(57)【要約】  本開示は、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼなどのヌクレアーゼの活性、特に、「オフターゲット」位置でのその切断を分析する方法に関する。
2020503056.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
方法であって、
（ａ）部位特異的ヌクレアーゼと接触させた細胞または組織から得られたゲノムＤＮＡ試料を、トランスポゾンの５’末端に第１の検出配列を含む前記トランスポゾンと、前記トランスポゾンが前記ゲノムＤＮＡ試料に挿入され、かつ前記ゲノムＤＮＡ試料が断片化されて、複数のタグメンテーションされた二本鎖核酸断片であって、前記核酸断片の５’末端に付着された前記トランスポゾンを含む二本鎖核酸断片になる条件下で接触させることと；
（ｂ）
（ｉ）前記ゲノムＤＮＡ内のあらかじめ決定された位置に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつその５’末端に第２の検出配列を含む第１の固定のプライマーと、
（ｉｉ）前記第１の検出配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の選択的プライマーと
を使用して、前記タグメンテーションされた核酸断片を増幅させて、前記第１の検出配列、前記核酸断片の前記５’末端に付着された前記トランスポゾン、および前記第２の検出配列を含む、増幅された核酸断片を形成させることと；
（ｃ）前記増幅された核酸断片を配列決定することと
を含む方法。
【請求項２】
前記第１の検出配列が、第１の配列決定タグを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｃ）が、前記増幅された核酸断片を、前記第１の配列決定タグとハイブリッド形成する第１の配列決定プライマーと接触させることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の検出配列が、第２の配列決定タグを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｃ）が、前記増幅された核酸断片を、前記第２の配列決定タグとハイブリッド形成する第２の配列決定プライマーと接触させることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ゲノムＤＮＡ試料が、単一の細胞から得られる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）が、それぞれが前記ゲノムＤＮＡ内の異なるあらかじめ決定された位置に相補的なヌクレオチド配列を含む、複数の第１の固定プライマーを使用することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）が、それぞれの反応が異なる第１の固定プライマーを使用する、複数の増幅反応を実施することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の第１の固定プライマーのそれぞれが、（ｉ）同じ配列決定タグと（ｉｉ）固有のバーコードとを含む検出配列を含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記二本鎖核酸断片が、約５００〜約５０００ｂｐを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
方法であって、
（ａ）細胞または組織から得られたゲノムＤＮＡ試料を、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼと、前記ヌクレアーゼによる前記ゲノムＤＮＡの切断に好都合な条件下で接触させることと；
（ｂ）前記切断されたゲノムＤＮＡを、トランスポゾンの５’末端に第１の検出配列を含む前記トランスポゾンと、前記切断されたゲノムＤＮＡに前記トランスポゾンが挿入され、かつ前記切断されたゲノムＤＮＡが断片化されて、複数のタグメンテーションされた二本鎖核酸断片であって、前記核酸断片の５’末端に付着された前記トランスポゾンを含む二本鎖核酸断片になる条件下で接触させることと；
（ｃ）
（ｉ）前記ゲノムＤＮＡ内のあらかじめ決定された位置に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつその５’末端に第２の検出配列を含む第１の固定プライマーと、
（ｉｉ）前記第１の検出配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の選択的プライマーと
を使用して、前記タグメンテーションされた核酸断片を増幅させて、前記第１の検出配列、前記核酸断片の前記５’末端に付着された前記トランスポゾン、および前記第２の検出配列を含む、増幅された核酸断片を形成させることと；
（ｄ）増幅された核酸断片を配列決定することと
を含む方法。
【請求項１３】
前記第１の検出配列が、第１の配列決定タグを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｄ）が、前記増幅された核酸断片を、前記第１の配列決定タグとハイブリッド形成する第１の配列決定プライマーと接触させることを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の検出配列が、第２の配列決定タグを含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｄ）が、前記増幅された核酸断片を、前記第２の配列決定タグとハイブリッド形成する第２の配列決定プライマーと接触させることを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ゲノムＤＮＡ試料が、単一の細胞から得られる、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｃ）が、それぞれが前記ゲノムＤＮＡ内の異なるあらかじめ決定された位置に相補的なヌクレオチド配列を含む、複数の第１の固定プライマーを使用することを含む、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｃ）が、それぞれの反応が異なる第１の固定プライマーを使用する、複数の増幅反応を実施することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記複数の第１の固定プライマーのそれぞれが、（ｉ）同じ配列決定タグと（ｉｉ）固有のバーコードとを含む検出配列を含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記二本鎖核酸断片が、約５００〜約５０００ｂｐを含む、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項１２〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
方法であって、
（ａ）細胞または組織から得られたゲノムＤＮＡ試料を、トランスポゾンの５’末端に第１の検出配列を含む前記トランスポゾンと、前記トランスポゾンが前記ゲノムＤＮＡに挿入され、かつ前記ゲノムＤＮＡが断片化されて、複数のタグメンテーションされた二本鎖核酸断片であって、前記核酸断片の５’末端に付着された前記トランスポゾンを含む二本鎖核酸断片になる条件下で接触させることであって、前記ゲノムＤＮＡは、部位特異的ヌクレアーゼによって切断された少なくとも１つの部位に組み込まれた二本鎖オリゴヌクレオチドを含む、ことと；
（ｂ）
（ｉ）前記二本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつその５’末端に第２の検出配列を含む第１の固定プライマーと、
（ｉｉ）前記第１の検出配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の選択的プライマーと
を使用して、前記タグメンテーションされた核酸断片を増幅させて、前記第１の検出配列、前記核酸断片の前記５’末端に付着された前記トランスポゾン、および前記第２の検出配列を含む、増幅された核酸断片を形成させることと；
（ｃ）前記増幅された核酸断片を配列決定することと
を含む方法。
【請求項２４】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）細胞または組織から得られたゲノムＤＮＡ試料を、ヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの切断、および二本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの切断部位への組み込みに好都合な条件下で、前記ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼおよび前記二本鎖オリゴヌクレオチドと接触させることであって、それによって、前記組み込まれた二本鎖オリゴヌクレオチドを含むタグ付けされたゲノムＤＮＡが産生される、ことと；
（ｂ）前記タグ付けされたゲノムＤＮＡを、トランスポゾンの５’末端に第１の検出配列を含む前記トランスポゾンと、前記タグ付けされたゲノムＤＮＡに前記トランスポゾンが挿入され、かつ前記タグ付けされたゲノムＤＮＡが断片化されて、複数のタグメンテーションされた二本鎖核酸断片であって、前記核酸断片の５’末端に付着された前記トランスポゾンを含む二本鎖核酸断片になる条件下で接触させることと；
（ｃ）
（ｉ）前記二本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつその５’末端に第２の検出配列を含む第１の固定プライマーと、
（ｉｉ）前記第１の検出配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の選択的プライマーと
を使用して、前記タグメンテーションされた核酸断片を増幅させて、前記第１の検出配列、前記核酸断片の前記５’末端に付着された前記トランスポゾン、および前記第２の検出配列を含む、増幅された核酸断片を形成させることと；
（ｄ）前記増幅された核酸断片を配列決定することと
を含む方法。
【請求項２６】
前記ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドのどちらの鎖も、前記ゲノムＤＮＡに対してオルソロガスである、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドの各５’末端が、リン酸基を含む、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドの各３’末端が、ホスホロチオエート結合を含む、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドの各５’末端が、ホスホロチオエート結合を含む、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドが、３０〜３５個のヌクレオチドまたは６０〜６５個のヌクレオチドを含む、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドが、平滑末端化される、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドが、１、２、３、または４塩基の突出ヌクレオチドを有する５’末端を含む、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の検出配列が、第１の配列決定タグを含む、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
配列決定することが、前記増幅された核酸断片を、前記第１の配列決定タグとハイブリッド形成する第１の配列決定プライマーと接触させることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第２の検出配列が、第２の配列決定タグを含む、請求項２３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
配列決定することが、前記増幅された核酸断片を、前記第２の配列決定タグとハイブリッド形成する第２の配列決定プライマーと接触させることを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記二本鎖核酸断片が、約５００〜約５０００ｂｐを含む、請求項１９〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記配列決定された核酸断片が、参照ゲノムＤＮＡ試料に対する転座を含む、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ゲノムＤＮＡ試料が、ウイルスによって導入された配列を含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ゲノムＤＮＡ、前記切断されたゲノムＤＮＡ、または前記タグ付けされたゲノムＤＮＡを前記トランスポゾンと接触させる前に、ウイルスベクターを使用して、配列を前記ゲノムＤＮＡに導入するステップをさらに含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記配列決定された核酸断片を前記参照ゲノムＤＮＡ試料と比較することをさらに含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも１つの配列決定された核酸が、前記参照ゲノムＤＮＡ試料に対する転座を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記配列決定された核酸の１％未満が、前記参照ゲノムＤＮＡ試料に対する転座を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ゲノムＤＮＡ試料が、生きている細胞または組織を含有しない試料から得られる、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ゲノムＤＮＡ試料が、痕跡量の細胞および／または組織を含有する試料から得られる、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記ゲノムＤＮＡ試料が、真核細胞から得られる、請求項１〜４４または４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ゲノムＤＮＡ試料が、原核細胞から得られる、請求項１〜４４または４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ゲノムＤＮＡ試料が、１つまたは複数の微生物叢から得られる、請求項１〜４４、４６、または４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
１つまたは複数の処理装置によって実施される方法であって、
複数の実体についてのヌクレオチド配列を含むデータセットであって、次世代配列決定データを含むデータセットを受け取ることと；
前記データセットから第１のデータを得るために前記データセットを逆多重化することであって、前記第１のデータは、前記複数の実体の中のある実体から得られるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、前記実体を特定するバーコードを含み、前記ヌクレオチド配列はまた、１つまたは複数の識別子を含み、前記１つまたは複数の識別子は、前記ヌクレオチド配列上で実施される遺伝子編集事象に基づいている、ことと；
前記第１のデータに基づいて、第２のデータによって表される参照アンプリコンに対して、前記ヌクレオチド配列の少なくとも一部を整列させることであって、前記参照アンプリコンは、変異、欠失、挿入、インデル、転座、逆位、および／または重複を含む１つまたは複数の予測される遺伝子編集事象の提示を含む参照ヌクレオチド配列を含む、ことと；
前記参照アンプリコンに対して整列される前記ヌクレオチド配列の前記少なくとも一部に含有される、前記識別子の数を決定することと；
識別子の前記数に基づいて、前記遺伝子編集事象の結果を評価することと
を含む方法。
【請求項５１】
前記１つまたは複数の識別子が、前記ヌクレオチド配列上で実施される複数の遺伝子編集事象に基づいており；かつ
評価することが、識別子の前記数に基づく前記複数の遺伝子編集事象の結果を評価することを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ヌクレオチド配列の前記少なくとも一部を、前記参照アンプリコンに対して整列させることが、前記ヌクレオチド配列のヌクレオチドを、前記参照アンプリコンのヌクレオチドと適合させることを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
バーコードを含む前記ヌクレオチド配列が、前記バーコード中の前記ヌクレオチドの１つを除いてすべてが適合するならば、前記実体を特定する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
整列の前に、前記ヌクレオチド配列から１つまたは複数のアダプターを取り除くことをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
１つまたは複数の表示装置を与えるために、前記遺伝子編集事象の精度を代表する画像データを作成することと；
前記１つまたは複数の表示装置上に、前記画像データに基づいて、１つまたは複数の画像を与えることと
をさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
前記参照アンプリコンが、１つまたは複数のベクター配列または１つまたは複数のプラスミド配列を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記１つまたは複数の識別子が、固有分子インデックス（ＵＭＩ）を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５８】
前記１つまたは複数の識別子が、１つまたは複数の予測される遺伝子編集事象を示すものである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５９】
前記参照アンプリコンに対して整列される前記ヌクレオチド配列の前記少なくとも一部における前記識別子の前記数を決定することが、予測される遺伝子編集事象に対して整列される識別子の数を計数することを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項６０】
前記データセットが、ＵＤｉＴａＳライブラリに基づいている、請求項５０に記載の方法。
【請求項６１】
前記バーコードが、前記ヌクレオチド配列に対して固有であり、その結果、前記ヌクレオチド配列に由来する配列決定ライブラリのすべてのメンバーが、同じバーコードを含むようになる、請求項５０に記載の方法。
【請求項６２】
前記遺伝子編集事象の精度に基づいて、遺伝子編集プロセスを選択すること
をさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項６３】
１つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体であって、
複数の実体についてのヌクレオチド配列を含むデータセットであって、次世代配列決定データを含むデータセットを受け取ることと；
前記データセットから第１のデータを得るために前記データセットを逆多重化することであって、前記第１のデータは、前記複数の実体の中のある実体から得られるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、前記実体を特定するバーコードを含み、前記ヌクレオチド配列はまた、１つまたは複数の識別子を含み、前記１つまたは複数の識別子は、前記ヌクレオチド配列上で実施される遺伝子編集事象に基づいている、ことと；
前記第１のデータに基づいて、第２のデータによって表される参照アンプリコンに対して、前記ヌクレオチド配列の少なくとも一部を整列させることであって、前記参照アンプリコンは、１つまたは複数のオンターゲット遺伝子編集事象、１つまたは複数のオフターゲット遺伝子編集事象、または１つまたは複数のオンターゲット遺伝子編集事象と１つまたは複数のオフターゲット遺伝子編集事象との両方の提示を含む参照ヌクレオチド配列を含む、ことと；
前記参照アンプリコンに対して整列される前記ヌクレオチド配列の前記少なくとも一部に含有される、前記識別子の数を決定することと；
識別子の前記数に基づいて、前記遺伝子編集事象の結果を評価することと
を含む、動作を実施するための１つまたは複数の処理装置によって実行可能である、命令を保存する１つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
【請求項６４】
前記１つまたは複数の識別子が、前記ヌクレオチド配列上で実施される複数の遺伝子編集事象に基づいており；かつ
評価することが、識別子の前記数に基づく前記複数の遺伝子編集事象の結果を評価することを含む、請求項６３に記載の１つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
【請求項６５】
前記ヌクレオチド配列の少なくとも一部を、前記参照アンプリコンに対して整列させることが、前記ヌクレオチド配列のヌクレオチドを、前記参照アンプリコンのヌクレオチドと適合させることを含む、請求項６３に記載の１つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
【請求項６６】
前記バーコードを含む前記ヌクレオチド配列が、前記バーコード中の前記ヌクレオチドの１つを除いてすべてが適合するならば、前記実体を特定する、請求項６３に記載の１つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
【請求項６７】
前記動作が、
整列の前に、前記ヌクレオチド配列から１つまたは複数のアダプターを取り除くことを含む、請求項６３に記載の１つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
【請求項６８】
前記動作が、
１つまたは複数の表示装置を与えるために、前記遺伝子編集事象の精度を代表する画像データを作成することと；
前記１つまたは複数の表示装置上に、前記画像データに基づいて、１つまたは複数の画像を与えることと
を含む、請求項６３に記載の１つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
【請求項６９】
前記参照アンプリコンが、１つまたは複数のベクター配列または１つまたは複数のプラスミド配列を含む、請求項６３に記載の１つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
【請求項７０】
前記１つまたは複数の識別子が、固有分子インデックス（ＵＭＩ）を含む、請求項６３に記載の１つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
【請求項７１】
前記１つまたは複数の識別子が、１つまたは複数の予測される遺伝子編集事象を示すものである、請求項６３に記載の１つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
【請求項７２】
前記参照アンプリコンに対して整列される前記ヌクレオチド配列の前記少なくとも一部における前記識別子の前記数を決定することが、予測される遺伝子編集事象に対して整列される識別子の数を計数することを含む、請求項６３に記載の１つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
【請求項７３】
前記データセットが、ＵＤｉＴａＳライブラリに基づいている、請求項６３に記載の１つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
【請求項７４】
前記バーコードが、前記ヌクレオチド配列に対して固有であり、その結果、前記ヌクレオチド配列に由来する配列決定ライブラリのすべてのメンバーが、同じバーコードを含むようになる、請求項６３に記載の１つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
【請求項７５】
前記遺伝子編集事象の精度に基づいて、遺伝子編集プロセスを選択すること
をさらに含む、請求項６３に記載の１つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
【請求項７６】
システムであって、
実行可能である命令を保存する非一過性の機械可読ストレージと；
複数の実体についてのヌクレオチド配列を含むデータセットであって、次世代配列決定データを含むデータセットを受け取ることと；
