kabat注釈)又は配列番号10-12、22-24、70-72、82-84、94-96、118-120、154-156、166-168、178-180、190-192、202-204、214-216又は226-228(IMGT注釈)。全ての配列番号及び対応する配列を表5に列挙する。
【００２１】
別の実施形態では、抗体が配列番号229〜232、239〜244、247〜248、又は253〜266のいずれか1つに記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び/又は軽鎖可変ドメインを含む。
【００２２】
別の態様において、本発明は、上記のCD96結合剤のアミノ酸配列をコードする単離された核酸を提供する。CD96結合剤を産生する単離された細胞も提供される。
【００２３】
別の態様において、本発明は、上記のCD96結合剤及び薬学的に受容可能な賦形剤又は担体を含む薬学的組成物を提供する。
【００２４】
別の態様において、本発明は、患者における疾患の処置のための使用のための、上記のCD96結合剤又は医薬組成物を提供する。好ましくは、疾患は癌又は感染性疾患である。
【００２５】
一実施形態では治療は単独療法であり、アゴニストCD96結合剤は腫瘍微小環境又は慢性感染症環境においてインビボで増殖するようにT細胞を刺激するために単独で使用されてもよい。このような様式でT細胞を刺激するために単独で使用され得るアゴニスト抗体の実施例としては、抗CD28、抗CD27、抗CD137、抗GITR、抗OX40及び抗ICOSが挙げられる(Sanmamedら、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28及びICOSに対する癌免疫療法における同時刺激のアゴニスト：Seminars in oncology.42(4):640-655(2015))が、これらに限定されない。
【００２６】
別の実施形態では、治療は併用療法である。例えば、本発明のCD96結合剤は、刺激剤、T細胞刺激又は増殖剤、T細胞同時刺激剤、又は免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用され得る。
【００２７】
さらなる実施形態において、CD96結合剤は、T細胞刺激剤又は増殖剤と組み合わせて使用され得る。T細胞刺激又は増殖剤には、抗CD3モノクローナル抗体、酢酸塩ミリスチンホルボール及びイオノマイシン、ブドウ球菌エンテロトキシンなどのスーパー抗原、トキシンショック症候群毒素1、剥脱性毒素、連鎖球菌発熱性毒素、又はコムギ胚芽凝集素もしくはフィトヘマグルチニンなどの凝集素が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
別の実施形態において、CD96結合剤は、T細胞同時刺激剤と組み合わせて使用され得る。T細胞同時刺激剤には、抗CD28、抗ICOS、抗CD226、抗CD40L、抗CD27、抗HVEM、抗OX40、抗CD137又は抗GITRモノクローナル抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
別の実施形態において、CD96結合剤は、刺激剤と組み合わせて使用され得る。
刺激剤には抗CD40又は抗HVEMモノクローナル抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
さらに別の実施形態において、CD96結合剤は、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用され得る。免疫チェックポイント阻害剤には、抗CEACAM1、抗TIM3、抗CD80、抗BTLA、抗CD160、抗VISTA、抗PD1、抗HVEM、抗CTLA4、抗PDL1又は抗TIGITモノクローナル抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
別の例において、CD96結合剤は、癌細胞又は免疫抑制細胞殺傷剤と組み合わせて使用され得る。例えば、癌細胞又は免疫抑制細胞殺傷剤は、放射線療法又は化学療法剤であってもよい。化学療法剤にはアルキル化剤、窒素マスタード、ニトロソウレア、白金剤、代謝拮抗剤、天然産物、抗腫瘍抗生物質、アントラサイクリン、エピポドフィロトキシン、ビンカアルカロイド、タキサン及びカンプトテシン類似体が含まれるが、これらに限定されない。癌細胞又は免疫抑制細胞殺傷剤は、上記に列挙した任意のタイプの化学療法剤に関連する抗体薬物抱合体であってもよい。別の実施形態において、癌細胞又は免疫抑制細胞殺傷剤は、シグナル伝達経路の阻害剤/アンタゴニスト/デコイであり得る。
標的シグナル伝達経路にはEGFR及びMAPキナーゼ、PI3K、Akt、mTOR、ALK及びROS、細胞代謝、オートファジー、アポトーシス、ならびに血管新生が含まれるが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、癌細胞又は免疫抑制細胞殺傷剤は、DNA損傷修復系の阻害剤又はアンタゴニストであり得る。DNA修復系の経路には相同組換え、ミスマッチ修復、ヌクレオチド切除修復、DNA鎖架橋修復及び非相同末端結合が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、CD96結合剤は、感染性疾患を処置するための薬剤と組み合わせて使用され得る。感染症の治療には抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤及び抗寄生虫剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
別の態様において、本発明は、CD96に結合した際のT細胞の活性化及び/又は増殖の刺激のための、本発明の異なる実施形態によるCD96結合剤又は医薬組成物の使用を提供する。さらなる実施形態において、前記使用は、CD96結合剤がT細胞同時刺激剤及び/又はT細胞増殖剤と組み合わせてT細胞を増殖させることができることを特徴とする。なおさらなる実施形態において、CD96結合剤は、CD96アゴニストである。なおさらなる実施形態において、前記使用は、薬剤のCD96への結合がCD96の二量体化又は多量体化を誘導することを特徴とする。別の実施形態では、前記使用は、T細胞がCD4+及び/又はCD8+T細胞であることを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ヒトPBMCサブセットにおけるCD96及びCD226の発現(A、B及びC)及び共発現(D及びE)。抗CD96(クローン628211)及び抗CD226(クローンDX11)抗体を用いて、CD56+(NK及びNKT細胞)、CD3+(T及びNKT細胞)、CD3+CD4+T細胞、CD3+ CD8+T細胞、CD14+(単球)及びCD19+(B細胞)上でのCD96及びCD226の共発現をフローサイトメトリーにより検討した。A及びC)異なる細胞集団におけるCD96及びCD226を発現する細胞の%。B)異なる集団におけるCD96のMFI。D)示された細胞サブセットについてCD96及びCD226を共発現する細胞の%。E)示された細胞サブセットの各々について、CD226陽性細胞のうちCD96を発現する細胞の%。データは、健康なドナーからの4〜13の独立したサンプルから得られた。
【００３４】
【図２】ヒトナイーブ及び記憶CD4+及びCD8+T細胞におけるCD96及びCD226の発現。CD226及びCD96の発現を、精製PBMC(n=4)からゲートされた（得られた）CD3+CD4+及びCD3+CD8+T細胞上でのFCMによる多重染色によって分析した。記憶T細胞を、CD45RO抗原の発現によってさらに同定した。異なるT細胞サブセット上のCD96及びCD226の蛍光強度中央値(MedFI)をあとのパネルに示す。
【００３５】
【図３】抗CD3活性化ヒトCD4+及びCD8+記憶T細胞におけるCD96及びCD226の発現の増加。健康なドナーから精製したPBMCを、可溶性抗CD3 mAbOKT3で活性化した。示された異なる時点で、細胞を回収し、抗CD4、抗CD8及び抗CD45RO抗体、ならびに抗CD96又は抗CD226抗体で染色した。CD45RO+記憶及びCD45RO-ナイーブ細胞上のCD96及びCD226の平均蛍光強度(MFI)を、CD4+及びCD8+T細胞上のFCMによって測定する。
【００３６】
【図４】健常個体のヒト循環CD4+Treg及び従来のCD4+T細胞におけるhCD96及びhCD226の発現。CD226及びCD96の発現を、精製PBMC(n=4)からゲートされた（得られた）従来の及び調節CD4+T細胞上でフローサイトメトリーによって分析した。従来の(細い破線:アイソタイプ対照、太い平線:抗CD226又は抗CD96)及び調節T細胞(黒い灰色:アイソタイプ対照、太い破線:抗CD226又は抗CD96)上のCD226(左)及びCD96(右)発現のフローサイトメトリーオーバーレイヒストグラムを示す。CD25hi CD127lo CD4+調節T細胞(白四角)及びCD25loCD127+CD4+従来型T細胞(白丸)上のCD226(左)又はCD96(右)の蛍光の中央値を示す。
【００３７】
【図５】FRETアッセイによるhCD96のホモ二量体化及びヘテロ二量体化。CHOを(A)hCD226‐His,(B)hCD226‐His及びhTIGIT‐Myc、(C)hCD96‐HA及び(D)hCD96‐HA及びhCD226‐Hisでトランスフェクトした。24時間後、細胞を(A)抗hCD226-PE(クローンDX11)及び抗hCD226-APC(クローンDX11)、(B)抗hCD226-PE(クローンDX11)及び抗hTIGIT-APC(クローン741182)、(C)抗HA-PE(クローンGG8-1F3.3.1)及び抗HA-APC(クローンGG8-1F3.3.1)及び(D)抗hCD226-PE(クローンDX11)及び抗HA-APC(クローンGG8-1F3.3.1)で、別々にプールし(右パネル、FRETの陰性対照)、又は同時に(左パネル)標識した。
【００３８】
【図６】ヒトCD96トランスフェクトCHO細胞(hCD96v2、短アイソフォーム)に対する抗hCD96抗体の結合プロフィール。hCD96v2を発現するCHO細胞を、示されたmIgG1又はmIgG2a抗CD96又はアイソタイプ対照抗体の連続希釈と共にインキュベートした。+4℃でのインキュベーション及び洗浄の後、抗体の結合を、PE結合抗mIgG抗体の添加によって明らかにし、そしてフローサイトメトリーによって定量した。結果は、抗体で染色した細胞と抗体を含まない細胞との間の平均蛍光強度(デルタMFI)の差として表される。ドーズ応答曲線は、可変勾配モデル(4つのパラメータ)を用いた非線形回帰フィットを用いて、GraphPadプリズムソフトウェアから得た。読みを簡単にするために、種々の抗hCD96候補からの結果を4つの異なるパネルに示す。
【００３９】
【図７】アカゲザルCD96でトランスフェクトしたCHO細胞に対する抗CD96抗体の結合プロフィール。抗CD96抗体又は対応するアイソタイプ対照mAbを、フローサイトメトリーによってCHO細胞上で一過性に発現されるアカゲザルCD96を認識する能力について試験した。各ヒストグラムは1μg/ml(黒線)及び10μg/ml(太い破線の黒線)で試験した各抗体について得られた蛍光強度のオーバーレイ（重ね合わせ）を表し、アイソタイプ対照(塗りつぶされた灰色のヒストグラム)で得られた蛍光と比較したものである。
【００４０】
【図８】抗CD96抗体によるCHO細胞上で発現されたhCD96へのhCD155結合の阻害(2つの独立した実験の平均)。hCD96v2を発現するCHO細胞を、ビオチン化hCD155-Fcの存在下で、示された抗CD96又はアイソタイプ対照抗体の連続希釈と共にインキュベートした。+4℃でのインキュベーション及び洗浄後、hCD155のCHO細胞への結合を、FITC結合ストレプトアビジンの添加によって明らかにし、フローサイトメトリーによって定量した。結果を、CD96へのCD155結合の阻害%として表す。ドーズ応答曲線は、可変勾配モデル(4つのパラメータ)を用いた非線形回帰フィットを用いて、GraphPadプリズムソフトウェアから得た。読み取りを単純化するために、種々の抗ヒトCD96クローンからの結果を4つの異なるパネルに示す。
【００４１】
【図９】(A)健康なドナーから単離されたヒトT細胞(左パネル)及びNK細胞(右パネル)に対する抗hCD96候補及びベンチマークの結合。結果は、各抗CD96抗体で測定した蛍光とアイソタイプ対照抗体(10μg/mLで試験した抗体)で測定したMFIとの間の平均蛍光強度(デルタMFI)の差を示す。各抗体について、個々のデータポイントは、3人の健康なドナーから単離された細胞で得られた値を表す。(B)4人の患者から得られた頭頸部腫瘍から抽出された腫瘍浸潤リンパ球におけるCD96の発現(HN314、315、306及び316)。評価した各リンパ球サブセット(CD8+T細胞、NK細胞、Treg細胞及び従来のCD4+T細胞)について、オーバーレイヒストグラムは、アイソタイプ対照(灰色陰影)及び抗CD96 mAb(太い黒線)によるバックグラウンド染色を示す。
【００４２】
【図１０】異なる抗CD96候補によって認識されるCD96エピトープのマッピング。hCD96v2の完全配列又はhCD96v2の異なる細胞外ドメイン(D1〜D3)又はそれらの組み合わせ(D1D2、D1D3又はD2D3)のいずれかを含む発現プラスミドを、CHO-S細胞に一時的にトランスフェクトした。各一過性トランスフェクトを、異なる抗CD96候補で間接的に染色し、フローサイトメトリーによって分析した。試験した各抗CD96についての3〜4回の独立した実験から得られた染色CHO-Sトランスフェクトの中央値%を表す。
【００４３】
【図１１】固定化抗CD96候補BL006-4-20は、抗CD3抗体を用いてヒトCD4+及びCD8+T細胞活性化を同時刺激する。代表的な健康なドナー(ドナー#1)から単離され、0.1又は1ng/mLの可溶性OKT3の存在下、抗CD96候補BL006-4-20又は10μg/mLでコーティングされたアイソタイプ対照mAbの有無にかかわらず培養されたPBMC中のCD4+及びCD8+T細胞上のCD25の発現によって、T細胞活性化を測定した。CD25発現を、CD3+/CD4+及びCD3+/CD8+ゲートT細胞での培養の3日後にFCMによって測定した。縦の破線は、ヒストグラムの各セット上のCD25陽性についての閾値を示す。
【００４４】
【図１２】固定化された抗CD96候補は、抗CD3抗体を用いてヒトCD4+及びCD8+T細胞活性化を同時刺激する。代表的な健康なドナー(ドナー#1)から単離されたPBMCの培養開始後3日目のFCMによるCD4+及びCD8+T細胞上のCD25の発現によって、T細胞活性化を測定する。PBMCを、0.1又は1ng/mLの可溶性抗CD3 OKT3と共に(灰色のバー)又は10μg/mLの固定化抗CD96候補なしで(白色のバー)培養した。アイソタイプ対照抗体を10μg/mLで固定化して試験した(白色バー)。結果を、CD3+/CD4+及びCD3+/CD8+T細胞集団内のCD25陽性細胞の%として表す。移植片上で、破線はOKT3のみによる刺激後のCD25+細胞の%を示し、単純な線は、OKT3及びアイソタイプ対照抗体による刺激後のCD25+細胞の%を示す。
【００４５】
【図１３】抗hCD96候補BL006-4-20によるCD4+及びCD8+T細胞増殖の同時刺激。健康なドナー由来のPBMCをCFSEで標識し、10μg/mLの抗CD96 BL006-4-20抗体又は対照アイソタイプ抗体でコーティングしたプレート上で0.1、1又は10ng/mLのOKT3の存在下で培養した。3日後、細胞を回収し、CD4+及びCD8+T細胞上のFCMによってCFSEの希釈を測定した。縦の破線は、ヒストグラムの各セット上のCFSE希釈についての閾値を示す。
【００４６】
【図１４】抗hCD96候補によるCD4+及びCD8+T細胞増殖の同時刺激。2人の健康なドナーからのPBMCをCFSEで標識し、10μg/mLの抗CD96抗体(灰色バー)、参照抗CD96抗体(NK92.39、斜線バー)又は対照アイソタイプ抗体(白色バー)でコーティングしたプレート上で0.1ng/mLのOKT3(白色バー)の存在下で培養した。3日後、細胞を回収し、CD4+及びCD8+T細胞上のFCMによってCFSEの希釈を測定し、分裂細胞の%を決定した。結果を、2人の独立したドナー(ドナー#2及び#3)を用いた2回の実験からの3連の平均+/-SDとして表す。グラフト上で、破線はOKT3のみによる刺激後の分裂細胞の%を示し、単純な線はOKT3及びアイソタイプ対照抗体による刺激後の分裂細胞の%を示す。
【００４７】
【図１５】最適濃度以下のOKT3を有する抗hCD96候補によるCD4+及びCD8+T細胞増殖の同時刺激。健康なドナーからのPBMCをCFSEで染色し、プラスチック固定化抗CD96 mAb、アイソタイプ対照、又は参照抗CD96抗体(NK92.39)(すべて10μg/mL)上で、0.1ng/mLの可溶性OKT3の存在下で培養した。CD4+及びCD8+分裂T細胞の%を、培養開始後3、4及び5日目に、CFSEの希釈を示す細胞の%を測定することによって、FCMによって測定した。結果を3連の平均+/-SDとして表す。グラフト上に現れていないエラーバーは、エラーバーが記号より小さいことを示す。
【００４８】
【図１６−１】抗CD96候補抗体によるCD4+T細胞増殖の同時刺激。健康なドナー由来のPBMCをCFSEで染色し、プラスチック固定化抗CD96 mAb(灰色バー)又はアイソタイプ対照マウスIgG2a(白色バー)mAb(10μg/mL)、又は可溶性抗CD28 mAb(斜線バー)、参照抗CD96(NK92.39、斜線バー)又はアイソタイプ対照マウスIgG 1(白色バー)mAb(すべて10μg/mL)上で、0.1、0.3又は1ng/mLの可溶性OKT3の存在下で培養した。CD4+分裂T細胞の%を、CFSEの希釈を示す細胞の%を測定することによって、培養開始後4日目にFCMによって測定した。上のパネルは分裂細胞の%を示し、中央パネルは各培養条件について測定したCFSEの強度を示し、下のパネルは試験した3つのOKT3濃度について得られた結果の要約である。下のパネルの読みを簡単にするために、種々の抗ヒトCD96候補からの結果を4つの異なるパネルに示す。結果を3連の平均+/-SDとして表す。グラフト上に現れていないエラーバーは、エラーバーが記号より小さいことを示す。
【図１６−２】同上
【００４９】
【図１７−１】抗CD96候補抗体によるCD8+T細胞増殖の同時刺激。健康なドナー由来のPBMCをCFSEで染色し、プラスチック固定化抗CD96 mAb(灰色バー)又はアイソタイプ対照マウスIgG2a(白色バー)mAb(10μg/mL)、又は可溶性抗CD28 mAb(斜線バー)、参照抗CD96(NK92.39、斜線バー)若しくはアイソタイプ対照マウスIgG 1(白色バー)mAb(すべて10μg/mL)上で、0.1、0.3又は1ng/mLの可溶性OKT3の存在下で培養した。CD8+分裂T細胞の%を、CFSEの希釈を示す細胞の%を測定することによって、培養開始後4日目にFCMによって測定した。上のパネルは分裂細胞の%を示し、中央パネルは各培養条件について測定したCFSEの強度を示し、下のパネルは試験した3つのOKT3濃度について得られた結果の要約である。下のパネルの読みを簡単にするために、種々の抗ヒトCD96候補からの結果を4つの異なるパネルに示す。結果を3連の平均+/-SDとして表す。グラフト上に現れていないエラーバーは、エラーバーが記号より小さいことを示す。
