(57)【要約】  本発明は概して、免疫調節の分野に関する。ウイルスおよび微生物による病態形成、自己免疫の要素に関与する疾患および炎症ならびにがんの治療において有用なＴｏｌｌ様受容体により媒介される免疫刺激を阻害するための薬剤を本明細書において教示する。この薬剤は、Ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）のＣ９８とＣ４７５との間のジスルフィド結合形成に拮抗し、これによりＴＬＲ７の活性化を防ぐ。医薬組成物をまた本明細書において可能とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＬＲ７により媒介される免疫刺激活性を対象において阻害する方法であって、ＴＬＲ７を発現する前記対象由来の細胞を、ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間またはその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する有効量の薬剤に接触させることを含む方法。
【請求項２】
薬剤が、ＴＬＲ７のアミノ酸４〜１９４の間の連続アミノ酸最大１９０個に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を有する、アミノ酸約４〜約１９０個の長さのペプチドを含み、但し、ペプチドがＴＬＲ７の９８番目に相当する位置にシステイン残基を含むことを条件とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ペプチドが、ＴＬＲ７のアミノ酸４８〜１４８の間の連続アミノ酸最大１００個に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を含み、但し、ペプチドがＴＬＲ７の９８番目に相当する位置にシステイン残基を含むことを条件とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ペプチドが、ＴＬＲ７のアミノ酸７８〜１１８の間の連続アミノ酸最大４０個に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を含み、但し、ペプチドがＴＬＲ７の９８番目に相当する位置にシステイン残基を含むことを条件とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
薬剤が、ヒトＴＬＲ７の９５〜Ｘ１０４番目のアミノ酸に対応する、ＤＸ１ＲＣＮＣＸ２ＰＸ３Ｘ４（配列番号２７）（ここで、Ｘ１はＬ、ＦまたはＭであり、Ｘ２はＶまたはＩであり、Ｘ３はＶまたはＩまたはＡまたはＰであり、Ｘ４はＰまたはＬまたはＫまたはＲである）に対して少なくとも７０％の類似性を有するアミノ酸配列を有するペプチドを含み、但し、ペプチドがＴＬＲ７の９８番目に相当する位置にシステイン残基を含むことを条件とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ペプチドが、アミノ酸配列ＤＦＲＣＮＣＶＰＩＰ（配列番号２６）を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ペプチドが、アミノ酸配列ＤＬＲＣＮＣＶＰＶＬ（配列番号１）を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ペプチドが、ペプチドの細胞への取込みを可能とする、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合する部分をさらに含む、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
部分が、親水性ペプチド、両親媒性ペプチド、周期性アミノ酸配列またはコレステノールとの結合体を有するペプチドである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
親水性ペプチドが、ＴＡＴ（配列番号２）、ＳｙｎＢ１（配列番号３）、ＳｙｎＢ３（配列番号４）、ＰＴＤ−４（配列番号５）、ＰＴＤ−５（配列番号６）、ＦＨＶｃｏａｔ（配列番号７）、ＢＭＶ  Ｇａｇ−（７−２５）（配列番号８）、ＨＴＬＶ−ＩＩ  Ｒｅｘ−（４−１６）（配列番号９）、Ｄ−Ｔａｔ（配列番号１０）およびＲ９−Ｔａｔ（配列番号１１）からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
両親媒性ペプチドが、トランスポータンキメラ（配列番号１２）、ＭＡＰ（配列番号１３）、ＳＢＰ（配列番号１４）、ＦＢＰ（配列番号１５）、ＭＰＧ［ＭＰＧａｃ］（配列番号１６）、ＭＰＧ（ΔＮＬＳ）（配列番号１７）、Ｐｅｐ−１（配列番号１８）およびＰｅｐ−２（配列番号１９）からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
周期性アミノ酸配列を有するペプチドが、ポリアルギニンまたはポリリジン配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
対象が、ヒトまたは非ヒト哺乳動物である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
自己免疫疾患、ウイルスもしくは微生物による病態形成、炎症またはがんの阻害における、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
自己免疫疾患、ウイルスもしくは微生物による病態形成、炎症またはがんを対象において阻害する医薬の製造における、ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間またはその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する薬剤の使用。
【請求項１６】
自己免疫疾患、ウイルスもしくは微生物による病態形成、炎症またはがんについて対象を治療する方法であって、ＴＬＲ７を発現する前記対象由来の細胞を、ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間またはその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する有効量の薬剤に接触させることを含む方法。
【請求項１７】
薬剤が、ＴＬＲ７のアミノ酸４〜１９４の間の連続アミノ酸最大１９０個に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を有する、アミノ酸約４〜約１９０個の長さのペプチドを含み、但し、ペプチドがＴＬＲ７の９８番目に相当する位置にシステイン残基を含むことを条件とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ペプチドが、ＴＬＲ７のアミノ酸４８〜１４８の間の連続アミノ酸最大１００個に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を有し、但し、ペプチドがＴＬＲ７の９８番目に相当する位置にシステイン残基を含むことを条件とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ペプチドが、ＴＬＲ７のアミノ酸７８〜１１８の間の連続アミノ酸最大４０個に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を有し、但し、ペプチドがＴＬＲ７の９８番目に相当する位置にシステイン残基を含むことを条件とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
薬剤が、Ｄ９５〜Ｘ１０４に対応し、ここで、Ｘは、Ｐ（ヒト）またはＬ（マウス）である、ＤＦＲＣＮＣＶＰＩＰ（配列番号２６）に対して少なくとも７０％の類似性を有するアミノ酸配列を有するペプチドであり、但し、ペプチドがＴＬＲ７の９８番目に相当する位置にシステイン残基を含むことを条件とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
ペプチドが、アミノ酸配列ＤＦＲＣＮＣＶＰＩＰ（配列番号２６）を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ペプチドが、ペプチドの細胞への取込みを可能とする、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合する部分をさらに含む、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
部分が、親水性ペプチド、両親媒性ペプチドまたは周期性アミノ酸配列を有するペプチドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
親水性ペプチドが、ＴＡＴ（配列番号２）、ＳｙｎＢ１（配列番号３）、ＳｙｎＢ３（配列番号４）、ＰＴＤ−４（配列番号５）、ＰＴＤ−５（配列番号６）、ＦＨＶｃｏａｔ（配列番号７）、ＢＭＶ  Ｇａｇ−（７−２５）（配列番号８）、ＨＴＬＶ−ＩＩ  Ｒｅｘ−（４−１６）（配列番号９）、Ｄ−Ｔａｔ（配列番号１０）およびＲ９−Ｔａｔ（配列番号１１）からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
両親媒性ペプチドが、トランスポータンキメラ（配列番号１２）、ＭＡＰ（配列番号１３）、ＳＢＰ（配列番号１４）、ＦＢＰ（配列番号１５）、ＭＰＧ（配列番号１６）、Ｐｅｐ−１（配列番号１７）およびＰｅｐ−２（配列番号１８）からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
周期性アミノ酸配列を有するペプチドが、ポリアルギニンもしくはポリリジン配列またはコレステノールとの結合体を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
対象が、ヒトまたは非ヒト哺乳動物である、請求項１６〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
対象における自己免疫疾患、ウイルスもしくは微生物による病態形成、炎症またはがんの阻害における使用のための、ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間またはその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する薬剤。
【請求項２９】
薬剤が、ＴＬＲ７のアミノ酸４〜１９４の間の連続アミノ酸最大１９０個に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を有する、アミノ酸約４〜約１９０個の長さのペプチドを含み、但し、ペプチドがＴＬＲ７の９８番目に相当する位置にシステイン残基を含むことを条件とする、請求項１５に記載の使用または請求項２８に記載の薬剤。
【請求項３０】
薬剤が、ヒトＴＬＲ７の９５〜１０４番目のアミノ酸に対応する、ＤＸ１ＲＣＮＣＸ２ＰＸ３Ｘ４（配列番号２７）（ここで、Ｘ１はＬ、ＦまたはＭであり、Ｘ２はＶまたはＩであり、Ｘ３はＶまたはＩまたはＡまたはＰであり、Ｘ４はＰまたはＬまたはＫまたはＲである）に対して少なくとも７０％の類似性を有するアミノ酸配列を有するペプチドを含み、但し、ペプチドがＴＬＲ７の９８番目に相当する位置にシステイン残基を含むことを条件とする、請求項２９に記載の使用または薬剤。
【請求項３１】
ペプチドが、アミノ酸配列ＤＦＲＣＮＣＶＰＩＰ（配列番号２６）を含む、請求項３０に記載の使用または薬剤。
【請求項３２】
ペプチドが、ペプチドの細胞への取込みを可能とする、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合する部分をさらに含む、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の使用または薬剤。
【請求項３３】
部分が、親水性ペプチド、両親媒性ペプチドまたは周期性アミノ酸配列もしくはコレステノールとの結合体を有するペプチドである、請求項３２に記載の使用または薬剤。
【請求項３４】
親水性ペプチドが、ＴＡＴ（配列番号２）、ＳｙｎＢ１（配列番号３）、ＳｙｎＢ３（配列番号４）、ＰＴＤ−４（配列番号５）、ＰＴＤ−５（配列番号６）、ＦＨＶｃｏａｔ（配列番号７）、ＢＭＶ  Ｇａｇ−（７−２５）（配列番号８）、ＨＴＬＶ−ＩＩ  Ｒｅｘ−（４−１６）（配列番号９）、Ｄ−Ｔａｔ（配列番号１０）およびＲ９−Ｔａｔ（配列番号１１）からなる群から選択される、請求項３３に記載の使用または薬剤。
【請求項３５】
両親媒性ペプチドが、トランスポータンキメラ（配列番号１２）、ＭＡＰ（配列番号１３）、ＳＢＰ（配列番号１４）、ＦＢＰ（配列番号１５）、ＭＰＧ［ＭＰＧａｃ］（配列番号１６）、ＭＰＧ（ΔＮＬＳ）（配列番号１７）、Ｐｅｐ−１（配列番号１８）およびＰｅｐ−２（配列番号１９）からなる群から選択される、請求項３３に記載の使用または薬剤。
【請求項３６】
周期性アミノ酸配列を有するペプチドが、ポリアルギニンまたはポリリジン配列を含む、請求項３３に記載の使用または薬剤。
【請求項３７】
対象が、ヒトまたは非ヒト哺乳動物である、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の使用または薬剤。
【請求項３８】
ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間またはその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する薬剤、ならびに１つまたは複数の医薬担体、賦形剤および／または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項３９】
薬剤が、ＴＬＲ７のアミノ酸４〜１９４の間の連続アミノ酸最大１９０個に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を有する、アミノ酸約４〜約１９０個の長さのペプチドを含み、但し、ペプチドがＴＬＲ７の９８番目に相当する位置にシステイン残基を含むことを条件とする、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
薬剤が、ヒトＴＬＲ７の９５〜１０４番目のアミノ酸に対応する、ＤＸ１ＲＣＮＣＸ２ＰＸ３Ｘ４（配列番号２７）（ここで、Ｘ１は、Ｌ、ＦまたはＭであり、Ｘ２は、ＶまたはＩであり、Ｘ３は、ＶまたはＩまたはＡまたはＰであり、Ｘ４は、ＰまたはＬまたはＫまたはＲである）に対して少なくとも７０％の類似性を有するアミノ酸配列を有するペプチドを含み、但し、ペプチドがＴＬＲ７の９８番目に相当する位置にシステイン残基を含むことを条件とする、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
ペプチドが、アミノ酸配列ＤＦＲＣＮＣＶＰＩＰ（配列番号２６）を含む、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
ペプチドが、ペプチドの細胞への取込みを可能とする、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合する部分をさらに含む、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
部分が、親水性ペプチド、両親媒性ペプチドまたは周期性アミノ酸配列もしくはコレステノールとの結合体を有するペプチドである、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
親水性ペプチドが、ＴＡＴ（配列番号２）、ＳｙｎＢ１（配列番号３）、ＳｙｎＢ３（配列番号４）、ＰＴＤ−４（配列番号５）、ＰＴＤ−５（配列番号６）、ＦＨＶｃｏａｔ（配列番号７）、ＢＭＶ  Ｇａｇ−（７−２５）（配列番号８）、ＨＴＬＶ−ＩＩ  Ｒｅｘ−（４−１６）（配列番号９）、Ｄ−Ｔａｔ（配列番号１０）およびＲ９−Ｔａｔ（配列番号１１）からなる群から選択される、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
両親媒性ペプチドが、トランスポータンキメラ（配列番号１２）、ＭＡＰ（配列番号１３）、ＳＢＰ（配列番号１４）、ＦＢＰ（配列番号１５）、ＭＰＧ［ＭＰＧａｃ］（配列番号１６）、ＭＰＧ（ΔＮＬＳ）（配列番号１７）、Ｐｅｐ−１（配列番号１８）およびＰｅｐ−２（配列番号１９）からなる群から選択される、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
周期性アミノ酸配列を有するペプチドが、ポリアルギニンまたはポリリジン配列を含む、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
ヒトまたは非ヒト哺乳動物における使用のための、請求項３８〜４６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全内容を参照により全体が本明細書に組み込み、「治療方法」と題する、２０１７年６月３０日申請の豪国仮特許出願第２０１７９０２５４５号の優先権に関連し、この優先権を主張する。本明細書は、配列表に言及する。「ＳＴ２５．ｔｘｔ」ファイルは、ＡＮＳＩフォーマットである。このファイルは、本明細書によって、その全体を豪国仮特許出願第２０１７９０２５４５号の参照により対象明細書に組み込む。
【０００２】
本発明は概して、免疫調節の分野に関する。ウイルスおよび微生物による病態形成、自己免疫の要素に関与する疾患および炎症ならびにがんの治療において有用なＴｏｌｌ様受容体により媒介される免疫刺激を阻害するための薬剤を本明細書において教示する。医薬組成物をまた本明細書において可能とする。
【背景技術】
【０００３】
本明細書において著者の言及する公表文献の書誌詳細は、本記載の最後にアルファベット順にまとめる。
【０００４】
本明細書における、任意の先行公表文献（もしくはそれに由来する情報）、または既知の任意の記事への参照は、承認または許可、あるいは先行公表文献（もしくはそれに由来する情報）または既知の記事が、本明細書の関連する注力分野において一般的共通知識の一部を形成することを示唆するいかなる形態も得られたものと見なされず、また見なされるべきではない。
【０００５】
免疫刺激は、ウイルスおよび微生物による病態形成の予防における主要な構成要素である。しかし、免疫系の制御は、複雑、繊細および多面的である。正当性がない刺激により、自己免疫疾患が生じ得る。医療従事者が、ウイルス性の伝染病およびパンデミックの切迫した脅威に対処し、自己免疫をコントロールしようとする場合、免疫応答をコントロールする制御プロセスのより完全な理解が必要とされる。感染株または自己免疫症状にかかわりなく病理を標的とする新たな治療法が緊急に必要とされている。
【０００６】
活性酸素種（ＲＯＳ）の生成は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ）ファミリーの酵素により達成される高度に協調的なプロセスである。ＮＯＸ酵素は、単細胞真核生物において１５億年よりも前に発生し、アメーバ、真菌、藻類および植物、線形動物、棘皮動物、尾索動物、昆虫、魚類、爬虫類ならびに哺乳動物を含むほとんどの真核生物群に存在する（Ｋａｗａｈａｒａら（２００７年）ＢＭＣ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ７巻１０９頁、Ａｇｕｉｒｒｅ（２０１０年）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ４９巻（９号）１３４２〜１３５３頁）。ＮＡＤＰＨオキシダーゼの真核生物における機能は、多種多様であるが、共通機能は、病原体に応答した自然免疫細胞によるＲＯＳの生成である。実際、植物（ＡｒｔｂｏｈＤおよびＡｒｔｂｏｈＦ）、真菌（ＮＯＸＡ／Ｂ）ならびに無脊椎動物線虫（Ｃｅｌｅｇａｎｓ）（Ｄｕｏｘオルソログ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌｏｎｇａｓｔｅｒ）（ＮＯＸ５ホモログ、ｄ−ＮＯＸおよびＤＵＯＸ）とネッタイシマカ（ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（ＮＯＸＭおよびＤＵＯＸ）におけるＮＡＤＰＨオキシダーゼのオルソログは、宿主を保護する殺菌活性によりＲＯＳを産生する（Ｋａｗａｈａｒａら（２００７年）上記参照、Ａｇｕｉｒｒｅ（２０１０年）上記参照）。硬骨類、両生類、鳥類および哺乳動物を含む脊椎動物は、ＮＯＸ２  ＮＡＤＰＨオキシダーゼを有し、これはファゴソームにおいてＲＯＳのバーストを生じさせて、侵入する病原体、特に細菌を殺傷する。しかし、ウイルス感染に対するＲＯＳの影響は、ほとんど分かっていない。
【０００７】
スーパーオキシドアニオンおよび過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）のようなＲＯＳは、マウスおよびヒト炎症細胞により、ウイルス感染に応答して生成され、インフルエンザＡ型ウイルスを含む低病原性から高病原性ウイルスに起因する病態を亢進させる（Ｉｍａｉら（２００８年）Ｃｅｌｌ１３３巻（２号）２３５〜２４９頁、Ｓｎｅｌｇｒｏｖｅら（２００６年）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ３６巻（６号）１３６４〜１３７３頁、Ｔｏら（２０１４年）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ４８巻（８号）９４０〜９４７頁、Ｖｌａｈｏｓら（２０１１年）ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ７巻（２号）ｅ１００１２７１頁、Ｖｌａｈｏｓら（２０１２年）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ３３巻（１号）３０８頁、ＶｌａｈｏｓおよびＳｅｌｅｍｉｄｉｓ（２０１４年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ８６巻（６号）７４７〜７５９頁）。炎症細胞ＲＯＳの一次供給源は、ＮＯＸ２オキシダーゼ酵素である（ＶｌａｈｏｓおよびＳｅｌｅｍｉｄｉｓ（２０１４年）上記参照、Ｓｅｌｅｍｉｄｉｓら（２００８年）Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ１２０巻（３号）２５４〜２９１頁、Ｄｒｕｍｍｏｎｄら（２０１１年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ１０巻（６号）４５３〜４７１頁、ＢｅｄａｒｄおよびＫｒａｕｓｅ（２００７年）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ８７巻（１号）２４５〜３１３頁）。ＮＯＸ２オキシダーゼは、ファゴソームのＲＯＳ生成を介して細菌および真菌の殺傷において役割を果たすが、ＮＯＸ２オキシダーゼは、細菌に対する役割と同様にウイルスを除去するようには思われない。実際、ＮＯＸ２の非存在下で、インフルエンザＡ型ウイルスは、肺の損傷および機能障害を実質的にほとんど生じず、ウイルス負荷が低くなる。これは、ＮＯＸ２オキシダーゼ由来のＲＯＳが、ウイルス感染を阻害するのではなく助長することを示唆する（Ｉｍａｉら（２００８年）上記参照、Ｓｎｅｌｇｒｏｖｅら（２００６年）上記参照、Ｔｏら（２０１４年）上記参照、Ｖｌａｈｏsら（２０１１年）上記参照、Ｖｌａｈｏｓら（２０１２年）上記参照、ＶｌａｈｏｓおよびＳｅｌｅｍｉｄｉｓ（２０１４年）上記参照）。しかし、ウイルスがＲＯＳ生成をどのように生じさせるのかを明らかとすることは、大部分がその生成部位に限局するように思われる、高反応性の酸素分子が、疾患にどのように寄与するかと同様、捉えどころがない。
【０００８】
細胞膜に結合した後（ＣｏｓｓａｒｔおよびＨｅｌｅｎｉｕｓ（２０１４年）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ６巻（８号））、ウイルスが細胞および最終的にはエンドソームに多様な機構によって侵入すると、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９を含む、エンドソームのパターン認識受容体によりウイルスＲＮＡが検出される（ＩｗａｓａｋｉおよびＰｉｌｌａｉ（２０１４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１４巻（５号）３１５〜３２８頁）。特異的受容体の相互作用は、ウイルスの群（Ｉ〜Ｖ）またはゲノムの配向（すなわちｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡまたはＤＮＡ）のいずれかに依存し、Ｉ型ＩＦＮおよびＩＬ−１βの生成ならびにＢ細胞依存性抗体の生成を特徴とする免疫応答を引き起こす（ＩｗａｓａｋｉおよびＰｉｌｌａｉ（２０１４年）上記参照）。宿主の核酸および自己抗原もまた、エンドソームＴＬＲにより検出され、自己免疫疾患では、類似のＩ型ＩＦＮ応答を媒介し、自己のＲＮＡおよび抗原に対する抗体生成を刺激する。注目すべきことには、ＮＯＸ２オキシダーゼが慢性的に欠損しているマウスは、自己抗体を発生させる傾向が高まり（Ｃａｍｐｂｅｌｌら（２０１２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ４巻（１５７号）１５７ｒａ１４１頁）、慢性肉芽腫性疾患を有する患者は、ＮＯＸ２オキシダーゼを介するＲＯＳ産生能が不全であり、Ｉ型ＩＦＮおよび自己抗体の循環が進行する（Ｋｅｌｋｋａら（２０１４年）Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ＆Ｒｅｄｏｘ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ２１巻（１６号）２２３１〜２２４５頁）。このような知見は、ＲＯＳレベルが低ければ、免疫応答が増強されるという考えを支持する。しかし、本発明の出現まで、ＲＯＳが、病原体に起因する炎症および病態をどのように調節するか、ならびにＲＯＳを標的として（および急性に）抑止することが、感染症および自己免疫疾患症状のような免疫応答に関連する他の症状の治療に実際に有益であり得るかどうかは分かっていなかった。
