(57)【要約】  本発明は、フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む溶液をろ過する方法であって、（ａ）ＶＷＦと塩基性アミノ酸とを含む溶液を準備する工程、および（ｂ）工程（ａ）の溶液を、細孔径が３５ｎｍ以下であるフィルタに通すウイルスろ過にかける工程を含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む溶液をろ過する方法であって、
（ａ）ＶＷＦと、少なくとも１種の塩基性アミノ酸とを含む溶液を準備する工程であり、該溶液における前記少なくとも１種の塩基性アミノ酸の濃度は少なくとも１５０ｍＭである、準備する工程；
（ｂ）工程（ａ）の溶液を、細孔径が３５ｎｍ以下であるフィルタに通すウイルスろ過にかける工程
を含む前記方法。
【請求項２】
工程（ａ）の溶液中の前記ＶＷＦはＶＷＦの高分子量多量体（ＨＭＷＭ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）におけるウイルスろ過中の圧力は０．５ｂａｒ未満である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）で準備される溶液のｐＨは５．０〜９．０であり、特に６．０〜８．０である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）におけるウイルスろ過は１５〜３０℃、特に１８〜２８℃の温度で行う、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）で準備される溶液における前記少なくとも１種の塩基性アミノ酸の濃度は、少なくとも３００ｍＭ、少なくとも３５０ｍＭ、少なくとも４００ｍＭ、少なくとも４５０ｍＭ、または少なくとも５００ｍＭである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）で準備される溶液における前記少なくとも１種の塩基性アミノ酸の濃度は、１，０００ｍＭ未満、９５０ｍＭ未満、９００ｍＭ未満、８５０ｍＭ未満、８００ｍＭ未満、または７５０ｍＭ未満である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）で準備される溶液は、カルシウムイオンを、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも３００ｍＭ、または少なくとも３５０ｍＭの濃度でさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
フィルタは、細孔径が２５ｎｍ以下、または２０ｎｍ以下である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
フィルタは、細孔径が１３ｎｍ〜３５ｎｍ、１３ｎｍ〜２５ｎｍ、１８ｎｍ〜２２ｎｍ、または１３ｎｍ〜１７ｎｍである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＶＷＦは、血漿由来のＶＷＦ、または組み換えにより得られたＶＷＦである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｂ）で得られるろ液における比ＲＣｏ  ＶＷＦ／Ａｇ  ＶＷＦは、少なくとも０．７５、少なくとも０．８、少なくとも０．９、少なくとも１．０、少なくとも１．１、または少なくとも１．２である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）で得られるろ液における比ＲＣｏ  ＶＷＦ／Ａｇ  ＶＷＦは、工程（ａ）で準備される溶液における比ＲＣｏ  ＶＷＦ／Ａｇ  ＶＷＦの少なくとも７５％である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ろ過後のＶＷＦ：Ａｇ収率は少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ろ過後のＲＣｏ  ＶＷＦ収率は少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、または少なくとも５５％である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ａ）で準備される溶液、および工程（ｂ）で得られるろ液は、多量体電気泳動により分析した場合に、ＶＷＦの低多量体（１〜５のバンド）、ＶＷＦの中間多量体（６〜１０のバンド）、およびＶＷＦの大多量体（ＨＭＷＭ、高分子量多量体、１１超のバンド）を含み、但し、工程（ｂ）で得られるろ液における大多量体の相対量は、工程（ａ）で準備される溶液における総ＶＷＦ含有量および工程（ｂ）で得られるろ液における総ＶＷＦ含有量それぞれと比較して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１種のアミノ酸は、アルギニン、リシン、ヒスチジン、オルニチン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択され、好ましくは、塩基性アミノ酸はアルギニンである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ａ）で準備される溶液は、ＶＷＦに加えて因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法により得ることができるＶＷＦのろ過溶液。
【請求項２０】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法により得ることができるＶＷＦを含む組成物。
【請求項２１】
ＶＷＦを精製する方法であって、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む溶液をろ過する方法であって、（ａ）ＶＷＦと塩基性アミノ酸とを含む溶液を準備する工程、および（ｂ）工程（ａ）の溶液を、細孔径が３５ｎｍ以下であるフィルタに通すウイルスろ過にかける工程を含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固因子の欠乏により様々な出血障害が引き起こされる。最も一般的な障害は血友病ＡおよびＢであり、それぞれ血液凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）およびＩＸの欠乏に起因する。別の既知の出血障害はフォン・ウィルブランド病（ＶＷＤ）である。血漿中において、ＦＶＩＩＩは、フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）との非共有結合性複合体として主に存在し、その凝固機能は、因子ＸからＸａへの因子ＩＸａ依存性変換を促進することである。
【０００３】
フォン・ウィルブランド病（ＶＷＤ）の様々な形態において欠損している、機能不全である、または少ない量しか利用可能でないＶＷＦは、哺乳動物の血漿中に存在する多量体接着性糖タンパク質であり、これは複数の生理学的機能を有する。一次止血の間、ＶＷＦは、血小板表面上の特定のレセプターと、コラーゲン等の細胞外マトリックスの成分との間のメディエータの役割を果たす。さらに、ＶＷＦは、凝血原ＦＶＩＩＩの担体および安定化タンパク質として機能する。ＶＷＦは、２８１３個のアミノ酸の前駆体分子として、内皮細胞および巨核球で合成される。前駆体ポリペプチド（プレプロＶＷＦ）は、Ｎ末端の２２残基のシグナルペプチド、続いて７４１残基のプロペプチド、および成熟血漿ＶＷＦで見られる２０５０残基のポリペプチドからなる（非特許文献１）。小胞体中でのシグナルペプチドの切断後には、ＶＷＦの２つの単量体の間にＣ末端ジスルフィド架橋が形成される。分泌経路を経るさらなる輸送の間に、１２個のＮ連結型炭水化物側鎖および１０個のＯ−連結型炭水化物側鎖が付加される。さらに重要なことに、ＶＷＦ二量体は、Ｎ末端ジスルフィド架橋を介して多量体化され、７４１個のアミノ酸長のプロペプチドは、後期ゴルジ体（ｌａｔｅ  Ｇｏｌｇｉ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）中において酵素ＰＡＣＥ／フューリンにより切断される。
【０００４】
血漿中に分泌されると、プロテアーゼＡＤＡＭＴＳ１３は、ＶＷＦのＡ１ドメイン内で高分子量ＶＷＦ多量体を切断し得る。したがって、血漿ＶＷＦは、５００ｋＤａの単一の二量体から１０，０００ｋＤａ超の分子量の最大２０個超の二量体からなる多量体までの範囲の多量体の全範囲からなる。そのため、ＶＷＦ高分子量多量体（ＨＭＷＭ）は、リストセチンコファクター活性（ＶＷＦ：ＲＣｏ）で測定される最も強い止血活性を有する。ＶＷＦ：ＲＣｏ／ＶＷＦ抗原の比率が高いほど、高分子量多量体の相対量が高くなる。
【０００５】
ＶＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体を精製する様々な方法が、例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、または非特許文献２に記載されている。
