(57)【要約】  本明細書で開示されるいくつかの実施形態は、キメラ受容体を発現する操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む組成物であって、キメラ受容体は、特定の細胞、例えば癌細胞又は感染性疾患に冒された細胞を標的にする増強された能力をＮＫ細胞に付与する、組成物に関する。いくつかの実施形態は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドを発現する細胞を標的にするＮＫ細胞であって、ＮＫ細胞が標的細胞に結合するとき、細胞傷害性及び／又は細胞溶解性効果をもたらす膜貫通及び／又はシグナル伝達ドメインを含むＮＫ細胞に関する。疾患を治療するためのＮＫ細胞組成物の使用もいくつかの実施形態において提供される。
2020512005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）の天然リガンドに結合するペプチドを含む細胞外受容体ドメインであって、
ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合する前記ペプチドは、ＮＫＧ２Ｄの断片であり、
前記ＮＫＧ２Ｄの断片は、配列番号２を含むポリヌクレオチドによってコードされる、細胞外受容体ドメイン、及び
（ｂ）膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメインであって、
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζを含み、
前記ＣＤ３ζは、配列番号１３を含むポリヌクレオチドによってコードされる、エフェクタードメイン
を含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記エフェクタードメインの前記膜貫通領域は、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記エフェクタードメインの前記膜貫通領域は、ＣＤ８ａヒンジ領域をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ＣＤ８ａヒンジ領域は、配列番号５を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢをさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記４−１ＢＢは、配列番号１２を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記キメラ受容体は、ＣＤ８ａ、４−１ＢＢ及びＣＤ３ｚに共役された前記ＮＫＧ２Ｄの断片を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記キメラ受容体は、配列番号１８の核酸配列によってコードされる、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記キメラ受容体は、配列番号１０８の核酸配列によってコードされる、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記キメラ受容体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
癌を治療するための方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされる前記キメラ受容体を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む組成物を、癌を有する対象に投与することを含む方法。
【請求項１２】
前記ＮＫ細胞は、癌又は感染性疾患を有する患者から単離された自家細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＮＫ細胞は、ドナーから単離された同種細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ＮＫ細胞の細胞傷害性の増強を、それを必要とする哺乳動物において行うための薬剤の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項１５】
癌又は感染性疾患の治療又は予防を、それを必要とする哺乳動物において行うための薬剤の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項１６】
細胞によって発現されるキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドであって、
（ａ）ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）の天然リガンドに結合するペプチドを含む細胞外受容体ドメインであって、
ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合する前記ペプチドは、ＮＫＧ２Ｄの断片であり、
前記ＮＫＧ２Ｄの断片は、配列番号２を含むポリヌクレオチドによってコードされる、細胞外受容体ドメイン、及び
（ｂ）膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメインであって、
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζを含み、
前記ＣＤ３ζは、配列番号１３を含むポリヌクレオチドによってコードされる、エフェクタードメイン
を含み、前記細胞は、膜結合性インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）をさらに含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記エフェクタードメインの前記膜貫通領域は、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインを含む、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記エフェクタードメインの前記膜貫通領域は、ＣＤ８ａヒンジ領域をさらに含む、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記ＣＤ８ａヒンジ領域は、配列番号５を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記ｍｂＩＬ１５は、配列番号１６を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
前記ｍｂＩＬ１５は、前記キメラ受容体と同じポリヌクレオチド上でバイシストロン性に発現される、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
ｍｂＩＬ１５は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記エフェクタードメインは、ＯＸ−４０ドメインをさらに含む、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、前記ＯＸ−４０ドメイン、前記ＣＤ３ζに共役された前記ＮＫＧ２Ｄの断片を含む、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記キメラ受容体は、配列番号１６によってコードされる前記ｍｂＩＬ１５に共役された配列番号９０の核酸配列によってコードされる、請求項２４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
前記キメラ受容体は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む前記ｍｂＩＬ１５に共役された配列番号９１のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
前記キメラ受容体は、ＩｇＧ４ヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、前記ＯＸ−４０ドメイン、前記ＣＤ３ζに共役された前記ＮＫＧ２Ｄの断片を含む、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
前記キメラ受容体は、配列番号１６によってコードされる前記ｍｂＩＬ１５に共役された配列番号１００の核酸配列によってコードされる、請求項２７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２９】
前記キメラ受容体は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む前記ｍｂＩＬ１５に共役された配列番号１０１のアミノ酸配列を含む、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
癌を治療するための方法であって、請求項１５〜２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされる前記キメラ受容体を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む組成物を、癌を有する対象に投与することを含む方法。
【請求項３１】
前記ＮＫ細胞は、癌を有する患者から単離された自家細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＮＫ細胞は、ドナーから単離された同種細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ＮＫ細胞の細胞傷害性の増強を、それを必要とする哺乳動物において行うための薬剤の製造における、請求項１５〜２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項３４】
癌又は感染性疾患の治療又は予防を、それを必要とする哺乳動物において行うための薬剤の製造における、請求項１５〜２９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項３５】
キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドであって、
（ａ）ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）の天然リガンドに結合するペプチドを含む細胞外受容体ドメインであって、
ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合する前記ペプチドは、ＮＫＧ２Ｄの断片であり、
前記ＮＫＧ２Ｄの断片は、（ｉ）配列番号１、（ｉｉ）配列番号２、又は（ｉｉｉ）配列番号３の断片を含むポリヌクレオチドによってコードされる、細胞外受容体ドメイン、及び
（ｂ）膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメイン
を含むポリヌクレオチド。
【請求項３６】
前記エフェクタードメインは、ＣＤ１６を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３７】
前記エフェクタードメインは、天然細胞傷害誘発受容体１（ＮＣＲ１）を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３８】
前記エフェクタードメインは、天然細胞傷害誘発受容体２（ＮＣＲ２）又は天然細胞傷害誘発受容体３（ＮＣＲ３）を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３９】
前記エフェクタードメインは、４−１ＢＢをさらに含む、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４０】
前記キメラ受容体は、ＣＤ１６に共役された前記ＮＫＧ２Ｄの断片を含む、請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４１】
前記キメラ受容体は、配列番号２３の核酸配列によってコードされる、請求項４０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４２】
前記キメラ受容体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４３】
前記キメラ受容体は、ＮＣＲ１に共役された前記ＮＫＧ２Ｄの断片を含む、請求項４０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４４】
前記キメラ受容体は、配列番号２７の核酸配列によってコードされる、請求項４３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４５】
前記キメラ受容体は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４６】
前記キメラ受容体は、配列番号２１のアミノ酸配列の少なくとも一部を含む、請求項３８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４７】
前記キメラ受容体は、ＮＣＲ３に共役された前記ＮＫＧ２Ｄの断片を含む、請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４８】
前記キメラ受容体は、配列番号２９の核酸配列によってコードされる、請求項４７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４９】
前記キメラ受容体は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む、請求項４７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５０】
前記キメラ受容体は、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン及び４−１ＢＢに共役された前記ＮＫＧ２Ｄの断片を含む、請求項３９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５１】
前記キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン及び４−１ＢＢに共役された前記ＮＫＧ２Ｄの断片を含む、請求項３９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５２】
前記キメラ受容体は、配列番号２５の核酸配列によってコードされる、請求項５１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５３】
前記キメラ受容体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５４】
前記キメラ受容体は、ＮＣＲ１及び４−１ＢＢに共役された前記ＮＫＧ２Ｄの断片を含む、請求項３９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５５】
前記キメラ受容体は、配列番号２０のＮＣＲ１アミノ酸配列を含む、請求項５４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５６】
前記キメラ受容体は、ＣＤ８ａ、４−１ＢＢ及びＣＤ３ｚに共役された前記ＮＫＧ２Ｄの断片を含む、請求項３９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５７】
前記キメラ受容体は、配列番号１８の核酸配列によってコードされる、請求項５６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５８】
前記キメラ受容体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む、請求項５６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５９】
前記キメラ受容体は、ＮＣＲ３及び４−１ＢＢに共役された前記ＮＫＧ２Ｄの断片を含み、前記ＮＣＲ３は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６０】
前記キメラ受容体は、配列番号２０のＮＣＲ１膜貫通／細胞内ドメイン又は配列番号２２のＮＣＲ３膜貫通／細胞内ドメインの１つ以上を含む、請求項３９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６１】
前記エフェクタードメインは、４−１ＢＢと、ＣＤ１６、ＮＣＲ１、ＮＣＲ３、２Ｂ４又はＮＫｐ８０の１つとの間にＧＳリンカーを含む、請求項３９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６２】
前記キメラ受容体ドメインは、ヒンジ領域を含む、請求項３５〜６１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６３】
前記ヒンジ領域は、配列番号５の核酸配列によってコードされる、請求項６２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６４】
前記ヒンジ領域は、配列番号５の核酸配列の断片によってコードされる、請求項６２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６５】
前記ヒンジ領域は、配列番号３１のアミノ酸配列を有するグリシン−セリン反復モチーフを含む、請求項６２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６６】
前記ヒンジ領域は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項６２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６７】
前記ヒンジ領域は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む、請求項６２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６８】
前記ヒンジ領域は、配列番号３４の核酸配列によってコードされる、請求項６２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６９】
前記ヒンジ領域は、βアドレナリン受容体の一部を含む、請求項６２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７０】
前記ヒンジ領域は、配列番号４０の核酸配列によってコードされる、請求項６９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７１】
前記ヒンジ領域は、配列番号４２の核酸配列によってコードされる、請求項６９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７２】
前記細胞外受容体ドメインは、ＣＤ８ａシグナルペプチドをさらに含み、前記シグナルペプチドは、配列番号４の核酸配列を含む、請求項３５〜７１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７３】
前記エフェクタードメインは、１つ以上のヘミＩＴＡＭ配列を含む、請求項３５〜７２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７４】
ヘミＩＴＡＭは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７５】
ヘミＩＴＡＭは、配列番号３７のアミノ酸配列を含む、請求項７２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７６】
前記エフェクタードメインは、１つ以上のＩＴＳＭ配列を含む、請求項３５〜７５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７７】
前記ＩＴＳＭは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項７６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７８】
前記ＩＴＳＭは、配列番号３５のアミノ酸配列を含む、請求項７６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７９】
前記エフェクタードメインは、２Ｂ４ドメインを含む、請求項７６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８０】
前記キメラ受容体は、ＧＳ３リンカー、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン及び４−１ＢＢに共役された前記ＮＫＧ２Ｄの断片を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８１】
前記キメラ受容体は、配列番号４３の核酸配列によってコードされる、請求項８０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８２】
前記キメラ受容体は、ＧＳ３リンカー、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン及び４−１ＢＢに共役された前記ＮＫＧ２Ｄの断片を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８３】
前記キメラ受容体は、配列番号４４の核酸配列によってコードされる、請求項８２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８４】
前記キメラ受容体は、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン及び４−１ＢＢに共役された前記ＮＫＧ２Ｄの断片を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８５】
前記キメラ受容体は、配列番号４５の核酸配列によってコードされる、請求項８４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８６】
前記キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ及び２Ｂ４に共役された前記ＮＫＧ２Ｄの断片を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８７】
前記キメラ受容体は、配列番号４６の核酸配列によってコードされる、請求項８６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８８】
前記キメラ受容体は、βアドレナリン細胞外ドメイン、βアドレナリン膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ及び２Ｂ４に共役された前記ＮＫＧ２Ｄの断片を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８９】
前記キメラ受容体は、配列番号４７の核酸配列によってコードされる、請求項８８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９０】
前記キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ、２Ｂ４、ＧＳ３リンカー及びＮＫｐ８０に共役された前記ＮＫＧ２Ｄの断片を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９１】
前記キメラ受容体は、配列番号４８の核酸配列によってコードされる、請求項９０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９２】
前記キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ、ＧＳ３リンカー及びＮＫｐ８０に共役された前記ＮＫＧ２Ｄの断片を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９３】
前記キメラ受容体は、配列番号４９の核酸配列によってコードされる、請求項９２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９４】
前記キメラ受容体は、ＧＳ３リンカー、追加的なＮＫＧ２Ｄ断片、βアドレナリン細胞外ドメイン、βアドレナリン膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ、追加的なＧＳ３リンカー及びＮＫｐ８０に共役されている、コドン最適化されている前記ＮＫＧ２Ｄの断片を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９５】
前記キメラ受容体は、配列番号５０の核酸配列によってコードされる、請求項９４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９６】
前記キメラ受容体は、ＧＳ３リンカー、追加的なＮＫＧ２Ｄ断片、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ、追加的なＧＳ３リンカー及びＮＫｐ８０に共役されている、コドン最適化されている前記ＮＫＧ２Ｄの断片を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９７】
前記キメラ受容体は、配列番号５１の核酸配列によってコードされる、請求項９６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９８】
前記キメラ受容体は、ＧＳ３リンカー、追加的なＮＫＧ２Ｄ断片、ｃｄ８ａヒンジ、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン及び４−１ＢＢに共役されている、コドン最適化されている前記ＮＫＧ２Ｄの断片を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９９】
前記キメラ受容体は、配列番号５２の核酸配列によってコードされる、請求項９８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１００】
前記キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン、４−１ＢＢ及び２Ｂ４に共役された前記ＮＫＧ２Ｄの断片を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０１】
前記キメラ受容体は、配列番号５３の核酸配列によってコードされる、請求項１００に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０２】
前記キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン、４−１ＢＢ、ＧＳ３リンカー及びＮＫｐ８０に共役された前記ＮＫＧ２Ｄの断片を含む、請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０３】
前記キメラ受容体は、配列番号５４の核酸配列によってコードされる、請求項１０２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０４】
前記キメラ受容体は、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１０（ＤＡＰ１０）を含まない、請求項３５〜１０３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０５】
前記キメラ受容体は、ＩＴＡＭモチーフを含まない、請求項３５〜５５又は６０〜１０４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０６】
（ａ）ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）の天然リガンドに結合するペプチドを含む細胞外受容体ドメインであって、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合する前記ペプチドは、ＮＫＧ２Ｄの断片である、細胞外受容体ドメイン、
（ｂ）ＣＤ８ａを含む膜貫通領域、及び
（ｃ）４−１ＢＢ及びＣＤ３ζを含むエフェクタードメイン
を含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドであって、膜結合性インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）をコードする追加的な構築物と同時発現されるポリヌクレオチド。
【請求項１０７】
（ａ）ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）の天然リガンドに結合するペプチドを含む細胞外受容体ドメインであって、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合する前記ペプチドは、ＮＫＧ２Ｄの断片である、細胞外受容体ドメイン、
（ｂ）ＣＤ８ａを含む膜貫通領域、及び
（ｃ）４−１ＢＢ及び２Ｂ４又はＤＡＰ１０の細胞内ドメインを含むエフェクタードメイン
を含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０８】
膜結合性インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）をコードする追加的な構築物と同時発現される、請求項１０６又は１０７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０９】
（ａ）ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）の天然リガンドに結合するペプチドを含む細胞外受容体ドメインであって、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合する前記ペプチドは、ＮＫＧ２Ｄの断片であり、前記ＮＫＧ２Ｄの断片は、（ｉ）配列番号１の配列、（ｉｉ）配列番号２の配列、（ｉｉｉ）配列番号３の配列、又は（ｉｖ）配列番号６８の配列の断片を含むポリヌクレオチドによってコードされる、細胞外受容体ドメイン、
（ｂ）ＣＤ３ζ膜貫通領域を含む膜貫通領域、及び
（ｃ）エフェクタードメイン
を含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１０】
膜結合性インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）と同時発現される、請求項１０９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１１】
（ａ）ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）の天然リガンドに結合するペプチドを含む細胞外受容体ドメインであって、
ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合する前記ペプチドは、ＮＫＧ２Ｄの断片であり、
前記ＮＫＧ２Ｄの断片は、（ｉ）配列番号１の配列、（ｉｉ）配列番号２の配列、（ｉｉｉ）配列番号３の配列、（ｉｖ）又は配列番号６８の配列の断片を含むポリヌクレオチドによってコードされる、細胞外受容体ドメイン、及び
（ｂ）膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメイン
を含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１２】
前記キメラ受容体の発現のための少なくとも１つの調節エレメントに作動可能に連結される、請求項３５〜１１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１３】
請求項３５〜１１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクターであって、前記ポリヌクレオチドは、前記キメラ受容体の発現のための少なくとも１つの調節エレメントに作動可能に連結される、ベクター。
【請求項１１４】
レトロウイルスである、請求項１１３に記載のベクター。
【請求項１１５】
請求項３５〜１１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子操作されたナチュラルキラー細胞。
【請求項１１６】
患者から単離された自家細胞である、請求項１１５に記載の単離された遺伝子操作されたナチュラルキラー細胞。
【請求項１１７】
ドナーから単離された同種細胞である、請求項１１５に記載の単離された遺伝子操作されたナチュラルキラー細胞。
【請求項１１８】
ＮＫ細胞の細胞傷害性の増強を、それを必要とする哺乳動物において行うための方法であって、ＮＫ細胞を前記哺乳動物に投与することを含み、前記ＮＫ細胞は、請求項３５〜１１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるキメラ受容体を発現する、方法。
【請求項１１９】
前記ＮＫ細胞は、患者から単離された自家細胞である、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記ＮＫ細胞は、ドナーから単離された同種細胞である、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
癌又は感染性疾患の治療又は予防を、それを必要とする哺乳動物において行うための方法であって、治療有効量のＮＫ細胞を前記哺乳動物に投与することを含み、前記ＮＫ細胞は、請求項３５〜１１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるキメラ受容体を発現する、方法。
【請求項１２２】
前記ＮＫ細胞は、癌又は感染性疾患を有する患者から単離された自家細胞である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記ＮＫ細胞は、ドナーから単離された同種細胞である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２４】
ＮＫ細胞の細胞傷害性の増強を、それを必要とする哺乳動物において行うための薬剤の製造における、請求項３５〜１１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項１２５】
癌又は感染性疾患の治療又は予防を、それを必要とする哺乳動物において行うための薬剤の製造における、請求項３５〜１１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項１２６】
ＮＫ細胞の細胞傷害性の増強を、それを必要とする哺乳動物において行うための薬剤の製造における、請求項１１４又は１１５に記載のベクターの使用。
【請求項１２７】
癌又は感染性疾患の治療又は予防を、それを必要とする哺乳動物において行うための薬剤の製造における、請求項１１４又は１１５に記載のベクターの使用。
【請求項１２８】
ＮＫ細胞の細胞傷害性の増強を、それを必要とする哺乳動物において行うための、請求項１１５〜１１７のいずれか一項に記載の単離された遺伝子操作されたナチュラルキラー細胞の使用。
【請求項１２９】
癌又は感染性疾患の治療又は予防を、それを必要とする哺乳動物において行うための、請求項１１６又は１１７に記載の単離された遺伝子操作されたナチュラルキラー細胞の使用。
【請求項１３０】
（ａ）ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）の天然リガンドに結合するペプチドを含む細胞外受容体ドメインであって、
ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合する前記ペプチドは、ＮＫＧ２Ｄの断片であり、
前記ＮＫＧ２Ｄの断片は、（ｉ）配列番号１、（ｉｉ）配列番号２、（ｉｉｉ）配列番号３、又は（ｉｖ）配列番号６８の断片を含むポリヌクレオチドによってコードされる、細胞外受容体ドメイン、及び
（ｂ）膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメイン
を含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３１】
ａ）キメラ受容体を含む免疫細胞であって、前記キメラ受容体は、
（ｉ）ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）の天然リガンドに結合するペプチドを含む細胞外受容体ドメインであって、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合する前記ペプチドは、ＮＫＧ２Ｄの断片である、細胞外受容体ドメイン、及び
（ｉｉ）膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメインであって、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζを含む、エフェクタードメイン
を含む、免疫細胞、
ｂ）膜結合性インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）
を含むトランスジェニック細胞。
【請求項１３２】
癌を治療するための方法であって、
ａ）キメラ受容体を含む免疫細胞であって、前記キメラ受容体は、
（ｉ）ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）の天然リガンドに結合するペプチドを含む細胞外受容体ドメインであって、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合する前記ペプチドは、ＮＫＧ２Ｄの断片である、細胞外受容体ドメイン、及び
（ｉｉ）膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメインであって、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζを含む、エフェクタードメイン
を含む、免疫細胞、
ｂ）膜結合性インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）
