(57)【要約】本発明は、合成生物学および代謝工学の技術分野に属する。より特に、本発明は、代謝的に操作した微生物の発酵の技術分野に属する。本発明は、細胞内生合成経路を介してシアル酸付加化合物を合成することができる操作した微生物を説明する。これらの微生物は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸を脱リン酸化してＮ−アセチルグルコサミンにし、Ｎ−アセチルグルコサミンをＮ−アセチルマンノサミンに変換することができる。これらの微生物はまた、Ｎ−アセチルマンノサミンをＮ−アセチル−ノイラミン酸塩に変換する能力を有する。
2020503066.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物におけるシアル酸付加化合物を生成するための方法であって、
−  培養培地中で微生物を培養するステップであって、前記培養培地が、必要に応じて、外因性前駆体を含み、
前記微生物が、ホスファターゼをコードする少なくとも１つの核酸、Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸およびシアル酸合成酵素をコードする少なくとも１つの核酸を含み、
前記微生物が、ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐをグルコサミン−６−Ｐに変換すること、ｉｉ）Ｎ−アセチル−グルコサミンをＮ−アセチル−グルコサミン−６−Ｐに変換すること、およびｉｉｉ）Ｎ−アセチル−ノイラミン酸塩をＮ−アセチル−マンノサミンに変換することができない、ステップと、
−  ＨＡＤ様ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸の、前記微生物における発現を調節するステップであって、前記ＨＡＤ様ホスファターゼポリペプチドが、
−  以下のモチーフ：
モチーフ１：ｈＤｘＤｘ［ＴＶ］（配列番号７３）、もしくは
モチーフ２：［ＧＳＴＤＥ］［ＤＳＥＮ］ｘ（１−２）［ｈＰ］ｘ（１−２）［ＤＧＴＳ］（配列番号７４、７５、７６、７７）（ｈは、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｖ、Ｐ、Ｇ）を意味し、ｘは、任意の別個のアミノ酸であり得る）
のうちの少なくとも１つ、
−  または前記ポリペプチドと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的な配列同一性を有する配列番号４３、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５または５７のいずれか１つのホモログまたは誘導体
を含む、ステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＨＡＤ様ポリペプチドが、配列番号４３、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５または５７のいずれか１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発現の調節が、ＨＡＤ様ポリペプチドをコードする核酸を微生物に導入し、発現させることによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記発現の調節が、構成的プロモーターの作用によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記シアル酸付加化合物が、Ｎ−アセチルノイラミン酸、シアル酸付加オリゴ糖、シアル酸付加脂質、シアル酸付加タンパク質、シアル酸付加アグリコンからなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記シアル酸付加化合物が、シアル酸付加オリゴ糖である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記シアル酸付加オリゴ糖が、シアリルラクトースである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記シアル酸付加オリゴ糖が、ジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記シアル酸付加化合物が、Ｎ−アセチルノイラミン酸である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記シアル酸付加化合物が、シアル酸付加ラクト−Ｎ−トリオース、ラクト−Ｎ−テトラオースまたはラクト−Ｎ−ネオテトラオースであり、前記微生物が、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．３８）の活性をさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物が、ＵＤＰ糖加水分解酵素およびガラクトース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を発現することができない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物が、シアル酸付加化合物より、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％少ない細胞外Ｎ−アセチルグルコサミンを生成する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
シアル酸付加オリゴ糖を生成するための方法であって、
ａ）請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法による微生物を培養するステップであって、前記微生物が、シアリルトランスフェラーゼのドナー基質として活性化Ｎ−アセチルノイラミン酸塩を内部で生成する、ステップと、
ｂ）ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−ビオース、ガラクトース、ベータ−ガラクトシドおよびアルファ−ガラクトシド、例えば非限定的に、グロボ三糖（Ｇａｌ−アルファ−１，４Ｇａｌ−ベータ−１，４Ｇｌｃ）ガラクトースからなる群より選択される外因性前駆体を含む培養培地中で前記微生物を培養するステップであって、前記外因性前駆体の前記微生物への能動的取り込みが起こり、前記外因性前駆体が、前記シアル酸付加オリゴ糖を生成するための前記シアリルトランスフェラーゼのアクセプター基質である、ステップと
を含む、方法。
【請求項１４】
前記Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼおよび前記シアル酸合成酵素のうちのいずれか１つまたは複数が、前記微生物で過剰発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼおよび前記シアル酸合成酵素のうちのいずれか１つまたは複数が、前記微生物に導入され、発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物が、細菌、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株、より好ましくはＫ１２株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株であり、さらにより好ましくは前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記微生物が、酵母である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＨＡＤ様ポリペプチドをコードする組換え核酸を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる微生物。
【請求項１９】
シアル酸付加化合物を生成するための微生物であって、ホスファターゼをコードする少なくとも１つの核酸、Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸およびシアル酸合成酵素をコードする少なくとも１つの核酸を含み、ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐをグルコサミン−６−Ｐに変換すること、ｉｉ）Ｎ−アセチル−グルコサミンをＮ−アセチル−グルコサミン−６−Ｐに変換すること、およびｉｉｉ）Ｎ−アセチル−ノイラミン酸塩をＮ−アセチル−マンノサミンに変換することができず、
請求項１または２に定義されるＨＡＤ様ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸の調節された発現を含むことを特徴とする、微生物。
【請求項２０】
（ｉ）請求項１または２に定義されるＨＡＤ様ポリペプチドをコードする核酸と、
（ｉｉ）（ａ）の核酸配列の発現を駆動することができる１つまたは複数の制御配列と、必要に応じて、
（ｉｉｉ）転写終結配列と
を含む、構築物。
【請求項２１】
前記制御配列のうちの１つが、構成的プロモーターである、請求項２０に記載の構築物。
【請求項２２】
シアル酸付加化合物を生成するための方法における請求項２０または２１に記載の構築物の使用。
【請求項２３】
食品配合物、飼料配合物、医薬配合物、美容配合物または農芸化学配合物に添加される、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法により生成されるシアル酸付加化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、合成生物学および代謝工学の技術分野に属する。より特に、本発明は、代謝的に操作した微生物の発酵の技術分野におけるものである。本発明は、細胞内生合成経路を介してシアル酸付加化合物を合成することができる操作した微生物を記載する。これらの微生物は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸を脱リン酸化してＮ−アセチルグルコサミンにし、Ｎ−アセチルグルコサミンをＮ−アセチルマンノサミンに変換することができる。これらの微生物はまた、Ｎ−アセチルマンノサミンをＮ−アセチル−ノイラミン酸塩に変換する能力を有する。さらに、本発明は、シアル酸付加化合物のラージスケールｉｎ  ｖｉｖｏ合成のための方法であって、本方法は、必要に応じて、外因性前駆体、例えば非限定的に、ラクトース、ラクト−Ｎ−ビオース、Ｎ−アセチルラクトサミンおよび／またはアグリコンを含む培養培地中で、微生物を培養するステップによるものであり、前記微生物は、細胞内でＮ−アセチルグルコサミン−６−リン酸を脱リン酸化してＮ−アセチルグルコサミンにし、Ｎ−アセチルグルコサミンをＮ−アセチルマンノサミンに変換し、後者をさらにＮ−アセチル−ノイラミン酸塩に変換する、方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
シアル酸付加化合物、例えばシアル酸およびシアル酸付加オリゴ糖は、それらの広範な適用範囲のために、近年注目されている。例えば、シアル酸は、抗ウイルス前駆体と考えられている。シアル酸付加オリゴ糖は、ヒト乳汁の必須部分を形成し、抗接着特性および免疫調節特性はこれに帰するとされている。それらが脳の発達に関与することを説明した研究者もいる。一般に、タンパク質、脂質またはアグリコンのシアル酸付加は、抗がん薬において、および神経疾患の治療において使用される。
【０００３】
シアル酸は、真核細胞の細胞表面上に優勢に見られる酸性糖の大きなファミリーを説明するために使用される一般用語である。最も一般的なシアル酸は、酸性９炭素糖である、Ｎ−アセチルノイラミン酸またはＮｅｕ５Ａｃであり、これはいくつかの改変を受けてシアル酸ファミリーのメンバーを産生する。例えばＷＯ２００８０９７３６６の図１で分かる通り、５０の公知のメンバーにわたるシアル酸ファミリーの多様性が示されている。シアル酸は、Ｎ−アセチルノイラミン酸またはＮｅｕ５Ａｃと呼ばれる酸性９炭素親化合物に由来する、細胞表面炭水化物の大きなファミリーを示す。Ｎｅｕ５Ａｃは、多くの場合、アセチル基、リン酸基、メチル基、硫酸基およびラクチル基により修飾され、これらは、シアル酸により媒介される望ましい細胞シグナリングおよび細胞接着事象に必要であることが説明されている。
【０００４】
シアル酸およびシアル酸付加化合物は、高等真核生物において一般的であり、高等真核生物は、それらを保存された生合成経路において生成する。この経路は、内因性ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンから開始し、内因性ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ（加水分解）（ＥＣ３．２．１．１８３）、Ｎ−アシルマンノサミンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６０）、Ｎ−アシルノイラミン酸−９−リン酸合成酵素（ＥＣ２．５．１．５７）およびＮｅｕ５Ａｃ−９−Ｐホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２９）の作用を通してシアル酸に変換される。このシアル酸は続いて、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＥＣ２．７．７．４３）および例えばシアリルトランスフェラーゼを介して、活性化され、所望のアクセプターに移行され得る。
【０００５】
他の真核生物においてこの生合成経路を発現する努力がなされてきたが、原核生物系は報告されていなかった。シアル酸付加Ｎ−グリカンを生成する経路は、酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）および植物（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）において機能的に発現された。しかしながら、シアル酸付加オリゴ糖のラージスケール生成は、一度も報告されていなかった。原核生物系における真核生物遺伝子の機能的過剰発現は、特異的シャペロンの欠落、欠陥のある酵素フォールディングおよび細胞小器官の欠損のために、ある特定の結果を伴わない困難な課題のままである。その始めに、細胞増殖に必要な、経路の大きなエネルギー要件および細胞間ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン）の枯渇がある。
【０００６】
シアル酸付加化合物の酵素生成、化学生成および発酵生成に基づく工程が存在する。しかしながら、それらのすべては、顕著な不利益を有する。例えば、化学合成は多くの逐次的化学ステップを必要とし、酵素合成は高価な前駆体を必要とし、一方で、発酵工程はまだ過酷な開発下にある。それでもなお、後者は、最も高い産業的生産可能性を有する。
【０００７】
説明した発酵生成工程の１つのタイプは、天然にシアル酸またはシアル酸付加化合物を生成するＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉのような原核生物に由来する、生合成経路を使用する。この生合成経路は、細胞がそれらの細胞壁に使用する内因性ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンから開始する。これは、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンエピメラーゼ（一般にｎｅｕＣという名称）およびシアル酸合成酵素（一般にｎｅｕＢという名称）の作用によって、Ｎ−アセチルマンノサミンおよびＮ−アセチルノイラミン酸塩に変換される。
【０００８】
この原核生物生合成経路の部分のみを使用して、Ｐｒｉｅｍら（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２巻、２００２年、２３５〜２４０頁）は、シアリルオリゴ糖を生成する生細菌細胞の使用を説明している。この方法において、シアリルラクトースは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのアルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼおよびＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ合成酵素の遺伝子を過剰発現する代謝的に操作したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株の細胞を増殖させることにより直接生成され、これらの株はさらに、ベータ−ガラクトシダーゼおよびＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）アルドラーゼ活性を欠いていた。これらの微生物は、炭素およびエネルギー源としてグリセロールを伴って、高細胞密度で増殖し、一方で、外因性ラクトースおよびＮｅｕ５Ａｃが、シアリルラクトース合成の前駆体として供給された。増殖中、ラクトースおよびＮｅｕ５Ａｃは、Ｅ．ｃｏｌｉガラクトシドおよび外因性Ｎｅｕ５Ａｃ透過酵素の発現の誘導により内部移行した。ラクトースおよびＮｅｕ５Ａｃは、細胞質中に蓄積し、ここで、Ｎｅｕ５Ａｃはその後、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃに変換され、ラクトース上にさらに移行してシアリルラクトースを形成した。この微生物学的方法によるシアリルオリゴ糖のラージスケール生成は、前駆体として大量のＮｅｕ５Ａｃを必要とする。
【０００９】
別の微生物系が、外因的シアル酸供給の必要のないシアリルオリゴ糖の生成のために開発された。ＷＯ２００７１０１８６２は、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ合成酵素、シアル酸合成酵素、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ−６−リン酸２−エピメラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼをコードする異種遺伝子を含み、シアル酸アルドラーゼ（ＮａｎＡ）およびＭａｎＮＡｃキナーゼ（ＮａｎＫ）をコードする内因性遺伝子を欠損または不活性化させた微生物により、シアル酸付加オリゴ糖を生成するための方法を説明している。この原核生物生合成経路の使用は、細胞にとって非常にエネルギー集約的である。さらに、シアル酸付加オリゴ糖を生成するための説明した経路は、細胞自体のペプチドグリカン合成に必須のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃと競合する。この概念を元にして、Ｋａｎｇらは、シアル酸合成酵素を使用しないが、より有利でない化学平衡を有する内因性シアル酸アルドラーゼを使用する生成宿主を創出した（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １４巻、２０１２年、６２３〜６２９頁）。
【００１０】
ＥＰ１４８４４０６は、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼおよびＮｅｕ５Ａｃ合成酵素を過剰発現するが、外部前駆体としてＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を必要とするＥ．ｃｏｌｉを使用するＮｅｕ５Ａｃの生成を説明している。説明される方法において、ＧｌｃＮＡｃは、それ自体使用される必要がある。それゆえ、ＥＰ１４８４４０６の細胞は、ＧｌｃＮＡｃがＧｌｃＮＡｃ−２−エピメラーゼにより直接使用され得るように破壊される必要がある。Ｌｕｎｄｇｒｅｎら（Ｏｒｇ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２００７年、５巻、１９０３〜１９０９頁）によって説明される通り、インタクトな細胞は、入ってきたＧｌｃＮＡｃをＮ−アセチルグルコサミン−６−リン酸（ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐ）に変換し、これは細胞増殖のために細胞によって使用される。このＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐは、細胞間で利用可能でなく、それゆえ、ＭａｎＮＡｃへのエピマー化のために非リン酸化ＧｌｃＮＡｃを必要とするＧｌｃＮＡｃ−２−エピメラーゼがそれを使用することはできない。このことは、ＥＰ１４８４４０６の細胞の透過処理がなぜ必要であるかを説明する。Ｌｕｎｄｇｒｅｎらによって説明される通り、ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐは、Ｎｅｕ５Ａｃを作製するために使用され得るが、これは、ＷＯ２００７１０１８６２において上記に説明される、中間体としてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを含む別の合成経路を必要とする。得られた経路は、ＧｌｃＮＡｃのウリジル化が余分のＡＴＰを必要とするため、後者の特許において説明したものと比較してエネルギー要求をさらに増大する。
【００１１】
Ｄｅｎｇら（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７巻（２００５年）、２０１〜２１４頁）は、後に効率的に脱リン酸化されてＧｌｃＮＡｃとして培地に分泌されるＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐの細胞内生成を介する、ＧｌｃＮＡｃの生成を説明する。Ｄｅｎｇらによると、この脱リン酸化は、輸送に際して、より具体的にはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのペリプラズムにおいて起こる。この方法において説明される細胞外で生成したＧｌｃＮＡｃは、細胞内変換に利用可能でない。ＧｌｃＮＡｃを生成するこの方法は、リン酸化アミノ糖の阻害性効果を最小限にするために、二相供給バッチ工程、すなわち、細胞増殖相、および培養物が高細胞密度に達した後にのみ誘導される後続のＧｌｃＮＡｃ生成相を必要とする。
【００１２】
ホスファターゼを異種的に発現させることによって同様のことを試みた研究者もおり、増殖の低減および強い代謝負荷の問題に遭遇している（ＬｅｅおよびＯｈ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２０１５年、１４３〜１５０頁）。増殖／バイオマス形成における前記低減の主な理由は、他の必須のリン酸化化合物を脱リン酸化する、導入されたホスファターゼの非特異性である。このような改変は、それゆえ、適応度の低減およびより低い比生産性を引き起こす。それは、生成中に生成経路を変異させる選択圧をさらにもたらし、このことは、全体的な工程安定性を低減する。
シアル酸およびシアル酸付加オリゴ糖の生成経路は、高レベルのリン酸化（例えばＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐ）およびヌクレオチド経路中間体の形成を必要とする。このような形成は、非特異的ホスファターゼの活性化によりこれらの中間体の非特異的分解を引き起こし、このことは次に適応度の低減を引き起こすことが一般に理解されている。生成宿主の増殖に対する代謝経路の発現の効果を回避するために、誘導性発現系を使用することは標準的である。この方法において、最初にバイオマスを形成し、後に生成工程において、生成経路を、例えばＩＰＴＧによって、活性化する。このことは、シアル酸およびシアル酸付加オリゴ糖の生成のために他の研究者により適用されている（ＷＯ２００７１０１８６２；Ｐｒｉｅｍら  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２巻、２００２年、２３５〜２４０頁；Ｋａｎｇら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １４巻、２０１２年、６２３〜６２９頁；Ｙａｎｇら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４３巻、２０１７年、２１〜２８頁）。生産性および力価を失うことは別として、誘導性の系の使用における別のマイナス面は、中間体経路代謝物、例えばＧｌｃＮＡｃおよびＭａｎＮＡｃの排出である。これは、精製のための余分の下流の加工ステップの必要性、それゆえ、シアル酸、シアリルラクトースまたは他のシアル酸付加化合物の生成におけるより高い生成コストをもたらす。
本明細書中上記のシアル酸付加化合物を生成するための方法は、バイオテクノロジー産業、製薬産業および医療産業の大きな要求を満たすことにおいてまだ不十分である。上記に言及する問題をうまく克服する代謝工学アプローチは、本分野において顕著な、待望の進歩を示し得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２００８／０９７３６６号
【特許文献２】国際公開第２００７／１０１８６２号
【特許文献３】欧州特許第１４８４４０６号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｐｒｉｅｍら  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２年）１２巻、２３５〜２４０頁
【非特許文献２】Ｋａｎｇら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２０１２年）１４巻、６２３〜６２９頁
【非特許文献２】Ｌｕｎｄｇｒｅｎら、Ｏｒｇ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２００７年、５巻、１９０３〜１９０９頁
【非特許文献２】Ｄｅｎｇら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７巻（２００５年）、２０１〜２１４頁
【非特許文献２】ＬｅｅおよびＯｈ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２０１５年、１４３〜１５０頁
【非特許文献３】Ｙａｎｇら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２０１７年）４３巻、２１〜２８頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
驚くべきことに、本発明者らは、誘導を必要とせず、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを必要としないが、構成的発現を可能にし、また、生成を改善し、生成工程中の副産物形成を低減する代謝経路のより優れた調整を可能にする生成経路を創出することができた。
