(57)【要約】ゲルマクレンＡシンテターゼ又はその融合タンパク質を発現する組換え酵母を提供し、該融合タンパク質は、ゲルマクレンＡシンテターゼとファルネシルピロ燐酸シンターゼの融合タンパク質である。該組換え酵母は、ゲルマクレンＡの収量を改善し、またβ−エレメン及び／又はゲルマクレンＡの工業生産に好適である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ ｖｉｖｏでゲルマクレンＡシンテターゼ又はゲルマクレンＡシンテターゼの融合タンパク質を含む又は発現する酵母であり、
前記ゲルマクレンＡシンテターゼの融合タンパク質が、ゲルマクレンＡシンテターゼ及びファルネシルピロ燐酸シンターゼを含む、
組換え株。
【請求項２】
前記融合タンパク質をコードする核酸が前記ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸及び前記ファルネシルピロ燐酸シンターゼをコードする核酸を含み、
前記融合タンパク質が１つ又は複数のコードする核酸を有し、
前記融合タンパク質をコードする複数の核酸のうち、前記ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする少なくとも２つの核酸が異なる宿主に由来し、前記ファルネシルピロ燐酸シンターゼをコードする少なくとも２つの核酸が異なる宿主に由来する、
請求項１に記載の組換え株。
【請求項３】
前記ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸が、配列番号３に示す核酸又は配列番号１２の１３位から１６８６位に示す核酸を含み、
前記ファルネシルピロ燐酸シンターゼをコードする核酸が、配列番号２に示す核酸又は配列番号１１の１位から１０５６位に示す核酸を含む、
請求項２に記載の組換え株。
【請求項４】
前記融合タンパク質が、前記ゲルマクレンＡシンテターゼと前記ファルネシルピロ燐酸シンターゼとを連結するためのリンカーペプチドをさらに含み、
前記リンカーペプチドが、ＧＧＧＳ、ＹＧＱ、ＰＧＧＨ、ＹＲＳＱＩ、ＶＩＰＦＩＳ、ＦＬＹＬＫＦ、ＷＲＦＳＰＫＬＱ又はＨＨＶＱＥＳＱＣＩＳＴＶから選択される、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え株。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え株であって、
ｉｎ ｖｉｖｏで前記ゲルマクレンＡシンテターゼ又は前記ゲルマクレンＡシンテターゼの融合タンパク質を含む又は発現することが、前記ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸又は前記融合タンパク質をコードする核酸を前記酵母に導入することであり、
及び／又は、
前記ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸を前記酵母に導入することが、前記ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸を含む発現カセットを前記酵母に導入することであり、
前記融合タンパク質をコードする核酸を前記酵母に導入することが、前記融合タンパク質をコードする核酸を含む発現カセットを前記酵母に導入することであり、
及び／又は
前記ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸を含む前記発現カセットが、プロモーター、前記ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸、及びターミネーターを含み、
及び／又は、
前記融合タンパク質をコードする核酸を含む前記発現カセットが、プロモーター、前記融合タンパク質をコードする核酸、及びターミネーターを含み、
又は、前記プロモーターは、ＴＥＦ１もしくはＭＦ１もしくはＰＧＫ１から選択され、前記ターミネーターがＣＹＣ１もしくはＡＤＨ１であり、
又は、前記プロモーターがＴＥＦ１であり、また前記ターミネーターがＣＹＣ１であり、
又は、前記プロモーターがＭＦ１であり、また前記ターミネーターがＣＹＣ１であり、
又は、前記プロモーターがＰＧＫ１であり、また前記ターミネーターがＡＤＨ１である、
組換え株。
【請求項６】
前記組換え株が１つ又は複数のマーカー遺伝子をさらに発現する、
及び／又は
前記マーカー遺伝子がｈｉｓ３もしくはｔｒｐ１から選択される、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え株。
【請求項７】
前記ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸を含む前記発現カセットが、前記ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸を含む前記発現カセットを発現するベクターによって、前記酵母に導入され、
前記融合タンパク質をコードする核酸を含む前記発現カセットが、前記融合タンパク質をコードする核酸を含む前記発現カセットを発現するベクターによって、前記酵母に導入される、
請求項５又は６に記載の組換え株。
【請求項８】
前記ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸の前記発現カセットが、プラスミドの形で前記酵母に導入される、
又は
前記融合タンパク質をコードする核酸の前記発現カセットが、プラスミドの形及び／又は染色体に組み込まれた形で前記酵母に導入される、
請求項５〜７のいずれか一項に記載の組換え株。
【請求項９】
前記酵母が、元の酵母におけるアルコールデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアセチル−ＣｏＡシンテターゼの含量及び／又は活性を増加させることによって得られる株である、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換え株。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換え株であって、
前記元の酵母におけるアルコールデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアセチル−ＣｏＡシンテターゼの含量及び／又は活性を増加させることによって得られる前記株が、前記元の酵母におけるアルコールデヒドロゲナーゼをコードする核酸、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸及びアセチル−ＣｏＡシンテターゼをコードする核酸のコピー数を増加させることに関する、
及び／又は、前記元の酵母における前記アルコールデヒドロゲナーゼをコードする核酸、前記アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸、及び前記アセチル−ＣｏＡシンテターゼをコードする核酸のコピー数を増加させることが、前記アルコールデヒドロゲナーゼをコードする核酸の発現カセット、前記アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸の発現カセット、前記アセチル−ＣｏＡシンテターゼをコードする核酸の発現カセット、及び核酸をコードする別の前記マーカーを、相同組換えを用いて前記元の酵母に導入することである、
組換え株。
【請求項１１】
前記元の酵母がサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、及び／又は前記サッカロマイセス・セレビシエがＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＮＫ２−ＳＱである、請求項９又は１０に記載の組換え株。
【請求項１２】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１４８２９で
ある、請求項１１に記載の組換え株。
【請求項１３】
β−エレメン及び／又はゲルマクレンＡを生産するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組換え株の使用。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組換え株を発酵してゲルマクレンＡを得る工程を含む、ゲルマクレンＡの生産方法。
【請求項１５】
１）請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組換え株を発酵して発酵産物を取得する工程、
２）発酵産物を有機溶液で抽出し、有機相を回収する工程、及び
３）工程２）の有機相を加熱してβ−エレメンを取得する工程、
を含む、
β−エレメンの生産方法。
【請求項１６】
前記発酵方法が、まず前記組換え株を種培地で培養して種液を得て、次いで種液を発酵培地に接種して発酵培養を行い、発酵培養の産物を発酵系として記録する、
請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記発酵培養の間、流加培地を前記発酵系に加え、好ましくは、前記発酵系内溶存酸素値が６０％を超える場合に、前記発酵系内グルコース濃度が５ｇ/Ｌに達するまで、流加培地を前記発酵系に添加する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって、
前記種培地と前記発酵培地の調合物が、容量１Ｌにつき、２５ｇのグルコース、１５ｇの硫酸アンモニウム、６．１５ｇの硫酸マグネシウム七水和物、０．７２ｇの硫酸亜鉛七水塩、８ｇのリン酸二水素カリウム、２ｍＬの塩化カルシウム母液、１０ｍＬの微量金属塩母液、１２ｍＬのビタミン母液、１ｇのトリプトファンを含み、
前記塩化カルシウム母液が、塩化カルシウム二水和物の１９．２ｇ/Ｌ水溶液であり、
前記微量金属塩母液の調合物が、容量１Ｌにつき、１９．１ｇのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、１０．２ｇの硫酸亜鉛七水塩、０．５ｇの塩化マンガン四水和物、０．８６ｇの塩化コバルト六水和物、０．７８ｇの硫酸銅五水和物、０．５６ｇのモリブデン酸ナトリウム二水和物、５．１２ｇの亜硫酸鉄７水和物を含み、
前記ビタミン母液の調合物が、容量１Ｌにつき、０．０５ｇのビオチン、０．２ｇのｐ−アミノ安息香酸ナトリウム、１ｇのナイアシン、１ｇのパントテン酸カルシウム、１ｇの塩酸ピリドキシン、１ｇのチアミン塩酸塩、２５ｇのイノシトールを含む、
方法。
【請求項１９】
前記流加培地の調合物が、容量１Ｌにつき、８００ｇのグルコース、５．１２５ｇの硫酸マグネシウム七水和物、３．５ｇの硫酸カリウム、０．２８ｇの硫酸ナトリウム、９ｇのリン酸二水素カリウム及び１ｇのトリプトファンを含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記有機溶媒がｎ−ドデカンであり、
前記加熱条件が１００〜３８０℃で１時間の加熱である、
請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物化学産業分野、特に、組換え株及び組換え微生物法に従ったβ−エレメンの合成に関する。
【背景技術】
【０００２】
β−エレメン（ｂｅｔａ−ｅｌｅｍｅｎｅ）は、チューリップの香りを有する揮発性セスキテルペン化合物であり、中国の第一種抗癌薬のための有効医薬成分（ＡＰＩ）である。現在、主にハルウコン（Ｃｕｒｃｕｍａ ａｒｏｍａｔｉｃａ）やガジュツ（Ｃｕｒｃｕｍａ ｚｅｄｏａｒｙ）等の植物から分離抽出されるが、この方法には、低含量のβ−エレメンや植物間の大きな違い、難しい産物精製、植物の長い成長サイクル、及び生物学関連資源、特に野生資源への深刻なダメージ、といった多くの不利益がある。
【０００３】
合成生物学の原理を利用して、天然物を生産するための微生物株の設計、修飾は、最も有望な方法の一つとして国際的に認識されてきており、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける、パクリタキセルの前駆体であるタキサジエンの収量は１０００ｍｇ／Ｌに達し（Ｐａｒａｙｉｌ ＫｕＭａｒａｎ ＡｊｉｋｕＭａｒら、２０１０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３０：７０-７４）、ギンゴライドの前駆体であるレボピマラジエンは、操作したＥ．ｃｏｌｉにおいて収量７００ｍｇ／Ｌに達し（Ｅｆｆｅｎｄｉ Ｌｅｏｎａｒｄら、２０１０、ＰＮＡＳ、１０７（３１）：１３６５４-１３６５９）、アルテミシニンの前駆体であるアルテミシン酸の収量は操作した酵母において２５ｇ／Ｌに達し（Ｐａｄｄｏｎ ＣＪら、２０１３、Ｎａｔｕｒｅ、４９６（７４４６）：５２８-５３１）、また、現在、中国において、アルテミシニン、パクリタキセル及びタンシノン等の薬物分子の生合成に関する関連研究がある。
【０００４】
自然界では、ファルネシルピロ燐酸（ＦＰＰ）はゲルマクレンＡシンテターゼ（ＧＭＡＳ）により触媒され、ゲルマクレンＡを合成できる。ゲルマクレンＡは熱的に不安定であり、分子内で熱的再構成を起こしやすくβ−エレメンを生ずる。現在、β−エレメンの前駆体であるゲルマクレンＡの組換え株を用いた生産についていくつか研究が行われてきたが、その収量は低く、また産業利用の要請に応えることはできていない。例えば、Ｇａｏ