【図１７−２】同上
【００５０】
【図１８】抗CD96候補抗体による精製T細胞の同時刺激。健康なドナー由来のPBMCを使用して、磁気細胞選別によってT細胞を精製した。精製したCD4+及びCD8+T細胞をCFSEで染色し、プラスチック固定化抗CD96 mAb(灰色バー)若しくはアイソタイプ対照マウスIgG2a(白色バー)mAb(10μg/mL)上で2μL/mL四量体CD3/CD28抗体(ImmunoCult(商標))を用いて又は用いずに培養した。CD4+若しくはCD8+分裂T細胞の%を、CFSEの希釈を示す細胞の%を測定することによって、培養開始後5日目にFCMによって測定した。結果は、2つの独立した実験において2人のドナーから得られた3連の平均+/-SDとして表される。グラフト上で、破線はImmunoCult(商標)のみによる刺激後の分裂細胞の%を示し、単純な線は、ImmunoCult(商標)+アイソタイプ対照抗体による刺激後の分裂細胞の%を示す。
【００５１】
【図１９】最適濃度以下のOKT3での抗hCD96候補によるCD4+及びCD8+T細胞増殖の同時刺激、及びCD226又はCD155の遮断。健康なドナー由来のPBMCをCFSEで染色し、1ng/mLの可溶性OKT3及び25μg/mLのCD226(DX11)又はCD155(SKII.4)に対する可溶性ブロッキング抗体又は必要に応じてアイソタイプ対照の存在下で、プラスチック固定化抗CD96 mAb又はアイソタイプ対照(10μg/mL)上で培養した。CD4+及びCD8+細胞分裂は、CD4+又はCD8+T細胞上のCFSEの蛍光強度(MedFI)の中央値を測定することによって、培養開始後4日目にFCMによって評価した。結果を3連の平均+/-SDとして表す。グラフト上で、破線はOKT3のみによる刺激後のCFSE MedFIを示し、単純な線は、OKT3+アイソタイプ対照抗体による刺激後のCFSE MedFIを示す。
【００５２】
【図２０】CD96シグナルの時間的要件。健康なドナーからのPBMCを使用して、磁気細胞選別によってT細胞を精製した。精製CD4+及びCD8+T細胞をCFSEで染色し、プラスチック固定化抗CD96 mAb(灰色バー)又はアイソタイプ対照マウスIgG2a(点線バー)mAb(10μg/mL)上で、2μL/mL四量体CD3/CD28抗体(白色バー、ImmunoCult(商標))とともに、同時に(D0)又はday1、2又は3(それぞれD1、D2及びD3)で培養した。CD4+又はCD8+分裂T細胞の%を、CFSEの希釈を示す細胞の%を測定することによって、培養開始後5日目にFCMによって測定した。結果を3連の平均+/-SDとして表す。グラフト上で、破線はImmunoCult(商標)のみによる刺激後の分裂細胞の%を示し、単純な線は、ImmunoCult(商標)+アイソタイプ対照抗体による刺激後の分裂細胞の%を示す。
【００５３】
【図２１】可溶性キメラIgG1抗hCD96候補(CHG1)によるCD4+及びCD8+T細胞増殖の、最適以下の濃度のOKT3との同時刺激。健康なドナー由来のPBMCをCFSEで染色し、0.1又は0.3ng/mLの可溶性OKT3の存在下で、可溶性抗CD96 mAb(灰色のプレーンバー)又は2つの異なるアイソタイプ対照(白色バー)mAb(1μg/mL)とともに培養した。この実験で評価した各CHG1クローンについて、対応するFc-サイレントバージョン(灰色のハッチングバー、CHS1)を試験した。4日後、細胞を回収し、CD4+及びCD8+T細胞上のFCMによってCFSEの希釈を測定し、分裂細胞の%を決定した。結果を、2〜4人の異なる健康なドナーから得られた3連の平均+/-SDとして表す。グラフト上で、破線はOKT3のみによる刺激後の分裂細胞の%を示し、単純な線はOKT3及びアイソタイプ対照抗体による刺激後の分裂細胞の%を示す。
【００５４】
【図２２】最適以下の濃度のImmunocultTMでプレート結合キメラIgG1抗hCD96候補による腫瘍浸潤リンパ球(TIL)増殖の同時刺激。2人の患者から外科的に摘出した頭頸部腫瘍をTIL抽出のために処理した。回収したTILを、漸増濃度のImmunocultTM(白色バー)の存在下で培養した。次最適の濃度のImmunocult(3μL/mL)を用いて、プレート結合候補BL006-19-134CHG1(5μg/mL)の同時刺激効果を試験した。5日間の共培養後、TIL増殖を3〔H〕チミジン取り込み(16時間パルス)によって評価した。結果を3連の平均+/-SDとして表す。グラフにおいて、破線の水平線は、3μL/mL OKT3 ImmunocultTMのみによる刺激後のCPMを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明は、T細胞を活性化するCD96結合剤を提供する。好ましい実施形態において、CD96結合剤は、抗体又はそのフラグメントである。しかしながら、代替のCD96結合剤、例えば、CD96、好ましくはヒトCD96に結合するアプタマー、オリゴヌクレオチド、模倣物、ペプチド又は小分子量化合物、又はそれらの組み合わせもまた、本発明の範囲内である。一実施形態では、CD96結合剤がCD96に対する可溶性受容体、例えば、CD96に結合するCD155の可溶性断片(モノマー又はオリゴマー形態)である。
【００５６】
CD96結合剤は、T細胞の活性化及び/又は増殖を刺激する。これは、T細胞(又はそのサブセット)がインビトロ又はインビボのいずれかで、CD96結合剤の存在下で増加した活性化及び/又は増殖を示すことを意味する。T細胞の活性化及び/又は増殖は例えば以下の実施例に記載されるように、標準的なアッセイによって測定され得る。例えば、T細胞活性化はT細胞活性化マーカー(例えば、CD25、CD69、CD137又はCD107a)の増加した発現によって測定され得、そしてT細胞増殖は蛍光色素(例えば、CFSE)で予め標識された分裂T細胞における色素希釈の分析によって測定され得る。いくつかの実施形態において、T細胞は例えば、ヘルパーT細胞又は細胞傷害性T細胞(CD4+T細胞又はCD8+T細胞)であり得る。
【００５７】
T細胞の増加した活性化及び/又は増殖はCD96結合剤単独の存在下、例えば、インビボ腫瘍環境において、又はさらなる薬剤と組み合わせたCD96結合剤の存在下のいずれかで生じ得る。例えば、1つの実施形態において、CD96結合剤はT細胞活性化/増殖を同時刺激し、すなわち、CD96結合剤は、さらなる薬剤(T細胞同時刺激剤)と組み合わせて、T細胞活性化及び/又は増殖を刺激する。
【００５８】
好ましくはT細胞の活性化及び/又は増殖(例えば、T細胞活性化マーカー及び/又は蛍光色素希釈の発現によって決定される)はCD96結合剤の存在下(例えば、CD96結合剤及びT細胞同時刺激剤の存在下)で、CD96結合剤の非存在下(例えば、T細胞同時刺激剤単独の存在下)でのT細胞の活性化及び/又は増殖と比較して、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%又は少なくとも100%増加する。好ましくはCD96結合剤が、100 nM未満、10 nM未満、5 nM未満、又は1 nM未満のEC50値でT細胞活性化及び/又は増殖を刺激する。
【００５９】
好ましい実施形態では、CD96結合剤は、CD96アゴニストである。CD96アゴニストはCD96(好ましくはヒトCD96)に結合し、CD96を介してシグナル伝達を刺激し、それによってT細胞の活性化及び/又は増殖を促進する薬剤である。例えば、アゴニストは、CD96に結合し得、そしてCD96タンパク質においてコンホメーション変化を生成し得、それによって、CD96を介する細胞内シグナル伝達を促進する。いくつかの実施形態ではCD96結合剤がCD96の二量体化又は多量体化を誘導することができ、例えば、CD96への薬剤の結合はCD96のホモ二量体又は多量体への会合、又はCD226などのさらなる細胞表面タンパク質と組み合わせたCD96のヘテロ二量体又は多量体への会合をもたらすことができる。CD96の二量体化又は多量体化は標準的な技術を使用して、例えば、以下の実施例に記載されるような蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を使用して検出され得る。
【００６０】
いくつかの実施形態では、CD96結合剤が抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。1つの態様において、本発明は、CD96に特異的に結合し得るマウス、キメラ、ヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体、及びこのような抗体を産生する細胞株に関する。
【００６１】
いくつかの他の態様において、CD96結合剤は、抗体模倣物又は抗体模倣物フラグメントである。抗体模倣物は、種々の抗原に特異的に結合し得る有機化合物又は足場タンパク質である。抗体模倣物の実施例には、アフィボディ分子、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、DARPin、フィノマー、モノボディ、アプタマー、ベータヘアピン模倣物、非免疫グロブリンスカフォールド、又は融合タンパク質が含まれる。
【００６２】
「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体(全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び所望の生物学的活性を示す限り抗体断片を特に包含する。「抗体」(Ab)及び「免疫グロブリン」(Ig)は、同じ構造特性を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンには抗体と、抗原特異性を欠いている抗体様分子との両方が含まれる。後者の種類のポリペプチドは例えば、リンパ系によっては低いレベルで、そして骨髄腫によっては高いレベルで生産される。
【００６３】
「エピトープ」とは、抗体のパラトープが結合する抗原上の任意の抗原決定基を意味する。エピトープ決定基はアミノ酸や糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面グルーピングから成り、特定の三次元構造特性及び特定の電荷特性をもつのが普通である。
【００６４】
「天然抗体及び免疫グロブリン」は、通常、約15万ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、2つの同一の軽(L)鎖及び2つの同一の重(H)鎖から構成される。各軽鎖は、1つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結され、一方、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。各重鎖及び軽鎖はまた、規則的に間隔を空けた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、末端に可変ドメイン(VH)を有し、続いて多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、末端に可変ドメイン(VL)を有し、他端に定常ドメインを有する;軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第1定常ドメインとアラインされ、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインとアラインされる。特定のアミノ酸残基は、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。(Chothia C、NovotnyJ、Bruccoleri R、及びKarplus M、免疫グロブリン分子におけるドメイン会合、可変ドメインのパッキング、J. Mol. Biol. 186:651-63(1985); Novotny J. and Haber E、抗原結合の構造不変量:免疫グロブリンVL-VH及びVL-VLドメインダイマーの比較、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.82:4592-96(1985))。
【００６５】
用語「可変」は、可変ドメインのある部分が抗体の中で配列決定においてかなり異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性において用いられる。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一には分布していない。これは、相補性決定領域(CDR)又は超可変領域(いずれも、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインに存在している)と呼ばれる3つのセグメントの中に集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク(FR)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、βシート構造を連結し、場合によってはβシート構造の一部を形成するループを形成する3つのCDRによって連結された、主にβシート配置をとる4つのFR領域を含む。各鎖のCDRはFR領域によって近接して一緒に保持され、他の鎖からのCDRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(KABAT注釈、Kabat E.A.免疫学的関心のタンパク質の配列決定、第5版、National Institutes of Health, Bethesda,MD(1991)を参照のこと)か、又はIMGT注釈についてはhttp://www.imgt.orgを参照のこと)。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性(ADCC)における抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
【００６６】
抗体のパパイン消化は、２つの同じ抗原結合フラグメント(「Fab」フラグメントと呼ばれ、これらは各々、1つの抗原結合部位を含む)と、残りの「Fc」フラグメント(この名前は容易に結晶化する能力を反映する)とを生じる。ペプシンでの処理によって、2つの抗原結合部位を有し且つ抗原を架橋することができるF(ab')2フラグメントが生じる。
【００６７】
「Fv」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片であり、2本鎖Fv種では、この領域が1つの重鎖可変ドメイン及び1つの軽鎖可変ドメインのダイマーからなり、密接に非共有結合しており、単鎖Fv種(scFv)では1つの重鎖可変ドメイン及び1つの軽鎖可変ドメインが軽鎖及び重鎖が2本鎖Fv種のそれに類似した「ダイマー」構造で会合することができるように、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合することができる。この立体構造においては、個々の可変ドメインの3つのCDRが相互作用して、VH-VL二量体の表面に抗原結合部位の輪郭を形成する。まとめると、6個のCDRによって、抗体に対する抗原結合特異性が付与される。しかし、1つの可変ドメイン(又は抗原に特異的なCDRを3つしか含まないFvの半分)もなお、完全な結合部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し結合する能力を有している。scFvのレビューについては、Plurckthun A.、Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag,New York, vol. 113, pp. 269-315(1994)の「モノクロナールアンチボディの薬理学」のEscherichia coliからのAntibodiesを参照のこと。 
【００６８】
Fabフラグメントもまた軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一の定常ドメインを含有する。Fab'フラグメントは、重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端における少数の残基(抗体ヒンジ領域に由来する1つ以上のシステイン)の添加によって、Fabフラグメントとは異なる。Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基(単数又は複数)が遊離のチオール基を有しているFab'についての本明細書中での名称である。F(ab')2抗体フラグメントは、もともと、その間にヒンジシステインを有しているFab'フラグメントの対として生産された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも知られている。
【００６９】
免疫グロブリンには5つの主要なクラス: IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMがあり、これらのいくつかはサブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。種々のクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び3次元構造は周知である。
【００７０】
「抗体断片」及びその全ての文法的変異体は、本明細書で使用される場合、インタクトな抗体の抗原結合部位又は可変領域を含むインタクトな抗体の一部として定義され、その部分はインタクトな抗体のFc領域の定常重鎖ドメイン(すなわち、抗体アイソタイプに応じて、CH2、CH3、及びCH4)を含まない。抗体フラグメントの例には、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、及びFvフラグメント;ダイアボディ;連続するアミノ酸残基の1つの連続した配列を有するポリペプチドである任意の抗体フラグメント(本明細書では「単鎖抗体フラグメント」又は「単鎖ポリペプチド」と呼ぶ)、(1)単鎖Fv(scFv)分子、(2)1つの軽鎖可変ドメインのみを含有する単鎖ポリペプチド、又は関連する重鎖部分を含有しない軽鎖可変ドメインの3つのCDRを含有するそのフラグメント、及び(3)1つの重鎖可変領域のみを含有する単鎖ポリペプチド、又は関連する軽鎖部分を含有しない重鎖可変領域の3つのCDRを含有するそのフラグメントを限定なしに含み;及び抗体フラグメントから形成される多特異的又は多価構造が含まれる。1つ以上の重鎖を含む抗体フラグメントにおいて、重鎖はインタクトな抗体の非Fc領域において見出される任意の定常ドメイン配列(例えば、IgGアイソタイプにおけるCH1)を含み得、そして/又はインタクトな抗体において見出される任意のヒンジ領域配列を含み得、そして/又は重鎖のヒンジ領域配列又は定常ドメイン配列に融合されるか又は位置するロイシンジッパー配列を含み得る。
