(57)【要約】  本明細書において、ナノ構造脂質担体組成物、その作製法、およびその使用法が提供される。前記組成物はナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）を含み、前記ＮＬＣは、液相脂質と固相脂質との混合物から構成される油性コア、陽イオン性脂質、ソルビタンエステル、および親水性界面活性剤を含み、所望により生物活性剤を含む。前記生物活性剤は前記ＮＬＣと結合させることができる。前記組成物は、免疫応答の誘導のための、例えば、ワクチン用途、治療用途、または診断用途の、生体分子の細胞への送達を可能にする。また、免疫応答を刺激するための組成物、前記組成物の作製に関する方法、および前記組成物の使用に関する方法が提供される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に生物活性剤を送達するためのナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）粒子を含む組成物であって、
（ａ）液相脂質と固相脂質との混合物を含む油性コア、
（ｂ）陽イオン性成分、好ましくは陽イオン性脂質、
（ｃ）疎水性界面活性剤、好ましくはソルビタンエステル、および
（ｄ）界面活性剤、好ましくは親水性界面活性剤、
を含む、前記ＮＬＣ粒子。
【請求項２】
前記生物活性剤が前記ＮＬＣ粒子と結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞に前記生物活性剤を送達する、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記疎水性界面活性剤がソルビタンエステルであり、ソルビタンエステルを含まない対照組成物と比較した場合に前記生物活性剤を前記細胞に送達する前記組成物の能力を増強するのに十分な量でソルビタンエステルが存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記生物活性剤がタンパク質である、または、前記生物活性剤がタンパク質をコードしている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記生物活性剤がタンパク質抗原である、または、前記生物活性剤がタンパク質抗原をコードしている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記細胞が対象内の細胞であり、前記組成物が前記抗原に対する前記対象の免疫応答を誘発させる、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗原が、感染症、がん、または自己免疫疾患と関連している感染性病原体および／またはエピトープ、生体分子、細胞もしくは組織に由来する抗原である、または、それと免疫交差反応性の抗原である、請求項６または請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記疎水性界面活性剤がソルビタンエステルであり、ソルビタンエステルを含まない対照組成物と比較した場合に前記抗原に対する免疫応答を誘発させる前記組成物の能力を増強するのに十分な量でソルビタンエステルが存在する、請求項６〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記対象に有効量で投与された場合に、前記生物活性剤を前記ＮＬＣ無しで前記対象に投与した場合に誘発される免疫応答と同等以上の前記抗原に対する免疫応答を誘発させる、請求項６〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記疎水性界面活性剤がソルビタンエステルであり、前記対象に有効量で投与された場合に、ソルビタンエステルを含まない対照組成物を前記対象に投与した場合に誘発される抗体価よりも高いレベルの前記抗原に対する抗体価を誘発する、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記疎水性界面活性剤がソルビタンエステルであり、ソルビタンエステルを含まない対照組成物によって前記対象において誘導される中和抗体価よりも高いレベルの前記対象における中和抗体価を誘導する、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記生物活性剤がＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記生物活性剤がｍＲＮＡである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記生物活性剤が腫瘍溶解性ウイルスＲＮＡである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＲＮＡがレプリコンである、請求項１３または請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＲＮＡが抗原をコードしている、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＲＮＡが抗体をコードしている、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＲＮＡがノンコーディングＲＮＡである、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記液相脂質が代謝可能なものである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記液相脂質が植物油、動物油、または合成により作製された油である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記液相脂質が魚油である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記液相脂質がトリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル、ビタミンＥ、ラウロイルポリオキシルグリセリド、モノアシルグリセロール、ダイズレシチン、スクアレン、もしくはスクアラン、またはこれらの組み合わせである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記液相脂質がスクアレン、ヒマワリ油、ダイズ油、オリーブ油、ブドウ種子油、スクアラン、トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル、またはこれらの組み合わせである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記液相脂質が天然テルペノイドまたは合成テルペノイドである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記液相脂質がスクアレンである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記固相脂質がグリセロ脂質である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記固相脂質が微結晶トリグリセリドである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記微結晶トリグリセリドがトリミリスチンである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記陽イオン性成分が、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、および１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、並びにこれらの組み合わせ、から選択される陽イオン性脂質である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記陽イオン性脂質が１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記親水性界面活性剤がポリエチレングリコールである、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記親水性界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンエステルである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ＮＬＣ粒子の平均多分散指数が０．１〜約０．５である、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ＮＬＣ粒子の平均多分散指数が約０．２〜約０．５である、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ＮＬＣ粒子の平均多分散指数が約０．２〜約０．４または約０．１〜約０．４である、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ＮＬＣ粒子の平均多分散指数が約０．２〜約０．３または約０．１〜約０．３である、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ＮＬＣ粒子のｚ平均粒径が約４０ｎｍ〜約６０ｎｍである、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ＮＬＣ粒子のｚ平均粒径が約２０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１５０、約２０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０、約４０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約４０ｎｍ〜約８０ｎｍ、または約４０ｎｍ〜約６０ｎｍである、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記疎水性界面活性剤が１〜５の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）値を有するソルビタンエステルである、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記疎水性界面活性剤が４〜５のＨＬＢ値を有するソルビタンエステルである、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記疎水性界面活性剤がソルビタンエステルであり、前記ソルビタンエステルがソルビタンモノエステルである、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記疎水性界面活性剤がソルビタンエステルであり、前記ソルビタンエステルがソルビタンモノステアレートである、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記疎水性界面活性剤がソルビタンエステルであり、前記ソルビタンエステルがソルビタンモノオレートである、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ＮＬＣ粒子のｚ平均粒径が約４０ｎｍ〜約８０ｎｍである、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ＮＬＣ粒子のｚ平均粒径が約４０ｎｍ〜約６０ｎｍである、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４７】
油：界面活性剤モル比が約０．５〜約１２、より好ましくは約０．５〜約９である、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
油：界面活性剤モル比が約０．５〜約１である、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
親水性界面活性剤：陽イオン性成分比が約０．２〜約１．５である、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
親水性界面活性剤：陽イオン性成分比が約０．２〜約１である、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
ＲＮＡの積載量が少なくとも約１００μｇ／ｍＬである、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記疎水性界面活性剤がソルビタンエステルであり、前記ソルビタンエステルがソルビタントリエステルである、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５３】
前記疎水性界面活性剤がソルビタンエステルであり、前記ソルビタンエステルがソルビタントリオレエートである、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５４】
約０．２ｗ／ｖ％〜約４０ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％のソルビタンモノエステル、および約０．５ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤を含む、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５５】
約２ｗ／ｖ％〜約４０ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％のソルビタンモノエステル、および約０．５ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤を含む、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５６】
約１０ｗ／ｖ％〜約４０ｗ／ｖ％の液相脂質、約１％〜約２％の固相脂質、約２％〜約５％の陽イオン性脂質、約３〜約５ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約３ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤を含む、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５７】
約１５ｗ／ｖ％の液相脂質および約１％の固相脂質、または約３０ｗ／ｖ％の液相脂質および約１．８％の固相脂質、並びに、約３％の陽イオン性脂質、約３．７ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、並びに約３．７ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤を含む、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５８】
約２ｗ／ｖ％〜約６ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％のソルビタンモノエステル、および約０．５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤を含む、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５９】
約３．７５ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．２５ｗ／ｖ％の固相脂質、約３ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約３．７ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約３．７ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤を含む、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６０】
約０．２ｗ／ｖ％〜約４０ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤を含む、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６１】
約０．２ｗ／ｖ％〜約４０ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約１５ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約０．２ｗ／ｖ％〜約１５ｗ／ｖ％または約０．５ｗ／ｖ％〜約１５ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤を含む、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６２】
約２ｗ／ｖ％〜約４０ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤を含む、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６３】
約２ｗ／ｖ％〜約６ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％のソルビタンモノエステル、および約０．２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤を含む、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６４】
約４ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．２５ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．４ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．５ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約０．５ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤を含む、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６５】
請求項５４〜６４のいずれか一項に記載の組成物の希釈形態または濃縮形態を含む組成物。
【請求項６６】
請求項５４〜６４のいずれか一項に記載の組成物が２〜３０倍希釈されている、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６７】
請求項５４〜６４のいずれか一項に記載の組成物が２〜２０倍希釈されている、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６８】
請求項５４〜６４のいずれか一項に記載の組成物が２倍希釈されている、請求項６５に記載の組成物。
【請求項６９】
請求項５４〜６４のいずれか一項に記載の組成物が２〜３０倍に濃縮されている、請求項６５に記載の組成物。
【請求項７０】
請求項５４〜６４のいずれか一項に記載の組成物が２〜１０倍に濃縮されている、請求項６５に記載の組成物。
【請求項７１】
前記液相脂質が天然テルペノイドまたは合成テルペノイドである、請求項５４〜７０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７２】
前記液相脂質が天然スクアレンまたは合成スクアレンである、請求項５４〜７０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７３】
前記固相脂質がグリセロ脂質である、請求項５４〜７２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７４】
前記固相脂質が微結晶トリグリセリドである、請求項５４〜７２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７５】
前記固相脂質がトリミリスチンである、請求項５４〜７２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７６】
前記陽イオン性脂質がＤＯＴＡＰである、請求項５４〜７５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７７】
前記ソルビタンエステルがソルビタンモノステアレートである、請求項５４〜７６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７８】
前記ソルビタンエステルがソルビタンモノオレートである、請求項５４〜７６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７９】
前記ソルビタンエステルがソルビタントリオレエートである、請求項５４〜７６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８０】
前記親水性界面活性剤がポリソルベートである、請求項５４〜７７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８１】
前記親水性界面活性剤がポリソルベート８０である、請求項５４〜７７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８２】
前記油性コアが天然スクアレンまたは合成スクアレンおよびグリセロ脂質を含み、前記陽イオン性脂質がＤＯＴＡＰであり、前記ソルビタンエステルがソルビタンモノステアレートまたはソルビタンモノオレートであり、前記親水性界面活性剤がポリソルベートである、請求項１〜２０、請求項３４〜４１、請求項４５〜５１、および請求項５４〜７０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８３】
前記油性コアがスクアレンおよびトリミリスチンを含み、前記陽イオン性脂質がＤＯＴＡＰであり、前記ソルビタンエステルがソルビタンモノステアレートであり、前記親水性界面活性剤がポリソルベート８０である、請求項１〜２０、請求項３４〜４１、請求項４５〜５１、および請求項５４〜７０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８４】
前記ＮＬＣが、約２ｗ／ｖ％〜約４０ｗ／ｖ％のスクアレン、約０．１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％のトリミリスチン、約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％のＤＯＴＡＰ、約０．２５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％のソルビタンモノステアレート、および約０．５ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％のポリソルベート８０を含む、請求項８３に記載の組成物。
【請求項８５】
前記ＮＬＣが、約２ｗ／ｖ％〜約６ｗ／ｖ％のスクアレン、約０．１ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％のトリミリスチン、約０．２ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％のＤＯＴＡＰ、約０．２５ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％のソルビタンモノステアレート、および約０．５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％のポリソルベート８０を含む、請求項８３に記載の組成物。
【請求項８６】
前記ＮＬＣが、約３．７５ｗ／ｖ％のスクアレン、約０．２５ｗ／ｖ％のトリミリスチン、約３ｗ／ｖ％のＤＯＴＡＰ、約３．７ｗ／ｖ％のソルビタンモノステアレート、および約３．７ｗ／ｖ％のポリソルベート８０を含む、請求項８５に記載の組成物。
【請求項８７】
前記油性コアが天然スクアレンまたは合成スクアレンおよびグリセロ脂質を含み、前記陽イオン性脂質がＤＯＴＡＰであり、前記ソルビタンエステルがソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレートまたはソルビタントリオレエートであり、前記親水性界面活性剤がポリソルベートである、請求項１〜２０、請求項３４〜４１、請求項４５〜５１、および請求項５４〜７０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８８】
前記油性コアがスクアレンおよびトリミリスチンを含み、前記陽イオン性脂質がＤＯＴＡＰであり、前記ソルビタンエステルがソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレート、またはソルビタントリオレエートであり、前記親水性界面活性剤がポリソルベート８０である、請求項１〜２０、請求項３４〜４１、請求項４５〜５１、および請求項５４〜７０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８９】
前記ＮＬＣが、約２ｗ／ｖ％〜約４０ｗ／ｖ％のスクアレン、約０．１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％のトリミリスチン、約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％のＤＯＴＡＰ、約０．２５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％のソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレート、またはソルビタントリオレエート、および約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％のポリソルベート８０を含む、請求項８７または請求項８８に記載の組成物。
【請求項９０】
前記ＮＬＣが、約２ｗ／ｖ％〜約６ｗ／ｖ％のスクアレン、約０．１ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％のトリミリスチン、約０．２ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％のＤＯＴＡＰ、約０．２５ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％のソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレート、またはソルビタントリオレエート、および約０．２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％のポリソルベート８０を含む、請求項８７または請求項８８に記載の組成物。
【請求項９１】
前記ＮＬＣが、約４ｗ／ｖ％のスクアレン、約０．２５ｗ／ｖ％のトリミリスチン、約０．４ｗ／ｖ％のＤＯＴＡＰ、約０．５ｗ／ｖ％のソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレート、またはソルビタントリオレエート、および約０．５ｗ／ｖ％のポリソルベート８０を含む、請求項８７または請求項８８に記載の組成物。
【請求項９２】
対象において免疫応答を発生させる方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の請求項１〜９１のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含み、前記生物活性剤がタンパク質抗原またはタンパク質抗原をコードする核酸分子である、前記方法。
【請求項９３】
前記生物活性剤がＲＮＡである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記組成物の投与が筋肉内投与、非経口投与、または皮内投与である、請求項９２または請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
対象において免疫応答を発生させる方法であって、（ａ）それを必要とする対象に、治療有効量の、タンパク質抗原をコードする腫瘍溶解性ウイルスを投与することと、（ｂ）前記対象に治療有効量の請求項１〜９１のいずれか一項に記載の組成物を投与すること、とを含み、前記生物活性剤が前記タンパク質抗原または前記タンパク質抗原をコードする核酸分子である、前記方法。
【請求項９６】
前記（ａ）の投与および前記（ｂ）の投与を、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１か月間、少なくとも６週間、少なくとも２か月間、少なくとも３か月間、少なくとも６か月間、または少なくとも１年間の間隔を空けて行う、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
生物活性剤を細胞に送達する方法であって、前記細胞を請求項１〜９１のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項９８】
前記生物活性剤が核酸である、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記細胞と前記組成物とを接触させることが、前記組成物を対象に投与することを含み、前記細胞が前記対象の中に存在する、請求項９７または請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
生物活性剤の細胞への送達を最適化するための方法であって、前記細胞を含む対象において誘導される抗体価を最適化する、ＮＬＣに対する生物活性剤のモル比を選択することを含む、前記方法。
【請求項１０１】
前記ＮＬＣが請求項１〜９１のいずれか一項に記載のＮＬＣ粒子である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
請求項１〜９１のいずれか一項に記載の組成物を作製する方法であって、
（ａ）前記固相脂質と、前記液相脂質と、前記陽イオン性脂質と、前記疎水性界面活性剤とを混合して、油相混合物を形成させること；
（ｂ）前記親水性界面活性剤と、水とを混合して、水相混合物を形成させること；
（ｃ）前記油相混合物を前記水相混合物と混合して、前記ＮＬＣ粒子を形成させること；および
（ｄ）所望により、前記生物活性剤が非共有結合相互作用または可逆的共有結合相互作用によって前記ＮＬＣ粒子の表面と結合するように、前記生物活性剤を前記ＮＬＣ粒子と組み合わせること、
を含む、前記方法。
【請求項１０３】
前記生物活性剤がＲＮＡであり、前記ＲＮＡが１または複数のＴＢ抗原をコードしている、請求項１〜９１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０４】
前記ＲＮＡがＲｖ３６１９、Ｒｖ２３８９、Ｒｖ３４７８、およびＲｖ１８８６から選択される１または複数のＴＢ抗原をコードしている、請求項１０３に記載の組成物。
【請求項１０５】
前記ＲＮＡがＴＢ抗原であるＲｖ３６１９、Ｒｖ２３８９、Ｒｖ３４７８、およびＲｖ１８８６をコードしている、請求項１０４に記載の組成物。
【請求項１０６】
前記生物活性剤がＲＮＡであり、前記ＲＮＡが１または複数のＴＢ抗原をコードしている、請求項９２〜９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記ＲＮＡがＲｖ３６１９、Ｒｖ２３８９、Ｒｖ３４７８、およびＲｖ１８８６から選択される１または複数のＴＢ抗原をコードしている、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ＲＮＡがＴＢ抗原であるＲｖ３６１９、Ｒｖ２３８９、Ｒｖ３４７８、およびＲｖ１８８６をコードしている、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記生物活性剤がアジュバントである、請求項１〜９１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１０】
前記アジュバントがＴＬＲ作動薬、Ｒｉｇ−Ｉ作動薬、サポニン、糖、糖ポリマー、複合糖質、全ウイルス粒子、ウイルス様粒子、ウイルス断片、および細胞断片から選択される、請求項１０９に記載の組成物。
【請求項１１１】
前記アジュバントがＴＬＲ作動薬およびＲｉｇ−Ｉ作動薬から選択される、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１２】
前記ＴＬＲ作動薬がＴＬＲ２作動薬、ＴＬＲ３作動薬、ＴＬＲ４作動薬、ＴＬＲ７作動薬、ＴＬＲ８作動薬、またはＴＬＲ９作動薬である、請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１１３】
前記ＴＬＲ作動薬がＴＬＲ３作動薬である、請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１１４】
前記生物活性剤が二本鎖ＲＮＡ、ＲＩＢＯＸＸＯＬ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、およびＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）から選択される、請求項１０９〜１１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１５】
安定なエマルジョン中にアジュバントを含む組成物であって、前記アジュバントがＴＬＲ３作動薬およびＲｉｇ−Ｉ作動薬から選択され、前記安定なエマルジョンが水中油型エマルジョンである、前記組成物。
【請求項１１６】
前記エマルジョンが２〜１０％の油、２〜１５％の油、５〜１５％の油、または５〜１０％の油を含む、請求項１１５に記載の組成物。
【請求項１１７】
前記油がスクアレンである、請求項１１５または請求項１１６に記載の組成物。
【請求項１１８】
前記水中油型エマルジョンが０．０１〜０．１％のαトコフェロールを含む、請求項１１５〜１１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１９】
αトコフェロールに対する油の比が１より大きい、請求項１１８に記載の組成物。
【請求項１２０】
前記水中油型エマルジョンが０．３〜３％の界面活性剤を含む、請求項１１５〜１１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２１】
前記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレートまたはポロキサマー１８８（ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのコポリマー）である、請求項１２０に記載の組成物。
【請求項１２２】
前記水中油型エマルジョンが約１％のＳｐａｎ８５を含む、請求項１１５〜１２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２３】
前記水中油型エマルジョンが０．５％〜５％、０．５％〜５％、０．５％〜３％、または１％〜３％の１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）を含む、請求項１１５〜１２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２４】
前記水中油型エマルジョンが０．５％〜５％、０．５％〜５％、０．５％〜３％、または１％〜３％のグリセロールを含む、請求項１１５〜１２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２５】
免疫応答を誘導または増強する方法であって、前記方法を必要とする対象に治療有効量の請求項１０９〜１２４のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１２６】
前記免疫応答が、前記対象がアジュバントを単独で投与された場合の免疫応答よりも大きい、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記組成物の投与が筋肉内投与、非経口投与、または皮内投与である、請求項１２５または請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
（ａ）アジュバントと、（ｂ）水中油型エマルジョンまたはナノ粒子脂質担体（ＮＬＣ）粒子と、を含み、前記水中油型エマルジョンまたはＮＬＣ粒子がスクアレンを含む、組成物。
【請求項１２９】
前記アジュバントがＴＬＲ作動薬、Ｒｉｇ−Ｉ作動薬、サポニン、糖、糖ポリマー、複合糖質、全ウイルス粒子、ウイルス様粒子、ウイルス断片、および細胞断片から選択される、請求項１２８に記載の組成物。
【請求項１３０】
前記アジュバントがＴＬＲ作動薬およびＲｉｇ−Ｉ作動薬から選択される、請求項１２９に記載の組成物。
【請求項１３１】
前記ＴＬＲ作動薬がＴＬＲ２作動薬、ＴＬＲ３作動薬、ＴＬＲ４作動薬、ＴＬＲ７作動薬、ＴＬＲ８作動薬、またはＴＬＲ９作動薬である、請求項１３０に記載の組成物。
【請求項１３２】
前記ＴＬＲ作動薬がＴＬＲ３作動薬である、請求項１３１に記載の組成物。
【請求項１３３】
前記生物活性剤が二本鎖ＲＮＡ、ＲＩＢＯＸＸＯＬ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、およびＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）から選択される、請求項１２８〜１３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３４】
免疫応答を誘導または増強する方法であって、前記方法を必要とする対象に治療有効量の請求項１２８〜１３３のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１３５】
前記免疫応答が、前記対象がアジュバントを単独で投与された場合の免疫応答よりも大きい、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記組成物の投与が筋肉内投与、非経口投与、または皮内投与である、請求項１３４または請求項１３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年６月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／５２０，２０４号、２０１７年８月３日に出願された同第６２／５４０，９７３号、２０１７年９月８日に出願された同第６２／５５６，２９１号、２０１７年９月２６日に出願された同第６２／５６３，５４４号、２０１７年１１月７日に出願された同第６２／５８２，８５９号、２０１８年１月２６日に出願された同第６２／６２２，７４８号、２０１８年１月２６日に出願された同第６２／６２２，７５５号、２０１８年５月９日に出願された同第６２／６６９，２６２号、２０１８年５月２９日に出願された同第６２／６７７，３３６号、および２０１８年６月４日に出願された同第６２／６８０，４５４号に基づく優先権の利益を主張し、各米国仮特許出願の全内容をあらゆる目的のために参照により援用するものである。
【０００２】
技術分野
全体として、本開示は医薬分野およびワクチン製剤分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
核酸の免疫処置は、既存の感染症または新興感染症の脅威に対しワクチンを迅速に開発する際に魅力的な戦略となる。核酸ワクチンの候補は通常の合成法により容易に作製され、新たな感染症の出現から数週間以内に構築することができる。加えて、核酸ワクチンの生物物理学的特徴は発現抗原とは独立しているため、この新たなワクチンの製造に必要な抗原特異的プロセスの開発は最小限となる。現在、選ばれた少数の感染症に対してプラスミドＤＮＡワクチンが開発されているが、今のところ、付随する合併症から、ＤＮＡベースのワクチンでヒトでの使用を承認されたものはない（McKay, Cope et al. 2014、TregoningおよびKinnear 2014）。
【０００４】
ＤＮＡベースのプラットフォームに対する有望な代替案として、ＲＮＡベースのプラットフォームを用いた抗原送達が提唱されている。ＲＮＡの一過的な性質は抗原送達において好ましく、すなわち、長期に亘ってワクチンが残留するリスクがＤＮＡと比べて減少し、さらに、タンパク質産生のために送達後のワクチンが核移行する必要がない。しかしながら、ＲＮＡの相対的な不安定性と、単一のｍＲＮＡ転写物からの発現の有限性とにより、これらのワクチンの大規模な流通および使用が、この分野においては困難なものとなっており、また商業的開発も困難である。ＲＮＡの構造改変を通じＲＮＡの安定性を改善する方法に関して多くの研究がなされ、この問題に対しいくつかの解決法がもたらされた（Tavernier, Andries et al. 2011、Youn and Chung 2015）。特に、自己増幅性ＲＮＡをベースとするワクチンが、抗原発現の規模と持続期間を向上させる有望な機序を示した（（Vander Veen, Harris et al. 2012、Ljungberg and Liljestrom 2015）で概説されている）。
【０００５】
ロバストな免疫応答を可能にするには、通常、リポソーム製剤や水中油型エマルジョン製剤などが用いられて、ＲＮＡの細胞内への送達が増強される（Geall, Verma et al. 2012、Ulmer, Mason et al. 2012、Brito, Chan et al. 2014、Bogers, Oostermeijer et al. 2015、Brito, Kommareddy et al. 2015、Geall and Ulmer 2015）。加えて、薬剤または他の治療用物質の細胞内送達を増強するためにも、これらの製剤は使用される場合がある。しかしながら、陽イオン性脂質エマルジョン（cationic lipid emulsion）（ＣＮＥ）などのリポソームや水中油型エマルジョンは、生理環境においては構造的に不安定であり、個々の成分への急性の暴露による毒性の可能性を高め得る。また、このような担体の毒性の潜在性は、ＲＮＡの吸着に必要な陽イオン性リン脂質に一般的に付随する毒性の懸念を悪化させたり、それと混同されたりする（Bertholet et al. 2010）。加えて、水中油型エマルジョンの物理化学的性質（例えば、大きさ、表面電荷、賦形剤の化学的性質およびその相対比）がＲＮＡの結合性、送達、および最終的な抗原の発現にどのように影響するかに関して、限定的にしか理解されていない。
【０００６】
すなわち、核酸をはじめとする生物活性剤を細胞に送達するための多用途で、安定で、且つ安全な系として物理的にも化学的にも好適に機能する、製剤プラットフォームが求められている。
【０００７】
特許出願および特許公報を含む、本明細書で引用される全ての参考文献は、個々の参考文献が参照により援用されると明確且つ個別に示されているかのように、参照によってその全体が本明細書に援用されるものとする。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、生物活性剤の細胞送達において驚くほど効果的な製剤を開発した。従って、本明細書においては、特に、そのような製剤（組成物とも称される）およびその使用法が提供される。この製剤はナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）ベースの製剤である。ＮＬＣがＮＬＣ粒子から構成されていることは当業者には理解されよう。ＮＬＣについてはBeloqui et al., Nanomedicine. NBM 2016; 12:143-161で説明がなされている。本発明の例示的なＮＬＣ粒子は、（ａ）液相脂質と固相脂質とを含む油性コア、（ｂ）陽イオン性脂質、（ｃ）疎水性界面活性剤（好ましくはソルビタンエステル（例えば、ソルビタンモノエステル、ソルビタンジエステル、またはソルビタントリエステル）、および（ｄ）親水性界面活性剤、を含む。例示的な組成物は安定であり、生物活性剤の細胞送達を可能にする。生物活性剤の送達は、例えば、対象における、免疫応答の誘導および／または疾患や健康状態の治療を目的としたものであり得る。
【０００９】
本発明のこれらの態様および他の態様は以下の詳細な説明と添付の図面を参照することにより明らかとなる。さらに、様々な参考文献が本明細書に記載されるが、これらは本発明の特定の態様をより詳細に説明するものであり、故に、参照によってその全体が援用されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１−１】図１Ａ〜図１ＥはＣＮＥ製剤とＮＬＣ製剤との間での安定性の比較を示している。５℃（図１Ａ）、２５℃（図１Ｂ）、３７℃（図１Ｃ）、６０℃（図１Ｄ）、および８０℃で保存した、ＣＮＥ製剤（ＱＧ３８６）とＮＬＣ製剤（ＱＧ７５２）との間での、動的光散乱（ＤＬＳ）粒径（マルバーン社製Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｚ／ＺＳ）の比較。矢印は単に線を区別するのを補助するために示している。
【図１−２】同上。
【００１１】
【図２】図２Ａ〜図２Ｂは、ＮＬＣのｚ平均粒径を、動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて測定した油／界面活性剤比または界面活性剤／油比の関数として示している。
【００１２】
【図３−１】図３Ａ〜図３Ｅは、ゲル遅延度アッセイ（ＧＲＡ）という光学的な濃度測定法を示しており、図３Ａは窒素／リン酸（Ｎ／Ｐ）比の関数としての、ＮＬＣに結合しているＲＮＡの量を求めている。図３Ｂ〜図３Ｅは、ＱＧ９４２、ＱＧ９６３、ＱＧ８０７、およびＱＧ８４３（ＱＧ８４３はＣＮＥとも称される）について、Ｎ：Ｐ値の関数としての、インビトロにおけるＳＥＡＰ発現（相対発光量、ＲＬＵ）およびＲＮＡ−ＮＬＣ結合曲線を、重ね合わせて示している。
【図３−２】同上。
【図３−３】同上。
【００１３】
【図４】図４Ａ〜図４Ｃは、窒素／リン酸（計算）比（図４Ａ）、ＲＮＡ／粒子（理論）比（図４Ｂ）、またはＤＯＴＡＰ／ＲＮＡ質量比（計算）（図４Ｃ）を変動させた場合の、製剤−ＲＮＡ複合体のＤＬＳ粒径（Ｚ平均、ｎｍ）の比較を示している。
【００１４】
【図５】図５は、異なる量のＱＧ７６８製剤と複合体化されたジカ抗原発現ｒｖＲＮＡを単回筋肉内投与した１４日後の、マウス（ｎ＝５／群）から得られた、中和抗体価を示している。中和抗体価は８０％プラーク減少中和試験（80% plaque reduction neutralization test）（ＰＲＮＴ８０）により求めた。有意性は一元配置分散分析で確認した。
【００１５】
【図６】図６は、ＲＮＡを、製剤と複合させて（０．１μｇのＲＮＡを製剤と１：１（ｖ／ｖ）で混合）、または単独（naked）で（０．１μｇまたは１０μｇのＲＮＡを生理食塩水と１：１で混合）、筋肉内（ＩＭ）投与した後の、マウス（Ｎ＝５／群）から得られた、中和抗体価を示している。中和抗体価は８０％プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ８０）により求めた。有意性は一元配置分散分析で確認した。
【００１６】
【図７】図７Ａ〜図７Ｅは、表示されている製剤の存在下における、ヒト血液細胞全体からの、ケモカインの放出レベルを示している。ケモカイン発現レベルは、マルチプレックスサイトカインビーズアレイを用いたＬｕｍｉｎｅｘアッセイにより求めた。
【００１７】
【図８】図８Ａ〜図８Ｂは、選抜した製剤の、インビトロにおけるｒｖＲＮＡ送達能を示している。２９３Ｔ細胞またはＢＨＫ細胞を、表示の製剤を用いて、１０ｎｇ（図８Ａ）または１００ｎｇ（図８Ｂ）のＳＥＡＰコードｒｖＲＮＡでトランスフェクトし、さらに、リポフェクタミンをポジティブコントロールに用い、１０％スクロース溶液をネガティブコントロールに用いた。トランスフェクションの後、上清を回収し、発光測定法を用いてＳＥＡＰ活性を測定した。
【００１８】
【図９】図９は、選抜した製剤の、インビボにおけるタンパク質発現動態を示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１０％スクロース、ＣＮＥ、ＱＧ８０７、またはＱＧ８０８中に製剤化された、ＳＥＡＰをコードするｒｖＲＮＡを、筋肉内経路で１μｇ注射した。生理食塩水を注射したマウスをモック対照として用いた。注射の３日後、７日後、１４日後、２１日後、および２８日後に血清を採取し、発光測定法を用いてＳＥＡＰ活性を測定した。
【００１９】
【図１０】図１０は、製剤ＱＧ８０７のＲＮＡ積載量の最適化を示している。ＳＥＡＰをコードするｒｖＲＮＡをＸ軸に表示されている各種濃度に１０％スクロースで希釈し、ＱＧ８０７と１：１比で複合体を形成させた。次に、製剤化したＲＮＡを、５０μＬ体積中１μｇまたは０．１μｇの用量となるように希釈した。次に、各用量をＣ５７ＢＬ／６マウスに筋肉内経路で注射し、注射から３日後および８日後に血清を回収した。次に、ＳＥＡＰ活性を発光測定法で測定した。