【０００６】
ＶＷＦの精製には、存在する可能性がある病原体（例えばウイルス）を除去するために１つまたはそれ以上の工程が必要である。ウイルスの除去で非常に有効な１つ方法は、ウイルス粒子を阻むことが可能な細孔径を有するフィルタに通すろ過である（ウイルスろ過）。この方法の有効性は、使用するフィルタの細孔径に依存する。
【０００７】
様々な細孔径（通常は１５〜７５ナノメートル（ｎｍ））のナノフィルタが存在しており、細孔径が小さいほど、病原体の保持において有効性が高い。細孔径が３５ｎｍ未満であり、好ましくは１５〜２０ｎｍであるナノフィルタは、エリスロウイルスＢ１９またはＡ型肝炎ウイルス等の非常に小さいウイルスであっても除去し得る。しかしながら、高分子量のタンパク質もフィルタを通過すべきである場合には、細孔径が小さいナノフィルタに通すろ過には問題がある（特許文献４）。一般に、ＶＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体は、特に、ＶＷＦ溶液が、より高い分子量のＶＷＦの多量体形態を含む場合には、細孔径が３５ｎｍ未満であるナノフィルタに通す効率的なろ過に適しているようには思われない（特許文献５）。
【０００８】
特許文献６は、ナノろ過により、フィブリノゲンを含む溶液からウイルスを分離する方法を記載しており、ナノろ過の前に、このフィブリノゲン溶液にカオトロピック剤が添加される。しかしながら、特許文献６ではＶＷＦに言及していない。
【０００９】
特許文献７は、ＶＷＦまたはＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ複合体を含む溶液を、公称細孔径が３５ｎｍ未満であり、カルシウムイオンが存在する場合にはさらに２０ｎｍであるナノフィルタに通してろ過し得る方法を記載している（特許文献７の第［００３３］段落を参照されたい）。
【００１０】
特許文献８は、組み換えＶＷＦを製造する方法であって、ＶＷＦの多量体を、ＶＷＦの低分子量多量体に富む透過画分と、ＶＷＦのＨＭＷＭに富む保持画分とに分離する工程を含む方法を記載している。しかしながら、フィルタの細孔径は比較的大きい（０．０５μｍ〜１μｍ）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５８５４４０３号明細書
【特許文献２】欧州特許出願公開第０４１１８１０Ａ１号明細書
【特許文献３】欧州特許出願公開第０６３９２０３号明細書
【特許文献４】国際公開第２００５／０４０２１４Ａ１号パンフレット
【特許文献５】欧州特許出願公開第１６３２５０１号明細書
【特許文献６】欧州特許出願公開第１３４８４４５Ａ１号明細書
【特許文献７】欧州特許出願公開第２０７８７３０Ａ１号明細書
【特許文献８】国際公開第２０１５／１８８２２４Ａ１号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｆｉｓｃｈｅｒ他、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５１：３４５〜３４８頁、１９９４年
【非特許文献２】Ｒｉｓｔｏｌ  Ｐ．他、Ｓａｎｇｒｅ（１９９６年）４１：１２５〜１３０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従来技術の方法は、ろ液におけるＶＷＦの収率に関しては依然として不十分である。
【００１４】
そのため、ＶＷＦのウイルスろ過の改善された方法（特に、ＶＷＦの収率が良好である方法）が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本出願の発明者らは、少なくとも１５０ｍＭのアルギニンの存在下でウイルスろ過を実行する場合には、ＶＷＦ溶液のウイルスろ過の際のろ液において、ＶＷＦ抗原の驚くほど高い収率およびＶＷＦ活性が得られることを発見した。さらには、リシンおよびヒスチジンによっても同様の結果が得られることを発見した。したがって、本発明は、特に、下記の項目［１］〜［６４］で定義される態様および実施形態に関する。
【００１６】
［１］フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）を含む溶液をろ過する方法であって、
（ａ）ＶＷＦと、少なくとも１５０ｍＭの濃度の少なくとも１種の塩基性アミノ酸とを含む溶液を準備する工程；
（ｂ）工程（ａ）の溶液を、細孔径が３５ｎｍ以下であるフィルタに通すウイルスろ過にかける工程
を含む前記方法。
【００１７】
［２］工程（ａ）の溶液中の前記ＶＷＦはＶＷＦの高分子量多量体（ＨＭＷＭ）を含む、項目［１］に記載の方法。
【００１８】
［３］工程（ｂ）におけるウイルスろ過中の圧力は０．５ｂａｒ未満である、項目［１］または［２］に記載の方法。
【００１９】
［４］工程（ｂ）におけるウイルスろ過中の圧力は０．１〜０．４ｂａｒである、項目［３］に記載の方法。
【００２０】
［５］工程（ａ）で準備される溶液のｐＨは５．０〜９．０である、項目［１］〜［４］のいずれか１つに記載の方法。
【００２１】
［６］工程（ａ）で準備される溶液のｐＨは６．０〜８．０である、項目［１］〜［５］のいずれか１つに記載の方法。
【００２２】
［７］工程（ａ）で準備される溶液のｐＨは６．５〜７．５である、項目［１］〜［６］のいずれか１つに記載の方法。
【００２３】
［８］工程（ｂ）におけるウイルスろ過は１５〜３０℃の温度で行う、項目［１］〜［７］のいずれか１つに記載の方法。
【００２４】
［９］工程（ｂ）におけるウイルスろ過は１８〜２８℃の温度で行う、項目［１］〜［８］のいずれか１つに記載の方法。
【００２５】
［１０］工程（ａ）で準備される溶液における前記少なくとも１種の塩基性アミノ酸の濃度は少なくとも３００ｍＭである、項目［１］〜［９］のいずれか１つに記載の方法。
【００２６】
［１１］工程（ａ）で準備される溶液における前記少なくとも１種の塩基性アミノ酸の濃度は少なくとも３５０ｍＭである、項目［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の方法。
【００２７】
［１２］工程（ａ）で準備される溶液における前記少なくとも１種の塩基性アミノ酸の濃度は少なくとも４００ｍＭである、項目［１］〜［１１］のいずれか１つに記載の方法。
【００２８】
［１３］工程（ａ）で準備される溶液における前記少なくとも１種の塩基性アミノ酸の濃度は少なくとも４５０ｍＭである、項目［１］〜［１２］のいずれか１つに記載の方法。
【００２９】
［１４］工程（ａ）で準備される溶液における前記少なくとも１種の塩基性アミノ酸の濃度は少なくとも５００ｍＭである、項目［１］〜［１３］のいずれか１つに記載の方法。
【００３０】
［１５］工程（ａ）で準備される溶液における前記少なくとも１種の塩基性アミノ酸の濃度は１，０００ｍＭ未満である、項目［１］〜［１４］のいずれか１つに記載の方法。
【００３１】
［１６］工程（ａ）で準備される溶液における前記少なくとも１種の塩基性アミノ酸の濃度は９００ｍＭ未満である、項目［１］〜［１５］のいずれか１つに記載の方法。
【００３２】
［１７］工程（ａ）で準備される溶液における前記少なくとも１種の塩基性アミノ酸の濃度は８００ｍＭ未満である、項目［１］〜［１６］のいずれか１つに記載の方法。
【００３３】
［１８］工程（ａ）で準備される溶液における前記少なくとも１種の塩基性アミノ酸の濃度は７５０ｍＭ未満である、項目［１］〜［１７］のいずれか１つに記載の方法。
【００３４】
［１９］工程（ａ）で準備される溶液は、カルシウムイオンを少なくとも５０ｍＭの濃度でさらに含む、項目［１］〜［１８］のいずれか１つに記載の方法。
【００３５】
［２０］工程（ａ）で準備される溶液は、カルシウムイオンを少なくとも１００ｍＭの濃度でさらに含む、項目［１］〜［１９］のいずれか１つに記載の方法。
【００３６】
［２１］工程（ａ）で準備される溶液は、カルシウムイオンを少なくとも２００ｍＭの濃度でさらに含む、項目［１］〜［２０］のいずれか１つに記載の方法。
【００３７】
［２２］工程（ａ）で準備される溶液は、カルシウムイオンを少なくとも３００ｍＭの濃度でさらに含む、項目［１］〜［２１］のいずれか１つに記載の方法。
【００３８】
［２３］工程（ａ）で準備される溶液は、カルシウムイオンを少なくとも３５０ｍＭの濃度でさらに含む、項目［１］〜［２２］のいずれか１つに記載の方法。
【００３９】
［２４］フィルタは細孔径の中央値が３５ｎｍ以下である、項目［１］〜［２３］のいずれか１つに記載の方法。
【００４０】
［２５］フィルタは細孔径の中央値が２５ｎｍ以下である、項目［１］〜［２４］のいずれか１つに記載の方法。
【００４１】
［２６］フィルタは細孔径の中央値が２０ｎｍ以下である、項目［１］〜［２５］のいずれか１つに記載の方法。
【００４２】
［２７］フィルタは細孔径の中央値が１３ｎｍ〜３５ｎｍである、項目［１］〜［２６］のいずれか１つに記載の方法。
【００４３】
