(57)【要約】  本発明は、パピローマウイルス（ＰＶ）Ｌ１タンパク質またはＬ１／Ｌ２タンパク質を含むポリペプチドおよびヒト病原体由来のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む標的ペプチドから組み立てられたキメラウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。本発明はまた、免疫応答の抗原特異的リダイレクターとしてキメラＶＬＰを使用する方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
パピローマウイルス（ＰＶ）Ｌ１タンパク質および表面表示標的ペプチドを含む、キメラウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記標的ペプチドが、ヒト病原体のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含み、前記ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが、腫瘍関連抗原ではなく、前記標的ペプチドが、ＶＬＰに抱合されかつ前記標的ペプチドが、多イオン性システイン配列を介して前記ＶＬＰに抱合されない、キメラＶＬＰ。
【請求項２】
ＰＶＬ２タンパク質をさらに含む、請求項１に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項３】
前記標的ペプチドが、ジスルフィド結合、マレイミド結合、またはアミド結合を介して前記Ｌ１タンパク質のシステイン、リジンまたはアルギニンに抱合される、請求項１に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項４】
前記標的ペプチドが、ジスルフィド結合、マレイミド結合、またはアミド結合を介して前記Ｌ２タンパク質のシステイン、リジンまたはアルギニンに抱合される、請求項２に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項５】
前記標的ペプチドが、パピローマウイルスのペプチドでない、請求項１に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項６】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが、小児期ワクチンの抗原ポリペプチドに由来する、請求項１に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項７】
前記病原体が、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫である、請求項１に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項８】
前記ウイルスが、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、帯状疱疹ウイルス、風疹、肝炎ウイルス、例えば、Ａ型肝炎ウイルスまたはＢ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス、Ａ型またはＢ型インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、痘瘡（天然痘）ウイルス、狂犬病ウイルス、デングウイルス、エボラウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱病ウイルス、またはジカウイルスである、請求項７に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項９】
前記標的ペプチドが、表１に記載のペプチドを含む、請求項１に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項１０】
前記細菌が、ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、破傷風菌、ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、インフルエンザ菌、ｍｅｎｉｇｉｃｏｃｃｕｓ、例えば、Ｍｅｎｉｇｉｃｏｃｃａｌ  ＡＣＷＹ、ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、コレラ菌、結核菌、ＢＣＧ、ｔｙｐｈｏｉｄ、大腸菌、ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＡ群またはＢ群、肺炎連鎖球菌、炭疽菌、ｃｈｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、またはＹｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐ、例えば、ｙｅｒｉｓｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓである、請求項７に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項１１】
前記寄生虫が、ｅｎａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、トキソプラズマ、ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐ．、例えば、旋毛虫、ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、例えば、ｔｒｉｃｏｍｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐ．、例えば、ガンビアトリパノソーマ、ローデンシアトリパノソーマ、またはクルーズトリパノソーマ、またはｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、例えば、ｐｌａｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｉｕｍ、三日熱マラリア原虫、または四日熱マラリア原虫である、請求項７に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項１２】
前記Ｌ１タンパク質が、ＢＰＶ１またはＨＰＶ１、２、３、４、５、６、８、９、１１、１５、１６、１７、１８、２３、２７、３８、３１、４５、３３、３５、３９、５１、５２、５８、６６、６８、７０、７６、および９２型のＬ１タンパク質である、請求項１に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項１３】
前記Ｌ２タンパク質が、ＢＰＶ１またはＨＰＶ１、２、３、４、５、６、８、９、１１、１５、１６、１７、１８、２３、２７、３８、３１、４５、３３、３５、３９、５１、５２、５８、６６、６８、７０、７６、および９２型のＬ２タンパク質である、請求項２に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項１４】
前記Ｌ１タンパク質が、ＶＬＰの表面上に提示される３つを超えるシステインを含む、請求項１に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項１５】
前記Ｌ１タンパク質が、ＨＰＶ１６ＲＧ−１Ｌ１タンパク質（配列番号２２１）である、請求項１４に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項１６】
前記Ｌ１タンパク質が、ＱＬＹＫＴＣＫＱＡＧ  ＴＣＰＰＤＩＩＰＫＶ（配列番号２２２）を含む、請求項１５に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項１７】
前記ペプチドが、前記Ｌ１タンパク質のＤＥループ、ＨＩループまたはヘリックスＢ４ループの１つまたは複数に抱合される、請求項１に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項１８】
前記標的ペプチドが、ヒトＰＶ１６Ｌ１（ＨＰＶ１６Ｌ１）のヘリックスＢ４ループに抱合されるか、ウシＰＶ（ＢＰＶ）のＤＥループ、またはＰＶの等価なアミノ酸１３６／１３７に抱合される、請求項１に記載のキメラＶＬＰ。
【請求項１９】
癌細胞の成長を阻害するための方法であって、前記細胞を請求項１〜１６のいずれか１項に記載のキメラＶＬＰの有効量を含む組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項２０】
被験体における腫瘍の成長、進行または転移を阻害するための方法であって、
（ａ）それを必要とする被験体が病原体に対して免疫化またはワクチン接種されていたかどうかを確認すること、
（ｂ）キメラパピローマウイルス様粒子（ＶＬＰ）を前記腫瘍の成長、進行または転移の阻害に十分な量で前記被験体に投与すること
を含み、
前記キメラＶＬＰが、パピローマウイルスＬ１タンパク質および標的ペプチドを含み、前記標的ペプチドが、Ｌ１タンパク質のシステイン、リジンまたはアルギニンに抱合され、前記標的ペプチドが、それに対し前記被験体が免疫化されていた病原体のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含みかつ前記標的ペプチドが、キメラＶＬＰ上に表面表示される、方法。
【請求項２１】
前記被験体の細胞上に発現されるＭＨＣクラスＩ分子を決定することおよびキメラＶＬＰを選択することであって前記標的ペプチドが、ＭＨＣクラスＩ分子に結合することが公知である、決定することおよび選択すること、前記キメラＶＬＰを前記被験体に次いで投与することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記病原体が、ウイルス、細菌または寄生虫である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ウイルスが、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、帯状疱疹ウイルス、風疹、肝炎ウイルス、例えば、Ａ型肝炎ウイルスまたはＢ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス、Ａ型またはＢ型インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、痘瘡（天然痘）ウイルス、狂犬病ウイルス、デングウイルス、エボラウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱病ウイルス、またはジカウイルスである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記細菌が、ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、破傷風菌、ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、インフルエンザ菌、ｍｅｎｉｇｉｃｏｃｃｕｓ、例えば、Ｍｅｎｉｇｉｃｏｃｃａｌ  ＡＣＷＹ、ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、コレラ菌、結核菌、ＢＣＧ、ｔｙｐｈｏｉｄ、大腸菌、ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＡ群またはＢ群、肺炎連鎖球菌、炭疽菌、ｃｈｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐ、例えば、ｙｅｒｉｓｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記寄生虫が、ｅｎａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、トキソプラズマ、ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐ．、例えば、旋毛虫、ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．、例えば、ｔｒｉｃｏｍｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ、ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐ．、例えば、ガンビアトリパノソーマ、ローデンシアトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、  ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、例えば、ｐｌａｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｉｕｍ、三日熱マラリア原虫、または四日熱マラリア原虫である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的ペプチドが、ジスルフィド結合、またはマレイミド結合によって前記Ｌ１タンパク質のシステインに抱合される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的ペプチドが、前記Ｌ１タンパク質のループに抱合される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的ペプチドが、Ｌ１タンパク質のループに抱合されない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが、表１に列挙されるエピトープである、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが、表Ｉに列挙されるＭＨＣクラスＩ分子に結合する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＭＨＣクラスＩ分子が、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１／ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０３、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ２．１、またはＨＬＡ−Ａ＊０２である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが、ＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃファミリーに結合する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
前記キメラＶＬＰが、照射療法または化学療法後に投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
チェックポイント阻害剤を前記被験体に投与することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３５】
前記チェックポイント阻害剤が、キメラＶＬＰと順次にまたは本質的に同時に投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記チェックポイント阻害剤が、イプリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、およびニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、Ａｖｅｌｕｍａｂ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ）、Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
被験体における癌の成長を阻害するための方法であって、
（ａ）癌を有する被験体として前記被験体を同定すること、
（ｂ）前記被験体に以前に投与されたことのある抗原性因子を含むワクチンを同定すること、
（ｃ）パピローマＬ１タンパク質および標的ペプチドを含むキメラＶＬＰの有効量を含む組成物を前記被験体に投与することであって、前記標的ペプチドが、Ｌ１タンパク質に抱合されかつ前記標的ペプチドが、前記被験体に以前に投与された前記ワクチン中の前記抗原性因子のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む、投与すること
を含み、
前記キメラＶＬＰが、前記被験体における免疫応答を刺激するのに十分な量で投与され、前記抗原性因子の前記ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対し特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激することかつそれにより前記癌の成長を阻害することを含む、方法。
【請求項３８】
被験体における癌の成長を阻害するための方法であって、
（ａ）腫瘍を有する被験体として前記被験体を同定すること、
（ｂ）キメラＶＬＰを前記標的ペプチドに対する前記被験体による細胞性免疫応答を誘導するのに十分な量で前記被験体に投与すること
を含み、
前記キメラＶＬＰが、パピローマＬ１タンパク質もしくはＬ２タンパク質、またはＬ１およびＬ２タンパク質の両方、ならびに標的ペプチドを含み、前記標的ペプチドが、前記Ｌ１またはＬ２タンパク質のシステイン、リジンまたはアルギニンに抱合され、前記標的ペプチドが、前記腫瘍由来の腫瘍関連抗原でないＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含み、かつ前記細胞性免疫応答が、前記腫瘍の成長を阻害する、方法。
【請求項３９】
パピローマウイルスＬ１タンパク質、またはＬ１タンパク質およびＬ２タンパク質からＶＬＰを組み立てること、前記ＶＬＰのキャプシド様正二十面体構造を保持しながら前記ＶＬＰを還元するのに十分な還元条件に前記ＶＬＰを供すること、および還元されたＶＬＰに前記標的ペプチドを供しそれによりキメラＶＬＰを形成することを含む請求項１に記載のキメラＶＬＰを作製するための方法。
【請求項４０】
前記標的ペプチドが、前記ＶＬＰのＬ１またはＬ２タンパク質のシステイン（ｃｙｓｔｉｅｎｅ）および／またはリジンに抱合される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記標的ペプチドが、ジスルフィド結合マレイミド結合、またはアミド結合を介して前記ＶＬＰのＬ１またはＬ２タンパク質に抱合される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＶＬＰの表面システインの少なくとも３０％が、標的ペプチドを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＶＬＰの表面システインの少なくとも約３０％が、標的ペプチドを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
キメラＶＬＰ集団を含む組成物であって、各々のＶＬＰが、パピローマウイルスＬ１タンパク質および標的ペプチドを含み、前記ＶＬＰの前記システインの少なくとも３０％または前記リジンの３０％または前記システインおよび前記リジンの両方の３０％が、ジスルフィド結合、マレイミド結合を介して標的ペプチドに抱合される、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年５月２５日出願の特許出願第６２／６７６，５６６号および２０１７年６月２３日出願の特許出願第６２／５２４，３０８号（その全体が本明細書中で参考として援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、パピローマウイルス（ＰＶ）Ｌ１タンパク質またはＬ１／Ｌ２タンパク質を含み、ヒト病原体（複数可）に由来するＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ含有ペプチド（複数可）を含むキメラポリペプチドから組み立てられたキメラウイルス様粒子（ＶＬＰ）、かかるキメラＶＬＰを含む組成物、ならびに癌の処置のための自然免疫および適応免疫の両方の再指向および刺激におけるキメラＶＬＰの治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
国立がん研究所によれば、総癌死亡率は、減少し続けている：総癌発生率は、男性では減少しており、女性では一定である。すべてではないが、ほとんどの一般的な癌の５年生存率も改善されている。それにもかかわらず、２０１７年には、米国のみで１，６８８，７８０例が新たに癌と診断され、癌死亡者数は６００，９２０人に達すると推定される。
【０００４】
細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球（細胞傷害性Ｔリンパ球、またはＣＴＬと呼ばれることが多い）は、癌細胞を選択的に死滅させることができるので、腫瘍関連抗原に基づいた抗原特異的免疫療法は、腫瘍を制御するための有望な方法論として追求されている。免疫系を刺激し、腫瘍細胞を特異的に標的にして排除するためにかかる免疫療法が使用されてきた。かかる免疫治療は、非特異的な自己免疫がなく標的特異的であり、かつ潜在的に毒性が低いという点で魅力的である。それらはまた、手術、放射線療法、化学療法と比較して、侵襲性または外傷性が低いとみなされている。しかし、腫瘍関連抗原に基づいた癌ワクチンは、臨床的免疫原性、免疫寛容、および臨床成績が不良であるので、今日までの成功率は限られている。さらに、かかる方法は典型的には、腫瘍を特異的に標的にするために腫瘍関連抗原の同定を必要とする。さらに、腫瘍微小環境が、Ｔ細胞の癌細胞死滅を阻害し得る免疫抑制因子（例えば、チェックポイント（ＣＰ）タンパク質、例えば、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４／（Ｂ７−１／Ｂ７−２）、ＣＤ８６、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、およびＣＤ１３７L）を含み得ると認識されつつある。ＣＰタンパク質は、抗原指示免疫療法によって誘導される免疫応答の誘導期またはエフェクター期のいずれかを損なうことができる。かかる免疫抑制を克服するために、免疫ＣＰ阻害剤を使用してＣＰタンパク質を遮断し、腫瘍微小環境内の損なわれた腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を救出し、それらがよりよく癌細胞を死滅させることができるようになってきている。革新的ではあるが、ＣＰ阻害剤が有効であるためには抗腫瘍特異的免疫応答の存在が必要であるので、ＣＰ阻害剤の奏効率はせいぜい約３０％である。したがって、腫瘍の成長、進行、および転移を阻害するために、既存の強力で耐久性のあるＴ細胞応答を生成または活用する組成物および方法が依然として必要である。
【発明の概要】
【０００５】
発明の簡単な説明
本発明は、パピローマウイルス（ＰＶ）Ｌ１タンパク質、組換えＰＶＬ１タンパク質、またはＰＶＬ１タンパク質およびＬ２タンパク質を含むポリペプチドから組み立てられたキメラウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。本発明のキメラＶＬＰはまた、標的ペプチド（複数可）を含む。本明細書中で定義される標的ペプチドは、既存の記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されるＴ細胞エピトープを含む。本発明の１つの実施形態では、本発明のキメラＶＬＰは、表面に表示された標的ペプチド（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、標的ペプチドは、ＶＬＰの表面に付着または抱合されており、いくつかの実施形態では、標的ペプチドは、標的ペプチドが組み立てられたＶＬＰの表面に表示されるように、Ｌ１またはＬ２タンパク質中に組換えによって挿入されている。標的ペプチドは、別のヒト病原体由来のＴ細胞エピトープを含み、いくつかの実施形態では、標的ペプチドはパピローマウイルスのペプチドではない。いくつかの実施形態では、標的ペプチドは、マウスＥ７エピトープ（ａａ４９〜５７）を含まない。本発明はまた、本発明のキメラＶＬＰを含む組成物、および癌の処置におけるキメラＶＬＰの使用方法に関する。
【０００６】
本発明の１つの態様では、標的ペプチドは、ヒト病原体、例えば、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫に由来し、腫瘍関連抗原ではない。ウイルスには、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、アデノウイルス、アルボウイルス、エプスタイン・バーウイルス、コロナウイルス、サイトメガロウイルス、コクサッキーウイルス、帯状疱疹ウイルス、風疹、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルスまたはＢ型肝炎ウイルス、またはＣ型肝炎ウイルス）、単純ヘルペスウイルス１型または２型、ＪＣウイルス、Ａ型またはＢ型インフルエンザ、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、痘瘡（天然痘）ウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、デングウイルス、エボラウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱病ウイルス、またはジカウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
【０００７】
本発明の１つの態様では、ＶＬＰは、パピローマウイルス科の任意のメンバーのＬ１タンパク質から組み立てられている。本発明の１つの態様では、パピローマＬ１タンパク質は、動物パピローマウイルス（例えば、コットンラビットＰＶ、マウスＰＶ、またはウシＰＶ）またはヒトＰＶ（ＨＰＶ）（例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ５、ＨＰＶ３１など）のＬ１タンパク質である。本発明の１つの態様では、パピローマＬ１タンパク質は、ウシ（ＢＰＶ）またはＨＰＶのＬ１タンパク質である。本発明の１つの態様では、ＶＬＰはＲＧ１−ＶＬＰである。ＲＧ１−ＶＬＰは、ＨＰＶ１６Ｌ１のＤＥ−表面ループ内でＨＰＶ１６Ｌ２アミノ酸１７〜３６（ＲＧ１エピトープ）を提示するように改変されたＨＰＶ１６Ｌ１タンパク質から組み立てられている（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１３  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ；１３３（１２）：２７０６−２７１３；Ｓｌｕｐｅｔｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２５：２００１−１０；Ｋｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ  ８０；８４１−６；Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ８３：１００８５−９５；Ｃａｌｄｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８：４３８４−９３）。