【００１６】
本発明の一実施形態により、誘導を必要としない、微生物によるシアル酸付加化合物生成のための方法が提供される。
【００１７】
本発明のさらなる実施形態により、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼを必要としない生成経路であって、本分野で以前に示されたように細胞に代謝負荷を課さない、ホスファターゼの発現を調節することを含む生成経路が提供される。本発明の前記さらなる実施形態はまた、ホスファターゼの発現を調節することによりシアル酸付加化合物生成の増大を提供する。
【００１８】
別のさらなる実施形態において、上記方法はまた、代謝経路の遺伝子の構成的発現と組み合わせると、生成工程中の副産物形成を低減する代謝経路のより優れた調整を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図１は、本発明によるシアル酸を生成するための、実施例２で使用される例示的な経路を示す。図１Ａは、すべてのＫＯおよび過剰発現の標示を伴わない経路を示す。図１Ｂは、十字で示されるノックアウトと、示される酵素の隣の上向き矢印を伴う過剰発現とを含む、実施例２で使用される経路を示す。
【図１Ｂ】図１は、本発明によるシアル酸を生成するための、実施例２で使用される例示的な経路を示す。図１Ａは、すべてのＫＯおよび過剰発現の標示を伴わない経路を示す。図１Ｂは、十字で示されるノックアウトと、示される酵素の隣の上向き矢印を伴う過剰発現とを含む、実施例２で使用される経路を示す。
【００２０】
【図２】図２は、実施例２において説明するシアル酸を生成することができるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株の生成結果を示す。
【００２１】
【図３】図３は、本発明の方法において生成され得る様々なシアル酸付加化合物の例を示す。
【００２２】
【図４】図４は、示されるホスファターゼを補充した株の光学密度およびシアル酸生成を示す。
【００２３】
【図５】図５は、示されるホスファターゼを補充した株の増殖速度を示す。
【００２４】
【図６−１】図６は、実施例で試験したホスファターゼのアライメントの部分を示す。
【図６−２】図６は、実施例で試験したホスファターゼのアライメントの部分を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、微生物を使用するシアル酸付加化合物を生成するための経済的、より効率的、かつ代替的生合成経路を説明する。
【００２６】
本発明は、微生物の発酵増殖によってシアル酸付加化合物を生成する方法を提供する。
【００２７】
特に、本発明は、シアル酸付加化合物を生成するための方法であって、培養培地中で微生物を培養するステップを含む方法に関する。微生物は、細胞内で以下の反応：Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸をＮ−アセチルグルコサミンに、Ｎ−アセチルグルコサミンをＮ−アセチルマンノサミンに、およびＮ−アセチルマンノサミンをＮ−アセチル−ノイラミン酸塩に変換する。さらに、この微生物は、ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐをグルコサミン−６−Ｐに変換すること、ｉｉ）Ｎ−アセチルグルコサミンをＮ−アセチルグルコサミン−６−Ｐに変換すること、およびｉｉｉ）Ｎ−アセチル−ノイラミン酸塩をＮ−アセチル−マンノサミンに変換することができない。
【００２８】
好ましくは、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸のＮ−アセチルグルコサミンへの変換は、細胞内で発現したホスファターゼの作用によって得られる。別の好ましい実施形態において、Ｎ−アセチルグルコサミンは、細胞内で発現したＮ−アセチルマンノサミンエピメラーゼによってＮ−アセチルマンノサミンに変換される。代替の好ましい実施形態において、Ｎ−アセチルマンノサミンは、細胞内で発現したシアル酸合成酵素によってＮ−アセチル−ノイラミン酸塩に変換される。さらにより好ましくは、微生物が、ｉ）細胞内で発現したホスファターゼの作用によってＮ−アセチルグルコサミン−６−リン酸をＮ−アセチルグルコサミンに、ｉｉ）細胞内で発現したＮ−アセチルマンノサミンエピメラーゼによってＮ−アセチルグルコサミンをＮ−アセチルマンノサミンに、およびｉｉｉ）細胞内で発現したシアル酸合成酵素によってＮ−アセチルマンノサミンをＮ−アセチル−ノイラミン酸塩に変換するように、微生物は、すべての３つの酵素を含む。
【００２９】
好ましくは、本発明の方法において使用される微生物は、以下の酵素ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸デアセチラーゼ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）、ｉｉ）Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼおよびｉｉｉ）Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼを生成することができない。
【００３０】
本発明はまた、ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸を脱リン酸化してＮ−アセチルグルコサミンにするホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．）、ｉｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）をＮ−アセチルマンノサミン（ｍａｎＮａｃ）に変換するＧｌｃＮＡｃ  ２−エピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．８）およびｉｉｉ）Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）からＮ−アセチル−ノイラミン酸塩（Ｎｅｕ５Ａｃ）を合成するシアル酸合成酵素（ＥＣ２．５．１．５６）を発現する微生物を提供する。さらに、この微生物は、ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐをグルコサミン−６−Ｐに変換すること、ｉｉ）Ｎ−アセチル−グルコサミンをＮ−アセチル−グルコサミン−６−Ｐに変換すること、およびｉｉｉ）Ｎ−アセチル−ノイラミン酸塩をＮ−アセチル−マンノサミンに変換することができない。
【００３１】
一態様において、本発明は、以下の反応：Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸のＮ−アセチルグルコサミンへの細胞内変換、Ｎ−アセチルグルコサミンのＮ−アセチルマンノサミンへの細胞内変換およびＮ−アセチルマンノサミンのシアル酸への細胞内変換を触媒することを可能にした微生物を提供する。
【００３２】
Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸は天然では細胞から効率的に排出され、その間にペリプラズム中のホスファターゼによって脱リン酸化されることが一般に認められている（Ｄｅｎｇら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７巻（２００５年）、２０１〜２１４頁、２１２頁、第２欄を参照されたい）。したがって、本発明によらない場合、この排出された生成物は、シアル酸への変換に利用可能でない。さらに、Ｎ−アセチルグルコサミンをリン酸化する輸送タンパク質を通して、再内部移行が起こる。
【００３３】
細胞内Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼの使用は、（ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンを介する）古典的な原核生物経路より低いエネルギー（ＡＴＰ）消費を確実にする。このことは、より健常かつより効率的な株による、シアル酸、シアル酸付加オリゴ糖および／またはシアル酸付加生成物のより効率的な生成を可能にする。発現レベルを最適化することにより、文献におけるような、好ましくない化学平衡を克服し、大量の遊離Ｎ−アセチルグルコサミンの要求は必要でない。実際に、本分野において、この酵素は、Ｎ−アセチルマンノサミンを生成するために高濃度のＮ−アセチルグルコサミンを使用する酵素反応においてもっぱら使用される。それゆえ、エピメラーゼの使用が、培地中に放出されることが示される細胞内で形成した大量のＧｌｃＮＡｃを必要とし得ることは論理的であるが（上記のＤｅｎｇを参照されたい）、しかしながら、本発明は、これが回避可能であることを証明した。酵素法に優る本発明の別の利点は、本発明において、例えば、例えばグルコース、ガラクトースもしくはフルクトースなどの単糖、例えばスクロースもしくはマルトースなどの二糖、または非限定的に、グリセロールなどのポリオールとして、安価な基質が使用され得ることである。このことは、発酵による経済的生成法を可能にする。
【００３４】
Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸をＮ−アセチルグルコサミンに変換する様々なホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．）は、本分野において説明されており、本発明において使用することができる。ＨＡＤスーパーファミリーおよびＨＡＤ様ファミリーからのホスファターゼは、本分野において説明されている。これらのファミリーからの例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからの遺伝子ｙｑａＢ、ｉｎｈＸ、ｙｎｉＣ、ｙｂｉＶ、ｙｉｄＡ、ｙｂｊＩ、ｙｉｇＬまたはｃｏｆから発現する酵素において見ることができる。この反応を触媒する１つのホスファターゼは、Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｅｌｌａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉにおいて同定される。ホスファターゼは一般に、非特異的であり、活性は一般に、ファミリーにも構造にも関連しない。他の例は、したがって、すべてのホスファターゼファミリーにおいて見ることができる。特異的ホスファターゼは、Ｆａｈｓら（ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．、２０１６年、１１巻（１１号）、２９４４〜２９６１頁）によって説明される周知の方法により容易に同定およびスクリーニングされる。
【００３５】
好ましくは、本発明のホスファターゼは、ＨＡＤ様ホスファターゼである。本明細書で定義するＨＡＤ様ホスファターゼは、
−  以下に定義する以下のモチーフ：
モチーフ１：ｈＤｘＤｘ［ＴＶ］（配列番号７３）、もしくは
モチーフ２：［ＧＳＴＤＥ］［ＤＳＥＮ］ｘ（１−２）［ｈＰ］ｘ（１−２）［ＤＧＴＳ］（配列番号７４、７５、７６、７７）（ｈは、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｖ、Ｐ、Ｇ）を意味し、ｘは、任意の別個のアミノ酸であり得る）
のうちのいずれか１つまたは複数
を含む任意のホスファターゼポリペプチドを指す。
【００３６】
別の好ましい実施形態において、ＨＡＤ様ポリペプチドは典型的に、増大する優先順位で配列番号４３、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５または５７によって示されるポリペプチドのうちのいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的な配列同一性を有する。好ましくは、それらのポリペプチドはまた、上記の同定されるモチーフのうちの少なくとも１つを含む。より好ましくは、それらは両方のモチーフを含む。
【００３７】
全体的な配列同一性は、全体的なアライメントアルゴリズム、例えばプログラムＧＡＰ（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ａｃｃｅｌｒｙｓ）のＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して、好ましくはデフォルトパラメータにより、および好ましくは成熟タンパク質の配列により（すなわち、分泌シグナルまたは輸送ペプチドを考慮に入れずに）、決定される。全体的な配列同一性と比較して、保存されたドメインまたはモチーフのみが考慮される場合、配列同一性は一般に、より高い。
【００３８】
好ましい実施形態において、ＨＡＤ様ポリペプチドは、配列番号４３、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５または５７のうちのいずれか１つを含む。
【００３９】
別の好ましい実施形態において、ホスファターゼは、ＨＡＤスーパーファミリーまたはＨＡＤ様ホスファターゼファミリーから選択される。より好ましくは、ホスファターゼは、ｉ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからの遺伝子ｙｑａＢ、ｉｎｈＸ、ｙｎｉＣ、ｙｂｉＶ、ｙｉｄＡ、ｙｂｊＩ、ｙｉｇＬまたはｃｏｆによって発現する酵素、ｉｉ）Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｅｌｌａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉのホスファターゼおよびｉｉｉ）他のホスファターゼファミリーを含む群より選択される。
【００４０】
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−２−エピメラーゼ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｍｉｎｅ−２−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）（ＥＣ５．１．３．８）の例は、原核生物および真核生物において見ることができる。原核生物についての例は、例えばＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｍａｒｉｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、アカリオクロリス属（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ）種、アナベナ属種、ノストック属種およびシネコシスティス属種のようなシアノバクテリアにおいて見られる。それらはまた、例えばＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓおよびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎのようなバクテロイデス属種において、ならびにＣａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓおよびＭｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｍｕｌｉｅｒｉｓにおいて見られる。真核生物において、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−２−エピメラーゼは、Ｇｌｙｃｉｎ  ｍａｘ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ、Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓにおいて見られる。好ましくは、本発明の方法および微生物において、Ｎ−アセチルマンノサミン−２−エピメラーゼは、ｉ）シアノバクテリアからの、より特にＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｍａｒｉｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、アカリオクロリス属種、アナベナ属種、ノストック属種およびシネコシスティス属種からのＮ−アセチルマンノサミン−２−エピメラーゼ、ｉｉ）バクテロイデス属種からの、より特にＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓおよびＭｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｍｕｌｉｅｒｉｓからのＮ−アセチルマンノサミン−２−エピメラーゼ、ｉｉｉ）Ｇｌｙｃｉｎ  ｍａｘ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａまたはＣａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓからのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−２−エピメラーゼを含む群より選択される。
【００４１】
Ｎ−アセチルノイラミン酸合成酵素（本分野でシアル酸合成酵素とも呼ばれる）（ＥＣ２．５．１．５６）活性は、例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｔｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ  ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ、Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ  ｖｉｓｃｏｓａ、Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ  ｃｏｍｍｏｄａまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓのようないくつかの原核生物において見られる。好ましくは、本発明の方法および微生物において、シアル酸（またはＮ−アセチルノイラミン酸）合成酵素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｔｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ  ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ、Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ  ｖｉｓｃｏｓａ、Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ  ｃｏｍｍｏｄａまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓからのシアル酸合成酵素を含む群より選択される。
【００４２】
好ましい一態様において、ホスファターゼ、Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼおよびシアル酸合成酵素のうちのいずれか１つまたは複数は、微生物で過剰発現される。代替の好ましい態様において、ホスファターゼ、Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼおよびシアル酸合成酵素のうちのいずれか１つまたは複数は、微生物に導入され、発現される。
【００４３】
別の態様において、微生物は、以下の酵素ｉ）Ｎ−アセチルグリコサミン−６−リン酸デアセチラーゼ、ｉｉ）Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼおよびｉｉｉ）Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子を欠く。別の好ましい態様において、以下の酵素ｉ）Ｎ−アセチルグリコサミン−６−リン酸デアセチラーゼ、ｉｉ）Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼおよびｉｉｉ）Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子は、活性が低減しており、好ましくは、前記遺伝子は、微生物において欠損しているか、またはノックアウトされている。
【００４４】
別の好ましい態様において、微生物は、ラクトースの取り込みを促進するタンパク質をさらにコードし、ラクトースを代謝する酵素を欠く。ラクトース殺滅に抵抗する微生物を生成する方法および得られる微生物は、参照により本明細書に組み込むＷＯ２０１６／０７５２４３において説明されている。
【００４５】
好ましい態様において、本発明の微生物および本発明の方法において使用される微生物はまた、シアル酸を活性化し、それを所望の化合物に移行するために、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＥＣ２．７．７．４３）およびシアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．１）を発現する。
【００４６】
好ましい態様において、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸は、細胞内グルコサミン−６−リン酸を基質として使用するグルコサミン−リン酸Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．４）を導入することによって得られる。ほとんどの微生物において、グルコサミン−６−リン酸は、天然に細胞内に存在するが、細胞内生成は、タンパク質操作を通して、またはグラム陽性細菌に存在するような天然酵素をスクリーニングすることによって得られる、阻害を伴わないＬ−グルタミン：Ｄ−フルクトース−６−リン酸アミノトランスフェラーゼを発現することによって上昇させることができる（Ｄｅｎｇら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７巻（２００５年）、２０１〜２１４頁）。
【００４７】
本発明において、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸をＮ−アセチル−ノイラミン酸塩またはシアル酸に変換するための遺伝子の発現は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸の細胞内脱リン酸化を可能にし、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸の毒性蓄積を防止し、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルマンノサミンの排出を防止するように最適化される。前記最適化は、生成経路の遺伝子の構成的発現の使用の結果である。好ましい実施形態において、本発明は、形成したＮ−アセチルグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルマンノサミンの少なくとも１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％または６０％の排出を防止する。さらに好ましい実施形態において、微生物は、シアル酸付加化合物より少ない細胞外Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルマンノサミンを生成する。より好ましくは、微生物は、シアル酸付加化合物より、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％少ない細胞外Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルマンノサミンを生成する。本発明の別の好ましい実施形態において、微生物は、全細胞外炭水化物の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％に等しいか、またはそれよりも多い細胞外シアル酸付加化合物を生成する。
【００４８】
特定の態様において、本発明は、培養培地へのいかなる外因性シアル酸添加も伴わない、シアル酸付加化合物の合成のための方法に関する。
【００４９】
シアル酸付加化合物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸、シアル酸付加オリゴ糖、シアル酸付加脂質、シアル酸付加糖脂質（例えば非限定的に、ガングリオシド、セラミド）、シアル酸付加タンパク質またはシアル酸付加アグリコンであり得る。
【００５０】