を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む組成物を、癌を有する対象に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１７年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／４７７，３３５号明細書及び２０１８年２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／６２８，７７４号明細書の利益を主張する。上掲の出願の各々の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでのマテリアルの参照による援用
本願は、本明細書と同時に提出されている以下のＡＳＣＩＩテキストファイル中に含まれる配列表を参照により援用する。
ａ）ファイル名：４４５９１１４４００２ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；１８６ＫＢのサイズで２０１８年３月２７日に作成
【背景技術】
【０００３】
多くの疾患の出現及び持続性は、悪性及びウイルス感染細胞を含む異常細胞に対する不十分な免疫応答によって特徴付けられる。免疫療法は、様々な疾患を治療するための患者の免疫系の使用及び操作である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
免疫療法は、疾患の治療における新しい技術的進歩を提示し、免疫細胞は、罹患又は損傷細胞に対して特異的に同定及び反応する特定の標的化及び／又はエフェクター分子を発現するように操作される。これは、より従来の手法、例えば化学療法（すべての細胞が影響を受ける場合）と異なり、少なくとも部分的に、罹患又は損傷細胞を特異的に標的にするという能力に基づく有望な進歩を表し、また所望の結果は、十分な健常細胞が生存することで患者の生存を可能にすることである。１つの免疫療法アプローチは、目的の異常細胞の標的化された認識及び破壊を達成するための免疫細胞におけるキメラ受容体の組換え発現である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
罹患又は感染細胞に対する特異的標的化及び破壊、無能化又は特に不活性化に関するこの必要性に対処するため、細胞、例えばナチュラルキラー細胞に対して増強された標的化及び細胞傷害性を付与するキメラ受容体をコードするポリヌクレオチド、アミノ酸及びベクターが本明細書で提供される。さらに、その細胞を作製するための方法並びにその細胞を用いて罹患又は損傷細胞を標的化及び破壊する方法が提供される。いくつかの実施形態では、細胞外受容体ドメイン並びに膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメインを含むキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、細胞外受容体ドメインは、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）の天然リガンドに結合するペプチドを含み、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するペプチドは、ＮＫＧ２Ｄの断片である。
【０００６】
いくつかの実施形態では、（ａ）細胞外受容体ドメインと、（ｂ）膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメインとの一方又は両方を含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、細胞外受容体ドメインは、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）の天然リガンドに結合するペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するペプチドは、ＮＫＧ２Ｄの断片であり、例えば、ＮＫＧ２Ｄの断片は、配列番号２を含むポリヌクレオチドによってコードされる。本明細書で開示される通り、追加的なＮＫＧ２Ｄ断片も実施形態に応じて用いられる。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζを含む。一実施形態では、ＣＤ３ζは、配列番号１３を含むポリヌクレオチドによってコードされるが、本明細書で開示される通り、ＣＤ３ζと異なるが、類似機能を共有する配列も実施形態に応じて用いられ得る。
【０００７】
いくつかの実施形態では、エフェクタードメインの膜貫通領域は、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、エフェクタードメインの膜貫通領域は、ＣＤ８ａヒンジ領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８ａヒンジ領域は、配列番号５を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢをさらに含む。一実施形態では、４−１ＢＢは、配列番号１２を含むポリヌクレオチドによってコードされるが、本明細書で開示される通り、４−１ＢＢと異なるが、類似機能を共有する配列も実施形態に応じて用いられ得る。
【０００８】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａ、４−１ＢＢ及びＣＤ３ｚに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、かかるキメラ受容体は、配列番号１８の核酸配列によってコードされる。さらなる実施形態では、キメラ受容体は、配列番号１０８の核酸配列によってコードされるが、本明細書で開示される通り、配列番号１０８と異なるが、類似機能を共有する配列も実施形態に応じて用いられ得る。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるキメラ受容体のいずれかはまた、膜結合性インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）と同時発現され得る。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５は、配列番号１６を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。ｍｂＩＬ１５用の他の配列も実施形態に応じて用いられ得る。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５は、キメラ受容体と同じポリヌクレオチド上でバイシストロン性に発現される。他の実施形態では、ｍｂＩＬ１５は、別々の構築物上で同時発現される。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、その発現を膜結合性インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）の場合と共役させることにより、さらに増強される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＯＸ−４０ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ−４０ドメインは、ｍｂＩＬ１５を代替するもの又は追加するもののいずれかである。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ−４０ドメイン及びＣＤ３ζに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド構築物は、ｍｂＩＬ１５をバイシストロン性に同時発現するように設計される。いくつかのかかる実施形態では、ポリヌクレオチド構築物は、例えば、細胞質プロテアーゼによって認識及び切断された１つ以上の切断部位（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ及び／又はＦ２Ａ切断部位（複数））を含む。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５は、細胞質プロテアーゼ切断部位により、キメラ受容体に共役される。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、細胞質プロテアーゼ切断部位により、配列番号１６によってコードされるｍｂＩＬ１５に共役された配列番号９０の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、細胞質プロテアーゼ切断部位により、配列番号１６によってコードされるｍｂＩＬ１５に共役された配列番号１０９の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号９１のアミノ酸配列を含み、配列番号１７のアミノ酸配列を含むｍｂＩＬ１５と同時発現される。本明細書で開示される通り、配列番号９０、９１、１０９、１６及び／又は１６と異なるが、類似機能を共有する配列も実施形態に応じて用いられ得る。
【００１１】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＩｇＧ４ヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ−４０ドメイン及びＣＤ３ζに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド構築物は、ｍｂＩＬ１５をキメラ受容体とバイシストロン性に同時発現するように設計される。いくつかのかかる実施形態では、ポリヌクレオチド構築物は、細胞質プロテアーゼにより認識及び切断された１つ以上の切断部位（例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ及び／又はＦ２Ａ切断部位（複数））を含む。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５は、細胞質プロテアーゼ切断部位によりキメラ受容体に共役される。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、細胞質プロテアーゼ切断部位により、配列番号１６によってコードされるｍｂＩＬ１５に共役された配列番号１００の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号１０１のアミノ酸配列を含み、配列番号１７のアミノ酸配列を含むｍｂＩＬ１５と同時発現される。本明細書で開示される通り、配列番号１００、１０１及び／又は１６と異なるが、類似機能を共有する配列も実施形態に応じて用いられ得る。
【００１２】
いくつかの実施形態では、癌を治療するための方法であって、上記又は本明細書中の他の箇所に記載のポリヌクレオチドによってコードされるキメラ受容体を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む組成物を、癌を有する対象に投与することを含む方法が提供される。
【００１３】
一実施形態では、ＮＫ細胞は、癌又は感染性疾患を有する患者から単離された自家細胞である。さらなる実施形態では、ＮＫ細胞は、ドナーから単離された同種細胞である。
【００１４】
ＮＫ細胞の細胞傷害性の増強を、それを必要とする哺乳動物において行うための薬剤の製造における、上記又は本明細書中の他の箇所に記載のポリヌクレオチドの使用も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、癌又は感染性疾患の治療又は予防を、それを必要とする哺乳動物において行うための薬剤の製造における、上記又は本明細書中の他の箇所に記載のポリヌクレオチドの使用が提供される。
【００１５】
いくつかの実施形態によると、細胞外受容体ドメイン並びに膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメインを含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書中でより詳細に考察される通り、細胞外受容体ドメインは、標的細胞上のリガンドを認識及び結合することに役立つ。エフェクタードメインは、（細胞外ドメインによる標的細胞との結合時に）標的細胞に対する細胞傷害活性をもたらすシグナルカスケードを発動させるシグナルを伝達するのに役立つ。いくつかの実施形態によると、ポリヌクレオチドは、意外にも操作されていないＮＫ細胞と比べて増強された細胞傷害性をもたらすキメラ受容体をコードする。
【００１６】
いくつかの実施形態では、細胞外受容体ドメインは、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）の天然リガンドに結合するペプチドを含む。いくつかの実施形態によると、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するペプチドは、ＮＫＧ２Ｄの機能断片（例えば、完全長ＮＫＧ２Ｄの切断部、断片又は部分である。本明細書で用いられるとき、用語「断片」、「切断部」及び「部分」は、それらの通常の意味が与えられるものとし、互いに交換可能なものとする。例えば、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの断片は、配列番号１の配列の断片を含むポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの断片が配列番号２の配列を含む一方、さらなる実施形態では、ＮＫＧ２Ｄをコードする断片は、コドン最適化され、例えば配列番号３の配列を含む。さらなる実施形態では、ＮＫＧ２Ｄをコードする断片は、コドン最適化され、例えば配列番号６８の配列を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＣＤ１６、ＮＣＲ１、ＮＣＲ２、ＮＣＲ３、４−１ＢＢ、ＮＫｐ８０、ＣＤ３ζ及び２Ｂ４の１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、これらのエフェクタードメインは、ＣＤ８αに共役される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ１６に共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。本明細書で用いられるとき、共役されたとは、その通常の意味が与えられるものとし、ヌクレオチド配列の、ヌクレオチド配列の発現を例えばインビトロ転写／翻訳系、宿主細胞（例えば、インビトロ及び／又はインビボ）において可能にするような方法での直接的（例えば、第１のヌクレオチドに第２のヌクレオチドが直接的に後続する）又は間接的（例えば、配列が互いにインフレームであっても介在ヌクレオチドによって分離される）結合も指すこととする。本明細書で用いられるとき、「連結された」及び「共役された」は、交換可能に用いられる。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ１６キメラ受容体は、配列番号２３の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ１６キメラ受容体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＮＣＲ１に共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、かかるキメラ受容体は、配列番号２７の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
上で考察の通り、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ断片は、ＮＣＲ２に共役され、得られるキメラ受容体は、配列番号２１のアミノ酸配列の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態は、ＮＣＲ３に共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含むキメラ受容体を提供する。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号２９の核酸配列によってコードされ、キメラ受容体は、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
【００２０】
以下により詳細に考察される通り、膜貫通及び細胞内ドメインの組み合わせは、いくつかの実施形態で用いられ、キメラ受容体の成分間に相乗的相互作用をもたらし、増強された細胞傷害性効果をもたらす。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン及び４−１ＢＢに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン及び４−１ＢＢに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、かかるキメラ受容体は、配列番号２５の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、得られたキメラ受容体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ＮＣＲ１がＮＫＧ２Ｄ断片と併用される。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ断片は、ＮＣＲ１に単独で連結される。さらなる実施形態では、キメラ受容体は、ＮＣＲ１及び４−１ＢＢに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかのかかる実施形態では、キメラ受容体は、配列番号２０のＮＣＲ１アミノ酸配列を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａ、４−１ＢＢ及びＣＤ３ｚに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、かかるＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ８ａ／４−１ｂｂ／ＣＤ３ｚキメラ受容体は、配列番号１８の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ＮＣＲ３は、キメラ受容体に含まれる。例えば、ＮＫＧ２Ｄ／ＮＣＲ３構築物がいくつかの実施形態において提供される。それにより得られたキメラ受容体は、配列番号２２のＮＣＲ３アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＮＫＧ２Ｄ／ＮＣＲ２／４−１ＢＢ構築物又はＮＫＧ２Ｄ／ＮＣＲ３／４−１ＢＢ構築物を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、リンカー、ヒンジ又は他の「スペーシング」エレメントがキメラ受容体構築物において提供される。例えば、いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、リンカーを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、構築物の部分間、例えば４−１ＢＢ、ＣＤ１６、ＮＣＲ１、ＮＣＲ３、２Ｂ４又はＮＫｐ８０のいずれかの間でＧＳリンカーをコードする。いくつかの実施形態では、１つ以上、例えば１、２、３、４、５、６又は７つ以上のＧＳリンカーが提供される。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域を含むキメラ受容体が提供される。特定の構築物中の位置に応じて、ヒンジ領域は、リンカー領域と同義であり得、またその逆であり得る。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号５の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、所望の長さに切断でき、したがって配列番号５の核酸配列の断片によってコードされる。いくつかの実施形態では、グリシン−セリンモチーフがヒンジとして用いられる。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ここで、ｎは、反復数である）のアミノ酸配列（配列番号３１）を有するグリシン−セリン反復モチーフを含む。いくつかの実施形態では、９回反復が用いられることで、配列番号３３のアミノ酸配列を含むヒンジ領域が得られる。いくつかの実施形態では、３回反復が用いられることで、配列番号３４のアミノ酸配列を含むヒンジ領域が得られる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、２つの別々の分子をヒンジ又はリンカー、例えば配列番号３２のアミノ酸配列として用いることができる（ＣＤ８ａ／ＧＳ３）。いくつかの実施形態では、βアドレナリン受容体の一部がヒンジ又はリンカーとして用いられる。いくつかの実施形態では、β２アドレナリン受容体の一部が用いられる。一実施形態では、配列番号４０の核酸配列によってコードされる、β２アドレナリン受容体の細胞外ドメインが用いられる。いくつかの実施形態では、配列番号４２の核酸配列によってコードされる、β２アドレナリン受容体の第１の膜貫通らせんが用いられる。実施形態に応じて、これらの２つのβ２アドレナリン受容体部分がキメラ受容体と一緒に用いられる。いくつかの実施形態では、細胞外受容体ドメインは、配列番号４の核酸配列を含むＣＤ８ａシグナルペプチドをさらに含む。任意選択により、実施形態に応じて、他のシグナルペプチドが用いられる。シグナルペプチドは、いくつかの実施形態に従い、多量体形式で用いられ得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、１つ以上のヘミＩＴＡＭ配列を含む。いくつかのかかる実施形態では、ヘミＩＴＡＭは、アミノ酸モチーフＤＧＹＸＸＬ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸である；配列番号１４）を含む。複数のヘミＩＴＡＭがいくつかの実施形態において用いられる。いくつかの実施形態では、ヘミＩＴＡＭは、ＮＫｐ８０を含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、１つ以上のＩＴＳＭ配列を含む。ＩＴＳＭ配列は、いくつかの実施形態では、ヘミＩＴＡＭモチーフと併用される。いくつかの実施形態では、ＩＴＳＭは、アミノ酸モチーフＳ／ＴＸＹＸＸＬ／Ｉ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸である；配列番号１５）である。いくつかの実施形態では、エフェクターは、２Ｂ４ドメインを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＧＳ３リンカー、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン及び４−１ＢＢに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＧＳ３リンカー、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン及び４−１ＢＢに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン及び４−１ＢＢに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ及び２Ｂ４に共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、βアドレナリン細胞外ドメイン、βアドレナリン膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ及び２Ｂ４に共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ、２Ｂ４、ＧＳ３リンカー及びＮＫｐ８０に共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ、ＧＳ３リンカー及びＮＫｐ８０に共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＮＫＧ２Ｄの断片を含み、この断片は、ＧＳ３リンカー、追加的なＮＫＧ２Ｄ断片、βアドレナリン細胞外ドメイン、βアドレナリン膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ、追加的なＧＳ３リンカー及びＮＫｐ８０に共役されている、コドン最適化されている配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＧＳ３リンカー、追加的なＮＫＧ２Ｄ断片、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ、追加的なＧＳ３リンカー及びＮＫｐ８０に共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＧＳ３リンカー、追加的なＮＫＧ２Ｄ断片、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン及び４−１ＢＢに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン、４−１ＢＢ及び２Ｂ４に共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン、４−１ＢＢ、ＧＳ３リンカー及びＮＫｐ８０に共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ及びＣＤ８ａ膜貫通ドメインに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、エフェクターは、４−１ＢＢを含む。いくつかのかかる実施形態では、エフェクターは、任意選択により、ＮＫｐ８０、２Ｂ４、ＣＤ３ζ、Ｄａｐ１０、Ｄａｐ１２、ＣＤ２８又は本明細書中に提供される他のシグナル伝達ドメインの１つ以上と併せて４−１ＢＢを含む）。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＣＤ３ζをさらに含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、２Ｂ４の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＤＡＰ１０の細胞内ドメインをさらに含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ、２Ｂ４及びＣＤ３ζに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号５８の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。
【００２９】
加えて、本明細書で開示されるキメラ受容体のいずれかはまた、膜結合性インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）と同時発現され得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの断片である、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するペプチドを含む細胞外受容体ドメイン、膜貫通領域、エフェクタードメインを含むキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このポリヌクレオチドは、膜結合性インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）をコードする追加的な構築物と同時発現される。いくつかの実施形態では、本明細書で考察されるようなキメラ受容体は、ｍｂＩＬ−１５と同時発現される。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζを含み、膜貫通領域は、ＣＤ８ａを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１０（ＤＡＰ１０）を含まないように操作される。加えて、いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＩＴＡＭモチーフを含まないように操作される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、（ａ）ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄの断片を含む細胞外受容体ドメイン、（ｂ）ＣＤ８ａを含む膜貫通領域、及び（ｃ）４−１ＢＢ及び２Ｂ４又はＤＡＰ１０の細胞内ドメインを含むエフェクタードメインの１つ、２つ又は全部を含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、２Ｂ４、その後の４−１ＢＢを含む。さらなる実施形態では、エフェクタードメインは、４−１ＢＢ、その後の２Ｂ４を含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＤＡＰ１０、その後の４−１ＢＢを含む。さらなる実施形態では、エフェクタードメインは、４−１ＢＢ、その後のＤＡＰ１０を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ及びＤＡＰ１０に共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６０の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ、２Ｂ４及びＤＡＰ１０に共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、４−１ＢＢ、その後のＤＡＰ１０、その後の２Ｂ４を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６２の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、４−１ＢＢ、その後の２Ｂ４、その後のＤＡＰ１０を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６４の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６５のアミノ酸配列を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、細胞内エフェクタードメインに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの複数の断片が用いられ、例えば、（任意選択によりコドン最適化された）追加的なＮＫＧ２Ｄ断片が例えばＧＳ３リンカーにより第１の断片に共役される。いくつかの実施形態では、かかるキメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζをさらに含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６６の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、膜結合性インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）をコードする追加的な構築物と同時発現される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合し、且つ配列番号１の断片によってコードされるＮＫＧ２Ｄの断片を含む細胞外受容体ドメイン、ＣＤ３ζ膜貫通領域を含む膜貫通領域及びエフェクタードメインを含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合し、且つ配列番号２によってコードされるＮＫＧ２Ｄの断片を含む細胞外受容体ドメイン、ＣＤ３ζ膜貫通領域を含む膜貫通領域及びエフェクタードメインを含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合し、且つ配列番号３によってコードされるＮＫＧ２Ｄの断片を含む細胞外受容体ドメイン、ＣＤ３ζ膜貫通領域を含む膜貫通領域及びエフェクタードメインを含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合し、且つ配列番号６８によってコードされるＮＫＧ２Ｄの断片を含む細胞外受容体ドメイン、ＣＤ３ζ膜貫通領域を含む膜貫通領域及びエフェクタードメインを含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、配列番号２、３又は６８のいずれかによってコードされるＮＫＧ２Ｄの断片も用いられ得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ膜貫通領域は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、配列番号６９の配列の断片、すなわち（二量体を含む）天然ＣＤ３ζサブユニットのシグナル伝達の少なくとも約６５％、約７５％、約８５％又は約９５％を伝達する能力を保持する断片も用いられる。いくつかの実施形態では、細胞外受容体ドメインは、ＣＤ３ζ膜貫通領域に隣接した追加的な残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、追加的なアミノ酸は、天然ＣＤ３ζ配列の細胞外残基である。他の実施形態では、追加的なアミノ酸は、無作為に選択される。いくつかの実施形態では、２、３、４、５、６、８、１０、１５又は２０の追加的なアミノ酸が存在する。いくつかの実施形態では、キメラ受容体ドメインは、ヒンジ領域、いくつかの実施形態では、配列番号５の核酸配列によってコードされるＣＤ８ａヒンジを含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号５の核酸配列の断片によってコードされるＣＤ８ａヒンジである。実施形態に応じて、この断片は、配列番号５の核酸配列の長さの約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％である。実施形態に応じて、この断片は、配列番号５の核酸配列に対して約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％又は約９９％相同である。いくつかの実施形態では、細胞外受容体ドメインは、ＣＤ８ａシグナルペプチドをさらに含み、実施形態に応じて、配列番号４の核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、４−１ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＣＤ１６細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、（構築物中の「第１」対「第２」である部分のいずれかとともに）４−１ＢＢ及びＣＤ１６を含む。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢ及び／又はＣＤ��６の１つ以上の反復が用いられる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３ζ膜貫通領域及び４−１ＢＢを含むエフェクタードメインに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号７８の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号７９のアミノ酸配列を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３ζ膜貫通領域及びＣＤ１６、その後の４−１ＢＢを含むエフェクタードメインに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号７０の核酸配列によってコードされる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３ζ膜貫通領域及び４−１ＢＢ、その後のＣＤ１６を含むエフェクタードメインに共役されている、任意選択によりＧＳ３リンカーによって共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号８５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号８４の核酸配列によってコードされる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＧＳ３リンカー、追加的なＮＫＧ２Ｄ断片、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３ζ膜貫通領域並びにＣＤ１６及び４−１ＢＢを含むエフェクタードメインに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号７２の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＮＫｐ８０を含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＮＫｐ８０である。