(57)【要約】  バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６から単離された部分精製細胞外代謝物の皮膚加齢を防ぐための使用を開示する。より詳細には、本発明は、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６から単離された細胞外代謝物の、ヒト皮膚線維芽細胞における抗コラゲナーゼ、抗エラスターゼ、抗糖化活性、ならびにＴＧＦ−β、上皮増殖因子およびヒアルロン酸の発現の増強を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における皮膚加齢を防ぐ方法であって、バチルス・コアグランスから単離された部分精製細胞外代謝物を含有する有効濃度の組成物を前記哺乳動物に投与して、皮膚老化の徴候および症状の減少をもたらすステップを含む方法。
【請求項２】
皮膚加齢の徴候および症状が、皺、皮膚のたるみ、乾燥、斑状皮膚、および筋からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組成物が、酵素コラゲナーゼおよびエラスターゼの活性を阻害し、糖化を阻害し、ＴＧＦ−β、上皮増殖因子およびヒアルロン酸の発現を増強することにより皮膚加齢を防ぐ、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
バチルス・コアグランスの株が、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
部分精製細胞外代謝調製物の有効濃度が、総組成物の０．０１％ｖ／ｖ〜２．０％ｖ／ｖである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
組成物が、医薬／薬用化粧品として許容される賦形剤、アジュバント、基剤、希釈剤、担体、調整剤、生物学的利用増強剤、酸化防止剤および保存剤と共に製剤化され、ならびに／またはアンチエイジング成分を含有する製剤に組み込まれ、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤、散剤、セラム、オイル、懸濁剤、軟膏剤、石けん、スクラブ剤、エマルジョン剤、およびコンパクトの形態で局所的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物が、好ましくはヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
皮膚線維芽細胞においてコラゲナーゼ活性を阻害する方法であって、バチルス・コアグランス由来の部分精製細胞外代謝調製物を含有する有効濃度の組成物と前記線維芽細胞を接触させて、前記線維芽細胞においてコラゲナーゼ阻害作用をもたらすステップを含む方法。
【請求項９】
部分精製細胞外代謝調製物の有効濃度が、総組成物の０．０１％ｖ／ｖ〜２．０％ｖ／ｖである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
バチルス・コアグランスの株が、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
皮膚線維芽細胞においてエラスターゼ活性を阻害する方法であって、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の有効濃度の細胞外代謝調製物と前記線維芽細胞を接触させて、前記線維芽細胞においてエラスターゼ阻害作用をもたらすステップを含む方法。
【請求項１２】
部分精製細胞外代謝調製物の有効濃度が、総組成物の０．０１％ｖ／ｖ〜２．０％ｖ／ｖである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
バチルス・コアグランスの株が、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
皮膚線維芽細胞において糖化を阻害する方法であって、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の有効濃度の細胞外代謝調製物と前記線維芽細胞を接触させて、前記線維芽細胞において抗糖化作用をもたらすステップを含む方法。
【請求項１５】
部分精製細胞外代謝調製物の有効濃度が、総組成物の０．０１％ｖ／ｖ〜２．０％ｖ／ｖである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
バチルス・コアグランスの株が、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
本発明は、２０１７年６月６日出願の米国仮特許出願第６２５１６０８３号および２０１７年６月６日出願の第６２５１６０７７号の非仮出願である。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、概して、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）ＭＴＣＣ５８５６から単離された細胞外代謝物の生物学的適用に関する。より詳細には、本発明は、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６から単離された細胞外代謝物のアンチエイジング能を開示する。
先行技術文献
年齢を経ると共に、ヒト皮膚は、加齢の徴候を可視的に露わにする、皺、たるみ、および弛緩の増加を含む多くの変化を受ける。ホルモン、皮膚関連ミクロフローラ、皮膚ｐＨ、角質層の脂質含量の低減、活性酸素種（ＲＯＳ）消去能の減少、メタロプテイナーゼ活性の増大、乾燥、弛緩、縮緬皺、および皮膚の委縮のような皮膚加齢に影響する多くの内的および外的因子が存在する。上記の因子の中でも、多くは自然のものであり、改変することができない。早期の皮膚加齢を引き起こし、また美しい皮膚加齢を導くように影響を及ぼすことできる他のいくつかの因子が存在する。
【０００３】
皮膚加齢を防ぐことは、現在、化粧品分野の業界関係者により広く標的とされており、現在、皮膚加齢を防ぐ天然産物に対する要件が増加している。プロバイオティクスは、現在、健康上有益であるため、スキンケア業界にこれまでのところ使用されている。加齢、美容、光損傷、および皮膚の健康におけるプロバイオティクスの役割は、以下の先行技術文献に十分に記載されている。
1. Sharma D, Kober MM and Bowe WP, Anti-Aging Effects of Probiotics, J Drugs Dermatol. 2016 Jan; 15(1):9-12
2. Benedetta Cinque, Paola Palumbo, Cristina La Torre, Esterina Melchiorre, Daniele Corridoni, Gianfranca Miconi, Luisa Di Marzio, Maria Grazia Cifone and Maurizio Giuliani, Probiotics in Aging Skin, Textbook of Aging Skin, pp.1315-1327
3. Probiotics Provide Anti Aging Defense, LIFE EXTENSION MAGAZINE, October 2015
http://www.lifeextension.com/Magazine/2015/10/Probiotics-Provide-Anti-Aging-Defense/Page-01, accessed 24 May 2018.
