(57)【要約】本発明は、抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣとＲａｄ５１阻害剤の組み合わせを用いたＴｒｏｐ−２陽性がんの治療に関する。好ましくは、抗体にコンジュゲートした薬物はＳＮ−３８であり、ＡＤＣはサシツズマブゴビテカンである。４ｍｇ／ｋｇ〜１６ｍｇ／ｋｇ、好ましくは４、６、８、９、１０、１２または１６ｍｇ／ｋｇの用量で本ＡＤＣを投与してもよい。規定の用量及びスケジュールで投与する場合、ＡＤＣとＲａｄ５１阻害剤の組み合わせは、固形腫瘍のサイズを縮小させることができ、転移を抑制または排除することができ、標準療法、例えば、放射線治療、化学療法または免疫療法などに耐性を示すがんを治療するのに有効である。驚くべきことに、本組み合わせは、イリノテカンまたはトポテカンに耐性を示すまたはそれらから再発するがんを治療するのに有効である。【選択図】図２３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）Ｔｒｏｐ−２発現がんを有する対象に抗Ｔｒｏｐ−２抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を投与することと、
ｂ）前記対象にＲａｄ５１の阻害剤を投与することと、
を含む、
Ｔｒｏｐ−２発現がんを治療するための方法。
【請求項２】
前記抗体にコンジュゲートした前記薬物はＤＮＡ鎖切断を誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記薬物は、アウリスタチン、タキサン、カリケアミシン、エポチロン、カンプトテシンまたはアントラサイクリンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記薬物は、ＳＮ−３８、トポテカン、ドキソルビシン、エピルビシン、モルホリノドキソルビシン（モルホリノ−ＤＯＸ）、シアノモルホリノ−ドキソルビシン（シアノモルホリノ−ＤＯＸ）、２−ピロリノドキソルビシン（２−ＰＤＯＸ）、２−ＰＤＯＸのプロドラッグ形態（プロ−２−ＰＤＯＸ）、エトポシド、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、バッカチンＩＩＩ、パクリタキセル及びＭＭＡＥからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｒａｄ５１阻害剤は、Ｂ０２（（Ｅ）−３−ベンジル−２（２−（ピリジン−３−イル）ビニル）キナゾリン−４（３Ｈ）−オン）、ＲＩ−１（３−クロロ−１−（３，４−ジクロロフェニル）−４−（４−モルホリニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、ＤＩＤＳ（４，４’−ジイソチオシアノスチルベン−２，２’−ジスルホン酸）、ハレナキノンまたはイマチニブである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記対象はヒト対象である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＡＤＣは４ｍｇ／ｋｇ〜１６ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記用量は、４ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ及び１６ｍｇ／ｋｇからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記用量は８ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ、配列番号：１）、ＣＤＲ２（ＳＡＳＹＲＹＴ、配列番号：２）及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ、配列番号：３）、ならびに、重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号：４）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ、配列番号：５）及びＣＤＲ３（ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号：６）を含むヒト化ＲＳ７抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記治療は、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、または少なくとも４０％の腫瘍サイズの縮小をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記がんは転移性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
サイズを縮小させること、または転移部を除去することを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記がんは、その他の治療には耐性を示すが、前記ＡＤＣとＲａｄ５１阻害剤を用いた組み合わせ治療には反応を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記薬物はＳＮ−３８である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＳＮ−３８と前記抗体の間にＣＬ２Ａリンカーがあり、前記ＡＤＣの構造はＭＡｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８
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ＭＡｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８
である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
それぞれの抗体分子に結合した６またはそれ以上のＳＮ−３８分子がある、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
それぞれの抗体分子に結合した６〜８つのＳＮ−３８分子がある、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
それぞれの抗体分子に結合した７〜８つのＳＮ−３８分子がある、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体はＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ４抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体は、Ｇ１ｍ３、Ｇ１ｍ３，１、Ｇ１ｍ３，２、Ｇ１ｍ３，１，２、ｎＧ１ｍ１、ｎＧ１ｍ１，２及びＫｍ３アロタイプからなる群から選択されるアロタイプを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＡＤＣ用量は、（ｉ）週に１回、（ｉｉ）１週おき、（ｉｉｉ）１週間の治療に続いて２、３または４週間の休薬、（ｉｖ）２週間の治療に続いて１、２、３または４週間の休薬、（ｖ）３週間の治療に続いて１、２、３、４または５週間の休薬、（ｖｉ）４週間の治療に続いて１、２、３、４または５週間の休薬、（ｖｉｉ）５週間の治療に続いて１、２、３、４または５週間の休薬、及び（ｖｉｉｉ）毎月からなる群から選択されるサイクルのスケジュールで週に１回または週に２回、前記ヒト対象に投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項２３】
前記サイクルを４、６、８、１０、１２、１６または２０回繰り返す、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記患者はこれまでに、トポテカンまたはイリノテカンを用いた治療から再発している、または、トポテカンまたはイリノテカンを用いた治療に耐性を示している、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
ｃ）非コンジュゲート抗体、イムノコンジュゲート、遺伝子治療、化学療法、治療ペプチド、サイトカイン療法、局所放射線治療、外科手術、干渉ＲＮＡ療法、薬物、毒素及びサイトカインからなる群から選択される１種または複数種の治療モダリティを実施すること、
を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記薬物、毒素または化学療法剤は、５−フルオロウラシル、アファチニブ、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、アキシチニブ、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリケアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、Ｃｏｘ−２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、シクロホスファミド、クリゾチニブ、シタラビン、ダカルバジン、ダサチニブ、ジナシクリブ、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノ−モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エルロチニブ、エストラムスチン、エピドフィロトキシン、エルロチニブ、エンチノスタット、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、エキセメスタン、フィンゴリモド、フラボピリドール、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、フォスタマチニブ、ガネテスピブ、ＧＤＣ−０８３４、ＧＳ−１１０１、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イブルチニブ、イダルビシン、イデラリシブ、イホスファミド、イマチニブ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ラパチニブ、レノリダミド、ロイコボリン、ＬＦＭ−Ａ１３、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ネラチニブ、ニロチニブ、ニトロソウレア、オラパリブ、プリコマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ＰＣＩ−３２７６５、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、タモキシフェン、テマゾロミド（ＤＴＩＣの水溶性形態）、トランスプラチン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、バタラニブ、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド、及びＺＤ１８３９からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記薬物はシスプラチンまたはカルボプラチンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＡＤＣはサシツズマブゴビテカンである、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記がんは、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、尿路上皮癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、前立腺癌、卵巣癌、腎臓癌または膀胱癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記がんはＴＮＢＣである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年３月２７日出願の米国仮特許出願６２／４７７，２１６に対する米国特許法１１９（ｅ）条の利益を主張するものであり、その全文は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを経由してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。上記ＡＳＣＩＩのコピー（２０１８年３月１４日に作成）の名称はＩＭＭ３７２ＷＯ１＿ＳＬであり、そのサイズは７，９１６バイトである。
【０００３】
本発明は、Ｔｒｏｐ−２発現がんを治療するための、抗Ｔｒｏｐ−２抗体薬物複合体（ＡＤＣ）とＲａｄ５１の阻害剤を用いた組み合わせ治療に関する。抗Ｔｒｏｐ−２抗体にコンジュゲートした薬物は、ＤＮＡ鎖切断を誘導する薬物、例えば、アウリスタチン、カリケアミシン、カンプトテシン（例えば、ＳＮ−３８）またはアントラサイクリンなどであってもよい。ＤＮＡ鎖切断を誘導する例示的な薬物としては、ＳＮ−３８、トポテカン、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン、オキサリプラチンまたはカルボプラチンが挙げられるがこれらに限定されない。任意のＴｒｏｐ−２発現がんを治療してもよいが、がんは、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、尿路上皮癌、胃癌、膵臓癌、結腸直腸癌、前立腺癌、卵巣癌、腎臓癌または膀胱癌であることが好ましい。ＡＤＣは、抗Ｔｒｏｐ−２−ＳＮ−３８複合体、例えば、サシツズマブゴビテカンなどがより好ましい。特定の実施形態では、ＣＬ２Ａなどのリンカーを使用して薬物を抗体または抗体フラグメントに結合させてもよい。しかしながら、その他のリンカー、その他周知の細胞傷害性薬物、及び、薬物を抗体にコンジュゲートするためのその他周知の方法を利用してもよい。抗体またはフラグメントあたり１〜１２、１〜６、１〜５、６〜８、または７〜８コピーの薬物部分または薬物−リンカー部分に抗体またはフラグメントを結合させてもよい。標準的な抗がん療法、例えば、化学療法などに耐性を示すまたはそれから再発したのいずれかの患者の治療にＡＤＣを使用する。しかしながら、その他の実施形態では、ＴＮＢＣなどのＴｒｏｐ−２＋がんの第一選択治療にＡＤＣを使用してもよい。驚くべきことに、ＡＤＣもまたトポイソメラーゼＩの阻害剤であるにもかかわらず、イリノテカンまたはトポテカン治療から再発したまたはそれらに反応を示さないのいずれかのがん患者にＡＤＣは有用である。組み合わせ治療を単独で使用してもよく、または、外科手術、放射線治療、化学療法、免疫調節薬、サイトカイン、化学療法剤、プロアポトーシス薬、抗血管新生薬、細胞傷害薬、薬物、毒素、放射性核種、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、第二抗体または抗体フラグメント、及び、イムノコンジュゲートからなる群から選択される１種または複数種のその他の治療モダリティと共に使用してもよい。当該技術分野において周知の任意のＲａｄ５１阻害剤、例えば、Ｂ０２（（Ｅ）−３−ベンジル−２（２−（ピリジン−３−イル）ビニル）キナゾリン−４（３Ｈ）−オン）（Ｈｕａｎｇ  ＆  Ｍａｚｉｎ，２０１４，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ９（６）：ｅ１００９９３）、ＲＩ−１（３−クロロ−１−（３，４−ジクロロフェニル）−４−（４−モルホリニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）（Ｂｕｄｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４０：７３４７−５７）、ＤＩＤＳ（４，４’−ジイソチオシアノスチルベン−２，２’−ジスルホン酸）（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３７：３３６７−７６）、ハレナキノン（Ｔａｋａｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  １６：４２７−３６）、または、イマチニブ（Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ８：２０３−１３）などを利用してもよい。
【０００４】
関連技術
毒性のペイロードをがん細胞に選択的に送達するための活性な治療薬に結合した抗体を含む抗体薬物複合体（ＡＤＣ）がホジキンリンパ腫、全身性未分化大細胞リンパ腫及びＨＥＲ２陽性転移性乳癌用に承認されており、造血系がん及び固形腫瘍に関連する様々な抗原を標的とする数種類の新規ＡＤＣが開発中である（ｄｅ  Ｇｏｅｉｊ  ＆  Ｌａｍｂｅｒｔ，２０１６，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４０：１４−２３１−４；Ｇｒａｖａｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  ２１：１０２−９；Ｊｅｒｊｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  ３６：９９−１１６；Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １６：８８３−９３）。ほぼ全てのＡＤＣが、ピコモルの毒性を有する薬物、例えば、ＤＮＡと相互にキレート環を形成するカリケアミシン、または、微小管阻害剤であるアウリスタチンもしくはマイタンシンなどを利用している。それらの薬物は、極めて有毒であるため単独の薬剤としては用いられない。しかしながら、それら薬物の治療窓は適切に抗体に結合させると許容可能なものとなる。それゆえ、適切な抗体とリンカー技術を慎重に選択することが臨床適用を成功させる上で非常に重要である。
【０００５】
本発明者らは、周知の抗がん薬物、ＳＮ−３８、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）の活性成分であるカンプトテシン、トポイソメラーゼＩ阻害剤をベースにしてＡＤＣを開発した（Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｒｂｏｎｅｒｏ  ＆  Ｓｕｐｋｏ，２００２，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８：６４１−６１５；Ｍａｔｈｉｊｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７：２１８２−９４）。更にＳＮ−３８はその他のＡＤＣに用いられる薬物と比較してより適度なレベルの力価を有しており、マウス異種移植モデルを用いた前臨床試験では、最適化条件（すなわち、抗体とリンカーの選択）下において、ＳＮ−３８を用いて調製したＡＤＣが有効であり非常に好ましい治療窓を有していることが示された（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７−６９；Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：６０５２−６１；Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６−２６７−９）。これらＳＮ−３８複合体の１つ（会社表記ＩＭＭＵ−１３２、ＵＳＡＮ表記、サシツズマブゴビテカン）は、Ｔｒｏｐ−２（栄養膜細胞表面抗原、上皮糖タンパク質−１すなわちＥＧＰ−１とも呼ばれる）（多くの上皮癌で高発現する糖タンパク質）を標的とする（Ｃｕｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７９６：３０９−１４，Ｔｒｅｒｏｔｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３２：２２２−３３）。Ｔｒｏｐ−２はまた多くの対応する正常組織に存在している（Ｔｒｅｒｏｔｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３２：２２２−３３；Ｓｔｅｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ５９：７０１−１０）が、類似組織内で交差反応性Ｔｒｏｐ−２を発現するカニクイザルを用いた試験では、用量制限の好中球減少症及び胃腸毒性のみが示された（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：３１５７−６９）。これらの現象が一般的にイリノテカン治療に関連していることから、また比較的高いヒト当用量であってもＴｒｏｐ−２発現正常組織には顕著な損傷が認められなかったことから、本発明者らは、正常組織において抗原が何らかの様式で保護されている、または、正常組織がより適度な毒性を有するＳＮ−３８の影響をより少なく受けるのいずれかであると推測した。
【０００６】
本発明者らは最近、３週間の治療サイクル中の２週間にわたり多種多様な転移性上皮癌を有する患者にサシツズマブゴビテカン（ＩＭＭＵ−１３２）を投与した第Ｉ相用量漸増試験の結果を報告した（Ｓｔａｒｏｄｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２１：３８７０−８）。８、１０、１２及び１８  ｍｇ／ｋｇの用量を試験し、最大耐量（ＭＴＤ）（単一サイクルの治療に対する耐性で評価した）を１２ｍｇ／ｋｇに決定した。しかしながら、この用量ではサイクル内またはサイクル間に頻繁な延期が生じており、そればかりではなく、用量減少が必要であった。それゆえ、延期または用量減少が最小限である複数サイクルの治療を受ける患者においては、２種類のより低い投与濃度、８ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇで増加を継続した。
【０００７】
単剤治療のＩＭＭＵ−１３２（サシツズマブゴビテカン）による有望な結果にもかかわらず、当分野においては、ＩＭＭＵ−１３２とその他抗がん治療薬を用いた組み合わせ治療のための向上した方法及び組成物に対する要望が存在している。
【発明の概要】
【０００８】
様々な実施形態では、本発明は、１種または複数種のその他の治療モダリティ、例えば、外科手術、放射線治療、化学療法、免疫調節薬、サイトカイン、化学療法剤、プロアポトーシス薬、抗血管新生薬、細胞傷害薬、薬物、毒素、放射性核種、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、第二抗体もしくは抗体フラグメント、またはイムノコンジュゲートなどとの組み合わせ治療に用いられる抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を用いてがんを治療するための組成物及び方法に関する。好ましい実施形態では、ＡＤＣは、１種または複数種のＲａｄ５１の阻害剤と組み合わせて使用される。本ＡＤＣは、標準療法が有効ではないがん、例えば、転移性膵臓癌、転移性結腸直腸癌またはトリプルネガティブ乳癌などの治療に有用であってもよい。ＡＤＣとその他の治療モダリティの組み合わせが、個々の治療効果単独またはそれら効果の合計のいずれかと比較してより有効であることがより好ましい。
【０００９】
特定の一実施形態では、抗Ｔｒｏｐ−２抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ、配列番号：１）、ＣＤＲ２（ＳＡＳＹＲＹＴ、配列番号：２）及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ、配列番号：３）、ならびに、重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号：４）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ、配列番号：５）及びＣＤＲ３（ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号：６）を含む、ヒト化ＲＳ７抗体であってもよい（例えば、米国特許番号７，２３８，７８５を参照のこと（その図面セクション及び実施例セクションは参照により本明細書に組み込まれる））。しかしながら、後述するように、その他の抗Ｔｒｏｐ−２抗体は周知であり、それらを本ＡＤＣに用いてもよい。抗Ｔｒｏｐ−２抗体にコンジュゲートした薬物は、ＤＮＡ鎖切断を誘導する薬物、例えば、アウリスタチン、カリケアミシン、カンプトテシン（例えば、ＳＮ−３８）またはアントラサイクリンなどであることが好ましい。ＤＮＡ鎖切断を誘導する例示的な薬物としては、ＳＮ−３８、ドキソルビシン、トポテカン、ドキソルビシン、エトポシド、シスプラチン、オキサリプラチンまたはカルボプラチンが挙げられるがこれらに限定されない。より好ましい実施形態では、抗体にコンジュゲートした薬物はカンプトテシンまたはアントラサイクリンであり、最も好ましくはＳＮ−３８またはドキソルビシンである（例えば、米国特許番号９，０２８，８３３（その図面セクション及び実施例セクションは参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【００１０】
抗体部分は、モノクローナル抗体、抗原結合抗体フラグメント、二重特異性抗体もしくはその他の多価抗体、またはその他の抗体ベース分子であってもよい。抗体は、様々なアイソタイプであってもよく、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であり、より好ましくは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域配列及び定常領域配列を含む。抗体またはそのフラグメントは、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体に加え、それらの変異体、例えば、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ  Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００７；３１７：１５５４−１５５７）に記載されている半ＩｇＧ４抗体（「ユニボディ」と呼ばれる）などであってもよい。より好ましくは、抗体またはそのフラグメントは、ヒト対象にＡＤＣを投与する際に免疫原性を低減させ得るヒト定常領域配列（特定のアロタイプに属する）を含むように設計または選択されてもよい。投与に好ましいアロタイプとしては、非Ｇ１ｍ１アロタイプ（ｎＧ１ｍ１）、例えば、Ｇ１ｍ３、Ｇ１ｍ３，１、Ｇ１ｍ３，２またはＧ１ｍ３，１，２などが挙げられる。より好ましくは、アロタイプは、ｎＧ１ｍ１、Ｇ１ｍ３、ｎＧ１ｍ１，２及びＫｍ３アロタイプからなる群から選択される（Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ，２００９，ｍＡｂｓ  １（４）：１−７）。
【００１１】
抗体または抗体フラグメントにコンジュゲートする薬物は、アントラサイクリン、カンプトテシン、チューブリン阻害剤、メイタンシノイド、カリケアマイシン、アウリスタチン、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、タキサン、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗生物質、酵素阻害剤、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、ビンカアルカロイド、置換ウレア、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、ホルモン拮抗薬、代謝拮抗薬、アルキル化剤、抗有糸分裂薬、抗血管新生薬、チロシンキナーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ９０）阻害剤、プロテオソーム阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、プロアポトーシス薬、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。
【００１２】
使用する特定の薬物は、５−フルオロウラシル、アファチニブ、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、アキシチニブ、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリケアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、ＣＯＸ−２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダサチニブ、ジナシクリブ、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ＤＭ１、ＤＭ３、ＤＭ４、ドキソルビシン、シアノ−モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エンドスタチン、エピルビシングルクロニド、エルロチニブ、エストラムスチン、エピドフィロトキシン、エルロチニブ、エンチノスタット、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、エキセメスタン、フィンゴリモド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、フラボピリドール、フォスタマチニブ、ガネテスピブ、ＧＤＣ−０８３４、ＧＳ−１１０１、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イブルチニブ、イダルビシン、イデラリシブ、イホスファミド、イマチニブ、ラパチニブ、レノリダミド、ロイコボリン、ＬＦＭ−Ａ１３、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、ナベルビン、ネラチニブ、ニロチニブ、ニトロソウレア、オラパリブ、プリコマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ＰＣＩ−３２７６５、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ＳＮ−３８、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、タモキシフェン、テマゾロミド、トランスプラチン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、バタラニブ、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド、及びＺＤ１８３９からなる群から選択されてもよい。薬物はＳＮ−３８であることが好ましい。
【００１３】
好ましい最適用量の本ＡＤＣとしては、４ｍｇ／ｋｇ〜１８ｍｇ／ｋｇの用量を挙げてもよく、週に１回、週に２回、または１週おきのいずれかで投与することが好ましい。最適な投与スケジュールとしては、２週間連続の治療の後に１、２、３または４週間の休薬という治療サイクル、１週おきの治療及び休薬という治療サイクル、１週間の治療の後に２、３または４週間の休薬という治療サイクル、３週間の治療の後に１、２、３または４週間の休薬という治療サイクル、４週間の治療の後に１、２、３または４週間の休薬という治療サイクル、もしくは、５週間の治療の後に１、２、３、４または５週間の休薬という治療サイクル、または、２週間に１回、３週間に１回もしくは１ヶ月間に１回の投与を挙げてもよい。任意のサイクル数、好ましくは少なくとも２サイクル、少なくとも４サイクル、少なくとも６サイクル、少なくとも８サイクル、少なくとも１０サイクル、少なくとも１２サイクル、少なくとも１４サイクル、または少なくとも１６サイクル、治療を延長してもよい。用いる例示的な用量としては、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２２ｍｇ／ｋｇ及び２４ｍｇ／ｋｇを挙げることができる。好ましい用量は、４、６、８、９、１０、１２、１４、１６または１８ｍｇ／ｋｇである。より好ましい用量は、６〜１２、６〜８、７〜８、８〜１０、１０〜１２、または８〜１２ｍｇ／ｍｌである。ＡＤＣの最適用量を選択する上で、年齢、全身健康、特定器官の機能または重量などの様々な因子に加えて、特定の器官系（例えば、骨髄）に対する前治療の影響を検討してもよいということ、及び、治療期間中の用量及び／または投与頻度を増加または減少させてもよいということについて、当業者は理解するであろう。わずか４〜８回の投与後に認められた腫瘍縮小のエビデンスを元に、必要に応じて、投与を繰り返してもよい。本明細書で開示する最適化された用量及び投与スケジュールは、ヒト対象において、動物モデル研究からは予測され得なかった予想外に優れた効果及び毒性低下を示している。驚くべきことに、その優れた効果により、以前に１つまたは複数の標準的な抗がん療法に耐性を示すことが判明していた腫瘍の治療が可能となっている。更に驚くべきことに、以前にカンプトテシン、例えば、イリノテカン（ＳＮ−３８の親化合物）などに耐性を示していた腫瘍において、その治療が有効であることが判明している。
【００１４】
組み合わせ治療に使用するＲａｄ５１阻害剤は、Ｂ０２（ＣＡＳ  １２９０５４１−４６−６、例えば、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡから市販されている）、ＲＩ−１（ＣＡＳ  ４１５７１３−６０−９、例えば、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡから市販されている）、ＤＩＤＳ（ＣＡＳ  ６７４８３−１３−０、例えば、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫから市販されている）、ハレナキノン（ＣＡＳ  ８６６９０−１４−４、例えば、Ａｎｇｅｎｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ．，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ，Ｃｈｉｎａから市販されている）、または、イマチニブ（ＧＬＥＥＶＡＣ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｅａｓｔ  Ｈａｎｏｖｅｒ，ＮＪ）を含むがこれらに限定されない当該技術分野において周知の任意のＲａｄ５１阻害剤であってもよい。
【００１５】
抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣを用いた組み合わせ治療は、がん、例えば、ＴＮＢＣ、ＳＣＬＣ、ＮＳＣＬＣ、尿路上皮癌、膀胱癌、胃癌または卵巣癌などの治療に有用である。このような使用は第一選択、第二選択であってもよく、あるいは、がん進行の後期ステージに使用してもよい。使用する組成物及び方法は、カンプトテシン耐性がんに加えカンプトテシン感受性がんに有効である。一般的に、抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣは、Ｔｒｏｐ−２抗原を発現する任意のがんの治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ｈＲＳ７（抗Ｔｒｏｐ−２）、ｈＰＡＭ４（抗ＭＵＣ５ａｃ）、ｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５）または非特異的対照ｈＡ２０（抗ＣＤ２０）のＳＮ−３８複合体を用いた、Ｃａｐａｎ  １ヒト膵臓癌を有する無胸腺ヌードマウスの前臨床インビボ治療を示す図である。
【図２】対照と比較して抗Ｔｒｏｐ２−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体を用いた、ＢｘＰＣ−３ヒト膵臓癌を有する無胸腺ヌードマウスの前臨床インビボ治療を示す図である。
【図３Ａ】ＣＬ２−ＳＮ−３８及びＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の構造を示す図である。
【図３Ｂ】ＣＯＬＯ  ２０５結腸腺癌を使用して、ＣＬ２リンカーに結合した抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣ、ＣＬ２Ａリンカーに結合した抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣ、ｈＡ２０  ＡＤＣ、及び生理食塩水対照における効果の比較を示す図である。矢印に示すとおり、４週間にわたり週に２回動物を治療した。０．４ｍｇ／ｋｇのＡＤＣでＣＯＬＯ  ２０５マウス（Ｎ＝６）を治療し、週に２回腫瘍を測定した。
【図３Ｃ】Ｃａｐａｎ−１膵腺癌を使用して、ＣＬ２リンカーに結合した抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣ、ＣＬ２Ａリンカーに結合した抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣ、ｈＡ２０  ＡＤＣ、及び生理食塩水対照における効果の比較を示す図である。矢印に示すとおり、４週間にわたり週に２回動物を治療した。０．２ｍｇ／ｋｇのＡＤＣでＣａｐａｎ−１マウス（Ｎ＝１０）を治療し、週に１回腫瘍を測定した。