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３ζ膜貫通領域並びにＣＤ１６、４−１ＢＢ及びＮＫｐ８０を含むエフェクタードメイン、また任意選択によりＧＳ３リンカーなどに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号７４の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号７５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＧＳ３リンカー、追加的なＮＫＧ２Ｄ断片（任意選択によりコドン最適化された）、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３ζ膜貫通領域並びにＣＤ１６、４−１ＢＢ及びＮＫｐ８０を含むエフェクタードメイン、また任意選択によりＧＳ３リンカーなどに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号７６の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号７７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３ζ膜貫通領域並びに４−１ＢＢ及びＮＫｐ８０を含むエフェクタードメイン、また任意選択によりＧＳ３リンカーなどに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号８２の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号８３のアミノ酸配列を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＣＤ３ζを含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３ζ膜貫通領域並びに４−１ＢＢ及びＣＤ３ζを含むエフェクタードメインに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号８０の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号８１のアミノ酸配列を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＦｃＲγを含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３ζ膜貫通領域並びに４−１ＢＢ及びＦｃＲγを含むエフェクタードメインに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号８６の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号８７のアミノ酸配列を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＣＤ２８を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３ζ膜貫通領域並びにＣＤ２８及びＣＤ３ζを含むエフェクタードメインに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号１０２の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号１０３のアミノ酸配列を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＧＳリンカーを含む。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、膜結合性インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）と同時発現される。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合する能力があり、且つ配列番号１の配列、配列番号２の配列、配列番号３の配列又は配列番号６８の配列のいずれか１つの断片によってコードされるＮＫＧ２Ｄの断片を含む細胞外受容体ドメイン並びに膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメインを含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合する能力があり、且つ（ｉ）配列番号１の配列の断片、（ｉｉ）配列番号２の配列、（ｉｉｉ）配列番号３の配列、又は（ｉｖ）配列番号６８の配列によってコードされるＮＫＧ２Ｄの断片を含む細胞外受容体ドメイン並びに膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメインを含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合する能力があり、且つ配列番号２の配列によってコードされるＮＫＧ２Ｄの断片を含む細胞外受容体ドメイン並びに膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメインを含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合する能力があり、且つ配列番号３の配列によってコードされるＮＫＧ２Ｄの断片を含む細胞外受容体ドメイン並びに膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメインを含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合する能力があり、且つ配列番号６８の配列の断片によってコードされるＮＫＧ２Ｄの断片を含む細胞外受容体ドメイン並びに膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメインを含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、細胞外受容体ドメインは、ヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号５の核酸配列又は任意選択により配列番号５の核酸配列の断片（例えば、配列番号５に対して約７５％、約８５％、約９５％相同である断片）によってコードされるＣＤ８ａヒンジである。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号１０４の核酸配列によってコードされる免疫グロブリンＧ４（ＩｇＧ４）ヒンジである。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号１０４の核酸配列の断片（例えば、配列番号１０４に対して約７５％、約８５％、約９５％相同である断片）によってコードされる免疫グロブリンＧ４（ＩｇＧ４）ヒンジである。いくつかの実施形態では、細胞外受容体ドメインは、配列番号４の核酸配列を含むＣＤ８ａシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３ζ、４−１ＢＢ、ＣＤ２８及びＤＡＰ１２からなる群から選択される少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ及びＣＤ３ｚに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片に（任意選択によ���ＧＳ３リンカーにより）連結されたＩＬ−１５を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号８８の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号８９のアミノ酸配列を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＩｇＧ４ヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号９６の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号９７のアミノ酸配列を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＯＸ４０を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０及びＣＤ３ｚに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号９０の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号１０９の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号９１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＩｇＧ４ヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０及びＣＤ３ζに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号１００の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ２８膜貫通／細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ２８膜貫通／細胞内ドメイン及びＣＤ３ζに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号９２の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ２８膜貫通／細胞内ドメイン、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号９４の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号９５のアミノ酸配列を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＩｇＧ４ヒンジ、ＣＤ２８膜貫通／細胞内ドメイン及びＣＤ３ζに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号９８の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号９９のアミノ酸配列を含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＧＳリンカーを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、膜結合性インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）と（同じポリヌクレオチド上又は別のポリヌクレオチド上のいずれかで）同時発現されるように設計される。
【００５１】
キメラ受容体のいずれかは、任意選択により、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合する第２のペプチドを含む細胞外受容体ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、第２のペプチドは、ＮＫＧ２Ｄと相同である一方、他の実施形態では、第２のペプチドは、ＮＫＧ２Ｄについて異種である。キメラ受容体が二量体化された細胞外受容体ドメインを含むか否かにかかわらず、細胞外受容体ドメインは、ＮＫＧ２Ｄの少なくとも以下の天然リガンド：ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５又はＵＬＢＰ６を認識し得る。
【００５２】
以下により詳細に考察される通り、ＮＫＧ２Ｄリガンド結合ドメインの機能的変異体がいくつかの実施形態において用いられる。例えば、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するペプチドは、いくつかの実施形態では、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号６８に対して少なくとも８０％相同である。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号６８に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同である。
【００５３】
加えて、いくつかの実施形態では、キメラ受容体を発現するためのベクターが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡであり、キメラ受容体の発現のための少なくとも１つの調節エレメントに対する作動可能な結合を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルスである。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるキメラ受容体構築物のいずれかを発現する操作されたナチュラルキラー細胞も提供され、操作されたＮＫ細胞は、標的細胞に対する増強された細胞傷害性効果を示す。増強された細胞傷害性効果は、限定されないが、標的（例えば、癌性）細胞に対する、正常（例えば、非癌性）細胞と比べてより高い親和性、標的細胞に特異的なより大きい殺滅効果、低下したオフターゲット効果、細胞傷害性効果の持続時間の増加、より効率的な細胞傷害性などを含む。かかる増強効果は、様々なインビトロ細胞傷害性アッセイの使用（例えば、サイトカイン産生の測定など）、標的細胞死の測定又は様々な臨床成績（例えば腫瘍量の減少）を通じて同定可能である。いくつかの実施形態では、操作されたＮＫ細胞は、患者から単離された自家細胞である。さらなる実施形態では、操作されたＮＫ細胞は、ドナーから単離された同種細胞から作製される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるような操作されたＮＫ細胞が用いられ、かかるＮＫ細胞を投与することにより、ＮＫ細胞の細胞傷害性の増強を、それを必要とする哺乳動物において行う。いくつかの実施形態では、哺乳動物における癌又は感染性疾患を治療又は予防するため、これらの操作されたＮＫ細胞が用いられる。いくつかの実施形態では、（例えば、癌又は感染性疾患を治療又は予防するために）ＮＫ細胞の細胞傷害性を増強するための薬剤の製造において、本明細書で開示される様々なキメラ受容体をコードするポリヌクレオチド、それらを担持するベクター及びそれらを発現するＮＫ細胞を用いることもできる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるキメラ受容体構築物は、操作されたＮＫ細胞の正常細胞に対する細胞傷害性を増強することが有意でなく、また本明細書に記載の通り、非操作ＮＫ細胞と比べて有利に改善される。いくつかの実施形態では、細胞外受容体ドメイン、膜貫通領域及びエフェクタードメインを含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、細胞外受容体ドメインは、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）の天然リガンドに結合するペプチドを含み、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するペプチドは、ＮＫＧ２Ｄの断片である。いくつかの実施形態は、（ａ）ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）の天然リガンドに結合するペプチドを含む細胞外受容体ドメインであって、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するペプチドは、ＮＫＧ２Ｄの断片であり、ＮＫＧ２Ｄの断片は、（ｉ）配列番号１の配列の断片、（ｉｉ）配列番号２の配列、（ｉｉｉ）配列番号３の配列、又は（ｉｖ）配列番号６８の配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、細胞外受容体ドメイン、（ｂ）膜貫通領域、及び（ｃ）エフェクタードメインを含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、（ａ）ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）の天然リガンドに結合するペプチドを含む細胞外受容体ドメインであって、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するペプチドは、ＮＫＧ２Ｄの断片であり、ＮＫＧ２Ｄの断片は、（ｉ）配列番号１の配列の断片、（ｉｉ）配列番号２の配列、（ｉｉｉ）配列番号３の配列、（ｉｖ）又は配列番号６８の配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる細胞外受容体ドメイン；及び（ｂ）膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメインを含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【００５６】
いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、ＣＤ３ζ膜貫通領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ膜貫通領域は、配列番号６９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通領域は、ＣＤ８ａを含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、４−１ＢＢ、２Ｂ４の細胞内ドメイン、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６細胞内ドメイン、天然細胞傷害誘発受容体１（ＮＣＲ１）、天然細胞傷害誘発受容体２（ＮＣＲ２）、天然細胞傷害誘発受容体３（ＮＣＲ３）及び／又はＤＡＰ１０の細胞内ドメインを含む。一実施形態では、エフェクタードメインは、４−１ＢＢ及びＣＤ１６を含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζを含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、４−１ＢＢ及び２Ｂ４又はＤＡＰ１０の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、２Ｂ４、その後の４−１ＢＢを含む一方、他の実施形態では、エフェクタードメインは、４−１ＢＢ、その後の２Ｂ４を含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＤＡＰ１０、その後の４−１ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、４−１ＢＢ、その後のＤＡＰ１０を含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＣＤ３ζをさらに含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３ζ、４−１ＢＢ、ＣＤ２８及びＤＡＰ１２からなる群から選択される少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、１つ以上のヘミＩＴＡＭ配列を含む。いくつかの実施形態では、ヘミＩＴＡＭは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヘミＩＴＡＭは、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、１つ以上のＩＴＳＭ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＳＭは、配列番号１５のアミノ酸配列又は配列番号３５のアミノ酸配列を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ、２Ｂ４及びＣＤ３ζに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。一実施形態では、キメラ受容体は、配列番号５８の核酸配列によってコードされる。一実施形態では、キメラ受容体は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ及びＤＡＰ１０に共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６０の核酸配列によってコードされ、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。
【００５８】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ、２Ｂ４及びＤＡＰ１０に共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、４−１ＢＢ、その後のＤＡＰ１０、その後の２Ｂ４を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６２の核酸配列によってコードされ、キメラ受容体は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、４−１ＢＢ、その後の２Ｂ４、その後のＤＡＰ１０を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６４の核酸配列によってコードされ、キメラ受容体は、配列番号６５のアミノ酸配列を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＧＳ３リンカー、追加的なＮＫＧ２Ｄ断片、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片を含む。一実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６６の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３ζ膜貫通領域及び４−１ＢＢを含むエフェクタードメインに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片を含み、配列番号７８の核酸配列によってコードされ、且つ／又は配列番号７９のアミノ酸配列を含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３ζ膜貫通領域及びＣＤ１６、その後の４−１ＢＢを含むエフェクタードメインに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号７０の核酸配列によってコードされ、且つ／又は配列番号７１のアミノ酸配列を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３ζ膜貫通領域並びに４−１ＢＢ、その後のＧＳ３リンカー及びＣＤ１６を含むエフェクタードメインに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片を含む。一実施形態では、キメラ受容体は、配列番号８５のアミノ酸配列を含み、且つ／又は配列番号８４の核酸配列によってコードされる。
【００６３】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＧＳ３リンカー、追加的なＮＫＧ２Ｄ断片、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３ζ膜貫通領域並びにＣＤ１６及び４−１ＢＢを含むエフェクタードメインに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片を含む。一実施形態では、キメラ受容体は、配列番号７２の核酸配列によってコードされ、且つ／又は配列番号７３のアミノ酸配列を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片にＧＳ３リンカーにより連結されたＩＬ−１５を含み、配列番号８８の核酸配列によってコードされ、且つ／又は配列番号８９のアミノ酸配列を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＩｇＧ４ヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含み、配列番号９６の核酸配列によってコードされ、且つ／又は配列番号９７のアミノ酸配列を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０及びＣＤ３ｚに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含み、配列番号９０の核酸配列によってコードされ、且つ／又は配列番号９１のアミノ酸配列を含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＩｇＧ４ヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＯＸ４０及びＣＤ３ζに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含み、配列番号１００の核酸配列によってコードされ、且つ／又は配列番号１０１のアミノ酸配列を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ２８膜貫通／細胞内ドメイン及びＣＤ３ζに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含み、配列番号９２の核酸配列によってコードされ、且つ／又は配列番号９３のアミノ酸配列を含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ２８膜貫通／細胞内ドメイン、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含み、配列番号９４の核酸配列によってコードされ、且つ／又は配列番号９５のアミノ酸配列を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＩｇＧ４ヒンジ、ＣＤ２８膜貫通／細胞内ドメイン及びＣＤ３ζに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含み、配列番号９８の核酸配列によってコードされ、且つ／又は配列番号９９のアミノ酸配列を含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３ζ膜貫通領域並びにＣＤ１６、４−１ＢＢ、ＧＳ３リンカー及びＮＫｐ８０を含むエフェクタードメインに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。一実施形態では、キメラ受容体は、配列番号７４の核酸配列によってコードされ、且つ／又は配列番号７５のアミノ酸配列を含む。
【００７２】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＧＳ３リンカー、追加的なＮＫＧ２Ｄ断片、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３ζ膜貫通領域並びにＣＤ１６、４−１ＢＢ、ＧＳ３リンカー及びＮＫｐ８０を含むエフェクタードメインに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片を含む。一実施形態では、キメラ受容体は、配列番号７６の核酸配列によってコードされ、且つ／又は配列番号７７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３ζ膜貫通領域並びに４−１ＢＢ、ＧＳ３リンカー及びＮＫｐ８０を含むエフェクタードメインに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片を含む。一実施形態では、キメラ受容体は、配列番号８２の核酸配列によってコードされ、且つ／又は配列番号８３のアミノ酸配列を含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３ζ膜貫通領域並びに４−１ＢＢ及びＣＤ３ζを含むエフェクタードメインに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片を含む。一実施形態では、キメラ受容体は、配列番号８０の核酸配列によってコードされ、且つ／又は配列番号８１のアミノ酸配列を含む。
【００７４】
実施形態に応じて、エフェクタードメインは、ＦｃＲγも含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３ζ膜貫通領域並びに４−１ＢＢ及びＦｃＲγを含むエフェクタードメインに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。一実施形態では、キメラ受容体は、配列番号８６の核酸配列によってコードされ、且つ／又は配列番号８７のアミノ酸配列を含む。
【００７５】
実施形態に応じて、エフェクタードメインは、ＣＤ２８も含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ３ζ膜貫通領域並びにＣＤ２８及びＣＤ３ζを含むエフェクタードメインに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号１０２の核酸配列によってコードされ、且つ／又は配列番号１０３のアミノ酸配列を含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＧＳリンカーを含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、細胞外受容体ドメインは、ＣＤ８ａシグナルペプチドをさらに含み、シグナルペプチドは、配列番号４の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞外受容体ドメインは、ＣＤ３ζ膜貫通領域に直に隣接したＣＤ３ζの２つの細胞外残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞外受容体ドメインは、ＣＤ８ａシグナルペプチドを含み、シグナルペプチドは、配列番号４の核酸配列を含む。
【００７８】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、１つ以上のＧＳ３リンカーを含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体ドメインは、ヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号５の核酸配列によってコードされる一方、いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号５の核酸配列の断片によってコードされる。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＤ８ａヒンジである。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号３１のアミノ酸配列を有するグリシン−セリン反復モチーフを含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号３２のアミノ酸配列を含み、いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号３４の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、βアドレナリン受容体の一部を含む。いくつかのかかる実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号４０の核酸配列によってコードされる。さらなる実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号４２の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号１０４の核酸配列によってコードされる免疫グロブリンＧ４（ＩｇＧ４）ヒンジである。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、配列番号１０４の核酸配列の断片によってコードされる免疫グロブリンＧ４（ＩｇＧ４）ヒンジである。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ及びＣＤ８ａ膜貫通ドメインに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。
【００７９】
一実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ１６に共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含み、配列番号２３の核酸配列によってコードされ、且つ／又は配列番号２４のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、キメラ受容体は、ＮＣＲ１に共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかのかかる実施形態では、キメラ受容体は、配列番号２７の核酸配列によってコードされ、且つ／又は配列番号２８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号２１のアミノ酸配列の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＮＣＲ３に共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含み、いくつかの実施形態では、配列番号２９の核酸配列によってコードされ、且つ／又は配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン及び４−１ＢＢに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン及び４−１ＢＢに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含み、配列番号２５の核酸配列によってコードされ、且つ／又は配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＮＣＲ１及び４−１ＢＢに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含み、キメラ受容体は、配列番号２０のＮＣＲ１アミノ酸配列を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａ、４−１ＢＢ及びＣＤ３ｚに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含み、配列番号１８の核酸配列によってコードされ、且つ／又は配列番号１９のアミノ酸配列を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＮＣＲ３及び４−１ＢＢに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含み、ＮＣＲ３は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、キメラ受容体は、配列番号２０のＮＣＲ１膜貫通／細胞内ドメイン又は配列番号２２のＮＣＲ３膜貫通／細胞内ドメインの１つ以上を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＧＳ３リンカー、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン及び４−１ＢＢに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号４３の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＧＳ３リンカー、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン及び４−１ＢＢに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含む。一実施形態では、キメラ受容体は、配列番号４４の核酸配列によってコードされる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン及び４−１ＢＢに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含み、配列番号４５の核酸配列によってコードされる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ及び２Ｂ４に共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含み、配列番号４６の核酸配列によってコードされる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、βアドレナリン細胞外ドメイン、βアドレナリン膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ及び２Ｂ４に共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含み、配列番号４７の核酸配列によってコードされる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ、２Ｂ４、ＧＳ３リンカー及びＮＫｐ８０に共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含み、配列番号４８の核酸配列によってコードされる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ、ＧＳ３リンカー及びＮＫｐ８０に共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含み、配列番号４９の核酸配列によってコードされる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＧＳ３リンカー、追加的なＮＫＧ２Ｄ断片、βアドレナリン細胞外ドメイン、βアドレナリン膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ、追加的なＧＳ３リンカー及びＮＫｐ８０に共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片を含み、配列番号５０の核酸配列によってコードされる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＧＳ３リンカー、追加的なＮＫＧ２Ｄ断片、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ、追加的なＧＳ３リンカー及びＮＫｐ８０に共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片を含み、配列番号５１の核酸配列によってコードされる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＧＳ３リンカー、追加的なＮＫＧ２Ｄ断片、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン及び４−１ＢＢに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片を含み、配列番号５２の核酸配列によってコードされる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン、４−１ＢＢ及び２Ｂ４に共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含み、配列番号５３の核酸配列によってコードされる。
