(57)【要約】ＣＤ１９及びＨｅｒ２に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＮＫ細胞と、当該ＮＫ細胞に対して毒性を及ぼさずに、腫瘍細胞を抑制または死滅させる１つまたは複数の抗がん治療薬の有効量を担持させた複数の細胞表面結合多層リポソーム小胞とを含む組成物を提供する。ＣＡＲ操作ＮＫ細胞の有効量を投与することを含む、腫瘍を有する対象を処置するために前記組成物を使用する方法も提供し、ここで、抗腫瘍治療薬の有効量は、担体ＮＫ細胞に対して毒性を及ぼさずに、これらのＣＡＲ操作ＮＫ細胞の表面に結合している粒子（例えば、架橋した多層リポソーム小胞）で送達される。2020524992.tif 000003
2020524992.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と、
前記ＮＫ細胞の表面に結合した複数のナノ粒子と
を含む、操作された免疫エフェクター細胞であって、
前記ＮＫ細胞は、細胞外抗原特異的ドメインを含む１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含有し、かつ
前記複数のナノ粒子は、ＮＫ細胞の集団に対する細胞傷害性をもたらさないまたは１５％未満の細胞傷害性をもたらす量の化学療法剤を封入している、
前記操作された免疫エフェクター細胞。
【請求項２】
複数の、請求項１に記載の操作された免疫エフェクター細胞を含む、細胞集団であって、
各々の操作された免疫エフェクター細胞が、
ａ．細胞外抗原特異的ドメインを含む１つまたは複数のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と、
ｂ．前記ＮＫ細胞の表面に結合した複数のナノ粒子であって、少なくとも１つのナノ粒子が化学療法剤を封入している、前記ナノ粒子と
を含み、
前記複数の操作された免疫エフェクター細胞に対する細胞傷害性をもたらさないまたは１５％未満の細胞傷害性をもたらすが、腫瘍細胞の抑制または死滅に有効である、前記化学療法剤の総量を、前記細胞集団が有する、
前記細胞集団。
【請求項３】
前記ナノ粒子が、架橋した多層リポソーム小胞（ｃＭＬＶ）を含むリポソームである、請求項１に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
【請求項４】
前記ＣＡＲが、ＣＤ１９に結合する、請求項１に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
【請求項５】
前記ＣＡＲが、Ｈｅｒ２に結合する、請求項１に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
【請求項６】
前記ＣＡＲが、二重特異性ＣＡＲであり、かつＣＤ１９及びＨｅｒ２に結合する、請求項１に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
【請求項７】
前記ナノ粒子が、ｃＭＬＶであり、かつ前記化学療法剤が、パクリタキセルである、請求項１に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
【請求項８】
前記ナノ粒子が、ｃＭＬＶであり、かつ前記ｃＭＬＶが、１００：１〜１５０：１の個数の比で、前記ＮＫ細胞の表面に化学的に結合している、請求項１に記載の操作された免疫エフェクター細胞。
【請求項９】
請求項１に記載の操作された免疫エフェクター細胞、及び医薬として許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
請求項２に記載の細胞集団、及び医薬として許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
がんを有する対象を処置する方法であって、請求項１に記載の操作された免疫エフェクター細胞の有効量を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１２】
がんを有する対象を処置する方法であって、請求項１０に記載の医薬組成物の治療有効量を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１３】
前記医薬組成物が、静脈内注入によって投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記医薬組成物の投与前に、前記対象が、全身照射（ＴＢＩ）、ＩｇＧ１抗体投与、またはその両方を受けている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
毎週、隔週、三週間毎、毎月、四半期毎、または毎年の間隔での、前記医薬組成物の１回または複数回の後続の投与をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象が、白血病、黒色腫、腎がん、前立腺がん、乳がん、結腸がん、及び肺がんからなる群から選択される１つまたは複数のがんを有する、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年６月２２日に出願した、米国仮出願第６２／５２３，４０１号の優先権と利益を主張するものであって、本明細書の一部を構成するものとして、同出願の全内容を援用する。
【０００２】
連邦政府から資金提供を受けた研究または開発に関する陳述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈより、補助金交付番号第ＡＩ０６８９７８号の下で、合衆国政府の支援を受けて完成した。合衆国政府は、本発明について、一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本明細書では、がんを処置するための組成物及び方法を記載している。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
本明細書に記載のすべての刊行物は、個々の刊行物または特許出願を、本明細書の一部を構成するものとして具体的かつ個別に援用するのと同じ程度で、本明細書の一部を構成するものとして援用する。以下の説明は、本発明を理解する上で有用な情報を含む。本明細書で示したあらゆる情報が、先行技術であること、または、現在特許請求をしている発明に関連すること、または、具体的または暗示的に参照した刊行物が先行技術であること、を認めるものではない。
【０００５】
従来の化学療法薬での治療上の限界として、化学的耐性、腫瘍の再発、及び転移がある。腫瘍細胞における薬物の細胞内濃度を高めるために、ナノ粒子をベースとした数多くの能動的ターゲティング手法が開発されてきた。しかしながら、健常組織を温存しつつ、腫瘍部位に対して、これらのシステムを効率的に送達することは実現に至っていないままである。
【０００６】
免疫細胞は、腫瘍及び炎症箇所に移動することができるので、最近では、ヒト免疫細胞指向性ナノ粒子薬物送達に大きな関心が寄せられている。ナチュラルキラー細胞は、がんの免疫監視において重要な役割を果たす細胞傷害性リンパ球のサブセットである。抗腫瘍特異性をリダイレクトするようにキメラ抗原受容体を発現させる、ヒトナチュラルキラー細胞株、ＮＫ９２の操作に、大きな期待が寄せられている。
【０００７】
したがって、本発明の目的とするところは、細胞をベースとした免疫療法と化学療法薬とを組み合わせた組成物、及び／または、送達システムを提供して、抗がん治療の送達、有効性、及び特異性を高めることにある。
【０００８】
本発明の別の目的は、免疫療法と化学療法の両方を利用して、腫瘍を有する対象を処置する方法を提供することである。
【発明の概要】
【０００９】
以下の実施形態及びそれらの態様は、典型的かつ例示的なシステム、組成物、及び方法に沿って説明及び例示するものであって、発明の範囲を限定するものではない。
【００１０】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）操作免疫エフェクター細胞を提供して、腫瘍標的指向送達と有効性を改善するものであって、ここで、当該ＣＡＲは、細胞外抗原特異的ドメインを含み、かつ、当該細胞の表面は、当該担体であるＣＡＲ操作免疫エフェクター細胞に対して細胞傷害性を及ぼすことなく、標的細胞に対して有効性を奏する、有効量の活性物質（例えば、化学療法剤）を含む複数のナノ粒子、または、微粒子と結合している。様々な実施形態は、当該免疫エフェクター細胞を、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞として提供する。ＣＡＲ操作ＮＫ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、あるいは、表面ＣＡＲで発現される、ポリヌクレオチドを有する。概して、ＮＫ細胞は貪食能力を有しているが、ＣＡＲ操作ＮＫ細胞が、当該結合粒子を、取り込んだり、内部移行させたりすることはない。一部の態様では、当該ＣＡＲ操作ＮＫ細胞は、有効量の活性物質（例えば、化学療法剤）を運搬して、化学療法剤誘発毒性自体の影響を受けることなく、標的細胞を死滅させる。例えば、送達される抗腫瘍治療薬／ＣＡＲ操作ＮＫ細胞の平均有効量は、操作された免疫エフェクター細胞：抗原発現標的腫瘍細胞が、１：１〜１０：１である細胞数の比（例えば、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または、１０：１）で、標的抗原を発現する標的腫瘍細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％を抑制または死滅させるが、ＣＡＲ操作ＮＫ細胞の１％、３％、５％、７％、１０％、または、１５％を超える細胞死または細胞傷害性を引き起こすことはない。その他の実施形態は、操作された免疫エフェクター細胞：抗原発現標的腫瘍細胞の細胞数の比が、１０：１より大きく、例えば、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、２０：１、２５：１であり；これにより、標的抗原を発現する腫瘍細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または、６０％を抑制または死滅させる。概して、インビボモデルにおいて、ＮＫ細胞の表面にコンジュゲートさせたナノ粒子を介して、腫瘍の増殖を抑制し、かつ、腫瘍の大きさを低減させるために必要な化学療法薬の用量は、同様の抑制または低減の効果のために、遊離の化学療法薬（ＮＫ細胞なし）の場合に必要とされる用量の少なくとも８分の１、９分の１、１０分の１、１１分の１、１２分の１、１３分の１、１４分の１、１５分の１、２０分の１、３０分の１、４０分の１、５０分の１、１００分の１、または、２００分の１よりも小さい。
【００１１】
様々な実施形態では、活性物質を担持した複数の粒子をその表面に結合した当該ＣＡＲ操作ＮＫ細胞は、投与後の腫瘍環境において蓄積し、かつ高濃度を示し、かつ、活性物質を担持した粒子を表面に結合していないＣＡＲ操作ＮＫ細胞（これらの細胞が、単独で投与される、あるいは、遊離の未結合の活性物質を担持した粒子との混合物で投与される場合）と比較して、抗腫瘍効果を高める。
【００１２】
ＣＡＲ操作ＮＫ細胞の表面への粒子のコンジュゲーションは、同種の抗原（ＣＡＲが認識する）を有する標的細胞と共に細胞を培養した場合、抗原なしの標的細胞と共に培養したＣＡＲ操作ＮＫ細胞と比較して、ＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−γ）の放出を増加させる。放出されたＩＦＮ−γは、腫瘍細胞をＮＫ細胞傷害性に対して感作させ、幅広い適応及び自然免疫応答を開始させる。
【００１３】
一部の実施形態では、ＣＡＲ操作ＮＫ９２細胞は、ＣＡＲ操作Ｔ細胞よりも好ましい。ＮＫ９２細胞は、Ｔ細胞よりも短時間で増殖し、そして、親細胞株と同一であるため、ドナーの多様性に関する問題は最小限である。照射した後のＮＫ９２細胞は、一般的には臨床的に使用しても安全であり、ＣＡＲ操作Ｔ細胞と比較して、オフターゲット効果のリスクは小さい。本明細書に開示したように、ＣＡＲ操作及び粒子コンジュゲーションを含む、同種ＮＫ９２細胞をベースとした治療法は、概して、自己のＣＡＲ操作Ｔ細胞をベースとした同様の治療法よりも費用が抑えられる。
【００１４】
ある実施形態では、当該ＣＡＲは、ＣＤ１９に結合する。別の実施形態では、当該ＣＡＲは、Ｈｅｒ２に結合する。さらなる実施形態では、当該細胞は、ＣＤ１９及びＨｅｒ２に結合する二重特異性ＣＡＲを含む。一部の実施形態では、当該細胞は、核酸を含み、当該核酸は、ＣＤ１９及びＨｅｒ２に結合するＣＡＲをコードする。
【００１５】
一部の実施形態では、ＣＡＲ操作ＮＫ細胞の表面に結合した当該粒子は、ナノ粒子であり、１ｎｍ〜１，０００ｎｍの平均直径を有する。その他の実施形態では、ＣＡＲ操作ＮＫ細胞の表面に結合した当該粒子は、微粒子である。例示的な粒子として、リポソーム、または、架橋した多層リポソーム（ｃＭＬＶ）などの代替リポソーム製剤、及び、徐放性ポリマーナノ粒子がある。一部の態様では、活性物質担体としてのｃＭＬＶは、ＣＡＲを発現するＮＫ細胞の表面に結合し、脂質間二重層が、リポソーム内で架橋され、安定した多層構造が得られる。その他の態様では、ポリマーナノ粒子は、活性物質担体であり、そして、ＣＡＲ発現ＮＫ細胞の表面に結合する。組み込まれた活性物質の溶解度に応じて、疎水性ポリマーまたはブロックコポリマー、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、または、それらのコポリマーを選択して、そこから活性物質を徐放するためのナノ粒子を形成し得る。ある実施形態では、ｃＭＬＶを、ＣＡＲ操作ＮＫ細胞と、５００：１を超える個数の比、例えば、約１，０００：１または２，０００：１でインキュベートして、約１００〜１５０のｃＭＬＶ／ＣＡＲ操作ＮＫ細胞のコンジュゲーション比とする。その他の実施形態では、大きさ、化学組成、及び、結合官能基に応じて、コンジュゲートナノ粒子の数／ＣＡＲ操作ＮＫ細胞は、４００〜３５０、３５０〜３００、３００〜２５０、２５０〜２００、２００〜１５０、または、１５０〜１００である。例示的なコンジュゲーション構造は、粒子上で官能化されたマレイミド基と免疫エフェクター細胞上の遊離チオールとの間である。任意で、それら粒子と細胞表面との間に、例えば、ポリエチレングリコールを介してリンカーが存在する。
【００１６】
例示的な活性物質として、パクリタキセル及びＳＮ−３８などの腫瘍治療薬、インターロイキン（ＩＬ）−１５及びＩＬ−２１などの炎症誘発性サイトカイン、チェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１に対する抗体を含むＰＤ−１阻害剤）、及び、免疫調節剤がある。ある実施形態では、当該化学療法剤は、パクリタキセルである。別の実施形態では、パクリタキセル及びドキソルビシンなどの２つ以上の化学療法剤を、１つのＣＡＲ発現ＮＫ細胞の表面に結合される、同じ、または、個々のナノ粒子で送達する。
【００１７】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含有するＮＫ細胞を含む医薬組成物も提供し、ここで、当該細胞は、化学療法剤を封入する、表面に結合した架橋した多層リポソーム小胞（ｃＭＬＶ）と、医薬として許容可能な担体とをさらに含む。
【００１８】
本明細書に記載した通りの、当該細胞及び／または医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、その必要がある対象におけるがんを処置する方法を、本明細書でさらに提供する。
【００１９】
腫瘍（複数可）を有する対象を処置する方法も提供し、ここで、表面結合ナノ粒子を有するＣＡＲ操作ＮＫ細胞（例えば、ＮＫ９２細胞）を含む組成物が、対象に投与され、当該ナノ粒子は、治療薬の送達と有効性を増大させかつ正常組織に対するオフターゲット毒性を低減させるように、抗がん治療薬を含む。概して、当該ＣＡＲは、組成物の投与を受ける対象のがん細胞の抗原に結合するようにデザインする。例えば、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ、抗Ｈｅｒ２  ＣＡＲ、または、その両方が、ＮＫ細胞で発現される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
例示的な実施形態を、添付した図面に沿って説明する。本明細書で開示した実施形態及び図面は、限定を意図しておらず、むしろ例示的なものとして解釈すべきである。
【００２１】
【図１Ａ】マレイミド官能化ｃＭＬＶに対するＮＫ９２細胞コンジュゲーションを示す。図１Ａは、ＰＴＸを担持したｃＭＬＶとコンジュゲートしたＣＡＲ．ＮＫ細胞の概略図である。ＣＡＲは、抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、及び、当該Ｔ細胞受容体シグナル伝達複合体に由来する。ＣＡＲは、ＮＫ９２細胞に形質導入することができ、また、ｃＭＬＶは、遊離チオールと相互作用することで細胞表面にコンジュゲートできる。
【図１Ｂ】マレイミド官能化ｃＭＬＶに対するＮＫ９２細胞コンジュゲーションを示す。図１Ｂは、様々なｃＭＬＶ：細胞の比で、当該ＮＫ細胞表面に結合したｃＭＬＶを示す。蛍光色素ＤｉＤを含むｃＭＬＶを、様々な個数の比で、ＮＫ細胞と共インキュベートした。各細胞の表面上のｃＭＬＶの数を、ＤｉＤ蛍光を分析して計算した。１０００：１の比率は、ｃＭＬＶ／細胞の最大量をもたらし、そして、その後の実験で使用した。
【図１Ｃ】マレイミド官能化ｃＭＬＶに対するＮＫ９２細胞コンジュゲーションを示す。図１Ｃは、ＤｉＤを担持したｃＭＬＶ（ｃＭＬＶ（ＤｉＤ））とコンジュゲートしたＣＡＲ．ＮＫ細胞の共焦点顕微鏡画像を示す。ＣＡＲ．ＮＫ細胞を、１μＭ  ＣＦＳＥで標識し、そして、ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）とコンジュゲーションさせる前に、ＰＢＳで洗浄した。共焦点顕微鏡を使用して、ＣＡＲ．ＮＫ細胞表面でのｃＭＬＶを視覚化した。
【図１Ｄ】マレイミド官能化ｃＭＬＶに対するＮＫ９２細胞コンジュゲーションを示す。図１Ｄは、コンジュゲートｃＭＬＶの内部移行アッセイを示す。ＣＡＲ．ＮＫ細胞を、カルボキシフルオレセインでタグ付けしたマレイミド標識ｃＭＬＶとコンジュゲートした。当該細胞外コンジュゲーションを、コンジュゲーションの２時間後に、表面結合ｃＭＬＶと内部移行ｃＭＬＶとを区別するために、トリパンブルーでクエンチした。ＣＡＲ．ＮＫ細胞に対するｃＭＬＶの付着は、細胞による粒子の内部移行を招かない。とりまとめた統計データをグラフに示す（ｎ＝３、平均値±ＳＥＭ、ＮＳ、有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１Ｅ】図１Ｅは、形質導入されたＮＫ細胞でのＣＡＲ発現を示す。非形質導入ＮＫ細胞を、陰性対照として使用した（灰色の陰影付きピーク）。抗ＣＤ１９  ＣＡＲを、ＦＩＴＣにコンジュゲートしたビオチン化プロテインＬとストレプトアビジンとで標識した後に、フローサイトメトリーを使用して検出した。抗Ｈｅｒ２  ＣＡＲ．ＮＫ細胞を、ｒｈＨｅｒ２−ＦｃキメラとＰＥ標識ヤギ抗ヒトＦｃとで標識した後に、フローサイトメトリーで検出した。
【図１Ｆ】図１Ｆは、ＤｉＤを担持したｃＭＬＶ（ｃＭＬＶ（ＤｉＤ））とコンジュゲートしたＣＡＲ．ＮＫ細胞の共焦点顕微鏡−３Ｄ及びＺスタック画像を示す。ＣＡＲ．ＮＫ細胞を、１μＭＣＦＳＥで標識し、そして、ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）とコンジュゲーションする前にＰＢＳで洗浄した。
【図２Ａ】ＣＤ１９＋またはＨｅｒ２＋標的細胞に対するＣＡＲ．ＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図２Ａは、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ．ＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。抗ＣＤ１９  ＣＡＲ．ＮＫ細胞を、ＣＤ１９−ＳＫＯＶ３細胞、または、ＣＤ１９＋ＳＫＯＶ．ＣＤ１９細胞と、１：１、５：１、または、１０：１のエフェクター：標的の比で、２４時間、共培養して、細胞傷害性を測定した。
【図２Ｂ】ＣＤ１９＋またはＨｅｒ２＋標的細胞に対するＣＡＲ．ＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。図２Ｂは、抗Ｈｅｒ２  ＣＡＲ．ＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。抗Ｈｅｒ２  ＣＡＲ．ＮＫ細胞を、Ｈｅｒ２−ＭＤＡ．ＭＢ．４６８細胞、または、Ｈｅｒ２＋ＳＫＯＶ３細胞と、１：１、５：１、または、１０：１のエフェクター：標的の比で、２４時間、共培養して、細胞傷害性を測定した。とりまとめた統計データをグラフに示す（ｎ＝３、平均値±ＳＥＭ、ＮＳ、有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図２Ｃ】図２Ｃは、照射（５Ｇｙ）した細胞と非照射ＣＡＲ．ＮＫ細胞との間で比較した細胞傷害性を示す。ＮＫまたはＣＡＲ．ＮＫ細胞を、ＳＫＯＶ．ＣＤ１９細胞と、２４時間、１：１、５：１、または、１０：１のエフェクター：標的の比で共培養して、細胞傷害性を測定した。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＰＴＸに曝露したＮＫ細胞、及び、ＳＫＯＶ３細胞を用いた細胞生存率アッセイを示す。細胞を様々な濃度のｃＭＬＶ（ＰＴＸ）とインキュベートした。細胞生存率は、処置したウェルから得た吸光度値から、培地だけのウェルから得た吸光度値を差し引くことで決定し、次いで、薬物を含まない細胞を含有する対照ウェルで正規化した。
【図２Ｅ】図２Ｅは、遊離ｃＭＬＶ、及び、ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶからのＰＴＸ放出動態を示す。細胞コンジュゲーションの前後に、ｃＭＬＶからのＰＴＸの放出動態を得るために、ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）、及び、ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）を、１０％ＦＢＳ含有培地で、３７℃で、インキュベートし、そして、遠心分離して、次いで、毎日、新鮮な培地で再懸濁した。当該ＰＴＸを、取り出した培地からＨＰＬＣで毎日定量した。
【図３Ａ】ｃＭＬＶとコンジュゲートした場合のＣＡＲ．ＮＫサイトカインの放出と移動を示す。図３Ａ及び図３Ｂは、ＩＦＮγ染色アッセイを示す。抗ＣＤ１９（図３Ａ）または抗Ｈｅｒ２（図３Ｂ）ＣＡＲ．ＮＫ細胞を、ブレフェルジンＡタンパク質輸送阻害剤を用いて、６時間、様々な標的細胞と共培養して、ＩＦＮγ放出を検出した。未刺激のＣＡＲ．ＮＫ細胞を、陰性対照として使用した。ＣＡＲ．ＮＫ細胞は、未コンジュゲートであるか、あるいは、空のｃＭＬＶ（ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＥＭＰＴＹ））、または、ＰＴＸを担持したｃＭＬＶ（ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＰＴＸ））とコンジュゲートしている。ＩＦＮγは、細胞内染色で測定した。
【図３Ｂ】ｃＭＬＶとコンジュゲートした場合のＣＡＲ．ＮＫサイトカインの放出と移動を示す。図３Ａ及び図３Ｂは、ＩＦＮγ染色アッセイを示す。抗ＣＤ１９（図３Ａ）または抗Ｈｅｒ２（図３Ｂ）ＣＡＲ．ＮＫ細胞を、ブレフェルジンＡタンパク質輸送阻害剤を用いて、６時間、様々な標的細胞と共培養して、ＩＦＮγ放出を検出した。未刺激のＣＡＲ．ＮＫ細胞を、陰性対照として使用した。ＣＡＲ．ＮＫ細胞は、未コンジュゲートであるか、あるいは、空のｃＭＬＶ（ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＥＭＰＴＹ））、または、ＰＴＸを担持したｃＭＬＶ（ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＰＴＸ））とコンジュゲートしている。ＩＦＮγは、細胞内染色で測定した。
【図３Ｃ】ｃＭＬＶとコンジュゲートした場合のＣＡＲ．ＮＫサイトカインの放出と移動を示す。図３Ｃ及び図３Ｄは、細胞傷害性アッセイを示す。抗ＣＤ１９（図３Ｃ）、または、抗Ｈｅｒ２（図３Ｄ）ＣＡＲ．ＮＫ細胞を、様々な標的細胞と、１：１の比で、２４時間、共培養して、細胞傷害性を測定した。ＣＡＲ．ＮＫ細胞は、未コンジュゲートであるか、あるいは、空のｃＭＬＶ（ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＥＭＰＴＹ））、または、ＰＴＸを担持したｃＭＬＶ（ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＰＴＸ））とコンジュゲートしている。
【図３Ｄ】ｃＭＬＶとコンジュゲートした場合のＣＡＲ．ＮＫサイトカインの放出と移動を示す。図３Ｃ及び図３Ｄは、細胞傷害性アッセイを示す。抗ＣＤ１９（図３Ｃ）、または、抗Ｈｅｒ２（図３Ｄ）ＣＡＲ．ＮＫ細胞を、様々な標的細胞と、１：１の比で、２４時間、共培養して、細胞傷害性を測定した。ＣＡＲ．ＮＫ細胞は、未コンジュゲートであるか、あるいは、空のｃＭＬＶ（ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＥＭＰＴＹ））、または、ＰＴＸを担持したｃＭＬＶ（ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＰＴＸ））とコンジュゲートしている。
