(57)【要約】  本発明は、負に帯電したグリコサミノグリカンと、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤との併用投与を含む癌の治療のための医薬として使用するための負に帯電したグリコサミノグリカンであって、このグリコサミノグリカンは、ヘパリンの末端五糖の不存在を特徴とする負に帯電したグリコサミノグリカンに関する。本発明は、単独のＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤治療に対して抵抗性を示す癌種の治療のための医薬としてのグリコサミノグリカンとＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤との併用投与も包含する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療における医薬として使用するための負に帯電したグリコサミノグリカンであって、前記癌の治療は、
（１）負に帯電したグリコサミノグリカンであって、前記グリコサミノグリカンは、ヘパリンの末端五糖の不存在を特徴とする負に帯電したグリコサミノグリカンと、
（２）ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤と
の併用投与を含む、医薬として使用するための負に帯電したグリコサミノグリカン。
【請求項２】
前記グリコサミノグリカンが硫酸化されている請求項１に記載の医薬として使用するためのグリコサミノグリカン。
【請求項３】
前記グリコサミノグリカンの硫酸化度が、１．０超、好ましくは１．２超、より好ましくは１．４超である請求項１又は請求項２に記載の医薬として使用するためのグリコサミノグリカン。
【請求項４】
存在しない前記ヘパリンの末端五糖が、五糖ＧｌｃＮＡｃ／ＮＳ（６Ｓ）−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＳ（３Ｓ，６Ｓ）−ｌｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）である請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の医薬として使用するためのグリコサミノグリカン。
【請求項５】
前記グリコサミノグリカンが、約５０００〜約１２０００ダルトンの平均分子量を示す請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の医薬として使用するためのグリコサミノグリカン。
【請求項６】
前記グリコサミノグリカンがペントサンポリ硫酸（ＰＰＳ）である請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の医薬として使用するためのグリコサミノグリカン。
【請求項７】
前記グリコサミノグリカンがデキストラン硫酸（ＤＸＳ）である請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の医薬として使用するためのグリコサミノグリカン。
【請求項８】
併用投与のための前記ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤がＭＥＫ阻害剤である請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の医薬として使用するためのグリコサミノグリカン。
【請求項９】
前記ＭＥＫ阻害剤がセルメチニブである請求項８に記載の医薬として使用するためのグリコサミノグリカン。
【請求項１０】
前記ＭＥＫ阻害剤が、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、コビメチニブ又はＸＬ５１８、ビニメチニブ（ＭＥＫ１６２）、ＰＤ−３２５９０１、ＣＩ−１０４０、ＰＤ０３５９０１、ＴＡＫ−７３３からなる群から選択される請求項８又は請求項９に記載の医薬として使用するためのグリコサミノグリカン。
【請求項１１】
併用投与のための前記ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤がＲａｆ阻害剤であり、好ましくはエンコラフェニブ（ＬＧＸ８１８）、ダブラフェニブ（ＧＳＫ２１１８４３６）及びベムラフェニブ（ＰＬＸ４０３２）からなる群から選択される請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の医薬として使用するためのグリコサミノグリカン。
【請求項１２】
前記癌が、前記ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、好ましくはＭＥＫ阻害剤及び／又はＲａｆ阻害剤に抵抗性があり、かつ／又は前記ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、好ましくはＭＥＫ阻害剤及び／又はＲａｆ阻害剤に対する抵抗性を発現する高まったリスクにある癌性細胞を含む請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の医薬として使用するためのグリコサミノグリカン。
【請求項１３】
前記癌が、細胞表面に１以上のＥｒｂＢファミリータンパク質の存在を示す癌性細胞を含む請求項１から請求項１２のいずれか一項に記載の医薬として使用するためのグリコサミノグリカン。
【請求項１４】
前記癌が、適切な（非癌性の）対照細胞と比べて、１以上のＥｒｂＢファミリータンパク質の上昇した発現（上方制御）及び／又は上昇したＥｒｂＢシグナル伝達を示す癌性細胞を含む請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の医薬として使用するためのグリコサミノグリカン。
【請求項１５】
前記上方制御されたＥｒｂＢファミリータンパク質が、Ｈｅｒ１（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１）、Ｈｅｒ２（Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ３）、及びＨｅｒ４（ＥｒｂＢ４）、好ましくはＨｅｒ３（ＥｒｂＢ３）である請求項１４に記載の医薬として使用するためのグリコサミノグリカン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、負に帯電したグリコサミノグリカンと、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤との併用投与を含む癌の治療のための医薬として使用するための負に帯電したグリコサミノグリカンであって、このグリコサミノグリカンは、ヘパリンの末端五糖の不存在を特徴とする負に帯電したグリコサミノグリカンに関する。本発明は、単独のＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤治療に対して抵抗性を示す癌種の治療のための医薬としてのグリコサミノグリカンとＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤との併用投与をも包含する。
【背景技術】
【０００２】
現在の癌治療の目標は、細胞成長に影響を及ぼすシグナル伝達経路の中の分子、特に、正常細胞を癌性にさせる分子を特定することである。１つのこのような経路は、Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路又はＲａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫとも呼ばれるＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路であり、そのメンバーのうちの１以上のものの上方制御は、いくつかの癌に関与していると考えられる。
【０００３】
ＭＡＰＫの構成的作用は、結腸、肺、乳房、膵臓、卵巣及び腎臓に由来する細胞株を含めた原発性腫瘍細胞株の３０％超において報告されている（Ｈｏｓｈｉｎｏら、１９９９）。正常な隣接組織と比べてより高濃度の活性なＭＡＰＫ／ＥＲＫ（ｐＭＡＰＫ／ｐＥＲＫ）も腫瘍組織において検出されている（Ｓｉｖａｒａｍａｎら、１９９７）。
【０００４】
このＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路は、多くの癌において特定されており腫瘍成長、進行及び転移を促進するＲａｓ（例えばＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、及びＨＲＡＳ）及びＲａｆ（例えばＢＲＡＦ）の変異表現型等の成長因子及び発癌因子からの増殖性で抗アポトーシスのシグナル伝達を媒介することが特定されている。
【０００５】
複数の成長因子受容体からの成長促進的なシグナルの媒介における役割に起因して、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の化合物は、特に癌の治療に関してだけでなく、望まれない細胞増殖に関連する他の障害の治療においても潜在的に幅広い治療への応用を有する分子標的である。
【０００６】
このＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路は、後生動物で高度に保存された、膜から核へのシグナル伝達モジュールである。この経路の出発点において、リガンド（例えば、成長因子、サイトカイン又はホルモン）は受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の細胞外部分に結合し、これは、受容体チロシンキナーゼの細胞質ドメインのリン酸化を引き起こす。ＲＴＫの活性化により、細胞質内のアダプタータンパク質がグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）を動員することが可能になり、このグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）は、ＧＤＰからＧＴＰへの交換を触媒することにより低分子ＧＴＰアーゼＲＡＳを活性化する。次に、ＲａｓはＲａｆを活性化し、このＲａｆは、ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫＫ又はＭＡＰ３Ｋ）として機能する。その後、ＲａｆはＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）をリン酸化し活性化する。このＭＡＰキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）は、この経路の中ではＭＥＫ（ＭＡＰＫ又はＥＲＫキナーゼ）と呼ばれる。ＭＥＫは、ＥＲＫ（細胞外シグナル制御キナーゼ）と呼ばれるＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）である、この経路における第３でかつ最終の酵素をリン酸化して活性化する。活性化されると、ＥＲＫは、核の中へと移動することができ、その核の中で、ＥＲＫは転写因子をリン酸化し、これにより、成長因子により誘導される遺伝子制御、細胞周期移行又は細胞分化等の重要な細胞プロセスにおける活性を制御する（Ｐｅｙｓｓｏｎｎａｕｘら、２００１）。
【０００７】
ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路では、ＭＥＫ（特にＭＥＫ１及びＭＥＫ２）は、そのＭＡＰＫ基質、ＥＲＫ１及びＥＲＫ２のリン酸化を触媒することにおいて、戦略的に下流の位置を占める（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９０）。基質ＥＲＫ１及びＥＲＫ２に対する高選択性並びに二重特異性キナーゼとして作用するというユニークな能力に起因して、ＭＥＫは、ＭＡＰＫ経路へのシグナルの統合において中心的な役割を果たす。しばしば、ＭＥＫは、ＢＲＡＦ及びＲＡＳ遺伝子（ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、及びＨＲＡＳ）中の変異を活性化する結果として、ヒトの癌では調節解除される。ＥＲＫシグナル伝達異常の高い発生率並びにこれらの癌化ドライバー（がんを支配している原因、ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｄｒｉｖｅｒ）に対するＲＡＳ及びＢＲＡＦ変異腫瘍の依存性をふまえ、抗癌治療としての使用のためにこの経路の阻害剤を特定する多大な努力が進行中である。
【０００８】
ＲＡＦ阻害剤ベムラフェニブ及びダブラフェニブは、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ又はＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ黒色腫の患者において顕著な臨床活性を示している（Ｆｌａｈｅｒｔｙら、２０１０、Ｃｈａｐｍａｎら、２０１１、Ｈａｕｓｃｈｉｌｄら、２０１２）。同様に、いくつかの非常に特異的で強力なＭＥＫ１／２阻害剤が開発されており、臨床研究で評価されている。例えば、トラメチニブ投与は、ＢＲＡＦ−Ｖ６００変異及び切除不可能な黒色腫又は転移した黒色腫の患者を処置することにおいて成功裏の治療戦略として証明されている（Ｌｕｇｏｗｓｋａら、２０１５）。しかしながら、また、多くのＭＥＫ阻害剤は、単剤療法では、臨床試験において限られた有効性しか示さなかった（Ｙ．Ｚｈａｏら、２０１５）。
【０００９】
さらに、他の発癌性キナーゼの阻害剤の場合のように、標的キナーゼＲａｆ又はＭＥＫの阻害に基づく治療の臨床的恩恵は、薬物耐性の出現によって限定的である（Ｐｏｕｌｉｋａｋｏｓら、２０１１、Ｒｏｓｅｎら、２０１３）。
【００１０】
複数の薬剤を使用する併用治療による戦略は、有望な結果を示している。例えば、ＭＥＫ阻害剤とＲａｆ阻害剤との組み合わせは、治療有効性を改善する（国際公開第２００９／０１８２３８Ａ号パンフレット、Ｅｒｏｇｌｕら、２０１６）。ＭＥＫ阻害剤とＢＴＫ阻害剤との併用投与も提案されている（国際公開第２０１７／０３３１１３Ａ１号パンフレット）。米国特許出願公開第２０１４／１３４１５８Ａ１号明細書、国際公開第２０１５／１６１２３０Ａ１号パンフレット及びＤｏｏｌｅｙ  Ａ．ら、２０１４も、癌の治療におけるＭＡＰＫ／ＭＥＫ阻害剤の使用を提案する。しかしながら、併用治療アプローチをもってしても、疾患進行及び抵抗性の発現が認められている（Ｇｒｉｍａｌｄｉら、２０１７）。
【００１１】
異常なＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路活性に関連する癌の治療のためのさらなる薬理学的な療法に対するニーズがあり続けている。
【００１２】
Ｃｌａｉｒｅ  Ｌｏｕｉｓｅ  Ｃｏｌｅらは、血管新生に対する阻害剤としてのオリゴ糖の使用を提案する（Ｃｏｌｅら、２０１０）。さらには、最近、血小板と増殖する癌性細胞の表面との物理的相互作用を邪魔することに拠る抗増殖治療が提案されている（国際公開第２０１５／０５９１７７Ａ１号パンフレット）。
【００１３】
国際公開第２０１５／０５９１７７Ａ１号パンフレットに示されているように、硫酸化グリコサミノグリカンは、血小板と癌性細胞の表面との物理的相互作用を妨げ、これは、増殖を、従って腫瘍成長を低下する可能性があり、又は停止させる可能性さえある。
【００１４】
上記文献に記載されているアプローチは、異なるが、血小板が腫瘍細胞の表面に結合すること、及びこの結合が腫瘍転移に関与することという知見に補完的である。例えば、Ｍｏｄｅｒｙ−Ｐａｗｌｏｗｓｋｉら、２０１３及びＴａｋａｇｉら、２０１３は、血小板と腫瘍細胞との物理的相互作用が腫瘍細胞の転移に重要な役割を果たすことを開示した。
【００１５】
血小板−細胞表面相互作用を崩壊させることによる癌性細胞の増殖の阻害についての機構は、血小板によって癌性細胞まで運ばれる成長因子を邪魔することに拠る可能性が高い。
【００１６】
成長因子は、正常細胞及び悪性細胞の成長にとって必須であり、増殖細胞にとって利用可能になっている必要がある。Ｇ０期を離れてＧ１期で準備している細胞は、Ｓ期への移行及び関連する細胞増殖に関する適切なシグナルを必要とする。しかしながら、かなりの程度で、成長因子は、インビボの血液中では遊離の物質として利用可能ではなく、むしろ血小板内の小胞中にあり、従って血小板が成長因子を提供する。さらには、血小板と腫瘍細胞の表面との物理的相互作用及びその際に想定される形態に起因して、成長因子は、細胞増殖にとって特定の必要な場所で放出される。
【００１７】
ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤を開発することに関してなされた進展にもかかわらず、このような阻害剤に対して抵抗性の癌細胞を処置するために、又はそのような抵抗性の出現を予防するため、若しくはそのような抵抗性の出現のリスク又は頻度を低下させるため大きなニーズが当該技術分野にある。