【００７１】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」(mAb)という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る可能性のある天然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対して向けられる。各mAbは、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養又は哺乳動物細胞系によって合成され得るという点で有利である。修飾「モノクローナル」は抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、不死化B細胞又はそのハイブリドーマにおいて作製され得るか、又は組換えDNA方法によって作製され得る。
【００７２】
本明細書中のモノクローナル抗体は、抗CD96抗体の可変(超可変を含む)ドメインを定常ドメイン(例えば、「ヒト化」抗体)とスプライシングすることによって、又は軽鎖を重鎖とスプライシングすることによって、又は1つの種由来の鎖を別の種由来の鎖とスプライシングすることによって、又は異種タンパク質と融合させることによって産生される組換え抗体、ならびに抗体フラグメント(例えば、Fab、F(ab')2、及びFv)を所望の生物学的活性を示す限り、異種タンパク質との融合を含む。
【００７３】
本明細書中のモノクローナル抗体は、特に、重鎖及び/又は軽鎖の一部が特定の種に由来するか、又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列決定と同一であるか、又は相同である一方で、鎖の残りが、別の種に由来するか、又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列決定と同一であるか、又は相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、ならびに所望の生物学的活性を示す限り、このような抗体のフラグメントを含む。
【００７４】
本発明のCD96結合剤(例えば、抗体)は、単離された形態で使用され得る。「単離された」抗体は、同定され、かつその天然環境の成分から分離され及び/又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分は抗体の診断的又は治療的使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質（solute）を含み得る。いくつかの実施形態において、抗体は、(1)ローリー法によって決定されるように75重量%を超える抗体まで、最も好ましくは80重量%、90重量%又は99重量%を超える抗体まで、又は(2)クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を使用する還元又は非還元状態でSDS-PAGEによって均質に精製される。単離された抗体とは、その抗体の天然環境の少なくとも1つの成分が存在しないので組換え細胞中でインサイチュに存在する抗体を包含する。しかし、通常は、単離された抗体が少なくとも1つの精製工程によって調製される。
【００７５】
一態様では、本発明が0.01〜50nM、例えば0.18〜42.3 nMの範囲の解離定数(KD)でヒトCD96に結合するマウス及びキメラ又はヒト化マウス-ヒトモノクローナル抗体を提供する。抗体のいくつかは、ヒトCD4+及びCD8+T細胞の活性化及び増殖を同時刺激する。これらのアゴニスト抗体は、癌又は感染性疾患を有する患者における免疫応答を刺激するための使用を見出す。開示された抗体のいくつかは、CD96-CD155相互作用を破壊又は阻害し、T細胞機能の調節において機能的役割を有し得る。
【００７６】
抗ヒトCD96(hCD96)抗体を、hCD96をコードするDNAでプライミングし、ヒトCD96を提示する細胞株で追加免疫することにより、マウスを免疫化することによって生成した。次いで、脾臓及びリンパ節から単離されたB細胞を、ISAAC(ImmunoSpotArrayAssayon Chip)によってスクリーニングして、hCD96に結合する抗体の大きなパネルを単離した。生成された抗体の大きな多様性により、以前に開示されていない新規な生物学的活性を有する抗hCD96候補が同定された。
【００７７】
19の抗ヒトCD96抗体が産生され、そしてインビトロで特徴付けられている。9つの候補は、5.92〜19.42 nMの範囲のIC50及び98〜100%の最大阻害能で、CD96とCD155との間の相互作用を強く阻害した。候補BL006-4-20を含む3つのmAbは、50%より低い最大阻害能でCD96/CD155相互作用を阻害した(部分的阻害剤)。
【００７８】
ヒトCD4+及びCD8+T細胞の活性化及び増殖に対して強力な同時刺激活性を有する抗CD96候補を同定した。13の候補(表4を参照のこと)は、最適以下の濃度の抗CD3抗体OKT3で活性化された末梢血T細胞の同時刺激を示した。重要なことに、他の研究グループ(Fuchs et al.,2004; WO2015024060)によって使用されたベンチマーク抗hCD96 NK92.39抗体は、同じインビトロアッセイにおいて有意な同時刺激活性を示さなかった。
【００７９】
本発明の抗CD96抗体のいくつかはヒト及びアカゲザルCD96に結合するが、他はヒトに限定される。交差反応性は前臨床開発、例えば、同じモデルにおいて有効性及び安全性試験を受ける能力に関して利点を表す。
【００８０】
従って、ヒトCD96発現T細胞に対して特異的活性化活性を有する新規抗体が、本発明において同定された。従って、これらの抗体は、単独で、又はチェックポイント阻害剤又は癌を処置するための他の治療薬と組み合わせて、T細胞応答を刺激するための治療薬として使用され得る。
【００８１】
表1: 候補番号で示される選択された候補、抗体名、重鎖(VH)配列番号の可変領域、及び軽鎖(VL)配列番号の可変領域: 
【表１】
2020530859.tif 000002
【００８２】
表2: 候補番号で示される選択された候補、抗体名、重鎖(VH)配列番号のCDR及び軽鎖(VL)配列番号のCDR(KABAT注釈): 
【表２】
2020530859.tif 000003
【００８３】
表3: 候補番号で示される選択された候補、抗体名、重鎖(VH)配列番号のCDR及び軽鎖(VL)配列番号のCDR(IMGT注釈): 
【表３】
2020530859.tif 000004
【００８４】
本発明の抗体は、以下の特徴の少なくとも1つを有し得る:T細胞活性化及び/又は増殖の刺激(同時刺激を含む)、(例えば、ヒト又はアカゲザル)CD96への結合、(例えば、ヒト)CD96の作動性、T細胞での(例えば、ヒト)CD96上の二量体化又は多量体化の誘導、(例えば、ヒト)CD155のCD96への結合の阻害、及び、例えば、異種移植マウスモデルにおける腫瘍増殖の阻害。
【００８５】
以下の段落では、候補抗体がいくつかの場合には便宜上省略することができる表1〜3に与えられた名称によって言及され、例えば、BL006-4-31G1-31K3をBL006-4-31と呼ぶことができ、BL006-19-183G3-183K4をBL006-19-183と呼ぶことができ、以下同様である。いくつかの実施形態では、抗体が表1〜3に記載される候補のうちの1つ、又はその変異体、例えば、上記抗体のうちの1つからの1つ以上のCDR配列又は可変領域を含む抗体である。
【００８６】
好ましい実施形態において、抗体は、ヒトCD96への結合に対して高い親和性を有する。例えば、一実施形態では、抗体が例えば10 nM未満のEC50値でヒトCD96(例えば、変異体2、短いアイソフォーム、配列番号268)に結合する。11の候補は、CD96(BL006-4-31、BL006-19-183、BL006-19-190、BL006-19-134、BL006-19-21、BL006-19-55、BL006-19-352、BL006-19-363、BL006-19-370、BL006-19-14、BL006-19-29)に強く結合することが見出された。したがって、いくつかの実施形態では、抗体が上記の候補のうちの1つ又はその変異体、例えば、上記の抗体のうちの1つからの1つ以上のCDR配列又は可変領域を含む抗体である。
好ましい抗体は、1つ以上のCDR配列（例えば、３つの重鎖と３つの軽鎖CDR配列）又は重及び/又は軽鎖可変ドメインを含み以下から選ばれる；配列番号109-120、247、248(BL006-4-31);85-96、243、244(BL006-19-183);181-192、259、260(BL006-19-190);73-84、241、242(BL006-19-134);145-156、253、254(BL006-19-21);169-180、257、258(BL006-19-55);193-204、261、262(BL006-19-352);205-216、263、264(BL006-19-363);217-228、265、266(BL006-19-370);61-72、239、240(BL006-19-14);及び157-168、255、256(BL006-19-29)。
【００８７】
別の実施形態では抗体がヒトCD96の長い形態、すなわち変異体1、配列番号267に対して高い親和性を有し、例えば、抗体はヒトCD96変異体1でトランスフェクトされたCHO細胞上でのフローサイトメトリー分析によって決定された10 nM未満のEC50値と結合する、8つの候補もまた、ヒトCD96の長い形態(CD96v1)に強く結合することが見出された(BL006-19-183、BL006-19-14、BL006-19-29、BL006-2-19、BL006-11-5、BL006-4-61、BL006-9-1、BL006-8-3、BL006-9-15)。したがって、いくつかの実施形態では、抗体が上記の候補のうちの1つ又はその変異体、例えば、上記の抗体のうちの1つからの1つ以上のCDR配列又は可変領域を含む抗体である。
好ましい抗体は、1つ以上のCDR配列（例えば、３つの重鎖と３つの軽鎖CDR配列）又は重及び/又は軽鎖可変ドメインを含み以下から選ばれる；配列番号85-96、243、244(BL006-19-183);61-72、239、240(BL006-19-14);157-168、255、256(BL006-19-29);97-108、245、246(BL006-2-19);49-60、237、238(BL006-11-5);25-36、233、234(BL006-4-61);121-132、249、250(BL006-9-1);37-48、235、236(BL006-8-3);133-144、251、252(BL006-9-1)。
【００８８】
別の実施形態において、抗体は、ヒトT細胞及び/又はNK細胞に強く結合する。したがって、いくつかの実施形態では、抗体が上記の候補のうちの1つ又はその変異体、例えば、上記の抗体のうちの1つからの1つ以上のCDR配列又は可変領域を含む抗体である。
好ましい抗体は、1つ以上のCDR配列決定（例えば、３つの重鎖と３つの軽鎖CDR配列）又は重及び/又は軽鎖可変ドメインを含み以下から選ばれる；配列番号1-12、229、230(BL006-4-20G5)、13-24、231、232(BL006-4-52G6)、109-120、247、248(BL006-4-31);85-96、243、244(BL006-19-183);181-192、259、260(BL006-19-190);73-84、241、242(BL006-19-134);145-156、253、254(BL006-19-21);169-180、257、258(BL006-19-55);193-204、261、262(BL006-19-352);205-216、263、264(BL006-19-363);217-228、265、 266(BL006-19-370); 61-72、 239、240(BL006-19-14); 及び157-168、255、256(BL006-19-29)。
【００８９】
別の実施形態では抗体はアカゲザルCD96に対して高い親和性を有し、例えば、抗体はアカゲザルCD96(配列番号: 272)をトランスフェクトしたCHO細胞において、フローサイトメトリー分析によって決定された10 nM未満のEC50値と結合する。8つの抗体はアカゲザルCD96を強く認識する(BL006-4-31、BL006-19-352、BL006-19-14、BL006-19-29、BL006-4-52、BL006-2-19、BL006-4-61、BL006-9-1)。したがって、いくつかの実施形態では、抗体が上記の候補のうちの1つ又はその変異体、例えば、上記の抗体のうちの1つからの1つ以上のCDR配列又は可変領域を含む抗体である。
好ましい抗体は、1つ以上のCDR配列決定（例えば、３つの重鎖と３つの軽鎖CDR配列）又は重及び/又は軽鎖可変ドメインを含み以下から選ばれる；配列番号109-120、247、248(BL006-4-31);193-204、261、262(BL006-19-352);61-72、239、240(BL006-19-14);157-168、255、256(BL006-19-29);13-24、231、232(BL006-4-52);97-108、245、246(BL006-2-19);25-36、233、234(BL006-4-61);121-132、249、250(BL006-9-1)。
【００９０】
従って、好ましい実施形態において、抗体はCD96の1つ以上の形態(例えば、ヒトCD96改変体1及び2、又はヒトCD96及びアカゲザルCD96)に結合する。ヒト及びアカゲザルCD96と交差反応する好ましい抗体は1つ以上のCDR配列(例えば、3重鎖及び3軽鎖CDR配列)、又は配列番号61〜72、239、240(BL006-19-14);109-120、247、248(BL006-4-31);157-168、255、256(BL006-19-29);及び193-204、261、262(BL006-19-352)から選択される重鎖及び/又は軽鎖可変ドメインを含む。
【００９１】
別の実施形態では、抗体がCD155のCD96への結合を阻害する。例えば、抗体はフローサイトメトリーによって決定されるように、20 nM未満のIC50値で、CHO細胞上で発現されるhCD96v2へのhCD155の結合を阻害し得る。9つの候補は、5.9〜19.4 nMの範囲のIC50値を有するhCD155のhCD96v2への結合を強く阻害した(候補BL006-4-31、BL006-19-21、BL006-19-183、BL006-19-190、BL006-19-134、BL006-19-55、BL006-19-352、BL006-19-363、BL006-19-370)。これらの9つの抗CD96候補は、このアッセイにおいてクローン628211及びNK92.39抗体に類似していた。したがって、いくつかの実施形態では、抗体が上記の候補のうちの1つ又はその変異体、例えば、上記の抗体のうちの1つからの1つ以上のCDR配列又は可変領域を含む抗体である。
好ましい抗体は、1つ以上のCDR配列決定（例えば、３つの重鎖と３つの軽鎖CDR配列）又は重及び/又は軽鎖可変ドメインを含み以下から選ばれる；配列番号109-120、247、248(BL006-4-31);145-156、253、254(BL006-19-21);85-96、243、244(BL006-19-183);181-192、259、260(BL006-19-190);73-84、241、242(BL006-19-134);169-180、257、258(BL006-19-55);193-204、261、262(BL006-19-352);205-216、263、264(BL006-19-363);217-228、265、266(BL006-19-19-370)。
【００９２】
別の実施形態では、抗体はCD155のCD96への結合を部分的に阻害する。「部分的に阻害する」又は「部分的阻害剤」とは抗体が過剰濃度の抗体で利用可能なCD155/CD96結合部位の100%未満を阻害することを意味し、例えば、抗体はCD155/CD96結合の95%未満、90%未満、80%未満、70%未満、60%未満又は50%未満を最大限に阻害する。例えば、3つの候補(BL006-4-20、BL006-19-14及びBL006-19-29)はCD96に結合するCD155の部分的阻害剤であることが見出され、最大阻害能は50%未満であったが、相対IC50値は2.67〜5.24 nMであった。したがって、いくつかの実施形態では、抗体が1つ以上のCDR配列 (例えば、3重鎖及び3軽鎖CDR配列決定)、又は配列番号1-12、229、230(BL006-4-20);61-72、239、240(BL006-19-14);及び157-168、255、256(BL006-19-29)から選択される重鎖及び/又は軽鎖可変ドメインを含む。
【００９３】
別の実施形態では、抗体はCD155のCD96への結合を阻害しない。例えば、6つの候補(BL006-4-52、BL006-4-61、BL006-11-5、BL006-8-3、BL006-9-1及びBL006-9-15)はCD96/CD155相互作用を阻害しなかった。
好ましい抗体は1つ以上のCDR配列決定(例えば、3重鎖及び3軽鎖CDR配列決定)、又は配列番号13-24、231、232(BL006-4-52);25-36、233、234(BL006-4-61);49-60、237、238(BL006-11-5);37-48、235、236(BL006-8-3);121-132、249、250(BL006-9-1)及び133-144、251、252(BL006-9-15)から選択される重鎖及び/又は軽鎖可変ドメインを含む。
【００９４】
別の実施形態において、抗体は、CD96タンパク質のD1ドメインに結合する。例えば、1つの候補(BL006-19-183)は、CD96のD1ドメインに結合する。好ましい抗体は1つ以上のCDR配列決定(例えば、3重鎖及び3軽鎖CDR配列決定)、又は配列番号85-96、243、244(BL006-19-183)から選択される重鎖及び/又は軽鎖可変ドメインを含む。
【００９５】
別の実施形態において、抗体は、CD96タンパク質のD1ドメイン及びD2ドメインに結合する。例えば、9候補(BL006-4-31、BL006-4-20、BL006-19-190、BL006-19-21、BL006-19-55、BL006-19-370、BL006-19-363、BL006-19-352及びBL006-19-134)はCD96のD1及びD2ドメインに結合する。