【０００８】
本発明の１つの態様では、標的ペプチドは、ＶＬＰに付着している。本発明の１つの態様では、標的ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかは、ＶＬＰ表面上のアミノ酸残基に抱合されている。表面残基は、例えば、システイン、リジン、またはアルギニンであり得る。ペプチドのタンパク質への抱合方法は、当該分野で多数公知である（例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１３）Ａｕｔｈｏｒ，Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｉｏｎｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｊａｎ  ２００６，９５（１）：７０−７９、およびＪｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，２０１２，１３４：１８４７−１８５２（すべて、かかる方法の開示のために、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【０００９】
本発明の１つの態様では、ＶＬＰを、パピローマウイルスＬ１タンパク質またはＬ１タンパク質およびＬ２タンパク質から組み立て、次いで、ＶＬＰのキャプシド様正二十面体構造を保持しながらＶＬＰ中のシステイン残基のスルフヒドリル基へのジスルフィド結合を還元するのに十分な還元条件下に供し、標的ペプチドを、ジスルフィド結合またはマレイミド結合を介してスルフヒドリル基に抱合する。本発明の１つの実施形態では、システインは、ＶＬＰの表面上に存在する。本発明の１つの態様では、標的ペプチドを、ＶＬＰのＬ１タンパク質のシステインのスルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｙｄｙｌ）基に抱合する。本発明の１つの態様では、標的ペプチドを、ＶＬＰのＬ２タンパク質のシステインのスルフヒドリル（ｓｕｌｆｈｙｄｙｌ）基に抱合する。本発明の１つの態様では、システインは、多イオン性システイン配列、ポリカチオン性システイン配列、またはポリアニオン性システイン配列の一部ではない。本発明の１つの態様では、ＶＬＰを、パピローマウイルスＬ１タンパク質またはＬ１タンパク質およびＬ２タンパク質から組み立て、標的ペプチドを、ジスルフィド結合またはマレイミド結合を介して組み立てたＶＬＰのシステインのスルフヒドリル基に抱合し、ここで、抱合反応を、窒素雰囲気下で行う。本発明の１つの実施形態では、システインは、ＶＬＰの表面上に存在する。
【００１０】
本発明の１つの態様では、ＶＬＰは、パピローマウイルスＬ１タンパク質、またはＬ１タンパク質およびＬ２タンパク質から組み立てられ、次いで、ＶＬＰのキャプシド様正二十面体構造を維持しながら塩基性ｐＨの環境条件に供され、Ｎ末端にマレイミド基を有する標的ペプチドが、１−４付加反応を介してＶＬＰのリジン残基上の第一級アミンおよび／またはアルギニン残基上のグアニジル基に抱合されている。本発明の１つの実施形態では、リジンおよび／またはアルギニンは、ＶＬＰの表面上に存在する。
【００１１】
本発明の１つの態様では、ＶＬＰは、パピローマウイルスＬ１タンパク質、またはＬ１タンパク質およびＬ２タンパク質から組み立てられ、次いで、ＶＬＰのキャプシド様正二十面体構造を維持しながら塩基性ｐＨの環境条件に供され、そのＮ末端にジ−ブロモマレイミド基またはジ−ヨードマレイミド基を有する標的ペプチドが、１−４付加反応を介してＶＬＰのリジン残基上の第一級アミン基および／またはアルギニン残基上のグアニジル基に抱合されている。本発明の１つの実施形態では、リジンおよび／またはアルギニンは、ＶＬＰの表面上に存在する。
【００１２】
本発明の１つの態様では、ＶＬＰは、パピローマウイルスＬ１タンパク質、またはＬ１タンパク質およびＬ２タンパク質から組み立てられ、次いで、ＶＬＰのキャプシド様正二十面体構造を維持しながら塩基性ｐＨに対して生理学的な環境条件に供され、Ｃ末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有するＮ保護された標的ペプチドが、アミド形成を介してＶＬＰ上のリジン残基上の第一級アミン基および／またはアルギニン残基上のグアニジル基に抱合されている。本発明の１つの実施形態では、リジンおよび／またはアルギニンは、ＶＬＰの表面上に存在する。
【００１３】
本発明の１つの態様では、標的ペプチドは、ＰＶＬ１タンパク質のループ（例えば、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧ、またはＨＩループ）に付着している。本発明の１つの態様では、標的ペプチドは、ＨＰＶＬ１タンパク質のＤＥループ、Ｈ１ループ、またはヘリックスＢ４ループに付着している。本発明の１つの態様では、標的は、ヘリックスＢ４ループ（例えば、ＨＰＶ１６Ｌ１のアミノ酸４３０と４３３との間）に付着しているか、ＤＥループ（例えば、ウシＰＶ（ＢＰＶ）のアミノ酸１３３／１３４間）、またはＰＶ（ＨＰＶが含まれるが、これらに限定されない）の等価なアミノ酸１３６／１３７間に付着している。
【００１４】
本発明の１つの実施形態では、標的ペプチドまたはＶＬＰのいずれかは、多イオン性システイン、ポリカチオン性システイン、またはポリアニオン性システイン（標的ペプチドがＶＬＰとドッキングしてキメラＶＬＰを形成するための配列）を含まない。本発明の１つの実施形態では、標的ペプチドおよびＶＬＰのいずれも、多イオン性システイン、ポリカチオン性システイン、ポリアニオン性システイン（標的ペプチドがＶＬＰとドッキングして本発明のキメラＶＬＰを形成するための配列）を含まない。
【００１５】
標的ペプチドを、ジスルフィド結合を介してＶＬＰに抱合することができる（Ｐｅｊａｗａｒ−Ｇａｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２０１０）５９（１１）：１６８５−１６９６（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
【００１６】
本発明の１つの態様では、標的ペプチドは、ＰＶＬ１タンパク質のループ（例えば、ＰＶＬ１タンパク質のＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧ、またはＨＩループ）中に組換えによって挿入されている。本発明の１つの態様では、標的ペプチドは、ＨＰＶＬ１タンパク質のＤＥループまたはヘリックスＢ４ループ中に挿入されている。本発明の１つの態様では、標的は、ＨＰＶ１６Ｌ１のアミノ酸４３０と４３３との間のヘリックスＢ４ループ中に挿入されているか、ウシＰＶ（ＢＰＶ）のアミノ酸１３３／１３４の間、またはＨＰＶの等価なアミノ酸１３６／１３７の間のＤＥループ中に挿入されている。
【００１７】
本発明の１つの態様では、荷電ペプチド（例えば、９つのグルタミン酸アミノ酸または９つのアルギニンアミノ酸は、ＰＶＬ１タンパク質のループ中に組換えによって挿入されている。標的ペプチドは、ループ中の荷電ペプチドに抱合されている。ループは、例えば、ＰＶＬ１タンパク質のＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧ、またはＨＩループであり得る。本発明の１つの態様では、標的ペプチドは、ＨＰＶＬ１タンパク質のＤＥループまたはヘリックスＢ４ループ中の荷電ペプチドに抱合されている。本発明の１つの態様では、標的ペプチドは、ＨＰＶ１６Ｌ１のアミノ酸４３０と４３３との間のヘリックスＢ４ループ中、またはウシＰＶ（ＢＰＶ）のアミノ酸１３３／１３４の間、もしくはＨＰＶの等価なアミノ酸１３６／１３７の間のＤＥループ中に挿入された荷電ペプチドに抱合されている。
【００１８】
本発明の１つの態様では、ＶＬＰは、最初にパピローマウイルスＬ１タンパク質、またはＬ１およびＬ２タンパク質から組み立てられ、次いで、ヒト病原体由来のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む標的ペプチドがＶＬＰに付着されて、表面表示された標的ペプチドを有するキメラＶＬＰを生成する。本発明の１つの態様では、標的ペプチドをＬ１またはＬ２タンパク質に付着させ、次いで、標的ペプチドが表面に表示されるようにＶＬＰを組み立てる。標的ペプチドを、ＶＬＰのＬ１タンパク質もしくはＬ２タンパク質のいずれかまたはＶＬＰのＬ１およびＬ２タンパク質の両方に付着させることができる。ＶＬＰへの標的ペプチドの付着は、ジスルフィド結合、マレイミド結合、またはアミド結合を介して標的ペプチドをＶＬＰに抱合することによって行うことができる。
【００１９】
キメラＶＬＰを、パピローマウイルスＬ１タンパク質またはＬ１およびＬ２タンパク質から組み換えによって生成し組み立てることもでき、ここで、Ｌ１タンパク質またはＬ２タンパク質は、標的ペプチドが組み立てられたＶＬＰの表面に表示されるように、標的ペプチドが挿入されている。
【００２０】
本発明の１つの実施形態では、標的ペプチドは、リンカーによってＶＬＰに付着している。本発明の１つの実施形態では、標的ペプチドは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープおよびリンカーを含むか、これらから本質的になるか、これらからなる。本発明の１つの態様では、リンカーは、腫瘍細胞によって発現されるか腫瘍微小環境に存在する１つまたは複数の酵素によって認識および切断されるアミノ酸配列（複数可）を含む。切断部位（複数可）は、その部位（複数可）の切断が標的ペプチドからペプチドを放出させるような標的ペプチド中の位置にあってよく、ここで、放出されたペプチドは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むか、これから本質的になるか、これからなる。放出されたペプチドは、複合体が放出されたペプチドのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに特異的な既存のＣＴＬによって認識されＣＴＬを活性化するようにＭＨＣと結合することができる。酵素は、例えば、フューリン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）（例えば、ＭＭＰ１、２、３、７、８、９、１１、１３、１４、または１９）、ＡＤＡＭ（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）（例えば、ＡＤＡＭＳ８、９、１０、１５、１７、または２８）、カテプシン（例えば、カテプシンＢ、Ｄ、Ｄ、Ｇ、またはＨ）、Ｎ．エラスターゼ、プロテイナーゼ−３、Ａｚｕｒｏｃｉｄｉｎ、またはＡＤＡＭＴＳ−１、またはヒト腫瘍細胞のプロテアソーム中の酵素であり得る。酵素切断部位は、例えば、ＲＸ−Ｋ／Ｒ−Ｒ（配列番号２０９）であってよく、式中、Ｘは、任意のアミノ酸、例えば、ＲＶＫＲ（配列番号２１０）またはＭＭＰ切断ペプチド基質、例えば、Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｃｉｔ−Ｇｌｙ−Ｈｏｆ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ（配列番号２１１）、またはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ＊＊（配列番号２１２）またはＰｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（配列番号２１３）であり得る。本発明の１つの態様では、切断部位は、フューリン切断部位またはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）切断部位ではない。本発明の１つの態様では、切断部位は、ＭＭＰ１、２、３、７、８、９、１１、１３、１４、または１９、ＡＤＡＭ（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）（例えば、ＡＤＡＭＳ８、９、１０、１５、１７、または２８）、カテプシン（例えば、カテプシンＢ、Ｄ、Ｄ、Ｇ、またはＨ）、Ｎ．エラスターゼ、プロテイナーゼ−３、Ａｚｕｒｏｃｉｄｉｎ、またはＡＤＡＭＴＳ−１のうちの１つまたは複数の切断部位ではない。本発明の１つの態様では、標的ペプチドは、酵素切断部位を含まない。
【００２１】
本発明の１つの態様では、標的ペプチドは、１つまたは複数のヒト病原体（例えば、寄生虫、細菌、またはウイルス）のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む。
【００２２】
かかる病原体由来の標的ペプチドは、好ましくは、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子に結合するＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むものである。ＭＨＣクラスＩ分子は、例えば、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、またはＣファミリーのＭＨＣクラスＩであり得る。ＭＨＣクラスＩ分子は、例えば、表１または表２に列挙したＭＨＣクラスＩ分子であり得る。ＭＨＣクラスＩ分子は、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１／ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０３、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ２．１、またはＨＬＡ−Ａ＊０２であり得る。
【００２３】
本発明の１つの態様では、病原体は、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、アデノウイルス、アルボウイルス、エプスタイン・バーウイルス、コロナウイルス、サイトメガロウイルス、コクサッキーウイルス、帯状疱疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型または２型、ＪＣウイルス、風疹ウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルスまたはＢ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス）、インフルエンザウイルス（Ａ型またはＢ型）、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、痘瘡（天然痘）ウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、デングウイルス、エボラウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱病ウイルス、またはジカウイルスを含むが、これらに限定されないウイルスである。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、または肝炎ウイルスに由来し得る。
【００２４】
本発明の１つの態様では、病原体は細菌である。かかる細菌の非限定的な例には、ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、破傷風菌、ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、インフルエンザ菌、ｍｅｎｉｇｉｃｏｃｃｕｓ、ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、コレラ菌、結核菌、ＢＣＧ、ｔｙｐｈｏｉｄ、大腸菌、ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＡ群またはＢ群、肺炎連鎖球菌、炭疽菌、ｃｈｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐ（例えば、ｙｅｒｉｓｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）が含まれる。
【００２５】
本発明の１つの態様では、病原体は寄生虫である。かかる寄生虫の非限定的な例には、ｅｎａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、トキソプラズマ、ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐ．（例えば、旋毛虫）、ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．（例えば、ｔｒｉｃｏｍｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐ．（例えば、ガンビアトリパノソーマ）、ローデンシアトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ）が含まれる。
【００２６】
本発明はまた、腫瘍の成長、増殖、および転移を阻害するための本発明のキメラＶＬＰおよび組成物の使用方法に関する。
【００２７】
本発明の１つの実施形態では、本明細書中に記載の本発明のキメラＶＬＰは、標的ペプチドのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを結合し表示できるＭＨＣ分子を有する抗原提示細胞の検出で、および標的ペプチドのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞の検出で使用される。例えば、既存の免疫応答を有する動物由来の脾細胞を、本発明のキメラＶＬＰと共培養し、共培養した細胞を、例えば、当該分野で公知の免疫蛍光染色およびインターフェロン−γＣＤ８＋Ｔ細胞活性化アッセイを利用して、Ｔ細胞の再活性化について査定することができる。裸のＶＬＰ（すなわち、標的ペプチドを持たないＶＬＰ）を、ネガティブコントロールとして使用することができる。
【００２８】
本明細書中に記載の本発明の１つの態様は、種々の病原体に対する以前の感染および／またはワクチン接種によって付与された既存の免疫を活用することによって、腫瘍の成長および／または進行および／または転移を阻害する方法である。本明細書中に記載の方法は、大規模なヒト集団が種々の病原体に曝露されるか、免疫化されるという事実を利用している。さらに、後者に関して、その免疫化およびワクチン接種の記録にアクセス可能である。例えば、大規模な小児期のヒト集団は、種々の病原体に対する当該分野で周知のワクチンが積極的に接種されている。本明細書中に記載の方法では、当業者は、腫瘍を有する被験体のワクチン接種／免疫化歴または感染歴を容易に確認し次いで適切なキメラＶＬＰを投与でき、それはそのワクチンに関連するＴ細胞エピトープを含む標的ペプチドを表示して被験体の既存のＣＤ８＋記憶Ｔ細胞を誘発する。
【００２９】
本発明の方法は、Ｔ細胞を特定の腫瘍に向けるための特異的腫瘍関連抗原を同定する必要がないので、既存の方法より有利である。したがって、本明細書中に記載の方法を、以前に病原体に対するワクチンが接種されていたか、病原体に感染していた被験体における全ての腫瘍に、腫瘍細胞が発現する腫瘍関連抗原と無関係に、その成長、進行、および転移を阻害するために、適用することができる。
【００３０】
本発明の１つの態様では、どのキメラＶＬＰ（複数可）を被験体に投与するかを決定するために、被験体が所与の病原体、例えば、ウイルス（例えば、ａ型インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、またはポリオウイルス）、細菌（例えば、ｍｅｎｉｎｇｉｃｏｃｃｕｓ）、真菌（例えば、鵞口瘡カンジダ）、または寄生虫に対するワクチンで能動免疫化されていたかどうかを確認する。次いで、被験体が免疫化されていた病原体由来のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む標的ペプチドを含むキメラＶＬＰを投与する。本発明の１つの態様では、どのＶＬＰ（複数可）を被験体に投与するのかを決定するために、被験体が所与の病原体、例えば、ウイルス（例えば、ａ型インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、またはポリオウイルス）、細菌（例えば、ｍｅｎｉｎｇｉｃｏｃｃｕｓ）、真菌（例えば、鵞口瘡カンジダ）、または寄生虫に天然に感染していたかどうかを確認する。次いで、かかる病原体由来のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む標的ペプチドを含むキメラＶＬＰを、被験体に投与する。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩ分子を結合するものである。特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合するＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの非限定的な例は、表１および表２に記載されている（Ｒｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９７）１５：４０５−４３１（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。本明細書中に記載の方法はまた、どのＭＨＣクラスＩ決定基（複数可）を被験体が発現するかを決定し、次いで、そのＭＨＣクラスＩ決定基（複数可）と複合体を形成することが公知のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有する標的ペプチドを含むキメラＶＬＰを投与することを含み得る。
【００３１】
本発明の１つの実施形態は、それを必要とする被験体における腫瘍の成長、進行、および／もしくは転移、または癌細胞の増殖を阻害するまたは予防するための方法であって、腫瘍の組織供給源を決定する工程、被験体が組織供給源への向性を有する病原体に対するワクチンを接種されていたかまたは前述の病原体に感染していたかどうかを決定する工程、および病原体のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープまたはワクチンの抗原成分を含むキメラＶＬＰを被験体に投与する工程を含む、方法である。本発明の１つの態様では、キメラＶＬＰを、ＭＨＣクラスＩ分子との複合体中のＣＤ８＋エピトープを認識するＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激し腫瘍にそれらの細胞傷害活性を再指向させるのに十分な量で被験体に投与する。本発明の１つの態様では、キメラＶＬＰを、腫瘍の成長、進行、および／または転移を阻害するのに十分な量で投与する。キメラＶＬＰを、癌細胞の増殖を阻害し、かつ／または癌細胞のアポトーシスを誘導するのに十分な量で被験体に投与することもできる。
【００３２】
本発明の１つの実施形態は、それを必要とする被験体における腫瘍の成長、進行、および／もしくは転移または癌細胞の増殖を阻害するまたは予防するための方法であって、被験体が、腫瘍塊を有する組織への向性を有する病原体に対するワクチンを能動的に接種されていたかまたは前述の病原体に感染していたかどうかを決定すること、およびそれに対し被験体が免疫化されていた病原体のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープまたはワクチンの抗原成分を含むキメラＶＬＰを被験体に投与することを含む、方法である。本発明の１つの態様では、キメラＶＬＰを、腫瘍塊を有する組織中のＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、組織常在性記憶Ｔ細胞）を刺激し、ＭＨＣクラスＩ分子との複合体中のＣＤ８＋エピトープを認識し、かつ腫瘍にその細胞傷害活性を再指向するのに十分な量で被験体に投与する。本発明の１つの実施形態では、腫瘍塊および腫瘍が存在する組織は、異なる組織タイプである（例えば、肺組織での肺腫瘍転移または脳組織での肺腫瘍転移）。
【００３３】
本発明の１つの実施形態は、腫瘍の成長、進行、および／もしくは転移または癌細胞の増殖を処置するまたは予防するための方法であって、腫瘍を有する被験体が以前に病原体（例えば、寄生虫、細菌、またはウイルス、例えば、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、またはポリオウイルスのうちの１つまたは複数）に対するワクチンを接種されていたかどうかを決定する工程、および、次いで、それに対して被験体がワクチン接種されていた病原体由来の表面表示標的ペプチドを含むキメラＶＬＰ（複数可）の有効量をかかる被験体に投与する工程を含む、方法である。標的ペプチドは、ワクチン中に含まれる抗原成分のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む。本発明の方法の１つの実施形態は、腫瘍を有する被験体が以前に病原体（例えば、寄生虫、細菌、またはウイルス、例えば、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、またはポリオウイルスのうちの１つまたは複数）に感染していたかどうかを決定する工程、および、次いで、かかる病原体に由来するＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む表面表示されたペプチドを含むキメラＶＬＰ（複数可）の有効量をかかる被験体に投与する工程を含む。キメラＶＬＰを、腫瘍の成長、進行、および／または転移を阻害するのに十分な量で被験体に投与する。キメラＶＬＰを、癌細胞の増殖を阻害し、かつ／または癌細胞のアポトーシスを誘導するのに十分な量で被験体に投与することもできる。この方法はさらに、予め選択された病原体に対するワクチンが接種されていた被験体が病原体に対する記憶Ｔ細胞（すなわち、病原体のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを認識する既存のＣＴＬ）を有するかどうかを決定することを含み得る。被験体がかかるＣＴＬを持たない場合、本方法はさらに、病原体に対するワクチンを被験体に再度接種するさらなる「追加免疫する」工程を含む。被験体が再度ワクチン接種された後、病原体のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むキメラＶＬＰを、腫瘍を結合するのに十分な量で投与し、それにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞特異的ＣＴＬを、キメラＶＰＬが結合した腫瘍に再指向させる。所与のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに特異的な活性化ＣＴＬについて被験体をアッセイする方法は、当該分野で周知である。