【００９４】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジ、ＣＤ１６膜貫通／細胞内ドメイン、４−１ＢＢ、ＧＳ３リンカー及びＮＫｐ８０に共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含み、配列番号５４の核酸配列によってコードされる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体構築物は、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドによってコードされ、細胞外受容体ドメインは、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンド（例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５又はＵＬＢＰ６の１つ以上に結合する第２のペプチドを含む。実施形態に応じて、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するペプチドは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３に対して少なくとも８０％相同である。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、膜結合性インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）をコードする追加的な構築物と同時発現される。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号１８の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、配列番号１９のアミノ酸配列によってコードされる。
【００９７】
いくつかの実施形態によると、キメラ受容体は、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１０（ＤＡＰ１０）を含まず、且つ／又はキメラ受容体は、免疫受容体チロシンに基づく活性化（ＩＴＡＭ）モチーフをコードしない。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。加えて、いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるポリヌクレオチドは、キメラ受容体の発現のため、少なくとも１つの調節エレメントに作動可能に連結される。
【００９９】
本明細書では、本明細書で開示されるポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、キメラ受容体の発現のため、少なくとも１つの調節エレメントに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルスである。
【０１００】
本明細書では、本明細書で開示されるポリヌクレオチドのいずれか１つ以上を含む遺伝子操作されたナチュラルキラー細胞も提供される。いくつかの実施形態では、ナチュラルキラー細胞は、自家使用を目的とする一方、いくつかの実施形態では、同種使用を目的とする。
【０１０１】
本明細書では、ＮＫ細胞の細胞傷害性の増強を、それを必要とする哺乳動物において行う方法であって、ＮＫ細胞を哺乳動物に投与することを含み、前記ＮＫ細胞は、本明細書で開示されるポリヌクレオチドによってコードされるキメラ受容体を発現する、方法も提供される。
【０１０２】
加えて、癌又は感染性疾患の治療又は予防を、それを必要とする哺乳動物において行うための方法であって、治療有効量のＮＫ細胞を前記哺乳動物に投与することを含み、前記ＮＫ細胞は、本明細書で開示されるポリヌクレオチドによってコードされるキメラ受容体を発現する、方法が提供される。上で開示される通り、ＮＫ細胞は、同種又は自家であり得る。
【０１０３】
ＮＫ細胞の細胞傷害性の増強を、それを必要とする哺乳動物において行うための薬剤の製造における、本明細書で開示されるようなポリヌクレオチドの使用が提供される。さらに、癌又は感染性疾患の治療又は予防を、それを必要とする哺乳動物において行うための薬剤の製造におけるポリヌクレオチドの使用が提供される。
【０１０４】
ＮＫ細胞の細胞傷害性の増強を、それを必要とする哺乳動物において行うための薬剤の製造における、本明細書で開示されるポリヌクレオチドを含むベクターの使用も提供される。癌又は感染性疾患の治療又は予防を、それを必要とする哺乳動物において行うための薬剤の製造における、本明細書で開示されるポリヌクレオチドを含むベクターの使用も提供される。
【０１０５】
ＮＫ細胞の細胞傷害性の増強を、それを必要とする哺乳動物において行うための、本明細書で開示されるようなキメラ受容体を発現する単離された遺伝子操作されたナチュラルキラー細胞の使用も提供される。癌又は感染性疾患の治療又は予防を、それを必要とする哺乳動物において行うための、本明細書で開示されるようなキメラ受容体を発現する単離された遺伝子操作されたナチュラルキラー細胞の使用も提供される。
【０１０６】
上で概説され、以下でさらに詳細に示される組成物及び関連の方法は、施術者によってとられる特定の行動を説明するが、それらが別の団体によるそれら行動の指示も含み得ることが理解されるべきである。したがって、「キメラ受容体を発現するＮＫ細胞の集団を投与すること」などの行動は、「キメラ受容体を発現するＮＫ細胞の集団の投与を指示すること」を含む。
【０１０７】
下図の説明は、本明細書で開示される本発明の非限定的な実施形態を表す実験及び結果に関する。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１Ａ−１Ｃ】本明細書で開示されるいくつかの実施形態に従うキメラ受容体の概略図を示す。図１Ａは、内因性ＮＫＧ２Ｄを示し、図１Ｂは、ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ζを示し、図１Ｃは、ＮＫＧ２Ｄ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζを示す。
【図２Ａ−２Ｂ】本明細書で開示されるいくつかの実施形態に従うキメラ受容体の概略図を示す。図２Ａは、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６を示し、図２Ｂは、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６−４１ＢＢを示す。
【図３Ａ−３Ｂ】いくつかの実施形態に従う特定の構築物のプラスミドへの挿入のポイントを例示するプラスミドマップを示し、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プラスミドが例示される。図３Ａは、ベクター内のＩＲＥＳ−ＧＦＰ配列が除去され、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限部位に挿入された、ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ζ及びＮＫＧ２Ｄ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζにおける遺伝子構築物を示す。図３Ｂは、複数のクローニング部位（ＭＣＳ）に位置するＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限部位に挿入された、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６−４１ＢＢに対するプラスミドを示す。ベクター内のＩＲＥＳ−ＧＦＰ配列は、形質導入効率の追跡を可能にする。
【図４Ａ−４Ｃ】ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ζ及びＮＫＧ２Ｄ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζの発現に関するデータを示す。図４Ａは、形質導入後のＮＫＧ２Ｄ陽性ＮＫ細胞の百分率を例示するフローサイトメトリーデータを示す。図４Ｂは、ＮＫＧ２Ｄ陽性ＮＫ細胞の百分率を要約するドットプロットを示す。図４Ｃは、形質導入後のＮＫ細胞の異なる群における平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関するデータを示す。
【図５Ａ−５Ｃ】培養されたＲＥＨ細胞に対するドナー１、ドナー２及びドナー３（それぞれ図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃ）からのＮＫ細胞から作成された様々な構築物の細胞傷害性に関するデータを示す。
【図６Ａ−６Ｃ】培養されたＵ−２  ＯＳ細胞に対するドナー１、ドナー２及びドナー３（それぞれ図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃ）からのＮＫ細胞から作成された様々な構築物の細胞傷害性に関するデータを示す。
【図７Ａ−７Ｂ】ＲＥＨ細胞による刺激の存在下及び不在下での様々なＮＫＧ２Ｄ構築物を発現するＮＫ細胞によるインターフェロンγの産生に関するデータを示す。図７Ａは、ＲＥＨ細胞による刺激の存在下及び不在下でのＮＫ細胞の異なる群におけるＩＦＮγの相対量を示す。図７Ｂは、刺激後でのＮＫ細胞の異なる群間でのＩＦＮγのレベルを示す（中央値で表される）。
【図８Ａ−８Ｃ】ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ζ及びＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６の発現に関するデータを示す。図８Ａは、形質導入後のＮＫＧ２Ｄ陽性ＮＫ細胞の百分率を例示するフローサイトメトリーデータを示す。図８Ｂは、ＮＫＧ２Ｄ陽性ＮＫ細胞の百分率を要約するドットプロットを示す。図８Ｃは、形質導入後のＮＫ細胞の異なる群における平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関するデータを示す。
【図９Ａ−９Ｃ】培養されたＲＥＨ細胞に対するドナー３名（それぞれ図９Ａ、９Ｂ及び９Ｃ）からのＮＫ細胞から作成された様々な構築物の細胞傷害性に関するデータを示す。
【図１０Ａ−１０Ｃ】培養されたＵ−２  ＯＳ細胞に対するドナー３名（それぞれ図１０Ａ、１０Ｂ及び１０Ｃ）からのＮＫ細胞から作成された様々な構築物の細胞傷害性に関するデータを示す。
【図１１】ＲＥＨ細胞による刺激の存在下及び不在下で様々なＮＫＧ２Ｄ構築物を発現するＮＫ細胞によるインターフェロンγの産生に関するデータを示す。
【図１２Ａ−１２Ｂ】ＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ζ及びＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６−４１ＢＢの発現に関するデータを示す。図１２Ａは、形質導入後のＮＫＧ２Ｄ陽性ＮＫ細胞の百分率を例示するフローサイトメトリーデータを示す。図１２Ｂは、ＮＫ細胞上での様々な構築物の表面発現の相対量に関するヒストグラムを示す。
【図１３Ａ−１３Ｂ】様々なＮＫＧ２ｄ構築物の細胞傷害性の程度に関するデータを示す。図１３Ａは、培養されたＲＥＨ細胞に対する細胞傷害性の程度を示す。図１３Ｂは、培養されたＵ２ＯＳ細胞に対する細胞傷害性の程度を示す。
【図１４】本明細書で開示されるいくつかの実施形態に従う、いくつかのＮＫＧ２Ｄ構築物の構築物マップを概略的に示す。
【図１５】本明細書で開示されるいくつかの実施形態に従う、追加的なＮＫＧ２Ｄ構築物の構築物マップを概略的に示す。
【図１６Ａ−１６Ｃ】ＮＫ細胞における様々なＮＫＧ２Ｄ構築物の発現に関するデータを示す。図１６Ａは、ＮＫ細胞における様々なＮＫＧ２Ｄ構築物の平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関するデータを示す。図１６Ｂは、様々なＮＫＧ２Ｄ構築物のドナー２名（５０５及び８７０）のＮＫ細胞への形質導入後のＮＫＧ２Ｄ陽性及びＣＤ５６陽性ＮＫ細胞の百分率を例示するフローサイトメトリーデータを示す。図１６Ｃは、形質導入から７日後のドナー２名からのＮＫ細胞における平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関するデータを示す。
【図１７】ＮＫ細胞への形質導入から１４日後の１：１のＥ：Ｔ比での様々なＮＫＧ２Ｄ構築物の細胞傷害性に関するデータを示す。
【図１８Ａ−１８Ｂ】ＮＫ細胞への形質導入後の様々なＮＫＧ２Ｄ構築物の発現に関するデータを示す。図１８Ａは、形質導入から７日後のＮＫ細胞における平均蛍光強度（ＭＦＩ）に関するデータを示す。図１８Ｂは、モック形質導入ＮＫ細胞と比べた様々なＮＫＧ２Ｄ構築物のＭＦＩにおける倍数変化に関するデータを示す。
【図１９Ａ−１９Ｂ】様々なＮＫＧ２Ｄ構築物の細胞傷害性に関するデータを示す。図１９Ａは、１：１のＥ：Ｔ比でのＮＫ細胞に形質導入された様々なＮＫＧ２Ｄ構築物の細胞傷害性に関するデータを示す。図１９Ｂは、モック形質導入ＮＫ細胞と比べた様々なＮＫＧ２Ｄ構築物の細胞傷害性におけるパーセント変化に関するデータを示す。
【図２０】ＮＫ細胞への形質導入から１４日後の１：１のＥ：Ｔ比での様々なＮＫＧ２Ｄ構築物の細胞傷害性に関するデータを示す。分析前、ＮＫ細胞は、４０ＩＵのＩＬ−２／ｍＬが添加された培地中で培養された。
【図２１】（２日ごとに４０ＩＵのＩＬ−２／ｍＬが添加された培地中での４日間の培養を伴う）ドナー２３８のＮＫ細胞への形質導入から１０日後の、様々なＮＫＧ２Ｄ構築物の、１：１及び１：２のＥ：Ｔ比で２時間培養されたＲＥＨ細胞に対する細胞傷害性に関するデータを示す。
【図２２】本明細書で開示される実施形態に従う追加的なＮＫＧ２Ｄ構築物の構築物マップを概略的に示す。
【図２３Ａ−２３Ｂ】２つの異なるドナー（それぞれ図２３Ａ及び２３Ｂにおけるドナー６１及びドナー１０３）からのＮＫ細胞から作成された様々なＮＫＧ２Ｄ構築物の持続性に関するデータを示す。ＮＫ細胞は、４０ＩＵのＩＬ−２／ｍＬが添加された培地中で培養された。
【図２４】様々なＮＫＧ２Ｄ構築物の発現に関するデータを示す。ＮＫ細胞は、健常ドナー４名（２２４、２２５、３６２及び３６３）の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から拡大され、指定の構築物の発現を指示するウイルスが形質導入された。形質導入から３日後、ＮＫ細胞は、蛍光標識抗ＮＫＧ２Ｄ抗体で染色され、フローサイトメトリーを用いて分析された。相対的なＮＫＧ２Ｄの発現は、標識細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）により評価された。
【図２５Ａ−２５Ｂ】様々なＮＫＧ２Ｄ構築物が形質導入されたＮＫ細胞の細胞傷害性に関するデータを示す。ＮＫ細胞は、ドナー４名のＰＢＭＣから拡大され；形質導入から８日後、培養されたＲＥＨ及びＨＬ６０細胞（それぞれ図２５Ａ及び２５Ｂ）に対するＮＫ細胞傷害性を１：１のＥ：Ｔ比で測定した。ＮＫ細胞は、分析前、４０ＩＵのＩＬ−２／ｍＬが添加された培地中で培養された。
【図２６Ａ−２６Ｃ】ＲＥＨ腫瘍細胞による一晩刺激後の様々なＮＫＧ２Ｄ構築物を発現するＮＫ細胞によるインターフェロンγ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の産生に関するデータを示す。指定の構築物の形質導入から８日後、１×１０5個のＮＫ細胞を９６ウェル丸底プレートの各ウェル内で１×１０5個のＲＥＨ細胞で刺激し；一晩のインキュベーション後、上清を収集し、関連の標準に対するサイトカインレベルを、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ装置を用いて測定した。刺激後のＮＫ細胞の異なる群において、図２６Ａは、ＩＦＮγの蓄積されたレベルを示し、図２６Ｂは、ＴＮＦαのレベルを示し、図２６Ｃは、ＧＭ−ＣＳＦのレベルを示す。分析前、ＮＫ細胞は、４０ＩＵのＩＬ−２／ｍＬが添加された培地中で培養された。
【図２７Ａ−２７Ｂ】形質導入から７、１４及び２１日後の、様々なＮＫＧ２Ｄ構築物を発現するドナー２名（それぞれ図２７Ａ及び２７Ｂにおけるドナー２２４及び２２５）からのＮＫ細胞の持続性に関するデータを示す。分析前、ＮＫ細胞は、４０ＩＵのＩＬ−２／ｍＬが添加された培地中で培養された。
【図２８Ａ−２８Ｂ】指定のＮＫＧ２Ｄ構築物が形質導入されたＮＫ細胞の細胞傷害性に関するデータを示す。ＮＫ細胞傷害性が、赤色蛍光タンパク質を発現するように安定に形質導入されたＵ２ＯＳ細胞に対して測定され；Ｕ２ＯＳ細胞は、１：４及び１：２のＥ：Ｔ比（それぞれ図２８Ａ及び２８Ｂ）でＮＫ細胞とともに培養された。生きたＵ２ＯＳ細胞が、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｓ３  Ｌｉｖｅ−Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、６０分ごとに７２時間カウントされた。分析前、ＮＫ細胞は、４０ＩＵのＩＬ−２／ｍＬが添加された培地中で培養された。
【発明を実施するための形態】
【０１０９】
概要
多くの疾患の基礎をなす（ウイルス感染及び悪性細胞を含む）異常細胞の出現及び持続は、前記異常細胞に対する不十分な免疫応答によって可能になる。免疫療法の目標は、患者の免疫系の応答を開始又は増強する例えば免疫細胞、例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が損傷又は異常細胞を損傷させるか、殺滅するか、又は他に阻害する能力を後押しすることである。１つの免疫療法アプローチは、異常細胞の認識及び破壊を標的にするための免疫細胞におけるキメラ受容体の組換え発現である。一般に、キメラ受容体は、標的細胞上のリガンドを認識する細胞外受容体ドメイン、アンカー膜貫通ドメイン及びリガンド結合時のシグナルの活性化を伝達するエフェクタードメインを含む。本明細書で開示されるいくつかの実施形態では、その一般的構造を有するか又はその一般的構造におけるバリエーションを有するキメラ受容体が用いられる。加えて、いくつかの実施形態では、膜貫通ドメイン及びエフェクタードメインは、一緒に融合された別々のペプチドである。いくつかの他の実施形態では、膜貫通及びエフェクタードメインは、同じペプチドに由来する。いくつかのかかる実施形態では、膜貫通及びエフェクタードメインは、単一のペプチド（例えば、膜を貫通することに加え、平衡が保たれ、シグナルカスケードを開始させる１つのペプチド）を含む。以下により詳細に考察される通り、免疫細胞（例えばＮＫ細胞）において所望の程度の発現を示し、非標的細胞に対する有害作用を回避する程度の標的結合活性と平衡した、ＮＫ細胞から細胞傷害活性を誘導するキメラ受容体構築物を作製するため、切断、突然変異、追加的なリンカー／スペーサーエレメント、二量体などが用いられる。免疫細胞の表面上での本明細書で開示されるようなキメラ受容体の組換え発現により、目的の異常細胞に対する免疫細胞の標的化が再誘導され、且つ会合時の免疫活性化が増強される可能性がある。
【０１１０】
免疫療法のためのＮＫ細胞
１つの免疫療法アプローチは、キメラ受容体を発現するように操作されたＴ細胞を患者に投与し、陽性免疫応答を誘発することを含む。しかし、この手法の欠点は、患者における移植片対宿主病の誘導を予防するために自家細胞の使用が必要である点である。本明細書で開示されるいくつかの実施形態において提供される通り、操作されたＮＫ細胞を含む組成物は、いくつかの利点を享受する。例えば、自家又はドナー由来同種細胞のいずれかは、ＮＫ細胞アプローチで用いることができる。加えて、いくつかの実施形態によると、本明細書で提供されるような操作されたＮＫ細胞は、正常細胞に対して細胞傷害性を増強することが有意でない。さらに、ＮＫ細胞は、活性化されると、有意な細胞傷害性効果を有する。これを考慮すると、本明細書で提供されるような操作されたＮＫ細胞が、その細胞傷害性効果をさらに高めることにより、罹患した標的細胞を選択的に殺滅するといったさらにより有効な手段を提供し得ることは、想定外である。したがって、いくつかの実施形態では、癌又は感染性疾患を治療又は予防する方法であって、治療有効量の、本明細書に記載のキメラ受容体を発現するＮＫ細胞を投与することを含む方法が提供される。一実施形態では、投与されるＮＫ細胞は、自家細胞である。さらなる実施形態では、投与されるＮＫ細胞は、ドナー由来（同種）細胞である。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体を発現する（例えば、標的細胞上のリガンドに結合することによる）組換えＮＫ細胞の会合及び活性化により、細胞溶解によるストレス及び／又は異常細胞（例えば、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞など）の直接的殺滅がもたらされる。したがって、いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞の細胞傷害性を増強する方法であって、本明細書に記載のキメラ受容体を発現するように操作されたＮＫ細胞を投与することを含む方法が提供される。一実施形態では、投与されるＮＫ細胞は、自家細胞である。さらなる実施形態では、ＮＫ細胞は、ドナー由来（同種）細胞である。いくつかの実施形態では、操作されたＮＫ細胞は、ストレス及び／又は異常細胞（例えば、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞など）の間接的破壊又は阻害をもたらす。
【０１１２】
リガンド結合ドメイン
上記の通り、いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、腫瘍細胞及びウイルス感染細胞を含む異常細胞を認識及び破壊する。これらの天然免疫細胞の細胞傷害活性は、細胞表面上に存在する阻害性及び活性化受容体の各々からのシグナル伝達の平衡によって調節される。前者は、健常細胞の表面上に発現される自己分子に結合する一方、後者は、異常細胞上に発現されるリガンドに結合する。阻害性受容体に対する活性化受容体の会合の増加により、ＮＫ細胞の活性化及び標的細胞の溶解がもたらされる。ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）は、ストレス及び異常細胞上に発現されるいくつかのリガンドを認識する重要なＮＫ細胞の活性化受容体である。様々なＮＫＧ２Ｄリガンドの表面発現は、健常細胞において一般に低いが、悪性形質転換又はウイルス感染時に上方制御される。ＮＫＧ２Ｄによって認識されるリガンドの非限定例として、限定されないが、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５及びＵＬＢＰ６並びにＮＫ細胞の細胞溶解又は細胞傷害性機能を制御する、標的細胞上に発現される他の分子が挙げられる。
【０１１３】
細胞ストレス及び感染の複数の表面マーカーを認識するＮＫＧ２Ｄの能力は、それをキメラ受容体に基づく免疫療法アプローチの潜在的に有用な成分にする。しかし、キメラ受容体としてのＮＫＧ２Ｄの使用を複雑化していることは、パートナーＤＡＰ１０とのその関係性である。ＮＫＧ２Ｄは、ホモ二量体を形成し、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１０（ＤＡＰ１０）の２つのホモ二量体と集合し、膜表面上に六量体複合体を生成するＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。このＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０の会合は、内因性ＮＫＧ２Ｄの表面膜発現とリガンド結合時の活性化シグナルの伝達との両方にとって必要である。いくつかの実施形態では、完全長ＮＫＧ２Ｄが用いられる。一実施形態では、完全長ＮＫＧ２Ｄは、配列番号１の核酸配列を有する。本明細書で開示されるいくつかの実施形態によると、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、細胞外受容体ドメインは、その天然膜貫通又は細胞内ドメインを欠いているが、有利にはＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するとともに、リガンド結合時に活性化シグナルを伝達するその能力を保持するＮＫＧ２Ｄの断片である。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるポリペプチドによってコードされるキメラ受容体は、ＤＡＰ１０を含まない。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ断片は、配列番号２によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの断片は、完全長野生型ＮＫＧ２Ｄと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同である。いくつかの実施形態では、この断片は、配列番号２から１つ以上の追加的な突然変異を有し得るが、リガンド結合機能を保持するか、又はいくつかの実施形態では増強している。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ断片は、二量体、三量体又は他のコンカテマー形式として提供され、かかる実施形態は、リガンド結合活性の増強をもたらす。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ断片をコードする配列は、任意選択により完全に又は部分的にコドン最適化される。一実施形態では、コドン最適化されたＮＫＧ２Ｄ断片をコードする配列は、配列番号３の配列を含む。加えて、いくつかの実施形態では、シグナルペプチドが用いられる。シグナルペプチドの種又は配列は、構築物とともに変化し得る。しかし、いくつかの実施形態では、ＣＤ８由来のシグナルペプチドが用いられる。一実施形態では、シグナルペプチドは、ＣＤ８ａに由来し、配列番号４の配列を有する。一実施形態では、コドン最適化されたＮＫＧ２Ｄ断片をコードする配列は、配列番号６８の配列を含む。いくつかの実施形態では、この断片は、配列番号６８から１つ以上の追加的な突然変異を有し得るが、リガンド結合機能を保持する。いくつかの実施形態では、この断片は、配列番号６８から１つ以上の追加的な突然変異を有し得るが、改善されたリガンド結合機能を有する。
【０１１４】
膜貫通、シグナル伝達及び組み合わせドメイン
上記の通り、一般的なキメラ抗原受容体構造は、リガンド結合ドメインをシグナル伝達ドメインに連結する少なくとも１つの膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、しかし、膜貫通ドメインは、シグナル伝達機能を提供することにも役立ち得る。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ断片は、その正常な膜貫通ドメインの少なくとも一部を保持する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、通常、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の両方で発現される膜貫通糖タンパク質であるＣＤ８の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインがＣＤ８αを含む一方、いくつかの実施形態では、ＣＤ８βが用いられる。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αの「ヒンジ」は、配列番号５の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αは、配列番号５の配列を有するＣＤ８αと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断又は修飾され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ８βは、配列番号６の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８βは、配列番号６の配列を有するＣＤ８βと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断又は修飾され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ８α及びＣＤ８βの二量体が用いられる。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、シグナル伝達ドメインとして同様に役立つＣＤ１６を含む。ＣＤ１６は、２つのアイソフォームａ及びｂ（それぞれＦｃγ受容体ＩＩＩａ及びＩＩＩｂとしても公知）で存在する。これらの受容体は、通常、順番にＮＫ細胞を活性化するＩｇＧ抗体のＦｃ部分に結合する。したがって、いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインがＣＤ１６ａを含む一方、いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ｂが用いられる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ａは、配列番号７の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ａは、配列番号７の配列を有するＣＤ１６ａと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断又は修飾され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ｂは、配列番号８の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ｂは、配列番号８の配列を有するＣＤ１６ｂと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断又は修飾され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ｂの二量体が用いられる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６膜貫通ドメインに対する修飾は、ドメインの長さを増加するための追加的な核酸残基を含む。代わりに、ＣＤ１６は、短縮され得る。ＣＤ１６の長さに対する修飾は、有利にはリガンド−受容体相互作用の増強を促進し得る。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、シグナル伝達ドメインとして同様に役立つナチュラルキラー受容体２Ｂ４ドメイン（本明細書中で「２Ｂ４」と称され、ＣＤ２４４としても公知である）を含む。２Ｂ４は、ＮＫ細胞上で発現され、この受容体と標的細胞上のそのリガンドとの相互作用を通じて、非主要組織適合複合体（ＭＨＣ）制限による殺滅を制御する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、２Ｂ４を含む一方、いくつかの実施形態では、２Ｂ４ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態では、２Ｂ４は、配列番号９の配列を有する。いくつかの実施形態では、２Ｂ４は、配列番号９の配列を有する２Ｂ４と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断又は修飾され得る。いくつかの実施形態では、２Ｂ４は、構築物中の唯一の膜貫通／シグナル伝達ドメインとして用いられるが、いくつかの実施形態では、２Ｂ４は、１つ以上の他のドメインと併用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＤ１６、４−１ＢＢ及び／又は２Ｂ４の組み合わせが用いられる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、シグナル伝達は、上述した通り、ＤＡＰ１０を通じて達成される。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの断片は、ＮＫ細胞に前細胞傷害性シグナルを提供するためにＤＡＰ１０と会合する。いくつかの実施形態では、ＤＡＰ１０の二量体が用いられる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＤＡＰ１０を含む。いくつかの実施形態では、ＤＡＰ１０は、配列番号１０の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＤＡＰ１０は、配列番号１０の配列を有するＤＡＰ１０と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断又は修飾され得る。同様に、いくつかの実施形態では、ＤＡＰ１２もかかるシグナルを伝達し得るために使用可能である。いくつかの実施形態では、ＤＡＰ１２は、配列番号１１の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＤＡＰ１２は、配列番号１１の配列を有するＤＡＰ１２と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断又は修飾され得る。いくつかの実施形態では、ＤＡＰ１０及びＤＡＰ１２のヘテロ二量体が用いられる。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７及び腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９）としても公知である）を通じてシグナル伝達が提供される。４−１ＢＢは、典型的には活性化Ｔ細胞のための刺激性分子として機能する（例えば、４−１ＢＢの架橋によりＴ細胞増殖及び細胞溶解活性が増強される）同時刺激性の免疫チェックポイント分子である。しかし、いくつかの実施形態では、４−１ＢＢの機能は、有利にはＮＫ細胞と併せて用いられる。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢは、配列番号１２の配列を有する。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢは、配列番号１２の配列を有する４−１ＢＢと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断又は修飾され得る。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢは、唯一のシグナル伝達ドメインであるが、上で考察の通り、いくつかの実施形態では、４−１ＢＢは、本明細書で開示される他の膜貫通／シグナル伝達ドメインの１つ以上と併せて意外にも十分に機能する。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＤ１６は、４−１ＢＢと併せて相乗的刺激効果をもたらし、特に有効な（例えば、細胞傷害性）ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、ＤＡＰ１０は、４−１ＢＢと併せて相乗的刺激効果をもたらし、特に有効な（例えば、細胞傷害性）ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、ＤＡＰ１０は、４−１ＢＢ及び／又は２Ｂ４と併せて相乗的刺激効果をもたらし、特に有効な（例えば、細胞傷害性）ＮＫ細胞をもたらす。他の改善された特徴により、いくつかの実施形態では、例えば改善された発現、改善された持続性などが得られる。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３  Ｔ細胞受容体複合体の少なくとも一部を含む。Ｔ細胞受容体複合体は、ζ、α、β、γ、δ及びεサブユニットを含む複数のサブユニットを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるいくつかの実施形態に従って操作されたＮＫ細胞は、これらサブユニット（又はその断片）の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζサブユニットを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζは、配列番号１３の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζは、配列番号１３の配列を有するＣＤ３ζと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断又は修飾され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζは、ドメインがもはや基準の免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ又はＩＴＡＭモチーフに一致しないように突然変異される（例えば、アミノ酸の突然変異、挿入又は欠失）。したがって、いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＩＴＡＭモチーフを含まない操作された受容体を含む。いくつかの実施形態では、得られる操作されたＮＫ細胞は、特に標的細胞に対して増強された細胞傷害性を示すとともに、有害な副作用は、制限又は低減される。いくつかの実施形態では、これは、その所与の実施形態において用いられるキメラ受容体の様々な部分の相乗的相互作用に起因する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζは、４−１ＢＢと併せて相乗的刺激効果をもたらし、特に有効な（例えば、細胞傷害性）ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζは、２Ｂ４と併せて相乗的刺激効果をもたらし、特に有効な（例えば、細胞傷害性）ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζは、２Ｂ４及び４−１ＢＢと併せて相乗的刺激効果をもたらし、特に有効な（例えば、細胞傷害性）ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、その膜貫通ドメインを介してＣＤ３ζの二量体化に影響する。したがって、いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン（又はその断片）を含む。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６つ又はそれを超える細胞外ＣＤ３ζ残基（「膜近傍部分」）は、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインに直に隣接する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインは、配列番号６９の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインは、配列番号６９の配列を有するＣＤ３ζ膜貫通ドメインと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断又は修飾され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインに対する修飾は、ドメインの長さを増加させるための追加的な核酸残基を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン及びＣＤ３ζ膜近傍部分は、完全長ＣＤ３ζ分子をシナプスに動員する。いくつかの実施形態では、天然ＣＤ３ζの（ＣＤ３ζ膜貫通ドメインを有しない受容体と比べて）操作された受容体への動員は、実施形態に応じて、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％又はそれを超えて増強される。い���つかの実施形態では、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインは、ＣＤ１６、ＮＣＲ１、ＮＣＲ２、ＮＣＲ３、４−１ＢＢ、ＮＫｐ８０、ＦｃＲγ、ＣＤ３ζ及び２Ｂ４の１つ以上を含むエフェクタードメインに共役される。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＣＤ２８ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８を含む一方、いくつかの実施形態では、ＣＤ２８ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインであり、またいくつかの実施形態では、ＣＤ２８ドメインは、膜貫通／細胞内シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１０５の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１０５の配列を有するＣＤ２８と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断又は修飾され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１０６の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１０６の配列を有するＣＤ２８と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断又は修飾され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８は、構築物中の唯一の膜貫通／シグナル伝達ドメインとして用いられるが、いくつかの実施形態では、ＣＤ２８は、１つ以上の他のドメインと併用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４−１ＢＢ及び／又はＣＤ３ζの組み合わせが用いられる。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体は、ＯＸ４０ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１０７の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号１０７の配列を有するＯＸ４０と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断又は修飾され得る。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０は、構築物中の唯一の膜貫通／シグナル伝達ドメインとして用いられるが、いくつかの実施形態では、ＯＸ４０は、１つ以上の他のドメインと併用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４−１ＢＢ及び／又はＣＤ３ζの組み合わせが用いられる。