【図３Ｅ】ｃＭＬＶとコンジュゲートした場合のＣＡＲ．ＮＫサイトカインの放出と移動を示す。図３Ｅは、移動アッセイを示す。未コンジュゲートＮＫ、または、ｃＭＬＶ（ＥＭＰＴＹ）とコンジュゲートしたＮＫを、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌプレートの上部チャンバーに播種した。下部のウェルには、陰性対照であるプレーン培地が入っており、そして、ＣＸＣＬ９を、下部ウェルの非対照群での化学誘引物質として使用した。６時間のインキュベートの後、下部のチャンバーから培地を回収し、そして、ＮＫ細胞を計数した。とりまとめた統計データをグラフに示す（ｎ＝３、平均値±ＳＥＭ、ＮＳ、有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｆは、遊離ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）、及び、コンジュゲートＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）の体内分布を示す。静脈内注射して２４時間後（図４Ａ及び４Ｂ）、４８時間後（図４Ｃ及び４Ｄ）、または、７２時間後（図４Ｅ及び４Ｆ）の生体分布データ。皮下にＳＫＯＶ３．ＣＤ１９腫瘍を持つＮＯＤ／ｓｃｉｄ／ＩＬ２ｒγ−／−（ＮＳＧ）マウスに、ＤｉＤ標識ｃＭＬＶとコンジュゲートした２×１０７個のＣＡＲ．ＮＫ細胞、または、同等数のＤｉＤ標識ｃＭＬＶだけを静脈内注射した（ｎ＝３／群／時点）。２４時間後、４８時間後、及び、７２時間後に、示した組織を取り出し、重量を測定し、ハサミで切断した。ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍイメージングシステムを使用して、各臓器の特定のＤｉＤ組織蛍光を定量して、注入用量／組織１グラムの平均割合（％ＩＤ／ｇ）を、最終読み取り値として計算した。とりまとめた統計データをグラフに示す（ｎ＝３、平均値±ＳＥＭ、ＮＳ、有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図４Ｂ】図４Ａの説明を参照のこと。
【図４Ｃ】図４Ａの説明を参照のこと。
【図４Ｄ】図４Ａの説明を参照のこと。
【図４Ｅ】図４Ａの説明を参照のこと。
【図４Ｆ】図４Ａの説明を参照のこと。
【図５】固形腫瘍異種移植モデルにおけるＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）の抗腫瘍効果を示す。腫瘍増殖曲線。ＳＫＯＶ．ＣＤ１９細胞を、０日目に、ＮＳＧマウスの右脇腹に皮下注射した。マウスを、無作為に６つの群に分け（ｎ＝５／群）、そして、群の説明に従って、合計で４回、尾静脈注射を３〜４日間隔で行って処置をした。腫瘍の大きさを、精密キャリパーで測定した（ｎ＝５、平均値±ＳＥＭ、ＮＳ、有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図６Ａ】ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）処置のエクスビボ分析を示す。図６Ａは、腫瘍内ＰＴＸ濃度を示す。解凍した腫瘍試料を均質化し、そして、ＨＰＬＣを使用してＰＴＸ濃度を分析した（ｎ＝３、平均値±ＳＥＭ、ＮＳ、有意ではない；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図６Ｂ】ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）処置のエクスビボ分析を示す。図６Ｂは、固定した凍結腫瘍切片のＴＵＮＥＬアッセイを示す。腫瘍切片を、製造元の指示に従って、ＴＵＮＥＬキットで染色し、そして、共焦点顕微鏡で画像化した。代表的な画像をここに示す。
【図６Ｃ】ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）処置のエクスビボ分析を示す。図６Ｃは、心臓毒性の組織学的分析を示す。心臓組織を固定及び凍結して、切片をスライドガラスに載せた。これらの凍結切片を、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。病理組織学的標本を、光学顕微鏡で検査した。代表的な画像をここに示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
詳細な説明
本明細書で引用したすべての文献は、あたかも全体の記載がされているが如く、本明細書の一部を構成するものとして、それらの全内容を援用する。特に断りのない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ  （Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １５，  ２０１２）；Ｈｏｒｎｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  （２００８）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｅｄ．，  Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  ２００６）；Ｓｍｉｔｈ，  Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ７ｔｈ  ｅｄ．，  Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  ２０１３）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  （Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２８，  ２０１２）；及び  Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  ２０１２）は、本願で使用する数多くの用語の一般的なガイドを当業者に提供する。抗体の調製方法に関する文献としては、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ，  ２０１３）；Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９７６  Ｊｕｌ，  ６（７）：５１１−９；Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｉｃｋ，  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，  米国特許第５，５８５，０８９号  （１９９６年１２月）；及び  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｎａｔｕｒｅ  １９８８  Ｍａｒ  ２４，  ３３２（６１６２）：３２３−７を参照されたい。
【００２３】
当業者であれば、本明細書に記載したものと類似または同等の数多くの方法及び材料を認識するものであり、それらは、本発明の実施において使用することができる。本発明のその他の特徴及び利点は、本発明の実施形態の様々な特徴を例として示す添付した図面を勘案すれば、以下の詳細な説明から明らかになる。実際のところ、本発明は、記載した方法及び材料に限定するものでは決してない。便宜上、本願、本明細書、実施例、及び、添付した特許請求の範囲で使用する特定の用語を、ここで示している。
【００２４】
特に断りのない限り、あるいは、文脈が暗示していない限りは、以下の用語及び語句は、以下に示す意味を含む。特に断りのない限り、あるいは、文脈から明らかである限りは、以下の用語及び語句は、その用語または語句が関連する技術分野で知られている意味を排除しない。本発明の範囲は、特許請求の範囲の制限だけを受けるので、これらの定義は、特定の実施形態の説明を補助するために提供しており、特許請求した発明の限定を意図していない。特に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。
【００２５】
本明細書で使用する用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、実施形態に有用である組成物、方法、及び、それぞれの要素（複数可）に関して使用しており、有用か否かに関係なく、不特定の要素を含むことも許容する。当業者であれば、本明細書で使用する用語は、一般的に、「オープン」用語を意図しているものと理解する（例えば、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「含むが、これに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ）」と解釈し、用語「有する」は、「少なくとも〜を有する」と解釈し、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は、「含むが、これに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｅｓ  ｂｕｔ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ）」などと解釈する）。
【００２６】
特に断りのない限り、用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」、及び、本願の特定の実施形態を説明する文脈（特に、請求項の文脈）で使用する同様の記載は、単数及び複数の両方を含む、と解釈することができる。本明細書での数値の範囲の記載は、単に、当該範囲内にある個々の数値を個別に引用するための簡便な方法として機能させること、を意図している。本明細書で特に断りのない限り、個々の数値は、あたかも本明細書において個別に引用しているかのようにして、本明細書では援用する。本明細書で説明したすべての方法は、本明細書で特に断りがない限り、または、文脈と明らかに矛盾しない限りは、あらゆる適切な順序で実行することができる。本明細書の特定の実施形態に関して示されたありとあらゆる実施例、または、例示的文言（例えば、「など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、単に本願の理解を容易にすることを意図するものであって、特許請求した出願の範囲を限定するものではない。略語「ｅ．ｇ．」は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａに由来するものであり、本明細書では、非限定的な例を示すために使用する。したがって、当該略語「ｅ．ｇ．」は、用語「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」と同義である。本明細書での文言を、特許請求をしておらず、本願の実施に必須である、あらゆる要素を示すものと解釈すべきではない。
【００２７】
本明細書で使用する用語「約」は、量、持続時間などの測定可能な数値のことを指し、特定の数値から±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または、±０．１％の変動を含む。
【００２８】
本明細書で使用する「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」または「ＣＡＲｓ」とは、細胞（例えば、ＮＫ細胞）に対して、抗原特異性を移植する操作された受容体のことを指す。ＣＡＲには、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、または、キメラ免疫受容体の別名がある。様々な実施形態では、ＣＡＲは、抗原特異的ドメイン（ＡＳＤ）、ヒンジ領域（ＨＲ）、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）、共刺激ドメイン（ＣＳＤ）及び、細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）を含む組換えポリペプチドである。
【００２９】
「エフェクター機能」とは、分化した細胞の特殊な機能のことを指す。Ｔ細胞のエフェクター機能を、例えば、細胞溶解／細胞傷害性活性、または、サイトカインの分泌などのヘルパー活性とし得る。
【００３０】
本明細書で使用する「遺伝子改変された細胞が標的とする疾患」は、当該遺伝子改変された細胞が、疾患細胞または健常細胞を標的として、治療的に有益な結果を招くか否かに関係なく、本発明の遺伝子改変された細胞による、任意の疾患に何らかの方法で関与する任意の細胞のターゲティングを含む。当該遺伝子改変された細胞として、遺伝子改変されたＴ細胞、ＮＫ細胞、造血幹細胞、多能性胚性幹細胞、または、胚性幹細胞があるが、これらに限定されない。本明細書に記載した遺伝子改変された細胞は、特定の抗原を標的とするＣＡＲを発現し、かつ、それらを組み合わせて、化学療法薬送達担体として機能する。標的とし得る抗原の例として、Ｂ細胞で発現される抗原；がん腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、及び、芽細胞腫で発現される抗原；様々な免疫細胞で発現される抗原；及び、様々な血液疾患、自己免疫疾患、及び／または、炎症性疾患に関連した細胞で発現される抗原があるが、これらに限定されない。標的とし得るその他の抗原は、当業者に自明であり、また、それらの代替の実施形態に関連して、本発明のＣＡＲによって標的とされ得る。
【００３１】
本明細書で使用する「自己」細胞とは、当該細胞を後に再投与する個体と同じ個体に由来する細胞のことを指す。
【００３２】
本明細書で使用する「遺伝子改変された細胞」、「リダイレクト細胞」、「遺伝子操作された細胞」、「操作された細胞」または「改変された細胞」は、抗原特異的ＣＡＲを発現し、そして、粒子、好ましくは、ナノサイズリポソーム（多層リポソーム小胞など）など、化学療法薬などの治療薬を運搬するナノ粒子をさらに有する細胞のことを指し、同粒子は、当該細胞の表面に結合している。一部の実施形態では、当該遺伝子改変された細胞は、特定の抗原を標的とするＣＡＲを発現し、かつ、それらを組み合わせて、化学療法薬送達担体として機能する。
【００３３】
本明細書で使用する「免疫細胞」とは、抗原提示細胞、Ｂ細胞、好塩基球、細胞傷害性Ｔ細胞、樹状細胞、好酸球、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、白血球、リンパ球、マクロファージ、肥満細胞、メモリー細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、好中球、食細胞、形質細胞、Ｔ細胞などの哺乳動物免疫系の細胞のことを指すが、これらに限定されない。
【００３４】
ＣＡＲ含有細胞の「免疫エフェクター機能」という用語は、刺激分子による刺激を受けると、ＣＡＲ発現細胞が示す任意の活性のことを指す。例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞における免疫エフェクター機能の例として、サイトカインの分泌など、細胞溶解活性、及び、ヘルパー活性がある。
【００３５】
本明細書で使用する「免疫エフェクター細胞」として、Ｔ細胞、及び、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞がある。
【００３６】
本明細書で使用する「免疫応答」とは、自然免疫、体液性免疫、細胞性免疫、免疫、炎症応答、後天性（適応）免疫、自己免疫、及び／または、過剰免疫などの免疫のことを指すが、これらに限定されない。
【００３７】
本明細書で使用する「ＣＤ４リンパ球」とは、ＣＤ４を発現するリンパ球、すなわち、ＣＤ４＋であるリンパ球のことを指す。ＣＤ４リンパ球を、ＣＤ４を発現するＴ細胞とし得る。
【００３８】
用語「Ｔ細胞」及び「Ｔリンパ球」は互換可能であり、本明細書では同義的に使用する。例として、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、または、これらの組み合わせがあるが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書で使用する用語「抗体」とは、インタクトな免疫グロブリン、または、Ｆｃ（結晶化可能断片）領域、または、Ｆｃ領域のＦｃＲｎ結合断片を有するモノクローナル、または、ポリクローナル抗原結合断片のことを指し、本明細書では「Ｆｃ断片」または「Ｆｃドメイン」と称する。抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術、または、インタクトな抗体の酵素的または化学的開裂によって生成し得る。抗原結合断片として、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及び、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、及び、ポリペプチドがあり、当該ポリペプチドに特異的な抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含む。Ｆｃドメインは、当該抗体の２つまたは３つのクラスに寄与する、２つの重鎖の一部を含む。当該Ｆｃドメインは、組換えＤＮＡ技術、または、酵素的（例えば、パパイン開裂）、または、インタクトな抗体の化学的開裂によって生成し得る。
【００４０】
本明細書で使用する用語「抗体断片」とは、インタクトな抗体の一部だけを含むタンパク質断片のことを指し、一般的に、インタクトな抗体の抗原結合部位を含み、そして、抗原に結合する能力を保持している。本定義が含む抗体断片の例として：（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、及び、ＣＨ１ドメインを有するＦａｂ断片；（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つまたは複数のシステイン残基を有するＦａｂ断片であるＦａｂ’断片；（ｉｉｉ）ＶＨ、及び、ＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；（ｉｖ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインと、ＣＨ１ドメインのＣ末端にある１つまたは複数のシステイン残基とを有するＦｄ’断片；（ｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを有するＦｖ断片；（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９））；（ｖｉｉ）単離したＣＤＲ領域；（ｖｉｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋して結合させた２つのＦａｂ’断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｘ）一本鎖抗体分子（例えば、一本鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）；及び、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８５：５８７９−５８８３（１９８８））；（ｘ）同じポリペプチド鎖の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する「ダイアボディ」（例えば、ＥＰ  ４０４，０９７；ＷＯ  ９３／１１１６１；及び、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい）；（ｘｉ）一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含み、相補的な軽鎖ポリペプチドと共に、一対の抗原結合領域を形成する「直鎖状抗体」（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）；及び、米国特許第５，６４１，８７０号）、がある。
【００４１】
本明細書で使用する「一本鎖可変断片」、「一本鎖抗体可変断片」、または、「ｓｃＦｖ」抗体とは、リンカーペプチドで結合した重（ＶＨ）及び軽（ＶＬ）鎖のみの可変領域を含む抗体の形態のことを指す。当該ｓｃＦｖは、一本鎖ポリペプチドとして発現可能である。当該ｓｃＦｖは、由来するインタクトな抗体の特異性を保持する。当該軽鎖及び重鎖は、標的抗原に対するｓｃＦｖの特異性を保持する限りは、例えば、ＶＨ−リンカー−ＶＬ、または、ＶＬ−リンカー−ＶＨなどの任意の順序とし得る。
【００４２】
本明細書で使用する「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とは、抗体の可変領域内にあるアミノ酸配列のことを指し、その領域は、特異性と結合親和性とを付与する。一般的に、軽鎖可変領域の各々（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及び、ＬＣＤＲ３）には３つのＣＤＲがあり、また、重鎖可変領域の各々（ＨＣＤ１、ＨＣＤｒ２、及び、ＨＣＤＲ３）には、３つのＣＤＲがある。これらＣＤＲの境界は、「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム、及び／または、「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキームなど、当該技術分野で周知の方法を使用して決定し得る（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  ５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ、（１９９７）ＪＭＢ  ２７３，９２７−９４８）。
【００４３】
本明細書で使用する用語「特異的結合」は、抗体と、少なくとも１０−６Ｍの結合親和性を有する抗原との接触を意味する。特定の態様では、抗体は、少なくとも約１０−７Ｍ、そして、好ましくは、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または、１０−１２Ｍの親和性で結合する。
【００４４】
本明細書で使用する「治療薬」とは、例えば、疾患の処置、抑制、予防、影響の緩和、重症度の軽減、発症の可能性の軽減、進行の遅延、及び／または、治癒のために使用する作用物質のことを指す。当該治療薬が対象とする疾患として、感染症、がん、例えば、がん腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、及び、芽細胞腫などがあるが、これらに限定されない、そして、様々な免疫細胞に発現する抗原、及び、様々な血液疾患、及び／または、炎症性疾患に関連した細胞に発現する抗原があるが、これらに限定されない。
【００４５】
「がん」及び「がん性」とは、通常、無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳動物での生理学的病態を指すものであり、または、そのことを表現する。用語「がん」とは、組織病理学的タイプ、または、侵襲性の段階に関係なく、すべてのタイプのがん性増殖、または、発がんプロセス、転移組織、または、悪性に形質転換した細胞、組織、または、臓器を含むことを意味する。固形腫瘍の例として、肝臓、肺、乳房、リンパ系、胃腸（例えば、結腸）、泌尿生殖路（例えば、腎臓、尿路上皮細胞）、前立腺、及び、咽頭に対して影響を及ぼすものなど、様々な臓器系の悪性腫瘍、例えば、肉腫、腺がん、及び、がん腫がある。腺がんとして、ほとんどの結腸がん、直腸がん、腎細胞がん、肝臓がん、肺の非小細胞がん、小腸のがん、食道のがんなどの悪性腫瘍がある。ある実施形態では、当該がんは、黒色腫、例えば、進行期黒色腫である。前出のがんの転移性病変も、本発明の方法及び組成物を使用して、処置または予防することができる。治療可能なその他のがんの例として、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管のがん、子宮内膜のがん、頸部のがん、膣のがん、外陰部のがん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、急性骨髄性白血病を含む慢性または急性白血病、慢性骨髄白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、小児の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱のがん、腎臓または尿管のがん、腎盂のがん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストが誘発したものを含む環境誘発がん、及び、前述したがんの組み合わせがある。転移性がん、例えば、ＰＤ−Ｌ１を発現する転移性がんの処置（Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７：１３３−１４４）は、本明細書に記載の抗体分子を使用して、効果的に行うことができる。
【００４６】
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（スモールヘアピンＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（スモール核ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（短い核小体ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、及び／または、ｔＲＮＡがあるが、これらに限定されない。
【００４７】
