(57)【要約】  本開示は、細胞透過性抗ＤＮＡ結合タンパク質に関する。これらの結合タンパク質を含む組成物は、作用物質を細胞に送達するために、及びがんなどの疾患を処置するために有用であり得る。
2020527355.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原結合ドメインを有する細胞透過性抗ＤＮＡ結合タンパク質であって、前記抗原結合ドメインがＤＮＡに結合し、かつ
−  配列番号１に示されているとおりの相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号２または配列番号３に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、
−  配列番号５または配列番号６に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、前記細胞透過性抗ＤＮＡ結合タンパク質。
【請求項２】
抗原結合ドメインを有する細胞透過性抗ＤＮＡ結合タンパク質であって、前記抗原結合ドメインがＤＮＡに結合し、かつ
−  配列番号９に示されているとおりの相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１０または配列番号１１に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、
−  配列番号１３または配列番号１４に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、前記細胞透過性抗ＤＮＡ結合タンパク質。
【請求項３】
（ｉ）配列番号１７〜２３のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨ、
（ｉｉ）配列番号２４〜２９のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬ、または
（ｉｉｉ）配列番号１７〜２３のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨ及び配列番号２４〜２９のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬ
を含む、請求項１または請求項２に記載の結合タンパク質。
【請求項４】
前記ＶＨ及びＶＬがリンカーによって分離されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項５】
前記リンカーが配列番号３０に示されている配列を含む、請求項４に記載の結合タンパク質。
【請求項６】
前記ＶＨ及びＶＬが単一のポリペプチド鎖中にある、請求項１〜５のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項７】
（ｉ）一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ジ−ｓｃＦｖ）、
（ｉｉｉ）三量体ｓｃＦｖ（トリ−ｓｃＦｖ）、
（ｉｖ）抗体の定常領域、Ｆｃまたは重鎖定常ドメインＣＨ２及び／またはＣＨ３に連結している（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のいずれか１つ
である、請求項６に記載の結合タンパク質。
【請求項８】
ｓｃＦｖである、請求項６に記載の結合タンパク質。
【請求項９】
ジ−ｓｃＦｖである、請求項６に記載の結合タンパク質。
【請求項１０】
前記ｓｃＦｖがリンカーによって分離されている、請求項９に記載の結合タンパク質。
【請求項１１】
前記リンカーが、配列番号３１に示されている配列を含む、請求項１０に記載の結合タンパク質。
【請求項１２】
前記ＶＨ及びＶＬが別々のポリペプチド鎖中にある、請求項１〜５のいずれか１項に記載の結合タンパク質。
【請求項１３】
（ｉ）ダイアボディ、
（ｉｉ）トリアボディ、
（ｉｉｉ）テトラボディ、
（ｉｖ）Ｆａｂ、
（ｖ）Ｆ（ａｂ’）２、
（ｖｉ）Ｆｖ、
（ｖｉｉ）抗体の定常領域、Ｆｃまたは重鎖定常ドメインＣＨ２及び／またはＣＨ３に連結している（ｉ）〜（ｖｉ）の１つ、または、
（ｖｉｉｉ）インタクトな抗体
である、請求項１２に記載の結合タンパク質。
【請求項１４】
抗原結合ドメインを有する細胞透過性抗ＤＮＡ  Ｆｖ断片であって、前記抗原結合ドメインがＤＮＡに結合し、かつ
−  配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号２または配列番号３に示されているとおりのＣＤＲ２、配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号５または配列番号６に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬ、
−  配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１０または配列番号１１に示されているとおりのＣＤＲ２、配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号１３または配列番号１４に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬ、
−  配列番号１７〜２３のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨ及び配列番号２４〜２９のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬ
のうちの少なくとも１つを含む、前記細胞透過性抗ＤＮＡ  Ｆｖ断片。
【請求項１５】
ジ−ｓｃＦｖである、請求項１４に記載の細胞透過性抗ＤＮＡ  Ｆｖ断片。
【請求項１６】
配列番号３２〜４７のいずれか１つに示されているとおりのアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の細胞透過性抗ＤＮＡ  Ｆｖ断片。
【請求項１７】
別の化合物にコンジュゲートされている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の結合タンパク質または請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のＦｖ断片。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に定義される結合タンパク質またはＦｖ断片をコードする核酸。
【請求項１９】
請求項１８に定義される核酸を含む発現構築物。
【請求項２０】
請求項１〜１７のいずれか１項に定義される結合タンパク質もしくはＦｖ断片、請求項１８に定義される核酸または請求項２０に記載の発現ベクターを発現する単離または組み換え細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１７のいずれか１項に定義される結合タンパク質またはＦｖ断片と、薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項２２】
対象においてがんを処置する方法であって、前記対象に、有効量の請求項１〜１７のいずれか１項に定義される結合タンパク質もしくはＦｖ断片または請求項２１に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項２３】
前記がんが神経膠芽細胞腫である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
がんを処置するための医薬品の製造における、請求項１〜１７のいずれか１項に定義される結合タンパク質もしくはＦｖ断片または請求項２１に記載の組成物の使用。
【請求項２５】
がんの処置において使用するための、請求項１〜１７のいずれか１項に定義される結合タンパク質もしくはＦｖ断片または請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
がんの処置を必要とする対象においてがんを処置する方法であって、前記対象に、請求項１〜１７のいずれか１項に定義される結合タンパク質またはＦｖ断片及びＰＡＲＰ阻害薬を投与することを含む、前記方法。
【請求項２７】
前記ＰＡＲＰ阻害薬がオラパリブである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記がんが実質的にＨＤＲ欠損している、請求項２６または請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記がんがＰＡＲＰ阻害に対して抵抗性を有する、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記がんが実質的にＢＲＣＡ２欠損している、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記がんが実質的にＰＴＥＮ欠損している、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記がんが、結腸癌、脳癌、前立腺、卵巣、乳房、子宮内膜、黒色腫、または膵臓の癌である、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記がんが三重陰性乳癌である、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記がんが神経膠芽細胞腫である、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、細胞透過性抗ＤＮＡ結合タンパク質に関する。これらの結合タンパク質を含む組成物は、作用物質を細胞に送達するために、及びがんなどの疾患を処置するために有用であり得る。
【背景技術】
【０００２】
ヒト疾患のための治療薬としての細胞透過性抗ＤＮＡ結合タンパク質の開発は、特に、ＤＮＡ修復経路を選択的に損なう、及び／または様々な治療的ペイロードを標的細胞に送達するそれらの能力によって、多大な臨床的可能性を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、改善された細胞透過性抗ＤＮＡ結合タンパク質が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、核透過を驚くほど増大させる細胞透過性抗ＤＮＡ結合タンパク質の修飾を同定した。場合によっては、これらの修飾はまた、物理的安定性を改善し得る、及び免疫原性を低下させ得る。
【０００５】
したがって、第１の例では、本開示は、抗原結合ドメインを有する細胞透過性抗ＤＮＡ結合タンパク質であって、前記抗原結合ドメインが、ＤＮＡに結合する、または特異的に結合し、かつ配列番号１に示されているとおりの相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号２または配列番号３に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有する重鎖可変領域（ＶＨ）ならびに配列番号５または配列番号６に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、前記細胞透過性抗ＤＮＡ結合タンパク質に関する。この例では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔを使用して定義されている。
【０００６】
別の例では、本開示は、抗原結合ドメインを有する細胞透過性抗ＤＮＡ結合タンパク質であって、前記抗原結合ドメインが、ＤＮＡに結合する、または特異的に結合し、かつ：
−  配列番号９に示されているとおりの相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１０または配列番号１１に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有する重鎖可変領域（ＶＨ）、
−  配列番号１３または配列番号１４に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、前記細胞透過性抗ＤＮＡ結合タンパク質に関する。この例では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴを使用して定義されている。
【０００７】
別の例では、本開示による結合タンパク質は、
（ｉ）配列番号１７〜２３のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨ、
（ｉｉ）配列番号２４〜２９のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬ、または
（ｉｉｉ）配列番号１７〜２３のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨ及び配列番号２４〜２９のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬ
を含む。例えば、結合タンパク質は、配列番号１７〜２３のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含み得る。別の例では、結合タンパク質は、配列番号２４〜２９のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含み得る。別の例では、結合タンパク質は、配列番号１７〜２３のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨ及び配列番号２４〜２９のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含み得る。
【０００８】
別の例では、ＶＨ及びＶＬは、リンカーによって分離されている。例えば、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み得る。別の例では、リンカーは、配列番号３０に示されているとおりのアミノ酸配列を含む。
【０００９】
一例では、ＶＨ及びＶＬは、単一のポリペプチド鎖中にある。例えば、結合タンパク質は、
（ｉ）一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ジ−ｓｃＦｖ）、
（ｉｉｉ）三量体ｓｃＦｖ（トリ−ｓｃＦｖ）、
（ｉｖ）抗体の定常領域、Ｆｃまたは重鎖定常ドメインＣＨ２及び／またはＣＨ３に連結している（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のいずれか１つ
であってよい。例えば、結合タンパク質は、ジ−ｓｃＦｖであってもよい。この例では、ｓｃＦｖは、リンカーによって分離されていてもよい。例えば、リンカーは、配列番号３１に示されているとおりのアミノ酸配列を含み得る。
【００１０】
別の例では、ＶＨ及びＶＬは、別々のポリペプチド鎖中にある。例えば、結合タンパク質は、
（ｉ）ダイアボディ、
（ｉｉ）トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、
（ｉｉｉ）テトラボディ、
（ｉｖ）Ｆａｂ、
（ｖ）Ｆ（ａｂ’）２、
（ｖｉ）Ｆｖ、
（ｖｉｉ）抗体の定常領域、Ｆｃまたは重鎖定常ドメインＣＨ２及び／またはＣＨ３に連結している（ｉ）〜（ｖｉ）の１つ、または、
（ｖｉｉｉ）インタクトな抗体
であり得る。
【００１１】
したがって、ＦｖのＶＨ及びＶＬは、単一のペプチド鎖（例えば、ｓｃＦｖ）から形成され得るか、または２つの別々のペプチド鎖から形成され得る。
【００１２】
一例では、結合タンパク質は、ヒト化されている。
【００１３】
別の例では、本開示は、抗原結合ドメインを有する細胞透過性抗ＤＮＡ  Ｆｖ断片であって、前記抗原結合ドメインが、ＤＮＡに結合する、または特異的に結合し、かつ
−  配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号２または配列番号３に示されているとおりのＣＤＲ２、配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号５または配列番号６に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬ、
−  配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１０または配列番号１１に示されているとおりのＣＤＲ２、配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号１３または配列番号１４に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬ、
−  配列番号１７〜２３のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨ及び配列番号２４〜２９のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬ
のうちの少なくとも１つを含む、前記細胞透過性抗ＤＮＡ  Ｆｖ断片に関する。この例では、Ｆｖ断片は、ジ−ｓｃＦｖであってもよい。一例では、Ｆｖ断片は、配列番号３２〜４７のいずれか１つに示されているとおりのアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、Ｆｖ断片は、配列番号４１に示されているとおりのアミノ酸配列を含んでもよい。
【００１４】
一部の実施形態では、Ｆｖは、ネイキッドである。別の例では、Ｆｖ断片は、別の化合物にコンジュゲートされていてもよい。
【００１５】
一例では、Ｆｖは、ヒト化されている。例えば、Ｆｖは、ヒト化ジ−ｓｃＦｖであってもよい。
【００１６】
別の例では、本開示は、上で言及した結合タンパク質をコードする核酸配列に関する。例示的な核酸配列は、配列番号５１〜６６に示されている。本開示の核酸配列は、タンパク質を合成する発現レベルを上昇させるためにコドン最適化され得る。別の例では、本開示は、本開示による核酸配列を含む発現ベクターに関する。例えば、発現ベクターは、配列番号５１〜６６のいずれか１つに示されている核酸配列またはそのコドン最適化配列を含んでもよい。
【００１７】
別の例では、本開示は、上で言及した結合タンパク質、核酸もしくはベクター、またはそのコドン最適化配列を含む宿主細胞に関する。
【００１８】
別の例では、本開示は、がんを処置する方法に関する。例えば、対象に、配列番号３２、３６、４１または４３のいずれか１つに示されているとおりのアミノ酸配列を含むＦｖ断片を投与することを含む、がんを処置する方法。例えば、配列番号３２に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＦｖ断片を対象に投与してもよい。別の例では、配列番号３６に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＦｖ断片を対象に投与してもよい。別の例では、配列番号４１に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＦｖ断片を対象に投与してもよい。別の例では、配列番号４３に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＦｖ断片を対象に投与してもよい。一例では、がんは、結腸癌、脳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、乳癌、または膵臓癌である。例えば、がんは、結腸癌または脳癌であってもよい。一例では、がんは脳癌である。一例では、脳癌は神経膠芽細胞腫である。
【００１９】
別の例では、本開示は、がんを処置するための医薬品の製造における、本開示によるＦｖ断片、組成物、ベクターまたは宿主細胞などの結合タンパク質の使用に関する。別の例では、本開示は、がんの処置において使用するための、本開示によるＦｖ断片、組成物、ベクターまたは宿主細胞などの結合タンパク質に関する。
【００２０】
下の実験結果も、本明細書に開示の結合タンパク質が、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害薬と共に作用して、がん細胞を死滅させ得ることを例証している。したがって、別の例では、本開示は、がんの処置を必要とする対象においてがんを処置する方法であって、対象に、本明細書に定義の結合タンパク質またはＦｖ断片と、ＰＡＲＰ阻害薬とを投与することを含む、前記方法に関する。
【００２１】
一例では、ＰＡＲＰ阻害薬は、オラパリブである。
【００２２】
一例では、がんは、実質的にＨＤＲ欠損している。別の例では、がんは、実質的にＢＲＣＡ２欠損している。別の例では、がんは、実質的にＰＴＥＮ欠損している。一例では、がんは、結腸癌、脳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、乳癌、または膵臓癌である。例えば、がんは、結腸癌または脳癌であってもよい。一例では、がんは脳癌である。一例では、脳癌は神経膠芽細胞腫である。一例では、がんはＰＡＲＰ阻害に対して抵抗性を有する。例えば、がんは、オラパリブでの処置に対して抵抗性があってもよい。別の例では、がんは三重陰性乳癌である。
【００２３】
別の例では、本開示は、本明細書に定義の結合タンパク質またはＦｖ断片と、ＰＡＲＰ阻害薬とを含む治療用組み合わせであって、同時または連続投与で与えられる、前記治療用組み合わせに関する。別の例では、本開示は、
−  配列番号４１のＣＤＲを含む結合タンパク質もしくはＦｖ、または、
−  配列番号４１に示されているアミノ酸配列を含む結合タンパク質と、
ＰＡＲＰ阻害薬とを含む治療用組み合わせであって、同時または連続投与で与えられる、前記治療用組み合わせに関する。例えば、結合タンパク質またはＦｖは、配列番号１、３及び４に示されているとおりの重鎖ＣＤＲならびに配列番号６、７及び８に示されているとおりの軽鎖ＣＤＲを含み得る。これらの例では、治療用組み合わせを、がんを処置するために使用してもよい。さらに、これらの例では、ＰＡＲＰ阻害薬はオラパリブであってよい。
【００２４】
本明細書のいずれの例も、別段に特に述べられていない限り、必要な変更を加えて、いずれの他の例にも当てはまると解釈されるものとする。
【００２５】
本開示は、本明細書に記載の具体的な実施例によって範囲を限定されることはなく、それらは、例示の目的のために意図されているにすぎない。機能的に均等な生成物、組成物及び方法は明らかに、本明細書に記載のとおり、本開示の範囲内である。
【００２６】
本明細書を通じて、別段に具体的に述べられていない限り、または別段に文脈が必要としていない限り、単一のステップ、物質組成、ステップの群または物質組成の群についての言及は、それらのステップ、物質組成、ステップの群または物質組成の群のうちの１つ及び複数（すなわち１つまたは複数）を包含すると解釈されることとする。
【００２７】
本明細書において下記では、本開示を、次の非限定的実施例に従って、かつ添付の図面を参照することによって記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】還元型及び変性バリアントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す画像である。
【図２】非還元型バリアントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す画像である。
【図３】核透過のアルカリホスファターゼベースの検査の結果を示す画像である。
【図４】核透過のアルカリホスファターゼベースの検査の定量分析を示すプロットである。
【図５−１】核透過のアルカリホスファタゼ−ベースの検査の定量分析のヒストグラムである。
【図５−２】核透過のアルカリホスファタゼ−ベースの検査の定量分析のヒストグラムである。
【図６】核透過の免疫蛍光ベースの検査の結果を示す画像である。
【図７】核透過の免疫蛍光ベースの検査の定量分析を示すプロットである。
【図８】パネルＡは、ＰＴＥＮ有能及びＰＴＥＮ欠損がん細胞におけるＤＮＡ損傷の蓄積を示す例示的な画像である。パネルＢは、ＰＴＥＮ有能及びＰＴＥＮ欠損がん細胞におけるＤＮＡ損傷の蓄積を示すヒストグラムである。