【００３４】
また、本発明の１つの実施形態は、ナイーブ被験体（すなわち、予め選択された病原体のエピトープに特異的な既存のＣＴＬを持たない被験体）において腫瘍の成長、進行、および／もしくは転移、または癌細胞の増殖を阻害または予防するための方法である。ナイーブ被験体には、例えば、病原体に対するワクチンが事前に能動的に接種されていなかったか、病原体に対して天然に免疫化／曝露されていなかった被験体が含まれる。被験体の細胞を、予め選択された病原体のエピトープに特異的なＣＴＬの存在についてアッセイすることもできる。被験体が病原体に対するワクチンを接種されていたか、または前述の病原体に暴露されていたかどうかを、例えば、被験体のワクチン接種記録を再調査するか、ワクチン接種または曝露されていたか、または特定の疾患に罹患していたかどうかを被験体に尋ねることによって決定することができる。本方法は、予め選択された病原体に対するワクチンを、それを必要とするナイーブ被験体に能動的に接種することを含む。被験体へのワクチン接種後、病原体のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを表示する本発明のキメラＶＬＰを、そのキメラＶＬＰが腫瘍に結合するのに十分な量で被験体に投与し、それにより、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ特異的ＣＴＬを、キメラＶＬＰが結合した腫瘍細胞に再指向させる。ＣＴＬのキメラＶＬＰ結合腫瘍細胞への再指向により、腫瘍の成長、進行、および／もしくは転移または癌細胞の増殖が阻害または予防される。１つの実施形態では、キメラＶＬＰの投与前にＣＴＬを活性化させるために被験体にワクチン接種をした１週間後、２週間後、またはそれを超えた期間の後に、キメラＶＬＰを被験体に投与する。本発明の１つの実施形態では、ナイーブ被験体に、予め選択された病原体に対するワクチンを接種し、次いで、被験体を、ワクチンのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに特異的な活性化ＣＴＬ細胞の存在についてモニタリングする。かかる活性化されたＣＴＬが検出された後、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むキメラＶＬＰを被験体に投与する。キメラＶＬＰを、腫瘍を結合しかつ、結合した腫瘍にキメラＶＬＰのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに特異的なＣＴＬを指向させるのに十分な量で投与する。次いで、再指向されたＣＴＬは、腫瘍の成長、進行、および／もしくは転移または癌細胞の増殖を阻害または予防する。ワクチンは、本明細書中に記載の任意の病原体（例えば、麻疹、ムンプス、水痘、またはＢ型肝炎）に対するものであり得る。
【００３５】
ＨＰＶキャプシド（ＶＬＰおよび偽ビリオン（ｐｓｕｅｄｏｖｉｒｉｏｎ）（ＰｓＶ））が腫瘍向性を有し、腫瘍細胞（例えば、卵巣および肺の癌細胞を含む）を直接結合し感染することが報告されている。Ｋｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（１５  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１６）１３８（４）：９０１−９１１（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。Ｋｉｎｅｓは、かかる結合がヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）依存性であり得ることを報告している。理論に拘束されることを望まないが、本明細書中に記載のキメラＶＬＰが腫瘍細胞に優先的に結合し（例えば、非腫瘍細胞よりも腫瘍細胞に結合する）、キメラＶＬＰの存在が、浸潤性のＣＤ８＋Ｔ細胞を引きつける陽性の炎症促進性の腫瘍微小環境をもたらすことができると予想される。それと同時に、ＶＬＰは、以前のワクチン接種または感染に起因しかつ標的ペプチドのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを認識する適応記憶Ｔ細胞によって応答を刺激することができる。これらの強力な応答が免疫寛容を迂回でき、この既存の免疫に対して腫瘍細胞を感受性にし、それにより、腫瘍の成長、進行、および転移を阻害すると予想される。
【００３６】
本明細書中に記載のキメラＶＬＰまたはキメラＶＬＰを含む組成物を、それを必要とする被験体に、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内、眼内、皮内、腫瘍内、経粘膜、またはエアロゾルにて投与することができる。
【００３７】
本発明の別の実施形態では、本発明のキメラＶＬＰを、別の抗癌治療（例えば、照射療法、化学療法、免疫療法、または手術）と併せて、腫瘍を有する被験体に投与する。例えば、キメラＶＬＰを、チェックポイント阻害剤と併せて、腫瘍を有する被験体に投与する。当該分野で公知であり、本発明で有用であるチェックポイント阻害剤は、イプリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、およびニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、Ａｖｅｌｕｍａｂ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ）、Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）を含むが、これらに限定されない。チェックポイント阻害剤の投与および投薬計画は、各チェックポイント阻害剤についての処方情報（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【００３８】
化学療法剤は、当該分野で周知であり、アフリベルセプト、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エトポシド、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、ペントスタチン、プロカルバジン、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、レチノイン酸、オキサリプラチン、カルボプラチン、５−フルオロウラシル、テニポシド、アムサクリン（ａｍａｓａｃｒｉｎｅ）、ドセタキセル、パクリタキセル、ビノレルビン、ボルテゾミブ、クロファラビン、カペシタビン、アクチノマイシンＤ、エピルビシン、ビンデシン、メトトレキサート、６−チオグアニン、ティピファニブ、イマチニブ、エルロチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ラパチニブ、ゲフィチニブ、テムシロリムス、エベロリムス、ラパマイシン、ボスチニブ、パゾパニブ（ｐｚｏｐａｎｉｂ）、アキシチニブ、ネラチニブ、バタラニブ、パゾパニブ、ミドスタウリン、エンザスタウリン、トラスツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、リツキシマブ、ベバシズマブ、マパツムマブ、コナツムマブ、およびレキサツムマブを含むが、これらに限定されない。かかる薬剤の使用方法も、当該分野で周知である。
【００３９】
また、本発明の実施形態は、本発明のキメラＶＬＰおよび１つまたは複数の担体または賦形剤を含む薬学的に許容され得る組成物である。組成物は、例えば、単一のタイプのキメラＶＬＰまたはキメラＶＬＰの少なくとも２つが同一の標的ペプチドを含まない複数のキメラＶＬＰを含み得る。
【００４０】
本発明の別の態様は、本発明のキメラＶＬＰを含むキットである。キットは、被験体のワクチン接種／免疫化歴および／または感染歴を決定するため、かつキット中の適切なキメラＶＬＰを被検体に投与するための説明書を含み得る。適切なキメラＶＬＰは、それに対し被験体が能動的に免疫化されていた病原体または被験体が以前に感染していた病原体のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む標的ペプチドを含む。説明書は、被験体によって発現されたか、被験体の人種の祖先に基づいて被験体によって発現されると予想されるＭＨＣクラスＩ分子補体を決定し、キット中の適切なキメラＶＬＰを被験体に投与するための説明書も含んでよく、ここで、適切なキメラＶＬＰは、被験体によって発現されるか、発現されると予想されるＭＨＣクラスＩ分子に結合する病原体のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、本明細書中に記載の本発明の方法の１つの実施形態を示す。既存の免疫によって認識される免疫原性ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（例えば、ＭＭＲ、水痘、ポリオ）を含む標的ペプチドを有するキメラＶＬＰは、免疫寛容が迂回されるように腫瘍細胞に選択的に結合し、既存の免疫がキメラＶＬＰを結合する腫瘍を制御するために使用される：被験体は小児期に複数の承認ワクチンを接種されており、それらは強力な免疫を生じる（Ｔ細胞応答および抗体応答の両方）（白色ドット）（Ｉ）；成人期に被験体が不運にも癌を発症すると、被験体のワクチン接種歴を査定し、それに対し被験体がワクチン接種されていた病原体のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む本発明のキメラＶＬＰ（複数可）を被験体に投与する（ＩＩＩ）；刺激された既存のＣＤ８＋Ｔ細胞、免疫応答の呼び戻しが、キメラＶＬＰに結合していた腫瘍を攻撃するように再指向され（ＩＩＩ）、癌の成長、進行、および／または転移の阻害をもたらす（ＩＶ）。１つの実施形態では、ＣＴＬエピトープはさらに、腫瘍が存在する目的の臓器への天然の組織向性を有するウイルスに由来し得る。
【図２】図２は、空の非抱合ＶＬＰ（５０ｎＭ）と比較して、抱合したＶＬＰ（６０〜７０ｎＭ）がわずかに大きいことを示すＴＥＭを示す。
【図３】図３は、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、および水痘ウイルス由来のエピトープに抱合したＨＰＶ１６ＲＧ−１  ＶＬＰ（左のパネル）または野生型ＨＰＶ１６Ｌ１  ＶＬＰ（右のパネル）のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。
【図４】図４は、腫瘍細胞へのＶＬＰ結合のフローサイトメトリー分析の結果を示す。細胞集団の移動は、試験した全ての細胞株へのＶＬＰ結合を実証している。上の行は、種々の腫瘍細胞株への空のＨＰＶ１６  ＲＧ−１  ＶＬＰの結合の結果を示し、下の行は、Ｌ１ループのうちの１つに組み換えによって挿入されたペプチドを有するウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）ＶＬＰの結果を示す）。
【図５】図５は、標的ペプチドを含むキメラＶＬＰのフローサイトメトリー分析の結果を示す。結果は、キメラＶＬＰの腫瘍結合能力が、ＶＬＰ表面上にペプチドを抱合することによって損なわれないことを実証している。
【図６】図６は、表面ＣＤ８および細胞内ＩＦＮ−γの染色後のフローサイトメトリー分析によって査定したＯＴ−１特異的ＣＴＬ活性化を実証している。
【図７】図７は、表面ＣＤ８および細胞内ＩＦＮ−γの染色後のフローサイトメトリー分析によって査定したＥ７特異的ＣＴＬ活性化を実証している。
【図８】図８は、ＩＤ８／ｌｕｃ生細胞によるルシフェラーゼ発現に基づいた生物発光画像化の結果を示す。これらの細胞は典型的には、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されない。結果は、ＡＩＲ−ＶＬＰ（ＯＶＡ標的ペプチドを含むキメラＶＬＰ）とのインキュベーションにより、腫瘍細胞がＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識されるようになるが、空の非抱合ＶＬＰでは認識されないことを実証している。ＡＩＲ−ＶＬＰとのインキュベーションは、発光活性の著しい減少によって実証されるように、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔの殺細胞によって媒介される腫瘍細胞死の最大量をもたらした。
【図９】図９は、ＩＤ８／ｌｕｃ生細胞によるルシフェラーゼ発現に基づく生物発光画像化の結果を示す。これらの細胞は典型的には、Ｅ７ａａ４９−５７特異的ＣＴＬによって認識されない。ＩＤ８／ｌｕｃ腫瘍細胞を、０．３μｇ／ｍｌの空の非抱合ＶＬＰまたはキメラＶＬＰ−Ｒ−Ｅ７（マウスＨ２−ＤＢ拘束ＨＰＶ１６−Ｅ７エピトープ（ａａ４９〜５７）（腫瘍関連抗原）に抱合したウシパピローマウイルスＶＬＰ）で処置し、次いで、Ｅ７ａａ４９−５７特異的ＣＴＬとインキュベートした。著しく低いルシフェラーゼ活性が、キメラＶＬＰ−Ｒ−Ｅ７で処置しＥ７特異的ＣＴＬとインキュベートしたＩＤ８腫瘍細胞で観察され、これは、処置後のＩＤ８腫瘍細胞の生存度が著しく低下したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
発明の詳細な説明
パピローマウイルスは、小型で二本鎖の環状ＤＮＡ腫瘍ウイルスである。パピローマウイルスビリオンのシェルは、Ｌ１主要キャプシドタンパク質およびＬ２マイナーキャプシドタンパク質を含む。真核生物または原核生物の発現系におけるＬ１タンパク質のみまたはＬ２タンパク質との組み合わせの発現により、キャプソメアおよびＶＬＰが組み立てられることが公知である。本明細書中で使用される場合、用語「キャプソメア」は、パピローマウイルスＬ１ポリペプチド（全長Ｌ１タンパク質およびそのフラグメントを含む）の五量体アセンブリを意味することが意図される。未変性Ｌ１キャプシドタンパク質は、分子間ジスルフィド結合を介して自己組み立てされて五量体（キャプソメア）を形成する。
【００４３】
パピローマウイルスビリオンは、７２のＬ１タンパク質の五量体（キャプソメア）を含む。Ｔｒｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，４  Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．４１３−２０（１９９７）。Ｌ１タンパク質は、真核細胞内で発現されたときに未変性ビリオンと形態学的に識別可能なキャプシド様構造を自己組み立てすることができる。Ｂｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，８２  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１９０−９７（２００８）およびＲｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，４  Ｈｕｍ．Ｖａｃｃｉｎ．５−１２（２００８）（共に本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。Ｌ１単量体は、１２のβ−ストランド、６つのループ（ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧ、ＨＩ）、および５つのヘリックス（Ｈ１〜Ｈ５）を含む。ループの大部分がキャプシド外面に向かって高度に露呈され、これらの領域での本明細書中に記載の、例えば、ジスルフィド結合、マレイミド結合による、「クリック」ケミストリーによる、または多イオン性ドッキング部位への結合によるこれらのループの１つへの標的ペプチドの付着により、標的ペプチドがＶＬＰの外面上に表示されるであろう。
【００４４】
本発明の１つの実施形態は、パピローマウイルス（ＰＶ）Ｌ１タンパク質、またはＰＶＬ１およびＰＶＬ２タンパク質、ならびに表面表示標的ペプチドを含むキメラＶＬＰである。標的ペプチドは、ヒト病原体のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むか、これらから本質的になるか、これらからなり、ここで、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは腫瘍関連抗原ではない。本発明の１つの態様では、標的ペプチドは、ＶＬＰのシステインの還元スルフヒドリル基（ｓｕｌｈｙｄｒｙｌ  ｇｒｏｕｐ）に抱合されており、任意選択的に、システインは、多イオン性システイン配列、ポリカチオン性システイン配列、ポリアニオン性システイン配列の一部ではない。ＶＬＰは、パピローマＬ１およびＬ２タンパク質の両方を含み得る。標的ペプチドを、ジスルフィド結合またはマレイミド結合を介してＬ１タンパク質および／またはＬ２タンパク質の還元スルフヒドリル基（ｓｕｌｈｙｄｒｙｌ  ｇｒｏｕｐ）（複数可）に抱合することができる。本発明の１つの態様では、標的ペプチドは、アミド結合を介してＶＬＰのリジンおよび／またはアルギニンに抱合されている。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」は、キャプソメアのより高次のアセンブリから構成された粒子を指す。ＶＬＰは、非感染性および非複製性であるが、未変性パピローマウイルスビリオンと形態学的に類似している。かかるより高次のアセンブリの一例は、完全な（７２キャプソメア）または実質的に完全な空のパピローマウイルスキャプシドの外観を有する粒子であり、それは直径が約５０〜約６０ｎｍであり、Ｔ＝７の正二十面体構造を有する。かかるより高次のアセンブリの別の例は、直径約３０〜約３５ｎｍの粒子であり、それは未変性パピローマウイルスビリオンのサイズより小さく、Ｔ＝１構造（１２キャプソメアを含む）を有する。本発明の目的のために、キャプソメアの他のより高次のアセンブリも、用語ＶＬＰに含まれることが意図される。ある実施形態では、ＶＬＰは、Ｌ１タンパク質もしくはポリペプチドまたはＬ２タンパク質もしくはポリペプチドが由来する未変性パピローマウイルスの高次構造のエピトープを複製することができる。本発明のヒトパピローマウイルスＶＬＰおよびキャプソメアの組み立ておよび形成の方法は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第６，１６５，４７１号、同第６，１５３，２０１号、および同第９，１４９，５０３号、ならびにＷＯ９４／０２０１３７号（これらの全ての全体が、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００４６】
本発明は、キメラパピローマウイルスＶＬＰ、キメラＶＬＰを含む組成物、キメラＶＬＰの作製方法、および腫瘍処置におけるキメラＶＬＰの使用に関する。本発明のキメラパピローマウイルスＶＬＰは、標的ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、標的ペプチドは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含むか、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープから本質的になるか、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープからなる。いくつかの実施形態では、標的ペプチドは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープおよび標的ペプチドをＶＬＰに付着させるためのリンカーを含むか、これらから本質的になるか、これらからなる。リンカーは、ＶＬＰからＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを放出させるための酵素切断部位を含み得る。本発明の１つの態様では、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、ヒト病原体（例えば、寄生虫、真菌、細菌、またはウイルス）のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである。ウイルスの非限定的な例は、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、帯状疱疹ウイルス、風疹、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルスまたはＢ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス）、インフルエンザ（例えば、Ａ型またはＢ型）、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、痘瘡（天然痘）ウイルス、狂犬病ウイルス、デングウイルス、エボラウイルス、ウエストナイルウイルス、黄熱病ウイルス、またはジカウイルスを含む。
【００４７】
細菌の非限定的な例は、ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、破傷風菌、ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、インフルエンザ菌、ｍｅｎｉｇｉｃｏｃｃｕｓ、ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、コレラ菌、結核菌、ＢＣＧ、ｔｙｐｈｏｉｄ、大腸菌、ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのＡ群またはＢ群、肺炎連鎖球菌、炭疽菌、ｃｈｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐ（例えば、ｙｅｒｉｓｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）を含む。
【００４８】
寄生虫の非限定的な例は、ｅｎａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、トキソプラズマ、ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐ．（例えば、旋毛虫）、ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．（例えば、ｔｒｉｃｏｍｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐ．（例えば、ガンビアトリパノソーマ、ローデンシアトリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ）、またはｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（例えば、ｐｌａｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｉｕｍ、三日熱マラリア原虫、または四日熱マラリア原虫）を含む。
【００４９】
本発明の１つの態様では、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、Ａ型インフルエンザウイルスまたはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはＢ型肝炎ウイルスのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである。本発明の１つの態様では、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、表１に記載のＴ細胞エピトープである。本発明の１つの態様では、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、以下である：
ＫＬＷＥＳＰＱＥＩ（配列番号６）、
ＹＶＹＤＨＳＧＥＡＶＫ（配列番号１５）、
ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ（配列番号６９）、
ＦＬＬＴＲＩＬＴＩ（配列番号７０）、
ＷＬＳＬＬＶＰＦＶ（配列番号７１）、
ＧＬＳＲＹＶＡＲＬ（配列番号７２）、
ＦＬＬＳＬＧＩＨＬ（配列番号７３）、
（Ｋ）ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（Ｔ）（Ｖ）（配列番号２１７）、
ＫＬＳＴＲＧＶＱＩＡＳＮＥＮ（配列番号１２５）、
ＲＧＬＱＲＲＲＦＶＱＮＡＬＮＧＮＧ（配列番号１３１）、
ＦＭＹＳＤＦＨＦＩ（配列番号１３６）、
ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１５１）、
ＶＡＩＩＥＶＤＮＥＱＰＴＴＲＡＱＫＬ（配列番号１５２）、
ＴＲＡＱＫＬＦＡＭＷＲＩＴＹＫＤＴＶ（配列番号１５３）、
ＧＡＣＶＡＩＩＥＶＤＮＥＱＰＴＴＲＡＱＫＬＦＡＭＷＲＩＴＹＫＤＴＶＱＬＲＲＫＬ（配列番号１５４）の任意の９量体配列、
ＳＶＲＤＲＬＡＲＬ（配列番号１６７）、
ＬＬＤＲＶＲＦＭＧＶ（配列番号２１７）、
ＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（配列番号１９６）、または
ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号１４３）。
ＳＬＰＲＳＲＴＰＩ（配列番号２１８）または
ＳＡＰＬＰＳＮＲＶ（配列番号２１９）。
【００５０】
本発明の１つの態様では、標的ペプチドのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩ分子に結合する。ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃファミリーに由来し得る。ＭＨＣクラスＩ分子は、表１または表２に列挙したＭＨＣクラスＩ分子であり得る。ＭＨＣクラスＩ分子は、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０３、ＨＬＡ−Ａ＊０２０６、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ２．１、またはＨＬＡ−Ａ＊０２であり得る。
【００５１】
本発明の１つの態様では、標的ペプチドは、約８アミノ酸長〜約５０アミノ酸長、または約８アミノ酸長〜約４５アミノ酸長、または約８アミノ酸長〜約４０アミノ酸長、約８アミノ酸長〜約３５アミノ酸長、または約８アミノ酸長〜約３０アミノ酸長、約８アミノ酸長〜約２５アミノ酸長、約８アミノ酸長〜約２０アミノ酸長、約８アミノ酸長〜約１５アミノ酸長である。本発明の１つの態様では、標的ペプチドは、約１３アミノ酸長〜約５０アミノ酸長、または約１３アミノ酸長〜約４５アミノ酸長、または約１３アミノ酸長〜約４０アミノ酸長、約１３アミノ酸長〜約３５アミノ酸長、または約１３アミノ酸長〜約３０アミノ酸長、約１３アミノ酸長〜約２５アミノ酸長、約１３アミノ酸長〜約２０アミノ酸長、約１３アミノ酸長〜約１５アミノ酸長である。本発明の１つの態様では、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７アミノ酸長であり得る。
【００５２】
