(57)【要約】  本明細書に記載するのは、小細胞肺癌の検出、診断、及び治療において有用な方法ならびに組成物である。トランスジェニック動物モデル及び細胞株を小細胞肺癌サブタイプの研究用に開示する。小細胞肺癌サブタイプの治療用の活性薬剤をスクリーニング及び特定する方法ならびにａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤での治療に対して感受性の患者を特定する方法も同様に提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニックマウスであって、
ａ．内因性Ｒｂ１及びＴｒｐ５３遺伝子の両方の対立遺伝子が除去されたゲノム、ならびに
ｂ．肺細胞で外因性Ｍｙｃ遺伝子の発現を指示する調節配列に作動可能に連結された前記外因性Ｍｙｃ遺伝子を発現する導入遺伝子を含む前記トランスジェニックマウスであり、
前記外因性Ｍｙｃ遺伝子は、前記トランスジェニックマウスで発現される、前記トランスジェニックマウス。
【請求項２】
小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）に関連する中央に位置する肺腫瘍を提示する、請求項１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３】
５〜７週齢でＳＣＬＣに関連する中央に位置する肺腫瘍を提示する、請求項３に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項４】
前記小細胞肺癌がバリアントＳＣＬＣである、請求項２に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項５】
前記調節配列が神経内分泌プロモーターである、請求項１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項６】
前記神経内分泌プロモーターがカルシトニン遺伝子関連ペプチドである、請求項５に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項７】
前記Ｍｙｃ遺伝子が変異型Ｍｙｃ遺伝子である、請求項１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項８】
前記変異型Ｍｙｃ遺伝子が、配列番号２７のアミノ酸５８でトレオニンからアラニンへの置換を含む、請求項７に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項９】
請求項１に記載のトランスジェニックマウス由来の細胞株または初代細胞培養物。
【請求項１０】
ＮＥＵＲＯＤ１を発現しない、請求項９に記載の細胞株。
【請求項１１】
参照細胞株と比較して、ＡＳＣＬ１を発現しないか、またはＡＳＣＬ１の発現の低下を示す、請求項９に記載の細胞株。
【請求項１２】
小細胞肺癌の治療に有効な生物活性剤をスクリーニングする方法であって、
ａ．内因性Ｒｂ１及びＴｒｐ５３遺伝子の両方の対立遺伝子が除去されたゲノム、ならびに
ｂ．肺細胞で外因性遺伝子の発現を指示する調節配列に作動可能に連結された前記外因性Ｍｙｃ遺伝子を発現する導入遺伝子を含むトランスジェニックマウスに対して候補薬剤を投与することを含む前記方法であり、
生存を延長するまたは腫瘍のサイズを低減する薬剤が、小細胞肺癌の治療に有効であると特定される、前記方法。
【請求項１３】
ＮＥＵＲＯＤ１が前記トランスジェニックマウスで発現される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｍｙｃｌが前記トランスジェニックマウスで発現されない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
小細胞肺癌の治療用の生物活性剤をスクリーニングする方法であって、
ａ．ｉ．内因性Ｒｂ１及びＴｒｐ５３遺伝子の両方の対立遺伝子が除去されたゲノム、ならびに
ｉｉ．肺細胞で外因性遺伝子の発現を指示する調節配列に作動可能に連結された前記外因性Ｍｙｃ遺伝子を発現する導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス細胞株におけるａｕｒｏｒａキナーゼの発現を測定すること、
ｂ．生物活性剤を前記トランスジェニックマウス細胞株に接触させること、ならびに
ｃ．ステップ（ｂ）の後、前記トランスジェニックマウス細胞株においてａｕｒｏｒａキナーゼの発現を測定し、
ステップ（ａ）の前記トランスジェニックマウス細胞株におけるａｕｒｏｒａキナーゼのレベルと、ステップ（ｃ）の前記トランスジェニックマウス細胞株におけるａｕｒｏｒａキナーゼのレベルを相関させることを含む前記方法であり、ここでは、ステップ（ａ）と比較したステップ（ｃ）におけるａｕｒｏｒａキナーゼのレベルの低下が、前記生物活性剤が小細胞肺癌の治療に有効である可能性があることを示す、前記方法。
【請求項１６】
前記細胞が、前記生物活性剤と７２〜９６時間接触させられる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
対象における小細胞肺癌のバリアントサブタイプを検出する方法であって、
ａ．ヒト対象から試料を採取すること、
ｂ．前記対象の試料中の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベルを測定すること、ならびに
ｃ．前記対象の試料の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベルを、小細胞肺癌を有さないヒト対象由来の試料と比較することを含む前記方法であり、
前記対象の試料におけるＮＥＵＲＯＤ１のレベルの上昇、Ｍｙｃのレベルの上昇またはＭｙｃｌのレベルの低下、及びＡＳＣＬ１のレベルの低下が、前記対象が小細胞肺癌のバリアントサブタイプを有することを示す、前記方法。
【請求項１８】
（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１の前記レベルが、ＲＮＡ−シーケンスデータ解析またはポリメラーゼ連鎖反応を用いて測定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料が、血液または肺組織の試料である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
さらに、前記対象をａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤またはＢＣＬ−２阻害剤で処理することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
バリアント小細胞肺癌の患者を治療する方法であって、
ａ．治療を必要とする患者を特定すること、及び
ｂ．前記患者に治療有効量のａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項２２】
バリアント小細胞肺癌を有する前記患者が、参照試料と比較して、ＮＥＵＲＯＤ１のレベルの上昇、Ｍｙｃのレベルの上昇またはＭｙｃｌのレベルの低下、及びＡＳＣＬ１のレベルの低下を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記患者がヒト患者である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
さらに、１つ以上の化学療法剤を投与することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１に記載のトランスジェニックマウスを用いて小細胞肺癌の治療に有効な生物活性剤をスクリーニングする方法。
【請求項２６】
ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤治療に対する小細胞肺癌患者の反応性を予測する方法であって、
ａ．患者から試料を採取すること、
ｂ．前記患者の試料中の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃもしくはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベル、または神経内分泌遺伝子の任意のパネルもしくはＥＰＣＡＭを測定すること、ならびに
ｃ．前記患者の試料の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベルを、小細胞肺癌を有さないヒト対象由来の試料、または神経内分泌遺伝子の任意のパネルもしくはＥＰＣＡＭと比較することを含む前記方法であり、
前記患者の試料におけるＮＥＵＲＯＤ１のレベルの上昇、Ｍｙｃのレベルの上昇、及びＡＳＣＬ１またはＥＰＣＡＭもしくは他の神経内分泌遺伝子のレベルの低下が、前記対象がａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤治療に対して反応する可能性があることを示す、前記方法。
【請求項２７】
ＢＣＬ−２阻害剤治療に対する小細胞肺癌患者の反応性を予測する方法であって、
ａ．患者から試料を採取すること、
ｂ．前記患者の試料中の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃもしくはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベル、または神経内分泌遺伝子の任意のパネルもしくはＥＰＣＡＭを測定すること、ならびに
ｃ．前記患者の試料の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベルを、小細胞肺癌を有さないヒト対象由来の試料、または神経内分泌遺伝子の任意のパネルもしくはＥＰＣＡＭと比較することを含む前記方法であり、
前記患者の試料におけるＮＥＵＲＯＤ１またはＭｙｃのレベルの低下、Ｍｙｃｌのレベルの上昇、またはＡＳＣＬ１もしくはＥＰＣＡＭもしくは他の神経内分泌遺伝子のレベルの上昇が、前記対象がＢＣＬ−２阻害剤治療に対して反応する可能性があることを示す、前記方法。
【請求項２８】
小細胞肺癌の患者におけるａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤治療の成功を予測する方法であって、
ａ．患者から試料を採取すること、
ｂ．前記患者の試料中の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃもしくはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベル、または神経内分泌遺伝子の任意のパネルもしくはＥＰＣＡＭを測定すること、ならびに
ｃ．前記患者の試料の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベルを、小細胞肺癌を有さないヒト対象由来の試料、または神経内分泌遺伝子の任意のパネルもしくはＥＰＣＡＭと比較することを含む前記方法であり、
前記患者の試料におけるＮＥＵＲＯＤ１のレベルの上昇、Ｍｙｃのレベルの上昇、及びＬｍｙｃ、ＡＳＣＬ１、ＥＰＣＡＭ、または他の神経内分泌遺伝子のレベルの低下が、前記患者において前記ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤治療が成功するであろうことを示す、前記方法。
【請求項２９】
小細胞肺癌の患者におけるＢＣＬ−２阻害剤治療の成功を予測する方法であって、
ａ．患者から試料を採取すること、
ｂ．前記患者の試料中の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃもしくはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベル、または神経内分泌遺伝子の任意のパネルもしくはＥＰＣＡＭを測定すること、ならびに
ｃ．前記患者の試料の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベルを、小細胞肺癌を有さないヒト対象由来の試料、または神経内分泌遺伝子の任意のパネルもしくはＥＰＣＡＭと比較することを含む前記方法であり、
前記患者の試料におけるＮＥＵＲＯＤ１またはＭＹＣのレベルの低下、ＭＹＣＬまたはＡＳＣＬ１またはＥＰＣＡＭまたは他の神経内分泌遺伝子のレベルの上昇が、前記患者において前記ＢＣＬ−２阻害剤治療が成功するであろうことを示す、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１０月２８日に出願された米国仮出願第６２／４１４，３６２号、及び２０１７年１月１１日に出願された米国仮出願第６２／４４４，９６８号の出願日の利益を主張する。これらの先願出願の内容は、本明細書に参照することにより、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府支援の研究に関する声明
本発明は、国立衛生研究所により付与された助成金番号Ｒ０１ＣＡ１８７４５７−０１の下、政府の支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
配列表の参照
本明細書とともにテキストとして提出された、２０１７年１０月２７日に作成され、８，１９２バイトのサイズを有するファイル名「２１１０１＿０３４０Ｐ１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」は、米国特許法施行規則第１．５２条（ｅ）（５）項に従って、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）は、肺癌全体の約１４％を占め、米国では毎年約３０，０００人が死に至る。ＳＣＬＣの患者の平均生存期間は、約１０ヶ月であり、２年生存率は６％である（Ｋａｌｅｍｋｅｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｐｉｅｔａｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＳＣＬＣの標準的な全身療法は、エトポシドによる白金を用いた化学療法であり、これは４０年近く変わっていない。患者の６０〜８０％が化学療法に反応するものの、腫瘍は急速に耐性を発現し、複数の治療に交差耐性を示すようになる。ＳＣＬＣはまた、高転移性であり、患者の５０〜８０％は剖検時に転移を有している（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。これらの悲惨な統計は、この疾患をより深く理解すること及び新たな治療方法に対する必要性を浮き彫りにしている（Ｂｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。
【０００５】
ＳＣＬＣの包括的なゲノム解析で、ＳＣＬＣの９０〜１００％におけるＲＢ１及びＴＰ５３の機能消失の変化が報告された（Ｇｅｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｐｅｉｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｒｕｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＭＹＣ、ＭＹＣＬ、及びＭＹＣＮを含めたＭＹＣファミリー転写因子の増幅も腫瘍の約２０％に生じ、相互に排他的である（Ｐｅｉｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｓｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＭＹＣにおけるゲノム増幅は、原発性のヒト腫瘍の６〜２５％（Ｇａｚｚｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｇｅｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、及びＳＣＬＣの細胞株の３０〜５０％（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、Ｓｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）で特定されている。ＭＹＣの増幅は、不良転帰、腫瘍進行、及び治療耐性と関連しているが、ＭＹＣがどのようにこれらの過程に影響を与えるかは、まだインビボで試験されていない（Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７、Ｓｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１Ａ〜図１Ｍは、ＭｙｃがＲｂ１及びＴｒｐ５３の消失と協働して急速に小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を促進することを示す。図１Ａは、１０8ＰＦＵのＣｇｒｐ−Ｃｒｅに感染させたマウスを示す生存曲線である。****ｐ＜０．０００１。図１Ｂは、未感染（ＷＴ）またはＣｇｒｐ−Ｃｒｅに感染させたＲＰＭマウスの１０6ＰＦＵウイルスの感染の６９日後での代表的な生物発光画像である。単位は、相対的な光の単位を表す。図１Ｃは、感染の８週間後、黒矢印で示される気道に腫瘍を有するＲＰＭマウスから切除した肺の明視野像である。図１Ｄは、肺がグレー、腫瘍が赤、及び主要気道が青色のマイクロＣＴデータの３Ｄレンダリングである。図１Ｅは、それぞれＣｇｒｐ−Ｃｒｅの３９日及び４４日後のＷＴまたはＲＰＭマウスからの表示された平面におけるマイクロＣＴ画像を示す。赤い線は心臓を囲んでいる。図１Ｆは、感染の３週間後の代表的なＨ＆Ｅ染色を示す。スケールバーは１ｍｍである。図１Ｇは、血管周囲及びリンパ管周囲の広がりのＨ＆Ｅを示す。スケールバーは２５０μｍである。図１Ｈ〜図１Ｉは、クラシック（Ｈ）及びバリアント（Ｉ）のＳＣＬＣの形態のＨ＆Ｅを示す。スケールバーは５０μｍである。図１Ｊ〜図１Ｍは、表示された腫瘍モデルにおけるｐＨＨ３（Ｊ、Ｋ）またはＣＣ３（Ｌ、Ｍ）の免疫細胞化学及び定量化を示す。スケールバーは５０μｍである。エラーバーは平均＋／−ＳＥＭを示す。****ｐ＜０．０００１、***ｐ＝０．００１。図８Ａ〜図８Ｎも参照のこと。
【図２】図２Ａ〜図２Ｅは、ＭＹＣがインビボにおいてＮＥＵＲＯＤ１発現を伴う神経内分泌低小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を促進することを示す。図２Ａは、ＲＮＡ−ｓｅｑまたは発現アレイ（＃で示す）によるマウスＳＣＬＣ腫瘍由来のＮＥマーカーの階層的クラスター分析を示す。図２Ｂは、図２Ａに従ってグループ分けされたマウス肺腫瘍におけるＡＳＣＬ１及びＮＥＵＲＯＤ１の発現を示す。ＭＹＣ−高試料の割合は、円グラフで示す（下のパネル）。図２Ｃは、ＮＥＵＲＯＤ１高及びＡＳＣＬ１高指標に関する正規化された濃縮スコア（ＮＥＳ）及びｐ値を用いたＲＰＭ対ＲＰＲ２の腫瘍の遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）を示す。図２Ｄは、表示された抗体に関する免疫組織化学及び腫瘍面積当たりの陽性細胞パーセントの自動定量化を示す。スケールバーは５０μｍである。対応のない両側ｔ検定、****ｐ＜０．０００１、***ｐ＜０．００１、*ｐ＜０．０１、ｎｓ＝有意でない。図２Ｅは、ＮＥＵＲＯＤ１抗体及び供給源を用いたマウス肺腫瘍溶解物の免疫ブロットを示す。ＨＳＰ９０はローディング対照である。対照のヒトＳＣＬＣ細胞株は、−（Ｈ１９６３）及び＋（Ｈ８２）である。図９Ａ〜図９Ｃも参照のこと。
【図３】図３Ａ〜図３Ｅは、ＲＰＭ腫瘍がＭＹＣ−高ヒト小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）の分子サブセットを再現することを示す。図３Ａは、ＲＮＡ−ｓｅｑによるヒトＳＣＬＣ患者試料及び細胞株由来のＮＥマーカーの教師なし階層的クラスター分析を示す。ＭＹＣ発現（高及び低）、試料の種類（細胞株または腫瘍）、及びデータセットの起源（ＲｕｄｉｎらまたはＣｏｌｏｇｎｅ）はヒートマップの上に示されている。図３Ｂは、パネル３ＡのＮＥマーカー発現によってグループ分けされたヒトＳＣＬＣ及び細胞株におけるＡＳＣＬ１及びＮＥＵＲＯＤ１の発現を示す。ＭＹＣ−高（赤）対ＭＹＣ−低（グレー）試料の割合は、円グラフで示す（下のパネル）。図３Ｃ  ＮＥＵＲＯＤ１高及びＡＳＣＬ１高 指標に関する正規化された濃縮スコア（ＮＥＳ）及びｐ値を用いたＭＹＣ−高またはＭＹＣ−低ヒトＳＣＬＣの遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）。図３Ｄは、パネル３Ｅの発現パターンを表す、表示された抗体で染色された早期（上皮内）及び後期（浸潤性）病変由来のＲＰＭ肺腫瘍試料の免疫細胞化学（ＩＨＣ）の連続切片を示す。スケールバーは５０μｍである。図３Ｅは、ＡＳＣＬ１またはＮＥＵＲＯＤ１高もしくは低としてＩＨＣ染色の自動定量化に基づいてグループ分けされた腫瘍を示す。各パターンの腫瘍の割合（ｎ＝２６の合計上皮内病変、ｎ＝４１の浸潤性病変）を示す。対応のない両側ｔ検定、****ｐ＜０．０００１、***ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意でない。図１０Ａ〜図１０Ｈも参照のこと。
【図４】図４Ａ〜図４Ｆは、Ｍｙｃ促進型の腫瘍が、ヒト疾患と同様に転移性であることを示す。図４Ａは、転移性の肝臓病変の代表的なＨ＆Ｅ染色である。中央のパネルの黒いボックス内の領域を右側のパネルで拡大している。黒い矢印は、血管内の有糸分裂像を示す。左から右のパネルにおけるスケールバーは、５００、２００、及び５０μｍである。図４Ｂは、縦隔リンパ節転移のＨ＆Ｅを示す。スケールバー（右のパネル）は５０μｍである。図４Ｃは、表示されたマウスにおける肝臓転移の定量化を、フィッシャーの直接確率検定、両側、ｐ＝０．０１１５の分割表を用いて示す。バーの中には、マウスの総数のうちの肝臓転移を有するマウスの数が示されている。図４Ｄは、表示された転移組織における表示された抗体に対する代表的な免疫細胞化学（ＩＨＣ）である。スケールバーは５０μｍである。図４Ｅは、表示されたマウス由来の原発性肺組織におけるＮＦＩＢに関する代表的なＩＨＣである。スケールバーは５０μｍである。図４Ｆは、３つの独立したＲＰＭ細胞株におけるＭＹＣゲノム標的のＣｈＩＰ−ｓｅｑ解析を示す。
【図５】図５Ａ〜図５Ｇは、Ｍｙｃ促進型小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）が化学療法に反応するものの、再発することを示す。図５Ａは、化学療法（７ｍｇ／ｋｇシスプラチン＋１０ｍｇ／ｋｇエトポシド）の単回投与がない場合（ＰＢＳ）またはある場合のＨ＆Ｅ染色肺腫瘍組織及び表示された抗体に対する代表的な免疫細胞化学（ＩＨＣ）を示す。スケールバーは５０μｍである。図５Ｂ〜図５Ｄは、Ａで表示されたマウス由来のｐＨ２ＡＸ（Ｂ）、ＢｒｄＵ（Ｃ）、またはＣＣ３（Ｄ）に対する腫瘍面積当たりの陽性細胞パーセントのＩＨＣの自動定量化を示す。ドットは、動物当たりの平均である。***ｐ＜０．０００３、**ｐ＜０．００３、*ｐ＜０．０５。図５Ｅは、ＰＢＳまたは２回の化学療法（２Ｘ化学療法）で処理したＲＰＭマウス由来の全切片のＨ＆Ｅを示す。肺は黒で輪郭を示し、腫瘍は赤で輪郭を示す。スケールバーは４ｍｍである。腫瘍量パーセントの自動定量化、処理群当たりのマウスｎ＝７。***ｐ＜０．０００７。図６Ｆは、表示された時点におけるパネルＥの動物由来の代表的なマイクロＣＴ画像及び総腫瘍量の定量化である。腫瘍は可視化のため疑似色の黄色であり、気腔は紫である。エラーバーは平均＋／−ＳＥＭを示す。***ｐ＜０．０００８、****ｐ＜０．０００１。図５Ｇは、垂直破線で示された５ｍｇ／ｋｇシスプラチン及び１０ｍｇ／ｋｇエトポシドで処理されたＲＰＭマウスのカプランマイヤー生存率分析の結果を示す。****ｐ＜０．０００１。図１１Ａ〜図１１Ｉも参照のこと。
【図６】図６Ａ〜図６Ｈは、Ｍｙｃ促進型小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）がＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害に対して弱いことを示す。図６Ａは、表示された薬物で７２〜９６時間処理された、表示されたヒトＳＣＬＣ細胞株についてのＧＩ50値の中央値のヒートマップを示す。図６Ｂは、各化合物について調べたパネル６Ａにおける薬物反応の増加の統計的有意性を示す（片側ｔ検定、ｐ値はＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−Ｈｏｌｍに従って調整）。図６Ｃ〜Ｆは、シスプラチン（Ｃ）、エトポシド（Ｄ）、アリセルチブ（Ｅ）、またはバラセルチブ（Ｆ）で９６時間３連にて処理した細胞のＧＩ50値を示す。ｎ＝４〜７の実験の平均＋／−ＳＥＭ。図６Ｇは、ＭＹＣ状態に従ってグループ分けされたＳＣＬＣ細胞株の平均ＧＩ50薬物反応を示す。統計的有意性は、多重検定のためのＢｏｎｆｅｒｏｎｉ−Ｈｏｌｍ補正を用いた両側ｔ検定によって計算された。図６Ｈは、表示された濃度のアリセルチブで４８時間処理された細胞株由来の全細胞溶解物の免疫ブロットを示す。ＨＳＰ９０は、ローディング対照の役割を果たす。図６Ｉは、アリセルチブで処理された（４８時間）ＰＢ１２０（ＲＰＭ）、３１５１Ｔ１（ＲＰ）、及びＭＣ３３１（ＲＰＰ）マウス細胞株のフローサイトメトリーで測定されたｎ＝２の実験の代表のＤＮＡ含量を示す。図１１も参照のこと。
【図７】図７Ａ〜図７Ｇは、ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害と化学療法の併用が、Ｍｙｃ促進型ＳＣＬＣを有するマウスの生存を有意に延長させることを示す。図７Ａは、ＲＰＭマウスにおけるインビボ薬物研究の概略図である。黒の矢じりは、マイクロＣＴ画像化を示す。紫の矢印はアリセルチブ（Ａｌｉ）処理（２０ｍｇ／ｋｇ、１日２回）を示し、グレーの矢印はシスプラチン（５ｍｇ／ｋｇ）またはエトポシド（１０ｍｇ／ｋｇ）を示す。日数はＸ軸上の白のドットで示す。図７Ｂは、表示されたコホートのＲＰＭマウスにおける腫瘍量の比を示す。エラーバーは、化学療法対化学療法＋ＡｌｉのＳＥＭを表し、表示された時点で*ｐ＜０．０５。図７Ｃは、腫瘍（黄色）及び正常組織／気道（紫）が疑似色のＲＰＭマウス由来の代表的なマイクロＣＴ画像を表す。図７Ｄは、Ａの通りに３サイクル処理された個々のＲＰＭマウスの０〜１９日目（または死亡前の最後のスキャン）の総腫瘍体積変化のパーセントのウォーターフォールプロットである。部分反応及び安定した疾患は、グレーの陰影で示される。対応のない両側ｔ検定、ｐ＜*０．０２３、**＜０．００２、****＜０．０００１。図７Ｅは、パネルＧでの死亡の時点で分析した各処理群における表示された抗体に対する免疫細胞化学を示す。スケールバーは５０μｍである。図７Ｆは、個々の腫瘍についての腫瘍面積当たりの平均陽性細胞の定量化を示す。*ｐ＜０．０２、***＜０．０００８、****＜０．０００１。ｎｓ＝有意でない。図７Ｇは、０日目を処理の開始としたＡの通りに処理されたＲＰＭマウス由来のカプランマイヤー生存率分析を示す。破線は、Ａの通りシスプラチン処理を示す。ログ・ランク（マンテル・コックス）検定、ｐ**＜０．００９、***＜０．０００６、****＜０．０００１、ｎｓ＝有意でない。図１２も参照のこと。
【図８】図８Ａ〜図８Ｎは、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）のＭｙｃ促進型Ｒｂ１fl/flＴｒｐ５３fl/flマウスモデルの作製及び検証を示す。図８Ａは、Ｃｒｅ発現の前後のＨ１１遺伝子座におけるＬＳＬ−ＭｙｃＴ５８Ａ−ＩＲＥＳ−ルシフェラーゼ対立遺伝子と、Ｔｒｐ５３及びＲｂ１の条件付き対立遺伝子を組み合わせた描画図を示す。描画の三角形はＬｏｘＰ部位を表す。長方形はエクソンを示す。図８Ｂは、ホモ接合型ＲＰＭまたはＭＹＣ−ヘテロ接合型（ＲＰＭ／＋）マウスにおけるＣｇｒｐ−Ｃｒｅ感染後の生存曲線を示す。図８Ｃは、感染の３週間後、黒矢印で示される気道に腫瘍を有するＲＰＭマウスから切除した肺の明視野像を示す。図８Ｄ〜図８Ｅは、３週間のクラシック病変の代表的なＨ＆Ｅ画像である。黒いボックス内の領域をパネルＥで拡大している。スケールバーはそれぞれ１００及び５０μｍである。図８Ｆは、３週間の腫瘍のＫｉ−６７の免疫細胞化学（ＩＨＣ）を示す。スケールバーは５０μｍである。図８Ｇは、腫瘍成長の表示されたステージでの代表的なＭＹＣのＩＨＣである。スケールバーは５０μｍである。図８Ｈは、表示された遺伝子型由来のＭＹＣのＩＨＣの定量化を示す。*ｐ＝０．０２２４。図８Ｉは、表示されたマウスにおけるｐＨＨ３のＩＨＣの定量化を示す。図８Ｊは、表示されたマウスにおけるＣＣ３のＩＨＣの定量化を示す。Ｈ〜Ｊの棒グラフ内に分析された腫瘍数が示されている。図８Ｋ〜Ｎは、表示されたマウス由来の肺腫瘍組織における代表的なＩＨＣ（Ｋ）及びＳＰＣ（Ｌ）、ＣＣＳＰ（Ｍ）、またはＮＫＸ２−１（Ｎ）の手動による定量化を示す。パネルＫのスケールバーは５０μｍである。ドットプロット中の破線は、陰性染色を示す。エラーバーは平均＋／−ＳＥＭを表す。****ｐ＜０．０００１、ｎｓ＝有意でない。
【図９】図９Ａ〜Ｃは、ＭＹＣが高ＮＥＵＲＯＤ１発現を伴う神経内分泌低ＳＣＬＣを促進することを示す。図９Ａは、表示されたＲＰＭ腫瘍及び細胞株由来のＤＮＡシーケンシングによるコピー数の変動を示す。第４染色体は、黒い矢印及び黄色の線で示されるＭｙｃｌ及びＮｆｉｂの位置で示される。３１５１Ｔ１（ＲＰ）細胞株は陽性（＋）対照の役割を果たす。スケールバーはコピー数を示す。図９Ｂは、表示された遺伝子型の新たに採取された腫瘍のＭｙｃ及びＭｙｃｌ発現の定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを示す。各ドットは１つの腫瘍を表す。****ｐ＜０．０００１、***ｐ＜０．００１。図９Ｃは、表示されたマウス由来の連続肺腫瘍切片におけるＡＳＣＬ１及びＮＥＵＲＯＤ１の代表的な免疫細胞化学ならびに定量化を示す。スケールバーは５０μｍである。バー内に分析された腫瘍数が示されている。ｎｓ＝有意でない。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｈは、ＲＰＭ腫瘍がＭＹＣ−高ヒトＳＣＬＣの分子サブセットを再現することを示す。図１０Ａは、３つのサブグループを示す６５のヒトＳＣＬＣ細胞株に関する公開された遺伝子発現データの神経内分泌（ＮＥ）マーカー発現に基づく教師なし階層的クラスタリングを示す（Ｐｏｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，２０１６）。アノテーション（上）はＰｏｌｌｅｙらに特有の細胞株（緑）及び我々の細胞株のパネルにも存在するもの（黄色）を示す。アノテートされた高／低ＭＹＣ（赤／白）としての細胞株の分類は、補足の方法に記載の通りに行った。図１０Ｂは、図１０Ａのクラスター分析から得たサブグループ（Ａ〜Ｃ）に従って分割したＰｏｌｌｅｙらの細胞株におけるＡＳＣＬ１及びＮＥＵＲＯＤ１の発現を示す。１グループ当たりのＭＹＣ高／低細胞株の割合は円グラフで示される（下のパネル）。有意性は、両側ｔ検定で計算した。ｎｓ＝有意でない、**ｐ＜０．０１、****ｐ＜０．０００１。図１０Ｃは、ＲＰＭマウス由来のＣＧＲＰ及びＮＣＡＭ１の代表的な免疫細胞化学（ＩＨＣ）である。スケールバーは５０μｍである。図１０Ｄは、表示されたマウス由来の肺腫瘍組織におけるＵＣＨＬ１の代表的なＩＨＣ及び定量化を示す。スケールバーは５０μｍである。**ｐ＜０．００２、****ｐ＜０．０００１。図１０Ｅは、３１５１Ｔ１（ＲＰ）細胞におけるＭＹＣまたはＭＹＣＴ５８Ａの過剰発現がＳＹＰタンパク質のレベルを低減することを示す。ＨＳＰ９０は、ローディング対照の役割を果たす。図１０Ｆは、細胞株当たり２回の独立した実験で行われたｑＲＴ−ＰＣＲによる対照（ｓｈＧＦＰ）またはＭＹＣノックダウン後のヒトＳＣＬＣ細胞株ＧＬＣ１、ＧＬＣ２、Ｈ８２において評価されたＭＹＣ、ＡＳＣＬ１、ＳＹＰ、及びＮＣＡＭ１の発現を示す。バーは、平均２＾−ｄｄＣｔ値と細胞株全体のＳＥＭを表す。ｐ値は両側ｔ検定で計算される。ｎｓ＝有意でない、*ｐ＜０．０５。図１０Ｇは、ＳＹＰタンパク質レベルがＧＬＣ１及びＧＬＣ２細胞においてＭＹＣのノックダウンで増加することを示す。表示された抗体による対照（ｓｈＧＦＰ）またはＭＹＣノックダウン（ｓｈＭＹＣ）細胞の全細胞溶解物の代表的な免疫ブロット。ＨＳＰ９０は、ローディング対照の役割を果たす。グラフは、３回の独立した実験におけるＭＹＣノックダウン時のＧＬＣ１及びＧＬＣ２におけるＳＹＰタンパク質レベルの平均と標準偏差（ＳＤ）を示す。ＳＹＰシグナルは、ＨＳＰ９０及び対照（ｓｈＧＦＰ）に対して正規化した。図１０Ｈは、３つの独立したＲＰＭ細胞株におけるＭＹＣゲノム標的のＣｈＩＰ−Ｓｅｑ分析を示す。Ｐｔｍａは陽性対照の役割を果たす。Ｍｙｃの結合はＮｅｕｒｏＤ１遺伝子の近傍では検出されなかった。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｉは、Ｍｙｃ促進型ＳＣＬＣがＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害に対して弱いことを示す。図１１Ａは、Ｐｏｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，ＪＮＣＩ，２０１６から得られた表示された薬物で処理したＭＹＣ−高対ＭＹＣ−低ヒトＳＣＬＣ細胞株（ｎ＝６５株）のＩＣ５０を示す。ウィルコクソン（マン・ホイットニー）ｐ値が図に示されている。図１１Ｂは、ＰＢ１１５細胞の明視野像であり、培養中の緩く凝集したクラスター（Ｃｇｒｐ−Ｃｒｅに感染させたＲＰＭマウス由来）を示している。スケールバーは５０μｍである。図１１Ｃは、表示された細胞株を用いた表示された抗体に対する免疫ブロット分析を示す。黒い矢印はＲＢ１の正しいバンドを示す。アクチンはローディング対照の役割を果たす。ＰＢ１１５及びＰＢ１２０は、ホモ接合型ＲＰＭである。ＰＢ１２４及びＰＢ１１９はＲＰＭＬＳＬ／＋である。ＡＤ＝腺癌。完全な遺伝子型については図６を参照のこと。図１１Ｄは、ピアソン相関係数によるアリセルチブ感受性（ＧＩ５０により測定）に対する倍加時間の分析を示す。図１１Ｅは、漸増量のアリセルチブで処理したＧＬＣ２細胞を示した。全細胞溶解物が表示された抗体に対する免疫ブロットにより分析されている。ＨＳＰ９０は、ローディング対照の役割を果たす。図１１Ｆは、表示された時点について１μＭのアリセルチブまたはバラセルチブで処理されたＧＬＣ２細胞の（Ｅ）と同様の免疫ブロットを示す。図１１Ｇは、ＧＬＣ２細胞におけるＡＵＲＫＡ及びＡＵＲＫＢノックダウン。グラフは、３回の独立した実験の平均を平均＋／−ＳＤとして、対照（ｓｈＧＦＰ）に対して正規化した相対細胞生存率を示す。ノックダウン後のＡＵＲＫＡ及びＡＵＲＫＢの代表的な免疫ブロット。ＨＳＰ９０は、ローディング対照の役割を果たす。図１１Ｈは、フローサイトメトリーで測定した表示された濃度のアリセルチブ（４８時間）またはＤＭＳＯ対照で処理された表示されたマウス細胞株のＰＩ染色によって測定されたＤＮＡ含量を示す。２つの独立した実験の代表。完全な遺伝子型については図６を参照のこと。図１１Ｉは、ＰＢ１１５（マウスＲＰＭ）またはＧＬＣ１（ヒト、ＭＹＣ−高）細胞中、２４時間１μＭのアリセルチブまたはＤＭＳＯで処理後の表示された時点でシクロヘキシミド（ＣＨＸ）の添加後のＭＹＣレベルの免疫ブロットである。ＨＳＰ９０は、ローディング対照の役割を果たす。グラフは、３回の独立した実験における０分時点に正規化したＨＳＰ９０に対するＭＹＣタンパク質の平均とＳＥＭを示す。有意性は、対応のある両側ｔ検定で各時点について計算した。ｎｓ＝有意でない。*は非特異的交差反応のバンドを示す。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｄは、Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害と化学療法の併用がＭｙｃ促進型ＳＣＬＣを有するマウスの生存を有意に延長させることを示す。図１２Ａは、ＰＢＳ媒体対照（ｎ＝５）、アリセルチブ（２０ｍｇ／ｋｇの１日２回、５日間オン、２日間オフ、ｎ＝５）、化学療法（５ｍｇ／ｋｇシスプラチン＋１０ｍｇ／ｋｇエトポシド、週１回、ｎ＝７）、またはアリセルチブ＋化学療法の併用（ｎ＝７）での２０日間の処理にわたるマウスの体重を示す。図１２Ｂは、図７Ａの通りに処理された個々のＲＰＭ動物に関する総腫瘍体積の成長の比を示し、各処理群に関する平均の比は図７Ｂに示されている。各マウスの最後の体積は、サクリファイス前、最後に取り込んだ画像を示す。図１２Ｃは、アリセルチブ処理ＲＰＭマウス由来の１日２回、２０ｍｇ／ｋｇでの２週間の処理後の腫瘍の代表的なＨ＆Ｅ画像を示す。黄色の矢印は、遅れや分離した染色体を伴う異常な有糸分裂を示す。赤い円は、隣接する細胞と比較して異常な量のＤＮＡを含む細胞を強調している。スケールバーは５０μｍである。動物ごとに分析したｎ＝４のランダム４０倍視野による処理群当たりのＲＰＭマウス（ｎ＝４）由来の肺腫瘍組織の異常有糸分裂の定量化。エラーバーはＳＥＭを表す。****ｐ＜０．０００１。ＡＳＣＬ１またはＮＥＵＲＯＤ１に対する抗体で染色したアリセルチブ処理動物の肺腫瘍組織から採取した代表的な連続切片は、大きな異常細胞がＮＥＵＲＯＤ１＋であることを示している。図１１Ｄは、０．１μＭのエトポシドまたはシスプラチンと組み合わせて９６時間ＤＭＳＯまたは１０ｎＭのアリセルチブで処理された表示されたヒト細胞株ＧＬＣ２（ＭＹＣ）、ＧＬＣ１（ＭＹＣ）、及びＧＬＣ８（ＭＹＣＮ）の棒グラフを示す。２連で行われた３回の独立した実験の平均とＳＤ。有意性は、スチューデントｔ検定で分析された。ｎｓ＝有意でない、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。