【図４Ａ】いくつかの固形腫瘍異種移植疾患モデルにおけるｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣの治療効果を示す図である。ｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８  ＡＤＣ治療及びｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８  ＡＤＣ治療の効果について、ヒト非小細胞肺腫瘍、結腸直腸腫瘍、膵臓腫瘍または扁平細胞肺腫瘍の異種移植片を有するマウスを用いて試験を行った。表示量（用量あたりのＳＮ−３８の量で表し、長い矢印＝複合体の注射であり、短い矢印＝イリノテカンの注射である）で、全てのＡＤＣと対照を投与した。Ｃａｌｕ−３腫瘍を有するマウス（Ｎ＝５〜７）にｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８を３日おきに合計４回の注射となるように注射した（ｑ４ｄｘ４）。
【図４Ｂ】いくつかの固形腫瘍異種移植疾患モデルにおけるｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣの治療効果を示す図である。ｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８  ＡＤＣ治療及びｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８  ＡＤＣ治療の効果について、ヒト非小細胞肺腫瘍、結腸直腸腫瘍、膵臓腫瘍または扁平細胞肺腫瘍の異種移植片を有するマウスを用いて試験を行った。表示量（用量あたりのＳＮ−３８の量で表し、長い矢印＝複合体の注射であり、短い矢印＝イリノテカンの注射である）で、全てのＡＤＣと対照を投与した。ＣＯＬＯ  ２０５腫瘍を有するマウス（Ｎ＝５）に、ＡＤＣを８回（ｑ４ｄｘ８）、または、ＭＴＤのイリノテカンを１日おきに合計５回の注射となるように（ｑ２ｄｘ５）注射した。
【図４Ｃ】いくつかの固形腫瘍異種移植疾患モデルにおけるｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣの治療効果を示す図である。ｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８  ＡＤＣ治療及びｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８  ＡＤＣ治療の効果について、ヒト非小細胞肺腫瘍、結腸直腸腫瘍、膵臓腫瘍または扁平細胞肺腫瘍の異種移植片を有するマウスを用いて試験を行った。表示量（用量あたりのＳＮ−３８の量で表し、長い矢印＝複合体の注射であり、短い矢印＝イリノテカンの注射である）で、全てのＡＤＣと対照を投与した。４週間にわたり週に２回表示薬剤でＣａｐａｎ−１（Ｎ＝１０）を治療した。
【図４Ｄ】いくつかの固形腫瘍異種移植疾患モデルにおけるｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣの治療効果を示す図である。ｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８  ＡＤＣ治療及びｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８  ＡＤＣ治療の効果について、ヒト非小細胞肺腫瘍、結腸直腸腫瘍、膵臓腫瘍または扁平細胞肺腫瘍の異種移植片を有するマウスを用いて試験を行った。表示量（用量あたりのＳＮ−３８の量で表し、長い矢印＝複合体の注射であり、短い矢印＝イリノテカンの注射である）で、全てのＡＤＣと対照を投与した。４週間にわたり週に２回表示薬剤でＢｘＰＣ−３腫瘍を有するマウス（Ｎ＝１０）を治療した。
【図４Ｅ】いくつかの固形腫瘍異種移植疾患モデルにおけるｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣの治療効果を示す図である。ｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８  ＡＤＣ治療及びｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８  ＡＤＣ治療の効果について、ヒト非小細胞肺腫瘍、結腸直腸腫瘍、膵臓腫瘍または扁平細胞肺腫瘍の異種移植片を有するマウスを用いて試験を行った。表示量（用量あたりのＳＮ−３８の量で表し、長い矢印＝複合体の注射であり、短い矢印＝イリノテカンの注射である）で、全てのＡＤＣと対照を投与した。４週間にわたり週に２回ＡＤＣを投与することに加え、ＳＫ−ＭＥＳ−１腫瘍を有するマウス（Ｎ＝８）にＭＴＤのＣＰＴ−１１を投与した（ｑ２ｄｘ５）。
【図５Ａ】Ｓｗｉｓｓ−ＷｅｂｓｔｅｒマウスにおけるｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の忍容性を示す図である。５６匹のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに２  ｉ．ｐ．用量の緩衝液またはｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を３日の間隔をあけて投与した（用量あたり４、８または１２ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８、用量あたり２５０、５００または７５０ｍｇの複合体タンパク質／ｋｇ）。最後の注射の７日後と１５日後にそれぞれの群の７匹のマウスを安楽死させて、血球カウント及び血清化学検査を実施した。グラフは、それぞれの群において高レベルのＡＳＴを有していた動物のパーセントを示している。
【図５Ｂ】Ｓｗｉｓｓ−ＷｅｂｓｔｅｒマウスにおけるｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の忍容性を示す図である。５６匹のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに２  ｉ．ｐ．用量の緩衝液またはｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を３日の間隔をあけて投与した（用量あたり４、８または１２ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８、用量あたり２５０、５００または７５０ｍｇの複合体タンパク質／ｋｇ）。最後の注射の７日後と１５日後にそれぞれの群の７匹のマウスを安楽死させて、血球カウント及び血清化学検査を実施した。グラフは、それぞれの群において高レベルのＡＬＴを有していた動物のパーセントを示している。
【図５Ｃ】カニクイザルにおけるｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の忍容性を示す図である。群あたり６匹のサルに緩衝液（対照）またはｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を、用量あたり０．９６ｍｇ／ｋｇまたは１．９２ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８当量（６０ｍｇ／ｋｇ及び１２０ｍｇ／ｋｇの複合体タンパク質）で３日の間隔をあけて２回注射した。−１日目、３日目及び６日目に全ての動物の採血を行った。１１日目に、０．９６ｍｇ／ｋｇ群における４匹のサル、１．９２ｍｇ／ｋｇ群における３匹のサルの採血を行った。カニクイザルにおける好中球数の変化をカウントする。
【図５Ｄ】カニクイザルにおけるｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の忍容性を示す図である。群あたり６匹のサルに緩衝液（対照）またはｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を、用量あたり０．９６ｍｇ／ｋｇまたは１．９２ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８当量（６０ｍｇ／ｋｇ及び１２０ｍｇ／ｋｇの複合体タンパク質）で３日の間隔をあけて２回注射した。−１日目、３日目及び６日目に全ての動物の採血を行った。１１日目に、０．９６ｍｇ／ｋｇ群における４匹のサル、１．９２ｍｇ／ｋｇ群における３匹のサルの採血を行った。カニクイザルにおける血小板数の変化をカウントする。
【図６】ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳腺癌に対する抗Ｔｒｏｐ−２−パクリタキセルＡＤＣのインビトロ効果を示す図である。
【図７】ＢｘＰＣ−３ヒト膵腺癌に対する抗Ｔｒｏｐ−２−パクリタキセルＡＤＣのインビトロ効果を示す図である。
【図８Ａ】Ｃａｐａｎ−１ヒト膵腺癌における抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣ（ｈＲＳ７−ＳＮ−３８対ＭＡＢ６５０−ＳＮ−３８）のインビトロ効果の比較を示す図である。
【図８Ｂ】ＢｘＰＣ−３ヒト膵腺癌における抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣ（ｈＲＳ７−ＳＮ−３８対ＭＡＢ６５０−ＳＮ−３８）のインビトロ効果の比較を示す図である。
【図８Ｃ】ＮＣＩ−Ｎ８７ヒト胃腺癌における抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣ（ｈＲＳ７−ＳＮ−３８対ＭＡＢ６５０−ＳＮ−３８）のインビトロ効果の比較を示す図である。
【図９】図９Ａは、ＢｘＰＣ−３ヒト膵腺癌におけるｎａｋｅｄまたはＳＮ−３８をコンジュゲートさせたｈＲＳ７抗体対１６２−４６．２抗体の細胞傷害性の比較を示す図である。図９Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳腺癌におけるｎａｋｅｄまたはＳＮ−３８をコンジュゲートさせたｈＲＳ７抗体対１６２−４６．２抗体の細胞傷害性の比較を示す図である。
【図１０】ＲＥＣＩＳＴ基準による最良効果のＩＭＭＵ−１３２第Ｉ／ＩＩ相データを示す図である。
【図１１−１】無増悪期間及び最良効果（ＲＥＣＩＳＴ）のＩＭＭＵ−１３２第Ｉ／ＩＩ相データを示す図である。
【図１１−２】無増悪期間及び最良効果（ＲＥＣＩＳＴ）のＩＭＭＵ−１３２第Ｉ／ＩＩ相データを示す図である。
【図１２】ＩＭＭＵ−１３２、カルボプラチンもしくはシスプラチンの単剤、非標的化ＡＤＣまたは生理食塩水対照と比較した、ＩＭＭＵ−１３２とカルボプラチンまたはシスプラチンを用いた組み合わせ治療を示す図である。
【図１３】ＩＭＭＵ−１３２もしくはカルボプラチンの単剤または生理食塩水対照と比較した、ＩＭＭＵ−１３２＋カルボプラチンを用いた組み合わせ治療を示す図である。
【図１４】ＩＭＭＵ−１３２もしくはシスプラチンの単剤または生理食塩水対照と比較した、ＩＭＭＵ−１３２＋シスプラチンを用いた組み合わせ治療を示す図である。
【図１５】ＩＭＭＵ−１３２、カルボプラチンもしくはシスプラチンの単剤または生理食塩水対照と比較した、ＩＭＭＵ−１３２とカルボプラチンまたはシスプラチンを用いた組み合わせ治療で治療したマウスにおける悪液質を示す図である。
【図１６】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞におけるＩＭＭＵ−１３２、イリノテカン、生理食塩水及び対照ＡＤＣの細胞傷害性を示す図である。
【図１７】ＭＤＡ−ＨＣＣ１８０６腫瘍細胞におけるＩＭＭＵ−１３２、イリノテカン、生理食塩水及び対照ＡＤＣの細胞傷害性を示す図である。
【図１８】ＭＤＡ−ＳＫ−ＭＥＳ−１腫瘍細胞におけるＩＭＭＵ−１３２、イリノテカン、生理食塩水及び対照ＡＤＣの細胞傷害性を示す図である。
【図１９】親ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株における腫瘍増殖に対するＩＭＭＵ−１３２、イリノテカン、対照ＡＤＣ、非コンジュゲートｈＲＳ７  ＩｇＧまたは生理食塩水の効果を示す図である。
【図２０】Ｃ１３細胞株における腫瘍増殖に対するＩＭＭＵ−１３２、イリノテカン、対照ＡＤＣ、非コンジュゲートｈＲＳ７  ＩｇＧまたは生理食塩水の効果を示す図である。
【図２１】親Ｃ３９細胞株における腫瘍増殖に対するＩＭＭＵ−１３２、イリノテカン、対照ＡＤＣ、非コンジュゲートｈＲＳ７  ＩｇＧまたは生理食塩水の効果を示す図である。
【図２２】親ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株を注射されたマウスの生存率に対するＩＭＭＵ−１３２、イリノテカン、対照ＡＤＣ、非コンジュゲートｈＲＳ７  ＩｇＧまたは生理食塩水の効果を示す図である。
【図２３】Ｃ１３細胞株を注射されたマウスの生存率に対するＩＭＭＵ−１３２、イリノテカン、対照ＡＤＣ、非コンジュゲートｈＲＳ７  ＩｇＧまたは生理食塩水の効果を示す図である。
【図２４】Ｃ３９細胞株を注射されたマウスの生存率に対するＩＭＭＵ−１３２、イリノテカン、対照ＡＤＣ、非コンジュゲートｈＲＳ７  ＩｇＧまたは生理食塩水の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
特に明記しない限り、「ａ」または「ａｎ」とは、１つまたは複数のことを意味する。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「約」とは±１０％のことを意味する。例えば、「約１００」は、９０〜１１０の間の任意の数字を含む。
【００１９】
本明細書に記載する場合、抗体とは、全長（すなわち、天然、または標準的な免疫グロブリン遺伝子フラグメント組換えプロセスにより形成）免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）、または、抗体フラグメントのような免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な（すなわち、特異的に結合する）部位のことを意味する。
【００２０】
抗体フラグメントは、抗体の一部、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどである。抗体フラグメントとしてはまた、以下に記載する単一ドメイン抗体及びＩｇＧ４半分子を挙げてもよい。構造にかかわらず、抗体フラグメントは、全長抗体が認識する同一抗原に結合する。用語「抗体フラグメント」としてはまた、抗体の可変領域、例えば、重鎖及び軽鎖ならびに組換え単鎖ポリペプチド分子の可変領域（軽鎖可変領域と重鎖可変領域は、ペプチドリンカー（「ｓｃＦｖタンパク質」）により連結されている）からなる「Ｆｖ」フラグメントなどからなる独立したフラグメントが挙げられる。
【００２１】
キメラ抗体とは、抗体分子の定常ドメインはヒト抗体の定常ドメインに由来するが、１つの種に由来する抗体（好ましくはげっ歯類抗体）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変ドメインを含有する組換えタンパク質のことである。獣医学的用途において、キメラ抗体の定常ドメインは、他種、例えば、ネコまたはイヌに由来していてもよい。
【００２２】
ヒト化抗体とは、１種に由来する抗体（例えば、げっ歯類抗体）のＣＤＲが、げっ歯類抗体の可変重鎖及び可変軽鎖からヒトの重鎖及び軽鎖可変ドメイン（例えば、フレームワーク領域配列）へと導入された組換えタンパク質のことである。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体の定常ドメインに由来する。特定の実施形態では、親（げっ歯類）抗体由来の限られた数のフレームワーク領域アミノ酸残基が、ヒト抗体フレームワーク領域配列内へと代入され得る。
【００２３】
ヒト抗体とは、例えば、抗原誘発で特定のヒト抗体を産生するように「遺伝子操作」されたトランスジェニックマウスから得た抗体のことである。この技術においては、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座のエレメントを、内因性の特定マウス重鎖及び軽鎖遺伝子座を破壊した胚性幹細胞株から誘導したマウスの株内に導入する。トランスジェニックマウスは、特定の抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、そのマウスを用いて、ヒト抗体を分泌するハイブリドーマを産生することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法については、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，がＮａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３  （１９９４）に、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，がＮａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）に、またＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，がＩｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）に記載している。完全ヒト抗体もまた、遺伝子または染色体のトランスフェクション法に加えて、ファージディスプレイ技術を用いて構築することができる（これらの全ては、当技術分野において周知である）。ヒト抗体及びそのフラグメントをインビトロで、免疫されていないドナー由来の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーから作製することについては、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０）を参照されたい。この技術においては、抗体可変ドメイン遺伝子を、繊維状バクテリオファージのメジャーコートタンパク質遺伝子またはマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングしてから、機能的抗体フラグメントとしてファージ粒子の表面上にディスプレイさせる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含んでいるため、抗体の機能特性に基づいた選択はまた、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択にもつながる。この方法において、ファージは、Ｂ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは様々な方式で実施可能であり、確認には、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。ヒト抗体もまた、インビトロで活性化させたＢ細胞を用いて作製可能である。米国特許番号５，５６７，６１０及び５，２２９，２７５を参照されたい（それらの実施例セクションは参照により本明細書に組み込まれる）。
【００２４】
治療薬とは、抗体部分（すなわち、抗体または抗体フラグメントもしくはサブフラグメント）とは別々に、それと同時にまたは連続的に投与される化合物、分子または原子のことであるか、あるいは、抗体部分（すなわち、抗体または抗体フラグメントもしくはサブフラグメント）にコンジュゲートした化合物、分子または原子のことであり、疾患の治療に有用である。治療薬の例としては、抗体、抗体フラグメント、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節薬、プロアポトーシス薬、抗血管新生薬、ホウ素化合物、光活性剤または色素及び放射性同位体が挙げられる。使用する治療薬については以下でより詳細に説明する。
【００２５】
イムノコンジュゲートとは、少なくとも１種の治療薬及び／または診断薬にコンジュゲートした抗体、抗体フラグメントまたは融合タンパク質のことである。
【００２６】
多重特異性抗体とは、構造が異なる少なくとも２種類の標的、例えば、２種類の異なる抗原、同一抗原上の２種類の異なるエピトープ、または、ハプテン及び／または抗原もしくはエピトープに同時に結合可能な抗体のことである。多重特異性の多価抗体とは、２つ以上の結合部位を有し、それら結合部位が異なる特異性を有する構築物のことである。
【００２７】
二重特異性抗体とは、２種類の異なる標的に同時に結合可能な抗体のことである。二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）及び二重特異性抗体フラグメント（ｂｓＦａｂ）は、例えば、腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも１つのアーム、及び、治療薬または診断薬を有し標的となり得る複合体に特異的に結合する少なくとも１つの別のアームを有し得る。分子工学を用いて、様々な二重特異性融合タンパク質を作製することができる。
【００２８】
抗Ｔｒｏｐ−２抗体
本ＡＤＣは、Ｔｒｏｐ−２に結合する抗体またはそのフラグメントを含んでいてもよい。特定の好ましい実施形態では、抗Ｔｒｏｐ−２抗体は、軽鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ、配列番号：１）、ＣＤＲ２（ＳＡＳＹＲＹＴ、配列番号：２）及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ、配列番号：３）、ならびに、重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号：４）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ、配列番号：５）及びＣＤＲ３（ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号：６）を含む、ヒト化ＲＳ７抗体であってもよい（例えば、米国特許番号７，２３８，７８５を参照のこと（その全体は参照により本明細書に組み込まれる））。
【００２９】
ＲＳ７抗体は、ヒト原発性扁平上皮細胞肺癌の粗膜標品を用いて産生したマウスＩｇＧ１であった（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１３３０，１９９０）。ＲＳ７抗体は、クラスター１３として同定されている４６〜４８ｋＤａの糖タンパク質を認識する（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐ．８：９８−１０２，１９９４）。その抗原はＥＧＰ−１（上皮糖タンパク質−１）と命名されたが、Ｔｒｏｐ−２とも呼ばれる。
【００３０】
Ｔｒｏｐ−２はＩ型膜貫通タンパク質であり、ヒト細胞（Ｆｏｒｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９５；６２：６１０−８）とマウス細胞（Ｓｅｗｅｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９８；７５：３２４−３０）の両方からクローニングされている。腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質としてのその機能（Ｒｉｐａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９８；７６：６７１−６）に加えて、ヒトＴｒｏｐ−２の発現が、結腸癌細胞の腫瘍形成及び浸潤に必須であり、Ｔｒｏｐ−２の細胞外ドメインに対するポリクローナル抗体により効果的に抑制可能であることが判明している（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００８；７：２８０−５）。
【００３１】
固形がんの治療標的としてのＴｒｏｐ−２に関心が高まっているが（Ｃｕｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２００９；１７９６：３０９−１４）、乳癌（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５；１１：４３５７−６４）、結腸直腸癌（Ｏｈｍａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６；１２：３０５７−６３；Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｄｉｓ  ２００９；２４：８７５−８４）、及び口腔扁平上皮細胞癌（Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００８；２１：１８６−９１）における過剰発現Ｔｒｏｐ−２の臨床的有意性について記載された更なる報告により、そのことが裏付けられている。高レベルのＴｒｏｐ−２を発現する前立腺基底細胞がインビトロ及びインビボで幹細胞様活性を増強させるという最新のエビデンスは特に注目に値する（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００８；１０５：２０８８２−７）。
【００３２】
フローサイトメトリー及び免疫組織化学染色試験により、ＲＳ７  ＭＡｂが、正常ヒト組織への結合性を制限することにより、様々な腫瘍タイプ上の抗原を検出することが示されている（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。Ｔｒｏｐ−２は主に、肺癌、胃癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌及び前立腺癌などのがんにより発現されている。放射能標識マウスＲＳ７  ＭＡｂを用いた動物モデルの局在化及び治療研究は、腫瘍標的化及び治療効果を示している（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。
【００３３】
肺、乳房、膀胱、卵巣、子宮、胃及び前立腺の腫瘍に強いＲＳ７染色が認められた（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５５：９３８，１９９３）。肺癌症例には、扁平上皮癌と腺癌の両方が含まれていた（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５５：９３８，１９９３）。両方の細胞型が強く染色されているということは、ＲＳ７抗体が、肺の非小細胞癌の組織学的分類を区別していないことを示している。
【００３４】
ＲＳ７  ＭＡｂは、標的細胞へと速やかに内部移行する（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。ＲＳ７  ＭＡｂの内在化速度定数は、速やかに内部移行するその他２つのＭＡｂの内在化速度定数間の中間であり、免疫毒素産生に有用であることが示されている（Ｉｄ．）。免疫毒素複合体の内部移行が抗腫瘍活性に必要であることが十分に記載されている（Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４７：６４１，１９８６）。薬物イムノコンジュゲートの内部移行が抗腫瘍効果をもたらす主要因子として記載されている（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：１１８９，１９８８）。それゆえ、ＲＳ７抗体は、治療適用において、いくつかの重要な特性を示す。
【００３５】
ｈＲＳ７抗体が好ましいが、その他の抗Ｔｒｏｐ−２抗体は周知及び／または一般に利用可能であり、代替実施形態では、本ＡＤＣに利用可能である。低い免疫原性という点においてはヒト化抗体またはヒト抗体が好ましいが、代替実施形態では、キメラ抗体を用いてもよい。以下に記載するが、抗体をヒト化するための方法は当該技術分野において周知であり、それらの方法を利用して、市販のマウス抗体またはキメラ抗体をヒト化形態へと変換してもよい。
【００３６】
抗Ｔｒｏｐ−２抗体は多数の供給業者から市販されており、ＬＳ−Ｃ１２６４１８、ＬＳ−Ｃ１７８７６５、ＬＳ−Ｃ１２６４１６、ＬＳ−Ｃ１２６４１７（ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）、１０４２８−ＭＭ０１、１０４２８−ＭＭ０２、１０４２８−Ｒ００１、１０４２８−Ｒ０３０（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）、ＭＲ５４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ｓｃ−３７６１８１、ｓｃ−３７６７４６（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ＭＭ０５８８−４９Ｄ６（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ）、ａｂ７９９７６及びａｂ８９９２８（ＡＢＣＡＭ（登録商標），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）が挙げられる。
【００３７】
その他の抗Ｔｒｏｐ−２抗体については、特許文献において開示されている。例えば、米国公開番号２０１３／００８９８７２は、抗Ｔｒｏｐ−２抗体Ｋ５−７０（受入番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２５１）、Ｋ５−１０７（受入番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２５２）、Ｋ５−１１６−２−１（受入番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２５３）、Ｔ６−１６（受入番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３４６）、及びＴ５−８６（受入番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２５４）（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ，Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎに寄託）について開示している。米国特許番号５，８４０，８５４は、抗Ｔｒｏｐ−２モノクローナル抗体ＢＲ１１０（ＡＴＣＣ番号ＨＢ１１６９８）について開示している。米国特許番号７，４２０，０４０は、ハイブリドーマ細胞株ＡＲ４７Ａ６．４．２（受入番号１４１２０５−０５で、ＩＤＡＣ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ，Ｗｉｎｎｉｐｅｇ，Ｃａｎａｄａ）に寄託）により産生された抗Ｔｒｏｐ−２抗体について開示している。米国特許番号７，４２０，０４１は、ハイブリドーマ細胞株ＡＲ５２Ａ３０１．５（受入番号１４１２０５−０３で、ＩＤＡＣに寄託）により産生された抗Ｔｒｏｐ−２抗体について開示している。米国公開番号２０１３／０１２２０２０は、抗Ｔｒｏｐ−２抗体３Ｅ９、６Ｇ１１、７Ｅ６、１５Ｅ２、１８Ｂ１について開示している。代表的な抗体をコードするハイブリドーマ（受入番号ＰＴＡ−１２８７１及びＰＴＡ−１２８７２）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されていた。米国公開番号２０１６／０２９７８９０は、ＴＩＮＡ１抗Ｔｒｏｐ−２抗体について開示している。米国特許番号８，７１５，６６２は、寄託番号ＰＤ  ０８０１９、ＰＤ  ０８０２０、及びＰＤ  ０８０２１でＡＩＤ−ＩＣＬＣ（Ｇｅｎｏａ，Ｉｔａｌｙ）に寄託したハイブリドーマにより産生された抗Ｔｒｏｐ−２抗体について開示している。米国特許出願公開番号２０１２０２３７５１８は、抗Ｔｒｏｐ−２抗体７７２２０、ＫＭ４０９７及びＫＭ４５９０について開示している。米国特許番号８，３０９，０９４（Ｗｙｅｔｈ）は、配列表により識別される抗体Ａ１及びＡ３について開示している。本パラグラフ中で上記したそれぞれの特許または特許出願の実施例セクションは、参照により本明細書に組み込まれる。特許公報ではないが、Ｌｉｐｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，７８：５１４７−５０）は、抗Ｔｒｏｐ−２抗体１６２−２５．３及び１６２−４６．２について開示している。Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．による論文（Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ，Ｊａｎ  １５，２０１８（出版前に電子出版されている））は、ＰＦ−０６６６４１７８抗Ｔｒｏｐ−２抗体薬物複合体について開示している。Ｓｔｒｏｐ  ｅｔ  ａｌ．による論文（２０１６，Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  １５：２６９８−７０８）は、ＲＮ９２７Ｃ抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣについて開示している。
【００３８】
非常に多くの抗Ｔｒｏｐ−２抗体が、当技術分野において周知及び／または一般に利用可能である。以下に記載するが、周知の抗原に対する抗体を作製するための方法は、当該技術分野において定型化された手順である。ヒトＴｒｏｐ−２タンパク質の配列も当該技術分野において周知である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＣＡＡ５４８０１．１を参照のこと）。ヒト化抗体、ヒト抗体またはキメラ抗体の作製方法もまた周知である。当該技術分野における一般的な知識に鑑みて本開示を読解すれば、当業者は、本ＡＤＣにおける抗Ｔｒｏｐ−２抗体種を調製及び使用することが可能になるであろう。
【００３９】
抗Ｔｒｏｐ−２抗体の使用は、ＡＤＣ以外の免疫療法用に開示されている。マウスＩｇＧ２ａ抗体エドレコロマブ（ＰＡＮＯＲＥＸ（登録商標））が結腸直腸癌の治療に使用されてきたが、マウス抗体は、ヒトへの臨床使用には適していない（Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ＆  Ｇｉｒｅｓ，２００７，Ｂｒ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９６：４１７−４２３）。エドレコロマブの低用量皮下投与がワクチン抗原に対する体液性免疫反応を誘導することが報告されている（Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ＆  Ｇｉｒｅｓ，２００７）。アデカツムマブ（ＭＴ２０１）（完全ヒト抗Ｔｒｏｐ−２抗体）は転移性乳癌及び初期前立腺癌に使用されており、ＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性を介して作用すると報告されている（Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ＆  Ｇｉｒｅｓ，２００７）。ＭＴ１１０（一本鎖抗Ｔｒｏｐ−２／抗ＣＤ３二重特異性抗体構築物）は、卵巣癌に対する効果を有することが報告されている（Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ＆  Ｇｉｒｅｓ，２００７）。カツマキソマブ（Ｔｒｏｐ−２、ＣＤ３及びＦｃ受容体に結合親和性を有するハイブリッドマウス／ラット抗体）は、卵巣癌に対する活性を有すると報告されている（Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ＆  Ｇｉｒｅｓ，２００７）。Ｐｒｏｘｉｎｉｕｍ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシンに結合した抗Ｔｒｏｐ−２一本鎖抗体を含む免疫毒素）は、頭頸部癌及び膀胱癌において試験されている（Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ＆  Ｇｉｒｅｓ，２００７）。これら研究のいずれも、抗Ｔｒｏｐ−２抗体薬物複合体の使用に関する任意の開示を含んでいなかった。
【００４０】
カンプトテシン複合体
抗体または抗原結合抗体フラグメントに結合したカンプトテシン治療薬を含むイムノコンジュゲートを調製するための限定されない方法及び組成物について、以下で説明する。好ましい実施形態では、所定のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分（すなわち、所定数のモノマー単位を含有するＰＥＧ）（所定のＰＥＧは低分子量ＰＥＧであり、好ましくは１〜３０モノマー単位を含有し、より好ましくは１〜１２モノマー単位含有し、最も好ましくは６〜８モノマー単位を含有する）を、薬物と抗体の間に配置することにより、薬物の溶解性が向上する。
【００４１】
好ましくは、第１のリンカーは一方の端で薬物と結合し、もう一方の端においてアセチレン基またはアジド基を末端としていてもよい。この第１のリンカーは、一方の端にアジド基またはアセチレン基を有する所定のＰＥＧ部分を、もう一方の端に別の反応性基（例えば、カルボン酸基またはヒドロキシル基など）を含んでいてもよい。上記二官能性の所定のＰＥＧは、アミノアルコールのアミン基に結合していてもよく、また後者のヒドロキシル基は、カーボネート形態で薬物上のヒドロキシル基に結合していてもよい。代替的に、上記所定の二官能性ＰＥＧの非アジド（またはアセチレン）部分は任意選択的に、Ｌ−アミノ酸またはポリペプチドのＮ末端に結合し、Ｃ末端はアミノアルコールのアミノ基に結合し、後者のヒドロキシ基は、それぞれカーボネートまたはカルバメートの形態で薬物のヒドロキシル基に結合する。
【００４２】
抗体結合基、及び第１のリンカーのアジド（またはアセチレン）基に対して相補的な反応性基（すなわち、アセチレン（またはアジド））を含む第２のリンカーは、アセチレン−アジド付加環化反応を介して薬物−（第１のリンカー）複合体と反応し、疾患標的化抗体にコンジュゲートするのに有用な最終の二官能性薬物生成物を得てもよい。抗体結合基は、チオールまたはチオール反応性基のいずれかであることが好ましい。
【００４３】