【００１８】
本明細書に記載されるように、負に帯電したグリコサミノグリカンと一緒のＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤の併用投与は、驚くべきことに、種々の腫瘍を治療するための、特にＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤に抵抗性であるか抵抗性になるリスクにある腫瘍を処置すること関して有効な治療的アプローチを表す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】国際公開第２００９／０１８２３８Ａ号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１７／０３３１１３Ａ１号パンフレット
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１４／１３４１５８Ａ１号明細書
【特許文献４】国際公開第２０１５／１６１２３０Ａ１号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２０１５／０５９１７７Ａ１号パンフレット
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｈｏｓｈｉｎｏ  Ｒ．、Ｃｈａｔａｎｉ  Ｙ．、Ｙａｍｏｒｉ  Ｔ．、Ｔｓｕｒｕｏ  Ｔ．、Ｏｋａ  Ｈ．、Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｏ．、Ｓｈｉｍａｄａ  Ｙ．、Ａｒｉ−ｉ  Ｓ．、Ｗａｄａ  Ｈ．、Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  Ｊ．、Ｋｏｈｎｏ  Ｍ．、Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ４１−／４３−ｋＤａ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｕｒｓ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１８：８１３−８２２（１９９９）
【非特許文献２】Ｓｉｖａｒａｍａｎ，Ｖ．Ｓ．、Ｗａｎｇ，Ｈ．、Ｎｕｏｖｏ，Ｇ．Ｊ．及びＭａｌｂｏｎ，Ｃ．Ｃ．  Ｈｙｐｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、９９：１４７８−１４８３（１９９７）
【非特許文献３】Ｐｅｙｓｓｏｎｎａｕｘ  Ｃ．、Ｅｙｃｈｅｎｅ  Ａ．、Ｔｈｅ  Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ  ｐａｔｈｗａｙ：ｎｅｗ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ、９３：５３−６２（２００１）
【非特許文献４】Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＮＧ．、Ｍａｌｌｅｒ  Ｊ．Ｌ．、Ｔｏｎｋｓ  Ｎ．Ｋ．、Ｓｔｕｒｇｉｌｌ  Ｔ．Ｗ．、Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ、３４３：６５１−６５３（１９９０）
【非特許文献５】Ｆｌａｈｅｒｔｙ，Ｋ．Ｔ．ら、Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｅｄ，ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＢＲＡＦ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．  ３６３：８０９−８１９（２０１０）
【非特許文献６】Ｃｈａｐｍａｎ，Ｐ．Ｂ．ら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈ  ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｗｉｔｈ  ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ．  Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．  ３６４：２５０７−２５１６（２０１１）
【非特許文献７】Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ，Ａ．ら、Ｄａｂｒａｆｅｎｉｂ  ｉｎ  ＢＲＡＦ−ｍｕｔａｔｅｄ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ：ａ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ，ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ，ｐｈａｓｅ  ３  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ．  Ｌａｎｃｅｔ  ３８０：３５８−３６５（２０１２）
【非特許文献８】Ｌｕｇｏｗｓｋａ  Ｉ．、Ｋｏｓｅｌａ−Ｐａｔｅｒｃｚｙｋ  Ｈ．、Ｋｏｚａｋ  Ｋ．、Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ  Ｐ．、Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ：ａ  ＭｅＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｆｏｒ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ、ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、８：２２５１−２２５９（２０１５）
【非特許文献９】Ｚｈａｏ，Ｙ．、Ａｄｊｅｉ，Ａ．Ａ．、Ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ＭＥＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．  １１：３８５−４００（２０１４）
【非特許文献１０】Ｐｏｕｌｉｋａｋｏｓ  Ｐ．Ｉ．ら、Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ＭＥＫ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ｓｈｏｕｌｄ  Ｗｅ  Ｃｏ−Ｔａｒｇｅｔ  Ｕｐｓｔｒｅａｍ？、Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ４（１６６）：ｐｅ１６（２０１１）
【非特許文献１１】Ｒｏｓｅｎ  Ｎ．ら、Ｔｕｍｏｕｒ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ＲＡＦ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９：１１（２０１３）
【非特許文献１２】Ｅｒｏｇｌｕ  Ｚ．、Ｒｉｂａｓ  Ａ．、Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ＢＲＡＦ  ａｎｄ  ＭＥＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｍｅｌａｎｏｍａ：ｌａｔｅｓｔ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｌａｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、８（１）：４８−５６（２０１６）
【非特許文献１３】Ｄｏｏｌｅｙ  Ａ．Ｊ．ら、Ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ  ｄｏｓｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ  ｉｎ  ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ−ｍｕｔａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ：Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃａｓｅ  ｓｅｒｉｅｓ、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、６（６）：２６２−２６６（２０１４）
【非特許文献１４】Ｇｒｉｍａｌｄｉ  Ｍ．ら、Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ＢＲＡＦ  ａｎｄ  ＭＥＫ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ  ａｎｄ  Ｃｏｂｉｍｅｔｉｎｉｂ  ｆｏｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｅｌａｎｏｍａ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、１３：１−５（２０１７）
【非特許文献１５】Ｃｏｌｅら、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｈｅｐａｒａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、５（７）：ｅ１１６４４
【非特許文献１６】Ｍｏｄｅｒｙ−Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ，Ｃ．Ｌ．、Ｍａｓｔｅｒ，Ａ．Ｍ．、Ｐａｎ，Ｖ．、Ｈｏｗａｒｄ，Ｇ．及びＧｕｐｔａ，Ａ．Ｓ．、Ａ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｍｉｍｅｔｉｃ  Ｐａｒａｄｉｇｍ  ｆｏｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ．  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１４（３）：９１０−９１９（２０１３）
【非特許文献１７】Ｔａｋａｇｉ，Ｓ．、Ｓａｔｏ，Ｓ．、Ｏｈ−ｈａｒａ，Ｔ．、Ｔａｋａｍｉ，Ｍ．、Ｋｏｉｋｅ，Ｓ．、Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｙ．、Ｈａｔａｋｅ  Ｋ．、Ｆｕｊｉｔａ，Ｎ．、Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｖｉａ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ａｇｇｒｕｓ／Ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎ  ａｎｄ  ＣＬＥＣ−２．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、８（８）：ｅ７３６０９（２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
上記先行技術を踏まえて、本発明の根底にある技術的課題は、癌の治療のための代替手段を提供することである。本発明のさらなる目的は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤に抵抗性であるか抵抗性になるリスクにある腫瘍を治療するための手段の提供である。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
この課題は、独立請求項の特徴によって解決される。本発明の好ましい実施形態は、従属請求項によって提供される。
【００２３】
本発明は、それゆえ、癌の治療のための医薬として使用するための負に帯電したグリコサミノグリカンであって、この癌の治療は、
（１）負に帯電したグリコサミノグリカンであって、このグリコサミノグリカンは、ヘパリンの末端五糖の不存在を特徴とする負に帯電したグリコサミノグリカンと、
（２）ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤と
の併用投与を含む、医薬として使用するための負に帯電したグリコサミノグリカンに関する。
【００２４】
ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路カスケードの化合物のうちの１つとの相互作用を標的とし、従ってＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路活性の低下につながる任意の分子に関連しうる。これらの阻害剤は、特に、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、低分子ＧＴＰアーゼであるＲａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ又はＥＲＫを含めたＭＡＰＫ／ＥＲＫカスケードの酵素のうちの１以上に対する阻害機能を誘導する。上記のとおり、異常なＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達活性は、多くの癌性疾患に関与し、その経路の阻害剤に基づくいくつかの有望な治療的アプローチにつながる。
【００２５】
しかしながら、ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達カスケードの酵素の多くの特定された強力な阻害剤について、エスケープ機構が認められており、この機構は、臨床試験において抵抗性及び低い治療有効性につながる。
【００２６】
しかしながら、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害治療からのそのような「エスケープ事象」（すなわち、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤抵抗性の発現又は強化を介する腫瘍のエスケープ）は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤の投与を負に帯電したグリコサミノグリカンと組み合わせるとき、克服することができるというのが、本発明者の驚くべき知見である。
【００２７】
グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、繰り返しの二糖単位から構築される大きい、好ましくは直鎖状の多糖である。一次構成は、好ましくはアミノ糖（ＧｌｃＮＡｃ又はＧａｌＮＡｃのいずれか）及びウロン酸（グルクロン酸及び／又はイズロン酸のいずれか）を含む。
【００２８】
これまでに、硫酸化グリコサミノグリカンは、血小板（すなわち栓球）と癌性細胞との間の物理的相互作用を損なう可能性があるということが示されている。より一般的には、上記の血小板−細胞結合の阻害の根底にある機構を決める特徴は、グリコサミノグリカンの負電荷である。
【００２９】
事実上すべての哺乳類の細胞は、プロテオグリカンを産生し、それをＥＣＭ中に分泌し、それを細胞膜中に挿入し、又はそれを分泌顆粒の中に保存する。それゆえ、特に増殖に関与する細胞の細胞膜は、血小板に結合することができる負に帯電したグリコサミノグリカンに似た構造を保有する。本発明の負に帯電したグリコサミノグリカンは、例えば血小板上の膜受容体分子をブロックするという点で、競合的に作用する可能性があり、この膜受容体分子は、ブロックされなければ、癌性細胞の膜の上の負に帯電した表面分子を認識することに関与するものである。このようにして、グリコサミノグリカンに、血小板−癌細胞相互作用に対するその化合物の阻害機能をもたらすのは、グリコサミノグリカンの負電荷である。
【００３０】
特に好ましい負に帯電したグリコサミノグリカンは硫酸化グリコサミノグリカンに関するが、しかしながら、負電荷を保有する非硫酸化グリコサミノグリカンも、開示された発明に従って使用されてもよい。
【００３１】
いくつかの実施形態では、他の負に帯電したグリコサミノグリカンは、１以上のブタン酸アニオンを含むグリコサミノグリカン、又は酪酸化グリコサミノグリカン、すなわち対応する負電荷を示すための酪酸で官能化されたグリコサミノグリカンに関する。このような分子は、ブタノイル化ＬＭＷＨ等のブタノイル化グリコサミノグリカンと名付けさられてもよい。
【００３２】