前記データセットから第１のデータを得るために前記データセットを逆多重化することであって、前記第１のデータは、前記複数の実体の中のある実体から得られるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、前記実体を特定するバーコードを含み、前記ヌクレオチド配列はまた、１つまたは複数の識別子を含み、前記１つまたは複数の識別子は、前記ヌクレオチド配列上で実施される遺伝子編集事象に基づいている、ことと；
前記第１のデータに基づいて、第２のデータによって表される参照アンプリコンに対して、前記ヌクレオチド配列の少なくとも一部を整列させることであって、前記参照アンプリコンは、１つまたは複数のオンターゲット遺伝子編集事象、１つまたは複数のオフターゲット遺伝子編集事象、または１つまたは複数のオンターゲット遺伝子編集事象と１つまたは複数のオフターゲット遺伝子編集事象との両方の提示を含む参照ヌクレオチド配列を含む、ことと；
前記参照アンプリコンに対して整列される前記ヌクレオチド配列の前記少なくとも一部に含有される、前記識別子の数を決定することと；
識別子の前記数に基づいて、前記遺伝子編集事象の結果を評価することと
を含む動作を実施するための前記命令を遂行するための１つまたは複数の処理装置と
を含むシステム。
【請求項７７】
前記１つまたは複数の識別子が、前記ヌクレオチド配列上で実施される複数の遺伝子編集事象に基づいており；かつ
評価することが、識別子の前記数に基づく前記複数の遺伝子編集事象の結果を評価することを含む、請求項７６に記載のシステム。
【請求項７８】
前記ヌクレオチド配列の前記少なくとも一部を、前記参照アンプリコンに対して整列させることが、前記ヌクレオチド配列のヌクレオチドを、前記参照アンプリコンのヌクレオチドと適合させることを含む、請求項７６に記載のシステム。
【請求項７９】
バーコードを含む前記ヌクレオチド配列が、前記バーコード中の前記ヌクレオチドの１つを除いてすべてが適合するならば、前記実体を特定する、請求項７６に記載のシステム。
【請求項８０】
前記動作が、
整列の前に、前記ヌクレオチド配列から１つまたは複数のアダプターを取り除くことを含む、請求項７６に記載のシステム。
【請求項８１】
前記動作が、
１つまたは複数の表示装置を与えるために、前記遺伝子編集事象の精度を代表する画像データを作成することと；
前記１つまたは複数の表示装置上に、前記画像データに基づいて、１つまたは複数の画像を与えることと
を含む、請求項７６に記載のシステム。
【請求項８２】
前記参照アンプリコンが、１つまたは複数のベクター配列または１つまたは複数のプラスミド配列を含む、請求項７６に記載のシステム。
【請求項８３】
前記１つまたは複数の識別子が、固有分子インデックス（ＵＭＩ）を含む、請求項７６に記載のシステム。
【請求項８４】
前記１つまたは複数の識別子が、１つまたは複数の予測される遺伝子編集事象を示すものである、請求項７６に記載のシステム。
【請求項８５】
前記参照アンプリコンに対して整列される前記ヌクレオチド配列の前記少なくとも一部における前記識別子の前記数を決定することが、予測される遺伝子編集事象に対して整列される識別子の前記数を計数することを含む、請求項７６に記載のシステム。
【請求項８６】
前記データセットが、ＵＤｉＴａＳライブラリに基づいている、請求項７６に記載のシステム。
【請求項８７】
前記バーコードが、前記ヌクレオチド配列に対して固有であり、その結果、前記ヌクレオチド配列に由来する配列決定ライブラリのすべてのメンバーが、同じバーコードを含むようになる、請求項７６に記載のシステム。
【請求項８８】
前記遺伝子編集事象の精度に基づいて、遺伝子編集プロセスを選択すること
をさらに含む、請求項７６に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年１０月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／５７０，３００号明細書、２０１７年５月５日に出願された同第６２／５０２，４３４号明細書、および２０１７年１月６日に出願された同第６２／４４３，２１２号明細書の利益を主張するものであり、これらの明細書のそれぞれの内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ−ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）関連ヌクレアーゼなどのヌクレアーゼは、特定のＤＮＡ配列を標的にするその能力のおかげで、ますます使用されるようになっている。遺伝性疾患の治療のための手段としてのこれらのものなどのヌクレアーゼの価値は、広く認識されている。例えば、アメリカ食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）は、２０１６年１１月１５日に、こうしたシステムの使用、およびそれによって生じる法的問題点の可能性に取り組む科学委員会（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏａｒｄ  Ｍｅｅｔｉｎｇ）を開催した。この委員会では、ＦＤＡは、Ｃａｓ９／ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を、対象となる遺伝子座での正確な編集をもたらすようにカスタマイズすることができるが、この複合体は、他の「オフターゲット」位置とも相互作用し、切断する可能性があることを指摘した。オフターゲット切断（「オフターゲット」）の可能性は、ひいては、少なくとも、これらのヌクレアーゼを利用する治療法の承認に関する法的問題点の可能性を生じる。
ゲノム編集の修復結果を解析するための一般的方法は、標的とされるゲノム領域のＰＣＲ増幅、および塩基ミスマッチでのエンドヌクレアーゼ切断または配列決定によるその後の解析を含む（Ｍａｓｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９５；９：１７７−１８３；Ｖｏｕｉｌｌｏｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｇ３  ２０１５；５：４０７−４１５；Ｈｅｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ．２０１５：３３：１３２−１４０；Ｔｙｋｃｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２０１６；６３：３５５−３７０；Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１４；４２：ｅ１６８）。しかし、ＰＣＲ介在性の分析は、根本的に、小さいインデルと共に、ゲノムへの構造的変化（例えば、欠失（１００ｂｐよりも大きいもの）、逆位、および転座）を測定することができない。予期せぬ転座、および他の構造的変化は、ＮＩＨの組換えＤＮＡ諮問委員会（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＲＡＣ）およびＦＤＡによるゲノム編集療法の研究について、具体的に挙げられている（Ａｔｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．ＲＡＣ  Ｒｅｖｉｅｗ  ２０１６；Ｗｉｔｔｅｎ，Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｍｅｓａ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，２０１６）。構造的変化を測定することは、発癌性の転座の臨床的検出を意図するＡＭＰ−Ｓｅｑ（アンカードマルチプレックスＰＣＲ（Ａｎｃｈｏｒｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ）配列決定）と呼ばれる方法、およびＨＴＧＴＳ（ハイスループット、ゲノムワイド転座配列決定（Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ，  Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ））またはＬＡＭ−ＨＴＧＴＳ（線形増幅を介するＨＴＧＴＳ（Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ−ＨＴＧＴＳ））と呼ばれる類似の方法を使用して、最近、より実現可能になりつつある（Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１４；２０：１４７９−１４８４；Ｃｈｉａｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２０１１；１４７：１０７−１１９；Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌ．２０１６；１１：８５３−８７１）。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ、すなわちＡＭＰ−ｓｅｑの改変は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼによる新規オフターゲット編集を捉えるための強力なツールである（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４；３３：１８７−１９７）。これらの方法はすべて、「一方向性の」増幅、および配列決定を達成するために、剪断されたＤＮＡ上のアダプター連結ユニバーサルプライミング部位に加えて、標的特異的なプライマーを利用する。しかし、ＤＮＡ剪断は、これらのすべての方法において使用されるライブラリ調製における厄介なステップである。ＤＮＡ剪断は、特殊化された設備を必要とし、また、多数の試料の研究を容易に行いやすくはない。したがって、ＤＮＡ剪断は、遺伝子編集分野において、広くは適用されていない。さらに、ＤＮＡを剪断することは、低レベル（例えば：１％未満）の遺伝子編集頻度を評価する場合に問題となり得る塩基のミスコールをもたらすＤＮＡ損傷を誘発することが示されている（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１７；３５５：７５２−６；Ｃｏｓｔｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３；４１：１−１２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｍａｓｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９５；９：１７７−１８３
【非特許文献２】Ｖｏｕｉｌｌｏｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｇ３  ２０１５；５：４０７−４１５
【非特許文献３】Ｈｅｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ．２０１５：３３：１３２−１４０
【非特許文献４】Ｔｙｋｃｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２０１６；６３：３５５−３７０
【非特許文献５】Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１４；４２：ｅ１６８
【非特許文献６】Ａｔｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．ＲＡＣ  Ｒｅｖｉｅｗ  ２０１６
【非特許文献７】Ｗｉｔｔｅｎ，Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｍｅｓａ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，２０１６
【非特許文献８】Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１４；２０：１４７９−１４８４
【非特許文献９】Ｃｈｉａｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２０１１；１４７：１０７−１１９
【非特許文献１０】Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌ．２０１６；１１：８５３−８７１
【非特許文献１１】Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４；３３：１８７−１９７
【非特許文献１２】Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１７；３５５：７５２−６
【非特許文献１３】Ｃｏｓｔｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３；４１：１−１２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、特に、トランスポゾン組成物を使用してＤＮＡを断片化およびタグ付けすることによるヌクレアーゼ活性の特徴付けのための方法およびシステムを提供する。一態様では、この開示は、（ａ）部位特異的ヌクレアーゼと接触させた細胞または組織から得られたゲノムＤＮＡ試料を、５’末端に第１の検出配列を含むトランスポゾンと、トランスポゾンがゲノムＤＮＡに挿入され、かつゲノムＤＮＡが断片化されて核酸断片の５’末端に付着されたトランスポゾンを含む複数のタグメンテーションされた（ｔａｇｍｅｎｔｅｄ）二本鎖核酸断片になる条件下で接触させることと；（ｂ）（ｉ）ゲノムＤＮＡ内のあらかじめ決定された位置に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつその５’末端に第２の検出配列を含む第１の固定のプライマーと、（ｉｉ）第１の検出配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の選択的プライマーとを使用して、タグメンテーションされた核酸断片を増幅させて、第１の検出配列、核酸断片の５’末端に付着されたトランスポゾン、および第２の検出配列を含む、増幅された核酸断片を形成させることと；（ｃ）増幅された核酸断片を配列決定することとを含む方法を特徴とする。
【０００５】
いくつかの実施態様では、第１の検出配列は、第１の配列決定タグを含む。いくつかの実施態様では、ステップ（ｃ）は、増幅された核酸断片を、第１の配列決定タグとハイブリッド形成する第１の配列決定プライマーと接触させることを含む。いくつかの実施態様では、第２の検出配列は、第２の配列決定タグを含む。いくつかの実施態様では、ステップ（ｃ）は、増幅された核酸断片を、第２の配列決定タグとハイブリッド形成する第２の配列決定プライマーと接触させることを含む。
【０００６】
いくつかの実施態様では、ゲノムＤＮＡ試料は、単一の細胞から得られる。
【０００７】
いくつかの実施態様では、ステップ（ｂ）は、それぞれがゲノムＤＮＡ内の異なるあらかじめ決定された位置に相補的なヌクレオチド配列を含む、複数の第１の固定プライマーを使用することを含む。いくつかの実施態様では、ステップ（ｂ）は、それぞれの反応が異なる第１の固定プライマーを使用する、複数の増幅反応を実施することを含む。いくつかの実施態様では、複数の第１の固定プライマーのそれぞれは、（ｉ）同じ配列決定タグと（ｉｉ）固有のバーコードとを含む検出配列を含む。いくつかの実施態様では、複数の第１の固定プライマーが、多重化アッセイで使用される。
【０００８】
いくつかの実施態様では、二本鎖核酸断片は、約５００〜約５０００ｂｐ、例えば、約１００〜約４０００ｂｐ、例えば、約５００〜約３０００ｂｐを含む。
【０００９】
いくつかの実施態様では、部位特異的ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。
【００１０】
別の態様では、この開示は、（ａ）ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼと接触させた細胞または組織から得られたゲノムＤＮＡ試料を、ヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの切断に好都合な条件下で接触させることと；（ｂ）切断されたゲノムＤＮＡを、５’末端に第１の検出配列を含むトランスポゾンと、切断されたゲノムＤＮＡにトランスポゾンが挿入され、かつ切断されたゲノムＤＮＡが断片化されて核酸断片の５’末端に付着されたトランスポゾンを含む複数のタグメンテーションされた二本鎖核酸断片になる条件下で接触させることと；（ｃ）（ｉ）ゲノムＤＮＡ内のあらかじめ決定された位置に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつその５’末端に第２の検出配列を含む第１の固定プライマーと、（ｉｉ）第１の検出配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の選択的プライマーとを使用して、タグメンテーションされた核酸断片を増幅させて、第１の検出配列、核酸断片の５’末端に付着されたトランスポゾン、および第２の検出配列を含む、増幅された核酸断片を形成させることと；（ｄ）増幅された核酸断片を配列決定することとを含む方法を特徴とする。
【００１１】
いくつかの実施態様では、第１の検出配列は、第１の配列決定タグを含む。いくつかの実施態様では、ステップ（ｄ）は、増幅された核酸断片を、第１の配列決定タグとハイブリッド形成する第１の配列決定プライマーと接触させることを含む。いくつかの実施態様では、第２の検出配列は、第２の配列決定タグを含む。いくつかの実施態様では、ステップ（ｄ）は、増幅された核酸断片を、第２の配列決定タグとハイブリッド形成する第２の配列決定プライマーと接触させることを含む。
【００１２】
いくつかの実施態様では、ゲノムＤＮＡ試料は、単一の細胞から得られる。
【００１３】
いくつかの実施態様では、ステップ（ｃ）は、それぞれがゲノムＤＮＡ内の異なるあらかじめ決定された位置に相補的なヌクレオチド配列を含む、複数の第１の固定プライマーを使用することを含む。いくつかの実施態様では、ステップ（ｃ）は、それぞれの反応が異なる第１の固定プライマーを使用する、複数の増幅反応を実施することを含む。いくつかの実施態様では、複数の第１の固定プライマーのそれぞれは、（ｉ）同じ配列決定タグと（ｉｉ）固有のバーコードとを含む検出配列を含む。いくつかの実施態様では、複数の第１の固定プライマーが、多重化アッセイで使用される。
【００１４】
いくつかの実施態様では、二本鎖核酸断片は、約５００〜約５０００ｂｐ、例えば、約１００〜約４０００ｂｐ、例えば、約５００〜約３０００ｂｐを含む。
【００１５】
いくつかの実施態様では、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。
【００１６】
別の態様では、この開示は、（ａ）細胞または組織から得られたゲノムＤＮＡ試料を、５’末端に第１の検出配列を含むトランスポゾンと、トランスポゾンがゲノムＤＮＡに挿入され、かつゲノムＤＮＡが断片化されて核酸断片の５’末端に付着されたトランスポゾンを含む複数のタグメンテーションされた二本鎖核酸断片になる条件下で接触させることであって、前記ゲノムＤＮＡは、部位特異的ヌクレアーゼによって切断された少なくとも１つの部位に組み込まれた二本鎖オリゴヌクレオチドを含む、ことと；（ｂ）（ｉ）二本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつその５’末端に第２の検出配列を含む第１の固定プライマーと、（ｉｉ）第１の検出配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の選択的プライマーとを使用して、タグメンテーションされた核酸断片を増幅させて、第１の検出配列、核酸断片の５’末端に付着されたトランスポゾン、および第２の検出配列を含む、増幅された核酸断片を形成させることと；（ｃ）増幅された核酸断片を配列決定することとを含む方法を特徴とする。
【００１７】
いくつかの実施態様では、部位特異的ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。
【００１８】
別の態様では、この開示は、（ａ）細胞または組織から得られたゲノムＤＮＡ試料を、ヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの切断、および二本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの切断部位への組み込みに好都合な条件下で、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼおよび二本鎖オリゴヌクレオチドと接触させることとであって、それによって、組み込まれた二本鎖オリゴヌクレオチドを含むタグ付けされたゲノムＤＮＡが産生される、ことと；（ｂ）タグ付けされたゲノムＤＮＡを、５’末端に第１の検出配列を含むトランスポゾンと、タグ付けされたゲノムＤＮＡにトランスポゾンが挿入され、かつタグ付けされたゲノムＤＮＡが断片化されて核酸断片の５’末端に付着されたトランスポゾンを含む複数のタグメンテーションされた二本鎖核酸断片になる条件下で接触させることと；（ｃ）（ｉ）二本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつその５’末端に第２の検出配列を含む第１の固定プライマーと、（ｉｉ）第１の検出配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の選択的プライマーとを使用して、タグメンテーションされた核酸断片を増幅させて、第１の検出配列、核酸断片の５’末端に付着されたトランスポゾン、および第２の検出配列を含む、増幅された核酸断片を形成させることと；（ｄ）増幅された核酸断片を配列決定することとを含む方法を特徴とする。
【００１９】
いくつかの実施態様では、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。
【００２０】
いくつかの実施態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドのどちらの鎖も、ゲノムＤＮＡに対してオルソロガスである。
【００２１】
いくつかの実施態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドの各５’末端は、リン酸基を含む。いくつかの実施態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドの各３’末端は、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドの各５’末端は、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、３０〜３５個のヌクレオチドまたは６０〜６５個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、平滑末端化される。いくつかの実施態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、１、２、３、または４塩基の突出ヌクレオチドを有する５’末端を含む。
【００２２】
いくつかの実施態様では、第１の検出配列は、第１の配列決定タグを含む。いくつかの実施態様では、配列決定することは、増幅された核酸断片を、第１の配列決定タグとハイブリッド形成する第１の配列決定プライマーと接触させることを含む。いくつかの実施態様では、第２の検出配列は、第２の配列決定タグを含む。いくつかの実施態様では、配列決定することは、増幅された核酸断片を、第２の配列決定タグとハイブリッド形成する第２の配列決定プライマーと接触させることを含む。
【００２３】
いくつかの実施態様では、二本鎖核酸断片は、約５００〜約５０００ｂｐを含む。
【００２４】
いくつかの実施態様では、配列決定された核酸断片は、参照ゲノムＤＮＡ試料に対する転座を含む。いくつかの実施態様では、ゲノムＤＮＡ試料は、ウイルスによって導入された配列を含む。
【００２５】
いくつかの実施態様では、方法は、ゲノムＤＮＡ、切断されたゲノムＤＮＡ、またはタグ付けされたゲノムＤＮＡをトランスポゾンと接触させる前に、ウイルスベクターを使用して、配列をゲノムＤＮＡに導入するステップをさらに含む。
【００２６】
いくつかの実施態様では、方法は、配列決定された核酸断片を参照ゲノムＤＮＡ試料と比較するステップをさらに含む。
【００２７】
いくつかの実施態様では、少なくとも１つの配列決定された核酸は、参照ゲノムＤＮＡ試料に対する転座を含む。いくつかの実施態様では、配列決定された核酸断片の１％未満は、参照ゲノムＤＮＡ試料に対する転座を含む。
【００２８】
別の態様では、この開示は、本明細書に記載したタグメンテーションされた核酸断片のライブラリを特徴とする。別の態様では、この開示は、本明細書に記載したトランスポザーゼ、プライマー、および／または捕捉プローブを含む、標的核酸、例えばＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡを配列決定するためのシステムを特徴とする。
【００２９】