シアル酸付加オリゴ糖は、オリゴ糖を含有する荷電シアル酸、すなわち、シアル酸残基を有するオリゴ糖である。それは酸性の性質を有する。一部の例としては、３−ＳＬ（３−シアリルラクトース）、３−シアリルラクトサミン、６−ＳＬ（６−シアリルラクトースまたはｎ−アセチルノイラミン酸塩アルファ２，６ガラクトシルベータ１，４グルコース）、６−シアリルラクトサミン、６−シアリルラクトースを含むオリゴ糖、ＳＧＧ六糖（Ｎｅｕ５Ａｃアルファ−２，３Ｇａｌベータ−１，３ＧａｌＮａｃベータ−１，３Ｇａｌａ−１，４Ｇａｌベータ−１，４Ｇａｌ）、シアル酸付加四糖（Ｎｅｕ５Ａｃ−アルファ−２，３Ｇａｌベータ−１，４ＧｌｃＮＡｃベータ−１４ＧｌｃＮＡｃ）、五糖ＬＳＴＤ（Ｎｅｕ５Ａｃアルファ−２，３Ｇａｌベータ−１，４ＧｌｃＮＡｃベータ−１，３Ｇａｌベータ−１，４Ｇｌｃ）、シアル酸付加ラクト−Ｎ−トリオース、シアル酸付加ラクト−Ｎ−テトラオース、シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオース、モノシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオース、ジシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオースＩ、モノシアリルラクト−Ｎ−ネオヘキサオースＩ、モノシアリルラクト−Ｎ−ネオヘキサオースＩＩ、ジシアリルラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、ジシアリルラクト−Ｎ−テトラオース、ジシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオースＩＩ、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースａ、ジシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオースＩ、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｂ、３−シアリル−３−フコシルラクトース、ジシアロモノフコシルラクト−Ｎ−ネオヘキサオース、モノフコシルモノシアリルラクト−Ｎ−オクタオース（シアリルＬｅａ）、シアリルラクト−Ｎ−フコヘキサオースＩＩ、ジシアリルラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、モノフコシルジシアリルラクト−Ｎ−テトラオース、ならびに１つまたは数個のシアル酸残基を担持するオリゴ糖：非限定的に、ＧＭ３（３シアリルラクトース、Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，３Ｇａｌベータ−４Ｇｌｃ）から選択されるガングリオシドのオリゴ糖部分、およびＧＭ３モチーフ、ＧＤ３  Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，８Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，３Ｇａｌベータ−１，４Ｇｌｃ  ＧＴ３（Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，８Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，８Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，３Ｇａｌベータ−１，４Ｇｌｃ）；ＧＭ２  ＧａｌＮＡｃベータ−１，４（Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，３）Ｇａｌベータ−１，４Ｇｌｃ、ＧＭ１  Ｇａｌベータ−１，３ＧａｌＮＡｃベータ−１，４（Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，３）Ｇａｌベータ−１，４Ｇｌｃ、ＧＤ１ａ  Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，３Ｇａｌベータ−１，３ＧａｌＮＡｃベータ−１，４（Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，３）Ｇａｌベータ−１，４Ｇｌｃ  ＧＴ１ａ  Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，８Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，３Ｇａｌベータ−１，３ＧａｌＮＡｃベータ−１，４（Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，３）Ｇａｌベータ−１，４Ｇｌｃ  ＧＤ２  ＧａｌＮＡｃベータ−１，４（Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，８Ｎｅｕ５Ａｃａ２，３）Ｇａｌベータ−１，４Ｇｌｃ  ＧＴ２  ＧｓｐａｌＮＡｃベータ−１，４（Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，８Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，８Ｎｅｕ５Ａｃａ２，３）Ｇａｌベータ−１，４Ｇｌｃ  ＧＤ１ｂ、Ｇａｌベータ−１，３ＧａｌＮＡｃベータ−１，４（Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，８Ｎｅｕ５Ａｃａ２，３）Ｇａｌベータ−１，４Ｇｌｃ  ＧＴ１ｂ  Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，３Ｇａｌベータ−１，３ＧａｌＮＡｃベータ−１，４（Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，８Ｎｅｕ５Ａｃａ２，３）Ｇａｌベータ−１，４Ｇｌｃ  ＧＱ１ｂ  Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，８Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，３Ｇａｌベータ−１，３ＧａｌＮＡｃベータ−１，４（Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，８Ｎｅｕ５Ａｃａ２，３）Ｇａｌベータ−１，４Ｇｌｃ  ＧＴ１ｃ  Ｇａｌベータ−１，３ＧａｌＮＡｃベータ−１，４（Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，８Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，８Ｎｅｕ５Ａｃａ２，３）Ｇａｌベータ−１，４Ｇｌｃ  ＧＱ１ｃ、Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，３Ｇａｌベータ−１，３ＧａｌＮＡｃベータ−１，４（Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，８Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，８Ｎｅｕ５Ａｃａ２，３）Ｇａｌベータ−１，４Ｇｌｃ  ＧＰ１ｃ  Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，８Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，３Ｇａｌベータ−１，３ＧａｌＮＡｃベータ−１，４（Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，８Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，８Ｎｅｕ５Ａｃａ２，３）Ｇａｌベータ−１，４Ｇｌｃ  ＧＤ１ａ  Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，３Ｇａｌベータ−１，３（Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，６）ＧａｌＮＡｃベータ−１，４Ｇａｌベータ−１，４Ｇｌｃフコシル−ＧＭ１  Ｆｕｃａ−１，２Ｇａｌベータ−１，３ＧａｌＮＡｃベータ−１，４（Ｎｅｕ５Ａｃａ−２，３）Ｇａｌベータ−１，４Ｇｌｃを含むオリゴ糖があり、それらのすべては、上記のオリゴ糖部分をセラミドと反応させること、またはセラミド上で上記オリゴ糖を合成することによって、対応するガングリオシドの生成に拡張してもよい。
【００５１】
上記に示す、微生物または生物または細胞という用語は、細菌、酵母もしくは真菌を含むリストから選択される微生物を指すか、または植物もしくは動物細胞を指す。後者の細菌は、好ましくはプロテオバクテリア門またはフィルミクテス門またはシアノバクテリア門またはデイノコックス・テルムス門に属する。プロテオバクテリア門に属する後者の細菌は、好ましくはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科に、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ種に属する。後者の細菌は、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ種、例えば非限定的に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｃ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｉｓｓｌｅに属する任意の株に関する。より具体的には、後者の用語は、研究環境に十分に適合し、野生型株とは異なり、腸内で繁殖するそれらの能力を失っている培養Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株という名称）に関する。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株の周知の例としては、Ｋ１２野生型、Ｗ３１１０、ＭＧ１６５５、Ｍ１８２、ＭＣ１０００、ＭＣ１０６０、ＭＣ１０６１、ＭＣ４１００、ＪＭ１０１、ＮＺＮ１１１およびＡＡ２００がある。それゆえ、本発明は具体的に、上記に示す変異および／または形質転換Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株であって、Ｋ１２株である、変異および／または形質転換Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株に関する。より具体的には、本発明は、上記に示す変異および／または形質転換Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株であって、前記Ｋ１２株が、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５である、変異および／または形質転換Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株に関する。フィルミクテス門に属する後者の細菌は、好ましくはバチルス属、好ましくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓなどのメンバーを有するラクトバチルス目、またはバチルス属種、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓからなどのメンバーを有するバチルス目に属する。アクチノバクテリア門に属する後者の細菌は、好ましくはメンバーＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍもしくはＣ．ａｆｅｒｍｅｎｔａｎｓを有するコリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科に属するか、またはメンバーＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓもしくはＳ．ｆｒａｄｉａｅを有するストレプトミセス科に属する。後者の酵母は、好ましくは子嚢菌門または担子菌門または不完全菌門または接合菌門に属する。後者の酵母は、好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、ＹａｒｒｏｗｉａまたはＳｔａｒｍｅｒｅｌｌａ属に属する。後者の真菌は、好ましくはＲｈｉｚｏｐｕｓ、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、ＭｕｃｏｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属に属する。
【００５２】
生成宿主のための培養培地は、必要に応じて、例えばラクトース、ラクトサミン、ラクト−Ｎ−トリオース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースのようなグリカン；オリゴ糖；ペプチド；脂質もしくはアグリコンなどの、外因性前駆体を含んでもよく、あるいはこの前駆体は、株それ自体によって生成してもよい。特定の一態様において、本発明の工程は、例えば単糖、二糖または三糖などの外因性前駆体、より特にラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−ビオース、ガラクトース、ベータ−ガラクトシドおよびアルファ−ガラクトシド、例えば非限定的に、グロボ三糖（ｇｌｏｂｏｔｒｉｏｓｅ）（Ｇａｌ−アルファ−１，４Ｇａｌ−ベータ−１，４Ｇｌｃ）から選択される外因性前駆体の能動的取り込みに基づき、一方で、微生物は、安価な炭素基質、例えば二糖、例えばスクロースまたはマルトースで増殖する。さらに、これらの微生物はまた、グルコース、フルクトースまたはグリセロールで増殖することができる。発現外因性前駆体は、微生物によって内部移行される本発明による生成物の生合成経路に関与する化合物を意味すると意図される。
【００５３】
一態様において、本発明は、ラクト−Ｎ−トリオース、ラクト−Ｎ−テトラオースまたはラクト−Ｎ−ネオテトラオースのシアル酸付加形態を生成するための方法を提供する。これらの３つの分子のいずれか１つは、好ましくはＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、Ｍｕｓ  ｍｕｌａｔｔａ、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉおよびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙを含む群に由来するガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．３８）ならびに／または好ましくはＢｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ、Ｈｏｍｏ  ＳａｐｉｅｎｓおよびＭｕｓ  Ｍｕｓｃｕｌｕｓを含む群に由来するＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．９０）の活性を介して微生物によって合成される。これらのオリゴ糖の形成を向上させるために、ＵＤＰ糖加水分解酵素およびガラクトース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、微生物において欠損しているか、活性が低減しているか、またはノックアウトされている。
【００５４】
別の態様において、シアル酸付加オリゴ糖を生成するための方法であって、上記の微生物を培養するステップを含み、微生物が、シアリルトランスフェラーゼのドナー基質として活性化Ｎ−アセチルノイラミン酸塩を内部で生成し、方法が、ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−ビオース、ガラクトース、ベータ−ガラクトシドおよびアルファ−ガラクトシド、例えば非限定的に、グロボ三糖（Ｇａｌ−アルファ−１，４Ｇａｌ−ベータ−１，４Ｇｌｃ）ガラクトースからなる群より選択される外因性前駆体を含む培養培地中で微生物を培養するステップをさらに含む、方法が提供される。外因性前駆体は、微生物に能動的に取り込まれ、外因性前駆体は、シアル酸付加オリゴ糖を生成するためのシアリルトランスフェラーゼのアクセプター基質である。
【００５５】
さらなる態様において、本発明による方法は、３シアリルラクトースまたは６シアリルラクトースの生成を提供する。この方法において、微生物を、炭素基質、例えばグルコースまたはグリセロール上で高細胞密度で培養し、ラクトースを供給する。ラクトースは、ラクトース透過酵素によって内部移行され、Ｎ−アセチルグルコサミンから内因的に産生するＣＭＰ−Ｎ−アセチル−ノイラミン酸塩を使用して組換えシアリルトランスフェラーゼによってシアル酸付加される。
【００５６】
本発明の微生物または細胞は、主要な炭素源として単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、ポリオール、複合培地またはそれらの混合物上で増殖することができる。主要な、という用語により、バイオマス形成、二酸化炭素および／または副産物形成（例えば酸および／またはアルコール、例えば酢酸、乳酸および／またはエタノール）に最も重要な炭素源を意味する、すなわち、すべての必要とされる炭素の２０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９％が、上記の炭素源に由来する。本発明の一実施形態において、前記炭素源は、前記生物の唯一の炭素源である、すなわち、すべての必要とされる炭素の１００％が、上記の炭素源に由来する。
【００５７】
さらに好ましい実施形態において、本発明の微生物または細胞は、参照により本明細書に組み込むＷＯ２０１２／００７４８１において説明される、生成経路およびバイオマス経路を有するスプリット代謝（ｓｐｌｉｔ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）を使用している。前記生物は、例えばホスホグルコイソメラーゼ遺伝子、ホスホフルクトキナーゼ遺伝子、フルクトース−６−リン酸アルドラーゼ遺伝子、フルクトースイソメラーゼ遺伝子および／またはフルクトース：ＰＥＰホスホトランスフェラーゼ遺伝子から選択される遺伝子を変更することによって、フルクトース−６−リン酸を蓄積するように遺伝子改変され得る。
【００５８】
単糖という用語により、加水分解によってより単純な糖に分解することができない、アルドースまたはケトースのいずれかに分類される、１分子当たり１つまたは複数のヒドロキシル基を含有する糖を意味する。例としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、リボースおよび／またはアラビノースがある。
【００５９】
二糖という用語により、化学結合した２つの単糖からなる糖を意味する。例としては、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、セロビオースおよび／またはキトビオースがある。
【００６０】
オリゴ糖という用語により、化学結合した３〜１０個の単糖からなる糖を意味する。例としては、マルトトリオース、フルクト−オリゴ糖、ガラクト−オリゴ糖、マンナンオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ヒト乳汁オリゴ糖および／またはグルコオリゴ糖がある。
【００６１】
ポリオールという用語により、多数のヒドロキシル基を含有するアルコールを意味する。例えば、グリセロール、ソルビトールまたはマンニトールである。
【００６２】
複合培地という用語により、正確な構成が決定されていない培地を意味する。例としては、糖蜜、コーンスティープリカー（ｃｏｒｎ  ｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）、ペプトン、トリプトンまたは酵母抽出物がある。
【００６３】
シアル酸付加化合物の生成は、培地に前駆体、例えばＮ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、グルタミン、グルタミン酸塩、ホスホエノールピルビン酸塩および／またはピルビン酸塩を添加することによって増大することができる。
【００６４】
上記の本発明の方法において生成されるシアル酸付加化合物は、本分野で公知の様々な方法またはその組み合わせを使用して回収され得る。生成したシアル酸付加化合物により、化合物は、細胞外画分中で利用可能であるか、または細胞内に保持されている。生成したシアル酸付加化合物が細胞内に保持されている場合、シアル酸付加化合物は、最初に細胞破壊によって細胞から放出される。ここでもまた生成したシアル酸付加化合物により、細胞は、細胞外画分から分離してもよい。他の場合において、細胞は、細胞外画分から最初に分離することなく破壊され、ここで、細胞は、非限定的に、加熱、凍結融解および／もしくは超音波処理による剪断応力、混合ならびに／またはフレンチプレスなどの技術によって破壊される。細胞外および／または細胞内画分は、遠心分離、濾過、精密濾過およびナノ濾過によって細胞および／または細胞残屑から分離され得る。生成物分離において補助するために凝集剤を使用してもよい。細胞外または細胞内画分中のシアル酸付加化合物は、イオン交換、限外濾過もしくはナノ濾過または電気透析、クロマトグラフィー、例えばサイズ排除、イオンクロマトグラフィーおよび疑似移動床式によって抽出され得る。液相からシアル酸付加化合物を濾過する別の例は、綿および活性炭または炭素フィルターを有する深層フィルター（ｄｅｅｐ  ｂｅｄ  ｆｉｌｔｅｒ）を使用する濾過によるものであり、ここでは、透過物が炭素研磨機（ｃａｒｂｏｎ  ｐｏｌｉｓｈｅｒ）、続いて色素、微生物および懸濁した炭素粒子を除去するために例えば０．２ミクロン精密濾過膜系を通過する。その後、シアル酸付加化合物を、真空蒸発器中で濃縮して濃縮物を得てもよい。濃縮物を、沈殿し、かつ／または加熱乾燥、噴霧乾燥および／もしくは凍結乾燥を通して乾燥させて、高純度シアル酸付加化合物を得ることができる。その後、非晶質形粉末を得ることができる。この非晶質粉末を、結晶シアル酸付加化合物を得るためにさらに結晶化してもよい。
【００６５】
例示的な実施形態において、シアル酸付加化合物を、発酵について本分野で公知の方法を使用して培養培地から単離してもよい。例えば、細胞を、遠心分離、濾過、凝集、デカンテーションまたはその他によって培養培地から除去してもよい。その後、シアル酸付加化合物を、イオン交換などの方法を使用して細胞外画分から単離してもよい。前記シアル酸付加化合物のさらなる精製を、例えばナノ濾過もしくは限外濾過またはイオン交換によって達成して、あらゆる残存するＤＮＡ、タンパク質、ＬＰＳ（エンドトキシン）または他の不純物を除去してもよい。
【００６６】
別の例示的な実施形態において、シアリルラクトースを、発酵について本分野で公知の方法を使用して培養培地から単離してもよい。例えば、細胞を、遠心分離、濾過、凝集、デカンテーションまたはその他によって培養培地から除去してもよい。その後、シアリルラクトースを、イオン交換などの方法を使用して細胞外画分から単離してもよい。前記シアリルラクトースのさらなる精製を、例えばナノ濾過もしくは限外濾過またはイオン交換によって達成して、あらゆる残存するＤＮＡ、タンパク質、ＬＰＳ（エンドトキシン）または他の不純物を除去してもよい。別の精製および製剤化ステップは、生成物の結晶化または沈殿によって達成される。別の製剤化ステップは、シアリルラクトースを噴霧乾燥または凍結乾燥することである。
【００６７】
シアル酸付加化合物は、対イオン、例えば一価のイオン、例えばプロトン、ナトリウムイオン、カリウム、二価のイオン、例えばカルシウム、マグネシウム、鉄もしくは三価のイオン、例えば鉄またはイオンの組み合わせを含有してもよい。
【００６８】
本開示の開示全体を通して、シアル酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸塩およびＮ−アセチルノイラミン酸という用語は、互換的に使用される。
【００６９】
本明細書で使用されるとき、例えば細胞内での変換、細胞内での生成、細胞内での発現、細胞内での形成における細胞内（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）または細胞内で（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｌｙ）、という用語は、微生物の細胞内を意味すると理解されなければならない。細胞外という用語は、細胞の外側を意味すると理解されなければならない。
【００７０】
本明細書全体を通して使用されるさらなる定義
【００７１】
ホモログ
タンパク質の「ホモログ」は、問題の非改変タンパク質と比較してアミノ酸置換、欠失および／または挿入を有し、それらが由来する非改変タンパク質と同様の生物学的および機能的活性を有する、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質および酵素を包含する。
【００７２】
欠失は、タンパク質からの１つまたは複数のアミノ酸の除去を指す。
【００７３】
挿入は、タンパク質中の所定の部位に導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を指す。挿入は、単一または複数のアミノ酸のＮ−末端および／またはＣ−末端融合ならびに配列内挿入を含み得る。一般に、アミノ酸配列内の挿入は、約１〜１０残基程度で、Ｎ−またはＣ−末端融合より小さい。Ｎ−またはＣ−末端融合タンパク質またはペプチドの例として、酵母ツーハイブリッド系、ファージコートタンパク質、（ヒスチジン）−６−タグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−タグ、プロテインＡ、マルトース結合タンパク質、ジヒドロ葉酸還元酵素、Ｔａｇ＞＞１００エピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、ＦＬＡＧ（Ｒ）−エピトープ、ｌａｃＺ、ＣＭＰ（カルモジュリン結合ペプチド）、ＨＡエピトープ、プロテインＣエピトープおよびＶＳＶエピトープにおいて使用される転写アクチベーターの結合ドメインまたは活性化ドメインが挙げられる。
【００７４】
置換は、タンパク質のアミノ酸の、同様の特性（例えば同様の疎水性、親水性、抗原性、ヘリックス構造またはベータ−シート構造を形成または破壊する性質）を有する他のアミノ酸による置換を指す。アミノ酸置換は典型的に、単一の残基の置換であるが、ポリペプチド上に置かれた機能的制約によってクラスター化される場合があり、１〜１０個のアミノ酸に及んでもよい。挿入は通常、約１〜１０アミノ酸残基程度の挿入である。アミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換である。保存的置換表は、本分野で周知である（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（編）および以下の表１を参照されたい）。
【表１−１】
2020503066.tif 000003
【００７５】
アミノ酸置換、欠失および／または挿入は、固相ペプチド合成などの本分野で周知のペプチド合成技術を使用して、または組換えＤＮＡ操作によって、容易に行われ得る。タンパク質の置換、挿入または欠失バリアントを生成するためのＤＮＡ配列の操作のための方法は、本分野で周知である。例えば、ＤＮＡにおける所定の部位で置換変異を作製するための技術は、当業者に周知であり、Ｍ１３変異誘発、１７−Ｇｅｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発（ＵＳＢ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＰＣＲ媒介部位特異的変異誘発または他の部位特異的変異誘発プロトコールを含む。
【００７６】
誘導体