【発明の概要】
【０００９】
活性酸素種（ＲＯＳ）は、ウイルスおよび微生物ならびに他の寄生生物の病原性を促進する。本発明に至るまでの研究では、細胞内ＲＯＳ生成の部位および酵素供給源は、免疫刺激についてのＲＯＳに対する影響とともに決定した。本発明によれば、ＴＬＲ７タンパク質が、ＴＬＲ７の９８番目（Ｃ９８）と４７５番目（Ｃ４７５）のシステイン残基間に形成するジスルフィド結合により活性化され、これにより毒性ＲＯＳの生成が、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ２）を介して生じることが決定される。次いで、ＲＯＳは、抗ウイルスおよび抗微生物活性を抑制する。したがって、本発明では、ＴＬＲ７を治療標的として検証する。ＴＬＲ７活性を減少させることによって、自己免疫疾患、炎症およびがん、ならびにＴＬＲ７活性により増悪する他の症状の治療もまた可能となる。
【００１０】
ＴＬＲ７により媒介される免疫刺激活性を対象において阻害する方法であって、ＴＬＲ７を発現する対象由来の細胞を、ヒト（もしくはマウス）ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間または他のＴＬＲ７におけるその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する有効量の薬剤に接触させることを含む方法を本明細書において可能とする。自己免疫疾患、ウイルスもしくは微生物による病態形成、炎症またはがんについて対象を治療する方法であって、ＴＬＲ７を発現する対象由来の細胞を、ヒト（もしくはマウス）ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間または他のＴＬＲ７におけるその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する有効量の薬剤と接触させることを含む方法を本明細書においてさらに教示する。本発明はまた、ＲＯＳにより誘導される免疫刺激低下の低減を可能とし、ＴＬＲ７活性と関連する、またはそれにより増悪する症状を回復させる。ある実施形態では、薬剤は、ＴＬＲ７活性を抑制し、自己免疫疾患症状の治療において有用である。
【００１１】
ある実施形態では、薬剤は、ヒト（またはマウス）ＴＬＲ７のアミノ酸４〜１９４の間の連続アミノ酸最大１９０個に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を有する、アミノ酸約４〜約１９０個の長さの、本明細書において「おとりペプチド」と呼ぶ、ペプチドを含み、ＴＬＲ７のアミノ酸４８〜１４８の間の連続アミノ酸最大１００個に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を有するペプチドを含み、ＴＬＲ７のアミノ酸７８〜１１８の間の連続アミノ酸最大４０個に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を有するペプチドをも含み、但し、ペプチドがＴＬＲ７の９８番目に相当する位置にシステイン残基（Ｃ９８）を含むことを条件とする。
【００１２】
ある実施形態では、おとりペプチドは、ＴＬＲ７のアミノ酸Ｒ９７〜Ｃ１００に対応するアミノ酸配列ＲＣＮＣ（１文字表記のアミノ酸コードを使用）を含む。ある実施形態では、おとりペプチドは、ヒトＴＬＲの９５〜１０４番目にアミノ酸１０個の長さを含み、ＤＸ１ＲＣＮＣＸ２ＰＸ３Ｘ４（配列番号２７）（ここで、
Ｘ１はＬ、ＦまたはＭであり、
Ｘ２はＶまたはＩであり、
Ｘ３はＶまたはＩまたはＡまたはＰであり、
Ｘ４はＰまたはＬまたはＫまたはＲである）に対して少なくとも７０％の類似性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１３】
ある実施形態では、おとりペプチドは、ヒトＴＬＲ７のＤ９５〜Ｐ１０４の間に対応するＤＦＲＣＮＣＶＰＩＰ（配列番号２６）である。
【００１４】
別の実施形態では、ペプチドは、マウスＴＬＲ７のＤ９５〜Ｌ１０４に対応するアミノ酸配列ＤＬＲＣＮＣＶＰＶＬ（配列番号１）を含む。
【００１５】
ペプチドの細胞への取込みを促進するために、ペプチドは、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合し、親水性もしくはカチオン性ペプチド、両親媒性（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃもしくはａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ）ペプチド、または周期性アミノ酸配列を有するペプチドを含む、部分をさらに含み得る。あるいは、ペプチドは、コレスタノールと結合する。
【００１６】
親水性ペプチドの例としては、ＴＡＴ（配列番号２）、ＳｙｎＢ１（配列番号３）、ＳｙｎＢ３（配列番号４）、ＰＴＤ−４（配列番号５）、ＰＴＤ−５（配列番号６）、ＦＨＶｃｏａｔ（配列番号７）、ＢＭＶ  Ｇａｇ−（７−２５）（配列番号８）、ＨＴＬＶ−ＩＩ  Ｒｅｘ−（４−１６）（配列番号９）、Ｄ−Ｔａｔ（配列番号１０）およびＲ９−Ｔａｔ（配列番号１１）からなる群から選択されるペプチドが挙げられる。
【００１７】
両親媒性ペプチドの例としては、トランスポータンキメラ（配列番号１２）、ＭＡＰ（配列番号１３）、ＳＢＰ（配列番号１４）、ＦＢＰ（配列番号１５）、ＭＰＧ［ＭＰＧａｃ］（配列番号１６）、ＭＰＧ（ΔＮＬＳ）（配列番号１７）、Ｐｅｐ−１（配列番号１８）およびＰｅｐ−２（配列番号１９）からなる群から選択されるペプチドが挙げられる。
【００１８】
周期性アミノ酸配列を有するペプチドの例としては、ポリアルギニンまたはポリリジン配列を有するペプチドが挙げられる。他の例は、Ｇｕｉｄｏｔｔｉら（２０１７年）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ３８巻（４号）４０６〜４２４頁の表１に提示し、その内容を参照により組み込む。細胞内取込みはまた、ＮＯＸ２−コレスタノールリンカー（ＰＥＧ）−ｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴ構築物により促進され得る。コレスタノールおよびＰＥＧとｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴが結合すると、ｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴのエンドソームへの送達が促進される。
【００１９】
ある実施形態では、対象は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物である。
【００２０】
自己免疫疾患、ウイルスもしくは微生物による病態形成、炎症またはがんを対象において阻害する医薬の製造における、ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間またはその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する薬剤の使用を本明細書においてさらに可能とする。関連する実施形態では、本発明は、対象における自己免疫疾患、ウイルスもしくは微生物による病態形成、炎症またはがんの阻害における使用のための、ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間またはその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する薬剤を教示する。
【００２１】
ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間またはその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する薬剤、ならびに１つまたは複数の医薬担体、賦形剤および／または希釈剤を含む医薬組成物を本明細書において教示する。ある実施形態では、このような薬剤は、ＴＬＲ７のアミノ酸４〜１９４の間の連続アミノ酸最大１９０個に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を有する、アミノ酸約４〜約１９０個の長さのペプチドを含む薬剤を含む。別の実施形態では、薬剤は、ＴＬＲ７のアミノ酸４８〜１４８の間の連続アミノ酸最大１００個に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を有する、アミノ酸約４〜１００個の長さのペプチドを含む。別の実施形態では、薬剤は、ＴＬＲ７のアミノ酸７８〜１１８の間の連続アミノ酸最大４０個に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を有する、アミノ酸約４〜４０個の長さのペプチドを含む。このような実施形態のそれぞれは、但し、ペプチドがＴＬＲ７の９８番目に相当する位置にシステイン残基（Ｃ９８）を含むことを条件とする。あるいは、または加えて、ペプチドは、ＴＬＲ７のＲ９７〜Ｃ１００に対応するアミノ酸配列ＲＣＮＣを含む。外来性アミノ酸は、ＲＣＮＣを含め総計５〜５００個を、Ｈ２Ｎ−ＲＣＮＣ−Ｃ００ＨのＮおよび／またはＣ末端上に含み得る。ＴＬＲ７阻害ペプチドの模倣化合物もまた本発明の一部を形成する。
【００２２】
本明細書において使用する略号を表１に定義する。
【００２３】
【表１】
2020527546.tif 000002
【００２４】
アミノ酸配列は、配列識別番号（配列番号）により言及する。配列番号は、配列識別子＜４００＞１（配列番号１）、＜４００＞２（配列番号３）等に数値的に対応する。３文字もしくは１文字コードまたは省略せずに記載されるアミノ酸配列は、他に明示しない限り、Ｎ末端からＣ末端方向（それぞれ左から右）で提示する。
【００２５】
対象明細書を通して使用する配列識別子の要約を表２に提示する。
【００２６】
【表２】
2020527546.tif 000003
2020527546.tif 000004
2020527546.tif 000005
【００２７】
本明細書において使用するアミノ酸の１文字または３文字コードを表３に定義する。
【００２８】
【表３】
2020527546.tif 000006
【００２９】
プライマーおよびその供給源ならびに参照配列のリストを表４に示す。インフルエンザポリメラーゼプライマーは、カスタム合成し、その配列を示す。
【００３０】
【表４】
2020527546.tif 000007
【００３１】
いくつかの図は、色彩表現または実体を含む。カラー写真は、特許権所有者から要求に応じて、または適切な特許事務所から入手可能である。特許事務所から入手する場合、費用が課せられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１−１】季節性およびパンデミック インフルエンザＡ型ウイルスが、ＮＯＸ２オキシダーゼの活性化を介してエンドソームＲＯＳ生成を誘導することを示す、写真およびグラフの提示である。（Ａ〜Ｂ）インフルエンザＡ型ウイルス株ＨＫｘ３１（ＭＯＩは１０）に１時間感染させ、初期エンドソーム抗原１（ＥＥＡ１）に対する抗体、およびＡ）インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質（ＮＰ）またはＢ）ＮＯＸ２のいずれかに対する抗体で標識し、次いで、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；青色）で標識した、野生型（ＷＴ）マウス一次肺胞マクロファージの共焦点顕微鏡像である。また、結果を定量化したものを示す（ｎ＝５）。（Ｃ〜Ｄ）ＯｘｙＢＵＲＳＴ（１００μＭ）共焦点蛍光顕微鏡法により評価し、ＤＡＰＩで標識した場合の、マウス一次肺胞マクロファージにおけるエンドソームＲＯＳ対照レベルの経時的上昇を示す（ｎ＝５）。（Ｅ〜Ｆ）ＯｘｙＢＵＲＳＴ共焦点蛍光顕微鏡法によりＨＫｘ３１ウイルスの非存在または存在下で評価し、ＤＡＰＩで標識した場合の、ＷＴ、ＮＯＸ２−／ｙおよびスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ；３００Ｕ／ｍＬ）で処理したＷＴマウスの一次肺胞マクロファージにおけるエンドソームＲＯＳ生成を示す（ｎ＝５）。（Ｇ）非感染およびＨＫｘ３１ウイルス感染マウス一次肺胞マクロファージを、ＯｘｙＢＵＲＳＴおよび酸性化エンドソームマーカーであるＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（５０ｎＭ）で標識した。いくつかの細胞は、バフィロマイシンＡ（Ｂａｆ−Ａ；１００ｎＭ）で処理してエンドソームの酸性化を抑制した（ｎ＝４）。（Ｈ）季節性Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／５５／２００４、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／９／２００７）、季節性Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６）および流行性Ａ型（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９株（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９、Ａ／Ａｕｃｋｌａｎｄ／１／２００９）に感染させ、エンドソームＲＯＳについてＯｘｙＢＵＲＳＴで標識したヒト肺胞マクロファージを示す（ｎ＝４）。（Ｉ〜Ｊ）ＯｘｙＢＵＲＳＴ蛍光顕微鏡法により評価し、熱（５６℃）不活化ＨＫｘ−３１ウイルス（ウイルス融合を遮断するため）またはＵＶ不活化ＨＫｘ−３１ウイルス（複製を遮断するため）のいずれかに曝露し、ＤＡＰＩで標識した場合の、ＷＴマウス一次肺胞マクロファージにおけるエンドソームＲＯＳ生成を示す（ｎ＝４）。（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｇ、ＨおよびＩ）画像は、各実験にわたって解析した１５０個を超える細胞を表す。オリジナルの倍率は×１００である。（Ａ、Ｂ、Ｄ、ＦおよびＪ）データは、平均値±ＳＥＭとして表す。（ＡおよびＢ）Ｓｔｕｄｅｎｔｓの独立ｔ検定を行った。＊はＰ＜０．０５である。（Ｄ、ＦおよびＪ）一元配置分散分析の後、Ｄｕｎｎｅｔｔのポストホック検定を行って多重比較した。＊はＰ＜０．０５であり、＊＊はＰ＜０．０１である。
【図１−２】同上。
【図１−３】同上。
【図１−４】同上。
【図１−５】同上。
【図１−６】同上。
【図２−１】ＴＬＲ７のインフルエンザＡ型ウイルス、ＮＯＸ２およびＥＥＡ１との共局在が、ＴＬＲ７およびＰＫＣ依存性機構を介するインフルエンザＡ型ウイルスに対するエンドソームＲＯＳ生成のためのシグナル伝達プラットフォームであることを示す写真およびグラフの提示である。（Ａ〜Ｃ）無処理か、またはインフルエンザＡ型ウイルスＨＫｘ３１（ＭＯＩは１０）に感染させ、ＴＬＲ７およびＡ）インフルエンザＡ型ウイルスＮＰ、Ｂ）ＮＯＸ２またはＣ）ＥＥＡ１のいずれかに対する抗体で標識し、次いで、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で標識した、マウス一次肺胞マクロファージの共焦点顕微鏡像である。また、複数の実験から取得した定量化データを示す（ｎ＝５）。（Ｄ）ＯｘｙＢＵＲＳＴ（１００μＭ）蛍光顕微鏡法によりＨＫｘ３１ウイルスの非存在または存在下で評価し、ＤＡＰＩで標識した場合の、ＷＴおよびＴＬＲ７−／−マウス一次肺胞マクロファージにおけるエンドソームＲＯＳ生成を示す（ｎ＝６）。（Ｅ）ＮＯＸ２およびｐ４７ｐｈｏｘ会合の評価のための免疫蛍光顕微鏡像である。ＷＴおよびＴＬＲ７−／−不死化骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を無処理とするか、またはＨＫｘ３１ウイルス（ＭＯＩは１０）にバフィロマイシンＡ（Ｂａｆ−Ａ；１００ｎＭ）またはダイナソア（Ｄｙｎａ；１００μＭ）の非存在または存在下で感染させ、次いで、ＮＯＸ２およびｐ４７ｐｈｏｘに対する抗体で標識した。また、結果を定量化したものを示す（ｎ＝５）。（Ｆ〜Ｉ）ＯｘｙＢＵＲＳＴ蛍光顕微鏡法により、Ｆ）イミキモド（Ｉｍｉｑ；１０μｇ／ｍｌ）およびＧ）ｓｓＲＮＡ（１００μｇ／ｍｌ）の非存在または存在下で評価し、ＤＡＰＩで同時標識した場合の、ＷＴおよびＮＯＸ２−／ｙマウス一次肺胞マクロファージにおけるエンドソームＲＯＳ生成を示す（ｎ＝５）。（Ｈ、Ｉ）ＦＲＥＴ解析によりＷＴおよびＴＬＲ７−／−ＢＭＤＭにおいて評価した場合の、細胞質ＰＫＣ活性を示す。細胞を溶媒対照で、またはバフィロマイシンＡ（１００ｎＭ）もしくはダイナソア（１００μＭ）のいずれかで処理し、次いで、インフルエンザＡ型ウイルス（ＨＫｘ３１、ＭＯＩは１０）またはイミキモド（１０μｇ／ｍｌ）に２５分間曝露した（ｎ＝３）。（Ａ〜ＦおよびＨ）画像は、各実験にわたって解析した１５０個を超える細胞を表す。オリジナルの倍率は×１００である。すべてのデータは、平均値±ＳＥＭとして表す。（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＦおよびＧ）Ｓｔｕｄｅｎｔｓの独立ｔ検定を行った。＊はＰ＜０．０５である。（Ｄ、Ｅ、ＨおよびＩ）一元配置分散分析の後、Ｄｕｎｎｅｔｔのポストホック検定を行って多重比較した。＊はＰ＜０．０５である。
【図２−２】同上。
【図２−３】同上。
【図２−４】同上。
【図３−１】ｓｓＲＮＡおよびＤＮＡウイルスに対するエンドソームＲＯＳ生成が、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９依存性機構を介することをそれぞれ示す、写真およびグラフの提示である。（Ａ）ＯｘｙＢＵＲＳＴ（１００μＭ）蛍光顕微鏡法により、インフルエンザＡ型ウイルス（ＨＫｘ３１ウイルス）、ライノウイルス（ｒｈｉｎｏ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）、センダイウイルス、デングウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ムンプスウイルス（ＭｕＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ロタウイルス（ＵＫおよびウシ株）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）およびワクシニアウイルスの非存在または存在下で評価し、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で標識した場合の、ＷＴおよびＴＬＲ７−／−骨髄由来マクロファージにおけるエンドソームＲＯＳ生成を示す。また、結果を定量化したものを示す（ｎ＝５）。（Ｂ）ＯｘｙＢＵＲＳＴ蛍光顕微鏡法により、ＨＫｘ３１ウイルス、ライノウイルス、センダイウイルス、デングウイルス、および単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）の非存在または存在下で評価し、ＤＡＰＩで標識した場合の、ＷＴおよびＴＬＲ９−／−マウス一次肺胞マクロファージにおけるエンドソームＲＯＳ生成を示す（ｎ＝５）。（ＡおよびＢ）画像は、各実験にわたって解析した１５０個を超える細胞を表す。オリジナルの倍率は×１００である。すべてのデータは、平均値±ＳＥＭとして表す。一元配置分散分析の後、Ｄｕｎｎｅｔｔのポストホック検定を行って多重比較した。＃はＰ＜０．０５であり、ＷＴ対照と比較した。＊はＰ＜０．０５による比較であり、横軸により示す。
【図３−２】同上。
【図４−１】細菌により誘導されるＲＯＳ生成が、ウイルス依存性ＲＯＳ機構と異なることを示す、写真およびグラフの提示である。（Ａ）ＯｘｙＢＵＲＳＴ（１００μＭ）蛍光顕微鏡法によりＷＴおよびＴＬＲ７−／−不死化骨髄由来マクロファージにおいて評価した場合の、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）および肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対するファゴソームのスーパーオキシド生成を示す。画像は、各実験にわたって解析した１５０個を超える細胞を表す。オリジナルの倍率は×１００である。（Ｂ）は、結果を定量化したものを示す（ｎ＝５）。すべてのデータは、平均値±ＳＥＭとして表す。一元配置分散分析の後、Ｄｕｎｎｅｔｔのポストホック検定を行って多重比較した。＊はＰ＜０．０５であり、ＷＴ対照と比較した。
【図４−２】同上。
【図５】エンドソームＮＯＸ２オキシダーゼが、サイトカイン発現をＴＬＲ７活性に応答してｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで抑制することを示す、グラフの提示である。（Ａ〜Ｂ）ＷＴおよびＴＬＲ７−／−不死化骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を、無処理とするか、またはＡ）アポシニン（Ａｐｏ；３００μＭ）またはＢ）バフィロマイシンＡ（Ｂａｆ−Ａ；１００ｎＭ）の非存在または存在下で、イミキモド（Ｉｍｉｑ；１０μｇ／ｍＬ）により処理し、２４時間後にＩＦＮ−β、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６のｍＲＮＡ発現をＱＰＣＲにより定量した（ｎ＝６）。（Ｃ〜Ｄ）ＷＴおよびＮＯＸ２−／ｙマウスにイミキモド（５０μｇ／マウス、鼻腔内）を投与し、Ｃ）では、総気道炎症を気管支肺胞洗浄液の解析により定量し、Ｄ）では、２４時間後にサイトカイン発現を評価した（ｎ＝５）。（Ａ、Ｂ、Ｄ）応答は、ＧＡＰＤＨとの比較であって、ＷＴ対照に対する倍率変化として表す。（Ａ〜Ｄ）データは、平均値±ＳＥＭとして表す。（Ａ、ＢおよびＤ）Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定の後、Ｄｕｎｎのポストホック検定を行って多重比較した。（Ｃ）一元配置分散分析の後、Ｄｕｎｎｅｔｔのポストホック検定を行って多重比較した。統計学的有意性は、Ｐ＜０．０５の場合に認められた。＊はＰ＜０．０５であり、＊＊はＰ＜０．０１である。
【図６−１】エンドソームＮＯＸ２オキシダーゼ由来過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が、サイトカイン発現をＴＬＲ７の活性化に応答してｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで阻害することを示す、写真およびグラフの提示である。（Ａ）ＷＴマウス一次肺胞マクロファージを、無処理のままとするか、またはＦＩＴＣ標識カタラーゼで処理して５分間置いた後、ＨＫｘ３１ウイルス（ＭＯＩは１０）に感染させた。細胞をＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（５０ｎＭ）で標識し、ＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒおよびＦＩＴＣカタラーゼの共局在を、共焦点顕微鏡を用いて評価した。画像は、各実験にわたって解析した１００個を超える細胞を表す。オリジナルの倍率は×１００である（ｎ＝３）。（Ｂ）ＷＴおよびＴＬＲ７−／−不死化骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を、無処理のままとするか、またはカタラーゼ（１０００Ｕ／ｍＬ）で処理して１時間置き、２４時間後にＩＦＮ−βおよびＩＬ−１βのｍＲＮＡ発現をＱＰＣＲにより定量した（ｎ＝７）。（Ｃ）ＷＴのＢＭＤＭを、無処理のままとするか、またはカタラーゼ（１０００Ｕ／ｍＬ）の非存在または存在下で、イミキモド（Ｉｍｉｑ）により処理して１時間置き、２４時間後にＩＦＮ−βおよびＩＬ−１βのｍＲＮＡ発現をＱＰＣＲにより評価した（ｎ＝６）。（Ｄ）ＷＴのＢＭＤＭを、ＤＭＳＯ（０．１％）またはダイナソア（Ｄｙｎａ；１００μＭ）のいずれかで３０分間処理し、次いで、カタラーゼ（１０００Ｕ／ｍＬ）で１時間処理した。２４時間後にサイトカインｍＲＮＡ発現をＱＰＣＲにより定量した（ｎ＝６）。（Ｅ）ＷＴおよびＴＬＲ７−／−不死化ＢＭＤＭをカタラーゼ（１０００Ｕ／ｍＬ）で１時間処理し、２４時間後にサイトカインｍＲＮＡ発現をＱＰＣＲにより定量した（ｎ＝６）。（Ｆ）ＷＴおよびＵＮＣＢ９３−／−不死化ＢＭＤＭをカタラーゼ（１０００Ｕ／ｍＬ）で１時間処理し、２４時間後にサイトカインｍＲＮＡ発現をＱＰＣＲにより定量した（ｎ＝６）。（Ｇ〜Ｉ）ＷＴのＢＭＤＭをカタラーゼまたはイミキモド（１０μｇ／ｍｌ）のいずれかで１時間処理し、２４時間後にＧ）ＴＬＲ７、Ｈ）ＮＬＲＰ３またはＩ）ＴＲＥＭＬ４のｍＲＮＡ発現をＱＰＣＲにより定量した（ｎ＝６）。（Ｊ）カタラーゼ（１０００Ｕ／マウス）をマウスの鼻腔内に処置し、次いで、ＴＲＥＭＬ４の肺における発現をＱＰＣＲにより定量した（ｎ＝５）。（ＫおよびＬ）カタラーゼ（１０００Ｕ／マウス、鼻腔内）をＷＴマウスに投与し、２４時間後にＫ）総ＢＡＬＦ気道炎症およびＬ）肺サイトカイン発現を評価した（ｎ＝５）。（Ｂ〜ＨおよびＬ）応答は、ＧＡＰＤＨとの比較であって、ＷＴ対照に対する倍率変化として表す。（Ｂ〜ＨおよびＬ）Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定の後、Ｄｕｎｎのポストホック検定を行って多重比較した。（ＩおよびＪ）Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定を行った。すべてのデータは、平均値±ＳＥＭとして表す。Ｐ＜０．０５の場合に統計学的に有意であるとした。＊はＰ＜０．０５である。