【図９】ＰＴＥＮ欠損がん細胞の細胞生存率を示すヒストグラムである。
【図１０】パネルＡは、ＢＲＣＡ２有能及びＢＲＣＡ２欠損がん細胞におけるＤＮＡ損傷の蓄積を示す例示的な画像である。パネルＢは、ＢＲＣＡ２有能及びＢＲＣＡ２欠損がん細胞におけるＤＮＡ損傷の蓄積を示すヒストグラムである。
【図１１】ジ−ｓｃＦｖ（配列番号４１）は、ＨＤＲ欠損ＤＬＤ−１結腸癌細胞核を透過する。
【図１２】ジ−ｓｃＦｖ（配列番号４１）は、ＨＤＲ欠損ＭＣＦ−７乳癌細胞核を透過する。
【図１３】ＨＤＲ欠損がん細胞においてジ−ｓｃＦｖ（配列番号４１）及びＰＡＲＰ阻害薬によって媒介される、相加を上回る細胞死（＊ｐ＜０．０５、単独のオラパリブまたはジ−ｓｃＦｖと比較）。
【図１４】ジ−ｓｃＦｖ（配列番号４１）は、一次ヒト神経膠芽細胞腫細胞を死滅させる。
【図１５】ジ−ｓｃＦｖ（配列番号４１）は、ヒト神経膠芽細胞腫球を透過し（Ａ）、かつスフェア体積を時間依存的（Ｂ）に、かつ用量依存的（Ｃ）に縮小させる。
【図１６】神経膠芽細胞腫の同所マウスモデルにおけるジ−ｓｃＦｖ（配列番号４１）のインビボ評価である。ａ）対照またはジ−ｓｃＦｖ（配列番号４１）で処置されたマウスからの代表的なＨ＆Ｅ染色脳切片及び対応する面積定量化（＊Ｐ＜０．０４、ｎ＝３）。ｂ）ＴＵＮＥＬ染色の代表的な顕微鏡写真、及び対応するＴＵＮＥＬ陽性細胞のパーセンテージ。＊は、一元ＡＮＯＶＡ検定によって決定されたＰ≦０．０５を示す。ｃ）腫瘍及び隣接脳組織においてジ−ｓｃＦｖ（配列番号４１）を比較するためのプロテインＬベースの免疫染色。ｄ）生存試験におけるマウスの体重（グラム）プロファイル（ｎ＝７）。ｅ）対照ＰＢＳ対ジ−ｓｃＦｖ（配列番号４１）処置アームでの生存データ（ｎ＝７、Ｐ＝０．０２、マンテル・コックス検定）。
【図１７】フォーカス蓄積に対するジ−ｓｃＦｖ（配列番号４１）の効果。ＨＤＲ欠損ＤＬＤ１及びＵ２５１細胞において、２４時間のＰＡＴ−ＤＸ１及び併用処理（複数可）後に、Ｐ５３ＢＰ１陽性細胞のパーセンテージが上昇した。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
配列表の要点
配列番号１  −  重鎖ＣＤＲ１  ＫＡＢＡＴ
配列番号２  −  重鎖ＣＤＲ２（バリアント２〜４、６〜８、１０〜１２）ＫＡＢＡＴ
配列番号３  −  重鎖ＣＤＲ２（バリアント１３〜１９）ＫＡＢＡＴ
配列番号４  −  重鎖ＣＤＲ３  ＫＡＢＡＴ
配列番号５  −  軽鎖ＣＤＲ１（バリアント２〜４、６〜８、１０〜１２）ＫＡＢＡＴ
配列番号６  −  軽鎖ＣＤＲ１（バリアント１３〜１９）ＫＡＢＡＴ
配列番号７  −  軽鎖ＣＤＲ２  ＫＡＢＡＴ
配列番号８  −  軽鎖ＣＤＲ３  ＫＡＢＡＴ
配列番号９  −  重鎖ＣＤＲ１  ＩＭＧＴ
配列番号１０  −  重鎖ＣＤＲ２（バリアント２〜４、６〜８、１０〜１２）ＩＭＧＴ
配列番号１１  −  重鎖ＣＤＲ２（バリアント１３〜１９）ＩＭＧＴ
配列番号１２  −  重鎖ＣＤＲ３  ＩＭＧＴ
配列番号１３  −  軽鎖ＣＤＲ１（バリアント２〜４、６〜８、１０〜１２）ＩＭＧＴ
配列番号１４  −  軽鎖ＣＤＲ１（バリアント１３〜１９）ＩＭＧＴ
配列番号１５  −  軽鎖ＣＤＲ２  ＩＭＧＴ
配列番号１６  −  軽鎖ＣＤＲ３  ＩＭＧＴ
配列番号１７  −  重鎖可変領域（バリアント２、６及び１０）
配列番号１８  −  重鎖可変領域（バリアント３、７及び１１）
配列番号１９  −  重鎖可変領域（バリアント４、８及び１２）
配列番号２０  −  重鎖可変領域（バリアント６及び１０）
配列番号２１  −  重鎖可変領域（バリアント１３、１６及び１９）
配列番号２２  −  重鎖可変領域（バリアント１４及び１７）
配列番号２３  −  重鎖可変領域（バリアント１５及び１８）
配列番号２４  −  軽鎖可変領域（バリアント２、３及び４）
配列番号２５  −  軽鎖可変領域（バリアント６、７及び８）
配列番号２６  −  軽鎖可変領域（バリアント１０、１１及び１２）
配列番号２７  −  軽鎖可変領域（バリアント１３、１４及び１５）
配列番号２８  −  軽鎖可変領域（バリアント１６、１７及び１８）
配列番号２９  −  軽鎖可変領域（バリアント１９）
配列番号３０  −  リンカー配列１
配列番号３１  −  リンカー配列２
配列番号３２  −  バリアント２
配列番号３３  −  バリアント３
配列番号３４  −  バリアント４
配列番号３５  −  バリアント６
配列番号３６  −  バリアント７
配列番号３７  −  バリアント８
配列番号３８  −  バリアント１０
配列番号３９  −  バリアント１１
配列番号４０  −  バリアント１２
配列番号４１  −  バリアント１３
配列番号４２  −  バリアント１４
配列番号４３  −  バリアント１５
配列番号４４  −  バリアント１６
配列番号４５  −  バリアント１７
配列番号４６  −  バリアント１８
配列番号４７  −  バリアント１９
配列番号４８  −  重鎖可変領域マウス（Ｄ３１Ｎ）抗ＤＮＡ結合抗体
配列番号４９  −  軽鎖可変領域マウス（Ｄ３１Ｎ）抗ＤＮＡ結合抗体
配列番号５０  −（Ｄ３１Ｎ）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓから産生されたマウス原型
配列番号５１  −  ＤＮＡ配列バリアント２
配列番号５２  −  ＤＮＡ配列バリアント３
配列番号５３  −  ＤＮＡ配列バリアント４
配列番号５４  −  ＤＮＡ配列バリアント６
配列番号５５  −  ＤＮＡ配列バリアント７
配列番号５６  −  ＤＮＡ配列バリアント８
配列番号５７  −  ＤＮＡ配列バリアント１０
配列番号５８  −  ＤＮＡ配列バリアント１１
配列番号５９  −  ＤＮＡ配列バリアント１２
配列番号６０  −  ＤＮＡ配列バリアント１３
配列番号６１  −  ＤＮＡ配列バリアント１４
配列番号６２  −  ＤＮＡ配列バリアント１５
配列番号６３  −  ＤＮＡ配列バリアント１６
配列番号６４  −  ＤＮＡ配列バリアント１７
配列番号６５  −  ＤＮＡ配列バリアント１８
配列番号６６  −  ＤＮＡ配列バリアント１９
配列番号６７  −（ＧＧＧＧＳ）３リンカー
配列番号６８  −  ３Ｅ１０ヒトＩｇＧ１  Ｌ２３４５Ａ／Ｌ２３５Ａ重鎖全長配列
配列番号６９  −  ３Ｅ１０ヒトＩｇＧ１定常重領域１
配列番号７０  −  ３Ｅ１０ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域
配列番号７１  −  ３Ｅ１０ヒトＩｇＧ１  Ｌ２３４５Ａ／Ｌ２３５Ａ定常重領域２
配列番号７２  −  ３Ｅ１０ヒトＩｇＧ１定常重領域３
配列番号７３  −  ３Ｅ１０ヒトＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｄ重鎖全長配列
配列番号７４  −  ３Ｅ１０ヒトＩｇＧ１  Ｎ２９７Ｄ定常重領域２
配列番号７５  −  ３Ｅ１０ヒトＩｇＧ１  Ｌ２３４５Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｎ２９７Ｄ重鎖全長配列
配列番号７６  −  ３Ｅ１０ヒトＩｇＧ１  Ｌ２３４５Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｎ２９７Ｄ定常重領域２
配列番号７７  −  未修飾定常重鎖領域２
配列番号７８  −  軽鎖全長配列
【００３０】
本発明の詳細な説明
一般的技術及び選択定義
別段に特に定義されていない限り、本明細書で使用されている専門及び科学用語はすべて、当技術分野（例えば、分子生物学、生化学、抗体、一本鎖可変断片などの抗体断片、及び臨床研究）における当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有すると解釈されることとする。
【００３１】
「細胞透過（性）」という用語は、本開示の文脈では、生哺乳類細胞の核に輸送されて、ＤＮＡ（例えば、一本鎖及び／または二本鎖ＤＮＡ）に結合する抗原結合断片などの抗ＤＮＡ結合タンパク質を指すために使用される。一例では、細胞透過性抗ＤＮＡ結合タンパク質は、担体またはコンジュゲートの援助なしに、細胞の核に輸送される。
【００３２】
「抗ＤＮＡ結合タンパク質」という用語は、本開示の文脈では、ＤＮＡに結合し得るタンパク質を指すために使用される。例示的な結合タンパク質には、免疫グロブリン、抗体及び抗原結合断片が含まれる。結合タンパク質の他の例は、下で論述する。
【００３３】
「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリンドメインを含む任意の抗ＤＮＡ結合タンパク質を含むと理解されるであろう。例示的な免疫グロブリンは、抗体である。「免疫グロブリン」という用語に包含される追加のタンパク質には、ドメイン抗体、ラクダ科動物抗体及び軟骨魚類に由来する抗体（すなわち、免疫グロブリン新抗原受容体（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＩｇＮＡＲ））が含まれる。一般に、ラクダ科動物抗体及びＩｇＮＡＲは、ＶＨを含むがＶＬを欠き、多くの場合に、重鎖免疫グロブリンと称される。他の「免疫グロブリン」には、Ｔ細胞受容体が含まれる。
【００３４】
「抗体」という用語は、本開示の文脈では、特定の抗原と免疫学的に反応性な免疫グロブリン分子を指すために使用され、ポリクローナル及びモノクローナル抗体の両方を含む。この用語にはまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）及びヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）などの遺伝子操作された形態が含まれる。「抗体」という用語にはまた、抗原結合能を有する断片（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）、Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）に論述されているとおりのＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ及びｒＩｇＧ）を含む抗体の抗原結合形態が含まれる。この用語は、組み換え一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、さらにはその二価（ジ−ｓｃＦｖ）及び三価（トリ−ｓｃＦＶ）形態を指すためにも使用される。抗体という用語にはまた、二価または二重特異性分子、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディが含まれる。二価及び二重特異性分子の例は、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：１５４７、Ｐａｃｋ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：１５７９、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ｓｕｐｒａ、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．：５３６８、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ６：７８１、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３０５５、Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：４０２６、及びＭｃＣａｒｔｎｅｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：３０１に記載されている。
【００３５】
抗体の「抗原結合断片」は、インタクトな抗体の１つまたは複数の可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片、ダイアボディ、線状抗体、抗体断片から形成される一本鎖抗体分子及び多重特異性抗体が含まれる。例えば、抗原結合断片という用語は、組み換え一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、さらには、その二価（ジ−ｓｃＦｖ）及び三価（トリ−ｓｃＦＶ）形態を指すために使用され得る。そのような断片は、当技術分野で公知の様々な方法によって生成され得る。例えば、本開示に包含されるジ−ｓｃＦｖを、下の実施例１に記載の方法によって生成及び精製することができる。
【００３６】
「全長抗体」、「インタクトな抗体」または「全抗体」という用語は、抗体の抗原結合断片とは対照的に、その実質的にインタクトな形態にある抗体を指すために互換的に使用される。具体的には、全抗体には、Ｆｃ領域を含めて、重鎖及び軽鎖を有するものが含まれる。定常ドメインは、野生型配列定常ドメイン（例えば、ヒト野生型配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントであってよい。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「可変領域」は、抗原に特異的に結合する、本明細書で定義するとおりの抗体の軽鎖及び／または重鎖の部分を指し、例えば、ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む。例えば、可変領域は、３つまたは４つのＦＲ（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び任意選択でＦＲ４）を３つのＣＤＲと一緒に含む。ＶＨは、重鎖の可変領域を指す。ＶＬは、軽鎖の可変領域を指す。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「相補性決定領域」という用語（同意語はＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、その存在が特異的な抗原結合の主な一因である抗体可変領域のアミノ酸残基を指す。各可変領域は典型的には、ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として同定される３つのＣＤＲ領域を有する。一例では、ＣＤＲ及びＦＲに割り当てられるアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７及び１９９１（本明細書では「Ｋａｂａｔナンバリングシステム」または「Ｋａｂａｔ」とも称される）に従って定義される。
【００３９】
可変ドメインのための補正または代替ナンバリングシステムを含む他の規則には、ＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ，ｅｔ  ａｌ．（２００３），Ｄｅｖ  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：５５−７７）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ，Ｌｅｓｋ  ＡＭ（１９８７），Ｊ  Ｍａｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１−９１７、Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３）及びＡＨｏ（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  Ａ，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ（２００１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０９：６５７−６７０）が含まれる。便宜的に、本開示の結合タンパク質の例は、ＩＭＧＴに従って標識されることもある。これらの例は、そのように明確に示される。例えば、配列番号９〜１６を参照されたい。
【００４０】
「フレームワーク領域」（同意語はＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４１】
本明細書で使用する場合の「定常領域」という用語は、可変領域以外の抗体の重鎖または軽鎖の部分を指す。重鎖では、定常領域は一般に、複数の定常ドメイン及びヒンジ領域を含み、例えば、ＩｇＧ定常領域は、次の連結した構成要素、定常重鎖ＣＨ１、リンカー、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。重鎖では、定常領域はＦｃを含む。軽鎖では、定常領域は一般に、１つの定常ドメイン（ＣＬ１）を含む。
【００４２】
「結晶性断片」または「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃ部分」（本明細書では互換的に使用され得る）という用語は、少なくとも１つの定常ドメインを含む抗体の領域を指し、それは一般に（必ずではないが）、グリコシル化され、１つまたは複数のＦｃ受容体及び／または補体カスケードの構成要素に結合することができる。重鎖定常領域は、５つのアイソタイプ、α、δ、ε、γ、またはμのいずれかから選択され得る。例示的な重鎖定常領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ２（ＩｇＧ２）、及びガンマ３（ＩｇＧ３）、またはそれらのハイブリッドである。
【００４３】
「定常ドメイン」は、抗体におけるドメインであり、その配列は、抗体／同じ種類の抗体、例えば、ＩｇＧまたはＩｇＭまたはＩｇＥで非常に類似している。抗体の定常領域は一般に、複数の定常ドメインを含み、例えば、γ、α、またはδ重鎖の定常領域は、２つの定常ドメインを含む。
【００４４】
「ネイキッド」という用語は、別の化合物、例えば、毒性化合物または放射標識にコンジュゲートしていない本開示の結合タンパク質を指すために使用される。例えば、「ネイキッド」という用語は、別の化合物にコンジュゲートしていないジ−ｓｃＦｖなどの結合タンパク質を指すために使用され得る。したがって、一例では、本開示の結合タンパク質は「ネイキッド」である。言い換えると、本開示の結合タンパク質は、コンジュゲートされていなくてよい。
【００４５】
対照的に、「コンジュゲートされている」という用語は、本開示の文脈では、別の化合物、例えば、細胞傷害性薬物または放射標識などの毒性化合物にコンジュゲートしている本開示の結合タンパク質を指すために使用されている。したがって、一例では、本開示の結合タンパク質は、「コンジュゲートされている」。
【００４６】
本明細書で使用する場合の「細胞傷害性薬物」という用語は、細胞機能を阻害または妨害する、及び／または細胞死または破壊をもたらす物質を指す。細胞傷害性薬物には、これに限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、１１３１、１１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ、Ｐ、Ｐｂ及びＬｕの放射性同位体）、化学療法薬または薬物（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）、成長阻害剤、核酸分解酵素などの酵素及びその断片、抗生物質、その断片及び／またはバリアントを含む細菌、真菌、植物または動物由来の小分子毒素または酵素的に活性な毒素などの毒素、ならびに下記に開示の様々な抗腫瘍または抗がん剤が含まれる。
【００４７】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」などの用語は、外来核酸が導入されている細胞（そのような細胞の後代を含む）を指すために本開示の文脈で互換的に使用される。宿主細胞には、一次形質転換細胞及び継代数にかかわらず、それに由来する後代を含む「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれる。後代は、核酸内容において親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含んでもよい。当初の形質転換細胞においてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異後代は本明細書に含まれる。
【００４８】
本開示による「単離核酸」は、その天然環境の構成要素から分離されている核酸分子である。単離核酸は、核酸分子を普通は含有する細胞中に含有される核酸分子を含むが、その核酸分子は、染色体外に、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【００４９】
基準ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列同士をアラインさせ、かつ必要な場合には、ギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後に、かついずれの保存的置換も配列同一性の一部としてみなさなかった場合に、基準ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一な、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的でのアラインメントは、当業者の技能の範囲内である様々な方法で、例えば、公共利用可能なコンピューターソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含めて、配列をアラインさせるために適切なパラメーターを決定することができる。
【００５０】
本明細書で使用する場合、結合タンパク質及び抗原の相互作用に関する「結合する」という用語は、その相互作用が抗原上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存していることを意味する。例えば、結合タンパク質は、一般に抗原ではなく、特異的な抗原構造を認識し、それに結合する。例えば、ある結合タンパク質がエピトープ「Ａ」に結合する場合、標識「Ａ」及びその結合タンパク質を含有する反応において、エピトープ「Ａ」を含有する分子（または遊離の非標識「Ａ」）の存在は、結合タンパク質に結合する標識「Ａ」の量を減少させるであろう。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「特異的に結合する」という用語は、結合タンパク質とＤＮＡとの間の結合相互作用が、結合タンパク質によるＤＮＡの検出に左右されることを意味すると解釈されることとする。したがって、結合タンパク質は、他の分子または生体の混合物中に存在する場合にも、ＤＮＡに優先的に結合またはそれを優先的に認識する。
【００５２】
一例では、結合タンパク質は、代替の抗原または細胞と反応または会合するよりも、より頻繁に、より迅速に、より長い持続期間で、及び／またはより高い親和性で、ＤＮＡと反応または会合する。この定義を読むことによって、例えば、ＤＮＡに特異的に結合する結合タンパク質が第２の抗原に特異的に結合しても、または結合しなくてもよいことも理解される。したがって、「特異的結合」は、排他的結合または別の抗原の検出不可能な結合を必ずしも必要としない。「特異的に結合する」という用語は、本明細書では「選択的に結合する」と互換的に使用され得る。一般に、本明細書における結合との言及は、特異的結合を意味し、かつ各用語は、その他の用語に対し明確な支持を与えると理解されることとする。特異的結合を決定するための方法は、当業者には明らかであろう。例えば、本開示の結合タンパク質を、ＤＮＡまたは代替抗原と接触させる。次いで、ＤＮＡまたは代替の抗原への結合タンパク質の結合を決定し、かつ代替の抗原ではなくＤＮＡに上記のとおり結合する結合タンパク質をＤＮＡに特異的に結合するとみなす。
【００５３】
