(57)【要約】Ｎ−メチル−ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）の阻害剤による、自閉症（ＡＳＤ）、知的障害、またはてんかんなどの若年発症神経学的疾患を治療するための方法を本明細書に開示する。阻害剤は、ニトロシナプシンまたはその誘導体であり得る。
2020530033.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−メチルｄ−アスパラギン酸型グルタミン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）の阻害剤による、若年発症神経学的疾患の治療を、それを必要とする対象において行う、方法。
【請求項２】
前記ＮＭＤＡＲの阻害剤が、ニトロシナプシンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＮＭＤＡＲの阻害剤が、ニトロシナプシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＮＭＤＡＲの阻害剤が、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩であり、
【化７】
2020530033.tif 000009
式Ｉ
式中、
各Ｒ１は、−ＣＨ３および−ＣＨ２ＣＨ３から独立して選択され、
Ｒ２は、水素および−ＯＮＯ２から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
各Ｒ１が、−ＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ２が、−ＯＮＯ２である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＮＭＤＡＲの阻害剤が、式ＩＩの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩であり、
【化８】
2020530033.tif 000010
式ＩＩ
式中、
各Ｒ１は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択され、
Ｒ２は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、および−ＯＮＯ２から選択され、
Ｒ３およびＲ４は各々、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルから独立して選択されるか、
または、Ｒ３およびＲ４は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、ヘテロシクロアルキルを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ３およびＲ４が、各々水素である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｒ２が、水素および−ＯＮＯ２から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
Ｒ２が、−ＯＮＯ２である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
各Ｒ１が、独立してＣ１−Ｃ６アルキルである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
各Ｒ１が、メチルおよびエチルから独立して選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
各Ｒ１が、エチルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記若年発症神経学的疾患が、知的発達障害である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記若年発症神経学的疾患が、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記若年発症神経学的疾患が、てんかんを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記若年発症神経学的疾患が、結節性硬化症である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記若年発症神経学的疾患が、自閉症である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記若年発症神経学的疾患が、レット症候群である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象が、小児である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全であり、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全症候群（ＭＣＨＳ）を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ＭＥＦ２Ｃ、ＳＬＣ３２Ａ１、ＳＬＣ１７Ａ６、ＳＹＰ、およびＧＡＤ６５から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルに基づいて、前記治療対象を選択することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記発現レベルが、前記対象の細胞の前記発現レベルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記発現レベルが、前記対象の脳内の細胞の前記発現レベルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記発現レベルが、前記対象の循環細胞の前記発現レベルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記発現レベルが、ｍＲＮＡの発現レベルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記発現レベルが、タンパク質の発現レベルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記対象が、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記遺伝子が、ＳＬＣ３２Ａ１であり、前記発現レベルが、前記ＭＥＦ２Ｃ遺伝子の２つのコピーを含む平均的な対象の前記発現レベルと比較して、有意に低下している、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記遺伝子が、ＳＬＣ１７Ａ６であり、前記発現レベルが、前記ＭＥＦ２Ｃ遺伝子の２つのコピーを含む平均的な対象の前記発現レベルと比較して、有意に増加している、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記遺伝子が、ＳＹＰであり、前記発現レベルが、前記ＭＥＦ２Ｃ遺伝子の２つのコピーを含む平均的な対象の前記発現レベルと比較して、有意に低下している、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記遺伝子が、ＧＡＤ６５であり、前記発現レベルが、前記ＭＥＦ２Ｃ遺伝子の２つのコピーを含む平均的な対象の前記発現レベルと比較して、有意に低下している、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年８月１日に出願された、米国仮特許出願第６２／５３９，５４９号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
脳においては、筋細胞エンハンサ因子２（ＭＥＦ２）の転写は、神経細胞の分化、シナプス形成、および神経細胞の生存について重要な意味を持っている。ネスチン発現神経前駆細胞におけるＭｅｆ２ｃの条件付きノックアウトは、ＡＳＤに関連する神経障害であるレット症候群を連想させる電気生理学的ネットワーク特性の不全および行動障害のあるマウスを生成することが示されている。染色体５ｑ１４．３ｑ１５の微小欠失の領域は、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全と特定された小児に神経学的欠損表現型を引き起こす。こうした患者は、ＡＳＤ、知的障害および発達障害（ＩＤＤ）、互恵的行動の不良、発話の欠如、定型的かつ反復的な行動、ならびにてんかんを含む兆候および症状を示す。ＭＥＦ２Ｃハプロ不全によって引き起こされる障害は、集合的にＭＥＦ２Ｃハプロ不全症候群（ＭＣＨＳ）と呼ばれている。さらに、複数のＭＥＦ２標的遺伝子が、祖先が共通するヒト血統における自閉症関連遺伝子として特定されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
いくつかの態様では、Ｎ−メチルｄ−アスパラギン酸型グルタミン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）の阻害剤による、若年発症神経学的疾患の治療を、それを必要とする対象において行う、方法を本明細書に開示する。いくつかの例では、ＮＭＤＡＲの阻害剤は、ニトロシナプシンを含む。いくつかの例では、ＮＭＤＡＲの阻害剤は、ニトロシナプシンである。いくつかの例では、ＮＭＤＡＲの阻害剤は、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩であり、
【化１】
2020530033.tif 000003
式Ｉ
式中、
各Ｒ１は、−ＣＨ３および−ＣＨ２ＣＨ３から独立して選択され、
Ｒ２は、水素および−ＯＮＯ２から選択される。
いくつかの例では、各Ｒ１は、−ＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ２は、−ＯＮＯ２である。いくつかの例では、ＮＭＤＡＲの阻害剤は、式ＩＩの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩であり、
【化２】
2020530033.tif 000004
式ＩＩ
式中、
各Ｒ１は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択され、
Ｒ２は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、および−ＯＮＯ２から選択され、
Ｒ３およびＲ４は各々、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルから独立して選択されるか、
または、Ｒ３およびＲ４は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、ヘテロシクロアルキルを形成する。
いくつかの例では、Ｒ３およびＲ４は、各々水素である。いくつかの例では、Ｒ２は、水素および−ＯＮＯ２から選択される。いくつかの例では、Ｒ２は、−ＯＮＯ２である。いくつかの例では、各Ｒ１は、独立してＣ１−Ｃ６アルキルである。いくつかの例では、各Ｒ１は、メチルおよびエチルから独立して選択される。いくつかの例では、各Ｒ１は、エチルである。いくつかの例では、若年発症神経学的疾患は、知的障害および発達障害である。いくつかの例では、若年発症神経学的疾患は、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）である。いくつかの例では、若年発症神経学的疾患は、てんかんを含む。いくつかの例では、若年発症神経学的疾患は、結節性硬化症である。いくつかの例では、若年発症神経学的疾患は、自閉症である。いくつかの例では、若年発症神経学的疾患は、レット症候群である。いくつかの例では、対象は、小児である。いくつかの例では、対象は、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全であり、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全症候群（ＭＣＨＳ）を有する。いくつかの例では、ＭＥＦ２Ｃ、ＳＬＣ３２Ａ１、ＳＬＣ１７Ａ６、ＳＹＰ、およびＧＡＤ６５から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルに基づいて、治療対象を選択すること。いくつかの例では、該発現レベルは、対象の細胞の該発現レベルである。いくつかの例では、該発現レベルは、対象の脳内の細胞の該発現レベルである。いくつかの例では、該発現レベルは、対象の循環細胞の該発現レベルである。いくつかの例では、該発現レベルは、ｍＲＮＡの発現レベルである。いくつかの例では、該発現レベルは、タンパク質の発現レベルである。いくつかの例では、対象は、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全を有する。いくつかの例では、遺伝子は、ＳＬＣ３２Ａ１であり、該発現レベルは、ＭＥＦ２Ｃ遺伝子の２つのコピーを含む平均的な対象の該発現レベルと比較して、有意に低下している。いくつかの例では、遺伝子は、ＳＬＣ１７Ａ６であり、該発現レベルは、ＭＥＦ２Ｃ遺伝子の２つのコピーを含む平均的な対象の該発現レベルと比較して、有意に増加している。いくつかの例では、遺伝子は、ＳＹＰであり、該発現レベルは、ＭＥＦ２Ｃ遺伝子の２つのコピーを含む平均的な対象の該発現レベルと比較して、有意に低下している。いくつかの例では、遺伝子は、ＧＡＤ６５であり、該発現レベルは、ＭＥＦ２Ｃ遺伝子の２つのコピーを含む平均的な対象の該発現レベルと比較して、有意に低下している。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】（図１）ニトロシナプシン（ニトロメマンチンＹＱＷ−０３６またはＮＭＩ−６９７９としても知られている）によって回復されたＥ／Ｉ不均衡およびＭＣＨＳ様表現型につながるＭｅｆ２ｃハプロ不全の要約図を示している。
【図２】（図２）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔ脳においてＭＥＦ２Ｃタンパク質レベルが低下したことを示している。前脳組織溶解物の免疫ブロッティングは、ＷＴと比較して、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいてＭＥＦ２Ｃの減少を示した。β−アクチンに対して正規化されたタンパク質レベル（制御％）。下に例示された代表的なブロット。値は、平均＋標準誤差であり、ｎ＝５、スチューデントのｔ検定で＊＊Ｐ＜０．０１。
【図３Ａ】（図３）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスがＭＣＨＳ様表現型を示したことを示している。（図３Ａ）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスが早期に死亡することを示している。ＷＴマウスと比較したＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔの数は、Ｅ１８でほぼ同等であったが、成人期（約３か月）までには、ＷＴに対するＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔの数は、約４５％になった（＊カイ２乗によるＰ＜０．０５）。
【図３Ｂ】（図３Ｂおよび図３Ｃ）訓練中（図３Ｂ）およびその後のプローブ試験（図３Ｃ）におけるＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスのバーンズ迷路における空間学習および記憶の障害を示している。
【図３Ｃ】（図３Ｂおよび図３Ｃ）訓練中（図３Ｂ）およびその後のプローブ試験（図３Ｃ）におけるＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスのバーンズ迷路における空間学習および記憶の障害を示している。
【図３Ｄ】（図３Ｄおよび図３Ｅ）穴ボード探査におけるＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの増加した手足の握り（図３Ｄ）および反復的な頭部突っ込み（図３Ｅ）を示している。データは、平均±標準誤差であり、図３Ｂ、Ｃ、およびＥにおいては、遺伝子型あたりｎ＝９〜１１匹のマウスであり、ｄにおいては、ｎ＝３０匹（ＷＴ）および２１匹（ｈｅｔ）であり、ｎ．ｓ．は有意ではなく、スチューデントのｔ検定（図３Ｃ〜Ｅ）またはＡＮＯＶＡ（図３Ｂ）で＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図３Ｅ】（図３Ｄおよび図３Ｅ）穴ボード探査におけるＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの増加した手足の握り（図３Ｄ）および反復的な頭部突っ込み（図３Ｅ）を示している。データは、平均±標準誤差であり、図３Ｂ、Ｃ、およびＥにおいては、遺伝子型あたりｎ＝９〜１１匹のマウスであり、ｄにおいては、ｎ＝３０匹（ＷＴ）および２１匹（ｈｅｔ）であり、ｎ．ｓ．は有意ではなく、スチューデントのｔ検定（図３Ｃ〜Ｅ）またはＡＮＯＶＡ（図３Ｂ）で＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図４Ａ】（図４）マイクロアレイ分析によるＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおける神経原性およびシナプス遺伝子の下方制御を示している。（図４Ａ）火山プロットが、出生後日数（Ｐ）３０のＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔおよびＷＴ海馬（赤＝上、青＝下、緑線で示されるＰ＜０．０５）におけるＲＮＡ発現プロファイリングを示すことを示している。［注記：カラーを参照する図４および後続の図５〜１９において、カラー画像が我々の公報に表示されている：Ｔｕ  Ｓ，Ｌｉｐｔｏｎ  ＳＡ，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．ＮｉｔｒｏＳｙｎａｐｓｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ＭＥＦ２Ｃ  ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｕｔｉｓｍ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎ  ８，１４８８（２０１７）］。
【図４Ｂ】（図４Ｂ）ＮｅｘｔＢｉｏおよびＧｅｎｅ−Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯターム）フィルタリングを使用した、ＷＴと比較して、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔにおける発現が有意に変化したすべての遺伝子の経路濃縮分析を示している。
【図４Ｃ】（図４Ｃ）ＷＴ制御の割合としてのＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおけるｍＲＮＡの発現レベル（１８Ｓに関する）を示すｑＰＣＲ実験のグラフを示している（制御％、グループあたりｎ＝４匹）。データは、平均値±標準誤差であり、スチューデントのｔ検定で＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図５Ａ】（図５）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスが異常な神経特性を示したことを示している。（図５Ａ）ＷＴおよびＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの歯状回（ＤＧ）におけるＮｅｕＮ＋細胞を示す免疫組織化学を示している。
【図５Ｂ】（図５Ｂ）ＷＴと比較して、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおける海馬（ｈｉｐｐ）および皮質（Ｃｔｘ）のＮｅｕＮ＋細胞数の減少を示す定量化を提示している。海馬の測定値は、ＤＧの分子層における顆粒細胞に関して得られたものであり、皮質の測定値は、前頭葉層ＩＶおよびＶに関して得られたものである。
【図５Ｃ】（図５Ｃおよび図５Ｄ）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおける星状細胞と一致するＧＦＡＰ＋細胞数の増加を示す。
【図５Ｄ】（図５Ｃおよび図５Ｄ）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおける星状細胞と一致するＧＦＡＰ＋細胞数の増加を示す。
