(57)【要約】本明細書に開示されているのは、ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有する突然変異光合成微生物である。突然変異体は、野生型細胞と比べて、クロロフィルが減少し、生産性が増大している。バイオマスまたはバイオ産物を産生するためにそのような突然変異体を使用する方法、およびそのような突然変異体をスクリーニングする方法もまた開示されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＧＩ１ポリペプチドをコードする遺伝子の減衰を有する突然変異光合成生物であって、該光合成生物が、バイオマスまたは少なくとも１つのバイオ産物を、実質的に同じ条件下で成長または培養させた対照光合成生物よりも多く産生し、かつ該対照光合成生物が、ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有さない、突然変異光合成生物。
【請求項２】
実質的に同じ条件下で成長または培養させた対照光合成生物よりも、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも１００％多くのバイオマス、または少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも１００％多くの、少なくとも１つのバイオ産物を産生する、請求項１に記載の突然変異光合成生物。
【請求項３】
対照光合成微生物と比べて、減少したクロロフィルを有する、請求項１に記載の突然変異光合成生物。
【請求項４】
対照光合成生物と比べて、上昇したクロロフィルａ：ｂ比を有する、請求項３に記載の突然変異光合成生物。
【請求項５】
対照光合成生物と比べて、減少した光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）アンテナサイズを有する、請求項１に記載の突然変異光合成生物。
【請求項６】
対照光合成生物と比べて、より高い１４Ｃ  Ｐｍａｘを有する、請求項１に記載の突然変異光合成生物。
【請求項７】
対照生物よりも高いＦｖ／Ｆｍを有する、請求項１記載の突然変異光合成生物。
【請求項８】
対照生物よりも高いタンパク質含有量を有する、請求項１に記載の突然変異光合成生物。
【請求項９】
対照生物よりも高いｒｕｂｉｓｃｏ活性化酵素含有量を有する、請求項１に記載の突然変異光合成生物。
【請求項１０】
植物である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の突然変異光合成生物。
【請求項１１】
藻類である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の突然変異光合成生物。
【請求項１２】
緑藻植物または車軸藻類である、請求項１１に記載の突然変異光合成生物。
【請求項１３】
緑藻綱、クロロデンドロン藻綱、プラシノ藻綱、またはトレボウクシア藻綱の科の緑藻植物である、請求項１２に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項１４】
対照微生物と比べて、減少した光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）アンテナサイズを有する、請求項１１に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項１５】
ＰＳＩＩアンテナサイズの断面単位サイズが、対照微生物のＰＳＩＩアンテナの断面単位サイズと比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％減少している、請求項１４に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項１６】
対照藻類微生物と比べて、上昇したＰｍａｘ（１４Ｃ）を有する、請求項１１に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項１７】
Ｐｍａｘ（１４Ｃ）が、対照微生物のＰｍａｘ（１４Ｃ）と比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％上昇している、請求項１６に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項１８】
対照藻類微生物と比べて、減少したクロロフィル含有量を有する、請求項１１に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項１９】
対照藻類微生物と比べて、減少した量のクロロフィルｂを有する、請求項１８に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項２０】
対照藻類微生物と比べて、少なくとも２０％少ないクロロフィルを有する、請求項１８に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項２１】
対照藻類微生物と比べて、少なくとも２０％少ないクロロフィルｂを有する、請求項１９に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項２２】
対照藻類微生物よりも高いタンパク質含有量を有する、請求項１に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項２３】
対照藻類微生物よりも全有機炭素率（パーセント）で少なくとも１０％多いタンパク質を有する、請求項２２に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項２４】
対照藻類微生物よりも全有機炭素率（パーセント）で少なくとも２０％多いタンパク質を有する、請求項２３に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項２５】
対照藻類微生物と比べて、少なくとも１０個のＬＨＣ遺伝子の発現の低下を有する、請求項１に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項２６】
対照藻類微生物と比べて、リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼアクチベーター（ＲＡ）ポリペプチドの存在量の増加を有する、請求項１に記載の突然変異微生物。
【請求項２７】
リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼアクチベーターポリペプチドが、対照藻類微生物における存在量の少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、または少なくとも２．５倍である、請求項２６に記載の突然変異微生物。
【請求項２８】
緑藻植物または車軸藻類である、請求項１に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項２９】
緑藻綱、クロロデンドロン藻綱、プラシノ藻綱、またはトレボウクシア藻綱の科の緑藻植物である、請求項２８に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項３０】
緑藻綱のメンバー、任意で、アルテロモナス（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）、カルテリア（Ｃａｒｔｅｒｉａ）、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、クロロコッカム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）、クロロゴニウム（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）、クリソスファエラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、モノラフィディウム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、オエドゴニウム（Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ）、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）、プレウロコッカス（Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピロボツリス（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）、イカダモ（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）、およびボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）からなる群から選択される属の種である、請求項２８に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項３１】
クロロデンドロン藻綱のメンバー、任意で、プラシノクラダス（Ｐｒａｓｉｎｏｃｌａｄｕｓ）、スケルフェリア（Ｓｃｈｅｒｆｆｅｌｉａ）、およびテトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）からなる群から選択される属の種である、請求項２８に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項３２】
プラシノ藻綱のメンバー、任意で、オストレオコッカスまたはミクロモナスの種である、請求項２８に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項３３】
トレボウクシア藻綱のメンバーであり、任意で、ボツリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、オキセノクロレラ（Ａｕｘｅｎｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、ヘベオクロレラ（Ｈｅｖｅｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、マリニクロレラ（Ｍａｒｉｎｉｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、シュードクロレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、テトラクロレラ（Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、エレモスファエラ（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）、フランケイア（Ｆｒａｎｃｅｉａ）、ミクラクチニウム（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）、ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）、オオキスティス（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）、ピコクロラム（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）、スチココックス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、またはビリジエラ（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）からなる群から選択される属の種である、請求項２８に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項３４】
クロレラ、オキセノクロレラ、ヘベオクロレラ、マリニクロレラ、パラクロレラ、シュードクロレラ、およびテトラクロレラからなる群から選択される属のものである、請求項２８に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項３５】
藻類産物の製造方法であって、該産物を産生するために請求項１に記載の藻類突然変異体を培養することを含む、方法。
【請求項３６】
培養物から産物を回収することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
産物がバイオマスである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
藻類産物が、１つ以上の脂質、タンパク質、ポリケチド、テルペノイド、色素、抗酸化物質、ビタミン、ヌクレオチド、核酸、アミノ酸、炭水化物、アルコール、ホルモン、サイトカイン、ペプチド、またはポリマーである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
産物が、１つ以上の脂質である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
産物がトリアシルグリセリドである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
藻類産物が、１つ以上のタンパク質である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
培養がバッチ式、半連続式、または連続式である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
培養が、栄養素豊富条件下である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
培養が、窒素欠乏条件下である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
それが由来する祖先藻類と比べてより高い生産性を有する突然変異藻類を単離する方法であって、
光独立栄養性の半連続的条件下または連続的条件下で少なくとも３０世代にわたって藻類株を培養することと、
培養物から少なくとも１つの株を単離することであって、該少なくとも１つの単離された株が、祖先藻類よりも高い成長速度を有する、単離することと、
それによって、それが由来する祖先藻類と比べてより高い生産性を有する突然変異藻類を単離することと
を含む、方法。
【請求項４６】
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、少なくとも５００μＥの強度の光へ曝露することを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、少なくとも６００μＥの強度の一定の光へ曝露することを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、少なくとも８００μＥの強度の光へ曝露することを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、少なくとも１０００μＥの強度の光へ曝露することを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項５０】
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、少なくとも１２００μＥの強度の光へ曝露することを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、少なくとも１５００μＥの強度の光へ曝露することを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、少なくとも２０００μＥの強度の光へ曝露することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、少なくとも２５００μＥの強度の光へ曝露することを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、５ｘ１０６細胞／ｍＬ未満の密度で藻類培養物を維持することを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、２．５ｘ１０６細胞／ｍＬ未満の密度で藻類培養物を維持することを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５６】
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、約１．５ｘ１０６細胞／ｍＬ未満またはそれと同等の密度で藻類培養物を維持することを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５７】
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、約１ｘ１０６細胞／ｍＬ未満またはそれと同等の密度で藻類培養物を維持することを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５８】
藻類株が、光独立栄養性の半連続的条件または連続的条件下で培養する前に突然変異誘発されている、請求項４５に記載の方法。
【請求項５９】
藻類株が、ＵＶ、化学的突然変異誘発、挿入的突然変異誘発、または標的ゲノム編集を用いて突然変異誘発されている、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
単離された突然変異藻類のＳＧＩ１遺伝子座の少なくとも一部を増幅するためにＰＣＲを実施することをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項６１】
単離された突然変異藻類のＳＧＩ１遺伝子座の少なくとも一部を配列決定することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項６２】
単離された突然変異藻類のゲノムを配列決定することをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項６３】
単離された突然変異藻類の生産性をアッセイすることをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項６４】
藻類株が、光独立栄養性の半連続的条件または連続的条件下で少なくとも１００世代培養される、請求項４５に記載の方法。
【請求項６５】
高生産性突然変異体を選択する方法であって、
ａ）藻類の集団を突然変異誘発することと、
ｂ）蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて、突然変異誘発された藻類の集団の低クロロフィル蛍光細胞を選択することと、
ｃ）選択された低クロロフィル蛍光細胞の単離系統をマルチウェルプレートに分配することと、
ｄ）選択された低クロロフィル蛍光細胞を光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）アンテナサイズ、Ｆｖ／Ｆｍについてスクリーニングすることと、
ｅ）野生型細胞と比べて、減少したＰＳＩＩアンテナサイズ、上昇したＦｖ／Ｆｍ、および増加したを有する、少なくとも１つの細胞系を選択することと
を含む、方法。
【請求項６６】
選択された細胞系が、少なくとも２０％減少したＰＳＩＩアンテナサイズを有する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
選択された細胞系が、少なくとも１０％上昇したＦｖ／Ｆｍを有する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
選択された細胞系が、少なくとも１０％上昇した、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
上昇したＰｍａｘ（Ｃ）についてスクリーニングすることをさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
生産性アッセイを実施することをさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
単離系統のゲノムの少なくとも一部を配列決定することをさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１６年１２月３０日に出願された米国特許出願第６２／２５０，３９７号に対する３５  ＵＳＣ  １１９（ｅ）に基づく優先権の恩典を主張し、その全内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の組み込み
添付の配列表の内容は、参照により本出願に組み込まれる。ファイル名「ＳＧＩ２０８０＿１ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」の添付の配列表テキストファイルは、２０１７年１２月２８日に作成されたものである（２６５ｋｂ）。本ファイルは、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＯＳを使用しているコンピュータでＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｏｒｄを使用してアクセスできる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、クロロフィルの減少、ならびにバイオマスおよび脂質生産性の増大を有する光合成生物の突然変異体に関する。本発明はまた、こうした突然変異体を作製し、選択し、かつスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
より高い生産性となるように、光合成生物を操作して、光合成効率を高めることは、植物および藻類生物学者の長年の目標である。米国特許出願公開第２０１４／０２２０６３８号および米国特許出願公開第２０１６／０３０４８９号（両方とも参照により本明細書に組み入れられる）は、弱光順化能力が損なわれている、クロロフィルの減少を有する「ＬＩＨＬＡ」突然変異体と称される藻類突然変異体を得るための突然変異体スクリーニングについて記載している。すなわち、弱光であっても、強光適合細胞の低クロロフィル状態を保持する。米国特許出願公開第２０１４／０２２０６３８号には、光順化調節因子ＬＡＲ１、ＬＡＲ２、およびＬＡＲ３遺伝子に突然変異を有する藻類突然変異体について記載されており、米国特許第２０１６／０３０４８９６号では、葉緑体ＳＲＰ５４遺伝子に突然変異を有する藻類変異体について開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
概要
本明細書に提供されるのは、Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  １（ＳＧＩ１）ポリペプチドをコードしている遺伝子の減衰を有する突然変異光合成生物である。この突然変異光合成生物は、ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有さないこと以外は実質的に同一である対照光合成生物よりも、高い生産性を有する。より高い生産性は、バイオマス蓄積速度、またはバイオ産物、例えば脂質、タンパク質、炭水化物（例えば、１つ以上の糖またはアルコール）、色素、抗酸化物質、テルペノイド、ビタミン、またはポリマーなどの産生速度として測定することができる。本明細書に開示されているＳＧＩ１突然変異体は、光独立栄養条件下で生産性の増大を呈し得る。
【０００６】
本明細書に記載されるように、ＳＧＩ１ポリペプチドは、レスポンスレギュレーターレシーバードメイン（ＲＲドメイン）およびｍｙｂ様ＤＮＡ結合（ｍｙｂ）ドメインを有するポリペプチドであり、ＲＲドメインは、ｍｙｂドメインのＮ末端にあり、２つのドメインは、本明細書においてリンカーと称される、いずれのドメインにも属さないアミノ酸の配列によって分離されている。様々な実施形態におけるＲＲドメインおよびｍｙｂドメインは、タンパク質のＮ末端側の半分にあり得る。
【０００７】
減衰したＳＧＩ１遺伝子とは、その機能または発現が妨害されたＳＧＩ１遺伝子であり、その結果、野生型生物におけるその存在量または活性と比べて、遺伝子産物（ＳＧＩ１ポリペプチド）の量または活性が低下する。すなわち、ＳＧＩ１ポリペプチドの機能は、ＳＧＩ１遺伝子の突然変異によって、またはＳＧＩ１遺伝子の発現に影響を及ぼすＳＧＩ１遺伝子そのものの外側の遺伝子操作によって、低下する。
【０００８】
ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有する、本明細書において提供される突然変異光合成生物は、対照光合成生物と比べてより高い生産性を呈し、対照光合成生物と比べて減少したクロロフィルを有する。いくつかの例では、ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有する突然変異光合成生物は、減少した量のクロロフィルｂを有し、いくつかの例では、ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有する突然変異光合成生物は、上昇したクロロフィルａ：クロロフィルｂ比を有する。ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有する本明細書において提供される突然変異光合成生物は、光合成アンテナサイズの減少、例えば光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）アンテナサイズの減少および／または光化学系Ｉ（ＰＳＩ）アンテナサイズの減少を有することができる。
【０００９】
高生産性ＳＧＩ１突然変異体では、対照光合成生物よりも多くのバイオマス、例えば、対照光合成生物または突然変異光合成生物がそこから派生した野生型の光合成生物よりも多くのバイオマスを１日に生産することができる。バイオマスの生産性は、無灰乾燥重量（ＡＦＤＷ）、乾燥重量、湿潤重量、または全有機炭素（ＴＯＣ）生産性であり得る。代替的には、または追加的には、ＳＧＩ１突然変異体は、同じ期間にわたって実質的に同じ条件下で培養された対照生物によって産生されるものよりも、より多くのバイオ産物（これらに限定されないが、脂質、タンパク質、炭水化物、１つ以上のポリケチド、テルペノイド、色素、抗酸化物質、ビタミン、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上の核酸、１つ以上のアミノ酸、１つ以上の炭水化物、アルコール、ホルモン、サイトカイン、ペプチド、またはポリマーなど）を産生できる。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される突然変異光合成生物は、実質的に同じ条件下で培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）または培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｅ）された対照光合成生物よりも、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％多くバイオマスを生産する。条件は、藻類では、バッチ、半連続、または連続培養条件であり得、また栄養素が豊富な培養条件であり得るか、または窒素欠乏条件であり得、かつ光独立栄養条件であり得る。
【００１１】
高生産性ＳＧＩ１突然変異体は、ＰＳＩＩの機能的吸収断面積（σＰＳＩＩ）の減少または「ＰＳＩＩアンテナサイズの減少」を有することができる。例えば、ＰＳＩＩアンテナの断面単位サイズは、対照微生物のＰＳＩＩアンテナサイズと比べて、少なくとも約１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％減少し得る。ＳＴＩ１突然変異体は、さらに、減少されたＰＳＩの機能的吸収断面積（σＰＳＩ）を有し得る。例えば、ＰＳＩアンテナの断面単位サイズは、対照光合成生物のＰＳＩアンテナサイズと比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、または少なくとも６０％減少させることができる。
【００１２】
様々な実施形態において、本明細書に提供されるような突然変異光合成生物は、対照光合成生物と比べて増大したＦｖ／Ｆｍを有する。例えば、突然変異光合成生物は、Ｆｖ／Ｆｍが、対照光合成生物と比べて少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％上昇し得る。例えば、対照光合成生物と比べて約５％〜約５０％、または約５％〜３０％上昇する。
【００１３】
さらに、本明細書において提供される突然変異光合成生物は、対照または野生型細胞と比べて、光化学系ＩＩのアクセプター側で上昇した電子伝達速度（１／τ’Ｑａ）を有することができる。本明細書で提供されるような突然変異体は、野生型または対照生物と比べて少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、８０％、または１００％増加している１／τ’Ｑａの値を有し得る。
【００１４】
さらに、本明細書において提供されるＳＧＩ１突然変異体における炭素固定率（Ｐｍａｘ（Ｃ））は、対照生物と比べて、上昇させることができる。例えば、Ｐｍａｘ（１４Ｃ）は、野生型または対照生物と比べて少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、８０％、または１００％上昇し得る。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＳＧＩ１突然変異体は、ＰＳＩおよび／またはＰＳＩＩアンテナサイズの減少を有し、対照または野生型生物よりも多量のリブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ活性化酵素（Ｒｕｂｉｓｃｏ活性化酵素または「ＲＡ」）、例えば、対照生物の少なくとも１．２、１．４、１．６、１．８、２、２．２、または２．５倍のＲＡ量をさらに有し得る。いくつかの実施形態では、突然変異体は、６、８、１０、１２、または１４個のＬＨＣＰ遺伝子の発現低下およびＲＡ−αまたはＲＡ−β遺伝子などのＲＡ遺伝子の発現増加を示す。本明細書に開示されるのは、減少したクロロフィルおよび減少したＰＳＩＩアンテナサイズを有する突然変異光合成生物であって、対照光合成生物よりも多量のＲｕｂｉｓｃｏ活性化酵素を有する突然変異体である。突然変異体は、ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有することができ、また対照光合成生物よりも高い生産性を有することができる。
【００１６】
ＳＧＩ１遺伝子は、レスポンスレシーバー（ＲＲ）ドメインおよびｍｙｂドメインを有するポリペプチドをコードし、ｍｙｂドメインは、ＲＲドメインのＣ末端側である。いくつかの実施形態では、遺伝子は、ドメインアーキテクチャ（Ｎ末端から始まる）ＲＲ−リンカー−ｍｙｂを有するポリペプチドをコードしており、リンカーは、ＲＲドメインまたはｍｙｂドメインの一部分ではないアミノ酸配列である。リンカーは、核局在化配列（ＮＬＳ）を任意に含み得る。ＳＧＩ１ポリペプチドは、ｍｙｂドメインのＮ末端側にＲＲドメインを有し、いずれのドメインにも属さないリンカーによってｍｙｂドメインから分離されたポリペプチドであり得る。このポリペプチドは、実施例６に記載のように、藻類ＳＧＩ１ポリペプチドのＳＧＩ１ドメインアーキテクチャを認識する隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）によりスキャンした際、少なくとも３５０のスコアを有する。こうしたＳＧＩポリペプチドの例は、表３および４に提供する。様々な例では、本明細書において提供される突然変異体において減衰されている遺伝子は、（野生型生物において）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５などのｍｙｂドメインに対し、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するｍｙｂドメインを有し、かつ／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７などのＲＲドメインに対し、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＲＲドメインを含むＳＧＩ１ポリペプチドをコードし得る。代替的には、または追加的には、本明細書に提供されている突然変異体において減衰している遺伝子は、（野生型生物において）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９などのＳＧＩ１ポリペプチドに少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし得る。
【００１７】
いくつかの実施形態において本明細書において提供されるのは、ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有する突然変異藻類微生物であり、突然変異体は、対照藻類微生物よりも高いバイオマス生産性を有するか、またはより多くのバイオ産物を産生する。藻類突然変異体は、減少したクロロフィルを有し得、減少したＰＳＩＩアンテナのサイズを有し得る。いくつかの例では、減衰されたＳＧＩ１遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７などのｍｙｂドメインに対し、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有するｍｙｂドメインを有し、かつ／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９などのＲＲドメインに対し、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するＲＲドメインを含むＳＧＩ１ポリペプチドをコードできる。代替的には、または追加的には、本明細書において提供されている突然変異体藻類において減衰している遺伝子は、（野生型藻類において）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９などのＳＧＩ１ポリペプチドに対し、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードできる。
【００１８】
本明細書でさらに提供されるのは、それらが由来する祖先藻類よりも単位バイオマス当たりの高いタンパク質含有量を有する、ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有する藻類突然変異体である。高タンパク質含有藻類は、バイオマス当たりの基準で、例えば、対照または野生型藻類よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％多いタンパク質を有し得る。いくつかの実施形態では、増加したタンパク質含有量を有する藻類ＳＧＩ１突然変異体は、対照またはそれらが由来する野生型藻類株よりも高い成長速度および／または高いバイオマス生産性を示す。高タンパク質藻類バイオマスも含まれ、藻類バイオマスは、ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有する突然変異藻細胞を含み、突然変異藻細胞は、対照またはそれらが由来する野生型藻類よりも高いタンパク質含有量を有する。さらに提供されるのは、藻類ＳＧＩ１突然変異細胞の溶解物である。溶解物は、野生型藻細胞の藻類溶解物よりも高いタンパク質含有量を任意で有することができる。
【００１９】
ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有する突然変異藻類微生物は、実質的に同じ条件下で培養された対照生物によって産生されるよりも多くのバイオマスまたはさらに多くのバイオ産物を産生できる。バイオ産物は、例えば、バイオマス、脂質、タンパク質、または炭水化物であり得る。様々な実施形態では、ＳＧＩ１突然変異体は、減衰ＳＧＩ１遺伝子を有さない対照藻類によって産生されるものよりも多くの１つ以上の脂質、１つ以上のタンパク質、１つ以上のポリケチド、テルペノイド、色素、抗酸化物質、ビタミン、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上の核酸、１つ以上のアミノ酸、１つ以上の炭水化物、アルコール、ホルモン、サイトカイン、ペプチド、またはポリマーを産生できる。いくつかの実施形態では、ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有する突然変異藻類は、実質的に同じ条件下で培養した対照藻類よりも、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％多いバイオ産物を産生し、条件は、バッチ、半連続、または連続培養条件であり得るか、栄養豊富な培養条件があり得るか、または窒素欠乏状態であり得るか、光独立栄養条件であり得る。バイオマスは、例えば、無灰乾燥重量（ＡＦＤＷ）または全有機炭素（ＴＯＣ）として測定することができる。
【００２０】
さらに、ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有し、対照または野生型藻類と比べてより高い生産性を有する藻類突然変異体は、対照または野生型藻類と比べて減少したクロロフィルを有することができる。例えば、総クロロフィルは、野生型レベルと比べて約２０％〜約８０％、例えば野生型レベルの約３０％〜約７０％減少し得る。