【図１３】ＭＹＣの発現が、ＢＣＬ２の発現及びＢＣＬ２阻害に対する感受性と反相関することを示す。
【図１４】ＢＣＬ２の阻害が、ＭＹＣの状態にかかわらず、アリセルチブに対する反応を増加させることを示す。
【図１５】ＢＣＬ２の発現が、ＲＰＭマウス細胞株のＭＹＣと逆相関することを示す。
【図１６】ＢＣＬ２の過剰発現がアリセルチブ耐性を促進することを示す。
【図１７】Ｍｙｃ促進型ＳＣＬＣが、低いＥＰＣＡＭ発現を有することを示す。
【図１８】ＥＰＣＡＭの発現が、ＡＳＣＬ１＋クラシックＳＣＬＣ発現と相関することを示す。
【図１９】ＥＰＣＡＭの発現が、クラシック細胞株の表現型及びＡＳＣＬ１発現と相関することを示す。
【図２０】Ｍｙｃ促進型マウス腫瘍が、他のモデルと比較して低／陰性ＥＰＣＡＭ発現を示すことを示す。
【図２１】クラシックＳＣＬＣヒト細胞株が、より高いＥＰＣＡＭの表面発現を示すことを示す。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書に開示するのは、トランスジェニックマウスであって、ａ．内因性Ｒｂ１及びＴｒｐ５３遺伝子の両方の対立遺伝子が除去されたゲノム、ならびにｂ．肺細胞で外因性Ｍｙｃ遺伝子の発現を指示する調節配列に作動可能に連結された外因性Ｍｙｃ遺伝子を発現する導入遺伝子を含むトランスジェニックマウスであり、該外因性Ｍｙｃ遺伝子は、当該トランスジェニックマウスで発現される。
【０００８】
本明細書に開示するのは、小細胞肺癌の治療に有効な生物活性剤のスクリーニング方法であって、ａ．内因性Ｒｂ１及びＴｒｐ５３遺伝子の両方の対立遺伝子が除去されたゲノム、ならびにｂ．肺細胞で外因性遺伝子の発現を指示する調節配列に作動可能に連結された外因性Ｍｙｃ遺伝子を発現する導入遺伝子を含むトランスジェニックマウスに候補薬剤を投与することを含む該方法であり、ここでは、生存を延長するまたは腫瘍のサイズを低減する薬剤が、小細胞肺癌の治療に有効であると特定される。
【０００９】
本明細書に開示するのは、小細胞肺癌の治療用の生物活性剤のスクリーニング方法であって、ａ．ａｕｒｏｒａキナーゼの発現を、ｉ．内因性Ｒｂ１及びＴｒｐ５３遺伝子の両方の対立遺伝子が除去されたゲノム、ならびにｉｉ．肺細胞で外因性遺伝子の発現を指示する調節配列に作動可能に連結された外因性Ｍｙｃ遺伝子を発現する導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス細胞株において測定すること、ｂ．生物活性剤を該トランスジェニックマウス細胞株と接触させること、及びｃ．ステップ（ｂ）の後、該トランスジェニックマウス細胞株におけるａｕｒｏｒａキナーゼの発現を測定すること、ステップ（ａ）の該トランスジェニックマウス細胞株におけるａｕｒｏｒａキナーゼのレベルとステップ（ｃ）の該トランスジェニックマウス細胞株におけるａｕｒｏｒａキナーゼのレベルの相互関係を示すことを含む該方法であり、ここでは、ステップ（ａ）と比較したステップ（ｃ）におけるａｕｒｏｒａキナーゼのレベルの低下が、当該生物活性剤が小細胞肺癌の治療に有効である可能性があることを示す。
【００１０】
本明細書に開示するのは、対象における小細胞肺癌のバリアントサブタイプを検出する方法であって、ａ．ヒト対象から試料を採取すること、ｂ．該対象の試料中の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベルを測定すること、ならびにｃ．該対象の試料中の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベルを、小細胞肺癌を有さないヒト対象由来の試料と比較することを含む該方法であり、ここでは、該対象の試料中のＮＥＵＲＯＤ１のレベルの上昇、Ｍｙｃのレベルの上昇またはＭｙｃｌのレベルの低下、及びＡＳＣＬ１のレベルの低下が、当該対象が小細胞肺癌のバリアントサブタイプを有することを示す。
【００１１】
本明細書に開示するのは、バリアント小細胞肺癌の患者を治療する方法であって、ａ．治療を必要とする患者を特定すること、及びｂ．当該患者に治療有効量のａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤を投与することを含む該方法である。
【００１２】
本明細書に開示するのは、ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤治療に対する小細胞肺癌患者の反応性を予測する方法であって、ａ．患者から試料を採取すること、ｂ．該患者の試料中の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベル、または神経内分泌遺伝子の任意のパネルもしくはＥＰＣＡＭを測定すること、ならびにｃ．該患者の試料の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベルを、小細胞肺癌を有さないヒト対象由来の試料、または神経内分泌遺伝子の任意のパネルもしくはＥＰＣＡＭと比較することを含む該方法であり、該患者の試料中のＮＥＵＲＯＤ１のレベルの上昇、Ｍｙｃのレベルの上昇、及びＡＳＣＬ１またはＥＰＣＡＭもしくは他の神経内分泌遺伝子のレベルの低下が、当該対象がａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤治療に反応する可能性があることを示す。
【００１３】
本明細書に開示するのは、ＢＣＬ−２阻害剤治療に対する小細胞肺癌患者の反応性を予測する方法であって、ａ．患者から試料を採取すること、ｂ．該患者の試料中の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベル、または神経内分泌遺伝子の任意のパネルもしくはＥＰＣＡＭを測定すること、及びｃ．該患者の試料の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベルを、小細胞肺癌を有さないヒト対象由来の試料、または神経内分泌遺伝子の任意のパネルもしくはＥＰＣＡＭと比較することを含む該方法であり、ここでは、該患者の試料中のＮＥＵＲＯＤ１もしくはＭｙｃのレベルの低下、Ｍｙｃｌのレベルの上昇、またはＡＳＣＬ１もしくはＥＰＣＡＭもしくは他の神経内分泌遺伝子のレベルの上昇が、当該対象がＢＣＬ−２阻害剤治療に反応する可能性があることを示す。
【００１４】
本明細書に開示するのは、小細胞肺癌の患者におけるａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤治療の成功を予測する方法であって、ａ．患者から試料を採取すること、ｂ．該患者の試料中の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベル、または神経内分泌遺伝子の任意のパネルもしくはＥＰＣＡＭを測定すること、及びｃ．該患者の試料の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベルを、小細胞肺癌を有さないヒト対象由来の試料、または神経内分泌遺伝子の任意のパネルもしくはＥＰＣＡＭと比較することを含む該方法であり、ここでは、該患者の試料中のＮＥＵＲＯＤ１のレベルの上昇、Ｍｙｃのレベルの上昇、及びＬｍｙｃ、ＡＳＣＬ１、ＥＰＣＡＭ、または他の神経内分泌遺伝子のレベルの低下が、該ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤治療が当該患者で成功するであろうことを示す。
【００１５】
本明細書に開示するのは、小細胞肺癌の患者におけるＢＣＬ−２阻害剤治療の成功を予測する方法であって、ａ．患者から試料を採取すること、ｂ．該患者の試料中の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベル、または神経内分泌遺伝子の任意のパネルもしくはＥＰＣＡＭを測定すること、及びｃ．該患者の試料の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベルを、小細胞肺癌を有さないヒト対象由来の試料、または神経内分泌遺伝子の任意のパネルもしくはＥＰＣＡＭと比較することを含む該方法であり、ここでは、該患者の試料中のＮＥＵＲＯＤ１もしくはＭｙｃのレベルの低下、ＭＹＣＬまたはＡＳＣＬ１またはＥＰＣＡＭまたは他の神経内分泌遺伝子のレベルの上昇が、当該患者においてＢＣＬ−２阻害剤治療が成功するであろうことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本開示は、本明細書に含まれる以下の本発明の詳細な説明、図面、及び実施例を参照することによってより容易に理解することができる。
【００１７】
本方法及び組成物を開示ならびに説明する前に、それらは、他に特定されない限り、特定の合成方法に限定されず、他に特定されない限り、特定の試薬にも限定されず、よって、当然のことながら、異なるものになってもよいことを理解されたい。本明細書で使用する用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法及び材料をここで記載する。
【００１８】
さらに、特に明記しない限り、本明細書に記載のいずれの方法も、そのステップが特定の順序で実行されることを必要とすると解釈されることを決して意図するものではないことを理解されたい。従って、方法の請求項がそのステップが従うべき順序を実際に記載していない場合、または該ステップが特定の順序に限定されるべきであることが請求項または説明に具体的に述べられていない場合、いかなる点でも順序が推測されることを決して意図しない。これは、ステップの配置または操作の流れに関する論理的な問題、文法構成または句読法から派生する明らかな意味、及び本明細書に記載の態様の数または種類を含めた、任意のあり得る非明示的な解釈の根拠に対して成り立つ。
【００１９】
本明細書で言及するすべての刊行物は、参照することにより本明細書に組み込まれ、該刊行物の引用に関連した方法及び／または材料を開示ならびに説明する。本明細書で論じられる刊行物は、本出願の出願日前に単独でそれらの開示が提供されている。本明細書におけるいかなる内容も、本発明が先行発明により、かかる公開に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、本明細書に提供する公開日は、実際の公開日と異なる場合があり、独立した確認が必要な場合がある。
【００２０】
定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。
【００２１】
本明細書で使用される「または」という用語は、特定のリストの任意の１つの成員を意味するとともに、そのリストの成員の任意の組み合わせも含む。
【００２２】
範囲は、本明細書では、「約」もしくは「およそ」１つの特定の値から、及び／または「約」もしくは「およそ」別の特定の値までのように表され得る。かかる範囲が表される場合、さらなる態様は、該１つの特定の値から、及び／または該他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表される場合、先行詞「約」または「およそ」を使用することによって、該特定の値がさらなる態様を形成することが理解される。さらに、該範囲の各々の端点は、他の端点との関連において、及び他の端点とは独立しての両方で重要であることが理解される。また、本明細書に開示される多くの値があること、及び各値もまた、該値自体に加えて、「約」その特定の値として本明細書に開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」もまた開示される。また、２つの特定の単位間の各単位も開示されることが理解される。例えば、１０及び１５が開示される場合、１１、１２、１３、及び１４も開示される。
【００２３】
本明細書で使用される、「任意の」または「任意に」という用語は、その後に記載される事象または状況が生じても生じなくてもよいこと、ならびにその記載が、該事象または状況が生じる場合及びそれが生じない場合を含むことを意味する。
【００２４】
本明細書で使用される、「試料」という用語は、対象由来の組織または器官、細胞（対象内、対象から直接採取、または培養中で維持された細胞もしくは培養細胞株由来の細胞のいずれか）、細胞溶解物（もしくは溶解物画分）または細胞抽出物、あるいは、細胞または細胞物質（例えば、ポリペプチドもしくは核酸）由来の１つ以上分子を含む溶液を意味し、本明細書に記載の通りにアッセイされる。試料はまた、細胞もしくは細胞成分を含む任意の体液または排出物（例えば、これらに限定されないが、血液、尿、ふん便、唾液、涙液、胆汁）でもよい。試料という用語はまた、「がん試料」または「がんの試料」等も指すことができる。該試料は、針生検、外科生検等の生検によって採取することができる。がん試料としては、例えば、がんの標本、がんの一部、がんから得られたがん細胞（がんから得られたがん細胞株を含み、細胞培養で増殖される）、及び同様に、がんに侵されている疑いがある、またはがん性細胞を含む疑いがある対象由来のがん塊全体、細胞株、細胞、及び／または組織が挙げられる。従って、該がん試料は、非がん性細胞も含み得る可能性がある。
【００２５】
本明細書で使用される、「対象」という用語は、投与の標的、例えば、ヒトを指す。従って、本開示の方法の対象は、脊椎動物、例えば、哺乳類、魚類、鳥類、ハ虫類、または両生類であり得る。「対象」という用語にはまた、飼育動物（例えば、ネコ、イヌ等）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）、及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ミバエ等）も含まれる。１つの態様では、対象は哺乳類である。別の態様では、対象はヒトである。該用語は、特定の年齢や性別を示さない。従って、雌雄にかかわらず、成年、幼年、青年、及び新生対象、ならびに胎児が包含されることが意図される。
【００２６】
本明細書で使用される、「患者」という用語は、疾患または障害に罹患している対象を指す。「患者」という用語は、ヒト及び動物対象を含む。本開示の方法のいくつかの態様において、「患者」は、例えば、投与段階の前等にがんの治療の必要性を診断されている。「がん患者」という用語は、本明細書に記載のがんを有する対象を指すことができ、がんに罹患していると診断された対象が含まれるが、例えば、治療中または治療後の対象も含まれる。
【００２７】
本明細書で使用される、「含む」という用語は、「〜からなる」及び「〜から本質的になる」態様を含むことができる。「含む」は、「含むが限定されない」を意味することもできる。
【００２８】
「阻害する」、「阻害すること」、及び「阻害」は、活性、反応、状態、疾患、または他の生物学的パラメータを弱めるまたは減少させることを意味する。これは、該活性、反応、状態、または疾患の完全な除去を含むことができるがこれに限定されない。これはまた、例えば、自然または対照のレベルと比較して、該活性、反応、状態、または疾患における１０％の阻害または低下を含み得る。従って、ある態様では、該阻害または低下は、自然または対照のレベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、またはその間の任意の低下幅であり得る。ある態様では、該阻害または低下は、自然または対照のレベルと比較して、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、または９０〜１００％である。ある態様では、該阻害または低下は、自然または対照のレベルと比較して、０〜２５、２５〜５０、５０〜７５、または７５〜１００％である。
【００２９】
本明細書で使用される、「調節する」、「調節すること」、及び「調節」は、活性もしくは機能または数の変化を意味する。該変化は、該活性、機能、もしくは数の増加または減少、向上または阻害であり得る。
【００３０】
例えば、細胞におけるヌクレオチド配列の発現に言及する「変更する」または「調節する」という用語は、本明細書では互換的に使用される場合があり、本明細書に記載の方法の適用後の細胞における該ヌクレオチド配列の発現レベルが、該方法を適用する前の細胞におけるその発現と異なることを意味する。
【００３１】
「促進する」、「促進」、及び「促進すること」は、活性、反応、状態、疾患、または他の生物学的パラメータにおける増加を指す。これは、該活性、反応、状態、または疾患の開始を含むことができるが、これに限定されない。これはまた、例えば、自然または対照のレベルと比較して、該活性、反応、状態、または疾患における１０％の増加を含み得る。従って、ある態様では、該増加または促進は、自然または対照のレベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、もしくはそれ以上、またはその間の任意の促進幅であり得る。ある態様では、該増加または促進は、自然または対照のレベルと比較して、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、または９０〜１００％である。ある態様では、該増加または促進は、自然または対照のレベルと比較して、０〜２５、２５〜５０、５０〜７５、もしくは７５〜１００％、またはそれ以上であり、例えば、２００、３００、５００、または１０００％多い。ある態様では、該増加または促進は、自然または対照のレベルと比較して、１００パーセントを超える場合があり、例えば、該自然または対照のレベルと比較して、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００％、またはそれ以上であり得る。
【００３２】
本明細書で使用される、「測定すること」という用語は、活性の量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）もしくは量（ａｍｏｕｎｔ）または変化を測定もしくは確認することを指すことができる。例えば、本明細書で使用される、試料中の開示されたポリペプチドの量を測定することとは、当業者が該試料中の該ポリペプチドのいくつかの定量化できる値を測定または確認するために取るであろうステップを指すことができる。当技術分野は、開示されたポリペプチド及び開示されたヌクレオチドの試料中における量を測定する方法に精通している。
【００３３】
本明細書で使用される、「疾患」もしくは「障害」または「状態」という用語は、互換的に使用され、身体のもしくはいくつかの器官の状態の任意の変化、機能の遂行を中断もしくは阻害すること、及び／または症状、例えば、不快感、機能障害、苦痛、もしくは死でさえもその患者もしくは人と接触する者に引き起こすことを指す。疾患もしくは障害または状態は、病気（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ）、病気（ａｉｌｉｎｇ）、病気（ａｉｌｍｅｎｔ）、病気（ｍａｌａｄｙ）、障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、病気（ｓｉｃｋｎｅｓｓ）、病気（ｉｌｌｎｅｓｓ）、愁訴（ｃｏｍｐｌａｉｎｔ）、疾患（ａｆｆｅｃｔｉｏｎ）とも関連する場合がある。
【００３４】
本明細書で使用される、「正常」という用語は、がんを有さない、または小細胞肺癌を有さない個体、試料、または対象を指す。
【００３５】
「ベクター」または「構築物」という用語は、当該ベクター配列が結合している別の核酸を細胞内に輸送することが可能な核酸配列を指す。「発現ベクター」という用語は、細胞による発現に適した形で遺伝子構築物を含む任意のベクター（例えば、プラスミド、コスミド、またはファージ染色体）を含む（例えば、転写調節因子に連結される）。「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの一般的に使用される形態であるため、互換的に使用される。さらに、本発明は、同等の機能を果たす他のベクターを含むことを意図している。
【００３６】
「発現ベクター」という用語は、本明細書では、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することが可能なベクターを指すことである。組み換えＤＮＡ技術に有用な一般的な発現ベクターは、多くの場合プラスミドの形態である。組み換え発現ベクターは、本明細書に開示する核酸を、宿主細胞において該酸の発現に適した形態で含むことができる。換言すれば、該組み換え発現ベクターは、発現される核酸配列に作動可能に連結された、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され得る１つ以上の調節要素またはプロモーターを含むことができる。
【００３７】
「目的の配列」または「目的の遺伝子」という用語は、これが導入される細胞に対して部分的または完全に異種、すなわち、外来の核酸配列（例えば、治療用遺伝子）を意味することができる。
【００３８】
「目的の配列」または「目的の遺伝子」という用語はまた、それが導入される細胞の内因性遺伝子に対して部分的または完全に同種であるが、当該ゲノムを変更するような方法で該細胞のゲノムに挿入される（例えば、それが天然の遺伝子の位置とは異なる位置に挿入されるか、またはその挿入が「ノックアウト」をもたらす）ように設計された核酸配列を意味することができる。例えば、目的の配列は、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、またはｍＲＮＡであり得る。
【００３９】
「目的の配列」または「目的の遺伝子」という用語はまた、それが導入される細胞の内因性遺伝子に対して部分的または完全に相補的である核酸配列を意味することができる。
【００４０】
「目的の配列」または「目的の遺伝子」はまた、選択された核酸の最適な発現に必須であり得る１つ以上の転写調節配列及び任意の他の核酸、例えば、イントロンを含むことができる。「目的のタンパク質」は、目的の配列または目的の遺伝子から発現されるペプチドまたはペプチド配列を意味する。
【００４１】
「作動可能に連結された」という用語は、ある核酸と別の核酸配列との機能的な関係を指す。プロモーター、エンハンサー、転写及び翻訳終止部位、ならびに他のシグナル配列は、他の配列に作動可能に連結された核酸配列の例である。例えば、転写調節因子へのＤＮＡの作動可能な連結とは、かかるＤＮＡの転写が、該ＤＮＡを特異的に認識し、これに結合し、これを転写するＲＮＡポリメラーゼによって当該プロモーターから開始されるような該ＤＮＡとプロモーターの間の物理的かつ機能的な関係を指す。
【００４２】
本明細書で使用される、「プロモーター」、「プロモーター要素」、または「プロモーター配列」という用語は同等であり、本明細書で使用される場合、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結された場合に該目的のヌクレオチド配列のｍＲＮＡへの転写を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。あるプロモーターは通常、必ずしもではないが、ｍＲＮＡへの転写をそれが制御する目的のヌクレオチド配列の５’（すなわち、上流）に位置し（例えば、構造遺伝子の転写開始部位の近位）、転写の開始のためのＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子による特異的な結合用の部位を提供する。
【００４３】
適切なプロモーターは、発現が生じるべき宿主細胞の遺伝子由来でも、この宿主細胞用の病原体由来でもよい（例えば、組織プロモーターまたはウイルスのような病原体）。プロモーターが誘導性プロモーターの場合、転写速度は誘導剤に応じて増加する。対照的に、該プロモーターが構成的プロモーターの場合、転写速度は誘導剤によって調節されない。また、該プロモーターは、それが特定の組織型（複数可）、例えば、葉、根、または分裂組織の関連するコード領域を転写することにおいてのみ活性であるように、組織特異的または組織優先的な様式で調節され得る。プロモーターに適用される「組織特異的」という用語は、特定の型の組織に対して目的のヌクレオチド配列または遺伝子の選択的発現を指示することが可能であり、異なる型の組織において同じ目的のヌクレオチド配列または遺伝子の発現が相対的にないプロモーターを指す。
【００４４】
一連の要素に先行する「少なくとも」という句は、該一連のすべての要素を指すと理解される。例えば、「少なくとも１つ」は、１、２、３、４、またはそれ以上を含む。
【００４５】
本明細書で使用される、「導入遺伝子」という用語は、細胞（例えば、生きている動物に移植するための哺乳類細胞）のゲノムに挿入された、もしくはされる、またはされつつある遺伝物質を示す。
【００４６】
本明細書で使用される、「形質転換」という用語は、当該細胞に外因性ＤＮＡを組み込んだ後に細胞に誘導される永久的または一時的な遺伝的変化を指す。
【００４７】
本明細書で使用される、「トランスジェニック動物」という句は、非内因性（例えば、異種）核酸配列が染色体外要素としてその細胞の一部に含まれているか、またはその生殖細胞ＤＮＡに安定に組み入れられている（例えば、その細胞のほとんどすべてのゲノム配列に）非ヒト動物、通常は、哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ等）を指す。「トランスジェニック動物」という句はまた、初代トランスジェニック非ヒト動物及び該初代の後代だけでなく、かかる動物の細胞、細胞株、及び組織も含み、該動物の該細胞の１つ以上は、１つ以上の導入遺伝子を含む。
【００４８】
本明細書で使用される、遺伝子の「ノックアウト」とは、遺伝子の配列または遺伝子に関連する配列の変化を意味し、標的遺伝子の機能の低下をもたらす。例えば、遺伝子のノックアウトまたは除去は、標的遺伝子の発現を検出可能なレベル未満にするか、または、発現レベルを伴う場合には、有意でないレベルにすることができる。
【００４９】
本明細書で使用される、「バリアント小細胞肺癌」または「バリアントサブタイプ」または「小細胞肺癌バリアントサブタイプ」等の句は、典型的なクラシック小細胞肺癌よりわずかに大きい細胞、単一の中央に位置する突出した核小体、はっきりと分かれている好酸性細胞質を含むがこれらに限定されない特定の組織病理を指す。
【００５０】
「小細胞肺癌クラシックサブタイプ」は、以下の発現プロファイルを有し得る。すなわち、低ＮＥＵＲＯＤ１、高ＡＳＣＬ１、高ＥＰＣＡＭ、高神経内分泌遺伝子（複数可）、高ＭＹＣＬまたはＭＹＣＮ、及び低ＭＹＣ。クラシック表現型は、対象がＢＣＬ２阻害剤に反応するかどうかを予測することができる。
【００５１】
「小細胞肺癌バリアントサブタイプ」は、以下の発現プロファイルを有し得る。すなわち、高ＮＥＵＲＯＤ１、低ＡＳＣＬ１、低ＥＰＣＡＭ、低神経内分泌遺伝子（複数可）、低ＭＹＣＬまたはＭＹＣＮ、及び高ＭＹＣ。バリアント表現型は、対象がａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤（例えば、アリセルチブ）に反応するかどうかを予測することができる。
【００５２】
ＭＹＣＬ（ＬＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、Ｌ−ＭＹＣとしても知られる）は、Ｌ−ｍｙｃ−１がん原遺伝子タンパク質を指し、ＭＹＣＬ１遺伝子がコードするタンパク質である。
【００５３】
ＭＹＣ（ＭＹＣＣ及びｃ−ＭＹＣとしても知られる）は、細胞周期の進行、アポトーシス、及び細胞の形質転換に関与するタンパク質である。
【００５４】
ＭＹＣＮ（Ｎ−Ｍｙｃ及びＮＭＹＣとしても知られる）は、Ｎ−ｍｙｃがん原遺伝子タンパク質を指す。
【００５５】
本明細書で言及するすべての刊行物及び特許出願は、本発明が属する分野の当業者のレベルを示す。すべての刊行物及び特許出願は、各個別の刊行物または特許出願が、参照することにより具体的かつ個別に組み込まれることが示されているのと同程度に、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００５６】
前述の開示は、理解を明確にする目的で実例及び例としてある程度詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲内である特定の変更及び修正を実施してもよい。
【００５７】
序論
小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）は、歴史的に、分子の層化がない均質疾患として治療的に処置されてきた。ＳＣＬＣは、予後不良であり、治療用に認可された標的治療がない。腫瘍は、一様にＲＢ１及びＴＰ５３を欠き、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ、またはＭＹＣＮを含めたＭＹＣファミリーメンバーのゲノム増幅をしばしば獲得する。本明細書に記載するのは、ヒトＳＣＬＣの重要な特徴を再現する、新規なＭＹＣ促進型の遺伝子操作マウスモデル（ＧＥＭＭ）である。このモデルは、「バリアント」形態、高ＮＥＵＲＯＤ１、及び神経内分泌遺伝子の低発現を特徴とするヒトＳＣＬＣサブタイプを模倣する。標的薬物スクリーニングで、ＭＹＣ促進型ＳＣＬＣは、Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤に対して感受性であることが明らかになり、これがインビボでの化学療法反応を改善する。初回化学療法でのＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害は、ＭＹＣ促進型ＳＣＬＣに対する新規な治療方法であり得る。
【００５８】
細胞株、遺伝子操作マウスモデル（ＧＥＭＭ）、及び患者の腫瘍由来の異種移植片（ＰＤＸ）または循環腫瘍細胞由来の異種移植片（ＣＤＸ）を含めたＳＣＬＣのモデルが生成されている（Ｇａｚｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｈｏｄｇｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ヒトＳＣＬＣ細胞株は、クラシックまたはバリアントと特徴づけられており、バリアント株は、より速い倍加時間、頻繁なＭＹＣ増幅、神経内分泌マーカー発現の減少、及び緩やかに凝集した形態を示す（Ｃａｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５、Ｇａｚｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。細胞株がＭＹＣ増幅を有する患者は、そうでない患者と比較して低い生存率を示す（Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。細胞株の形態とヒト腫瘍との関係及びこれらの表現型を促進する要因はよくわかっていない。これは、一部には、ＳＣＬＣからの生検が小さく、希少であり、しばしば化学療法を未実施の患者由来であることによる。ＳＣＬＣの分類は、混合型または「組み合わせ」型のＳＣＬＣを含み（Ｔｒａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、ＳＣＬＣの約１０〜２０％は、診断用神経内分泌マーカーの発現を欠いている場合があることが認められている（Ｇｅｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｒｅｋｈｔｍａｎ，２０１０、Ｔｒａｖｉｓ，２００９）が、これらの表現型は、現在のところ治療決定に影響を及ぼさない。神経内分泌マーカーの例としては、ＡＳＣＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＳＹＰ、ＩＮＳＭ１、ＣＨＧＡ、ＳＣＧ２、ＧＲＰ、ＮＣＡＭ１、ＵＣＨＬ１（ＰＧＰ９．５）、ＮＳＥ、及びＣＡＬＣＡ／Ｂ（ＣＧＲＰアルファ／ベータ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５９】
ＳＣＬＣにおける腫瘍の不均一性の分子指標は、神経原性転写因子であるＡｃｈａｅｔｅ−Ｓｃｕｔｅ  Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ１（ＡＳＣＬ１）及びＮｅｕｒｏｎａｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  １（ＮＥＵＲＯＤ１）の間の逆相関を含めた遺伝子発現及びメチル化パターンのレベルで発見されている（Ｂｏｒｒｏｍｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｐｏｉｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｐｏｉｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＮＥＵＲＯＤ１ではなくＡＳＣＬ１は、クラシックＳＣＬＣのマウスモデルにおいて腫瘍形成に必要であり、ＡＳＣＬ１が少なくともこの腫瘍のサブセットの重要なドライバーであることを示している（Ｂｏｒｒｏｍｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。対照的に、ＮＥＵＲＯＤ１高指標は、ヒト細胞株におけるバリアント形態及びＭＹＣ増幅と関連している（Ｂｏｒｒｏｍｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｐｏｉｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。マウスモデルはしかしながら、バリアントであるＮＥＵＲＯＤ１＋腫瘍を生じておらず、これがこの分子サブセットの関連性に疑いをかけている（Ｂｏｒｒｏｍｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｂｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。
【００６０】
ＳＣＬＣの条件付きマウスモデルは、マウス肺におけるＲｂ１及びＴｒｐ５３の同時消失に基づいている。マウスは、長い潜伏期でＳＣＬＣを増殖させ（例えば、１０〜１５ヶ月）、腫瘍はしばしばヒトＳＣＬＣと同様、Ｍｙｃｌ増幅を有する（Ｃａｌｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｄｏｏｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｍｅｕｗｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。キメラモデルを用いたＲｂ１fl/fl；Ｔｒｐ５３fl/flマウスにおけるＭｙｃｌの過剰発現は、肺腫瘍の形成を促進し、ＭｙｃｌがＳＣＬＣのドライバーであることを示している（Ｈｕｉｊｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｓｅｍｅｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。Ｒｂ１及びＴｒｐ５３の消失と協働して、Ｒｂ１ファミリーメンバーであるＲｂｌ２（ｐ１３０）またはＰｔｅｎ腫瘍抑制因子の欠失は、腫瘍潜伏期を短縮するが、マウスはまた、可変の組織学的サブタイプを増殖させる（Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｇａｚｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、ＭｃＦａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｓｃｈａｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。これらの高悪性度神経内分泌肺癌のマウスモデルは、病理組織学的にクラシックＳＣＬＣである大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）または神経内分泌性を備えた非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ−ＮＥ）に分類されているが、これまでにバリアントＳＣＬＣ病理を示したものはない（Ｂｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｇａｚｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。本明細書に記載するのは、ＳＣＬＣの新たなＧＥＭＭならびにヒト及びマウスのＳＣＬＣの統合されたゲノム解析ならびに転写学的解析の使用であり、これは、ＳＣＬＣの腫瘍形成及びインビボでの治療反応の臨床的特徴に対するＭＹＣの影響を測定するために使用することができる。