［２８］フィルタは細孔径の中央値が１３ｎｍ〜２５ｎｍである、項目［１］〜［２７］のいずれか１つに記載の方法。
【００４４】
［２９］フィルタは細孔径の中央値が１８ｎｍ〜２２ｎｍである、項目［１］〜［２８］のいずれか１つに記載の方法。
【００４５】
［３０］フィルタは細孔径の中央値が１３ｎｍ〜１７ｎｍである、項目［１］〜［２９］のいずれか１つに記載の方法。
【００４６】
［３１］ＶＷＦは血漿由来のＶＷＦである、項目［１］〜［３０］のいずれか１つに記載の方法。
【００４７】
［３２］ＶＷＦは組み換えにより得られたＶＷＦである、項目［１］〜［３０］のいずれか１つに記載の方法。
【００４８】
［３３］ＶＷＦは半減期延長部分（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）を含む、項目［３２］に記載の方法。
【００４９】
［３４］前記半減期延長部分は、ＶＷＦアミノ酸配列に融合した異種アミノ酸配列である、項目［３３］に記載の方法。
【００５０】
［３５］前記異種アミノ酸配列は、免疫グロブリン定常領域およびそのタンパク質、例えば、Ｆｃフラグメント、トランスフェリンおよびそのフラグメント、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド、ＸＴＥＮとして既知の、大きな流体力学的体積を有する溶媒和ランダム鎖、ホモアミノ酸リピート（ＨＡＰ）、プロリン−アラニン−セリンリピート（ＰＡＳ）、アルブミン、アファミン、アルファ−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、生理学的条件下でアルブミンまたは免疫グロブリン定常領域への結合が可能なポリペプチド、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択されるポリペプチドを含むか、またはそれからなる、項目［３４］に記載の方法。
【００５１】
［３６］前記半減期延長部分はポリペプチドにコンジュゲートしている、項目［３３］に記載の方法。
【００５２】
［３７］前記半減期延長部分は、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡｓ）、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、ヒアルロン酸およびアルブミン結合リガンド、例えば、脂肪酸鎖、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、項目［３６］に記載の方法。
【００５３】
［３８］工程（ｂ）で得られるろ液における比ＲＣｏ  ＶＷＦ／Ａｇ  ＶＷＦは少なくとも０．７５である、項目［１］〜［３７］のいずれか１つに記載の方法。
【００５４】
［３９］工程（ｂ）で得られるろ液における比ＲＣｏ  ＶＷＦ／Ａｇ  ＶＷＦは少なくとも０．８である、項目［１］〜［３８］のいずれか１つに記載の方法。
【００５５】
［４０］工程（ｂ）で得られるろ液における比ＲＣｏ  ＶＷＦ／Ａｇ  ＶＷＦは少なくとも０．９である、項目［１］〜［３９］のいずれか１つに記載の方法。
【００５６】
［４１］工程（ｂ）で得られるろ液における比ＲＣｏ  ＶＷＦ／Ａｇ  ＶＷＦは少なくとも１．０である、項目［１］〜［４０］のいずれか１つに記載の方法。
【００５７】
［４２］工程（ｂ）で得られるろ液における比ＲＣｏ  ＶＷＦ／Ａｇ  ＶＷＦは少なくとも１．１である、項目［１］〜［４１］のいずれか１つに記載の方法。
【００５８】
［４３］工程（ｂ）で得られるろ液における比ＲＣｏ  ＶＷＦ／Ａｇ  ＶＷＦは少なくとも１．２である、項目［１］〜［４２］のいずれか１つに記載の方法。
【００５９】
［４４］工程（ｂ）で得られるろ液における比ＲＣｏ  ＶＷＦ／Ａｇ  ＶＷＦは、工程（ａ）で準備される溶液における比ＲＣｏ  ＶＷＦ／Ａｇ  ＶＷＦの少なくとも７５％である、項目［１］〜［４３］のいずれか１つに記載の方法。
【００６０】
［４５］ろ過後のＶＷＦ：Ａｇ収率は少なくとも５０％である、項目［１］〜［４４］のいずれか１つに記載の方法。
【００６１】
［４６］ろ過後のＶＷＦ：Ａｇ収率は少なくとも６０％である、項目［１］〜［４５］のいずれか１つに記載の方法。
【００６２】
［４７］ろ過後のＶＷＦ：Ａｇ収率は少なくとも７０％である、項目［１］〜［４６］のいずれか１つに記載の方法。
【００６３】
［４８］ろ過後のＶＷＦ：Ａｇ収率は少なくとも７５％である、項目［１］〜［４７］のいずれか１つに記載の方法。
【００６４】
［４９］ろ過後のＲＣｏ  ＶＷＦ収率は少なくとも４０％である、項目［１］〜［４８］のいずれか１つに記載の方法。
【００６５】
［５０］ろ過後のＲＣｏ  ＶＷＦ収率は少なくとも４５％である、項目［１］〜［４９］のいずれか１つに記載の方法。
【００６６】
［５１］ろ過後のＲＣｏ  ＶＷＦ収率は少なくとも５０％である、項目［１］〜［５０］のいずれか１つに記載の方法。
【００６７】
［５２］ろ過後のＲＣｏ  ＶＷＦ収率は少なくとも５５％である、項目［１］〜［５１］のいずれか１つに記載の方法。
【００６８】
［５３］工程（ａ）で準備される溶液、および工程（ｂ）で得られるろ液は、多量体電気泳動により分析した場合に、ＶＷＦの低多量体（１〜５のバンド）、ＶＷＦの中間多量体（６〜１０のバンド）、およびＶＷＦの大多量体（ＨＭＷＭ、高分子量多量体、１１超のバンド）を含み、但し、工程（ｂ）で得られるろ液における大多量体の相対量は、工程（ａ）で準備される溶液における総ＶＷＦ含有量および工程（ｂ）で得られるろ液における総ＶＷＦ含有量それぞれと比較して、少なくとも７０％である、項目［１］〜［５２］のいずれか１つに記載の方法。
【００６９】
［５４］工程（ｂ）で得られるろ液における大多量体の相対量は少なくとも７５％である、項目［５３］に記載の方法。
【００７０】
［５５］工程（ｂ）で得られるろ液における大多量体の相対量は少なくとも８０％である、項目［５３］に記載の方法。
【００７１】
［５６］工程（ｂ）で得られるろ液における大多量体の相対量は少なくとも８５％である、項目［５３］に記載の方法。
【００７２】
［５７］前記少なくとも１種のアミノ酸は、アルギニン、リシン、ヒスチジン、オルニチン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、項目［１］〜［５６］のいずれか１つに記載の方法。
【００７３】
［５８］前記少なくとも１種のアミノ酸はアルギニンである、項目［１］〜［５７］のいずれか１つに記載の方法。
【００７４】
［５９］前記少なくとも１種のアミノ酸はリシンである、項目［１］〜［５７］のいずれか１つに記載の方法。
【００７５】
［６０］前記少なくとも１種のアミノ酸はヒスチジンである、項目［１］〜［５７］のいずれか１つに記載の方法。
【００７６】
［６１］工程（ａ）で準備される溶液は、ＶＷＦに加えて因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）を含み、工程（ａ）で準備される溶液は好ましくは、ＶＷＦおよびＦＶＩＩＩの複合体を含み得る、項目［１］〜［６０］のいずれか１つに記載の方法。
【００７７】
［６２］項目［１］〜［６１］のいずれか１つに記載の方法により得ることができるＶＷＦのろ過溶液。
【００７８】
［６３］項目［１］〜［６１］のいずれか１つに記載の方法により得ることができるＶＷＦを含む組成物。
【００７９】
［６４］ＶＷＦを精製する方法であって、項目［１］〜［６１］のいずれか１つに記載の方法を含む前記方法。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
第１の態様では、本発明は、ＶＷＦを含む溶液をろ過する方法に関する。この方法は、（ａ）ＶＷＦと、少なくとも１５０ｍＭの塩基性アミノ酸とを含む溶液を準備すること、および（ｂ）工程（ａ）の溶液を、細孔径が３５ｎｍ以下であるフィルタに通すウイルスろ過にかけることを含む。
【００８１】
フォン・ウィルブランド因子
用語「フォン・ウィルブランド因子」または「ＶＷＦ」は、本明細書で使用される場合、野生型ＶＷＦの生物活性またはＶＷＦの少なくとも部分的な生物活性を有するあらゆるポリペプチドを指す。
【００８２】
「生物活性」は、ヒトに投与された場合にＶＷＦがインビボでも果たすＶＷＦの測定可能な機能を意味する。本明細書で使用される場合、用語「機能」および「機能的な」ならびに同類のものは、ＶＷＦの生物学的な、酵素的な、または治療的な機能を指す。ＶＷＦの生物活性を、例えば、リストセチン補因子活性（ＶＷＦ：ＲＣｏＦ）を決定する方法（Ｆｅｄｅｒｉｃｉ  ＡＢ他、２００４．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ８９：７７〜８５頁）を使用して、血小板糖タンパク質複合体Ｉｂ−Ｖ−ＩＸのＧＰ  １ｂに対するＶＷＦの結合を決定する方法（Ｓｕｃｋｅｒ他、２００６．Ｃｌｉｎ  Ａｐｐｌ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ．１２：３０５〜３１０頁）を使用して、コラーゲン結合アッセイ（Ｋａｌｌａｓ  ＆  Ｔａｌｐｓｅｐ．２００１．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ８０：４６６〜４７１頁）を使用して、またはＦＶＩＩＩ結合アッセイを使用して、当業者により決定され得る。ＦＶＩＩＩ結合は、例えばＢｉａｃｏｒｅ分析により決定することができる。