Ｙｕｎｙｕｎらは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてゲルマクレンＡの生合成経路を構築したが、得られた組換え株により合成されたゲルマクレンＡの収量は最高でもわずか６.３２ｍｇ／Ｌであり、工業化からは程遠い（β−エレメンの前駆体-ゲルマクレンＡ−の微生物生合成の研究、Ｇａｏ Ｙｕｎｙｕｎ、２０１２、杭州師範大学）。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、組換え株を提供することである。
【０００６】
本発明において提供する組換え株は、ｉｎ ｖｉｖｏでゲルマクレンＡシンテターゼ又はゲルマクレンＡシンテターゼの融合タンパク質を含む又は発現する酵母である。
【０００７】
ゲルマクレンＡシンテターゼの融合タンパク質は、ゲルマクレンＡシンテターゼ及びファルネシルピロ燐酸シンターゼを含む。
【０００８】
上記組換え株は、融合タンパク質の遺伝子の宿主源によって１つ又は複数種に分類され、また、融合タンパク質をコードする核酸は、ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸及びファルネシルピロ燐酸シンターゼをコードする核酸を含む。
【０００９】
融合タンパク質は、１つ又は複数のコードする核酸を有する。
【００１０】
融合タンパク質をコードする複数の核酸のうち、ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする少なくとも２つの核酸は異なる宿主に由来し、また、ファルネシルピロ燐酸シンターゼをコードする少なくとも２つの核酸も異なる宿主に由来する。
【００１１】
本発明において、遺伝子が由来する異なる宿主とは、遺伝子が元来由来する宿主が異なることを意味する。本発明のゲルマクレンＡシンテターゼの遺伝子は、ゲルマクレンＡシンテターゼを含むことが知られる植物又は微生物からクローニングして取得可能であり、例えば、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ Ｌ．）、ナツシロギク（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ Ｌｉｎｎ．）、カワラニンジン（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ｃａｒｖｉｆｏｌｉａ）、シアノバクテリア等から選択できる。ファルネシルピロ燐酸シンターゼ（ｆａｒｎｅｓｙｌ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）の遺伝子は、ファルネシルピロ燐酸シンターゼを含むことが知られる植物又は微生物からクローニングして取得可能であり、例えば、タンジン（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ）、酵母、エゾウコギ（Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｘ ｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ（Ｒｕｐｒ．Ｍａｘｉｍ．）Ｈａｒｍｓ）、トチュウ（Ｅｕｃｏｍｍｉａｕｌｍｏｉｄｅｓ Ｏｌｉｖ．）等から選択できる。
【００１２】
ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸は、配列番号３に示す核酸又は配列番号１２の１３位から１６８６位に示す核酸を含む。
【００１３】
ファルネシルピロ燐酸シンターゼをコードする核酸は、配列番号２に示す核酸又は配列番号１１の１位から１０５６位に示す核酸を含む。
【００１４】
組換え株において、融合タンパク質は、ゲルマクレンＡシンテターゼとファルネシルピロ燐酸シンターゼとを連結するためのリンカーペプチドをさらに含む。
【００１５】
リンカーペプチドは、ＧＧＧＳ、ＹＧＱ（３Ａ００１）、ＰＧＧＨ（４Ａ００１）、ＹＲＳＱＩ（５Ａ００２）、ＶＩＰＦＩＳ（６Ａ００５）、ＦＬＹＬＫＦ（６Ｂ００４）、ＷＲＦＳＰＫＬＱ（８Ａ００５）又はＨＨＶＱＥＳＱＣＩＳＴＶ（１２Ａ００３）から選択される。
【００１６】
上記組換え株において、ｉｎ ｖｉｖｏでゲルマクレンＡシンテターゼ又はゲルマクレンＡシンテターゼの融合タンパク質を含む又は発現することが、
ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸又は融合タンパク質をコードする核酸を酵母に導入することであり、
及び／又は、
ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸を酵母に導入することが、ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸を含む発現カセットを酵母に導入することであり、
融合タンパク質をコードする核酸を酵母に導入することが、融合タンパク質をコードする核酸を含む発現カセットを酵母に導入することであり、
及び／又は、
ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸を含む発現カセットは、プロモーター、ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸、及びターミネーターを含み、
及び／又は、
融合タンパク質をコードする核酸を含む発現カセットは、プロモーター、融合タンパク質をコードする核酸、及びターミネーターを含み、
又は
プロモーターは、ＴＥＦ１もしくはＭＦ１もしくはＰＧＫ１から選択され、ターミネー
ターがＣＹＣ１もしくはＡＤＨ１であり、
又は
プロモーターがＴＥＦ１であり、またターミネーターがＣＹＣ１であり、
又は
プロモーターがＭＦ１であり、またターミネーターがＣＹＣ１であり、
又は
プロモーターがＰＧＫ１であり、またターミネーターがＡＤＨ１である。
【００１７】
以上、プロモーターＴＥＦ１は配列番号４に示す配列を含み、プロモーターＭＦ１は配列番号１に示す配列を含み、またターミネーターＣＹＣ１は配列番号５に示す配列を含む。
【００１８】
上記組換え株において、組換え株は１つ又は複数のマーカー遺伝子をさらに発現、及び／又は該マーカー遺伝子がｈｉｓ３もしくはｔｒｐ１から選択される。
【００１９】
上記組換え株において、ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸を含む発現カセットは、ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸の発現カセットを発現するベクターによって酵母に導入される。
【００２０】
融合タンパク質をコードする核酸を含む発現カセットは、融合タンパク質をコードする核酸を含む発現カセットを発現するベクターによって酵母に導入される。
上記組換え株において、ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸の発現カセットは、プラスミドの形で酵母に導入、
又は、融合タンパク質をコードする核酸の発現カセットは、プラスミドの形及び／又は染色体内に組み込まれた形で酵母内へ導入される。
【００２１】
本発明の実施例において、
融合タンパク質は以下のＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ、ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＹＧＱ−ＳＴｐＧＭＡＳ、ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＰＧＧＨ−ＳＴｐＧＭＡＳ、ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＹＲＳＱＩ−ＳＴｐＧＭＡＳ、ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＶＩＰＦＩＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ、ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＦＬＹＬＫＦ−ＳＴｐＧＭＡＳ、ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＷＲＦＳＰＫＬＱ−ＳＴｐＧＭＡＳ、ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＨＨＶＱＥＳＱＣＩＳＴＶ−ＳＴｐＧＭＡＳ、ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＷＲＦＳＰＫＬＱ−ＳＴｐＧＭＡＳ、ＥＲＧ２０−ＧＧＧＳ−ＬｓＬＴＣ２の少なくとも一つから選択され；
融合タンパク質は好ましくはＳｙｎＳｍＦＰＳ−８Ａ００５−ＳＴｐＧＭＡＳであり、
特に好ましい融合タンパク質は、３種の融合タンパク質：ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＷＲＦＳＰＫＬＱ（８Ａ００５）−ＳＴｐＧＭＡＳ、ＥＲＧ２０−ＧＧＧＳ−ＬｓＬＴＣ２、ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳである。
融合タンパク質をコードする核酸を発現する発現カセットは以下の
ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１、
ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＹＧＱ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１、
ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＰＧＧＨ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１、
ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＹＲＳＱＩ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１、
ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＶＩＰＦＩＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１、
ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＦＬＹＬＫＦ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１、
ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＷＲＦＳＰＫＬＱ（８Ａ００５）−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１、
ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＨＨＶＱＥＳＱＣＩＳＴＶ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１又は
ＰＭＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＷＲＦＳＰＫＬＱ（８Ａ００５）−ＳＴｐＧＭＡＳ−Ｔ
ＣＹＣ１の少なくとも１つから選択される。
融合タンパク質をコードする核酸を発現する発現カセットは好ましくはＰＭＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−８Ａ００５−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１である。
融合タンパク質をコードする核酸を発現する特に好ましい発現カセットは以下の３種：ＰＭＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−８Ａ００５−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１、ＰPGK１−ＥＲＧ２０−ＧＧＧＳ−ＬｓＬＴＣ２−ＴＡＤＨ１及びＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１である。
【００２２】
ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸の発現カセットを発現するベクターは以下の
ｐＲＳ３１３−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１、
ｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１から選択する。
ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸の発現カセットを発現するベクターは以下の
ｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１、
ｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＹＧＱ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１、
ｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＰＧＧＨ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１、
ｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＹＲＳＱＩ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１、
ｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＶＩＰＦＩＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１、
ｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＦＬＹＬＫＦ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１、
ｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＷＲＦＳＰＫＬＱ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１、もしくは
ｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＨＨＶＱＥＳＱＣＩＳＴＶ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１、又は
ｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＭＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＷＲＦＳＰＫＬＱ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１から選択する。
【００２３】
染色体に組み込まれた融合タンパク質の上記遺伝子発現カセットはＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１およびＰＰＧＫ１−ＥＲＧ２０−ＧＧＧＳ−ＬｓＬＴＣ２−ＴＡＤＨ１から選択する。
【００２４】
上記組換え株において、酵母は、元の酵母におけるアルコールデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアセチル−ＣｏＡシンテターゼの含量及び／又は活性を増加させることにより得られる株である。
【００２５】
元の酵母におけるアルコールデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアセチル−ＣｏＡシンテターゼの含量及び／又は活性を増加させることにより得られる株は、元の酵母におけるアルコールデヒドロゲナーゼをコードする核酸、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸及びアセチル−ＣｏＡシンテターゼをコードする核酸のコピー数の増加に関する。
【００２６】
前記組換え株において、元の酵母におけるアルコールデヒドロゲナーゼをコードする核酸、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸、及びアセチル−ＣｏＡシンテターゼをコードする核酸のコピー数の増加ことが、アルコールデヒドロゲナーゼをコード
する核酸の発現カセット、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸の発現カセット、アセチル−ＣｏＡシンテターゼをコードする核酸の発現カセット、及び別の前記マーカー遺伝子（ｈｉｓ３）を、相同組換えにより元の酵母に導入することである。
【００２７】
前記組換え株において、元の酵母はサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）及び／又は前記サッカロマイセス・セレビシエはSaccharomyces cerevisiae ＮＫ２−ＳＱである。
【００２８】
マーカー遺伝子の一つはＴＲＰ１であり、もう一つのマーカー遺伝子ＨＩＳ３である。
【００２９】
上記アルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子ＡＤＨ２は、配列番号６に示す配列を含み、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの遺伝子ＡＬＤ６は、配列番号７に示す配列を含み、またアセチル−ＣｏＡシンテターゼの遺伝子ＡＣＳ１は、配列番号８に示す配列を含む。
【００３０】
本発明の組換え株並びにそれぞれ必要なベクター及び断片の構築を以下実施例に示す。
【００３１】
本発明の実施例において、組換え株は詳細には以下の通りである。
組換え株ＥＬＥ−００１は、ｐＲＳ３１３−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１を酵母ＦＰＰ−００１に導入して得られる株である。
組換え株ＥＬＥ−００２は、ｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１を酵母ＦＰＰ−００１に導入して得られる株である。
組換え株ＥＬＥ−０１１は、ｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１を酵母ＦＰＰ−００１に導入して得られる株である。
組換え株ＥＬＥ−０１２は、ｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−３Ａ００１−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１を酵母ＦＰＰ−００１に導入して得られる株である。
組換え株ＥＬＥ−０１３は、ｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−４Ａ００１−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１を酵母ＦＰＰ−００１に導入して得られる株である。
組換え株ＥＬＥ−０１４は、ｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−５Ａ００２−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１を酵母ＦＰＰ−００１に導入して得られる株である。
組換え株ＥＬＥ−０１５は、ｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−６Ａ００５−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１を酵母ＦＰＰ−００１に導入して得られる株である。
組換え株ＥＬＥ−０１６は、ｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−６Ｂ００４−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１を酵母ＦＰＰ−００１に導入して得られる株である。
組換え株ＥＬＥ−０１７はｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−８Ａ００５−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１を酵母ＦＰＰ−００１に導入して得られる株である。
組換え株ＥＬＥ−０１８は、ｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−１２Ａ００３−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１を酵母ＦＰＰ−００１に導入して得られる株である。
組換え株ＥＬＥ−０１９は、ｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＭＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−８Ａ００５−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１を酵母ＦＰＰ−００１に導入して得られる株である。
組換え株ＥＬＥ−０２０は、ｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＭＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−８Ａ００５−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１、次いでＰＰＧＫ１−ＥＲＧ２０−ＧＧＧＳ−
ＬｓＬＴＣ２−ＴＡＤＨ１、ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１、ｒＤＮＡ−ＴＲＰ１−ｕｐ及びｒＤＮＡ−ＴＲＰ１−ｄｏｗｎを相同組換えにより、酵母ＦＰＰ−００１に導入して得られる株である。
【００３２】
上記酵母ＦＰＰ−００１は、ＮＤＴ８０−ＨＩＳ３−ｕｐ、ＰＰＧＫ１−ＡＤＨ２−ＴＡＤＨ１、ＰＴＤＨ３−ＡＣＳ１−ＴＴＰＩ１、ＰＴＥＦ１−ＡＬＤ６−ＴＣＹＣ１及びＮＤＴ８０−ＨＩＳ３−ｄｏｗｎをサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に導入して得られる株である。
ここで、組換え株ＥＬＥ−０２０は、本発明の保護範囲内でもある、サッカロマイセス・セレビシエＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１４８２９である。
【００３３】
この組換え株ＥＬＥ−０２０は、２０１７年１０月２０日付で中国科学院微生物研究所（ｔｈｅ Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、ＣＧＭＣＣ）に寄託してある。本寄託先の住所は中国北京市朝陽区北辰西路１号院３号楼である。本株名は、サッカロマイセス・セレビシエ、ラテン名がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであり、またその寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１４８２９である。
【００３４】
β−エレメン及び／又はゲルマクレンＡ生産のための上記組換え株の使用もまた本発明の保護範囲内である。
【００３５】
本発明の第３の目的は、ゲルマクレンＡの生産方法を提供することである。
【００３６】
本発明により提供される方法は、以下の工程を含む：上記組換え株を発酵してゲルマクレンＡを得る。
【００３７】
本発明の第４の目的は、β−エレメンの生産方法を提供することである。
【００３８】
本発明により提供される方法は以下の
１）組換え株を発酵して発酵産物を取得する工程、
２）発酵産物を有機溶液で抽出し、有機相を回収する工程、及び
３）有機相を加熱してβ−エレメンを取得する工程、
を含む。
【００３９】
上記方法において、発酵は、まず組換え株を種培地にて培養して種液を得て、次いで、種液を発酵培地に接種して発酵培養を行い、さらに発酵培養の産物を発酵系として記録する、ことに関する。
【００４０】
上記方法において、発酵培養の間、流加培地を発酵系に加え、好ましくは、発酵系内溶存酸素値が６０％を超える場合に、発酵系内グルコース濃度が５ｇ/Ｌに達するまで、流加培地を発酵系に添加する。
【００４１】
上記方法において、種培地と発酵培地の調合物が、容量１Ｌにつき、２５ｇのグルコース、１５ｇの硫酸アンモニウム、６．１５ｇの硫酸マグネシウム七水和物、０．７２ｇの硫酸亜鉛七水塩、８ｇのリン酸二水素カリウム、２ｍＬの塩化カルシウム母液、１０ｍＬの微量金属塩母液、１２ｍＬのビタミン母液、１ｇのトリプトファン、および残部の水を含む。
【００４２】
塩化カルシウム母液が、塩化カルシウム二水和物の１９．２ｇ/Ｌ水溶液である。
【００４３】
微量金属塩母液の調合物が、容量１Ｌにつき、１９．１ｇのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、１０．２ｇの硫酸亜鉛七水塩、０．５ｇの塩化マンガン四水和物、０．８６ｇの塩化コバルト六水和物、０．７８ｇの硫酸銅五水和物、０．５６ｇのモリブデン酸ナトリウム二水和物、５．１２ｇの硫酸鉄七水和物（亜硫酸鉄７水和物）および残部の水を含む。
【００４４】
ビタミン母液の調合物が、容量１Ｌにつき、０．０５ｇのビオチン、０．２ｇのｐ−アミノ安息香酸ナトリウム、１ｇのナイアシン、１ｇのパントテン酸カルシウム、１ｇの塩酸ピリドキシン、１ｇのチアミン塩酸塩、２５ｇのイノシトールおよび残部の水を含む。
【００４５】
流加培地の調合物が、容量１Ｌにつき、８００ｇのグルコース、５．１２５ｇの硫酸マグネシウム七水和物、３．５ｇの硫酸カリウム、０．２８ｇの硫酸ナトリウム、９ｇのリン酸二水素カリウムと１ｇのトリプトファン、および残部の水を含む。
調合前に、以下の工程をさらに含む：
a）固体選択培地中の組換え株を活性化する工程、
b）液体選択培地中での振盪培養後、組換え株を種培地に移して培養し、種液を得る工程。
ここで固体又は液体選択培地は、ＳＤ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ培地である。
【００４６】
前記工程ｂ）における培養条件は、３０℃、２５０ｒｐｍであり、接種工程ではフレームループ接種を行う。
【００４７】
