(57)【要約】  豚サーコウイルス３型免疫原性タンパク質及び当該免疫原性タンパク質から調製される免疫原性組成物が提供される。前記免疫原性組成物を調製する方法及び前記免疫原性組成物の豚サーコウイルス３型関連疾患を予防及び／又は治療する医薬の調製における用途が更に提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
豚サーコウイルス３型免疫原性組成物であって、
前記免疫原性組成物は、免疫量の豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質又は免疫量の前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子が組み換えられた生担体と、獣医学的に許容可能な担体とを含む豚サーコウイルス３型免疫原性組成物。
【請求項２】
前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１が示すヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質である請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質含有量は、２０μｇ／ｍｌ以上である請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質含有量は、２０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質含有量は、２０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌである請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質含有量は、３０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌである請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子が組み換えられた生担体は、組み換え弱毒サルモネラ菌、組み換えニューカッスル病ウイルス、組み換えポックスウイルス又は組み換えアデノウイルスである請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記獣医学的に許容可能な担体はアジュバントを含み、前記アジュバントは、（１）水酸化アルミニウム、サポニン、アブリジン、ＤＤＡ、（２）アクリル酸又はメタクリル酸の重合体、無水マレイン酸とアルケニル誘導体との重合体、（３）水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン又は水中油中水型エマルジョン、或いは（４）Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）Ｇｅｌを含む請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記アジュバントはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）Ｇｅｌであり、前記アジュバントの使用量は体積比で５〜２０％である請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記アジュバントの使用量は体積比で１０％である請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の免疫原性組成物を調製する方法であって、
前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子をクローンし、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子を発現担体に組み換えて、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子を含有する組み換え発現担体を得るステップ（１）と、
前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子を含有する組み換え発現担体が分子シャペロンの発現担体とともに大腸菌に共形質転換させ、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質を発現するステップ（２）と、
前記発現された豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質を分離し、非イオン界面活性剤を使用して処理してエンドトキシンを除去するステップ（３）と、
前記エンドトキシンが除去された豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質をアジュバントと均一に混ぜ合わせ、乳化させて、前記免疫原性組成物を得るステップ（４）とを含む方法。
【請求項１２】
前記ステップ（１）において、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子を含有する組み換え発現担体は組み換えｐＥＴ２８ａプラスミドであり、
前記ステップ（２）において、前記分子シャペロンの発現担体はｐＧ−Ｔｆ２であり、前記大腸菌は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）であり、
前記ステップ（３）において、非イオン界面活性剤はＴｒｉｔｏｎ（トリトン）Ｘ−１１４である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の豚サーコウイルス３型関連疾患を予防及び／又は治療する医薬の調製における用途。
【請求項１４】
豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質であって、
その配列はＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１が示すヌクレオチド配列によりコードされる豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、獣医薬分野に関し、具体的に、豚サーコウイルス３型タンパク質、当該タンパク質を含む免疫原性組成物、調製方法及び用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
豚サーコウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓｅｓ、ＰＣＶ）は環状一本鎖ＤＮＡウイルスであり、ゲノム長さが約１.７ｋｂであり、最も小さい動物ＤＮＡウイルスの一つである。既に二種類のＰＣＶ、即ち、豚サーコウイルス１型（ＰＣＶ１）及び豚サーコウイルス２型（ＰＣＶ２）が存在することが確定されている。ＰＣＶ１は、１９７４年初めにＰＫ細胞培養物の中で一種の汚染物質として鑑定されて発見されたが、豚に対して病原性がない。ＰＣＶ２は、１９９８年初めに報道されたが、臨床条件の下で豚の豚サーコウイルス関連疾患（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ、ＰＣＶＡＤ）を引き起こすことが可能であり、主に仔豚の多臓器性発育不良症候群、肺炎、豚皮膚炎、腎症症候群及び繁殖障害を引き起こし、主に呼吸、泌尿、腸管、リンパ、心血管、神経、繁殖システム及び皮膚の機能障害として現れ、全世界の生豚の養殖に深刻な経済的損失をもたらしている。