限定はされないが、ヌクレアーゼ切断を評価するためのコンピュータによって実行されるプロセスを含めた、本明細書に記載したプロセス、方法、システム、および技術の少なくとも一部は、１つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体上に保存されるおよび１つまたは複数の処理装置上で遂行可能である命令を含む、コンピュータプログラム製品として実行することができる。非一過性の機械可読記憶媒体の例としては、例えば、読み出し専用メモリ、光ディスクドライブ、メモリディスクドライブ、ランダムアクセスメモリなどが挙げられる。本明細書に記載したプロセス、方法、システム、および技術の少なくとも一部は、定められた操作を実施するための、１つまたは複数の処理装置、および１つまたは複数の処理装置によって遂行可能である命令を保存するメモリを含む、装置、方法、またはシステムとして実行することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ヌクレアーゼによって改変されたゲノムＤＮＡについての例示的な配列決定方法のステップを示す模式図を示す。
【図２】（図２Ａ）固有分子インデックス（Ｕｎｉｑｕｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｄｅｘ）（ＵＭＩ）バーコード、プーリング（ｐｏｏｌｉｎｇ）バーコード、およびｉ５配列タグを伴う、例示的なカスタムな高活性なＴｎ５酵素（Ｔｎ５＊）を示す模式図を示す。    （図２Ｂ）ヌクレアーゼによって改変されたゲノムＤＮＡについての例示的な配列決定方法のステップを示す模式図を示す。
【図３】配列決定ライブラリを作成するための、二本鎖オリゴヌクレオチドインサート（ｄｓＯＤＮ）に相補的なプライマーを使用する、例示的な配列決定方法のステップを示す模式図を示す。
【図４−１】例示的な方法に使用されるプライマーを図示する。Ｉｌｌｕｍｉｎａテイルには下線を引いてある。
【図４−２】例示的な方法に使用されるプライマーを図示する。Ｉｌｌｕｍｉｎａテイルには下線を引いてある。
【図５】ＵＤｉＴａＳを使用する、Ｇ１およびＧ２標的についてのＭｉＳｅｑリードの結果を図示する。
【図６】ＵＤｉＴａＳにおける、Ｇ１固定プライマーおよびＧ２固定プライマーを使用する、Ｇ１およびＧ２遺伝子のリード被覆プロットを図示する。
【図７】ＵＤｉＴａＳを使用するインデルの検出の結果を図示する。
【図８】デュアルガイド編集による可能な染色体内再構成の模式図である。
【図９】安定なＨＥＫ２９３ＴクローンのゲノムＤＮＡ混合物を使用する、染色体内再構成の検出の検証を図示する。
【図１０】ゲノムＤＮＡ混合物を使用する、染色体内再構成の検出の追加の検証を図示する。
【図１１】この開示の例示的な方法の模式図である。
【図１２】この開示のある種の方法に関する例示的なバイオインフォマティクス・パイプラインの模式図である。
【図１３】小さいインデル、大きい欠失（＞１００ｂｐを超えるもの）、および逆位を含めた遺伝子編集事象の検出を示す模式図を図示する。
【図１４ＡＢ】（図１４Ａ）約１．１ｋｂ離れた２つのＳａＣａｓ９ガイドを用いるＧｅｎｅ３  ＩＶＳ遺伝子座でのＵ−２  ＯＳ細胞の編集後の、例示的な編集の型を図示する。    （図１４Ｂ）改変されていない親系統と様々な割合で混合されたＨＥＫ２９３細胞株の、例示的な線形性および検出下限（Ｌｏｗｅｒ  Ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）（ＬＬｏＤ）を図示する。
【図１４Ｃ】１つはＧｅｎｅ１を、もう１つはＧｅｎｅ２を標的にする２つのＳｐＣａｓ９  ＲＮＰを用いるヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）後に測定された、Ｔ細胞における例示的な染色体間転座を図示する。この模式図および表は、すべての結果の可能性、および適用できる場合には測定された結果を示す。縦線は、編集部位を示し、矢印は、プライマーを示す（１＝ＯＬＩ６２５９および２＝ＯＬＩ６２５６）。
【図１５Ａ】Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）（Ｔｈｏｒｖａｌｄｓｄｏｔｔｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｉｅｆ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．２０１３；１４：１７８−１９２；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１；２９：２４−２６）において示される、Ｕ−２  ＯＳ編集研究における例示的な編集事象を図示する。各図の最上部の模式図は、観察された編集事象を示す。赤色／青色に色付けしたリードを、上部／下部のゲノム参照ＤＮＡ配列に対して整列させた。図１５Ａは、ガイド２の部位の小さいインデルを図示する。図１５Ｂは、ガイド１および２を使用する大きい１．１ｋｂの欠失接合部を図示する。図１５Ｃは、ガイド１および２を使用する大きい１．１ｋｂの逆位接合部を図示する。図１５Ｄは、ガイド２を使用する相同の接合部を図示する。
【図１５Ｂ】Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）（Ｔｈｏｒｖａｌｄｓｄｏｔｔｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｉｅｆ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．２０１３；１４：１７８−１９２；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１；２９：２４−２６）において示される、Ｕ−２  ＯＳ編集研究における例示的な編集事象を図示する。各図の最上部の模式図は、観察された編集事象を示す。赤色／青色に色付けしたリードを、上部／下部のゲノム参照ＤＮＡ配列に対して整列させた。図１５Ａは、ガイド２の部位の小さいインデルを図示する。図１５Ｂは、ガイド１および２を使用する大きい１．１ｋｂの欠失接合部を図示する。図１５Ｃは、ガイド１および２を使用する大きい１．１ｋｂの逆位接合部を図示する。図１５Ｄは、ガイド２を使用する相同の接合部を図示する。
【図１５Ｃ】Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）（Ｔｈｏｒｖａｌｄｓｄｏｔｔｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｉｅｆ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．２０１３；１４：１７８−１９２；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１；２９：２４−２６）において示される、Ｕ−２  ＯＳ編集研究における例示的な編集事象を図示する。各図の最上部の模式図は、観察された編集事象を示す。赤色／青色に色付けしたリードを、上部／下部のゲノム参照ＤＮＡ配列に対して整列させた。図１５Ａは、ガイド２の部位の小さいインデルを図示する。図１５Ｂは、ガイド１および２を使用する大きい１．１ｋｂの欠失接合部を図示する。図１５Ｃは、ガイド１および２を使用する大きい１．１ｋｂの逆位接合部を図示する。図１５Ｄは、ガイド２を使用する相同の接合部を図示する。
【図１５Ｄ】Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）（Ｔｈｏｒｖａｌｄｓｄｏｔｔｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｉｅｆ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．２０１３；１４：１７８−１９２；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１；２９：２４−２６）において示される、Ｕ−２  ＯＳ編集研究における例示的な編集事象を図示する。各図の最上部の模式図は、観察された編集事象を示す。赤色／青色に色付けしたリードを、上部／下部のゲノム参照ＤＮＡ配列に対して整列させた。図１５Ａは、ガイド２の部位の小さいインデルを図示する。図１５Ｂは、ガイド１および２を使用する大きい１．１ｋｂの欠失接合部を図示する。図１５Ｃは、ガイド１および２を使用する大きい１．１ｋｂの逆位接合部を図示する。図１５Ｄは、ガイド２を使用する相同の接合部を図示する。
【図１６】ＵＤｉＴａＳに適用される例示的な二項の検出力計算を図示する。所与の数の予想された観察（１、２、または３）についての、固有分子識別子（例えば：試行）の数に対して編集頻度（例えば：成功の確率）をプロットする、シミュレーションされた二項分布。左のグラフは、９５％の信頼度を示し、右のグラフは、９９％の信頼度を示す。
【図１７】ＵＤｉＴａＳに対する例示的なゲノムマッピング率を図示する。Ｇｅｎｅ３ガイド２に対する遺伝子特異的プライマー（ＯＬＩ６０６２）を使用して分析した１０本の別個の試料を、ｘ軸上にプロットした。ｙ軸は、各試料についての予想された参照アンプリコンに対してマッピングされたリードの割合を示す。
【図１８】Ｇｅｎｅ３構造多型（図１８Ａ）またはＧｅｎｅ１／Ｇｅｎｅ２均衡型転座（図１８Ｂ）を含有するプラスミド標準を使用する、例示的なＵＤｉＴａＳ特徴付け、およびＡＭＰ−Ｓｅｑとの比較を図示する。
【図１９】担体ＤＮＡを伴わないプラスミド標準の例示的なＵＤｉＴａＳ特徴付けを図示する。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
定義
この明細書全体を通して、以下の段落で定義されるいくつかの用語が用いられる。この明細書の本文内では、他の定義も参照することができる。本出願では、文脈からそうではないと明らかでない限り、（ｉ）用語「ａ」は、「少なくとも１つ」を意味すると理解することができ；（ｉｉ）用語「または」は、「および／または」を意味すると理解することができ；（ｉｉｉ）用語「〜を含むこと」および「〜を含めて」は、それらだけで示されるか、１つまたは複数の追加の構成要素またはステップと共に示されるかにかかわらず、列挙された構成要素またはステップを包含すると理解することができ；（ｉｖ）用語「約」および「およそ」は、当業者によって理解されるであろう標準偏差を許容すると理解することができ；（ｖ）範囲が提供される場合、両端が含まれる。
【００３２】
本明細書で使用する場合、数に関する用語「約」および「およそ」は、本明細書では、そうではないと記述がないまたは文脈からそうではないと明らかでない限り、その数のいずれかの（それよりも大きいまたは小さい）方向の２０％、１０％、５％、または１％の範囲内にある数を含めるために使用される（こうした数が可能な値の１００％を超えるであろう場合を除く）。
【００３３】
「バーコード」は、本明細書で使用する場合、オリゴヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施態様では、ランダムなバーコードは、いかなる特定の配列とも関係がなく、例えば、品質管理目的で使用することができる。例えば、ランダムなバーコードを含む連結産物を分析する際に、ある特定の連結産物の増幅バイアスを評価するために、ランダムなバーコードを使用することができる。増幅産物間の所与のランダムなバーコードの過剰なまたは低い提示によって、増幅バイアスを示すことができる。いくつかの実施態様では、こうした偏りのある増幅産物に伴うデータは除外される。ランダムなバーコードの好適なサイズは、実施態様に応じて変動し得る。非限定的な例として、いくつかの実施態様では、ランダムなバーコードは、長さが２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヌクレオチドである。
【００３４】
いくつかの実施態様では、バーコードは、ハミングコード、すなわち、誤り訂正バーコードである。ハミングコードは、例えば、試料が多重化されている場合にある特定の試料を特定するために、使用することができる配列である。いくつかの実施態様では、定義された数の可能なハミングコード、例えば、非限定的な例として、最大２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の可能なハミングコードなどが、集合的に存在する。
【００３５】
いくつかの実施態様では、バーコードは、試料バーコードである。いくつかの実施態様では、試料バーコードは、ある特定の試料に対して固有であり、その結果、その特定の試料由来の配列決定ライブラリのすべてのメンバーは、同じバーコードを含む。いくつかの実施態様では、試料バーコードは、例えば、複数の試料が一緒に分析される場合に、配列解析の結果を特定および／または分類するために、使用される。いくつかの実施態様では、試料バーコードは、プーリングバーコードと呼ばれる。
【００３６】
「切断」は、本明細書で使用する場合、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破壊を指す。切断は、限定はされないが、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含めた様々な方法によって開始することができる。一本鎖切断と二本鎖切断のどちらも可能であり、二本鎖切断は、２つの別個の一本鎖切断事象の結果として起こる可能性がある。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生をもたらす可能性がある。
【００３７】
本明細書で使用する場合、用語「縮重した」は、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を指すために使用される場合、複数の異なる塩基のいずれかを含有することができる１つまたは複数の位置を指す。オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチド配列内の縮重した残基は、以下に示した通りの標準のＩＵＰＡＣ核酸表記によって表される：
【００３８】
【表Ａ】
2020503056.tif 000003
【００３９】
そうではないと指定されない限り、縮重した残基は、可能な塩基のランダムなまたは均等な分布を意味するわけではなく、例えば、「Ｎ」残基は、Ａ、Ｃ、Ｇ、および／またはＴ／Ｕ残基の均等な分布を表すわけではない。
【００４０】
本明細書で使用する場合、核酸分子またはその断片を「検出すること」という用語は、典型的には、核酸分子またはその断片が、試料または組成物の他の構成要素から完全にまたは部分的に分離されている場合に、核酸分子の存在を決定することを指し、核酸分子またはその断片の電荷質量比、質量、量、吸光度、蛍光、または他の特性を決定することも含めることができる。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「検出可能な標識」は、検出可能であるあらゆる元素、分子、官能基、化合物、断片、または部分を指す。いくつかの実施態様では、検出可能な実体は、単独で提供されるまたは利用される。いくつかの実施態様では、検出可能な実体は、別の薬剤に伴って（例えば、連結させて）提供されるおよび／または利用される。検出可能な実体の例としては、限定はされないが：様々なリガンド、放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１８Ｆ、１９Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、１３５Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、６４Ｃｕ、１８７Ｒｅ、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１７７Ｌｕ、８９Ｚｒなど）、蛍光染料（具体的な例示的な蛍光染料については以下を参照）、化学発光剤（例えば、アクリジニウムエステル、安定化ジオキセタンなど）、生物発光剤、スペクトル的に分解可能な無機蛍光半導体ナノ結晶（すなわち、量子ドット）、金属ナノ粒子（例えば、金、銀、銅、白金など）のナノクラスター、常磁性金属イオン、酵素（酵素の具体例については以下を参照）、比色定量標識（例えば、染料、コロイド金など）、ビオチン、ジオキシゲニン（ｄｉｏｘｉｇｅｎｉｎ）、ハプテン、および抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なタンパク質が挙げられる。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「連結」、「連結すること」、およびその文法的等価物は、典型的には鋳型によって推進される反応において、２つ以上の核酸、例えばオリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドの終端間の共有結合またはつながりを形成することを指す。結合またはつながりの性質は、大きく変動する可能性があり、また、連結は、酵素的または化学的に行われる可能性がある。本明細書で使用する場合、連結は通常、酵素的に行われて、あるオリゴヌクレオチドの５’炭素末端ヌクレオチドと別のヌクレオチドの３’炭素との間のホスホジエステル結合が形成される。用語「連結」はまた、ホスホジエステル結合の非酵素的形成、ならびにオリゴヌクレオチドの末端間の非ホスホジエステル共有結合、例えばホスホロチオエート結合、ジスルフィド結合などの形成も包含する。
【００４３】
本明細書で使用する場合、用語「ヌクレアーゼ」は、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断することが可能なポリペプチドを指し；用語「エンドヌクレアーゼ」は、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断することが可能なポリペプチドを指す。
【００４４】
本明細書で使用する場合、用語「核酸」、「核酸分子」、または「ポリヌクレオチド」は、本明細書では互換的に使用される。これらは、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指し、そうではないと記述がない限り、天然起源のヌクレオチドと類似の方式で機能することができる天然のヌクレオチドの公知の類似体を包含する。この用語は、合成の骨格を有する核酸様の構造、ならびに増幅産物を包含する。ＤＮＡとＲＮＡは、どちらもポリヌクレオチドである。このポリマーには、天然のヌクレオシド（すなわち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、Ｃ５−プロピニルシチジン、Ｃ５−プロピニルウリジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）、化学的に修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化された塩基）、挿入を受けた（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ）塩基、修飾された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）、または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホロアミダイト結合）が含まれ得る。
【００４５】
本明細書で使用する場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドまたはその類似体の鎖を指す。オリゴヌクレオチドは、例えば、化学合成、制限酵素消化、またはＰＣＲを含めた、いくつかの方法によって得ることができる。当業者によって認識される通り、オリゴヌクレオチドの長さ（すなわち、ヌクレオチドの数）は、しばしばオリゴヌクレオチドの意図される機能または使用に応じて、大きく変動し得る。一般に、オリゴヌクレオチドは、約５〜約３００ヌクレオチド、例えば、約１５〜約２００ヌクレオチド、約１５〜約１００ヌクレオチド、または約１５〜約５０ヌクレオチドを含む。この明細書全体を通して、オリゴヌクレオチドが、（４つの塩基の文字：Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ（これらはそれぞれ、アデノシン、シチジン、グアノシン、およびチミジンを表す）から選択される）文字の連続によって表される時はいつでも、ヌクレオチドは、左から右に、５’〜３’の順序で示される。ある種の実施態様では、オリゴヌクレオチドの配列には、本明細書に記載した１つまたは複数の縮重した残基が含まれる。
【００４６】
本明細書で使用する場合、用語「参照」は、比較が実施されるものに対する標準または対照を表現する。例えば、いくつかの実施態様では、対象となる薬剤、動物、個人、集団、試料、配列、または値が、参照または対照の薬剤、動物、個人、集団、試料、配列、または値と比較される。いくつかの実施態様では、参照または対照は、対象となる試験または決定と実質的に同時に試験および／または決定される。いくつかの実施態様では、参照または対照は、任意選択で有形の媒体に組み込まれた歴史的な参照または対照である。典型的には、当業者によって理解されるであろう通り、参照または対照は、評価を受けるものに匹敵する条件または状況下で決定されるまたは特徴付けられる。当業者は、ある特定の可能な参照または対照に対する信頼性および／または比較を正当化するための、十分な類似性が存在する時を認識するであろう。
【００４７】
本明細書で使用する場合、用語「標的部位」は、結合が存在するのに十分な条件ならば、結合分子が結合することとなる核酸の部分を定義する核酸配列を指す。いくつかの実施態様では、標的部位は、本明細書に記載したヌクレアーゼが結合するおよび／またはこうしたヌクレアーゼによって切断される核酸配列である。いくつかの実施態様では、標的部位は、本明細書に記載したガイドＲＮＡが結合する核酸配列である。標的部位は、一本鎖または二本鎖であり得る。二量体化するヌクレアーゼ、例えばＦｏｋｌ  ＤＮＡ切断ドメインを含むヌクレアーゼという状況では、標的部位は、典型的には、左半分部位（ヌクレアーゼの１つのモノマーが結合する）、右半分部位（ヌクレアーゼの第２のモノマーが結合する）、および切断が行われる半分の部位の間のスペーサー配列を含む。いくつかの実施態様では、左半分部位および／または右半分部位は、１０〜１８ヌクレオチド長である。いくつかの実施態様では、半分の部位のいずれかまたは両方は、より短いまたはより長い。いくつかの実施態様では、左半分部位と右半分部位は、異なる核酸配列を含む。ジンクフィンガーヌクレアーゼという状況では、標的部位は、いくつかの実施態様では、４〜８ｂｐの長さである特定されないスペーサー領域に隣接する、それぞれ６〜１８ｂｐの長さである２つの半分の部位を含むことができる。ＴＡＬＥＮという状況では、標的部位は、いくつかの実施態様では、１０〜３０ｂｐの長さである特定されないスペーサー領域に隣接する、それぞれ１０〜２３ｂｐの長さである２つの半分の部位を含むことができる。ＲＮＡガイド型（例えば、ＲＮＡ−プログラム可能）ヌクレアーゼという状況では、標的部位は、典型的には、ＲＮＡ−プログラム可能ヌクレアーゼのガイドＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列、およびガイドＲＮＡ相補的配列に隣接する３’末端または５’末端のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含む。ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼＣａｓ９については、標的部位は、いくつかの実施態様では、１６〜２４塩基対＋３〜６塩基対（ＰＡＭ）（例えばＮＮＮ（ここでは、Ｎは、あらゆるヌクレオチドに相当する））であり得る。Ｃａｓ９などのＲＮＡガイド型ヌクレアーゼについての例示的な標的部位は、当業者に公知であり、限定はされないが、ＮＮＧ、ＮＧＮ、ＮＡＧ、およびＮＧＧ（ここでは、Ｎは、あらゆるヌクレオチドに相当する）が含まれる。さらに、異なる種（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の代わりにストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））由来のＣａｓ９ヌクレアーゼは、配列ＮＧＧＮＧを含むＰＡＭを認識する。限定はされないがＮＮＡＧＡＡＷおよびＮＡＡＲを含めた、追加のＰＡＭ配列が公知である（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｓｖｅｌｔ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：６４１（２０１３）を参照のこと）。例えば、例えばＣａｓ９などのＲＮＡガイド型ヌクレアーゼの標的部位は、構造［Ｎｚ］−［ＰＡＭ］（ここでは、各Ｎは、独立に、あらゆるヌクレオチドであり、ｚは、１〜５０の整数である）を含むことができる。いくつかの実施態��では、ｚは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、または少なくとも５０である。いくつかの実施態様では、ｚは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０である。いくつかの実施態様では、Ｚは、２０である。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「タグ」は、それが連結された核酸断片を突き止める手段を提供する、非標的核酸構成要素、一般にＤＮＡを指す。例えば、いくつかの実施態様では、タグは、（例えば、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長のためのプライマーなどのオリゴヌクレオチド、または捕捉のためのもしくは連結反応のためのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせるための部位を提供することによって）タグが付着されたＤＮＡの同定、認識、および／または分子的または生化学的操作を可能にするヌクレオチド配列であるまたは当該ヌクレオチド配列を含む。タグをＤＮＡ分子に連結させるためのプロセスは、時として、本明細書では「タギング」と呼ばれ、タギングを受けるまたはタグを含有するＤＮＡは、「タグ付けされた」（例えば、「タグ付けされたＤＮＡ」）と呼ばれる。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「トランスポザーゼ」は、トランスポゾン含有組成物（例えばトランスポゾン）との機能複合体を形成し、インビトロ転移反応においてそれと共にインキュベートされる二本鎖標的核酸、例えば、ＤＮＡへのトランスポゾンの挿入または転移を触媒することが可能な酵素を意味する。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「トランスポゾン」は、インビトロ転移反応において機能性であるトランスポザーゼまたはインテグラーゼ酵素との複合体を形成するのに必要であるヌクレオチド配列（「トランスポゾン配列」）を含む二本鎖核酸、例えばＤＮＡを意味する。トランスポゾンは、トランスポゾンを認識し結合するトランスポザーゼまたはインテグラーゼと共に、「複合体」または「シナプス複合体」または「トランスポソーム複合体」または「トランスポソーム組成物」を形成し、その複合体は、トランスポゾンを、インビトロ転移反応においてそれと共にインキュベートされる標的ＤＮＡに挿入または転移させることが可能である。トランスポゾンは、「転移トランスポゾン配列」または「転移鎖」および「非転移トランスポゾン配列」または「非転移鎖」からなる２つの相補的配列を呈する。転移鎖の３’末端は、インビトロ転移反応において、標的ＤＮＡに連結または転移される。転移トランスポゾン配列に相補的なトランスポゾン配列を呈する非転移鎖は、インビトロ転移反応において、標的ＤＮＡに連結も転移もされない。いくつかの実施態様では、トランスポゾンは、検出配列を含む。いくつかの実施態様では、検出配列は、追加の配列、例えば、ＵＭＩバーコード、プーリングもしくは試料バーコード、および／または配列タグを含む。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「トランスポゾン連結末端」は、挿入部位で標的ＤＮＡと連結する二本鎖トランスポゾンＤＮＡの末端を意味する。トランスポゾン連結末端は、標的ＤＮＡと実際に連結する鎖を指さない。例えば、トランスポゾンＭｕＡ連結末端の３’末端は、標的ＤＮＡの３’末端とトランスポゾン連結末端の５’末端との間のギャップを残して、標的ＤＮＡの５’末端と連結する。