【００２１】
本明細書において提供される、ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有する突然変異藻類微生物は、減少した光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）アンテナサイズを有することができる。例えば、ＰＳＩＩアンテナの断面単位サイズは、対照微生物のＰＳＩＩアンテナサイズと比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、または少なくとも６０％減少させることができる。
【００２２】
ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有し、対照微生物よりも高い生産性を示す、本明細書に提供される藻類突然変異体は、さらに任意で、減少した光化学系Ｉ（ＰＳＩ）アンテナを有し得る。例えば、ＰＳＩＩアンテナの断面単位サイズは、対照微生物のＰＳＩＩアンテナサイズと比べて、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、または少なくとも６０％減少させることができる。
【００２３】
さらに、ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有する本明細書において提供される突然変異藻類は、対照藻類と比較して、増大した炭素吸収（光合成速度を示す）、例えば対照藻類と比較して上昇したＰｍａｘ（Ｃ）を有することができる。Ｐｍａｘ（Ｃ）は、対照微生物のＰｍａｘ（Ｃ）と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、または少なくとも５０％上昇させることができる。
【００２４】
ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有する、本明細書において提供される藻類突然変異体は、発現が減少しているＬＨＣ遺伝子をさらに有し得る。例えば、少なくとも６個、少なくとも８個、少なくとも１０個、または少なくとも１２個のＬＨＣ遺伝子を、対照細胞におけるそれらの発現レベルに関して下方制御することができる。ＬＨＣ遺伝子の発現の減少は、例えば、ＬＨＣ転写物のレベルの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％の減少であり得る。
【００２５】
さらに、ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有する、本明細書において提供される藻類突然変異体は、Ｒｕｂｉｓｃｏ活性化酵素（ＲＡ）ポリペプチドの存在量の増加を有することができる。ＲＡタンパク質のレベルは、例えば、対照または野生型細胞のレベルの１．５倍、２倍、２．５倍、または２．５倍超であり得る。ＲＡアルファアイソザイムまたはＲＡベータアイソザイムの一方または両方は、本明細書に提供される高生産性突然変異体において増加させることができる。ＲＡ転写物のレベルはまた、本明細書に提供される藻類突然変異体において、例えば、野生型レベルの約１．２倍から１０倍またはそれ以上まで上昇し得る。いくつかの実施形態において本明細書において提供されるのは、ＰＳＩＩアンテナサイズの減少およびＲＡの発現の増大を有する低クロロフィル藻類突然変異体である。ＰＳＩＩアンテナサイズの減少は、例えば野生型ＰＳＩＩアンテナサイズと比べて少なくとも２０％または少なくとも３０％であり得、ＲＡタンパク質レベルの増加は、野生型の少なくとも２倍であり得る。
【００２６】
様々な実施形態において、ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有する本明細書に提供される高生産性藻類突然変異体は、ＴＯＣを基準として、対照藻類よりも少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１７％、または少なくとも２０％多いタンパク質を有する。例えば、高生産性藻類突然変異体は、バッチ式、連続式、または半連続式培養系において、１日当たり、対照細胞よりも、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、または少なくとも６０％以上多いタンパク質を産生できる。
【００２７】
本明細書において提供される突然変異藻類微生物は、これに限定されるものではないが、緑藻植物または車軸藻類などの任意の真核微細藻類であり得る。例えば、突然変異微細藻類は、緑藻綱、クロロデンドロン藻綱、プラシノ藻綱、またはトレボウクシア藻綱の科の緑藻類であり得る。いくつかの実施形態では、突然変異微細藻類は、アルテロモナス（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）、カルテリア（Ｃａｒｔｅｒｉａ）、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、クロロコッカム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）、クロロゴニウム（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）、クリソスファエラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、モノラフィディウム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、オエドゴニウム（Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ）、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）、プレウロコッカス（Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピロボツリス（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）、イカダモ（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）、またはボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）の種などの緑藻綱のメンバーであり得る。代替的実施形態では、突然変異微細藻類は、プラシノクラダス（Ｐｒａｓｉｎｏｃｌａｄｕｓ）、スケルフェリア（Ｓｃｈｅｒｆｆｅｌｉａ）、またはテトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）の種などのクロロデンドロン藻綱のメンバーであり得る。さらなる代替的実施形態では、突然変異藻類は、プラシノ藻、任意でオストレオコッカス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）またはミクロモナス（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ）の種のメンバーであり得る。さらに、代替的には、突然変異微細藻類は、プラシノクラダス、スケルフェリア、もしくはテトラセルミスの種など、クロロデンドロン藻綱のメンバーであり得るか、任意で、ボツリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、オキセノクロレラ（Ａｕｘｅｎｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、ヘベオクロレラ（Ｈｅｖｅｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、マリニクロレラ（Ｍａｒｉｎｉｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、シュードクロレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、テトラクロレラ（Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、エレモスファエラ（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）、フランケイア（Ｆｒａｎｃｅｉａ）、ミクラクチニウム（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）、ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）、オオキスティス（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）、ピコクロラム（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）、スチココックス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、またはビリジエラ（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）からなる群から選択される属の種のトレボウクシア藻綱のメンバーであり得る。
【００２８】
本発明のさらなる態様は、ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有する本明細書に提供されている突然変異体光合成突然変異体を培養して、バイオ産物を生成することを含む、バイオ産物を生成する方法である。本方法は、培養物または生物からバイオ産物を回収することをさらに含み得る。例えば、産物は、培地、収穫された藻細胞、もしくは全培養物から回収することができ、または例えば植物組織を収穫もしくは均質化することによって植物から単離することができる。バイオ産物は、例えば、バイオマス、タンパク質、脂質、または炭水化物であってもよい。さらに、産物は、１つ以上の脂質、タンパク質、ポリケチド、テルペノイド、色素、抗酸化物質、ビタミン、ヌクレオチド、核酸、アミノ酸、炭水化物、アルコール、ホルモン、サイトカイン、ペプチド、またはポリマーであり得る。いくつかの実施形態では、産物は高タンパク質バイオマスであり、タンパク質は、光合成生物またはその組織のＴＯＣの少なくとも５０％を構成する。代替的実施形態において、産物は脂質であり、例えばトリグリセリドであり得る。
【００２９】
この方法は、藻類のＳＧＩ１突然変異体をバッチ培養、半連続培養、または連続培養において培養することを含むことができ、これらの培養では、培養培地は、栄養素が豊富であり得るか、または例えば窒素欠乏であり得る。培養は、無機態炭素、例えば二酸化炭素または炭酸塩が、藻類突然変異体による有機分子を産生するための培地中において、実質的に唯一の炭素源である光独立栄養条件下で行うことができる。
【００３０】
本発明のさらに別の態様は、由来元の祖先藻類と比べて、より高い生産性を有する突然変異藻類を単離する方法である。この方法は、藻類株を半連続または連続光独立栄養条件下で少なくとも２０世代培養すること、および培養物から少なくとも１つの突然変異系統を単離することを含み、単離系統は、祖先藻類系統よりも高い成長速度を有する。この方法は、培養の前に突然変異誘発工程を含み得る。突然変異誘発は、例えば、ＵＶ、ガンマ線照射、化学的突然変異誘発因子、ランダム挿入突然変異誘発、または標的指向性突然変異誘発によるものであり得る。様々な実施形態において、藻類は、培養中に一定の光にさらされる。様々な実施形態において、培養中に藻類がさらされる強度は、少なくとも５００μＥ、少なくとも６００μＥ、少なくとも７００μＥ、少なくとも８００μＤ、少なくとも９００μＥ、少なくとも１０００μＥ、少なくとも１１００μＥ、少なくとも１２００μＤ、少なくとも１４００μＥ、少なくとも１６００μＥ、少なくとも１８００μＥ、少なくとも２０００μＥ、少なくとも２２００μＥ、少なくとも２５００μＥ、または少なくとも３０００μＥである。
【００３１】
より高い成長速度を有する単離系統は、例えばバッチ培養、半連続培養または連続培養において、祖先系統と比べてより高い生産性についてアッセイすることができる。高生産性突然変異体を単離することには、Ｆｖ／Ｆｍ、シグマ、ＰＳＩＩ、ＰＳＩ、またはＰｍａｘ（Ｃ）（炭素固定のＰｍａｘ）のうちの１つ以上を測定することをさらに含み得る。
【００３２】
本方法は、突然変異を同定するために単離された高生産性変異体のゲノムを配列決定することをさらに含み得る。
【００３３】
本発明のさらに別の態様は、高生産性の藻類突然変異体を選択する方法であって、本方法は、藻類集団の突然変異を誘発することと、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて低クロロフィル細胞を選択することと、選択された低クロロフィル蛍光細胞の単離系統をマルチウェルプレートに分配することと、光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）アンテナサイズ、Ｆｖ／Ｆｍについて、マルチウェルプレート中の低クロロフィル蛍光細胞をスクリーニングすることと、野生型細胞と比べて、ＰＳＩＩアンテナサイズの減少、Ｆｖ／Ｆｍの上昇有する少なくとも１つの細胞系を選択して、高生産性突然変異を選択することを含む。本方法は、Ｐｍａｘを測定することを任意でさらに含むことができる。より高い成長速度を有する単離系統は、例えばバッチ培養、半連続培養または連続培養において、祖先系統と比べてより高い生産性についてアッセイすることができる。本方法は、突然変異を同定するために、単離された高生産性突然変異体のゲノムの少なくとも一部分に対してＰＣＲおよび／またはシーケンシングを実施することをさらに含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】連続光による半連続培養条件下（１日６５％の希釈、２０００μＥ、１％ＣＯ２）での、ＷＴ−１１８５と比較した、パラクロレラ古典的突然変異体Ａ）ＮＥ−７８４３およびＢ）ＮＥ−１３３８０のＴＯＣ生産性の向上を示すグラフである。示されているデータは、生物学的複製培養物のものである。
【図２】ＮＥ−７８４３およびＮＥ−１３３８０のゲノム配列決定により検出されたＳＮＰの場所を表すパラクロレラＴ−２２６１（ＳＧＩ１）遺伝子構造の図である。Ｃａｓ９媒介挿入変異誘発のためのガイドＲＮＡによって標的とされる場所もまた示されている。
【図３】Ｃａｓ９によって生成されたパラクロレラＴ−２２６１（ＳＧＩ１）ノックアウト突然変異体のＴＯＣ生産性を示すグラフである。データは、連続光（２０００μＥ）による半連続培養条件下で評価された３つの生物学的複製からの平均および標準偏差を表している。
【図４】藻類ＳＧＩ１ポリペプチドのレスポンスレギュレーターレシーバー（ＲＲ）ドメインのアラインメントを示す図である。示す配列は、パラクロレラ種  ＷＴ−１１８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）、コッコミクサ・スベリプソイデア（Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ  ｓｕｂｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、オストレオコッカス・ルミナリヌス（Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｍｉｎａｒｉｎｕｓ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）、クラミドモナス・レインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、クロモクロリス・ゾフィンジエンシス（Ｃｈｒｏｍｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）、ボルボックス・カルテリ（Ｖｏｌｖｏｘ  ｃａｒｔｅｒｉ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、テトラセルミス種  １０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、オオキスティス種（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）、およびミクロモナス種  ＲＣＣ２９９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）である。
【図５】藻類ＳＧＩ１ポリペプチドのｍｙｂドメインのアラインメントを示す図である。示す配列は、パラクロレラ種  ＷＴ−１１８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）、コッコミクサ・スベリプソイデア（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、オストレオコッカス・ルシマリヌス（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）、クラミドモナス・レインハルディ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）、クロモクロリス・ゾフィンジエンシス（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）、ボルボックス・カルテリ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）、テトラセルミス種  １０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）、オオキスティス種  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）、およびミクロモナス種  ＲＣＣ２９９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）である。
【図６】ＦＡＣＳ−ＦＩＲｅスクリーニング方法を示す概略図である。突然変異誘発は示されていないが、これはＦＡＣＳの前に実施することができる。この方法では、生産性試験をさらに含むことができる。
【図７】Ｃａｓ９媒介突然変異誘発から生じるＮＥ−０７８４３およびＮＥ−１３３８０および標的指向性突然変異ＧＥ−１３３７１、ＧＥ１３３８０、ＧＥ−１６３４５、ＧＥ−１６３４６、ＧＥ−１６３４７、ＧＥ−１６３９９、ＧＥ−１３２３２、ＧＥ−１３４２８、およびＧＥ−１６９８０のゲノム配列決定によって検出されたＳＮＰの場所を示すパラクロレラＳＧＩ１遺伝子構造の図である。ガイドＲＮＡの場所は矢印で示されている。
【図８】脂質、タンパク質および炭水化物含有量を決定するためのパラクロレラ野生型株ＷＴ−１１８５および古典的突然変異体ＮＥ−１３３８０のバイオマスの微小近似分析の結果を示すグラフである。サンプルは、半連続系における定常状態の４０％希釈／日に適した培養物から得た。ＦＡＭＥ、炭水化物、およびアミノ酸は、分析物の各クラスの炭素含有量によって算出された各分画に割り当てられたＴＯＣ（％）として表される。タンパク質中のＣ（％）内の挿入数字は、実際の百分率値を示す。
【図９】パラクロレラの１５のＬＨＣ遺伝子（ＣＰ２６を除く）について、親の野生型株ＷＴ−１１８５と比較してＳＧＩ１変異体ＮＥ−７８４３において下方制御されているトランスクリプトームデータに基づくヒートマップを示す図である。
【図１０】パラクロレラ野生型（ＷＴ−１１８５）およびＳＧＩ１古典的突然変異体（ＮＥ−７８４３およびＮＥ−１３３８０）のＰＳＩＩ、ＰＳＩおよびＲｕｂｉｓｃｏ含有量のＭＲＭ分析の結果を示すグラフである。Ａ）野生型ＷＴ−１１８５および突然変異体ＮＥ−７８４３におけるＴＯＣ当たりのＰＳＩ、ＰＳＩＩ、およびＲｕｂｉｓｃｏタンパク質複合体の数、Ｂ）野生型ＷＴ−１１８５および突然変異体ＮＥ−１３３８０におけるＴＯＣ当たりのＰＳＩ、ＰＳＩＩ、およびＲｕｂｉｓｃｏタンパク質複合体の数、ならびにＣ）野生型ＷＴ−１１８５および突然変異体ＮＥ−１３３８０中のＰＳＩ、ＰＳＩＩ、およびＲｕｂｉｓｃｏタンパク質複合体の数（タンパク質１グラム当たり）、Ｄ）微小近似分析（図８）と比較して、ＭＲＭ分析において、ＴＯＣ当たりのタンパク質が少ないことは、抽出効率が理想的でないことに関連している。
【図１１】図１１Ａ）微量分析によるパラクロレラ野生型（ＷＴ−１１８５）およびＳＧＩ１古典的変異体ＮＥ−７８４３のＰＳＩＩ、ＰＳＩおよびＲｕｂｉｓｃｏ活性化酵素（ＲＡ）含有量の差を示すグラフである。１１Ｂ）パラクロレラ野生型（ＷＴ−１１８５）およびＳＧＩ１古典的変異体ＮＥ−７８４３におけるＰＳＩＩ、ＰＳＩおよびＲｕｂｉｓｃｏ活性化酵素（ＲＡ）の定量化に使用されたウエスタンブロットを提供する。
【図１２】典型的な５月４日のカリフォルニア州インペリアルバレーをモデルとした日周の光において培養したＳＣＰＡ（半連続）培養下において、ＳＧＩ１突然変異体ＮＥ−７８４３が、バイオマスの生産性の増加を呈するグラフである。データは、生物学的三連測定値を表す。
【図１３】Ｎ豊富バッチＥＰＩＣの日周の照射量条件下における体積ＴＯＣ蓄積を示すグラフである。生物学的複製データは、ＷＴ−１１８５およびＮＥ−１３３８０について個別に示す。
【図１４Ａ】野生型株ＷＴ−１１８５と比較して、Ｎ非含有バッチＡＦＳモード下でのＮＥ−０７８４３株において観察された体積ＴＯＣ生産性を示すグラフである。
【図１４Ｂ】野生型株ＷＴ−１１８５と比較して、Ｎ非含有バッチＡＦＳモード下でのＮＥ−０７８４３株において観察された体積ＦＡＭＥ生産性を示すグラフである。
【図１５】テトラセルミスＳＧＩ１対立遺伝子ならびにガイド標的配列ＭＡ１（ガイド１）およびＪＣ２（ガイド２）の位置の図を提供する。
【図１６】Ａ）ＴＯＣ基準およびＢ）細胞基準でのＣａｓ９標的ＳＧＩ１突然変異体のクロロフィル含有量を示すグラフであり、Ｃ）は、突然変異体クローンのクロロフィルａ：ｂ比を提供する。
【図１７】Ｃａｓ９標的テトラセルミスＳＧＩ１突然変異体の光生理学測定結果を示すグラフである。Ａ）４５０ｎｍで測定したＰＳＩＩ断面、Ｂ）５２０ｎｍで測定したＰＳＩＩ断面、Ｃ）ＦＶ／ＦＭ、およびＤ）ＰＳＩＩ代謝回転速度。
【図１８】Ｃａｓ９標的テトラセルミスＳＧＩ１突然変異体の光生理学測定結果を示すグラフである。Ａ）細胞当たり１４Ｃ  Ｐｍａｘ、Ｂ）ＴＯＣ当たり１４Ｃ  Ｐｍａｘ、およびＣ）成長速度。
【図１９】半連続２４時間光培養系における２つのＣａｓ９標的テトラセルミスＳＧＩ１突然変異体株ＳＴＲ２４０９６およびＳＴＲ２４０９８の面積ＴＯＣ生産性を示すグラフである。
【図２０】Ａ）日周の半連続的培養系における、２つのＣａｓ９標的テトラセルミスＳＧＩ１変異株ＳＴＲ２４０９６およびＳＴＲ２４０９８の面積ＴＯＣ生産性を示すグラフである。Ｂ）日周の半連続的培養系における、古典的に突然変異誘発させたパラクロレラＳＧＩ１突然変異株ＮＥ−７８４３の面積ＴＯＣ生産性を示すグラフである。
【図２１】Ａ）同じ日数の間成長させた野生型アラビドプシス植物（左側の４つのセクター）およびＡＲＲ２突然変異アラビドプシス植物（右側の４つのセクター）を示す写真である。Ｂ）アラビドプシスの野生型植物およびＡＲＲ２突然変異植物のクロロフィルａおよびクロロフィルｂ含有量を湿潤重量の百分率として示すグラフである。
【図２２Ａ】２３日目のアラビドプシスの野生型植物およびＡＲＲ２突然変異植物の乾燥重量を示すグラフである。
【図２２Ｂ】２３日目のアラビドプシスの野生型植物およびＡＲＲ２突然変異植物の湿潤重量を示すグラフである。
【図２２Ｃ】１８日目のアラビドプシスの野生型植物およびＡＲＲ２突然変異植物の乾燥重量を示すグラフである。
【図２２Ｄ】１８日目のアラビドプシスの野生型植物およびＡＲＲ２突然変異植物の湿潤重量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
発明の詳細な説明
本明細書において提供されるのは、対照藻類と比べて、クロロフィルの減少、およびより高い光合成効率を有する藻類突然変異体であり、藻類突然変異体は、レスポンスレシーバードメインおよびホメオドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現の減衰を有する。細菌性ＣｈｅＹタンパク質は、環境シグナルに応答して転写変化をもたらす二成分系の既知のメンバーである。
【００３６】
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾がある場合には、定義を含め、本出願が優先するものとする。文脈上別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本出願内に提供されるすべての範囲は、特に明記しない限り、範囲の上限および下限の値を含む。
【００３７】
本明細書で言及されているすべての刊行物、特許および他の参考文献は、各個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されているかのように、あらゆる目的でその全体が参照により組み込まれる。
【００３８】
本明細書で「Ａおよび／またはＢ」などの句で使用される用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」、および「Ｂ」を含むことを意図している。
【００３９】
「約」とは、表示値の１０％以内、表示値の５％以内、もしくは場合によっては表示値の２．５％以内のいずれかを意味するか、または「約」は、最も近い有効数字に四捨五入されていることを意味し得る。
【００４０】
用語「遺伝子」は、ポリペプチドまたは発現ＲＮＡをコードしている核酸分子（典型的にはＤＮＡであるが、任意でＲＮＡ）の任意のセグメントを指すために広く用いられる。したがって、遺伝子は、発現ＲＮＡ（ポリペプチドコード配列、例えば、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、リボザイムなど機能的ＲＮＡを挙げることができる）をコードしている配列を含む。遺伝子は、それらの発現に必要な、またはそれらの発現に影響を及ぼす調節配列、ならびにその天然状態のタンパク質またはＲＮＡコード配列に関連する配列、例えばイントロン配列、５’または３’非翻訳配列などをさらに含み得る。いくつかの例では、「遺伝子」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子のタンパク質コード部分のみを指すことがある（イントロンを含んでいても、含んでいなくてもよい）。遺伝子は、好ましくは５０ヌクレオチド長、より好ましくは１００ヌクレオチド長であり、例えば５０ヌクレオチド〜５００，０００ヌクレオチド長、例えば１００ヌクレオチド〜１００，０００ヌクレオチド長、または約２００〜約５０，０００ヌクレオチド長さ、または約２００ヌクレオチド〜約２０，０００ヌクレオチド長であり得る。遺伝子は、目的の供給源からのクローニング、または既知のもしくは予測される配列情報からの合成など、様々な供給源から得ることができる。
【００４１】
「核酸」または「核酸分子」という用語は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の任意のセグメントを指し、また修飾骨格を有する核酸（例えば、ペプチド核酸、ロック核酸）または修飾もしくは非天然核酸塩基を含む。核酸分子は、二本鎖または一本鎖であり得る。遺伝子またはその一部分を含む一本鎖核酸分子は、コーディング（センス）鎖または非コーディング（アンチセンス）鎖であり得る。
【００４２】
核酸分子またはポリペプチドは、示された供給源からの核酸セグメントまたはポリペプチドの（全体的なまたは部分的な）単離を含む、示された供給源に「由来」し得る。核酸分子はまた、例えば、直接クローニング、ＰＣＲ増幅、または示されたポリヌクレオチド供給源からの人工合成によって、または示されたポリヌクレオチド供給源に関連する配列に基づいて、示された供給源に由来し得る。これらは、例えば、生物種であり得る。
【００４３】
特定の供給源または種に由来する遺伝子または核酸分子としては、供給源核酸分子に対して配列修飾を有する遺伝子または核酸分子も挙げられる。すなわち、遺伝子または核酸分子の配列は、参照された供給源または種に由来する遺伝子または核酸分子の配列に由来するが、修飾を有し得る配列に由来する。例えば、ある供給源（例えば、特定の参照遺伝子）由来の遺伝子または核酸分子は、意図しない、または故意に導入された、供給源遺伝子または核酸分子に対する１つ以上の突然変異を含み得る。置換、欠失、もしくは挿入など、１つ以上の突然変異が故意に導入された場合、これらの配列の変化は、増幅もしくは他の遺伝子合成もしくは分子生物学的技術、または化学合成、またはこれらの組み合わせによって、細胞もしくは核酸の無作為突然変異もしくは標的指向性突然変異によって導入され得る。機能性ＲＮＡもしくはポリペプチドをコードする参照遺伝子もしくは核酸分子に由来する遺伝子もしくは核酸分子は、参照機能性ＲＮＡもしくはポリペプチドもしくは供給源の機能性ＲＮＡもしくはポリペプチド、またはそれらの機能的断片と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する機能性ＲＮＡもしくはポリペプチドをコードすることができる。例えば、機能性ＲＮＡもしくはポリペプチドをコードする参照遺伝子もしくは核酸分子に由来する遺伝子もしくは核酸分子は、参照機能性ＲＮＡもしくはポリペプチドもしくは供給源の機能性ＲＮＡもしくはポリペプチド、またはそれらの機能的断片と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する機能性ＲＮＡもしくはポリペプチドをコードすることができる。
【００４４】
同様に、特定の供給源または種に由来するポリペプチドまたはタンパク質としては、供給源プロペプチドに対して配列修飾を有するポリペプチドまたはタンパク質が挙げられ、すなわち、ポリペプチドは、修飾を有し得る参照供給源または種に由来するポリペプチドの配列に由来する。例えば、ある供給源に由来するポリペプチドまたはタンパク質（例えば、特定の参照タンパク質）は、意図しないまたは故意に導入された（例えば、コード核酸分子の突然変異によって）供給源ポリペプチドに対して１つ以上の突然変異（アミノ酸の差異）を含み得る。参照ポリペプチドに由来するポリペプチドは、参照ポリペプチドまたは供給源ポリペプチドと、またはその機能的断片と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有し得る。例えば、参照ポリペプチドに由来するポリペプチドは、参照ポリペプチドまたは供給源ポリペプチドと、またはその機能的断片と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し得る。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、「単離された」核酸またはタンパク質は、その天然の環境または核酸またはタンパク質が天然に存在する状況から取り出される。例えば、単離されたタンパク質または核酸分子は、それがその天然のまたは天然環境において会合している細胞または生物から取り出される。単離された核酸またはタンパク質は、場合によっては、部分的または実質的に精製されていてもよいが、単離のために特定の精製レベルは求められていない。したがって、例えば、単離された核酸分子は、それが天然に組み込まれている染色体、ゲノム、またはエピソームから切り取られた核酸配列であり得る。
【００４６】
「精製された」核酸分子もしくはヌクレオチド配列、またはタンパク質もしくはポリペプチド配列は、細胞材料および細胞成分を実質的に含まない。精製された核酸分子またはタンパク質は、例えば緩衝液または溶媒以外に化学物質を実質的に含まなくてもよい。「実質的に含まない」とは、新規核酸分子以外の他の成分が検出不可能であることを意味することを意図するものではない。
【００４７】
「天然に存在する」および「野生型」という用語は、天然に見られる形態を指す。例えば、天然に存在するまたは野生型の核酸分子、ヌクレオチド配列またはタンパク質は、天然の供給源に存在し、かつそこから単離されてもよく、またヒトの操作によって意図的に改変されていない。
【００４８】
本明細書において使用される場合、「減衰された」とは、量、程度、強度、または強さが減少したことを意味する。減衰された遺伝子は、減衰されていない遺伝子、または野生型遺伝子と比較して、そのコードされた産物の産生がより少なく、かつ／またはより機能的でないコードされた産物を産生する遺伝子である。いくつかの例では、減衰された遺伝子はそのコードされた産物を全く産生しないか、または完全に不活性である遺伝子産物（ポリペプチド）を産生できる。減衰された遺伝子発現は、問題の遺伝子の有意に低下した量および／もしくは転写速度、またはコードされたタンパク質の翻訳、折り畳み、もしくは組み立ての有意に低下した量および／もしくは転写速度を意味し得る。非限定的な例として、減衰された遺伝子は、完全な機能的オープンリーディングフレームをコードしないか、または遺伝子調節配列の変更もしくは妨害による発現の減少を有する突然変異遺伝子または妨害遺伝子（例えば、部分的もしくは完全欠失、短縮、フレームシフト、または挿入突然変異によって妨害された遺伝子）であり得る。減衰された遺伝子はまた、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼす１つ以上の突然変異を有する遺伝子であり得、コードされたポリペプチドは、突然変異（複数可）によって量および／または活性が低減されている。減衰された遺伝子はまた、例えばアンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＲＮＡｉ分子、またはリボザイムなどの、遺伝子の発現を減少させる構築物によって標的とされた遺伝子であり得る。減衰された遺伝子発現は、遺伝子発現の消失、例えば、遺伝子発現の微量または検出不可能な量までの減少であり得る。減衰された遺伝子発現はまた、完全に機能的ではないまたは非機能的なＲＮＡまたはタンパク質をもたらす遺伝子発現であり得、例えば、減衰された遺伝子発現は、短縮型ＲＮＡおよび／またはポリペプチドをもたらす遺伝子発現であり得る。
【００４９】
「外因性核酸分子」または「外因性遺伝子」は、細胞に導入された（「形質転換された」）核酸分子または遺伝子を指す。形質転換細胞は、組換え細胞と称されることがあり、内部に追加の外因性遺伝子（複数可）が導入され得る。核酸分子により形質転換された細胞の子孫は、外因性核酸分子を受け継いでいる場合には、「形質転換された」とも称される。外因性遺伝子または核酸分子は、形質転換されている細胞に関して、異なる種（したがって「異種」）または同じ種（したがって「同種」）に由来し得る。「内因性」核酸分子、遺伝子またはタンパク質は、宿主中に存在するか、または宿主によって天然に産生されるため、天然の核酸分子、遺伝子またはタンパク質である。
【００５０】
用語「天然の」は、本明細書では、宿主中に天然に存在する核酸配列またはアミノ酸配列を指すために使用される。用語「非天然」は、本明細書では、宿主中に天然には存在しない核酸配列またはアミノ酸配列を指すのに使用される。したがって、「非天然」核酸分子は、宿主細胞に天然には存在しない核酸分子であり、例えば、非天然核酸分子は、導入される宿主細胞または微生物にとって外因性であり、宿主細胞または微生物に対して異種であり得る。さらに、細胞から取り出され、実験室操作に供され、宿主細胞に導入または再導入され、かつ、これにより、操作されていない生物におけるその位置に対して、ゲノム中の配列または位置が異なる（すなわち、非形質転換生物において並置されていない、または作動可能に連結されていない配列と並置されているか、または作動可能に連結されている）ようになっている核酸配列またはアミノ酸配列は、「非天然」である。非天然遺伝子としては、宿主ゲノム中に再結合された１つ以上の異種調節配列に作動可能に連結された、宿主微生物にとって内因性の遺伝子も挙げられる。
【００５１】
「組換え」または「操作された」核酸分子は、ヒトの操作によって改変された核酸分子である。非限定的な例として、組換え核酸分子は、以下の任意の核酸分子が挙げられる：１）例えば、化学的または酵素的技術を用いて（例えば、化学的核酸合成を用いることによる、または核酸分子の複製、重合、消化（エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ）、ライゲーション、逆転写、転写、塩基修飾（例えば、メチル化など）、組み込みまたは組換え（相同および部位特異的組換えなど）のための酵素を用いることによる）インビトロで部分的にまたは完全に合成または修飾されている；２）本来結合していない結合ヌクレオチド配列を含んでいる；３）天然に存在する核酸分子配列に対して、１つ以上のヌクレオチドを欠くように分子クローニング技術を用いて操作されている；かつ／または４）天然に存在する核酸配列に対して、１つ以上の配列変化または再配置を有するように分子クローニング技術を用いて操作されている。非限定的な例として、ｃＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏポリメラーゼ反応（複数可）によって生成された、またはリンカーが付着した、またはベクター（クローニングベクターもしくは発現ベクターなど）に組み込まれた任意の核酸分子と同様に、組換えＤＮＡ分子である。
【００５２】
本明細書で使用される「組換えタンパク質」という用語は、アミノ酸が野生型タンパク質のものと異なるか否かにかかわらず、遺伝子操作によって産生されるタンパク質を指す。
【００５３】