【００８３】
用語「フォン・ウィルブランド因子」（ＶＷＦ）は、天然に存在する（天然の）ＶＷＦを含むだけでなく、天然に存在するＶＷＦの生物活性の少なくとも一部を有する、天然に存在するＶＷＦのバリアントも含み、例えば、１つまたはそれ以上の残基が挿入されているか、欠失されているか、または置換されている配列バリアントも含む。野生型ＶＷＦをコードする遺伝子は９ｋｂのｍＲＮＡへと転写され、このｍＲＮＡは、推定分子量が３１０，０００Ｄａである２８１３個のアミノ酸のプレプロポリペプチドへと翻訳される。このプレプロポリペプチドは２８１３個のアミノ酸からなり、２２個のアミノ酸のシグナルペプチドと、７４１個のアミノ酸のプロポリペプチドと、成熟サブユニットとを含む。Ｎ末端からの７４１個のアミノ酸のプロポリペプチドの切断により、２０５０個のアミノ酸からなる成熟ＶＷＦが生じる。野生型プレプロＶＷＦのｃＤＮＡ配列を配列番号１に示す。野生型プレプロＶＷＦのアミノ酸配列を配列番号２に示す。用語「ＶＷＦ」は、本明細書で使用される場合、別途示さない限りＶＷＦの成熟形態を指す。
【００８４】
好ましくは、野生型ＶＷＦは、配列番号２に示す野生型ＶＷＦのアミノ酸配列を含む。同様に包含されるのは、ＶＷＦの少なくとも一部の生物活性が保持される限りにおいて、ＶＷＦの付加、挿入、Ｎ末端欠失、Ｃ末端欠失、または内部欠失である。
【００８５】
好ましい実施形態では、ＶＷＦは血漿由来のＶＷＦであり、より好ましくはヒト血漿由来のＶＷＦである。
【００８６】
本発明の方法のある特定の実施形態では、ＶＷＦは、例えば国際公開第２０１０／０４８２７５Ａ２号パンフレットに記載のように、組み換えにより産生された野生型ＶＷＦであるか、またはこの野生型ＶＷＦのバリアントであって、例えば１つもしくはそれ以上のアミノ酸の欠失、付加、および／もしくは置換が導入されて、タンパク質の少なくとも１種の生物活性が増加しているかもしくは減少している、バリアントである。
【００８７】
したがって、ある特定の実施形態は、これらの組み合わせおよびそのバリアントを含むＶＷＦ関連配列の内のいずれか１つまたはそれ以上を用いてもよい。同様に含まれるのは、他の生物（例えば、本明細書に記載の他の哺乳動物および当分野で既知の他の哺乳動物）からのＶＷＦ関連配列である。
【００８８】
ある特定の実施形態では、用語「ＶＷＦ」はＶＷＦの融合タンパク質、好ましくは、ＶＷＦタンパク質と異種融合パートナーとの融合タンパク質を含む。異種融合パートナーまたは異種配列と、ＶＷＦタンパク質の少なくとも１つの最小フラグメントまたは最小部分とを含む融合タンパク質または改変タンパク質も、同様に含まれる。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」は、（例えば、複数のフラグメントを作成するために）別の（例えば異なる）ＶＷＦタンパク質に連結されたか、非ＶＷＦタンパク質に連結されたか、または両方に連結されたＶＷＦタンパク質またはそのフラグメントを含む。「非ＶＷＦタンパク質」は、野生型ＶＷＦタンパク質とは異なるタンパク質に対応するアミノ酸配列を有する「異種ポリペプチド」を指し、同一のまたは異なる生物に由来し得る。融合タンパク質のＶＷＦ部分は、生物学的に活性なＶＷＦタンパク質のアミノ酸配列の全てまたはフラグメントに対応し得る。ある特定の実施形態では、ＶＷＦ融合タンパク質は、ＶＷＦタンパク質の少なくとも１つ（または２つ、３つ等）の生物学的に活性な部分を含む。
【００９０】
より一般的には、アルブミンもしくは免疫グロブリン等の異種配列への融合、または抗原結合ドメインを有しない免疫グロブリンに由来するフラグメント（例えばＦｃフラグメント）への融合を利用して、ＶＷＦの望ましくない特性を除去し得るか、または望ましい特性（例えば薬物動態特性）を改善し得る。例えば、異種配列への融合は、化学的安定性を増加させ得、免疫原性を減少させ得、インビボでのターゲティングを改善し得、および／またはＶＷＦタンパク質の循環中の半減期を延長し得る。
【００９１】
ＶＷＦ配列と融合し得る好適な異種配列として、下記が挙げられるがこれらに限定されない：免疫グロブリン定常領域およびその一部、例えばＦｃフラグメント、トランスフェリンおよびそのフラグメント、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド、ＸＴＥＮとして既知の、大きな流体力学的体積を有する溶媒和ランダム鎖、ホモアミノ酸リピート（ＨＡＰ）、プロリン−アラニン−セリンリピート（ＰＡＳ）、アルブミン、アファミン、アルファ−フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、生理学的条件下でアルブミンまたは免疫グロブリン定常領域への結合が可能なポリペプチド、ならびにこれらの組み合わせ。
【００９２】
「アルブミン」は、本明細書で使用される場合、ヒト血清アルブミンおよびウシ血清アルブミン等のアルブミンファミリのタンパク質（そのバリアントおよびその誘導体、例えば、遺伝子操作されたかまたは化学的に改変されたアルブミンバリアントおよびアルブミンタンパク質のフラグメントを含む）のポリペプチドを含む。融合タンパク質のアルブミン部分は、どの脊椎動物（特に、あらゆる哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、またはブタ）に由来してもよい。非哺乳動物のアルブミンとして、ニワトリおよびサケが挙げられるがこれらに限定されない。アルブミン連結ポリペプチドのアルブミン部分は、融合タンパク質のＶＷＦタンパク質部分とは異なる動物に由来してもよい。好ましくは、アルブミンはヒト血清アルブミンである。
【００９３】
本明細書で使用される用語「アルブミン」に含まれるアルブミンファミリのタンパク質は、進化的に関連する血清輸送タンパク質を含み、例えば、アルブミン、アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ；Ｂｅａｔｔｉｅ  ＆  Ｄｕｇａｉｃｚｙｋ、Ｇｅｎｅ．２０：４１５〜４２２頁、１９８２年）、アファミン（ＡＦＭ；Ｌｉｃｈｅｎｓｔｅｉｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１８１４９〜１８１５４頁、１９９４年）、およびビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ；Ｃｏｏｋｅ  ＆  Ｄａｖｉｄ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６：２４２０〜２４２４頁、１９８５年）を含む。アルファ−フェトプロテインは、付着した治療用ポリペプチドの半減期を延長させると言われている（国際公開第２００５／０２４０４４Ａ号パンフレットを参照されたい）。これらの遺伝子は、構造的なおよび機能的な類似性がヒト、マウス、およびラットの同一の染色体領域にマッピングされている多重遺伝子クラスターを表す。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、融合タンパク質の一部として、本明細書で定義されたそのようなアルブミンファミリメンバーまたはそのフラグメントおよびそのバリアントを使用し得る。本発明の治療用融合タンパク質のアルブミンファミリメンバーは、ＡＦＰ、ＡＦＭ、およびＤＢＰの天然に存在する多型バリアントを含み得る。
【００９４】
ＶＷＦタンパク質またはそのフラグメントもしくはそのバリアントは、ヒト血清アルブミンポリペプチドまたはそのフラグメントもしくはそのバリアントに融合し得る（例えば国際公開第２００９／１５６１３７Ａ１号パンフレットを参照されたい）。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡまたはＨＡ）は、成熟形態では５８５個のアミノ酸のタンパク質であり、血清の浸透圧のかなりの割合を担い、内因性のおよび外因性のリガンドのキャリアとしても機能する。数ある利点の中でも、ＨＳＡまたはそのフラグメントもしくはそのバリアントへの融合により、本明細書に記載のＶＷＦタンパク質の貯蔵寿命、血清半減期、および／または治療活性が増加し得る。
【００９５】
好ましくは、融合タンパク質は、Ｃ末端部分としてアルブミンを含み、Ｎ末端部分としてＶＷＦタンパク質を含む。他の実施形態では、この融合タンパク質は、アルブミンのＮ末端およびＣ末端の両方に融合したＶＷＦタンパク質を有する。
【００９６】
好ましい実施形態では、本発明に従うＶＷＦは、国際公開第２００９／１５６１３７Ａ１号パンフレットで開示されているＶＷＦ−アルブミン融合タンパク質である。
【００９７】