【図６−２】同上。
【図６−３】同上。
【図７−１】ＴＬＲ７上のＣ９８が、受容体の活性を制御し、エンドソームＨ２Ｏ２の標的であることを示す、グラフの提示である。（Ａ）ＴＬＲ７−／−ＢＭＤＭに、空のベクターＷＴ  ＴＬＲ７、あるいはシステイン９８、２６０、２６３、２７０、２７３および４４５をアラニンに変異させたＴＬＲ７（ＴＬＲ７  ６ｍｕｔ）、システイン９８および４４５をアラニンに変異させたＴＬＲ７（ＴＬＲ７Ｃ９８Ａ／４４５Ａ）、またはシステイン４４５（ＴＬＲ７Ｃ４４５Ａ）もしくはシステイン９８（ＴＬＲ７Ｃ９８Ａ）をアラニンに変異させたＴＬＲ７のいずれかをトランスフェクトした。４８時間後、細胞を無処理のままとするか、またはカタラーゼ（１０００Ｕ／ｍＬ）またはイミキモド（Ｉｍｉｑ、１０μｇ／ｍｌ）のいずれかで処理して１時間置き、２４時間後にサイトカイン発現を評価した（ｎ＝６）。応答は、ＧＡＰＤＨとの比較であって、ＴＬＲ−／−対照に対する倍率変化として表す。データは、平均値±ＳＥＭとして表す。一元配置分散分析の後、Ｄｕｎｎｅｔｔのポストホック検定を行って多重比較した。統計学的有意性は、Ｐ＜０．０５の場合に認められた。＊はＰ＜０．０５である。（ｎ．ｓ）は、非有意を意味する。（Ｂ）ＣＬＵＳＴＡＬ  ＯＭＥＧＡを用いた多重配列アラインメントにより、ＴＬＲ７上のＣｙｓ９８が種を越えて保存されていることが示される。
【図７−２】同上。
【図８−１】ＮＯＸ２オキシダーゼを阻害すると、Ｉ型ＩＦＮおよびＩＬ−１βの発現、およびインフルエンザＡ型ウイルス感染に対する抗体生成が増加することを示す、グラフの提示である。（Ａ）ＷＴおよびＮＯＸ２−／ｙマウス由来の肺胞マクロファージを無処理のままとするか（ナイーブ）、またはＨＫｘ３１インフルエンザＡ型ウイルス（ＭＯＩは１０）に感染させて置き、２４時間後にＩＦＮ−β、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６のｍＲＮＡ発現をＱＰＣＲにより解析した（ｎ＝８）。（Ｂ〜Ｃ）ＷＴおよびＮＯＸ２−／ｙマウスを生きたＨＫｘ３１インフルエンザＡ型ウイルス（１マウスあたり１×１０５ＰＦＵ）に感染させ、３日後にＢ）サイトカインｍＲＮＡ発現、およびＣ）ＢＡＬＦまたはＤ）血清中のＩＦＮ−βタンパク質発現を評価した（ｎ＝５）。（Ｅ〜Ｉ）ＷＴおよびＮＯＸ２−／ｙマウスを不活化ＨＫｘ３１インフルエンザＡ型ウイルス（１マウスあたり１×１０４ＰＦＵと等価）に感染させて、７日目にＥ）体重、Ｆ）気道炎症および識別細胞数（すなわち、マクロファージ、好中球およびリンパ球）、Ｇ）肺全体におけるサイトカイン発現（応答は、ＧＡＰＤＨに対する倍率変化として示す）ならびにＨ）血清およびＩ）ＢＡＬＦの抗体レベルを測定した（ｎ＝６）。データは、平均値±ＳＥＭとして表す。（Ａ）Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定の後、Ｄｕｎｎのポストホック検定を行って多重比較した。（Ｂ〜Ｉ）独立ｔ検定を行い、Ｐ＜０．０５の場合に統計学的に有意であるとした。＊はＰ＜０．０５である。＊＊はＰ＜０．０１である。
【図８−２】同上。
【図８−３】同上。
【図８−４】同上。
【図８−５】同上。
【図９−１】ＮＯＸ２オキシダーゼ阻害物質を、エンドソームを標的として送達すると、インフルエンザＡ型ウイルス感染後にｉｎ  ｖｉｖｏでマウスを保護することを示す、写真およびグラフの提示である。（Ａ〜Ｅ）ＷＴマウス由来の肺胞マクロファージをＣｙ５コレスタノール−ＰＥＧリンカーフルオロフォア（Ｃｙ５−ｃｈｏｌ；１００ｎＭ）で３０分間処理し、ＨＫｘ３１インフルエンザＡ型ウイルス（ＭＯＩは１０）に感染させた。次いで、細胞をＡ）およびＢ）ＥＥＡ１、Ｃ）ＮＯＸ２またはＤ）インフルエンザＡ型核タンパク質（ＮＰ）のいずれかに対する抗体で対比標識した。次いで、すべての細胞を４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色し、共焦点顕微鏡で撮像した。Ｂ）細胞をダイナソア（１００μＭ）で３０分間前処理した後、Ｃｙ５−コレスタノールに曝露した。Ｅ）Ａ〜Ｄから取得したデータを定量化した（ｎ＝５）。Ｆ）ＲＡＷ２６４．７マクロファージを無処理とするか、または種々の濃度のコレスタノール結合ｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴ（Ｃｇｐ９１）、エチル結合ｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴ（Ｅｇｐ９１）もしくは非結合ｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴ（Ｕｇｐ９１）で３０分間処理した後、ＲＯＳ生成をＬ−Ｏ１２（１００μＭ）増強化学発光により定量した（ｎ＝７）。（Ｇ）キサンチン／キサンチンオキシダーゼ無細胞アッセイによる、Ｕｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴ（１μＭ）またはＣｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴ（１μＭ）の非存在または存在下でのスーパーオキシド生成を示す（ｎ＝６）。（Ｈ〜Ｉ）Ｕｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴ（０．０２ｍｇ／ｋｇ／日）またはＣｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴ（０．０２ｍｇ／ｋｇ／日）を１日１回４日間、ＷＴマウスに鼻腔内投与により送達した。最初の阻害物質投与後２４時間で、マウスを食塩水で処置するか、またはＨＫｘ３１インフルエンザＡ型ウイルス（１マウスあたり１×１０５ＰＦＵ）に感染させた。感染後３日目にマウスを選別し、Ｈ）気道炎症をＢＡＬＦ細胞計数により評価し、Ｉ）肺ＩＦＮ−β  ｍＲＮＡをＱＰＣＲにより定量した（ｎ＝７）。（ｎ．ｓ）は、非有意を意味する。（Ｊ〜Ｍ）ＮＯＸ２阻害物質を０．２ｍｇ／ｋｇ／日の用量で送達したことを除いてＨ）と同様に、マウスをＮＯＸ２阻害物質処置法およびウイルス感染プロトコルに供した（ｎ＝７）。Ｊ）気道炎症をＢＡＬＦ計数により、Ｋ）体重（１日目の測定値からの％体重変化）、Ｌ）ＢＡＬＦ炎症細胞によるＲＯＳ生成をＬ−Ｏ１２増強化学発光を用いて、およびＭ）ウイルスｍＲＮＡをＱＰＣＲにより解析した。データは、平均値±ＳＥＭとして表す。Ｅ）独立ｔ検定を行い、Ｐ＜０．０５の場合に統計学的に有意であるとした。（Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、Ｌ）一元配置分散分析の後、Ｄｕｎｎｅｔｔのポストホック検定を行って多重比較した。（ＩおよびＭ）Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定の後、Ｄｕｎｎのポストホック検定を行って多重比較した。統計学的有意性は、Ｐ＜０．０５の場合に認めた。＊はＰ＜０．０５であり、＊＊はＰ＜０．０１である。
【図９−２】同上。
【図９−３】同上。
【図９−４】同上。
【図１０−１】ａ〜ｄは、ヒトＴＬＲ７上のすべてのシステイン残基の位置を実証する多重配列アラインメント解析を示す。ヒトＴＬＲの個々の配列は、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベースから次の受託番号、ＴＬＲ１（ＣＡＧ３８５９３．１）、ＴＬＲ２（ＡＡＨ３３７５６．１）、ＴＬＲ３（ＡＢＣ８６９１０．１）、ＴＬＲ４（ＡＡＦ０７８２３．１）、ＴＬＲ５（ＡＡＩ０９１１９．１）、ＴＬＲ６（ＢＡＡ７８６３１．１）、ＴＬＲ７（ＡＡＺ９９０２６．１）、ＴＬＲ８（ＡＡＺ９５４４１．１）、ＴＬＲ９（ＡＡＺ９５５２０．１）およびＴＬＲ１０（ＡＡＹ７８４９１．１）により入手し、次いで、配列アラインメントをＣＬＵＳＴＡＬ  ＯＭＥＧＡ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ）により実施した。赤色の点による四角形の囲みで示すものは、ヒトＴＬＲ７上のシステインであり、それぞれの位置を示す。
【図１０−２】同上。
【図１０−３】同上。
【図１０−４】同上。
【図１１−１】ａ〜ｃは、脊椎動物ＴＬＲ７の多重配列アラインメント解析を示す。ＴＬＲの個々の配列は、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋタンパク質データベースから次の受託番号、タイセイヨウサケ（ＣＣＸ３５４５７．１）、ネッタイツメガエル（ＡＡＩ６６２８０．１）、セキショクヤケイ（ＡＣＲ２６２４３．１）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ＡＡＩ３２３８６．１）、ドブネズミ（ＮＰ＿００１０９１０５１．１）、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）（ＡＡＺ９９０２６．１）、イノシシ（ＡＢＱ５２５８３．１）およびウシ（ＮＰ＿００１０２８９３３．１）により入手し、次いで、配列アラインメントをＣＬＵＳＴＡＬ  ＯＭＥＧＡ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ）により実施した。赤色の点による四角形の囲みで示すものは、ヒトＴＬＲ７上のシステインであり、それぞれの位置を示す。
【図１１−２】同上。
【図１１−３】同上。
【図１２】図１２ａおよびｂは、Ｃ９８ｉの非存在または存在下でＴＬＲ７アゴニストであるイミキモドへの曝露後に骨髄由来マクロファージにより生成されるＩＬ−１βサイトカインの発現データを示す、グラフの提示である。Ｃ９８ｉ処理の持続時間は１時間であり、その後、イミキモドに曝露して、２４時間後にサイトカインを定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。
【図１３】Ｃ９８ｉの非存在または存在下でＴＬＲ７アゴニストであるガーディキモドへの曝露後に骨髄由来マクロファージにより生成されるＩＬ−１βサイトカインの発現データを示す、グラフの提示である。Ｃ９８ｉ処理の持続時間は１時間であり、その後、イミキモドに曝露して、２４時間後にサイトカインを定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。
【図１４】Ｃ９８ｉへの曝露後に骨髄由来マクロファージにより生成されるＩＬ−１βサイトカインの発現データを示す、グラフの提示である。Ｃ９８ｉ処理の持続時間は、１時間であり、２４時間後にサイトカインを定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。
【図１５】Ｃ９８ｉの非存在または存在下でＴＬＲ７アゴニストであるイミキモドへの曝露後に骨髄由来マクロファージによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されるＩＬ−１βサイトカインのタンパク質発現のデータを示す、グラフの提示である。Ｃ９８ｉ処理の持続時間は１時間であり、その後、イミキモドに曝露して、２４時間後にサイトカインをＥＬＩＳＡにより測定した。
【図１６】ａおよびｂは、ＴＬＲ７アゴニストであるイミキモド、およびＴＡＴを有しないＣ９８ｉ（ｎｏＴＡＴ）に応答した、ＩＬ−１β生成（ａ）および細胞生存率（ｂ）の図表の提示である。
【図１７】Ｃ９８ｉがインフルエンザＡ型（Ｘ３１）ウイルス応答（ＩＬ−６ＧＡＰＤＨ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害すること（Ｃ９８ｉ  ３０μＭ＋Ｘ３１−ＩＬ−６ｍＲＮＡ発現）を示す、グラフの提示である。
【図１８】Ｃ９８ｉのスクランブルアミノ酸配列が、ＴＬＲ７アゴニスト（イミキモド）に対して作用しなかったことを示す、グラフの提示である。スクランブルアミノ酸配列は、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＣＬＶＰＮＤＣＲＬＶ−ＮＨ２（配列番号４４）である。
【図１９】Ｃ９８ｉ  ＲＣＮＣ（配列番号４５）の短いモチーフのいずれも、およびその修飾形態（ＲＡＮＣ、配列番号４６；ＲＡＮＡ、配列番号４７；またはＲＣＮＡ、配列番号４８）のいずれも、ＴＬＲ７アゴニスト（イミキモド）応答をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害できなかったことを示す、グラフの提示である。ペプチドは、１００μＭ±１０μｇ／ｍｌイミキモドで使用し、ＩＬ−６ｍＲＮＡ発現を測定した。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本明細書を通して、文脈上他に必要とされない限り、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」のような変化形は、述べられた要素もしくは整数もしくは方法ステップまたは要素もしくは整数もしくは方法ステップの群を包含することを意味するが、他の任意の要素もしくは整数もしくは方法ステップまたは要素もしくは整数もしくは方法ステップの群を除外することを意味しないことが理解され得る。
【００３４】
対象明細書において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明らかに述べない限り、複数の態様を含む。したがって、例えば、「ａ  ｐａｔｈｏｇｅｎ（病原体）」に言及する場合、単一の病原体、ならびに２つ以上の病原体を含み、「ａｎ  ａｇｅｎｔ（薬剤）」に言及する場合、単一の薬剤、ならびに２つ以上の薬剤を含み、「ｔｈｅ  ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ（開示）」に言及する場合、開示により教示する単一および複数の態様を含む等とする。本明細書において教示および可能とする態様は、用語「発明」により包含する。本明細書において検討する、いかなる変形および派生物も、本発明の「形態」により包含する。本発明のすべての態様は、本特許請求の範囲にわたって可能とする。
【００３５】
本発明は、細胞のエンドソーム区画にウイルスが侵入すると、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ）依存性の活性酸素種（ＲＯＳ）生成がエンドソームにおいて引き起こされるという決定に部分的に基づく。エンドソームＲＯＳが、抗ウイルス免疫を付与する分子機構の負の制御因子であり、Ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）の活性化に依存すると決定されている。ＴＬＲ７活性化に対する拮抗によりＲＯＳ生成を制限することが可能であれば、不偏的抗ウイルス療法ならびに抗病原体療法がより一般的に提供可能となる。ＴＬＲ７活性化に対する拮抗により、さもなければ免疫刺激と拮抗し得るＲＯＳの生成が制限される。ＴＬＲ７それ自体が、炎症の形態と関連することを考慮すれば、本発明は、微生物感染症（例えば、細菌および真菌等の微生物）、自己免疫疾患症状、炎症ならびにがんの治療において広範な意義を有する。したがって、ＴＬＲ７活性化に対する拮抗は、ＴＬＲ７活性化と関連する、またはＴＬＲ７活性化により増悪する、疾患および症状の回復に役立つ。
【００３６】
したがって、本発明は、
（ｉ）ＮＯＸ２を介するエンドソームＲＯＳ生成の減少、
（ｉｉ）炎症症状の軽減をもたらす活性化ＴＬＲ７の減少、
（ｉｉｉ）免疫刺激低下の低減、
（ｉｖ）液性免疫応答ネットワークの負の制御の低減、
（ｖ）病原体感染能の低下、
（ｖｉ）炎症の軽減、
（ｖｉｉ）がん増殖能の低下、および／または
（ｖｉｉｉ）これらにより生じる自己免疫症状もしくは疾患の回復
をもたらす、活性化ＴＬＲ７レベルの低下を可能とする。
【００３７】
したがって、ＴＬＲ７により媒介される免疫刺激活性を対象において阻害する方法であって、ＴＬＲ７を発現する対象由来の細胞を、ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間またはその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する有効量の薬剤と接触させることを含む方法を本明細書において可能とする。
【００３８】
自己免疫疾患、ウイルスもしくは微生物による病態形成、炎症またはがんについて対象を治療する方法であって、ＴＬＲ７を発現する対象由来の細胞を、ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間またはその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する有効量の薬剤と接触させることを含む方法を本明細書においてさらに可能とする。
【００３９】
活性酸素種の過剰生成について対象を治療する方法であって、ＴＬＲ７を発現する対象由来の細胞を、ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間またはその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する有効量の薬剤と接触させることを含む方法をまた本明細書において可能とする。
【００４０】
ＴＬＲ７により媒介される炎症について対象を治療する方法であって、ＴＬＲ７を発現する対象由来の細胞を、ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間またはその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する有効量の薬剤と接触させることを含む方法を本明細書において可能とする。
【００４１】
自己免疫症状について対象を治療する方法であって、ＴＬＲ７を発現する対象由来の細胞を、ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間またはその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する有効量の薬剤と接触させることを含む方法を本明細書においてさらに可能とする。
【００４２】
がんについて対象を治療する方法であって、ＴＬＲ７を発現する対象由来の細胞を、ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間またはその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する有効量の薬剤と接触させることを含む方法を本明細書においてまたさらに可能とする。
【００４３】
ＴＬＲ７に言及する場合、任意の種由来の任意のＴＬＲ７を含む。一般には、言及するＴＬＲ７は、治療する対象由来のＴＬＲ７である。したがって、対象がヒトである場合、アンタゴニストは、細胞により発現するヒトＴＬＲ７であり得る。ヒトＴＬＲ７のアミノ酸配列は、配列番号２０に定義する。種々の種由来のＴＬＲ７のアミノ酸配列の比較は、図１１（Ｆｉｇｕｒｅ  １１）に定義する。４７５番目のアミノ酸（Ｃ４７５）のシステインとジスルフィド結合を形成する９８番目のアミノ酸（Ｃ９８）、または種々の種由来のホモログにおける対応する位置のシステイン残基（Ｃｙｓ；Ｃ）は、重要である。このようなアミノ酸の位置は、ＴＬＲ７分子において種を越えて保存されている。ある実施形態では、本発明は、このジスルフィド結合の形成と拮抗して、活性化ＴＬＲ７レベルの低下をもたらす。次いで、これによってＴＬＲ７により媒介される免疫刺激が減少し、ＮＡＤＰＨオキシダーゼにより媒介されるＲＯＳ形成が減少する。
【００４４】
このジスルフィド結合を形成するペアのアンタゴニストの使用を本明細書において提唱する。この薬剤は、タンパク質性または非タンパク質性であり得る。ある実施形態では、おとりペプチドは、ＴＬＲ７のＣ４７５とジスルフィド結合を形成し、これによりＣ９８とＣ４７５との間のジスルフィド結合形成を阻止することを提唱する。ある実施形態では、薬剤は、おとりペプチドの模倣化合物である。
【００４５】
微生物病原体の例としては、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）菌種（結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・カンサシ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）およびマイコバクテリウム・ゴルドネ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）等）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ））、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群レンサ球菌）、レンサ球菌（嫌気性菌種）、肺炎レンサ球菌、病原性カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）菌種、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）菌種、インフルエンザ菌、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌種、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）菌種、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバチルス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、トレポネーマ・ペルテニュ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）およびアクチノマイセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉ）が挙げられる。病原性真菌の例としては、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）およびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）���挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
ウイルス病原体の例としては、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含むが、これに限定されない）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）、カリシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（胃腸炎を引き起こす株等）、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、コロナウイルス）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、エボラウイルス）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、インフルエンザウイルス）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ハンタウイルス（Ｈａｎｔａａｎ  ｖｉｒｕｓ）、ブニヤウイルス、フレボウイルス、およびナイロウイルス（Ｎａｉｒｏ  ｖｉｒｕｓ））、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａ  ｖｉｒｉｄａｅ）（出血熱ウイルス）、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、およびロタウイルス）、ビルナウイルス科（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）（Ｂ型肝炎ウイルス）、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）（パルボウイルス）、パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（ほとんどのアデノウイルス）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型およびＨＳＶ−２型、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ））、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）、およびイリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（アフリカブタコレラウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）等）、ならびに未分類ウイルス（例えば、海綿状脳症の病原体、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの不完全なサテライトであると考えられる）、非Ａ型、非Ｂ型肝炎の病原体（クラス１＝内部感染、クラス２＝非経口的に感染（すなわち、Ｃ型肝炎））、ノーウォークおよび関連するウイルス、ならびにアストロウイルス）が挙げられる。