【００２０】
【図１１−１】図１１Ａ〜図１１Ｃ。図１１Ａおよび図１１Ｂについて、モック（mock）とは１０％スクロースであり、単独（naked）とは１００ｎｇの製剤化されていないＳＥＡＰ  ｒｖＲＮＡであり、ＣＮＥとはＣＮＥ（Ｓｐａｎ８５含有）と複合体を形成したＳＥＡＰ  ｒｖＲＮＡであり、ＱＧ７６８とはＳｐａｎ６０を含有するＮＬＣであり、ＱＧ９０６とはＳｐａｎ８０を含有するＮＬＣであり、ＱＧ８０８とはＳｐａｎ８５を含有するＮＬＣであり、ＳＱ８０７とはＳｐａｎ６０を含有するＮＬＣである。図１１Ａは、タンパク質発現と、その後の分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードするＲＮＡとの複合体形成とを増強する能力について、乳化剤組成が異なる４種のＮＬＣ製剤と、ＣＮＥまたは希釈剤との比較を示している。１００ｎｇの単回筋肉内（ＩＭ）注射（ｎ＝３／群）の３日後、マウスから血清を回収し、ＳＥＡＰ活性を測定した。データポイントをそれぞれプロットし、それらの平均値±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を示している。図１１Ｂは、ＺＩＫＶのｐｒＭおよびＥをコードするＲＮＡと複合体を形成した（図１１Ａ）で使用した同一製剤を示している。単回１００ｎｇ筋肉内注射（ｎ＝５／群）の１４日後に中和抗体を測定した。一元配置分散分析後のテューキーの多重比較検定によりデータ解析を行った（＊ｐ＜０．０５；ＮＬＣ  Ｓｐａｎ６０をＣＮＥまたはＮＬＣ  Ｓｐａｎ８５と比較、＊＊ｐ＜０．００８；ＮＬＣ  Ｓｐａｎ６０をＮＬＣ  Ｓｐａｎ８０と比較、＊＊＊ｐ＝０．０００７、ＣＮＥをＮＬＣ  Ｓｐａｎ８０またはＳｐａｎ８５と比較、有意差なし（not significant））。図１１Ｃは、ＺＩＫＶのｐｒＭおよびＥをコードするＲＮＡと複合体を形成した、２種の異なる疎水性界面活性剤（Ｓｐａｎ８５およびＳｐａｎ６０）から構成されるＣＮＥまたはＮＬＣ、および中和抗体、を示しており、単回１００ｎｇ筋肉内注射の１４日後に測定した。多変量二元配置分散分析後のテューキーの多重比較検定によりデータ解析を行った。＊＊ｐ＜０．０００１。
【図１１−２】同上。
【図１２−１】図１２Ａ〜図１２Ｈ。Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝９／群）に単回筋肉内注射で１μｇのＣＮＥ製剤化ＲＮＡまたはＮＬＣ製剤化ＲＮＡを接種し、１０または１μｇの非製剤化ＲＮＡと比較した（図１２Ａ）。接種の１４日後に中和抗体を評価した。その後、２８日後に、１群当たり３匹のマウスを、２回目の各ワクチンの投与でブーストした（図１２Ｂ〜図１２Ｆ）。ブーストの４６日後、脾臓を摘出し、ＺＩＫＶのｐｒＭおよびＥにおけるエピトープに対応するＣＤ８ペプチドで刺激した。図１４Ｇ〜図１４Ｈ：単回筋肉内投与で免疫したマウス（ｎ＝６／群）を、３０日目に、モノクローナル抗体投与でインターフェロンα受容体を遮断した後、致死量のＺＩＫＶでチャレンジした。チャレンジの４日後にプラークアッセイによりウイルスについて血清の評価を行った（図１２Ｇ）。生存率のモニタリングを行った（図１２Ｈ）。ＮＬＣ４はＱＧ８０７である。
【図１２−２】同上。
【００２１】
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｂ。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３／群）に、非製剤化型ＳＥＡＰ  ＲＮＡ、または４００μｇ／ｍＬのＲＮＡと複合体を形成させることによりＱＧ８０７、ＱＧ９２４、ＱＧ９２５、ＱＧ９４１、もしくはＱＧ９４２で製剤化したＳＥＡＰ  ＲＮＡを、１μｇ筋肉内注射し、ＳＥＡＰ発現を、ＱＧ８０７の最適なＲＮＡ濃度である４０μｇ／ｍＬにおいて複合体形成したＱＧ８０７と比較した（図１３Ａ）。ＢＨＫ細胞を１：２０希釈した各々の高ＲＮＡ積載量製剤と共に４時間インキュベートした後、ヨウ化プロピジウムおよびアネキシンで染色することで、死細胞またはアポトーシス中の細胞を検出した。その後、フローサイトメトリーを用いて、死細胞でもアポトーシス中の細胞でもない、細胞の比率を定量化した（図１３Ｂ）。
【００２２】
【図１４】図１４はインビボにおけるＳＥＡＰ発現データを示しており、４００μｇ／ｍＬまたは４０μｇ／ｍＬのＲＮＡと複合体形成したＱＧ８０７を比較している。
【００２３】
【図１５−１】図１５Ａ〜図１５Ｄは、表示されている製剤の存在下における、ヒト血液細胞全体からの、ケモカインの放出レベルを示している。ケモカイン発現レベルは、マルチプレックスサイトカインビーズアレイを用いたＬｕｍｉｎｅｘアッセイにより求めた。
【図１５−２】同上。
【００２４】
【図１６−１】図１６Ａ〜図１６Ｄ。図１６Ａは例示的なＮＬＣ粒子を示している。図１６ＢはＮＬＣｖ１およびＣＮＥ（ＱＧ３８６）の強度加重サイズ分布を示している。図１６Ｃは、２５℃で保存された製剤のコロイド安定性を評価するための、９か月間に亘る粒径（ｚ平均粒径）の発達（evolution）を示している。ＣＮＥ（ＱＧ３８６）とＮＬＣｖ１製剤（ＱＧ７５２）との間での動的光散乱（ＤＬＳ）粒径（ｚ平均粒径、マルバーン社製Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｚ／ＺＳ）の比較。図１６Ｄは、界面活性剤相（界面活性剤と陽イオン性脂質の合計質量の３５％）に比較的少量のＴｗｅｅｎ８０画分を含むＮＬＣによる、ＲＮａｓｅプロテクションを示しており、ｒｖＲＮＡが分解から保護された。
【図１６−２】同上。
【００２５】
【図１７】図１７は例示的なＮＬＣ製造工程を示している。
【００２６】
【図１８】図１８Ａ〜図１８Ｂは、ＮＬＣ製剤化ＺＩＫＶ  ｒｖＲＮＡの１回または２回の投与による２つの独立した実験の後の、中和抗体応答の持続性を示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５／群）に、０日目（図１８Ａ）に１回、または０日目および２８日目（図１８Ｂ）に、筋肉内経路で、１μｇまたは０．１μｇのＮＬＣｖ１製剤化ＺＩＫＶ  ｒｖＲＮＡを接種し、種々の時点の中和抗体価を、１０μｇまたは１μｇの非製剤化（単独）ＺＩＫＶ  ｒｖＲＮＡを接種したマウスと比較した。データは各バイオロジカルレプリケートの平均値±標準偏差としてプロットしている。図１８Ａ〜図１８ＢのデータをＬｏｇ１０変換したものを、一元配置分散分析後のテューキーの多重比較検定により解析し、各群の各時点におけるＰＲＮＴ８０の平均を、１４日目の各ピーク抗体価と比較した。図１８Ａでは、８８日目および１５６日目のＮＬＣｖ１（１μｇ）または単独（１０μｇ）を１４日目の抗体価と比較している（＊＊ｐ＜０．０００１、＊＊ｐ＜０．００１）。図１８Ｂでは、１２６日目および２０９日目のＮＬＣｖ１（１μｇ）を１４日目の抗体価と比較している（それぞれ、＊ｐ＝０．０５、＊＊＊ｐ＝０．０００１）。
【００２７】
【図１９】図１９Ａ〜図１９Ｂ。マウスに筋肉内注射でＮＬＣ製剤化ＲＮＡを接種し、１４日目（図１９Ａ）および４９日目（図１９Ｂ）に、ＣＤ＋Ｔ細胞のレベルについて、１０μｇまたは１μｇの非製剤化ＲＮＡおよびＣＮＥと比較した。
【００２８】
【図２０−１】図２０Ａ〜図２０Ｅ。マウスに筋肉内注射で表示用量のＮＬＣ製剤化ＲＮＡを接種した。ＮＬＣｖ２（ＱＧ９４２）を、ＺＩＫＶ  ｐｒＭ／ＥをコードするｒｖＲＮＡと、Ｎ：Ｐ値１５で複合体形成させた。１００ｎｇ、３０ｎｇ、１０ｎｇ、および３ｎｇの用量をＣ５７ＢＬ／６マウスに単回筋肉内注射で投与し（ｎ＝１４／群）、１４日後に採血し、ＰＲＮＴ８０で中和抗体価を評価するか（図２０Ａ）、または、安楽死させて（ｎ＝４／群）総脾細胞における抗原特異的Ｂ２２０ｌｏＣＤ８＋ＩＦＮγ＋Ｔ細胞の割合を定量化し（図２０Ｂ）、モックワクチン接種マウス（基剤）、または１００ｎｇもしくは１０ｎｇのｒｖＲＮＡ単独（スクロース）（ｎ＝１４／群）、または１００ｎｇの、Ｎ：Ｐ値１５でＮＬＣｖ１（ｎ＝１４）もしくはＣＮＥ（ｎ＝４）で製剤化したｒｖＲＮＡと比較した（図２０Ａ〜図２０Ｂ）。データは、個々の値と、平均値±標準偏差として示されている。
【００２９】
接種の３０日後、残りの１０匹／群のマウスを、Smith et al., PLoS Negl Trop Dis. 11(1):e0005296 (2017)に記載されているようにＩ型インターフェロンの抗体遮断を行った後、５ｌｏｇ１０  ＰＦＵのＺＩＫＶ  Ｄａｋａｒ  ４１５２５菌株でチャレンジし、４日後に採血してプラークアッセイにより血液中のウイルス（viremia）を定量化した（図２０Ｃ）。データは、個々の値と、平均値±標準偏差として示されている。生存率（図２０Ｄ）および体重減少（図２０Ｅ）についてマウスを毎日モニタリングした。図２５Ｅのデータは平均値±標準偏差として示されている。図２０Ａおよび図２０ＣのデータをＬｏｇ１０変換したものを、一元配置分散分析後のテューキーの多重比較検定により解析した（図２５ＡのＰＲＮＴ８０抗体価は、対照群であるモック、非製剤化型の１００ｎｇおよび１０ｎｇの用量と、ＮＬＣｖ２製剤型の１００ｎｇ、３０ｎｇ、および１０ｎｇの用量との間では＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、または、ＣＮＥ製剤型１００ｎｇとの間では＊ｐ＝０．０４；ＮＬＣｖ２製剤型の１００ｎｇおよび３０ｎｇの用量と、ＣＮＥ製剤型１００  ｎｇとの間では＊＊ｐ＝０．００６；図２０Ｃの血中ウイルス価は、対照群であるモック、非製剤化型の１００ｎｇおよび１０ｎｇの用量と、ＮＬＣｖ２製剤型またはＮＬＣｖ１製剤型の全用量との間では、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図２０Ｅのデータを２元配置分散分析後のテューキーの多重比較検定により解析した（５日目〜１０日目の体重変化率、対照群であるモック、または１００ｎｇおよび１０ｎｇのｒｖＲＮＡ単独と、全製剤型群との間で、＊ｐ＜０．０５）。図２０Ａ〜図２０Ｃのデータは２つの独立した実験の代表である。
【図２０−２】同上。
【図２０−３】同上。
【００３０】
【図２１−１】図２１Ａ〜図２１ＤはＺＩＫＶ  ｒｖＲＮＡの設計および品質保証を示している。図２１Ａは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下にある、ワクチン株ＴＣ−８３由来のベネズエラウマ脳炎レプリコンをコードするプラスミドＤＮＡを示している。非翻訳領域（ＵＴＲ）、サブゲノム領域（ＳＧ）、目的遺伝子（gene of interest）（ＧＯＩ）。図２１Ｂは、ＺＩＫＶ  Ｈ／ＰＦ／２０１３菌株のプレメンブレン（ｐｒＭ）遺伝子およびエンベロープ（Ｅ）遺伝子、または分泌型ヒト胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードする複製型ウイルスＲＮＡの設計を示している。ＺＩＫＶ  ｒｖＲＮＡまたはＳＥＡＰ  ｒｖＲＮＡでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の上清を、３０％スクロースの中を沈降させた後、抗ＺＩＫＶポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロット（図２１Ｃ）および／または透過型電子顕微鏡法（図２１Ｄ）で分析した。
【図２１−２】同上。
【００３１】
【図２２−１】図２２Ａ〜図２２Ｈは、ＮＬＣｖ２とｒｖＲＮＡとの間の物理的な関係を、遺伝子発現、免疫原性、および反応源性を含む生物学的反応と併せて、図化している。インビトロの実験（図２２Ａ〜図２２Ｄ）について、ＮＬＣｖ２を様々なＮ：Ｐ比でＳＥＡＰ  ｒｖＲＮＡと複合体を形成させ、遺伝子発現（図１１Ａ）を上記の通りのＳＥＡＰアッセイで測定し、粒径（図１１Ｂ）およびゼータ電位（図２２Ｃ）を動的光散乱で測定し、ＲＮＡ結合率（図２２Ｄ）をゲル電気泳動後のデンシトメトリーにより測定した。図２２Ａ〜図２２Ｄのデータは平均値±標準偏差として示されており、少なくとも３つの独立した実験の代表である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いるインビボ実験（図２２Ｅ〜図２２Ｇ）では、ＮＬＣｖ２をＺＩＫＶ  ｒｖＲＮＡまたはＳＥＡＰ  ｒｖＲＮＡと３、５．６、１５、および３７のＮ：Ｐ比で複合体形成させ、マウス（ＳＥＡＰはｎ＝３／群、またはＺＩＫＶはｎ＝５／群）に１０００ｎｇ、１００ｎｇ、もしくは１０ｎｇのＳＥＡＰ  ｒｖＲＮＡまたは１０００ｎｇもしくは１００ｎｇのＺＩＫＶ  ｒｖＲＮＡを筋肉内経路で注射した。注射の３日後にＳＥＡＰ定量によりＳＥＡＰ発現を測定し（図２２Ｅ〜図２２Ｇ）、注射の１４日後にＰＲＮＴ８０によりＺＩＫＶ中和抗体価を測定した（図２２Ｆ〜図２２Ｇ）。反応源性（図２２Ｈ）の測定のために、モルモット（ｎ＝４／群）に、Ｎ：Ｐ値３、５．６、１５、および３７でＮＬＣｖ２と複合体形成されたＺＩＫＶ  ｒｖＲＮＡを５０μｇ、皮内経路で注射し、２４時間後に発赤直径を測定した。図２２Ｅ〜図２２ＧのＳＥＡＰデータは平均値±標準偏差として表されており、単一の実験で得られたものである。一方、図２２Ｆおよび図２２ＧのＰＲＮＴ８０データは平均値±標準偏差おより最小／最大箱ひげ図として表されており、３つの独立した実験のうちの代表である。図２２Ｈのデータは単一の実験から得られたものであり、平均値±標準偏差および最小／最大箱ひげ図で個々のバイオロジカルレプリケートとして表される。図２２ＧのＰＲＮＴ８０データのＬｏｇ１０変換は、一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定で解析された（Ｎ：Ｐ値３７の力価とＮ：Ｐ値１５の力価は有意差なし；Ｎ：Ｐ値１５の力価とＮ：Ｐ値５．６の力価は、＊＊ｐ＝０．００３３）。図２２Ｈのデータは、一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定で解析された（Ｎ：Ｐ値３７とＮ：Ｐ値１５の発赤直径は、＊＊＊ｐ＝０．０００４；Ｎ：Ｐ値１５とＮ：Ｐ値５．６またはＮ：Ｐ値３は、有意差なし）。これらのデータによって裏付けられる、ＮＬＣとｒｖＲＮＡとの間の物理的相互作用の仮定モデルを、図２２Ｄに図示する。
【図２２−２】同上。
【００３２】
【図２３−１】図２３Ａ〜図２３ＥはＲＮＡ積載量が増強されたＮＬＣｖ２の特徴を示している。図２３ＡはＤＬＳで測定された粒径を示している。データはＺ平均として表される。図２２Ｂは、未処理ｒｖＲＮＡ（レーン２）、ＮＬＣｖ２  ｒｖＲＮＡ（レーン４）、リボヌクレアーゼ処理ｒｖＲＮＡ（レーン３）、ＮＬＣｖ２  ｒｖＲＮＡ（レーン５）の変性ＲＮＡアガロースゲル電気泳動を示している。データは３つの独立した試験の代表である。図２３Ｃは、漸増濃度のｒｖＲＮＡと複合体形成されたＮＬＣｖ１またはＮＬＣｖ２を変性アガロースゲル電気泳動にかけた後にデンシトメトリー解析によって測定された、ＮＬＣｖ１またはＮＬＣｖ２に結合したＲＮＡの割合（％）を示している。データは３つの独立した実験の代表である。図２３Ｄは、様々なＮ：Ｐ比でＳＥＡＰ  ｒｖＲＮＡと複合体形成されたＮＬＣｖ１またはＮＬＣｖ２と共に２４時間インキュベートした後のＢＨＫ細胞上清におけるＳＥＡＰ発現を示している。データは３つのバイオロジカルレプリケートの平均値±標準偏差として表され、３つの独立した実験の結果の代表である。比較目的で図２３ＥからＮＬＣｖ１データを複製した。図２３Ｅについては、モルモット（ｎ＝４／群）に、単回５０μｇ用量の非製剤化ＺＩＫＶ  ｒｖＲＮＡ、または、５μｇもしくは０．５μｇのＮＬＣｖ１製剤化ＺＩＫＶ  ｒｖＲＮＡ、または、５０μｇ、５μｇ、もしくは０．５μｇのＮＬＣｖ２製剤化ＺＩＫＶ  ｒｖＲＮＡを、筋肉内経路または皮内経路で接種し、２８日後に血清中和抗体価をＰＲＮＴ８０測定により定量した。それぞれの各データポイントが平均値±標準偏差と共に記載される。データのＬｏｇ１０変換を一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定で解析した（５μｇ用量のＮＬＣｖ１製剤と５μｇ用量のＮＬＣｖ２製剤とを比較して、筋肉内の場合＊ｐ＝０．０５、皮内の場合＊ｐ＝０．０４）。
【図２３−２】同上。
【図２３−３】同上。
【００３３】
【図２４】図２４Ａ〜図２４Ｂ。図２４Ａは、上記の図１１Ｃで回収された血清の連続希釈による、インビトロにおけるＺＩＫＶ中和を示している。それぞれの血清希釈度を平均値±標準偏差としてプロットし、Ｓ字形非線形回帰モデルを用いて曲線あてはめを行った。データを２元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定で複合解析した（１／６４０の血清希釈度において、ＮＬＣ  Ｓｐａｎ  ６０とＣＮＥ  Ｓｐａｎ  ８５との比較およびＣＮＥ  Ｓｐａｎ  ６０とＣＮＥ  Ｓｐａｎ  ８５との比較では、＊ｐ＜０．０５；ＮＬＣ  Ｓｐａｎ  ６０とＣＮＥ  Ｓｐａｎ  ６０との比較では、＊＊ｐ＜０．０００１）。図２４Ｂは、非製剤化型（単独）の、または、Ｎ：Ｐ値１５で、スクアレンエマルジョン中にＳＰＡＮ６０もしくはＳＰＡＮ８５を含有するＣＮＥと複合体形成された、または、Ｓｐａｎ６０、Ｓｐａｎ８０、もしくはＳｐａｎ８５およびスクアレン／Ｄｙｎａｓａｎを含有するＮＬＣと複合体形成された、または、Ｓｐａｎ６０およびＭｉｇｌｙｏｌ（登録商標）／Ｄｙｎａｓａｎエマルジョンを含有するＮＬＣと複合体形成された、４０ｎｇのＺＩＫＶ  ｒｖＲＮＡと共に、２４時間インキュベートした後に回収されたヒト末梢血単核球（ｎ＝６ドナー）の上清中の、ＥＬＩＳＡで測定された、Ｍｉｐ−１β濃度を示している。ドナー当たり２つのテクニカルレプリケートでＥＬＩＳＡを実施した。６人のドナーの平均値±標準偏差と共に、各ドナーの平均値をプロットしている。データを一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定で複合解析した（ＮＬＣ−Ｓｐａｎ６０−スクアレンまたはＮＬＣ−Ｓｐａｎ８５−スクアレンを単独またはＣＮＥ−Ｓｐａｎ８５と比較、＊＊ｐ＜０．００５）。
【００３４】
【図２５】図２５は、ＮＬＣｖ１またはＣＮＥで製剤化されたｒｖＲＮＡのインビボ送達後のタンパク質発現の動態を示している。ＳＥＡＰをコードするｒｖＲＮＡをＮＬＣｖ１、ＣＮＥ、または１０％スクロース（単独）で製剤化し、１００ｎｇをＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３／群）に筋肉内経路で投与した。１０％スクロース単独を注射されたモックマウスを陰性対照として用いた。３日目、７日目、１４日目、２１日目、および２８日目にマウスから採血し、血清ＳＥＡＰ活性をＳＥＡＰアッセイで測定した。
【００３５】
【図２６】図２６は、ＮＬＣｖ１のｒｖＲＮＡ積載量の最適化を示している。ＳＥＡＰをコードするｒｖＲＮＡを１０％スクロースで最終濃度４００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、および４０μｇ／ｍＬに希釈し、穏やかなピペッティングによりＮＬＣｖ１と１：１で複合体形成させた。ＣＮＥは４０μｇ／ｍＬのｒｖＲＮＡと１：１で複合体形成させた。次に、複合体化ｒｖＲＮＡまたは非製剤化ｒｖＲＮＡを、それぞれの５０μＬ筋肉内注射が１００ｎｇ用量を与えるような投与用に１０％スクロースで希釈した。３日後、マウスから採血し、ＳＥＡＰ定量により血清ＳＥＡＰ活性を測定し、モック注射マウスと比較した。
【００３６】
【図２７】図２７は、血清ＳＥＡＰ活性に対する高容量ＮＬＣ中のスクアレン濃度減少の影響を示している。３０ｗ／ｖ％、１５ｗ／ｖ％、７．５ｗ／ｖ％、および３．７５ｗ／ｖ％のスクアレンを用いて製造された高容量ＮＬＣ（３ｗ／ｖ％のＤＯＴＡＰを含有）を、Ｎ：Ｐ値３７で、ＳＥＡＰをコードするｒｖＲＮＡと１：１で複合体形成させ、１００ｎｇを筋肉内経路でＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３／群）に投与し、３日後に血清ＳＥＡＰ活性を測定し、非製剤化ｒｖＲＮＡ注射マウスまたはモック注射マウスと比較した。
【００３７】
【図２８−１】図２８Ａ〜図２８Ｇは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＮＬＣｖ１／ｒｖＲＮＡ複合体の免疫原性および有効性を示している。ＮＬＣｖ１をｒｖＲＮＡまたはＺＩＫＶ  ｐｒＭ／ＥをコードするｍＲＮＡとＮ：Ｐ値５０で複合体形成させ、単回１μｇ用量をＣ５７ＢＬ／６マウスに筋肉内注射で投与し（ｎ＝９／群）、１４日後に採血して、ＰＲＮＴ８０による中和抗体価を、モック接種マウス、または１０μｇもしくは１μｇのｒｖＲＮＡ単独もしくはｍＲＮＡ単独（ｎ＝９／群）、または１μｇのＣＮＥ製剤化ｒｖＲＮＡ（Ｎ：Ｐ値５０）と比較して、評価した（図２８Ａ）。データは、個々の値と、平均値±標準偏差として示されている。接種の３０日後、６匹／群のマウスを、Smith et al., PLoS Negl Trop Dis 11(1):e0005296 (2017)に記載されているようにＩ型インターフェロンの抗体遮断を行った後、５ｌｏｇ１０  ＰＦＵのＺＩＫＶ  Ｄａｋａｒ  ４１５２５菌株でチャレンジし、４日後に採血してプラークアッセイにより血中ウイルスを定量した（図２０Ｂ）。生存率（図２９Ｃ）および体重減少（図２８Ｄ）についてマウスを毎日モニタリングした。残りの３匹／群のマウスには３０日目に２回目の接種を行い、ブースト後のＣＤ８＋Ｔ細胞応答を評価した。１４日後、マウスを安楽死させ、脾細胞を単離し、染色し、ＩＦＮγ陽性（図２８Ｅ）、ＣＤ１０７ａ陽性（図２８Ｆ）、またはＴＮＦα陽性（図２８Ｇ）であるＢ２２０ｌｏＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（％）をフローサイトメトリーで定量した（図３７）。
【図２８−２】同上。
【図２８−３】同上。
【図２８−４】同上。
【００３８】
【図２９】図２９は、４種類のＭｔｂ抗原／タンパク質（Ｒｖ３６１９、Ｒｖ２３８９、Ｒｖ３４７８、およびＲｖ１８８６）を含む例示的な融合タンパク質ＩＤ９１（上段）、およびＩＤ９１をコードするアルファウイルスレプリコンの設計を図示している。このレプリコンコンストラクトはレポーター遺伝子としてＧａｕｓｓｉａルシフェラーゼシグナルを含んでいる。
【００３９】
【図３０−１】図３０Ａ〜図３０Ｂは、タンパク質ベースまたはＲＮＡベースのＩＤ９１ワクチンからの、ＴＨ１サイトカインを分泌するＣＤ４＋／ＣＤ４４＋Ｔ細胞（図３０Ａ）またはＣＤ８＋／ＣＤ４４＋Ｔ細胞（図３０Ｂ）の割合（％）を示している。２元配置分散分析を用いて統計的有意性（P＜０．０５）を解析し、アステリスクで示した。
【図３０−２】同上。
【００４０】
【図３１−１】図３１Ａ〜図３１Ｄは、増殖性またはサイトカイン産生性のＣＤ４＋集団からのデータを示している。ＩＤ９１タンパク質／ＧＬＡ−ＳＥ（青）またはＩＤ９１  ＲＮＡ／ＱＧ８０７（赤）を接種したマウス由来の脾細胞を、培地、ＩＤ９１完全タンパク質、１０ペプチドがプールされたＩＤ９１重複ペプチドの１３種類のペプチドプールで刺激した。
【図３１−２】同上。
【００４１】
【図３２−１】図３２Ａ〜図３２Ｄは、増殖性またはサイトカイン産生性のＣＤ８＋集団からのデータを示している。ＩＤ９１タンパク質／ＧＬＡ−ＳＥ（青）またはＩＤ９１  ＲＮＡ／ＱＧ８０７（赤）を接種したマウス由来の脾細胞を、培地、ＩＤ９１完全タンパク質、１０ペプチドがプールされたＩＤ９１重複ペプチドの１３種類のペプチドプールで刺激した。
【図３２−２】同上。
【００４２】
【図３３−１】図３３Ａ〜図３３Ｂは、ＩＤ９１  ＲＮＡの接種が予防的な保護をもたらし、ＩＤ９１タンパク質と比較した場合にＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの誘導に差異が生じたという所見を示している。マウスのコホートにＩＤ９１タンパク質＋ＧＬＡ−ＳＥまたはＩＤ９１抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡを３週間の間隔を空けて２回接種し、脾臓細胞を単離し、ＩＤ９１ペプチドを用いてインビトロで再刺激した。ヒートマップの強度スケールは、各プールに応答した、ＣＤ４＋（赤）およびＣＤ８＋（青）Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン応答の割合を示している（図３０Ａ）。図３３Ａにおいて、Ｍは培地のみ、ＩＤ９１はＩＤ９１単独、およびＰＰ１〜ＰＰ１３はペプチドプール１〜１３を表す。右側のスケールは、ＣＤ４＋集団またはＣＤ８＋集団からの、増殖性細胞またはサイトカイン＋細胞の割合を示している。図３３Ｂは、Ｍｔｂ  Ｈ３７Ｒｖチャレンジの３週間後の肺ホモジネートから評価された細菌負荷を示している。マウスコホートに、生理食塩水、ＩＤ９１タンパク質＋ＧＬＡ−ＳＥ、またはＩＤ９１抗原をコードするアルファウイルスＲＮＡを含むＲＮＡ製剤を、１回接種し、その３週間後に再度チャレンジを行った。一元配置分散分析およびダネットの多重比較検定により生理食塩水と比較した場合の有意性（ｐ＜０．０５）を、アステリスクにより示す。
【図３３−２】同上。
【００４３】
【図３４−１】図３４Ａ〜図３４Ｂは、Ｚｉｋａウイルス（ＺＩＫＶ）または日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）に由来するシグナル配列を比較している。図３４Ａは、ｐｒＭの上流にＺＩＫＶシグナル配列またはＪＥＶシグナル配列を有する、ＺＩＫＶ  ｐｒＭ／ＥをコードするｒｖＲＮＡの設計を示している。図34Bでは、ＺＩＫＶ  ｐｒＭ／ＥおよびＺＩＫＶシグナル配列またはＪＥＶシグナル配列をコードするｒｖＲＮＡを、１０％スクロース中で（単独）、または陽イオン性ナノエマルジョンと（ＣＮＥ）、製剤化し、１０μｇの当該１０％スクロース製剤または１μｇの当該ＣＮＥ製剤を筋肉内経路でＣ５７ＢＬ／６マウスに注射し（ｎ＝５／群）、２１日後に血清中のＰＲＮＴ８０力価を測定した。その後、マウスを２回目の接種でブーストし、さらに２１日後にＰＲＮＴ８０力価を測定した。
【図３４−２】同上。
【００４４】
【図３５】図３５は、ＮＬＣ粒径（Ｚ平均（ｎｍ））に対する界面活性剤：油モル比の影響を示している。油の含量を一定に保ちながら、界面活性剤の総量を変化させることで、界面活性剤：油比を変化させた。実験データは単相指数関数的減衰式（Ｒ２＝０．９７２）に近似された。全ての製剤は同一条件（３０，０００ｐｓｉで１０回循環）下でマイクロフルイダイザー処理した。
【００４５】
【図３６−１】図３６Ａ〜図３６Ｂは、インビボにおける、リボヌクレアーゼチャレンジからの保護およびＳＥＡＰ発現ｒｖＲＮＡの送達に対する親水性界面活性剤の影響を示している。ｒｖＲＮＡを、１０ｍＭクエン酸緩衝液を用いてまたは用いずに製造された、界面活性剤および陽イオン性脂質の合計が７０％または３５％の、各種ＮＬＣと複合体形成させ、リボヌクレアーゼチャレンジからｒｖＲＮＡを保護する能力を評価した（図３６Ａ）。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３／群）に、１０％スクロース（単独）、または界面活性剤および陽イオン性脂質の合計が７０％もしくは３５％のＮＬＣ、またはＣＮＥと複合体形成させたＳＥＡＰをコードするｒｖＲＮＡを投与し、３日後に血清ＳＥＡＰ活性を測定した（図３６Ｂ）。
【図３６−２】同上。
【００４６】
【図３７】図３７は、例示的なフローサイトメトリーのゲーティング戦略を示している。
【００４７】
【図３８】図３８Ａ〜図３８Ｂは、制限酵素で改変を受けたＩＤ９１の例を図示している。図３８ＡはｐＥＴ２９ベクターを図示しており、図３８ＢはｐＥＴ２８ベクターを図示している。
【００４８】
【図３９−１】図３９Ａ〜図３９Ｅは、ＮＬＣ製剤を含むまたは含まない、ＴＬＲ３（Ｒｏｂｏｘｘｏｌ、ｐＩＣ：ＨＭＷ）作動薬およびＲＩＧ−Ｉ（ＳＥＶＤＩ）作動薬で刺激後の、ヒトＰＢＭＣ由来ＤＣにおける自然免疫シグナル伝達を示している。６人のヒトドナーから得たＰＢＭＣ−ＤＣを、ＮＬＣ製剤化型（「ＱＧ９４２製剤化」）または単独（「非製剤化」）のｐｏｌｙＩＣ：ＨＭＷ、Ｒｉｂｏｘｘｏｌ、またはＳＥＶＤＩで刺激した。製剤のみの対照は「培地対照」と標識される。３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で２４時間のインキュベートした後、市販のＥＬＩＳＡキットを用いて、上清を自然免疫マーカーの濃度について定量した。２元配置分散分析およびシダックの多重比較検定により統計解析を行った。Ｐ値：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図３９−２】同上。
【図３９−３】同上。
【００４９】
【図４０】図４０は、ＲｉｂｏｘｘｏｌアジュバントまたはｐＩＣ：ＨＭＷアジュバントで刺激されたＭＭ６細胞におけるＩＦＮα／βの誘導を示している。細胞はＲＮＡ単独または製剤化ＲＮＡで刺激した。製剤組成は表ＸＸに示す。非刺激ＭＭ６細胞と比較して、刺激されたＭＭ６細胞の上清からのＩＦＮα／βを測定し、ＨＥＫ−ｂｌｕｅ  ＩＦＮα／β  ＳＥＡＰレポーター細胞株を用いて決定した。点線は、既知の（nown）ＩＦＮα濃度の添加後に測定された、相対的刺激に相当する。
【００５０】
【図４１】図４１は、Ｎ：Ｐモル比およびｒｉｂｏｘｘｏｌ用量の関数としてのＩＦＮα／β誘導をまとめたヒートマップを示している。
【００５１】
【図４２−１】図４２Ａ〜図４２Ｄは、ＮＬＣまたはＳＥと製剤化されたｄｓＲＮＡアジュバントの投与後のサイトカイン発現を示している。
【図４２−２】同上。
【図４２−３】同上。
【００５２】
【図４３】図４３は、ｄｓＲＮＡアジュバント（ＴＬＲ３リガンド）およびＮＬＣと製剤化されたＳＥＡＰの投与後のＳＥＡＰ発現の減少を示している。
【００５３】
【図４４】図４４Ａ〜図４４Ｂは、ＮＬＣ、ＳＥ、または対照と製剤化されたＶＥＥｒｅｐ−ＳＥＡＰの投与後のＩＰ−１０（図４２Ａ）およびＳＥＡＰ発現（図４２Ｂ）を示している。図４２Ａにおいて、＊＊＊＝１μｇ＋ＱＧ９４２と１μｇ単独との比較の統計的有意性。図４２Ｂにおいて、＊＝１μｇ＋ＱＧ９４２と０．１μｇ＋ＱＧ９４２との間の比較の統計的有意性、＊＊＝０．１μｇ＋ＱＧ９４２と０．１μｇＳＥまたは単独との間の比較の統計的有意性、＊＊＊＝０．１μｇ＋ＱＧ９４２と０．１μｇ単独との間の比較の統計的有意性。
【図４５−１】図４５は、抗原特異的な抗体応答を示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、表示のアジュバント製剤と混合されたＬＥＩＳＨ−Ｆ２タンパク質１μｇを、３週間の間隔を空けて合計２回注射した。２１日目（ブースト前）および４２日目に血清を採取し、抗原特異的なＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｃのエンドポイント力価をＥＬＩＳＡで測定した。データは５匹／群のマウスの平均値＋ＳＤとして示される。
【図４５−２】同上。
【００５４】
【図４６】図４６Ａ〜図４６Ｂは、Ｔ細胞応答に対するＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）製剤の影響を示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、表示のアジュバント製剤と混合されたＬＥＩＳＨ−Ｆ２タンパク質１μｇを、３週間の間隔を空けて合計２回注射した。最後の接種の３週間後、脾臓を摘出して単一細胞懸濁液を作製し、細胞をＬＥＩＳＨ−Ｆ２抗原と共にインキュベートした後に、培養上清中のサイトカイン量をＥＬＩＳＡで測定した。データは、最小値および最大値、２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイルを示すボックス、並びにボックス内の水平バーで示される平均値、として示される（５匹／群のマウス）。
【００５５】
【図４７−１】図４７Ａ〜図４７Ｅは、Ｔ細胞応答に対するＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）製剤の影響を示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、表示のアジュバント製剤と混合されたＬＥＩＳＨ−Ｆ２タンパク質１μｇを、３週間の間隔を空けて合計２回注射した。最後の接種の３週間後、脾臓を摘出して単一細胞懸濁液を作製し、細胞をＦ２抗原と共にインキュベートした後に、細胞の表現型をフローサイトメトリーで決定した。データは、各マウスの個々のポイント、並びに、水平バーおよび垂直バーで各々示される平均値＋ＳＥＭ、として表される。Ｎ＝５匹／群のマウス。
【図４７−２】同上。
【図４７−３】同上。
【００５６】
【図４８】図４８は、抗原特異的な抗体応答に対するＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）製剤の影響を示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、表示のアジュバント製剤と混合されたＬＥＩＳＨ−Ｆ３＋タンパク質１ｍｇを、１回注射した。接種の４週間後、血清を回収し、抗原特異的なＩｇＧのエンドポイント力価をＥＬＩＳＡで測定した。データは、各動物の個々のポイント、並びに平均値＋ＳＥＭ、として示される。Ｎ＝５匹／群のマウス。
【００５７】
【図４９−１】図４９Ａ〜図４９Ｃは、Ｔ細胞応答に対するＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）製剤の影響を示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、表示のアジュバント製剤と混合されたＬＥＩＳＨ−Ｆ３＋タンパク質１μｇを、１回注射した。最後の接種の４週間後、脾臓を摘出して単一細胞懸濁液を作製し、細胞をＦ３＋タンパク質またはＭＨＣＩ制限ペプチド（ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープ）と共にインキュベートした後に、培養上清中のサイトカイン量をＥＬＩＳＡで測定した。データは、各マウスの個々のポイント、並びに、水平バーおよび垂直バーで各々示される平均値＋ＳＥＭ、として表される。Ｎ＝５匹／群のマウス。
【図４９−２】同上。
【００５８】
【図５０−１】図５０Ａ〜図５０Ｇは、様々な製剤との免疫原性応答に対する抗原ワクチン送達の影響を示している。
【図５０−２】同上。
【００５９】
【図５１】図５１Ａ〜図５１Ｂは、様々な製剤との免疫原性応答に対する抗原ワクチン送達の影響を示している。
【００６０】
【図５２−１】図５２Ａ〜図５２Ｃは、様々な製剤との免疫原性応答に対する抗原ワクチン送達の影響を示している。
【図５２−２】同上。
【図５２−３】同上。
【００６１】
本明細書で参照される特定の配列を表１に列挙する。
【表１−１】
2020524143.tif 000003
【表１−２】
2020524143.tif 000004
【表１−３】
2020524143.tif 000005
【表１−４】
2020524143.tif 000006
【表１−５】
2020524143.tif 000007
【表１−６】
2020524143.tif 000008
【表１−７】
2020524143.tif 000009
【表１−８】
2020524143.tif 000010
【表１−９】
2020524143.tif 000011
【表１−１０】
2020524143.tif 000012
【表１−１１】
2020524143.tif 000013
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本明細書では、生物活性剤を細胞に送達するための組成物、およびそのような送達の方法が提供される。ＮＬＣは液相脂質と固相脂質との組み合わせから構成されるコアを有する。完全に固体の結晶コアを有する固体脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）とは異なり、ＮＬＣの混合相コアは、自由度が高く、様々な構造の活性分子を取り込める。理論に制限されるものではないが、この組成物に固体脂質を加えることにより、ＮＬＣコアが構造的な完全性と安定性とを得ると考えられている。本発明のＮＬＣでは、混合相の油性コアを、界面活性剤（通常、ソルビタンエステルおよび親水性界面活性剤）と、陽イオン性成分（通常、陽イオン性の脂質またはリン脂質）との混合物で乳化する。通常、小分子薬剤などの生物活性剤がＮＬＣの油性コアに組み込まれるが、本発明者らは、負の電荷を帯びた分子（例えば、ＲＮＡ）などの生物活性剤と表面または表面付近で相互作用できるＮＬＣ（すなわち、この生物活性剤はＮＬＣによってカプセル化されていない）を合成した。本発明者らは、本ＮＬＣは安定であり、本ＮＬＣは核酸を細胞に送達することができ、且つ、生物活性剤である核酸とＮＬＣとは別々に製造および保存して使用の直前に混合でき、これ故、係るＮＬＣは、複数の予防的または治療的な処置を開発するための、高速応答核酸プラットフォーム技術をはじめとする様々な応用に利用できる、という知見を得た。この高速応答核酸送達プラットフォームは、ＮＬＣ組成物を利用して、ＲＮＡ複製および／またはタンパク質発現を駆動する核酸（例えば、複製ウイルスＲＮＡ（ｒｖＲＮＡ））を送達するという、柔軟性のある系をベースとしている（例えば、多種多様なウイルス抗原、細菌抗原または寄生虫抗原に対するロバスト且つ迅速な免疫応答をもたらす）。本発明のＮＬＣ組成物は製造後に長期間貯蔵することができる。その後、貯蔵後の基剤は、新興疾患発生または他の公衆衛生イベントの際に、核酸（例えば、感染防御抗原を発現する合成ｒｖＲＮＡ）と組み合わせることができる。
【００６３】
生物活性剤と組み合わせるためのＮＬＣを提供する以外に、組み合わせが既になされているＮＬＣも提供される。すなわち、いくつかの態様では、前記生物活性剤が前記ＮＬＣと結合されている。このＮＬＣ−生物活性剤組成物を投与することにより、必要な時に、この生物活性剤を対象に送達することができる。
【００６４】
Ｉ．定義
【００６５】
特に記載がない限り、下記の用語は下記の意味を有する。定義がなされていない用語はいずれも、当該技術分野において認知されているその意味を有する。
【００６６】
本明細書では、特に記載がない限り、「約（about）」および「実質的に成る（consisting essentially of）」という用語は、表示されている範囲、値、または構造の±２０％を意味する。
【００６７】
択一（例えば、「または（or）」）の使用は、択一物の一方、両方、またはそのあらゆる組み合わせを意味すると理解されたい。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「包含する（include）」、「有する（have）」および「含む（comprise）」という用語は、同義的に使用されており、これらの用語およびその変形は非限定的な用語と解釈されることが意図される。
【００６９】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数を表す語形である「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈によって特に明示されない限り、複数形を包含する。
【００７０】
用語「高分子」とは、本明細書で使用される場合、巨大分子を指し、例えば、生物由来または合成由来の、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００７１】
用語「アルキル」とは、直鎖状または分岐鎖状の、非環式または環式の、不飽和または飽和の、表示される数の炭素原子を含有する脂肪族炭化水素を意味する。不飽和アルキルは、隣接する炭素原子の間に少なくとも１個の二重結合または三重結合を含有する。
【００７２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では同義的に使用されており、あらゆる長さのアミノ酸重合体を指す。この重合体は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、修飾ヌクレオチドまたは修飾アミノ酸を含んでいてもよく、さらに、ヌクレオチド以外のものまたはアミノ酸以外のものにより途切れていてもよい。これらの用語は、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、またはあらゆる他の操作もしくは修飾、例えば標識成分との結合など、天然にまたは介入により修飾されたヌクレオチド重合体またはアミノ酸重合体をも包含する。また、１または複数のヌクレオチド類似体またはアミノ酸類似体（例えば、非天然アミノ酸などが挙げられる）を含有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドなども前記定義に含まれ、当該技術分野において公知の他の修飾が含有されていてもよい。
【００７３】
用語「単離された（isolated）」とは、その分子がその天然の環境から取り除かれていることを意味する。
【００７４】
「精製された（purified）」とは、天然環境で存在しているときと比較して、および／または、実験室条件下で最初に合成および／もしくは増幅されたときと比較して、分子がより純度の高い形態で存在するように、分子の純度が増加されていること、を意味する。純度は相対的な用語であり、必ずしも絶対純度を意味しない。
【００７５】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書では同義的に使用されており、ＤＮＡおよびＲＮＡ含む、あらゆる長さのヌクレオチド重合体を指す。このようなヌクレオチドは、例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらの類似体とすることもできるし、ＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼによってまたは合成反応によって重合体に組み込むことができるあらゆる基質とすることもできる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びその類似体などの修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。修飾を行う場合、ヌクレオチド構造の修飾は重合体構築の前でも後でもよい。
【００７６】
「オリゴヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、短く、通常は一本鎖であり、通常は合成型の、必ずしもそうである必要はないが通常は約２００ヌクレオチド長未満である、ポリヌクレオチドを通常は指す。「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は互いに排他的ではない。ポリヌクレオチドに関しての上記の記述はオリゴヌクレオチドにも等しく且つ完全にあてはまる。
【００７７】
「個体」または「対象」は哺乳動物であれば特に限定されない。哺乳類の例としては、ヒト、霊長類、家畜、競技動物（sport animal）、ペット（ネコ、イヌ、ウマ）、およびげっ歯類が挙げられ、これらに限定はされない。
【００７８】
「レプリコン」には、本明細書で使用される場合、それ自体の制御の下で大量複製を可能とするあらゆる遺伝因子、例えば、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ、またはウイルス、が含まれる。レプリコンはＲＮＡであってもＤＮＡであってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
【００７９】
ビタミンＥとは、トコフェロール（ＴＣＰ）およびトコトリエノールの両方を指し、天然ビタミンＥとすることも合成ビタミンＥとすることもできる。
【００８０】
モノアシルグリセロールは、三価アルコールであるグリセロールのエステルであって、ヒドロキシル基の１つが長鎖脂肪酸でエステル化しているものである。
【００８１】
ラウロイルポリオキシルグリセリドは、グリセロールのモノエステル、ジエステル、およびトリエステル、並びにポリエチレングリコールのモノエステルおよびジエステルの混合物であり、典型的な平均相対分子量は約３００〜約１５００である。
【００８２】
トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリルは、グリセリンのトリエステルと、カプリル酸と、カプリン酸との混合物である。
【００８３】
液相脂質という用語は、他の成分と混合される前に室温で液体である脂質を指す。
【００８４】
固相脂質という用語は、他の成分と混合される前に室温で固体である脂質を指す。
【００８５】
室温は１５℃〜２５℃である。
【００８６】
グリセロ脂質は、脂肪酸とエステル結合したグリセロールから構成される脂肪性分子である。グリセロ脂質にはトリグリセリドおよびジグリセリドが含まれる。
【００８７】
用語「ソルビタンエステル」とは、本明細書で使用される場合、ソルビタンのエステルを指す。ソルビタンは式Ａで示される。
【００８８】
【化１】
2020524143.tif 000014
式Ａ
【００８９】
特に好ましいソルビタンエステルは、アルキルがＣ１〜Ｃ３０アルキル基、好ましくは飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、より好ましくは飽和または不飽和のＣ１０〜Ｃ２０アルキル基である、ソルビタンアルキルエステルである。
【００９０】
本発明の実施には、特に記載がない限り、当業者の技能の範囲内にある、従来の分子生物学、組換えＤＮＡ、生化学、および化学の手法を用いることとする。そのような手法は下記の文献において十分な説明がなされている。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al., U.S. Pat. No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.);およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)を参照されたい。
【００９１】
ＩＩ．ナノ構造脂質担体
【００９２】
本開示では、特に、生物活性剤を細胞に送達するためのＮＬＣが提供される。前記ＮＬＣ組成物は、（ａ）液相脂質と固相脂質とから構成される油性コア、（ｂ）陽イオン性成分（好ましくは、陽イオン性の脂質またはリン脂質）、（ｃ）疎水性界面活性剤、好ましくはソルビタンエステル（例えば、ソルビタンモノエステル、ソルビタンジエステル、またはソルビタントリエステル）、および（ｄ）界面活性剤（好ましくは、親水性界面活性剤）、を含むＮＬＣ粒子から構成される。通常、本発明のＮＬＣは、水相に分散した固体脂質および液体脂質の混合物から構成される、構造化されていない、すなわち無定形の、固体脂質マトリックスを含む。上述の界面活性剤のうちの１または複数は、油相中、水相中、または油相と水相の界面に存在し得る。ある態様では、前記ソルビタンエステルおよび前記陽イオン性脂質は油相と水相の界面に存在する。
【００９３】
本発明者らは、特許請求されたＮＬＣがタンパク質をコードする核酸（ＲＮＡなど）の送達において特に有効であることを見出した。さらに、前記ＮＬＣの特定の成分を操作することにより、コードされたタンパク質の発現レベルを増加させることができることを見出した。驚くべきことに、例示的なＮＬＣは、ＲＮＡを効果的に送達できるだけでなく、コードされたタンパク質に対する免疫応答を向上させることもできる。
【００９４】
Ａ．固相脂質および液相脂質
【００９５】
ＮＬＣは固体脂質と液体脂質の混合物で構成される。ＮＬＣに使用される液体脂質および固体脂質は、非構造化または無定形の固体脂質マトリックスを形成し安定な組成物を形成することができる脂質であれば、特に限定はされない。固体：液体の重量比は、広く変動させることができ、例えば０．１：９９．９〜９９．９：０．１である。いくつかの例示的な実施形態では、約７０：３０〜約９９．９：０．１または約１：１０〜約１：３０の固体脂質：液体脂質重量比で、固体脂質は液体脂質と混合される。いくつかの態様では、約１：１６の固体脂質：液体脂質重量において、固体脂質は液体脂質と混合される。
【００９６】