【００５２】
本明細書で使用する場合、用語「トランスポザーゼ」は、レトロトランスポゾンおよびレトロウイルス由来のインテグラーゼを含めた、転移反応に必要とされる１つまたは複数のトランスポゾンとの機能複合体を形成することが可能な酵素を意味する。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「転移反応」は、トランスポゾンが標的ＤＮＡのランダムなまたはほぼランダムな部位に挿入する反応である。転移反応における不可欠な構成要素は、トランスポゾンおよびトランスポザーゼもしくはインテグラーゼ酵素、または機能性の転移複合体を形成するために必要とされる何らかの他の構成要素である。ランダムなまたはほぼランダムな方式で増幅プライマー部位を挿入することが可能なすべての転移システムが、本明細書に記載した方法において有用である（Ｃｒａｉｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：２５３−２５４，１９９５）。こうしたシステムの例は、Ｔｙ１（Ｄｅｖｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｏｅｋｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２２（１８）：３７６５−３７７２、および国際公開第９５／２３８７５号パンフレット）、トランスポゾンＴｎ７（Ｃｒａｉｇ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０４：２７−４８，１９９６）、Ｔｎ１０およびＩＳ１０（Ｋｌｅｃｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，２０４：４９−８２）、マリナートランスポザーゼ（Ｌａｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９６，１５（１９）：５４７０−５４７９）、Ｔｃ１（Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１９９６，１０（６）：７５５−６１）、Ｔｎ５（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：３８１−３８９（１９９２））、Ｐ因子（Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｒｉｏ，Ｃｅｌｌ，１９９２，６９（１）：２７−３９）およびＴｎ３（Ｉｃｈｉｋａｗａ  ａｎｄ  Ｏｈｔｓｕｂｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９０，２６５（３１）：１８８２９−３２）、細菌性挿入配列（Ｏｈｔｓｕｂｏ  ａｎｄ  Ｓｅｋｉｎｅ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，２０４：１−２６）、レトロウイルス（Ｖａｒｍｕｓ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．ｉｎ  Ｍｏｂｉｌｅ  ＤＮＡ．Ｂｅｒｇ  Ｄ．Ｅ．ａｎｄ  Ｈｏｗｅ  Ｍ．Ｍ．ｅｄｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．ｐｐ．５３−１０８（１９８９））、および酵母のレトロトランスポゾン（Ｂｏｅｋｅ，Ｂｅｒｇ  Ｄ．Ｅ．ａｎｄ  Ｈｏｗｅ  Ｍ．Ｍ．ｅｄｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．ｐｐ．３３５−３７４（１９８９））である。
【００５４】
本明細書で使用する場合、用語「配列決定タグ」は、そのタグが連結される核酸の配列決定を容易にする目的のための（例えば、合成による配列決定のためのプライミング部位を提供するための、または連結による配列決定のためのアニーリング部位を提供するための、またはハイブリダイゼーションによる配列決定のためのアニーリング部位を提供するための）配列であるまたは当該配列を含むタグを意味する。例えば、いくつかの実施態様では、配列決定タグは、ＤＮＡ断片またはＤＮＡ断片の相補体のＤＮＡ合成を開始するための部位を提供する。いくつかの実施態様では、配列決定タグは、全長のＩｌｌｕｍｉｎａフォワードアダプター（ｉ５）である。いくつかの実施態様では、配列決定タグは、全長のＩｌｌｕｍｉｎａリバースアダプター（ｉ７）である。
【００５５】
本明細書で使用する場合、用語「増幅タグ」は、前記タグが付加される核酸の増幅を容易にする目的のための配列であるまたは当該配列を含むタグを意味する。例えば、いくつかの実施態様では、増幅タグは、ＤＮＡポリメラーゼを使用する核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ増幅反応もしくは鎖置換増幅反応、またはローリングサークル増幅反応）のためのプライミング部位、または核酸増幅反応（例えば、ライゲーション連鎖反応（ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ））における鋳型依存性リガーゼを使用するプローブの連結のための連結鋳型を提供する。
【００５６】
本明細書で使用する場合、核酸または核酸反応に関して使用される場合の用語「増幅する」、「増幅された」、または「増幅すること」は、標的核酸、または例えば本明細書に記載した方法によって生成されたタグ付けされた核酸などの、ある特定の核酸のコピーを作製するインビトロ方法を指す。核酸を増幅する多数の方法が、当技術分野で公知であり、増幅反応には、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、ＮＡＳＢＡなどの転写増幅法（例えば、米国特許第５，４０９，８１８号明細書）、ループ介在増幅法（例えば、ループ形成配列を使用する「ＬＡＭＰ」増幅、例えば、米国特許第６，４１０，２７８号明細書に記載されている通り）が含まれる。増幅される核酸は、改変されたＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含めた、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはＤＮＡとＲＮＡの混合物を含む、またはこれらからなる、またはこれらに由来するＤＮＡであり得る。１つまたは複数の核酸分子の増幅から得られる産物（すなわち「増幅産物」）は、出発核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方であるかにかかわらず、ＤＮＡまたはＲＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡ（ヌクレオシドまたはヌクレオチド）の両方の混合物であり得る。または、これらは、改変されたＤＮＡまたはＲＮＡ（ヌクレオシドまたはヌクレオチド）を含むことができる。「コピー」は、必ずしも、標的配列に対する完全な配列相補性または同一性を意味しない。例えば、コピーには、ヌクレオチド類似体、例えばデオキシイノシンまたはデオキシウリジン、意図的な配列変更（標的配列に対してハイブリッド形成可能であるが相補的ではない配列を含むプライマーを介して導入された配列変更など）、および／または増幅中に起こる配列の誤りが含まれる可能性がある。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「プライマー」は、核酸ポリメラーゼによって伸長することができる、一般に遊離の３’−ＯＨ基を有するオリゴヌクレオチドである。鋳型依存性ポリメラーゼについては、一般に、プライマーの少なくとも３’部分は、鋳型核酸の一部分に相補的であり、その鋳型核酸の一部分に、オリゴヌクレオチドが、水素結合および他の分子力によって「結合」（または「複合体形成」、「アニーリング」、もしくは「ハイブリッド形成」）して、ＤＮＡポリメラーゼによる合成の開始のためのプライマー／鋳型複合体が与えられ、これは、ＤＮＡ合成のプロセスにおいて、鋳型に相補的であるその３’末端に連結される共有結合された塩基の付加によって伸長（すなわち「プライマー伸長」）される。その結果は、プライマー伸長生成物である。鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素が含まれる）は、一般に、ＤＮＡ合成（「プライミング」）を開始するために、オリゴヌクレオチドプライマーの一本鎖鋳型に対する複合体形成を必要とするが、ＲＮＡポリメラーゼは一般に、ＤＮＡ鋳型に相補的であるＲＮＡの合成（転写）のためのプライマーを必要としない。
【００５８】
「固定プライマー」は、本明細書で使用する場合、標的または鋳型核酸、例えばＤＮＡ内の公知の配列に相補的な配列を有するプライマーを意味する。
【００５９】
「選択的プライマー」は、本明細書で使用する場合、トランスポゾンＤＮＡの配列に相補的な（連結部の５’末端を有する鎖に相補的な）配列を有するプライマーを意味する。選択的プライマーは、標的または鋳型核酸、例えばＤＮＡに対して５’→３’方向である。
【００６０】
詳細な説明
本開示は、特に、トランスポゾン組成物を使用してＤＮＡを断片化およびタグ付けすることによるヌクレアーゼ活性の特徴付けのための方法およびシステムを提供する。本明細書に記載した方法、組成物、およびキットは、本明細書に記載したヌクレアーゼでの切断を受けている標的または鋳型核酸（例えばＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡ）から核酸断片を産生および増幅するのに有用である。いくつかの実施態様では、こうした増幅された核酸断片は、例えばヌクレアーゼ活性を特徴付けるために、配列決定することができる。
【００６１】
本明細書に記載した方法、組成物、およびキットは、標的または鋳型核酸内の大きい挿入、大きい欠失、逆位、および／または転座を評価するのに特に有用である。例えば、開示した方法、組成物、および／またはキットは、試料（例えばゲノムＤＮＡ試料）の５％未満、１％未満、０．５％未満、０．３％未満、０．１％未満、０．０５％未満、および／または０．０１％未満の存在量で存在する、染色体再構成（例えば、大きい挿入、大きい欠失、逆位、および／または転座）を検出することができる。この開示の方法は、例えば、アンカードマルチプレックスＰＣＲ配列決定（ＡＭＰ−ｓｅｑ）（例えば、Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１４  Ｄｅｃ；２０（１２）：１４７９−８４；Ａｄｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１（１２），Ｒ１１９（２０１０）を参照のこと）を含めた公知の方法よりも好都合である。
【００６２】
いくつかの実施態様では、この開示は、一方向性の標的配列決定（Ｕｎｉ−Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（「ＵＤｉＴａＳ」）を提供する。本明細書に記載したある種の実施態様では、こうした方法は、単一プライマーターゲティング手法、例えば、トランスポザーゼと複合体化された単一のアダプター、アダプター上の固有分子インデックス（ＵＭＩ）（例えば、ＵＭＩバーコード）および／またはプーリングもしくは試料バーコード、タグメンテーション中のＵＭＩを直接的に用いたＤＮＡの標識、およびＰＣＲタグメンテーションされた産物を利用する。いくつかの実施態様では、第２ラウンドの本発明者らのＰＣＲは、アダプター（例えば、リバースＩｌｌｕｍｉｎａアダプター、例えばｉ７）および追加の試料バーコードを追加する。ある種の実施態様では、標的部位を通ってゲノムＤＮＡ断片の末端までの単一プライマー伸長が、転座事象を特定することができる。こうした方法はまた、本明細書に記載した通りの多重化にも適合できる。
【００６３】
本明細書で提供した戦略、方法、および試薬は、あらゆる部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、有機化合物ヌクレアーゼ、およびエンジイン抗生物質（例えば、ダイネミシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）、ネオカルジノスタチン、カリチアマイシン、エスペラミシン、ブレオマイシン）に対する切断および／または修復事象を分析するために利用することができる。本明細書に記載したものに加えて、好適なヌクレアーゼは、この開示に基づいて、当業者には明らかであろう。
【００６４】
さらに、本明細書で提供した戦略、方法、および試薬は、当業者が、特異性が高められたヌクレアーゼを特定、設計、および／または選択すること、および／またはあらゆる所与のヌクレアーゼ（例えば、部位特異的ヌクレアーゼ、例えばＺＦＮ、およびＴＡＬＥＮ、ならびにＲＮＡ−プログラム可能ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９）のオフターゲット効果を最小限にすることを可能にする。特にＤＮＡおよびＤＮＡ切断ヌクレアーゼに関しては、本明細書で提供した発明の概念、方法、戦略、および試薬は、この点では制限されないが、あらゆる核酸：ヌクレアーゼ対に適用することができる。
【００６５】
一方向性の標的配列決定（Ｕｎｉ−Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＵＤｉＴａＳ）
いくつかの態様では、本開示は、ヌクレアーゼおよび／またはヌクレアーゼバリアントを、ある特定の標的部位を切断する能力について評価する方法を提供する。いくつかの実施態様では、ＵＤｉＴａＳは、可変長のＰＣＲ増幅に伴うバイアスを除去し、単一の反応で、小さな挿入および欠失事象（インデル）に加えて、構造的変化を測定する。いくつかの実施態様では、ＵＤｉＴａＳ方法は、全長のＩｌｌｕｍｉｎａフォワードアダプター（ｉ５）、試料バーコード、および／または固有分子識別子（ＵＭＩ）を含むカスタム設計されたＴｎ５トランスポゾンを使用する（図２Ａ）。一般に、こうした方法は、核酸鋳型（例えばＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡ、例えば、本明細書に記載したヌクレアーゼを使用して切断、改変、および／または編集されているゲノムＤＮＡ）を、トランスポゾンと、トランスポゾンが核酸鋳型に挿入される条件下で接触させることを含む。
【００６６】
この条件は、例えば本明細書に記載したトランスポザーゼの存在下で、転移反応が起こるのに十分である。こうした転移反応および条件は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第６，５９３，１１３号明細書および米国特許第９，０８０，２１１号明細書を参照のこと）。いくつかの実施態様では、転移条件は、所望される断片サイズを念頭において選択される。転移反応は、核酸鋳型の、複数のタグメンテーションされた二本鎖核酸断片への断片化をもたらし、ここでは、トランスポゾンの転移鎖の３’末端は、核酸断片の５’末端に付着される。トランスポゾンの転移鎖は、５’末端に第１の検出配列を含む。いくつかの実施態様では、第１の検出配列は、ＵＭＩバーコード、プーリングバーコード、および／またはアダプター（全長のＩｌｌｕｍｉｎａフォワードアダプター（ｉ５））を含む。
【００６７】
転移反応の後に、タグメンテーションされた核酸断片を、例えば、プライマーのセットを使用するＰＣＲを使用して、増幅させる。第１のプライマーは、ゲノムＤＮＡ内のあらかじめ決定された位置に相補的なヌクレオチド配列を含む、固定プライマーであり得る。第１のプライマーはまた、本明細書に記載した通りの二本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、固定プライマーであり得る。第１のプライマーはまた、その５’末端に第２の検出配列を含む。第２のプライマーは、第１の検出配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む、選択的プライマーである。増幅は、（５’から３’方向に）第１の検出配列、核酸断片の５’末端に付着されたトランスポゾンの転移鎖、および第２の検出配列を含む、増幅された核酸断片を形成する。
【００６８】
いくつかの実施態様では、第１の検出配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の選択的プライマーと、第２の検出配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第３の選択的プライマーを使用して、第２ラウンドのＰＣＲが実施される。いくつかの実施態様では、第３の選択的プライマーは、バーコード（例えば、プーリングバーコード）および／または配列タグ（例えば、リバースＩｌｌｕｍｉｎａアダプター（ｉ７））を含む。例示的な方法を、図１および２Ａ〜２Ｃに示す。
【００６９】
次いで、増幅された核酸断片を、配列決定することができる。例えば、第１および第２の検出配列は、配列決定を容易にするための、本明細書に記載した配列決定タグを含むことができる。いくつかの実施態様では、この方法は、タグメンテーション後かつＰＣＲ前に、サイズ分離ステップを含むことができる。
【００７０】
いくつかの実施態様では、ゲノムＤＮＡ試料中の特定のアレル（例えば、１つまたは複数のインデルを有する、および／または１つまたは複数の染色体再構成を有する野生型）の相対存在量は、増幅された核酸断片中のアレルの相対存在量と同じである。
【００７１】
いくつかの実施態様では、複数のタグメンテーションされた二本鎖核酸断片は、こうした断片のライブラリであり得る。いくつかの実施態様では、ライブラリは、約１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０個、またはそれ以上の核酸断片を含む。いくつかの実施態様では、本明細書に記載した方法は、５００ｂｐ、１０００ｂｐ、１５００ｂｐ、２０００ｂｐ、２５００ｂｐ、３０００ｂｐ、３５００ｂｐ、４０００ｂｐ、５０００ｂｐ、６０００ｂｐ、７０００ｂｐ、８０００ｂｐ、９０００ｂｐ、１００００ｂｐ、またはそれ以上を配列決定することができる。
【００７２】
いくつかの実施態様では、この方法は、（ａ）核酸鋳型を、５’末端に第１の検出配列を含むトランスポゾンと、トランスポゾンが核酸鋳型に挿入され、かつ核酸鋳型が断片化されて核酸断片の５’末端に付着されたトランスポゾンを含む複数のタグメンテーションされた二本鎖核酸断片になる条件下で接触させることと；（ｂ）（ｉ）核酸鋳型内のあらかじめ決定された位置に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつその５’末端に第２の検出配列を含む第１の固定プライマーと、（ｉｉ）第１の検出配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の選択的プライマーとを使用して、タグメンテーションされた核酸断片を増幅させて、第１の検出配列、核酸断片の５’末端に付着されたトランスポゾン、および第２の検出配列を含む、増幅された核酸断片を形成させることと；（ｃ）増幅された核酸断片を配列決定することとを含み、ここでは、核酸鋳型は、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼを使用して改変されている。
【００７３】
いくつかの実施態様では、ステップ（ｂ）の増幅された核酸断片は、第１の検出配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の選択的プライマーと、第２の検出配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第３の選択的プライマーとを使用して増幅される。いくつかの実施態様では、第３の選択的プライマーは、バーコード（例えば、プーリングバーコード）および／または配列タグ（例えば、リバースＩｌｌｕｍｉｎａアダプター（ｉ７））を含む。
【００７４】
いくつかの実施態様では、この方法は、（ａ）細胞または組織から得られたゲノムＤＮＡ試料を、ヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの切断、および二本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの切断部位への組み込みに好都合な条件下で、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼおよび二本鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）と接触させることとであって、それによって、組み込まれた二本鎖オリゴヌクレオチドを含むタグ付けされたゲノムＤＮＡが産生される、ことと；（ｂ）タグ付けされたゲノムＤＮＡを、５’末端に第１の検出配列を含むトランスポゾンと、タグ付けされたゲノムＤＮＡにトランスポゾンが挿入され、かつタグ付けされたゲノムＤＮＡが断片化されて核酸断片の５’末端に付着されたトランスポゾンを含む複数のタグメンテーションされた二本鎖核酸断片になる条件下で接触させることと；（ｃ）（ｉ）二本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつその５’末端に第２の検出配列を含む第１の固定プライマーと、（ｉｉ）第１の検出配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の選択的プライマーとを使用して、タグメンテーションされた核酸断片を増幅させて、第１の検出配列、核酸断片の５’末端に付着されたトランスポゾン、および第２の検出配列を含む、増幅された核酸断片を形成させることと；（ｄ）増幅された核酸断片を配列決定することとを含む。
【００７５】