【図５Ｅ】（図５Ｅ）ＷＴおよびＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの視覚皮質のＶ１（一次視覚皮質）、Ｍ２ＭＬ（二次視覚皮質の中外側領域）、およびＬＰｔＡ（側方頭頂連合皮質）におけるゴルジ染色によって視覚化された代表的な樹状突起のＮｅｕｒｏｌｕｃｉｄａ図面を示している。
【図５Ｆ】（図５Ｆおよび図５Ｇ）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔ神経細胞における樹状突起交差（図５Ｆ）および樹状突起長（図５Ｇ）の累積数の減少を示すＳｈｏｌｌ分析の要約グラフを示している。スケールバー：５０μｍ。データは、平均値±標準誤差であり、グループあたりｎ＝４匹。図５Ａ〜Ｄにおけるスチューデントのｔ検定ならびに図５Ｆおよび図５ＧにおけるＡＮＯＶＡで＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図５Ｇ】（図５Ｆおよび図５Ｇ）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔ神経細胞における樹状突起交差（図５Ｆ）および樹状突起長（図５Ｇ）の累積数の減少を示すＳｈｏｌｌ分析の要約グラフを示している。スケールバー：５０μｍ。データは、平均値±標準誤差であり、グループあたりｎ＝４匹。図５Ａ〜Ｄにおけるスチューデントのｔ検定ならびに図５Ｆおよび図５ＧにおけるＡＮＯＶＡで＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図６Ａ】（図６）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスが異常な成体神経新生を示したことを示している。（図６Ａ）８週齢のＷＴおよびＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスのＤＧの顆粒下領域（ＳＧＺ）におけるＰＣＮＡ（緑）およびＤＣＸ（赤）の二重染色を示す共焦点画像。
【図６Ｂ】（図６Ｂおよび図６Ｃ）ＰＣＮＡ＋およびＤＣＸ＋細胞の定量化が、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔ  ＤＧにおける増殖細胞（図６Ｂ）および発達中の神経細胞（図６Ｃ）の数の減少を明らかにしたことを示している。
【図６Ｃ】（図６Ｂおよび図６Ｃ）ＰＣＮＡ＋およびＤＣＸ＋細胞の定量化が、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔ  ＤＧにおける増殖細胞（図６Ｂ）および発達中の神経細胞（図６Ｃ）の数の減少を明らかにしたことを示している。
【図６Ｄ】（図６Ｄ）８週齢のＷＴおよびＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにＢｒｄＵを注射してから４週間後に、ＢｒｄＵ（緑）およびＮｅｕＮ（赤）の二重染色が、新生ＤＧ神経細胞を明らかにしたことを示している（矢印：ＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋）。
【図６Ｅ】（図６Ｅ）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔ  ＤＧにおけるＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋細胞の減少を示し、ｎ＝パネルＡ〜Ｅにおける遺伝子型あたり４匹のマウス。
【図６Ｆ】（図６Ｆ）成体Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔおよびＷＴマウスで生まれた神経細胞の形態学的発達の例を示している。歯状回（ＤＧ）の分裂細胞は、レトロウイルスを介した遺伝子導入を介してｍＣｈｅｒｒｙで標識された。４週間後にマウスを屠殺した。
【図６Ｇ】（図６Ｇ）４週齢の神経細胞の総樹状突起長の定量化が、ＷＴマウス（ｎ＝１２）と比較して、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウス（ｎ＝１７）における樹状突起長の減少を明らかにしたことを示している。
【図６Ｈ】（図６Ｈ）定量化が、ＷＴマウス（ｎ＝２８）と比較して、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウス（ｎ＝７１）における体細胞サイズの減少を示したことを示している。
【図６Ｉ】（図６Ｉ）神経突起数の定量化が、ＷＴ脳と比較して、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔにおける４週齢の神経細胞の一次（ｎＷＴ＝２５、ｎＨｅｔ＝５５）、二次（ｎＷＴ＝２５、ｎＨｅｔ＝５５）、三次（ｎＷＴ＝２５、ｎＨｅｔ＝５５）、四次（ｎＷＴ＝１２、ｎＨｅｔ＝１７）、および五次（ｎＷＴ＝１２、ｎＨｅｔ＝１７）神経突起の正常な数を示したことを示している。切片厚：４０μｍ。スケールバー：５０μｍ。値は、平均±標準誤差であり、スチューデントのｔ検定で＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図７Ａ】（図７）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスが、シナプス特性の変化およびシナプス神経伝達における興奮性／抑制性（Ｅ／Ｉ）不均衡を示したことを示している。（図７Ａ）ＷＴおよびＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔ海馬におけるシナプトフィジン（ＳＹＰ）、ＶＧＬＵＴ１、およびＶＧＡＴの免疫組織化学を示している。スケールバー：５００μｍ（上部パネル）、５０μｍ（中央および下部パネル）。
【図７Ｂ】（図７Ｂ）皮質（Ｃｔｘ）または線条体（ｓｔｒ、左）ではなく、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔ海馬の歯状回（ＤＧ）およびＣＡ１領域におけるＳＹＰの免疫反応性の低下を示している。分子層においてＤＧ測定、錐体細胞層においてＣＡ１測定、前頭皮質層ＩＶおよびＶＩにおいてＣｔｘ測定、ならびに側坐核レベルの被殻においてｓｔｒ測定を実行した。Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔ海馬におけるＶＧＬＵＴ１ではなくＶＧＡＴの発現の減少（右）。データは、平均±標準誤差であり、グループあたりｎ＝４匹、スチューデントのｔ検定で＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図７Ｃ】（図７Ｃおよび７Ｄ）ＷＴおよびＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスのＤＧ神経細胞のスライス記録からのｍＩＰＳＣ（図７Ｃ）および小型興奮性シナプス後電流（ｍＥＰＳＣ）（図７Ｄ）の代表的なトレースを示している。
【図７Ｄ】（図７Ｃおよび７Ｄ）ＷＴおよびＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスのＤＧ神経細胞のスライス記録からのｍＩＰＳＣ（図７Ｃ）および小型興奮性シナプス後電流（ｍＥＰＳＣ）（図７Ｄ）の代表的なトレースを示している。
【図７Ｅ】（図７Ｅ〜Ｈ）小型抑制性シナプス後電流（ｍＩＰＳＣ）およびｍＥＰＳＣ振幅およびイベント間間隔の累積プロットを示している。ｎ＝遺伝子型あたり７〜９匹、２試料コルモゴロフ−スミルノフ検定で＊＊Ｐ＜０．０１。
【図７Ｆ】（図７Ｅ〜Ｈ）小型抑制性シナプス後電流（ｍＩＰＳＣ）およびｍＥＰＳＣ振幅およびイベント間間隔の累積プロットを示している。ｎ＝遺伝子型あたり７〜９匹、２試料コルモゴロフ−スミルノフ検定で＊＊Ｐ＜０．０１。
【図７Ｇ】（図７Ｅ〜Ｈ）小型抑制性シナプス後電流（ｍＩＰＳＣ）およびｍＥＰＳＣ振幅およびイベント間間隔の累積プロットを示している。ｎ＝遺伝子型あたり７〜９匹、２試料コルモゴロフ−スミルノフ検定で＊＊Ｐ＜０．０１。
【図７Ｈ】（図７Ｅ〜Ｈ）小型抑制性シナプス後電流（ｍＩＰＳＣ）およびｍＥＰＳＣ振幅およびイベント間間隔の累積プロットを示している。ｎ＝遺伝子型あたり７〜９匹、２試料コルモゴロフ−スミルノフ検定で＊＊Ｐ＜０．０１。
【図８Ａ】（図８）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスが、海馬において変化したレベルのシナプスタンパク質を発現したことを示している。（図８Ａ）シナプトソームが豊富な海馬溶解物の免疫ブロットが、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいてＶＧＬＵＴ１ではなくシナプトフィジン（ＳＹＰ）およびＧＡＤ６５の減少を示したことを示している。α−チューブリンに対して正規化されたタンパク質レベル（制御％）。下に例示された代表的なブロット。
【図８Ｂ】（図８Ｂ）ＶＧＬＵＴ１とＧＡＤ６５との比を示している。
【図８Ｃ】（図８Ｃ）シナプトソームが豊富な海馬溶解物の免疫ブロットが、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおけるα−チューブリンに対して正規化されたＶＧＬＵＴ２の増加を示したことを示している。下の代表的なブロット。データは、平均値＋標準誤差であり、ｎ＝遺伝子型あたり４匹、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。統計的有意性を、スチューデントのｔ検定によって判定した。
【図９Ａ】（図９）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスが、脳スライス記録において海馬長期増強（ＬＴＰ）およびペアパルス促進（ＰＰＦ）の障害を示したことを示している。（図９Ａおよび９Ｂ）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスが、ＬＴＰの障害（図９Ａ）およびＰＰＦの減少（図９Ｂ）を示したことを示している。グラフの下に代表的なトレースを示す。データは、平均値±標準誤差であり、ｎ＝遺伝子型あたり５〜９匹。統計的有意性を、ＡＮＯＶＡ（図９Ａ、＊Ｐ＜０．０１）または符号検定（図９Ｂ、＊Ｐ＜０．０５）によって判定した。
【図９Ｂ】（図９）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスが、脳スライス記録において海馬長期増強（ＬＴＰ）およびペアパルス促進（ＰＰＦ）の障害を示したことを示している。（図９Ａおよび９Ｂ）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスが、ＬＴＰの障害（図９Ａ）およびＰＰＦの減少（図９Ｂ）を示したことを示している。グラフの下に代表的なトレースを示す。データは、平均値±標準誤差であり、ｎ＝遺伝子型あたり５〜９匹。統計的有意性を、ＡＮＯＶＡ（図９Ａ、＊Ｐ＜０．０１）または符号検定（図９Ｂ、＊Ｐ＜０．０５）によって判定した。
【図１０Ａ】（図１０）ニトロシナプシンが、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいてＭＣＨＳ様表現型を回復させたことを示している。（図１０Ａ）モリス水迷路における訓練セッション中に隠されたプラットフォームを見つける待ち時間を示している。
【図１０Ｂ】（図１０Ｂ）プローブ試験の結果を示しており、ビヒクルで治療したＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウス（Ｈｅｔ／Ｖ）は、標的と反対の象限との間に選好を示さず、これは、記憶障害を示唆している。ニトロシナプシン（Ｎ）による治療は、この効果を回復させた（Ｈｅｔ／Ｎ）。下に示す代表的な水泳パターン。
【図１０Ｃ】（図１０Ｃおよび図１０Ｄ）オープンフィールド試験を示しており、Ｈｅｔ／Ｖマウスは、Ｎでの治療により回復された中心時間の増加を示した（図１０Ｃ）。対照的に、Ｈｅｔ／Ｖマウスは、正常な総活動を示した（図１０Ｄ）。
【図１０Ｄ】（図１０Ｃおよび図１０Ｄ）オープンフィールド試験を示しており、Ｈｅｔ／Ｖマウスは、Ｎでの治療により回復された中心時間の増加を示した（図１０Ｃ）。対照的に、Ｈｅｔ／Ｖマウスは、正常な総活動を示した（図１０Ｄ）。
【図１０Ｅ】（図１０Ｅ）Ｈｅｔ／Ｖマウスが、穴あたりの頭部突っ込みの増加を示したことを示しており、これは、反復的な行動を示唆している。回復された各薬物。
【図１０Ｆ】（図１０Ｆ〜Ｉ）Ｎ治療が、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの異常な社会的能力を回復させたことを示している。（図１０Ｅ）３部屋社会的能力試験におけるマウスの動きの代表的なトレースを示している。
【図１０Ｇ】（図１０Ｇ〜Ｉ）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウス（Ｈｅｔ／Ｖ）が、各部屋で過ごした時間（図１０Ｇ）、ならびにＥ（空）またはＳ１（見知らぬマウス１）部屋への訪問数（図１０Ｈ）および訪問期間（図１０Ｉ）によって測定される社会的相互作用の異常を示すことを示している。Ｎ治療は、この障害（Ｈｅｔ／Ｎ）を改善した。Ｍ：中間の部屋。データは、平均±標準誤差であり、グループあたりｎ＝７〜９匹。ＡＮＯＶＡで＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１０Ｈ】（図１０Ｇ〜Ｉ）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウス（Ｈｅｔ／Ｖ）が、各部屋で過ごした時間（図１０Ｇ）、ならびにＥ（空）またはＳ１（見知らぬマウス１）部屋への訪問数（図１０Ｈ）および訪問期間（図１０Ｉ）によって測定される社会的相互作用の異常を示すことを示している。Ｎ治療は、この障害（Ｈｅｔ／Ｎ）を改善した。Ｍ：中間の部屋。データは、平均±標準誤差であり、グループあたりｎ＝７〜９匹。ＡＮＯＶＡで＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１０Ｉ】（図１０Ｇ〜Ｉ）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウス（Ｈｅｔ／Ｖ）が、各部屋で過ごした時間（図１０Ｇ）、ならびにＥ（空）またはＳ１（見知らぬマウス１）部屋への訪問数（図１０Ｈ）および訪問期間（図１０Ｉ）によって測定される社会的相互作用の異常を示すことを示している。Ｎ治療は、この障害（Ｈｅｔ／Ｎ）を改善した。Ｍ：中間の部屋。データは、平均±標準誤差であり、グループあたりｎ＝７〜９匹。ＡＮＯＶＡで＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１１】（図１１）Ｍｅｆ２ｃヘテロ接合性またはニトロシナプシン治療のいずれも、モリス水迷路におけるマウスの水泳速度を変化させなかったことを示している。モリス水迷路の訓練段階中にマウスが隠れたプラットフォームに逃げる速度を、距離を待ち時間で割ったものとして計算した。プラットフォームへの待ち時間（図１０を参照されたい）とは異なり、マウスの３つのグループ（ＷＴ／Ｖ、Ｈｅｔ／Ｖ、およびＨｅｔ／Ｎ）の速度に、有意な差はなかった。データは、平均±標準誤差であり、グループあたりｎ＝７〜９匹。
【図１２Ａ】（図１２）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの神経学的欠損の救済において、ニトロシナプシンがメマンチンよりも効果的であることを示している。（図１２Ａ）３部屋社会的相互作用試験において、ニトロシナプシン（Ｎ）で治療されたＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスによる社会的訪問数が、メマンチン（Ｍ）で治療されたマウスの社会的訪問数よりも有意に多かったことを示す要約グラフを示している。社会的訪問は、見知らぬマウスによる部屋への訪問数（Ｓ１）から空の部屋への訪問数（Ｅ）を引いたものである。データは、平均＋標準誤差であり、グループあたりｎ＝７〜９匹、＊スチューデントのｔ検定でＰ＜０．０５。
【図１２Ｂ】（図１２Ｂ）メトロニン（Ｍ）ではなくニトロシナプシン（Ｎ）で治療されたＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおける海馬ＮｅｕＮ＋細胞の数が、ビヒクル（Ｖ）で治療されたマウスよりも有意に多かったことを示す要約グラフを提示している。データは、平均＋標準誤差であり、グループあたりｎ＝４〜５匹、＊＊ＡＮＯＶＡでＰ＜０．０１。
【図１３Ａ】（図１３）ニトロシナプシン（Ｎ）治療が３部屋アッセイにおいてＷＴマウスの社会的行動を変化させなかったことを示している。ビヒクル（Ｖ）またはニトロシナプシン（Ｎ）による３か月の治療後のＷＴマウスによる３つの部屋における時間（図１３Ａ）、訪問数（図１３Ｂ）、および訪問期間（図１３Ｃ）を示す要約グラフ。ニトロシナプシン治療は、ＷＴマウスの社会的行動を有意に変化させなかった。データは、平均＋標準誤差であり、ＷＴ／ＶおよびＷＴ／Ｎグループについてｎ＝各々１０匹。Ｅ：空の部屋、Ｓ１：見知らぬマウス１部屋。＊ＡＮＯＶＡまたはｔ検定によるＥと比較して、Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１３Ｂ】（図１３）ニトロシナプシン（Ｎ）治療が３部屋アッセイにおいてＷＴマウスの社会的行動を変化させなかったことを示している。ビヒクル（Ｖ）またはニトロシナプシン（Ｎ）による３か月の治療後のＷＴマウスによる３つの部屋における時間（図１３Ａ）、訪問数（図１３Ｂ）、および訪問期間（図１３Ｃ）を示す要約グラフ。ニトロシナプシン治療は、ＷＴマウスの社会的行動を有意に変化させなかった。データは、平均＋標準誤差であり、ＷＴ／ＶおよびＷＴ／Ｎグループについてｎ＝各々１０匹。Ｅ：空の部屋、Ｓ１：見知らぬマウス１部屋。＊ＡＮＯＶＡまたはｔ検定によるＥと比較して、Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１３Ｃ】（図１３）ニトロシナプシン（Ｎ）治療が３部屋アッセイにおいてＷＴマウスの社会的行動を変化させなかったことを示している。ビヒクル（Ｖ）またはニトロシナプシン（Ｎ）による３か月の治療後のＷＴマウスによる３つの部屋における時間（図１３Ａ）、訪問数（図１３Ｂ）、および訪問期間（図１３Ｃ）を示す要約グラフ。ニトロシナプシン治療は、ＷＴマウスの社会的行動を有意に変化させなかった。データは、平均＋標準誤差であり、ＷＴ／ＶおよびＷＴ／Ｎグループについてｎ＝各々１０匹。Ｅ：空の部屋、Ｓ１：見知らぬマウス１部屋。＊ＡＮＯＶＡまたはｔ検定によるＥと比較して、Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１４Ａ】（図１４）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスが、ニトロシナプシンによって回復されなかった手足の握りを除いて、異常な運動行動を示さなかったことを示している。ビヒクル（Ｖ）またはニトロシナプシン（Ｎ）による３か月の治療後のＷＴおよびＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの運動行動を示す要約グラフ。Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスは、平均台（図１４Ａ）、円柱状ロッド（図１４Ｂ）、牽引力（図１４Ｃ）、懸垂試験（図１４Ｄ）、または垂直ポール試験（図１４Ｅ）に対する有意に変化した行動を示さなかった。これらの実験では、ニトロシナプシンによる治療は、ＷＴまたはＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの行動に有意な影響を与えなかった。Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいて観察された異常な手足の握り行動は、ニトロシナプシン治療によって回復されなかった（図１４Ｆ）。データは、平均＋標準誤差であり、それぞれ、ＷＴ／Ｖ、ＷＴ／Ｎ、Ｈｅｔ／Ｖ、およびＨｅｔ／Ｎのグループについてｎ＝１２、５、１１、および１３匹。＊ＷＴ／Ｖと比較して、ＡＮＯＶＡでＰ＜０．０５。
【図１４Ｂ】（図１４）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスが、ニトロシナプシンによって回復されなかった手足の握りを除いて、異常な運動行動を示さなかったことを示している。ビヒクル（Ｖ）またはニトロシナプシン（Ｎ）による３か月の治療後のＷＴおよびＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの運動行動を示す要約グラフ。Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスは、平均台（図１４Ａ）、円柱状ロッド（図１４Ｂ）、牽引力（図１４Ｃ）、懸垂試験（図１４Ｄ）、または垂直ポール試験（図１４Ｅ）に対する有意に変化した行動を示さなかった。これらの実験では、ニトロシナプシンによる治療は、ＷＴまたはＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの行動に有意な影響を与えなかった。Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいて観察された異常な手足の握り行動は、ニトロシナプシン治療によって回復されなかった（図１４Ｆ）。データは、平均＋標準誤差であり、それぞれ、ＷＴ／Ｖ、ＷＴ／Ｎ、Ｈｅｔ／Ｖ、およびＨｅｔ／Ｎのグループについてｎ＝１２、５、１１、および１３匹。＊ＷＴ／Ｖと比較して、ＡＮＯＶＡでＰ＜０．０５。