本明細書で使用する用語「単離した」とは、その他の物質を実質的に含まない分子、または、生物学的物質、または、細胞物質のことを指す。ある態様では、用語「単離した」とは、自然の供給源に存在する、その他のＤＮＡまたはＲＮＡ、または、タンパク質またはポリペプチド、または、細胞または細胞小器官、または、組織または臓器からそれぞれ分離をした、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸、タンパク質またはポリペプチド（例えば、抗体、または、その誘導体）、または、細胞または細胞小器官、または、組織または臓器のことを指す。用語「単離した」とは、組換えＤＮＡ技術で産生する場合には、細胞材料、ウイルス材料、または、培養培地を実質的に含まない核酸またはペプチドを、あるいは、化学合成する場合には、化学前駆体、または、その他の化学物質のことも指す。さらに、「単離した核酸」とは、断片として自然界に存在せず、自然状態では認められない核酸断片を含む、ことを意味する。本明細書で使用する用語「単離した」とは、その他の細胞タンパク質から単離したポリペプチドのことも指し、また、精製したポリペプチド、及び、組換えポリペプチドの両方を含む、ことを意味する。本明細書で使用する用語「単離した」とは、その他の細胞または組織から単離した細胞または組織のことも指し、また、培養及び操作された細胞または組織の両方を含む、ことを意味する。
【００４８】
本明細書で使用する用語「裸のＤＮＡ」とは、発現のために適切な配向で好適な発現ベクターにクローニングしたＣＡＲをコードするＤＮＡのことを指す。使用し得るウイルスベクターとして、ＳＩＮレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ハイブリッドベクター、及び／または、プラスミドトランスポゾン（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンシステム）、または、インテグラーゼをベースとしたベクターがあるが、これらに限定されない。本発明の代替実施形態に関連して使用し得るその他のベクターは、当業者に自明である。
【００４９】
本明細書で使用する用語「標的細胞」とは、疾患に関与し、かつ、本発明の遺伝子改変された細胞（遺伝子改変されたＴ細胞、ＮＫ細胞、造血幹細胞、多能性幹細胞、及び、胚性幹細胞などがあるが、これらに限定されない）によって標的とされ得る細胞のことを指す。その他の標的細胞は、当業者に自明であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用し得る。
【００５０】
本明細書で使用する用語「ベクター」、「クローニングベクター」、及び、「発現ベクター」とは、ポリヌクレオチド配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入して、宿主を形質転換し、そして、導入した当該配列の発現（例えば、転写、及び、翻訳）を促すことができる媒介物のことを指す。ベクターとして、プラスミド、ファージ、ウイルスなどがある。
【００５１】
本明細書で使用する用語「投与する」とは、所望の部位で作用物質の少なくとも一部を局在させる方法または経路で、本明細書で開示した作用物質を対象内に配置することを指す。
【００５２】
「有益な結果」として、病状の重篤度の軽減または緩和、病状の悪化の予防、病状の治癒、病状の進行の予防、患者の病状が進行する可能性の低減、及び、患者の寿命または平均余命の延長があるが、これらに限定されない。「有益な結果」または「望ましい結果」として、１つまたは複数の症状（複数可）の緩和、障害の程度の低減、安定した（すなわち、悪化していない）がん進行の状態、転移または浸潤の遅延または緩慢化、及び、がんに関連する症状の緩和または改善があるが、これらに限定されない。
【００５３】
本明細書で使用する用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「緩和（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）」とは、治療的処置のことを指し、その目的は、疾患または障害に関連する病態の進行または重篤度を、逆転、緩和、改善、抑制、鈍化、または、停止することにある。用語「処置する」とは、がんなどの病態、疾患、または、障害の少なくとも１つの悪影響または症状を、軽減または緩和することを含む。１つまたは複数の症状または臨床マーカーを低減させた場合、処置は、一般的に、「効果的」である。あるいは、疾患の進行が鈍化または停止した場合、処置は、「効果的」である。つまり、「処置」は、症状またはマーカーの改善だけでなく、処置の非存在下で予想される症状の少なくとも進行の鈍化または悪化の停止も含む。有益な、または、所望の臨床結果として、検出の可能または不可能にかかわらず、１つまたは複数の症状（複数可）の緩和、疾患の程度の低減、安定した（すなわち、悪化していない）疾患の状態、疾患の進行の遅延または鈍化、病状の緩和または改善、及び、寛解（部分的、または、全体的）があるが、これらに限定されない。疾患の「処置」という用語は、疾患の症状または副作用の緩和（緩和処置を含む）をも含む。一部の実施形態では、がんの治療として、腫瘍体積の減少、がん細胞の個数の減少、がん転移の抑制、平均余命の延長、がん細胞増殖の低減、生存がん細胞の減少、または、がん病態に関連する様々な生理学的症状の改善がある。
【００５４】
本明細書で使用する「病態」及び「病状」は、がん、腫瘍、または、感染症を含み得る。例示的な実施形態では、病態として、悪性新生物細胞増殖性障害または疾患の任意の形態を含むが、決してこれらに限定されない。例示的な実施形態では、病態として、腎臓がん、黒色腫、前立腺がん、乳がん、膠芽腫、肺がん、結腸がん、または、膀胱がんの１つまたは複数を含む。
【００５５】
本明細書で使用する用語「有効量」または「治療有効量」とは、疾患または障害の少なくとも１つまたは複数の症状を軽減する、本明細書に開示した１つまたは複数のペプチド、または、その突然変異体、変異体、類似体、または、誘導体を含む医薬組成物の量のことを指すものであり、所望の効果をもたらすのに十分な量の薬理学的組成物に関する。本明細書で使用する表現「治療有効量」とは、任意の医学的処置に適用可能な合理的な利益／リスク比で、障害を処置するのに十分な組成物の量のことを意味する。
【００５６】
症状の治療的または予防的に有意な低減とは、対照、または、未処置の対象、または、本明細書に記載したオリゴペプチドを投与する前の対象での状態と比較して、計測したパラメーターにおいて、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％またはそれ以上の低減である。測定した、または、測定可能なパラメーターとして、臨床的に検出可能な疾患マーカー、例えば、生物学的マーカーのレベルの上昇または低下、ならびに、臨床的に認められた症状のスケール、または、糖尿病のマーカーに関連するパラメーターがある。しかしながら、本明細書に開示した組成物及び製剤の１日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医が決定することは理解されよう。必要とされる正確な量は、処置する疾患のタイプ、対象の性別、年齢、体重などの要素によって変化する。
【００５７】
表現「一次」または「二次」または「三次」とは、患者が受ける処置の順序のことを指す。一次治療レジメンは、最初に行う処置のことであり、二次または三次治療は、それぞれ、一次治療の後、または、二次治療の後に行う。Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｉｔｕｔｅは、一次治療を、「疾患に対して行う最初の処置」と定義しており、大抵の場合、処置の標準セットの一部である。単独で使用する場合、一次治療は、最良の処置として認められている。疾患が治癒しない場合、または、重篤な副作用を招く場合は、その他の処置を追加するか、または、その他の処置を代わりに使用し得る。導入療法、一次療法、及び、一次処置とも称されている。２０１８年６月８日に最後にアクセスした、Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｉｔｕｔｅのウェブサイトを参照されたい。一般的には、患者が一次治療に対して肯定的な臨床的応答または準臨床的応答を示さなかった、または一次治療が中止されたという理由で、患者は、後続の化学療法レジメンの投与を受ける。
【００５８】
本明細書で使用する用語「哺乳動物」とは、哺乳綱のメンバーのことを指し、同メンバーとして、ヒト、ならびに、チンパンジー、及び、その他の類人猿、及び、サル種などの非ヒト霊長類；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及び、ウマなどの家畜；犬や猫などの家庭動物；マウス、ラット、及び、モルモットなどの齧歯類を含む実験動物などがあるが、これらに限定されない。この用語は、特定の年齢や性別を示すものではない。したがって、成体または新生児の対象、及び、胎児を、オスまたはメスに関係なく、この用語の範囲内に含むことを意図している。
【００５９】
本明細書で使用する用語「粒子」とは、様々な大きさ及び任意の形状の粒子状物質のことを指す。適切な粒子サイズは、粒子を作るために使用する材料、運搬される活性物質または治療剤、及び、免疫エフェクター細胞とのコンジュゲーションに関与する官能基と化学的性質とに基づいて変化させることができ、これらのことは、当業者であれば、本明細書で開示した教示に照らして適切に理解する。例えば、当該粒子は、１ｎｍ〜１，０００ｎｍの平均直径を有するナノ粒子、または、１μｍよりも大きいものの、当該粒子がコンジュゲートする免疫エフェクター細胞よりも少なくとも一桁小さい平均直径を有する微粒子とすることができる。例えば、一部の実施形態では、当該粒子は、約１ｎｍ〜約１０００ｎｍ；約２５ｎｍ〜約７５０ｎｍ；または、約５０ｎｍ〜約５００ｎｍ；または、約１００ｎｍ〜約３００ｎｍの直径を有する。一部の実施形態では、当該平均粒子サイズを、約１ｎｍ、約１０ｎｍ、約５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約３００ｎｍ、約３５０ｎｍ、約４００ｎｍ、約４５０ｎｍ、約５００ｎｍ、約５５０ｎｍ、約６００ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７５０ｎｍ、約８００ｎｍ、約８５０ｎｍ、約９００ｎｍ、約９５０ｎｍ、または、約１０００ｎｍ、または、約２，０００ｎｍ、または、約５，０００ｎｍ、または、約６，０００ｎｍ、または、約１０，０００ｎｍとすることができる。一部の実施形態では、これらの用語は、本明細書で定義したように、当該粒子を、ナノ粒子またはマイクロ粒子とすることができる。これらの粒子を、すべてをナノ粒子、すべてを微粒子、または、ナノ粒子と微粒子との組み合わせとすることができる。一部の実施形態では、当該粒子は、リポソームである。その他の実施形態では、当該粒子は、生体適合性、及び／または、生分解性ポリマーから形成したポリマー粒子である。一部の実施形態では、当該粒子は、コアを含む。一部の実施形態では、当該粒子は、コーティングを含む。
【００６０】
本明細書で使用する用語「生分解性ポリマー」は、合成ポリマーを含むことができるが、天然ポリマーも使用することができる。当該ポリマーを、例えば、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリスチレン、または、それらの組み合わせとすることができる。当該ポリスチレンを、例えば、カルボキシ基で修飾することができる。生分解性ポリマーのその他の例として、ポリ（ヒドロキシ酸）；ポリ（乳酸）；ポリ（グリコール酸）；ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）；ポリ（ラクチド）；ポリ（グリコリド）；ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）；ポリ無水物；ポリオルトエステル；ポリアミド；ポリカーボネート；ポリアルキレン；ポリエチレン；ポリプロピレン；ポリアルキレングリコール；ポリ（エチレングリコール）；ポリアルキレンオキシド；ポリ（エチレンオキシド）；ポリアルキレンテレフタレート；ポリ（エチレンテレフタレート）；ポリビニルアルコール；ポリビニルエーテル；ポリビニルエステル；ポリビニルハライド；ポリ（塩化ビニル）；ポリビニルピロリドン；ポリシロキサン；ポリ（ビニルアルコール）；ポリ（酢酸ビニル）；ポリウレタン；ポリウレタンのコポリマー；誘導体化セルロース；アルキルセルロース；ヒドロキシアルキルセルロース；セルロースエーテル；セルロースエステル；ニトロセルロース；メチルセルロース；エチルセルロース；ヒドロキシプロピルセルロース；ヒドロキシプロピルメチルセルロース；ヒドロキシブチルメチルセルロース；酢酸セルロース；プロピオン酸セルロース；酢酸酪酸セルロース；酢酸フタル酸セルロース；カルボキシルエチルセルロース；三酢酸セルロース；硫酸セルロースナトリウム塩；アクリル酸のポリマー；メタクリル酸；メタクリル酸のコポリマー；メタクリル酸の誘導体；ポリ（メチルメタクリレート）；ポリ（エチルメタクリレート）；ポリ（ブチルメタクリレート）；ポリ（イソブチルメタクリレート）；ポリ（ヘキシルメタクリレート）；ポリ（イソデシルメタクリレート）；ポリ（ラウリルメタクリレート）；ポリ（フェニルメタクリレート）；ポリ（メチルアクリレート）；ポリ（イソプロピルアクリレート）；ポリ（イソブチルアクリレート）；ポリ（オクタデシルアクリレート）；ポリ（酪酸）；ポリ（吉草酸）；ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）；ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）のコポリマー；ポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン）のブレンド；ポリ（イソブチルシアノアクリレート）；ポリ（２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタミン）；及び、前出のいずれかの１つまたは複数の組み合わせ、コポリマー、及び／または、混合物がある。さらに、当業者であれば理解するであろうが、「生体適合性」として上記に列挙した一部のポリマーは、上記した代表的な生分解性ポリマーのリストでのそれらの記載の有無に関係なく、生分解性と見なすことができる。本明細書で使用する用語「誘導体」として、当業者が日常的に行っている、化学基の置換及び付加、ならびに、その他の修飾を経たポリマーがある。
【００６１】
「細胞傷害性」とは、細胞に対して毒性を示す作用物質のことを指し、細胞と共にインキュベートした時間にわたる、細胞死滅の程度（例えば、当該作用物質とインキュベートする前の当初の細胞の個数に対する、死滅細胞の個数の割合）として定量できる。例えば、細胞傷害性は、細胞と共に２４時間にわたって作用物質とインキュベートする前の当初の細胞数に対する、死滅細胞の個数の割合として定量する。
【００６２】
特定の理論に縛られるものではないが、腫瘍特異的ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を、薬物充填ナノ粒子を送達するための担体として使用すると、本発明で説明したように、化学療法の有効性は大きくなる。一部の実施形態では、腫瘍特異的ＮＫ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ．ＮＫ）と、パクリタキセル（ＰＴＸ）を封入する架橋した多層リポソーム小胞（ｃＭＬＶ）とを含む。様々な態様では、これらのｃＭＬＶは、チオール反応性マレイミド頭部基で官能化したリポソームであり、チオールが豊富なＮＫ細胞表面に安定的にコンジュゲートする。この組成物、及び／または、送達システムは、化学療法薬、及び、免疫エフェクター細胞を、単一部位（近接近）に共局在化させ、インビトロ及びインビボで相乗的な抗腫瘍効果を誘導することで、組み合わせ薬物送達を可能にする。本明細書で説明したものは、免疫療法と化学療法薬送達との組み合わせであり、ＣＡＲ．ＮＫ細胞を、ＰＴＸを担持した架橋した多層リポソーム小胞（ｃＭＬＶ（ＰＴＸ））の担体として利用して、Ｈｅｒ２及びＣＤ１９過剰発現がんモデルにおいて抗腫瘍効果を高める（図１Ａ）。
【００６３】
組成物
本発明の一部の実施形態では、抗原特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するベクターを含み、かつ、細胞表面に結合した薬物担持粒子をさらに含む、遺伝子操作された細胞を本明細書では提供する。一部の実施形態では、これらの粒子は、化学療法剤を担持させたリポソーム（例えば、架橋した多層小胞）である。一部の実施形態では、当該ＣＡＲは、１つの抗原を標的とする。別の実施形態では、ＣＡＲは二重特異性ＣＡＲであり、２つの異なる抗原を標的とする。当該二重特異性ＣＡＲは、同じタイプの標的細胞または異なる細胞の抗原を標的とし得る。
【００６４】
様々な実施形態では、抗原特異的ＣＡＲを発現し、かつ治療薬担持リポソームと表面でコンジュゲートした、遺伝子操作された細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。ある実施形態では、ＣＡＲを発現し、かつ治療薬担持リポソームと表面でコンジュゲートした、遺伝子操作された細胞は、遺伝子操作されたＮＫ細胞である。
【００６５】
様々な実施形態では、当該リポソームは、多層小胞（幾つかの層状脂質二重層を含む）、小さな単層リポソーム小胞（１つの脂質二重層を含む）、大きな単層小胞、または、渦巻状小胞である。
【００６６】
一部の実施形態では、本明細書に記載の通り、細胞（ＮＫ細胞など）で発現されるとＣＡＲによって標的とされ得る抗原として、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＭＰＬ、ＣＤ１２３、ＣＤ３２、ＣＤ１３８、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７６、ＣＤ３２４、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＦｃＲＨ５、ＣＤ９９、組織因子、アミロイド、免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１（ＣＬＥＣＬ１）、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、ＩＬ１１Ｒａ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＰＲＳＳ２１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅａ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＴＣＲ−ベータ１定常鎖、ＴＣＲベータ２定常鎖、ＴＣＲガンマ−デルタ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＨＴＬＶｌ−Ｔａｘ、ＫＳＨＶ  Ｋ８．１タンパク質、ＥＢＢ  ｇｐ３５０、ＨＩＶ１−エンベロープ糖タンパク質ｇｐｌ２０、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａｌ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロスタイン、サバイビン、及び、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ−ｌ／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、ＤＬＬ３、ＴＲＯＰ２、ＰＴＫ７、ＧＣＣ、ＡＦＰ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＦＩＴＣ、黄体形成ホルモン受容体（ＬＨＲ）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、絨毛性ゴナドトロピンホルモン受容体（ＣＧＨＲ）、ＣＣＲ４、ＧＤ３、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ４、ＦＩＴＣ、黄体形成ホルモン受容体（ＬＨＲ）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、絨毛性ゴナドトロピンホルモン受容体（ＣＧＨＲ）、ＣＣＲ４、ＧＤ３、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ４��または、それらの組み合わせのうちの任意の１つまたは複数があるが、これらに限定されない。
【００６７】
様々な実施形態では、リポソームまたはポリマー粒子に封入され得る、あるいは、リポソームまたはポリマー粒子で送達され得る化学療法剤として、テモゾロミド、アクチノマイシン、アリトレチノイン、オールトランスレチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ベバシズマブ、ベキサトテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、セツキシマブ、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、ドキシル（ペグ化フォーム）、マイオセット（非ペグ化フォーム）、及び、キャエリクスなどのリポソーム内包ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エルロチニブ、エトポシド、フルオロウラシル、フォリン酸、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、ナノリポソームイリノテカン（Ｎａｌ−ＩＲＩ）、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オクレリツマブ、オファツムマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、タキソール、アブラキサン、ジェネキソール、タンパク質結合パクリタキセル、ナブ−パクリタキセル、パニツマブ、ペメトレキセド、リツキシマブ、タフルポシド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、トレチノイン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ボリノスタット、ロミデプシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、クラドリビン、クロファラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ペントスタチン、マイトマイシン、イクサベピロン、エストラムスチン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、または、それらの組み合わせのうちの任意の１つまたは複数があるが、これらに限定されない。
【００６８】
様々な実施形態では、当該化学療法薬は、プラチナをベースとした抗腫瘍薬である。プラチナをベースとした抗腫瘍薬の例として、オキサリプラチン、シスプラチン、リポプラチン（シスプラチンのリポソームバージョン）、カルボプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、及び、トリプラチン、ならびに、それらの機能的等価物、類似体、誘導体、変異体、または、塩があるが、これらに限定されない。
【００６９】
概して、当該粒子を、細胞の機能を妨げないが、高負荷の活性物質／細胞の送達に十分である比率で、各細胞にコンジュゲートする。例えば、１細胞あたりのコンジュゲートナノ粒子（例えば、ｃＭＬＶなど）の個数は、１５０〜１００、２００〜１５０、２５０〜２００、３００〜２５０、３５０〜３００、または、４００〜３５０である。
【００７０】
一部の実施形態では、粒子内の活性物質、例えば、化学療法剤は、投与後に操作ＮＫ細胞に対する細胞傷害性をもたらさないが、インビトロ及びインビボで腫瘍細胞の抑制または死滅に十分である量で、送達される。その他の実施形態では、化学療法剤などの当該活性物質は、正常細胞の集団の５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、または、２０％未満にしか細胞傷害性をもたらさないが、腫瘍細胞の１０％、１５％、または、２０％超の抑制または死滅に十分である量で、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞上の粒子中に保持される。なおも別の実施形態では、化学療法剤などの当該活性物質は、遺伝子操作されたＮＫ細胞の集団の５％、６％、７％、８％、９％、または、１０％未満にしか細胞傷害性（例えば、死滅）をもたらさないが、腫瘍細胞の１０％、１５％、または、２０％超の抑制または死滅に十分である量で、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞上の粒子中に保持される。
【００７１】
一部の実施形態では、遺伝子操作されたＮＫ細胞を含む組成物を提供し、当該ＮＫ細胞は、１つまたは複数のＣＡＲを発現し、かつ、化学療法剤を封入する架橋した多層リポソーム小胞（ｃＭＬＶ）を表面で結合している。一部の実施形態では、遺伝子操作されたＮＫ細胞を含む組成物を提供し、当該ＮＫ細胞は、Ｈｅｒ２を標的とするＣＡＲを発現し、かつ、化学療法剤を封入する複数のｃＭＬＶと表面で化学結合している。一部の実施形態では、遺伝子操作されたＮＫ細胞を含む組成物を本明細書で提供し、当該ＮＫ細胞は、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲを発現し、かつ、化学療法剤を封入する複数のｃＭＬＶと表面で化学結合している。一部の実施形態では、遺伝子操作されたＮＫ細胞を含む組成物を本明細書で提供し、当該ＮＫ細胞は、ＣＤ１９及びＨｅｒ２を標的とするＣＡＲを発現し、かつ、化学療法剤を封入する複数のｃＭＬＶと表面で化学結合している。