ペプチドリンカー配列を用いて、融合タンパク質の構成成分を分離することができる。例えば、ペプチドリンカーは、各ポリペプチドがその二次構造および三次構造へと確実に折り畳むのに十分な距離で構成成分を分離し得る。そのようなペプチドリンカー配列は、本明細書に記載されており且つ当分野で公知の標準的な技術を使用して、融合タンパク質へと組み込まれ得る。適切なペプチドリンカー配列は、下記の因子に基づいて選択され得る：（１）柔軟な拡張コンフォメーションを採用することができること；（２）第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの機能的エピトープと相互作用する可能性がある二次構造を採用することができないこと；ならびに（３）ポリペプチドの機能的エピトープと反応する可能性がある疎水性のまたは荷電した残基の欠如。リンカーとして有用に用いられるアミノ酸配列として、Ｍａｒａｔｅａ他、Ｇｅｎｅ  ４０：３９〜４６頁、１９８５年；Ｍｕｒｐｈｙ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８〜８２６２頁、１９８６年；米国特許第４９３５２３３号明細書および米国特許第４７５１１８０号明細書で開示されているものが挙げられる。
【００９８】
非ペプチドリンカーまたはペプチドリンカーの内の１つまたはそれ以上は任意選択される。例えば、第１および第２のポリペプチドが、機能的ドメインを分離し且つ立体干渉を防ぐために使用される非必須のＮ末端アミノ酸領域および／またはＣ末端アミノ酸領域を有する融合タンパク質では、リンカー配列は必要とされない場合がある。
【００９９】
本発明のある特定の実施形態はまた、本明細書に記載のように、タンパク質の所望の特性を改善した改変を含む改変ＶＷＦタンパク質の使用も企図する。ＶＷＦタンパク質の改変として、１つまたはそれ以上の構成アミノ酸での化学的なおよび／または酵素的な誘導体化が挙げられ、例えば、側鎖改変、骨格改変、ならびにＮ末端改変およびＣ末端改変が挙げられ、例えば、アセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化、ならびに炭水化物部分または脂質部分、補因子、および同類のものの付着が挙げられる。例示的な改変としてＶＷＦタンパク質のＰＥＧ化も挙げられる（例えば、参照により本明細書に組み入れるＶｅｒｏｎｅｓｅ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４：４５３〜４５６頁、２００２年を参照されたい）。生物学的に許容可能なポリマーに化学的にコンジュゲートしているＶＷＦバリアントは、例えば国際公開第２００６／０７１８０１Ａ２号パンフレットに記載されている。
【０１００】
ある特定の実施形態では、半減期延長部分はポリペプチドのＶＷＦ部分にコンジュゲートしている。適切な半減期延長部分として、下記が挙げられるがこれらに限定されない：ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡｓ）、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、ヒアルロン酸およびアルブミン結合リガンド、例えば、脂肪酸鎖、ならびにこれらの組み合わせ。
【０１０１】
本発明はまた、ＶＷＦタンパク質の「バリアント」と共に使用され得る。タンパク質「バリアント」という用語は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、および／または置換により配列番号２と区別されており且つ、典型的に参照タンパク質の１つまたはそれ以上の活性を保持するタンパク質を含む。置換に適したアミノ酸を特定し、参照配列と比較して活性が実質的に変更されていない、改善されている、または減少しているバリアントを設計することは、当業者の技術内である。
【０１０２】
タンパク質バリアントは、本明細書に記載されており且つ当分野で公知であるように、保存的であってもよいし非保存的であってもよい、１つまたはそれ以上の置換により参照配列と区別され得る。ある特定の実施形態では、タンパク質バリアントは保存的置換を含み、これに関して、タンパク質の活性の性質を変えることなく、いくつかのアミノ酸が広く類似した特性を有する他のものに変更され得ることは、当分野で十分に理解される。
【０１０３】
上記のように、生物学的に活性なバリアントタンパク質は、参照残基と比較して、配列に沿った様々な位置で保存的アミノ酸置換を含んでもよい。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられているものを含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリは当分野で定義されており、通常は下記のように下位分類される。
【０１０４】
酸性：残基は、生理的ｐＨでＨイオンが失われることにより負電荷を有し、この残基が含まれているペプチドが生理的ｐＨで水性媒体中に存在する場合には、この残基は、このペプチドのコンフォメーションの表面位置をとるように水溶液に引き付けられる。酸性側鎖を有するアミノ酸として、グルタミン酸およびアスパラギン酸が挙げられる。
【０１０５】
塩基性：残基は、生理的ｐＨでＨイオンと会合する、またはその１つもしくは２つのｐＨユニット内のＨイオン（例えばヒスチジン）と会合することにより、正電荷を有し、この残基が含まれているペプチドが生理的ｐＨで水性媒体中に存在する場合には、この残基は、このペプチドのコンフォメーションの表面位置をとるように水溶液に引き付けられる。塩基性側鎖を有するアミノ酸として、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが挙げられる。
【０１０６】
帯電：残基は生理的ｐＨで帯電しており、したがって、酸性側鎖または塩基性側鎖を有するアミノ酸（即ち、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リシン、およびヒスチジン）が挙げられる。
【０１０７】
疎水性：残基は生理的ｐＨで帯電しておらず、この残基が含まれているペプチドが水性媒体中に存在する場合には、この残基は、このペプチドのコンフォメーションの内部位置をとるように水溶液にはじかれる。疎水性側鎖を有するアミノ酸として、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンが挙げられる。
【０１０８】
中性／極性：残基は生理的ｐＨで帯電していないが、この残基が含まれているペプチドが水性媒体中に存在する場合に、この残基は、このペプチドのコンフォメーションの内部位置をとるほどには水溶液に十分にはじかれていない。中性／極性側鎖を有するアミノ酸として、アスパラギン、グルタミン、システイン、ヒスチジン、セリン、およびトレオニンが挙げられる。
【０１０９】
この説明はまた、特定のアミノ酸を「小さい」とも特徴付け、なぜならば、疎水性を付与するために極性基が欠如しているとしても側鎖が十分に大きくないからである。プロリンを除いて、「小さい」アミノ酸は、少なくとも１つの極性基が側鎖に存在する場合には４個以下の炭素を有するものであり、そうでない場合には３個以下の炭素を有するものである。小さい側鎖を有するアミノ酸として、グリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンが挙げられる。遺伝子にコードされた二次アミノ酸プロリンは、ペプチド鎖の二次コンフォメーションへの既知の影響に起因して、特殊なケースである。プロリンの構造は、その側鎖がα−アミノ基の窒素およびα−炭素に結合しているという点で、全ての他の天然に存在するアミノ酸とは異なる。本発明の目的のために、プロリンは「小さい」アミノ酸と分類される。
【０１１０】
極性または非極性としての分類に必要な引力または斥力の程度は任意であり、したがって、本発明により具体的に企図されるアミノ酸は、どちらか一方に分類されている。具体的に名前が挙げられていないほとんどのアミノ酸は、既知の挙動に基づいて分類され得る。
【０１１１】
アミノ酸残基は、残基の側鎖置換基を基準として環状または非環状の、および芳香族または非芳香族の自明の分類へとさらに下位分類され、且つさらに大きさにより下位分類される。残基は、追加の極性置換基が存在するという条件で、カルボキシル炭素を含んで合計で４個以下の炭素原子を含む場合には小さいと見なされ、そうでない場合には３個以下の炭素原子を含む場合に小さいと見なされる。当然のことながら、小さい残基は常に非芳香族である。構造上の特性に応じて、アミノ酸残基は２つ以上のクラスに分類され得る。天然に存在するタンパク質アミノ酸に関して、このスキームに従う下位分類を下記の表１に表す。
【０１１２】
【表１】
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【０１１３】