【００４７】
がんまたは腫瘍は、急性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、神経膠腫、膀胱がん、胆道がん、乳がん、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、絨毛癌、上皮細胞がん、胃がん、肝細胞がん、ホジキンリンパ腫、肺がん、リンパ球系細胞由来の白血病、黒色腫、骨髄腫、非小細胞肺癌、上咽頭がん、卵巣がん、前立腺がん、膵臓がん、腎臓がん、頸部および食道の扁平上皮がん、精巣がん、Ｔ細胞白血病ならびに黒色腫を含む。
【００４８】
自己免疫障害は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、炎症性腸疾患、シェーグレン症候群、多発性筋炎、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、強直性脊椎炎、ライター症候群、乾癬性関節炎およびベーチェット症候群を含む。ある実施形態では、自己免疫障害は、免疫複合体に関連する疾患である。免疫複合体関連疾患は特に、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、結節性多発動脈炎、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、クリオグロブリン血症、ならびに急性および慢性血清病を含むが、これらに限定されない。
【００４９】
本発明により考えられる炎症性疾患症状の例としては、傷害または疾患により冒された組織を保護することを意図する、特定領域における、赤み、腫れ、疼痛の応答、および熱感を生じる疾患および障害が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法を使用して治療可能な炎症疾患は、ざ瘡、狭心症、関節炎、喘息、誤嚥性肺炎疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、大腸炎、膿胸、胃腸炎、腸感冒、壊死性腸炎、骨盤内炎症性疾患、咽頭炎、胸膜炎、咽喉の痛み、発赤、咽喉炎、尿路感染症、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、慢性炎症性脱髄性多発神経根筋障害を含むが、これらに限定されない。
【００５０】
おとりペプチドは、アミノ酸４〜１９０個の長さを含み、ある実施形態では、ＴＬＲ７のＲ９７〜Ｃ１００に対応するアミノ酸配列ＲＣＮＣを含む。この配列は、種を越えて保存される。ＴＬＲ７もしくはその等価物のＣ９８またはＴＬＲ７ホモログもしくは変異体における対応する位置は、重要である。ある実施形態では、おとりペプチドは、
（ａ）アミノ酸４〜１９０個の長さと、
（ｂ）ＴＬＲ７のＲ９７〜Ｃ１００に対応するアミノ酸配列ＲＣＮＣと、
（ｃ）ＴＬＲ７のＣ９８に対応する位置にシステインと
を含む。
【００５１】
アミノ酸は、Ｃ９８に対応するシステインを除き、コンフォメーションについてまたは機能的に等価または類似のアミノ酸に関して置換することができる。
【００５２】
ある実施形態では、薬剤は、ＴＬＲ７のアミノ酸４〜１９４間の連続アミノ酸最大１９０個に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を有する、アミノ酸４〜１９０個の長さの、「おとりペプチド」と呼ぶペプチドを含み、ＴＬＲ７のアミノ酸４８〜１４８の間の連続アミノ酸最大１００個に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を有するペプチドを含み、ＴＬＲ７のアミノ酸７８〜１１８の間の連続アミノ酸最大４０個に対して少なくとも７０％のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列を有するペプチドをも含み、但し、ペプチドがＴＬＲ７の９８番目に相当する位置にシステイン残基（Ｃ９８）を含むことを条件とする。ペプチドは、アミノ酸４〜１９０個の長さであり得る。
【００５３】
おとりペプチドの長さに関する表現「４〜１９０個」は、アミノ酸４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８，１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９および１９０個の長さを含む。アミノ酸４８〜１４８間の領域は、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７および１４８番目を含む。７８〜１１８の間の領域は、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６，１１７および１１８番目を含む。パーセント類似性に関する表現「少なくとも７０％」は、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９および１００％を含む。
【００５４】
用語「類似性」は、本明細書において使用する場合、比較する配列間のアミノ酸レベルでの正確な同一性を含む。非同一性がアミノ酸レベルで存在する場合、「類似性」は、構造的、機能的、生化学的および／またはコンフォメーションレベルで、それでもなお相互に関連するアミノ酸を含む。特に好ましい実施形態では、ヌクレオチドおよび配列の比較は、類似性ではなく同一性のレベルで行う。
【００５５】
２つ以上のペプチド間の配列関係を説明するために使用する用語は、「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列類似性」、「配列同一性」、「パーセント配列類似性」、「パーセント配列同一性」、「実質的に類似」および「実質的同一性」を含む。「参照配列」は、アミノ酸残基少なくとも４個以上の長さを含むものである。２つのポリペプチドがそれぞれ、（１）２つのポリペプチド間で類似する配列（すなわち、完全なＴＬＲ７アミノ酸配列の一部分のみ）、および（２）２つのポリペプチド間で分岐するアミノ酸配列を含むため、２つ（またはそれよりも多く）のポリペプチド間の配列比較は典型的に、「比較ウインドウ」にわたって配列を比較して、配列が類似する局所領域を同定および比較することにより実施する。「比較ウインドウ」は、参照配列と比較する典型的に４つの連続アミノ酸残基の概念的区域を指す。比較ウインドウは、２つの配列の最適アラインメントについて参照配列（付加または欠失を含まない）と比較した場合に約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウインドウを整列させるための配列の最適アラインメントは、アルゴリズム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ社、５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ州、米国によるＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ７．０のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）をコンピュータによって実行することにより、または検査、および選択された種々の任意の方法により生成する最良のアラインメント（すなわち、比較ウインドウにわたるパーセント相同性が最も高くなる）により行われ得る。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５巻３３８９頁により開示されるように、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラムをまた参照することができる。配列解析の詳細な考察は、ＡｕｓｕｂｅｌらＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．１９９４〜１９９８年のＵｎｉｔ１９．３に見出すことができる。ＴＬＲ７アミノ酸配列の比較は、図１０ａ〜ｄ（Ｆｉｇｕｒｅ  １０Ａ〜Ｄ）に提示する。
【００５６】
用語「配列類似性」および「配列同一性」は、本明細書において使用する場合、配列が、比較ウインドウにわたって単一アミノ酸単位で、同一である、または機能的もしくは構造的に類似している程度を指す。したがって、「パーセント配列同一性」は、例えば、比較ウインドウにわたって最適に整列させた２つの配列を比較し、同一アミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＭｅｔ）が両方の配列において生じる位置数を決定して適合した位置数を得、適合した位置数を比較ウインドウの総位置数（すなわち、ウインドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けてパーセント配列同一性を得ることにより計算する。本発明の目的において、「配列同一性」は、ＤＮＡＳＩＳコンピュータプログラム（ｗｉｎｄｏｗｓ用バージョン２．５、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州、米国から入手可能）により、ソフトウェアに添付の参照マニュアルにおいて使用する標準的初期設定を使用して計算した「適合パーセント」を意味すると理解され得る。配列類似性に関しては、類似のコメントを適用されたい。
【００５７】
ある実施形態では、ヒトＴＬＲ７のアミノ酸４〜１９４の間のアミノ酸配列に対するパーセント類似性は、少なくとも８０％または８５％または９０％または９５％または９９％である。これは、ヒトＴＬＲ７の、アミノ酸４８〜１４８の間、および７８〜１１８の間のパーセント類似性にも適用する。
【００５８】
したがって、薬剤は、ペプチドまたはおとりペプチドならびにＣ９８とＣ４７５との間のジスルフィド結合形成に拮抗する非タンパク質性化学物質を含む。非タンパク質性化学物質は、Ｃ９８ｉの模倣化合物を含む。おとりペプチドは、Ｃ９８に相当する位置にシステインを含む。おとりペプチドはまた、ヒトＴＬＲ７のＲ９７〜Ｃ１００に対応するアミノ酸配列ＲＣＮＣを含み得る。
【００５９】
ある実施形態では、おとりペプチドは、配列番号２７に対する少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の類似性を含む最適アラインメントの後に、アミノ酸配列ＤＸ１ＲＣＮＣＸ２ＰＸ３Ｘ４（配列番号２７）（ここで、
Ｘ１はＬ、ＦまたはＭであり、
Ｘ２はＶまたはＩであり、
Ｘ３はＶまたはＩまたはＡまたはＰであり、
Ｘ４はＰまたはＬまたはＫまたはＲである）、または配列番号２７に対して少なくとも約７０％の類似性を有するアミノ酸配列を有する、アミノ酸１０個を含む。上記の配列は、ヒトＴＬＲまたはその等価物の９５〜１０４番目のアミノ酸に対応する。ヒトＴＬＲ７は、１０４番目にＰを含む。マウスＴＬＲ７では、アミノ酸Ｌが、１０４番目である。ともに９５番目にＤを有する。
【００６０】
ある実施形態では、おとりペプチドは、ヒトＴＬＲ７のアミノ酸７８〜１１８から選択されるアミノ酸４〜４０個を含み、但し、ペプチドがヒトＴＬＲ７のＣ９８に対応する位置にシステイン残基を含むか、またはペプチドがヒトＴＬＲ７のＲ９７〜Ｃ１００に対応する位置にアミノ酸配列ＲＣＮＣを含むことを条件とする。
【００６１】
さらに別の実施形態では、おとりペプチドは、最適アラインメントの後に、ヒトＴＬＲ７のＤ９５〜Ｐ１０４に対応するアミノ酸配列ＤＦＲＣＮＣＶＰＩＰ（配列番号２６）、または配列番号２０に対して少なくとも７０％の類似性を有するアミノ酸配列を含み、但し、ペプチドがＴＬＲ７のＣ９８に対応する位置にシステインを含むことを条件とする。特定の実施形態では、おとりペプチドは、配列番号２０に定義するアミノ酸配列を含む。対応するマウスＴＬＲ７おとりペプチド配列は、最適アラインメントの後に、ＤＬＲＣＮＣＶＰＶＬ（配列番号１）であるか、または配列番号１に対して７０％の類似性を有し、但し、ペプチドがＴＬＲ７のＣ９８に対応する位置にシステインを含むことを条件とする。
【００６２】
１つまたは複数のアミノ酸を１つまたは複数のアミノ酸類似体で置換し得るか、または１つまたは複数の側鎖を修飾し得る。このような修飾により、血中半減期を向上させ、安定性を向上させることができる。
【００６３】
本発明により検討する側鎖修飾の例としては、アルデヒドとの反応後、ＮａＢＨ４での還元による還元的アルキル化等によるアミノ基の修飾；メチルアセトイミデートによるアミジン化；無水酢酸によるアシル化；シアン酸によるアミノ基のカルバモイル化；２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸およびテトラヒドロフタル酸無水物によるアミノ基のアシル化；ならびにピリドキサール−５−リン酸によるリジンのピリドキシル化の後、ＮａＢＨ４による還元が挙げられる。
【００６４】
アルギニン残基のグアニジン基は、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオキサールのような試薬による複素環縮合物の形成により修飾することができる。
【００６５】
カルボキシ基は、Ｏ−アシルイソ尿素形成によるカルボジイミド活性化の後に引き続く、例えば、対応するアミドへの誘導体化により修飾することができる。
【００６６】
スルフィドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物による混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドによる反応；４−クロロ水銀安息香酸、４−クロロ水銀フェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノールおよび他の水銀化合物を使用する水銀誘導体の形成；アルカリ性ｐＨでのシアン酸によるカルバモイル化のような方法により修飾することができる。
【００６７】
トリプトファン残基は、例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミドによる酸化、または２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミドもしくはハロゲン化スルフェニルによるインドール環のアルキル化により修飾することができる。一方、チロシン残基は、テトラニトロメタンによるニトロ化により変化させて３−ニトロチロシン誘導体を形成することができる。
【００６８】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化、またはジエチルピロカルボネートによるＮ−カルボエトキシル化により達成することができる。
【００６９】
ペプチド合成において組み込む非天然アミノ酸および誘導体の例としては、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、２−チエニルアラニンおよび／またはアミノ酸のＤ異性体の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
架橋剤を使用して、例えば、３Ｄコンフォメーションを安定化することができ、ｎ＝１からｎ＝６の（ＣＨ２）ｎスペーサー基を有する二機能性イミドエステル、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのようなホモ二機能性架橋剤、ならびにＮ−ヒドロキシスクシンイミドのようなアミノ反応性部分およびマレイミドのような別の基に特異的な反応性部分またはジチオ部分（ＳＨ）もしくはカルボジイミド（ＣＯＯＨ）を通常含むヘテロ二機能性試薬を使用する。加えて、ペプチドは、例えば、ＣαおよびＮα−メチルアミノ酸の組込み、アミノ酸のＣαおよびＣβ原子間の二重結合の導入、ならびにＮおよびＣ末端間、２つの側鎖間、または側鎖とＮもしくはＣ末端との間のアミド結合の形成のような共有結合の導入による環状ペプチドまたは類似体の形成によりコンフォメーションが束縛さていてもよい。
【００７１】
模倣体は、Ｃ９８とＣ４７５との間のジスルフィド結合によるＴＬＲ７活性化の拮抗能を試験するのに有用な別の群の薬剤である。この用語は、それが模倣するが、標的（すなわち、ヒト（またはマウス）ＴＬＲ７のＣ４７５）とのその相互作用に拮抗する、おとりペプチドに対していくつかの化学的類似性を有する物質を指すことを意図する。ペプチド模倣体は、タンパク質二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子であり得る（Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９３年）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｕｒｎ  Ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｐｅｚｚｕｔｏら編、Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ社、ニューヨーク）。ペプチド模倣体の使用の基礎をなす論理的根拠は、タンパク質のペプチド骨格が、ＴＬＲ７のＣ４７５との分子相互作用を促進させるようにアミノ酸側鎖を主に方向づけるために存在することである。したがって、ペプチド模倣体は、おとりペプチドに類似の分子相互作用を可能とするようにデザインする。非タンパク質性であるが、Ｃ９８ｉと同一の作用および／またはいくつかのコンフォメーションを有する模倣化合物もまた本明細書において検討する。
【００７２】
おとりペプチドは、細胞によるペプチドの取込みを促進する部分をさらに含み得る。いかなる数または型の細胞取込み部分も利用することができ、例えば、ＴＡＴ（配列番号２）、ＳｙｎＢ１（配列番号３）、ＳｙｎＢ３（配列番号４）、ＰＴＤ−４（配列番号５）、ＡＤ−５（配列番号６）、ＦＨＶ  Ｃｏａｔ（配列番号７）、ＢＭＶ  Ｇａｇ（７−２５）（配列番号８）、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ  Ｒｅｘ−（４−１６）（配列番号９）、Ｄ−Ｔａｔ（配列番号１０）およびＲ９−Ｔａｔ（配列番号１１）が挙げられるが、これらに限定されない。このような部分は、親水性またはカチオン性ペプチドと呼ばれる。他の取込みペプチドは、トランスポータンキメラ（配列番号１２）、ＭＡＰ（配列番号１３）、ＳＢＰ（配列番号１４）、ＦＢＰＣ（配列番号１５）、ＭＰＧ［ＭＰＧａｃ］（配列番号１６）、ＭＰＧ（ΔＮＬＳ）（配列番号１７）、Ｐｅｐ−１（配列番号１８）およびＰｅｐ−２（配列番号１９）のような両親媒性ペプチドを含むが、これらに限定されない。さらに別の選択肢としては、取込み部分は、ポリアルギニンまたはポリリジンを含むもののような周期性アミノ酸配列を含む。他の取込みペプチドは、Ｇｕｉｄｏｔｔｉら（２０１７年）上記参照の表１に列挙するものであり、その内容を本明細書において参照により組み込む。
【００７３】
ヒトＴＬＲ７を標的とすることにより治療する対象はヒトを含むが、本発明は、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ）、家庭のペット（例えば、ネコ、イヌ）ならびに捕獲した野生動物および研究所の試験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ）の治療のような獣医学的適用を包含する。ある実施形態では、対象はヒトである。
【００７４】
したがって、ＴＬＲ７により媒介される免疫刺激活性をヒト対象において阻害する方法であって、ＴＬＲ７を発現する対象由来の細胞を、ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間またはその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する有効量の薬剤に接触させることを含む方法を本明細書において可能とする。
【００７５】
自己免疫疾患、ウイルスもしくは微生物による病態形成、炎症またはがんについてヒト対象を治療する方法であって、ＴＬＲ７を発現する対象由来の細胞を、ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間またはその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する有効量の薬剤に接触させることを含む方法を本明細書においてさらに可能とする。
【００７６】
活性酸素種の過剰生成についてヒト対象を治療する方法であって、ＴＬＲ７を発現する対象由来の細胞を、ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間またはその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する有効量の薬剤に接触させることを含む方法をまた本明細書において可能とする。
【００７７】
ＴＬＲ７により媒介される炎症についてヒト対象を治療する方法であって、ＴＬＲ７を発現する対象由来の細胞を、ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間またはその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する有効量の薬剤に接触させることを含む方法を本明細書において可能とする。
【００７８】
自己免疫症状についてヒト対象を治療する方法であって、ＴＬＲ７を発現する対象由来の細胞を、ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間またはその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する有効量の薬剤に接触させることを含む方法を本明細書においてさらに可能とする。
【００７９】
がんについてヒト対象を治療する方法であって、ＴＬＲ７を発現する対象由来の細胞を、ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間またはその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する有効量の薬剤に接触させることを含む方法を本明細書においてまたさらに可能とする。
【００８０】
薬剤がおとりペプチドである場合、アミノ酸配列は、治療する同一種のＴＬＲ７（例えば、ヒト対象を治療するためのヒトＴＬＲ７）に一般に由来する。これは、自家治療と呼ばれる。しかし、別の種における使用において、ある種のＴＬＲとの間に実質的なアミノ酸配列類似性が存在する場合、異種治療が検討され、これは、本発明により包含する。
【００８１】
自己免疫疾患、ウイルスもしくは微生物による病態形成、炎症またはがんを対象において阻害する医薬の製造における、ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間またはその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する薬剤の使用を本明細書においてさらに教示する。
【００８２】
対象における自己免疫疾患、ウイルスもしくは微生物による病態形成、炎症またはがんの阻害における使用のための、ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間またはその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する薬剤を本明細書において可能とする。
【００８３】
ＴＬＲ７のＣ９８とＣ４７５との間またはその対応する位置の間のジスルフィド結合形成に拮抗する薬剤、ならびに１つまたは複数の医薬担体、賦形剤および／または希釈剤を含む医薬組成物を本明細書においてまたさらに可能とする。
【００８４】
活性酸素種の過剰生成について、またはＴＬＲ７により媒介される炎症について対象を治療するための、使用および薬剤を本明細書においてまた可能とする。
【００８５】
薬剤は、その薬剤の薬学的に許容される塩を含む。用語「薬学的に許容される塩」は、本発明の薬剤の生理学的および薬学的に許容される塩、すなわち、その親薬剤の所望の生物活性を保持し、望ましくない毒性学的作用をそれに分与しない塩を指す。
【００８６】
本発明の医薬組成物は、局所治療または全身治療のいずれが望ましいか、および治療する領域に応じて、多数の方法で投与することができる。投与は、局所投与（点眼ならびに膣および直腸への送達を含む粘膜への投与を含む）、例えば、噴霧器によるものを含む、散剤またはエアロゾルの吸入または吹送による肺内投与、気管内投与、鼻腔内投与、上皮および経皮投与、経口投与あるいは非経口投与であり得る。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内への注射または輸注、あるいは頭蓋内、例えば、髄腔内または脳室内への投与を含む。局所投与のための医薬組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤および散剤を含み得る。在来の医薬担体、水性、粉末または油性の基剤、増粘剤等が、必要であるか望ましい場合がある。