【０００４】
プロバイオティクスおよびその細胞外代謝物はともに、現在、スキンケア製品に組み込まれている（Katie Schaefer, Anti-aging Probiotic from Bacillus coagulans, https://www.cosmeticsandtoiletries.com/formulating/function/active/142099203.html, March 9, 2012, accessed 26 May 2018）。しかし、プロバイオティクスまたはその産物の生物学的作用が、株特異的であり、属、種および株の間で一般化することができないことが当科学技術分野において周知である（Probiotics: In Depth/NCCIH, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health）。したがって、皮膚加齢のすべての徴候を効果的に低減させるのに使用可能な優れたプロバイオティクス株、および細胞外産物を見出すことが必要とされている。本発明は、バチルス・コアグランスの部分精製細胞外代謝調製物の、皮膚加齢の低減に対する有益な作用を開示することにより上述の課題を解決する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の原理的目的は、コラゲナーゼおよびエラスターゼの活性を阻害し、ＴＧＦ−β、上皮増殖因子およびヒアルロン酸の発現を増加させることによる、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６の細胞外代謝調製物を含有する組成物のアンチエイジング活性を開示することである。
本発明の別の目的は、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６の細胞外代謝調製物を含有する組成物の抗糖化活性を開示することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上述の目的を満たし、さらに関連する利点をもたらす。
生物学的材料の寄託
本出願において言及する、受託番号ＭＴＣＣ５８５６を有する生物学的材料であるバチルス・コアグランスの寄託は、２０１３年９月１９日にＭｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ＆  Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ（ＭＴＣＣ）、ＣＳＩＲ−Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｅｃｔｏｒ  ３９−Ａ、Ｃｈａｎｄｉｇａｒｈ−１６００３６、Ｉｎｄｉａにおいてなされている。
本発明は、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６から単離された部分精製細胞外代謝物の皮膚加齢を防ぐ能力を開示する。より詳細には、本発明は、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６から単離された細胞外代謝物の、ヒト皮膚線維芽細胞における、抗コラゲナーゼ、抗エラスターゼ、抗糖化活性、ならびにＴＧＦ−β、上皮増殖因子、およびヒアルロン酸の発現の増強を開示する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６から単離された部分精製細胞外代謝物によるコラゲナーゼ活性の阻害率％のグラフ表示である。
【図２】バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６から単離された部分精製細胞外代謝物によるエラスターゼ活性の阻害率％のグラフ表示である。
【図３】バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６から単離された部分精製細胞外代謝物による、ヒト皮膚線維芽細胞における、ＴＧＦ−β、上皮増殖因子およびヒアルロン酸の発現の増加のグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
最も好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物における皮膚加齢を防ぐ方法であって、バチルス・コアグランスから単離された部分精製細胞外代謝物を含有する有効濃度の組成物を前記哺乳動物に投与して、皮膚老化の徴候および症状の減少をもたらすステップを含む方法を開示する。関連する実施形態では、皮膚加齢の徴候および症状は、皺、皮膚のたるみ、乾燥、斑状皮膚、および筋（ｌｉｎｅ）からなる群から選択される。別の関連する実施形態では、酵素コラゲナーゼおよびエラスターゼの活性を阻害し、糖化を阻害し、ＴＧＦ−β、上皮増殖因子およびヒアルロン酸の発現を増強することにより皮膚加齢を防ぐ。別の関連する実施形態では、バチルス・コアグランスの株は、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である。別の関連する実施形態では、部分精製細胞外代謝調製物の有効濃度は、総組成物の０．０１％ｖ／ｖ〜２．０％ｖ／ｖである。さらに別の関連する実施形態では、組成物は、医薬／薬用化粧品として許容される賦形剤、アジュバント、基剤、希釈剤、担体、調整剤、生物学的利用増強剤、酸化防止剤および保存剤と共に製剤化され、ならびに／またはアンチエイジング成分を含有する製剤に組み込まれ、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤、散剤、セラム、オイル、懸濁剤、軟膏剤、石けん、スクラブ剤、エマルジョン剤、およびコンパクトの形態で局所的に投与される。関連する実施形態では、哺乳動物は、好ましくはヒトである。
【０００９】