保存的アミノ酸置換には、側鎖に基づくグルーピングも含まれる。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリンおよびトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リシン、アルギニン、およびヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、システインおよびメチオニンである。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンへの置き換え、アスパラギン酸のグルタミン酸への置き換え、トレオニンのセリンへの置き換え、または構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の同様の置き換えは、結果として生じるバリアントポリペプチドの特性への大きな影響を有しないであろうと予想することは理にかなっている。アミノ酸の変更により生物学的に活性なタンパク質が得られるかどうかを、本明細書に記載のように、その発色活性および／または凝固活性をアッセイすることにより容易に決定し得る。
【０１１４】
ＶＷＦ溶液
本発明の工程（ａ）で言及される溶液は、ＶＷＦと、少なくとも１５０ｍＭの塩基性アミノ酸または塩基性アミノ酸の組み合わせを含む。
【０１１５】
ろ過される溶液中のＶＷＦは好ましくは、ＶＷＦの高分子量多量体（ＨＭＷＭ）を含む。
【０１１６】
用語「高分子量ＶＷＦ多量体」または「ＨＭＷ  ＶＷＦ多量体」または「ＶＷＦのＨＭＷＭ」は同義語として使用され、Ｏｔｔ他（Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０１０；１３３：３２２〜３３０頁）に従うＶＷＦ濃度分析でのバンド１１以上に対応することを意味しており、「より高い」は、バンド１１および全てのより大きいＶＷＦ多量体を意味する。
【０１１７】
用語「低分子量ＶＷＦ多量体」または「低多量体」または「ＶＷＦのＬＭＷＭ」は同義語として使用され、Ｏｔｔ他（Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０１０；１３３：３２２〜３３０頁）に従うＶＷＦ濃度分析でのバンド１〜５に対応することを意味している。
【０１１８】
用語「中間分子量ＶＷＦ多量体」または「中間多量体」または「ＶＷＦのＩＭＷＭ」は同義語として使用され、Ｏｔｔ他（Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０１０；１３３：３２２〜３３０頁）に従うＶＷＦ濃度分析でのバンド６〜１０に対応することを意味している。
【０１１９】
ろ過される溶液におけるＶＷＦ濃度（Ａｇ  ＶＷＦ）は、０．１〜３０ＩＵ／ｍｌの範囲であり得、好ましくは、１〜２５ＩＵ／ｍｌの範囲、または３〜２０ＩＵ／ｍｌの範囲、または５〜１５ＩＵ／ｍｌの範囲である。
【０１２０】
ろ過される溶液におけるＶＷＦ濃度（ＲＣｏ  ＶＷＦ）は、０．１〜３０ＩＵ／ｍｌの範囲であり得、好ましくは、１〜２５ＩＵ／ｍｌの範囲、または３〜２０ＩＵ／ｍｌの範囲、または５〜１５ＩＵ／ｍｌの範囲である。
【０１２１】
ろ過される溶液における比ＲＣｏ  ＶＷＦ／Ａｇ  ＶＷＦは好ましくは、少なくとも０．７５、または少なくとも０．８、または少なくとも０．９、または少なくとも１．０、または少なくとも１．１、または少なくとも１．２である。典型的には、ろ過される溶液における比ＲＣｏ  ＶＷＦ／Ａｇ  ＶＷＦは０．５〜２の範囲、好ましくは０．７５〜１．８または０．８〜１．６の範囲である。
【０１２２】
ろ過されるＶＷＦ溶液はまた、因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）も含んでもよい。ろ過される溶液におけるＦＶＩＩＩ濃度は、約０．１ＩＵ／ｍｌ〜約２０ＩＵ／ｍｌまたは約１ＩＵ／ｍｌ〜約１０ＩＵ／ｍｌの範囲であり得る。ＦＶＩＩＩは、ＶＷＦとの複合体として存在する場合がある。
【０１２３】
塩基性アミノ酸
用語「塩基性アミノ酸」は、本明細書で使用される場合、等電点が７超であるアミノ酸を指す。
【０１２４】
ろ過されるＶＷＦ溶液は、少なくとも１５０ｍＭの濃度で１種の塩基性アミノ酸を含み得るか、または塩基性アミノ酸の組み合わせを含み得、このＶＷＦ溶液における全ての塩基性アミノ酸の総濃度は少なくとも１５０ｍＭである。例えば、このＶＷＦ溶液は、１５０ｍＭのアルギニンを含み得るか、または７５ｍＭのアルギニンと７５ｍＭのリシンとを含み得、その結果、塩基性アミノ酸の総濃度は１５０ｍＭである。両方の実施形態が本発明の範囲内である。
【０１２５】
好ましくは、塩基性アミノ酸は、アルギニン、リシン、ヒスチジン、オルニチン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。より好ましくは、塩基性アミノ酸は、アルギニン、リシン、ヒスチジン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１２６】
好ましい実施形態では、塩基性アミノ酸はアルギニンである。より好ましくは、アルギニンは、ろ過されるＶＷＦ溶液中の唯一の塩基性アミノ酸である。
【０１２７】
別の実施形態では、塩基性アミノ酸はリシンである。好ましくは、リシンは、ろ過されるＶＷＦ溶液中の唯一の塩基性アミノ酸である。
【０１２８】
別の実施形態では、塩基アミノ酸はヒスチジンである。好ましくは、ヒスチジンは、ろ過されるＶＷＦ溶液中の唯一の塩基性アミノ酸である。
【０１２９】
さらに別の実施形態では、塩基性アミノ酸は、アルギニンおよびリシンの組み合わせである。
【０１３０】
さらに別の実施形態では、塩基性アミノ酸は、アルギニンおよびヒスチジンの組み合わせである。
【０１３１】
さらに別の実施形態では、塩基性アミノ酸は、ヒスチジンおよびリシンの組み合わせである。
【０１３２】
さらに別の実施形態では、塩基性アミノ酸は、アルギニン、リシン、およびヒスチジンの組み合わせである。
【０１３３】
ろ過される溶液における少なくとも１種の塩基性アミノ酸の濃度は好ましくは、少なくとも２００ｍＭ、または少なくとも２５０ｍＭ、または少なくとも３００ｍＭ、または少なくとも３５０ｍＭ、または少なくとも４００ｍＭ、または少なくとも４５０ｍＭ、または少なくとも５００ｍＭである。ろ過される溶液における少なくとも１種の塩基性アミノ酸の濃度は、１，０００ｍＭ未満、または９５０ｍＭ未満、または９００ｍＭ未満、または８５０ｍＭ未満、または８００ｍＭ未満、または７５０ｍＭ未満、または７００ｍＭ未満であることがさらに好ましい。他の実施形態では、ろ過される溶液における少なくとも１種の塩基性アミノ酸の濃度は、１５０ｍＭ〜１，０００ｍＭの範囲、または２００ｍＭ〜９５０ｍＭの範囲、または２５０ｍＭ〜９００ｍＭの範囲、または３００ｍＭ〜８５０ｍＭの範囲、または３５０ｍＭ〜８００ｍＭの範囲である。最も好ましくは、ろ過される溶液における少なくとも１種の塩基性アミノ酸の濃度は４００ｍＭ〜８００ｍＭの範囲であり、例えば４５０ｍＭ〜７５０ｍＭまたは５００ｍＭ〜７００ｍＭの範囲である。特に好適な濃度として、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約５５０ｍＭ、約６００ｍＭ、約６５０ｍＭ、約７００ｍＭ、および約７５０ｍＭが挙げられる。
【０１３４】
ろ過される溶液は、ＶＷＦおよび少なくとも１種の塩基性アミノ酸に加えて、さらなる化合物を含んでもよい。好ましい実施形態では、ろ過される溶液はカルシウムイオン（Ｃａ２＋）をさらに含む。ろ過される溶液におけるカルシウムイオンの濃度は好ましくは、少なくとも５０ｍＭ、または少なくとも１００ｍＭ、または少なくとも１５０ｍＭ、または少なくとも２００ｍＭ、または少なくとも２５０ｍＭ、または少なくとも３００ｍＭ、または少なくとも３５０ｍＭである。好ましくは、ろ過される溶液におけるカルシウムイオンの濃度は、５０ｍＭ〜８００ｍＭの範囲、または１００ｍＭ〜７５０ｍＭの範囲、または１５０ｍＭ〜７００ｍＭの範囲、または２００ｍＭ〜６５０ｍＭの範囲、または２５０ｍＭ〜６００ｍＭの範囲、または３００ｍＭ〜５５０ｍＭの範囲、または３５０ｍＭ〜５００ｍＭの範囲である。
【０１３５】
ろ過されるＶＷＦ溶液は、追加の化合物（例えば、限定されないが、アルカリ金属塩、アミノ酸、および緩衝物質）を含んでもよい。好ましい追加の化合物として、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、グリシン、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、ＭＥＳ、およびＨＥＰＥＳが挙げられる。
【０１３６】
最も好ましくは、ろ過される溶液は、ＶＷＦと、４００ｍＭ〜８００ｍＭのアルギニンと、３００ｍＭ〜５００ｍＭのＣａＣｌ２とを含む。
【０１３７】
ろ過される溶液は概して、ｐＨが６．０〜８．０の範囲である。好ましくは、この溶液のｐＨは６．１〜７．８、または６．２〜７．６、または６．３〜７．４、または６．４〜７．２である。より好ましくは、この溶液のｐＨは６．５〜７．１である。最も好ましくは、このｐＨは６．６〜７．０または６．７〜６．９であり、例えば約６．８である。このｐＨを、適切な緩衝物質（例えばＭＥＳまたはＨＥＰＥＳ）の使用により調整、維持することができる。