【図１４Ｃ】（図１４）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスが、ニトロシナプシンによって回復されなかった手足の握りを除いて、異常な運動行動を示さなかったことを示している。ビヒクル（Ｖ）またはニトロシナプシン（Ｎ）による３か月の治療後のＷＴおよびＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの運動行動を示す要約グラフ。Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスは、平均台（図１４Ａ）、円柱状ロッド（図１４Ｂ）、牽引力（図１４Ｃ）、懸垂試験（図１４Ｄ）、または垂直ポール試験（図１４Ｅ）に対する有意に変化した行動を示さなかった。これらの実験では、ニトロシナプシンによる治療は、ＷＴまたはＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの行動に有意な影響を与えなかった。Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいて観察された異常な手足の握り行動は、ニトロシナプシン治療によって回復されなかった（図１４Ｆ）。データは、平均＋標準誤差であり、それぞれ、ＷＴ／Ｖ、ＷＴ／Ｎ、Ｈｅｔ／Ｖ、およびＨｅｔ／Ｎのグループについてｎ＝１２、５、１１、および１３匹。＊ＷＴ／Ｖと比較して、ＡＮＯＶＡでＰ＜０．０５。
【図１４Ｄ】（図１４）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスが、ニトロシナプシンによって回復されなかった手足の握りを除いて、異常な運動行動を示さなかったことを示している。ビヒクル（Ｖ）またはニトロシナプシン（Ｎ）による３か月の治療後のＷＴおよびＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの運動行動を示す要約グラフ。Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスは、平均台（図１４Ａ）、円柱状ロッド（図１４Ｂ）、牽引力（図１４Ｃ）、懸垂試験（図１４Ｄ）、または垂直ポール試験（図１４Ｅ）に対する有意に変化した行動を示さなかった。これらの実験では、ニトロシナプシンによる治療は、ＷＴまたはＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの行動に有意な影響を与えなかった。Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいて観察された異常な手足の握り行動は、ニトロシナプシン治療によって回復されなかった（図１４Ｆ）。データは、平均＋標準誤差であり、それぞれ、ＷＴ／Ｖ、ＷＴ／Ｎ、Ｈｅｔ／Ｖ、およびＨｅｔ／Ｎのグループについてｎ＝１２、５、１１、および１３匹。＊ＷＴ／Ｖと比較して、ＡＮＯＶＡでＰ＜０．０５。
【図１４Ｅ】（図１４）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスが、ニトロシナプシンによって回復されなかった手足の握りを除いて、異常な運動行動を示さなかったことを示している。ビヒクル（Ｖ）またはニトロシナプシン（Ｎ）による３か月の治療後のＷＴおよびＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの運動行動を示す要約グラフ。Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスは、平均台（図１４Ａ）、円柱状ロッド（図１４Ｂ）、牽引力（図１４Ｃ）、懸垂試験（図１４Ｄ）、または垂直ポール試験（図１４Ｅ）に対する有意に変化した行動を示さなかった。これらの実験では、ニトロシナプシンによる治療は、ＷＴまたはＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの行動に有意な影響を与えなかった。Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいて観察された異常な手足の握り行動は、ニトロシナプシン治療によって回復されなかった（図１４Ｆ）。データは、平均＋標準誤差であり、それぞれ、ＷＴ／Ｖ、ＷＴ／Ｎ、Ｈｅｔ／Ｖ、およびＨｅｔ／Ｎのグループについてｎ＝１２、５、１１、および１３匹。＊ＷＴ／Ｖと比較して、ＡＮＯＶＡでＰ＜０．０５。
【図１４Ｆ】（図１４）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスが、ニトロシナプシンによって回復されなかった手足の握りを除いて、異常な運動行動を示さなかったことを示している。ビヒクル（Ｖ）またはニトロシナプシン（Ｎ）による３か月の治療後のＷＴおよびＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの運動行動を示す要約グラフ。Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスは、平均台（図１４Ａ）、円柱状ロッド（図１４Ｂ）、牽引力（図１４Ｃ）、懸垂試験（図１４Ｄ）、または垂直ポール試験（図１４Ｅ）に対する有意に変化した行動を示さなかった。これらの実験では、ニトロシナプシンによる治療は、ＷＴまたはＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの行動に有意な影響を与えなかった。Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいて観察された異常な手足の握り行動は、ニトロシナプシン治療によって回復されなかった（図１４Ｆ）。データは、平均＋標準誤差であり、それぞれ、ＷＴ／Ｖ、ＷＴ／Ｎ、Ｈｅｔ／Ｖ、およびＨｅｔ／Ｎのグループについてｎ＝１２、５、１１、および１３匹。＊ＷＴ／Ｖと比較して、ＡＮＯＶＡでＰ＜０．０５。
【図１５Ａ】（図１５）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいて、ニトロシナプシンが異常な神経細胞およびシナプス特性を回復させたことを示している。（図１５Ａ）ビヒクル（Ｖ）またはニトロシナプシン（Ｎ）で治療したＷＴおよびＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの海馬歯状回（ＤＧ）の分子層（ＭＬ）における、ＮｅｕＮ、ＶＧＬＵＴ１、ＶＧＡＴ、およびＶＧＬＵＴ２の免疫組織化学画像を示している。スケールバー：５００μｍ（上部パネル）、２５μｍ（中央パネル）、４０μｍ（下部パネル）。
【図１５Ｂ】（図１５Ｂ〜Ｆ）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの海馬における、総ＮｅｕＮ＋細胞数の減少（図１５Ｂ）、ＶＧＡＴ（図１５Ｄ）およびＶＧＬＵＴ２（図１５Ｆ）の免疫反応性の低下、ならびにＶＧＬＵＴ１／ＶＧＡＴ（ｅ）またはＶＧＬＵＴ２／ＶＧＡＴの比の増加（図１５Ｇ）についてのニトロシナプシンによる回復を示す要約グラフを提示している。
【図１５Ｃ】（図１５Ｂ〜Ｆ）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの海馬における、総ＮｅｕＮ＋細胞数の減少（図１５Ｂ）、ＶＧＡＴ（図１５Ｄ）およびＶＧＬＵＴ２（図１５Ｆ）の免疫反応性の低下、ならびにＶＧＬＵＴ１／ＶＧＡＴ（ｅ）またはＶＧＬＵＴ２／ＶＧＡＴの比の増加（図１５Ｇ）についてのニトロシナプシンによる回復を示す要約グラフを提示している。
【図１５Ｄ】（図１５Ｂ〜Ｆ）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの海馬における、総ＮｅｕＮ＋細胞数の減少（図１５Ｂ）、ＶＧＡＴ（図１５Ｄ）およびＶＧＬＵＴ２（図１５Ｆ）の免疫反応性の低下、ならびにＶＧＬＵＴ１／ＶＧＡＴ（ｅ）またはＶＧＬＵＴ２／ＶＧＡＴの比の増加（図１５Ｇ）についてのニトロシナプシンによる回復を示す要約グラフを提示している。
【図１５Ｅ】（図１５Ｂ〜Ｆ）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの海馬における、総ＮｅｕＮ＋細胞数の減少（図１５Ｂ）、ＶＧＡＴ（図１５Ｄ）およびＶＧＬＵＴ２（図１５Ｆ）の免疫反応性の低下、ならびにＶＧＬＵＴ１／ＶＧＡＴ（ｅ）またはＶＧＬＵＴ２／ＶＧＡＴの比の増加（図１５Ｇ）についてのニトロシナプシンによる回復を示す要約グラフを提示している。
【図１５Ｆ】（図１５Ｂ〜Ｆ）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの海馬における、総ＮｅｕＮ＋細胞数の減少（図１５Ｂ）、ＶＧＡＴ（図１５Ｄ）およびＶＧＬＵＴ２（図１５Ｆ）の免疫反応性の低下、ならびにＶＧＬＵＴ１／ＶＧＡＴ（ｅ）またはＶＧＬＵＴ２／ＶＧＡＴの比の増加（図１５Ｇ）についてのニトロシナプシンによる回復を示す要約グラフを提示している。
【図１５Ｇ】（図１５Ｂ〜Ｆ）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの海馬における、総ＮｅｕＮ＋細胞数の減少（図１５Ｂ）、ＶＧＡＴ（図１５Ｄ）およびＶＧＬＵＴ２（図１５Ｆ）の免疫反応性の低下、ならびにＶＧＬＵＴ１／ＶＧＡＴ（ｅ）またはＶＧＬＵＴ２／ＶＧＡＴの比の増加（図１５Ｇ）についてのニトロシナプシンによる回復を示す要約グラフを提示している。
【図１５Ｈ】（図１５Ｈ）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスのＬＴＰの障害もニトロシナプシンによって回復されたことを示している。データは、平均±標準誤差であり、図１５Ａ〜Ｇでは、グループあたりｎ＝４〜５匹、図１５Ｈでは、７〜９匹である。ＡＮＯＶＡで＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１６Ａ】（図１６）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスが、海馬におけるカスパーゼ３活性化およびアポトーシスの増加を示したことを示している。（図１６Ａ）ビヒクル（ＷＴ／Ｖ）またはニトロシナプシン（ＷＴ／Ｎ）で治療したＷＴマウスの海馬ＣＡ３領域における、かつビヒクル（Ｈｅｔ／Ｖ）またはニトロシナプシン（Ｈｅｔ／Ｎ）で治療したＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおける、カスパーゼ３の活性化（Ａｃｔ  Ｃａｓｐ  ３、上部パネル）およびＴＵＮＥＬ染色（下部パネル）の免疫組織化学を示している。スケールバー、２５μｍ。
【図１６Ｂ】（図１６Ｂおよび図１６Ｃ）カスパーゼ３＋（図１６Ｂ）およびＴＵＮＥＬ＋神経細胞（図１６Ｃ）が、対照ＷＴ／Ｖマウスと比較して、Ｈｅｔ／Ｖマウスにおいて有意に増加したことを示すヒストグラムを提示している。さらに、これらの表現型のうちの両方が、Ｈｅｔ／Ｎマウスにおいて改善された。データは、平均＋標準誤差であり、グループあたりｎ＝４〜５匹、ＡＮＯＶＡで＊Ｐ＜０．０５。
【図１６Ｃ】（図１６Ｂおよび図１６Ｃ）カスパーゼ３＋（図１６Ｂ）およびＴＵＮＥＬ＋神経細胞（図１６Ｃ）が、対照ＷＴ／Ｖマウスと比較して、Ｈｅｔ／Ｖマウスにおいて有意に増加したことを示すヒストグラムを提示している。さらに、これらの表現型のうちの両方が、Ｈｅｔ／Ｎマウスにおいて改善された。データは、平均＋標準誤差であり、グループあたりｎ＝４〜５匹、ＡＮＯＶＡで＊Ｐ＜０．０５。
【図１７Ａ】（図１７）ニトロシナプシンが、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔ海馬の星状細胞の数を正常化したことを示している。（図１７Ａ〜Ｃ）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウス対ＷＴ（図１７Ｂ対図１７Ａ）における星状細胞の形態を有するＧＦＡＰ＋細胞の増加を示す代表的な画像を提示している。ＧＦＡＰ＋細胞の数は、ニトロシナプシンによる長時間治療によってＷＴレベルに回復された（図１７Ｃ）。ＭＬ、歯状回の分子層（ＤＧ）。スケールバー、２５μｍ。（図１７Ｄ）ビヒクル（Ｖ）またはニトロシナプシン（Ｎ）で治療したＷＴおよびＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの海馬におけるＧＦＡＰ＋細胞の定量化。データは、平均＋標準誤差であり、グループあたりｎ＝４または５匹、＊＊ＷＴ／Ｖと比較して、Ｐ＜０．０１、Ｈｅｔ／Ｖと比較して、♯Ｐ＜０．０５。
【図１７Ｂ】（図１７）ニトロシナプシンが、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔ海馬の星状細胞の数を正常化したことを示している。（図１７Ａ〜Ｃ）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウス対ＷＴ（図１７Ｂ対図１７Ａ）における星状細胞の形態を有するＧＦＡＰ＋細胞の増加を示す代表的な画像を提示している。ＧＦＡＰ＋細胞の数は、ニトロシナプシンによる長時間治療によってＷＴレベルに回復された（図１７Ｃ）。ＭＬ、歯状回の分子層（ＤＧ）。スケールバー、２５μｍ。（図１７Ｄ）ビヒクル（Ｖ）またはニトロシナプシン（Ｎ）で治療したＷＴおよびＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの海馬におけるＧＦＡＰ＋細胞の定量化。データは、平均＋標準誤差であり、グループあたりｎ＝４または５匹、＊＊ＷＴ／Ｖと比較して、Ｐ＜０．０１、Ｈｅｔ／Ｖと比較して、♯Ｐ＜０．０５。
【図１７Ｃ】（図１７）ニトロシナプシンが、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔ海馬の星状細胞の数を正常化したことを示している。（図１７Ａ〜Ｃ）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウス対ＷＴ（図１７Ｂ対図１７Ａ）における星状細胞の形態を有するＧＦＡＰ＋細胞の増加を示す代表的な画像を提示している。ＧＦＡＰ＋細胞の数は、ニトロシナプシンによる長時間治療によってＷＴレベルに回復された（図１７Ｃ）。ＭＬ、歯状回の分子層（ＤＧ）。スケールバー、２５μｍ。（図１７Ｄ）ビヒクル（Ｖ）またはニトロシナプシン（Ｎ）で治療したＷＴおよびＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの海馬におけるＧＦＡＰ＋細胞の定量化。データは、平均＋標準誤差であり、グループあたりｎ＝４または５匹、＊＊ＷＴ／Ｖと比較して、Ｐ＜０．０１、Ｈｅｔ／Ｖと比較して、♯Ｐ＜０．０５。
【図１７Ｄ】（図１７）ニトロシナプシンが、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔ海馬の星状細胞の数を正常化したことを示している。（図１７Ａ〜Ｃ）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウス対ＷＴ（図１７Ｂ対図１７Ａ）における星状細胞の形態を有するＧＦＡＰ＋細胞の増加を示す代表的な画像を提示している。ＧＦＡＰ＋細胞の数は、ニトロシナプシンによる長時間治療によってＷＴレベルに回復された（図１７Ｃ）。ＭＬ、歯状回の分子層（ＤＧ）。スケールバー、２５μｍ。（図１７Ｄ）ビヒクル（Ｖ）またはニトロシナプシン（Ｎ）で治療したＷＴおよびＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの海馬におけるＧＦＡＰ＋細胞の定量化。データは、平均＋標準誤差であり、グループあたりｎ＝４または５匹、＊＊ＷＴ／Ｖと比較して、Ｐ＜０．０１、Ｈｅｔ／Ｖと比較して、♯Ｐ＜０．０５。
【図１８Ａ】（図１８）Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスが、パルブアルブミン＋（ＰＶ＋）抑制性シナプスおよび細胞の減少を示したことを示している。（図１８Ａ）ビヒクルで治療したＷＴマウス（ＷＴ／Ｖ）の海馬およびビヒクル（Ｈｅｔ／Ｖ）またはニトロシナプシン（Ｈｅｔ／Ｎ）で治療したＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおけるＰＶ＋免疫反応性を示す代表的な画像を提示している。ＰＶ＋神経細胞（各パネルの左下）またはシナプス（各パネルの右下）の高倍率。スケールバー、２５μｍ。
【図１８Ｂ】（図１８Ｂ）ＷＴ／Ｖマウスと比較したＨｅｔ／ＶマウスにおけるＰＶ免疫反応性シナプスの減少を示すヒストグラムを提示している。この減少は、ニトロシナプシン治療後に著しく改善された。
【図１８Ｃ】（図１８Ｃ）ＷＴ／Ｖマウスと比較したＨｅｔ／ＶマウスではなくＨｅｔ／ＮマウスにおけるＰＶ免疫反応性細胞の数の減少を示すヒストグラムを提示している。データは、平均＋標準誤差であり、グループあたりｎ＝４〜５匹、ＡＮＯＶＡで＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１９】（図１９）ニトロシナプシン治療が、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおけるＬＴＰの欠損を回復させたことを示している。ＷＴ／Ｖ−、Ｈｅｔ／Ｖ−、およびＨｅｔ／Ｎ治療マウスから調製したスライスにおける海馬ＬＴＰの誘導前（左）および誘導後（右）の誘発電流の代表的なトレース。動物の各グループのｆＥＰＳＰ勾配は、図１５Ｈの本文に提示されている。
【図２０Ａ】（図２０Ａ）シナプス外Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ｅＮＭＤＡＲ）活性が、結節性硬化症２（ＴＳＣ２）を不活性化し、ＮＭＤＡＲ拮抗薬ニトロメマンチン（別名、ニトロシナプシン、ＹＱＷ−０３６、ＮＭＩ−６９７９）によってメマンチンよりも大きい程度に弱毒化されるシグナル伝達をトリガしたことを示している。スキーマは、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬がｐ３８  ＭＡＰＫカスケードの活性化を遮断したことを示している。ニトロメマンチンＹＱＷ−０３６（ニトロシナプシンとしても知られている）は、メマンチンよりも効果的な拮抗薬であるため、さらに大きな有益な効果を発揮した（したがって、より大きな阻害剤のシンボル）。
【図２０Ｂ】（図２０Ｂ）ｅＮＭＤＡＲ刺激が、ｐ３８  ＭＡＰＫ／ＭＡＰＫＡＰＫ２／ＴＳＣ２／ｍＴＯＲＣ１／Ｓ６Ｋ１カスケードのリン酸化／活性化を増加させたというウエスタンブロット証拠を示している。ｅＮＭＤＡＲ拮抗薬メマンチン（１０μＭ）によるｅＮＭＤＡＲの遮断は、このシグナル伝達を減少させた。この実験を、同様の結果で４回繰り返し、図２０Ｃにおいて定量化した。
【図２０Ｃ】（図２０Ｃ）不対のｔ検定による免疫ブロットの定量化を示しており、平均値±標準誤差、ｎ＝４、＊Ｐ＜０．０５（Ｍｅｍ、メマンチン）。
【図２１Ａ】（図２１）Ｔｓｃ２＋／−（ｈｅｔ）マウスのシナプス完全性に対するメマンチン（Ｍ）およびニトロシナプシン（Ｎ、図ではニトロメマンチンと標識されている）治療の効果を示している。（図２１Ａ）ビヒクル、Ｍ、またはＮで治療した３か月齢のＷＴおよびＴｓｃ２＋／−遺伝子導入マウスからの脳スライスの代表的な組織学的画像を示している。ＳＹ３８（シナプトフィジン）陽性シナプス末端（赤）に対する染色を海馬に示す。
【図２１Ｂ】（図２１Ｂ）ビヒクル、Ｍ、またはＮ治療をしたＷＴおよびＴＳＣ２＋／−遺伝子導入マウスにおけるシナプトフィシンの免疫反応性の定量化を示している。シナプスの完全性は、免疫反応性ＳＹ３８の占有面積の割合として測定された。Ｎによる治療Ｔｓｃ２＋／−Ｎのマウスは、シナプスシグナルをＷＴレベルに上昇させ、治療されたビヒクルよりも有意に大きかった。面積％＋標準誤差として提示された値、ｔ検定で＊Ｐ＜０．５、治療グループあたりｎ＝３匹のマウス。
【図２２Ａ】（図２２）Ｔｓｃ２＋／−（ｈｅｔ）マウスにおける異常なＣＡ１−ＬＴＰおよびニトロシナプシンによる改善を示している。（図２２Ａ）多電極アレイ（ＭＥＡ）によって海馬スライスから記録されたＬＴＰ（長期増強）を示している。ｆＥＰＳＰ勾配は、３０秒ごとにプロットされ、Ｔｓｃ２＋／＋およびＴｓｃ２＋／−の平均値±標準誤差を表している（ｎ＝７匹のマウスからの７つのスライス）。