いくつかの実施態様では、ステップ（ｃ）の増幅された核酸断片は、第１の検出配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第２の選択的プライマーと、第２の検出配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第３の選択的プライマーとを使用して増幅される。いくつかの実施態様では、第３の選択的プライマーは、バーコード（例えば、プーリングバーコード）および／または配列タグ（例えば、リバースＩｌｌｕｍｉｎａアダプター（ｉ７））を含む。例示的な方法を、図３に示す。
【００７６】
いくつかの実施態様では、配列決定のステップから得られた配列が、参照ゲノムＤＮＡ試料（例えば、対照試料）からの１つまたは複数の配列と比較される。
【００７７】
例えば、本明細書によって開示された方法は、診断ツールとして使用することができる。
【００７８】
例えば、配列決定のステップから得られた配列に基づいて、および／またはこうした配列の、参照ゲノムＤＮＡ試料からの配列との比較に基づいて、決定を行うことができる。
【００７９】
いくつかの実施態様では、核酸鋳型は、標的ＤＮＡへの複数の挿入が起こり、これらがそれぞれ、転移鎖を含むまたは転移鎖からなる第１のタグの、標的ＤＮＡ内のヌクレオチドの５’末端への連結をもたらし、それによって、標的ＤＮＡが断片化され、アニーリングされた５’−タグ付けされたＤＮＡ断片（これらはそれぞれ、５’末端上に第１のタグを有する）の集団がもたらされる条件下かつ十分な時間、トランスポゾンと接触される。
【００８０】
いくつかの実施態様では、インビトロ転移反応において使用されるトランスポザーゼおよびトランスポゾンの、またはトランスポソーム組成物の量は、５０マイクロリットルの反応あたり、５０ナノグラムの標的ＤＮＡあたり、約１ピコモル〜約２５ピコモルである。いくつかの実施態様では、インビトロ転移反応において使用されるトランスポザーゼおよびトランスポゾン組成物の、またはトランスポソーム組成物の量は、５０マイクロリットルの反応あたり、５０ナノグラムの標的ＤＮＡあたり、約５ピコモル〜約５０ピコモルである。トランスポザーゼが高活性なＴｎ５トランスポザーゼまたはＭｕＡトランスポザーゼであるいくつかの実施態様では、インビトロ転移反応において使用されるトランスポザーゼおよびトランスポゾンの、またはトランスポソームの最終濃度は、少なくとも２５０ｎＭであり；いくつかの他の実施態様では、高活性なＴｎ５トランスポザーゼまたはＭｕＡトランスポザーゼの、また、そのそれぞれのトランスポゾン最終組成物またはトランスポソーム組成物の最終濃度は、少なくとも５００ｎＭである。
【００８１】
いくつかの実施態様では、インビトロ転移反応のための反応時間は、２時間以下、１時間以下、３０分以下、または１５分以下である。いくつかの実施態様では、インビトロ転移反応のための反応時間は、５分以下である。トランスポソーム組成物が高活性なＴｎ５トランスポザーゼを含むいくつかの実施態様では、インビトロ転移反応のための反応時間は、５分以下である。
【００８２】
トランスポゾンは、検出可能な標識で標識することができる。こうした標識は、例えば、トランスポゾンを含有する核酸を捉える、精製する、および／または濃縮するために有用であり得る。例えば、ビオチン、蛍光標識、抗体標識、抗体断片標識、および／または本明細書に言及した他の検出可能な標識を含めた、非常に様々な検出可能な標識のいずれかが、この目的のために好適であり得る。
【００８３】
いくつかの実施態様では、配列決定タグは、ある特定の配列決定プラットフォームのための次世代配列決定のための鋳型の産生のために使用される（例えば、ＲＯＣＨＥ  ４５４Ａまたは４５４Ｂ配列決定プラットフォームのための；ＩＬＬＵＭＩＮＡ  ＳＯＬＥＸＡ配列決定プラットフォームのための；ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ  ＳＯＬＩＤ（商標）配列決定プラットフォームのための；ＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ’  ＳＭＲＴ（商標）配列決定プラットフォームのための；ＰＯＬＬＯＮＡＴＯＲ  ＰＯＬＯＮＹ配列決定プラットフォームのための；ＨＥＬＩＣＯＳ配列決定プラットフォームのための；ＣＯＭＰＬＥＴＥ  ＧＥＮＯＭＩＣＳ配列決定プラットフォームのための；ＩＮＴＥＬＬＩＧＥＮＴ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ配列決定プラットフォームのための；または他のあらゆる配列決定プラットフォームのための配列決定タグ）。いくつかの実施態様では、配列決定タグは、全長のＩｌｌｕｍｉｎａフォワードアダプター（ｉ５）である。いくつかの実施態様では、配列決定タグは、全長のＩｌｌｕｍｉｎａリバースアダプター（ｉ７）である。
【００８４】
ＰＣＲによる増幅反応を実施するために、非常に様々な酵素およびキットが利用可能である。例えば、いくつかの実施態様では、ＰＣＲ増幅は、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＦＡＩＬＳＡＦＥ（商標）ＰＣＲシステムまたはＭＡＳＴＥＲＡＭＰ（商標）Ｅｘｔｒａ−Ｌｏｎｇ  ＰＣＲシステムを、製造業者によって記載されている通りに使用して実施される。これらのシステムは、特定の鋳型およびプライマー対に最適なＰｒｅＭｉｘを特定するための各システムと共に提供される一連の２×ＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘを使用して、ＰＣＲ反応条件の迅速な最適化を可能にする。しかし、この開示は、増幅反応のためのこれらの生成物または条件の使用に限定されず、標的配列とアニーリングするプライマーと、トランスポゾンとアニーリングするプライマーとの間の配列の増幅を可能にする、あらゆる好適な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび反応混合物を使用することができる。本明細書に記載した方法のいずれかにおいて、非鎖置換型ポリメラーゼまたは鎖置換型ポリメラーゼを使用することができる。
【００８５】
核酸の増幅のためのプロトコルは、当技術分野で公知であり、例えば、１ラウンドの増幅または複数ラウンドの増幅が含まれ得る。例えば、第１の増幅ラウンドの後に、増幅の２つのラウンドの間に１つまたは複数の処理（例えば、精製、濃縮など）ステップを伴ってまたは伴わずに、第２の増幅ラウンドが続くことができる。いくつかの実施態様では、間に１つまたは複数の処理ステップを伴ってまたは伴わずに、追加のラウンドの増幅を使用することができる。
【００８６】
増幅サイクルの数は、実施態様に応じて様々であり得る。例えば、増幅の各ラウンドは、少なくとも８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、または３２サイクルを含むことができる。２ラウンド以上の増幅を含む実施態様では、各ラウンドにおいて使用される増幅サイクルの数は、同じである可能性も、異なる可能性もある。２ラウンドの増幅が使用される場合、２つのラウンドにおける増幅サイクルの数は異なり、第１のラウンドは、第２のラウンドよりも多いサイクルを含むこともできるし、第２のラウンドよりも少ないサイクルを含むこともできる。一例として、増幅の第１のラウンドは、１２サイクルを含むことができ、増幅の第２のラウンドは、１５サイクルを含むことができる。別の例として、増幅の第１のラウンドは、１０サイクルを含むことができ、増幅の第２のラウンドは、１２サイクルを含むことができる。
【００８７】
２ラウンド以上の増幅が使用される場合、同じまたは異なるセットのプライマーを使用することができる。例えば、ネステッド増幅スキーム（例えばネステッドＰＣＲ）を使用することができる。
【００８８】
２ラウンドの増幅を含むいくつかの実施態様では、あるラウンドにおけるフォワードプライマーは、別のラウンドにおけるフォワードプライマーとして使用されるが、２つのラウンドにおけるリバースプライマーは異なる。あるいは、フォワードプライマーとリバースプライマーが、２つのラウンドにおいて異なる可能性がある。あるいは、一方のラウンドにおけるリバースプライマーは、他方のラウンドにおけるリバースプライマーとして使用されるが、２つのラウンドにおけるフォワードプライマーは異なる。
【００８９】
増幅反応におけるプライマーの最終濃度は、実施態様に応じて変動し得る。例えば、単一ラウンドの増幅において、または多ラウンドの増幅の同じラウンドにおいて、２つ以上のプライマーが一緒に使用される場合、プライマーの濃度は、異なる可能性も同じである可能性もある。例えば、プライマーは、増幅反応において、約１００ｎＭ〜約５００ｎＭの範囲の濃度、例えば、約１００ｎＭ、約１５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約３００ｎＭ、約３５０ｎＭ、約４００ｎＭ、約４５０ｎＭ、または約４００ｎＭで存在することができる。
【００９０】
いくつかの実施態様では、同じラウンドの増幅中に存在する別のプライマーに対して過剰量の、あるプライマーが使用される。いくつかの実施態様では、少なくとも１ラウンドの増幅における少なくとも１種のプライマーは、５００ｎＭを超える濃度、例えば、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭなどで存在する。
【００９１】
いくつかの実施態様では、反応は、マグネシウム、例えばＭｇＣｌ２を含有する緩衝液中で行われる。マグネシウム（例えばＭｇＣｌ２）の好適な濃度の例としては、限定はされないが、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約３ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４ｍＭ、約４．５ｍＭ、または約５ｍＭが挙げられる。
【００９２】
いくつかの実施態様では、ｄＮＴＰの混合物は、約０．２ｍＭ〜約０．８ｍＭまでの範囲の濃度、例えば、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、または約０．８ｍＭで使用される。
【００９３】
増幅反応の総体積は、実施態様に応じて変動し得る。例えば、約１０μＬ〜約２００μＬ、例えば、約１０μＬ、約１５μＬ、約２０μＬ、約２５μＬ、約３０μＬ、約３５μＬ、約４０μＬ、約４５μＬ、約５０μＬ、約５５μＬ、約６０μＬ、約６５μＬ、約７０μＬ、約７５μＬ、約８０μＬ、約８５μＬ、約９０μＬ、約９５μＬ、約１００μＬ、約１１０μＬ、約１２０μＬ、約１３０μＬ、約１４０μＬ、約１５０μＬ、約１６０μＬ、約１７０μＬ、約１８０μＬ、約１９０μＬ、または約２００μＬの反応体積を使用することができる。
【００９４】
一般に、増幅のサイクルは、変性段階（その間、核酸の鎖が分離される）、アニーリング段階（その間、プライマーが核酸鋳型にアニーリングする）、および伸長段階（その間、アニーリングされたプライマーが、核酸鋳型を使用して伸長する）を含む。
【００９５】
各段階の温度は異なり、変性段階中に使用される温度は、伸長段階の温度よりも高い傾向があり、伸長段階の温度は、アニーリング段階中に使用される温度よりも高い傾向がある。
【００９６】
例えば、変性段階に適した温度は、約９０℃〜約１００℃までの範囲、例えば、約９０℃、約９１℃、約９２℃、約９３℃、約９４℃、約９５℃、約９６℃、約９７℃、約９８℃、約９９℃、または約１００℃であり得る。
【００９７】
例えば、アニーリング段階に適した温度は、約５０℃〜約６５℃までの範囲、例えば、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、または約６５℃であり得る。
【００９８】
例えば、伸長段階に適した温度は、約６８℃〜約８０℃までの範囲、例えば、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃、または約８０℃であり得る。
【００９９】
単一のサイクル中の各段階の期間は、変動し得る。一般に、アニーリングおよび伸長段階の期間は、変性段階の期間よりも長い可能性がある。
【０１００】
例えば、変性段階は、各サイクルにおいて、約４秒〜約２０秒、例えば、約４秒、約５秒、約６秒、約７秒、約８秒、約９秒、約１０秒、約１１秒、約１２秒、約１３秒、約１４秒、約１５秒、約１６秒、約１７秒、約１８秒、約１９秒、または約２０秒、持続することができる。
【０１０１】
アニーリングおよび伸長段階の期間は、同じまたは異なる可能性がある。例えば、アニーリングまたは伸長段階は、各サイクルにおいて、約２０秒〜約２分、例えば、約２０秒、約２５秒、約３０秒、約３５秒、約４０秒、約４５秒、約５０秒、約５５秒、約６０秒、約６５秒、約７０秒、約７５秒、約８０秒、約８５秒、約９０秒、約９５秒、約１００秒、約１０５秒、約１１０秒、または約１２０秒、持続することができる。
【０１０２】
２ラウンド以上の増幅が使用される実施態様では、ラウンド間に、１つまたは複数の処理ステップを使用することができる。例えば、１つまたは複数の精製および／または濃縮ステップを使用することができる。好適な精製ステップには、限定はされないが、プロテイナーゼＫでの処理、タンパク質の化学変性剤（例えば尿素）での処理、ビーズに基づく方法（例えば、可逆的固相固定化（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）技術を使用するもの）、カラム上ＤＮＡ精製法などが含まれる。ＤＮＡ精製および／または濃縮装置のキットは、市販品として入手可能であり、例えば、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈなどからのキットが挙げられる。
【０１０３】
例えば、反応の構成成分を不活性化するための１つまたは複数のステップ、例えば、加熱、ｐＨの変化、および／または化学物質によるポリメラーゼなどの酵素の失活を使用することができる。
【０１０４】
この開示はまた、ＤＮＡ断片を増幅するためのＰＣＲの使用に限定されない。同じ配列を増幅し、かつ意図される目的に適した組成および量の増幅産物を産生する、あらゆる好適な増幅方法（例えば、ローリングサークル増幅、リボプライマー増幅（例えば、米国特許第７，４１３，８５７号明細書）、ＩＣＡＮ、ＵＣＡＮ、ｒｉｂｏｓｐｉａ、末端タギング（米国特許出願第２００５０１５３３３３号明細書）、Ｅｂｅｒｗｉｎｅ型ａＲＮＡ増幅、または鎖置換増幅）を、本開示の実施態様において使用することができる。例えば、使用することができるいくつかの鎖置換方法は、宝酒造株式会社（日本、京都）の国際公開第０２／１６６３９号パンフレット；国際公開第００／５６８７７号パンフレット；およびＡＵ  ００／２９７４２号明細書；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙの米国特許第５，５２３，２０４号；同第５，５３６，６４９号；同第５，６２４，８２５号；同第５，６３１，１４７号；同第５，６４８，２１１号；同第５，７３３，７５２号；同第５，７４４，３１１号；同第５，７５６，７０２号；および同第５，９１６，７７９号明細書；Ｎａｎｏｇｅｎ／Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｐａｒｔｎｅｒｓｈｉｐの米国特許第６，２３８，８６８号；同第６，３０９，８３３号；および同第６，３２６，１７３号明細書；Ｂｉｏ  Ｍｅｒｉｅｕｘの米国特許第５，８４９，５４７号；同第５，８７４，２６０号；および同第６，２１８，１５１号明細書；Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．の米国特許第５，７８６，１８３号；同第６，０８７，１３３号；および同第６，２１４，５８７号明細書；Ｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６，０６３，６０４号明細書；Ｋｕｒｎの米国特許第６，２５１，６３９号明細書；栄研化学株式会社（日本、東京）の米国特許第６，４１０，２７８号明細書；および国際公開第００／２８０８２号パンフレット；Ａｕｅｒｂａｃｈの米国特許第５，５９１，６０９号；同第５，６１４，３８９号；同第５，７７３，７３３号；同第５，８３４，２０２号；および同第６，４４８，０１７号明細書；ならびにＬｉｚａｒｄｉの米国特許第６，１２４，１２０号；および同第６，２８０，９４９号明細書に記載されている。
【０１０５】
ゲノムＤＮＡ
本明細書に開示した方法において使用されるゲノムＤＮＡ試料は、一般に、あらゆる種類の細胞および／または組織、例えば、初代細胞および／または組織、少なくともある期間培養した細胞または組織、または初代と培養細胞および／または組織の組み合わせから得ることができる。
【０１０６】
いくつかの実施態様では、ＵＤｉＴａＳは、単一の細胞由来のゲノムＤＮＡ上で実施される。例えば、単一の細胞由来のゲノムＤＮＡは、ＵＤｉＴａＳを実施する前に増幅することができる。全ゲノム増幅方法は、当技術分野で公知である。様々なプロトコルおよび／または市販品として入手可能なキットのいずれかを使用することができる。市販品として入手可能なキットの例としては、限定はされないが、ＱＩＡＧＥＮのＲＥＰＬＩ−ｇ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｋｉｔ、Ｓｉｇｍａ  ＡｌｄｒｉｃｈのＧＥＮＯＭＥＰＬＥＸ（登録商標）Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｓｉｌｉｃｏｎ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＡｍｐｌｉ１（商標）ＷＧＡ  Ｋｉｔ、およびＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓのｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔが挙げられる。したがって、いくつかの実施態様では、ＵＤｉＴａＳが、単一の細胞由来のゲノムＤＮＡ上で実施されるとしても、そのゲノムＤＮＡ上で、複数の反応、例えば、それぞれの反応が本明細書にさらに記載する通りの異なる固定プライマーを使用する複数の反応を実施することが可能である。
【０１０７】
この開示の方法はまた、ウイルスによって導入された配列を含む、および／または本明細書に記載した二本鎖オリゴヌクレオチドを含む、ゲノムＤＮＡ試料を使用して実施することができる。例えば、この開示の方法は、ウイルスベクターを使用して配列をゲノムＤＮＡに導入する、および／または二本鎖オリゴヌクレオチドを本明細書に記載した通りにゲノムＤＮＡに挿入するステップを含むことができる。配列を導入するステップは、一般に、ゲノムＤＮＡをトランスポゾンと接触させるステップの前に実施される。
【０１０８】
いくつかの実施態様では、ゲノムＤＮＡ試料は、生きている細胞および／または組織を含有しない、または、痕跡量の細胞および／または組織を含有する試料から得られる。例えば、本開示の方法は、限定はされないが、血液、骨、爪、毛髪、歯、スワブ（例えば、頬側スワブ、生殖器スワブ、子宮頸部スワブ、肛門スワブなど）、および尿試料などの、法医学的ＤＮＡ試料に対して使用することができる。使用されたガーゼまたは創傷被覆材からの試料も使用することができる。
【０１０９】
あるいはまたはさらに、本明細書に開示した方法は、真核細胞由来のゲノムＤＮＡ試料および／または原核細胞由来の組織と共に使用することができる。例えば、本開示の方法は、微生物由来の、および／または患者（例えば、抗生物質を受けている患者）からの分離物由来のゲノムＤＮＡを使用して実施することができる。いくつかの実施態様では、例えばメタゲノムマイニングのために、微生物群集および／または１つまたは複数の微生物叢由来のゲノムＤＮＡが使用される。（例えば、Ｄｅｌｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ，“Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ  ｍｉｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ，”ＩＳＭＥ  Ｊ．２０１１  Ｄｅｃ；５（１２）：１８３７−４３を参照のこと）。
【０１１０】
ゲノムＤＮＡは、例えば、本明細書に記載した細胞および／または組織に対するある種の操作を含めた、様々な好適な方法のいずれかを使用して調製することができる。例示的な非限定的な操作には、細胞および／または組織をヌクレアーゼ（例えば、部位特異的ヌクレアーゼおよび／またはＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ）と接触させること、またはこうしたヌクレアーゼを含むゲノム編集システムが含まれる。
【０１１１】
検出配列
検出配列は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載した核酸鋳型、トランスポゾン、および／またはプライマー上に存在することができる、また、それを含有する核酸、または核酸断片の回収および／または検出を容易にする配列要素を指す。いくつかの実施態様では、１つまたは複数の検出配列が、オリゴヌクレオチドアレイによる捕捉を容易にするまたは媒介する、および／または配列決定、例えば、本明細書に記載した連結産物の配列決定を容易にするまたは媒介する。
【０１１２】
いくつかの実施態様では、検出配列は、増幅および／または配列決定を容易にする。いくつかの実施態様では、検出配列は、増幅および／または配列決定プライマーによって認識されることが可能な１つまたは複数の配列を含む。
【０１１３】
いくつかの実施態様では、検出配列は、ＵＭＩを含む。いくつかの実施態様では、検出配列は、バーコードを含む。いくつかの実施態様では、検出配列は、試料バーコードを含む。
【０１１４】
例えば、いくつかの実施態様では、検出配列は、配列決定方法に使用するための配列アダプターを含む。いくつかの実施態様では、こうした配列アダプターは、増幅プライマー結合部位および配列決定プライマー結合部位を含む。いくつかの実施態様では、こうした配列アダプターは、増幅プライマー結合部位と配列決定プライマー結合部位の両方として働くプライマー結合部位を含む。いくつかの実施態様では、増幅プライマー結合部位は、配列決定プライマー結合部位と重なる。
【０１１５】
いくつかの実施態様では、増幅プライマー結合部位は、長距離の増幅のために使用される。
【０１１６】
いくつかの実施態様では、配列アダプターは、アダプターの一端を標識するマーカー配列をさらに含む。
【０１１７】
いくつかの実施態様では、配列アダプターは、バーコード配列をさらに含む。本明細書に記載した方法において使用することができる検出配列は、当技術分野で公知である。例えば、配列決定アダプター（例えば、ＭｉＳｅｑアダプター）（Ｉｌｌｕｍｉｎａから入手可能）を、検出配列として使用することができる（例えば、ｉ５、ｉ７）。
【０１１８】
二本鎖オリゴヌクレオチド
本明細書に記載した通り、ゲノムＤＮＡは、二本鎖オリゴヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、（ゲノムＤＮＡ試料が得られる）細胞または組織が、二本鎖オリゴヌクレオチドおよびヌクレアーゼ（例えば、部位特異的ヌクレアーゼおよび／またはＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ）と、例えば、ヌクレアーゼによるゲノムＤＮＡの切断に好都合な条件下で接触される。二本鎖オリゴヌクレオチドが使用される場合、二本鎖オリゴヌクレオチドを、ゲノムＤＮＡ内の１つまたは複数のヌクレアーゼ切断部位に組み込むことができる。例えば、ヌクレアーゼは、ゲノムＤＮＡ中の１つまたは複数の二本鎖切断を誘発することができ、二本鎖オリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の二本鎖切断の少なくとも１つに組み込まれることができる。
【０１１９】
ゲノムＤＮＡが、二本鎖オリゴヌクレオチドを含む場合、本明細書に記載した方法は、例えば増幅ステップにおいて、二本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む固定プライマーを使用することを含む。
【０１２０】
好適な二本鎖オリゴヌクレオチドを設計し、こうしたオリゴヌクレオチドを組み込む方法は、当技術分野で公知であり、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１５／２００３７８Ａ１号パンフレットに記載されている。
【０１２１】
いくつかの実施態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドのどちらの鎖も、ゲノムＤＮＡに対してオルソロガスである。例えば、ゲノムＤＮＡがヒトゲノムＤＮＡである実施態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドのどちらの鎖も、存在する場合には、ヒトゲノムＤＮＡに対してオルソロガスであり得る。
【０１２２】
いくつかの実施態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、化学修飾を含む。例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドの各５’末端は、リン酸基を含むことができる。あるいはまたはさらに、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含有することができる。例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドの各３’末端および／または各５’末端は、ホスホロチオエート結合を含むことができる。