【０１２３】
なおさらなる実施形態では、キメラ受容体のシグナル伝達部分は、ＩＴＡＭの一部、例えばヘミ−タムを含む。いくつかの実施形態では、これらの部分は、基準のＩＴＡＭ配列を構成しないというよりも、ＮＫ細胞の細胞傷害性に要求されるシグナルをさらに伝達し得る部分を含む。いくつかの実施形態では、ヘミ−タムは、配列番号１４の配列を有する（ここで、Ｘは、任意の残基であり得る）。いくつかの実施形態では、ヘミ−タムは、配列番号１４の配列を有するヘミ−タムと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断又は修飾され得る。いくつかの実施形態では、キメラ受容体構築物は、配列番号１４のヘミ−タムを含む。いくつかの実施形態では、複数のヘミ−タムは、例えば、ヘッドトゥテール、テールトゥヘッド、ヘッドトゥヘッド又はテールトゥテールの配置で使用可能である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヘミ−タムの存在は、少なくとも１つのヘミ−タムを用いるキメラ受容体を含むＮＫ細胞に対し、増強されたシグナル伝達及び細胞傷害性をもたらす。以下により詳細に考察される通り、いくつかのキメラ受容体は、ヘミ−タムの１つの非限定例であるＮＫｐ８０を含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、例えば、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリーの受容体に由来するシグナル伝達領域を含む追加的なシグナル伝達領域が用いられる。これらの受容体として、限定されないが、２Ｂ４（上で考察）が挙げられる。ＳＬＡＭファミリーの受容体は、それらの細胞質側末端においてチロシンに基づく共通モチーフを共有する。そのモチーフは、免疫受容体チロシンに基づくスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）と称されるＳ／ＴｘＹｘｘＬ／Ｉである（配列番号１５）。これらの受容体は、チロシンキナーゼＦｙｎを動員するＳＬＡＭ関連タンパク質（ＳＡＰ、遺伝子ＳＨ２Ｄ１Ａによってコードされる）を通じて活性化シグナルを伝達する。したがって、いくつかの実施形態によると、シグナル伝達領域は、ＩＴＳＭモチーフを含むポリペプチド配列（又はそれをコードする核酸）を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＳＭモチーフは、完全にコードされる必要はないが、シグナル伝達領域は、ＳＡＰ（又は別の類似経路）を通じて活性化シグナルを伝達することができる。いくつかの実施形態では、ＩＴＳＭモチーフは、配列番号１５の配列を有する（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸残基であり得る）。いくつかの実施形態では、ＩＴＳＭモチーフは、配列番号１５の配列を有するＩＴＳＭモチーフと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断又は修飾され得る。いくつかの実施形態では、ＩＴＳＭモチーフは、配列番号１５の配列を含む。
【０１２５】
ＮＫＧ２Ｄ受容体、膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメイン（及び膜貫通／シグナル伝達ドメインの組み合わせ）におけるこれらのバリエーションに加えて、いくつかの実施形態では、追加的な同時活性化分子が提供され得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、膜結合性インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように操作される。かかる実施形態では、ＮＫ細胞上でのｍｂＩＬ１５の存在は、ＮＫ細胞の増殖及び寿命を相乗的に高めることにより、ＮＫ細胞の細胞傷害性効果をさらに増強するように機能する。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５は、配列番号１６の核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５は、配列番号１６の配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相同であるように切断又は修飾され得る。いくつかの実施形態では、ｍｂＩＬ１５は、配列番号１７のアミノ酸配列を有する。本明細書で開示されるキメラ受容体と併せて、かかる実施形態は、特定の標的細胞を標的化及び破壊するのに特に有効なＮＫ細胞組成物を提供する。
【０１２６】
キメラ受容体構築物
本明細書に記載された本開示を考慮して、特定の標的細胞（例えば、疾患細胞又は癌細胞）に標的を定めて破壊するために、ＮＫ細胞中で生成及び発現され得る様々なキメラ受容体が存在する。そのようなキメラ受容体の非限定的な例を下記でより詳細に論じる。
【０１２７】
上記で論じたように、Ｔ細胞受容体複合体の一部（具体的にはＣＤ３ζ）は、免疫シグナル伝達カスケードの強力な活性化因子として機能する。同様に、腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーである受容体４−１ＢＢは、リガンドの結合時にＮＫ細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、これらの２つのシグナル伝達成分は、キメラ受容体へのリガンドの結合時に相乗的に作用してＮＫ細胞を活性化する。そのため、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ８ａ／４−１ＢＢ／ＣＤ３ζキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片細胞外受容体ドメインと、ＣＤ８膜貫通領域と、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメインとを含む。一実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号１８の核酸配列によってコードされる。一実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号１０８の核酸配列によってコードされる。さらに別の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζキメラ受容体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、この構築物は、ＮＫ細胞がｍｂＩＬ１５を同時に発現する場合に特に有効であり、ｍｂＩＬ１５は、ＮＫ細胞の活性化及び細胞傷害性に関してさらなる相乗効果をもたらす。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号１８と異なり得る（例えば、配列番号１０８）が、実施形態に応じて、配列番号１８と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号１８と異なり得る（例えば、配列番号１０８）が、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。
【０１２８】
受容体２Ｂ４は、いくつかの免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を有し、活性化シグナルを伝達する可能性がある。同様に、腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーである受容体４−１ＢＢを介したシグナル伝達もリガンドの結合時にＮＫ細胞を活性化する。そのため、これらのシグナル伝達分子が協働して細胞傷害性ＮＫ細胞を予想外にも効果的に生成する能力を利用して、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ８ａ／２Ｂ４／４−１ＢＢキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片細胞外受容体ドメインと、ＣＤ８ａ膜貫通領域と、４−１ＢＢ及び２Ｂ４のシグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメインとを含む。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、２Ｂ４とＣＤ３ζとの組み合わせは、ＮＫ細胞とともに使用されて標的細胞に対する細胞傷害性を高める。そのため、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ８ａ／２Ｂ４／ＣＤ３ζキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片細胞外受容体ドメインと、ＣＤ８ａ膜貫通領域と、ＣＤ３ζ及び２Ｂ４のシグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメインとを含む。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。上記で論じたように、４−１ＢＢは、ＣＤ３ζ及び２Ｂ４と同様に、免疫シグナル伝達カスケードの強力な活性化因子として機能し得る。いくつかの実施形態では、これらの３つのシグナル伝達成分は、キメラ受容体へのリガンドの結合時に相乗的に作用してＮＫ細胞を活性化する。そのため、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ８ａ／４−１ＢＢ／２Ｂ４／ＣＤ３ζキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片細胞外受容体ドメインと、ＣＤ８膜貫通領域と、４−１ＢＢ、２Ｂ４及びＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメインとを含む。一実施形態では、このキメラセレプターは、配列番号５８の核酸配列によってコードされる。さらに別の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζキメラ受容体は、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、この構築物は、ＮＫ細胞がｍｂＩＬ１５を同時に発現する場合に特に有効であり、ｍｂＩＬ１５は、ＮＫ細胞の活性化及び／又は細胞傷害性に関してさらなる相乗効果をもたらす。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号５８と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号５８と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号５８と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。
【０１３０】
いくつかの代替実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ８ａ／ＤＡＰ１０／４−１ＢＢキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片細胞外受容体ドメインと、ＣＤ８ａ膜貫通領域と、４−１ＢＢ及びＤＡＰ１０のシグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメインとを含む。一実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号６０の核酸配列によってコードされる。さらに別の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＤＡＰ１０キメラ受容体は、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。いくつかの実施形態では、この構築物は、ＮＫ細胞がｍｂＩＬ１５を同時に発現する場合に特に有効であり、ｍｂＩＬ１５は、ＮＫ細胞の活性化及び細胞傷害性に関してさらなる相乗効果をもたらす。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号６０と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号６０と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号６０と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。さらに、上記で論じたように、２Ｂ４は、ＤＡＰ１０及び４−１ＢＢと同様に、免疫シグナル伝達カスケードの強力な活性化因子である。いくつかの実施形態では、これらの３つのシグナル伝達成分は、キメラ受容体へのリガンドの結合時に相乗的に作用してＮＫ細胞を活性化する。そのため、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ８ａ／４−１ＢＢ／ＤＡＰ１０／２Ｂ４キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片細胞外受容体ドメインと、ＣＤ８膜貫通領域と、４−１ＢＢ、２Ｂ４及びＤＡＰ１０のシグナル伝達ドメインを含むエフェクードメインとを含み、４−１ＢＢの後にＤＡＰ１０が続き、ＤＡＰ１０の後に２Ｂ４が続く。一実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号６２の核酸配列によってコードされる。さらに別の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζキメラ受容体は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、この構築物は、ＮＫ細胞がｍｂＩＬ１５を同時に発現する場合に特に有効であり、ｍｂＩＬ１５は、ＮＫ細胞の活性化及び細胞傷害性に関してさらなる相乗効果をもたらす。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号６２と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号６２と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号６２と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。いくつかの他の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ８ａ／４−１ＢＢ／２Ｂ４／ＤＡＰ���０キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片細胞外受容体ドメインと、ＣＤ８膜貫通領域と、４−１ＢＢ、２Ｂ４及びＤＡＰ１０のシグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメインとを含み、４−１ＢＢの後に２Ｂ４が続き、２Ｂ４の後にＤＡＰ１０が続く。一実施形態では、このキメラセレプターは、配列番号６４の核酸配列によってコードされる。さらに別の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζキメラ受容体は、配列番号６５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、この構築物は、ＮＫ細胞がｍｂＩＬ１５を同時に発現する場合に特に有効であり、ｍｂＩＬ１５は、ＮＫ細胞の活性化及び細胞傷害性に関してさらなる相乗効果をもたらす。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号６４と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号６４と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号６４と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。
【０１３１】
いくつかの追加的な実施形態では、本キメラ受容体の膜貫通ドメイン及びエフェクタードメイン（並びに関連する機能）は、同一のペプチドに由来する。ＣＤ１６は、ＮＫ細胞の表面上で発現される強力な活性化受容体である。そのため、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ１６キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片細胞外受容体ドメインと、膜貫通領域及び細胞内エフェクタードメインの両方を含むＣＤ１６ペプチドとを含む。一実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号２３の核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、このキメラセレプターは、配列番号２４のアミン酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号２３と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号２３と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号２３と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。
【０１３２】
いくつかの追加的な実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ１６／４−１ＢＢキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、エフェクタードメイン中における活性化シグナルの第２のトランスデューサーとして機能する。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。
【０１３３】
ＣＤ３ζは、その膜貫通ドメインを介して二量体化する。そのため、いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインがシナプスに完全長ＣＤ３ζ分子を補充するキメラ受容体が提供される。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片と、ＣＤ８ａヒンジと、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインに直接隣接する０、１、２、３、４、５、６つ又はより多くの細胞外ＣＤ３ζ残基（「膜近傍部分」）と、ＣＤ１６、ＮＣＲ１、ＮＣＲ２、ＮＣＲ３、４−１ＢＢ、ＮＫｐ８０、ＦｃＲγ、ＣＤ３ζ及び２Ｂ４の１つ又は複数を含むエフェクタードメインとを含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供される。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインが、４−１ＢＢ及びＣＤ１６の一方又は両方を含むエフェクタードメインに共役されているキメラ受容体が提供される。そのため、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ３ζＴＭ／４−１ＢＢキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラセレプターは、ＣＤ８ａヒンジに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片と、ＣＤ３ζ膜貫通領域と、４−１ＢＢを含むエフェクタードメインとを含む。一実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号７８の核酸配列を含む。さらの別の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号７９のアミノ酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号７８と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号７８と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号７８と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ３ζＴＭ／ＣＤ１６／４−１ＢＢキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片と、ＣＤ３ζ膜貫通領域と、ＣＤ１６及びそれに続く４−１ＢＢを含むエフェクタードメインとを含む。一実施形態では、このキメラセレプターは、配列番号７０の核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、このキメラセレプターは、配列番号７１のアミノ酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号７０と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号７０と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号７０と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。さらに、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ３ζＴＭ／４−１ＢＢ／ＣＤ１６キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラセプターは、ＣＤ８ａヒンジに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片と、ＣＤ３ζ膜貫通領域と、４−１ＢＢ及びそれに続くＣＤ１６を含むエフェクタードメインとを含む。一部の実施形態では、このエフェクタードメインは、ＧＳ３リンカーをさらに含む。一部の実施形態では、このＧＳ３リンカーは、４−１ＢＢとＣＤ１６との間に位置する。一実施形態では、このキメラセレプターは、配列番号８４の核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号８５のアミノ酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号８４と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号８４と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号８４と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。さらに、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄｘ２／ＣＤ３ζＴＭ／ＣＤ１６／４−１ＢＢキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＧＳ３リンカーに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片と、追加的なＮＫＧ２Ｄ断片と、ＣＤ８ａヒンジと、ＣＤ３ζ膜貫通領域と、ＣＤ１６及び４−１ＢＢを含むエフェクタードメインとを含む。一実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号７２の核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、このキメラセレプターは、配列番号７３のアミノ酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号７２と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号７２と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号７２と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインが、ＮＫｐ８０を含むエフェクタードメインに共役されているキメラ受容体が提供される。そのため、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ３ζＴＭ／ＣＤ１６／４−１ＢＢ／ＮＫｐ８０キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラセレプターは、ＣＤ８ａヒンジに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片と、ＣＤ３ζ膜貫通領域と、ＣＤ１６、４−１ＢＢ及びＮＫｐ８０を含むエフェクタードメインとを含む。一部の実施形態では、このエフェクタードメインは、ＧＳ３リンカーをさらに含む。一部の実施形態では、このＧＳ３リンカーは、４−１ＢＢとＮＫｐ８０との間に位置する。一実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号７４の核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号７５のアミノ酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号７４と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号７４と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号７４と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。さらに、いくつかの実施形態では、２ｘＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ３ζＴＭ／ＣＤ１６／４−１ＢＢ／ＮＫｐ８０キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＧＳ３リンカーに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片と、追加的なＮＫＧ２Ｄ断片と、ＣＤ８ａヒンジと、ＣＤ３ζ膜貫通領域と、ＣＤ１６、４−１ＢＢ及びＮＫｐ８０を含むエフェクタードメインとを含む。一部の実施形態では、このエフェクタードメインは、ＧＳ３リンカーをさらに含む。一部の実施形態では、このＧＳ３リンカーは、４−１ＢＢとＮＫｐ８０との間に位置する。一実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号７６の核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号７７のアミノ酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号７６と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号７６と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号７６と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。さらに、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ３ζＴＭ／４−１ＢＢ／ＮＫｐ８０キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片と、ＣＤ３ζ膜貫通領域と、４−１ＢＢ及びＮＫｐ８０を含���エフェクタードメインとを含む。一部の実施形態では、このエフェクタードメインは、ＧＳ３リンカーをさらに含む。一部の実施形態では、このＧＳ３リンカーは、４−１ＢＢとＮＫｐ８０との間に位置する。一実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号８２の核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号８３のアミノ酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号８２と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号８２と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号８２と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインが、ＣＤ３ζを含むエフェクタードメインに共役されているキメラ受容体が提供される。そのため、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ３ζＴＭ／４−１ＢＢ／ＣＤ３ζキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片と、ＣＤ３ζ膜貫通領域と、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζを含むエフェクタードメインとを含む。一実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号８０の核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号８１のアミノ酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号８０と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号８０と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号８０と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインが、ＦｃＲγを含むエフェクタードメインに共役されているキメラ受容体が提供される。そのため、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ３ζＴＭ／４−１ＢＢ／ＦｃＲγキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＣＤ８ａヒンジに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片と、ＣＤ３ζ膜貫通領域と、４−１ＢＢ及びＦｃＲγを含むエフェクタードメインとを含む。一実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号８６の核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号８７のアミノ酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号８６と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号８６と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号８６と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインが、ＣＤ２８を含むエフェクタードメインに共役されているキメラ受容体が提供される。そのため、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ３ζＴＭ／ＣＤ２８／ＣＤ３ζキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片細胞外受容体ドメインと、ＣＤ８ａヒンジと、ＣＤ３ζ膜貫通領域と、ＣＤ２８及びＣＤ３ζを含む細胞内エフェクタードメインとを含む。一実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号１０２の核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号１０３のアミノ酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号１０２と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号１０２と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号１０２と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、細胞外ドメインが、ＩＬ１５に結合したＮＫＧ２Ｄの断片を含むキメラ受容体が提供される。そのため、いくつかの実施形態では、ＩＬ１５／ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ８ａ／４−１ＢＢ／ＣＤ３ζキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＩＬ−１５に共役されたＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片細胞外受容体ドメインと、ＣＤ８ａヒンジと、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインと、４−１ＢＢ及びＣＤ３ｚを含む細胞内エフェクタードメインとを含む。一部の実施形態では、この細胞外ドメインは、ＧＳ３リンカーをさらに含む。一部の実施形態では、このＧＳ３リンカーは、ＩＬ１５とＮＫＧ２Ｄ断片細胞外受容体ドメインとの間に位置する。