【００６１】
腫瘍抑制因子ＲＢ１及びＴＰ５３の消失及びＭＹＣ増幅は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）における頻繁な発がん事象である。本明細書に記載の結果により、Ｍｙｃの発現は、マウス肺において、Ｒｂ１及びＴｒｐ５３の消失と協働して、ヒトＳＣＬＣと同様、初期には化学療法に感受性であり、その後再発する悪性の高転移性腫瘍を促進することが示される。重要なことには、Ｍｙｃは、ヒトＳＣＬＣの転写プロファイルに対応する高ＮＥＵＲＯＤ１発現を伴うＳＣＬＣの神経内分泌−低「バリアント」サブセットを促進する。標的薬物スクリーニングにより、高ＭＹＣ発現を伴うＳＣＬＣは、Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害に対して弱い可能性があり、これと化学療法の併用は、腫瘍の進行を強く抑制し、生存を延長させることが明らかにされる。これらのデータは、患者の層別化のための分子的特徴を特定し、ＭＹＣ促進型ＳＣＬＣの新規な標的治療方法を明らかにする。
【００６２】
小細胞肺癌
小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）の一般的な症状としては、咳、呼吸困難、体重減少、及び衰弱が挙げられるがこれらに限定されない。ＳＣＬＣはまた、肝臓、リンパ節、副腎、骨、及び脳が挙げられるがこれらに限定されない転移性疾患を有する一部の患者にも存在する場合がある。ＳＣＬＣのほとんどの症例は進行期にあり、ほとんどの患者は小生検及び細胞診標本を基に診断される。多くの異なる型の細胞を含む２種類のＳＣＬＣが認められている。「バリアント」サブタイプと呼ばれる１つのサブタイプは、以下の遺伝子型プロファイルによって特徴づけることができる。すなわち、ＭＹＣ増幅を伴う高（例えば、増加）ＮＥＵＲＯＤ１発現及び低（例えば、減少）神経内分泌遺伝子（例えば、ＡＳＣＬ１）発現。例えば、ＳＣＬＣのバリアントサブタイプは、以下の遺伝子型発現プロファイル、すなわち、高ＮＥＵＲＯＤ１、低ＡＳＣＬ１、低ＥＰＣＡＭ、低神経内分泌遺伝子、低ＭＹＣＬまたはＭＹＣＮ、及び高ＭＹＣを有する場合があるとともに、対象が、例えば、アリセルチブ、すなわち、ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤での治療を含めたある特定の治療的治療に反応するかどうかを予測することができる。「クラシック」サブタイプと呼ばれる他方のサブタイプは、Ｍｙｃｌ増幅を伴うＡＳＣＬ１の発現によって特徴づけることができる。例えば、ＳＣＬＣのクラシックサブタイプは、以下の遺伝子型発現プロファイル、すなわち、低ＮＥＵＲＯＤ１、高ＡＳＣＬ１、高ＥＰＣＡＭ、高神経内分泌遺伝子、高ＭＹＣＬまたはＭＹＣＮ、及び低ＭＹＣを有する場合があるとともに、対象が、例えば、ＢＣＬ２阻害での治療を含めたある特定の治療的治療に反応するかどうかを予測することができる。
【００６３】
クラシック及びバリアントとは、Ｈ＆Ｅ染色切片で見られる病理組織学的外観を指す。典型的な「クラシック」ＳＣＬＣは、小細胞、わずかな不明瞭な細胞質、細かい粒状の核クロマチン、及び目立たない核小体を含む（Ｔｒａｖｉｓ，２０１２）（図１Ｈ）。バリアントＳＣＬＣは、ＳＣＬＣのバリアント形態として説明したものと同様、単一の中央に位置した突出した核小体及びはっきりと分かれている好酸性細胞質を伴うわずかに大きい細胞からなる。本明細書に記載のデータにより、「バリアント」組織病理もまたＮＥＵＲＯＤ１発現、及び例えば、ＡＳＣＬ１等のほとんどの他の神経内分泌マーカーの比較的低レベルと相関することが示される。さらに、バリアントサブタイプによる高ＭＹＣ発現及び／または増幅と密接な相関関係があるため、これらのパラメータのすべてが指標の役割を果たすことができる。
【００６４】
方法
本明細書に開示するのは、トランスジェニックマウス及びトランスジェニックマウスの作製方法である。本明細書に開示するのは、薬物または候補薬物のスクリーニング及び患者集団の診断に有用な非ヒトトランスジェニック動物モデルである。ある態様では、該トランスジェニックマウスは、内因性Ｒｂ１及びＴｒｐ５３遺伝子の両方の対立遺伝子が除去されたゲノム、ならびに肺細胞においてＣｒｅリコンビナーゼへの曝露時に、外因性Ｍｙｃ遺伝子を発現させる調節配列（または要素）に作動可能に連結された外因性Ｍｙｃ遺伝子を発現する導入遺伝子を含み、該外因性Ｍｙｃ遺伝子は、当該トランスジェニックマウスで発現される。ある態様では、該外因性Ｍｙｃ遺伝子は、Ｔ５８Ａの変異を含む。ある態様では、該外因性Ｍｙｃ遺伝子は、野生型のＭｙｃ遺伝子を含む。ある導入遺伝子を用いて、外因性ＤＮＡの組み込み後に、誘導された細胞において遺伝子変化が存在し得るように細胞を形質転換することができる。永久的な遺伝子変化は、細胞に外因性ＤＮＡを、例えば、該細胞のゲノムに組み込んだ後に誘導することができる。安定した組み込みのためのベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、他の動物ウイルス等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６５】
本明細書で使用される、「調節要素」または「調節配列」という用語は、プロモーター、プロモーターエンハンサー、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び発現を制御することが可能な他の要素（例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列を含むがこれらに限定されない転写終結シグナル）を指す。調節要素は、恒常的発現を指示することができる。調節要素は、エンハンサー要素も指す場合がある。ある態様では、該調節配列は、神経内分泌プロモーターであり得る。ある態様では、該神経内分泌プロモーターは、カルシトニン遺伝子関連ペプチドであり得る。一般に、任意の構成的プロモーターを、ＲＮＡ依存性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結することができる。特定の遺伝子特異的プロモーターを使用することができる。かかるプロモーターは、細胞特異的発現または特異的経路に関連する発現を可能にする。哺乳類細胞で活性な任意のプロモーターを使用することができる。肺組織または肺細胞でＣｒｅリコンビナーゼの発現を制御できる任意のプロモーターを使用することができる。ある態様では、Ｃｒｅリコンビナーゼは、神経内分泌プロモーターによって促進され得る。プロモーターの例としては、神経内分泌プロモーター、肺サーファクタントタンパク質Ｃ、クララ細胞分泌タンパク質、ケラチン５、及びサイトメガロウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。遺伝子発現に有用であり得るプロモーターの例としては、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ＳＶ４０、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、β−ラクタマーゼプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｇａｌ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、伸長因子１アルファプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、及びアルカリホスファターゼプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。哺乳類宿主細胞においてベクターからの転写を制御するためのプロモーターの例は、様々な供給源、例えば、これらに限定されないが、ポリオーマウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはサイトメガロウイルス等のウイルスのゲノムから、または異種哺乳類プロモーター（例えば、ベータアクチンプロモーター）から得ることができる。さらに、宿主細胞または関連種由来のプロモーターも使用することができる。
【００６６】
トランスジェニックノックアウトは、内因性遺伝子の一方または両方の対立遺伝子に部分的または完全な機能消失を有する場合がある。ある態様では、網膜芽細胞腫（Ｒｂ１）、腫瘍抑制遺伝子、及びＴｒｐ５３、腫瘍タンパク質５３、同様に腫瘍抑制遺伝子をノックアウトまたは除去することができる。該ノックアウトは、コード配列の破壊の導入、コード配列の欠失を含めた様々な機序によって達成することができる。「ノックアウト」はまた、例えば、動物を標的遺伝子の改変を促進する物質に暴露する、すなわち、該標的遺伝子の部位にて組み換えを促進する酵素を導入する際に、ある標的遺伝子もしくは複数の標的遺伝子の改変が生じる条件付きノックアウト、または該標的遺伝子の改変を指示する他の方法も含むことができる。
【００６７】
Ｍｙｃ（ＭＹＣＣ、ｃ−Ｍｙｃとも呼ばれる）は転写因子をコードする調節遺伝子であり、ＤＮＡ複製の制御において直接的な役割を有することが知られている。外因性Ｍｙｃ遺伝子は、ヒト遺伝子でよく、それはまた、野生型遺伝子でも遺伝子操作されている配列でもよく、例えば、コード領域もしくは非コード領域に欠失、置換、または挿入を有してもよい。導入された配列は、Ｍｙｃポリペプチドをコードすることができるか、または、レポーター遺伝子に作動可能に連結されたＭｙｃプロモーターを利用することができる。誘導された遺伝子がコード配列の場合、それは、構成的でも誘導性でもよいプロモーター、及び宿主動物への発現に必要な他の調節配列に作動可能に連結され得る。ある態様では、該Ｍｙｃ遺伝子は、変異型Ｍｙｃ遺伝子であり得る。ある態様では、該変異型Ｍｙｃ遺伝子は、トレオニンからアラニンへの置換がアミノ酸５８であるタンパク質をコードする（配列番号２７）。ある態様では、ｃｒｅリコンビナーゼは、ＭｙｃＴ５８Ａ対立遺伝子を調節することができる。Ｔ５８Ａの変異を有するアミノ酸の例は、アクセッション番号ＮＰ＿００１１７０８２５．１の配列であり得る。Ｔ５８Ａの変異を有するアミノ酸の例は、
2020503845.tif 000002
2020503845.tif 000003
（配列番号２７）の配列であり得る。
【００６８】
相同的組み換えのためのＤＮＡ構築物は、少なくとも所望の遺伝子修飾を有するＭｙｃ遺伝子の部分を含むことができ、標的遺伝子座に対する相同領域を含むことができる。ランダム組み込み用のＤＮＡ構築物は、組み換えを媒介するための相同領域を含む必要はない。相同的組み換えによる標的遺伝子修飾を有する細胞を生成するための方法は、当技術分野で既知である。
【００６９】
一般に、トランスジェニック動物は、所与の導入遺伝子を、該導入遺伝子を発現させる方法でゲノムに組み込むことによって作製される。トランスジェニック動物を作製するための方法は当技術分野で既知である。
【００７０】
ある態様では、本明細書に開示するトランスジェニックマウスは、ヒトＳＣＬＣのモデルの役割を果たすことができる。ある態様では、本明細書に開示するトランスジェニックマウスモデルは、ＳＣＬＣのバリアントサブタイプであり得る。
【００７１】
ある態様では、該トランスジェニックマウスは、約５〜７週齢で小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）に関連する１つ以上の中央に位置する肺腫瘍を提示し得る。ある態様では、該ＳＣＬＣは、ＳＣＬＣサブタイプであり得る。ある態様では、該ＳＣＬＣサブタイプは、バリアントのＳＣＬＣサブタイプであり得る。ある態様では、該トランスジェニックマウスは、神経原性転写因子ＡＳＣＬ１の発現の減少及びＮＥＵＲＯＤ１の発現の増加を示し得る。ある態様では、該トランスジェニックマウスは、ＭＹＣＬより多くのＭＹＣを発現することができる。ある態様では、該発現レベルは、該トランスジェニックマウス由来の肺腫瘍において測定することができる。該トランスジェニック非ヒト動物またはそれに由来する任意の細胞由来の本明細書に記載の遺伝子またはタンパク質のいずれかの発現レベルを測定し、その後、野生型の、あるいは健康もしくは正常な非ヒト動物または細胞もしくは細胞株における発現レベルと比較することができる。
【００７２】
ベクターとしては、プラスミド、コスミド、及びウイルス（例えば、バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、ならびに人工染色体（例えば、ＹＡＣ）を挙げることができる。ベクターは、標的分子を含むことができる。標的分子は、所望の核酸を対象の体内の特定の器官、組織、細胞、または他の位置に向けるものである。ベクターは、一般に、それが適切な制御要素（例えば、プロモーター、終止コドン、及びポリアデニル化シグナル）と会合した場合に複製を引き起こす。当技術分野で日常的に使用されるベクターの例としては、プラスミド及びウイルスが挙げられる。「ベクター」という用語は発現ベクターを含み、転写され得る遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターを指す。発現ベクターを細胞に導入するために様々な方法を用いることができる。ある態様では、該発現ベクターは、ウイルスまたはウイルスゲノム由来の改変ベクターを含む。本明細書で使用される、「発現ベクター」は、調節領域を含むベクターである。本明細書に開示する核酸配列を発現するために様々な宿主／発現ベクターの組み合わせを用いることができる。発現ベクターの例としては、プラスミド、ならびに、例えば、バクテリオファージ、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）、及び他のウイルス（例えば、アデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）由来のウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。ベクター及び発現系は市販されており、当業者に既知である。
【００７３】
検出可能なマーカーまたはラベルを当該遺伝子座に導入することができ、この場合、発現の上方制御の結果として、その表現型に変化が検出され得る。本明細書に開示するベクターのいずれかは、検出可能なマーカーまたはラベルを含むことができる。かかる検出可能なラベルとしては、発現されるポリペプチドの検出（例えば、精製または局在化）用に設計されたタグ配列を挙げることができるがこれに限定されない。タグ配列としては、例えば、緑色蛍光タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、血球凝集素、またはＦｌａｇ（商標）が挙げられ、これらはコードされたポリペプチドと融合され、カルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかを含めた該ポリペプチド内の任意の場所に挿入され得る。該ラベルは、例えば、蛍光ラベル、放射性ラベル、及び電子ラベルを含めた任意の検出可能な部分を含むことができる。
【００７４】
Ｍｙｃ遺伝子をコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡでも、ゲノムＤＮＡでも、その断片でもよい。ある態様では、該ＤＮＡ配列は、ＭＹＣ  Ｔ５８Ａ  ｃＤＮＡであり得る。ある態様では、該ＤＮＡ配列は、野生型ＭＹＣをコードする。ある態様では、本明細書に記載の遺伝子または複数の遺伝子は、宿主に組み込むための適切なベクターに導入することができる。ベクターの例としては、ウイルスが挙げられるがこれに限定されない。ある態様では、任意のプロモーターに作動可能に連結されたＣｒｅリコンビナーゼを含むウイルスを肺または肺細胞に送達することができる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、部位特異的組み換え事象を行うために使用され得る。例えば、マウスＭｙｃ野生型遺伝子（遺伝子ＩＤ＃１７８６９）は、以下のアクセッション番号の複数の転写産物を産生する。すなわち、ＮＭ＿０１０８４９．４→ＮＰ＿０３４９７９．３、ｍｙｃがん原遺伝子タンパク質アイソフォームａ、ＮＭ＿００１１７７３５４．１→ＮＰ＿００１１７０８２５．１、ｍｙｃがん原遺伝子タンパク質アイソフォームｂ、ＮＭ＿００１１７７３５３．１→ＮＰ＿００１１７０８２４．１、ｍｙｃがん原遺伝子タンパク質アイソフォームｃ、及びＮＭ＿００１１７７３５２．１→ＮＰ＿００１１７０８２３．１、ｍｙｃがん原遺伝子タンパク質アイソフォームｂ。
【００７５】
本明細書に開示するのは、細胞株または初代細胞培養物である。ある態様では、該細胞株または初代細胞培養物は、本明細書に記載のトランスジェニックマウス由来であり得る。ある態様では、細胞または細胞株は、該トランスジェニック動物から単離することができる。ある態様では、該細胞または初代細胞培養物は、外因性Ｍｙｃ遺伝子を有する哺乳類細胞（例えば、マウス細胞株）である。ある態様では、該Ｍｙｃ遺伝子は、変異型Ｍｙｃ遺伝子であり得る。ある態様では、該変異型Ｍｙｃ遺伝子は、Ｔ２８Ａの変異を含む。ある態様では、該Ｍｙｃ遺伝子は、野生型遺伝子であり得る。ある態様では、該細胞株または初代細胞培養物は、不活性化腫瘍抑制遺伝子を含む。ある態様では、該不活性化腫瘍抑制遺伝子は、Ｒｂ１及びＴｒｐ５３であり得る。ある態様では、該細胞株は、１つ以上の神経内分泌バイオマーカーを発現し得る。神経内分泌マーカー（例えば、遺伝子パネル）の例としては、ＡＳＣＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＳＹＰ、ＩＮＳＭ１、ＣＨＧＡ、ＳＣＧ２、ＧＲＰ、ＮＣＡＭ１、ＵＣＨＬ１（ＰＧＰ９．５）、ＮＳＥ、及びＣＡＬＣＡ／Ｂ（ＣＧＲＰアルファ／ベータ）が挙げられるがこれらに限定されない。ある態様では、該細胞株は、ＮＥＵＲＯＤ１を発現することができる。ある態様では、該細胞株は、ＮＥＵＲＯＤ１を発現しない。ある態様では、該細胞株は、低レベルの本明細書に開示する神経内分泌マーカー（例えば、遺伝子パネル）の１つ以上を発現し得る。ある態様では、該細胞株は、低レベルのＡＳＣＬ１を発現することができる。ある態様では、該細胞株は、参照細胞株と比較して、ＡＳＣＬ１を発現しないか、またはその発現の低下を示す。ある態様では、該細胞株は、高レベルのＭＹＣを発現することができる。ある態様では、該細胞株は、高レベルのＮＥＵＲＯＤ１を発現することができる。ある態様では、該細胞株は、ＳＣＬＣのバリアントサブタイプのモデルであり得る。ある態様では、該細胞株は、ＡＳＣＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、及び／または本明細書に開示するほとんどの神経内分泌マーカーの発現を欠く場合がある。ある態様では、本明細書に記載の細胞株は、ヒト腫瘍のサブクラスを表すことができ、例えば、ＡＳＣＬ１及びＮＥＵＲＯＤ１の発現を欠き、高ＭＹＣ発現レベルを有する場合がある。
【００７６】
本明細書に記載の細胞株は、ヒト組織またはヒト循環腫瘍細胞等の検査を含むがこれに限定されない様々な目的に使用することができる。
【００７７】
ＡＳＣＬ１（ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １とも呼ばれる）は、神経発達及び神経芽細胞形成に関与する転写因子である。
【００７８】
ＮＥＵＲＯＤ１（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  １とも呼ばれ、β２と呼ばれることもある）は、ＮｅｕｒｏＤ型の転写因子である。
【００７９】
ＳＹＰ（シナプトフィジンとも呼ばれる）は、シナプス小胞の糖タンパク質である主要なシナプス小胞タンパク質ｐ３８をコードする。
【００８０】
ＩＮＳＭ１（インスリノーマ関連タンパク質１とも呼ばれる）は、イントロンを含まない遺伝子であり、ヒト肺腫瘍を識別するためのバイオマーカーの役割を果たす。
【００８１】
ＣＨＧＡ（クロモグラニンＡもしくはＣｇＡまたは副甲状腺分泌タンパク質１とも呼ばれる）は、神経内分泌タンパク質のグラニンファミリーのメンバーである。
【００８２】
ＳＣＧ２（セクレトグラニンＩＩ及びクロモグラニンＣとも呼ばれる）は、神経内分泌タンパク質をコードする遺伝子である。
【００８３】
ＧＲＰ（プロガストリン放出ペプチドまたはＰｒｏＧＲＰとも呼ばれる）は、ガストリンの放出に関与する調節性ヒトペプチドをコードする。
【００８４】
ＮＣＡＭ１（神経細胞接着分子またはＣＤ５６とも呼ばれる）は、細胞接着、神経突起伸長、シナプス可塑性、ならびに学習及び記憶に関与する。
【００８５】
ＵＣＨＬ１（ユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼＬ１及びＰＧＰ９．５とも呼ばれる）は、脱ユビキチン化酵素をコードする。
【００８６】
ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼとしても知られる）は、ＥＮＯ２遺伝子によってヒトでコードされるホスホピルビン酸ヒドラターゼである。
【００８７】
ＣＡＬＣＡ／Ｂ（カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）とも呼ばれる）は、アルファ及びベータの２つの形態で存在する。
【００８８】
本明細書に記載のトランスジェニックマウスモデルを使用して、ウイルスを用いることにより、例えば、目的の遺伝子または複数の遺伝子を操作するため、または別の遺伝子操作されたマウスと掛け合わせることにより、ＳＣＬＣにおける他の遺伝子の役割を調べることもできる。本明細書に記載のトランスジェニックマウスモデルで産生された腫瘍を採取し、さらに分析することができる。同様に、本明細書に記載のトランスジェニックマウスモデルの循環系に存在する循環腫瘍細胞もまた、取り出して分析することができる。
【００８９】
本明細書に記載のトランスジェニックマウスモデルは、腫瘍内微小環境、腫瘍免疫学、転移、腫瘍進行、腫瘍開始、遺伝子機能、腫瘍ゲノミクス等を含むがこれらに限定されないすべての腫瘍関連プロセスを研究するために使用することができる。
【００９０】
スクリーニング方法
本明細書に開示するのは、小細胞肺癌の治療用の生物活性剤をスクリーニングする方法である。また、本明細書に開示するのは、ＳＣＬＣの予後またはＳＣＬＣの１つ以上の徴候及び症状に影響を及ぼす（例えば、調節、阻害、低減、予防、または減増する）生物活性剤または生物活性化合物（例えば、ペプチド、環状ペプチド、ペプチド模倣薬、小分子、小有機分子、または他の薬物）を特定するための方法である。ある態様では、該方法は、内因性Ｒｂ１及びＴｒｐ５３遺伝子の両方の対立遺伝子が除去されたゲノム、ならびに肺細胞で外因性遺伝子の発現を指示する調節配列に作動可能に連結された外因性Ｍｙｃ遺伝子を発現する導入遺伝子を含むトランスジェニックマウスに候補薬剤を投与することを含み、ここでは、生存を延長するまたは腫瘍のサイズを低減する薬剤が、小細胞肺癌の治療に有効であると特定される。ある態様では、ＮＥＵＲＯＤ１が該トランスジェニックマウスで発現され得る。ある態様では、Ｍｙｃｌは、該トランスジェニックマウスで発現されない（例えば、陰性である）か、低減されるか、または低レベルで発現される場合がある。ある態様では、ＡＳＣＬ１が発現され得る。生存及び／または腫瘍サイズの変化は、プラセボを投与された動物と比較され得る。本明細書に記載の通りに特定される薬剤または化合物を動物モデルに用いて、該薬剤または化合物による治療の作用機序、有効性、毒性、または副作用を測定することができる。
【００９１】
試験化合物は、医薬的に許容される非毒性の賦形剤または担体の混合によって医薬組成物に製剤化し、本明細書に記載のトランスジェニック非ヒト動物に任意の投与経路で投与することができる。例えば、皮下、筋肉内、血管内、皮内、鼻腔内、吸入、髄腔内、または腹腔内投与等の非経口経路、及び舌下、経口、または直腸投与などの経腸経路を使用することができる。
【００９２】
本明細書に開示するのは、ＳＣＬＣの治療に有効な生物活性剤をスクリーニングする方法である。ある態様では、該方法は、本明細書に開示するトランスジェニックマウスを使用することを含む。ある態様では、該トランスジェニックマウスは、内因性Ｒｂ１及びＴｒｐ５３遺伝子の両方の対立遺伝子が除去されたゲノム、肺細胞で外因性Ｍｙｃ遺伝子の発現を指示する調節配列に作動可能に連結されたＴ５８の変異を含む外因性Ｍｙｃ遺伝子を発現する導入遺伝子を含み、該外因性Ｍｙｃ遺伝子は、当該トランスジェニックマウスで発現される。
【００９３】
同様に本明細書に記載するのは、インビトロスクリーニング方法である。本明細書に開示するのは、小細胞肺癌の治療に有効な生物活性剤をスクリーニングする方法である。ある態様では、該方法は、候補薬剤を、内因性Ｒｂ１及びＴｒｐ５３遺伝子の両方の対立遺伝子が除去されたゲノム、ならびに肺細胞で外因性遺伝子の発現を指示する調節配列に作動可能に連結された外因性Ｍｙｃ遺伝子を発現する導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス細胞株と接触させることを含み、ここでは、ａｕｒｏｒａキナーゼを、該トランスジェニック細胞株の未処理の試料と比較して阻害する薬剤が、小細胞肺癌の治療に有効であると特定される。ある態様では、該細胞は、該候補薬剤と約７２〜９６時間接触させることができる。ある態様では、該細胞は、該候補薬剤と、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００時間、またはその間の任意の時間接触させることができる。本明細書に記載の通りに特定される薬剤または化合物を動物モデルに用いて、該薬剤または化合物による治療の作用機序、有効性、毒性、または副作用を測定することができる。
【００９４】
本明細書に開示するのは、ＳＣＬＣの治療用の生物活性剤をスクリーニングする方法である。ある態様では、該方法は、ａ．内因性Ｒｂ１及びＴｒｐ５３遺伝子の両方の対立遺伝子が除去されたゲノム、ならびに肺細胞で当該外因性遺伝子の発現を指示する調節配列に作動可能に連結された外因性Ｍｙｃ遺伝子を発現する導入遺伝子を含むトランスジェニックマウス細胞株におけるａｕｒｏｒａキナーゼの発現を測定すること、ｂ．生物活性剤と該トランスジェニックマウス細胞株と接触させること、ｃ．ステップ（ｂ）の後、該トランスジェニックマウス細胞株においてａｕｒｏｒａキナーゼの発現を測定することを含む。該方法は、さらに、ステップ（ａ）の該トランスジェニックマウス細胞株におけるａｕｒｏｒａキナーゼのレベルとステップ（ｃ）の該トランスジェニックマウス細胞株におけるａｕｒｏｒａキナーゼのレベルを相関させるステップを含むことができ、ここでは、ステップ（ａ）と比較したステップ（ｃ）におけるａｕｒｏｒａキナーゼのレベルの低下が、当該生物活性剤がＳＣＬＣの治療に有効である可能性があることを示す。
【００９５】
本明細書に開示するのは、対象において小細胞肺癌を検出する方法である。ある態様では、本明細書に記載の方法はＳＣＬＣを検出することができる。ある態様では、該ＳＣＬＣは、クラシックＳＣＬＣであり得る。例えば、本明細書に開示するデータ及び知見は、一部には、ＥＰＣＡＭ発現と該クラシックＳＣＬＣサブタイプの相関を示す。従って、ＥＰＣＡＭ発現は、ＡＳＣＬ１発現及び低神経内分泌遺伝子発現と相関させるために用いることができ、それに応じて、ＭＹＣ促進型ＳＣＬＣにおいて極めて低いか、または陰性である。ＥＰＣＡＭは表面マーカーであるため、これをクラシックＳＣＬＣ用のバイオマーカーとしても使用することができる。
【００９６】
ある態様では、本明細書に記載の方法は、ＳＣＬＣの臨床サブタイプを検出することができる。ある態様では、該ＳＣＬＣは、バリアントサブタイプであり得る。ある態様では、該方法は、ヒト対象から試料を採取すること、及び該試料において１つ以上の神経内分泌バイオマーカー及び転写因子のＭｙｃファミリーの有無を検出することを含む。ある態様では、ＮＥＵＲＯＤ１の存在及びＭｙｃｌの非存在が検出され得る。ある態様では、ＮＥＵＲＯＤ１の発現レベルが上昇し、Ｍｙｃｌの発現レベルが低下し得る。該試料の発現レベルは、参照試料と比較され得る。ある試料における１つ以上の神経内分泌バイオマーカー及び転写因子のＭｙｃファミリーを検出するために様々な方法を用いることができる。ある態様では、該検出は、ＲＮＡ−シーケンスデータ解析またはポリメラーゼ連鎖反応を用いて測定することができる。ある態様では、該試料は、血液または肺組織試料であり得る。
【００９７】
ある態様では、該方法は、該対象の試料中のＮＥＵＲＯＤ１、ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及びＡＳＣＬ１のレベルを測定するステップを含むことができる。ある態様では、該方法は、本明細書に開示する神経内分泌遺伝子の１つ以上のレベルを測定することを含むことができる。ある態様では、該方法は、ＥＰＣＡＭのレベルを測定することを含むことができる。ある態様では、該方法は、ＮＥＵＲＯＤ１、Ｍｙｃ、Ｍｙｃｌ、ＡＳＣＬ１、ＥＰＣＡＭ、及び本明細書に開示する１つ以上のさらなる神経内分泌遺伝子、またはそれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない本明細書に開示するバイオマーカーのいずれか１つのレベルを測定することを含むことができる。該方法は、さらに、例えば、該対象の試料のＮＥＵＲＯＤ１、ＭｙｃもしくはＭｙｃｌ、及びＡＳＣＬ１（または、ＮＥＵＲＯＤ１、Ｍｙｃ、Ｍｙｃｌ、ＡＳＣＬ１、ＥＰＣＡＭ、及び本明細書に開示する１つ以上のさらなる神経内分泌遺伝子、もしくはそれらの組み合わせのいずれか）のレベルを、ＳＣＬＣを有さないヒト対象由来の試料と比較するステップを含むことができる。ある態様では、該対象の試料におけるＮＥＵＲＯＤ１のレベルの上昇、ＭｙｃまたはＭｙｃｌのレベルの上昇、及びＡＳＣＬ１のレベルの低下は、該対象がＳＣＬＣのバリアントサブタイプを有することを示す。
【００９８】
ある態様では、ＮＥＵＲＯＤ１、ＭｙｃもしくはＭｙｃｌ、及びＡＳＣＬ１（または、ＮＥＵＲＯＤ１、Ｍｙｃ、Ｍｙｃｌ、ＡＳＣＬ１、ＥＰＣＡＭ、及び本明細書に開示する１つ以上のさらなる神経内分泌遺伝子、もしくはそれらの組み合わせのいずれか）のレベルは、ＲＮＡ−シーケンスデータ解析またはポリメラーゼ連鎖反応を用いて測定することができる。
【００９９】
ある態様では、該方法は、さらに、該対象をａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤またはＢＣＬ−２阻害剤で処理することを含むことができる。
【０１００】
対象の肺組織または血液試料の抽出及び採集の手順は、当技術分野で既知の方法で行うことができる。生検で得る肺組織が標準的技法である。凍結組織標本も使用することができる。該試料は全細胞でも細胞小器官でもよい。細胞は、当該組織を削り取ること、該組織試料を処理して個々の細胞を遊離させること、または体液から細胞を単離することによって採集することができる。該試料は、新鮮組織でも、乾燥組織でも、培養細胞または組織でもよい。該試料は、未固定でも固定されていてもよい。本明細書に記載の方法を用いて、肺の任意の部分を採取し、評価することができる。
【０１０１】
本明細書で使用される、「発現」という用語は、１つ以上の遺伝子の発現もしくは発現レベルを測定または検出するという文脈において使用される場合、該遺伝子の転写を測定もしくは検出すること（すなわち、ｍＲＮＡレベルを測定すること）、及び／または該遺伝子の翻訳を測定もしくは検出すること（例えば、産生されたタンパク質を測定もしくは検出すること）を指すことができる。遺伝子の発現レベルを測定することとは、遺伝子が発現されているかどうかを判断することを意味し、発現されている場合、相対的にどの程度まで発現されているかを測定することを意味する。本明細書に開示する１つ以上の遺伝子の発現レベルは、直接測定（例えば、免疫アッセイ、質量分析）しても、間接的に測定（例えば、タンパク質またはペプチドのｍＲＮＡ発現を測定）してもよい。質量分析の例としては、ＥＩ、ＣＩ、ＭＡＬＤＩ、ＥＳＩ等のイオン化源及びＱｕａｄ、イオントラップ、ＴＯＦ、ＦＴまたはそれらの組み合わせ、分光分析、同位体比質量分析（ＩＲＭＳ）、熱イオン化質量分析（ＴＩＭＳ）、スパーク光源質量分析、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、またはＳＲＭ等の分析が挙げられる。これらの技術のいずれかを予備分画または濃縮法と組み合わせて行うことができる。免疫アッセイの例としては、免疫ブロット、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、放射免疫アッセイが挙げられる。免疫アッセイ法は、検出用の抗体を使用し、抗原のレベルの測定は当技術分野で既知である。該抗体は、スティック、プレート、ビーズ、マイクロビーズ、またはアレイ等の固体担体に固定化され得る。
【０１０２】
本明細書に記載の遺伝子の１つ以上の発現レベルもまた、組織試料中の該１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡ発現を測定することによって間接的に測定され得る。ＲＮＡ発現の方法として挙げられるのは、これらに限定されないが、細胞のｍＲＮＡの抽出ならびに当該遺伝子のすべてまたは一部をコードする転写産物にハイブリダイズする標識プローブを用いたノーザンブロット法、遺伝子特異的プライマー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いたｍＲＮＡの増幅、それに続く様々な方法による遺伝子産物の定量的検出、細胞からのＲＮＡの抽出、それに続く標識、その後、当該遺伝子をコードするｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドをプローブするために使用される、インサイチュハイブリダイゼーション、ＲＮＡシーケンシング、ならびにレポーター遺伝子の検出である。
【０１０３】
タンパク質の発現レベルを測定する方法としては、ウェスタンブロット、免疫ブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、表面プラズモン共鳴、化学発光、蛍光偏光、リン光、免疫組織化学分析、マイクロサイトメトリー、マイクロアレイ、顕微鏡検査、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）、及びフローサイトメトリーが挙げられるがこれらに限定されない。該方法はまた、酵素活性または他のタンパク質パートナーとの相互作用が挙げられるがこれらに限定されない特定のタンパク質特性に基づくアッセイを含むことができる。結合アッセイもまた使用することができ、当技術分野では周知である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置を使用して、２つのタンパク質間の複合体の結合定数を測定することができる。１つのタンパク質から別のタンパク質への結合を測定または検出するために適切な他のアッセイとしては、免疫アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ及びラジオイムノアッセイが挙げられる。分光学的変化を観察することによる結合の測定が用いられる場合もあれば、当該タンパク質の光学特性が、蛍光、ＵＶ吸収、円偏光二色性、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって測定される場合もある。別の方法として、特定の抗体を用いた免疫アッセイを用いて、腫瘍細胞における特定のタンパク質の発現を検出することができる。
【０１０４】
本明細書で使用される、用語「参照」、「参照発現」、「参照試料」、「参照値」、「対照」、「対照試料」等は、試料または１つ以上の遺伝子もしくはタンパク質の発現レベルの文脈で用いられる場合、参照基準を指し、この場合、該参照は、異なる組織（すなわち、同じ組織ではないが複数の組織）間で一定のレベルで発現され、実験条件によって影響を受けず、所定の病態（例えば、ＳＣＬＣに罹患していない）の試料におけるレベルを示す。該参照値は、所定の基準値でも所定の基準値の範囲でもよく、無病、または所定の型もしくは重症度の病気を表す。
【０１０５】
参照発現は、ＳＣＬＣまたは所定の重症度もしくは型のＳＣＬＣに罹患していない対象または対象のプール由来の参照試料における本明細書に記載の１つ以上の遺伝子のレベルであり得る。ある態様では、該参照値は、ある対象または複数の対象の組織における本明細書に開示する１つ以上の遺伝子のレベルであり、この場合、該対象または複数の対象はＳＣＬＣに罹患していない。
【０１０６】