ＣＰＴ類似体（ＳＮ−３８など）を含む薬物−リンカー前駆体の調製において、Ｃ−２０カーボネートの存在下、１０−ヒドロキシル基を選択的に再生するための方法について以下で説明する。薬物中の反応性ヒドロキシル基（ＳＮ−３８中のフェノール性ヒドロキシルなど）用のその他の保護基、例えば、ｔ−ブチルジメチルシリルまたはｔ−ブチルジフェニルシリルもまた使用してもよく、これらの保護基は、誘導体化薬物を抗体結合部分に結合させる前にフッ化テトラブチルアンモニウムで脱保護される。この保護基をあらかじめ脱保護することなく、二官能性ＣＰＴが抗体にコンジュゲートするように、ＣＰＴ類似体の１０−ヒドロキシル基を「ＢＯＣ」以外のエステルまたはカーボネートで代わりに保護する。バイオコンジュゲートの投与後、保護基は生理学的ｐＨ条件下で容易に脱保護される。
【００４４】
アセチレン−アジド結合（「クリックケミストリー」と呼ばれる）において、アジド部分はＬ２上で、アセチレン部分はＬ３上であってもよい。代替的に、Ｌ２はアセチレンを含んでいてもよく、Ｌ３はアジドを含んでいてもよい。「クリックケミストリー」とは、銅（＋１）が触媒する、アセチレン部分とアジド部分の間における付加環化反応（Ｋｏｌｂ  ＨＣ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ  ＫＢ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  ２００３；８：１１２８−３７）のことを指す（別の形態のクリックケミストリーが周知であり使用可能であるが）。クリックケミストリーは中性ｐＨ条件付近の水溶液中で生じるため、薬物のコンジュゲートに適している。クリックケミストリーの利点は、それが化学選択的なものであり、その他の周知のコンジュゲーション化学反応、例えば、チオール−マレイミド反応を補完することである。
【００４５】
例示的な好ましい実施形態は、以下に示す一般式（１）の、薬物誘導体と抗体の複合体に関する。
ＭＡｂ−［Ｌ２］−［Ｌ１］−［ＡＡ］ｍ−［Ａ’］−薬物（１）
式中、ＭＡｂは疾患標的化抗体であり、Ｌ２は、抗体結合部分及び１個または複数個のアセチレン（またはアジド）基を含むクロスリンカーの構成要素であり、Ｌ１は、一方の端にアジド（またはアセチレン）を有する所定のＰＥＧ（Ｌ２のアセチレン（またはアジド）部分に対して相補的）、及びもう一方の端にカルボン酸基またはヒドロキシル基などの反応性基を含み、ＡＡはＬ−アミノ酸であり、ｍは０、１、２、３または４の値の整数であり、Ａ’は、エタノールアミン、４−ヒドロキシベンジルアルコール、４−アミノベンジルアルコール、または置換または非置換エチレンジアミンの群から選択される追加のスペーサーである。「ＡＡ」のＬ−アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンから選択される。Ａ’基がヒドロキシルを含む場合、Ａ’基は、それぞれカーボネートまたはカルバメートの形態で薬物のヒドロキシル基またはアミノ基に結合する。
【００４６】
式１の好ましい実施形態では、Ａ’はＬ−アミノ酸から誘導した置換エタノールアミンであり、アミノ酸のカルボン酸基はヒドロキシメチル部分で置換されている。Ａ’は、以下のＬ−アミノ酸、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンのいずれか１つから誘導してもよい。
【００４７】
式１の好ましい実施形態における複合体の一例では、ｍは０であり、Ａ’はＬ−バリノールであり、薬物はＳＮ−３８で例示される。式１の別の例では、ｍは１であり誘導体化Ｌ−リジンで表され、Ａ’はＬ−バリノールであり、薬物はＳＮ−３８で例示される。この実施形態では、リジンアミノ基の直交保護基を使用して、リジンなどのアミノ酸のカルボン酸とバリノールのアミノ基の間にアミド結合が最初に形成される。リジン側鎖上の保護基はインタクトに維持しつつ、リジンＮ末端の保護基を除去してから、Ｎ末端を、もう一方の端にアジド（またはアセチレン）を有する所定ＰＥＧ上のカルボキシル基に結合させる。その後、バリノールのヒドロキシル基を、１０−ヒドロキシ保護ＳＮ−３８の２０−クロロホルメート誘導体に結合させてから、付加環化クリックケミストリーにより、この中間体を、抗体結合部分に加え相補的なアセチレン（またはアジド）基を有するＬ２構成要素に結合させる。最後に、リジン側鎖とＳＮ−３８の両方の保護基を除去して、この例の生成物を得る。
【００４８】
理論に束縛されるものではないが、細胞内におけるタンパク質加水分解後に生成された低分子量のＳＮ−３８生成物（すなわち、バリノール−ＳＮ−３８カーボネート）は、バリノールのアミノ基及びカーボネートのカルボニルが関与する分子内環化を介した、インタクトＳＮ−３８の別の遊離経路を有する。
【００４９】
別の好ましい実施形態では、一般式１のＡ’はＡ−ＯＨであり、それにより、Ａ−ＯＨは、４−アミノベンジルアルコールなどの崩壊性部分、またはベンジル位においてＣ１−Ｃ１０アルキル基で置換された置換４−アミノベンジルアルコールであり、後者は、アミノ基を介して、Ｌ−アミノ酸、または最大４つのＬ−アミノ酸部分を含むポリペプチドに結合し、式中、Ｎ末端は、抗体結合基で末端処理されたクロスリンカーに結合する。
【００５０】
好ましい実施形態の別の例では、一般式１のＡ’のＡ−ＯＨは、置換４−アミノベンジルアルコールから誘導され、「ＡＡ」は、単一のＬ−アミノ酸（一般式１においてｍ＝１）を含み、薬物はＳＮ−３８で例示される。ＡＡの単一アミノ酸は、以下のＬ−アミノ酸、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンのいずれか１つから選択してもよい。４−アミノベンジルアルコール部分（Ａ’のＡ−ＯＨ実施形態）の置換基Ｒは、水素、またはＣ１−Ｃ１０アルキル基から選択されるアルキル基である。この式の一例（式中、単一アミノ酸ＡＡはＬ−リジンであり、Ｒ＝Ｈであり、薬物はＳＮ−３８で例示される）をＭＡｂ−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（以下に示す）と呼ぶ。その構造は、ＭＡｂ−ＣＬ２−ＳＮ−３８のリンカーとは、ＣＬ２リンカーにみられるＰｈｅ−Ｌｙｓジペプチドの単一リジン残基の置換の点で異なる。Ｐｈｅ−Ｌｙｓジペプチドは、リソソーム酵素用のカテプシンＢ開裂部位として設計され、結合薬物の細胞内放出において重要であると考えられてきた。驚くべきことに、カテプシン開裂部位がないにもかかわらず、ＣＬ２Ａリンカーを含むイムノコンジュゲートは、ＣＬ２リンカーを含むイムノコンジュゲートと比較して、インビボで明らかにより有効である。
【化１】
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【００５１】
好ましい実施形態では、ＡＡは、細胞内ペプチダーゼによって開裂可能なポリペプチド部分、好ましくは、ジ、トリまたはテトラペプチドを含む。例としては、Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ及びＡｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号：９）が挙げられる（Ｔｒｏｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）。
【００５２】
別の好ましい実施形態では、複合体のＬ１構成要素は、１〜３０の繰り返しモノマー単位を有する所定のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スペーサーを含む。更に好ましい実施形態では、ＰＥＧは、１〜１２の繰り返しモノマー単位を有する所定のＰＥＧである。ＰＥＧの導入は、市販のヘテロ二官能性化ＰＥＧ誘導体の使用を伴っていてもよい。ヘテロ二官能性ＰＥＧは、アジド基またはアセチレン基を含んでいてもよい。
【００５３】
好ましい実施形態では、Ｌ２は、２〜４０、しかし好ましくは２〜２０、より好ましくは２〜５個の範囲の複数のアセチレン（またはアジド）基、及び単一の抗体結合部分を有する。代表的な例では、「Ｌ２」構成要素は２個のアセチレン基に結合し、２個のアジド結合ＳＮ−３８分子の結合をもたらす。ＭＡｂへの結合部はスクシンイミドを含んでいてもよい。
【００５４】
好ましい実施形態では、二官能性薬物が抗体結合基としてチオール反応性部分を含む場合、抗体上のチオールは、チオール化試薬を用いて、抗体のリジン基上に生成される。ＭＡｂのリジン基を修飾することでチオール基を抗体上に導入するための方法は、当該技術分野において周知である（Ｗｏｎｇ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９９１），ｐｐ  ２０−２２）。代替的に、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）などの還元剤を用いて、抗体上の鎖間ジスルフィド結合を緩やかに還元することにより（Ｗｉｌｌｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．４：５２１−５２７（１９９３））、抗体上に７〜１０のチオールを生成することができる。そしてそのことは、複数の薬物部分を抗原結合領域から離れたＭＡｂの鎖間領域に導入するという利点を有している。より好ましい実施形態では、還元ジスルフィドスルフヒドリル基にＳＮ−３８を結合させることにより、抗体分子毎に６〜８のＳＮ−３８部分が共有結合した抗体−ＳＮ−３８イムノコンジュゲートが形成される。薬物またはその他の治療薬を結合させるためにシステイン残基を提供するその他の方法は周知であり、例えば、システイン改変抗体の使用などである（米国特許番号７，５２１，５４１を参照のこと（その特許の実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる））。
【００５５】
別の好ましい実施形態では、化学療法剤部分は、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、エピルビシン、モルホリノドキソルビシン（モルホリノ−ＤＯＸ）、シアノモルホリノ−ドキソルビシン（シアノモルホリノ−ＤＯＸ）、ＣＰＴ、１０−ヒドロキシカンプトテシン、ＳＮ−３８、トポテカン、ラルトテカン、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、タキサン、ゲルダナマイシン、アンサマイシン、及びエポチロンからなる群から選択される。より好ましい実施形態では、化学療法剤部分はＳＮ−３８である。好ましい実施形態の複合体では、好ましくは、抗体は少なくとも１つの化学療法剤部分に結合し、好ましくは１〜約１２の化学療法剤部分に結合し、最も好ましくは約６〜約８の化学療法剤部分に結合する。
【００５６】
更に、好ましい実施形態では、リンカー構成要素「Ｌ２」は、上記抗体の１個または複数個のリジン側鎖アミノ基に導入されたチオール反応性残基と反応するチオール基を含む。このようなケースでは、当該技術分野において十分説明されている手順を用いて、マレイミド、ビニルスルホン、ブロモアセトアミドまたはヨードアセトアミドなどのチオール反応性基で抗体をあらかじめ誘導体化する。
【００５７】
この作業に関連し、驚くべきことに、ＣＰＴ薬物−リンカー（ＣＰＴは更に、１０−ヒドロキシル基を有する）を調製可能なプロセスが発見された。このプロセスは、限定するわけではないが、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）誘導体として１０−ヒドロキシル基を保護してから、薬物−リンカー複合体の最後から二番目の中間体を調製することを含む。一般的に、ＢＯＣ基を除去するためには、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などの強酸による処理が必要とされる。これらの条件下では、除去する保護基を含むＣＰＴ  ２０−Ｏ−リンカーカーボネートもまた開裂しやすく、その結果、未修飾ＣＰＴが増加することになる。事実、リンカー分子のリジン側鎖用の、緩やかに除去可能なメトキシトリチル（ＭＭＴ）保護基を用いる論理的根拠は、当該技術分野において明言されているが、この可能性を的確に回避することであった（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。短期間、最適には３〜５分間の反応を行うことにより、フェノール性ＢＯＣ保護基を選択的に除去することが可能であることが発見された。これらの条件下では、主な生成物は、１０−ヒドロキシル位の「ＢＯＣ」が除去される一方で「２０」位のカーボネートがインタクトである生成物であった。
【００５８】
別のアプローチは、１０−ＯＨ保護基を脱保護する必要なしに、最終生成物を抗体にコンジュゲートする準備が整うように、ＣＰＴ類似体の１０−ヒドロキシ位を「ＢＯＣ」以外の基で保護することを含む。１０−ヒドロキシ保護基（１０−ＯＨをフェノール性カーボネートまたはフェノール性エステルに変換する）は、複合体のインビボ投与後、生理学的ｐＨ条件またはエステラーゼにより速やかに脱保護される。生理学的条件下における、１０−ヒドロキシカンプトテシンの、１０位のフェノール性カーボネート対２０位の三級カーボネートのより速やかな除去については、Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．が記載している（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：４００３−４００８（２００４））。ＳＮ−３８上の１０−ヒドロキシ保護基は、「ＣＯＲ」（式中、Ｒは「Ｎ（ＣＨ３）２−（ＣＨ２）ｎ−」などの置換アルキルであってもよく、式中、ｎは１〜１０であり、式中、末端アミノ基は任意選択的に、水溶解性の高い四級塩形態である）、または単純なアルキル残基、例えば、「ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−」（式中、ｎは０〜１０）であってもよく、アルコキシ部分、例えば、「ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−」（式中、ｎは０〜１０）、「Ｎ（ＣＨ３）２−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−」（式中、ｎは２〜１０）、または「Ｒ１Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−」（式中、Ｒ１はエチルまたはメチルであり、ｎは０〜１０の値の整数）であってもよい。最終的な誘導体がカーボネートである場合、これらの１０−ヒドロキシ誘導体は、選択試薬のクロロホルメートで処理することで容易に調製される。通常、１０−ヒドロキシ含有カンプトテシン（例えば、ＳＮ−３８など）は、トリエチルアミンを塩基として用いて、ジメチルホルムアミド中のモル当量のクロロホルメートで処理される。これらの条件下では、２０−ＯＨ位は変化しない。１０−Ｏ−エステルを形成するために、選択試薬の酸塩化物を用いる。
【００５９】
一般式１（式中、記述子Ｌ２、Ｌ１、ＡＡ及びＡ−Ｘは前のセクションに記載のとおり）の薬物誘導体と抗体の複合体を調製する好ましいプロセスでは、二官能性薬物部分、［Ｌ２］−［Ｌ１］−［ＡＡ］ｍ−［Ａ−Ｘ］−薬物を最初に調製してから、その二官能性薬物部分を抗体（本明細書では「ＭＡｂ」を指し示す）にコンジュゲートする。
【００６０】
一般式１（式中、記述子Ｌ２、Ｌ１、ＡＡ及びＡ−ＯＨは前のセクションに記載のとおり）の薬物誘導体と抗体の複合体を調製する好ましいプロセスでは、二官能性薬物部分は、最初にＡ−ＯＨをアミド結合でＡＡのＣ末端に結合させてから、ＡＡのアミン末端をＬ１のカルボン酸基に結合させることにより調製される。ＡＡが存在しない場合（すなわち、ｍ＝０）、Ａ−ＯＨをアミド結合で直接Ｌ１に結合させる。クリックケミストリーによるＬ１及びＬ２のアジド（またはアセチレン）基とアセチレン（またはアジド）基の間の反応を用いることにより、Ｌ１部分に結合させてから、クロスリンカー、［Ｌ１］−［ＡＡ］ｍ−［Ａ−ＯＨ］を薬物のヒドロキシル基またはアミノ基に結合させる。
【００６１】
一実施形態では、抗体はモノクローナル抗体（ＭＡｂ）である。その他の実施形態では、抗体は、多価ＭＡｂ及び／または多重特異性ＭＡｂであってもよい。抗体は、マウス、キメラ、ヒト化またはヒトモノクローナル抗体であってもよく、上記抗体は、インタクト、フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２）またはサブフラグメント（一本鎖構造）形態、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡアイソタイプ、または、それらのサブ分子であってもよい。
【００６２】
抗体の調製
事実上のあらゆる標的抗原（例えば、Ｔｒｏｐ−２など）に対するモノクローナル抗体を作製するための技術は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）、及びＣｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１，ｐａｇｅｓ  ２．５．１−２．６．７（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９１）を参照されたい。簡潔に説明すると、モノクローナル抗体は、抗原を含む組成物をマウスに注入し、脾臓を取り出しＢリンパ球を採取して、Ｂリンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、そのハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選抜し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養してから、ハイブリドーマ培養液から抗体を単離することによって得ることができる。
【００６３】
様々な確立技術を用いて、ハイブリドーマ培養液からＭＡｂを単離及び精製してもよい。このような単離技術としては、プロテインＡセファロースまたはプロテインＧセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ  ａｔ  ｐａｇｅｓ  ２．７．１−２．７．１２、及びｐａｇｅｓ  ２．９．１−２．９．３を参照されたい。また、Ｂａｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ）」  ｉｎ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１０，ｐａｇｅｓ  ７９−１０４（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）を参照されたい。
【００６４】
免疫原で抗体の初期産生を行った後、その抗体をシークエンスしてから、組換え技術により作成してもよい。マウス抗体及び抗体フラグメントのヒト化及びキメラ化については当業者に周知であり、以下で説明する。
【００６５】
様々な技術（例えば、キメラ抗体またはヒト化抗体の作製など）は、抗体のクローニングと構築の手順を含み得る。目的の抗体用の抗原結合Ｖκ（可変軽鎖）及びＶＨ（可変重鎖）配列は、様々な分子クローニング手法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、５´−ＲＡＣＥ及びｃＤＮＡライブラリスクリーニングなどにより得ることができる。マウスＭＡｂを発現する細胞に由来するＭＡｂのＶ遺伝子をＰＣＲ増幅でクローニングして配列決定することができる。それらＶ遺伝子の信頼性を確認するため、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６：３８３３（１９８９））に記載のとおりに、クローニングしたＶＬ遺伝子とＶＨ遺伝子を細胞培養液中でキメラＡｂとして発現させてもよい。その後、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：１４１３（１９９５））に記載のとおりに、Ｖ遺伝子配列に基づきヒト化ＭＡｂを設計し構築してもよい。
【００６６】
一般的な分子クローニング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ（１９８９））を用いて、マウスＭＡｂを産生する任意の周知のハイブリドーマ株またはトランスフェクト細胞株からｃＤＮＡを作製してもよい。プライマーＶＫ１ＢＡＣＫ及びＶＫ１ＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）またはＬｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１５：２８６（１９９３））に記載されている伸長プライマーセットを使用して、ＭＡｂ用のＶκ配列を増幅してもよい。プライマーペアＶＨ１ＢＡＣＫ／ＶＨ１ＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）またはＬｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９（１９９４））に記載されているマウスＩｇＧの定常領域にアニールするプライマーを使用して、ＶＨ配列を増幅してもよい。Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：１４１３（１９９５））に記載されているロングオリゴヌクレオチドテンプレート合成とＰＣＲ増幅の組み合わせにより、ヒト化Ｖ遺伝子を構築してもよい。
【００６７】
ステージングベクター、例えば、ｐＢＲ３２７ベースのステージングベクターであるＶＫｐＢＲ（Ｉｇプロモーター、シグナルペプチド配列及び好都合な制限部位を含有する）などに、Ｖκ用のＰＣＲ産物をサブクローニングしてもよい。同様のステージングベクター、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベースのＶＨｐＢＳなどに、ＶＨ用のＰＣＲ産物をサブクローニングしてもよい。プロモーター及びシグナルペプチド配列と共にＶκ配列及びＶＨ配列を含有する発現カセットをＶＫｐＢＲ及びＶＨｐＢＳからそれぞれ切り出して、適切な発現ベクター、例えば、ｐＫｈ及びｐＧ１ｇなどにライゲートしてもよい（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９（１９９４））。発現ベクターを適切な細胞に共トランスフェクションして、上清液におけるキメラＭＡｂ、ヒト化ＭＡｂまたはヒトＭＡｂの産生をモニターしてもよい。代替的に、Ｖκ発現カセット及びＶＨ発現カセットを切り出して、単一の発現ベクター、例えば、Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１（１９８９）に記載されており、Ｌｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，８０：２６６０（１９９７）にも示されているｐｄＨＬ２などにサブクローニングしてもよい。
【００６８】
代替実施形態では、無血清培地内におけるトランスフェクション、増殖及び発現に前適応している宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクションしてもよい。使用できる例示的な細胞株としては、Ｓｐ／ＥＥＥ細胞株、Ｓｐ／ＥＳＦ細胞株及びＳｐ／ＥＳＦ−Ｘ細胞株が挙げられる（例えば、米国特許番号７，５３１，３２７、７，５３７，９３０及び７，６０８，４２５（それぞれの特許の実施例セクションは参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。これらの例示的な細胞株は、変異Ｂｃｌ−ＥＥＥ遺伝子をトランスフェクションされ、トランスフェクションされた遺伝子配列を増幅するようにメトトレキサートに曝露され、タンパク質発現用の無血清細胞株に前適応したＳｐ２／０骨髄腫細胞株をベースとしている。
【００６９】
キメラ抗体
キメラ抗体とは、ヒト抗体の可変領域が、例えば、マウス抗体の可変領域（マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む）で置換された組換えタンパク質のことである。キメラ抗体は、対象に投与する際、低い免疫原性及び高い安定性を示す。マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般的な技術については、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６：３８３３（１９８９）に開示されている。キメラ抗体を構築するための技術は当業者に周知である。一例として、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １３：４６９（１９９４）は、マウスＬＬ２のＶκ及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列（抗ＣＤ２２モノクローナル抗体）を対応するヒトκ及びＩｇＧ１定常領域ドメインと組み合わせることによりＬＬ２キメラを作製した。
【００７０】
ヒト化抗体
ヒト化ＭＡｂを作製するための技術は当該技術分野において周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６），Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８），Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８），Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５（１９９２），Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７（１９９２）、及びＳｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４（１９９３）を参照のこと）。マウス免疫グロブリンの可変重鎖及び可変軽鎖由来のマウスＣＤＲを、ヒト抗体の対応する可変ドメインに導入することにより、キメラまたはマウスモノクローナル抗体をヒト化してもよい。キメラモノクローナル抗体のマウスフレームワーク領域（ＦＲ）もまた、ヒトＦＲ配列で置換する。マウスＣＤＲを単にヒトＦＲに導入すると抗体親和性が減少するまたは更に喪失する場合が多く、マウス抗体の元の親和性を回復させるためには追加の修飾が必要となり得る。このことは、ＦＲ領域内の１つまたは複数のヒト残基をそれらのマウス対応物で置換して、マウス抗体のエピトープに良好な結合親和性を有する抗体を得ることにより達成することができる。例えば、Ｔｅｍｐｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６（１９９１）及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４（１９８８）を参照されたい。置換用の好ましい残基としては、ＣＤＲ残基側鎖の１、２または３オングストローム以内に位置するＦＲ残基、ＣＤＲ配列に隣接して位置するＦＲ残基、または、ＣＤＲ残基と相互作用すると予測されるＦＲ残基が挙げられる。
【００７１】
ヒト抗体
組み合わせアプローチ、またはヒト免疫グロブリン遺伝子座で形質転換したトランスジェニック動物のいずれかを用いて完全ヒト抗体を作製するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｍａｎｃｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：３１５−２８；Ｃｏｎｒａｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌｅｒ，２００５，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．８：１１７−２６；Ｂｒｅｋｋｅ  ａｎｄ  Ｌｏｓｅｔ，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３：５４４−５０）。完全ヒト抗体もまた、遺伝子または染色体のトランスフェクション法に加えて、ファージディスプレイ技術を用いて構築することができる（これらの全ては、当技術分野において周知である）。例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０）を参照されたい。このような完全ヒト抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体と比較して更に副作用が少なく、事実上の内因性ヒト抗体としてインビボで機能すると予想されている。
【００７２】
１つの代替実施形態では、ファージディスプレイ技術を用いてヒト抗体を作製してもよい（例えば、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．４：１２６−４０）。正常なヒトから、または特定の疾患状態（例えば、がんなど）を示すヒトから、ヒト抗体を作製してもよい（Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。疾患個体からヒト抗体を構築する利点は、循環抗体レパートリーが、疾患関連抗原に対する抗体に偏り得ることである。
【００７３】
この方法における１つの非限定例において、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）は、骨肉腫患者由来のヒトＦａｂ抗体フラグメントのファージディスプレイライブラリを構築した。一般的に、トータルＲＮＡは、循環血液中のリンパ球から得た（Ｉｄ．）。μ鎖、γ鎖及びκ鎖の抗体レパートリーから組換えＦａｂをクローニングして、ファージディスプレイライブラリに挿入した（Ｉｄ．）。ＲＮＡをｃＤＮＡに変換してから、重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列に特異的なプライマーを用いたＦａｂ  ｃＤＮＡライブラリの作製に使用した（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７）。ライブラリ構築は、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．（２０００，Ｉｎ：Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ｐｐ．９．１  ｔｏ  ９．２２）に従って実施した。最終Ｆａｂフラグメントを制限エンドヌクレアーゼで消化してから、バクテリオファージゲノムに挿入して、ファージディスプレイライブラリを作製した。当該技術分野において周知のとおり、標準的なファージディスプレイ法を用いて、このようなライブラリをスクリーニングしてもよい。ファージディスプレイは様々な方式で実施可能であり、それらの確認には、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。
【００７４】
ヒト抗体もまた、インビトロで活性化させたＢ細胞を用いて作製可能である。米国特許番号５，５６７，６１０及び５，２２９，２７５を参照されたい（それら全体は参照により本明細書に組み込まれる）。これらの技術は例示であり、ヒト抗体または抗体フラグメントを作製及びスクリーニングするための任意の周知の方法が利用可能であることを当業者は理解するであろう。
【００７５】
別の代替実施形態では、ヒト抗体を産生するように遺伝子組換えされたトランスジェニック動物を用い、標準的な免疫化プロトコルを使用して、事実上あらゆる免疫原性標的に対応する抗体を作製してもよい。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法については、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，がＮａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３  （１９９４）に、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，がＮａｔｕｒｅ  ３６８：８５６（１９９４）に、またＴａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，がＩｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）に開示している。このような方法の非限定例は、Ａｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）製のＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）（例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３（参照により本明細書に組み込まれる））である。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）及び類似動物では、マウス抗体遺伝子を不活化して機能的ヒト抗体遺伝子で置換している（残りのマウス免疫機構はそのまま維持しつつ）。
【００７６】
ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）を、ヒトＩｇＨ及びＩｇκ遺伝子座の一部（大部分の可変領域配列に加え、アクセサリー遺伝子及び調節配列を含む）を含む、生殖細胞系を設計したＹＡＣ（酵母人工染色体）で形質転換した。ヒト可変領域レパートリーを用いて、Ｂ細胞を産生する抗体を作製してもよく、周知の技術を用いて、その抗体をハイブリドーマに導入してもよい。標的抗原で免疫したＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）は正常な免疫応答でヒト抗体を産生するが、上述した標準的な技術を用いて、そのヒト抗体を回収及び／または調製してもよい。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）の様々な株が市販されており、そのそれぞれは、異なる種類の抗体を産生することができる。遺伝子組換えで作製されたヒト抗体は、正常ヒト抗体の薬物動態特性を維持しつつも、治療ポテンシャルを有することが示された（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。当業者は、本願請求項に記載の組成物及び方法がＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）系の使用に限定されず、ヒト抗体を産生するように遺伝子組換えされたあらゆるトランスジェニック動物が利用可能であることを理解するであろう。
【００７７】
周知の抗体及び標的抗原
上述のように、好ましい実施形態では、ＡＤＣをがんの治療に使用する。特定の実施形態では、標的のがんは、１種または複数種の標的腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現し得る。がんの治療に使用可能な個々の抗体としては、ＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ＬＬ２またはＲＦＢ４（抗ＣＤ２２）、ベルツズマブ（ｈＡ２０、抗ＣＤ２０）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１、抗ＣＤ２０）、ランブロリズマブ（抗ＰＤ−１受容体）、ニボルマブ（抗ＰＤ−１受容体）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）、ＲＳ７（抗上皮糖タンパク質−１（ＥＧＰ−１、Ｔｒｏｐ−２としても周知））、ＰＡＭ４またはＫＣ４（両方とも抗ムチン）、ＭＮ−１４（抗がん胎児性抗原（ＣＥＡ、ＣＤ６６ｅまたはＣＥＡＣＡＭ５としても周知））、ＭＮ−１５またはＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、Ｍｕ−９（抗結腸特異的抗原ｐ）、Ｉｍｍｕ  ３１（抗α−フェトプロテイン）、Ｒ１（抗ＩＧＦ−１Ｒ）、Ａ１９（抗ＣＤ１９）、ＴＡＧ−７２（例えば、ＣＣ４９）、Ｔｎ、Ｊ５９１またはＨｕＪ５９１（抗ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原））、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（抗ＰＳＭＡ二量体）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ）、Ｇ２５０（抗炭酸脱水酵素ＩＸ  ＭＡｂ）、Ｌ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、イブリツモマブチウキセタン（抗ＣＤ２０）、パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、トシツモマブ（抗ＣＤ２０）、ＰＡＭ４（別名クリバツズマブ、抗ムチン）、及びトラスツズマブ（抗ＥｒｂＢ２）が挙げられるがこれらに限定されない。このような抗体は当技術分野において周知である（例えば、米国特許番号５，６８６，０７２、５，８７４，５４０、６，１０７，０９０、６，１８３，７４４、６，３０６，３９３、６，６５３，１０４、６，７３０．３００、６，８９９，８６４、６，９２６，８９３、６，９６２，７０２、７，０７４，４０３、７，２３０，０８４、７，２３８，７８５、７，２３８，７８６、７，２５６，００４、７，２８２，５６７、７，３００，６５５、７，３１２，３１８、７，５８５，４９１、７，６１２，１８０、７，６４２，２３９、及び、米国特許出願公開番号２００５０２７１６７１、２００６０１９３８６５、２００６０２１０４７５、２００７００８７００１（それぞれの実施例セクションは参照により本明細書に組み込まれる））。使用される特に周知の抗体としては、ｈＰＡＭ４（米国特許番号７，２８２，５６７）、ｈＡ２０（米国特許番号７，１５１，１６４）、ｈＡ１９（米国特許番号７，１０９，３０４）、ｈＩＭＭＵ−３１（米国特許番号７，３００，６５５）、ｈＬＬ１（米国特許番号７，３１２，３１８）、ｈＬＬ２（米国特許番号５，７８９，５５４）、ｈＭｕ−９（米国特許番号７，３８７，７７２）、ｈＬ２４３（米国特許番号７，６１２，１８０）、ｈＭＮ−１４（米国特許番号６，６７６，９２４）、ｈＭＮ−１５（米国特許番号８，２８７，８６５）、ｈＲ１（米国特許番号９，４４１，０４３）、ｈＲＳ７（米国特許番号７，２３８，７８５）、ｈＭＮ−３（米国特許番号７，５４１，４４０）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（米国特許出願１１／９８３，３７２、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−４４０５及びＰＴＡ−４４０６として寄託）、及びＤ２／Ｂ（ＷＯ２００９／１３０５７５）が挙げられる（列挙した特許または特許出願におけるそれぞれの本文（図面セクション及び実施例セクションに対応）は、参照により本明細書に組み込まれる）。好ましい実施形態では、抗体はｈＲＳ７抗Ｔｒｏｐ−２抗体である。