【００８７】
本発明の医薬製剤は、単位剤形で好都合に提供することができ、製薬業界において公知の在来の技術に従って調製することができる。このような技術は、有効成分を医薬担体（複数可）または賦形剤（複数可）と会合させることを含む。一般には、製剤は、有効成分を液体担体もしくは微粉化した固体担体または両方と均一および密接に会合させ、次いで、必要に応じて、生成物を成形することにより調製する。
【００８８】
本発明の組成物は、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、ソフトゲル、坐剤、および浣腸のような多くの可能な任意の剤形に処方することができるが、これらに限定されない。本発明の組成物はまた、水性、非水性または混合培地中の懸濁剤として処方することができる。水性懸濁剤は、懸濁剤の粘性を増加させる物質をさらに含むことができ、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む。懸濁剤はまた、安定剤を含むことができる。
【００８９】
本発明の製剤は、リポソーム製剤を含む。本発明において使用する場合、用語「リポソーム」は、球状二重層または二重層に配置される両親媒性脂質から構成される小胞を意味する。リポソームは、単層または多重層の小胞であり、親油性の物質と送達する組成物を含む水性の内部から形成される膜を有する。
【００９０】
治療組成物の処方およびその後の投与（投薬）は、当業者の技能の範囲内にあると考えられる。投薬は、治療する病状の重症度および応答性に依存し、治療の経過は、数日から数カ月、または治癒がもたらされるか、もしくは病状の減退が達成されるまで持続する。最適な投薬スケジュールは、患者の体内における薬物蓄積の測定値から計算することができる。当業者は、最適投与量、投薬方法および反復率を容易に決定することができる。最適投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対効力に応じて変化することがあり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルにおいて有効であることが分かっているＥＣ５０ｓに基づいて一般に推定することができる。一般には、投与量は、体重１ｋｇあたりおとりペプチド０．０１μｇ〜１００ｇであり、１日、１週、１カ月もしくは１年に１回または複数回、または２〜２０年毎に１回のみ投与され得る。当業者は、体液または体組織において測定した薬物の滞留時間および濃度に基づいて投薬の反復率を容易に推定することができる。治療が成功した後に、患者に維持療法を受けさせて、病状の再発を防ぐことが望ましいことがあり、この場合、薬剤は、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇの範囲の維持量で数日、数週または数カ月にわたって投与する。
【００９１】
標的とする細胞は一般に、自然および適応免疫細胞またはＴＬＲ７を発現する任意の細胞である。例としては、貪食細胞（例えば、マクロファージ、好中球および樹状細胞）、NK細胞、マスト細胞、好酸球、好塩基球、ＢおよびＴリンパ球などのリンパ球、ならびに上皮細胞が挙げられる。
【実施例】
【００９２】
本明細書において開示する態様を、以下の非限定的実施例によりさらに説明する。
【００９３】
材料および方法
ウイルス
インフルエンザＡ型ウイルス（ＩＡＶ）ワクチン株ＨＫｘ３１（Ｈ３Ｎ２）およびＢＪｘ１０９（Ｈ３Ｎ２）は、ディーキン大学医学部およびメルボルン大学免疫微生物学部ピーター・ドハーティ感染免疫研究所により提供された。ウイルスは、６．７×１０８プラーク形成単位／ｍｌ（ＰＦＵ／ｍｌ）で提供され、−８０℃で保存された。アリコートを解凍し、使用する当日にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、米国（Ｎｏ．Ｄ８３７）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染に必要とする場合）で希釈した。ヒトＩＡＶウイルスは、季節性Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／５５／２００４、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／９／２００７）、季節性Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｂｒａｚｉｌ／１１／１９７８、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６）、Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９株（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９、Ａ／Ａｕｃｋｌａｎｄ／１／２００９）、ライノウイルス（ＲＶ１６株）、呼吸器合胞体ウイルス（Ａ２株）、ヒトパラインフルエンザウイルス３型（Ｃ２４３）、ヒトメタニューモウイルス（ＣＡＮ９７−８３株）、ムンプスウイルス（Ｅｎｄｅｒｓ株）およびニューカッスル病ウイルス（Ｖ４株）を含み、メルボルン大学免疫微生物学部ピーター・ドハーティ感染免疫研究所により提供された。さらなるウイルスは、次の研究所により提供された：デングウイルス血清型２型（Ｖｉｅｔｎａｍ２００５単離菌、モナシュ大学、クレイトン、ビクトリア州）、ロタウイルス（アカゲザルおよびＵＫ株、微生物免疫学部ピーター・ドハーティ感染免疫研究所）、センダイウイルス（Ｃａｎｔｅｌｌ株、モナシュ大学ハドソン医学研究所、単純ヘルペスウイルス２型（１８６株、モナシュ大学ハドソン医学研究所）、ワクシニアウイルス（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ株、ＷＲ  ＮＩＨ−ＴＣ、オーストラリア国立大学）およびＨＩＶ（ＮＬ４−３（ＡＤ８）−ＥＧＦＰ株、メルボルン大学ピーター・ドハーティ感染免疫研究所）。ウイルスは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Ｃａｔ＃Ｄ８５３７、Ｓｉｇｍａ社、米国）中に提供され、使用するまで−８０℃で保存された。使用する当日に、ウイルスを急速に解凍し、３７℃でインキュベートした後、感染させた。指示する場合、ＨＫｘ３１ウイルスは、熱（５６℃）により３０分間またはＵＶ光（３０分）により不活化した。
【００９４】
細菌
肺炎レンサ球菌ＥＦ３０３０（カプセル型１９Ｆ）を親肺炎レンサ球菌株としてすべての実験において使用した（豪国メルボルン大学により提供された）。ＥＦ３０３０株は、典型的に、菌血症ではない状態の鼻咽頭に定着するため、ヒト保菌モデルとして頻用される臨床的単離菌である。感染実験では、肺炎レンサ球菌は、０．５％ｗ／ｖの酵母抽出物を添加したＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ培地中に０．４〜０．４５の光学密度（６００ｎｍ）まで３７℃で静的に増殖させた。培養物を湿った氷上に５分間置き、８％ｖ／ｖのグリセリン中に−７０℃で凍結した。生菌数を確認した後に各実験を行った。分類不可能なインフルエンザ菌の定義の株（ＮＴＨｉ；ＭＵ／ＭＭＣ−１）は、発明者らがこれまでに示したように（Ｋｉｎｇら（２０１３年）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１３１巻（５号）１３１４〜１３２１頁ｅ１３１４頁）、事前に分類および配列決定され、ＮＴＨｉであることが実証された。
【００９５】
Ｃ９８ｉカスタムペプチド
次のカスタムペプチドをＧｅｎｉｃＢｉｏ  Ｌｉｍｉｔｅｄ社から購入した：ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＤＬＲＣＮＣＶＰＶＬ−ＮＨ２（配列番号５７）（Ｃ９８ｉ−ＴＡＴ；アミノ酸１０個のＴＬＲ７阻害物質）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＣＬＶＰＮＤＣＲＬＶ−ＮＨ２（配列番号４４）（スクランブルＣ９８ｉ−ＴＡＴ；アミノ酸１０個のＴＬＲ７阻害物質）、ＤＬＲＣＮＣＶＰＶＬ−ＮＨ２（配列番号１）（Ｃ９８ｉ−無ＴＡＴ；アミノ酸１０個の、ＨＩＶ−ＴＡＴを除くＴＬＲ７阻害物質）、ＤＦＲＣＮＣＶＰＩＰ−ＮＨ２（配列番号２６）、（ヒトＣ９８ｉ−無ＴＡＴ；アミノ酸１０個の、ＨＩＶ−ＴＡＴを除くＴＬＲ７阻害物質）、ＲＣＮＣ−ＮＨ２（配列番号４５）（４ＡＡ  Ｃ９８ｉ−無ＴＡＴ；アミノ酸４個の、ＨＩＶ−ＴＡＴを除くＴＬＲ７阻害物質）、ＲＡＮＣ−ＮＨ２（配列番号４６）（４ＡＡ  ９８Ｍ  Ｃ９８ｉ−無ＴＡＴ；システイン９８変異、アミノ酸４個の、ＨＩＶ−ＴＡＴを除くＴＬＲ７阻害物質）、ＲＡＮＡ−ＮＨ２（配列番号４７）（４ＡＡ  ９８１００Ｍ  Ｃ９８ｉ−無ＴＡＴ；システイン９８および１００変異、アミノ酸４個の、ＨＩＶ−ＴＡＴを除くＴＬＲ７阻害物質）、ＲＣＮＡ−ＮＨ２（配列番号４８）（４ＡＡ  １００Ｍ  Ｃ９８ｉ−無ＴＡＴ；システイン１００変異、アミノ酸４個の、ＨＩＶ−ＴＡＴを除くＴＬＲ７阻害物質）。すべてのペプチドを、エンドトキシンを含まない水中に溶解し、１０ｍＭの保存液としてアリコート２０μＬ、５０μＬおよび１００μＬに調製し、−２０℃で保存した。
【００９６】
ＮＯＸ２オキシダーゼ阻害物質の結合
ｇｐ９１ｄｓ−ｔａｔ（ＹＧＲＫＫ−ＲＲＱＲＲ−ＲＣＳＴＲ−ＩＲＲＱＬ−ＮＨ２、配列番号２３）の調製を標準的Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によりＦｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国、０．１７ｍｍｏｌ／ｇをロード）上で行った。Ｎ，Ｎジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％ｖ／ｖのピペリジンを使用してＦｍｏｃ脱保護反応を行った。カップリング剤としてＯ１３（６−クロロベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）および活性化剤としてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）によりＦｍｏｃ保護アミノ酸を使用してカップリング反応を行った。２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）試験を使用して反応を監視し、遊離アミノ基の非存在または存在を示した。脱保護およびカップリング反応による配列の入れ替えは、適切なＦｍｏｃ鎖および側鎖保護アミノ酸を使用して、すべてのアミノ酸残基２０個について手動で行った。最終の脱保護ステップの後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）／１，２−エタンジチオール（ＥＤＴ）／水（９２．５：２．５：２．５：２．５）を使用して４時間、ペプチドのごく一部を樹脂から切断し、その間に側鎖保護基を同時に除去した。次いで、粗ペプチドを逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ５  Ｃ８（２）１００Å  ＡＸＩＡカラム（１０Å、２５０×２１．２ｍｍ）を使用し０．１％のＴＦＡ／水および０．１％ｖ／ｖのＴＦＡ／ＡＣＮを緩衝液として用いて精製した。精製したｇｐ９１ｄｓ−ｔａｔペプチドが正確な分子量有することをＥＳＩ−ＭＳ解析により確かめた：Ｃ１０９Ｈ２０７Ｎ５２Ｏ２５Ｓの計算値［Ｍ＋５Ｈ＋］ｍ／ｚ５３５．３、観測値ｍ／ｚ５３５．７；Ｃ１０９Ｈ２０８Ｎ５２Ｏ２５Ｓの計算値［Ｍ＋６Ｈ＋］ｍ／ｚ４４６．３、観測値ｍ／ｚ４４６．６；Ｃ１０９Ｈ２０９Ｎ５２Ｏ２５Ｓの計算値［Ｍ＋７Ｈ＋］ｍ／ｚ３８２．７、観測値ｍ／ｚ３８２．９。
【００９７】
コレスタノール結合ｇｐ９１ｄｓ−ｔａｔ（ｃｇｐ９１ｄｓ−ｔａｔ；Ａｃ−Ａｓｐ（ＯＣｈｏｌ）−ＰＥＧ４−ＰＥＧ３−ＰＥＧ４−ｇｐ９１−ＮＨ２）の調製は、手動ＳＰＰＳにより樹脂結合ｇｐ９１ｄｓ−ｔａｔから（上記のように）Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ４−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ３−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ４−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＣｈｏｌ）−ＯＨをアミノ酸として使用して行った。最終の脱保護ステップの後、ＤＭＦ中の無水酢酸およびＤＩＰＥＡの混合物を使用してＮ末端をキャッピングし、ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／ＥＤＴ／水（９２．５：２．５：２．５：２．５）を使用してペプチド構築物を樹脂から切断した。粗ペプチドをこれまで説明したように精製してｃｇｐ９１ｄｓ−ｔａｔを得た：Ｃ１７３Ｈ３１９Ｎ５６Ｏ４３Ｓの計算値［Ｍ＋５Ｈ＋］ｍ／ｚ７８０．３、観測値ｍ／ｚ７８０．６；Ｃ１７３Ｈ３２０Ｎ５６Ｏ４３Ｓの計算値［Ｍ＋６Ｈ＋］ｍ／ｚ６５０．４、観測値ｍ／ｚ６５０．７；Ｃ１７３Ｈ３２１Ｎ５６Ｏ４３Ｓの計算値［Ｍ＋７Ｈ＋］ｍ／ｚ５５７．６、観測値ｍ／ｚ５５８．０。
【００９８】
エチルエステル結合ｇｐ９１ｄｓ−ｔａｔ（ｅｇｐ９１ｄｓ−ｔａｔ；Ａｃ−Ａｓｐ（ＯＥｔ）−ＰＥＧ４−ＰＥＧ３−ＰＥＧ４−ｇｐ９１−ＮＨ２）の調製は、最終のカップリングステップにおけるＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＣｈｏｌ）−ＯＨのＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＥｔ）−ＯＨとの置換を除いてｃｇｐ９１ｄｓ−ｔａｔの方法と同一の方法で行った：Ｃ１４８Ｈ２７７Ｎ５６Ｏ４３Ｓの計算値［Ｍ＋５Ｈ＋］ｍ／ｚ７１１．８、観測値ｍ／ｚ７１２．１；Ｃ１４８Ｈ２７８Ｎ５６Ｏ４３Ｓの計算値［Ｍ＋６Ｈ＋］ｍ／ｚ５９３．３、観測値ｍ／ｚ５９３．７；Ｃ１４８Ｈ２７９Ｎ５６Ｏ４３Ｓの計算値［Ｍ＋７Ｈ＋］ｍ／ｚ５０８．７、観測値ｍ／ｚ５０９．０。
【００９９】
１８個のアミノ酸スクランブルｇｐ９１ｄｓ−ｔａｔ（Ｓｇｐ９１ｄｓ−ｔａｔ；Ａｃ−Ａｓｐ（ＯＣｈｏｌ）−ＰＥＧ４−ＰＥＧ３−ＰＥＧ４−ＲＫＫ−ＲＲＱＲＲ−ＲＣＬＲＩ−ＴＲＱＳＲ−ＮＨ２、配列番号２４）ペプチドの調製は、非スクランブルｇｐ９１ｄｓ−ｔａｔのため上記に説明するように手動ＳＰＰＳにより行った。次いで、非スクランブルｃｇｐ９１ｄｓ−ｔａｔのための上記の同一の方法を使用して、樹脂結合ｓｇｐ９１ｄｓ−ｔａｔをＰＥＧリンカーによりコレスタノールと結合させた。粗ペプチドを同一の方法で精製してｃｇｐ９１ｄｓ−ｔａｔを得た：Ｃ１６２Ｈ３０７Ｎ５４Ｏ４０Ｓの計算値［Ｍ＋５Ｈ＋］ｍ／ｚ７３６．３、観測値ｍ／ｚ７３６．５；Ｃ１６２Ｈ３０８Ｎ５４Ｏ４０Ｓの計算値［Ｍ＋６Ｈ＋］ｍ／ｚ６１３．７、観測値ｍ／ｚ６１４．０；Ｃ１６２Ｈ３０９Ｎ５４Ｏ４０Ｓの計算値［Ｍ＋７Ｈ＋］ｍ／ｚ５２６．２、観測値ｍ／ｚ５２６．３。
【０１００】
インフルエンザＡ型ウイルスによるｉｎ  ｖｉｖｏ感染および薬物処置
老齢で同齢（６〜１２週）の同腹雄ナイーブＷＴ対照およびＮＯＸ２−／ｙマウス（ｇｐ９１ｐｈｏｘ−／−としても知られる［Ｐｏｌｌｏｃｋら（１９９５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ９巻（２号）２０２〜２０９頁］）を、ペントレン（ｐｅｎｔｈｒａｎｅ）を吸入させることにより麻酔し、ＰＢＳで希釈した３５Ｌ容量のＨｋｘ３１を１×１０４または１×１０５プラーク形成単位（ＰＦＵ）で鼻腔内（ｉ．ｎ．）感染させた。インフルエンザ感染後１、３または７日目にマウスを安楽死させた。いくつかの実験では、Ｈｋ−ｘ３１による感染の１日前およびその後３日間毎日、麻酔下のマウスをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、対照；Ｓｉｇｍａ社）、非結合ｇｐ９１ｄｓｔａｔ（０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ）、コレステノール結合ｇｐ９１ｄｓｔａｔ（０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ）またはコレスタノール結合スクランブルｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴ（０．０２ｍｇ／ｋｇ）のいずれかの鼻腔内送達により処置した。さらなる実験では、麻酔下のマウスをイミキモド（５０μｇ／マウス、ｉ．ｎ．）またはカタラーゼ（１０００Ｕ／マウス、ｉ．ｎ．）で処置し、次いで１日目に、安楽死させて解析した。
【０１０１】
気道炎症および細胞の識別計数
ケタミン／キシラゼン（１００ｍｇ／ｋｇ）混合物の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によりマウスを犠死させた。下顎から胸郭の上部まで切開し、そこで唾液腺を分離して気管の表面を露出した。気管上の平滑筋の層を除去し、気管の上部付近を小さく切開することを可能とした。シース付きの２１ゲージ針を管腔に挿入し、ＰＢＳ３００〜４００μｌで繰り返し（４回）洗浄した。ＢＡＬＦ中の全細胞を０．４％ｗ／ｖのトリパンブルー溶液（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）で染色し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）自動セルカウンター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｔ＃Ｃ１０２２７）を使用して生細胞を評価した。細胞の識別解析は、３×ｇで５分間、Ｃｙｔｏｓｐｉｎ３（Ｓｈａｎｄｏｎ社、英国）上で遠心分離したＢＡＬＦ（５×１０４細胞）から準備した。この後、スライドを１００％ｖ／ｖのプロパノール中に１分間固定し、一晩乾燥させた。最終的に、Ｒａｐｉｄ  Ｉ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｒｅｄ  Ｓｔａｉｎ（商標）（ＡＭＢＥＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、豪国）およびＲａｐｉｄ  ＩＩ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ（商標）（ＡＭＢＥＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、豪国）で１０分間試料を染色し、次いで、７０％ｖ／ｖのエタノールおよび無水エタノールに２回浸した後、キシレン中に５分間（２回）置いた。次いで、試料をＤＰＸ封入剤（Ｌａｂｃｈｅｍ社、ＮＳＷ州、豪国）中に載せ、カバーガラスを上部に定着させた。ランダムフィールドから採取した１試料あたり細胞５００個を、標準の形態学的基準によりマクロファージ、好中球、好酸球およびリンパ球に識別した。データは、各細胞型に総生細胞数を掛けて計算した総細胞数として、および細胞集団のパーセントとして表した。
【０１０２】
細胞培養および一次細胞の単離
ヒト肺胞マクロファージは、豪国クレイトンのモナシュ大学モナシュ医療センターにおいて、原因となる肺疾患を調べるために、気管支鏡検査を受けている対象から入手した。気管支鏡を右中葉に差し込み、食塩水２５〜５０ｍＬを気道内に流し込み、その後、吸引した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、培養培地（ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃａｔ＃２１８７０−０７６）に１０％ｖ／ｖのＦＣＳならびに１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを追加）中に約２４時間懸濁した後に使用した。
【０１０３】
同齢（６〜１２週）の雄Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ（ＷＴ）、ＮＯＸ２−／ｙ、ＮＯＸ４−／−（豪国メルボルン大学眼科研究センターにより提供）、ＴＬＲ７−／−（ニューカッスル大学医療学部生体医科学および薬学スクールおよび豪国ニューサウスウェールズ州ハンター医学研究所により提供）、ＴＬＲ９−／−（豪国ビクトリア州メルボルン、ベイカーＩＤＩ心臓糖尿病研究所により提供）またはＳＯＤ３−／−マウス（ＲＭＩＴ大学医療および生体医科学スクールにより提供）から肺胞マクロファージを肺洗浄により単離した。下顎から胸郭の上部まで薄く浅く正中を切開し、喉頭を分離して気管の上部を露出した。気管を覆う平滑筋の層を除去し、小さく切開して、シース付きの２１ゲージ針を管腔に挿入した。肺をＰＢＳ３００〜４００μＬで繰り返し（３回）洗浄した。細胞懸濁液を遠心分離法（２００×ｇ、４℃で５分間）により遠心沈殿した。上清を採り出し、次いで、細胞を無菌ＰＢＳ１ｍＬ中に再懸濁し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）自動セルカウンター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｔ＃Ｃ１０２２７）を使用して計数した。次いで、細胞を２４ウェルプレートに播種して（１×１０５細胞／ウェル）、以下に述べるように、免疫細胞化学および蛍光顕微鏡により観察した。
【０１０４】
不死化細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞（ＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ−７１（商標）））および不死化した骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ；モナシュ大学ハドソン医学研究所および独国ボン大学自然免疫研究所の厚意による）を、Ｌグルタミン、グルコース（４５００ｍｇ／Ｌ）、ピルビン酸ナトリウム（１１０ｍｇ／Ｌ）およびウシ胎仔血清（ＦＢＳ、１０％ｖ／ｖ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ社）中に維持した。ＴＬＲ２−／−、ＴＬＲ３−／−、ＴＬＲ４−／−、ＴＬＲ７−／−、ＴＲＩＦ−／−、ＲＩＧ−Ｉ−／−、ＭｙＤ８８−／−、ＮＬＲＰ３−／−およびＵＮＣ９３Ｂ１−／−不死化ＢＭＤＭを、グルコース（４５００ｍｇ／Ｌ）、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ストレプトマイシンおよびＦＢＳ（１０％ｖ／ｖ）を添加したＲＰＭＩ培地、ならびにＤＭＥＭ（２０％ｖ／ｖ）（上述のすべての添加物を含む）中に維持した。すべての細胞を５％ＣＯ２および９５％ｖ／ｖ空気の混合により加湿することによって３７℃で保持した。培地は、週に２〜３回交換し、細胞は、約８０〜９０％の集密度である場合、擦過することにより継代培養し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）自動セルカウンターを使用して計数した。
【０１０５】
不死化細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞（マウス腹膜に由来）および不死化骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を、Ｌグルタミン、グルコース（４５００ｍｇ／Ｌ）、ピルビン酸ナトリウム（１１０ｍｇ／Ｌ）およびウシ胎仔血清（ＦＢＳ、１０％）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ社）中に維持した。すべての細胞を５％ＣＯ２および９５％ｖ／ｖ空気の混合により加湿することによって３７℃で保持した。培地は、週に２〜３回交換し、細胞は、約８０〜９０％の集密度である場合、擦過することにより継代培養し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）自動セルカウンター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して計数した。
【０１０６】
共焦点蛍光顕微鏡