別の態様では、本発明は、皮膚線維芽細胞においてコラゲナーゼ活性を阻害する方法であって、バチルス・コアグランス由来の部分精製細胞外代謝調製物を含有する有効濃度の組成物と前記線維芽細胞を接触させて、前記線維芽細胞においてコラゲナーゼ阻害作用をもたらすステップを含む方法に関する。別の関連する実施形態では、部分精製細胞外代謝調製物の有効濃度は、総組成物の０．０１％ｖ／ｖ〜２．０％ｖ／ｖである。別の関連する実施形態では、バチルス・コアグランスの株は、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である。
別の好ましい実施形態では、本発明は、皮膚線維芽細胞においてエラスターゼ活性を阻害する方法であって、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の有効濃度の細胞外代謝調製物と前記線維芽細胞を接触させて、前記線維芽細胞においてエラスターゼ阻害作用をもたらすステップを含む方法に関する。別の関連する実施形態では、部分精製細胞外代謝調製物の有効濃度は、総組成物の０．０１％ｖ／ｖ〜２．０％ｖ／ｖである。別の関連する実施形態では、バチルス・コアグランスの株は、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である。
【００１０】
別の好ましい実施形態では、本発明は、皮膚線維芽細胞において糖化を阻害する方法であって、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の有効濃度の細胞外代謝調製物と前記線維芽細胞を接触させて、前記線維芽細胞において抗糖化作用をもたらすステップを含む方法に関する。別の関連する実施形態では、部分精製細胞外代謝調製物の有効濃度は、総組成物の０．０１％ｖ／ｖ〜２．０％ｖ／ｖである。別の関連する実施形態では、バチルス・コアグランスの株は、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である。
別の好ましい実施形態では、本発明は、ヒト皮膚線維芽細胞においてＴＧＦ−β、上皮増殖因子およびヒアルロン酸の発現を増強する方法であって、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の有効濃度の細胞外代謝調製物と前記線維芽細胞を接触させて、アンチエイジング作用に関連する遺伝子の発現の増加をもたらすステップを含む方法に関する。
最も好ましい実施形態を表明する詳細で説明的な例は、以下に含まれる。
（実施例１）
抗コラゲナーゼ活性
細胞外代謝物の単離
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の細胞外代謝物は、ＵＳ９５９６８６１に概要を述べるステップに従って単離した。製品は、ＬＡＣＴＯＳＰＯＲＩＮ（登録商標）（ＩＮＣＩ：バチルス発酵濾過抽出液）の商標でＳａｂｉｎｓａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国から市販されている。
【００１１】
材料と方法
コラゲナーゼは、コラーゲンおよび細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の他の構成成分を分解する、マトリクスメタロプロテアーゼの１つである。ＥＣＭは、足場として作用して皮膚構造を安定化させ、また、皮膚細胞の増殖および代謝機能に役立つ。コラーゲンが減少すると、皺および皮膚のたるみが生じる。コラゲナーゼ阻害アッセイの原理は、基質ＤＱ（商標）ゼラチンが、蛍光化合物であるフルオレセインと共役することに基づいている。ＤＱ（商標）ゼラチンにおいて、蛍光は、消光する。ＤＱ（商標）ゼラチンは、コラゲナーゼにより効率的に分解されて、測定可能な蛍光化合物を生じる。蛍光の増加は、酵素活性に比例する。抗コラゲナーゼ化合物の存在下では、蛍光の量は、一定濃度の酵素および基質において減少し得る。
【００１２】
材料
装置−ＢＭＧ  ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ（蛍光マイクロプレートリーダー）
試薬：リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
コラゲナーゼ酵素アッセイキット（Ｅｎｚｃｈｅｋ（登録商標）コラゲナーゼ、ゼラチナーゼアッセイキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）
マイクロタイタープレート−９６ウェルマイクロタイタープレート（黒）−Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国
アッセイは、９６ウェルの黒色マイクロタイタープレートで行った。クロストリジウム・ヒストリチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のタイプＩＶを、基質としてＤＱゼラチンとともにアッセイに使用した。様々な濃度のＬＡＣＴＯＳＰＯＲＩＮ（登録商標）（８０μｌ）をゼラチン基質２０μｌ（１２．５μｇ／ｍｌ）で事前にインキュベートした。コラゲナーゼ酵素溶液１００μｌ（最終濃度−０．４Ｕ／ｍｌ）を加え、３０分後に蛍光強度をＥｍ：４８５ｎｍおよびＥｘ：５２０ｎｍで測定した。対照（緩衝液）の酵素活性を記録した。
【００１３】
阻害率は、次のように算出する：−
（Ｂ−ＢＣ）−（Ｔ−Ｃ）
阻害率％＝--------------------------×１００
（Ｂ−ＢＣ）
Ｂ−酵素存在下における蛍光
ＢＣ−酵素活性の非存在下における蛍光
Ｔ−阻害物質存在下における酵素活性の蛍光
ＴＣ−阻害物質単独の蛍光
結果
細胞外代謝物は、ＩＣ50（酵素活性の５０％阻害）が１．８％の用量依存性の抗コラゲナーゼ活性を示たであった（図１）。結果は、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６から単離された細胞外代謝物が、皮膚の細胞外マトリクスを保存して皺の形成および皮膚のたるみを防ぎ、これにより皮膚加齢を防ぐことができることを明らかにした。
【００１４】
（実施例２）
抗エラスターゼ活性
細胞外代謝物の単離