【０１２３】
いくつかの実施態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、両方の５’末端でリン酸化され、両方の５’末端上にホスホロチオエート結合を含有し、両方の３’末端上にホスホロチオエート結合を含有する。
【０１２４】
いくつかの実施態様では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、３０〜３５個のヌクレオチドまたは６０〜６５個のヌクレオチドを含む。
【０１２５】
二本鎖オリゴヌクレオチドの末端は、平滑であるまたは突出を含む（例えば、１、２、３、または４塩基の突出ヌクレオチドを有する５’末端を含む）こともできるし、一方の末端が平滑であり、他方が突出を含むこともできる。
【０１２６】
増幅ステップを含む方法において二本鎖オリゴヌクレオチドが使用されるいくつかの実施態様では、増幅ステップは、二本鎖オリゴヌクレオチド内のあらかじめ決定された配列に相補的なヌクレオチド配列を含む固定プライマーを使用して、ローリングサークルＰＣＲを実施することを含む。
【０１２７】
検出可能な標識
いくつかの実施態様では、本明細書に記載したトランスポゾン、二本鎖オリゴヌクレオチド、および／またはプライマーは、検出可能な標識で標識される。こうした標識は、例えば、トランスポゾン、二本鎖オリゴヌクレオチド、および／またはプライマーを含有する核酸を捉える、精製する、および／または濃縮するために有用であり得る。例えば、ビオチン、蛍光標識、抗体標識、抗体断片標識、および／または本明細書に言及した他の検出可能な標識を含めた、非常に様々な検出可能な標識のいずれかが、この目的のために好適であり得る。
【０１２８】
固有分子識別子
いくつかの実施態様では、本明細書に記載した核酸鋳型、トランスポゾン、および／またはプライマーは、固有分子識別子（本明細書では「ＵＭＩ」と省略される）を含むことができる。ＵＭＩは、核酸鋳型またはその一部分に関する情報を検索するために使用することができる配列を指す。例えば、複数のプライマーを含む開示の方法では、各ＵＭＩは、特定のプライマー、例えば、特異的な標的配列と結合するプライマーと関係がある可能性がある。いくつかの実施態様では、ＵＭＩは、ＵＭＩバーコードと呼ばれる。
【０１２９】
いくつかの実施態様では、検出配列の検出は、特定のＵＭＩを特定する、例えば、その特定のＵＭＩが伴われる標的、トランスポゾン、またはプライマーを特定するために使用することができる。
【０１３０】
いくつかの実施態様では、ＵＭＩは、ランダムに作成される配列である。いくつかの実施態様では、ＵＭＩは、長さが８〜２０ヌクレオチド、例えば、長さが１０〜１６ヌクレオチド、例えば長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６ヌクレオチドである。様々な状況でのＵＭＩの生成および使用は、当技術分野で公知である。
【０１３１】
ヌクレアーゼ
本開示の方法は、周知のヌクレアーゼとそれほど特徴づけられていないヌクレアーゼとの両方を含めた、様々なヌクレアーゼの切断プロフィールを評価するのに適している。一般に、ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼの「標的部位」と呼ばれる特定の配列または配列のセットでのみ切断することが知られているまたは予想される点において、部位特異的である。
【０１３２】
本明細書によって開示された方法では、ヌクレアーゼとのインキュベーションステップは、一般に、ヌクレアーゼによる切断に好都合な条件下で行われる。すなわち、所与の候補標的部位またはバリアント標的部位が、ヌクレアーゼによって実際には切断されないとしても、インキュベーション条件は、ヌクレアーゼが、その公知の標的部位を含有する鋳型の少なくともかなりの部分（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％）を切断するようなものである。公知のおよび一般に良く特徴付けられたヌクレアーゼについては、こうした条件は、当技術分野で一般に公知である、および／または容易に発見または最適化することができる。新しく発見されたヌクレアーゼについては、こうした条件は、一般に、より特徴付けられている関連するヌクレアーゼ（例えば、相同体およびオルソログ）に関する情報を使用して概算することができる。
【０１３３】
いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼである。いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼは、部位特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼなど）である。
【０１３４】
いくつかの実施態様では、部位特異的ヌクレアーゼの部位特異性は、補助的な分子によって与えられる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼは、本明細書に記載した通りの「ガイドＲＮＡ」またはｇＲＮＡによって、特定の部位に誘導される。いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼは、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼである。いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼである。
【０１３５】
いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼは、これまでに知られているヌクレアーゼの相同体またはオルソログ、例えば、新しく発見された相同体またはオルソログである。
【０１３６】
ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ
本開示によるＲＮＡガイド型ヌクレアーゼには、限定はされないが、天然起源のクラス２  ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９、およびＣｐｆ１、ならびにそれに由来するまたはそこから得られる他のヌクレアーゼが含まれる。ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼは、機能面では、（ａ）ｇＲＮＡと相互作用（例えば複合体形成）する；および（ｂ）ｇＲＮＡと共に、（ｉ）ｇＲＮＡのターゲティングドメインに相補的な配列、および場合によっては（ｉｉ）「プロトスペーサー隣接モチーフ」または「ＰＡＭ」と呼ばれる追加の配列（これは、以下により詳細に記載される）を含むＤＮＡの標的領域と結合し、場合によっては切断するまたは改変するヌクレアーゼと定義される。以下の実施例が説明する通り、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼは、同じＰＡＭ特異性または切断活性を有する個々のＲＮＡガイド型ヌクレアーゼの間に差異が存在する可能性があるとしても、大まかに、そのＰＡＭ特異性および切断活性によって定義することができる。当業者は、本開示のいくつかの態様が、ある種のＰＡＭ特異性および／または切断活性を有するあらゆる好適なＲＮＡガイド型ヌクレアーゼを使用して実行することができるシステム、方法、および組成物に関することを認識するであろう。この理由から、そうではないと指定されない限り、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼという用語は、包括的な用語と理解されるべきであり、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼの、いずれかの特定の型（例えば、Ｃｐｆ１に対するＣａｓ９）、種（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、または差異（例えば、切り詰めまたは分断に対する全長；操作されたＰＡＭ特異性に対する天然起源のＰＡＭ特異性など）に限定されない。
【０１３７】
ＰＡＭ配列は、ｇＲＮＡターゲティングドメイン（または「スペーサー」）に相補的である「プロトスペーサー」配列に対するその連続的な関係から、その名前が付けられている。プロトスペーサー配列と共に、ＰＡＭ配列は、特定のＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ／ｇＲＮＡ組み合わせのための標的領域または配列を定義する。
【０１３８】
様々なＲＮＡガイド型ヌクレアーゼが、ＰＡＭとプロトスペーサーとの間の異なる連続的な関係を必要とする可能性がある。一般に、Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡターゲティングドメインに対して可視化されているプロトスペーサーの３’であるＰＡＭ配列を認識する。他方で、Ｃｐｆ１は、一般に、プロトスペーサーの５’であるＰＡＭ配列を認識する。
【０１３９】
ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼは、ＰＡＭおよびプロトスペーサーの特定の連続的方向性を認識することに加えて、特定のＰＡＭ配列を認識することもできる。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９は、例えば、ＮＮＧＲＲＴまたはＮＮＧＲＲＶ（ここでは、Ｎ残基は、ｇＲＮＡターゲティングドメインによって認識される領域に隣接する３’である）のＰＡＭ配列を認識する。化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９は、ＮＧＧ  ＰＡＭ配列を認識する。また、フランシセラ・ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｃｐｆ１は、ＴＴＮ  ＰＡＭ配列を認識する。ＰＡＭ配列は、様々なＲＮＡガイド型ヌクレアーゼについて同定されており、新規のＰＡＭ配列を同定するための戦略は、Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ６０，３８５−３９７，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ５，２０１５によって記載されている。操作されたＲＮＡガイド型ヌクレアーゼが、参照分子のＰＡＭ特異性とは異なるＰＡＭ特異性を有する可能性がある（例えば、操作されたＲＮＡガイド型ヌクレアーゼの場合、参照分子は、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼが由来する天然起源のバリアント、または操作されたＲＮＡガイド型ヌクレアーゼに対する最大のアミノ酸配列相同性を有する天然起源のバリアントであり得る）ことにも留意するべきである。
【０１４０】
ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼは、そのＰＡＭ特異性に加えて、そのＤＮＡ切断活性で特徴付けることができる：天然起源のＲＮＡガイド型ヌクレアーゼは、典型的には、標的核酸においてＤＳＢを形成するが、ＳＳＢのみをもたらす（上記）参照により本明細書に組み込まれるＲａｎ＆Ｈｓｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５４（６），１３８０−１３８９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １２，２０１３（“Ｒａｎ”））、または全く切断しない、操作されたバリアントが産生されている。
【０１４１】
Ｃａｓ９
化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９について（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３（６１７６），１２４７９９７，２０１４（“Ｊｉｎｅｋ  ２０１４”）、また、単分子ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの複合体の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９について（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ２０１４；Ａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１４  Ｓｅｐ  ２５；５１３（７５１９）：５６９−７３（“Ａｎｄｅｒｓ  ２０１４”）；およびＮｉｓｈｉｍａｓｕ  ２０１５）、結晶構造が決定されている。
【０１４２】
天然起源のＣａｓ９タンパク質は、２つのローブ：認識（ＲＥＣ）ローブとヌクレアーゼ（ＮＵＣ）ローブを含む；これらはそれぞれ、特定の構造および／または機能ドメインを含む。ＲＥＣローブは、アルギニンリッチブリッジヘリックス（ＢＨ）ドメイン、および少なくとも１つのＲＥＣドメイン（例えば、ＲＥＣ１ドメインと、場合によってはＲＥＣ２ドメイン）を含む。ＲＥＣローブは、他の公知のタンパク質との構造的類似性を有さず、これが固有の機能ドメインであることが示唆される。いかなる理論にも拘泥されることを望まないが、変異解析は、ＢＨおよびＲＥＣドメインについての特定の機能的役割を示唆している：ＢＨドメインが、ｇＲＮＡ：ＤＮＡ認識における役割を果たすようであるのに対し、ＲＥＣドメインは、ｇＲＮＡのリピート：アンチリピート二本鎖と相互作用して、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の形成を媒介すると考えられる。
【０１４３】
ＮＵＣローブは、ＲｕｖＣドメイン、ＨＮＨドメイン、およびＰＡＭ相互作用（−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ）（ＰＩ）ドメインを含む。ＲｕｖＣドメインは、レトロウイルスインテグラーゼスーパーファミリーメンバーとの構造的類似性を有し、標的核酸の非相補（すなわち、ボトム）鎖を切断する。これは、２つ以上のスプリットＲｕｖＣモチーフ（化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）におけるＲｕｖＣ  Ｉ、ＲｕｖＣＩＩ、およびＲｕｖＣＩＩＩなど）から形成される可能性がある。一方、ＨＮＨドメインは、ＨＮＮエンドヌクレアーゼモチーフと構造的に類似であり、標的核酸の相補（すなわち、トップ）鎖を切断する。ＰＩドメインは、その名前が示唆する通り、ＰＡＭ特異性に寄与する。
【０１４４】
Ｃａｓ９のある種の機能は、（必ずしもそれによって完全に決定されるわけではないが）上で説明した特定のドメインと関係があるが、これらの機能および他の機能は、他のＣａｓ９ドメインによって、またはいずれかのローブ上の複数のドメインによって媒介されるまたは影響を受ける可能性がある。例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９では、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ２０１４に記載されている通り、ｇＲＮＡのリピート：アンチリピート二本鎖は、ＲＥＣとＮＵＣローブとの間の溝に入り、この二本鎖内のヌクレオチドは、ＢＨ、ＰＩ、およびＲＥＣドメイン内のアミノ酸と相互作用する。第１のステム・ループ構造内のいくつかのヌクレオチドも、複数のドメイン（ＰＩ、ＢＨ、およびＲＥＣ１）内のアミノ酸と相互作用し、第２および第３のステム・ループ内のいくつかのヌクレオチドも同様である（ＲｕｖＣおよびＰＩドメイン）。
【０１４５】
Ｃｐｆ１
ｃｒＲＮＡと二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ標的（ＴＴＴＮ  ＰＡＭ配列を含む）との複合体のアシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）種Ｃｐｆ１の結晶構造は、Ｙａｍａｎｏらによって解明されている（参照により本明細書に組み込まれるＣｅｌｌ．２０１６  Ｍａｙ  ５；１６５（４）：９４９−９６２（“Ｙａｍａｎｏ”））。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９のように、２つのローブ：ＲＥＣ（認識）ローブ、およびＮＵＣ（ヌクレアーゼ）ローブを有する。ＲＥＣローブは、あらゆる公知のタンパク質構造との類似性がないＲＥＣ１およびＲＥＣ２ドメインを含む。一方、ＮＵＣローブは、３つのＲｕｖＣドメイン（ＲｕｖＣ−Ｉ、−ＩＩ、および−ＩＩＩ）、ならびにＢＨドメインを含む。しかし、Ｃａｓ９とは対照的に、Ｃｐｆ１  ＲＥＣローブは、ＨＮＨドメインがなく、やはり公知のタンパク質構造との類似性がない他のドメイン：構造的に固有のＰＩドメイン、３つのくさび（Ｗｅｄｇｅ）（ＷＥＤ）ドメイン（ＷＥＤ−Ｉ、−ＩＩ、および−ＩＩＩ）、ならびにヌクレアーゼ（Ｎｕｃ）ドメインを含む。
【０１４６】
Ｃａｓ９とＣｐｆ１は、構造および機能において類似性を有するが、ある種のＣｐｆ１活性が、あらゆるＣａｓ９ドメインと類似ではない構造ドメインによって媒介されることを認識するべきである。例えば、標的ＤＮＡの相補鎖の切断は、Ｃａｓ９のＨＮＨドメインとは配列的および空間的に異なるＮｕｃドメインによって媒介されるようである。さらに、Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡの非ターゲティング部分（ハンドル）は、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡにおいてリピート：アンチリピート二本鎖によって形成されるステム・ループ構造ではなく、シュードノット構造をとる。
【０１４７】
ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼをコードする核酸
ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、またはその機能性断片をコードする核酸は、本明細書で提供される。ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼをコードする例示的な核酸は、以前に記載されている（例えば、Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８１９−２３（“Ｃｏｎｇ  ２０１３”）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３  Ｄｅｃ  ３１；８（１２）：ｅ８５６５０（“Ｗａｎｇ  ２０１３”）；Ｍａｌｉ  ２０１３；Ｊｉｎｅｋ  ２０１２を参照のこと）。
【０１４８】
いくつかの場合では、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼをコードする核酸は、合成の核酸配列であり得る。例えば、合成の核酸分子は、化学的に改変することができる。ある種の実施態様では、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは、次の性質の１つまたは複数（例えばすべて）を有することとなる：キャップ形成され得る；ポリアデニル化され得る；および５−メチルシチジンおよび／またはシュードウリジンで置換され得る。
【０１４９】
合成の核酸配列はまた、コドン最適化することができる。例えば、少なくとも１つの非共通コドンまたはそれほど共通でないコドンが、共通コドンによって置き換えられている。例えば、合成の核酸は、例えば本明細書に記載した、例えば哺乳類の発現系における発現のために最適化された、最適化されたメッセンジャーｍＲＮＡの合成を誘導することができる。コドン最適化されたＣａｓ９コード配列の例は、国際公開第２０１６／０７３９９０号パンフレット（“Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏ”）に示される。
【０１５０】
さらにまたはあるいは、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼをコードする核酸は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含むことができる。核局在化配列は、当技術分野で公知である。
【０１５１】
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子
用語「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１などのＲＮＡガイド型ヌクレアーゼの、細胞内のゲノムまたはエピソーム配列などの標的配列に対する特異的な結合（または「ターゲティング」）を促進するあらゆる核酸を指す。ｇＲＮＡは、単分子（単一のＲＮＡ分子を含み、あるいはキメラとも呼ばれる）またはモジュール式（２つ以上、典型的には２つの別のＲＮＡ分子（ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡなど）を含み、これらは通常、例えば二本鎖化によって互いに結合されている）であり得る。ｇＲＮＡおよびその構成部分は、文献を通して、例えば、Ｂｒｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（参照により組み込まれるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ５６（２），３３３−３３９，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２３，２０１４（“Ｂｒｉｎｅｒ”））に、また（ａｎｄ）Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏに記載されている。
【０１５２】
細菌および古細菌では、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は一般に、Ｃａｓ９などのＲＮＡガイド型ヌクレアーゼタンパク質、外来配列に相補的である５’領域を含むＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、およびｃｒＲＮＡの３’領域に相補的でありこれと二本鎖を形成する５’領域を含むトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。いかなる理論に拘泥されることも意図しないが、この二本鎖が、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の形成を容易にする−Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の活性に必要である−ことが考えられる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、遺伝子編集に使用するために適合されたので、ある非限定的な例では、ｃｒＲＮＡ（その３’末端）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（その５’末端）の相補的領域をつなぐ、４つのヌクレオチド（例えばＧＡＡＡ）「テトラループ」または「リンカー」配列を用いて、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡが連結されて単一の単分子またはキメラガイドＲＮＡになる可能性があることが発見された。（Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３  Ｆｅｂ  １５；３３９（６１２１）：８２３−８２６（“Ｍａｌｉ  ２０１３”）；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３  Ｍａｒ；３１（３）：２３３−２３９（“Ｊｉａｎｇ”）；およびＪｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｕｇ．１７；３３７（６０９６）：８１６−８２１（“Ｊｉｎｅｋ  ２０１２”）（これらをすべて参照により本明細書に組み込む））。
【０１５３】
ガイドＲＮＡは、単分子かモジュール式かにかかわらず、編集が所望される細胞のゲノム内のＤＮＡ配列などの標的配列内の標的ドメインに完全にまたは部分的に相補的である「ターゲティングドメイン」を含む。ターゲティングドメインは、限定はされないが、「ガイド配列」（参照により本明細書に組み込まれるＨｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３  Ｓｅｐ；３１（９）：８２７−８３２（“Ｈｓｕ”））、「相補性領域」（Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏ）、「スペーサー」（Ｂｒｉｎｅｒ）、および総称的な「ｃｒＲＮＡ」（Ｊｉａｎｇ）を含めて、文献中で様々な名前で呼ばれている。与えられた名前とは関係なく、ターゲティングドメインは、典型的には、長さが１０〜３０ヌクレオチドであり、ある種の実施態様では、長さが１６〜２４ヌクレオチド（例えば、長さが１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチド）であり、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡの場合には５’末端にまたはその近くに、Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡの場合には３’末端にまたはその近くにある。