【０００３】
然しながら、一つの豚の繁殖障害症例において、ウイルスゲノムが２．０ｋｂであるサーコウイルスが１株分離され、後続的な試験の結果、既知のサーコウイルスとのホモロジーがヌクレオチド配列であれ、アミノ酸配列であれ、いずれも５０％より小さいことが実証された。国際ウイルス分類委員会の標準によると、サーコウイルスのうち同一種類に属するウイルスは７５％より大きいゲノムヌクレオチド配列のホモロジーを有するべきであり、Ｃａｐタンパク質は７０％より大きいアミノ酸配列のホモロジーを有するべきである。従って、これは一種の新しい豚サーコウイルスであることが確定できる。当該ウイルスは、豚の皮膚炎腎症症候群、繁殖障害、心臓及び多臓器系炎症性反応を引き起こすことが可能であるため、当該新しいウイルスに対して新しいワクチンを調製するのは養豚場疾患防除にとって非常に重要である。
【０００４】
＜発明の内容＞
先行技術の不足を解決するために、本発明は、豚サーコウイルス３型関連疾患を予防及び／又は治療する免疫原性組成物を提供する。当該免疫原性組成物は、豚サーコウイルス３型に対して効果的な防御を提供でき、著しい免疫特性を表している。
【０００５】
このため、本発明の一目的は、豚サーコウイルス３型免疫原性タンパク質であるＣａｐタンパク質を提供することにある。その配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１が示すヌクレオチド配列によりコーディングされることであり、これによる調製された免疫原性組成物は流行株からの攻撃を効果的に防御し、異なる由来の豚サーコウイルス３型に対して完全に防御することができる。
【０００６】
本発明の別の目的は、豚サーコウイルス３型関連疾患を予防及び／又は治療する免疫原性組成物を提供することにある。前記免疫原性組成物は、免疫量の豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質又は免疫量の前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子が組み換えられた生担体と、獣医学的に許容可能な担体とを含む。
【０００７】
本発明の別の目的は、前記免疫原性組成物を調製する方法を提供することである。前記方法は、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子をクローンし、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子を発現担体に組み換えて、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子を含有する組み換え発現担体を得るステップ（１）と、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子を含有する組み換え発現担体が分子シャペロンの発現担体とともに大腸菌に共形質転換させ、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質を発現するステップ（２）と、前記発現された豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質を分離し、非イオン界面活性剤を使用して処理してエンドトキシンを除去するステップ（３）と、前記エンドトキシンが除去された豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質をアジュバントと均一に混ぜ合わせ、乳化させて、前記免疫原性組成物を得るステップ（４）とを含む。
【０００８】
本発明は、更に、前記免疫原性組成物の豚サーコウイルス３型関連疾患を予防及び／又は治療する医薬の調製における用途に関する。
【０００９】
本発明は、初めに豚サーコウイルス３型免疫原性Ｃａｐタンパク質遺伝子を用い、効果的に発現させた後、免疫原性組成物を調製することであり、豚サーコウイルス３型関連疾患に起因する疫病を予防又は治療することができる。
【００１０】
本発明の豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質から調製される免疫原性組成物は、その免疫原性が良く、豚のウイルスからの攻撃を完全に防御し、多様な地域由来の野生株を効果的に予防することができ、即ち、臨床用途上で、豚サーコウイルス３型の感染及びまん延を予防、治療及び制御することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施形態を説明する。
【００１２】
豚サーコウイルス３型は、ゲノム２.０ｋｂのサーコウイルスであって、既知のサーコウイルスとのホモロジーがヌクレオチド配列であれ、アミノ酸配列であれ、いずれも５０％より小さく、新しい豚サーコウイルスである。現在、豚サーコウイルス３型は豚の皮膚炎腎症症候群、繁殖障害、心臓及び多臓器系炎症性反応を引き起こし得ることが既に知られている。
【００１３】
本発明は、豚サーコウイルス３型免疫原性組成物に関する。前記免疫原性組成物は、免疫量の豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質抗原又は免疫量の前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子が組み換えられた生担体及び獣医学的に許容可能な担体を含む。本発明は初めに豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質が良好な免疫原性を有し、これによる調製されたサブユニット抗原又はその遺伝子が組み換えられた生担体はいずれも免疫後に良好な免疫効果を得られることができ、豚に１００パーセントの保護を提供できるということを発現した。
【００１４】
用語「免疫原性組成物」とは、豚サーコウイルス３型免疫原性を含有する医薬組成物を指す。当該医薬組成物は、豚の豚サーコウイルス３型に対する免疫反応を誘発、刺激又は強化し得るものである。
【００１５】