一実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号８８の核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号８９のアミノ酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号８８と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号８８と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号８８と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、細胞外ドメインが、ＩｇＧ短ヒンジに共役されたＮＫＧ２Ｄの断片を含むキメラ受容体が提供される。そのため、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＩｇＧ４／ＣＤ８ａ／４−１ＢＢ／ＣＤ３ζキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片細胞外受容体ドメインと、ＩｇＧ４短ヒンジと、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインと、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζを含む細胞内エフェクタードメインとを含む。一実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号９６の核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号９７のアミノ酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号９６と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号９６と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号９６と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、エフェクタードメインがＯＸ４０を含むキメラ受容体が提供される。そのため、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ８ａ／ＯＸ４０／ＣＤ３ｚキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片細胞外受容体ドメインと、ＣＤ８ａヒンジと、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインと、ＯＸ４０及びＣＤ３ｚを含む細胞内エフェクタードメインとを含む。一実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号９０の核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号９１のアミノ酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号９０と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号９０と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号９０と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＩｇＧ４／ＣＤ８ａ／ＯＸ４０／ＣＤ３ζキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片細胞外受容体ドメインと、ＩｇＧ４ヒンジと、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインと、ＯＸ４０及びＣＤ３ζを含む細胞内エフェクタードメインとを含む。一実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号１００の核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号１０１のアミノ酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号１００と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号１００と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号１００と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、膜貫通領域及び細胞内エフェクタードメインの両方を含むＣＤ２８ペプチドを含むキメラ受容体が提供される。そのため、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ２８／ＣＤ３ζキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片細胞外受容体ドメインと、ＣＤ８ａヒンジと、ＣＤ２８膜貫通／細胞内ドメインと、ＣＤ３ζとを含む。一実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号９２の核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号９３のアミノ酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号９２と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号９２と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号９２と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。さらなる実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＣＤ２８／ＣＤ３ζ／４−１ＢＢキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片細胞外受容体ドメインと、ＣＤ８ａヒンジと、ＣＤ２８膜貫通／細胞内ドメインと、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζとを含む。一実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号９４の核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号９５のアミノ酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号９４と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号９４と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号９４と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。さらなる実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＩｇＧ４／ＣＤ２８／ＣＤ３ζキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片細胞外受容体ドメインと、ＩｇＧ４ヒンジと、ＣＤ２８膜貫通／細胞内ドメインと、ＣＤ３ζとを含む。一実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号９８の核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号９９のアミノ酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号９８と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号９８と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号９８と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。
【０１４４】
ＮＣＲ１（ＮＫｐ４６）、ＮＣＲ２（ＮＫｐ４４）及びＮＣＲ３（ＮＫｐ３０）は、リガンドの結合時に活性化シグナルを伝達する、ＮＫ細胞上の受容体である。そのため、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＮＣＲ１キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片細胞外受容体ドメインと、膜貫通領域及び細胞内エフェクタードメインの両方を含むＮＣＲ１ペプチドとを含む。一実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号２７の核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、このキメラセレプターは、配列番号２８のアミノ酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号３０と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号２７と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号２７と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。
【０１４５】
いくつかの追加的な実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＮＣＲ１／４−１ＢＢキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、エフェクタードメイン中における活性化シグナルの第２のトランスデューサーとして機能し、ＮＫ細胞の活性化及び細胞傷害性が相乗的に増強される。いくつかの追加的な実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＮＣＲ２キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片細胞外受容体ドメインと、膜貫通領域及び細胞内エフェクタードメインの両方を含むＮＣＲ２ペプチドとを含む。ＮＣＲ１と同様に、いくつかの実施形態では、これらの構築物は、それらの比較的小さいサイズ及び配列の単純さに起因して、このキメラ受容体を発現するＮＫ細胞の作成での使用に特に適している。しかしながら、これらの構築物は、いくつかの実施形態では、この構築物の見かけ上の単純さにもかかわらず、非常に効果的なＮＫ細胞を生じる能力を保持する。加えて、いくつかの実施形態では、これらの構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。
【０１４６】
いくつかの追加的な実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＮＣＲ３キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、このキメラ受容体は、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するＮＫＧ２Ｄ断片細胞外受容体ドメインと、膜貫通領域及び細胞内エフェクタードメインの両方を含むＮＣＲ３ペプチドとを含む。ＮＣＲ１及び又はＮＣＲ２と同様に、いくつかの実施形態では、これらの構築物は、それらの比較的小さいサイズ及び配列の単純さに起因して、このキメラ受容体を発現するＮＫ細胞の作成での使用に特に適している。しかしながら、これらの構築物は、いくつかの実施形態では、この構築物の見かけ上の単純さにもかかわらず、非常に効果的なＮＫ細胞を生じる能力を保持する。一実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号２９の核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、このキメラセレプターは、配列番号３０のアミノ酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体の配列は、配列番号２９と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号２９と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号２９と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。
【０１４７】
いくつかの追加的な実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＮＣＲ２／４−１ＢＢキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、エフェクタードメイン中における活性化シグナルの第２のトランスデューサーとして機能し、それにより、シグナル伝達ドメイン間の相乗効果と、予想外にも効果的な細胞傷害性ＮＫ細胞とが生じる。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。
【０１４８】
いくつかの追加的な実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ／ＮＣＲ３／４−１ＢＢキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドが提供され、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、エフェクタードメイン中における活性化シグナルの第２のトランスデューサーとして機能し、それにより、シグナル伝達ドメイン間の相乗効果と、予想外にも効果的な細胞傷害性ＮＫ細胞とが生じる。加えて、いくつかの実施形態では、この構築物は、任意選択によりｍｂＩＬ１５と同時発現され得る。
【０１４９】
一部の実施形態では、本明細書で開示されたキメラ受容体の表面発現及び効力は、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ断片と膜貫通ドメインとの間の細胞外ドメインに位置するスペーサー領域（ヒンジ）の変動により増強される。一部の実施形態では、このヒンジ領域は、このキメラ受容体の他の部分間（例えば、細胞内ドメインと膜貫通ドメインとの間又は複数の細胞内ドメイン間）に含まれ得る。一部の実施形態では、本明細書の他の箇所で開示される特定の目的に役立つドメインは、追加的な機能を果たし得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＤ８ａは、（いくつかの実施形態では配列番号５の核酸配列によってコードされる）ヒンジ領域として機能するように再利用される。さらに別の実施形態では、このヒンジ領域は、ＣＤ８ａのＮ末端切頭型及び／又はＣＤ８ａのＣ末端切頭型を含む。実施形態に応じて、これらの切頭は、配列番号５によってコードされるヒンジに対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％相同であり得る。いくつかの追加的な実施形態では、このヒンジは、グリシン残基及びセリン残基のスパン（本明細書では「ＧＳリンカー」と称される）を含み、ＧＳｎは、配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（配列番号４２）を表す。一実施形態では、このヒンジは、ＣＤ８ａ及びＧＳ３の両方を含み、配列番号３２のアミノ酸配列によってコードされ、例えばｎ＝３である。追加的な実施形態では、ｎの値は、実施形態に応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５と等しいか又はそれより高いことができる。いくつかの実施形態では、このヒンジは、ＧＳｎ／ＣＤ８ａとして構成されている可能性もある。代わりに、このＧＳリンカーは、ヒンジ領域全体を含み得る。そのような一実施形態では、このヒンジ領域は、配列番号３３の核酸配列によってコードされる。別のそのような実施形態では、このヒンジ領域は、配列番号３４の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４は、（いくつかの実施形態では配列番号１０４の核酸配列によってコードされる）ヒンジ領域として再利用される。さらに別の実施形態では、このヒンジ領域は、ＩｇＧ４のＮ末端切頭型及び／又はＩｇＧ４のＣ末端切頭型を含む。実施形態に応じて、これらの切頭は、配列番号１０４によってコードされるヒンジに対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％相同であり得る。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本キメラ受容体構築物は、２Ｂ４細胞内シグナル伝達ドメインを利用する。いくつかの実施形態では、このドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、この２Ｂ４ドメインは、配列番号３６の核酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、キメラ受容体中で使用される２Ｂ４細胞内ドメインの配列は、配列番号３６と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号３６と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体のシグナル伝達ドメインは、配列番号３６と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。同様に、いくつかの実施形態では、ＮＫｐ８０細胞内ドメインがいくつかの実施形態で使用される。一部の実施形態では、このＮＫｐ８０ドメインは、唯一の細胞内シグナル伝達ドメインであるが、一部の実施形態では、このドメインは、１つ又は複数の追加的なドメインとともに使用される。いくつかの実施形態では、このＮＫｐ８０は、配列番号３７のアミノ酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、このＮＫｐ８０ドメインは、配列番号３８の核酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、キメラ受容体中で使用されるＮＫｐ８０細胞内ドメインの配列は、配列番号３８と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号３８と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体のシグナル伝達ドメインは、配列番号３８と異なり得るが、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞の活性化機能及び／又は細胞傷害機能を保持するか、又は一部の実施形態では増強している。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本キメラ受容体は、膜貫通ドメインとしてβアドレナリン受容体の一部を使用する。いくつかの実施形態では、この部分は、βアドレナリン細胞外ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、この部分は、βアドレナリン受容体膜貫通ドメインの一部である。いくつかの実施形態では、βアドレナリン受容体の細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインの組み合わせが使用される。実施形態に応じて、この部分は、β−１及び／β−２のアドレナリン受容体に由来する。いくつかの実施形態では、このβ−２アドレナリン受容体のＮ末端細胞外領域の一部が使用される。いくつかの実施形態では、この部分は、配列番号３９のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、細胞外β−２アドレナリンドメインは、配列番号４０の核酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、キメラ受容体中で使用される細胞外β−２アドレナリンドメインの配列は、配列番号３９と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号３９と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このβ−２アドレナリン受容体の第１の膜貫通ヘリックスは、任意選択により細胞外β−２アドレナリンドメインとともに使用される。いくつかの実施形態では、このβ−２アドレナリン受容体の第１の膜貫通ヘリックスは、配列番号４１のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、このβ−２アドレナリン受容体の第１の膜貫通ヘリックスは、配列番号４２の核酸配列によってコードされる。一部の実施形態では、キメラ受容体中で使用されるβ−２アドレナリン受容体の第１の膜貫通ヘリックスの配列は、配列番号４１と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号４１と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。
【０１５２】
一実施形態では、本キメラ受容体は、ＣＤ８、切頭型ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ８ａ、膜貫通ドメイン、ＣＤ１６細胞内ドメイン及び共刺激分子として４−１ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、そのような構築物は、配列番号２５によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号２５と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号２５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、ＣＤ８を囲むヒンジ領域は、非限定的な例としてＧＳ３等のＧＳリンカー（本明細書で開示されている）の追加により増加する。そのような実施形態では、この構築物は、配列番号４３の核酸によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号４３と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号４３と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、ＣＤ８を囲むヒンジ領域は、ＧＳ１２等のより長いＧＳリンカー又は他のリンカーの追加により増加する。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＣＤ８を切頭することにより減少する。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＤ８ａのＮ末端領域は、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又は少なくとも５０％切頭されている。いくつかの実施形態では、このＣＤ８ヒンジ領域は、ＧＳリンカーに置き換えられている。例えば、いくつかの実施形態では、このヒンジ領域は、ＧＳ３リンカーを含み、それにより、構築物は、ＮＫＧ２Ｄ−ＧＳ３−ＣＤ１６−４−１ＢＢを含む。一実施形態では、そのような構築物は、配列番号４４の核酸によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号４４と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号４４と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、ＣＤ８又はＧＳｎのいずれも使用されない。一実施形態では、そのような構築物は、配列番号４５の核酸によってコードされる。一部の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号４５と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号４５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。
【０１５３】
上記で論じたように、いくつかの実施形態では、コドン最適化された配列が利用される。例えば、いくつかの実施形態では、コドン最適化（完全又は部分的）は、キメラ受容体のＮＫＧ２Ｄドメイン上で実施される。しかしながら、いくつかの実施形態では、コドン最適化は、実施されない。いくつかの実施形態では、キメラ受容体構築物は、最適化されていないＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインと、ＣＤ８ａヒンジと、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインとを備えている。いくつかの実施形態では、キメラ受容体構築物は、最適化されていないＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインと、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメインと、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインとを備えている。いくつかの実施形態では、キメラ受容体構築物は、最適化されていないＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインと、ＣＤ８ａヒンジ及び膜貫通ドメインと、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインと、２Ｂ４シグナル伝達ドメインとを備えている。いくつかの実施形態では、そのような構築物は、配列番号４６の核酸配列を有する。一部の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号４６と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号４６と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体構築物は、最適化されていないＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインと、βアドレナリン由来膜貫通ドメインと、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインとを備えている。いくつかの実施形態では、キメラ受容体構築物は、最適化されていないＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインと、β−２アドレナリン受容体の細胞外領域及びβ−２アドレナリン受容体の第１の膜貫通ヘリックスで構成されているβアドレナリン由来膜貫通ドメインと、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインとを備えている。いくつかの実施形態では、キメラ受容体構築物は、最適化されていないＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインと、β−２アドレナリン受容体の細胞外領域及びβ−２アドレナリン受容体の第１の膜貫通ヘリックスで構成されているβアドレナリン由来膜貫通ドメインと、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインと、２Ｂ４シグナル伝達ドメインとを備えている。いくつかの実施形態では、そのような構築物は、配列番号４７の核酸配列を有する。一部の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号４７と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号４７と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体構築物は、最適化されていないＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインと、ＣＤ８ａヒンジと、２Ｂ４シグナル伝達ドメインとを備えている。いくつかの実施形態では、キメラ受容体構築物は、最適化されていないＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインと、ＣＤ８ａヒンジ及び膜貫通ドメインと、２Ｂ４シグナル伝達ドメイン及び４−１ＢＢシグナル伝達ドメインの両方とを備えている。いくつかの実施形態では、キメラ受容体構築物は、最適化されていないＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインと、ＣＤ８ヒンジ及び膜貫通ドメインと、４−１ＢＢシグナル伝達ドメイン及び２Ｂ４シグナル伝達ドメインと、ＮＫｐ８０ドメインとを備えている。いくつかの実施形態では、２Ｂ４ドメイン及びＮＫｐ８０ドメインは、ＧＳ３リンカー等のＧＳリンカーにより連結されている。いくつかの実施形態では、そのような構築物は、配列番号４８の核酸配列を有する。一部の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号４８と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号４８と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、キメラ受容体構築物は、最適化されていないＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインと、ＣＤ８ａヒンジと、ＮＫｐ８０シグナル伝達ドメインとを備えている。いくつかの実施形態では、キメラ受容体構築物は、最適化されていないＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインと、ＣＤ８ａヒンジ及び膜貫通ドメインと、ＮＫｐ８０シグナル伝達ドメインとを備えている。いくつかの実施形態では、キメラ受容体構築物は、最適化されていないＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインと、ＣＤ８ａヒンジ及び膜貫通ドメインと、４−１ＢＢシグナル伝達ドメインと、ＮＫｐ８０ドメインとを備えている。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢドメイン及びＮＫｐ８０ドメインは、ＧＳ３リンカー等のＧＳリンカーにより連結されている。いくつかの実施形態では、そのような構築物は、配列番号４９の核酸配列を有する。一部の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号４９と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号４９と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、２Ｂ４細胞内ドメインに共役されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ８膜貫通ドメインは、膜貫通であり且つ細胞内である２Ｂ４ドメインに置き換えられている。いくつかの実施形態では、このＣＤ８膜貫通ドメインは、２Ｂ４に置き換えられており、４−１ＢＢは、近位配置で発現される。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、ＣＤ１６細胞内シグナル伝達ドメインは、本明細書で説明されたキメラ受容体に対してトランスで外因的に発現されるＣＤ３ζ又はγサブユニットに共役されている。上記で論じたように、そのような構築物は、予想外にも増強されたシグナル伝達をもたらし得、そのため、ＮＫ細胞の細胞毒性効果の予想外の増加をもたらし得る。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、本明細書でさらに詳細に論じられているように、本キメラ受容体は、二量体化するように構成されている。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたいくつかの実施形態に係る切頭型ＮＫＧ２Ｄ受容体は、任意選択により二量体化されている。二量体化は、実施形態に応じてホモ二量体又はヘテロ二量体を含み得る。いくつかの実施形態では、二量体化により、このキメラ受容体（したがって、この受容体を発現するＮＫ細胞）のアビディティは、有害な毒性効果の減少（又は欠如）における同等のバランスを有してより良好なリガンド認識にシフトされる。さらなる実施形態では、細胞外受容体ドメインは、ＣＤ８ａシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、内部二量体を利用するか、又は１つ若しくは複数の成分サブユニットの繰り返しを利用する。例えば、いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、第２のＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインに共役されたＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインと、膜貫通／シグナル伝達領域（又は別個のシグナル伝達領域とともに別個の膜貫通領域）とを含む。いくつかの実施形態では、このＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインの１つ又は複数は、コドン最適化されている。いくつかの実施形態では、２つのＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインがリンカー（例えば、ＧＳｎリンカー）により分離されている。一実施形態では、ＧＳ３リンカーが使用される。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、βアドレナリン受容体の細胞外領域を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメイン膜貫通ドメインは、β−２アドレナリン受容体の細胞外領域を含み、β−２アドレナリン受容体の第１の膜貫通ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達領域は、４−１ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達領域は、ＮＫｐ８０を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達領域は、ＣＤ１６膜貫通−細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達領域は、ＮＫｐ８０又はＣＤ１６膜貫通−細胞内ドメインとともに４−１ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号５０の核酸配列を有する。一部の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号５０と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号５０と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号５１の核酸配列を有する。一部の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号５１と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号５１と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号５２の核酸配列を有する。一部の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号５２と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号５２と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、ヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８ａは、（いくつかの実施形態では配列番号５の核酸配列によってコードされる）ヒンジ領域として機能するように再利用される。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、このシグナル伝達領域は、２Ｂ４及びＣＤ３ζとともに４−１ＢＢを含む。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、ＧＳ３リンカーに共役されている、コドン最適化されているＮＫＧ２Ｄの断片と、追加的なＮＫＧ２Ｄ断片と、ＣＤ８ａヒンジと、ＣＤ８ａ膜貫通ドメインと、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζを含むエフェクタードメインとを含む。いくつかの実施形態では、このキメラセプターは、配列番号６６の核酸配列を有する。一部の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号６６と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号５０と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。いくつかの実施形態では、このキメラセプターキメラ受容体は、配列番号６７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号６６と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号５０と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、本明細書でさらに詳細に論じられているように、本キメラ受容体は、二重特異性であるように構成されている。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されたいくつかの実施形態に係る切頭型ＮＫＧ２Ｄ受容体は、例えば、非ＮＫＧ２Ｄリガンドに結合する第２のペプチドに起因して二重特異性である。いくつかの実施形態では、二重特異性により、このキメラ受容体（したがって、この受容体を発現するＮＫ細胞）のターゲティングは、有害な毒性効果の減少（又は欠如）における同等のバランスを有してより良好な標的細胞認識にシフトされる。さらなる実施形態では、細胞外受容体ドメインは、ＣＤ８シグナルペプチドをさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、他の（非ＮＫＧ２Ｄ）リガンドに結合する第２の細胞外ドメインに共役されたＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインと、膜貫通／シグナル伝達領域（又は別個のシグナル伝達領域とともに別個の膜貫通領域）とを含む。いくつかの実施形態では、２つの細胞外ドメインがリンカー（例えば、ＧＳｎリンカー）により分離されている。一実施形態では、ＧＳ３リンカーが使用される。