【０１３８】
ろ過される溶液におけるタンパク質濃度は概して、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの範囲、好ましくは約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約０．８ｍｇ／ｍｌの範囲、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約０．５ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【０１３９】
フィルタ
本発明の方法で使用するフィルタは、公称細孔径が３５ｎｍ以下である。好ましくは、このフィルタの公称細孔径は２５ｎｍ以下である。より好ましくは、このフィルタの公称細孔径は２２ｎｍ以下である。最も好ましくは、このフィルタの公称細孔径は２０ｎｍ以下であり、例えば、１５ｎｍ、１６ｎｍ、１７ｎｍ、１８ｎｍ、または１９ｎｍである。本発明の方法で使用するフィルタの公称細孔径は好ましくは、１５ｎｍ〜３５ｎｍの範囲、または１６ｎｍ〜３０ｎｍの範囲、または１７ｎｍ〜２５ｎｍの範囲、または１８ｎｍ〜２２ｎｍの範囲である。
【０１４０】
本発明の方法で使用するフィルタは、細孔径の中央値が３５ｎｍ以下である。好ましくは、このフィルタの細孔径の中央値は２５ｎｍ以下である。より好ましくは、このフィルタの細孔径の中央値は２２ｎｍ以下である。最も好ましくは、このフィルタの細孔径の中央値は２０ｎｍ以下であり、例えば、１５ｎｍ、１６ｎｍ、１７ｎｍ、１８ｎｍ、または１９ｎｍである。本発明の方法で使用するフィルタの細孔径の中央値は好ましくは、１５ｎｍ〜３５ｎｍの範囲、または１６ｎｍ〜３０ｎｍの範囲、または１７ｎｍ〜２５ｎｍの範囲、または１８ｎｍ〜２２ｎｍの範囲である。
【０１４１】
このフィルタの膜を様々な材料で製造し得る。好ましくは、この膜は、ポリエーテルスルホン（例えば、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｖｉｒｏｓａｒｔ（登録商標）ＣＰＶ）、親水性で場合により改変されているポリフッ化ビニリデン（例えば、Ｐａｌｌ  Ｐｅｇａｓｕｓ（商標）ＳＶ４）、またはセルロース、例えば銅アンモニア再生セルロース（例えば、ＡｓａｈｉＫａｓｅｉ  Ｐｌａｎｏｖａ  ２０Ｎ）を含むか、またはこれから実質的になる。
【０１４２】
好適なフィルタとして、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｖｉｒｏｓａｒｔ（登録商標）ＣＰＶ、Ｐａｌｌ  Ｐｅｇａｓｕｓ（商標）ＳＶ４、およびＡｓａｈｉＫａｓｅｉ  Ｐｌａｎｏｖａ  ２０Ｎが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの好適なフィルタを下記の表２にまとめる。
【０１４３】
【表２】
2020531516.tif 000003
【０１４４】
フィルタ膜の有効表面は約０．００１ｍ２〜約１０ｍ２の範囲、または約０．０１ｍ２〜約４ｍ２の範囲、または約０．１ｍ２〜約１ｍ２であり得る。
【０１４５】
ろ過プロセス
典型的には、本発明の方法に従うろ過をデッドエンドろ過として実行する。ろ過される溶液の量は１０ｍＬ〜１００Ｌの範囲、または１００ｍｌ〜１０Ｌの範囲、または０．５Ｌ〜５Ｌの範囲であり得る。
【０１４６】
ろ過の開始時およびろ過プロセスの最中でのろ過される溶液の温度は、約１０℃〜約３０℃の範囲であり得る。好ましくは、ろ過の開始時およびろ過プロセスの最中でのろ過される溶液の温度は、１５℃〜２９℃または１８℃〜２８℃であり、例えば、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、または約２７℃である。
【０１４７】
このろ過を概して１ｂａｒ未満の圧力で実行する。好ましくは、このろ過を０．７５ｂａｒ未満の圧力で実行する。より好ましくは、このろ過を０．５ｂａｒ未満の圧力で実行する。最も好ましくは、このろ過を０．１ｂａｒ〜０．４５ｂａｒまたは０．２ｂａｒ〜０．４ｂａｒの圧力で実行し、例えば約０．３ｂａｒの圧力で実行する。
【０１４８】
ろ過の流速は約１Ｌ／時間／ｍ２〜約３０Ｌ／時間／ｍ２の範囲であり得る。好ましくは、ろ過の流速は約５Ｌ／時間／ｍ２〜約２５Ｌ／時間／ｍ２であり、より好ましくはろ過の流速は約１０Ｌ／時間／ｍ２〜約２０Ｌ／時間／ｍ２であり得る。
【０１４９】
ろ液
本発明のろ過プロセスにより、生物活性が高いＶＷＦを含むろ液が得られる。
【０１５０】
本発明の方法におけるろ過後のＶＷＦ：Ａｇ収率は概して少なくとも５０％であり、好ましくは少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％である。
【０１５１】
本発明の方法におけるろ過後のＲＣｏ  ＶＷＦ収率は概して少なくとも４０％であり、好ましくは少なくとも４５％、少なくとも５０％、または少なくとも５５％である。
【０１５２】
好ましくは、本発明の方法の工程（ｂ）で得られるろ液における比ＲＣｏ  ＶＷＦ／Ａｇ  ＶＷＦは、少なくとも０．７５、少なくとも０．８、少なくとも０．９、少なくとも１．０、少なくとも１．１、または少なくとも１．２である。
【０１５３】
別の実施形態では、工程（ｂ）で得られるろ液における比ＲＣｏ  ＶＷＦ／Ａｇ  ＶＷＦは、工程（ａ）で準備される溶液における比ＲＣｏ  ＶＷＦ／Ａｇ  ＶＷＦの少なくとも７５％である。この比ＲＣｏ  ＶＷＦ／Ａｇ  ＶＷＦは、ろ過に起因して２５％未満減少し、好ましくは、この減少は２０％未満、または１５％未満、または１０％未満、または５％未満である。より好ましくは、この比ＲＣｏ  ＶＷＦ／Ａｇ  ＶＷＦは、ＶＷＦ溶液のろ過に起因して減少しない。最も好ましくは、この比ＲＣｏ  ＶＷＦ／Ａｇ  ＶＷＦは、ろ過に起因して増加する。
【０１５４】
別の実施形態では、工程（ｂ）で得られるろ液は、多量体電気泳動により分析した場合に、ＶＷＦの低多量体（１〜５のバンド）、ＶＷＦの中間多量体（６〜１０のバンド）、およびＶＷＦの大多量体（ＨＭＷＭ、高分子量多量体、１１超のバンド）を含む。用語「大多量体」および「高分子量多量体」は、別途示さない場合には本明細書において同義語として使用される。好ましくは、工程（ｂ）で得られるろ液における大多量体の相対量は、このろ液における総ＶＷＦ含有量と比較して、それぞれ少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％である。
【０１５５】
さらに別の実施形態では、工程（ａ）で準備される溶液、および工程（ｂ）で得られるろ液は、多量体電気泳動により分析した場合に、ＶＷＦの低多量体（１〜５のバンド）、ＶＷＦの中間多量体（６〜１０のバンド）、およびＶＷＦの大多量体（ＨＭＷＭ、高分子量多量体、１１超のバンド）を含む。好ましくは、工程（ｂ）で得られるろ液における大多量体の相対量は、この実施形態に従って工程（ａ）で準備される溶液における総ＶＷＦ含有量および工程（ｂ）で得られるろ液における総ＶＷＦ含有量それぞれと比較して、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％である。さらに別の好ましい実施形態では、工程（ｂ）で得られるろ液における大多量体の前記相対量は、工程（ａ）で準備される溶液における大多量体の相対量と本質的に同一である。
【０１５６】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のプロセスにより得ることができる、ＶＷＦを含むろ過溶液である。このろ過溶液は概して、ＶＷＦ  Ａｇ活性、ＶＷＦ  ＲＣｏ活性、および多量体含有量に関して、上で説明されている特性の内の１つまたはそれ以上を有する。
【０１５７】
別の態様では、本発明は、ＶＷＦと、４００ｍＭ〜８００ｍＭの濃度のアルギニンとを含む溶液に関する。本発明の溶液における好ましいアルギニン濃度は、上で説明されているように、ろ過される溶液における好ましいアルギニン濃度に対応する。好ましくは、この溶液は、カルシウムイオンを少なくとも１００ｍＭの濃度でさらに含む。本発明の溶液における好ましいカルシウムイオン濃度は、上で説明されているように、ろ過される溶液における好ましいカルシウムイオン濃度に対応する。他の実施形態では、本発明の溶液は、上で説明されているように、ろ過される溶液の任意の成分である１種またはそれ以上のさらなる化合物を含んでもよい。
【０１５８】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の方法により得ることができる、ＶＷＦを含む組成物である。
【０１５９】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書において上で説明されている方法を含む、ＶＷＦを精製するプロセスに関する。
【０１６０】
精製されるＶＷＦは、血漿由来のＶＷＦであってもよいし、組み換えにより産生されたＶＷＦであってもよい。