本開示による結合タンパク質及びそれを含む組成物は、対象に、様々な適応症を処置するために投与することができる。「対象」、「患者」または「個体」などの用語は、文脈において、本開示で互換的に使用され得る用語である。一例では、対象は哺乳類である。哺乳類は、イヌもしくはネコなどのコンパニオン動物、またはウマもしくはウシなどの家畜動物であってよい。一例では、対象はヒトである。例えば、対象は成人であってよい。別の例では、対象は小児であってよい。別の例では、対象は青年であってよい。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「処置」という用語は、臨床病理の経過中に、処置されている個体または細胞の自然な経過を変更するように設計された臨床的介入を指す。処置の望ましい効果には、疾患の進行速度を減速させること、病態を改善または緩和すること、及び寛解することまたは予後を改善することが含まれる。例えば、疾患に関連する１つまたは複数の症状が軽減または除去されるならば、個体は成功裏に「処置される」。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「予防」という用語は、個体において、疾患の発生または再発に関して予防をもたらすことを含む。個体は、疾患の発生または疾患の再発を起こしやすいか、またはそのリスクを有し得るが、まだ疾患または再発を有するとは診断されていない。
【００５６】
「処置」という用語は、本明細書の文脈において、疾患、病的状態、または障害を治癒させる、改善させる、または安定化させる目的での患者の医学的管理を指すために使用される。「処置」という用語には、積極的な処置、すなわち、特に疾患、病的状態、または障害の改善を指向する処置が含まれ、また、原因的処置、すなわち、関連疾患、病的状態、または障害の原因の除去を指向する処置が含まれる。加えて、「処置」という用語には、姑息的処置、すなわち、疾患、病的状態、または障害の治癒ではなく、症状の軽減のために設計された処置、予防的処置、すなわち、関連疾患、病的状態、または障害の発生を最小限にする、または部分的もしくは完全に阻害することを指向する処置、及び支持的処置、すなわち、関連疾患、病的状態、または障害の改善を指向する別の特定の治療を補充するために用いられる処置が含まれる。
【００５７】
「有効量」は、少なくとも、所望の治療または予防結果を達成するために必要な投薬及び期間で有効な量を指す。有効量を１回または複数回の投与で与えることもできる。本開示の一部の例では、「有効量」という用語は、下記の疾患または状態の処置を行うために必要な量を意味する。有効量は、処置される疾患または状態に応じて、また、処置されている対象に関連する体重、年齢、人種的背景、性別、健康状態及び／または体調ならびに他の要因に応じて変動し得る。典型的には、有効量は、医師によるルーチン的な試行及び実験によって決定することができる比較的広範囲（例えば、「投薬量」範囲）に該当するであろう。有効量を処置期間にわたって単回用量または１回もしくは複数回の反復用量で投与することができる。
【００５８】
「治療有効量」は、少なくとも、特定の障害（例えば、がん）の測定可能な改善を得るのに必要とされる最小濃度である。本明細書における治療有効量は、患者の病態、年齢、性別及び体重ならびに個体において結合タンパク質が所望の応答を誘発する能力などの要因に応じて変動し得る。治療有効量はまた、治療上の有益効果が結合タンパク質の何らかの毒性または有害作用を上回る量である。がんの場合には、結合タンパク質の治療有効量は、がん細胞の数を減少させ得る、原発腫瘍のサイズを縮小させ得る、周辺器官へのがん細胞の浸潤を阻害し得る（すなわち、ある程度減速させ得る、及び一部の例では、停止させ得る）、腫瘍転位を阻害し得る（すなわち、ある程度減速させ得る、及び一部の例では、停止させ得る）、腫瘍成長または腫瘍進行をある程度阻害し得る、または遅延させ得る、及び／またはがんに関連する症状のうちの１つまたは複数をある程度緩和し得る。結合タンパク質はある程度、既存のがん細胞の成長を阻止し得る、及び／またはそれを死滅させ得るということにおいて、これは、細胞増殖抑制性及び／または細胞傷害性であり得る。がん治療では、インビボでの有効性を例えば、生存期間、無増悪期間（ＴＴＰ）、奏功率（ＲＲ）、応答期間、及び／または生活の質を評価することによって測定することができる。
【００５９】
脱免疫（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）、キメラ、ヒト化、合成ヒト化（ｓｙｎｈｕｍａｎｉｚｅｄ）、霊長類化及びヒト抗体または抗原結合断片
モノクローナル抗体は、本開示が企図する結合タンパク質の例示的な形態の１つである。「モノクローナル抗体」または「ＭＡｂ」という用語は、同じ抗原（複数可）に、例えば、抗原内の同じエピトープに結合することができる均一な抗体集団を指す。この用語は、抗体の供給源または抗体が作製される手法に関して制限されることを意図されていない。
【００６０】
一例では、本開示に包含される結合タンパク質は、「ヒト化」されていてもよい。「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する免疫グロブリン分子である。ヒト化抗体には、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種のＣＤＲ（ドナー抗体）からの残基に置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても、移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列においても見い出されない残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むこととなり、その際、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、かつフレームワーク（ＦＲ）領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。一例では、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含むこととなる（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２））。
【００６１】
一例では、本開示の「ヒト」結合タンパク質は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基、例えば、インビトロでランダムまたは部位特異的変異によって導入された変異を含み得る（特に、タンパク質の少数の残基、例えば、タンパク質の残基のうちの１、２、３、４または５個における保存的置換または変異を含む変異）。これらの「ヒト抗体」は必ずしも、ヒトの免疫応答の結果として生成される必要はなく、むしろそれらは、組み換え手段（例えば、ファージディスプレイライブラリのスクリーニング）を使用して、及び／またはヒト抗体定常及び／または可変領域をコードする核酸を含むトランスジェニック動物（例えば、マウス）によって、及び／またはガイド選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号に記載のとおり）を使用して生成され得る。この用語はまた、そのような抗体の親和性成熟形態を包含する。
【００６２】
別の例では、本開示によって包含される結合タンパク質は、合成ヒト化されていてもよい。「合成ヒト化」という用語は、ＷＯ２００７／０１９６２０に記載の方法によって調製される抗体を指す。合成ヒト化抗体は抗体の可変領域を含み、その際、可変領域は、新世界霊長類抗体可変領域からのＦＲ及び非新世界霊長類抗体可変領域からのＣＤＲを含む。
【００６３】
別の例では、本開示の結合タンパク質は、霊長類化されていてもよい。「霊長類化抗体」は、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）の免疫化後に生成される抗体からの可変領域（複数可）を含む。一例では、非ヒト霊長類抗体の可変領域をヒト定常領域に連結して、霊長類化抗体を生成する。霊長類化抗体を生成するための例示的な方法は米国特許第６，１１３，８９８号に記載されている。
【００６４】
一例では、本開示の結合タンパク質は、キメラ抗体または断片である。「キメラ抗体」または「キメラ抗原結合断片」という用語は、可変ドメインのうちの１つまたは複数が特定の種（例えば、マウスまたはラットなどのネズミ）に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属している一方で、抗体または断片の残りが、別の種（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類など）に由来するか、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属している抗体または断片を指す。一例では、キメラ抗体は、非ヒト抗体（例えば、マウス抗体）に由来するＶＨ及び／またはＶＬを含み、抗体の残りの領域は、ヒト抗体に由来する。
【００６５】
本開示はまた、例えば、ＷＯ２０００／３４３１７及びＷＯ２００４／１０８１５８に記載されているとおりの脱免疫化抗体またはその抗原結合断片を企図する。脱免疫化抗体及び断片は、１種または複数のエピトープ、例えば、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープが除去されていて（すなわち、変異していて）、それによって、対象が抗体またはタンパク質に対する免疫応答を起こす可能性が低下している。例えば、本開示の抗体を分析して、１種または複数のＢまたはＴ細胞エピトープを同定し、そのエピトープ内の１個または複数のアミノ酸残基を変異させて、それによって、抗体の免疫原性を低下させる。
【００６６】
抗体断片
単一ドメイン抗体
一部の例では、本開示の結合タンパク質は、単一ドメイン抗体（「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」という用語と互換的に使用される）であるか、またはそれを含む。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部または一部を含む単一ポリペプチド鎖である。
【００６７】
一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片
当業者は、ｓｃＦｖが、単一ポリペプチド鎖中のＶＨ及びＶＬ領域、ならびに抗原結合のために（すなわち、単一ポリペプチド鎖のＶＨ及びＶＬが相互に会合してＦｖを形成するために）望ましい構造をｓｃＦｖが形成することを可能にするＶＨとＶＬとの間のポリペプチドリンカーを含むことを認めるであろう。一本鎖可変断片は、完全抗体分子中に存在する定常Ｆｃ領域を欠いており、したがって、低下した免疫原性を有し得る。例示的なリンカーは、１２個よりも多くのアミノ酸残基を含み、その際、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３が、ｓｃＦｖのためのより好ましいリンカーの１つである。適切なリンカーの別の例が、配列番号３１で示されている。
【００６８】
本開示はまた、単一のシステイン残基がＶＨのＦＲ及びＶＬのＦＲに導入されていて、それらのシステイン残基がジスルフィド結合によって連結されて安定なＦｖをもたらしているジスルフィド安定化Ｆｖ（またはｄｉＦｖまたはｄｓＦｖ）を企図している。
【００６９】
別の例では、本開示は、二量体ｓｃＦｖ（ジ−ｓｃＦＶ）、すなわち、非共有結合もしくは共有結合によって、例えば、ロイシンジッパードメイン（例えば、ＦｏｓまたはＪｕｎに由来）によって連結した２個のｓｃＦｖ分子を含むタンパク質、または三量体ｓｃＦＶ（トリ−ｓｃＦｖ）を包含する。別の例では、２個のｓｃＦｖは、例えば、米国特許出願公開第２００６０２６３３６７号に記載されているとおりの、両方のｓｃＦｖが形成し、かつ抗原に結合することを可能にする十分な長さのペプチドリンカーによって連結される。
【００７０】
ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ
一部の例では、本開示の抗原結合断片は、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディまたはＷＯ９８／０４４００１及び／またはＷＯ９４／００７９２１に記載のものなどのより高次のタンパク質複合体であるか、またはそれを含む。
【００７１】
例えば、ダイアボディは、２つの会合したポリペプチド鎖を含むタンパク質であり、その際、各ポリペプチド鎖は、構造式ＶＬ−Ｘ−ＶＨまたはＶＨ−Ｘ−ＶＬを含み、式中、Ｘは、単一のポリペプチド鎖中のＶＨ及びＶＬが会合する（またはＦｖを形成する）ことを可能にするには不十分な残基を含むリンカーであるか、または存在せず、一方のポリペプチド鎖のＶＨが他方のポリペプチド鎖のＶＬに結合して、抗原結合部位を形成している、すなわち、１つまたは複数の抗原に特異的に結合し得るＦｖ分子を形成している。ＶＬ及びＶＨは、各ポリペプチド鎖中で同じであってよいか、またはＶＬ及びＶＨは、二重特異性ダイアボディを形成するように、各ポリペプチド鎖中で異なってよい（すなわち、異なる特異性を有する２つのＦｖを含む）。
【００７２】
他の抗体及び抗体断片
本開示に包含される結合タンパク質の他の例には、
（ｉ）米国特許第５，７３１，１６８号に記載されているとおりの「キー・アンド・ホール」二重特異性タンパク質、
（ｉｉ）例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に記載のとおりのヘテロコンジュゲートタンパク質、
（ｉｉｉ）例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に記載のとおりの化学的クロス−リンカーを使用して生成されるヘテロコンジュゲートタンパク質、及び
（ｉｖ）Ｆａｂ３（例えば、欧州特許第１９９３０３０２８９４号に記載のとおり）
が含まれる。
【００７３】
免疫グロブリン及び免疫グロブリン断片
本開示の結合タンパク質の例は、Ｔ細胞受容体などの免疫グロブリンの可変領域を含むタンパク質（例えば、抗体模倣物質）または重鎖免疫グロブリン（例えば、ＩｇＮＡＲ、ラクダ科動物抗体）である。
【００７４】
Ｖ様タンパク質
本開示の結合タンパク質の一例は、Ｔ細胞受容体である。Ｔ細胞受容体は、組み合わさって抗体のＦｖモジュールと同様の構造になる、２つのＶドメインを有する。Ｎｏｖｏｔｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：８６４６−８６５０,１９９１は、どのようにＴ細胞受容体の２つのＶドメイン（アルファ及びベータと称される）が融合され、一本鎖ポリペプチドとして発現されるか、さらに、抗体ｓｃＦｖに類似の疎水性を直接的に低下させるためにどのようにして表面残基を変えるかを記載している。一本鎖Ｔ細胞受容体、または２つのＶ−アルファ及びＶ−ベータドメインを含む多量体Ｔ細胞受容体の生成を記載している他の刊行物には、ＷＯ１９９９／０４５１１０またはＷＯ２０１１／１０７５９５が含まれる。
【００７５】
抗原結合ドメインを含む他の非抗体タンパク質には、一般に単量体である、Ｖ様ドメインを有するタンパク質が含まれる。そのようなＶ様ドメインを含むタンパク質の例には、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８、及びＩＣＯＳが含まれる。そのようなＶ様ドメインを含むタンパク質のさらなる本開示は、ＷＯ１９９９／０４５１１０に含まれる。
【００７６】
アフィボディ
さらなる一例では、本開示の結合タンパク質は、アフィボディである。アフィボディは、抗原に結合するよう操作されることができる、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのプロテインＡのＺドメイン（抗原結合ドメイン）に由来するスキャフォールドである。Ｚドメインは、約５８アミノ酸の３つのヘリックスの束からなる。ライブラリは、表面残基のランダム化によって生成されている。さらなる詳細については、欧州特許第１６４１８１８号を参照されたい。
【００７７】
アビマー
さらなる一例では、本開示の結合タンパク質は、アビマーである。アビマーは、Ａドメインスキャフォールドファミリーに由来するマルチドメインタンパク質である。約３５アミノ酸の天然ドメインは規定のジスルフィド結合構造を取る。多様性は、Ａドメインのファミリーによって示される天然変形のシャッフルによって生成される。さらなる詳細については、ＷＯ２００２／０８８１７１号を参照されたい。
【００７８】
結合タンパク質
一例では、本開示による抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号２または配列番号３に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。例えば、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号２に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨを含み得る。別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号３に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨを含み得る。
【００７９】
別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号５または配列番号６に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。例えば、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号５に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号６に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。
【００８０】
別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号２または配列番号３に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号５または配列番号６に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含む。例えば、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号２に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号５に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号２に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号６に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号３に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号５に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号３に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号６に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。
【００８１】
上に例示の結合タンパク質はまた、ＩＭＧＴシステムを使用して割り当てられたＣＤＲを有してもよい。したがって、別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１０または配列番号１１に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨを含む。例えば、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１０に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨを含み得る。別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１１に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨを含み得る。
【００８２】
別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号１３または配列番号１４に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含む。例えば、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号１３に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号１４に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。
【００８３】
別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１０または配列番号１１に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号１３または配列番号１４に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含む。例えば、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１０に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号１３に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１０に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号１４に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１１に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号１３に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１１に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号１４に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。
【００８４】
別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号１７〜２３のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨを含む。例えば、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号１８に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨを含み得る。別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号２３に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨを含み得る。別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号２４〜２９のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含む。例えば、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号２５に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含み得る。別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号２７に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含み得る。別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号１７〜２３のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨ及び配列番号２４〜２９のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含む。例えば、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号１８に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨ及び配列番号２５に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含み得る。別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号２３に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨ及び配列番号２７に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含み得る。これらの例では、ＶＨ及び／またはＶＬは、列挙した配列番号と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり得る。