生物に適用する場合、組換え、操作された、または遺伝子操作されたという用語は、異種または外因性の組換え核酸配列（例えば、非天然核酸配列）をその生物に導入することによって操作された生物を指す。これには、遺伝子ノックアウト、標的指向性突然変異、遺伝子置換、およびプロモーター置換、欠失、妨害、または挿入、ならびに導入遺伝子または合成遺伝子または核酸配列の生物への導入が挙げられる。すなわち、組換え、操作された、または遺伝子操作されたは、ヒトの介入によって改変された生物を指す。組換え生物または遺伝子操作生物もまた、遺伝子「ノックダウン」のための構築物が導入されている生物であり得る。こうした構築物としては、これらに限定されないが、ＲＮＡｉ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、およびリボザイム構築物が挙げられる。また、そのゲノムがメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはｃａｓ／ＣＲＩＳＰＲ系の活性によって改変されている生物も挙げられる。外因性または組換え核酸分子は、組換え／遺伝子操作された生物のゲノムに組み込まれ得るか、または他の場合には宿主ゲノムに組み込まれなくてもよい。本明細書において使用される場合、「組換え微生物」または「組換え宿主細胞」としては、本発明の組換え微生物の子孫または派生物が挙げられる。突然変異または環境の影響のいずれかにより、後続の世代においてある種の改変が起こり得るので、こうした子孫または派生物は、実際に、親細胞と同一ではない可能性もあるが、それでも本明細書で用いる用語の範囲内に含まれる。
【００５４】
用語「プロモーター」は、細胞内のＲＮＡポリメラーゼに結合し、かつ下流（３’方向）コード配列の転写を開始することができる核酸配列を指す。プロモーターは、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含む。プロモーターは、転写開始部位ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）を含み得る。真核生物プロモーターは、常にではないが、多くの場合「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。原核生物プロモーターは、−１０および−３５原核生物プロモーターコンセンサス配列を含み得る。種々の異なる供給源からの構成的、誘導性および抑制性プロモーターなど、多数のプロモーターが当該分野において周知である。代表的な供給源としては、例えば、藻類、ウイルス、哺乳動物、昆虫、植物、酵母、および細菌の細胞型が挙げられ、これらの供給源由来の好適なプロモーターは容易に入手可能であるか、または、オンラインで、もしくは、例えば、ＡＴＣＣなどの寄託機関ならびに他の商業的もしくは個々の供給源から公的に利用可能な配列に基づいて、合成により作製できる。プロモーターは、一方向性（一方向に転写を開始する）または双方向性（いずれかの方向に転写を開始する）であり得る。プロモーターは、構成的プロモーター、抑制性プロモーター、または誘導性プロモーターであり得る。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始する遺伝子近位プロモーターに加えて、遺伝子の転写開始部位の１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂまたはそれ以上の範囲内であり得る遺伝子の上流のさらなる配列を含み得る。この追加の配列は、下流遺伝子の転写速度、および任意で発生的、環境的または生化学的（例えば、代謝的）条件に対するプロモーターの応答性に影響を及ぼし得る。
【００５５】
ポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチド、または酵素に関して使用される場合の「異種」という用語は、宿主生物の種以外の供給源からのものであるかそれに由来するポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチド、または酵素を指す。対照的に、「相同な」ポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチド、または酵素は、宿主生物種に由来するポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチド、または酵素を示すために本明細書で使用される。遺伝子調節配列または遺伝子配列を維持または操作するために使用される補助核酸配列（例えば、プロモーター、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、ポリＡ付加配列、イントロン配列、スプライス部位、リボソーム結合部位、内部リボソーム進入配列、ゲノム相同領域、組換え部位など）を指す場合、「異種」は、構築物、ゲノム、染色体、またはエピソームにおいて、調節配列または補助配列が、調節核酸配列または補助核酸配列が並置されている遺伝子と天然では会合していないことを意味する。したがって、その天然状態において（すなわち、遺伝子操作されていない生物のゲノムにおいて）作動可能に連結されていない遺伝子に作動可能に連結されているプロモーターは、プロモーターが、連結している遺伝子と同じ種（または、場合によっては同じ生物）に由来している場合であっても、本明細書においては、「異種プロモーター」と呼ばれる。
【００５６】
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質」または「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」を包含することを意図し、また、アミド結合（ペプチド結合としても公知である）によって直線状に連結されたモノマー（アミノ酸）からなる分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖（複数可）を指し、特定の長さの産物を指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の鎖（複数可）を指すために使用される他の任意の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはそれらと交換可能に使用できる。
【００５７】
遺伝子およびタンパク質の受託番号は、一般に遺伝子名または種名の後に括弧で括られており、米国国立衛生研究所が管理する国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（ncbi.nlm.nih.gov）で公的に入手可能である配列記録の一意の識別子である。「ＧｅｎＩｎｆｏ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ」（ＧＩ）配列識別番号は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に特異的である。配列が何らかの形で変化した場合は、新しいＧＩ番号が割り当てられる。配列改訂履歴ツール（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ｈｉｓｔｏｒｙ  ｔｏｏｌ）は、特定のＧｅｎＢａｎｋレコードに現れる配列の様々なＧＩ番号、バージョン番号、および更新日を追跡するために、利用可能である。受託番号およびＧＩ番号に基づいて核酸または遺伝子配列またはタンパク質配列を検索し、取得することは、例えば、細胞生物学、生化学、分子生物学、および分子遺伝学の分野において周知である。
【００５８】
本明細書で使用される場合、核酸またはポリペプチド配列に関する用語「同一性パーセント」または「相同性」は、最大の同一性パーセントとなるように配列を整列させ、かつ必要に応じて、最大相同性を達成するためにギャップを導入した後の、既知のポリペプチドと同一である候補配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージ（百分率）として定義される。Ｎ末端またはＣ末端の挿入または欠失は、相同性に影響を及ぼすと解釈されてはならず、約３０未満、約２０未満、または約１０未満のアミノ酸残基に対する内部欠失および／またはポリペプチド配列への挿入は、相同性に影響を及ぼすと解釈されてはならない。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列レベルでの相同性または同一性は、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９７年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５、３３８９−３４０２、およびＫａｒｌｉｎ（１９９０年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７、２２６４−２２６８）が用いるアルゴリズムを使用したＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）分析によって決定でき、これらは配列類似性検索用に調整されている。ＢＬＡＳＴプログラムによって使用されるアプローチでは、最初に、クエリ配列とデータベース配列との間のギャップの有無で類似セグメントを考慮し、次に同定されたすべての一致の統計的有意性を評価し、最後に、事前に選択された重要度のしきい値を満たすそれらの一致のみを要約する。配列データベースの類似性検索における基本的な問題の議論については、Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９４年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６、１１９−１２９を参照されたい。ヒストグラム、説明、アライメント、期待値（すなわち、データベース配列に対する一致を報告するための統計的有意性のしきい値）、カットオフ、行列、およびフィルター（低複雑度）の検索パラメータは、デフォルト設定であり得る。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘによって使用されるデフォルトのスコアリングマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスであり（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９、１０９１５−１０９１９）、長さ８５を超えるクエリ配列（ヌクレオチド塩基またはアミノ酸）に推奨される。
【００５９】
ヌクレオチド配列を比較するために設計されたｂｌａｓｔｎの場合、スコアリングマトリックスは、Ｍ（すなわち、一対の一致残基に対する報酬スコア）対Ｎ（すなわち、不一致残基に対するペナルティスコア）の比によって設定される。Ｍのデフォルト値は＋５であり、Ｎのデフォルト値は、−４である。４つのｂｌａｓｔｎパラメータは、次のように調整できる：Ｑ＝１０（ギャップ作成ペナルティ）；Ｒ＝１０（ギャップ延長ペナルティ）；ｗｉｎｋ＝１（クエリに沿ってすべてのウインク位置に単語ヒットを生成する）；およびｇａｐｗ＝１６（ギャップのあるアライメントが生成されるウィンドウ幅を設定する）。アミノ酸配列を比較するための等価のＢｌａｓｔｐパラメータ設定は、以下であり得る：Ｑ＝９；Ｒ＝２；ｗｉｎｋ＝１；およびｇａｐｗ＝３２。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０で利用可能な配列間のベストフィット比較は、ＤＮＡパラメータＧＡＰ＝５０（ギャップ生成ペナルティ）およびＬＥＮ＝３（ギャップ伸長ペナルティ）を使用することができ、タンパク質比較における等価設定は、ＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２であり得る。
【００６０】
本明細書で使用される場合、句「保存的アミノ酸置換」または「保存的突然変異」は、共通の性質を有する別のアミノ酸により、１つのアミノ酸を置換することを指す。個々のアミノ酸間の共通の性質を定義する機能的方法は、相同生物の対応するタンパク質間におけるアミノ酸変化の正規化した頻度を分析することである（Ｓｃｈｕｌｚ（１９７９年）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。こうした分析によれば、グループ内のアミノ酸が優先的に互いに交換するアミノ酸のグループを定義することができ、したがって、全タンパク質構造に対するそれらの影響において互いに最も類似している（Ｓｃｈｕｌｚ（１９７９年）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。このように定義されるアミノ酸基の例は、以下を挙げることができる：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓなどの「荷電／極性基」；Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐなどの「芳香族または環式基」；ならびにＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｙｓなどの「脂肪族基」。各グループ内で、サブグループも同定可能である。例えば、荷電／極性アミノ酸の群は、以下のものを含む小群に細分することができる：Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓを含む「正荷電サブグループ」；ＧｌｕおよびＡｓｐを含む「負荷電サブグループ」；ＡｓｎおよびＧｌｎを含む「極性サブグループ」。別の例では、芳香族基または環式基は、以下のものを含むサブグループに細分することができる：Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、およびＴｒｐを含む「窒素環サブグループ」；およびＰｈｅおよびＴｙｒを含む「フェニルサブグループ」。別のさらなる例では、脂肪族基は、以下を含むサブグループに細分することができる：Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅを含む「大脂肪族非極性サブグループ」；Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｙｓを含む「脂肪族微極性サブグループ」；ＧｌｙおよびＡｌａを含む「小残基サブグループ」。保存的突然変異の例としては、これらに限定されるものではないが、以下など上記サブグループ内のアミノ酸のアミノ酸置換が挙げられる：正電荷を維持できるように、ＡｓｐではＬｙｓ、またはその逆；負電荷を維持できるように、ＡｓｐではＧｌｕ、またはその逆；遊離−ＯＨを維持できるように、ＴｈｒではＳｅｒ、またはその逆；遊離−ＮＨ２を維持できるように、ＡｓｎではＧｌｎ、またはその逆。「保存的変異体」は、参照ポリペプチド（例えば、その配列が刊行物もしくは配列データベースに開示されているか、または核酸シーケンシングによって決定された配列のポリペプチド）の１つ以上のアミノ酸を、例えば、上で説明したものと同じアミノ酸グループもしくはサブグループに属している共通の特性を有するアミノ酸と交換するために置換された１つ以上のアミノ酸を含むポリペプチドである。
【００６１】
本明細書において使用される場合、「発現」は、少なくともＲＮＡの産生レベルでの遺伝子の発現を含み、「発現産物」としては、結果として得られた産物、例えば、発現遺伝子のポリペプチドまたは機能性ＲＮＡ（例えば、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイムなど）が挙げられる。「発現の増加」という用語には、ｍＲＮＡ産生の増大および／またはポリペプチド発現の増加を促進するための遺伝子発現の変化を含む。「（遺伝子産物の）産生の増加」は、ポリペプチドの天然の産生もしくは酵素活性と比較して、ポリペプチドの発現量の増加、ポリペプチドの酵素活性のレベルの上昇、またはその両方の組み合わせを含む。
【００６２】
本発明のいくつかの態様は、特定のポリヌクレオチド配列の発現の部分的、実質的または完全な欠失、サイレンシング、不活性化、または下方制御を含む。遺伝子は、部分的に、実質的にまたは完全に欠失、サイレンシング、不活性化されてもよいか、またはその発現は、それらがコードするポリペプチドによって行われる活性（酵素の活性など）に影響を及ぼすために下方制御されてもよい。遺伝子は、遺伝子の機能および／または発現を妨害する核酸配列の挿入（例えば、ウイルス挿入、トランスポゾン突然変異誘発、メガヌクレアーゼ操作、相同組換え、または当技術分野で公知の他の方法）によって部分的、実質的または完全に欠失、サイレンシング、不活性化、または下方制御され得る。「消失する」、「消失」、および「ノックアウト」という用語は、「欠失」、「部分的欠失」、「実質的な欠失」、または「完全欠失」という用語と同義的に使用することができる。特定の実施形態では、目的の微生物は、目的の特定の遺伝子をノックアウトするために、ｃａｓ／ＣＲＩＳＰＲ系を使用する部位特異的相同組換えまたは標的組込みもしくは突然変異によって操作することができる。さらに他の実施形態では、ｃａｓ／ＣＲＩＳＰＲ系、ＲＮＡｉ、またはアンチセンスＤＮＡ（ａｓＤＮＡ）構築物を用いた遺伝子調節領域への標的指向性挿入または突然変異を用いて、部分的に、実質的にまたは完全に特定の目的遺伝子のサイレンシングを行い、不活性化し、または下方制御し得る。
【００６３】
特定の核酸分子または特定のポリヌクレオチド配列のこれらの挿入、欠失、または他の修飾は、得られる微生物または宿主細胞の株が「遺伝子改変」、「遺伝子操作」または「形質転換」されていることが理解され得るように、「遺伝子修飾（複数可）」または「形質転換（複数可）」を包含するものと理解され得る。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「上方制御された」または「上方制御」は、他の点では同一であるが上方制御されていない遺伝子または酵素における発現または活性と比較して、目的遺伝子もしくは目的核酸分子の発現の増加または酵素の活性の増大、例えば、遺伝子発現の増加、または酵素活性の増大を含む。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「下方制御された」または「下方制御」は、他の点では同一であるが下方制御されていない遺伝子または酵素における発現または活性と比較して、目的遺伝子もしくは目的核酸分子の発現の減少または酵素の活性の低下、例えば、遺伝子発現の減少、または酵素活性の低下を含む。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「突然変異体」とは、例えばガンマ線照射、ＵＶ、または化学的変異原を使用する、古典的な突然変異誘発の結果である突然変異を遺伝子中に有する生物を指すか、またはこれらに限定されないが、以下の遺伝子操作の結果として遺伝子の構造または発現を変化させた組換え生物である；異なる時間的、生物学的、もしくは環境的調節下での、および／または天然に発生するものとは異なる程度までの遺伝子の発現、および／または組換え細胞において天然に発現しない遺伝子の発現を含む過剰発現；ノックアウトおよびノックインなどの相同組換え（例えば、野生型ポリペプチドおよび／またはドミナントネガティブポリペプチドよりも高いまたは低い活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子による遺伝子置換）；ＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡ、またはリボザイムなどによる遺伝子の減衰；およびメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、および／またはＣＲＩＳＰＲ技術などを用いたゲノム操作など。したがって、突然変異体は、天然の生物ではなく、ヒトの介入の結果である。目的の突然変異生物は、典型的には、突然変異を有さない対応する野生型または祖先株とは異なる表現型を有しており、表現型は、成長アッセイ、生成物分析、光合成特性、生化学的アッセイなどによって評価することができる。遺伝子に言及するとき、「変異体」は、その遺伝子が、天然型または野生型の遺伝子に対して少なくとも１つの塩基（ヌクレオチド）の変化、欠失、または挿入を有することを意味する。突然変異（１つ以上のヌクレオチドの変化、欠失、および／または挿入）は、遺伝子のコード領域に存在してもよく、またはイントロン、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、またはプロモーター領域、例えば転写開始部位の２ｋｂ以内または翻訳開始部位の３ｋｂ以内に存在してもよい。例えば、本明細書に開示されるような遺伝子の発現が減衰している突然変異体は、５’遺伝子転写開始部位領域に対する１つ以上の核酸塩基変化および／または１つ以上の核酸塩基欠失および／または１つ以上の核酸塩基挿入であり得る突然変異を有し得る。例えば、非限定的な例において、既知または推定の転写開始部位の２ｋｂ以内、１．５ｋｂ以内、１ｋｂ以内、もしくは０．５ｋｂ以内、または翻訳開始部位の３ｋｂ以内、２．５ｋｂ以内、２ｋｂ以内、１．５ｋｂ以内、１ｋｂ以内、もしくは０．５ｋｂ以内である。非限定的な例として、突然変異遺伝子は、遺伝子の発現を増加させること、または減少させることのいずれかが可能であるプロモーター領域内に突然変異、挿入もしくは欠失を有する遺伝子であり得る；または非機能的タンパク質、切断型タンパク質、ドミナントネガティブタンパク質、もしくはタンパク質を含まない産生をもたらす欠失を有する遺伝子であり得る；またはコードされたタンパク質のアミノ酸の変化をもたらすか、もしくは結果として遺伝子転写物の異常なスプライシングなどとなる１つ以上の点突然変異を有する遺伝子であり得る。
【００６７】
ポリペプチドの保存ドメインとしては、「ｃｄ」（保存ドメイン）データベース、ＣＯＧデータベース、ＳＭＡＲＴデータベース、ＰＲＫデータベース、ＴＩＧＲＦＡＭデータベース、ＩｎｔｅｒＰｒｏデータベース（ebi.ac.uk/interpro/）または他の既知のもので同定されたものが挙げられる。米国国立衛生研究所後援の国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイト（ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）には、古いドメインおよび完全長タンパク質のための十分に注釈が付けられている多重配列アラインメントモデルの集合から構成されている「タンパク質アノテーションリソース」として記載されている保存ドメインデータベース（ＣＤＤ）が含まれている。これらは、ＲＰＳ−ＢＬＡＳＴを介したタンパク質配列中の保存ドメインを迅速に同定するための位置特異的スコアマトリックス（ＰＳＳＭ）として利用可能である。ＣＤＤコンテンツとしては、３Ｄ構造情報を使用してドメイン境界を明示的に画定し、配列／構造／機能の関係についての洞察を提供するＮＣＢＩキュレーションドメイン、ならびに複数の外部ソースデータベース（Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、ＣＯＧ、ＰＲＫ、ＴＩＧＲＦＡＭ）からインポートしたドメインモデルが挙げられる。
【００６８】
用語「Ｐｆａｍ」は、Ｐｆａｍコンソーシアムにより維持されており、以下のいくつかの後援ワールドワイドウエブサイトにおいて入手可能であるタンパク質ドメインおよびタンパク質ファミリーの大規模なコレクションを指す：pfam.sanger.ac.uk/(Welcome Trust, Sanger Institute);pfam.sbc.su.se (Stockholm Bioinformatics Center);pfam.janelia.org/(Janelia Farm,Howard Hughes Medical Institute);pfam.jouy.inra.fr/ (Institut national de la Recherche Agronomique);およびpfam.ccbb.re.kr。Ｐｆａｍの最新リリースはＰｆａｍ  ３０．０（２０１６年５月）である。Ｐｆａｍドメインおよびファミリーは、多重配列アラインメントおよび隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を用いて同定される。Ｐｆａｍ−Ａファミリーまたはドメインアサインメントは、タンパク質ファミリーの代表的なメンバーおよびシードアラインメントに基づくプロファイル隠れマルコフモデルを使用して精選されたシードアラインメントによって生成される高品質のアサインメントである（特に指定のない限り、照会されたタンパク質とＰｆａｍドメインまたはファミリーとの一致はＰｆａｍ−Ａの一致である）。次いで、そのファミリーに属するすべての同定された配列を使用して、そのファミリーの完全アラインメントを自動的に生成する（Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ（１９９８年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６、３２０−３２２；Ｂａｔｅｍａｎ（２０００年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６、２６３−２６６；Ｂａｔｅｍａｎ（２００４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２、Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１３８−Ｄ１４１；Ｆｉｎｎ（２００６年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ  ３４、Ｄ２４７−２５１；Ｆｉｎｎ（２０１０年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ  ３８、Ｄ２１１−２２２）。例えば上記のウェブサイトのいずれかを使用してＰｆａｍデータベースにアクセスすることによって、タンパク質配列は、ＨＭＭＥＲ相同性検索ソフトウェア（例えば、ＨＭＭＥＲ２、ＨＭＭＥＲ３、またはそれ以降のバージョン、hmmer.janelia.org/）を用いてＨＭＭに対して照会され得る。照会されたタンパク質をｐｆａｍファミリーにある（または特定のＰｆａｍドメインを有する）と同定する有意な一致は、ビットスコアがＰｆａｍドメインの収集しきい値以上であるものである。期待値（ｅ値）はまた、照会されたタンパク質をＰｆａｍに含めるための基準として、または照会されたタンパク質が特定のＰｆａｍドメインを有するかどうかを判断するための基準として使用することができる。低ｅ値（１．０よりはるかに小さい、例えば、０．１未満、もしくは０．０１以下）は、一致が偶然によるものである可能性が低いことを表す。
【００６９】
「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡ配列中に存在するウリジン（Ｕ）の代わりにＤＮＡ分子が核酸塩基チミン（Ｔ）を置換することを除いて、ｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部分を含むＤＮＡ分子である。ｃＤＮＡは二本鎖または一本鎖であり得、例えばｍＲＮＡ配列の相補体であり得る。好ましい例では、ｃＤＮＡには、そのｃＤＮＡが対応する天然に存在する遺伝子（すなわち、生物のゲノムに存在する遺伝子）に存在する１つ以上のイントロン配列を含まない。例えば、ｃＤＮＡは、天然に存在する遺伝子のイントロンの下流の配列に並置された天然に存在する遺伝子のイントロンの上流からの配列を有することができ、上流および下流の配列は、天然のＤＮＡ分子においては並置されていない（すなわち、これらの配列は、天然に存在する遺伝子においては並置されていない）。ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡ分子の逆転写によって産生され得るか、または例えば化学合成によって、および／または１つ以上の制限酵素、１つ以上のリガーゼ、１つ以上のポリメラーゼ（これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用できる高温耐性ポリメラーゼ）、１つ以上のリコンビナーゼなどを用いて、ｃＤＮＡ配列の知識に基づいて合成され得る。ｃＤＮＡ配列の知識は、任意でゲノム配列由来のコード領域の同定に基づくか、または配列から複数の部分的ｃＤＮＡを編集したものであってよい。
【００７０】
意図する意味をさらに説明していない「実質的に同じ」または「実質的に同一」である特性への言及は、その特性がその基準値の１０％以内、好ましくは５％以内であり、２．５％以内であり得ることを意味することを意図している。特定の文脈における「実質的に」の意図された意味が記載されていない場合、その用語は、本発明の文脈において重要であると考えられる特徴にとって重要ではない軽微で無関係の逸脱を含むために用いられる。
【００７１】
「対照細胞」、「対照生物」もしくは「対照微生物」は、突然変異細胞、生物、もしくは微生物（遺伝子操作されたもしくは突然変異誘発された細胞、生物、または微生物）が直接もしくは間接的に由来する野生型細胞、生物もしくは微生物のいずれかであるか、または対照細胞、生物、もしくは微生物が生産性の増加をもたらす突然変異を有さないこと、例えば、対照細胞、生物、もしくは微生物は、ＳＧＩ１遺伝子を減衰するように遺伝子操作もしくは変異誘発されていないことを除いて、言及された突然変異細胞、生物、もしくは微生物と実質的に同一である細胞、生物もしくは微生物である。例えば、組換え藻類がＳＧＩ１遺伝子に突然変異を含む場合、対照藻類は、ＳＧＩ１遺伝子に突然変異を含まないことを除いて組換え藻類と実質的に同一であり得る。
【００７２】
本明細書で使用される「同じ条件」または「同じ培養条件」は、実質的に同じ条件を意味し、すなわち、存在し得る言及された条件間の差異はいずれもわずかであり、脂質産生またはバイオマス産生など本発明の実体である微生物の機能または性質に関連しない。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、「脂質（複数可）」は、脂肪、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコールなどの脂肪酸誘導体、ワックスエステル、アルカン、およびアルケン、ステロール、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、およびグリセロ脂質を指す。「ＦＡＭＥ脂質」または「ＦＡＭＥ」は、脂肪酸メチルエステルに誘導体化することができるアシル部分を有する脂質、例えばモノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリド、ワックスエステル、および膜脂質（例えばリン脂質、ガラクト脂質など）を指す。脂質生産性は、ＦＡＭＥ生産性（単位１リットル当たりミリグラム（ｍｇ／Ｌ））として評価することができ、藻類については、１日当たりのグラム／メートル２（ｇ／ｍ２／日）として報告され得る。本明細書において提供される半連続アッセイでは、ｍｇ／Ｌ値は、入射照度面積（１  １／２インチｘ３３／８インチのまたは０．００３１４５ｍ２のＳＣＰＡフラスコラック開口部）および培養物量（５５０ミリリットル）を考慮して、ｇ／ｍ２／日に変換される。生産性の値（単位ｇ／ｍ２／日）を得るために、ｍｇ／Ｌ値に１日の希釈率（３０％）と換算係数０．１７５を掛ける。脂質またはそのサブカテゴリ（例えば、ＴＡＧまたはＦＡＭＥ）が百分率として言及される場合、その百分率は、他に示されない限り重量パーセントである。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、用語「脂肪酸産物」としては、遊離脂肪酸、モノ、ジまたはトリグリセリド、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪酸エステル（これに限定されないが、ワックスエステルなど）、およびこれらに限定されないがアルカンおよびアルケンなどの炭化水素が挙げられる。
【００７５】
「バイオマス」とは、生細胞または死細胞の細胞密度を指し、当技術分野で公知の方法を用いて、例えば、湿潤重量または吸引ペレット重量、または乾燥重量（例えば、培養サンプルまたはペレット細胞の凍結乾燥物）、無灰乾燥重量（ＡＦＤＷ）、または全有機炭素（ＴＯＣ）として査定され得る。バイオマスは、成長許容条件下での培養物の成長中に増加し、例えばバッチ培養における「バイオマス蓄積」と称され得る。定常的または規則的な希釈を受ける連続的または半連続的培養において、そうでなければ培養物中に蓄積するであろう産生バイオマスが、培養物の希釈中に除去される。したがって、これらの培養による毎日のバイオマス生産性（バイオマスの増加）はまた、「バイオマス蓄積」とも呼ばれ得る。バイオマス生産性は、ＴＯＣ生産性（単位１リットル当たりのミリグラム（ｍｇ／Ｌ））として評価することができ、藻類については、１日当たりのグラム／メートル２（ｇ／ｍ２／日）として報告され得る。本明細書において提供される半連続アッセイでは、ｍｇ／Ｌ値は、入射照度面積（１  １／２インチｘ３３／８インチのまたは０．００３１４５ｍ２のＳＣＰＡフラスコラック開口部）および培養物量（５５０ミリリットル）を考慮して、ｇ／ｍ２／日に変換される。生産性の値（単位ｇ／ｍ２／日）を得るために、ｍｇ／Ｌ値に１日の希釈率（３０％）と換算係数０．１７５を掛ける。バイオマスが百分率で表される場合、その百分率は、他に示されない限り重量パーセントである。
【００７６】
本発明の文脈において、「窒素源」は、対象微生物によって取り込まれ代謝され、成長および増殖のために生体分子に組み込まれ得る窒素の供給源である。例えば、成長のために微生物によって取り込まれること、および／または代謝することができない窒素などの化合物（例えば、Ｈｅｐｅｓ、トリスなどの、窒素含有生物学的バッファ）は、本発明の文脈において窒素源とみなされない。
【００７７】
本明細書で使用される「還元窒素」は、培養されている微生物によって取り込まれ、かつ代謝されて、生体分子に取り込まれるための窒素源を提供することができる、アンモニウム、アンモニア、尿素、またはアミノ酸の化学形態の窒素であり、これにより、成長を補助する。例えば、アンモニウム／アンモニアおよび尿素に加えて、還元窒素は種々のアミノ酸を含むことができ、アミノ酸（複数可）は、対象微生物に対する窒素源として役立ち得る。アミノ酸の例としては、グルタメート、グルタミン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、アスパラギン、アラニン、およびグリシンが挙げられるが、これらに限定されない。微生物のための培地中に存在し得る窒素源の文脈における「非還元窒素」は、微生物による有機化合物への同化の前に還元されなければならない硝酸塩または亜硝酸塩を指す。
【００７８】
「（培地中）の唯一の窒素源」は「実質的に唯一の窒素源」と同義的に使用され、他の窒素源が意図的に培地に添加されていないこと、または参照培地で培養された微生物または細胞の成長を有意に増大させるのに十分な量で他の窒素源が培地中に存在していないことを示す。本出願を通して、簡潔にするために、「硝酸塩のみ」という用語は、硝酸塩が、成長を補助するために微生物に利用可能な唯一の窒素源である培地を特徴付けるために使用される。
【００７９】
同様に、「（培地中の）唯一の炭素源」は、「実質的に唯一の炭素源」と同義的に使用され、他の炭素源が、参照培地中で培養される微生物または細胞の生産性、成長、または増殖を増大させるか、または微生物もしくは細胞によって産生される脂質などの生体分子に組み込まれるのに十分な量で存在していないことを示す。
【００８０】
「窒素が豊富な」条件は、培地に追加の窒素を（微生物によって使用され得る形態で）添加することによって、さらなる成長または増殖の利益が付与されることのない培地条件を指す。同様に、「栄養素が豊富な」条件は、栄養素が成長または増殖を制限していない培地条件を指し、すなわち、培地の栄養素が豊富である場合、追加の栄養素（複数可）を培地に添加しても成長率または増殖率の改善がもたらされることはない。「栄養素が豊富な」の文脈において、「栄養素」としては、非限定的な例として、リン酸塩、硫黄、鉄、および任意でシリカが挙げられるが、エネルギー源として生物によって使用され得る糖または有機酸などの炭素源を除く。
【００８１】
ＳＧＩ１ポリペプチド
本明細書に記載されるように、ＳＧＩ１または「有意な成長改善１」ポリペプチドは、レスポンスレギュレーターレシーバーまたは「ＲＲ」ドメイン（ｐｆａｍ  ＰＦ０００７２）およびＭｙｂ様結合ドメイン（本明細書において単に「ｍｙｂ」ドメイン（ｐｆａｍ  ＰＦ００２４９）と称される）を含むポリペプチドであり、ＲＲドメインは、ｍｙｂドメインに対してＮ末端側に位置付けられている。ＲＲドメインおよびｍｙｂドメインを包含するＳＧＩ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＳＲＧ１ポリペプチドの間ではあまり保存されていないかまたは保存されていないことが判明しているＲＲドメインとｍｙｂドメインとの間に生じるアミノ酸の伸長を含む。ＲＲドメインとｍｙｂドメインとの間に生じるアミノ酸配列は、本明細書において２つのドメイン間のリンカーと称され得る。リンカーは任意の長さのものであってもよく、様々な実施例において１〜約３００個のアミノ酸、１０〜約２００個のアミノ酸、または２０〜約１５０個のアミノ酸の長さの範囲であり得る。リンカー領域は、核局在化配列（ＮＬＳ）を任意に含み得る。
【００８２】