「誘導体」は、天然に存在する形態のタンパク質、例えば目的のタンパク質のアミノ酸配列と比較して、天然に存在しないアミノ酸残基によるアミノ酸置換、または天然に存在しないアミノ酸残基の付加を含み得るペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドを含む。タンパク質の「誘導体」はまた、天然に存在する形態のポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、天然に存在する変更された（グリコシル化、アシル化、プレニル化、リン酸化、ミリストイル化、硫酸化など）、または非天然の変更されたアミノ酸残基を含むペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドを包含する。誘導体はまた、それが由来するアミノ酸配列と比較して１つまたは複数の非アミノ酸置換基または付加、例えばその検出を促進するために結合されるレポーター分子などの、アミノ酸配列に共有結合または非共有結合したレポーター分子または他のリガンド、および天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列と比較して天然に存在しないアミノ酸残基を含み得る。さらに、「誘導体」はまた、天然に存在する形態のタンパク質の、標識ペプチド、例えばＦＬＡＧ、ＨＩＳ６またはチオレドキシンとの融合を含む（標識ペプチドの概略については、Ｔｅｒｐｅ、Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ６０巻、５２３〜５３３頁、２００３年を参照されたい）。
【００７７】
オルソログ／パラログ
オルソログおよびパラログは、遺伝子の祖先関係を説明するために使用される進化概念を包含する。パラログは、祖先遺伝子の重複に由来する同じ種内の遺伝子であり；オルソログは、種分化に由来する異なる生物からの遺伝子であり、また共通の祖先遺伝子に由来する。
【００７８】
ドメイン、モチーフ／コンセンサス配列／シグネチャー
「ドメイン」という用語は、進化的に関連するタンパク質の配列のアライメントに沿った特定の位置で保存されている１組のアミノ酸を指す。他の位置のアミノ酸がホモログ間で変動し得る一方で、特定の位置で高度に保存されているアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性または機能において必須であろうアミノ酸を示す。タンパク質ホモログのファミリーのアライメントした配列におけるそれらの高度な保存によって同定されると、それらは、問題の任意のポリペプチドが以前に同定したポリペプチドファミリーに属するかどうかを決定するための識別子として使用することができる。
【００７９】
「モチーフ」または「コンセンサス配列」または「シグネチャー」という用語は、進化的に関連するタンパク質の配列における短い保存領域を指す。モチーフは多くの場合、ドメインの高度に保存された部分であるが、また、ドメインの部分のみを含む場合もあり、保存されたドメインの外側に位置する場合もある（モチーフのアミノ酸のすべてが、定義されたドメインの外側に入る場合）。
【００８０】
ドメインの同定のための専門データベース、例えばＳＭＡＲＴ（Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９９８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５巻、５８５７〜５８６４頁；Ｌｅｔｕｎｉｃら（２００２年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０巻、２４２〜２４４頁）、ＩｎｔｅｒＰｒｏ（Ｍｕｌｄｅｒら、（２００３年）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  ３１巻、３１５〜３１８頁）、Ｐｒｏｓｉｔｅ（ＢｕｃｈｅｒおよびＢａｉｒｏｃｈ（１９９４年）、Ａ  ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｓｙｎｔａｘ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｍｏｔｉｆｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ．  （Ｉｎ）  ＩＳＭＢ−９４；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ２ｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ａｌｔｍａｎ  Ｒ．、Ｂｒｕｔｌａｇ  Ｄ．、Ｋａｒｐ  Ｐ．、Ｌａｔｈｒｏｐ  Ｒ．、Ｓｅａｒｌｓ  Ｄ．編、５３〜６１頁、ＡＡＡＩ  Ｐｒｅｓｓ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ；Ｈｕｌｏら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  ３２巻：Ｄ１３４〜Ｄ１３７、（２００４年））またはＰｆａｍ（Ｂａｔｅｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０巻（１号）：２７６〜２８０頁（２００２年））が存在する。タンパク質配列のインシリコ解析のための１組のツールは、ＥｘＰＡＳｙプロテオミクスサーバー（Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｇａｓｔｅｉｇｅｒら、ＥｘＰＡＳｙ：  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｉｎ−ｄｅｐｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１巻：３７８４〜３７８８頁（２００３年）））上で利用可能である。ドメインまたはモチーフはまた、慣例技術を使用して、例えば配列アライメントによって同定され得る。
【００８１】
比較のための配列のアライメントのための方法は、本分野において周知であり、このような方法として、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡが挙げられる。ＧＡＰは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（（１９７０年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８巻：４４３〜４５３頁）を使用して、適合数を最大限にし、ギャップ数を最小限にする２つの配列の全体的な（すなわち、完全配列にわたる）アライメントを発見する。ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５巻：４０３〜１０頁）は、配列同一性パーセントを計算し、２つの配列間の類似性の統計的解析を実行する。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）を通して公に利用可能である。ホモログは、例えばデフォルトのペアワイズアライメントパラメータを用いるＣｌｕｓｔａｌＷ多配列アライメントアルゴリズム（１．８３版）およびパーセンテージでのスコア付け法を使用して、容易に同定され得る。類似性および同一性の全体的なパーセンテージはまた、ＭａｔＧＡＴソフトウェアパッケージ（Ｃａｍｐａｎｅｌｌａら、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ２００３年７月１０日；４巻：２９頁  ＭａｔＧＡＴ：  ａｎ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ／ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｒ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．）において利用可能な方法のうちの１つを使用して決定してもよい。当業者に明らかである通り、保存されたモチーフ間でのアライメントを最適化するために、軽微な手動編集を実行してもよい。さらに、また、ホモログの同定のために全長配列を使用する代わりに、特定のドメインを使用してもよい。上記に挙げるプログラムを使用し、デフォルトパラメータを使用して、配列同一性の値は、全核酸またはアミノ酸配列にわたり決定してもよく、あるいは選択されたドメインまたは保存されたモチーフにわたり決定してもよい。局所アライメントのために、スミス・ウォーターマンアルゴリズムは特に有用である（Ｓｍｉｔｈ  ＴＦ、Ｗａｔｅｒｍａｎ  ＭＳ（１９８１年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ  １４７巻（１号）；１９５〜７頁）。
【００８２】
Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ＢＬＡＳＴ
典型的に、これは、任意の配列データベース、例えば公に利用可能なＮＣＢＩデータベースに対して（例えば実施例の節の表Ａに列挙する配列のいずれかを使用して）クエリー配列にＢＬＡＳＴを実行することに関する第１のＢＬＡＳＴを含む。ヌクレオチド配列から開始する場合、ＢＬＡＳＴＮまたはＴＢＬＡＳＴＸ（標準のデフォルト値を使用する）が一般に使用され、タンパク質配列から開始する場合、ＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮ（標準のデフォルト値を使用する）が使用される。ＢＬＡＳＴ結果は、必要に応じて、フィルターにかけてもよい。フィルターにかけた結果またはフィルターにかけていない結果のいずれかの全長配列を、その後、クエリー配列が由来する生物からの配列に対してＢＬＡＳＴを実行して戻す（第２のＢＬＡＳＴ）。それから、第１および第２のＢＬＡＳＴの結果を比較する。第１のｂｌａｓｔからの高ランクのヒットが、クエリー配列が由来する種と同じ種からのものであり、ＢＬＡＳＴバック（ＢＬＡＳＴ  ｂａｃｋ）が理想的には、最も高いヒットの中のクエリー配列をもたらす場合、パラログが同定され；第１のＢＬＡＳＴにおける高ランクのヒットが、クエリー配列が由来する種と同じ種からのものでなく、好ましくはクエリー配列におけるＢＬＡＳＴバックに際しての結果が最も高いヒットの中にある場合、オルソログが同定される。
【００８３】
高ランクのヒットは、低いＥ値を有するヒットである。Ｅ値が低ければ低いほど、スコアはより有意になる（または言い換えると、ヒットが偶然に発見される機会が低くなる）。Ｅ値の算出は、本分野において周知である。Ｅ値に加えて、比較はまた、同一性パーセンテージによってスコア付けされる。同一性パーセンテージは、特定の長さにわたる２つの比較される核酸（またはポリペプチド）配列間の同一のヌクレオチド（またはアミノ酸）の数を指す。大きなファミリーの場合、関連する遺伝子のクラスター化を視覚化することを補助するため、ならびにオルソログおよびパラログを同定するために、ＣｌｕｓｔａｌＷ、続いて近隣結合系統樹（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ  ｊｏｉｎｉｎｇ  ｔｒｅｅ）を使用してもよい。
【００８４】
構築物
追加の調節エレメントは、転写および翻訳エンハンサーを含み得る。当業者は、本発明の実行における使用に好適であり得る転写終結配列およびエンハンサー配列を認識するであろう。また、定義の節において説明する通り、サイトゾルに蓄積する成熟メッセージの量を増大させるために、イントロン配列を、５非翻訳領域（ＵＴＲ）に、またはコード配列において付加してもよい。他の制御配列は（プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、イントロン配列、３ＵＴＲおよび／または５ＵＴＲ領域に加えて）、タンパク質および／またはＲＮＡ安定化エレメントであり得る。このような配列は公知であるか、または当業者によって容易に得ることができる。
【００８５】
本発明の遺伝子構築物は、特定の細胞種における維持および／または複製に必要な複製起点配列をさらに含み得る。一例としては、遺伝子構築物が、エピソームの遺伝子エレメント（例えばプラスミドまたはコスミド分子）として細菌細胞において維持されるために必要とされる場合がある。
【００８６】
本発明の方法において使用される核酸配列の移行が成功したことを検出するため、および／またはこれらの核酸を含むトランスジェニック微生物の選択のために、マーカー遺伝子（またはレポーター遺伝子）を使用することは有益である。それゆえ、遺伝子構築物は、必要に応じて、選択可能なマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子は、もはや必要なくなると、トランスジェニック細胞から除去または切除してもよい。マーカー除去のための技術は、本分野において公知であり、有用な技術は、定義の節において上記に説明する。
【００８７】
調節エレメント／制御配列／プロモーター
「調節エレメント」、「制御配列」および「プロモーター」という用語は、本明細書においてすべて互換的に使用され、それらがライゲートされた配列の発現に影響を及ぼすことができる調節性核酸配列を指すことが広範な文脈において理解されるべきである。「プロモーター」という用語は典型的に、遺伝子の転写開始から上流に位置し、ＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与し、それによって作動可能に連結した核酸の転写を導く核酸制御配列を指す。古典的真核生物ゲノム遺伝子由来の転写調節配列（ＣＣＡＡＴボックス配列を伴うか、または伴わない、正確な転写開始に必要とされるＴＡＴＡボックスを含む）ならびに発生上および／もしくは外部の刺激に応答して、または組織特異的様式で遺伝子発現を変更する追加の調節エレメント（すなわち、上流活性化配列、エンハンサーおよびサイレンサー）は、上記に挙げる用語によって包含される。古典的原核生物遺伝子の転写調節配列もまた、上記用語に含まれ、この場合において、それは、−３５ボックス配列および／または−１０ボックス転写調節配列を含み得る。「調節エレメント」という用語はまた、細胞、組織または器官において核酸分子の発現を与えるか、活性化するか、または向上する合成融合分子または誘導体を包含する。
【００８８】
構成的プロモーター
「構成的プロモーター」は、少なくとも１つの細胞、組織または器官において、増殖および発生の大半であるが、必ずしもすべてではない相の間、かつほとんどの環境条件下で転写的に活性であるプロモーターを指す。
【００８９】
トランスジェニック／導入遺伝子／組換え
本発明の目的のために、「トランスジェニック」、「導入遺伝子」または「組換え」は、例えば、本発明にしたがう核酸配列、該核酸配列を含む発現カセット、遺伝子構築物またはベクターあるいは該核酸配列、発現カセットまたはベクターで形質転換した生物について、
（ａ）本発明の方法において有用なタンパク質をコードする核酸配列または
（ｂ）本発明による核酸配列に作動可能に連結された遺伝子制御配列、例えばプロモーターまたは
（ｃ）ａ）およびｂ）が、それらの天然遺伝子環境に位置しないか、もしくは組換え法によって改変されており、改変が、例えば１つもしくは複数のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、逆位もしくは挿入の形態をとることが可能である
ような組換え法によってもたらされたすべてのそれらの構築を意味する。天然遺伝子環境とは、元の微生物における天然ゲノム遺伝子座もしくは染色体遺伝子座、またはゲノムライブラリーにおける存在を意味すると理解される。ゲノムライブラリーの場合、核酸配列の天然遺伝子環境は、好ましくは少なくとも部分的に保持されている。環境は、少なくとも片側で核酸配列に隣接しており、少なくとも５０ｂｐ、好ましくは少なくとも５００ｂｐ、特に好ましくは少なくとも１０００ｂｐ、最も好ましくは少なくとも５０００ｂｐの配列長を有する。天然に存在する発現カセット（例えば核酸配列の天然プロモーターと上記に定義する本発明の方法において有用なポリペプチドをコードする対応する核酸配列との天然に存在する組み合わせ）は、この発現カセットが例えば変異促進処理などの非天然合成（「人工」）法によって改変された場合、トランスジェニック発現カセットになる。好適な方法は、例えば米国特許第５，５６５，３５０号またはＷＯ００／１５８１５において説明されている。
【００９０】
本発明の目的のためのトランスジェニック微生物は、したがって、上記の通り、本発明の方法において使用される核酸が、前記微生物のゲノムに存在しないか、もしくは前記微生物のゲノムに由来しないか、または前記微生物のゲノムに存在するが前記微生物のゲノムのそれらの天然の遺伝子座に存在しないことを意味し、核酸が、相同的に、または異種的に発現することが可能であると理解される。しかしながら、上述の通り、トランスジェニックはまた、本発明による核酸または本発明の方法において使用される核酸が、微生物のゲノムにおけるそれらの天然の位置に存在する一方で、この配列が天然配列について改変されていること、および／または天然配列の調節配列が改変されていることを意味する。トランスジェニックは、好ましくはゲノム内の非天然遺伝子座での本発明による核酸の発現を意味し、すなわち、核酸の相同発現、または好ましくは異種発現が起こると理解される。好ましいトランスジェニック微生物は、本明細書中で挙げる。
【００９１】
本発明の文脈において、「単離された核酸」または「単離されたポリペプチド」という用語は、場合によって、それぞれ、「組換え核酸」または「組換えポリペプチド」の同義語と考えてもよく、その天然遺伝子環境に位置しない、かつ／または組換え法によって改変された核酸またはポリペプチドを指すことにさらに留意すべきである。
【００９２】
調節
「調節」という用語は、発現または遺伝子発現に関して、発現レベルが対照微生物と比較して前記遺伝子発現によって変えられ、発現レベルが増大または減少し得るプロセスを意味する。調節されていない元の発現は、構造的ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）またはｍＲＮＡの発現および後続の翻訳の任意の種類のものであってもよい。本発明の目的について、調節されていない元の発現はまた、あらゆる発現の非存在であってもよい。「活性を調節すること」という用語は、微生物の生産収量の増大および／または増殖の増大をもたらす、本発明の核酸配列またはコードされるタンパク質の発現の任意の変化を意味する。発現は、０（発現の非存在または測定不能な発現）からある特定の量まで増大する場合もあり、あるいは、ある特定の量から測定不能な少ない量または０まで減少する場合もある。
【００９３】
発現
「発現」または「遺伝子発現」という用語は、特定の遺伝子（単数）もしくは特定の遺伝子（複数）または特定の遺伝子構築物の転写を意味する。「発現」または「遺伝子発現」という用語は、特に、遺伝子（単数）もしくは遺伝子（複数）または遺伝子構築物の、構造的ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）またはｍＲＮＡへの転写であって、後続の、後者の、タンパク質への翻訳を伴うか、または伴わない転写を意味する。プロセスは、ＤＮＡの転写および得られるｍＲＮＡ産物のプロセシングを含む。
【００９４】
発現増大／過剰発現
「発現増大」または「過剰発現」という用語は、本明細書で使用されるとき、元の野生型の発現レベルに追加的な発現の任意の形態を意味する。本発明の目的について、元の野生型の発現レベルはまた、０、すなわち、発現の非存在であってもよく、測定不能な発現であってもよい。
【００９５】
遺伝子または遺伝子産物の発現を増大するための方法は、本分野において十分に実証されており、例えば適切なプロモーターによって駆動される過剰発現、転写エンハンサーまたは翻訳エンハンサーの使用が挙げられる。プロモーターまたはエンハンサーエレメントとして働く単離された核酸は、目的のポリペプチドをコードする核酸の発現をアップレギュレートするように、非異種形態のポリヌクレオチドの適切な位置（典型的に上流）に導入され得る。例えば、遺伝子の発現を制御するために、内因性プロモーターを、変異、欠失および／または置換によってｉｎ  ｖｉｖｏで変更してもよく（Ｋｍｉｅｃ、米国特許第５，５６５，３５０号；Ｚａｒｌｉｎｇら、ＷＯ９３２２４４３を参照されたい）、あるいは単離されたプロモーターを、本発明の遺伝子から適切な配向および距離で微生物細胞に導入してもよい。
【００９６】
ポリペプチド発現が所望される場合、一般に、ポリヌクレオチドコード領域の３末端にポリアデニル化領域を含めることが望ましい。ポリアデニル化領域は、天然遺伝子に由来してもよく、様々な他の微生物遺伝子に由来してもよく、またはＴ−ＤＮＡに由来してもよい。
【００９７】
さらに、本発明は、以下の特定の実施形態に関する。
１．  シアル酸付加化合物を生成するための方法であって、
−  培養培地中で微生物を培養するステップであって、前記培養培地が、必要に応じて、外因性前駆体を含み、
−  前記微生物が、細胞内でＮ−アセチルグルコサミン−６−リン酸をＮ−アセチルグルコサミンに、前記Ｎ−アセチルグルコサミンをＮ−アセチルマンノサミンに、前記Ｎ−アセチルマンノサミンをＮ−アセチル−ノイラミン酸塩に変換し、
−  前記微生物が、ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐをグルコサミン−６−Ｐに変換すること、ｉｉ）Ｎ−アセチル−グルコサミンをＮ−アセチル−グルコサミン−６−Ｐに変換すること、およびｉｉｉ）Ｎ−アセチル−ノイラミン酸塩をＮ−アセチル−マンノサミンに変換することができない、ステップ
を含む、方法。
【００９８】
２．  ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸のＮ−アセチルグルコサミンへの前記変換が、細胞内で発現したホスファターゼの作用により得られ、
ｉｉ）前記Ｎ−アセチルグルコサミンのＮ−アセチルマンノサミンへの変換が、細胞内で発現したＮ−アセチルマンノサミンエピメラーゼにより実行され、
ｉｉｉ）細胞内で発現したシアル酸合成酵素が、前記Ｎ−アセチルマンノサミンをＮ−アセチル−ノイラミン酸塩に変換する、
実施形態１に記載の方法。
【００９９】
３．  前記微生物が、以下の酵素ｉ）Ｎ−アセチルグリコサミン−６−リン酸デアセチラーゼ、ｉｉ）Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼおよびｉｉｉ）Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼを生成することができない、実施形態１または２に記載の方法。
【０１００】
４．  すべての前記変換が、構成的に発現する遺伝子によってコードされる酵素により触媒される、実施形態１から３のいずれか１つに記載の方法。
【０１０１】
５．  ホスファターゼが、ＨＡＤスーパーファミリーまたはＨＡＤ様ホスファターゼファミリーから選択され、好ましくは前記ホスファターゼが、ｉ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからの遺伝子ｙｑａＢ、ｉｎｈＸ、ｙｎｉＣ、ｙｂｉＶ、ｙｉｄＡ、ｙｂｊＩ、ｙｉｇＬまたはｃｏｆによって発現する酵素、ｉｉ）Ｂｌａｓｔｏｃｌａｄｉｅｌｌａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉのホスファターゼおよびｉｉｉ）他のホスファターゼファミリーを含む群より選択され、より好ましくは前記ホスファターゼが、特許請求の範囲において定義されるＨＡＤ様ホスファターゼポリペプチドである、実施形態２に記載の方法。
【０１０２】
６．  Ｎ−アセチルマンノサミン−２−エピメラーゼが、ｉ）シアノバクテリアからの、より特にＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｍａｒｉｎａ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ａｎａｂａｅｎａ  ｍａｒｉｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、アカリオクロリス属種、アナベナ属種、ノストック属種およびシネコシスティス属種からのＮ−アセチルマンノサミン−２−エピメラーゼ、ｉｉ）バクテロイデス属種からの、より特にＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｃａｎｉｍｏｒｓｕｓおよびＭｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｍｕｌｉｅｒｉｓからのＮ−アセチルマンノサミン−２−エピメラーゼ、ｉｉｉ）Ｇｌｙｃｉｎ  ｍａｘ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａまたはＣａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓからのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン−２−エピメラーゼを含む群より選択される、実施形態２、３、４または５のいずれか１つに記載の方法。
【０１０３】
７．  シアル酸合成酵素が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｔｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａ  ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ、Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ  ｖｉｓｃｏｓａ、Ａｌｉｉｖｉｂｒｉｏ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｏｒｄｅｌｌｉｉ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎａｓ  ｃｏｍｍｏｄａまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓからのシアル酸合成酵素を含む群より選択される、実施形態２、３、４、５または６のいずれか１つに記載の方法。
【０１０４】
８．  前記シアル酸付加化合物が、Ｎ−アセチルノイラミン酸、シアル酸付加オリゴ糖、シアル酸付加脂質、シアル酸付加タンパク質、シアル酸付加アグリコンからなる群より選択される、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１０５】
９．  前記シアル酸付加化合物が、シアル酸付加オリゴ糖である、前記実施形態に記載の方法。
【０１０６】
１０．  前記シアル酸付加オリゴ糖が、シアリルラクトース、好ましくは３−ＳＬまたは６−ＳＬのいずれか１つである、実施形態９に記載の方法。
【０１０７】
１１．  前記シアル酸付加オリゴ糖が、ジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースである、実施形態９に記載の方法。