【００８５】
別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号１７〜２３のいずれか１つに示されているとおりの配列を含むＶＨを含む。例えば、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号１８に示されているとおりの配列を含むＶＨを含み得る。別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号２３に示されているとおりの配列を含むＶＨを含み得る。別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号２４〜２９のいずれか１つに示されているとおりの配列を含むＶＬを含む。例えば、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号２５に示されているとおりの配列を含むＶＬを含み得る。別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号２７に示されているとおりの配列を含むＶＬを含み得る。別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号１７〜２３のいずれか１つに示されているとおりの配列を含むＶＨ及び配列番号２４〜２９のいずれか１つに示されているとおりの配列を含むＶＬを含む。例えば、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号１８に示されているとおりの配列を含むＶＨ及び配列番号２５に示されているとおりの配列を含むＶＬを含み得る。別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号２３に示されているとおりの配列を含むＶＨ及び配列番号２７に示されているとおりの配列を含むＶＬを含み得る。
【００８６】
一例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡに結合する、または特異的に結合する抗原結合ドメインを有する細胞透過性抗ＤＮＡ  Ｆｖ断片であり得る。例えば、Ｆｖは、配列番号４８に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４９に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＬを有する結合タンパク質と同じエピトープに結合し得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号５０に示されているとおりのアミノ酸配列を有するジ−ｓｃＦｖと同じエピトープに結合し得る。一例では、Ｆｖは、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号２または配列番号３に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨを含む。例えば、Ｆｖは、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号２に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨを含み得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号３に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨを含み得る。
【００８７】
別の例では、Ｆｖは、配列番号５または配列番号６に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含む。例えば、Ｆｖは、配列番号５に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号６に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。
【００８８】
別の例では、Ｆｖは、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号２または配列番号３に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号５または配列番号６に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含む。例えば、Ｆｖは、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号２に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号５に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号２に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号６に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号３に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号５に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号３に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号６に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。
【００８９】
上に例示のＦｖはまた、ＩＭＧＴシステムを使用して割り当てられるＣＤＲを有してもよい。したがって、別の例では、Ｆｖは、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１０または配列番号１１に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨを含む。例えば、Ｆｖは、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１０に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨを含み得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１１に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨを含み得る。
【００９０】
別の例では、Ｆｖは、配列番号１３または配列番号１４に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含む。例えば、Ｆｖは、配列番号１３に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号１４に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。
【００９１】
別の例では、Ｆｖは、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１０または配列番号１１に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号１３または配列番号１４に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含む。例えば、Ｆｖは、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１０に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号１３に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１０に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号１４に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１１に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号１３に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１１に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号１４に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。
【００９２】
別の例では、Ｆｖは、配列番号１７〜２３のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨを含む。例えば、Ｆｖは、配列番号１８に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨを含み得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号２１に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨを含み得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号２３に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨを含み得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号２４〜２９のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含む。例えば、Ｆｖは、配列番号２５に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含み得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号２７に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含み得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号１７〜２３のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨ及び配列番号２４〜２９のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含む。例えば、Ｆｖは、配列番号１８に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨ及び配列番号２５に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含み得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号２１に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨ及び配列番号２７に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含み得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号２３に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨ及び配列番号２７に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含み得る。これらの例では、ＶＨ及び／またはＶＬは、列挙した配列番号と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり得る。これらの例では、Ｆｖは、ＣＤＲの上で言及した組み合わせを有し得る。例えば、Ｆｖは、配列番号２１に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨ及び配列番号２７に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含み得、その際、ＶＨは、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号３に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有し、かつＶＬは、配列番号６に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有する。
【００９３】
別の例では、Ｆｖは、配列番号１７〜２３のいずれか１つに示されているとおりの配列を含むＶＨを含む。例えば、Ｆｖは、配列番号１８に示されているとおりの配列を含むＶＨを含み得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号２１に示されているとおりの配列を含むＶＨを含み得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号２３に示されているとおりの配列を含むＶＨを含み得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号２４〜２９のいずれか１つに示されているとおりの配列を含むＶＬを含む。例えば、Ｆｖは、配列番号２５に示されているとおりの配列を含むＶＬを含み得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号２７に示されているとおりの配列を含むＶＬを含み得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号１７〜２３のいずれか１つに示されているとおりの配列を含むＶＨ及び配列番号２４〜２９のいずれか１つに示されているとおりの配列を含むＶＬを含む。例えば、Ｆｖは、配列番号１８に示されているとおりの配列を含むＶＨ及び配列番号２５に示されているとおりの配列を含むＶＬを含み得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号２１に示されているとおりの配列を含むＶＨ及び配列番号２７に示されているとおりの配列を含むＶＬを含み得る。別の例では、Ｆｖは、配列番号２３に示されているとおりの配列を含むＶＨ及び配列番号２７に示されているとおりの配列を含むＶＬを含み得る。
【００９４】
別の例では、Ｆｖは、配列番号４８に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４９に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＬを有する結合タンパク質と比較して、改善された製造可能性を有する。別の例では、Ｆｖは、配列番号５０に示されているとおりのアミノ酸配列を有するジ−ｓｃＦｖと比較して、改善された製造可能性を有する。
【００９５】
改善された製造可能性は、脱アミド部位、アスパラギン酸塩異性化部位、メチオニン及びトリプトファンなどの酸化部位、遊離システインチオール基、Ｎ＆Ｏ−グリコシル化部位、Ｃ末端リシン及び／または等電点の存在の数の減少に関連する翻訳後修飾または化学的安定性の上昇を含む。
【００９６】
一例では、Ｆｖは、配列番号４８に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４９に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＬを有する結合タンパク質と比較して、ＶＨ及び／またはＶＬ中に、より少ないアスパラギンを含む。別の例では、Ｆｖは、配列番号５０に示されているとおりのアミノ酸配列を有するジ−ｓｃＦｖと比較して、ＶＨ及び／またはＶＬ中に、より少ないアスパラギンを含む。
【００９７】
一例では、Ｆｖは、配列番号４８に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４９に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＬを有する結合タンパク質と比較して、ＶＨ及び／またはＶＬ中に、より少ないメチオニンを含む。別の例では、Ｆｖは、配列番号５０に示されているとおりのアミノ酸配列を有するジ−ｓｃＦｖと比較して、ＶＨ及び／またはＶＬ中に、より少ないメチオニンを含む。
【００９８】
一例では、Ｆｖは、配列番号４８に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４９に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＬを有する結合タンパク質と比較して、ＶＨ及び／またはＶＬ中に、より少ないトリプトファンを含む。別の例では、Ｆｖは、配列番号５０に示されているとおりのアミノ酸配列を有するジ−ｓｃＦｖと比較して、ＶＨ及び／またはＶＬ中に、より少ないトリプトファンを含む。
【００９９】
一例では、Ｆｖは、配列番号４８に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４９に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＬを有する結合タンパク質と比較して、ＶＨ及び／またはＶＬ中に、より少ないアスパラギン酸を含む。別の例では、Ｆｖは、配列番号５０に示されているとおりのアミノ酸配列を有するジ−ｓｃＦｖと比較して、ＶＨ及び／またはＶＬ中に、より少ないアスパラギン酸を含む。
【０１００】
一例では、Ｆｖの物理的安定性は、配列番号４８に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４９に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＬを有する結合タンパク質よりも高い。別の例では、Ｆｖの物理的安定性は、配列番号５０に示されているとおりのアミノ酸配列を有するジ−ｓｃＦｖよりも高い。
【０１０１】
物理的安定性は、溶液中で凝集する性質を含み得る。「凝集」という用語は、本開示の文脈において、細胞培養及び発酵から単離、精製及び製剤プロセスまでの複数の環境中で生じ得るタンパク質自己会合を指すために使用される。例えば、「凝集」という用語は、特に、包含物の形成、細胞分画後の「不溶性」画分中でのタンパク質の蓄積、試料中での混濁、タンパク質沈殿もしくは粒子形成の出現、または小さな可溶性オリゴマーの形成について記載する場合に使用され得る。
【０１０２】
したがって、上で言及した例では、Ｆｖの物理的安定性は、溶液中でのその物理的安定性に基づき得て、その際、溶液からのＦｖの沈殿は、Ｆｖが不安定になっていることを示す。物理的安定性を評価するために、本開示によるＦｖ、または配列番号４８に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４９に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＬを有する結合タンパク質もしくは配列番号５０に示されているとおりのアミノ酸配列を含むジ−ｓｃＦｖのいずれかを含む溶液を４℃でインキュベートし、かつ２週間目、４週間目、１２週間目、６か月目及び１２か月目に沈殿について肉眼で評価することができる。
【０１０３】
一例では、本開示によるＦｖの物理的安定性は、Ｆｖを少なくとも４週間にわたって４℃で溶液中にとどめた場合に、配列番号４８に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４９に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＬを有する結合タンパク質または配列番号５０に示されているとおりのアミノ酸配列を含むジ−ｓｃＦｖよりも高い。一例では、本開示によるＦｖの物理的安定性は、Ｆｖを少なくとも６か月にわたって４℃で溶液中にとどめた場合に、配列番号４８に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４９に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＬを有する結合タンパク質または配列番号５０に示されているとおりのアミノ酸配列を含むジ−ｓｃＦｖよりも高い。
【０１０４】
別の例では、Ｆｖは、ヒト対象において、配列番号４８に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４９に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＬを有する結合タンパク質と比較して、低下した免疫原性を有する。例えば、Ｆｖは、免疫原性を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した場合に、配列番号４８に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４９に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＬを有する結合タンパク質と比較して、低下した免疫原性を有し得る。別の例では、Ｆｖは、免疫原性を表面プラスモン共鳴によって測定した場合に、配列番号４８に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４９に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＬを有する結合タンパク質と比較して、低下した免疫原性を有し得る。
【０１０５】