【図２２Ｂ】（図２２Ｂ）Ｔｓｃ＋／−マウスに対するビヒクル制御対１〜２μＭのメマンチンまたはニトロシナプシンによる治療の効果を示している（ｎ＝１３匹のマウスからの１３個のスライス、誘導後５５〜６５分モニタされた、ニトロシンナプシン（しかしメマンチンではない）によるＬＴＰの改善について、Ｐ＜０．００１）。
【図２３】（図２３）恐怖条件付け試験によって評価されたＴｓｃ２＋／−（ｈｅｔ）マウスにおけるコンテキスト識別に対するメマンチンではなくニトロシナプシンによる治療の有益な効果を示している。恐怖条件付け試行において、ビヒクル、メマンチン、またはニトロシナプシンで治療した３か月齢のＷＴおよびＴｓｃ２＋／−遺伝子導入マウスの身動き停止時間。試験されたマウスの４つすべてのグループ（ＷＴビヒクル、Ｈｅｔビヒクル、Ｈｅｔメマンチン、およびＨｅｔニトロシナプシン）が、「訓練コンテキスト」および「新規コンテキスト＋キュー」において身動き停止を示し、これは、条件付けられた恐怖反応が遺伝子型または薬物によって影響を受けなかったことを示している。さらに、ＷＴマウスは、訓練コンテキストと新規コンテキストとの間のコンテキスト識別を表示した（＊Ｐ＝０．０３２）。対照的に、ビヒクルまたはメマンチンで治療されたＴｓｃ２＋／−マウスは、この行動において欠陥を示し、訓練と新しいコンテキストと間の識別の欠如をもたらした（ｎ．ｓ．＝有意差なし）。ニトロシナプシン（メマンチンではない）治療は、この表現型を改善し、Ｔｓｃ２＋／−マウスのコンテキスト識別を正常化した（＊＊Ｐ＝０．０２３）。値は、平均＋標準誤差である（グループあたりｎ＝７〜１２匹のマウス）。
【図２４】（図２４）ニトロシナプシンによる治療によるレット症候群のＭｅＣＰ２ノックアウト（ＫＯ）マウスモデルのロータロッド能力の改善を示している。マウスを静止したシリンダ上に置き、シリンダをゆっくりと１０回転／分まで加速した。シリンダから落下するまでの１０ｒｐｍでの合計時間を記録した。Ｖ＝ビヒクル治療（ＷＴについてｎ＝１２匹、ＭｅＣＰ２  ＫＯマウスについて、ｎ＝７匹、Ｍ＝メマンチン治療（ＷＴについてｎ＝１６匹、ＭｅＣＰ２  ＫＯについてｎ＝１３匹、Ｎ＝ニトロシナプシン治療（ＷＴについてｎ＝５匹、ＭｅＣＰ２  ＫＯについてｎ＝１４匹）。値は、＋標準誤差であり、＊Ｐ＜０．０５。ＭではなくＮによる治療が、このロータロッド試験において運動能力の有意な改善を示した。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
脳においては、転写因子である筋細胞エンハンサ因子２（ＭＥＦ２）が、神経細胞の分化、シナプス形成、および神経細胞の生存について重要な意味を持っている。ネスチン発現神経前駆細胞におけるＭｅｆ２ｃの条件付きノックアウトは、電気生理学的ネットワーク特性の障害および自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）に関連する神経障害であるレット症候群を連想させる行動障害のあるマウスを生成することが示されている。染色体５ｑ１４．３ｑ１５の微小欠失の領域は、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全として特定された小児に神経学的欠損表現型を引き起こす。こうした患者は、ＡＳＤ、知的障害および発達障害（ＩＤＤ）、互恵的行動の不良、発話の欠如、定型的かつ反復的な行動、ならびにてんかんを含む兆候および症状を示す。ＭＥＦ２Ｃハプロ不全によって引き起こされる障害は、集合的にＭＥＦ２Ｃハプロ不全症候群（ＭＣＨＳ）と呼ばれている。さらに、複数のＭＥＦ２標的遺伝子が、祖先が共通するヒト血統における自閉症関連遺伝子として特定されている。したがって、請求されたＭＣＨＳに対する治療法は、同様に他の形態のＡＳＤ／ＩＤＤおよびてんかんも効果的に治療するのに有用である。
【０００６】
ＡＳＤ、ＩＤＤ、てんかん、および関連する症状の治療には、改善された治療が必要である。これらの線に沿って、デュアルメマンチン様作用および主にシナプス外ＮＭＤＡ受容体（ｅＮＭＤＡＲ）のレドックス（Ｓ−ニトロシル化）ベースの阻害に基づいて、一連の改善された薬物が最近合成された。当初、これらの化合物は、「ニトロメマンチン」と呼ばれていたが、最近、リード化合物であるＹＱＷ−０３６（またはＮＭＩ−６９７９）が、複数の損傷に直面してシナプス数および機能を回復させる能力があるため、ニトロシナプシンに指定された。スキーム１は、メマンチンおよびニトロメマンチン（別名、ニトロシナプシン）の構造を示している。
スキーム１．
【化３】
2020530033.tif 000005
【０００７】
本明細書の実施例に具体化されているように、神経行動障害、興奮性／抑制性（Ｅ／Ｉ）の不均衡、および組織学的損傷はすべて、Ｍｅｆ２ｃ＋／−（Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔ）マウスにおいてニトロシナプシン（ニトロメマンチンＹＱＷ−０３６／ＮＭＩ−６９７９としても知られている−構造Ｉを参照されたい）による治療によって改善された。Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスは、ＡＳＤのヒトＭＥＦ２Ｃハプロ不全形態に対するモデルとして開発された。Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスは、神経細胞およびシナプスの異常を示し、海馬における抑制性および興奮性シナプス伝達を減少させ、長期増強（ＬＴＰ）およびＭＣＨＳ様行動表現型を抑制した。ニトロシナプシンによる治療の前に、これらのマウスは、神経新生の減少、神経細胞のアポトーシスの強化、Ｅ／Ｉ神経伝達の割合の変化、ならびに自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、知的発達障害（ＩＤＤ）、およびを有するヒト患者に似た行動障害の表現型を示した。重要なことに、これらの表現型のほぼすべてが、ニトロシナプシンによる長時間治療によって回復または軽減された。さらに、レット症候群および結節性硬化症のヒト疾患の追加のマウスモデルは、ニトロシナプシンがこれらの他の形態のＡＳＤ／ＩＤＤに関連する表現型およびＥ／Ｉ不均衡に関連するてんかんの修正にも同様に有効であることを示した。メカニズムにもかかわらず、ニトロシナプシンは、ＡＳＤ／ＩＤＤおよびてんかんの複数のマウスモデルにおいて効果的な治療法として示されたため、ヒトＡＳＤ／ＩＤＤおよびてんかんの治療に効果的であるはずである。
【０００８】
メマンチンのような他のＮＭＤＡＲ拮抗薬がこの目的のためのヒト臨床試験において失敗したため、ニトロシナプシンが、ＭＣＨＳならびに他の形態のＡＳＤ／ＩＤＤおよびてんかん症候群に対する効能を持っていたことは、我々にとって驚くべきことであった（Ｆｕｎｇ  ＬＫ，Ｈａｒｄａｎ  ＡＹ．Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｇｌｕｔａｍａｔｅｒｇｉｃ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｕｔｉｓｍ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏ  ｄａｔｅ．ＣＮＳ  Ｄｒｕｇｓ  ２９，４５３−４６３（２０１５）；Ｔｕ  Ｓ，Ｌｉｐｔｏｎ  ＳＡ，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．ＮｉｔｒｏＳｙｎａｐｓｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ＭＥＦ２Ｃ  ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｕｔｉｓｍ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎ  ８，１４８８（２０１７））。ニトロシナプシンは、この点において、シナプス伝達および長期増強（ＬＴＰ）の遮断を回避する臨床的に許容可能な特性を持ちながら、優れた効能を発揮するため、機能する。
【０００９】
図１は、ニトロシナプシンにより回復されたＥ／Ｉ不均衡およびＭＣＨＳ様表現型につながるＭｅｆ２ｃハプロ不全の要約図を示している。Ｍｅｆ２ｃハプロ不全は、ＶＧＡＴの減少およびＶＧＬＵＴ２タンパク質レベルの増加につながり、Ｅ／Ｉの不均衡（過剰興奮性）およびシナプス機能障害をもたらす。Ｍｅｆ２ｃハプロ不全は、神経細胞の損失、特にＰＶ＋抑制性介在神経細胞の数の減少も引き起こす。これらのシナプスおよび細胞の異常は、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいて観察されるＭＣＨＳ様行動表現型の根本的な原因である可能性が高い。組織学的および行動的表現型は、ＦＤＡ承認薬であるメマンチン（Ｍｅｍ）よりも有意に大きい程度まで、ニトロシナプシン（ＮｉｔｒｏＭｅｍ）による長期治療によって改善される。
神経学的疾患
【００１０】
いくつかの態様では、対象における少なくとも１つの神経学的疾患を治療する方法を本明細書に提供する。方法は、本明細書に開示される化合物を対象に送達することを含み得る。方法は、本明細書に開示される化合物の組み合わせを対象に送達することを含み得る。当業者であればどのように評価するのかを知っているので、神経学的疾患を、Ｅ／Ｉ不均衡に関連づけることができる。簡単に言えば、Ｅ／Ｉは、いくつかの方法、例えば、抑制性伝達の興奮性亢進または欠損を示すパッチクランプ電気記録によって評価することができる（Ｔｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７、同上）。Ｔｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７（同上）に記載されている興奮性および抑制性シナプスの組織学的評価は、Ｅ／Ｉ不均衡の評価にも部分的に使用することができる。本明細書に開示される方法に従って治療され得るヒトまたは他の動物における神経学的疾患には、任意の形態の自閉症（ＡＳＤ）、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全症候群（ＭＣＨＳ）、知的発達障害（ＩＤＤ）、てんかん、レット症候群、および結節性硬化症が含まれるがこれらに限定されない。
【００１１】
本明細書に開示される治療方法は、若年発症神経学的疾患を治療することを含む。若年発症神経学的疾患は、小児期に１つ以上の神経学的または行動異常が現れる疾患である。いくつかの例では、小児期は、年齢が０〜１８歳とみなされる。いくつかの例では、小児の年齢は、０〜１２歳である。神経学的および行動異常の非限定的な例には、手の握り、アイコンタクトの欠如、頭部成長の遅れ、発作、反復運動、言語の減少または喪失、手すり、拍手、タッピング、ランダムな把持および解放、呼吸異常、社会的相互作用の減少または喪失、コミュニケーションスキルの社会的相互作用の減少または喪失、不安定な歩行、失行、運動障害、筋力低下、硬直、痙縮、精神運動遅延、全身性筋緊張低下、アイコンタクトの不良、手口ステレオタイプ、斜視、および顔の二形性が含まれる。若年発症神経学的疾患の非限定的な例には、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、知的発達障害（ＩＤＤ）、てんかん、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全症候群（ＭＣＨＳ）、および結節性硬化症が含まれる。いくつかの例では、ＩＤＤは、自閉症自体を含むＡＳＤに該当する状態を含む。自閉症スペクトラム障害には、自閉症、アスペルガー症候群、およびレット症候群が含まれるがこれらに限定されない。若年発症神経学的疾患と考えられ得る追加の状態には、注意欠陥障害、注意欠陥多動性障害、広汎性発達障害、および強迫性障害が含まれる。いくつかの例では、若年発症神経学的疾患は、病気／感染、頭部外傷、または毒性によって引き起こされる脳損傷によるものである。
【００１２】
本明細書に開示される治療方法は、シナプス可塑性の回復をもたらし、Ｅ／Ｉ不均衡を改善し得る。本明細書に開示される治療方法は、神経細胞の損失の予防をもたらし得る。本明細書に開示される治療方法は、シナプスマーカの増加をもたらし得る。本明細書に開示される治療方法は、長期増強（ＬＴＰ）をもたらし得る。本明細書に開示される治療方法は、神経細胞数の増加をもたらし得る。本明細書に開示される治療方法は、Ｅ／Ｉ不均衡の修正をもたらし得る。本明細書に開示される治療方法は、自閉症／ＭＣＨＳ様行動障害の改善をもたらし得る。本明細書に開示される治療方法は、抑制性介在神経細胞／パルブアルブミン（ＰＶ）＋シナプスの増加をもたらし得る。本明細書に開示される治療方法は、ＶＧＡＴおよび／またはＶＧＬＵＴ２レベルの正常化をもたらし得る。本明細書に開示される治療方法は、ＶＧＬＵＴ１のＶＧＡＴに対する比率、ＶＧＬＵＴ２のＶＧＡＴに対する比率、またはそれらの組み合わせの正常化をもたらし得る。本明細書に開示される治療方法は、アポトーシス神経細胞を回復し得る。本明細書に開示される治療方法は、対象の脳において観察されるアポトーシス性神経細胞の数を減少させ得る。本明細書に開示される治療方法は、認知障害の低減または防止をもたらし得る。本明細書に開示される治療方法は、反復的な行動の低減または防止をもたらし得る。本明細書に開示される治療方法は、社会的相互作用の障害の低減または防止をもたらし得る。本明細書に開示される治療方法は、不安の低減または防止をもたらし得る。本明細書に開示される治療方法は、異常な運動行動の低減または防止をもたらし得る。本明細書に開示される治療方法は、手の握りを低減または防止し得る。本明細書に開示される治療方法は、異常な社会的行動を低減または防止し得る。本明細書に開示される治療方法は、記憶を改善し得る。本明細書に開示される治療方法は、学習を改善し得る。
【００１３】
いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を有する対象を治療することを含む。ＡＳＤに該当する対象には、自閉症、アスペルガー症候群、および特に指定のない広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）、ならびに小児崩壊性障害と診断された対象が含まれる。これらの対象は、社会的コミュニケーションおよび相互作用に困難を示す。また、反復的な行動を示す場合がある。ＡＳＤの診断は、精神障害の最新の診断および統計マニュアルおよび／または疾病および関連する健康問題（ＩＣＤ）の国際統計分類に公開されている基準に基づいて行うことができる。開業医は、自閉症診断面接改訂版および自閉症診断観察スケジュールなどの評価を実施することができる。てんかん、結節性硬化症（非悪性腫瘍）、不安、うつ病、統合失調症、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、および感覚処理障害などの他の状態が、ＡＳＤと併存することが多い。本明細書に開示される方法は、ＡＳＤの重症度またはＡＳＤと併存する状態を評価することを含み得る。方法は、本明細書に開示される化合物を対象に送達する前に、ＡＳＤの１つ以上の症状またはＡＳＤと併存する状態の存在および／または重症度を評価することを含み得る。方法は、本明細書に開示される化合物を対象に送達した後に、ＡＳＤの１つ以上の症状またはＡＳＤと併存する状態の存在および／または重症度を評価することを含み得る。本明細書に開示される方法は、ＡＳＤまたはＡＳＤと併存する状態の１つ以上の症状の重症度を低下させる可能性がある。いくつかの例では、方法は、本明細書に開示される化合物を、ＡＳＤを有する対象に送達することと、発話および言語療法ならびに作業療法などの行動療法を対象に提供することと、を含む。
【００１４】
いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、知的発達障害（ＩＤＤ）を有する対象を治療することを含む。ＩＤＤは、対象の身体的、認知的、および／または感情的な発達に影響を与える状態である。ＩＤＤを有する対象は、学習、推論、問題解決、および／または社交の困難を有し得る。ＩＤＤを有する対象は、１つ以上の行動障害、発話障害、言語の問題、発作、および身体障害を示し得る。ＩＤＤを有する対象は、視力の障害を有し得る。ＩＤＤを有する対象は、聴覚の障害を有し得る。ＩＤＤを有する患者は、代謝障害を有し得る。いくつかの例では、これらの問題は、年齢と共に悪化する。ＩＤＤまたはＩＤＤに関連する状態の例には、脳性麻痺、ダウン症候群、脆弱Ｘ症候群、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、および先天性甲状腺機能低下症が含まれるがこれらに限定されない。本明細書に開示される方法は、ＩＤＤの重症度またはＩＤＤと併存する状態を評価することを含み得る。方法は、本明細書に開示されている化合物を対象に送達する前に、ＩＤＤの１つ以上の症状の存在および／または重症度を評価することを含み得る。方法は、本明細書に開示される化合物を対象に送達した後に、ＩＤＤの１つ以上の症状の存在および／または重症度を評価することを含み得る。本明細書に開示される方法は、ＩＤＤの１つ以上の症状の重症度を低減し得る。いくつかの例では、方法は、本明細書に開示される化合物を対象に送達することと、発話および言語療法ならびに作業療法などのＩＤＤを有する対象に行動療法を提供することと、を含む。
【００１５】
いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、てんかんを有する対象を治療することを含む。てんかんは、てんかん発作によって特徴づけられる様々な神経障害を記載するための用語である。これらの発作は、脳の過剰な活動および／または異常な活動によって引き起こされると考えられている。多くの場合、発作は、投薬、手術、神経刺激、食事制限、またはそれらの組み合わせにより制御され得る。方法は、投薬、手術、神経刺激、食事制限、またはそれらの組み合わせと組み合わせて、本明細書に開示される１つ以上の化合物を、てんかんを有する対象に送達することを含み得る。方法は、本明細書に開示される化合物を対象に送達する前に、対象の発作の存在および／または重症度を評価することを含み得る。方法は、本明細書に開示される化合物を対象に送達した後に、対象の発作の存在および／または重症度を評価することを含み得る。本明細書に開示される方法は、対象の発作の重症度の低減をもたらし得る。本明細書に開示される方法は、対象の発作の発生回数の低減をもたらし得る。本明細書に開示される方法は、対象の発作の頻度の低減をもたらし得る。本明細書に開示される方法は、対象の発作の持続時間の低減をもたらし得る。
【００１６】
いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、レット症候群を有する対象を治療することを含む。レット症候群は、言語および協調の問題、ならびに反復運動を特徴とする神経障害である。いくつかの例では、レット症候群を有する対象は、発作、脊柱側弯症、および睡眠障害を有する。他の症状には、頭部成長の低下（４歳未満）、手の制御の低下または喪失、言語の低下または喪失、手すり、拍手、タッピング、ランダムな把持および解放、呼吸異常、社会的相互作用の減少または喪失、コミュニケーションスキルの社会的相互作用の減少または喪失、不安定な歩行、失行、運動障害、筋力低下、硬直、および痙縮が含まれる。方法は、睡眠補助薬、選択的セロトニン再取り込み阻害薬、抗精神病薬、およびベータ遮断薬、ならびにそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、レット症候群の治療に使用される薬品と組み合わせて、本明細書に開示される１つ以上の化合物をレット症候群の対象に送達することを含み得る。方法は、本明細書に開示される化合物を、レット症候群を有する対象に送達する前に、対象の症状の存在および／または重症度を評価することを含み得る。方法は、本明細書に開示される化合物を、レット症候群を有する対象に送達した後に、対象の症状の存在および／または重症度を評価することを含み得る。本明細書に開示される方法は、レット症候群の症状を有する対象の症状のうちの１つ以上の重症度の低減をもたらし得る。本明細書に開示される方法は、レット症候群の症状を有する対象の症状のうちの１つ以上の緩和をもたらし得る。
【００１７】
いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、結節性硬化症を有する対象を治療することを含む。結節性硬化症（ＴＳＣ）は、ＴＳＣ１またはＴＳＣ２遺伝子におけるヘテロ接合変異によって引き起こされる常染色体優性疾患である。ＴＳＣは、神経学的、認知的、および行動障害に関連づけられることが多い。ＴＳＣ患者は、不安および気分障害との併存疾患を発現する場合がある。ＴＳＣ関連の神経学的症状には、過剰なグルタミン酸作動性活動およびシナプスの脊椎構造の変化が伴う場合がある。結節性硬化症は、典型的に良性腫瘍を特徴とする状態である。これらの腫瘍は、脳、心臓、腎臓、肝臓、目、肺、皮膚などの臓器に現れることがある。症状には、ＡＳＤの徴候、発作、認知障害、行動異常（例えば、攻撃性、注意欠陥多動性障害、強迫性障害、自傷）、皮膚疾患、肺疾患、および腎疾患が含まれるがこれらに限定されない。この疾患に対する治療の選択肢はほとんどないが、エベロリムスは、脳および腎臓における腫瘍の治療薬として承認されている。方法は、エベロリムス、神経外科的介入、またはそれらの組み合わせと組み合わせて、本明細書に開示される１つ以上の化合物を、結節性硬化症を有する対象に送達することを含み得る。方法は、本明細書に開示される化合物を、結節性硬化症を有する対象に送達する前に、対象の症状の存在および／または重症度を評価することを含み得る。方法は、本明細書に開示される化合物を結節性硬化症の対象に送達した後に、対象の症状の存在および／または重症度を評価することを含み得る。本明細書に開示される方法は、結節性硬化症の症状を有する対象の症状のうちの１つ以上の重症度の低減をもたらし得る。本明細書に開示される方法は、結節性硬化症の症状を有する対象の症状のうちの１つ以上の緩和をもたらし得る。
【００１８】
いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全を有する対象を治療することを含む。ＭＥＦ２Ｃハプロ不全症候群（ＭＣＨＳ）は、知的障害、自閉症の特徴、てんかん、および異常な運動に関連する神経発達障害である。症状には、精神運動遅延、全身性筋緊張低下、アイコンタクト不良、手口のステレオタイプ、斜視、および軽度の顔の二形性が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの症状は、脳における正常な電気活動の興奮性と抑制性との比（Ｅ／Ｉ比）の変化に起因する場合がある。本明細書に開示される方法は、Ｅ／Ｉ比を正常範囲（例えば、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全のない人のもの）に向かって回復させることと、ＡＳＤの徴候を改善することと、を含み得る。方法は、本明細書に開示される化合物を、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全を有する対象に送達する前に、対象の症状の存在および／または重症度を評価することを含み得る。方法は、本明細書に開示される化合物を、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全を有する対象に送達した後に、対象の症状の存在および／または重症度を評価することを含み得る。本明細書に開示される方法は、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全の症状を有する対象の症状のうちの１つ以上の重症度の低減をもたらし得る。本明細書に開示される方法は、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全の症状を有する対象の症状のうちの１つ以上の緩和をもたらし得る。
【００１９】
いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、対象を治療することを含み、対象は、小児である。小児は、約１４歳未満、約１３歳未満、約１２歳未満、または約１０歳未満であり得る。いくつかの例では、対象は、１歳超、２歳超、３歳超、４歳超、または５歳超である。
【００２０】
本明細書に開示される方法は、治療対象を選択することを含み得る。いくつかの例では、対象は、対象における遺伝子の発現に基づいて選択される。いくつかの例では、対象は、対象における遺伝子の配列に基づいて選択される。いくつかの例では、対象は、対象の遺伝子の変異に基づいて選択される。変異は、欠失変異であり得る。欠失変異は、ハプロ不全（例えば、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全）であり得る。変異は、フレームシフト変異であり得る。変異は、一塩基多型であり得る。いくつかの例では、対象は、遺伝子によってコードされるタンパク質の対象の発現に基づいて選択される。いくつかの例では、対象は、遺伝子によってコードされるタンパク質の活性に基づいて選択される。遺伝子は、筋細胞エンハンサ因子２Ｃ（ＭＥＦ２Ｃ）をコードするＭＥＦ２Ｃであり得る。遺伝子は、小胞性γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）輸送体（ＶＧＡＴ）をコードするＳＬＣ３２Ａ１であり得る。遺伝子は、小胞性グルタミン酸輸送体２（ＶＧＬＵＴ２）をコードするＳＬＣ１７Ａ６であり得る。遺伝子は、主要なシナプス小胞タンパク質ｐ３８としても知られる、タンパク質シナプトフィシンをコードするＳＹＰであり得る。遺伝子は、グルタミン酸デカルボキシラーゼをコードするＧＡＤ６５であり得る。
【００２１】
方法は、本明細書に開示される遺伝子の発現レベルを得ることを含み得る。方法は、本明細書に開示されるタンパク質の発現レベルを得ることを含み得る。方法は、本明細書に開示されるタンパク質の活性に関する情報を得ることを含み得る。方法は、本明細書に開示される遺伝子の発現レベルを分析することを含み得る。方法は、本明細書に開示されるタンパク質の発現レベルを分析することを含み得る。方法は、本明細書に開示されるタンパク質の活性に関する情報を分析することを含み得る。方法は、本明細書に開示される遺伝子の発現レベルを定量化することを含み得る。方法は、本明細書に開示されるタンパク質の発現レベルを定量化することを含み得る。方法は、本明細書に開示されるタンパク質の活性に関する情報を定量化することを含み得る。遺伝子およびタンパク質の発現および活性をそれぞれ定量化および分析することは、当該技術分野でよく知られている。遺伝子発現の定量化および分析の非限定的な例は、ｑ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、配列決定、およびノーザンブロットである。方法は、対立遺伝子特異的発現を分析することを含み得る。タンパク質の発現および活性の定量化および分析の非限定的な例は、免疫組織化学、ウエスタンブロット、免疫沈降、フローサイトメトリ、免疫蛍光、およびそれらの組み合わせである。方法は、本明細書に開示されている遺伝子の配列決定を含み得る。
【００２２】
方法は、本明細書に開示される遺伝子の発現レベルを得ることを含み得、ここで、発現レベルは、対象の細胞の発現レベルである。方法は、対象から細胞を得ることを含み得る。方法は、対象から細胞を単離することを含み得る。細胞は、脳細胞であり得る。細胞は、循環細胞であり得る。細胞は、脳脊髄液中を循環する細胞であり得る。細胞は、血球であり得る。細胞は、皮膚細胞であり得る。細胞は、上皮細胞であり得る。細胞は、患者の皮膚生検に由来し、神経細胞または他の脳細胞（例えば、星状細胞、乏突起膠細胞、およびミクログリア）に分化し、二次元（２Ｄ）培養システムまたは３Ｄ脳オルガノイドにおいてアッセイされたヒト誘導多能性幹細胞であり、生体外で生成され、よって「ディシュ内の病気」をモデル化することができる小さな脳様構造であり得る。
【００２３】
遺伝子の発現レベルを得ることは、対象から無細胞核酸を単離することを含み得る。無細胞核酸は、ＲＮＡを含み得る。無細胞核酸は、メッセンジャＲＮＡを含み得る。無細胞核酸は、本質的にメッセンジャＲＮＡからなり得る。無細胞核酸は、ＤＮＡを含み得る。ＤＮＡは、メチル化ＤＮＡであり得る。遺伝子の発現レベルを得ることは、対象から無細胞核酸を単離することを含み得る。無細胞核酸は、循環する無細胞核酸であり得る。方法は、対象から試料を得ることを含み得、ここで、試料は、無細胞核酸を含有する。このような試料の非限定的な例は、全血、血漿、血清、尿、脳脊髄液、および唾液である。
【００２４】
本明細書に開示される方法は、対象、またはその細胞、またはその生体液におけるＳＬＣ３２Ａ１の発現レベルを定量化することを含み得る。対象は、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全を有し得る。対象は、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全を有しない場合がある。対象は、ＭＥＦ２Ｃ遺伝子の２つのコピーを有する複数の対照対象の平均レベルと比較して、有意に低下したＳＬＣ３２Ａ１発現レベルを有し得る。対象は、神経障害の兆候または症状を示さない複数の対照対象の平均レベルと比較して、有意に低下したＳＬＣ３２Ａ１発現レベルを有し得る。対象は、本明細書に開示される神経障害の兆候または症状を示さない複数の対照対象の平均レベルと比較して、有意に低下したＳＬＣ３２Ａ１発現レベルを有し得る。有意に低下したとは、少なくとも約１０％の低下、少なくとも約２０％の低下、少なくとも約３０％の低下、少なくとも約４０％の低下、少なくとも約５０％の低下、少なくとも約７５％の低下、または約１００％の低下であり得る。
【００２５】
本明細書に開示される方法は、対象、またはその細胞、またはその生体液におけるＳＬＣ１７Ａ６の発現レベルを定量化することを含み得る。対象は、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全を有し得る。対象は、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全を有しない場合がある。対象は、ＭＥＦ２Ｃ遺伝子の２つのコピーを有する複数の対照対象の平均レベルと比較して、有意に増加したＳＬＣ１７Ａ６発現レベルを有し得る。対象は、神経障害の兆候または症状を示さない複数の対照対象の平均レベルと比較して、有意に増加したＳＬＣ１７Ａ６発現レベルを有し得る。対象は、本明細書に開示される神経障害の兆候または症状を示さない複数の対照対象の平均のレベルと比較して、有意に増加したＳＬＣ１７Ａ６発現レベルを有し得る。有意に増加したとは、少なくとも約１０％の増加、少なくとも約２０％の増加、少なくとも約３０％の増加、少なくとも約４０％の増加、少なくとも約５０％の増加、少なくとも約７５％の増加、または約１００％であり得る。
【００２６】
本明細書に開示される方法は、対象、またはその細胞、またはその生体液における、シナプス前タンパク質であるシナプトフィシン（ＳＹＰ）の発現レベルを定量化することを含み得る。対象は、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全を有し得る。対象は、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全を有しない場合がある。対象は、ＭＥＦ２Ｃ遺伝子の２つのコピーを有する複数の対照対象の平均レベルと比較して、有意に低下したＳＹＰ発現レベルを有し得る。対象は、神経障害の兆候または症状を示さない複数の対照対象の平均レベルと比較して、有意に低下したＳＹＰ発現レベルを有し得る。対象は、本明細書に開示される神経障害の兆候または症状を示さない複数の対照対象の平均のレベルと比較して、有意に低下したＳＹＰ発現レベルを有し得る。有意に低下したとは、少なくとも約１０％の低下、少なくとも約２０％の低下、少なくとも約３０％の低下、少なくとも約４０％の低下、少なくとも約５０％の低下、少なくとも約７５％の低下、または約１００％の低下であり得る。
【００２７】
本明細書に開示される方法は、対象、またはその細胞、またはその生体液におけるＧＡＤ６５の発現レベルを定量化することを含み得る。対象は、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全を有し得る。対象は、ＭＥＦ２Ｃハプロ不全を有しない場合がある。対象は、ＭＥＦ２Ｃ遺伝子の２つのコピーを有する複数の対照対象の平均レベルと比較して、有意に低下したＧＡＤ６５発現レベルを有し得る。対象は、神経障害の兆候または症状を示さない複数の対照対象の平均レベルと比較して、有意に低下したＧＡＤ６５発現レベルを有し得る。対象は、本明細書に開示される神経障害の兆候または症状を示さない複数の対照対象の平均レベルと比較して、有意に低下したＧＡＤ６５発現レベルを有し得る。有意に低下したとは、少なくとも約１０％の低下、少なくとも約２０％の低下、少なくとも約３０％の低下、少なくとも約４０％の低下、少なくとも約５０％の低下、少なくとも約７５％の低下、または約１００％の低下であり得る。
化合物
【００２８】
式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩による自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、知的発達障害（ＩＤＤ）、てんかん、レット症候群、および／または結節性硬化症の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、
【化４】
2020530033.tif 000006
式Ｉ
式中、
各Ｒ１は、−ＣＨ３および−ＣＨ２ＣＨ３から独立して選択され、
Ｒ２は、水素および−ＯＮＯ２から選択される、方法を本明細書に開示する。
【００２９】
式Ｉの化合物、またはその医薬的に許容可能な塩のいくつかの実施形態では、Ｒ２は、水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、−ＯＮＯ２である。
【００３０】
式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩のいくつかの実施形態では、各Ｒ１は、異なる。いくつかの実施形態では、各Ｒ１は、同じである。いくつかの実施形態では、各Ｒ１は、−ＣＨ３である。いくつかの実施形態では、各Ｒ１は、−ＣＨ２ＣＨ３である。
【００３１】
式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩のいくつかの実施形態では、各Ｒ１は、−ＣＨ２ＣＨ３であり、Ｒ２は、−ＯＮＯ２である。
【００３２】
また、式ＩＩの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩による他の形態の自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、知的発達障害（ＩＤＤ）、てんかん、レット症候群、および／または結節性硬化症の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、
【化５】
2020530033.tif 000007
式ＩＩ
式中、
各Ｒ１は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールから独立して選択され、
Ｒ２は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、および−ＯＮＯ２から選択され、
Ｒ３およびＲ４は各々、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルから独立して選択されるか、
または、Ｒ３およびＲ４が、それらが結合している窒素原子と一緒になって、ヘテロシクロアルキルを形成する、方法を本明細書に開示する。
【００３３】
式ＩＩの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩のいくつかの実施形態では、Ｒ３およびＲ４は、水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、およびｔ−ブチルから独立して選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ３およびＲ４は、水素およびメチルから独立して選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ３およびＲ４は、同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ３とＲ４は、異なる。いくつかの実施形態では、Ｒ３およびＲ４は、水素である。
【００３４】
式ＩＩの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩のいくつかの実施形態では、Ｒ３およびＲ４は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、ヘテロシクロアルキルを形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ３およびＲ４は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、単環式ヘテロシクロアルキルを形成する。
【００３５】
式ＩＩの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩のいくつかの実施形態では、Ｒ２は、水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、−ＯＮＯ２である。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、水素または−ＯＮＯ２である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、式ＩＩの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩は、式ＩＩＩの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩である。
【化６】
2020530033.tif 000008
式ＩＩＩ．
【００３７】
式ＩＩまたは式ＩＩＩ、またはその薬学的に許容可能な塩の化合物のいくつかの実施形態では、各Ｒ１は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、およびアリールから独立して選択される。いくつかの実施形態では、各Ｒ１は、水素およびＣ１−Ｃ６アルキルから独立して選択される。いくつかの実施形態では、各Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキルから独立して選択される。いくつかの実施形態では、各Ｒ１は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、およびｔ−ブチルから独立して選択される。いくつかの実施形態では、各Ｒ１は、メチル、エチル、およびｎ−プロピルから独立して選択される。いくつかの実施形態では、各Ｒ１は、メチルおよびエチルから独立して選択される。いくつかの実施形態では、各Ｒ１は、同じである。いくつかの実施形態では、各Ｒ１は、異なる。いくつかの実施形態では、各Ｒ１は、メチルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ１は、エチルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ１は、ｎ−プロピルである。
製剤
【００３８】
方法は、本明細書に開示される約１ｍｇ〜約２５ｍｇの用量の化合物を対象に送達することを含み得る。方法は、本明細書に開示される約１ｍｇ〜約２０ｍｇの用量の化合物を対象に送達することを含み得る。方法は、本明細書に開示される約１ｍｇ〜約５ｍｇの用量の化合物を対象に送達することを含み得る。方法は、本明細書に開示される約５ｍｇ〜約１０ｍｇの用量の化合物を対象に送達することを含み得る。方法は、本明細書に開示される約１０ｍｇ〜約１５ｍｇの用量の化合物を対象に送達することを含み得る。方法は、本明細書に開示される約１５ｍｇ〜約２０ｍｇの用量の化合物を対象に送達することを含み得る。方法は、本明細書に開示される約１ｍｇ〜約１０ｍｇの用量の化合物を対象に送達することを含み得る。方法は、本明細書に開示される約１０ｍｇ〜約２０ｍｇの用量の化合物を対象に送達することを含み得る。小児（小児患者）に対して１日あたり１〜５ｍｇの用量の化合物で十分であり得る。用量は、分割用量で１日あたり最大約２０ｍｇまで許容可能であるため、ゆっくりと増加させることができる。用量は、１週間以上かけてゆっくりと増加させることができる。
【００３９】
方法は、本明細書に開示される用量の化合物を１日１回送達することを含み得る。方法は、本明細書に開示される用量を１日１回送達することを含み得る。方法は、本明細書に開示される用量を１日２回送達することを含み得る。方法は、日中の第１の時点で第１の用量を送達し、日中の第２の時点で第２の用量を送達することを含み得る。第１の用量および第２の用量は、同じであり得る。第１の用量および第２の用量は、異なり得る。
【００４０】
本明細書に開示される方法は、本明細書に開示される化合物の日用量を経時的に増加させることを含み得る。例えば、方法は、本明細書に開示される少なくとも１つの化合物を第１週に第１の用量で送達することと、少なくとも１つの化合物を第２の週に第２の用量で送達することと、を含み得る。いくつかの例では、第２の用量は、第１の用量よりも多くなる。いくつかの例では、第２の用量は、第１の用量未満である。
【００４１】