ＮＬＣベースの組成物または製剤の全油性コア成分（固体脂質＋液体油）は、通常、約０．２％〜約５０％（ｗ／ｖ）の量で存在する。例えば、前記ＮＬＣは、約０．２％〜約５０％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、０．２％〜約４０％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約０．２％〜約３０％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約０．２％〜約２０％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約０．２％〜約１５％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約０．２％〜約１０％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約０．２％〜約９％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約０．２％〜約８％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約０．２％〜約７％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約０．２％〜約６％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約０．２％〜約５％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約０．２％〜約４．３％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約０．３％〜約２０％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約０．４％〜約２０％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約０．５％〜約２０％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約１％〜約２０％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約２％〜約２０％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約３％〜約２０％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約４％〜約２０％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約５％〜約２０％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約０．５％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約１％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約１．５％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約２％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約２．５％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約３％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約３．５％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約４％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約４．３％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、約５％（ｗ／ｖ）の油性コア成分、または約１０％（ｗ／ｖ）の油性コア成分を含んでよく、油性コア成分に関して本明細書に記載されている他のいかなる含量または範囲であってもよい。特に希釈または濃縮された製剤を考慮する場合、より高いｗ／ｖ％またはより低いｗ／ｖ％が本明細書で企図される。
【００９７】
前記ＮＬＣの油性コアは液相脂質を含む。必ずしもそうである必要はないが、前記液相脂質は代謝可能な無毒の油であることが好ましく、より好ましくは、６個程度〜３０個程度の炭素原子の油であり、例えば、アルカン、アルケン、アルキン、並びに、それらの対応する酸およびアルコール、そのエーテルおよびエステル、並びにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定はされない。前記油は、対象に投与可能な、あらゆる植物油、魚油、動物油、または合成により作製された油などであり得る。いくつかの態様においては、前記液相脂質は非代謝性の脂質とする。
【００９８】
前記油は、例えば、あらゆる長鎖アルカン、長鎖アルケンもしくは長鎖アルキン、または、遊離酸、その塩、もしくはモノエステル、ジエステル、もしくはトリエステルなどのエステルとしての、その酸誘導体もしくはアルコール誘導体、例えば、１，２−プロパンジオールまたは同様の多価アルコールのトリグリセリドおよびエステル、とすることができる。アルコールはアシル化されたものでもよく、単官能基酸または多官能基酸、例えば酢酸、プロパン酸、クエン酸などを用いてよい。油であり、且つ本明細書に記載の他の基準を満たす長鎖アルコール由来エーテルを用いてもよい。
【００９９】
個々のアルカン部分、アルケン部分、またはアルキン部分、およびその酸誘導体またはアルコール誘導体は、通常、約６〜約４０または６〜約３０個の炭素原子を有することとなる。前記部分は直鎖構造を有しても分岐鎖構造を有してもよい。前記部分は完全飽和であってもよいし、１または複数の二重結合または三重結合を有してもよい。モノエステル系、ポリエステル系、またはエーテル系の油を用いる場合、約６〜約４０個の炭素という制限は、総炭素数にではなく、個々の脂肪酸部分または脂肪族アルコール部分にかかる。
【０１００】
好適であれば、動物、魚、または野菜を供給源とするいかなる油も使用してもよい。植物油の供給源には堅果、種子および穀粒が含まれ、好適な油としては、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、ヤシ油、およびオリーブ油などが挙げられる。他の好適な種子油としては、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油などが挙げられる。穀粒の群では、トウモロコシ油、並びに、コムギ、カラスムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギなどの他の穀類の穀粒の油も使用されてよい。植物油を得るための技術は充実しており周知である。これらの油および他の同様の油の組成物は、例えば、メルクインデックス（Merck Index）、並びに食物、栄養、および食品技術に関する資料、で見つけることができる。
【０１０１】
ほとんどの魚は、容易に回収できる代謝可能な油を含有している。本明細書で使用できるいくつかの魚油として、例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨ろうなどの鯨油が例示される。５炭素のイソプレン単位で、いくつかの分岐鎖油が生化学的に合成されており、これらは一般にテルペノイドと呼ばれる。天然テルペノイドまたは合成テルペノイド、別名イソプレノイドを、本明細書では液相脂質として使用することができる。本明細書においては、分岐鎖状の不飽和テルペノイドであるスクアレンが特に好ましい。スクアレンの主な供給源はサメ肝油であるが、アマランス種子、米糠、コムギ胚芽、およびオリーブ油をはじめとする植物油（主に野菜油）も好適な供給源である。スクアレンの飽和類似体であるスクアランも好ましい。スクアレンおよびスクアランなどの魚油をはじめとする油は、商業的供給源から容易に調達でき、当該技術分野において公知の方法で入手してもよい。本明細書で使用される油は、遺伝子工学をはじめとする合成手段を用いて作製してもよい（例えば、スクアレンを含む、遺伝子操作酵母から作製した油）。
【０１０２】
本発明で使用できる例示的な液相脂質は、例えば、ヒマシ油、ヤシ油、トウモロコシ油、綿実油、マツヨイグサ油、魚油、ブドウ種子油、ホホバ油、ラード油、亜麻仁油、オリーブ油、ピーナッツ油、サフラワー油、ゴマ油、ダイズ油、スクアレン、スクアラン、ヒマワリ油、コムギ胚芽油、鉱物油、トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル（例えば、Ｍｙｇｌｙｏｌ（登録商標）８１０、Ｍｙｇｌｙｏｌ（登録商標）８１２、Ｌａｂｒａｆａｃ（商標））、ビタミンＥ（例えば、ＴＯＳ、ＴＰＧＳ）、ラウロイルポリオキシルグリセリド（例えば、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ（登録商標）４４／１４）、モノアシルグリセロール（例えば、Ｍｙｖｅｒｏｌ  １８−９９  Ｋ）、ダイズレシチン（例えば、Ｅｐｉｋｕｒｏｎ（商標）２００）、ファルネセン、またはこれらの組み合わせを含む。
【０１０３】
前記液相脂質は、例えば、スクアレン、ヒマワリ油、ダイズ油、オリーブ油、ブドウ種子油、スクアラン、トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル、またはこれらの組み合わせを含むことができる。
【０１０４】
前記液相脂質は、例えば、スクアレン、スクアレン、トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル、またはこれらの組み合わせを含むことができる。
【０１０５】
前記液相脂質は、例えば、トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル、ビタミンE、ラウロイルポリオキシルグリセリド、モノアシルグリセロール、ダイズレシチン、スクアレン、もしくはスクアラン、またはこれらの組み合わせを含むことができる。
【０１０６】
前記液相脂質は、例えば、スクアレン、スクアレン、もしくはファルネセン、またはこれらの組み合わせを含むことができる。
【０１０７】
前記ＮＬＣの前記油性コアは固相脂質を含む。種々様々な固相脂質を使用することができ、例えば、グリセロ脂質が挙げられる。例示的な固相脂質は、例えば、ルミトステアリン酸グリセリン（Ｐｒｅｃｉｔｏｌ  ＡＴＯ（登録商標）５）、モノステアリン酸グリセリン、ジベヘン酸グリセリル（Ｃｏｍｐｒｉｔｏｌ（登録商標）８８８  ＡＴＯ）、パルミチン酸セチル（Ｃｒｏｄａｍｏｌ（商標）  ＣＰ）、ステアリン酸、トリパルミチン、または微結晶トリグリセリドを含む。例示的な微結晶トリグリセリドとしては、Ｄｙｎａｓａｎ（登録商標）の商品名で販売されているものが挙げられる（例えば、トリミリスチン（Ｄｙｎａｓａｎ（登録商標）１１４）またはトリステアリン（Ｄｙｎａｓａｎ（登録商標）１１８）またはトリパルミチン（Ｄｙｎａｓａｎ（登録商標）１１６））。
【０１０８】
前記固相脂質は、例えば、微結晶トリグリセリド、例えば、トリミリスチン（Ｄｙｎａｓａｎ（登録商標）１１４）またはトリステアリン（Ｄｙｎａｓａｎ（登録商標）１１８）から選択される１つ、とすることができる。
【０１０９】
前記油性コアの固相脂質は室温で固体であることが好ましい。屋内の場合、室温は通常１５℃〜２５℃である。
【０１１０】
本明細書において提供される実施形態のいずれかにおいて、前記固相脂質はグリセロ脂質、例えば微結晶トリグリセリド、とすることができる。
【０１１１】
本明細書において提供される実施形態のいずれかにおいて、前記液相脂質は合成スクアレンまたは天然スクアレンとすることができる。
【０１１２】
Ｂ．陽イオン性成分
【０１１３】
本明細書に記載のＮＬＣは、陽イオン性成分、通常は陽イオン性脂質、を含む。前記陽イオン性成分は、前記ＮＬＣの表面上の負に帯電した生物活性剤との相互作用において有用である。前記ＮＬＣの安定性を妨げず、対象に投与することができ、負に帯電した生物活性剤と相互作用可能である限り、いかなる陽イオン性脂質も使用できる。通常、前記陽イオン性脂質は、生理条件下では正に帯電している窒素原子を含有する。好適な陽イオン性脂質としては、以下が挙げられる：塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）、塩化ベンゼトニウム、セトリミド（テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含有し、さらに、少量のドデシルトリメチルアンモニウムブロミドおよびヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含有し得る）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）、一級アミン、二級アミン、三級アミン、例えば、限定はされないが、Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−ポリオキシエチレン（１０）−Ｎ−牛脂−１，３−ジアミノプロパン、他の四級アミン塩、例えば、限定はされないが、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチル−アンモニウムブロミド、混合アルキル−トリメチル−アンモニウムブロミド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサデシル−アンモニウムクロリド、ベンジルトリメチルアンモニウムメトキシド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、メチルベンゼトニウムクロリド、デカメトニウムクロリド、メチル混合トリアルキルアンモニウムクロリド、メチルトリオクチルアンモニウムクロリド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［２（２−メチル−４−（１，１，３，３テトラメチルブチル）−フェノキシ］−エトキシ）エチル］−ベンゼンメタンアミニウムクロリド（ＤＥＢＤＡ）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ジアシル−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジアシル−３（ジメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジオレオイル−３−（４′−トリメチル−アンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール、１，２−ジオレオイル３−サクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル、コレステリル（４′−トリメチルアンモニオ）ブタノエート）、Ｎ−アルキルピリジニウム塩（例えば、臭化セチルピリジニウムおよび塩化セチルピリジニウム）、Ｎ−アルキルピペリジニウム塩、二陽イオン性ボラ型電解質（Ｃ１２Ｍｅ６；Ｃ１２Ｂｕ６）、ジアルキルグリセチルホスホリルコリン、リゾレシチン、Ｌ−αジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロールヘミスクシネートコリンエステル、リポポリアミン、例えば、限定はされないが、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノール−アミドスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、リポポリ−Ｌ（またはＤ）−リジン（Ｌ���ＬＬ、ＬＰＤＬ）、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン結合型のポリ（Ｌ（またはＤ）−リジン、ペンダント基としてアミノ基を有するジドデシルグルタメートエステル（Ｃ１２ＧｌｕＰｈＣｎＮ＋）、ペンダント基としてアミノ基を有するジテトラデシルグルタメートエステル（Ｃ１４ＧｌｕＣｎＮ＋）、コレステロールの陽イオン性誘導体、例えば、限定はされないが、コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレンジメチルアミン、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレンジメチルアミン、および３γ−［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ−ジメチルアミノエタンカルボモイル］コレステロール）（ＤＣ−コレステロール）、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、並びにこれらの組み合わせ。
【０１１４】
本発明で用いるのに好適な他の陽イオン性脂質としては、例えば、米国特許公開２００８／００８５８７０号（２００８年４月１０日に公表）および同第２００８／００５７０８０号（２００８年３月６日）に記載の陽イオン性脂質が挙げられる。
【０１１５】
本発明で用いるのに好適な他の陽イオン性脂質としては、例えば、国際公開第２０１１／０７６８０７号の表６（頁１１２〜１３９）に記載のようなＥ０００１〜Ｅ０１１８またはＥ０１１９〜Ｅ０１８０の脂質が挙げられる（当該国際公開はこれらの陽イオン性脂質の作製法および使用法についても記述している）。追加の好適な陽イオン性脂質としては、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）が挙げられる。
【０１１６】
本ＮＬＣは、本明細書に記載の陽イオン性脂質のうちの１つを含んでいてもよいし、そのうちの２つ以上のあらゆる組み合わせを含んでいてもよい。
【０１１７】
例示的な実施形態において、前記陽イオン性脂質は、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３１３−［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、国際公開第２０１１／０７６８０７号の表６（頁１１２〜１３９）に記載のようなＥ０００１〜Ｅ０１１８またはＥ０１１９〜Ｅ０１８０の脂質、およびこれらの組み合わせ、からなる群から選択される。
【０１１８】
他の例示的な実施形態において、前記陽イオン性脂質は、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３１３−［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、国際公開第２０１１／０７６８０７号の表６（頁１１２〜１３９）に記載のようなＥ０００１〜Ｅ０１１８またはＥ０１１９〜Ｅ０１８０の脂質、およびこれらの組み合わせ、からなる群から選択される。
【０１１９】
例示的な陽イオン性脂質は以下から選択される：１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、またはこれらの組み合わせ。さらなる好適な陽イオン性脂質として、当業者に公知のものであってもよい。
【０１２０】
ある実施形態では、前記ＮＬＣベースの組成物または製剤は、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬの前記陽イオン性成分（例えば、前記陽イオン性脂質）を含む。ある実施形態では、前記陽イオン性脂質はＤＯＴＡＰである。本ＮＬＣは、例えば、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬまたは３０ｍｇ／ｍＬのＤＯＴＡＰを含んでいてもよいし、あるいは、ＤＯＴＡＰに関して本明細書に記載されるあらゆる他の含量または範囲のＤＯＴＡＰを含んでいてよい。
【０１２１】
ある実施形態では、前記陽イオン性脂質はＤＣコレステロールである。ある態様では、本ＮＬＣは、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬのＤＣコレステロールを含んでいてもよい。ある実施形態では、前記陽イオン性脂質はＤＤＡである。本ＮＬＣは、例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬのＤＤＡを含んでいてもよい。ある実施形態では、前記陽イオン性脂質はＤＯＴＭＡである。本ＮＬＣは、例えば、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２５または３０ｍｇ／ｍＬのＤＯＴＭＡを含んでいてもよい。ある実施形態では、前記陽イオン性脂質はＤＯＥＰＣである。本ＮＬＣは、例えば、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬのＤＯＥＰＣを含んでいてもよい。ある実施形態では、前記陽イオン性脂質はＤＳＴＡＰである。本ＮＬＣは、例えば、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬのＤＳＴＡＰを含んでいてもよい。ある実施形態では、前記陽イオン性脂質はＤＯＤＡＣである。本ＮＬＣは、例えば、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬのＤＯＤＡＣを含んでいてもよい。ある実施形態では、前記陽イオン性脂質はＤＯＤＡＰである。本ＮＬＣは、例えば、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬのＤＯＤＡＰを含んでいてもよい。
【０１２２】
ｗ／ｖ換算で、例示的なＮＬＣベースの組成物または製剤は、例えば、約０．０５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％または約１０ｗ／ｖ％の陽イオン性成分（例えば、ＤＯＴＡＰなどの陽イオン性脂質）、約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の陽イオン性成分（例えば、ＤＯＴＡＰなどの陽イオン性脂質）、約０．２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の陽イオン性成分（例えば、ＤＯＴＡＰなどの陽イオン性脂質）、約０．２ｗ／ｖ％〜約２ｗ／ｖ％の陽イオン性成分（例えば、ＤＯＴＡＰなどの陽イオン性脂質）、約２ｗ／ｖ％〜１０ｗ／ｖ％の陽イオン性成分（例えば、ＤＯＴＡＰなどの陽イオン性脂質）、約２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の陽イオン性成分（例えば、ＤＯＴＡＰなどの陽イオン性脂質）、約１ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の陽イオン性成分（例えば、ＤＯＴＡＰなどの陽イオン性脂質）、約３ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の陽イオン性成分（例えば、ＤＯＴＡＰなどの陽イオン性脂質）、または約３ｗ／ｖ％〜約４ｗ／ｖ％の陽イオン性成分（例えば、ＤＯＴＡＰなどの陽イオン性脂質）、または、陽イオン性成分に関して本明細書に記載されるあらゆる他の含量もしくは範囲の陽イオン性成分、を含んでいてもよい。特に希釈または濃縮された製剤を考慮する場合、より高いｗ／ｖ％またはより低いｗ／ｖ％が本明細書で企図される。
【０１２３】
一部の例では、前記油性コアに可溶性の陽イオン性脂質を用いることが好ましい場合がある。例えば、ＤＯＴＡＰ  ＤＯＥＰＣ、ＤＯＤＡＣ、およびＤＯＴＭＡが、スクアレンまたはスクアランに可溶性である。他の例では、前記油性コアに不溶性である陽イオン性脂質を用いることが好ましい場合がある。例えば、ＤＤＡおよびＤＳＴＡＰがスクアレンに不溶性である。特定の脂質が前記油に可溶性であるか不溶性であるかを判定し、それに従って適当な油と脂質との組み合わせを選ぶことは、当該技術分野の知識の範囲内である。例えば、溶解性は脂質および油の構造から予測可能である（例えば、脂質の溶解性はその脂質の末端の構造によって決定され得る）。例えば、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＥＰＣ、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡなどの、１または２本の不飽和脂肪酸鎖（例えば、オレオイル末端）を有する脂質は、スクアレンまたはスクアランに可溶性であるが；飽和脂肪酸鎖（例えば、ステアロイル末端）を有する脂質はスクアレンに不溶性である。あるいは、溶解性は、所与の量の油に溶解し飽和溶液を形成する脂質の量に従って、求めることができる。
【０１２４】
生物活性剤との混合前の本ＮＬＣの正味の表面電荷が陽性である限り、本ＮＬＣは、前記陽イオン性脂質と組み合わせて、追加の脂質（すなわち、中性脂質および陰イオン性脂質）を含んでいてもよい。ＮＬＣの表面電荷を測定する方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）、光子相関分光法（ＰＣＳ）、またはゲル電気泳動による測定が挙げられる。
【０１２５】
Ｃ．ソルビタンモノエステル
【０１２６】
本発明者らは、生物活性剤が抗原であるか抗原をコードし、組成物が対象に投与される場合、本ＮＬＣに添加されたソルビタンエステルが、対象における生物活性剤の細胞への送達および／または抗原に対する抗体の誘導における本ＮＬＣの有効性を増強するように働き得ることを見出した。特に、生物活性核酸にコードされるタンパク質に対する免疫応答が、本ＮＬＣに用いられるソルビタンエステルの選定により調節可能であるとの所見が得られた。ソルビタンモノエステルの使用が、本ＮＬＣの有効性を増強するのに特に有効であるという、驚くべき発見が得られた。いくつかの態様で、前記ソルビタンモノエステルのアシル鎖は飽和している。さらに、理論に制限されるものではないが、前記ソルビタンエステル、特にソルビタンモノエステルは、固体脂質（例えば、微結晶トリグリセリド）との組み合わせにおいて、本ＮＬＣのアジュバント活性の有効性（例えば、生物活性剤が抗原であるか抗原をコードし、組成物が対象に投与される場合の、対象における抗原に対する抗体の誘導における有効性）を増強するように働くという、驚くべき所見が得られた。
【０１２７】
例示的なソルビタンモノエステルは、ＳＰＡＮ（登録商標）またはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）の商品名で市販されている。本明細書で用いられる例示的なソルビタンモノエステルは、式Ｉの化合物またはその立体異性体（例えば、限定はされないが、式Ｉａ、式Ｉｂ、式Ｉｃ、または式Ｉｄ）として表すことができ、式中、Ｒは飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ３０アルキル基、好ましくは飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、より好ましくは飽和または不飽和のＣ１０〜Ｃ２０アルキル基である。例示的な実施形態において、前記アルキル基は非環式アルキル基である。例示的なソルビタンモノエステルには、式Ｉ、式Ｉａ、式Ｉｂ、式Ｉｃまたは式Ｉｄの位置異性体も含まれる（例えば、ヒドロキシ官能基の１つがエステル官能基（例えば、アルキルが飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ３０アルキル基、好ましくは飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、より好ましくは飽和または不飽和のＣ１０〜Ｃ２０アルキル基であり、ＲがＯＨである、アルキルエステル）で置換されている）。当業者には理解されることであるが、例示的なソルビタンモノエステルは、式Ｉ、式Ｉａ、式Ｉｂ、式Ｉｃ、式Ｉｄ、およびその立体異性体または位置異性体の塩形態（例えば、薬剤的に許容できる塩）であってもよい。
【化２】
2020524143.tif 000015
【０１２８】
これに関して、特に好ましいソルビタンモノエステルは、ソルビタンモノステアレート（Ｓｐａｎ（登録商標）６０としても知られ、以下に示される）およびソルビタンモノオレート（Ｓｐａｎ（登録商標）８０としても知られ、以下に示される）であるが、他のソルビタンモノエステルを用いることもできる（例えば、限定はされないが、ソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ（登録商標）２０）、ソルビタンモノパルミテート（Ｓｐａｎ（登録商標）４０））。
例示的なソルビタンモノステアレートは、式ＩＩもしくは式ＩＩａまたはその塩形態で表され、例示的なソルビタンモノオレートは、式ＩＩＩもしくは式ＩＩＩａまたはその塩形態で表される。
【化３】
2020524143.tif 000016
【０１２９】
ソルビタンモノエステルをＮＬＣの一成分とすることの他に、ソルビタンモノエステルを別の疎水性界面活性剤に置換することも企図され、例えば、別のソルビタン系非イオン性界面活性剤への置換が挙げられる。すなわち、本明細書では、液相脂質と固相脂質とから構成される油性コア、陽イオン性成分（好ましくは、陽イオン性の脂質またはリン脂質）、疎水性界面活性剤（例えば、ソルビタン系非イオン性界面活性剤を含む非イオン性界面活性剤）、および親水性界面活性剤、を含むＮＬＣ粒子も提供される。ソルビタン系非イオン性界面活性剤としては、ソルビタンモノエステル以外のソルビタンエステル、例えば、ソルビタンジエステルおよびソルビタントリエステル、例えば、ソルビタントリオレエート（ＳＰＡＮ８５（商標））およびソルビタントリステアレート（ＳＰＡＮ６５（商標））など、が挙げられる。通常、前記非イオン性界面活性剤（ソルビタン系非イオン性界面活性剤を含む）は、１．８〜８．６の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）値を有することとなる。ソルビタンモノエステルを含むＮＬＣの本明細書で提供される全ての実施形態は、ソルビタンモノエステルの代わりに別の疎水性界面活性剤を含むＮＬＣ、例えば、ソルビタンモノエステルの代わりにソルビタンジエステルまたはソルビタントリエステルを含むＮＬＣにも適用でき、企図される。ソルビタンジエステルおよびソルビタントリエステルまたは他の疎水性界面活性剤は、ソルビタンモノエステルと同じ濃度で存在させることができる。いくつかの態様では、ソルビタンジエステルまたはソルビタントリエステルのアシル鎖は飽和されることとなる。
【０１３０】
通常、ソルビタンエステル（例えば、ソルビタンモノエステル）は１〜９の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）値を有する。いくつかの実施形態で、ソルビタンエステル（例えば、ソルビタンモノエステル）は１〜５のＨＬＢ値を有する。いくつかの実施形態で、前記疎水性界面活性剤は４〜５程度のＨＬＢ値を有する。
【０１３１】
本明細書で用いられる例示的なソルビタンジエステルは、下記の式ＩＶの化合物またはその立体異性体として表すことができる（例えば、式中、Ｒは飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ３０アルキル基、好ましくは飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、より好ましくは飽和または不飽和のＣ１０〜Ｃ２０アルキル基であり、Ｒ１の少なくとも１つはＨであるが、その他は−Ｃ（＝Ｏ）Ｙであり、式中、Ｙは飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ３０アルキル基、好ましくは飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、より好ましくは飽和または不飽和のＣ１０〜Ｃ２０アルキル基である）。例示的な実施形態において、前記アルキル基は非環式アルキル基である。例示的なソルビタンジエステルには式ＩＶの位置異性体も含まれる。当業者には理解されることであるが、例示的なソルビタンジエステルは、式ＩＶ、およびその立体異性体または位置異性体の塩形態（例えば、薬剤的に許容できる塩）であってもよい。
【化４】
2020524143.tif 000017
式ＩＶ
【０１３２】
本明細書で用いられる例示的なソルビタントリエステルとしては、下記の式Ｖの化合物またはその立体異性体（例えば、限定はされないが、式Ｖａ、式Ｖｂ、または式Ｖｃ）として表すことができ、式中、Ｒは飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ３０アルキル基、好ましくは飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、より好ましくは飽和または不飽和のＣ１０〜Ｃ２０アルキル基であり、Ｒ１は−Ｃ（＝Ｏ）Ｙであり、式中、Ｙはそれぞれの場合で同じであっても異なっていてもよく、飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ３０アルキル基、好ましくは飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、より好ましくは飽和または不飽和のＣ１０〜Ｃ２０アルキル基である。例示的な実施形態において、前記アルキル基は非環式アルキル基である。例示的なソルビタントリエステルには式Ｖ、式Ｖａ、式Ｖｂ、または式Ｖｃの位置異性体も含まれる（例えば、ヒドロキシ官能基がエステル官能基（例えば、アルキルが飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ３０アルキル基、好ましくは飽和または不飽和のＣ１〜Ｃ２０アルキル基、より好ましくは飽和または不飽和のＣ１０〜Ｃ２０アルキル基であるアルキルエステル）で置換されており、アルキルエステルの１つ（例えば、環式アルキルエステルまたは非環式アルキルエステル）がヒドロキシ官能基で置換されている）。当業者には理解されることであるが、例示的なソルビタントリエステルは、式Ｖ、式Ｖａ、式Ｖｂ、または式Ｖｃ、およびその立体異性体または位置異性体の塩形態（例えば、薬剤的に許容できる塩）であってもよい。
【化５】
2020524143.tif 000018
【０１３３】
立体異性体に関して、前記ソルビタンエステルが、キラル中心を有しており、例えば、ラセミ化合物として、ラセミ混合物として、並びに、個々の鏡像異性体およびジアステレオマーとして、存在し得ることは、当業者には理解される。
【０１３４】
前記ソルビタン系非イオン性界面活性剤がソルビタンエステルである実施形態では、通常、前記ＮＬＣベースの組成物または製剤は、例えば、約０．１％〜約１５％のソルビタンエステル（ｗ／ｖ）、０．１％〜約１０％のソルビタンエステル（ｗ／ｖ）、０．１％〜約５％のソルビタンエステル（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約４％のソルビタンエステル（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約４％のソルビタンエステル（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約２．５％のソルビタンエステル（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約２％のソルビタンエステル（ｗ／ｖ）、０．１％〜約１．５％のソルビタンエステル（ｗ／ｖ）、０．１％〜約１％のソルビタンエステル（ｗ／ｖ）、０．１％〜約０．５％のソルビタンエステル（ｗ／ｖ）、０．３％〜約２．５％のソルビタンエステル（ｗ／ｖ）、約０．３％〜約２％のソルビタンエステル（ｗ／ｖ）、０．３％〜約１．５％のソルビタンエステル（ｗ／ｖ）、０．３％〜約１％のソルビタンエステル（ｗ／ｖ）、０．３％〜約０．５％のソルビタンエステル（ｗ／ｖ）、を通常含有し、あるいは、ソルビタンエステルに関して本明細書に記載されるあらゆる他の含量または範囲、例えば約０．２５％〜約１５％、のソルビタンエステルを含有する。いくつかの態様において、前記ＮＬＣベースの組成物は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約２％、約３％、または約４％（ｗ／ｖ）のソルビタンエステルを含有する。特に希釈または濃縮された製剤を考慮する場合、より高いｗ／ｖ％またはより低いｗ／ｖ％が本明細書で企図される。
【０１３５】
すなわち、前記ソルビタンエステルがソルビタンモノエステル（例えば、ＳＰＡＮ６０（商標）、ＳＰＡＮ８０（商標））である場合、前記ＮＬＣベースの組成物または製剤は、例えば、約０．１％〜約１５％のソルビタンモノエステル（ｗ／ｖ）、０．１％〜約１０％のソルビタンモノエステル（ｗ／ｖ）、０．１％〜約５％のソルビタンモノエステル（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約４％のソルビタンモノエステル（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約４％のソルビタンモノエステル（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約２．５％のソルビタンモノエステル（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約２％のソルビタンモノエステル（ｗ／ｖ）、０．１％〜約１．５％のソルビタンモノエステル（ｗ／ｖ）、０．１％〜約１％のソルビタンモノエステル（ｗ／ｖ）、０．１％〜約０．５％のソルビタンモノエステル（ｗ／ｖ）、０．３％〜約２．５％のソルビタンモノエステル（ｗ／ｖ）、約０．３％〜約２％のソルビタンモノエステル（ｗ／ｖ）、０．３％〜約１．５％のソルビタンモノエステル（ｗ／ｖ）、０．３％〜約１％のソルビタンモノエステル（ｗ／ｖ）、０．３％〜約０．５％のソルビタンモノエステル（ｗ／ｖ）を通常含有し、あるいは、ソルビタンモノエステルに関して本明細書に記載されるあらゆる他の含量または範囲、例えば約０．２５％〜約１５％、のソルビタンモノエステルを含有する。いくつかの態様において、前記ＮＬＣベースの組成物または製剤は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約２％、約３％、または約４％（ｗ／ｖ）のソルビタンモノエステルを含有する。特に希釈または濃縮された製剤を考慮する場合、より高いｗ／ｖ％またはより低いｗ／ｖ％が本明細書で企図される。
【０１３６】
すなわち、前記ソルビタンエステルがソルビタンジエステルである場合、前記ＮＬＣベースの組成物または製剤は、例えば、約０．１％〜約１５％のソルビタンジエステル（ｗ／ｖ）、０．１％〜約１０％のソルビタンジエステル（ｗ／ｖ）、０．１％〜約５％のソルビタンジエステル（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約４％のソルビタンジエステル（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約４％のソルビタンジエステル（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約２．５％のソルビタンジエステル（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約２％のソルビタンジエステル（ｗ／ｖ）、０．１％〜約１．５％のソルビタンジエステル（ｗ／ｖ）、０．１％〜約１％のソルビタンジエステル（ｗ／ｖ）、０．１％〜約０．５％のソルビタンジエステル（ｗ／ｖ）、０．３％〜約２．５％のソルビタンジエステル（ｗ／ｖ）、約０．３％〜約２％のソルビタンジエステル（ｗ／ｖ）、０．３％〜約１．５％のソルビタンジエステル（ｗ／ｖ）、０．３％〜約１％のソルビタンジエステル（ｗ／ｖ）、０．３％〜約０．５％のソルビタンジエステル（ｗ／ｖ）を通常含有し、あるいは、ソルビタンジエステルに関して本明細書に記載されるあらゆる他の含量または範囲、例えば約０．２５％〜約１５％、のソルビタンジエステルを含有する。いくつかの態様において、前記ＮＬＣベースの組成物または製剤は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約２％、約３％、または約４％（ｗ／ｖ）のソルビタンジエステルを含有する。特に希釈または濃縮された製剤を考慮する場合、より高いｗ／ｖ％またはより低いｗ／ｖ％が本明細書で企図される。
【０１３７】
従って、前記ソルビタンエステルがソルビタントリエステル（例えば、ＳＰＡＮ８５（商標）またはＳＰＡＮ６５（商標））である場合、前記ＮＬＣベースの組成物または製剤は、例えば、約０．１％〜約１５％のソルビタントリエステル（ｗ／ｖ）、０．１％〜約１０％のソルビタントリエステル（ｗ／ｖ）、０．１％〜約５％のソルビタントリエステル（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約４％のソルビタントリエステル（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約４％のソルビタントリエステル（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約２．５％のソルビタントリエステル（ｗ／ｖ）、約０．１％〜約２％のソルビタントリエステル（ｗ／ｖ）、０．１％〜約１．５％のソルビタントリエステル（ｗ／ｖ）、０．１％〜約１％のソルビタントリエステル（ｗ／ｖ）、０．１％〜約０．５％のソルビタントリエステル（ｗ／ｖ）、０．３％〜約２．５％のソルビタントリエステル（ｗ／ｖ）、約０．３％〜約２％のソルビタントリエステル（ｗ／ｖ）、０．３％〜約１．５％のソルビタントリエステル（ｗ／ｖ）、０．３％〜約１％のソルビタントリエステル（ｗ／ｖ）、０．３％〜約０．５％のソルビタントリエステル（ｗ／ｖ）を通常含有し、あるいは、ソルビタントリエステルに関して本明細書に記載されるあらゆる他の含量または範囲、例えば約０．２５％〜約１５％、のソルビタントリエステルを含有する。いくつかの態様において、前記ＮＬＣベースの組成物または製剤は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約２％、約３％、または約４％（ｗ／ｖ）のソルビタントリエステルを含有する。特に希釈または濃縮された製剤を考慮する場合、より高いｗ／ｖ％またはより低いｗ／ｖ％が本明細書で企図される。
【０１３８】
例示的な実施形態において、前記ソルビタンエステル（例えば、ソルビタンモノエステル、ソルビタンジエステル、またはソルビタントリエステル）は、前記ソルビタンエステル（例えば、それぞれ、ソルビタンモノエステル、ソルビタンジエステル、またはソルビタントリエステル）を含まない対照組成物と比較した場合に、前記生物活性剤（例えば、ＲＮＡ）の送達および／または発現を促進する前記組成物の能力を増強するのに十分な量で存在する。前記組成物が有効量で前記対象に投与される実施形態では、前記組成物は、前記ソルビタンエステルを含まない対照組成物が対象に投与された場合に誘導される、または生物活性剤が本ＮＬＣなしで対象に投与された場合に誘導される抗体価以上の、前記抗原に対する抗体価を誘導し得る。いくつかの実施形態では、前記組成物は、前記ソルビタンエステルを含まない対照組成物によって前記対象において誘導される免疫応答よりも高いレベルの、前記対象における免疫応答（例えば、中和抗体価）を誘導する。免疫応答は、例えば、自然免疫応答でも、細胞性免疫応答でも、抗体応答であってもよい。中和抗体価は当業者に公知のいかなるアッセイで測定されてもよく、例えば、プラーク減少中和滴定分析（Ratnam, S et al. J. Clin. Microbiol (2011), 33 (4): 811-815; Timiryazova, T et al. Am J Trop Med Hyg (2013), 88(5): 962-970）が挙げられるが、これに限定はされない。
【０１３９】
Ｄ．界面活性剤
【０１４０】
本明細書に記載のＮＬＣは、前記ソルビタン系非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステル）に加えて、界面活性剤を含む。生物学的応用において通常用いられる、それ用に特別に設計された界面活性剤がいくつか存在する。そのような界面活性剤は４つの基本的な種類に分類されるが、これらが本発明に使用できる（陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、および非イオン性界面活性剤）。界面活性剤の特に有用な群は親水性の非イオン性界面活性剤であり、特に、ポリオキシエチレンソルビタンモノエステルおよびポリオキシエチレンソルビタントリエステルである。これらの物質はポリソルベートと称され、ＴＷＥＥＮ（登録商標）の商品名で市販されており、本ＮＬＣの作製において有用である。ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤は通常、９．６〜１６．７の範囲のＨＬＢ値を有する。ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤は市販されている。使用できる他の非イオン性界面活性剤は、例えば、ラウリルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪酸エーテル、アセチルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪酸エーテル、ステアリルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪酸エーテル、およびオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪酸エーテル、エチレンオキシドと長鎖脂肪酸との反応で作製されるポリオキシエチレン脂肪酸、ポリオキシエチレン、ポリオール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシプロピレン脂肪エーテル、ポリオキシエチレンを含有する蜜蝋誘導体、ポリオキシエチレンラノリン誘導体、ポリオキシエチレン脂肪グリセリド、ポリオキシエチレングリセロール脂肪酸エステル、または、Ｃ１２〜２２の長鎖脂肪酸の他のポリオキシエチレン脂肪酸誘導体、アルコール誘導体もしくはエーテル誘導体である。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、約７〜１６の範囲のＨＬＢ値を有する非イオン性界面活性剤を選ぶことが好ましい。この値は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤などの単一の非イオン性界面活性剤の使用により得てもよいし、界面活性剤の混合物の使用により達成してもよい。ある実施形態では、本ＮＬＣは、エマルジョンを安定化させる非イオン性界面活性剤として、単一の非イオン性界面活性剤を含み、最も多くは特にＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤を含む。例示的な実施形態では、前記エマルジョンはＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（別名ポリソルベート８０）を含む。
【０１４２】
前記ＮＬＣベースの組成物または製剤は、例えば、約０．０１％〜約１５％の界面活性剤（ｗ／ｖ）、約０．０１％〜約１０％の界面活性剤（ｗ／ｖ）、約０．０１％〜約５％の界面活性剤（ｗ／ｖ）、約０．０１％〜約２．５％の界面活性剤、約０．０１％〜約２％の界面活性剤、０．０１％〜約１．５％の界面活性剤、０．０１％〜約１％の界面活性剤、０．０１％〜約０．５％の界面活性剤、０．０５％〜約０．５％の界面活性剤、０．０８％〜約０．５％の界面活性剤、約０．０８％の界面活性剤、約０．５％の界面活性剤、約０．６％の界面活性剤、約０．７％の界面活性剤、約０．８％の界面活性剤、約０．９％の界面活性剤、約１％の界面活性剤、約２％の界面活性剤、約３％の界面活性剤、約４％の界面活性剤、または界面活性剤に関して本明細書に記載されるあらゆる他の含量もしくは範囲の界面活性剤、を含有する含有し得る。特に希釈または濃縮された製剤を考慮する場合、より高いｗ／ｖ％またはより低いｗ／ｖ％が本明細書で企図される。
【０１４３】
本発明のＮＬＣには追加成分を含ませることができ、例えば、ＮＬＣ形成を促進する成分、負に帯電している分子と陽イオン性粒子との間の複合体形成を向上させる成分、負に帯電している分子（ＲＮＡ分子など）の適切な放出を促進する成分、および／または、負に帯電している分子の安定性を増加させる（例えば、ＲＮＡ分子の分解を防ぐ）成分、が挙げられる。
【０１４４】
本ＮＬＣの水相（連続相）は通常、緩衝塩類溶液（例えば、生理食塩水）または水である。前記緩衝塩類溶液は、通常、塩（例えば、ＮａＣｌ）、緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液）を含む水溶液であり、さらに、例えば、オスモル濃度調整剤（例えば、糖類）、ポリマー、界面活性剤、またはこれらの組み合わせを含むことができる。エマルジョンを非経口投与用に製剤化する場合、前記組成物の投与後の膨張または急速吸収などの好ましくない投与後事象を防ぐために、張度、すなわちオスモル濃度が正常生理液と本質的に同じになるように、最終緩衝液を構成することが好ましい。正常な生理条件と適合するｐＨを維持するように、前記水相を緩衝剤処理することも好ましい。また、場合により、本ＮＬＣの特定の成分の安定性を確保するために、ｐＨを特定のレベルに維持することが好ましい場合がある。例えば、等張性（isotonic）（すなわち、身体および血液の正常細胞と同じ透過性溶質（例えば、塩）濃度）であり、且つ等浸透圧性（isosmotic）である、ＮＬＣを調製することが好ましい場合がある。張度の調節のために、本ＮＬＣは、生理的塩類（ナトリウム塩など）を含んでもよい。いくつかの態様では、例えば約０．９％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（生理食塩水）を用いてもよい。含まれてもよい他の塩としては、例えば、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。非イオン性の張度増加剤（tonicifying agent）を用いて張度を調節することもできる。本発明では、非イオン性張度増加剤として、グルコース、マンノース、アラビノース、およびリボースなどのアルドースに分類される単糖類、並びに、フルクトース、ソルボース、およびキシルロースなどのケトースに分類される単糖類を用いることができる。スクロース、マルトース、トレハロース、およびラクトースなどの二糖類も使用できる。さらに、グリセロール、マンニトール、キシリトール、およびソルビトールなどのアルジトール（非環式多価アルコール、別名糖アルコール）も、本発明で有用であり得る非イオン性張度増加剤である。非イオン性張度調節剤は、使用される非イオン性張度調節剤に応じて、例えば、約０．１％〜約１０％または約１％〜約１０％の濃度で存在させることができる。