ＳＧＩ１タンパク質内のＲＲドメインは、ｐｆａｍ  ＰＦ０００７２、または「シグナルレシーバードメイン」もしくは単に「レシーバードメイン」として特徴付けることができ、かつ／または保存ドメインデータベース（ＣＤＤ）ではｃｄ００１５６として、タンパク質データベースのオルソロググループのクラスターではＣＯＧ０７８４として、またはＩｎｔｅｒｐｒｏの「ＣｈｅＹ様スーパーファミリー」ドメインのＩＰＲ０１１００６として分類することができる。ＲＲドメインは、細菌の二成分調節系（ＣｈｅＹとして公知であるポリペプチドを含む細菌の走化性二成分系など）に見られ、その系では、センサーパートナーからシグナルを受け取る。こうした系のＲＲドメインは、多くの場合ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端側に見出され、ホスホアクセプター部位を含み得る。図４には、パラクロレラ種  ＷＴ−１１８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）、コッコミクサ・スベリプソイデア（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、オストレオコッカス・ルシマリヌス（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）、クラミドモナス・レインハルディ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、クロモクロリス・ゾフィンジエンシス（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）、ボルボックス・カルテリ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）、テトラセルミス種  １０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、オオキスティス種  ＷＴ−４１８３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）、およびミクロモナス種  ＲＣＣ２９９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）のＲＲドメインのアライメントを提供する。
【００８３】
ＳＧＩ１タンパク質内のｍｙｂドメインは、例えば、ｐｆａｍＰＦ００２４９：「Ｍｙｂ様ＤＮＡ結合ドメイン」として特徴付けることができ、かつ／または保存ドメインＴＩＧＲ０１５５７「ｍｙｂ様ＤＮＡ結合ドメイン、ＳＨＡＱＫＹＦクラス」、またはＩｎｔｅｒｐｒｏ  Ｈｏｍｅｏｂｏｘ様ドメインスーパーファミリードメイン（ＩＰＲ００９０５７）および／またはＩｎｔｅｒｐｒｏ  Ｍｙｂドメイン（ＩＰＲ０１７９３０）として同定することができる。
【００８４】
ｍｙｂドメインのＮ末端にＲＲドメインを有することに加えて、本明細書において提供されるＳＧＩ１タンパク質は、タンパク質のアミノ酸配列が藻類中のＳＧＩ１相同体の領域の保存アミノ酸にどのぐらい一致しているか基づいて、タンパク質をスコアリングするように設計された隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）でスキャンした場合、３００以上、３２０以上、３４０以上、３５０以上、３６０以上、または３７０以上のスコアを有することができ、約１ｅ−１０、１ｅ５０、１ｅ−７０、または１ｅ−１００未満のｅ値を有し得る（実施例６を参照されたい）。ＨＭＭを開発するために使用されるＳＧＩ１ポリペプチドの領域は、（Ｎ末端からＣ末端方向に）ＲＲドメイン、リンカー、およびｍｙｂドメインを含むアミノ酸配列である。ＨＭＭでは、高度に保存されたアミノ酸位置は、スコアに到達するために、ポリペプチドの比較された領域内においてあまり保存されていないアミノ酸位置よりも重く重み付けされる。これらに限定されないが、パラクロレラ種  １１８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、コッコミクサ・スベリプソイデア（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、オストレオコッカス・ルシマリヌス（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、クラミドモナス・レインハルディ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ボルボックス・カルテリ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、テトラセルミス種  １０５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、１５、および１６）、オオサイスティス種（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、ミクロモナス種  ＲＣＣ２９９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、ミクロモナス・プシラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ  ｐｕｓｉｌｌａ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、スファグナム・ファラクス（Ｓｐｈａｇｎｕｍ  ｆａｌｌａｘ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、アラビドプシス・ハレリ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｈａｌｌｅｒｉ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、アラビドプシス・リラタ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｌｙｒａｔａ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、アンボレラ・トリコポダ（Ａｍｂｏｒｅｌｌａ  ｔｒｉｃｈｏｐｏｄａ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）、アプランドワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）、ファエロリス・ブルガリス（Ｐｈａｅｏｌｉｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）、キヌア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｑｕｉｎｏａ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）、セイヨウリンゴ（Ｍａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）、ブラッシカ・ラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）、およびアジアイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）などの藻類および植物種のポリペプチドを用いて生育したＲＲドメイン、リンカー、およびｍｙｂドメインを含む単一の連続配列を含む藻類ＳＧＩ１ポリペプチドのタンパク質配列に基づくＨＭＭモデルでスキャンすると、ポリペプチドは、少なくとも約３００、または３５０以上、例えば３７０以上のスコアを有する。ＳＧＩ１ポリペプチドとして、前述のいずれかに対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドも含まれる。ポリペプチドは、ＲＲドメインおよびｍｙｂドメインを有し、ＲＲドメインは、ｍｙｂドメインのＮ末端にあり、ＳＧＩ１ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドまたはその変異体である。様々な実施形態において、ＳＧＩ１ポリペプチドは、植物または藻類種由来であり、すなわち植物または藻類種の天然に存在するポリペプチドである。本明細書において提供されるＳＧＩ１ポリペプチドをコードする遺伝子、例えば本明細書において提供される突然変異体において妨害されているかまたはその発現が減衰されている遺伝子は、様々な実施形態において、本明細書に開示のポリペプチドをコードする植物または藻類の天然に存在する遺伝子であり得る。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供されるＳＧＩ１ポリペプチドは、例えば、天然に存在する藻類ＳＧＩ１ポリペプチドの配列を有する藻類ＳＧＩ１ポリペプチドであり、藻類ポリペプチドは、ＲＲドメインおよびｍｙｂドメインを含み、ＲＲドメインは、ｍｙｂドメインのＮ末端である。藻類ポリペプチドは、本明細書に開示の藻類ＳＧＩ１ポリペプチドのいずれかに対して、任意で、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有することができる。いくつかの実施形態では、ＳＧＩ１遺伝子は、例えば、天然に存在する藻類ＳＧＩ１ポリペプチドの配列を有するポリペプチドなどの藻類ＳＧＩ１ポリペプチドをコードする遺伝子であり得る。天然に存在する藻類ＳＧＩポリペプチドの配列を有するポリペプチドをコードするＳＧＩ１遺伝子は、遺伝子コード配列の天然に存在する遺伝子配列を有する遺伝子であり得るか、または天然に存在する遺伝子の配列とは異なる配列を有し得る。様々な実施形態では、本明細書に開示の突然変異光合成生物において減衰、突然変異、または妨害されたＳＧＩ１遺伝子は、例えばクエリとして本明細書に開示の１つ以上の配列を用いて、ＢＬＡＳＴにより、および／またはＨＭＭスキャニングにより同定される遺伝子であり得る。ＨＭＭは、例えば少なくとも６つのＳＧＩ１ポリペプチドの多重アラインメント時にアミノ酸配列から構築され、アミノ酸配列は、ＲＲドメインおよびｍｙｂドメインを含み、ＲＲドメインはｍｙｂドメインのＮ末端にあり、また、ＲＲドメインとｍｙｂドメインの間に、いずれのドメインにも属していないリンカー配列がある。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ＳＧＩ１ポリペプチドは、藻類ＳＧＩ１ポリペプチドの配列を有するか、天然に存在する藻類ＳＧＩ１ポリペプチドのＲＲドメインに対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する天然に存在する藻類ＳＧＩ１ポリペプチドの変異体であるか、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９のいずれかに対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＳＧＩ１ポリペプチドは、藻類ＳＧＩ１ポリペプチドの配列を有するか、天然に存在する藻類ＳＧＩ１ポリペプチドのｍｙｂドメインに対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する天然に存在する藻類ＳＧＩ１ポリペプチドの変異体であるか、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７のいずれかに対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ＳＧＩ１ポリペプチドは、藻類ＳＧＩ１ポリペプチドの配列を有するか、または天然に存在する藻類ＳＧＩ１ポリペプチドに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有する天然に存在する藻類ＳＧＩ１ポリペプチドの変異体であり、かつ／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のいずれかに対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ＳＧＩポリペプチドは、植物ＳＧＩ１ポリペプチドの配列を有するか、または天然に存在する藻類ＳＧＩポリペプチドに対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する天然に存在する植物ＳＧＩ１ポリペプチドの変異体であり、かつ／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のＲＲドメインに対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＳＧＩポリペプチドは、植物ＳＧＩ１ポリペプチドを有するか、または天然に存在する藻類ＳＧＩポリペプチドに対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する天然に存在する植物ＳＧＩ１ポリペプチドの変異体であり、かつ／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５のｍｙｂドメインに対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ＳＧＩポリペプチドは、植物ＳＧＩ１ポリペプチドの配列を有するか、天然に存在する藻類ＳＧＩポリペプチドに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有する天然に存在する植物ＳＧＩ１ポリペプチドの変異体であり、かつ／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９のいずれかに対して、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する。
【００９０】
突然変異株
ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有する、本明細書において提供される突然変異体としては、植物および藻類を含む、単細胞真核生物藻類（微細藻類）などの真核生物光合成生物などの光合成生物が挙げられる。
【００９１】
様々な例において、ＳＧＩ１遺伝子の減衰した発現を有するように遺伝子操作された株であり得る突然変異ＳＧＩ１遺伝子を有する藻類株は、例えば、以下の任意の属の種などのあらゆる真核藻類株であり得る：アクナンテス属（Ａｃｈｎａｎｔｈｅｓ）、アンフィプローラ属（Ａｍｐｈｉｐｒｏｒａ）、アンフォラ属（Ａｍｐｈｏｒａ）、アンキストロデスムス属、アルテロモナス属、ボエケロビア属（Ｂｏｅｋｅｌｏｖｉａ）、ボリドモナス属（Ｂｏｌｉｄｏｍｏｎａｓ）、ボロジネラ属（Ｂｏｒｏｄｉｎｅｌｌａ）、フウセンモ属（Ｂｏｔｒｙｄｉｕｍ）、ボトリオコッカス属、ブラクテオコッカス属（Ｂｒａｃｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）、カエトセロス属（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ）、カルテリア属、クラミドモナス属、クロロコッカム属、クロロゴニウム属、クロレラ属、クロオモナス属（Ｃｈｒｏｏｍｏｎａｓ）、クリソスファエラ属、クリコスファエラ属（Ｃｒｉｃｏｓｐｈａｅｒａ）、クリプテコディニウム属（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）、クリプトモナス属（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）、シクロテラ属（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）、デスモデスムス属（Ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ）、ドナリエラ属、エリプソイドン属（Ｅｌｉｐｓｏｉｄｏｎ）、エミリアニア属（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）、エレモスファエラ属、エルノデスミウス属（Ｅｒｎｏｄｅｓｍｉｕｓ）、ユーグレナ属（Ｅｕｇｌｅｎａ）、ユースティグマトス属（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ）、フランケイア属、フラギラリア属（Ｆｒａｇｉｌａｒｉａ）、フラジラリオプシス属（Ｆｒａｇｉｌａｒｏｐｓｉｓ）、グロエオサムニオン属（Ｇｌｏｅｏｔｈａｍｎｉｏｎ）、ヘマトコッカス属、ハンチア属（Ｈａｎｔｚｓｃｈｉａ）、ヘテロシグマ属（Ｈｅｔｅｒｏｓｉｇｍａ）、ヒメノモナス属（Ｈｙｍｅｎｏｍｏｎａｓ）、イソクリシス属（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ）、レポシンクリス属（Ｌｅｐｏｃｉｎｃｌｉｓ）、ミクラクチニウム属、モノダス属（Ｍｏｎｏｄｕｓ）、モノラフィジウム属、ナノクロリス属、ナノクロロプシス属（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、ナビクラ属（Ｎａｖｉｃｕｌａ）、ネオクロリス属、ネフロクロリス属（Ｎｅｐｈｒｏｃｈｌｏｒｉｓ）、ネフロセルミス属（Ｎｅｐｈｒｏｓｅｌｍｉｓ）、ニッチア属（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）、オクロモナス属（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）、オエドゴニウム属、オオサイスティス属、オストレオコッカス属、パラクロレラ属、パリエトクロリス属（Ｐａｒｉｅｔｏｃｈｌｏｒｉｓ）、パスケリア属（Ｐａｓｃｈｅｒｉａ）、パブロバ属（Ｐａｖｌｏｖａ）、ペラゴモナス属、ファエオダクチラム属（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）、ファガス属（Ｐｈａｇｕｓ）、ピコクロラム属、プラチモナス属（Ｐｌａｔｙｍｏｎａｓ）、プレウロクリシス属（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ）、プレウロコッカス属、プロトテカ属、シュードクロレラ属、シュードネオクロリス属（Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、シュードスタウラストラム属（Ｐｓｅｕｄｏｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）、ピラミモナス属（Ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｓ）、ピロボトリス属、イカダモ属、シゾクラミデラ属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｌａｍｙｄｅｌｌａ）、スケレトネマ属（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）、スピロギラ属（Ｓｐｙｒｏｇｙｒａ）、スチココッカス属、テトラクロレラ属、テトラセルミス属、タラシオシーラ属（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ）、トリボネマ属（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ）、フシナシミドロ属（Ｖａｕｃｈｅｒｉａ）、ビリジエラ属、ヴィシェリア属（Ｖｉｓｃｈｅｒｉａ）、およびボルボックス属。
【００９２】
例えば、本明細書に開示されているＳＧＩ１遺伝子に突然変異を有する藻類は、以下のいずれかに属する種であり得る：オクロ植物門（珪藻綱（ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、コアミケイソウ綱（ｃｏｓｃｉｎｏｄｉｓｃｏｐｈｙｃｅａｅ）、オビケイソウ綱（ｆｒａｇｉｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、真正眼点藻綱（ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｃｅａｅ）、黄緑藻綱（ｘａｎｔｈｏｐｈｙｃｅａｅ）、ペラゴ藻綱（ｐｅｌａｇｏｐｈｙｃｅａｅ）、黄金色藻綱（ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｃｅａｅ）、ラフィド藻綱（ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｃｅａｅ）、およびシヌラ藻綱（ｓｙｎｕｒｏｐｈｙｃｅａｅ）のメンバーなど）、ハプト植物門（ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）（コッコリツス藻綱（ｃｏｃｃｏｌｉｔｈｏｐｈｙｃｅａｅ）およびパブロバ藻綱（ｐａｖｌｏｐｈｙｃｅａｅ）のメンバーなど）、および緑藻植物門（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）（トレボウクシア藻綱（ｔｒｅｂｏｕｘｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、緑藻植物門（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）、ネフロセルミス藻綱（ｎｅｐｈｒｏｐｈｙｃｅａｅ）、ピラミモナス藻綱（ｐｙｒａｍｉｍｏｎａｄｏｐｈｙｃｅａｅ）、アオサ藻綱（ｕｌｖｏｐｈｙｃｅａｅ）、マミエラ藻綱（ｍａｍｉｅｌｌｏｐｈｙｃｅａｅ），およびクロロデンドロン藻綱（ｃｈｌｏｒｏｄｅｎｄｒｏｐｈｙｃｅａｅ）のメンバーなど）、ならびに車軸藻植物門（ｃｈａｒｙｏｐｈｙｔａ）、ユーグレナ植物門（ｅｕｇｌｅｎｏｉｄｓ）、および渦鞭毛植物（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓ）。
【００９３】
本出願のいくつかの実施形態では、突然変異させ得るかまたは遺伝子操作し得る好ましい微生物としては、これらに限定されないが、以下などの緑色植物種が挙げられる：クロレラ、パラクロレラ、シュードクロレラ、テトラクロレラ、オキセノクロレラ、プロトテカ、オオキスティス、フランケイア、ミクラクチニウム（Ｍｉｃｒａｔｉｎｉｕｍ）、ピコクロラム、ナノクロリス、シゾクラミデラ、エレモスファエラ、スチココッカス、ボツリオコッカス、ビリジエラ、パリエトクロリス、ボロジネラ、ブラクテアコックス（Ｂｒａｃｔｅａｃｏｃｃｕｓ）、ネオクロリス、モノラフィディウム、デスモデスムス、イカダモ、アンキストロデスムス、カルテリア、クラミドモナス、クロロコッカム、クロロゴニウム、ボルボックス、プラチモナス、ドナリエラ、ヘマトコッカス、アルテロモナス、ピロボツリス、オエドゴニウム、ネフロセルミス、プレウロコッカス、ピラミモナス、シュードネオクロリス（Ｐｓｅｕｄｏｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、オストレオコッカス、テトラセルミス、およびスタウラスツルム（Ｓｔａｕｒａｓｔｒｕｍ）。
【００９４】
他の例では、突然変異体は、例えば、アンフォラ、カエトセロス、シクロテラ、フラギラリア、フラジラリオプシス、ハンチア、ナビクラ、ニッチア、フェオダクチラム、またはタラシオシーラの任意の属の種などの珪藻種などのヘテロコント藻類種を用いて操作または単離することができる。さらなる例において、本明細書に開示される突然変異体は、例えば、エリプソイジオン（Ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｉｏｎ）、ユースティグマトス、ヴィシェリア、モノダス、ナノクロロプシス、またはシュードスタウラストラムの種などの真正眼点藻綱（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｃｅａｅ）の種である。考慮され得るオクロ植物門の他の属としては、これらに限定されないが、ボルジモナス（Ｂｏｌｄｉｍｏｎａｓ）、フウセンモ属、バウチェリア属（Ｂａｕｃｈｅｒｉａ）、トリボネマ属、モノダス属、アウレオコッカス属（Ａｕｒｅｏｃｏｃｃｕｓ）、ビゲロウィエラ属（Ｂｉｇｅｌｏｗｅｉｌｌａ）、ペラゴモナス属、クリソスファエラ属、オクロモナス属、ヘテロシグマ属、ネフロクロリス属、ボエケロビア属、クリコスファエラ属、ヒメノモナス属、イソクリシス属、プレウロクリシス属、およびパブロバ属が挙げられる。
【００９５】
追加的実施形態では、突然変異または減衰されたＳＧＩ１遺伝子を含むように突然変異され得るか、または操作され得る生物としては、植物種が挙げられる。例えば、核酸構築物および当該分野で公知の様々な形質転換方法を使用して、ＳＧＩ遺伝子の発現を減衰するために、多種多様な植物および植物細胞系が突然変異され得か、または操作され得る（Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ  Ｆ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９５年）４９：１−３２を参照されたい）。好ましい実施形態では、標的植物および植物細胞としては、これらに限定されないが、穀物作物（例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、キビ、オオムギ）などの作物、果実作物（例えば、トマト、リンゴ、ナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えばアルファルファ）、根菜類作物（例えば、ニンジンポテト、サトウダイコン、ヤマノイモ）、葉菜類作物（例えばレタス、ホウレンソウ）などの単子葉植物および双子葉植物；開花植物（例、ペチュニア、バラ、キク）、針葉樹およびマツ（例えば、マツ、モミ、エゾマツ）、ファイトレメディエーションに使用される植物（例、重金属蓄積植物）、油料作物（例えば、ヒマワリ、アブラナ）、および実験目的に使用される植物（例えば、シロイヌナズナ）が挙げられる。このため、ＳＧＩ１変異体は、例えば、以下の目に属する双子葉植物など、広範囲の植物において生成され得る：モクレン目（Ｍａｇｎｉｏｌａｌｅｓ）、ミシアレス（Ｍｉｃｉａｌｅｓ）、クスノキ目（Ｌａｕｒａｌｅｓ）、コショウ目（Ｐｉｐｅｒａｌｅｓ）、ウマノスズクサ目（Ａｒｉｓｔｏｃｈｉａｌｅｓ）、スイレン目（Ｎｙｍｐｈａｅａｌｅｓ）、キンポウゲ目（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｌｅｓ）、アワ目（Ｐａｐｅｖｅｒａｌｅｓ）、サラセニア科（Ｓａｒｒａｃｅｎｉａｃｅａｅ）、ヤマグルマ目（Ｔｒｏｃｈｏｄｅｎｄｒａｌｅｓ）、マンサク目（Ｈａｍａｍｅｌｉｄａｌｅｓ）、トチュウ目（Ｅｕｃｏｍｉａｌｅｓ）、レイトネリア目（Ｌｅｉｔｎｅｒｉａｌｅｓ）、ヤマモモ目（Ｍｙｒｉｃａｌｅｓ）、ブナ目（Ｆａｇａｌｅｓ）、モクマオウ目（Ｃａｓｕａｒｉｎａｌｅｓ）、ナデシコ目（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｌｅｓ）、バティス目（Ｂａｔａｌｅｓ）、タデ目（Ｐｏｌｙｇｏｎａｌｅｓ）、イソマツ目（Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｌｅｓ）、ビワモドキ目（Ｄｉｌｌｅｎｉａｌｅｓ）、ツバキ目（Ｔｈｅａｌｅｓ）、アオイ目（Ｍａｌｖａｌｅｓ）、イラクサ目（Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ）、サガリバナ目（Ｌｅｃｙｔｈｉｄａｌｅｓ）、スミレ目（Ｖｉｏｌａｌｅｓ）、ヤナギ目（Ｓａｌｉｃａｌｅｓ）、フウチョウソウ目（Ｃａｐｐａｒａｌｅｓ）、ツツジ目（Ｅｒｉｃａｌｅｓ）、イワウメ目（Ｄｉａｐｅｎｓａｌｅｓ）、カキノキ目（Ｅｂｅｎａｌｅｓ）、サクラソウ目（Ｐｒｉｍｕｌａｌｅｓ）、バラ目（Ｒｏｓａｌｅｓ）、マメ目（Ｆａｂａｌｅｓ）、カワゴケソウ目（Ｐｏｄｏｓｔｅｍａｌｅｓ）、アリノトウグサ目（Ｈａｌｏｒａｇａｌｅｓ）、フトモモ目（Ｍｙｒｔａｌｅｓ）、ミズキ目（Ｃｏｒｎａｌｅｓ）、ヤマモガシ目（Ｐｒｏｔｅａｌｅｓ）、ビャクダン目（Ｓａｎ  ｔａｌｅｓ）、ラフレシア目（Ｒａｆｆｌｅｓｉａｌｅｓ）、ニシキギ目（Ｃｅｌａｓｔｒａｌｅｓ）、トウダイグサ目（Ｅ���ｐｈｏｒｂｉａｌｅｓ）、クロウメモドキ目（Ｒｈａｍｎａｌｅｓ）、ムクロジ目（Ｓａｐｉｎｄａｌｅｓ）、クルミ目（Ｊｕｇｌａｎｄａｌｅｓ）、フウロソウ目（Ｇｅｒａｎｉａｌｅｓ）、ヒメハギ目（Ｐｏｌｙｇａｌａｌｅｓ）、セリ目（Ｕｍｂｅｌｌａｌｅｓ）、リンドウ目（Ｇｅｎｔｉａｎａｌｅｓ）、ハナシノブ目（Ｐｏｌｅｍｏｎｉａｌｅｓ）、シソ目（Ｌａｍｉａｌｅｓ）、オオバコ目（Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｌｅｓ）、ゴマノハグサ目（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｌｅｓ）、キキョウ目（Ｃａｍｐａｎｕｌａｌｅｓ）、アカネ目（Ｒｕｂｉａｌｅｓ）、マツムシソウ目（Ｄｉｐｓａｃａｌｅｓ）、およびキク目（Ａｓｔｅｒａｌｅｓ）。ＳＧＩ１変異体はまた、以下の目に属するものなどの単子葉植物においても生成され得る：オモダカ目（Ａｌｉｓｍａｔａｌｅｓ）、トチカガミ目（Ｈｙｄｒｏｃｈａｒｉｔａｌｅｓ）、イバラモ目（Ｎａｊａｄａｌｅｓ）、ホンゴウソウ目（Ｔｒｉｕｒｉｄａｌｅｓ）、ツユクサ目（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａｌｅｓ）、ホシクサ目（Ｅｒｉｏｃａｕｌａｌｅｓ）、レスティオ目（Ｒｅｓｔｉｏｎａｌｅｓ）、イネ目（Ｐｏａｌｅｓ）、イグサ目（Ｊｕｎｃａｌｅｓ）、カヤツリグサ目（Ｃｙｐｅｒａｌｅｓ）、ガマ目（Ｔｙｐｈａｌｅｓ）、パイナップル目（Ｂｒｏｍｅｌｉａｌｅｓ）、ショウガ目（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ）、ヤシ目（Ａｒｅｃａｌｅｓ）、パナマソウ目（Ｃｙｃｌａｎｔｈａｌｅｓ）、タコノキ目（Ｐａｎｄａｎａｌｅｓ）、サトイモ目（Ａｒａｌｅｓ）、ユリ目（Ｌｉｌｌｉａｌｅｓ）、およびラン目（Ｏｒｃｈｉｄ  ａｌｅｓ）、または裸子植物下門に属する植物、例えば、マツ目（Ｐｉｎａｌｅｓ）、イチョウ目（Ｇｉｎｋｇｏａｌｅｓ）、ソテツ目（Ｃｙｃａｄａｌｅｓ）、マキ目（Ａｒａｕｃａｒｉａｌｅｓ）、ヒノキ目（Ｃｕｐｒｅｓｓａｌｅｓ）およびグネツム目（Ｇｎｅｔａｌｅｓ）に属するもの、または蘚類（マゴケ植物門（Ｂｒｙｏｐｈｙｔａ））として分類される植物、例えば、ミズゴケ目（Ｓｐｈａｇｎａｌｅｓ）およびヒョウタンゴケ目（Ｆｕｎａｒｉａｌｅｓ）。
【００９６】
ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有し得る例示的かつ非限定的な植物種としては、スファグナム・ファラクス、ヒメツリガネゴケ、シロイヌナズナ、アラビドプシス・ハレリ、アラビドプシス・リラタ、ヒマワリ、ブドウ、アンボレラ・トリコポダ、トウゴマ、トマト、ジャガイモ、アプランドワタ、カカオ、ファエロリス・ブルガリス、ダイズ、キヌア、セイヨウリンゴ、トウモロコシ、ブラッシカ・ラパ、およびアジアイネが挙げられる。
【００９７】
遺伝子の減衰
ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有する本明細書に提供される突然変異微生物は、ヒトの介入によって、例えば古典的突然変異誘発または遺伝子操作によって生成される突然変異体である。例えば、本明細書において提供される突然変異微生物は、実行可能な任意の突然変異誘発方法、これらに限定されないが、ＵＶ照射、ガンマ線照射、または化学的突然変異誘発、ならびにクロロフィルの減少および生産性の増加を有する突然変異体のスクリーニングなど、例えば、本明細書に開示された方法を用いて生成された突然変異体であり得る。例えば、クロロフィルの減少した突然変異体のスクリーニングでは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、目視検査、および／またはクロロフィル吸収の抽出および測定を使用することができる。生産性の向上は、突然変異体の成長、および乾燥重量、湿潤重量、無灰乾燥重量、または全有機炭素（ＴＯＣ）の測定によって評価され得る。古典的突然変異誘発および遺伝子操作を用いて光合成生物の突然変異体を生成する方法は周知である。
【００９８】
減衰された遺伝子の例としては、これらに限定されるものではないが、コードされたタンパク質の活性の低下または消滅をもたらす、１つ以上のアミノ酸の配列を変化させる１つ以上のヌクレオチド置換を有する遺伝子；フレームシフトおよび／または終止コドンの導入によってタンパク質のアミノ酸配列を変化させる、遺伝子内の挿入または欠失（インデル）；コードされたポリペプチドのフレームシフトもしくはトランケーションまたは遺伝子によって転写されたＲＮＡの不安定性をもたらす、遺伝子への大きな挿入、機能的タンパク質を生じない大きい欠失；転写に影響を与えるコード領域の５’または３’の遺伝子の領域における挿入、欠失、または点突然変異；転写、スプライシング、またはＲＮＡの安定性に影響を与え得るイントロンまたはイントロン／エクソン接合部での挿入、欠失、または点突然変異が挙げられる。減衰された遺伝子はまた、その転写物が、例えば、ＲＮＡｉ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムなどによって標的とされる遺伝子であり得る。ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有する光合成生物は、本明細書において、ＳＧＩ１遺伝子の減衰のメカニズムにかかわらず、「ＳＧＩ１突然変異体」と称される。ＳＧＩ１突然変異体は、本明細書に開示の突然変異誘発およびスクリーニング手順などの本明細書に開示の方法、ならびに遺伝子操作によって単離することができる。
【００９９】
したがって、突然変異体は、遺伝子操作された突然変異体、例えば、ノックアウト、ノックダウン、および／または遺伝子置換（例えば、野生型ポリペプチドと比べて活性が低下したポリペプチドをコードし得る、突然変異された形態の遺伝子による置換）のための相同組換えによって、ＳＧＩ１遺伝子が標的とされている突然変異体であり得る。例えば、目的の光合成生物は、部位指向型相同組換えによって操作して、配列をゲノム遺伝子座に挿入し、それによって遺伝子および／またはその発現を改変し、かつ／またはプロモーターを宿主微生物の遺伝子座に挿入して、遺伝子座での遺伝子の発現に影響を与えることができる。
【０１００】
例えば、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックダウン、または相同組換えによる遺伝子置換は、改変されるゲノムの領域に相同である配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）断片の形質転換によるものであり得る。相同配列は、外来配列、典型的には組み込まれた構築物の選択が可能である選択マーカー遺伝子により、中断されている。外来配列または突然変異遺伝子配列のいずれかの側のゲノム相同隣接配列は、例えば、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１，０００、少なくとも約１，２００、少なくとも約１，５００、少なくとも約１，７５０、または少なくとも約２，０００（例えば、少なくとも５０、１００、２００、５００、１０００、１５００または２０００のいずれかの）ヌクレオチド長であり得る。外来配列が標的遺伝子配列に隣接している遺伝子ノックアウトまたは遺伝子「ノックイン」構築物は、任意で直線状にすることができる、例えば相同組換えを受ける領域の外側でベクターに提供することができるか、またはベクターの文脈ではない線状断片として提供され得る。例えば、ノックアウトまたはノックイン構築物は、これに限定されないが、ＰＣＲ産物など、単離または合成された断片であり得る。場合によっては、分割マーカー系を用いて、相同組換えによって遺伝子ノックアウトを生成することができ、２つのＤＮＡ断片を導入して選択マーカーを再度生成し、３つの交差事象によって目的の遺伝子座を妨害することができる（Ｊｅｏｎｇら、（２００７年）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  ２７３：１５７−１６３）。
【０１０１】