細胞を２４ウェルプレート内のスライドガラス上に播種し、２４時間ＤＭＥＭ中で接着させた。次いで、ＨＫｘ３１インフルエンザＡ型ウイルス（ＭＯＩは０．１、１または１０）の非存在または存在下で無血清１６培地中に様々な時点（５分、１５分、３０分および１時間）において細胞をインキュベートした。いくつかの場合では、細胞をダイナソア（１００μＭ）またはダイナソア用の溶媒、ＤＭＳＯ（０．１％ｗ／ｖ）で３０分間前処理した後、感染させた。次いで、細胞をＰＢＳ（０．０１Ｍ）で洗浄し、４％ｖ／ｖのパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１５分間固定した。細胞を１０分間ＰＢＳ含有トリトンＸ−１００（０．２５％ｖ／ｖ）で処理し、次いで、１５分を超えて３回、ＰＢＳで洗浄した。次いで、１０％ｖ／ｖのヤギ血清含有ＰＢＳで２時間および／またはマウスオンマウスＩｇＧブロッキング試薬（Ｃａｔ＃ＭＫＢ−２２１３、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で試料をインキュベートした。この後、４℃で２４時間、核タンパク質の一次抗体を加えて（１：１０００）インフルエンザＡ型ウイルスを局在化するか、精製マウス抗ＮＯＸ２を加えて（１：５００）ＮＯＸ２を局在化するか、ウサギ抗ＴＬＲ７を加えて（１：１０００）ＴＬＲ７を局在化するか、またはマウス抗初期エンドソーム抗原１を加えて（ＥＥＡ１：１０００）初期エンドソームを局在化した。いくつかの実験では、抗体の組合せを指示濃度で使用して、タンパク質共局在性を決定した。細胞をＰＢＳ（０．０１Ｍ）で３０分を超えて３回洗浄した。洗浄後、二次抗体ヤギ抗ウサギａｌｅｘａ５９４（１：１０００）、ヤギ抗ウサギ赤色６４７（１：５００、１：１０００）および／またはビオチン化抗マウスＩｇＧを適切なウェルに暗所で加え２時間おいた。最終的に、細胞をＰＢＳ（０．０１Ｍ）で３０分を超えて３回洗浄し、必要に応じて、マウス一次および二次抗フルオレセインアビジンＤＣＳを５分間適用した。ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）１０〜２０μＬで３分間標識した顕微鏡スライド上にカバーガラスを載せた。スライドを観察し、Ｎｉｋｏｎ社の正立、倒立共焦点蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｄ−ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｃ１）上で撮影した。解析プロセスを通じて処理群についてマスク化した２人の観察者により、すべての免疫組織化学検査を行い、適切な対照実験をすべて実施し、これによって、一次および二次抗体のすべての組合せを使用して交差反応が生じないことを確実とした。
【０１０７】
ＴＬＲ７およびＮＯＸ２抗体の両方の特異性を、ＷＴ、ＴＬＲ７−／−およびＮＯＸ２−／−マウスからそれぞれ採取した肺胞マクロファージの染色度を調べることにより検証した。ＴＬＲ７−／−マクロファージのＴＬＲ７は、染色されなかった（図２ｃ（Ｆｉｇｕｒｅ  ２Ｃ））。同様にＮＯＸ２抗体では、ＮＯＸ２−／ｙマウスの肺胞マクロファージの染色は、ＷＴ細胞と比較して観察されなかった。このＮＯＸ２抗体の特異性についてのさらなる証拠は、Ｊｕｄｋｉｎｓら（２０１０年）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ２９８巻（１号）Ｈ２４〜３２頁に見出すことができる。
【０１０８】
エンドソームＲＯＳの生成
ヒト肺胞マクロファージ；ＷＴ、ＴＬＲ７−／−、ＴＬＲ２−／−、ＴＬＲ３−／−、ＴＬＲ４−／−、ＴＲＩＦ−／−、ＭｙＤ８８−／−、ＲＩＧ−Ｉ−／−およびＮＬＲＰ３−／−ＢＭＤＭ；マウス一次ＷＴ、ＮＯＸ２−／ｙ、ＮＯＸ４−／−、ＴＬＲ７−／−、ＴＬＲ９−／−またはＳＯＤ３−／−肺胞マクロファージならびにＲＡＷ２６４．７細胞を、２４ウェルプレート内のスライドガラス上に播種して（１×１０５細胞／ウェル）、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ培地中に細胞を２４時間接着させた後、ＯｘｙＢＵＲＳＴ  Ｇｒｅｅｎ  Ｈ２ＨＦＦ（１００μＭ）および／またはＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ（５０ｎＭ）で５分間前処理した。この後、ＰＢＳ（対照群；０．０１Ｍ）、イミキモド（１０μｇ／ｍＬ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ；１００μＭ）とともにインキュベートするか、あるいはＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス（Ａ／Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ／５５／２００４、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／９／２００７）、季節性Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／Ｂｒａｚｉｌ／１１／１９７８、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９、Ａ／Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉｓｌａｎｄｓ／３／２００６）、Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍインフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９、Ａ／Ａｕｃｋｌａｎｄ／１／２００９）のいずれか、または再集合体ワクチン株ＨＫｘ３１（ＭＯＩは０．１〜１０）もしくはＢＪｘ１０９（ＭＯＩは１０）に無血清培地中で様々な時点（５分、１５分、３０分および１時間）において感染させた。他のウェルは、デングウイルス（ＭＯＩは１０）、センダイウイルス（４０ＨＡＵ／ｍＬ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＭＯＩは１０）、ヒトメタニューモウイルス（ＭＯＩは１０）、ライノウイルス（ＭＯＩは１０）、呼吸器合胞体ウイルス（ＭＯＩは１０）、ＨＩＶ（ＭＯＩは１０）、ニューカッスル病ウイルス（ＭＯＩは１０）、ムンプスウイルス（ＭＯＩは１０）、アカゲザルもしくはＵＫロタウイルス（それぞれＭＯＩは１０）または単純ヘルペスウイルス２型（ＭＯＩは１０）に類似条件下で感染させた。いくつかの場合では、細胞をスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ；３００Ｕ／ｍＬ）、アポシニン（３００μＭ）、ｇｐ９１ｄｓｔａｔ（５０μＭ）またはバフィロマイシンＡ（１００ｎＭ）で３０分間前処理した後に感染させた。次いで、細胞をＰＢＳ（０．０１Ｍ）で洗浄し、４％のＰＦＡで１５分間固定した。次いで固定後、細胞をＰＢＳで３０分を超えて３回洗浄した。次いで、ＤＡＰＩ１０〜２０μＬで３分間標識した顕微鏡スライド上にスライドガラスを載せ、次いで解析し、Ｎｉｋｏｎ社の正立共焦点蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｄ−ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｃ１）上で撮影した。
【０１０９】
ＮＯＸ２オキシダーゼの集合
ＮＯＸ２オキシダーゼ活性を測定するために、発明者らは、共焦点蛍光顕微鏡を使用してｐ４７ｐｈｏｘおよびＮＯＸ２の集合を評価した。対照ならびにＨＫｘ３１ウイルス感染ＷＴおよびＴＬＲ７−／−肺胞マクロファージを上記のように「共焦点蛍光顕微鏡」下で処理した。さらなる実験では、ＷＴ細胞をダイナソア（１００μＭ）またはバフィロマイシンＡ（１００ｎＭ）で３０分間処理した後にウイルス感染させた。試料を１０％ｖ／ｖのヤギ血清含有ＰＢＳに２時間曝した後、ウサギ抗ｐ４７ｐｈｏｘ抗体（１：１０００）およびマウス抗ＮＯＸ２抗体（１：５００）を加え、その後、上に明示するように、適切な二次抗体を加えた。
【０１１０】
Ｌ−Ｏ１２増強化学発光
Ｌ−Ｏ１２増強化学発光を使用してＲＯＳ生成を定量した。ＲＡＷ２６４．７細胞および一次マウス肺胞マクロファージを９６ウェルＯｐｔｉＶｉｅｗプレート内に播種した（５×１０４細胞／ウェル）。ＲＡＷ２６４．７細胞をＤＭＳＯ（対照、適切な濃度）、非結合ｇｐ９１ｄｓｔａｔ（１００ｎＭ〜３０μＭ）、コレスタノール結合ｇｐ９１ｄｓｔａｔ（１００ｎＭ〜３０μＭ）またはエチル結合ｇｐ９１ｄｓｔａｔ（１００ｎＭ〜３０μＭ）のいずれかで１時間処理した。ＤＭＳＯ（対照）、非結合ｇｐ９１ｄｓｔａｔ（０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ）、コレスタノール結合ｇｐ９１ｄｓｔａｔ（０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ）で処置、および／またはＨｋｘ３１インフルエンザＡ型ウイルス（１×１０５ＰＦＵ）に感染させたマウスからＢＡＬＦを採取した。次いで、細胞を３７℃のＫｒｅｂｓ−ＨＥＰＥＳ緩衝液で培地から洗浄し、次いで、ＰＫＣおよびＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化物質であるホルボールジブチレート（ＰＤＢ；１０〜６ｍｏｌ／Ｌ）の非存在（すなわち、基礎ＲＯＳ生成）または存在（ＲＯＳ生成刺激）下でＬ−Ｏ１２（１０〜４ｍｏｌ／Ｌ）を含むＫｒｅｂｓ−ＨＥＰＥＳ緩衝液に曝露した。同一の処理をブランクウェル（すなわち、無細胞）に実施し、これはバックグラウンド発光の対照として作用した。すべての処理群は、３回ずつ実施した。Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ（商標）発光検出器（Ｈｉｄｅｘ社、モデル４２５１０５、フィンランド）を使用して光子発光［相対発光量（ＲＬＵ）／秒］を検出し、各ウェルのデータを１秒について６０サイクルにわたって記録した。各群の個々のデータの点数は、３回の平均値から各ブランク対照を引くことにより導き出した。データは、用量応答曲線における％対照として、またはそのままの生の値として（ｅｘ  ｖｉｖｏ実験）表す。
【０１１１】
非結合またはコレスタノール結合ｇｐ９１ｄｓｔａｔが、ＲＯＳ除去特性を示したかどうかを試験するために、キサンチンオキシダーゼ細胞遊離アッセイを使用した。簡潔には、Ｌ−０１２（１００μＭ）を含むＫｒｅｂｓ−ＨＥＰＥＳ緩衝液を９６ウェルＯｐｔｉｖｉｅｗプレート内に加えた。この後、０．１％ｗ／ｖのＤＭＳＯ、非結合ｇｐ９１ｄｓｔａｔ（Ｕｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴ、１μＭ）またはコレスタノール結合ｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴ（１μＭ）を、キサンチン（１００μＭ）と組み合わせて加えた。キサンチンオキシダーゼ（０．０３Ｕ／ｍＬ）を加えた直後に、Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ（商標）発光検出器（Ｈｉｄｅｘ社、モデル４２５１０５、フィンランド）を使用して光子発光［相対発光量（ＲＬＵ）／秒］を検出し、各ウェルのデータを１秒について６０サイクルにわたって記録した。各群の個々のデータの点数は、３回の平均値から各ブランク対照を引くことにより導き出した。データは、そのままの生の値として表す。
【０１１２】
部位特異的変異誘発、配列決定およびトランスフェクション
ＨＡ−ＴＬＲ７  ｃＤＮＡをＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社（マウスＴＬＲ７；Ｃａｔ＃ＭＧ５０９６２−ＮＹ、Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ番号ＮＭ＿１３３２１１．３を有する）から購入した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｃａｔ＃２００５１４、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用してＴＬＲ７の鍵となるシステイン残基（Ｃｙｓ２６０、Ｃｙｓ２６３、Ｃｙｓ２７０、Ｃｙｓ２７３、Ｃｙｓ９８およびＣｙｓ４４５）をアラニンに置換変異させた。ＷＴおよび変異ＨＡ−ＴＬＲ７の配列は、豪国ゲノム研究所により確認された。直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して細胞にトランスフェクトした［Ｈａｌｌｓら（２０１５年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１３３５巻１３１〜１６１頁］。
【０１１３】
ハイコンテンツ比率計測ＦＲＥＴイメージング
細胞を播種し、黒色で光学的に透明な９６ウェルプレート内でＰＥＩを使用して２００ｎｇ／ウェルのＦＲＥＴバイオセンサーＤＮＡを懸濁状態で４８時間トランスフェクトした。実験前に、０．５％ｖ／ｖのＦＢＳ培地中で一晩、細胞を部分的に血清飢餓培養した。Ｊｅｎｓｅｎら（２０１４年）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８９巻（２９号）２０２８３〜２０２９４頁に記載のように、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のハイコンテンツなＩＮＣｅｌｌ２０００Ａｎａｌｙｚｅｒを、Ｎｉｋｏｎ社Ｐｌａｎ  Ｆｌｕｏｒ  ＥＬＷＤ４０×（ＮＡ０．６）対物レンズおよびＦＲＥＴモジュールとともに使用して蛍光イメージングを実施した。ＣＦＰ／ＹＦＰ（ＣＫＡＲ）発光比解析では、ＣＦＰフィルター（４３０／２４）を使用して細胞を経時的に励起し、ＹＦＰ（５３５／３０）およびＣＦＰ（４７０／２４）フィルターを使用して発光を測定し、ポリクロイックモジュールをＣＦＰ／ＹＦＰフィルターのペア用に最適化した（Ｑｕａｄ３）。ＧＦＰ／ＲＦＰ（ＥＫＡＲ）発光比解析では、ＦＩＴＣフィルター（４９０／２０）を使用して細胞を経時的に励起し、ｄｓＲｅｄ（６０５／５２）およびＦＩＴＣ（５２５／３６）フィルターを使用して発光を測定し、ポリクロイックモジュールをＦＩＴＣ／ｄｓＲｅｄフィルターのペア用に最適化した（Ｑｕａｄ４）。細胞を１００秒毎に２０分間撮像した（２つの視野を１２のウェルにおいて１００秒毎に画像取得）。記載のように（Hallsら（２０１５年）上記参照）、ＦＩＪＩより配給のＩｍａｇｅＪ３４用に作成された自家スクリプトを使用してデータを解析した。
【０１１４】
ＱＰＣＲによるｍＲＮＡの定量
細胞をイミキモド（１０μｇ／ｍｌ）、ポリＩ：Ｃ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＣｐＧ（１０μｇ／ｍＬ）、ｓｓＲＮＡ（５００μｇ／ｍＬ）またはカタラーゼ（１０００Ｕ／ｍｌ）で２４時間処理した。指示する場合、細胞をアポシニン（３００μＭ）、ＳＯＤ（３００Ｕ／ｍＬ）またはバフィロマイシンＡ（１００ｎＭ）で３０分間前処理した。ＤＭＳＯ（対照）、非結合ｇｐ９１ｄｓｔａｔ（０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ）、コレスタノール結合ｇｐ９１ｄｓｔａｔ（０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ）、スクランブルコレスタノール結合ｇｐ９１ｄｓｔａｔ（０．０２ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで処置、および／またはＨｋ−ｘ３１インフルエンザＡ型ウイルス（１×１０５ＰＦＵ）に感染させたマウスの肺組織からＲＮＡを抽出して、感染から３日後にウイルスｍＲＮＡおよびサイトカイン発現を評価した。Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ社、米国）とβメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社；１％）との混合物を含むエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブに右肺葉を置き、弯剪刀を使用してこれを小片に刻んだ。この後、超音波ホモジナイザー（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  ＧｍＢＨ社、テルトウ、独国）を使用して肺試料を均質化し、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１：１の割合のライセートを７０％ｖ／ｖのＲＮａｓｅを含まないエタノールと混合し、ＲＮａｓｅｙスピンカラム（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｋｉｔ、Ｃａｔ＃７４１０４、Ｑｉａｇｅｎ社）に移した。試料を１０，０００ｒｐｍで１５秒間回転させ、次いで、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＷ１で洗浄した。通過画分の廃棄後、ＤＮａｓｅＩ（Ｃａｔ＃７９２５４、Ｑｉａｇｅｎ社）５μｌをＢｕｆｆｅｒ  ＲＤＤ３５μｌと混合し、スピンカラムの膜上にピペットで直接滴下し、室温で１５分間インキュベートした。Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＰＥを加え、１０，０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離した。通過画分の廃棄後、Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＰＥを再度加え、１０，０００ｒｐｍで２分間回転させた。１４，０００ｒｐｍで１分間さらに回転させた後、残留通過画分をスピンカラムから除去した。最終的にＲＮａｓeを含まない水を加え、遠心分離してＲＮＡをエッペンドルフチューブ内に溶出した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）を使用してＲＮＡ試料を測定した。Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ＃４３６８８１４、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、ＣＡ州、米国）を使用して全ＲＮＡ１．０〜２．０μｇを用いてｃＤＮＡ合成を実施した。Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  ＲＴ  ｋｉｔ中の試薬の混合物にＲＮＡを加えて、最終用量２０μｌを作製した。これをＢｉｏＲａｄ  Ｍｙｃｙｃｌｅｒ（商標）サーマルサイクラー（ＢｉｏＲａｄ社、米国）を使用して、次の設定で転写した：２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５分間および４℃で静置。試料を−２０℃で保存した後に使用した。ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｃａｔ＃４３０４４３７、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスタ��シティ、ＣＡ州、米国）またはＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｃａｔ＃４３６７６５９、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、ＣＡ州、米国）を使用して定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＡＢＩ  Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ（商標）およびＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、ＣＡ州、米国）上で解析した。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−βおよびＩＬ−６用のＰＣＲプライマーは、Ａｓｓａｙｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｍｉｘに含まれていた。さらに、インフルエンザウイルスのセグメント３ポリメラーゼ（ＰＡ）のフォワードおよびリバースのカスタムデザインプライマーを使用してウイルス力価を測定した（表４）。ＰＣＲプログラム実行設定：５０℃で２分間、その後９５℃で１時間、次いで９５℃で１５秒＋６０℃で６０秒＋プレートを読取る（４０サイクル）。定量値１２９は、閾値サイクル（Ｃｔ）数から取得した。標的遺伝子発現レベルは、１８秒またはＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現に対して各試料について正規化し、データは、対照と比較して表した。
【０１１５】
ＲＡＷ２６４．７またはＢＭＤＭ細胞を６ウェルプレート内に播種した（５×１０５細胞／ウェル）。Ｃ９８ｉペプチドのすべての回において、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；対照、適切な濃度）または適切なペプチドのいずれかで１時間前処理した。次いで、細胞をイミキモド（１０μｇ／ｍｌ）でさらに１時間処理した。処理後、細胞をＰＢＳで洗浄し、培地を新鮮なＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）で補充し、放置して２４時間を超えてインキュベートした。
【０１１６】
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、ヒルデン、独国）を使用して全ＲＮＡを調製し、次いで、２回蒸留したＨ２Ｏで抽出することにより全ＲＮＡを精製した。Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  ＲＴ  ｋｉｔ（Ｐ／Ｎ４３２２１７１、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、ＣＡ州、米国）を使用して全ＲＮＡ１．０〜３．０μｇを用いてｃＤＮＡの合成を実施した。ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、ＣＡ州、米国）を使用して定量的ポリメラーゼ連鎖反応を行い、ＡＢＩ  ＳｔｅｐＯｎｅ（商標）およびＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、ＣＡ州、米国）上で解析した。ＩＬ−１およびＩＬ−６用のＰＣＲプライマーは、Ａｓｓａｙｏｎ−Ｄｅｍａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、ＣＡ州、米国）に含まれていた。ＰＣＲプログラム実行設定：５０℃で２分間、その後９５℃で１時間、次いで９５℃で１５秒＋６０℃で６０秒＋プレートを読み取る（４０サイクル）。定量値は、閾値サイクル（Ｃｔ）数から取得した。標的遺伝子発現レベルは、１８秒またはＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現に対して各試料について正規化し、データは、ＷＴナイーブと比較して表した。
【０１１７】
ＥＬＩＳＡおよびマルチプレックスイムノアッセイ
ＨＫｘ３１感染（１×１０４ＰＦＵ）野生型およびＮＯＸ２−／ｙマウスのＢＡＬＦ中に分泌されたＩＦＮ−β（ＶｅｒｉＫｉｎｅ  ＨＭマウスＩＦＮβ血清ＥＬＩＳＡキット；Ｃａｔ＃４２４１０−１、ＰＢＬ  Ａｓｓａｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）、ＩＬ−１β（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡマウスＩＬ−１β／ＩＬ−ＩＦ２；Ｃａｔ＃ＭＬＢ００Ｃ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＴＮＦ−α（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡマウスＴＮＦα、Ｃａｔ＃ＭＴＡ００Ｂ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＩＬ−６（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡマウスＩＬ−６、Ｃａｔ＃Ｍ６０００Ｂ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）のタンパク質レベルを、ＥＬＩＳＡを使用して測定し、製造者の指示に従って市販のキットを使用して実施した。試料のサイトカイン力価は、４つのパラメータによる標準曲線に対するフィッティングにより光学密度をプロットすることによって決定した。
【０１１８】
抗体の決定
種々の抗体アイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、Ｉｇ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭおよび総ＩｇＧ）の血清およびＢＡＬＦレベルをＨＫｘ３１感染（１×１０４ＰＦＵ）ＷＴおよびＮＯＸ２−／ｙマウスにおいてＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｍｏｕｓｅ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  ７ｐｌｅｘ、Ｃａｔ＃ＥＰＸ０７０−２８１５−９０１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を製造者の指示に従って使用して定量した。簡潔には、抗体結合磁気ビーズを９６ウェルプレートの各ウェル内に加えた。スタンダード抗体をユニバーサルアッセイ緩衝液中に段階希釈して（１：４）、７点測定標準曲線を作成した。血清およびＢＡＬＦ試料（ユニバーサルアッセイ緩衝液中１：２０，０００に希釈）ならびに／またはスタンダード抗体を、抗体結合磁気ビーズを含む９６ウェルプレートの適切なウェルに加えた。この後、検出抗体混合物を各ウェルに加え、プレートを暗室のマイクロプレート振盪機（５００ｒｐｍ）上、室温で３０分間インキュベートした。洗浄後、読取り用緩衝液をすべてのウェルに加えた。プレートをＭａｇｐｉｘ（登録商標）マルチプレックスリーダー（Ｌｕｍｉｎｅｘ社、米国）によりｘＰＯＮＥＮＴ（登録商標）ソフトウェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ社、米国）を使用して読み取った。Ｐｒｏｃａｒｔａｐｌｅｘ（商標）Ａｎａｌｙｓｔ１．０ソフトウェア（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、米国）を使用して、各試料の血清およびＢＡＬＦ抗体濃度を標準曲線から補間した。