特に、上記調合法において、種液の培養方法では、組換え株を活性化した後、プレート上のモノクローナルコロニーを採取し、ＳＤ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ培地を含む試験管内に接種し、２５０ｒｐｍで振盪し、３０℃で一晩培養、５００μＬの株培養物を５０ｍＬのＳＤ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ培地を含む２５０ｍＬ容三角フラスコにピペッティングし、２５０ｒｐｍで振盪し３０℃で２４時間培養し、２ｍＬの株培養物を１００ｍＬの種培地を含む３つの１Ｌ容三角フラスコにそれぞれピペッティングし、２５０ｒｐｍで振盪し、３０℃で４８時間培養する。
【００４８】
上記β−エレメンの生産方法において、有機溶媒はｎ−ドデカンであり、加熱条件は１００〜３８０℃で１時間の加熱である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ゲルマクレンＡの生合成経路を示す。
【図２】ＧＣ−ＭＳ試験のクロマトマップ（ｃｈｒｏｍａｔｏｍａｐ）である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
特に記載の無い限り、下記実施例にて用いた実験方法は従来の方法である。
【００５１】
特に記載の無い限り、下記実施例にて用いた材料、試薬その他は市販されているものである。
【００５２】
図１はゲルマクレンＡの生合成経路を示す。
【実施例】
【００５３】
〔実施例１：使用する標的遺伝子及びプラスミドの調製〕
１．標的遺伝子の調製
（１）ＡＤＨ２、ＡＬＤ６、ＡＳＣ１、ＭＦ１、ＴＥＦ１及びＣＹＣ１の取得
酵母ＮＫ２−ＳＱのゲノムＤＮＡ（Ｃｈｉｎａ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ 
Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ、Ｌｉｎ Ｔｉｎｇｔｉｎｇ、Ｗａｎｇ Ｄｏｎｇ、Ｄａｉ Ｚｈｕｂｏ、Ｚｈａｎｇ Ｘｕｅｌｉ、Ｈｕａｎｇ Ｌｕｑｉ、２０１６、４１（６）：１００８-１０１５）を鋳型として抽出し、表１における遺伝子増幅で必要とされるプライマーを用いて増幅し、所望サイズを有するＡＤＨ２、ＡＬＤ６、ＡＳＣ１遺伝子断片、プロモーターＭＦ１、ＴＥＦ１およびターミネーターＣＹＣ１を得た。
【００５４】
ＰＣＲ増幅キットＴＡＫＡＲＡ ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅系を構築した（ＴＡＫＡＲＡ）。増幅系は、５×ＰＳ緩衝液（１０μＬ）、ｄＮＴＰＭｉｘ（４μＬ）、プライマー（各１μＬ）、ゲノムＤＮＡ鋳型（１μＬ）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）ＨＳポリメラーゼ（２．５Ｕ/μL）（０．５μＬ）、及び総量５０μＬとなるよう添加する蒸留水を含む。増幅条件は、予備変性を９８℃で３分（１サイクル）、変性を９８℃で１０秒、アニーリングを５５℃で１５秒、伸長を７２℃で２．５分（３０サイクル）、さらに伸長を７２℃で１０分（１サイクル）とした。
【００５５】
【表１】
2020503888.tif 000002
【００５６】
（２）タンジン（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ）由来ファルネシルピロ燐酸シンターゼ遺伝子ＳｙｎＳｍＦＰＳ及びナツシロギク（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）由来ゲルマクレンＡシンテターゼ遺伝子ＳＴｐＧＭＡの取得
Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ.,Ｌｔｄ．により、ＳｙｎＳｍＦＰＳ（配列番号２、タンジン（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ）由来）及びＳＴｐＧＭＡＳ（配列番号３、ナツシロギク（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）由来）遺伝子の配列に従って全長プライマーを設計し、さらに鋳型ＤＮＡをＯＶＥＲＬＡＰ法を用いて形成した。ＳｙｎＳｍＦＰＳ（配列番号２）及びＳＴｐＧＭＡＳ（配列番号３）の二重鎖ＤＮＡをＰＣＲ増幅法により得て、続いてＰＣＲ産物をクローニングベクターｐＵＣ５７（Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ.,Ｌｔｄ.）に形質転換、クローニングし、ＳｙｎＳｍＦＰＳ遺伝子とＳＴｐＧＭＡＳ遺伝子をそれぞれ含むｐＵＣ５７−ＳｙｎＳｍＦＰＳおよびｐＵＣ５７−ＳＴｐＧＭＡＳクローニングプラスミドを構築した。
【００５７】
（３）酵母由来ファルネシルピロ燐酸シンターゼ遺伝子ＥＲＧ２０-ＧＧＧＳ及びレタス由来ゲルマクレンＡシンテターゼ遺伝子ＧＧＧＳ−ＬｓＬＴＣ２の取得
レタスの葉を２００ｍｇ採取し、液体窒素で粉砕し、続いてその全ＲＮＡをＣＴＡＢ法（臭化セチルトリメチルアンモニウム法）によって抽出した。すなわち、１ｍｌの２×Ｃ
ＴＡＢ抽出液（２％ＣＴＡＢ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＰＨ８．０、２０ｍＭのＥＤＴＡ溶液（エチレンジアミン四酢酸）及び１．４ＭのＮａＣｌ溶液）を１．５ｍｌの遠心分離管に加えた。６５℃の予備加熱後、２０μＬの２-メルカプトエタノールを加え、少量のレタス葉粉末（約５０ｍｇ）をこれに加え、続いてこれらをよく混合、６５℃で１０分維持し、５回振盪し、１２、０００ｒｐｍで１０分、４℃で遠心分離した。得られた上清を取り除き、等量のクロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、１２、０００ｒｐｍで１０分、４℃で遠心分離した。得られた上清を取り除き、等量のクロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、１２、０００ｒｐｍで１０分、４℃で遠心分離した。得られた上清を取り除き、１/６量のクロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、１５、０００ｒｐｍで３０分、４℃で遠心分離した。得られた上清を取り除き、これに１/４量の１０ｍｏｌ/Ｌ ＬｉＣｌを加え、４℃で一晩維持し、１５、０００ｒｐｍで３０分、４℃で遠心分離した。上清を廃棄し、得られた沈殿物を７５％エタノールで２回洗浄し、無水エタノールで１回洗浄し、スーパークリーンベンチ上に１５分（室温）置いた。これを２０μＬのｍｉｌｌｉＱ ＤＥＰＣ−処理水（この溶媒はｍｉｌｌｉＱ純水であり、溶質はピロ炭酸ジエチルであり、ピロ炭酸ジエチル：水の容積比は１：１０００であった）に溶解し、これに対して１/１０量の２ｍｏｌ/ＬのＮａＡＣ（ｐＨ４．０）と２容量の無水エタノールを加え、−２０℃で２時間維持し、１２、０００ｒｐｍで１０分、４℃で遠心分離した。得られた上清は廃棄し、得られた沈殿物を７５％エタノールで２回洗浄し、無水エタノールで１回洗浄し、スーパークリーンベンチ上に１５分（室温）置き、これに１５μＬのｍｉｌｌｉＱ ＤＥＰＣ−処理水を加え、沈殿物を完全に溶解させ、−７０℃で保存した。
【００５８】
第１鎖逆転写−ＰＣＲ：ＲＮａｓｅフリーＰＣＲ管を用い、本系を第１鎖逆転写キット（（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｌｉａｎ）Ｃｏ.,Ｌｔｄ．）：Ｒａｄｏｍ ６ Ｍｅｒｓ（２μＬ）、ｄＮＴＰ（１μＬ）、全ＲＮＡ（１μＬ）（２００ｎｇ）、Ｈ２Ｏ（６μＬ）、全１０μＬ）に従い構築した。一時遠心分離（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）を行った。ＰＣＲを６５℃で５分行い、氷上で急冷してから、これを以下系（第１鎖逆転写キットに付随：５×プライマー緩衝液（４μＬ）、ＲＮＡ阻害剤（０．５μＬ）、Ｒ−転写（１μＬ）、Ｈ２Ｏ（４．５μＬ））に加えて反応させた。一時遠心分離を行い、ＰＣＲ装置にて反応させた（３０℃で１０分、４２℃で６０分、７０℃で１５分、そして４℃で維持）。
【００５９】
ＮＫ２−ＳＱゲノムＤＮＡおよびレタスｃＤＮＡをそれぞれ鋳型として用い、表２のプライマーを用いて増幅し、約１０６８ｂｐのＥＲＧ２０−ＧＧＧＳ（配列番号１１中１３位〜１６８６位の１つはＥＲＧ２０であった）および１６８８ｂｐのＧＧＧＳ−ＬｓＬＴＣ２（配列番号１２中１位〜１０５６位の１つはＬｓＬＴＣ２であった）を得た。
【００６０】
ＰＣＲ増幅キット、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘとＨＦ緩衝液（ＮＥＢ Ｃｏ.,Ｌｔｄ（北京）から購入）によりこの系を構築した。増幅系は、５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液（１０μＬ）、ｄＮＴＰ（各１０ｍＭのｄＮＴＰ）（１μＬ）、ＤＮＡ鋳型（２０ｎｇ）、プライマー（１０μＭ、各１．５μＬ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ/μＬ）（０．５μＬ）、および総量５０μＬとなるよう添加する蒸留水を含む。増幅条件は、予備変性を９８℃で３分（１サイクル）、変性を９８℃で１０秒、アニーリングを５８℃で１０秒、伸長を７２℃で１分（３０サイクル）さらに伸長を７２℃で１０分（１サイクル）とした。
【００６１】
【表２】
2020503888.tif 000003
【００６２】
２．組換えプラスミドの構築
（１）プラスミドｐＭ２−ＡＤＨ２
上記「１．標的遺伝子の調製」における増幅により得たＡＤＨ２及びプラスミドｐＭ２−ｔＨＭＧ１（中国特許ＺＬ２０１３１０３９９９４７．Ｘに記載）をＳｅｘＡ１（ＮＥＢ Ｃｏ.,Ｌｔｄ（北京）から購入）とＡｓｃ１（ＮＥＢ Ｃｏ.,Ｌｔｄ（北京）から購入）を用いて二重酵素消化し、１０５２ｂｐのＡＤＨ２酵素消化産物及び４７３８ｂｐの酵素消化プラスミドｐＭ２−ｔＨＭＧ１基本骨格を得て、ＡＤＨ２酵素消化産物を次いで酵素消化プラスミドｐＭ２−ｔＨＭＧ１基本骨格にライゲートし、組換えプラスミドｐＭ２−ＡＤＨ２を得た。
【００６３】
（２）プラスミドｐＭ４−ＡＣＳ１
上記「１．標的遺伝子の調製」における増幅により得たＡＣＳ１及びプラスミドｐＭ４−ＡｔＣＰＲ１（中国特許ＺＬ２０１３１０３９９９４７．Ｘに記載）をＳｅｘＡ１とＡｓｃ１を用いて二重酵素消化し、２２０１ｂｐのＡＣＳ１酵素消化産物及び５０６１ｂｐの酵素消化プラスミドｐＭ４−ＡｔＣＰＲ１基本骨格を得て、ＡＣＳ１酵素消化産物を次いで酵素消化プラスミドｐＭ４−ＡｔＣＰＲ１基本骨格にライゲートし、組換えプラスミドｐＭ４−ＡＣＳ１を得た。
【００６４】
（３）プラスミドｐＭ３−ＡＬＤ６
上記「１．標的遺伝子の調製」における増幅により得たＡＬＤ６及びプラスミドｐＭ３−ＥＲＧ９（中国特許ＺＬ２０１３１０３９９９４７．Ｘに記載）をＳｅｘＡ１とＡｓｃ１を用いて二重酵素消化し、１５１１ｂｐのＡＬＤ６酵素消化産物及び４５９８ｂｐの酵素消化プラスミドｐＭ３−ＥＲＧ９基本骨格を得て、ＡＬＤ６酵素消化産物を次いで酵素消化プラスミドｐＭ３−ＥＲＧ９基本骨格にライゲートし、組換えプラスミドｐＭ３−ＡＬＤ６を得た。
【００６５】
（４）プラスミドｐＲＳ３１３−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１及びｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１の構築
上記「１．標的遺伝子の調製」における増幅により得たＴＥＦ１をＳｅｘＡ１を用いて酵素消化し、４４０ｂｐのＴＥＦ１酵素消化産物を得た。
上記「１．標的遺伝子の調製」における増幅により得たＣＹＣ１をＡｓｃ１を用いて酵素消化し、３２２ｂｐのＣＹＣ１酵素消化産物を得た。
ｐＵＣ５７−ＳＴｐＧＭＡＳをＳｅｘＡ１とＡｓｃ１を用いて酵素消化し、また１６９４ｂｐのＳＴｐＧＭＡＳを回収した。
【００６６】
各５０ｎｇの酵素消化産物、ＴＥＦ１、ＣＹＣ１及びＳＴｐＧＭＡＳを、２μＬの１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液（ＮＥＢ）、１μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、４００，０００付着端単位/ｍｌ）、２０μＬになるよう添加する蒸留水を含む、ライゲー
ション系に加えた。これらは室温で２時間反応させ、ライゲーション産物を得た。
【００６７】
１μＬのライゲーション産物を、５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液（１０μＬ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭの各ｄＮＴＰ、１μＬ）、ＤＮＡ鋳型（２０ｎｇ）、並びに表３のＳａｃ１１−ＴＥＦ１及びＣＹＣ１−Ｓａｃ１１プライマー（１０μＭ、各１．５μＬ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ/μＬ、０．５μＬ）、及び総量５０μＬとなるよう添加する蒸留水を含む、ＰＣＲ系（Ｐｈｕｓｉｏｎ
Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ＨＦ緩衝液キット、ＮＥＢ）に加えた。増幅条件は、予備変性を９８℃で３分（１サイクル）、変性を９８℃で１０秒、アニーリングを５８℃で１０秒、伸長を７２℃で１．５分（３０サイクル）さらに伸長を７２℃で１０分（１サイクル）とした。２４５６ｂｐのＰＣＲ増幅産物が得られた。
【００６８】