一態様では、本開示は、遺伝子組換え生物、例えば、ＳＧＩ１遺伝子の発現を減衰させるための１つ以上の遺伝子改変または突然変異を有する微生物を提供する。本明細書で使用される場合、遺伝子（例えば、ＳＧＩ１遺伝子）の「発現および／もしくは機能」を「減衰させる」または「変化させる」とは、通常発現する完全に機能的なタンパク質の産生、発現および／もしくは機能を低減する任意の様式で、遺伝子の発現を低減するもしくは除去することを意味する。ＳＧＩ１遺伝子などの遺伝子を減衰するための手段としては、例えば相同組換え構築物；ガイドＲＮＡ、Ｃａｓ９または他のｃａｓ酵素（例えば、Ｃｐｆ１、Ｃｍｓ１、Ｃｓｍ１など）などのＣＲＩＳＰＲ系、および任意で標的部位へ挿入するためのドナー断片；ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ構築物などのＲＮＡｉ構築物；リボザイム構築物；ＴＡＬＥＮＳ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；およびメガヌクレアーゼが挙げられる。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子は、例えば相同組換えによっておよび／またはメガヌクレアーゼなどの二本鎖切断誘導剤の活性によって媒介される挿入または遺伝子置換によって妨害することができる（例えば、国際公開第２０１２０１７３２９号（米国特許第２０１３０１６４８５０号および米国特許第２０１６０２７２９８０号）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａら（２０１２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１６：２６８−２７７；国際公開第２０１２０１７３２９号（米国特許第２０１３０１６４８５０号および米国特許第２０１２０３２４６０３号）、ＴＡＬＥＮ（国際公開第２０１４／２０７０４３号（米国特許第２０１６０１３０５９９号）；または国際公開第２０１４／０７６５７１号（米国特許第２０１６０２７２９８０号）、またはＣＲＩＳＰＲ系のｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質、またはＣｓｍ１エフェクタータンパク質）（例えば、米国特許第８，６９７，３５９号；米国特許第８，７９５，９６５号；米国特許第８，８８９，３５６号；米国特許第２０１６／００９０６０３号；米国特許第２０１４／００６８７９７号；米国特許第２０１６／０２０８２４３号；米国特許第２０７／０２３３７５６号を参照されたい）。当業者には理解されるように、他の妨害方法も当技術分野において公知であり、本明細書において好適であろう。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、突然変異微生物は、ＳＧＩ１遺伝子に存在する１つ以上の突然変異、またはＳＧＩ１遺伝子の発現に影響を及ぼす１つ以上の突然変異を有する。ＳＧＩ１遺伝子の発現の減衰を有するように操作された組換え微生物は、完全に機能的なＳＧＩ１遺伝子が産生されないか、または妨害ＳＧＩ１遺伝子を含まない対照の微生物によって産生されるよりも少ない量で産生されるように、遺伝子の発現を減少させるかまたは消滅させる少なくとも１つの挿入、突然変異または欠失を含む妨害ＳＧＩ１遺伝子を有することができる。例えば、いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異（１つ以上のヌクレオチドの変化、欠失、および／または挿入）は、遺伝子のコード領域にあり得るか、またはイントロン、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、例えば、転写開始部位から約１ｋｂ以内、転写開始部位から約２ｋｂ以内、または翻訳開始部位から約３ｋｂ以内のプロモーター領域にあり得る。いくつかの実施形態では、例えば、本明細書に開示された、減衰した遺伝子発現を有する突然変異微生物は、１つ以上の突然変異を有し得る。これらの突然変異は、１つ以上の核酸塩基の変化および／または１つ以上の核酸塩基の欠失および／または転写開始部位の５’側の遺伝子領域への１つ以上の核酸塩基の挿入であり得る。非限定的な例において、既知または推定の転写開始部位の約２ｋｂ以内、約１．５ｋｂ以内、約１ｋｂ以内、または約０．５ｋｂ以内、または翻訳開始部位の約３ｋｂ以内、約２．５ｋｂ以内、約２ｋｂ以内、約１．５ｋｂ以内、約１ｋｂ以内、または約０．５ｋｂ以内である。非限定的な例として、突然変異遺伝子は、遺伝子の発現を増加させること、または減少させることのいずれかが可能であるプロモーター領域内に突然変異、挿入または欠失を有する遺伝子であり得る；または非機能的タンパク質、切断型タンパク質、ドミナントネガティブタンパク質、またはタンパク質を含まない産生をもたらす欠失を有する遺伝子であり得る；またはコードされたタンパク質のアミノ酸の変化をもたらすか、または結果として遺伝子転写物の異常なスプライシングなどとなる１つ以上の点突然変異を有する遺伝子であり得る。
【０１０３】
本明細書で参照され、Ｈｓｕら（Ｃｅｌｌ１５７：１２６２−１２７８，２０１４）によって概説されたＣＲＩＳＰＲ系としては、ｃａｓヌクレアーゼポリペプチドまたは複合体に加えて、標的部位配列との相補性によってゲノム標的部位と相互作用する標的ＲＮＡ（多くの場合「ｃｒＲＮＡ」と呼ばれる）、およびｃａｓポリペプチドと複合体を形成し、標的ｃｒＲＮＡに（相補性により）結合する領域も含む、トランス活性化（「ｔｒａｃｒ」）ＲＮＡが挙げられる。本開示は、ゲノム編集、または標的配列に相補的な配列ならびにｃａｓタンパク質と相互作用する配列を含む単一ガイドＲＮＡの使用のために、ｃａｓタンパク質を発現するか、またはｃａｓタンパク質とトランスフェクトされる宿主株に同時形質転換（または宿主株で発現）され得る２つのＲＮＡ分子（「ｃｒＲＮＡ」および「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）の使用を企図する。すなわち、いくつかの戦略において、本明細書においては使用されるＣＲＩＳＰＲ系は、２つの別個のＲＮＡ分子（ＲＮＡポリヌクレオチド：「ｔｒａｃｒ−ＲＮＡ」および「ｔａｒｇｅｔｅｒ−ＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」、下記参照）を含み得、本明細書においては「二分子ＤＮＡ標的指向性ＲＮＡ」または「二分子ＤＮＡ標的指向性ＲＮＡ」と称される。あるいは、実施例に示されるように、ＤＮＡ標的指向性ＲＮＡは、（標的相同（「ｃｒ」）配列に加えて）ｃａｓタンパク質との相互作用のためのトランス活性化配列も含み得、すなわち、ＤＮＡ標的指向性ＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子（単一のＲＮＡポリヌクレオチド）であり得、本明細書において、「キメラガイドＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」、または「ｓｇＲＮＡ」と称される。用語「ＤＮＡ標的指向性ＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」は包括的であり、二分子ＤＮＡ標的指向性ＲＮＡおよび単分子ＤＮＡ標的指向性ＲＮＡ（すなわち、ｓｇＲＮＡ）の両方を指す。単一分子ガイドＲＮＡおよび２つのＲＮＡ系の両方が、文献中に、および例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号に詳細に記載されている。本明細書に提示される方法および組成物のいくつかの実施形態は、ＳＧＩ１遺伝子中の標的配列に対応する配列を有するガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡはキメラガイドである。他の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒ配列を含まない。いくつかの例では、遺伝子座を標的とするためのｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方が、ｃａｓ媒介突然変異誘発において使用される。いくつかの実施形態では、ｃａｓタンパク質は、標的細胞または生物において発現し、いくつかの代替的実施形態では、ｃａｓタンパク質は、例えば、キメラガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ、またいくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡであり得るガイドＲＮＡを含むリボ核タンパク質複合体として細胞に導入されてもよい。任意のｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても公知である）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｍｓ１、Ｃｐｆ１、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、およびそれらの相同体、またはそれらの改変体が、本明細書の方法において使用できる。ｃａｓタンパク質は、非限定的な例として、化膿性ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、または髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９タンパク質などのＣａｓ９タンパク質であり得る。その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜２５６および７９５〜１３４６として提供されるＣａｓ９タンパク質、ならびに２つ以上のＣａｓ９タンパク質からのドメイン、ならびに同定されたＣａｓ９タンパク質の変異体および突然変異体を組み合わせ得るキメラＣａｓ９タンパク質も考慮される。ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼは、例えば、Ｃｐｆ１タンパク質（例えば、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２４３号参照）またはＣｓｍ１タンパク質（例えば、米国特許出願公開第２０１７／０２３３７５６号参照）であり得る。
【０１０４】
Ｃａｓヌクレアーゼ活性は、標的ＤＮＡを切断して二本鎖切断を生じさせる。次いで、これらの切断は、２つの方法（非相同末端結合または相同性指向修復）のうちの１つで細胞によって修復される。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）では、切断末端を互いに直接ライゲーションすることによって、二本鎖切断が修復される。この場合、新しい核酸材料がその部位に挿入されることはないが、いくつかの核酸材料は失われる可能性があり、その結果欠失、または変化となり、多くの場合突然変異となる。相同性指向修復においては、切断された標的ＤＮＡ配列に対して相同性を有し得るドナーポリヌクレオチド（「ドナーＤＮＡ」または「編集ＤＮＡ」と呼ばれることもある）は、切断された標的ＤＮＡ配列を修復するための鋳型として用いられ、その結果、ドナーポリヌクレオチドから標的ＤＮＡへ遺伝情報が伝達されることとなる。このようにして、新しい核酸材料をその部位に挿入／コピーすることができる。ＮＨＥＪおよび／または相同性指向修復（例えばドナーＤＮＡ分子を使用する）による標的ＤＮＡの修飾は、例えば遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子タギング、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠失、遺伝子妨害、遺伝子突然変異などをもたらし得る。
【０１０５】
場合によっては、部位特異的修飾ポリペプチド（例えば、ｃａｓヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮ）によるＤＮＡの切断を用いて、標的ＤＮＡ配列を切断することによって標的ＤＮＡ配列から核酸物質を削除し、外因的に提供されたドナーポリヌクレオチドの非存在下で、細胞が配列を修復できるようにする。こうしたＮＨＥＪ事象は、切断された末端の再結合部位に突然変異（「誤修復」）をもたらし得、遺伝子の妨害となり得る。
【０１０６】
あるいは、ＤＮＡ標的指向性ＲＮＡが、ドナーＤＮＡとともにｃａｓヌクレアーゼを発現する細胞に同時投与された場合、本方法を用いて、核酸材料を標的ＤＮＡ配列に追加、すなわち挿入または置換して（例えば、挿入突然変異誘発による「ノックアウト」、またはタンパク質（例えば、選択マーカーおよび／もしくは任意の目的のタンパク質）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどをコードする核酸の「ノックイン」）、核酸配列を改変する（例えば、突然変異を導入する）ことができる。
【０１０７】
ドナーＤＮＡは、特定の実施形態では、遺伝子調節配列（例えば、プロモーター）を含むことができる。遺伝子調節配列は、ＣＲＩＳＰＲ標的化を使用して、遺伝子のコード領域の上流および遺伝子の推定される近位プロモーター領域の上流、例えば、ＳＧＩ１遺伝子のコード領域の開始ＡＴＧの少なくとも約５０ｂｐ、少なくとも約１００ｂｐ、少なくとも約１２０ｂｐ、少なくとも約１５０ｂｐ、少なくとも約２００ｂｐ、少なくとも約２５０ｂｐ、少なくとも約３００ｂｐ、少なくとも約３５０ｂｐ、少なくとも約４００ｂｐ、少なくとも約４５０ｂｐ、または少なくとも約５００ｂｐ（例えば、少なくとも５０、１００、２００、３００、４００、または５００ｂｐ）上流に挿入することができる。ドナーＤＮＡは、天然のプロモーターを阻害し得る配列、例えば選択マーカーまたは任意の都合のよい配列などの配列を含み得る。ＳＧＩ１オープンリーディングフレームの開始ＡＴＧの上流（例えば、５’ＵＴＲ内またはＳＧＩ１遺伝子の転写開始部位の上流）に挿入された追加の配列は、内因性ＳＧＩ１遺伝子の発現を減少させるか、さらには消失させることができる。代替的に、または追加的に、天然のＳＧＩ１遺伝子は、より弱く、もしくは異なるように制御されているプロモーター、または非プロモーター配列によって、全体的にもしくは部分的に置換されているその内因性プロモーターを有し得る。
【０１０８】
いくつかの例では、高効率ゲノム編集細胞系を作製するために宿主細胞に導入された核酸分子は、対応する野生型酵素に対して突然変異したＣａｓ９酵素をコードし、その結果、突然変異Ｃａｓ９酵素は、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠失するようになる。例えば、化膿性ブドウ球菌由来のＣａｓ９のＲｕｖＣ  Ｉ触媒ドメインにおいて、アスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）により、Ｃａｓ９を両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する酵素）に変換する。Ｃａｓ９をニッカーゼにする突然変異の他の例としては、これらに限定するものではないが、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、およびＮ８６３Ａが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ガイド配列（複数可）（例えば、ＤＮＡ標的のセンス鎖およびアンチセンス鎖をそれぞれ標的とする２つのガイド配列）と組み合わせて使用され得る。このように組み合わせることにより、両方の鎖にニックが入れられ、またＮＨＥＪを誘導するために使用できるようになる。変異原性ＮＨＥＪを誘導するために、（近接しているがＤＮＡの異なる鎖を標的とする）２つのニッカーゼ標的を使用することができる。また、互い違いの位置で相対する株を切断する酵素を用いて遺伝子座をこのように標的とすることにより、ゲノム突然変異を達成するために両方の鎖が正確にかつ特異的に切断される必要があるため、非標的切断が減少し得る。追加の例では、ＤＮＡを切断するその能力が損なわれている突然変異Ｃａｓ９酵素を細胞内で発現させることができ、標的遺伝子の転写または翻訳開始部位の上流の配列を標的とする１つ以上のガイドＲＮＡも導入される。この場合、ｃａｓ酵素は、標的配列に結合し、標的遺伝子の転写を阻止し得る（Ｑｉら、（２０１３年）Ｃｅｌｌ  １５２：１１７３−１１８３）。遺伝子発現のこのＣＲＩＳＰＲ干渉は、ＲＮＡｉと称することができ、またＬａｒｓｏｎら（２０１３年）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．８：２１８０−２１９６に詳細に記載されている。場合によっては、Ｃａｓ９ポリペプチドなどのｃａｓポリペプチドは、例えば、以下のものを含む融合ポリペプチドである。ｉ）Ｃａｓ９ポリペプチド（任意で、上記のような多様型Ｃａｓ９ポリペプチドであり得る）、およびｂ）共有結合した異種ポリペプチド（「融合パートナー」とも称される）。異種核酸配列は、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を生成するために、（例えば、遺伝子操作によって）別の核酸配列に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９融合ポリペプチドは、細胞内局在（すなわち、異種配列は、細胞内局在配列、例えば、核を標的とするための核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアを標的とするためのミトコンドリア局在化シグナル；葉緑体を標的とするための葉緑体局在シグナル；ＥＲ保持シグナルなど）をもたらす異種配列とＣａｓ９ポリペプチドを融合することによって生成される。いくつかの実施形態では、異種配列は、追跡および／または精製を容易にするためのタグ（すなわち、異種配列は、検出可能な標識である）（例えば、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦ��、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏなど；およびヘマグルチニン（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグなど）を提供することができる。
【０１０９】
宿主細胞は、例えば、宿主細胞のＳＧＩ１遺伝子座の一部分またはそれに隣接する領域に相同である核酸配列を含む相同組換え用のベクターであり得るか、またはｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）、ＣＲＩＳＰＲキメラガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、および／またはｔｒａｃｒＲＮＡ、ＲＮＡｉ構築物（例えば、ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、またはリボザイムのいずれかもしくはそれらの組み合わせの発現のための発現ベクターであり得るベクター構築物を用いて、遺伝子操作（例えば、形質導入または形質転換またはトランスフェクト）され得る。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。ポリペプチドの発現のためのベクターまたはゲノム編集のためのＲＮＡはまた、例えば、相同組換えによる宿主への組込みのために設計され得る。本明細書に記載のポリヌクレオチド配列、例えば、宿主ＳＧＩ１遺伝子配列に対して相同性を有する配列（ＳＧＩ１ポリペプチドコード配列の上流および下流にある配列など）、ならびに任意で選択マーカーまたはレポーター遺伝子を含むベクターは、ＳＧＩ１遺伝子の減衰を引き起こすために、適切な宿主を形質転換するのに使用することができる。
【０１１０】
いくつかの例における組換え微生物は、ＳＧＩ１遺伝子の発現を減少させるが消滅させない可能性があり、組換え微生物は、例えば、約２５％〜約２００％以上の脂質産生の増大を有することができる。例えば、脂質産生の増大は、対照微生物と比べて、約２５％以上〜約２００％以上、約２５％以上〜約１７５％以上、約２５％以上〜約１５０％以上、約２５％以上〜約１２５％以上、約５０％以上〜約２００％以上、約５０％以上〜約１７５％以上、約５０％以上〜約１５０％以上、約５０％以上〜約１２５％以上、約７５％以上〜約２００％以上、または約７５％以上〜約１７５％以上、約７５％以上〜約１５０％、または約７５％以上〜約１２５％以上（例えば、２５〜２００％以上）であり得る。本明細書に提供される遺伝子改変された光合成生物としては、いくつかの例において、ＳＧＩ１遺伝子の発現を減衰させるための核酸構築物を挙げることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される遺伝子改変された微生物としては、ＳＧＩ１ポリペプチドの発現を減衰させるための核酸構築物を挙げることができる。例えば、宿主微生物としては、ＳＧＩ１遺伝子の発現を減少させるＲＮＡｉ分子、リボザイム、またはアンチセンス分子を発現させるための構築物を挙げることができる。いくつかの例では、本明細書に提供される組換え微生物として、ＳＧＩ１遺伝子の発現を減少させるための少なくとも１つの導入された（外因性または非天然）構築物を挙げることができる。
【０１１１】
いくつかの例では、遺伝子操作株は、例えば、ＲＮＡ−Ｓｅｑまたは逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）などの当技術分野で公知の方法を使用して、ＳＧＩ１遺伝子の発現を減衰させるための遺伝子改変を含まない対照細胞と比べて、減少しているが消失していないＳＧＩ１遺伝子の発現についてスクリーニングされ得る。本明細書において提供される遺伝子操作株は、ＳＧＩ１ポリペプチドをコードする遺伝子のｍＲＮＡの量、安定性、または翻訳能力を低下させることによって遺伝子発現を減衰させるための構築物を含むように操作され得る。例えば、藻類または不等毛株などの微生物は、当技術分野において公知の方法を用いて、ＳＧＩ１遺伝子のｍＲＮＡを標的とするアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、またはリボザイム構築物により形質転換することができる。例えば、遺伝子の転写領域の全部または一部分を含むアンチセンスＲＮＡ構築物を、微生物に導入して遺伝子発現を減少させることができる（Ｓｈｒｏｄａら、（１９９９年）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １１：１１６５−７８；Ｎｇｉａｍら（２０００年）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：７７５−７８２；Ｏｈｎｕｍａら（２００９年）Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ２３６：１０７−１１２；Ｌａｖａｕｄら（２０１２年）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：ｅ３６８０６）。代替的には、または追加的には、ＴＰＲドメインを有する遺伝子を標的とするＲＮＡｉ構築物（例えば、短いヘアピンＲＮＡをコードする構築物）を、ＳＧＩ１遺伝子の発現を減少させるために、藻類または植物などの光合成生物に導入することができる（例えば、Ｃｅｒｒｕｔｉら（２０１１年）Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ（２０１１年）１０：１１６４−１１７２；Ｓｈｒｏｄａら（２００６年）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．４９：６９−８４）。
【０１１２】
リボザイムは、部位特異的方式で核酸を切断するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特異的触媒ドメインを有する。例えば、米国特許第５，３５４，８５５号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）では、特定のリボザイムが、既知のリボヌクレアーゼよりも大きい配列特異性を有し、かつＤＮＡ制限酵素に近づくエンドヌクレアーゼとして作用し得ることが報告されている。触媒ＲＮＡ構築物（リボザイム）は、ｍＲＮＡ標的を切断するために本明細書に提供される遺伝子をコードするｍＲＮＡと塩基対合するように設計することができる。いくつかの例では、リボザイム配列をアンチセンスＲＮＡ構築物内に組み込んで、標的の切断を媒介することができる。様々な種類のリボザイムを考慮することができ、それらの設計および使用は当技術分野において公知であり、例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆら（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ３３４：５８５−５９１に記載されている。リボザイムは、相補的塩基対の相互作用により部位へアニーリングすることで、所与の配列を標的とする。２つの相同体の伸長がこの標的化のために必要とされる。相同配列のこれらの伸長は、上記で定義された触媒リボザイム構造に隣接している。相同配列の各伸長は、７〜１５のヌクレオチド長さを変えることができる。相同配列を定義するための唯一の要件は、標的ＲＮＡ上で、それらが切断部位である特定の配列によって分離されていることである。ハンマーヘッド型リボザイムの場合、切断部位は、標的ＲＮＡ上のジヌクレオチド配列がウラシル（Ｕ）であり、続いてアデニン、シトシンまたはウラシル（Ａ、ＣまたはＵ）のいずれかである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、（１９９５年）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ２３：２２５０−６８）。任意の所与のＲＮＡ中に存在するこのジヌクレオチドの頻度は、統計的には１６中の３である。したがって、１，０００塩基の所与の標的メッセンジャーＲＮＡについて、１８７個のジヌクレオチド切断部位が統計的に可能である。
【０１１３】
リボザイム指向性ＲＮＡ切断活性の一般的な設計および最適化は詳細に論じられており（ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１；Ｓｙｍｏｎｓ（１９９２年）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６１：６４１−７１；Ｃｈｏｗｒｉｒａら（１９９４年）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：２５８５６−６４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９５年）上記）、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。標的ＲＮＡを効率よく切断するためのリボザイムの設計および試験は、当業者に周知のプロセスである。リボザイムを設計および試験するための科学的方法の例は、Ｃｈｏｗｒｉｒａら（１９９４年、上記）およびＬｉｅｂｅｒおよびＳｔｒａｕｓｓ（１９９５年）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５：５４０−５１に記載されており、そのそれぞれが、参照によって本明細書に組み込まれる。所与の遺伝子の下方制御に使用するための有効かつ好ましい配列を同定することは、所与の配列の調製および試験に関する問題であり、当業者に公知の日常的に実施される「スクリーニング」方法である。ＲＮＡｉ構築物の使用は、上記の引用文献、ならびに例えば、米国特許出願公開第２００５／０１６６２８９号および国際公開第２０１３／０１６２６７号（両方とも参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。標的遺伝子と相同性を有する二本鎖ＲＮＡは、細胞に送達されるか、またはＲＮＡｉ構築物、例えば、ＲＮＡｉ短鎖ヘアピン（ｓｈ）構築物の発現によって細胞内で産生される。構築物は、標的遺伝子と同一であるか、または、標的遺伝子の配列に対して、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一である。構築物は、標的遺伝子と相同である、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、または少なくとも約１ｋｂの配列（例えば、少なくとも２０、５０、１００、２００、４００、６００、８００、または１ｋｂの配列）を有し得る。発現ベクターは、ｓｈＲＮＡを産生する構築物などのＲＮＡｉ構築物の連続的または誘導的発現のために選択されたプロモーターを用いて、操作することができる。
【０１１４】
アンチセンス、ＲＮＡｉ、またはリボザイム構築物において使用されるプロモーターは、宿主生物において機能的であり、かつ標的遺伝子の発現を所望の量まで減少させるのに必要とされる発現レベルに好適なあらゆるものであり得る。藻類および植物において機能的なプロモーターは、当技術分野において公知であり、本明細書に開示されている。構築物は、本明細書に開示されたあらゆるものを含む任意の実行可能な方法を用いて、藻類または植物に形質転換することができる。これらに限定されないが、アンチセンス、ＲＮＡｉ、またはリボザイム構築物など、ＳＧＩ１遺伝子発現を減衰させるために、核酸分子で形質転換された組換え生物または微生物は、減衰された遺伝子発現をもたらす外因性核酸分子を含まない宿主生物または微生物と比べて、例えば、クロロフィルの減少、光合成効率の向上、および培養における生産性の増大など、本明細書に記載のＳＧＩ１突然変異体の特性を有することができる。
【０１１５】
当業者であれば、微生物の遺伝的形質転換のために複数の形質転換方法を使用することができ、したがって本発明の方法のために展開することができることを理解するであろう。「安定した形質転換」は、ある生物に導入された核酸構築物が、その生物のゲノムに組み込まれるか、または安定なエピソーム構築物の一部であり、かつその子孫によって受け継がれ得ることを意味することを意図している。「一過性の形質転換」では、ポリヌクレオチドが、生物に導入されるが、ゲノムに組み込まれていないか、さもなければ確立されて後続世代によって安定的に受け継がれることのないことを意味することを意図している。
【０１１６】
遺伝的形質転換は、導入遺伝子、核またはプラスチドのいずれかからの構築物の安定な挿入および／または発現をもたらし得、いくつかの場合には導入遺伝子の一過性の発現をもたらし得る。形質転換方法は、ガイドＲＮＡまたは編集ＤＮＡの導入にも使用できる。微細藻類の遺伝的形質転換は、少なくとも約２２種の緑、赤、および褐藻類、珪藻、ユーグレナ類、および渦鞭毛藻に所属する微細藻類の３０超の異なる株における成功が報告されている（例えば、Ｒａｄａｋｏｖｉｔｓら、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ、２０１０年；およびＧｏｎｇら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１１年を参照されたい）。そのような有用な形質転換方法の非限定的な例としては、ガラスビーズまたは炭化ケイ素ウィスカーの存在下での細胞の撹拌が挙げられる。これらは、例えば、Ｄｕｎａｈａｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１５（３）：４５２−４６０、１９９３年；Ｋｉｎｄｌｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９０年；ＭｉｃｈａｅｌおよびＭｉｌｌｅｒ、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１３、４２７−４３５、１９９８年に報告されている。エレクトロポレーション技術は、例えば、ナンノクロリス種、（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｊ．  Ｐｈｙｃｏｌ．、４４：７６８−７６、２００８年）、クロレラ属（例えば、Ｃｈｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，３９：３６５−３７０，２００１年；ＣｈｏｗおよびＴｕｎｇ、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．第１８巻、第９号、７７８−７８０、１９９９年）、クラミドモナス（Ｓｈｉｍｏｇａｗａｒａら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４８：１８２１−１８２８、１９９８年）、およびドナリエラ属（Ｓｕｎら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０（３）：１８５−１９２、２００５年）など、いくつかの微細藻類種の遺伝的形質転換に首尾よく使用されてきた。マイクロパーティクルボンバードメント、遺伝子銃形質転換、またはバイオリスティックボンバードメントとも称されるマイクロプロジェクタイルボンバードメントは、例えば、フェオダクチラム（ＡｐｔらＭｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２５２：５７２−５７９、１９９６年）、シクロテラ属およびナビクラ属（Ｄｕｎａｈａｙら、Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，３１：１００４−１０１２、１９９５年）、キリンドロテカ属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａ）（Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．，３５：１１３−１２０、１９９９年）、およびカエトセロス属（Ｍｉｙａｇａｗａ−Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｐｈｙｃｏｌ．Ｒｅｓ．５９：１１３−１１９、２０１１年）などの珪藻種、ならびにクロレラ（Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈ、Ｂｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ、第４２巻、第２号：２０９−２１６、１９９９年）、およびボルボックス種（Ｊａｋｏｂｉａｋら、Ｐｒｏｔｉｓｔ、１５５：３８１−９３、２００４年）などの緑藻など、いくつかの藻類種に首尾よく使用されている。さらに、アグロバクテリウム媒介遺伝子導入技術も、微細藻類の遺伝的形質転換に有用であり得る。これらは、例えば、Ｋｕｍａｒ、Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ、１６６（３）：７３１−７３８、２００４年、およびＣｈｅｎｅｙら、Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．、第３７巻、Ｓｕｐｐｌ．１１、２���０１年によって報告されている。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２０１６／０２４４７７０号に開示されているように、細菌種との接合も、遺伝子および構築物の藻類への転移に用いられてきた。
【０１１７】
本明細書に記載の形質転換ベクターまたは構築物は、典型的には標的宿主細胞、例えば、藻類細胞に選択可能またはスコア付け可能な表現型を付与するマーカー遺伝子を含むか、またはマーカーを含む構築物と同時形質転換され得る。藻類の遺伝的形質転換体を効率よく単離するために、複数の選択マーカーが首尾よく開発されてきた。一般的な選択マーカーとしては、抗生物質耐性、蛍光マーカー、および生化学的マーカーが挙げられる。以下に記載するものなど、いくつかの異なる抗生物質耐性遺伝子が、微細藻類形質転換体の選択に首尾よく使用されている：ブラストシジン、ブレオマイシン（例えば、Ａｐｔら、１９９６年、上記；Ｆｉｓｃｈｅｒら、１９９９年、上記；Ｆｕｈｒｍａｎｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１９、３５３−６１、１９９９年、Ｌｕｍｂｒｅｒａｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１４（４）：４４１−４４７、１９９８年；Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａら、Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．、３６：３７９−３８６、２０００年を参照されたい）、スペクチノマイシン（Ｃｅｒｕｔｔｉら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４５：９７−１１０、１９９７年；Ｄｏｅｔｓｃｈら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、３９、４９−６０、２００１年；Ｆａｒｇｏ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９：６９８０−９０、１９９９年）、ストレプトマイシン（Ｂｅｒｔｈｏｌｄら、Ｐｒｏｔｉｓｔ、１５３：４０１−４１２、２００２年）、パロモマイシン（Ｊａｋｏｂｉａｋら、Ｐｒｏｔｉｓｔ、上記；Ｓｉｚｏｖａら、Ｇｅｎｅ、２７７：２２１−２２９、２００１年）、ノーセオスリシン（Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａら、２０００年、上記）、Ｇ４１８（Ｄｕｎａｈａｙら、１９９５年、上記；ＰｏｕｌｓｅｎおよびＫｒｏｇｅｒ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２７２：３４１３−３４２３、２００５年、Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａら、２０００年、上記）、ハイグロマイシン（Ｂｅｒｔｈｏｌｄら、２００２年、上記）、クロラムフェニコール（ＰｏｕｌｓｅｎおよびＫｒｏｇｅｒ、２００５年、上記）、および他の多くのもの。クラミドモナスなどの微細藻類に使用するための追加の選択マーカーは、カナマイシン耐性およびアミカシン耐性（Ｂａｔｅｍａｎ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６３：４０４−１０、２０００年）、ゼオマイシンおよびフレオマイシン（例えば、ＺＥＯＣＩＮ（商標）ｐｈｅｏｍｙｃｉｎ  Ｄ１）耐性（Ｓｔｅｖｅｎｓ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５１：２３−３０、１９９６年）、パロモマイシンおよびネオマイシン耐性（Ｓｉｚｏｖａら、２００１年、上記）を提供するマーカーであり得る。使用されている他の蛍光または発色マーカーとしては、ルシフェラーゼ（Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅら、Ｊ．Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１：２３９−２５１、１９９９年；Ｆｕｈｒｍａｎｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００４年；ＪａｒｖｉｓおよびＢｒｏｗｎ、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，１９：３１７−３２２、１９９１年）、β−グルクロニダーゼ（Ｃｈｅｎら、２００１年、上記；Ｃｈｅｎｅｙら、２００１年、上記；ＣｈｏｗおよびＴｕｎｇ、１９９９年、上記；Ｅｌ−Ｓｈｅｅｋｈ、１９９９年、上記；Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅら、１９９９年、上記；Ｋｕｂｌｅｒら、Ｊ．Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１：１６５−１６９、１９９４年）、β−ガラクトシダーゼ（Ｇａｎら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｃｏｌ．、１５：３４５−３４９、２００３年；Ｊｉａｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．、２１：１２１１−１２１６、２００３年；ＱｉｎらＨｉｇｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１３：８７−８９、２００３年）、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｃｈｅｎｅｙら、２００１年、上記；Ｅｎｄｅｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、２００２、Ｆｒａｎｋｌｉｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、２００２年；５６、１４８、２１０）が挙げられる。