【００７２】
一部の実施形態では、遺伝子操作されたＮＫ細胞を含む組成物を本明細書で提供し、当該ＮＫ細胞は、１つまたは複数のＣＡＲを発現し、かつ、パクリタキセルを封入する複数のｃＭＬＶと表面で化学結合している。一部の実施形態では、遺伝子操作されたＮＫ細胞を含む組成物を本明細書で提供し、当該ＮＫ細胞は、Ｈｅｒ２を標的とするＣＡＲを発現し、かつ、パクリタキセルを封入する複数のｃＭＬＶと表面で化学結合している。一部の実施形態では、遺伝子操作されたＮＫ細胞を含む組成物を本明細書で提供し、当該ＮＫ細胞は、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲを発現し、かつ、パクリタキセルを封入する複数のｃＭＬＶと表面で化学結合している。一部の実施形態では、遺伝子操作されたＮＫ細胞を含む組成物を本明細書で提供し、当該ＮＫ細胞は、ＣＤ１９及びＨｅｒ２を標的とするＣＡＲを発現し、かつ、パクリタキセルを封入する複数のｃＭＬＶと表面で化学結合している。
【００７３】
様々な実施形態は、架橋した多層リポソームを、免疫エフェクター細胞の表面に結合する活性物質担体として提供する。架橋した多層リポソームは、外側表面と内側表面とを備え、当該内側表面は、中央のリポソーム空洞を区画する。当該多層リポソームは、少なくとも第１の脂質二重層と、第２の脂質二重層とを含み、当該第１の脂質二重層は、当該第２の脂質二重層と共有結合する。ある態様では、当該脂質二重層は、エーテル結合、及び／または、チオエーテル結合で共有結合する。概して、多層リポソームは、第２の脂質二重層に共有結合した第３の脂質二重層など、少なくとも１つのさらなる脂質二重層を含む。ある実施形態では、多層リポソームは、平均で、２〜１０個の脂質二重層を含む。別の実施形態では、多層リポソームは、平均で、３〜９個の脂質二重層を含む。なおも別の実施形態では、多層リポソームは、平均で、３〜６個の脂質二重層を含む。一部の変形例では、ポリ（アルキレングリコール）基（例えば、ポリ（エチレングリコール））を、リポソームの外面に共有結合させて、水溶性を改善する。例えば、当該ポリ（エチレングリコール）基は、約４００〜２５００ダルトンの重量平均分子量を有する。別の改良形では、当該ポリ（エチレングリコール）基は、−ＯＣＨ２ＣＨ２−の繰り返し単位を、９〜４５個含む。
【００７４】
様々な化学的、及び／または、物理的相互作用を使用して、複数のナノ粒子（例えば、ｃＭＬＶ）を、免疫エフェクター細胞の表面に結合させることができる。様々な実施形態では、活性物質担持ナノ粒子は、細胞の表面に化学的に結合している。ある実施形態では、マレイミド基をナノ粒子上で官能化させて、免疫エフェクター細胞上の遊離チオールと化学的に結合させることができる。任意で、ナノ粒子と細胞表面との間にリンカーが、例えば、ポリエチレングリコールを介して存在する。様々な実施形態は、ＮＫ細胞の表面に結合したｃＭＬＶが、ＮＫ細胞による内部移行または貪食を受けないようにする。
【００７５】
様々な実施形態は、物理的封入、捕捉、または、化学結合を介して、多層リポソームによって運搬される少なくとも１つの活性物質、例えば、抗がん化合物を提供する。ある実施形態では、活性物質は、架橋した多層リポソームの空洞内に配置することができる。別の実施形態では、活性物質を、脂質二重層、及び、任意のさらなる脂質層内に配置する。
【００７６】
治療法
本明細書では、その必要がある対象において、がんを処置する、抑制する、がんの転移を予防する、及び／または、がんの重篤度を軽減する方法を提供する。これらの方法は、本明細書に記載の組成物の有効量を対象に投与することを含む。
【００７７】
一部の実施形態では、その必要がある対象において、がんを処置する、抑制する、がんの転移を予防する、及び／または、がんの重篤度を軽減する方法であって、ＣＡＲを発現し、かつ、化学療法剤を封入する複数の粒子と表面で化学結合している遺伝子操作されたＮＫ細胞を含む組成物の有効量を当該対象に投与する当該方法を、本明細書で提供する。
【００７８】
本明細書に記載した治療法の一部の実施形態では、本明細書に記載の通り、細胞（ＮＫ細胞など）で発現されるとＣＡＲによって標的とされ得る抗原として、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＭＰＬ、ＣＤ１２３、ＣＤ３２、ＣＤ１３８、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２７６、ＣＤ３２４、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＦｃＲＨ５、ＣＤ９９、組織因子、アミロイド、免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１（ＣＬＥＣＬ１）、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、ＩＬ１１Ｒａ、メソセリン、ＰＳＣＡ、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＰＲＳＳ２１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅａ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＴＣＲ−ベータ１定常鎖、ＴＣＲベータ２定常鎖、ＴＣＲガンマ−デルタ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＨＴＬＶｌ−Ｔａｘ、ＫＳＨＶ  Ｋ８．１タンパク質、ＥＢＢ  ｇｐ３５０、ＨＩＶ１−エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロスタイン、サバイビン、及び、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／Ｍ  ＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、ＤＬＬ３、ＴＲＯＰ２、ＰＴＫ７、ＧＣＣ、ＡＦＰ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＦＩＴＣ、黄体形成ホルモン受容体（ＬＨＲ）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、絨毛性ゴナドトロピンホルモン受容体（ＣＧＨＲ）、ＣＣＲ４、ＧＤ３、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ４、ＦＩＴＣ、黄体形成ホルモン受容体（ＬＨＲ）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、絨毛性ゴナドトロピンホルモン受容体（ＣＧＨＲ）、ＣＣＲ４、ＧＤ３、ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭＦ４、または、それらの組み合わせのうちの任意の１つまたは複数があるが、これらに限定されない。
【００７９】
本明細書に記載した治療法の様々な実施形態では、多層リポソーム小胞に封入され得るまたは多層リポソーム小胞で送達され得る（例えば、それとの化学結合を含む）他のクラスの化合物と任意で併用される化学療法剤として、テモゾロミド、アクチノマイシン、アリトレチノイン、オールトランスレチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ベバシズマブ、ベキサトテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、カルボプラチン、カペシタビン、セツキシマブ、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、ドキシル（ペグ化フォーム）、マイオセット（非ペグ化フォーム）、及び、キャエリクスなどのリポソーム内包ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エルロチニブ、エトポシド、フルオロウラシル、フォリン酸、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イマチニブ、イピリムマブ、イリノテカン、ナノリポソームイリノテカン（Ｎａｌ−ＩＲＩ）、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、オクレリツマブ、オファツムマブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、タキソール、アブラキサン、ジェネキソール、タンパク質結合パクリタキセル、ナブ−パクリタキセル、パニツマブ、ペメトレキセド、リツキシマブ、タフルポシド、テニポシド、チオグアニン、トポテカン、トレチノイン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ボリノスタット、ロミデプシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、クラドリビン、クロファラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ペントスタチン、マイトマイシン、イクサベピロン、エストラムスチン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、または、それらの組み合わせのうちの任意の１つまたは複数があるが、これらに限定されない。
【００８０】
ある実施形態では、当該がん特異的抗原は、正常細胞とがん細胞の両方で発現されるが、正常細胞ではより低レベルで発現される。ある実施形態では、当該方法は、当該抗原特異的ＣＡＲが、がん細胞に結合して死滅させることを可能にする親和性で、目的とする当該がん特異的抗原に結合するＣＡＲを選択する、ことをさらに含む。一部の実施形態では、当該抗原特異的ＣＡＲは、がん細胞を死滅させるが、当該がん抗原を発現する正常細胞の３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％未満を死滅させる。例示的な実施形態では、当該抗原特異的ＣＡＲが死滅させる細胞の割合は、本明細書に記載した細胞死アッセイを使用して決定し得る。
【００８１】
一部の実施形態では、その必要がある対象において、がんを処置する、抑制する、がんの転移を予防する、及び／または、がんの重篤度を軽減する方法であって、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲを発現し、かつ、化学療法剤（例えば、パクリタキセル）を封入する複数のｃＭＬＶと表面で化学結合している細胞であるＮＫ細胞を含む組成物の有効量を当該対象に投与する当該方法を、本明細書で提供する。
【００８２】
一部の実施形態では、その必要がある対象において、がんを処置する、抑制する、がんの転移を予防する、及び／または、がんの重篤度を軽減する方法であって、Ｈｅｒ２を標的とするＣＡＲを発現し、かつ、化学療法剤（例えば、パクリタキセル）を封入する複数のｃＭＬＶと表面で化学結合している細胞であるＮＫ細胞を含む組成物の有効量を当該対象に投与する当該方法を、本明細書で提供する。
【００８３】
一部の実施形態では、その必要がある対象において、がんを処置する、抑制する、がんの転移を予防する、及び／または、がんの重篤度を軽減する方法であって、ＣＤ１９及びＨｅｒ２を標的とするＣＡＲを発現し、かつ、化学療法剤（例えば、パクリタキセル）を封入する複数のｃＭＬＶと表面で化学結合している細胞であるＮＫ細胞を含む組成物の有効量を当該対象に投与することを含む当該方法を、本明細書で提供する。
【００８４】
その増殖を抑制することができる例示的ながんとして、概して、免疫療法に応答するがんがある。処置に供するがんの例として、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓がん（例えば、明細胞がん）、前立腺がん（例えば、ホルモン抵抗性前立腺腺がん）、乳がん、結腸がん、及び、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）があるが、これらに限定されない。加えて、難治性または再発性の悪性腫瘍は、本明細書に記載した組成物を使用して処置することができる。ある実施形態では、本明細書に記載した遺伝子操作された免疫エフェクター細胞を、卵巣腫瘍を有する対象の処置に使用する。別の実施形態では、本明細書に記載した遺伝子操作された免疫エフェクター細胞を、黒色腫を有する対象の処置に使用する。さらに別の実施形態では、本明細書に記載した遺伝子操作された免疫エフェクター細胞を、腎臓がんを有する対象の処置に使用する。別の実施形態では、本明細書に記載した遺伝子操作された免疫エフェクター細胞を、前立腺がんを有する対象の処置に使用する。本明細書に記載した遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、乳がん、肺がん、または、その両方を有する対象の処置にも使用することができる。別の実施形態では、本明細書に記載した遺伝子操作された免疫エフェクター細胞を、白血病を有する対象の処置に使用する。
【００８５】
例示的な実施形態では、本明細書に記載した方法で処置するがんとして、肝臓、肺、乳房、リンパ系、胃腸（例えば、結腸）、泌尿生殖路（例えば、腎臓、尿路上皮細胞）、前立腺、及び、咽頭に対して影響を及ぼすものなど、様々な臓器系の固形腫瘍、例えば、肉腫、腺がん、及び、がん腫がある。腺がんとして、ほとんどの結腸がん、直腸がん、腎細胞がん、肝臓がん、肺の非小細胞がん、小腸のがん、食道のがんなどの悪性腫瘍がある。ある実施形態では、当該がんは、黒色腫、例えば、進行期黒色腫である。前出のがんの転移性病変も、本発明の方法及び組成物を使用して、処置または予防することができる。
【００８６】
処置することができるその他のがんの例として、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部のがん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管のがん、子宮内膜のがん、頸部のがん、膣のがん、外陰部のがん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、急性骨髄性白血病を含む慢性または急性白血病、慢性骨髄白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、小児の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱のがん、腎臓または尿管のがん、腎盂のがん、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストが誘発したものを含む環境誘発がん、及び、前述したがんの組み合わせがある。転移性がん、例えば、ＰＤ−Ｌ１を発現する転移性がんの処置（Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７：１３３−１４４）は、本明細書に記載の抗体分子を使用して、効果的に行うことができる。さらに、本明細書に記載したがん関連抗原に関連する疾患として、例えば、本明細書に記載したがん関連抗原の発現に関連する非定型、及び／または、非古典的がん、悪性腫瘍、前がん病態、または、増殖性疾患があるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に記載したＣＡＲ発現Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、細胞及び／またはがん細胞の数量、個数、量、または、割合を、細胞を発現する、血液がんを有するまたは本明細書に記載したがん関連抗原に関連する別のがんを有する対象において、陰性対照と比較して、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％減少させる。ある実施形態では、当該対象は、ヒトである。
【００８７】
一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変された細胞の治療有効量（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに、化学療法剤を封入する複数の粒子を表面で化学結合したＮＫ細胞）を、１０４〜１０９個の細胞／体重ｋｇ、一部の事例では、１０５〜１０６個の細胞／体重ｋｇで、これらの範囲内にあるすべての整数値の用量で投与する。その他の事例では、約０．１×１０９〜０．５×１０９、約０．５×１０９〜１．０×１０９、または、約１．０×１０９〜５．０×１０９の個数の操作された免疫エフェクター細胞を、単回の注射で、ヒト対象に投与する。様々な実施形態は、免疫エフェクター細胞を、１回または複数回の投与で提供する。後続の投与は、通常、毎週、隔週、三週間毎、毎月、四半期毎、または、毎年の間隔で、または、上記した頻度の組み合わせで行う。また、Ｔ細胞組成物を、これらの投与量で複数回投与し得る。これらの細胞は、免疫療法として一般的に公知の注入技術を使用して投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｍｅｄ．  ３１９：１６７６，  １９８８）。これらの細胞は、病変部位への注射（例えば、腫瘍内注射）で投与することができる。
【００８８】
一部の実施形態では、本明細書に記載した治療方法は、既存の療法を、順次に、または、同時に対象に投与することをさらに含む。既存のがん処置の例として、積極的監視、観察、外科的介入、化学療法、免疫療法、放射線療法（外照射、定位放射線手術（ガンマナイフ）、及び、分割定位放射線療法（ＦＳＲ）など）、フォーカルセラピー、全身療法、ワクチン療法、ウイルス療法、分子標的療法、または、それらの組み合わせがあるが、これらに限定されない。
【００８９】
遺伝子操作された細胞を調製する方法であって、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターで細胞をトランスフェクトすることを含む、当該方法も本明細書で提供する。一部の実施形態では、当該細胞は、ヒトＴ細胞、または、ヒトＮＫ細胞などの免疫エフェクター細胞、または、免疫エフェクター細胞をもたらす幹細胞である。一部の実施形態では、当該細胞は、自己ヒトＴ細胞、または、自己ヒトＮＫ細胞、または、自己ヒト幹細胞である。一部の実施形態では、当該細胞は、同種ヒトＴ細胞、または、同種ヒトＮＫ細胞、または、同種ヒト幹細胞である。
【００９０】
一部の実施形態では、遺伝子改変された細胞を調製する方法は、細胞の集団を取得し、及び、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、及び／または、ＣＤ４５ＲＯの１つまたは複数を発現する細胞を選択する、ことを含む。特定の実施形態では、提供を受ける免疫エフェクター細胞の集団は、ＣＤ３＋、及び／または、ＣＤ２８＋である。
【００９１】
ある実施形態では、遺伝子改変された細胞を調製する方法は、細胞の集団を取得し、及び、例えば、ＣＤ２５に特異的な抗体を使用することで、ＣＤ２５＋  Ｔ調節細胞を増やす、ことを含む。当該細胞集団からＣＤ２５＋  Ｔ調節細胞を増やす方法は、当業者に自明である。一部の実施形態では、Ｔｒｅｇ濃縮細胞は、３０％、２０％、１０％、５％未満の非Ｔｒｅｇ細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲをコードするベクターを、Ｔｒｅｇ濃縮細胞にトランスフェクトする。ＣＡＲを発現するＴｒｅｇ濃縮細胞を使用して、ＣＡＲが標的とする抗原に対する寛容性を誘導し得る。
【００９２】
一部の実施形態では、本方法は、本明細書に記載のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを細胞にトランスフェクトした後に、細胞の集団を増殖させることをさらに含む。実施形態では、当該細胞の集団を、８日以下の期間にわたって増殖させる。特定の実施形態では、当該細胞の集団を、５日間培養して増殖させ、そして、そこで得た細胞は、同じ培養条件下での９日間の培養で増殖させた同じ細胞よりもより能力がある。その他の実施形態では、当該細胞の集団を、５日間の培養で増殖させると、同じ培養条件下での９日間の培養で増殖させた同じ細胞と比較して、抗原で刺激を与えた場合に、細胞の倍加において、少なくとも１、２、３、または、４倍の増大を示す。一部の実施形態では、当該細胞の集団は、１４日間の増殖期間で、フローサイトメトリーで測定して少なくとも２００倍、２５０倍、３００倍、または、３５０倍の細胞の増加をもたらす、１つまたは複数のインターロイキンを含む適切な培地で増殖させる。
【００９３】
様々な実施形態では、当該増殖させた細胞は、１つまたは複数のＣＡＲを含み、かつ、本明細書に記載したような、化学療法剤にコンジュゲートしたリポソーム（例えば、多層リポソーム小胞）をさらに含む。一部の実施形態では、当該増殖させた細胞は、１つ、２つ、３つ、または、それ以上のＡＳＤを有する１つのＣＡＲを含む。一部の実施形態では、当該増殖させた細胞は、本明細書に記載のアクセサリーモジュール、及び、治療対照をさらに含む。
【００９４】
併用療法
本明細書に記載した治療法は、ＣＡＲをコードする核酸を含み、かつ複数の化学療法剤担持粒子と表面結合している、遺伝子改変された細胞を有する組成物を使用することを含む。様々な実施形態では、本明細書に記載した治療法は、既存の治療と作用物質とを組み合わせ得る。本明細書に記載した治療用組成物、例えば、ＣＡＲをコードする核酸を含み、かつ複数の化学療法剤担持粒子と表面で結合している遺伝子改変された細胞は、少なくとも１つのさらなる公知の治療または治療薬と共に対象に投与する。一部の実施形態では、本明細書に記載した組成物、及び、さらなる治療または治療薬を連続して投与する。一部の実施形態では、本明細書に記載した組成物、及び、さらなる治療または治療薬を同時に投与する。本明細書に記載した組成物及び既存の治療の最適な投与順序は、医師などの当業者に自明である。
【００９５】
本明細書に記載した複数の化学療法剤担持ナノ粒子、及び、少なくとも１つのさらなる治療薬を表面にさらに含む遺伝子操作されたＣＡＲ発現細胞を、同時に、同じ、または、別個の組成物で、または、連続して投与することができる。連続投与の場合、本明細書に記載した細胞を最初に投与し、そして、さらなる作用物質を２番目に投与し、あるいは、投与順序を逆にすることもできる。
【００９６】
併用療法は、疾患の期間にわたって当該対象に投与し得る。疾患の持続期間は、診断から処置の終了までを含み、処置により症状の軽減、及び／または、症状の解消をもたらす。様々な実施形態では、２つの処置の効果は、部分的に相加的、完全に相加的、または、相加的より大きくなる。送達は、送達した最初の処置の効果を、２番目の処置を送達したときに、なおも検出可能とすることができる。
【００９７】
本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに表面に複数の化学療法剤担持ナノ粒子を含むＮＫ細胞）、及び／または、その他の治療薬、手順またはモダリティを使用する治療は、活動性障害の期間、または、寛解期または活動性が低い疾患の期間に投与することができる。本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに表面に複数の化学療法剤担持ｃＭＬＶを含むＮＫ細胞）を使用する治療は、その他の処置の前、その処置と同時に、その処置の後、または、当該障害の寛解中に投与することができる。
【００９８】
組み合わせで投与する場合、本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに表面に複数の化学療法剤担持ｃＭＬＶを含むＮＫ細胞）、及び、さらなる作用物質（例えば、第２または第３の作用物質）、または、すべてを使用する治療は、例えば、単独療法として個々に使用する各作用物質の量または用量よりも多い、少ない、または、同じ、量または用量で投与することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに表面に複数の化学療法剤担持ｃＭＬＶを含むＮＫ細胞）、及び、さらなる作用物質（例えば、第２または第３の作用物質）、または、すべてを使用する治療での投与量または用量は、例えば、単独療法として個々に使用する各作用物質の量または用量よりも少ない（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または、少なくとも５０％少ない）。その他の実施形態では、本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに表面に複数の化学療法剤担持ｃＭＬＶを含むＮＫ細胞）、及び、さらなる作用物質（例えば、第２または第３の作用物質）、または、すべてを使用する治療での量または用量は、所望の効果（例えば、がんの処置）と同じ治療効果を達成するために必要な、例えば、単剤療法として個々に使用する各作用物質の量または用量よりも少ない（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または、少なくとも５０％少ない）。
【００９９】
さらなる方法の態様は、免疫細胞の有効性、及び／または、安全性を高める作用物質と任意に組み合わせて、本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに表面に複数の化学療法剤担持ｃＭＬＶを含むＮＫ細胞）の有効量を、当該対象に投与することに関する。さらなる態様では、免疫細胞の有効性、及び／または、安全性を高める作用物質とは：（ｉ）プロテインホスファターゼ阻害剤；（ｉｉ）キナーゼ阻害剤；（ｉｉｉ）サイトカイン；（ｉｖ）免疫抑制分子の阻害剤；または、（ｖ）ＴＲＥＧ細胞のレベルまたは活性を低下させる作用物質；ｖｉ）ＣＡＲ改変細胞の増殖、及び／または、持続性を高める作用物質  ｖｉｉ）ケモカイン  ｖｉｉｉ）ＣＡＲの発現を高める作用物質  ｉｘ）ＣＡＲの発現または活性の調節を可能にする作用物質  ｘ）ＣＡＲ改変細胞の生存、及び／または、持続性の制御を可能にする作用物質  ｘｉ）ＣＡＲ改変細胞の副作用を制御する作用物質  ｘｉｉ）Ｂｒｄ４阻害剤  ｘｉｉｉ）疾患の部位に治療薬（例えば、ｓＨＶＥＭ）または予防薬を送達する作用物質  ｘｉｖ）ＣＡＲが向かおうとする標的抗原の発現を高める作用物質；ｘｖ）アデノシンＡ２ａ受容体アンタゴニスト、の１つまたは複数である。