【００７８】
標的となり得るその他の有用な腫瘍関連抗原としては、炭酸脱水酵素ＩＸ、Ｂ７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢｒＥ３、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０（例えば、Ｃ２Ｂ８、ｈＡ２０、１Ｆ５  ＭＡｂ）、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＴＬＡ−４、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＶＥＧＦ（例えば、アバスチン（登録商標）、フィブロネクチンスプライスバリアント）、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン（例えば、Ｌ１９）、ＥＧＰ−１（Ｔｒｏｐ−２）、ＥＧＰ−２（例えば、１７−１Ａ）、ＥＧＦ受容体（ＥｒｂＢ１）（例えば、アービタックス（登録商標））、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、Ｈ因子、ＦＨＬ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、Ｇａ  ７３３、ＧＲＯ−β、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ３、ヒストンＨ４、インスリン様成長因子（ＩＬＧＦ）、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−λ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２５、ＩＰ−１０、ＩＧＦ−１Ｒ、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ガングリオシド、ＨＣＧ、Ｌ２４３が結合するＨＬＡ−ＤＲ抗原、ＣＤ６６抗原、すなわち、ＣＤ６６ａ〜ｄまたはこれらの組み合わせ、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＰＳＭＡ、ＰＡＭ４抗原、ＰＤ−１受容体、ＰＤ−Ｌ１、ＮＣＡ−９５、ＮＣＡ−９０、Ａ３、Ａ３３、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＫＳ−１、Ｌｅ（ｙ）、メソテリン、Ｓ１００、テネイシン、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍａｓ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、腫瘍血管新生抗原、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１及びＲ２）、ＴＲＯＰ−２、ＶＥＧＦＲ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、及びがん幹細胞抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、ならびにがん遺伝子産物が挙げられる。ＴＡＡはＴｒｏｐ−２であることが好ましい。
【００７９】
より治療に耐性を示す前駆体悪性細胞集団と考えられているがん幹細胞（Ｈｉｌｌ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｉｓ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２００７；９９：１４３５−４０）は、特定のがんタイプ、例えば、前立腺癌のＣＤ１３３（Ｍａｉｔｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｒｎｓｔ  Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐｏｓ．Ｐｒｏｃ．２００６；５：１５５−７９）、非小細胞肺癌（Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００７；１２２（３）：３８５−９１）、膠芽腫（Ｂｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；６７（９）：４０１０−５）、結腸直腸癌のＣＤ４４（Ｄａｌｅｒｂａ  ｅｒ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００７；１０４（２４）１０１５８−６３）、膵臓癌（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７；６７（３）：１０３０−７）、及び頭頸部扁平上皮細胞癌（Ｐｒｉｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００７；１０４（３）９７３−８）などにおいて、標的となり得る抗原を有している。乳癌治療のための別の有用な標的は、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２００３；３７５：５１−９）が記載するＬＩＶ−１抗原である。
【００８０】
がん治療にチェックポイント阻害抗体が使用されている。免疫チェックポイントとは、末梢組織損傷を最小限とするために自己寛容を維持して免疫機構応答の度合いを調節することに影響を及ぼす、免疫機構内の阻害経路のことを意味する。しかしながら、腫瘍細胞はまた、免疫機構チェックポイントを活性化して腫瘍組織に対する免疫応答の効果を抑制し得る。細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４、ＣＤ１５２としても周知）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１、ＣＤ２７９としても周知）及びプログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７４としても周知）に対する例示的なチェックポイント阻害抗体を、１種または複数種のその他の薬剤、例えば、抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣなどと組み合わせて使用し、疾患細胞、組織または病原体に対する免疫応答の効果を向上させてもよい。例示的な抗ＰＤ１抗体としては、ランブロリズマブ（ＭＫ−３４７５，ＭＥＲＣＫ）、ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８，ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）、ＡＭＰ−２２４（ＭＥＲＣＫ）及びピディリズマブ（ＣＴ−０１１，ＣＵＲＥＴＥＣＨ  ＬＴＤ．）が挙げられる。抗ＰＤ１抗体は、例えば、ＡＢＣＡＭ（登録商標）（ＡＢ１３７１３２）、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（登録商標）（ＥＨ１２．２Ｈ７、ＲＭＰ１−１４）、及びＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ  ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（Ｊ１０５、Ｊ１１６、ＭＩＨ４）から市販されている。抗ＰＤ−Ｌ１抗体の例としては、ＭＤＸ−１１０５（ＭＥＤＡＲＥＸ）、ＭＥＤＩ４７３６（ＭＥＤＩＭＭＵＮＥ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）及びＢＭＳ−９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ−ＭＹＥＲＳ  ＳＱＵＩＢＢ）が挙げられる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体はまた、例えば、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ  ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（ＭＩＨ１）から市販されている。例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体としては、イピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）及びトレメリムマブ（ＰＦＩＺＥＲ）が挙げられる。抗ＰＤ１抗体は、例えば、ＡＢＣＡＭ（登録商標）（ＡＢ１３４０９０）、ＳＩＮＯ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＣ．（１１１５９−Ｈ０３Ｈ、１１１５９−Ｈ０８Ｈ）、及びＴＨＥＲＭＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＰＩＥＲＣＥ（ＰＡ５−２９５７２、ＰＡ５−２３９６７、ＰＡ５−２６４６５、ＭＡ１−１２２０５、ＭＡ１−３５９１４）から市販されている。イピリムマブは最近、転移性黒色腫の治療用にＦＤＡの承認を受けた（Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  １１：８９）。
【００８１】
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、自然免疫及び適応免疫ならびにアポトーシスの重要な調節因子である。ＣＤ７４がＭＩＦの内因性受容体であるという報告がある（Ｌｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９７：１４６７−７６）。ＭＩＦが介在する細胞内経路における拮抗的な抗ＣＤ７４抗体の治療効果は、広範囲の疾患状態、例えば、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、肺癌及び結腸癌などの治療に利用されてもよい（例えば、Ｍｅｙｅｒ−Ｓｉｅｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：３４；Ｓｈａｃｈａｒ  ＆  Ｈａｒａｎ，２０１１，Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ５２：１４４６−５４）。ミラツズマブ（ｈＬＬ１）は、ＭＩＦ介在性疾患を治療するための例示的な治療用抗ＣＤ７４抗体である。
【００８２】
使用される様々なその他の抗体は当該技術分野において周知である（例えば、米国特許番号５，６８６，０７２、５，８７４，５４０、６，１０７，０９０、６，１８３，７４４、６，３０６，３９３、６，６５３，１０４、６，７３０．３００、６，８９９，８６４、６，９２６，８９３、６，９６２，７０２、７，０７４，４０３、７，２３０，０８４、７，２３８，７８５、７，２３８，７８６、７，２５６，００４、７，２８２，５６７、７，３００，６５５、７，３１２，３１８、７，５８５，４９１、７，６１２，１８０、７，６４２，２３９及び米国特許出願公開番号２００６０１９３８６５（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる））。
【００８３】
使用する抗体は、多種多様な周知の供給業者から商業的に入手可能である。例えば、様々な抗体を分泌するハイブリドーマ株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能である。腫瘍関連抗原を含む様々な疾患標的に対する多数の抗体がＡＴＣＣに寄託されている、及び／または、可変領域配列が公開されており、本願請求項に記載の方法及び組成物に用いることが可能である。例えば、米国特許番号７，３１２，３１８、７，２８２，５６７、７，１５１，１６４、７，０７４，４０３、７，０６０，８０２、７，０５６，５０９、７，０４９，０６０、７，０４５，１３２、７，０４１，８０３、７，０４１，８０２、７，０４１，２９３、７，０３８，０１８、７，０３７，４９８、７，０１２，１３３、７，００１，５９８、６，９９８，４６８、６，９９４，９７６、６，９９４，８５２、６，９８９，２４１、６，９７４，８６３、６，９６５，０１８、６，９６４，８５４、６，９６２，９８１、６，９６２，８１３、６，９５６，１０７、６，９５１，９２４、６，９４９，２４４、６，９４６，１２９、６，９４３，０２０、６，９３９，５４７、６，９２１，６４５、６，９２１，６４５、６，９２１，５３３、６，９１９，４３３、６，９１９，０７８、６，９１６，４７５、６，９０５，６８１、６，８９９，８７９、６，８９３，６２５、６，８８７，４６８、６，８８７，４６６、６，８８４，５９４、６，８８１，４０５、６，８７８，８１２、６，８７５，５８０、６，８７２，５６８、６，８６７，００６、６，８６４，０６２、６，８６１，５１１、６，８６１，２２７、６，８６１，２２６、６，８３８，２８２、６，８３５，５４９、６，８３５，３７０、６，８２４，７８０、６，８２４，７７８、６，８１２，２０６、６，７９３，９２４、６，７８３，７５８、６，７７０，４５０、６，７６７，７１１、６，７６４，６８８、６，７６４，６８１、６，７６４，６７９、６，７４３，８９８、６，７３３，９８１、６，７３０，３０７、６，７２０，１５５、６，７１６，９６６、６，７０９，６５３、６，６９３，１７６、６，６９２，９０８、６，６８９，６０７、６，６８９，３６２、６，６８９，３５５、６，６８２，７３７、６，６８２，７３６、６，６８２，７３４、６，６７３，３４４、６，６５３，１０４、６，６５２，８５２、６，６３５，４８２、６，６３０，１４４、６，６１０，８３３、６，６１０，２９４、６，６０５，４４１、６，６０５，２７９、６，５９６，８５２、６，５９２，８６８、６，５７６，７４５、６，５７２；８５６、６，５６６，０７６、６，５６２，６１８、６，５４５，１３０、６，５４４，７４９、６，５３４，０５８、６，５２８，６２５、６，５２８，２６９、６，５２１，２２７、６，５１８，４０４、６，５１１，６６５、６，４９１，９１５、６，４８８，９３０、６，４８２，５９８、６，４８２，４０８、６，４７９，２４７、６，４６８，５３１、６，４６８，５２９、６，４６５，１７３、６，４６１，８２３、６，４５８，３５６、６，４５５，０４４、６，４５５，０４０、６，４５１，３１０、６，４４４，２０６、６，４４１，１４３、６，４３２，４０４、６，４３２，４０２、６，４１９，９２８、６，４１３，７２６、６，４０６，６９４、６，４０３，７７０、６，４０３，０９１、６，３９５，２７６、６，３９５，２７４、６，３８７，３５０、６，３８３，７５９、６，３８３，４８４、６，３７６，６５４、６，３７２，２１５、６，３５９，１２６、６，３５５，４８１、６，３５５，４４４、６，３５５，２４５、６，３５５，２４４、６，３４６，２４６、６，３４４，１９８、６，３４０，５７１、６，３４０，４５９、６，３３１，１７５、６，３０６，３９３、６，２５４，８６８、６，１８７，２８７、６，１８３，７４４、６，１２９，９１４、６，１２０，７６７、６，０９６，２８９、６，０７７，４９９、５，９２２，３０２、５，８７４，５４０、５，８１４，４４０、５，７９８，２２９、５，７８９，５５４、５，７７６，４５６、５，７３６，１１９、５，７１６，５９５、５，６７７，１３６、５，５８７，４５９、５，４４３，９５３、５，５２５，３３８を参照されたい。これらは例示に過ぎず、多種多様なその他の抗体及びそのハイブリドーマは当技術分野において周知である。当業者は、ＡＴＣＣ、ＮＣＢＩ及び／またはＵＳＰＴＯのデータベースにおいて、選択した疾患関連目的標的に対する抗体を単に検索することにより、ほぼあらゆる疾患関連抗原に対する抗体配列または抗体分泌ハイブリドーマを入手可能であることを理解するであろう。当該技術分野において周知の標準的な技術を使用して、クローン抗体の抗原結合ドメインを増幅して切り出し、発現ベクターにライゲートし、適合宿主細胞にトランスフェクションしてから、タンパク質産生に用いてもよい。
【００８４】
抗体アロタイプ
治療抗体の免疫原性は、インフュージョンリアクションリスクの増加、及び治療効果期間の短縮に関係している（Ｂａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４８：６０２−０８）。治療抗体が宿主内の免疫応答を誘導する程度は、抗体のアロタイプにより部分的に測定することができる（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：２１３−２１）。抗体アロタイプは、抗体の定常領域配列の特定位置におけるアミノ酸配列バリエーションに関係している。重鎖γ型定常領域を含むＩｇＧ抗体のアロタイプは、Ｇｍアロタイプとして設計されている（１９７６，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１７：１０５６−５９）。
【００８５】
一般的なＩｇＧ１ヒト抗体において、最も一般的なアロタイプはＧ１ｍ１である（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：２１３−２１）。しかしながら、Ｇ１ｍ３アロタイプはまた、白人において頻繁に発生している（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。非Ｇ１ｍ１（ｎＧ１ｍ１）レシピエント、例えば、Ｇ１ｍ３患者などに投与する際、Ｇ１ｍ１抗体が免疫応答を誘導する傾向のあるアロタイプ配列を含んでいることが報告されている（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。非Ｇ１ｍ１アロタイプ抗体は、Ｇ１ｍ１患者に投与する際、免疫原性とはならない（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【００８６】
ヒトＧ１ｍ１アロタイプは、重鎖ＩｇＧ１のＣＨ３配列の３５６カバット位にアミノ酸のアスパラギン酸を、また３５８カバット位にロイシン含む。ｎＧ１ｍ１アロタイプは、３５６カバット位にアミノ酸のグルタミン酸を、また３５８カバット位にメチオニンを含む。Ｇ１ｍ１アロタイプとｎＧ１ｍ１アロタイプの両方は３５７カバット位にグルタミン酸残基を含み、それらアロタイプはＤＥＬアロタイプ及びＥＥＭアロタイプと呼ばれることもある。Ｇ１ｍ１アロタイプ抗体及びｎＧ１ｍ１アロタイプ抗体における重鎖定常領域配列の非限定例を、例示的な抗体リツキシマブ（配列番号：７）及びベルツズマブ（配列番号：８）で以下に示す。
リツキシマブ重鎖可変領域配列（配列番号：７）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＡＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ベルツズマブ重鎖可変領域（配列番号：８）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【００８７】
Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ（２００９，ｍＡｂｓ  １：１−７）は、ＩｇＧアロタイプの配列バリエーション特性、及び免疫原性に与える配列バリエーションの影響についてレビューしている。彼らは、Ｇ１ｍ１７アロタイプにおける２１４カバット位のリジン残基と比較して、Ｇ１ｍ３アロタイプが、２１４カバット位のアルギニン残基を特徴としていることを報告している。ｎＧ１ｍ１，２アロタイプは、３５６カバット位のグルタミン酸、３５８カバット位のメチオニン、及び４３１カバット位のアラニンを特徴としていた。Ｇ１ｍ１，２アロタイプは、３５６カバット位のアスパラギン酸、３５８カバット位のロイシン、及び４３１カバット位のグリシンを特徴としていた。重鎖定常領域配列変異体に加えて、Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ（２００９）は、１５３カバット位のバリン及び１９１カバット位のロイシンを特徴とするＫｍ１アロタイプ、１５３カバット位のアラニン及び１９１カバット位のロイシンを特徴とするＫｍ１，２アロタイプ、及び、１５３カバット位のアラニン及び１９１カバット位のバリンを特徴とするＫｍ３アロタイプ、を有するκ軽鎖定常領域のアロタイプ変異体について報告している。
【００８８】
治療抗体に関して、ベルツズマブ及びリツキシマブはそれぞれ、多種多様な血液悪性腫瘍及び／または自己免疫疾患の治療に用いる、ＣＤ２０に対するヒト化ＩｇＧ１抗体及びキメラＩｇＧ１抗体である。表１では、リツキシマブ対ベルツズマブのアロタイプ配列を比較している。表１に示すように、リツキシマブ（Ｇ１ｍ１７，１）は、ベルツズマブのアルギニンに対してリツキシマブのリジンの２１４カバット位（重鎖ＣＨ１）に追加の配列バリエーションを有するＤＥＬアロタイプＩｇＧ１である。対象におけるベルツズマブの免疫原性がリツキシマブと比較して低いことが報告されている（効果は、ヒト化抗体とキメラ抗体の間の違いに起因している）（例えば、Ｍｏｒｃｈｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７：３３４６−５３；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｌｏｏｄ  １１３：１０６２−７０；Ｒｏｂａｋ  ＆  Ｒｏｂａｋ，２０１１，ＢｉｏＤｒｕｇｓ  ２５：１３−２５を参照のこと）。しかしながら、ＥＥＭアロタイプとＤＥＬアロタイプの間におけるアロタイプの違いはまた、ベルツズマブのより低い免疫原性にも起因するようである。
【００８９】
【表１】
2020512314.tif 000004
【００９０】
ｎＧ１ｍ１遺伝子型の個体における治療抗体の免疫原性を低減させるためには、２１４カバット位のアルギニンを特徴とするＧ１ｍ３アロタイプ、及び、３５６カバット位のグルタミン酸、３５８カバット位のメチオニン及び４３１カバット位のアラニンを特徴とするｎＧ１ｍ１，２無アロタイプ、に相当する抗体のアロタイプを選択することが望ましい。驚くべきことに、長期間にわたるＧ１ｍ３抗体の反復皮下投与が著しい免疫応答とはならないことが見出された。代替実施形態では、Ｇ１ｍ３アロタイプと同様、ヒトＩｇＧ４重鎖は、２１４カバット位にアルギニン、３５６カバット位にグルタミン酸、３５９カバット位にメチオニン、及び４３１カバット位にアラニンを有している。免疫原性が少なくとも部分的に上記位置における残基に関係していると思われるため、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域配列を治療抗体に使用することはまた好ましい実施形態である。Ｇ１ｍ３  ＩｇＧ１抗体とＩｇＧ４抗体の組み合わせをまた、治療薬投与に使用してもよい。
【００９１】
ナノボディ
ナノボディとは、約１２〜１５ｋＤａサイズ（約１１０アミノ酸長）の単一ドメイン抗体のことである。ナノボディは、完全サイズ抗体と同様、標的抗原に選択的に結合することができ、抗原に対してほぼ同等の親和性を有する。しかしながら、そのはるかにより小さなサイズにより、ナノボディはより良好に固形腫瘍に浸透可能となり得る。より小さなサイズはまたナノボディの安定性に寄与し、そのナノボディは完全サイズ抗体と比較してｐＨ極限及び温度極限により耐性を示す（Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔ  １４３１：３７−４６）。単一ドメイン抗体は元々、ラクダ科（ラクダ、アルパカ、ラマ）が軽鎖を持たない完全機能性抗体を有するということが発見された後に開発された（例えば、Ｈａｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７７：１３−２２）。重鎖抗体は、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）及び２つの定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）からなる。抗体と同様に、多価構築物及び／または二重特異性構築物としてナノボディを開発及び使用してもよい。様々な標的抗原、例えば、ＩＬ−６Ｒ、ｖＷＦ、ＴＮＦ、ＲＳＶ、ＲＡＮＫＬ、ＩＬ−１７Ａ  ＆  Ｆ、及びＩｇＥ（例えば、ＡＢＬＹＮＸ（登録商標），Ｇｈｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）などを標的とし、がん及びその他の疾患の臨床使用に可能性を有するナノボディのヒト化形態が商業開発されている（例えば、Ｓａｅｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ８：６００−８；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，２０１３，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ８２：７７５−９７；Ｉｂａｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０３：１０６３−７２）。
【００９２】
ナノボディの血漿中半減期は完全サイズ抗体の血漿中半減期よりも短い（主に腎臓経路で排出される）。Ｆｃ領域を欠いていることから、ナノボディは補体依存性細胞傷害を示さない。
【００９３】
ラクダ、ラマ、アルパカまたはサメを標的抗原で免疫化してからｍＲＮＡを単離し、ライブラリにクローニングし、抗原結合性でスクリーニングすることにより、ナノボディを作製してもよい。標準的な技術（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２，Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３，Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４，Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：４２８５，Ｓａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７，Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４）を用いてナノボディ配列をヒト化してもよい。ラクダ科ＦＲ配列とヒトＦＲ配列の間の相同性が高いことから、ヒト化は比較的簡単である。
【００９４】
様々な実施形態では、本ＡＤＣは、コンジュゲートした薬物を標的がん細胞に標的化送達するためのナノボディを含んでいてもよい。使用するナノボディについては、例えば、米国特許番号７，８０７，１６２、７，９３９，２７７、８，１８８，２２３、８，２１７，１４０、８，３７２，３９８、８，５５７，９６５、８，６２３，３６１及び  ８，６２９，２４４（それぞれの実施例セクションは参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００９５】
抗体フラグメント
抗体フラグメントとは、抗体の抗原結合部位、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｓｃＦｖなどのことである。周知の技術を用いて、特定のエピトープを認識する抗体フラグメントを作製することができる。例えば、抗体分子のペプシン消化により、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを作製することができる。これら及びその他の方法については、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許番号４，０３６，９４５及び４，３３１，６４７ならびにその中に含まれる参照文献に記載されている。更に、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０（１９６０）；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９（１９５９），Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  ＶＯＬ．１，ｐａｇｅ  ４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９６７），及びＣｏｌｉｇａｎ  ａｔ  ｐａｇｅｓ  ２．８．１−２．８．１０  ａｎｄ  ２．１０．−２．１０．４を参照されたい。代替的に、モノクローナルＦａｂ’フラグメントを所望の特異性で迅速かつ容易に同定することを可能とするＦａｂ’発現ライブラリを構築することができる（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７４−１２８１）。
【００９６】
単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）はＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む。ＶＬドメインとＶＨドメインは結合して標的結合部位を形成する。これら２つのドメインは更に、ペプチドリンカー（Ｌ）により共有結合している。ｓｃＦｖ分子は、ＶＬドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部分である場合にはＶＬ−Ｌ−ＶＨ、または、ＶＨドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部分である場合にはＶＨ−Ｌ−ＶＬのいずれかを表す。ｓｃＦｖ分子を作製するための方法及び好適なペプチドリンカーを設計するための方法については、米国特許番号４，７０４，６９２、米国特許番号４，９４６，７７８、Ｒ．Ｒａａｇ  ａｎｄ  Ｍ．Ｗｈｉｔｌｏｗ，「Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｆｖｓ．」ＦＡＳＥＢ  Ｖｏｌ  ９：７３−８０（１９９５）及びＲ．Ｅ．Ｂｉｒｄ  ａｎｄ  Ｂ．Ｗ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ，ＴＩＢＴＥＣＨ，Ｖｏｌ  ９：１３２−１３７（１９９１）に記載されている。
【００９７】
その他の抗体フラグメント、例えば、単一ドメイン抗体フラグメントは当該技術分野において周知であり、本願請求項に記載の構築物に使用することができる。標準的な免疫化技術を用いて、例えば、ラクダ、アルパカまたはラマから単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を得てもよい（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＳ  ２６：２３０−２３５，２００１；Ｙａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８１：１６１−７５，２００３；Ｍａａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２４：１３−２５，２００７を参照のこと）。ＶＨＨは強力な抗原結合能を有していてもよく、一般的なＶＨ−ＶＬペアに接近できない新規のエピトープと相互作用することができる（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。アルパカ血清ＩｇＧは、約５０％ラクダ科重鎖のみＩｇＧ抗体（ＨＣＡｂ）を含有する（Ｍａａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＴＮＦ−αなどの周知の抗原でアルパカを免疫化してもよく、標的抗原に結合して中和するＶＨＨを単離してもよい（Ｍａａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。事実上全てのアルパカＶＨＨコード配列を増幅するＰＣＲ用プライマーが同定されており、それらを使用してアルパカＶＨＨファージディスプレイライブラリを構築してもよく、当該技術分野において周知の標準的なバイオパニング法により、それらのライブラリを使用して抗体フラグメントを単離することができる（Ｍａａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【００９８】
抗体フラグメントはまた、全長抗体のタンパク質加水分解、または、Ｅ．ｃｏｌｉまたは別の宿主におけるフラグメントをコードするＤＮＡの発現によっても調製することができる。通常の方法で全長抗体をペプシン消化またはパパイン消化することにより抗体フラグメントを得ることができる。例えば、抗体をペプシンで酵素開裂させて抗体フラグメントを作製し、約１００ｋＤのフラグメント（Ｆ（ａｂ’）２と表記する）を得ることができる。チオール還元剤、及び任意選択的に、ジスルフィド結合の開裂により生じたスルフヒドリル基用のブロック基を用いて、このフラグメントを更に開裂させて、約５０ＫｄのＦａｂ’一価フラグメントを作製することができる。代替的に、パパインを用いた酵素開裂により、２つの一価Ｆａｂフラグメント、及び１つのＦｃフラグメントを直接作製する。
【００９９】
インタクト抗体が認識する抗原にフラグメントが結合する限りにおいて、抗体を開裂させるためのその他の方法（例えば、重鎖を分離して一価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成すること、フラグメントを更に開裂させること）、またはその他の酵素技術、化学技術または遺伝技術もまた使用してもよい。
【０１００】
二重特異性抗体及び多重特異性抗体
二重特異性抗体は、多数の生物医学用途において有用である。例えば、腫瘍細胞表面抗原及びＴ細胞表面受容体に対する結合部位を有する二重特異性抗体は、Ｔ細胞による特定腫瘍細胞の溶解を誘導することができる。神経膠腫及びＴ細胞上のＣＤ３エピトープを認識する二重特異性抗体は、ヒト患者における脳腫瘍の治療に成功裏に用いられている（Ｎｉｔｔａ，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．１９９０；３５５：３６８−３７１）。好ましい二重特異性抗体は抗ＣＤ３  Ｘ  抗Ｔｒｏｐ−２抗体である。代替実施形態では、抗ＣＤ３抗体またはそのフラグメントを、Ｂ細胞関連抗原に対する抗体またはフラグメント、例えば、抗ＣＤ３  Ｘ  抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３  Ｘ  抗ＣＤ２０、抗ＣＤ３  Ｘ  抗ＣＤ２２、抗ＣＤ３  Ｘ  抗ＨＬＡ−ＤＲ、または抗ＣＤ３  Ｘ  抗ＣＤ７４などに結合してもよい。特定の実施形態では、本明細書で開示する治療薬複合体のための技術及び組成物を、標的化部分としての二重特異性抗体または多重特異性抗体と共に使用してもよい。
【０１０１】
二重特異性抗体または多重特異性抗体を作製するための数多くの方法が周知であり、例えば、米国特許番号７，４０５，３２０に開示されている（その実施例セクションは参照により本明細書に組み込まれる）。二重特異性抗体は、別々の抗原部位を認識するモノクローナル抗体をそれぞれが産生する２種類の異なるハイブリドーマを融合することを含む、クアドローマ法を用いて作製可能である（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８３；３０５：５３７−５４０）。
【０１０２】
二重特異性抗体を作製するための別の方法においては、２種類の異なるモノクローナル抗体を化学的につなぐためのヘテロ二官能性のクロスリンカーを使用する（Ｓｔａｅｒｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，１９８５；３１４：６２８−６３１；Ｐｅｒｅｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，１９８５；３１６：３５４−３５６）。二重特異性抗体はまた、２種類の親モノクローナル抗体のそれぞれを対応する半分子へと還元してから、混合、再酸化してハイブリッド構造を得ることにより作製可能である（Ｓｔａｅｒｚ  ａｎｄ  Ｂｅｖａｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９８６；８３：１４５３−１４５７）。別の代替方法は、個々に精製した２種類または３種類のＦａｂ’フラグメントを、適切なリンカーを用いて化学的に架橋することを含む（例えば、欧州特許出願４５３０８２を参照のこと）。
【０１０３】
その他の方法としては、レトロウイルス由来のシャトルベクターを対応する親ハイブリドーマに導入してから融合させることで異なる選択マーカーを遺伝子導入することにより、ハイブリッドハイブリドーマの作製効率を向上させること（ＤｅＭｏｎｔｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９０，８７：２９４１−２９４５）、または、ハイブリドーマ細胞株に、別の抗体の重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子を含む発現プラスミドをトランスフェクションすることが挙げられる。
【０１０４】