【０１１９】
データは、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。サイトカインｍＲＮＡ発現および抗体力価を、一元配置分散分析を使用して解析した後、Ｔｕｋｅｙのポストホック検定を行って多重比較した。すべての検定は、Ｇｒａｐｈｐａｄ社のＰｒｉｓｍ７．０ｂ（サンディエゴ、ＣＡ州、米国）により実施し、Ｐ＜０．０５で統計学的に有意であるとした。
【０１２０】
統計学的解析および画像解析
蛍光顕微鏡データを定量するために、共焦点システムから取得した画像をＩｍａｇｅＪにおいて解析した。図の説明文において他に指示しない限り、少なくとも３回の独立した実験から入手した１処置群あたり細胞約１００〜１５０個を解析して、各細胞の蛍光を計算し、次いで、これを平均し、蛍光領域のパーセントとして表した。すべての統計検定は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社バージョン６．０、サンディエゴ、ＣＡ州、米国）を使用して実施した。Ｐ＜０．０５を、有意であるとした。単離した細胞の培養研究では、ｎは、種々の継代由来の細胞を使用した別々の実験を表す。
【０１２１】
化学物質
イミキモド（Ｃａｔ＃ｔｌｒｌ−ｉｍｑ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）、Ｈ．Ｍ．ＷポリＩ：Ｃ（Ｃａｔ＃ｔｌｒｌ−ｐｉｃ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）およびＣｐＧ  ＯＤＮ（Ｃａｔ＃ｔｌｒｌ−１６６８、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）は、エンドトキシンを含まない水中に溶解し、５〜１０ｍｇ／ｍＬの保存液としてアリコート３０μＬおよび１００μＬに調製し、−２０℃で保存した。ｓｓＲＮＡ（Ｃａｔ＃ｔｌｒｌ−ｌｒｎａ４０、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）は、エンドトキシンを含まない水中に溶解し、５ｍＭの保存液としてアリコート５０μＬに調製し、−２０℃で保存した。ダイナソア（Ｃａｔ＃Ｄ７６９３、Ｓｉｇｍａ社）（その日に新たに調製）は、ＤＭＳＯ（１００％）中に溶解し、１０ｍＭの保存液として調製した。ＦＢＳ（Ｃａｔ＃１２００３Ｃ、Ｓｉｇｍａ社）は、アリコート５０ｍｌとして−２０℃で保存した。ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｃａｔ＃Ｐ４３３３、Ｓｉｇｍａ社）は、−２０℃で保存した。ＳＯＤ（Ｃａｔ＃Ｓ２５１５、Ｓｉｇｍａ社）は、蒸留水中に溶解し、３０，０００ユニット／ｍｌの保存液（１０μｌ）として調製し、−２０℃で保存した。ＯｘｙＢＵＲＳＴ  Ｇｒｅｅｎ  Ｈ２ＨＦＦウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｃａｔ＃１３２９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）およびＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ（Ｃａｔ＃Ｌ１２４９２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）の保存液（１ｍｇ／ｍＬ）を作成した直後、ＰＢＳに溶解して使用した。バフィロマイシンＡ（ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来、Ｃａｔ＃Ｂ１７９３、Ｓｉｇｍａ社）は、１００μＭの保存液としてアリコート１０μＬに調製し、−２０℃で保存した。使用するその日に新たに作成したアポシニン（４’−ヒドロキシ−３’−メトキシアセトフェノン、Ｃａｔ＃Ａ１０８０９；Ｓｉｇｍａ社）およびｇｐ９１ｄｓｔａｔ（Ｃａｔ＃ＡＳ−６３８１８；Ａｎａｓｐｅｃ社）は、１００ｍＭおよび５０ｍＭの保存液としてそれぞれ１００％ｖ／ｖのＤＭＳＯ中に調製した。ホルボールジブチレート（Ｃａｔ＃Ｐ１２３９；Ｓｉｇｍａ社）は、１００％ｖ／ｖのＤＭＳＯ中に１０ｍＭの保存液として溶解し、使用するその日に新たに作成した。カタラーゼ（Ｃａｔ＃Ｃ１３４５、Ｓｉｇｍａ社）は、１０６Ｕ／ｍｌの保存液として蒸留水中に調製し、−２０℃で保存した。５ｍＭのＭｉｔｏＳＯＸ（Ｃａｔ＃Ｍ３６００８５０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）は、ＭｉｔｏＳＯＸ（商標）ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ（Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａ）のうちの１つのバイアルの内容（５０μｇ）をＤＭＳＯ１３μＬ中に溶解することにより調製した。キサンチンオキシダーゼ（Ｃａｔ＃Ｘ１８７５；Ｓｉｇｍａ社）は、蒸留水に３０Ｕ／ｍｌまで溶解することにより、その日に新たに調製し、キサンチン（Ｃａｔ＃Ｘ０６２６；Ｓｉｇｍａ社）は、１００ｍＭの保存液として０．１ＭのＮａＯＨ中に調製した。ＭＬ１７１（Ｃａｔ＃４９２００２；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）。
【０１２２】
インフルエンザ核タンパク質の抗体（インフルエンザＡ型ウイルス核タンパク質［ＡＡ５Ｈ］に対するｍＡｂ；Ｃａｔ＃１２０−２０３４３、ＡｂＣＡＭ社）、初期エンドソーム抗原１抗体（Ｃａｔ＃１２０−０２９００、ＡｂＣＡＭ社）、マウス抗ｇｐ９１ｐｈｏｘ抗体（Ｃａｔ＃６１１４１５、ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、精製マウス抗ｇｐ９１［ｐｈｏｘ］クローン５３／ｇｐ９１［ｐｈｏｘ］（ＲＵＯ））、ウサギ抗ＴＬＲ７抗体（Ｃａｔ＃ＮＢＰ２−２４９０６、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社）、ウサギ抗ｐ４７ｐｈｏｘ抗体（Ｃａｔ＃ｓｃ１４０１５、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）、ＦＩＴＣヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃａｔ＃Ａ−１１０２９；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ヤギ抗ウサギａｌｅｘａ５９４（Ｃａｔ＃Ａ−１１０３７；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ヤギ抗ウサギ遠赤色６４７（Ｃａｔ＃Ａ−２１２４４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびＤＡＰＩ（Ｃａｔ＃Ｈ−１２００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を−２０℃で保存した。
【０１２３】
（実施例１）
インフルエンザウイルスはエンドソームＲＯＳを活性化する
エンドソームＲＯＳ生成のウイルス病理における潜在的役割に取り組むために、オルトミクソウイルス科ファミリーの第ＩＶ群マイナスセンスｓｓＲＮＡウイルスに属し、エンドサイトーシスにより内部移行するインフルエンザＡ型ウイルスを、はじめに検討した。マウス肺胞マクロファージ（ＡＭ）、マウス腹膜ＲＡＷ２６４．７細胞または骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）をインフルエンザＡ型ウイルス株ＨＫｘ３１（Ｈ３Ｎ２）に曝露すると、インフルエンザ核タンパク質（ＮＰ）蛍光が用量および時間依存性に増加した。これは、ダイナミン阻害物質であるダイナソア（１００μＭ）によりほとんど消失し、これにより、内部移行がクラスリン被覆ピットまたはカベオリン依存性機構であることが示された。内部移行したウイルスが、初期エンドソームマーカーＥＥＡ１と強力に共存することが示された（図１ａ（Ｆｉｇｕｒｅ  １Ａ））。しかし、ＮＰのすべてがＥＥＡ１と共存するとは限らず、これにより、インフルエンザＡ型ウイルスが、排他的に初期エンドソームにおいては存在せず（図１ａ）、後期エンドソームおよび／またはリソソームに既に侵入した可能性があることが示された。ＮＯＸ２は、対照およびインフルエンザ感染細胞においてＥＥＡ１と共存した（図１ｂ（Ｆｉｇｕｒｅ  １Ｂ））。したがって、ＲＯＳ生成の酵素的機構が初期エンドソームに存在し、これがインフルエンザＡ型ウイルス感染により著しく増強され、内部移行したウイルスとの共存を促進する。ウイルスの取込みに応答したエンドソームＲＯＳ生成をＯｘｙＢＵＲＳＴ１６により評価した。一連の低病原性から高病原性、季節性および流行性インフルエンザＡ型ウイルスに曝露すると、マウス一次ＡＭ（図１ｃおよびｄ（Ｆｉｇｕｒｅ  １Ｃ  ａｎｄ  Ｄ））ならびにヒト肺胞マクロファージ（図１ｈ（Ｆｉｇｕｒｅ  １Ｈ））においてＯｘｙＢＵＲＳＴ蛍光が急速および用量依存性に増加した。このＯｘｙＢＵＲＳＴ由来のシグナルは、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ；３００Ｕ／ｍＬ）を加えることにより消失した。このＳＯＤは、ウイルス１７とともにエンドソーム内に内部移行し、スーパーオキシドをＨ２Ｏ２に変換する（図１ｅ、ｆ（Ｆｉｇｕｒｅ  １Ｅ  ａｎｄ  Ｆ）。対照的に、ＲＯＳシグナルは、エンドソームＳＯＤが欠損したマウス（ＳＯＤ３−／−マウス）由来のＡＭにおいて著しく増加し、スーパーオキシド誘導体の検出を確立した。ＲＯＳ生成が酸性化したエンドソームにおいて生じたことを確認するために、ＯｘｙＢＵＲＳＴ蛍光の共存をＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（５０ｎＭ）によりインフルエンザウイルスの存在下で実証した（図１ｇ（Ｆｉｇｕｒｅ  １Ｇ））。バフィロマイシンＡ（１００ｎＭ）による液胞型Ｖ−ＡＴＰａｓｅポンプの阻害、およびこれによるエンドソーム酸性化の阻害によって、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ蛍光およびインフルエンザＡ型ウイルス感染に応答したエンドソームＲＯＳ生成が消失した（図１ｇ）。エンドソームＲＯＳは、ＮＯＸ２−／ｙ肺胞マクロファージにおいて最少であったが、ＮＯＸ４−／−マクロファージにおいて、およびＮＯＸ１阻害物質ＭＬ１７１（１００ｎＭ）で処理したマクロファージにおいては影響を受けなかった（図１ｅおよびｆ）。イ��フルエンザＡ型ウイルスのＡＭへの内部移行は、ＮＯＸ２−／ｙ細胞において障害されず、これにより、エンドソームＲＯＳ生成の減少が、ウイルス侵入が減少したためではないことが示された。加えて、熱およびＵＶ不活性型インフルエンザ（複製欠損性）は、エンドソームＲＯＳ生成の増加を引き起こし、これは、生ウイルス対照に類似していた（図１ｉおよびｊ（Ｆｉｇｕｒｅ  １Ｉおよび１Ｊ）。したがって、インフルエンザＡ型ウイルスは、サブタイプ、株および病原性にかかわらず、エンドソームにおいて、ＮＯＸ２オキシダーゼ依存性ＲＯＳ生成は刺激するが、ＮＯＸ４およびＮＯＸ１オキシダーゼ依存性ＲＯＳ生成はともに刺激せず、これは、エンドソーム酸性化は必要とするが、ウイルス複製は必要としない。
【０１２４】
（実施例２）
エンドソームＴＬＲ７−ＮＯＸ２シグナル伝達系
ＲＮＡウイルスは、エンドソームＴＬＲ７（ｓｓＲＮＡウイルスの）［Ｌｕｎｄら（２００４年）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ１０１巻（１５号）５５９８〜５６０３頁、ＤｉｅｂｏｌｄらＳｃｉｅｎｃｅ３０３巻（５６６３号）１５２９〜１５３１頁］およびＴＬＲ３（ｄｓＲＮＡウイルス）、ならびに細胞質センサーであるレチノイン酸誘導遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）（ウイルスＲＮＡ担持５’トリホスフェートを検出可能（Ｌｕｎｄら（２００４年）上記参照））およびＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）により認識される［ＩｗａｓａｋｉおよびＰｉｌｌａｉ（２０１４年）上記参照；Ｉｃｈｉｎｏｈｅら（２００９年）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２０６巻（１号）７９〜８７頁；Ａｌｌｅｎら（２００９年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ３０巻（４号）５５６〜５６５頁］。インフルエンザＡ型ウイルスが酸性化エンドソーム内に侵入すると、ウイルスＲＮＡが遊離し、ＴＬＲ７が活性化し、ＮＯＸ２オキシダーゼ依存性ＲＯＳ生成を刺激すると仮定した。この示唆と一致して、ＴＬＲ７は、インフルエンザＡ型ウイルス（図２ａ（Ｆｉｇｕｒｅ  ２Ａ））、ＮＯＸ２（図２ｂ（Ｆｉｇｕｒｅ  ２Ｂ））およびＥＦＡ１（図２ｃ（Ｆｉｇｕｒｅ  ２Ｃ））と共存し、ＴＬＲ７−／−マウス由来の一次ＡＭ、ならびにＴＬＲ７およびＭｙＤ８８欠損ＢＭＤＭでは、インフルエンザＡ型ウイルスに応答して最少のエンドソームＲＯＳ生成を示す（図２ｄ（Ｆｉｇｕｒｅ  ２Ｄ））。ＰＫＣ活性化因子であるホルボールジブチレート（ＰＤＢ；１０〜６Ｍ）によるＮＯＸ２活性化が、このような細胞とＷＴ対照細胞とで類似していたため、ＴＬＲ７−／−およびＭｙＤ８８−／−細胞における、ウイルスに応答したエンドソームＲＯＳ生成の欠乏は、ＮＯＸ２オキシダーゼそれ自体の能力の低下が原因ではなかった。ＮＯＸ２オキシダーゼ活性の第２の尺度として、ＮＯＸ２触媒サブユニットのｐ４７ｐｈｏｘ制御サブユニットとの会合度を調べることにより酵素集合を評価した。刺激されていない細胞では、ＮＯＸ２とｐ４７ｐｈｏｘとの共局在は、ほとんど存在しなかった（図２ｅ（Ｆｉｇｕｒｅ  ２Ｅ））。しかし、インフルエンザウイルスにより、ＮＯＸ２とｐ４７ｐｈｏｘとの強力な共存が生じ、これは、ダイナソアまたはバフィロマイシンＡによる前処理によって減少し、ＴＬＲ７−／−細胞においてほとんど消失した（図２ｅ）。ＴＬＲ７の活性化によりエンドソームＲＯＳ生成が生じるというさらなる証拠を提供するために、特異的ＴＬＲ７アゴニストであるイミキモド（１０μｇ／ｍＬ）を使用した。イミキモドによって、ヒトおよびＷＴマウス由来のＡＭにおいてエンドソームＲＯＳは顕著に増加したが、ＮＯＸ２−／ｙマウス由来のＡＭ（図２ｆ（Ｆｉｇｕｒｅ  ２Ｆ））またはＴＬＲ７もしくはＭｙＤ８８欠損マクロファージにおいては、増加しなかった。最終的には、ＡＭまたはＲＡＷ２６４．７細胞は、グアニジンおよびウリジンに富むｓｓＲＮＡ配列（ｓｓＲＮＡ４０；１００μＭ）により活性化された。ＴＬＲ７依存性機構を介してＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αのｍＲＮＡを増加可能な濃度では、ｓｓＲＮＡ４０により、エンドソームＲＯＳ生成の上昇が生じた（図２ｇ（Ｆｉｇｕｒｅ  ２Ｇ））。対照的に、インフルエンザＡ型ウイルスに応答したエンドソームＲＯＳ生成は、ＲＩＧ−Ｉ−／−、ＮＬＲＰ３−／−、ＴＬＲ２−／−およびＴＬＲ４−／−マクロファージにおいて、ならびにＴＬＲ３阻害物質（５０μＭ）で処理したマクロファージにおいて保たれた。
【０１２５】
次いで、ＴＬＲ７がエンドソームＮＯＸ２オキシダーゼの集合および活性化をどのように誘発するかを調べた。ＮＯＸ２オキシダーゼは、プロテインキナーゼＣにより活性化することができ、これは、ｐ４７ｐｈｏｘ上の鍵となるセリン残基の安定したリン酸化を引き起こして、ＮＯＸ２オキシダーゼ依存性の酸化のバーストを生じさせる（Ｄｒｕｍｍｏｎｄら（２０１１年）上記参照）。ＰＫＣシグナル伝達の時空間的制御を定義するため、およびＴＬＲ７によるその制御を評価するために、ＦＲＥＴバイオセンサーであるｃｙｔｏＣＫＡＲを発現させて、ＷＴおよびＴＬＲ７−／−マクロファージにおいて細胞質ＰＫＣを検出した（Ｊｅｎｓｅｎら（２０１４年）上記参照；Ｖｉｏｌｉｎら（２００３年）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１６１巻（５号）８９９〜９０９頁；Ｈａｌｌｓら（２０１５年）上記参照）。ＷＴマクロファージをインフルエンザＡ型ウイルスまたはイミキモドにより処理すると、細胞質ＰＫＣ活性が５分以内に上昇したが、この応答は、ダイナソアまたはバフィロマイシンＡで処理した、ＴＬＲ７−／−マクロファージおよびＷＴマクロファージにおいては生じなかった（図２ｈおよびｉ（Ｆｉｇｕｒｅ  ２Ｈ  ａｎｄ  Ｉ）。細胞質ｐＥＲＫ１／２活性についてのＦＲＥＴバイオセンサー法（Ａｌｌｅｎら（２００９年）上記参照；Ｈａｌｌｓら（２０１５年）上記参照）により、インフルエンザウイルスとイミキモドの両方によって細胞質ｐＥＲＫ１／２がＴＬＲ７依存性に増加したことが示された。対照的に、ｐＥＲＫ１／２をＰＤ９８０５９（３０μＭ）で遮断しても、インフルエンザに応答したｐ４７ｐｈｏｘによる、エンドソームＲＯＳ生成またはＮＯＸ２の会合には影響しなかった。このようなデータは、インフルエンザＡ型ウイルスが、ｐＥＲＫ１／２を介してではなく、ＴＬＲ７、およびＰＫＣの下流活性化を介して、エンドソームＮＯＸ２オキシダーゼ活性を増大させたことを示す。ウイルスに感染すると、ＮＯＸ２オキシダーゼ依存性のＲＯＳ生成が、低いｐＨに依存するプロセスを使用してエンドソームにおいて引き起こされると結論付けられる。実際、この結論は、次の実験的証拠により支持される。第１に、エンドソームの酸性化が減少すると、ＴＬＲ７の活性化がウイルスＲＮＡにより障害されることが知られている１８、１９。ウイルス感染およびＴＬＲ７アゴニストであるイミキモドに応答したＮＯＸ２依存性ＲＯＳ生成は、ＴＬＲ７−／−細胞において消失し、またバフィロマイシンＡによる前処理によっても消失した。第２に、バフィロマイシンＡは、インフルエンザウイルスおよびイミキモド処理によりＰＫＣ活性化を抑制した。これによりＰＫＣは、急性ＮＯＸ２活性化の上流にあると言える（Ｄｒｕｍｍｏｎｄら（２０１１年）上記参照；ＢｅｄａｒｄおよびＫｒａｕｓｅ（２００７年）上記参照）。第３に、バフィロマイシンＡは、ｐ４７ｐｈｏｘ−ＮＯＸ２の会合を抑制した。これは、ＮＯＸ２集合および活性化に関する重要なステップである。
【０１２６】
（実施例３）
エンドソームＲＯＳのウイルス株非依存性
マクロファージをライノウイルス（ピコルナウイルス科、第ＩＶ群）、呼吸器合胞体ウイルス（パラミクソウイルス科、第Ｖ群）、ヒトパラインフルエンザウイルス（パラミクソウイルス科、第Ｖ群）、ヒトメタニューモウイルス（パラミクソウイルス科、第Ｖ群）、センダイウイルス（パラミクソウイルス科、第Ｖ群）、デングウイルス（フラビウイルス科、第ＩＶ群）、またはＨＩＶ（レトロウイルス科、第ＶＩ群、ｓｓＲＮＡ−ＲＴウイルス）に曝露すると、エンドソームＲＯＳの有意な上昇が生じた。これは、ＴＬＲ７−／−マクロファージでは顕著に抑制されたが、ＴＬＲ９−／−細胞では影響されなかった（図３ａおよびｂ（Ｆｉｇｕｒｅ  ３Ａおよび３Ｂ）。ムンプスウイルス（パラミクソウイルス科、第Ｖ群）とニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ、パラミクソウイルス科、第Ｖ群）はともに、有意にはエンドソームＲＯＳを生成できなかった（図３ａおよびｂ）。ここで、このようなウイルスが、エンドサイトーシスではなく細胞膜融合プロセスを介して、細胞に主に侵入することに注目すべきである。マクロファージをロタウイルス（アカゲザル株またはウシＵＫ株、（レオウイルス科、第ＩＩＩ群））へ曝露した場合でも、エンドソームＲＯＳを生成することができなかった（図３ａおよびｂ）。ＤＮＡウイルスである単純ヘルペスウイルス２型（ヘルペスウイルス科、第Ｉ群）およびワクシニアウイルス（ポックスウイルス科、第Ｉ群）ではそれぞれ、エンドソームＲＯＳの上昇が、ＷＴマクロファージおよびＴＬＲ７−／−マクロファージでは生じたが、ＴＬＲ９−／−マクロファージでは生じなかった（図３ａおよびｂ）。ＴＬＲ７によりｓｓＲＮＡウイルス、またはＴＬＲ９によりＤＮＡウイルスのいずれかが特異的に認識されることによって、ＮＯＸ２オキシダーゼ依存性にエンドソームＲＯＳのバーストが生じることが結論付けられる。
【０１２７】
（実施例４）
細菌およびウイルスは異なるＲＯＳ経路を活性化する
細胞膜ＴＬＲ、特にＴＬＲ１、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４、ならびにエンドソーム内に存在しないもの（ＴＬＲ７等）は、細菌を検知すると、ミトコンドリアをマクロファージファゴソームへ動員し、ミトコンドリア依存性にＲＯＳを生成する（Ｗｅｓｔら（２０１１年）Ｎａｔｕｒｅ４７２巻（７３４４号）４７６〜４８０頁）。しかし、エンドソームＴＬＲを刺激することによって、ミトコンドリアＲＯＳを増大させることはできなかった（Ｗｅｓｔら（２０１１年）上記参照）。イミキモドによるＴＬＲ７活性化は、エンドソームＲＯＳの有意な上昇を生じるが（図２ｆ（Ｆｉｇｕｒｅ  ２Ｆ））、マクロファージミトコンドリアスーパーオキシドの生成を増加させることができなかった。グラム陽性細菌である肺炎レンサ球菌（ＳＰ）またはグラム陰性の分類不可能なインフルエンザ菌（ＮＴＨＩ）に応答するファゴソームＲＯＳの生成を調べた。ＳＰとＮＴＨＩはともに、ＷＴマウスマクロファージにおいてＲＯＳ生成を生じた（図４（Ｆｉｇｕｒｅ  ４））。これは、ＳＯＤ３−／−細胞では有意に増強されたが、ＴＬＲ７−／−マクロファージでは影響されなかった（図４）。したがって、エンドソームＲＯＳ生成は、エンドサイトーシスそれ自体に特有ではないが、「病原体（カーゴ）特異的」応答であると言える。抗菌目的で生成されたＲＯＳは、中心的ハブとして作用して自然免疫シグナル伝達を促進する、ミトコンドリアに必須の役割を必要とする。対象的に、ｓｓＲＮＡウイルスは、このような抗菌のためのＲＯＳ生成経路を利用しない。
【０１２８】
（実施例５）
エンドソームＨ２Ｏ２はＴＬＲ７免疫を抑制する
エンドソームＲＯＳの機能的重要性を確立するために、エンドソームＴＬＲ７依存性であり、したがって、ウイルス病原性に関連する、サイトカインの生成についてＮＯＸ２阻害の影響を評価した（Ｄｉｅｂｏｌｄら（２００４年）上記参照）。イミキモドによってＩＦＮ−β、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６発現がＷＴマクロファージにおいては有意に上昇したが、ＴＬＲ７−／−マクロファージ（図５ａ）またはバフィロマイシンＡ（１００ｎＭ）で処理したマクロファージ（図５ｂ）においては上昇しなかったことを示すことにより、エンドソームおよびＴＬＲ７依存性シグナルを確認した。第２に、ＮＯＸ２オキシダーゼ阻害物質およびＨ２Ｏ２スカベンジャーであるアポシニン（３００μＭ）によって前処理することにより、ＩＦＮ−β、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６発現が、イミキモドに応答してＷＴマクロファージでは有意に増強されたが、ＴＬＲ７−／−マクロファージでは増強されず、ＮＯＸ２オキシダーゼ由来ＲＯＳのサイトカイン発現に対する抑制作用が、ＴＬＲ７に依存することを示した（図５ａ）。対照的に、ＴＬＲ３アゴニストであるポリＩ：Ｃ（２５μｇ／ｍＬ）に応答したＩＦＮ−β、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６発現は、アポシニンによる前処理により抑制されたが、ＴＬＲ９アゴニストであるＣｐＧ（１０μｇ／ｍＬ）により引き起こされた、同一のこのようなサイトカインの増加は、アポシニンによって影響されなかった。ＮＯＸ２オキシダーゼがＴＬＲ７免疫にｉｎ  ｖｉｖｏで影響するかどうかをさらに試験した。ＷＴおよびＮＯＸ２−／ｙマウスを、単一用量のイミキモド（５０μｇ／マウス、鼻腔内）で処置して、２４時間後に肺におけるＩＦＮ−β、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αを測定した。この測定の時点は、ＲＮＡ感染の初期相を反映するように選択された。イミキモドに応答した気道炎症の識別可能な変化は存在しなかったが（図５ｃ）、イミキモドで処置すると、ＩＦＮ−β、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αのレベルがＮＯＸ２−／ｙマウスにおいて上昇した（図５ｄ）。
【０１２９】