【０１００】
一部の実施形態では、本明細書に記載した遺伝子改変された細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに表面に複数の化学療法剤担持ｃＭＬＶを含むＮＫ細胞）を、手術、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、及び、ＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、または、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、または、その他の抗体療法、シトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、及び、放射線治療などのその他の免疫除去剤、Ｉｚｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  １０８：９６３−９７１に記載されたようなペプチドワクチン、と組み合わせて治療レジメンで使用し得る。ある実施形態では、本明細書に記載したＣＡＲ発現細胞は、化学療法剤と組み合わせて使用することができる。例示的な化学療法剤として、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン（例えば、リポソームドキソルビシン））、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、デカルバジン、メルファラン、イフォスファミド、テモゾロミド）、免疫細胞抗体（例えば、アレムツザマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、ブレンツキシマブ）、代謝拮抗剤（例えば、葉酸拮抗薬、ピリミジン類似体、プリン類似体、及び、アデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えば、フルダラビン））、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦＲグルココルチコイド誘発ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）アゴニスト、プロテアソーム阻害剤（例えば、アクラシノマイシンＡ、グリオトキシン、または、ボルテゾミブ）、サリドマイド、または、サリドマイド誘導体（例えば、レナリドミド）などの免疫調節剤がある。
【０１０１】
実施形態では、本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、表面に複数の化学療法剤担持ｃＭＬＶを含むＮＫ細胞）を、シクロホスファミド、及び、フルダラビンと組み合わせて、対象に投与する。
【０１０２】
実施形態では、本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに表面に複数の化学療法剤担持ｃＭＬＶを含むＮＫ細胞）を、ベンダムスチン、及び、リツキシマブと組み合わせて、対象に投与する。実施形態では、当該対象は、ＣＬＬを有している。
【０１０３】
実施形態では、本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに表面に複数の化学療法剤担持ｃＭＬＶを含むＮＫ細胞）を、リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及び／または、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン）と組み合わせて、対象に投与する。実施形態では、本明細書に記載したＣＡＲ発現細胞は、リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及び、プレドニゾン（Ｒ−ＣＨＯＰ）と組み合わせて、対象に投与する。実施形態では、当該対象は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を有している。
【０１０４】
実施形態では、本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに表面に複数の化学療法剤担持ｃＭＬＶを含むＮＫ細胞）を、エトポシド、プレドニゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、及び／または、リツキシマブと組み合わせて、対象に投与する。実施形態では、本明細書に記載したＣＡＲ発現細胞を、エトポシド、プレドニゾン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、及び、リツキシマブ（ＥＰＯＣＨ−Ｒ）と組み合わせて、対象に投与する。実施形態では、本明細書に記載したＣＡＲ発現細胞を、用量調整したＥＰＯＣＨ−Ｒ（ＤＡ−ＥＰＯＣＨ−Ｒ）と組み合わせて、対象に投与する。実施形態では、当該対象は、Ｂ細胞リンパ腫、例えば、Ｍｙｃ再構成侵襲性Ｂ細胞リンパ腫を有する。
【０１０５】
実施形態では、本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに表面に複数の化学療法剤担持ｃＭＬＶを含むＮＫ細胞）を、ブレンツキシマブと組み合わせて、対象に投与する。ブレンツキシマブは、抗ＣＤ３０抗体とモノメチルオーリスタチンＥとの抗体医薬コンジュゲートである。実施形態では、当該対象は、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、例えば、再発性または難治性ＨＬを有する。実施形態では、当該対象は、ＣＤ３０＋  ＨＬを含む。実施形態では、当該対象は、自家幹細胞移植（ＡＳＣＴ）を受けている。
【０１０６】
一部の実施形態では、本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに表面に複数の化学療法剤担持ｃＭＬＶを含むＮＫ細胞）を、ＣＤ２０阻害剤、例えば、抗ＣＤ２０抗体（例えば、抗ＣＤ２０単一特異性または二重特異性抗体）、または、その断片と組み合わせて、対象に投与する。
【０１０７】
ある実施形態では、本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに表面に複数の化学療法剤担持ｃＭＬＶを含むＮＫ細胞）を、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、本明細書に記載したｍＴＯＲ阻害剤、例えば、エベロリムスなどのラパログと組み合わせて、対象に投与する。ある実施形態では、当該ｍＴＯＲ阻害剤を、ＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、ある実施形態では、当該細胞のアフェレーシスの前に、当該ｍＴＯＲ阻害剤を投与することができる。ある実施形態では、当該対象は、ＣＬＬを有する。
【０１０８】
ある実施形態では、本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに表面に複数の化学療法剤担持ｃＭＬＶを含むＮＫ細胞）を、キナーゼ阻害剤と組み合わせて、使用することができる。ある実施形態では、当該キナーゼ阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤、例えば、本明細書に記載したＣＤＫ４阻害剤、例えば、ＣＤ４／６阻害剤、例えば、６−アセチル−８−シクロペンチル−５−メチル−２−（５−ピペラジン−１−イル−ピリジン−２−イルアミノ）−８Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オン、塩酸塩（別名、パルボシクリブまたはＰＤ０３３２９９１）などである。ある実施形態では、当該キナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤、例えば、本明細書に記載したＢＴＫ阻害剤、例えば、イブルチニブなどである。一部の実施形態では、イブルチニブを、約３００〜６００ｍｇ／日（例えば、約３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０、または、５５０〜６００ｍｇ／日、例えば、約４２０ｍｇ／日、または、約５６０ｍｇ／日）の用量で、例えば、経口投与する。実施形態では、イブルチニブを、約２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、４２０ｍｇ、４４０ｍｇ、４６０ｍｇ、４８０ｍｇ、５００ｍｇ、５２０ｍｇ、５４０ｍｇ、５６０ｍｇ、５８０ｍｇ、６００ｍｇ（例えば、２５０ｍｇ、４２０ｍｇ、または、５６０ｍｇ）の用量で、毎日、一定期間、例えば、２１日間のサイクルで、または、毎日、２８日間のサイクルで投与する。ある実施形態では、イブルチニブを、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２サイクル以上、投与する。理論に拘束されるものではないが、イブルチニブを添加すると、Ｔ細胞増殖反応を増強し、そして、Ｔ細胞を、Ｔ−ヘルパー−２（Ｔｈ２）からＴ−ヘルパー−１（Ｔｈｌ）表現型にシフトし得る、と考えられている。Ｔｈ１及びＴｈ２は、ヘルパーＴ細胞の表現型であり、Ｔｈ１とＴｈ２とでは、異なる免疫応答経路に関係している。Ｔｈ１表現型は、例えば、細胞内病原体／ウイルス、または、がん細胞などの細胞などを死滅させるための、または、自己免疫応答を持続させるための炎症誘発性応答に関連している。Ｔｈ２表現型は、好酸球の蓄積と抗炎症反応に関連している。ある実施形態では、当該キナーゼ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、本明細書に記載したｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシン、ラパマイシン類似体、ＯＳＩ−０２７などである。当該ｍＴＯＲ阻害剤を、例えば、ｍＴＯＲＣ１阻害剤、及び／または、ｍＴＯＲＣ２阻害剤、例えば、本明細書に記載したｍＴＯＲＣ１阻害剤、及び／または、ｍＴＯＲＣ２阻害剤とすることができる。ある実施形態では、当該キナーゼ阻害剤は、ＭＮＫ阻害剤、例えば、本明細書に記載したＭＮＫ阻害剤、例えば、４−アミノ−５−（４−フルオロアニリノ）−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンなどである。当該ＭＮＫ阻害剤を、例えば、ＭＮＫ１ａ、ＭＮＫ１ｂ、ＭＮＫ２ａ、及び／または、ＭＮＫ２ｂ阻害剤とすることができる。ある実施形態では、当該キナーゼ阻害剤は、本明細書に記載したデュアルＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ＰＦ−０４６９５１０２などである。ある実施形態では、当該キナーゼ阻害剤は、Ｓｒｃキナーゼ阻害剤である。ある実施形態では、当該キナーゼ阻害剤は、ダサチニブである。ある実施形態では、ＣＡＲ発現細胞の投与の後に、当該Ｓｒｃキナーゼ阻害剤を患者に投与して、ＣＡＲ発現細胞の活性を制御または停止する。ある実施形態では、ＣＡＲ発現細胞の投与の後に、ダサチニブを患者に投与して、ＣＡＲ発現細胞の活性を制御または停止する。ある実施形態では、ダサチニブを、少なくとも１０ｍｇ／日、２０ｍｇ／日、４０ｍｇ／日、６０ｍｇ／日、７０ｍｇ／日、９０ｍｇ／日、１００ｍｇ／日、１４０ｍｇ／日、１８０ｍｇ／日、または、２１０ｍｇ／日の用量で経口投与する。
【０１０９】
実施形態では、本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに表面に複数の化学療法剤担持ｃＭＬＶを含むＮＫ細胞）を、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤と組み合わせて、対象に投与する。例示的なＡＬＫキナーゼとして、クリゾチニブ（Ｐｆｉｚｅｒ）、セリチニブ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、アレクチニブ（Ｃｈｕｇａｉ）、ブリガチニブ（別名、ＡＰ２６１１３；Ａｒｉａｄ）、エントレチニブ（Ｉｇｎｙｔａ）、ＰＦ−０６４６３９２２（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＴＳＲ−０１１（Ｔｅｓａｒｏ）（例えば、臨床試験識別子番号ＮＣＴ０２０４８４８８を参照されたい）、ＣＥＰ−３７４４０（Ｔｅｖａ）、及び、Ｘ−３９６（Ｘｃｏｖｅｒｙ）があるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、当該対象は、固形がん、例えば、本明細書に記載した固形がん、例えば、肺がんを有する。
【０１１０】
カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリン（シクロスポリン、及び、ＦＫ５０６）、または、成長因子誘導シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼ（ラパマイシン）のいずれかを阻害する薬剤も使用することができる。さらなる態様では、本発明の細胞組成物を、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤を使用するＴ細胞除去療法、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、及び／または、ＯＫＴ３やＣＡＭＰ  ＡＴＨなどの抗体と併せて、（例えば、先に、同時に、または、後に）患者に投与し得る。ある態様では、本発明の細胞組成物を、ＣＤ２０と反応する作用物質、例えば、リツキサンなどのＢ細胞除去療法の後に投与する。例えば、ある実施形態では、対象は、高用量化学療法と、それに続く末梢血幹細胞移植による標準治療を受け得る。特定の実施形態では、移植の後に、対象は、本発明の増殖させた免疫細胞の注入を受ける。さらなる実施形態では、増殖させた細胞を、手術の前または後に投与する。
【０１１１】
実施形態では、本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに表面に複数の化学療法剤担持ｃＭＬＶを含むＮＫ細胞）を、自家幹細胞移植、同種幹細胞移植、自家骨髄移植、または、同種骨髄移植と組み合わせて、対象に投与する。
【０１１２】
実施形態では、本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、表面に複数の化学療法剤担持ｃＭＬＶを含むＮＫ細胞）を、マイクロ移植、または、ＵＬＡミスマッチ同種細胞療法と組み合わせて、対象に投与する。
【０１１３】
実施形態では、本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに表面に複数の化学療法剤担持ｃＭＬＶを含むＮＫ細胞）を、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤と組み合わせて、対象に投与する。
【０１１４】
実施形態では、本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに表面に複数の化学療法剤担持ｃＭＬＶを含むＮＫ細胞）を、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）のモジュレーターと組み合わせて、対象に投与する。ＭＤＳＣは、数多くの固形腫瘍の末梢及び腫瘍部位に蓄積する。これらの細胞は、Ｔ細胞応答を抑制し、それにより、ＣＡＲ発現細胞療法の有効性を妨げる。理論に拘束されるものではないが、ＭＤＳＣモジュレーターの投与は、本明細書に記載したＣＡＲ発現細胞の有効性を高めるものと考えられる。ある実施形態では、当該対象は、固形腫瘍、例えば、本明細書に記載した固形腫瘍、例えば、膠芽腫を有する。ＭＤＳＣの例示的なモジュレーターとして、ＭＣＳ１１Ｏ、及び、ＢＬＺ９４５があるが、これらに限定されない。ＭＣＳ１１Ｏは、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。ＢＬＺ９４５は、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）の小分子阻害剤である。実施形態では、本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに表面に複数の化学療法剤担持ｃＭＬＶを含むＮＫ細胞）を、Ｂｒｄ４またはＢＥＴ（ブロモドメイン、及び、末端外モチーフ）阻害剤と組み合わせて、対象に投与する。ＢＥＴタンパク質ＢＲＤ４は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞における転写因子ＢＡＴＦの発現を直接調節するものであり、Ｔ細胞のエフェクターメモリー表現型への分化に関連していた。ブロモドメイン、及び、末端外モチーフ（ＢＥＴ）タンパク質の阻害剤であるＪＱ１は、幹細胞様及びセントラルメモリーＴ細胞の機能的特性を備えたＣＤ８＋  Ｔ細胞を維持した。ＣＡＲ発現細胞と組み合わせて投与できる例示的なＢｒｄ４阻害剤として、ＪＱ１、ＭＳ４１７、ＯＴＸＯ１５、ＬＹ  ３０３５１１、及び、ＵＳ  ２０１４０２５６７０６  Ａ１に記載されているＢｒｄ４阻害剤、及び、それらの類似体があるが、これらに限定されない。
【０１１５】
一部の実施形態では、本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに表面に複数の化学療法剤担持ｃＭＬＶを含むＮＫ細胞）を、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチド、インターロイキン−１５受容体アルファ（ＩＬ−１５Ｒａ）ポリペプチド、または、ＩＬ−１５ポリペプチド及びＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方の組み合わせ、例えば、ｈｅｔｉＬ−１５（Ａｄｍｕｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＬＬＣ）と組み合わせて、対象に投与する。ｈｅｔｉＬ−１５は、ＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒａとのヘテロ二量体非共有複合体である。ｈｅｔｉＬ−１５は、例えば、Ｕ．Ｓ．８，１２４，０８４、Ｕ．Ｓ．２０１２／０１７７５９８、Ｕ．Ｓ．２００９／００８２２９９、Ｕ．Ｓ．２０１２／０１４１４１３、及び、Ｕ．Ｓ．２０１１１００８１３１１に記載されている。実施形態では、ｈｅｔ−ＩＬ−１５を、皮下投与する。実施形態では、当該対象は、がん、例えば、固形がん、例えば、黒色腫、または、結腸がんを有する。実施形態では、当該対象は、転移がんを有する。
【０１１６】
ある実施形態では、ＣＡＲ発現細胞の投与に伴う副作用を軽減または改善する作用物質を、対象に投与することができる。ＣＡＲ発現細胞の投与に伴う副作用として、ＣＲＳ、及び、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）、別名、マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）があるが、これらに限定されない。ＣＲＳの症状として、高熱、悪心、一過性低血圧、低酸素などがある。ＣＲＳとして、発熱、疲労、食欲不振、筋肉痛、関節痛、吐き気、嘔吐、及び、頭痛などの臨床的な体質に起因する兆候、及び、症状を含み得る。ＣＲＳとして、臨床的な皮膚の兆候、及び、発疹などの症状を含み得る。ＣＲＳとして、悪心、嘔吐、下痢などの臨床的な胃腸の兆候、及び、症状を含み得る。ＣＲＳとして、頻呼吸や低酸素血症などの臨床的な呼吸の兆候、及び、症状を含み得る。ＣＲＳとして、頻脈、脈圧の拡大、低血圧、心拍出量の増加（早期）、及び、潜在的な心拍出量の減少（後期）などの臨床的な心血管の兆候、及び、症状を含み得る。ＣＲＳとして、ｄダイマーの上昇、出血を伴う、または、伴わない低フィブリノゲン血症などの臨床的な凝固の兆候、及び、症状を含み得る。ＣＲＳとして、臨床的な腎臓の兆候、及び、高窒素血症などの症状を含み得る。ＣＲＳとして、高トランスアミナーゼ血症、及び、高ビリルビン血症などの臨床的な肝臓の兆候、及び、症状を含み得る。ＣＲＳとして、頭痛、精神状態の変化、錯乱、せん妄、喚語困難、または、明らかな失語症、幻覚、振戦、嘔吐、歩調の変化、及び、発作などの臨床的な神経学的の兆候、及び、症状を含み得る。
【０１１７】
したがって、本明細書に記載した方法は、本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、表面にｃＭＬＶなどの複数の化学療法剤担持ナノ粒子を含むＫ細胞）を対象に投与し、及び、１つまたは複数の作用物質をさらに投与して、可溶性因子の上昇レベルを管理して、ＣＡＲ発現細胞を用いた処置を行う。ある実施形態では、当該対象において上昇する可溶性因子は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦａ、ＩＬ−２、及び、ＩＬ−６の１つまたは複数である。ある実施形態では、当該対象において上昇する因子は、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−５、及び、フラクタルカインの１つまたは複数である。したがって、この副作用を処置するために投与する作用物質を、これらの可溶性因子の１つまたは複数を中和する作用物質とすることができる。ある実施形態では、これらの可溶性形態の１つまたは複数を中和する作用物質は、抗体、または、その抗原結合断片である。そのような作用物質の例として、ステロイド（例えば、コルチコステロイド）、Ｓｒｃ阻害剤（例えば、ダサチニブ）、ＴＮＦａ阻害剤、及び、ＩＬ−６阻害剤があるが、これらに限定されない。ＴＮＦａ阻害剤の例として、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、及び、ゴリムマブなどの抗ＴＮＦａ抗体分子がある。ＴＮＦａ阻害剤の別の例として、エンタネルセプトなどの融合タンパク質がある。ＩＬ−６阻害剤の例として、トシリズマブ（ｔｏｅ）、サリルマブ、エルシリモマブ、ＣＮＴＯ  ３２８、ＡＬＤ５１８／ＢＭＳ−９４５４２９、ＣＮＴＯ  １３６、ＣＰＳＩ−２３６４、ＣＤＰ６０３８、ＶＸ３０、ＡＲＧＸ−１０９、ＦＥ３０１、及び、ＦＭ１０１などの抗ＩＬ−６抗体分子、または、抗ＩＬ−６受容体抗体分子がある。ある実施形態では、当該抗ＩＬ−６受容体抗体分子は、トシリズマブである。ある実施形態では、当該ＩＬ−６阻害剤は、ＩＬ６Ｒ、及び、ヒト血清アルブミン（例えば、ＩＬ６Ｒ−３０４−Ａｌｂ８）（配列番号２６４９）に結合するラクダ科の二重特異性抗体である。ＩＬ−１Ｒをベースとした阻害剤の例として、アナキンラがある。ある実施形態では、ＣＡＲ発現細胞の副作用を処置するために投与する作用物質は、Ｓｒｃ阻害剤（例えば、ダサチニブ）である。ある実施形態では、ＣＡＲ発現細胞の副作用を処置するために投与する作用物質は、Ｓｒｃ阻害剤ダサチニブである。実施形態では、ダサチニブを、約１０ｍｇ／日〜２４０ｍｇ／日（例えば、１０ｍｇ／日、２０ｍｇ／日、４０ｍｇ／日、５０ｍｇ／日、７０ｍｇ／日、８０ｍｇ／日、１００ｍｇ／日、１１０ｍｇ／日、１２０ｍｇ／日、１４０ｍｇ／日、１８０ｍｇ／日、２１０ｍｇ／日、２４０ｍｇ／日、または、３００ｍｇ／日）の用量で投与する。
【０１１８】
ある実施形態では、本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、表面にｃＭＬＶなどの複数の化学療法剤担持ナノ粒子をさらに含むＮＫ細胞）の活性を高める作用物質を、対象に投与することができる。例えば、ある実施形態では、当該作用物質を、阻害分子を阻害する作用物質とすることができる。一部の実施形態では、阻害分子、例えば、プログラム死１（ＰＤ−１）は、ＣＡＲ発現細胞の免疫エフェクター応答を開始する能力を低減させうる。阻害分子の例として、ＰＤ−１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、及び／または、ＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ−３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及び、ＴＧＦＲベータがある。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、タンパク質レベルで阻害することで阻害分子を阻害すると、ＣＡＲ発現細胞の性能を最適化できる。実施形態では、阻害性核酸、例えば、阻害性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、クラスター化した規則的に間隔を置いた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、または、例えば、本明細書に記載したジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して、ＣＡＲ発現細胞における阻害分子の発現を阻害することができる。ある実施形態では、当該阻害剤は、ｓｈＲＮＡである。ある実施形態では、当該阻害分子を、ＣＡＲ発現細胞内で阻害する。これらの実施形態では、阻害分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子は、ＣＡＲの成分、例えば、すべての成分をコードする核酸に結合している。ある実施形態では、阻害性シグナルの当該阻害剤を、例えば、阻害分子に結合する抗体または抗体断片とすることができる。例えば、当該作用物質を、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、または、ＣＴＬＡ４に結合する抗体または抗体断片（例えば、イピリムマブ（別名、ＭＤＸ−０１０、及び、ＭＤＸ−１０１、Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）として市販されている；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ；トレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒが販売しているＩｇＧ２モノクローナル抗体、旧名、チシリムマブ、ＣＰ−６７５，２０６）とすることができる。ある実施形態では、当該作用物質は、ＴＩＭ３に結合する抗体または抗体断片である。ある実施形態では、当該作用物質は、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、及び／または、ＣＥＡＣＡＭ−５）に結合する抗体または抗体断片である。ある実施形態では、当該作用物質は、ＬＡＧ３に結合する抗体または抗体断片である。