用語「免疫量」は、「免疫有効量」として理解されるべきであり、又は免疫防御量又は免疫応答を起こす有効量とも称され、受容者体内で免疫応答を効果的に誘導可能な抗原量であるが、当該量は、有害な健康影響又はその合併症を含む疾患の症候又は症状を十分予防又は改善することができる。前記免疫応答は、診断目的又は他の試験に用いられるのに十分であり得るか、又は病原体により引き起こされる感染による有害な健康結果又はその合併症を含む疾患の兆候或症状を予防するために好適に用いられる。体液免疫力又は細胞により仲介される免疫力、或いはこの両者ともに誘導され得る。動物の免疫原性組成物に対する免疫応答は、例えば、抗体価測定、リンパ細胞増殖分析により間接的に評価されるか、或いは、野生型株でチャレンジした後に兆候又は症状を監視することにより直接的に評価されても良い。当該免疫原性組成物から提供された防御性免疫力は、例えば、被験動物の健康分娩の減少、死胎数の増加のような臨床兆候、被験動物の全体的な生理状況及び全体的な健康及び表現を測定することによって評価されても良い。前記免疫応答は、誘導細胞性及び／又は体液免疫力を含むことができるが、これらに限定されない。
【００１６】
用語「豚サーコウイルス３型抗原」とは、少なくとも一種の豚サーコウイルス３型抗原形態を含有するいかなる組成物を指す。前記豚サーコウイルス３型抗原は、豚サーコウイルス３型感染の免疫応答を誘導、刺激又は強化し得るものであり、前記抗原形態は、不活化された、弱毒化された又はサブユニットの抗原を含むがこれらに限定されない。
【００１７】
本発明に係る豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質抗原は、組み換え発現されたＣａｐタンパク質サブユニット抗原であっても良く、その発現体系は原核発現システム、真核発現システムであっても良く、人工的に合成された合成ペプチド抗原であっても良く、或いは、前記豚サーコウイルスＣａｐタンパク質遺伝子が組み換えられた生担体であっても良い。
【００１８】
「サブユニット抗原」とは、遺伝子工学方法により病原体の防御性抗原遺伝子を原核又は真核発現システムにクローンして、効果的に発現させることにより作られた抗原を指す。サブユニット抗原は、トティウイルス抗原と比べて、副反応を引き起こす可能性が小さくなることである。
【００１９】
「合成ペプチド抗原」とは、免疫決定基組成成分のみを含有する低分子ペプチド、即ち、人工的な方法により天然タンパク質のアミノ酸配列順に従って防御性オリゴペプチドを合成し、担体に結合させた後にアジュバントを加えることにより作られた抗原を指す。
【００２０】
「生担体」とは、遺伝子工学の方法により非病原性微生物に一種の抗原又は抗原決定基の遺伝子を含有して発現させて、免疫原性を持たせることを指す。非病原性微生物は、細菌及びウイルスであっても良い。ウイルス生担体が通常担体として用いられるウイルスとして、痘苗ウイルス、禽痘ウイルス、七面鳥ヘルペスウイルス、アデノウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスがある。細菌生担体は、弱毒サルモネラ、バシラス・カルメット・ゲラン、弱毒リステリア・モノサイトゲネス、弱毒コレラ菌、弱毒シゲラ、乳酸球菌、ラクトバチルス・プランタラム、ゴルドニ・ストレプトコッカスであっても良い。
【００２１】
本発明の一実施形態として、本発明の免疫原性組成物において、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１が示すヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質である。
【００２２】
本発明の一実施形態として、本発明の免疫原性組成物において、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質のコーディング遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１が示すヌクレオチド配列又はその縮重配列を有する。
【００２３】
本発明の一実施形態として、本発明の免疫原性組成物において、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質含有量は、２０μｇ／ｍｌ以上である。
【００２４】
本発明の好ましい一実施形態として、本発明の免疫原性組成物において、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質含有量は、２０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌである。
【００２５】
本発明のより好ましい一実施形態として、本発明の免疫原性組成物において、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質抗原含有量は、２０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌである。
【００２６】
本発明のより好ましい一実施形態として、本発明の免疫原性組成物において、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質抗原含有量は、３０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌである。本発明の免疫原性組成物において、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質抗原含有量は、２０μｇ／ｍｌ〜３０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、又は５０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌから選択されても良い。
【００２７】
本発明の一実施形態として、本発明の免疫原性組成物において、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子が組み換えられた生担体は、組み換え弱毒サルモネラ菌、組み換えニューカッスル病ウイルス、組み換えポックスウイルス又は組み換えアデノウイルスである。
【００２８】
本発明の生担体免疫原性組成物は、不活化ワクチン及び生ワクチンの利点を兼ね備えるため、免疫効果上で豚を防御できることを確保でき、且つその免疫効果がより強いため、アジュバントを添加しなくても良い。
【００２９】
本発明の豚サーコウイルス３型Ｃａｐ遺伝子は、更に、発現担体、核酸ワクチン、診断薬の開発及び他の豚サーコウイルス３型関連疾患を予防及び／又は治療する医薬の開発に応用することができる。
【００３０】
本発明は、豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質に関する。前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質の配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１が示すヌクレオチド配列によりコードされている。
【００３１】
本発明は、組み換え担体に関する。前記組み換え担体は、本発明に係る豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質を発現でき、免疫原性を持ち、且つ免疫反応を引き起こすことができる。
【００３２】