本明細書に開示される方法は、本明細書に開示される少なくとも１つの化合物を対象に経口的に送達することを含み得る。化合物は、錠剤またはカプセルを介して経口的に送達され得る。化合物は、液体溶液として経口的に送達され得る。液体溶液を、飲み込む場合がある。液体溶液は、スポイトまたはピペットを介して送達され得る。代替的または追加的に、送達は、化合物の注射（非経口投与）、化合物の局所投与、化合物の吸入、化合物の脳への経鼻投与、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【００４２】
本明細書に開示される方法は、本明細書に開示される少なくとも１つの化合物を含む医薬組成物を送達することを含み得る。医薬組成物は、薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤、担体、またはそれらの組み合わせを含み得る。本明細書で使用される「薬学的に許容可能な」という用語は、本明細書に記載の化合物の生物活性または特性を無効にせず、比較的非毒性である材料を指す（すなわち、材料の毒性は、材料の利益を著しく上回る）。いくつかの例では、薬学的に許容可能な材料は、重大な望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含有される組成物の成分のうちのいずれかと有害な方法で有意に相互作用することなく、個体に投与され得る。
【００４３】
本明細書の医薬組成物は、薬学的に使用される製剤への活性薬剤の加工を促進する賦形剤および補助剤を含む１つ以上の生理学的に許容可能な担体を使用して製剤化することができる。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。医薬組成物の要約は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）、Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １９７５、Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０、およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９９）において見られる。
【００４４】
本明細書に開示される医薬組成物は、薬学的に許容可能な希釈剤（複数可）、賦形剤（複数可）、または担体（複数可）を含み得る。医薬組成物は、他の医療薬剤または医薬品、担体、保存剤、安定剤、湿潤剤、または乳化剤などのアジュバント、溶液促進剤、浸透圧を調節するための塩、および／または緩衝剤を含み得る。加えて、医薬組成物は、他の治療的に価値のある物質も含有する。
【００４５】
本明細書に開示される医薬組成物は、非経口（静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、血管内、くも膜下、硝子体内、注入、または局所）、局所、経口、または経鼻投与を含むがこれらに限定されない、任意の好適な投与経路によって対象に投与され得る。
【００４６】
筋肉内、皮下、腫瘍周囲、または静脈内注射に好適な製剤には、生理学的に許容可能な無菌の水性または非水性溶液、分散液、懸濁液、またはエマルジョン、および無菌の注射可能な溶液または分散液に再構成するための無菌の粉末が含まれ得る。水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、クレモホールなど）、それらの好適な混合物、植物油（オリーブ油など）、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルを含む、好適な水性および非水性担体、希釈剤、溶媒、またはビヒクルの例。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合は必要な粒子径の維持、および界面活性剤の使用によって維持される。皮下注射に好適な製剤には、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および調剤などの任意選択的な添加剤も含有される。
【００４７】
静脈内注射について、活性剤は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水緩衝液などの生理学的に適合性のある緩衝液で任意選択的に製剤化することができる。
【００４８】
非経口注射は、任意選択的に、ボーラス注射または持続注入を伴う。注射用製剤は、任意選択的に、保存剤を加えたアンプルまたは複数用量用容器などの単位剤形で提示される。本明細書に記載の医薬組成物は、油性または水性ビヒクル中の無菌懸濁液、溶液、またはエマルジョンとして非経口注射に好適な形態であり得、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの製剤化剤を含有し得る。非経口投与用の医薬製剤には、水溶性形態の活性薬剤の水溶液が含まれる。さらに、懸濁液は、任意選択的に、適切な油性注射懸濁液として調製される。
【実施例】
【００４９】
以下の例示的な例は、本明細書に記載のソフトウェアアプリケーション、システム、および方法の実施形態の代表例であり、いかなる方法でも限定することを意図しない。
実施例１  Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスは、ＭＣＨＳ様行動を示し、生存率を低減する
【００５０】
ＭＥＦ２Ｃタンパク質の発現は、図２の野生型（ＷＴ）同腹仔よりもＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいて有意に低く（Ｐ＜０．０１）、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいて、有意な数の早期死亡が観察された（図３Ａ）。ＷＴ親およびＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔ親との間の交配からの生存可能な動物の数を数えた。ＷＴおよびＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔの子孫の数は、胎生期（Ｅ）１８（それぞれ２８対２３）でほぼ等しかったが、生存しているＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔのＷＴマウスに対する比率は、生後日（Ｐ）２１および９０日までに、それぞれ、４４％および４０％であった。Ｅ１８と成人との間の生存率の差は、有意であった（カイ２乗でＰ＜０．０５）。生存率の減少に加えて、生後３か月まで生存したＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスは、それらのＷＴ同等物と比較して、体重の減少（約１４％）を示した（ＷＴについて３１．９±１．０ｇｍ対Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔについて２７．４±０．８ｇｍ、スチューデントのｔ検定でＰ＜０．００１）。
【００５１】
成体のＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスがＭＣＨＳ様表現型を示すかどうかを判定するために、オスのＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスとそれらのＷＴ同腹仔（≧３か月齢）で行動試験を行った。認知障害を示すヒト患者と同様に、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスは、空間学習および記憶機能を測定する試験であるバーンズ迷路における成績が低かった。Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスは、訓練セッション中に脱出トンネルを見つけるのに有意に長い時間を要した（図３Ｂ）。その後のプローブ試験では、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスではなくＷＴマウスが、反対側の象限と比較して、標的象限に対する選好を示し（図３Ｃ）、これは、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおける空間記憶障害を示唆している。Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスは、異常な足を握る行動（図３Ｄ）および穴ボード探査試験での反復的な頭部突っ込み（図２Ｅ）を含むステレオタイプを示した。総合すると、これらの結果は、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスが、ＭＣＨＳをモデル化した幅広い範囲のＭＣＨＳ様表現型を示すことを示唆している。
実施例２  神経新生およびシナプス機能を調節する遺伝子は、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいて下方制御される
【００５２】
ＭＣＨＳの病因の根底にある分子経路を識別するために、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウス対ＷＴ同腹仔の遺伝子発現をマイクロアレイによって調査した。Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおける３９４の下方制御および３８９の上方制御を含む、海馬における発現レベルが有意に変化した合計７８３個の遺伝子が特定された（図４Ａ、緑線の上）。これらのデータを用いて、ＮｅｘｔＢｉｏ経路分析を使用して、マウスにおけるＭｅｆ２ｃハプロ不全によって下方制御された、神経新生、神経細胞分化、およびシナプス機能についてのバイオグループを含む、上位神経細胞バイオグループを特定した（図４Ｂ）。同時に、神経細胞死の制御のためのバイオグループを上方制御した（図４Ｂ）。マイクロアレイの結果は、３か月齢のマウスから抽出されたＲＮＡを使用したｑＰＣＲによって確認された（図４Ｃ）。ＮｅｘｔＢｉｏ分析と一致して、抑制性シナプス前マーカを表す小胞性γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）輸送体ＶＧＡＴ（Ｓｌｃ３２ａ１によってコードされる）のｍＲＮＡレベルは、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいて有意に低下した。興奮性シナプスマーカを表す小胞性グルタミン酸輸送体１／２（ＶＧＬＵＴ１／２）のｍＲＮＡレベルも調査し、ＶＧＬＵＴ１ではなくＶＧＬＵＴ２のレベルが、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいて有意に増加していることが分かり、これは、これらのマウスにおける興奮性神経伝達および抑制性神経伝達の両方の機能障害を示している。
実施例３．Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおける神経細胞の減少および興奮性／抑制性（Ｅ／Ｉ）シナプス伝達の障害
【００５３】
不偏立体解析学的計数法として光学ディセクタを使用した組織学的実験では、ＮｅｕＮ＋細胞（すなわち、神経細胞）の総数は、海馬（ＷＴ制御値の６９．５±１．６％、スチューデントのｔ検定でＰ＜０．０１）および前頭皮質（ＷＴ制御の７９．８±５．１％、Ｐ＜０．０５）において、ＷＴと比較して、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいて有意に減少した（図５Ａ、図５Ｂ）。ＮｅｕＮ＋細胞とは対照的に、グリア線維酸タンパク質（ＧＦＡＰ）＋細胞の数は、海馬（ＷＴ制御の１２３．０±６．８％、Ｐ＜０．０１）および前頭皮質（ＷＴ制御の１３５．１６±１１．７０％、Ｐ＜０．０５）の両方において、ＷＴと比較して、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいて有意に増加した（図５Ｃ、図５Ｄ）。
【００５４】
Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔ脳およびＷＴ脳の両方においてゴルジ染色を行って、３Ｄモンタージュ画像上でＮｅｕｒｏｌｕｃｉｄａソフトウェアを使用して、大脳皮質のＶ層における錐体細胞の樹状分岐パターンを判定した（図５Ｅ）。Ｓｈｏｌｌ分析は、樹状相互作用の減少（図５Ｆ）、総樹状長さの減少（図５Ｇ）によって実証されるように、ＭＥＦ２ｃ−ｈｅｔ神経細胞の樹状突起の複雑さが著しく減少したことを示した。
【００５５】
神経細胞数の減少をさらに説明するために、ＭＥＦ２Ｃ欠乏によって媒介される胚性神経新生の既知の減少に加えて、２〜３か月齢のＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの歯状回（ＤＧ）の顆粒下ゾーン（ＳＧＺ）において、成人の神経新生が特徴づけられ、増殖細胞（ＰＣＮＡ＋、図６Ａ、図６Ｂ）および発達中の神経細胞の数の両方の減少が観察された（ＤＣＸ＋、図６Ａ、図６Ｃ）。ＤＧでは、ＢｒｄＵ標識ＮｅｕＮ＋細胞の数も減少した（図６Ｄ、図６Ｅ）。これらの結果は、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの成体神経新生の減少が神経細胞の減少に寄与することを示唆している。さらに、ｍＣｈｅｒｒｙのレトロウイルス媒介遺伝子伝達を介して視覚化された、新たに形成された神経細胞の発達および複雑さも、体細胞サイズおよび樹状突起長の減少によって示されるように、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔ  ＤＧにおいて減少した（図６Ｆ〜Ｉ）。したがって、Ｍｅｆ２ｃハプロ不全は、神経細胞数の減少、成体の神経新生の障害、およびマウスの樹状突起の複雑性の減少をもたらす。
【００５６】
その後、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスのシナプスを調査した。シナプスタンパク質の変化を予測するマイクロアレイ分析と一致して、定量的共焦点免疫組織化学は、シナプス前マーカであるシナプトフィシン（ＳＹＰ）の発現がＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの海馬において有意に減少することを示した（図７Ａ、図７Ｂ）。シナプス欠損をより明確に定義するために、海馬における定量的な共焦点免疫組織化学によって、支配的な興奮性シナプスタンパク質ＶＧＬＵＴ１および抑制性シナプスタンパク質ＶＧＡＴの発現レベルを調査した（図７Ａ）。ＶＧＬＵＴ１ではなくＶＧＡＴの発現は、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいて有意に減少した（図７Ｂ）。さらに、海馬シナプトソーム濃縮溶解物において免疫ブロット実験を行ったところ、ＶＧＬＵＴ１ではなくＳＹＰおよびＧＡＤ６５（別の抑制性神経細胞マーカ）のレベルが、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいて下方制御されていることが分かった（図８Ａ）。ＶＧＬＵＴ１（興奮性神経細胞）とＧＡＤ６５（抑制性神経細胞）との比率は、Ｅ／Ｉ不均衡の兆候であるＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウス（図８Ｂ）において有意に増加した。さらに、ＶＧＬＵＴ１とは対照的に、ｍＲＮＡの所見と一致して、通常、成人海馬において非常に低いレベルでのみ発現されるＶＧＬＵＴ２タンパク質が、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔ対ＷＴにおいて有意に上方制御された（図８Ｃ）。総合すると、これらの発見は、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔ海馬における異常な興奮性および抑制性シナプスタンパク質の発現を示している。
【００５７】
Ｅ／Ｉマーカ発現におけるこれらの変化が機能的シナプス伝達の異常を伴うかどうかを判定するために、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスおよびＷＴマウスの海馬スライスからの自発的な小型興奮性および抑制性シナプス後電流（ｍＥＰＳＣｓ／ｍＩＰＳＣｓ）を記録した。量子放出の理論から、小型周波数の変化は、シナプス前神経伝達物質の放出またはシナプスの数の変化を反映しているが、小型振幅の変化は、シナプス後機能の変化、例えば、シナプス後受容体の数を表すと考えられる。Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスは、シナプス前ＶＧＡＴ、樹状突起、およびシナプスにおける全体的な減少と一致して、ｍＩＰＳＣ頻度の減少を示した（図７Ｃ、図７Ｇでは、イベント間間隔の増加として現れている）。ｍＩＰＳＣ振幅の減少も観察され（図７Ｃ、図７Ｅ）、これは、おそらく、ＭＥＦ２レベルが特定のＧＡＢＡ受容体サブユニットの発現と相関することが知られているという事実を反映している。興味深いことに、これらのマウスは、脳特異的Ｍｅｆ２ｃ−ＫＯマウスにおけるｍＥＰＳＣ頻度の増加に関する以前の報告と同様に、ｍＥＰＳＣ頻度の増加（イベント間間隔の減少として現れる、図７Ｄ、図７Ｆ）も示した。この結果は、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔ海馬におけるシナプス前ＶＧＬＵＴ２の発現の増加の発見とも一致した。ｍＥＰＳＣ振幅のわずかな減少（図７Ｄ、図７Ｈ）は、ＭＥＦ２が、通常、転写的に、グルタミン酸受容体の発現を上方制御するという事実に関連している。ｍＩＰＳＣおよびｍＥＰＳＣの全体的な変化は、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスのＥ／Ｉ比の上昇をもたらすと予想される。実際、平均ｍＥＰＳＣとｍＩＰＳＣ値との割合によって決定されるように、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスはＷＴマウスと比較して、Ｅ／Ｉ周波数比が１１６．２％増加し、Ｅ／Ｉ振幅比が２５．７％増加したことを示し、機能的なＥ／Ｉ不均衡の存在を確認している。
【００５８】
これらの神経細胞およびシナプスの欠陥が、シナプス可塑性および神経細胞回路に有害な影響を与えるかどうかを判定するために、海馬のＬＴＰを記録した。Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスは、海馬のＣＡ１領域においてＬＴＰの低下を示した（図９Ａ）。ペアパルス促進（ＰＰＦ）は、最初の刺激後のシナプス前末端における残留Ｃａ２＋によって引き起こされる２つのペア刺激のうちの２番目に応答するシナプス前機能の短期増強を表している。例えば、ＰＰＦの減少は、神経伝達物質放出の可能性の増加と関連している。ＷＴマウスと比較して、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔにおけるＰＰＦの統計的な減少が観察され（図９Ｂ）、ｍＥＰＳＣ頻度において観察されたわずかな増加と一致した（図７Ｄ、図７Ｆ）。まとめると、これらの結果は、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスが神経細胞数の減少を示し、抑制性の低下および興奮性シナプス神経伝達の増加と共にシナプス欠損を伴うため、Ｅ／Ｉの不均衡につながることを示している。
実施例４  ニトロシナプシンは、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおける自閉症様行動を回復させる
【００５９】
オスのＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスまたはＷＴマウスを、ニトロシナプシンまたはＰＢＳビヒクルで３か月間治療した。次に、行動、電気生理学、および組織学的分析を行って、この薬物の効果を判定した。重要なことに、ＷＴマウスのニトロシナプシン治療は、モリス水迷路、ＥＰＳＣ、またはＬＴＰに対する影響を示さなかった。
【００６０】
Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスをニトロシナプシンで治療すると、自閉症／ＭＣＨＳ様行動表現型を回復することができるかどうかを判定するために、神経行動試験を使用した。最初に、モリス水迷路を行って、空間学習および記憶に対する効果を試験した（図１０Ａ、図１０Ｂ）。隠されたプラットフォームの訓練セッション中に、ビヒクルで治療されたＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔ（Ｈｅｔ／Ｖ）マウスは、最初の２日間で、ビヒクルで治療されたＷＴ（ＷＴ／Ｖ）マウスよりも隠れたプラットフォームを見つけるのに時間がかかり、空間学習障害を示した（図１０Ａ）。しかしながら、ニトロシナプシン（Ｈｅｔ／Ｎ）で治療されたＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスは、これらの試験中に、ビヒクルと比較して、能力の改善を示した。この改善は、水泳速度自体の増加に起因するものではなく、Ｍｅｆ２ｃヘテロ接合性もニトロシナプシン治療も、水泳速度に影響を与えなかった（図１１）。すべてのグループのマウスが基準に到達してから２４時間（隠されたプラットフォームを見つけるために２０秒）後に、記憶保持を調査するためのプローブ試験を行った。図１０Ｂに示すように、ＷＴ／Ｖマウスは、隠されたプラットフォームが以前に位置していた標的象限で有意に長い時間を過ごすことによって、通常の記憶保持を示した。対照的に、Ｈｅｔ／Ｖマウスは、反対側の象限よりも標的象限への選好を示さないことによって、記憶障害を示した。興味深いことに、Ｈｅｔ／Ｎマウスは、反対象限よりも標的象限において有意に長い時間を過ごし、これは、ニトロシナプシン治療が記憶機能を正常化した兆候である（図１０Ａ、図１０Ｂ）。次に、一般的な自発運動をアッセイするための３０分間の試験であるオープンフィールド試験を行った。Ｈｅｔ／Ｖマウスは、中心活動の増強を示したが（図１０Ｃ）、総活動の増強は示さなかった（図１０Ｄ）。この異常な行動は、ニトロシナプシンによる長期治療によって回復された。薬物はまた、穴ボード探査試験におけるＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの頭部突っ込みの増加の異常な反復的行動を修正した（図１０Ｅ）。さらに、社会的相互作用の行動試験を行った。ＷＴ／Ｖマウスは、類似しているが空のケージのある部屋よりも、見知らぬマウス１（Ｓ１）のいる部屋で有意に長い時間を過ごした（図１０Ｅ）。しかしながら、Ｈｅｔ／Ｖマウスは、どちらの部屋で過ごす時間にも選好を示さず（図１０Ｆ、図１０Ｇ）、これは、社会的能力の障害の兆候である。さらに、Ｈｅｔ／Ｖマウスは、ＷＴ／ＶマウスよりもＳ１への訪問数が有意に少なく、１回の訪問あたりの時間がより短かった（図１０Ｈ、図１０Ｉ）。ニトロシナプシンによる治療は、この異常な社会的行動を改善した。重要なことに、Ｍｅｆ２ｃ  ｈｅｔマウスを、直接比較において等モルメマンチンまたはニトロシナプシンにより治療した最初の実行可能性実験では、これらの行動パラダイムにおけるニトロシナプシンの優位性が実証された（図１２Ａ）。さらに、ニトロシナプシン治療は、ＷＴマウスの社会的行動を有意に変化させなかった（図１３）。
【００６１】
総合すると、これらの結果は、ニトロシナプシンによるＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの長時間治療が、認知障害、反復的な行動、社会的相互作用の障害、およびおそらく不安の変化を有意に改善したことを示している。注目すべきことに、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスは、手足の握りを除いて異常な運動行動を示さなかった（図１４Ａ〜Ｅ）。しかしながら、ニトロシナプシン治療は、手足の握り表現型を改善しなかった（図１４Ｆ）。
実施例５  Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおける神経細胞の損失、Ｅ／Ｉマーカの変化、およびＬＴＰの障害に対するニトロシナプシンの有益な効果
【００６２】
Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの海馬における神経細胞の損失およびＶＧＡＴまたはＶＧＬＵＴ２の発現の変化に対する薬物治療の効果を判定するために、免疫組織化学を行った（図１５Ａ〜Ｇ）。具体的には、光学ディセクタ法を使用した立体解析学によってモニタすると、Ｈｅｔ／Ｎマウスの海馬のＮｅｕＮ＋細胞の総数は、Ｈｅｔ／Ｖマウスよりも有意に多く（図１５Ｂ）、以前の行動におけるニトロシナプシンの効能と一致した。さらに、初期の実現可能性実験では、ＮｅｕＮ＋細胞数においてメマンチンを超えるニトロシナプシンの有意に大きい効果が観察された（図１２Ｂ）。
【００６３】
海馬のＣＡ３領域における、活性カスパーゼ３および末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）に対する神経細胞染色の数は、ＷＴと比較して、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいて有意に増加した（Ｐ＜０．０１２、図１６）ため、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおけるＮｅｕＮ＋細胞の減少は、少なくとも部分的にはアポトーシス細胞の損失によって説明することができる。さらに、活性化されたカスパーゼ３陽性およびＴＵＮＥＬ陽性細胞の数は、Ｈｅｔ／Ｖでは増加したが、Ｈｅｔ／Ｎマウスでは正常に戻った（図１６）。この結果は、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいて観察されたアポトーシス神経細胞が、ニトロシナプシンによって著しく回復されたという考えと一致していた。さらに、ニトロシナプシンによる治療は、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおける星状細胞形態を有するＧＦＡＰ＋細胞の数も正常化した（図１７）。
【００６４】
Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおけるＥ／Ｉマーカの発現の変化に対するニトロシナプシンの効果を、定量的な共焦点免疫組織化学によって判定した。ＶＧＬＵＴ１免疫反応性のレベルは、ニトロシナプシン治療によって変化しなかったが、ＶＧＡＴおよびＶＧＬＵＴ２レベルならびにＶＧＬＵＴ１／ＶＧＡＴまたはＶＧＬＵＴ２／ＶＧＡＴの比率は、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおけるニトロシナプシン治療によって正常化された（図１５Ｃ〜Ｇ）。パルブアルブミン（ＰＶ）を発現するバスケット介在神経細胞およびＰＶ陽性シナプスの両方の数が、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいて有意に減少し（図１８）、一方、ニトロシナプシンはＰＶ＋シナプスを有意に増加させた（面積％）（図１８）。これらの結果は、ニトロシナプシンが、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいてＥ／Ｉ均衡を回復させることを示唆している。最後に、ニトロシナプシンによる長時間治療は、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおける海馬ＬＴＰの障害も有意に回復させた（図１５Ｈ、図１９）。
【００６５】
図１に要約されるように、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスは、ＭＣＨＳ様行動障害を示し、したがって、疾患の病態生理学を研究するためのモデルを表した。Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスは、生存率の低下を示したが、その原因は現在のところ不明である。成人期まで生存したＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスは、神経細胞数およびシナプス障害の減少、特に抑制性および興奮性神経伝達の低下によって引き起こされるＥ／Ｉ不均衡を示す。驚くべきことに、新しい改善されたＮＭＤＡＲ拮抗薬ニトロシナプシンによるＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの治療は、Ｅ／Ｉ不均衡を修正するだけでなく、自閉症／ＭＣＨＳ様行動障害も改善し、よって標的の検証および潜在的な疾患治療を提供する。
【００６６】
本明細書で提供された結果は、ＶＧＡＴがＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの海馬において有意に減少することを示した。この発見と一致して、自発的ｍＩＰＳＣの記録において実証されているように、機能的抑制性シナプス伝達が減少した。さらに、ＶＧＬＵＴ２は、異常に上方制御され、興奮性神経伝達の増加と一致しており、これは、ｍＥＰＳＣ頻度の増加によって実証されている。その結果、機能不全の抑制性および興奮性神経伝達は、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの海馬におけるＥ／Ｉ不均衡に寄与する。驚くべきことに、ニトロシナプシンは、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおける３つのパラメータすべてを有意に改善し、シナプスマーカ、ＬＴＰ、および神経細胞数を増加させた。最も重要なことに、ニトロシナプシンは、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおける自閉症／ＭＣＨＳ様行動を有意に改善した。
実施例６  結節性硬化症のＴＳＣ＋／−マウスモデルにおけるニトロシナプシンの有益な効果
【００６７】
結節性硬化症（ＴＳＣ）は、知的障害、てんかん／電気生理学的障害、および神経行動異常によって明らかにされる常染色体優性障害であり、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の特徴を生成することが多い。この障害は、２つの遺伝子、Ｔｓｃ１またはＴｓｃ２のうちの一方を不活性化するヘテロ接合変異によって引き起こされる。ＴＳＣタンパク質は、ＴＳＣ１／２複合体を形成し、これは、ラパマイシン複合体１（ｍＴＯＲＣ１）の哺乳動物の標的を活性化するＧＴＰアーゼであるＲｈｅｂを阻害する。ｍＴＯＲＣ１は、ｍＲＮＡの翻訳および細胞増殖を刺激し、ＴＳＣ１／２複合体が不活性であるために、この経路が過剰に活性化されると、シナプスでの異常なシグナル伝達、および様々な神経細胞型におけるＡＭＰＡ受容体の異常なサブユニット組成など、ＴＳＣの病理学的特徴が生じる場合がある。１つの重要な病因経路には、ｍＴＯＲの過剰刺激が含まれる。ＴＳＣにおけるｍＴＯＲの過剰活性化により、マクロオートファジーが阻害され、その結果、シナプス棘および行動異常が喪失され、ラパマイシンによるｍＴＯＲの阻害は、これらの表現型を回復させることができる。
【００６８】
この例では、ｅＮＭＤＡＲで強壮活性を優先的に遮断する拮抗薬、特に新薬ニトロシナプシンが、Ｔｓｃ２＋／−（ｈｅｔ）マウス表現型における生物学的かつ統計的に有意な改善を提供することが分かった。これらの研究では、結節性硬化症のＴｓｃ２＋／−マウスモデルを使用した。この改善に伴って、ｐ３８  ＭＡＰＫ−ＴＳＣ−Ｒｈｅｂ−ｍＴＯＲＣ１−Ｓ６Ｋ１経路における活動が修正された（図２０）。Ｔｓｃ２＋／−マウスにおける海馬長期増強（ＬＴＰ）、シナプスの組織学的な喪失、および行動恐怖条件付けにおける欠損はすべて、ニトロシナプシンによる治療後に改善された。総合すると、これらの結果は、過剰なｅＮＭＤＡＲ活動を制限することによる興奮性／抑制性（Ｅ／Ｉ）の不均衡の改善が、ＴＳＣに対する新しい治療アプローチを示し得ることを示唆している。
ニトロシナプシンは、Ｔｓｃ２ヘテロ接合マウスにおける長期海馬可塑性の欠損を回復させる
【００６９】
興奮性入力に応答して誘発されるシナプス可塑性の一形態であり、海馬における学習および記憶の電気的相関を表すと考えられる、長期増強（ＬＴＰ）を調査した。海馬スライスのＣＡ１領域におけるフィールド記録を使用して、この形態のシナプス可塑性に対するＴｓｃ２変異の影響を調査した。この目的のために、生後１か月のマウスからの急性海馬スライスを準備し、人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）を灌流した微小電極アレイ（ＭＥＡ）部屋でフィールド記録を行った。ｆＥＰＳＰ（フィールド興奮性シナプス後電位）を、シャッファー側枝の刺激を介してＬＴＰを誘発した後、ＣＡ１領域において記録した（各１秒間に１００Ｈｚパルスの４回の繰り返し）。ｆＥＰＳＰの初期勾配を分析して、ＬＴＰを評価した。しかしながら、ここで使用されているより強力な誘導プロトコルでは、誘導後６０分でモニタされたＬＴＰの減少が観察された。驚くべきことに、１〜２μＭの、メマンチンではなく、より効果的なｅＮＭＤＡＲ拮抗薬ニトロシナプシンによる４時間の治療が、ビヒクル対照治療と比較して、Ｔｓｃ２＋´−マウスにおけるＬＴＰを改善する（５５〜６５分でＰ＜０．００１）ことが分かった。図２１〜２３に示すように、ニトロシナプシン（別名、ニトロメマンチン）は、シナプス、長期増強（ＬＴＰ）、およびＡＤＤ／ＩＤＤの結節性硬化症複合体（ＴＳＣ）ｈｅｔモデルにおける神経行動を、メマンチンよりも有意に良好な程度に保護した。
Ｔｓｃ２ヘテロ接合マウスのニトロシナプシン治療は、シナプス喪失を減少させる
【００７０】
Ｔｓｃ２＋／−マウスの脳組織学に対するｅＮＭＤＡＲ拮抗薬の効果を判定するために、定量的共焦点免疫組織化学を使用して、ビヒクル、メマンチン、またはニトロシナプシンにより２日半治療された３か月齢の野生型（ＷＴ）およびＴｓｃ２＋／−マウスからの冠状脳スライスを分析した。Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ背景上のＴｓｃ２＋／−マウスに、腹腔内経路を介して、ビヒクルまたは９２μｍｏｌ／ｋｇの負荷用量のメマンチンもしくはニトロシナプシンのいずれかを投与し、続いて、４．６μｍｏｌ／ｋｇの薬剤を、２日半の間１日２回投与し、最後は、行動訓練セッションの３時間前に投与した（合計５回の薬物注射について）。この投与計画により、脳内のＮＭＤＡＲで１〜１０μＭの有効濃度の薬物が得られる。
【００７１】
ＴＳＣの重要な特徴は、シナプスの喪失を伴うと考えられている。重要なことに、ニトロシナプシン（ニトロメマンチン）で治療したＴｓｃ２＋／−マウスは、海馬におけるシナプス前マーカシナプトフィシン（ＳＹ３８）に対する染色が、未治療のヘテロ接合同腹仔よりも有意に多かったのに対し、メマンチンの効果は、統計的に有意ではなかった（図２１Ａおよび２１Ｂを参照されたい）。
【００７２】
追加のマーカ分析には、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、これらの条件下での星状細胞マーカ）、ＮｅｕＮ（神経細胞核および細胞体マーカ）、および微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２、神経細胞樹状突起棘を標識する）が含まれた。海馬の共焦点免疫組織化学画像は、ＷＴ対Ｔｓｃ２＋／−マウスにおけるＮｅｕＮ、ＭＡＰ２、またはＧＦＡＰの発現に差がないことを明らかにした。まとめると、これらの組織学的結果は、シナプスの喪失とは対照的に、海馬における疾患のこの段階で神経細胞／神経線維網の有意な喪失または反応性星状細胞の増加の増加がなかったことを示している。
ニトロシナプシンは、Ｔｓｃ２ヘテロ接合マウスにおける神経行動表現型を改善する
【００７３】
恐怖条件付け試験を、３か月齢のＴＳＣ２＋／＋およびＴＳＣ２＋／＋マウスに対して行い、ＴＳＣ２＋／−マウスにおける不安、ならびに学習および記憶障害に対するｅＮＭＤＡＲ拮抗薬の効果を探査した。ビヒクル、メマンチン、またはニトロシナプシンを２日半の間投与し、最後の用量の薬物は、最初の訓練セッションの３時間前に行った。恐怖条件付け試験（図２３を参照されたい）において、ＷＴ同腹仔マウスは、新しいコンテキスト（Ｐ＝０．０３２）を超える訓練コンテキストで身動き停止時間の有意な増加量を示し、これは、これらの動物が２つの条件を区別することができることを示している。図２３は、恐怖条件付け試験によって評価されたＴｓｃ２＋／−マウスにおけるコンテキスト識別に対するメマンチンまたはニトロシナプシンによる治療の効果を示している。恐怖条件付け試行において、ビヒクル、メマンチン、またはニトロシナプシンで治療した３か月齢のＷＴおよびＴｓｃ２＋／−遺伝子導入マウスの身動き停止時間。試験されたマウスの４つすべてのグループ（ＷＴビヒクル、Ｈｅｔビヒクル、Ｈｅｔメマンチン、およびＨｅｔニトロシナプシン）は、「訓練コンテキスト」および「新規コンテキスト＋キュー」において身動き停止を示し、これは、条件付けられた恐怖反応は遺伝子型または薬物によって影響を受けなかったことを示している。さらに、ＷＴマウスは、訓練コンテキストと新規コンテキストとの間のコンテキスト識別を表示した（＊Ｐ＝０．０３２）。対照的に、ビヒクルまたはメマンチンで治療されたＴｓｃ２＋／−マウスは、この行動において欠陥を示し、訓練コンテキストと新しいコンテキストとの間の識別の欠如（ｎ．ｓ．＝有意差なし）をもたらした。ニトロシナプシン治療は、この表現型を改善し、Ｔｓｃ２＋／−マウスにおけるコンテキスト識別を正常化した（＊＊Ｐ＝０．０２３）。値は、平均＋標準誤差である（グループあたりｎ＝７〜１２匹のマウス）。略語：訓練コンテキスト＝音声キューが先行するショックによりマウスが以前に訓練された訓練環境。新しいコンテキスト＝試験部屋内の新しいフローリングおよび壁。新規コンテキスト＋キュー＝音声キューを備えた新規コンテキスト。
【００７４】
対照的に、Ｔｓｃ２＋／−（ｈｅｔ）マウスは、この形式のコンテキスト識別が欠落していた。驚くべきことに、メマンチンは、この欠陥を緩和することができなかったが、ニトロシナプシンは、Ｔｓｃ２＋／−マウスにおけるコンテキストを正常なＷＴレベルに対して識別する能力を改善した（Ｐ＝０．０２３）。対照として、試験されたマウスの４つすべてのグループ（ＷＴビヒクル、Ｈｅｔビヒクル、Ｈｅｔメマンチン、およびＨｅｔニトロシナプシン）が、新規コンテキストにおいて条件付きキューに対して身動き停止を示し、これは、海馬に依存しない恐怖反応が、遺伝子型または薬物の影響を受けなかったことを示している。
【００７５】
要約すると、ＣＡ１海馬におけるＬＴＰの誘導から約１時間後にモニタされたように、メマンチンではなく、新しい改善された薬物であるニトロシナプシンの短期（４時間）の適用により、シナプス可塑性の欠損を回復させることができた。重要なことに、ニトロシナプシンによる２日半の治療は、シナプトフィジン染色によってモニタされるように、Ｔｓｃ２＋／−マウスの海馬においてモニタされたシナプス喪失を逆転させた。ニトロシナプシンによる２日半の治療は、Ｔｓｃ２＋／−マウスにおけるコンテキスト識別を正常化したが、メマンチンによる治療ではそうならなかった。ニトロシナプシンは、シナプス可塑性の電気生理学的読み出し、シナプスの神経組織学的分析、ならびに不安および記憶の神経行動学的評価において、メマンチンよりも大きな利点を提供した。これらの結果は、生活の質を改善するための努力において、ＴＳＣの神経学的側面に対する潜在的な治療薬としてニトロシナプシンを試験する必要があることを示唆している。
実施例７  レット症候群のＭｅＣＰ２ヌルマウスモデルにおけるニトロシナプシンの有益な効果
【００７６】
図２４に示すように、ニトロシナプシンは、別の型のＡＤＤ／ＩＤＤであるレット症候群のＭｅＣＰ２ノックアウト（ＫＯ）マウスモデルにおける運動行動を改善した（当業者によく知られているロータロッド試験において）。
【００７７】
本出願は、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスが、ヒトＭＣＨＳに対する有用なモデルであることを実証しており、Ｅ／Ｉ不均衡は、ＭＣＨＳの病因においてある役割を果たす可能性がある。適切なＮＭＤＡＲ拮抗薬によるシナプス可塑性の回復および神経細胞損失の防止は、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおける自閉症／ＭＣＨＳ様表現型を回復または改善した。ここでの結果は、ニトロシナプシン（ニトロメマンチンＹＱＷ−０３６またはＮＭＩ−６９７９としても知られている、構造１を参照されたい）の投与による、ヒトＭＣＨＳならびに他の形態のＡＳＤ、ＩＤＤ、およびてんかん（例えば、本明細書に示すような、ＴＳＣおよびレット症候群）の治療を記載している。
実施例８．方法
【００７８】
実施例１〜７は、記載されている以下の方法を用いた。当業者は、以下の説明が例示であり、実施例１〜７で同じまたは類似の結果を得ながらも、些細な変形を行うことができることを理解している。
マウス、薬物治療、および行動試験
【００７９】
Ｍｅｆ２ｃヘテロ接合ノックアウト（Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔ）マウスは、それらのＷＴ同腹仔とＭｅｆ２ｃ（Ｍｅｆ２ｃΔ２）の従来のエキソン２欠失対立遺伝子を保有するマウスを交配することによって作成された。これらのマウスを維持および使用するためのすべての手順は、Ｓａｎｆｏｒｄ  Ｂｕｒｎｈａｍ  Ｐｒｅｂｙｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。この研究では、（薬物治療の有無にかかわらず）均一性を保証するために、行動アッセイについてオスのマウスのみを使用した。メマンチン、ニトロシナプシン（両方とも４．６μｍｏｌ／ｋｇ体重）またはビヒクル（ＰＢＳ）による長時間治療を、約２．５週齢から開始して、少なくとも３か月間、１日２回、腹腔内注射で投与した。この年齢が選択されたのは、マウスがまだ幼いため、治療がヒトと同等の段階で始まる可能性があるためである。薬物治療のこの用量および持続期間は、ニトロシナプシンが神経細胞およびシナプスに対して有意な保護効果を示した、以前の研究に基づいて選択された。