同じ性質のＶＨドメインとＶＬドメインを、適切な組成及び長さ（通常は、１２超のアミノ酸残基からなる）のペプチドリンカーで結合させて、結合活性を有する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成することができる。ｓｃＦｖの製造方法については、米国特許番号４，９４６，７７８及び米国特許番号５，１３２，４０５に開示されている（それぞれの特許の実施例セクションは参照により本明細書に組み込まれる）。ペプチドリンカー長を１２アミノ酸残基未満にまで短くすることで、同一鎖上におけるＶＨドメインとＶＬドメインのペアリングを防止して、別の鎖上に相補的なドメインを有するＶＨドメインとＶＬドメインのペアリングを強制することにより、機能的多量体を形成させる。３〜１２アミノ酸残基のリンカーで結合したＶＨドメインとＶＬドメインのポリペプチド鎖は、主に二量体（ディアボディと呼ばれる）を形成する。０〜２アミノ酸残基のリンカーを有する三量体（トリアボディと呼ばれる）及び四量体（テトラボディと呼ばれる）が好都合であるが、厳密なオリゴマー形成パターンは、組成、Ｖドメインの配向（ＶＨ−リンカーＶＬ、またはＶＬ−リンカー−ＶＨ）に加え、リンカー長によって決まるようである。
【０１０５】
多重特異性抗体または二重特異性抗体を作製するためのこれらの技術は、これら技術における低収率性、精製の必要性、低安定性、または労働集約性に関する様々な問題を呈している。ごく最近では、事実上のあらゆる所望の抗体と、抗体フラグメントとその他エフェクター分子の組み合わせを作製するために、「ｄｏｃｋ  ａｎｄ  ｌｏｃｋ」（ＤＮＬ）として周知の技術が利用されている（例えば、米国特許番号７，５２１，０５６、７，５２７，７８７、７，５３４，８６６、７，５５０，１４３、７，６６６，４００、７，８５８，０７０、７，８７１，６２２、７，９０６，１２１、７，９０６，１１８、８，１６３，２９１、７，９０１，６８０、７，９８１，３９８、８，００３，１１１及び８，０３４，３５２を参照のこと（それぞれの特許の実施例セクションは参照により本明細書に組み込まれる））。この技術は、アンカードメイン（ＡＤ）、及び二量化及びドッキングドメイン（ＤＤＤ）と呼ばれる相補的なタンパク質結合ドメインを利用しており、それらは、互いに結合して、二量体、三量体、四量体、五量体及び六量体の範囲の複合体構造がアセンブリされる。これらは、大規模な精製を必要とせずに高収率で安定した複合体を形成する。ＤＮＬ技術により、単特異性抗体、二重特異性抗体または多重特異性抗体のアセンブリが可能となる。本願請求項に記載の方法を実施するにあたり、二重特異性抗体または多重特異性抗体を作製するための当該技術分野において周知の技術のいずれかを利用してもよい。
【０１０６】
コンジュゲーションプロトコル
特定の実施形態では、細胞傷害性薬物、またはその他の治療薬もしくは診断薬を、抗体または抗体フラグメントに共有結合で結合させて、イムノコンジュゲートを形成してもよい。一部の実施形態では、薬物またはその他の薬剤を、担体部分を介して抗体またはそのフラグメントに結合させてもよい。担体部分を、例えば、還元ＳＨ基及び／または炭水化物側鎖に結合させてもよい。還元抗体構成要素のヒンジ領域において、ジスルフィド結合形成を介し担体部分を結合させることができる。代替的に、ヘテロ二官能性クロスリンカー、例えば、Ｎ−サクシニル  ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）などを使用して、このような薬剤を結合させることができる（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５６：２４４（１９９４））。このような結合を実施するための一般的な技術は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｗｏｎｇ，ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」ｉｎ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  １８７−２３０（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５）；Ｐｒｉｃｅ，「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」ｉｎ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，Ｒｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅｓ  ６０−８４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）を参照されたい。代替的に、抗体のＦｃ領域中の炭水化物部分を介して、担体部分を結合することができる。
【０１０７】
抗体炭水化物部分を介して官能基を抗体にコンジュゲートするための方法は、当業者に周知である。例えば、Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４１：８３２（１９８８）；Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４６：１１０１（１９９０）；及び、Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許番号５，０５７，３１３を参照されたい（その実施例セクションは参照により本明細書に組み込まれる）。一般的な方法は、酸化した炭水化物部分を有する抗体を、少なくとも１個の遊離アミン基を有する担体ポリマーと反応させることを含む。この反応により最初にシッフ塩基（イミン）結合が生じ、二級アミンへと還元することにより安定化し、最終複合体を形成することができる。
【０１０８】
ＡＤＣの抗体構成要素が抗体フラグメントである場合、Ｆｃ領域は存在しなくてもよい。しかしながら、炭水化物部分を、全長抗体または抗体フラグメントの軽鎖可変領域に導入することは可能である。例えば、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５９１９（１９９５）、米国特許番号５，４４３，９５３及び６，２５４，８６８を参照されたい（それらの実施例セクションは参照により本明細書に組み込まれる）。設計した炭水化物部分を用いて、治療薬または診断薬を結合させる。
【０１０９】
担体部分を標的化分子に結合させるための別の方法は、クリックケミストリー反応の使用を含む。クリックケミストリー法は元々、小さなサブユニットをモジュール式で互いに結合させることにより、複合体物質を急速に生成するための方法として構想された（例えば、Ｋｏｌｂ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４０：３００４−３１；Ｅｖａｎｓ，２００７，Ａｕｓｔ  Ｊ  Ｃｈｅｍ  ６０：３８４−９５を参照のこと）。様々な形態のクリックケミストリー反応が当技術分野において周知であり、例えば、ヒュスゲン１，３−双極子付加環化銅触媒反応（Ｔｏｒｎｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍ  ６７：３０５７−６４）などが挙げられ、多くの場合、「クリック反応」と呼ばれる。その他の代替実施形態では、付加環化反応、例えば、ディールスアルダー、求核置換反応（特に、エポキシ化合物及びアジリジン化合物のような小さな張力環に対する）、尿素化合物のカルボニル化学形成、及び、炭素−炭素二重結合を含む反応（例えば、チオール−エン反応におけるアルキンなど）などを含む。
【０１１０】
アジドアルキンヒュスゲン付加環化反応では、第１の分子に結合した末端アルキン基の反応を触媒するために、還元剤の存在下で銅触媒を用いる。アジド部分を含む第２の分子の存在下で、アジドは活性化アルキンと反応して、１，４−ジ置換１，２，３−トリアゾールを形成する。銅触媒反応は、室温で進行し、また反応生成物の精製を多くの場合必要としないほど十分に特異的である（Ｒｏｓｔｏｖｓｔｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４１：２５９６；Ｔｏｒｎｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ６７：３０５７）。アジド官能基及びアルキン官能基は、水性媒体中の生体分子に対してほぼ不活性であるため、複合体溶液中において反応が進行する。形成されたトリアゾールは化学的に安定であり酵素開裂を受けないため、クリックケミストリー生成物は、生物学的機構において非常に安定なものになる。銅触媒は生細胞にとって有毒ではあるが、銅をベースとしたクリックケミストリー反応は、イムノコンジュゲート形成にインビトロで使用することができる。
【０１１１】
生体分子の共有結合修飾に銅フリークリック反応が提案されている（例えば、Ａｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２６：１５０４６−４７を参照のこと）。銅フリー反応では、［３＋２］アジド−アルキン付加環化反応を促進するために、銅触媒の代わりに環ひずみを利用する（Ｉｄ．）。例えば、シクロオクチンは、内部アルキン結合を含む８炭素環構造である。閉環構造によりアセチレンの結合角にかなりの変形が引き起こされるが、それによりアジド基との反応性が高くなり、トリアゾールを形成することになる。それゆえ、シクロオクチン誘導体を銅フリークリック反応に使用することができる（Ｉｄ．）。
【０１１２】
別のタイプの銅フリークリック反応（ひずみ促進アルキン−ニトロン付加環化を伴う）は、Ｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４９：３０６５−６８）により報告された。元のシクロオクチンにおける反応速度の低さに対処するために、電子吸引基を三重結合の隣に結合させる（Ｉｄ．）。このような置換シクロオクチンの例としては、ジフッ素化シクロオクチン、４−ジベンゾシクロオクチノール、及びアザシクロオクチンが挙げられる（Ｉｄ．）。別の銅フリー反応は、Ｎ−アルキル化イソオキサゾリンを得るためのひずみ促進アルキン−ニトロン付加環化を伴っていた（Ｉｄ．）。その反応が並外れて速い反応動態を有していると報告され、ペプチド及びタンパク質の部位特異的修飾用のワンポット３ステッププロトコルに使用された（Ｉｄ．）。Ｎ−メチルヒドロキシルアミンで適切なアルデヒドを縮合させてニトロンを調製してから、アセトニトリルと水の混合液中で付加環化反応を行った（Ｉｄ．）。これら及びその他の周知のクリックケミストリー反応を用いて、インビトロで担体部分を抗体に結合させてもよい。
【０１１３】
Ａｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００４，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２６：１５０４６−４７）は、ペルアセチル化Ｎ−アジドアセチルマンノサミンの存在下、ＣＨＯ細胞中で発現する組換え糖タンパク質が、糖タンパク質の炭水化物中における対応するＮ−アジドアセチルシアル酸の生体内取り込みをもたらすことを実証した。アジド誘導体化糖タンパク質は、特異的にビオチン化シクロオクチンと反応してビオチン化糖タンパク質を形成した（一方、アジド部分のない対照の糖タンパク質は、非標識のまま）（Ｉｄ．）。Ｌａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０：６６４−６６７）は、同様の技術を使用して、ペルアセチル化Ｎ−アジドアセチルガラクトサミンでインキュベートしたゼブラフィッシュ胚内の細胞表面グリカンを代謝標識した。アジド誘導体化グリカンをジフッ素化シクロオクチン（ＤＩＦＯ）試薬と反応させて、インビボでグリカンを可視化させた。
【０１１４】
ディールスアルダー反応もまた、分子のインビボ標識に使用されてきた。Ｒｏｓｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４９：３３７５−７８）は、トランス−シクロオクテン（ＴＣＯ）反応性部分を担持する腫瘍局在化抗ＴＡＧ７２（ＣＣ４９）抗体と１１１Ｉｎ標識テトラジンＤＯＴＡ誘導体の間において、インビボで５２％の収率があることを報告している。結腸癌異種移植片を有するマウスにＴＣＯ標識ＣＣ４９抗体を投与し、その１日後、１１１Ｉｎ標識テトラジンプローブを注入した（Ｉｄ．）。放射能標識プローブと腫瘍局在化抗体が反応することにより、放射能標識プローブの注入後３時間時点における生マウスのＳＰＥＣＴイメージングを実施したところ、腫瘍内に放射能の著しい局在化が認められた（腫瘍：筋肉の比率は１３：１）（Ｉｄ．）。その結果は、ＴＣＯとテトラジン標識分子のインビボ化学反応を裏付けるものであった。
【０１１５】
クリックケミストリー反応による修飾は、インビトロまたはインビボでの使用に適している。反応性標的化分子は、化学的コンジュゲートまたは生体内取り込みのいずれかにより形成されてもよい。標的化分子、例えば、抗体または抗体フラグメントなどを、アジド部分、置換シクロオクチン基もしくはアルキン基、またはニトロン部分で活性化させてもよい。標的化分子がアジド基またはニトロン基を含む場合、対応する標的となり得る構築物は置換シクロオクチン基またはアルキン基を含み、逆の場合もまた同様である。このような活性化分子は、上述したとおり、生細胞内における代謝取り込みにより生成してもよい。
【０１１６】
代替的に、このような部分を生体分子に化学的にコンジュゲートするための方法は当該技術分野において周知であり、任意のこのような周知の方法を利用してもよい。一般的なイムノコンジュゲート形成方法については、例えば、米国特許番号４，６９９，７８４、４，８２４，６５９、５，５２５，３３８、５，６７７，４２７、５，６９７，９０２、５，７１６，５９５、６，０７１，４９０、６，１８７，２８４、６，３０６，３９３、６，５４８，２７５、６，６５３，１０４、６，９６２，７０２、７，０３３，５７２、７，１４７，８５６、及び７，２５９，２４０に開示されている（それぞれの実施例セクションは参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１１７】
治療薬
別の態様では、本発明は、治療有効量の本明細書に記載の抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を対象に投与することを含む、対象を治療するための方法に関する。本明細書に記載のＡＤＣにより、例えば、別のＣＤ２２エピトープ（ｈＲＦＢ４）に対する抗ＣＤ２２抗体、例えば、ｈＬＬ２  ＭＡｂ（エプラツズマブ、米国特許番号６，１８３，７４４を参照のこと）など、または、その他のＢ細胞抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５２、ＣＤ７４、ＣＤ８０またはＨＬＡ−ＤＲなどに対する抗体を使用して治療可能な疾患としては、Ｂ細胞悪性腫瘍（例えば、非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、毛様細胞性白血病）が挙げられるがこれらに限定されない。その他の疾患としては、内胚葉由来消化器系上皮の腺癌、がん、例えば、乳癌及び非小細胞肺癌など、ならびに、その他の癌腫、肉腫、神経膠腫瘍、骨髄性白血病などが挙げられるがこれらに限定されない。悪性固形腫瘍または造血腫瘍、例えば、胃腸、胃、結腸、食道、肝臓、肺、乳房、膵臓、肝臓、前立腺、卵巣、精巣、脳、骨、尿路上皮またはリンパの腫瘍、肉腫または黒色腫が産生するまたはそれらに関連する抗原、例えば、がん胎児性抗原に対する抗体をとりわけ有利に使用する。疾患状態及び複合体の忍容性に応じて、このような治療薬を一度または繰り返し投与してもよく、また任意選択的に、その他の治療モダリティ、例えば、外科手術、外部放射線、放射免疫治療、免疫療法、化学療法、アンチセンス療法、干渉ＲＮＡ療法、遺伝子治療などと組み合わせて使用してもよい。それぞれの組み合わせは、腫瘍タイプ、ステージ、患者の状態、及び前治療、ならびに、管理医師が検討するその他の因子に合わせられる。
【０１１８】
本明細書で使用する場合、用語「対象」とは、ヒトを含む哺乳動物を含むがこれらに限定されない任意の動物（すなわち、脊椎動物及び無脊椎動物）のことを意味する。この用語が特定の年齢または性別に限定されるということを意図するものではない。それゆえ、成人及び新生児の対象に加えて胎児（男性または女性にかかわらず）は、この用語に包含される。本明細書において示す用量はヒト用であるが、体重または平方メートルサイズに従い、その他の哺乳動物に加えて小児のサイズに調節することは可能である。
【０１１９】
好ましい実施形態では、米国特許番号７，２３８，７８５、７，５１７，９６４及び８，０８４，５８３に開示されるような抗Ｔｒｏｐ−２抗体、例えば、ｈＲＳ７  ＭＡｂなどを含む治療用複合体を用いて、がん、例えば、食道癌、膵臓癌、肺癌、胃癌、結腸癌及び直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、腎臓癌、ならびに前立腺癌を治療することができる（その実施例セクションは参照として本明細書に組み込まれる）。ｈＲＳ７抗体は、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）配列ＣＤＲ１（ＫＡＳＱＤＶＳＩＡＶＡ、配列番号：１）、ＣＤＲ２（ＳＡＳＹＲＹＴ、配列番号：２）及びＣＤＲ３（ＱＱＨＹＩＴＰＬＴ、配列番号：３）、ならびに、重鎖ＣＤＲ配列ＣＤＲ１（ＮＹＧＭＮ、配列番号：４）、ＣＤＲ２（ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＴＤＤＦＫＧ、配列番号：５）及びＣＤＲ３（ＧＧＦＧＳＳＹＷＹＦＤＶ、配列番号：６）を含むヒト化抗体である。
【０１２０】
マウス型及びキメラ型の抗体も使用可能ではあるが、好ましい実施形態では、ヒト疾患の治療に使用される抗体はヒト型またはヒト化（ＣＤＲ移植）型の抗体である。免疫応答を最小限とするには同一種のＩｇＧ分子（送達物質）が最も好ましい。反復治療を考慮する上で、このことは特に重要である。ヒトにおいて、ヒトＩｇＧ抗体またはヒト化ＩｇＧ抗体は、患者の抗ＩｇＧ免疫応答をより少なく生じさせるようである。ｈＬＬ１及びｈＬＬ２などの抗体は、標的細胞上の内在化抗原に結合後、速やかに内部移行する。そのことは、担持されている化学療法剤も同様に、細胞内へと速やかに内部移行することを意味する。しかしながら、より遅い内在化速度を有する抗体もまた、選択的治療を達成するのに使用され得る。
【０１２１】
別の好ましい実施形態では、本発明のカンプトテシン複合体と組み合わせて使用する治療薬は、１種または複数種の同位体を含んでいてもよい。患部組織を治療するのに有用な放射性同位体としては、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２２７Ｔｈ及び２１１Ｐｂが挙げられるがこれらに限定されない。治療用放射性核種は、２０〜６，０００ｋｅＶの範囲の崩壊エネルギー、好ましくは、オージェ放出体において６０〜２００ｋｅＶの範囲、β放出体において１００〜２，５００ｋｅＶの範囲、及び、α放出体において４，０００〜６，０００ｋｅＶの範囲の崩壊エネルギーを有していることが好ましい。有用なβ粒子放射性核種の最大崩壊エネルギーは、好ましくは２０〜５，０００ｋｅＶ、より好ましくは１００〜４，０００ｋｅＶ、最も好ましくは５００〜２，５００ｋｅＶである。実質的にオージェ放射性粒子を伴って崩壊する放射性核種もまた好ましい。例えば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、Ｉ−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍ及びＩｒ−１９２である。有用なβ粒子放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは＜１，０００ｋｅＶ、より好ましくは＜１００ｋｅＶ、最も好ましくは＜７０ｋｅＶである。実質的にα粒子を発生して崩壊する放射性核種もまた好ましい。このような放射性核種としては、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３、Ｔｈ−２２７及びＦｍ−２５５が挙げられるがこれらに限定されない。有用なα粒子放射性の放射性核種における崩壊エネルギーは、好ましくは２，０００〜１０，０００ｋｅＶ、より好ましくは３，０００〜８，０００ｋｅＶ、最も好ましくは４，０００〜７，０００ｋｅＶである。別の使用可能な放射性同位体としては、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５Ｂｒ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、１６９Ｙｂなどが挙げられる。
【０１２２】
放射性核種及びその他の金属を、例えば、抗体または複合体に結合させたキレート基を使用して送達してもよい。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ及びＴＥＴＡなどの大環状キレートを、様々な金属及び放射性金属と共に、最も特に、それぞれガリウム、イットリウム及び銅の放射性核種と共に使用する。このような金属−キレート複合体は、環サイズを目的の金属に合わせて調節することにより、極めて安定した状態で調製することができる。その他の環状キレート、例えば、２２３Ｒａを錯化させるための大環状ポリエーテルなどを使用してもよい。
【０１２３】
本明細書に記載のカンプトテシン複合体と組み合わせて使用する治療薬としてはまた、例えば、化学療法剤、例えば、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピドフィロトキシン、タキサン、代謝拮抗薬、チロシンキナーゼ阻害剤、アルキル化剤、抗生物質、Ｃｏｘ−２阻害剤、抗有糸分裂薬、抗血管新生薬及びプロアポトーシス薬、特に、ドキソルビシン、メトトレキサート、タキソール、その他のカンプトテシン、ならびに、これら及びその他の部類の抗がん剤に由来するその他の治療薬などが挙げられる。その他のがん化学療法剤としては、ナイトロジェンマスタード、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位錯体、ホルモンなどが挙げられる。好適な化学療法剤については、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１９ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９９５）、及びＧＯＯＤＭＡＮ  ＡＮＤ  ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ  ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ，７ｔｈ  Ｅｄ．（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９８５）、ならびに、これら刊行物の改訂版に記載されている。その他の適切な化学療法剤、例えば、実験用薬物などは、当業者に周知である。
【０１２４】
使用する例示的な薬物としては、５−フルオロウラシル、アファチニブ、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、アキシチニブ、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９１、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、カリケアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０−ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、Ｃｏｘ−２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、ＳＮ−３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダサチニブ、ジナシクリブ、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン（２Ｐ−ＤＯＸ）、シアノ−モルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシングルクロニド、エルロチニブ、エストラムスチン、エピポドフィロトキシン、エルロチニブ、エンチノスタット、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、エキセメスタン、フィンゴリモド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’−Ｏ−ジオレオイル−ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ−ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、フラボピリドール、フォスタマチニブ、ガネテスピブ、ＧＤＣ−０８３４、ＧＳ−１１０１、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イブルチニブ、イダルビシン、イデラリシブ、イホスファミド、イマチニブ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ラパチニブ、レノリダミド、ロイコボリン、ＬＦＭ−Ａ１３、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ネラチニブ、ニロチニブ、ニトロソウレア、オラパリブ、プリコマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ＰＣＩ−３２７６５、ペントスタチン、ＰＳＩ−３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、タモキシフェン、テマゾロミド、トランスプラチン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、バタラニブ、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド、及びＺＤ１８３９が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、薬物はＳＮ−３８である。このような薬剤は本明細書に記載の複合体の一部であってもよく、あるいは、本明細書に記載の複合体と組み合わせて、複合体の投与前に、それと同時に、またはその投与後のいずれかで投与されてもよい。代替的に、当該技術分野において周知の１種または複数種の治療用ｎａｋｅｄ抗体を、記載した複合体と組み合わせて使用してもよい。例示的な治療用ｎａｋｅｄ抗体については上述したとおりである。
【０１２５】
好ましい実施形態では、ＤＮＡ切断抗体複合体（例えば、ＳＮ−３８−ＡＤＣ）と組み合わせて使用される治療薬は、微小管阻害剤、例えば、ビンカアルカロイド、タキサン、メイタンシノイドまたはアウリスタチンなどである。例示的な周知の微小管阻害剤としては、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルタンシン、エポチロン、ドセタキセル、ディスコデルモライド、コンブレスタチン、ポドフィロトキシン、ＣＩ−９８０、フェニラヒスチン、ステガナシン、クラシン、２−メトキシエストラジオール、Ｅ７０１０、メトキシベンゼンスルホンアミド、ビノレルビン、ビンフルニン、ビンデシン、ドラスタチン、スポンジスタチン、リゾキシン、タシドチン、ハリコンドリン、ヘミアステリン、クリプトフィシン５２、ＭＭＡＥ、及びエリブリンメシラートが挙げられる。
【０１２６】
代替的な好ましい実施形態では、ＤＮＡ切断ＡＤＣ、例えば、ＳＮ−３８−抗体複合体などと組み合わせて使用される治療薬は、ＰＡＲＰ阻害剤、例えば、オラパリブ、タラゾパリブ（ＢＭＮ−６７３）、ルカパリブ、ベリパリブ、ＣＥＰ９７２２、ＭＫ４８２７、ＢＧＢ−２９０、ＡＢＴ−８８８、ＡＧ０１４６９９、ＢＳＩ−２０１、ＣＥＰ−８９８３、または３−アミノベンズアミドなどである。
【０１２７】
別の代替実施形態では、抗体またはイムノコンジュゲートと組み合わせて使用される治療薬は、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、イブルチニブ（ＰＣＩ−３２７６５）、ＰＣＩ−４５２９２、ＣＣ−２９２（ＡＶＬ−２９２）、ＯＮＯ−４０５９、ＧＤＣ−０８３４、ＬＦＭ−Ａ１３またはＲＮ４８６などである。
【０１２８】
更に別の代替実施形態では、抗体またはイムノコンジュゲートと組み合わせて使用する治療薬は、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば、イデラリシブ、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ペリフォシン、ＰＸ−８６６、ＩＰＩ−１４５（デュベリシブ）、ＢＡＹ８０−６９４６、ＢＥＺ２３５、ＲＰ６５３０、ＴＧＲ１２０２、ＳＦ１１２６、ＩＮＫ１１１７、ＧＤＣ−０９４１、ＢＫＭ１２０、ＸＬ１４７、ＸＬ７６５、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４、ＰＷＴ３３５９７、ＩＣ８７１１４、ＴＧ１００−１１５、ＣＡＬ２６３、ＰＩ−１０３、ＧＮＥ４７７、ＣＵＤＣ−９０７、ＡＥＺＳ−１３６、またはＬＹ２９４００２である。
【０１２９】
カンプトテシン複合体と共に使用可能な治療薬はまた、標的化部分にコンジュゲートした毒素を含んでいてもよい。これに関連して使用可能な毒素としては、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ランピルナーゼ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌエンテロトキシン−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシン、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエンドトキシンが挙げられる（例えば、Ｐａｓｔａｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８６），４７：６４１、及びＳｈａｒｋｅｙ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ．２００６  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；５６（４）：２２６−４３を参照のこと）。本明細書で用いるのに好適な別の毒素は当業者に周知であり、米国６，０７７，４９９に開示されている。
【０１３０】
更に別の部類の治療薬は、１種または複数種の免疫調節薬を含んでいてもよい。使用する免疫調節薬は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンフォトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、及びこれらの組み合わせから選択してもよい。特に有用な免疫調節薬は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのリンフォトキシン、インターロイキン（ＩＬ）などの造血因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γまたはインターフェロン−λなどのインターフェロン、及び「Ｓ１因子」と呼ばれる幹細胞増殖因子などである。サイトカインに含まれるものは、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；サイロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質；肝増殖因子；プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子α及び腫瘍壊死因子β；ミュラー阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βなどのトランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉ及びインスリン様成長因子−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ及びインターフェロン−λなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５などのインターロイキン（ＩＬ）、ＬＩＦ、ｋｉｔ−リガンドまたはＦＬＴ−３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子及びリンフォトキシン（ＬＴ）である。本明細書で使用する場合、用語サイトカインは、天然資源由来のタンパク質、または組換え細胞培養物由来のタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。
【０１３１】
使用するケモカインとしては、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−β及びＩＰ−１０が挙げられる。
【０１３２】
本イムノコンジュゲート（抗体または抗体フラグメントにコンジュゲートしたカンプトテシンを含む）を単独で、または１種または複数種のその他治療薬、例えば、第二抗体、第二抗体フラグメント、第二イムノコンジュゲート、放射性核種、毒素、薬物、化学療法剤、放射線治療、ケモカイン、サイトカイン、免疫調節薬、酵素、ホルモン、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡなどと組み合わせて使用してもよいということを、当業者は理解するであろう。このような別の治療薬を、本抗体薬物イムノコンジュゲートとは別々に、それらと組み合わせて、またはそれらに結合させた状態で、投与してもよい。
【０１３３】
製剤及び投与
複合体の好適な投与経路としては、経口投与、非経口投与、皮下投与、直腸投与、経粘膜投与、腸内投与、筋肉内注射、髄内注射、硬膜内注射、直接心室内注射、静脈内注射、硝子体内注射、腹腔内注射、鼻腔内注射、または眼内注射が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい投与経路は非経口である。代替的に、例えば、固形腫瘍に直接化合物を注入することにより、全身ではなく局所に化合物を投与してもよい。
【０１３４】
薬学的に有用な組成物を調製するための周知の方法に従いイムノコンジュゲートを製剤化してもよい（イムノコンジュゲートを薬学的に好適な賦形剤と混合物中で混合する）。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に好適な賦形剤の一例である。その他の好適な賦形剤は当業者に周知である。例えば、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０）、及びＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）、ならびにそれらの改訂版を参照されたい。
【０１３５】
好ましい実施形態では、イムノコンジュゲートは、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、３−（Ｎ−モルホリニル）−２−ヒドロキシプロパンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、及びピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）［Ｐｉｐｅｓ］からなる群から選択される緩衝液を使用して、グッド生化学用緩衝液（ｐＨ６〜７）中で製剤化される。より好ましい緩衝液はＭＥＳまたはＭＯＰＳであり、好ましくは２０〜１００ｍＭの濃度範囲、より好ましくは約２５ｍＭである。２５ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．５が最も好ましい。製剤は更に、添加剤として２５ｍＭのトレハロース及び０．０１％（体積／体積）のポリソルベート８０を含んでいてもよい（添加剤を加えた状態で、最終緩衝液濃度を２２．２５ｍＭに調節）。好ましい保管方法は、複合体の凍結乾燥製剤で、−２０℃〜２℃の温度範囲で保管することであり、最も好ましくは、２℃〜８℃で保管することである。
【０１３６】
例えば、ボーラス注入、低速注入または持続注入による静脈内投与用に、イムノコンジュゲートを製剤化してもよい。本発明の抗体は、約４時間未満にわたって注入されることが好ましく、また、約３時間未満にわたって注入されることがより好ましい。例えば、最初の２５〜５０ｍｇを３０分間以内、更に好ましくは１５分間以内に注入してから、残りをその先２〜３時間にわたって注入してもよい。防腐剤を添加した単位投与剤形（例えば、アンプル）または複数回用量の容器で、注射用製剤を提供してもよい。組成物を懸濁剤、液剤、または油性溶媒または水性溶媒中のエマルション剤などの剤形としてもよく、また懸濁化剤、安定化剤及び／または分散剤などの配合剤を含有していてもよい。代替的に、活性成分を、使用前に好適な溶媒、例えば、滅菌した発熱物質を含まない水で戻す粉末形態としてもよい。
【０１３７】
別の薬学的な方法を採用して、治療用複合体の作用持続時間をコントロールしてもよい。イムノコンジュゲートと複合体となるまたはイムノコンジュゲートを吸着するポリマーを使用して、放出制御製剤を調製してもよい。例えば、生体適合性ポリマーとしては、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）のマトリックス、及びステアリン酸二量体とセバシン酸のポリ無水物コポリマーのマトリックスが挙げられる（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４４６（１９９２））。このようなマトリックスからのイムノコンジュゲートの放出速度は、イムノコンジュゲートの分子量、マトリックス内におけるイムノコンジュゲートの量、及び分散粒子のサイズに依存する（Ｓａｌｔｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５５：１６３（１９８９）；Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ）。その他の固体剤形については、Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＤＯＳＡＧＥ  ＦＯＲＭＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９０）、及びＧｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）、ならびにそれらの改訂版に記載されている。