増幅産物を精製してから、ＳａｃＩＩを用いて酵素消化を行った。標的断片ＳａｃＩＩ−ＴＥＦ１−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＣＹＣ１−ＳａｃＩＩをゲルから回収し、調製して用いた。
【００６９】
プラスミドｐＲＳ３１３（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ、Ｒ．Ｓ．及びＨｉｅｔｅｒ，Ｐ．１９８９、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２２（１）：１９-２７）及びｐＲＳ４２５（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ、Ｒ．Ｓ．及びＨｉｅｔｅｒ，P．１９８９、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２２（１）：１９-２７）を、それぞれＳａｃＩＩを用いて酵素消化し、４９６７ｂｐのｐＲＳ３１３ベクター断片及び６８４９ｂｐのｐＲＳ４２５ベクター断片を得た。４μＬのＮＥＢ緩衝液及び１μＬのＣＩＰ脱リン酸化酵素 （ＮＥＢ）を加え、蒸留水を添加して４０μＬとした。これを３７℃で１時間処理し、最終濃度１０μｍｏｌのＥＤＴＡを加えた。６５℃で３０分維持し、反応を終わらせ、ｐＲＳ３１３−ＳａｃＩＩベクター断片及びｐＲＳ４２５−ＳａｃＩＩベクター断片をゲルから回収した。
【００７０】
上記工程「１．標的遺伝子の調製」における増幅において得た各５０ｎｇのベクター断片、ｐＲＳ３１３−ＳａｃＩＩ、ｐＲＳ４２５−ＳａｃＩＩ及びＳａｃＩＩ−ＴＥＦ１−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＣＹＣ１−ＳａｃＩＩをそれぞれ、２μＬの１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液（ＮＥＢ））、１μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、４００，０００付着端単位/ｍｌ）、２０μＬとなるよう添加する蒸留水を含むライゲーション系に加えた。これらは室温で２時間反応させ、ライゲーション産物を得て、これをＴｒａｎｓ１０コンピテント細胞に導入し、配列決定により、プラスミドｐＲＳ３１３−ＨＩＳ３−ＰＴＥＦ１−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１及びｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１の取得を確認した。
【００７１】
プラスミドｐＲＳ３１３−ＨＩＳ３−ＰＴＥＦ１−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１を鋳型として用い、６６９２ｂｐのプラスミドｐＲＳ３１３−ＴＥＦ１−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＣＹＣ１基本骨格を、表３のプライマーを用いて増幅した。
【００７２】
ｐＲＳ４２５を鋳型として用い、ＬＥＵ２（１８０８ｂｐ）を表３のプライマーを用いて増幅した。
【００７３】
増幅系は、５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液（１０μＬ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭの各ｄＮＴＰ、１μＬ）、ＤＮＡ鋳型（２０ｎｇ）、プライマー（１０μＭ、各１．５μＬ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ/μＬ、０．５μＬ）、及び総量５０μＬとなるように添加する蒸留水を含む。増幅条件は、予備変性を９８℃で３分（１サイクル）、変性を９８℃で１０秒、アニーリングを５８℃で１０秒、伸長を７２℃で４分（３０サイクル）、さらに伸長を７２℃で１０分（１サイクル）
とした。
【００７４】
標的断片は、ゲルから精製した。２μＬの１０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液（ＮＥＢ）及び１μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）をＬＥＵ２断片の産物に加え、総量２０μＬとなるよう蒸留水を添加した。リン酸化を３７℃で１時間行い、ゲルからの回収後、これをＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）によりｐＲＳ３１３−ＰＴＥＦ１−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１にライゲートし、形質転換し、配列決定によってプラスミドｐＲＳ３１３−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１の取得を確認した。
【００７５】
【表３】
2020503888.tif 000004
【００７６】
（５）プラスミドｐＲＳ４２５-ＬＥＵ２-ＰＴＥＦ１-ＳｙｎＳｍＦＰＳ-ＧＧＧＳ-ＳＴｐＧＭＡＳ-ＴＣＹＣ１の構築
ｐＵＣ５７−ＳｙｎＳｍＦＰＳ及びｐＵＣ５７−ＳＴｐＧＭＡＳを鋳型として用い、１０８０ｂｐのＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ及び１７０４ｂｐのＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳを表４のプライマーを用いる増幅により得た。
【００７７】
増幅系は、５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液（１０μＬ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭの各ｄＮＴＰ、１μＬ）、ＤＮＡ鋳型（２０ｎｇ）、プライマー（１０μＭ、各１．５μＬ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ/μＬ、０．５μＬ）及び総量５０μＬとなるよう添加する蒸留水を含む。増幅条件は、予備変性を９８℃で３分（１サイクル）、変性を９８℃で１０秒、アニーリングを５８℃で１０秒、伸長を７２℃で１分（３０サイクル）、伸長を７２℃で１０分（１サイクル）とした。
【００７８】
ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ及びＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳを共に鋳型として用いて、また表４のプライマー（ＳｅｘＡ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ及びＳＴｐＧＭＡＳ−Ａｓｃ１）を用いた増幅により、２７６７ｂｐのＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ断片を得た。
【００７９】
増幅系は、５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液（１０μＬ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭの各ｄＮＴＰ、１μＬ）、ＤＮＡ鋳型ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ及びＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ（各２０ｎｇ）、プライマー（１０μＭ、各１．５μＬ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ/μＬ、０．５μＬ）、及び総量５０
μＬとなるよう添加する蒸留水を含む。増幅条件は、予備変性を９８℃で３分（１サイクル）、変性を９８℃で１０秒、アニーリングを５８℃で１０秒、伸長を７２℃で２分（３０サイクル）、伸長を７２℃で１０分（１サイクル）とした。
【００８０】
増幅産物を精製し、ＳｅｘＡ１とＡｓｃ１で酵素消化し、標的断片ＳｅｘＡ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ−Ａｓｃ１（２７６０ｂｐ）をゲルから回収、調製して使用した。
【００８１】
上記項目（４）において構築したプラスミドｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１をＳｅｘＡ１とＡｓｃ１で酵素消化し、７６０２ｂｐの大きな断片をゲルから回収した結果、ベクターｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−．．．−ＴＣＹＣ１を得た。各５０ｎｇのベクターｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−．．．−ＴＣＹＣ１及びＳｅｘＡ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ−Ａｓｃ１を、２μＬの１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液（ＮＥＢ）、１μLのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、４００，０００付着端単位/ｍｌ）、及び２０μLとなるよう添加する蒸留水を含むライゲーション系に加えた。これらを室温で２時間反応させ、ライゲーション産物を得て、これをＴｒａｎｓ１０コンピテント細胞に導入し、プラスミドを抽出し配列決定によってプラスミドｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１の取得を確認した。
【００８２】
【表４】
2020503888.tif 000005
【００８３】
（６）プラスミドｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＭＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１の構築
上記「１．標的遺伝子の調製」にて得たＭＦ１及び上記項目（５）において構築したプラスミドｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１をそれぞれ、ＢａｍＨ１（ＴａＫａＲａより購入）とＳｅｘＡ１を用いて二重酵素消化した。８１４ｂｐの標的プロモーター遺伝子ＭＦ１及び９８９８ｂｐのベクター断片ｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−．．．−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１をゲルから精製し、この２つ（各５０ｎｇ）を、２μLの１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液（ＮＥＢ）、１μLのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、４００，
０００付着端単位/ｍｌ）、及び２０μLとなるよう添加する蒸留水を含むライゲーション系に加えた。これらを室温で２時間反応させライゲーション産物を得て、Ｔｒａｎｓ１０コンピテント細胞を形質転換し、プラスミドを抽出、配列決定により確認した。得られたプラスミドで正しい配列と一致したものを、ｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＭＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１と名付けた。
【００８４】
（７）プラスミドｐＭ２−ＥＲＧ２０−ＧＧＧＳ−ＬｓＬＴＣ２の構築
ＥＲＧ２０−ＧＧＧＳとＧＧＧＳ−ＬｓＬＴＣ２を共に鋳型として用い、約２７４４ｂｐのＥＲＧ２０−ＧＧＧＳ−ＬｓＬＴＣ２断片を、表５のプライマー（ＳｅｘＡ１−ＥＲＧ２０及びＬｓＬＴＣ２−Ａｓｃ１）を用いる増幅により得た。
【００８５】
増幅系は、５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液（１０μＬ）、ｄＮＴＰ（各１０ｍＭのｄＮＴＰ、１μＬ）、ＤＮＡ鋳型ＥＲＧ２０-ＧＧＧＳ及びＧＧＧＳ−ＬｓＬＴＣ２（各２０ｎｇ）、プライマー（１０μＭ、各１．５μＬ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ/μＬ、０．５μＬ）、及び総量５０μＬとなるよう添加する蒸留水を含む。増幅条件は、予備変性を９８℃で３分（１サイクル）、変性を９８℃で１０秒、アニーリングを５８℃で１０秒、伸長を７２℃で２分（３０サイクル）さらに伸長を７２℃で１０分（１サイクル）とした。
【００８６】
増幅産物を精製し、ＳｅｘＡ１とＡｓｃ１で酵素消化し、標的断片ＳｅｘＡ１−ＥＲＧ２０−ＧＧＧＳ−ＬｓＬＴＣ２−Ａｓｃ１（約２７４４ｂｐ）をゲルから回収し、酵素消化プラスミドベクターｐＭ２−ｔＨＭＧ１基本骨格とライゲートして、組換えプラスミドｐＭ２−ＥＲＧ２０−ＧＧＧＳ−ＬｓＬＴＣ２を得た。
【００８７】
【表５】
2020503888.tif 000006
【００８８】
（８）プラスミドｐＥＡＳＹ−ＮＤＴ８０−ＨＩＳ３の構築
ＮＫ２−ＳＱゲノムＤＮＡとｐＲＳ３１３を鋳型として用い、１２５２ｂｐのＮＤＴ８０（配列番号１３）及び１１６８ｂｐのＨＩＳ３（配列番号１４）を、表６のプライマーを用いる増幅によって得た。
【００８９】