別の例では、細胞を透過するＦｖの能力は、配列番号４８に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４９に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＬを有する結合タンパク質よりも高い。別の例では、細胞を透過するＦｖの能力は、配列番号５０に示されているとおりのアミノ酸配列を有するジ−ｓｃＦｖよりも高い。別の例では、細胞核を透過するＦｖの能力は、配列番号４８に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４９に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＬを有する結合タンパク質よりも高い。別の例では、細胞核を透過するＦｖの能力は、配列番号５０に示されているとおりのアミノ酸配列を有するジ−ｓｃＦｖよりも高い。例えば、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号３６に示されているとおりのアミノ酸配列を含み得る。別の例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号４１に示されているとおりのアミノ酸配列を含み得る。別の例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号４３に示されているとおりのアミノ酸配列を含み得る。上で言及した例では、細胞または細胞核を透過する結合タンパク質の能力は、比色アッセイを使用して測定することができる。例えば、細胞を、対照培地、本開示による結合タンパク質または配列番号４８に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４９に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＬを有する結合タンパク質もしくは配列番号５０に示されているとおりのアミノ酸配列を有するジ−ｓｃＦｖのいずれかで１時間にわたって処理することができる。次いで、細胞を洗浄し、固定し、１％ＢＳＡ−ＴＢＳＴで遮断し、次いで、プロテインＬで１時間にわたってプローブする。次いで、細胞を洗浄し、抗プロテインＬ一次抗体と共に１時間にわたってインキュベートする。別のラウンドの洗浄後に、細胞をアルカリホスファターゼ−コンジュゲートした二次抗体と共に１時間にわたってインキュベートする。最後に、細胞を洗浄し、シグナルをＮＢＴ／ＢＣＩＰの添加によって発生させる。明瞭な核染色を試料のいずれかにおいて同定することができると、シグナルの発生をＮＢＴ／ＢＣＩＰの除去及び洗浄によって停止する。次いで、核及びまたは細胞染色を、Ｉｍａｇｅ  Ｊを使用して測定する。
【０１０６】
一例では、少なくとも１９０の吸光度単位（ａｕ）の相反強度（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を有する核染色をもたらすＦｖは、細胞核を透過する高い能力を有する。一例では、少なくとも２００ａｕの相反強度を有する核染色をもたらすＦｖは、細胞核を透過する高い能力を有する。一例では、少なくとも２１０ａｕの相反強度を有する核染色をもたらすＦｖは、細胞核を透過する高い能力を有する。一例では、少なくとも２２０ａｕの相反強度を有する核染色をもたらすＦｖは、細胞核を透過する高い能力を有する。別の例では、細胞核を透過するＦｖの能力を、個々の細胞の蛍光を測定することによって評価することができる。一例では、少なくとも２０個の細胞で少なくとも１９０ａｕの相反強度を有する核染色をもたらすＦｖは、細胞核を透過する高い能力を有する。別の例では、少なくとも３０個の細胞で少なくとも１９０ａｕの相反強度を有する核染色をもたらすＦｖは、細胞核を透過する高い能力を有する。別の例では、少なくとも４０個の細胞で少なくとも１９０ａｕの相反強度を有する核染色をもたらすＦｖは、細胞核を透過する高い能力を有する。別の例では、少なくとも２０個の細胞で少なくとも２００ａｕの相反強度を有する核染色をもたらすＦｖは、細胞核を透過する高い能力を有する。別の例では、少なくとも３０個の細胞で少なくとも２００ａｕの相反強度を有する核染色をもたらすＦｖは、細胞核を透過する高い能力を有する。別の例では、少なくとも５０個の細胞で少なくとも２００ａｕの相反強度を有する核染色をもたらすＦｖは、細胞核を透過する高い能力を有する。別の例では、少なくとも７０個の細胞で少なくとも２００ａｕの相反強度を有する核染色をもたらすＦｖは、細胞核を透過する高い能力を有する。別の例では、少なくとも８０個の細胞で少なくとも２００ａｕの相反強度を有する核染色をもたらすＦｖは、細胞核を透過する高い能力を有する。
【０１０７】
別の例では、Ｆｖは、ＤＮＡについて、配列番号４８に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４９に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＬを有する結合タンパク質よりも高い特異性を有する。別の例では、Ｆｖは、ＤＮＡについて、配列番号５０に示されているとおりのアミノ酸配列を有するジ−ｓｃＦｖよりも高い特異性を有する。
【０１０８】
別の例では、Ｆｖは、配列番号４８に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４９に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＬを有する結合タンパク質と比較して、低い交差反応性（すなわち、異なるタンパク質上の同様の抗原部位と反応するＦｖの能力）を有する。別の例では、Ｆｖは、配列番号５０に示されているとおりのアミノ酸配列を有するジ−ｓｃＦｖと比較して、低い他の標的との交差反応性を有する。この例では、Ｆｖの交差反応性を、様々な方法を使用して測定することができる。一例では、交差反応性をＥＬＩＳＡによって評価する。
【０１０９】
別の例では、Ｆｖは、ＤＮＡについて、配列番号４８に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４９に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＬを有する結合タンパク質よりも高い結合親和性を有する。別の例では、Ｆｖは、ＤＮＡについて、配列番号５０に示されているとおりのアミノ酸配列を有するジ−ｓｃＦｖよりも高い結合親和性を有する。
【０１１０】
上で言及した例では、ＤＮＡについてのＦｖの親和性は、様々な方法を使用して測定することができる。一例では、ＤＮＡについての結合タンパク質の解離定数（ＫＤ）または会合定数（ＫＡ）または平衡定数（ＫＤ）を決定する。結合タンパク質についてのこれらの定数を一例では、放射標識または蛍光標識ＤＮＡ結合アッセイによって測定する。このアッセイでは、結合タンパク質を、未標識ＤＮＡの滴定列の存在下で、最小濃度の標識ＤＮＡ（または、例えば、Ｆｃ領域に融合しているＤＮＡの細胞外領域を含むその可溶性形態）と平衡化させる。未結合ＤＮＡを除去するための洗浄後に、標識の量を決定する。
【０１１１】
親和性の測定は、抗体反応のための標準的な方法論、例えば、イムノアッセイ、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）（Ｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｍｙｓｚｋａ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １１：５４，２０００、Ｅｎｇｌｅｂｉｅｎｎｅ  Ａｎａｌｙｓｔ．１２３：１５９９，１９９８）、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）または当技術分野で公知の他の動力学的相互作用アッセイによって決定することができる。
【０１１２】
一例では、定数を、表面プラスモン共鳴アッセイを使用すること、例えば、固定化ＤＮＡを用いるＢＩＡｃｏｒｅ表面プラスモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ,Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用することによって測定する。例示的なＳＰＲ方法は、米国特許第７，２２９，６１９号に記載されている。
【０１１３】
一部の実施形態では、ＤＮＡについてのＦｖの結合親和性は、約５ｎＭと約１００ｐＭ、１０ｐＭ、１ｐＭ、１００ｆＭ、１０ｆＭ、または１ｆＭとの間である。
【０１１４】
一例では、本開示により包含されるＦｖは、ＤＮＡについて、約５ｎＭ以下、または約４．９ｎＭ、または約４．８ｎＭ、または約４．７ｎＭ、または約４．６ｎＭ、または約４．７ｎＭ、または約４．６ｎＭ、または約４．５ｎＭ、または約４．４ｎＭ、または約４．３ｎＭ、または約４．２ｎＭ、または約４．１ｎＭ、または約４．０ｎＭ、または約３．９ｎＭ、または約３．８ｎＭ、または約３．７ｎＭ、または約３．６ｎＭ、または約３．５ｎＭ、または約３．４ｎＭ、または約３．３ｎＭ、または約３．２ｎＭ、または約３．１ｎＭ、または約３．０ｎＭに匹敵する結合親和性を有する。
【０１１５】
他の例では、本Ｆｖは、表面プラスモン共鳴（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００装置を使用）によって測定した場合に、ＤＮＡについて約１００ｐＭ、または約１５０ｐＭ、または約２００ｐＭ、または約２５０ｐＭ、または約３００ｐＭ、または約３５０ｐＭ、または約４００ｐＭ、または約４５０ｐＭ、または約４６６ｐＭに匹敵する結合親和性を有し得る。
【０１１６】
他の例では、ＤＮＡについての結合タンパク質の親和性を、Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙを使用して測定することができる。
【０１１７】
一例では、Ｆｖはリンカーを含む。様々な適切なリンカー及びそれらを設計するための方法がすでに記載されている（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、ＷＯ１９９４／０１２５２０、及び米国特許第４，７０４，６９２号）。一例では、Ｆｖは、グリシン−セリン（ＧＳ）リンカーを含む。例えば、ＧＳリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号６７）を含み得る。一例では、Ｆｖは、配列番号３０に示されている配列を有するリンカーを含む。別の例では、Ｆｖは、配列番号３１に示されている配列を有するリンカーを含む。別の例では、Ｆｖは、配列番号３０及び配列番号３１に示されている配列を有するリンカーを含む。
【０１１８】
一例では、ＦｖのＶＨ及びＶＬは、単一のポリペプチド鎖中にあってよい。別の例では、Ｆｖは、Ｆｃ領域を欠いている。例えば、Ｆｖは、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、二量体ｓｃＦｖ（ジ−ｓｃＦｖ）、三量体ｓｃＦｖ（トリ−ｓｃＦｖ）であってよい。一例では、Ｆｖは、ｓｃＦｖであってよい。別の例では、Ｆｖは、ジ−ｓｃＦｖである。別の例では、Ｆｖは、トリ−ｓｃＦｖである。
【０１１９】
別の例では、ｓｃＦｖ、ジ−ｓｃＦｖまたはトリ−ｓｃＦｖは、抗体の定常領域、Ｆｃまたは重鎖定常ドメインＣＨ２及び／またはＣＨ３に連結していてよい。
【０１２０】
一例では、本開示は、ＤＮＡに結合する、または特異的に結合する抗原結合ドメインを有する細胞透過性ジ−ｓｃＦｖを包含する。
【０１２１】
一例では、本開示によるジ−ｓｃＦｖは、配列番号３２〜４７のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号３２に示されている配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号３３に示されている配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号３４に示されている配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号３５に示されている配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号３６に示されている配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号３７に示されている配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号３８に示されている配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号３９に示されている配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号４０に示されている配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号４１に示されている配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号４２に示されている配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号４３に示されている配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号４４に示されている配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号４５に示されている配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号４６に示されている配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号４７に示されている配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。例えば、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号３２、３６、４１または４３のいずれか１つに示されているアミノ酸配列と少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含む。これらの例では、アミノ酸配列は、列挙した配列番号と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり得る。
【０１２２】
一例では、本開示によるジ−ｓｃＦｖは、配列番号３２〜４７のいずれか１つに示されているとおりのアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号３２に示されているとおりのアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号３３に示されているとおりのアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号３４に示されているとおりのアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号３５に示されているとおりのアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号３６に示されているとおりのアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号３７に示されているとおりのアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号３８に示されているとおりのアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号３９に示されているとおりのアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号４０に示されているとおりのアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号４１に示されているとおりのアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号４２に示されているとおりのアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号４３に示されているとおりのアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号４４に示されているとおりのアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号４５に示されているとおりのアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号４６に示されているとおりのアミノ酸配列を含む。一例では、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号４７に示されているとおりのアミノ酸配列を含む。例えば、ジ−ｓｃＦｖは、配列番号３２、３６、４１及び４３のいずれか１つに示されているとおりのアミノ酸配列を含み得る。
【０１２３】
別の例では、結合タンパク質のＶＨ及びＶＬは、別々のポリペプチド鎖中にある。例えば、結合タンパク質は、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２であってよい。別の例では、結合タンパク質は、ＶＨ及びＶＬを別々のポリペプチド鎖中に含むＦｖであり得る。これらの例では、結合タンパク質は、抗体の定常領域、Ｆｃまたは重鎖定常ドメインＣＨ２及び／またはＣＨ３に連結していてもよい。別の例では、結合タンパク質は、インタクトな抗体であってよい。したがって、一例では、本開示は、ＤＮＡに結合する、または特異的に結合する抗原結合ドメインを有する抗体を包含する。例えば、抗体は、配列番号４８に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４９に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＬを有する結合タンパク質と同じエピトープに結合し得る。別の例では、抗体は、配列番号５０に示されているとおりのアミノ酸配列を有するジ−ｓｃＦｖと同じエピトープに結合し得る。一例では、抗体は、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号２または配列番号３に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨを含む。例えば、抗体は、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号２に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨを含み得る。別の例では、抗体は、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号３に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨを含み得る
【０１２４】
別の例では、抗体は、配列番号５または配列番号６に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含む。例えば、抗体は、配列番号５に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、抗ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号６に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。
【０１２５】
別の例では、抗体は、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号２または配列番号３に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号５または配列番号６に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含む。例えば、抗体は、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号２に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号５に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、抗体は、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号２に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号６に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、抗体は、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号３に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号５に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、抗体は、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号３に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号６に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。
【０１２６】
上に例示の抗体はまた、ＩＭＧＴシステムを使用して割り当てられたＣＤＲを有してもよい。したがって、別の例では、抗体は、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１０または配列番号１１に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨを含む。例えば、抗体は、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１０に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨを含み得る。別の例では、抗体は、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１１に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨを含み得る。
【０１２７】
別の例では、抗体は、配列番号１３または配列番号１４に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含む。例えば、抗体は、配列番号１３に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、抗体は、配列番号１４に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。
【０１２８】
別の例では、抗体は、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１０または配列番号１１に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号１３または配列番号１４に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含む。例えば、抗体は、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１０に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号１３に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、抗体は、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１０に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号１４に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、抗体は、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１１に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号１３に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。別の例では、抗体は、配列番号９に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１１に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１２に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号１４に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号１５に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号１６に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含み得る。