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の細胞外代謝物は、ＵＳ９５９６８６１に概要を述べるステップに従って単離した。製品は、ＬＡＣＴＯＳＰＯＲＩＮ（登録商標）（ＩＮＣＩ：バチルス発酵濾過抽出液）の商品名でＳａｂｉｎｓａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国から市販されている。
【００１５】
材料および方法
エラスターゼは、エラスチンおよび細胞外マトリクスの他の成分を分解する、マトリクスメタロプロテアーゼの１つであり、ともに正常な皮膚の発達に重要である。この酵素が阻害物質により調節されない場合、タンパク質は、皮膚の皺、早期加齢および発癌をもたらす。Ｅｎｚ  Ｃｈｅｋエラスターゼアッセイキットによる抗エラスターゼアッセイにより、産物のエラスターゼ阻害活性を判定する。アッセイは、Ｅｎｚ  Ｃｈｅｋエラスターゼアッセイキットを使用して行った。基質は、ＤＱエラスチン可溶性ウシ頸部靭帯である。ＤＱエラスチンは、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ色素で標識する。無蛍光基質は、エラスターゼにより分解されて、強い蛍光を発する断片を生じ得、阻害物質の存在下では、蛍光強度は弱められる。蛍光強度をマイクロプレートリーダーで測定した（４８５ｎｍで発光および５２０ｎｍで励起）。
【００１６】
材料
装置−ＢＭＧ  ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ（蛍光マイクロプレートリーダー）
試薬：リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
コラゲナーゼ酵素アッセイキット（Ｅｎｚｃｈｅｋ（登録商標）コラゲナーゼ、ゼラチナーゼアッセイキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）
マイクロタイタープレート−９６ウェルマイクロタイタープレート（黒）−Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国
アッセイは、９６ウェルの黒色マイクロタイタープレートで行った。ブタ膵臓由来のエラスターゼ酵素および基質としてのＤＱエラスチンをアッセイに使用した。様々な濃度のＬＡＣＴＯＳＰＯＲＩＮ（登録商標）（５０μｌ）をエラスチン基質５０μｌ（２５μｇ／ｍｌ）で事前にインキュベートした。エラスターゼ酵素溶液１００μｌ（最終濃度−０．１Ｕ／ｍｌ）を加え、３０分後に蛍光強度をＥｍ：４８５ｎｍおよびＥｘ：５２０ｎｍで測定した。対照（緩衝液）の酵素活性を記録した。
【００１７】
阻害率は、次のように算出する：−
（Ｂ−ＢＣ）−（Ｔ−Ｃ）
阻害率％＝--------------------------×１００
（Ｂ−ＢＣ）
Ｂ−酵素存在下における蛍光
ＢＣ−酵素活性の非存在下における蛍光
Ｔ−阻害物質存在下における酵素活性の蛍光
ＴＣ−阻害物質単独の蛍光
結論
細胞外代謝物は、ＩＣ50（酵素活性の５０％阻害）が１．８％の用量依存性の抗エラスターゼ活性を示した（図２）。結果は、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６から単離された細胞外代謝物が、エラスターゼ酵素を阻害することにより、皮膚の細胞外マトリクスを保存して皺の形成および皮膚のたるみを防ぎ、これにより皮膚加齢を防ぐことができることを明らかにした。
【００１８】
（実施例３）
抗糖化
細胞外代謝物の単離
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の細胞外代謝物は、ＵＳ９５９６８６１に概要を述べるステップに従って単離した。製品は、ＬＡＣＴＯＳＰＯＲＩＮ（登録商標）（ＩＮＣＩ：バチルス発酵濾過抽出液）の商品名でＳａｂｉｎｓａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国から市販されている。
【００１９】
材料および方法
高度糖化最終産物（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）（ＡＧＥ）は、メイラード反応としても知られる、タンパク質のアミノ基（主にリシンとアルギニン）と還元糖のカルボニル基との間の非酵素的付加物形成により生成される。初期では、還元糖は、遊離のアミノ基と反応して、不安定なアルジミン化合物を形成し、これは分子内転位を受けて、アマドリ産物としても知られる安定な初期糖化産物を形成する。後期では、酸化、脱水および環化反応による糖化プロセスにより、ＡＧＥとしても知られる高度糖化最終産物が形成される。Ｎε−（カルボシキメチル）−リシン（ＣＭＬ）、ピラリン（ｐｙｒｒａｌｉｎｅ）、ペントシジンのようなＡＧＥの種々の構造は、加齢、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、および腎不全を含む、変性障害と関連することで知られる。皮膚加齢にも関係づけられるＡＧＥは、老化も光加齢もした皮膚の両方を生じるＵＶ照射の結果を蓄積する。
【００２０】
ＡＧＥは、本質的に、蛍光性であると同時に非蛍光性であり得る。典型的には、下に示す典型的構造を有するヴェスパーリシン（ｖｅｓｐｅｒｌｙｓｉｎｅ ）型のＡＧＥは、３７０ｎｍ〜で励起および４４０ｎｍで発光を有し、一方、ペントシジン様ＡＧＥは、３３５ｎｍで励起および３８５ｎｍ発光を有する。原理は、リボース糖およびウシ血清アルブミンを特定の比率で混合し、２４時間インキュベートすることに基づいている。反応により形成されるヴェスパーリシン様ＡＧＥは、３９０／４６０ｎｍのＥｘ／Ｅｍで検出される蛍光の増加により推定され、ペントシジンは、３２０／４０５ｎｍのＥｘ／Ｅｍで検出された。
材料
リボース、ウシ血清アルブミン、９６ウェルの黒色マイクロタイタープレート