好ましい抗体は、1つ以上のCDR配列決定（例えば、３つの重鎖と３つの軽鎖CDR配列）又は重及び/又は軽鎖可変ドメインを含み以下から選ばれる；配列番号109-120、247、248(BL006-4-31);1-12、229、230(BL006-4-20);181-192、259、260(BL006-19-190);145-156、253、254(BL006-19-21);169-180、257、258(BL006-19-55);217-228、265、266(BL006-19-370);205-216、263、264(BL006-19-363);193-204、261、262(BL006-19-352)及び73-84、241、242(BL006-19-134)。
【００９６】
別の実施形態において、抗体は、CD96タンパク質のD2ドメイン及びD3ドメインに結合する。例えば、2つの候補(BL006-19-14及びBL006-19-29)は、CD96のD2及びD3ドメインに結合する。
好ましい抗体は1つ以上のCDR配列決定(例えば、3重鎖及び3軽鎖CDR配列決定)、又は配列番号61-72、239、240(BL006-19-14)及び157-168、255、256(BL006-19-29)から選択される重鎖及び/又は軽鎖可変ドメインを含む。
【００９７】
別の実施形態において、抗体は、CD96タンパク質のD3ドメインに結合する。例えば、2つの候補(BL006-4-52及びBL006-2-19)がCD96のD3ドメインに結合する。
好ましい抗体は1つ以上のCDR配列決定(例えば、3重鎖及び3軽鎖CDR配列決定)、又は配列番号13-24、231、232(BL006-4-52)及び97-108、245、246(BL006-2-19)から選択される重鎖及び/又は軽鎖可変ドメインを含む。
【００９８】
別の実施形態において、抗体は、CD96タンパク質のD4ドメインに結合する。例えば、5つの候補(BL006-4-61、BL006-8-3、BL006-9-1、BL006-9-15及びBL006-11-5)はCD96のD4ドメインに結合したが、T細胞の活性化又は増殖は示さなかった。
好ましい抗体は1つ以上のCDR配列決定(例えば、3重鎖及び3軽鎖CDR配列決定)、又は配列番号25-36、233、234(BL006-4-61);37-48、235、236(BL006-8-3);121-132、249、250(BL006-9-1);133-144、251、252(BL006-9-15)及び49-60、237、238(BL006-11-5)から選択される重鎖及び/又は軽鎖可変ドメインを含む。
【００９９】
別の実施形態において、本発明の実施形態のいずれか1つによる抗体は、T細胞の増殖を同時活性化し得、そしてD1ドメイン、又はD1ドメイン及びD2ドメイン、又はD2ドメイン及びD3ドメイン、又はD3ドメインのいずれかに存在するエピトープに結合する。例えば、このような抗体は最適以下の濃度のT細胞刺激剤又は増殖剤(例えば、抗CD3抗体)を用いて、CD4+及び/又はCD8+T細胞を同時活性化し得る。活性化された細胞のパーセンテージは例えば、CD25のようなT細胞マーカーの増加した発現、CFSE染色の希釈、及び/又は分裂細胞の数に相関する3[H]-チミジンの取り込みを測定することによって測定され得る。好ましくは、抗体の同時刺激活性が低濃度の抗CD3抗体(例えば、0.1ng/ml以下)で観察される。BL006-4-31、BL006-4-20、BL006-19-14、BL006-19-190、BL006-19-21、BL006-19-55、BL006-19-370、BL006-19-363、BL006-19-352、BL006-19-29、BL006-19-183、BL006-19-134及びBL006-4-52はT細胞刺激活性を示した。したがって、いくつかの実施形態では、抗体が上記候補のうちの1つのキメラ、ヒト化、又は操作されたバージョンである。
別の実施形態において、抗体は、可溶性形態として使用される。したがって、いくつかの実施形態では、抗体が上記の候補のうちの1つ又はその変異体、例えば、上記の抗体のうちの1つからの1つ以上のCDR配列又は可変領域を含む抗体である。
好ましい抗体は、1つ以上のCDR配列決定（例えば、３つの重鎖と３つの軽鎖CDR配列）又は重及び/又は軽鎖可変ドメインを含み以下から選ばれる；配列番号109-120、247、248(BL006-4-31);1-12、229、230(BL006-4-20);61-72、239、240(BL006-19-14);181-192、259、260(BL006-19-190);145-156、253、254(BL006-19-21);169-180、257、258(BL006-19-55);217-228、265、266(BL006-19-370);205-216、263、264(BL006-19-363);193-204、261、262(BL006-19-352);157-168、255、256（BL006-19-29）;85-96、243、244(BL006-19-183);73-84、 241、242(BL006-19-134);及び13-24、 231、232(BL006-4-52)。
【０１００】
好ましい候補は、ヒト化抗体及びそれに由来するさらに操作された抗体を含む、上記に定義された抗体の1つ以上である。例示的な抗体(本明細書では、通常、候補NO又は抗体名によって言及される)のCDR(KABAT(表2)及びIMGT(表3)注釈)及び可変領域(表1)が提供される(IMGT注釈が好ましい)。目的の抗体はこれらの提供された組み合わせ、ならびに、例えば、F(ab)'抗体を生成するための、可変領域と定常領域の適切な定常領域又はフラグメントとの融合を含む。目的の可変領域は提供される抗CD96抗体の少なくとも1つのCDR配列決定を含み、ここで、CDRは、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又はそれ以上のアミノ酸であり得る。あるいは、目的の抗体が提供される抗体に記載される可変領域、又は本明細書に記載される可変領域配列の対を含む。これらの抗体は例えば、任意のアイソタイプ(例えば、lgG1、lgG2、lgG3、lgG4、IgA)のヒト免疫グロブリン定常領域を有する全長抗体であり得る。
抗体はIgG1であることが好ましく、すなわち抗体は、本発明の抗体のアゴニスト及び他のエフェクター機能を増強するFc部分(Zhang D、GoldbergM.V.及びChiu M.L、抗OX40抗体のアゴニスト及びエフェクター機能を増強するFcエンジニアリングアプローチ、The journal of biological chemistry,291(53):27134-27146(2016); Saxena A.及びWu, D、治療的Fcエンジニアリングの進歩-IgG関連エフェクター機能及び血清半減期の調節、Frontiers in Immunology, 12(7):580(2016))などのヒトIgG1定常領域を含む。本発明の他の好ましい抗体は、抗体の多量体化を付与する抗体である。
【０１０１】
表4:  抗ヒトCD96候補特性の要約 
【表４】
2020530859.tif 000005
-: FCMによる結合なし;+/-:FCMによる弱い結合;+:FCMによる結合;++FCMによる強い結合。
【０１０２】
CD96結合剤(例えば、抗体)は例えば、抱合体の形態で、さらなる活性剤に結合され得る。抱合体は例えば、1つ以上の活性剤(例えば、抗体フラグメント)の1つ以上のポリマー分子への共有結合によって形成される不均一分子であり得、ここで、不均一分子は水溶性であり、すなわち、血液のような生理学的流体に可溶性であり、そしてここで、不均一分子は、任意の構造化凝集体を含まない。所望の抱合体はPEGである。前述の定義の文脈において、用語「構造化凝集体」は(1)不均一分子がミセル又は他のエマルジョン構造になく、脂質二重層、小胞又はリポソームに固定されないような、回転楕円体又は回転楕円体シェル構造を有する水溶液中の分子の任意の凝集体;及び(2)水相と接触したときに不均一分子を溶液中に放出しない、クロマトグラフィービーズマトリックスのような、固体又は不溶化形態の分子の任意の凝集体を指し、したがって、本明細書で定義される用語「抱合体」は、固体の水和時に不均一分子を水溶液中に放出することができる沈殿物、沈殿物、生体侵食性マトリックス又は他の固体中の前述の不均一分子を包含する。
【０１０３】
CD96結合剤(例えば、抗体)は、エピトープタグ化され得る。本明細書中で使用される場合、用語「エピトープタグ」は、「エピトープタグ」に融合された抗CD96抗体をいう。エピトープタグポリペプチドは抗体が作製され得るエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、CD96抗体の活性を妨害しないように十分に短い。エピトープタグは好ましくはエピトープに特異的な抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように、十分に特異的である。適切なタグポリペプチドは一般に、少なくとも6アミノ酸残基、通常は約8〜50アミノ酸残基(好ましくは約9〜30残基)を有する。例としては、c-mycタグ及びそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10が挙げられる(Evan G.I、Lewis G.K、RamsayG、ら「ヒトc-mycプロトオンコジーン生成物に特異的なモノクローナル抗原の単離」、Mol.Cell. Biol. 5(12):3610-3616(1985));ならびにHerpes Simplex virus糖タンパク質D(gD)タグ及びその抗原(Paborsky L.R、Fendly B.M、FisherK.L、ら「抗原産生のための組織因子のマンマリアン細胞過渡発現」、タンパク質工学3(6):547-553(1990))。
【０１０４】
さらなる標識をCD96結合剤に付着させてもよい。「標識」という用語は本明細書中で使用される場合、薬剤(例えば、抗体)に直接的又は間接的に結合される検出可能な化合物又は組成物をいう。標識はそれ自体で検出可能であってもよく(例えば、放射性同位元素標識又は蛍光標識)、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変化を触媒してもよい。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、CD96結合剤は、固相に付着され得る。「固相」とは、本発明の薬剤(例えば、抗体)が付着し得る非水性マトリックスを意味する。本明細書に包含される固相の例には、ガラス(例えば、制御細孔ガラス)、多糖類(例えば、アガロース)、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから部分的又は全体的に形成されるものが含まれる。特定の実施形態では状況に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを含むことができ、他の実施形態ではそれは精製カラム(例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム)である。この用語には、U.S. Pat No.4,275,149に記述されているような離散粒子の不連続な固体相も含まれる。。
【０１０６】
本明細書中に開示されるCD96結合剤(例えば、抗体)は疾患の処置において、特に哺乳動物(例えば、ヒト)において使用され得る。「治療」とは治療及び予防薬又は予防薬の両方の手段をいい、治療を必要とするものには既に障害を有しているもの並びに障害を予防すべきものが含まれる。治療の目的のための「哺乳動物」とはヒト、飼育動物及び家畜、並びに動物園の、スポーツ用の又はペット用の動物(イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等)を含む哺乳動物に分類されるあらゆる動物をいう。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０１０７】
本発明のCD96結合剤(例えば、モノクローナル抗体)は、癌及び感染症治療における、T細胞の活性化及び/又は増殖を増加させるために投与され得る。例えば、CD96結合剤(例えば、抗体)組成物は、癌免疫療法におけるT細胞の活性化及び/又は増殖を増加させるために投与され得る。
【０１０８】
別の実施形態において、抗CD96結合剤は癌又は慢性感染症関連抗原に対するT細胞応答をさらに刺激するために、予防ワクチン又は治療ワクチンに対するアジュバントとして使用され得る。ワクチンの実施例としてはペプチドワクチン、タンパク質ワクチン、ウイルスベースのワクチン、DNAベースのワクチン、RNAベースのワクチン、自己樹状細胞ベースのワクチン、同種腫瘍細胞ワクチン及び樹状細胞ベースのワクチンが挙げられるが、これらに限定されない(Melero et al. Therapeutic vaccines forcancer: an overview of clinical trials. Nature reviews. Clinical oncology.11(9):509-524(2014)) 
【０１０９】
本発明のCD96結合剤(例えば、ヒト化又はキメラモノクローナル抗体)及び場合により薬学的に適切な賦形剤又は担体を含む、癌の治療に使用するための医薬組成物も提供される。
【０１１０】
好ましい実施形態において、本発明のCD96結合剤(例えば、抗体)は、単独療法として、又は他の抗癌剤(単数又は複数)と組み合わせて、癌又は他の腫瘍状態の症状の処置、進行の遅延、再発の予防、又は軽減において使用され得る(併用療法)。本明細書中で使用される場合、用語「癌」「新生物」及び「腫瘍」は互換可能である。癌の例としては胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、膵臓癌、肝癌、腎癌、甲状腺癌、脳癌、頭頸部癌、血液癌、癌腫、黒色腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、神経膠芽腫などが挙げられるが、これらに限定されない。固形腫瘍には、例えば、胃腫瘍、乳房腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、膀胱腫瘍、結腸直腸腫瘍、膵臓腫瘍、肝臓腫瘍、腎臓腫瘍、甲状腺腫瘍、脳腫瘍、頭頸部腫瘍、食道腫瘍及び黒色腫腫瘍などが含まれる。癌及び他の腫瘍性障害に関連する症状には炎症、発熱、全身倦怠感、疼痛、食欲不振、体重減少、浮腫、頭痛、疲労、発疹、貧血、筋力低下及び筋肉疲労が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
併用療法はサイトカイン及び成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、及び/又は細胞傷害性剤又は細胞増殖抑制剤などの化学療法剤又は抗腫瘍剤などの、1つ又は複数の追加の治療剤と共製剤化され、かつ/又は共投与される、本発明の1つ又は複数のCD96結合剤(例えば、抗体)を含むことができる。この文脈における「併用」という語は薬剤が実質的に同時に、同時に又は連続して与えられることを意味する。例示的な化学療法剤としては、アルデスロイキン、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、カルボプラチン、カルムスチン、シスアプリド、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン(DTIC)、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ドロナビノール、デュオカルマイシン、エトポシド、フィルグラスチム、フルダラビン、ゲムシタビン、グラニセトロン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、インターフェロンアルファ、イリノテカン、ランソプラゾール、ロイコボリン、メゲストロール、メソトレキサート、メトクロプラミド、ミトマイシン、ミトキサントロン、オメプラゾール、オンダンセトロンが挙げられるが、これらに限定されない。パクリタキセル(taxol(商標))、ピロカルピン、サプロイン、タモキシフェン、タキソール、トポテカン塩酸塩、ビンブラスチン、ビンクリスチン及び酒石酸ビノレルビンが、限定されず、含まれる。
【０１１２】
本発明のCD96結合剤(例えば、抗体)は患者のヘマトクリットを増加させる薬剤、例えば、エリスロポエチン刺激剤(ESA)の有効用量と組み合わせることができる。このような薬剤は例えば、Aranesp(登録商標)、Epogen(登録商標)NF/Procrit(登録商標)NF、Omontys(登録商標)、Procrit(登録商標)などを含む、当技術分野で公知であり、使用される。
【０１１３】
他の実施形態では、本発明のCD96結合剤(例えば、抗体)は、制限するのではなく、以下のFDA承認モノクローナル抗体を含む癌治療に使われる、他の抗体の有効量と併用できる:リツキシマブ(Rituxan(登録商標)、CD20:キメラIgG1)、トラスツズマブ(Herceptin(登録商標)、HER2:キメラIgG1)、アレムツズマブ(Campath(登録商標)、CD52:ヒト化IgG1)、イブリツモマブチクセタン(Zevaline(登録商標)、CD20:マウス、放射性標識(Yttrium 90)、トシツモマブ-I-131(Bexxar(登録商標):CD20、マウス、IgG2a、放射性標識(ヨウ素131))、セツキシマブ(Erbitux(登録商標)、EGFR:キメラ、IgG1)、ベバシズマブ(Avastin(登録商標)、VEGF:ヒト化、IgG4)、パニツムマブ(VectibixEGFR:ヒトIgG2、オファツムマブ(Arzerra(登録商標)、CD20:ヒトIgG1)、イピリムマブ(Yervoy(登録商標)、CTLA-4:ヒトIgG1)、ブレンツキシマブベドチン(Adcetris(登録商標)、CD30:キメラ、IgG1、薬物抱合体)、ペルツズマブ(Perjeta(登録商標)、HER2:ヒト化IgG1)、アドトラスツズマブエムタンシン(Kadcyla(登録商標))HER2:ヒト化、IgG1、薬物抱合体)、オビナツズマブ(Gazyva(登録商標)、CD20:ヒト化及びグリコール操作)、ニボルマブ及びペンブロリズマブ(抗PD-1s)など。トラスツズマブはHER-2抗原を標的とする。この抗原は、乳癌の25%〜35%及び転移性胃癌に見られる。トラスツズマブは、HER2過剰発現乳癌の治療、及びHER2過剰発現転移性胃及び胃食道接合部腺癌の治療に承認されている。セツキシマブは、転移性結腸直腸癌、転移性非小細胞肺癌及び頭頸部癌の治療に使用される。ニボルマブ及びペンブロリズマブは、転移性黒色腫及び非小細胞肺癌を治療するために最近承認されている。肺がん、腎細胞がん、リンパ腫、中皮腫を対象とした臨床試験が実施されている。現在臨床試験又は研究中の他がん治療薬も併用できる。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、抗CD96抗体は、T細胞刺激剤又は増殖剤、例えば、抗CD3抗体と組み合わせて使用され得る。いくつかの他の実施形態では、抗CD96抗体がT細胞同時刺激剤、例えば、CD28などのT細胞同時刺激分子に結合する薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、T細胞同時刺激剤は、抗CD28、抗ICOS、抗CD226、抗CD40、抗OX40、抗CD137、抗GITR、又は抗CD27抗体であり得る。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、抗CD96抗体をチェックポイント阻害剤と組み合わせることができる。例えば、チェックポイント阻害剤は、プログラムされた死(death)-1(PD-1)経路の阻害剤、例えば、ニボルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ又はペンブロリズマブなどの抗PD1抗体であってもよい。別の実施形態では、チェックポイント阻害剤が抗細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4(CTLA4)抗体、例えば、イピリムマブ又はトレメリムマブである。