本明細書に開示する１つ以上の遺伝子の発現レベルの測定には、該遺伝子が対照もしくは参照試料と比較して上方制御または増加されているかどうか、対照もしくは参照試料と比較して下方制御または減少されている（例えば、低い）かどうか、あるいは、対照もしくは参照試料と比較して不変であるかどうかを判断することを含む場合がある。本明細書で使用される、「上方制御」及び「発現レベルの上昇」または「増加した発現レベル」という用語は、発現される本明細書に開示する１つ以上の遺伝子に対応する配列に言及し、この場合、該配列の量の尺度は、参照試料または「正常」対照と比較して増加した発現レベル（例えば、高）を表している。例えば、「上方制御」及び「発現レベルの上昇」または「増加した発現レベル」という用語は、発現される本明細書に開示する１つ以上の遺伝子に対応する配列に言及し、この場合、該配列の量の尺度は、１つ以上のタンパク質及び／またはｍＲＮＡの発現レベルの、参照試料または「正常」対照由来の同じｍＲＮＡ（複数可）の発現と比較した増加を表している。「発現レベルの上昇」とは、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、またはそれ以上、例えば、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上、あるいは１倍を超えて２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上までの発現の増加を指す。本明細書で使用される、「下方制御」、「減少した発現レベル５」、または「発現レベルの低下」という用語は、発現される本明細書に開示する１つ以上の遺伝子に対応する配列に言及し、この場合、該配列の量の尺度は、参照試料または「正常」対照と比較して減少した発現レベルを表している。例えば、「下方制御」、「減少した発現レベル」、または「発現レベルの低下」という用語は、発現される本明細書に開示する１つ以上の遺伝子に対応する配列に言及し、この場合、該配列の量の尺度は、１つ以上のタンパク質及び／またはｍＲＮＡの発現レベルの、参照試料または「正常」対照由来の同じｍＲＮＡ（複数可）の発現と比較した減少を表している。「減少した発現レベル」とは、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、またはそれ以上、例えば、２０％、３０％、４０％、もしくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上、あるいは１倍を超えて２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上までの発現の低下を指す。
【０１０７】
本明細書に開示するのは、小細胞肺癌の患者を診断する方法である。ある態様では、該方法は、ヒト対象から試料を採取すること、該試料において１つ以上の神経内分泌バイオマーカーまたは転写因子のＭｙｃファミリーが存在するかどうかを検出すること、及び該１つ以上の神経内分泌バイオマーカーまたは転写因子のＭｙｃファミリーの存在が検出された場合に該対象が小細胞肺癌を有すると診断することを含む。ある態様では、ＮＥＵＲＯＤ１の存在及びＭｙｃｌの非存在が検出され得る。ある態様では、該試料は、血液または肺組織試料であり得る。ある態様では、該検出は、ＲＮＡ−シーケンスデータ解析またはポリメラーゼ連鎖反応を用いて測定することができる。
【０１０８】
１つ以上の遺伝子の参照発現レベルと比較して増加した（高い）または減少した（低い）１つ以上の遺伝子の試料発現レベルの指標パターン（複数可）を認めることができ、これが対象におけるＳＣＬＣ及び／またはＳＣＬＣのサブタイプを示す。
【０１０９】
ある態様では、ＮＥＵＲＯＤ１及びＭＹＣの発現レベルの低下、ならびにＡＳＣＬ１、ＥＰＣＡＭ、１つ以上の神経内分泌遺伝子、ＭＹＣＬ、またはＭＹＣＮの発現レベルの上昇は、クラシックＳＣＬＣサブタイプを示す。
【０１１０】
ある態様では、ＮＥＵＲＯＤ１及びＭＹＣの発現レベルの上昇、ならびにＡＳＣＬ１、ＥＰＣＡＭ、１つ以上の神経内分泌遺伝子、ＭＹＣＬ、またはＭＹＣＮの発現レベルの低下は、バリアントＳＣＬＣサブタイプを示す。
【０１１１】
本明細書に記載の１つ以上の遺伝子の発現レベルは、例えば、単位重量当たりまたは単位体積当たりの１つ以上の遺伝子の尺度であり得る。ある態様では、該発現レベルは比（例えば、参照値の１つ以上のマーカーの量に対する試料中の１つ以上の遺伝子の量）であり得る。
【０１１２】
本明細書に記載する方法は、さらに、当該対象由来の肺組織試料をアッセイし、ＳＣＬＣ及び／またはＳＣＬＣサブタイプの他の分子的特徴の存在を検出するステップを含むことができる。
【０１１３】
ある態様では、該肺組織試料は、ＳＣＬＣであり得る。ある態様では、該肺組織試料は、腫瘍であり得る。ある態様では、該肺組織試料及び／または腫瘍は、ＳＣＬＣサブタイプであり得る。ある態様では、該ＳＣＬＣサブタイプは、そのバリアントサブタイプであり得る。該ＳＣＬＣのバリアントサブタイプは、ゲノム増幅または高レベルのＭＹＣ  ｍＲＮＡに由来し得る高レベルのＭＹＣを特徴とすることができる。ある態様では、該ＳＣＬＣのバリアントサブタイプは、低ＡＳＣＬ１及び／またはＭＹＣＬ発現ならびに本明細書に記載の他の神経内分泌マーカーの低発現も有し得る。ある態様では、該肺組織試料は、ＮＥＵＲＯＤ１の高発現を有し得る。該ＳＣＬＣのバリアントサブタイプはまた、バリアントの組織病理を有し得る。ある態様では、該ＳＣＬＣサブタイプは、Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害に対して感受性である可能性が高い場合がある。
【０１１４】
ある態様では、該ＳＣＬＣサブタイプは、クラシックサブタイプであり得る。該ＳＣＬＣのクラシックサブタイプは、高レベルのＭＹＣＬを特徴とすることができる。ある態様では、該ＳＣＬＣのクラシックサブタイプはまた、高レベルのＭＹＣＮを発現し得る。さらに、該ＳＣＬＣのクラシックサブタイプは、ＭＹＣＬのゲノム増幅または高レベルのＭＹＣＬ  ｍＲＮＡであり得る。ＳＣＬＣのクラシックサブタイプの腫瘍はまた、ＡＳＣＬ１及び本明細書に記載の他の神経内分泌マーカーの高発現も有し得る。該ＳＣＬＣのクラシックサブタイプは、クラシックの組織病理を有し得る。ある態様では、該ＳＣＬＣのクラスサブタイプは、ＥＰＣＡＭの高発現及び／またはＢＣＬ２の高発現を有し得る。ある態様では、該ＳＣＬＣのクラシックサブタイプは、ＢＣＬ２阻害剤に対して反応性である可能性が高い場合がある。
【０１１５】
治療方法
本明細書に開示するのは、対象または患者を治療する方法である。ある態様では、該対象または患者はヒトである。
【０１１６】
本明細書に開示するのは、治療を必要とする小細胞肺癌を有する患者を特定する方法である。ある態様では、該方法は、ＮＥＵＲＯＤ１またはＭＹＣの高発現を有し、ＭｙｃｌまたはＡＳＣＬ１の発現を欠く患者を特定すること、及び該患者に対して治療有効量のａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤を投与することを含む。ある態様では、該患者はヒト患者であり得る。ある態様では、該方法は、さらに、１つ以上の化学療法剤を投与するステップを含むことができる。ある態様では、ＮＥＵＲＯＤ１、ＭＹＣ、Ｍｙｃｌ、ＡＳＣＬ１、及びＥＰＣＡＭの発現は、ＲＮＡ−シーケンスデータ解析またはポリメラーゼ連鎖反応を用いて測定することができる。
【０１１７】
治療を必要とする患者を特定するため、遺伝子またはタンパク質の発現を検出する任意の方法を用いることができる。ある態様では、該治療は、治療有効量のａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤の投与であり得る。
【０１１８】
本明細書に開示するのは、小細胞肺癌の患者を治療する方法である。ある態様では、該方法は、治療を必要とする患者を特定すること、及び当該患者に治療有効量のａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤を投与することを含む。ある態様では、該患者はヒト患者であり得る。ある態様では、該方法は、さらに、１つ以上の化学療法剤を投与するステップを含むことができる。
【０１１９】
本明細書に開示するのは、バリアント小細胞肺癌の患者を治療する方法である。ある態様では、該方法は、治療を必要とする患者を特定すること、及び当該患者に治療有効量のａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤を投与することを含む。ある態様では、バリアントＳＣＬＣを有する患者は、参照試料と比較して、ＮＥＵＲＯＤ１のレベルの上昇、Ｍｙｃのレベルの上昇またはＭｙｃｌのレベルの低下、及びＡＳＣＬ１のレベルの低下を有する。ある態様では、ＮＥＵＲＯＤ１、ＭｙｃもしくはＭｙｃｌ、及びＡＳＣＬ１（または、ＮＥＵＲＯＤ１、Ｍｙｃ、Ｍｙｃｌ、ＡＳＣＬ１、ＥＰＣＡＭ、及び本明細書に開示する１つ以上のさらなる神経内分泌遺伝子のいずれか）、あるいはそれらの組み合わせのレベルが測定及び比較され得る。
【０１２０】
Ａｕｒｏｒａキナーゼは、細胞増殖に関与する酵素であり、様々ながんの治療における既知の標的である。３つのａｕｒｏｒａキナーゼ遺伝子、すなわち、Ａ、Ｂ、及びＣが特定されており、Ａ及びＢは、腫瘍形成に役割を果たすことが分かっている。ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤の例としては、ＺＭ４４７４３９、ヘスペリジン、ＶＸ−６８０、アリセルチブ（ＭＬＮ８２３７）、バラセルチブ（ＡＺＤ１１５２−ＨＱＰＡ）、またはそれらの誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２１】
バイオマーカーの発現または増幅の変化を用いて、対象がａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤の投与に対して感受性であり得ることを示すことができる。ある態様では、増加したまたは高発現のＭＹＣ、ＭＹＣ増幅、及び／またはＮＥＵＲＯＤ１は、ＳＣＬＣのバリアント（例えば、ｃＭＹＣ）及び／またはＳＣＬＣの患者のａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤感受性を示すことができる。ある態様では、減少したまたは低発現のＡＳＣＬ１、本明細書に記載の１つ以上の神経内分泌遺伝子パネル、及び／またはＥＰＣＡＭは、ＳＣＬＣのバリアント（例えば、ｃＭＹＣ）及び／またはＳＣＬＣの患者のａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤感受性を示すことができる。ある態様では、増加したまたは高発現のＭＹＣ、ＭＹＣ増幅、及び／またはＮＥＵＲＯＤ１、ならびに減少したまたは低発現のＡＳＣＬ１、本明細書に記載の１つ以上の神経内分泌遺伝子パネル、及び／またはＥＰＣＡＭの組み合わせは、ＳＣＬＣのバリアント（例えば、ｃＭＹＣ）及び／またはＳＣＬＣの患者のａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤感受性を示すことができる。本明細書に記載のバイオマーカーの発現または増幅のこれら変化のいずれかを、バリアント形態を示す組織病理的変化と組み合わせて、ＳＣＬＣのバリアント（例えば、ｃＭＹＣ）及び／またはＳＣＬＣの患者のａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤感受性を示すことができる。
【０１２２】
ＥＰＣＡＭは、細胞シグナル伝達、遊走、増殖、及び分化が挙げられるがこれらに限定されない多くの細胞機能に関与する内皮細胞接着分子としても知られる。ＥＰＣＡＭは、腫瘍の増殖及びがんの転移に役割を果たし得る。ＥＰＣＡＭ発現は、がんにおいて上方制御され得る。血液は肺を通って流れるため、悪性細胞を含み得る。ある態様では、ＥＰＣＡＭはＳＣＬＣのバイオマーカーの役割を果たすことができ、肺癌のサブタイプを識別する。
【０１２３】
ある態様では、ＥＰＣＡＭは、ＭＹＣＬ関連のクラシックＳＣＬＣで高発現され得る。ある態様では、ＥＰＣＡＭタンパク質発現は、ＡＳＣＬ１及び高発現の本明細書に開示する１つ以上の神経内分泌遺伝子が挙げられるがこれらに限定されないＳＣＬＣのクラシックサブタイプの指標のすべてと高度に相関し得る。ある態様では、ＥＰＣＡＭは、ＭＹＣ関連のＳＣＬＣのバリアントサブタイプにおいて少ないか、または陰性であり得る。ある態様では、ＥＰＣＡＭ低または陰性腫瘍は、患者のａｕｒｏｒａキナーゼ阻害に対する感受性を示すことができる。ある態様では、ＢＣＬ２発現は、ＭＹＣＬ関連のＳＣＬＣのクラシックサブタイプ及びＡＳＣＬ１発現が挙げられるがこれに限定されないその指標のすべてと高度に相関し得る。ある態様では、低ＢＣＬ２発現は、患者のａｕｒｏｒａキナーゼ阻害に対する感受性を示すことができる。
【０１２４】
治療の成功を判断する方法
本明細書に開示するのは、ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤治療に対する小細胞肺癌患者の反応性を予測する方法である。ある態様では、該方法は、当該患者から試料を採取すること、該患者の試料中の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベルを測定すること、該患者の試料の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベルを、小細胞肺癌を有さないヒト対象由来の試料と比較することを含む。該患者の試料におけるＮＥＵＲＯＤ１のレベルの上昇、Ｍｙｃのレベルの上昇、及びＡＳＣＬ１のレベルの低下は、該対象がａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤治療に対して反応する可能性があることを示す。ある態様では、ＮＥＵＲＯＤ１、ＭｙｃもしくはＭｙｃｌ、及びＡＳＣＬ１（または、ＮＥＵＲＯＤ１、Ｍｙｃ、Ｍｙｃｌ、ＡＳＣＬ１、ＥＰＣＡＭ、及び本明細書に開示する１つ以上のさらなる神経内分泌遺伝子のいずれか）、あるいはそれらの組み合わせのレベルが測定及び比較され得る。
【０１２５】
本明細書に開示するのは、ＢＣＬ−２阻害剤治療に対するＳＣＬＣの患者の反応性の方法である。ある態様では、該方法は、当該患者から試料を採取すること、該患者の試料中の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベルを測定すること、該患者の試料の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベルを、小細胞肺癌を有さないヒト対象由来の試料と比較することを含む。該患者の試料におけるＮＥＵＲＯＤ１もしくはＭｙｃのレベルの低下、Ｍｙｃｌのレベルの上昇、またはＡＳＣＬ１のレベルの上昇は、該ＢＣＬ−２阻害剤治療が該患者において成功するであろうことを示す。ある態様では、ＮＥＵＲＯＤ１、ＭｙｃもしくはＭｙｃｌ、及びＡＳＣＬ１（または、ＮＥＵＲＯＤ１、Ｍｙｃ、Ｍｙｃｌ、ＡＳＣＬ１、ＥＰＣＡＭ、及び本明細書に開示する１つ以上のさらなる神経内分泌遺伝子のいずれか）、あるいはそれらの組み合わせのレベルが測定及び比較され得る。ある態様では、該患者の試料におけるＥＰＣＡＭまたは本明細書に開示する１つ以上の神経内分泌遺伝子のレベルの上昇は、該ＢＣＬ−２阻害剤治療が該患者において成功するであろうことを示す。
【０１２６】
本明細書に開示するのは、ＳＣＬＣの患者におけるａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤治療の成功を予測する方法である。ある態様では、該方法は、当該患者から試料を採取すること、該患者の試料中の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベルを測定すること、該患者の試料の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベルを、小細胞肺癌を有さないヒト対象由来の試料と比較することを含む。該患者の試料におけるＮＥＵＲＯＤ１のレベルの上昇、Ｍｙｃのレベルの上昇及びＡＳＣＬ１のレベルの低下、ならびにＭｙｃｌのレベルの低下は、該患者においてａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤治療が成功するであろうことを示す。ある態様では、ＮＥＵＲＯＤ１、ＭｙｃもしくはＭｙｃｌ、及びＡＳＣＬ１（または、ＮＥＵＲＯＤ１、Ｍｙｃ、Ｍｙｃｌ、ＡＳＣＬ１、ＥＰＣＡＭ、及び本明細書に開示する１つ以上のさらなる神経内分泌遺伝子のいずれか）、あるいはそれらの組み合わせのレベルが測定及び比較され得る。ある態様では、該患者の試料におけるＥＰＣＡＭまたは本明細書に開示する１つ以上の神経内分泌遺伝子のレベルの低下は、該ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤治療が該患者において成功するであろうことを示す。
【０１２７】
本明細書に開示するのは、ＳＣＬＣの患者におけるＢＣＬ−２阻害剤治療の成功を予測する方法である。ある態様では、該方法は、当該患者から試料を採取すること、該患者の試料中の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベルを測定すること、該患者の試料の（ｉ）ＮＥＵＲＯＤ１、（ｉｉ）ＭｙｃまたはＭｙｃｌ、及び（ｉｉｉ）ＡＳＣＬ１のレベルを、小細胞肺癌を有さないヒト対象由来の試料と比較することを含む。該患者の試料におけるＮＥＵＲＯＤ１もしくはＭｙｃのレベルの低下、及びＭｙｃｌまたはＡＳＣＬ１のレベルの上昇は、該ＢＣＬ−２阻害剤治療が該患者において成功するであろうことを示す。ある態様では、ＮＥＵＲＯＤ１、ＭｙｃもしくはＭｙｃｌ、及びＡＳＣＬ１（または、ＮＥＵＲＯＤ１、Ｍｙｃ、Ｍｙｃｌ、ＡＳＣＬ１、ＥＰＣＡＭ、及び本明細書に開示する１つ以上のさらなる神経内分泌遺伝子のいずれか）、あるいはそれらの組み合わせのレベルが測定及び比較され得る。ある態様では、該患者の試料におけるＥＰＣＡＭまたは本明細書に開示する１つ以上の神経内分泌遺伝子のレベルの上昇は、該ＢＣＬ−２阻害剤治療が該患者において成功するであろうことを示す。
【実施例】
【０１２８】
実施例１：ＭｙｃはＲｂ１及びＴｒｐ５３の消失と協働して急速にＳＣＬＣを促進する。
Ｃｒｅリコンビナーゼで調節可能なＭｙｃT58A対立遺伝子をＨ１１遺伝子座において有するノックインＬｏｘ−Ｓｔｏｐ−Ｌｏｘ（ＬＳＬ）−ＭｙｃT58A−ＩＲＥＳ−ルシフェラーゼマウス（図８Ａ）を作製した。これらのマウスをＲｂ１fl/flＴｒｐ５３fl/fl動物と掛け合わせ、Ｒｂ１fl/flＴｒｐ５３fl/flＭｙｃLSL/LSL（ＲＰＭ）マウスを作製した。６週齢時、神経内分泌カルシトニン遺伝子関連ペプチド（Ｃｇｒｐ）プロモーターによって促進されるＣｒｅを有するアデノウイルスにより、マウスの気管内に感染させた。Ｃｇｒｐ発現細胞は、ＳＣＬＣのＲｂ１fl/flＴｒｐ５３fl/fl（ＲＰ）マウスモデルにおける優勢な起始細胞であることが実証されている（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。比較として、Ｒｂ１fl/flＴｒｐ５３fl/flＰｔｅｎfl/fl（ＲＰＰ）動物に、ＳＣＬＣを５〜８か月で発生させる（Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｇａｚｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、ＭｃＦａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）Ｃｇｒｐ−Ｃｒｅウイルスを感染させた。ウイルス感染から５週間以内に、一部のＲＰＭマウスは呼吸困難を示し始め、サクリファイスを余儀なくされた。ＲＰＭマウスは、ＲＰＰマウスと比較して有意に死亡率が増加した（それぞれ、生存中央値６０日に対して１６４日）（図１Ａ）。ＲＰＭマウスと比較して、ヘテロ接合型ＲＰＭLSL/+マウスは、わずかに長い生存中央値である８１日を有した（図８Ｂ）。ＲＰＭマウスはルシフェラーゼ対立遺伝子を有するため、動物を、生物発光画像化を用いて観察したところ、大部分（ｎ＝１１中８）が転移の明らかな徴候なしに胸部にシグナルを示した（図１Ｂ）。サクリファイスに際して肺を解剖したところ、上部中央気道に大きな腫瘍が認められ、多くは主気管支を巻き込んでいた（図１Ｃ）。
【０１２９】
別のコホートのＲＰＭマウスを、Ｃｇｒｐ−Ｃｒｅ感染後５〜７週の間に低用量マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）画像化を用いて画像化した。肺の遠位及び末梢部に発生する腺癌（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｏｌｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）とは対照的に、ＲＰＭの腫瘍は中央に位置し、主気管支及び大細気管支でドーナツ型の密度パターンを示した（図１Ｄ及び１Ｅ）。発生の初期段階で腫瘍を可視化するため、あるコホートのマウスを感染の１〜４週後にサクリファイスした（図１Ｆ及び８Ｃ〜Ｆ）。小さい増殖型（Ｋｉ６７＋）の病変が、２〜３週の早さで気道内または気道周囲において明らかであった（図８Ｆ）。感染の５〜６週後までに、肺腫瘍は大量のリンパ浸潤ならびに血管周囲及び気管支周囲の広がりを示した（図１Ｇ）。３人の正式な病理学者（ＡＦＧ、ＢＬＷ、ＭＥＳ）によってすべての腫瘍がＳＣＬＣに分類された。全体的な外観はヒトＳＣＬＣと一致していたが、腫瘍は、異なる形態を有する２つの細胞集団を含むように見えた。１つの集団は、小細胞、わずかな不明瞭な細胞質、細かい粒状の核クロマチン、及び目立たない核小体を備えた典型的な「クラシック」ＳＣＬＣの特徴（Ｔｒａｖｉｓ，２０１２）を有していた（図１Ｈ）。他方の集団は、ＳＣＬＣのバリアント形態として説明したものと同様、単一の中央に位置した突出した核小体及びはっきりと分かれている好酸性細胞質を伴うわずかに大きい細胞（Ｇａｚｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）からなっていた（図１Ｉ）。個々の腫瘍は、これらの形態のうちの一方または両方の混合物からなっていた。マウスの神経内分泌肺癌の病理における最近の再調査では、これらモデルにおけるバリアント形態を特定することができなかった（Ｇａｚｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。興味深いことに、ＬＣＮＥＣまたはＮＳＣＬＣ腫瘍成分は、ＲＰＭ動物において留意されなかったが、他のＧＥＭＭではそれらが記載されている（Ｇａｚｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【０１３０】
ヒトＳＣＬＣは、高増殖性かつアポトーシス性であり得るため（Ｔｒａｖｉｓ，２０１２）、ＲＰＭの腫瘍における細胞増殖及びアポトーシスを感染の６〜８週後に調べた。それらの急速な発達と一致して、ＲＰＭの腫瘍は、ＲＰ、Ｒｂ１fl/flＴｒｐ５３fl/flＲｂｌ２fl/fl（ＲＰＲ２）、及びＲＰＰの腫瘍と比較して、リン酸化ヒストンＨ３（ｐＨＨ３）レベルによって測定される増殖のレベルが著しく高かった（図１Ｊ及び１Ｋ）。治療をしない場合には、ＲＰＭの腫瘍は壊死の領域を示し、他のＧＥＭＭにおいて述べられているようにＡｚｚｏｐａｒｄｉ現象は認められなかった（Ｇａｚｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＲＰＭ腫瘍は、切断カスパーゼ−３（ＣＣ３）の免疫組織化学（ＩＨＣ）によって測定したところ、他のＳＣＬＣモデルより有意に多いアポトーシス細胞を示した（図１Ｌ及び１Ｍ）。ホモ接合型ＲＰＭの腫瘍と比較して、ＲＰＭLSL/+の腫瘍は、わずかに低下したレベルのＭＹＣを示した（図８Ｇ及び図８Ｈ）が、統計的に異なるレベルのｐＨＨ３またはＣＣ３は有さなかった（図８Ｉ及び図８Ｊ）。ＲＰＭの腫瘍は、肺胞（すなわち、ＳＦＴＰＣ／ＳＰＣ）及びクララ細胞（すなわち、ＳＣＧＢ１Ａ１／ＣＣＳＰ）マーカーに対して一様に陰性であった（図８Ｋ〜図８Ｍ）。ＴＴＦ１としても知られるＮＫＸ２−１は、大多数の腺癌及びＳＣＬＣで発現され、ＲＰＭ、ＲＰＰ、及びＬＳＬ−ＫｒａｓG12D/+；ｐ５３fl/fl（ＫＰ）の腫瘍は予想通り核ＮＫＸ２−１を発現した（図８Ｋ及び図８Ｎ）。これらのデータは、Ｍｙｃが、バリアント組織病理を主に示す腫瘍形成を促進することを示している。
【０１３１】
マウス。マウスは、環境を管理した部屋で飼育した。ｐ５３fl/flマウスは、Ａ．Ｂｅｒｎｓ（Ｍｅｕｗｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）により作製し、ｐ５３fl/flＲｂ１fl/flマウスは、Ｔ．Ｊａｃｋｓ（Ｓａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）により提供された。Ｒｂ１fl/flＴｒｐ５３fl/flＰｔｅｎfl/flマウスは、Ｄ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ（Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）により提供された。６〜８週齢で、麻酔下のマウスに１０7または１０8プラーク形成単位のＡｄ５−Ｃｇｒｐ−Ｃｒｅウイルス（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ）を、他に記載の通りに気管内注入により感染させた（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ウイルスは、施設内バイオセーフティー委員会のガイドラインに従い、バイオセーフティーレベル２＋の部屋にて投与した。すべての実験について、雌雄両方のマウスを処理群間で等しく分けた。
【０１３２】
該Ｍｙｃトランスジェニックマウスは、ａｔｔＢ−ＣＡＧ−ｌｏｘＰ−Ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ−ＭｙｃＴ５８Ａ−ＩＲＥＳ−ルシフェラーゼ−ＷＰＲＥ−ｐＡカセット（導入遺伝子のカセット）を第１１染色体のＨ１１遺伝子座にＡｐｐｌｉｅｄ  Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｉｎｃ．によるインテグラーゼ媒介ＴＡＲＧＡＴＴ技術を用いて挿入することによって作製した。該導入遺伝子のカセットはφＣ３１インテグラーゼにより媒介されるＨ１１遺伝子で部位特異的に挿入した。ＬＳＬ−ＭｙｃＴ５８Ａマウスの作製のため、ホモ接合型Ｈ１１Ｐ３マウス（ＦＶＢ系統）を胚ドナーとして使用した。導入遺伝子のプラスミドＤＮＡおよびφＣ３１のｍＲＮＡの混合物を１０７個のＨ１１Ｐ３接合体に顕微注入し、４匹のＣＤ１レシピエント母体に移植した。１匹の陽性初代が特定され、これをすべてのその後の実験に使用した。交雑ＲＰＭマウスを、１２９／Ｏｌａ、１２９／Ｓｖ、及びＣ５７Ｂ６／ＦＶＢからなる混合バックグランド系統で維持した。ＬＳＬ−ＭｙｃＴ５８Ａマウスの遺伝子型決定は、以下のプライマー配列を用いて行った。すなわち、Ｍｙｃ−Ｆ  ５’−ＡＡＣＴＴＣＣＣＧＣＣＧＣＣＧＴＴＧＴＴ−３’（配列番号１）、Ｍｙｃ−Ｒ  ５’−ＣＡＡＣＧＧＧＣＣＡＣＡＡＣＴＣＣＴＣＡ−３’（配列番号２）、Ｈ１１−ＷＴ−Ｆ  ５’−ＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＡＣＴＧＧＴＣＡＣ−３’（配列番号３）、及びＨ１１−ＷＴ−Ｒ  ５’−ＴＴＣＣＣＴＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＴＣＴＴＧＣ−３’（配列番号４）。Ｍｙｃ導入遺伝子産物は約４２０ｂｐであり、Ｈ１１野生型産物は約３２１ｂｐである。
【０１３３】
マウスに、新たに調製したシスプラチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）のＰＢＳ溶液を１日目に、エトポシド（７０％ＰＥＧ水溶液中、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を２日目に、またはＰＢＳを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって与えた。アリセルチブ（ＭＬＮ８２３７，ＡｐｅｘＢｉｏ、１０％２−ヒドロキシ−ベータ−シクロデキストリン及び１％重炭酸ナトリウムに溶解）を１日２回、２０ｍｇ／ｋｇを、経口強制飼養により、５日間オン、２日間オフのスケジュールで与えた。ＢｒｄＵ標識実験のため、サクリファイスの２４時間前に、ＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ）をｉ．ｐ．で注射した（３０ｍｇ／ｋｇのＰＢＳ溶液）。生存試験に関して、評価項目としては、呼吸困難、摂食もしくは移動、明らかな痛みの徴候、または最初の体重の２０％を超える体重減少が挙げられるがこれらに限定されない。該生存試験におけるマウスは、原発性肺腫瘍量または毒性を受けてサクリファイスされたが、遠隔転移を認める疾患によってサクリファイスされた動物はなかった。
【０１３４】
マイクロＣＴ及び生物発光画像化。マウスをイソフルラン麻酔下で、小動物用マイクロＣＴ  Ｑｕａｎｔｕｍ  ＦＸ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて分解能４５μｍ、９０ｋＶ、電流１６０μＡで３４秒間スキャンした。画像をＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｑｕａｎｔｕｍ  ＦＸソフトウェアを用いて取得し、Ａｎａｌｙｚｅ  １１．０（ＡｎａｌｙｚｅＤｉｒｅｃｔ）で処理した。生物発光画像化のため、マウスを剃毛し、これらに１５０ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリンカリウム塩（Ｒｅｇｉｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をｉ．ｐ．で投与し、これらをＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ機器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で画像化した。
【０１３５】
スキャンを、ハウンスフィールド単位（ＨＵ）に対して、関心領域（ＲＯＩ）ツールを通した代表的なスキャンについて、「ベッド」及び「空気」の平均値を測定し、「Ｉｍａｇｅ  Ａｌｇｅｂｒａ」ツールを用いてそれらの値を既知のＨＵ（それぞれ、４０ＨＵ及び−１０００ＨＵ）に一致させることによって較正した。すべての画像にその後「Ｓｐａｔｉａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ」ウインドウから３ｘ３ｘ３のメディアンフィルタを適用した。「空気」対「密な組織」のしきい値をＲＯＩ及びヒストグラムツールを用いて設定した。すべての画像を処理し「Ｉｍａｇｅ  Ａｌｇｅｂｒａ」ツールを用いて正規化し、その後「Ｓｐａｔｉａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ」ウインドウから３ｘ３ｘ３のメディアンフィルタを続けた。総腫瘍量分析に関しては、先に設定したしきい値を用いてオブジェクトマップを作成し、調整は、「Ｓｐｌｉｎｅ  Ｅｄｉｔ」、「Ｄｒａｗ」、及び「Ｎｕｄｇｅ  Ｅｄｉｔ」ツールを用いて手動で行った。このオブジェクトマップをその後、「Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ」ツールを用いてモーフィングした。このオブジェクトマップは、しきい値モーフィングツールを用いてバイナリにした。その後、このマップを５ｘ５ｘ５のジャック型構造化要素を用いて３倍に拡大した。それらの穴を次にすべての２Ｄ方向に埋めた。このマップを最後に、「Ｅｒｏｄｅ」ツールを３回使用し、５ｘ５ｘ５のジャック型構造化要素を用いて元のサイズに戻した。この容量分析をその後、予め設定したしきい値を用いてＲＯＩウインドウで行い、以下の式を用いて非気腔を計算した。すなわち、非気腔＝１−（ＶｏｌＡｉｒ／ＲＯＩＶｏｌ）。個々の腫瘍に関しては、Ａｎａｌｙｚｅ  １１．０「オブジェクト抽出ツール」を用いて半自動的に３Ｄ分割を行った。調整は、「Ｓｐｌｉｎｅ  Ｅｄｉｔ」、「Ｄｒａｗ」、及び「Ｎｕｄｇｅ  Ｅｄｉｔ」ツールを用いて手動で行った。腫瘍分割をその後「穴を埋める」半自動ツールを用いて処理し、このオブジェクトを、軸平面、横平面、及び冠状面に広げ、平滑化した。総腫瘍量分析と同様、ＲＯＩツールを用いて体積の定量化を得た。
【０１３６】
免疫組織化学。肺を、ＰＢＳまたはホルマリンで膨張させ、中性緩衝ホルマリン中で一夜固定し、７０％エタノールに移した。パラフィン包埋肺葉を４μｍで切断し、腫瘍病理学用にはＨ＆Ｅで、または先に記載の通り（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）抗体で染色した。
【０１３７】
切片を脱ロウし、再水和し、高温抗原回復、すなわち、ｐＨ６．０の０．０１Ｍクエン酸緩衝液中、２０分間プレッシャークッカーでの煮沸に供した。スライドを３％のＨ２Ｏ２にて１５分間ブロックし、５％ヤギ血清のＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）溶液にて１時間ブロックし、ブロッキング緩衝液中、一次抗体で一夜染色した。ＨＲＰ結合二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をＰＢＳ−Ｔで１：２００希釈して用い、室温で４５分間インキュベートし、その後ＤＡＢ染色（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を続けた。すべての染色はＳｅｑｕｅｎｚａカバープレート技術で行った。マウスオンマウス（Ｍ．Ｏ．Ｍ．）基本キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、ＢｒｄＵ及びＫｉ６７マウス一次抗体での染色に用いた。リンタンパク質抗体用には、ＰＢＳ−Ｔの代わりにＴｗｅｅｎ−２０を含むトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）を用いた。この一次抗体は、以下を含む。すなわち、Ｍｙｃ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−７６４）１：１５０、ＳＰＣ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡＢ３７８６）１：２０００、ＣＣＳＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ０７−６２３）１：２０００、ＮＫＸ２−１（Ａｂｃａｍ  ａｂ７６０１３）１：２５０、ＵＣＨＬ１（Ｓｉｇｍａ  ＨＰＡ００５９９３）１：２５０、ＢｒｄＵ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３４７５８０）１：２００、Ｋｉ−６７（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＃５５６００３）１：３００、リン酸化ヒストンＨ３（Ｓｅｒ１０）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＃９７０１）１：１００、切断カスパーゼ３（Ａｓｐ１７５）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＃９６６１）１：３００、リン酸化Ｈ２ＡＸ（Ｓｅｒ１３９）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＃９７１８）１：１２０、ＣＧＲＰ（Ｓｉｇｍａ  Ｃ８１９８）１：２５０、ＡＳＣＬ１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ５５６６０４）１：１００、ＮＥＵＲＯＤ１（Ａｂｃａｍ  ａｂ１０９２２４）１：１５０、ＮＣＡＭ１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ５０３２）１：２００、ＮＦＩＢ（Ｓｉｇｍａ  ＨＰＡ００３９５６）１：２５０。
【０１３８】
免疫細胞化学（ＩＨＣ）分析は、手動で、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｓｃｏｐｅ．Ａ１顕微鏡により捉えた染色組織のデジタル画像を用いて行い、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  ＳＥ６４ソフトウェアを用いて分析したか、または、Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｓｃａｎｓｃｏｐｅソフトウェアを用いた自動化された方法で行った。どちらの場合も、動物当たり３〜５個の肺葉を含むスライド全体を分析した。手動の定量化に関しては、ＩＨＣスコア（Ｓ）は、陽性細胞のパーセンテージ（Ｐ、０〜１００％）に強度（Ｉ、０〜３）をかけて計算した。式：Ｓ＝Ｐ×Ｉ、範囲＝０〜３００。
【０１３９】