【０１４５】
前記水相を緩衝剤処理してもよい。生理学的に許容されるものであればいかなる緩衝液も本明細書で使用してよく、例えば、水、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝溶液、トリス緩衝液、炭酸水素緩衝液、炭酸緩衝液、コハク酸緩衝液などが挙げられる。好ましくは、前記水性成分のｐＨは４．０〜８．０または約４．５〜約６．８となる。別の例示的な実施形態では、前記水相、または前記緩衝液は、ＲＮａｓｅを含有しない水またはＤＥＰＣで処理した水を用いて調製される。一部の例では、緩衝液中の塩濃度が高いと、負に帯電している分子とエマルジョン粒子との複合体形成が妨げられる場合があるため、塩濃度が高い緩衝液は避ける。他の例では、緩衝液中には特定量の塩が含まれる場合がある。
【０１４６】
例示的な実施形態において、前記緩衝液は約５．０〜８．０のｐＨを有する１０ｍＭクエン酸緩衝液（例えば、クエン酸ナトリウム）である。別の例示的な実施形態では、前記水相、または前記緩衝液は、ＲＮａｓｅを含有しない水またはＤＥＰＣで処理した水を用いて調製される。他の例示的な実施形態では、本発明の組成物はクエン酸緩衝液を含まない。
【０１４７】
前記水相は、前記水相のオスモル濃度を変化させる分子、または前記負に帯電している分子を複合体形成後に安定化させる分子、などの追加の成分を含んでもよい。前記水相のオスモル濃度は、糖（例えば、トレハロース、スクロース、デキストロース、フルクトース、還元パラチノースなど）、糖アルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、マルチトール、グリセロールなど）、またはこれらの組み合わせ、などの非イオン性張度増加剤を用いて調節することが好ましい。必要に応じて、非イオン性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリブチレングリコールなどのポリ（アルキルグリコール））または非イオン性界面活性剤を使用できる。
【０１４８】
Ｅ．油／界面活性剤比
【０１４９】
例示的なＮＬＣは、液体の油および固体の脂質を含有する疎水性コアと、疎水性相（液体油および固体脂質、本明細書ではまとめて油と称する）を水相から分離する界面を構成する界面活性剤（乳化剤またはエマルジョン剤としても知られている）と、から構成される。界面活性剤は通常ＮＬＣナノ粒子の表面上に存在するため、その含量によって利用可能な総表面積が決定される。一方、前記油は前記コア中に存在して、利用可能な総体積に主に寄与する。結果として、界面活性剤／油比が増加すると表面積（ＳＡ）／体積（Ｖ）比が増加し、すなわち、物質体積が固定されている場合、ＳＡ／Ｖ比の増加はＮＬＣ粒径の減少を意味する。例示的なＮＬＣ組成物は、各種成分の重量体積パーセントの観点から説明することの代わりに、あるいはそれに加えて、各種成分のモル比で説明することもできる。いくつかの態様において、本発明の例示的なＮＬＣは、約０．０５〜約１２、約０．０５〜約９、約．０５〜約８、約０．０５〜約１、または約０．１〜約１の油：界面活性剤モル比を有する。本発明者らにより、油：界面活性剤モル比を減少させることで、より小さなＮＬＣを合成できることが示されている。さらに、本ＮＬＣ中の油の含量を減少させることにより、前記製剤が毒性を有する可能性を減少させることができる。他の態様では、本発明の例示的なＮＬＣは、約０．５〜約１２、約０．５〜約９、１〜約９、約２〜約９、約３〜約９、約４〜約９、約４．５〜約９、または約４．５もしくは約５〜約７の油：界面活性剤モル比を有する。例示的な製剤は、約０．５、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、または約１２の油：界面活性剤モル比を有する。本明細書で使用される場合、油：界面活性剤モル比は、（ｉ）油性コア内脂質のモル数の値を確保するための、前記油性コア（固相脂質および液相脂質）を構成する脂質のモル数を加算し、（ｉｉ）界面活性剤のモル数の値を確保するための、陽イオン性成分（例えば、ＤＯＴＡＰ）、疎水性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステル）、および親水性界面活性剤（Tween 80）のモル数を加算し、（ｉｉｉ）油性コア内脂質のモル数を界面活性剤のモル数で除算すること、により求める。
【０１５０】
Ｆ．親水性界面活性剤：陽イオン性成分比
【０１５１】
本発明者らは、陽イオン性成分に対する親水性界面活性剤の比が、本ＮＬＣのＲＮＡａｓｅ分解に対する保護作用能に影響を与え、その製剤の免疫原性に影響を与え得ることを、見出した。特に、約０．６のＴｗｅｅｎ：ＤＯＴＡＰ比がＲＮＡ生物活性剤の送達および発現について一貫した結果を得るのに最適であるが、一方で、約２．０以上のＴｗｅｅｎ：ＤＯＴＡＰ比がそのような一貫性を得るのに最適とはいえないことを、本発明者らは見出した。従って、本発明の例示的なＮＬＣは、約０．２〜約１．５、約０．２〜約１、または約０．５〜約１の親水性界面活性剤／陽イオン性成分（例えば、陽イオン性脂質）比を有する。ＴｗｅｅｎおよびＤＯＴＡＰが前記組成物中に存在する場合、本発明の例示的なＮＬＣは、約０．２〜約１．５、約０．２〜約１、または約０．５〜約１のＴｗｅｅｎ：ＤＯＴＡＰ比を有する。本明細書で使用される場合、親水性界面活性剤：陽イオン性成分比は、（ｉ）親水性界面活性剤のモル数の値を確保するための、親水性界面活性剤のモル数を加算し、（ｉｉ）陽イオン性成分のモル数の値を確保するための、陽イオン性成分のモル数を加算し、（ｉｉｉ）親水性界面活性剤のモル数を陽イオン性成分のモル数で除算すること、により求める。
【０１５２】
Ｇ．積載量
【０１５３】
本発明者らは、陽イオン性成分に対する親水性界面活性剤の比と、製剤中に存在する油の量とを調節することで、平均ＮＬＣ粒径を減少させることにより、ＮＬＣ製剤の積載量を操作できることを見出した。例示的なＮＬＣ製剤が有するＲＮＡ積載量は、少なくとも約１０μｇ／ｍＬのＲＮＡ、少なくとも約２０μｇ／ｍＬのＲＮＡ、少なくとも約５０μｇ／ｍＬのＲＮＡ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬのＲＮＡ、少なくとも約２００μｇ／ｍＬのＲＮＡ、少なくとも約３００μｇ／ｍＬ、または少なくとも約４００μｇ／ｍＬのＲＮＡである。通常、平均粒径が２０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約６０ｎｍであるＮＬＣ製剤が、積載量の増加を示す。
【０１５４】
Ｈ．例示的なナノ構造担体およびその重量体積パーセント
【０１５５】
選抜された例示的な実施形態において、前記ＮＬＣ組成物は、約０．２ｗ／ｖ％〜約４０ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．０２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の疎水性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステル）、および約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％、約０．２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％、約０．５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％、または約０．５ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。このＮＬＣ組成物を本明細書では製剤Ａと称する。製剤Ａのあらゆる態様で、前記親水性界面活性剤は０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％、０．２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％、０．５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％、または約０．５ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％で存在し得る。
【０１５６】
選抜された例示的な実施形態において、前記ＮＬＣ組成物は、約０．２ｗ／ｖ％〜約４０ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の疎水性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステル）、および約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％、約０．２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％、約０．５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％、または約０．５ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。このＮＬＣ組成物を本明細書では製剤Ｂと称する。製剤Ｂのあらゆる態様で、前記親水性界面活性剤は０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％、０．２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％、０．５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％、または約０．５ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％で存在し得る。
【０１５７】
選抜された例示的な実施形態において、前記ＮＬＣ組成物は、約０．２ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．０２ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％の固相脂質、約２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。このＮＬＣ組成物を本明細書では製剤Ｃと称する。
【０１５８】
選抜された例示的な実施形態において、前記ＮＬＣ組成物は、約２ｗ／ｖ％〜約４０ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の疎水性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステル）、および約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％、約０．２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％、約０．５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％、または約０．５ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。このＮＬＣ組成物を本明細書では製剤Ｄと称する。製剤Ｄのあらゆる態様で、前記親水性界面活性剤は、０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％、０．２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％、約０．５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％、または約０．５ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤として存在し得る。
【０１５９】
選抜された例示的な実施形態において、前記ＮＬＣ組成物は、約２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％または約０．２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。このＮＬＣ組成物を本明細書では製剤Ｅと称する。製剤Ｅのあらゆる態様で、前記親水性界面活性剤は０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％または約０．２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％で存在し得る。
【０１６０】
選抜された例示的な実施形態において、前記ＮＬＣ組成物は、約２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約３ｗ／ｖ％の固相脂質、約１ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約１ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約１ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。このＮＬＣ組成物を本明細書では製剤Ｆと称する。
【０１６１】
選抜された例示的な実施形態において、前記ＮＬＣ組成物は、約２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約２ｗ／ｖ％の固相脂質、約２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。このＮＬＣ組成物を本明細書では製剤Ｇと称する。
【０１６２】
選抜された例示的な実施形態において、前記ＮＬＣ組成物は、約２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約３ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約２ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約２ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約０．２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％または約０．５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。このＮＬＣ組成物を本明細書では製剤Ｈと称する。製剤Ｈのあらゆる態様で、前記親水性界面活性剤は約０．２％〜約５ｗ／ｖ％または約０．５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％で存在し得る。
【０１６３】
選抜された例示的な実施形態において、前記ＮＬＣ組成物は、約２ｗ／ｖ％〜約６ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約０．２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％または約０．５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。このＮＬＣ組成物を本明細書では製剤Ｉと称する。製剤Ｉのあらゆる態様で、前記親水性界面活性剤は約０．２％〜約５ｗ／ｖ％または約０．５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％で存在し得る。
【０１６４】
選抜された例示的な実施形態において、前記ＮＬＣ組成物は、約２ｗ／ｖ％〜約６ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約０．２ｗ／ｖ％〜約２ｗ／ｖ％または約０．２ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。このＮＬＣ組成物を本明細書では製剤Ｊと称する。
【０１６５】
選抜された例示的な実施形態において、前記ＮＬＣ組成物は、約２ｗ／ｖ％〜約６ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約０．２ｗ／ｖ％〜約０．５ｗ／ｖ％または０．２ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。このＮＬＣ組成物を本明細書では製剤Ｋと称する。製剤Ｋのあらゆる態様で、前記親水性界面活性剤は約０．２ｗ／ｖ％〜約０．５ｗ／ｖ％または０．２ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％で存在し得る。
【０１６６】
選抜された例示的な実施形態において、前記ＮＬＣ組成物は、約１０ｗ／ｖ％〜約４０ｗ／ｖ％の液相脂質、約１％〜約２％の固相脂質、約２％〜約５％の陽イオン性脂質、約３ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約３ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。このＮＬＣ組成物を本明細書では製剤Ｌと称する。
【０１６７】
選抜された例示的な実施形態において、前記ＮＬＣ組成物は、約１０ｗ／ｖ％〜約２０ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．５％〜約１．５％の固相脂質、約３％〜約４％の陽イオン性脂質、約３ｗ／ｖ％〜約４ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約３ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。このＮＬＣ組成物を本明細書では製剤Ｍと称する。
【０１６８】
選抜された例示的な実施形態において、前記ＮＬＣ組成物は、約１５ｗ／ｖ％の液相脂質、約１％の固相脂質、約３％の陽イオン性脂質、約３．７ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約３．７ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。このＮＬＣ組成物を本明細書では製剤Ｎと称する。
【０１６９】
選抜された例示的な実施形態において、前記ＮＬＣ組成物は、約３０ｗ／ｖ％の液相脂質、約１．８％の固相脂質、約３％の陽イオン性脂質、約３．７ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約３．７ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。このＮＬＣ組成物を本明細書では製剤Ｏと称する。
【０１７０】
選抜された例示的な実施形態において、前記ＮＬＣ組成物は、約３ｗ／ｖ％〜約４ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．２％〜約１％の固相脂質、約３％〜約５％の陽イオン性脂質、約３％〜約５％のソルビタンエステル、および約３％〜約５％の親水性界面活性剤、を含む。このＮＬＣ組成物を本明細書では製剤Ｐと称する。
【０１７１】
選抜された例示的な実施形態において、前記ＮＬＣ組成物は、約０．２ｗ／ｖ％〜約４０ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約１５ｗ／ｖ％のソルビタンモノエステル、および約０．５ｗ／ｖ％〜約１５ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。このＮＬＣ組成物を本明細書では製剤Ｑと称する。
【０１７２】
選抜された例示的な実施形態において、前記ＮＬＣ組成物は、約４ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．２５ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．４ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．５ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約２ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。このＮＬＣ組成物を本明細書では製剤Ｒと称する。
【０１７３】
選抜された例示的な実施形態において、前記ＮＬＣ組成物は、約４ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．２５ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．４ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．５ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約０．５ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。このＮＬＣ組成物を本明細書では製剤Ｓと称する。
【０１７４】
選抜された例示的な実施形態において、前記ＮＬＣ組成物は、約３．７５ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．２５ｗ／ｖ％の固相脂質、約３ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約３．７ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約３．７ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。このＮＬＣ組成物を本明細書では製剤Ｔと称する。
【０１７５】
選抜された例示的な実施形態において、前記ＮＬＣ組成物は、約３．７５ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．２５ｗ／ｖ％の固相脂質、約１．５ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約３．７ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約１．５ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。このＮＬＣ組成物を本明細書では製剤Ｕと称する。
【０１７６】
選抜された例示的な実施形態において、前記ＮＬＣ組成物は、約４．７５ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．２５ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．５ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．５ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約０．４ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。このＮＬＣ組成物を本明細書では製剤Ｖと称する。
【０１７７】
選抜された例示的な実施形態において、前記ＮＬＣ組成物は、約０．２ｗ／ｖ％〜約４０ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の疎水性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステル）、および約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％、約０．２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％、約０．５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％、または約０．５ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。このＮＬＣ組成物を本明細書では製剤Ｗと称する。製剤Ｗのあらゆる態様で、前記親水性界面活性剤は０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％、０．２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％、０．５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％、または約０．５ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％で存在し得る。
【０１７８】
本発明での使用の際に、製剤Ａ〜Ｗを含む本明細書に記載のいずれのＮＬＣ組成物／製剤も希釈または濃縮できることは、当業者には理解される。例えば、送達用に生物活性剤と混合される場合、前記製剤はその混合工程の中で希釈され得る。前記ＮＬＣ組成物／製剤は例えば１：２希釈され得る。本明細書に記載の全てのＮＬＣ組成物／製剤は例えば、約２〜約５００倍希釈、好ましくは約２〜約１００倍希釈され得る。通常、ただし必ずではないが、送達用に前記製剤を生物活性剤（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）と混合する場合は、希釈を行う。前記ＮＬＣ組成物／製剤は、例えば、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約１００倍、または約５００倍に希釈され得る。当業者には理解されることであるが、希釈された本発明の製剤は、液相脂質、固相脂質、陽イオン性成分、疎水性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステル）、および界面活性剤（例えば、親水性界面活性剤）の濃度は減少したものとなるが、液相脂質と固相脂質と陽イオン性成分と疎水性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステル）と界面活性剤との比は同じままとなる。本発明は、製剤Ａ〜Ｗだけでなく、製剤Ａ〜Ｗの希釈形態も提供する。場合によっては、希釈された製剤が、生物活性剤と結合（例えば、複合体を形成）する。例えば、特に好ましい製剤は２倍希釈した製剤Ｓまたは製剤Ｔである。そのような希釈された製剤Ｓは、約２ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１３ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約０．２５ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。そのような希釈された製剤Ｔ、約１．８８ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１３ｗ／ｖ％の固相脂質、約１．５ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約１．８５ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約１．８５ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤、を含む。
【０１７９】
あるいは、前記組成物／製剤は、例えば約２〜約３０倍、好ましくは約２〜約２０倍に濃縮され得る。前記組成物／製剤は、例えば、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍（old）、約２０倍、約２５倍、または約３０倍に濃縮され得る。すなわち、本発明は、製剤Ａ〜Ｗだけでなく、製剤Ａ〜Ｕの濃縮形態も提供する。
【０１８０】
製剤Ａ〜Ｖの希釈製剤および濃縮製剤を含んで、製剤Ａ〜Ｖを含む本発明のＮＬＣ製剤のいずれに関しても、以下、および以下のあらゆる組み合わせが当てはまり得る：（ｉ）前記ソルビタンエステルはソルビタンモノエステル、ソルビタンジエステル、またはソルビタントリエステルである；（ｉｉ）前記ソルビタンエステルは、ソルビタンモノステアレートもしくはソルビタンモノオレートもしくはソルビタンモノラウレートから選択されるソルビタンモノエステル、またはソルビタントリオレエートもしくはソルビタントリステアレートから選択されるソルビタントリエステルである；（ｉｉｉ）前記液相脂質はスクアレンである；（ｉｖ）前記固相脂質はグリセロ脂質である；（ｖ）前記固相脂質は微結晶トリグリセリドである；（ｖｉ）前記固相脂質はトリミリスチンである；（ｖｉｉ）前記陽イオン性脂質はＤＯＴＡＰである；（ｖｉｉｉ）前記親水性界面活性剤はポリソルベート８０（別名Ｔｗｅｅｎ８０）；（ｉｘ）前記ソルビタンエステルはモノエステルであり、前記液相脂質はスクアレンであり；前記固相脂質はグリセロ脂質である；（ｘ）前記ソルビタンエステルはモノエステルであり、前記液相脂質はスクアレンであり；前記固相脂質はグリセロ脂質であり；前記陽イオン性脂質はＤＯＴＡＰであり、前記親水性界面活性剤はポリソルベート８０である；（ｘｉ）前記ソルビタンエステルはソルビタンモノステアレートまたはソルビタンモノオレートまたはソルビタンモノラウレートであり、前記液相脂質はスクアレンであり；前記固相脂質はトリミリスチンであり；前記陽イオン性脂質はＤＯＴＡＰであり、前記親水性界面活性剤はポリソルベート８０である；（ｘｉｉ）前記ソルビタンエステルはトリエステルであり、前記液相脂質はスクアレンであり；前記固相脂質はグリセロ脂質である；（ｘｉｉｉ）前記ソルビタンエステルはトリエステルであり、前記液相脂質はスクアレンであり；前記固相脂質はグリセロ脂質であり；前記陽イオン性脂質はＤＯＴＡＰであり、前記親水性界面活性剤はポリソルベート８０である；（ｘｉｖ）前記ソルビタンエステルはソルビタントリオレエートまたはソルビタントリステアレートであり、前記液相脂質はスクアレンであり；前記固相脂質はトリミリスチンであり；前記陽イオン性脂質はＤＯＴＡＰであり、前記親水性界面活性剤はポリソルベート８０である。
【０１８１】
また本発明は、前記油／界面活性剤比が約０．０５〜約１２、または約０．０５〜約９、または約．０５〜約８、または約０．０５〜約１、または約０．１〜約１である、上記の段落［０１８０］に示されたものを含む、製剤Ａ〜Ｑを提供する。また、前記油：界面活性剤モル比が約０．５〜約１２、約１〜約９、約２〜約９、約３〜約９、約４〜約９、約４．５〜約９、または約４．５〜約５〜約７である、上記の段落［０１８０］に示されたものを含む、製剤Ａ〜Ｑも提供される。
【０１８２】
本発明は、前記親水性界面活性剤／陽イオン性成分（例えば、陽イオン性脂質）比が約０．２〜約１、または約０．５〜約１である、上記のものを含む、製剤Ａ〜Ｑを提供する。
【０１８３】
すなわち、いくつかの例示的なＮＬＣ組成物は、油：界面活性剤モル比が約０．５〜約１２、約１〜約９、約２〜約９、約３〜約９、約４〜約９、約４．５〜約９、または約４．５もしくは約５〜約７であり、親水性界面活性剤／陽イオン性成分（例えば、陽イオン性脂質）比が約０．２〜約１．５である、希釈または濃縮された、製剤Ａ、製剤Ｂ、または製剤Ｑである。
【０１８４】
すなわち、いくつかの例示的なＮＬＣ組成物は、油：界面活性剤モル比が約０．５〜約１２、約１〜約９、約２〜約９、約３〜約９、約４〜約９、約４．５〜約９、または約４．５もしくは約５〜約７であり、親水性界面活性剤／陽イオン性成分（例えば、陽イオン性脂質）比が約０．２〜約１である、希釈または濃縮された、製剤Ａ、製剤Ｂ、または製剤Ｑである。
【０１８５】
いくつかの例示的なＮＬＣ組成物は、油：界面活性剤モル比が約０．５〜約１２、約１〜約９、約２〜約９、約３〜約９、約４〜約９、約４．５〜約９、または約４．５もしくは約５〜約７であり、親水性界面活性剤／陽イオン性成分（例えば、陽イオン性脂質）比が約０．５〜約１である、希釈または濃縮された、製剤Ａ、製剤Ｂ、または製剤Ｑである。
【０１８６】
いくつかの例示的なＮＬＣ組成物は、油：界面活性剤モル比が０．０５〜約１２または約０．０５〜約９または約．０５〜約８または約０．０５〜約１または約０．１〜約１であり、親水性界面活性剤／陽イオン性成分（例えば、陽イオン性脂質）比が約０．５〜約１．５である、希釈または濃縮された、製剤Ａ、製剤Ｂ、または製剤Ｑである。
【０１８７】
いくつかの例示的なＮＬＣ組成物は、油：界面活性剤モル比が０．０５〜約１２または約０．０５〜約９または約．０５〜約８または約０．０５〜約１または約０．１〜約１であり、親水性界面活性剤／陽イオン性成分（例えば、陽イオン性脂質）比が約０．５〜約１である、希釈または濃縮された、製剤Ａ、製剤Ｂ、または製剤Ｑである。
【０１８８】
本発明は、ＮＬＣ粒子の平均粒径が約４０ｎｍまたは５０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約４０ｎｍまたは５０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約４０ｎｍまたは５０ｎｍ〜約６０ｎｍである、段落［０１８０］〜［０１８７］に記載される全ての製剤を含む、製剤Ａ〜Ｗを提供する。
【０１８９】
ＩＩＩ．ナノ構造脂質担体の生理科学的特徴
【０１９０】
Ａ．サイズ
【０１９１】
本ＮＬＣのサイズは当該技術分野において公知の手法で評価することができ、例えば、Ｘ線回折、レーザー回折、動的光散乱（ＤＬＳ）、クライオ電子顕微鏡法（ＣｒｙｏＥＭ）、またはマルバーン社製Ｚｅｔａｓｉｚｅが挙げられるが、これらに限定はされない。いくつかの実施形態では、本ＮＬＣのサイズはＺ平均粒径を指す。
【０１９２】
本ＮＬＣは、１μｍ以下の平均粒径（すなわち、数平均粒径）を有する。本ＮＬＣの平均粒径（すなわち、数平均粒径）は、約９００ｎｍ以下、約８００ｎｍ以下、約７００ｎｍ以下、約６００ｎｍ以下、約５００ｎｍ以下、約４００ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、または８０ｎｍ以下、例えば、約５０ｎｍ〜約９００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約８００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約７００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約６００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約４００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１７５ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１２５ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約８０ｎｍ、または約４０ｎｍ〜約６０ｎｍであることが、特に好ましい。ＮＬＣがＮＬＣ粒子から構成されていることは当業者には理解されよう。この平均粒径とは、本ＮＬＣを構成する各粒子の平均粒径を指す。前記ＮＬＣ粒子の平均粒径は、通常、約４０ｎｍ、約６０ｎｍ、約８０ｎｍ、約８５ｎｍ、約９０ｎｍ、約９５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１４５ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１５５ｎｍ、約１６０ｎｍ、約１６５ｎｍ、約１７０ｎｍ、約１７５ｎｍ、約１８０ｎｍ、約１８５ｎｍ、約１９０ｎｍ、約１９５ｎｍ、または約２００ｎｍである。
【０１９３】
いくつかの態様では、前記ＮＬＣ粒子の平均粒径は、約２０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約６０ｎｍである。
【０１９４】
いくつかの態様では、前記ＮＬＣ粒子の平均粒径は、約５０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約６０ｎｍである。
【０１９５】
いくつかの態様では、前記ＮＬＣ粒子の平均粒径は、約４０ｎｍ〜約８０または約４０ｎｍ〜約６０ｎｍである。
【０１９６】
本発明の例示的なＮＬＣは少なくとも０．４５μｍフィルターで濾過することができる。例示的な実施形態では、本ＮＬＣは０．２０または０．２２μｍフィルターで濾過することができる。
【０１９７】
Ｂ．安定性
【０１９８】
本明細書において提供される例示的なＮＬＣは、安定であり、使い易さ、製造性、運搬性、および貯蔵を実現する。本ＮＬＣの生理化学的特徴（サイズを含み、これに限定はされない）は、様々な温度で、および様々な条件下で、長期間維持される。
【０１９９】
時間の関数としての粒径の発達（evolution）は、コロイド安定性の情報を与える。例示的な安定なＮＬＣ組成物は、その粒子が、ある期間（例えば、３０日間または７日間）に亘って、様々な温度（通常、限定はされないが、３７℃、２５℃または５℃）で、実質的に同じｚ平均粒径を保持するものである。実質的に同じｚ平均粒径を保持することとは、粒子が３０日間に亘ってその元の粒径の２０％以内、１５％以内、１０％以内、５％以内にとどまることを意味する。特に安定なＮＬＣ組成物は、その粒子が３０日間に亘って、４℃で、２５℃で、または３７℃でも、実質的に同じｚ平均粒径を保持するものである。
【０２００】
本ＮＬＣの安定性は当業者に周知の手法で測定できる。いくつかの実施形態では、安定性は目視で確認される。目視検査としては、微粒子物検査、フロキュレート（flocculence）検査、またはアグリゲート検査を挙げることができる。通常、コロイド安定性は、ｚ平均粒径の測定などにより、本ＮＬＣの粒径によって求められ、所望により、経時的なサイズの変化、または様々な温度におけるサイズの変化、または特定の条件下でのサイズの変化、として表される。いくつかの実施形態では、安定性は、粒径の増加を評価することにより求められる。いくつかの実施形態では、安定性は、例えば動的光散乱（ＤＬＳ）法を用いて、多分散指数（ＰＤＩ）を測定することにより求められる。他の実施形態では、安定性は、ＤＬＳ法を用いて、ゼータ電位を測定することにより求められる。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、本ＮＬＣのＺ平均粒径の増加は、アッセイ期間に亘って、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１２％未満、１０％未満、７％未満、５％未満、３％未満、１％未満である。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、本ＮＬＣの多分散指数は、約０．５、約０．４、約０．３、約０．２、約０．１、または約０．１〜約０．５、約０．１〜約０．４、約０．１〜約０．３、約０．１〜約０．２、約０．２〜約０．４、または約０．２〜約０．３に維持される。いくつかの好ましい態様では、多分散指数は０．１超、０．１５超、または０．２超である。
【０２０３】
本発明の例示的なＮＬＣベースの組成物は２５℃で６か月間を超えて安定である（例えば、実質的に同じｚ平均粒径を保持する）。
【０２０４】
ＩＶ．生物活性薬剤
【０２０５】
いくつかの例示的な実施形態において、生物活性剤を送達するために、本発明の製剤は、１または複数の生物活性剤と混合または製剤化される。用語「生物活性剤」とは、本明細書で使用される場合、本開示の製剤により送達されるあらゆる物質を指し、例えば、限定はされないが、高分子、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣薬、核酸、オリゴヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、プラスミドＤＮＡ、環状ＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、リボヌクレオチド、ｍＲＮＡ、化学修飾ＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡリボザイム、レプリコンＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、ＤＮＡアプタマー、二本鎖ＲＮＡ、塩基置換ＲＮＡ、イノシン含有ＲＮＡ、アジュバント、例えば、ＴＬＲ作動薬（例えばＴＬＲ２作動薬、ＴＬＲ３作動薬、ＴＬＲ４作動薬、ＴＬＲ７作動薬、ＴＬＲ８作動薬、およびＴＬＲ９作動薬）、Ｒｉｇ−Ｉ作動薬、サポニン、糖、糖ポリマー、複合糖質、全ウイルス粒子、ウイルス様粒子、ウイルス断片、および細胞断片を挙げることができる。非限定的で例示的なアジュバントとして、二本鎖ＲＮＡ、ＲＩＢＯＸＸＯＬ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、およびＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）（ポリＩＣＬＣ）が挙げられる。Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）（ポリＩＣＬＣ）は、カルボキシメチルセルロース、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸二本鎖ＲＮＡ、およびポリ−Ｌ−リジンの合成複合体である。ＲＩＢＯＸＸＯＬは、アニールした５０ｂｐのＲＮＡ二本鎖である（Ｒｉｂｏｘｘ社）。細胞に安全に送達できるものであればいかなる生物活性剤も、本発明のＮＬＣと混合することができる。負に帯電している分子が送達される場合、いくつかの実施形態では、陽イオン性のＮＬＣ表面が負に帯電している生物活性剤と相互作用することにより、当該分子を本ＮＬＣに繋留し得る。
【０２０６】
生物活性剤として使用される、例示的な負に帯電している分子としては、例えば、ペプチド含有抗原、１または複数のペプチド含有抗原をコードする核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）、負に帯電している多糖類、負に帯電している小分子、および負に帯電している免疫アジュバントが挙げられる。負に帯電している免疫アジュバントとしては、例えば、免疫賦活性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）、一本鎖ＲＮＡ、小分子免疫増強剤（small molecule immune potentiator）（ＳＭＩＰ）などが挙げられる。負に帯電している小分子としては、例えば、ホスホン酸、フルオロホスホン酸などが挙げられる。
【０２０７】
最近のアジュバントは、アラムなど、ほとんどがＴｈ２バイアス型である。いくつかの実施形態で、がん標的および感染症標的（例えば、結核、いくつかのウイルス性疾患など）、並びにアレルギーに対するワクチン用の、Ｔｈ１バイアスを促進するアジュバントが求められている。これに関連して、本明細書に記載のように、本発明者らは、ＴＬＲ３作動薬などのためにＴｈ１バイアスを促進する製剤を示した。そのような製剤は、ＩＦＮγ産生を促進し、ＩＬ−５をダウンレギュレートし、Ｔｈ１バイアスが望まれる様々な用途において好適である。
【０２０８】
１または複数の生物活性剤が本発明の製剤と結合してもよい。当業者には理解されることであるが、様々な組み合わせの生物活性剤が前記製剤と結合していてもよく、例えば、複数のＲＮＡ、複数のＤＮＡ、配列が定められている１または複数のＲＮＡおよび１または複数のタンパク質、１または複数のＤＮＡおよび１または複数のタンパク質、並びに、１または複数のＲＮＡおよび１または複数のＤＮＡなどであり、これらに限定はされない。いくつかの態様では、一方の生物活性剤をＮＬＣの油性コアに存在させることができ、もう一方の生物活性剤はＮＬＣの表面と結合させられる。例えば、核酸をＮＬＣ表面と結合させ、一方で、生物学的に活性な小分子をＮＬＣの油性コア内に存在させてよい。
【０２０９】
例示的な実施形態では、前記負に帯電している生物活性剤が、陽イオン性の表面と結合することにより、ＮＬＣと複合体を形成している。この負に帯電している生物活性剤とＮＬＣ表面との結合は、非共有結合性の相互作用であっても、可逆的な共有結合性の相互作用であってもよい。
【０２１０】
別の実施形態では、Ｔｏｌｌ様受容体リガンド（例えば、ＴＬＲ４リガンド）などの疎水性の生物活性剤を、油性コアに、またはＮＬＣ粒子の界面に、組み込むことができる。
【０２１１】
Ａ．ＲＮＡ分子
【０２１２】
前記生物活性剤がＲＮＡ分子である実施形態では、ＲＮＡ分子は様々な種類のタンパク質をコードしていてもよく、そのようなタンパク質としては、例えば、抗原、抗体、毒素、増殖因子、サイトカイン、およびホルモンが挙げられるが、これらに限定はされない。本明細書で使用されるＲＮＡ分子はノンコーディングＲＮＡであってもよく、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、ヘアピン、ＲＮＡアプタマー、ＲＮＡ作動薬、および免疫調節ＲＮＡが挙げられるが、これらに限定はされない。
【０２１３】
例示的な実施形態では、前記負に帯電しているＲＮＡ分子が、陽イオン性の表面と結合することにより、ＮＬＣと複合体を形成している。このＲＮＡ分子とＮＬＣ表面との結合は、非共有結合性の相互作用であっても、可逆的な共有結合性の相互作用であってもよい。
【０２１４】
例示的な実施形態では、前記生物活性剤は自己複製ＲＮＡ分子である。自己複製ＲＮＡ分子は、当該技術分野において周知であり、ウイルス（例えば、アルファウイルス、フラビウイルス、ピコルナウイルス）由来の複製エレメントを用いて、ウイルス構造タンパク質を目的タンパク質をコードするヌクレオチド配列と置き換えることにより、生成することができる。自己複製ＲＮＡ分子は通常、細胞への送達後にそのまま翻訳できる（＋）鎖分子であるが、この翻訳によりＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが用意され、その後、このポリメラーゼにより送達されたＲＮＡからアンチセンス転写物およびセンス転写物の両方が産生される。すなわち、送達されたＲＮＡは複数の娘ＲＮＡの産生をもたらす。これらの娘ＲＮＡ、並びにコリニアリティを示すサブゲノム転写物は、それ自体の翻訳により、コードされた抗原のインサイツ発現を実現してもよいし、あるいは、転写により、送達されたＲＮＡと同じセンス鎖を有するさらなる転写物を得て、これの翻訳により抗原のインサイツ発現を実現してもよい。この一連の転写の全体の結果として、導入されたレプリコンＲＮＡの数が増幅され、これにより、コードされていた抗原がこの細胞の主なポリペプチド産物となる。
【０２１５】
有利な点として、自己複製ＲＮＡ分子により細胞の翻訳機構が利用されることで、コードされた遺伝子産物（タンパク質または抗原など）の著しい増加が起こり、この産物は、細胞内に蓄積させることもできるし、細胞から分泌させることもできる。自己複製ＲＮＡ分子は、例えば、ＲＮＡの複製産物および増幅産物、並びに翻訳産物によってＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）３、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８、並びに非ＴＬＲ経路（例えば、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤ−５）を刺激することで、トランスフェクト細胞のアポトーシスを誘導する場合がある。
【０２１６】
自己複製ＲＮＡには、例えば、ウイルス性レプリカーゼ、ウイルス性プロテアーゼ、ウイルス性ヘリカーゼ、および他の非構造ウイルスタンパク質からなる群から選択される１または複数の遺伝子を少なくとも含有させ、また、５′末端および３′末端にシス活性複製配列を含ませ、必要に応じて、目的のアミノ酸配列（例えば、目的の抗原）をコードする異種配列を含ませることができる。異種配列の発現を指示するサブゲノムプロモーターを自己複製ＲＮＡに含ませることができる。必要であれば、この異種配列（例えば、目的の抗原）は、自己複製ＲＮＡにリボソームスキッピングペプチド配列を含ませて、または含ませずに、他のコード領域にインフレーム融合させてもよいし、さらに／あるいは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の制御下においてもよい。
【０２１７】
ある実施形態では、前記自己複製ＲＮＡ分子はウイルス様粒子に封入されない。本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、当該自己複製ＲＮＡ分子が感染性ウイルス粒子の産生を誘導できないように設計することができる。これは、例えば、自己複製ＲＮＡ内の、ウイルス粒子の産生に必要な構造タンパク質をコードする１または複数のウイルス遺伝子を取り除くことで達成できる。例えば、自己複製ＲＮＡ分子がシンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）などのアルファウイルスをベースにしている場合、カプシド（Ｃ）糖タンパク質および／またはエンベロープ（Ｅ）糖タンパク質などのウイルス構造タンパク質をコードする１または複数の遺伝子を取り除くことができる。