本発明は、転換体に関する。前記転換体は、本発明に係る発現豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質が導入されている組み換え担体を含む。
【００３３】
本発明の一実施形態として、本発明に係る免疫原性組成物において、前記獣医学的に許容可能な担体はアジュバントを含む。前記アジュバントは、（１）水酸化アルミニウム、サポニン、アブリジン、ＤＤＡ、（２）アクリル酸又はメタクリル酸の重合体、無水マレイン酸とアルケニル誘導体との重合体、（３）水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン又は水中油中水型エマルジョン、或いは（４）Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）Ｇｅｌを含む。
【００３４】
本発明の好ましい一実施形態として、本発明に係る免疫原性組成物において、前記アジュバントは、（１）サポニンＱｕｉｌＡ、（２）アクリル酸又はメタクリル酸重合体と糖又は多価アルコールのポリアルケニルエーテル架橋物であるカルボマーを含み、（３）前記アジュバントは、軽質流動パラフィンオイル、イソプレノイドオイルに基づいたエマルジョン、例えば、スクワラン又はスクアレンを含み、オレフィン、特に、イソブチレン又はデセンがオリゴマー化されて生成されたオイル、直鎖型アルキル付きの酸又はアルコールにより形成されたエステル、より特に、植物油、オレイン酸エチルエステル、プロピレングリコールジ（オクタン酸エステル／カプリン酸エステル）、グリセリントリ（オクタン酸エステル／カプリン酸エステル）、プロピレングリコールジオレイン酸エステルを含み、分岐脂肪酸エステル又はアルコールのエステル、特に、イソステアリン酸エステルを含み、オイルと乳化剤とを共に使用してエマルジョンを形成し、乳化剤は非イオン界面活性剤であることが好ましく、特に、ポリオキシエチル化脂肪酸（例えば、オレイン酸）、ソルビタン、マンニトール（例えば、無水マンニトールオレイン酸エステル）、グリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、及び選択可能なエトキシ化されたオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸、ヒドロキシオクタデカン酸により形成されたエステル、脂肪族アルコールと多価アルコール（例えば、オレイルアルコール）のエーテル、ポリオキシプロピレン・ポリオキシエチレンブロック共重合体、特に、ＰｌｕｒｏｎｉｃＲ、より特に、Ｌ１２１であることが好ましい、又は（４）Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）Ｇｅｌを含む。
【００３５】
好ましくは、前記アジュバントは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）Ｇｅｌであり、前記アジュバントの使用量は体積比で５〜２０％である。より好ましくは、前記アジュバントの使用量は体積比で１０％である。
【００３６】
前記アジュバントは、ホワイトオイル、ドレイクオイル、及び動物油、植物油又はミネラルオイル、或いは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及び金属塩、或いは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）Ｇｅｌ、カルボマー、スクワラン又はスクアレン、ＩＳＡ２０６アジュバント、サポニン、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、水中油中水型エマルジョンを含む。
【００３７】
好ましくは、前記アジュバントは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）Ｇｅｌであり、前記アジュバントの使用量は体積比で５〜２０％である。より好ましくは、前記アジュバントの使用量は体積比で１０％である。
【００３８】
本発明に係る免疫原性組成物における前記担体は、アジュバントである。前記アジュバントは、ホワイトオイル、ドレイクオイル（Ｄｒａｋｅｏｉｌ）、及び他の動物油、植物油又はミネラルオイル、或いは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及び他の金属塩、或いは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）Ｇｅｌ、カルボマー、スクワラン又はスクアレン、ＩＳＡ２０６アジュバント、サポニン、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、水中油中水型エマルジョンを含む。
【００３９】
本発明の免疫原性組成物は、利用可能な技術を採用して配合することができ、獣医学的に許容可能な担体と共に配合することが好ましい。例えば、オイルは、配合物を安定させるのに寄与する以外に、ワクチンアジュバントとしても機能する。オイルアジュバントは、自然由来であっても良いし、人工合成により得られたものであっても良い。
【００４０】
用語「アジュバント」とは、組成物の免疫原性を高めるように、本発明の組成物の中に加えられる物質を指す。既知のアジュバントは、（１）水酸化アルミニウム、サポニン（Ｓａｐｏｎｉｎｅ）（例えば、ＱｕｉｌＡ）、アブリジン、ＤＤＡ、（２）アクリル酸又はメタクリル酸の重合体、無水マレイン酸とアルケニル誘導体の重合体、（３）免疫原性組成物が水中油、油中水又は水中油中水型のエマルジョンの形で調製することができ、或いは、（４）Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）Ｇｅｌを含むがこれらに限定されない。
【００４１】
特に、エマルジョンは、軽質流動パラフィンオイル、イソプレノイドオイル、例えば、スクワラン又はスクアレン、オレフィン、特に、イソブチレン又はデセンオリゴマー化されて生成されたオイル、直鎖型アルキル付きの酸又はアルコールにより形成されたエステル、より特に、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（オクタン酸エステル／カプリン酸エステル）、グリセリントリ（オクタン酸エステル／カプリン酸エステル）、プロピレングリコールジオレイン酸エステル、分岐脂肪酸エステル又はアルコールのエステル、特に、イソステアリン酸エステルに基づくことが可能である。オイルと乳化剤とを共に使用してエマルジョンを形成する。乳化剤は、非イオン界面活性剤、特に、ポリオキシエチル化脂肪酸（例えば、オレイン酸）、ソルビタン、マンニトール（例えば、無水マンニトールオレイン酸エステル）、グリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、及び選択可能なエトキシ化されたオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸、ヒドロキシオクタデカン酸により形成されたエステル、脂肪族アルコールと多価アルコール（例えば、オレイルアルコール）のエーテル、ポリオキシプロピレン・ポリオキシエチレンブロック共重合体、特に、ＰｌｕｒｏｎｉｃＲ、より特に、Ｌ１２１（Ｈｕｎｔｅｒ等、１９９５、「Ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」（Ｓｔｅｗａｒｄ−Ｔｕｌｌ、Ｄ．Ｅ．Ｓ監修）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、５１−９４、Ｔｏｄｄ等、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９７、１５、５６４−５７０を参照）であるのが好ましい。