【０１６１】
本明細書で開示されたいくつかの実施形態によれば、コドン最適化されたＮＫＧ２Ｄドメインを利用する追加的なキメラ受容体が提供される（任意選択により、この構築物は、最適化されていないか又は部分的に最適化されたドメインによっても複製され得る）。例えば、いくつかの実施形態では、コドン最適化された細胞外ドメインは、ヒンジ及び少なくとも２つの膜貫通／シグナル伝達ドメインに共役されている。いくつかの実施形態では、複数のシグナル伝達ドメインによりＮＫ細胞の細胞傷害効力が増強され、なぜなら、複数の非冗長のシグナルカスケードが開始されるからである。いくつかの実施形態では、これらの複数の経路は、単一のシグナル伝達分子（例えば、ＩＦＮγ）に収束し得るが、細胞傷害エンドポイントを駆動するシグナル伝達分子の全体的な大きさのため、全体的な細胞傷害効果が予想外にも増加する。非限定的な例として、いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄは、ＣＤ１６膜貫通−細胞内シグナル伝達ドメイン及び４−１ＢＢシグナル伝達ドメインが後に続くＣＤ８ａヒンジに共役されている。いくつかの実施形態では、この構築物は、２Ｂ４シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、そのようなキメラ受容体は、配列番号５３の核酸配列を有する。一部の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号５３と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号５３と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。追加的な実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ８ａ−ＣＤ１６ＩＣ／ＴＭ構築物は、ＮＫｐ８０シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、そのような構築物は、４−１ＢＢドメインとＮＫｐ８０ドメインとの間にＧＳ３リンカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、そのようなキメラ受容体は、配列番号５４の核酸配列を有する。一部の実施形態では、このキメラ受容体は、配列番号５４と異なり得るが、実施形態に応じて、配列番号５４と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％相同のままである。
【０１６２】
さらに追加的な実施形態では、キメラ受容体の特定の成分は、効力（例えば、ＮＫ細胞の活性化又は細胞傷害性）の増強をもたらす１つ又は複数の追加的なサブユニットに置き換えられ得る。例えば、一実施形態では、ＣＤ１６細胞内シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１０の四重反復（例えば、４×ＤＡＰ１０）に置き換えられ得る。追加的な実施形態では、ＣＤ１６細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｚａｐ７０サブユニットに置き換えられ得る。特定のそのような実施形態は、ＮＫ細胞の細胞傷害性の予想外の増強をもたらす。
【０１６３】
いくつかの追加的な実施形態では、エフェクタードメインは、リガンドの結合時に活性化シグナル伝達を増強するために１つ又は複数のコンセンサスヘミＩＴＡＭ配列を含む。追加的な実施形態では、４−１ＢＢ、ＣＤ１６、ＮＣＲ１、ＮＣＲ２及び／又はＮＣＲ３のシグナル伝達ドメイン間のＧＳリンカーの包含によりシグナル伝達が増強される。さらに、いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ及びＦｃＲγの一方又は両方は、（同一又は別個の構築物上で）本明細書で説明されたキメラ受容体とともにさらに発現され、これによりシグナル伝達が予想外にも増強され、そのため、ＮＫ細胞の細胞傷害効果が予想外にも増加する。実施形態に応じて、ＣＤ３ζ及びＦｃＲγの１つ又は複数の操作された発現は、ＮＫ細胞によるこれらの分子の内因性発現を補い、それによりＮＫ細胞のシグナル伝達及び究極の細胞傷害効力がさらに増強される。
【０１６４】
任意選択により、実施形態に応じて、本明細書で開示されたポリヌクレオチドのいずれかは、キメラ受容体の構成サブユニットの１つ又は複数の切頭及び／又はバリアントもコードし得、ＮＫ細胞を標的細胞に向ける能力を依然として保持し得、いくつかの実施形態では、結合時に細胞傷害性を予想外にも増強し得る。加えて、本明細書で開示されたポリヌクレオチドのいずれかは、任意選択により、キメラ受容体の様々な構成サブユニットをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列も含み得る。本明細書で使用される場合、用語「断片」及び「切頭型」は、それらの通常の意味が与えられるものとし、且つタンパク質のＮ末端欠失バリアント及びＣ末端欠失バリアントも含むものとする。
【０１６５】
本明細書で説明されたキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドをベクターに挿入して、ＮＫ細胞中での組換えタンパク質発現を達成し得る。一実施形態では、このポリヌクレオチドは、このキメラ受容体の発現のための少なくとも１つの調節エレメントに作動可能に連結されている。具体的な実施形態では、本明細書で開示されたペプチドに対して異種の転写調節エレメント（例えば、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）又はエンハンサーエレメント）を利用して、このキメラ受容体の転写が指示される。いくつかの実施形態では、このポリヌクレオチドは、１つ又は複数の細胞質プロテアーゼ開裂部位を含む。いくつかの実施形態では、この開裂部位は、細胞質プロテアーゼにより認識されて開裂される。一部の実施形態では、この開裂部位は、Ｔ２Ａ開裂部位、Ｐ２Ａ開裂部位、Ｅ２Ａ開裂部位及びＦ２Ａ開裂部位を含む群から選択される。実施形態に応じて、キメラ受容体の様々な構成部分は、単一のベクターで又は代わりに複数のベクターでＮＫ細胞に送達され得る。一部の実施形態では、キメラ受容体構築物は、単一のベクターで送達されるが、キメラ受容体の効力を増強する別の因子（例えば、ｍｂＩＬ１５）は、別個のベクターで送達される。いくつかの実施形態では、キメラ受容体及びこのキメラ受容体の効力を増強する因子（例えば、ｍｂＩＬ１５）は、単一のベクターで送達される。使用されるベクターの数に関係なく、任意のポリヌクレオチドは、タグ配列を任意選択により含み得、この構築物を発現するＮＫ細胞の存在の認識を可能にする。例えば、いくつかの実施形態では、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号５５）が使用される。同様に利用可能であるのは、他のタグ配列であり、例えばポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−タグ）（ＨＨＨＨＨＨ、配列番号５６）、ＨＡ−タグ又はｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号５７）である。代わりに、緑色蛍光タンパク質又は他の蛍光部分が使用される。タグのタイプの組み合わせも使用して、キメラ受容体のサブコンポーネントを個別に認識し得る。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、本キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションによりＮＫ細胞中に導入され得るｍＲＮＡである。別の実施形態では、ベクターは、形質導入によりＮＫ細胞中に導入され得るウイルス（好ましくはレトロウイルス）である。いくつかの実施形態では、このベクターは、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）である。追加的な実施形態では、他のベクターが使用され得、例えばレンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及び同様のものが使用され得る。いくつかの実施形態では、非ＨＩＶ由来レトロウイスルが使用される。選択されるベクターは、様々な因子（例えば、限定されないが、転写調節エレメントの強度及びタンパク質を発現するために使用される細胞）に依存するであろう。このベクターは、プラスミド、ファージミド、コスミド、ウイルスベクター、ファージ、人工染色体及び同様のものであり得る。追加的な実施形態では、このベクターは、エピソームの非相同的に又は相同的に組み込むベクターであり得、このベクターは、このベクターを形質転換するための任意の適切な手段（形質転換、遺伝子導入、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション等）により、適切な細胞中に導入され得る。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞中でキメラ受容体の発現を誘導するための他のアプローチが使用され、このアプローチとして例えば下記が挙げられる：ＳＶ４０初期プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、メタロチオネイン遺伝子の調節配列、アデノウイルス（ＡＤＶ）プロモーター、サイトメガロウイスル（ＣＭＶ）プロモーター、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）プロモーター、パロウイルスＢ１９ｐ６プロモーター、βラクタマーゼプロモーター、ｔａｃプロモーター、ノパリンシンテターゼプロモーター領域又はカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター、リブロースビスリン酸カルボキシラーゼのプロモーター、Ｇａｌ  ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーとともに、操作されたＭｏＭｕＬＶ  ＬＴＲのＵ３領域を含む合成ＭＮＤプロモーター及びアルカリホスファターゼプロモーター。
【０１６７】
本明細書で開示されたキメラ受容体を発現するようにナチュラルキラー細胞を操作し得る。キメラ受容体発現構築物は、当業者に既知の技術のいずれかを使用してＮＫ細胞に導入され得る。一実施形態では、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞中で一時的に発現される。別の実施形態では、このキメラ受容体は、ＮＫ細胞中で安定的に発現される。追加的な実施形態では、このＮＫ細胞は、自己細胞である。さらに別の実施形態では、このＮＫ細胞は、ドナー由来（同種）細胞である。
【０１６８】
本明細書でさらに提供されるのは、癌又は感染性疾患を有する対象を処置する方法であって、本明細書で開示されたキメラ受容体を発現するように操作されたＮＫ細胞を含む組成物を対象に投与することを含み、このキメラ受容体は、損傷又は罹患した細胞又は組織上で差次的に発現される（例えば、正常な細胞又は組織と比較して異なる程度で発現される）マーカー又はリガンドを標的とするように設計されている、方法である。本明細書で使用される場合、用語「発現する」、「発現される」及び「発現」は、それらの通常の意味が与えられ、遺伝子配列又はポリヌクレオチド配列の情報の顕在化を可能にすること又は引き起こすことを指すものとし、例えば対応する遺伝子配列又はＤＮＡ配列の転写及び翻訳に関与する細胞機能を活性化させることによるタンパク質の産生を指すものとする。発現産物自体（例えば、結果として生じるタンパク質）が細胞により「発現される」と呼ばれる場合もある。発現産物は、細胞内、細胞外又は膜貫通として特徴付けられ得る。用語「細胞内」は、その通常の意味が与えられるものとし、且つ細胞の内側を指すものとする。用語「細胞外」は、その通常の意味が与えられるものとし、且つ細胞の外側を指すものとする。用語「膜貫通」は、その通常の意味が与えられるものとし、且つポリペプチドの少なくとも一部が細胞膜に埋め込まれていることを指すものとする。用語「細胞質」は、その通常の意味が与えられるものとし、且つ細胞膜内、核外に存在することを指すものとする。本明細書で使用される場合、対象への治療の投与に関連する用語「処置する」、「処置すること」及び「処置」は、それらの通常の意味が与えられるものとし、且つ対象が治療から得られる有益な効果を指すものとする。いくつかの実施形態では、本明細書で説明された遺伝子操作細胞による対象の処置により、例えば下記で挙げられる効果の１つ、２つ、３つ、４つ又はより多くが達成される：（ｉ）疾患又はそれに関連する症状の重症度の軽減又は寛解；（ｉｉ）疾患に関連する症状の持続時間の短縮；（ｉｉｉ）疾患又はそれに関連する症状の進行に対する保護；（ｉｖ）疾患又はそれに関連する症状の退行；（ｖ）疾患に関連する症状の発生又は発症に対する保護；（ｖｉ）疾患に関連する症状の再発に対する保護；（ｖｉｉ）対象の入院の減少；（ｖｉｉｉ）入院の長さの短縮；（ｉｘ）疾患を有する対象の生存率の増加；（ｘ）疾患に関連する症状の数の減少；（ｘｉ）別の治療の予防効果又は治療効果の増強、改善、補充、補完又は増大。投与は、様々な経路（例えば、限定されないが、罹患した組織への静脈内送達、動脈内送達、皮下送達、筋肉内送達、肝内送達、腹腔内送達及び／又は局所送達）によるものであり得る。ＮＫ細胞の用量は、所定の対象に関して、この対象の体重、疾患の種類及び状態並びに所望の処置の積極性に基づいて用意に決定され得るが、実施形態に応じて、１ｋｇ当たり約１０5個の細胞〜１ｋｇ当たり約１０12個の細胞の範囲（例えば、１０5〜１０7個、１０7〜１０10個、１０10〜１０12個及びそれらの重複範囲）である。一実施形態では、用量漸増レジメンを使用する。いくつかの実施形態では、ある範囲のＮＫ細胞（例えば、約１×１０6個の細胞／ｋｇ〜約１×１０8個の細胞／ｋｇ）を投与する。実施形態に応じて、様々な種類の癌又は感染性疾患を処置し得る。本明細書で提供される様々な実施形態は、下記の癌の非限定的な例の処置又は予防を含む：例えば、限定されないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、カポジ肉腫、リンパ腫、胃腸癌、虫垂癌、中枢神経癌、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍（例えば、限定されないが、星状細胞腫、脊髄腫瘍、脳幹グリオーマ、頭蓋咽頭腫、上衣芽細胞腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮腫）、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、子宮頸癌、結腸癌、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性障害、乳管癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞白血病、腎細胞癌、白血病、口腔癌、上咽頭癌、肝癌、肺癌（例えば、限定されないが、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び小細胞肺癌）、膵癌、腸癌、リンパ腫、黒色腫、眼癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、下垂体癌、子宮癌並びに腟癌。
【０１６９】
さらに、本明細書で提供される様々な実施形態は、下記の非限定的な例の感染性疾患の処置又は予防を含み、この感染性疾患として細菌起源の感染が挙げられるが、それに限定されず、例えば下記の属の１つ又は複数からの細菌による感染が含まれ得る：ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）及びクラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）及びエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）並びにこれらの変異体又は組み合わせ。いくつかの実施形態では、ウイルス感染（例えば、１つ又は複数のウイルスにより引き起こされるもの）を処置するために様々なものを処置する方法が提供され、このウイルとして下記が挙げられる：アデノウイルス、コクサッキーウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ａ型肝炎ウイルス、ｂ型肝炎ウイルス、ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、サイトメガロウイルス、デボラウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合抱体ウイルス、風疹ウイルス及び水痘帯状疱疹ウイルス。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、同様に本明細書で提供されるのは、配列番号１〜６８のそれぞれの核酸配列又はアミノ酸配列と比較して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（及びそれらの中の範囲）相同であり、且つそれぞれの配列番号１〜６８と比較して機能の１つ又は複数も示す核酸配列及びアミノ酸配列であり、この機能として下記が挙げられるが、それらに限定されない：（ｉ）増殖の増強、（ｉｉ）活性化の増強、（ｉｉｉ）核酸配列及びアミノ鎖配列によってコードされる受容体を有するＮＫ細胞が結合するリガンドを提示する細胞に対する細胞傷害活性の増強、（ｉｖ）腫瘍又は感染部位へのホーミングの増強、（ｖ）オフターゲット細胞傷害効果の減少、（ｖｉ）免疫刺激性サイトカイン及びケモカイン（例えば、限定されないが、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、ＩＬ−２２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４及びＣＣＬ５）の分泌の増強、（ｖｉｉ）さらなる自然免疫応答及び適応免疫応答を刺激する能力の増強、並びに（ｖｉｉｉ）これらの組み合わせ。
【０１７１】
加えて、いくつかの実施形態では、核酸コードの縮重を説明しつつ、本明細書で開示された核酸のいずれかに対応するアミノ鎖配列が提供される。さらに、本明細書で明示的に開示されたものと異なるが、機能の類似性又は均等性を有するこの配列（核酸又はアミノ酸）も本開示の範囲内で企図される。上記には、変異体、切頭、置換又は他の種類の改変が含まれる。
【０１７２】
本明細書では、いくつかの実施形態に従い、細胞外受容体ドメインを含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドであって、この細胞外受容体ドメインは、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）の天然リガンドに結合するペプチドを含み、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するペプチドは、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメインであるＮＫＧ２Ｄの断片である、ポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの断片は、配列番号２、若しくは３、若しくは６８の配列を含むポリヌクレオチド又はその機能的均等物によってコードされる。いくつかの実施形態では、このポリヌクレオチドは、ＣＤ１６を含むエフェクタードメインをコードする。いくつかの実施形態では、このポリヌクレオチドは、ＮＣＲ１を含むエフェクタードメインをコードする。いくつかの実施形態では、このポリヌクレオチドは、ＮＣＲ２を含むエフェクタードメインをコードする。いくつかの実施形態では、このポリヌクレオチドは、ＮＣＲ３を含むエフェクタードメインをコードする。いくつかの実施形態では、このポリヌクレオチドは、４−１ＢＢを含む追加的なエフェクタードメイン部分をコードする。いくつかの実施形態では、このポリヌクレオチドは、ＮＫＧ２Ｄ及びＣＤ１６で構成されたキメラ受容体をコードする。いくつかの実施形態では、このポリヌクレオチドは、ＮＫＧ２Ｄ及びＮＣＲ１で構成されたキメラ受容体をコードする。いくつかの実施形態では、このポリヌクレオチドは、ＮＫＧ２Ｄ及びＮＣＲ２で構成されたキメラ受容体をコードする。追加的な実施形態では、このポリヌクレオチドは、ＣＤ１６及び任意選択により４−１ＢＢに共役されたＮＫＧ２Ｄで構成されたキメラ受容体をコードする。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６は、ＮＣＲ１に置き換えられており、いくつかの実施形では、実施形態に応じて、ＮＣＲ２又はさらにＮＣＲ３に置き換えられている。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、例えば、４−１ＢＢとＣＤ１６、ＮＣＲ１、ＮＣＲ２又はＮＣＲ３の１つとの間にＧＳリンカーをさらに含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、細胞外受容体ドメインは、ヒンジ領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、このヒンジ領域は、ＣＤ８ａを含む。しかしながら、追加的な実施形態では、このヒンジ領域は、１つ又は複数のリンカーを含み、このリンカーは、いくつかの実施形態では、ＧＳ９、ＣＤ８ａ／ＧＳ３、切頭型ＣＤ８ａ、ＧＳ３及び同様のものを含む。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、この細胞外受容体ドメインは、ＣＤ８ａシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、１つ又は複数のヘミＩＴＡＭ配列を含む。いくつかの実施形態では、本キメラ受容体は、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１０（ＤＡＰ１０）を含まない。いくつかの実施形態では、このキメラ受容体は、ＩＴＡＭモチーフを含まず、むしろ代替シグナル伝達領域（例えば、ＩＴＳＭ、ヘミ−タム又は他の共刺激領域）を利用する。
【０１７５】
一実施形態では、細胞外受容体ドメインを含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドであって、この細胞外受容体ドメインは、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）の天然リガンドに結合するペプチドを含み、このＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するペプチドは、膜貫通領域であるＮＫＧ２Ｄの断片であり、この膜貫通領域は、ＣＤ８ａ及びエフェクタードメインを含み、このエフェクタードメインは、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζを含み、このポリヌクレオチドは、膜結合インターロイキン１５（ｍｂＩＬ１５）をコードする追加的な構築物と同時発現される、ポリヌクレオチドが提供される。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、細胞外受容体ドメインを含む、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドであって、この細胞外受容体ドメインは、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）の天然リガンドに結合するペプチドを含み、このＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するペプチドは、膜貫通領域であるＮＫＧ２Ｄの断片であり、この膜貫通領域は、ＣＤ８ａ及びエフェクタードメインを含み、このエフェクタードメインは、４−１ＢＢと２Ｂ４又はＤＡＰ１０の細胞内ドメインとを含む、ポリヌクレオチドも提供される。本明細書で説明されたキメラ受容体をコードするポリヌクレオチドは、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合する第２のペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドとして、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５又はＵＬＢＰ６が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ｄの天然リガンドに結合するキメラ受容体の部分は、配列番号１、２、３又は６８に対して少なくとも８０％相同である。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、提供されるポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、このポリヌクレオチドは、キメラ受容体の発現のための少なくとも１つの調節エレメントに作動可能に連結されている。本明細書で使用される場合、用語「核酸」、「ヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、その通常の意味が与えられるものとし、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボ核酸、リボヌクレオチド及びリボ核酸並びにそれらのポリマー形態を含むものとし、且つ一本鎖形態又は二本鎖形態を含む。核酸は、天然に存在する核酸（例えば、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）及びリボ核酸（「ＲＮＡ」））並びに核酸類似体を含む。核酸類似体として、天然に存在するホスホジエステル結合以外の他のヌクレオチドと結合するヌクレオチドである、天然に存在しない塩基を含むもの又はホスホジエステル結合以外の結合を介して付着した塩基を含むものが挙げられる。そのため、核酸類似体として、例えば、限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、ホスホルアミデート、ボラノホスフェート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）及び同様のものが挙げられる。本明細書で使用される場合、例えば異種核酸配列に「作動可能に連結されている」調節核酸配列に関連する用語「作動可能に連結されている」は、その通常の意味が与えられるものとし、且つこの調節核酸配列が異種核酸配列と機能的関係に置かれていることを意味するものとする。ＩＲＥＳに関連して、「作動可能に連結されている」は、内部リボソーム侵入部位を含む核酸配列と、異種コード配列が翻訳されるｍＲＮＡ配列の中央での異種コード配列開始との間の機能的連結を指す。本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、その通常の意味が与えられるものとし、且つＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を遺伝子操作細胞中に導入し、遺伝子操作された細胞を形質転換させて、導入された配列の発現（例えば、転写及び／又は翻訳）を促進し得る媒体を指すものとする。ベクターとして、ウイルス、プラスミド、ファージ等が挙げられる。用語「キメラ受容体」は、本明細書で使用される場合、その通常の意味が与えられるものとし、且つ単一タンパク質上で天然に一緒に見出されない少なくとも２つのポリペプチドドメインを含む細胞表面受容体を指すものとする。用語「キメラ受容体複合体」は、本明細書で使用される場合、単一タンパク質上で自然界において一緒に見出されない組み合わせで少なくとも２つのポリペプチドドメインを含み得る第１のポリペプチドを指し、この第１のポリペプチドは、第２のポリペプチド（例えば、アダプターポリペプチド）、シグナル伝達分子又は刺激分子と関連している。本明細書で開示されたキメラ受容体の生成及び使用に関する追加的な用語は、当業者により容易に理解され、且つ国際公開第２０１４／１１７１２１号パンフレット及び米国特許第７，９９４，２９８号明細書（これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）でも見出され得る。
【０１７８】
いくつかの実施形態に従って追加で提供されるのは、本明細書で提供されたポリヌクレオチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含むベクターであって、このポリヌクレオチドは、任意選択により、キメラ受容体の発現のための少なくとも１つの調節エレメントに作動可能に連結されている、ベクターである。いくつかの実施形態では、このベクターは、レトロウイルスである。
【０１７９】
本明細書でさらに提供されるのは、本明細書で開示されたポリヌクレオチド、ベクター又はキメラ受容体を含む操作されたナチュラルキラー細胞である。いくつかの実施形態では、このＮＫ細胞は、疾患（例えば、癌及び／又は感染性疾患）の予防の処置での使用に適している。
【実施例】
【０１８０】
方法
以下の実験方法及び材料は、以下に開示される非限定的な実験例において用いられる。
【０１８１】
細胞株及び培養条件
ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞株ＲＥＨ、ヒト骨肉腫細胞株Ｕ−２  ＯＳ及びヒト胚性腎線維芽細胞２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から入手した。ＲＥＨ細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅシリーズ１６４０（ＲＰＭＩ−１６４０；Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中で維持し、増殖させた。ＨＥＫ２９３Ｔ及びＵ−２  ＯＳ細胞の両方は、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）中で維持し、増殖させた。すべての哺乳動物細胞を５％ＣＯ２下において３７℃でインキュベートした。
【０１８２】
ＤＮＡプラスミド
キメラ受容体ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ζを含有するＤＮＡプラスミドを前述のように作製した（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．７３（６）：２０１３を参照されたい）。伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＳＯＥ−ＰＣＲ）を重複させることによるスプライシングを用いて、ＮＫＧ２Ｄ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ構築物を形成する個々のドメインを融合させた。次に、その構築物をマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）レトロウイルスベクターに挿入した（図３Ａ）。ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６−４１ＢＢにおける構築物は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｎａｎｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）により、コドン最適化し、ＭＳＣＶベクターに挿入した（図３Ｂ）。構築物の配列は、ＤＮＡ配列決定により検証した。
【０１８３】
ヒトＮＫ細胞の拡大
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、健常成人ドナーからの血液サンプルのフィコール密度遠心分離により入手した。ＮＫ細胞を拡大するため、ＰＢＭＣを膜結合性ＩＬ−１５及び４−１ＢＢリガンド（Ｋ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ）で遺伝子組換えしたＫ５６２とともに培養した。細胞は、４０ＩＵのＩＬ−２／ｍｌを２日ごとに添加した幹細胞増殖培地（ＳＣＧＭ；Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で培養した。
【０１８４】
７日間の培養後、ＮＫ細胞において、抗ＣＤ３  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてＴ細胞を欠失させた。次に、ＮＫ細胞を、４０〜２００ＩＵのＩＬ−２／ｍｌを２日ごとに添加したＳＣＧＭ中で培養した。
【０１８５】
レトロウイルスの産生及びＮＫ細胞の形質導入
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にレトロウイルスパッケージングプラスミドを一過性にトランスフェクトすることにより、レトロウイルスの産生を実施した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションの１８時間前、まず１２ｍｌ中２．５×１０6個の細胞の濃度のＤＭＥＭに播種した。次に、この細胞に、各ＮＫＧ２Ｄキメラ受容体を含有する３．５μｇのＭＳＣＶベクター（非限定的な構築物を図１Ｂ〜１Ｃ及び２Ａ〜２Ｂに概略的に示す）、３．５μｇのｐＥＱ−ＰＡＭ３及び３．０μｇのｐＲＤＦをトランスフェクトした。対照として、ＧＦＰを含有する空のＭＳＣＶベクターを用いた。Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ９  ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をトランスフェクションのために用いた。トランスフェクションから２４時間後にＤＭＥＭを馴化ＲＰＭＩ−１６４０と交換した。
【０１８６】
培地の変更から１８時間後、ＮＫＧ２Ｄキメラ受容体導入遺伝子のＮＫ細胞への形質導入を行った。まずＮＫ細胞を２ｍｌの馴化ＲＰＭＩ−１６４０に０．２５×１０6個の細胞の濃度で懸濁した。その後、細胞をレトロネクチン（タカラバイオ株式会社、大津、日本）でコーティングしたチューブに播種した。レトロウイルスを含有するＲＰＭＩ−１６４０（ウイルス上清）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養物から収集し、新しい馴化培地を培養物に戻し添加した。ウイルス上清に２００ＩＵのＩＬ−２／ｍｌを添加し、ウイルス上清３ｍｌを（播種したＮＫ細胞を含有する）各々のレトロネクチンでコーティングしたチューブに分注した。ＮＫ細胞を生成する特定の実施形態に従い、播種したＮＫ細胞に新しいウイルス培地を１２時間ごとに１回で６回、形質導入した。次に、形質導入したＮＫ細胞を最終の形質導入から４８時間後に収集し、２００ＩＵのＩＬ−２／ｍｌを２日ごとに添加したＳＣＧＭ中で培養した。形質導入したＮＫ細胞を拡大後の１４〜２８日の実験中に用いた。
【０１８７】
フローサイトメトリーによるキメラ受容体発現の検出
形質導入したＮＫ細胞を、アルブミンを含有するリン酸緩衝食塩水で１回洗浄し、ウサギ血清２μｌを添加した。次に、暗所で細胞をペリジニンクロロフィル（ＰｅｒＣＰ）コンジュゲート抗ヒトＮＫＧ２Ｄ抗体（クローン１４９８１０；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）で１０分間染色した。対照として、形質導入したＮＫ細胞を各々のＰｅｒＣＰコンジュゲートＩｇＧアイソタイプ抗体で染色した。Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）を用いる分析前、すべてのＮＫ細胞を再洗浄し、０．５％ホルムアルデヒド３００μｌで固定した。対応ｔ検定を用いて、データを分析した。
【０１８８】
細胞傷害性アッセイ
ＲＥＨ細胞をカルセインＡＭの赤−オレンジ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で染色した。ＲＥＨ細胞を９６ウェル丸底プレート（ＣｏＳｔａｒ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に播種した。次に、形質導入したＮＫ細胞を様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で添加した。細胞培養物を３７℃及び５％ＣＯ2で４時間インキュベートした。Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターを用いて、染色した生存可能標的細胞をカウントした。Ｕ−２  ＯＳ細胞を９６ウェル平底白色プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種し、４時間インキュベートした。次に、形質導入したＮＫ細胞を異なるＥ：Ｔ比に応じて添加した。次に、細胞培養物をさらに４時間インキュベートした。分析前、Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）をこの細胞に添加した。生存可能標的細胞からの発光の強度を、ＦＬ×８００  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ  Ｔｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，Ｖｅｒｍｏｎｔ）を用いて測定した。発光の強度と対照との差を細胞傷害性の百分率に変換した。