【０１１６】
免疫チェックポイントは、免疫反応を減速又は停止させ、免疫細胞の制御されていない活性からの過剰な組織損傷を防止する阻害経路である。「チェックポイント阻害剤」とは、阻害経路を阻害し、より広範な免疫活性を可能にする、任意の小分子化学化合物、抗体、核酸分子、又はポリペプチド、又はそれらのフラグメントを意味する。特定の実施形態ではチェックポイント阻害剤がプログラムされた死-1(PD-1)経路の阻害剤、例えば、ニボルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ又はペンブロリズマブなどの抗PD1抗体であるが、これらに限定されない。他の実施形態では、チェックポイント阻害剤が抗細胞傷害性Tリンパ球関連抗原(CTLA-4)抗体である。さらなる実施形態ではチェックポイント阻害剤がBTLA、LAG3、ICOS、PDL1又はKIRなどのCD28/CTLA4Igスーパーファミリーの別のメンバーを標的とする(Page D.B、Postow M.A、Callahan M.K、Allison J.P.及びWolchok、J.、Immune modulation in cancer with antibodies、AnnualReview of Medicine、65:185-202(2014)。 さらなる追加の実施形態ではチェックポイント阻害剤がCD40、OX40、4-1BB、GITR、又はCD27などのTNFRスーパーファミリーのメンバーを標的とする。場合によっては、チェックポイント阻害剤を標的とすることは阻害抗体又は類似の分子を用いて達成される。他の場合において、それは標的に対するアゴニストを用いて達成され;このクラスの例は、刺激標的4-1BB、OX40及びGITRを含む。
【０１１７】
好ましい組み合わせは、本発明のCD96抗体と、i)免疫チェックポイント阻害剤又はii)腫瘍関連抗原に対する抗体との組み合わせである。
例示される組み合わせは本明細書において、Herceptin(登録商標)及びErbitux(登録商標)について記載され、ここで、Herceptin(登録商標)との組み合わせはその相加的、協同的、又はおそらく相乗効果のために好ましい。他の薬剤もまた、組み合わせるのに有用であり得る。
【０１１８】
本発明のCD96結合剤(例えば、モノクローナル抗体)は、それらが液相で利用され得るか、又は固相キャリアに結合され得るインビトロイムノアッセイにおいて使用され得る。さらに、これらのイムノアッセイにおけるモノクローナル抗体は、種々の方法で検出可能に標識され得る。本発明のモノクローナル抗体を利用することができるイムノアッセイのタイプの例はフローサイトメトリー、例えば、FACS、MACS、免疫組織化学、直接又は間接形式の競合及び非競合イムノアッセイなどである。本発明のモノクローナル抗体を使用して抗原を検出するには、生理学的サンプルに対する免疫組織検定を始めとして、正、逆若しくは同時モードで実施するイムノアッセイを利用することができる。当業者は過度の実験なしに、他のイムノアッセイ形式を知っているか、又は容易に識別することができる。
【０１１９】
本発明のCD96結合剤(例えば、モノクローナル抗体)は、多くの異なるキャリアに結合され得、そしてCD96発現細胞の存在を検出するために使用され得る。周知の担体の例は、ガラス、ポリススチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース及び磁鉄鉱を含む。担体の性質は、本発明の目的のために可溶性であっても不溶性であってもよい。当業者は、モノクローナル抗体を結合するための他の適切な担体を知っているか、又は日常的な実験を使用して、このようなものを確かめることができる。
【０１２０】
当業者に公知の多くの異なる標識及び標識方法が存在し、これらは、治療方法におけるトレーサーとしての使用、診断方法における使用などのための使用を見出す。診断目的のために、標識は、本発明の抗体又はそのフラグメント(CDR配列からなるか又はそれを含むフラグメントを含む)に共有結合又は非共有結合で付着され得る。本発明で用いることができる標識の種類の例には、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物、及び生物発光化合物が含まれる。当業者は本発明のCD96結合剤(例えば、モノクローナル抗体)に結合するための他の適切な標識を知っているか、又は日常的な実験を用いてそれを確認することができる。さらに、本発明のCD96結合剤(例えば、モノクローナル抗体)へのこれらの標識の結合は、当業者が一般的な標準的な技術を用いて行うことができる。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、CD96結合剤(例えば、モノクローナル抗体又はそのフラグメント)は例えば、イメージングにおける使用のために、ナノ粒子に付着される。有用なナノ粒子は例えば、Raman-シリカ金ナノ粒子(R-Si-Au-NP)を含むがこれに限定されない、当該分野で公知のものである。RSi-Au-NPは、金コア上に吸着された狭帯域スペクトルシグネチャを有するラマン有機分子からなる。ラマン有機分子を変化させることができるので、各ナノ粒子はそれ自体のシグネチャを有することができ、それによって、多重化によって複数のナノ粒子を独立して同時に検出することができる。ナノ粒子全体をシリカシェルに封入して、ラマン有機分子を金ナノコア上に保持する。R-Si-Au-NPの任意のポリエチレングリコール(PEG)-イル化はそのバイオアベイラビリティを増加させ、標的部分を付着させるための機能的「ハンドル」を提供する(Thakor A.S., Luong R., Paulmurugan R.ら、マウスにおけるラマン活性シリカ-金ナノ粒子の運命及び毒性、Sci. Transl. Med.3(79):79ra33(2011); Jokerst J.V., Miao Z., Zavaleta C., Cheng Z、及びGambhirS.S., Affibody-官能化金-シリカナノ粒子、Small7(5):625-633(2011)); Gao J., Chen K., Miao Z., Ren G., Chen X., Gambhir S.S.and Cheng Z., Affibody-based nanoprobes for HER2-expressing cell and tumorimaging, Biomaterials 32(8):2141-2148(2011); 各々は参照により、ここに特異的に組み込まれる). 
【０１２２】
本発明の目的のために、CD96は生体液中及び組織上に、インビボ又はインビトロで存在する場合、本発明のCD96結合剤(例えば、モノクローナル抗体)によって検出され得る。検出可能な量のCD96を含有する任意のサンプルを使用することができる。サンプルは尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清等のような液体、又は組織、糞等のような固体もしくは半固体、又は代わりに、組織学的診断において一般的に使用されるものような固体組織であり得る。
【０１２３】
より高い感度をもたらすことができる別の標識技術は、抗体を低分子量ハプテンに結合させることからなる。次いで、これらのハプテンは、第2の反応の手段によって特異的に検出され得る。例えば、アビジンと反応するビオチンなどのハプテン、又は特異的抗ハプテン抗体と反応することができるジニトロフェノール、ピリドキサール、又はフルオレセインを使用することが一般的である。
【０１２４】
便宜上、本発明のCD96結合剤(例えば、抗体)はキット、すなわち、診断アッセイを実施するための説明書を有する所定量の試薬のパッケージされた組み合わせで提供され得る。CD96結合剤(例えば、抗体)が酵素で標識される場合、キットは酵素によって必要とされる基質及びコファクター(例えば、検出可能な発色団又は蛍光団を提供する基質前駆体)を含む。加えて、安定化剤、緩衝液(例えば、反応停止用緩衝液もしくは細胞溶解用緩衝液)等のような他の添加剤が含まれ得る。種々の試薬の相対量はアッセイ感度を実質的に至適化する試薬の溶液中濃度を提供するために、広く変動し得る。特に、試薬は、溶解時に適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む、通常は凍結乾燥された乾燥粉末として提供されてもよい。
【０１２５】
本発明の1つ以上のCD96結合剤(例えば、抗体)を含む治療用製剤は所望の純度を有するCD96結合剤(例えば、抗体)を、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed.(1980))と、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で混合することによって、貯蔵のために調製される。この組成物は、良好な医療行為と一致する様式で処方され、投薬され、そして投与される。この文脈において考慮すべき因子としては、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与のスケジューリング、及び医師に公知の他の因子が挙げられる。投与されるCD96結合剤(例えば、抗体)の「治療有効量」は、このような考慮事項によって支配され、疾患を予防するために必要な最小量である。
【０１２６】
治療用量は、少なくとも約0.01mg/kg体重、少なくとも約0.05mg/kg体重;少なくとも約0.1mg/kg体重、少なくとも約0.5mg/kg体重、少なくとも約1mg/kg体重、少なくとも約2.5mg/kg体重、少なくとも約5mg/kg体重、少なくとも約10mg/kg体重、及び約100mg/kg体重以下であってよく、0.1〜20mg/kg体重が好ましい。このようなガイドラインは例えば、抗体フラグメントの使用において、又は抗体抱合体の使用において、活性物質の分子量について調節されることが、当業者によって理解される。投薬量はまた、局所投与(例えば、鼻腔内、吸入など)のために、又は全身投与(例えば、i.m.、i.p.、i.v.、s.c.など)のために変動され得る。
【０１２７】
CD96結合剤(例えば、抗体)は活性を増強するか、又はそれでなければ治療効果を増加させる1つ以上の薬剤で、必要はないが、必要に応じて処方される。これらは、一般に、以前に使用されたのと同じ投薬量で、及び投与経路で、又は以前に使用された投薬量の約1〜99%で使用される。
【０１２８】
許容される担体、賦形剤、又は安定剤は使用される用量及び濃度でレシピエントに無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤;アスコルビン酸及びメチオニンなどの抗酸化剤;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンズアルコニウム;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;レゾルシノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾール;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸;単糖類、二糖類、及び、グルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物;EDTAのようなキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Znタンパク質錯体);及び/又はTWEENTM、PLURONICSTM、ポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤、を含む。in vivo投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に行うことができる。
【０１２９】
活性成分はまた、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルジョンにおいて、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メチルメタシレート)マイクロカプセルによって調製されたマイクロカプセル中に捕捉され得る。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition, Osol, A. Ed.(1980)に開示されている。
【０１３０】
CD96結合剤(例えば、抗体)は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻腔内を含む任意の適切な手段によって投与される。非経口輸液には、筋内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が含まれる。さらに、CD96結合剤(例えば、抗体)はパルス注入によって、特に薬剤の用量を減少させながら、適切に投与される。
【０１３１】
疾患の予防又は処置のために、CD96結合剤(例えば、抗体)の適切な投薬量は上記に定義されるように、処置される疾患の型、疾患の重症度及び経過、薬剤が予防目的のために投与されるかどうか、以前の治療、患者の臨床履歴及び薬剤に対する応答、ならびに主治医の裁量に依存する。薬剤は一度に、又は一連の治療にわたって、患者に適切に投与される。
【０１３２】
本発明の別の実施形態では、上記の障害の治療に有用な材料を含有する製品が提供される。製造品は、容器及びラベルを含む。好ましい容器は例えば、ボトル、ガラス瓶、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラスやプラスチックなど種々の材料で作ることができる。容器は病状の治療に有効な活性剤を含む組成物を収容しており、滅菌した出入口を有している(例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを具備する静脈溶液用のバック又はバイアルであってよい)。組成物中の活性剤はCD96結合剤(例えば、抗体)である。容器上の、又は容器に付随するラベルは、組成物が選択された状態を治療するために使用されることを示す。製造物品は、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液及び/又はデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第2の容器をさらに含んでもよい。それはさらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器、及び使用説明書を伴う添付文書を含む、商業的及び使用者の観点から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０１３３】
ここで本発明を完全に説明すると、当業者には、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、様々な変更及び修正を行うことができることが明らかであろう。
【０１３４】
表5: Seq Id番号の概要。
Xは「任意の」アミノ酸を示すか、又はXは欠如する。
【表５−１】
2020530859.tif 000006
【表５−２】
2020530859.tif 000007
【表５−３】
2020530859.tif 000008
【表５−４】
2020530859.tif 000009
【表５−５】
2020530859.tif 000010
【表５−６】
2020530859.tif 000011
【表５−７】
2020530859.tif 000012
【表５−８】
2020530859.tif 000013
【実施例】
【０１３５】
１．ヒトCD96のキャラクタリゼーション 
１．１  T、NK及び他の造血細胞集団におけるCD96発現 
ヒトPBMCの異なる集団におけるヒトCD96の発現を、抗CD96クローン628211(R&D Biotech)及びNK92.39(Fuchs,2004)抗体を使用することによって試験した。CD4+及びCD8+細胞、NK細胞及び少数のB細胞でのCD96発現を図1A及び1Bに示す。NK、CD4+及びCD8+T細胞もCD226を発現する(図1C)。NK細胞及びT細胞の約40%がCD226及びCD96を共発現する(図1D)。CD226を発現するT細胞のより高い割合は、NK細胞と比較してCD96を共発現する(図1E)。
【０１３６】
より具体的には、本発明者らが健常ドナーの末梢血単核細胞(PBMC)で、38.5%(中央値、55〜22.5%、n=8)のNK細胞、39.1%(53.2〜29%、n=4)のCD4+T細胞、及び45.6%(53.8〜26.2%、n=4)のCD8+T細胞がCD96及びCD226を共発現することを見出した。興味深いことに、NK細胞の51%(75〜25%,n=8)、CD4+T細胞の96.8%(99.6〜96.5%, n=4)及びCD226を発現するCD8+T細胞の73.1%(87.7〜68.1%,n=4)がCD96を共発現することが見出された。注目すべきことに、NK細胞の27%(45〜20%、n=4)、CD4+T細胞の15.5%(20〜8%、n=4)、CD226及びCD96を発現するCD8+T細胞の28%(30〜16%、n=4)もTIGITを共発現する(データは示さず)。
【０１３７】
FCM分析はさらに、CD226と同様に、CD96が休止ナイーブT細胞よりもCD45RO+記憶T細胞上でより強く発現されたことを示した(図2)。
【０１３８】
CD226について観察されたように(Lozanoら、TIGIT/CD226 Axis Regulates Human T Cell Function. J. Immunol.188:3869-3875(2012))、CD96の発現は抗CD3抗体(OKT3)で活性化されたCD4+及びCD8+記憶T細胞の両方で増加したが、この活性化条件ではナイーブT細胞では増加しなかった(図3)。