例えば、ヒアルロン酸も用いられてよい。癌性細胞上の血小板のシグナル伝達活性を妨害することにより、負に帯電したグリコサミノグリカンは、上記細胞に対する阻害機能を示す。しかしながら、本明細書で使用する場合、負に帯電したグリコサミノグリカンとの用語は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤には該当しない。なぜなら、グリコサミノグリカンは、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の酵素を直接妨げるのではなく、血小板と癌性細胞との物理的相互作用を妨げて、成長因子の供給を邪魔することにより細胞シグナル伝達に下流で効果を及ぼすだけだからである。
【００３３】
本発明者により発見されたように、負に帯電したグリコサミノグリカンと一緒のＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤の併用投与は、癌性疾患の治療において、単独様式で考慮されたときのそれぞれ個別の効果の和よりも大きい、相乗的な治療効果をもたらす。
【００３４】
これまでの研究から得られた見通しに基づくと、治療不成功及び／又はＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤に対する抵抗性は、成長因子依存的なエスケープ経路におよその原因がある可能性があるということが仮定される。
【００３５】
例として、例えばＭＥＫ阻害剤セルメチニブによってＭＥＫの機能を妨げることによるＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害は、Ｅｒｂファミリータンパク質等のさらなるＲＴＫタンパク質の産生を誘導する非リン酸化ＥＲＫを介して代替のシグナル伝達経路の活性化を生じる可能性がある。これにより、Ｒａｓシグナル伝達と並行なシグナル伝達連鎖が活性化され、これは、例えばＥｒｂｂ３の場合は、ＭＡＰ３Ｋ１及びＭＡＰ２Ｋ４を介する膜−核シグナル伝達モジュールを通して細胞成長を促進しうる（図１を参照）。ＭＥＫ阻害剤が癌性細胞におけるＥｒｋのリン酸化、従ってＲａｓシグナル伝達を効率的に崩壊させる可能性があるとしても、並行するＥｒｂファミリータンパク質依存的な経路により、増殖及び腫瘍成長の連続支援が可能になる。
【００３６】
同様に、研究は、ＢＲＡＦ阻害剤ベムラフェニブに対する抵抗性が、Ｅｒｂタンパク質ファミリーの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を介するシグナル伝達の増加に起因する可能性があるということを示唆した。ベースラインレベルで、ＢＲＡＦ→ＭＥＫ→ＥＲＫシグナル伝達は、ＲＴＫ  ＥＧＦＲシグナル伝達を減弱するように働く負のフィードバックループを活性化する一方で、ベムラフェニブによるＢＲＡＦ阻害は、この負のフィードバックを緩和し、ＥＧＦＲを介するシグナル伝達の増加につながる。これにより増殖を支えるＰＩ３Ｋによる正の膜対核のシグナル伝達が誘導される。従って、単一の治療的なＢＲＡＦ阻害剤のその目的に向かう活性は、特定の癌、特に転移性の結腸直腸癌及び甲状腺癌においては、化学療法抵抗性の迅速な、適応機構を活性化する可能性がある（Ｈｏｌｄｅｒｆｉｅｌｄら、２０１４）。
【００３７】
しかしながら、驚くべきことに、負に帯電したグリコサミノグリカンの併用投与は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤についてのそのようなシグナル伝達エスケープ経路を有効に妨げる可能性がある。理論に結びつけられたくはないが、本発明者は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤に対するエスケープ経路は、部分的又は全体的なＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害に応答して増加的に産生されるＥｒｂファミリーのタンパク質の成長因子依存的活性化に拠ると確信している。負に帯電したグリコサミノグリカンの投与は、血小板により送達される成長因子を断つことによって、Ｅｒｂタンパク質依存的な代替のシグナル伝達経路の活性化のために必要な成長因子の供給を減少させることにより、上記エスケープ経路を妨げる可能性が高い。
【００３８】
上記のとおり、負に帯電したグリコサミノグリカンは、特に、癌性細胞に関して血小板−細胞表面相互作用に対して強い阻害機能を示す。血小板はインビボでの成長因子の主要な源を代表することを考慮すると、血小板の妨害は、従って成長因子の供給の妨害は、癌の治療における負に帯電したグリコサミノグリカンとＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤との併用投与の相乗効果のもっともらしい説明である。
【００３９】
本発明の併用投与は、白血病、例えば急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、血液悪性腫瘍又はリンパ腫等の非固形腫瘍、並びに固形腫瘍及びそれらの転移、例えば黒色腫、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、神経膠芽腫、甲状腺の細胞腫、胆管、骨、胃、脳／ＣＮＳ、頭頸部、肝臓、胃、前立腺、乳房、腎臓、精巣、卵巣、皮膚、子宮頸部、肺、筋肉、神経細胞、食道、膀胱、肺、子宮、外陰部、子宮内膜、腎臓、結腸直腸、膵臓、胸膜／腹膜、唾液腺、及び類表皮の腫瘍並びに血液学的悪性腫瘍を含めた（これらに限定されない）癌を有する患者の治療のために特に有用であると予想される。
【００４０】
本発明の併用投与は、肺癌、黒色腫、胃癌、結直腸癌、卵巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、肝癌、及びそれらの転移を有する患者の治療に、並びに急性骨髄性白血病又は多発性骨髄腫を有する患者の治療にもとりわけ有用であると予想される。
【００４１】
本発明の併用投与は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ（Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ）経路と関連するか、又はＭＡＰＫ／ＥＲＫ（Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ）経路の生物活性に、それのみに又は部分的に、依存する腫瘍を有する患者の治療に特に有用であると予想される。ＭＡＰＫ／ＥＲＫ（Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ）経路の生物活性に関連する癌は、この経路のメンバーのうちのいずれか１つの発現量又はタンパク質の量を評価するための一般の分子生物学的な技術を使用してことにより、当業者によって決定されてよい。
【００４２】
本発明の治療の組み合わせは、ＭＥＫに関連するか、又はＭＥＫの生物活性に、それのみに又は部分的に、依存する腫瘍を有する患者の治療に特に有用であるとも予想される。
【００４３】
本発明の治療の組み合わせは、Ｒａｆと関連するか、又はＲａｆの生物活性に、それのみに又は部分的に、依存する腫瘍を有する患者の治療に特に有用であるとも予想される。
【００４４】
さらに、本発明のいくつかの実施形態によれば、ヘパリンの末端五糖の不存在を特徴とする負に帯電したグリコサミノグリカンを投与することが好ましい。硫酸化グリコサミノグリカンであるヘパリンは、その抗凝血活性について周知であり、この活性を、ヘパリンは、主に、凝血性の第Ｘａ因子及びトロンビンの阻害によって成し遂げる。ヘパリンの抗凝血活性についての主要な機構は、ヘパリンの非還元末端にある末端五糖配列（ＧｌｃＮＡｃ／ＮＳ（６Ｓ）−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＳ（３Ｓ，６Ｓ）−ＩｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）、分子量１．７ＫＤ）によって介在される。
【００４５】
その末端の五糖を介して、ヘパリンは、酵素阻害剤アンチトロンビンＩＩＩに結合し、アンチトロンビンＩＩＩの反応性部位ループの柔軟性の増大によってアンチトロンビンＩＩＩの活性化をもたらす立体構造変化を引き起こす。活性化されたアンチトロンビンは、次に、トロンビン、第Ｘａ因子又は凝血関連反応の触媒反応に関与する他のプロテアーゼを不活性化する。第Ｘａ因子の阻害は、ヘパリン結合の際のアンチトロンビンにおける立体構造変化によって介在される。しかしながら、トロンビン阻害のためには、アンチトロンビンＩＩＩ、トロンビン及びヘパリンの間の三元複合体の形成が必要である。第Ｘａ因子に対するヘパリン活性は単に末端五糖の結合部位にのみ拠るが、トロンビンに対するヘパリンの活性は、加えてサイズ依存性を示す。
【００４６】
このサイズ依存性は、抗凝血医薬としての低分子量ヘパリン（ｌｏｗ−ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｗｅｉｇｈｔ  ｈｅｐａｒｉｎ：ＬＭＷＨ）を開発することにより、凝血の低下した、従ってより制御された調節を可能にするために利用されてきた。より最近では、フォンダパリヌクス（Ｆｏｎｄａｐａｒｉｎｕｘ）と呼ばれるヘパリンの末端五糖の合成版が、さらなる抗凝血薬として生み出された。
【００４７】
未分画ヘパリン（ｕｎｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ  ｈｅｐａｒｉｎ：ＵＶＨ）とは対照的に、ＬＭＷＨ及びフォンダパリヌクスは、ともに、アンチトロンビン活性よりはむしろ抗Ｘａ活性を特徴とし、ヘパリン起因性血小板減少症のリスクを低下させる。
【００４８】
しかしながら、あらゆる抗凝血薬のように、未分画ヘパリン（ＵＶＨ）、ＬＭＷＨ又はフォンダパリヌクスは、重篤な副作用として、胃腸出血及び頭蓋内出血を含めた出血を誘起する可能性がある（Ｈａｒｔｅｒら、２０１５）。
【００４９】
本発明者は、負に帯電したグリコサミノグリカンの中のヘパリンの末端五糖配列は、血小板−細胞表面相互作用を崩壊させることによる腫瘍増殖の阻害のためには不必要であるということを実感した。有利なことに、ヘパリンの末端五糖の不存在を特徴とする負に帯電したグリコサミノグリカンを、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤と一緒に併用投与することは、出血等の抗凝血薬の副作用のリスクなしに癌治療を可能にする。
【００５０】
かくして、本明細書に記載される併用投与は、癌性疾患に罹患しているが、抗凝血薬投与の場合には出血を起こすリスクにある患者に対して特に有利である。当該併用投与は、抗凝血薬療法の必要が医学的に示されない腫瘍患者に特に有用であり、そのような療法と関連する副作用のリスクを必ずしも増大させないと思われる。
【００５１】
本発明の１つの実施形態では、抗凝血活性を実質的に又は本質的に欠く負に帯電したグリコサミノグリカンが投与され、未分画ヘパリン又はＬＭＷＨと比べて、低下した抗凝血活性を示す。
【００５２】
本発明の１つの実施形態では、上記医薬として使用するためのグリコサミノグリカンは、存在しないヘパリンの末端五糖が五糖ＧｌｃＮＡｃ／ＮＳ（６Ｓ）−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＳ（３Ｓ，６Ｓ）−ｌｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）であることを特徴とする。
【００５３】
本発明の１つの実施形態では、ヘパリンの末端五糖の不存在を特徴とする負に帯電したグリコサミノグリカンは、ペントサンポリ硫酸（ＰＰＳ）、デキストラン硫酸（ＤＸＳ）、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸又はケラタン硫酸等の硫酸化グリコサミノグリカンである。
【００５４】
様々な硫酸化度が、天然に存在する硫酸化グリコサミノグリカン及び合成の硫酸化グリコサミノグリカンの両方で生じる。好ましい実施形態では、本明細書に記載される技術的効果を増強するために、硫酸化グリコサミノグリカンは、特定の硫酸化度について選択され、又は修飾されてもよい。
【００５５】
先行技術で公知のように、硫酸化は、分子を負に帯電させる。高い程度で硫酸化されたグリコサミノグリカン、従ってより負に帯電した硫酸化グリコサミノグリカンは、いくつかの実施形態では、血小板−細胞相互作用を阻害することにおいて、低い程度に硫酸化された硫酸化グリコサミノグリカン、従って、より少なく負に帯電した硫酸化グリコサミノグリカンよりも有効である。それゆえ、比較的高レベルの硫酸化は、治療効果を増大させることができる。さらには、高い程度で硫酸化されたグリコサミノグリカンは、通常、いくつかのこのような受容体分子を一度にブロックすることができ、そのグリコサミノグリカンが体液で希釈されるか又は洗い流される前に、より多くの結合される機会を持つことになる。
【００５６】
硫酸化グリコサミノグリカンの硫酸化度は、好ましくは、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、又は２．０超であってもよい。
【００５７】
本発明の１つの実施形態では、上記医薬として使用するためのグリコサミノグリカンは、硫酸化グリコサミノグリカンであり、硫酸化度は、＞１．０（１．０超）、好ましくは＞１．２（１．２超）、より好ましくは＞１．４（１．４超）である。硫酸化度＞１．０、好ましくは＞１．２、より好ましくは＞１．４を有する硫酸化グリコサミノグリカンは、通常、高い程度で硫酸化されていると考えられる。
【００５８】
後述するように、任意の与えられたグリコサミノグリカンの硫酸化度は、当業者に公知の方法を使用して、調整することができる。硫酸化度は、適切な実験法を用いて決定することもでき、これにより当業者は、意図した使用のために最適の特性を示すグリコサミノグリカンを製造するために、硫酸化度を調整することができるようになる。それゆえ、市販のグリコサミノグリカン分子又は天然に入手されるグリコサミノグリカン分子は、適宜にそれぞれの硫酸化度を調整するために修飾されることが可能であろう。
【００５９】
本発明の１つの実施形態では、本明細書に記載される医薬として使用するためのヘパリンの末端五糖の不存在を特徴とするグリコサミノグリカンは、ペントサンポリ硫酸（ＰＰＳ）である。
【００６０】
本発明の１つの実施形態では、本明細書に記載される医薬として使用するためのヘパリンの末端五糖の不存在を特徴とするグリコサミノグリカンはデキストラン硫酸（ＤＸＳ）である。
【００６１】
硫酸化グリコサミノグリカンＰＰＳ及びＤＸＳの両方は、血小板−細胞相互作用に対して顕著な阻害効果を示し、従って、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ阻害剤の投与と組み合わされるときに有益な治療効果をもたらすのに特に適している。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態では、ヘパリンの末端五糖の不存在を特徴とするグリコサミノグリカンは、好ましくは、１０００〜約５０００００ダルトン、好ましくは２０００〜１０００００ダルトン、より好ましくは約５０００〜約１２０００ダルトンの分子量、又は先行技術において公知であり本明細書に開示される低分子量ヘパリン分子（ＬＭＷＨ）と実質的に同じ近似分子量を示す。約５０００〜約１２０００ダルトン分子量のグリコサミノグリカンは、低分子量グリコサミノグリカンと呼ばれてもよい。
【００６３】
本発明のさらなる実施形態では、ヘパリンの末端五糖の不存在を特徴とするグリコサミノグリカン、例えばＤＸＳ又はＰＰＳ、は、約２ｋＤａ〜約１２ｋＤａ、より好ましくは約３ｋＤａ〜約８ｋＤａ、最も好ましくは約４ｋＤａ〜約６ｋＤａの分子量を有する。本明細書に記載される低分子量グリコサミノグリカン（約２ｋＤａ〜約１２ｋＤａ、好ましくは８ｋＤａ未満）は、未分画又は高分子量のグリコサミノグリカンと比較してさらなる利点を特徴とする。低分子量グリコサミノグリカンは、通常、未分画又は高分子量の調製物よりも低い量の血小板凝集体につながる。そのような比較的低分子量の調製物の投与により、治療の間の血栓症の合併症は、顕著に低下する。
【００６４】
上記ヘパリンの末端五糖の不存在を特徴とするグリコサミノグリカンは、血小板減少症（ヘパリン関連の免疫性血小板減少症；ＨＩＴ、ＩＩ型によって引き起こされる可能性が高い）及び血栓症（望まれない凝固）の両方のリスクを下げることを可能にする。これらの２つの合併症は対照的な機序に起因するように見えるが、いずれも、未分画ヘパリン等のヘパリンの末端五糖を含む未分画グリコサミノグリカンを用いた治療の間に起こる可能性がある。それゆえ、未分画ヘパリンは、血小板数をあまりに強く減少させることができるか、又は血小板凝集につながる可能性があり、それらのいずれも、危険な副作用につながりうる。驚くべきことに、ＰＰＳ及びＤＸＳは、ともに、これらの効果の回避を可能にする有益な特性を示す。