【０１１８】
当業者であれば、様々な既知のプロモーター配列が、本発明による微細藻類種の形質転換系に有用に展開され得ることを容易に認識するであろう。例えば、一般に微細藻類において、導入遺伝子発現を駆動するために使用されるプロモーターは、渦鞭毛藻類および緑藻植物門の両方で使用されてきたカリフラワーモザイクウイルスプロモーター３５Ｓ（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）の様々なバージョンを含む（Ｃｈｏｗら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ、１８：７７８−７８０、１９９９年；ＪａｒｖｉｓおよびＢｒｏｗｎ、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、３１７−３２１、１９９１年；ＬｏｈｕｉｓおよびＭｉｌｌｅｒ、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１３：４２７−４３５、１９９８年）。サルウイルス由来のＳＶ４０プロモーターはまた、いくつかの藻類において活性であることが報告されている（Ｇａｎら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｃｏｌ．、１５１  ３４５−３４９、２００３年；Ｑｉｎら、Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ  ３９８−３９９、４６９−４７２、１９９９年）。ＲＢＣＳ２（リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ、小サブユニット）（Ｆｕｈｒｍａｎｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ、１９：３５３〜３６１、１９９９年）およびクラミドモナスのＰｓａＤ（光化学系Ｉ複合体の豊富なタンパク質；ＦｉｓｃｈｅｒおよびＲｏｃｈａｘ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５８１：５５５５−５５６０、２００１年）のプロモーターも有用であり得る。ＨＳＰ７０Ａ／ＲＢＣＳ２とＨＳＰ７０Ａ／β２ＴＵＢ（チューブリン）との融合プロモーター（Ｓｃｈｒｏｄａら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、２１：１２１−１３１、２０００年）はまた、導入遺伝子の発現の改善に有用であり得、ＨＳＰ７０Ａプロモーターが、他のプロモーターの上流に置かれたときに、転写活性化因子として機能し得る。目的遺伝子の高レベルの発現は、また、珪藻フコキサンチン−クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質をコードするｆｃｐ遺伝子（Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅら、Ｍａｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１：２３９−２５１、１９９９年；Ｚａｓｌａｖｓｋａｉａら、Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．３６：３７９−３８６、２０００年）、または真正糸状菌ビオラキサンチン−クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質をコードするｖｃｐ遺伝子（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３１８，４８２号を参照のこと）のプロモーターの制御下で、例えば、珪藻種において達成することができる。所望であれば、誘導性プロモーターは、トランスジェニック微細藻類における迅速で、かつ厳密に制御された遺伝子の発現を提供し得る。例えば、硝酸レダクターゼをコードするＮＲ遺伝子のプロモーター領域をそのような誘導性プロモーターとして使用することができる。ＮＲプロモーター活性は、典型的にはアンモニウムによって抑制され、アンモニウムが硝酸塩によって置き換えられるときに誘導され（ＰｏｕｌｓｅｎおよびＫｒｏｇｅｒ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ２７２：３４１３−３４２３、２００５年）、したがって、微細藻類細胞がアンモニウム／硝酸塩存在下で成長するとき、遺伝子発現はスイッチが入るか、またはスイッチが切られ得る。アンモニウム抑制性ナンノクロリスプロモーターは、「アンモニア抑制性亜硝酸塩／亜硫酸レダクターゼ」プロモーターと称���れ、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第２０１７／００７３６９５号に開示されている。本明細書に提供される構築物および形質転換系において用途を見出すことができる追加の藻類プロモーターには、米国特許第８，８３５，４１９号、米国特許第８，８８３，９９３号、米国特許出願公開第２０１３／００２３０３５号；米国特許出願公開第２０１３／０３２３７８０号；米国特許出願公開第２０１４／０３６３８９２号、米国特許出願公開第２０１７／０１５２５２０号、および米国特許出願公開第２０１７／０１１４１０７号に開示されているものが挙げられ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
宿主細胞または生物は、非形質転換細胞もしくは生物のいずれかであり得るか、または少なくとも１つの外因性核酸分子で既にトランスフェクトされている細胞または生物のいずれかであり得る。例えば、ＳＧＩ１遺伝子の発現が減衰するように操作されている藻類または植物宿主細胞は、これらに限定されるものではないが、１つ以上のタンパク質、色素、アルコール、または脂質などの目的の生体分子の産生の増大などの任意の望ましい形質を付与するか、または寄与し得る１つ以上の導入遺伝子をさらに含み得る。
【０１２０】
マイクロボンバードメントによる藻類細胞の形質転換は、例えば、米国特許第８，８８３，９９３号および米国特許出願公開第２０１７／０１３０２３８号に記載されており、これらの両方は、参照によりその全体が組み込まれる。ＢｉｏＲａｄ  Ｈｅｌｉｏｓ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎを使用したボンバードメントは、Ｈｅｌｉｏｓ  Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎシステム取扱説明書、Ｍ１６５２４１１（bio-rad.com/en-us/product/helios-gene-gun-system?tab=Documents）にも記載されている。
【０１２１】
様々な態様において、遺伝子減衰突然変異は、植物において生じる。方法としては、例えば、１つ以上の植物ＳＧＩ１遺伝子を標的とするために本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ系を導入することが挙げられる。多種多様な植物および植物細胞系は、本開示の核酸構築物および当該分野で公知の種々の形質転換方法を使用して、本明細書に記載の所望の生理学的および農学的特徴について操作し得る（Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ  Ｆ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９５年）４９：１−３２を参照されたい）。好ましい実施形態では、操作するための標的植物および植物細胞としては、これらに限定されないが、穀物作物（例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、キビ、オオムギ）などの作物、果実作物（例えば、トマト、リンゴ、ナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えばアルファルファ）、根菜類作物（例えば、ニンジンポテト、サトウダイコン、ヤマノイモ）、葉菜類作物（例えばレタス、ホウレンソウ）などの単子葉植物および双子葉植物；開花植物（例、ペチュニア、バラ、キク）、針葉樹およびマツ（例えば、マツ、モミ、エゾマツ）、ファイトレメディエーションに使用される植物（例、重金属蓄積植物）、油料作物（例えば、ヒマワリ、アブラナ）、および実験目的に使用される植物（例えば、シロイヌナズナ）が挙げられる。このため、ＳＧＩ１変異体は、例えば、以下の目に属する双子葉植物など、広範囲の植物において生成され得る：モクレン目、Ｍｉｃｉａｌｅｓ、クスノキ目、コショウ目、ウマノスズクサ目、スイレン目、キンポウゲ目、アワ目、サラセニア科、ヤマグルマ目、マンサク目、トチュウ目、レイトネリア目、ヤマモモ目、ブナ目、モクマオウ目、ナデシコ目、バティス目、タデ目、イソマツ目、ビワモドキ目、ツバキ目、アオイ目、イラクサ目、サガリバナ目、スミレ目、ヤナギ目、フウチョウソウ目、ツツジ目、イワウメ目、カキノキ目、サクラソウ目、バラ目、マメ目、カワゴケソウ目、アリノトウグサ目、フトモモ目、ミズキ目、ヤマモガシ目、ビャクダン目、ラフレシア目、ニシキギ目、トウダイグサ目、クロウメモドキ目、ムクロジ目、クルミ目、フウロソウ目、ヒメハギ目、セリ目、リンドウ目、ハナシノブ目、シソ目、オオバコ目、ゴマノハグサ目、キキョウ目、アカネ目、マツムシソウ目、およびキク目。
【０１２２】
ＳＧＩ１突然変異体は、オモダカ目、トチカガミ目、イバラモ目、ホンゴウソウ目、ツユクサ目、ホシクサ目、レスティオ目、イネ目、イグサ目、カヤツリグサ目、ガマ目、パイナップル目、ショウガ目、ヤシ目、パナマソウ目、タコノキ目、サトイモ目、ユリ目、およびラン目に属するもの、裸子植物下門に属する植物、例えば、マツ目、イチョウ目、ソテツ目、マキ目、ヒノキ目およびグネツム目に属するものなどの単子葉植物でも生成することができる。
【０１２３】
上記の実施形態のいずれかに代えてまたは加えて、本明細書に含まれるものは以下の実施形態である：
実施形態１は、ＳＧＩ１ポリペプチドをコードする遺伝子の減衰を有する突然変異光合成生物であって、光合成生物は、バイオマスまたは少なくとも１つのバイオ産物を実質的に同じ条件下で成長または培養させた対照光合成生物よりも、より多く産生し、任意で、以下のうちの１つ、またはそれ以上を満たすものとする：
a) 突然変異光合成生物は、対照光合成微生物と比べてクロロフィルの減少を有する。
b) 突然変異光合成生物は、対照光合成生物と比べてクロロフィルａ：ｂ比の上昇を有する。
c) 突然変異光合成生物は、対照光合成生物と比べて、減少した光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）アンテナサイズを有する。
d) 突然変異光合成生物は、対照光合成生物と比べて、より高い１４Ｃ  Ｐｍａｘを有する請求項１記載の突然変異光合成生物。
e) 突然変異光合成生物が、対照生物よりも高いＦｖ／Ｆｍを有する、請求項１記載の突然変異光合成生物。
f) 突然変異光合成生物が、対照生物よりも高いタンパク質含有量を有する。
g) 突然変異光合成生物が、対照生物よりも高いＲｕｂｉｓｃｏ活性化酵素含有量を有する。
実施形態２は、突然変異光合成生物が、実質的に同じ条件下で成長または培養させた対照光合成生物よりも、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも１００％以上のバイオマス、または少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは１００％より多くの、少なくとも１つのバイオ産物を産生する、実施形態１の突然変異光合成生物であり、任意で、バイオ産物は、１つ以上の脂質、１つ以上の炭水化物、１つ以上のタンパク質またはペプチド、１つ以上の核酸、１つ以上の糖、１つ以上のアルコール、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のヌクレオチド、１つ以上の抗酸化物質、１つ以上の色素もしくは着色剤、１つ以上のビタミン、１つ以上のテルペノイド、または１つ以上のポリマーである。
実施形態３は、実施形態１または実施形態２の突然変異光合成生物であって、ＳＧＩ１遺伝子は、レスポンスレギュレーターレシーバードメインのＣ末端にｍｙｂドメインを有するＳＧＩポリペプチドをコードしており、任意でＳＧＩ１ポリペプチドは：
a) ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のいずれかに対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するレスポンスレギュレーターレシーバー（ＲＲ）ドメインをコードするアミノ酸配列を含み、かつ／または
b) ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５のいずれかに対して少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性を有するｍｙｂドメインをコードするアミノ酸配列を含む。
実施形態４は、ＳＧＩ１遺伝子が突然変異している、実施形態１〜３のいずれかの突然変異光合成生物である。任意で：
a) ＳＧＩ１遺伝子は、遺伝子を不活性化するインデルを含む。
b) ＳＧＩ１遺伝子は、その遺伝子によってコードされるＳＧＩ１ポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸を変化させる突然変異を含む。
c) ＳＧＩ１遺伝子は、遺伝子を不活性化する導入されたＤＮＡ断片の挿入を含む。
d) ＳＧＩ１遺伝子は、遺伝子の発現を減少させる、遺伝子の５’または３’非翻訳領域へ導入されたＤＮＡ断片の挿入を含む。
e) ＳＧＩ１遺伝子は、遺伝子の発現を減少させる遺伝子の５’または３’非翻訳領域にインデルを含む。
実施形態５は、突然変異光合成生物が、ＳＧＩ１遺伝子転写物を標的とするＲＮＡｉ構築物、アンチセンス構築物、またはリボザイム構築物を含む、実施形態１〜３のいずれかの突然変異光合成生物である。
実施形態６は、突然変異光合成生物が植物、任意で単子葉植物、双子葉植物、またはコケである、実施形態１〜５のいずれかの突然変異光合成生物である。
実施形態７は、突然変異光合成生物が藻類、任意で微細藻類、任意で緑藻植物または車軸藻類である、実施形態１〜５のいずれかの突然変異光合成生物である。
実施形態７は、実施形態７の突然変異光合成生物であって、突然変異光合成微生物が、緑藻綱、クロロデンドロン藻綱、プラシノ藻、またはトレボウクシア藻綱の緑藻類である。
実施形態８は、上記の実施形態のいずれかの突然変異光合成生物を含むバイオマスである。
実施形態９は、実施形態１〜７の突然変異光合成生物のいずれかを培養すること、およびバイオマスを単離することを含む、バイオマスまたはバイオ産物を製造する方法である。
【実施例】
【０１２４】
培地
ＰＭ１１９は、以下を含む栄養豊富培地である：３５ｐｐｔのＩｎｓｔａｎｔ  Ｏｃｅａｎ  Ｓａｌｔ（Ａｑｕａｔｉｃ  Ｅｃｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ａｐｏｐｋａ、ＦＬ）、５ｘギラードＦ／２海洋水濃縮溶液（５０Ｘストック、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、カタログ番号Ｇ０１５４；培地中の成分の最終濃度：４．４１３ｍＭ硝酸ナトリウム；一塩基性０．１６ｍＭリン酸ナトリウム；０．１０３μＭビオチン；０．２４０μＭ塩化コバルト・６Ｈ２Ｏ；０．２００μＭ硫酸銅・５Ｈ２Ｏ；０．０５８５ｍＭ  ＥＤＴＡ二ナトリウム・２Ｈ２Ｏ；４．５４μＭ塩化マンガン・４Ｈ２Ｏ；０．１２４μＭモリブデン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ；１．４８μＭチアミン・ＨＣｌ；０．０１８５μＭのビタミンＢ１２；０．３８２μＭ硫酸亜鉛・７Ｈ２Ｏ）。
【０１２５】
ＰＭ０７４は、１．３ｍｌのＰＲＯＬＩＮＥ（登録商標）Ｆ／２藻類飼料パートＡ（Ａｑｕａｔｉｃ  Ｅｃｏ−Ｓｙｓｔｅｍｓ）および１．３ｍｌのＰＲＯＬＩＮＥ（登録商標）Ｆ／２藻類飼料パートＢ（Ａｑｕａｔｉｃ  Ｅｃｏ−Ｓｙｓｔｅｍｓ）を最終量１リットルのＩｎｓｔａｎｔ  Ｏｃｅａｎ  ｓａｌｔ（３５ｇ／Ｌ）溶液（Ａｑｕａｔｉｃ  Ｅｃｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｐｏｐｋａ、ＦＬ）となるように添加することによって作製される栄養豊富培地である。プロリンＡとプロリンＢは、一緒に、８．８  ｍＭのＮａＮＯ３、０．３６１ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏ、１０ｘＦ／２微量金属、および１０ｘＦ／２ビタミン類に含むようにする（Ｇｕｉｌｌａｒｄ（１９７５年）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ  ｆｏｒ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｍａｒｉｎｅ  ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ．ｉｎ「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  Ａｎｉｍａｌｓ」（編：Ｓｍｉｔｈ  ＷＬおよびＣｈａｎｌｅｙ  Ｍ．Ｈ．））Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ．２６−６０頁）。
【０１２６】
ＰＭ１４７は、ＰＭ０７４をベースにしているが、５０％の塩を有する栄養豊富な培地である。１．３ｍｌのＰＲＯＬＩＮＥ（登録商標）Ｆ／２藻類飼料パートＡ（Ａｑｕａｔｉｃ  Ｅｃｏ−Ｓｙｓｔｅｍｓ）および１．３ｍｌのＰＲＯＬＩＮＥ（登録商標）Ｆ／２藻類飼料パートＢ（Ａｑｕａｔｉｃ  Ｅｃｏ−Ｓｙｓｔｅｍｓ）を最終量１リットルのＩｎｓｔａｎｔ  Ｏｃｅａｎ  ｓａｌｔ（１７．５ｇ／Ｌ）溶液（Ａｑｕａｔｉｃ  Ｅｃｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｐｏｐｋａ、ＦＬ）となるように添加することによって作製する。
【０１２７】
ＰＭ１５３は、ＰＭ０７４をベースにしているが、窒素源として硝酸塩の代わりに尿素を含む栄養豊富培地である。ＰＭ１５３は、１．３ｍｌのＰＲＯＬＩＮＥ（登録商標）Ｆ／２藻類飼料パートＡ（Ａｑｕａｔｉｃ  Ｅｃｏ−Ｓｙｓｔｅｍｓ）および１．３ｍｌの「溶液Ｃ」を最終量１リットルのＩｎｓｔａｎｔ  Ｏｃｅａｎ  ｓａｌｔｓ（１７．５ｇ／Ｌ）（Ａｑｕａｔｉｃ  Ｅｃｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｐｏｐｋａ、ＦＬ）溶液となるように添加し、次いで、１．１Ｍの濾過滅菌尿素の場合は４ｍｌを添加することによって作製される。溶液Ｃは、３８．７５ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４  Ｈ２Ｏ、７５８ｍｇ／ＬのチアミンＨＣｌ、３．８８ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２、および３．８４ｍｇ／Ｌのビオチンである。
【０１２８】
実施例１  パラクロレラ株のＵＶ突然変異誘発
葉緑素、または緑藻種から突然変異体を単離するために、パラクロレラ株ＷＴ−１１８５の細胞を、ＵＶにより突然変異誘発し、弱光順化後に、低クロロフィル蛍光に基づいて選択した。突然変異誘発に使用するためのパラクロレラ株ＷＴ−１１８５は、海洋環境から単離させた。パラクロレラＷＴ−１１８５細胞を対数増殖期中期まで成長させ、次いで成長培地ＰＭ１１９で１ｘ１０６細胞／ｍＬに希釈した。細胞懸濁液をピペットで１００ｍｍペトリ皿に移し、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ（登録商標）２４００  ＵＶ架橋剤（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）内に入れ、プレートの蓋を外した。ＵＶ照射は、１０，０００、２５，０００、および５０，０００μＪ／ｃｍ２で行った。照射後、回収の間２４時間にわたって光曝露を妨げるために、細胞懸濁液を箔で包み込んだ振とうフラスコにピペットにより入れた。
【０１２９】
実施例２  低クロロフィルパラクロレラ種  ＷＴ−１１８５突然変異株のスクリーニング
実施例１に記載したように突然変異誘発させ、回収した後、淡色コロニーからの細胞を選択し、弱光（光量子束密度１００μｍｏｌ  ｍ−２ｓｅｃ−１）において、１〜５日の間成長させ、次いで、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いてフローサイトメトリーにより選別し、低クロロフィル蛍光を有する細胞を選択した。一般に、細胞の全集団と比較して、クロロフィル蛍光が最も少ない細胞の部分（約０．５〜２％）を選択した。選別した細胞をプレーティングした後、視覚的に淡緑色または黄色のコロニーを選択することによって、フローサイトメトリーによって単離されたアンテナが減少している系統のさらなる一次スクリーニングを行った。他の色素減少突然変異体および偽陽性から推定上のアンテナ減少系統をスクリーニングするために、選択されたコロニーを中程度の処理量の二次培養スクリーニングに供し、光生理学的測定の前に分離株を弱光条件に順化させた。クロロフィル蛍光を弱光順化中にモニターして、強光順化状態の特徴である減少したクロロフィル蛍光特性を保持しているコロニーを選択した。選択されたクローンは、強光から弱光に移されたときに、クロロフィルのほんのわずかな増加（野生型細胞と比較して）を示した。
【０１３０】
７５ｃｍ２の組織培養フラスコ中の１６５ｍｌ培養物を用いて、一定の強光（光量子束密度約１，７００μｍｏｌ  ｍ−２ｓｅｃ−１）において半連続培養アッセイを行い、野生型祖先株ＷＴ−１１８５と比べて、生産性の増大を有する株（ＴＯＣ蓄積として測定したバイオマス生産性の上昇）を同定した。２つの７５ｃｍ２フラスコに、所定の突然変異株のシード培養物を接種した。フラスコは、培養物からバブリングされたＣＯ２富化空気（１％ＣＯ２）を送達するためのシリンジフィルターに接続された管を有する栓を有していた。フラスコは、ＬＥＤライトバンクに対して幅（最も狭い寸法）により整列させた。培養物の深さ（光源に最も近いフラスコの壁からフラスコの背部の壁までの距離）は約８．０ｃｍであった。培養物は、培養体積の６５％を除去し、培養物において発生する蒸発による塩分の増加を調整するために希釈した新鮮ＰＭ１１９培地に交換して、光周期の開始時に毎日希釈した（１Ｌ  ＰＭ１１９培地に対して、２１２ｍｌ  ２Ｈ２Ｏ）。ＴＯＣ分析用のサンプルは、希釈のために取り出した培養物から採取した。本アッセイにおいて生産性の増大を有すると同定された２つの単離株（ＮＥ−７８４３およびＮＥ−１３３８０）をさらに分析した。
【０１３１】
実施例３  藻類突然変異体ＮＥ−７８４３およびＮＥ−１３３８０の半連続生産性アッセイ
弱光条件下でクロロフィルの減少を有することが判明したパラクロレラ株において、生産性の増大について、２つの分離株（突然変異体ＮＥ−７８４３およびＮＥ−１３３８０）を分析した。生産性アッセイでは、突然変異体の光独立栄養培養物を、一定の光の半連続式（ＣＬ−ＳＣＰＡ）で数日間にわたって成長させた。培養サンプルは、バイオマス測定のために毎日取り出した。光は、１日２４時間、一定の光量子束密度１９００〜２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓｅｃ−１に維持した。このアッセイでは、２２５ｃｍ２フラスコ中のＰＭ１１９培地に、所定の突然変異株のシード培養物を接種した。１株につき３つの培養を開始した。フラスコは、培養物からバブリングされたＣＯ２富化空気（１％ＣＯ２）を送達するためのシリンジフィルターに接続された管を有する栓を有していた。フラスコは、ＬＥＤライトバンクに対して幅（最も狭い寸法）により整列させた。光源から背部にわたるフラスコの「深さ」寸法は、１３．７ｃｍであった。フラスコの配置を考慮に入れると、光源の表面からのフラスコ内の細胞の最も遠い距離は、約１５．５ｃｍであった。培養物は、培養体積の６５％を除去し、その分を新鮮なＰＭ１１９培地に交換して、培養物において発生する蒸発による塩分の増加を調整するよう希釈することで、毎日希釈した。ＴＯＣ分析用のサンプルは、希釈のために取り出した培養物から採取した。培養物が定常状態に達した後、半連続生産性アッセイを１２日間実施した。
【０１３２】
アッセイの生産性は、毎日取り出したサンプルから全有機炭素（ＴＯＣ）を測定することによって評価した。全有機炭素（ＴＯＣ）は、２ｍＬの細胞培養物を脱イオン水で総量２０ｍＬに希釈することによって測定した。全炭素（ＴＣ）および全無機炭素（ＴＩＣ）を決定するために、測定１回当たり３回の注入物をＳｈｉｍａｄｚｕ  ＴＯＣ−Ｖｃｓｊ  Ａｎａｌｙｚｅｒに注入した。燃焼炉は７２０℃に設定し、ＴＯＣはＴＣからＴＩＣを差し引くことによって決定した。４点較正範囲は、２ｐｐｍ〜２００ｐｐｍまでであり、これは、非希釈培養物の２０〜２０００ｐｐｍに対応し、相関係数はｒ２＞０．９９９であった。
【０１３３】
小規模生産性アッセイの例示的な結果は、突然変異体ＮＥ−７８４３については図１Ａに、突然変異体ＮＥ−１３３８０については図１Ｂに提供される。１２日間の培養にわたる二連の培養物の１日の平均生産性を示す。図１Ａおよび図１Ｂは、突然変異体ＮＥ−７８４３およびＮＥ−１３３８０がそれぞれこのＣＬＳＣＰＡアッセイにおいてより高い生産性を有し、それぞれが、ＴＯＣにおいては、１２日のアッセイの過程にわたって、野生型と比べて平均３４％増大していることを実証している。
【０１３４】
実施例４  パラクロレラＬＩＨＬＡ突然変異体の遺伝子型判定
ＮＥ−１３３８０およびＮＥ−７８４３のゲノムを配列決定し、一塩基多型（ＳＮＰ）または挿入／欠失突然変異（インデル）などの突然変異を同定する。これらのうちのいずれもが、この２つの株において観察される表現型の遺伝的基礎を形成し得る。ＳＮＰは、４つの異なる遺伝子のコード領域において突然変異が引き起こされたＮＥ−１３３８０のゲノムにおいて同定された（表１の最初の４行）。
【０１３５】
（表１）ＮＥ−１３３８０ゲノムのＳＮＰ
2020503051.tif 000002
【０１３６】
ＮＥ−１３３８０突然変異のこの分析が進行中である間に、ＮＥ−７８４３ゲノムを分析することにより、この株が、以下の異なるＳＮＰを有することも明らかになった（表２）：Ｔ−２２６１遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１として提供される遺伝子配列、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のタンパク質配列をコードするＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として提供されるコード配列）におけるＳＮＰ、およびＮＥ−１３３８０においても突然変異された遺伝子（表１の列４）。これらは、Ｔ−２２６１遺伝子における突然変異が、これらの株の非常に望ましい高生産性表現型の原因であることの強力な証拠となる。
【０１３７】
（表２）ＮＥ−７８４３ゲノムのＳＮＰ
2020503051.tif 000003
【０１３８】
図２は、レスポンスレギュレーターＣｈｅＹ様ドメインを有するパラクロレラＴ−２６６１遺伝子における変異の場所を示す。
【０１３９】
実施例５  パラクロレラＴ−２６６１「レスポンスレギュレーターＣｈｅＹ様タンパク質」遺伝子における標的指向性突然変異の生成
Ｔ−２２６１遺伝子の突然変異が結果的に高生産性表現型をもたらしたことを明確に実証するために、Ｔ−２２６１遺伝子が、２番目のエクソンの３’末端を標的とするガイドＲＮＡを用いて、Ｃａｓ９媒介挿入突然変異誘発によってノックアウトされた３つの株を作製した（図２）。単一ガイドＲＮＡ（ｓｇ  ＲＮＡ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の標的配列（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ配列またはＴ−２２６１遺伝子の標的配列に対応する配列）を含んでいた。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のために、Ｔ７プロモーターの配列を組み込んで二重鎖鋳型を生成する２つの相補的ＤＮＡオリゴマーをアニーリングすることによって生成した。製造業者のプロトコールに従って、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号ＡＭ１３５４Ｍ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応を実施した。得られたＲＮＡは、製造業者のプロトコールに従って、Ｚｙｍｏ−Ｓｐｉｎ（商標）Ｖ−Ｅカラム（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ；カタログ番号Ｃ１０２４−２５）を使用して精製した。
【０１４０】
精製したガイドＲＮＡを、パラクロレラＣａｓ９発現エディター細胞系ＧＥ−１５６９９の細胞に形質転換した。野生型パラクロレラ株ＷＴ−１１８５を以下を含む構築物により形質転換することによって、Ｃａｓ９発現エディター系を作製した：
１）パラクロレラのために最適化され、パラクロレラ由来のイントロンを含む、操作されたＣａｓ９遺伝子コドンを含有し、Ｎ末端ＦＬＡＧタグ、核局在化シグナル、およびパラクロレラＲＰＳ１７プロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）およびパラクロレラＲＰＳ１７ターミネーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）に作動可能に連結したペプチドリンカー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）を含む、Ｃａｓ９発現カセット；
２）パラクロレラのために最適化されたアスペルギルス・テレウスコドン由来のブラストサイジン耐性遺伝子を含み、およびパラクロレラＲＰＳ４プロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０）に作動可能に連結されたパラクロレライントロン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）、およびパラクロレラＲＰＳ４ターミネーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１）を含む、選択マーカー発現カセット；ならびに
３）ＴｕｒｂｏＧＦＰ遺伝子（Ｅｖｒｏｇｅｎ、Ｍｏｓｃｏｗ、Ｒｕｓｓｉａ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２）を含み、パラクロレラＡＣＰ１プロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３）によって駆動され、パラクロレラＡＣＰ１ターミネーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）によって終結される、ＧＦＰレポーター発現カセット
（例えば、同時係属中の米国特許出願公開第２０１６／０３０４８９６号、米国特許出願公開第２０１７／００７３６９５号および米国特許出願公開第２０１７／０１５２５２０号（これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【０１４１】
ガイドＲＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）は、パラクロレラに対して最適化した、ブレオマイシン耐性「ＢｌｅＲ」遺伝子コドンを含み、パラクロレラＲＰＳ４プロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）に作動可能に連結しているパラクロレライントロン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）およびパラクロレラＲＰＳ４ターミネーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）を含む、ＤＮＡドナー断片と共にエディター系ＧＥ−１５６９９において形質転換した。形質転換は、本質的に米国特許出願公開第２０１６／０３０４８９６号に記載されているように、エレクトロポレーションによるものであった。エレクトロポレーション後、ＢｌｅＲカセットを組み込んだ形質転換体を選択するために、細胞を２５０μｇ／ｍｌのゼオシンを含む寒天培地上にプレーティングした。形質転換体を、天然の標的遺伝子座で増幅するように設計されたプライマーを用いたコロニーＰＣＲによってスクリーニングし、ＢｌｅＲカセットをＴ−２６６１遺伝子座に挿入したことを実証する３つの株：ＧＥ−１６３９１、ＧＥ−１６３９２、およびＧＥ−１６３９３を選択した。
【０１４２】
Ｃａｓ９操作突然変異体ＧＥ−１６３９１、ＧＥ−１６３９２、およびＧＥ−１６３９３、ならびに古典的誘導突然変異体ＮＥ−７８４３を、実施例３に記載の条件下で半連続希釈生産性アッセイ（ＳＣＰＡ）において連続光下でアッセイした（ＣＬ２０００アッセイ：光は、１日２４時間、一定の光量子束密度１９００〜２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓｅｃ−１に維持し、培養物を毎日６５％希釈した）。Ｃａｓ９操作突然変異体は、古典的な突然変異誘発（図３）から単離された原株で観察されたものと本質的に同一の規模で、野生型株よりも、ＴＯＣ生産性の増大を呈することが見出された。ＧＥ−１６３９２では、バイオマス生産性が２６％増大し、ＧＥ−１６３９１およびＧＥ−１６３９３突然変異体では、バイオマス生産性が３３％および３４％増大したことを実証している。このことから、パラクロレラＷＴ１１８５におけるＴ−２６６１の発現または機能のノックアウトまたは極度の減少は、連続的な強光条件下でバイオマス生産性の２５〜３５％の増大となり得ると結論付けられた。この生産性への影響のために、Ｔ−２６６１遺伝子はＳＧＩ１、またはＳｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  １（重要な成長改善１）と命名した。
【０１４３】
実施例６  他の光合成生物におけるパラクロレラＳＧＩ１（Ｔ−２６６１）遺伝子およびオルソログ