本発明の１つの実施形態では、キメラパピローマウイルスＶＬＰは、Ｌ１ポリペプチドおよび標的ペプチドを含む。他の実施形態では、キメラＶＬＰは、Ｌ１ポリペプチドおよびＬ２ポリペプチドおよび標的ペプチドを含み得る。Ｌ１ポリペプチドは、全長Ｌ１タンパク質またはＬ１ポリペプチド断片であり得る。特定の実施形態では、全長Ｌ１タンパク質またはＬ１ポリペプチド断片は、ＶＬＰ組み立て適合性であり；すなわち、Ｌ１ポリペプチドは自己組み立てされて、より高次のアセンブリに自己組み立てする適格性のあるキャプソメアを形成し、それにより、ＶＬＰを形成する。より具体的な実施形態では、ＶＬＰは、完全に組み立てられたパピローマウイルスキャプシド（約５０ｎｍの構造）を含み、７２のキャプソメアまたは３６０コピーのＬ１タンパク質から構成される。
【００５３】
Ｌ１配列は、今日までに同定されている実質的に全てのパピローマウイルス遺伝子型で知られており、これらのＬ１配列またはフラグメントのいずれかを、本発明で使用することができる。Ｌ１ポリペプチドの例は、全長Ｌ１ポリペプチド（例えば、ＨＰＶ１６Ｌ１ポリペプチド、配列番号２０５）、未変性Ｃ末端を欠くＬ１短縮物、未変性Ｎ末端を欠くＬ１短縮物、および内部ドメインを欠くＬ１短縮物を含むが、これらに限定されない。Ｃｏｎｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，８８（４）Ｊ．Ｄｅｎｔａｌ  Ｒｅｓ．３０７−１７（２００９）；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，５  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．５５７−６７（２０００）；およびＰａｉｎｔｓｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２２３（１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３８−４４（１９９６）（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。ＬＩタンパク質は、例えば、改変Ｌ１タンパク質（例えば、ＨＰＶ１６Ｌ２アミノ酸１７〜３６（ＲＧ１エピトープ）がＨＰＶ１６Ｌ１のＤＥ−表面ループ内に挿入された改変ＨＰＶ１６Ｌ１タンパク質）であり得る（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１３  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ；１３３（１２）：２７０６−２７１３；Ｓｌｕｐｅｔｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２５：２００１−１０；Ｋｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ  ８０；８４１−６；Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ８３：１００８５−９５；Ｃａｌｄｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８：４３８４−９３）。
【００５４】
Ｌ２ポリペプチドは、全長Ｌ２タンパク質またはＬ２ポリペプチド断片であり得る。Ｌ２配列は、今日までに同定されている実質的に全てのパピローマウイルス遺伝子型で知られており、これらのＬ２配列またはフラグメントのいずれかを、本発明で使用することができる。Ｌ２ポリペプチドの例は、全長Ｌ２ポリペプチド（例えば、ＨＰＶ１６Ｌ２ポリペプチド、配列番号２０７）、未変性Ｃ末端を欠くＬ２短縮物、未変性Ｎ末端を欠くＬ２短縮物、および内部ドメインを欠くＬ２短縮物を含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
パピローマウイルスＶＬＰを、任意の動物パピローマウイルス由来のＬ１および任意選択的なＬ２ポリペプチド、またはその誘導体もしくはフラグメントを使用して形成することができる。したがって、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、シカ、イヌ、ネコ、げっ歯類、ウサギなどのパピローマウイルスの任意の公知の（または、以後、同定された）Ｌ１および任意選択的なＬ２配列を、本発明のＶＬＰまたはキャプソメアを調製するために使用することができる。パピローマウイルス遺伝子型およびその関係性のほぼ完全なリストについては、ｄｅ  Ｖｉｌｌｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３２４：１７−２７（２００４）（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００５６】
ある実施形態では、ＶＬＰを形成するために使用されるＬ１および任意選択的なＬ２ポリペプチドは、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１６、およびＨＰＶ−１８以外の非ヒトパピローマウイルスまたはヒトパピローマウイルスの遺伝子型に由来する。例えば、Ｌ１および／またはＬ２タンパク質は、ＨＰＶ１、２、３、４、５、６、８、９、１５、１７、２３、２７、３１、３３、３５、３８、３９、４５、５１、５２、５８、６６、６８、７０、７６、または９２に由来し得る。
【００５７】
特定の実施形態では、キメラＶＬＰ（Ｌ１ポリペプチドまたはＬ１およびＬ２ポリペプチドのいずれを含む場合でも）は、正電荷アミノ酸領域を含む標的ペプチドに結合することができる負電荷アミノ酸領域を表面露呈領域上に含む。さらなる実施形態では、負電荷アミノ酸領域は、片側または両側が、１つまたは複数のシステイン残基（ポリアニオン性システイン、または、より詳細には、ポリグルタミン酸：システインまたはポリアスパラギン酸：システインと呼ばれる）に隣接し得る。そのような場合、ＶＬＰおよび標的ペプチドの抱合は、ＶＬＰの相補アミノ酸電荷と標的ペプチドの間の非共有結合およびシステイン間のジスルフィド結合に起因するであろう。他の実施形態では、システイン（複数可）は、任意の二次／三次構造によって荷電アミノ酸領域がシステイン（複数可）に近接するような荷電アミノ酸領域から離れた１つまたは複数のアミノ酸である。例えば、２０１４年２月２０日公開の米国特許出願公開第２０１４／００５０７５３号（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。本発明の１つの実施形態では、標的ペプチドは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（例えば、表１または表２のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ）および相補多イオン性システイン配列を含むＶＬＰに標的ペプチドを付着させるための多イオン性システインから構成される。本発明の１つの実施形態では、標的ペプチドは、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープおよび相補多イオン性システイン配列を含むＶＬＰに標的ペプチドを付着させるための多イオン性システインおよび末端システインとＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの間に存在する酵素切断部位を含むか、これらから本質的になるか、これらからなる。本発明の１つの実施形態では、標的ペプチドは、末端システイン、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（例えば、表１または表２のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ）、および末端システインとＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの間に存在する酵素切断部位を含むか、これらから本質的になるか、これらからなる。
【００５８】
キメラＶＬＰの産生で使用できる負電荷アミノ酸は、例えば、グルタミン酸およびアスパラギン酸を含む。これらのアミノ酸を、単独で（例えば、ポリグルタミン酸）または組み合わせて使用できる。１つの具体的な実施形態では、領域は、グルタミン酸を含む。負電荷アミノ酸数は変化する可能性があり、約４〜約２０アミノ酸、約６〜約１８アミノ酸、および約８〜約１６アミノ酸などを含み得る。１つの具体的な実施形態では、領域は、約８つの負電荷アミノ酸を含む。１つのさらに具体的な実施形態では、領域は、ＥＥＥＥＥＥＥＥＣ（Ｅ８Ｃ）（配列番号２１４）を含む。別の実施形態では、領域は、ＣＥＥＥＥＥＥＥＥＣ（配列番号２１５）を含む。ジスルフィド結合を介してＶＬＰに標的ペプチドを抱合する方法については、例えば、Ｐｅｊａｗａｒ−Ｇａｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２０１０）５９（１１）：１６８５−１６９６（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。簡潔に述べれば、標的ペプチド上のポリアルギニン−システイン部分の存在が、Ｌ１粒子の種々のループに存在するポリアニオン性部位（ＥＥＥＥＥＥＥＥＣ、Ｅ８Ｃ（配列番号２１４））へのペプチドのドッキングを可能にする。２つのシステイン残基間の共有結合性の架橋は、酸化条件下でこの会合を不可逆にするはずである。抱合反応について、精製されたＨＰＶ粒子を、抱合緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）中で透析し、次いで、ペプチドおよび酸化試薬を添加し、４℃で１６時間反応を進行させる。インキュベーションの終了時に、反応混合物をサイズ排除カラム（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−１００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、容積２０ｍｌ、流速１ｍｌ／分、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２）にアプライして、非抱合ペプチドを除去し、緩衝液を交換する。空隙容量中に溶出する抱合粒子を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでのＬ１タンパク質の存在によって同定する。抱合粒子を、電子顕微鏡法によって分析する。当業者は、日常的実験により、表面露呈領域（例えば、１つまたは複数のループ）中に多イオン性領域を含みかつＶＬＰ組み立てに適合性があるＶＬＰを作出できる。
【００５９】
別の実施形態では、キメラパピローマウイルスＶＬＰを、負電荷アミノ酸領域および１つまたは複数のシステイン（ポリアニオン性システイン）を含む標的ペプチドに結合できる正電荷アミノ酸領域および１つまたは複数のシステイン（ポリカチオン性システイン）を表面露呈領域上に含むように操作する。
【００６０】
特定の実施形態では、キメラＶＬＰは、ポリアニオン性システインアミノ酸領域がＬ１ポリペプチドの１つまたは複数のループ（例えば、ＨＩループ）に挿入されているＬ１ポリペプチド（例えば、全長）を含む。かかる領域を、例えば、特定のループ（対応するＬ１アミノ酸が欠失していない）をコードするアミノ酸配列中に挿入するか、ループ中に挿入しＬ１アミノ酸を置換するか、さらには特定のループ中に挿入しＬ１アミノ酸を部分的に欠失できる。特定の実施形態では、キメラＶＬＰは、ポリアニオン性システインアミノ酸領域が挿入されたＬ２ポリペプチド（例えば、全長）を含む。挿入は対応するＬ２アミノ酸の欠失なしである、それが挿入されアミノ酸がＬ２ポリペプチドから欠失され得る。日常的実験を使用する当業者は、ポリアニオン性アミノ酸配列の置換についてキメラＶＬＰを最適化して特定の標的ペプチドに適合できる。
【００６１】
あるいは、ＶＬＰへの標的ペプチドの付着のために、ＶＬＰのＬ１および／またはＬ２タンパク質を、目的の部位に少なくとも１つの第１の非天然アミノ酸（非天然のアミノ酸または非標準アミノ酸（ｎｎＡＡ）とも呼ばれる）を含むように改変することもでき、２つまたはそれを超える標的ペプチドを、少なくとも１つの第２の非天然アミノ酸を含むように改変することができ、ここで、第１の非天然アミノ酸は、第２の非天然アミノ酸と異なり、このアミノ酸と反応する。例えば、２０１６年７月２１日公開の米国特許出願公開第２０１６／０２０６７１５号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。１つの第１の非天然アミノ酸の例は、アジドホモアラニンである。第２の非天然アミノ酸の例は、プロパルギルオキシフェニルアラニンである。ＶＬＰのキャプシドタンパク質中に組み込まれるアジドホモアラニンのアジド官能基は、標的ペプチド中に組み込まれるプロパルギルオキシフェニルアラニンのアルキン官能基との（３＋２）付加環化クリック反応に関与し、標的ペプチドへのＶＬＰの架橋をもたらす。同一ＶＬＰ内の他の非天然アミノ酸含有キャプシドタンパク質は、同様に（３＋２）付加環化クリック反応に関与して、２つまたはそれを超える標的ペプチドを有するＶＬＰを生成できる。別の実施形態では、キメラＶＬＰは、標的ペプチドおよびＣｐＧを表示できる。別の実施形態では、キメラＶＬＰは、標的ペプチドおよび核酸または改変された核酸を表示できる。別の実施形態では、キメラＶＬＰは、２つまたはそれを超える標的ペプチドおよびＣｐＧを表示できる。１つの個別の実施形態では、キメラＶＬＰは、２つまたはそれを超える標的ペプチドおよび核酸または改変された核酸を表示できる。
【００６２】
本発明の１つの実施形態では、ＶＬＰは、キャプシドモノマーサブユニットあたり少なくとも１つまたは少なくとも２つの非天然アミノ酸を含む。例えば、ＶＬＰ中の非天然アミノ酸の総数の少なくとも１／２０を使用して、標的ペプチドまたは核酸に付着させてキメラＶＬＰを産生できる。別の実施形態では、ＶＬＰ中の非天然アミノ酸の総数の約１／４を使用して標的ペプチドまたは核酸を付着させることができる。１つのさらなる実施形態では、ＶＬＰ中の非天然アミノ酸の総数の約１／３を使用して、標的ペプチドまたは核酸を付着させることができる。さらに別の実施形態では、ＶＬＰ中の非天然アミノ酸の総数の約１／２を使用して、標的ペプチドまたは核酸を付着させることができる。
【００６３】
本発明の１つの態様では、ＶＬＰは、パピローマウイルスＬ１タンパク質またはＬ１タンパク質およびＬ２タンパク質から組み立てられ、次いで、ＶＬＰのキャプシド様正二十面体構造を維持しながらＶＬＰの表面上のシステイン残基のスルフヒドリル基を還元するのに十分な還元条件に供され、標的ペプチドは、ジスルフィド結合またはマレイミド結合を介してスルフヒドリル基に抱合される。本発明の１つの実施形態では、システインは、ＶＬＰの表面上に存在する。本発明の１つの態様では、ＶＬＰは、パピローマウイルスＬ１タンパク質またはＬ１タンパク質およびＬ２タンパク質から組み立てられ、標的ペプチドは、ジスルフィド結合またはマレイミド結合を介してシステインのスルフヒドリル基に抱合され、ここで、抱合反応を、窒素雰囲気下で行う。本発明の１つの実施形態では、システインは、ＶＬＰの表面上に存在する。
【００６４】
本発明の１つの態様では、ＶＬＰは、パピローマウイルスＬ１タンパク質、またはＬ１タンパク質およびＬ２タンパク質から組み立てられ、次いで、ＶＬＰのキャプシド様正二十面体構造を維持しながら塩基性ｐＨの環境条件に供され、Ｎ末端のマレイミド基を有する標的ペプチドが、１−４付加反応を介してＶＬＰのリジン残基上の第一級アミンおよび／またはアルギニン残基上のグアニジル基に抱合される。本発明の１つの実施形態では、リジンおよび／またはアルギニンは、ＶＬＰの表面上に存在する。
【００６５】
本発明の１つの態様では、ＶＬＰは、パピローマウイルスＬ１タンパク質、またはＬ１タンパク質およびＬ２タンパク質から組み立てられ、次いで、ＶＬＰのキャプシド様正二十面体構造を維持しながら塩基性ｐＨの環境条件に供され、そのＮ末端にジ−ブロモマレイミド基またはジ−ヨードマレイミド基を有する標的ペプチドが、１−４付加反応を介してＶＬＰのリジン残基上の第一級アミン基および／またはアルギニン残基上のグアニジル基に抱合される。本発明の１つの実施形態では、リジンおよび／またはアルギニンは、ＶＬＰの表面上に存在する。
【００６６】
本発明の１つの態様では、ＶＬＰは、パピローマウイルスＬ１タンパク質、またはＬ１タンパク質およびＬ２タンパク質から組み立てられ、次いで、ＶＬＰのキャプシド様正二十面体構造を維持しながら塩基性ｐＨの環境条件に供され、Ｃ末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を有する標的ペプチドが、アミド形成を介してリジン残基上の第一級アミン基および／またはアルギニン残基上のグアニジル基に抱合される。本発明の１つの実施形態では、リジンおよび／またはアルギニンは、ＶＬＰの表面上に存在する。
【００６７】
例えば、負電荷もしくは正電荷のアミノ酸の結合を介する、またはマレイミドベースの抱合を介するＶＬＰへの標的ペプチドの付着よりもむしろ、標的ペプチドをコードする核酸配列を、発現の際に融合タンパク質が産生されるようにＬ１タンパク質および／またはＬ２タンパク質をコードする核酸中に挿入でき、ここで、標的ペプチドは、Ｌ１ポリペプチドのループ中におよび／またはＬ２タンパク質中に挿入され、ＶＬＰの表面上に表示される。
【００６８】
また、本発明の１つの実施形態では、キメラＶＬＰにおいて、ウイルスコートタンパク質の少なくとも１／１０が標的ペプチドを表示できる。別の実施形態では、ウイルスコートタンパク質の少なくとも１／５が標的ペプチドを表示できる。さらに別の実施形態では、ウイルスコートタンパク質の約半分が標的ペプチドを表示できる。１つのさらなる実施形態では、ウイルスコートタンパク質の約１／３が標的ペプチドを表示できる。さらに別の実施形態では、ウイルスコートタンパク質のほぼ全てが標的ペプチドを表示できる。
【００６９】
本発明の別の実施形態では、ＶＬＰまたは標的ペプチドはさらに、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１５、Ｐａｍ３ＳＫ４、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＬＰＳ、フラジェリン、イミキモド、およびＣｐＧ−ＸおよびＭＰＬの群からの１つまたは複数の薬剤を含み得る。
【００７０】
標的ペプチドをコードする配列を含むか含まない、Ｌ１タンパク質（例えば、全長または部分長Ｌ１ポリペプチド）および任意選択的にＬ２タンパク質（例えば、全長または部分長Ｌ２ポリペプチド）をコードする遺伝子構築物を、当業者に周知の標準的な組換え手順に従って調製できる。種々のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ分子を共にライゲーションしてインフレームの遺伝子融合物を形成し、その結果、例えば、多イオン性パピローマウイルスキャプシドポリペプチド（Ｌ１またはＬ１／Ｌ２）、または標的ペプチドを含むパピローマウイルスキャプシドポリペプチド（Ｌ１またはＬ１／Ｌ２）を発現する、例えば、単一の読み取り枠が得られる。全体のまたは部分的なＬ１および／またはＬ１／Ｌ２ポリペプチドをコードするＤＮＡコード配列（すなわち、読み取り枠）を、ＤＮＡ分子によってコードされたタンパク質の発現（すなわち、転写および翻訳）をもたらす適切な制御エレメントにライゲーションできる。これらの制御配列（典型的には、プロモーター、エンハンサーエレメント、リーダー配列、転写終結シグナルなど）は、当該分野で周知である。
【００７１】
特定の実施形態では、標的ペプチドを含むか含まないＶＬＰを、組換えバキュロウイルスを使用するＬ１タンパク質の発現の際にＳｆ−９昆虫細胞中で形成させる。バキュロウイルスベクターおよびバキュロウイルスＤＮＡの一般的な取り扱いおよび調製方法、ならびに昆虫細胞の培養手順は、当業者に公知である。例えば、Ｖｏｌｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，６９  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３２５８−６４（１９９５）；Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，６７（１２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９２９−３６（１９９３）；Ｋｏｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，１３０  Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１−１６（１９９３）；Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，６７（４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９３６−４４（１９９３）；および米国特許出願公開第２０１４００５０７５３号（それぞれ、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００７２】
その後の形質転換のために原核生物宿主細胞を選択する場合、組換えＤＮＡ分子を構築するために使用されるプロモーター領域は、特定の宿主に適するべきである。当該分野で周知であるように、真核生物宿主細胞における発現のための真核生物プロモーターのＤＮＡ配列は、原核生物プロモーターのＤＮＡ配列と異なる。真核生物プロモーターおよび付随する遺伝子シグナルは、原核生物系で認識されず機能せず、さらに、原核生物プロモーターは、真核細胞において認識されず、機能しない。
【００７３】
したがって、本発明にしたがって発現されるべきポリペプチド産物をコードするＤＮＡ分子を、当該分野で公知の標準的なクローニング手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２００８）（それぞれ、その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載の制限酵素切断およびＤＮＡリガーゼを用いたライゲーションを含む）を使用して、適切な発現ベクターにクローン化できる。組換え分子（プラスミドを含む）を、形質転換、特に形質導入、抱合、動員、またはエレクトロポレーションを介して細胞中に移入できる。これらの組換えプラスミドが単細胞培養物（原核生物および真核細胞を含む）中に導入された時点で、細胞を組織培養で成長させ、ベクターを複製できる。
【００７４】
パピローマウイルスＬ１タンパク質（および任意選択的なＬ２タンパク質）および得られたＶＬＰアセンブリの組換え発現のために、上記で産生された組換えベクターを使用して、宿主細胞を感染させる。多数のベクター−宿主組み合わせ（植物細胞ベクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と植物細胞の組み合わせ、酵母ベクターと酵母宿主の組み合わせ、バキュロウイルスベクターと昆虫宿主細胞の組み合わせ、ワクシニアウイルスベクターと哺乳動物宿主細胞の組み合わせ、または大腸菌でのプラスミドベクターを含む）を使用できる。さらなる哺乳動物発現ベクターは、アデノウイルス  アデノ随伴ウイルス、ノダウイルス、およびレトロウイルス由来のベクターを含む。
【００７５】
別の実施形態では、酵母細胞または哺乳動物細胞におけるパピローマウイルスＶＬＰの発現に適切な組換え発現ベクターおよび制御配列は、当該分野で周知であり、本発明で使用できる。例えば、Ｂｕｏｎａｍａｓｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２９３（２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３３５−４４（２００２）；Ｓａｓａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２６−９５（１９９５）；Ｈａｇｅｎｓｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，６７（１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３１５−２２（１９９３）を参照のこと。米国特許第７，１１２，３３０号および米国特許出願公開第２００８０１６６３７号（その全てが、本明細書中で参考として援用される）も参照のこと。
【００７６】
キャプソメアおよび／またはＶＬＰの組換え発現および自己組み立てのために利用される宿主−ベクター系と無関係に、これらの産物を、公知の技術を使用して宿主細胞から単離し、次いで、精製できる。１つの実施形態では、キメラパピローマウイルスＶＬＰを、ＣｓＣｌまたはスクロース勾配での遠心分離によって精製できる。Ｓａｓａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２６−９５（１９９５）；Ｖｏｌｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，６９  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３２５８−６４（１９９５）；Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，７５  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２４４５−４９（１９９４）；Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，６７（１２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９２９−３６（１９９３）；Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，６７（４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９３６−４４（１９９３）を参照のこと。実質的に純粋なＶＬＰ調製物を、標的ペプチドと抱合し、次いで、本発明の方法で使用できる。
【００７７】