【０１２９】
別の例では、抗体は、配列番号１７〜２３のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨを含む。例えば、抗体は、配列番号１８に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨを含み得る。別の例では、抗体は、配列番号２１に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨを含み得る。別の例では、抗体は、配列番号２３に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨを含み得る。別の例では、抗体は、配列番号２４〜２９のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含む。例えば、抗体は、配列番号２５に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含み得る。別の例では、抗体は、配列番号２７に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含み得る。別の例では、抗体は、配列番号１７〜２３のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨならびに配列番号２４〜２９のいずれか１つに示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含む。例えば、抗体は、配列番号１８に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨ及び配列番号２５に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含み得る。別の例では、抗体は、配列番号２１に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨ及び配列番号２７に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含み得る。別の例では、抗体は、配列番号２３に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨ及び配列番号２７に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含み得る。これらの例では、ＶＨ及び／またはＶＬは、列挙した配列番号と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり得る。これらの例では、抗体は、上で言及したＣＤＲの組み合わせを有し得る。例えば、抗体は、配列番号２１に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＨ及び配列番号２７に示されているとおりの配列と少なくとも９５％同一な配列を含むＶＬを含み得、その際、ＶＨは、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号３に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有し、かつＶＬは、配列番号６に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有する。
【０１３０】
別の例では、抗体は、配列番号１７〜２３のいずれか１つに示されているとおりの配列を含むＶＨを含む。例えば、抗体は、配列番号１８に示されているとおりの配列を含むＶＨを含み得る。別の例では、抗体は、配列番号２１に示されているとおりの配列を含むＶＨを含み得る。別の例では、抗体は、配列番号２３に示されているとおりの配列を含むＶＨを含み得る。別の例では、抗体は、配列番号２４〜２９のいずれか１つに示されているとおりの配列を含むＶＬを含む。例えば、抗体は、配列番号２５に示されているとおりの配列を含むＶＬを含み得る。別の例では、抗体は、配列番号２７に示されているとおりの配列を含むＶＬを含み得る。別の例では、抗体は、配列番号１７〜２３のいずれか１つに示されているとおりの配列を含むＶＨ及び配列番号２４〜２９のいずれか１つに示されているとおりの配列を含むＶＬを含む。例えば、抗体は、配列番号１８に示されているとおりの配列を含むＶＨ及び配列番号２５に示されているとおりの配列を含むＶＬを含み得る。別の例では、抗体は、配列番号２１に示されているとおりの配列を含むＶＨ及び配列番号２７に示されているとおりの配列を含むＶＬを含み得る。別の例では、抗体は、配列番号２３に示されているとおりの配列を含むＶＨ及び配列番号２７に示されているとおりの配列を含むＶＬを含み得る。
【０１３１】
別の例では、上で言及した抗体は、配列番号６９に示されているとおりの配列を含む定常重領域１を含み得る。別の例では、上で言及した抗体は、配列番号７２に示されているとおりの配列を含む定常重領域３を含み得る。別の例では、上で言及した抗体は、配列番号７０に示されているとおりの配列を含むヒンジ領域を含み得る。これらの例では、抗体は、配列番号２７に示されているアミノ酸配列を含むＶＬを含み得る。例えば、抗体は、配列番号７８に示されているアミノ酸配列を含み得る。
【０１３２】
別の例では、上で言及した抗体は、配列番号６９に示されているとおりの配列を含む定常重領域１、配列番号７２に示されているとおりの配列を含む定常重領域３、配列番号７０に示されているとおりの配列を含むヒンジ領域及び配列番号７１、７４、７６のいずれか１つに示されているとおりの配列を含む定常重領域２を含み得る。この例では、抗体は、配列番号２７に示されているアミノ酸配列を含むＶＬを含み得る。例えば、抗体は、配列番号７８に示されているアミノ酸配列を含み得る。
【０１３３】
別の例では、抗体は、配列番号６８に示されているアミノ酸配列を有する。別の例では、抗体は、配列番号７３に示されているアミノ酸配列を有する。別の例では、抗体は、配列番号７５に示されているアミノ酸配列を有する。別の例では、抗体は、配列番号６８、７３または７５のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を有する。
【０１３４】
当技術分野で公知のとおり、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭなどの異なるアイソタイプで生じ得る。一例では、本開示によって包含される抗体は、ＩｇＧである。別の例では、本開示によって包含される抗体は、ＩｇＭである。
【０１３５】
一例では、本開示による抗体の物理的安定性は、対応するＶＨ及びＶＬ配列を有するｓｃＦｖまたはジ−ｓｃＦｖなどのＦｖよりも高い。一例では、本開示による抗体の物理的安定性は、抗体を少なくとも４週間にわたって４℃で溶液中にとどめた場合に、配列番号５０に示されているとおりのアミノ酸配列を含むジ−ｓｃＦｖよりも高い。一例では、本開示による抗体の物理的安定性は、抗体を少なくとも６か月間にわたって４℃で溶液中にとどめた場合に、配列番号５０に示されているとおりのアミノ酸配列を含むジ−ｓｃＦｖよりも高い。
【０１３６】
別の例では、抗体は、ヒト対象において、配列番号４８に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４９に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＬを有する結合タンパク質と比較して、低下した免疫原性を有する。例えば、抗体は、免疫原性を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した場合に、配列番号４８に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４９に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＬを有する結合タンパク質と比較して、低下した免疫原性を有し得る。別の例では、抗体は、免疫原性を表面プラスモン共鳴によって測定した場合に、配列番号４８に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＨ及び配列番号４９に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＶＬを有する結合タンパク質と比較して、低下した免疫原性を有し得る。
【０１３７】
別の例では、抗体は、ヒト対象において、配列番号５０に示されているとおりのアミノ酸配列を含むジ−ｓｃＦｖと比較して、低下した免疫原性を有する。例えば、抗体は、免疫原性を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した場合に、配列番号５０に示されているとおりのアミノ酸配列を含むジ−ｓｃＦｖと比較して、低下した免疫原性を有し得る。別の例では、抗体は、免疫原性を表面プラスモン共鳴によって測定した場合に、配列番号５０に示されているとおりのアミノ酸配列を含むジ−ｓｃＦｖと比較して、低下した免疫原性を有し得る。
【０１３８】
一例では、抗体は、修飾されたＦｃ領域を有する。例えば、抗体Ｆｃ領域は、配列番号７１に示されているとおりのアミノ酸配列を含み得る。別の例では、抗体Ｆｃ領域は、配列番号７４に示されているとおりのアミノ酸配列を含む。別の例では、抗体は、配列番号７６に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＦｃ領域を含む。別の例では、抗体は、配列番号７１、７４または７６のいずれか１つに示されているとおりのアミノ酸配列を含むＦｃ領域を含む。別の例では、抗体は、３つのアミノ酸置換を有する配列番号７７に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＦｃ領域を含む。この例では、アミノ酸置換のうちの２つは、配列番号７７のアミノ酸１から１０の間にある。別の例では、アミノ酸置換のうちの２つは、配列番号７７のアミノ酸５から１０の間にある。別の例では、アミノ酸置換のうちの２つは、配列番号７７の７及び８位にある。これらの例では、第３のアミノ酸置換は、配列番号７７のアミノ酸６５から７５の間にある。別の例では、第３のアミノ酸置換は、配列番号７７のアミノ酸６８から７２の間にある。別の例では、第３のアミノ酸置換は、配列番号７７のアミノ酸６５から７５の間にある。一例では、抗体は、Ｌ７Ａ変異を有する配列番号７７に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＦｃ領域を含む。別の例では、抗体は、Ｌ８Ａ変異を有する配列番号７７に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＦｃ領域を含む。別の例では、抗体は、Ｎ７０Ｄ変異を有する配列番号７７に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＦｃ領域を含む。別の例では、抗体は、Ｌ７Ａ及びＬ８Ａ変異を有する配列番号７７に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＦｃ領域を含む。別の例では、抗体は、Ｌ７Ａ及びＮ７０Ｄ変異を有する配列番号７７に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＦｃ領域を含む。別の例では、抗体は、Ｌ８Ａ及びＮ７０Ｄ変異を有する配列番号７７に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＦｃ領域を含む。別の例では、抗体は、Ｌ７Ａ、Ｌ８Ａ及びＮ７０Ｄ変異を有する配列番号７７に示されているとおりのアミノ酸配列を含むＦｃ領域を含む。
【０１３９】
上では、基準配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、重鎖及び軽鎖ポリペプチド配列、ならびにそのＣＤＲを含む本開示の配列の変形形態が一般に提示されているが、より低い同一性を有するバリアントも明らかに本開示されている。したがって、一部の例では、ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号３２〜４７のいずれかのポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、または少なくとも９４％同一なポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号３２〜４７のいずれか（例えば、配列番号１７〜２９のいずれか）の重鎖及び／または軽鎖のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、または少なくとも９４％同一な可変重鎖及び／または軽鎖を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質は、配列番号３２〜４７（例えば、配列番号１〜１６のいずれか）のいずれかのＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、または少なくとも９４％同一な１つまたは複数のＣＤＲを含む。
【０１４０】
結合タンパク質の生成
組み換え発現
一例では、本明細書に記載のとおりの結合タンパク質は、ペプチドまたはポリペプチドである（例えば、抗体またはその抗原結合断片である）。一例では、結合タンパク質は組み換え体である。
【０１４１】
組み換えペプチドまたはポリペプチドの場合には、それらをコードする核酸を、発現ベクターにクローニングすることができ、次いで、それを、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、あるいはサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞、または免疫グロブリンもしくは抗体タンパク質を他には産生しない骨髄腫細胞などの哺乳類細胞などの宿主細胞にトランスフェクトする。
【０１４２】
適切な分子クローニング技術は当技術分野で公知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までのアップデート版を含む）またはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている。広範囲の様々なクローニング及びインビトロ増幅方法が組み換え核酸の構築に適している。組み換え抗体を生成する方法も当技術分野で公知である。米国特許第４，８１６，５６７または米国特許第５，５３０，１０１を参照されたい。
【０１４３】
単離後に、核酸は、さらなるクローニング（ＤＮＡ増幅）のために、または無細胞系もしくは細胞における発現のために、発現構築物または発現ベクター中のプロモーターに作動可能に連結して挿入される。したがって、本開示の別の例は、本開示の単離核酸及び１つまたは複数の追加のヌクレオチド配列を含む発現構築物を提供する。適切には、発現構築物は、当技術分野において理解されるように、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、酵母、または細菌性人工染色体の形態であるか、またはそれらの遺伝的構成要素を含む。発現構築物は、細菌もしくは他の宿主細胞における単離された核酸の維持及び増殖のために、組み換えＤＮＡ技術による操作のために、及び／または本開示の核酸または結合タンパク質の発現のために、適切であり得る。
【０１４４】
細胞において発現させるために多くのベクターが利用可能である。ベクター構成要素は一般に、限定されないが、次のうちの１つまたは複数を含む：シグナル配列、（例えば、本明細書に提供される情報に由来する）結合タンパク質をコードする配列、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列。例示的なシグナル配列には、原核生物分泌シグナル（例えば、ｐｅｌＢ、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩ）、酵母分泌シグナル（例えば、インベルターゼリーダー、αファクターリーダー、または酸性ホスファターゼリーダー）、または哺乳類分泌シグナル（例えば、単純ヘルペスｇＤシグナル）が含まれる。
【０１４５】
哺乳類細胞において活性な例示的なプロモーターには、サイトメガロウイルス媒介初期プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）、ヒト伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１）、核内低分子ＲＮＡプロモーター（Ｕ１ａ及びＵ１ｂ）、α−ミオシン重鎖プロモーター、サルウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ）、アデノウイルス主要遅延プロモーター、β−アクチンプロモーター、ＣＭＶエンハンサー／β−アクチンプロモーター、または免疫グロブリンもしくは抗体プロモーターもしくはそれらの活性断片を含むハイブリッド調節エレメントが含まれる。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）、ヒト胎児由来腎臓系（懸濁培養での成長のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）である。
【０１４６】
例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳ．ｐｏｍｂｅを含む群から選択される酵母細胞などの、酵母細胞における発現に適した典型的なプロモーターには、限定されないが、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ４プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ｎｍｔプロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、またはＴＥＦ１プロモーターが含まれる。
【０１４７】
単離核酸またはそれを含む発現構築物を発現のために細胞に導入する手段は当業者に公知である。所与の細胞のために使用される技術は既知の成功した技術による。組み換えＤＮＡを細胞に導入する手段には、特に微量注入、ＤＥＡＥ−デキストランを媒介するトランスフェクション、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ、ＭＤ、ＵＳＡ）及び／またはｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（Ｇｉｂｃｏ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いることなどによる、リポソームを媒介するトランスフェクション、ＰＥＧ媒介性ＤＮＡ取り込み、電気穿孔法及びＤＮＡコーティングされたタングステンまたは金粒子（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ  Ｉｎｃ．、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いることなどによる微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）が含まれる。
【０１４８】
結合タンパク質（例えば、抗体または抗原結合断片）を生成するために使用される宿主細胞は、使用される細胞型に応じて、様々な培地中で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（（ＭＥＭ），（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭｌ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が哺乳類細胞を培養するために適している。本明細書で論述される他の細胞型を培養するための培地は当技術分野で公知である。
【０１４９】
当業者であれば、上述の記載から、本開示が本開示の結合タンパク質（例えば、ペプチドもしくはポリペプチド結合タンパク質または抗体もしくはその抗原結合断片）をコードする単離核酸も提供することを理解するであろう。
【０１５０】
本開示は、プロモーターに作動可能に連結した本開示の単離核酸を含む発現構築物も提供する。一例では、発現構築物は発現ベクターである。
【０１５１】
一例では、本開示の発現構築物は、プロモーターに作動可能に連結したポリペプチド（例えば、ＶＨを含む）をコードする核酸及びプロモーターに作動可能に連結した別のポリペプチド（例えば、ＶＬを含む）をコードする核酸を含む。
【０１５２】
本開示は、本開示による発現構築物を含む宿主細胞も提供する。
【０１５３】
本開示は、本開示の結合タンパク質を発現する単離細胞または結合タンパク質を発現するように遺伝子組み換えされた組み換え細胞も提供する。
【０１５４】
タンパク質の単離
本開示による結合タンパク質を精製するための方法は、当技術分野で公知であり、及び／または本明細書に記載されている。例を下の実施例１に示す。
【０１５５】
ペプチドまたはポリペプチドが培地に分泌される場合、このような発現系からの上清を先ず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を用いて濃縮することができる。タンパク質分解を阻害するために、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害薬が前述のステップのうちのいずれかに含まれていてもよく、外来性混入物の増殖を予防するために、抗生物質が含まれていてもよい。
【０１５６】
細胞から調製された結合タンパク質は、例えば、イオン交換、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーまたはプロテインＧクロマトグラフィー）または前述のいずれかの組み合わせを用いて精製することができる。これらの方法は、当技術分野で公知であり、例えば、ＷＯ９９／５７１３４またはＥｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）に記載されている。
【０１５７】
コンジュゲート
一例では、本開示の結合タンパク質は、別の化合物にコンジュゲートしている。結合タンパク質を化合物に直接的または間接的に結合することができる（例えば、間接的な結合の場合には、リンカーを含み得る）。化合物の例には、放射性同位体（例えば、ヨウ素−１３１、イットリウム−９０またはインジウム−１１１）、検出可能な標識（例えば、フルオロフォアまたは蛍光ナノ結晶または量子ドット）、治療用化合物（例えば、化学療法薬または抗炎症薬）、コロイド（例えば、金）、毒素（例えば、リシンまたは破傷風トキソイド）、核酸、ペプチド（例えば、血清アルブミン結合ペプチド）、タンパク質（例えば、抗体の抗原結合ドメインを含むタンパク質または血清アルブミン）、対象における化合物の半減期を増加させる作用物質（例えば、ポリエチレングリコールまたはこの活性を有する他の水溶性ポリマー）及びその混合物が含まれる。
【０１５８】
抗体に薬物または他の小分子医薬を結合させるための方法は周知であり、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）−アミノベンゾアート、スルホンスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）−アミノベンゾアート、４−スクシンイミジル−オキシカルボニル−−（２−ピリジルジチオ）トルエン、スルホンスクシンイミジル−６−［α−メチル−∀−（ピリジルジチオール）−トルアミド］ヘキサノアート、Ｎ−スクシンイミジル−３−（−２−ピリジルジチオ）−プロプリオナート、スクシンイミジル−６−［３（−（−２−ピリジルジチオ）−プロプリオンアミド］ヘキサノアート、スルホスクシンイミジル−６−［３（−（−２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノアート、３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド、エルマン試薬、ジクロロトリアジン酸、Ｓ−（２−チオピリジル）−Ｌ−システインなどの二官能性化学的リンカーの使用を含み得る。さらなる二官能性連結分子が、例えば、米国特許第５，３４９，０６６号、同第５，６１８，５２８号、同第４，５６９，７８９号、同第４，９５２，３９４号、及び同第５，１３７，８７７号において論述されている。