【０１３９】
最後に、CD96の発現を、CD25の高発現及びCD127マーカーの低発現によって同定された循環CD4+調節T細胞(Tregs)上のFCMによって調べた。図4に示すように、CD96はCD226(Fuhrmanら、Divergent Phenotypes of Human  Regulatory T Cells Expressing Receptors TIGIT and CD226.JImmunol.195(1):145-155(2015))と同様に、従来のCD4+T細胞(CD25lo/CD127+細胞)と比較して、CD4+ Treg細胞上でより少なく発現されることが見出された。従って、アゴニスト性抗CD96治療抗体の使用は、調節性T細胞よりもむしろ従来のT細胞を優先的に同時刺激することが予想される。
【０１４０】
１．２  CD96はCD226とホモダイマー及びヘテロダイマーを形成することができる：
CD226は、CD226とCD155との効率的な相互作用のため、及びCD226を発現する細胞の活性化のために必要とされるシスホモダイマーを形成し得ることが記載されている。CD226はまた、TIGITとシス-ヘテロ二量体を形成し得、これは、CD226ホモ二量体化の破壊、したがってCD226活性化の破壊をもたらし、おそらくCD226/CD155相互作用の阻害を介する(Johnstonら、The Immunoreceptor TIGIT Regulates Antitumor and Antiviral CD8+ T CellEffector Function. Cancer cell 26(6):923-937(2014))。しかしながら、CD96がCD226とホモダイマー及び/又はヘテロダイマーを形成できるかどうかは知られていない。従って、我々はフィコエリトリン(488nmレーザーにより励起されたPE)で標識された抗体とアロフィコシアニン(APC-発光フィルター670 LPを用いて検出された)との間の蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を用いることにより、hCD96及びhCD226によるhCD96のホモ二量体化及びヘテロ二量体化を検討した(Batardら、フローサイトメトリーにより分析された蛍光共鳴エネルギー転移のためのフィコエリトリン及びアロフィコシアニンの使用:利点及び限界Cytometry 48(2):97-105(2002))。
【０１４１】
HG10565-NH, HG11202-NY, HG10917-NM(SinoBiolic)と遺伝子をトランスフェクションすることにより、hCD96-HA及び/又はhTIGIT-Mycタグを組み合わせたタンパク質と一時的にhCD226-Hisタグ付きたんぱく質をCHO細胞上に発現した。CD226、CD96及びTIGITを、PE及びAPCに結合した抗hCD226、-hCD96、-hTIGIT、-His、-HA又はMyc mAbで標識した。対照として、細胞を抗タグmAbs-PE又は抗タグmAbs-APCのいずれかで別々に標識し、次いでプールする。トランスフェクトした細胞をmAbsと30分間+4℃でインキュベートし、数回の洗浄後、分子間の相互作用(PE結合mAbsとAPC結合mAbsの間のFRET)をFACSCanto IIフローサイトメーター(BDバイオサイエンス)上のフローサイトメトリーにより分析した。注目すべきは、トランスフェクトされた各条件について、mAbsの4つの組み合わせがテストされたことである。抗タグ-PE +抗タグ-APC；抗タグ-PE+抗受容体-APC；抗受容体-PE+抗受容体-APC；抗受容体-PE +抗タグ-APC。Batard et al.に記述されているように、エネルギー移動を許容できるのはmAbsのいくつかの組合せのみである(データは示されていない)(Batard, 2002)。
【０１４２】
hCD226が形成したhCD226-hCD226ホモダイマー(図5A)及びhTIGITを有するヘテロダイマー(図5B)を確認した。重要なことに、本発明者らは、hCD96がhCD96-hCD96ホモダイマー(図5C)ならびにhCD226を有するヘテロダイマー(図5D)を形成することができることを観察した。したがって、TIGITと同様に、CD96はCD226とヘテロ二量体を形成することができ、CD226-CD155相互作用の阻害の新しいメカニズムをもたらすか、又はCD155との相互作用を介してCD226及びCD96を発現する細胞の活性化(同時刺激)の新しいメカニズムを表し得た。
【０１４３】
文献に既に記載されているように、CD96の発現は、健康な個体の循環NK、T及びNKT細胞上で確認されている。さらに、CD96は、NK、T及びNKT細胞の大部分においてCD226と共発現されることが見出された。循環NK細胞において、本発明者らは、CD96が休止及び活性化されたCD56dim及びCD56bright/CD16loサブセット上で発現される一方で、TIGITがCD56bright/CD16loサブセット上で発現されないことを今や観察した(データ示さず)。循環T細胞において、本発明者らは、CD96がCD226のように、CD4+記憶T細胞及びナイーブ及び記憶CD8+T細胞の両方において大部分発現されることを示した。CD96の発現は、CD226のような抗CD3活性化記憶T細胞でさらに増加する。最後に、本発明者らは、CD96の発現が従来のCD4+T細胞と比較して、循環CD4+ Treg群においてより弱いことを観察した。
【０１４４】
本発明者らはまた、ヒトCD96が、ヒトCD226とホモダイマーならびにヘテロダイマーを形成し得ることを実証した。この二量体化は、CD96及びCD226を発現する細胞に対するCD96の機能的活性において重要な役割を果たし得る。
【０１４５】
まとめると、これらの観察は、開示された抗CD96抗体のいくつかがヒトT細胞を同時刺激することを示す本発明者らの結果と組み合わされて(以下を参照のこと)、アゴニスト抗CD96抗体が従来のCD8+及びCD4+T細胞を優先的に刺激し、したがって、癌などの疾患を有する患者における細胞性免疫応答を増加させるための使用を見出すことを示唆する。CD96の刺激活性は、モノマー又はホモダイマーとして、及び/又は活性化レセプターCD226とのヘテロダイマーとして、CD96のトリガーによって媒介され得る。
【０１４６】
２. マウス抗ヒトCD96抗体の産生 
２．１ アッセイに使用されるヒトCD96は特に言及しない限り、ヒトリンパ球上で発現される主要な形態でより短い形態のCD96(エキソン4を欠くアイソフォームv2)である。
【０１４７】
ヒトCD96に対するマウス抗体を作製するために、マウスを、2週間隔で4回のDNA注射を含むプロトコールを適用し、続いて1週間隔で2回の最終追加免疫を行い、血清スクリーニング結果に従って動物を屠殺することによって免疫した: 
- 5匹のWTマウス:プライムヒトCD96 DNA +ブーストヒトCD96 DNA 
- 5 匹のWTマウス:プライムヒトCD96 DNA +ブーストヒトCD96 CHO(hCD96発現ベクターでトランスフェクトされたCHO細胞) 
【０１４８】
ヒトCD96へのIgG結合の存在及び力価を、免疫動物の血清中で、ELISA(hCD96 humanIgG1融合タンパク質、hCD96-hFcのコーティング、インハウスで産生及び精製)及びhCD96を発現するCHO細胞上でのフローサイトメトリーによってモニターした。CD155-CD96相互作用を阻害するmAbsの存在も、干渉ELISAを用いて試験した。強力な抗CD96 IgG力価を示す動物を屠殺した。それらの脾臓及びリンパ節を抽出し、単核細胞(MNC)を精製し、凍結した。ヒトCD96-CHOで追加免疫した5匹のマウスからの細胞をプールした。
【０１４９】
２．２ ISAAC技術を用いた単回B細胞スクリーニング及び組換え抗CD96抗体の作製 
国際公開第2009/017226号パンフレットに記載されているISAAC技術はマイクロアレイチップを使用して個々の抗体分泌細胞を検出するための特異的な方法であり、これは、単一細胞ベースでの生細胞の分析を可能にし、関連する細胞を同定し高回収するための迅速、効率的、高ハイスループット(234,000個までの個々の細胞)システムを提供する。
【０１５０】
免疫化マウスの脾臓及びリンパ節から予め精製したマウスMNCをマイクロアレイチップに適用することにより、単一生細胞のアレイを調製した。チップ表面を予め標的抗原(hCD96-hFc)でコーティングし、抗体分泌細胞によって分泌された抗CD96マウス抗体を、ウェルの周りの表面上にコーティングされたCD96によって捕捉した。洗浄後、固定化CD96に結合したマウスIgGの存在を、Cy3に結合した抗マウスIgG抗体及び蛍光顕微鏡によって検出した。特異的抗体への抗原の結合は、非特異的シグナルから容易に区別可能な、別個の環状スポットを形成した。
【０１５１】
次いで、CD96特異的抗体分泌単細胞をマイクロマニピュレーションによって回収し、mRNAを単細胞から回収し、IgGの重鎖(VH)及び軽鎖(VL)の可変領域をコードするcDNA配列をRT-PCRによって増幅した。次いで、VH及びVL配列決定を、マウスγ-2a定常領域(Fcγ2a)及びκ定常領域をそれぞれ含む発現ベクター中にクローニングした。抗体はまた、Fcγ受容体に対するmIgG2aの親和性を減少させるD265A変異(mIgG2a-D265A)を含むmIgG2a形式でクローニングした。
【０１５２】
CHO細胞におけるH及びL鎖発現ベクターの共トランスフェクション後、hCD96-hFc又はhFcに融合されそしてhCD96-hFcタンパク質に関する限りで産生及び精製された無関係のヒトタンパク質でコーティングされたプレート上で、ELISAによるCD96認識及び特異性の確認について、組換え抗体を試験した。CD155-CD96相互作用の阻害をELISAによってモニターした。天然CD96の認識及びCD96-CD155相互作用の阻害を、hCD96又は無関係なタンパク質でトランスフェクトされたCHO細胞に対するフローサイトメトリーによって確認した。
【０１５３】
全体で、160対のVH及びVLを増幅し、得られたIgG抗体を、ヒトCD96への特異的結合について確認した。これらの中で、19個の抗体が産生され、精製された。これら19の抗体から、12はhCD155‐hCD96相互作用を阻害した。
【０１５４】
３. 組換えマウス抗CD96抗体のIn vitro特徴付け 
３．１  ヒトCD96を発現するCHO細胞へのFACS結合 
【０１５５】
同定されたマウス抗CD96抗体が細胞膜発現ヒトCD96を認識する能力を、CD96短イソフォームv2(CD96v2; Genbank受入番号NM_005816、HA-tagでC末端に隣接)を安定的にトランスフェクトしたCHO細胞を用いて、フローサイトメトリー(FCM)によりさらに分析した(配列番号:268)。ヒトCD96(v1アイソフォーム; CD96v1)(配列番号267)の長い形態の認識もまた、ヒトCD96v1を一時的に発現するCHO細胞(Genbank受託番号NM_198196.2)を用いたフローサイトメトリーによって試験した。19の候補の結合能力を、2 mIgG1ベンチマーク抗体NK92.39(Fuchs,2004;Biolegend)及びクローン628211(R&DSystem)の結合能力と比較した。
【０１５６】
マウス抗CD96抗体及びアイソタイプ対照抗体を、ヒトCD96を発現するCHO細胞と共に、+4℃で30分間、10μg/mL〜4.6ng/mLの様々な濃度でインキュベートした。2回の洗浄後、細胞膜CD96に結合した抗体の存在を、PE結合抗マウス抗体とのインキュベーション及びAccuri-C6フローサイトメーター(BD-Biosciences)での分析によって明らかにした。抗体濃度の各々について得られた平均蛍光強度(MFI)と一次抗体の非存在下で得られた強度(Δ-MFI)との間の差を計算し、抗体の濃度に対してプロットした。CD96を認識しなかった適切なアイソタイプの陰性対照抗体を、抗体染色(非特異的染色)のバックグラウンドを測定するために同じ状態で試験した。
【０１５７】
19のマウス抗hCD96抗体について得られた結合結果を図6に示し、表6に要約し、ベンチマーク抗体について得られた結果と比較する。
【０１５８】
検討した19種類の抗体のうち、11種類の候補がhCD96v2に強く結合することが認められた(BL006-4-31、BL006-19-183、BL006-19-190、BL006-19-134、BL006-19-21、BL006-19-55、BL006-19-352、BL006-19-363、BL006-19-370、BL006-19-14、BL006-19-29)。これらの候補のhCD96v2への結合は、クローン628211のものと類似しているか、又はそれよりも優れていた。6つの候補(BL006-4-20、BL006-4-52、BL006-4-61、BL006-11-5、BL006-8-3、BL006-9-1)はベンチマークNK92.39と同様に、CD96v2により弱く結合した。候補BL006-9-15はさらに弱くCD96v2に結合した。
最後に、候補BL006-2-19は、FCMによるCD96v2への非常に弱い結合を示した(図示せず)。
【０１５９】
試験した19 の中で、11 の候補はまた、FCM(BL006-4-31; BL006-19-21; BL006-19-183, BL006-19-14,BL006-19-29,BL006-4-52;BL006-2-19, BL006-11-5, BL006-4-61, BL006-9-1,BL006-8-3,BL006-9-15)によりCHO細胞上に発現されたヒトCD96(CD96v1)の長形に強く結合する。残りの候補は2つのベンチマークNK92.39及び628211と同様に、hCD96(CD96v1)の長い形態により弱く結合した。
【０１６０】
表6:  フローサイトメトリー分析によるhCD96トランスフェクトCHO細胞に対する抗CD96抗体のEC50値及び最大結合能力(1つの代表的な実験の値)
【表６】
2020530859.tif 000014
*抗体BL006-2-19は、FCMによるhCD96v2に非常に弱く結合した。
EC50及び最大結合値は計算できなかった; 
+/-: 10μg/ml抗体での弱い結合; +:10μg/ml抗体での結合; ++:10μg/ml抗体での強い結合。
【０１６１】
３．２ マウス及びアカゲザルCD96との交差反応性 
同定されたマウス抗ヒトCD96抗体の他の種由来のCD96タンパク質を認識する能力を、マウス又はアカゲザルCD96を発現するCHO細胞を使用するフローサイトメトリーによってさらに分析した。CHO細胞表面上の種特異的CD96の発現を、適切な抗CD96抗体での染色及び非固定細胞でのフローサイトメトリーを使用することによって確認した。rat anti-mCD96抗体クローン#630612(R&D Systems)と候補BL006-9-1(rhesus CD96上でELISAにより陽性)を用いてrhesus CD96の発現を確認し、一方クローン6A6(rat Ig2a, e-Bioscience)を用いて、ヒトCD96の発現を検証した。
【０１６２】
マウス抗CD96抗体及びアイソタイプ対照抗体を、+4℃で30分間、異なるCD96種を発現するCHO細胞と共に10又は1μg/mLでインキュベートした。2回の洗浄後、細胞膜CD96に結合した抗体の存在を、PE結合抗マウス抗体とのインキュベーション及びAccuri-C6フローサイトメーター(BD-Biosciences)での分析によって明らかにした。
【０１６３】
19のマウス抗CD96抗体について得られた結果を図7に示し、ベンチマーク抗体で得られた結果と比較する。試験した19の候補のうち、8つの抗体がアカゲザルCD96を強く認識した(BL006-4-31、BL006-19-352、BL006-19-14、BL006-19-29、BL006-4-52、BL006-2-19、BL006-4-61、BL006-9-1)。2つの候補BL006-19-21及びBL006-19-55は、抗体628211と同様に、アカゲザルCD96により弱く結合した。残りの9つの候補及びベンチマークNK92.39は、アカゲザルCD96に結合しなかった。
注目すべきことに、19の候補のいずれも、FCMによってマウスCD96を認識しなかった(データは示さず)。
【０１６４】
３．３ CHO細胞に対するフローサイトメトリーにより測定したCD96/CD155相互作用の阻害 
FCMによってhCD96v2に非常に弱く結合したBL006-2-19を除く全ての候補を、CHO細胞上で安定に発現されたhCD96v2へのヒトCD155の結合を阻害するそれらの能力について試験した。ヒトCD96トランスフェクトCHO細胞(96ウェルプレートの3×105細胞/ウェル)を、4μg/mLのビオチン化hCD155-Fc(BliNKで産生され、ビオチン化された)の存在下で、抗CD96抗体又はアイソタイプ対照抗体(mIgG2a又はmIgG2aD265Aフォーマット)の連続希釈物と共に+4℃で30分間インキュベートした。次いで、細胞を2回洗浄し、FITC抱合ストレプトアビジン(BD Biosciences)とのインキュベーション及びAccuri-C6フローサイトメーター(BD biosciences)でのフローサイトメトリー分析によって、CD155-hFcのCHO細胞への結合を明らかにした。
【０１６５】
hCD96へのhCD155結合の阻害のパーセンテージは、以下のように計算した: 
% 阻害=(1-(MFI_wAb&CD155-MFI_CHO)/(MFI_wCD155-MFI_CHO)×100、
ここで、MFI_wAb&CD155は試験した抗体及びhCD155-hFcとインキュベートしたhCD96-CHO細胞で得られた平均強度蛍光(MFI)であり、MFI_CHOはhCD155及びmAbの非存在下で得られたMFIであり、MFI_wCD155はhCD155での蛍光であるが、抗体とのプレインキュベーションなし(0% CD155結合阻害)である。阻害%を抗体濃度に対してプロットし、GraphPad Prismソフトウェアの非線形回帰分析モデルを用いてIC50値を計算した。
【０１６６】
図8及び表7に示される結果は、9つの候補が5.9〜19.4 nMの範囲のIC50値で、CHO細胞上で発現されるhCD155のhCD96v2への結合を強く阻害したことを示す(候補BL006-4-31、BL006-19-21、BL006-19-183、BL006-19-190、BL006-19-134、BL006-19-55、BL006-19-352、BL006-19-363、BL006-19-370)。これらの9つの抗CD96候補は、クローン628211及びNK92.39抗体に類似していた。候補BL006-4-20、BL006-19-14及びBL006-19-29もCD96v2へのCD155結合を阻害したが、30μg/mL(200 nM)では結合阻害の50%に達しなかったため、より低い効力であった。最後に、6つの候補BL006-4-52、BL006-4-61、BL006-11-5、BL006-8-3、BL006-9-1及びBL006-9-15は、30μg/mL(200nM)でCD96v2/CD155相互作用を阻害しなかった。