増幅系は、５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液（１０μＬ）、ｄＮＴＰ（各１０ｍＭのｄＮＴＰ、１μＬ）、ＤＮＡ鋳型（２０ｎｇ）、プライマー（１０μＭ、各１．５μＬ）、
Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ/μＬ、０．５μＬ）及び総量５０μＬとなるよう添加する蒸留水を含む。増幅条件は、予備変性を９８℃で３分（１サイクル）、変性を９８℃で１０秒、アニーリングを５８℃で１０秒、伸長を７２℃で１分（３０サイクル）、さらに伸長を７２℃で１０分（１サイクル）とした。
【００９０】
増幅産物ＮＤＴ８０をｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔ Ｓｉｍｐｌｅクローニングベクター（ｐＥＡＳＹクローニングベクター、北京ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）にクローニングし、Ｔｒａｎｓ１０コンピテント細胞を形質転換し、プラスミドを抽出、配列決定により確認したところ、プラスミドｐＥＡＳＹ−ＮＤＴ８０が得られた。
【００９１】
【表６】
2020503888.tif 000007
【００９２】
ｐＥＡＳＹ−ＮＤＴ８０をＰｍｅＩ（ＮＥＢ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（北京）より購入）を用いて酵素消化し、５１２２ｂｐの標的断片（３０ｎｇ）をゲルから精製し、４μＬのＮＥＢ緩衝液（反応緩衝液、ＮＥＢ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（北京）より購入）及び１μＬのＣＩＰ脱リン酸化酵素（ＮＥＢ）を加え、蒸留水を４０μＬとなるまで添加した。これを３７℃で１時間処理し、ＥＤＴＡを最終濃度１０μｍｏｌで加え、６５℃で３０分維持してから反応を終了させた。５１２２ｂｐの標的断片ｐＥＡＳＹ−ＮＤＴ８０をゲルから回収、調製して使用した。
【００９３】
ＨＩＳ３（３０ｎｇ）をゲルから精製し、４μLの１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液（ＮＥＢ）と１μLのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）を加え、蒸留水を４０μLとなるまで添加し、これを３７℃で１時間リン酸化した。ゲルからの回収後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いてｐＥＡＳＹ−ＮＤＴ８０とライゲートし、これでＴｒａｎｓ１０コンピテント細胞を形質転換し、配列決定によってプラスミドｐＥＡＳＹ−ＮＤＴ８０-ＨＩＳ３の取得を確認した。
【００９４】
上述のように構築したプラスミドの情報を下表７に示す。
【００９５】
【表７】
2020503888.tif 000008
【００９６】
（９）プラスミドｐＥＡＳＹ−ｒＤＮＡ−ＴＲＰ１の構築
ＮＫ２−ＳＱゲノムＤＮＡとｐＲＳ３１４（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ、Ｒ．Ｓ．及びＨｉｅｔｅｒ，Ｐ．１９８９，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２２（１）：１９-２７）をそれぞれ鋳型として用い、表８のプライマーを用いる増幅によってｒＤＮＡ（配列番号９）及びＴＲＰ１（配列番号１０）を得た。
【００９７】
増幅系は、５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液（１０μＬ）、ｄＮＴＰ（各１０ｍＭのｄＮＴＰ、１μＬ）、ＤＮＡ鋳型（２０ｎｇ）、プライマー（１０μＭ、各１．５μＬ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ/μＬ、０．５μＬ）及び総量５０μＬとなるよう添加する蒸留水を含む。増幅条件は、予備変性を９８℃で３分（１サイクル）、変性を９８℃で１０秒、アニーリングを５８℃で１０秒、伸長を７２℃で１分（３０サイクル）、さらに伸長を７２℃で１０分（１サイクル）とした。
【００９８】
増幅産物ｒＤＮＡをｐＥＡＳＹ−Ｂｌｕｎｔ Ｓｉｍｐｌｅ クローニングベクターにクローニングし、Ｔｒａｎｓ１０コンピテント細胞を形質転換し、プラスミドを抽出、配列決定によってプラスミドｐＥＡＳＹ−ｒＤＮＡの取得を確認した。
【００９９】
【表８】
2020503888.tif 000009
【０１００】
ｐＥＡＳＹ−ｒＤＮＡをＰｍｅＩを用いて酵素消化し、５１２２ｂｐの標的断片（３０ｎｇ）をゲルから精製し、４μＬのＮＥＢ緩衝液と１μＬのＣＩＰ脱リン酸化酵素（ＮＥＢ）を加え、蒸留水を総量４０μＬとなるまで添加した。これを３７℃で１時間処理し、これにＥＤＴＡを最終濃度１０μｍｏｌで加え、６５℃で３０分維持してから反応を終了させた。５１２２ｂｐの標的断片ｐＥＡＳＹ−ｒＤＮＡをゲルから回収、調製して用いた。
【０１０１】
ＴＲＰ１（３０ｎｇ）をゲルから精製し、４μＬの１０×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液（ＮＥＢ）及び１μLのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）を加え、蒸留水を総量４０μLとなるまで添加し、これを３７℃で１時間リン酸化した。ゲルからの回収後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて、ｐＥＡＳＹ−ｒＤＮＡとライゲートし、Ｔｒａｎｓ１０コンピテント細胞を形質転換し、配列決定によってプラスミドｐＥＡＳＹ−ｒＤＮＡ−ＴＲＰ１の取得を確認した。
【０１０２】
〔実施例２：組換え株の構築〕
１．酵母コンピテント細胞の調製
元の株をそれぞれ対応する培地（表１３）で３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養した。１ｍＬの培養懸濁液（ＯＤ約０．６〜１０）を１．５ｍＬのＥＰ管に加え、１０，０００gで１分、４℃で遠心分離した。得られた上清を廃棄し、沈殿物を滅菌水で洗浄（４℃）し、同条件下で遠心分離し、得られた上清を廃棄した。１ｍＬの処理溶液（１０ｍＭのＬｉＡｃ（酢酸リチウム）、１０ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）、０．６Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩緩衝液、ｐＨ７．５）、ＤＴＴを処理溶液使用直前に加えた）を酵母に加え、これを２５℃で２０分維持した。遠心分離後、上清を廃棄し、１ｍＬの１Ｍソルビトール（０．２２μmの水性膜を通してろ過、滅菌した）を再懸濁した酵母に加え、これを遠心分離し、最終容量が約９０μLとなるまで上清を廃棄した（１Ｍソルビトールで２回再懸濁）。
【０１０３】
２．ＦＰＰ−００１株の構築
１）ＮＤＴ８０−ＨＩＳ３−ｕｐ、ＰＰＧＫ１−ＡＤＨ２−ＴＡＤＨ１、ＰＴＤＨ３−ＡＣＳ１−ＴＴＰＩ１、ＰＴＥＦ１−ＡＬＤ６−ＴＣＹＣ１及びＮＤＴ８０−ＨＩＳ３−ｄｏｗｎの調製
ＰＰＧＫ１−ＡＤＨ２−ＴＡＤＨ１、ＰＴＤＨ３−ＡＣＳ１−ＴＴＰＩ１及びＰＴＥＦ
１−ＡＬＤ６−ＴＣＹＣ１は、アルコールデヒドロゲナーゼ２、アセチル−ＣｏＡシンテターゼ１、及びアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ６をそれぞれ担持する、発現カセットであり、ＮＤＴ８０−ＨＩＳ３−ｕｐ及びＮＤＴ８０−ＨＩＳ３−ｄｏｗｎは、それぞれＨＩＳ３の上流及び下流ホモロジーアームであり、断片はそれぞれ以下の方法に従って増幅した。
【０１０４】
機能モジュールは、表９に記載のＰＣＲの鋳型とプライマーを用いたＰＣＲによりそれぞれ、６９８ｂｐのＭ１（ＮＤＴ８０−ＨＩＳ３−ｕｐ）、２０８１ｂｐのＭ２（ＰＰＧＫ１−ＡＤＨ２−ＴＡＤＨ１）、３５１９ｂｐのＭ３（ＰＴＤＨ３−ＡＣＳ１−ＴＴＰＩ１）、２３７６ｂｐのＭ４（ＰＴＥＦ１−ＡＬＤ６−ＴＣＹＣ１）、１８３５ｂｐのＭ５（ＮＤＴ８０−ＨＩＳ３−ｄｏｗｎ）が得られた。
【０１０５】
増幅系は、５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液（１０μＬ）、ｄＮＴＰ（各１０ｍＭのｄＮＴＰ、１μＬ）、ＤＮＡ鋳型（２０ｎｇ）、プライマー（１０μＭ、各１．５μＬ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ/μＬ、０．５μＬ）、及び総量５０μＬとなるよう添加する蒸留水を含む。増幅条件は、予備変性を９８℃で３分（１サイクル）、変性を９８℃で１０秒、アニーリングを５８℃で１０秒、伸長を７２℃で２分（３０サイクル）さらに伸長を７２℃で１０分（１サイクル）とした。産物はゲルから回収し保存した。
【０１０６】
【表９−１】
2020503888.tif 000010
【表９−２】
2020503888.tif 000011
【０１０７】
２）ＦＰＰ−００１株の構築
元株サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＫ２−ＳＱをＳＤ−Ｕｒａ液体培地（０．８％酵母選択培地ＳＤ−Ｕｒａ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ（Ｂｅｉｊｉｎｇ ＦｕｎＧｅｎｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ.,Ｌｔｄ．）、２％グルコース、０．００５％Ｈｉｓ、０．０１％Ｔｒｐ）で一晩培養し、コンピテント細胞に調製した。次いで、表９の形質転換断片Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４及びＭ５を総量５μg（モル比=１：１：１：１：１）で加え、よく混合し電気ショックカップに移して、電気的なショックを２．７ｋｖで５．７ｍｓ与え、これに１ｍＬの１Ｍソルビトールを加え、３０℃で１時間蘇生させ、ＳＤ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ培地上に広げ、３０℃で３６時間以上培養した。スクリーニング培地組成の成分は、０．８％酵母選択培地ＳＤ−Ｕｒａ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ（Ｂｅｉｊｉｎｇ ＦｕｎＧｅｎｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、２％グルコース及び０．０１％Ｔｒｐであった。真陽性クローンはＰＣＲ
により同定しＦＰＰ−００１株と名付けた。
【０１０８】
３．ＥＬＥ−００１及びＥＬＥ−００２株の構築
元株サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＦＰＰ−００１をＳＤ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ液体培地で一晩培養し、コンピテント細胞に調製した。次いで、プラスミドｐＲＳ３１３−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１及びｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１をそれぞれ加え、よく混合し電気ショックカップに移して、電気的なショックを２．７ｋｖで５．７ｍｓ与え、これに１ｍＬの１Ｍソルビトールを加え、３０℃で１時間蘇生させ、ＳＤ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ培地上に広げて、３０℃で３６時間以上培養した。スクリーニング培地組成の成分は、０．８％酵母選択培地ＳＤ−Ｕｒａ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ（Ｂｅｉｊｉｎｇ ＦｕｎＧｅｎｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、２％グルコース及び０．０１％Ｔｒｐであった。真陽性クローンはＰＣＲにより同定し、それぞれＥＬＥ−００１株（これにプラスミドｐＲＳ３１３−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１を導入した）とＥＬＥ−００２株（これにプラスミドｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１を導入した）と名付けた。
【０１０９】
４．ＥＬＥ−０１１株の構築
ＦＰＰ−００１コンピテント細胞を上記項目３の工程に従って調製した。次いで、これにプラスミドｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１を加え、よく混合し電気ショックカップに移して、電気的なショックを２．７ｋｖで５．７ｍｓ与え、これに１ｍＬの１Ｍソルビトールを加え、３０℃で１時間蘇生させ、ＳＤ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ培地上に広げ、３０℃で３６時間以上培養した。真陽性クローンはＰＣＲにより同定しＥＬＥ−０１１株と名付けた。
【０１１０】
５．ＥＬＥ−０１２〜ＥＬＥ−０１９株の構築