本明細書中の本発明の１つの実施形態では、Ｌ１タンパク質およびＬ２タンパク質は、標的ペプチドの付着または挿入および付着のために必要なＬ１およびＬ２配列への変更を除いて、本質的に野生型バージョンである。しかし、当業者は、Ｌ１およびＬ２タンパク質のバリアントも使用できるが、但し、前述のタンパク質が適切な標的ペプチドの挿入または付着に耐えることができ、かつＶＬＰ、または少なくとも１つの五量体（キャプソマー）へと組み立てできることを条件とすることを認識しているであろう。かかるバリアントのいくつかの例は、記載されている。例えば、そのＮ末端から最大で１０アミノ酸を欠くか、そのＣ末端から最大で３０アミノ酸を欠く短縮Ｌ１を使用できる（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ  ２００１  Ｍａｒ．１６；３０７（１）：１７３−８２またはＢｉｓｈｏｏｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８２，３１８０３−３１８１１（その両方が、かかる短縮Ｌ１タンパク質の作製および使用の開示のために参考として援用される）を参照のこと）。別の実施形態では、約６０アミノ酸のペプチドへの小融合物を使用できる（例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９７  Ｊｕｌ．２１；２３４（１）：９３−１１１（かかる融合ペプチドの開示のために参考として援用される）を参照のこと）。別の実施形態では、第１のＰＶ株由来の分子の１つの部分を第２のＰＶ株由来のＬ１分子と交換したハイブリッドＬ１分子を使用できる。例えば、Ｌ１分子の一定の機能的部分（本発明の外部に露呈される「ループ」など）を、異なるＰＶ株由来の分子間で交換できる。かかるハイブリッドＬ１タンパク質の例については、例えば、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００１  Ｄｅｃ．２０：２９１（２）：３２４−３４またはＯｒｏｃｚｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９，９５０３−９５１４（これらの両方が、かかるハイブリッドＬ１タンパク質の開示のために参考として援用される）を参照のこと。他のバリアントタイプは、当業者に明白であろう。例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００６  Ｍａｙ；８０（１０）：４６６４−７２；Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３，４８８２−４８８９；またはＲｏｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７１，６２４７−５２（これらの全てが、Ｌ１の適切なバリアントの他のタイプの開示のために本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。本発明のキメラＶＬＰで用いるＬ１タンパク質の別の適切な例は、ＨＰＶ１６Ｌ１のＤＥ−表面ループ内にＨＰＶ１６Ｌ２アミノ酸１７〜３６（ＲＧ１エピトープ）が存在するように改変されたＨＰＶ１６Ｌ１タンパク質である（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１３  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ；１３３（１２）：２７０６−２７１３；Ｓｌｕｐｅｔｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２５：２００１−１０；Ｋｏｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．２００８  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ  ８０；８４１−６；Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００９  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ８３：１００８５−９５；Ｃａｌｄｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８：４３８４−９３（これらの全ての全体が、本明細書中で参考として援用される））。
【００７８】
挿入物がＶＬＰの表面上に表示され、かつ挿入がタンパク質のＶＬＰへの組み立て能力を妨害しないならば、Ｌ１またはＬ２タンパク質の中またはその上の種々の部位のいずれかで標的ペプチドを操作できる。Ｌ１  ＨＰＶ１６  ＶＬＰの結晶化は、ウイルスキャプシドの原子構造、特に、中和抗体によって認識されかつウイルス血清型を決定する免疫優性エピトープおよび高次構造依存性エピトープを含む超可変表面ループを明らかにした（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ５，５５７−５６７（本明細書中で参考として援用される））。したがって、Ｌ１タンパク質中への標的ペプチドの挿入または付着に適切な部位は、当業者に明白であろう。
【００７９】
標的ペプチドを、パピローマウイルスＬ１ポリペプチドのループＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、ＦＧ、ＨＩのいずれかに挿入または付着させることができる。本発明の１つの実施形態では、標的ペプチドを、Ｌ１のＤＥループ（例えば、ＢＰＶ１のアミノ酸１３３と１３４の間、ＨＰＶ１６Ｌ１のアミノ酸１３６と１３７の間、または他のパピローマウイルス由来のＬ１分子の等価な部位の間）に付着または挿入する。本発明の別の実施形態では、標的ペプチドを、ヘリックスＢ４ループ（例えば、ＨＰＶ１６Ｌ１のアミノ酸４３０と４３３の間）に挿入または付着させる。
【００８０】
その中に標的ペプチドが付着または挿入されるＬ１タンパク質は、種々のタイプ（菌株／遺伝子型）のパピローマウイルス（ＰＶ）（例えば、ヒトＰＶ（例えば、ＨＰＶ１、２、３、４、５、６、８、９、１１、１５、１６、１７、１８、２３、２７、３１、３３、３５、３８、３９、４５、５１、５２、５８、６６、６８、７０、７６、または９２）、ウシＰＶ（例えば、ＢＰＶ１、ＢＰＶ２、ＢＰＶ４、ＢＰＶ６）、またはイヌ口腔ＰＶ（ＣＯＰＹ））のいずれかに由来し得る。
【００８１】
本明細書中で使用される場合、用語「抗原」は、Ｔ細胞受容体によって結合され得る分子である。抗原はさらに、体液性応答および／または細胞性免疫応答を誘導してＢ−および／またはＴリンパ球を刺激でき、本発明に関して、ＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成するときに抗原がＣＤ８＋Ｔリンパ球を刺激することが好ましい。生物学的応答を生じる抗原の構造的態様は、本明細書中で「抗原決定基」または「エピトープ」と呼ばれ、これらは同義である。Ｂリンパ球は、抗体産生を介して外来抗原決定基に応答するのに対して、Ｔリンパ球は、細胞性免疫のメディエーターである。したがって、抗原決定基またはエピトープは、抗体によって、または、ＭＨＣの文脈では、Ｔ細胞受容体によって認識される、抗原の一部である。抗原決定基またはエピトープは、タンパク質の隣接する／連続する配列またはセグメントである必要はなく、相互に直接隣接していない種々の配列を含み得る。
【００８２】
特定のアミノ酸配列に関して、「エピトープ」は、特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基組、または、Ｔ細胞の文脈では、Ｔ細胞受容体タンパク質および／またはＭＨＣ受容体による認識に必要な残基である。エピトープのアミノ酸残基は、隣接／連続している必要はない。免疫系の状況では、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、エピトープは、組み合わさって免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体、またはＨＬＡ分子によって認識される部位を形成する分子の集合的フィーチャ（ペプチドの一次、二次、および三次構造、ならびに電荷など）である。
【００８３】
本明細書中で使用される場合、「Ｔ細胞エピトープ」は、細胞表面上のＭＨＣ分子との会合においてその抗原を含むペプチドに対する免疫学的応答の開始時にＴ細胞受容体によって認識されるペプチドまたはタンパク質のフィーチャを意味する。Ｔ細胞によるＴ細胞エピトープの認識は一般に、抗原提示細胞上で発現されるＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子に結合される抗原のペプチドフラグメントをＴ細胞が認識する機序を介すると考えられる。本発明のいくつかの実施形態では、本明細書中に記載のＴ細胞エピトープおよびキメラＶＬＰを含む標的ペプチドは、標的ペプチドのＴ細胞エピトープに結合して表示できるＭＨＣ分子を有する抗原提示細胞の検出で使用される。Ｔ細胞エピトープは典型的には、クラスＩまたはＩＩＭＨＣ分子に結合される短いペプチドを必要とし、適切な親和性でＭＨＣ／ペプチド複合体に結合する適合Ｔ細胞分子を保有するＴ細胞によって認識され得る三元複合体（ＭＨＣクラスＩα鎖、β−２−ミクログロブリン、およびペプチド）を形成する。ＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドは典型的には、８〜１４アミノ酸長、もっとも典型的には、９アミノ酸長である。
【００８４】
本明細書中で使用される場合、「ＨＰＶ」および「ヒトパピローマウイルス」は、ヒトに感染できるパピローマウイルス科のメンバーを指す。ＨＰＶには、その向性（生殖器／粘膜群および皮膚群）によって定義される２つの主な群が存在し、そのそれぞれは、複数のウイルス「タイプ」または「菌株／遺伝子型」（例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３２など）を含む。
【００８５】
世界保健機関によれば、「ワクチン」は、特定の疾患に対する免疫を改善する生物学的調製物である。ワクチンは典型的には、疾患を引き起こす微生物に類似する薬剤を含み、微生物の弱毒化形態もしくは死滅させた形態、その毒素、またはその表面タンパク質の１つから作製されることが多い。この薬剤は、この薬剤を異物として認識し、この薬剤を破壊し、そしてこの薬剤を「記憶する」ように身体の免疫系を刺激し、その結果、免疫系は、後に遭遇するこれらの微生物のいずれかをより容易に認識して破壊することができる。ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｔｏｐｉｃｓ／ｖａｃｃｉｎｅｓ／ｅｎ／を参照のこと。
【００８６】
用語「ＶＬＰワクチン」は、１、２、３、４、５、またはそれを超える本発明のキメラＶＬＰを含む製剤を指す。本発明のキメラＶＬＰを含む組成物は典型的には、既存の免疫を再指向させ腫瘍の増殖、成長、および／または転移を阻害するために被験体に投与できる形態であろう。典型的には、ＶＬＰワクチンは、その中で本発明の組成物が懸濁または溶解される従来の生理食塩水または緩衝液を含むが、例えば吸入によるドライパウダーおよびミョウバンなどのさらなるアジュバントを含むさらなる製剤の投与も意図される。本発明の組成物を使用して、腫瘍の増殖、成長、および／または転移を阻害できる。宿主中への導入の際、本発明のキメラＶＬＰ含有組成物（例えば、ＶＬＰワクチン）は、免疫応答（サイトカインの産生、および／または細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞の活性化、および／または他の細胞応答を含むが、これらに限定されない）を誘発できる。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、「治療用」組成物は、腫瘍を有する患者のために設計され、投与される組成物である。治療用組成物（例えば、治療用キメラＶＬＰ含有組成物）を、良性腫瘍または悪性腫瘍を処置するために使用する。本発明のいくつかの実施形態では、キメラＶＬＰを、以前に腫瘍を有し現在は見かけ上腫瘍／癌のない被験体に投与して腫瘍／癌の再発を阻害する。
【００８８】
用語「阻害する」、「低下させる」、「予防する」、またはこれらの用語の任意のバリエーションは、特許請求の範囲および／または明細書中で使用される場合、望ましい結果（腫瘍の成長、増殖、および／または転移の阻害、低下、または予防など）を達成するための任意の測定可能な減少または完全な阻害を含む。
【００８９】
本明細書を通して、用語「約」を、値は値を決定するために使用されるデバイスまたは方法の誤差の標準偏差を含むことを示すために使用する。
【００９０】
本明細書中で使用される「被験体」または「それを必要とする被験体」は、腫瘍／癌を有するか、腫瘍／癌を有したことがある任意の動物を含む。適切な被験体（患者）は、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット、またはブタなど）、家畜（ウシなど）、競技動物（イヌまたはウマなど）、愛玩用の動物またはペット（ウマ、イヌ、またはネコなど）、非ヒト霊長類、およびヒトを含む。
【００９１】
本明細書中で使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、任意の特定のアミノ酸数に制限されない；これらの用語は、時折、本明細書中で互換的に使用される。本発明のタンパク質およびタンパク質をコードする核酸の性質およびアミノ酸配列は周知であり、日常的に決定でき、種々の公知のデータベースからダウンロードすることもできる。例えば、ＮＣＢＩＧｅｎＢａｎｋデータベースを参照のこと。いくつかの配列を本明細書中に提供する。しかし、いくつかの配列情報は、日常的に更新されるので（例えば、既存のエントリーの誤りを訂正するため）、タンパク質およびタンパク質をコードする核酸に関する更新された（訂正された）情報が、本出願に含まれる。本明細書中で考察した配列データベース中に提供される情報は、本出願で参考として援用される。
【００９２】
本明細書中で使用される場合、用語「キメラＶＬＰ」は、標的ペプチドを含むＶＬＰを示すことを意図する。この用語は、標的ペプチドが共にＶＬＰに付着または結合する特定の様式や標的ペプチドがＶＬＰに挿入される特定の様式に関するいかなる意味を付与することも意図しない。本発明の１つの実施形態では、標的ペプチドは、ジスルフィド結合、マレイミド結合、またはアミド結合を介してＶＬＰに抱合される。
【００９３】
用語「ＨＰＶ」および「ヒトパピローマウイルス」は、ヒトに感染できるパピローマウイルス科のメンバーを指す。ＨＰＶには、その向性（生殖器／粘膜群および皮膚群）によって定義される２つの主な群が存在し、そのそれぞれは、複数のウイルス「タイプ」または「菌株」（例えば、ＨＰＶ５、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３２など）を含む。
【００９４】
「チェックポイント阻害剤」は、いくつかのタイプの免疫系細胞（Ｔ細胞など）およびいくつかの癌細胞によって作製されるある種のタンパク質である「チェックポイントタンパク質」を遮断する薬物のタイプである。チェックポイントタンパク質は、免疫応答の抑制を補助し、Ｔ細胞が癌細胞を死滅させることを防ぐことができる。チェックポイントタンパク質が阻害されると、免疫系の抑制が開放され、Ｔ細胞が癌細胞をよりうまく死滅させることができる。Ｔ細胞または癌細胞上で見出されるチェックポイントタンパク質の例は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１およびＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／Ｂ７−２、ＣＤ８６、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴおよびＣＤ１３７Ｌを含む。チェックポイント阻害剤の例は、イプリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））、およびニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標））、Ａｖｅｌｕｍａｂ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標））、Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ（ＩＭＦＩＮＺＩ（登録商標））を含むが、これらに限定されない。
【００９５】
「ＭＨＣ」または「主要組織適合性遺伝子複合体」は、免疫系が外来物質を認識するのを補助する、細胞表面上に見出されるタンパク質をコードする遺伝子群である。ＭＨＣタンパク質は、全ての高等脊椎動物で見出される。ＭＨＣ分子には２つの主なタイプ（ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ）が存在する。ヒトでは、ＭＨＣクラスＩ分子（ヒトのＭＨＣ−分子は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも命名されている）をコードする３つの異なる遺伝子座が存在する：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ。ＨＬＡ−Ａ＊０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２、およびＨＬＡ−Ａ＊１１は、これらの遺伝子座から発現され得る異なるＭＨＣクラスＩ対立遺伝子の例である。
【００９６】
本明細書中に列挙したリストの１つまたは複数のメンバーを、本発明から具体的に排除するか、本発明に含めてよいことが意図される。
【００９７】
ＶＬＰの作製するための方法は、当該分野で公知である（例えば、米国特許第９，１４９，５０３号および米国特許第９，５８０，４７４号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。本発明の１つの態様は、本発明のキメラＶＬＰ（またはそのポリペプチド成分）を作製するための方法である。本発明の１つの態様では、Ｔ細胞エピトープを、特定のアミノ酸配列のために修正した従来の方法を使用して合成する。かかる技術は、例えば、当業者に周知のペプチド合成方法、例えば、液相合成（Ｆｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｎｅｕｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｈｉｌｌ（Ｅｄｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，２，１０５−２５３，１９７６を参照のこと）、または固相合成（Ｂａｒａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ（Ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，３−２８４，１９７９を参照のこと）、または段階的固相合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９−２１５４によって報告されている）（これらの各々の内容が、本明細書中で参考として援用される）を含む。ペプチド合成技術についての他の参考文献は、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４６，３４３３によって開示された固相ペプチド合成のＦｍｏｃ−ポリアミドモードによって合成されたペプチド、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ手順を使用して合成したペプチド（Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ：Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９）を含む。Ｆｍｏｃアミノ酸を、様々な販売者（例えば、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ，Ｉｌｌ．，ＵＳＡ）、Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）、およびＢａｃｈｅｍ  ＵＫ  Ｌｔｄ．（Ｓｔ．Ｈｅｌｅｎｓ，ＵＫ））から得る事ができる。当該分野で公知の方法を使用して、合成したペプチドを、ＶＬＰに付着させることができる。本発明の１つの実施形態では、本明細書中に記載のキメラＶＬＰを作製するための方法は、当該分野で公知の方法によってパピローマウイルスＬ１タンパク質からＶＬＰを組み立てること、ＶＬＰを還元するのに十分であるが、ＶＬＰのキャプシド様正二十面体構造が依然として維持される還元条件にＶＬＰを供すること、および標的ペプチドをＶＬＰに抱合しそれにより、キメラＶＬＰを形成することを含む。標的ペプチドを、ジスルフィド結合、マレイミド結合、またはアミド結合を介して還元されたか活性化されたＶＬＰに抱合できる。例えば、本発明の１つの実施形態では、標的ペプチドは、ジスルフィド結合またはマレイミド結合を介してキメラＶＬＰのＬ１またはＬ２タンパク質のいずれかまたはＬ１およびＬ２タンパク質の両方のシステインのスルフヒドリル基に抱合される。標的ペプチドは、ジスルフィド結合またはマレイミド結合を介してキメラＶＬＰのＬ１またはＬ２タンパク質のいずれかまたはＬ１およびＬ２タンパク質の両方のシステインのスルフヒドリル基に抱合できる。還元されたシステインは、ＶＬＰの表面上に存在し得る。本発明の１つの実施形態では、ＶＬＰのＬ１またはＬ２タンパク質は、Ｌ１またはＬ２タンパク質あたり平均して１つの標的ペプチド、２つの標的ペプチド、３つの標的ペプチド、４つの標的ペプチド、または５つの標的ペプチドを含み得る。本発明の１つの実施形態では、平均して３〜５つの標的ペプチドがキメラＶＬＰの各々のＬ１またはＬ２タンパク質に抱合される。本発明の１つの実施形態では、ＶＬＰの表面システインの少なくとも３０％が標的ペプチドを含む。本発明の１つの実施形態では、ＶＬＰの表面システインの約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％が、標的ペプチドを含む。本発明の１つの実施形態では、ＶＬＰの表面システインの約３０％〜５０％が標的ペプチドを含む。
【００９８】
本発明の１つの実施形態では、標的ペプチドを、アミド結合を介してキメラＶＬＰのＬ１またはＬ２タンパク質のいずれかまたはＬ１およびＬ２タンパク質の両方のリジンまたはアルギニンに抱合できる。標的ペプチドに抱合されたリジンおよび／またはアルギニンは、ＶＬＰの表面上に存在し得る。本発明の１つの実施形態では、ＶＬＰの表面リジンおよび／または表面アルギニンの少なくとも３０％が標的ペプチドを含む。本発明の１つの実施形態では、ＶＬＰの表面リジンおよび／または表面アルギニンの約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％が、標的ペプチドを含む。本発明の１つの実施形態では、ＶＬＰの表面リジンおよび／または表面アルギニンの約３０％〜５０％が、標的ペプチドを含む。
【００９９】
本発明の１つの実施形態では、ＶＬＰの表面リジンおよび表面システインの約３０％〜５０％が標的ペプチドに抱合される。本発明の１つの実施形態では、ＶＬＰの表面リジンおよび／または表面システインの少なくとも３０％が、標的ペプチドに抱合される。本発明の１つの態様では、表面システインおよび表面リジンは、表面システインおよびリジンの約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％が標的ペプチドに抱合されるように、標的ペプチドに抱合される。リジンおよびシステインを、ＶＬＰが異なるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有する複数の標的ペプチドに抱合されるように、同一のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有する標的ペプチドまたは異なるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有する標的ペプチドに抱合できる。
【０１００】
本発明の１つの実施形態では、ＶＬＰの表面アルギニンおよび表面システインの約３０％〜５０％が、標的ペプチドに抱合される。本発明の１つの実施形態では、ＶＬＰの表面アルギニンおよび／または表面アルギニンの少なくとも３０％が、標的ペプチドに抱合される。本発明の１つの態様では、表面システインおよび表面アルギニンは、表面システインおよび表面アルギニンの約３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％が標的ペプチドに抱合されるように、標的ペプチドに抱合される。アルギニンおよびシステインを、ＶＬＰが異なるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有する複数の標的ペプチドに抱合されるように、同一のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有する標的ペプチドまたは異なるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを有する標的ペプチドに抱合できる。
【０１０１】
本発明の１つの実施形態では、ＶＬＰに抱合される全ての標的ペプチドは、同一のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む。本発明の別の実施形態では、ＶＬＰは、複数の標的ペプチドに抱合され、ここで、標的ペプチドは、異なるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む。ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、同一の病原体または異なる病原体のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープであり得る。
【０１０２】
また、本発明の実施形態は、本明細書中に記載のキメラＶＬＰ集団および薬学的に許容され得る賦形剤を含む組成物である。キメラＶＬＰ集団は、同一のキメラＶＬＰの集団または同一でないキメラＶＬＰの集団であり得る。
【０１０３】
あるいは、本発明のポリペプチド（例えば、標的ペプチドおよびＬ１またはＬ２タンパク質）を、組換えによって調製することができる。本発明は、組換えクローニングおよびＤＮＡを含む発現ベクター、ならびに組換えベクターを含む宿主細胞を提供する。ＤＮＡを含む発現ベクターを使用して、ＤＮＡによってコードされるポリペプチド（例えば、標的ペプチドならびにＬ１およびＬ２タンパク質）を調製できる。ポリペプチドを産生するための方法は、ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養し、次いで、発現されたポリペプチドを培養物から回収することを含む。当業者は、発現されたポリペプチドを精製するための手順が、使用される宿主細胞のタイプ、およびポリペプチドが膜結合型であるまたは宿主細胞から分泌される可溶型であるかなどの要因に応じて変化すると認識するであろう。本発明のポリペプチドは、輸送を指示するか精製を補助する種々のリーダー配列を含み得る。
【０１０４】
任意の適切な発現系を使用できる。ベクターは、適切な転写または翻訳制御ヌクレオチド配列（哺乳動物、微生物、ウイルス、または昆虫の遺伝子に由来するものなど）に作動可能に連結された本発明のポリペプチド（例えば、標的ペプチド、Ｌ１またはＬ２タンパク質、またはＬ１またはＬ２タンパク質および標的ペプチドを含むポリペプチド）をコードするＤＮＡを含む。制御配列の例は、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボゾーム結合部位、ならびに転写および翻訳の開始および終結を調節する適切な配列を含む。ヌクレオチド配列は、制御配列がＤＮＡ配列に機能的に関連するとき、作動可能に連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列は、プロモーターヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を調節する場合、ＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。所望の宿主細胞中で複製する能力を付与する複製起点、および形質転換体が同定される選択遺伝子を一般に、発現ベクター中に組み込む。