【０２１８】
必要であれば、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、弱毒化されたまたは毒性の感染性ウイルス粒子の産生を誘導するように設計することもできるし、続発感染が一回可能なウイルス粒子を産生するように設計することもできる。
【０２１９】
このような自己複製を実現するのに適した系の１つとして、アルファウイルスをベースとしたレプリコンの使用がある。アルファウイルスは、一連の、遺伝的、構造的、血清学的に関連した、トガウイルス科の節足動物媒介ウイルスを含む。３１種類がアルファウイルス属に分類されており、例えば、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、チクングニアウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスが挙げられる。従って、本発明の自己複製ＲＮＡは、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、東部ウマ脳炎ウイルス、チクングニアウイルス、またはアルファウイルス属に属する他のウイルスに由来するＲＮＡレプリカーゼを組み込んでいてもよい。
【０２２０】
アルファウイルスをベースとした「レプリコン」発現ベクターを本発明で用いることができる。ＤＮＡ、ＲＮＡ、および組換えレプリコン粒子を含む、いくつかの型のレプリコンベクターを利用してよい。そのようなレプリコンベクターは、例えば、シンドビスウイルス（Xiong et al. (1989) Science 243:1188-1191; Dubensky et al., (1996) J. Virol. 70:508-519; Hariharan et al. (1998) J. Virol. 72:950-958; Polo et al. (1999) PNAS 96:4598-4603）、セムリキ森林ウイルス（Liljestrom (1991) Bio/Technology 9:1356-1361; Berglund et al. (1998) Nat. Biotech. 16:562-565）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（Pushko et al. (1997) Virology 239:389-401）を含む、アルファウイルスから得られている。アルファウイルス由来のレプリコンは概して全体的な特徴（例えば、構造、複製）が互いにかなり似ているが、個々のアルファウイルスはユニークないくつかの特別な性質（例えば、インターフェロン感受性、および疾患プロファイル）を示す場合がある。従って、多岐にわたるウイルス科から作製されたキメラアルファウイルスレプリコンも有用となり得る。
【０２２１】
アルファウイルスをベースとするＲＮＡレプリコンは通常、（＋）鎖ＲＮＡであり、細胞への送達後にレプリカーゼ（またはレプリカーゼ転写酵素）の翻訳をもたらす。このレプリカーゼがポリタンパク質として翻訳され、自己開裂して複製複合体を生じ、これが（＋）鎖送達ＲＮＡのゲノム（−）鎖コピーを生成する。この（−）鎖転写物それ自体の転写により、さらなる（＋）鎖の親ＲＮＡコピーを得ることができ、また、抗原をコードするサブゲノム転写物を得ることができる。すなわち、サブゲノム転写物の翻訳は、感染細胞による抗原のインサイツ発現をもたらす。好適なアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを利用することができる。
【０２２２】
ＲＮＡレプリコンは、例えば、１または複数の構造タンパク質遺伝子が目的産物をコードする選択された異種核酸配列により置換されることで改変された、ピコルナウイルス、トガウイルス（例えば、アルファウイルス、例えば、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、またはロスリバーウイルスなど）、フラビウイルス（例えば、黄熱病ウイルス）、コロナウイルス、パラミクソウイルス、から得られたＲＮＡゲノムを含むことができる。
【０２２３】
いくつかの態様において、レプリコンは、（ｉ）当該レプリコンからＲＮＡを転写できるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと、（ｉｉ）抗原と、をコードすることとなる。このポリメラーゼは、例えばアルファウイルスタンパク質のｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４のうちの１または複数を含むアルファウイルスレプリカーゼなどとすることができる。天然アルファウイルスゲノムは非構造的なレプリカーゼポリタンパク質の他に構造的なビリオンタンパク質をコードするが、前記レプリコンはアルファウイルス構造タンパク質をコードしないことが好ましい。すなわち、レプリコンは、細胞におけるそれ自体のゲノムＲＮＡコピーの産生をもたらすことはできるが、ＲＮＡ含有ビリオンの産生はもたらさない。これらのビリオンを産生できないことは、野生型アルファウイルスと異なり、前記好ましいレプリコンがそれ自体を感染形態で永続化できないことを意味する。野生型ウイルスにおける永続化に必要なアルファウイルス構造タンパク質が、前記好ましいレプリコンには存在しておらず、サブゲノム転写物が構造的なアルファウイルスビリオンタンパク質ではなく抗原をコードするように、目的抗原をコードする遺伝子が代わりに存在している。
【０２２４】
本発明で有用なレプリコンは、例えば、２つのオープンリーディングフレームを持つことができる。１つの例では、１つ目の（５′）オープンリーディングフレームがレプリカーゼをコードし；２つ目の（３′）オープンリーディングフレームが抗原をコードする。いくつかの実施形態では、このＲＮＡは、例えば追加の抗原をコードするために、または、アクセサリーポリペプチドをコードするために、追加で（例えば下流に）オープンリーディングフレームを有してもよい。
【０２２５】
レプリコンは、例えば、５′キャップ（例えば、７−メチルグアノシン）を持つことで、ＲＮＡのインビボ翻訳を増強できる場合が多い。いくつかの実施形態では、レプリコンの５′配列は、コードされたレプリカーゼとの適合性を確保するため、選択が必要となる場合がある。
【０２２６】
レプリコンは３′ポリＡ尾部を有していてもよい。レプリコンは３′末端付近にポリＡポリメラーゼ認識配列（例えばＡＡＵＡＡＡ）を含んでいてもよい。
【０２２７】
レプリコンは様々な長さを持つことができるが、通常は５０００〜２５０００ヌクレオチド長であり、例えば、８０００〜１５０００ヌクレオチド長、または９０００〜１２０００ヌクレオチド長である。
【０２２８】
前記レプリコンはインビトロ転写（ＩＶＴ）で作製できると都合が良い。ＩＶＴは、細菌においてプラスミド形態で作製および増殖された、または、合成によって（例えば、遺伝子合成および／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による操作法によって）作製された、（ｃＤＮＡ）鋳型を利用できる。例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、バクテリオファージＴ３  ＲＮＡポリメラーゼ、またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼなど）を用いて、鋳型ＤＮＡからレプリコンを転写することができる。必要に応じて、適切なキャップ形成反応およびポリＡ付加反応を利用することもできる（ただし、レプリコンのポリＡは通常は鋳型ＤＮＡ内にコードされる）。これらのＲＮＡポリメラーゼには、転写された５′ヌクレオチドについて厳しい要求事項がある場合があり、いくつかの実施形態では、これらの要求事項は、ＩＶＴにより転写されたＲＮＡがそれ自体にコードされたレプリカーゼの基質として効率的に機能できるように、コードされたレプリカーゼの要求事項と適合する必要がある。具体例としては、ｐＳＩＮＣＰなどのシンドビスウイルスをベースとするプラスミド（ｐＳＩＮ）が挙げられ、例えば、米国特許第５，８１４，４８２号および同第６，０１５，６８６号、並びに国際公開第９７／３８０８７号、同第９９／１８２２６号、および同第０２／２６２０９号に記載されている。そのようなレプリコンの構築は、概して、米国特許第５，８１４，４８２号および同第６，０１５，６８６号に記載されている。
【０２２９】
他の態様では、前記自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス以外のウイルス、好ましくは、プラス鎖（positive-stranded）ＲＮＡウイルス、ピコルナウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、カリシウイルス、またはコロナウイルス、に由来するか、それをベースとする。好適な野生型アルファウイルス配列は周知であり、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（メリーランド州ロックヴィル）などの配列寄託機関から入手できる。好適なアルファウイルスの代表例としては、アウラウイルス（Aura）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６８）、ベバルウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６００、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４０）、カバスーウイルス（Cabassou）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２２）、チクングニアウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６４、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４１）、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６５、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４２）、フォートモーガンウイルス（Fort Morgan）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２４）、ゲタウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４３）、キジラガッハウイルス（Kyzylagach）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２７）、マヤロウイルス（Mayaro）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６６）、マヤロウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２７７）、ミドレブルクウイルス（Middleburg）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７０）、ムカンボウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４４）、ヌドゥムウイルス（Ndumu）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７１）、ピクスナウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４５）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、セムリキ森林ウイルス（Semliki Forest）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、シンドビスウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６８、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４８）、トナットウイルス（Tonate）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２５）、トリニティウイルス（Triniti）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−４６９）、ウナウイルス（Una）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７４）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（Venezuelan equine encephalomyelitis）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０  ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス（Western equine encephalomyelitis）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６２２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５２）、ワタロアウイルス（Whataroa）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２６）、およびＹ−６２−３３ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７５）が挙げられる。
【０２３０】
他の態様では、前記自己複製ＲＮＡ分子は、複製能を有するウイルス（例えば、腫瘍溶解性ウイルス）に由来するか、それをベースとする。腫瘍溶解性ウイルスはがん細胞に優先的に感染し、それを溶解（破壊）する。感染したがん細胞が破壊されると、新たな感染性ウイルス粒子またはビリオンが放出され、さらなるがん細胞に感染しそれを破壊し得る。すなわち、腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞の直接的な破壊を引き起こすだけでなく、宿主の抗がん免疫応答も刺激する。いくつかの実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍関連性またはウイルス関連性の抗原、ネオアンチゲン、および／またはペプチドをコードし得る。好適な腫瘍溶解性ウイルスは当該技術分野において公知であり、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（メリーランド州ロックヴィル）などの配列寄託機関から入手できる。好適な腫瘍溶解性ウイルスの代表例としては、ポックスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、セネカウイルス、麻疹ウイルス（measles）、単純ヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、流行性耳下腺炎ウイルス（mumps）、インフルエンザウイルス（influenza）、パルボウイルス、ヒトハンタウイルス、粘液腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レンチウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、セネカバレーウイルス、シンドビスウイルス、ＪＸ−５９４、ｐ５３発現ウイルス、ＯＮＹＸ−１５、Ｄｅｌｔａ２４、テロメライシン（Telemelysin）、テロメライシン−ＧＦＰ、およびワクシニアなど、並びにこれらの組換え変異株、が挙げられるが、これらに限定はされない。いくつかの実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍選択性に関して遺伝子改変されたものである。他の実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルスは天然のものである。天然の腫瘍溶解性ウイルスとしては、レオウイルスおよびセネカウイルスが挙げられるが、これらに限定はされない。
【０２３１】
修飾ヌクレオチドを用いて作製された本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、他種のＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）よりも通常大きくなる。通常、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は少なくとも約３ｋｂを有する。例えば、前記自己複製ＲＮＡは、少なくとも約４ｋｂ、少なくとも約５ｋｂ、少なくとも約６ｋｂ、少なくとも約７ｋｂ、少なくとも約８ｋｂ、少なくとも約９ｋｂ、少なくとも約１０ｋｂ、少なくとも約１１ｋｂ、少なくとも約１２ｋｂ、または１２ｋｂ超を有し得る。特定の例で、前記自己複製ＲＮＡは、約４ｋｂ〜約１２ｋｂ、約５ｋｂ〜約１２ｋｂ、約６ｋｂ〜約１２ｋｂ、約７ｋｂ〜約１２ｋｂ、約８ｋｂ〜約１２ｋｂ、約９ｋｂ〜約１２ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１２ｋｂ、約１１ｋｂ〜約１２ｋｂ、約５ｋｂ〜約１１ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約５ｋｂ〜約９ｋｂ、約５ｋｂ〜約８ｋｂ、約５ｋｂ〜約７ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約１２ｋｂ、約６ｋｂ〜約１１ｋｂ、約６ｋｂ〜約１０ｋｂ、約６ｋｂ〜約９ｋｂ、約６ｋｂ〜約８ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約７ｋｂ〜約１１ｋｂ、約７ｋｂ〜約１０ｋｂ、約７ｋｂ〜約９ｋｂ、約７ｋｂ〜約８ｋｂ、約８ｋｂ〜約１１ｋｂ、約８ｋｂ〜約１０ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂ、約９ｋｂ〜約１１ｋｂ、約９ｋｂ〜約１０ｋｂ、または約１０ｋｂ〜約１１ｋｂである。
【０２３２】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は１または複数種類の修飾ヌクレオチド（例えば、プソイドウリジン、Ｎ６−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン）を含んでいてもよい。
【０２３３】
前記自己複製ＲＮＡ分子は、単一の異種ポリペプチド抗原をコードしていてもよいし、あるいは、所望により、アミノ酸配列として発現された際にその独自性を保持するように各配列が連結された（例えば、直列に連結された）２種以上の異種ポリペプチド抗原をコードしていてもよい。自己複製ＲＮＡから生成される異種ポリペプチドは、融合ポリペプチドとして生成されてもよいし、別々のポリペプチド配列またはペプチド配列となるように操作されてもよい。
【０２３４】
本発明の自己複製ＲＮＡは１または複数のポリペプチドをコードしていてもよい。これらのポリペプチドは、結合タンパク質、酵素、サイトカイン、ケモカイン、ホルモンまたは他の機能性タンパク質からなり得る。あるいは、これらのポリペプチドは、一連のエピトープ、好ましくはヘルパーＴ細胞応答もしくは細胞傷害性Ｔ細胞応答または両方を惹起できるエピトープ、を含有する抗原からなり得る。
【０２３５】
本明細書に記載の自己複製ＲＮＡ分子は、２以上のオープンリーディングフレームから複数のヌクレオチド配列を発現するように操作してもよく、これにより、２以上の抗体配列または２種以上の抗原とサイトカインまたは他の免疫調節物質となど、タンパク質の共発現が可能となり、これにより、免疫応答の発生を増強することができる。このような自己複製ＲＮＡ分子は、例えば、様々な遺伝子産物（例えば、タンパク質）を同時に、例えば、２種の異なる一本鎖抗体配列、重鎖および軽鎖の抗体配列、または複数の抗原として生成して、二価以上のワクチンを作製する際に、特に有用であり得る
【０２３６】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、好適であればいかなる方法を用いても作製することができる。修飾ヌクレオチドを含有するＲＮＡ分子を生成するための、いくつかの好適な方法が当該技術分野において公知である。例えば、修飾ヌクレオチドを含有する自己複製ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子への修飾ヌクレオチドの効率的な組み込みを可能にする、好適なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ファージＲＮＡポリメラーゼなど、またはこれらのポリメラーゼの変異体、を用いて、自己複製ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを転写（例えば、インビトロ転写）することにより、作製できる。転写反応は、ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチド、並びに、好適な緩衝液および好適な塩類などの、選択されたポリメラーゼの活性を支持する他の成分、を含有する。自己複製ＲＮＡへの核酸アナログの組み込みを操作することにより、例えば、係るＲＮＡ分子の安定性を変化させたり、リボヌクレアーゼに対する抵抗性を増加させたり、適切な宿主細胞に導入された後の複製を確立させたり（ＲＮＡの「感染性」）、並びに／または、自然免疫および適応免疫応答を誘導もしくは低減したり、してもよい。
【０２３７】
好適な合成法を、単独で用いて、または１もしくは複数の他の方法（例えば、組換えＤＮＡ技術または組換えＲＮＡ技術）と組み合わせて用いて、本発明の自己複製ＲＮＡ分子を生成することができる。好適なデノボ合成法は当該技術分野において周知であり、特定の用途に適合させることができる。例示的な方法としては、例えば、ＣＥＭなどの好適な保護基を用いる化学合成のβ−シアノエチルホスホラミダイト法；およびヌクレオシドＨ−ホスホン酸法が挙げられる。これらの化学反応は、市販の自動核酸合成機との使用用に実行または適合できる。Uhlmann et al. (1990) Chem Rev 90:544-84、およびGoodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1: 165には追加の好適な合成法が記載されている。核酸合成は、当該技術分野において従来公知の好適な組換え法を用いて実行することもでき、例えば、ポリヌクレオチドおよびそのようなポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子産物の、クローニング、プロセシング、並びに／または発現、が挙げられる。ランダム断片化によるＤＮＡシャフリングと、遺伝子断片および合成ポリヌクレオチドのＰＣＲによる再構築は、ポリヌクレオチド配列の設計および操作に用いることができる公知の手法の一例である。部位特異的変異誘発を用いて核酸およびコードされるタンパク質を変化させることで、例えば、新たな制限酵素認識部位を挿入したり、グリコシル化パターンを変えたり、コドン選好性を変えたり、スプライスバリアントを生成したり、変異を導入したりできる。核酸配列の転写、翻訳、および発現のための好適な方法は当該技術分野において従来公知である。
【０２３８】
自己複製ＲＮＡ分子中の１または複数の修飾ヌクレオチドの存在および／または含量は、好適であればいかなる方法を用いても確認することができる。例えば、自己複製ＲＮＡを消化して一リン酸塩（例えば、ヌクレアーゼＰ１を使用）とし、脱リン酸化して（例えば、ＣＩＡＰなどの好適なホスファターゼを使用）、得られたヌクレオシドを逆相ＨＰＬＣにより分析することができる。
【０２３９】
所望により、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、修飾ヌクレオチドを含有しない対応する自己複製ＲＮＡ分子と比較して、導入後すなわち宿主細胞（例えば、ヒト細胞）へ進入後のその免疫調節活性が小さくなるように、１または複数の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。
【０２４０】
必要であれば、当業者に公知の様々なインビトロまたはインビボ試験法を用いて、自己複製ＲＮＡ分子をスクリーニングまたは分析にかけることで、その治療特性および予防特性を確認することができる。例えば、自己複製ＲＮＡ分子を含むワクチンは、目的の特定リンパ球種（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、Ｔ細胞株、およびＴ細胞クローン）の増殖誘導またはエフェクター機能誘導に対する作用について、試験することができる。例えば、免疫化マウス由来の脾臓細胞を単離することができ、ポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含有する標的自己細胞を溶解する細胞傷害性Ｔリンパ球の能力。さらに、ヘルパーＴ細胞の分化を、増殖測定、またはサイトカインであるＴＨ１（ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）および／もしくはＴＨ２（ＩＬ−４およびＩＬ−５）の産生のＥＬＩＳＡ測定により分析することもできるし、抗原刺激後の細胞質サイトカイン染色およびフローサイトメトリーによってＣＤ４陽性Ｔ細胞において直接分析することもできる。
【０２４１】
ポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子は、液性免疫応答を誘導する能力について調べることもでき、これは例えば、目的抗原に特異的な抗体のＢ細胞における産生の誘導によって明らかとなる。これらのアッセイは、例えば、免疫化された個体由来の末梢Ｂリンパ球を用いて行うことができる。このようなアッセイ法は当業者に公知である。本発明の自己複製ＲＮＡ分子の特徴付けに用いることができる他のアッセイは、標的細胞による被コード抗原の発現の検出が含むことがある。例えば、細胞表面上または細胞内での抗原発現の検出には、ＦＡＣＳを用いることができる。ＦＡＣＳを選択する別の利点としては、発現レベルの差異に関して選別をかけることができる点であるが、これは、発現が少ないことが好ましい場合があるためである。特定の抗原を発現する細胞を同定するための他の好適な方法には、プレート上のモノクローナル抗体を利用したパニングまたはモノクローナル抗体で被覆された磁気ビーズを用いた捕獲が含まれる。
【０２４２】
Ｂ．ＤＮＡ分子
【０２４３】
生物活性剤がＤＮＡ分子である実施形態では、ＤＮＡ分子は、抗原、抗体、毒素、増殖因子、サイトカイン、およびホルモンを含むがこれらに限定されない、様々な種類のタンパク質をコードし得る。ＤＮＡとしては、プラスミドＤＮＡ、環状ＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、およびアプタマーＤＮＡを挙げることができるが、これらに限定はされない。
【０２４４】
Ｃ．抗原
【０２４５】
本明細書に記載の生物活性剤は、抗原をコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）とすることができる。好適な抗原としては、細菌性抗原、ウイルス性抗原、真菌性抗原、原生動物性抗原、植物性抗原、がん抗原、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定はされない。抗原は、例えば、アレルギー、がん、感染症、または自己免疫疾患に関与するものとすることもできるし、それに由来するものとすることもできる。
【０２４６】
抗原は、対象におけるそれに対する免疫反応性の惹起または増強が望まれる、あらゆる標的エピトープ、標的分子（生体分子を含む）、標的分子複合体（生体分子を含有する分子複合体を含む）、標的細胞内構築体（subcellular assembly）、標的細胞、または標的組織であってよい。抗原という用語は目的のポリペプチド抗原を指すことが多い。ある実施形態では、抗原は、感染、がん、自己免疫疾患、アレルギー、喘息、または抗原特異的免疫応答の刺激が望ましいか有益であろうあらゆる他の状態に関連している感染性病原体および／またはエピトープ、生体分子、細胞もしくは組織であってもよいし、それに由来するものであってもよいし、それと免疫学的に交差反応性のものであってもよい。
【０２４７】
特定の実施形態では、細菌、ウイルスまたは真菌などの少なくとも１種の感染性病原体に由来する抗原が企図され、例えば以下が挙げられる：アクチノバクテリウム（Actinobacterium）、例えば、結核菌（M. tuberculosis）もしくはらい菌（M. leprae）または別のマイコバクテリウム；細菌、例えば、大腸菌属、サルモネラ属、ナイセリア属、ボレリア属、クラミジア属、クロストリジウム属またはボルデテラ属のメンバー；ウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２などのＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、コロナウイルス（ＳＡＲＳまたはＭＥＲＳなど）、ロタウイルス、ノロウイルス、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、腸内ウイルス、またはコクサッキー（coxsacchie）ウイルスなど）、動物由来病原体、例えば、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、肝炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、フラビウイルス属ウイルス（デングウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、ポワッサンウイルス、またはダニ媒介性脳炎ウイルスなど）、ヘニパウイルス（henipah virus）（ヘンドラウイルスまたはニパーウイルスなど）、ブニアウイルス（ハンタウイルスまたはリフトバレー出血熱ウイルスなど）、アレナウイルス（ラッサ熱ウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、またはグアナリトウイルスなど）、フィロウイルス（エボラウイルスまたはマールブルグウイルスなど）、リッサウイルス（狂犬病ウイルスなど）、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、およびサイトメガロウイルス；真菌、例えば、アスペルギルス属、ブラストミセス属、コクシジオイデス属、およびニューモシスチス属、または酵母、例えば、カンジダ・アルビカンス（C. albicans）、カンジダ・グラブラタ（C. glabrata）、カンジダ・クルセイ（C. krusei）、カンジダ・ルシタニエ（C. lusitaniae）、カンジダ・トロピカリス（C. tropicalis）、およびカンジダ・パラプローシス（C. parapsilosis）などのカンジダ属種；寄生虫、例えば原生動物、例えばプラスモディウム属種、例えば、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）、および卵形マラリア原虫（P. ovale）；または、アカントアメーバ属、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、アンギオストロンギルス属、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansonii）、ビルハルツ住血吸虫（Schistosoma haematobium）、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）、クリプトスポリジウム属、鉤虫属、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、大腸アメーバ（Entamoeba coli）、エントアメーバ・ディスパー（Entamoeba dispar）、ハルトマンアメーバ（Entamoeba hartmanni）、ポレックアメーバ（Entamoeba polecki）、バンクロフト糸状虫（Wuchereria bancrofti）、ジアルジア属、トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）、およびリーシュマニア属のうちの１もしくは複数などの別の寄生虫。特定の実施形態では、前記抗原は、結核、インフルエンザ、アメーバ症、ＨＩＶ、肝炎、またはレーシュマニア症に関与する抗原から得られるか、それに関連するものであり得る。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、前記抗原はインフルエンザ関連抗原である。いくつかの実施形態では、前記抗原はインフルエンザの原因となる抗原である。いくつかの実施形態では、前記抗原はインフルエンザの原因となるウイルス由来である。１つの実施形態では、前記抗原はＨ５Ｎ１由来の赤血球凝集素（ＨＡ）を含む。１つの実施形態では、前記抗原はＨ５Ｎ１由来のノイラミニダーゼを含む。
【０２４９】
例えば、ある実施形態では、抗原はボレリア属種に由来し、その抗原としては、核酸、病原体由来抗原、または抗原性調製物、組み換えにより産生されたタンパク質もしくはペプチド、およびキメラ融合タンパク質を挙げることができる。１つのそのような抗原としてＯｓｐＡがある。ＯｓｐＡは、宿主細胞におけるその生合成により脂質を付加された形態の完全成熟タンパク質（Ｌｉｐｏ−ＯｓｐＡ）であってもよいし、あるいは、脂質が付加されていない誘導体であってもよい。そのような非脂質付加誘導体としては、インフルエンザウイルスの非構造タンパク質（ＮＳ１）の最初の８１個のＮ末端アミノ酸および完全ＯｓｐＡタンパク質を有する非脂質付加ＮＳ１−ＯｓｐＡ融合タンパク質が挙げられ、それとは別に、ＭＤＰ−ＯｓｐＡは、３個の追加のＮ末端アミノ酸を有するＯｓｐＡの非脂質付加形態である。
【０２５０】
ある実施形態では、前記抗原は、ＨＩＶ−１（例えば、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０）、ヒトヘルペスウイルス（例えば、ｇＤもしくはその誘導体、またはＨＳＶ１由来もしくはＨＳＶ２由来のＩＣＰ２７などの前初期タンパク質）、サイトメガロウイルス（（特に、ヒトサイトメガロウイルス）例えば、ｇＢまたはその誘導体）、ロタウイルス（弱毒生ウイルスを含む）、エプスタイン・バーウイルス（例えば、ｇｐ３５０またはその誘導体）、水痘帯状疱疹ウイルス（例えば、ｇｐｌ、ＩＩおよびＩＥ６３）、または、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原またはその誘導体）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、およびＥ型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルス、または、他のウイルス病原体、例えば、パラミクソウイルス：呼吸器合胞体ウイルス（例えば、Ｆタンパク質およびＧタンパク質またはその誘導体）、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８など）、フラビウイルス（例えば、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、ポワッサンウイルス（Poswanan virus）、ダニ媒介性脳炎ウイルス）、またはインフルエンザウイルス（全粒子の生または不活性化ウイルス、スプリットされたインフルエンザウイルス、卵もしくはＭＤＣＫ細胞内で増殖させたもの、または全粒子インフルエンザビロソーム（Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920で説明されている）、または、その精製タンパク質もしくは組換えタンパク質、例えば、ＨＡタンパク質、ＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、ＰＢ１タンパク質、ＰＢ２タンパク質、ＰＡタンパク質、ＮＳ１タンパク質、もしくはＭタンパク質、またはこれらの組み合わせ）などのウイルスに由来する抗原である。
【０２５１】
他のとある実施形態では、前記抗原は、淋菌（N. gonorrhea）および髄膜炎菌（N. meningitidis）（例えば、莢膜性多糖類およびそのコンジュゲート、トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、ＰｉｌＣ、アドヘシン）を含むナイセリア属菌種；化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）（例えば、Ｍタンパク質またはその断片、Ｃ５Ａプロテアーゼ、リポテイコ酸）、アガラクチア菌（S. agalactiae）、ストレプトコッカス・ミュータンス（S. mutans）：軟性下疳菌（H. ducreyi）；モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）、別名カタル球菌（Branhamella catarrhalis）（例えば、高分子および低分子のアドヘシンおよびインベイシン）を含むモラクセラ属菌種；百日咳菌（B. pertussis）（例えば、パータクチン、百日咳毒素、またはその誘導体、線維状赤血球凝集素（filamenteous hemagglutinin）、アデニル酸シクラーゼ、線毛）、パラ百日咳菌（B. parapertussis）、および気管支敗血症菌（B. bronchiseptica）を含むボルデテラ属菌種；結核菌（M. tuberculosis）（例えば、ＥＳＡＴ６、抗原８５Ａ、８５Ｂ、または８５Ｃ）、ウシ型結核菌（M. bovis）、らい菌（M. leprae）、トリ型結核菌（M. avium）、ヨーネ菌（M. paratuberculosis）、スメグマ菌（M. smegmatis）を含むマイコバクテリウム属菌種；レジオネラ・ニューモフィラ（L. pneumophila）を含むレジオネラ属菌種；腸管毒性大腸菌（enterotoxic E. coli）（例えば、定着因子、易熱性毒素またはその誘導体、耐熱性毒素またはその誘導体）、腸管出血性大腸菌、腸管病原性大腸菌（例えば、志賀毒素様毒素またはその誘導体）を含む大腸菌属菌種；コレラ菌（V. cholera）（例えば、コレラ毒素またはその誘導体）を含むビブリオ属菌種；ソンネ菌（S. sonnei）、志賀赤痢菌（S. dysenteriae）、シゲラ・フレックスネリ（S. flexnerii）を含む赤痢菌属菌種；エルシニア・エンテロコリチカ（Y. enterocolitica）（例えば、Ｙｏｐタンパク質）、ペスト菌（Y. pestis）、仮性結核菌（Y. pseudotuberculosis）を含むエルシニア属菌種；カンピロバクター・ジェジュニ（C. jejuni）（例えば、毒素、アドヘシンおよびインベイシン）およびカンピロバクター・コリ（C. coli）を含むカンピロバクター属菌種；チフス菌（S. typhi）、パラチフス菌（S. paratyphi）、ブタコレラ菌（S. choleraesuis）、腸炎菌（S. enteritidis）を含むサルモネラ属菌種；リステリア菌（L. monocytogenes）を含むリステリア属菌種；ピロリ菌（H. pylori）（例えば、ウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化致死毒素）を含むヘリコバクター属菌種；緑膿菌（P. aeruginosa）を含むシュードモナス属菌種；黄色ブドウ球菌（S. aureus）、表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）を含むブドウ球菌属菌種；大便連鎖球菌（E. faecalis）、フェシウム菌（E. faecium）を含むエンテロコッカス属菌種；破傷風菌（C. tetani）（例えば、破傷風毒素およびその誘導体）、ボツリヌス菌（C. botulinum）（例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体）、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）（例えば、クロストリジウムトキシンＡまたはトキシンＢおよびその誘導体）を含むクロストリジウム属菌種；炭疽菌（B. anthracis）（例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体）を含むバチルス属菌種；ジフテリア菌（C. diphtheriae）（例えば、ジフテリア毒素およびその誘導体）を含むコリネバクテリウム属菌種；ボレリア・ブルグドルフェリ（B. burgdorferi）（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、ボレリア・ガリニ（B. garinii）（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、ボレリア・アフゼリ（B. afzelii）（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、ボレリア・アンダーソニ（B. andersonii）（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、ボレリア・ヘルムシ（B. hermsii）を含むボレリア属菌種；エーリキア・エクイ（E. equi）およびヒト顆粒球エーリキア症の病原体を含むエーリキア属菌種；リケッチア・リケッチイ（R. rickettsii）を含むリケッチア属菌種；クラミジア・トラコマチス（C. trachomatis）（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、肺炎クラミジア（C. pneumoniae）（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、オウム病クラミジア（C. psittaci）を含むクラミジア属菌種；レプトスピラ・インターロガンス（L. interrogans）を含むレプトスピラ属菌種；梅毒トレポネーマ（T. pallidum）（例えば、微量（rare）外膜タンパク質）、トレポネーマ・デンティコラ（T. denticola）、トレポネーマ・ヒオディセンテリア（T. hyodysenteriae）を含むトレポネーマ属菌種；または他の病原性微生物、などの１または複数の病原性微生物に由来する抗原である。
【０２５２】
他のとある実施形態では、前記抗原は１または複数の寄生虫（例えば、ohn, D.T. and Petri, W.A., Markell and Voge’s Medical Parasitology-9th Ed., 2006, WB Saunders, Philadelphia; Bowman, D.D., Georgis’ Parasitology for Veterinarians-8th Ed., 2002, WB Saunders, Philadelphiaを参照）に由来する抗原であり、例えば、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）を含むプラスモディウム属種；トキソプラズマ原虫（T. gondii）（例えば、ＳＡＧ２、ＳＡＧ３、Ｔｇ３４）を含むトキソプラズマ属種；赤痢アメーバ（E. histolytica）を含むエントアメーバ属種；ネズミバベシア（B. microti）を含むバベシア属種；クルーズトリパノソーマ（T. cruzi）を含むトリパノソーマ属種；ランブル鞭毛虫（G. lamblia）を含むジアルジア属種；森林型熱帯リーシュマニア（L. major）を含むリーシュマニア属種（Leshmania spp.）；ニューモシスチス・カリニ（P. carinii）を含むニューモシスチス属種；膣トリコモナス（T. vaginalis）を含むトリコモナス属種；または、哺乳動物に感染可能な蠕虫、例えば、（ｉ）線虫感染（例えば、限定はされないが、蟯虫（Enterobius vermicularis）、回虫（Ascaris lumbricoides）、トリクリス・トリクリア（Trichuris trichuria）、アメリカ鉤虫（Necator americanus）、ズビニ鉤虫（Ancylostoma duodenale）、バンクロフト糸状虫（Wuchereria bancrofti）、マレー糸状虫（Brugia malayi）、回旋糸状虫（Onchocerca volvulus）、メジナ虫（Dracanculus medinensis）、旋毛虫（Trichinella spiralis）、および糞線虫（Strongyloides stercoralis））；（ｉｉ）吸虫感染（例えば、限定はされないが、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）、ビルハルツ住血吸虫（Schistosoma haematobium）、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）、メコン住血吸虫（Schistosoma mekongi）、肝吸虫（Opisthorchis sinensis）、肺吸虫属種（Paragonimus sp）、肝蛭（Fasciola hepatica）、ファスキオラ・マグナ（Fasciola magna）、巨大肝蛭（Fasciola gigantica））；並びに（ｉｉｉ）条虫感染（例えば、限定はされないが、無鉤条虫（Taenia saginata）および有鉤条虫（Taenia solium））が挙げられる。ある実施形態では、前記抗原は、住血吸虫属（Schisostoma）種、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansonii）、ビルハルツ住血吸虫（Schistosoma haematobium）、および／もしくは日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）、に由来する抗原、または、カンジダ・アルビカンス（C. albicans）を含むカンジダ属菌種；クリプトコッカス・ネオフォルマンス（C. neoformans）を含むクリプトコッカス属菌種、などの酵母、に由来する抗原である。
【０２５３】
他の特異的抗原は、結核菌（M. tuberculosis）由来の抗原であり、例えば、Ｔｈ  Ｒａ１２、Ｔｂ  Ｈ９、Ｔｂ  Ｒａ３５、Ｔｂ３８−１、Ｅｒｄ１４、ＤＰＶ、ＭＴＩ、ＭＳＬ、ｍＴＴＣ２およびｈＴＣＣ１である（国際公開第９９／５１７４８）。結核菌（M. tuberculosis）のタンパク質には、少なくとも２、３、もしくは４またはそれ以上の、結核菌（M. tuberculosis）のポリペプチドがより大きなタンパク質に融合している融合タンパク質およびそのバリアントも含まれる。特定の融合物としては、Ｒａ１２−ＴｂＨ９−Ｒａ３５、Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ、ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ、Ｅｒｄ１４ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ−ｍＴＣＣ２、Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ、ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ−ｍＴＣＣ２、ＴｂＨ９−ＤＰＶ−ＭＴＩが挙げられる（国際公開第９９１５１７４８）。使用してもよい他の抗原には、米国特許出願公開第２０１０／０１２９３９１号および国際公開第２００８／１２４６４７号に記載の抗原、抗原の組み合わせ、および融合タンパク質が含まれる。例示的な１つの実施形態では、前記融合タンパク質はＩＤ９３である。例示的な１つの実施形態では、前記融合タンパク質はＩＤ９１（配列番号１）である。
【０２５４】