【０１０８】
１２．  前記シアル酸付加化合物が、Ｎ−アセチルノイラミン酸である、実施形態８に記載の方法。
【０１０９】
１３．  前記シアル酸付加化合物が、シアル酸付加ラクト−Ｎ−トリオース、ラクト−Ｎ−テトラオースもしくはラクト−Ｎ−ネオテトラオースであり、前記微生物が、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．３８）の活性をさらに含み、好ましくは前記ガラクトシルトランスフェラーゼが、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、Ｍｕｓ  ｍｕｌａｔｔａ、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉおよびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙを含む群に由来し、かつ／または前記微生物が、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．９０）の活性を含み、好ましくは前記Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓおよびＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓを含む群に由来する、実施形態１から１０のいずれか１つに記載の方法。
【０１１０】
１４．  前記微生物が、ＵＤＰ糖加水分解酵素およびガラクトース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を発現することができない、実施形態１３に記載の方法。
【０１１１】
１５．  前記微生物が、シアル酸付加化合物より、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％少ない細胞外Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／もしくはＮ−アセチルマンノサミンを生成し、かつ／または前記微生物が、全炭水化物の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％に等しいか、もしくはそれよりも多いシアル酸付加化合物を生成する、実施形態１からの１４のいずれか１つに記載の方法。
【０１１２】
１６．  シアル酸付加オリゴ糖を生成するための方法であって、
ａ）実施形態１から７、１４および１５のいずれか１つに記載の方法による微生物を培養するステップであって、前記微生物が、シアリルトランスフェラーゼのドナー基質として活性化Ｎ−アセチルノイラミン酸塩を内部で生成する、ステップと、
ｂ）ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−ビオース、ガラクトース、ベータ−ガラクトシドおよびアルファ−ガラクトシド、例えば非限定的に、グロボ三糖（Ｇａｌ−アルファ−１，４Ｇａｌ−ベータ−１，４Ｇｌｃ）ガラクトースからなる群より選択される外因性前駆体を含む培養培地中で前記微生物を培養するステップであって、前記外因性前駆体の微生物への能動的取り込みが起こり、前記外因性前駆体が、シアル酸付加オリゴ糖を生成するための前記シアリルトランスフェラーゼのアクセプター基質である、ステップと
を含む、方法。
【０１１３】
１７．  前記ホスファターゼ、Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼおよびシアル酸合成酵素のうちのいずれか１つまたは複数が、微生物で過剰発現される、実施形態２に記載の方法。
【０１１４】
１８．  前記ホスファターゼ、Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼおよびシアル酸合成酵素のうちのいずれか１つまたは複数が、微生物に導入され、発現される、実施形態２に記載の方法。
【０１１５】
１９．  前記微生物が、以下の酵素ｉ）Ｎ−アセチルグリコサミン−６−リン酸デアセチラーゼ、ｉｉ）Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼおよびｉｉｉ）Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子を欠く、実施形態３に記載の方法。
【０１１６】
２０．  前記微生物において、以下の酵素ｉ）Ｎ−アセチルグリコサミン−６−リン酸デアセチラーゼ、ｉｉ）Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼおよびｉｉｉ）Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子は、活性が低減しており、好ましくは前記遺伝子が、欠失しているか、またはノックアウトされている、実施形態３に記載の方法。
【０１１７】
２１．  前記微生物が、ラクトースの取り込みを促進するタンパク質をさらにコードし、ラクトースを代謝する酵素を欠く、実施形態１から２０のいずれか１つに記載の方法。
【０１１８】
２２．  前記微生物が、細菌、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株、より好ましくはＫ１２株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株であり、さらにより好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５である、実施形態１から２１のいずれか１つに記載の方法。
【０１１９】
２３．  前記微生物が、酵母である、実施形態１から２１のいずれか１つに記載の方法。
【０１２０】
２４．  外因性前駆体が、ラクトース、ガラクトース、ベータ−ガラクトシドおよびアルファ−ガラクトシド、例えばグロボ三糖（Ｇａｌ−アルファ−１，４Ｇａｌ−ベータ−１，４Ｇｌｃ）を含む群より選択される、実施形態１から２３のいずれか１つに記載の方法。
【０１２１】
２５．  シアル酸付加化合物を生成するための微生物であって、
−  細胞内でＮ−アセチルグルコサミン−６−リン酸をＮ−アセチルグルコサミンに、前記Ｎ−アセチルグルコサミンをＮ−アセチルマンノサミンに、前記Ｎ−アセチルマンノサミンをＮ−アセチル−ノイラミン酸塩に変換し、
−  ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐをグルコサミン−６−Ｐに変換すること、ｉｉ）Ｎ−アセチル−グルコサミンをＮ−アセチル−グルコサミン−６−Ｐに変換すること、およびｉｉｉ）Ｎ−アセチル−ノイラミン酸塩をＮ−アセチル−マンノサミンに変換することができない
微生物。
【０１２２】
２６．  シアル酸付加化合物を生成するための微生物であって、実施形態２から２４のいずれか１つに定義される微生物。
【０１２３】
２７．  前駆体としてのラクトースと実施形態２５または２６に記載の微生物とを含む細胞培養培地。
【０１２４】
２８．  ３シアリルラクトースまたは６シアリルラクトースを生成するための、実施形態１から２４のいずれか１つに記載の方法であって、微生物が、炭素基質、例えばグルコースまたはグリセロール上で高細胞密度で培養され、ラクトース透過酵素によって内部移行され、Ｎ−アセチルグルコサミンから内因的に産生するＣＭＰ−Ｎ−アセチル−ノイラミン酸塩を使用して組換えシアリルトランスフェラーゼによってシアル酸付加されるラクトースを供給される、方法。
【０１２５】
２９．  前記シアル酸付加化合物が、遠心分離、濾過、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過、イオン交換、電気透析、クロマトグラフィー、疑似移動床式、蒸発、沈殿、結晶化、凍結乾燥および／または噴霧乾燥の群より選択される単位操作によって前記培養培地から単離される、実施形態１から２４のいずれか１つに記載の方法。
【０１２６】
３０．  実施形態１から２４のいずれか１つに記載の方法により生成されるシアル酸付加化合物であって、遠心分離および／または濾過、イオン交換、蒸発またはナノ濾過による濃縮、結晶化または噴霧乾燥もしくは凍結乾燥による製剤化により精製される、シアル酸付加化合物。
【０１２７】
３１．  食品配合物、飼料配合物、医薬配合物、美容配合物または農芸化学配合物に添加される、実施形態１から２４のいずれか１つに記載の方法により生成されるシアル酸付加化合物。
【０１２８】
３２．  前記培養培地が、主要な炭素源として以下の、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、ポリオール、複合培地のうちのいずれか１つまたは複数を含む、実施形態１から２４のいずれか１つに記載の方法。
【０１２９】
３３．  前記主要な炭素源が、前記微生物の増殖に必要なすべての炭素の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％を提供する、実施形態３２に記載の方法。
【０１３０】
３４．  前記単糖が、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、リボースまたはアラビノースを含む群より選択される、実施形態３２に記載の方法。
【０１３１】
３５．  前記二糖が、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、セロビオースまたはキトビオースを含む群より選択される、実施形態３２に記載の方法。
【０１３２】
３６．  前記オリゴ糖が、マルトトリオース、フルクト−オリゴ糖、ガラクト−オリゴ糖、マンナンオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖またはグルコオリゴ糖を含む群より選択される、実施形態３２に記載の方法。
【０１３３】
３７．  前記ポリオールが、グリセロールを含む群より選択される、実施形態３２に記載の方法。
【０１３４】
３８．  前記複合培地が、糖蜜、コーンスティープリカー、ペプトン、トリプトンまたは酵母抽出物を含む群より選択される、実施形態３２に記載の方法。
【０１３５】
好ましい態様において、本発明は、以下の好ましい特定の実施形態に関する。
１．  微生物におけるシアル酸付加化合物を生成するための方法であって、
−  培養培地中で微生物を培養するステップであって、前記培養培地が、必要に応じて、外因性前駆体を含み、
前記微生物が、ホスファターゼをコードする少なくとも１つの核酸、Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸およびシアル酸合成酵素をコードする少なくとも１つの核酸を含み、
前記微生物が、ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐをグルコサミン−６−Ｐに変換すること、ｉｉ）Ｎ−アセチル−グルコサミンをＮ−アセチル−グルコサミン−６−Ｐに変換すること、およびｉｉｉ）Ｎ−アセチル−ノイラミン酸塩をＮ−アセチル−マンノサミンに変換することができない、ステップと、
−  ＨＡＤ様ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸の、前記微生物における発現を調節するステップであって、前記ＨＡＤ様ホスファターゼポリペプチドが、
−  以下のモチーフ：
モチーフ１：ｈＤｘＤｘ［ＴＶ］（配列番号７３）、もしくは
モチーフ２：［ＧＳＴＤＥ］［ＤＳＥＮ］ｘ（１−２）［ｈＰ］ｘ（１−２）［ＤＧＴＳ］（配列番号７４、７５、７６、７７）（ｈは、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｖ、Ｐ、Ｇ）を意味し、ｘは、任意の別個のアミノ酸であり得る）
のうちの少なくとも１つ、
−  あるいは前記ポリペプチドと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的な配列同一性を有する配列番号４３、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５または５７のいずれか１つのホモログまたは誘導体
を含む、ステップと
を含む、方法。
【０１３６】
２．  前記ＨＡＤ様ポリペプチドが、配列番号４３、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５、５７のいずれか１つを含む、好ましい実施形態１に記載の方法。
【０１３７】
３．  前記発現の調節が、ＨＡＤ様ポリペプチドをコードする核酸を微生物に導入し、発現させることによって行われる、好ましい実施形態１に記載の方法。
【０１３８】
４．  前記発現の調節が、構成的プロモーターの作用によって行われる、好ましい実施形態１に記載の方法。
【０１３９】
５．  前記シアル酸付加化合物が、Ｎ−アセチルノイラミン酸、シアル酸付加オリゴ糖、シアル酸付加脂質、シアル酸付加タンパク質、シアル酸付加アグリコンからなる群より選択される、前記好ましい実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１４０】
６．  前記シアル酸付加化合物が、シアル酸付加オリゴ糖である、前記好ましい実施形態に記載の方法。
【０１４１】
７．  前記シアル酸付加オリゴ糖が、シアリルラクトースである、好ましい実施形態８に記載の方法。
【０１４２】
８．  前記シアル酸付加オリゴ糖が、ジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースである、好ましい実施形態８に記載の方法。
【０１４３】
９．  前記シアル酸付加化合物が、Ｎ−アセチルノイラミン酸である、好ましい実施形態７に記載の方法。
【０１４４】
１０．  前記シアル酸付加化合物が、シアル酸付加ラクト−Ｎ−トリオース、ラクト−Ｎ−テトラオースもしくはラクト−Ｎ−ネオテトラオースであり、前記微生物が、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．３８）の活性をさらに含み、好ましくは前記ガラクトシルトランスフェラーゼが、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、Ｍｕｓ  ｍｕｌａｔｔａ、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉおよびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙを含む群に由来し、かつ／または前記微生物が、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．９０）の活性を含み、好ましくは前記Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓおよびＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓを含む群に由来する、好ましい実施形態１から９のいずれか１つに記載の方法。
【０１４５】
１１．  前記微生物が、ＵＤＰ糖加水分解酵素およびガラクトース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を発現することができない、好ましい実施形態１２に記載の方法。
【０１４６】
１２．  前記微生物が、シアル酸付加化合物より、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％少ない細胞外Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／もしくはＮ−アセチルマンノサミンを生成し、かつ／または前記微生物が、全炭水化物の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％に等しいか、もしくはそれよりも多いシアル酸付加化合物を生成する、好ましい実施形態１から１３のいずれか１つに記載の方法。
【０１４７】
１３．  シアル酸付加オリゴ糖を生成するための方法であって、
ａ）好ましい実施形態１から１２のいずれか１つに記載の方法による微生物を培養するステップであって、前記微生物が、シアリルトランスフェラーゼのドナー基質として活性化Ｎ−アセチルノイラミン酸塩を内部で生成する、ステップと、
ｂ）ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−ビオース、ガラクトース、ベータ−ガラクトシドおよびアルファ−ガラクトシド、例えば非限定的に、グロボ三糖（Ｇａｌ−アルファ−１，４Ｇａｌ−ベータ−１，４Ｇｌｃ）ガラクトースからなる群より選択される外因性前駆体を含む培養培地中で前記微生物を培養するステップであって、前記外因性前駆体の微生物への能動的取り込みが起こり、前記外因性前駆体が、シアル酸付加オリゴ糖を生成するための前記シアリルトランスフェラーゼのアクセプター基質である、ステップと
を含む、方法。
【０１４８】
１４．  前記Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼおよびシアル酸合成酵素のうちのいずれか１つまたは複数が、微生物で過剰発現される、好ましい実施形態１に記載の方法。
【０１４９】
１５．  前記Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼおよびシアル酸合成酵素のうちのいずれか１つまたは複数が、微生物に導入され、発現される、好ましい実施形態１に記載の方法。
【０１５０】
１６．  前記微生物が、以下の酵素ｉ）Ｎ−アセチルグリコサミン−６−リン酸デアセチラーゼ、ｉｉ）Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼおよびｉｉｉ）Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子を欠く、好ましい実施形態１に記載の方法。
【０１５１】
１７．  前記微生物において、以下の酵素ｉ）Ｎ−アセチルグリコサミン−６−リン酸デアセチラーゼ、ｉｉ）Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼおよびｉｉｉ）Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子は、活性が低減しており、好ましくは前記遺伝子が、欠失しているか、またはノックアウトされている、好ましい実施形態１に記載の方法。
【０１５２】
１８．  前記微生物が、ラクトースの取り込みを促進するタンパク質をさらにコードし、ラクトースを代謝する酵素を欠く、好ましい実施形態１から１７のいずれか１つに記載の方法。
【０１５３】
１９．  前記微生物が、細菌、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株、より好ましくはＫ１２株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株であり、さらにより好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５である、好ましい実施形態１から１８のいずれか１つに記載の方法。
【０１５４】
２０．  前記微生物が、酵母である、好ましい実施形態１から１８のいずれか１つに記載の方法。
【０１５５】
２１．  外因性前駆体が、ラクトース、ガラクトース、ベータ−ガラクトシドおよびアルファ−ガラクトシド、例えばグロボ三糖（Ｇａｌ−アルファ−１，４Ｇａｌ−ベータ−１，４Ｇｌｃ）を含む群より選択される、好ましい実施形態１から２０のいずれか１つに記載の方法。
【０１５６】
２２．  ＨＡＤ様ポリペプチドをコードする組換え核酸を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる微生物。
【０１５７】
２３．  シアル酸付加化合物を生成するための微生物であって、ホスファターゼをコードする少なくとも１つの核酸、Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸およびシアル酸合成酵素をコードする少なくとも１つの核酸を含み、ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐをグルコサミン−６−Ｐに変換すること、ｉｉ）Ｎ−アセチル−グルコサミンをＮ−アセチル−グルコサミン−６−Ｐに変換すること、およびｉｉｉ）Ｎ−アセチル−ノイラミン酸塩をＮ−アセチル−マンノサミンに変換することができず、好ましい実施形態１に定義されるＨＡＤ様ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸の調節された発現を含むことを特徴とする、微生物。
【０１５８】
２４．  （ｉ）好ましい実施形態１または２に定義されるＨＡＤ様ポリペプチドをコードする核酸と、
（ｉｉ）（ｉ）の核酸配列の発現を駆動することができる１つまたは複数の制御配列と、必要に応じて、
（ｉｉｉ）転写終結配列と
を含む構築物。
【０１５９】
２５．  前記制御配列のうちの１つが、構成的プロモーターである、好ましい実施形態２４に記載の構築物。
【０１６０】
２６．  シアル酸付加化合物を生成するための方法における好ましい実施形態２４または２５に記載の構築物の使用。
【０１６１】
２７．  食品配合物、飼料配合物、医薬配合物、美容配合物または農芸化学配合物に添加される、好ましい実施形態１から２１のいずれか１つに記載の方法により生成されるシアル酸付加化合物。
【０１６２】
２８．  シアル酸付加化合物を生成するための微生物であって、実施形態２から２１のいずれか１つに定義される微生物。
【０１６３】
２９．  前駆体としてのラクトースと実施形態２２、２３または２８のいずれか１つに記載の微生物とを含む細胞培養培地。
【０１６４】
３０．  ３シアリルラクトースまたは６シアリルラクトースを生成するための、実施形態１から２１のいずれか１つに記載の方法であって、微生物が、炭素基質、例えばグルコースまたはグリセロールまたはスクロース上で高細胞密度で培養され、ラクトース透過酵素によって内部移行され、Ｎ−アセチルグルコサミンから内因的に産生するＣＭＰ−Ｎ−アセチル−ノイラミン酸塩を使用して前記組換えシアリルトランスフェラーゼによってシアル酸付加されるラクトースを供給される、方法。
【０１６５】
３１．  前記シアル酸付加化合物が、遠心分離、濾過、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過、イオン交換、電気透析、クロマトグラフィー、疑似移動床式、蒸発、沈殿、結晶化、凍結乾燥および／または噴霧乾燥の群より選択される単位操作によって前記培養培地から単離される、実施形態１から２１のいずれか１つに記載の方法。
【０１６６】
３２．  実施形態１から２１のいずれか１つに記載の方法により生成されるシアル酸付加化合物であって、遠心分離および／または濾過、イオン交換、蒸発またはナノ濾過による濃縮、結晶化または噴霧乾燥または凍結乾燥による製剤化によって精製される、シアル酸付加化合物。
【０１６７】
３３．  食品配合物、飼料配合物、医薬配合物、美容配合物または農芸化学配合物に添加される、実施形態１から２１のいずれか１つに記載の方法により生成されるシアル酸付加化合物。
【０１６８】
３４．  前記培養培地が、主要な炭素源として以下の、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、ポリオール、複合培地のうちのいずれか１つまたは複数を含む、実施形態１から２１のいずれか１つに記載の方法。
【０１６９】
３５．  前記主要な炭素源が、前記微生物の増殖に必要なすべての炭素の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％を提供する、実施形態３４に記載の方法。
【０１７０】
３６．  前記単糖が、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、リボースまたはアラビノースを含む群より選択される、実施形態３４に記載の方法。
【０１７１】
３７．  前記二糖が、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、セロビオースまたはキトビオースを含む群より選択される、実施形態３４に記載の方法。
【０１７２】
３８．  前記オリゴ糖が、マルトトリオース、フルクト−オリゴ糖、ガラクト−オリゴ糖、マンナンオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖またはグルコオリゴ糖を含む群より選択される、実施形態３４に記載の方法。
【０１７３】
３９．  前記ポリオールが、グリセロールを含む群より選択される、実施形態３４に記載の方法。
【０１７４】
４０．  前記複合培地が、糖蜜、コーンスティープリカー、ペプトン、トリプトンまたは酵母抽出物を含む群より選択される、実施形態３４に記載の方法。
【０１７５】
以下の図面および実施例は、本発明のさらなる例示および明りょう化として働き、限定とは意図されない。
【実施例】
【０１７６】
（実施例１：材料および方法）
方法および材料  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ
培地
３種の異なる培地、つまり、リッチルリアブロス（ＬＢ：Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ）、振盪フラスコ用最少培地（ＭＭｓｆ：ｍｉｎｉｍａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｓｈａｋｅ  ｆｌａｓｋ）および発酵用最少培地（ＭＭｆ：ｍｉｎｉｍａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を使用した。両方の最少培地は、微量元素混合物を使用する。
【０１７７】
微量元素混合物は、３．６ｇ／ＬのＦｅＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、５ｇ／ＬのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、１．３ｇ／ＬのＭｎＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．３８ｇ／ＬのＣｕＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／ＬのＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、０．９４ｇ／ＬのＺｎＣｌ２、０．０３１１ｇ／ＬのＨ３ＢＯ４、０．４ｇ／ＬのＮａ２ＥＤＴＡ．２Ｈ２Ｏおよび１．０１ｇ／ＬのチアミンＨＣｌからなった。モリブデン酸溶液は、０．９６７ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏを含有した。セレン溶液は、４２ｇ／ＬのＳｅＯ２を含有した。