【００６５】
１つの実施形態では、関係するグリコサミノグリカンの分子量は、質量分析ベースの方法、例えばＲｈｏｍｂｅｒｇら、１９９８に記載されるものを使用して決定することができる。特定の糖類構造並びに硫酸化及び分子量に関するさらなる情報は、Ｔｕｒｎｂｕｌｌら、１９９９に開示される配列決定技術を使用して決定することができる。
【００６６】
本発明の１つの実施形態では、本明細書に記載される併用投与のためのＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤は、ＭＥＫ阻害剤である。
【００６７】
好ましくは、上記ＭＥＫ阻害剤は、ＡＺＤ８３３０（ＡＲＲＹ−４２４７０４）、レファメチニブ（ＢＡＹ  ８６−９７６６、ＲＤＥＡ１１９）、コビメチニブ（ＧＤＣ−０９７３、ＸＬ−５１８、ＲＧ７４２１）；Ｅ６２０１；ビニメチニブ（ＭＥＫ１６２、ＡＲＲＹ−１６２）；ＰＤ０３２５９０１；ピマセルチブ（ＡＳ７０３０２６、ＭＳＣ１９３６３６９Ｂ）；ＲＯ４９８７６５５（ＣＨ４９８７６５５）、ＲＯ５１２６７６６（ＣＨ５１２６７６６）、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４、ＡＲＲＹ−１４２，８８６）；ＴＡＫ−７３３；トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、ＧＤＣ−０６２３、ＰＤ０３５９０１、ＰＤ１８４３５２（ＣＩ−１０４０）及びＷＸ−５５４からなる群から選択される。また、このＭＥＫ阻害剤は、Ｕ０１２６−ＥｔＯＨ、ＰＤ９８０５９、ＢＩＸ  ０２１８９、ピマセルチブ（ＡＳ−７０３０２６）、ＢＩＸ  ０２１８８、ＡＺＤ８３３０及びＰＤ３１８０８８、ホノキオール、ＳＬ−３２７、レファメチニブ（ＲＤＥＡ１１９、Ｂａｙ  ８６−９７６６）、ＧＤＣ−０６２３及びＡＰＳ−２−７９  ＨＣｌからなる群から選択されてもよい。
【００６８】
上記ＭＥＫ阻害剤が、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、コビメチニブ又はＸＬ５１８、ビニメチニブ（ＭＥＫ１６２）、ＰＤ３２５９０１、ＰＤ１８４３５２（ＣＩ−１０４０）、ＰＤ０３５９０１、及びＴＡＫ−７３３からなる群から選択されることが特に好ましい。
【００６９】
本発明の１つの実施形態では、ＭＥＫ阻害剤はセルメチニブである。
【００７０】
本明細書で使用する場合、括弧内の名称は、好ましくは、阻害剤についての代替の命名法を表す。
【００７１】
単独治療研究においては、いくつかのＭＥＫ阻害剤は、治療上有効であるために用量を増大させると、治療活性の低下又は副作用の増加を示す。
【００７２】
有利なことに、ＭＥＫ阻害剤と負に帯電したグリコサミノグリカンとの本発明に係る併用投与は、治療効果を維持しながら、より低い用量のレジメンを可能にする。
【００７３】
癌の治療のためのＭＥＫ阻害剤の投与は、負に帯電したグリコサミノグリカンＰＰＳ及び／又はＤＸＳと組み合わせると特に好ましい。
【００７４】
本発明の１つの実施形態では、本明細書に記載される併用投与において医薬として使用するためのグリコサミノグリカンは、治療対象の癌が、卵巣癌、黒色腫、好ましくは転移性黒色腫、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ変異若しくはＶ６００Ｋ変異を保有する進行黒色腫又はＮＲＡＳ  Ｑ６１変異黒色腫、卵巣癌、乳癌、結腸癌又は肺癌、好ましくは非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であることを特徴とする。上述のタイプの癌については、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤がＭＥＫ阻害剤であることが特に好ましい。
【００７５】
本発明の１つの実施形態では、本明細書に記載される併用投与についてのＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤はＲａｆ阻害剤である。
【００７６】
好ましくは、上記Ｒａｆ阻害剤は、ベムラフェニブ（ＰＬＸ４０３２、ＲＧ７２０４）、ソラフェニブトシル酸塩、ＰＬＸ−４７２０、ダブラフェニブ（ＧＳＫ２１１８４３６）、ＧＤＣ−０８７９、ＣＣＴ１９６９６９、ＲＡＦ２６５（ＣＨＩＲ−２６５）、ＡＺ  ６２８、ＮＶＰ−ＢＨＧ７１２、ＳＢ５９０８８５、ＺＭ  ３３６３７２、ソラフェニブ、ＧＷ５０７４、ＴＡＫ−６３２、ＣＥＰ−３２４９６、エンコラフェニブ（ＬＧＸ８１８）、ＲＯ５１２６７６６（ＣＨ５１２６７６６）、ＭＬＮ２４８０、ＰＬＸ７９０４、ＣＣＴ１９６９６９及びＬＹ３００９１２０からなる群から選択される。
【００７７】
上記Ｒａｆ阻害剤が、エンコラフェニブ（ＬＧＸ８１８）、ダブラフェニブ（ＧＳＫ２１１８４３６）及びベムラフェニブ（ＰＬＸ４０３２）からなる群から選択されることが特に好ましい。
【００７８】
本発明の１つの実施形態では、上記併用投与のためのＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤はＲａｆ阻害剤であり、治療対象の癌は黒色腫、甲状腺癌又は結腸癌である。
【００７９】
１つの実施形態では、本発明は、癌の治療におけるチロシンキナーゼ阻害剤と一緒の、本明細書に記載される負に帯電したグリコサミノグリカンの併用投与に関する。好ましくは、このようなチロシンキナーゼ阻害剤は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の初期活性化の機能を邪魔することによりＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路を妨げる受容体チロシンキナーゼ阻害剤である。
【００８０】
１つの実施形態では、上記チロシンキナーゼ阻害剤は、アファチニブ、アフリベルセプト、アキシチニブ、ベバシズマブ、ボスチニブ、カボザンチニブ、クリゾチニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、パニツムマブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ポナチニブ、ラニビズマブ、レゴラフェニブ、ルキソリチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、トファシチニブ、トラスツズマブ及びバンデタニブからなる群から選択される。
【００８１】
１つの実施形態では、本発明は、２以上のＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤と一緒の本明細書に記載される負に帯電したグリコサミノグリカンの併用投与に関する。例えば、負に帯電したグリコサミノグリカンがＭＥＫ阻害剤及びＲＡＦ阻害剤と組み合わせて投与されることが好ましい場合がある。
【００８２】
好ましい実施形態では、本発明は、医薬として使用するためのグリコサミノグリカンであって、治療対象の癌が、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤に、特にＭＥＫ阻害剤及び／又はＲａｆ阻害剤に抵抗性があり、かつ／又はＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤に、特にＭＥＫ阻害剤及び／又はＲａｆ阻害剤に対する抵抗性を発現する高まったリスクにある癌性細胞を含む、医薬として使用するためのグリコサミノグリカンに関する。
【００８３】
上記のとおり、ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路の異常な活性に関連する癌性疾患をＭＥＫ阻害剤又はＲａｆ阻害剤等のＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤を用いて治療する場合、適応性のエスケープ機構の出現が観察され、これは、その癌の治療への抵抗性につながる。このような癌の治療は、特に、本明細書に記載されるＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤と負に帯電したグリコサミノグリカンとの併用投与から恩恵を受ける可能性がある。
【００８４】
当業者は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤に抵抗性があり、かつ／又はＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤に対する抵抗性を発現する高まったリスクにある癌性細胞又は癌を特定する方法を知っているであろう。このような特定は、好ましくは２つの側面を伴う。第１の側面では、その癌性細胞が、健常な（非癌性の）細胞と比較してＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の異常な、例えば、高まった活性を示すか否かが判定される。この経路の異常な活性は、例えばＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の鍵となるメンバー、例えばＲＡＳ、ＭＥＫ又はＲａｆ遺伝子の過剰発現及び／又は変異から推定することができる。ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の異常な活性を示すタイプの癌については、上記経路の特異的阻害剤は有望な治療標的であると予想されうる。しかしながら、上述にように、エスケープ経路は、単独のＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤療法に対する抵抗性につながりうる。それゆえ、第２の側面では、その癌又は癌性細胞が、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、特にＭＥＫ阻害剤及び／又はＲａｆ阻害剤に抵抗性があり、又はＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤、特にＭＥＫ阻害剤及び／又はＲａｆ阻害剤に対する抵抗性を発現するリスクにあるか否かが特定される。
【００８５】
この目的のために、当業者は、好適なインビトロ及び／又はインビボでのアッセイを認識している。例えば、インビトロアッセイは、ＭＥＫ阻害剤の癌性細胞への施用、及びその後の、好適な対照と比較した細胞周期及び／又は細胞増殖に対する効果のモニタリングを含んでもよい。このようなインビトロアッセイは、直接の下流標的に対する予想される効果をモニタリングすることにより、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤が施用された用量で機能しているか否かを評価するための対照アッセイをさらに含んでもよい。例えば、強力なＭＥＫ阻害剤の場合、下流のＥＲＫのリン酸化は、低下すると予想される。にもかかわらず、癌性細胞の細胞増殖及び／又は細胞周期が損なわれない場合、並行するシグナル伝達経路は、抵抗性の発現において活性化されている可能性が高い。それゆえ、インビトロアッセイは、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤が細胞増殖を支える代替のシグナル伝達経路を活性化するかをモニタリングすることも含んでよい。例えば、Ｅｒｂファミリータンパク質シグナル伝達の上方制御が、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害に対する抵抗性の発現において観察されている。それゆえ、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤に応答した癌性細胞におけるＥｒｂファミリータンパク質シグナル伝達の上昇は、抵抗性の発現も示唆しうる。さらには、当業者は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤の投与に応答した好適なモデル生物における腫瘍成長のモニタリングを含む、抵抗性又は抵抗性の発現をモニタリングするためのインビボアッセイも知っている。さらに、当業者は、例えばＭｃＣｕｂｒｅｙら、２００７、Ｒｏｓｅｎら、２０１３及びＰｏｕｌｉｋａｋｏｓ  Ｐ．Ｉ．ら、２０１１に開示されたような、特定の癌種におけるＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤に対する抵抗性の発現を報告する文献又は臨床データに拠ってもよい。
【００８６】
ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤に対する癌性細胞の抵抗性は、１以上のＥｒｂＢファミリータンパク質、例えばＥＧＦＲ又はＥｒｂＢ３の存在又は活性の上昇を示す癌性細胞において特に観察される。
【００８７】
加えて、特定のシグナル伝達経路に関与する酵素をコードするｍＲＮＡの検出及び／又は定量が、健常な（非癌性の）細胞と比較してＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の異常な、例えば高まった活性を癌性細胞が示すか否かを検出するために使用されてもよい。好適な酵素、経路のメンバー、ｍＲＮＡ配列及び特定のプライマーの選択は、過度の労力なしに当業者によって選択されうる。
【００８８】
それゆえ、１つの実施形態では、本発明は、癌が、細胞表面の１以上のＥｒｂＢファミリータンパク質の存在を示す癌性細胞を含む、本明細書に記載される併用投与において医薬として使用するためのグリコサミノグリカンに関する。それゆえ、ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路の阻害剤と一緒の、負に帯電したグリコサミノグリカンの併用投与は、ＥｒｂＢファミリータンパク質の基礎レベルの上昇を示すか、又はＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤治療に応答してＥｒｂＢファミリータンパク質のシグナル伝達レベルの上昇を発現する癌性細胞に対して特に有益である。
【００８９】
それゆえ、１つの実施形態では、本発明は、癌が、適切な（非癌性の）対照細胞と比べて、１以上のＥｒｂＢファミリータンパク質の上昇した発現（上方制御）及び／又は上昇したＥｒｂＢシグナル伝達を示す癌性細胞を含む、本明細書に記載される併用投与において医薬として使用するためのグリコサミノグリカンに関する。
【００９０】
好ましい実施形態では、上方制御されるＥｒｂＢファミリータンパク質はＨｅｒ１（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１）、Ｈｅｒ２（Ｎｅｕ、ＥｒｂＢ２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ３）、又はＨｅｒ４（ＥｒｂＢ４）であり、最も好ましくは、上方制御されるＥｒｂＢファミリータンパク質はＨｅｒ３（ＥｒｂＢ３）である。
【００９１】
負に帯電したグリコサミノグリカンは血小板との細胞表面接触を直接阻害するため、好ましい実施形態では、本発明は、腫瘍組織に近接した領域への上記負に帯電したグリコサミノグリカンの局所投与に関する。
【００９２】
腫瘍組織に近接した領域への負に帯電したグリコサミノグリカンの局所投与は、低下した全身性毒性で有効な抗増殖効果を維持するより低い用量の負に帯電したグリコサミノグリカンが投与されることを可能にする。本発明の意味において、局所投与は、例えば注射、経粘膜又は経皮の手法による腫瘍組織から好ましくは１０ｃｍ以内、５ｃｍ以内、若しくは好ましくは１ｃｍ以内の領域への投与、又は腫瘍自体の内部への送達に関する。
【００９３】
それゆえ、局所投与の方法は、静脈内（静脈への）、動脈内（動脈への）、骨内注入（骨髄への）、筋肉内、脳内（脳実質への）、脳室内（脳室系への）、髄腔内（脊柱管への注射）又は皮下（皮膚の下への）投与等の非経口投与に関連してもよい。
【００９４】
当該併用治療では、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤の投与は、好ましくはグリコサミノグリカンについての経路と同一の経路を使用して、局所的であることができるが、グリコサミノグリカンが局所的に投与される場合であっても、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤の投与は、全身的であってもよい。
【００９５】
１つの実施形態では、局所投与は、腫瘍に血液を供給することを担う動脈への動脈内投与に関する。このようなアプローチは、腫瘍が発生した場合であっても、特定の器官又は組織が患者から取り除けないかもしれない場合に、特に関係する。動脈内投与によるこの領域における局所投与は、これにより、血小板と分裂細胞の細胞表面との間の相互作用を崩壊させ、これにより有用な治療効果をもたらすという独特の方法を提供する。