融合タンパク質ＩＤ９１は、４種のＭｔｂタンパク質、すなわち、Ｒｖ３６１９（病原性因子、ＥｓＸファミリー、配列番号２）、Ｒｖ２３８９（低酸素条件下で産生、再活性化（resuscitation）因子Ｄ  配列番号３）、Ｒｖ３４７８（ＰＥ／ＰＰＥファミリーのメンバー、配列番号４）、およびＲｖ１８８６（Ａｇ８５Ａ、分泌／膜タンパク質；マイコリルトランスフェラーゼ（mycolyltransferase）、配列番号５）、の融合体を含む（図２９）。ＩＤ９１に含まれるＭｔｂ抗原は、ヒト配列相同性の欠如、および抗原刺激後のＰＰＤ＋ドナー（ＰＰＤ−ドナーではない）からのヒトＰＢＭＣによるＩＦＮ−ｇ分泌に基づいて優先度を付けることにより、ヒト集団においての免疫原性が確保された（Bertholet et al., J Immunol. 181(11):7948-57 (2008)）。安定なエマルジョンの状態で合成Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）作動薬であるグルコピラノシル脂質アジュバントと組み合わされたＩＤ９１タンパク質（ＧＬＡ−ＳＥ）は、前臨床マウスモデルにおける１回接種の４週間後に、Ｍｔｂ  Ｈ３７Ｒｖに対する保護を示す（Orr et al., J Immunol. 193(6):2911-18 (2014)）。このサブユニットワクチンを用いた場合、ＩＤ９１に対するロバストなＴＨ１反応（ＩＦＮ−ｇ、ＴＮＦ、およびＩＬ−２）が確認された（同上）。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、ＩＤ９１は当業者に周知の制限酵素を含んでもよい。例示的な制限酵素としては、Ｎｄｅｌ、Ｋｐｎｌ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、および／またはＨｉｎｄＩＩＩが挙げられるが、これらに限定はされない。例えば、図３８Ａ並びに配列番号６および配列番号１２のベクターｐＥＴ２９、並びに、図３８ＢのベクターｐＥＴ２８を参照されたい。
【０２５６】
他の特異的抗原はクラミジア属に由来するものであり、例えば、高分子量タンパク質（ＨＷＭＰ）（国際公開第９９／１７７４１号）、ＯＲＦ３（ＥＰ３６６４１２）、および推定膜タンパク質（Ｐｍｐ）が挙げられる。他のクラミジア属由来抗原は国際公開第９９１２８４７５号に記載の群から選択することができる。特定の抗原は連鎖球菌属菌種由来であり得るが、例えば、肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）由来抗原（例えば、莢膜性多糖類およびその複合物、ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、ストレプトリシン、コリン結合性タンパク質）、並びに、タンパク質抗原のニューモリシン（Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342）、および変異体であるその無毒化誘導体（国際公開第９０／０６９５１号；国際公開第９９／０３８８４号）が挙げられる。他の細菌ワクチンは、ヘモフィルス属菌種に由来する抗原、例えば、ヘモフィルスインフルエンザＢ菌（H. influenzae type B）由来抗原（例えば、ＰＲＰおよびその複合物）、分類不能型インフルエンザ菌由来抗原、例えば、ＯＭＰ２６、高分子量アドヘシン、Ｐ５、Ｐ６、プロテインＤ、およびリポタンパク質Ｄ、並びに、フィンブリンおよびフィンブリン由来ペプチド（米国特許第５，８４３，４６４号）またはその多コピー変異体もしくは融合タンパク質を含む。
【０２５７】
他の特異的抗原はＢ型肝炎由来の抗原である。Ｂ型肝炎表面抗原の誘導体は当該技術分野において周知であり、特に、欧州特許出願ＥＰ−Ａ４１４３７４；ＥＰ−Ａ−０３０４５７８、およびＥＰ１９８４７４に記載される、ＰｒｅＳ１抗原、ＰｒｅＳ２抗原、Ｓ抗原が含まれる。
【０２５８】
他の実施形態では、前記抗原は、性器疣贅に関与すると考えられているヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）（ＨＰＶ６またはＨＰＶ１１など）由来抗原、および子宮頸がんに関与すると考えられているＨＰＶウイルス（ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８など）由来抗原である。特定の抗原として、Ｌ１粒子またはカプソメア、並びに、ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１のＥ６タンパク質、Ｅ７タンパク質、Ｌ１タンパク質、およびＬ２タンパク質から選択される１または複数の抗原を含む融合タンパク質、が挙げられる。ある特定の形態の融合タンパク質としては、国際公開第９６／２６２７７号に開示されているＬ２Ｅ７、およびＧＢ９７１７９５３．５（ＰＣＴ／ＥＰ９８／０５２８５）に開示されているプロテインＤ（１／３）−Ｅ７が含まれる。追加で考えられる抗原としてはＨＰＶ１６抗原、ＨＰＶ１８抗原、ＨＰＶ３３抗原、ＨＰＶ５８抗原が挙げられる。例えば、Ｌ１抗原モノマーもしくはＬ２抗原モノマー、または、まとめてウイルス様粒子（ＶＬＰ）として現れているＬ１抗原もしくはＬ２抗原、または、ＶＬＰ構造もしくはカプソメア構造に単独で現れているＬ１単独タンパク質。このような抗原、ウイルス様粒子、およびカプソメアはそれ自体公知である。例えば、国際公開第９４／００１５２号、同第９４／２０１３７号、同第ＷＯ９４／０５７９２号、および同第ＷＯ９３／０２１８４号を参照されたい。
【０２５９】
他の実施形態では、前記抗原は融合タンパク質である。融合タンパク質は、単独で含まれていてもよいし、例えばＥ７、Ｅ２またはＦ５などの融合タンパク質として含まれていてもよく；特定の実施形態にはＬ１Ｅ７融合タンパク質を含むＶＬＰが含まれる（国際公開第９６／１１２７２号）。特定のＨＰＶ１６抗原は、初期タンパク質Ｅ６またはＦ７と、それと融合したプロテインＤ担体とを含んで、ＨＰＶ１６由来のプロテインＤ−Ｅ６融合体もしくはプロテインＤ−Ｅ７融合体、またはその組み合わせ、を形成しており；あるいは、Ｅ６またはＥ７と、Ｌ２との組み合わせを含む（国際公開第９６／２６２７７）。あるいは、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８の初期タンパク質であるＥ６およびＥ７は、単一分子の状態で存在してもよい（例えば、プロテインＤ−Ｅ６／Ｅ７融合体）。組成物は所望により、例えばプロテインＤ−Ｅ６融合タンパク質もしくはプロテインＤ−Ｅ７融合タンパク質またはプロテインＤ  Ｅ６／Ｅ７融合タンパク質の形態で、ＨＰＶ１８の全面に、Ｅ６タンパク質およびＥ７タンパク質の一方または両方を含有していてもよい。加えて、組成物は他のＨＰＶ菌株由来の抗原、例えばＨＰＶ３１菌株由来抗原またはＨＰＶ３３菌株由来抗原、を含んでいてもよい。
【０２６０】
抗原はマラリアを引き起こす寄生虫に由来する抗原であってもよい。例えば、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodia falciparum）由来抗原としてはＲＴＳ，ＳおよびＴＲＡＰが挙げられる。ＲＴＳは、Ｂ型肝炎表面抗原のｐｒｅＳ２タンパク質の４個のアミノ酸を介して、Ｂ型肝炎ウイルスの表面（Ｓ）抗原に連結されている、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）のスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパクの実質上すべてのＣ末端部分、から構成されるハイブリッドタンパク質である。その完全な構造は国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９２／０２５９１号に開示されており、当該国際特許出願第は英国特許出願第９１２４３９０．７号に基づく優先権を主張する国際公開第９３／１０１５２号として公開された。酵母で発現される場合、ＲＴＳはリポタンパク質粒子として産生され、ＨＢＶ由来のＳ抗原と共発現される場合、ＲＴＳ，Ｓとして知られている混合粒子が産生される。
【０２６１】
ＴＲＡＰ抗原については、国際公開第９０／０１４９６号として公開された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ８９／００８９５号で説明されている。本発明の１つの実施形態はマラリアワクチンであり、その抗原性調製物はＲＴＳ，Ｓ抗原およびＴＲＡＰ抗原の組み合わせから構成される。多段マラリアワクチンの成分候補になり得る他のマラリア原虫抗原としては、熱帯熱マラリア原虫（P. faciparum）のＭＳＰ１、ＡＭＡ１、ＭＳＰ３、ＥＢＡ、ＧＬＵＲＰ、ＲＡＰ１、ＲＡＰ２、セクウェストリン（Sequestrin）、ＰｆＥＭＰ１、Ｐｆ３３２、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＰｆＥＸＰ１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８、ＰＦＳ２７１２５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２３０、およびマラリア原虫に含まれるこれらの類似体、がある。
【０２６２】
１つの実施形態では、前記抗原は、免疫療法によるがん治療に有用であり得るような、がん細胞由来抗原である。例えば、前記抗原は腫瘍拒絶抗原であってもよく、例えば、前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、膵がん、腎がんまたはメラノーマがんに対する腫瘍拒絶抗原である。例示的ながん由来抗原またはがん細胞由来抗原としては、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、およびＭＡＧＥ４、またはＷＯ９９／４０１８８に開示されているものなどの他のＭＡＧＥ抗原、ＰＲＡＭＥ、ＢＡＧＥ、Ｌａｇｅ（別名ＮＹ  Ｅｏｓ１）  ＳＡＧＥおよびＨＡＧＥ（国際公開第９９／５３０６１号）またはＧＡＧＥ（Robbins and Kawakami, 1996 Current Opinions in Immunology 8, pp. 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997 & 1998); Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p. 293）が挙げられる。非限定例としてのこれらのがん抗原は、メラノーマ、肺癌、肉腫および膀胱癌などの広範な腫瘍型で発現されている。例えば、米国特許第６，５４４，５１８号を参照されたい。
【０２６３】
他の腫瘍特異的抗原としては、ＧＭ２およびＧＭ３などの腫瘍特異的もしくは腫瘍関連性のガングリオシド、もしくは担体タンパク質とのその複合体；または、多くのがん治療で有用な、１０アミノ酸長の短ペプチドである全長性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ、国際公開第９５／２０６００号）などの自己ペプチドホルモン、が挙げられるが、これらに限定はされない。別の実施形態では、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＰＳＣＡ（例えば、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95(4) 1735-1740 1998）、ＰＳＭＡなどの前立腺抗原が用いられ、あるいは、１つの実施形態では、Ｐｒｏｓｔａｓｅとして知られている前立腺抗原が用いらる（例えば、Nelson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96: 3114-3119; Ferguson, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. 96, 3114-3119；国際公開第９８／１２３０２号；米国特許第５，９５５，３０６号；国際公開第９８／２０１１７号；米国特許第５，８４０，８７１号および同第５，７８６，１４８号；国際公開第００／０４１４９号）。他の前立腺特異抗原は、国際公開第９８／１３７４１８号、および国際公開第／００４１４９号からのものが知られている。別の前立腺特異抗原としてはＳＴＥＡＰ（PNAS 96 14523 14528 7-12 1999）がある。
【０２６４】
本発明との関連において有用な他の腫瘍関連抗原には、Ｐｌｕ−１（J Biol. Chem 274 (22) 15633-15645, 1999）、ＨＡＳＨ−１、ＨａｓＨ−２、Ｃｒｉｐｔｏ（Salomon et al Bioessays 199, 21:61-70、米国特許第５，６５４，１４０号）、およびＣｒｉｐｔｉｎ（米国特許第５，９８１，２１５号）が含まれる。さらに、がん治療におけるワクチンに特に関連している抗原には、チロシナーゼおよびサバイビンも含まれる。
【０２６５】
他の実施形態では、本発明の組成物中に用いられる薬剤としては、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの状態の予防および治療のための、細菌感染症（例えば肺炎球菌感染症）を原因とするまたはそれによって増悪する呼吸器疾患などの、呼吸器疾患に関連した抗原が挙げられる。ＣＯＰＤは、生理学的には、慢性気管支炎および／または肺気腫を患う患者における、不可逆的または部分的に可逆的な気道閉塞の存在によって定義される（Am J Respir Crit Care Med. 1995 Nov;152(5 Pt 2):S77-121）。ＣＯＰＤの増悪は細菌（例えば肺炎球菌）感染によって引き起こされる場合が多い（Clin Microbiol Rev. 2001 Apr;14(2):336-63）。
【０２６６】
Ｄ．抗体をコードする核酸
【０２６７】
本明細書に記載の生物活性剤（例えば、ＲＮＡ）は、対象に送達されることでその対象における抗体または抗原結合性断片の産生が起こるように、所望により１または複数の発現調節領域に機能的に連結された、抗体および／または抗体の抗原結合性断片をコードしていてもよい。いくつかの実施形態では、前記生物活性剤は単一のオープンリーディングフレームに重鎖および軽鎖のコード配列を含有していてもよい。他の実施形態では、本発明のＮＬＣは２種の生物活性剤を含んでいてもよく、それらの生物活性剤の一方が重鎖をコードし、他方が軽鎖をコードする。他の実施形態では、前記生物活性剤は、発現された生体分子が目的抗原と結合するように、柔軟性のある短ポリペプチド配列で連結された重鎖可変領域および軽鎖可変領域のコード配列を含有していてもよい。いくつかの特定の実施形態では、産生された抗体は個体における免疫応答の誘発が可能である。
【０２６８】
Ｅ．ＲＮＡ干渉
【０２６９】
いくつかの実施形態では、本ＮＬＣと結合した生物活性ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）ポリヌクレオチドなどのノンコーディングＲＮＡである。ＲＮＡｉは、哺乳類細胞のＲＮＡ干渉経路機構との相互作用を通じてＲＮＡ干渉を誘導し、導入遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物を配列特異的に分解または翻訳阻害することが可能な分子である。２種類の主なＲＮＡｉポリヌクレオチドとして、低分子（small or short）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）がある。ＲＮＡｉポリヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉を誘導可能なＲＮＡをコードする、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、および発現カセットを含む群から選択され得る。ｓｉＲＮＡは、通常は１５〜５０個の塩基対、好ましくは２１〜２５個の塩基対を含有し、且つ、細胞内の発現標的遺伝子またはＲＮＡ内のコード配列と同一（完全に相補的）またはほぼ同一（部分的に相補的）の核酸配列を有する、二本鎖構造を含む。ｓｉＲＮＡは３′オーバーハングとしてジヌクレオチドを有してもよい。ｓｉＲＮＡは、２本のアニールされたポリヌクレオチドから構成されてもよいし、ヘアピン構造を形成している一本のポリヌクレオチドから構成されてもよい。
【０２７０】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、ｍＲＮＡ標的の破壊または翻訳抑制を指示する、約２２ヌクレオチド長の低分子量ノンコーディングＲＮＡ遺伝子産物である。ｍｉＲＮＡと標的ｍＲＮＡとの間の相補性が部分的である場合、標的ｍＲＮＡの翻訳は抑制される。相補性が広範囲にわたる場合、標的ｍＲＮＡは切断される。ｍｉＲＮＡについて、この複合体はｍＲＮＡの３’非翻訳領域に通常位置している標的部位に結合するが、通常、この標的部位はこのｍｉＲＮＡと部分的にしか相同性を共有していない。「シード領域」、その標的と完全な塩基対合を形成するｍｉＲＮＡの５′末端に存在するおよそ７個の連続ヌクレオチド配列、はｍｉＲＮＡの特異性において重要な役割を果たす。ＲＩＳＣ／ｍｉＲＮＡ複合体がｍＲＮＡに結合すると、タンパク質翻訳の抑制か、またはｍＲＮＡの切断および分解のいずれかが生じ得る。
【０２７１】
Ｆ．ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ
【０２７２】
いくつかの実施形態では、本ＮＬＣ製剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集の合成低分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むことにより、目的遺伝子を標的化する。ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）は、配列決定された細菌のおよそ４０％および配列決定された古細菌のおよそ９０％のゲノムに存在する、複数の短いダイレクトリピートを含有する遺伝子座である。ＣＲＩＳＰＲは、プラスミドおよびファージなどの外来性遺伝因子に対する耐性を付与するという点で、原核生物の免疫系として機能する。ＣＲＩＳＰＲシステムは獲得免疫の一形態をもたらす。スペーサーと呼ばれる、外来ＤＮＡの短セグメントが、ＣＲＩＳＰＲリピート間のゲノムに挿入され、過去の暴露の記憶として働く。次に、ＣＲＩＳＰＲスペーサーを利用して、真核生物におけるＲＮＡｉと類似した方法で外来性遺伝因子の認識およびサイレンシングが行われる。Ｃａｓ９は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに必須のタンパク質成分であるが、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と呼ばれる２種のＲＮＡと複合体形成して活性型エンドヌクレアーゼを形成し、侵入ファージ内または侵入プラスミド内の外来性遺伝因子をサイレンシングすることにより、宿主細胞を保護する。
【０２７３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムに基づくＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼは、真核生物のゲノム編集に利用されてきた。本発明のある実施形態では、前記生物活性剤はｓｇＲＮＡおよび／またはＣａｓ９エンドヌクレアーゼをコードするＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記ＲＮＡは、Ｃａｓ９および２本のガイドＲＮＡをコードする１または複数のポリヌクレオチドを含み、ここで、一本目のガイドＲＮＡは５’二本鎖切断（ＤＳＢ）部位のセグメントに相補的なスペーサー配列を含み、二本目のガイドＲＮＡは３’ＤＳＢ部位のセグメントに相補的なスペーサー配列を含む。両方のガイドＲＮＡが単一分子ガイドＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを含む）として用意されてもよいし、あるいは、一方または両方が、互いに結合されず隔てられた分子であるｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む二分子ガイドＲＮＡとして用意されてもよい。
【０２７４】
Ｇ．ポリペプチド
【０２７５】
いくつかの実施形態では、前記１または複数の生物活性剤はポリペプチドである。前記ポリペプチドは、完全長タンパク質とすることもできるし、その断片とすることもできる。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドはペプチドである。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは融合タンパク質である。いくつかの特定の実施形態では、前記融合タンパク質は個体への投与後に免疫応答を誘発することが可能である。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、上記でさらに詳細に説明されたような抗原である。ポリペプチドは当業者に公知のいかなる好適な方法によって作製されてもよく、例えば組み換え発現が挙げられる。
【０２７６】
Ｈ．小分子
【０２７７】
ある実施形態では、本開示は概して、前記１または複数の生物活性剤が薬物送達のための小分子または治療薬である、ＮＬＣ組成物に関連している。薬剤分子および本ＮＬＣの結合の密接さは、薬剤の物理化学的性質、界面活性剤の種類および濃度、脂質の種類、並びに製造法の影響を受ける場合がる。ある実施形態では、小分子薬剤が本ＮＬＣによって封入されるが、これは、高い薬剤溶解性をもたらす油性コアの液体脂質相成分によって可能となる（Beloqui, A., et al. Nanomedicine 2016; 12(1): 143-161）。
【０２７８】
本明細書において提供されるＮＬＣ組成物は、種々の投与経路を通じての薬物送達に好適であり得る。前記投与経路としては、皮膚（dermal）、経皮（transdermal）、経口、鼻腔内、肺内、または点眼（ophthalmological）投与経路が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０２７９】
Ｉ．ホルモン
【０２８０】
いくつかの実施形態では、本ＮＬＣと結合した前記１または複数の生物活性剤は、ホルモンまたはホルモン類似体をコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本ＮＬＣはホルモンと複合体形成した脂質を含む。前記ホルモンは、ヒト成長ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、ゴナドトロピン放出ホルモン、オキシトシン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（leutinizing-hormone-releasing-hormone）、卵胞刺激ホルモン、インスリン、インスリン様増殖因子、レプチン、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、またはいくつかのその組み合わせを含む群から選択され得る。ある実施形態では、本ＮＬＣ製剤は、ホルモンまたはホルモン類似体を、上記のような小分子治療化合物と組み合わせて含む。
【０２８１】
Ｊ．アジュバント
【０２８２】
いくつかの実施形態では、本ＮＬＣはワクチン送達用であり、前記生物活性剤のうちの１または複数がアジュバントであるか、あるいは、本明細書において提供されるＮＬＣ組成物はアジュバントと同時投与され得る。本明細書で使用される場合、アジュバントという用語は免疫応答を亢進または増強する物質を指す。この免疫応答は、例えば、外来性抗原などに対する抗原特異的免疫応答であり得る。
【０２８３】
多くのアジュバントは、水酸化アルミニウムまたは鉱物油などの急速な異化反応から抗原を保護するように設計された物質と、リピドＡ（天然または合成）などの免疫応答の刺激物質と、を含有する。好適なアジュバントは市販されており、例えば、不完全／完全フロイトアジュバント（ディフコ・ラボラトリーズ社（Difco Laboratories）、ミシガン州デトロイト）；Ｍｅｒｃｋ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ６５（メルク・アンド・カンパニー社（Merck and Company, Inc.）、ニュージャージー州ローウェー）；ＡＳ−２およびその誘導体（スミスクライン・ビーチャム社（SmithKline Beecham）、ペンシルベニア州フィラデルフィア）；ＣＷＳ、ＴＤＭ、Ｌｅｉｆ、水酸化アルミニウムゲル（アラム）またはリン酸アルミニウムなどのなどのアルミニウム塩；カルシウム塩、鉄塩または亜鉛塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖類；陽イオン性または陰イオン性に誘導体化された多糖類；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドＡ、並びにＱｕｉｌ  Ａなどである。ＧＭ−ＣＳＦまたはインターロイキン−２、インターロイキン−７、もしくはインターロイキン−１２などのサイトカインも、アジュバントとして用いてよい。
【０２８４】
ある特定の例示的な組成物は、主にＴｈ１型の免疫応答を誘導するように設計されたアジュバント系を用いる。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２）は、投与された抗原に対する細胞性免疫応答の誘導に偏る傾向がある。対照的に、高レベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０）は、液性免疫応答の誘導に偏る傾向がある。本明細書に提供されるような組成物の適用後、患者はＴｈ１型応答およびＴｈ２型応答を含む免疫応答を維持し得る。応答が専らＴｈ１型である例示的な実施形態では、Ｔｈ１型サイトカインのレベルが、Ｔｈ２型サイトカインのレベルを大きく超えて増加する。これらのサイトカインのレベルは標準的な試験法を用いて容易に評価できる。このサイトカインファミリーの概要については、Mossman & Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173 (1989)を参照されたい。
【０２８５】
専らＴｈ１型応答を誘導するのに用いられる特定のアジュバントとしては、例えば、モノホスホリルリピドＡ、例えば３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬＴＭ）と、アルミニウム塩との組み合わせが挙げられる（米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号；および同第４，９１２，０９４号）。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていない）も、専らＴｈ１応答を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、国際公開第９６／０２５５５号、国際公開第９９／３３４８８号、並びに米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号に記載されている。免疫賦活性のＤＮＡ配列も、例えば、Sato et al., Science 273:352 (1996)で説明がなされている。別の例示的なアジュバントは、Ｑｕｉｌ  Ａ、またはその誘導体、例えばＱＳ２１およびＱＳ７（アクイラ・バイオシューティカルズ社（Aquila Biopharmaceuticals Inc.）、マサチューセッツ州フレーミングハム）；エスチン；ジギトニン；またはカスミソウ属（Gypsophila）もしくはキノア（Chenopodium quinoa）のサポニン、などのサポニンを含む。他の例示的な製剤は、本開示のアジュバントの組み合わせに２種以上のサポニンを含み、例えば、以下のＱＳ２１、ＱＳ７、ＱｕｉｌＡ、０−エスチン（0-escin）、またはジギトニンから構成される群のうちの少なくとも２種の組み合わせを含む。
【０２８６】
本開示との関連において有用なアジュバントの他の例としては、ＴＬＲ１作動薬、ＴＬＲ２作動薬、ＴＬＲ３作動薬、ＴＬＲ４作動薬、ＴＬＲ５作動薬、ＴＬＲ６作動薬、ＴＬＲ７作動薬、ＴＬＲ８作動薬、ＴＬＲ７／８作動薬、ＴＬＲ９作動薬などのＴｏｌｌ様受容体作動薬が挙げられる。アジュバントのさらに他の例としては、イミキモド、ガルジキモド（gardiquimod）、レシキモド、および関連化合物が挙げられる。
【０２８７】
他の実施形態では、前記アジュバントは、その全体が参照によって本明細書に援用される米国特許第８，６０９，１１４号または同第８，７２２，０６４号に記載されるグルコピラノシル脂質Ａ（ＧＬＡ）アジュバントである。
【０２８８】
例えば、ある実施形態では、前記ＴＬＲ４作動薬は下記式（ＶＩＩ）の構造を有する合成ＧＬＡアジュバント、
【化６】
2020524143.tif 000019
（ＶＩＩ）
またはその薬剤的に許容できる塩であり、式中、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６は同じであっても異なっていてもよく、独立して−Ｏ−、−ＮＨ−または−（ＣＨ２）−であり；
Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、およびＬ１０は同じであっても異なっていてもよく、独立して存在していないか、または−Ｃ（＝Ｏ）−であり；
Ｙ１は酸性官能基であり；
Ｙ２およびＹ３は同じであっても異なっていてもよく、独立して−ＯＨ、−ＳＨ、または酸性官能基であり；
Ｙ４は−ＯＨまたは−ＳＨであり；
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は同じであっても異なっていてもよく、独立してＣ８−１３アルキルであり；
Ｒ２およびＲ４は同じであっても異なっていてもよく、独立してＣ６−１１アルキルである。
【０２８９】
前記合成ＧＬＡ構造のいくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ１０アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はＣ８アルキルであり。ある実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ１１アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はＣ９アルキルである。
【０２９０】
例えば、ある実施形態では、前記ＴＬＲ４作動薬は、下記の式（ＶＩＩＩ）の構造を有する合成ＧＬＡアジュバント、またはその薬剤的に許容できる塩である。
【化７】
2020524143.tif 000020
（ＶＩＩＩ）
【０２９１】
上記のＧＬＡ構造のある実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ１１〜Ｃ２０アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はＣ１２〜Ｃ２０アルキルである。別の特定の実施形態では、前記ＧＬＡは上記の式を有しており、式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ１１アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はＣ１３アルキルである。別の特定の実施形態では、前記ＧＬＡは上記の式を有しており、式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ１０アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はＣ８アルキルである。
【０２９２】
別の特定の実施形態では、前記ＧＬＡは上記の式を有しており、式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ１１〜Ｃ２０アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はＣ９〜Ｃ２０アルキルである。ある実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ１１アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はＣ９アルキルである。
【０２９３】
ある実施形態では、前記ＴＬＲ４作動薬は、下記の式（ＩＸ）の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントまたはその薬剤的に許容できる塩である。
【化８】
2020524143.tif 000021
（ＩＸ）
【０２９４】
上記のＧＬＡ構造のある実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ１１〜Ｃ２０アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はＣ９〜Ｃ２０アルキルである。ある実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ１１アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はＣ９アルキルである。
【０２９５】
ある実施形態では、前記ＴＬＲ４作動薬は、下記の式（Ｘ）の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントである。
【化９】
2020524143.tif 000022
（Ｘ）
【０２９６】
上記のＧＬＡ構造のある実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ１１〜Ｃ２０アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はＣ９〜Ｃ２０アルキルである。ある実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ１１アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はＣ９アルキルである。
【０２９７】
ある実施形態では、前記ＴＬＲ４作動薬は、下記の式（ＸＩ）の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントまたはその薬剤的に許容できる塩である。
【化１０】
2020524143.tif 000023
（ＸＩ）
【０２９８】
上記のＧＬＡ構造のある実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ１１〜Ｃ２０アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はＣ９〜Ｃ２０アルキルである。ある実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５およびＲ６はＣ１１アルキルであり；Ｒ２およびＲ４はＣ９アルキルである。
【０２９９】
ある実施形態では、前記ＴＬＲ４作動薬は、下記の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントまたはその薬剤的に許容できる塩である。
【化１１】
2020524143.tif 000024
【０３００】
ある実施形態では、前記ＴＬＲ４作動薬は、下記の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントまたはその薬剤的に許容できる塩である。
【化１２】
2020524143.tif 000025
【０３０１】
ある実施形態では、前記ＴＬＲ４作動薬は、下記の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントまたはその薬剤的に許容できる塩である。
【化１３】
2020524143.tif 000026
【０３０２】
別の実施形態では、弱毒化リピドＡ誘導体（ＡＬＤ）が本明細書に記載の組成物に組み込まれる。ＡＬＤは、リピドＡの有害作用を弱めたものまたはそれと異なるものを示すように改変または構築されたリピドＡ様分子である。これらの有害作用としては、発熱原性、局所的なシュワルツマン（Shwarzman）反応性、およびニワトリ胚５０％致死量分析（ＣＥＬＤ５０）で評価されるような毒性が挙げられる。本開示において有用なＡＬＤとしては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡまたはＭＰＬ）および３−ｄｅアシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＬＡまたは３Ｄ−ＭＰＬ）が挙げられる。ＭＬＡ（ＭＰＬ）および３Ｄ−ＭＬＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）は公知であるため、本明細書で詳細に説明する必要はない。
【０３０３】
上記のＴＬＲ４アゴニスト化合物において、全体の電荷は分子内の官能基に基づいて決定できる。例えばリン酸基は、リン酸基のイオン化状態により、負に帯電しているかまたは中性であり得る。
【０３０４】
Ｖ．生物活性薬剤およびナノ構造脂質担体を含む例示的な組成物を作製する方法
【０３０５】
本明細書において提供されるように、本明細書に記載のＮＬＣを作製する１つの方法は、（ａ）前記固相脂質、前記液相脂質、前記陽イオン性脂質、および前記疎水性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステル）を混合して、油相混合物を形成させること；（ｂ）前記親水性界面活性剤および水を混合して水相を形成させること；並びに、（ｃ）前記油相混合物を前記水相混合物と混合して前記ＮＬＣを形成させること、を含む。いくつかの実施形態では、更なる工程として、前記生物活性剤が非共有結合相互作用または可逆的共有結合相互作用によって前記ＮＬＣの表面と結合するように、前記生物活性剤を前記ＮＬＣと組み合わせること、を含む。そのような実施形態は、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子など、生物活性剤が負に帯電している場合に好ましい。前記生物活性剤上の負電荷を前記ＮＬＣ中の陽イオン性脂質と相互作用させることで、負に帯電している生物活性剤を前記ＮＬＣに結合させる。生物活性剤が疎水性である他の実施形態では、生物活性剤が工程（ａ）の成分と混合されることで、油相混合物の一部が形成される。いくつかの実施形態では、前記生物活性剤は共有結合相互作用を介して前記ＮＬＣの表面の成分に結合され得る。
【０３０６】
前記固相脂質、前記液相脂質、前記陽イオン性脂質、および前記疎水性界面活性剤（例えば、ソルビタンエステル）を混合して油相混合物を形成することは、例えば、加熱および超音波処理によって達成できる。前記油相混合物と前記水相混合物との混合は、様々な乳化法で達成することができ、例えば、高剪断乳化およびマイクロフルイダイゼーション（microfluidization）が挙げられるがこれらに限定はされない。
【０３０７】
ＶＩ．ナノ構造脂質担体を含む組成物
【０３０８】
本明細書では、本明細書に記載のＮＬＣ組成物を含む製剤、組成物、および医薬組成物が提供される。
【０３０９】
本ＮＬＣおよび生物活性剤を含む組成物は、所望により、薬剤的に許容できる担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことができる。
【０３１０】
本明細書に記載の組成物は、あらゆるワクチン接種目的で、治療目的で、または診断目的で、対象に投与できる。
【０３１１】
本明細書では、薬剤的に許容できる担体、賦形剤または希釈剤とさらに組み合わされて、本開示の組成物を含む医薬組成物が提供される。
【０３１２】
本明細書において提供される特に好ましい実施形態では、本明細書において提供される本ＮＬＣおよび医薬組成物は、０．４５μｍフィルターに通して濾過することができる。いくつかの実施形態では、前記医薬組成物は０．２０μｍフィルターに通して濾過することができる。いくつかの実施形態では、前記医薬組成物は０．２２μｍフィルターに通して濾過することができる。
【０３１３】
１つの実施形態では、本発明は、ＮＬＣおよび結合した生物活性剤を含む組成物を含む医薬組成物に関する。そのような組成物は、生物による感染などの、疾患または他の状態の診断、治療、または予防を目的として、免疫応答、例えば非特異的な免疫応答または抗原特異的な免疫応答、を刺激するために、対象に投与されてもよい。
【０３１４】
いくつかの他の実施形態において、前記医薬組成物は、本明細書に記載の組成物を薬剤的に許容できる担体、賦形剤または希釈剤と組み合わせて含むワクチン組成物である。例示的な担体は通常、使用される用量および濃度においてレシピエントに対して無毒である。
【０３１５】
いくつかの態様では、本明細書において提供される医薬組成物は、対象における応答を発生させるために、例えば、対象における免疫応答を発生させるために、対象に投与される。通常、治療有効量が対象に投与される。
【０３１６】
「有効量」または「治療有効量」という用語は、目的の効果を達成する、または少なくとも部分的に達成するのに十分な量を指し、例えば、目的の免疫応答を発生させるのに十分な量である。有効量のＮＬＣまたは医薬組成物が「有効なレジーム（regime）」で投与される。用語「有効なレジーム（regime）」とは、目的の効果を達成するのに適した投与される組成物の量および投与頻度の組み合わせを指す。
【０３１７】
実際の用量レベルは、特定の患者、組成物、および投与様式が、前記患者に毒性でない、目的の応答を達成するのに有効な量が得られるように、変更してもよい。用量レベルの選択は、使用される特定の組成物、治療される対象の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康、および既往歴、並びに医療分野で周知の要因などと組み合わされた、様々な薬物動態学的要因に基づいて決定するものとする。
【０３１８】
本明細書において提供される例示的な治療目的の実施形態では、約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量の治療用医薬組成物が投与される。当業者には明らかなように、投与回数および投与頻度は対象の応答に基づいて決定するものとする。
【０３１９】
本明細書において提供される例示的なワクチンベースの実施形態では、約１μｇ〜１００μｇの前記抗原または０．１μｇ〜１０ｍｇの前記抗原をコードする核酸が投与毎に投与されるものとする。例示的な本製剤は、約０．１μｇ、約１μｇ、約５μｇまたは約１０μｇ〜約５００μｇのレプリコンＲＮＡのヒト投与を可能にする。例示的な本製剤は、約５μｇ〜約２０μｇのレプリコンＲＮＡのヒト投与を可能にする。
【０３２０】
当業者には明らかなように、投与回数および投与頻度は対象の応答に基づいて決定するものとする。例示的な製剤はわずか１回の接種後に治療効果を発揮する。
【０３２１】
治療用途における「薬剤的に許容できる担体」は製薬分野では周知であり、例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985)に記載されている。例えば、生理的ｐＨの滅菌した生理食塩水およびリン酸緩衝生理食塩水を用いてよい。保存剤、安定剤、色素、さらには香味剤も、医薬組成物中に含まれてもよい。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルを保存剤として加えてもよい（同上、１４４９）。さらに、抗酸化剤および懸濁化剤を用いてもよい（同上）。
【０３２２】
前記医薬組成物の形態は、当該組成物の患者への投与を可能とする限り、特に限定はされない。例えば、前記組成物は、固体形態であっても、液体形態であっても、気体形態（エアロゾル）であってもよい。通常の投与経路としては、経口経路、局所経路、非経口経路、舌下経路、頬側経路、直腸内経路、膣内経路、静脈内経路、皮内経路、経皮経路、鼻腔内経路、粘膜内経路、肺内経路、または皮下経路が挙げられ、これらに限定はされない。非経口という用語には、本明細書で使用される場合、イオン導入法、超音波導入法、熱（thermal）、経皮投与とさらには皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内、陰茎海綿体内、くも膜下腔内、道内（intrameatal）、尿道内への注射法または点滴法も含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物（ワクチンおよび医薬組成物を含む）は、イオン導入、マイクロキャビテーション（microcavitation）、超音波導入、ジェット注射、またはマイクロニードルから選択される手法で皮内投与される。１つの好ましい実施形態では、本明細書に記載の組成物は、ナノパス・テクノロジーズ社（NanoPass Technologies Ltd.）（ネスジオナ、イスラエル）製のマイクロニードルデバイス、例えば、ＭｉｃｒｏｎＪｅｔ６００を用いて皮内投与される（例えば、その全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第６，５３３，９４９号および同第７，９９８，１１９号、並びにYotam, et al., Human vaccines & immunotherapeutics 11(4): 991-997 (2015)を参照されたい）。
【０３２３】
前記医薬組成物は、対象に当該組成物が投与されてすぐに当該組成物中に含有される活性成分が生物学的に利用可能となるように製剤化することもできる。対象に投与されることとなる組成物は、１または複数の投与単位の形態をとり、例えば、錠剤は単一の投与単位であり、エアロゾル形態の１または複数の本発明の化合物の容器は複数の投与単位を保持し得る。
【０３２４】
経口投与においては、賦形剤および／または結合剤が含まれてもよい。例として、スクロース、カオリン、グリセリン、デンプン  デキストリン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、およびエチルセルロースが挙げられる。着色剤および／または香味剤が含まれてもよい。コーティングシェル（coating shell）が用いられてもよい。
【０３２５】
前記組成物は液体の形態、例えば、エリキシル剤、シロップ剤、液剤、乳剤、または懸濁剤の形態をとってもよい。２つの例として、前記液体は経口投与用の液体であっても注射による送達用の液体であってもよい。経口投与を目的とする場合、組成物は、甘味剤、保存剤、色素／着色剤、および調味料のうちの１または複数を含有することができる。針と注射器または無針ジェット注射による注射での投与を目的とする組成物には、界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定剤、および等張化剤（isotonic agent）のうちの１または複数が含まれてもよい。
【０３２６】
本明細書において用いられる液体医薬組成物は、液剤形態、懸濁剤形態、または他の同様の形態のいずれであっても、以下の担体または賦形剤のうちの１または複数を含んでもよい：注射用蒸留水、食塩水、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張食塩（isotonic sodium chloride）などの無菌希釈剤、スクアレン、スクアラン、鉱物油、マンニドモノオレエート、コレステロールなどの不揮発性油、および／または、溶媒もしくは懸濁媒として働き得る合成モノグリセリドもしくは合成ジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤、並びに、塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの張度調節剤。
【０３２７】
別の実施形態では、本開示の組成物はエアロゾル化が可能なように製剤化される。
【０３２８】
送達基剤などの他の成分を医薬組成物に含むことが好ましい場合があり、例えば、アルミニウム塩、油中水型エマルジョン、生分解性の油基剤、水中油型エマルジョン、生分解性のマイクロカプセル、およびリポソームが挙げられるが、これらに限定はされない。このような基剤に用いられる追加の免疫賦活性物質（コアジュバント）の例は、上記のものであり、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニン−Ｄ−イソグルタミン（ＭＤＰ）、グルカン、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、γインターフェロン、およびＩＬ−１２を含んでもよい。
【０３２９】
本開示の医薬組成物には当業者に公知のあらゆる好適な担体を用いてもよいが、担体の種類は、投与様式と、持続放出を目的とするか否かに基づいて決定するものとする。皮下注射などの非経口投与用では、前記担体は、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、または緩衝液を含むことができる。経口投与用では、上記のうちいずれかの担体を用いてもよいし、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム（sodium saccharine）、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウムなどの固体担体を用いてもよい。また、生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ガラクチド（polylactic galactide））を本発明の医薬組成物の担体として用いてもよい。好適な生分解性ミクロスフェアは例えば、米国特許第４，８９７，２６８号および同第５，０７５，１０９号に開示されている。これに関連して、前記ミクロスフェアはおよそ２５μｍよりも大きいことが好ましい。
【０３３０】