【００４２】
とりわけ、アクリル酸又はメタクリル酸重合体は、糖又は多価アルコールのポリアルケニルエーテルにより架橋される。これらの化合物は、カルボマーと称される。
【００４３】
好ましくは、本発明は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）Ｇｅｌであるアジュバントを用いる。
【００４４】
本発明の組成物に適用されるアジュバントの量は、有効量であるのが好ましい。前記「有効量」とは、アジュバントが本発明の抗原と併用される際、過度な副作用を起こすことがなく、宿主の中でそれらの免疫学上の効果が得られることに対して、必要な、或いは十分な量であることを指す。施用すべきアジュバントの正確な量は、例えば、用いられる成分、治療する疾患の類型、治療すべき動物の類型と年齢、施用される方式、及び組成物における他の成分のような因子によって変わる。
【００４５】
本発明のＣａｐタンパク質は、本分野におけるいかなる既知の方法により調製されて良い。例えば、Ｃａｐ遺伝子を組み換え発現することによりＣａｐタンパク質を調製しても良い。発現システムは、例えば、真核発現システム、原核発現システムのようないかなる既知の発現システムを使用することができるか、或いは、Ｃａｐタンパク質を直接的に合成しても良い。真核発現システムは、哺乳動物細胞発現システムと、酵母発現システムと、昆虫発現システムとを含んでも良い。
【００４６】
本発明は、更に、前記免疫原性組成物を調製する方法に関する。前記方法は、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子をクローンし、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子を発現担体に組み換えて、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子を含有する組み換え発現担体を得るステップ（１）と、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子を含有する組み換え発現担体が分子シャペロンの発現担体とともに大腸菌に共形質転換させ、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質を発現するステップ（２）と、前記発現された豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質を分離し、非イオン界面活性剤を使用して処理してエンドトキシンを除去するステップ（３）と、前記エンドトキシンが除去された豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質をアジュバントと均一に混ぜ合わせ、乳化させて、前記免疫原性組成物を得るステップ（４）とを含む。
【００４７】
本発明の一実施形態として、前記免疫原性組成物を調製する方法において、前記ステップ（１）において、前記豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質遺伝子を含有する組み換え発現担体は組み換えｐＥＴ２８ａプラスミドであり、前記ステップ（２）において、前記分子シャペロンの発現担体はｐＧ−Ｔｆ２であり、前記大腸菌は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）であり、前記ステップ（３）において、非イオン界面活性剤はＴｒｉｔｏｎ（トリトン）Ｘ−１１４である。
【００４８】
本発明の免疫原性組成物は、さらに他の試薬を本発明の組成物の中に加えても良い。例えば、本発明の組成物は、例えば、医薬、免疫賦活剤（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ-ＣＳＦ）及びインターロイキン２（ＩＬ２））、抗酸化剤、界面活性剤、着色剤、揮発性油、緩衝剤、分散剤、プロペラント及び防腐剤のような試薬を更に含むことができる。
【００４９】
このような組成物を調製するためには、本分野において周知である方法を使用しても良い。
【００５０】
本発明の免疫原性組成物に基づいて経口剤型又は非経口剤型に調製しても良い。
【００５１】
皮内、筋肉、腹膜内、静脈内、皮下、鼻内又は硬脳膜外経路を経て投与可能な非経口剤型であるのが好ましい。
【００５２】
本発明は、更に、前記免疫原性組成物の豚サーコウイルス３型関連疾患を予防及び／又は治療する医薬の調製における用途にも関する。
【００５３】
本発明で使用される用語「豚サーコウイルス３型関連疾患」は、豚サーコウイルス３型感染に起因する疾患を指すためのものである。豚皮膚炎腎症症候群、繁殖障害、心臓及び多臓器系炎症性反応を非網羅的に含むがこれらに限定されない。
【００５４】
用語「予防及び／又は治療」とは、豚サーコウイルス３型関連疾患に係わる場合、豚サーコウイルス３型の複製を抑制し、豚サーコウイルス３型の感染を抑制するか、又は豚サーコウイルス３型がその宿主の体内で定住するのを防止し、豚サーコウイルス３型感染の疾患又は病症の症状を軽減することを指す。ウイルス負荷量が減少し、病症が軽減されるか及び／又は摂食量及び／又は生長が増加すると、前記治療が治療効果に達したとみなされることができる。
【００５５】
以下、具体的な実施例を結び付けて本発明をさらに具体的に記述する。本発明の利点及び特徴は記述につれてより明らかになる。しかし、これらの実施例は単に例示的なものであり、本発明の範囲に対していかなる制限も構成しない。当業者は、本発明の精神及び範囲を逸脱しないという前提で本発明に係る構成の詳細及び形態に対して変更又は置換を実施することができるが、これらの変更及び置換はいずれも本発明の技術的範囲に含まれるということを理解すべきである。
【００５６】
本発明の実施例で用いられる化学試薬は分析グレードであり、中国国薬集団から入手可能である。
【００５７】
本発明をより理解しやすいようにするために、以下では、具体的な実施例を結び付けて本発明をさらに具体的に記述する。本発明に係る試験方法は、特に説明がない限り、いずれも従来の方法である。記載される生物材料は、特に説明がない限り、いずれも商業的に入手可能である。
【００５８】
実施例１  豚サーコウイルス３型の分離・同定
１.病理材料の由来