【００９６】
さらなる態様では、本発明は、負に帯電したグリコサミノグリカン及び薬学的に許容できる担体と、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤及び薬学的に許容できる担体との併用投与を含む癌の治療のための医薬組成物に関する。
【００９７】
上記負に帯電したグリコサミノグリカン及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤は、同じ薬学的に許容できる担体を使用する単一の医薬組成物で一緒に投与されてもよい。しかしながら、この負に帯電したグリコサミノグリカン及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路阻害剤は、別個の医薬組成物及び異なる医薬担体において逐次的に投与されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】癌性細胞におけるＭＥＫ阻害剤抵抗性につながる成長因子依存的なエスケープ機構の概略図。
【図２】癌性細胞におけるＭＥＫ阻害剤抵抗性の発現を防止するための負に帯電したグリコサミノグリカンの追加の投与の恩恵の概略図。
【発明を実施するための形態】
【００９９】
特許文献及び非特許文献のすべての引用した文献は、参照によりその全体を援用したものとする。
【０１００】
本発明は、負に帯電したグリコサミノグリカン及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤の併用投与による、癌性疾患（１種又は複数種）に罹患した対象の治療に関する。
【０１０１】
用語「対象」は、ヒト及び動物対象の両方を含む。用語「治療」又は「処置」は、疾患若しくは病態の徴候又は症候が発生し始めたあとに、その疾患若しくは病態の徴候又は症候を改善する治療的介入を指す。本明細書で使用する場合、疾患又は病態に関して用語「改善すること」は、治療の何らかの認められる有益な効果を指す。この有益な効果は、例えば、感受性対象における疾患の臨床症状の発症の遅れ、疾患のいくつか若しくはすべての臨床症状の重症度の低減、疾患のより緩慢な進行、その対象の全体的な健康若しくは幸福の状態の改善によって、又は特定の疾患に特異的である当該技術分野で周知の他のパラメータによって裏付けることができる。
【０１０２】
本発明は、対象の治療及び予防的処置の両方を包含する。「予防的」処置は、疾患の徴候を示していないか、又は初期徴候のみを示している対象に、病態を発症するリスクを低下させる目的で投与される処置である。いくつかの実施形態では、本発明は、それゆえ、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤に対する癌の抵抗性の阻止又は予防に関する。
【０１０３】
本明細書中で用いられる場合の用語「組み合わせて」、「併用投与」、「組み合わせて投与される」等は、同じ疾患又は状態の治療において、選択された単一の患者に対して複数の治療薬を投与することであって、これらの薬剤を同じ経路若しくは異なる経路を使用して、又は同時に若しくは異なる時に投与することを包含することが意図されている。従って、負に帯電したグリコサミノグリカン及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤の併用投与は、両方（又はすべて）の活性薬剤が一定時間にわたって同時にそれらの生物活性を奏するように、別々の処方物若しくは単一の医薬処方物で、又はいずれかの順序による連続投与で投与される２以上の活性薬剤の使用と理解されるべきである。このグリコサミノグリカン及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤は、組み合わせて同時に同じ頻度で投与される必要はなく、同じ投与経路によって投与される必要もない。いくつかの実施形態では、上記グリコサミノグリカン及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤は、互いの約６０分以内、３０分以内、１５分以内、１０分以内、５分以内又は１分以内に逐次的に投与される。いくつかの実施形態では、上記グリコサミノグリカン及びＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤は、互いの約１時間以内、５時間以内、１日以内、１週間以内又は１ヶ月以内に逐次的に投与される。進行中の治療の治療レジメン、及び複数の投与イベントを包含することが意図されている。
【０１０４】
本発明は、負に帯電したグリコサミノグリカンと、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤とを含む医薬組成物にも関する。あるいは、本発明は、別々に、負に帯電したグリコサミノグリカンと、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤とを含む複数の医薬組成物の採用にも関する。この医薬組成物は、好ましくは、１以上の薬学的に許容できる担体を含む。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容できる担体」は、当業者に公知の種々の担体のいずれかを意味する。いくつかの常法として使用される医薬担体を採用する以下の送達システムは、本発明の組成物を投与するために想定される多くの実施形態の代表例にすぎない。
【０１０５】
注射による薬物送達システムとしては、溶液、懸濁液、ゲル、ミクロスフェア及びポリマー注射剤が挙げられ、これは、溶解性調整剤（例えば、エタノール、プロピレングリコール及びスクロース）及びポリマー（例えば、ポリカプロラクトン及びＰＬＧＡ）等の賦形剤を含むことができる。埋め込み型のシステムとしては、ロッド及びディスクが挙げられ、これらは、ＰＬＧＡ及びポリカプロラクトン等の賦形剤を含有することができる。
【０１０６】
経口送達システムとしては、錠剤及びカプセルが挙げられる。これらは、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、他のセルロース由来の材料及びデンプン）、希釈剤（例えば、ラクトース（乳糖）及び他の糖、デンプン、リン酸二カルシウム及びセルロース由来の材料）、崩壊剤（例えば、デンプンポリマー及びセルロース由来の材料）並びに潤滑剤（例えば、ステアリン酸塩及びタルク）等の賦形剤を含有することができる。
【０１０７】
経粘膜送達システムとしては、パッチ、錠剤、座薬、ペッサリー、ゲル及びクリームが挙げられ、これらは、可溶化剤及び促進剤（例えば、プロピレングリコール、胆汁酸塩及びアミノ酸）、並びに他のビヒクル（媒質）（例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステル及び誘導体、並びにヒドロキシプロピルメチルセルロース及びヒアルロン酸等の親水性ポリマー）等の賦形剤を含有することができる。
【０１０８】
経皮送達システムとしては、例えば、水性ゲル及び非水性ゲル、クリーム、多相エマルション、マイクロエマルション、リポソーム、軟膏、水溶液及び非水溶液、ローション剤、エアロゾル、炭化水素基剤（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｂａｓｅｓ）及び粉末が挙げられ、これらは、可溶化剤、透過促進剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコール及びアミノ酸）、及び親水性ポリマー（例えば、ポリカルボニル及びポリビニルピロリドン）等の賦形剤を含有することができる。１つの実施形態では、上記薬学的に許容できる担体は、リポソーム又は経皮促進剤である。
【０１０９】
再構成可能送達システム用の溶液、懸濁液及び粉末は、懸濁剤（例えば、ガム、キサンタン（ｚａｎｔｈａｎ）、セルロース由来の及び糖類）等のビヒクル、湿潤剤（例えば、ソルビトール）、可溶化剤（例えば、エタノール、水、ＰＥＧ及びプロピレングリコール）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、Ｓｐａｎｓ、Ｔｗｅｅｎｓ、及びセチルピリジン）、防腐剤及び抗酸化物質（例えば、パラベン、ビタミンＥ及びビタミンＣ、並びにアスコルビン酸）、アンチケーキング剤（固化防止剤）、コーティング剤、並びにキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を含む。
【０１１０】
それゆえ、本発明は、グリコサミノグリカン及び／又はＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤を、対象に経口送達する方法であって、その対象に薬学的有効量の上記の医薬組成物を投与する工程を備える方法を提供する。
【０１１１】
本発明の医薬組成物（１又は複数種）は、治療上有効な用量で患者に投与され、治療上有効な用量は、所望の効果、つまり、治療されている状態若しくは兆候の重症度又は広がりを予防するか又は和らげることを、耐え難い有害な副作用を生じる用量に到達することなくもたらすのに十分である用量を意味する。正確な用量は、例えば兆候、配合物及び投与方法等の多くの要因に依存し、各それぞれの兆候についての前臨床試験及び臨床試験で決定される必要がある。
【０１１２】
体重１キログラムあたり、１日あたりおよそ０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇの負に帯電したグリコサミノグリカン及びおよそ０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇのＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤という投薬量レベルは、上で特定された状態の治療において有用である。例えば、癌性疾患は、体重１キログラムあたり、１日あたり約０．０１〜１００ｍｇの上記の各化合物（患者あたり、１日あたり約０．５ｍｇ〜約３．５ｇ）の併用投与によって有効に治療されうる。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わされてもよい活性成分の量は、治療される宿主及び特定の投与方法に応じて変動することになる。例えば、ヒトにおける経口投与を意図した処方は、全組成物の約１〜約９５％で変動してもよい。投薬単位形態は、一般に、約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を含有することになろう。しかしながら、いずれの特定の患者に対しても、具体的な用量レベルは、用いられる具体的な化合物の活性、年齢、体重、全般的な健康状態、性別、投与に関連する食事時間（ｄｉｅｔ  ｔｉｍｅ  ｏｆ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、投与経路、排泄の速度、薬物の組み合わせ及び治療を受けている特定の疾患の重症度を含めた様々な要因に依存することになるということを理解されたい。本発明に係る化合物の投薬有効量は、特定の化合物、毒性、及び阻害活性、治療される状態、及び化合物が単独で投与されるか又は他の療法とともに投与されるかを含めた要因に応じて変動することになる。通常、上記負に帯電したグリコサミノグリカンについての投薬有効量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１５００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１〜１５０ｍｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは約１０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の量のＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤の投薬量と組み合わせて投与される場合、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１５００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１〜１５０ｍｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは約１０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲にあることになろう。
【０１１３】
ＰＰＳ投与で行われる動物モデルは、例えばＳｃｈｗａｒｔｚら、１９９９にあるように、通常、増進された同種移植生存のための治療の間、１０〜３０ｍｇ／ｋｇ体重のＰＰＳを使用してきた。
【０１１４】
用語「約」は、本明細書では、およそ、…の領域の、概略的に、又は…あたり、を意味するために使用される。用語「約」が数値範囲と併せて使用される場合、この「約」は、示された数値超及び示された数値未満に境界を広げることによりその範囲を改変する。一般に、用語「約」は、数値を、記載された値の１０％超及び記載された値の１０％未満で改変するために本明細書で使用される。
【０１１５】
本明細書で使用する場合、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（…を含む）」は、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ，ｂｕｔ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ（…を含むが、これらに限定されない）」を意味する。
【０１１６】
本発明に関連して、用語「細胞成長」及び「増殖」がともに使用され、これらは互換的に使用されてもよい。医学では、とりわけ腫瘍学では、細胞成長との用語は、（例えば腫瘍成長に起因する）細胞数の増加に関して使用されることが多い。腫瘍成長は、腫瘍細胞の増殖の高まりによって引き起こされる。規模による細胞成長及び単独の細胞の体積の増加もこの定義に包含される。好ましい実施形態では、本発明は、細胞増殖の、特に癌性細胞の調節に関する。細胞成長又は細胞増殖は、細胞の遊走（場所の変化）に関する腫瘍細胞の転移とは区別することができる。転移及び増殖は、腫瘍の異なる態様を表し、異なる臨床兆候とみなすことができる。
【０１１７】
本発明によれば、本明細書で使用する場合の「癌」又は「増殖性障害」は、悪性に変化した内在細胞の制御されない成長及び／又は広がりを特徴とする増殖性の疾患又は障害の群である。
【０１１８】
本明細書で使用する場合の癌は、外胚葉組織から起こる細胞癌、すなわち皮膚、乳房、神経系の癌、中胚葉組織から起こる細胞癌、すなわち骨、軟骨、筋肉、腎臓の癌、リンパ腫又は白血病、胚細胞腫瘍、及び内胚葉組織から起こる細胞癌、すなわち肝臓、膵臓、甲状腺、肺、胃、腸及び膀胱の癌等の、発症した組織の成長制御機構における変質によって引き起こされる、あらゆる与えられた細胞癌に関してもよい。
【０１１９】
癌の例としては、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、ウィルムス腫瘍、精巣癌、軟部組織肉腫、膀胱癌、慢性顆粒球性白血病、原発性脳癌、悪性黒色腫、小細胞肺癌、胃癌、結腸癌、骨原性肉腫、膵癌、急性顆粒球性白血病、ヘアリー細胞白血病、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、泌尿生殖器癌、甲状腺癌、食道癌、腎細胞癌、子宮内膜癌、本態性血小板増加症、副腎皮質癌、皮膚癌、及び前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。さらには、例えば、良性前立腺過形成、家族性大腸腺腫症（ｆａｍｉｌｉａｌ  ａｄｅｎｏｍａｔｏｓｉｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ：ＦＡＰ）、乾癬、アテローム性動脈硬化症関連の血管平滑筋細胞増殖、肺線維症、高ケロイド症（ｈｙｐｅｒｋｅｌｏｉｄｏｓｉｓ）、糸球体腎炎並びに手術後の狭窄及び再狭窄等の、特定の細胞増殖障害が、本発明によって包含される。
【０１２０】
本明細書に提示される場合の用語「癌性細胞」は、上で特定された状態のうちのいずれか１つに罹患している細胞を含む。
【０１２１】
望まれない細胞増殖に関連する他の障害は、自己免疫疾患に関連するが、これらに限定されない。それゆえ、本発明は、さらに、（１）負に帯電したグリコサミノグリカンであって、このグリコサミノグリカンは、ヘパリンの末端五糖の不存在を特徴とする負に帯電したグリコサミノグリカン、及び（２）ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤の併用投与を含む自己免疫疾患等の望まれない細胞増殖に関連する疾患の治療における医薬として使用するための負に帯電したグリコサミノグリカンに関する。