【０１５４】
ターゲティングドメインに加えて、ｇＲＮＡは、典型的には（以下に論じる通り、必ずしもというわけではないが）、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の形成または活性に影響を与える可能性がある複数のドメインを含む。例えば、上に言及した通り、ｇＲＮＡの第１と第２の相補性ドメインによって形成された二本鎖化された構造（リピート：アンチリピート二本鎖とも呼ばれる）は、Ｃａｓ９の認識（ＲＥＣ）ローブと相互作用し、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体の形成を媒介することができる。（どちらも参照により本明細書に組み込まれるＮｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５６，９３５−９４９，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２７，２０１４（“Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ２０１４”）およびＮｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １６２，１１１３−１１２６，Ａｕｇｕｓｔ  ２７，２０１５（“Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ２０１５”）。第１のおよび／または第２の相補性ドメインが、ＲＮＡポリメラーゼによって終結シグナルと認識される可能性がある１つまたは複数のポリ−Ａトラクトを含有する可能性があることに留意するべきである。したがって、第１および第２の相補性ドメインの配列は、場合によっては、これらのトラクトを除去し、例えば、Ｂｒｉｎｅｒに記載されている通りのＡ−Ｇ交換、またはＡ−Ｕ交換の使用を介する、ｇＲＮＡの完全なインビトロ転写を促進するために改変される。第１および第２の相補性ドメインに対するこれらのおよび他の同様の改変は、本開示の範囲内である。
【０１５５】
第１および第２の相補性ドメインと共に、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡは典型的には、インビトロでは必ずしもというわけではないがインビボでのヌクレアーゼ活性に関与する、２つ以上の追加の二本鎖化された領域を含む（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ２０１５）。第２の相補性ドメインの３’部分の近くの第１のステム・ループ第一（ｏｎｅ）は、「近位ドメイン」（Ｃｏｔｔａ−Ｒａｍｕｓｉｎｏ）、「ステム・ループ１」（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ２０１４  ａｎｄ  ２０１５）、および「ネクサス」（Ｂｒｉｎｅｒ）と様々に呼ばれる。ｇＲＮＡの３’末端の近くに、１つまたは複数の追加のステム・ループ構造が一般に存在し、その数は、種によって様々である：化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｇＲＮＡは典型的には、２つの３’ステム・ループ（リピート：アンチリピート二本鎖を含む合計４つのステム・ループ構造に対して）を含むのに対して、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および他の種は、１つ（合計３つのステム・ループ構造に対して）しか有しない。種によって組織化された、保存されているステム・ループ構造（および、より一般的にはｇＲＮＡ構造）の説明は、Ｂｒｉｎｅｒによって提供されている。
【０１５６】
前述の説明は、Ｃａｓ９と共に使用するためのｇＲＮＡに焦点を合わせてきたが、この時点までに記載されているものといくつかの点で異なるｇＲＮＡを利用する、他のＲＮＡガイド型ヌクレアーゼが、発見または発明されている（または将来、される可能性がある）ことを認識するべきである。例えば、Ｃｐｆ１（「プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）およびフランシスセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ）由来のＣＲＩＳＰＲ  １（ＣＲＩＳＰＲ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ  １）」）は、機能するためにｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない、最近発見されたＲＮＡガイド型ヌクレアーゼである。（参照により本明細書に組み込まれるＺｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ  １６３，７５９−７７１  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２２，２０１５（“Ｚｅｔｓｃｈｅ  Ｉ”））。Ｃｐｆ１ゲノム編集システムに使用するためのｇＲＮＡは、一般に、ターゲティングドメインおよび相補性ドメイン（代わりに「ハンドル」とも呼ばれる）を含む。Ｃｐｆ１と共に使用するためのｇＲＮＡでは、ターゲティングドメインが通常、Ｃａｓ９  ｇＲＮＡに関して上に記載した５’末端ではなく、３’末端にまたはその近くに存在する（ハンドルは、Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡの５’末端にまたはその近くにある）ことにも留意するべきである。
【０１５７】
しかし、当業者は、異なる原核生物種由来のｇＲＮＡの間に、または、Ｃｐｆ１  ｇＲＮＡとＣａｓ９  ｇＲＮＡの間に、構造の違いが存在する可能性はあるが、ｇＲＮＡが動作する原理は一般に一致していることを認識するであろう。この動作の不変性から、ｇＲＮＡは、そのターゲティングドメイン配列によって大まかに定義することができ、当業者は、所与のターゲティングドメイン配列を、単分子もしくはキメラｇＲＮＡ、または１つまたは複数の化学的改変および／または配列的改変（置換、追加のヌクレオチド、切り詰めなど）を含むｇＲＮＡを含めた、あらゆる好適なｇＲＮＡに組み込むことができることを認識するであろう。したがって、この開示における提示の節約のために、ｇＲＮＡは、そのターゲティングドメイン配列に関してのみ記載することができる。
【０１５８】
より一般的には、当業者は、本開示のいくつかの態様が、複数のＲＮＡガイド型ヌクレアーゼを使用して実行することができるシステム、方法、および組成物に関することを認識するであろう。この理由から、そうではないと指定されない限り、ｇＲＮＡという用語は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１のある特定の種と適合性のあるｇＲＮＡだけでなく、あらゆるＲＮＡガイド型ヌクレアーゼと共に使用することができるあらゆる好適なｇＲＮＡを包含すると理解されるべきである。実例として、用語ｇＲＮＡには、ある種の実施態様では、ＩＩ型またはＶ型またはＣＲＩＳＰＲ系などのクラス２  ＣＲＩＳＰＲ系に存在するあらゆるＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ、またはそれに由来するまたはそこから適合されるＲＮＡガイド型ヌクレアーゼと共に使用するためのｇＲＮＡが含まれ得る。
【０１５９】
連結
本明細書によって開示された方法のいくつかの実施態様は、核酸配列、例えば、核酸鋳型の切断された末端を、オリゴヌクレオチド捕捉プローブまたはその混合物と連結するステップを含む。いくつかの実施態様では、連結のステップは、核酸、例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡリガーゼ上で作用するリガーゼ酵素を使用して達成される。様々なこうしたリガーゼは、当技術分野で公知であり、これらの多くは、市販品として入手可能である。
【０１６０】
本明細書によって開示された方法の種々の実施態様において使用することができるリガーゼの例としては、限定はされないが、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、およびＥ．ｃｏｌｉリガーゼが挙げられる。
【０１６１】
選択されるリガーゼの種類は、切断組成物中に存在する切断される末端および／またはオリゴヌクレオチド捕捉プローブの捕捉末端の種類に依存し得る。
【０１６２】
例えば、切断組成物における切断された末端が、平滑末端を含む、または連結前に（例えば、本明細書に記載した通りの平滑化の追加のステップ中に）平滑化される切断された末端を含むならば、平滑末端を連結するのに適したリガーゼを選択することができる。
【０１６３】
例えば、切断組成物における切断された末端が、連結前に（例えば、本明細書に記載した通りの平滑化の追加のステップ中に）平滑化されない突出（「付着末端」）を含むならば、粘着末端を連結するのに適したリガーゼを選択することができる。
【０１６４】
いくつかのリガーゼは、平滑末端と突出を有する末端の両方に対して良く働き、これらのリガーゼのいずれかを、本開示の方法において使用することができる。さらに、２つ以上のリガーゼのあらゆる組み合わせも、連結ステップ中に使用することができる。
【０１６５】
連結産物の分析
いくつかの実施態様では、本明細書に記載した複数の連結産物が分析される。いくつかの実施態様では、複数の連結産物は、増幅される。複数の連結産物が１つまたは複数の検出配列を含むいくつかの実施態様では、１つまたは複数の検出配列を認識する増幅プライマーを使用することができる。
【０１６６】
いくつかのこうした実施態様では、増幅産物が分析される。例えば、いくつかの実施態様では、方法は、連結産物のレベルを決定するステップをさらに含む。決定されるレベルは、絶対的および／または相対的であり得る。
【０１６７】
いくつかの実施態様では、方法は、連結産物の相対的存在量を算出するステップをさらに含む。この分析は、連結産物および／またはその増幅産物の核酸配列決定を含むことができる。非限定的な例として、次世代（ハイスループットシーケンシングとしても公知である）を実施することができる。
【０１６８】
いくつかの実施態様では、各ヌクレオチドが、例えば少なくとも７、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０よりも大きい、またはさらに大きい深度で、配列決定プロセス中に数回読み取りされることを意味する、ディープシーケンシングが実施される。ここでは、深度（Ｄ）は、
Ｄ＝Ｎ×Ｌ／Ｇ（式１）
（式中、Ｎは、読み取りの数であり、Ｌは、実際のゲノムの長さであり、Ｇは、配列決定されるポリヌクレオチドの長さである）として算出される。
【０１６９】
いくつかの実施態様では、連結産物および／またはその増幅産物の少なくともいくつかを分析するために、サンガー配列決定が使用される。
【０１７０】
いくつかの実施態様では、配列決定データは、バイオインフォマティクス、例えば、図１２に示された１つまたは複数のステップを使用して処理される。例えば、配列決定のリードは、最初に、適切な配列決定バーコードを使用して、その実行における異なる実験に逆多重化することができる。いくつかの場合、１、２、または３個までのミスマッチが、各バーコードにおいて許容される。次いで、さらなるダウンストリーム解析のために、各リードについてのＵＭＩを抽出することができる。いくつかの方法では、次いで、（例えば、Ｍａｒｔｉｎ，ＥＭＢｎｅｔ．ｊｏｕｒｎａｌ  １７：１０−１２（２０１１）に記載されている通りに）ｃｕｔａｄａｐｔなどの公知の方法を使用して、配列決定リードから、アダプター（例えば、３’アダプター）を取り除くことができる。いくつかの場合、１つまたは複数の参照アンプリコンが作製される。例えば、予想された切断部位を使用して、予想された染色体再構成（例えば、野生型、大きい欠失、逆位、転座など）を有する参照アンプリコンを構築することができる。参照アンプリコンは、あらゆる予測される遺伝子編集事象ならびに「オフターゲット」事象を含むことができる。いくつかの実施態様では、参照アンプリコンは、ベクターまたはプラスミド配列を含むことができる。ベクターまたはプラスミドからの配列を含む参照アンプリコンはまた、あらゆる予測される遺伝子編集事象および／またはあらゆる「オフターゲット」事象を含むことができる。
【０１７１】
いくつかの方法では、次いで、対形成させたリードを、例えば配列アライナー（ａｌｉｇｎｅｒ）を使用して、すべてまたはほとんどすべての参照アンプリコンに対して包括的に整列させることができる。ある例示的な配列アライナーは、ｂｏｗｔｉｅ２である（例えば、Ｌａｎｇｍｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９：３５７−９（２０１２）に記載されている通り）。さらにまたはあるいは、ＳＡＭｔｏｏｌｓなどの好適なツールを使用して、ソートされたｂａｍファイルを作成および／またはインデックス付けすることができる（例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５：２０７８−９（２００９）に記載されている通り）。いくつかの方法では、予測される接合部（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｂｐ）の周囲のウィンドウを完全にカバーする配列リードを抽出し、固有のＵＭＩの総数を計数することができる。いくつかの方法では、参照アンプリコンに対してマッピングできない配列リードを抽出し、例えば、適切なバックグラウンド参照ゲノムに対してｂｏｗｔｉｅ２を使用して、包括的にマッピングすることができる。
【０１７２】
ヌクレアーゼ切断を評価するための、本明細書に記載した実例プロセスの少なくとも一部は、ハードウェアまたはハードウェアとソフトウェアの組み合わせを含む１つまたは複数のコンピュータシステムを使用して実行することができる。例えば、コンピュータシステムは、自動化された要素の動作を制御するための、様々な点に位置する様々な制御装置および／または処理装置を含むことができる。中央コンピュータは、様々な制御装置または処理装置間の動作を協調させることができる。中央コンピュータ、制御装置、および処理装置は、様々な自動化された要素の制御および協調を実行するために、様々なソフトウェアルーチンを遂行することができる。
【０１７３】
実例プロセスは、少なくともある程度、１つまたは複数のコンピュータプログラム製品、例えば、１つまたは複数の情報担体に有形的に組み込まれた１つまたは複数のコンピュータプログラム、例えば、１つまたは複数のデータ処理装置による遂行のための、または当該装置の動作を制御するための、１つまたは複数の非一過性の機械可読媒体など、（例えば、プログラム可能プロセッサ、コンピュータ、複数のコンピュータ、および／またはプログラム可能な論理構成要素）を使用して実行することができる。
【０１７４】
コンピュータプログラムは、コンパイルされるまたはインタプリタされる言語を含めた、あらゆる形式のプログラムミング言語で書くことができ、スタンドアロンプログラムとしてまたはモジュールとして、コンポーネント、サブルーチン、またはコンピューティング環境における使用に適した他のユニット含めた、あらゆる形式でデプロイすることができる。１つのコンピュータ上でまたは１つのサイトで複数のコンピュータ上で遂行されることとなるコンピュータプログラムを、デプロイする、または複数のサイトに分散させ、ネットワークによって相互接続することができる。
【０１７５】
実例プロセスのすべてまたは一部を実行することに関連する動作は、本明細書に記載した機能を実施するために１つまたは複数のコンピュータプログラムを遂行する１つまたは複数のプログラム可能プロセッサによって実施することができる。実例プロセスのすべてまたは一部は、特殊目的の論理回路、例えば、ＦＰＧＡ（現場でプログラム可能なゲートアレイ（ｆｉｅｌｄ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｇａｔｅ  ａｒｒａｙ））および／またはＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｃｉｒｃｕｉｔ））を使用して実行することができる。
【０１７６】
コンピュータプログラムの遂行に適したプロセッサとしては、例として、一般目的と特殊目的のマイクロプロセッサ、およびあらゆる種類のデジタルコンピュータのあらゆる１つまたは複数のプロセッサが挙げられる。一般に、プロセッサは、読み出し専用記憶領域またはランダムアクセス記憶領域またはこれらの両方からの命令およびデータを受け取ることとなる。コンピュータ（サーバーが含まれる）の要素には、命令を遂行するための１つまたは複数のプロセッサ、および命令およびデータを保管するための１つまたは複数の記憶領域装置が含まれる。一般に、コンピュータはまた、データを受け取る、データを移す、またはこれらの両方のために、１つまたは複数の機械可読記憶媒体、例えばデータを保管するための大容量記憶装置、例えば、磁気、光磁気ディスク、または光ディスクを含む、またはそれと動作可能に接続されることとなる。コンピュータプログラム命令およびデータを組み込むのに適した機械可読記憶媒体には、例として、半導体記憶領域装置、例えば、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、およびフラッシュ記憶領域装置；磁気ディスク、例えば、内蔵ハードディスクまたはリムーバルディスク；光磁気ディスク；ならびにＣＤ−ＲＯＭおよびＤＶＤ−ＲＯＭディスクを含めた、すべての形態の不揮発性の記憶領域が含まれる。
【０１７７】
本明細書に言及したすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献の全体を、参照によって組み込む。さらに、材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定的であることを意図しない。そうではないと定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、この発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと類似のまたは等価な方法および材料を、本発明の実施または実験において使用することができるが、好適な方法および材料を、本明細書に記載する。
【０１７８】
この開示を、次の実施例によって、さらに例示する。これらの実施例は、例示目的に限って提供される。これらは、決してこの開示の範囲または内容を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１７９】
実施例１：ＵＤｉＴａＳを使用する標的遺伝子切断の分析
部位特異的ヌクレアーゼおよび種々のガイドＲＮＡで処理したＫ５６２細胞由来のゲノムＤＮＡ試料を配列決定するための本開示の方法において、トランスポゾンを使用した。第１の実験では、（１）Ｇ１遺伝子の一部分に対して相補的な配列を含む第１の固定プライマーと、（２）トランスポゾンに相補的なヌクレオチド配列を含む選択的プライマーとを含むプライマー対を使用した。第２の実験では、（１）Ｇ２遺伝子の一部分に対して相補的な配列を含む第１の固定プライマーと、（２）トランスポゾンに相補的なヌクレオチド配列を含む選択的プライマーとを含むプライマー対を使用した。これらのプライマーを、図４に示す（固定プライマー「Ｇ１＿Ｆ１」および「Ｇ２＿Ｆ１」；選択的プライマー「Ｓｅｑ１５＿Ｇ１＿Ｆ＿ＵＤＩＴＡＳｄｅｖ」および「Ｓｅｑ１６＿Ｇ２＿Ｆ＿ＵＤＩＴＡＳｄｅｖ」）。その後、ＤＮＡ断片を増幅および配列決定した。
【０１８０】
図５は、Ｇ１またはＧ２標的上であった配列リード（％）を示す。図５に示す通り、ＭｉＳｅｑリードの７８〜９３％は、Ｇ１またはＧ２標的を正確に配列決定した。これは、標的遺伝子を、その標的遺伝子に特異的なたった１つの固定プライマーを使用して、成功裏に配列決定することができることを実証する。図６は、ＧｅｎｏｍｅＶｉｅｗにおける配列リードを示す。
【０１８１】
実施例２：インデルを検出するためにＵＤｉＴａＳを使用すること
ＵＤｉＴａＳがモデルゲノム標的についての小さいインデルの割合を特定する能力を検定した。モデルゲノム標的をトランスポゾンと接触させた後、（１）モデルゲノム標的の一部分に相補的な配列を含む第１の固定プライマーと、（２）トランスポゾンに相補的なヌクレオチド配列を含む選択的プライマーとを含むプライマー対を使用して、ＤＮＡ断片を増幅した。ＵＤｉＴａＳ方法を、２つの公知の方法−アンプリコン配列決定およびＴ７Ｅ１配列決定と比較した。図７に示す通り、ＵＤｉＴａＳがインデルを検出する能力は、標的配列決定およびＴ７Ｅ１アッセイと良く相関していた。
【０１８２】
実施例３：染色体内再構成を検出するためにＵＤｉＴａＳを使用すること
ゲノムＤＮＡを部位特異的ヌクレアーゼおよびデュアルガイドで処理することは、複数の結果の可能性を得る可能性がある。図８に示す通り、デュアルガイドは、欠失、一方または両方の鎖におけるインデル、および逆位をもたらす可能性がある。ＵＤｉＴａＳ方法が、こうした染色体内再構成を検出するために使用できるかどうかを決定するために、野生型ＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来のまたは安定なＨＥＫ２９３Ｔクローン由来のゲノムＤＮＡを使用した。安定なクローンのゲノムＤＮＡは、そのゲノムＤＮＡの６６％における欠失、およびそのゲノムＤＮＡの３３％における逆位を含む（図９、左側参照）。野生型由来とクローン由来のゲノムＤＮＡを、様々な比率で混合し、本明細書に記載した通りのＵＤｉＴａＳによる配列決定にかけた。配列決定の結果を、ｄｄＰＣＲ配列決定と比較した。
【０１８３】
図９（右側）に示す通り、混合物における野生型ゲノムＤＮＡの％が、１００％から０％まで低下するにつれて、ＵＤｉＴａＳが検出できる野生型ゲノムＤＮＡの頻度は低下し、混合物における欠失および逆位を有するゲノムＤＮＡの頻度は増大した。対照的に、ｄｄＰＣＲは、野生型および欠失を有するゲノムＤＮＡを検出したのに対し、この方法は、逆位を有するゲノムＤＮＡを検出できなかった。
【０１８４】
ＵＤｉＴａＳが染色体内再構成を検出する能力はまた、２つの異なるプライマーを使用して、様々な割合の野生型ゲノムＤＮＡ、逆位を含むゲノムＤＮＡ、および大きい欠失を含むゲノムＤＮＡを含むゲノムＤＮＡ試料を使用して評価した（図１０参照）。図１０に示す通り、ＵＤｉＴａＳは、１）わずか０．１％の大きい欠失、または２）実質的に１％未満の逆位を有する試料における特定の種類の再構成の割合を正確に決定することができた。（図１０の右側参照）。異なるプライマーを使用して、ＵＤｉＴａＳは、より低いレベルの該当するアレルについてはより低い精度ではあったが、さらに低いレベルの逆位および欠失を検出することができた。（図１０の左側を参照のこと）。
【０１８５】
実施例４：バイオインフォマティクス・パイプライン
ある例示的な方法では、配列決定データを、バイオインフォマティクス・パイプラインを使用して処理した。特殊化されたステップのための追加ソフトウェアと呼ばれるパイソン（ｐｙｔｈｏｎ）コードを使用して、解析パイプラインを構築した。このバイオインフォマティクス・パイプラインを、図１２に模式的に示し、また、これは、次のステップからなる。
【０１８６】
逆多重化
配列決定リードを、最初に、適切な配列決定バーコード（各バーコードにおいて１つまでのミスマッチが可能である）を使用して、その実行における異なる実験に逆多重化した。各リードについてのＵＭＩを、さらなるダウンストリーム解析のために抽出した。
【０１８７】
トリミング
３’アダプターを、ｃｕｔａｄａｐｔ（Ｍａｒｔｉｎ，ＥＭＢｎｅｔ．ｊｏｕｒｎａｌ  １７：１０−１２（２０１１）），ｖｅｒｓｉｏｎ  １．９．１を使用して取り除いた。
【０１８８】
参照アンプリコンの作製
予想された切断部位を使用して、予想された染色体再構成：野生型、大きい欠失、重複、逆位、転座、小さいインデルなどを有する参照アンプリコンを構築した。参照アンプリコンは、あらゆる予測される遺伝子編集事象、例えば「オフターゲット」事象を含むことができる。いくつかの実施態様では、参照アンプリコンは、ベクターまたはプラスミド配列を含むことができる。ベクターまたはプラスミドからの配列を含む参照アンプリコンはまた、１つまたは複数の予測される遺伝子編集事象、例えば「オフターゲット」事象を含むことができる。
【０１８９】
アラインメント