【０１５９】
リンカーは、切断可能または切断不可能であってよい。高度に安定なリンカーは、循環で減少するペイロードの量を減少させ、したがって、安全性プロファイルを改善し、かつペイロードの大部分が標的細胞に到達することを保証し得る。リンカーは、ジスルフィド、ヒドラゾンまたはペプチド（切断可能）、またはチオエーテル（切断不可能）を含む化学的モチーフに基づいてよく、かつ標的細胞への活性薬剤の分布及び送達を制御し得る。リンカーの切断可能または切断不可能な種類は、前臨床及び治験で安全であることが実証されている（例えば、カテプシンによって切断可能な酵素感受性リンカーを含むブレンツキシマブベドチン、及び安定していて切断不可能なリンカーを含むトラスツズマブエムタンシンを参照されたい）。特定の実施形態では、リンカーは、エドマン分解によって切断可能なペプチドリンカーである（Ｂａｃｈｏｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，１７（３）：６０５−１１（２０１３））。
【０１６０】
切断不可能なリンカーは、活性薬剤を細胞または標的微小環境内に維持し得る。結果として、抗体全体、リンカー及び活性薬剤は標的化細胞に侵入し、そこで、その抗体は、アミノ酸のレベルまで分解される。抗体のアミノ酸と、リンカーと、活性薬剤との間で生じる複合体は実薬となる。対照的に、切断可能なリンカーは、標的細胞または微小環境において酵素によって触媒されて、そこで、活性薬剤を放出する。切断されると、ペイロードは標的化細胞から脱出して、隣接細胞を攻撃し得る（「バイスタンダー死滅」とも称される）。本開示の結合タンパク質の場合には、リンカーの切断は、標的細胞または微小環境において異なる作用機序を有し得る２つの活性薬剤、抗体自体及びそのペイロードをもたらし得る。
【０１６１】
一部の実施形態では、活性薬剤と切断部位との間に１つまたは複数の追加の分子が存在する。他の検討事項には、部位特異的コンジュゲーション（ＴＤＣ）（Ａｘｕｐ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１０９（４０）：１６１０１−６（２０１２））ならびに安定性及び治療指数を改善し得る、Ｌｙｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，３２（１０）：１０５９−１０６２（２０１４）、及びＫｏｌｏｄｙｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，２６（２）：１９７−２００（２０１５）に記載されているものなどのコンジュゲーション技術、ならびにα線放射性免疫複合体（Ｗｕｌｂｒａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｌｔｈｏｆｆ，Ｇａｂｒｉｅｌｅ，ｅｄ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．８（５）：ｅ６４７３０（２０１３））が含まれる。
【０１６２】
一例では、結合タンパク質を、ナノ粒子またはマイクロ粒子にコンジュゲートさせる（例えば、Ｋｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ）．２：２８７−３０６，２００７において概説されているとおりに）。ナノ粒子は、金属ナノ粒子であってもよい。粒子は、ポリマー粒子、リポソーム、ミセル、マイクロバブル、ならびに当技術分野で公知の他の担体及び送達ビヒクルであり得る。
【０１６３】
送達ビヒクルがポリマー粒子である場合、結合タンパク質を、粒子に、またはポリマーに組み込まれている脂肪酸などのアダプター要素に直接カップリングさせることができる。リガンドを、粒子の表面上に存在する官能性化学基（カルボン酸、アルデヒド、アミン、スルフヒドリル及びヒドロキシル）、及び結合させるリガンド上に存在する官能性化学基（カルボン酸、アルデヒド、アミン、スルフヒドリル及びヒドロキシル）を介してポリマー粒子の表面に結合させてもよい。官能基を、粒子の調製後に、粒子及びリガンドをホモまたはヘテロ二官能性クロスリンカーで架橋することによって導入してもよい。この手順では、適切な化学作用、及び調製後に粒子表面の化学的修飾によって粒子表面にリガンドをカップリングする一群のクロスリンカー（下により詳細に論述するとおりのＣＤＴ、ＥＤＡＣ、グルタルアルデヒドなど）または任意の他のクロスリンカーを使用してもよい。
【０１６４】
結合タンパク質を、ポリマー粒子と相互作用するアダプター要素を介して間接的に、ポリマー粒子に結合させてもよい。アダプター要素は、少なくとも２つの方法でポリマー粒子に結合させることができる。第１の方法は、マイクロ及びナノ粒子の調製中に、例えば、マイクロ粒子のエマルジョン調製中に官能性化学基を有する安定剤を導入することによる方法である。例えば、脂肪酸、疎水性または両親媒性ペプチド及びポリペプチドなどのアダプター要素を、エマルジョン調製中に、粒子に挿入することができる。第２の実施形態では、アダプター要素は、粒子表面に受動的に吸着及び結合し、それによって、結合タンパク質に係留するための官能性末端基を導入することができる脂肪酸または脂質などの両親媒性分子であってもよい。アダプター要素は、限定されないが、疎水性相互作用、静電相互作用及び共有結合を含む様々な相互作用によって、マイクロ及びナノ粒子と会合してよい。
【０１６５】
適切なポリマーには、エチルセルロース及び他の天然または合成セルロース誘導体が含まれる。水性環境中でゆっくり溶解してゲルを形成するヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリエチレンオキシドなどのポリマーも、粒子の材料として適し得る。他のポリマーには、限定されないが、ポリ無水物、ポリ（エステル無水物）、ポリヒドロキシ酸、例えば、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ−３−ヒドロキシブチラート（ＰＨＢ）及びそのコポリマー、ポリ−４−ヒドロキシブチラート（Ｐ４ＨＢ）及びそのコポリマー、ポリカプロラクトン及びそのコポリマー、ならびにその組み合わせが含まれる。
【０１６６】
本開示の結合タンパク質にコンジュゲートさせ得る一部の例示的化合物を表１に列挙する。
【表１】
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【０１６７】
一例では、本開示の結合タンパク質は、化学療法薬にコンジュゲートしている。
【０１６８】
一例では、本開示の結合タンパク質は、メイタンシノイド、例えば、ＤＭ１またはＤＭ４にコンジュゲートしている。
【０１６９】
別の例では、本開示の結合タンパク質は、オーリスタチン、例えば、ＭＭＡＥまたはＭＭＡＤにコンジュゲートしている。
【０１７０】
別の例では、本開示の結合タンパク質は、酵素、例えば、ＭＴＭ１、ＧＡＡまたはＡＧＬにコンジュゲートしている。
【０１７１】
別の例では、本開示の結合タンパク質は、ＭＢＮＬにコンジュゲートしている。
【０１７２】
別の例では、本開示の結合タンパク質は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）にコンジュゲートしている。様々な例で、本開示の結合タンパク質は、ＨＳＰ３３、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＨＳＰ１００、スモールＨＳＰ（ｓＨＳＰ）のファミリーまたはその組み合わせからのＨＳＰにコンジュゲートしている。例えば、本開示の結合タンパク質は、ＨＳＰ７２にコンジュゲートしていてよい。したがって、一例では、本開示は、ＨＳＰ７０ファミリーからのＨＳＰにコンジュゲートしているＦｖを包含する。別の例では、本開示は、ＨＳＰ７２にコンジュゲートしているＦｖを包含する。
【０１７３】
別の例では、本開示の結合タンパク質は、本明細書に開示のＰＡＲＰ阻害薬にコンジュゲートしている。例えば、本開示の結合タンパク質は、オラパリブにコンジュゲートしていてよい。
【０１７４】
上の例の一態様では、結合タンパク質コンジュゲートを、コンジュゲートしたペイロードを細胞に送達するために使用することができる。例示的な細胞には、心筋細胞などの心臓細胞、肺胞細胞などの肺細胞及びニューロンなどの神経細胞が含まれる。他の例示的な細胞には、がん細胞またはウイルス感染細胞が含まれる。
【０１７５】
一部の実施形態では、上述の化合物の１種または複数は、本開示の結合タンパク質にコンジュゲートしていることから明確に除外される。例えば、結合タンパク質は、ネイキッドであってよい。
【０１７６】
組成物
適切には、本開示による結合タンパク質を対象に投与するための組成物または方法では、当技術分野で理解されるように、結合タンパク質を薬学的に許容される担体と組み合わせる。一例では、本開示は、薬学的に許容される担体と組み合わされた本開示の結合タンパク質を含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。別の例では、本開示は、対象に投与する前に結合タンパク質と組み合わせるまたは混合するために適した薬学的に許容される担体を含むキットを提供する。この例では、キットは、取扱説明書をさらに含んでもよい。
【０１７７】
一般名では、「担体」は、対象、例えば、ヒト対象に安全に投与することができる固体または液体の増量剤、結合剤、希釈剤、カプセル化物質、乳化剤、湿潤剤、溶媒、懸濁化剤、コーティング剤または滑沢剤を指すために使用される。個別の投与経路に応じて、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ，１９９１）に記載されているとおりの当技術分野で公知の様々な許容される担体を使用することができる。
【０１７８】
例えば、適切な担体は、糖（例えば、スクロース、マルトース、トレハロース、グルコース）、デンプン、セルロース及びその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油及び合成モノ−またはジ−グリセリドを含む油、低級アルコール、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、ステアリン酸ナトリウムまたはマグネシウムなどの滑沢剤、等張性生理食塩水ならびに発熱物質不含の水を含む群から選択することができる。一例では、担体は、Ｈ２Ｏではない。
【０１７９】
一例では、担体は、非経口投与と適合するか、または適している。非経口投与には、消化管を介さないいずれの投与経路も含まれる。非経口投与の例には、注射、注入などが含まれる。注射による投与の例には、静脈内、動脈内、筋肉内及び皮下注射が含まれる。別の例では、組成物は、皮内、筋肉内または皮下送達することができるデポー剤または徐放性製剤によって送達することができる。
【０１８０】
一部の実施形態では、結合タンパク質を、限定されないが、上に論述されているものなどのナノ粒子、マイクロ粒子、または他の送達ビヒクルに封入するか、または組み込む。
【０１８１】
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質を、がん、組織損傷、傷害、感染、または虚血の１つまたは複数の部位を検出するために利用する。この方法は典型的には、それを必要とする対象に、画像診断または核医学技術を使用して検出可能な有効量の作用物質を投与すること、及びその作用物質を検出することを含む。そのような方法では、作用物質は典型的には、ＤＮＡ結合タンパク質にコンジュゲートしているか、またはＤＮＡ結合タンパク質とコンジュゲートしている送達ビヒクル中にカプセル封入されている。画像診断または核医学技術は、例えば、ＰＥＴ−ＣＴ、骨スキャン、ＭＲＩ、ＣＴ、心エコー、超音波、及びＸ線であってよい。
【０１８２】
一例では、結合タンパク質及びそれを含む組成物は、状態を処置するための医薬品の製造において使用することができる。別の例では、本開示は、状態の処置において使用するための結合タンパク質またはそれを含む組成物に関する。処置される状態の例は、下に論述する。
【０１８３】
方法及び使用は典型的には、それを必要とする対象に、有効量の結合タンパク質を投与することを含む。一部の実施形態では、対象は、がん細胞またはウイルス感染細胞または形質転換細胞を有する。一部の実施形態では、対象は、限定されないが、虚血、組織損傷、傷害、または感染を含む外因性または細胞外ＤＮＡによって特徴づけられる疾患または障害を有する。方法及び使用は、第２、第３、またはそれ以上の追加の活性薬剤との併用療法を含み得る。例えば、本開示の結合タンパク質は、標準的な化学療法、放射線療法、及び他の抗がん処置と組み合わせて使用することができる。放射線療法（ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）（放射線療法（ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ）としても公知）は、悪性細胞を制御するためのがん処置の一部としての、電離放射線の医学的使用である。
【０１８４】
併用療法
本発明者が編集したデータは、本開示の結合タンパク質がポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害薬と共に作用して、がん細胞を死滅させることを示している。例えば、相加を上回る細胞死が、ジ−ｓｃＦｖ及びＰＡＲＰ阻害薬で処置したＨＤＲ欠損がん細胞で観察された。
【０１８５】
したがって、別の例では、本開示は、がんの処置を必要とする対象においてがんを処置する方法であって、対象に、本明細書に開示の結合タンパク質及びＰＡＲＰ阻害薬を投与することを含む、前記方法を包含する。別の例では、本開示は、本明細書に開示の結合タンパク質及びＰＡＲＰ阻害薬を含み、その組み合わせが同時または連続投与で与えられる治療用組み合わせに関する。別の例では、本開示は、がんの処置において使用するための、本明細書に開示の結合タンパク質及びＰＡＲＰ阻害薬を含む治療用組み合わせに関する。
【０１８６】
一例では、ＰＡＲＰ阻害薬は、オラパリブ、ニラパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ、タラゾパリブ及びＢＧＢ−２９０からなる群から選択される。例えば、ＰＡＲＰ阻害薬は、オラパリブであってよい。
【０１８７】
ＰＡＲＰ阻害薬と共に投与するために適した結合タンパク質の例は上に示されている。一例では、結合タンパク質は、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号２に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号５に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含む。別の例では、結合タンパク質は、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号２に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号６に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含む。別の例では、結合タンパク質は、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号３に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号５に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含む。別の例では、結合タンパク質は、配列番号１に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号３に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号４に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＨならびに配列番号６に示されているとおりのＣＤＲ１、配列番号７に示されているとおりのＣＤＲ２及び配列番号８に示されているとおりのＣＤＲ３を有するＶＬを含む。これらの例では、結合タンパク質は、Ｆｖであってよい。一例では、結合タンパク質は、ジ−ｓｃＦｖであってよい。
【０１８８】
下に論述されている状態のうちの１つまたは複数を有する対象を、本明細書に開示の結合タンパク質及びＰＡＲＰ阻害薬を投与することによって処置することができる。一例では、対象は、膵臓癌を有する。別の例では、対象は、結腸癌を有する。一例では、対象は、実質的にＢＲＣＡ２欠損のがんを有する。
【０１８９】
別の例では、上で言及した併用療法を、ＰＡＲＰ阻害薬治療に抵抗性を有するがんを有する対象を処置するために使用することができる。
【０１９０】
一例では、結合タンパク質及びＰＡＲＰ阻害薬を単一組成物として投与する。
【０１９１】
別の例では、結合タンパク質及びＰＡＲＰ阻害薬を別々の組成物として投与する。例えば、結合タンパク質及びＰＡＲＰ阻害薬を同時で投与することができる。別の例では、結合タンパク質及びＰＡＲＰ阻害薬を連続的に投与することができる。この例では、結合タンパク質及びＰＡＲＰ阻害薬の投与を規定期間（通常、複数分、複数時間または複数日間）にわたって実施する。一例では、第２の治療薬が投与されるときに第２の治療薬の治療効果が得られるか、それに付け加わるまだ十分なレベルの第１の治療薬が存在する限り、連続投与の間の期間は数日であってよい。一例では、結合タンパク質の投与の後に、ＰＡＲＰ阻害薬の連続投与が続く。別の例では、ＰＡＲＰ阻害薬の投与の後に、結合タンパク質の連続投与が続く。
【０１９２】
本開示による治療用組み合わせは、様々な経路によって投与することができる。例示的な投与経路には、ボーラスとしての、またはある期間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）、髄腔内、経口経路が含まれる。
【０１９３】
一例では、結合タンパク質及びＰＡＲＰ阻害薬を同じ経路によって投与する。例えば、結合タンパク質及びＰＡＲＰ阻害薬の両方を、連続注入によって静脈内投与することができる。別の例では、結合タンパク質及びＰＡＲＰ阻害薬を異なる経路によって投与する。例えば、結合タンパク質は連続注入によって静脈内投与することができ、ＰＡＲＰ阻害薬は経口投与することができる。
【０１９４】
一部の例では、本明細書に定義の結合タンパク質またはＦｖ断片及びＰＡＲＰ阻害薬の投与は、結合タンパク質またはＦｖ断片及びＰＡＲＰ阻害薬を単独で、または単離して投与する場合よりも大きな結果を達成する。例えば、この組み合わせによって達成される結果は、個々の成分によって単独で達成される結果の相加を上回り得る。
【０１９５】
一例では、本明細書に定義の結合タンパク質またはＦｖ断片及びＰＡＲＰ阻害薬の組み合わせの投与は、がんを有する対象において、対象に同量の個々の成分を単独で投与する場合よりも高い程度で、がん細胞増殖または生存の減少に有効である。例えば、がんを有する対象におけるがん細胞増殖または生存の減少は、個々の成分によって単独で達成される結果の相加を上回り得る。一部の例では、がんを有する対象では、この組み合わせは、腫瘍量を減少させるために、腫瘍の進行を減少させるために、またはその組み合わせのために有効であり、これは、個々の成分によって単独で達成される結果の相加を上回り得る。
【０１９６】
処置される状態
一例では、本開示による結合タンパク質は、対象に、様々な状態を処置するために投与することができる。
【０１９７】
本開示の一部の例では、本明細書に記載の方法は、がんを処置するための方法である。「がん」という用語は、典型的には未制御の細胞成長／増殖によって特徴づけられる哺乳類における生理学的状態を指す、またはそれを説明する。がんの例には、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病またはリンパ悪性病変が含まれる。そのようながんのより個別の例には、これに限定されないが、扁平上皮細胞癌（例えば、上皮性扁平上皮細胞癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及び肺扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌及び胃腸間質癌を含む胃（ｇａｓｔｒｉｃ）または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）または腎臓（ｒｅｎａｌ）癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端性黒子型黒色腫、結節型黒色腫、多発性骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、及びワルデンストレームマクログロブリン血症を含む）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽急性白血病（ＡＬＬ）、ヘアリーセル白血病、慢性骨髄芽球性白血病、ならびに移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、さらには、母斑症と関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍と関連するものなど）、メーグス症候群、脳、さらには頭頚部癌、ならびに関連転移が含まれる。別の例では、「がん」という用語は、三重陰性乳癌を包含する。したがって、一例では、本開示は、乳房、卵巣、結腸、前立腺、肺、脳、皮膚、肝臓、胃、膵臓または血液ベースのがんを処置する方法に関する。別の例では、本開示は、神経膠芽細胞腫の処置に関する。この例では、神経膠芽細胞腫を、配列番号４１を有するジ−ｓｃＦｖまたは配列番号４１に定義されている重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体などの本明細書に開示の結合タンパク質を投与することによって処置し得る。
【０１９８】
他の例では、本明細書に記載の方法を、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＬＢ２、ＯＲ  ＲＡＤ５１Ｂ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄまたは関連遺伝子の変異に関連しているがんを処置するために使用する。他の例では、本明細書に記載の方法を、ＤＮＡミスマッチ修復と関連している遺伝子、例えば、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、及び関連遺伝子における変異に関連するがんを処置するために使用する。他の例では、本明細書に記載の方法を、サイレンスＤＮＡ修復遺伝子、例えば、ＢＲＣＡ１、ＭＬＨ１、ＯＲ  ＲＡＤ５１Ｂ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＯＲ  ＲＡＤ５１Ｄを有するがんを処置するために使用する。
【０１９９】