【０１２２】
多くの疾患の病変形成は細胞成長と関連する。一例として、望まれない免疫応答は、１つのこのような疾患である。免疫応答は、原因因子に対するさらなる免疫細胞又は抗体を産生するために、免疫系による１又はいくつかの関与する細胞クローンの増殖につながる。望まれない又は発症状態の免疫応答の場合には、免疫系のエフェクター細胞、又は免疫系によって産生される抗体が、身体自身の組織に向けられ、自己免疫につながる可能性がある。これらの免疫反応は、顕著な組織の損傷につながる。この損傷は、自己免疫疾患の疾患症候を引き起こす。
【０１２３】
本発明によれば、「自己免疫障害」又は「自己免疫疾患」は、本明細書で使用する場合、個体自身の組織に対する、体液性若しくは細胞性のいずれか又はそれらの両方の病態的な免疫応答及びそれに由来する状態から生じる疾患又は障害の群である。
【０１２４】
自己免疫疾患又は自己免疫障害の例としては、リウマチ熱、関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、及び強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群等の急性及び慢性のリウマチ様疾患、じん麻疹、皮膚筋炎、中毒性表皮壊死症、強皮症等の皮膚の急性及び慢性の自己免疫疾患、多発性硬化症、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、喘息等のアレルギー状態、並びに潰瘍性結腸炎、クローン病等の自己免疫性の胃腸及び内分泌の障害、糖尿病、橋本甲状腺炎、自己免疫性の拡張型心筋症類似型心筋炎、閉塞性血栓性血管炎等の自己免疫性血管炎、並びに筋炎、自己免疫性貧血及び骨髄癆の自己免疫型、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、並びに急性及び慢性の糸球体腎炎等の腎臓の自己免疫疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２５】
本発明は、上述の病態の治療のためのプロセス又は方法にも関する。本発明の化合物は、そのような治療を必要としている温血動物、例えばヒトに、好ましくは上述の障害に対して有効である量で、予防的に又は治療的に投与されることが可能であり、当該化合物は、好ましくは医薬組成物の形態で使用される。
【０１２６】
用語「血小板（栓球）と癌性細胞との物理的相互作用」は、上記血小板及び静止細胞が一緒にインビトロに存在するときに偶然に起こると思われる頻度又は強度よりも大きい頻度又は強度の血小板と上記癌性細胞の細胞表面との任意の与えられた物理的相互作用又は結合に関する。好ましい実施形態では、上記相互作用は、国際公開第２０１５／０５９１７７Ａ１号パンフレットに記載される方法、例えば共培養又はインキュベーション、洗浄（好ましくは２〜４回）及びその後の固定及び同定を実施することにより、定義し、調べることができる。本明細書に記載されるように、負に帯電したグリコサミノグリカンの投与により、血小板と癌性細胞との物理的相互作用を妨げ、及び／又は阻害することが可能になる。
【０１２７】
用語「グリコサミノグリカン」は、本明細書で使用する場合、好ましくはアミノヘキソース単位を含むオリゴ糖又は多糖を指す。用語「負に帯電したグリコサミノグリカン」は、好ましくは、先行技術と同様に、アニオン性であり中性のｐＨ値で負電荷を示すグリコサミノグリカンを指して使用される。硫酸化グリコサミノグリカンは、負に帯電したグリコサミノグリカンの特に好ましい群である。硫酸化グリコサミノグリカンとしては、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ペントサンポリ硫酸（ＰＰＳ）及びデキストランポリ硫酸（ＤＸＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。負に帯電している未硫酸化グリコサミノグリカンとしては、ヒアルロン酸が挙げられるが、これに限定されない。
【０１２８】
用語「ヘパリンの末端五糖の不存在を特徴とする負に帯電したグリコサミノグリカン」は、好ましくはＧｌｃＮＡｃ／ＮＳ（６Ｓ）−ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＳ（３Ｓ，６Ｓ）−ｌｄｏＡ（２Ｓ）−ＧｌｃＮＳ（６Ｓ）を欠く負に帯電したグリコサミノグリカンを指す。「ヘパリンの末端五糖の不存在を特徴とする負に帯電したグリコサミノグリカン」の例としては、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、ペントサンポリ硫酸（ＰＰＳ）及びデキストランポリ硫酸（ＤＸＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２９】
用語「ヘパリン」は、未分画ヘパリン及びより低い分子量を有するヘパリンを含む。１つの実施形態では、本発明に従って使用されるヘパリンは、約８ｋＤａ〜約３０ｋＤａ、好ましくは約１０ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、最も好ましくは約１２ｋＤａ〜約１６ｋＤａ、例えば約１５ｋＤａの平均分子量を有していてもよい「未分画ヘパリン」（ＵＦＨ）である。
【０１３０】
用語「ヘパリン」は、天然に存在するヘパリンから切断及び単離によって誘導されたものであれ、合成経路によって誘導されたものであれ、ヘパリン分子の低分子量断片も包含する。
【０１３１】
本明細書に記載されるように、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）との用語は、好ましくは、８０００Ｄａ未満の平均分子量を有し、すべての鎖のうちの少なくとも６０％が８０００Ｄａ未満の分子量を有するヘパリン又はヘパリン塩を指す。低分子量ヘパリンは、当該技術分野で一般に受け入れられている用語であり、当業者には、さらなる明確化は必要ではない。ＬＭＷＨは、ＵＦＨほど頻繁に血小板減少症を引き起こさない。ＬＭＷＨの血小板に結合する能力は、実質的に低下している。
【０１３２】
好ましくは、本発明に従って使用されるＬＭＷＨの分子量は、約２ｋＤａ〜約８ｋＤａ、より好ましくは約３ｋＤａ〜約６ｋＤａ、最も好ましくは約４ｋＤａ〜約５ｋＤａ、例えば約４．５ｋＤａである。ＬＭＷＨは、高分子ヘパリンの分画又は解重合の種々の方法によって得ることができる。
【０１３３】
ＬＭＷＨの例としては、アルデパリン（ノルミフロ（Ｎｏｒｍｉｆｌｏ））、セルトパリン（サンドパリン（Ｓａｎｄｏｐａｒｉｎ））、エノキサパリン（ラブノックス（Ｌｏｖｅｎｏｘ）及びクレキサン（Ｃｌｅｘａｎｅ））、パルナパリン（フルクサム（Ｆｌｕｘｕｍ））、チンザパリン（イノヘップ（Ｉｎｎｏｈｅｐ）及びロギパリン（Ｌｏｇｉｐａｒｉｎ））、ダルテパリン（フラグミン（Ｆｒａｇｍｉｎ））、レビパリン（クリバリン（Ｃｌｉｖａｒｉｎ））及びナドロパリン（フラキシパリン（Ｆｒａｘｉｐａｒｉｎ））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３４】
本明細書で使用する場合、用語「硫酸化度」は、単糖単位あたりの硫酸基（−ＯＳＯ３）の数を指す。硫酸化度は、二糖単位あたりの硫酸基（−ＯＳＯ３）の数として他の文献ソースで与えられることがあるが、本発明の定義は、単糖単位あたりの硫酸基の数に関する。いくつかのＧＡＧは、二糖ポリマーとして存在しないが、単糖ポリマーとしては存在する。一貫した硫酸化度の測定値を提供するために、単糖単位あたりの硫酸化度が使用され、二糖単位についての硫酸化度は、対応して調整される。
【０１３５】
任意の与えられた多糖又はＧＡＧの硫酸化は、米国特許出願公開第２００５０１１９４６９Ａ１号明細書に記載される糖硫酸化方法に従って改変されてもよく、この文献は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０１３６】
硫酸化度は、Ｚａｉａら、（ＢｉｏＭｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、第２０１４巻（２０１４）、論文ＩＤ  ９８６５９４）に開示される方法、又は質量分光分析法を使用する他の関連方法等の当業者に公知の技術により決定されてよい。
【０１３７】
ヘパリンは、ヘパラン硫酸の（０．３〜０．７）硫酸基／単糖と比べて、より高い硫酸化度（１〜３硫酸基／単糖、好ましくは１．５又は２）を示す。
【０１３８】
【表１】
2020531635.tif 000003
【０１３９】
表１中の硫酸化度は、各ＧＡＧの単糖単位の中の硫酸基の平均数である。示されているＧＡＧは二糖ＧＡＧであるが、硫酸化度は、単糖ＧＡＧに対して調整されている。略語は、以下のとおりである：ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミン；ＧａｌＮＡｃ、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミン；ＧｌｃＮＳ、Ｎ−スルホ−α−Ｄ−グルコサミン；ＧｌｃＡ、β−Ｄ−グルクロン酸；α−Ｌ−ＩｄｏＡ  イズロン酸；及びＳ、スルホ。
【０１４０】
例えば、オーソ・マクニール・ファーマスーティカル（Ｏｒｔｈｏ−ＭｃＮｅｉｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）によりエルミロン（Ｅｌｍｉｒｏｎ）の名称で販売されるペントサンポリ硫酸（ＰＰＳ）は、米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ：ＦＤＡ）によって、疼痛性膀胱症候群としても知られる間質性膀胱炎（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｙｓｔｉｔｉｓ：ＩＣ）の治療について承認された経口薬物であり、ベン・ファーマ（ｂｅｎｅ  Ｐｈａｒｍａ）によって、Ｆｉｂｒｅｚｙｍ（登録商標）及びＰｅｎｔｏｓａｎｐｏｌｙｓｕｌｆａｔ  ＳＰ５４（登録商標）の名称でも販売されている。獣医学分野では、ペントサンポリ硫酸は、バイオファーム・オーストラリア（Ｂｉｏｐｈａｒｍ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によりカートロフェン・ベット（Ｃａｒｔｒｏｐｈｅｎ  Ｖｅｔ）の名称で販売されている。ＰＰＳは、ネイチャーベット・エキン（Ｎａｔｕｒｅｖｅｔ  Ｅｑｕｉｎｅ）およびアースロペン（Ａｒｔｈｒｏｐｅｎ）の名称でも販売されている。ＰＰＳの抗凝血活性は、ヘパリンの抗凝血活性の１／１５である。ＰＰＳは、高い程度で硫酸化されている半合成の多糖であり、ヘパリンよりも高い負電荷密度および硫酸化度を有する。他のグリコサミノグリカンと同様に、ＰＰＳの構造的および化学的な特性は、この薬物の内皮への結合を促進する。ＰＰＳは典型的に、グルコシル残基当り１．５硫酸基よりも高い硫酸化度を示す。
【０１４１】
デキストラン硫酸（ＤＸＳ）は、クロロスルホン酸によるデキストランのエステル化によって生成されるデキストランのポリアニオン誘導体である。ＤＸＳはｄ−グルコースの分岐鎖多糖ポリマーであり、透水性であり、かつ粘着性のゼラチン質の材料を形成する。硫黄含有量はおよそ１７％であり、これはデキストラン分子のグルコシル残基当り平均１．９硫酸基に相当する。
【０１４２】
本明細書で使用する場合、用語「抗凝血薬」は、直接的又は間接的に、血液の凝固を防止する能力又は血餅を溶解する能力を有するあらゆる化合物を意味することが意図されている。好ましい実施形態では、本発明は、抗凝血活性を実質的に欠くグリコサミノグリカンに関する。抗凝血活性を実質的に欠くことは、好ましくは、アンチトロンビンＩＩＩ及び／又は第Ｘａ因子に対して低下した活性を示す、例えば５０ＩＵ／ｍｇ未満のアンチトロンビンＩＩＩ活性及び／又は５０ＩＵ／ｍｇ未満の抗Ｘａ活性を有する化合物を指す。
【０１４３】
本明細書で使用する場合、用語「阻害剤」は、酵素の活性をブロックするか又は低下させる化合物を記述することを意図されている。阻害剤は、競合的阻害で、不競合阻害で、又は非競合的阻害で作用することができる。阻害剤は可逆的に又は不可逆的に結合することができ、それゆえ、この用語は、酵素の自殺基質である化合物を包含する。阻害剤は、酵素の活性部位上又は酵素の活性部位近傍の１以上の部位を修飾することができ、又は阻害剤は、酵素上の別のところで立体構造変化を引き起こすことができる。本明細書で使用する場合、阻害剤は、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、低分子量化合物、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、組換えタンパク質、抗体、ペプチボディ、又はこれらの結合体若しくは融合タンパク質であってもよい。ｓｉＲＮＡの総説については、Ｍｉｌｈａｖｅｔ  Ｏ．ら、２００３を参照のこと。アンチセンスの総説については、Ｏｐａｌｉｎｓｋａ  ＪＢら、２００３を参照のこと。
【０１４４】
低分子量化合物は、２０００ダルトン未満、１０００ダルトン未満、７００ダルトン未満又は５００ダルトン未満の分子量を持つ化合物を指す。
【０１４５】
「ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤」は、好ましくは、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路に関与する酵素のうちのいずれかのものの野生型又は何らかの変異型の生物活性に対する阻害剤を指す。本明細書で使用する場合、用語「ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路」又は「ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路」は、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ及びＥＲＫマイトジェン活性化キナーゼを伴い、細胞内応答を細胞表面受容体への成長因子の結合に結び付けるシグナル伝達経路を指す。ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路シグナル伝達経路という用語は、多くのタンパク質成分及びこのシグナル伝達経路の一部分であるキナーゼカスケード、並びにこの経路によって制御される種々の標的を包含する。
【０１４６】
ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路は、文献では、Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路又はＲａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路とも呼ばれる。ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路に関与する酵素の総説については、例えばＭｃＣｕｂｒｅｙ  Ｊ．Ａ．ら、２００７を参照のこと。
【０１４７】
ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤としては、ＲＴＫ阻害剤、Ｒａｓ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、Ｒａｆ阻害剤及び／又はＥＲＫ阻害剤が挙げられてよいがこれらに限定されない。
【０１４８】
本明細書で使用する場合、「ＭＥＫ」は、好ましくは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）をリン酸化するキナーゼ酵素であるマイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＡＰ２Ｋ、ＭＡＰＫＫとしても知られる）を指す。ＭＥＫのＩＵＢＭＢ酵素命名法はＥＣ  ２．７．１２．２である。ＭＡＰ２Ｋ１（ＭＥＫ１）、ＭＡＰ２Ｋ２（ＭＥＫ２）、ＭＡＰ２Ｋ３（ＭＫＫ３）、ＭＡＰ２Ｋ４（ＭＫＫ４）、ＭＡＰ２Ｋ５（ＭＫＫ５）、ＭＡＰ２Ｋ６（ＭＫＫ６）、ＭＡＰ２Ｋ７（ＭＫＫ７）を含めたＭＥＫの７つのサブタイプがある。最も好ましくは、本明細書で使用する場合、ＭＥＫはＭＥＫ１又はＭＥＫ２である。
【０１４９】
本明細書で使用する場合の用語「ＭＥＫ阻害剤」は、好ましくは、以下に記載されるＭＥＫ酵素阻害アッセイによって測定可能な、約１００μＭ以下又は約５０μＭ以下のＭＥＫ活性に関するＩＣ５０を示す化合物を指す。「ＩＣ５０」は、酵素（例えば、ＭＥＫ）の活性を最大半量レベルまで低下させる阻害剤の濃度を指す。
【０１５０】