【０１０５】
ポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、または高等真核細胞を含む。哺乳動物細胞または昆虫細胞は、宿主細胞としての使用に適切である。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞の宿主と共に使用するのに適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｉｎ：Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８５に記載されている。無細胞翻訳系を、本明細書中に開示のＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡを使用してポリペプチドを産生するために、使用することもできる。一般に、本明細書中で言及されている分子生物学的方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。
【０１０６】
ポリペプチドをＶＬＰへと組み立てる方法は、被験体における使用のためにこれらを精製する方法と同様に、周知でありふれた方法である。適切な自己組み立て条件については、例えば、本明細書中の実施例に記載の方法またはＫｉｒｎｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６７，６９２９−６９３６；Ｖｏｌｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００，５０４−５１２；またはＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００１  Ｍａｒ．１６；３０７（１）：１７３−８２（これらの全てが、かかる方法の説明のために参考として援用される）に記載の方法を参照のこと。
【０１０７】
本発明の方法は、有効量の本発明のキメラＶＬＰでの既存の処置を含む。本発明の方法は、本発明のキメラＶＬＰを、それを必要とする被験体に、腫瘍の成長、進行、または転移を阻害するのに十分な量で投与することを含む。本発明の方法の１つの実施形態では、キメラＶＬＰを、それを必要とする被験体に、サイトカイン産生、および／または細胞性免疫、特に、先天免疫を刺激する（マクロファージおよびナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性の刺激が含まれる）のに十分な量で投与する。本発明の態様では、それを必要とする被験体は、以前に腫瘍の処置を受けたことがあり、医療水準によると、現時点で癌や疾患に罹患していないと考えられる被験体である。
【０１０８】
本発明の１つの態様は、本発明のキメラＶＬＰを被験体に投与することによる、それを必要とする被験体において癌を処置するための方法であり、ここで、標的ペプチドのＣＤ８＋エピトープが、癌の供給源である組織（「供給組織」）に向性を有する病原体のエピトープである。本方法は、供給組織を決定すること、被験体が供給組織に向性を有する病原体に対して能動的にワクチン接種されていたか、または前述の病原体に感染していたかどうかを決定すること、および、次いで、有効量の本発明のキメラＶＬＰを被検体に投与することを含み、ここで、標的ペプチドのＣＤ８＋エピトープが、以前に被験体に投与されたワクチンまたは被験体が感染していた病原体中の抗原決定基のエピトープである。
【０１０９】
いくつかのウイルスが特定の組織タイプに向性を示すことが当該分野で公知である。例えば、脳組織に向性を示すウイルスは、ＪＣウイルス、麻疹ウイルス、ＬＣＭウイルス、アルボウイルス、および狂犬病ウイルスを含むが、これらに限定されない；眼組織に向性を示すウイルスは、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびサイトメガロウイルスを含むが、これらに限定されない；鼻腔組織に向性を示すウイルスは、ライノウイルス、パラインフルエンザウイルス（ｐａｒｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、および呼吸器合胞体ウイルスを含むが、これらに限定されない；口腔組織（例えば、口腔粘膜、歯肉、唾液腺、咽頭）に向性を示すウイルスは、単純ヘルペスウイルスＩ型およびＩＩ型、ムンプスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、およびサイトメガロウイルスを含むが、これらに限定されない；肺組織に向性を示すウイルスは、Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、アデノウイルス、およびＳＡＲＳコロナウイルスを含むが、これらに限定されない；神経組織（例えば、脊髄）に向性を示すウイルスは、ポリオウイルスおよびＨＴＬＶ−１を含むが、これらに限定されない；心臓組織に向性を示すウイルスは、コクサッキーＢウイルスを含むが、これに限定されない；肝臓組織に向性を示すウイルスは、Ａ型、Ｂ型、およびＣ型肝炎ウイルスを含むが、これらに限定されない；胃腸組織（例えば、胃、大腸、および小腸）に向性を示すウイルスは、アデノウイルス、ロタウイルス、ノロウイルス、アストロウイルス、およびコロナウイルスを含むが、これらに限定されない；膵臓組織に向性を示すウイルスは、コクサッキーＢウイルスを含むが、これに限定されない；皮膚組織に向性を示すウイルスは、水痘帯状疱疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス６、痘瘡ウイルス、ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ  ｃｏｎｔａｇｉｏｕｓｕｍ、パピローマウイルス、パルボウイルスＢ１９、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、およびコクサッキーＡウイルスを含むが、これらに限定されない；生殖器組織に向性を示すウイルスは、単純ヘルペス２型、パピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含むが、これらに限定されない。
【０１１０】
本発明の１つの態様は、肺癌を処置するための方法であって、肺細胞に感染する病原体（例えば、インフルエンザウイルス、例えば、Ａ型またはＢ型インフルエンザウイルス）に対するワクチンが能動的に接種されていたかどうかを決定すること、次いで、有効量の本発明のキメラＶＬＰを投与することを含み、ここで、標的ペプチドのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープがワクチン中に含まれる病原体の抗原決定基のエピトープであり、Ｔ細胞エピトープが被験体のＭＨＣ分子クラスＩと複合体を形成する、方法である。肺癌を処置するための本発明の方法の１つの態様は、被験体が肺細胞に感染する病原体（例えば、インフルエンザウイルス、例えば、Ａ型またはＢ型インフルエンザウイルス）に感染していたかどうかを決定すること、次いで、有効量の本発明のキメラＶＬＰを投与することを含み、ここで、標的ペプチドのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープが病原体のエピトープであり、Ｔ細胞エピトープが被験体のＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成する。
【０１１１】
本発明の１つの態様は、本発明のキメラＶＬＰを投与することによる一般に頭頸部癌と呼ばれる癌群の一部である口腔がんを処置するための方法であり、ここで、標的ペプチドのＣＤ８＋エピトープが、口腔組織に向性を有する病原体（例えば、ムンプスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、または単純ヘルペスウイルス１型）のエピトープである。本方法は、それを必要とする被験体が、例えば、ムンプスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、または単純ヘルペスウイルス１型に対するワクチンを接種していたか、またはこれらのウイルスに感染していたかどうかを決定すること、および被験体が以前にワクチン接種されていたか、感染していた場合、次いで、本発明のキメラＶＬＰを被験体に投与することを含み、ここで、標的ペプチドのＣＤ８＋エピトープが、ムンプスウイルスもしくは麻疹ウイルスの、被験体が受けていたワクチンの抗原成分の、または被験体が以前に感染していた病原体（すなわち、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、または単純ヘルペスウイルス１型）のＣＤ８＋エピトープである。
【０１１２】
本発明の１つの態様は、有効量の本発明のキメラＶＬＰを、それを必要とする被験体に投与することによる、マクロファージおよびナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性を刺激するための方法である。マクロファージおよびナチュラルキラー細胞は、腫瘍微小環境に存在するものであり得る。本発明の１つの態様では、キメラＶＬＰを、腫瘍微小環境に既に存在するマクロファージおよびナチュラルキラー細胞の細胞傷害活性を刺激するのに有効な量で被験体に投与する。本発明の１つの態様では、キメラＶＬＰを、マクロファージおよびナチュラルキラー細胞を腫瘍微小環境に誘引するのに有効な量で被験体に投与する。
【０１１３】
本発明の１つの態様では、キメラＶＬＰを、マクロファージ、好中球、およびナチュラルキラー細胞を誘引および刺激するのに十分な数の抗体を標的ペプチドに結合させるのに十分な量で被験体に投与する。
【０１１４】
本発明の１つの態様は、有効量の本発明のキメラＶＬＰを、それを必要とする被験体非投与することによる、既存の記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害活性を腫瘍細胞または腫瘍微小環境に再指向させるための方法である。好ましくは、キメラＶＬＰの標的ペプチドのＴ細胞エピトープは、それに対して被験体が能動的にワクチン接種された病原体または被験体が以前に感染したことのある病原体に由来し、被験体は、腫瘍細胞上でＭＨＣクラスＩ分子と複合体形成しているＴ細胞エピトープを認識する記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞を有する。本発明の１つの態様では、キメラＶＬＰの有効量は、記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞を腫瘍微小環境に誘引するのに十分な量である。本発明の１つの態様では、キメラＶＬＰの有効量は、腫瘍微小環境に存在する記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激するのに十分な量である。
【０１１５】
本発明の１つの態様は、本発明のキメラＶＬＰを、それを必要とする被験体に投与することによって腫瘍微小環境に本明細書中に記載の標的ペプチドを導入するための方法である。本発明の１つの態様では、標的ペプチドのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、微小環境で記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激するのに十分な量で、ＶＬＰから腫瘍微小環境内に放出される。本発明の１つの態様では、キメラＶＬＰおよび／またはキメラＶＬＰの標的ペプチドは、腫瘍微小環境でのタンパク質分解酵素による切断に感受性であり、キメラＶＬＰまたは標的ペプチド中の標的切断部位の位置は、標的部位の切断によってＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む標的ペプチドの全部または一部がキメラＶＬＰから腫瘍微小環境内に放出されるような部位である。本発明の１つの態様では、切断部位は、フューリン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）（例えば、ＭＭＰ、１、２、３、７、８、９、１１、１３、１４、または１９）、ＡＤＡＭ（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）（例えば、ＡＤＡＭＳ８、９、１０、１５、１７、または２８）、カテプシン（例えば、カテプシンＢ、Ｄ、Ｄ、Ｇ、またはＨ）、Ｎ．エラスターゼ、プロテイナーゼ−３、Ａｚｕｒｏｃｉｄｉｎ、またはＡＤＡＭＴＳ−１によって認識される。キメラＶＬＰの十分な量は当業者によって容易に決定され、この量は、例えば、被験体の特徴（例えば、被験体の年齢、体重、性別、病状）および腫瘍の特徴（例えば、タイプ、容積、および発症状態）に依存することが認識されるであろう。
【０１１６】
本発明の１つの態様では、キメラＶＬＰおよび／またはキメラＶＬＰの標的ペプチドは、腫瘍細胞内のタンパク質分解酵素による切断に感受性であり、ＶＬＰまたは標的ペプチド中の標的切断部位の位置は、標的部位の切断によってＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む標的ペプチドの全部または一部がキメラＶＬＰから放出されるような位置であり、前述のエピトープは、腫瘍細胞のＭＨＣクラスＩ分子と複合体を形成する。キメラＶＬＰの十分な量は当業者によって容易に決定され、この量は、例えば、被験体の特徴（例えば、被験体の年齢、体重、性別、病状）および腫瘍の特徴（例えば、タイプ、容積、および発症状態）に依存することが認識されるであろう。
【０１１７】
本発明の１つの態様では、それを必要とする被験体に投与するのに適切な本発明のキメラＶＬＰ（複数可）を選択するために、被験体が所要の病原体（例えば、寄生虫、細菌、またはウイルス、例えば、麻疹ウイルスまたはポリオウイルス）に対するワクチンを能動的に接種されていたかどうかを確認し、次いで、本発明のキメラＶＬＰを選択し、被験体に投与し、ここで、標的ペプチドのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、被験体が免疫化されていた病原体に由来する。被験体の診療記録を再調査するか、被験体に問診することによって、被験体が特定の病原体に対するワクチンを能動的に接種していたかどうかを確認することができる。本発明の１つの態様では、それを必要とする被験体に投与するのに適切なキメラＶＬＰ（複数可）を選択するために、被験体が所要の病原体（例えば、寄生虫、細菌、またはウイルス、例えば、麻疹ウイルスまたはポリオウイルス）に以前に感染していたかどうか、および感染から回復していたかどうかを確認し、次いでキメラＶＬＰを選択して被験体に投与し、ここで、標的ペプチドのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、かかる病原体に由来するＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープである。被験体の診療記録を再調査するか、被験体に問診することによって、被験体が特定の病原体に感染していたかどうかを確認することができる。特定のＭＨＣクラスＩ分子に結合するＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの非限定的な例を、表１および表２に記載する。本方法はまた、被験体の細胞が発現するＭＨＣクラスＩ決定基（複数可）を決定することおよび次いで本発明のキメラＶＬＰを投与することを含んでよく、ここで、標的ペプチドのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープは、ワクチン中の病原体または被験体が以前に感染していた病原体の抗原成分のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープであり、このエピトープは、被験体のＭＨＣクラスＩ決定基（複数可）と複合体を形成する。
【０１１８】
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書中に記載のキメラＶＬＰを、他の癌治療法（例えば、照射療法、化学療法、手術、および／または免疫療法）と併せて投与する。本発明のいくつかの態様では、本明細書中に記載のキメラＶＬＰを、チェックポイント阻害剤と併せて投与する。本発明のキメラＶＬＰおよび他の治療薬または治療剤を、同一または異なる投与経路によって同時または連続的に投与できる。医師は、本発明の方法で用いる治療剤（複数可）の同一性および量を、当該分野で公知の標準的な技術を使用して容易に決定できる。
【０１１９】
ＶＬＰは、アジュバントの性質を有する。いくつかの実施形態では、本発明のキメラＶＬＰ組成物の免疫原性を、アジュバントとして公知のさらなる非特異的な免疫応答の刺激物質によって増強できる。適切なアジュバントは、全ての許容され得る免疫促進性化合物（サイトカイン、毒素、またはミョウバンなどの合成組成物など）を含む。
【０１２０】
アジュバントは、水中油型乳濁液、油中水型乳濁液、無機塩、ポリヌクレオチド、および天然物質を含むが、これらに限定されない。使用できる特異的なアジュバントは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、γ−インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＢＣＧ、アルミニウム塩（水酸化アルミニウムまたは他のアルミニウム化合物など）、ＭＤＰ化合物（ｔｈｕｒ−ＭＤＰおよびｎｏｒ−ＭＤＰなど）、ＣＧＰ（ＭＴＰ−ＰＥ）、リピドＡ、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、または不活性化微生物剤を含む。ＲＩＢＩは、細菌から抽出された３つの成分（ＭＰＬ、リトレハロースジミコラート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ））を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０乳濁液中に含む。ＭＨＣ抗原をさらに使用できる。他のアジュバントまたは方法は、米国特許第６，８１４，９７１号、同第５，０８４，２６９号、同第６，６５６，４６２号（各々が、本明細書中で参考として援用される）で例示されている。
【０１２１】
キメラＶＬＰ組成物にアジュバントの効果を付与する種々の方法は、リン酸緩衝生理食塩水中の約０．０５〜約０．１％溶液として一般に使用される、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム（ミョウバン）などの薬剤の使用、約０．２５％溶液として使用される糖の合成ポリマー（ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標））との混合、約７０℃〜約１０１℃の範囲の温度でのそれぞれ３０秒間〜２分間の熱処理による組成物中のタンパク質の凝集を含む。アルブミンに対するペプシン処理（Ｆａｂ）抗体での再活性化による凝集；細菌細胞（例えば、Ｃ．ｐａｒｖｕｍ）、グラム陰性菌の内毒素またはリポ多糖成分との混合物；生理学的に許容され得る油性ビヒクル（例えば、マンニドモノオレアート（Ａｒａｃｅｌ  Ａ））での乳濁液；またはブロック基質として使用されるペルフルオロカーボン（ＦＬＵＯＳＯＬ−ＤＡ（登録商標））の２０％溶液を含む乳濁液を使用して、アジュバント効果を得ることもできる。典型的なアジュバントは、完全フロイントアジュバント（死滅させた結核菌を含む）、不完全フロイントアジュバント、および水酸化アルミニウムである。
【０１２２】
ヒトへの投与のために、種々の適切なアジュバントが、当業者に明白であろう。これらは、例えば、アジュバントとしてのＡｌｕｍ−ＭＰＬ、または類似の製剤ＡＳＯ４（承認されたＨＰＶワクチンＣＥＲＶＡＲＩＸ（登録商標）で使用される）、ＡＳ０３、ＡＳ０２、ＭＦ５９、ｍｏｎｔａｎｉｄｅ、サポニンベースのアジュバント（ＧＰＩ−０１００など）、ＣｐＧベースのアジュバント、またはイミキモドを含む。本発明の実施形態では、アジュバントは、単純に混合されるよりもむしろ、ＶＬＰに物理的にカップリングされるか、ＶＬＰによってカプセル化される。
【０１２３】
アジュバントに加えて、免疫応答を増強するために生物的反応修飾物質（ＢＲＭ）と同時投与することが望ましいかもしれない。ＢＲＭは、Ｔ細胞の免疫を上方制御するか、サプレッサー細胞の活性を下方制御することが示されている。かかるＢＲＭは、シメチジン（ＣＩＭ；１２００ｍｇ／ｄ）（Ｓｍｉｔｈ／Ｋｌｉｎｅ、ＰＡ）；または低用量シクロホスファミド（ＣＹＰ；３００ｍｇ／ｍ２）（Ｊｏｈｎｓｏｎ／Ｍｅａｄ、ＮＪ）およびサイトカイン（γ−インターフェロン、ＩＬ−２、またはＩＬ−１２など）またはＢ−７などの免疫ヘルパー機能に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含むが、これらに限定されない。本発明の実施形態では、これらの遺伝子は、被験体中へのそれらの送達を容易にするために、ＶＬＰによってカプセル化される。
【０１２４】
有効成分としてポリペプチド配列またはペプチド配列（複数可）を含む組成物の調製は、一般に、米国特許第４，６０８，２５１号；同第４，６０１，９０３号；同第４，５９９，２３１号；同第４，５９９，２３０号；同第４，５９６，７９２号；および同第４，５７８，７７０号（その全てが、本明細書中で参考として援用される）に例示されるように、当該分野で十分に理解されている。典型的には、かかる組成物は、溶液または懸濁液のいずれかの注射剤として調整される：注射前に溶液または液体中の懸濁液にするのに適切な固体形態も調製できる。調製物を乳化することもできる。活性免疫原性成分は、薬学的に許容され得、かつ有効成分に適合する賦形剤と混合されることも多い。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノールなど、およびその組み合わせである。さらに、必要に応じて、組成物は、一定量の補助剤（湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤など）、またはワクチンの有効性を増強するアジュバントを含んでよい。特定の実施形態では、米国特許第６，７９３，９２３号および同第６，７３３，７５４号（本明細書中で参考として援用される）に記載のように、ワクチンを、物質と組み合わせて製剤化する。
【０１２５】
本発明のキメラＶＬＰを含む組成物は、被験体へのｉｎ  ｖｉｖｏ投与に適切な生物学的に適合な形態である。医薬組成物はさらに、薬学的に許容され得る担体を含む。用語「薬学的に許容され得る」は、動物、より具体的にはヒトでの使用について連邦政府または州政府の規制当局によって承認されているか、米国薬局方または他の一般に認識されている薬局方に列挙されていることを意味する。用語「担体」は、ＶＬＰと共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。かかる薬学的担体は、水および油などの無菌の液体であり得、石油、動物、植物、または合成に由来するものを含み、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、およびゴマ油などを含むが、これらに限定されない。水は、医薬組成物を経口投与するときの担体であり得る。生理食塩水およびデキストロース水溶液は、医薬組成物を静脈内投与するときの担体であり得る。生理食塩水およびデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液を、注射液のための液体担体として使用できる。適切な医薬品賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリム、グリセロールモノステアラート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳（ｄｒｉｅｄ  ｓｌｉｍ  ｍｉｌｋ）、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールなどを含む。医薬組成物はまた、微量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。
【０１２６】
本発明のキメラＶＬＰを含む医薬組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸薬、カプセル、散剤、および徐放製剤などの形態を取ることができる。経口製剤は、標準的な担体（医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど）を含み得る。１つの具体的な実施形態では、医薬組成物は、患者への適切な投与のための形態を得るための適当量の薬学的に許容され得る担体と共に有効量の本発明のキメラＶＬＰを含む。製剤は、投与様式に適合すべきである。
【０１２７】
本発明の医薬組成物を、任意の特定の投与経路（静脈内、筋肉内、関節内（ｉｎｔｒａｒｔｉｃｕｌａｒ）、気管支内、腹腔内、包内、軟骨内、腔内、体腔内、小脳内（ｉｎｔｒａｃｅｌｅｂｅｌｌａｒ）、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝臓内、心筋内、骨内性、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、経口、非経口、皮下、膣、直腸、口内、舌下、鼻腔内、イオン導入手段、または経皮手段を含むが、これらに限定されない）によって投与できる。最も適切な経路は、静脈内注射または経口投与である。特定の実施形態では、組成物を、標的領域またはその付近に投与する（例えば、腫瘍内注射）。
【０１２８】
水溶液での非経口投与のために、例えば、溶液は、適切に緩衝化されているべきであり、必要に応じて、液体希釈剤で最初に十分な生理食塩水またはグルコースと等張にする。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮下、および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用できる滅菌水性媒体は、本開示を考慮して、当業者に公知であろう。例えば、１回投薬量を等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、皮下注入液に添加するか、計画した注入部位に注射できる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９０を参照のこと）。被験体の容態に応じて、投薬量のいくらかの変化が必要であろう。投与担当者は、いかなる場合においても、各被験体に適切な用量を決定するであろう。
【０１２９】