【０１８９】
インターフェロンγ（ＩＦＮγ）産生アッセイ
ＮＫ細胞によって産生されるＩＦＮγの量を判定するため、エフェクター及び標的細胞をまず９６ウェル丸底プレート内、（１：１のＥ：Ｔ）又はＲＥＨ不在下で培養した。ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ブレフェルジンＡ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の添加前、細胞を１時間インキュベートした。さらに５時間の培養後、細胞をフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗ヒトＣＤ５６抗体（クローンＭＹ３１，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識した。専売透過処理試薬を用いて細胞を透過処理し、暗所で４０分間インキュベートした。次に、この細胞を専売洗浄緩衝液で洗浄した。細胞内ＩＦＮγを、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲートＩＦＮγ抗体（クローン２５７２３．１１；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて４５分間検出した。次に、この細胞を固定し、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターを用いて分析した。
【０１９０】
実施例１  −  ＮＫＧ２Ｄ構築物を含有するＣＤ３ζ
本明細書で開示される通り、様々な膜貫通及び／又はシグナル伝達ドメインと共役されたＮＫＧ２Ｄ及び／又はＮＫＧ２Ｄ変異体を含む様々な構築物を準備する。ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む構築物の発現及び細胞傷害活性を評価するため、本実験を実施した。上記の方法及び材料に従い、２つのＣＤ３ζ構築物を調製し、試験した。構築物に応じて、用いる方法を容易に調節することで、構築物の生成、発現及び試験にとって必要とされるバリエーションを構成することができる。２つの構築物は、ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ζ及びＮＫＧ２Ｄ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζであった。参照として、図１Ａは、内因性ＮＫＧ２Ｄを概略的に示す。ＮＫ細胞では、ＮＫＧ２Ｄの膜貫通領域間のイオン相互作用により、そのアダプタータンパク質ＤＡＰ１０との会合が可能になる（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。リガンド結合時、ＮＫＧ２Ｄシグナルは、ＤＡＰ１０上に見出されるシグナル伝達モチーフＹｘＮＭを通じて伝達される。ＣＤ３ζは、その免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ；Ｌａｎｉｅｒ，２００８）を通じてシグナルを伝達する。２つの実験構築物をそれぞれ図１Ｂ及び１Ｃに概略的に示す。図１Ｂは、ＹｘＮＭ及びＩＴＡＭモチーフの両方を通じてシグナル伝達が生じるＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ζを示す。図１Ｃは、膜貫通ドメインとしてＣＤ８ａヒンジ領域、またシグナル伝達ドメインとして４−１ＢＢ及びＣＤ３ζを用いるＮＫＧ２Ｄ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ構築物を示す。
【０１９１】
まず、ＮＫ細胞がこれらの構築物を有効に発現する能力を評価した。健常成人ドナーのＰＢＭＣから拡大したＮＫ細胞に２つのキメラ受容体の一方を形質導入した。モック形質導入ＮＫ細胞を（ＧＦＰのみを含有する空のＭＳＣＶベクターを形質導入した）対照として用いた。ＮＫ細胞をＰｅｒ−ＣＰコンジュゲート抗ＮＫＧ２Ｄ抗体で染色することを通じて、キメラ受容体の存在及び相対的存在量を判定した。図４Ａは、モック（左パネル）、ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ζ（中央パネル）又はＮＫＧ２Ｄ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ（右パネル）構築物の形質導入後の、ＮＫＧ２Ｄ陽性ＮＫ細胞の百分率に関する代表的なフローサイトメトリーデータを示す。モック形質導入ＮＫ細胞は、抗体を用いて、ＮＫＧ２Ｄの発現を示さない（活性化ＮＫ細胞上で天然に高いＮＫＧ２Ｄの発現に反して、アイソタイプマッチ非反応性抗体を上回る染色を示さない）一方、ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ζ構築物を形質導入した細胞の６０％弱は、アイソタイプマッチ非反応性抗体対照を上回り、またＮＫＧ２Ｄ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζを形質導入したＮＫ細胞の８０％を上回るようなＮＫＧ２Ｄの発現を示した。すべてのドナーからのＮＫＧ２Ｄ陽性ＮＫ細胞の百分率についてのプールデータを図４Ｂに示す。操作したＮＫＧ２Ｄ構築物の両方は、モックと比べてＮＫＧ２Ｄの発現における実質的増加をもたらすが、２つの構築物のパーセント発現間での有意差は、認められない。図４Ｃは、ＮＫＧ２Ｄ構築物を発現する集団内での細胞がこの構築物を発現する程度を表す、平均蛍光強度（ＭＦＩ）に基づく発現データを示す（例えば、１細胞当たりの構築物の複数コピーであれば、より高いＭＦＩを生じることになる）。この尺度によると、ＮＫＧ２Ｄ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζの発現は、ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ζ構築物の場合よりも有意に高い。
【０１９２】
まとめると、これらのデータは、本明細書で開示されるいくつかの実施形態によると、操作した構築物がＮＫ細胞上で十分に発現され得ることを示す。いくつかの実施形態では、構築物の増強された発現は、ＮＫ細胞への特定構築物の形質導入の反復により達成され得る。いくつかの実施形態では、構築物の成分は、単一のベクターで又は代わりに複数のベクターを用いて細胞に送達され得る。実施形態に応じて、構築物自体が増強された発現をもたらし得、例えば、線状又はヘッドトゥテール構築物は、複数のサブユニット構築物が必要とする細胞内アセンブリの程度減少が理由で、増強された発現をもたらし得る。
【０１９３】
ＮＫ細胞上でＮＫＧ２Ｄ構築物を十分に発現することに加えて、ＮＫ細胞の有効なシグナル伝達が標的細胞上で作用することが要求される。形質導入したＮＫ細胞の２つの集団の効力を評価するため、細胞傷害性アッセイを、ＮＫ細胞活性に対して感受性がある細胞株に対してＲＥＨ（懸濁細胞）及びＵ−２  ＯＳ（接着性細胞）を用いて実施した。独立ドナーを通じてＲＥＨ細胞に対するＮＫ細胞の異なる群の２つのＥ：Ｔ比での細胞傷害性百分率をまとめたデータを図５Ａ〜５Ｃに示す（エラーバーは、標準偏差を表す；すべての実験は、３連で実施する；ｎ＝３（Ｐ＜０．００１））。図５Ａ〜５Ｃに表す通り、ＮＫＧ２Ｄキメラ受容体のいずれか（（ａ）表示の矢印で示すＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ζ及び（ｂ）表示の矢印で示すＮＫＧ２Ｄ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ）を発現するＮＫ細胞は、３つすべてのドナーにおいて、（（ｃ）表示の矢印で示す）モックＮＫ細胞と比べてＲＥＨに対する有意により高い細胞傷害性を有した。ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ζを発現するＮＫ細胞の細胞傷害性の平均百分率は、９１．８％±５．８％（１：１のＥ：Ｔ比）及び８３．９％±５．６％（１：２のＥ：Ｔ比）であった。ＮＫＧ２Ｄ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζを形質導入したＮＫ細胞は、類似の効力（１：１のＥ：Ｔ比で８７．４％±６．１％及び１：２のＥ：Ｔ比で７６．２％±４．８％）を示した。キメラ受容体を発現するＮＫ細胞は、モック形質導入ＮＫ細胞と比べてＵ−２  ＯＳに対して増強された細胞傷害性も示した（図６Ａ〜６Ｃを参照されたく、図６Ａは、（ａ）表示の矢印で示すＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ζを表し、図６Ｂは、（ｂ）表示の矢印で示すＮＫＧ２Ｄ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζを表し、図６Ｃは、（ｃ）表示の矢印で示すモックＮＫ細胞を表す）。
【０１９４】
これらのデータは、キメラ受容体構築物を発現するように操作され得るだけでなく、キメラ受容体を発現するそれら細胞が、活性化され、標的細胞に対して増強された細胞傷害性効果を十分にもたらすことができるという証拠を提示する。重要なことに、これらのデータは、より多数の（この実験では倍増された）標的細胞の存在下で細胞の効力におけるごくわずかな低下が認められることも示す。これは、臨床使用であり得る状況として、ＮＫ細胞が標的細胞と相対的により少数で存在するときでも、操作されたＮＫ細胞の所望の細胞傷害性効果をやはり実現できることを示唆する。さらに、これらのデータは、いくつかの実施形態によると、所与のＮＫ細胞上でのキメラ受容体発現の密度又は程度が低下することが細胞傷害性効果の協調的低下を必ずしももたらさず、それらの構築物発現の低下に照らしたＮＫ細胞の想定外の有効性に関連し得ることを示す。加えて、これらのデータは、いくつかの実施形態に応じて達成される想定外に増強された細胞傷害性を例示する。非操作ＮＫ細胞が細胞傷害性を示し、活性化時にＮＫＧ２Ｄを有意な量で発現する一方、本明細書で開示される操作された細胞が、細胞傷害性効果を既に達した上限と考え得るもの（例えば天然ＮＫ細胞の細胞傷害性）を超えて有意に増強し得ることは、想定外である。
【０１９５】
細胞傷害性データに加えて、ＮＫ細胞がこれらの効果を発揮している機構を、様々なＮＫＧ２Ｄ構築物を発現するＮＫ細胞によるインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の産生を評価することにより試験した。ＩＦＮγは、マクロファージを動員し、免疫刺激効果を有する、（典型的には自然免疫応答中に）ＮＫ細胞によって産生及び放出される主要なサイトカインである。図７Ａは、ＲＥＨ細胞による刺激下又は非刺激下での、モック（左パネル）、ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ζを発現するＮＫ細胞（中央パネル）及びＮＫＧ２Ｄ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζを発現するＮＫ細胞（右パネル）における（ＭＦＩによって測定した）ＩＦＮγ産生の相対量を示す。ＮＫ細胞は、細胞内ＩＦＮγに対するＡＰＣコンジュゲート抗ＩＦＮγ抗体により染色した。データは、対応ｔ検定により分析した。これらのデータは、ＮＫ細胞の３群の各々が非刺激下で類似レベルのＩＦＮγ産生を有することが認められ、ＲＥＨ細胞による刺激後に増加が認められたことを示す。いくつかの実施形態において提示される通り、ＮＫＧ２Ｄ構築物を発現する操作されたＮＫ細胞は、強力なサイトカイン産生をもたらし得る。操作されたＮＫ細胞が応答する対象の標的細胞（ここではＲＥＨ細胞）の存在により、ＩＦＮγ産生、最終的に細胞傷害性効果をもたらす生化学的カスケードが開始する。図７Ａに示すように、ＮＫＧ２Ｄ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζを発現するＮＫ細胞は、刺激性ＲＥＨ細胞の存在下でＩＦＮγの強力な産生を示す。興味深いことに、ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ζを発現するＮＫ細胞は、類似した応答度を示さなかった。これは、図７Ｂにさらに示され、ここでは、ＲＥＨ細胞による刺激後のＮＫ細胞の異なる群間でのＩＦＮγのレベル（中央値を表示した；データを独立ｔ検定によって分析した）を評価する。すべてのＩＦＮγ実験は、３つの独立ドナー（ｎ＝９）の場合に３連で実施した。図７Ｂは、ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ζを発現するＮＫ細胞によるＩＦＮγ産生がモック形質導入ＮＫ細胞と有意に異ならなかったことを示す。それに対し、ＮＫＧ２Ｄ−４１ＢＢ−ＣＤ３ζを発現するＮＫ細胞は、モック形質導入ＮＫ細胞と比べてＩＦＮγ産生における有意な増加を示す。これらのデータは、本明細書で考察の通り、リガンド結合に応答したキメラ受容体によるシグナル伝達が、目的の標的細胞に対する細胞傷害性効果をもたらす上での本質的なステップであることを示すことから興味深い。しかし、２つの異なるキメラ受容体を形質導入したＮＫ細胞がいずれも比較的類似した細胞傷害性を示すが、ミラーリングレベルのＩＦＮγ産生を伴わないことから、様々な構築物がシグナル伝達するための唯一の経路は存在しない。したがって、いくつかの実施形態によると、正常なＮＫ細胞と比べて、ＩＦＮγ又は他の免疫刺激サイトカインの増強された産生を通じて細胞傷害性効果を達成する構築物が提供される。しかし、いくつかの実施形態では、増強された細胞傷害性効果を達成するため、ＩＦＮγの増強された産生が必ずしも達成又は検出されず、むしろ別の免疫刺激経路が所与のキメラ構築物により利用され得る。
【０１９６】
実施例２  −  ＣＤ１６及びＣＤ１６−４−１ＢＢを含有するＮＫＧ２Ｄ構築物
発現、細胞傷害性及びサイトカイン産生を評価するため、追加的な構築物を作製した。本明細書で提供される通り、いくつかの実施形態は、ＣＤ１６膜貫通及び／又はシグナル伝達ドメインを用いる、（いくつかの実施形態ではコドン最適化された）切断されたＮＫＧ２Ｄを含む構築物に関する。この実験における評価のために作製した構築物を図２Ａ〜２Ｂに概略的に示し、それは、Ａ）ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６、及びＢ）ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６−４１ＢＢキメラ受容体の構造を示す。両方のキメラ受容体は、ＣＤ１６の膜貫通領域に依存し、ＣＤ３ζ又はＦｃＲγのいずれかと会合する。これらの構築物を作製するために用いるプラスミドを図３Ｂに示す。上で考察の通り、いくつかの実施形態では、用いる構築物は、ＣＤ３ζ又はＦｃＲγの内因性発現に依存するが、いくつかの実施形態では、キメラ受容体をコードするプラスミド（又は分離プラスミド）は、ＮＫ細胞によるＣＤ３ζ及び／又はＦｃＲγの発現を高め、それによりこの細胞の効力を増強するように設計する。
【０１９７】
上記の通り、構築物の発現レベルを評価した。図８Ａは、モック（左パネル）、ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ζを発現するＮＫ細胞（中央パネル）及びＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６を発現するＮＫ細胞についての代表的なフローサイトメトリーデータを示す（実験は、異なる記号によって表される３つの独立ドナーからの細胞を用いて実施した。データは、対応ｔ検定により分析した）。図８Ｂは、ＮＫＧ２Ｄ（したがって構築物）を発現する細胞の百分率に関するサマリーデータを示す。予想通り、モックトランスフェクトＮＫ細胞は、抗体を用いると、低レベルのＮＫＧ２Ｄ発現を示す。それに対し、操作した構築物の両方は、有意に増強された発現を示し、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６形質導入ＮＫ細胞は、モック形質導入ＮＫ細胞と比べて３５．８％±６．９％高い発現を表した。加えて、ＭＦＩによる評価として（図８Ｃ）、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６形質導入ＮＫ細胞は、この構築物の増強された発現も示した。これらのデータは、この構築物がＮＫ細胞に有効に導入可能であり、発現されることを実証するために重要である。
【０１９８】
この構築物の発現を樹立しており、それらが細胞傷害性効果を示す能力を評価した。上で考察の通り、３つのドナーからのＮＫ細胞を、ＲＥＨ細胞及びＵ−２  ＯＳ細胞に対する細胞傷害性効果について各々３つのＥ：Ｔ比で試験した（すべての実験を３連で実施した，ｎ＝３）。興味深いことに、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６構築物のモックＮＫ細胞と比べて増強された発現は、細胞傷害性の増強をもたらさなかった（図９Ａ〜９Ｃを参照されたい、エラーバーは、標準偏差を表す）。先行例と同様に、（（ａ）表示の矢印で示す）ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ζを発現するＮＫ細胞は、確かに増強された細胞傷害性を示した。Ｕ−２  ＯＳ細胞に対する細胞傷害性に関して、（（ｂ）表示の矢印で示す）ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６は、（（ｃ）表示の矢印で示す）モックＮＫ細胞と比べて確かに増強された細胞傷害性を示した（図１０Ａ〜１０Ｃを参照されたい）。これらのデータは、特定の所与の標的細胞型に対する細胞傷害性の影響度がＮＫ構築物の使用とともに変化する場合があることを示す。いくつかの実施形態では、特定の構築物が有効とされないことがあるが、いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞の集団の組み合わせが使用可能であり、相乗効果を示し得る。換言すれば、ＮＫ細胞の集団は、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６を発現する部分及びＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ζ（又は本明細書で開示される構築物のいずれかの他の組み合わせ）を発現する部分を伴い、いずれかの亜集団単独と比べて予想外に増強された細胞傷害性を示すことがある。
【０１９９】
トランスフェクトＮＫ細胞の作用機構を確認するため、次にインターフェロンγ産生を測定した。様々な構築物を発現するＮＫ細胞は、ＲＥＨ細胞によって刺激したか又は刺激せず、ＩＦＮγの産生を測定した。これらのデータを図１１に示す（データは、対応ｔ検定により分析した）。ＮＫ細胞のすべての群が刺激不在下で類似レベルのＩＦＮγを有し、ＲＥＨ細胞とのインキュベーション後に増加を有した。ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６を発現するＮＫ細胞は、ＩＦＮγ産生における６３４±２１１ＭＦＩの増加を示し、それは、モック形質導入ＮＫ細胞によって示された増加（４２３±７０ＭＦＩ）よりも大きかった。しかし、その増加は、２０４１±４１１ＭＦＩ増加した、ＮＫＧ２Ｄ−ＤＡＰ１０−ＣＤ３ζを発現するＮＫ細胞で認められた場合よりも低かった。いくつかの実施形態に従うデータと合致して、ＩＦＮγの産生は、特定の構築物を発現するＮＫ細胞が示す細胞傷害性効果と相関する。
【０２００】
本明細書で開示されるいくつかの実施形態によると、複数のシグナル伝達領域が用いられ得る。拡大されたＮＫ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６−４１ＢＢの発現を評価するため、追加的実験を実施した（実験は、ドナー１名からの細胞を用いて実施した）。発現データを図１２Ａ〜１２Ｂに示す。図１２Ａは、４−１ＢＢシグナル伝達領域の追加が、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６構築物と比べて、ＮＫ細胞による構築物の発現を損なうことが有意でないことを実証する生フローサイトメトリーデータを示す。これは、試験したＮＫ細胞群の各々の表面上でのＮＫＧ２Ｄ受容体の相対量を示す図１２Ｂの要約ヒストグラム中にも反映される。ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６−４１ＢＢは、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６と比べてやや低下したＭＦＩを示すが、両方の構築物は、モックに対して増強された発現を示す。
【０２０１】
ＲＥＨ及びＵ−２  ＯＳ細胞の両方を標的として用いて、細胞傷害性効果を上記のように評価した。図１３Ａ〜１３Ｂは、得られたデータを示す（エラーバーは、標準偏差を表す；すべての実験は、３連で実施した，ｎ＝３）。図１３Ａは、ＲＥＨ細胞に対する構築物の細胞傷害性効果を示す。上の実験と同様に、（（ｂ）表示の矢印で示すＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６を発現する細胞は、（ａ）表示の矢印で示すモックＮＫ細胞と比べて有意に増強された細胞傷害性効果を示さなかった。それに対し、（（ｃ）表示の矢印で示す）ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６−４１ＢＢを発現するＮＫ細胞は、ＲＥＨ細胞に対して増強された細胞傷害性を示した。Ｕ−２  ＯＳ細胞に対する有効性に関して、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６−４１ＢＢを発現する細胞の両方は、増強された細胞傷害性を示し、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１６−４１ＢＢを発現する細胞は、より強力な細胞傷害性効果を示した。これは、いくつかの実施形態によると、シグナル伝達ドメインの組み合わせの使用により、形質導入ＮＫ細胞の有効性における想定外の増強がもたらされ得ることを示す。したがって、上記の通り、いくつかの実施形態では、標的細胞に対する増強された細胞傷害性をもたらすように一緒に相乗的に機能する２つ以上の膜貫通／シグナル伝達ドメインを用いる。
【０２０２】
実施例３  −  追加的なＮＫＧ２Ｄ構築物
異なる細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内エフェクタードメインを有する追加的な構築物を作製し、それらの発現及び細胞傷害性を評価した。この実験において評価のために作製した１２の構築物を図１４に概略的に示す。これらキメラ受容体変異体の一部は、ＣＤ１６膜貫通領域に依存し、ＣＤ３ζ又はＦｃＲγのいずれかと会合する。上で考察の通り、いくつかの実施形態では、用いる構築物は、ＣＤ３ζ又はＦｃＲγの内因性発現に依存するが、いくつかの実施形態では、このキメラ受容体をコードするプラスミド（又は分離プラスミド）は、ＮＫ細胞によるＣＤ３ζ及び／又はＦｃＲγの発現を高め、それによりこの細胞の効力を増強するように設計する。上記のように、この構築物の発現レベルを評価した。モックトランスフェクトＮＫ細胞は、ＭＦＩによる評価として、低レベルのＮＫＧ２Ｄ発現を示す（図１６Ａ）。それに対し、上記のＮＫＧ２Ｄ変異体構築物を形質導入したＮＫ細胞は、異なるレベルのＮＫＧ２Ｄ発現を示し、操作した変異体構築物４及び９は、ＮＫ細胞における有意に増強された発現を示した。図１６Ｂは、ＮＫＧ２Ｄ変異体構築物１、４、８、９の、２つのドナーのＮＫ細胞への形質導入後についての代表的なフローサイトメトリーデータを示す。モック形質導入ＮＫ細胞と比べて、変異体８及び９の形質導入ＮＫ細胞は、キメラ受容体の特に強力な発現を示した。変異体構築物の発現は、形質導入後７日間、２つのドナーのＮＫ細胞において持続し、変異体８及び９は、ＭＦＩによる評価として特に上昇したレベルを示した（図１６Ｃ）。これらのデータは、構築物がＮＫ細胞に有効に導入可能であり、発現されることを実証するために重要である。構築物の発現を樹立しており、それらが細胞傷害性効果を形質導入ＮＫ細胞に送達する能力についても評価した。ＮＫＧ２Ｄ変異体構築物４、８及び９の細胞傷害性を、１：１のＥ：Ｔ比でＮＫ細胞に形質導入してから１４日後に評価した（図１７）。
【０２０３】
作製したさらなる変異体構築物を、様々な細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内エフェクタードメインを含むキメラ受容体の構造を示す図１５に概略的に示す。これらのキメラ受容体変異体の一部は、ＣＤ３ζ及び／又は別のシグナル伝達ドメインを含むエフェクタードメインに依存し、リガンド結合時にシグナルを伝達する一方、他のキメラ受容体変異体は、二量体化を通じて完全長ＣＤ３ζ分子をシナプスに動員するＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む。上記のように、この構築物の発現レベルを評価した。ＭＦＩによる評価として（図１８Ａ〜Ｂ）、操作した構築物を形質導入したＮＫ細胞は、モック形質導入細胞と比べてキメラ受容体の増強された発現を示した。細胞傷害性効果を、１：１のエフェクター：標的比を用いて、上記のように評価した。図１９Ａ〜Ｂに示す通り、操作した構築物（特に変異体１８）を形質導入したＮＫ細胞は、モック対照と比べて増強された細胞傷害性を有する。
【０２０４】
変異体１８が増強された細胞傷害性効果を伴うＮＫ細胞において強力な発現を示したことから、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む一連のＮＫＧ２Ｄ変異体構築物を作製した。これらの変異体は、「ＮＫ３９」と称し、図１５に概略的に示す。ドナーＮＫ細胞へのトランスフェクションから１４日後（低ＩＬ−２条件下での４日間の培養を伴う）、形質導入ＮＫ細胞の細胞傷害性を評価した。図２１は、１：１及び１：２のＥ：Ｔ比で培養したＲＥＨ細胞に対するこの構築物の細胞傷害性効果を示す。操作されたＮＫ３９構築物を発現するＮＫ細胞のすべては、１：１のＥ：Ｔ比で対照ＮＫ細胞と比べて有意に増強された細胞傷害性効果を示した。１：２のＥ：Ｔ比で評価したとき、キメラ構築物１６−７、３９−１、３９−２、３９−３及び３９−５の各々は、それらの各形質導入ＮＫ細胞の細胞傷害性効果をモック対照と比べて増強した。活性化受容体の外因性発現がＮＫ細胞のアネルギー及び細胞死をもたらし得ることから、操作した構築物を２つのドナーＮＫ細胞に形質導入し、２１日後に生存を評価した。図２３Ａ〜Ｂに示すように、ＮＫ３９−５及びＮＫ３９−１０形質導入細胞は、２つの試験ドナーにおいてＮＫ１６よりも良好な生存を示す。
【０２０５】
実施例４  −  ＮＫ４５  ＮＫＧ２Ｄ構築物の評価
本明細書で開示される実施形態に記載の異なる細胞外ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン及び細胞内エフェクタードメインを有する追加的な構築物を図２２に概略的に示す。本実施例において、これらの７つの構築物によって媒介される発現、細胞傷害性、持続性及びサイトカイン産生を、実施例３に記載のＮＫ３９構築物の３つ（ＮＫ３９−５、ＮＫ３９−６、ＮＫ３９−１０）並びに膜結合性インターロイキン１５をバイシストロン性に発現するＮＫ１６の一バージョン（ＮＫ２６−８）に対して評価した。本明細書で開示されるいくつかの実施形態によると、複数のシグナル伝達領域を用い得る。これらのキメラ受容体変異体の一部は、ＣＤ３ζ及び／又は別のシグナル伝達ドメイン（例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２８及び／又は４−１ＢＢ同時刺激ドメイン）を含むエフェクタードメインに依存し、リガンド結合時にシグナルを伝達する一方、他のキメラ受容体変異体は、二量体化を通じて完全長ＣＤ３ζ分子をシナプスに動員するＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む。本明細書で開示される通り、これらの構築物は、膜結合性ＩＬ１５を同時発現するようにさらに設計する。
【０２０６】
上記のように、まずＮＫ細胞がこれらの構築物を有効に発現する能力を評価した。ドナー４名のＰＢＭＣから拡大したＮＫ細胞にこの変異体構築物（又はＧＦＰのみを含有する空のＭＳＣＶコントロールベクター）を形質導入し、３日後にＮＫＧ２Ｄの発現をＭＦＩにより評価した。図２４に示す通り、モックトランスフェクトＮＫ細胞は、比較的低いレベルのＮＫＧ２Ｄの発現を示す。それに対し、操作した変異体構築物は、有意に増強された発現を示し、ＮＫ４５−４（ＮＫＧ２Ｄ−ＯＸ４０−ＣＤ３ζ）は、意外にもすべてのドナーにおいて強力な発現を示した。ＯＸ４０は、活性化ＮＫ細胞で発現されるが、その役割は、十分に確立されていない。ＣＤ２８同時刺激ドメイン（ＮＫ４５−２；ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ２８−ＣＤ３ζ）を含有するエフェクタードメインを有するキメラ受容体変異体も形質導入から３日後に強力な発現を示した。
【０２０７】
この変異体構築物の発現を樹立しており、それらが細胞傷害性効果を発揮する能力を、標的としてＲＥＨ及びＨＬ６０細胞を用いて、上記のように評価した。形質導入から１４日後、１：１のＥ：Ｔ比でＲＥＨ細胞（図２５Ａ）及びＨＬ６０細胞（図２５Ｂ）に対するドナー４名からのＮＫ細胞の効力を試験した。図２５Ａ〜Ｂに示す通り、操作した構築物は、４つ全部のドナーにおけるＲＥＨ及びＨＬ６０細胞の両方に対して、モックＮＫ細胞と比べて増強された細胞傷害性を発揮した。その明白な発現特性に加えて、ＮＫ４５−４（ＮＫＧ２Ｄ−ＯＸ４０−ＣＤ３ζ）を発現する細胞も、モック対照及び試験した他の構築物と比べて意外にも増強された細胞傷害性を示した。ＮＫ４５−１及びＮＫ４５−２を発現するＮＫ細胞もこれらのアッセイにおいて明白な細胞傷害性を示した。これらのデータは、いくつかの実施形態によると、シグナル伝達ドメインの組み合わせ（特にＯＸ４０同時刺激ドメイン）の使用により、形質導入ＮＫ細胞の有効性において想定外の増強がもたらされ得ることを示す。図２８Ａ〜Ｂは、様々なＥ：Ｔ比（１：２及び１：４）での、いくつかの変異体構築物を形質導入したＮＫ細胞のＵ２ＯＳ細胞に対する、より長期間にわたり評価した細胞傷害活性を示す。意外にも、４５−４構築物を形質導入したＮＫ細胞は、全期間を通じて細胞傷害活性を維持するように思われる。有利には、これらの実験は、本明細書で開示されるいくつかの実施形態によると、ＮＫＧ２Ｄ変異体構築物が、実施形態に応じて、２〜３日、３〜５日、５〜７日、７〜８日、８〜１０日、１０〜１４日、１４〜２１日又は２１〜５０日の範囲（及びエンドポイントを含む、列挙された日数間の任意の範囲）であり得るような長期間にわたり、想定外に増強された細胞傷害性をもたらすことを示す。いくつかの実施形態では、細胞傷害性効果がさらにより長い持続期間で達成される。
【０２０８】
細胞傷害性データに加えて、ＮＫ細胞がこれらの効果を発揮している機構を、ＲＥＨ細胞による刺激後にＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＧＭ−ＣＳＦのその産生を評価することにより試験した。図２６Ａ〜Ｃに示す通り、変異体構築物の各々の発現により、ＧＦＰ発現対照ＮＫ細胞によって示されたＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＧＭ−ＣＳＦの産生と比べてサイトカイン分泌の増強がもたらされた。キメラ受容体ＮＫ４５−１は、一貫して高いサイトカイン産生を媒介したが、この構築物が実質的にＮＫ２６−８（専らヒンジ領域についてそれと異なる）よりも低いレベルで発現することから、それは、意外である。したがって、これらのデータは、刺激に応答した強力なサイトカイン産生を媒介することに対する本明細書で開示されるヒンジ領域の想定外の重要性を示す。加えて、ＮＫＧ２Ｄ−ＯＸ４０−ＣＤ３ζを発現するＮＫ細胞もＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＧＭ−ＣＳＦの増強された産生を示した。
【０２０９】
活性化受容体の外因性発現がＮＫ細胞のアネルギー及び細胞死をもたらし得ることから、操作した構築物を２つのドナーＮＫ細胞に形質導入し、形質導入から７、１４及び２１日後に総細胞数を評価した。意外にも、ＮＫ４５−４の想定外に強力な発現は、培養下でのＮＫ細胞の持続性低下という不利な状況で生じず、なぜなら、総細胞数は、ＧＦＰ発現対照細胞と同等のレベルで維持されるからである（図２７Ａ及び２７Ｂ）。同様に、変異体構築物を高いレベルで発現する他のＮＫ細胞は、形質導入後の少なくとも３週間、ドナー２名において増殖し続けた。まとめると、これらのデータは、本明細書で開示されるいくつかの実施形態によると、操作した構築物がＮＫ細胞において高レベルで十分に発現され、細胞傷害性効果を媒介し得ること、したがって、この増強された発現がＮＫ細胞の増殖及び／又は生存の低下という不利な状況で生じないことを示す。
【０２１０】
上に開示された実施形態の具体的特徴及び態様の様々な組み合わせ又は部分的組み合わせが本発明の１つ以上の範囲内に設けられ、さらに属し得ることが考慮される。さらに、本明細書で示されるすべての他の実施形態において、実施形態に関連した任意の特定の特色、態様、方法、特性、特徴、品質、属性、要素などに関する本明細書中の開示を用いることができる。したがって、開示される本発明の異なる態様を形成するため、開示される実施形態の様々な特徴及び態様は、相互に組み合わせるか又は置き換えられ得ることが理解されるべきである。したがって、本明細書で開示される本発明の範囲は、上記の特定の開示される実施形態によって限定されるべきでないことが意図される。さらに、本発明は、様々な修飾形態及び代替形態が可能であるが、その具体例は、図面で示されており、本明細書中で詳述される。しかし、本発明が開示される特定の形態又は方法に限定されるべきでなく、逆に、本発明は、記述される様々な実施形態及び添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に入るすべての修飾形態、均等物及び代替物を網羅するべきであることが理解されるべきである。本明細書で開示される任意の方法は、列挙される順序で実施される必要はない。本明細書で開示される方法は、施術者によってとられる特定の行動を含むが、それらは、明示的又は暗示的のいずれかでそれらの行動についての任意の第三者の指示も含み得る。例えば、「拡大されたＮＫ細胞の集団を投与すること」などの行動は、「拡大されたＮＫ細胞の集団の投与を指示すること」を含む。さらに、本開示の特色又は態様がマーカッシュグループの観点で説明される場合、当業者は、本開示が、それにより、マーカッシュグループの任意の個々のメンバー又はそのメンバーのサブグループの観点でも説明されることを理解するであろう。
【０２１１】
本明細書で開示される範囲は、あらゆる重複、部分範囲及びそれらの組み合わせも包含する。「最大」、「少なくとも」、「〜よりも大きい」、「〜よりも少ない」、「〜の間」などの文言は、列挙される数を含む。「約」又は「概ね」などの用語が先行する数は、列挙される数を含む。例えば、「約９０％」は、「９０％」を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも９５％の相同性は、参照配列に対する９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％の相同性を含む。さらに、配列がヌクレオチド又はアミノ酸配列を「含んでいる」として開示されるとき、かかる参照は、別段の指示がない限り、この配列が列挙される配列「を含む」、「からなる」又は「から本質的になる」ことも含むものとする。
【図１Ａ−１Ｃ】
2020512005.tif 000003
【図２Ａ−２Ｂ】
2020512005.tif 000004
【図３Ａ−３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ−４Ｃ】
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【図５Ａ−５Ｃ】
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【図６Ａ−６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ−８Ｃ】
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【図９Ａ−９Ｃ】
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【図１０Ａ−１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ−１２Ｂ】
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【図１３Ａ−１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５−１】
2020512005.tif 000020
【図１５−２】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ−１】
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【図１６Ｂ−２】
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【図１６Ｂ−３】
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【図１６Ｂ−４】
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【図１６Ｂ−５】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８Ａ−１８Ｂ】
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【図１９Ａ−１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
2020512005.tif 000039
【図２６Ａ−２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2020512005.tif 000046
2020512005.tif 000047
2020512005.tif 000048
2020512005.tif 000049