中国国内の一商品化養豚場で、従来の平均値に比べ、母豚の死亡率が９．４％増加し、受胎率が１．２％低下し、ミイラ変性胎子が８．２％増加する現象が現れた。臨床表現的に、影響を受けた母豚は、拒食現象を現し、多巣状丘疹、斑点及び表面皮膚炎の症状を現した。流産した巣に異なる在胎週数のミイラ変性胎子を含有し、ＰＣＶ２感染により流産が引き起こされる症状と一致している。母豚から観察された臨床表現及び流産症状全体として、豚サーコウイルス２型による繁殖障害疾患と一致するが、全ての母豚の腎臓、リンパ節、肺、皮膚及び死胎を含む異なる組織を免疫組織化学及び定量ＰＣＲによりＰＣＶ２、ＰＲＲＳＶ、ＰＰＶ、ＣＳＦＶ、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ検査を行った結果、いずれも陰性であった。さらに原因を究明するために、各組織の病理材料を選び取って病原分離を行った。
【００５９】
２.ウイルス株の分離及び培養
病理材料を１：１０（体積比）でＤＭＥＭ培養液に加え、研磨して、組織懸濁液を調製し、組織懸濁液を繰り返して３回にかけて凍結融解させた後、１２０００ｒ／ｍｉｎ下で１５ｍｉｎ遠心し、上清液を収集し、上清液を０．２２μm膜フィルターを経て濾過し、ろ液をＰＫ１５細胞上で継代させて、３７℃で１ｈ培養し、２％仔ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培養液を入れ替えるように加え、３７℃に置いて５日間培養する。ウイルスを収穫し、２回にかけて凍結融解させた後、ウイルスを含有する培養液を収穫する。
【００６０】
３.ＰＣＲ及びシークエンシング解析によるウイルス種の同定
上記のステップにおけるウイルス培養物を取って、核酸抽出キットを用いてウイルスサンプルの核酸を抽出し、サーコウイルス種の特異的プライマーを使ってＰＣＲ増幅同定を行い、その結果、２０００ｂｐターゲットバンドがＰＣＲ増幅されたことが示された。ＰＣＲ生成物をシークエンシング社に送ってヌクレオチド配列決定を行い、配列決定結果に対して遺伝進化解析を行った。その結果、当該ウイルス株の全ゲノム配列及びアミノ酸配列は、既に報道された他のサーコウイルスとのホモロジーがいずれも５０％より小さいことが示された。然しながら、国際ウイルス分類委員会の標準によると、サーコウイルスのうち同一種類に属するウイルスは７５％より大きいゲノムヌクレオチド配列のホモロジー及びＣａｐタンパク質７０％より大きいアミノ酸配列のホモロジーを有するべきである。従って、これは新しい豚サーコウイルスであることが確定でき、現在、豚の体で発見された第３の種類のサーコウイルスでもある。
【００６１】
実施例２  ｐＥＴ２８ａ−ＰＣＶ３−Ｃａｐ発現担体の構築
１.ＰＣＶ３ウイルスＤＮＡの抽出
プラスミド抽出キットは中国天根生物社から入手可能であり、Ｔ４  ＤＮＡ  ＬｉｇａｓｅはＢｉｏＬａｂ社から入手可能であり、ｐＥＴ２８ａプラスミドはＮｏｖａｇｅｎ社から入手可能であり、アガロースゲル抽出キットは中国天澤生物社から入手可能であり、他の試薬はいずれも分析グレードである。
【００６２】
ウイルスＤＮＡ抽出キット明細書に従って、０.２ｍｌの豚サーコウイルス３型ウイルス液を無菌の１.５ｍｌの遠沈管に取り、０.４ｍｌのＶＢをウイルス液に加え、渦流混合させて、室温で１０分間静置する。０.４５ｍｌのＡＤ  ｂｕｆｆｅｒ（バッファ）をウイルス液に加え、力を入れて均一に混ぜ合わせる。ＶＢカラムを２ｍｌの収集管に入れ、０.６ｍｌの混合液を取ってＶＢカラムに加え、１４０００ｇで１分間遠心し、残りの混合液をＶＢカラムに加え、１４０００ｇで１分間遠心し、２ｍｌ収集管を廃棄し、ＶＢカラムを新しい２ｍｌ収集管に入れ、０.４ｍｌのＷ１  ｂｕｆｆｅｒを加え、１４０００ｇで３０秒間遠心し、０.６ｍｌのＷａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（洗浄バッファ）をＶＢカラムに加え、１４０００ｇで３０秒間遠心した後、ｂｕｆｆｅｒ（バッファ）を加えずに再びそのまま置いて３分間遠心し、ＶＢカラムを新しい１.５ｍｌ  ＥＰ管に入れ、５０μｌのＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ（ＲＮａｓｅフリー水）を加えてフィルムの中心に置いて３分間静置し、１４０００ｇで１分間遠心し、ＥＰ管内で遠心して分離された液体はＤＮＡゲノム溶液である。
【００６３】
２.Ｃａｐタンパク質遺伝子の増幅
Ｃａｐタンパク質遺伝子５′及び３′末端の保存領域配列に従ってオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを合成し、ＰＣＲを行う。プライマー配列は表１を参照する。
【表１】
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【００６４】
ＰＣＲ生成物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社に送ってシークエンシングを行い、その結果に基づいてＣａｐタンパク質遺伝子に対してコドン最適化を行い、最適化されたＣａｐタンパク質遺伝子配列は配列表ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１が示す通りである。
【００６５】
３.発現担体構築
最適化されたＣａｐタンパク質遺伝子を中国蘇州泓迅生物科技株式会社に送って完全配列合成を行い、ｐＥＴ２８ａプラスミドに連結させる。連結されたプラスミドと分子シャペロンプラスミドｐＧ−Ｔｆ２とを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に共形質転換させ、モノクローンを選んで１００μｇ／ｍｌのカナマイシン及び２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地で一晩培養して、プラスミドを抽出した後にシークエンシング解析を行い、陽性クローンはｐＥＴ２８ａ−ＰＣＶ３−Ｃａｐ／ｐＧ−Ｔｆ２発現菌株である。
【００６６】
実施例３  Ｃａｐタンパク質の発現
実施例２で調製されたｐＥＴ２８ａ−ＰＣＶ３−Ｃａｐ／ｐＧ−Ｔｆ２／Ｅ.Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株を５０〜１００μｇ／ｍｌのカナマイシン及び２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地に接種する。一方、ＬＢ培地に分子シャペロンタンパク質の誘導発現に用いられる５〜１０ｎｇ／ｍｌのテトラサイクリンが含有され、接種量は１％（Ｖ／Ｖ）であり、３７℃で振盪培養する。ＯＤ６００＝０.４〜０.６である場合、２８℃で３０分間放置する。イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えて、その最終濃度が０.１〜１.０ｍＭになるようにし、２８℃で２４時間振盪培養させる。培養が完了した後、菌体を収集し、ＰＢＳ（塩化ナトリウム８ｇ、塩化カリウム０.２ｇ、りん酸水素二ナトリウム１.４４ｇ、リン酸二水素カリウム０.２４ｇでｐＨが７.４になるように調整し、１Ｌに定容する）で菌体を再懸濁し、超音波破砕を行い、遠心して上清を取る。発現生成物の中の可溶性標的タンパク質の含有量は比較的に高く、発現量は菌体タンパク質の総量の２５％に達し得、エンドトキシンの含有量は０.２８×１０５ＥＵ／ｍｌである。