【０１１９】
ＰＤ−１は、ＣＤ２８ファミリーの受容体の阻害メンバーであり、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、及び、ＢＴＬＡをも含む。ＰＤ−１は、活性化したＢ細胞、Ｔ細胞、及び、骨髄細胞に発現する。ＰＤ−１の２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１、及び、ＰＤ−Ｌ２は、ＰＤ−１に結合すると、Ｔ細胞活性化をダウンレギュレートする、ことが示されている。ＰＤ−Ｌ１は、ヒトのがんに豊富にある。免疫抑制は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の局所的相互作用を阻害することで、逆転させることができる。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及び、ＰＤ−Ｌ２の抗体、抗体断片、及び、その他の阻害剤は、当該技術分野において利用可能であり、そして、本明細書に記載した本発明のＣＡＲと組み合わせて使用し得る。例えば、ニボルマブ（別名、ＢＭＳ−９３６５５８、または、ＭＤＸ１１０６；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）は、ＰＤ−１を特異的にブロックする完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ニボルマブ（クローン５Ｃ４）、及び、ＰＤ−１に特異的に結合するその他のヒトモノクローナル抗体は、ＵＳ  ８，００８，４４９、及び、ＷＯ２００６／１２１１６８に開示されている。ピディリズマブ（ＣＴ−０１１；Ｃｕｒｅ  Ｔｅｃｈ）は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体である。ピディリズマブ、及び、その他のヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、ＷＯ２００９／１０１６１１に開示されている。ペンブロリズマブ（旧名、ラムブロリズマブ、別名、ＭＫ０３４７５；Ｍｅｒｃｋ）は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペンブロリズマブ、及び、その他のヒト化抗ＰＤ−１抗体は、ＵＳ  ８，３５４，５０９、及び、ＷＯ  ２００９／１１４３３５に開示されている。ＭＥＤＩ４７３６（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）は、ＰＤＬ１に結合し、かつ、リガンドとＰＤ１との相互作用を阻害するヒトモノクローナル抗体である。ＭＤＰＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉ  Ｒｏｃｈｅ）は、ＰＤ−Ｌ１に結合するヒトＦｅ最適化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＭＤＰＬ３２８０Ａ、及び、ＰＤ−Ｌ１に対するその他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号、及び、米国公開第２０１２００３９９０６に開示されている。その他の実施形態では、ＣＡＲ発現細胞の活性を高める作用物質は、ＣＥＡＣＡＭ阻害剤（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、及び／または、ＣＥＡＣＡＭ−５阻害剤）である。
【０１２０】
ある実施形態では、本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに表面にｃＭＬＶなどの複数の化学療法剤担持ナノ粒子を含むＮＫ細胞）の活性を高める作用物質は、ＣＡＲが対象とする標的抗原の発現を高める別の作用物質である。本明細書に記載したＣＡＲ発現細胞を投与する対象に投与することができる作用物質として：三酸化ヒ素、ＡＴＲＡ（全トランスレチノイン酸）、化合物２７、４０、４９のＩＤＨ２阻害剤（例えば、ＡＧ−２２１）、または、これらの組み合わせがある。ある実施形態では、当該作用物質を、ＣＡＲ発現細胞の投与の前、投与と同時、または、投与の後に投与する。好ましい実施形態では、これらの作用物質は、ＣＡＲ発現細胞の投与の前に投与する。好ましい実施形態では、上記した作用物質と共に投与するＣＡＲ発現細胞は、Ｂ細胞抗原（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、または、ＣＤ２２など）を標的とする。
【０１２１】
本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに表面にｃＭＬＶなどの複数の化学療法剤担持ナノ粒子を含むＮＫ細胞）の投与を受ける当該対象に投与できるサイトカインとして、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＬＩＧＨＴ、及び、ＩＬ−２１、または、それらの組み合わせがある。好ましい実施形態では、投与するサイトカインは、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、または、ＩＬ−２１、ＩＬ１２Ｆ、または、それらの組み合わせである。当該サイトカインは、１日１回、または、１日１回より多く、例えば、１日２回、１日３回、または、１日４回投与することができる。当該サイトカインを、１日以上、例えば、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、または、４週間、投与することができる。例えば、当該サイトカインを、１日１回で、７日間、投与する。ＣＡＲ発現細胞療法に対する準最適応答を有する対象に対してサイトカインを投与すると、ＣＡＲ発現細胞の有効性、または、抗がん活性が改善される。好ましい実施形態では、ＣＡＲ発現細胞の投与後に投与するサイトカインは、ＩＬ−７である。
【０１２２】
ある実施形態では、本明細書に記載した細胞（例えば、ＣＡＲを発現し、かつ、さらに表面にｃＭＬＶなどの複数の化学療法剤担持ナノ粒子を含むＮＫ細胞）の活性を高める作用物質は、ＢＲＤ４を標的とするＢｒｄ４阻害剤、または、ｓｉＲＮＡ、または、ｓｈＲＮＡである。
【０１２３】
医薬組成物
様々な実施形態では、本発明は、医薬組成物を提供する。当該医薬組成物は、抗原特異的ＣＡＲを発現し、かつ、１つまたは複数の化学療法剤を封入またはそうでなければ運搬する複数のリポソーム（例えば、多層リポソーム小胞）またはその他のナノ粒子を細胞表面に結合している、遺伝子改変された細胞と；医薬として許容可能な任意の賦形剤とを含む。例示的な実施形態では、遺伝子改変された細胞は、Ｈｅｒ２、及び／または、ＣＤ１９に特異的なＣＡＲを発現するＮＫ細胞であり、かつ、パクリタキセルを封入する複数のナノ粒子（例えば、多層リポソーム小胞）と表面で結合している。
【０１２４】
「医薬として許容可能な賦形剤」とは、一般的に、安全で、非毒性で、及び、望ましい医薬組成物の調製において有用な賦形剤のことを意味し、かつ、獣医学的使用、及び、ヒト医薬使用に許容される賦形剤を含む。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、または、エアロゾル組成物では気体とし得る。賦形剤の例として、デンプン、糖類、微結晶セルロース、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味料、香味料、香料、防腐剤、酸化防止剤、可塑剤、ゲル化剤、増粘剤、硬化物、硬化剤、懸濁剤、界面活性物質、保湿剤、担体、安定剤、及び、それらの組み合わせがあるが、これらに限定されない。
【０１２５】
様々な実施形態では、本発明の医薬組成物は、任意の投与経路を介した送達のために製剤し得る。「投与経路」として、エアロゾル、鼻腔、経口、経粘膜、経皮、非経口、または、経腸など、当該技術分野で公知のあらゆる投与経路があるが、これらに限定されない。「非経口」とは、一般的には、注射に関連した投与経路のことを指し、眼窩内、注入、動脈内、嚢内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨下、髄腔内、子宮内、静脈内、クモ膜下、嚢下、皮下、経粘膜、または、経気管などがある。非経口経路を介する場合、当該組成物は、注入または注射用の溶液または懸濁液の形態、または、凍結乾燥粉末の形態とし得る。非経口経路を介する場合、当該組成物は、注入または注射用の溶液または懸濁液の形態とし得る。経腸経路を介する場合、当該医薬組成物は、制御した放出が可能な錠剤、ゲルカプセル、糖衣錠、シロップ、懸濁液、溶液、粉末、顆粒、エマルジョン、ミクロスフェア、または、ナノスフェア、または、脂質小胞、または、ポリマー小胞の形態とし得る。概して、当該組成物を、注射で投与する。これらの投与の方法は、当業者に公知である。
【０１２６】
本発明の医薬組成物は、医薬として許容可能な任意の担体を含むことができる。本明細書で使用する用語「医薬として許容可能な担体」とは、ある組織、臓器、または、身体の一部から別の組織、臓器、または、当該身体の一部への、目的の化合物の運搬または輸送に関与する医薬として許容可能な材料、組成物、または媒体のことを指す。例えば、当該担体を、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または、封入材料、または、それらの組み合わせとし得る。当該担体の各成分は、当該製剤のその他の成分と適合しなくてはならないという点で「医薬として許容可能な」ものでなければならない。また、接触し得る組織または臓器と接触させる用途に適している必要があり、このことは、毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、または、治療上の利点を著しく超えるその他の合併症のリスクを負ってはならないことを意味する。
【０１２７】
本発明の医薬組成物は、経口投与のために、封入、錠剤化、または、エマルジョン、または、シロップに調製することもできる。当該組成物を向上または安定化させるため、または、当該組成物の調製を容易にするために、医薬として許容可能な固体または液体の担体を添加し得る。液体担体として、シロップ、落花生油、オリーブ油、グリセリン、生理食塩水、アルコール、及び、水がある。固体担体として、デンプン、乳糖、硫酸カルシウム、二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウム、または、ステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシア、寒天、または、ゼラチンがある。また、担体は、グリセリルモノステアレート、または、グリセリルジステアレートなどの徐放性物質を、単独で、または、ワックスとともに含み得る。
【０１２８】
当該医薬組成物を、必要に応じて、錠剤形態では、粉砕、混合、造粒、及び、圧縮の作業、または、硬ゼラチンカプセルでは、粉砕、混合、充填の作業を含む従来の調剤技術に従って製造する。液体担体を使用する場合、当該製剤は、シロップ、エリキシル、エマルジョン、または、水性または非水性懸濁液の形態になる。そのような液体製剤は、直接に経口投与し、または、ソフトゼラチンカプセルに充填し得る。
【０１２９】
本発明の医薬組成物は、治療有効量で送達し得る。正確な治療有効量とは、所定の対象における処置の有効性に関して最も効果的な結果をもたらす組成物の量である。この量は、治療化合物の特性（活性、薬物動態、薬力学、及び、生物学的利用可能性など）、当該対象の生理学的病態（年齢、性別、疾患の種類及び病期、全身的な身体的状態、所定の投与量に対する反応性、及び、薬物の種類など）、製剤に含まれる医薬として許容可能な担体の性質、及び、投与経路などの様々な要素に応じて変化するが、これらに限定されない。臨床及び薬理学の分野の当業者であれば、例えば、化合物の投与に対する対象の反応をモニターし、そして、それに応じて投与量を調整することで、通常の実験を経て、治療有効量を決定することができる。さらなるガイダンスとして、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄ．２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ，ＵＳＡ）（２０００）を参照されたい。
【０１３０】
患者への投与前に、操作された免疫エフェクター細胞、または、複数の当該操作された免疫エフェクター細胞を含む細胞集団に対して、製剤を添加し得る。液体製剤が、好ましい場合がある。例えば、これらの製剤は、油、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミノ酸、塩類、緩衝剤、アルブミン、界面活性剤、増量剤、または、それらの組み合わせを含み得る。
【０１３１】
炭水化物製剤として、単糖類、二糖類、または、多糖類などの糖または糖アルコール、または、水溶性グルカンがある。これらの糖類またはグルカンとして、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、アルファ及びベータシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、及び、カルボキシメチルセルロース、または、それらの混合物がある。「糖アルコール」とは、−ＯＨ基を有するＣ４〜Ｃ８炭化水素として定義されるものであり、そして、ガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、及び、アラビトールがある。上記したこれらの糖類または糖アルコールは、個々に、または、組み合わせて使用し得る。当該糖類または糖アルコールが、水性製剤に可溶である限り、使用量に一定の制限はない。ある実施形態では、当該糖類または糖アルコール濃度は、１．０ｗ／ｖ％〜７．０ｗ／ｖ％、より好ましくは、２．０〜６．０ｗ／ｖ％である。
【０１３２】
アミノ酸製剤として、カルニチン、アルギニン、ベタインの左旋性（Ｌ）型があるが、その他のアミノ酸も、追加し得る。
【０１３３】
一部の実施形態では、不活性物質であるポリマーとして、平均分子量が２，０００〜３，０００のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、または、平均分子量が３，０００〜５，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がある。
【０１３４】
また、当該組成物に緩衝剤を使用して、凍結乾燥前、または、再構成後の溶液のｐＨ変化を最小限にすることが好ましい。あらゆる生理学的緩衝剤を使用し得るものであり、同緩衝剤として、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、及び、グルタミン酸緩衝剤、または、それらの混合物を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、当該濃度は、０．０１〜０．３モルである。当該製剤に添加できる界面活性剤は、ＥＰ第２７０，７９９号、及び、第２６８，１１０号に記載されている。
【０１３５】
循環半減期を延長する別の薬物送達システムは、リポソームである。リポソーム送達システムの調製方法は、Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）４２：４７３４；Ｃａｆｉｓｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ（１９８１）６４９：１２９；及び、Ｓｚｏｋａ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｅｎｇ（１９８０）９：４６７で議論されている。その他の薬物送達システムは、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ（Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ，  ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．１９８０），ｐｐ．２５３−３１５；Ｍ．Ｌ．Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｖｓ（１９８４）３６：２７７に記載されている。
【０１３６】
キット
様々な実施形態では、本発明は、本明細書に記載した医薬組成物を含むキットを提供する。
【０１３７】
当該キットは、本発明のベクター及び組成物の少なくとも１つを含む材料または要素の集合体である。したがって、一部の実施形態では、当該キットは、上記した通り、抗原特異的ＣＡＲを発現し、かつ、１つまたは複数の化学療法剤を封入またはそうでなければ運搬する複数のリポソーム（例えば、多層リポソーム小胞）またはその他のナノ粒子を細胞表面に結合している、遺伝子改変された細胞を有する組成物を含む。
【０１３８】
本発明のキットで構成される構成要素の正確な性質は、その意図する目的による。ある実施形態では、当該キットは、特に、ヒト対象のために構成される。さらなる実施形態では、当該キットは、家畜、家庭動物、及び、実験動物など、これらに限定されない対象を処置する獣医学用途のために構成される。
【０１３９】
使用説明書を、キットに含み得る。一般的に、「使用説明書」には、キットの構成要素を使用して、対象のがんを処置する、がんの重症度を軽減する、がんを抑制または予防するなど、望ましい結果をもたらすために使用する技術を説明する具体的な表現を含む。任意に、当該キットは、測定用具、希釈剤、緩衝剤、医薬として許容可能な担体、注射器、または、当業者に自明なその他の有用な用具など、その他の有用な構成要素も含む。
【０１４０】
キットに組み込まれた材料または構成要素は、操作性と有用性を維持する簡便かつ適切な方法で保管して、開業医に提供することができる。例えば、当該構成要素は、溶解、脱水、または、凍結乾燥した形態とすることができ、それらは、室温、冷蔵、または、冷凍温度で提供できる。当該構成要素は、通常、適切な包装材料（複数可）で梱包されている。本明細書で使用する語句「包装材料」とは、本発明の組成物など、当該キットの内容物を収容するために使用する１つまたは複数の物理的構造のことを指す。当該包装材料は、好ましくは、周知の方法で作ったものであって、無菌で、汚染物質のない環境を提供する。本明細書で使用する用語「パッケージ」とは、固体マトリックス、または、個々のキットの構成要素を保持することができる、ガラス、プラスチック、紙、ホイルなどの適切な材料のことを指す。したがって、例えば、パッケージを、適量の組成物を収容するために使用するガラスバイアルとすることができる。概して、当該梱包材料には、キット、及び／または、その構成要素の内容、及び／または、目的を示す外部ラベルが付けられている。
【実施例】
【０１４１】
以下の実施例は、本発明の特許請求の範囲の限定を意図するものではなく、特定の実施形態の例示を意図している。当業者が想到するものと考えられる例示した方法のあらゆる変形は、本発明の範囲内に属することを意図している。
【０１４２】
実施例１
実験方法
細胞株及び試薬：ＭＤＡ．ＭＢ．４６８（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１３２）、及び、ＳＫＯＶ３（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−７７）腫瘍細胞株を、１０％ＦＢＳ、１％ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、及び、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ）培地にて、５％ＣＯ２環境で維持した。ＮＫ９２細胞（Ｄｒ．  Ｊｉｈａｎｅ  Ｋｈａｌｉｆｅ，  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２４０７）を、１０％ＦＢＳ、１０％ウマ血清、１％ＮＥＡＡ、１％ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、１％ピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ  ２−βメルカプトエタノール、０．２ｍＭ  ミオイノシトール、及び、２．５μＭ葉酸を補充したＭＥＭ−α（Ｇｉｂｃｏ）で維持した。ＣＤ１９＋  ＳＫＯＶ３（ＳＫＯＶ．ＣＤ１９）細胞は、ＣＤ１９  ｃＤＮＡを含むレンチウイルスでＳＫＯＶ３細胞の形質導入を行い、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）でＣＤ１９＋細胞を選別することによって生成した。
【０１４３】
ＰＴＸを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ. Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。すべての脂質を、ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｊａｐａｎ）から購入した：１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１０−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、及び、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチルアミド（マレイミド頭部基脂質、ＭＰＢ−ＰＥ）。
【０１４４】
ナノ粒子の合成：リポソームは、従来の脱水−再水和法に基づいて調製した（Ｊｏｏ，Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇｓ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３４：  ３０９８−３１０９；Ｍｏｏｎ，  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）．Ｉｎｔｅｒｂｉｌａｙｅｒ−ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｓ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｐｏｔｅｎｔ  ｈｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ  １０：  ２４３−２５１）。ｃＭＬＶを、脂質ＤＯＰＣ：ＤＯＰＧ：ＭＰＥ−ＰＥ＝４０：１０：５０の混合物を含むクロロホルムの１．５μｍから調製し、次いで、アルゴンガス下で蒸発させた後に、真空下で一晩乾燥させて、乾燥脂質フィルムを形成した。当該脂質フィルムを、ｐＨ７．０の１０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパンで再水和した。当該脂質を、１時間にわたって１０分間おきに、激しくボルテックスで攪拌した後に、１５秒間の超音波処理（Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｍｉｃｒｏｓｏｎ  ＸＬ２０００，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）を３サイクル行い、そして、各サイクルの後、１分間の間隔で、氷上に置いた。最終濃度が１０ｍＭのＭｇＣｌ２を添加して、二価誘発小胞融合を誘発した。多層小胞（ｃＭＬＶ）の架橋を、最終濃度１．５ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を、３７℃で、１時間添加して行った。これらのｃＭＬＶを、１４，０００ｇで、５分間の遠心分離で回収し、次いで、ＰＢＳで２回洗浄した。分析前に、これらの粒子を、濾過水に懸濁させ、ボルテックスで攪拌し、そして、超音波処理した。小胞の多層構造の形態学的分析を行い、そして、以前にＪｏｏ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．が研究した低温電子顕微鏡法で確認した。ｃＭＬＶの流体力学的サイズを、動的光散乱（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）で測定した。
【０１４５】