【０１７８】
ルリアブロス（ＬＢ）培地は、１％トリプトンペプトン（Ｄｉｆｃｏ、Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、０．５％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）および０．５％塩化ナトリウム（ＶＷＲ、Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）からなった。
【０１７９】
ルリアブロス寒天（ＬＢＡ）プレートは、１２ｇ／Ｌの寒天（Ｄｉｆｃｏ、Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を添加した、ＬＢ培地からなった。
【０１８０】
振盪フラスコ実験用最少培地（ＭＭｓｆ）は、２．００ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、５．００ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２．９９３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、７．３１５ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、８．３７２ｇ／ＬのＭＯＰＳ、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏを含有した。非限定的に、グルコース、フルクトース、マルトース、グリセロールおよびマルトトリオースから選択される炭素源を使用した。濃度はデフォルトで１５ｇ／Ｌであったが、これは実験によって変えることを条件とした。１ｍＬ／Ｌの微量元素混合物、１００μＬ／Ｌのモリブデン酸溶液および１ｍＬ／Ｌのセレン溶液。１Ｍ  ＫＯＨにより、培地をｐＨ７に設定した。実験によって、ラクトースを前駆体として添加する場合があった。
【０１８１】
発酵用最少培地は、６．７５ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、１．２５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．１５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４（低リン酸培地）または２．９３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４および７．３１ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４（高リン酸培地）、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、非限定的に、グルコース、スクロース、フルクトース、マルトース、グリセロールおよびマルトトリオースを含む炭素源、上記と同じ組成を有する１ｍＬ／Ｌの微量元素混合物、１００μＬ／Ｌのモリブデン酸溶液および１ｍＬ／Ｌのセレン溶液を含有した。
【０１８２】
複合培地、例えばＬＢをオートクレーブ（１２１℃、２１）によって滅菌し、最少培地（ＭＭｓｆおよびＭＭｆ）を濾過（０．２２μｍ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）によって滅菌した。必要に応じて、抗生物質（例えばアンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）、クロラムフェニコール（２０ｍｇ／Ｌ）、カルベニシリン（１００ｍｇ／Ｌ）、スペクチノマイシン（４０ｍｇ／Ｌ）および／またはカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ））を添加することによって、培地を選択的にした。
【０１８３】
株
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５［ラムダ−、Ｆ−、ｒｐｈ−１］を、２００７年３月に、Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＵＳ）、ＣＧＳＣ株番号７７４０から得た。ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（ＰＮＡＳ  ９７巻（２０００年）、６６４０〜６６４５頁）によって説明される通り、変異体株を、相同組換えを使用して構築した。
【０１８４】
プラスミド
ｐＫＤ４６（Ｒｅｄヘルパープラスミド、アンピシリン抵抗性）、ｐＫＤ３（ＦＲＴ隣接クロラムフェニコール抵抗性（ｃａｔ）遺伝子を含有する）、ｐＫＤ４（ＦＲＴ隣接カナマイシン抵抗性（ｋａｎ）遺伝子を含有する）およびｐＣＰ２０（ＦＬＰリコンビナーゼ活性を発現する）プラスミドを、Ｒ．Ｃｕｎｉｎ教授（Ｖｒｉｊｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ  Ｂｒｕｓｓｅｌ、Ｂｅｌｇｉｕｍ、２００７年）から譲受した。
【０１８５】
プラスミドｐＣＸ−ＣｊｎｅｕＢを、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを使用して構築した。遺伝子ＣｊｎｅｕＢ１を、Ａｅｒｔｓら（Ｅｎｇ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ２０１１年、１１巻、１号、１０〜１９頁）によって説明される通り、発現ベクターを使用して発現させた。
【０１８６】
プラスミドｐＣＸ−ＣｊｎｅｕＢ−ＮｍｎｅｕＡ−Ｐｄｂｓｔを、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを使用して構築した。遺伝子ＣｊｎｅｕＢ１、ＮｍｎｅｕＡおよびＰｄｂｓｔを、Ａｅｒｔｓら（Ｅｎｇ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ２０１１年、１１巻、１号、１０〜１９頁）によって説明される通り、発現ベクターを使用して発現させた。
【０１８７】
ホスファターゼ発現のためのプラスミドを、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅアセンブリを使用して構築した。ホスファターゼ（ＥｃＡｐｈＡ、ＥｃＣｏｆ、ＥｃＨｉｓＢ、ＥｃＯｔｓＢ、ＥｃＳｕｒＥ、ＥｃＹａｅｄ、ＥｃＹｃｊＵ、ＥｃＹｅｄＰ、ＥｃＹｆｂＴ、ＥｃＹｉｄＡ、ＥｃＹｉｇＢ、ＥｃＹｉｈＸ、ＥｃＹｎｉＣ、ＥｃＹｑａＢ、ＥｃＹｒｂＬおよびＰｓＭｕｐＰ）を、プロモーターａｐＦＡＢ８７およびａｐＦＡＢ３４６ならびにＵＴＲ遺伝子１０＿ＳＤ２−ジャンクション＿ＨｉｓＨＡおよび
【化１】
2020503066.tif 000004
を使用して発現させた。すべてのプロモーターおよびＵＴＲ１を除くＵＴＲは、Ｍｕｔａｌｉｋら（Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１３年、１０巻、３５４〜３６０頁）によって説明されている。ホスファターゼＥｃＡｐｐＡ、ＥｃＧｐｈ、ＥｃＳｅｒＢ、ＥｃＮａｇＤ、ＥｃＹｂｈＡ、ＥｃＹｂｉＶ、ＥｃＹｂｊＬ、ＥｃＹｆｂＲ、ＥｃＹｉｅＨ、ＥｃＹｊｇＬ、ＥｃＹｊｊＧ、ＥｃＹｒｆＧ、ＥｃＹｂｉＵ、ＳｃＤＯＧ１およびＢｓＡｒａＬをまた、同じプロモーターおよびＵＴＲを使用して発現させる。
【０１８８】
プラスミドｐＢＲ３２２−ＮｍｎｅｕＢを、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅアセンブリを介してｐＢＲ３２２ベクターを使用して構築した。ＮｍＮｅｕＢの発現に使用したプロモーターおよびＵＴＲは、プロモーターａｐＦＡＢ２９９およびＵＴＲ  ｇａｌＥ＿ＳＤ２−ジャンクション＿ＢＣＤ１２である。プラスミドｐＳＣ１０１−ＮｍｎｅｕＡ−Ｐｄｂｓｔを、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅアセンブリを介してｐＳＣ１０１ベクターを使用して構築した。ＮｍｎｅｕＡの発現に使用したプロモーターおよびＵＴＲは、プロモーターａｐＦＡＢ３７およびＵＴＲ  ｇａｌＥ＿ＳＤ２−ジャンクション＿ＢＣＤ１８である。Ｐｄｂｓｔの発現に使用したプロモーターおよびＵＴＲは、プロモーターａｐＦＡＢ３３９およびＵＴＲ  ｇａｌＥ＿ＳＤ２−ジャンクション＿ＢＣＤ１２である。すべてのプロモーターおよびＵＴＲは、Ｍｕｔａｌｉｋら（Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１３年、１０巻、３５４〜３６０頁）によって説明されている。
【０１８９】
プラスミドを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した宿主Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５アルファ（Ｆ−、ｐｈｉ８０ｄｌａｃＺｄｅｌｔａＭ１５、ｄｅｌｔａ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９、ｄｅｏＲ、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−、ｍｋ＋）、ｐｈｏＡ、ｓｕｐＥ４４、ｌａｍｂｄａ−、ｔｈｉ−１、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１）において維持した。
【０１９０】
遺伝子破壊
ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（ＰＮＡＳ  ９７巻（２０００年）、６６４０〜６６４５頁）によって公開された技術を使用して、遺伝子破壊および遺伝子導入を実行した。この技術は、ラムダＲｅｄリコンビナーゼによって実行される相同組換え後の抗生物質選択に基づく。後続のフリッパーゼリコンビナーゼの触媒作用は、最終生成株における抗生物質選択カセットの除去を確実にする。
【０１９１】
表Ａにおいて、遺伝子破壊カセットの構築に必要なプライマーを列挙する。
【表１−２】
2020503066.tif 000005
【０１９２】
上記に説明する遺伝子破壊に使用したものと同じ技術に基づいての、生成宿主ゲノムへの必要な遺伝子のゲノム組込みのために、破壊カセットについては特定の変更を行った。相同部位と破壊カセットのＦＲＴ部位との間に、組み込もうとする構築物を配置する。そうすることにより、相同部位によって規定される領域への構築物の組込みをうまく行うことができる。
【０１９３】
このワークフローを使用して、直接遺伝子破壊およびゲノム組込みが可能である。特定の部位での標的組込みに使用したプライマーを、表Ｂに列挙する。
【表１−３】
2020503066.tif 000006
【０１９４】
温度感受性ｐＫＤ４６ヘルパープラスミドを担持するクローンを、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）およびＬ−アラビノース（１０ｍＭ）を含む１０ｍＬ  ＬＢ培地中で３０℃にて、０．６のＯＤ６００ｎｍまで増殖させた。細胞を、氷冷脱イオン水５０ｍＬで１回および１ｍＬで１回の逐次洗浄によって、エレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）にした。次に、細胞を、５０μＬの氷冷水中に再懸濁した。最後に、１０〜１００ｎｇの破壊／組込みカセットを、エレクトロポレーションのための５０μＬの洗浄した細胞溶液に添加した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄの商標）（６００オーム  ２５μＦＤおよび２５０Ｖ）を使用して、エレクトロポレーションを実行した。
【０１９５】
エレクトロポレーション後、細胞を、１ｍＬのＬＢ培地中で３７℃にて１時間回復させ、最後に２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールまたは５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するＬＢ−寒天上に播種して、抗生物質抵抗性形質転換体を選択した。選択した変異体を、改変した領域の上流および下流のプライマーによるＰＣＲによって確証し、続いてＬＢ−寒天上で４２℃にて増殖させ、ｐＫＤ４６ヘルパープラスミドを消失させた。最後に、変異体を、アンピシリン感受性について試験した。
【０１９６】
選択した変異体（クロラムフェニコールまたはカナマイシン抵抗性）を、温度感受性複製およびＦＬＰ合成の熱誘導を示す、アンピシリンおよびクロラムフェニコール抵抗性プラスミドであるｐＣＰ２０プラスミドで形質転換した。アンピシリン抵抗性形質転換体を３０℃で選択し、その後、いくつかをＬＢ中で４２℃にてコロニー精製し、その後、すべての抗生物質抵抗性の消失について、したがってまた、ＦＬＰヘルパープラスミドの消失について試験した。遺伝子破壊および／または遺伝子組込みを、対照プライマーでチェックし、配列決定した。これらのプライマーを、表Ｃに列挙する。
【表１−４】
2020503066.tif 000007
【０１９７】
異種発現および相同発現
発現する必要のある遺伝子は、プラスミドからのものであっても、ゲノムからのものであっても、以下の会社：ＤＮＡ２．０、Ｇｅｎ９またはＩＤＴのうちの１つにより合成的に合成した。
【０１９８】
例えばホスファターゼとしての、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ天然遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ＭＧ１６５５ゲノムから選択した。他の遺伝子の起源は、関連する表において示す。
【０１９９】
発現は、コドン使用頻度を発現宿主のコドン使用頻度に最適化することによってさらに促進することができた。遺伝子を、供給者のツールを使用して最適化した。
【０２００】
培養条件
９６ウェルマイクロタイタープレート実験の事前培養物を、１７５μＬ中のＬＢプレート上のシングルコロニーから開始し、オービタルシェーカー上で８００ｒｐｍにて、３７℃で８時間インキュベートした。この培養物を、１７５μＬの３００倍希釈したＭＭｓｆ培地を有する、９６ウェルマイクロタイタープレートの接種物として使用した。これらの培養物を次に、ここでもまた３００倍希釈した、９６ウェルプレートにおける最終実験の事前培養物として使用した。９６ウェルプレートは、１７５μＬの培養体積を有するマイクロタイタープレートであってもよく、３ｍＬの培養体積を有する２４ウェルディープウェルプレートであってもよい。
【０２０１】
振盪フラスコ実験のための事前培養物を、５ｍＬのＬＢ培地中のＬＢプレート上のシングルコロニーから開始し、オービタルシェーカー上で２００ｒｐｍにて、３７℃で８時間インキュベートした。この培養物から、１ｍＬを、５００ｍＬ振盪フラスコ中の１００ｍＬの最少培地（ＭＭｓｆ）に移し、オービタルシェーカー上で２００ｒｐｍにて、３７℃でインキュベートした。この設定を、振盪フラスコ実験に使用する。
【０２０２】
１６時間増殖させた振盪フラスコ実験はまた、バイオリアクターの接種物として使用することができた。ＭＦＣＳ制御ソフトウェア（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって制御して、４％のこの細胞溶液を、４Ｌの作業体積を有する２ＬのＢｉｏｓｔａｔ  Ｄｃｕ−Ｂに接種した。培養条件を３７℃、８００ｒｐｍ撹拌および１．５Ｌ／分のガス流量に設定した。０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４および２５％  ＮＨ４ＯＨを使用して、ｐＨを７に制御した。排出ガスを冷却した。発酵中に発泡が起こった場合、シリコーン消泡剤の１０％溶液を添加した（約１０  ６Ｌ）。すべての遺伝子は構成的に発現するので、インデューサーの使用は必要ではない。
【０２０３】
材料および方法  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
培地
６．７ｇ／Ｌの酵母ニトロゲンベース（アミノ酸不含）（ＹＮＢ  ｗ／ｏ  ＡＡ、Ｄｉｆｃｏ）、２０ｇ／Ｌの寒天（Ｄｉｆｃｏ）（固体培養）、２２ｇ／Ｌのグルコース一水和物または２０ｇ／Ｌのラクトースおよび０．７９ｇ／ＬのＣＳＭまたは０．７７ｇ／ＬのＣＳＭ−Ｕｒａ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を含有する、完全補充混合物（ＳＤ  ＣＳＭ）またはＣＳＭドロップアウト（ＳＤ  ＣＳＭ−Ｕｒａ）を伴う限定酵母用合成培地上で、株を増殖させる。
【０２０４】
株
Ｂａｃｈｍａｎｎら（Ｙｅａｓｔ（１９９８年）１４巻：１１５〜３２頁）によって創出され、Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎにおいて利用可能なＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＹ４７４２を使用した。Ｇｉｅｔｚ（Ｙｅａｓｔ  １１巻：３５５〜３６０頁、１９９５年）の方法を使用して相同組換えまたはプラスミド形質転換によって、すべての変異体株を創出した。Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ  ｌａｃｔｉｓは、ＬＭＧ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）で利用可能である。
【０２０５】
プラスミド
酵母発現プラスミドｐ２ａ＿２μ＿ｓｉａ＿ＧＦＡ１（Ｃｈａｎ  ２０１３年（Ｐｌａｓｍｉｄ  ７０巻（２０１３年）２〜１７頁））を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける外来遺伝子の発現のために使用した。このプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける選択および維持を可能にするための、アンピシリン抵抗性遺伝子および細菌の複製起点を含有する。プラスミドは、酵母における選択および維持のための、２μ酵母ｏｒｉおよびＵｒａ３選択マーカーをさらに含有する。最後に、プラスミドは、ベータ−ガラクトシダーゼ発現カセットを含有し得る。次に、このプラスミドはまた、（例えばＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓからの（ＢｏＡＧＥ））Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼおよび（例えばＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉからの（ＣｊｎｅｕＢ））シアル酸合成酵素を含有する。最後に、それはまた、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ＳｃＧＦＡ１からのフルクトース−６−Ｐ−アミノトランスフェラーゼを含有する。
【０２０６】
酵母発現プラスミドｐ２ａ＿２μ＿ｓｉａ＿ｇｌｍＳは、ｐ２ａ＿２μ＿ｓｉａに基づくが、ｇｌｍＳ＊５４（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからのフルクトース−６−Ｐ−アミノトランスフェラーゼ）もまた発現するように改変されている。
【０２０７】
酵母発現プラスミドｐ２ａ＿２μ＿ｓｉａ＿ｇｌｍＳ＿ｐｈｏｓｐｈａは、ｐ２ａ＿２μ＿ｓｉａ＿ｇｌｍＳに基づくが、ＥｃＡｐｈＡ（配列番号４２）、ＥｃＣｏｆ（配列番号４３）、ＥｃＨｉｓＢ（配列番号４４）、ＥｃＯｔｓＢ（配列番号４５）、ＥｃＳｕｒＥ（配列番号４６）、ＥｃＹａｅｄ（配列番号４７）、ＥｃＹｃｊＵ（配列番号４８）、ＥｃＹｅｄＰ（配列番号４９）、ＥｃＹｆｂＴ（配列番号５０）、ＥｃＹｉｄＡ（配列番号５１）、ＥｃＹｉｇＢ（配列番号５２）、ＥｃＹｉｈＸ（配列番号５３）、ＥｃＹｎｉＣ（配列番号５４）、ＥｃＹｑａＢ（配列番号５５）、ＥｃＹｒｂＬ（配列番号５６）、ＰｓＭｕｐＰ（配列番号５７）、ＥｃＡｐｐＡ（配列番号５８）、ＥｃＧｐｈ（配列番号５９）、ＥｃＳｅｒＢ（配列番号６０）、ＥｃＮａｇＤ（配列番号６１）、ＥｃＹｂｈＡ（配列番号６２）、ＥｃＹｂｉＶ（配列番号６３）、ＥｃＹｂｊＬ（配列番号６４）、ＥｃＹｆｂＲ（配列番号６５）、ＥｃＹｉｅＨ（配列番号６６）、ＥｃＹｊｇＬ（配列番号６７）、ＥｃＹｊｊＧ（配列番号６８）、ＥｃＹｒｆＧ（配列番号６９）、ＥｃＹｂｉＵ（配列番号７０）、ＳｃＤＯＧ１（配列番号７１）およびＢｓＡｒａＬ（配列番号７２）もまた発現するように改変されている。
【０２０８】
酵母発現プラスミドｐ２ａ＿２μ＿ＳＬ−ｇｌｍＳは、ｐ２ａ＿２μ＿ｓｉａに基づくが、ＫｌＬＡＣ１２（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓからのラクトース透過酵素）、ＮｍｎｅｕＡ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓからのＣＭＰ−シアル酸合成酵素）およびＰｄｂｓｔ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅのシアリルトランスフェラーゼ）もまた発現するように改変されている。
【０２０９】
プラスミドを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した宿主Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５アルファ（Ｆ−、ｐｈｉ８０ｄｌａｃＺｄｅｌｔａＭ１５、ｄｅｌｔａ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９、ｄｅｏＲ、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−、ｍｋ＋）、ｐｈｏＡ、ｓｕｐＥ４４、ｌａｍｂｄａ−、ｔｈｉ−１、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１）において維持した。
【０２１０】
遺伝子発現プロモーター
Ｂｌａｚｅｃｋ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０９巻、１１号、２０１２年）によって説明される通り、遺伝子を、合成構成的プロモーターを使用して発現させる。
【０２１１】
異種発現および相同発現
発現する必要のある遺伝子は、プラスミドからのものであっても、ゲノムからのものであっても、以下の会社：ＤＮＡ２．０、Ｇｅｎ９またはＩＤＴのうちの１つにより合成的に合成した。
【０２１２】
発現は、コドン使用頻度を発現宿主のコドン使用頻度に最適化することによってさらに促進することができた。遺伝子を、供給者のツールを使用して最適化した。
【０２１３】
培養条件
概して、酵母株を、最初にＳＤ  ＣＳＭプレート上で増殖させて、シングルコロニーを得た。これらのプレートを、３０℃で２〜３日間増殖させた。
【０２１４】
シングルコロニーから開始して、事前培養物を、２００ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で５ｍＬ中にて一晩増殖させた。後続の５００ｍＬ振盪フラスコ実験は、１００ｍＬ培地中にて、２％のこの事前培養物で接種した。これらの振盪フラスコを、２００ｒｐｍのオービタルシェーカーによる振盪を伴って３０℃でインキュベートした。すべての遺伝子は構成的に発現するので、インデューサーの使用は必要ではない。
【０２１５】
材料および方法  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ
培地
２種の異なる培地、つまり、リッチルリアブロス（ＬＢ）、振盪フラスコ用最少培地（ＭＭｓｆ）を使用する。最少培地は、微量元素混合物を使用する。
【０２１６】
微量元素混合物は、０．７３５ｇ／ＬのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ＬのＭｎＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．０３３ｇ／ＬのＣｕＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、０．０６ｇ／ＬのＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、０．１７ｇ／ＬのＺｎＣｌ２、ＸＸｇ／ＬのＨ３ＢＯ４、ＸＸｇ／ＬのＮａ２ＥＤＴＡ．２Ｈ２Ｏおよび０．０６ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４からなった。Ｆｅ−クエン酸溶液は、０．１３５ｇ／ＬのＦｅＣｌ３．６Ｈ２Ｏ、１ｇ／Ｌのクエン酸Ｎａを含有した（Ｈｏｃｈ  １９７３年  ＰＭＣ１２１２８８７）。
【０２１７】
ルリアブロス（ＬＢ）培地は、１％トリプトンペプトン（Ｄｉｆｃｏ、Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、０．５％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）および０．５％塩化ナトリウム（ＶＷＲ、Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）からなった。
【０２１８】
ルリアブロス寒天（ＬＢＡ）プレートは、１２ｇ／Ｌの寒天（Ｄｉｆｃｏ、Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を添加した、ＬＢ培地からなった。
【０２１９】
振盪フラスコ実験用最少培地（ＭＭｓｆ）は、２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、７．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１７．５ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１．２５ｇ／Ｌのクエン酸Ｎａ、０．２５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．０５ｇ／Ｌのトリプトファン、１０〜最大３０ｇ／Ｌのグルコースまたは非限定的に、グルコース、フルクトース、マルトース、グリセロールおよびマルトトリオースを含む別の炭素源、１０ｍＬ／Ｌの微量元素混合物ならびに１０ｍＬ／ＬのＦｅ−クエン酸溶液を含有する。１Ｍ  ＫＯＨにより、培地をｐＨ７に設定した。
【０２２０】