自動化された画像分析に関しては、ＩＨＣ染色スライドをＡｐｅｒｉｏ  ＡＴ２  Ｓｃａｎｓｃｏｐｅにてデジタルスキャンし、全スライド画像をＨａｌｏデジタル画像解析ソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ  Ｌａｂｓ，ＮＭ，ＵＳＡ）を用いて、画像解析核アルゴリズムにて定量的に解析した。腫瘍領域に手動でアノテートし、画像解析アルゴリズムは、腫瘍領域にのみ適用した。適用した核アルゴリズムは、発現プロファイルに基づいて細胞を陽性及び陰性としてだけでなく、強度にも基づいて識別する。結果は腫瘍面積当たりの陽性細胞のパーセントとして表す。腫瘍量は、すべての肺切片由来の全腫瘍面積を全肺面積で除し、その結果をパーセンテージの値に変換することによって算出した（「腫瘍量」）。
【０１４０】
肝臓及びリンパ節転移の定量化に関しては、我々は、Ｈ＆Ｅ染色組織から４段の切片（１００ミクロン間隔）を取り、明らかな転移のある動物の数を定量化した。
【０１４１】
統計分析。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて統計分析を行った。生存分析は、ログ・ランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を用いて分析した。エラーバーは、他に示さない限り、平均＋／−ＳＥＭを表す。ＩＨＣ染色または腫瘍量の統計分析に関しては、カラム分析を、ｐ値＜０．０５が統計的に有意であると見なす対応のないスチューデントｔ検定により行った。箱ひげ図に関しては、箱は２５分位、中央値、７５分位数を示し、ひげは、最も高い／最も低い分位数の上／下の１．５×四分位範囲に延びる。
【０１４２】
実施例２：ＭｙｃはＮＥＵＲＯＤ１発現を伴う神経内分泌低ＳＣＬＣを促進する。
神経内分泌分化は、クラシックＳＣＬＣの特徴であると考えられる。先のマウスモデルは、クラシック表現型を再現し、多くの場合、Ｍｙｃｌ増幅と関連している（Ｃａｌｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。対照的に、バリアントＳＣＬＣは、神経内分泌マーカーのレベルの低下を示すことが以前に報告された（Ｃａｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）。興味深いことに、ＲＰＭ腫瘍は、バリアントＳＣＬＣ形態を再現し、Ｍｙｃｌ増幅を欠いている（図９Ａ）。ＲＰＭ腫瘍は、ＲＰＰ及びＲＰＲ２モデル由来の腫瘍より有意に多くのＭｙｃならびに少ないＭｙｃｌを発現した（図９Ｂ）。
【０１４３】
ＭＹＣがインビボにおいて神経内分泌分化の減弱と関連しているかどうかを判断するため、階層的クラスタリング解析を、ＲＰ（ｎ＝１０）及びＲＰＲ２の腫瘍（ｎ＝３）由来の公開されたマイクロアレイデータ間で重複した神経内分泌マーカーについて（Ｓｃｈａｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、ならびにさらなるＲＰＲ２の腫瘍（ｎ＝４）及びＲＰＭの腫瘍（ｎ＝１１）について作製したＲＮＡ−ｓｅｑデータについても行った（図２Ａ）。ＲＰＭの腫瘍は、ＲＰ及びＲＰＲ２の腫瘍から独立してクラスター化したところ、神経内分泌遺伝子の大部分の発現の低下を示した。興味深いことに、ＲＰＭの腫瘍は、有意に減少した神経原性転写因子Ａｓｃｌ１の発現を有したが、ＮｅｕｒｏＤ１の高発現を有した（図２Ｂ）。先の研究では、ＳＣＬＣにおいてＡＳＣＬ１及びＮＥＵＲＯＤ１の明らかな腫瘍形成機能が示され（Ｂｏｒｒｏｍｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｐｏｉｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｐｏｉｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、本明細書に記載のＳＣＬＣモデルにおいて高ＭＹＣ発現と神経内分泌分化の関連性が検討された。第一に、マウス腫瘍のＲＮＡ−ｓｅｑデータを、遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）を用いて分析した。ＲＰＲ２の腫瘍と比較して、ＲＰＭの腫瘍では、ＮＥＵＲＯＤ１高指標は有意に濃縮されていることが分かり、ＡＳＣＬ１高指標は有意に枯渇していた（図２Ｃ）。
【０１４４】
次に、複数のＧＥＭＭにおけるＡＳＣＬ１及びＮＥＵＲＯＤ１のタンパク質発現をＩＨＣによって調べた。すべてのＳＣＬＣモデルがＡＳＣＬ１＋肺腫瘍を有したが、ＲＰ、ＲＰＲ２、及びＲＰＰモデルと比較して、ＲＰＭの腫瘍においてＡＳＣＬ１のレベルは有意に低かった（図２Ｄ）。対照的に、ＲＰＰの腫瘍ではまれにしか検出されないクラシックＧＥＭＭと比較して、ＲＰＭの腫瘍はＮＥＵＲＯＤ１の高く不均一な発現を示した（図２Ｄ）。ホモ接合型ＲＰＭの腫瘍と比較して、ＲＰＭLSL/+の腫瘍は、ＡＳＣＬ１発現が増加し、ＮＥＵＲＯＤ１発現が低下する傾向があった（図９Ｃ）。ＲＰＭの腫瘍は、ＩＨＣに用いられるものを含めて２つの独立した抗体を用いてＮＥＵＲＯＤ１を発現することが確認された（図２Ｅ）。総合して、これらのデータは、ＭＹＣが、ＳＣＬＣのバリアント、神経内分泌低ＮＥＵＲＯＤ１＋サブセットを促進することを示唆する。
【０１４５】
３０年以上前、バリアント形態を有するヒトＳＣＬＣ細胞株は、頻繁なＭＹＣ増幅を示すことが分かった（Ｃａｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５、Ｇａｚｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）。本明細書に記載のデータは、ＭＹＣが、マウスモデルでは以前に観察されていない腫瘍のサブセットであるバリアント組織病理をインビボで促進し（Ｇａｚｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、これは、Ｍｙｃｌが他のＧＥＭＭでは腫瘍形成のドライバーであるためである可能性がある（Ｃａｌｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｄｏｏｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）一方、本明細書に記載のモデルでは、Ｍｙｃがこの機能を果たすことを示唆している。重要なことには、本明細書に開示するデータは、ＭＹＣがＮＥＵＲＯＤ１の高発現と関連する神経内分泌低表現型を促進することを示している。ＮＥＵＲＯＤ１の発現は、最初、細胞株のバリアントサブタイプと相関することが分かり（Ｐｏｉｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、その後、複数の研究で、ＡＳＣＬ１低初代ヒトＳＣＬＣのサブセットを層別化することが分かった（Ｂｏｒｒｏｍｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｐｏｉｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。さらに、ＮＥＵＲＯＤ１は、ＭＹＣ−高細胞株におけるスーパーエンハンサーにおいて、ＭＹＣとともに存在する（Ｂｏｒｒｏｍｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。これまでのところ、正常なマウスの神経内分泌細胞はＮｅｕｒｏＤ１を発現しないと思われるため、ＮＥＵＲＯＤ１を発現するヒト腫瘍は、肺内で実際に発生するのか、体内の他の場所から転移するのかが疑問視されている（Ｂｏｒｒｏｍｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｂｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。本明細書に記載のデータは、マウスのＭｙｃ促進型ＳＣＬＣが実際にＮＥＵＲＯＤ１を発現し、かつ他のＧＥＭＭより有意に高いＮｅｕｒｏＤ１指標を有することを示しており、それらのヒト対応物が肺で生じることを示唆している。ＡＳＣＬ１及びＮＥＵＲＯＤ１のインサイチュ免疫染色パターンに基づいて、ＭＹＣ促進型の腫瘍細胞は、ＡＳＣＬ１＋前駆体にて生じること、及びこれら早期の腫瘍細胞は、最初はクラシック形態を示すことが仮定された。時間とともに、腫瘍は、バリアント形態及び低神経内分泌表現型の出現と一致して、ＡＳＣＬ１低／ＮＥＵＲＯＤ１高状態に切り替わると思われる。ＮＥＵＲＯＤ１の過剰発現は、転移及び侵襲性の強いＳＣＬＣの発症と関連している（Ｏｓｂｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）ため、本明細書に示すデータは、ＭＹＣの活性化が、ＮＥＵＲＯＤ１のシグナル伝達を介してこの表現型を促進し得ることを示唆する。さらに、本明細書に記載のデータは、ＭＹＣ＋である上皮内病変におけるＮＥＵＲＯＤ１の発現の欠如を考えると、ＮＥＵＲＯＤ１の調節におけるＭＹＣの役割が間接的であり得ることを示唆する。これらのデータは、ＤＬＬ３−抗体薬物コンジュゲート等の神経内分泌遺伝子標的治療の最近の発達を考えると、重要な臨床的意味を有する（Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。本明細書に開示する結果は、神経内分泌遺伝子発現が低いＭＹＣ促進型ＳＣＬＣが、一部の神経内分泌標的治療に対して比較的反応性が低���可能性があることを予測する。
【０１４６】
免疫ブロット。原発性肺腫瘍溶解物に関しては、マウス肺腫瘍を無菌条件下で顕微解剖し、急速冷凍し、−８０℃で使用まで保存した。およそ２０〜４０ｍｇの腫瘍片を、使い捨ての乳棒及びコードレスモーター（ＶＷＲ）を用いて、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｉｎｉ）及びオルトバナジン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を添加した２００μｌのＲＩＰＡ緩衝液中で均質になるまで破砕し溶解させた。溶解物を１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を新たなチューブに移す。細胞株の溶解物に関しては、全タンパク質溶解物を前述の通りに調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に転写する（Ｏｌｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。膜は、５％ミルクまたは５％ＢＳＡ中で１時間ブロックし、続いて一次抗体とともに４℃で一夜インキュベートした。膜を６×５分間、室温にてＴＢＳ−Ｔ中で洗浄した。マウス及びウサギＨＲＰ結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，１：１０，０００）を室温にて１時間インキュベートし、続いて６×５分間、室温にてＴＢＳ−Ｔ中で洗浄した。検出のため、膜をＷｅｓｔｅｒｎＢｒｉｇｈｔ  ＨＲＰ  Ｑｕａｎｔｕｍ基質（Ａｄｖａｎｓｔａ）に曝露し、Ｈｙｂｌｏｔ  ＣＬフィルム（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ）で検出した。一次抗体は、ｃ−Ｍｙｃ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃１３９８７、１：１０００）、リン酸化Ａｕｒｏｒａキナーゼ汎（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃２９１４、１：１０００）、ＡｕｒｏｒａキナーゼＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＃４５−８９００、１：５００）、ＡｕｒｏｒａキナーゼＢ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃３０９４、１：１０００）、リン酸化ヒストンＨ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃９７０１、１：１０００）、切断カスパーゼ−３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃９６６１、１：１０００）、シナプトフィジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＃ＲＢ−１４６１−Ｐ１，１：２００）、Ｒｂ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃９３１３、１：１０００）、ｐ５３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＃ｓｃ−６２４３、１：１０００）、アクチン（Ｓｉｇｍａ  ＃Ａ２０６６、１：１００００）、Ｈｓｐ９０（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃４８７７、１：１０００）、ＮＥＵＲＯＤ１（Ａｂｃａｍ  ａｂ１０９２２４、１：１０００）、ＮＥＵＲＯＤ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃４３７３、１：１０００）を含む。
【０１４７】
別の方法として、細胞溶解物をプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｉｎｉ）及びベンゾナーゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を添加したＲＩＰＡ緩衝液を用いて調製し、４〜２０％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて分離し、ＰＶＤＦ−ＦＬ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。膜をＬｉ−Ｃｏｒブロッキング用緩衝液（１：１０のＴＢＳ溶液）を用いてブロックし、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むブロッキング溶液中、一次抗体とともに４℃で一夜インキュベートした。近赤外線撮像システム（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ）での検出に先立って、膜をＴＢＳ−Ｔ中で洗浄し、二次抗体とともにインキュベートし、ＴＢＳ−Ｔ中で洗浄した。図６Ｈの全Ａｕｒｏｒａ  Ａに関しては、化学発光シグナル（ＥＣＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）は、ＣＣＤカメラ（ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｌｄｏｃ  ＸＲ＋）で捉えた。一次抗体：ｃ−Ｍｙｃ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃９４０２、１：１０００）、リン酸化Ａｕｒｏｒａキナーゼ汎（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃２９１４，１：５００）、ＡｕｒｏｒａキナーゼＡ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃３０９２、１：１０００）、ＡｕｒｏｒａキナーゼＡ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−１４３１８、１：１０００）、ＡｕｒｏｒａキナーゼＢ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６１１０８２、１：１０００）、Ｈｓｐ９０（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ  ＳＰＡ−８３５、１：５０００）、リン酸化ヒストンＨ３（Ｓ１０、Ｐ．Ｅｙｅｒｓ，Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄから寄贈、ウサギポリクローナル、１：５０００）、シナプトフィジン（Ｔｈｅｒｍｏ  ＲＭ９１１１−Ｓ、１：１０００）。二次抗体：ヤギ抗ウサギ８００ＣＷ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｃａｔ．９２６−３２２１１、１：１００００）、ヤギ抗マウス８００ＣＷ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｃａｔ．９２６−３２２０、１：１００００）、抗ラット６８０（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｃａｔ．９２５−６８０２９）、抗ヤギＨＲＰ結合抗体。
【０１４８】
マウスのコピー数の変動（ＣＮＶ）のゲノム解析。個々の原発性肺腫瘍を切除し、正常ＤＮＡ対照用の対応する尾とともに、無菌条件下で顕微解剖した。ＣＮＶ解析用のＤＮＡは、ＤＮｅａｓｙ  ＤＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｓ２  Ｆｏｃｕｓｅｄ−ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒを用いて切断し、約３５０ｂｐのＤＮＡ断片を生成した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  ＤＮＡ  ＰＣＲ−Ｆｒｅｅ試料調製キット（カタログ番号ＦＣ−１２１−３００１及びＦＣ−１２１−３００２）を用いて配列ライブラリを作成した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｃＢｏｔを、化学変性したライブラリ（２５ｐＭ）をＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ｖ４  ペアエンドフローセルに適用するために使用した。ハイブリダイズした分子のクローン増幅は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ＰＥクラスターキットｖ４−ｃＢｏｔ（ＰＥ−４０１−４００１）を用いて行った。１２５サイクルのペアエンドシーケンスランを、ＨｉＳｅｑ  ＳＢＳキットｖ４  シーケンシング試薬（ＦＣ−４０１−４００３）を用いてＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００機器（ＨＣＳ  ｖ２．２．３８及びＲＴＡ  ｖ１．１８．６１）にて行った。リードは、ｂｗａ  ｍｅｍ（ｖ０．７．１０）を用いてｍｍ１０に合わせた。重複したリードをｓａｍｂｌａｓｔｅｒ（ｖ０．１．２２）で識別し、除去した。ＣＮＶは、ＣＮＶＫｉｔ（ｖ０．７．１１）のバッチコマンドを用い、全ゲノムシーケンシング設定を使用してｃｈｒ４でコールした（Ｔａｌｅｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。ＣＮＶヒートマップを、ＣＮＶＫｉｔのヒートマップコマンドを用いて、予測されたコピー数領域で生成した。
【０１４９】
マウス腫瘍のＲＮＡ−Ｓｅｑ。原発腫瘍及び健康な肺由来のＲＮＡの単離をＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、標準的なプロトコルで行った。ＲＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ鎖ｍＲＮＡ試料調製キット（カタログ番号ＲＳ−１２２−２１０１、ＲＳ−１２２−２１０２）を用い、製造業者のプロトコルに従ってライブラリ構築に供した。化学変性したシーケンシングライブラリ（２５ｐＭ）をＩｌｌｕｍｉｎａ  ｃＢｏｔを用いてＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ｖ４シングルリードフローセルに適用した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ＳＲクラスターキットｖ４−ｃＢｏｔ（ＧＤ−４０１−４００１）の試薬を用い、ハイブリダイズした分子をクローン増幅させシーケンシングプライマーにアニールした。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２５００機器（ＨＣＳｖ２．２．３８及びＲＴＡ  ｖ１．１８．６１）にフローセルを移した後、５０サイクルのシングルリードシーケンスランをＨｉＳｅｑ  ＳＢＳキットｖ４シーケンシング試薬（ＦＣ−４０１−４００２）を用いて行った。マウスｍｍ１０アノテーション（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｂｕｉｌｄ  ８２）をＲＳＥＭ（ｖ１．２．１２）ユーティリティのｒｓｅｍ−ｐｒｅｐａｒｅ−ｒｅｆｅｒｅｎｃｅで用い、ｂｏｗｔｉｅ（ｖ１．０．１）インデックスを作成した。遺伝子発現は、ＲＳＥＭユーティリティのｒｓｅｍ−ｃａｌｃｕｌａｔｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎを用い、順方向鎖確率をゼロに設定して測定した。差次的発現は、ＥＢＳｅｑ（ｖ１．４．０）を用い、「ＭｅｄｉａｎＮｏｒｍ」機能を使用してサイズ因子を計算し、「ｍａｘｒｏｕｎｄ」を１０に設定して測定した。転写長を調整するため、１００万リード当たりのキロベース当たり断片（ＦＰＫＭ）をすべての遺伝子について計算し、小さい定数（０．０１）を足した後、ｌｏｇ２変換した。マウスＳＣＬＣ腫瘍に関する遺伝子セット濃縮解析（ＧＥＳＡ）を、ＡＳＣＬ１／ＮＥＵＲＯＤ１高／低遺伝子セットでのＲＮＡ−ｓｅｑ遺伝子発現で行った（Ｂｏｒｒｏｍｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。他のマウスＳＣＬＣモデルに対してＲＰＭの腫瘍（ｎ＝１１）におけるＮＥマーカーの発現を比較するため、（Ｓｃｈａｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）に記載の通り、マウスのＲｂ１／Ｔｒｐ５３（ＲＰ，ｎ＝１０）、Ｒｂ１／Ｔｒｐ５３／Ｒｂｌ２（ＲＰＲ２，ｎ＝３）原発腫瘍の発現アレイデータを含むＧＥＯ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）からＧＳＥ１８５３４のデータセットをダウンロードした。ｌｏｇ２変換正規化強度値を得、プローブ間で平均し、遺伝子発現レベルを得た。発現方法による系統的バイアスを避けるため、上記の通り、ＳｃｈａｆｆｅｒらのマウスＲＰＲ２腫瘍モデルの４つの試料に対してもＲＮＡ−Ｓｅｑを行った。複合解析のため、ｌｏｇ２変換ＦＰＫＭ及び強度値を試料内のｚスコアに変換し、試料間のｑｕａｎｔｉｌｅ正規化により、分散を遺伝子ごとに調整した。その後、ユークリッド距離及びワードクラスタリングメトリックを用い、神経内分泌（ＮＥ）マーカーに対してクラスタリングを行った。結果は、参照遺伝子としてベータアクチン（ＡＣＴＢ）発現とともにアノテートした。
【０１５０】
ヒトゲノミクス。ヒト患者試料及び細胞株のＲＮＡ−ｓｅｑデータは既刊文献（Ｇｅｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｐｅｉｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｒｕｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）から得、遺伝子発現による新たに作成されたデータセットは、１００万リード当たりのキロベース当たりの断片（ＦＰＫＭ）として定量化し、分析はｌｏｇ２（ＦＰＫＭ＋１）に対して行った。
【０１５１】
ヒト原発性ＳＣＬＣ腫瘍試料（ｎ＝８１）及びヒトＳＣＬＣ細胞株（ｎ＝３４）のトランスクリプトームシーケンシングデータを調査した。ヒト原発腫瘍に対するＲＮＡ−ｓｅｑデータは、以前の研究（Ｇｅｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｐｅｉｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）から得、ヒト細胞株に関する研究は、以前に発表された症例（ｎ＝１９、（Ｒｕｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）及びｎ＝１、（Ｐｅｉｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２））を含み、我々はさらに１４のＳＣＬＣ細胞株に対してＲＮＡ−ｓｅｑを行った。簡潔には、ＳＣＬＣ細胞株をサブコンフルエンシーで採取し、ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、製造業者の指示に従ってＲＮＡを抽出した。ポリ（Ａ）選択ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを調製した後、ｍＲＮＡ用のＩｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑプロトコルを用いてシーケンシングライブラリを作成した。シーケンシングは、２ｘ１００ｂｐのペアエンドプロトコルを用い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）で行った。ＲＮＡ−ｓｅｑデータは、先に記載の通りに分析した（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃｕｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｇｅｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。生のペアエンドシーケンシングリードを、ＧＳＮＡＰ（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｎａｃｕ，２０１０）を用いてＮＣＢＩ３７／ｈｇ１９ヒト参照ゲノムにそろえ、発現をＣｕｆｆｌｉｎｋｓ（Ｔｒａｐｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）を用いてＦＰＫＭ（マップされた１００万断片当たりのエクソンのキロベース当たりの断片）として定量化した。遺伝子発現は、患者の遺伝子当たり最も豊富な転写産物から推測した。ＦＰＫＭ値は、対数正規分布に大体従うため、さらなる処理のため、それらをｌｏｇ２（ＦＰＫＭ＋１）に変換した。
【０１５２】
ＳＣＬＣ患者試料でのゲノムＭＹＣ増幅の保有率は比較的低い（Ｇｅｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）にもかかわらず、相当数の患者がＭＹＣのＦＰＫＭ値が高いため、ＭＹＣ発現は、混合ガウスモデルを二峰性分布のＭＹＣ発現レベルに当てはめることによって患者の層別化に使用した（Ｂｅｎａｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。患者をＭＹＣ−高またはＭＹＣ−低に分類するためのｌｏｇ２−ＦＰＫＭカットオフは、いずれかの分布から引き出されるＦＰＫＭ値の確率が同程度であったしきい値で重なる正規分布に基づいて選択した。一貫性を保証するため、同じカットオフ値を用いて、コピー数の状態と独立して細胞株をＭＹＣ−高またはＭＹＣ−低に分類した。ＧＳＥＡ遺伝子に関しては、ＭＹＣ−高／ＭＹＣ−低患者の平均に基づいて、比率の差によってランク付けした。教師なし階層的クラスタリングは、ユークリッド距離及びワードクラスタリングメトリック（Ｗａｒｄ，１９６３）を用いて行った。解析は、Ｒ統計環境で行った（Ｔｅａｍ，２０１４）。
【０１５３】
検証のため、さらに、ｈｔｔｐ：／／ｓｃｌｃｃｅｌｌｌｉｎｅｓ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖから、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘエクソンマイクロアレイで最近生成された６５のヒトＳＣＬＣ細胞株のデータ（Ｐｏｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）を得た（２０１６−０８−１３にアクセス）。２５の細胞株をＣｏｌｏｇｎｅ／Ｒｕｄｉｎら及びＰｏｌｌｅｙの細胞株パネル間で共有した。Ｐｏｌｌｅｙのパネルにおける細胞株のＭＹＣ−高またはＭＹＣ−低としての分類は、「Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｄｒｕｇ  ｓｃｒｅｅｎ」に記載の通りに行った。クラスタリング解析に先立って、遺伝子発現をｚスコアに変換した。非ＳＣＬＣ細胞株及びＮＣＩ−Ｈ６９（ＮＣＩ−Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ１０、及びＮＣＩ−Ｈ６９ＶＣＲ／Ｒ）由来の細胞株は、この分析には含めなかった。
【０１５４】
細胞の計数。ウェル当たりの細胞数は、Ｚ２  Ｃｏｕｌｔｅｒパーティクルカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて測定し、各細胞株及び実験的複製について対照（ｓｈＧＦＰまたは未処理）の平均細胞数に対して正規化した。別段の指示がない限り、グラフは平均相対細胞数と標準偏差を示す。図Ｓ６Ｄにおける併用治療に関しては、計数に先立って、細胞を１０ｎＭのアリセルチブ及び０．１μＭのシスプラチンもしくはエトポシドとともに、またはそれらなしで、９６時間処理した。
【０１５５】
マウス腫瘍の定量的ＲＴ−ＰＣＲ。ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、顕微解剖した腫瘍から単離した。合計１μｇのＲＮＡを、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてｃＤＮＡに変換した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、３連でＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ装置にて行った。発現値は、標準の１０倍連続希釈に基づき、アクチンのレベルに対して正規化した。Ｍｙｃｌ順方向プライマー：ＡＣＧＧＣＡＣＴＣＣＴＡＧＴＣＴＧＧＡＡ（配列番号２１）、Ｍｙｃｌ逆方向プライマーＣＣＡＣＧＴＣＡＡＴＣＴＣＴＴＣＡＣＣＴＴ（配列番号２２）、Ｍｙｃ順方向プライマー：ＣＣＴＡＧＴＧＣＴＧＣＡＴＧＡＧＧＡＧＡ（配列番号２３）、Ｍｙｃ逆方向プライマー：ＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧＣＴＣＴＴＣ（配列番号２４）、（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）から取得。アクチン順方向プライマー：ＧＧＣＡＴＡＧＡＧＧＴＣＴＴＴＡＣＧＧＡＴＧＴＣ（配列番号２５）、アクチン逆方向プライマー：ＴＡＴＴＧＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＧＴＴＣＣ（配列番号２６）。
【０１５６】
使用される方法及び材料は、本明細書及び上記に記載されている。
【０１５７】
実施例３：ＲＰＭ腫瘍はＭＹＣ−高ヒトＳＣＬＣの分子サブセットを再現する。
次に、ＭＹＣの発現と神経内分泌シグナル伝達の調節因子の関連性がヒトＳＣＬＣで再現され得ること（Ｂｏｒｒｏｍｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｐｏｉｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を調査した。この目的のため、公的に入手可能な８１のＳＣＬＣ標本（Ｇｅｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）及び２０のＳＣＬＣ細胞株（Ｐｅｉｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｒｕｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）のトランスクリプトームシーケンシングデータを採集し、１４のさらなるＳＣＬＣ細胞株に対してＲＮＡ−ｓｅｑ解析を行った。所定のセットの神経内分泌マーカー（ＡＳＣＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＳＹＰ、ＩＮＳＭ１、ＣＨＧＡ、ＳＣＧ２、ＧＲＰ、ＮＣＡＭ１、ＵＣＨＬ１（ＰＧＰ９．５）及び／またはＣＡＬＣＡ／Ｂ（ＣＧＲＰアルファ／ベータ））に基づく階層的クラスタリング解析で、ＭＹＣの低発現（Ａ群）または高発現（Ｂ及びＣ群）のいずれかを有する群に試料を着実に分離した（図３Ａ）。これら３群においてＮＥＵＲＯＤ１及びＡＳＣＬ１の明確な発現パターンが認められ、これらは細胞株及びＰＤＸモデルにおけるクラシック及びバリアントのＳＣＬＣの組織学を区別する（Ｐｏｉｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｐｏｉｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＭＹＣの発現が低いＲＰ及びＲＰＰの腫瘍（図２Ｂ）と同様、Ａ群でＡＳＣＬ１が高発現であるが、高ＭＹＣが濃縮されたＢ群及びＣ群でＡＳＣＬ１の低発現（図３Ｂ）が認められた。対照的に、高ＭＹＣ発現試料が濃縮されたＣ群において高ＮＥＵＲＯＤ１発現が存在し、大部分ＲＰＭ腫瘍の発現プロファイルと似ていた（図２Ｂ）。さらに、ＭＹＣ発現によって層別化されたヒト患者試料のＧＳＥＡは、ＭＹＣ−高試料におけるＮＥＵＲＯＤ１高指標の有意な濃縮及びＭＹＣ−低試料におけるＡＳＣＬ１高指標の濃縮を示した。（図３Ｃ）。高ＭＹＣ発現の試料の同様のクラスタリングパターンが、遺伝子発現アレイを用いて解析された最近公開された６５のＳＣＬＣ細胞株のコレクション（２５は本明細書で使用される細胞株と共有）で観察された（図１０Ａ及び１０Ｂ）（Ｐｏｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。従って、これらのデータは、ＲＰＭマウスの腫瘍では、ＭＹＣは、ＡＳＣＬ１及びＮＥＵＲＯＤ１の差次的発現と関連し得ること、ならびにこれらの発現プロファイルは、ヒトＳＣＬＣで保存されていることを示す。
【０１５８】
ＲＮＡ−ｓｅｑ解析によるマウス腫瘍と比較したヒトＳＣＬＣ腫瘍におけるＡＳＣＬ１及びＮＥＵＲＯＤ１発現の大きな変動性を考慮し、このＲＰＭマウスモデルを早期（上皮内）及び後期（浸潤性）の時点でのＡＳＣＬ１及びＮＥＵＲＯＤ１の発現について調べた。これらの結果は、感染の１〜４週間後のＲＰＭ動物由来の上皮内病変が、高ＡＳＣＬ１発現を伴う主にクラシック形態であったことを示す（図３Ｄ）。調べた２６の上皮内病変のうち、２３（８８％）が明らかにＡＳＣＬ＋であった一方、ＮＥＵＲＯＤ１＋はなかった（図３Ｅ）。対照的に、感染の６〜８週間後の大きな浸潤性病変の４４％（４１のうち１８）は、ＮＥＵＲＯＤ１発現を伴い、ＡＳＣＬ１発現がいくらかあるか、またはないバリアント形態を示した。さらに、腫瘍の１７％は、最も高いレベルのＭＹＣを伴うヒト腫瘍のサブセット（Ｂ群）と同様、ＡＳＣＬ１及びＮＥＵＲＯＤ１の両方が低いかまたは陰性であった（図３Ｄ及び図３Ｂ）。一部の浸潤性腫瘍は、ＡＳＣＬ１及びＮＥＵＲＯＤ１の両方の高レベルを示したが、細胞が混合されているのか、両タンパク質が共発現されているのかは、この方法では判断することはできない。ＲＰＭの腫瘍はまた、ＣＧＲＰ及び神経細胞接着分子１（ＮＣＡＭ１）を含めた他の神経内分泌マーカーも発現しており、これは、ＡＳＣＬ１発現と同様、クラシック病変で見られ、バリアント腫瘍の大部分で低下していた（図１０Ｃ）。注目すべきことに、ＲＰＭ腫瘍は、ＵＣＨＬ１（ＰＧＰ９．５とも呼ばれる）に関して強い染色を示した（図１０Ｄ）が、これは、ＭＹＣの状態に関係なく、マウス及びヒトＳＣＬＣ腫瘍ならびに細胞株にわたって一貫して発現された（図３Ａ及び図２Ａ）。ＲＰ細胞株におけるＭＹＣの過剰発現は、シナプトフィジン（ＳＹＰ）の抑制につながる（図１０Ｅ）一方、ＭＹＣ増幅ＳＣＬＣ細胞株におけるＭＹＣのノックダウンは、ＳＹＰのｍＲＮＡ及びタンパク質の増加につながり（図１０Ｆ及び図１０Ｇ）、ＭＹＣが実際に神経内分泌分化の調節に関与し得ることを示唆した。ＭＹＣはＮＥＵＲＯＤ１の標的遺伝子として記載されている（Ｂｏｒｒｏｍｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）が、ＮｅｕｒｏＤ１は、ＣｈＩＰ−ｓｅｑで分析されたＲＰＭ細胞株ではＭＹＣの標的遺伝子として特定されなかった（図１０Ｈ）。ＭＹＣが、ＮＥＵＲＯＤ１発現がない上皮内病変において発現されることを考えると、これは、ＮＥＵＲＯＤ１の調節におけるＭＹＣの役割が間接的な機序を介している可能性があることを示唆する。総合して、これは、腫瘍進行の過程での高ＭＹＣ発現が、ＳＣＬＣの神経内分泌表現型を調節し、不均一なパターンの神経内分泌分化を伴う進行病変につながり得ることを示している。
【０１５９】