【００６７】
実施例４  大腸菌発現Ｃａｐタンパク質のエンドトキシン除去
１.５ｍｌ遠沈管に０.５ｍｌの可溶性Ｃａｐタンパク質を含有する処理すべき上清溶液及び最終濃度が１％（Ｖ／Ｖ）であるトリトンＸ−１１４（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４）（添加量は５μlである）を加え、渦流振盪で均一に混ぜ合わせる。均一に混ぜ合わせられたサンプルを氷上で５分間放置する。サンプルが冷却された後、遠沈管を直ちに３７℃水浴に入れて５ｍｉｎ温浴させて、新しい二相を形成させる。そして、サンプルを３７℃で６０ｓ遠心させる。遠心後、標的タンパク質は上層に残る一方、エンドトキシンを含有する非イオン界面活性剤は油滴の形状で遠沈管の底部に残留し、これにより二相が分離される。エンドトキシンを除去する全体の操作は３回循環される。測定の結果、タンパク質純度は低下せず、エンドトキシン含有量は０.００８×１０５ＥＵ／ｍｌに低下する。一方、２００ＫＶ透過型電子顕微鏡により６００００倍まで拡大させて、５％リンタングステン酸ネガティブ染色を経て、炭素が噴射された銅メッシュ上に固定されたＰＣＶ３ウイルス様粒子を観察し、その結果、多量のウイルス様粒子が示され、且つ大きさが均一で、中空粒子状態を現した。
【００６８】
その結果は、Ｔｒｉｔｏｎ（トリトン）  Ｘ−１１４は、組み換えタンパク質に残留するエンドトキシンを除去でき、タンパク質の純度に影響を与えず、且つ、ＰＣＶ３ウイルス様粒子の形成及び安定な形態にも影響を与えていないことを示している。
【００６９】
実施例５  豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質免疫原性組成物の調製
実施例４の方法に従って純化されたＣａｐタンパク質を水溶性アジュバントＧｅｌアジュバントＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）Ｇｅｌ（フランスＳＥＰＰＩＣ社）に徐々に加え、加える過程で絶え間なく回転数が８００ｒｐｍである乳化機で１２ｍｉｎ撹拌して均一に混ぜ合わせる。免疫原性組成物の具体的な配合は表２を参照することにする。
【表２】
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【００７０】
実施例６  豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質免疫原性組成物の免疫原性試験
２８〜３０日齢の仔豚に対してＥＬＩＳＡ検査を行った結果、ＰＣＶ２、ＰＣＶ３抗原、抗体がいずれも陰性である健康な仔豚２５匹を５匹／群になるようにランダムに五つの群に分け、実施例５で調製された豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質免疫原性組成物で免疫する。第１〜４の群の仔豚はそれぞれ免疫原性組成物１〜４で免疫し、第５の群は免疫せずにウイルスチャレンジする比較群とする。各免疫群の仔豚に免疫原性組成物２ｍｌ／匹を注射し、ウイルスチャレンジ比較群の仔豚に生理食塩水２ｍｌ／匹を接種する。免疫後２８日目に各群にウイルスチャレンジを行い、ウイルスチャレンジの分量は豚サーコウイルス３型ＳＧ株（Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ３、ｓｔｒａｉｎ  ＳＧ、中国典型培養物保蔵センターに寄託され、寄託番号はＣＣＴＣＣ  ＮＯ．Ｖ２０１７１２であり、寄託日付は２０１７年３月２３日であり、寄託住所は中国武漢・武漢大学である）１０５．０ＴＣＩＤ５０／匹である。ウイルスチャレンジ後、各群の仔豚を連続して観察し、ウイルスチャレンジ後２５日目に全ての試験豚を解剖して、各群の仔豚の臨床症状、病理変化及びウイルス検査結果に基づいて判定を行い、その具体的な結果は表３を参照することにする。
【表３】
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【００７１】
その結果は、豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質免疫原性組成物が仔豚に免疫させた後、仔豚に１００％（５／５）の防御を行うことができる一方、ウイルスチャレンジ比較群の仔豚はウイルスチャレンジ後に全て罹患したことを示している。これは、本発明が提供する豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質免疫原性組成物がかなり良い防御能力を有することを示している。
【００７２】
実施例７  豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質免疫原性組成物の広範囲性防御試験
２８〜３０日齢の仔豚に対してＥＬＩＳＡ検査を行った結果、ＰＣＶ２、ＰＣＶ３抗原、抗体がいずれも陰性である健康な仔豚５０匹を５匹／群になるようにランダムに１０個の群に分け、第６〜１０の群を実施例５で調製された豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質免疫原性組成物１に免疫させ、第１１〜１５の群は免疫せずにウイルスチャレンジ比較群とする。各々の免疫群の仔豚に免疫原性組成物２ｍｌ／匹を注射し、比較群の仔豚に生理食塩水２ｍｌ／匹を接種する。免疫してから２８日後にウイルスチャレンジを行い、第６の群及び第１１の群の仔豚は、最近中国河南省から分離された豚サーコウイルス３型ＨＮ１２ウイルス株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第７の群及び第１２の群の仔豚は、最近中国江蘇省から分離された豚サーコウイルス３型ＪＳ０８ウイルス株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第８の群及び第１３の群の仔豚は、最近中国吉林省から分離された豚サーコウイルス３型ＪＬ１１ウイルス株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第９の群及び第１４の群の仔豚は、最近中国重慶市から分離された豚サーコウイルス３型ＣＱ０４ウイルス株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、第１０の群及び第１５の群の仔豚は、最近中国広東省から分離された豚サーコウイルス３型ＧＤ０５ウイルス株の強毒性のウイルス株でウイルスチャレンジし、ウイルスチャレンジの分量は１０５．０ＴＣＩＤ５０／匹である。ウイルスチャレンジ後、各々の仔豚を連続して観察し、ウイルスチャレンジしてから２５日後に全ての試験豚を解剖して、各々の仔豚の臨床症状、病理変化及びウイルス検査に基づいて判定を行い、その具体的な結果は表４を参照することにする。