プラスミドｐＲＳ４２５-ＬＥＵ２-ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１を鋳型として用い、ＰＣＲ増幅を表１１のプライマーを用いて行い、異なるプライマーに対応する増幅産物を得た。次いで、異なるプライマーに対応する増幅産物をそれぞれ酵母ＦＰＰ-００１に導入し、それ自身の相同組換えを実施し、組換え株ＥＬＥ−０１２〜ＥＬＥ−０１８をそれぞれ得た。ベクター中の融合タンパク質ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳのリンカーペプチドＧＧＧＳは、それぞれ３Ａ００１、４Ａ００１、５Ａ００２、６Ａ００５、６Ｂ００４、８Ａ００５、１２Ａ００３と置換した（表１０に示す通り）。
【０１１１】
プラスミドｐＲＳ４２５−ＬＥＵ２−ＰＭＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１を鋳型として用い、ＰＣＲ増幅を表１０（表１１）のプライマーと８Ａ００５のリンカーペプチドとを用いて行い、異なるプライマーに対応する増幅産物を得た。次いで異なるプライマーに対応する増幅産物をそれぞれ酵母ＦＰＰ-００１に導入し、それ自身の相同組換えを実施し、組換え株ＥＬＥ−０１９を得た。ベクター中の融合タンパク質ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳのリンカーペプチドＧＧＧＳは、８Ａ００５と置換した。
【０１１２】
【表１０】
2020503888.tif 000012
【０１１３】
特定の反応条件は以下の通り。
【０１１４】
上記増幅系は、５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液（１０μＬ）、ｄＮＴＰ（各１０ｍＭのｄＮＴＰ、１μＬ）、ＤＮＡ鋳型（２０ｎｇ）、プライマー（表１１に示す）（１０μＭ、各１．５μＬ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ/μＬ、０．５μＬ）及び総量５０μＬとなるよう添加する蒸留水を含む。増幅条件は、予備変性を９８℃で３分（１サイクル）、変性を９８℃で１０秒、アニーリングを５８℃で１０秒、伸長を７２℃で５．５分（３０サイクル）、さらに伸長を７２℃で１０分（１サイクル）とした。
【０１１５】
増幅産物は、精製後にＤｐｎＩ酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて消化した。この系は５×Ｆａｓｔ Ｄｉｇｅｓｔ Ｇｒｅｅｎ緩衝液（４μL）、精製産物（３４μＬ）、ＤｐｎＩ（２μＬ）を含む。酵素消化温度及び反応時間はそれぞれ３７℃、１時間であった。最後にこれをゲルから回収し保存した。
【０１１６】
【表１１】
2020503888.tif 000013
【０１１７】
ＦＰＰ−００１コンピテント細胞を上記項目３の工程に従って調製した。次いで、上記工程でゲルから回収して得た産物をそれぞれ加え、よく混合し、電気ショックカップに移して、電気的なショックを２．７ｋｖで５．７ｍｓ与え、これに１ｍＬの１Ｍソルビトールを加え、３０℃で１時間蘇生させ、それぞれＳＤ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ培地上に広げて３０℃で３６時間以上培養した。真陽性クローンはＰＣＲにより同定し、それぞれＥＬＥ−０１２株〜ＥＬＥ−０１９株と名付けた。
【０１１８】
６．組換え株ＥＬＥ−０２０の構築
１）ＰＰＧＫ１−ＥＲＧ２０−ＧＧＧＳ−ＬｓＬＴＣ２−ＴＡＤＨ１、ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１、ｒＤＮＡ−ＴＲＰ１−ｕｐ及びｒＤＮＡ−ＴＲＰ１−ｄｏｗｎの調製
ＰＰＧＫ１−ＥＲＧ２０−ＧＧＧＳ−ＬｓＬＴＣ２−ＴＡＤＨ１およびＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１は、酵母ファルネシルピロ燐酸
シンターゼとレタス由来ゲルマクレンＡシンテターゼとの融合タンパク質、コドン最適化タンジン（Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ）由来ファルネシルピロ燐酸シンターゼとコドン最適化ナツシロギク（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）由来ゲルマクレンＡシンテターゼとの融合タンパク質をそれぞれ担持する発現カセットであり、ｒＤＮＡ−ＴＲＰ１−ｕｐ及びｒＤＮＡ−ＴＲＰ１−ｄｏｗｎはそれぞれ、ｒＤＮＡの上流及び下流相同アームであり、これら断片を、下記方法に従い増幅した。
【０１１９】
機能モジュールはそれぞれ、表１２に記載の鋳型及びプライマーを用いるＰＣＲによって得た。
Ｍ１（ｒＤＮＡ−ＴＲＰ１−ｕｐ）、
Ｍ２（ＰＰＧＫ１−ＥＲＧ２０−ＧＧＧＳ−ＬｓＬＴＣ２−ＴＡＤＨ１）、
Ｍ３（ＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１）、
Ｍ４（ｒＤＮＡ−ＴＲＰ１−ｄｏｗｎ）。
【０１２０】
増幅系は、５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液（１０μＬ）、ｄＮＴＰ（各１０ｍＭのｄＮＴＰ、１μＬ）、ＤＮＡ鋳型（２０ｎｇ）、プライマー（１０μＭ、各１．５μＬ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ/μＬ、０．５μＬ）及び総量５０μＬとなるよう添加する蒸留水を含む。増幅条件は、予備変性を９８℃で３分（１サイクル）、変性を９８℃で１０秒、アニーリングを５８℃で１０秒、伸長を７２℃で２分（３０サイクル）さらに伸長を７２℃で１０分（１サイクル）とした。産物はゲルから回収し保存した。
【０１２１】
【表１２】
2020503888.tif 000014
【０１２２】
元酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＥＬＥ−０１９株はＳＤ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ液体培地で一晩培養し、コンピテント細胞に調製した。次いで、表１２の形質転換断片Ｍ1、Ｍ２、Ｍ３及びＭ４を総量４μg（モル比=１：１：１：１）で加え、よく混合し電気ショックカップに移して、電気的なショックを２．７ｋｖで５．７ｍｓ与え、これに１ｍＬの１Ｍソルビトールを加え、３０℃で１時間蘇生させ、ＳＤ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ培地上に広げ、３０℃で３６時間以上培養した。スクリーニング培地組成の成分は０．８％酵母選択培地ＳＤ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｅｉｊｉｎｇ ＦｕｎＧｅｎｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、２％グルコースであった。真陽性クローンはＰＣＲにより同定しＥＬＥ−０２０株と名付けた。
【０１２３】
ＥＬＥ−０２０組換え株は２０１７年１０月２０日付で中国科学院微生物研究所（ｔｈｅ Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ、ＣＧＭＣＣ）に寄託された。寄託先住所はＢｕｉｌｄｉｎｇ ３、Ｎｏ．１ Ｗｅｓｔ Ｂｅｉｃｈｅｎ Ｒｏａｄ、Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ、北京であった。本株名はサッカロマイセス・セレビシエ、ラテン名はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであり、またその寄託番号はＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１４８２９であった。
全ての上記操作株の情報を表１３に示す。
【０１２４】
【表１３】
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【０１２５】
〔実施例３：β−エレメン生産における組換え株の適用〕
１．操作株培養物及び産物の抽出
実施例２にて調製した全操作酵母株を対応固形選択培地ＳＤ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕにて活性化し、種溶液を対応液体選択培地ＳＤ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（３０℃、２５
０ｒｐｍ、１６ｈ）にて調製し、１５ｍＬの対応液体選択培地を含む１００ｍＬ容三角フラスコに１％量を接種し、２５０ｒｐｍで振盪し、３０℃で１日培養した。次いで、１．５ｍＬのｎ−ドデカンをこれに加え、振盪、培養を５日間継続して行った。最後に、三角フラスコ内の液体を５０ｍＬの遠心分離管に移し、遠心分離を５，０００ｒｐｍで５分行い、有機相を回収して使用した。
【０１２６】
２．β−エレメン変換並びにその定性及び定量分析
１）β−エレメン変換
上記有機相サンプルを通風室内の油槽中、１００〜３８０℃（１８０℃）で１時間加熱し、変換材料を得た。
【０１２７】
２）検出
変換材料をｎ-ヘキサンで１０倍希釈し、有機ナイロン膜（０．２２μm）でろ過し、ＧＣ-ＭＳを用いて検出した。試験機器は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＧＣＭＳＤ Ａｇｉｌｅｎｔ ７８９０Ａ/５９７５Ｃであり、ＧＣ-ＭＳ測定条件は、入口温度２５０℃、注入量１μL、スプリットレス、溶媒遅延３分であり、カラムはＨＰ-５ｍｓ（３０ｍ×０．２５ｍｍ）であり、クロマトグラフィー条件は、４５℃で１分、１０℃／分で３００℃まで予熱し、５分維持し、ＭＳ条件は、Ｆｕｌｌ Ｓｃａｎで５０〜７５０ａｍｕであった。Ｃｈｉｎａ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｆｏｒ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｔｒｏｌから購入した標準β−エレメン（Ｃａｔ．Ｎｏ．１００２６８）を用いて定性及び定量分析を行った。図２は、実施例２にて調製した全操作酵母株が産生したβ−エレメンのＧＣ-ＭＳ試験のクロマトマップである。
【０１２８】
その結果、６日間発酵後の各操作株の収量は以下の通りであった。
操作株ＥＬＥ−００１及びＥＬＥ−００２は、ＦＰＰ−００１に基づく低コピー数及び高コピー数のＳＴｐＧＭＡＳの導入により得られた。ここで、ＥＬＥ−００１のβ−エレメンの収量は９．３ｍｇ／Ｌに達し、またＥＬＥ−００２のβ−エレメンの収量は２２．１ｍｇ／Ｌに達した。
操作株ＥＬＥ−０１１は、ＦＰＰ−００１に基づく高コピー数の融合タンパク質遺伝子ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳの導入により得られ、β−エレメンの収量は１０１．１ｍｇ／Ｌに達した。
【０１２９】
操作株ＥＬＥ−０１２〜ＥＬＥ−０１９（そのプロモーターとリンカーはそれぞれ、ＴＥＦ１と３Ａ００１、ＴＥＦ１と４Ａ００１、ＴＥＦ１と５Ａ００２、ＴＥＦ１と６Ａ００５、ＴＥＦ１と６Ｂ００４、ＴＥＦ１と８Ａ００５、ＴＥＦ１と１２Ａ００３、ＭＦ１と８Ａ００５）は、ＦＰＰ−００１に基づく高コピー数の融合タンパク質遺伝子ＳｙｎＳｍＦＰＳ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＳＴｐＧＭＡＳの導入により得られた。
【０１３０】
操作株ＥＬＥ−０２０は、ＥＬＥ−０１９に基づく融合タンパク質遺伝子ＰＰＧＫ１−ＥＲＧ２０−ＧＧＧＳ−ＬｓＬＴＣ２−ＴＡＤＨ１及びＰＴＥＦ１−ＳｙｎＳｍＦＰＳ−ＧＧＧＳ−ＳＴｐＧＭＡＳ−ＴＣＹＣ１の組換え及び導入により得られた。
【０１３１】
ＥＬＥ−０１２〜ＥＬＥ−０２０株を用いて生産されたβ−エレメンの収量はそれぞれ、２．２ｍｇ／Ｌ（培養液に対して）、３５．５ｍｇ／Ｌ、１１０．４ｍｇ／Ｌ、１０８．６ｍｇ／Ｌ、７３．６ｍｇ／Ｌ、１０９．７ｍｇ／Ｌ、４８．３ｍｇ／Ｌ、１５８．１ｍｇ／Ｌ及び４６９ｍｇ／Ｌであった。
【０１３２】
３．バイオリアクター発酵培養
１）培地の組成
塩化カルシウム母液：１９．２ｇ/Ｌの塩化カルシウム二水和物の水溶液。
【０１３３】
微量金属塩母液：１９．１ｇ／Ｌのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、１０．２ｇ／Ｌの硫酸亜鉛七水塩、０．５ｇ／Ｌの塩化マンガン四水和物、０．８６ｇ／Ｌの塩化コバルト六水和物、０．７８ｇ／Ｌの硫酸銅五水和物、０．５６ｇ／Ｌのモリブデン酸ナトリウム二水和物及び５．１２ｇ／Ｌの亜硫酸鉄七水和物。
【０１３４】
ビタミン母液：０．０５ｇ／Ｌのビオチン、０．２ｇ／Ｌのp-アミノ安息香酸ナトリウム、１ｇ／Ｌのナイアシン、１ｇ／Ｌのパントテン酸カルシウム、１ｇ/Ｌの塩酸ピリドキシン、１ｇ／Ｌのチアミン塩酸塩及び２５ｇ／Ｌのイノシトール。
【０１３５】
種培地及び発酵培地：２５ｇ／Ｌのグルコース、１５ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、６．１５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物、０．７２ｇ／Ｌの硫酸亜鉛七水塩、８ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、２ｍＬ/Ｌの塩化カルシウム母液、１０ｍＬ/Ｌの微量金属塩母液、１２ｍＬ/Ｌのビタミン母液、１ｇ／Ｌのトリプトファン及び残部の水。
【０１３６】