上記のように、ヒト疾患の臨床面を再現するＳＣＬＣモデルが必要である。ＲＰＭマウスではＳＣＬＣ発生の潜伏期間が短いため、ＳＣＬＣの新規な治療方法を調べる前臨床試験が著しく容易になり得る。Ｍｙｃ促進型のＳＣＬＣはまた、ヒト疾患と同様の頻度で、かつＮＦＩＢの役割を含めた転移の機序の研究用に管理可能な時間枠で、リンパ節及び肝臓への転移を起こす。ＲＰＭマウスは免疫適格性であるため、これらのマウスは、ＰＤＸ及びＣＤＸ等の他の免疫不全ＳＣＬＣモデルを補完することができる（Ｈｏｄｇｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０１６０】
ＳＣＬＣの治療に対する主要な臨床的障害の１つは、化学療法耐性の急速な発達である。ヒトＳＣＬＣと同様、ＲＰＭの腫瘍は、化学療法に対して急性の感受性を示し、ＭＹＣ単独では化学療法耐性を促進するには不十分であることを示唆している。本明細書に開示する知見は、ＭＹＣの腫瘍進行における役割が、悪性の増殖及び転移を促進することであるという仮説を導く。本明細書に開示するＲＰＭのＧＥＭＭは、化学療法耐性の機序を明らかにするため、および新規な治療方法を試験して化学療法耐性疾患に対抗するための有用なツールの役割を果たすことができる。
【０１６１】
クロマチン免疫沈降シーケンシング（ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ）。ＣｈＩＰ−Ｓｅｑは、先に記載の通りに行った（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。簡潔には、ＣｈＩＰ当たり２０００万個の細胞を１％ホルムアルデヒド中で１０分間、室温にて架橋した。架橋は１２５ｍＭのグリシンで停止し、核を抽出した。クロマチンをＥｐｉｓｈｅａｒプローブソニケーター（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）を用い、４分間、４０％のパワーで超音波処理した。ｃ−ＭＹＣ（クローンＤ３Ｎ８Ｆ）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を免疫沈降に用い、各細胞株用のインプット試料が対照の役割を果たした。ライブラリは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００でシングルエンドの５０  ｂｐリードとして、試料当たり最低３５００万リードの深さまでシーケンスした。リードは、以下のパラメータを用い、ｂｏｗｔｉｅ（Ｌａｎｇｍｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）を使用して、マウスゲノムのｍｍ１０ビルドに合わせた。すなわち、−ｍ  １  −ｔ  −−ｂｅｓｔ  −ｑ  −Ｓ  −ｌ  ３２  −ｅ  ８０  −ｎ  ２。ピークは、ｐ値カットオフ１ｅ−１０を用い、ＭＡＣＳ２（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）でコールし、ｍｆｏｌｄパラメータを１５〜１００の範囲で指定した。７，８３０、１３，５２７、及び５，１６８のピークがそれぞれＰＢ１１５、ＰＢ１１９、及びＰＢ１２０に対してコールされた。可視化のため、ＭＡＣＳ２が−Ｂ及び−ＳＰＭＲ  ｏｐｔｉｏｎでｂｅｄｇｒａｐｈを作成した。
【０１６２】
マウス及びヒト細胞株。マウス原発性肺腫瘍を切除し、無菌条件下で顕微解剖した。個々の腫瘍を、ハサミを用いた機械的分離及び０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（１Ｘ）溶液（Ｇｉｂｃｏ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）中２０分間のインキュベーションによる化学的分離によって単細胞懸濁液まで加工した。細胞懸濁液を１００μｍの細胞ストレーナーで濾過し、ＲＰＭＩ培地に再懸濁した。ＲＰＭ、ＲＰＰ、及びＲＰ細胞を、コーティングなしの組織培養フラスコまたはコーティングされた１００ｍｍプレートで、ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、及びＬ−Ｇｌｕｔ中で増殖させた。ＬＫＲ１０／１３及びＲＰ細胞は、Ｔ．Ｊａｃｋｓより寄贈された。ＫＰ７Ｂ及びＫＰ１０Ｂ細胞は、上記の通りＫＰマウスから作製し、ＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、及びＬ−Ｇｌｕｔ中、コーティングされたディッシュにて増殖させた。ヒト細胞株Ｈ８２をＡＴＣＣから入手し、５％ＦＢＳ及びＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを加えたＲＰＭＩ培地中維持した。他のヒト細胞株は、薬物スクリーニングにて記載の通りであった。
【０１６３】
マウス細胞生存率及び増殖アッセイ。細胞を３連（１５００／ウェル）で、ホワイト平底９６ウェルプレートに播種した。翌日、細胞を漸増用量のアリセルチブ（ＭＬＮ８２３７，Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）、バラセルチブ（ＡＺＤ１１５２−ＨＱＰＡ，Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）、シスプラチン（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）、またはエトポシド（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）で処理した。処理の９６時間後、細胞生存率を  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（ＣＴＧ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用い、照度計にて測定した。正規化され変換された用量反応曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて作成及び分析し、各化合物のＧＩ５０を測定した。増殖速度に関しては、細胞を透明９６ウェルプレートに播種し（５０００細胞／ウェル）、２時間ごとに９６時間、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｚｏｏｍシステム（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＵＳＡ）にて、３７℃及び５％ＣＯ２で画像化した。各時点でのコンフルエンスのパーセンテージをＥｓｓｅｎ  ＩｎｃｕＣｙｔｅソフトウェアにより計算した。
【０１６４】
細胞周期解析。細胞を、６ウェルプレート中、表示された濃度のアリセルチブ（ＭＬＮ８２３７，Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）で処理し、トリプシンを用いて採集し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、１×１０６細胞を氷冷７０％エタノール中で一夜固定した。細胞をＰＢＳ／１％  ＢＳＡ中で２回洗浄し、１００  μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅで１０分間３７℃にて処理し、その後２５μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で一夜、４Ｃにて染色した。細胞をＢＤ  ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで分析し、細胞のダブレットを除いた細胞周期解析を、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて行った。
【０１６５】
薬物スクリーニング。ヒトＳＣＬＣ細胞株を、以前記載された（Ｓｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）通り、ＲＰＭＩまたはＨＩＴＥＳ中で培養した。シスプラチン及びエトポシドのスクリーニングに関しては、ウェル当たり４０００細胞を９６ウェルの平底アッセイ用プレートにて２４時間増殖させ、その後、シスプラチン（Ｕｎｉｋｌｉｎｉｋ  Ａｐｏｔｈｅｋｅ、ＰＢＳに溶解）またはエトポシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＤＭＳＯに溶解）で、最大濃度１０μＭから始めて処理した。９６時間後、細胞生存率を、ＣＴＧ試薬を用いて分析した。各細胞株及び濃度を実験ごとに３連で分析し、ＧＩ５０値（５０％の増殖阻害）を、ＧｒａｐｈＰａｄを用いて計算した。少なくとも３回の独立した試験の平均ＧＩ５０値を示す。ＰＦ−６７０４６２（Ａｐｅｘｂｉｏ）、ＭＳ４３６（ＭｅｄＣｈｅｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓ）、バラセルチブ／１１５２−ＨＱＰＡ（Ａｐｅｘｂｉｏ）、アリセルチブ／ＭＬＮ８２３７（Ａｐｅｘｂｉｏ）、及びミルシクリブ（ｍｉｌｃｉｃｌｉｂ）／ＰＨＡ−８４８１２５（ＭｅｄＣｈｅｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓ）に関しては、すべてＤＭＳＯに溶解し、表示された細胞株を同じプロトコルを用い、３８４ウェル形式にて、ウェル（２５ｍｌ）当たり５００（付着）または５０００（懸濁）細胞でスクリーニングし、ロボットシステム（ＣｙＢｉｏ  ＣｙＢｉ  ｗｅｌｌ  ｖａｒｉｏ）を用いて処理した。処理に際し、細胞を７２時間インキュベートした後、ＣＴＧ試薬を添加した。各細胞株及び濃度を、ｎ＝３の独立した試験で、実験ごとに４連で分析した。
【０１６６】
公開された薬物スクリーニングのバイオインフォマティクス解析。Ｐｏｌｌｅｙ（Ｐｏｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）から公的に入手可能な遺伝子発現及び薬物反応データをｈｔｔｐｓ：／／ｓｃｌｃｃｅｌｌｌｉｎｅｓ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｓｃｌｃ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ．ｘｈｔｍｌからダウンロードした。Ｌｏｇ１０  ＩＣ５０  μＭ値は、試験範囲より上であれば２に、下であれば−３に設定した。ＳＬＣＬ試料を、ＭＹＣ発現に基づいて２群に分け、ここでは、ｌｏｇ２の発現値が８．５超の細胞を高に分類した。基本Ｒ（ｖ３．２．２）関数ｗｉｌｃｏｘ．ｔｅｓｔを用いて低及び高ＭＹＣ群間のＬｏｇ１０  ＩＣ５０の差を調べた。
【０１６７】
ヒト細胞株におけるｓｈＲＮＡ媒介ＭＹＣノックダウン。ｐＬＫＯ．１−ｓｈＧＦＰまたはｐＬＫＯ．１−ｓｈＭＹＣに関して、基本的に先に記載の通り（Ｓｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）レンチウイルス産生を行った。簡潔には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｐＬＫＯ．１ｐｕｒｏ系のベクターならびにｐＭＤ．２及びｐＣＭＶｄ．８．９ヘルパープラスミドで、ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの４８及び７２時間後、複製能力のないレンチウイルス粒子を採集し、１０  μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の存在下、細胞（ＧＬＣ１、ＧＬＣ２、Ｈ８２）を感染させた。ピューロマイシン（１．５μｇ／ｍｌ）選択を１６時間後に開始し、細胞を７２時間後（ＲＮＡ抽出）または９６時間後（ＳＹＰのウェスタンブロット）に採集した。以下のｓｈＲＮＡ標的配列を使用した。すなわち、ＧＦＰ（ＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣ）（配列番号５）、ＭＹＣ（ＣＣＴＧＡＧＡＣＡＧＡＴＣＡＧＣＡＡＣＡＡ）（配列番号６）。ノックダウン効率をｑＲＴ−ＰＣＲまたは免疫ブロットで評価した。
【０１６８】
マウス細胞株におけるＭＹＣの過剰発現。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｐＭＳＣＶ  ＰＩＧ（Ａｄｄｇｅｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ＃２１６５４）、すなわち、空のベクター、またはマウスのＭｙｃ配列、すなわち、ＷＴまたはＴ５８Ａ変異体のいずれかをコードするインサートを有するベクターをｐＣＭＶ−ＶＳＶＧ及びｐＣＭＶデルタＲ８．２プラスミドに加えて、ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ）を用いてトランスフェクトした。ウイルスをトランスフェクションの４８及び７２時間後に採集した。３１５１Ｔ１マウスのＳＣＬＣ細胞株に、８μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含むウイルス上清を感染させた。感染させた細胞を、すべての未感染の対照細胞がピューロマイシンによって死滅するまでピューロマイシン（５μｇ／ｍｌ）で数日間選択した。感染効率は、選択後、蛍光顕微鏡法で確認し、９０％を超える細胞がＧＦＰ陽性であった。細胞を先に記載の通り免疫ブロッティング用に採集した。
【０１６９】
ＭＹＣノックダウン後の定量的ＲＴ−ＰＣＲヒト細胞株。ＧＬＣ１、Ｈ８２、及びＧＬＣ２に、２つの独立して作製したＭＹＣ及びＧＦＰ  ｓｈＲＮＡ  レンチウイルスを感染させた。ｓｈＲＮＡの選択の７２時間後、全ＲＮＡを製造業者のプロトコル（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）に従って抽出した。１μｇの全ＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製造者のプロトコルに従ってｃＤＮＡ合成に使用した。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）反応を試料ごとに２連で、７３００  リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とともに、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び以下のオリゴ、すなわち、ＭＹＣ−１ｆ（ＣＣＴＡＣＣＣＴＣＴＣＡＡＣＧＡＣＡＧＣ）（配列番号７）、ＭＹＣ−１ｒ（ＣＴＣＴＧＡＣＣＴＴＴＴＧＣＣＡＧＧＡＧ）（配列番号８）、ＡＳＣＬ１−１ｆ（ＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＣＴＧＧＴＴＣＴ）（配列番号９）、ＡＳＣＬ１−１ｒ（ＣＣＧＴＧＡＡＴＧＡＴＴＧＧＡＧＴＧＣ）（配列番号１０）、ＡＳＣＬ１−２ｆ（ＧＣＴＣＴＧＣＣＡＡＧＡＴＧＧＡＧＡＧ）（配列番号１１）、ＡＳＣＬ１−２ｒ（ＣＴＧＴＣＧＣＴＴＧＡＣＴＴＧＣＴＴＧ）（配列番号１２）、ＳＹＰ−１ｆ（ＡＣＣＴＣＧＧＧＡＣＴＣＡＡＣＡＣＣＴＣ）（配列番号１３）、ＳＹＰ−１ｒ（ＣＴＧＡＧＧＣＣＣＧＴＡＧＧＡＡＴＣ）（配列番号１４）、ＳＹＰ−２ｆ（ＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＴＣＡＧＡＴＧ）（配列番号１５）、ＳＹＰ−２ｒ（ＣＡＡＧＡＣＴＧＧＧＣＡＣＣＴＡＧＴＧ）（配列番号１６）、ＮＣＡＭ１−１ｆ（ＧＴＧＴＧＧＴＴＡＣＡＧＧＣＧＡＧＧＡＴ）（配列番号１７）、ＮＣＡＭ１−１ｒ（ＧＡＴＧＡＣＡＴＣＴＣＧＧＣＣＴＴＴＧＴ）（配列番号１８）、アクチン−ｆ（ＧＴＣＴＴＣＣＣＣＴＣＣＡＴＣＧＴＧＧ）（配列番号１９）、アクチン−ｒ（ＧＡＴＧＣＣＴＣＴＣＴＴＧＣＴＣＴＧＧＧ）（配列番号２０）を用いて行った。Ｃｔ値は、この７３００システムのソフトウェアを用いて計算した。プライマー対当たりの複製物を平均し、ｄＣｔを介して、参照対照としてアクチンに対して正規化した。細胞株当たりの各ウイルス調製物由来の平均ｄＣｔ値を用いてｓｈＭＹＣとｓｈＧＦＰ間のｄｄＣｔ値を計算した。対照に対するノックダウンの相対発現を、細胞株及びプライマーにわたり、平均２−ｄｄＣｔとＳＥＭとして示した。
【０１７０】
使用される方法及び材料は、本明細書及び上記に記載されている。
【０１７１】
実施例４：Ｍｙｃ促進型の腫瘍はヒト疾患と同様に高転移性である。
Ｍｙｃ促進型の腫瘍形成が、転移と関連しているかどうかを評価するため、肝臓及びリンパ節を、腫瘍を有するＲＰＭマウスからは８週で、ＲＰＰマウスからは２４週で採集し、各遺伝子型での原発腫瘍量を調整した。リンパ管を介した縦郭の広がり及び肝臓における血行性の転移は、一部のマウスで顕著であった（図４Ａ及び図４Ｂ）。ＲＰＭマウス由来の１６の肝臓のうち、１４（約８８％）が肝臓転移を示し、多くの場合複数の微小転移が存在した（図４Ａ及び図４Ｃ）。注目すべきことに、腫瘍細胞の塊が肝臓の血管において識別され、複数の有糸分裂細胞からも明らかなように増殖型であった（図４Ａ）。はるかに長い腫瘍成長時間にもかかわらず、ＲＰＰ動物は有意に少ない肝臓転移を示した（３６％）（図４Ｃ）。２１匹のＲＰＭマウスのうちの１５匹（約７１％）も同様に縦郭及び遠位リンパ節への転移を示した（図４Ｂ）。転移は、Ｋｉ６７染色に基づいて高増殖型であり、ＮＫＸ２−１  及びＵＣＨＬ１に対して強く染色され（図４Ｄ）、肺神経内分泌起源と一致した。ＲＰＭ腫瘍は、原発腫瘍及び転移の両方において転移ドライバーであるＮＦＩＢを高レベルで示した（図４Ｄ）が、Ｍｙｃｌ促進型のＳＣＬＣで通常見られるＮｆｉｂ増幅を示さなかった（図９Ａ）（Ｄｅｎｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｄｏｏｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｓｅｍｅｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。しかしながら、原発腫瘍におけるその均一な発現（図４Ｅ）と一致して、Ｎｆｉｂは、マウスＲＰＭ細胞株のＣｈＩＰ−ｓｅｑにより、ＭＹＣの標的遺伝子として特定された（図４Ｆ）。ＭＹＣの結合は、例えば、Ｎｆｉｂ遺伝子の近傍で検出された。これは、ＭＹＣが、急速な転移に寄与し得るＮｆｉｂを直接調節することを示唆している。総合して、Ｍｙｃ促進型のマウスＳＣＬＣの転移パターンは、ヒトＳＣＬＣと似ており、他のクラシックＧＥＭＭにおけるよりはるかに急速に生じる（ＭｃＦａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｍｅｕｗｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、Ｓｃｈａｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０１７２】
使用される方法及び材料は、本明細書及び上記に記載されている。
【０１７３】
実施例５：Ｍｙｃ促進型ＳＣＬＣは化学療法に高反応性であるが急速に再発する。
ヒトＳＣＬＣは、化学療法に反応するが、ＭＹＣの化学療法反応への影響は物議をかもしており、インビボでの結果は公表されていない（Ｈｏｄｇｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。これに対処するため、ＲＰＭ及びＲＰＰマウスを、７ｍｇ／ｋｇのシスプラチン（１日目）及び１０ｍｇ／ｋｇのエトポシド（２日目）の単回投与の有無で処理し、続いて、ＢｒｄＵの２４時間の単回パルスを施し、その後、ＩＨＣ分析用に肺組織を採集した。化学療法がない場合、両遺伝子型の対照腫瘍は、リン酸化ヒストンＨ２Ａ．Ｘ（ｐＨ２ＡＸ）のレベルによって測定される検出可能なＤＮＡ損傷を示した（図５Ａ）。化学療法に反応して、ＲＰＭ及びＲＰＰ腫瘍は、予想通りｐＨ２ＡＸの有意な増加を示した（図５Ａ及び図５Ｂ）。化学療法後に強い細胞周期停止を示す腺癌（Ｏｌｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）とは対照的に、ＲＰＭ腫瘍とＲＰＰ腫瘍のいずれも増殖の低下を示さなかった（図５Ａ及び５Ｃ）。代わりに、化学療法で処理したＲＰＭの腫瘍は、未処理の対照と比較して、有意に増加したレベルのＣＣ３を有し、これはＲＰＰの腫瘍では観察されなかった（図５Ａ及び図５Ｄ）。総合して、これらのデータは、細胞周期の停止ができないことに加えて高レベルのＤＮＡ損傷が、ＲＰＭの腫瘍におけるアポトーシス細胞死につながることを示唆する。
【０１７４】
化学療法の単回投与に対する劇的な反応のため、次の一連の実験を行い、ＲＰＭ動物において化学療法が腫瘍量を低減し得るかどうかを判断した。ＲＰＭマウスのコホートを、２回投与の併用化学療法（５ｍｇ／ｋｇシスプラチン及び１０ｍｇ／ｋｇエトポシド）または媒体対照で処理し、２回目の投与の７２時間後に肺組織を採取した。化学療法で処理されたＲＰＭの腫瘍は、対照動物（腫瘍量１９．５＋／−３．１％）と比較して、腫瘍量の劇的な減少（３．８＋／−１．６％）を示し（図５Ｅ）、Ｍｙｃ促進型の腫瘍が実際に化学療法感受性であることを示した。ＰＢＳ対照または２回投与の併用化学療法で処理された各ＲＰＭ動物のスライド全体は、図５Ｅ及び図５Ｆの通り。マイクロＣＴ画像化は、腫瘍量のより包括的な評価を与えるため、腫瘍量を処理前（ｄ０）及び再度２回投与の化学療法後１２日目（ｄ１２）にも定量化した。ＰＢＳで処理された腫瘍は、１２日で腫瘍量が１２％から３５％へと有意に増加した一方、化学療法で処理された腫瘍は、腫瘍量が１２％から１７％へのわずかな増加であり、有意には増加しなかった（図５Ｆ）。進行、停滞、及び退行を含め、個々の腫瘍の反応には不均一性が観察された。ＲＰＭマウスの別のコホートでは、併用化学療法は有意に生存を延長させたが、総合的な生存の延長は１０．５日であった（図５Ｇ）。化学療法を繰り返し受けているＲＰＭマウスの肺の大部分は、依然として腫瘍を有しており、これらが化学療法に対して耐性を獲得した可能性があることを示唆した。これらのデータは、ＲＰＭの腫瘍がヒトＳＣＬＣの臨床反応を正確に反映することを示唆する。Ｍｙｃ単独では、それ自体化学療法耐性を与えないが、Ｍｙｃ促進型の腫瘍は、治療後に急速に再発する。
【０１７５】
使用される方法及び材料は、本明細書及び上記に記載されている。
【０１７６】
実施例６：Ｍｙｃ促進型ＳＣＬＣはＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害に対して弱い。
多くの努力にもかかわらず、ＭＹＣは小分子での標的が依然として困難である。しかしながら、治療的に利用可能な脆弱性をこれらの患者に提供し得るいくつかの合成致死標的がＭｙｃ促進型の腫瘍において特定されている（Ｂｒｏｃｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｂｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｓｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。かかる合成致死標的の候補を阻害する薬物の有効性を評価するため、エトポシド、シスプラチン、ＰＦ−６７０４６２（ＣＫＩε阻害剤）、ＭＳ４３６（ＢＲＤ４阻害剤）、アリセルチブ（Ａｕｒｏｒａ  Ａ阻害剤）、バラセルチブ（Ａｕｒｏｒａ  Ｂ阻害剤）、及びミルシクリブ（ＣＤＫ２阻害剤）を１７のヒトＳＣＬＣ細胞株にわたりプロファイルした（図６Ａ）。ＭＹＣＬやＭＹＣＮで促進されるものではないＭＹＣ促進型のＳＣＬＣは、エトポシド（調整ｐ＝０．０３８）、アリセルチブ（ｐ＝０．００１）、及びバラセルチブ（ｐ＝０．０２２）に対して有意に反応性が高かった（図６Ａ及び６Ｂ）。また、６８のヒトＳＣＬＣ細胞株を含む最近公開された薬物スクリーニングは、高または低ＭＹＣ発現に基づいて細胞を分けることによって解析された（Ｐｏｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。この場合もやはり、アリセルチブ、バラセルチブ、及び複数の他のＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤は、ＭＹＣ−高細胞株で高い有効性を示した（図１１Ａ）。次に、マウス細胞株を、ＲＰＭマウスから５個及びＲＰＭLSL/+マウスから２個を含めたＲＰＭの腫瘍から作製した。細胞は、懸濁状態で大部分成長し、多くの場合、緩い凝集または塊状であり、ヒトバリアントＳＣＬＣ細胞株と同様であった（図１１Ｂ）。ＲＰＭ細胞株は、高レベルのＭＹＣを発現し、ＲＢ１もＴＲＰ５３も発現しなかった（図１１Ｃ）。次に、ＲＰＭ（ｎ＝７）、ＲＰＰ（ｎ＝３）、ＲＰ（ｎ＝３）、及びＫＰ（ｎ＝２）細胞株を、シスプラチン、エトポシド、アリセルチブ、またはバラセルチブで処理した。ＲＰＭ細胞は、シスプラチンに反応して高マイクロモル濃度のＧＩ50を示したが、エトポシドに対してはナノモル濃度で感受性であった（図６Ｃ及び６Ｄ）。ＲＰＭ細胞は、腺癌細胞株及び非ＭＹＣ促進型細胞と比較した場合、特にアリセルチブ及びバラセルチブに対して、感受性であった（図６Ｅ〜図Ｇ）。ＲＰＭ細胞は、倍加時間がより短い傾向があったが、倍加時間とアリセルチブ感受性の間に有意な相関はなかった（図１１Ｄ）。換言すれば、増殖速度とアリセルチブ感受性は有意に相関しない。アリセルチブ処理は、マウス及びヒト細胞において測定されたＧＩ50値の範囲内の濃度でＡＵＲＫＡ及びＡＵＲＫＢの用量依存的阻害をもたらしたが、バラセルチブは、ＡＵＲＫＢに対して特異的であった（図６Ｈならびに１１Ｅ及び１１Ｆ）。ＭＹＣ増幅ＧＬＣ２細胞では、ＡＵＲＫＢのノックダウン後に、ＡＵＲＫＡと比較して生存率の大幅な低下が認められ、ＡＵＲＫＢの阻害がアリセルチブ処理細胞の生存率の低下に役割を果たし得ることが示唆された（図１１Ｇ）（Ｓｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＲＰＭ細胞では、アリセルチブは、Ｇ２／Ｍ期の細胞の用量依存的な増加に続いて、ｓｕｂＧ１細胞��増加を引き起こした。これは、細胞が有糸分裂を適切に終了することができず、その後死ぬことを示唆している（図６Ｉ）。ＫＰ、ＲＰＰ、及びＲＰ細胞と比較して、ＲＰＭ細胞は、アリセルチブ処理後にｓｕｂＧ１細胞の大幅な増加を示した（図６Ｉ及び１１Ｈ）。他の悪性腫瘍におけるＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害の記載された機序（Ｂｒｏｃｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｏｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）と対照的に、アリセルチブ処理は、マウスまたはヒト細胞においてＭＹＣタンパク質の減少を、シクロヘキシミド誘導性のタンパク質合成のブロック後（図１１Ｉ）でさえ、主要にはもたらさなかった（図６Ｈならびに図１１Ｅ及び図１１Ｆ）。予想通り、ＭＹＣは、ＭＹＣwt細胞（ＧＬＣ１）と比較して、ＭＹＣT58A対立遺伝子（ＰＢ１１５）を発現するマウス細胞でより安定であった（図１１Ｉ）。しかしながら、両細胞株において、対照細胞と比較して、アリセルチブ処理後のＭＹＣの強い減少は認められず、ＭＹＣT58Aがアリセルチブ感受性の基本機序を変更しない可能性があることを示唆した（図１１Ｉ）。これは、ＭＹＣ促進型ＳＣＬＣが、増殖速度及びそのＭＹＣレベルへの影響とは独立して、マウス及びヒト細胞においてＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害に対して感受性であることを示唆する。
【０１７７】
タンパク質安定性シクロヘキシミド（ＣＨＸ）実験。アリセルチブ処理時のｃ−Ｍｙｃ安定性のアッセイを、基本的に（Ｂｒｏｃｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）に記載の通りに行った。細胞を、シャットオフに先立って、１μＭのアリセルチブまたは０．１％のＤＭＳＯで２４時間処理した。シクロヘキシミドを最終濃度１００μｇ／ｍｌまで、表示された時点で加えた。細胞溶解物を、ＲＩＰＡ緩衝液を用いて上記の通りに調製し、４〜２０％トリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて分離し、Ｍｙｃ及びＨｓｐ９０に対する免疫ブロットにより分析した。シグナルをＬｉ−Ｃｏｒ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて定量化し、Ｍｙｃ／Ｈｓｐ９０比を０分の時点に対して正規化した。グラフは、３回の独立した実験の平均正規化Ｍｙｃ／Ｈｓｐ９０比とＳＥＭを示す。
【０１７８】
使用される方法及び材料は、本明細書及び上記に記載されている。
【０１７９】
実施例７：Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害はＭｙｃ促進型ＳＣＬＣの化学療法反応を有意に向上させる。
インビボでのアリセルチブの有効性を判断するため、ＲＰＭマウスをマイクロＣＴにより画像化し、腫瘍が検出された際には、媒体対照（ＰＢＳ）、５ｍｇ／ｋｇシスプラチン及び１０ｍｇ／ｋｇエトポシド（週１回）、２０ｍｇ／ｋｇアリセルチブ（１日２回、５日間オン、２日間オフ）、または化学療法プラスアリセルチブのいずれかを受けるようにランダムに割り当てた（図７Ａ）。マウスを、処理の直前、及び最大２０日間各シスプラチン処理の４日後にマイクロＣＴ画像化によって観察した。アリセルチブ処理時の体重減少はＰＢＳ対照処理動物と変わらなかったが、化学療法を伴うレジメンは、約１５〜２０％の体重減少を引き起こしたため、各処理群の１匹の動物は、毒性のためにサクリファイスを必要とした（図１２Ａ）。治療の影響の包括的な測定として、総腫瘍体積を総空気体積に対して定量した。ＰＢＳ処理動物は、急速な腫瘍成長が原因で、腫瘍の検出後平均１２日間生存した（図７Ｂ、図７Ｃ、及び図１２Ｂ）。アリセルチブ処理動物は、腫瘍増殖のわずかな遅れを示したが、これは、主に早い時点でのその影響に起因していた。化学療法処理動物の大部分は、有意に遅い腫瘍増殖を伴い３サイクルの治療を完了した（図７Ｂ、図７Ｃ、及び図１２Ｂ）。際立ったことに、アリセルチブ及び化学療法の併用で処理された動物は、３サイクルの治療にわたって完全な腫瘍の停止を示した（図７Ｂ、図７Ｃ、及び図１２Ｂ）。総腫瘍体積の変化率を、ウォーターフォールプロットにより、各処理群において０日目と比較して１９日目（または、よより早い場合には死亡時）に分析した。初期に腫瘍増殖が遅れたにもかかわらず、アリセルチブ単独では、この時間枠において未処理動物と比較して全体的な反応に影響がなかった（図７Ｄ）。化学療法で処理された動物のうち、１４匹中５匹が安定した疾患状態であった一方、大部分の動物（ｎ＝１４中９）は処理の過程で進行した。注目すべきことに、化学療法及びアリセルチブで処理された動物の大部分（ｎ＝１６中１０）は、腫瘍体積が＞３０％減少した３匹を含め、安定した疾患を示した（図７Ｄ）。アリセルチブ処理の効果はインビトロにおいてより顕著であったが、シスプラチンではなくエトポシドとアリセルチブの併用は、ＭＹＣ増幅細胞における細胞生存率をさらに減少させた（図１２Ｄ）。
【０１８０】
ＲＰＭモデルにおけるクラシック及びバリアント細胞の不均一性を考慮して、これらの処理がインビボでＡＳＣＬ１、ＮＥＵＲＯＤ１、またはＭＹＣのレベルに影響を与えるかどうかを判断するために次の一連の実験を行った。興味深いことに、化学療法はＡＳＣＬ１レベルの低下を導き、クラシックまたは早期病変がこのモデルにおいてより化学療法感受性であり得ることを示唆した（図７Ｅ及び図７Ｆ）。最も際立ったことに、アリセルチブ処理は、その作用機序（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）と一致する倍数性及び異常な有糸分裂を伴う細胞（図１２Ｃ）の劇的な濃縮につながる。これらの異常な細胞は、ＮＥＵＲＯＤ１＋であり、他の処理群と比較して、アリセルチブ処理動物において有意に濃縮された（図７Ｅ、図７Ｆ、及び図１２Ｃ）。アリセルチブと化学療法の併用は、しかしながら、ＮＥＵＲＯＤ１＋細胞の濃縮にはつながらず、化学療法がこれらの大きな異常細胞の枯渇に寄与した可能性があることを示唆した。
【０１８１】
腫瘍増殖の遅れがわずかであったにもかかわらず、アリセルチブ処理は、未処理動物と比較して生存期間の中央値を１０日延長し、生存期間を１１日延長した化学療法に匹敵した（図７Ｇ）。化学療法とアリセルチブの併用は、未処理マウスと比較して生存期間の中央値を１４日延長し、アリセルチブ単独または化学療法単独より有意に効果が高かった。重要なことには、併用処理マウスの４７％が、ＰＢＳ０％、５％、及び８％、化学療法、またはアリセルチブ処理動物（フィッシャーの直接確率検定、それぞれ、ｐ＝０．０００８、０．００３２、及び０．０４３３）と比較して、３０日間生存した。総合して、これらの結果は、アリセルチブは、化学療法との併用で、ＭＹＣ促進型ＳＣＬＣの初回治療において、腫瘍増殖を停止させ、標準治療の化学療法と比較して有意に生存を延長させることを示唆する。
【０１８２】
ＳＣＬＣを含めたＭＹＣ促進型の腫瘍は、Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害で合成致死性を示すが、これはＳＣＬＣのＧＥＭＭにおいてインビボでは検討されていなかった（Ｂｒｏｃｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｈｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｏｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｓｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。本明細書に開示するデータは、ＭＹＣの発現が、ＳＣＬＣをＡｕｒｏｒａキナーゼ阻害に対して、特に、化学療法との併用において感受性にすることを示唆し、化学療法単独と比較して有意に腫瘍制御が改良され、生存期間が延長された。アリセルチブの単独療法は、インビボでの影響はわずかであったが、最適化された投与計画がこの反応を改良し得る可能性がある。再発したＳＣＬＣにおける最近の臨床試験で、アリセルチブ単独療法が試験され、患者の約２０％が部分反応を示した（Ｍｅｌｉｃｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）一方、汎Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤は、少数の再発患者において反応がなかった（Ｓｃｈｏｆｆｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。現在の臨床試験では、第二次療法として化学療法との併用でアリセルチブを評価している（ＮＣＴ０２０３８６４７）。本明細書に示すデータは、ＭＹＣのレベル、神経内分泌低、またはバリアントの組織病理が、患者のアリセルチブ感受性に関するバイオマーカーの役割を果たし得ることを予測する。最後に、これらのデータは、Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害がインビボにおける化学療法反応性を改善することができることを示唆しており、ＭＹＣ増幅ＳＣＬＣを有する患者にとって、標準化学療法との併用での初回Ａｕｒｏｒａキナーゼ阻害剤が有効であり得ることが示唆される。総合して、これらの知見は、均質な疾患としてのＳＣＬＣの現行の分類に異議を唱え、患者の転帰を改善する態勢にある標的治療に対して特定の脆弱性を備えたＳＣＬＣの異なるサブタイプが存在することを示唆する。
【０１８３】
実施例８：ＭＹＣの発現はＢＣＬ２の発現と逆相関する。
ヒト細胞株由来の全細胞溶解物をプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｉｎｉ）及びベンゾナーゼ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を添加したＲＩＰＡ緩衝液を用いて調製し、トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。膜は、０．０１％ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）中の５％ミルクまたは５％ＢＳＡ溶液中で１時間ブロックし、続いて一次抗体とともに４℃で一夜インキュベートした。膜を６×５分間、室温にてＴＢＳ−Ｔ中で洗浄した。マウス及びウサギＨＲＰ結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，１：１０，０００）を室温にて１時間インキュベートし、続いて６×５分間、室温にてＴＢＳ−Ｔ中で洗浄した。検出（図１３参照）のため、膜をＷｅｓｔｅｒｎＢｒｉｇｈｔ  ＨＲＰ  Ｑｕａｎｔｕｍ基質（Ａｄｖａｎｓｔａ）に曝露し、Ｈｙｂｌｏｔ  ＣＬフィルム（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ）で検出した。
【０１８４】