本発明のキメラＶＬＰ含有組成物を、吸入によって投与できる。ある実施形態では、組成物を、エアロゾルとして投与できる。本明細書中で使用される場合、用語「エアロゾル」または「エアロゾル化組成物」は、ガス中に固体または液体の粒子を含む懸濁液を指す。この用語を、一般に、蒸発されているか、霧状にされているか、そうでなければ、固体または液体から吸入可能な形態（懸濁した固体または液体の薬物粒子が含まれる）に変換されている組成物を指すために使用できる。かかるエアロゾルを、呼吸器系を介して組成物を送達するために使用できる。本明細書中で使用される場合、「呼吸器系」は、酸素の取り込みおよび二酸化炭素の排出を担う身体の臓器系を指す。この系は一般に、鼻から肺胞までの全ての気道を含む。哺乳動物では一般に、肺、気管支、細気管支、気管、鼻道、および横隔膜を含むと見なされている。本開示の目的のために、呼吸器系への組成物の送達は、薬物が１つまたは複数の呼吸器系の気道、特に、肺に送達されることを示す。
【０１３０】
他の投与様式に適切なさらなる製剤は、坐剤（肛門または膣への適用のため）および、場合によっては、経口製剤を含む。坐剤のために、伝統的な結合剤および担体は、例えば、ポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドを含み得る：かかる坐剤を、約０．５％〜約１０％、好ましくは約１％〜約２％の範囲で有効成分を含む混合物から形成できる。経口製剤は、そのような通常使用される賦形剤（例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウムなど）を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放製剤、または散剤の形態を取り、約１０％〜約９５％、好ましくは約２５％〜約７０％の有効成分を含む。
【０１３１】
キメラＶＬＰ組成物を、中性または塩の形態としてワクチンへと製剤化できる。薬学的に許容され得る塩は、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基を用いて形成される）および無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）または有機酸（酢酸、シュウ酸、酒石酸、およびマンデル酸など）を用いて形成される塩を含む。遊離カルボキシル基を使用して形成される塩を、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄など）および有機塩基（イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、およびプロカインなど）から誘導することもできる。
【０１３２】
本発明の医薬組成物はまた、有効量のさらなるアジュバントを含み得る。本明細書中で述べるように、パピローマウイルスＶＬＰは、アジュバントの性質を有する。適切なさらなるアジュバントは、完全または不完全フロイントアジュバント、ミネラルゲル（水酸化アルミニウムなど）、界面活性物質（リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、ジニトロフェノールなど）、および潜在的に有用なヒトアジュバント（などカルメット・ゲラン桿菌、Ｃａｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、および非毒性コレラ毒素など）を含むが、これらに限定されない。
【０１３３】
通常の保存および使用条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための防腐剤を含む。あらゆる場合において、医薬形態は、無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性を示さなければならない。医薬形態はまた、製造および貯蔵条件下で安定であるべきであり、微生物（細菌および真菌など）の汚染に対して防腐されなければならない。
【０１３４】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性を、例えば、コーティング（レシチンなど）の使用、分散液の場合の必要な粒径の維持、および表面活性剤の使用によって維持できる。微生物作用を、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、およびチロメサールなど）によって防止できる。多くの場合、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含めることが好ましいであろう。注射組成物の吸収を、組成物中に吸収遅延剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム、およびゼラチン）を使用することによって延長できる。
【０１３５】
無菌注射液を、適切な溶媒中に種々の上記列挙の成分と共に必要量のキメラＶＬＰを組み込むことによって調整し、必要に応じて、その後に濾過滅菌できる。一般に、分散液を、基本分散媒および上に列挙した成分由来の必要な他の成分を含む無菌ビヒクル中に種々の滅菌された有効成分を組み込むことによって調製する。無菌注射液の調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、それは事前に濾過滅菌した溶液から有効成分および任意のさらなる所望の成分の粉末をもたらす。
【０１３６】
本発明の異なる態様は、有効量のキメラＶＬＰを含む組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む。本発明のいくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含む標的ペプチドを含むキメラＶＬＰを、腫瘍を処置するためか、かかる腫瘍の再発を予防するために患者に投与する。かかる組成物は一般に、薬学的に許容され得る担体または水性媒体に溶解または分散されるであろう。
【０１３７】
本発明の方法では、腫瘍は、小肺細胞癌、肝細胞癌、肝臓癌、肝細胞癌、黒色腫、転移性黒色腫、副腎癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨の癌、脳／ＣＮＳ癌、乳癌、原発巣が未知の癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍ファミリー、眼球の癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、消化管絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭および下咽頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔の癌、鼻咽喉癌、神経芽細胞腫、口腔および口腔咽頭の癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、脾性辺縁帯リンパ腫、辺縁層リンパ腫（結節外または結節）、成人混合細胞型びまん性急速進行性リンパ腫、成人大細胞型びまん性急速進行性リンパ腫、成人大細胞免疫芽球性びまん性急速進行性リンパ腫、成人小非切れ込み核細胞びまん性急速進行性リンパ腫、または濾胞性リンパ腫、頭頸部癌、子宮内膜癌または子宮癌、非小細胞肺癌、骨肉腫、膠芽細胞腫、または転移性癌であり得る。１つの好ましい実施形態では、癌は、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、膵臓癌、または黒色腫（例えば、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫）である。
【０１３８】
したがって、本発明の方法の特定の実施形態は、有効量の本発明のキメラＶＬＰを含む組成物の投与に関する。本明細書中で使用される場合、用語「有効な」は、所望されるか、期待されるか、意図される結果を遂行するのに十分であることを意味する。より具体的には、「有効量」は、所望の治療効果を得るために必要な単独または別の治療剤（例えば、未変性Ｌ１タンパク質、化学療法剤、またはチェックポイント阻害剤を含むパピローマウイルスＶＬＰ）と組み合わせた本発明の組成物（例えば、標的抗原を含むキメラパピローマウイルスＶＬＰ）の量（例えば、腫瘍の成長、進行、または転移を阻害するか、疾患（例えば、癌）を予防、緩和、処置、またはその症状を改善するか、処置される被験体を延命するのに有効な量）を指す。当業者は、正確な必要量が、被験体の年齢、全身状態、処置される容態の重症度、ならびに投与される特定の化合物および／または組成物などに応じて、被験体ごとに変化することを認識している。当業者は、任意の個別の症例における適切な「治療有効量」または「予防有効量」を、適切なテキストおよび文献の参照ならびに／または日常的な実験によって決定できる。医薬組成物（例えば、ワクチン）、その製剤、および投与などの言及が、文脈に応じて、標的ペプチドを含むキメラパピローマウイルスＶＬＰ、未変性Ｌ１タンパク質を含むパピローマウイルスＶＬＰ、または前述の物質の混合物（異なる標的ペプチドを含むキメラＶＬＰの混合物を含む）を指し得ると理解される。用語「単位用量」または「投薬量」は、被験体で用いるのに適切な物理的に分離した単位を指し、各単位は、その投与（すなわち、適切な経路およびレジメン）に関連して上記で考察した所望の応答が得られるように計算された所定量の組成物を含む。処置数および単位用量の両方にしたがって投与すべき量は、所望の結果に依存する。
【０１３９】
本発明の組成物の投与は典型的には、任意の一般的な経路を介するであろう。この経路は、静脈内、皮内、腫瘍内、皮下、筋肉内、腹腔内、呼吸器、鼻、経口／摂取、口内、舌下、または同所への投与を含むが、これらに限定されない。ある実施形態では、ＶＬＰ含有組成物は、吸入されてよい（例えば、具体的に参考として援用される米国特許第６，６５１，６５５号）。本発明のキメラＶＬＰ含有組成物を、ＶＬＰが腫瘍微小環境中に導入されるように、腫瘍に直接投与するか、腫瘍近傍に投与することもできる。かかる組成物は、通常、生理学的に許容され得る担体、緩衝液、または他の賦形剤を含む薬学的に許容され得る組成物として投与されるであろう。組成物の投薬量は、投与経路に依存し、例えば、被験体のサイズおよび健康ならびに容態の重症度に応じて変動するであろう。
【０１４０】
一般に、本発明のキメラＶＬＰ含有組成物を、任意の潜在的な毒性を最小にしながら最適な有効性を得るための日常的試験によって定義された適切な投薬量で、単独でまたは他の治療剤と併せて使用できる。他の治療剤は、例えば、化学療法剤およびチェックポイント阻害剤を含むが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物を利用する投薬レジメンを、種々の要因（患者のタイプ、種、年齢、体重、性別、病状；処置すべき容態の重症度；意図する処置の目的（症状の緩和対治癒）；投与経路；患者の腎臓および肝臓の機能；ならびに使用される特定の医薬組成物、および特定の組成物の効力、安定性、および毒性を含む）にしたがって選択できる。医師は、容態（例えば、腫瘍／癌）を予防するか、反撃するか、進行を停止させるのに必要な医薬組成物（および治療剤を含む他の薬剤も可能）の有効量を容易に決定し、処方できる。
【０１４１】
最小の毒性で最大の有効性が得られる範囲内の治療レジメンの濃度を得るために精度を最適にするには、１つまたは複数の標的部位に対して利用可能な医薬組成物の動態学に基づくレジメンが必要であり得る。処置レジメンの最適濃度を決定する場合、医薬組成物の分布、平衡、および排出を考慮することができる。所望の効果を達成するために組み合わせる場合、本明細書中に開示の医薬組成物の投薬量を調整できる。他方では、医薬組成物および種々の治療剤の投薬量を独立して最適化し、相乗効果を得るために組み合わせることができ、ここで、いずれかを単独で使用した場合よりも病態が軽減される。
【０１４２】
特に、医薬組成物の毒性および治療有効性を、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が死亡する用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定するための細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定できる。毒性効果と治療効果の間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として示すことができる。組成物の細胞傷害性が望ましい活性または治療結果である場合を除き、治療指数の大きな医薬組成物が好ましい。中毒性副作用を示す医薬組成物を使用できるが、送達系は、非感染細胞への潜在的損傷を最小にしそれにより副作用を軽減するために、かかる組成物を罹患組織部位に向かわせることができる。一般に、本発明の医薬組成物を、有効性を最大にし、かつ毒性を最小にする様式で投与できる。
【０１４３】
多くの場合、ＶＬＰ含有組成物を、通常は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５回、もしくはそれを超える回数（その間の全ての範囲を含む）を最大とするか、下らないか、超えないワクチン接種で、複数回投与することが望ましいであろう。ワクチン接種は、通常、１、２、３、４、５、６、５〜６、７、８、９、１０、１１〜１２週間／月／年間隔で（これらの間の全ての値および範囲を含む）、より通常には、３〜５週間の間隔であろう。
【０１４４】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒトで用いる投薬量範囲の処方において使用できる。かかる組成物の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないか全く無いＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にある。投薬量は、使用した投薬形態および利用した投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。本発明の方法で使用される任意の組成物について、治療有効用量を、細胞培養アッセイから最初に推定できる。動物モデルにおける用量を処方して、細胞培養で決定したＩＣ５０（症状の最大半量の阻害を達成する試験組成物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成できる。かかる情報を使用して、ヒトにおける有用な用量を正確に決定できる。血漿レベルを、例えば、高速液体クロマトグラフィによって測定できる。
【０１４５】
処方の際、溶液を、投薬製剤に適合する様式および治療または予防に有効な量などで投与するであろう。製剤は、種々の投薬形態（本明細書中に記載の注射液タイプなど）で容易に投与される。
【０１４６】
本発明の別の態様は、本発明の処置のためのキットである。１つの実施形態では、キットは、バイアルおよび任意選択的な投与法を説明した添付文書を含み、バイアルは、本発明の方法にしたがって投与するためのキメラＶＬＰ含有組成物を含む。
【０１４７】
本明細書中に記載の任意の組成物を、キット中に含めることができる。非限定的な例において、ＶＬＰの調製および／またはＶＬＰを用いたワクチン接種によるＶＬＰの投与を準備するための試薬を、キット中に含めることができる。キットは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方におけるＶＬＰの活性を査定するための試薬をさらに含み得る。したがって、キットは、適切な容器中にＶＬＰ組成物を含むであろう。ある態様では、キットは、投与のための試薬および／またはデバイス（例えば、シリンジ、吸入器、またはネブライザー）を含み得る。キットはまた、投与のための組成物を調整するための１つまたは複数の緩衝液、化合物、またはデバイスを含み得る。
【０１４８】
キットの構成要素を、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかで包装できる。キットの容器手段は一般に、その中に組成物を配置でき、好ましくは、適切に等分できる少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段を含むであろう。キット中に１つを超える構成要素が存在する場合、キットはまた一般に、その中にさらなる構成要素を個別に配置できる第２の、第３の、または他のさらなる容器を含むであろう。しかし、構成要素の種々の組み合わせをバイアル中に含めることができる。本発明のキットはまた典型的には、市販のために厳重に閉じ込められる容器を含めるための手段を含むであろう。かかる容器は、所望のバイアルが保持される射出成形または吹込み成形されたプラスチック容器を含み得る。
【０１４９】
キットの構成要素を１つおよび／または複数の溶液で提供する場合、溶液は水溶液であり、滅菌水溶液が特に好ましい。しかし、キットの構成要素を、乾燥粉末（複数可）として提供できる。試薬および／または構成要素を乾燥粉末として提供する場合、粉末を、適切な溶媒の添加によって再構成できる。溶媒を別の容器中で提供できることも想定される。キットはまた、キットの構成要素の使用説明書を含んでよく、キットに含まれない任意の他の試薬の使用説明書も含んでよい。説明書は、実施できるバリエーションを含み得る。かかる試薬が本発明のキットの実施形態であることが意図される。
【０１５０】
しかし、かかるキットは、上記で確認した特定の品目に制限されず、本発明のキメラＶＬＰ組成物の調製および／または投与のために使用される任意の試薬を含み得る。
【０１５１】
様々な用途の中でも特に、本発明のキットを、実験で使用できる。当業者は、本発明の方法の実施に適切なキットの構成要素を認識するであろう。
【０１５２】
以下の実施例は、限定としてではなく例示として提供される。本発明の意図から逸脱することなく様々な修正を行うことができ、この修正は当業者に容易に知られると理解される。
【０１５３】
実施例
実施例Ｉ．ＶＬＰの産生
Ａ．ＨＰＶＬ１タンパク質のバキュロウイルス発現およびＶＬＰの産生。ＨＰＶ粒子（ＶＬＰ）を、当該分野で公知の方法によって産生する。簡潔に述べれば、ＨＰＶ粒子を、昆虫細胞中で、パピローマウイルス主要キャプシドＬ１タンパク質を発現する組換えバキュロウイルスから産生する。Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標））細胞またはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ＳＦ９細胞）に、無血清条件下のＥｘｐｒｅｓｓ  Ｆｉｖｅ培地またはＳＦ９００−ＩＩＩ培地（無血清培地）中で、高力価組換えバキュロウイルスを感染させる。２７℃で９６時間のインキュベーション後、細胞を回収し、細胞ペレットを、プロテアーゼインヒビターを含む抽出緩衝液（２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に再懸濁する。凍結融解によって粒子を放出させる。高塩活性ヌクレアーゼの存在下でのインキュベーションによって核酸を消化する。ライセートを、８，０００×ｇで３０分間の遠心分離によって清澄化し、Ｖｅｒｔｒｅｌ抽出によって脱脂する。清澄化したライセートを、４０％スクロースのクッション上にロードし、ＳＷ−２８ローター中にて２７，０００ｒｐｍ、４℃で９０分間遠心分離する。ペレットを、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、および０．０３％Ｔｗｅｅｎ８０に再懸濁し、４℃で保存する。ナノ粒子調製物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定し、粒子の形態を、電子顕微鏡法（ＥＭ）によって決定する。典型的な調製物の純度は９０％超であり、ＥＭによると完全に組み立てられたキャプシド様の５０ｎｍ粒子のようである。
【０１５４】
ＨＰＶ粒子をまた、当該分野で公知の方法によって哺乳動物細胞中で産生させる。簡潔に述べれば、コドン最適化パピローマウイルスＬ１のみまたはＬ１およびＬ２のキャプシド遺伝子を、２９３ＴＴ細胞（ＳＶ４０ラージＴ抗原でトランスフェクトしたヒト胚腎臓細胞（Ｐａｓｔｒａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４））中に同時トランスフェクトする。Ｌ１および／またはＬ１／Ｌ２発現ベクターで同時トランスフェクトした細胞を、２４時間維持し、次いで、回収する。簡潔に述べれば、ＨＰＶ粒子を、界面活性剤での溶解によって２９３ＴＴ細胞から放出させる。細胞ライセートを、３７℃で一晩インキュベートする。成熟したＨＰＶ粒子を、ライセートへの塩化ナトリウムの添加によって可溶化し、ライセートを低速遠心分離によって清澄化する。キャプシドを、高塩抽出およびその後の製造者の説明書にしたがうＯｐｔｉｐｒｅｐ（イオジキサノール）段階勾配による超遠心分離によって細胞デブリおよび界面活性剤から分離する。調製物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定し、粒子の形態を、電子顕微鏡法（ＥＭ）によって決定する。典型的な調製物の純度は９０％超であり、ＥＭによると完全に組み立てられたキャプシド様の５０ｎｍ粒子のようである。
【０１５５】
ＨＰＶ粒子をまた、２９３ＥＸＰＩ細胞中へのパピローマウイルスＬ１のみまたはＬ１およびＬ２のキャプシド遺伝子のトランスフェクションを介して産生する。Ｌ１および／またはＬ１／Ｌ２発現ベクターで同時トランスフェクトした細胞を、７２時間維持し、次いで、回収する。ＨＰＶ粒子を、界面活性剤での溶解によって２９３ＥＸＰＩ細胞から放出させ、ライセートを、中性界面活性剤（例えば、Ｂｒｉｊ５８またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００）と３７℃で一晩インキュベートする。次いで、一晩インキュベートしたライセート中の粒子を、塩化ナトリウムの添加によって可溶化する。次いで、ライセートを、低速遠心分離によって清澄化する。キャプシドを、高塩抽出およびその後の製造者の説明書にしたがうＯｐｔｉｐｒｅｐ（イオジキサノール）段階勾配による超遠心分離によって細胞デブリおよび界面活性剤から分離する。ナノ粒子調製物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定し、粒子の形態を、電子顕微鏡法（ＥＭ）によって決定する。典型的な調製物の純度は９０％超であり、ＥＭによると完全に組み立てられたキャプシド様の５０ｎｍ粒子のようである。
【０１５６】
Ｂ．ＨＰＶ  ＶＬＰへの標的ペプチドの付着
末端システイン、配列ＦＭＹＳＤＦＨＦＩ（配列番号１３６）（インフルエンザ）、またはＧＩＬＧＦＶＦＴＬ配列番号１１９（インフルエンザ）、またはＫＬＷＥＳＰＱＥＩ（配列番号６）（麻疹）、またはＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ（配列番号６９）（ＨｅｐＢ）、またはＳＬＰＲＳＲＴＰＩ（配列番号２１８）（水痘ウイルス）またはＳＡＰＬＰＳＮＲＶ（配列番号２１９）（水痘ウイルス）を有するＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの１つ、およびシステインとＴ細胞エピトープの間の酵素切断部位（例えば、ＲＲＲＲまたはＲＶＫＲ）を含む標的ペプチドを含むキメラＶＬＰ（例えば、Ｃ−ＲＲＲＲ−エピトープ）を、マレイミド抱合を介する実施例１．ＡのＨＰＶ１６（Ｋ）−Ｌ１  ＶＬＰへの標的ペプチドの抱合によって調製する。簡潔に述べれば、Ｌ１タンパク質濃度１４ｍＭにて５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．４）中のＨＰＶ  ＶＬＰを、市販のヘテロ二官能性架橋剤４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ｓＳＭＣＣ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｒｏｃｋｆｏｒｔ，ＩＬ）と、最終ｓＳＭＣＣ／Ｌ１タンパク質（ｍｏｌ／ｍｏｌ）比約１００まで混合する。反応を２〜８℃で１時間進行させ、次いで、１０ｍＭヒスチジン、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５％ポリソルベート８０を含むｐＨ６．２の緩衝液に対する透析によって脱塩して、ｓＳＭＣＣ活性化ＨＰＶ  ＶＬＰを生成する。マレイミド当量を、ＤＴＮＢアッセイ（Ｆａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００４）Ｖｏｌ．２２：２９９３−３００３；Ｉｏｎｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．９５（１）：７０−７９（Ｊａｎ．２００６）を参照のこと）によって決定する。標的ペプチドをＮ２スパージ緩衝液に溶解し、各々をｓＳＭＣＣ活性化ＨＰＶ  ＶＬＰとチオ／マレイミド（ｍｏｍ／ｍｏｌ）比約３まで混合する。反応を２〜８℃で約１５時間進行させる。次いで、両方の試料を、β−メルカプトエタノールで処理して、任意の過剰なマレイミドをクエンチする。最後に、試料を、０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０１５％ポリソルベート８０に対して透析する（Ｄｉｓｐｏｄｉａｌｙｓｅｒ  ＭＷＣＯ  ３０００００  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＣＡ）。
【０１５７】
実施例２．ＢＭＤＣおよびマクロファージによるサイトカインのＶＬＰ誘導
標的ペプチドを含む実施例１のキメラＨＰＶ  ＶＬＰ（２０μｇ）、または標的ペプチドを含まないＨＰＶ  ＶＬＰ（２０μｇ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、２０μｌ）を、骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ、１０６細胞／ウェル）および初代マクロファージのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中に添加する。ＢＭＤＣおよびマクロファージは、Ｃ５７ＢＬ６マウスから採取される。３７℃で２４時間の培養後、細胞培養物から上清を採取し、サイトカインプロフィールを、マウス３２ｐｌｅｘ  ｌｕｍｉｎｅｘ  Ａｓｓａｙを使用して定量する。
【０１５８】
結果：標的ペプチドを含むか含まないＶＬＰに曝露したＢＭＤＣおよびマクロファージは、ＰＢＳのみに曝露した対照のＢＭＤＣおよびマクロファージと比較して、高レベルの炎症促進性サイトカインを産生する。
【０１５９】
実施例３．Ｔ細胞と共培養したＢＭＤＣによるサイトカイン産生のＶＬＰ誘導
ＢＭＤＣを、上記の実施例１に記載のように産生させた標的ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）、ＨＰＶ１６（Ｋ）−Ｌ１  ＶＬＰ（１０μｇ／ｍｌ）、またはｒＩＦＮ−γ（１０００Ｕ／ｍｌ）を含むキメラＶＬＰの存在下で、高度に精製した同系Ｔ細胞（比１：１）と共に３７℃で４８時間共培養する。対照として、ＢＭＤＣを、培地のみで培養するか、Ｔ細胞の非存在下での実施例１のキメラＶＬＰ（１０μｇ／ｍｌ）、ＨＰＶ１６（Ｋ）−Ｌ１  ＶＬＰ（１０μｇ／ｍｌ）、またはｒＩＦＮ−γの存在下で培養する。各々の培養条件を、少なくとも２連で実施する。標準的な手順を使用して、各々の培養条件についてのＩＬ−１２ｐ７０産生を決定する。
【０１６０】
実施例４．ＶＬＰはｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞を結合する