【０１６７】
表7:  CD96v2トランスフェクトCHO細胞を用いたCD96/hCD155阻害アッセイ及びフローサイトメトリー分析における抗CD96抗体のIC50値(n=2の独立した実験の平均)
【表７】
2020530859.tif 000015
*相対IC50; nd:未決定 
【０１６８】
３．４ ヒトPBMCに対する抗CD96候補の結合
抗CD96 mAb候補を、ヒトPBMCに対するそれらの結合能力について試験した。3名の健常ドナー由来のPBMCを抗CD3-PerCP(CloneSK7、BD biosciences)、CD56-FITC(CloneREA196 Miltenyi)、及び抗CD96-Biotinylated(10μg/ml)で染色した(EZ-link Sulfo-NHS-LC-Biotin)。T細胞集団をCD3pos、CD56neg(平均: 64.9%、SD: 9.4%)、NK細胞をCD3neg、CD56pos(平均:11.1%、SD: 1.7%)、NKT細胞をCD3pos、CD56pos(平均:4.2%、SD:2.9%)としてゲート化し、ストレプトアビジン‐APC(Abcam)を用いて抗CD96ビオチン化mAbを検出した。
【０１６９】
試験した18個の抗体(BL006-9-1は試験されなかった)のうち、9個の候補(BL006-4-20、BL006-4-31、BL006-19-29、BL006-19-14、BL006-19-55、BL006-19-183、BL006-19-190、BL006-19-134、BL006-19-21)は、T細胞及びNK細胞(図示せず)と同様に強い結合を示した。7つの候補(BL006-2-19、BL006-8-3、BL006-4-61、BL006-19-352、BL006-19-363、BL006-19-370、BL006-4-52)はNK、T及びNKT細胞に対するより弱い結合を示し(図9A及び図示せず)、2つはNK、T及びNKT細胞に対する非常に弱い結合を示した(BL006-11-5及びBL006-9-15)。
【０１７０】
CD96の発現は、頭頸部腫瘍から得られたヒト腫瘍浸潤リンパ球(TIL)について試験された。TILを抽出するために、頭頸部腫瘍を無血清RPMI培地で2回洗浄し、血餅をピンセットで除去した。腫瘍サンプルを、まず、滅菌メスブレードを使用して機械的に解凝集させて、小片に切断し、次いで、DNAse I(800 U/mL)及びLiberase Dispase Low(0.15 WU/mL)を使用して、37℃で20分間、連続撹拌しながら酵素的に消化した。酵素反応を5mlのRMPI 10% FCSでクエンチし、脱凝集した腫瘍サンプルを100μm細胞ストレーナーに通した。
【０１７１】
計数の前に、細胞溶解緩衝液を用いて、室温で5分間、細胞を除去した。4人の患者から得たTILを、抗CD3-eFluor450(UCHT1、ebioscience)、抗CD56-PC7(CMSSB、ebioscience)、抗CD4-APC-eFluor780(RPA-T4、ebioscience)、抗CD8-FITC(RPA-T8、Biolegend)、抗FoxP3-PE(PCH101(CL)、ebioscience)及び抗CD96-APC(FAB6199A、R&D Systems)で染色した。CD96は、4人の患者からのCD3+CD8+T細胞(ドナーHN306を除く)、CD3+CD4+従来型T細胞、CD3-CD56+NK細胞及びCD3+CD4+FoxP3+細胞上で顕著に発現された(図9B)。注目すべきことに、試験した種々のリンパ球サブセット上のCD96の存在は、これらの腫瘍のHPV状態に関連しなかった。
【０１７２】
３．５  CD96はヒト血小板に発現せず、我々の抗CD96候補は血小板に結合しない 
CD226は血小板上で発現されることが記載されており、これは、治療的抗CD226抗体の使用のための潜在的な副作用を表し得る。対照的に、CD96は、ヒト血小板上で発現されない(Wang,1992)。血小板に対する我々の19の抗CD96候補の潜在的結合を、FCMによってさらに試験した。候補ならびにベンチマークNK92.39及び628211のいずれも、ヒト血小板への有意な結合を示さない(データは示さず)。したがって、CD226とは対照的に、CD96はヒト血小板上で発現されず、本発明者らの抗CD96候補は血小板上で反応性を示さない。結論として、CD226とは逆に、CD96に対するアゴニスト抗体は、血小板凝集を誘発するリスクを負うことなく安全に開発され得る。
【０１７３】
３．６ hCD96切断タンパク質上のFCMによるエピトープマッピング 
hCD96v2の切断された細胞外ドメイン(短いアイソフォームv2)をコードする発現ベクターを構築して、hCD96v2の3つの記載された免疫グロブリンドメイン内で、抗hCD96候補によって認識されるエピトープをマッピングした。構築された全ての発現ベクターは、シグナルペプチド、D4ドメイン、膜貫通、hCD6の細胞内鎖、及び種々の構築物のトランスフェクション効率をモニターするためのHA-タグを含んでいた。発現ベクターはD1、D2、D3のみ、又はこれら3つのドメインの組み合わせ(D1D2、D1D3、D2D3)を含んでいた。抗hCD96抗体を、CHO-S細胞上で一時的に発現される切断型CD96タンパク質を認識する能力についてFCMによって試験した。図10に示されるように、試験したすべての抗CD96抗体は、CHO-S細胞で一時的に表されたネイティブなhCD96v2タンパク質を認識した。
【０１７４】
試験した19個の抗体のうち、9個の候補及び2個の参照抗CD96抗体(NK92.39及び628211)はD1及びD2ドメインの融合体である構築体を発現するCHO-S細胞に特異的結合を示し(BL006-4-20、BL006-4-31、BL006-19-134、BL006-19-190、BL006-19-21、BL006-19-352、BL006-19-363、BL006-19-370及びBL006-19-55)、2個の候補はD1及びD2ドメインの融合体とD2及びD3ドメインの融合体である構築体を発現するCHO-S細胞に特異的結合を示し (BL006-19-14及びBL006-19-29)、1個の候補は、D1ドメイン、D1及びD2ドメインの融合体、ならびにD1及びD3ドメインの融合体である構築体を発現するCHO-S細胞に特異的結合を示し(BL006-19-183)、2つの候補はD3ドメイン、D1及びD3ドメインの融合体、ならびにD2及びD3ドメインの融合体である構築物を発現するCHO-S細胞への特異的結合を示し(BL006-4-52及びBL006-2-19)、ならびに、5つの候補は試験したすべての構築物を発現するCHO-S細胞への特異的結合を示した (BL006-4-61、BL006-8-3、BL006-9-1、BL006-9-15及びBL006-11-5)。
【０１７５】
これらの結果は(i)抗CD96抗体及び候補BL006-4-20、BL006-4-31、BL006-19-134、BL006-19-190、BL006-19-21、BL006-19-352、BL006-19-363、BL006-19-370及びBL006-19-55がD1及びD2ドメイン内に含まれるエピトープを認識すること; (ii)候補BL006-19-14とBL006-19-29がD2ドメイン内に含まれるエピトープを認識すること; (iii)候補BL006-19-183がD1ドメイン内に含まれるエピトープを認識すること;(iv)候補BL006-4-52及びBL006-2-19がD3ドメイン内に含まれるエピトープを認識すること;(v)一方、候補BL006-4-61、BL006-8-3、BL006-9-1、BL006-9-15及びBL006-11-5はD4ドメイン内のエピトープを認識する。
【０１７６】
3.7 最良のマウス抗CD96候補の親和性 
抗hCD96候補の速度定数(Kon及びKoff)及び解離定数(KD)を、チップ上にコーティングされた抗huFc抗体によって捕捉されたhCD96-hFcタンパク質(自家生産)を使用して、Biacore上の表面プラズモン共鳴(SPR)によって測定し、ベンチマークと比較した。結果を下記表8に示す。Biacoreによるこの設定において結合を示さなかった候補BL006-2-19を除いて、候補の大部分は、0.18〜42.3 nMの間のKD値を有するnM範囲において親和性を示した。10の候補は、NK92.39クローンよりも良好な親和性を有する。
【０１７７】
表8:  SPR(Biacore)によって測定した抗CD96抗体の会合(Kon)、解離(Koff)及び親和性(KD)定数。
【表８】
2020530859.tif 000016
【０１７８】
３．８  抗CD96抗体候補は、ヒトCD4+及びCD8+T細胞の活性化及び増殖を同時刺激することができる 
抗CD96候補の生物学的活性を、抗CD3抗体OKT3で同時刺激したヒトT細胞でさらに評価した。PBMCを健康な個体から単離し、CFSE蛍光色素で染色し、異なる濃度の可溶性抗CD3抗体(OKT3、mIgG2a)の存在下又は非存在下で、可溶性又はプレート結合抗CD96抗体(mIgG2a-D265Aフォーマット)で培養した。細胞を異なる培養時間で収集し、CD4+及びCD8+T細胞の活性化及び増殖を、それぞれCD25活性化マーカー及びCFSE蛍光希釈の発現を測定することによって、FCMによって分析した。
【０１７９】
以下の図11〜17に報告される結果は、固定化された抗hCD96候補が抗CD3抗体の最適以下の濃度でCD4+及びCD8+T細胞の両方を同時活性化することができたことを示す。活性化された細胞のパーセンテージは、CD25の増加した発現(図11及び12)及び分裂細胞の数に相関するCFSE染色の希釈(図13〜17)によって測定した。
【０１８０】
0.1又は1ng/mLのOKT3と組み合わせた候補BL006-4-20について、T細胞上での増加したCD25発現の実施例を図11に示す。抗CD96候補の同時刺激活性は、非常に低濃度の抗CD3抗体(0.1ng/mL)について既に観察された。mIgG2aアイソタイプ対照で得られた結果と比較して、実験の第1のセット(BL006-4-20、BL006-19-183、BL006-19-134、BL006-4-52、BL006-11-5、BL006-8-3)で試験された6つの候補はすべて、抗CD3で同時刺激されたCD4+及びCD8+T細胞の両方でCD25の発現を増加させることが見出され(図12)、BL006-4-20、BL006-19-183及びBL006-19-134の候補は、抗CD3で同時刺激されたCD4+及びCD8+T細胞の両方でCD25の発現を増加させるのに最も強力であった(図12)。同様の結果が、2人のさらなる健康なドナーから精製されたPBMCで得られた(示さず)。
【０１８１】
実験の第2のセットにおいて、8つの抗CD96候補を、2人のドナー(#2及び#3)からのT細胞を同時刺激するそれらの能力について試験し、そしてベンチマーク抗hCD96抗体(NK92.39)と比較した。FCMによって測定したCFSE希釈の実施例を、0.1、1又は10ng/mLのOKT3と組み合わせた候補BL006-4-20について図13に示す。対照(OKT3のみ又はプラスmIgG2aアイソタイプ対照)と比較して、試験した8つの候補はすべて、低濃度のOKT3でサブ最適に活性化された分裂CD4+及びCD8+T細胞のパーセンテージを増加させることが見出された(図14)。候補BL006-19-183、BL006-19-134及びBL006-4-20は、このような状態において分裂細胞の%を増加させるのに最も強力であった(図14)。
【０１８２】
CFSE希釈を示すCD4+及びCD8+T細胞の%として報告された同時刺激レベル(FCMによって決定される)はより高いOKT3濃度(示されていない)についてより有意ではなかったが、4、5又は6倍に分割された細胞の相対的割合は対照と比較して、候補BL-006-4-20の存在下でより高かった(図13)。重要なことに、ベンチマーク抗体NK92.39は、両方のドナーで試験したOKT3濃度のいずれとも同時刺激活性を示さなかった(図14)。抗CD96候補によるCD4+及びCD8+T細胞増殖の同時刺激はNK92.39によるものではないが、3日目から5日目までの間に試験したすべての時点で観察された(図15)。
【０１８３】
BL006-2-19を除く全ての候補抗体を、OKT3-準最適に活性化されたT細胞増殖に対する同時刺激効果について並行して試験した。分裂細胞(減少したCFSE染色を示す細胞、上のパネル)のパーセンテージ、ならびに蛍光強度のCFSE中央値(中央のパネル)を報告した。下のパネルは、最適以下の刺激のために使用されるOKT3の濃度に従って、各抗体候補についての分裂細胞のパーセンテージを報告する。結果は候補BL006-4-20、BL006-4-31、BL006-19-183、BL006-19-134、BL006-19-14、BL006-19-190、BL006-19-21、BL006-19-55、BL006-19-370、BL006-19-363、BL006-19-352、BL006-19-29及びBL006-4-52がCD4+及びCD8+T細胞(図17)増殖を同時刺激したことを示し、候補BL006-19-183、BL006-19-134及びBL006-4-20の以前の結果が確認された。
【０１８４】
対照(OKT3単独又はアイソタイプ対照の存在下)で観察された結果によれば、同時刺激効果は、CD4+T細胞については0.1及び0.3ng/mLで(図16)、CD8+T細胞については0.3ng/mLで最良に観察された(図17)。ベンチマーク抗hCD96抗体NK92.39では、有意な同時刺激は再び観察されなかった。注目すべきことに、抗hCD96候補は、抗CD28抗体で得られたものと同様のレベルにT細胞増殖を同時刺激することが見出された。
【０１８５】
観察された現象に対するPBMC中に存在するアクセサリー細胞の役割を評価するために、3つの候補の同時刺激特性を精製CD4+及びCD8+T細胞(磁気細胞選別)で試験した。CFSE染色精製T細胞を、2μL/mLの四量体CD3/CD28複合体(ImmunoCult(商標)、Stemcell)で最適以下に活性化した。これらのT細胞に対する抗CD96候補の活性(10μg/mL)を、5日後にFCMによって評価した。結果は、候補BL006-4-20、BL006-19-134及びBL006-4-31が精製CD4+及びCD8+T細胞を同時刺激したことを示す(図18)。最適以下の前活性化の非存在下でのこれら3つの候補によるCD96結合は、精製されたT細胞増殖を誘発することができなかった。この観察は、ヒトリンパ球におけるCD96シグナル伝達の同時刺激性を確認する。
【０１８６】
CD96及びCD226(DNAM-1)は両方ともCD155と相互作用することができる。CD155によるCD226の関与は、NK細胞及びT細胞に対する刺激シグナルを提供する。CD155は、単球及び活性化T細胞上で発現される(データは示さず)。候補抗体によるCD96マスキングがCD226とCD155との間の相互作用に有利であり得る可能性を除外するために、PBMCの同時刺激実験を、CD226に対するブロッキング抗体又はCD155に対するブロッキング抗体のいずれかの存在下で行った。同時刺激の4日後のCFSE蛍光の中央値として報告された結果は、候補BL006-19-134がCD226とCD155との間の相互作用とは独立して、CD4+及びCD8+T細胞増殖を誘導することができたことを示す(図19)。
【０１８７】
候補BL006-4-20、BL006-19-134及びBL006-4-31によって誘導される同時刺激の最適タイミングを評価した。精製したCD4+又はCD8+T細胞を、2μL/mLの四量体CD3/CD28複合体(ImmunoCult(商標)、Stemcell)で最適以下に活性化した。抗CD96抗体による同時刺激を、24時間、48時間又は72時間同時に又は遅延させて導入した。結果は、最大の同時刺激効果を得るためにはCD96関与が最適以下のCD3刺激と同時になければならないことを示している(図20)。
【０１８８】
ヒトIgG1骨格(CHG1)上の候補BL006-4-20、BL006-19-134及びBL006-19-14についてキメラ抗体を作製した。各候補について、可溶性抗CD96候補抗体の活性に対するFc受容体との相互作用の影響を評価するために、Fcサイレントバージョン(CHS1)も構築した。最適以下に活性化された(0.1及び0.3ng/mL OKT3)CD4+及びCD8+T細胞の増殖に対するこれらの種々の可溶性構築物(1μg/mL)の効果を、以前に記載されたように評価した。結果は、同時刺激実験において可溶性ヒトIgG1として導入された候補BL006-4-20、BL006-19-134及びBL006-19-14がCD4+及びCD8+T細胞を同時刺激することができることを示す(図21)。この効果は、OKT3の最低濃度でより顕著である。各候補のFcサイレントバージョンはCD4+及びCD8+T細胞の同時刺激を誘導することができず、これはPBMC中のアクセサリー細胞上に存在するヒトFc受容体による架橋が観察された効果に必須であることを示す。
【０１８９】
腫瘍浸潤リンパ球を、インフォームドコンセントを与えた2人の患者から外科的に摘出した頭頸部癌から抽出した。この研究は、サウサンプトン(英国)の病院の地域倫理委員会によって承認された。プレート結合BL006-19-134CHG1候補(5μg/mL)の、最適以下に活性化された(3μL/mL ImmunocultTM)TILの増殖に対する効果を、3[H]-チミジンの16時間長パルスによる5日間の共培養後に評価した。結果は、同時刺激実験においてプレート結合ヒトIgG1として導入された候補BL006-19-134CHG1が頭頸部腫瘍細胞からのex vivo TILを同時刺激及び再活性化することができることを示す(図22)。この効果は、TILの基礎的な最適以下の増殖が低い2つの実験のうちの1つにおいて、より顕著であった。この場合、BL006-19-134CHG1誘導同時刺激は、最適用量のImmunocultTM(25μL/mL)の増殖に匹敵する増殖を誘導した。
【０１９０】
本明細書中で引用又は参照される全ての文献(「本明細書中で引用される文献」)、及び本明細書中で引用又は参照される全ての文献は本明細書中又は参照により本明細書中に組み込まれる任意の文献についての任意の製造業者の指示書、説明書、製品仕様書、及び製品シートとともに、本明細書中で引用又は参照される全ての文献は、参照により本明細書中に組み込まれ、本発明の実施において使用され得る。より具体的には、すべての参照文献があたかも各個々の文献が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されたかのように、同じ程度まで参照により組み込まれる。
【０１９１】