ＭＥＫ阻害剤の例としては、ＡＺＤ８３３０（ＡＲＲＹ−４２４７０４）、レファメチニブ（ＢＡＹ  ８６−９７６６、ＲＤＥＡ１１９）、コビメチニブ（ＧＤＣ−０９７３、ＸＬ−５１８、ＲＧ７４２１）；Ｅ６２０１；ビニメチニブ（ＭＥＫ１６２、ＡＲＲＹ−１６２）；ＰＤ０３２５９０１；ピマセルチブ（ＡＳ７０３０２６、ＭＳＣ１９３６３６９Ｂ）；ＲＯ４９８７６５５（ＣＨ４９８７６５５）、ＲＯ５１２６７６６（ＣＨ５１２６７６６）、セルメチニブ（ＡＺＤ６２４４、ＡＲＲＹ−１４２，８８６）、トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）、ＧＤＣ−０６２３、ＰＤ０３５９０１、ＰＤ１８４３５２（ＣＩ−１０４０）、ＷＸ−５５４、Ｕ０１２６−ＥｔＯＨ、ＰＤ９８０５９、ＢＩＸ  ０２１８９、ＢＩＸ  ０２１８８、ＰＤ３１８０８８、ホノキオール、ＳＬ−３２７、ＧＤＣ−０６２３、ＡＰＳ−２−７９  ＨＣｌ、コビメチニブ、ＸＬ５１８、ＰＤ３２５９０１、ＴＡＫ−７３３、ＲＯ５１２６７６６又はＨＬ−０８５が挙げられる。
【０１５１】
しかしながら、ＭＥＫ阻害剤の上記一覧は網羅的なものではなく、当業者は、化合物がＭＥＫ阻害剤であるか否かを、化合物のＩＣ５０を決定するための公知のＭＥＫ酵素阻害アッセイによって判定してもよい。１つのそのようなアッセイは、例えば米国特許第９，０３４，８６１Ｂ２号明細書に記載されており、この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０１５２】
ＭＥＫ酵素阻害アッセイ：
材料及び試薬の調製：精製した組換え全長ヒトＧＳＴ−ＭＥＫ１をセル・シグナリングテクノロジー社（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）（ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、マサチューセッツ州、米国）から購入する。ＭＡＰキナーゼ基質Ｅｒｋ１／Ｅｒｋ２ペプチドを、エンゾ・ライフ・サイエンシーズ（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（プリマスミーティング（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ）、ペンシルベニア州、米国）から購入する。
【０１５３】
酵素活性の決定：化合物を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で１ｍＭ〜１．３７μＭの濃度の範囲に３倍希釈する。通常の２０マイクロタイターアッセイは、５ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．２、２．５ｍＭ  β−グリセロリン酸、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭ  ＤＴＴを含有する１×アッセイ緩衝液中、８０ｎｇ  ＭＥＫ１、４μｇ  Ｅｒｋ１／Ｅｒｋ２ペプチド、１００μＭ又は１ｍＭ  ＡＴＰ、１μＭ〜１．３７ｎＭの試験化合物を含有していた。酵素反応を、室温で９０分間インキュベーションする。キナーゼ反応の最後で、２０μＬのＡＤＰ−Ｇｌｏ試薬（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州、米国）を添加し、室温で４０分間インキュベーションする。４０μＬのキナーゼ検出試薬（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を添加し、室温で１時間インキュベーションする。化学発光を読み取り、ＩＣ５０を、ＳｏｆｔＭａｘソフトウェアを使用して算出する。
【０１５４】
本明細書で使用する場合、「Ｒａｆ」は、セリン／トレオニン特異的タンパク質キナーゼのファミリーであるＲａｆキナーゼを指し、これには、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ又はｃ−Ｒａｆ（Ｒａｆ１）が含まれる。
【０１５５】
本明細書で使用する場合の用語「Ｒａｆ阻害剤」又は「Ｒａｆキナーゼ阻害剤」は、後述するようにＲａｆタンパク質キナーゼ阻害剤についてのＩＣ５０値を決定するためのアッセイによって測定可能な、約１００μＭ以下又は約５０μＭ以下のＲａｆ活性に関するＩＣ５０を示す化合物を指す。「ＩＣ５０」は、酵素（例えば、Ｒａｆ）の活性を最大半量レベルまで低下させる阻害剤の濃度を指す。
【０１５６】
Ｒａｆ阻害剤の例としては、ベムラフェニブ（ＰＬＸ４０３２、ＲＧ７２０４）、ソラフェニブトシル酸塩、ＰＬＸ−４７２０、ダブラフェニブ（ＧＳＫ２１１８４３６）、ＧＤＣ−０８７９、ＣＣＴ１９６９６９、ＲＡＦ２６５（ＣＨＩＲ−２６５）、ＡＺ  ６２８、ＮＶＰ−ＢＨＧ７１２、ＳＢ５９０８８５、ＺＭ  ３３６３７２、ＧＷ５０７４、ＴＡＫ−６３２、ＣＥＰ−３２４９６、エンコラフェニブ（ＬＧＸ８１８）、ＲＯ５１２６７６６（ＣＨ５１２６７６６）、ＭＬＮ２４８０、ＰＬＸ７９０４、ＣＣＴ１９６９６９及びＬＹ３００９１２０が挙げられる。
【０１５７】
しかしながら、Ｒａｆ阻害剤の上記一覧は網羅的なものではなく、当業者は、化合物がＲａｆ阻害剤に該当するか否かを、化合物のＩＣ５０を決定するための公知のＲａｆキナーゼアッセイによって判定してもよい。１つのそのようなアッセイは、例えば国際公開第２００９／０１８２３８Ａ号パンフレットに記載されており、この文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０１５８】
Ｒａｆ  ＩＣ５０データの一般化：ヒト癌性細胞株におけるＲａｆタンパク質キナーゼ阻害剤、例えばソラフェニブについてのＩＣ５０値を決定するための方法は、２００４年３月４日出願の、発明の名称「Ｐｙｒｉｄｙｌｆｕｒａｎｓ  ａｎｄ  ｐｙｒｒｏｌｅｓ  ａｓ  Ｒａｆ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｒａｆキナーゼ阻害剤としてのピリジルフラン及びピロール）」の米国特許出願第１０／４８８，５７６号に記載されており、この方法は、参照によりその全体が本明細書に援用される。ヒト二倍体包皮線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ  ｄｉｐｌｏｉｄ  ｆｏｒｅｓｋｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ＨＦＦ）又はヒト結腸癌（Ｃｏｌｏ  ２０１）細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び抗生物質ペニシリン（１００単位／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００マイクログラム／ｍｌ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）／ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を含有するそのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）／ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））で成長させる。成長を、加湿された５％ＣＯ２インキュベーター内にて、７５ｃｍの２つのプラスチックフラスコ中で３７℃に維持する。細胞を、０．２５％トリプシン／１ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を使用して回収し、増殖培地に再懸濁し、血球計数器を使用して数える。平底９６穴プレートに、トリプシン処理した指数関数的に成長する培養物からの２００μｌの体積で、２×１０  ３細胞／ウェルで播種する。「ブランク」ウェルに、添加物なしの増殖培地を添加する。細胞は、一晩インキュベーションされ、付着されることになる。
【０１５９】
２４時間後、細胞を含有するウェルからの培地を１８０マイクロリットルの新しい培地で置き換える。試験化合物の適切な希釈物を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したＲａｆタンパク質キナーゼ化合物の原液からそれらのウェルに添加する。すべてのウェルの中の最終のＤＭＳＯ濃度は０．２％であった。細胞と化合物とを、通常の成長条件下で、３７℃でさらに７２時間インキュベーションする。次いで、細胞を、標準的なＸＴＴ／ＰＭＳを使用して生存率についてアッセイする。５０マイクロリットルのＸＴＴ／ＰＭＳ溶液を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で９０分間インキュベーションする。次いで、４５０ｎＭでの吸光度を、９６穴ＵＶプレートリーダー（モレキュラー・デバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ））を使用して決定する。これらの条件下で、４５０ｎｍでの未処置の対照細胞の吸光度は、少なくとも１．０光学密度単位／ｍｌである。各ウェル中の細胞のパーセント生存率を（バックグラウンド吸光度を補正した後の）これらのデータから算出する。これは、１０００×（Ａ４５０試験ウェル／Ａ４５０未処置の対照ウェル）に等しいことになり、この式中、Ａ４５０は三連の決定値の平均であり、ＩＣ５０は、濃度対パーセント生存率のプロットから求められる、対照（未処置の）生存率の５０％まで細胞生存率を低下させたＲａｆキナーゼ阻害剤化合物の濃度に基づいて決定される。
【０１６０】
本明細書で使用する場合、用語「受容体チロシンキナーゼ」又は略号「ＲＴＫ」は、野生型のリガンドに結合することができ、内因性チロシンキナーゼ活性を有することができるあらゆる内在性細胞膜貫通タンパク質を意味することが意図されている。ＲＴＫは、細胞外領域、典型的には単一の膜貫通へリックスである膜貫通ドメイン、及び細胞質内又は細胞内領域からなる特徴的な分子構造を有する。細胞外領域は、リガンド結合を受け入れる１以上のドメインから構成されてもよい。このようなドメインとしては、免疫グロブリンドメイン、システインリッチドメイン、ロイシンリッチドメイン、フィブロネクチンタイプＩＩＩドメイン、クリングルドメイン、エフリン結合ドメイン、ＷＩＦドメイン、Ｓｅｍａドメイン、Ｌドメインが挙げられるが、これらに限定されない。細胞質内又は細胞内（本明細書では互換的に使用される）領域は、通常、チロシンキナーゼドメイン（「ＴＫＤ」と略される）を含み、膜近傍調節領域及び／又はＣ末端領域をさらに含んでもよい。
【０１６１】
ＲＴＫの２４のサブファミリーがヒトにおいて記述されており、それらには、ＥＧＦ受容体ファミリー（ＥｒｂＢファミリー）、インスリン受容体ファミリー、ＰＤＧＦ受容体ファミリー、ＶＥＧＦ受容体ファミリー、ＦＧＦ受容体ファミリー、ＨＧＦ受容体ファミリー、Ｔｒｋ受容体ファミリー、Ｅｐｈ受容体ファミリー、ＡＸＬ受容体ファミリー、ＬＴＫ受容体ファミリー、ＴＩＥ受容体ファミリー、ＲＯＲ受容体ファミリー、ＤＤＲ受容体ファミリー、ＲＥＴ受容体ファミリー、ＫＬＧ受容体ファミリー、ＲＹＫ受容体ファミリー及びＭｕＳＫ受容体ファミリーが含まれる。
【０１６２】
本明細書で使用する場合、用語「ＥｒｂＢファミリータンパク質」又は「Ｅｒｂタンパク質」は、受容体のＥＧＦＲファミリーとも呼ばれる受容体のＥｒｂＢファミリーのメンバーの１つを指す。本明細書で使用する場合、ＥｒｂＢファミリータンパク質は、１）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）としても知られるＨＥＲ−１；２）ｅｒｂＢ２、ｃ−ｎｅｕ、又はｐ１８５としても知られるＨＥＲ−２；３）ｅｒｂＢ３としても知られるＨＥＲ−３；及び４）ｅｒｂＢ４としても知られるＨＥＲ−４を含む受容体チロシンキナーゼの群を指す。
【０１６３】
好ましい実施形態では、本発明は、癌の治療のためのＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路の阻害剤と負に帯電したグリコサミノグリカンとの併用投与に関し、癌性細胞は、対照細胞と比較してのＥｒｂＢファミリータンパク質の存在の増加及び／又はＥｒｂＢファミリータンパク質介在性シグナル伝達の活性の上昇を特徴とする。
【０１６４】
当該技術分野で公知のいくつかの方法が、癌性細胞がＥｒｂＢファミリータンパク質の存在又は活性の上昇を示すか否かを評価するために使用することができる。これは、本発明の目的のためのタンパク質、ｍＲＮＡ、又は酵素活性のレベルの検出を含んでよい。例えば、本明細書に記載される方法のうちのいくつかでは、タンパク質、ｍＲＮＡ、又はＥｒｂＢファミリータンパク質、例えばＥＧＦＲ若しくはＥｒｂ３の活性のレベル、存在又は不存在が、癌性細胞の試料中で決定され、対照（例えば非癌性の）細胞と比較される。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ（転写物）のレベルは、当該技術分野で公知の方法、例えば、ノーザンブロット、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＲＮＡ−ＩＳＨ）、ＲＮＡ発現アッセイ、例えば、マイクロアレイ解析、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ配列決定（例えば、ランダムプライマー又はオリゴＴプライマーを使用する）、大規模シークエンシング、クローニング、ノーザンブロットを使用して、そして転写物を、例えば定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して増幅することにより評価することができる。ＲＮＡ発現を判定するための分析技法は公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（２００１）を参照のこと。
【０１６６】
（例えば、注目するタンパク質、例えばＥｒｂ−ファミリーのタンパク質に特異的に結合する１以上の抗体を使用して）タンパク質の存在を検出するために、当該技術分野で公知のいずれの方法も使用することができる。例えば、試料は、上記タンパク質、例えばＥｒｂファミリータンパク質に特異的に結合する１以上の抗体又はその抗原部分と接触させられてもよい。その試料中に存在するタンパク質への１以上の抗体の結合は、当該技術分野で公知の方法を使用して検出することができる。
【０１６７】
標的タンパク質への抗体の結合の検出方法は、当該技術分野で公知であり、二次抗体の使用を含むことができる。この二次抗体は、一般に、検出可能であるように修飾され、例えば、標識されている。用語「標識され」は、検出可能な物質を二次抗体に結合すること（すなわち、物理的に連結すること）による直接標識、及び検出可能な物質との反応性による多量体抗原の間接的な標識を包含することが意図されている。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光性物質、発光性物質、生物発光性物質、及び放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられる。好適な蛍光性物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、及び量子ドット、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、及びフィコエリトリンが挙げられる。発光性物質の例としては、ルミノールが挙げられる。生物発光物質の例としては、緑色蛍光タンパク質及びその変異体、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられる。好適な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、又は３Ｈが挙げられる。このような標識抗体の生成方法は当該技術分野で公知であり、多くは市販されている。
【０１６８】
試料中に存在するタンパク質を検出するいずれの方法も使用することができ、その例としては、ラジオイムノアッセイ（放射免疫測定法）（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法、表面プラスモン共鳴、微少流体デバイス、タンパク質アレイ、タンパク質精製（例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー）、質量分析、二次元電気泳動、又は当該技術分野で公知の他のアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６９】
あるいは、アッセイは、注目するタンパク質、例えばＥｒｂファミリータンパク質をコードするｍＲＮＡに特異的に結合する１以上の核酸プローブを準備する工程と、この核酸プローブを、癌性細胞由来の核酸を含む試料と接触させる工程とを備えることができ、試料中に存在する注目するタンパク質、例えばＥｒｂファミリータンパク質をコードする何らかのｍＲＮＡへのそのプローブの結合は、検出することができる。