パラクロレラＳＧＩ１遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として提供されるコード配列）は、２つの主要な機能的ドメイン（両方とも、６１９個のアミノ酸タンパク質のＮ末端側半分において生じる）を含むポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）をコードすることが見出された。レスポンスレギュレーターレシーバーまたは「ＲＲ」ドメイン（Ｐｆａｍ  ＰＦ０００７２）の存在（パラクロレラＳＧＩ１ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）の約アミノ酸３６からアミノ酸１４８まで及ぶ）は、ＣｈｅＹ様ポリペプチドとして、ＳＧＩ１のバイオインフォマティックアノテーションを担っている（表１および２参照）。このＲＲドメインはまた、保存ドメインデータベース（ＣＤＤ）において「シグナルレシーバードメイン」ｃｄ００１５６としても特徴付けられ、約アミノ酸３７からアミノ酸１５４まで及んでいる。このドメインは、タンパク質のＣＯＧ（Ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｒｏｕｐｓ）データベースにおける「ＣｈｅＹ様レシーバー（ＲＥＣ）ドメイン」ＣＯＧ０７８４として、およびＩｎｔｅｒｐｒｏの「ＣｈｅＹ様スーパーファミリー」ドメインＩＰＲ０１１００６としても特徴付けられ、これらの特徴付けられたドメインは両方とも、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のパラクロレラＳＧＩ１ポリペプチドの約アミノ酸３３から約アミノ酸１６１まで及んでいる。ＲＲドメイン（時に「レシーバー」または多くの場合「ＲＥＣ」ドメインと称される）は、細菌性二成分調節系（ＣｈｅＹとして公知であるポリペプチドを含む細菌性走化性二成分系など）に見られ、センサーパートナーからシグナルを受け取る。こうした系のＲＲドメインは、多くの場合ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端側に見出され、典型的にはリン酸化され得るホスホアクセプター部位を含む。リン酸化は、その活性化または不活性化の原因であり得る。
【０１４４】
パラクロレラＳＧＩ１遺伝子（Ｔ−２６６１遺伝子）は、ＲＲドメインのＣ末端に位置付けられたｍｙｂドメインも有する。ｍｙｂドメインは、ｐｆａｍ  ＰＦ００２４９：「Ｍｙｂ様ＤＮＡ結合ドメイン」として同定され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の約アミノ酸位置２０４から約アミノ酸位置２５４まで及び、また保存ドメインＴＩＧＲ０１５５７「ｍｙｂ様ＤＮＡ−結合ドメイン、ＳＨＡＱＫＹＦクラス」として同定され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の約アミノ酸位置２０２からアミノ酸位置２５５まで及んでいる（パラクロレラＳＧＩ１ポリペプチド）。Ｉｎｔｅｒｐｒｏタンパク質分析および分類データベースにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を照会すると、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸位置２０１からアミノ酸位置２５９に及ぶＩｎｔｅｒｐｒｏホメオボックス様ドメインスーパーファミリードメイン（ＩＰＲ００９０５７）、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸位置１９９からアミノ酸位置２５８に及ぶＩｎｔｅｒｐｒｏ  Ｍｙｂドメイン（ＩＰＲ０１７９３０）が同定される。
【０１４５】
さらに、本明細書において保存ドメイン間のリンカーと呼ばれる低アミノ酸保存の領域内で、ＲＲドメインとＭｙｂドメインとの間に位置付けられたパラクロレラＳＧＩ１ポリペプチドにおいて核局在化シグナルを同定することができた。
【０１４６】
ｍｙｂドメインのＣ末端のパラクロレラＳＧＩ１ポリペプチドの領域には、保存されたタンパク質ドメインは見ることはできなかった。対照的に、ｍｙｂドメインが、ＲＲドメインのＣ末端に位置する、ＲＲドメインおよびｍｙｂドメインのＳＧＩ１アーキテクチャは、緑色植物亜界ゲノムにおいてコードされた多くのタンパク質に見ることができる。バイオインフォマティック解析を使用して、この保存されたアーキテクチャに基づいて、追加の植物および藻類種におけるパラクロレラＳＧＩ１の可能性のあるオルソログを同定した。
【０１４７】
追加の光合成生物におけるＳＧＩ１タンパク質のクラスを同定するために、パラクロレラＳＧＩ１ポリペプチドに見られる「ＲＲドメイン−ｍｙｂドメイン」アーキテクチャのために隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を構築した。ＨＭＭを開発するために使用されるアミノ酸配列は、ＲＲドメインおよびｍｙｂドメインの両方、ならびにこの２つのドメイン間のリンカー領域を含むアミノ酸配列の連続伸長を含むものであった。
【０１４８】
第１の工程として、パラクロレラＳＧＩ１ポリペプチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を用いて、植物および藻類のゲノムを含むＪＧＩ  Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅデータベースｖ．１２をＢＬＡＳＴ検索した。３つの専売藻類ゲノム（パラクロレラ、テトラセルミス、およびオオキスティス種由来）も検索されたデータベースに追加された。検索は、約２，０００ヒットに達すると中止された。次いで、これらの結果をＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ［Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ−Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、例えば、ebi.ac.uk]から入手可能）により分析し、選択された結果がＩｎｔｅｒｐｒｏ  ＣｈｅＹ様スーパーファミリードメイン（ＩＰＲ０１１００６）およびＩｎｔｅｒｐｒｏホメオボックス様ドメインまたはＭｙｂドメイン（ＩＰＲ００９０５７またはＩＰＲ０１７９３０）の両方を有することを確認した。いずれのドメインも有さない候補は除外した。この工程では、選択されたヒット数を９００〜１，０００の間に減らし、２つのドメインアーキテクチャ（ＲＲドメインＮ末端からｍｙｂドメインまで）を有するポリペプチドが、藻類および高等植物の両方のポリペプチドにおいて明確に同定された。得られた配列を用いて、配列相同性に基づいて系統樹を組み立てた。系統樹は、藻類種由来のＳＧＩ１相同ポリペプチドの明確なグループ分けを示した。
【０１４９】
ある種の藻類では、ＳＧＩ様遺伝子の数は少ない。典型的には、ある種の藻類においては単一の遺伝子が同定されるが、テトラセルミスでは３つの高相同性である遺伝子が同定され、これらはすべて、三倍体であると評価された株の同じ遺伝子の対立遺伝子である可能性が高い。一倍体であるパラクロレラで見つかった単一のＳＧＩ１ポリペプチドの機能、および三倍体であると考えられているテトラセルミスで同定された３つの類似性の高いＳＧＩ１ポリペプチドの機能が検証された（実施例５、７、および１６〜１８を参照されたい）ことから、ある種の藻類においてＳＧＩ１遺伝子の数が少ないということは、その藻類の種において同定されたＳＧＩ１遺伝子（複数可）が、実際にはその種の機能的ＳＧＩ１遺伝子であることを意味する（パラクロレラおよびテトラセルミスゲノムは施設内で配列が決定された）。
【０１５０】
他の光合成生物における可能性の高いＳＧＩ１オルソログについての基準を確立するために、ＳＧＩ１ポリペプチド配列の藻類クラスターに基づいて隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）が開発された。ＨＭＭは、２つの保存ドメイン間のリンカー領域など、ＲＲドメインおよびｍｙｂドメインの両方を包含するＳＧＩ１ポリペプチドのＮ末端部分に基づいて開発された。いかなる認識可能な保存構造も含まないｍｙｂドメインのＣ末端側のポリペプチドの配列は、モデル構築から除外した。ＨＭＭＥＲ  ３．１ｂ２を使用して、多重配列アライメント（ＭＳＡ）を用いて、パラクロレラ、オオキスティス、およびテトラセルミスポリペプチドの専売配列、ならびにクラミドモナス・レインハルディ、ボルボックス・カルテリ、クロモクロリス・ゾフィンジエンシス、コッコミクサ・スベリプソイデア、ミクロモナス種  ＲＣＣ２９９、およびオストレオコッカス・ルミナリヌスのポリペプチドの公的データベースの配列から、ＨＭＭを構築した。上記のタンパク質のＮ末端部分の多重配列アラインメント（ＭＳＡ）は、ＥＴＥ３  ｔｏｏｌｋｉｔおよびｅｇｇｎｏｇ４１ワークフローを使用して生成した。このプログラムでは、内部的に、アライメントのためにプログラムＭｕｓｃｌｅ、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ、およびＭ−ｃｏｆｆｅｅを、アライメントトリミングのためにｔｒｉｍＡｌを、系統発生の干渉のためにＰｈｙＭＬを使用する。これらのプログラムは、すべて一般公開されている。ＨＭＭは、例えば、相同性比較に使用される単一のタンパク質配列とは異なり、複数のタンパク質配列から情報を捕獲し、このため、ポリペプチド配列内の高度に保存された残基と高度に多様な残基とを区別し、配列の関連性を決定する際にそれらを考慮に入れることができる。ＨＭＭを使用して配列をスコア付けすると、高度に保存された残基は、非常に多様な残基よりも大きな重み付けを受け、それによってより単純なＰＳＡよりも優れた感度および正確さがもたらされる。
【０１５１】
ＳＧ１１  ＨＭＭを使用して、２つの保存ドメイン（ＲＲおよびｍｙｂ）を有することも検証されたＢＬＡＳＴ検索で同定されたポリペプチドにスコアを割り当てた。最も高いスコア（非常に高いスコアのアラビドプシス・ハレリ相同体、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３を除く）は藻類において見出され、推定オルソログのＨＭＭスコアは、光合成生物データベースにおいて約４７５〜２００未満の範囲であった。このサンプル中での藻類相同体ＨＭＭスコアは、一般に約４００〜約４５０の範囲であった。表３に示すように、オオキスティス、テトラセルミス、パラクロレラのＳＧＩ１相同体、および照会したほぼすべての追加の藻類相同体では、約４００以上のスコアが得られた。クロモクロリス・ゾフィンジエンシス  ポリペプチドのスコアが異常に低いのは、欠陥のあるゲノム注釈の結果である可能性が高い。藻類ＳＧＩ１ポリペプチドのＲＲドメインのアラインメント（図４）は、Ｃ．ゾフィンジエンシス  ＲＲドメインの配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）が、このドメインのＮ末端領域において連続したアミノ酸伸長を欠いているように見えることを示す。図４に示す藻類ＳＧＩ１相同体のＲＲドメインとパラクロレラＳＧＩ１  ＲＲドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）との配列相同性は、約５５％〜約８０％のアミノ酸配列同一性の範囲であった。図５には、このセットの藻類相同体のうち、パラクロレラｍｙｂドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）との配列相同性が約８５％〜約９７％のアミノ酸配列同一性の範囲である、藻類ＳＧＩ１ポリペプチドのｍｙｂドメイン配列のアラインメントを提供する。
【０１５２】
（表３）藻類種におけるＳＧＩ１オルソログ
2020503051.tif 000004
【０１５３】
植物種は、ＨＭＭスコアが４７５．９（アラビドプシス・ハレリ）〜２００未満の範囲の相同体を有していた。３７０以上のＨＭＭスコアを有する植物相同体の例を表４に提供する。これらの相同体のうちの１つをコードする遺伝子において突然変異を有する植物に対する成長効果は、ＨＭＭスコア３７１を有するアラビドプシス・ガディタナ「ＡＲＲ２」遺伝子は、実施例１９に示す。
【０１５４】
（表４）植物種におけるＳＧＩ１相同体
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【０１５５】
表２および３に列挙された藻類および植物相同体のすべてにおいて、ＲＲドメインおよびｍｙｂドメインは、ＪＧＩゲノムにおいて注釈を付けられている、ポリペプチド配列の最初の（最もＮ末端の）アミノ酸内にあり、これらのＳＧＩ１相同体において、ｍｙｂドメインのカルボキシ末端では、いずれの保存ドメインも同定されていない。
【０１５６】
実施例７  ＳＧＩ１突然変異体ＮＥ−７８４３およびＮＥ−１３３８０のクロロフィル含有量、アンテナサイズおよび光生理学
高生産性突然変異体のクロロフィル含有量は、細胞をメタノールで抽出し、上清を分光光度法で分析することによって決定した。簡単に説明すると、５００μｌアリコートの培養物を２．０ｍｌツイストトップチューブにピペットで移し、卓上型微量遠心機を用いて１５，０００ｒｐｍで１０分間ペレット化した。上清をペレットから吸引し、各ペレットを１．５ｍｌの９９．８％メタノール（予め炭酸マグネシウムで中和している）中に再懸濁した。０．２ｍｌのガラスビーズ（直径０．１ｍｍ）を各バイアルに添加し、３分間ビーズビートした。１．０ｍｌの上清を新しい１．７ｍｌのフリップトップチューブに移し、卓上型微量遠心機で１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られたペレットは白色であり、完全な抽出が行われたことを示していた。各上清０．８ｍｌを光学ガラスキュベットにピペットで移し、吸収波長を７２０ｎｍ、６６５ｎｍおよび６５２ｎｍの波長で直ちに読み取った。分光光度測定は、９９．８％メタノールブランクを用いて二重ビームモードで行った。以下の式を用いてクロロフィル濃度を算出した：クロロフィルａ［ｇ  ｍ−３］＝１６．７２（Ａ６６５−Ａ７２０）＋９．１６（Ａ６５２−Ａ７２０）およびクロロフィルｂ［ｇ  ｍ−３］＝３４．０９（Ａ６５２−Ａ７２０）−１５．２８（Ａ６６５−Ａ７２０）。クロロフィルａおよびｂの量は、細胞ごとおよびＴＯＣごとに標準化した。表５は、細胞当たりの総クロロフィル量は、ＳＧＩ１突然変異体間で幾分変動したが、野生型細胞と比べて約３０％〜約６５％の範囲の量だけ普遍的に減少したことを示す。これは、観察されたアンテナサイズの減少と一致している。ＴＯＣごとに、野生型細胞に対するＳＧＩ１突然変異体中の総クロロフィルの減少は、約３０％〜約５０％の範囲であった。
【０１５７】
（表５）ＳＧＩ１突然変異体および野生型藻類のクロロフィル含有量
2020503051.tif 000006
【０１５８】
クロロフィル含有量に加えて、ＰＳＩＩアンテナサイズ、ＰＳＩアンテナサイズ、１／τ’Ｑａ（光飽和における光化学系ＩＩのアクセプター側の電子輸送の光飽和速度、線形光合成電子輸送の効率の尺度）および炭素固定のＰｍａｘについて、ＳＧＩ１ノックアウト株ＮＥ−７８４３、ＮＥ−１３３８０、ＧＥ−１６３９１、ＧＥ−１６３９２、およびＧＥ−１６３９３を分析した。野生型およびＳＧＩ１突然変異株の細胞を実施例３に記載の一定の光の半連続培養アッセイ（ＣＬ−ＳＣＰＡ）で培養した。パラクロレラ野生型およびＳＧＩ１古典的突然変異体（ＮＥ−７８４３およびＮＥ−１３３８０）に関するデータは、３つの標的指向性ＳＧＩ１ノックアウト（ＧＥ−１６４９１、ＧＥ−１６４９２、ＧＥ−１６４９３）を含むものとは別の実験で得られた。様々な光合成パラメータの分析は、光合成生物の包括的な一連の光合成的特性および生理学的特性を測定するために開発された蛍光誘導および緩和（ＦＩＲｅ）技術を用いて行われた（ＧｏｒｂｕｎｏｖおよびＦａｌｋｏｗｓｋｉ（２００５年）「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ（ＦＩＲｅ）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ａｎｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｑｕａｔｉｃ  Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ」：Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｔｏ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，  Ｐｒｏｃ．第１３回国際光合成会議モントリオール、２００４年８月２９日〜９月３日（編：Ａ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｓｔ  ａｎｄ  Ｄ．Ｂｒｕｃｅ）、Ａｌｌｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｖ．２、１０２９−１０３１頁）。ＦＩＲｅ技術は、クロロフィル「可変蛍光」プロファイルの測定および分析に依存し（Ｆａｌｋｏｗｓｋｉら、２００４年「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍｓ」：Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ａ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：Ａ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｃ．ＰａｐａｇｅｏｒｇｉｏｕおよびＧｏｖｉｎｇｊｅｅ、編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、７５７−７７８頁に論じられている）、クロロフィル蛍光と光合成過程の効率との間の関係に依存している。この技術は、光合成集光プロセス、光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）での光化学、および炭素固定までの光合成電子輸送の特徴を明らかにする一連のパラメータを提供する。本明細書で実施された測定は、ｍｉｎｉ−ＦＩＲｅ装置（Ｍａｘｉｍ  Ｇｏｒｂｕｎｏｖ  ａｏｆ  Ｒｕｔｇｅｒｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｅａｓｔ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）を使用した。市販のＦＩＲｅ装置は、Ｓｅａ−Ｂｉｒｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｈａｌｉｆａｘ，Ｃａｎａｄａ，ｓａｔｌａｎｔｉｃ．ｃｏｍおよびｐｌａｎｅｔ−ｏｃｅａｎ．ｃｏ．ｕｋ）から入手可能である。ＦＩＲｅ装置の使用に関する詳細情報は、企業のマニュアルに記載されている。すべての測定は、一定の光（光量子束密度２��００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓｅｃ−１）の半連続培養（ＣＬ−ＳＣＰＡ）培養物を用いて行われた（実施例３参照）。ＦＶ／ＦＭおよびσＰＳＩＩを求めるために、蛍光誘導および緩和（ＦＩＲｅ）動態の測定を暗所で行った。表７に示すＦｖ／ＦｍおよびσＰＳＩＩの値は、６回の測定値（２つの生物学的複製の各々の３回の測定値）の平均値として算出した（これらのパラメータの誤差は５％を超えない）。
【０１５９】
ＰＳＩ断面積の測定は、特注のｓｉｎｇｌｅ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｆｌａｓｈｅｒ（ＳＴＦ）を備え、５２０ｎｍでエレクトロクロミックシフト（ＥＣＳ）を測定するためのフィルターセットを備えた改良型ＪＴＳ−１０スペクトロメーターを用いて行った。サンプルチャンバ内のピーク電力密度は、約１０μｓ以内に反応中心を完全に閉じるのに十分なほど高かった。得られた励起速度は、（光化学系の機能的吸収断面積に応じて）１０μｓ当たり反応中心当たり約１〜３ヒットであった。ＳＴＦは、短い超高輝度青色光パルス（４５５ｎｍ、３０ｎｍ半帯域幅）を生成し、パルスタイミングはＪＴＳ−１０分光計からのトリガーによって制御した。パルス幅は、ＳＴＦ  Ｐｕｌｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｂｏｘによって制御され、フロントパネルのポテンショメータを使用して１μｓ〜５０μｓの範囲で調整可能のものであった。ＰＳＩ断面積を測定するために、積分球を備えたＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ６５０分光光度計を使用して、細胞懸濁液の吸収スペクトルの測定に基づいて、クロロフィル最大（約４４０ｎｍ）で約０．２ＯＤまで培養物を希釈した。ＥＣＳは、ＤＣＭＵおよびヒドロキシルアミンの存在下で、光量子束密度４０００〜１２０，０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１範囲の強度で、１０μｓフラッシュを用いて測定した。実験曲線は、単純指数関数：
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を用いてフィッテイングさせた。式中、ＥＣＳＭは、最大ＥＣＳシグナルであり；Ｉｔは、光子密度（単位ｐｈｏｔｏｎ／ｍ２）であり；σＰＳＩは、ＰＳＩの機能的断面積である。野生型のパラクロレラ（ＷＴ−１１８５）のＰＳＩ機能的断面積の得られた値は、（４．０＋/−０．５）×１０−１８ｍ２であった。これらの値は、同じ条件下で成長させたＰＳＩＩの機能的断面積について得られたものに近接している（σＰＳＩＩ＝（４．３＋/−０．１）×１０−１８ｍ２）。これらのパラメータの誤差は、２０％を超えないと推定した。
【０１６０】
炭素固定速度（Ｃ１４Ｐｍａｘ）は、０．５ｇｌ−１（５．９５ｍＭ）の重炭酸ナトリウムを含む培地において、５μｇ  ｃｈｌ  ｍｌ−１に正規化された培養物を用いて測定した。Ｃ１４標識された重炭酸ナトリウム２０．４μＣｉｍｌ−１を各培養物に添加し、２５００μＥに１０分間曝露した。サンプルは、直ちに２Ｎ  ＨＣｌで酸性化し、一晩脱ガスした。翌日、サンプルをＢｅｃｋｍａｎ  ＬＳ６５００シンチレーションカウンターを用いて測定し、定量した。
【０１６１】
τ’Ｑａ（飽和光条件下で測定されたＰＳＩＩのアクセプター側の電子輸送時間−線形光合成電子輸送の最も遅い段階によって効率よく決定される）は、ＦＩＲｅ光曲線および暗所誘起緩和速度論（ＤＩＲＫ）プロファイルから測定した。野生型に対する体積ＰＳＩＩ濃度は、（Ｆｖ／σ５３０ＰＳＩＩ）として推定した。これらのパラメータの誤差は、１５％を超えないと推定した。光吸収断面積（光源の発光スペクトルの平均）は、以下の式を用いて推定した。
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式中、［Ｃｈｌ／ＴＯＣ］は、サンプルのクロロフィル／ＴＯＣであり；ＯＤ（λ）は、波長λで測定されたサンプルの光学密度であり；ΔＩは、キュベット内の測定光路長（１ｃｍ）であり；Ｉ（λ）は、波長λで藻類を成長させるために使用される光源の強度である。
【０１６２】
（表６）ＦＩＲｅ技術で測定した蛍光および光合成パラメータ
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【０１６３】
表７は、ＳＧＩ１突然変異体のすべてが、それが由来する野生型株と比較して、Ｆｖ／Ｆｍの上昇（約１０〜１４％）を示し、かつアンテナ断面サイズの減少を呈することを示す。ＳＧＩ１変異体は、ＰＳＩＩおよびＰＳＩのアンテナサイズの減少（野生型と比べて４０〜５０％減少）、飽和光下でのＰＳＩＩのアクセプター側での高電子輸送率（１／τ’Ｑａ）（操作された突然変異体における野生型と比べて、約３５％〜約１３０％の間、および、少なくとも約１００％で増加）、および高炭素吸収率（Ｐｍａｘ）（野生型と比べて、少なくとも最大３０〜４０％）を有し、多重反応モニタリングタンパク質決定により決定されるように、ＴＯＣ当たりの光化学系の数は維持された（実施例７参照）。株はまた、野生型と比較してクロロフィルａ対クロロフィルｂの比がより高い（約７０％高い）ことを特徴とし、これは末梢集光複合体が喪失していることを示しており、ＰＳＩＩの観察された機能的断面のサイズの減少と一致する（表７）。反復されたＳＧＩ１  ＫＯ変異体（ＧＥ−１６４９１、ＧＥ−１６４９２、およびＧＥ−１６４９３、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して操作されたもの）は、元の突然変異体と非常に類似した光生理学的表現型を示したが、ＰＳＩＩのアンテナのさらに大きな減少（最大５５％）、飽和光下でのＰＳＩＩのアクセプター側でのより速い電子輸送速度（最大１３０％上昇）、およびより高い炭素吸収速度（ＧＥ−１６４９１では最大８０％高い）（表７）を有していた。
【０１６４】
（表７）パラクロレラＳＧＩ変異体の光生理学
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【０１６５】
実施例８  高生産性藻類突然変異体の光生理学的スクリーニング
アンテナ減少株のスクリーニングおよび生産性アッセイを使用した高生産性変異体ＮＥ−７８４３およびＮＥ−１３３８０の発見、ならびにその後のこれらの高生産性変異体が、より高い最大光合成収率（ＦＶ／ＦＭ）、ＰＳＩＩアンテナサイズσＰＳＩＩ）の減少（σＰＳＩＩ）、およびＰＳＩＩ代謝回転速度（１／τ’Ｑａ）の上昇など、表５および６に記載の特徴的な光生理学的特性を有するという発見に基づき、本明細書では「ＦＡＣＳ−ＦＩＲＥ」スクリーニングと呼ばれる、高生産性藻類突然変異体のスクリーニングを考案した。このスクリーニングは、ＦＡＣＳを使用して、祖先藻類集団から低クロロフィル変異体を選択することを含み、実施例６に記載のＦＩＲｅ装置を用いて低クロロフィル蛍光についてＦＡＣＳにより選択された集団から、個々の系統のスクリーニングを行い、１つ以上の波長でのＰＳＩＩアンテナサイズ（σＰＳＩＩ）、ＦＶ／ＦＭ、およびＰＳＩＩのアクセプター側での電子輸送速度（１／τ’Ｑａ）を決定した。ＰＳＩＩアンテナのサイズの減少、ＦＶ／ＦＭの上昇、および１／τ’Ｑａの上昇を有する系統を拡大し、再試験し、炭素吸収速度（Ｐｍ（１４Ｃ））および培養中の生産性についてアッセイした。
【０１６６】
予備実験では、実施例１に記載したように、野生型パラクロレラ細胞（ＷＴ−１１８５株）をＵＶによって突然変異誘発した。突然変異誘発はまた、化学的突然変異誘発因子、ランダム挿入突然変異誘発（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０２２０６３８号参照）、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるなど、標的指向性突然変異誘発（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／０３０４８９６号）によっても達成され得る。
【０１６７】
実施例２に記載したように、突然変異誘発藻類細胞を弱光で回収し、次いで蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）に供した。低クロロフィル蛍光細胞は、細胞の全集団と比較して、最小で、約０．５〜２％のクロロフィル蛍光を有する（ユーザの判断により、より厳格である、厳密でない、より広い、またはより狭い範囲のクロロフィル蛍光をＦＡＣＳ選択に課すことができる）。ＦＡＣＳ選別細胞をプレーティングし、コロニーの成長後、それらを個々に拾い上げ、９６ウェルプレート中の培養培地（還元炭素源を欠いている）に接種し、培養物を明所で光独立栄養により成長させた（５００μＥ  ｍ−２ｓ−１）。１０枚の９６ウェルプレートで小規模（約１００〜２００μｌ）培養を開始し、その結果、低クロロフィル選択系統の約９６０個の個々の培養物を得た。
【０１６８】
高生産性突然変異体のスクリーニングの第２の段階では、細胞蛍光をプローブするための光パルスを転送し、収集された蛍光を機器検出器に転送する付属の光ファイバケーブルを備えたＦＩＲｅ装置を使用した。光ファイバケーブルは、単離された細胞系からの蛍光をプローブし、測定するため、各個々のウェル上に保持され、記録し、ＦＩＲｅ装置により、ＦＶ／ＦＭ、ＰＳＩＩアンテナサイズ（σＰＳＩＩ）、およびＰＳＩＩ代謝回転速度（ＰＳＩＩのアクセプター側における電子輸送の速度、１／τ’Ｑａ）を算出するために使用した。少なくとも１０％のＦＶ／ＦＭの上昇、少なくとも３０％のＰＳＩＩアンテナサイズの減少、および少なくとも５０％のＰＳＩＩ回転率の増加を呈する系統を、さらに調べるために選択した。このようなパラメータのカットオフ値は、ユーザの判断で異なる値に設定できる。例えば、目的株を選択するために、ＦＶ／ＦＭの上昇が少なくとも５％、ＰＳＩＩアンテナサイズの減少が少なくとも２０％、ＰＳＩＩ代謝回転速度の上昇が少なくとも２０％、またはより厳密な基準を用いることができる。
【０１６９】
スクリーニングプロセスの概略図を図６に示す。ＦＡＣＳをベースにした低クロロフィル系統の選択およびＦＩＲｅをベースにした小規模培養のスクリーニングを伴うスクリーニングは、例えば、低クロロフィル細胞をマルチウェルプレートのウェルに直接向けるＦＡＣＳ装置および／または自動化された機械的手段によってさらに自動化され、ＦＩＲｅ光ファイバケーブルまたは発光ＬＥＤを、蛍光検出器システム、またはマイクロ秒の高強度の光フラッシュを提供し、マルチウェルプレートの個々のウェルに蛍光シグナルを収集することができる別のシステムを連続的に位置決めすることができる。
【０１７０】
低クロロフィル蛍光およびアンテナサイズの減少、ＦＶ／ＦＭの上昇、およびＰＳＩＩ代謝回転速度（１／τ’Ｑａ）の上昇を示す藻類系統は、上記実施例６に提供されるように、例えば低クロロフィルｂ含有量、培養中、例えば半連続培養中（例えば実施例３）の炭素吸収の増加およびより高い生産性について、さらに評価され得る。
【０１７１】
ＦＡＣＳ−ＦＩＲＥスクリーニング法を用いていくつかの突然変異株が同定され、その中でＮＥ−１６９８０はゲノムが配列決定され、ＳＧＩ１（Ｔ−２６６１）遺伝子においてフレームシフト突然変異を有することが見出された（図７）。
【０１７２】
実施例９  ＳＧＩ１突然変異体ＮＥ−７８４３およびＮＥ−１３３８０の微小近似分析
ＳＧＩ１減衰突然変異体の全バイオマス組成を決定するために、毎日４０％希釈を行い、半連続モードで成長させた培養物からのサンプルの定量分析を行い、半連続培養における細胞の脂質、タンパク質および炭水化物の含有量を決定した。培養物が定常状態に達した後、毎日希釈のために取り出した培養物のアリコートを脂質、タンパク質、および炭水化物を分析するために使用した。藻類培養サンプルの全有機炭素（ＴＯＣ）は、２ｍＬの細胞培養物をＤＩ水で総量２０ｍＬに希釈することによって決定した。全炭素（ＴＣ）および全無機炭素（ＴＩＣ）を決定するために、測定１回当たり３回の注入物をＳｈｉｍａｄｚｕ  ＴＯＣ−Ｖｃｓｊ  Ａｎａｌｙｚｅｒに注入した。燃焼炉は７２０℃に設定し、ＴＯＣはＴＣからＴＩＣを差し引くことによって決定した。４点較正範囲は、２ｐｐｍ〜２００ｐｐｍまでであり、これは、非希釈培養物の２０〜２０００ｐｐｍに対応し、相関係数はｒ２＞０．９９９であった。
【０１７３】
脂質含有量を決定するために、ＨＴ−４Ｘ（ＧｅｎｅＶａｃ）を使用して乾燥させた２ｍＬのサンプルに対してＦＡＭＥ分析を実施した。乾燥ペレットに以下を添加した：５００ｍＭ  ＫＯＨを含むメタノール５００μＬ、０．０５％ブチル化ヒドロキシルトルエンを含むテトラヒドロフラン２００μＬ、２ｍｇ／ｍｌ  Ｃ１１：０遊離脂肪酸／Ｃ１３：０トリグリセリド／Ｃ２３：０脂肪酸メチルエステルを含む内部標準混合物４０μＬ、およびガラスビーズ（直径４２５〜６００μｍ）５００μＬ。バイアルをオープントップＰＴＦＥ隔膜キャップで蓋をし、ＳＰＥＸ  ＧｅｎｏＧｒｉｎｄｅｒ中に１．６５ｋｒｐｍで７．５分間置いた。次に、サンプルを８０℃で５分間加熱し、放冷した。誘導体化のために、８０℃で３０分間加熱する前に、１０％三フッ化ホウ素を含むメタノール５００μＬをサンプルに添加した。チューブは、２ｍＬのヘプタンおよび５００μＬの５Ｍ  ＮａＣｌを添加する前に冷却させた。次にサンプルを２ｋｒｐｍで５分間ボルテックスし、最後に１ｋｒｐｍで３分間遠心分離した。ヘプタン層は、Ｇｅｒｓｔｅｌ  ＭＰＳ  Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒを用いてサンプリングした。定量には、８０μｇのＣ２３：０  ＦＡＭＥ内部標準を使用した。
【０１７４】
タンパク質含有量を決定するために、単離したバイオマスサンプルを加水分解し、アミノ酸をプロポキシカルボニルプロピルエステル（ＡＡＰＥ）に誘導体化し、ＧＣ／ＭＳにより分析し、以下に詳述するように内部標準に対して定量した。半連続培養物からの野生型パラクロレラ（ＷＴ−１１８５）およびＳＧＩ１ノックアウト株ＧＥ−１３３８０のアリコート（０．５ｍｌ）を遠心分離し、ペレットをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。最後に、細胞を最終量０．５ｍｌ（開始量）に再懸濁し、４ｍｌガラスバイアルに移した。培養サンプルに、ＴＧＡを含む８００μｌの６Ｍ  ＨＣｌを加えた（チオグリコール酸（ＴＧＡ）４００μｌを使用直前に６Ｍ  ＨＣｌ  １９．６ｍｌに加えた）。次いで、１０μｌのベータメルカプトエタノールをバイアルに添加し、続いて２００μｌの２０ｍＭノルバリンを内部標準として使用した。各バイアルを１０秒間Ｎ２で覆い、その後、バイアルを２５００ｒｐｍで１分間ボルテックスしてサンプルを均質化した。次にバイアルを１１０℃のオーブンに２２時間入れた。加水分解インキュベーションの終わりに、バイアルを２５００ｒｐｍで１０分間ボルテックスし、次いで１０００ｒｐｍまで遠心分離し、その後遠心分離機を停止した。５０μｌのアリコートを各バイアルから取り出し、誘導体化の前に少なくとも３時間ＨＣｌ法を行った酸に対し安全なＥＺ−２（Ｇｅｎｅｖａｃ）に入れることによって乾燥させた。
【０１７５】
誘導体化のために、２５０μｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏを乾燥酸加水分解物に添加し、続いて１０μｌの抗酸化物質混合物、次いで１２０μｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨを添加した。抗酸化物質混合物は、０．２５ｍｌのｎ−プロパノール、５０μｌのチオジグリコール、および数粒のフェノールを２．２０ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏに加え、ボルテックスすることによって作製した。次いで、８０μｌの触媒、ピリジンとｎ−プロパノールの４：１混合物を添加し、バイアルにキャップをし、２５００ｒｐｍで１分間ボルテックスした。次いで、５０μｌのプロピルクロロホルメートを添加し、このバイアルにキャップをし、２５００ｒｐｍで１分間ボルテックスした。１分間インキュベートした後、バイアルを再び２５００ｒｐｍで１分間ボルテックスした。次に、イソオクタンとクロロホルムの４：１混合物５００μｌをバイアルに加え、これに再びキャップをして２５００ｒｐｍで１分間ボルテックスした。次いで、サンプルバイアルのラックを別のサンプルラックで覆い、確実にサンプルの乳濁液とするために２０回振とうした。次いで、遠心分離機が１０００ｒｐｍに達するまでサンプルを遠心分離し、次いで遠心分離機を停止した。２００μｌの有機層を取り出してガラスインサート付きの新しいＧＣバイアルに入れ、ＧＣ／ＭＳにより分析した。
【０１７６】
サンプルを、ＺＢ−ＡＡＡ  １０ｘ０．２５ｍｍ  ＩＤアミノ酸分析ＧＣカラムを使用してＧＣ／ＭＳにより分析し、内部ノルバリン標準を使用して定量した。ニードル洗浄１溶媒はアセトン、ニードル洗浄２溶媒はイソオクタン／クロロホルム（８０／２０）で、１１０℃、０分間保持、３０℃／分で３２０℃まで、０．５分間保持し、１５：１スプリットで４μｌの注入、２５０℃、１．１ｍｌ／分で、３００℃の移送ラインを使用するプログラムを用いた。
【０１７７】
ＧＣ−ＭＳデータに０．０００５Ｌを掛けてμｍｏｌ値を得、アミノ酸の分子量を掛けた。その値を５で割って量を補正し、各アミノ酸のμｇ／ｍｌを求めた。アスパラギンは、酸加水分解中にアスパラギン酸に変換され、したがってアスパラギンおよびアスパラギン酸は、これらの方法でアスパラギン酸として決定される。トリプトファンはこれらの方法では測定されないが、パラクロレラタンパク質中のアミノ酸の大部分を構成していない。
【０１７８】
全炭水化物定量については、バイオマスを６Ｎ塩酸中で１時間加水分解し、多糖類を単糖類に変換した。得られた単糖類を、１％トリメチルクロロシランと共にＭＳＴＦＡ  Ｎ−メチル−Ｎ−トリエチルシリルトリフルオロアセトアミドを用いてトリメチルシリルエーテルに変換し、ＧＣ−ＭＳ分析を用いてエーテルを分解し、定量した。
【０１７９】
培養サンプルの酸加水分解のために、５００μｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏを４ｍｌバイアル中の５００μｌの培養サンプルに添加した。または、培養サンプルがより濃縮されている場合（より高いＴＯＣ）、８００μｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏを培養サンプル２００μｌに加えた。内部標準として２．５ｍｇ／ｍｌのリビトールおよびＵ−１３Ｃ−グルコース２０μｌを４ｍｌバイアル中の１ｍｌ希釈培養サンプルに添加した。次に、１ｍｌの濃ＨＣｌを各バイアルに加え、バイアルにキャップをして１０５℃の乾燥浴に１時間入れた。次にサンプルを室温まで冷却し、１００μｌを１．５ｍｌの微量遠心分離管内のガラスインサートに移した。
【０１８０】
誘導体化のために、サンプルの入ったガラスインサートを含む微量遠心管を、少なくとも３時間ＨＣｌ法を行った酸に対し安全なＥＺ−２（Ｇｅｎｅｖａｃ）に入れた。乾燥後、１ｍｌの開封後のＭＦＳＴＡ−１％ＴＭＣＳに加えた８００μｌの乾燥ピリジンからなる１００μｌの誘導体化試薬を各サンプルに加えた。サンプルをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒにおいて、１０００ｒｐｍで混合しながら４０℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルをＧＣ／ＭＳによって直接分析した。
【０１８１】