本発明及びその利点を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書で様々な変更、置換、及び変更を行うことができることを理解されたい。
【０１９２】
（引用文献）
Batard P., SzollosiJ., Luescher I., CerottiniJ.-C., MacDonald R. and Romero P., Use of phycoerythrin and allophycocyanin forfluorescence resonance energy transfer analyzed by flow cytometry: advantagesand limitations, Cytometry, 2002, 48:97-105
BlakeS.J., Dougall W.C., Miles J.J., Teng M.W.L, and SmythM.J., Molecular pathways: Targeting CD96 and TIGIT for cancer immunotherapy, ClinicalCancer Research, 2016, 22(21): 5183-8
ChanC.J., Martinet L., Gilfillan S., Souza-Fonseca-Guimaraes F., Chow M., Town L.,Ritchie D.S., Colonna M., Andrews D.M. & Smyth M.J., The receptors CD96 andCD226 oppose each other in the regulation of natural killer cell functions,Nature Immunology, 2014, 15(5):431-8
Chothia C., Novotny J., Bruccoleri R. and Karplus M., Domain association inimmunoglobulin molecules. The packing of variable domains, J. Mol. Biol., 1985,186:651-63 
EvanG.I., Lewis G.K., Ramsay G., et al., Isolation of monoclonal antibodiesspecific for human c-myc proto-oncogene product, Mol.Cell. Biol., 1985, 5(12):3610-6
Fuchs A., CellaM., Giurisato E., Shaw A.S., and Colonna M. CuttingEdge: CD96 (Tactile) Promotes NK Cell-Target Cell Adhesion by Interacting withthe Poliovirus Receptor (CD155), Journal of Immunology, 2004, 172:3994-8
FuhrmanC.A., Yeh W.-I., Seay H.R., Saikumar Lakshmi P.,Chopra G., Zhang L., Perry D.J., McClymont S.A.,Yadav M., Lopez M.-C., Baker H.V., Zhang Y., Li Y., Whitley M., von Schack D.,Atkinson M.A., Bluestone J.A. and Brusko T.M.,Divergent phenotypes of human regulatory T cells expressing the receptors TIGITand CD226, The Journal of Immunology, 2015, 195:145-55
GaoJ., Chen K., Miao Z., Ren G., Chen X., Gambhir S.S. and Cheng Z., Affibody-basednanoprobes for HER2-expressing cell and tumor imaging, Biomaterials, 2011,32(8):2141-8
JohnstonR.J., Comps-Agrar L., Hackney J., Yu X., Huseni M., Yang Y., Park S., JavinalV., Chiu H., Irving B., Eaton D.L. and Grogan J.L., The immunoreceptor TIGITregulates antitumor and antiviral CD8+ T cell effector function, Cancer Cell,2014, 26:923-37
JokerstJ.V., Miao Z., Zavaleta C., Cheng Z., and GambhirS.S., Affibody-functionalized gold-silica nanoparticles for ramanmolecular imaging of the epidermal growth factor receptor, Small., 2011, 7(5):625-33
KennedyJ., Vicari A. P., Saylor V., Zurawski,S.M., Copeland N.G., Gilber D.J., Jenkins N.A. and Zlotnik A., A molecular analysis of NKT cells:identification of a class-I restricted T cell-associated molecule (CRTAM),Journal of Leukocyte Biology, 2000, 67:725-34
NovotnyJ. and Haber E., Structural invariants of antigen binding: comparison ofimmunoglobulin VL-VH and VL-VL domain dimers., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,1985, 82:4592-96
LozanoE., Dominguez-Villar M., KuchrooV. and Hafler D.A., The TIGIT/CD226 axis regulateshuman T cell function, The Journal of Immunology, 2012, 188:3869-75
Melero et al. Therapeuticvaccines for cancer: an overview of clinical trials. Nature reviews. Clinicaloncology. 11(9):509-524 (2014)
Paborsky L.R., Fendly B.M., Fisher K.L., et al., Mammalian cell transientexpression of tissue factor for the production of antigen, Protein Engineering,1990, 3(6):547-53
PageD.B., Postow M.A., Callahan M.K., Allison J.P. and Wolchok, J., Immune modulation in cancer with antibodies,Annual Review of Medicine, 2014, 65:185-202
Sanmamed et al. Agonists ofco-stimulation in cancer immunotherapy directed against CD137, OX40, GITR,CD27, CD28 and ICOS. Seminars in oncology. 42(4):640-655 (2015)
SaxenaA. and Wu, D., Advances in therapeutic Fc engineering &#8211; Modulation ofIgG-associated effector functions and serum half-life, Frontiers in Immunology,2016, 12(7):580
SethS., Maier M.K., Qiu Q., Ravens I., Kremmer E., F&ouml;rster, R. andBernhardt G., The murine pan T cell marker CD96 is an adhesion receptor forCD155 and nectin-1, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2007,364:959-65
Shibuya A., Campbell D., Hannum C., Yssel H., Franz-BaconK., McClanahan T., Kitamura T., Nicholl J., Sutherland G.R., Lanier L.L. andPhillips J.H., DNAM-1, a novel adhesion molecule involved in the cytolyticfunction of T lymphocytes, Immunity, 1996, 4:573-81
Stanietsky N., SimicH., Arapovic J., ToporikA., Levy O., Novik A., Levine Z., BeimanM., Dassa L., Achdout H.,Stern-Ginossar N., TsukermanP., Jonjic S. and MandelboimO., The interaction of TIGIT with PVR and PVRL2 inhibits human NK cellcytotoxicity, PNAS, 2009, 106(42):17858-63
Thakor A.S., Luong R., Paulmurugan R., et al. et al., The fate and toxicity of raman-active silica-gold nanoparticles in mice, Sci. Transl.Med., 2011, 3(79):79ra33
WangP., O’Farrell S., Clayberger C., Krensky A.Identification and molecular cloning of tactile. A Novel Human T CellActivation Antigen that Is a Member of the Ig Gene Superfamily, Journal ofImmunology, 1992, 148:2600-8
YuX., Harden K., Gonzales L.C., Francesco M., Chiang E., Irving B., Tom I., Ivejla S., Refino C.J., Clark H.,Eaton D. and Grogan J.L., The surface protein TIGIT suppresses T cellactivation by promoting the generation of mature immunoregulatory dendriticcells, Nature Immunology, 2009, 10(1):48-57
【図１】
2020530859.tif 000017
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年9月4日(2019.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD96を経てシグナル伝達を刺激し、CD96に結合するとT細胞の活性化及び/又は増殖を刺激することができる、CD96結合剤。
【請求項２】
前記CD96結合剤が、T細胞同時刺激剤及び/又はT細胞増殖剤と組み合わせてT細胞の活性化及び/又は増殖を刺激することができる、請求項1に記載のCD96結合剤。
【請求項３】
該結合剤のCD96への結合が、CD96の二量体化又は多量体化を誘導する、請求項1又は２に記載のCD96結合剤。
【請求項４】
CD96結合剤が、抗CD96抗体又はそのフラグメントである、請求項１〜３のいずれか１に記載のCD96結合剤。
【請求項５】
T細胞が、CD4+及び/又はCD8+細胞である、請求項１〜４のいずれか１に記載のCD96結合剤。
【請求項６】
該結合剤が、ヒトCD96、ヒトCD96変異体1(配列番号267)及び/又はヒトCD96変異体2(配列番号268)及び/又はアカゲザルCD96(配列番号272)に結合する、請求項１〜５のいずれか１に記載のCD96結合剤。
【請求項７】
該結合剤が、細胞外ドメインD1(配列番号269)、ドメインD2v1もしくはv2(配列番号270もしくは配列番号273)、又はドメインD3(配列番号271)中の少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する、請求項１〜６のいずれか１に記載のCD96結合剤。
【請求項８】
該結合剤が、ヒトCD96のドメインD1及びD2、ドメインD2及びD3で代表されるドメインD1、D2及びD3によって共有されるエピトープに特異的に結合する、請求項１〜７のいずれか１に記載のCD96結合剤。
【請求項９】
50 nM未満、10 nM未満、若しくは1 nM未満の解離定数(KD)でヒトCD96に結合することができる、請求項１〜８のいずれか１に記載のCD96結合剤。
【請求項１０】
0.01〜50nM、0.1〜10nM、若しくは0.1〜1nMの解離定数(KD)でヒトCD96に結合することができる、請求項９に記載のCD96結合剤。
【請求項１１】
50 nM未満、10 nM未満、若しくは1 nM未満の解離定数(KD)で、T細胞上で発現されるヒトCD96に結合することができる、請求項１〜１０のいずれか１に記載のCD96結合剤。
【請求項１２】
抗体が、キメラ、ヒト化又は完全ヒト抗体である、請求項４〜１１のいずれか１に記載のCD96結合剤。
【請求項１３】
抗体が、抗体フラグメント、若しくは抗体フラグメントであるF(ab')2又はFabフラグメントである、請求項４〜１２のいずれか1に記載のCD96結合剤。
【請求項１４】
抗体が、単一特異性抗体、二重特異性抗体又は多重特異性抗体である請求項４〜１３のいずれか１に記載のCD96結合剤。
【請求項１５】
前記抗体が、配列番号1-3、13-15、61-63、73-75、85-87、109-111、145-147、157-159、169-171、181-183、193-195、205-207若しくは217-219(カバットアノテーション)又は配列番号4-6、16-18、64-66、76-78、88-90、112-114、148-150、160-162、172-174、184-186、196-198、208-210若しくは220-222(IMGTアノテーション)を有する３つのCDR配列を持つ重鎖を含み、及び/又は配列番号7-9、19-21、67-69、79-81、91-93、115-117、151-153、163-165、175-177、187-189、199-201、211-213若しくは223-225(カバットアノテーション)又は配列番号10-12、22-24、70-72、82 -84、94-96、118-120、154-156、166-168、178-180、190-192、202-204、214-216若しくは226-228(IMGTアノテーション) を有する３つのCDR配列を持つ軽鎖を含む、請求項４〜１４のいずれかに記載のCD96結合剤。
【請求項１６】
前記抗体が、配列番号229〜244、247〜248、又は253〜266のいずれか1つに記載のアミノ酸配列である、重鎖可変ドメイン及び/又は軽鎖可変ドメインを含む、請求項１５に記載のCD96結合剤。
【請求項１７】
該抗体が、Fc突然変異に対して増加したエフェクター機能若しくは増加したアゴニスト効果を有する、請求項４〜１６のいずれか１に記載のCD96結合剤。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか1に記載のCD96結合剤のアミノ酸配列をコードする単離核酸。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか1に記載のCD96結合剤を産生する単離細胞。
【請求項２０】
請求項１〜１７のいずれか１に記載のCD96結合剤と、医薬的に許容される賦形剤又は担体とを含む医薬組成物。
【請求項２１】
患者の疾患の治療に使用するための、請求項１〜１７のいずれか１に記載のCD96結合剤又は請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
疾患が癌又は感染性疾患である、請求項２１に記載のCD96結合剤又は医薬組成物。
【請求項２３】
治療が単独療法である、請求項２１又は２２に記載のCD96結合剤又は医薬組成物。
【請求項２４】
治療が併用療法である、請求項２１又は２２に記載のCD96結合剤又は医薬組成物。
【請求項２５】
同時刺激剤若しくは免疫チェックポイント阻害剤、又はT細胞同時刺激剤若しくは免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用するためのもので請求項２４に記載のCD96結合剤又は医薬組成物。
【請求項２６】
CD96に結合する際のT細胞の活性化及び/又は増殖の刺激用である、請求項１〜１７又は２１〜２５のいずれか1に記載のCD96結合剤、又は請求項２０〜２５のいずれか1に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
CD96結合剤が、T細胞同時刺激剤及び/又はT細胞増殖剤と組み合わせてT細胞を増殖させることができる、請求項２６に記載のCD96結合剤又は医薬組成物。
【請求項２８】
CD96結合剤がCD96アゴニストである、請求項２６又は２７に記載のCD96結合剤又は医薬組成物。
【請求項２９】
前記CD96結合剤のCD96への結合が、CD96の二量体化又は多量体化を誘導する、請求項２６〜２８のいずれか1に記載のCD96結合剤又は医薬組成物。
【請求項３０】
T細胞がCD4+及び/又はCD8+細胞である、請求項２６〜２９のいずれか1に記載のCD96結合剤又は医薬組成物。
【請求項３１】
予防又は治療用ワクチンにおけるアジュバントである、請求項１〜１７のいずれかに記載のCD96結合剤又は請求項２０に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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