【０１７０】
以下の図面は、本発明の実際の実行を、本発明の範囲又は本明細書に記載される概念に限定することなく例証することにより、本発明の特定の実施形態を記載するために提示される。
【０１７１】
図の詳細な説明
図１は、癌性細胞におけるＭＥＫ阻害剤抵抗性につながる成長因子依存的なエスケープ機構を図示する。ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路では、膜に結合したＲＴＫの活性化により、細胞増殖を支える下流の転写因子の活性化につながるＲａｓチロシンキナーゼ連鎖が開始される。このプロセスには、血小板が関与する。セルメチニブ等のＭＥＫ阻害剤は、リン酸化を阻害し、これにより細胞増殖も阻害する。しかしながら、セルメチニブで処置された腫瘍又は癌性細胞は、この阻害剤に対する抵抗性を急速に獲得する。この抵抗性は、リン酸化されないＥＲＫが別のチロシンキナーゼ連鎖、描かれたＭＡＰ３Ｋ１経路、を活性化し、この別の連鎖がＨＥＲファミリーに属するＲＴＫ、例えばＥＲＢＢ３の新規合成につながるということによって引き起こされる可能性が高い。ＨＥＲ  ＲＴＫは、ＭＡＰ３Ｋ１経路シグナル伝達につながる成長因子によって活性化され、このシグナル伝達によって、細胞が、損なわれたＲａｓシグナル伝達連鎖を迂回することができるようになる。
【０１７２】
上述のエスケープ機構では、以下の工程で示すことができるように、成長因子の供給における血小板のドッキングが関与している。
１  血小板は、成長委任細胞（ｇｒｏｗｔｈ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｃｅｌｌ）の膜上にある血小板受容体にドッキングし、これにより活性化される。このプロセスの過程で、そのα顆粒の内容物が放出される。
２  これらは、他の物質と合わせて、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）にドッキングするのにここで利用できる成長因子も含有する。
３  この結果、ＲＴＫは、古典的なＲａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路（左）においてＲａｓを活性化する。この経路は、細胞増殖における主要なシグナル伝達カスケードであり、活性化カスケードとしてＭＥＫに到達し、このＭＥＫの機能は、ＥＲＫリン酸化し活性化することである。癌を治療するための治療的アプローチは、ＥＲＫのリン酸化をブロックして、これにより細胞増殖に向かうさらなるシグナル伝達を停止するＭＥＫ阻害剤を提供することによりこの経路を妨げる。ＭＥＫ阻害剤は、腫瘍細胞のアポトーシスを促進してその細胞増殖を防止する有望な抗癌剤として明らかになっている。
４  しかしながら、臨床の状況ではＭＥＫ阻害剤に対する抵抗性の発現が認められることが多い。特に、リン酸化されないＥＲＫは、ＭＡＰ３Ｋ１ホスホキナーゼを上方制御及び／又は活性化することができる。
５  ＭＡＰ３Ｋ１ホスホキナーゼ依存的な経路（左）は、他の機能と合わせて、他の受容体チロシンキナーゼのためのｍ−ＲＮＡ、例えばＥＲＢＢ３等、の核合成も誘導することができる。
６  ＭＡＰ３Ｋ１ホスホキナーゼの活性化を通して、ｍＲＮＡ（ＥＲＢＢ３等）の合成が促進される。
７  ＥＲＢＢ３及び類似の受容体チロシンキナーゼは、活性化した血小板から放出された成長因子との反応後に、代替経路として、細胞増殖を促進するためのＭＡＰ３Ｋ１依存的な経路を開始する可能性がある。Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路を迂回することにより、こうしてこの細胞は、ＭＥＫ阻害剤に対する抵抗性を発現して、増殖し続けることができる。
【０１７３】
本明細書に記載されるように、負に帯電したグリコサミノグリカンは、成長委任細胞の細胞表面上に発現された血小板受容体への血小板の付着性を阻害する可能性があり、こうして、ＭＡＰ３Ｋ１の活性化を介するエスケープ経路も阻害する可能性がある。これにより、ＭＥＫ阻害剤に対する抵抗性は破壊される可能性がある。
【０１７４】
図２は、負に帯電したグリコサミノグリカンの投与と一緒のＭＥＫ−阻害剤治療の組み合わせの効果を図示する。
【０１７５】
負に帯電したグリコサミノグリカンは、血小板が上記細胞にドッキングすることを防ぎ、従って成長因子の供給を防ぐ。利用できる成長因子が存在しないため、ＭＡＰ３Ｋ１を介する代替のシグナル伝達経路は活性化され得ず、ＭＥＫ阻害治療に対する抵抗性の獲得は邪魔される。
【０１７６】
腫瘍成長につながる生物学的プロセスの連鎖におけるＲＴＫの上流で作用する負に帯電したグリコサミノグリカンの併用投与に起因して、こうしてＭＥＫ阻害剤は、その抗癌有効性及び抗増殖有効性を保持する。
【０１７７】
このような併用治療は、転移の治療において特に有用である。死因が癌である患者の９０％が、転移が原因で死亡している。これらは、娘腫瘍であり、通常は原発性腫瘍組織以外の他の組織で発生する。転移の始めにおいて、腫瘍が、血液中で循環していようと転移ニッチに留まっていようと、１細胞期にあるとき、又は腫瘍が直径でまだ数ミリメートルよりも小さい場合、負に帯電したグリコサミノグリカンとＭＥＫ阻害剤との併用治療は、特に効率的である。それゆえ、この治療は、転移を選択的に予防するための新しい機会も示す。
【実施例】
【０１７８】
本発明は、以下の実施例によりさらに説明される。これらは、本発明の範囲を限定することを意図されていない。
【０１７９】
実施例１
この実験は、ＭＥＫ阻害剤セルメチニブに対する抵抗性を発現した癌性細胞に対して実施する。Ｌｉｔｔｌｅら、２０１１に詳細に記載されているように、ＭＥＫ阻害剤セルメチニブに対する抵抗性を発現した癌性細胞は、ＢＲＡＦ（ＣＯＬＯ２０５及びＨＴ２９株）又はＫＲＡＳ（ＨＣＴ１１６及びＬｏＶｏ株）に変異を有する結直腸癌細胞株を、これらの細胞が１μｍ、２μＭ又は４μＭのこの薬物の中で明らかに正常に成長するまで、増加する濃度のＡＺＤ６２４４（セルメチニブ）の存在下でクローン選択なしに成長させることにより生成する。
【０１８０】
ＭＥＫ阻害剤セルメチニブに対する抵抗性を発現した癌性細胞株の各々に対して、以下の工程を実施する。
【０１８１】
３つの細胞集団を、無血清条件下、上記阻害剤の存在下で培養する。
【０１８２】
上記細胞の第１集団に対して、ＰＰＳを組織培養皿に添加し、他方で、第２集団、すなわち対照細胞に対しては、ＰＰＳは添加しない。
【０１８３】
第３の上記細胞集団に対しては、ＤＸＳを組織培養皿に添加する。
【０１８４】
毎日、すべての細胞集団を、血小板と共に３０分間、共インキュベーションし、その後洗い流す。
【０１８５】
成長サイクルにある対照細胞は、その表面に血小板受容体を発現する。血小板は、対照細胞に付着し、そのα顆粒から成長因子を放出する。この対照細胞は、その因子を取り込み、ＭＥＫ阻害剤の存在下でさえも細胞周期をさらに進むことになる。
【０１８６】
第１及び第３の細胞集団については、ＰＰＳ及びＤＸＳは、血小板が癌性細胞に付着するのを防ぎ、それゆえ、血小板由来成長因子は放出されず、増殖は邪魔される。
【０１８７】
対照癌性細胞は、ＭＥＫ阻害剤の存在下でさえも成長及び分裂し続けるのに対して、ＭＥＫ阻害剤とＰＰＳ又はＤＸＳとの存在下でインキュベーションされる細胞集団は消滅する。
【０１８８】
実施例２
第２の実験を、細胞をＭＥＫ阻害剤ＣＩ−１０４０（ＰＤ１８４３５２）の存在下で培養することを除いて、実施例１に記載したようにして実施する。
【０１８９】
Ｌｉｔｔｌｅら、２０１１に詳細に記載されているように、ＭＥＫ阻害剤ＰＤ１８４３５２に対する抵抗性を発現した癌性細胞は、ＢＲＡＦ（ＣＯＬＯ２０５）又はＫＲＡＳ（ＨＣＴ１１６）に変異を有する結直腸癌細胞株を、これらの細胞が１μｍ、２μＭ又は４のこの薬物の中で明らかに正常に成長するまで、増加する濃度のＡＺＤ６２４４（セルメチニブ）の存在下でクローン選択なしに成長させることにより生成する。
【０１９０】
ＭＥＫ阻害剤ＣＩ−１０４０（ＰＤ１８４３５２）に対する抵抗性を発現した癌性細胞株の各々に対して、培養工程を、細胞をＭＥＫ阻害剤ＣＩ−１０４０（ＰＤ１８４３５２）の存在下で培養することを除いて、実施例１のようにして実施する。
【０１９１】
対照癌性細胞は、ＭＥＫ阻害剤ＣＩ−１０４０（ＰＤ１８４３５２）の存在下でさえも成長及び分裂し続けるのに対して、ＭＥＫ阻害剤ＣＩ−１０４０（ＰＤ１８４３５２）とＰＰＳ又はＤＸＳとの存在下でインキュベーションされる細胞集団は消滅する。
【０１９２】
実施例３
第３の実験を、ＭＥＫ阻害剤トラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）に対する抵抗性を発現した細胞を使用し、このＭＥＫ阻害剤トラメチニブの存在下で培養することを除いて、実施例１に記載したようにして実施する。
【０１９３】
Ｖｕｊｉｃら、２０１４に詳細に記載されているように、ＭＥＫ阻害剤トラメチニブに対する抵抗性を発現した癌性細胞は、ヒトＮＲＡＳ変異黒色腫細胞株ＤＯ４及びＭＭ４１５を増加する濃度のトラメチニブ（ＧＳＫ１１２０２１２）の存在下でおよそ６ヶ月にわたって成長させることにより生成する。
【０１９４】
ＭＥＫ阻害剤トラメチニブに対する抵抗性を発現した癌性細胞株の各々に対して、培養工程を、細胞をＭＥＫ阻害剤トラメチニブの存在下で培養することを除いて、実施例１のようにして実施する。
【０１９５】
対照癌性細胞は、ＭＥＫ阻害剤トラメチニブの存在下でさえも成長及び分裂し続けるのに対して、ＭＥＫ阻害剤トラメチニブとＰＰＳ又はＤＸＳとの存在下でインキュベーションされる細胞集団は消滅する。
【０１９６】
実施例４
第４の実験を、Ｒａｆ阻害剤ベムラフェニブに対する抵抗性を発現した細胞を使用し、Ｒａｆ阻害剤ベムラフェニブの存在下で培養することを除いて、実施例１に記載したようにして実施する。
【０１９７】
Ｓａｎｄｒｉら、２０１６に詳細に記載されているように、Ｒａｆ阻害剤ベムラフェニブに対する抵抗性を発現した癌性細胞は、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異を有する黒色腫細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−２８を０．５〜０．６μＭベムラフェニブの存在下で４〜６週間成長させ、その後クローンコロニーを単離することにより生成する。
【０１９８】
Ｒａｆ阻害剤ベムラフェニブに対する抵抗性を発現した癌性細胞株の各々に対して、培養工程を、細胞をＲａｆ阻害剤ベムラフェニブの存在下で培養することを除いて、実施例１のようにして実施する。
【０１９９】
対照癌性細胞は、Ｒａｆ阻害剤ベムラフェニブの存在下でさえも成長及び分裂し続けるのに対して、Ｒａｆ阻害剤ベムラフェニブとＰＰＳ又はＤＸＳとの存在下でインキュベーションされる細胞集団は消滅する。
【０２００】
実施例５
第５の実験を、Ｒａｆ阻害剤ソラフェニブに対する抵抗性を発現した細胞を使用し、Ｒａｆ阻害剤ソラフェニブの存在下で培養することを除いて、実施例１に記載したようにして実施する。
【０２０１】
Ｃｈｅｎら、２０１１に詳細に記載されているように、Ｒａｆ阻害剤ソラフェニブに対する抵抗性を発現した癌性細胞を、ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）Ｈｕｈ７をソラフェニブへの長期曝露で成長させることにより生成する。
【０２０２】
Ｒａｆ阻害剤ソラフェニブに対する抵抗性を発現した癌性細胞株の各々に対して、培養工程を、細胞をＲａｆ阻害剤ソラフェニブの存在下で培養することを除いて、実施例１のようにして実施する。
【０２０３】
対照癌性細胞は、Ｒａｆ阻害剤ソラフェニブの存在下でさえも成長及び分裂し続けるのに対して、Ｒａｆ阻害剤ソラフェニブとＰＰＳ又はＤＸＳとの存在下でインキュベーションされる細胞集団は消滅する。
【０２０４】
実施例６
第６の実験を、Ｒａｆ阻害剤ダブラフェニブに対する抵抗性を発現した細胞を使用し、Ｒａｆ阻害剤ダブラフェニブの存在下で培養することを除いて、実施例１に記載したようにして実施する。
【０２０５】
Ｃａｐａｒｏｒａｌｉら、２０１１に詳細に記載されているように、Ｒａｆ阻害剤ダブラフェニブに対する抵抗性を発現した癌性細胞は、ヒト黒色腫細胞株Ａ３７５を徐々に増加する濃度のダブラフェニブ（１ｎＭから１．５μＭまで）の中で４ヶ月にわたって成長させ、その後このダブラフェニブ抵抗性細胞株を、１．５μＭダブラフェニブを添加したＣＭ中で維持することにより生成する。
【０２０６】
Ｒａｆ阻害剤ダブラフェニブに対する抵抗性を発現した癌性細胞株の各々に対して、培養工程を、細胞をＲａｆ阻害剤ダブラフェニブの存在下で培養することを除いて、実施例１のようにして実施する。
【０２０７】
対照癌性細胞は、Ｒａｆ阻害剤ダブラフェニブの存在下でさえも成長及び分裂し続けるのに対して、Ｒａｆ阻害剤ダブラフェニブとＰＰＳ又はＤＸＳとの存在下でインキュベーションされる細胞集団は消滅する。
【０２０８】
実施例７
第７の実験を、癌性細胞がＲＴＫ阻害剤に対して抵抗性であり、３つの細胞集団をＲＴＫ阻害剤の存在下で培養することを除いて、実施例１に記載したようにして実施する。
【０２０９】
対照癌性細胞は、ＲＴＫ阻害剤の存在下でさえも成長及び分裂し続けるのに対して、ＰＰＳ又はＤＸＳの追加的な存在下でインキュベーションする細胞集団は消滅する。
【０２１０】
参考文献
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Ｓｉｖａｒａｍａｎ，Ｖ．Ｓ．、Ｗａｎｇ，Ｈ．、Ｎｕｏｖｏ，Ｇ．Ｊ．及びＭａｌｂｏｎ，Ｃ．Ｃ．  Ｈｙｐｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、９９：１４７８−１４８３（１９９７）．
Ｔａｋａｇｉ，Ｓ．、Ｓａｔｏ，Ｓ．、Ｏｈ−ｈａｒａ，Ｔ．、Ｔａｋａｍｉ，Ｍ．、Ｋｏｉｋｅ，Ｓ．、Ｍｉｓｈｉｍａ，Ｙ．、Ｈａｔａｋｅ  Ｋ．、Ｆｕｊｉｔａ，Ｎ．、Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｖｉａ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ａｇｇｒｕｓ／Ｐｏｄｏｐｌａｎｉｎ  ａｎｄ  ＣＬＥＣ−２．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、８（８）：ｅ７３６０９（２０１３）．  
Ｔｕｒｎｂｕｌｌ  Ｊ．Ｅ．、Ｈｏｐｗｏｏｄ  Ｊ．Ｊ．、Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  Ｊ．Ｔ．、Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ａｎｄ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９６：２６９８−２７０３（１９９９）．
Ｖｕｊｉｃら、Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ  ａｎｄ  ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ  ｈａｖｅ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ＮＲＡＳ  ｍｕｔａｎｔ  ｃａｎｃｅｒ、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１４）．
Ｗａｎｇ，Ｚ．、Ｚｈａｎｇ，Ｆ．、Ｄｏｒｄｉｃｋ，Ｊ．Ｓ．及びＬｉｎｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｊ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍａｓｓ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｄｅｇｒｅｅｓ  ｏｆ  Ｓｕｌｆａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｂｙ  Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、８（４）、５０６−５１１（２０１２）．  
Ｚｈａｏ，Ｙ．、Ａｄｊｅｉ，Ａ．Ａ．、Ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ＭＥＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．  １１：３８５−４００（２０１４）．
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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