複合培地、例えばＬＢをオートクレーブ（１２１℃、２１）によって滅菌し、最少培地（ＭＭｓｆ）を濾過（０．２２μｍ  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）によって滅菌した。必要に応じて、抗生物質（例えばゼオシン（２０ｍｇ／Ｌ））を添加することによって、培地を選択的にした。
【０２２１】
株
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｏｈｉｏ、ＵＳ）で利用可能なＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８。
【０２２２】
プラスミドおよび遺伝子過剰発現
Ｃｒｅ／ｌｏｘを介する遺伝子欠失のためのプラスミドを、Ｙａｎら（Ａｐｐｌ  ＆  ｅｎｖｉｒｏｎｍ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、２００８年９月、５５５６〜５５６２頁）によって説明される通りに構築する。
【０２２３】
発現ベクターは、Ｍｏｂｉｔｅｃ（Ｇｅｒｍａｎｙ）で、またはＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ（登録商標）番号８７０５６）で発見することができる。遺伝子ＢｓｇｌｍＳ、ＳｃＧＮＡ１およびＣｊｎｅｕＢを、これらの発現ベクターにクローニングする。発現に好適なプロモーターは、ｐａｒｔ  ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ｉＧｅｍ）：配列ｉｄ：ＢＢａ＿Ｋ１４３０１２、ＢＢａ＿Ｋ８２３０００、ＢＢａ＿Ｋ８２３００２またはＢＢａ＿Ｋ８２３００３に由来し得る。クローニングは、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅアセンブリ、Ｃｌｉｖａアセンブリ、ＬＣＲまたは制限酵素ライゲーションを使用して実行することができる。
【０２２４】
プラスミドを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した宿主Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５アルファ（Ｆ−、ｐｈｉ  ８０ｄｌａｃＺｄｅｌｔａＭ１５、ｄｅｌｔａ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９、ｄｅｏＲ、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−、ｍｋ＋）、ｐｈｏＡ、ｓｕｐＥ４４、ｌａｍｂｄａ−、ｔｈｉ−１、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１）において維持する。
【０２２５】
遺伝子破壊
遺伝子の破壊を、Ｘｕｅら（Ｊ．  ｍｉｃｒｏｂ．  Ｍｅｔｈ．  ３４巻（１９９９年）１８３〜１９１頁）によって説明される通り、直鎖ＤＮＡによる相同組換えおよびエレクトロポレーションによる形質転換によって行う。遺伝子ノックアウト法は、Ｌｉｕら（Ｍｅｔａｂ．  Ｅｎｇｉｎｅ．  ２４巻（２０１４年）６１〜６９頁）によって説明されている。この方法は、標的遺伝子の上流および下流の１０００ｂｐのホモロジーを使用する。本発明において使用されるホモロジーを、表Ｄに列挙する。改変後、変異体を、改変領域の上流および下流のプライマーを使用して確証する。これらのプライマーを、表Ｅに示す。次に、改変を、（ＬＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＬＧＣ  ｇｒｏｕｐ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で実行される）配列決定により確認する。
【表１−５】
2020503066.tif 000008
【表１−６】
2020503066.tif 000009
【表１−７】
2020503066.tif 000010
【０２２６】
異種発現および相同発現
発現する必要のある遺伝子は、プラスミドからのものであっても、ゲノムからのものであっても、以下の会社：ＤＮＡ２．０、Ｇｅｎ９またはＩＤＴのうちの１つにより合成的に合成した。
【０２２７】
発現は、コドン使用頻度を発現宿主のコドン使用頻度に最適化することによってさらに促進することができた。遺伝子を、供給者のツールを使用して最適化した。
【０２２８】
培養条件
５ｍＬのＬＢ培地中の、ＬＢプレート上のシングルコロニーからの事前培養物を、オービタルシェーカー上で２００ｒｐｍにて、３７℃で８時間インキュベートした。この培養物から、１ｍＬを、５００ｍＬ振盪フラスコ中の１００ｍＬの最少培地（ＭＭｓｆ）に移し、オービタルシェーカー上で２００ｒｐｍにて、３７℃でインキュベートした。この設定を、振盪フラスコ実験に使用する。すべての遺伝子は構成的に発現するので、インデューサーの使用は必要ではない。
【０２２９】
分析法
光学密度
６００ｎｍでの光学密度を測定すること（Ｉｍｐｌｅｎ  Ｎａｎｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  ＮＰ８０、Ｗｅｓｔｂｕｒｇ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって、培養物の細胞密度を頻繁にモニターした。事前に乾燥および秤量したｆａｌｃｏｎ中の２０ｇのリアクターブロスの遠心分離（１０分、５０００ｇ、Ｌｅｇｅｎｄ  Ｘ１Ｒ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって、細胞乾燥重量を得た。続いて、ペレットを、２０ｍＬの生理溶液（９ｇ／ＬのＮａＣｌ）で１回洗浄し、７０℃で一定重量になるまで乾燥させた。ＯＤ６００ｎｍ測定値をバイオマス濃度に変換することを可能にするために、ＯＤ６００ｎｍの、バイオマス濃度に対する相関曲線を作成した。
【０２３０】
細胞乾燥重量の測定
ブロス試料から、４×１０ｇを遠心分離管に移し、細胞をスピンダウンし（５０００ｇ、４℃、５分）、細胞を０．９％ＮａＣｌ溶液で２回洗浄した。細胞ペレットを含有する遠心分離管を、７０℃のオーブン内で一定重量になるまで４８時間乾燥させた。細胞乾燥重量を重量測定により得た。管は、秤量前に乾燥器内で冷却した。
【０２３１】
液体クロマトグラフィー
非限定的に、グルコース、フルクトースおよびラクトースのような炭水化物の濃度を、ＥＬＳＤ検出器を伴うＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  Ｈ−クラスシステムにより、３５℃に加熱したＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨアミド、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍを使用して、移動相として０．２％トリエチルアミンを伴う７５／２５  アセトニトリル／水の溶液（０．１３０ｍＬ／分）を使用して決定した。
【０２３２】
シアリルラクトースを、同じ機械上で同じカラムにより定量した。しかしながら、溶離液は、１％蟻酸を伴う７５／２５  アセトニトリル／水の溶液に改変した。流量を０．１３０ｍＬ／分に設定し、カラム温度を３５℃に設定した。
【０２３３】
シアル酸を、同じ機械上で、ＲＥＺＥＸ  ＲＯＡカラム（３００×７．８ｍｍ  ＩＤ）を使用して定量した。溶離液は、水中の０．０８％酢酸である。流量を０．５ｍＬ／分に設定し、カラム温度を６５℃に設定した。また、ＧｌｃＮＡｃおよびＭａｎＮＡｃを、この方法を使用して測定した。
【０２３４】
増殖速度測定
Ｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ｇｒｏｆｉｔを使用して、６００ｎｍで観察された光学密度に基づいて、最大増殖速度（μＭａｘ）を計算した。
【０２３５】
（実施例２：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおけるシアル酸の生成）
第１の例は、Ｎ−アセチルノイラミン酸塩（シアル酸）を生成することができるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株を提供する（図１Ｂを参照されたい）。
【０２３６】
炭素源としてスクロースを使用してグルコサミン−６−リン酸を蓄積することができる株を、Ｎ−アセチルノイラミン酸塩生成を可能にするためにさらに操作した。ベースの株は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓからのスクロースホスホリラーゼ（ＢａＳＰ）、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓからのフルクトキナーゼ（Ｚｍｆｒｋ）、変異体フルクトース−６−Ｐ−アミノトランスフェラーゼ（ＥｃｇｌｍＳ＊５４、Ｄｅｎｇら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８８巻、４１９〜４２９頁（２００６年））によって説明される）を過剰発現する。遺伝子シアル酸生成を可能にするために、オペロンｎａｇＡＢＣＤＥ、ｎａｎＡＴＥＫおよびｍａｎＸＹＺを破壊した。ＢａＳＰおよびＺｍｆｒｋをｎａｇＡＢＣＤＥの位置に導入し、ＥｃｇｌｍＳ＊５４をｎａｎＡＴＥＫの位置に導入した。これらの改変は、実施例１において説明する通りに行われ、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９７巻、６６４０〜６６４５頁（２０００年））の原理に基づく。
【０２３７】
この株において、本発明において説明するシアル酸を生成するための生合成経路は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのグルコサミン−６−Ｐ−アミノトランスフェラーゼ（ＳｃＧＮＡ１）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓからのＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（ＢｏＡＧＥ）およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉからのシアル酸合成酵素（ＣｊｎｅｕＢ）を過剰発現させることによって実行した。ＳｃＧＮＡ１およびＢｏＡＧＥは、それぞれ、位置ｎａｇＡＢＣＤＥおよびｍａｎＸＹＺ上で発現させた。ＣｊｎｅｕＢは、高コピープラスミドｐＣＸ−ＣｊｎｅｕＢを使用して発現させた。
【０２３８】
実施例１（材料および方法）において説明する通り、株を培養した。簡単に説明すると、５ｍＬのＬＢ事前培養物を接種し、３７℃で一晩増殖させた。この培養物を、１０ｇ／Ｌのスクロースを含有し、実施例１において説明する通りに作製した１００ｍＬの培地での振盪フラスコ実験における接種物として使用した。定期的に試料を採取し、実施例１において説明する通り、分析した。バイオマス、スクロースおよびシアル酸の濃度の進展を追跡するのは容易であり、図２で見ることができる通り、細胞外で０．２２ｇ／ＬのＮ−アセチルノイラミン酸塩の最終濃度が生成した。
【０２３９】
同じ生物はまた、炭素源としてグルコース、マルトースまたはグリセロールに基づいてＮ−アセチルノイラミン酸塩を生成する。
【０２４０】
（実施例３：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおける６−シアリルラクトースの生成）
本発明による別の例は、６−シアリルラクトースを生成するための方法および株の使用である。
【０２４１】
実施例３の株は、実施例２において使用した株の娘株である。株を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからのラクトース透過酵素ＥｃｌａｃＹ（また、参照により本明細書に組み込むＷＯ  ２０１６／０７５２４３の実施例１において説明および実証される）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓからのＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＮｍｎｅｕＡ）およびＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅからのシアリルトランスフェラーゼ（Ｐｄｂｓｔ）を過剰発現させることによってさらに改変する。その始めに、ｌａｃＺを破壊する。
【０２４２】
遺伝子ＮｍｎｅｕＡおよびＰｄｂｓｔは、ＣｊｎｅｕＢを伴って、プラスミドから発現する。このプラスミドは、ｐＣＸ−ＣｊｎｅｕＢ−ＮｍｎｅｕＡ−Ｐｄｂｓｔであり、実施例１において説明する通りに作製する。
【０２４３】
実施例１において説明する通り、前記株を、５ｍｌのＬＢ培地からなる事前培養物として接種する。インキュベーター内で３７℃にて一晩増殖させた後、１％のこの事前培養物を、炭素源として１０ｇ／ｌのスクロースおよび前駆体として１０ｇ／ｌのラクトースを含有する１００ｍｌの培地（ＭＭｓｆ）を含有する振盪フラスコ中に接種する。株を、３７℃で３００時間増殖させる。
【０２４４】
この株は、大量の６−シアリルラクトースを生成する。
【０２４５】
（実施例４：異種フルクトース−６−Ｐ−アミノトランスフェラーゼを使用する、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるシアル酸の生成）
別の例は、本発明のために、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形態における真核生物の使用を提供する。本発明の経路を利用するこの方法は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（例えばＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓからの（ＢｏＡＧＥ））およびシアル酸合成酵素（例えばＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉからの（ＣｊｎｅｕＢ））を導入し、発現させることによって得られ得る。
【０２４６】
開始点として、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸への代謝フラックスの増大を有する株が必要とされる。これは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからのフルクトース−６−Ｐ−アミノトランスフェラーゼ変異体（ＥｃｇｌｍＳ＊５４）を過剰発現させることによって達成される。
【０２４７】
本発明によるＮ−アセチルノイラミン酸塩生成Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを創出するために、実施例１においてもまた説明する通り、２ミクロンプラスミドを介して遺伝子を導入し（Ｃｈａｎ  ２０１３年（Ｐｌａｓｍｉｄ  ７０巻（２０１３年）２〜１７頁））、合成構成的プロモーターを使用して遺伝子を発現させる（Ｂｌａｚｅｃｋ  ２０１２年（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０９巻、１１号））。この実施形態において使用される特定のプラスミドは、ｐ２ａ＿２μ＿ｓｉａ＿ｇｌｍＳである。このプラスミドを、ＧｉｅｔｚおよびＷｏｏｄｓ（２００２年、ＰＭＩＤ  １２０７３３３８）によって説明される形質転換技術を使用してＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入し、変異体株を得る。
【０２４８】
前記株は、フルクトース−６−リン酸をグルコサミン−６−リン酸に変換し、続いてグルコサミン−６−リン酸をＮ−アセチルグルコサミン−６−リン酸に変換することができる。このＮ−アセチルグルコサミン−６−リン酸部分はＮ−アセチルグルコサミンにさらに変換され、前記Ｎ−アセチルグルコサミンはＮ−アセチルマンノサミンに、最後にこのＮ−アセチルマンノサミンはＮ−アセチルノイラミン酸塩に変換される。
【０２４９】
実施例１において説明する通り、前記株の事前培養物を、２２ｇ／Ｌのグルコースを含有する５ｍＬの限定合成培地ＳＤ−ＣＳＭ中に作製し、３０℃で増殖させる。この事前培養物を、唯一の炭素源として１０ｇ／Ｌのスクロースを含む振盪フラスコ中の１００ｍＬの培地中に接種し、３０℃で増殖させる。定期的に試料を採取し、実施例１において説明する通り、Ｎ−アセチルノイラミン酸塩の生成を測定する。この株および方法は、大量のＮ−アセチルノイラミン酸塩を生成する。
【０２５０】
同じ生物はまた、炭素源としてグルコース、マルトースまたはグリセロールに基づいてＮ−アセチルノイラミン酸塩を生成する。
【０２５１】
（実施例５：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける６−シアリルラクトースの生成）
別の例は、本発明のために、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形態における真核生物の使用を提供する。本発明の経路を利用するこの方法は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（例えばＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓからの（ＢｏＡＧＥ））およびシアル酸合成酵素（例えばＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉからの（ＣｊｎｅｕＢ））を導入し、発現させることによって得られ得る。
【０２５２】
その始めに、６シアリルラクトースを生成するために、さらなる改変を行う。これらの改変は、ラクトース透過酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素およびシアリルトランスフェラーゼの付加を含む。好ましいラクトース透過酵素は、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓからのＫｌＬＡＣ１２遺伝子（ＷＯ  ２０１６／０７５２４３）である。実施例３においてもまた説明する通り、好ましいＣＭＰ−シアル酸合成酵素およびシアリルトランスフェラーゼは、それぞれ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓからのＮｍｎｅｕＡおよびＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅからのＰｄｂｓｔである。
【０２５３】
開始点として、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸への代謝フラックスの増大を有する株が必要とされる。これは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからのフルクトース−６−Ｐ−アミノトランスフェラーゼ変異体（ＥｃｇｌｍＳ＊５４）を過剰発現させることによって達成される。
【０２５４】
本発明によるＮ−アセチルノイラミン酸塩生成Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを創出するために、実施例１においてもまた説明する通り、２ミクロンプラスミドを介して遺伝子を導入し（Ｃｈａｎ  ２０１３年（Ｐｌａｓｍｉｄ  ７０巻（２０１３年）２〜１７頁））、合成構成的プロモーターを使用して遺伝子を発現させる（Ｂｌａｚｅｃｋ  ２０１２年（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０９巻、１１号））。この実施形態において使用される特定のプラスミドは、ｐ２ａ＿２μ＿ｓｉａ＿ｇｌｍＳである。このプラスミドを、ＧｉｅｔｚおよびＷｏｏｄｓ（２００２年）によって説明される形質転換技術を使用してＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入し、変異体株を得る。
【０２５５】
前記株は、フルクトース−６−リン酸をグルコサミン−６−リン酸に、前記グルコサミン−６−リン酸をＮ−アセチルグルコサミン−６−リン酸に、前記Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸をＮ−アセチルグルコサミンに、前記Ｎ−アセチルグルコサミンをＮ−アセチルマンノサミンに、最後に前記Ｎ−アセチルマンノサミンをＮ−アセチルノイラミン酸塩に変換することができる。前記Ｎ−アセチルマンノサミンは、次に、ＣＭＰ−シアル酸に変換され、ラクトースに移されて、６シアリルラクトースが得られる。
【０２５６】
実施例１において説明する通り、前記株の事前培養物を、２２ｇ／Ｌのグルコースを含有する５ｍＬの限定合成培地ＳＤ−ＣＳＭ中に作製し、３０℃で増殖させる。この事前培養物を、唯一の炭素源として１０ｇ／Ｌのスクロースを含む振盪フラスコ中の１００ｍＬの培地中に接種し、３０℃で増殖させる。定期的に試料を採取し、実施例１において説明する通り、Ｎ−アセチルノイラミン酸塩の生成を測定する。この株および方法は、大量の６シアリルラクトースを生成する。
【０２５７】
同じ生物はまた、炭素源としてグルコース、マルトースまたはグリセロールに基づいてＮ−アセチルノイラミン酸塩を生成する。
【０２５８】
（実施例６：自家フルクトース−６−Ｐ−アミノトランスフェラーゼを使用する、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるシアル酸の生成）
別の例は、本発明のために、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形態における真核生物の使用を提供する。本発明の経路を利用するこの方法は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（例えばＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓからの（ＢｏＡＧＥ））およびシアル酸合成酵素（例えばＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉからの（ＣｊｎｅｕＢ））を導入し、発現させることによって得られ得る。
【０２５９】
開始点として、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸への代謝フラックスの増大を有する株が必要とされる。これは、天然フルクトース−６−Ｐ−アミノトランスフェラーゼＳｃＧＦＡ１を過剰発現させることによって達成される。
【０２６０】
本発明によるＮ−アセチルノイラミン酸塩生成Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを創出するために、実施例１においてもまた説明する通り、２ミクロンプラスミドを介して遺伝子を導入し（Ｃｈａｎ  ２０１３年（Ｐｌａｓｍｉｄ  ７０巻（２０１３年）２〜１７頁））、合成構成的プロモーターを使用して遺伝子を発現させる（Ｂｌａｚｅｃｋ  ２０１２年（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０９巻、１１号））。この実施形態において使用される特定のプラスミドは、ｐ２ａ＿２μ＿ｓｉａ＿ＧＦＡ１である。このプラスミドを、ＧｉｅｔｚおよびＷｏｏｄｓ（２００２年）によって説明される形質転換技術を使用してＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入し、変異体株を得る。
【０２６１】
前記株は、フルクトース−６−リン酸をグルコサミン−６−リン酸に、前記グルコサミン−６−リン酸をＮ−アセチルグルコサミン−６−リン酸に、前記Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸をＮ−アセチルグルコサミンに、前記Ｎ−アセチルグルコサミンをＮ−アセチルマンノサミンに、最後に前記Ｎ−アセチルマンノサミンをＮ−アセチルノイラミン酸塩に変換することができる。
【０２６２】
実施例１において説明する通り、前記株の事前培養物を、２２ｇ／Ｌのグルコースを含有する５ｍＬの限定合成培地ＳＤ−ＣＳＭ中に作製し、３０℃で増殖させる。この事前培養物を、唯一の炭素源として１０ｇ／Ｌのスクロースを含む振盪フラスコ中の１００ｍＬの培地中に接種し、３０℃で増殖させる。定期的に試料を採取し、実施例１において説明する通り、Ｎ−アセチルノイラミン酸塩の生成を測定する。この株および方法は、大量のＮ−アセチルノイラミン酸塩を生成する。
【０２６３】
同じ生物はまた、炭素源としてグルコース、マルトースまたはグリセロールに基づいてＮ−アセチルノイラミン酸塩を生成する。
【０２６４】
（実施例７：シアリルラクトースおよび他のシアル酸付加化合物の生成）
実施例３の代替の実施形態において、シアリルトランスフェラーゼを、異なる活性を有する別のシアリルトランスフェラーゼに変更する。これは、アルファ−２，３−シアリルトランスフェラーゼ、アルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼ、アルファ−２，８−シアリルトランスフェラーゼまたはこれらの組み合わせであり得る。これらのシアリルトランスフェラーゼは、天然に広く利用可能であり、十分に注釈されている。
【０２６５】
このようにして、例えば６−シアリルラクトース、３−シアリルラクトースまたはこれらの混合物のような様々なシアリルラクトースの生成を得ることができる。
【０２６６】
実施例１および実施例３で示す通り、株を培養する。
【０２６７】
実施例２〜７において創出した経路はまた、より大きなオリゴ糖、例えばシアリル−ラクト−Ｎ−トリオース、シアリルラクト−Ｎ−テトラオース、ジシアリルラクトース−Ｎ−テトラオース、シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオースおよびジシアリルラクトース−Ｎ−ネオテトラオースの合成のための他の経路と組み合わせることができる。この目的のために、これらのグリコシド結合を合成するためのトランスフェラーゼを経路遺伝子と共に共発現させてＣＭＰ−シアル酸を形成し、トランスフェラーゼ（上記）を共発現させて前記オリゴ糖にシアル酸付加する。
【０２６８】
このようなシアリルトランスフェラーゼの例としては、Ｄａｔｔａ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ、２００９年、１０巻、４８３〜４９８頁）およびＨａｒｄｕｉｎ−Ｌｅｐｅｒｓ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８３巻（２００１年）７２７〜７３７頁）によって説明される通り、ＳＴ６ＧａｌＩ、ＳＴ６ＧａｌＩＩ、ＳＴ３ＧａｌＩ〜ＶＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ  Ｉ〜ＶＩおよびＳＴ８Ｓｉａ  Ｉ〜ＶＩがある。海洋生物に由来するさらなる例は、Ｙａｍａｍｏｔｏ（Ｍａｒ．  Ｄｒｕｇｓ  ２０１０年、８巻、２７８１〜２７９４頁）によって説明されている。