エンドソームＮＯＸ２オキシダーゼ活性によりＴＬＲ７依存性応答の抑制がどのように生じるかを確立することが求められ、親種のスーパーオキシドおよびその直接の下流生成物であるＨ２Ｏ２が、原因となるメディエーターであると仮定された。外因性ＳＯＤ（３００Ｕ／ｍＬ）の追加によるスーパーオキシドを不活化は、基礎的な、またはイミキモドにより刺激された、ＩＦＮ−β、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の発現に影響することができず、スーパーオキシドそれ自体がＴＬＲ７応答を調節するのにほとんど役立たないことを示唆した。Ｈ２Ｏ２を調べるために、カタラーゼを利用して、エンドソーム内で生成されたＨ２Ｏ２を不活化した。３０分以内に、ＦＩＴＣ標識カタラーゼに曝露すると、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒとの共局在が生じたことが見出され、酸性化エンドソーム区画への内部移行が確認された（図６ａ（Ｆｉｇｕｒｅ  ６Ａ））。カタラーゼ（１０００Ｕ／ｍＬ）に１時間、「パルス」曝露すると、２４時間後にＩＦＮ−βおよびＩＬ−１β発現の有意な上昇が、ＷＴマクロファージでは生じたが、ＴＬＲ７−／−マクロファージでは生じなかった（図６ｂ（Ｆｉｇｕｒｅ  ６Ｂ））。その上、イミキモド依存性の応答は、カタラーゼの存在下で有意に増大した（図６ｃ（Ｆｉｇｕｒｅ  ６Ｃ））。カタラーゼ依存性のサイトカインの増加は、ダイナソアで処理したＷＴマクロファージでは有意に抑制されたが（図６ｄ（Ｆｉｇｕｒｅ  ６Ｄ））、ＴＬＲ２−／−マクロファージでは影響されなかった（図６ｅ（Ｆｉｇｕｒｅ  ６Ｅ））。ＴＬＲ７のエンドソームへの移行は、シャペロンタンパク質であるＵＮＣＢ９３の作用により制御される。実際、ＵＮＣＢ９３の非存在下では、ヌクレオチド検知ＴＬＲが、ＭｙＤ８８／ＴＲＩＦ依存性シグナル伝達経路を開始するエンドリソソーム内に達することができないため、実質的なシグナル伝達異常が存在する。ＵＮＣＢ９３−／−細胞では、カタラーゼ処理に対するサイトカインの増加は、ＷＴ細胞において観察されたそれよりも有意に小さかった（図６ｆ（Ｆｉｇｕｒｅ  ６Ｆ））。したがって、Ｈ２Ｏ２の抑制作用は、ＴＬＲ７がエンドソーム区画内に存在する場合に生じる可能性が最も高い。カタラーゼは、ＴＬＲ７、ＴＲＥＭＬ４またはＮＬＲＰ３発現に対しては作用せず、Ｈ２Ｏ２がＴＬＲ７、ＴＬＲ７活性の正の制御因子（すなわち、ＴＲＥＭＬ４  ２６）またはＴＬＲ７に類似の抗ウイルスサイトカインを活性化するＮＬＲＰ３の発現を調節しないことを示した（図６ｇ〜ｊ（Ｆｉｇｕｒｅ  ６Ｇ〜Ｊ））。したがって、Ｈ２Ｏ２は、翻訳後に作用する可能性がある。エンドソームＮＯＸ２オキシダーゼ由来Ｈ２Ｏ２が、ＴＬＲ７応答にｉｎ  ｖｉｖｏで影響するかどうかを調べた。カタラーゼ（１０００Ｕ／マウス）をＷＴマウスに鼻腔内投与すると、肺のＩＦＮ−β、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６が２４時間後に３〜４倍の増加を示し、この発生後に気道炎症が明白となった（図６ｋおよびｌ（Ｆｉｇｕｒｅ  ６ＫおよびＩ）。
【０１３０】
受容体活性を制御し、活性化の際にエンドソーム区画内に露出するＴＬＲ７（Ｋａｎｎｏら（２０１３年）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２５巻（７号）４１３〜４２２頁）のタンパク質ドメイン上のシステイン残基を、エンドソームＮＯＸ２オキシダーゼにより放出されたＨ２Ｏ２が標的とするかどうかという疑問が生じた。このようなシステイン残基は、ロイシン反復領域内にＣｙｓ２６０、Ｃｙｓ２６３、Ｃｙｓ２７０およびＣｙｓ２７３、ならびにＴＬＲ７に特有の２つのさらなるシステイン、Ｃｙｓ９８およびＣｙｓ４４５を含む（図１０および１１（Ｆｉｇｕｒｅ  １０および１１））。部位特異的変異誘発を実施して、１）このようなシステイン残基の６つすべてがアラニンで置換されている変異体、２）Ｃｙｓ９８とＣｙｓ４４５の二重変異を有する変異体（ＴＬＲ７Ｃ９８Ａ／Ｃ４４５Ａ）、ならびに３）Ｃｙｓ９８（ＴＬＲ７Ｃ９８Ａ）およびＣｙｓ４４５（ＴＬＲ７Ｃ４４５Ａ）の単一変異を含む、一連のＴＬＲ７変異体を作製した。ＷＴ  ＴＬＲ７またはＴＬＲ７Ｃ４４５ＡのＴＬＲ７−／−マクロファージへのトランスフェクションでは、サイトカイン発現をこのような細胞において刺激するイミキモドの能力が回復したが、６つの変異を含むＴＬＲ７、ＴＬＲ７Ｃ９８Ａ／Ｃ４４５ＡまたはＴＬＲ７Ｃ９８Ａによるトランスフェクションでは、回復しなかった（図７ａ（Ｆｉｇｕｒｅ  ７Ａ））。カタラーゼ（１０００Ｕ／ｍＬ）処理は、変異ＴＬＲ７、ＴＬＲ７Ｃ９８Ａ／Ｃ４４５ＡまたはＴＬＲ７Ｃ９８Ａを発現する細胞におけるサイトカイン発現に対してほとんど、または全く作用しなかったが、これによりＷＴ  ＴＬＲ７またはＴＬＲ７Ｃ４４５Ａを有する細胞におけるサイトカイン発現は、顕著に増加した（図７ａ）。配列解析は、多重配列解析アルゴリズム（すなわち、ＣＬＵＳＴＡＬ  ＯＭＥＧＡ）と対比較配列解析（ＮＣＢＩ、Ｂｌａｓｔ）の両方を使用し、ヒトＴＬＲ７を基準点として用いて行った。多重配列解析を使用して、Ｃｙｓ９８が、ＴＬＲ７に特有であり、硬骨類からヒトまでを含む脊椎動物ＴＬＲ７において十分に保存されていることが確認された（図７ｂ、１０および１１（Ｆｉｇｕｒｅ  ７Ｂ、１０および１１））。対比較配列アラインメントでは、Ｃｙｓ９８が、ＴＬＲ７上の２７個のシステインのうち、ＴＬＲ７に特有であり、脊椎動物において十分に保存されている、唯一のシステイン残基であることが示された。エンドソームＮＯＸ２オキシダーゼにより生成されたＨ２Ｏ２が、進化上保存された特有の単一システイン残基、すなわち、ＴＬＲ７のエンドソーム表面上に存在するＣｙｓ９８を修飾して、抗ウイルスサイトカイン応答を減衰させる可能性があることがここで示唆される。潜在的には、このことは、ＴＬＲ７のＣｙｓ９８が、ウイルス感染において免疫機能をコントロールする新たな酸化還元センサーであることを示す。
【０１３１】
（実施例６）
ＮＯＸ２オキシダーゼは抗体生成を減衰させる
エンドソームＮＯＸ２オキシダーゼ活性の抑制作用を、インフルエンザＡ型ウイルス感染後にやはり生じるＩ型ＩＦＮおよびＩＬ−１β発現について調べた。第１に、ウイルスにより、転写因子であるＩＲＦ−７の、ＴＬＲ７−／−ＢＭＤＭではなくＷＴ  ＢＭＤＭの核への移行が引き起こされ、インフルエンザＡ型ウイルスが、ＴＬＲ７依存性抗ウイルスシグナル伝達をマクロファージにおいて活性化したことを示した。第２に、ウイルスにより、ＩＦＮ−β、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−α発現がＮＯＸ２−／ｙＡＭにおいて大幅に上昇した（図８ａ（Ｆｉｇｕｒｅ  ８Ａ））。第３に、インフルエンザＡ型ウイルス（Ｈｋｘ３１；１０５ＰＦＵ／マウス）にマウスをｉｎ  ｖｉｖｏで２４時間感染させると、肺ＩＦＮ−β、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６のｍＲＮＡ（図８ｂ（Ｆｉｇｕｒｅ  ８Ｂ））、ならびに血清（図８ｃ（Ｆｉｇｕｒｅ  ８Ｃ））および肺ＩＦＮ−βタンパク質（図８ｄ（Ｆｉｇｕｒｅ  ８Ｄ））がＮＯＸ２−／ｙマウスにおいて大幅に増加した。したがって、十分に機能的なＮＯＸ２オキシダーゼにより、インフルエンザＡ型ウイルスにより引き起こされる抗ウイルスサイトカイン生成が抑制される。ＴＬＲ７は、Ｂ細胞の活性化および抗体生成に必須である。ＮＯＸ２オキシダーゼにより、ＴＬＲ７依存性免疫がインフルエンザＡ型ウイルスに対してｉｎ  ｖｉｖｏで抑制されるかどうかを試験するために、熱により不活化した複製欠損インフルエンザＡ型ウイルスを刺激として使用し、これにより、ある種のウイルス型は、ＴＬＲ７  ＰＲＲの結合を主に引き起こし、ＲＩＧ−ＩおよびＮＬＲＰ３には、ほとんど全く寄与しないと予想された２０。不活化ウイルスの鼻腔内接種は、７日間の体重減少（図８ｅ（Ｆｉｇｕｒｅ  ８Ｅ））またはＢＡＬＦにおける気道炎症（図８ｆ（Ｆｉｇｕｒｅ  ８Ｆ））に作用しなかった。ＮＯＸ２が欠失すると、肺におけるＩＦＮ−β、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α  ｍＲＮＡレベル（図８ｇ（Ｆｉｇｕｒｅ  ８Ｇ））、ならびに血清およびＢＡＬＦの両方におけるＩｇＡ、総ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３レベル（図８ｈおよびｉ（Ｆｉｇｕｒｅ  ８ＨおよびＩ）の有意な上昇が生じた。したがって、インフルエンザＡ型ウイルス感染後にエンドソームＮＯＸ２オキシダーゼが活性化されると、ウイルスの最適クリアランスおよび再感染に対する抵抗性に必要とされるプロセスである抗体生成の抑制による、抗ウイルスサイトカインおよび液性免疫の抑制が生じる。
【０１３２】
（実施例７）
エンドソーム標的化ＮＯＸ２阻害物質
革新的な分子標的システムを合成して、ウイルスシグナル伝達プラットフォームを、ＲＯＳ生成を抑止することによって破壊するために、特異的ＮＯＸ２オキシダーゼ阻害物質（すなわち、ｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴ）を直接エンドソームに送達した。この実施のため、ＰＥＧリンカーにより膜アンカーコレスタノールと結合したｇｐ９１ｄｓ−ｔａｔをペプチドのＮ末端領域に含む３部分構造体を作製した。類似の構築物は、ベータセクレターゼ酵素阻害物質のエンドソーム局在性を増強することが、これまでに示されている（Ｒａｊｅｎｄｒａｎら（２００８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ３２０巻（５８７５号）５２０〜５２３頁）。同一のＰＥＧリンカーを使用してコレスタノールと結合したＣｙ５フルオロフォアにより、核周囲領域における細胞質蛍光、ならびにＥＥＡ１、ＮＯＸ２およびインフルエンザウイルスＮＰとの共局在が、ウイルス感染後にダイナソア（１００μＭ）感受性様式で生じて、エンドサイトーシスがその主な細胞侵入機序であるという証拠をもたらした（図９ａ〜ｅ（Ｆｉｇｕｒｅ  ９Ａ〜Ｅ））。マクロファージにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのスーパーオキシド生成は、コレスタノール結合ｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴ（Ｃｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴ）により、非結合薬物（Ｕｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴ；図９ｆ（Ｆｉｇｕｒｅ  ９Ｆ））と比較して少なくとも１０倍強い効力で抑制された。これは、化合物のＲＯＳ除去特性の増強に起因しない（図９ｇ（Ｆｉｇｕｒｅ  ９Ｇ））。
【０１３３】
Ｃｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴが、インフルエンザＡ型ウイルス感染後にｉｎ  ｖｉｖｏで疾患重症度を抑制するかどうかを調べた。インフルエンザＡ型ウイルス感染の１日前から感染後３日目まで毎日Ｃｇｐ９１−ＴＡＴ（０．０２ｍｇ／ｋｇ／日）を鼻腔内投与すると、気道炎症が約４０％減少したが（図９ｈ（Ｆｉｇｕｒｅ  ９Ｈ））、Ｕｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴは、作用しなかった（図９ｈ）。Ｃｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴにより、肺のＩ型ＩＦＮ−β  ｍＲＮＡレベルが、対照ウイルス群と比較して有意に増加したが、Ｕｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴでは、そのようには増加しなかった（図９ｉ（Ｆｉｇｕｒｅ  ９Ｉ））。ｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴのコレスタノール結合によるＮＯＸ２阻害のこの向上が、コレスタノール−ＰＥＧリンカーそれ自体に起因した可能性を排除するために、コレスタノールＰＥＧリンカーをスクランブルｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴ（Ｓｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴ）と結合させ、インフルエンザ感染に対するｉｎ  ｖｉｖｏでのその作用を調べた。Ｓｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴは、気道炎症、肺ＩＦＮ−β  ｍＲＮＡレベルおよびスーパーオキシド生成に対して作用しなかった。Ｕｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴの用量を１０倍に０．２ｍｇ／ｋｇ／日まで増加すると、同一用量のＣｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴと同様に、インフルエンザＡ型ウイルスに起因する体重減少が３日目に有意に低減され、気道炎症ならびにＢＡＬＦ中の炎症細胞におけるスーパーオキシド生成がほとんど消失した（図９ｊ〜ｌ（Ｆｉｇｕｒｅ  ９Ｊ〜Ｌ）。際立ったことには、Ｃｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴ（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）とＵｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴ（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）の両方により、肺インフルエンザＡ型ウイルス負荷がほぼ１０，０００分の１に低下することとなった（図９ｍ（Ｆｉｇｕｒｅ  ９Ｍ））。したがって、エンドソームＮＯＸ２オキシダーゼをｇｐ９１ｄｓ−ＴＡＴの鼻腔内投与により抑制すると、インフルエンザＡ型ウイルス病原性が実質的に減少する。これは、エンドソーム区画において生じるＮＯＸ２オキシダーゼ活性を抑制するための革新的な方法である。カスタムメイドの阻害物質は、コレスタノール結合により細胞内区画を介して特異的および選択的に送達される。この裏付けとして、図９ａおよびｂ（Ｆｉｇｕｒｅ  ９ＡおよびＢ）の知見により、コレスタノールと結合させると、エンドソームへの送達を促進する薬物送達システムが生じることが示される。すなわち、薬物は、ダイナソアによる前処理によって消失する、ＥＥＡ１＋エンドソームとの強い共存を示した。この送達システムは、ＮＯＸ２阻害物質を、ウイルス感染に関する作用の中心的部位へと運ぶ（図９ｄ（Ｆｉｇｕｒｅ  ９Ｄ）は、ウイルス核タンパク質と発明者らによるＮＯＸ２阻害物質との強力な共存を示した）。エンドソームへの内部移行に続いて、薬物が、エンドソーム膜の内腔面上にあり、ＴＡＴ部分により膜を貫通し、ＮＯＸ２活性を抑制し得る可能性が最も高いことを本明細書において提唱する。薬物は、他の部位または位置のＮＯＸ２に向かって、さらに拡散可能であり得るが、薬物がエンドサイトーシス経路を介して選択的に送達されると考えられることを考慮すると、直接かつ主な作用点は、エンドソームにおけるＮＯＸ２活性であると提唱する。
【０１３４】
（実施例８）
ＮＯＸ２の役割
ウイルスがエンドソーム区画内に侵入すると、ＮＯＸ２オキシダーゼ依存性のＲＯＳ生成がエンドソームにおいて引き起こされるという証拠をここで提供する。エンドソームにおけるスーパーオキシドの濃縮への主要な寄与体は、この区画内で直接生成されるスーパーオキシドであることをここで提唱する。スーパーオキシドは、ＮＯＸ２の一次生成物であり、ＮＯＸ２のトポロジー、およびこの触媒サブユニットを通じた一方向性の電子の移動によって、エンドソーム区画においてのみ生成され得る。これを踏まえて、スーパーオキシドが、負の電荷を有するために、その生成部位から遠く離れては移動しないことは十分に受け入れられている。スーパーオキシドと比べると、過酸化水素は、膜を透過して拡散するいくらかの能力を有しており、そのため、いくつかのエンドソームＨ２Ｏ２が、細胞膜のような細胞の他の部位で発現したＮＯＸ２により、他の部位で生成されている可能性があると予想され得る。ほとんど離れていない部位で生成されたＨ２Ｏ２が、エンドソーム区画内に入る方法を見出している可能性が高いことを示す、いくつかの証拠が存在している。ウイルス感染後のＰＫＣ活性化は、ＮＯＸ２活性化に重要であり、１）ウイルスが細胞に侵入しないよう阻止される（図２Ｈおよび２Ｉ（Ｆｉｇｕｒｅ  ２Ｈおよび２Ｉ））、２）エンドソーム酸性化がバフィロマイシンＡにより遮断される（図２Ｈおよび２Ｉ）、または３）ＴＬＲ７が存在しない（すなわち、ＴＬＲ７−／−マクロファージを使用する）場合に著しく障害される。したがって、エンドソームＮＯＸ２由来のＲＯＳ生成は、ウイルスがエンドソームに侵入し、エンドソーム特異的経路を活性化した後にのみ生じ、このことは、エンドソームＮＯＸ２にＨ２Ｏ２生成の中心的部位としてのさらなる信憑性を与えている。
【０１３５】
ここで、エンドソームＲＯＳは、抗ウイルス免疫、および宿主がウイルス感染と戦い、それを除去する能力に影響する、ウイルス病原性の基礎的分子機構において必須の負の制御因子であることを実証する。重要なことには、この作用は、ウイルスの分類にかかわらず、エンドサイトーシス経路を介して細胞に侵入するすべてのウイルスについて保存され、ＴＬＲ７依存性である。これは、著しい罹患率および死亡率を世界的に生じる、広範なウイルスに対する抗ウイルス療法の標的を提示する。
【０１３６】
（実施例９）
ＴＬＲ７のＣ９８を包含するおとりペプチドの生成
ＨＩＶ−ＴＡＴ取込みペプチド部分（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、配列番号２）に動作可能に結合する、マウスＴＬＲ７のＤ９５〜Ｌ１０４（ＤＬＲＣＮＣＶＰＶＬ、配列番号１）を含む、おとりペプチドを生成する。おとりペプチド（本明細書においてＣ９８ｉと呼ぶ）は、Ｃ９８とＣ４７５との間に形成するジスルフィド結合を阻止し、したがって、ＴＬＲ７の活性化を防ぐ。
【０１３７】
（実施例１０）
Ｃ９８ｉはＴＬＲ７アゴニスト（イミキモド）に対する応答を遮断する
図１２ａ（Ｆｉｇｕｒｅ  １２Ａ）（生データ）および図１２ｂ（Ｆｉｇｕｒｅ  １２Ｂ）（正規化データ）は、イミキモド（ＴＬＲ７アゴニスト）への曝露後に骨髄由来マクロファージにより生成されるサイトカインＩＬ−１βが、Ｃ９８ｉの存在下で上昇することを示す。類似の結果が、図１５に示される。データは、Ｃ９８ｉがＴＬＲ７活性を遮断していることを示す。
【０１３８】
（実施例１１）
Ｃ９８ｉはＴＬＲ７アゴニスト（ガーディキモド）に対する応答を遮断する
図１３は、Ｃ９８ｉが、ＴＬＲ７アゴニストであるガーディキモドに対するＴＬＲ７応答を遮断することを示す。ＩＬ−１βの基礎的非刺激レベルに対する作用は示されない（図１３）。トリプトファンを９８番目に有する近縁腫のファミリーメンバーであるＴＬＲ９、またはＴＬＲ４アゴニスト応答もしくはＴＬＲ２アゴニスト応答に対しても作用しなかった。ＴＬＲ７とＴＬＲ４、およびＴＬＲ７とＴＬＲ２の間の配列相同性は、非常にわずかしか存在しない。
【０１３９】
類似の結果が、ＴＬＲ５アゴニスト応答に認められた。Ｃ９８ｉは、ＴＬＲ７発現に対しても、細胞生存に対しても有害作用を有しなかった。
【０１４０】
データは、Ｃ９８ｉが、ＴＬＲ７活性を遮断し、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ９活性に影響しないことを示す。これは、配列特有性のため、ＴＬＲファミリーの他のメンバー（すなわち、ＴＬＲ１、ＴＬＲ３、ＴＬＲ６およびＴＬＲ８）に影響する可能性は低い。Ｃ９８ｉがＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５およびＴＬＲ９の活性に影響しないという知見はまた、薬物が、サイトカインＩＬ−１βの生成に影響する細胞機能に対する非特異的特性を有しないことを示唆する。
【０１４１】
ＴＬＲ７は、ウイルス、自己免疫疾患およびがんに関与する標的である。ＴＬＲ７を標的とする新たな薬物は、莫大な可能性を有する。
【０１４２】
（実施例１２）
Ｃ９８ｉの無ＴＡＴバージョンの作用
ＴＡＴの非存在下では、Ｃ９８ｉペプチドは、ＴＬＲ７アゴニストであるイミキモドの応答をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害する能力を保持する。ＴＡＴの非存在は、「無ＴＡＴ」と呼ばれる。結果を図１６ａに示す。細胞生存に対する有害作用は存在しなかった（図１６ｂ）。
【０１４３】
（実施例１３）
Ｃ９８ｉはインフルエンザａ型ウイルス応答を阻害する
図１７は、Ｃ９８ｉが、インフルエンザＡ型ウイルス（Ｘ３１）応答（ＩＬ−６−ｍＲＮＡ発現）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害することを示す。Ｃ９８ｉの非存在下では、ＩＬ−６のｍＲＮＡ発現は、Ｃ９８ｉ＋インフルエンザＡ型ウイルス（Ｘ３１）と比較して有意に高い。
【０１４４】
（実施例１４）
スクランブルＣ９８ｉアミノ酸配列の作用
Ｃ９８ｉのアミノ酸配列を組み換えて、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＣＬＶＰＮＤＣＲＬＶ−ＮＨ２（配列番号４４）を生成した。スクランブルＣ９８ｉペプチド配列は、ＴＬＲ７アゴニスト（イミキモド）を阻害することができなかった。結果を図１８に示す。
【０１４５】
（実施例１５）
ＴＬＲ７アゴニスト（イミキモド）応答に対する短ペプチドの作用
Ｃ９８ｉのおとりペプチドのＡｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（ＲＣＮＣ）［配列番号４５］モチーフを修飾して、ＲＡＮＣ（配列番号４６）、ＲＡＮＡ（配列番号４７）およびＲＣＮＡ（配列番号４８）を形成した。このような短ペプチドを、無ＴＡＴを用いて試験して、ＴＬＲ７アゴニストであるイミキモドに対するその作用を確認した。図１９は、ＲＡＮＣ、ＲＣＮＣ、ＲＡＮＣ、ＲＡＮＡまたはＲＣＮＡが、いずれもＴＬＲ７アゴニストであるイミキモドの応答をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害しなかったことを示す。
【０１４６】
（実施例１６）
ウイルス感染後のＣ９８ｉの抗酸化および免疫調節作用のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける検査
単離マクロファージを使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏでの実験：酸化ストレスおよびウイルス複製をＣ９８ｉの存在または非存在下で調べるためのアッセイ。次のウイルスを調べた：低病原性から高病原性のインフルエンザＡ型ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、デングウイルス。
【０１４７】
エンドソーム酸化ストレスおよびウイルス複製がＣ９８ｉにより抑制されることが予想される。
【０１４８】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験：マウスにおけるＣ９８ｉの鼻腔内送達後、インフルエンザＡ型ウイルス感染（鼻腔内送達による）［Ｔｏら（２０１７年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ８巻（６９号）１〜１７頁］。肺酸化ストレス、炎症、損傷、ウイルス負荷および肺における免疫細胞応答の潜在的制御、ならびに体循環を評価する。
【０１４９】
（実施例１７）
自己免疫についてのループス様モデル試験におけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＣ９８ｉの免疫調節作用の検査
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＣ９８ｉで処置し、次いで、皮膚外用のＴＬＲ７アゴニストのイミキモド（Ａｌｄａｒａ  Ｃｒｅａｍ）を耳に週３回処置する。処置後、マウスを血清自己抗体およびクレアチニンレベル、ならびに腎臓、脾臓、肝臓、心臓および皮膚の組織病理について調べる。免疫学的異常を免疫組織化学検査、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、および蛍光活性化細胞分類により解析する。
【０１５０】
当業者は、本明細書に記載の開示が、特に記載するものを除く変形形態および変更形態を許容する余地があることを理解し得る。本開示では、このような変形形態および変更形態のすべてを検討することが理解される。本開示はまた、本明細書において言及または指示する、すべてのステップ、特徴、組成物および化合物を個別にまたはまとめて、ならびにステップまたは特徴または組成物または化合物の任意の２つ以上のあらゆる組合せを可能とする。
【０１５１】
本明細書において引用する、すべての特許、出願、公開、試験方法、文献、および他の資料は、これによって、本明細書において物理的に提示するものとして、その全体を参照により組み込む。
【０１５２】
参考文献
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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