【０１３８】
一般的に、ヒトへのイムノコンジュゲートの投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身状態、及び以前の病歴などの因子に応じて変化する。約１ｍｇ／ｋｇ〜２４ｍｇ／ｋｇの範囲の単回静注用量でイムノコンジュゲートをレシピエントに投与することが望ましい場合がある（状況に応じて、より少ないまたはより多い用量もまた投与可能ではあるが）。７０ｋｇの患者に対する１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量は、例えば、１．７ｍの患者に対する７０〜１，４００ｍｇ、または４１〜８２４ｍｇ／ｍ２の用量である。必要に応じ、例えば、４〜１０週間にわたり週に１回、８週間にわたり週に１回、または４週間にわたり週に１回などで、投薬を繰り返してもよい。また維持療法の必要に応じ、より少ない頻度で、例えば、数ヶ月間にわたり１週おき、または、何ヶ月にもわたり毎月または３ヶ月に１回などで投与してもよい。好ましい用量としては、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２２ｍｇ／ｋｇ及び２４ｍｇ／ｋｇを挙げることができるがこれらに限定されない。１〜２４ｍｇ／ｋｇの範囲の任意の量を用いてもよい。しかしながら、好ましい実施形態では、用量範囲は、４〜１６ｍｇ／ｋｇ、６〜１２ｍｇ／ｋｇ、または、８〜１０ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【０１３９】
この用量を、週に１回または週に２回、複数回投与することが好ましい。４週間の最短投与スケジュール、より好ましくは８週間、より好ましくは１６週間またはより長い投与スケジュールを用いてもよい。投与スケジュールは、（ｉ）週に１回、（ｉｉ）１週おき、（ｉｉｉ）１週間の治療に続いて２、３または４週間の休薬、（ｉｖ）２週間の治療に続いて１、２、３または４週間の休薬、（ｖ）３週間の治療に続いて１、２、３、４または５週間の休薬、（ｖｉ）４週間の治療に続いて１、２、３、４または５週間の休薬、（ｖｉｉ）５週間の治療に続いて１、２、３、４または５週間の休薬、及び（ｖｉｉｉ）毎月からなる群から選択されるサイクルで、週に１回または週に２回の投与を含んでいてもよい。このサイクルを、４、６、８、１０、１２、１６もしくは２０回、またはそれ以上の回数繰り返してもよい。
【０１４０】
代替的に、１週間おきまたは２週間おきに１回の投薬で、合計少なくとも３回の投薬となるように、繰り返しイムノコンジュゲートを投与してもよい。または、４〜６週間にわたり週に２回投与してもよい。約２００〜３００ｍｇ／ｍ２（１．７ｍの患者に対して１回の投薬あたり３４０ｍｇ、または７０ｋｇの患者に対して４．９ｍｇ／ｋｇ）にまで投与量を下げる場合、４〜１０週間にわたり週に１回または更に週に２回投与してもよい。代替的に、投与スケジュール頻度を少なく、すなわち、２〜３ヶ月間にわたり１週間おきまたは２週間おきとしてもよい。しかしながら、更に高用量、例えば、週に１回または１〜２週間おきに１回、１２ｍｇ／ｋｇを、反復投与サイクル、低速ｉ．ｖ．注入で投与可能であることも明らかとなっている。投与スケジュールをその他の間隔で任意選択的に繰り返してもよく、また、適切に調節した用量及びスケジュールで、様々な非経口経路を介して投与してもよい。
【０１４１】
好ましい実施形態では、イムノコンジュゲートをがんの治療に使用する。がんの例としては、がん、リンパ腫、膠芽腫、黒色腫、肉腫、白血病、骨髄腫またはリンパ性悪性腫瘍が挙げられるがこれらに限定されない。このようながんのより詳細な例としては、以下に記載するもの、例えば、扁平上皮細胞癌（例えば、上皮扁平細胞癌）、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、星状細胞腫、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜のがん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌（胃腸癌を含む）、膵臓癌、多形膠芽腫、頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、神経内分泌腫瘍、髄様甲状腺癌、分化甲状腺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）癌または腎臓（ｒｅｎａｌ）癌、前立腺癌、外陰癌、肛門癌、陰茎癌に加えて、頭頸部癌が挙げられる。用語「がん」は、原発性の悪性細胞または悪性腫瘍（例えば、元の悪性新生物部位または腫瘍部位以外の対象の体内部位に細胞が遊走していない悪性細胞または悪性腫瘍）及び二次性の悪性細胞または悪性腫瘍（例えば、転移により生じた悪性細胞または悪性腫瘍、原始腫瘍部位とは異なる二次的な部位への悪性細胞または腫瘍細胞の遊走）を含む。
【０１４２】
がんまたは悪性腫瘍のその他の例としては、急性小児期リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝臓癌、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝臓癌、成人軟部組織肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂及び尿管のがん、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、頸部癌、小児期（原発性）肝細胞癌、小児期（原発性）肝臓癌、小児期急性リンパ芽球性白血病、小児期急性骨髄性白血病、小児期脳幹神経膠腫、小児期小脳星状細胞腫、小児期大脳星状細胞腫、小児期頭蓋外胚細胞腫瘍、小児期ホジキン病、小児期ホジキンリンパ腫、小児期視床下部及び視覚路神経膠腫、小児期リンパ芽球性白血病、小児期髄芽腫、小児期非ホジキンリンパ腫、小児期松果体及びテント上未分化神経外胚葉性腫瘍、小児期原発性肝臓癌、小児期横紋筋肉腫、小児期軟部組織肉腫、小児期視覚路及び視床下部神経膠腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌腺膵島細胞癌、子宮内膜癌、上衣腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫及び関連腫瘍、外分泌膵臓癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼球癌、女性乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸腫瘍、胚細胞腫瘍、妊娠栄養膜腫瘍、毛様細胞性白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼内黒色腫、島細胞癌、島細胞膵臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、唇及び口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ増殖性疾患、マクログロブリン血症、男性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移性潜在性原発性扁平頸部癌、転移性原発性扁平頸部癌、転移性扁平頸部癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄増殖性疾患、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、潜在性原発性転移性扁平頸部癌、口咽頭癌、骨／悪性線維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、パラプロテイン血症、真性多血症、上皮小体癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂及び尿管癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平頸部癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉性及び松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行細胞癌、移行性腎盂及び尿管癌、栄養膜腫瘍、尿管及び腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、腟癌、視覚路及び視床下部神経膠腫、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症��ウィルムス腫瘍、及び任意のその他過剰増殖性疾患（上記器官系に位置する腫瘍形成を除く）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４３】
本明細書及び本願請求項に記載の方法及び組成物を用いて、上記の疾患を含むがこれらに限定されない悪性状態または前悪性状態を治療してもよく、新生物状態または悪性状態への進行を防止してもよい。このような使用は、腫瘍形成またはがんへの上記進行が分かっているまたは疑われる状態（特に、過形成、化生からなる非新生物細胞増殖、最も特に、異形成が生じている状態）であることを意味している（このような異常増殖状態について確認する場合、Ｒｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｇｅｌｌ，Ｂａｓｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐｐ．６８−７９（１９７６）を参照のこと）。
【０１４４】
異形成は多くの場合、がんの前兆であり、主に上皮で見つかっている。異形成は非新生物細胞増殖における最も無秩序な形態であり、個々の細胞の均一性低下及び細胞の構築配向性低下を伴う。異形成は特質上、慢性的な刺激または炎症が存在する場所に生じる。治療可能な異形成疾患としては、無汗症性外胚葉性異形成、前後異形成、窒息性胸郭異形成、心房指異形成、気管支肺異形成、大脳異形成、子宮頸部異形成、軟骨外胚葉性異形成、鎖骨頭蓋異形成、先天性外胚葉性異形成、頭蓋骨幹異形成、頭蓋骨手根骨足根骨異形成、頭蓋骨幹端異形成、象牙質異形成、骨幹異形成、外胚葉性異形成、エナメル質異形成、脳眼異形成、骨端半肢異形成、多発性骨端異形成（ｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｅｐｉｐｈｙｓｉａｌｉｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）、点状骨端異形成、上皮異形成、顔面指趾生殖器異形成、家族性線維性顎異形成、家族性白色襞性異形成、線維筋性異形成、骨の線維性異形成、開花性骨異形成、遺伝性腎網膜異形成、発汗性外胚葉性異形成、無汗性外胚葉性異形成、リンパ球減少性胸腺異形成、乳房異形成、下顎顔面異形成、骨幹端異形成、モンディーニ異形成、単発性線維性異形成、粘膜上皮異形成、多発性骨端異形成（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｐｉｐｈｙｓｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、眼耳脊椎異形成、眼歯指異形成、眼脊椎異形成、歯牙異形成症、眼下顎異形成（ｏｐｔｈａｌｍｏｍａｎｄｉｂｕｌｏｍｅｌｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、根尖性セメント質異形成症、多骨性線維性骨異形成、偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成、網膜異形成、中隔視神経異形成症、脊椎骨端異形成、及び心室橈骨異形成が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４５】
治療可能な別の新生物発生前疾患としては、良性増殖異常疾患（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞症、組織肥大、腸ポリープまたは腺腫、及び食道異形成）、白斑症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎、及び日光角化症が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、本発明の方法を、がん（特に上で列挙したがん）の増殖、進行及び／または転移を阻害するために使用する。
【０１４６】
別の過剰増殖性疾患、障害及び／または症状としては、悪性腫瘍の進行及び／または転移、ならびに、関連疾患、例えば、白血病（急性白血病、例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病［骨髄芽球性白血病、前骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、及び赤白血病を含む］を含む）及び慢性白血病（例えば、慢性骨髄性［顆粒球性］白血病、及び慢性リンパ性白血病）、真性多血症、リンパ腫（例えば、ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、ならびに固形腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、希突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫などの肉腫及びがんを含むがこれらに限定されない）などの進行及び／または転移が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４７】
イムノコンジュゲートを用いて治療可能な自己免疫疾患としては、急性及び慢性の免疫血小板減少症、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、真性糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、バージャー病、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発筋炎／皮膚筋炎、多発軟骨炎、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、ヴェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、または線維性肺胞炎を挙げてもよい。
【０１４８】
キット
様々な実施形態は、患者のがんを治療するのに好適な構成要素を含有するキットに関係していてもよい。例示的なキットは、本明細書に記載の少なくとも１種の薬物コンジュゲート抗体を含有していてもよい。投与用の構成要素を含有する組成物が、経口送達などによる消化管を介した送達用に製剤化されていない場合、一部の別の経路でキット構成要素を送達可能なデバイスが含まれていてもよい。非経口送達などの用途に用いる１種のデバイスは、対象の体内に組成物を注射するのに用いる注射器である。吸入用デバイスを使用してもよい。
【０１４９】
キット構成要素は、共にパッケージ化されてもよく、または２つまたはそれ以上の容器に分けてパッケージ化されてもよい。一部の実施形態では、容器は、復元に好適な組成物の滅菌凍結乾燥製剤を含有するバイアル瓶であってもよい。キットはまた、その他の試薬の復元及び／または希釈に好適な１種または複数種の緩衝液を含有していてもよい。使用可能なその他の容器としては、ポーチ、トレー、ボックス、チューブなどが挙げられるがこれらに限定されない。キット構成要素は、パッケージ化されてもよく、また容器内において滅菌状態に維持されてもよい。含まれ得る別の構成要素は、キットを使用する個人に向けた、その使用に関する取扱説明書である。
【実施例】
【０１５０】
以下の実施例は本発明の実施形態の例示であり、クレームの範囲を限定するものではない。
【０１５１】
実施例１．抗Ｔｒｏｐ−２−ＳＮ−３８抗体薬物複合体（ＡＤＣ）であるＩＭＭＵ−１３２（サシツズマブゴビテカン）を用いたＧＩ癌の標的化治療
Ｔｒｏｐ−２とは、多くの上皮癌において非常に広く認められる腫瘍関連糖タンパク質のことである。その高発現は、より活動的な病変及び予後不良と関連付けられている。Ｔｒｏｐ−２の細胞外ドメインへの結合性を有するヒト化ｍＡｂを、ＣＰＴ−１１の活性成分であるＳＮ−３８にコンジュゲートした（ＩＭＭＵ−１３２、平均的な薬物：ｍＡｂ比率＝７．６）。ヒト腫瘍異種移植片に強力な活性が認められた後、ＧＩ癌を含む多種多様な固形腫瘍を有する患者（ｐｔｓ）で第Ｉ／ＩＩ相試験を開始した。
【０１５２】
方法：標準療法に失敗した後の転移性がんを有する患者を登録し、３週間サイクルの１日目及び８日目に投与される８．０ｍｇ／ｋｇの用量で開始した。第ＩＩ相試験用に、ＭＴＤを１２ｍｇ／ｋｇに決定し、８ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの投与濃度を選択した。
【０１５３】
結果：進行ＧＩ癌を有する６０名の患者を第Ｉ／ＩＩ相試験に登録した。ＲＥＣＩＳＴによる最良効果として、２９名のＣＲＣ患者（９名は１０ｍｇ／ｋｇで、２０名は８ｍｇ／ｋｇで治療した）のうち１名はＰＲ（部分寛解）を示し、１４名はＳＤ（安定）を示し、無増悪期間（ＴＴＰ）はＰＲ（−６５％）患者で５０＋週間、平均無増悪期間（ＴＴＰ）はＳＤ患者（５名は継続中）で２１＋週間であった。１３名のＣＲＣ患者はＫＲＡＳ変異を有し、７名はＳＤを示し、１９．１＋週間の平均ＴＴＰ（１２．０〜３４．０の範囲、３名は継続中）を示した。治療した１５名の膵臓癌患者（５名は８ｍｇ／ｋｇで、７名は１０ｍｇ／ｋｇで、３名は１２ｍｇ／ｋｇで）のうち、７名は１５．０週間の平均ＴＴＰでＳＤ（最良効果）を示した。食道癌を有する１１名の患者（９名は８ｍｇ／ｋｇで、１名は１０ｍｇ／ｋｇで、１名は１８ｍｇ／ｋｇで開始した）のうち８名がＣＴ評価を受け、１名が３０＋週間のＴＴＰでＰＲを示し、４名が１７．４＋週間、２１．９週間、２６．３週間、２９．９週間でＳＤを示した。５名の胃癌患者（２名は８ｍｇ／ｋｇ、３名は１０ｍｇ／ｋｇ）のうち、３名だけがＣＴ評価を受け、その全員がＳＤ（１名は、標的病変が１９％縮小し、２９＋週間の継続ＴＴＰ）を示した。
【０１５４】
好中球減少症が主な用量制限毒性であり、その他の一般的に報告された毒性は疲労、下痢、悪心及び嘔吐であった。しかしながら、全試験における７５名の患者の毒性プロファイルは、わずか１７．３％と２．７％がそれぞれグレード３とグレード４の好中球減少症を示し、わずか６．７％がグレード３の下痢を示した。
【０１５５】
結論：ＩＭＭＵ−１３２は、多種多様な再発転移性ＧＩ癌を有する患者において高い治療指数を示した。ＩＭＭＵ−１３２は、２１日サイクルで週に１回×２で何ヶ月間にもわたり繰り返し投与可能な、内部移行するがん選択的ｍＡｂにコンジュゲートした適度な毒性の薬物を有している。
【０１５６】
実施例２．抗Ｔｒｏｐ−２−ＳＮ−３８抗体薬物複合体の調製及び使用
米国特許番号７，２３８，７８５に記載のとおり、ヒト化ＲＳ７（ｈＲＳ７）抗Ｔｒｏｐ−２抗体を作製した（その図面セクション及び実施例セクションは参照により本明細書に組み込まれる）。米国特許７，９９９，０８３に従い、ＣＬ２Ａリンカーに結合したＳＮ−３８を調製してから、ｈＲＳ７（抗Ｔｒｏｐ−２）抗体、ｈＰＡＭ４（抗ＭＵＣ５ａｃ）抗体、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０）抗体またはｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５）抗体にコンジュゲートした（その実施例１０及び実施例１２は参照により本明細書に組み込まれる）。コンジュゲーションプロトコルにより、抗体分子１つあたり結合したＳＮ−３８分子が約６つという比率となった。
【０１５７】
皮下ヒト膵臓または結腸腫瘍異種移植片を有する免疫不全無胸腺ヌードマウス（雌）を、特異的なＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体または対照複合体のいずれかで治療するか、または、治療せずに放置した。特異的な複合体に治療効果が認められた。図１はＣａｐａｎ  １膵臓腫瘍モデルを示し、特異的な、ｈＲＳ７（抗Ｔｒｏｐ−２）抗体、ｈＰＡＭ４（抗ＭＵＣ−５ａｃ）抗体及びｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡＣＡＭ５）抗体のＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体が、対照ｈＡ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体（抗ＣＤ２０）及び未治療対照と比較して、より優れた効果を示した。ヒト膵臓癌のＢＸＰＣ３モデルと同様に、特異的なｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、対照治療と比較して、より優れた治療効果を示した（図２）。
【０１５８】
実施例３．多種多様な上皮癌に対する抗Ｔｒｏｐ−２−ＳＮ−３８  ＡＤＣの効果（インビボ）
抄録
この試験の目的は、いくつかのヒト固形腫瘍タイプに対するＳＮ−３８抗Ｔｒｏｐ−２（ｈＲＳ７）ＡＤＣの効果を評価すること、及び、マウス及びサルにおけるＳＮ−３８抗Ｔｒｏｐ−２（ｈＲＳ７）ＡＤＣの忍容性（後者においては、ヒトに類似のｈＲＳ７に対する組織交差反応性が認められた）を評価することであった。２種類のＳＮ−３８誘導体、ＣＬ２−ＳＮ−３８及びＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を、抗Ｔｒｏｐ−２ヒト化抗体、ｈＲＳ７にコンジュゲートさせた。それらイムノコンジュゲートを、安定性、結合性及び細胞傷害性について、インビトロでキャラクタライズした。Ｔｒｏｐ−２抗原を発現した５種の異なるヒト固形腫瘍異種移植モデルを用いて、効果を試験した。マウス及びカニクイザルを用いて毒性を評価した。
【０１５９】
２種類のＳＮ−３８誘導体のｈＲＳ７複合体は、薬物置換（約６）、細胞結合性（Ｋｄ、約１．２ｎｍｏｌ／Ｌ）、細胞傷害性（ＩＣ５０、約２．２ｎｍｏｌ／Ｌ）及びインビトロ血清中安定性（ｔ／１／２、約２０時間）において同等であった。細胞をＡＤＣに曝露するとＰＡＲＰ切断をもたらすシグナル伝達経路が認められたが、遊離ＳＮ−３８と比較して、ｐ５３及びｐ２１の上方制御に差異が認められた。非標的化対照ＡＤＣと比較した際、Ｃａｌｕ−３腫瘍（Ｐ≦０．０５）、Ｃａｐａｎ−１腫瘍（Ｐ＜０．０１８）、ＢｘＰＣ−３腫瘍（Ｐ＜０．００５）、及びＣＯＬＯ  ２０５腫瘍（Ｐ＜０．０３３）を有するマウスにおいて、非毒性用量のｈＲＳ７−ＳＮ−３８が有意な抗腫瘍効果をもたらした。マウスは、ＡＬＴ及びＡＳＴの肝酵素レベルを短期間上昇させただけで、２  ｘ  １２ｍｇ／ｋｇ（ＳＮ−３８当量）の用量に耐性を示した。２  ｘ  ０．９６ｍｇ／ｋｇを注入したカニクイザルは、単に一時的な血球数減少を示したが、重要なことに、その値は正常範囲未満には低下しなかった。
【０１６０】
要約すると、抗Ｔｒｏｐ−２  ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８  ＡＤＣは、ある種のヒト固形腫瘍タイプに対する有意かつ特異的な抗腫瘍効果をもたらした。ヒトと類似した組織Ｔｒｏｐ−２発現を有するサルは、臨床的に意義のある用量において、十分に耐性を示した。
【０１６１】
緒言
固形腫瘍を有する患者において奏効するイリノテカン治療は、大部分において、活性なＳＮ−３８代謝物へのＣＰＴ−１１プロドラッグの低変換率により、限定的なものであった。この変換の必要性をバイパスしてＳＮ−３８を受動的に腫瘍へと送達するための方法として、非標的化形態のＳＮ−３８が他で試験されている。本発明者らは、ＳＮ−３８を、ヒト化抗Ｔｒｏｐ−２抗体、ｈＲＳ７に共有結合でコンジュゲートさせた。この抗体薬物複合体は、ある種のｓ．ｃ．ヒトがん異種移植モデル（非小細胞肺癌、膵臓癌、結腸直腸癌及び扁平上皮細胞肺癌を含む）に特異的な抗腫瘍効果（全て非毒性用量（例えば、≦３．２ｍｇ／ｋｇの累積ＳＮ−３８当用量）で）を有している。Ｔｒｏｐ−２は多くの上皮癌において広く発現しているが、一部の正常組織においても発現しているため、カニクイザルにおける用量漸増試験を実施してこの複合体の臨床的安全性を評価した。サルは、軽微で可逆的な毒性を示すだけで、２４ｍｇ  ＳＮ−３８当量／ｋｇに耐性を示した。その腫瘍標的化プロファイル及び安全性プロファイルにより、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８は、イリノテカンに反応を示す固形腫瘍の管理において著しい改善をもたらしている。
【０１６２】
原料及び方法
細胞株、抗体及び化学療法剤−この試験に使用した全てのヒトがん細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。これらには、Ｃａｌｕ−３（非小細胞肺癌）、ＳＫ−ＭＥＳ−１（扁平上皮細胞肺癌）、ＣＯＬＯ  ２０５（結腸腺癌）、Ｃａｐａｎ−１及びＢｘＰＣ−３（膵腺癌）、ならびにＰＣ−３（前立腺癌）が含まれる。Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．において、ヒト化ＲＳ７  ＩｇＧ抗体、ならびに、対照のヒト化抗ＣＤ２０（ｈＡ２０  ＩｇＧ、ベルツズマブ）抗体及び抗ＣＤ２２（ｈＬＬ２  ＩｇＧ、エプラツズマブ）抗体を作製した。イリノテカン（２０ｍｇ／ｍＬ）は、Ｈｏｓｐｉｒａ，Ｉｎｃ．から入手した。
【０１６３】
ＳＮ−３８イムノコンジュゲート及びインビトロ態様−ＣＬ２−ＳＮ−３８の合成については上で記載している（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６−２６）。ｈＲＳ７  ＩｇＧへのそのコンジュゲート及び血清中安定性については、上記のとおり実施した（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６−２６；Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  １５：６０５２−６１）。上記実施例に記載のとおり、ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（Ｍ．Ｗ．１４８０）及びそのｈＲＳ７複合体の調製、安定性試験、結合性試験及び細胞傷害性試験を実施した。
【０１６４】
インビボ治療試験−全ての動物実験において、ＳＮ−３８イムノコンジュゲート及びイリノテカンの用量は、ＳＮ−３８当量で示される。６の平均置換比率（ＳＮ−３８／ＩｇＧ）を基準とすると、２０ｇマウスへの５００μｇ  ＡＤＣの用量（２５ｍｇ／ｋｇ）は、０．４ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８を含有している。イリノテカンの用量も同様に、ＳＮ−３８当量として示される（すなわち、４０ｍｇイリノテカン／ｋｇは、２４ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８と同等である）。
【０１６５】
ＮＣｒ雌無胸腺ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス（４〜８週齢）及び雄Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（１０週齢）をＴａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ．から購入した。ＳＮＢＬ  ＵＳＡ，Ｌｔｄ．において、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、２．５〜４ｋｇの雄及び雌）の忍容性試験を実施した。
【０１６６】
異なるヒトがん細胞株を動物に皮下移植した。キャリパーを使用した２寸法測定法により、腫瘍容積（ＴＶ）を測定した（容積はＬ  ｘ  ｗ２／２と定義され、式中、Ｌは腫瘍の最長寸法であり、ｗは腫瘍の最短寸法である）。治療開始時の腫瘍サイズは、０．１０〜０．４７ｃｍ３であった。それぞれの実験における治療レジメン、用量、及び、動物の数については、結果に記載している。凍結乾燥させたｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８及び対照ＡＤＣを、必要に応じ、滅菌生理食塩水で戻して希釈した。イリノテカンを除く全ての試薬を腹腔内投与（０．１ｍＬ）した（イリノテカンは静脈内投与した）。投与レジメンは、本発明者らの先行研究（様々な期間長にわたり、３日おきまたは週に２回、ＡＤＣを投与）（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６−２６；Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  １５：６０５２−６１）の影響を受けた。この投与頻度は複合体のインビトロ血清中半減期への配慮を反映しており、ＡＤＣへのより持続的な曝露を可能とした。
【０１６７】
統計−増殖曲線を、初期ＴＶからの経時的なパーセント変化として示す。腫瘍増殖の統計解析は、曲線下面積（ＡＵＣ）を基準とした。線形曲線モデリングにより、個々の腫瘍増殖プロファイルを得た。増殖曲線の統計解析前に群間の等分散性を検定するために、Ｆ検定を採用した。生理食塩水対照を除く様々な治療群及び対照群間の統計的有意性を評価するために両側ｔ検定を使用した一方で、片側ｔ検定を使用した（有意性、Ｐ≦０．０５）。増悪により群内の最初の動物を安楽死させる時点となるまで、ＡＵＣの統計比較を実施した。
【０１６８】
薬物動態及び体内分布−１１１Ｉｎ放射能標識したｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８及びｈＲＳ７  ＩｇＧを、ｓ．ｃ．ＳＫ−ＭＥＳ−１腫瘍（約０．３ｃｍ３）を有するヌードマウスに注入した。１つの群に２０μＣｉ（２５０μｇのタンパク質）の１１１Ｉｎ  ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を静注し、その一方で、別の群に２０μＣｉ（２５０μｇのタンパク質）の１１１Ｉｎ  ｈＲＳ７  ＩｇＧを投与した。様々な時点において、マウス（時点毎に５匹）に麻酔を行い、心臓内穿刺で採血してから、安楽死させた。腫瘍及び様々な組織を取り出してから、重さを量り、γシンチレーションでカウントして、組織１グラムあたりのパーセント注入量（％ＩＤ／ｇ）を求めた。第３の群に２５０μｇの非標識ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を注入した３日後に、１１１Ｉｎ  ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を投与し、同様に剖検した。両側ｔ検定を使用して、Ｆ検定を用いた等分散性の検定後におけるｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８とｈＲＳ７  ＩｇＧの取り込みを比較した。ＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェア（Ｐａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．）を使用して、血液クリアランスに関する薬物動態解析を実施した。
【０１６９】
Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス及びカニクイザルにおける忍容性−簡潔に説明すると、結果に記載するとおりに、マウスを４群に分類して、０日目及び３日目に、それぞれの群に、酢酸ナトリウム緩衝液対照または３つの異なる用量（４、８または１２ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８）のｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８のいずれかで２ｍＬのｉ．ｐ．注入を行ってから、血液及び血清を採取した。カニクイザル（雄３匹及び雌３匹、２．５〜４．０ｋｇ）に、２つの異なる用量のｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を投与した。用量、回数、及び、発生し得る血液毒性を評価するために採血したサルの数、ならびに、血清化学検査については、結果に記載している。
【０１７０】
結果
ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の安定性及び力価−２種類の異なる結合部を用いて、ＳＮ−３８をｈＲＳ７  ＩｇＧにコンジュゲートさせた（図３Ａ）。第１の結合部はＣＬ２−ＳＮ−３８と呼ばれ、上に記載している（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ５１：６９１６−２６；Ｇｏｖｉｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  １５：６０５２−６１）。リンカー内部のフェニルアラニン部分を除去するＣＬ２合成の変化を利用して、ＣＬ２Ａリンカーを調製した。この変化により合成が簡略化されるが、コンジュゲート結果には影響を与えなかった（例えば、ＣＬ２−ＳＮ−３８とＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の両方には、ＩｇＧ分子毎に約６つのＳＮ−３８が導入された）。並列比較において、血清中安定性、抗原結合性またはインビトロ細胞傷害性に有意差は認められなかった。ＣＬ２内のフェニルアラニン残基が、リソソームプロテアーゼ用のカテプシンＢの設計開裂部位の一部であるため、この結果は驚くべきものであった。
【０１７１】
ＳＮ−３８リンカーがＣＬ２からＣＬ２Ａへと変化したことの影響を調査するために、ＣＯＬＯ  ２０５腫瘍（図３Ｂ）またはＣａｐａｎ−１腫瘍（図３Ｃ）を有するマウス（両方の試験開始時の腫瘍サイズは０．２５ｃｍ３）において、０．４ｍｇ／ｋｇまたは０．２ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８をそれぞれ週に２回  ｘ  ４週間使用して、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８とｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８を比較した。ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８複合体とｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８複合体の両方は、未治療（ＡＵＣ１４日間  ＣＯＬＯ  ２０５モデルにおいて生理食塩水と比較してＰ＜０．００２；ＡＵＣ２１日間  Ｃａｐａｎ−１モデルにおいて生理食塩水と比較してＰ＜０．００１）、及び非標的化抗ＣＤ２０対照ＡＤＣ、ｈＡ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（ＡＵＣ１４日間  ＣＯＬＯ−２０５モデルにおいてＰ＜０．００３；ＡＵＣ３５日間  Ｃａｐａｎ−１モデルにおいてＰ＜０．００２）と比較して、腫瘍増殖を有意に阻害した。Ｃａｐａｎ−１モデルの試験最終日（１４０日目）において、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８で治療したマウスの５０％及びｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８マウスの４０％が腫瘍フリーとなった一方で、ｈＡ２０−ＡＤＣで治療した動物のわずか２０％が疾患の可視徴候を有さなかった。図３に示すとおり、ＣＬ２ＡリンカーはＣＬ２と比較して幾分より高い効果をもたらした。
【０１７２】
作用機序−インビトロ細胞傷害性試験は、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８がいくつかの異なる固形腫瘍株に対するｎｍｏｌ／Ｌ範囲のＩＣ５０値を有することを示した（表２）。遊離ＳＮ−３８のＩＣ５０は、全ての細胞株において複合体よりも低かった。Ｔｒｏｐ−２発現とｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８への感受性の間に明らかな相関はなかったが、ＡＤＣ対遊離ＳＮ−３８のＩＣ５０比はＴｒｏｐ−２高発現細胞においてより低く、より多くの抗原が存在する場合に薬物を内部移行させる機能が高いということを最も反映していると考えられた。
【０１７３】
ＳＮ−３８が細胞内におけるいくつかのシグナル伝達経路を活性化させてアポトーシスを誘導することが知られている（例えば、Ｃｕｓａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１：３５３５−４０；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２００９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  ２７４：４７−５３；Ｌａｇａｄｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９８：３３５−４４）。本発明者らの初期の研究では、インビトロでの初期情報伝達現象（ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１及びｐ５３）及び１つの後期アポトーシス現象［ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断］に関与する２種類のタンパク質の発現について試験を行った（データは省略）。ＢｘＰＣ−３において、ＳＮ−３８がｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１発現を２０倍増加させる（データは省略）一方で、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８ではわずか１０倍の増加（データは省略）となっており、この発見は、この細胞株における遊離ＳＮ−３８の高い活性と一致する（表２）。しかしながら、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は、Ｃａｌｕ−３において、遊離ＳＮ−３８と比較して２倍超、ｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１発現を増加させた（データは省略）。