【０１６１】
組み換えＶＷＦまたはそのバリアントを、標準的なプロトコルを使用して簡便に製造することができる。一つの一般例として、組み換えＶＷＦを、下記の内の１つまたはそれ以上を含む手順により製造し得る：（ａ）タンパク質をコードし且つ少なくとも１つの調節エレメントに作動可能に連結されているポリヌクレオチド配列を含む構築物を製造する工程；（ｂ）この構築物を宿主細胞に導入する工程；（ｃ）この宿主細胞を培養してポリペプチドを発現させる工程；および（ｄ）この宿主細胞からポリペプチドを採取するかまたは単離する工程。ＶＷＦを発現するために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または機能的等価物を、適切な発現ベクター（即ち、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクター）に挿入してもよい。当業者に公知の方法を使用して、ＶＷＦをコードする配列と、適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントとを含む発現ベクターを構築し得る。この方法は、インビトロでの組み換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボでの遺伝子組換えを含み、当分野で既知である。
【０１６２】
ＶＷＦを、当分野で既知の様々な技術に従って精製して特性を明らかにすることができる。タンパク質精製を実施してタンパク質純度を分析するための例示的なシステムとして、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）（例えば、ＡＫＴＡシステムおよびＢｉｏ−Ｒａｄ  ＦＰＬシステム）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が挙げられる。精製のための例示的な化学手法として、当分野で既知の中でも、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、Ｑ，Ｓ）、サイズ排除クロマトグラフィー、塩勾配、アフィニティー精製（例えば、Ｎｉ、Ｃｏ、ＦＬＡＧ、マルトース、グルタチオン、プロテインＡ／Ｇ）、ゲルろ過、逆相、セラミックＨｙｐｅｒＤ（登録商標）イオン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）が挙げられる。同様に挙げられるのは、概してタンパク質組成物の純度を測定するために製造プロセスまたは精製プロセスの任意の工程の最中に利用される分析方法であり、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（例えば、クーマシー、銀染色）、分取用等電点電気泳動（ＩＥＦ）、免疫ブロット、ブラッドフォード、示差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、およびＥＬＩＳＡである。
【０１６３】
ある特定の態様では、ＶＷＦを、複数のクロマトグラフィー精製工程（例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、色素クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および好ましくは免疫アフィニティークロマトグラフィーの任意の組み合わせ）にかけて、主に所望のタンパク質を濃縮し、且つ製造、貯蔵、および／または使用の最中に組み換えタンパク質の断片化、活性化、および／または分解を引き起こす可能性がある物質を除去することができる。精製により除去されるのが好ましいそのような物質の実例として、下記が挙げられる：他のタンパク質夾雑物、例えば、ＰＡＣＥ／フリン、ＶＫＯＲ、およびＶＫＧＣのような改変酵素；組み換えタンパク質産生の最中に産生細胞から組織培養培地中に放出されるタンパク質、例えば宿主細胞タンパク質；非タンパク質夾雑物、例えば脂質；ならびにタンパク質夾雑物および非タンパク質夾雑物の混合物、例えばリポタンパク質。ＶＷＦタンパク質の精製手順は当分野で既知である（例えば国際公開第２０１１／０２２６５７Ａ１号パンフレットを参照されたい）。
【０１６４】
ウイルス汚染の理論的リスクを最小限に抑えるために、ウイルスの効果的な不活性化または除去を可能とする追加の工程をこのプロセスに含めてもよい。そのような工程として、例えば、液体状態または固体状態での加熱処理、溶媒および／または洗剤による処理、可視スペクトルまたはＵＶスペクトルでの照射、ガンマ線照射、ならびにウイルスろ過が挙げられる。
【０１６５】
ＶＷＦを精製するプロセスは、本発明の方法に加えて、下記の内の１つまたはそれ以上を含んでもよい：低温沈殿、Ａｌ（ＯＨ）３吸着、グリシン沈殿、塩沈殿、低温殺菌、透析、超遠心分離、滅菌ろ過、希釈、凍結乾燥、およびこれらの組み合わせ。
【０１６６】
本発明の方法およびプロセスにより得られるＶＷＦを、医薬組成物へと製剤化することができる。適切な製剤化は、国際公開第２０１５／１８８２２４Ａ１号パンフレットおよび国際公開第２０１０／０４８２７５Ａ２号パンフレットに記載されている。
【０１６７】
【表３】
2020531516.tif 000004
【実施例】
【０１６８】
実施例１
それぞれ「Ａ」および「Ｂ」と名付けた２種の異なるｒＶＷＦ溶液を、ウイルスろ過にかけた。このｒＶＷＦはＶＷＦ−アルブミン融合体であり、このアミノ酸配列は国際公開第２００９／１５６１３７Ａ１号パンフレットに記載されている。
【０１６９】
溶液「Ａ」または「Ｂ」は、組み換え発現されたＶＷＦを含んでおり、インハウスの細胞培養システムから得ており、且つ別々に精製した。
【０１７０】
ろ過前に様々な量のアルギニンを添加して、表４に示す最終濃度にした。
【０１７１】
全てのＶＷＦ溶液は、ウイルスろ過にかけている際のｐＨが６．８±０．１であった。全てのその後の工程を、２３±５℃の室温で実施した。ウイルスろ過を、デッドエンドろ過として実施した。ウイルスろ過の出発中間体（３０〜５０ｍｌ）を圧力容器に充填し、次いで、０．３ｂａｒの低入力圧力で０．２／０．１μｍプレフィルタおよび２０ｎｍフィルタ（２０Ｎ  Ｐｌａｎｏｖａ；０．００１ｍ２）に順次通してろ過した（入力圧力をプレフィルタの前で測定した）。圧力は圧縮空気から得た。２０Ｎろ液を画分ごとに集め、続いて洗浄後画分を集めた。ろ液画分および洗浄後画分のアリコートを元々の画分体積に比例してプールして、分析するろ過調査（「試料」）の最終サンプルとした。この調査は、使用前リーク試験、ならびに使用後リーク試験および金粒子試験によるろ過後の完全性試験に合格した場合に有効である。
【０１７２】
【表４】
2020531516.tif 000005
【０１７３】
表４から分かるように、ｒＶＷＦ溶液中にアルギニンが存在すると、ＶＷＦ：Ａｇおよび／またはＶＷＦ：ＲＣｏの収率が増加する。
【０１７４】
試料番号１および２からのろ液をポリアクリルアミドゲルで分離し、クーマシーブルーで染色した。このゲルをスキャンし、製造業者の指示に従ってＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアでバンドを評価した。結果を表５にまとめる。
【０１７５】
【表５】
2020531516.tif 000006
【０１７６】
分かるように、アルギニンを含む物質のろ液は高分子量多量体を高い割合で含んでいたが、アルギニンを含まないサンプルはＨＭＷＭが少なかった。
【０１７７】
実施例２
ＶＷＦをウイルスろ過（ＶＦ）にかける際にカルシウムイオンがプラスの効果をもたらしたという報告がある。したがって、カルシウムイオンの存在下でもアルギニンがＶＷＦ収率を改善し得るかどうかを調べた。
【０１７８】
溶液Ｃを調査した以外は、ろ過条件は実施例１で説明した通りであった。
【０１７９】
溶液「Ｃ」は血漿由来のＶＷＦを含み、血漿タンパク質製造プロセスから得られた。
【０１８０】
ろ過の前に様々な量のＣａＣｌ２およびアルギニンを添加し、表６に示す最終濃度にした。
【０１８１】
各試料でのろ過量は３６ｍｌであった。
【０１８２】
結果を表６にまとめる。
【０１８３】
【表６】
2020531516.tif 000007
【０１８４】
表６の試料番号５は、カルシウムイオンを含まない溶液（例えば、上の表４の試料番号３）と比較して、４００ｍＭのＣａＣｌ２の存在下でＶＷＦ収率が高いことを示す。しかしながら、表６のさらなる試料は、アルギニンが、カルシウムイオンの存在下でのウイルスろ過におけるＶＷＦ収率をさらに改善したことを示す。
【０１８５】
アルギニンの代わりにリシンまたはヒスチジンを添加することによってもＶＷＦ収率の改善を達成し得ることがさらに分かった。
【配列表】
2020531516000001.app
【国際調査報告】
2020531516.tif 000008
2020531516.tif 000009
2020531516.tif 000010
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