リボース−ＢＳＡ方法：様々な濃度の試料１０μｌをＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、２５ｍｇ／ｍｌの原液）４０μｌに加え、Ｄリボース（１５０ｍｇ／ｍｌの原液）５０μｌを黒色９６ウェルマイクロプレートのウェル毎に加えて３７℃で２４時間インキュベートした。試料は、ＢＳＡ単独に対照として採取する。形成されたＡＧＥ（高度糖化最終産物）を、ヴェスパーリシンは３９０／４６０ｎｍのＥｘ／Ｅｍにおいて、ペントシジンＡＧＥは３２０／４０５ｎｍのＥｘ／Ｅｍにおいて、蛍光検出した。
【００２１】
結果
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の細胞外代謝調製物によるＡＧＥヴェスパーリシンおよびペントシジンの阻害率を表１に作表する。
【表１】
2020524662.tif 000002
結果
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の細胞外代謝調製物は、５０％阻害が０．７％のヴェスパーリシン型高度糖化最終産物形成の顕著な阻害を示した。また、代謝物は、ペントシジン型ＡＧＥ形成を２％の濃度で４１．７５％阻害することが見出され、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の細胞外代謝調製物が、種々の型の糖化最終産物を防ぐ能力を有し、したがって糖化の破壊作用から防御して、皮膚の治癒を高めるのに役立ち、これにより皮膚加齢を防ぐことができることを示した。
【００２２】
（実施例４）
遺伝子発現
細胞外代謝物の単離
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の細胞外代謝物は、ＵＳ９５９６８６１に概要を述べるステップに従って単離した。製品は、ＬＡＣＴＯＳＰＯＲＩＮ（登録商標）（ＩＮＣＩ：バチルス発酵濾過抽出液）の商品名でＳａｂｉｎｓａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国から市販されている。
【００２３】
材料および方法
皮膚線維芽細胞は、皮膚の構造的完全性のための重要な細胞構成成分である。細胞外マトリクスは、コラーゲン、エラスチンおよびヒアルロンを含有し、これらは皮膚の完全性を決定する。ＵＤＰグルコサミンおよびＵＤＰグルクロン酸残基を増殖するＨＡポリマー鎖に加えるヒアルロナンシンターゼによりヒアルロナン（ＨＡ）を合成した。形質転換増殖因子（ＴＧＦ）βは、ＥＣＭ生合成において中心的役割を果たし、コラーゲンの合成と分解の両方を制御することによりコラーゲンホメオスタシスを調節する。上皮増殖因子は、細胞増殖を刺激し、コラーゲン合成を誘導する。
材料：ヒト皮膚線維芽細胞、６ウェルのマイクロタイタープレート、線維芽細胞増殖培地、トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）、合成キット、ＲＴ−ＰＣＲ用ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ
【００２４】
方法：
ヒト皮膚線維芽細胞を６ウェルのマイクロタイタープレート中、０．２５％のバチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来細胞外代謝物の存在下で２４時間培養した。無処理細胞を対照として使用した。インキュベーション時間の終了時に、細胞を溶解してＲＮＡを抽出した。
ＲＮＡ抽出
７日目の第２の増悪後に細胞を採取し、トリゾール法を使用して全ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡをＤＮＡｓｅＩで処理して、混入するＤＮＡを除去し、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール抽出物（２４：２５：１）を使用して再び抽出した。ＲＮＡの質は、２６０／２８０ｎｍでの吸光度をＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して調べることにより判定した。
【００２５】
定量的リアルタイムＰＣＲ
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用したｃＤＮＡ合成のために全ＲＮＡ  ２μｇを採取した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を行って、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔ  ｃｙｃｌｅｒ  ９６においてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して褐色脂肪特異的遺伝子の発現を判定した。βアクチンをハウスキーピング遺伝子として使用した。遺伝子の相対ＲＮＡ存在量をハウスキーピングβアクチン遺伝子に対して正規化し、デルタ  デルタＣＴ（Ｌｏｇ2により変換した倍率変化に等しい）として表した。表２は、発現試験に使用するプライマーの列挙を示す。
【００２６】
【表２】
2020524662.tif 000003
結果
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の細胞外代謝調製物は、ヒト皮膚線維芽細胞においてヒアルロン酸シンターゼ（２．１４倍）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−β（１．８倍）および上皮増殖因子（２．９４倍）の顕著な増強を示し、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の細胞外代謝調製物が、細胞外マトリクスの完全性の維持に関する遺伝子の発現を増加させる能力を有することを示した。細胞外マトリクス（ＥＣＭ）は、構造をもたらし、皮膚細胞を支持し、引張強度および硬度を皮膚に付与し、したがって皮膚をより若々しく見せる。
【００２７】
（実施例５）
バチルス・コアグランス由来の細胞外代謝調製物を含有する、皮膚加齢を防ぐための製剤。
バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の細胞外代謝物を含有する組成物は、医薬／薬用化粧品として許容される賦形剤、アジュバント、基剤、希釈剤、担体、調整剤、生物学的利用増強剤、酸化防止剤および保存剤と共に製剤化し、ならびに／またはアンチエイジング成分を含有する製剤に組み込み、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤、散剤、セラム、オイル、懸濁剤、軟膏剤、石けん、スクラブ剤、エマルジョン剤、およびコンパクトの形態で局所的に投与することができる。
【００２８】
関連する態様では、１つまたは複数のアンチエイジングスキンケア成分は、アルファリポ酸、オキシレスベラトロール、ビート根抽出物、ボスウェリア・セラータ（Ｂｏｓｗｅｌｌｉａ  ｓｅｒｒａｔａ）抽出物、βボスウェル酸、ボスウェリア・セラータオイル、ツボクサ（Ｃｅｎｔｅｌｌａ  ａｓｉａｔｉｃａ  ）抽出物、トリテルペン、ガルシニア・インディカ（Ｇａｒｃｉｎｉａ  ｉｎｄｉｃａ）抽出物、アントシアニン、ココヤシ（Ｃｏｃｏｓ  ｎｕｃｉｆｅｒａ）抽出物および果汁、コレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ  ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）抽出物、フォルスコリン、コレウス・フォルスコリオイル、テトラヒドロピペリン、エラグ酸、没食子（Ｇａｌｌｎｕｔ）抽出物、ポリフェノール、ガランガ（Ｇａｌａｎｇａ）抽出物、グリチルリジン酸、緑茶抽出物、没食子酸エピガロカテキン、甘草抽出物、グリチルリチン酸モノアンモニウム、リモノイド、オレアノール酸、化粧品ペプチド（Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒに連結するオレアノール酸、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓに連結するオレアノール酸）、オレウロペイン、ピペルロンミン（Ｐｉｐｅｒ  ｌｏｎｇｕｍｉｎｅ）抽出物、ピペリン、エラグ酸、ザクロ抽出物（水溶性）、プテロスチルベン（Ｐｉｐｅｒ  ｌｏｎｇｕｍｉｎｅ）、レスベラトロール、コウキ（Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓ  ｓａｎｔａｌｉｎｕｓ）抽出物、ローズマリー抽出物、ロスマリン酸、アムラ（Ａｍｌａ）抽出物、ベータグルコガリン、テトラヒドロクルクミン、サルビア・オフィシナリス（Ｓａｌｖｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）（セージ）葉抽出物、ウルソル酸、サポニン、セサムム・インディカム（Ｓｅｓａｍｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍ）（ゴマ）種子抽出物、セサミンおよびセサモリン（ｓｅｓａｍｏｌｉｎ）、モリンガオイル、モリンガ種子抽出物、セイヨウトチノキ抽出物、ハマゴウ（Ｖｉｔｅｘ）オイル、キシメニン酸、エチルアスコルビン酸、アルガンオイル、レモン果皮抽出物、ターメリックオイル、オオムギベータグルカン、コエンザイムＱ１０、オリーブオイル、アボカドオイルならびにクランベリーオイルからなる群から選択されるが、これらに制限されない。
【００２９】
別の関連する態様では、１つまたは複数の酸化防止剤および抗炎症剤は、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｃ、Ｂ複合体、ロスマリン酸、アルファリポ酸、オキシレスベラトロール、エラグ酸、グリチルリジン酸、没食子酸エピガロカテキン、植物ポリフェノール、グラブリジン、モリンガオイル、オレアノール酸、オレウロペイン、カルノシン酸（Ｃａｒｎｏｓｉｃ  ａｃｉｄ）、ウロカニン酸、フィトエン、リポ酸（ｌｉｐｏｉｄ  ａｃｉｄ）、リポアミド、フェリチン、デスフェラール、ビリルビン（ｂｉｌｌｉｒｕｂｉｎ）、ビリベルジン（ｂｉｌｌｉｖｅｒｄｉｎ）、メラニン、ユビキノン、ユビキノール、パルミチン酸アスコルビル、リン酸アスコルビルＭｇ、酢酸アスコルビル、トコフェロールおよび誘導体、例えば、酢酸ビタミンＥ、尿酸、α−グルコシルルチン（α−ｇｌｕｃｏｓｙｌｒｕｔｉｎ）、カタラーゼ（ｃａｌａｌａｓｅ）およびスーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオン、セレン化合物、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、二亜硫酸ナトリウム（ＳＭＢ）、没食子酸プロピル（ＰＧ）ならびにアミノ酸システインからなる群から選択されるが、これらに制限されない。
【００３０】
別の関連する態様では、１つまたは複数の生物学的利用増強剤は、ピペリン、テトラヒドロピペリン、ケルセチン、ニンニク抽出物、ショウガ抽出物、およびナリンギンの群から選択されるが、これらに制限されない。
表３〜７は、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の部分精製細胞外代謝調製物（バチルス発酵濾過抽出液）を含有するアンチエイジングスキンケア製剤の説明的な例を提供する。
【００３１】
【表３】
2020524662.tif 000004
*- Sabinsa Corporationの登録商標
# - Greentechの登録商標
【００３２】
【表４】
2020524662.tif 000005
*-Sabinsa Corporationの登録商標
# -Greentechの登録商標
【００３３】
【表５】
2020524662.tif 000006
*-Sabinsa Corporationの登録商標
# -Greentechの登録商標
【００３４】
【表６】
2020524662.tif 000007
*-Sabinsa Corporationの登録商標