次いで、対形成させたリードを、ｂｏｗｔｉｅ２（Ｌａｎｇｍｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９：３５７−９（２０１２）），ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．１．０を使用して、すべての参照アンプリコンに対して包括的に整列させた。最後に、ＳＡＭｔｏｏｌｓ  （Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５：２０７８−９（２００９）），ｖｅｒｓｉｏｎ  １．３−５−ｇ６６４ｃｃ５ｆを使用して、インデックスソートされたｂａｍファイルを作成した。
【０１９０】
アラインメント解析
予測される接合部（１５ｂｐ）の周囲のウィンドウを完全にカバーするリードを抽出し、固有のＵＭＩの総数を計数した。
【０１９１】
最終のゲノムワイド解析
最後に、参照アンプリコンに対してマッピングできなかったリードを抽出し、適切なバックグラウンド参照ゲノムに対してｂｏｗｔｉｅ２を使用して、包括的にマッピングした。
【０１９２】
実施例５：ＵＤｉＴａＳを使用する標的遺伝子切断の分析
複雑な遺伝子編集事象の評価の、ある例示的な方法では、Ｇｅｎｅ３のイントロン内の領域を標的にするために、一対の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）ｓｇＲＮＡを使用した。Ｇｅｎｅ３発現の低下は、いくつかのヒト疾患をもたらす。有害なイントロンスプライスドナー部位の除去が、Ｇｅｎｅ３の機能を回復させることが予測される。スプライスドナーの周囲の約１０００塩基対を切断する単一のガイドＲＮＡ対、Ｇｅｎｅ３−ガイド１とＧｅｎｅ３−ガイド２を、特徴付けのための内部スクリーニングから選択した。
【０１９３】
Ｕ−２  ＯＳ細胞に、ＳａＣａｓ９を発現するプラスミドと共に、ｓｇＲＮＡ  Ｇｅｎｅ３−ガイド１とＧｅｎｅ３−ガイド２を発現する線状ＤＮＡ断片を導入した。３日後、ゲノムＤＮＡを単離し、ＵＤｉＴａＳ配列決定ライブラリを作製した。このライブラリを、ＭｉＳｅｑ上で配列決定し、バイオインフォマティクス・パイプラインを介してデータを処理した（図１２）。
【０１９４】
Ｇｅｎｅ３−ガイド２切断部位に隣接する標的化プライマーを使用して（図１３）、予想された切断部位の周囲の編集および再構成の範囲を観察し（図１５Ａ〜１５Ｄ）、自動的に分類し、集計した（図１４Ａ）。小さいインデル事象をもたらす編集が、予想通り、約１７％の割合で観察された。このインデルは、再構成前の修復経路活性に起因して生じた可能性がある。さらに、所望される約１．１ｋｂ欠失からの接合部も、約４０％で存在していた。特に、２つの切断部位間の約１．１ｋｂ断片の逆位も約１８％で観察され、欠失に匹敵していた。同一の切断部位での相同染色体または姉妹染色体間の転座を含めた、他の、より低い頻度の接合部も、約０．７５％で観察された（図１５Ｄ）。
【０１９５】
線形性、精度、およびＬＬｏＤ
この方法の線形性、精度、および検出下限（Ｌｏｗｅｒ  Ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）（ＬＬｏＤ）を特徴付けるために、所望される大きい編集事象に対して、Ｇｅｎｅ３イントロン野生型遺伝子座、欠失、および逆位を含有する安定な細胞株およびプラスミドを構築した。ＨＥＫ２９３細胞は、Ｇｅｎｅ３遺伝子座の３つのコピーを有し、クローンは、２つの欠失と１つの逆位を有していた。編集されたＨＥＫ２９３細胞株由来のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、親の編集されていないゲノムＤＮＡと混合して、５桁の対数レンジにわたる約１．１ｋｂ欠失および逆位のタイトレーションをもたらした。欠失および逆位についてのＵＤｉＴａＳ測定された編集率に対する予想された率のプロットは、およそ０．１％までの優れた相関を示した（図１４Ｂ）。このＵＤｉＴａＳプロトコルは、５０ｎｇのインプットＤＮＡ（これは、およそ１４，３００のヒトハプローム（ｈａｐｌｏｍｅ）と同等である）を使用した。標本抽出の二項分布および約２０％工程歩留まりと仮定すると、ＵＤｉＴａＳライブラリにおける０．１％での２〜３例の観察が予想された（９５％の信頼度）。これは、観察された割合と一致していた（図１６）。感度は、インプットＤＮＡを増大させることによって、また、配列決定読み取り深度を高めることによって、どちらも、解析における固有のＵＭＩの数を増加させるために必要とされるので、増大した。ゲノムに対するオンターゲットマッピング率は、＞９５％であり、これは、このプロセスが頑強かつ生産的であることを示していた（図１７）。
【０１９６】
ＵＤｉＴａＳの線形性をさらに実証するために、また、これをＡＭＰ−Ｓｅｑと比較するために、イントロン野生型遺伝子座、大きい欠失、および逆位を含有するように合成した参照プラスミドを分析した。
【０１９７】
【表１】
2020503056.tif 000004
【０１９８】
【表２−１】
2020503056.tif 000005
【０１９９】
【表２−２】
2020503056.tif 000006
【０２００】
【表２−３】
2020503056.tif 000007
【０２０１】
【表２−４】
2020503056.tif 000008
【０２０２】
Ｇｅｎｅ１／Ｇｅｎｅ２均衡型転座またはＧｅｎｅ３構造多型を含有するプラスミドを合成し、これは、配列決定後にプラスミドを特定するために、インサート内に、操作された固有のＳＮＰを含有していた。約２，２００〜約７１４，０００ゲノム当量の範囲のプラスミドを、マウスゲノムＤＮＡに加え、ＵＤｉＴａＳおよびＡＭＰ−Ｓｅｑ方法を介して処理した。ＵＤｉＴａＳとＡＭＰ−Ｓｅｑの両方について、検出されたプラスミドの数に対するインプットプラスミドの数をプロットした。ＵＤｉＴａＳは、最も低い希釈までの優れた線形性を示した（図１８Ａおよび１８Ｂ）。ＵＤｉＴａＳは、ＡＭＰ−Ｓｅｑと比較した場合に、より高い精度と線形性を示した（図１８Ａおよび１８Ｂ）。
【０２０３】
ＵＤｉＴａＳライブラリは、同じＤＮＡインプット材料を与えたＡＭＰ−Ｓｅｑと比較すると、より線形性が高く、より高いダイナミックレンジを有していた。これは、ＡＭＰ−Ｓｅｑの剪断およびアダプター連結と比較して、より効率的なタグメンテーションプロセスに起因していた。また、ＵＤｉＴａｓが必要としているのは、ＡＭＰ−Ｓｅｑと比較して、全収量を高める、より少なく、合理化された処理ステップであった。
【０２０４】
担体マウスゲノムＤＮＡがＵＤｉＴａＳ反応に影響を与えていないことを確実にするために、いかなる担体ＤＮＡも存在しないプラスミドを用いて、ＵＤｉＴａＳ反応の追加のセットを実行した。図１９Ａは、野生型、大きい欠失、または大きい挿入配列を含有するＧｅｎｅ３プラスミド（ＰＬＡ３７９、ＰＬＡ３６７、およびＰＬＡ３７０）を示す。図１９Ｂは、均衡型転座を含有するＧｅｎｅ１／Ｇｅｎｅ２プラスミド（ＰＬＡ３７７、ＰＬＡ３７８、ＰＬＡ３６５、およびＰＬＡ３６６）を示す。プラスミドは希釈し、プラスミド混合物を、ＵＤｉＴａＳおよび解析パイプラインを介して処理した。ある構造多型についての測定された頻度に対する、所与の構造多型についての予想された頻度をプロットした（プロットされた線によってｘ＝ｙが示される場合）。４つすべてのプライマーを用いて、どちらの遺伝子座についても、精度と線形性は優れており、約０．０１％〜０．１％のＬＬＯＤは、このプロセスの頑強性をさらに示した。
【０２０５】
染色体間転座率
ＵＤｉＴａＳはまた、染色体間転座率を測定した。これを示すために、Ｇｅｎｅ１およびＧｅｎｅ２遺伝子を標的にするｓｇＲＮＡとの、２つの化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を、活性化されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞にヌクレオフェクト（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔ）させた。これらの細胞からのＵＤｉＴａＳライブラリを、各ガイド部位に隣接するプライマーを使用して調製した。１０例の末端連結結果の可能性のうち、２つのターゲティングプライマーを使用して、７例を測定することが可能であった。７つのすべての結果が検出され、定量化された。これらには、切断部位でのＮＨＥＪ（非相同末端連結）編集、ならびに相同染色体または姉妹染色体間の、また別個の無関係の染色体間の、均衡型の、無動原体性の、および二動原体性の融合が含まれていた（図１４Ｃ）。いくつかの研究が、遺伝子編集の状況での転座の特徴付けを公表しているが、どれも、すべての事象を測定していない（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１６；１１：８５３−７１；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．２０１６；６：２１９１８；Ｇｈｅｚｒａｏｕｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２０１４；５５：８２９−４２；Ｆｒｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５；３３：１７９−１８６）。代わりに、これらの研究は、転座をつなぎ合わせることを必要とする転座分析に頼っており、より小さなインデルの割合という状況に沿うことはできなかった。この実施例は、インデルを伴う二重の遺伝子編集転座率の定量化を示した。この実施例はまた、各ガイドＲＮＡに対してそれぞれ約８２％および約９１％というオンターゲットインデル編集と共に、約２．５％の染色体間転座率を示した（図１４Ｃ）。Ｇｅｎｅ１およびＧｅｎｅ２転座位置でのアッセイの線形性および約０．０１％というＬＬｏＤが、Ｇｅｎｅ３遺伝子座と同様の様式で、プラスミドを用いて特徴付けられ、転座事象を検出するためのＵＤｉＴａＳの高い感度が実証された（図１８Ａおよび図１９Ｂ）。
【０２０６】
この実施例は、ＵＤｉＴａＳが、小さいインデルと、大きい欠失、逆位、および転座などの、より大きな構造的再構成の同時測定を可能にする配列決定および解析方法論であることを実証した。ＵＤｉＴａＳ方法は、頑強であり、拡大縮小可能であり、低い（５０ｎｇ）インプットＤＮＡを使用する場合にアンカープライマーを多重化するのに適していた。これは、試料が限られる場合に、候補となるオフターゲット編集部位のパネルのモニタリングを可能にした。さらに、ここに記載したカスタムなトランスポゾンは、ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑなどのアンカープライマーと共にＤＮＡ剪断を利用する方法を改良する可能性を有する。ＵＤｉＴａｓ方法はまた、正確かつ線形であった。ＵＤｉＴａＳは、遺伝子編集技術の有効性の評価のために重要な、意図されるまたは意図されない大きい構造変化の正確な定量化を可能にする、重要な配列決定方法論である。
【０２０７】
実施例の方法
Ｕ−２  ＯＳバルク編集トランスフェクション実験
Ｕ−２  ＯＳ細胞（ＡＴＣＣ）を、ＤＭＥＭ（高グルコース、Ｇｌｕｔａｍａｘおよびピルビン酸ナトリウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１０％ウシ胎児血清を含有、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加）中で維持した。細胞は、４Ｄ  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステムを使用して、Ｌｏｎｚａヌクレオフェクションによって遺伝子導入した。簡単に言うと、２５０，０００個の細胞に、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＳａＣａｓ９を発現する１．５μｇプラスミドｐＡＦ００３と、Ｕ６プロモーターによって駆動されるｇＲＮＡを発現する５００ｎｇの線状ＤＮＡ断片（２５０ｎｇの各ガイド）を導入した。細胞を、ＳＥキットおよびパルス符号ＤＮ−１００を使用してヌクレオフェクトし、６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を、ヌクレオフェクション後、３日間培養し、トランスフェクション技術の３連の反復物を共にプールした。ゲノムＤＮＡは、製造業者の説明書に従ってＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＤＮＡｄｖａｎｃｅキット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して単離した。
【０２０８】
Ｇｅｎｅ３遺伝子座でのＨＥＫ２９３細胞株作製
ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）を、ＤＭＥＭ（高グルコース、Ｇｌｕｔａｍａｘおよびピルビン酸ナトリウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１０％ウシ胎児血清を含有、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加）中で維持した。細胞は、製造業者の説明書に従ってＭｉｒｕｓ  ＴｒａｎｓＩＴ  ２９３キットを使用して遺伝子導入した。簡単に言うと、１２０，０００個の細胞を、トランスフェクションの２４時間前に、２４ウェルプレートのウェルに播種した。細胞に、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるＳａＣａｓ９を発現する７５０ｎｇプラスミドｐＡＦ００３と、Ｕ６プロモーターによって駆動されるｇＲＮＡを発現する２５０ｎｇの線状ＤＮＡ断片（１２５ｎｇの各ガイド）を導入した。増殖後、細胞を、トリプシン処理し、希釈し、３つのウェルあたりおよそ１つの細胞の希釈度で９６ウェルプレートに再プレーティングした。細胞を、視覚によって観察して、単一細胞コロニーを確認し、２４ウェルプレートで増殖させた。編集を決定するために、ゲノムＤＮＡを、製造業者の説明書に従ってＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＤＮＡｄｖａｎｃｅキット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、クローンから単離した。クローンを、ｄｄＰＣＲによってスクリーニングし、サンガー配列決定によって確認した。
【０２０９】
Ｔ細胞−Ｇｅｎｅ１／Ｇｅｎｅ２
Ｇｅｎｅ１およびＧｅｎｅ２遺伝子座を標的にする化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ガイドＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＴ７−ＳｃｒｉｂｅＴＭ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＲＮＡ  ＩＶＴ  Ｋｉｔ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ）を使用して、ＰＣＲ産物のインビトロ転写によって産生した。インビトロ転写反応のためのＰＣＲ産物は、鋳型としてのプラスミドＰＬＡ３８０、および通共通のリバースプライマー（ＯＬＩ７０７８）と共に示されたフォワードプライマー（Ｇｅｎｅ２のためのＯＬＩ７０７６、およびＧｅｎｅ１のためのＯＬＩ７０７７）を使用して産生した。
【０２１０】
インビトロで転写されたガイドＲＮＡを、野生型Ｃａｓ９タンパク質と、２：１のモル比で複合体形成させて、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を産生した。複合体形成の完全性を、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）によって評価した。簡単に言うと、５μＬの複合体形成されたＲＮＰを、５μＬ  ２Ｘ  Ｄｙｅ  Ｍｉｘで希釈した。２Ｘ  Ｄｙｅ  Ｍｉｘは、５０００ＸストックＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ染料（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓ６６５１）を、ＭｇＣｌ２を含む１０×ＨＥＰＥＳ−生理食塩水（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃ−６７６７）に入れたもの（ヌクレアーゼフリー水で１×に希釈）から産生した。複合体形成された試料と、複合体形成されていないタンパク質対照を、３８４ウェルプレートに入れ、次のプロトコルを使用するＢｉｏＲａｄサーモサイクラーに入れた：２０℃で１分、１℃ずつ増える２０℃〜９５℃までの融解曲線（Ｍｅｌｔ  Ｃｕｒｖｅ）、４℃で１分。成功裏の複合体形成は、複合体形成されていない対照試料と複合体形成されたＲＮＰとの間の明らかな温度変化と定義される。
【０２１１】
ヒトＴ細胞を、製造業者のプロトコルに従ってＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＣＤ４マイクロビーズを使用して、バフィーコートから単離した。第０日に、Ｔ細胞を、Ｔ細胞増殖および活性化のためのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ヒトＴ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して活性化した。第２日に、ビーズを除去した。第４日に、製造業者のプロトコルに従ってトリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＴＣ２０（商標）自動セルカウンター（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、細胞を計数した。各条件について、５００，０００個のＴ細胞を、２μＭの総ＲＮＰを含有する２２μＬのＰｒｉｍａｒｙ  Ｃｅｌｌ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐ２（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁した。試料を、１６ウェルＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅＴＭ  Ｓｔｒｉｐｓ（Ｌｏｎｚａ）に移し、４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）システムのプログラムＤＳ１３０（Ｌｏｎｚａ）を使用して電気穿孔した。その後、細胞を、未処理９６ウェル丸底プレートに移し、５％  ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔ）、１．６ｍｇ／ｍＬ  Ｎ−アセチルシステイン（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ  Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５０ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、５ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、および０．５ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含有する、２００μＬのＸ−Ｖｉｖｏ１５培地（Ｌｏｎｚａ）中で培養した。
【０２１２】
ヌクレオフェクションの４日後、試料をペレット化し、製造業者のプロトコルに従ってＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＤＮＡｄｖａｎｃｅキット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、ゲノムＤＮＡを精製した。ＵＤｉＴａＳを、次の改変を伴って実施した。タグメンテーション後、１μＬの０．２％  ＳＤＳの添加、ピペット混合、および５分の室温インキュベーションを用いて、酵素を失活させた。タグメンテーションされたＤＮＡは、プライマーＯＬＩ６２５９およびＯＬＩ６２５６を使用するラウンド１  ＰＣＲに直接的に添加した（図１４Ｃ）。
【０２１３】
プラスミド感度実験
Ｇｅｎｅ３については、プラスミドに基づく感度実験ＰＬＡ３７０、ＰＬＡ３６７、およびＰＬＡ３７９を使用した（図１９Ａ）。Ｇｅｎｅ１／Ｇｅｎｅ２転座については、プラスミドに基づく感度実験ＰＬＡ３６５、ＰＬＡ３６６、ＰＬＡ３７７、およびＰＬＡ３７８を使用した（図１９Ｂ）。プラスミド濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計を使用して決定し、すべてのプラスミドについて、１０ｎｇ／μｌの作業用希釈液を作製した。簡単に言うと、Ｇｅｎｅ２感度実験については、第１の試料は、ＰＬＡ３７０（逆位）とＰＬＡ３６７（大きい欠失）の５０％混合物からなり、対照プラスミド（ＰＬＡ３７９）を含有しない。その後、ＰＬＡ３７０／ＰＬＡ３６７混合物を、様々な希釈全体を通して１０ｎｇ／μＬの全プラスミド濃度を維持しながら、対照プラスミド（ＰＬＡ３７９）で連続的に希釈する（ｓｑｒｔ１０希釈係数）ことによって、１０種の希釈物を作製した。最後の試料は、対照プラスミド（ＰＬＡ３７９）のみから構成されていた。Ｇｅｎｅ１／Ｇｅｎｅ２感度実験については、第１の試料は、ＰＬＡ３６５とＰＬＡ３６６の５０％混合物からなり、対照プラスミド（ＰＬＡ３７７／ＰＬＡ３７８）を含有しない。その後、ＰＬＡ３６６を、様々な希釈全体を通して１０ｎｇ／μＬの全プラスミド濃度を維持しながら、対照プラスミドＰＬＡ３７７／ＰＬＡ３７８の等量混合物で連続的に希釈する（ｓｑｒｔ１０希釈係数）ことによって、１０種の希釈物を作製した。最後の試料は、対照プラスミド（ＰＬＡ３７７／ＰＬＡ３７８の等量混合物）のみから構成されていた。その後、すべての試料を、ＵＤｉＴａＳにかけた：Ｇｅｎｅ１／Ｇｅｎｅ２転座試料は、ＯＬＩ６２５６およびＯＬＩ６２５９を用いて増幅させ、一方で、Ｇｅｎｅ３プラスミドは、ＯＬＩ６０６２を用いて増幅させた。ＵＤｉＴａＳプロトコルを、次の改変：第１および第２ラウンドのＰＣＲについて６サイクルを伴って適用した。
【０２１４】
マウスＤＮＡに加えられるプラスミドについては、異なる量の固有のプラスミドが、マウスｇＤＮＡに混合された。Ｇｅｎｅ３プラスミド添加実験については、表３に示す推定コピー数を有するプラスミドが、１０ｎｇ／μＬマウスｇＤＮＡに加えられた。
【０２１５】
【表３】
2020503056.tif 000009
【０２１６】
Ｇｅｎｅ１／Ｇｅｎｅ２プラスミド添加実験については、プラスミドは、表４に記載した通りに、１０ｎｇ／μＬマウスｇＤＮＡに加えられた。
【０２１７】
【表４】
2020503056.tif 000010
【０２１８】
【表５】
2020503056.tif 000011
【０２１９】
【表６】
2020503056.tif 000012
【０２２０】
【表７】
2020503056.tif 000013
【０２２１】
【表８−１】
2020503056.tif 000014
【０２２２】
【表８−２】
2020503056.tif 000015
【０２２３】
等価物
本発明を、その詳細な説明と共に記載してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することが意図され、本発明の範囲を限定しないことが理解されよう。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図１】
2020503056.tif 000016
【図２】
2020503056.tif 000017
【図３】
2020503056.tif 000018
【図４−１】
2020503056.tif 000019
【図４−２】
2020503056.tif 000020
【図５】
2020503056.tif 000021
【図６】
2020503056.tif 000022
【図７】
2020503056.tif 000023
【図８】
2020503056.tif 000024
【図９】
2020503056.tif 000025
【図１０】
2020503056.tif 000026
【図１１】
2020503056.tif 000027
【図１２】
2020503056.tif 000028
【図１３】
2020503056.tif 000029
【図１４ＡＢ】
2020503056.tif 000030
【図１４Ｃ】
2020503056.tif 000031
【図１５Ａ】
2020503056.tif 000032
【図１５Ｂ】
2020503056.tif 000033
【図１５Ｃ】
2020503056.tif 000034
【図１５Ｄ】
2020503056.tif 000035
【図１６】
2020503056.tif 000036
【図１７】
2020503056.tif 000037
【図１８】
2020503056.tif 000038
【図１９】
2020503056.tif 000039
【配列表】
2020503056000001.app
【国際調査報告】
2020503056.tif 000040
2020503056.tif 000041
2020503056.tif 000042
2020503056.tif 000043
2020503056.tif 000044
2020503056.tif 000045