ヒト細胞株を３連にて、ホワイト平底９６ウェルプレートに２０００細胞／ウェルで播種した。翌日、漸増用量のアリセルチブ（ＡｐｅｘＢｉｏ）、ＡＢＴ−７３７（ＡｐｅｘＢｉｏ）、またはＡＢＴ−１９９（ＡｐｅｘＢＩｏ）を添加した。薬物を４８時間で再度添加し、所望の最終濃度を維持した。処理の９６時間後、細胞生存率をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（ＣＴＧ）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて測定し、プレートを照度計で読み取った。正規化され変換された用量反応曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて作成及び分析し、各化合物のＧＩ５０を測定した（図１３参照）。エラーバーは平均＋／−ＳＥＭを表す。これらの結果は、ＭＹＣの発現が、ＢＣＬ２の発現及びＢＣＬ２阻害に対する感受性と反相関することを示す。
【０１８５】
別の実験において、ヒト細胞株を３連にて、ホワイト平底９６ウェルプレートに２０００細胞／ウェルで播種した。翌日、漸増用量のアリセルチブ（ＡｐｅｘＢｉｏ）を、ＡＢＴ−７３７  またはＡＢＴ−１９９（ＡｐｅｘＢｉｏ）の存在下または非存在下で添加した。薬物を４８時間で再度添加し、最終濃度を維持した。処理の９６時間後、細胞生存率をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（ＣＴＧ）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて測定し、プレートを照度計で読み取った。正規化され変換された用量反応曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて作成及び分析し、各化合物のＧＩ５０を測定した（図１４参照）。エラーバーは平均＋／−ＳＥＭを表す。これらの結果は、ＢＣＬ２の阻害が、ＭＹＣの状態にかかわらず、アリセルチブに対する反応を増加させることを示す。
【０１８６】
図１５は、ＲＰＭマウス細胞株において、ＢＣＬ２の発現がＭＹＣと逆相関することを示す。マウス細胞株を、表示されたマウスモデル、すなわち、ＲＰＭ（Ｒｂfl/fl；ｐ５３fl/fl；ＭｙｃLSL/LSL)ＲＰ（Ｒｂfl/fl；ｐ５３fl/fl）ＲＰＰ（Ｒｂfl/fl；ｐ５３fl/fl；Ｐｔｅｎfl/fl）の原発性のマウス腫瘍から得た。全細胞溶解物をＳＤＳ  ＰＡＧＥにより、先に記載の通り、表示されたタンパク質について分析した。アクチンはローディング対照の役割を果たした。
【０１８７】
これらの実験はまた、ＢＣＬ２の過剰発現がアリセルチブ耐性を促進することを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｐＭＳＣＶ  ＰＩＧ（Ａｄｄｇｅｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ＃２１６５４）の空のベクター、またはヒトＢｃｌ−２遺伝子をコードするインサートを有するｐＭＳＣＶ  ＰＩＧをｐＣＭＶ−ＶＳＶＧ及びｐＣＭＶデルタＲ８．２プラスミドに加えて、ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ）を用いてトランスフェクトした。ウイルスをトランスフェクションの４８及び７２時間後に採集した。ヒトＳＣＬＣ細胞株にウイルス上清を感染させた。感染させた細胞を、すべての未感染細胞がピューロマイシンによって死滅するまでピューロマイシンで数日間選択した。全細胞溶解物をＳＤＳ  ＰＡＧＥにより、先に記載の通り分析し、表示されたタンパク質についてプローブした。ＨＳＰ９０は、ローディング対照の役割を果たす。細胞生存率アッセイを、アリセルチブ＋／−０．５ｕＭ  ＡＢＴ−１９９（ＡｐｅｘＢｉｏ）を加えて、上記の感染ヒト細胞株を用いて先に記載の通りに行った。細胞生存率アッセイを、アリセルチブ＋／−０．５ｕＭ  ＡＢＴ−１９９（ＡｐｅｘＢｉｏ）を加えて、上記の感染ヒト細胞株を用いて先に記載の通りに行った。
【０１８８】
実施例９：循環腫瘍細胞及びマウスモデルを用いたクラシック及びバリアントＳＣＬＣのバイオマーカーの特定
ＲＰＭ（Ｒｂfl/fl；Ｔｒｐ５３fl/fl；ＭｙｃT58A)、ＲＰＰ（Ｒｂfl/fl；Ｔｒｐ５３fl/fl；Ｐｔｅｎfl/fl）及びＫＰ（ＫｒａｓG12D；Ｔｒｐ５３fl/fl）マウスの肺を、腫瘍量がサクリファイスを要した時点で動物から採取した。肺をホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。４μＭの未染色切片を脱ロウし、再水和し、高温抗原回復、すなわち、ｐＨ６．０の０．０１Ｍクエン酸緩衝液中、２０分間プレッシャークッカーでの煮沸に供した。スライドを３％のＨ２Ｏ２にて１５分間ブロックし、５％ヤギ血清のＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）溶液にて１時間ブロックし、ブロッキング緩衝液中、一次抗体で一夜染色した。ＨＲＰ結合二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をＰＢＳ−Ｔで１：２００希釈して用い、室温で４５分間インキュベートし、その後ＤＡＢ染色（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を続けた。すべての染色はＳｅｑｕｅｎｚａカバープレート技術で行った。ＥＰＣＡＭ一次抗体：Ａｂｃａｍ＃７１９１６、１：１００。図１７の結果は、ＭＹＣ促進型ＳＣＬＣが、免疫細胞化学により低いＥＰＣＡＭ発現を有することを示す。
【０１８９】
図１８は、ＥＰＣＡＭの発現が、ＡＳＣＬ１＋クラシックＳＣＬＣ発現と相関し、これが腫瘍進行の過程で消失することを示す。これらの実験に関しては、未染色の肺切片を調製し、上記の通りに染色した。マウスオンマウス（Ｍ．Ｏ．Ｍ．）基本キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、ＡＳＣＬ１での染色に用いた。使用一次抗体：ＥＰＣＡＭ（Ａｂｃａｍ＃７１９１６、１：１００）、ＡＳＣＬ１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ５５６６０４、１：１００）、ＮＥＵＲＯＤ１（Ａｂｃａｍ  ａｂ１０９２２４、１：１５０）、ＭＹＣ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−７６４、１：１５０）。上皮内（早期）及び浸潤性（後期）腫瘍の連続切片を先に記載の通り、ＭＹＣ、ＡＳＣＬ１、及びＮＥＵＲＯＤ１について染色し、腫瘍を、免疫組織化学染色の自動定量化に基づいてＡＳＣＬ１またはＮＥＵＲＯＤ１高もしくは低としてグループ分けした。各パターンの腫瘍の割合（ｎ＝２６の合計上皮内病変、ｎ＝４１の浸潤性病変）を示す（棒グラフ参照）。
【０１９０】
プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｉｎｉ）及びオルトバナジン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を添加したＲＩＰＡ緩衝液を用いて調製し、トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した（Ｏｌｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）ヒト細胞株由来の全細胞溶解物を用いて、さらなる実験を行った。膜は、０．０１％ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）中の５％ミルクまたは５％ＢＳＡ溶液中で１時間ブロックし、続いて一次抗体とともに４℃で一夜インキュベートした。膜を６×５分間、室温にてＴＢＳ−Ｔ中で洗浄した。マウス及びウサギＨＲＰ結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，１：１０，０００）を室温にて１時間インキュベートし、続いて６×５分間、室温にてＴＢＳ−Ｔ中で洗浄した。検出のため、膜をＷｅｓｔｅｒｎＢｒｉｇｈｔ  ＨＲＰ  Ｑｕａｎｔｕｍ基質（Ａｄｖａｎｓｔａ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）に曝露し、Ｈｙｂｌｏｔ  ＣＬフィルム（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）で検出した。アクチンはローディング対照の役割を果たす。図１９に示すこれらの結果は、ＥＰＣＡＭの発現が、クラシック細胞株の表現型及びＡＳＣＬ１発現（ｎ＝２）と相関することを示す。
【０１９１】
ＭＹＣ促進型マウス腫瘍におけるＥＰＣＡＭ発現を評価し、他のモデルと比較した。ＲＰＭまたはＲＰＲ２マウスの肺を、腫瘍量がサクリファイスを必要とした時点で採取した。腫瘍を新鮮な肺組織から無菌条件下で解剖し、瞬間冷凍し、−８０℃で使用まで保存した。約２０〜４０ｍｇの腫瘍片を、使い捨ての乳棒及びコードレスモーター（ＶＷＲ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いて、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｉｎｉ）及びオルトバナジン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を添加した２００μｌのＲＩＰＡ緩衝液中で均質になるまで破砕し溶解させた。溶解物を１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を新たなチューブに移す。溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した（Ｏｌｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。膜は、５％ミルクまたは５％ＢＳＡ中で１時間ブロックし、続いて一次抗体とともに４℃で一夜インキュベートした。膜を６×５分間、室温にてＴＢＳ−Ｔ中で洗浄した。マウス及びウサギＨＲＰ結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，１：１０，０００）を室温にて１時間インキュベートし、続いて６×５分間、室温にてＴＢＳ−Ｔ中で洗浄した。検出（図２０参照、ｎ＝２）のため、膜をＷｅｓｔｅｒｎＢｒｉｇｈｔ  ＨＲＰ  Ｑｕａｎｔｕｍ基質（Ａｄｖａｎｓｔａ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）に曝露し、Ｈｙｂｌｏｔ  ＣＬフィルム（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）で検出した。ＨＳＰ９０は、ローディング対照の役割を果たす。
【０１９２】
ＲＰＭまたはマウス腫瘍を上記の通りに採取した。原発腫瘍由来のＲＮＡの単離をＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、標準的なプロトコルで行った。ＲＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ鎖ｍＲＮＡ試料調製キット（カタログ番号ＲＳ−１２２−２１０１、ＲＳ−１２２−２１０２）を用い、製造業者のプロトコルに従ってライブラリ構築に供した。化学変性したシーケンシングライブラリ（２５ｐＭ）をＩｌｌｕｍｉｎａ  ｃＢｏｔを用いてＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ｖ４シングルリードフローセルに適用した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ＳＲクラスターキットｖ４−ｃＢｏｔ（ＧＤ−４０１−４００１）の試薬を用い、ハイブリダイズした分子をクローン増幅させシーケンシングプライマーにアニールした。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００機器（ＨＣＳｖ２．２．３８及びＲＴＡ  ｖ１．１８．６１）にフローセルを移した後、５０サイクルのシングルリードシーケンスランをＨｉＳｅｑ  ＳＢＳキットｖ４シーケンシング試薬（ＦＣ−４０１−４００２）を用いて行った。マウスｍｍ１０アノテーション（Ｅｎｓｅｍｂｌ  ｂｕｉｌｄ  ８２）をＲＳＥＭ（ｖ１．２．１２）ユーティリティのｒｓｅｍ−ｐｒｅｐａｒｅ−ｒｅｆｅｒｅｎｃｅで用い、ｂｏｗｔｉｅ（ｖ１．０．１）インデックスを作成した。遺伝子発現は、ＲＳＥＭユーティリティのｒｓｅｍ−ｃａｌｃｕｌａｔｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎを用い、順方向鎖確率をゼロに設定して測定した。差次的発現は、ＥＢＳｅｑ（ｖ１．４．０）を用い、「ＭｅｄｉａｎＮｏｒｍ」機能を使用してサイズ因子を計算し、「ｍａｘｒｏｕｎｄ」を１０に設定して測定した。転写長を調整するため、１００万リード当たりのキロベース当たり断片（ＦＰＫＭ）をすべての遺伝子について計算し、小さい定数（０．０１）を足した後、ｌｏｇ２変換した。遺伝子カウントをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ、図２０参照、ｎ＝２）を用いてプロットした。エラーバーは平均＋／−ＳＥＭを表す。
【０１９３】
総合して、これらの結果は、Ｍｙｃ促進型マウス腫瘍が、他のモデルと比較して低／陰性ＥＰＣＡＭ発現を示すことを示す。
【０１９４】
図２１は、クラシックＳＣＬＣヒト細胞株が、フローサイトメトリーによってより高いＥＰＣＡＭの表面発現を示すことを示す。これらの実験に関しては、ヒトＳＣＬＣ細胞株を採取し、１ｘ１０4の細胞をＦＡＣＳ緩衝液中２回洗浄し、氷上で３０分間、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ３２６（ＥＰＣＡＭ）抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃３２４２０７）にて濃度１２０ｎｇ／ｍｌで染色し、その後ＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄した。細胞を３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター上で分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて蛍光強度の中央値を計算するための分析を行った。蛍光強度の中央値の棒グラフをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ，ＵＳＡ）を用いて作成した。
【０１９５】
参考文献
Ｂｏｒｒｏｍｅｏ，Ｍ．Ｄ．，Ｓａｖａｇｅ，Ｔ．Ｋ．，Ｋｏｌｌｉｐａｒａ，Ｒ．Ｋ．，Ｈｅ，Ｍ．，Ａｕｇｕｓｔｙｎ，Ａ．，Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｊ．Ｋ．，Ｇｉｒａｒｄ，Ｌ．，Ｍｉｎｎａ，Ｊ．Ｄ．，Ｇａｚｄａｒ，Ａ．Ｆ．，Ｃｏｂｂ，Ｍ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）．  ＡＳＣＬ１  ａｎｄ  ＮＥＵＲＯＤ１  Ｒｅｖｅａｌ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｅ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １６，１２５９−１２７２．
Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｊ．，Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ，Ｔ．，Ｍａｋｕｃｈ，Ｒ．Ｗ．，Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ａ．Ｍ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｅ．，Ｌｉｎｎｏｉｌａ，Ｒ．Ｉ．，Ｐｈｅｌｐｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｇａｚｄａｒ，Ａ．Ｆ．，Ｉｈｄｅ，Ｄ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｂ．Ｅ．（１９９１）．  ｍｙｃ  ｆａｍｉｌｙ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  １０７  ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｇｉｍｅｎｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５１，１７０８−１７１２．
Ｂｒｏｃｋｍａｎｎ，Ｍ．，Ｐｏｏｎ，Ｅ．，Ｂｅｒｒｙ，Ｔ．，Ｃａｒｓｔｅｎｓｅｎ，Ａ．，Ｄｅｕｂｚｅｒ，Ｈ．Ｅ．，Ｒｙｃａｋ，Ｌ．，Ｊａｍｉｎ，Ｙ．，Ｔｈｗａｙ，Ｋ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｓ．Ｐ．，Ｒｏｅｌｓ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．  Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｕｒｏｒａ−ａ  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎ−ｍｙｃ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２４，７５−８９．
Ｂｕｎｎ，Ｐ．Ａ．，Ｊｒ．，Ｍｉｎｎａ，Ｊ．，Ａｕｇｕｓｔｙｎ，Ａ．，Ｇａｚｄａｒ，Ａ．，Ｏｕａｄａｈ，Ｙ．，Ｋｒａｓｎｏｗ，Ｍ．Ａ．，Ｂｅｒｎｓ，Ａ．，Ｂｒａｍｂｉｌｌａ，Ｅ．，Ｒｅｋｈｔｍａｎ，Ｎ．，Ｍａｓｓｉｏｎ，Ｐ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）．  Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ：  Ｃａｎ  ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｂｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ？  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｏｒａｃｉｃ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ．
Ｃａｌｂｏ，Ｊ．，ｖａｎ  Ｍｏｎｔｆｏｒｔ，Ｅ．，Ｐｒｏｏｓｔ，Ｎ．，ｖａｎ  Ｄｒｕｎｅｎ，Ｅ．，Ｂｅｖｅｒｌｏｏ，Ｈ．Ｂ．，Ｍｅｕｗｉｓｓｅｎ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｎｓ，Ａ．（２０１１）．  Ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １９，２４４−２５６．
Ｃａｒｎｅｙ，Ｄ．Ｎ．，Ｇａｚｄａｒ，Ａ．Ｆ．，Ｂｅｐｌｅｒ，Ｇ．，Ｇｕｃｃｉｏｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｍａｒａｎｇｏｓ，Ｐ．Ｊ．，Ｍｏｏｄｙ，Ｔ．Ｗ．，Ｚｗｅｉｇ，Ｍ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｍｉｎｎａ，Ｊ．Ｄ．（１９８５）．  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｃｌａｓｓｉｃ  ａｎｄ  ｖａｒｉａｎｔ  ｆｅａｔｕｒｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４５，２９１３−２９２３．
Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ，Ｎ．，Ａｂｒａｈａｍ，Ｂ．Ｊ．，Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ，Ｊ．，Ａｌ−Ｓｈａｈｒｏｕｒ，Ｆ．，Ｚｈａｎｇ，Ｔ．，Ｃｈｉｐｕｍｕｒｏ，Ｅ．，Ｈｅｒｔｅｒ−Ｓｐｒｉｅ，Ｇ．Ｓ．，Ａｋｂａｙ，Ｅ．Ａ．，Ａｌｔａｂｅｆ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｄｄｉｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ＣＤＫ７  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２６，９０９−９２２．
Ｃｕｉ，Ｍ．，Ａｕｇｅｒｔ，Ａ．，Ｒｏｎｇｉｏｎｅ，Ｍ．，Ｃｏｎｋｒｉｔｅ，Ｋ．，Ｐａｒａｚｚｏｌｉ，Ｓ．，Ｎｉｋｉｔｉｎ，Ａ．Ｙ．，Ｉｎｇｏｌｉａ，Ｎ．，ａｎｄ  ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｄ．（２０１４）．ＰＴＥＮ  ｉｓ  ａｐｏｔｅｎｔ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ：  ＭＣＲ  １２，６５４−６５９．
Ｄｅｎｎｙ，Ｓ．Ｋ．，Ｙａｎｇ，Ｄ．，Ｃｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｈ．，Ｂｒａｄｙ，Ｊ．Ｊ．，Ｌｉｍ，Ｊ．Ｓ．，Ｇｒｕｎｅｒ，Ｂ．Ｍ．，Ｃｈｉｏｕ，Ｓ．Ｈ．，Ｓｃｈｅｐ，Ａ．Ｎ．，Ｂａｒａｌ，Ｊ．，Ｈａｍａｒｄ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）．  Ｎｆｉｂ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ．  Ｃｅｌｌ  １６６，３２８−３４２．
Ｄｏｏｌｅｙ，Ａ．Ｌ．，Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｍ．Ｍ．，Ｃｈｉａｎｇ，Ｄ．Ｙ．，Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｓ．，Ｓｔｒａｎｓｋｙ，Ｎ．，Ｄａｙｔｏｎ，Ｔ．Ｌ．，Ｓｎｙｄｅｒ，Ｅ．Ｌ．，Ｓｅｎｎａ，Ｓ．，Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｂｒｏｎｓｏｎ，Ｒ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．  Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  Ｉ／Ｂ  ｉｓ  ａｎ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２５，１４７０−１４７５．
Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｊ．Ａ．，Ｏｓｔｅｒｌｉｎｄ，Ｋ．，Ｈｉｒｓｃｈ，Ｆ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．Ｈ．（１９８７）．  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ：  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｓｙ  ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｗｉｔｈ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｉｎ  ５３７  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ５，２４６−２５４．
Ｇａｚｄａｒ，Ａ．Ｆ．，Ｃａｒｎｅｙ，Ｄ．Ｎ．，Ｎａｕ，Ｍ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｍｉｎｎａ，Ｊ．Ｄ．（１９８５）．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｔ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｈａｖｉｎｇ  ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ，ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４５，２９２４−２９３０．
Ｇａｚｄａｒ，Ａ．Ｆ．，Ｓａｖａｇｅ，Ｔ．Ｋ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｂｅｒｎｓ，Ａ．，Ｓａｇｅ，Ｊ．，Ｌｉｎｎｏｉｌａ，Ｒ．Ｉ．，ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｄ．，ＭｃＦａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｆａｒａｇｏ，Ａ．，Ｊａｃｋｓ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．  Ｔｈｅ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｏｒａｃｉｃ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ：  ｏｆｆｉｃｉａｌｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  １０，５５３−５６４．
Ｇａｚｚｅｒｉ，Ｓ．，Ｂｒａｍｂｉｌｌａ，Ｅ．，Ｊａｃｒｏｔ，Ｍ．，Ｃｈａｕｖｉｎ，Ｃ．，Ｂｅｎａｂｉｄ，Ａ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｂｒａｍｂｉｌｌａ，Ｃ．（１９９１）．  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｃ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｈｅｔｅｒｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５１，２５６６−２５７１．
Ｇｅｏｒｇｅ，Ｊ．，Ｌｉｍ，Ｊ．Ｓ．，Ｊａｎｇ，Ｓ．Ｊ．，Ｃｕｎ，Ｙ．，Ｏｚｒｅｔｉｃ，Ｌ．，Ｋｏｎｇ，Ｇ．，Ｌｅｅｎｄｅｒｓ，Ｆ．，Ｌｕ，Ｘ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃｕｅｓｔａ，Ｌ．，Ｂｏｓｃｏ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  ５２４，４７−５３．
Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ，Ｗ．Ｃ．，Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｇ．，Ｎｅｋｒｉｔｚ，Ｅ．Ａ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｂｅｎｅｓ，Ｃ．，Ｃｈａｒｒｏｎ，Ｅ．，Ｓｉｍｏｎｄｓ，Ｅ．Ｆ．，Ｓｅｅｇｅｒ，Ｒ．，Ｍａｔｔｈａｙ，Ｋ．Ｋ．，Ｈｅｒｔｚ，Ｎ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．  Ｄｒｕｇｇｉｎｇ  ＭＹＣＮ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｎ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｕｒｏｒａ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２６，４１４−４２７．
Ｈｏｄｇｋｉｎｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｍｏｒｒｏｗ，Ｃ．Ｊ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｍｅｔｃａｌｆ，Ｒ．Ｌ．，Ｒｏｔｈｗｅｌｌ，Ｄ．Ｇ．，Ｔｒａｐａｎｉ，Ｆ．，Ｐｏｌａｎｓｋｉ，Ｒ．，Ｂｕｒｔ，Ｄ．Ｊ．，Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．  Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０，８９７−９０３．
Ｈｏｏｋ，Ｋ．Ｅ．，Ｇａｒｚａ，Ｓ．Ｊ．，Ｌｉｒａ，Ｍ．Ｅ．，Ｃｈｉｎｇ，Ｋ．Ａ．，Ｌｅｅ，Ｎ．Ｖ．，Ｃａｏ，Ｊ．，Ｙｕａｎ，Ｊ．，Ｙｅ，Ｊ．，Ｏｚｅｃｋ，Ｍ．，Ｓｈｉ，Ｓ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．  Ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｕｒｏｒａ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＰＦ−０３８１４７３５．  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １１，７１０−７１９．
Ｈｕｉｊｂｅｒｓ，Ｉ．Ｊ．，Ｂｉｎ  Ａｌｉ，Ｒ．，Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，Ｃ．，Ｃｏｚｉｊｎｓｅｎ，Ｍ．，Ｋｗｏｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｐｒｏｏｓｔ，Ｎ．，Ｓｏｎｇ，Ｊ．Ｙ．，ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ，Ｈ．，Ｂａｄｈａｉ，Ｊ．，Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．  Ｒａｐｉｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  ＥＭＢＯ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６，２１２−２２５．
Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｅ．Ｌ．，Ｗｉｌｌｉｓ，Ｎ．，Ｍｅｒｃｅｒ，Ｋ．，Ｂｒｏｎｓｏｎ，Ｒ．Ｔ．，Ｃｒｏｗｌｅｙ，Ｄ．，Ｍｏｎｔｏｙａ，Ｒ．，Ｊａｃｋｓ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｔｕｖｅｓｏｎ，Ｄ．Ａ．（２００１）．  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  Ｋ−ｒａｓ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １５，３２４３−３２４８．
Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｂ．Ｅ．，Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｉｈｄｅ，Ｄ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｇａｚｄａｒ，Ａ．Ｆ．（１９９２）．  ｍｙｃ  ｆａｍｉｌｙ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  Ｍｏｎｏｇｒ，３９−４３．
Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｂ．Ｅ．，Ｉｈｄｅ，Ｄ．Ｃ．，Ｍａｋｕｃｈ，Ｒ．Ｗ．，Ｇａｚｄａｒ，Ａ．Ｆ．，Ｃａｒｎｅｙ，Ｄ．Ｎ．，Ｏｉｅ，Ｈ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｅ．，Ｎａｕ，Ｍ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｍｉｎｎａ，Ｊ．Ｄ．（１９８７）．  ｍｙｃ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｃｏｕｒｓｅ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ７９，１６２９−１６３４．
Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｂ．Ｅ．，Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｅ．，Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ａ．Ｍ．，Ｐｈｅｌｐｓ，Ｒ．，Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｍ．，Ｉｈｄｅ，Ｄ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｇａｚｄａｒ，Ａ．Ｆ．（１９９６）．  ＭＹＣ  ｆａｍｉｌｙ  ＤＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  １２６  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｕｐｐｌ  ２４，２１０−２１７．
Ｋａｌｅｍｋｅｒｉａｎ，Ｇ．Ｐ．，Ａｋｅｒｌｅｙ，Ｗ．，Ｂｏｇｎｅｒ，Ｐ．，Ｂｏｒｇｈａｅｉ，Ｈ．，Ｃｈｏｗ，Ｌ．Ｑ．，Ｄｏｗｎｅｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｇａｎｄｈｉ，Ｌ．，Ｇａｎｔｉ，Ａ．Ｋ．，Ｇｏｖｉｎｄａｎ，Ｒ．，Ｇｒｅｃｕｌａ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．  Ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃｏｍｐｒ  Ｃａｎｃ  Ｎｅｔｗ  １１，７８−９８．
ＭｃＦａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｐａｐａｇｉａｎｎａｋｏｐｏｕｌｏｓ，Ｔ．，Ｔａｙｌｏｒ−Ｗｅｉｎｅｒ，Ａ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｃ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｃｉｂｕｌｓｋｉｓ，Ｋ．，Ｂｈｕｔｋａｒ，Ａ．，ＭｃＫｅｎｎａ，Ａ．，Ｄｏｏｌｅｙ，Ａ．，Ｖｅｒｎｏｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｃｌｏｎａｌ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．  Ｃｅｌｌ  １５６，１２９８−１３１１．
Ｍｅｌｉｃｈａｒ，Ｂ．，Ａｄｅｎｉｓ，Ａ．，Ｌｏｃｋｈａｒｔ，Ａ．Ｃ．，Ｂｅｎｎｏｕｎａ，Ｊ．，Ｄｅｅｓ，Ｅ．Ｃ．，Ｋａｙａｌｅｈ，Ｏ．，Ｏｂｅｒｍａｎｎｏｖａ，Ｒ．，ＤｅＭｉｃｈｅｌｅ，Ａ．，Ｚａｔｌｏｕｋａｌ，Ｐ．，Ｚｈａｎｇ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｌｉｓｅｒｔｉｂ，ａｎ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  ａｕｒｏｒａ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ，ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ，ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ，ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ−ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ａｎｄ  ｇａｓｔｒｏ−ｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ：  ａ  ｆｉｖｅ−ａｒｍ  ｐｈａｓｅ  ２  ｓｔｕｄｙ．  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  １６，３９５−４０５．
Ｍｅｕｗｉｓｓｅｎ，Ｒ．，Ｌｉｎｎ，Ｓ．Ｃ．，Ｌｉｎｎｏｉｌａ，Ｒ．Ｉ．，Ｚｅｖｅｎｈｏｖｅｎ，Ｊ．，Ｍｏｏｉ，Ｗ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｎｓ，Ａ．（２００３）．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  Ｔｒｐ５３  ａｎｄ  Ｒｂ１  ｉｎ  ａ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４，１８１−１８９．
Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ａ．，Ｂｅｒｒｅｔｔ，Ｋ．Ｃ．，Ｋｃ，Ｕ．，Ｃｌａｉｒ，Ｐ．Ｍ．，Ｐｏｐ，Ｓ．Ｍ．，Ｃａｒｒ，Ｓ．Ｒ．，Ｗｉｔｔ，Ｂ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｏｌｉｖｅｒ，Ｔ．Ｇ．（２０１４）．  Ｓｏｘ２  ｃｏｏｐｅｒａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｌｋｂ１  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ８，４０−４９．
Ｏｌｉｖｅｒ，Ｔ．Ｇ．，Ｍｅｒｃｅｒ，Ｋ．Ｌ．，Ｓａｙｌｅｓ，Ｌ．Ｃ．，Ｂｕｒｋｅ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｎｄｕｓ，Ｄ．，Ｌｏｖｅｊｏｙ，Ｋ．Ｓ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｍ．Ｈ．，Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ａ．，Ｍｕ，Ｄ．，Ｐｏｗｅｒｓ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．  Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄａｍａｇｅ  ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２４，８３７−８５２．
Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｊ．Ｋ．，Ｌａｒｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｍ．Ｄ．，Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｊ．Ｘ．，Ｓｈａｍｅｓ，Ｄ．Ｓ．，Ｓａｔｏ，Ｍ．，Ｋｕｌｋａｒｎｉ，Ａ．，Ｗｉｓｔｕｂａ，ＩＩ，Ｇｉｒａｒｄ，Ｌ．，Ｍｉｎｎａ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．  ＮｅｕｒｏＤ１  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｖｉａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ＴｒｋＢ  ａｎｄ  ＮＣＡＭ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１０，６５２４−６５２９．
Ｏｔｔｏ，Ｔ．，Ｈｏｒｎ，Ｓ．，Ｂｒｏｃｋｍａｎｎ，Ｍ．，Ｅｉｌｅｒｓ，Ｕ．，Ｓｃｈｕｔｔｒｕｍｐｆ，Ｌ．，Ｐｏｐｏｖ，Ｎ．，Ｋｅｎｎｅｙ，Ａ．Ｍ．，Ｓｃｈｕｌｔｅ，Ｊ．Ｈ．，Ｂｅｉｊｅｒｓｂｅｒｇｅｎ，Ｒ．，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎ−Ｍｙｃ  ｉｓ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｕｒｏｒａ  Ａ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １５，６７−７８．
Ｐｅｉｆｅｒ，Ｍ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃｕｅｓｔａ，Ｌ．，Ｓｏｓ，Ｍ．Ｌ．，Ｇｅｏｒｇｅ，Ｊ．，Ｓｅｉｄｅｌ，Ｄ．，Ｋａｓｐｅｒ，Ｌ．Ｈ．，Ｐｌｅｎｋｅｒ，Ｄ．，Ｌｅｅｎｄｅｒｓ，Ｆ．，Ｓｕｎ，Ｒ．，Ｚａｎｄｅｒ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｋｅｙ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｄｒｉｖｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４４，１１０４−１１１０．
Ｐｉｅｔａｎｚａ，Ｍ．Ｃ．，Ｂｙｅｒｓ，Ｌ．Ａ．，Ｍｉｎｎａ，Ｊ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｒｕｄｉｎ，Ｃ．Ｍ．（２０１５）．  Ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ：  ｗｉｌｌ  ｒｅｃｅｎｔ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｌｅａｄ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ？  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２１，２２４４−２２５５．
Ｐｏｉｒｉｅｒ，Ｊ．Ｔ．，Ｄｏｂｒｏｍｉｌｓｋａｙａ，Ｉ．，Ｍｏｒｉａｒｔｙ，Ｗ．Ｆ．，Ｐｅａｃｏｃｋ，Ｃ．Ｄ．，Ｈａｎｎ，Ｃ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｒｕｄｉｎ，Ｃ．Ｍ．（２０１３）．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｔｒｏｐｉｓｍ  ｏｆ  Ｓｅｎｅｃａ  Ｖａｌｌｅｙ  ｖｉｒｕｓ  ｆｏｒ  ｖａｒｉａｎｔ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  １０５，１０５９−１０６５．
Ｐｏｉｒｉｅｒ，Ｊ．Ｔ．，Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｅ．Ｅ．，Ｃｏｎｎｉｓ，Ｎ．，Ｍｏｒｅｉｒａ，Ａ．Ｌ．，ｄｅ  Ｓｔａｎｃｈｉｎａ，Ｅ．，Ｈａｎｎ，Ｃ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｒｕｄｉｎ，Ｃ．Ｍ．（２０１５）．  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＥＺＨ２．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３４，５８６９−５８７８．
Ｐｏｌｌｅｙ，Ｅ．，Ｋｕｎｋｅｌ，Ｍ．，Ｅｖａｎｓ，Ｄ．，Ｓｉｌｖｅｒｓ，Ｔ．，Ｄｅｌｏｓｈ，Ｒ．，Ｌａｕｄｅｍａｎ，Ｊ．，Ｏｇｌｅ，Ｃ．，Ｒｅｉｎｈａｒｔ，Ｒ．，Ｓｅｌｂｙ，Ｍ．，Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）．  Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｒｅｅｎ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｄｒｕｇｓ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｔｓ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  １０８．
Ｒｅｋｈｔｍａｎ，Ｎ．（２０１０）．  Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ：  ａｎ  ｕｐｄａｔｅ．  Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  １３４，１６２８−１６３８．
Ｒｕｄｉｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｄｕｒｉｎｃｋ，Ｓ．，Ｓｔａｗｉｓｋｉ，Ｅ．Ｗ．，Ｐｏｉｒｉｅｒ，Ｊ．Ｔ．，Ｍｏｄｒｕｓａｎ，Ｚ．，Ｓｈａｍｅｓ，Ｄ．Ｓ．，Ｂｅｒｇｂｏｗｅｒ，Ｅ．Ａ．，Ｇｕａｎ，Ｙ．，Ｓｈｉｎ，Ｊ．，Ｇｕｉｌｌｏｒｙ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ＳＯＸ２  ａｓ  ａ  ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４４，１１１１−１１１６．
Ｓａｇｅ，Ｊ．，Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｇ．Ｊ．，Ａｔｔａｒｄｉ，Ｌ．Ｄ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．，Ｃｈｅｎ，Ｓ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂ．，Ｔｈｅｏｄｏｒｏｕ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｊａｃｋｓ，Ｔ．（２０００）．  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｒｅｅ  Ｒｂ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  Ｇ（１）ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １４，３０３７−３０５０．
Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｌ．Ｒ．，Ｂａｎｋｏｖｉｃｈ，Ａ．Ｊ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｃ．，Ａｕｊａｙ，Ｍ．Ａ．，Ｂｈｅｄｄａｈ，Ｓ．，Ｂｌａｃｋ，Ｋ．，Ｄｅｓａｉ，Ｒ．，Ｅｓｃａｒｐｅ，Ｐ．Ａ．，Ｈａｍｐｌ，Ｊ．，Ｌａｙｓａｎｇ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．  Ａ  ＤＬＬ３−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｅｒａｄｉｃａｔｅｓ  ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ７，３０２ｒａ１３６．
Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｂ．Ｅ．，Ｐａｒｋ，Ｋ．Ｓ．，Ｙｉｕ，Ｇ．，Ｃｏｎｋｌｉｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｌｉｎ，Ｃ．，Ｂｕｒｋｈａｒｔ，Ｄ．Ｌ．，Ｋａｒｎｅｚｉｓ，Ａ．Ｎ．，Ｓｗｅｅｔ−Ｃｏｒｄｅｒｏ，Ｅ．Ａ．，ａｎｄ  Ｓａｇｅ，Ｊ．（２０１０）．  Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｐ１３０  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７０，３８７７−３８８３．
Ｓｃｈｏｆｆｓｋｉ，Ｐ．，Ｂｅｓｓｅ，Ｂ．，Ｇａｕｌｅｒ，Ｔ．，ｄｅ  Ｊｏｎｇｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｃａｍｂｉａ，Ｇ．，Ｓａｎｔｏｒｏ，Ａ．，Ｄａｖｉｔｅ，Ｃ．，Ｊａｎｎｕｚｚｏ，Ｍ．Ｇ．，Ｐｅｔｒｏｃｃｉｏｎｅ，Ａ．，ａｎｄ  Ｄｅｌｏｒｄ，Ｊ．Ｐ．（２０１５）．  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｂｉｗｅｅｋｌｙ  ｉ．ｖ．  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｕｒｏｒａ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｄａｎｕｓｅｒｔｉｂ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｉｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｈｏｒｔｓ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ，ｏｖａｒｉａｎ，ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ，ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ，ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ：  ａ  ｍｕｌｔｉ−ｔｕｍｏｕｒ，ｍｕｌｔｉ−ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｓｔｕｄｙ．  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２６，５９８−６０７．
Ｓｅｍｅｎｏｖａ，Ｅ．Ａ．，Ｋｗｏｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｍｏｎｋｈｏｒｓｔ，Ｋ．，Ｓｏｎｇ，Ｊ．Ｙ．，Ｂｈａｓｋａｒａｎ，Ｒ．，Ｋｒｉｊｇｓｍａｎ，Ｏ．，Ｋｕｉｌｍａｎ，Ｔ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ｄ．，Ｂｕｉｋｈｕｉｓｅｎ，Ｗ．Ａ．，Ｓｍｉｔ，Ｅ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）．  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ＮＦＩＢ  Ｉｓ  ａ  Ｄｒｉｖｅｒ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｍａｒｋｓ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １６，６３１−６４３．
Ｓｅｍｅｎｏｖａ，Ｅ．Ａ．，Ｎａｇｅｌ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｎｓ，Ａ．（２０１５）．  Ｏｒｉｇｉｎｓ，ｇｅｎｅｔｉｃ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ，ａｎｄ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２９，１４４７−１４６２．
Ｓｏｓ，Ｍ．Ｌ．，Ｄｉｅｔｌｅｉｎ，Ｆ．，Ｐｅｉｆｅｒ，Ｍ．，Ｓｃｈｏｔｔｌｅ，Ｊ．，Ｂａｌｋｅ−Ｗａｎｔ，Ｈ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｃ．，Ｋｏｋｅｒ，Ｍ．，Ｒｉｃｈｔｅｒｓ，Ａ．，Ｈｅｙｎｃｋ，Ｓ．，Ｍａｌｃｈｅｒｓ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．  Ａ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎａｂｌｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｉｅｓ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０９，１７０３４−１７０３９．
Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｋ．Ｄ．，Ｐｒｏｏｓｔ，Ｎ．，Ｂｒｏｕｎｓ，Ｉ．，Ａｄｒｉａｅｎｓｅｎ，Ｄ．，Ｓｏｎｇ，Ｊ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｎｓ，Ａ．（２０１１）．  Ｃｅｌｌ  ｏｆ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ：  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒｐ５３  ａｎｄ  Ｒｂ１  ｉｎ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｍｏｕｓｅ  ｌｕｎｇ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １９，７５４−７６４．
Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ，Ｍ．，Ｈｏｗｉｅ，Ｈ．Ｌ．，Ｉｍａｋｕｒａ，Ｍ．，Ｗａｌｓｈ，Ｒ．Ｍ．，Ａｎｎｉｓ，Ｊ．Ｅ．，Ｃｈａｎｇ，Ａ．Ｎ．，Ｆｒａｚｉｅｒ，Ｊ．，Ｃｈａｕ，Ｂ．Ｎ．，Ｌｏｂｏｄａ，Ａ．，Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ＭＹＣ−ｄｒｉｖｅｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０９，９５４５−９５５０．
Ｔｒａｖｉｓ，Ｗ．Ｄ．（２００９）．  Ｌｕｎｇ  ｔｕｍｏｕｒｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４５  Ｓｕｐｐｌ  １，２５１−２６６．
Ｔｒａｖｉｓ，Ｗ．Ｄ．（２０１２）．  Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．  Ｍｏｄｅｒｎ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ：  ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎａｄｉａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ  ２５  Ｓｕｐｐｌ  １，Ｓ１８−３０．
Ｔｒａｖｉｓ，Ｗ．Ｄ．，Ｂｒａｍｂｉｌｌａ，Ｅ．，Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ａ．Ｇ．，Ｙａｔａｂｅ，Ｙ．，Ａｕｓｔｉｎ，Ｊ．Ｈ．，Ｂｅａｓｌｅｙ，Ｍ．Ｂ．，Ｃｈｉｒｉｅａｃ，Ｌ．Ｒ．，Ｄａｃｉｃ，Ｓ．，Ｄｕｈｉｇ，Ｅ．，Ｆｌｉｅｄｅｒ，Ｄ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．  Ｔｈｅ  ２０１５  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｕｎｇ  Ｔｕｍｏｒｓ：  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｓｉｎｃｅ  ｔｈｅ  ２００４  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｏｒａｃｉｃ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  １０，１２４３−１２６０．
Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｒ．Ｗ．，Ｏｄｅｄｒａ，Ｒ．，Ｈｅａｔｏｎ，Ｓ．Ｐ．，Ｗｅｄｇｅ，Ｓ．Ｒ．，Ｋｅｅｎ，Ｎ．Ｊ．，Ｃｒａｆｔｅｒ，Ｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｂｒａｄｙ，Ｍ．Ｃ．，Ｂｉｇｌｅｙ，Ａ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．  ＡＺＤ１１５２，ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ａｕｒｏｒａ  Ｂ  ｋｉｎａｓｅ，ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３，３６８２−３６８８．
Ｙａｎｇ，Ｄ．，Ｌｉｕ，Ｈ．，Ｇｏｇａ，Ａ．，Ｋｉｍ，Ｓ．，Ｙｕｎｅｖａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｉｓｈｏｐ，Ｊ．Ｍ．（２０１０）．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｅｔｈａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ＭＹＣ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｒｏｒａ−Ｂ  ｋｉｎａｓｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０７，１３８３６−１３８４１．
Ｂｅｎａｇｌｉａ，Ｔ．，Ｃｈａｕｖｅａｕ，Ｄ．，Ｈｕｎｔｅｒ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｄ．（２００９）．  ｍｉｘｔｏｏｌｓ：  Ａｎ  Ｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｆｉｎｉｔｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ｍｏｄｅｌｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ３２，１−２９．
Ｂｏｒｒｏｍｅｏ，Ｍ．Ｄ．，Ｓａｖａｇｅ，Ｔ．Ｋ．，Ｋｏｌｌｉｐａｒａ，Ｒ．Ｋ．，Ｈｅ，Ｍ．，Ａｕｇｕｓｔｙｎ，Ａ．，Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｊ．Ｋ．，Ｇｉｒａｒｄ，Ｌ．，Ｍｉｎｎａ，Ｊ．Ｄ．，Ｇａｚｄａｒ，Ａ．Ｆ．，Ｃｏｂｂ，Ｍ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）．  ＡＳＣＬ１  ａｎｄ  ＮＥＵＲＯＤ１  Ｒｅｖｅａｌ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｔｕｍｏｒｓ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｅ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １６，１２５９−１２７２．
Ｂｒｏｃｋｍａｎｎ，Ｍ．，Ｐｏｏｎ，Ｅ．，Ｂｅｒｒｙ，Ｔ．，Ｃａｒｓｔｅｎｓｅｎ，Ａ．，Ｄｅｕｂｚｅｒ，Ｈ．Ｅ．，Ｒｙｃａｋ，Ｌ．，Ｊａｍｉｎ，Ｙ．，Ｔｈｗａｙ，Ｋ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｓ．Ｐ．，Ｒｏｅｌｓ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．  Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｕｒｏｒａ−ａ  ｉｎｄｕｃｅ  ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎ−ｍｙｃ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２４，７５−８９．
Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃｕｅｓｔａ，Ｌ．，Ｓｕｎ，Ｒ．，Ｍｅｎｏｎ，Ｒ．，Ｇｅｏｒｇｅ，Ｊ．，Ｌｏｒｅｎｚ，Ｓ．，Ｍｅｚａ−Ｚｅｐｅｄａ，Ｌ．Ａ．，Ｐｅｉｆｅｒ，Ｍ．，Ｐｌｅｎｋｅｒ，Ｄ．，Ｈｅｕｃｋｍａｎｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｌｅｅｎｄｅｒｓ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｄａｔａ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １６，７．
Ｇｅｏｒｇｅ，Ｊ．，Ｌｉｍ，Ｊ．Ｓ．，Ｊａｎｇ，Ｓ．Ｊ．，Ｃｕｎ，Ｙ．，Ｏｚｒｅｔｉｃ，Ｌ．，Ｋｏｎｇ，Ｇ．，Ｌｅｅｎｄｅｒｓ，Ｆ．，Ｌｕ，Ｘ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃｕｅｓｔａ，Ｌ．，Ｂｏｓｃｏ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  ５２４，４７−５３．
Ｋｉｍ，Ｄ．Ｗ．，Ｗｕ，Ｎ．，Ｋｉｍ，Ｙ．Ｃ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｐ．Ｆ．，Ｂａｓｏｍ，Ｒ．，Ｋｉｍ，Ｄ．，Ｄｕｎｎ，Ｃ．Ｔ．，Ｌｅｅ，Ａ．Ｙ．，Ｋｉｍ，Ｋ．，Ｌｅｅ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｍｙｃｌ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｐｏｌ  Ｉ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ３０，１２８９−１２９９．
Ｌａｎｇｍｅａｄ，Ｂ．，Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．，Ｐｏｐ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．（２００９）．  Ｕｌｔｒａｆａｓｔ  ａｎｄ  ｍｅｍｏｒｙ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １０，Ｒ２５．
Ｐｅｉｆｅｒ，Ｍ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃｕｅｓｔａ，Ｌ．，Ｓｏｓ，Ｍ．Ｌ．，Ｇｅｏｒｇｅ，Ｊ．，Ｓｅｉｄｅｌ，Ｄ．，Ｋａｓｐｅｒ，Ｌ．Ｈ．，Ｐｌｅｎｋｅｒ，Ｄ．，Ｌｅｅｎｄｅｒｓ，Ｆ．，Ｓｕｎ，Ｒ．，Ｚａｎｄｅｒ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｋｅｙ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｄｒｉｖｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４４，１１０４−１１１０．
Ｐｏｌｌｅｙ，Ｅ．，Ｋｕｎｋｅｌ，Ｍ．，Ｅｖａｎｓ，Ｄ．，Ｓｉｌｖｅｒｓ，Ｔ．，Ｄｅｌｏｓｈ，Ｒ．，Ｌａｕｄｅｍａｎ，Ｊ．，Ｏｇｌｅ，Ｃ．，Ｒｅｉｎｈａｒｔ，Ｒ．，Ｓｅｌｂｙ，Ｍ．，Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）．  Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｒｅｅｎ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｄｒｕｇｓ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｔｓ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  １０８．
Ｒｅｄｄｙ，Ｔ．Ｅ．，Ｐａｕｌｉ，Ｆ．，Ｓｐｒｏｕｓｅ，Ｒ．Ｏ．，Ｎｅｆｆ，Ｎ．Ｆ．，Ｎｅｗｂｅｒｒｙ，Ｋ．Ｍ．，Ｇａｒａｂｅｄｉａｎ，Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．（２００９）．  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １９，２１６３−２１７１．
Ｒｕｄｉｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｄｕｒｉｎｃｋ，Ｓ．，Ｓｔａｗｉｓｋｉ，Ｅ．Ｗ．，Ｐｏｉｒｉｅｒ，Ｊ．Ｔ．，Ｍｏｄｒｕｓａｎ，Ｚ．，Ｓｈａｍｅｓ，Ｄ．Ｓ．，Ｂｅｒｇｂｏｗｅｒ，Ｅ．Ａ．，Ｇｕａｎ，Ｙ．，Ｓｈｉｎ，Ｊ．，Ｇｕｉｌｌｏｒｙ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ＳＯＸ２  ａｓ  ａ  ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４４，１１１１−１１１６．
Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｂ．Ｅ．，Ｐａｒｋ，Ｋ．Ｓ．，Ｙｉｕ，Ｇ．，Ｃｏｎｋｌｉｎ，Ｊ．Ｆ．，Ｌｉｎ，Ｃ．，Ｂｕｒｋｈａｒｔ，Ｄ．Ｌ．，Ｋａｒｎｅｚｉｓ，Ａ．Ｎ．，Ｓｗｅｅｔ−Ｃｏｒｄｅｒｏ，Ｅ．Ａ．，ａｎｄ  Ｓａｇｅ，Ｊ．（２０１０）．  Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｐ１３０  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７０，３８７７−３８８３．
Ｓｏｓ，Ｍ．Ｌ．，Ｄｉｅｔｌｅｉｎ，Ｆ．，Ｐｅｉｆｅｒ，Ｍ．，Ｓｃｈｏｔｔｌｅ，Ｊ．，Ｂａｌｋｅ−Ｗａｎｔ，Ｈ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｃ．，Ｋｏｋｅｒ，Ｍ．，Ｒｉｃｈｔｅｒｓ，Ａ．，Ｈｅｙｎｃｋ，Ｓ．，Ｍａｌｃｈｅｒｓ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）．  Ａ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎａｂｌｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｉｅｓ  ｉｎ  ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０９，１７０３４−１７０３９．
Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ａ．，Ｔａｍａｙｏ，Ｐ．，Ｍｏｏｔｈａ，Ｖ．Ｋ．，Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｓ．，Ｅｂｅｒｔ，Ｂ．Ｌ．，Ｇｉｌｌｅｔｔｅ，Ｍ．Ａ．，Ｐａｕｌｏｖｉｃｈ，Ａ．，Ｐｏｍｅｒｏｙ，Ｓ．Ｌ．，Ｇｏｌｕｂ，Ｔ．Ｒ．，Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．  Ｇｅｎｅ  ｓｅｔ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ：  ａ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０２，１５５４５−１５５５０．
Ｔａｌｅｖｉｃｈ，Ｅ．，Ｓｈａｉｎ，Ａ．Ｈ．，Ｂｏｔｔｏｎ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｂａｓｔｉａｎ，Ｂ．Ｃ．（２０１６）．  ＣＮＶｋｉｔ：  Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＰＬｏＳ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １２，ｅ１００４８７３．
Ｔｅａｍ，Ｒ．Ｃ．（２０１４  ）．  Ｒ：  Ａ  ｌａｎｇｕａｇｅ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．．Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／．
Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂ．Ａ．，Ｐｅｒｔｅａ，Ｇ．，Ｍｏｒｔａｚａｖｉ，Ａ．，Ｋｗａｎ，Ｇ．，ｖａｎ  Ｂａｒｅｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．，Ｗｏｌｄ，Ｂ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｐａｃｈｔｅｒ，Ｌ．（２０１０）．  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｕｎａｎｎｏｔａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ａｎｄ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２８，５１１−５１５．
Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｈ．（１９６３）．Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  Ｇｒｏｕｐｉｎｇ  ｔｏ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅ  ａｎ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ５８，２３６−２４４．
Ｗｕ，Ｔ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｎａｃｕ，Ｓ．（２０１０）．Ｆａｓｔ  ａｎｄ  ＳＮＰ−ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ａｎｄ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｉｎ  ｓｈｏｒｔ  ｒｅａｄｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２６，８７３−８８１．
Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｌｉｕ，Ｔ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｅｅｃｋｈｏｕｔｅ，Ｊ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．，Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ｅ．，Ｎｕｓｂａｕｍ，Ｃ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｒ．Ｍ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．，Ｌｉ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．Ｍｏｄｅｌ−ｂａｓｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ（ＭＡＣＳ）．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  ９，Ｒ１３７．
【図１−１】
2020503845.tif 000004
【図１−２】
2020503845.tif 000005
【図１−３】
2020503845.tif 000006
【図２Ａ】
2020503845.tif 000007
【図２Ｂ】
2020503845.tif 000008
【図２Ｃ】
2020503845.tif 000009
【図２Ｄ】
2020503845.tif 000010
【図２Ｅ】
2020503845.tif 000011
【図３−１】
2020503845.tif 000012
【図３−２】
2020503845.tif 000013
【図３−３】
2020503845.tif 000014
【図３−４】
2020503845.tif 000015
【図３−５】
2020503845.tif 000016
【図４−１】
2020503845.tif 000017
【図４−２】
2020503845.tif 000018
【図５−１】
2020503845.tif 000019
【図５−２】
2020503845.tif 000020
【図５−３】
2020503845.tif 000021
【図６−１】
2020503845.tif 000022
【図６−２】
2020503845.tif 000023
【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
2020503845.tif 000030
【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図８−１】
2020503845.tif 000034
【図８−２】
2020503845.tif 000035
【図８−３】
2020503845.tif 000036
【図８−４】
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【図８−５】
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【図９Ａ】
2020503845.tif 000039
【図９Ｂ】
2020503845.tif 000040
【図９Ｃ】
2020503845.tif 000041
【図１０−１】
2020503845.tif 000042
【図１０−２】
2020503845.tif 000043
【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2020503845.tif 000058
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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