【０１７４】
ｐ５３発現において、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８媒介性シグナル伝達現象と遊離ＳＮ−３８媒介性シグナル伝達現象の間に大きな相違が認められた（データは省略）。ＢｘＰＣ−３とＣａｌｕ−３の両方において、遊離ＳＮ−３８によるｐ５３の上方制御が４８時間時点まで明らかとはならなかった一方で、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は２４時間以内にｐ５３を上方制御させた（データは省略）。加えて、ＡＤＣに曝露された細胞内のｐ５３発現は、両方の細胞株において、ＳＮ−３８の場合と比較してより増加していた（データは省略）。興味深いことに、ｈＲＳ７  ＩｇＧはｐ２１Ｗａｆ１／Ｃｉｐ１発現に対して顕著な影響力を有していなかったにもかかわらず、ｈＲＳ７  ＩｇＧは、ＢｘＰＣ−３とＣａｌｕ−３の両方においてｐ５３の上方制御を誘導した（４８時間の曝露後に限られてはいるが）（データは省略）。後期アポトーシス現象に関して言及すると、ＳＮ−３８または複合体のいずれかでインキュベートした場合、ＰＡＲＰの切断は両方の細胞株において明らかであった（データは省略）。切断ＰＡＲＰの存在は、ＢｘＰＣ−３の２４時間時点においてより多く（データは省略）、そのことは、ｐ２１の高発現及びその低いＩＣ５０と一致していた。ＡＤＣと比較した場合の遊離ＳＮ−３８によるより高い開裂度合いは、細胞傷害性所見と一致していた。
【０１７５】
ｈＲＳ７−ＳＮ−３８の効果−いくつかのヒトがんにおいてＴｒｏｐ−２が広く発現していることから、いくつかの異なるヒトがんモデルにおける試験（ｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８結合部を使用して開始したが、後ほどＣＬ２Ａ結合部を有する複合体を使用した）を実施した。ｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８を、３日おきに４回、０．０４ｍｇ  ＳＮ−３８／ｋｇで投与したＣａｌｕ−３を有するヌードマウスには、当量の非標的化ｈＬＬ２−ＣＬ２−ＳＮ−３８を投与された動物と比較して、有意に優れた効果があった（それぞれ、ＴＶ  ＝  ０．１４  ±  ０．２２ｃｍ３対０．８０  ±  ０．９１ｃｍ３；ＡＵＣ４２日間  Ｐ＜０．０２６、図４Ａ）。０．４ｍｇ／ｋｇ  ＳＮ−３８にまで用量を増加させた際に、用量反応が認められた（図４Ａ）。この高い投与濃度で特異的なｈＲＳ７複合体を投与した全てのマウスは、２８日以内に「治癒」されて、１４７日目の試験終了日まで腫瘍フリーを維持した一方で、関連性のないＡＤＣで治療した動物の腫瘍は再増殖した（特異的対関連性なしのＡＵＣ９８日間：Ｐ＝０．０５）。ｈＲＳ７  ＩｇＧとＳＮ−３８の混合物を投与されたマウスでは、腫瘍は、５６日目までに＞４．５倍進行した（ＴＶ  ＝  １．１０  ±  ０．８８ｃｍ３；ＡＵＣ５６日間  ｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８と比較してＰ＜０．００６）（図４Ａ）。
【０１７６】
ヒト結腸（ＣＯＬＯ  ２０５）腫瘍異種移植片及び膵臓（Ｃａｐａｎ−１）腫瘍異種移植片に対する効果についても試験した。ＣＯＬＯ  ２０５腫瘍を有する動物では、ｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８（０．４ｍｇ／ｋｇ、ｑ４ｄｘ８）は、対照抗ＣＤ２０  ＡＤＣ（ｈＡ２０−ＣＬ２−ＳＮ−３８）またはｈＲＳ７  ＩｇＧと比較して有意に小さな腫瘍容積（それぞれ、ＴＶ  ＝  ０．１６  ±  ０．０９ｃｍ３、１．１９  ±  ０．５９ｃｍ３、及び１．７７  ±  ０．９３ｃｍ３；ＡＵＣ２８日間  Ｐ＜０．０１６）で、２８日間の治療期間にわたり腫瘍の増殖を妨げた（図４Ｂ）。
【０１７７】
【表２】
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【０１７８】
マウス血清が、ヒト血清と比較して、より効率的にイリノテカンをＳＮ−３８に変換できるため（Ｍｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：４２０６−１０）、イリノテカンのＭＴＤ（２４ｍｇ  ＳＮ−３８／ｋｇ、ｑ２ｄｘ５）はＣＯＬＯ  ２０５細胞において、ｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８と同程度有効であったが、イリノテカン中のＳＮ−３８用量（２，４００μｇ累積）は、複合体（６４μｇ総量）の３７．５倍超であった。
【０１７９】
Ｃａｐａｎ−１を有する動物（図４Ｃ）は、ｈＲＳ７−ＣＬ２−ＳＮ−３８複合体に相当する用量のＳＮ−３８を投与した際、イリノテカン単剤に対する有意な効果を示さなかった（例えば、３５日目時点の平均腫瘍サイズは、０．４ｍｇ  ＳＮ−３８／ｋｇのｈＲＳ７−ＳＮ−３８を投与された動物で０．０４  ±  ０．０５ｃｍ３対０．４ｍｇ／ｋｇ  ＳＮ−３８を投与されてイリノテカン治療を受けた動物で１．７８  ±  ０．６２ｃｍ３；ＡＵＣ３５日間  Ｐ＜０．００１；図４Ｃ）。イリノテカン用量を１０倍の４ｍｇ／ｋｇ  ＳＮ−３８に増加させた際、効果は改善されたが、依然として、０．４ｍｇ／ｋｇ  ＳＮ−３８投与濃度の複合体と同程度には有意とならなかった（ＴＶ  ＝  ０．１７  ±  ０．１８ｃｍ３対１．６９  ±  ０．４７ｃｍ３、ＡＵＣ４９日間  Ｐ＜０．００１）（図４Ｃ）。当用量の非標的化ｈＡ２０−ＣＬ２−ＳＮ−３８もまた、イリノテカン治療動物と比較して有意な抗腫瘍効果をもたらしたが、特異的なｈＲＳ７複合体は、関連性のないＡＤＣと比較して有意に優れていた（ＴＶ  ＝  ０．１７  ±  ０．１８ｃｍ３対０．８０  ±  ０．６８ｃｍ３、ＡＵＣ４９日間  Ｐ＜０．０１８）（図４Ｃ）。
【０１８０】
その後、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８  ＡＤＣを用いた試験を、２つの別のモデルのヒト上皮癌へと適用した。ＢｘＰＣ−３ヒト膵臓腫瘍を有するマウス（図４Ｄ）では、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は更に、生理食塩水もしくは当量の非標的化ｈＡ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８（それぞれ、ＴＶ  ＝  ０．２４  ±  ０．１１ｃｍ３対１．１７  ±  ０．４５ｃｍ３、及び１．０５  ±  ０．７３ｃｍ３；ＡＵＣ２１日間  Ｐ＜０．００１）、または、１０倍多いＳＮ−３８当用量でイリノテカン（それぞれ、ＴＶ  ＝  ０．２７  ±  ０．１８ｃｍ３対０．９０  ±  ０．６２ｃｍ３；ＡＵＣ２５日間  Ｐ＜０．００４）を用いて治療した対照マウスと比較して、腫瘍増殖を有意に阻害した（図４Ｄ）。興味深いことに、０．４ｍｇ／ｋｇのＡＤＣで治療したＳＫ−ＭＥＳ−１ヒト扁平細胞肺腫瘍を有するマウス（図４Ｅ）では、腫瘍増殖抑制は、生理食塩水または非コンジュゲートｈＲＳ７  ＩｇＧよりも優れていたが（それぞれ、ＴＶ  ＝  ０．３６  ±  ０．２５ｃｍ３対１．０２  ±  ０．７０ｃｍ３、及び１．３０  ±  １．０８ｃｍ３；ＡＵＣ２８日間  Ｐ＜０．０４３）、非標的化ｈＡ２０−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８、またはイリノテカンのＭＴＤは、特異的なｈＲＳ７−ＳＮ−３８複合体（図５Ｅ）と同等の抗腫瘍効果をもたらした。
【０１８１】
全てのマウス試験において、体重減少を基準とすると、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣに対して十分に耐性を示した（データは省略）。
【０１８２】
ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の体内分布−対応する１１１Ｉｎ標識基質を使用して、ＳＫ−ＭＥＳ−１ヒト扁平上皮細胞肺癌異種移植片を有するマウス（データは省略）におけるｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８または非コンジュゲートｈＲＳ７  ＩｇＧの体内分布を比較した。薬物動態解析を実施して、非コンジュゲートｈＲＳ７と比較した、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８のクリアランスを測定した（データは省略）。ＡＤＣは、当量の非コンジュゲートｈＲＳ７よりも約４０％短い半減期及び平均滞留時間を示して、より早く消失した。それにもかかわらず、このことが腫瘍への取り込み率に与える影響は最小限であった（データは省略）。２４時間時点及び４８時間時点においては有意差があったが、７２時間（取り込みのピーク）付近では、腫瘍内における両方の薬剤量はほぼ同等であった。正常組織の中では、肝臓と脾臓の差異が最も顕著であった（データは省略）。注入後２４時間時点において、肝臓内には、ｈＲＳ７  ＩｇＧと比較して＞２倍超のｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８が存在していた（データは省略）。逆に、脾臓内には、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と比較して３倍超の親ｈＲＳ７  ＩｇＧ（取り込みピークの４８時間時点に存在）が存在していた（データは省略）。その他の組織内における取り込み及びクリアランスは一般的に、血中濃度の差異を反映していた（データは省略）。
【０１８３】
治療では週に２回の投薬を行うため、最初に０．２ｍｇ／ｋｇ（２５０μｇのタンパク質）のｈＲＳ７  ＡＤＣの予備投薬を受けた３日後に１１１Ｉｎ標識抗体を注入された動物群における腫瘍への取り込み率について試験した。予備投薬マウスにおける１１１Ｉｎ  ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の腫瘍への取り込み率は、予備投薬を受けなかった動物と比較して、全ての時点において実質的に低下した（例えば、７２時間時点において、予備投薬を受けた腫瘍への取り込み率は１２．５％  ±  ３．８％  ＩＤ／ｇ、それに対し、予備投薬を受けなかった動物では２５．４％  ±８．１％  ＩＤ／ｇ；Ｐ＝０．０１２３；データは省略）。予備投薬は、血液クリアランスまたは組織への取り込み率に対して顕著な影響を与えなかった（データは省略）。これらの試験は、一部の腫瘍モデルにおいて、予備投薬（複数可）を行うことにより、特異的抗体の腫瘍への付着を抑制可能であることを示唆しており、このことが、治療効果の特異性がＡＤＣ用量の増加に伴って低下し得る理由、及び更なる用量漸増を必要としない理由の説明になると考えられる。
【０１８４】
Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス及びカニクイザルにおけるｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８の忍容性−Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスは、最小限で一時的な体重減少を伴い、３日間にわたる２回の投薬（それぞれ４、８及び１２ｍｇ  ＳＮ−３８／ｋｇのｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８）に耐性を示した（データは省略）。造血毒性は生じず、血清化学検査は、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ、図５Ａ）及びアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ、図５Ｂ）の上昇を明らかとしただけであった。治療後７日時点において、全３治療群（図５Ａ）におけるＡＳＴが通常濃度（＞２９８Ｕ／Ｌ）超に上昇した（最大比率のマウスは２  ｘ  ８ｍｇ／ｋｇ群に含まれていた）。しかしながら、治療後１５日目までには、ほとんどの動物が正常範囲内に収まった。治療後７日以内におけるＡＬＴ濃度もまた正常範囲（＞７７Ｕ／Ｌ）超であり（図５Ｂ）、１５日目までには正常値となることが明らかとなった。全てのこれらのマウスの肝臓は、組織損傷の組織学的エビデンスを示さなかった（データは省略）。腎機能に関して言及すると、治療群におけるグルコース濃度及び塩素濃度だけがやや上昇していた。２  ｘ  ８ｍｇ／ｋｇで、７匹のマウスのうち５匹のグルコース濃度がわずかに上昇し（２７３〜３２０ｍｇ／ｄＬの範囲、正常値の上限は２６３ｍｇ／ｄＬ）、注入後１５日目までに正常値に戻った。同様に、２つの最高用量群（２  ｘ  ８ｍｇ／ｋｇ群のうち５７％のマウス、及び２  ｘ  １２ｍｇ／ｋｇ群のうち１００％のマウス）の塩素濃度もわずかに上昇し（１１６〜１２７ｍｍｏｌ／Ｌの範囲、正常値の上限は１１５ｍｍｏｌ／Ｌ）、注入後１５日目まで上昇を維持していた。ほとんどの塩素が消化管による吸収で得られていることから、塩素濃度上昇はまた胃腸毒性の徴候である場合があったが、終了時において、検査した任意の器官系における組織損傷の組織学的エビデンスは認められなかった（データは省略）。
【０１８５】
マウスがｈＲＳ７認識Ｔｒｏｐ−２を発現していないことから、臨床使用におけるｈＲＳ７複合体のポテンシャルを明らかにするためのより適切なモデルが必要となった。免疫組織学検査により、ヒトとカニクイザルの両方の複数の組織（乳房、眼、胃腸管、腎臓、肺、卵巣、卵管、膵臓、副甲状腺、前立腺、唾液腺、皮膚、胸腺、甲状腺、扁桃、尿管、膀胱及び子宮）における結合性が明らかとなった（データは省略）。この交差反応性を基準として、サルにおける忍容性試験を実施した。
【０１８６】
２  ｘ  ０．９６ｍｇ  ＳＮ−３８／ｋｇのｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８を投与された群は、注入後から試験終了時にかけて重大な臨床イベントを有していなかった。体重減少は７．３％を超えず、１５日目までに馴化体重に戻った。ほとんどの血球数データ（図５Ｃと図５Ｄに示す好中球と血小板のデータ）に一時的な低下が認められたが、その数値は正常範囲を下回らなかった。血清化学検査において異常値は認められなかった。１１日目（最後の注入後８日目）に剖検した動物の組織病理学では、造血器官（胸腺、下顎リンパ節及び腸間膜リンパ節、脾臓、ならびに骨髄）、胃腸器官（胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸及び直腸）、女性生殖器官（卵巣、子宮及び膣）、及び注入部位において微細変化が認められた。これらの変化は微小から中程度までの範囲であり、胸腺及び胃腸管を除く全組織において、回復期の最終日（３２日目）までに完全に回復した。胸腺及び胃腸管における変化が完全回復に向かったのは、この時点以降であった（データは省略）。
【０１８７】
２  ｘ  １．９２ｍｇ  ＳＮ−３８／ｋｇ投与濃度の複合体では、胃腸合併症及び骨髄抑制に起因して１匹が死亡し、この群のその他の動物には、類似してはいるが、２  ｘ  ０．９６ｍｇ／ｋｇ群よりも重篤な有害事象が認められた（データは省略）。これらのデータは、複合体の用量制限毒性（すなわち、腸管毒性及び血液毒性）がイリノテカンの用量制限毒性と同一であることを示している。それゆえ、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８のＭＴＤは、２  ｘ  ０．９６〜１．９２ｍｇ  ＳＮ−３８／ｋｇであり、これは、ヒト当用量の２  ｘ  ０．３〜０．６ｍｇ／ｋｇ  ＳＮ−３８に相当する。
【０１８８】
考察
Ｔｒｏｐ−２とは、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌及び卵巣癌を含むほとんどの上皮性腫瘍上で発現するタンパク質のことであり、それゆえ、細胞傷害薬を送達するための潜在的に重要な標的とされている（Ｏｈｍａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２：３０５７−６３；Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９９：１２９０−９５；Ｃｕｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７９６：３０９−１４）。ＲＳ７抗体はＴｒｏｐ−２に結合すると内部移行する（Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５：５８５７ｓ−６３ｓ）ため、細胞傷害性物質の直接細胞内送達が可能となる。
【０１８９】
ＳＮ−３８は、いくつかの細胞株においてナノモル範囲のＩＣ５０値を示す強力なトポイソメラーゼＩ阻害剤である。ＳＮ−３８は、プロドラッグであるイリノテカンの活性化形態であり、イリノテカンは結腸直腸癌の治療に用いられ、また肺癌、乳癌及び脳癌に活性を示す。本発明者らは、ＡＤＣ形態の直接標的化ＳＮ−３８が、活性化ＳＮ−３８へのＣＰＴ−１１の生物学的変換率の低さ及び患者によるばらつきを克服することにより、ＣＰＴ−１１と比較して有意に優れた治療効果を有し得ると推理した（Ｍａｔｈｉｊｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７：２１８２−９４）。
【０１９０】
元のＣＬ２誘導体に挿入されたＰｈｅ−Ｌｙｓペプチドにより、カテプシンＢにより起こり得る開裂が可能となった。合成プロセスを簡略化するために、ＣＬ２Ａ中のフェニルアラニンを除去することによりカテプシンＢ開裂部位を除去した。興味深いことに、この生成物は、ＣＬ２により得られたブロードなプロファイルと比較して、より明確なクロマトグラフィープロファイルを有していた（データは省略）。しかしより重要なことに、この変化は複合体の結合性または安定性に影響を与えず、並列試験において幾分より高い効果を示した。これらのデータは、主として、カテプシンＢ開裂部位ではなくＳＮ−３８のラクトン環へのｐＨ感受性ベンジルカーボネート結合部における開裂により、ＣＬ２中のＳＮ−３８が複合体から放出されたことを示唆している。
【０１９１】
ある種の固形腫瘍細胞株に対するｈＲＳ７  ＡＤＣのインビトロ細胞傷害性は一貫して、ｎｍｏｌ／Ｌ範囲のＩＣ５０値を示していた。しかしながら、遊離ＳＮ−３８に曝露された細胞は、ＡＤＣと比較して低いＩＣ５０値を示した。遊離ＳＮ−３８とコンジュゲートＳＮ−３８の間のこの相違はまた、ＥＮＺ−２２０８（Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：１８８８−９６，Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １９：８４９−５９）及びＮＫ０１２（Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：１００４８−５６）について報告されている。ＥＮＺ−２２０８では、ＰＥＧあたり約３．５〜４分子のＳＮ−３８を結合させるための分枝鎖ＰＥＧを利用しており、一方、ＮＫ０１２は、２０重量％のＳＮ−３８を含有するミセルナノ粒子である。本発明者らのＡＤＣを用いると、腫瘍細胞内におけるＴｒｏｐ−２発現レベルが上昇するにつれて、この相違（すなわち、遊離ＳＮ−３８対コンジュゲートＳＮ−３８の力価比）が減少する。このことは、薬物の標的化送達における利点であることを示唆している。インビトロ血清中安定性に関して言及すると、ＣＬ２−ＳＮ−３８形態のｈＲＳ７−ＳＮ−３８とＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８形態のｈＲＳ７−ＳＮ−３８の両方は、約２０時間のｔ／１／２をもたらした。このことは、ＥＮＺ−２２０８について報告された１２．３分間の短いｔ／１／２（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １９：８４９−５９）とは対照的ではあるが、２４時間後における生理学的条件下でのＮＫ０１２からのＳＮ−３８の５７％放出（Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：１００４８−５６）とは類似している。
【０１９２】
ｈＲＳ７−ＳＮ−３８（ＣＬ２−ＳＮ−３８またはＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８のいずれか）を用いて腫瘍を有するマウスを治療することにより、５つの異なる腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖が有意に阻害された。それら腫瘍モデルのうちの４つにおいては腫瘍退縮が認められ、Ｃａｌｕ−３について言えば、最高用量のｈＲＳ７−ＳＮ−３８を投与された全てのマウスは、試験の判定時において腫瘍フリーとなった。ヒトの場合とは異なり、マウスにおけるイリノテカンは、血漿エステラーゼによって極めて効率的にＳＮ−３８へと変換された（５０％超の変換率、ヒトよりもマウスにおいてより効果的に生成）（Ｍｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：４２０６−１０；Ｆｕｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １７：１８１５−２４）。イリノテカンを１０倍超のＳＮ−３８濃度または１０倍当量のＳＮ−３８濃度で投与する場合、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８は腫瘍増殖を制御する上で有意に優れていた。イリノテカンをそのＭＴＤの２４ｍｇ／ｋｇ  ｑ２ｄｘ５（３７．５倍超のＳＮ−３８）で投与する場合のみ、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８の効果と同等となった。患者において、イリノテカンの生物学的変換が実質的に低いことから、本発明者らは、この利点がｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８に更により有利であると期待した。
【０１９３】
本発明者らはまた、一部の抗原発現細胞株、例えば、ＳＫ−ＭＥＳ−１に対して抗原結合ＡＤＣを使用することは、非結合性で関連性のない複合体と比較して、より優れた治療効果を保証しないことを示した。これは異例または予想外な発見ではない。事実、イリノテカンと比較した場合、上で述べた非結合性ＳＮ−３８複合体は治療効果を高めるため、関連性のないＩｇＧ−ＳＮ−３８複合体は、一定の活性を有すると予想される。このことは、腫瘍が未熟で漏れやすい血管（正常組織と比較して巨大分子をより通す）を有するという事実に関係している（Ｊａｉｎ，１９９４，Ｓｃｉ  Ａｍ  ２７１：５８−６１）。本発明者らの複合体を用いると、ｐＨがリソソーム濃度を模倣するレベル（例えば、３７℃でｐＨ５．３；データは省略）にまで低下する場合、ＳＮ−３８の５０％が約１３時間以内に放出される。その一方、血清の中性ｐＨでは、放出速度はほぼ２倍低下する。関連性のない複合体が酸性の腫瘍微小環境に入る場合、一部のＳＮ−３８を局所的に放出することが予想される。その他の因子、例えば、腫瘍の生理機能、及び薬剤に対する腫瘍の固有感受性はまた、この「ベースライン」活性を決定する役割を果たしている。しかしながら、長い滞留時間を有する特異的な複合体は、特異的抗体を捕捉するための抗原が十分存在する限り、このベースライン応答にわたり高力価を有するはずである。ＳＫ−ＭＥＳ−１モデルにおける体内分布試験はまた、連続的な投薬の結果として腫瘍抗原が飽和状態となった場合、特異的複合体の腫瘍への取り込み率が低下することを示した。それにより、関連性のない複合体にみられる治療結果と同様の治療結果がもたらされる。
【０１９４】
本発明者らのＡＤＣと公開報告のその他ＳＮ−３８送達物質を直接比較することは困難ではあるが、ある程度全般的な観測は行うことができる。本発明者らの治療研究における個々の最高用量は０．４ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８であった。Ｃａｌｕ−３モデルでは、２０ｇのマウスに、１．６ｍｇ／ｋｇ  ＳＮ−３８または３２μｇ  ＳＮ−３８の総累積用量を、わずか４回の注入で投与した。ＥＮＺ−２２０８による複数の試験を、１０ｍｇ／ｋｇ  ｘ  ５のそのＭＴＤを使用して行った（Ｓａｐｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：１８８８−９６；Ｐａｓｔｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６：４８０９−２１）。またＮＫ０１２による前臨床試験は、３０ｍｇ／ｋｇ  ｘ  ３のそのＭＴＤを含んでいた（Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：１００４８−５６）。その結果、ＥＮＺ−２２０８及びＮＫ０１２のそれぞれの報告用量と比較して３０倍及び５５倍少ないＳＮ−３８当量のｈＲＳ７−ＳＮ−３８を使用して、有意な抗腫瘍効果が得られた。１０倍少ないｈＲＳ７  ＡＤＣ（０．０４ｍｇ／ｋｇ）であっても有意な抗腫瘍効果が観察された一方、低用量のＥＮＺ−２２０８では示されなかった。またＮＫ０１２の用量を４倍少ない７．５ｍｇ／ｋｇにまで減少させると効果は失われた（Ｋｏｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６：１００４８−５６）。標準的なマウスは、１週間にわたる２４ｍｇ／ｋｇ  ＳＮ−３８（１，５００ｍｇ／ｋｇの複合体）の累積用量では急性毒性を示しておらず、そのことは、ＭＴＤがより高いことを意味していた。その結果、腫瘍を有する動物は、７．５〜１５倍少ない量のＳＮ−３８当量で効果的に治療された。
【０１９５】
体内分布試験により、ｈＲＳ７−ＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８は親ｈＲＳ７  ＩｇＧとほぼ同等の腫瘍への取り込み率を有しているが、２倍高い肝臓への取り込み率で実質的により早く消失する（ＳＮ−３８の疎水性に起因し得る）ことが明らかとなった。ＡＤＣが肝臓を通過して消失することから、肝毒性及び胃腸毒性は用量制限であると予想された。マウスは肝臓トランスアミナーゼ上昇のエビデンスを有していたが、胃腸毒性はせいぜい軽度であり、体重減少は単に一時的なものであり、また組織病理学的検査で異常は認められなかった。興味深いことに、血液毒性は認められなかった。しかしながら、サルは、イリノテカンで予想されたものと同一の毒性プロファイルを示した（胃腸毒性及び血液毒性は用量制限）。
【０１９６】
ｈＲＳ７が認識するＴｒｏｐ−２はマウスにおいて発現していないため、ヒトとほぼ同等のＴｒｏｐ−２組織発現を有するサルで毒性試験を実施することが重要であった。サルは、軽度な毒性及び可逆的な毒性を有しつつ０．９６ｍｇ／ｋｇ／用量（約１２ｍｇ／ｍ２）に耐性を示したが、その用量は、ヒト用量の約０．３ｍｇ／ｋｇ／用量（約１１ｍｇ／ｍ２）と推定される。ＮＫ０１２の第Ｉ相臨床試験において、固形腫瘍を有する患者は、グレード４の好中球減少症を発症しつつ、用量制限毒性（ＤＬＴ；Ｈａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １６：５０５８−６６）となる２週間おきの２８ｍｇ／ｍ２のＳＮ−３８に耐性を示した。同様に、ＥＮＺ−２２０８を用いた第Ｉ相臨床試験では、用量制限の発熱性好中球減少症が明らかとなった（患者がＧ−ＣＳＦの投与を受ける場合、１０ｍｇ／ｍ２を２週間おき、または１６ｍｇ／ｍ２の投与を推奨）（Ｋｕｒｚｒｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＡＣＲ−ＮＣＩ−ＥＯＲＴＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；２００９  Ｎｏｖ  １５−１９；Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；Ｐｏｓｔｅｒ  Ｎｏ  Ｃ２１６；Ｐａｔｎａｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＡＣＲ−ＮＣＩ−ＥＯＲＴＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；２００９  Ｎｏｖ  １５−１９；Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；Ｐｏｓｔｅｒ  Ｎｏ  Ｃ２２１）。サルが累積ヒト当用量の２２ｍｇ／ｍ２に耐性を示したため、ｈＲＳ７が多数の正常組織に結合するものの、ｈＲＳ７  ＡＤＣ単剤治療のＭＴＤは、その他の非標的化ＳＮ−３８薬剤のＭＴＤとほぼ同等であり得ると思われる。実際、抗Ｔｒｏｐ−２抗体の毒性プロファイルがイリノテカンの毒性プロファイルとほぼ同等であったため、抗Ｔｒｏｐ−２抗体の特異性はＤＬＴの決定に役割を果たさないと思われた。より重要なことだが、ヒト当用量のちょうど０．０３ｍｇ  ＳＮ−３８当量／ｋｇ／用量に効果を示したマウスと同様の抗腫瘍活性がヒトにおいて達成可能であるならば、有意な抗腫瘍効果が臨床的に認識され得るだろう。
【０１９７】
結論として、マウスのインビボヒトがん異種移植モデルと組み合わせたサルの毒性試験は、Ｔｒｏｐ−２を標的とするこのＡＤＣが異なる上皮由来のいくつかの腫瘍に対する有効な治療薬であることを示している。
【０１９８】
実施例４．ｈＲＳ７とパクリタキセルを含む抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣ
パクリタキセル（タキソール（登録商標））をｈＲＳ７抗ヒトＴｒｏｐ−２抗体にコンジュゲートすることにより、新規抗体薬物複合体（ＡＤＣ）（ｈＲＳ７−パクリタキセル）を作製した。最終生成物は２．２の平均置換比率（薬物／抗体）を有していた。２種類の異なるＴｒｏｐ−２陽性細胞株（ＢｘＰＣ−３（ヒト膵腺癌）及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ヒトトリプルネガティブ乳癌））を標的として用いて、このＡＤＣをインビトロで試験した。ＡＤＣを加える１日前に、組織培養液から細胞を回収して、ウェルあたり２０００細胞で９６ウェルプレートに播種した。翌日、細胞を、遊離パクリタキセル（６．１  ×  １０−１１〜４  ×  １０−６Ｍ）または薬物当量のｈＲＳ７−パクリタキセルに曝露した。比較のために、３．８４  ×  １０−１２〜２．５  ×  １０−７Ｍの範囲でｈＲＳ７−ＳＮ−３８及び遊離ＳＮ−３８も試験した。プレートを３７℃で９６時間インキュベートした。このインキュベート期間後、ＭＴＳ基質を全プレートに加え、未処理対照ウェルが約１．０のＯＤ４９２ｎｍ測定値を示すまで、３０分間隔で色の発現を読んだ。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ及びＰｒｉｓｍソフトウェア（非線形回帰を用いて、ＩＣ５０値を算出するシグモイド用量反応曲線を作成）を使用し、増殖抑制を、未処理細胞と比較した増殖パーセントとして測定した。
【０１９９】
ｈＲＳ７−パクリタキセルＡＤＣはＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳房細胞株において、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８と比較して約４．５倍高いＩＣ５０値で細胞傷害活性を示した（図６）。遊離パクリタキセルは遊離ＳＮ−３８と比較してはるかに強力であった（図６）。遊離ＳＮ−３８のＩＣ５０が１．５４×１０−９Ｍであった一方、遊離パクリタキセルのＩＣ５０は６．１×１０−１１Ｍ未満であった。ＢｘＰＣ−３膵臓細胞株（図７）で同様の結果が得られ、ｈＲＳ７−パクリタキセルＡＤＣは、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣと比較して約２．８倍高いＩＣ５０値を示した。これらの結果は、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣと同様、ナノモル範囲のＩＣ５０値で、抗Ｔｒｏｐ−２コンジュゲートパクリタキセルがインビトロで有効であることを示している。
【０２００】
実施例５．抗Ｔｒｏｐ−２抗体の細胞結合アッセイ
ヒトＴｒｏｐ−２に対する２種類の異なるマウスモノクローナル抗体を、ＡＤＣコンジュゲート用に得た。第１の１６２−４６．２を、ローラーボトル内で増殖させたハイブリドーマ（ＡＴＣＣ、ＨＢ−１８７）から精製した。第２の抗体であるＭＡＢ６５０は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。結合性を比較するために、Ｔｒｏｐ−２陽性ヒト胃癌であるＮＣＩ−Ｎ８７を標的として使用した。結合アッセイの前日に、細胞（１．５  ｘ  １０５／ウェル）を９６ウェルプレートに播種した。翌朝、１６２−４６．２、ＭＡＢ６５０及びマウスＲＳ７（０．０３〜６６ｎＭ）を用いて、用量／反応曲線を作成した。これらの一次抗体を細胞と、４℃で１．５時間インキュベートした。ウェルを洗浄してから、抗マウスＨＲＰ二次抗体を全てのウェルに加え、４℃で１時間放置した。再度ウェルを洗浄してから、蛍光基質を加えた。Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダを用いてプレートを読み、相対蛍光単位の数値を記録した。
【０２０１】
全３種の抗体は、ほぼ同等のＫＤ値（ＲＳ７で０．５７ｎＭ、１６２−４６．２で０．５２ｎＭ、またＭＡＢ６５０で０．４９ｎＭ）を有していた。しかしながら、１６２−４６．２及びＭＡＢ６５０の最大結合量（Ｂｍａｘ）をＲＳ７の最大結合量（Ｂｍａｘ）と比較すると、それらはそれぞれ２５％、５０％減少しており（ＲＳ７でＢＭａｘ  １１，２５０、１６２−４６．２でＢＭａｘ  ８，４７１、またＭＡＢ６５０でＢＭａｘ  ６，０１８）、ＲＳ７と比較して異なる結合特性を示していた。
【０２０２】
実施例６．抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣ（ＭＡＢ６５０−ＳＮ−３８）の細胞傷害性
ＳＮ−３８及びＭＡＢ６５０を使用して、６．８９の平均置換比率（薬物／抗体）を有する新規抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣを調製した。２種類の異なるヒト膵腺癌細胞株（ＢｘＰＣ−３及びＣａｐａｎ−１）及びヒトトリプルネガティブ乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）を標的として用いて細胞傷害性アッセイを実施し、ＭＡＢ６５０−ＳＮ−３８とｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣを比較した。
【０２０３】
ＡＤＣを加える１日前に、組織培養液から細胞を回収して９６ウェルプレートに播種した。翌日、３．８４  ｘ  １０−１２〜２．５  ｘ  １０−７Ｍの薬物範囲で、細胞を、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８、ＭＡＢ６５０−ＳＮ−３８及び遊離ＳＮ−３８に曝露した。ＭＡＢ６５０−ＳＮ−３８とタンパク質当用量の非コンジュゲートＭＡＢ６５０を対照として使用した。プレートを３７℃で９６時間インキュベートした。このインキュベート期間後、ＭＴＳ基質を全プレートに加え、未処理細胞が約１．０のＯＤ４９２ｎｍに達するまで、３０分間隔で色の発現を読んだ。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ及びＰｒｉｓｍソフトウェア（非線形回帰を用いて、ＩＣ５０値を算出するシグモイド用量反応曲線を作成）を使用し、増殖抑制を、未処理細胞と比較した増殖パーセントとして測定した。
【０２０４】
図８に示すとおり、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８及びＭＡＢ６５０−ＳＮ−３８は、これら細胞株におけるＳＮ−３８−ＡＤＣでは標準的な低ｎＭ範囲のＩＣ５０値を有し、ほぼ同等の増殖抑制効果を有していた。ヒトＣａｐａｎ−１膵腺癌細胞株（図８Ａ）において、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣは、ＭＡＢ６５０−ＳＮ−３８  ＡＤＣの４．１ｎＭ、及び遊離ＳＮ−３８の１．０ｎＭと比較して、３．５ｎＭのＩＣ５０を示した。ヒトＢｘＰＣ−３膵腺癌細胞株（図８Ｂ）において、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣは、ＭＡＢ６５０−ＳＮ−３８  ＡＤＣの３．０ｎＭ、及び遊離ＳＮ−３８の１．０ｎＭと比較して、２．６ｎＭのＩＣ５０を示した。ヒトＮＣＩ−Ｎ８７胃腺癌細胞株（図８Ｃ）において、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣは、ＭＡＢ６５０−ＳＮ−３８  ＡＤＣの４．１ｎＭ、及び遊離ＳＮ−３８の４．３ｎＭと比較して、３．６ｎＭのＩＣ５０を示した。