【表４】
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【００７３】
その結果は、比較群である第１１〜１５の群の各々は、ウイルスチャレンジ後にいずれも異なる程度で体温が４０．５℃以上に上昇し、３〜５日間持続し、食欲が減退し、気分が沈み、被毛が乱雑で、痩せ細って、生長速度が減速する等の臨床症状が現れ、剖検でいずれも異なる程度の肺硬変、リンパ腫大、腎臓に壊死箇所有りの病理変化が現れたことを示し、各内臓及び器官組織に対してＰＣＲ検査を行うことによって、豚サーコウイルス３型ウイルスを再度分離できた一方、免疫群である第６〜１０の群の各々は、ウイルスチャレンジ後に異常臨床症状がなく、剖検でも各組織器官は異常がなく、各内臓及び器官組織に対してＰＣＲ検査を行った結果、いずれもＰＣＶ３陰性を現した。これは、本発明が提供する豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質免疫原性組成物は、豚に対して異なる地域由来の豚サーコウイルス３型ウイルスからの攻撃を効果的で完全に免疫防御することができ、且つ各内臓及び器官組織からウイルスチャレンジしたＰＣＶ３ウイルス株を検出できないことを示している。本発明の免疫原性組成物は、広範囲の免疫原性を有し、異なる地域由来の豚サーコウイルス３型に対していずれも完全に防御することができる。免疫後、豚の体に感染したウイルスがないため、本発明の免疫原性組成物は、ＰＣＶ３に感染した養豚場の清浄化にとって重要な意味を持つ。
【００７４】
実施例８  豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質免疫原性組成物の応用試験
中国国内の一商品化養豚場で、従来の平均値に比べ、母豚の死亡率が８．９％増加し、受胎率が１．４％低下し、ミイラ変性胎子が８．５％増加する現象が現れた。臨床表現的に、影響を受けた母豚は、拒食現象を現し、多巣状丘疹、斑点及び表面皮膚炎の症状を現した。流産した巣に異なる在胎週数のミイラ変性胎子を含有している。臨床表現症状のある母豚から３８匹の妊娠した母豚を選んで、１９匹／群になるようにランダムにＡ群、Ｂ群の二つの群に分ける。Ａ群は、免疫原性組成物接種群であり、Ａ群は実施例５で調製された豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質免疫原性組成物１に免疫させ、Ｂ群はブランクとして比較群である。免疫群に免疫原性組成物２ｍｌ／匹を注射し、ブランクである比較群に生理食塩水２ｍｌ／匹を接種する。２つの群の母豚の仔豚生産状況を統計し、その結果は表５を参照することにする。
【表５】
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【表６】
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【００７５】
その結果は、免疫群の母豚の仔豚生産に異常がなく、健康な仔豚を生産し、平均的に１１．７９匹／巣生産し、健康率は最大９９．６％である一方、比較群は明らかなミイラ変性胎子及び虚弱仔豚の状況が現れ、健康な仔豚を平均的に７．６匹／巣生産し、健康率は６５．０％であり、そのうち、２匹の母豚は流産状況が起こり、巣全体ミイラ変性胎子であり、免疫群と比較群の差異は顕著であることを示している。
【００７６】
表５の結果は、本発明の豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質免疫原性組成物は、豚サーコウイルス３型に感染した母豚に対して良好な免疫防御する役割を有し、既にＰＣＶ３ウイルスに感染した母豚及び生まれた仔豚に対して防御を行うことができるということを説明している。
【００７７】
一方、比較群であるＢ群が産んだ健康な仔豚をそれぞれ隔離させて巣毎に飼育して、以下の実験の対象とする。１７巣をＢ１群（Ｂ−１巣乃至Ｂ−１５巣を含んで、Ｂ−４巣は巣全体ミイラ変性胎子であるため計算に入れない以外、合計１４巣の仔豚）、Ｂ２群（Ｂ−１６乃至Ｂ−１９巣を含んで、Ｂ−１８巣は巣全体ミイラ変性胎子であるため計算に入れない以外、合計３巣の仔豚）の二つの群に分ける。Ｂ１群は母乳を飲む前に実施例５で調製された豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質免疫原性組成物１に免疫させ、Ｂ２群はブランクとして比較群である。免疫群の仔豚に免疫原性組成物２ｍｌ／匹を注射し、ブランクである比較群の仔豚に生理食塩水２ｍｌ／匹を接種する。各々の仔豚を連続して観察し、死亡仔豚は即時で解剖し、２５日目にＢ１の群のサンプリング検査仔豚及びＢ２の群の生き残った仔豚を解剖し、各々の仔豚の臨床症状、病理変化及びウイルス検査に基づいて判定を行い、その具体的な結果は表６を参照することにする。
【表７】
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【表８】
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【００７８】
その結果は、免疫群の仔豚は、異常臨床症状がなく、各組織器官をランダムに剖検した結果、同じく異常がなく、豚の各内臓及び器官組織を剖検してＰＣＲ検査を行った結果、いずれもＰＣＶ３陰性を現した一方、ブランクである比較群の仔豚はいずれも異なる程度で体温が４０．５℃以上に上昇し、３〜５日間持続し、食欲が減退し、気分が沈み、被毛が乱雑で、痩せ細って、生長速度が減速する等の臨床症状が現れ、一部の豚は死亡し、剖検でいずれも異なる程度の肺硬変、リンパ腫大、腎臓に壊死の箇所有りの病理変化が現れたことを示し、各内臓及び器官組織に対してＰＣＲ検査を行うことによって、豚サーコウイルス３型を再度分離できた。
【００７９】
ＰＣＶ３は豚の群の中で垂直感染されることが可能であるため、表６の結果は、本発明の豚サーコウイルス３型Ｃａｐタンパク質免疫原性組成物は、豚サーコウイルス３型に感染した仔豚に対して良好な免疫防御する役割を有し、既にＰＣＶ３ウイルスに感染した仔豚に対して防御を行うことができ、防御率は１００％であることを説明している。
【００８０】
以上の記載は、単に本発明の好ましい実施例であり、本発明に対するいかなる形式的な制限も行わない。好ましい実施例として本発明を以上のように開示したが、本発明を限定するものではない。本分野における当業者であれば、本発明の技術方案を逸脱しない範囲で、上記のように開示された技術内容を利用して変更又は修飾を同等変化とする若干の等価実施例を実施することができるが、本発明の技術方案を逸脱せずに本発明の技術実質に基づいて上記の実施例に対して行われるいかなる簡単な修正、同等変化及び修飾は、全て依然として本発明の技術方案の範囲内に属する。
【配列表】
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【国際調査報告】
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