【０２６９】
（実施例８：シアル酸付加ラクト−Ｎ−ネオテトラオースの生成）
この実験の目的は、他のシアル酸付加オリゴ糖、この場合、シアル酸付加ラクト−Ｎ−ネオテトラオースの生成の本発明の機能性を示すことであった。
【０２７０】
ラクト−Ｎ−ネオテトラオース生成株を、実施例１において説明するプロトコールに従って開発した。生成のために、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼおよびガラクトシルトランスフェラーゼの発現が必要とされ、これは、それぞれ、共にＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓからの遺伝子ＮｍｌｇｔＡおよびＮｍｌｇｔＢの導入によって達成される。次に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからのラクトースインポーターＥｃｌａｃＹがある（また、参照により本明細書に組み込むＷＯ  ２０１６／０７５２４３の実施例１において説明および実証される）。最後に、遺伝子ｕｓｈＡおよびｇａｌＴをノックアウトする。このようにして、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース生成株を得る。
【０２７１】
ラクトースで増殖し、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸を生成することができるように、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓからのスクロースホスホリラーゼ（ＢａＳＰ）、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓからのフルクトキナーゼ（ｆｒｋ）および変異体フルクトース−６−Ｐ−アミノトランスフェラーゼ（ＥｃｇｌｍＳ＊５４、Ｄｅｎｇら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８８巻、４１９〜４２９頁（２００６年））によって説明される）を、実施例１において説明する通り、過剰発現させた。
【０２７２】
この株において、本発明において説明するシアル酸を生成するための方法は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのグルコサミン−６−Ｐ−アミノトランスフェラーゼ（ＳｃＧＮＡ１）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓからのＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（ＢｏＡＧＥ）およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉからのシアル酸合成酵素（ＣｊｎｅｕＢ）を過剰発現させることによって実行した。ＳｃＧＮＡ１およびＢｏＡＧＥは、それぞれ、位置ｎａｇＡＢＣＤＥおよびｍａｎＸＹＺ上で発現させる。ＣｊｎｅｕＢは、プラスミドｐＣＸ−ＣｊｎｅｕＢ−ＮｍｎｅｕＡ−Ｐｄｂｓｔから発現させる。
【０２７３】
ラクト−Ｎ−ネオテトラオース部分のシアル酸付加は、ＣＭＰシアル酸合成酵素、例えばＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｅｓからのＮｍｎｅｕＡによるシアル酸のＣＭＰ−シアル酸（ＣＭＰ−ｓａｌｉｃ  ａｃｉｄ）への変換、続いてシアリルトランスフェラーゼ、例えばＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅからのＰｄｂｓｔによって実行される。これらの遺伝子（ＮｍｎｅｕＡおよびＰｄｂｓｔ）は、高コピープラスミドｐＣＸ−ＣｊｎｅｕＢ−ＮｍｎｅｕＡ−Ｐｄｂｓｔから発現する。
【０２７４】
実施例１（材料および方法）において説明する通り、株を培養する。簡単に説明すると、５ｍＬのＬＢ事前培養物を接種し、３７℃で一晩増殖させる。この培養物を、炭素およびエネルギー源として１０ｇ／Ｌのスクロース、前駆体として１０ｇ／Ｌのラクトースを含有し、実施例１の説明により作製した１００ｍＬの培地での振盪フラスコ実験における接種物として使用した。定期的に試料を採取し、分析する。この株は、大量のシアル酸付加ラクト−Ｎ−ネオテトラオースを生成する。
【０２７５】
代替のグリコシルトランスフェラーゼは可能である。例えば（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ５５：Ｈ７からの）ＥｃＷｇｂＯを、ＮｍｌｇｔＢの代わりに発現させる場合、シアル酸付加ラクト−Ｎ−テトラオースの生成が得られる。
【０２７６】
（実施例９：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓによるシアル酸の生成）
別の実施形態において、本発明は、また別の細菌生成宿主であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるＮ−アセチルノイラミン酸塩の生成に使用することができる。
【０２７７】
Ｎ−アセチルノイラミン酸塩生成株は、グルコサミン−６−リン酸を細胞内で過剰生成することができる株で開始することによって、本発明を通して得られる。このために、天然フルクトース−６−Ｐ−アミノトランスフェラーゼ（ＢｓｇｌｍＳ）を過剰発現させる。以下の酵素活性：Ｎ−アセチルグルコサミン−６−リン酸デアセチラーゼおよびグルコサミン−６−リン酸イソメラーゼは、遺伝子ｎａｇＡ、ｎａｇＢおよびｇａｍＡをノックアウトすることによって破壊する。
【０２７８】
この株において、本発明において説明するシアル酸を生成するための方法は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのグルコサミン−６−Ｐ−アミノトランスフェラーゼ（ＳｃＧＮＡ１）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓからのＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（ＢｏＡＧＥ）およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉからのシアル酸合成酵素（ＣｊｎｅｕＢ）を過剰発現させることによって実行する。実施例１において説明する通り、これらの遺伝子を、プラスミドを介して導入する。
【０２７９】
実施例１（材料および方法）において説明する通り、株を培養する。簡単に説明すると、５ｍＬのＬＢ事前培養物を接種し、３０℃で一晩増殖させる。この培養物を、１０ｇ／Ｌのスクロースを含有し、実施例１の説明により作製した１００ｍＬの培地での振盪フラスコ実験における接種物として使用する。この株は、大量のＮ−アセチルノイラミン酸を生成する。
【０２８０】
（実施例１０：ＧｌｃＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃまたはシアル酸の排出を伴わない６−シアリルラクトース生成株の発酵）
本発明による別の例は、６−シアリルラクトースを生成するための方法および株の使用を提供する。
【０２８１】
炭素源としてスクロースを使用してグルコサミン−６−リン酸を蓄積することができるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株を、Ｎ−アセチルノイラミン酸塩生成を可能にするようにさらに操作した。このベース株は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓからのスクロースホスホリラーゼ（ＢａＳＰ）、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓからのフルクトキナーゼ（Ｚｍｆｒｋ）、変異体フルクトース−６−Ｐ−アミノトランスフェラーゼ（ＥｃｇｌｍＳ＊５４、Ｄｅｎｇら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８８巻、４１９〜４２９頁（２００６年））によって説明される）を過剰発現する。６−シアリルラクトース生成を可能にするために、オペロンｎａｇＡＢＣＤＥ、ｎａｎＡＴＥＫおよびｍａｎＸＹＺを破壊した。ＢａＳＰおよびＺｍｆｒｋをｎａｇＡＢＣＤＥの位置に導入し、ＥｃｇｌｍＳ＊５４をｎａｎＡＴＥＫの位置に導入した。これらの改変は、実施例１において説明する通りに行われ、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９７巻、６６４０〜６６４５頁（２０００年））の原理に基づく。
【０２８２】
この株において、本発明において説明する６−シアリルラクトースを生成するための生合成経路は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのグルコサミン−６−Ｐ−アミノトランスフェラーゼ（ＳｃＧＮＡ１）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓからのＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（ＢｏＡＧＥ）およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓからのシアル酸合成酵素（ＮｍｎｅｕＢ）を過剰発現させることによって実行した。ＳｃＧＮＡ１およびＢｏＡＧＥは、それぞれ、位置ｎａｇＡＢＣＤＥおよびｍａｎＸＹＺ上で発現させた。ＮｍＮｅｕＢは、高コピープラスミドｐＢＲ３２２−ＮｍＮｅｕＢを使用して発現させた。株を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉからのラクトース透過酵素ＥｃｌａｃＹ（また、参照により本明細書に組み込むＷＯ  ２０１６／０７５２４３の実施例１において説明および実証される）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓからのＣＭＰ−シアル酸合成酵素（ＮｍＮｅｕＡ）およびＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅからのシアリルトランスフェラーゼ（Ｐｄｂｓｔ）を過剰発現させることによってさらに改変する。その始めに、ｌａｃＺを破壊する。ＮｍＮｅｕＡおよびＰｄｂｓｔを、低コピープラスミドｐＳＣ１０１−ＮｍｎｅｕＡ−Ｐｄｂｓｔを使用して発現させた。
【０２８３】
実施例１（材料および方法）において説明する通り、株をバイオリアクターにおいて培養した。簡単に説明すると、５ｍＬのＬＢ事前培養物を接種し、３７℃で一晩増殖させた。この培養物を、１０ｇ／Ｌのスクロースを含有し、実施例１において説明する通りに作製した５００ｍＬの培地での振盪フラスコ実験における接種物として使用した。この培養物を、２Ｌのバイオリアクター実験における接種物として使用した。定期的に試料を採取し、実施例１において説明する通り、分析した。６−シアリルラクトースの最終濃度は、３０．５ｇ／Ｌであった。発酵中および最終ブロスにおいて、細胞外ＧｌｃＮＡｃ、ＭａｎＮＡｃおよびシアル酸は検出されなかった。
【０２８４】
同じ生物はまた、炭素源としてグルコース、マルトースまたはグリセロールに基づいて６−シアリルラクトースを生成する。
【０２８５】
（実施例１１：増殖およびシアル酸生成に対するホスファターゼの効果）
さらなる例は、Ｎ−アセチルノイラミン酸塩（シアル酸）を生成することができる、いくつかのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株であって、本明細書以下に示す通り追加のホスファターゼを発現する株の増殖結果およびシアル酸生成を提供する。
【０２８６】
ベースの株は、変異体フルクトース−６−Ｐ−アミノトランスフェラーゼ（ＥｃｇｌｍＳ＊５４、Ｄｅｎｇら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８８巻、４１９〜４２９頁（２００６年））によって説明される）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのグルコサミン−６−Ｐ−アミノトランスフェラーゼ（ＳｃＧＮＡ１）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓからのＮ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ（ＢｏＡＧＥ）およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉからのシアル酸合成酵素（ＣｊｎｅｕＢ）を過剰発現する。遺伝子シアル酸生成を可能にするために、オペロンｎａｇＡＢＣＤＥおよびｎａｎＡＴＥＫを破壊した。ｌａｃＹＺＡオペロンを、単一の遺伝子オペロン、天然ｌａｃＹのみによって置換し、これは実施例１０において説明する通り、シアリルラクトースの生成に必要とされる。これらの改変は、実施例１において説明する通りに行われ、ＤａｔｓｅｎｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９７巻、６６４０〜６６４５頁（２０００年））の原理に基づく。
【０２８７】
その後、増殖およびシアル酸生成に対するホスファターゼの効果を比較するために、このベースの株に、様々なホスファターゼを担持するプラスミドを補充した。ベースの株は、比較においてブランクとして使用した。これらのプラスミドは、ホスファターゼおよびホスファターゼの発現を駆動するプロモーターに加えて、ｐＳＣ１０１  ｏｒｉおよびスペクチノマイシン（ｓｐｅｃｔｏｍｙｃｉｎ）抵抗性マーカーからなった。以下のホスファターゼ：ＥｃＡｐｈＡ（配列番号４２）、ＥｃＣｏｆ（配列番号４３）、ＥｃＨｉｓＢ（配列番号４４）、ＥｃＯｔｓＢ（配列番号４５）、ＥｃＳｕｒＥ（配列番号４６）、ＥｃＹａｅｄ（配列番号４７）、ＥｃＹｃｊＵ（配列番号４８）、ＥｃＹｅｄＰ（配列番号４９）、ＥｃＹｆｂＴ（配列番号５０）、ＥｃＹｉｄＡ（配列番号５１）、ＥｃＹｉｇＢ（配列番号５２）、ＥｃＹｉｈＸ（配列番号５３）、ＥｃＹｎｉＣ（配列番号５４）、ＥｃＹｑａＢ（配列番号５５）、ＥｃＹｒｂＬ（配列番号５６）およびＰｓＭｕｐＰ（配列番号５７）を発現させた。発現させる他のホスファターゼは、ＥｃＡｐｐＡ（配列番号５８）、ＥｃＧｐｈ（配列番号５９）、ＥｃＳｅｒＢ（配列番号６０）、ＥｃＮａｇＤ（配列番号６１）、ＥｃＹｂｈＡ（配列番号６２）、ＥｃＹｂｉＶ（配列番号６３）、ＥｃＹｂｊＬ（配列番号６４）、ＥｃＹｆｂＲ（配列番号６５）、ＥｃＹｉｅＨ（配列番号６６）、ＥｃＹｊｇＬ（配列番号６７）、ＥｃＹｊｊＧ（配列番号６８）、ＥｃＹｒｆＧ（配列番号６９）、ＥｃＹｂｉＵ（配列番号７０）、ＳｃＤＯＧ１（配列番号７１）およびＢｓＡｒａＬ（配列番号７２）である。
【０２８８】
第１の実験において、上記の株のサブセットを使用した。第２の実験において、上記の株の第２のサブセットを試験した。
【０２８９】
実施例１（材料および方法）において説明する通り、各株を培養した。簡単に説明すると、ワークフローは、３つの増殖ステップ：最初にＬＢ上での増殖、続いて１５ｇ／Ｌのグリセロールを含むＭＭｓｆ上での増殖および最後に１５ｇ／ＬのグリセロールＭＭｓｆを使用する増殖段階からなる。第１のステップを、９６ウェルプレート中で１ウェル当たり１７５μＬのＬＢを使用し、３７℃で一晩インキュベートして実行する。第２のステップを、９６ウェルプレート中で１７５μＬ培地を使用し、３７℃で２４時間インキュベートして実行する。最後の増殖ステップは、ｉ）９６ウェルプレート中で１７５μＬの培地を使用し、３７℃でインキュベートして、第１の実験についてのμＭａｘを決定すること（図５を参照されたい）、ならびにｉｉ）２４ウェルディープウェルプレート中で３ｍＬを使用し、第２の実験についてのシアル酸生成および光学密度を決定すること（図４を参照されたい）において実行した。
図４および５についての参照表：
【表１−８】
2020503066.tif 000011
【０２９０】
図４および５に基づいて、株が、ブランク株よりもよく増殖すること（増殖不能がない）を可能にし、ブランク株よりも多いシアル酸を生成するホスファターゼを選択し得る。
【０２９１】
上記に基づいて、少なくともモチーフ１およびモチーフ２を含むホスファターゼは、不能でなく、ブランク株よりも多いシアル酸を生成する株を提供することを発見した。
【０２９２】
（実施例１２：本発明の方法において使用されるホスファターゼに関連するさらなる配列の同定）
配列番号４３、４４、４５、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５４、５５および５７に関連する配列（ポリペプチド）を、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＥｎｔｒｅｚヌクレオチドデータベースにおいて維持されている配列の中から、データベース配列検索ツール、例えばＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５巻：４０３〜４１０頁；およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻：３３８９〜３４０２頁）を使用して同定した。プログラムは、核酸またはポリペプチド配列を配列データベースと比較することによって、および適合の統計的有意性を計算することによって、配列間の局所類似性領域を発見するために使用する。解析の出力を、ペアワイズ比較によって考察し、確率スコア（Ｅ値）によりランク付けし、ここでスコアは、特定のアライメントが偶然起こる確率を反映する（Ｅ値が低ければ低いほど、ヒットはより有意である）。Ｅ値に加えて、また、比較を同一性パーセンテージによってスコア付けした。同一性パーセンテージは、特定の長さにわたり比較される２つのポリペプチド配列間の同一のアミノ酸の数を指す。場合によって、デフォルトパラメータは、検索の厳密さを改変するために調節してもよい。例えば、Ｅ値は、より厳密でない適合を示すように増大してもよい。このようにして、短いほぼ正確な適合を同定してもよい。
【０２９３】
表１Ａ〜１Ｋは、それぞれ、配列番号４３、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５および５７に関連するホモログポリペプチド配列のリストを提供する。
【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【０２９４】
配列は仮に組み立てられ、ゲノム研究所（ＴＩＧＲ：Ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ；ＴＡで開始する）などの研究機関によって公に開示されている。真核生物遺伝子オルソログ（ＥＧＯ：Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇ）データベースを、目的の核酸配列またはポリペプチド配列により、キーワード検索によって、またはＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用することによって、このような関連する配列を同定するために使用してもよい。例えばＪｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって、特定の生物について、特別な核酸配列データベースが創出されている。
【０２９５】
（実施例１３：本発明の方法を実行することにおいて有用なポリペプチド配列に含まれるドメインおよびモチーフの同定）
タンパク質ファミリー、ドメインおよび部位の統合リソース（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆａｍｉｌｉｅｓ，Ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｉｔｅｓ）（ＩｎｔｅｒＰｒｏ）データベースは、テキストおよび配列ベースの検索のための通常使用されるシグネチャーデータベースの統合インタフェースである。ＩｎｔｅｒＰｒｏデータベースは、タンパク質シグネチャーを導き出すために様々な方法論および十分に特徴付けられたタンパク質についての様々な程度の生物学的情報を使用するこれらのデータベースを組み合わせる。共同作業するデータベースとして、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＲＯＳＩＴＥ、ＴｒＥＭＢＬ、ＰＲＩＮＴＳ、ＰｒｏＤｏｍおよびＰｆａｍ、ＳｍａｒｔならびにＴＩＧＲＦＡＭｓが挙げられる。Ｐｆａｍは、多重配列アライメントの大きなコレクションならびに多くの一般的なタンパク質ドメインおよびファミリーを含む隠れマルコフモデルである。Ｐｆａｍは、英国のサンガー研究所のサーバーでホスティングされている。ＩｎｔｅｒＰｒｏは、英国の欧州バイオインフォマティクス研究所でホスティングされている。
【０２９６】
配列番号４３、４４、４５、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５４および５５によって表されるポリペプチド配列のＩｎｔｅｒＰｒｏスキャンの結果を、表２に示す。
【表２】
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【０２９７】
試験したホスファターゼポリペプチドのアライメントを行い、図６は、アライメントの部分を示す。モチーフ１およびモチーフ２は、ボックスにより示す。アライメントは、ｃｌｕｓｔａｌｏｍｅｇａを使用して行った。
【０２９８】
（実施例１４：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける増殖およびシアル酸生成に対するホスファターゼの効果）
Ｎ−アセチルノイラミン酸塩（シアル酸）を生成することができるいくつかのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株であって、本明細書以下に示す通り追加のホスファターゼを発現する株のシアル酸生成のさらなる例。
【０２９９】
ここで使用する株は、実施例４において説明する株に由来する。本発明によりＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける増殖およびシアル酸生成を向上させるために、実施例１においてもまた説明する通り、２−ミクロンプラスミドを介してホスファターゼ遺伝子を導入し（Ｃｈａｎ  ２０１３年（Ｐｌａｓｍｉｄ  ７０巻（２０１３年）２〜１７頁））、合成構成的プロモーターを使用して遺伝子を発現させる（Ｂｌａｚｅｃｋ  ２０１２年（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０９巻、１１号））。この実施形態において使用される特定のプラスミドは、ｐ２ａ＿２μ＿ｓｉａ＿ｇｌｍＳ−ｐｈｏｓｐｈａである。プラスミドｐ２ａ＿２μ＿ｓｉａ＿ｇｌｍＳプラスミドに基づくこのプラスミドは、実施例１において説明する。これを、ＧｉｅｔｚおよびＷｏｏｄｓ（２００２年、ＰＭＩＤ  １２０７３３３８）によって説明される形質転換技術を使用してＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入し、変異体株を得る。これらの変異体の増殖およびシアル酸生成に対するホスファターゼ発現の効果を、実施例１１において説明する通り、評価する。
【０３００】
（実施例１５：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける増殖およびシアル酸生成に対するホスファターゼの効果）
別の実施形態において、本発明は、また別の細菌生成宿主であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて増殖およびシアル酸生成を向上させるために使用することができる。
【０３０１】
ここで使用する株は、実施例９において説明する株に由来する。実施例９において説明する変更に加えて、実施例１において説明する通り、ホスファターゼ遺伝子ＥｃＡｐｈＡ（配列番号４２）、ＥｃＣｏｆ（配列番号４３）、ＥｃＨｉｓＢ（配列番号４４）、ＥｃＯｔｓＢ（配列番号４５）、ＥｃＳｕｒＥ（配列番号４６）、ＥｃＹａｅｄ（配列番号４７）、ＥｃＹｃｊＵ（配列番号４８）、ＥｃＹｅｄＰ（配列番号４９）、ＥｃＹｆｂＴ（配列番号５０）、ＥｃＹｉｄＡ（配列番号５１）、ＥｃＹｉｇＢ（配列番号５２）、ＥｃＹｉｈＸ（配列番号５３）、ＥｃＹｎｉＣ（配列番号５４）、ＥｃＹｑａＢ（配列番号５５）、ＥｃＹｒｂＬ（配列番号５６）、ＰｓＭｕｐＰ（配列番号５７）、ＥｃＡｐｐＡ（配列番号５８）、ＥｃＧｐｈ（配列番号５９）、ＥｃＳｅｒＢ（配列番号６０）、ＥｃＮａｇＤ（配列番号６１）、ＥｃＹｂｈＡ（配列番号６２）、ＥｃＹｂｉＶ（配列番号６３）、ＥｃＹｂｊＬ（配列番号６４）、ＥｃＹｆｂＲ（配列番号６５）、ＥｃＹｉｅＨ（配列番号６６）、ＥｃＹｊｇＬ（配列番号６７）、ＥｃＹｊｊＧ（配列番号６８）、ＥｃＹｒｆＧ（配列番号６９）、ＥｃＹｂｉＵ（配列番号７０）、ＳｃＤＯＧ１（配列番号７１）およびＢｓＡｒａＬ（配列番号７２）を、プラスミド上で過剰発現させる。続いて、このプラスミドを、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに導入する。創出した変異体の増殖およびシアル酸生成に対するホスファターゼ発現の効果を、実施例１１において説明する通り、評価する。
【図１Ａ】
2020503066.tif 000024
【図１Ｂ】
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【図２】
2020503066.tif 000026
【図３】
2020503066.tif 000027
【図４】
2020503066.tif 000028
【図５】
2020503066.tif 000029
【図６−１】
2020503066.tif 000030
【図６−２】
2020503066.tif 000031
【配列表】
2020503066000001.app
【国際調査報告】
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2020503066.tif 000034
2020503066.tif 000035
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