【０２０５】
要約すると、これらインビトロアッセイにおいて、２種類の抗Ｔｒｏｐ−２抗体（ｈＲＳ７及びＭＡＢ６５０）のＳＮ−３８複合体は、いくつかの腫瘍細胞株に対して同等の効果（遊離ＳＮ−３８の効果とほぼ同等）を示した。抗Ｔｒｏｐ−２抗体の標的化能が、インビトロと比較してインビボではるかに影響を及ぼす因子となることから、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８に関する上記実施例に示すとおり、データは、抗Ｔｒｏｐ−２−ＳＮ−３８  ＡＤＣの部類がインビボで極めて有効となることを裏付けている。
【０２０６】
実施例７．抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣ（１６２−４６．２−ＳＮ−３８）の細胞傷害性
ＳＮ−３８及び１６２−４６．２を使用して、６．１４の置換比率（薬物／抗体）を有する新規抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣを調製した。２種類の異なるＴｒｏｐ−２陽性細胞株（ＢｘＰＣ−３ヒト膵腺癌及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒトトリプルネガティブ乳癌）を標的として用いて細胞傷害性アッセイを実施し、１６２−４６．２−ＳＮ−３８とｈＲＳ７−ＳＮ−３８  ＡＤＣを比較した。
【０２０７】
ＡＤＣを加える１日前に、組織培養液から細胞を回収して、ウェルあたり２０００細胞で９６ウェルプレートに播種した。翌日、３．８４  ｘ  １０−１２〜２．５  ｘ  １０−７Ｍの薬物範囲で、細胞を、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８、１６２−４６．２−ＳＮ−３８または遊離ＳＮ−３８に曝露した。それぞれ１６２−４６．２−ＳＮ−３８及びｈＲＳ７−ＳＮ−３８と同一タンパク質当用量の非コンジュゲート１６２−４６．２及び非コンジュゲートｈＲＳ７を対照として用いた。プレートを３７℃で９６時間インキュベートした。このインキュベート期間後、ＭＴＳ基質を全プレートに加え、未処理対照ウェルが約１．０のＯＤ４９２ｎｍ測定値を示すまで、３０分間隔で色の発現を読んだ。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ及びＰｒｉｓｍソフトウェア（非線形回帰を用いて、ＩＣ５０値を算出するシグモイド用量反応曲線を作成）を使用し、増殖抑制を、未処理細胞と比較した増殖パーセントとして測定した。
【０２０８】
図９Ａ及び図９Ｂに示すとおり、１６２−４６．２−ＳＮ−３８  ＡＤＣは、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８と比較して同等のＩＣ５０値を示した。ＢｘＰＣ−３ヒト膵腺癌細胞株（図９Ａ）に対して試験を行ったとき、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８は、１６２−４６．２−ＳＮ−３８の１０．６ｎＭ、及び遊離ＳＮ−３８の１．６ｎＭと比較して、５．８ｎＭのＩＣ５０を示した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳腺癌細胞株（図９Ｂ）に対して試験を行ったとき、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８は、１６２−４６．２−ＳＮ−３８の６．１ｎＭ、及び遊離ＳＮ−３８の０．８ｎＭと比較して、３．９ｎＭのＩＣ５０を示した。遊離抗体単独では、Ｔｒｏｐ−２陽性がん細胞株のいずれかに対してほとんど細胞傷害性を示さなかった。
【０２０９】
要約すると、同一の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした３種類の異なる抗Ｔｒｏｐ−２抗体のインビトロでの効果を比較した際、全３種のＡＤＣは、様々なＴｒｏｐ−２陽性がん細胞株に対して同等の細胞傷害効果を示した。これらのデータは、抗Ｔｒｏｐ−２抗体（薬物コンジュゲートＡＤＣ中に組み込まれる）の部類が、Ｔｒｏｐ−２発現固形腫瘍に有効な抗がん治療薬であることを裏付けている。
【０２１０】
実施例８．ＳＮ−３８にコンジュゲートしたｈＲＳ７抗体を含むＩＭＭＵ−１３２抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣを用いた臨床試験
要約
本実施例では、第Ｉ相臨床試験、及び、ＩＭＭＵ−１３２（ｐＨ感受性リンカーでＳＮ−３８にコンジュゲートした内部移行、ヒト化、ｈＲＳ７抗Ｔｒｏｐ−２抗体のＡＤＣ）（平均薬物−抗体比  ＝  ７．６）を用いた進行中の第ＩＩ相継続試験の結果について報告する。Ｔｒｏｐ−２とは、多くのヒトがんが高密度（約１  ｘ  １０５）で頻繁に特異的に発現する、カルシウムを変換するＩ型膜貫通タンパク質（正常組織における発現は限定的）のことである。Ｃａｐａｎ−１ヒト膵臓腫瘍異種移植片を有するヌードマウスでの前臨床試験では、ＩＭＭＵ−１３２が最大耐量のイリノテカン治療薬に由来する量と比較して１２０倍超ものＳＮ−３８を腫瘍に送達可能であること、が明らかとなった。
【０２１１】
本実施例では、複数の前治療（一部トポイソメラーゼＩ／ＩＩ阻害剤を含む）に失敗した２５名の患者に関する最初の第Ｉ相試験、及び、６９名の患者（結腸直腸癌（ＣＲＣ）、小細胞肺癌及び非小細胞肺癌（それぞれＳＣＬＣ、ＮＳＣＬＣ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、膵臓癌（ＰＤＣ）、食道癌、及びその他のがんを含む）について現在報告中の、進行中の第ＩＩ相継続試験について報告する。
【０２１２】
以下で詳細に説明するとおり、Ｔｒｏｐ−２は、血清中には検出されなかったが、ほとんどの保管腫瘍で強く発現していた（≧２＋）。３＋３試験デザインでは、反復２１日サイクルの１日目及び８日目にＩＭＭＵ−１３２を投与した（８ｍｇ／ｋｇ／用量で開始して、その後、用量制限の好中球減少症となる前に１２ｍｇ／ｋｇ及び１８ｍｇ／ｋｇ）。延期を最小化させつつ累積治療を最適化するために、第ＩＩ相では、８ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ（それぞれ、ｎ＝３０及び１４）に焦点を絞った。この時点で関連ＡＥと報告された４９名の患者のうち、２８％が≧Ｇ３の好中球減少症を発症した（４％  Ｇ４）。これらの患者に最初に現れた最も一般的な非血液毒性は、疲労（５５％；≧Ｇ３＝９％）、悪心（５３％；≧Ｇ３＝０％）、下痢（４７％；≧Ｇ３＝９％）、脱毛症（４０％）及び嘔吐（３２％；≧Ｇ３＝２％）であった。ホモ接合性ＵＧＴ１Ａ１  ＊２８／＊２８が６名の患者に見つかり、うち２名がより重篤な血液毒性及びＧＩ毒性を有していた。第Ｉ相及び拡大相では、現在、ＲＥＣＩＳＴ／ＣＴで最良効果と評価される４８名の患者（ＰＤＣを除く）が存在している。患者のうち７名（１５％）は部分寛解（ＰＲ）を示し、患者の内訳は、ＣＲＣ（Ｎ＝１）、ＴＮＢＣ（Ｎ＝２）、ＳＣＬＣ（Ｎ＝２）、ＮＳＣＬＣ（Ｎ＝１）及び食道癌（Ｎ＝１）であった。また別の２７名の患者（５６％）は安定（ＳＤ）を示した。３８名の患者全員（７９％）には疾患応答が認められた。１３名のＣＴで評価可能なＰＤＣ患者のうち８名の患者（６２％）はＳＤを示し、患者らの前回の前治療における８．０週間と比較して、１２．７週間の平均無増悪期間（ＴＴＰ）を示した。残る４８名の患者におけるＴＴＰは、１２．６＋週間（６．０〜５１．４週間の範囲）である。
【０２１３】
血漿中のＣＥＡ及びＣＡ１９−９は反応と相関していた。何ヶ月にもわたって投薬を行ったにもかかわらず、抗ｈＲＳ７抗体または抗ＳＮ−３８抗体は検出されなかった。複合体は３日間以内に血清中から消失したが、このことは、インビボ動物試験と一致していた。インビボ動物試験において、ＳＮ−３８の５０％は毎日放出され、血清中のＳＮ−３８の＞９５％は非グルクロン酸抱合形態でＩｇＧに結合し、また、イリノテカンを投与された患者において報告されたＳＮ−３８と比較して、１００倍を超えるほどの濃度であった。これらの結果は、管理可能な下痢及び好中球減少症を有しつつも、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８含有ＡＤＣが転移性固形がんにおいて治療的に有効であることを示している。
【０２１４】
薬物動態
２つのＥＬＩＳＡ法を用いて、ＩｇＧのクリアランス（抗ｈＲＳ７イディオタイプ抗体による補足）及びインタクト複合体のクリアランス（抗ｈＲＳ７イディオタイプ抗体を有する抗ＳＮ−３８  ＩｇＧ／プローブによる補足）を測定した。ＨＰＬＣを用いてＳＮ−３８を測定した。全ＩＭＭＵ−１３２部分（インタクト複合体）はＩｇＧよりも急速に消失した（データは省略）。このことは、周知である、複合体からのＳＮ−３８の徐放を反映している。ＳＮ−３８のＨＰＬＣ測定（非結合性及び全体）により、血清中における＞９５％のＳＮ−３８がＩｇＧに結合していることが示された。低濃度のＳＮ−３８Ｇは、ＩｇＧに結合したＳＮ−３８がグルクロン酸抱合から保護されていることを示唆している。複合体のＥＬＩＳＡとＳＮ−３８のＨＰＬＣを比較することにより、双方のオーバーラップが明らかとなった。このことは、ＥＬＩＳＡが、ＳＮ−３８のクリアランスをモニターするための代用法であることを示唆している。
【０２１５】
投与レジメン及び患者アンケート調査の要約については表３に記載する。
【０２１６】
【表３】
2020512314.tif 000006
【０２１７】
臨床試験ステータス
平均３種類の前治療暦があり多種多様な転移性がんを有する合計６９名の患者（第Ｉ相の２５名の患者を含む）について記録した。８名の患者に臨床増悪が認められ、ＣＴ評価前に中止した。１３名のＣＴで評価可能な膵臓癌患者については、個々に記録した。ＰＤＣ患者の平均ＴＴＰ（無増悪期間）は、最後の前治療による平均８週間のＴＴＰと比較して、１１．９週間（２〜２１．４週間の範囲）であった。
【０２１８】
多種多様ながんを有する合計４８名の患者は、そこから最良効果（図１０）及び無増悪期間（ＴＴＰ、図１１）を判定する、少なくとも１回のＣＴ評価を受けた。ＴＮＢＣ（トリプルネガティブ乳癌）を有する８名の評価可能な患者における最良効果データを集計すると、２名がＰＲ（部分寛解）、４名がＳＤ（安定）、２名がＰＤ（進行）であり、効果判定［ＰＲ＋ＳＤ］の合計は６／８（７５％）であった。ＳＣＬＣ（小細胞肺癌）を有する４名の評価可能な患者においては、２名がＰＲ、ＳＤは該当せず、２名がＰＤであり、効果判定の合計は２／４（５０％）であった。ＣＲＣ（結腸直腸癌）を有する１８名の評価可能な患者においては、１名がＰＲ、１１名がＳＤ、６名がＰＤであり、効果判定の合計は１２／１８（６７％）であった。食道癌を有する４名の評価可能な患者においては、１名がＰＲ、２名がＳＤ、１名がＰＤであり、効果判定の合計は３／４（７５％）であった。ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）を有する５名の評価可能な患者においては、１名がＰＲ、３名がＳＤ、１名がＰＤであり、効果判定の合計は４／５（８０％）であった。治療した患者全体のうち４８名の評価可能な患者においては、７名がＰＲ、２７名がＳＤ、１４名がＰＤであり、効果判定の合計は３４／４８（７１％）であった。これらの結果は、抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣ（ｈＲＳ７−ＳＮ−３８）が、ヒト患者における広範囲の固形腫瘍に対して有意な臨床効果を示したことを実証している。
【０２１９】
記録した治療副作用（有害事象）を表４にまとめる。表４のデータから明白ではあるが、ｈＲＳ７−ＳＮ−３８の治療効果は、許容できる低レベルの副作用を示すＡＤＣ用量により得られた。
【０２２０】
【表４】
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【０２２１】
抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣによる例示的な部分寛解は、ＣＴデータ（データは省略）により確認された。ＣＲＣにおける例示的なＰＲでは、ＣＲＣと初めて診断された６２歳の女性が原発性結腸癌の半切除術を受けた。４ヶ月後、彼女は肝転移による肝切除を受け、ＦＯＬＦＯＸによる治療を７ヶ月間、また５ＦＵによる治療を１ヵ月間受けた。彼女には、主に肝臓に複数の病変（免疫組織学検査により、３＋のＴｒｏｐ−２）が認められ、最初の診断から約１年後、８ｍｇ／ｋｇの開始用量でｈＲＳ７−ＳＮ−３８試験を始めた。彼女の最初のＣＴ評価ではＰＲが得られ、標的病変に３７％の縮小が認められた（データは省略）。当該患者は治療を継続し、１０ヶ月間の治療後に６５％縮小の最大縮小を達成し（７８１ｎｇ／ｍＬから２６．５ｎｇ／ｍＬにＣＥＡが減少）（データは省略）、その３ヶ月後に増悪した。
【０２２２】
ＮＳＣＬＣにおける例示的なＰＲでは、６５歳の男性がステージＩＩＩＢのＮＳＣＬＣ（扁平上皮細胞）と診断された。７０００ｃＧｙのＸＲＴと併用したカルボプラチン／エトポシドによる初期治療（３ヶ月間）により、１０ヶ月間継続する効果が得られた。その後、彼はタルセバによる維持療法を開始し、ＩＭＭＵ−１３２試験に加えて腰椎椎弓切除術を受けることを検討することになるまでその維持療法を継続した。彼は、タルセバの５ヶ月後に、初期用量のＩＭＭＵ−１３２を投与されたが、その時点において、右肺に大量の胸水を伴う５．６ｃｍの病変が認められた。彼は、最初のＣＴにおいて原発性標的病変が３．２ｃｍまで縮小したことが認められた（データは省略）２ヶ月後に、６回目の投薬を完了させたばかりであった。
【０２２３】
ＳＣＬＣにおける例示的なＰＲでは、６５歳の女性が低分化ＳＣＬＣと診断された。効果がなく２ヶ月後に終了したカルボプラチン／エトポシド（Ｔｏｐｏ−ＩＩ阻害剤）の投与後、これもまた効果がなく２ヶ月後に終了したトポテカン（Ｔｏｐｏ−Ｉ阻害剤）に続き、彼女は１ヶ月後に終了した局所ＸＲＴ（３０００ｃＧｙ）を受けた。しかしながら、増悪は翌月まで継続した。患者は翌月ＩＭＭＵ−１３２（１２ｍｇ／ｋｇ；６．８ｍｇ／ｋｇに減量；Ｔｒｏｐ−２発現  ３＋）を開始し、ＩＭＭＵ−１３２の２ヶ月後、標的病変が３８％縮小（主要肺病変のかなりの縮小を含む）した（データは省略）。患者は、１２回の投薬を受けた３ヶ月後に増悪した。
【０２２４】
これらの結果は、抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣが、複数の前治療に失敗したまたはそれらの後に増悪した患者においてでさえ有効であったことを示すという点で意義深い。
【０２２５】
結論として、用いた用量における主な毒性は、グレード３程度の毒性を有する管理可能な好中球減少症であった。ＩＭＭＵ−１３２は、トリプルネガティブ乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌及び食道癌を有する再発／耐性を示す患者（以前のトポイソメラーゼＩ阻害剤治療からの再発暦を有する患者を含む）における活性のエビデンス（ＰＲ及び長続きするＳＤ）を示した。これらの結果は、現行療法に耐性を示す広範囲のがんにおける抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣの有効性を示している。
【０２２６】
実施例９．二官能性ＳＮ−３８生成物の穏やかに還元した抗体へのコンジュゲート
ＣＬ２Ａリンカーを用いて、抗ＣＥＡＣＡＭ５ヒト化ＭＡｂであるｈＭＮ−１４（ラベツズマブとしても周知）、抗ＣＤ２２ヒト化ＭＡｂであるｈＬＬ２（エプラツズマブとしても周知）、抗ＣＤ２０ヒト化ＭＡｂであるｈＡ２０（ベルツズマブとしても周知）、抗ＥＧＰ−１ヒト化ＭＡｂであるｈＲＳ７、及び、抗ムチンヒト化ＭＡｂであるｈＰＡＭ４（クリバツズマブとしても周知）をＳＮ−３８にコンジュゲートした。それぞれの抗体を、５．４ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する４０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中５０〜７０倍モル過剰で用いたジチオスレイトール（ＤＴＴ）で、３７℃（恒温槽）で４５分間還元した。サイズ排除クロマトグラフィー及び／またはダイアフィルトレーションで還元生成物を精製し、ｐＨ６．５の好適な緩衝液に緩衝液交換した。エルマンアッセイでチオール含有量を測定すると、ＳＨ／ＩｇＧは６．５〜８．５の範囲であった。代替的に、リン酸緩衝液（５〜７の範囲のｐＨ）中のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で抗体を還元してから、ｉｎ  ｓｉｔｕコンジュゲートした。７〜１５％（体積／体積）のＤＭＳＯを共溶媒として用いて還元ＭＡｂを約１０〜１５倍モル過剰のＣＬ２Ａ−ＳＮ−３８と反応させ、周囲温度で２０分間インキュベートした。遠心分離ＳＥＣ、疎水性カラム中の通過、最終的に限外濾過−ダイアフィルトレーションにより複合体を精製した。３６６ｎｍのＳＮ−３８吸光度で生成物をアッセイして標準値と対比した一方、タンパク質濃度を２８０ｎｍの吸光度から演繹してこの波長におけるＳＮ−３８吸光度のスピルオーバーに対して補正を行った。このように、ＳＮ−３８／ＭＡｂ置換比率を求めた。精製複合体を凍結乾燥製剤としてガラスバイアル瓶内に収容して、減圧下で蓋をし、−２０℃のフリーザー内で保存した。これら複合体から得られたＳＮ−３８モル置換比率（ＭＳＲ）は一般的に、５〜７の範囲であった。
【０２２７】
実施例１０．ＳＣＬＣにおける抗Ｔｒｏｐ−２  ＡＤＣを用いた組み合わせ治療
シスプラチンが、進行小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）においてイリノテカンと組み合わせて使用される主な化学療法剤の１つであることから、ヒトＳＣＬＣ腫瘍（ＤＭＳ  ５３）を有するマウスでシスプラチンとＩＭＭＵ−１３２の組み合わせを試験する実験を実施した。ＳＣＬＣにおいてカルボプラチンも臨床的に使用されていることから、この腫瘍モデルでカルボプラチンを更に試験した。
【０２２８】
マトリゲルと１：１で混合した、ＤＭＳ  ５３ストック腫瘍（２０％（重量／体積））プラス組織培養液から回収した細胞から構成される腫瘍懸濁液を雌Ｃ．Ｂ．−１７  ＳＣＩＤマウスにｓ．ｃ．注射した（マウスあたり５×１０６個の細胞）。腫瘍が０．２７０  ±  ０．０４８ｃｍ３の平均腫瘍容積に達した時点で、動物を９つの異なる治療群（それぞれ９匹のマウス）へと分割した。３群のマウスにＩＭＭＵ−１３２（５００、２５０または１００μｇ  ｉ．ｐ．）を投与した一方で、対照群には、ｈ６７９（ヒト化抗ヒスタミン−サクシニル−グリシンＩｇＧ）を用いて調製した非腫瘍標的化抗体薬物複合体（ｈ６７９−ＳＮ−３８、５００μｇ  ｉ．ｐ．）を投与した。全群に対して４週間にわたり週に２回投与した。２群には、シスプラチン（５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）またはカルボプラチン（５０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）のいずれかの化学療法剤のみを４週間にわたり週に１回投与した。２群には、ＩＭＭＵ−１３２（２５０μｇ  ｉ．ｖ．、週に１回  ×  ４週間）と、シスプラチンまたはカルボプラチンのいずれかの組み合わせを投与した。最後の非治療対照群のマウスには、生理食塩水（１００μＬ  ｉ．ｐ．、週に２回  ×  ４週間）を投与した。週に２回、腫瘍を測定してマウスの体重を測った。
【０２２９】
結果
様々な群の平均腫瘍容積を図１２に示す。３つの用量のＩＭＭＵ−１３２全てが、生理食塩水対照動物と比較して著しい抗腫瘍効果をもたらした（Ｐ＜０．０１６１、ＡＵＣ  片側ｔ検定）。最高用量のＩＭＭＵ−１３２（５００μｇ）を用いた治療は、腫瘍を有するマウスにおいて、対照ｈ６７９−ＳＮ−３８を含む全ての単剤治療群と比較して著しく高い腫瘍退縮をもたらした（Ｐ＜０．００３２、ＡＵＣ  両側ｔ検定）。
【０２３０】
組み合わせ群であるＩＭＭＵ−１３２（２５０μｇ）＋カルボプラチン（図１３）は、対照カルボプラチン単剤治療群の最初のマウスが４１日目（治療１４日目）にそのエンドポイント（腫瘍容積＞１．０ｃｍ３）に到達した時点において、有意性（Ｐ＝０．０９８３、ＡＵＣ  両側ｔ検定）に接近していた。しかしながら、この日の絶対平均腫瘍容積を基準とすると、ＩＭＭＵ−１３２（２５０μｇ）＋カルボプラチンの組み合わせは、カルボプラチン単剤治療と比較した場合に、著しく小さな腫瘍を有していた（それぞれ、０．１６６  ±  ０．０１９ｃｍ３対０．６０２  ±  ０．２２４ｃｍ３、Ｐ＝０．０００４、両側ｔ検定）。ＩＭＭＵ−１３２（２５０μｇ、週に２回）のみで治療したマウスと比較した場合、ＩＭＭＵ−１３２（週に１回）＋カルボプラチンで治療した動物は、７３日目（エンドポイントに到達する数匹のマウスで比較した最終日、それぞれ０．７４５  ±  ０．１６２ｃｍ３対０．２８２  ±  ０．１５３ｃｍ３、Ｐ＝０．０００３、ＡＵＣ  両側ｔ検定）に著しく小さな腫瘍を有していた。
【０２３１】
ＩＭＭＵ−１３２（２５０μｇ）＋シスプラチンの組み合わせ（図１４）で治療したマウスは、シスプラチン単剤治療と比較した場合に著しい腫瘍増殖抑制を示した（Ｐ＝０．０００２、ＡＵＣ  両側ｔ検定）。７３日目（エンドポイントに到達するシスプラチン単剤治療群における数匹のマウスで比較した最終日）に腫瘍容積を比較した際、組み合わせ群は、シスプラチン単剤治療群の腫瘍と比較して約６．２倍小さな腫瘍を有していた（それぞれ、０．１２３  ±  ０．０４０ｃｍ３対０．７５８  ±  ０．２４０ｃｍ３、Ｐ＜０．０００１、両側ｔ検定）。同様に、シスプラチンと組み合わせたＩＭＭＵ−１３２（２５０μｇ）を用いて週に１回のスケジュールで治療したマウスは、ＩＭＭＵ−１３２（２５０μｇ）のみで治療した動物（単剤治療群ではＩＭＭＵ−１３２を週に２回投与していたにもかかわらず）と比較して著しく小さな腫瘍を有していた（Ｐ＜０．０００１、ＡＵＣ  両側ｔ検定）。最終的に、ＩＭＭＵ−１３２＋カルボプラチンの組み合わせ治療群及び高用量ＩＭＭＵ−１３２（５００μｇ）単剤治療群を含むその他の群全てよりも、ＩＭＭＵ−１３２＋シスプラチンの組み合わせが優れていることが証明された（Ｐ＜０．００６６、ＡＵＣ  両側ｔ検定）。
【０２３２】
マウスは、ＩＭＭＵ−１３２＋カルボプラチン治療とＩＭＭＵ−１３２＋シスプラチン治療の両方に十分に耐性を示した。この腫瘍モデル特有の特徴は、ＤＭＳ  ５３腫瘍を有するマウスが開始時からの平均１５％超の体重減少を伴う悪液質（図１５）を示すことが認められたことであった。例えば、生理食塩水対照マウスでは、全身腫瘍組織量が２７日目の０．２７０  ±  ０．０５３ｃｍ３から４１日目の０．６８３  ±  ０．１８５ｃｍ３に増加した際、動物の体重は１６．９％  ±  ３．４％減少した。しかしながら、ＩＭＭＵ−１３２（５００μｇ）単剤治療またはＩＭＭＵ−１３２＋カルボプラチンもしくはシスプラチンの組み合わせの抗腫瘍効果が明白となり、マウスは再び体重を増加させ始めた。例えば、ＩＭＭＵ−１３２＋カルボプラチン群では、マウスは３８日目付近にその体重を最も落とし（１５．３％  ±  ５．６％）、その後、それらマウスは、５８日目付近に開始体重の１００％にマウスが戻るように、腫瘍が退縮するにつれてこの体重減少分を取り戻し始めた。その期間の間、腫瘍は、２７日目における開始サイズの０．２７０  ±  ０．０５０ｃｍ３から０．１２８  ±  ０．０１８ｃｍ３に退縮した。しかしながら、治療開始時よりも大きなサイズ（７３日目の０．２８２  ±  ０．１５３ｃｍ３）に腫瘍が再び増大した際、動物は再び体重を落とし始めた。つまり、これらのマウスにおいては、これらの治療によって全身腫瘍組織量が減少すると悪液質の弱体化作用が逆転することになり、このヒトＳＣＬＣ疾患モデルにおけるこれら組み合わせの効果が更に示されることになった。
【０２３３】
実施例１１．サシツズマブゴビテカンを用いたＴＮＢＣの治療は、ＲＡＤ５１が媒介する相同組換え修復（ＨＲＲ）救援を克服する
抄録
ＩＭＭＵ−１３２とは、開裂可能なリンカーを介してＳＮ−３８（トポイソメラーゼＩ阻害剤でありイリノテカンの活性成分）にコンジュゲートしたヒト化抗Ｔｒｏｐ−２ＩｇＧからなる抗体薬物複合体のことである。固形腫瘍（ＮＣＴ０１６３１５５２）の範囲で現在臨床研究が行われている。本発明者らは、固形腫瘍のＴｒｏｐ−２を標的とすることにより、高いＴｒｏｐ−２発現でＴＮＢＣ腫瘍におけるＤＮＡ切断のＲａｄ５１媒介ＨＲＲ修復を克服する上で、ＩＭＭＵ−１３２がイリノテカンよりも優れているという仮説について検証を行った。
【０２３４】
ウェスタンブロットを用いてＲａｄ５１及びＤＮＡ切断（ｇ−Ｈ２Ａ．Ｘ）を確認した。扁平上皮細胞肺癌（ＳＫ−ＭＥＳ−１、約３０，０００のＴｒｏｐ−２／細胞）及びＴＮＢＣ（ＨＣＣ１８０６、約９０，０００のＴｒｏｐ−２／細胞、及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１、約３０，０００のＴｒｏｐ−２／細胞）を含む、Ｔｒｏｐ−２レベルが異なる細胞をＩＭＭＵ−１３２に２４時間曝露した（２５〜１００ｎＭのＳＮ−３８当量）。また、Ｃ１３及びＣ３９（それぞれ、Ｔｒｏｐ−２レベルが４倍と２５倍高い）と呼ばれるＭＤＡ−ＭＢ−２３１の２種類のＴｒｏｐ−２トランスフェクタントを同様にＩＭＭＵ−１３２に曝露した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍、Ｃ１３腫瘍またはＣ３９腫瘍を有するマウスを、イリノテカン（ＭＴＤ、４０ｍｇ／ｋｇ、ｑ２ｄｘ５）またはＩＭＭＵ−１３２（０．５ｍｇ、９ｍｇ  ＳＮ−３８当量、週に２回  ×  ４）で治療した。週に２回、腫瘍を測定してマウスの体重を測った。試験の生存エンドポイントは＞１．０ｃｍ３への腫瘍増悪であった。
【０２３５】
ＳＫ−ＭＥＳ−１及びＨＣＣ１８０６がＩＭＭＵ−１３２治療に感受性を示す一方で、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は耐性を示す。ＩＭＭＵ−１３２がＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＲａｄ５１レベルの＞２倍の上昇に関与したが、ＳＫ−ＭＥＳ−１またはＨＣＣ１８０６における影響はなかった。２５ｎＭのＩＭＭＵ−１３２では、ＳＫ−ＭＥＳ−１及びＨＣＣ１８０６と比較してＭＤＡ−ＭＢ−２３１において検出された低レベルのＤＮＡ切断があった（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１における２倍の上昇対＞３倍）。より高濃度のＩＭＭＵ−１３２（１００ｎＭ）では、全３種類の細胞株はほぼ同等レベルのＤＮＡ切断（約５倍超のバックグラウンド）を示し、より高いレベルのＳＮ−３８がＲａｄ５１媒介修復を克服可能であることを示していた。Ｃ１３クローンとＣ３９クローンの両方は、ＩＭＭＵ−１３２に曝露すると、親ＭＤＡ−ＭＢ−２３１とほぼ同等の効果を示した。イリノテカンで治療したＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍、Ｃ１３腫瘍またはＣ３９腫瘍を有するマウスは、生理食塩水と比較して平均生存期間（ＭＳＴ）において著しい改善を示した（Ｐ＜０．０００９）。予想したとおり、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍を有するマウスにおいて、ＩＭＭＵ−１３２は生理食塩水とは異なっていなかった（ＭＳＴ＝それぞれ２１日間と１９．５日間）。しかしながら、高Ｔｒｏｐ−２  Ｃ１３腫瘍及びＣ３９腫瘍を有するマウスでは、ＩＭＭＵ−１３２は、イリノテカン治療マウスと比較して著しい生存効果をもたらし（ＭＳＴはそれぞれ、Ｃ１３で＞７０日間対３５日間、Ｃ３９で＞７０日間対２８日間、Ｐ＜０．０００７）、ＩＭＭＵ−１３２が、イリノテカンにより達成可能なＳＮ−３８と比較してより多くのＳＮ−３８を高Ｔｒｏｐ−２腫瘍に送達可能であり、それゆえ、Ｒａｄ５１媒介ＨＲＲを克服可能であるという仮説を裏付けていた。
【０２３６】
ＩＭＭＵ−１３２に対する耐性に影響を及ぼす因子：ＨＲＲ救援経路対Ｔｒｏｐ−２発現
一定の腫瘍株がほぼ同等レベルのＴｒｏｐ−２を発現するという事実にもかかわらず、ＩＭＭＵ−１３２が異なる腫瘍タイプにおいて異なる抗腫瘍効果を媒介していることを過去の研究が示している。
【０２３７】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＴＮＢＣ（Ｔｒｏｐ−２は細胞あたり約３０，０００分子）では、ＩＭＭＵ−１３２もイリノテカンも何ら効果を示さなかった（図１６）。ＨＣＣ１８０６  ＴＮＢＣ（３倍高いＴｒｏｐ−２レベルの約９０，０００）では、ＩＭＭＵ−１３２は有意な抗腫瘍効果を示した（図１７）。同様に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（約３０，０００）とほぼ同等のＴｒｏｐ−２発現レベルを有するＳＫ−ＭＥＳ−１扁平上皮細胞肺癌では、ＩＭＭＵ−１３２とイリノテカンの両方は有意な抗腫瘍効果をもたらす（図１８）。
【０２３８】
本発明者らは、ＩＭＭＵ−１３２への曝露が確かに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１においてＨＲＲに関与する数種類の異なるタンパク質（Ｒａｄ５１を含む）の増加をもたらすことを発見した（Ｃａｒｄｉｌｌｏ  ＴＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１７（出版前に電子出版されている））。これらのデータは、一部の腫瘍細胞によるＨＲＲ修復がＩＭＭＵ−１３２を用いた治療への感受性を決める上で重要な役割を果たし得るということを示唆している。
【０２３９】
ＩＭＭＵが媒介するＲａｄ５１発現の上昇は耐性と相関する
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、ＳＫ−ＭＥＳ−１またはＨＣＣ１８０６のいずれかと比較してより高い構成レベルのＲａｄ５１を示した（データは省略）。このレベルは、２５ｎＭ  ＳＮ−３８当量のＩＭＭＵ−１３２への２４時間の曝露後に２倍超、１００ｎＭで最大４倍上昇した（データは省略）。ＳＫ−ＭＥＳ−１細胞もＨＣＣ１８０６細胞もＲａｄ５１の増加の何らを示さず、実際に、ＳＫ−ＭＥＳ−１において１００ｎＭで、ＨＣＣ１８０６において３つのレベル全てでレベルの低下を示した（データは省略）。
【０２４０】
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１と比較したｐ−Ｈ２Ａ．Ｘレベルから明らかであるが、２５ｎＭ及び５０ｎＭでは、ＳＫ−ＭＥＳ−１及びＨＣＣ１８０６におけるｄｓＤＮＡ切断に＞５０％の増加が認められた（データは省略）。３種類の細胞株中において、最高濃度のＩＭＭＵ−１３２（１００ｎＭ）のみに当量のＤＮＡ損傷が認められた（データは省略）。これらのデータは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１においてＩＭＭＵ−１３２が媒介するＲａｄ５１発現の上昇が、低濃度のＳＮ−３８においてＤＮＡ損傷に対する影響を低下させるが、Ｒａｄ５１発現の上昇が、高濃度においては十分なＤＮＡ修復を維持することができずに著しい損傷をもたらすことを示している。
【０２４１】
【表５】
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【０２４２】
高レベルのＴｒｏｐ−２を発現する細胞株を調製するために、ヒトＴｒｏｐ−２のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ７７７５４．１）をＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞にトランスフェクションした。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１親細胞において観察されたレベルを上回るＴｒｏｐ−２発現レベルを示す７つのクローンをＦＡＣＳ解析で同定した。７つのクローンのうち、２つのクローン、Ｃ１３及びＣ３９を更なる解析用に選択したが、６ヶ月間超にわたり選択フリー（すなわち、Ｇ４１８フリー）培地内で増殖させた後に安定的にトランスフェクションされることが判明した（表５）。
【０２４３】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１親対高Ｔｒｏｐ−２発現クローンＣ１３及びＣ３９の特性解析
Ｃ１３及びＣ３９のより高いＴｒｏｐ−２レベルにもかかわらず、それらの両方は、ＩＭＭＵ−１３２に２４時間曝露すると、Ｒａｄ５１レベルが未処理バックグラウンドよりも約２．５倍上方制御されるという点で親ＭＤＡ−ＭＢ−２３１と同様の挙動を示す（データは省略）。親ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｃ１３及びＣ３９の腫瘍異種移植片の免疫組織化学は、親ＭＤＡ−ＭＢ−２３１と比較して、Ｃ１３におけるより高いＴｒｏｐ−２発現、Ｃ３９における更により高い発現を示している（表５）。
【０２４４】
インビトロで観察されたものと同様に、イリノテカンまたはＩＭＭＵ−１３２のいずれかで治療されたマウスから採取した親腫瘍ならびにＣ１３腫瘍とＣ３９腫瘍の両方は、２４時間以内にＲａｄ５１の上方制御を示した（データは省略）。ＩＭＭＵ−１３２治療マウス及びイリノテカン治療マウスにおけるＲａｄ５１の平均発現レベルは、この上方制御が未治療対照動物と比較して有意（Ｐ＜０．０５）であったことを示している（データは省略）。これらのデータは、親腫瘍の細胞ならびにクローンＣ１３腫瘍とクローンＣ３９腫瘍の細胞が、インビトロ観察と同様の挙動を示し、ＤＮＡ損傷を被りＲａｄ５１の補助を受けてＨＲＲを試みたことを示唆している。
【０２４５】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍におけるＴｒｏｐ−２発現上昇は、イリノテカンではなくＩＭＭＵ−１３２に対する耐性を克服する
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１親細胞（図１９）、クローン１３細胞（Ｃ１３）（図２０）またはクローン３９細胞（Ｃ３９）（図２１）のいずれかから誘導した約０．３ｃｍ３の腫瘍を有するマウスを様々な治療群に無作為化し、イリノテカンまたはＩＭＭＵ−１３２で治療した。ＩＭＭＵ−１３２は親腫瘍の腫瘍増殖に対して効果を示さなかった（図１９）が、Ｔｒｏｐ−２発現が上昇した細胞における腫瘍増殖の阻害には有効であった（図２０、図２１）。Ｔｒｏｐ−２過剰発現腫瘍細胞株において、ＩＭＭＵ−１３２は、腫瘍増殖を阻害する上でイリノテカンと比較してはるかにより有効であった（図２０、図２１）。
【０２４６】
全３種の腫瘍タイプにおいて、イリノテカンはそのＭＴＤ（４０ｍｇ／ｋｇ  ｑ２ｄｘ５、２４ｍｇ／ｋｇのＳＮ−３８当量）で、生理食塩水対照動物と比較して、親腫瘍を有するマウスにおける２６．５日間からＣ１３腫瘍を有するマウスにおける３５日間の範囲の平均生存期間で生存効果（Ｐ＜０．０００９、ログランク）をもたらした（図２２〜図２４）。予想したとおり、ＩＭＭＵ−１３２は親腫瘍の生存率に対する抗腫瘍効果を有しておらず（図２２）、事実、イリノテカンは比較するとより優れた生存効果をもたらした（Ｐ＝０．０３９３）。しかしながら、Ｔｒｏｐ−２を高発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍（すなわち、Ｃ１３腫瘍及びＣ３９腫瘍）を有するマウスにおいて、ＩＭＭＵ−１３２治療は、イリノテカン治療及び対照ＡＤＣ治療を含む全てのその他の治療と比較して生存率の有意な上昇（Ｐ＜０．０００１）を媒介した（図２３、図２４）。
【０２４７】
結論
イリノテカンが全３種の腫瘍タイプにおいてほぼ同等で軽微な効果（腫瘍タイプ間で有意差なし）を有していたという事実は、ＩＭＭＵ−１３２のこの大いに向上した抗腫瘍活性が、Ｒａｄ５１媒介ＨＲＲ（及び発生し得るその他のＨＲＲタンパク質）を克服可能なレベルにおける、これら腫瘍におけるＳＮ−３８の標的化及び取り込み率の上昇によるものであり、ＳＮ−３８自体への任意の得られた感受性によるものではないということを示している。
【０２４８】
化学療法剤（例えば、イリノテカン）に対する耐性は部分的に、ＨＲＲ経路に用いられて続くＤＮＡ損傷から細胞を救援するタンパク質の発現上昇によるものであり得る。しかしながら、十分な量の薬物（例えば、ＳＮ−３８）が細胞に侵入すると、著しいＤＮＡ損傷が生じてアポトーシス及び細胞死がもたらされることになる。
【０２４９】
Ｔｒｏｐ−２陽性腫瘍細胞へとＳＮ−３８を向けるためにＩＭＭＵ−１３２を使用することは、ＨＲＲでは修復できない著しいＤＮＡ損傷を引き起こす十分な量のＳＮ−３８を腫瘍内に増大させることによって、この固有の耐性を克服するための新規の方法である。このことのエビデンスは、ＩＭＭＵ−１３２で治療する際、高Ｔｒｏｐ−２発現レベルはイリノテカン治療に影響を及ぼさないが有意に優れた効果をもたらす、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に示されている。
【０２５０】
腫瘍耐性を克服するためにＴｒｏｐ−２発現のレベルをインビボで操作することは実用的な手法ではない。しかしながら、本明細書で提供するデータは、がん治療を向上しＡＤＣに対する耐性を抑制するためにＩＭＭＵ−１３２またはその他のＳＮ−３８がコンジュゲートしたＡＤＣと組み合わせてＲＡＤ５１阻害剤を使用することを裏付けている。
【０２５１】
本発明の生成物、組成物、方法及びプロセスに対する様々な変更及び変形形態が実施可能であることは当業者には明白である。それゆえ、このような変更及び変形形態が添付の特許請求の範囲及びその等価物の範囲内である場合、本発明がこのような変更及び変形形態を対象として含むことを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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