医薬組成物は、緩衝液などの希釈剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストリンを含む糖、ＥＤＴＡなどのキレート化剤、グルタチオン、並びに他の安定剤および賦形剤、を含有していてもよい。非特異的血清アルブミスキリン（albumiskilln）と混合された中性の緩衝生理食塩水または生理食塩水が、適切な希釈剤として例示される。例えば、製品は、適切な賦形剤溶液（例えば、スクロース）を希釈剤として用いる凍結乾燥物として製剤化されてもよい。
【０３３１】
医薬組成物は局所投与を目的としてもよく、その場合、担体は溶液性基剤（solution base）、乳剤性基剤、軟膏基剤、またはゲル基剤を適切に含み得る。基剤は、例えば、以下のうちの１または複数を含み得る：ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱物油、水およびアルコールなどの希釈剤、並びに乳化剤および安定剤。局所投与用の医薬組成物には増粘剤が含まれてもよい。経皮投与を目的とする場合、前記組成物は経皮貼布またはイオン導入デバイスを含み得る。局所製剤は、約０．１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％（単位体積当たりの重量）の濃度の抗原（例えば、ＧＬＡを抗原とするワクチン組成物）またはＧＬＡ（例えば、免疫アジュバント組成物；ＧＬＡはアヴァンティ・ポーラ・リピッド社（Avanti Polar Lipids, Inc.）（アラバマ州アラバスター）から入手できる；例えば、製品番号６９９８００）を含有し得る。
【０３３２】
前記組成物は、直腸内投与を目的として、直腸で溶けて薬を放出することができる坐剤などの形態であってもよい。直腸内投与用の組成物は、好適な非刺激性の賦形剤として、油性基剤を含有してもよい。そのような基剤としては、ラノリン、カカオ脂、およびポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定はされない。本発明の方法では、前記医薬組成物／アジュバントは、インサート、ビーズ、徐放性製剤、パッチ、または速放性製剤を利用して投与されてよい。
【０３３３】
所望により、張度の調節のために、本ＮＬＣは、生理的塩類（ナトリウム塩など）を含んでもよい。例えば、約０．９％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（生理食塩水）を用いてもよい。存在してもよい他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどがある。張度を調節するために非イオン性張度増加剤を用いることもできる。本開示の組成物には、非イオン性張度増加剤として、グルコース、マンノース、アラビノース、およびリボースなどのアルドースに分類される単糖類、並びに、フルクトース、ソルボース、およびキシルロースなどのケトースに分類される単糖類を用いることができる。スクロース、マルトース、トレハロース、およびラクトースなどの二糖類も使用できる。加えて、グリセロール、マンニトール、キシリトール、およびソルビトールなどのアルジトール（非環式多価アルコール、別名糖アルコール）も、本開示の組成物において有用な非イオン性張度増加剤である。非イオン性張度調節剤は、使用される非イオン性張度調節剤に応じて、約０．１％〜約１０％または約１％〜約１０％の濃度で存在させることができる。ＮＬＣを非経口投与用に製剤化する場合、前記組成物の投与後の膨張または急速吸収などの投与後事象を防ぐために、ＮＬＣ組成物のオスモル濃度を正常生理液と同じにすることが好ましい。
【０３３４】
所望により、ＮＬＣは、トレハロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ１０２（微結晶性セルロース）、Ａｖｉｃｅｌ  ＲＣ５９１（微結晶性セルロースおよびカルボキシルメチルセルロースナトリウムの混合物）、Ｍｉｒｃｒｏｃｅｌａｃ（登録商標）（ラクトースおよびＡｖｉｃｅｌの混合物）、またはこれらの組み合わせ、を含む凍結保護物質と共に製剤化されてもよい。所望により、ＮＬＣは、例えばＨｙｄｒｏｌｉｔｅ５などの保存剤と共に製剤化されてもよい。
【０３３５】
ＶＩＩ．安定なエマルジョン
【０３３６】
いくつかの実施形態では、安定なエマルジョンが提供され、この安定なエマルジョンは少なくとも１種のアジュバントを含む。安定なエマルジョンと共に製剤化されてもよいアジュバントの例としては、ＴＬＲ３作動薬およびＲｉｇ−Ｉ作動薬が挙げられるが、これらに限定はされない。そのようなアジュバントの例としては、二本鎖ＲＮＡ、ＲＩＢＯＸＸＯＬ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、およびＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０３３７】
いくつかの実施形態では、安定なエマルジョン（ＳＥ）は水中油型エマルジョンである。いくつかのそのような実施形態では、前記水中油型エマルジョンは水中スクアレンエマルジョンである。いくつかの実施形態では、エマルジョンはαトコフェロール（ビタミンＥ、例えば、欧州特許第０３８２２７１Ｂ１号を参照）などの抗酸化剤を含む。国際公開第９５／１７２１０号および同第９９／１１２４１号では、スクアレン、αトコフェロール、およびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０をベースとするエマルジョンが論じられている。国際公開第９９／１２５６５号では、油相にステロールを添加することによる、これらのスクアレンエマルジョンの改良が論じられている。
【０３３８】
国際公開第０８／１５３５４１号では、各種成分の含量が、通常、２〜１０％の範囲の油（スクアレンなど）；存在する場合、０．０１〜０．１％の範囲のαトコフェロール；および０．３〜３％の範囲の界面活性剤（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレートまたはポロキサマー１８８（ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのコポリマー）など）であるような、水中油型エマルジョンが論じられている。油：界面活性剤の割合を１以下にすることで、エマルジョンの安定性を向上することができる。Ｓｐａｎ８５は約１％のレベルで存在してもよい。場合によっては、ワクチンは安定剤をさらに含有することが有利となり得る。１つの実施形態では、前記安定剤はトリカプリリン（Ｃ２７Ｈ５ＯＯ６）などのトリグリセリドであり得る（例えば、国際公開第９８／５６４１４号を参照）。いくつかの実施形態では、水中油型エマルジョンは０．５％〜５％、０．５％〜５％、０．５％〜３％、または１％〜３％のグリセロールを含む。いくつかの実施形態では、水中油型エマルジョンは０．５％〜５％、０．５％〜５％、０．５％〜３％、または１％〜３％の１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）を含む。水中油型エマルジョンとして、本明細書の実施例に記載のものが挙げられるが、これに限定はされない。
【０３３９】
安定な水中油型エマルジョン中に存在する油滴のサイズは、光子相関分光法で測定した場合に、１μｍ未満であることが好ましく、概ね３０〜６００ｎｍの範囲内、好ましくは概ね直径３０〜５００ｎｍ程度、最も好ましくは概ね直径１５０〜５００ｎｍ、特には直径約１５０ｎｍであり得る。これに関連して、数にして８０％の油滴が上記の好ましい範囲内にあるべきであり、より好ましくは数にして９０％超、最も好ましくは数にして９５％超の油滴が、上記で定義したサイズ範囲内である。本発明の油エマルジョン中に存在する各種成分の含量は、通常、２〜１０％の範囲の油（スクアレンなど）；存在する場合、２〜１０％の範囲のαトコフェロール；および０．３〜３％の範囲の界面活性剤（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレートなど）である。油：αトコフェロールの割合が１を超える場合、より安定なエマルジョンが得られるため好ましい。Ｓｐａｎ８５は約１％のレベルで存在してもよい。場合によっては、本発明のワクチンは安定剤をさらに含有することが有利となり得る。
【０３４０】
水中油型エマルジョンの製造法は当業者には周知である。通常、前記方法は、油相をＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ８０（登録商標）溶液などの界面活性剤と混合した後、ホモジナイザーを用いて均質化することを含む。例えば、前記混合物をシリンジの針に１回、２回またはそれ以上の回数通すことを含む方法が、少量の液体を均質化するのには適しているだろう。同様に、マイクロフルイダイザー内での乳化工程（Ｍ１１０Ｓマイクロフルイディクス機、最高入力圧６ｂａｒ（出力圧は約８５０ｂａｒ）下、２分間、最大５０回通過）は、より少量またはより大量のエマルジョンを製造するように構成できる。この構成は、要求される直径の油滴を含む調製物が得られるまで、得られたエマルジョンを測定することを含む、通例の実験法によって達成できる。
【０３４１】
ＶＩＩＩ．本開示の組成物を使用する方法
【０３４２】
Ａ．治療薬
【０３４３】
いくつかの実施形態では、前記薬剤は治療目的に有用である。すなわち、いくつかの実施形態では、前記組成物は、本明細書において提供されたＮＬＣを含み、疾患、異常、または障害の治療のための生物活性剤をさらに含む。
【０３４４】
いくつかの実施形態では、前記薬剤はアレルギー、がん、感染症、自己免疫、または中毒の治療または予防に有用である。いくつかの実施形態では、前記薬剤は免疫応答の刺激、増強、および／または調節に有用である。
【０３４５】
開示された実施形態のいくつかの態様では、前記組成物は、がん抗原またはがん抗原をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ発現、または他のがん特異的抗原もしくはがん関連抗原などの、腫瘍関連抗原の発現を特徴とするあらゆるがんに対して有用ながん抗原を含む。
【０３４６】
本開示のある実施形態における組成物および方法は、自己免疫疾患の予防または治療に使用されてもよく、自己免疫疾患としては、宿主または対象の免疫系が、「自己」の組織、細胞、生体分子（例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、プロテオリピド、脂質、糖脂質、ＲＮＡおよびＤＮＡなどの核酸、オリゴ糖、多糖類、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなど、並びに、対象の細胞および組織の他の分子成分）、またはエピトープ（例えば、抗体の可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）によって認識されるもの、またはＴ細胞受容体のＣＤＲによって認識されるものなどの、免疫学的に定義付けられた特異的認識構造）、を対象とする免疫応答を有害に媒介する、疾患、異常または障害が挙げられる。
【０３４７】
すなわち、自己免疫疾患は、どちらの場合でも正常な自己組織を標的とする細胞または抗体が関与する異常な免疫応答を特徴とする。哺乳類における自己免疫疾患は一般に、２つの異なる分類のうちの一方、細胞媒介性疾患（すなわち、Ｔ細胞媒介性疾患）または抗体媒介性障害、に分類できる。細胞媒介性自己免疫疾患の非限定例としては、多発性硬化症、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、Ｉ型糖尿病（若年発症糖尿病）、および自己免疫性ぶどう膜網膜炎（autoimmune uvoretinitis）が挙げられる。抗体媒介性自己免疫障害としては、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス（またはＳＬＥ）、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性喘息、クリオグロブリン血症、血栓性（thrombic）血小板減少性紫斑病、原発性胆汁性硬化症（primary biliary sclerosis）、および悪性貧血が挙げられるが、これらに限定はされない。全身性エリテマトーデスの関連抗原は低分子核内リボ核酸タンパク質（ｓｎＲＮＰ）であり；グレーブス病の関連抗原は甲状腺刺激ホルモン受容体、チログロブリン、甲状腺上皮細胞の他の成分であり；天疱瘡の関連抗原はデスモグレイン３および他の接着分子などのカドヘリン様天疱瘡抗原であり；血栓性（thrombic）血小板減少性紫斑病の関連抗原は血小板の抗原である。
【０３４８】
本明細書において提供される組成物は、結核などに対する防御免疫を誘導するために用いられてもよく、１または複数のマイコバクテリウムタンパク質の少なくとも１つの免疫原性部分を含有するポリペプチド、並びにそのようなポリペプチドをコードするＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子、の使用が含まれる。さらに、このような化合物は、マイコバクテリウム感染に対する予防接種用にワクチンおよび／または医薬組成物に製剤化されてもよい。
【０３４９】
他の実施形態では、本開示の組成物は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの状態の予防および治療のための、細菌感染症（例えば肺炎球菌感染症）を原因とするまたはそれによって増悪する呼吸器疾患などの、呼吸器疾患に関連した抗原を含む。
【０３５０】
直接的なインビボ法の他に、細胞を宿主から採取し、改変し、同じまたは別の宿主動物に移植する、エキソビボ法を用いてもよい。抗原をコードする核酸分子を組織細胞に導入するための上記の組成物のいずれもエキソビボ法で利用できることは明らかである。ウイルスを用いた取り込み法、物理的な取り込み法、および化学的な取り込み法のプロトコルは当該技術分野において周知である。
【０３５１】
いくつかの実施形態では、対象における免疫応答をブーストまたは増強するために本開示の組成物が用いられる。いくつかのそのような実施形態では、前記生物活性剤はアジュバントである。アジュバントの例としては、ＴＬＲ作動薬（ＴＬＲ２作動薬、ＴＬＲ３作動薬、ＴＬＲ４作動薬、ＴＬＲ７作動薬、ＴＬＲ８作動薬、およびＴＬＲ９作動薬）、Ｒｉｇ−Ｉ作動薬、サポニン、糖、糖ポリマー、複合糖質、全ウイルス粒子、ウイルス様粒子、ウイルス断片、および細胞断片が挙げられるが、これらに限定はされない。このようなアジュバントの例としては、二本鎖ＲＮＡ、ＲＩＢＯＸＸＯＬ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、およびＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定はされない。いくつかの実施形態では、前記組成物は安定なエマルジョンおよび／またはナノ構造脂質担体を含む。いくつかの実施形態では、前記組成物はスクアレンを含む安定なエマルジョンおよび／またはナノ構造脂質担体を含む。本発明者らは、スクアレンをベースとする製剤がＴＬＲ３作動薬などを予想外にも増強することを見出した。
【０３５２】
いくつかの好ましい態様では、本開示の組成物は、免疫応答を、宿主、患者、または細胞培養物において増強または誘導するのに有用である。本明細書で使用される場合、用語「対象」とはあらゆる哺乳動物を指す。患者は、感染症、乳がんなどのがん、または自己免疫疾患に罹患しているか、または正常（すなわち、検出可能な疾患および／または感染が無い）であり得る。「細胞培養物」は、免疫担当細胞または単離免疫系細胞（Ｔ細胞、マクロファージ、単球、Ｂ細胞および樹状細胞を含むがこれらに限定はされない）を含有する調製物であれば特に限定はされない。そのような細胞は、当業者に周知の様々な手法のいずれか（例えば、フィコール‐ハイパック密度遠心分離法）により、単離できる。細胞は（必ずしも必要ではないが）がん患者から単離されたものであってもよく、処理後に患者に再導入され得る。
【０３５３】
Ｂ．ワクチン
【０３５４】
すなわち、本開示は、免疫応答を開始することができる宿主において、免疫応答を変化させる（すなわち、例えば当業者によく知られている適切な対照と比較した場合に、統計的に有意に増加または減少させる）、組成物を提供する。当業者には明らかなことであるが、免疫応答は宿主の免疫状態の活発な変化であれば特に限定はされず、例えば、宿主の免疫状態の維持および／または制御に関与している１または複数の組織、臓器、細胞、または分子の構造または機能におけるあらゆる変化を含んでよい。通常、免疫応答は、様々な周知のパラメーターのいずれかにより検出でき、例えば、インビボまたはインビトロにおいての以下の確認が挙げられるが、これらに限定はされない：可溶性の免疫グロブリンまたは抗体；サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、ホルモン、増殖因子などの可溶性介在物質、並びに、低分子ペプチド、糖、ヌクレオチドおよび／または脂質などの他の可溶性介在物質；免疫系細胞の機能特性または構造特性の変化、例えば、細胞増殖、運動性の変化、特定の遺伝子発現または細胞溶解行動などの特殊な活性の誘導、によって確認される細胞活性化状態の変化；表面抗原発現プロファイルの変化を含む、免疫系細胞による細胞分化、またはアポトーシス（プログラム細胞死）の開始；あるいは、免疫応答の有無を検出できるあらゆる他の評価基準。
【０３５５】
本開示の組成物による免疫応答の誘導の確認は、いくつかの周知の免疫学的試験法のいずれかにより確立され得ることは、当業者には容易に明らかである。そのような試験法としては、例えば、インビボまたはインビトロにおいての以下の確認が挙げられるが、これらに限定はされない：可溶性の抗体；サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、ホルモン、増殖因子などの可溶性介在物質、並びに、低分子ペプチド、糖、ヌクレオチドおよび／または脂質などの他の可溶性介在物質；免疫系細胞の機能特性または構造特性の変化、例えば、細胞増殖、運動性の変化、特定の遺伝子発現または細胞溶解行動などの特殊な活性の誘導、によって確認される細胞活性化状態の変化；表面抗原発現プロファイルの変化を含む、免疫系細胞による細胞分化、またはアポトーシス（プログラム細胞死）の開始。これらの試験法および類似の試験法を実施するための手順は周知であり、例えば、Lefkovits(Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998;Current Protocols in Immunologyも参照されたい；例えば、Weir, Handbook of Experimental Immunology, 1986 Blackwell Scientific, Boston, MA; Mishell and Shigii (eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, 1979 Freeman Publishing, San Francisco, CA; Green and Reed, 1998 Science 281:1309、並びにこれらに引用された参考文献も参照されたい）で見つけることができる。
【０３５６】
抗原反応性Ｔ細胞の増殖の検出は様々な公知の手法で達成できる。例えば、Ｔ細胞増殖はＤＮＡ合成の速度を測定することで検出でき、抗原特異性は抗原反応性Ｔ細胞候補が暴露される刺激（例えば、特定の目的抗原または対照抗原をパルスした抗原提示細胞など）を調節することにより確認できる。増殖するよう刺激されたＴ細胞はＤＮＡ合成速度の増加を示す。ＤＮＡ合成速度の典型的な測定法は、例えば、Ｔ細胞の培養物を、新たに合成されるＤＮＡに挿入されるヌクレオシド前駆物質のトリチウム標識チミジンでパルス標識することによるものである。挿入されたトリチウム標識チミジンの量は液体シンチレーション分光光度計を用いて求めることができる。Ｔ細胞増殖の他の検出法として、インターロイキン−２（ＩＬ−２）産生の増加、Ｃａ２＋流入、または３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムなどの色素の取り込み、の測定が包含される。あるいは、リンホカイン（インターフェロン−γなど）の合成を測定することもできるし、あるいは、特定の抗原に反応できるＴ細胞の相対数を定量化してもよい。
【０３５７】
抗原特異的抗体の産生の検出は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、平衡透析、またはウェスタンブロッティングをはじめとする固相免疫ブロッティングなどのインビトロ法を用いて、本開示によるワクチンで処置された宿主から採取した試料（例えば、血清、血漿、または血液などの免疫グロブリン含有試料）をアッセイすることにより、達成できる。各実施形態において、ＥＬＩＳＡアッセイは、アッセイ感度増強などのために、固相の抗原特異的モノクローナル抗体で標的抗原を抗原捕捉固定することをさらに含んでもよい。可溶性メディエーター（例えば、サイトカイン、ケモカイン、リンホカイン、プロスタグランジンなど）の生成を、商業的供給源（例えば、シグマ社、ミズーリ州セントルイス；また、R & D Systems 2006 Catalog、Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネソタ州ネアポリス、も参照されたい）から容易に入手可能な方法、装置、および試薬などを用いる酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって容易に測定することもできる。
【０３５８】
当該技術分野において周知の通例のアッセイを用いて、他の免疫学的パラメーターをいくつでもモニターしてもよい。これらのアッセイとして、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、二次的なインビトロ抗体反応、確立したマーカー抗原系を用いた末梢血単核細胞またはリンパ系単核細胞の各種亜集団の免疫学的細胞蛍光フロー解析、免疫組織化学、または他の関連性のあるアッセイが包含されてもよい。これらおよび他のアッセイは、例えば、Rose et al. (Eds.), Manual of Clinical Laboratory Immunolog, 5th Ed., 1997 American Society of Microbiology, Washington, DCに見出すことができる。
【０３５９】
従って、本明細書において提供される組成物は、宿主において、Ｔｈ１型Ｔリンパ球応答、ＴＨ２型Ｔリンパ球応答、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答、抗体応答、サイトカイン応答、リンホカイン応答、ケモカイン応答、および炎症反応から選択される少なくとも１つの免疫応答を誘発または増強可能であることが企図される。ある実施形態では、前記免疫応答は、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）から選択される１または複数のサイトカインの産生、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２３から選択される１または複数のインターロイキンの産生、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ランテス、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、およびＣＸＣＬ５から選択される１または複数のケモカインの産生、並びに、メモリーＴ細胞応答、メモリーＢ細胞応答、エフェクターＴ細胞応答、細胞傷害性Ｔ細胞応答、およびエフェクターＢ細胞応答から選択されるリンパ球応答のうちの少なくとも１つを含み得る。
【０３６０】
Ｃ．診断用薬
【０３６１】
いくつかの実施形態では、前記生物活性剤は診断用薬である。すなわち、いくつかの実施形態では、前記組成物は、本明細書において提供されたＮＬＣを含み、さらに診断用薬を含み、疾患、異常、または障害の診断に有用である。
【０３６２】
いくつかの実施形態では、前記診断用薬はがんの検出に有用である。がんを有する対象またはがんを発症するリスクがあると疑われる対象を特定するための組成物および方法は当該技術分野において公知であり、本明細書に記載されている。がんを有するまたはがんのリスクがあると疑われる対象におけるがんの診断は、当該技術分野で認められている様々な方法のいずれにより達成されてもよく、このような方法は、臨床症状、がんの進行度、がんの種類、および他の要素を含む様々な要素に基づいて決定することができる。がん診断の例としては、患者試料（例えば、血液、皮膚生検、他の組織生検、外科検体など）の病理組織学的検査、細胞組織化学的検査、免疫細胞組織化学的検査、および免疫病理組織学的検査、所定の遺伝的（例えば、核酸）マーカーのＰＣＲ検査、循環がん関連抗原、そのような抗原を有する細胞、もしくは所定の特異性を有する抗体に関する血清学的検査、または、当業者に周知の他の方法が挙げられる。
【０３６３】
いくつかの実施形態では、前記診断用薬は自己免疫疾患の検出に有用である。すなわち、自己抗体の検出により、自己免疫疾患の存在または自己免疫疾患の発症リスクの早期の発見または認知が可能となる。これらの知見に基づき、自己抗原に対する種々の自己抗体が発見されており、これらの自己抗原に対する自己抗体の評価が臨床試験にて行われている。
【０３６４】
１つの実施形態では、前記診断用薬は感染症の検出に有用である。本明細書に記載されているような感染性病原体による感染を有する対象、またはそのような感染を発症するリスクがあると疑われる対象を特定するための組成物および方法は、当該技術分野において公知である。
【０３６５】
例えば、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）細菌は結核（ＴＢ）を引き起こす（cases）。すなわち、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＮＬＣのいずれかを含む組成物は、結核を診断するための薬剤をさらに含む。
【０３６６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＮＬＣのいずれかを含む組成物は、マラリアを診断するための薬剤をさらに含む。
【０３６７】
感染後の感受性哺乳類宿主の血漿中に分泌されているタンパク質またはタンパク質断片である、種特異的な三日熱マラリア原虫（P. vivax）のマラリア性ペプチド抗原をコードするポリヌクレオチドが当該技術分野において報告されており、同様に、これらの抗原に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体も報告されている。これらのペプチド抗原、モノクローナル抗体、および／またはポリクローナル抗体は、マラリアの診断、並びに三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）がその感染症に関与している種であるか否かの判定に用いられる試験法で利用される。感染後の感受性哺乳類宿主の血漿中に分泌されているタンパク質またはタンパク質断片である、種特異的な三日熱マラリア原虫（P. vivax）のマラリア性ペプチド抗原も報告されており、同様に、これらの抗原に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体も報告されている。これらのペプチド抗原、モノクローナル抗体、および／またはポリクローナル抗体は、マラリアの診断、並びに三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）がその感染症に関与している種であるか否かの判定に用いられる試験法で利用される。
【０３６８】
また、天然型分子の折り畳みおよびジスルフィド架橋を保持する高純度タンパク質を生成する方法によって、組み換え型の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）（３Ｄ７）のＡＭＡ−１の外部ドメインが発現された。この組換え型ＡＭＡ−１は、診断用試薬として、抗体産生用に、およびワクチンとして、有用である。同様に、天然型分子の折り畳みおよびジスルフィド架橋を保持する組み換え型の熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）（３Ｄ７）のＭＳＰ−１４２の発現および精製も、知られている。この組換え型ＭＳＰ−１４２は、診断用試薬として、抗体産生用に、およびワクチンとして、有用である。
【０３６９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＮＬＣのいずれかを含む組成物は、レーシュマニア症の診断に有用な薬剤をさらに含む。
【０３７０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＮＬＣのいずれかを含む組成物は、ＨＩＶの診断に有用な薬剤をさらに含む。
【０３７１】
ＩＸ．免疫応答を発生させる方法
【０３７２】
本明細書において、対象において免疫応答を発生させる方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の本明細書に記載の組成物を投与する工程を含み、前記生物活性剤がタンパク質抗原またはタンパク質抗原をコードする核酸分子である、前記方法が提供される。例示的な実施形態では、前記生物活性剤はタンパク質抗原をコードするＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）分子またはＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、免疫応答をブーストまたは増強すう方法であって、前記生物活性剤がアジュバントである、前記方法が提供される。
【０３７３】
前記治療有効量の組成物の通常の投与経路としては、経口経路、局所経路、非経口経路、舌下経路、頬側経路、直腸内経路、膣内経路、静脈内経路、皮内経路、経皮経路、鼻腔内経路、粘膜内経路、または皮下経路が挙げられ、これらに限定はされない。いくつかの例示的な実施形態では、組成物の投与は筋肉内投与、滴眼投与、非経口投与、または肺内投与である。
【０３７４】
例示的な実施形態では、本明細書で開示される組成物は、ワクチン組成物であり、ワクチンとして使用される。本明細書に記載の組成物は、対象において免疫応答（非特異的応答および抗原特異的応答を含む）を発生させるために使用できる。いくつかの実施形態では、前記免疫応答は全身性の免疫応答を含む。いくつかの実施形態では、前記免疫応答は粘膜免疫応答を含む。免疫応答の発生には、免疫応答の刺激、免疫応答のブースト、または免疫応答の増強が含まれる。
【０３７５】
本明細書に記載の組成物は、ウイルスに対する防御免疫を増強するために用いられてもよい。そのようなウイルスおよびウイルス抗原としては、例えば、ＨＩＶ−１、（例えば、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０）、ヒトヘルペスウイルス（例えば、ｇＤもしくはその誘導体、またはＨＳＶ１由来もしくはＨＳＶ２由来のＩＣＰ２７などの前初期タンパク質）、サイトメガロウイルス（（特に、ヒトサイトメガロウイルス、例えば、ｇＢまたはその誘導体）、ロタウイルス（弱毒生ウイルスを含む）、エプスタイン・バーウイルス（例えば、ｇｐ３５０またはその誘導体）、水痘帯状疱疹ウイルス（例えば、ｇｐｌ、ＩＩおよびＩＥ６３）、または、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原またはその誘導体）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、およびＥ型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルス、または、他のウイルス病原体、例えば、パラミクソウイルス：呼吸器合胞体ウイルス（例えば、Ｆタンパク質およびＧタンパク質またはその誘導体）、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８など）、フラビウイルス（例えば、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、ポワッサンウイルス（Poswanan virus）、ダニ媒介性脳炎ウイルス）、またはインフルエンザウイルス（全粒子の生または不活性化ウイルス、スプリットされたインフルエンザウイルス、卵もしくはＭＤＣＫ細胞内で増殖させたもの、または全粒子インフルエンザビロソーム（Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920で説明されている）、または、その精製タンパク質もしくは組換えタンパク質、例えば、ＨＡタンパク質、ＮＰタンパク質、ＮＡタンパク質、もしくはＭタンパク質、またはこれらの組み合わせ）が挙げられる。
【０３７６】
本明細書に記載の組成物は、１または複数の病原性微生物に対する防御免疫を増強するために使用されてもよく、例えば、淋菌（N. gonorrhea）および髄膜炎菌（N. meningitidis）（例えば、莢膜性多糖類およびそのコンジュゲート、トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、ＰｉｌＣ、アドヘシン）を含むナイセリア属菌種；化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）（例えば、Ｍタンパク質またはその断片、Ｃ５Ａプロテアーゼ、リポテイコ酸）、アガラクチア菌（S. agalactiae）、ストレプトコッカス・ミュータンス（S. mutans）：軟性下疳菌（H. ducreyi）；モラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）、別名カタル球菌（Branhamella catarrhalis）（例えば、高分子および低分子のアドヘシンおよびインベイシン）を含むモラクセラ属菌種；百日咳菌（B. pertussis）（例えば、パータクチン、百日咳毒素、またはその誘導体、線維状赤血球凝集素（filamenteous hemagglutinin）、アデニル酸シクラーゼ、線毛）、パラ百日咳菌（B. parapertussis）、および気管支敗血症菌（B. bronchiseptica）を含むボルデテラ属菌種；結核菌（M. tuberculosis）（例えば、ＥＳＡＴ６、抗原８５Ａ、８５Ｂ、または８５Ｃ）、ウシ型結核菌（M. bovis）、らい菌（M. leprae）、トリ型結核菌（M. avium）、ヨーネ菌（M. paratuberculosis）、スメグマ菌（M. smegmatis）を含むマイコバクテリウム属菌種；レジオネラ・ニューモフィラ（L. pneumophila）を含むレジオネラ属菌種；腸管毒性大腸菌（enterotoxic E. coli）（例えば、定着因子、易熱性毒素またはその誘導体、耐熱性毒素またはその誘導体）、腸管出血性大腸菌、腸管病原性大腸菌（例えば、志賀毒素様毒素またはその誘導体）を含む大腸菌属菌種；コレラ菌（V. cholera）（例えば、コレラ毒素またはその誘導体）を含むビブリオ属菌種；ソンネ菌（S. sonnei）、志賀赤痢菌（S. dysenteriae）、シゲラ・フレックスネリ（S. flexnerii）を含む赤痢菌属菌種；エルシニア・エンテロコリチカ（Y. enterocolitica）（例えば、Ｙｏｐタンパク質）、ペスト菌（Y. pestis）、仮性結核菌（Y. pseudotuberculosis）を含むエルシニア属菌種；カンピロバクター・ジェジュニ（C. jejuni）（例えば、毒素、アドヘシンおよびインベイシン）およびカンピロバクター・コリ（C. coli）を含むカンピロバクター属菌種；チフス菌（S. typhi）、パラチフス菌（S. paratyphi）、ブタコレラ菌（S. choleraesuis）、腸炎菌（S. enteritidis）を含むサルモネラ属菌種；リステリア菌（L. monocytogenes）を含むリステリア属菌種；ピロリ菌（H. pylori）（例えば、ウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化致死毒素）を含むヘリコバクター属菌種；緑膿菌（P. aeruginosa）を含むシュードモナス属菌種；黄色ブドウ球菌（S. aureus）、表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）を含むブドウ球菌属菌種；大便連鎖球菌（E. faecalis）、フェシウム菌（E. faecium）を含むエンテロコッカス属菌種；破傷風菌（C. tetani）（例えば、破傷風毒素およびその誘導体）、ボツリヌス菌（C. botulinum）（例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体）、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）（例えば、クロストリジウムトキシンＡまたはトキシンＢおよびその誘導体）を含むクロストリジウム属菌種；炭疽菌（B. anthracis）（例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体）を含むバチルス属菌種；ジフテリア菌（C. diphtheriae）（例えば、ジフテリア毒素およ��その誘導体）を含むコリネバクテリウム属菌種；ボレリア・ブルグドルフェリ（B. burgdorferi）（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、ボレリア・ガリニ（B. garinii）（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、ボレリア・アフゼリ（B. afzelii）（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、ボレリア・アンダーソニ（B. andersonii）（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、ボレリア・ヘルムシ（B. hermsii）を含むボレリア属菌種；エーリキア・エクイ（E. equi）およびヒト顆粒球エーリキア症の病原体を含むエーリキア属菌種；リケッチア・リケッチイ（R. rickettsii）を含むリケッチア属菌種；クラミジア・トラコマチス（C. trachomatis）（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、肺炎クラミジア（C. pneumoniae）（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、オウム病クラミジア（C. psittaci）を含むクラミジア属菌種；レプトスピラ・インターロガンス（L. interrogans）を含むレプトスピラ属菌種；梅毒トレポネーマ（T. pallidum）（例えば、微量（rare）外膜タンパク質）、トレポネーマ・デンティコラ（T. denticola）、トレポネーマ・ヒオディセンテリア（T. hyodysenteriae）を含むトレポネーマ属菌種；または他の病原性微生物、などの病原性微生物である。
【０３７７】
本明細書に記載の組成物は１または複数の寄生虫に対する防御免疫を増強するために使用されてもよく（例えば、ohn, D.T. and Petri, W.A., Markell and Voge’s Medical Parasitology-9th Ed., 2006, WB Saunders, Philadelphia; Bowman, D.D., Georgis’ Parasitology for Veterinarians-8th Ed., 2002, WB Saunders, Philadelphiaを参照）、例えば、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）を含むプラスモディウム属種；トキソプラズマ原虫（T. gondii）（例えば、ＳＡＧ２、ＳＡＧ３、Ｔｇ３４）を含むトキソプラズマ属種；赤痢アメーバ（E. histolytica）を含むエントアメーバ属種；ネズミバベシア（B. microti）を含むバベシア属種；クルーズトリパノソーマ（T. cruzi）を含むトリパノソーマ属種；ランブル鞭毛虫（G. lamblia）を含むジアルジア属種；森林型熱帯リーシュマニア（L. major）を含むリーシュマニア属種（Leshmania spp.）；ニューモシスチス・カリニ（P. carinii）を含むニューモシスチス属種；膣トリコモナス（T. vaginalis）を含むトリコモナス属種；または、哺乳動物に感染可能な蠕虫、例えば、（ｉ）線虫感染（例えば、限定はされないが、蟯虫（Enterobius vermicularis）、回虫（Ascaris lumbricoides）、トリクリス・トリクリア（Trichuris trichuria）、アメリカ鉤虫（Necator americanus）、ズビニ鉤虫（Ancylostoma duodenale）、バンクロフト糸状虫（Wuchereria bancrofti）、マレー糸状虫（Brugia malayi）、回旋糸状虫（Onchocerca volvulus）、メジナ虫（Dracanculus medinensis）、旋毛虫（Trichinella spiralis）、および糞線虫（Strongyloides stercoralis））；（ｉｉ）吸虫感染（例えば、限定はされないが、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）、ビルハルツ住血吸虫（Schistosoma haematobium）、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）、メコン住血吸虫（Schistosoma mekongi）、肝吸虫（Opisthorchis sinensis）、肺吸虫属種（Paragonimus sp）、肝蛭（Fasciola hepatica）、ファスキオラ・マグナ（Fasciola magna）、巨大肝蛭（Fasciola gigantica））；並びに（ｉｉｉ）条虫感染（例えば、限定はされないが、無鉤条虫（Taenia saginata）および有鉤条虫（Taenia solium））が挙げられる。ある実施形態では、前記抗原は、以下に由来する抗原である：住血吸虫属（Schisostoma）種、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansonii）、ビルハルツ住血吸虫（Schistosoma haematobium）、および／もしくは日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）、または、酵母、例えば、カンジダ・アルビカンス（C. albicans）を含むカンジダ属菌種；クリプトコッカス・ネオフォルマンス（C. neoformans）を含むクリプトコッカス属菌種、以下含む細菌、ウイルスもしくは真菌などの感染性病原体：アクチノバクテリウム（Actinobacterium）、例えば、結核菌（M. tuberculosis）、らい菌（M. leprae）もしくは別のマイコバクテリウム；細菌、例えば、サルモネラ属、ナイセリア属、ボレリア属、クラミジア属もしくはボルデテラ属のメンバー；ウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、肝炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ジカウイルス（ＺＩＫＶ）呼吸器合胞体ウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、およびサイトメガロウイルス；ＨＩＶ、例えば、ＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２；真菌、例えば、アスペルギルス属、ブラストミセス属、コクシジオイデス属、およびニューモシスチス属（Pneumocysti���、または、カンジダ属種、例えば、カンジダ・アルビカンス（C. albicans）、カンジダ・グラブラタ（C. glabrata）、カンジダ・クルセイ（C. krusei）、カンジダ・ルシタニエ（C. lusitaniae）、カンジダ・トロピカリス（C. tropicalis）、およびカンジダ・パラプローシス（C. parapsilosis）、を含む酵母；寄生虫、例えば、原生動物、例えば、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、三日熱マラリア原虫（P. vivax）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）、および卵形マラリア原虫（P. ovale）を含むプラスモディウム属種；または、別の寄生虫、例えば、アカントアメーバ、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、住血線虫、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansonii）、ビルハルツ住血吸虫（Schistosoma haematobium）、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）、クリプトスポリジウム属、鉤虫、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、大腸アメーバ（Entamoeba coli）、エントアメーバ・ディスパー（Entamoeba dispar）、ハルトマンアメーバ（Entamoeba hartmanni）、ポレックアメーバ（Entamoeba polecki）、バンクロフト糸状虫（Wuchereria bancrofti）、ジアルジア、およびリーシュマニアのうちの１または複数。
【０３７８】
本発明の組成物が、生物活性剤を効果的に送達することが可能かどうか、および／または対象において目的の効果を有することが可能かどうかを判定する方法は、当該技術分野において公知であるため、本明細書では詳細な説明はしない。一つの態様では、抗原に対する免疫応答は、血液試料中のまたは粘膜部由来の、投与前後の抗原特異的抗体（例えば、全身的なＩｇＭ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａなど）またはＩｇＡ）のレベルをモニタリングすることにより、判定できる。抗原刺激後のＴ細胞およびＢ細胞の機能を評価することでも、投与後の細胞免疫反応をモニタリングすることができる。
【０３７９】
前記核酸分子（例えば、ＲＮＡ）がタンパク質抗原をコードする、本明細書で開示される組成物またはワクチンの免疫原性の別の評価法では、免疫ブロットおよび／またはマイクロアレイにより患者の血清または粘膜分泌物をスクリーニングするために、組換えタンパク質抗原が発現されることとなる。前記タンパク質と前記患者試料との間の陽性反応は、前記患者が目的のタンパク質に対する免疫応答を開始したことを示している。この方法は免疫優性抗原および／またはタンパク質抗原内エピトープを特定するために使用されてもよい。
【０３８０】
前記組成物の有効性は、目的の感染症病原体で適切な動物モデルをチャレンジすることによって、インビボで判定することもできる。
【０３８１】
本明細書において提供される実施形態では、前記対象は、哺乳動物（例えば、家畜（雌ウシ、ブタ、ヤギ、ウマなど）、ペット（ネコ、イヌなど）、およびげっ歯類（ラット、マウスなど）を含む動物、またはヒト）である。１つの実施形態では、前記対象はヒトである。別の実施形態では、前記対象はヒト以外の哺乳動物である。別の実施形態では、前記ヒト以外の哺乳動物は、イヌ、雌ウシ、またはウマである。
【０３８２】
Ｘ．生物活性剤の細胞への送達法
【０３８３】
本明細書において、細胞に生物活性剤を送達する方法であって、前記細胞を本明細書に記載の組成物と接触させる工程を含む、前記方法が提供される。いくつかの実施形態では、前記生物活性剤は核酸である。いくつかの実施形態では、前記細胞が対象の中に存在する場合は、前記細胞と前記組成物の接触は、前記組成物を前記対象に投与する工程を含む。このような方法は、免疫応答を発生させるために抗原または抗原をコードする核酸を送達する際に有用となる。このような方法はまた、疾患および健康状態の治療のために、抗体をコードする核酸、タンパク質薬剤、小分子薬剤、ホルモン、ノンコーディングＲＮＡ分子、および他の生物活性剤を送達する際にも有用である。
【０３８４】
生物活性剤を細胞に送達するための本明細書に記載の方法は、疾患および健康状態の治療において有用であり得るが、これらの疾患および健康状態としては、髄膜腫、肝細胞癌、膵腫瘍などのがん；アレルギー；真菌性疾患、細菌性疾患、または寄生虫性疾患を含む感染症；乾癬および関節炎を含む炎症性疾患、並びに房室形成異常（atrial-ventricular malformation）；自己免疫疾患；並びに神経疾患が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０３８５】