インビトロでの薬物の封入と放出：ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）に組み込まれたパクリタキセルの量を、Ｃ−１８逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰＨＰＬＣ）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）で決定した。ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）懸濁液に、水とアセトニトリルを加えて、総量を０．５ｍＬになるまで希釈した。パクリタキセルの抽出は、５ｍＬのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを添加し、そして、当該試料を、１分間、ボルテックスで混合して行った。これらの混合物を遠心分離し、そして、有機層をガラス管に移し、次いで、アルゴン下で蒸発させた。緩衝剤Ａ（９５％水、５％アセトニトリル）を使用して、当該ガラス管を再水和した。ＰＴＸ濃度を試験するために、１ｍＬの溶液を、Ｃ１８カラムに注入し、そして、パクリタキセルを、２２７ｎｍ（流速１ｍＬ／分）で検出した。細胞コンジュゲーションの前後にｃＭＬＶからＰＴＸの放出動態を得るために、ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）、及び、ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）を、１０％ＦＢＳ含有培地で、３７℃でインキュベートし、次いで、スピンダウンして、そして、毎日、新鮮な培地で再懸濁した。ＰＴＸは、取り出した培地からＨＰＬＣで毎日定量した。
【０１４６】
細胞とのナノ粒子コンジュゲーション、及び、インサイチュでのペグ化：細胞へのｃＭＬＶの化学コンジュゲーションを、以前の研究で提供された方法に基づいて実施した（Ｈｕａｎｇ，Ｂ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ａｃｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｃａｒｒｙｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７７：  ２９１ｒａ２９４；Ｓｔｅｐｈａｎ，  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  １６：  １０３５−１０４１）。本発明者らは、無血清ＭＥＭ−α（Ｇｉｂｃｏ）培地に、１０×１０６個の細胞／ｍＬを再懸濁した。等量のナノ粒子を、異なるｃＭＬＶ対ＮＫ細胞コンジュゲーション比で、ヌクレアーゼを含まない水に再懸濁し、そして、３７℃でインキュベートした。当該細胞とナノ粒子を、３０分間にわたって１０分間おきに混合した。細胞から未結合のｃＭＬＶを除去するためにＰＢＳで洗浄した後に、細胞を、１ｍｇ／ｍｌのチオール末端２ｋＤａ  ＰＥＧと共に培地中、３７℃で、３０分間インキュベートして、細胞に結合した粒子の残存マレイミド基をクエンチした。未結合のＰＥＧを除去するために、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞に結合した粒子を定量するために、粒子を、脂質様蛍光色素ＤｉＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で蛍光標識した。粒子蛍光を、フローサイトメトリーと蛍光マイクロプレートリーダーで検出した。ｃＭＬＶを、脂質様色素ＤｉＤで標識し、そして、ＣＡＲ．ＮＫ細胞を、カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミドエステル（ＣＦＳＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、共焦点顕微鏡を使用してＮＫ細胞へのｃＭＬＶのコンジュゲーションを容易に検出できるようにした。
【０１４７】
レンチウイルス及びレトロウイルスの産生と、ＮＫ９２細胞の形質導入：本発明者らの抗Ｈｅｒ２  ＣＡＲ構築物（Ｚｈａｏ，Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．Ａ  Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８３：５５６３−５５７４）を、レンチウイルスｐＣＣＷベクター（ｐＣＣＬベクター（Ｈａａｓ，Ｄ，ｅｔ  ａｌ（２００３）．Ｔｈｅ  ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：９４３９−９４５０；Ｄｕｌｌ，Ｔ，ｅｔ  ａｌ（１９９８）．Ａ  ｔｈｉｒｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：８４６３−８４７１；Ｌｏｇａｎ，Ａ，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｉｔｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １５：９７６−９８８））にクローン化した。当該ＣＡＲは、抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖ  ４Ｄ５、ＣＤ８ヒンジ、及び、膜貫通領域、及び、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、及び、ＣＤ３ζ細胞質領域から構成されていた。本発明者らの抗ＣＤ１９  ＣＡＲ構築物は、ＭＰ−７１レトロウイルスベクターバックボーン（Ｅｎｇｅｌｓ，Ｂ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １４：１１５５−１１６８）にクローン化し、抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジ、及び、膜貫通領域、及び、ＣＤ２８、及び、ＣＤ３ζ細胞質領域を含んでいた。これらのプラスミドを使用して、ＣａＣｌ２沈殿法を用いて、３０ｍＬプレートにＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。新鮮な培地（１０％ＦＢＳ、及び、１％ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐを添加した高グルコースＤＭＥＭ）を、最初のトランスフェクションの４時間後に、細胞に対して加えた。４８時間後に、上清を回収し、そして、濾過した（０．４５μｍ）。ＮＫ９２細胞に、新たなレトロウイルスを導入した。レンチウイルス上清を濃縮し（４℃で、９０分間、２５，０００ｒｐｍ）、ＨＢＳＳに再懸濁し、後々の使用まで−８０℃で凍結した。ＮＫ９２細胞に、ＭＯＩ４０で、濃縮レンチウイルスを形質導入し；力価は、２９３Ｔ細胞の形質導入に基づいた。
【０１４８】
Ｔ細胞表面でのＣＡＲ検出：形質導入の３日後、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ．ＮＫ細胞（１×１０５）を、ビオチン化プロテインＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）と、１：５０の体積比で、ＰＢＳ＋４％ＦＢＳ中、４℃で、４５分間、インキュベートし、そして、ＰＢＳで濯いだ。続いて、これらの細胞を、ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）にコンジュゲートしたストレプトアビジンを、１：５００の体積比で、ＰＢＳ＋４％ＦＢＳ中、４℃で、１０分間インキュベートし、２度の濯ぎを行い、そして、フローサイトメトリーを使用して読み取りを行った。抗Ｈｅｒ２  ＣＡＲ．ＮＫ細胞（１×１０５）を、ｒｈＨｅｒ２−Ｆｃキメラ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）と、１：５０（２μｇ／ｍＬ）の体積比で、ＰＢＳ中、４℃で、３０分間インキュベートし、そして、ＰＢＳで濯いだ。続いて、これらの細胞を、ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と、１：１５０の体積比で、ＰＢＳ中、４℃で、１０分間インキュベートし、濯ぎを行い、そして、フローサイトメトリーを使用して読み取りを行った。非形質導入ＮＫ細胞を、陰性対照として用いた。
【０１４９】
内部移行アッセイ：細胞ｃＭＬＶの内部移行の定量を、以前に記載された方法（Ｈｕａｎｇ，Ｂ，ｅｔ  ａｌ（２０１５）．Ａｃｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｃａｒｒｙｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７７：  ２９１ｒａ２９４；Ｓｔｅｐｈａｎ，  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  １６：  １０３５−１０４１）に基づいて行った。ＮＫ、及び、ＣＡＲ．ＮＫ細胞を、５ｍｏｌ％  １８：１  ＰＥ  ＣＦ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（カルボキシフルオレセイン）（アンモニウム塩）（Ａｖａｎｔｉ，Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）でタグ付けしたリポソームとコンジュゲートした。ＰＢＳで２回洗浄した後に、細胞を、フィブロネクチン（１０ｕｇ／ｍｌ）でコーティングした９６ウェルプレートに移した。２時間のインキュベートの後に、膜結合リポソームと内部移行リポソームとを区別するために、細胞外蛍光消光色素である１００μｌのトリパンブルーを含むＨＢＳＳ（０．２５ｍｇ／ｍＬ）で、ウェルの半分を１分間処理した。穏やかな真空吸引によってトリパンブルーを除去し、そして、リポソームの細胞取り込みを、蛍光プレートリーダーで定量した。
【０１５０】
サイトカイン放出アッセイ：ＮＫ細胞（１×１０５個／ウェル）と、標的細胞とを、１：１の比率で、９６ウェルプレートで、３７℃で、６時間、共インキュベートした。１μｇのＢｒｅｆｅｌｄｉｎ−Ａ（Ｓｉｇｍａ）を、各ウェルに添加して、タンパク質の輸送を防いだ。インキュベートの最後に、ＣｙｔｏＦｉｘ／ＣｙｔｏＰｅｒｍキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、細胞を透過処理し、そして、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅコンジュゲート抗ヒトＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及び、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＩＦＮ−γ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、ＣＤ８及びＩＦＮ−γを染色した。非刺激細胞を、陰性対照として用いた。フローサイトメトリーを使用して、結果を読み取った。
【０１５１】
細胞傷害性アッセイ：標的細胞（１×１０４）を、５μＭカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、前述したようにして標識し（Ｈａｎ，Ｘ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）．Ｍａｓｋｅｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２５：２７４−２８４）、そして、９６ウェルプレートにて、３７℃で、２４時間、様々な比率でＮＫ細胞と共インキュベートした。次に、これらの細胞を、７−ＡＡＤ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＰＢＳ（１：１０００希釈）で、室温で、１０分間、インキュベートし、そして、フローサイトメトリーで分析した。死滅した細胞の割合を、［ＣＦＳＥ＋７−ＡＡＤ＋細胞／（ＣＦＳＥ＋７−ＡＡＤ−＋ＣＦＳＥ＋７−ＡＡＤ＋）］細胞として計算し、標的細胞の対照ウェルに基づいた生存／死滅ゲートで、自発的な細胞死を説明した。
【０１５２】
ＮＫ９２細胞及びＳＫＯＶ３細胞を、９６ウェルプレートの１０％ＦＢＳ含有培地に、２×１０４個の細胞／ウェルで播種し、そして、５％ＣＯ２の存在下で、３７℃で、６時間増殖させた。先に記載したようにして、細胞を、様々な濃度のｃＭＬＶ（ＰＴＸ）とインキュベートし（Ｌｉｕ，Ｙ，ｅｔ  ａｌ（２０１４））．Ｃｏｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ａｎｄ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｂｙ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ  １１：１６５１−１６６１）、そして、細胞の生存率を、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）のＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＸＴＴアッセイ）を製造元の指示に従って使用をして評価した。細胞生存率は、処理したウェルから得た吸光度値から、培地だけのウェルから得た吸光度値を差し引くことで決定し、次いで、薬物を含まない細胞を含有する対照ウェルで正規化した。
【０１５３】
移動アッセイ：ＮＫ細胞の移動アッセイを、直径２４ｍｍ、３μｍポアサイズのＴｒａｎｓｗｅｌｌプレート（Ｃｏｓｔａｒ）で行った。ｃＭＬＶとコンジュゲートした、または、未コンジュゲートのＮＫ細胞を上部ウェルに播種し、そして、培地を下部ウェルに添加した。化学誘引物質ＣＸＣＬ９（０．１ｍｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を、下部ウェルに加えた。３７℃で、６時間、インキュベートした後に、下部チャンバーに移動したＮＫ細胞を計数した。
【０１５４】
インビボ生体内分布試験：６〜１０週齢のメスのＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ２Ｒγｔｍ１Ｗｊ１／ＳＺ（ＮＳＧ）マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。すべてのマウスを、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）の動物施設で、特定の病原体低減条件下で飼育した。すべての実験を、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａでの動物の管理と使用に関するガイドラインに従って設定した。合計で３．５×１０６個のＳＫＯＶ３．ＣＤ１９細胞を、−１４日目に、ＮＯＤ／ｓｃｉｄ／ＩＬ２ｒγ−／−（ＮＳＧ）マウスの脇腹に皮下接種し、そして、腫瘍が、１００ｍｍ３に達するまで増殖させた。０日目に、ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）またはＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）のいずれかを、マウスの尾静脈から静脈内注射した。注射の２４、４８、及び、７２時間後に、マウスを屠殺して、臓器の蛍光強度を分析した。各臓器のＤｉＤ組織蛍光を、ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍイメージングシステムを使用して定量し、そして、組織１グラムあたりの注入用量の割合（％ＩＤ／ｇ）を計算した。
【０１５５】
異種移植腫瘍モデル：合計で３．５×１０６個のＳＫＯＶ３．ＣＤ１９細胞を、−１４日目に、ＮＳＧマウスの脇腹に皮下接種し、そして、腫瘍が、７０〜１００ｍｍ３に達するまで増殖させた。マウスを、各５匹の６つの群に無作為に振り分けた。０、４、７、及び、１１日目に、ＰＢＳ、ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）のみ、非形質導入ＮＫ細胞のみ、ＣＡＲ．ＮＫ細胞のみ、混合したＣＡＲ．ＮＫ＋ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）（一緒にコンジュゲートされていなかった、または、コンジュゲートされたＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）であった）のいずれかを、マウスに対して尾静脈から静脈内注射した。ＮＫ細胞を与えた群では、５×１０６個の細胞／マウスを、毎回、注射した。腫瘍の増殖とマウスの体重を、屠殺するまで記録した。腫瘍の長さと幅を、精密キャリパーで測定し、そして、腫瘍体積を、１／２×（長さ）×（幅）２として計算した。
【０１５６】
エクスビボでの腫瘍内ＰＴＸ濃度測定：高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、凍結腫瘍組織のＰＴＸ濃度を、前述したようにして定量した（Ｌｉｕ，Ｙ，ｅｔ  ａｌ（２０１４）．Ｃｏｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｖｉａ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｔｏ  ｏｖｅｒｃｏｍｅ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ９：ｅ１１０６１１）。簡単に説明すると、解凍した腫瘍組織を刻み、そして、酢酸エチル中で均質化し、そして、内部標準として各試料に対して既知濃度のドセタキセルを添加した。これらの試料を遠心分離し、そして、有機層を、清浄なチューブに移した。この有機層を、アルゴン気流下で蒸発させ、そして、希釈アセトニトリルで再水和した。これらの試料をＨＰＬＣに供した後、ピークの高さを分析して腫瘍内ＰＴＸ濃度を決定した。
【０１５７】
腫瘍の免疫組織化学、心臓毒性、及び、共焦点イメージング：腫瘍を切り出し、固定し、凍結し、凍結切片を作成し、そして、スライドガラスに載せた。凍結切片を固定し、そして、冷ＰＢＳで濯いだ。ブロッキング及び透過処理の後に、これらのスライドを、ＰＢＳで洗浄し、そして、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニックエンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）反応混合物（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）と共に１時間インキュベートし、そして、４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で対比染色した。蛍光画像を、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ−Ｅ顕微鏡を使用する、Ｙｏｋｏｇａｗａスピニングディスク共焦点スキャナーシステム（Ｓｏｌａｍｅｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ，Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，ＵＴ）によって得た。４０５、４９１、５６１、及び、６４０ｎｍの固体レーザーラインの照射パワーを、各レーザーに５０ｍＷのＡＯＴＦ（音響光学的チューナブルフィルター）制御レーザーマージシステムで提供した。すべての画像を、Ｎｉｋｏｎ  ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを使用して分析した。ＴＵＮＥＬ陽性細胞を定量するために、１０倍の倍率で、画像毎に４つの関心領域（ＲＯＩ）を無作為に選択した。１つの領域内で、ＴＵＮＥＬ陽性核の面積と、核染色の面積とを、Ｎｉｋｏｎ  ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔソフトウェアで計算し、データを、その領域におけるＴＵＮＥＬで染色された総核面積の％として表した。心臓毒性については、最後の注射の２日後に心臓組織を採取し、そして、４％ホルムアルデヒドで固定した。これらの組織を凍結し、次いで、切片に切り分け、そして、スライドガラスに載せた。これらの凍結切片を、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。病理組織学的標本を、ＥＶＯＳ光学顕微鏡で検査した。
【０１５８】
統計：２つの群間の差異を、スチューデントのｔ検定で決定した。３つ以上の群の間の差異を、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で決定した。
【０１５９】
実施例２
抗ＣＤ１９、及び、抗Ｈｅｒ２  ＣＡＲは、ＮＫ９２細胞で発現される
本発明者らは、抗ＣＤ１９及び抗Ｈｅｒ２  ＣＡＲを発現するＮＫ９２細胞の能力の確認を行った。当該ＣＡＲは、ｓｃＦｖ由来の抗原結合ドメイン、ＣＤ８ヒンジ、及び、膜貫通領域、ＣＤ２８、及び／または、４−１ＢＢ共刺激ドメイン、及び、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインから構成されていた。Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｕｃｋｅｒｔ博士からの厚意で提供を受けた、以前に報告されたＭＰ７１ベクターを使用して、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ．ＮＫ細胞を、レトロウイルス形質導入によって生成した。抗Ｈｅｒ２  ＣＡＲ．ＮＫ細胞を、ＷＲＥ転写後調節領域が追加されたｐＣＣＬベクター４３−４５に基づいたｐＣＣＷベクターにおいて上記したトラスツズマブ由来ＣＡＲを使用して、レンチウイルス形質導入によって生成した。蛍光活性化細胞選別を使用して形質導入細胞を選別して、ＣＡＲ＋細胞の割合をさらに高めた（図１Ｅ）。ＣＡＲの発現は、最初の形質導入と選別の後の数か月間は安定していた。
【０１６０】
ｃＭＬＶは、ＮＫ細胞表面に安定的にコンジュゲートする
以前の研究は、架橋した多層リポソーム小胞（ｃＭＬＶ）が、疎水性及び親水性の両方の薬物と共に首尾良く組み込まれる、ことを示した。これらの小胞は、従来の脱水−再水和法を使用して、隣接する脂質二重層の官能化頭部基を共有結合的に架橋することで合成した。合成したｃＭＬＶナノ粒子は、脂質二重層表面に存在するチオール反応性マレイミド頭部基を介して、ＮＫ細胞の表面に存在する還元チオール基に安定的にコンジュゲートした。高レベルの遊離チオールを、リンパ球の表面で検出した。このコンジュゲーションは、２つのステップで行った。まず、ＮＫ細胞とｃＭＬＶとを共インキュベートして、細胞表面の遊離チオールへの粒子結合を誘導した。最初の反応の後、ｃＭＬＶコンジュゲート細胞は、インサイチュでのペグ化を受けて、残存チオール反応性基をクエンチさせた。１ＮＫ細胞あたりのコンジュゲートできる粒子の最大数を決定するために、本発明者らは、異なる蛍光標識ｃＭＬＶ対細胞比（２０００：１、１０００：１、５００：１、１００：１、及び、１０：１）でコンジュゲーションの連続希釈を行った。２０００：１〜１０００：１のコンジュゲーション比で、１細胞あたりのコンジュゲートリポソームの数は横ばいになり始め、そして、１細胞あたり約１５０ナノ粒子の平均コンジュゲーションを示した（図１Ｂ）。このデータから、本発明者らは、使用する最適な比率は、１０００：１であると判定し、これはすなわち、この比率をさらに高めても、細胞表面でのコンジュゲートｃＭＬＶの数は増加しなかったことによる。本発明者らは、後続のすべての実験で、この比率を使用した。共焦点イメージングを使用して、ＮＫ細胞表面に対するｃＭＬＶのコンジュゲーションを確認及び視覚化した（図１Ｃ、図１Ｆ）。
【０１６１】
担体細胞の表面でのナノ粒子の、改善した表面保持の主な利点は、以下である：（１）分解性細胞内区画への内部移行に起因する急激な粒子分解の防止、及び、（２）腫瘍細胞への薬物の効果的な標的指向化を可能にする粒子コンジュゲート細胞からの持続的な薬物放出。ナノ粒子は、内皮細胞やマクロファージなどの様々な細胞によって取り込まれる。しかしながら、本発明者らの研究では、ｃＭＬＶがＮＫ細胞表面に残存していることが重要である。このことに対処するために、本発明者らは、コンジュゲーション後のこれらの粒子の内部移行を判定する実験を行った。これらのＮＫ細胞が、リポソームの取り込みを引き起こすか否かを判定するために、本発明者らは、ＮＫ細胞を、ＰＥ  ＣＦフルオレセイン色素でタグ付けしたｃＭＬＶとコンジュゲートさせ、次いで、当該細胞を、３７℃にまで加温し、そして、細胞関連蛍光を経時的に評価した。ＮＫ細胞に対するｃＭＬＶの付着は、これらの粒子の細胞取り込みを招くことなく、ＮＫ細胞に結合した粒子は、図１Ｄに示すように細胞表面に残存していた。
【０１６２】
ＣＡＲ．ＮＫ細胞は、インビトロで抗原発現標的細胞に対して大きな細胞傷害性効果を有しており、また、ＰＴＸに対する感受性が低い
本発明者らは、非形質導入ＮＫ、または、ＣＡＲ．ＮＫ細胞を、様々な標的細胞株と共培養し、そして、フローサイトメトリーで結果を読み取ることで、適切な抗原発現標的細胞に対する細胞傷害性効果を引き起こすＣＡＲ．ＮＫ細胞の能力を評価した。本発明者らは、レンチウイルスを使用して、ＳＫＯＶ３細胞の形質導入を行い、ＣＤ１９（ＳＫＯＶ．ＣＤ１９）を発現させて、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ．ＮＫ細胞の標的細胞として使用した。ＣＤ１９とＨｅｒ２の両方を標的とするＣＡＲ．ＮＫ細胞は、同族抗原（それぞれ、ＳＫＯＶ３、及び、ＭＤＡ．ＭＢ．４６８、図２Ａ、図２Ｂ）を発現しない標的細胞と共培養した非形質導入ＮＫ細胞、または、ＣＡＲ．ＮＫ細胞のいずれかと比較して、抗原発現標的細胞（それぞれ、ＳＫＯＶ．ＣＤ１９、及び、ＳＫＯＶ３）に対して有意に大きな細胞傷害性を示した。これらの傾向は、すべてのエフェクター対標的比で認められており（１：１、及び、１０：１では、ｐ＜０．０１、５：１では、ｐ＜０．００１）、そして、ＣＡＲ媒介細胞死を示した。