【００８０】
遺伝子型を決定する前に、マウスを、メマンチン、ニトロシナプシン、またはビヒクルグループにランダムに分配した。腹腔内注射および行動試験を行う実験室研究者は、遺伝子型を知らされていなかった。行動試験の後、以下に記載するように、マウスを免疫組織化学または電気生理学のいずれかのために使用し、盲検法で研究した。
自発運動
【００８１】
自発運動は、ケージの底から２ｃｍおよび７ｃｍの位置に、２つのレベルのフォトセルビームを取り付けたフレーム（２５．５×４７ｃｍ）内に置かれたポリカーボネートケージ（４２×２２×２０ｃｍ）において測定された（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。これら２つのビームセットにより、水平（移動）および垂直（後ろ足立ち）の両方の動作を記録することができた。薄い層の寝床材料をケージの底に適用した。マウスは、正確な試験に応じて、３０分間または１２０分間試験された。
手足の握り
【００８２】
手足の握り試験のために、マウスの尾の遠位３分の１でマウスを取り上げ、１０秒間観察した。それらは、前足および／または後足の握りに基づく遺伝子型に関して盲検法で評価された：０−前足の握りなし、１−前足の時々の握り、ならびに３−前足の絶え間ない握りおよび後足の時々の握り。
バーンズ迷路
【００８３】
バーンズ迷路は、直径７５ｃｍの不透明なプレキシガラス製ディスクで構成され、三脚によって床から５８ｃｍ高くなっている。直径５ｃｍの２０個の穴は、周囲から５ｃｍのところに位置し、黒いプレキシガラス脱出ボックス（１９×８×７ｃｍ）は、穴のうちの１つの下に置かれた。迷路の周りに明確な空間的キューが配置され、それらは研究全体を通じて一定に保たれた。試験の初日に、マウスを脱出ボックスに入れて１分間そのままにしておくことからなる訓練セッションを行った。１分後、最初のセッションが開始された。各セッションの開始時に、マウスを、高さ１０ｃｍの円筒形の黒い開始部屋内の迷路の中央に置いた。１０秒後、開始部屋を取り外し、ブザー（８０ｄＢ）およびライト（４００ルクス）をオンにし、マウスは迷路を探査させるため自由にされた。マウスが脱出トンネルに入ったとき、または３分が経過した後、セッションは終了した。マウスが脱出トンネルに入ると、ブザーがオフになり、マウスを１分間暗所に留まらせた。マウスが単独でトンネルに入らなかった場合、マウスを１分間優しく脱出ボックスに入れた。トンネルは常に同じ穴（空間環境内で安定）の下に位置し、各マウスについてランダムに決定された。マウスは、研究の取得部分について１２日間にわたって１日１回試験された。一般に、マウスは、バーンズ迷路をストレスが少ないためモリス水迷路よりも好むことが多いことに留意されたい。しかしながら、げっ歯類はモリス水迷路を使用して他の適応症についてニトロシナプシンで試験されたため、比較のために、ここで薬物試験についても使用された。
モリス水迷路
【００８４】
従来のバージョンのモリス水迷路を使用して、空間参照学習および記憶を試験した。マウスは、直径１４ｃｍのプラットフォームまで泳ぐように訓練され、水面下１．５ｃｍに沈められた。プラットフォームは、泳いでいる間、マウスには見えなかった。マウスが６０秒以内にプラットフォームを見つけることができなかった場合、マウスを手動でプラットフォームに誘導し、１０秒間そこに留まらせた。マウスには、基準に到達するのに必要な日数の間、１日４回の試行が行われた（２０秒未満の平均脱出待ち時間）。最後の訓練試行の２４時間後に、空間訓練の保持を評価した。両方のプローブ試行が、プラットフォームなしのプールにおける６０秒間の自由水泳で構成された。ＡＮＹ−ｍａｚｅビデオトラッキングシステム（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏ．）を使用して、自動分析についてのすべての試行をビデオテープに記録した。
３部屋社会的相互作用
【００８５】
この試験は、もともと、自閉症の動物モデルのためにクローリーグループによって開発された。自閉症の個体は、低レベルの社会的アプローチおよび異常な相互作用を含む、異常な互恵的社会的相互作用を示す。各部屋が２０ｃｍ（長さ）×４０．５ｃｍ（幅）×２２ｃｍ（高さ）の長方形の３部屋プレキシグラスボックスで構成される社会的相互作用装置を使用した。部屋を分割する壁は透明で、小さな半円形の開口部（半径３．５ｃｍ）があり、各部屋にアクセスすることができた。中間の部屋は空で、２つの外側の部屋には小さな丸いワイヤーケージが含まれていた（Ｇａｌａｘｙ  Ｃｕｐ，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ  Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｒｅｅｔｓｂｏｒｏ，ＯＨ）。マウスを装置全体に５分間馴化させた。社会的相互作用を評価するために、今度は見知らぬマウス（ワイヤーケージにつながれた同性のＣ５７ＢＬ／６Ｊ）と共に、マウスを中間の部屋に戻した。見知らぬマウスと一緒に部屋で過ごした時間と、空のワイヤーケージを含む部屋で過ごした時間を、各々５分間記録し、各部屋への進入回数も記録した。実験マウスを１回試験し、見知らぬＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを最大６回の試験に使用した。
穴ボード探査
【００８６】
装置は、プレキシガラス製ケージ（３２×３２×３０ｃｍ）で構成され、高床上に等間隔で４×４（各々直径３ｃｍ）の形式で１６個の穴があった。頭部突っ込みの数および頭部突っ込みに費やされた時間を含む探査活動を、５分間測定した。
海馬スライスの準備および電気生理学
【００８７】
１〜６か月齢のマウスにイソフルランの過剰投与で麻酔をかけ、断頭した。脳を迅速に解剖し、海馬スライス（厚さ３５０μｍ）を、以下（ｍＭ中）：２１２スクロース、３ＫＣｌ、５ＭｇＣｌ２、０．５ＣａＣｌ２、１ＮａＨ２ＰＯ４、２６ＮａＨＣＯ３、および１０グルコース（ｐＨ７．４）を含有する氷冷解剖緩衝液中に回収した。てんかん様活動を避けるために、ＣＡ３領域を切断した。スライスを、以下（ｍＭ中）：１２４ＮａＣｌ、５ＫＣｌ、２６ＮａＨＣＯ３、１．２５ＮａＨ２ＰＯ４、２ＣａＣｌ２、１ＭｇＣｌ２、および１０グルコース（ｐＨ７．４）を含有する人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）中に３０℃で置いた。ＡＣＳＦおよび解剖緩衝液を、９５％のＯ２／５％のＣＯ２で泡立てた。記録する前に、スライスを水没記録部屋に入れ、３０℃に維持し、ＡＣＳＦで≧１時間灌流した。
【００８８】
細胞外フィールドの記録には、同心の双極タングステン電極を使用して、海馬ＣＡ１領域におけるシャッファー側枝／交連（ＳＣ）線維を活性化した。ＡＣＳＦで満たされた細胞外ガラス微小電極（抵抗約１〜３ＭΩ）を放射状層に置き、フィールド興奮性シナプス後電位（ｆＥＰＳＰ）を測定した。ベースラインの記録では、スライスは、測定された最大のｆＥＰＳＰ振幅を引き出すために使用された刺激強度の３０〜４０％の刺激強度で０．０３３Ｈｚで２０分間刺激された。長期増強（ＬＴＰ）は、３つの１００Ｈｚパルス（持続時間：１秒、間隔：２０秒）で構成される高周波刺激（ＨＦＳ）を適用することによって誘発された。ペアパルス促進（ＰＰＦ）は、刺激間隔（ＩＳＩ）が２０〜２００ミリ秒の２つのパルスを適用することで試験された。実験には、Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ  ７００Ｂアンプ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用した。５ｋＨｚでデータをサンプリングし、Ｃｌａｍｐｆｉｔ  １０プログラム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して分析した。
【００８９】
シナプス活動は、全細胞電圧クランプ技術を使用して、歯状回（ＤＧ）顆粒神経細胞から記録された。データは、Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ  ７００ＢアンプおよびＣｌａｍｐｅ×１０．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して取得された。記録は２００μｓでサンプリングされ、２ｋＨｚでフィルタリングされた。ＡＣＳＦを外部浴液として使用し、５０μＭのピクロトキシンおよび１μＭのテトロドトキシン（ＴＴＸ）を用いて、自発的な小型興奮性シナプス後電流（ｍＥＰＳＣ）を分離するか、または１０μＭの６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオン（ＣＮＱＸ）、５０μＭの（２Ｒ）−アミノ−５−ホスホノペンタン酸（ＡＰ５）、および１μＭのＴＴＸを用いて、自発的な微小抑制性シナプス後電流（ｍＩＰＳＣ）を分離した。すべての溶液を、記録を開始する前に少なくとも２０分間平衡化させた。電圧クランプ実験用ピペット内部溶液は、以下（ｍＭ中）：１２０Ｋ−グルコン酸塩、１５ＫＣｌ、１ＭｇＣｌ２、５ＨＥＰＥＳ、５ＥＧＴＡ、２Ｍｇ−ＡＴＰ、ｐＨ７．４（３００ミリオスモル）を含有した。典型的には、ｍＥＰＳＣおよびｍＩＰＳＣは、少なくとも３〜５分間記録され、ミニ分析プログラムバージョン６．０．３（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ）を使用して分析された。
免疫組織化学および不偏立体細胞計数
【００９０】
マウスをＰＢＳ緩衝液で灌流し、次に、ＰＢＳ中に２％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流した。灌流後、脳を摘出し、固定後のために２％のＰＦＡに一晩置いてから、凍結する前にＰＢＳ中の３０％のスクロースに沈めた。クライオスタット切片を、１５μｍの厚さに切断した。切片を、Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｕｎｍａｓｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｖｅｃｔｏｒ）に浸し、３０秒間マイクロ波照射した後、ＰＢＳ中の０．２５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１５分間透過処理した。一次抗体を４℃で１６時間、蛍光標識二次抗体を２５℃で２時間インキュベートした。各フィールドの多くの未染色細胞は、染色特異性に対する内部制御として機能した。一次抗体には、ＮｅｕＮ（マウス、ＥＭＤ  ミリポア）、活性化カスパーゼ３（ウサギ、細胞シグナル伝達）、ＶＧＬＵＴ１（モルモット、ＳＹＳＹ）、ＶＧＬＵＴ２（ウサギ、ＳＹＳＹ）、ＶＧＡＴ（マウス、ＳＹＳＹ）、シナプトフィシン（マウス、シグマ）、ＧＦＡＰ（マウス、シグマ）、ＰＣＮＡ（マウス、サンタクルス）、ＤＣＸ（ヤギ、サンタクルス）が含まれた。ＴＵＮＥＬアッセイは、ベンダーの指示に従ってＲｏｃｈｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用してアポトーシスを評価するために行われた。ＮｅｕＮ、活性化カスパーゼ３、ＴＵＮＥＬ、ＧＦＡＰ、ＰＣＮＡ、またはＤＣＸによって占有される陽性またはパーセント領域の細胞数は、光学ディセクタを使用して特定の脳領域において計数されるか、または前述のように定量的共焦点免疫組織化学もしくは光学密度によって推定された。
脳溶解物の調製およびウエスタンブロッティング
【００９１】
脳組織を、１０容量の冷スクロース緩衝液（０．３２Ｍのスクロース、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）で均質化した。３，０００ｇで４℃で５分間の短時間の遠心分離を行った後、上清を回収し、１０，０００ｇで４℃で１２分間の遠心分離を行った。ペレットの外側の３分の４を回収し、穏やかなピペッティングによって同じスクロース緩衝液を使用して再懸濁したが、ミトコンドリアを含む暗い中心は避けた。１０，０００ｇで４℃で１２分間の２回目の遠心分離を行った後、暗い中心のないペレットを、シナプトソーム濃縮脳溶解物として冷ＨＢＳ（２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中に回収し、ウエスタンブロット実験のために使用した。免疫ブロットの一次抗体には、ＶＧＬＵＴ１（モルモット、ＳＹＳＹ）、ＶＧＬＵＴ２（ウサギ、ＳＹＳＹ）、ＧＡＤ６５（ウサギ、ミリポア）、シナプトフィシン（マウス、ミリポア）、ＭＥＦ２Ｃ（ウサギ、プロテインテック）、α−チューブリン（マウス、シグマ）、β−アクチン（マウス、シグマ）、およびその後に適切な二次抗体５２が含まれた。ＧＡＤ６５の抗体がウエスタンブロットに対して優れていることが証明されたため、免疫ブロットには、ＶＧＡＴの代わりにＧＡＤ６５が使用されたことに留意されたい。免疫シグナルは、コダックＸ線フィルムでキャプチャされ、Ｉｍａｇｅ  Ｊバージョン１．４５ｓを使用して定量化された。
ゴルジ染色およびＳｈｏｌｌ分析
【００９２】
製造元の指示に従って、ＦＤ  Ｒａｐｉｄ  ＧｏｌｇｉＳｔａｉｎキット（ＦＤ  ＮｅｕｒｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、ＷＴおよびＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔ脳を用いて標準的なゴルジコックス含浸を行った。細胞全体の３Ｄモンタージュをデコンボリューション顕微鏡によって４０倍で撮影し、ＳｌｉｄｅＢｏｏｋ  ５．０ソフトウェア（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）で再構築した後、いずれかに詳細に記載されているように、Ｎｅｕｒｏｌｕｃｉｄａ神経細胞追跡ソフトウェア（ＭＢＦ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、全細胞プロファイルを描写し、Ｓｈｏｌｌ分析を行った。累積樹状突起交差および樹状突起長を分析した。
成人の神経新生
【００９３】
成体の神経新生を研究するために、８週齢のマウスに、ＢｒｄＵ（５０ｍｇ／ｋｇ体重）を連続５日間毎日２回腹腔内注射し、最後の注射の４週間後に４％のＰＦＡで灌流した。次に、脳を解剖し、４％のＰＦＡ中に一晩固定し、すすぎ、凍結保護し、液体Ｎ２で凍結した。凍結切片（厚さ３０または４０μｍ）をクライオスタットでスライスした。適切な共役二次抗体と共に一次抗体に対して、標準的な免疫染色手順を使用した。ＢｒｄＵ免疫染色では、切片を２Ｎ  ＨＣＬで３０分間前治療した。ＰＣＮＡ、ＤＣＸ、ＢｒｄＵ、ＮｅｕＮ、またはｍＣｈｅｒｒｙに対して陽性の細胞を、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔおよびＷＴマウスの海馬ＤＧを通した連続切片において分析した。ＳｌｉｄｅＢｏｏｋソフトウェアを使用して、６３倍の対物レンズの下で陽性細胞を計数した。細胞の総数は、光学ディセクタ技術を使用して計数された。同じ露光時間およびコントラスト／輝度パラメータで写真を撮影した。特定のマーカに対する平均強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して決定され、ＤＧ顆粒神経細胞の平均強度に正規化された。各マーカについて、少なくとも４０個の細胞を含有する最低６枚の写真を分析した。
運動行動試験
【００９４】
均衡は、４回の２０秒間の試行において、高架（４０ｃｍ）水平ロッド（長さ５０ｃｍ）から落ちるまでの待ち時間によって測定された。試行１〜２では平らな木製のロッド（幅９ｍｍ）を使用し、試行３〜４では円筒状のアルミニウムロッド（直径１ｃｍ）を使用した。各試行において、動物を高架ロッド上のマーク付き中央ゾーン（１０ｃｍ）に置いた。動物が２０秒以内に落ちた場合は０、中央ゾーン内に２０秒間滞在した場合は１、中央ゾーンを離れた場合は２、バーの両端のうちの一方に到達した場合は３のスコアが与えられた。引き上げられた水平バー（直径２ｍｍ）の周りで握った前足によって吊るされたまま、後肢を上げる動物の能力として、牽引力を３回の５秒間の試行にわたって測定した。動物が手足を上げていない場合は０、１つの手足を上げている場合は１、２つの手足を上げている場合は２のスコアが与えられた。筋力は、マウスを上下逆さまの位置で水平バーの中央に置き、転倒するまでの待ち時間を測定した、６０秒間の１回の試行によって判定された。垂直ポール試験では、布テープ（直径１ｃｍ、高さ：試行１において７５ｃｍ、試行２〜３において５５ｃｍ）で覆われた木製の垂直ポールの上に頭を上向きにしてマウスを置いた。下向きになるまでの待ち時間および３回の試行にわたって床に降りるまでの合計時間を記録した。マウスが下向きにならない、落下する、または滑り落ちる場合、デフォルト値の６０秒が記録された。
マイクロアレイおよびＮｅｘｔＢｉｏ遺伝子ネットワーク分析
【００９５】
Ｑｉａｇｅｎ  ｍｉＲＮＡキットを使用して、出生後３０日目にＷＴおよびＭｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスの海馬から調製した凍結組織から総ＲＮＡを抽出した。ナノドロップ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡ濃度を判定し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用してＲＮＡの品質を評価した。発現分析に含まれるすべてのＲＮＡ試料のＲＮＡ完全性番号（ＲＩＮ）は、８を超えていた。ＭｏｕｓｅＲｅｆ−８  ｖ２発現ビーズチップ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を、遺伝子発現マイクロアレイに使用した。ＲソフトウェアおよびＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージを使用して、マイクロアレイデータ分析を行った。生の発現データを、ｌｏｇ２変換し、分位数正規化によって正規化した。データ品質管理基準には、高いアレイ間相関（ピアソン相関係数＞０．８５）ならびに平均アレイ間相関および階層的クラスタリングに基づく異常値アレイの検出が含まれた。
【００９６】
経路濃縮分析では、ＷＴマウスと比較して、Ｍｅｆ２ｃ−ｈｅｔマウスにおいて発現が統計的に変化した（Ｐ＜０．０５）すべての遺伝子を、ＮｅｘｔＢｉｏ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）の経路濃縮アプリケーションを使用して、ＧＯタームについてクラスター化した。使用された遺伝子の背景セットは、ヒトゲノム全体であった。ランクスコアは、前述の方法に基づいて、ＮｅｘｔＢｉｏによって割り当てられた。神経発達に関連するＧＯタームにクラスター化された遺伝子は、遺伝子発現の変化の検証のために優先順位が付けられた。
統計分析
【００９７】
データは、平均±標準誤差として報告される各実験の統計的試験は、ここ、図の凡例またはテキストに列挙されている。すべてのデータは、Ｐｒｉｓｍ  ６プログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して分析された。正常分布のデータの場合、ペアワイズ比較のスチューデントのｔ検定によって統計的有意性が判定された。複数の比較のために、Ｔｕｋｅｙ、Ｄｕｎｎｅｔｔ、またはＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓの事後分析によるＡＮＯＶＡを使用した。カテゴリデータでは、２×２分割表でのカイ２乗検定またはフィッシャーの正確検定を用いた。正常分布に適合しないデータについては、ノンパラメトリック検定が使用された。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意とみなされた。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
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【図１５Ｈ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
2020530033.tif 000095
【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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2020530033.tif 000100
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