サンプルを、ＤＢ５−ＭＳ  ３０ｍｘ２５０μｍｘ２５μｍ  ＧＣカラムを使用してＧＣ／ＭＳによって分析し、Ｕ−１３Ｃ−グルコース内部標準を使用して定量した。ニードル洗浄溶媒は、ピリジンであり、１分間の平衡化、１７０℃で１０℃／分で８分間、２１０℃まで０分間、次いで５０℃／分で３２５℃まで２分間行うプログラムを用いた（総実施時間１６．３分）。
【０１８２】
図８には、野生型パラクロレラ株ならびにＳＧＩ１遺伝子減衰ノックアウト突然変異体ＧＥ−１３３８０についてのこの分析の結果を示す。意外なことに、ＳＧＩ１ノックアウト突然変異体ＮＥ−１３３８０では、野生型と比べて、タンパク質としてその全有機炭素の割合が増加していることが観察され、野生型株（ＷＴ−１１８５）と比べてＴＯＣベースでタンパク質が約２０％増加したことを示した。実施例３に示されているようにＳＧＩ１突然変異体は、半連続的アッセイにおいて野生型と比較して全有機炭素の蓄積が増加し、それに対応して脂質および炭水化物の減少を示した。ＳＧＩ１突然変異体のタンパク質のアミノ酸組成は、野生型細胞のものと非常に類似していることがわかった。したがって、ＳＧＩ１突然変異株は、藻類および藻類バイオマスのタンパク質含有量を増加させる遺伝的手段をもたらす。培養条件に応じて、ＳＧＩ１突然変異体によって実証されたタンパク質の割合の増加とバイオマス生産性の上昇とを組み合わせると、面積タンパク質生産性の約４０％から約６０％の増加が予測できる。
【０１８３】
実施例１０  ＳＧＩ１突然変異体ＮＥ−７８４３およびＮＥ−１３３８０のトランスクリプトームおよびプロテオーム
実施例３に記載した一定の光の半連続培養アッセイ（ＣＬ−ＳＣＰＡまたは「ＣＬ２０００」アッセイ）で培養した野生型およびＳＧＩ１突然変異株ＮＥ−７８４３およびＮＥ−１３３８０のｍＲＮＡ抽出物についてトランスクリプトーム解析を行った。ＳＧＩ１突然変異体のトランスクリプトーム解析では、野生型と比べて異なるように調節された多数の遺伝子が示された。ＳＧＩ１突然変異体がクロロフィルの減少および光合成アンテナの減少を示したように、集光クロロフィル結合タンパク質（ＬＨＣ）遺伝子が、野生型祖先細胞株と比べて、突然変異体においてより少ない転写産物の存在量を有していたかを確認することは興味深いものであった。パラクロレラゲノムにおいて１５のＬＨＣ遺伝子が同定され、ＰＳＩＩ反応中心に会合するＬＨＣポリペプチドであるＣＰ２６をコードする遺伝子を除いて、野生型の発現レベルと比べて、同定されたパラクロレラＬＨＣ遺伝子のすべてが、ＳＧＩ１突然変異体において著しく下方調節されることが見出された（図９）。ＬＨＣ  ｍＲＮＡは、平均して、ＷＴ−１１８５と比較してＳＧＩ１の存在量において約１．７倍の減少を示した。これらのトランスクリプトームデータからの別の驚くべき観察は、Ｒｕｂｉｓｃｏ活性化酵素がＳＧＩ１突然変異体において、約６倍高い転写産物存在量を有することがわかったことである。
【０１８４】
実施例３に記載した一定の光の半連続培養アッセイ（ＣＬ−ＳＣＰＡまたは「ＣＬ２０００」アッセイ）で培養したＷＴ−１１８５およびＳＧＩ１突然変異体ＮＥ−７８４３についても包括的なプロテオーム解析を行った。質量分析法（Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｅａｓｔ  Ｌａｎｓｉｎｇ、ＭＩ）を実施して、全体的なタンパク質存在量を決定した。トランスクリプトームデータセットと一致して、ＳＧＩ１突然変異体では、野生型細胞に関してＬＨＣタンパク質存在量の減少およびＲｕｂｉｓｃｏ活性化酵素存在量の上昇が示された。
【０１８５】
実施例３に記載した一定の光の半連続培養アッセイ（ＣＬ−ＳＣＰＡまたは「ＣＬ２０００」アッセイ）で培養した野生型およびＳＧＩ１変異株（ＮＥ−７８４３およびＮＥ−１３３８０）についても標的プロテオーム解析を行った。目的の各タンパク質についての内部標準を使用して、高い特異性および感度で、目的のタンパク質の標的定量を可能にする質量分析アプローチである多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を使用してプロテオーム解析を実施した（例えば、Ｑｕら、（２００６年）Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．７８：４５４３−４５５２；Ｄｏｍｏｎら（２００６年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５：１９２１−１９２６；Ｗｏｌｆ−Ｙａｄｌｉｎら（２００７年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０４：５８６０−５８６５；Ｓｔａｈｌ−Ｚｅｎｇら、（２００７年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ６：１８０９−１８１７を参照されたい）。ＰｓａＤ（ＰＳＩサブユニット）、ＰｓｂＢ（ＰＳＩＩサブユニット）およびＲｂｃＬ（Ｒｕｂｉｓｃｏ大サブユニット）からの高品質ペプチドを用いて、野生型パラクロレラ（ＷＴ−１１８５）およびＳＧＩ１突然変異体（ＮＥ−７８４３およびＮＥ−１３３８０）におけるＰＳＩ、ＰＳＩＩおよびＲｕｂｉｓｃｏ存在量を定量した。ＭＲＭプロテオーム解析（ＪａｄｅＢｉｏ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）の結果は、ＳＧＩ１突然変異体がＰＳＩＩ／ＴＯＣ含有量およびＰＳＩＩ：ＰＳＩ比のわずかな上昇を特徴とすることを示した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。野生型と比較してより高いＲｕｂｉｓｃｏ／ＴＯＣ含有量もまたＳＧＩ１突然変異体において観察され（図１０Ａおよび１０Ｂ）、これは、微小近接分析（実施例６）と一致して、ＴＯＣ当たりより高いタンパク質含有量を有した。しかし、ＰｓｂＤ（ＰＳＩＩポリペプチド）、Ｒｕｂｉｓｃｏ大サブユニット、およびＲｕｂｉｓｃｏ活性化酵素のレベルを比較した定量的ウエスタン法では、全タンパク質に対して正規化した場合、ＰＳＩＩおよびＲｕｂｉｓｃｏのレベルは、ＳＧＩ１突然変異体が、全体としてより高いタンパク質／ＴＯＣ含有量を有するため、野生型およびＳＧＩ１突然変異体において同程度であった（図１０Ｃおよび１０Ｄ）。
【０１８６】
トランスクリプトームおよびプロテオーム解析の両方において、Ｒｕｂｉｓｃｏ活性化酵素（ＲＡ）タンパク質の存在量の増加が観察された（図１１Ａおよび１１Ｂ）。これらの観察結果は、定量的ウエスタン分析によって確認された。２つのＲｕｂｉｓｃｏ活性化酵素アイソザイム（アルファおよびベータ）は、主にそれらのＮ末端が異なり、ＲＡ−αはＲＡ−βと比べて、伸長されたＮ末端を有する。図１１Ｂには、ウエスタンブロットを示し、Ｒｕｂｉｓｃｏ活性化酵素タンパク質のアルファアイソザイム（ＲＡ−α）がわずかに増加していることがわかり、Ｒｕｂｉｓｃｏ活性化酵素タンパク質のベータアイソザイム（ＲＡ−β）が、野生型タンパク質レベルの約２．５倍、有意に増加していることがわかった。これは、トランスクリプトーム解析によって決定されるように、突然変異体中においてＲＡ転写物の存在量が増加していることと一致している。
【０１８７】
実施例１１  自然照射量条件をシミュレートした半連続培養におけるＳＧＩ１突然変異体の生産性
南カリフォルニアの春における自然の昼光条件を模倣した光レジメン下で半連続系におけるＳＧＩ１突然変異体の生産性を評価するために、スケールアップ培養を用いて、２２５ｃｍ２の長方形組織培養フラスコに接種した。そのそれぞれは、接種後に、培養液５５０ｍｌの最終総量を含んでいた。典型的な接種量は、約３５０ｍｌのＰＭ１１９培地に添加された約２００ｍｌのスケールアップ培養物であった。培養物は、照度がピークになった日中、体積の６５％を取り除き、その分を同体積のアッセイ媒体、および追加の１０ｍｌの脱イオン水と交換して、蒸発を補うことにより、毎日希釈した（補充培地に含まれる）。半連続アッセイは、典型的には１０〜１４日間実行した。毎日の脂質およびバイオマス生産性は、定常状態に達した培養物についてのみ算出した（このアッセイでは、成長の増加は、希釈率に等しかった）。
【０１８８】
１株につき３つの培養を開始した。フラスコは、培養物からバブリングされたＣＯ２富化空気（１％ＣＯ２、フローレート３００ｍｌ／分）を送達するためのシリンジフィルターに接続された管が挿入されている栓を有していた。アッセイ期間中、５７５ｒｐｍに設定した撹拌プレート上でフラスコを２５℃の一定温度を維持するようにプログラムされた水浴中に置いた。培養フラスコを不透明な白色プラスチックでマスキングして、培養物に到達する照射のために、３１．５ｃｍ２の長方形の開口部を設けた。フラスコは、明暗周期および「太陽の正午（ｓｏｌａｒ  ｎｏｏｎ）」まで増加させ、次いで明期間の終わりまで減少させる明プロフィールをプログラムされたＬＥＤライトバンクに対して幅（最も狭い寸法）により整列させた。光プロファイルは、南カリフォルニアの春の日を模倣して設計した：明１４時間：暗１０時間。光のピークは、約２０００μＥとした。フラスコは、ＣＯ２富化空気（１％ＣＯ２、フローレート３００ｍｌ／分）を送達するためのシリンジフィルターに接続された管が挿入されている栓を有していた。アッセイ期間中、５７５ｒｐｍに設定した撹拌プレート上で、フラスコを、２５℃の一定温度を維持するようにプログラムされた水浴中に置いた。
【０１８９】
毎日のバイオマス（ＴＯＣ）生産性は、定常状態に達した培養物から算出した。体積ＴＯＣ生産性（ｍｇ／Ｌ／日）は、体積ＴＯＣ量に希釈率を掛けることによって算出した。面積生産性（ｇ／ｍ２／日）は、培養物の全生産性を、照射が入る開口の大きさで割ることによって計算した。
2020503051.tif 000011
【０１９０】
図１２は、日周の半連続アッセイにおけるＮＥ−７８４３  ＳＧＩ１突然変異体および野生型ＷＴ−１１８５株の三連培養物の毎日の平均ＴＯＣ生産性を示しており、これらの条件下で、突然変異体が、野生型と比べて生産性の２０％の増加を呈したことを示している。
【０１９１】
実施例１２  栄養素豊富条件下でのバッチ培養の生産性
ＳＧＩ１突然変異体ＮＥ−１３３８０の生産性も、窒素豊富バッチモードで培養しながら１週間にわたって評価した。ＮＥ−１３３８０および野生型ＷＴ−１１８５の培養物を、窒素豊富培養培地中で成長させたシード（スケールアップ）培養物からの初期ＯＤ７３０  ０．５まで接種した。
【０１９２】
接種後、ＳＧＩ１ノックアウト株ＮＥ−１３３８０および野生型株ＷＴ−１１８５を、１７５ｍｌのＰＭ１１９培地を含有している７５ｃｍ２長方形組織培養フラスコ中で７日間、バッチアッセイにおいて三連培養で成長させた。フラスコをＬＥＤ光源に対して最も狭い「幅」寸法で位置付けた。培養フラスコを不透明な白色プラスチックでマスキングして、培養物に照射が到達するようにするために、２１．１ｃｍ２の長方形の開口部を設けた。入射照度は、４時間かけて０〜１２００μＥまでの照射量の直線的な上昇を伴う明１６時間：暗８時間のサイクルでプログラムし、その後、照射量を１２００μＥで６時間にわたって保持し、次いで、４時間にわたって照射量を１２００〜０μＥまで低下させた（上昇または低下は、１５分間隔で行った）。蒸発損失を補うために脱イオン化Ｈ２Ｏを毎日培養物に添加した。培養物の温度は、２５℃に設定した水浴で調節した。実施例３に記載したように、全有機炭素（ＴＯＣ）を評価するために、サンプル（５ｍｌ）を毎日取り出した。サンプリングは、光周期が終了する３０分前に行った。
【０１９３】
図１３は、これらのバッチ、窒素豊富条件下で、ＮＥ−１３３８０  ＳＧＩ１突然変異体がバイオマス蓄積において野生型よりも優れていることを示している。
【０１９４】
実施例１３  窒素制限下でのバッチ培養のＴＯＣおよび脂質生産性
ＳＧＩ１突然変異体も、窒素制限下においてバイオマスおよび脂質蓄積について評価した。バッチ生産性アッセイにおいて、ＳＧＩ１ノックアウト株ＮＥ−７８４３および野生型祖先株ＷＴ−１１８５を、窒素欠乏培地で培養した。すなわち、培地は細胞成長のための窒素源を有していなかった。生産培養物を、８．８ｍＭの硝酸塩を含むＰＭ０７４培地で成長させたシード（スケールアップ）培養物から、初期ＯＤ７３０  ０．５まで接種した。
【０１９５】
接種後、ＺｎＣｙｓノックアウト株ＮＥ−７８４３および野生型株ＷＴ−１１８５を、７５ｃｍ２長方形組織培養フラスコ中で７日間、バッチアッセイにおいて３連の１７５ｍｌ培養物中で成長させた。
【０１９６】
図１４Ａは、Ｎ豊富バッチ条件下における体積ＴＯＣの累積を示す。ＷＴ−１１８５およびＮＥ−１３３８０の生物学的複製データが示されており、ＮＥ−１３３８０突然変異体は、バイオマス蓄積において野生型株より優れていた。図１４Ｂは、ＳＧＩ１突然変異体も脂質（ＦＡＭＥ）蓄積において野生型株よりも優れており、１週間のアッセイの過程にわたって野生型よりも約５０％多くＦＡＭＥを蓄積していることを示している。
【０１９７】
実施例１４  高照射量培養
本明細書に開示されているＳＧＩ１突然変異体の成長速度の改善は、複数の培養条件において観察されている（表８）。栄養素を豊富に含む新鮮な培地を導入し、等量の培養物を排出する連続希釈システムによって、培養物を一定の強光下で高希釈度において維持した。パラクロレラＳＧＩ１突然変異体は、中程度から強光条件（５００〜１，４００μＥ）において、１８〜２０％上昇した成長速度を示し、非常に強い光（５，０００μＥ）においては、ＳＧＩ１突然変異体は、野生型祖先株の約５倍の速度で成長することが観察された（表８）。高光条件下での成長速度の劇的な差は、ＳＧＩ１突然変異体を選択するために使用され得る。
【０１９８】
（表８）低密度、高光条件下でのパラクロレラ株の成長度
2020503051.tif 000012
ａ毎日の継代培養および５００μＥ一定光による振とうフラスコでの成長速度。
ｂＴ２２５フォトバイオリアクター（ＣＬ−ＳＣＰＡ）中において、低密度（ＯＤ７２０＝０．１）、１，４００μＥに保たれた連続培養での成長速度。
ｃＦＭＴ１５０フォトバイオリアクター中において、低密度（ＯＤ７２０＝０．１）、５，０００μＥに保たれた連続培養での成長速度。
ｄ野生型パラクロレラ
ｅＳＧＩ１突然変異を有するパラクロレラ
ｆ野生型親株と比較して、ＳＧＩ１突然変異体における成長速度の上昇
【０１９９】
少数のＮＥ−１３３８０  ＳＧＩ１突然変異細胞を、高光（１，４００μＥ）、低密度条件（１ｘ１０６細胞／ｍｌ）において、連続培養で成長させている４００ｘ１０６野生型パラクロレラＷＴ−１１８５細胞を含むフォトバイオリアクターに接種した。６０日の期間にわたって成長速度はゆっくり上昇し、その結果、６０日後に培養物は特定の１日成長速度２．２７に達した。次いで、培養物を単一コロニー用の寒天プレートにプレーティングした。個々のクローンを拾い上げ、成長速度およびＳＧＩ１突然変異の存在について分析した。注目すべきことに、プレートから単離されたクローンはすべて、ＳＧＩ１突然変異を含んでおり、これは低密度、高光、連続培養を用いることにより、ＳＧＩ１型突然変異体を選択できることを示唆している。例えば、ＵＶ、化学的突然変異誘発、ランダム挿入突然変異誘発、または他の突然変異誘発手順を任意で実施し、続いて、低密度、高光、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、またはそれ以上の連続培養で行って、ＳＧＩ１型突然変異体などの高生産性突然変異体を選択することができる。
【０２００】
図７は、印を付けた様々な突然変異体において見出される突然変異の位置と共に、ＳＧＩ１遺伝子のマップを示す。株ＮＥ−７８４３は、実施例１〜６に開示したスクリーニングにより単離し、株ＮＥ−１６９８０は、実施例７に開示したスクリーニングにより単離した。図７でその突然変異が同定されているいくつかのさらなる突然変異は、本実施例の高光低密度の培養選択下で単離された。
【０２０１】
実施例１５  テトラセルミスＳＧＩ１遺伝子の同定および標的化
本明細書でテトラセルミスＷＴ−１０５と称される、テトラセルミス種の野生型藻類の環境単離物のゲノムは、施設内で完全にその配列が決定された（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）。ゲノムの分析は、三倍体であるＷＴ−１０５のテトラセルミス属と最も一致していた。テトラセルミスＷＴ−１０５ゲノムの翻訳された配列についての照会として、パラクロレラＳＧＩポリペプチド配列を用いた相互ＢＬＡＳＴに基づいて、３つの遺伝子が同定された。Ｔ−５１７２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６のタンパク質をコードする配列（またはｃＤＮＡ配列）を有する）、Ｔ−５１８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８のタンパク質をコードする配列（またはｃＤＮＡ配列）を有する）、およびＴ−５２３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０のタンパク質をコードする配列（またはｃＤＮＡ配列）を有する）。これらは、テトラセルミスＷＴ−１０５  ＳＧＩ１遺伝子の対立遺伝子とみなされる。対立遺伝子Ｔ−５１８５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）およびＴ−５２３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）によってコードされるタンパク質は高度に相同性であり、ＢＬＡＳＴにより９８％のアミノ酸配列同一性が示されている。ＢＬＡＳＴ分析によれば、Ｔ−５１７２対立遺伝子によってコードされるタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）は、Ｔ−５２３０対立遺伝子によってコードされるタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）と９０％同一であり、またＴ−５１８５対立遺伝子によってコードされるタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）と９２％同一である。各対立遺伝子は、ＲＲドメインおよびｍｙｂドメインを有すると決定された（表３参照）。表３にも提供されたとおり、テトラセルミスＳＧＩ１対立遺伝子ポリペプチドＴ−５１７２、Ｔ−５１８５およびＴ−５２３０は、少なくとも４００、すなわち、ＳＧＩ１ポリペプチドを同定するために開発されたＨＭＭに対して、それぞれ、４０３．０（ｅ値２ｅ−１１８）、４０３．６（ｅ値９ｅ−１１９）、および４０２．９（ｅ値３ｅ−１１８）のスコアを有することが見出された（実施例６）。
【０２０２】
テトラセルミスＳＧＩノックアウト株を作製するために、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびＣａｓ９タンパク質と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒＲＮＡ）を含むＣａｓ９リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を粒子ボンバードメントによりテトラセルミス藻類細胞に導入した。形質転換体を選択するための選択マーカーカセットを、金微粒子上にＣａｓ９  ＲＮＰと共に導入した。テトラセルミス形質転換用のＲＮＰを作製するために使用されたｔｒａｃｒ  ＲＮＡは、ＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、ＵＳＡ）から購入された化学修飾された６７ヌクレオチドのＡｌｔ−Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｔｒａｃｒＲＮＡであった。ＲＮＰ形質転換に使用されたｃｒＲＮＡは、ＳＧＩ１遺伝子の３つすべての対立遺伝子の４番目のエクソンに存在する２０ヌクレオチド標的配列（ＭＡ１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１またはＪＣ２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２）を含むＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ、ＵＳＡ）から購入した化学修飾Ａｌｔ−Ｒ（登録商標）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ｃｒＲＮＡであった（図１５参照）。ｃｒＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡの配列に相補的である１６ヌクレオチド配列を含んでいた。
【０２０３】
ＲＮＰ複合体を形成する前に、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをプレインキュベーションして、ｃｒＲＮＡをｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズさせた。各ＲＮＡを１００μＭの濃度で再懸濁し、等量のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ  ＲＮＡを２０μＭのアリコートで別々のチューブで混合し、各ＲＮＡが、各アニーリング混合物において５０μＭの濃度を有するようにした。ただし、１回の実験で２つのｃｒＲＮＡを使用した場合は、各ｃｒＲＮＡは、アニーリング混合物において、２５μＭの濃度を有するようにした。組み合わせたＲＮＡを９５℃で５分間加熱し、次にベンチトップで冷却した（すぐに使用されなかったアニーリング済みｃｒｉｓｐｒおよびｔｒａｃｅｒＲＮＡは−２０℃で保存された）。
【０２０４】
Ｃａｓ９タンパク質とアニーリング済みｃｒｉｓｐｒおよびｔｒａｃｒＲＮＡ混合物（アニーリング混合物１０μｌ）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で作製した。Ｃａｓ９タンパク質の最終濃度は１００μｇ／ｍＬであり、ＲＮＡの最終濃度は１０μＭであった。アニーリング済みｃｒＲＮＡ（複数可）とｔｒＲＮＡ、およびＣａｓ９タンパク質を室温で１５分間インキュベートし、ＲＮＰを形成した。
【０２０５】
金微粒子を調製するために、プロタミン（１ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液１００μｌ、５５℃〜６５℃に加熱し、使用前に室温まで冷却することによって作製）を５ｍｇの金粒子（０．６μｍ、ＢｉｏＲａｄ）に加えて、金粒子／プロタミン混合物をボルテックスし、次いで超音波処理した。ＤＮＡ断片（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３）には、テトラセルミスＲＢ４０プロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４）に作動可能に連結した選択マーカー遺伝子が含まれ、テトラセルミスＲＢ４０ターミネーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）をプロタミン／金懸濁液に添加し、混合物をボルテックスした。選択マーカーＤＮＡ断片は、ＲＢ４０プロモーターおよびターミネーターに作動可能に連結されたテトラセルミス（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）のために最適化されたヌーセオスリシン耐性遺伝子コドンを含むＰＣＲ産物であった。プラスミド鋳型を用いたＰＣＲによって選択マーカーカセットを作製するために使用された各プライマーの５つの５末端ヌクレオチド（プライマーＭＣＡ１８１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７およびプライマーＭＣＡ１８１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）は、ホスホロチオエート基を含み、これにより、形質転換に使用した最終選択マーカーカセット断片が、各末端でホスホロチオエート修飾されるようにした。
【０２０６】
選択マーカーＤＮＡ断片を金粒子に添加した直後に、Ｃａｓ９  ＲＮＰ調製物（アニーリング済みＲＮＡ／Ｃａｓ９タンパク質）を金粒子および選択マーカーＤＮＡ断片の入ったプロタミン溶液に添加し、混合物をボルテックスし、次いで氷上に２〜４時間置いた。氷上でのインキュベーション後、金微粒子調製物を微量遠心管中で短時間スピンダウンし、その上清を除去し、１．５ｍｇ／ｍｌのＰＶＰの入ったＰＢＳ４００μＬを各微粒子サンプルに添加した。サンプルをボルテックスし、５〜１０秒間超音波処理し、再びボルテックスした。その後、ＰＶＰ懸濁粒子をＴｅｆｚｅｌ（商標）チューブの予備乾燥セグメントに引き込んだ。シリンジは、Ｔｅｆｚｅｌ（商標）チューブに接続された可撓性チューブに取り付け、シリンジによる吸引を行うことにより、粒子混合物をＴｅｆｚｅｌ（商標）チューブの反対の端に引き込んだ。金粒子調製物の入ったＴｅｆｚｅｌ（商標）チューブは、金粒子が沈降するまで５分間下に置き、その後、シリンジを介して、穏やかにチューブからＰＶＰ溶液を押し出した。次にチューブを回転させてチューブの内周に金粒子を分散させ、約５分間風乾させた（その間にチューブをさらに１回以上回転させて粒子を分散させた）。その後、Ｔｅｆｚｅｌ（商標）チューブを窒素ガス源に取り付け、窒素ガスを０．１Ｌ／分で１分間、次に約０．３Ｌ／分〜約０．４Ｌ／分で５〜１０分間チューブの中に流して、乾燥を完了させた。次いで、内面を金粒子で被覆し、選択マーカーＤＮＡおよびＲＮＰを付着させたＴｅｆｚｅｌ（商標）チューブを０．５インチのセグメントに切断し、これをＢｉｏＲａｄ  Ｈｅｌｉｏｓ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎのカートリッジとして使用した。
【０２０７】
マイクロボンバードメント形質転換のために、テトラセルミス株ＷＴ−１０５は、ＯＤ７３０  ０．２で接種された体積１００ｍｌのＰＭ０７４培地で約３日間培養した。スターター培養物を使用して１リットルの培養物を３ｘ１０５細胞／ｍｌで接種し、１リットルの培養物をさらに３日間成長させた。各ボンバートメントについて、２％寒天ＰＭ０７４培地プレートの直径４ｃｍの円内に約１０７個の細胞（１００μｌ）をプレーティングして、細胞を１ｍｌ当たり１０８個の濃度に再懸濁した。プレーティングした細胞をフード内で乾燥させ、次いで調製したカートリッジを６００ｐｓｉに設定したヘリウムを用いて、約５ｃｍの距離から打ち込んだ。翌日、プレートをＰＭ１４７培地で浸し、２００μｇ／ｍｌのノルセオトリシンを含むＰＭ１４７プレートに再度プレーティングした。
【０２０８】
選択プレート上で１０〜１４日間成長させた後、数十個のコロニーを２００μｇ／ｍｌのノルセオトリシンを含む選択的ＰＭ１４７プレートに再パッチした。ＳＧＩ１遺伝子座の突然変異について、生存パッチのＰＣＲスクリーニングを行った。選択マーカー遺伝子カセット（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３）は、形質転換テトラセルミス細胞のＣａｓ９妨害遺伝子座に挿入されなかったこと、したがって、ＳＧＩ１標的指向性突然変異は、ＳＧＩ１標的部位において、ほとんどが小さい挿入または欠失（インデル）であることが見出された。これらの突然変異事象を検出するために、クローンから生成されたＰＣＲ断片に対して、Ｓａｎｇｅｒ配列決定を実施した。形質転換体の多くは、標的部位に突然変異を有することが判明した。これらのうちの１０個を、各対立遺伝子を配列決定するために、大腸菌におけるゲノムＤＮＡのクローニングのために選択した。表８中のクローンのすべては、突然変異対立遺伝子についてヘテロ接合性であったクローン８を除いて、配列決定によりトリプルノックアウト（すなわち、突然変異についてホモ接合性）であると決定した。
【０２０９】
（表９）ＳＧＩ標的指向性ガイドＲＮＡを用いたＲＮＰ形質転換後の単離テトラセルミスクローンにおける突然変異対立遺伝子
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【０２１０】
実施例１６  標的テトラセルミスＳＧＩ１突然変異体の光生理学
これらのクローンの特徴を明らかにするために、表８に列挙された１０個のクローンのうちの５個（クローン２、６、７、８、および１０）を、２４時間／日、弱光（光量子束密度１４０ｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１）下で、還元炭素源を含まず、窒素源として硝酸塩を含む豊富ＰＭ０７４培地において、光独立栄養により培養した。培養物は、毎日希釈して、固定細胞数を維持した。クロロフィルを抽出し、実施例７に記載したようにＦＩＲｅおよび１４Ｃ  Ｐｍａｘ測定を行った。この結果を図１６Ａ、Ｂ、およびＣ；図１７Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ、ならびに図１８Ａ、Ｂ、およびＣに示す。これらの弱光条件下では、変異体のすべてについて、野生型株と比較してクロロフィルａ：ｂ比が増加し（図１６Ｃ）、クローン２、７および１０は、総クロロフィル、特に、ＴＯＣ（図１６Ａ）およびセル（図１６Ｂ）を基準にした両方においてクロロフィルｂが減少したことを示した。クローンはすべて、４５０ｎｍおよび５２０ｎｍの両方の励起で測定されたＰＳＩＩ断面サイズの減少を示し、クローン２、７、および１０は、野生型と比較してＰＳＩＩ断面サイズの最大の減少を示す（図１７Ａおよび１７Ｂ）。クローン２、７および１０もまたＦｖ／Ｆｍの最大の上昇を示し（図１７Ｃ）、すべてのクローンが、光合成代謝回転時間ＰＳＩＩの短縮を示した（図１７Ｄ）。１４Ｃ  Ｐｍａｘは、細胞およびＴＯＣの両方を基準として、すべてのクローンにおいて上昇し（図１８Ａおよび図１８Ｂ）、すべてのクローンは、野生型よりも高い成長速度を有した（図１８Ｃ）。
【０２１１】
それぞれ株名ＳＴＲ２４０９４およびＳＴＲ２４０９６を付与されたクローン２および７は、南カリフォルニアの春の日光照度をシミュレートし、太陽正午に光量子束密度約２，０００ｍｏｌ  ｍ−２ｓ−１の照度をピークとした１４時間の明期間を有する日周の光プログラムを用いて、半連続的アッセイにおいて試験が行われた。各株の３つの生物学的複製物を同時に培養し、その３つの培養物の結果を平均した。最初に吸収されなかった光を培養物に反射して戻すために、培養瓶を部分的に箔で包んだ。培地は、窒素源として尿素を含み、還元炭素源を含まない（すなわち、株を光独立栄養により培養した）ＰＭ１５３であり、培養物を毎日６０％まで希釈し直した。表１０に要約されるように、これらの条件下で、ＳＧＩ１突然変異株ＳＴＲ２４０９４およびＳＴＲ２４０９６は、上昇したＦｖ／Ｆｍ、減少したＰＳＩＩアンテナサイズ（５２０ｎｍ励起で測定）、およびＴＯＣを基準として増加したＰＳＩＩを有する。テトラセルミスＳＧＩ１突然変異体において、ＴＯＣ率としてクロロフィルが減少し、クロロフィルｂに対するクロロフィルａの比は上昇する。１４Ｃの取り込みを測定した光合成速度は、これらの突然変異体において約１５〜２０％上昇する。１日当たり１メートル当たりに生産されるＴＯＣのグラム数として報告される生産性は、ＳＴＲ２４０９４では約６．５％、ＳＴＲ２４０９６では約１０％増加する。
【０２１２】
（表１０）毎日の半連続培養におけるテトラセルミスＳＧＩ１突然変異体の光生理学
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【０２１３】
実施例１７  一定の光の半連続培養系におけるテトラセルミスＳＧＩ１突然変異体の生産性
ＣＬ−ＳＣＵＢＡ（一定の光の半連続尿素系アッセイ）において、テトラセルミスＳＧＩ１突然変異体の光独立栄養培養物を、一定の光半連続モードで数日間にわたって成長させた。培養サンプルは、バイオマスを決定するために、各日、同じ時に取り出した。光は、光量子束密度２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓｅｃ−１にプログラムされた。このアッセイでは、５００ｍｌの四角フラスコ中の４２０ｍｌのＰＭ１５３培地（窒素源として尿素を含む）に所定の株のシード培養物を接種した。１株につき３つの培養を開始した。フラスコは、培養物からバブリングされたＣＯ２富化空気（１％ＣＯ２）を送達するためのシリンジフィルターに接続された管を有する栓を有していた。０．０８７５ｍ２の開口部を有するフラスコを光に向けて整列させ、光源から背部にわたるフラスコの「深さ」寸法は８ｃｍであった。培養物は、培養体積の４０％を取り出し、その分を新鮮なＰＭ１５３培地と交換して、培養物に生じる蒸発による塩分の増加を調整することにより、毎日希釈した。ＴＯＣ分析用のサンプルは、培養物が定常状態に達した後に、希釈のために取り出した培養物から採取した。
【０２１４】
図１９は、これらの一定の光の半連続培養条件下で、テトラセルミスＳＧＩ１突然変異体ＳＴＲ２４０９６およびＳＴＲ２４０９６が、野生型細胞（株ＳＴＲ０００１３）と比べて、それぞれ１３％および１８％のバイオマスの増加を示すことを示したものである。
【０２１５】
実施例１８  日周の半連続培養系におけるテトラセルミスおよびパラクロレラＳＧＩ１突然変異体の生産性
日周のＳＣＵＢＡ（半連続尿素系アッセイ）では、突然変異体の光独立栄養培養物を数日にわたって毎日、光半連続モードで成長させた。光は、暗所から正午の光量子束密度２０００μｍｏｌ  ｍ−２ｓｅｃ−１まで及ぶように、カリフォルニアのインペリアルバレーの平均的な春の日を模倣するようにプログラムされた。サンプルは毎日「夕暮れ」に採取した。このアッセイでは、５００ｍｌの四角フラスコに入った尿素ベースのＰＭ１５３培地４２０ｍｌに、所定の突然変異株のシード培養物を接種した。１株につき３つの培養を開始した。フラスコは、培養物からバブリングされたＣＯ２富化空気（１％ＣＯ２）を送達するためのシリンジフィルターに接続された管を有する栓を有していた。フラスコを光に向かって０．０８７５ｍ２の開口部と整列させ、光源から背部にわたるフラスコの「深さ」寸法は８ｃｍであった。培養物は、培養体積の４０％を除去し、その分を新鮮なＰＭ１５３培地と交換して、培養物中で生じる蒸発による塩分の増加を調整することによって、毎日希釈した。培養物が定常状態に達した後に、培養サンプルをバイオマス測定のために毎日取り出した。ＴＯＣ分析用のサンプルは、希釈のために取り出した培養物から採取した。
【０２１６】
図２０Ａは、これらの条件下において、野生型細胞と比べてテトラセルミスＳＧＩ１突然変異体ではバイオマスが１２％〜１６％の間で増大していることを示す。
【０２１７】
同じプロトコールに従って行われた日周の並行ＳＣＵＢＡアッセイにおいて、古典的に誘導されたパラクロレラＳＧＩ変異体ＮＥ−７８４３を、パラクロレラ野生型株ＷＴ−１１８５の三連培養物と共に、三連培養物で試験した。図２０Ｂは、この培養レジメンにおいて、パラクロレラＳＧＩ１突然変異体ＮＥ−７８４３が、野生型株と比べて１８％の生産性の増大を示していることを示す。
【０２１８】
実施例１９  アラビドプシスＳＧＩ１突然変異株の解析
高等植物におけるＳＧＩ１突然変異の影響を決定するために、最初にシロイヌナズナ内のパラクロレラＳＧＩ１遺伝子の最も近い関連種を同定した。実施例６に開示されたバイオインフォマティック解析を用いて、パラクロレラＳＧＩ１に最も近いシロイヌナズナ相同体はＡＲＲ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）であると決定された。
【０２１９】
ＡＲＲ１およびＡＲＲ２における突然変異を有するシロイヌナズナ植物からの種子ならびに野生型対照をアラビドプシスリソースセンター（ＡＢＲＣ）から得た。種子を土壌（５０％  ＭｉｒａｃｌｅＧｒｏ播種育苗ポットミックス、２５％パーライト、２５％バーミキュライト）に植えた。植えられた種子は、成長のためにｃｏｎｖｉｒｏｎに移す前に、５日間４℃で春化された。植物を２５℃に設定したｃｏｎｖｉｒｏｎ内で、４つの異なる状況で、並べて成長させた。植物は、１２時間にわたる暗期に約７０μＥの光を受けた。ＡＲＲ１突然変異体の成長は、野生型植物およびＡＲＲ２植物の両方よりも実質的に遅く、このため、野生型とＡＲＲ２／ＳＧＩ１突然変異植物（以後ＳＧＩ１植物と呼ぶ）との比較に焦点を合わせた。最初の２つの成長実験の間に、ＳＧＩ１突然変異植物の成長における視覚的改善を観察した（図２１Ａ）。パラクロレラＳＧＩ１突然変異体は、クロロフィルの減少を有し、このため、アラビドプシスの野生型とＳＧＩ１の葉のクロロフィル含有量を決定した。クロロフィルは、３つの野生型および３つのＡＲＲ２突然変異植物（各植物から２枚の葉）からのアセトンおよびメタノールの両方を用いて抽出した。ＳＧＩ１突然変異植物におけるクロロフィル量の有意な減少を観察した（図２１Ｂ）。最後の２つの成長実験では、２３日目および１８日目に植物を収穫して、植物苗条の湿潤重量および乾燥重量を求めた。個々の植物の高い変動、および野生型とＳＧＩ１植物との高い重なりが観察されたが、ＳＧＩ１植物では、一貫して、２３日目に約１０％（図２２ＡおよびＢ）および１８日目に約４０％（図２２ＣおよびＤ）高い平均苗条重量を有していた。ＳＧＩ１突然変異を有する緑藻（パラクロレラおよびテトラセルミス）に見られるように、シロイヌナズナＳＧＩ１突然変異体における植物性の成長中のクロロフィルの減少および平均バイオマスの増加を観察し、ＳＧＩ突然変異が他の高等植物における生産性の増加とも関連し得ることを示している。
【０２２０】
本発明を上記の実施例を参照して記載したが、修正および変更が本発明の主旨および範囲に含まれることは理解されよう。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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