【０１６３】
ＮＫ９２細胞は、ＮＫ細胞リンパ腫の患者に由来するので、これらの同種細胞に、臨床使用前に照射を行って、インビボでの増殖を防ぐ。照射は、本発明者らのＣＡＲ．ＮＫ細胞の細胞傷害性能力に影響を与えなかった（図２Ｃ）。また、本発明者らは、細胞生存率アッセイを実施して、ＳＫＯＶ３細胞が、ＮＫ細胞よりも、ＰＴＸに対してさらに感受性であることを実証した（図２Ｄ）。このことは、ＮＫ細胞が、ＰＴＸ誘発毒性の影響を受けずに、標的細胞を死滅させるのに十分なＰＴＸを運搬できることを確実にする。ＮＫ細胞にコンジュゲートしたｃＭＬＶは、３日目までに、それらのＰＴＸペイロードの大部分も放出する（図２Ｅ）。
【０１６４】
ＣＡＲ．ＮＫ機能は、ｃＭＬＶコンジュゲーションの影響を受けず、かつ、インビトロでｃＭＬＶ（ＰＴＸ）コンジュゲーションを向上させる
本発明者らは、ＣＡＲ．ＮＫ細胞表面に対するｃＭＬＶのコンジュゲーションが、ＣＡＲ．ＮＫ細胞それ自体の機能に影響を与えないようにした。抗原結合時にＮＫ細胞の活性化を検出するために、本発明者らは、ＩＦＮ−γ放出アッセイを実施し、様々な標的細胞株を、ｃＭＬＶコンジュゲーションの有無に関係なく、ＮＫ細胞と共培養した。ＣＡＲ．ＮＫ細胞は、単独でインキュベートした場合、または、同種抗原なしで標的細胞と共培養した場合では反応は認められなかったが、適切な抗原発現標的細胞と共インキュベートすると、抗ＣＤ１９、及び、抗Ｈｅｒ２  ＣＡＲ．ＮＫ細胞株の両方に由来するＩＦＮ−γ＋細胞の割合が大幅に増大しており（ｐ＜０．０５）、このことは、適切なＴＡＡに対する特異性を実証している。ＣＡＲ．ＮＫ細胞を、薬物を持たない空のｃＭＬＶ（ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＥＭＰＴＹ））、または、ＰＴＸを担持させたｃＭＬＶ（ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＰＴＸ））のいずれかとコンジュゲートさせた場合、ＩＦＮ−γの放出は、非コンジュゲートＣＡＲ．ＮＫ細胞のそれと顕著な差異は認められなかった（図３Ａ、図３Ｂ）。
【０１６５】
本発明者らが、エフェクター対標的の比を１対１にし、そして、未コンジュゲートのＣＡＲ．ＮＫ細胞、空のｃＭＬＶ（ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＥＭＰＴＹ））、または、ＰＴＸを担持したｃＭＬＶ（ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＰＴＸ））とコンジュゲートしたＣＡＲ．ＮＫ細胞を用いて、細胞傷害性アッセイを反復したところ、細胞の死滅に対して有意な影響は認められなかったが、標的細胞に対する細胞傷害性は、ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）で顕著に高まった（図３Ｃ、図３Ｄ）。これらのデータは、空のｃＭＬＶが、ＣＡＲ．ＮＫ機能に影響を与えない一方で、標的細胞に近接したｃＭＬＶからのＰＴＸの放出が、細胞傷害性効果をさらに高めることを示している。
【０１６６】
最後に、本発明者らは、ｃＭＬＶコンジュゲーションの有無に関係なく、ＮＫの移動をモニターした。抗腫瘍反応に影響を与えるために、ＮＫ細胞は、化学誘引物質に反応して、腫瘍部位に浸出しかつ移動する必要がある。ＮＫ表面へのｃＭＬＶコンジュゲーションが、細胞移動に影響を与えないことを確認するために、ＮＫ細胞移動アッセイを実施した。化学誘引物質ＣＸＣＬ９を使用して、ウェルの下部チャンバーへのＮＫ細胞の移動を促した。ＣＸＣＬ９を誘引剤として使用した場合に、プレーン培地対照と比較して、下部チャンバーへは相当数のＮＫ細胞が移動した（ｐ＜０．０５）が、コンジュゲート群と非コンジュゲート群との間に有意差はなく、このことは、細胞表面へのｃＭＬＶのコンジュゲーションが、ＮＫの移動能力に影響を与えないことを示す（図３Ｅ）。
【０１６７】
ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶは、腫瘍部位へのｃＭＬＶの送達を増大させる
インビトロで、本発明者らのｃＭＬＶ（ＰＴＸ）コンジュゲートＣＡＲ．ＮＫ細胞の機能を確認した後に、本発明者らは、生体内分布試験を実施して、ＣＡＲ．ＮＫ細胞が、腫瘍部位へのｃＭＬＶホーミングを高めたか否かを判定した。蛍光色素ＤｉＤを使用して、ｃＭＬＶ（ｃＭＬＶ（ＤｉＤ））にタグ付けを行い、そして、様々な臓器でのそれらの存在を追跡した。ＮＳＧマウスに、ＳＫＯＶ．ＣＤ１９細胞を皮下注射した。腫瘍接種の２週間後に、マウスに対して、ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）、または、コンジュゲートＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）を静脈内注射した。マウスを屠殺し、そして、様々な時点での臓器の蛍光シグナルについて分析した。２４時間（図４Ａ、図４Ｂ）の時点で、両方の群のｃＭＬＶの大半は、まだ血液中を循環していた。ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）群は、血液（ｐ＜０．００１）、リンパ節（ｐ＜０．０５）、及び、腫瘍（ｐ＜０．０１）で、ｃＭＬＶを有意に多く有していたが、ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）群は、肝臓（ｐ＜０．００１）で顕著な蓄積が認められた。４８時間（図４Ｃ、図４Ｄ）の時点で、ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）群の大半は、肝臓に蓄積していたが、ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）群は、血液、リンパ節、脾臓、及び、腫瘍で、ｃＭＬＶを有意に多く有していた（ｐ＜０．００１）。７２時間までに（図４Ｅ、図４Ｆ）、ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）シグナルの大半が消失しており、肝臓、血液、及び、腫瘍でわずかな量しか検出されなかった。対照的に、当該ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）群は、血液、リンパ節、脾臓、及び、腫瘍で、ｃＭＬＶを有意に多く有していた（ｐ＜０．００１）。全体として、肝クリアランスは、腎臓で除去するには大きすぎる粒子の主要なクリアランス経路として機能するので、シャペロンとして機能する細胞を持たないｃＭＬＶ（ＤｉＤ）は、肝臓で除去され得る。対照的に、ＣＡＲ．ＮＫ細胞にコンジュゲートしたｃＭＬＶ（ＤｉＤ）は、腫瘍部位にホーミングすることができた。
【０１６８】
ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）は、インビボで、抗腫瘍効果を高める
本発明者らは、マウス異種移植モデルを確立して、インビボでの抗ＣＤ１９  ＣＡＲ．ＮＫ細胞の効果を観察した。ＮＳＧマウスに、ＳＫＯＶ．ＣＤ１９細胞を皮下注射した。腫瘍接種の２週間後に、マウスを無作為に６つの群に分け、マウスに以下を尾静脈から（静脈内）注射した：（１）対照としてのＰＢＳ、（２）ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）のみ、細胞成分なし、（３）非形質導入ＮＫ細胞のみ、（４）ＣＡＲ．ＮＫ細胞のみ、（５）同時注入したが、コンジュゲートしていない、混合したｃＭＬＶ（ＰＴＸ）＋ＣＡＲ．ＮＫ、及び（６）コンジュゲートＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）細胞。群（６）では、０．１ｍｇ／マウスのＰＴＸを注射した。２０ｇのマウスでは、５００万個の細胞／注射を投与し、合計で４回の注射をした。ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）で処置したマウスは、ＰＢＳ、ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）、及び、ＮＫ群と比較して、腫瘍の増殖を大幅に遅延させ（ｐ＜０．００１）、そして、ＣＡＲ．ＮＫ及びＣＡＲ．ＮＫ＋ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）群と比較しても、腫瘍の増殖を大幅に遅延させた（ｐ＜０．０１、図５）。これらのデータは、ＮＫ細胞由来の免疫療法効果と、ＰＴＸ由来の化学療法効果との両方が、腫瘍細胞の死滅に役割を果たしており、一方の成分だけでは、両方を組み合わせた時ほどの効果は認められない、という仮説を支持する。さらに、ＣＡＲ．ＮＫ＋ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）で処置したマウスでさえも、ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）で処置したマウスほどの大きな抗腫瘍反応を有していなかった。このことは、当該薬物と当該ＮＫ細胞とのコンジュゲーションが、処置システムの完全な利点を享受する上で重要であり、また、当該ＣＡＲ．ＮＫ細胞が、抗がん効果を高めるために腫瘍部位へのＰＴＸの送達を促している、ことを示すものである。
【０１６９】
ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）は、腫瘍部位へのＰＴＸ送達を増大させる
本発明者らは、マウス異種移植腫瘍モデルのエクスビボ分析を実施して、ＣＡＲ．ＮＫ細胞が、当該腫瘍部位へのＰＴＸ送達を促進する、という仮説を実証した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、本発明者らは、ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）群、ＣＡＲ．ＮＫ＋ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）群、及びＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）群を含む、ＰＴＸで処置したマウスにおける、腫瘍内ＰＴＸ濃度を定量した。コンジュゲート群であるＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）は、ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）、または、ＣＡＲ．ＮＫ＋ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）と比較して、腫瘍組織内のＰＴＸ濃度が有意に高かった（それぞれ、ｐ＜０．０１、及び、ｐ＜０．００１、図６Ａ）。
【０１７０】
また、本発明者らは、共焦点イメージングを使用して、スライドガラスに固定した腫瘍組織のアポトーシス細胞を視覚化した。図６Ｂに示すように、対照、または、ＮＫ細胞群よりも、ＣＡＲ．ＮＫ細胞で処置した群の方が、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニックエンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）＋細胞が多く、このことは、ＣＡＲ．ＮＫ細胞に由来する細胞の死滅がより多いことを示している。ＣＡＲ．ＮＫ＋ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）で処置した群では、ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）処置だけと比較して、高レベルの細胞アポトーシスが認められたが、ＣＡＲ．ＮＫ処置と比較して、細胞アポトーシスの程度は類似していた。特に、ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＰＴＸ）で処置した腫瘍は、細胞アポトーシスの程度が最も大きく、このことは、当該薬剤とＣＡＲ．ＮＫ細胞との共局在送達によって誘発される相乗効果を示している。
【０１７１】
最後に、ＰＴＸの治療効果は、その心臓毒性の制限を受けるので、ヘマトキシリンとエオシンで染色して固定した心臓組織の切片を、光学顕微鏡で画像化した。心臓毒性を、筋原線維の喪失及び無秩序状態、ならびに、細胞質空胞化と定義する。本発明者らは、どの処置群についても、心臓組織への損傷を認めることはできなかった（図６Ｃ）。本発明者らの送達は標的指向化されたので、本発明者らは、従来のＰＴＸをベースとした処置で使用する用量と比較して、非常に低用量のＰＴＸ（０．５ｍｇ／ｋｇ）を使用することができ５７−５９、したがって、心臓毒性は最小限であった。
【０１７２】
本発明者らのシステムは、ナノ粒子をベースとした薬物送達と、免疫療法とを組み合わせて、細胞媒介性の能動的ターゲティング戦略を生み出す。本発明者らは、インビトロにあっては、ＮＫ細胞が食作用能力を持っている場合でも、ＮＫ細胞に対するｃＭＬＶコンジュゲーションは、エンドサイトーシスを招かない、ことを実証している。これらの粒子は、おそらくはｃＭＬＶのサイズが一因となって、ＮＫ細胞表面に残存しており、前述の研究は、直径５０ｎｍを超える表面コンジュゲート粒子は、効率的に内部移行しない、ことを示している。さらに、免疫細胞表面の遊離チオールに対するマレイミド官能化ｃＭＬＶの共有結合は、最初のコンジュゲーション後、さらには細胞分裂後でも、数日間は安定である、ことを示している。この長期の表面保持の正確なメカニズムは未だ発見されていないが、当該マレイミド−チオールコンジュゲーション戦略が、免疫細胞表面工学の有望な方法である、ことを示している。
【０１７３】
また、本発明者らは、ＣＡＲ．ＮＫ細胞が、抗原発現がん細胞を特異的に死滅することができること、ｃＭＬＶコンジュゲーションが、ＮＫ細胞の機能に悪影響を及ぼさないこと、及び、ＣＡＲ．ＮＫ細胞に対するｃＭＬＶ（ＰＴＸ）のコンジュゲーションが、細胞傷害性をさらに増強すること、をインビトロで実証した。ＣＡＲ．ＮＫ細胞の数多くの研究は、サイトカイン放出アッセイではなく、細胞傷害性アッセイの結果を含んでいるが、本発明者らは、ＣＡＲ．ＮＫ細胞は、ＴＡＡ＋標的細胞に応答してＩＦＮ−γを放出する、ことを示している。ＴＡＡ−標的細胞と共インキュベートしたＣＡＲ．ＮＫ細胞も、任意の標的細胞と共インキュベートした非形質導入ＮＫ細胞も、ＩＦＮ−γを放出しない。これらの結果は、ＣＡＲ．ＮＫ細胞の細胞傷害性の増大が、ＩＦＮ−γ放出の増加を伴う、ことを示す。初代ＮＫ細胞及びＮＫ細胞株の両方によるＩＦＮ−γ放出は、腫瘍細胞をＮＫ細胞傷害性に対して感作させることに加えて、Ｔ細胞、樹状細胞、単球、及びマクロファージなどの周囲の免疫細胞に対してシグナルを伝達して、より広範な適応及び自然免疫応答を開始させる。
【０１７４】
本発明者らのインビボでの生体分布研究は、ＣＡＲ．ＮＫ細胞が、腫瘍部位内のナノ粒子の蓄積を高める、ことをさらに支持する。細胞シャペロンを用いずに、ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）で処置したマウスは、肝臓でのｃＭＬＶの蓄積が有意に大きく、より大きなリポソームで一般的に認められる肝クリアランスを示す。しかしながら、ＣＡＲ．ＮＫ．ｃＭＬＶ（ＤｉＤ）で処置したマウスでは、腫瘍部位でのｃＭＬＶの蓄積が有意に大きかった。さらに、脾臓やリンパ節など、ＮＫ細胞が自然にホーミングする臓器において、有意に高いシグナルが認められた。本発明者らのインビボ及びエクスビボのデータは、同時投与はするが、コンジュゲートさせていないＣＡＲ．ＮＫ及びｃＭＬＶ（ＰＴＸ）を含む、その他のあらゆる処置群よりも、ＣＡＲ．ＮＫ細胞が、化学療法薬ＰＴＸの腫瘍部位への送達を促し、腫瘍の増殖を遅延させ、そして、腫瘍内ＰＴＸ濃度を効果的に高める、との証拠を提供する。最後に、本発明者らは、低用量のＰＴＸを使用することができ、また、いかなる心臓毒性も認めなかった。
【０１７５】
本発明者らは、特定の用量のＰＴＸは、腫瘍細胞を死滅させるが、ＮＫ９２細胞は死滅させないことを見出すに至り、本発明者らは、ＮＫ９２細胞を使用して、この化学療法薬を送達して腫瘍細胞を死滅させるが、当該担体細胞は死滅させない治療濃度域を得た。しかしながら、本発明者らは、このシステムが、ＰＴＸ送達に限定されるべきではない、と考えている。例えば、マウスＴ細胞を、当該細胞表面に結合した薬物担持ナノカプセルを使用して、インビボで抗がん剤ＳＮ−３８をリンパ腫部位に送達する、ことが示されている。ＳＮ−３８は、リンパ腫細胞を効果的に死滅させたが、当該Ｔ細胞担体に対して毒性はなかった。別の研究は、炎症性サイトカインＩＬ−１５及びＩＬ−２１を運搬する表面コンジュゲートリポソームを使用して、初代ヒトＴ細胞が、抗腫瘍免疫応答を増強できる、ことを実証した。免疫細胞の表面工学は、数多くの薬物またはアジュバントを、当該腫瘍部位に送達することを可能にした。本発明者らの知る限り、本発明者らは、腫瘍を標的とした薬物送達に関する、表面操作ＮＫ細胞の初めて研究、それに、ＣＡＲ．ＮＫ細胞を使用する初めての研究を提供する。本発明者らは、本発明者らのＣＡＲ．ＮＫを介した薬物送達システムが、従来の化学療法薬の送達だけでなく、免疫調節剤及び腫瘍微小環境に影響を与える小分子など、その他の抗がん処置までをも含むように広げることができる、と考えている。
【０１７６】
がん免疫療法は、化学療法の代替または追加の療法として大きな関心が寄せられており、現在のところ、幾つかの臨床試験では、ＣＡＲ操作Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞を使用して、膵臓がん、卵巣がん、前立腺がん、肺がんなどの再発固形がんを有する患者を標的にしている。しかしながら、ＣＡＲ−Ｔ療法は、患者の自己Ｔ細胞のエクスビボでの増殖に依存しているので、調達上の問題を抱えており、細胞を準備している間は、処置の開始が遅延する（一般的に、ＣＡＲ操作臨床用免疫細胞の増殖には２〜３週間を要する）。これらの問題は、自己細胞の代わりに同種異系細胞株を使用することで若干改善することができる；一方で、機能的な細胞傷害性Ｔ細胞株はほとんど無く、幾つかの機能的不死ＮＫ細胞株がある。これらのＮＫ細胞株の内、ＮＫ９２は、最も有望であり、また、臨床試験で使用されている唯一のＮＫ細胞株でもある。
【０１７７】
ＣＡＲ−Ｔ細胞よりも、ＣＡＲ操作ＮＫ９２細胞の使用には、数多くの潜在的な利点がある。ＣＡＲ操作ＮＫ９２細胞は、ＣＡＲをベースとした治療のための代替的「容易に入手可能な」媒介物、ならびに、表面工学によって当該腫瘍部位に対する標的指向薬物送達を提供し得る。ＮＫ９２細胞は、２〜４日で倍加するので、適正製造基準（ＧＭＰ）条件下での増殖、改変、及び、保管を容易にする。ＮＫ９２細胞は、親細胞株と同一であり、ドナーの多様性に関する問題を解消する。自己免疫細胞のエクスビボでの増殖と改変に必要な遅延時間はなく、このことは、数日から数週間の処置の遅れが、結果に影響を与える侵襲性の強いがんを有する患者では、特に重要である。ＮＫ９２細胞は、照射を受けると増殖が妨げられるので、臨床的に使用する上で安全である。これにより、ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して、オフターゲット効果のリスクも減少する。短命のＣＡＲ操作ＮＫ９２細胞を、必要に応じて再投与をして、「生きた薬物」として扱うことができる。最後に、同種ＮＫ９２細胞をベースとした治療法は、自家ＣＡＲ−Ｔ細胞治療法よりも安価であり、あるグループは、各ＣＡＲ−Ｔプロトコルの費用は、２５０，０００ドル以上／患者であると推定したが、クリニックで用いたＮＫ９２細胞に要する費用は、おおよそ２０，０００ドル／患者であった。
【０１７８】
本発明者らは、ＰＴＸを担持したｃＭＬＶとコンジュゲートしたＣＡＲ．ＮＫ細胞が、標的指向薬物送達及び改善された抗腫瘍効果をもたらす、ことを実証した。当該ＣＡＲ標的と薬物ペイロードの両方を潜在的に改変して様々な種類のがんを処置できるため、表面操作ＣＡＲ．ＮＫ細胞を使用する標的指向薬物送達は、広範に適用することができる、と本発明者らは考えている。全体として、この研究は、改善した抗腫瘍処置のための、免疫療法と薬物送達の有望な組み合わせを示す。
【０１７９】
上記した様々な方法と技術は、本願を実行するための数多くの方法を提供する。当然のことながら、説明をしたすべての目的または利点が、本明細書に記載した特定の実施形態によって必ずや達成できるものではないことを理解されたい。したがって、例えば、当業者であれば、本明細書で教示または示唆したその他の目的または利点を必ず達成せずとも、本明細書で教示した１つの利点、または、利点の一群を達成または最適化する方法で、これらの方法を実行できると認識する。様々な選択肢を、本明細書で言及している。一部の好ましい実施形態は、具体的に、１つの、別の、または、幾つかの特徴を含むが、その他のものは、具体的に、１つの、別の、または、幾つかの特徴を除外しており、さらに別のものは、１つの、別の、または、幾つかの有利な特徴を含めることで、特定の特徴を抑制することを理解されたい。
【０１８０】
さらに、当業者であれば、異なる実施形態から様々な特徴が適用可能であることを認識する。同様に、上記した様々な要素、特徴、及び、工程、ならびに、そのような要素、特徴、または、工程のそれぞれについてのその他の公知の均等物は、当業者であれば、様々な組み合わせで使用することで、本明細書に記載した原理に従って方法を実行することができる。そのような様々な要素、特徴、及び、工程の内の幾つかを具体的に含み、そして、その他を、様々な実施形態で具体的に除外する。
【０１８１】
本願を、特定の実施形態、及び、実施例の関係で開示したが、当業者であれば、本願の実施形態が、具体的に開示された実施形態を超えて、その他の代替実施形態、及び／または、その使用、及び、変更、及び、均等物にまで及ぶことを理解する。
【０１８２】
本願の好ましい実施形態を、本発明を実施するにあたって本発明者らが知得しているベストモードをも含めて、本明細書に記載している。本発明の好適な実施態様に対して修正を加えることは、上記した説明に接した当業者に自明の事項である。当業者が適切にそのような修正を行うものと考えており、そして、本明細書に具体的に記載された以外の発明の実施までをも意図している。したがって、本出願の数多くの実施形態は、適用法により許容される範囲において、本明細書に添付した特許請求の範囲に記載された発明を修正してなる発明と、それらと均等の発明までをも含む。さらに、本明細書において断りがなく、あるいは、本発明の説明と明らかに矛盾をしていない限りは、本発明を修正して得られるすべての発明における上記した要素のいかなる組み合わせも、本願に含まれる。
【０１８３】
本明細書で援用したすべての特許、特許出願、特許出願の刊行物、及び、記事、書籍、仕様、出版物、文書、物品、及び、または、その他のものを含むその他の資料を、同資料に関連するあらゆる出願経過書類；現在の記載と矛盾する、または、対立するあらゆる資料、または、現在の記載と関連する、現在における、または、将来での最も広範な特許請求の範囲に関して制限的な影響を与える得る資料を除いて、すべての目的のために、本明細書の一部を構成するものとして、それらの全内容を援用する。例として、説明、定義、及び／または、援用した資料のいずれかに関連する用語の使用と、本明細書に関連する用語との間に矛盾または対立がある場合には、本明細書での説明、定義、及び／または、用語の使用を優先する。
【０１８４】
本明細書に開示した本願の実施形態は、本願の実施形態の原理を例示するものであることを理解されたい。使用可能なその他の変更は、本願の範囲内で行うことができる。したがって、限定ではなく、例として、本願の実施形態の代替構成を、本明細書に記載した教示に従って利用することができる。したがって、本願の実施形態は、本明細書で示し、かつ、説明したものにまで限定されない。
【０１８５】
本発明の様々な実施形態は、詳細な説明において上記した通りである。これらの説明は、上記した実施形態を直接的に説明するものであるが、当業者であれば、本明細書で示し、かつ、説明した特定の実施形態に対する改変、及び／または、変更を考え得ることを理解されたい。この説明の範囲内にあるそのような改変または変更も、同範囲内に含めることを意図している。特に断りのない限り、明細書及び特許請求の範囲での用語及び語句が、適用可能な技術分野（複数可）の当業者に対して、通常の慣習的な意味を付与すること、が本発明者らの意図である。
【０１８６】
本願出願時に出願人が知り得た本発明の様々な実施形態に関する前掲の説明を提供し、かつ、それらは、例示及び説明の目的を意図している。本明細書は、包括的とすることも、開示した正確な形態に本発明を限定することも意図しておらず、上記した教示に照らして、数多くの改変及び変更が可能である。記載した実施形態は、本発明の原理、及び、その実際の応用を説明するものであり、また、当業者らが、様々な実施形態において、企図する特定の用途に適した様々な変更を施して、本発明を利用することを可能にする。したがって、本発明は、本発明を実施するために開示した特定の実施形態に限定されないことを意図している。
【０１８７】
本発明の特定の実施形態を示し、かつ、説明をしてきたが、当業者であれば、本明細書の教示に基づいて、本発明、及び、それより広範な態様から逸脱せずとも、変化及び変更を加えることができることは自明であり、したがって、添付した特許請求の範囲は、本発明の本質的な要旨、及び、範囲内に属するすべてのかような変化及び変更をも、その範囲内に含む。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【国際調査報告】
2020524992.tif 000030