# -Greentechの登録商標
【００３５】
【表７】
2020524662.tif 000008
上記の製剤は、単なる説明的な例であり、前記目的を意図する、上記の有効成分を含有する、いかなる製剤も等価であるとみなされる。
【００３６】
本発明に対する他の修飾および変形は、前述の開示および教示により当業者に明らかとなる。したがって、本発明のある特定の実施形態のみが、本明細書において詳細に記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、多数の修飾が、そこになされ得ることが明らかとなる。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲と関連する場合にのみ解釈される。
【図１】
2020524662.tif 000009
【図２】
2020524662.tif 000010
【図３】
2020524662.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月15日(2020.1.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における皮膚加齢を防ぐための組成物であって、バチルス・コアグランスから単離された部分精製細胞外代謝物を有効濃度で含有し、皮膚老化の徴候および症状の減少をもたらす、前記組成物。
【請求項２】
皮膚加齢の徴候および症状が、皺、皮膚のたるみ、乾燥、斑状皮膚、および筋からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、酵素コラゲナーゼおよびエラスターゼの活性を阻害し、糖化を阻害し、ＴＧＦ−β、上皮増殖因子およびヒアルロン酸の発現を増強することにより皮膚加齢を防ぐ、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
バチルス・コアグランスの株が、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
部分精製細胞外代謝調製物の有効濃度が、総組成物の０．０１％ｖ／ｖ〜２．０％ｖ／ｖである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、医薬／薬用化粧品として許容される賦形剤、アジュバント、基剤、希釈剤、担体、調整剤、生物学的利用増強剤、酸化防止剤および保存剤と共に製剤化され、ならびに／またはアンチエイジング成分を含有する製剤に組み込まれた、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤、散剤、セラム、オイル、懸濁剤、軟膏剤、石けん、スクラブ剤、エマルジョン剤、およびコンパクトの形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
皮膚線維芽細胞においてコラゲナーゼ活性を阻害するための組成物であって、バチルス・コアグランス由来の部分精製細胞外代謝調製物を有効濃度で含有し、前記線維芽細胞を接触させた際に前記線維芽細胞においてコラゲナーゼ阻害作用をもたらす、前記組成物。
【請求項９】
部分精製細胞外代謝調製物の有効濃度が、総組成物の０．０１％ｖ／ｖ〜２．０％ｖ／ｖである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
バチルス・コアグランスの株が、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
皮膚線維芽細胞においてエラスターゼ活性を阻害するための組成物であって、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の細胞外代謝調製物を有効濃度で含有し、前記線維芽細胞を接触させた際に前記線維芽細胞においてエラスターゼ阻害作用をもたらす、前記組成物。
【請求項１２】
部分精製細胞外代謝調製物の有効濃度が、総組成物の０．０１％ｖ／ｖ〜２．０％ｖ／ｖである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
バチルス・コアグランスの株が、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
皮膚線維芽細胞において糖化を阻害するための組成物であって、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の細胞外代謝調製物を有効濃度で含有し、前記線維芽細胞を接触させた際に前記線維芽細胞において抗糖化作用をもたらす、前記組成物。
【請求項１５】
部分精製細胞外代謝調製物の有効濃度が、総組成物の０．０１％ｖ／ｖ〜２．０％ｖ／ｖである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
バチルス・コアグランスの株が、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
非ヒト哺乳動物における皮膚加齢を防ぐ方法であって、バチルス・コアグランスから単離された部分精製細胞外代謝物を含有する有効濃度の組成物を前記非ヒト哺乳動物に投与して、皮膚老化の徴候および症状の減少をもたらすステップを含む方法。
【請求項１８】
皮膚線維芽細胞においてコラゲナーゼ活性を阻害する方法であって、バチルス・コアグランス由来の部分精製細胞外代謝調製物を含有する有効濃度の組成物と前記線維芽細胞を接触させて、前記線維芽細胞においてコラゲナーゼ阻害作用をもたらすステップを含み、ヒトに適用する方法を除く、方法。
【請求項１９】
皮膚線維芽細胞においてエラスターゼ活性を阻害する方法であって、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の有効濃度の細胞外代謝調製物と前記線維芽細胞を接触させて、前記線維芽細胞においてエラスターゼ阻害作用をもたらすステップを含み、ヒトに適用する方法を除く、方法。
【請求項２０】