Ａ．方法：ＳＨＩＮ−３  ＤＳＲ卵巣腫瘍を担持するか担持しないマウスに、１００μｌ  ＰＢＳまたは１％ｉ−カラギーナン（カラギーナンは細胞へのＨＰＶ結合を阻害する）を含むＰＢＳ中の１×１０８ＩＵのＨＰＶ１６−Ｌｕｃ（ルシフェラーゼ）偽ウイルス（ｐｓｕｅｄｏｖｉｒｕｓ）（ＰｓＶ）（Ｂｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，（２００４），７８：７５１−７５７またはＨｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２０１２）；７（７）：ｅ４０９８３（本明細書中で参考として援用される）に記載のように調製）を腹腔内注射する。４８時間後、ルシフェリン基質を投与し、生物発光を測定する。腹膜腔周囲の目的の領域を抜き取り、平均放射輝度を計算する。全てのデータは、ｎ＝５／群の代表値である。
【０１６１】
結果：ＨＰＶ１６−Ｌｕｃ  ＰｓＶは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＳＨＩＮ−３  ＤＳＲ卵巣腫瘍に結合する。
【０１６２】
Ｂ．方法：免疫不全動物のみで継代したヒト卵巣腫瘍を、マウスに皮下移植する。腫瘍の直径が７ｍｍと１５ｍｍの間に到達したとき、動物に、５０μｌ  ＰＢＳまたは５０μｌのＨＰＶ１６−Ｌｕｃ  ＰｓＶ（約１μｇ／ｕｌ）を腫瘍内注射する。腫瘍を担持しない動物の後側腹部に、５０μｌ  ＰＢＳまたは５０μｌ  ＨＰＶ１６−Ｌｕｃ  ＰｓＶ（およそ１μｇ／ｕｌ）を皮下注射する。発光画像を、ＨＰＶ−１６／ＬｕｃＰｓＶ注射の翌日に記録する。積分時間２分を、発光画像収集のために使用する。発光値を、平均放射輝度として報告する。
【０１６３】
結果：ＨＰＶ１６−Ｌｕｃ  ＰｓＶは、ｉｎ  ｖｉｖｏで樹立異種移植片ヒト卵巣腫瘍を結合して感染させるが、健康な組織を結合しない。
【０１６４】
実施例５．腫瘍微小環境のＶＬＰ免疫調節
方法：１〜８日目の各々に、標的ペプチドを含むか含まない１００μｇの実施例１のＨＰＶ  ＶＬＰを、腫瘍担持マウスに投与する。対照として、１〜８日目の各々に、腫瘍担持マウスに１００μｌのＰＢＳを投与する。
【０１６５】
最後の注射から２４時間後（９日目）に、マウスを屠殺し、腫瘍を採取し、ホモジナイズする。上清を回収し、マウス３２ｐｌｅｘ  ｌｕｍｉｎｅｘ  Ａｓｓａｙを使用したサイトカインプロファイリングに供する。
【０１６６】
結果：実施例１のＶＬＰで処置したマウスの腫瘍は、ＰＢＳで処置したマウスの腫瘍と比較して、高いレベルの炎症促進性サイトカインおよび化学誘引物質を示す。
【０１６７】
実施例６．腫瘍微小環境のＶＬＰ免疫調節
方法：１〜８日目の各々に、ＨＰＶ  ＶＬＰおよび各々の実施例１のキメラＶＬＰ（１００μｇ）を、腫瘍担持マウス群に投与する。対照として、１〜８日目の各々に、腫瘍担持マウスに１００μｌのＰＢＳを投与する。
【０１６８】
２４時間後（９日目）に、マウスを屠殺し、腫瘍を採取し、単一細胞懸濁液へと分離する。赤血球を、ＲＢＣ溶解緩衝液を使用して懸濁液から除去する。フローサイトメトリーを、ＣＤ４５、ＭＨＣ  ＩＩ、ＣＤ８６、ＣＤ１１ｂ、Ｆ４／８０、およびＬｙ６Ｇに特異的な抗マウス抗体を用いるＢＤ  Ｆａｃｓｃａｌｉｂｅｒを使用して行い、腫瘍の細胞組成を比較する。
【０１６９】
結果：標的ペプチドを含むか含まない実施例１のＶＬＰの投与は、ＰＢＳで処置したマウス由来の腫瘍と比較して、腫瘍免疫細胞の組成の劇的な変化を誘導する。
【０１７０】
実施例７．ＶＬＰ免疫療法は、全身性の永続的な抗腫瘍免疫を誘導する。
方法：ＨＰＶ  ＶＬＰおよび各々の実施例１のキメラＶＬＰ（１００μｇ）を、マウスのＢ１６Ｆ１０黒色腫に直接注射した。腫瘍壊死中心が腫瘍内に迅速に形成し、いくらかの処置マウスは腫瘍を完全に排除する。
【０１７１】
腫瘍を完全に排除したマウスを、それらの原発腫瘍の完全な消失が確認された４週間後に、それらの反対側の側腹部中にＢ１６Ｆ１０細胞を注射することによって再度誘発する。キメラＶＬＰの腫瘍内注射による原発性Ｂ１６Ｆ１０側腹部腫瘍が以前に治癒したマウスは、二次再誘発に対する耐性が増加する。これは、キメラＶＬＰナノ粒子を用いた原発腫瘍の直接注射がＢ１６Ｆ１０腫瘍に対する防御的全身免疫応答を誘導することを示す。
【０１７２】
結果：標的ペプチドを含むキメラＶＬＰは、全身性の永続的な抗腫瘍免疫を誘導する
【０１７３】
実施例８．キメラＶＬＰは、無関係のＴ細胞免疫を腫瘍に再指向させ、排除を促進できる
方法：ルシフェラーゼを過剰発現するマウスＩＤ８卵巣癌細胞株を、オボアルブミンペプチドエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２０）に特異的なＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養するであろう。次いで、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２０）含有標的ペプチドを含むか含まないＶＬＰを、共培養物に添加するであろう。
【０１７４】
結果：細胞死（減少したルシフェラーゼシグナルの形態で）は、ＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞およびマウスＩＤ８卵巣癌細胞株と共培養した標的ペプチドを含まないＶＬＰでは起こらないと考えられる。対照的に、減少したルシフェラーゼシグナルの形態での腫瘍細胞死は、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２０）含有標的ペプチドを含むキメラＶＬＰ（「ＯＶＡ−キメラＶＬＰ」）を投与されたＩＤ８／ＯＴ−１  Ｔ細胞同時培養物において認められると考えられる。
【０１７５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ法：１０週齢の卵巣腫瘍担持Ｃ５７／ＢＬ６マウスを、マウスへのＩＤ８マウス卵巣癌細胞株の注射によって作出する。１００μｇのＯＶＡ−キメラＶＬＰを、各々のマウスにｉ．ｐ注射する。対照は、（ａ）標的ペプチドを含まない１００μｇ／マウスの実施例１のＶＬＰをｉ．ｐ注射したマウス、および（ｂ）１００μｇ／マウスの実施例１のキメラＶＬＰをｉ．ｐ注射したマウスである。ＶＬＰを、マウスに４週間にわたって毎週投与し、２．５×１０６個の上記ＯＴ−１のＣＤ８＋Ｔ細胞を、マウスに２回（すなわち、１週間おきに１回）腹腔内注射する。全てのマウスを、生存について観察する。各々の群のマウスの少数のマウスを、ＶＬＰでの最後の処置から１週間後に屠殺する。卵巣腫瘍を、肉眼による組織学および浸潤Ｔ細胞についての測定のために採取する。
【０１７６】
結果。ＯＶＡ−キメラＶＬＰで処置したマウスの腫瘍は、標的ペプチドを含まないＶＬＰで処置したマウスの腫瘍および実施例１のキメラＶＬＰで処置したマウスの腫瘍より小さな腫瘍塊を有すると考えられる。腫瘍浸潤リンパ球を、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２０）負荷Ｈ−２Ｋｂ四量体染色を用いて、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２０）に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞について査定する。総ＴＩＬ中のＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２０）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率（平均±ＳＤ）も分析する。
【０１７７】
実施例９．キメラＶＬＰは、無関係のヒト小児期ワクチンＴ細胞免疫を腫瘍に再指向させることができる
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１（ＡＡＤ）トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウス群に、１／１０の用量の実施例１のキメラＶＬＰを１週間間隔で３回皮下注射した。マウスを最後の免疫化の１週間後に安楽死させ、脾臓細胞を回収して、免疫蛍光染色およびインターフェロン−γＣＤ＊＋Ｔ細胞活性化アッセイによりＦＭＹＳＤＦＨＦ（配列番号１３６）、ＫＬＷＥＳＰＱＥＩ（配列番号６）、またはＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ（配列番号６９）、またはＳＬＰＲＳＲＴＰＩ（配列番号２１８）またはＳＡＰＬＰＳＮＲＶ（配列番号２１９）ペプチドを用いて、ＨＬＡ−Ａ２拘束性小児期ワクチン抗原特異的応答について分析する。ワクチン接種スケジュールの終了後、脾細胞を、ＦＭＹＳＤＦＨＦ（配列番号１３６）、ＫＬＷＥＳＰＱＥＩ（配列番号６）、またはＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ（配列番号６９）、またはＳＬＰＲＳＲＴＰＩ（配列番号２１８）またはＳＡＰＬＰＳＮＲＶ（配列番号２１９）を含む標的ペプチドを含む実施例１のキメラＶＬＰと共培養し、免疫蛍光染色およびインターフェロン−γＣＤ＊＋Ｔ細胞活性化アッセイを利用してＴ細胞の再活性化について査定する。裸のＶＬＰ（すなわち、標的ペプチドを含まないＶＬＰ）を対照として使用する。ＶＬＰの結合および抗腫瘍効果を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を測定するための発光画像化を介して試験する。いくつかのルシフェラーゼ発現ＨＬＡ−Ａ２陽性腫瘍株（ＩＤ８／Ａ２（卵巣）、Ｂ１６／Ａ２（黒色腫）、ＴＣ−１／Ａ２（子宮頸癌）など）を、キメラＶＬＰをワクチン接種したＨＬＡ−Ａ＊０２０１（ＡＡＤ）トランスジェニックマウス由来の脾細胞と共培養する。これらの腫瘍細胞株は標的ペプチドのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープと抗原的に関係がないので、腫瘍の死滅は認められない。同様に、裸のＶＬＰの添加は、腫瘍死滅効果を全く持たないか殆ど無い。
【０１７８】
結果：ＦＭＹＳＤＦＨＦ（配列番号１３６）、ＫＬＷＥＳＰＱＥＩ（配列番号６）、またはＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ（配列番号６９）、ＳＬＰＲＳＲＴＰＩ（配列番号２１８）またはＳＡＰＬＰＳＮＲＶ（配列番号２１９）を含む標的ペプチドを含む実施例１のキメラＶＬＰのこの共培養物中への添加は、腫瘍を脾臓細胞培養物中の細胞傷害性Ｔ細胞による死滅に対し感受性にすると考えられる。
【０１７９】
実施例１０．キメラＶＬＰは、腫瘍排除のために無関係のヒト小児期ワクチンＴ細胞免疫を腫瘍に再指向させることができる。
方法：腫瘍の樹立：ＨＬＡ−Ａ＊０２０１（ＡＡＤ）トランスジェニックマウスに、ルシフェラーゼ発現ＩＤ８／Ａ２腫瘍細胞を腹腔内（ＩＰ）注射する。
【０１８０】
小児期ワクチン応答の生成：腫瘍細胞注射後、実施例８に記載のように、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１（ＡＡＤ）トランスジェニックマウスに、１／１０のインフルエンザウイルス、麻疹、Ｂ型肝炎、または水痘のためのヒト小児期ワクチンを用いて１週間間隔で能動的に免疫化する。ワクチンの抗原成分は、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープＦＭＹＳＤＦＨＦＩ（配列番号１３６）（インフルエンザ）、またはＧＩＬＧＦＶＦＴＬ  配列番号１１９（インフルエンザ）、またはＫＬＷＥＳＰＱＥＩ（配列番号６）（麻疹）、またはＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ（配列番号６９）（ＨｅｐＢ）、またはＳＬＰＲＳＲＴＰＩ（配列番号２１８）（水痘ウイルス）またはＳＡＰＬＰＳＮＲＶ（配列番号２１９）（水痘ウイルス）を含む。実施例８に記載のように、各マウス群を部分集団に分け、安楽死させて特徴づけを行い、小児期ワクチンに対する既存の免疫の樹立を確認する。
【０１８１】
処置および抗腫瘍効果の分析：腫瘍担持マウスに、キメラＶＬＰ、または裸のＶＬＰ（標的ペプチドを含まない）（１００μｇ／マウス）を毎週１回にて３回腹腔内注射した。無処置マウスを対照とする。腫瘍成長を、発光画像化によってモニタリングする。
【０１８２】
結果：キメラＶＬＰで処置された腫瘍担持マウスは、裸のＶＬＰを投与したマウスおよび対照マウスについて得た治療的抗腫瘍効果を超える治療的抗腫瘍効果を示すと考えられる。具体的には、キメラＶＬＰは標的ペプチドのＴ細胞エピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を腫瘍に再指向させ、腫瘍の成長を阻害し、場合によっては、腫瘍を消失させることができ、一方で、裸のＶＬＰをｉ．ｐ．注射した対照マウスまたはＶＬＰを全く投与しなかった対照マウスは、キメラＶＬＰのＴ細胞エピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を再指向させないと考えられる。裸のＶＬＰをｉ．ｐ．注射した対照マウスまたはＶＬＰを全く投与しなかった対照マウスでは、標的ペプチドを含むキメラＶＬＰを用いた場合よりも腫瘍の成長の阻害および腫瘍の消失がはるかに小さいと考えられる。
【０１８３】
実施例１１．エピトープ抱合ＶＬＰのデザインおよび合成
ＶＬＰを、実施例１に本質的に記載されるように、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標））細胞で産生させた。簡潔に述べれば、ＶＬＰを、本発明者らのキメラパピローマウイルスＬ１遺伝子を発現する組換えバキュロウイルスを感染させたＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標））細胞で産生させた。ＶＬＰを、４０％スクロース遠心分離、その後の別ラウンドのＣｓＣｌ段階勾配での精製を使用して精製した。ＶＬＰ調製物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定し、粒子の形態を、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって査定する。典型的な調製物の純度は９０％超であり、ＴＥＭによると完全に組み立てられたキャプシド様の５０ｎｍ粒子のようである（図２、左側のパネルのＴＥＭ）。標的ペプチド（ＦＭＹＳＤＦＨＦＩ（配列番号１３６）（インフルエンザ）、またはＧＩＬＧＦＶＦＴＬ  配列番号１１９（インフルエンザ）、またはＫＬＷＥＳＰＱＥＩ（配列番号６）（麻疹）、またはＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ（配列番号６９）（ＨｅｐＢ）、またはＳＬＰＲＳＲＴＰＩ（配列番号２１８）（水痘ウイルス）またはＳＡＰＬＰＳＮＲＶ（配列番号２１９）（水痘ウイルス））を、ポリカチオン性の（Ｎ末端マレイミド−Ａｒｇ４ＲＶＫＲ−エピトープ）１７量体ペプチドであるａｋａ  ＭＡＬ−ペプチドとして純度８５％超に合成した。抱合のために、空の非抱合ＶＬＰを、ＴＣＥＰ（６８μＭ、最終）を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ反応緩衝液と共に還元条件下に供した（ＴＣＥＰ：ＶＬＰタンパク質（ｍｏｌ：ｍｏｌ）＝１０：１）。混合物（体積＝６２５μｌ）を、１５分毎に２１℃で１時間穏やかに撹拌した。１時間の還元後、反応緩衝液中のＭＡＬ−ペプチド（１７０μＭ、６２５μｌ）を、ＴＣＥＰ前処理ＶＬＰ中に、ペプチド：ＲＧ−１タンパク質比（ｍｏｌ：ｍｏｌ）＝２５：１まで添加した。混合物を、約２５０ｒｐｍにて２１℃で１時間穏やかに撹拌し、その直後に精製プロセスに進んだ。抱合後、抱合されたＶＬＰを含む組成物を、ＰＢＳ（ｐＨ７）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ中で透析し、その後にダイアフィルトレーション工程を行って過剰なペプチドを除去した。抱合されたＶＬＰ（「ＡＩＲ  ＶＬＰ」）を、ＴＥＭによって分析した。複数のＡＩＲ  ＶＬＰバッチのＴＥＭの結果は一貫しており、空の非抱合ＶＬＰ（５０ｎＭ）と比較して、わずかに大きなＶＬＰ（６０〜７０ｎＭ）を示した。ＡＩＲ−ＶＬＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析と併せたこの結果は、抱合したＶＬＰへのペプチドの結合量が多いことを示している。この抱合プロセスを異なるＶＬＰに対して実施でき、図３で認められるように、多数の異なる種類の小児期ワクチンエピトープに抱合されたＨＰＶ１６ＲＧ−１  ＶＬＰおよび野生型ＨＰＶ１６  ＶＬＰを形成するためにこの抱合プロセスを行った。図３は、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、および水痘ウイルス由来のエピトープに抱合されたＨＰＶ１６ＲＧ−１  ＶＬＰ（左パネル）または野生型ＨＰＶ１６Ｌ１ＶＬＰ（右パネル）のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析である。
【０１８４】
実施例１２．異なるＶＬＰによる腫瘍特異的結合
本明細書中に記載のキメラＶＬＰの広範な腫瘍結合能力を確認するために、マウスの子宮頸癌（ＴＣ−１）、卵巣癌（ＩＤ８）、乳癌（４Ｔ１）、および黒色腫（Ｂ１６）細胞株をｉｎ  ｖｉｔｒｏにて０．３μｇ／ｍｌのキメラＶＬＰで２４時間処置し、細胞を腫瘍結合ＶＬＰの存在について染色し、次いで、フローサイトメトリー分析によって染色した細胞を分析した。
【０１８５】
図４は、全ての試験した腫瘍細胞株へのＶＬＰ結合を実証する細胞集団のシフトを示す。図４の上の行は、種々の腫瘍細胞株への空のＨＰＶ１６  ＲＧ−１  ＶＬＰ結合の結果を示し、下の行は、Ｌ１ループの１つに組換えによって挿入されたペプチドを有するウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）ＶＬＰの結果を示す。
【０１８６】
ＶＬＰの腫瘍結合能力がＶＬＰ表面上のペプチドの抱合によって損なわれないことを実証するために、本発明者らは、抱合したＶＬＰを使用して上記の腫瘍結合研究を繰り返した。非抱合ＶＬＰを用いて得た結果と一致して、抱合ＡＩＲ−ＶＬＰは、腫瘍細胞への結合能力を維持していた（図５を参照のこと）。
【０１８７】
実施例１３．抱合ＶＬＰによる抗原特異的抗腫瘍免疫の再指向は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合、ＣＤ８＋エピトープの負荷、およびコーティングしたエピトープ特異的ＣＴＬによる抗腫瘍死滅を誘導する
抗腫瘍免疫リダイレクターとしての本明細書中に記載の抱合ＶＬＰの可能性を評価するために、本発明者らは最初に、モデル抗原ＯＶＡ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ、配列番号２２０）を使用した。本発明者らは、フューリン切断部位を有するこのマウスＨ２−ＫＢ拘束ＯＶＡエピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ、配列番号２２０）をＨＰＶ１６ＲＧ−１  ＶＬＰに抱合してキメラＶＬＰ（ＡＩＲ−ＶＬＰ）を生成した。次いで、腫瘍細胞を、種々の量（濃度１．００ｐＭ〜０．０２ｎＭ）のＡＩＲ−ＶＬＰまたは対照ＶＬＰ（空のＶＬＰ、非抱合ＶＬＰ、または偽ＡＩＲ  ＶＬＰ（非抱合ＶＬＰおよびＶＬＰに抱合されないペプチドの組成物）など）とｉｎ  ｖｉｔｒｏで２４時間インキュベートし、次いで、処置した腫瘍細胞を１×１０５個のＯＴ１特異的ＣＴＬとインキュベートした。ＯＴ−１特異的ＣＴＬ活性化を、表面ＣＤ８および細胞内ＩＦＮ−γ染色、その後のフローサイトメトリー分析を介して査定した。有意により多くのＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞がＡＩＲ−ＶＬＰ処置腫瘍細胞とのインキュベーション後に検出され、これはＡＩＲ−ＶＬＰ処置が非ＯＶＡ発現腫瘍細胞をＯＶＡペプチドで首尾よくコートしたことを示し、その後ＯＴ−１特異的ＣＴＬによる認識およびその活性化をもたらす（図６を参照のこと）。
【０１８８】
ウイルスＣＤ８＋エピトープに抱合されたＶＬＰの抗腫瘍免疫リダイレクターとしての可能性を評価するために、本発明者らは、マウスＨ２−ＤＢ拘束ＨＰＶ１６−Ｅ７エピトープ（ａａ４９〜５７）を、フューリン切断部位を有するウシパピローマウイルスＶＬＰに抱合して、キメラＶＬＰ−Ｒ−Ｅ７を生成した。次いで、本発明者らは、ＩＤ８腫瘍細胞を、０．３μｇ／ｍｌの空の非抱合ＶＬＰまたはキメラＶＬＰ−Ｒ−Ｅ７とｉｎ  ｖｉｔｒｏで２４時間インキュベートし、次いで、処置した腫瘍細胞を２×１０５個のＥ７ａａ４９−５７特異的ＣＴＬとインキュベートした。
【０１８９】
Ｅ７特異的ＣＴＬ活性化を、表面ＣＤ８および細胞内ＩＦＮ−γ染色、その後のフローサイトメトリー分析を介して査定した。有意により多くのＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞がキメラＶＬＰ−Ｒ−Ｅ７処置ＩＤ８腫瘍細胞とのインキュベーション後に検出され、これは、キメラＶＬＰ−Ｒ−Ｅ７処置が非Ｅ７発現ＩＤ８腫瘍細胞をＥ７ペプチドで首尾よくコートしたことを示し、その後にＥ７特異的ＣＴＬによる認識およびその活性化をもたらす（図７を参照のこと）。
【０１９０】
キメラＶＬＰ誘導性免疫再指向がコーティングされた腫瘍細胞の細胞傷害性の死滅を引き起こせることを実証するために、本発明者らは、腫瘍細胞へのＡＩＲ−ＶＬＰ結合がＣＴＬ放出をもたらし、それが、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞による死滅に対し腫瘍細胞をより感受性にしたことを証明した。図８に示すように、空の非抱合ＶＬＰではなくＡＩＲ−ＶＬＰのインキュベーションが、発光活性の大きな減少によって実証される、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞死により媒介される最も大量の腫瘍細胞死をもたらした（図８を参照のこと）。
【０１９１】
ＩＤ８／ｌｕｃ腫瘍細胞を、０．３μｇ／ｍｌの空の非抱合ＶＬＰまたはキメラＶＬＰ−Ｒ−Ｅ７とｉｎ  ｖｉｔｒｏで２４時間処理し、次いで、処置した腫瘍細胞を２×１０４個のＥ７ａａ４９−５７特異的ＣＴＬとインキュベートした。次いで、本発明者らは、腫瘍細胞の生存度を、ＩＤ８／ｌｕｃ生細胞によるルシフェラーゼ発現に基づく生物発光画像化を介して査定した。有意なルシフェラーゼ活性の低下が、キメラＶＬＰ−Ｒ−Ｅ７で処置し、Ｅ７特異的ＣＴＬとインキュベートしたＩＤ８腫瘍細胞について認められ、これは、処置後のＩＤ８腫瘍細胞生存度の有意な低下を示す。まとめると、このデータは、標的ペプチドと抱合されたキメラＶＬＰが腫瘍細胞をコートし腫瘍細胞の表面ＭＨＣ−Ｉに標的ペプチドを負荷し、活性化されたＣＴＬによるコーティングされた腫瘍細胞のその後の死滅をもたらす能力を実証する（図９を参照のこと）。
【０１９２】
【表１】
2020524710.tif 000003
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【０１９３】
【表２】
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2020524710.tif 000014
【０１９４】
ＨＰＶ１６（１１４Ｋ）Ｌ１タンパク質配列  配列番号２０５
【化１】
2020524710.tif 000015
2020524710.tif 000016
2020524710.tif 000017
【０１９５】
ＨＰＶ１６Ｌ１  Ｉ１１４Ｋ）核酸配列（配列番号２０６）
【化２】
2020524710.tif 000018
2020524710.tif 000019
ＨＰＶＬ２タンパク質配列（配列番号２０７）
【化３】
2020524710.tif 000020
2020524710.tif 000021
2020524710.tif 000022
【０１９６】
ＨＰＶ１６Ｌ２  核酸配列（配列番号２０８）
【化４】
2020524710.tif 000023
フューリン切断部位
Ｒ  Ｘ  Ｒ／Ｋ  Ｒ（配列番号２０９）
フューリン切断部位
Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ（配列番号２１０）
ＭＭＰ切断ペプチド基質
Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｃｉｔ  Ｇｌｙ  Ｈｏｆ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ（配列番号２１１）
ＭＭＰ切断ペプチド基質
Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ（配列番号２１２）
ＭＭＰ切断ペプチド基質
Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ（配列番号２１３）
ポリグルタミン酸ドッキング部位
ＥＥＥＥＥＥＥＥＣ（配列番号２１４）．
ポリグルタミン酸ドッキング部位
ＣＥＥＥＥＥＥＥＥＣ（配列番号２１５）．
ＥＢＮＡ３Ｃペプチドａａ  ２８４〜２９３はＨＬＡ−Ａ２．０１を結合する
ＬＬＤＲＶＲＦＭＧＶ（配列番号２１６）
ＥＢＶペプチド
（Ｋ）ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（Ｔ）（Ｖ）（配列番号２１７）
水痘ウイルス  ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ
ＳＬＰＲＳＲＴＰＩ（配列番号２１８）
水痘ウイルス  ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ
ＳＡＰＬＰＳＮＲＶ（配列番号２１９）
ＯＶＡペプチド
ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号２２０）
ＲＧ−１  ＶＬＰ配列
【化５】
2020524710.tif 000024
ＨＰＶＬ２タンパク質由来ペプチド
ＱＬＹＫＴＣＫＱＡＧ  ＴＣＰＰＤＩＩＰＫＶ（配列番号：２２２）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2020524710.tif 000029
【図６】
2020524710.tif 000030
【図７】
2020524710.tif 000031
【図８】
2020524710.tif 000032
【図９】
2020524710.tif 000033
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月21日(2020.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020524710000001.app
【国際調査報告】
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2020524710.tif 000035
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