別の例では、本明細書に記載の方法を、ＤＮＡ修復プロセスが損傷している細胞を死滅させるために使用する。例えば、ＤＮＡ修復が損傷している細胞は、ＤＮＡ修復、ＤＮＡ合成、または相同的な組み換えと関係する遺伝子を異常発現し得る。例示的な遺伝子には、ＸＲＣＣ１、ＡＤＰＲＴ（ＰＡＲＰ−１）、ＡＤＰＲＴＬ２、（ＰＡＲＰ−２）、ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ  ＢＥＴＡ、ＣＴＰＳ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＦＡＮＣＤ２、ＰＭＳ２、ｐ５３、ｐ２１、ＰＴＥＮ、ＲＰＡ、ＲＰＡｌ、ＲＰＡ２、ＲＰＡ３、ＸＰＤ、ＥＲＣＣ１、ＸＰＦ、ＭＭＳ１９、ＲＡＤ５１、ＲＡＤ５１Ｂ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＤ５１Ｄ、ＤＭＣ１、ＸＲＣＣＲ、ＸＲＣＣ３、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２，ＰＡＬＢ２、ＲＡＤ５２、ＲＡＤ５４、ＲＡＤ５０、ＭＲＥＵ、ＮＢ５１、ＷＲＮ、ＢＬＭ、ＫＵ７０、ＫＵ８０、ＡＴＭ、ＡＴＲ  ＣＰＩＫ１、ＣＨＫ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＲＡＤ１、及びＲＡＤ９が含まれる。一例では、本明細書に記載の方法を、ＨＤＲ欠損細胞を死滅させるために使用することができる。別の例では、本明細書に記載の方法を、変異腫瘍抑制遺伝子を有する細胞を死滅させるために使用する。例えば、細胞は、ＢＲＣＡｌまたはＢＲＣＡ２中の１つまたは複数の変異を有し得る。例えば、細胞は、ＢＲＣＡ２欠損結腸癌細胞であってよい。
【０２００】
一例では、本明細書に記載の方法は、実質的にＨＤＲ欠損しているがんを処置するための方法である。一例では、本明細書に記載の方法は、実質的にＢＲＣＡ２欠損しているがんを処置するための方法である。例えば、ＢＲＣＡ２欠損結腸癌を処置することができる。別の例では、本明細書に記載の方法は、実質的にＰＴＥＮ欠損しているがんを処置するための方法である。例えば、ＰＴＥＮ欠損脳癌を処置することができる。別の例では、本明細書に記載の方法は、ＰＡＲＰ阻害に対して抵抗性を有するがんを処置するための方法である。
【０２０１】
本開示の他の例では、本明細書に記載の方法を、オンコウイルスに感染した細胞などのウイルス形質転換細胞を処置するために使用する。「オンコウイルス」という用語は、本開示の文脈では、腫瘍細胞において複製することができ、かつその成長を減少させることができるウイルスを指すために使用される。一例では、オンコウイルスは、腫瘍細胞において天然に複製することができ、かつその成長を減少させることができる。そのようなウイルスの例には、ニューカッスル病ウイルス、水疱性口内炎、粘液腫、レオウイルス、シンドビス、麻疹及びコクサッキーウイルスが含まれる。別の例では、オンコウイルスを、腫瘍細胞において複製し、かつその成長を減少させるように操作する。そのような操作に適した例示的なウイルスには、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、レンチウイルス、ワクシニア（ｖａｃｃｉｎａ）及び水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）が含まれる。
【０２０２】
他の例示的なオンコウイルスには、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、ヒトＴ−リンホトロピックウイルス（ＨＴＬＶ）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＨＨＶ−８）、メルケル細胞ポリオーマウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）が含まれる。
【０２０３】
本開示の他の例では、本明細書に記載の方法を、潜在性ウイルスで形質転換された細胞を死滅させるために使用する。例示的な潜在性ウイルスには、ＣＭＶ、ＥＢＶ、単純ヘルペスウイルス（１及び２型）、及び水痘帯状疱疹ウイルスが含まれる。
【０２０４】
本開示の他の例では、本明細書に記載の方法を、がん、免疫不全、肝炎、脳炎、肺実質炎または呼吸器疾患を起こすウイルスによる活発なウイルス感染症を処置するために使用する。例示的なウイルスには、上で言及したオンコウイルス、パルボウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルスが含まれる。
【０２０５】
本開示の他の例では、本明細書に記載の方法を、コロラドダニ熱（コルチウイルス、ＲＮＡウイルスに起因）、ウエストナイル熱（中東及びアフリカで主に発生する、フラビウイルスに起因する脳炎）、黄熱病、狂犬病（ラブドウイルス科の神経向性ウイルスのいくつかの異なる株に起因）、ウイルス性肝炎、胃腸炎（ウイルス性）−ノーウォーク及びノーウォーク様ウイルス、ロタウイルス、カリチウイルス、及びアストロウイルスに起因する急性ウイルス性胃腸炎、灰白髄炎、頻繁な抗原変異を受け得るオルトミクソウイルスに起因するインフルエンザ（流感）、麻疹（はしか）、パラミクソウイルス、流行性耳下腺炎、まとめて急性呼吸器ウイルスと称される様々なウイルスに起因するウイルス性肺炎を含む呼吸器症候群及び偽膜性喉頭炎を含む急性呼吸器症候群、ならびに呼吸器合胞体ウイルスに起因する呼吸器疾患を処置するために使用する。
【０２０６】
本開示の他の例では、本明細書に記載の方法を、ヌクレオチドリピート障害（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｐｅａｔ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）またはエクソンスプライシング障害（ｅｘｏｎ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を処置するために使用する。本開示の他の例では、本明細書に記載の方法を、筋強直性ジストロフィーなどの、異常なマイクロサテライト伸長と関連する障害を処置するために使用する。例えば、本開示の方法を、筋強直性ジストロフィーを処置するために使用することができる。筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１、筋強直性ジストロフィー−プロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の３’−非翻訳領域におけるトリヌクレオチド（ＣＴＧ）ｎ伸長（ｎ＝５０〜＞３０００））及び２型（ＤＭ２、亜鉛フィンガープロテイン９（ＺＮＦ９）遺伝子の第１のイントロンにおけるテトラヌクレオチド（ＣＣＴＧ）ｎ伸長（ｎ＝７５〜約１１，０００））の例。本開示の他の例では、本明細書に記載の方法を、神経線維種症を処置するために使用する。本開示の他の例では、本明細書に記載の方法を、ハンチントン病を処置するために使用する。本開示の他の例では、本明細書に記載の方法を、筋細管筋障害を処置するために使用する。本開示の他の例では、本明細書に記載の方法を、グリコーゲン貯蔵障害を処置するために使用する。本開示の他の例では、本明細書に記載の方法を、ポーンプ病を処置するために使用する。本開示の他の例では、本明細書に記載の方法を、フォーブス−コーリー病を処置するために使用する。本開示の他の例では、本明細書に記載の方法を、ラフォラ病を処置するために使用する。
【０２０７】
本開示の他の例では、本明細書に記載の方法を、ＭＢＮＬポリペプチドにコンジュゲートした本開示による結合タンパク質を投与することによって、細胞においてインビトロで、または対象において、マッスルブラインド様（ＭＢＮＬ）活性を上昇させるために使用する。本開示の他の例では、本明細書に記載の方法を酵素またはタンパク質補充療法のために使用する。
【０２０８】
本開示の他の例では、本明細書に記載の方法を、ＨＳＰ７０ファミリーからのＨＳＰにコンジュゲートしている本開示による結合タンパク質を投与することによって、細胞においてインビトロで、または対象において、ＨＳＰ活性を上昇させるために使用する。本開示の他の例では、本明細書に記載の方法を、ＨＳＰ７２ポリペプチドにコンジュゲートした本開示による結合タンパク質を投与することによって、細胞においてインビトロで、または対象において、ＨＳＰ７２活性を上昇させるために使用する。
【実施例】
【０２０９】
実施例１  −  ジ−ｓｃＦＶバリアントの発現及び精製
単一遺伝子ＧＳベクター（Ｌｏｎｚａ’ｓ  ＧＳ  Ｘｃｅｅｄ（商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用）を樹立し、配列決定し、直線化し、各バリアントのための安定なプールを生成するために使用した。凍結保存後に、増殖させた安定なプールをそれぞれ２００ｍＬ培養体積に展開し、４日目の単回ボーラス供給で短縮供給バッチ過剰成長（ａｂｒｉｄｇｅｄ  ｆｅｄ  ｂａｔｃｈ  ｏｖｅｒｇｒｏｗ）に掛け、８日目に採取した。上清力価を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ  Ｏｃｔｅｔによって決定した。遠心分離、続く、０．２２μｍフィルターを用いるフィルター滅菌によって、イオン交換精製用の清澄化上清を得た。基準としてマウス抗体の二量体バージョンを使用して、イオン交換精製法を展開した。
【０２１０】
事前充填５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  Ｃａｐｔｏ  Ｓカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−５４４１２２）をＡＫＴＡ清浄器（５ｍＬ／分で実行）で用いて清澄化上清を精製した。試料の装填前後にカラムを５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６で平衡化し、生成物を０〜１Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配で溶離した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ  Ｏｃｔｅｔによる結合及び非結合物質の定量化は、物質の約５７％が非結合画分中に残ったことを示した。再び非結合画分を用いてクロマトグラフィーを繰り返すと、出発物質の約６４％が非結合画分中に残った。
【０２１１】
残留した上清の精製を、０〜１Ｍ  ＮａＣｌの線形溶離勾配でのイオン交換クロマトグラフィーの２つの連続ステップを用いて行った。精製後に、生成物を定量化し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＣ９０３０２４）を用いる限外濾過によって約１ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。
【０２１２】
二重試料を、ＳＥ−ＨＰＬＣによって、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズＨＰＬＣシステムで、Ｚｏｒｂａｘ  ＧＦ−２５０  ９．４ｍｍ  ＩＤ×２５ｃｍカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって分析した。発現培養物の収量及び力価を表１にまとめている。バリアントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が図１及び２に示されている。
【表２】
2020527355.tif 000004
【０２１３】
実施例２  −  バリアントの核透過
核透過のアルカリホスファターゼベースの検査
ＤＬＤ１結腸癌細胞を、対照培地または表示のバリアントのそれぞれで、１時間にわたって処理した。次いで、細胞を洗浄し、固定し、１％ＢＳＡ−ＴＢＳＴで遮断し、次いで、プロテインＬで１時間にわたってプローブした。次いで、細胞を洗浄し、抗プロテインＬ一次抗体と共に１時間にわたってインキュベートした。別のラウンドの洗浄の後に、細胞をアルカリホスファターゼ−コンジュゲート二次抗体と共に１時間にわたってインキュベートした。最後に、細胞を洗浄し、シグナルを、ＮＢＴ／ＢＣＩＰの添加によって発生させた。代表的な画像が図３に示されている。暗色の着色部がバリアントの位置を示している。
【０２１４】
図３の実験からのＤＬＤ１細胞における核アルカリホスファターゼ染色を反映する生の密度積算値を、ＩｍａｇｅＪを用いる分析によって得た。値の分布の箱ひげ図が、各バリアントについて図４において示されている。
【０２１５】
細胞数と核染色強度（相反強度として任意単位で表されている）とのヒストグラムプロットが図５に示されている。バリアント１２及び１４以外のバリアントのほとんどが、原型酵母と比べて改善された核透過を示し、これは、ヒストグラムピークの右移動によって実証されている。加えて、ヒト化バリアントの多くについてヒストグラムで観察された分布の狭細化は、原型酵母と比べて改善された核透過の均一性を示している。バリアント１３及び１５は特に、原型酵母と比べて顕著な右移動及び分布の狭細化を示した。
【０２１６】
核透過の免疫蛍光ベースの検査
ＤＬＤ１結腸癌細胞を、対照培地または表示のバリアントのそれぞれで、１時間にわたって処理した。次いで、細胞を洗浄し、固定し、１％ＢＳＡ−ＴＢＳＴで遮断し、次いで、プロテインＬで１時間にわたってプローブした。次いで、細胞を洗浄し、抗プロテインＬ一次抗体と共に１時間にわたってインキュベートした。別のラウンドの洗浄の後に、細胞をＡｌｅｘａ４８８−コンジュゲート二次抗体と共に１時間にわたってインキュベートした。最後に、細胞を洗浄し、シグナルを蛍光顕微鏡法によって可視化した。代表的な画像が図６に示されている。緑色のシグナルがバリアントの位置を示している。
【０２１７】
図６の実験からのＤＬＤ１細胞におけるＡｌｅｘａ４８８蛍光シグナルを反映する生の密度積算値を、ＩｍａｇｅＪを用いる分析によって得た。値の分布の箱ひげ図が、各バリアントについて図７において示されている。
【０２１８】
実施例２  −  ＤＮＡ損傷の蓄積
ＰＴＥＮ有能及び欠損Ｕ２５１ヒト膠腫細胞の対応対を対照培地またはバリアント１０、１１、１３、１５、もしくは１６を含有する培地で２４時間にわたって処理した。次いで、細胞を洗浄し、固定し、遮断し、次いで、抗ホスホ−５３ＢＰ１抗体で終夜プローブした。次いで、細胞を洗浄し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５−コンジュゲート二次抗体と共にインキュベートした。最後に、細胞を洗浄し、ＤＡＰＩで対比染色し、蛍光顕微鏡下で可視化した。ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒによって画像を保存し、評価して、１細胞あたりのホスホ−５３ＢＰ１フォーカスの平均数を決定した。新たなバリアントは、ＰＴＥＮ欠損細胞ではフォーカスの数を増加させたが、ＰＴＥＮ有能細胞では増加させなかった。代表的な画像は図８のパネルＡに示されており、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒによる定量分析は、図８のパネルＢに示されている。
【０２１９】
対照培地またはバリアント１０、１３、１５、もしくは１６を含有する培地での処置後に、ＰＴＥＮ欠損Ｕ８７ヒト膠腫細胞の細胞生存率も評価した。処理から７日後に、トリパンブルー排除アッセイを使用して、かつ光学顕微鏡法による細胞形態の直接的な可視化によって、細胞生存率を決定した。すべてのバリアントが、対照処理された細胞と比べて細胞生存率の低下をもたらした（図９）。
【０２２０】
次に、ＢＲＣＡ２有能及び欠損ＤＬＤ１結腸癌細胞の対応対を対照培地またはバリアント１０、１３、１５、もしくは１６を含有する培地で処理した。７日後に、トリパンブルー排除アッセイによって、かつ光学顕微鏡法による細胞形態の直接的な可視化によって、細胞生存率を決定した。バリアントはＢＲＣＡ２有能細胞に対しては毒性がなかったが、ＢＲＣＡ２欠損細胞はバリアントによって死滅した。これらのデータは、バリアントが、ＤＮＡ修復の損傷を有するがん細胞を選択的に死滅させることができることを示している。さらに、これらのデータは、バリアントが、ＤＮＡ修復の損傷を有するがん細胞と健康な細胞とを識別して、がん細胞を選択的に死滅させることができるであろうことを示している。バリアントで処理されたＢＲＣＡ２欠損がん細胞の形態変化を示す代表的な光学顕微鏡画像が図１０のパネルＡに示されている。トリパンブルー排除アッセイによる細胞生存率の定量分析が、図１０のパネルＢに示されている。
【０２２１】
実施例３  −  ＨＤＲ欠損がん細胞におけるＰＡＲＰ阻害とのジ−ｓｃＦｖ同時投与
ＤＬＤ−１及びＭＣＦ−７細胞を対照またはジ−ｓｃＦｖ（配列番号４１）で処理し、核透過を固定細胞のプロテインＬ免疫染色によって評価した。ジ−ｓｃＦｖは、ＤＬＤ−１及びＭＣＦ−７細胞核を成功裏に透過した（図１１及び１２）。
【０２２２】
相同性配向型修復（ＨＤＲ）欠損ＢＲＣＡ２−ＤＬＤ１細胞及びＰＴＥＮ−Ｕ２５１細胞を対照、５ｎＭオラパリブ、１０μＭジ−ｓｃＦｖ、または１０μＭジ−ｓｃＦｖ＋５ｎＭオラパリブで処理した。生存率をコロニー形成アッセイによって決定した。驚くべきことに、相加を上回る細胞死がジ−ｓｃＦｖ及びＰＡＲＰ阻害薬で処理されたＨＤＲ欠損がん細胞において観察された（図１３）。
【０２２３】
次いで、ジ−ｓｃＦｖ及びオラパリブの組み合わせがＤＮＡ修復状態にかかわらず、単に普遍的に細胞傷害性であるかどうかを決定した。この可能性を評価するために、ＨＤＲ有能ＤＬＤ１細胞を上のレジメンで処理して、ＨＤＲ欠損悪性細胞に対する併用療法の選択性を確認した。単独か、またはＰＡＲＰ阻害薬と組み合わせたジ−ｓｃＦｖについて、細胞死に対する効果は観察されなかった。これらの所見は、ＨＤＲ有能細胞が、ジ−ｓｃＦｖ及びオラパリブの両方の作用に対して、それらを組み合わせて使用した場合にも、抵抗性であり続けることを実証している。
【０２２４】
実施例４  −  一次ヒト神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）細胞に対するジ−ｓｃＦｖ（配列番号４１）の効果
患者からの一次ヒトＧＢＭ腫瘍から抽出された一次ヒト神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）がん細胞を対照またはジ−ｓｃＦｖ（配列番号４１）で処理し、生細胞のパーセンテージをトリパンブルー染色によって評価した。ジ−ｓｃＦｖ（配列番号４１）で処理された７つの神経膠芽細胞腫腫瘍外植片のうちの５つが、有意ながん細胞死を示した（図１４）。
【０２２５】
患者からの一次ヒトＧＢＭ腫瘍から抽出され、スフェアとして成長させたＧＢＭがん幹細胞を対照またはジ−ｓｃＦｖ（配列番号４１）で処理し、スフェア体積の減少に対する用量及びインキュベーション時間の作用を、ＧＢＭ細胞へのＤＸ１−ローダミン細胞透過の共焦点顕微鏡写真によって評価した。腫瘍スフェアは、腫瘍異質性を保持し、かつ元の患者腫瘍をより綿密に表すので、前臨床研究のための有用なツールと認識されている。腫瘍スフェアとして成長させたヒトＧＢＭがん幹細胞（ＣＳＣ）のジ−ｓｃＦｖでの処理（配列番号４１）は、ＧＢＭスフェアにおける細胞透過を実証し、かつ用量依存的及び時間依存的にスフェア体積を縮小させた（図１５）。
【０２２６】
実施例５  −  同所マウスモデルにおけるヒトＧＢＭ細胞に対するジ−ｓｃＦｖ（配列番号４１）の作用の評価
ＧＢＭの同所マウスモデルを、ヒトＧＢＭ腫瘍から抽出されたＧＢＭ細胞の頭蓋内注射によって生成した。腫瘍が脳内で生じたら、マウスを対照またはジ−ｓｃＦｖバリアント１３（配列番号４１）の尾静脈注射によって処理し、腫瘍体積の減少に対するジ−ｓｃＦｖの作用を腫瘍の抽出によって評価した。脳切片の評価は、ジ−ｓｃＦｖで処理されたマウスにおける神経膠芽細胞腫腫瘍が対照マウスにおける比較可能な腫瘍よりも４０％超小さいことを示した（図１６Ａ）。ＴＵＮＥＬ染色はまた、ジ−ｓｃＦｖ処理腫瘍におけるアポトーシスの発生率の上昇を実証した（図１６Ｂ）。ジ−ｓｃＦｖ処理ＧＢＭ腫瘍において観察される腫瘍サイズの縮小及びＴＵＮＥＬ染色の増加は、ジ−ｓｃＦｖバリアント１３（配列番号４１）が血液脳関門を成功裏に通過して、ＧＢＭ腫瘍において局在化し、かつその成長に影響を及ぼすことを示唆した。これを確認するために、腫瘍及び正常脳をプロテインＬ免疫染色によって、ジ−ｓｃＦｖについて調べた。図１６Ｃに示されているとおり、ジ−ｓｃＦｖがＧＢＭ腫瘍細胞の核で検出されたが、周囲の隣接する正常脳細胞では明らかではなかった。
【０２２７】
加えて、７匹のマウスからなる群を延命効果について評価したところ、ジ−ｓｃＦｖで処置されたマウスは、対照（中央値７２日）よりも２０％超長い８７日の生存期間中央値を示した。平均生存データは、これらの傾向を反映した（ジ−ｓｃＦｖ処理マウスでは８３日±３．２日、対照では７１日±１．２日）（図１６Ｅ）。統計的解析は２つの群の間での有意な差を示し、Ｐ値＝０．００４であった。ジ−ｓｃＦｖ処置と関連する毒性または体重減少は観察されなかった（図１６Ｄ）。
【０２２８】
実施例６  −  フォーカス蓄積に対するＰＡＴ−ＤＸ１の効果
ＢＲＣＡ２有能及び欠損ＤＬＤ１結腸癌細胞ならびにＰＴＥＮ有能及び欠損Ｕ２５１ヒト膠腫細胞の対応対を対照培地または１０μＭジ−ｓｃＦｖバリアント１３（配列番号４１）、５ｎＭオラパリブ、もしくは併用処理を含有する培地で処理した。ホスホ−５３ＢＰ１抗体染色をＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒによって評価して、１細胞あたりのホスホ−５３ＢＰ１フォーカスの平均数を決定した。単独、及びオラパリブと組み合わせたジ−ｓｃＦｖバリアント１３（配列番号４１）処理は、ＢＲＣＡ２欠損ＤＬＤ１及びＰＴＥＮ欠損Ｕ２５１細胞の両方ではホスホ−５３ＢＰ１フォーカスの数を増加させたが、有能細胞では増加させなかった（図１７）。
【０２２９】
広く記載されている本開示の意図及び範囲から逸脱することなく、具体的な実施形態に示されているような本開示に対して、多数の変形及び／または変更が成され得ることは、当業者によって認められるであろう。したがって、本実施形態は、すべての点について例示であり、限定と考えられるべきではない。
【０２３０】
上記で論述したすべての刊行物は、その全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれている文献、行為、材料、デバイス、記事などの任意の考察は、本開示の文脈を提供する目的のためのものにすぎない。これらの事項のいずれかまたはすべてが従来技術の基礎の一部を形成するか、または本出願の各請求の優先日前に存在するような、本開示に関連する分野の共通の一般的な知識であったという承認と解釈されるべきではない。
【０２３１】
参照文献
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Ｎｏｖｏｔｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：８６４６−８６５０，１９９１
Ｐａｃｋ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：１５７９
Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）
Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ，１９９１）
Ｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｍｙｓｚｋａ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １１：５４，２０００；Ｅｎｇｌｅｂｉｅｎｎｅ  Ａｎａｌｙｓｔ．１２３：１５９９，１９９８
Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）
Ｗｕｌｂｒａｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｌｔｈｏｆｆ，Ｇａｂｒｉｅｌｅ，ｅｄ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．８（５）：ｅ６４７３０（２０１３）
Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ６：７８１
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2020527355.tif 000021
【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2020527355.tif 000023
2020527355.tif 000024
2020527355.tif 000025