皮膚線維芽細胞において糖化を阻害する方法であって、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の有効濃度の細胞外代謝調製物と前記線維芽細胞を接触させて、前記線維芽細胞において抗糖化作用をもたらすステップを含み、ヒトに適用する方法を除く、方法。
【請求項２１】
哺乳動物における皮膚加齢を防ぎ、皮膚老化の徴候および症状の減少をもたらすために使用するための医薬を調製するための、バチルス・コアグランスから単離された部分精製細胞外代謝物を含有する有効濃度の組成物の使用。
【請求項２２】
皮膚線維芽細胞においてコラゲナーゼ活性を阻害し、前記線維芽細胞においてコラゲナーゼ阻害作用をもたらすために使用するための医薬を調製するための、バチルス・コアグランス由来の部分精製細胞外代謝調製物を含有する有効濃度の組成物の使用。
【請求項２３】
皮膚線維芽細胞においてエラスターゼ活性を阻害し、前記線維芽細胞においてエラスターゼ阻害作用をもたらすために使用するための医薬を調製するための、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の有効濃度の細胞外代謝調製物の使用。
【請求項２４】
皮膚線維芽細胞において糖化を阻害し、前記線維芽細胞において抗糖化作用をもたらすために使用するための医薬を調製するための、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の有効濃度の細胞外代謝調製物の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
本発明に対する他の修飾および変形は、前述の開示および教示により当業者に明らかとなる。したがって、本発明のある特定の実施形態のみが、本明細書において詳細に記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、多数の修飾が、そこになされ得ることが明らかとなる。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲と関連する場合にのみ解釈される。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕哺乳動物における皮膚加齢を防ぐ方法であって、バチルス・コアグランスから単離された部分精製細胞外代謝物を含有する有効濃度の組成物を前記哺乳動物に投与して、皮膚老化の徴候および症状の減少をもたらすステップを含む方法。
〔２〕皮膚加齢の徴候および症状が、皺、皮膚のたるみ、乾燥、斑状皮膚、および筋からなる群から選択される、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕組成物が、酵素コラゲナーゼおよびエラスターゼの活性を阻害し、糖化を阻害し、ＴＧＦ−β、上皮増殖因子およびヒアルロン酸の発現を増強することにより皮膚加齢を防ぐ、前記〔１〕に記載の方法。
〔４〕バチルス・コアグランスの株が、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である、前記〔１〕に記載の方法。
〔５〕部分精製細胞外代謝調製物の有効濃度が、総組成物の０．０１％ｖ／ｖ〜２．０％ｖ／ｖである、前記〔１〕に記載の方法。
〔６〕組成物が、医薬／薬用化粧品として許容される賦形剤、アジュバント、基剤、希釈剤、担体、調整剤、生物学的利用増強剤、酸化防止剤および保存剤と共に製剤化され、ならびに／またはアンチエイジング成分を含有する製剤に組み込まれ、クリーム剤、ゲル剤、ローション剤、散剤、セラム、オイル、懸濁剤、軟膏剤、石けん、スクラブ剤、エマルジョン剤、およびコンパクトの形態で局所的に投与される、前記〔１〕に記載の方法。
〔７〕哺乳動物が、好ましくはヒトである、前記〔１〕に記載の方法。
〔８〕皮膚線維芽細胞においてコラゲナーゼ活性を阻害する方法であって、バチルス・コアグランス由来の部分精製細胞外代謝調製物を含有する有効濃度の組成物と前記線維芽細胞を接触させて、前記線維芽細胞においてコラゲナーゼ阻害作用をもたらすステップを含む方法。
〔９〕部分精製細胞外代謝調製物の有効濃度が、総組成物の０．０１％ｖ／ｖ〜２．０％ｖ／ｖである、前記〔８〕に記載の方法。
〔１０〕バチルス・コアグランスの株が、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である、前記〔８〕に記載の方法。
〔１１〕皮膚線維芽細胞においてエラスターゼ活性を阻害する方法であって、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の有効濃度の細胞外代謝調製物と前記線維芽細胞を接触させて、前記線維芽細胞においてエラスターゼ阻害作用をもたらすステップを含む方法。
〔１２〕部分精製細胞外代謝調製物の有効濃度が、総組成物の０．０１％ｖ／ｖ〜２．０％ｖ／ｖである、前記〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕バチルス・コアグランスの株が、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である、前記〔１１〕に記載の方法。
〔１４〕皮膚線維芽細胞において糖化を阻害する方法であって、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６由来の有効濃度の細胞外代謝調製物と前記線維芽細胞を接触させて、前記線維芽細胞において抗糖化作用をもたらすステップを含む方法。
〔１５〕部分精製細胞外代謝調製物の有効濃度が、総組成物の０．０１％ｖ／ｖ〜２．０％ｖ／ｖである、前記〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕バチルス・コアグランスの株が、バチルス・コアグランスＭＴＣＣ５８５６である、前記〔１４〕に記載の方法。
【国際調査報告】
2020524662.tif 000012
2020524662.tif 000013