流加培地：８００ｇ／Ｌのグルコース、５．１２５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物、３．５ｇ／Ｌの硫酸カリウム、０．２８ｇ／Ｌの硫酸ナトリウム、９ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、１ｇ／Ｌのトリプトファン及び残部の水。
【０１３７】
２）操作株ＥＬＥ−０１９の発酵
操作株ＥＬＥ−０１９は、項目１の方法に従って活性化した。プレート上のモノクローナルコロニーを採取し、ＳＤ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ培地を含む試験管に接種し、２５０ｒｐｍで振盪し、３０℃で一晩培養した。５００μＬの株培養物を、５０ｍＬのＳＤ−Ｕｒａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ培地を含む２５０ｍＬ容の三角フラスコにピペッティングし、２５０ｒｐｍで振盪、３０℃で２４時間培養した。
【０１３８】
２ｍＬの株培養物を、それぞれ１００ｍＬの種培地を含む３つの１Ｌ容の三角フラスコにピペッティングし、２５０ｒｐｍで振盪し３０℃で４８時間培養した。最後に、フレーム接種ループ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｏｍｐａｎｙ、ドイツ、モデルＮｏ．：ＢｉｏＦｌｏ（登録商標）３２０）を用いて種溶液を３Ｌの発酵培地を含む７Ｌ容の発酵タンクに接種した。
【０１３９】
発酵プロセスにおけるパラメーター設定は、温度３０℃、ｐＨ５．０、溶存酸素３０%、空気流量３〜２０Ｌ／分、攪拌速度３００〜１０００ｒｐｍであり、溶存酸素は、攪拌速度と空気流に伴いカスケージングした。溶存酸素値が６０％を超える場合、発酵液中グルコース濃度が５ｇ／Ｌになるまで流加培地を発酵タンクに加えた。
【０１４０】
発酵終了の３時間前に、ｎ−ドデカンの１０％（培養液量に対して）を加え、発酵終了後に、有機相を分離した。
【０１４１】
項目２の変換及び検出方法に従って処理を行った後、定性及び定量分析を行った。操作株ＥＬＥ−０１９の９６時間の高密度発酵後、２ｇ／Ｌ（培養液に対して）のβ−エレメンが得られ得る。本発明の目的に応じた組換え株は、表１３に記載の特定の実験実施例に限られるものではなく、項目「３」に記載の発酵方法に従った発酵培養を行ってゲルマクレンＡを得ることも可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
本発明の実験により、本発明において、ゲルマクレンＡの収量を著しく改善することのできる、ゲルマクレンＡシンテターゼ遺伝子又はその融合タンパク質遺伝子の宿主酵母における発現により組換え株が取得可能であることが確かめられた。これはβ−エレメン及
び／又はゲルマクレンＡの工業生産に好適であり、抗癌原料β−エレメンの生合成に有望な株や研究基盤を提供する。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年7月8日(2019.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ ｖｉｖｏでゲルマクレンＡシンテターゼ又はゲルマクレンＡシンテターゼの融合タンパク質を含む又は発現する酵母の組換え株であり、
前記ゲルマクレンＡシンテターゼの融合タンパク質が、ゲルマクレンＡシンテターゼ及びファルネシルピロ燐酸シンターゼを含み、
前記組換え株が、元の酵母と比較してアルコールデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアセチル−ＣｏＡシンテターゼの含量及び／又は活性が増加した株である、
組換え株。
【請求項２】
前記融合タンパク質をコードする核酸が前記ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする１つ又は複数の核酸、及び前記ファルネシルピロ燐酸シンターゼをコードする１つ又は複数の核酸を含む、
請求項１に記載の組換え株。
【請求項３】
前記融合タンパク質をコードする核酸が、異なる宿主に由来する前記ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする少なくとも２つの核酸、及び異なる宿主に由来する前記ファルネシルピロ燐酸シンターゼをコードする少なくとも２つの核酸を含む、
請求項２に記載の組換え株。
【請求項４】
前記ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする１つ又は複数の核酸が、配列番号３に示す核酸又は配列番号１２の１３位から１６８６位に示す核酸を含み、
前記ファルネシルピロ燐酸シンターゼをコードする１つ又は複数の核酸が、配列番号２に示す核酸又は配列番号１１の１位から１０５６位に示す核酸を含む、
請求項２又は３に記載の組換え株。
【請求項５】
前記融合タンパク質が、前記ゲルマクレンＡシンテターゼと前記ファルネシルピロ燐酸シンターゼとを連結するためのリンカーペプチドをさらに含む、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え株。
【請求項６】
前記リンカーペプチドが、ＧＧＧＳ、ＹＧＱ、ＰＧＧＨ、ＹＲＳＱＩ、ＶＩＰＦＩＳ、ＦＬＹＬＫＦ、ＷＲＦＳＰＫＬＱ及びＨＨＶＱＥＳＱＣＩＳＴＶから選択される、
請求項５に記載の組換え株。
【請求項７】
ｉｎ ｖｉｖｏで前記ゲルマクレンＡシンテターゼ又は前記ゲルマクレンＡシンテターゼの融合タンパク質を含む又は発現する組換え株が、前記ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸又は前記融合タンパク質をコードする核酸が導入された組換え株である、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換え株。
【請求項８】
前記ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸が導入された組換え株が、該核酸を含む発現カセットが導入された組換え株である、
又は
前記融合タンパク質をコードする核酸が導入された組換え株が、該核酸を含む発現カセットが導入された組換え株である、
請求項７に記載の組換え株。
【請求項９】
前記ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸を含む前記発現カセットが、プロモーター、前記ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸、及びターミネーターを含む、
又は
前記融合タンパク質をコードする核酸を含む前記発現カセットが、プロモーター、前記融合タンパク質をコードする核酸、及びターミネーターを含む、
請求項８に記載の組換え株。
【請求項１０】
前記プロモーターがＴＥＦ１、ＭＦ１又はＰＧＫ１であり、前記ターミネーターがＣＹＣ１又はＡＤＨ１である、請求項９に記載の組換え株。
【請求項１１】
１つ又は複数のマーカー遺伝子をさらに発現する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換え株。
【請求項１２】
前記マーカー遺伝子がｈｉｓ３又はｔｒｐ１である、請求項１１に記載の組換え株。
【請求項１３】
前記ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸を含む前記発現カセットが導入された組換え株が、該発現カセットを発現するベクターが導入された組換え株である、
又は
前記融合タンパク質をコードする核酸を含む前記発現カセットが導入された組換え株が、該発現カセットを発現するベクターが導入された組換え株である、
請求項８〜１２のいずれか一項に記載の組換え株。
【請求項１４】
前記ゲルマクレンＡシンテターゼをコードする核酸を含む前記発現カセットが導入された組換え株が、該発現カセットを含むプラスミドが導入された組換え株である、
又は
前記融合タンパク質をコードする核酸を含む前記発現カセットが導入された組換え株が、該発現カセットを含むプラスミドが導入された、及び／又は該発現カセットがその染色体に組み込まれた組換え株である、
請求項８〜１３のいずれか一項に記載の組換え株。
【請求項１５】
前記元の酵母と比較してアルコールデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナ
ーゼ及びアセチル−ＣｏＡシンテターゼの含量及び／又は活性が増加した前記株が、前記元の酵母と比較してアルコールデヒドロゲナーゼをコードする核酸、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸及びアセチル−ＣｏＡシンテターゼをコードする核酸のコピー数が増加した株である、
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組換え株。
【請求項１６】
前記元の酵母と比較して前記アルコールデヒドロゲナーゼをコードする核酸、前記アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸、及び前記アセチル−ＣｏＡシンテターゼをコードする核酸のコピー数が増加した株が、前記アルコールデヒドロゲナーゼをコードする核酸の発現カセット、前記アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸の発現カセット、前記アセチル−ＣｏＡシンテターゼをコードする核酸の発現カセット、及び前記マーカー遺伝子が、相同組換えを用いて導入された前記元の酵母の株である、
請求項１５に記載の組換え株。
【請求項１７】
前記元の酵母がサッカロマイセス・セレビシエである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組換え株。
【請求項１８】
前記サッカロマイセス・セレビシエが、サッカロマイセス・セレビシエＮＫ２−ＳＱである、請求項１７に記載の組換え株。
【請求項１９】
前記サッカロマイセス・セレビシエＮＫ２−ＳＱが、サッカロマイセス・セレビシエＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１４８２９である、請求項１８に記載の組換え株。
【請求項２０】
β−エレメン及び／又はゲルマクレンＡの生産における使用のための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組換え株。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組換え株を用いる発酵によりゲルマクレンＡを得る工程を含む、ゲルマクレンＡの生産方法。
【請求項２２】
１）請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組換え株を用いる発酵により発酵産物を取得する工程、
２）前記発酵産物を有機溶媒で抽出し、有機相を回収する工程、及び
３）前記有機相を加熱してβ−エレメンを取得する工程、
を含む、
β−エレメンの生産方法。
【請求項２３】
前記発酵が、まず前記組換え株を種培地で培養して種液を得て、次いで前記種液を発酵培地に接種して発酵培養を行い、前記発酵培養の産物を得ることを含む、
請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記発酵培養の間、流加培地を前記発酵培養を行う発酵系に加える、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記発酵系内の溶存酸素値が６０％を超える場合に、前記発酵系内のグルコース濃度が５ｇ/Ｌに達するまで、前記流加培地を前記発酵系に添加する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２３に記載の方法であって、
前記種培地と前記発酵培地の調合物が、容量１Ｌにつき、２５ｇのグルコース、１５ｇの硫酸アンモニウム、６．１５ｇの硫酸マグネシウム七水和物、０．７２ｇの硫酸亜鉛七
水塩、８ｇのリン酸二水素カリウム、２ｍＬの塩化カルシウム母液、１０ｍＬの微量金属塩母液、１２ｍＬのビタミン母液、１ｇのトリプトファンを含み、
前記塩化カルシウム母液が、塩化カルシウム二水和物の１９．２ｇ/Ｌ水溶液であり、
前記微量金属塩母液の調合物が、容量１Ｌにつき、１９．１ｇのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、１０．２ｇの硫酸亜鉛七水塩、０．５ｇの塩化マンガン四水和物、０．８６ｇの塩化コバルト六水和物、０．７８ｇの硫酸銅五水和物、０．５６ｇのモリブデン酸ナトリウム二水和物、５．１２ｇの亜硫酸鉄７水和物を含み、
前記ビタミン母液の調合物が、容量１Ｌにつき、０．０５ｇのビオチン、０．２ｇのｐ−アミノ安息香酸ナトリウム、１ｇのナイアシン、１ｇのパントテン酸カルシウム、１ｇの塩酸ピリドキシン、１ｇのチアミン塩酸塩、２５ｇのイノシトールを含む、
方法。
【請求項２７】
前記流加培地の調合物が、容量１Ｌにつき、８００ｇのグルコース、５．１２５ｇの硫酸マグネシウム七水和物、３．５ｇの硫酸カリウム、０．２８ｇの硫酸ナトリウム、９ｇのリン酸二水素カリウム及び１ｇのトリプトファンを含む、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記有機溶媒がｎ−ドデカンであり、前記加熱の条件が１００〜３８０℃で１時間の加熱である、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
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