細胞が対象の中に存在する場合で、組成物を対象に投与する工程を含む、組成物を細胞に送達する方法の実施形態では、治療有効量の前記組成物の通常の投与経路としては、経口経路、局所経路、非経口経路、舌下経路、頬側経路、直腸内経路、膣内経路、静脈内経路、皮内経路、経皮経路、鼻腔内経路、粘膜内経路、または皮下経路が挙げられるが、これらに限定はされない。好ましい実施形態では、前記組成物の投与は筋肉内投与、非経口投与、または皮内投与である。そのような実施形態では、前記対象は、哺乳動物（例えば、家畜（雌ウシ、ブタ、ヤギ、ウマなど）、ペット（ネコ、イヌなど）、およびげっ歯類（ラット、マウスなど）を含む動物、またはヒト）である。１つの実施形態では、前記対象はヒトである。別の実施形態では、前記対象はヒト以外の哺乳動物である。別の実施形態では、前記ヒト以外の哺乳動物は、イヌ、雌ウシ、またはウマである。
【０３８６】
いくつかの実施形態では、より大規模な免疫応答が生じるように、複数の送達様式が用いられてもよい。例えば、前記組成物は１回、２回、３回、または４回投与することができる。いくつかの実施形態では、この１回または複数回の投与はいわゆる「プライム・ブースト」プロトコルの一環として行われてもよい。いくつかの実施形態では、この「プライム・ブースト」法は、異なるベクターまたは複数回の投与による、同一抗原を提示するいくつかの段階での投与を含む。いくつかの実施形態では、投与は２回よりも多く（例えば、３回、４回など）行われてもよく、最初にプライミング目的の投与が行われた後に、ブースト目的の投与が２回以上行われる。複数のベクターの投与または反復投与が行われる場合、各投与を互いに、例えば、１週間、２週間、３週間、１か月間、６週間、２か月間、３か月間、６か月間、１年間、またはそれより長い期間、隔てることができる。いくつかの実施形態では、プライム・ブースト法は、ＲＮＡ段階とタンパク質段階とを含む。ＲＮＡ段階は、例えば、抗原タンパク質をコードする遺伝子を有するＲＮＡの投与、前記ＲＮＡの前記抗原への翻訳、および対象における対応する抗体の産生を含み得る。タンパク質段階は、例えば、タンパク質の形態の抗原の直接投与を含み得る。いくつかの実施形態では、対象に、ネオアンチゲンをコードする腫瘍溶解性ウイルス（ＮＬＣ有りで製剤化されていてもＮＬＣ無しで製剤化されていてもよい）を投与（例えば、プライム）した後、前記ネオアンチゲンをコードするＲＮＡコンストラクトを含むＮＬＣを投与（例えば、ブースト）する。
【０３８７】
ＸＩ．ＲＮＡの皮内送達（所望によりＭｉｃｒｏｎＪｅｔ６００（商標）を使用）
【０３８８】
ＭｉｃｒｏｎＪｅｔ６００（登録商標）は、各々６００μｍ（０．６ｍｍ）の長さの３本のマイクロニードルを備えた、小型のプラスチック製デバイスである。このデバイスは、標準的な針の代わりに、あらゆる標準的な注射器に装着できる。マイクロニードルそれ自体はシリコン結晶からできており、並んで切断された後に、生体適合性ＵＶ硬化接着剤を用いてポリカーボネート製の基部に接合（結合）される。
【０３８９】
皮内送達は、１ｍｍすなわち１０００μｍ未満の高さの、より好ましくは５００〜７５０μｍの高さの、マイクロニードルを用いることで行うことができる。
【０３９０】
マイクロニードル注射デバイスは複数の針を有することが好ましく、通常は３本のマイクロニードルを有する。
【０３９１】
マイクロニードル注射デバイスは「下向き」（斜面を下向き）にされ、すなわち、注射装置がより深く皮膚に向かい、斜面が上向きにならない。これにより、漏らすことなく確実な注射を行える。目視で、または基部／アダプタの機械的特徴により、注射の向きが分かることが好ましい。
【０３９２】
マイクロニードル注射は浅い真皮、および表皮に行われる。これにより効果的な発現および免疫化が可能となる。
【０３９３】
マイクロニードルを用いた注射の深さは、通常は１００〜７５０μｍ程度、より好ましくは３００〜４００μｍ程度であり、これは、通常の針、または典型的にはより深い皮膚層にもしくは皮膚より下に送達を行う他のミニニードルもしくはマイクロニードルとは異なっている。
【０３９４】
注射の角度は約４５°（通常は±２０°、より好ましくは±１０°）であることが好ましく、標準的な針、および他の垂直式のマイクロニードルと比較して、注射点を浅くすることができる。
【０３９５】
本明細書において、動物またはヒト患者（例えば、被験者）にｒｖＲＮＡ（レプリコンＲＮＡ）を包含するＲＮＡを送達するシステムおよび方法であって、ＲＮＡ（例えば、ｒｖＲＮＡ）を皮膚の表面から約１００〜約７００μｍの深さの皮膚の表皮または真皮に投与することを含む、前記システムおよび方法が提供される。有効量のＲＮＡが送達されることで、ＲＮＡにコードされるタンパク質の発現が可能となる。そのようなタンパク質は、本明細書に記載の抗原である場合と、ワクチン成分などである場合がある。
【０３９６】
前記ＲＮＡは、１または複数のマイクロニードルを備え、表層皮内送達用に設計された、皮内送達デバイスを用いて投与することができる。
【０３９７】
前記ＲＮＡは、全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第６５３３９４９号および／または同第７９９８１１９号の教示に基づく皮内送達デバイスを用いて、投与することができる。
【０３９８】
本明細書に記載のＲＮＡを含有する製剤および／または組成物はいずれも、本明細書に記載のマイクロニードルデバイスによって皮内投与することができる。他のＲＮＡ皮内送達デバイスも使用でき、例えば、皮内エレクトロポレーション送達デバイスが挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、ＲＮＡの送達は対象に免疫応答を発生させる。
【０３９９】
ＸＩＩ．細胞へのＲＮＡの送達を最適化する方法
【０４００】
本明細書において、細胞へのＲＮＡ送達を最適化する方法であって、前記細胞を含む対象で生じる抗体価を最適化する窒素（Ｎ）：リン酸（Ｐ）のモル比を選択する工程を含む、前記方法が提供される。例示的な実施形態では、実際に用いられるＮ：Ｐ比は、ＲＮＡ−ＮＬＣ間の結合、およびそれに応じたＲＮＡにコードされたタンパク質のインビトロ発現の所見を与えるものである。例示的なＮ：Ｐモル比は、１〜２００、１〜１００、好ましくは１〜５０、より好ましくは約５〜約５０、または約５〜約４０であり得る。いくつかの例示的な実施形態では、Ｎ：Ｐモル比は１〜１５または１〜７であり得る。
【０４０１】
ＸＩＩＩ．キットおよび製品
【０４０２】
ある実施形態では、本明細書に記載のナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）および組成物を含むキットも企図されており、これらのＮＬＣおよび組成物は１または複数の容器に含まれて提供されてもよい。１つの実施形態では、前記組成物の成分の全てが単一容器の中に一緒に存在する。他の実施形態では、前記組成物の各成分を２以上の容器の中に存在させてもよい。好ましい実施形態では、前記ＮＬＣがある容器に含まれて提供され、前記生物活性剤が別の容器に含まれて提供される。
【０４０３】
いくつかの実施形態では、前記キットの１つのバイアルが本明細書において提供されるＮＬＣを含み、前記キットの第二のバイアルがＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、前記キットは任意の成分を含む第三のバイアルを含む。
【０４０４】
本発明のキットは、本明細書に記載されるような使用説明書、または各バイアルに含まれる各物質を混合するための説明書、をさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、前記バイアル内の物質は、乾燥状態であるか、凍結乾燥状態である。いくつかの実施形態では、前記バイアル内の物質は、液体である。
【０４０５】
そのようなキットの実施形態における容器は、好適ないかなる容器（container, vessel）、バイアル、アンプル、チューブ、カップ、ボックス、ボトル、フラスコ、ジャー、ディッシュ、シングルウェル器具のウェル、マルチウェル器具のウェル、リザーバー、タンクなどであってもよく、あるいは、他のデバイスとして、本明細書において開示される組成物を格納、保存および／または輸送し、内容物を取り出すために利用できるものであってもよい。通例、このような容器は、その構成材料は用途に合致したものであればよく、格納された内容物が容易に回収できるものである。そのような容器の非限定的な例として、ガラス製および／またはプラスチック製の密封型または再密封可能なチューブおよびアンプルが挙げられ、ゴム製の仕切り、または針および注射器を用いて内容物を回収するのに適合した他の密封手段を有するものが包含される。そのような容器は、例えば、ガラス製であっても化学適合性のプラスチック製または樹脂製であってもよく、あるいは、容器から物質を効率的に取り出すことを可能にする、且つ／または、紫外線や極高低温などの分解性条件、汚染菌をはじめとする好ましくない汚染物質の移入などから物質を保護する、材料で構成されていてもよいし、それでコーティングされていてもよい。好ましくは、そのような容器は、滅菌されているか滅菌可能なものであり、本明細書に記載のワクチン組成物、および／または免疫アジュバント組成物、および／または抗原、および／または組み換え発現型コンストラクトなどの懸濁または溶解に使用され得るような、いかなる担体、賦形剤、溶媒、基剤などとも適合性である、材料からなるものである。
【０４０６】
ＸＩＶ．実施形態の例示
実施形態１
細胞に生物活性剤を送達するためのナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）粒子を含む組成物であって、
（ａ）液相脂質と固相脂質との混合物を含む油性コア、
（ｂ）陽イオン性成分、好ましくは陽イオン性脂質、
（ｃ）疎水性界面活性剤、好ましくはソルビタンエステル、および
（ｄ）界面活性剤、好ましくは親水性界面活性剤
を含む、前記ＮＬＣ粒子。
実施形態２
前記生物活性剤が前記ＮＬＣ粒子と結合している、実施形態１に記載の組成物。
実施形態３
前記細胞に前記生物活性剤を送達する、実施形態１または実施形態２に記載の組成物。
実施形態４
前記疎水性界面活性剤がソルビタンエステルであり、ソルビタンエステルを含まない対照組成物と比較した場合に前記生物活性剤を前記細胞に送達する前記組成物の能力を増強するのに十分な量でソルビタンエステルが存在する、実施形態１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態５
前記生物活性剤がタンパク質である、または、前記生物活性剤がタンパク質をコードしている、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態６
前記生物活性剤がタンパク質抗原である、または、前記生物活性剤がタンパク質抗原をコードしている、実施形態１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態７
前記細胞が対象内の細胞であり、前記組成物が前記抗原に対する前記対象の免疫応答を誘発させる、実施形態６に記載の組成物。
実施形態８
前記抗原が、感染症、がん、または自己免疫疾患と関連している感染性病原体および／またはエピトープ、生体分子、細胞もしくは組織に由来する抗原である、または、それと免疫交差反応性の抗原である、実施形態６または実施形態７に記載の組成物。
実施形態９
前記疎水性界面活性剤がソルビタンエステルであり、ソルビタンエステルを含まない対照組成物と比較した場合に前記抗原に対する免疫応答を誘発させる前記組成物の能力を増強するのに十分な量でソルビタンエステルが存在する、実施形態６〜８のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１０
前記対象に有効量で投与された場合に、前記生物活性剤を前記ＮＬＣ無しで前記対象に投与した場合に誘発される免疫応答と同等以上の前記抗原に対する免疫応答を誘発させる、実施形態６〜９のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１１
前記疎水性界面活性剤がソルビタンエステルであり、前記対象に有効量で投与された場合に、ソルビタンエステルを含まない対照組成物を前記対象に投与した場合に誘発される抗体価よりも高いレベルの前記抗原に対する抗体価を誘発する、実施形態６〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１２
前記疎水性界面活性剤がソルビタンエステルであり、ソルビタンエステルを含まない対照組成物によって前記対象において誘導される中和抗体価よりも高いレベルの前記対象における中和抗体価を誘導する、実施形態６〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１３
前記生物活性剤がＲＮＡまたはＤＮＡである、実施形態１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１４
前記生物活性剤がｍＲＮＡである、実施形態１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１５
前記生物活性剤が腫瘍溶解性ウイルスＲＮＡである、実施形態１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１６
前記ＲＮＡがレプリコンである、実施形態１３または実施形態１４に記載の組成物。
実施形態１７
前記ＲＮＡが抗原をコードしている、実施形態１３〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１８
前記ＲＮＡが抗体をコードしている、実施形態１３〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１９
前記ＲＮＡがノンコーディングＲＮＡである、実施形態１３〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態２０
前記液相脂質が代謝可能なものである、実施形態１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態２１
前記液相脂質が植物油、動物油、または合成により作製された油である、実施形態１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態２２
前記液相脂質が魚油である、実施形態１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態２３
前記液相脂質がトリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル、ビタミンＥ、ラウロイルポリオキシルグリセリド、モノアシルグリセロール、ダイズレシチン、スクアレン、もしくはスクアラン、またはこれらの組み合わせである、実施形態１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態２４
前記液相脂質がスクアレン、ヒマワリ油、ダイズ油、オリーブ油、ブドウ種子油、スクアラン、トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル、またはこれらの組み合わせである、実施形態１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態２５
前記液相脂質が天然テルペノイドまたは合成テルペノイドである、実施形態１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態２６
前記液相脂質がスクアレンである、実施形態１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態２７
前記固相脂質がグリセロ脂質である、実施形態１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態２８
前記固相脂質が微結晶トリグリセリドである、実施形態１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態２９
前記微結晶トリグリセリドがトリミリスチンである、実施形態２８に記載の組成物。
実施形態３０
前記陽イオン性成分が、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）、および１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、並びにこれらの組み合わせ、から選択される陽イオン性脂質である、実施形態１〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態３１
前記陽イオン性脂質が１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）である、実施形態３０に記載の組成物。
実施形態３２
前記親水性界面活性剤がポリエチレングリコールである、実施形態１〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態３３
前記親水性界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンエステルである、実施形態３２に記載の組成物。
実施形態３４
前記ＮＬＣ粒子の平均多分散指数が０．１〜約０．５である、実施形態１〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態３５
前記ＮＬＣ粒子の平均多分散指数が約０．２〜約０．５である、実施形態１〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態３６
前記ＮＬＣ粒子の平均多分散指数が約０．２〜約０．４または約０．１〜約０．４である、実施形態１〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態３７
前記ＮＬＣ粒子の平均多分散指数が約０．２〜約０．３または約０．１〜約０．３である、実施形態１〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態３８
前記ＮＬＣ粒子のｚ平均粒径が約４０ｎｍ〜約６０ｎｍである、実施形態１〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態３９
前記ＮＬＣ粒子のｚ平均粒径が約２０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約１５０、約２０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約４０ｎｍ〜約１５０、約４０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約４０ｎｍ〜約８０ｎｍ、または約４０ｎｍ〜約６０ｎｍである、実施形態１〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態４０
前記疎水性界面活性剤が１〜５の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）値を有するソルビタンエステルである、実施形態１〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態４１
前記疎水性界面活性剤が４〜５のＨＬＢ値を有するソルビタンエステルである、実施形態４０に記載の組成物。
実施形態４２
前記疎水性界面活性剤がソルビタンエステルであり、前記ソルビタンエステルがソルビタンモノエステルである、実施形態１〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態４３
前記疎水性界面活性剤がソルビタンエステルであり、前記ソルビタンエステルがソルビタンモノステアレートである、実施形態１〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態４４
前記疎水性界面活性剤がソルビタンエステルであり、前記ソルビタンエステルがソルビタンモノオレートである、実施形態１〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態４５
前記ＮＬＣ粒子のｚ平均粒径が約４０ｎｍ〜約８０ｎｍである、実施形態１〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態４６
前記ＮＬＣ粒子のｚ平均粒径が約４０ｎｍ〜約６０ｎｍである、実施形態１〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態４７
油：界面活性剤モル比が約０．５〜約１２、より好ましくは約０．５〜約９である、実施形態１〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態４８
油：界面活性剤モル比が約０．５〜約１である、実施形態１〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態４９
親水性界面活性剤：陽イオン性成分比が約０．２〜約１．５である、実施形態１〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態５０
親水性界面活性剤：陽イオン性成分比が約０．２〜約１である、実施形態１〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態５１
ＲＮＡの積載量が少なくとも約１００μｇ／ｍＬである、実施形態１〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態５２
前記疎水性界面活性剤がソルビタンエステルであり、前記ソルビタンエステルがソルビタントリエステルである、実施形態１〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態５３
前記疎水性界面活性剤がソルビタンエステルであり、前記ソルビタンエステルがソルビタントリオレエートである、実施形態１〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態５４
約０．２ｗ／ｖ％〜約４０ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％のソルビタンモノエステル、および約０．５ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤を含む、実施形態１〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態５５
約２ｗ／ｖ％〜約４０ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％のソルビタンモノエステル、および約０．５ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤を含む、実施形態１〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態５６
約１０ｗ／ｖ％〜約４０ｗ／ｖ％の液相脂質、約１％〜約２％の固相脂質、約２％〜約５％の陽イオン性脂質、約３〜約５ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約３ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤を含む、実施形態１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態５７
約１５ｗ／ｖ％の液相脂質および約１％の固相脂質、または約３０ｗ／ｖ％の液相脂質および約１．８％の固相脂質、並びに、約３％の陽イオン性脂質、約３．７ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、並びに約３．７ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤を含む、実施形態１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態５８
約２ｗ／ｖ％〜約６ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％のソルビタンモノエステル、および約０．５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤を含む、実施形態１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態５９
約３．７５ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．２５ｗ／ｖ％の固相脂質、約３ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約３．７ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約３．７ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤を含む、実施形態１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態６０
約０．２ｗ／ｖ％〜約４０ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤を含む、実施形態１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態６１
約０．２ｗ／ｖ％〜約４０ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約１５ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約０．２ｗ／ｖ％〜約１５ｗ／ｖ％または約０．５ｗ／ｖ％〜約１５ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤を含む、実施形態１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態６２
約２ｗ／ｖ％〜約４０ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤を含む、実施形態１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態６３
約２ｗ／ｖ％〜約６ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．１ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．２ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．２５ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％のソルビタンモノエステル、および約０．２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤を含む、実施形態１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態６４
約４ｗ／ｖ％の液相脂質、約０．２５ｗ／ｖ％の固相脂質、約０．４ｗ／ｖ％の陽イオン性脂質、約０．５ｗ／ｖ％のソルビタンエステル、および約０．５ｗ／ｖ％の親水性界面活性剤を含む、実施形態１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態６５
実施形態５４〜６４のいずれか一項に記載の組成物の希釈形態または濃縮形態を含む組成物。
実施形態６６
実施形態５４〜６４のいずれか一項に記載の組成物が２〜３０倍希釈されている、実施形態６５に記載の組成物。
実施形態６７
実施形態５４〜６４のいずれか一項に記載の組成物が２〜２０倍希釈されている、実施形態６５に記載の組成物。
実施形態６８
実施形態５４〜６４のいずれか一項に記載の組成物が２倍希釈されている、実施形態６５に記載の組成物。
実施形態６９
実施形態５４〜６４のいずれか一項に記載の組成物が２〜３０倍に濃縮されている、実施形態６５に記載の組成物。
実施形態７０
実施形態５４〜６４のいずれか一項に記載の組成物が２〜１０倍に濃縮されている、実施形態６５に記載の組成物。
実施形態７１
前記液相脂質が天然テルペノイドまたは合成テルペノイドである、実施形態５４〜７０のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態７２
前記液相脂質が天然スクアレンまたは合成スクアレンである、実施形態５４〜７０のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態７３
前記固相脂質がグリセロ脂質である、実施形態５４〜７２のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態７４
前記固相脂質が微結晶トリグリセリドである、実施形態５４〜７２のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態７５
前記固相脂質がトリミリスチンである、実施形態５４〜７２のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態７６
前記陽イオン性脂質がＤＯＴＡＰである、実施形態５４〜７５のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態７７
前記ソルビタンエステルがソルビタンモノステアレートである、実施形態５４〜７６のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態７８
前記ソルビタンエステルがソルビタンモノオレートである、実施形態５４〜７６のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態７９
前記ソルビタンエステルがソルビタントリオレエートである、実施形態５４〜７６のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態８０
前記親水性界面活性剤がポリソルベートである、実施形態５４〜７７のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態８１
前記親水性界面活性剤がポリソルベート８０である、実施形態５４〜７７のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態８２
前記油性コアが天然スクアレンまたは合成スクアレンおよびグリセロ脂質を含み、前記陽イオン性脂質がＤＯＴＡＰであり、前記ソルビタンエステルがソルビタンモノステアレートまたはソルビタンモノオレートであり、前記親水性界面活性剤がポリソルベートである、実施形態１〜２０、実施形態３４〜４１、実施形態４５〜５１、および実施形態５４〜７０のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態８３
前記油性コアがスクアレンおよびトリミリスチンを含み、前記陽イオン性脂質がＤＯＴＡＰであり、前記ソルビタンエステルがソルビタンモノステアレートであり、前記親水性界面活性剤がポリソルベート８０である、実施形態１〜２０、実施形態３４〜４１、実施形態４５〜５１、および実施形態５４〜７０のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態８４
前記ＮＬＣが、約２ｗ／ｖ％〜約４０ｗ／ｖ％のスクアレン、約０．１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％のトリミリスチン、約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％のＤＯＴＡＰ、約０．２５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％のソルビタンモノステアレート、および約０．５ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％のポリソルベート８０を含む、実施形態８３に記載の組成物。
実施形態８５
前記ＮＬＣが、約２ｗ／ｖ％〜約６ｗ／ｖ％のスクアレン、約０．１ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％のトリミリスチン、約０．２ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％のＤＯＴＡＰ、約０．２５ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％のソルビタンモノステアレート、および約０．５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％のポリソルベート８０を含む、実施形態８３に記載の組成物。
実施形態８６
前記ＮＬＣが、約３．７５ｗ／ｖ％のスクアレン、約０．２５ｗ／ｖ％のトリミリスチン、約３ｗ／ｖ％のＤＯＴＡＰ、約３．７ｗ／ｖ％のソルビタンモノステアレート、および約３．７ｗ／ｖ％のポリソルベート８０を含む、実施形態８５に記載の組成物。
実施形態８７
前記油性コアが天然スクアレンまたは合成スクアレンおよびグリセロ脂質を含み、前記陽イオン性脂質がＤＯＴＡＰであり、前記ソルビタンエステルがソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレートまたはソルビタントリオレエートであり、前記親水性界面活性剤がポリソルベートである、実施形態１〜２０、実施形態３４〜４１、実施形態４５〜５１、および実施形態５４〜７０のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態８８
前記油性コアがスクアレンおよびトリミリスチンを含み、前記陽イオン性脂質がＤＯＴＡＰであり、前記ソルビタンエステルがソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレート、またはソルビタントリオレエートであり、前記親水性界面活性剤がポリソルベート８０である、実施形態１〜２０、実施形態３４〜４１、実施形態４５〜５１、および実施形態５４〜７０のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態８９
前記ＮＬＣが、約２ｗ／ｖ％〜約４０ｗ／ｖ％のスクアレン、約０．１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％のトリミリスチン、約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％のＤＯＴＡＰ、約０．２５ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％のソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレート、またはソルビタントリオレエート、および約０．２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％のポリソルベート８０を含む、実施形態８７または実施形態８８に記載の組成物。
実施形態９０
前記ＮＬＣが、約２ｗ／ｖ％〜約６ｗ／ｖ％のスクアレン、約０．１ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％のトリミリスチン、約０．２ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％のＤＯＴＡＰ、約０．２５ｗ／ｖ％〜約１ｗ／ｖ％のソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレート、またはソルビタントリオレエート、および約０．２ｗ／ｖ％〜約５ｗ／ｖ％のポリソルベート８０を含む、実施形態８７または実施形態８８に記載の組成物。
実施形態９１
前記ＮＬＣが、約４ｗ／ｖ％のスクアレン、約０．２５ｗ／ｖ％のトリミリスチン、約０．４ｗ／ｖ％のＤＯＴＡＰ、約０．５ｗ／ｖ％のソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレート、またはソルビタントリオレエート、および約０．５ｗ／ｖ％のポリソルベート８０を含む、実施形態８７または実施形態８８に記載の組成物。
実施形態９２
対象において免疫応答を発生させる方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の実施形態１〜９１のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含み、前記生物活性剤がタンパク質抗原またはタンパク質抗原をコードする核酸分子である、前記方法。
実施形態９３
前記生物活性剤がＲＮＡである、実施形態９２に記載の方法。
実施形態９４
前記組成物の投与が筋肉内投与、非経口投与、または皮内投与である、実施形態９２または実施形態９３に記載の方法。
実施形態９５
対象において免疫応答を発生させる方法であって、（ａ）それを必要とする対象に、治療有効量の、タンパク質抗原をコードする腫瘍溶解性ウイルスを投与することと、（ｂ）前記対象に治療有効量の実施形態１〜９１のいずれか一項に記載の組成物を投与すること、とを含み、前記生物活性剤が前記タンパク質抗原または前記タンパク質抗原をコードする核酸分子である、前記方法。
実施形態９６
前記（ａ）の投与および前記（ｂ）の投与を、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１か月間、少なくとも６週間、少なくとも２か月間、少なくとも３か月間、少なくとも６か月間、または少なくとも１年間の間隔を空けて行う、実施形態９５に記載の方法。
実施形態９７
生物活性剤を細胞に送達する方法であって、前記細胞を実施形態１〜９１のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、前記方法。
実施形態９８
前記生物活性剤が核酸である、実施形態９７に記載の方法。
実施形態９９
前記細胞と前記組成物とを接触させることが、前記組成物を対象に投与することを含み、前記細胞が前記対象の中に存在する、実施形態９７または実施形態９８に記載の方法。
実施形態１００
生物活性剤の細胞への送達を最適化するための方法であって、前記細胞を含む対象において誘導される抗体価を最適化する、ＮＬＣに対する生物活性剤のモル比を選択することを含む、前記方法。
実施形態１０１
前記ＮＬＣが実施形態１〜９１のいずれか一項に記載のＮＬＣ粒子である、実施形態１００に記載の方法。
実施形態１０２
実施形態１〜９１のいずれか一項に記載の組成物を作製する方法であって、
（ａ）前記固相脂質と、前記液相脂質と、前記陽イオン性脂質と、前記疎水性界面活性剤とを混合して、油相混合物を形成させること；
（ｂ）前記親水性界面活性剤と、水とを混合して、水相混合物を形成させること；
（ｃ）前記油相混合物を前記水相混合物と混合して、前記ＮＬＣ粒子を形成させること；および
（ｄ）所望により、前記生物活性剤が非共有結合相互作用または可逆的共有結合相互作用によって前記ＮＬＣ粒子の表面と結合するように、前記生物活性剤を前記ＮＬＣ粒子と組み合わせること、
を含む、前記方法。
実施形態１０３
前記生物活性剤がＲＮＡであり、前記ＲＮＡが１または複数のＴＢ抗原をコードしている、実施形態１〜９１のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１０４
前記ＲＮＡがＲｖ３６１９、Ｒｖ２３８９、Ｒｖ３４７８、およびＲｖ１８８６から選択される１または複数のＴＢ抗原をコードしている、実施形態１０３に記載の組成物。
実施形態１０５
前記ＲＮＡがＴＢ抗原であるＲｖ３６１９、Ｒｖ２３８９、Ｒｖ３４７８、およびＲｖ１８８６をコードしている、実施形態１０４に記載の組成物。
実施形態１０６
前記生物活性剤がＲＮＡであり、前記ＲＮＡが１または複数のＴＢ抗原をコードしている、実施形態９２〜９９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態１０７
前記ＲＮＡがＲｖ３６１９、Ｒｖ２３８９、Ｒｖ３４７８、およびＲｖ１８８６から選択される１または複数のＴＢ抗原をコードしている、実施形態１０６に記載の方法。
実施形態１０８
前記ＲＮＡがＴＢ抗原であるＲｖ３６１９、Ｒｖ２３８９、Ｒｖ３４７８、およびＲｖ１８８６をコードしている、実施形態１０７に記載の方法。
実施形態１０９
前記生物活性剤がアジュバントである、実施形態１〜９１のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１１０
前記アジュバントがＴＬＲ作動薬、Ｒｉｇ−Ｉ作動薬、サポニン、糖、糖ポリマー、複合糖質、全ウイルス粒子、ウイルス様粒子、ウイルス断片、および細胞断片から選択される、実施形態１０９に記載の組成物。
実施形態１１１
前記アジュバントがＴＬＲ作動薬およびＲｉｇ−Ｉ作動薬から選択される、実施形態１１０に記載の組成物。
実施形態１１２
前記ＴＬＲ作動薬がＴＬＲ２作動薬、ＴＬＲ３作動薬、ＴＬＲ４作動薬、ＴＬＲ７作動薬、ＴＬＲ８作動薬、またはＴＬＲ９作動薬である、実施形態１１１に記載の組成物。
実施形態１１３
前記ＴＬＲ作動薬がＴＬＲ３作動薬である、実施形態１１１に記載の組成物。
実施形態１１４
前記生物活性剤が二本鎖ＲＮＡ、ＲＩＢＯＸＸＯＬ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、およびＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）から選択される、実施形態１０９〜１１２のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１１５
安定なエマルジョン中にアジュバントを含む組成物であって、前記アジュバントがＴＬＲ３作動薬およびＲｉｇ−Ｉ作動薬から選択され、前記安定なエマルジョンが水中油型エマルジョンである、前記組成物。
実施形態１１６
前記エマルジョンが２〜１０％の油を含む、実施形態１１５に記載の組成物。
実施形態１１７
前記油がスクアレンである、実施形態１１５または実施形態１１６に記載の組成物。
実施形態１１８
前記水中油型エマルジョンが０．０１％〜０．１％のαトコフェロールを含む、実施形態１１５〜１１７のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１１９
αトコフェロールに対する油の比が１より大きい、実施形態１１８に記載の組成物。
実施形態１２０
前記水中油型エマルジョンが０．３〜３％の界面活性剤を含む、実施形態１１５〜１１８のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１２１
前記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノオレートまたはポロキサマー１８８（ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのコポリマー）である、実施形態１２０に記載の組成物。
実施形態１２２
前記水中油型エマルジョンが約１％のＳｐａｎ８５を含む、実施形態１１５〜１２１のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１２３
前記水中油型エマルジョンが０．５％〜５％、０．５％〜５％、０．５％〜３％、または１％〜３％の１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）を含む、実施形態１１５〜１２１のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１２４
前記水中油型エマルジョンが０．５％〜５％、０．５％〜５％、０．５％〜３％、または１％〜３％のグリセロールを含む、実施形態１１５〜１２３のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１２５
免疫応答を誘導または増強する方法であって、前記方法を必要とする対象に治療有効量の実施形態１０９〜１２４のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
実施形態１２６
前記免疫応答が、前記対象がアジュバントを単独で投与された場合の免疫応答よりも大きい、実施形態１２５に記載の方法。
実施形態１２７
前記組成物の投与が筋肉内投与、非経口投与、または皮内投与である、実施形態１２５または実施形態１２６に記載の方法。
実施形態１２８
（ａ）アジュバントと、（ｂ）水中油型エマルジョンまたはナノ粒子脂質担体（ＮＬＣ）粒子と、を含み、前記水中油型エマルジョンまたはＮＬＣ粒子がスクアレンを含む、組成物。
実施形態１２９
前記アジュバントがＴＬＲ作動薬、Ｒｉｇ−Ｉ作動薬、サポニン、糖、糖ポリマー、複合糖質、全ウイルス粒子、ウイルス様粒子、ウイルス断片、および細胞断片から選択される、実施形態１２８に記載の組成物。
実施形態１３０
前記アジュバントがＴＬＲ作動薬およびＲｉｇ−Ｉ作動薬から選択される、実施形態１２９に記載の組成物。
実施形態１３１
前記ＴＬＲ作動薬がＴＬＲ２作動薬、ＴＬＲ３作動薬、ＴＬＲ４作動薬、ＴＬＲ７作動薬、ＴＬＲ８作動薬、またはＴＬＲ９作動薬である、実施形態１３０に記載の組成物。
実施形態１３２
前記ＴＬＲ作動薬がＴＬＲ３作動薬である、実施形態１３１に記載の組成物。
実施形態１３３
前記生物活性剤が二本鎖ＲＮＡ、ＲＩＢＯＸＸＯＬ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、およびＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）から選択される、実施形態１２８〜１３２のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１３４
免疫応答を誘導または増強する方法であって、前記方法を必要とする対象に治療有効量の実施形態１２８〜１３３のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
実施形態１３５
前記免疫応答が、前記対象がアジュバントを単独で投与された場合の免疫応答よりも大きい、実施形態１３４に記載の方法。
実施形態１３６
前記組成物の投与が筋肉内投与、非経口投与、または皮内投与である、実施形態１３４または実施形態１３５に記載の方法。
【０４０７】
以下の実施例は例示であり、限定を目的とするものではない。
【実施例】
【０４０８】
実施例１：ＮＬＣ製剤の開発
乳化剤の組み合わせを用いてナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）組成物を作製し、得られた組成物の貯蔵条件（５℃）下の安定性を粒径測定で評価した。油相はスクアレンから構成させ、油性コアの液相は、非イオン性ソルビタンエステル界面活性剤である、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ（登録商標）８５）またはソルビタンモノステアレート（Ｓｐａｎ（登録商標）６０）、陽イオン性脂質であるＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、および、ＮＬＣ製剤の場合、固体脂質（トリミリスチン酸グリセリル−Ｄｙｎａｓａｎ（登録商標）１１４）から構成させた。水相は、非イオン性ペグ化界面活性剤であるＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を含有する１０ｍＭクエン酸ナトリウム三水和物緩衝液とした。
【０４０９】
各実施例で示される製剤の構成を下記の表２に示す。
【表２】
2020524143.tif 000027
【０４１０】
ＮＬＣ製剤を合成するために、まず、液相脂質、固相脂質、正に帯電した脂質、および疎水性界面活性剤をＢｌｅｎｄ  Ｖｅｓｓｅｌ内で混合し、それを超音波処理用の水浴（７０±５℃）に入れて可溶化を促進することで、油相を調製した。水相の調製では、親水性界面活性剤、好ましくはＴｗｅｅｎ８０を注射用超純水（ＷＦＩ）または緩衝水溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム三水和物など）で希釈し、その後、完全に溶解させるために撹拌した。この水性組成物は前記油相との混合前に超音波処理槽などの中で６０〜７０℃に加熱した。場合によっては、２相とも、別々に超音波処理槽の中で６０℃に加熱した。高剪断ミキサーを用いて多相混合物を高度に剪断することにより油相と水相とを混合した。高速実験室用乳化機（シルバーソン・マシンズ社（Silverson Machines, Inc.））内での混合速度を徐々に５，０００ＲＰＭにまで、最大１０，０００ＲＰＭにまで上げた後、１０分間〜１時間混合を行って、ミクロンサイズの油滴を含有する粗混合物を得た。油を均一に分散させ完全に乳化させるために、シルバーソン社製混合用プローブの位置を適宜調整した。Ｍ−１１０Ｐマイクロフルイダイザー（マイクロフルイディクス社（Microfluidics, Corp.））の中で高剪断均質化を行うことにより、粒径をさらに減少させた。この粗エマルジョンから、Ｍ−１１０Ｐ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（マイクロフルイディクス社）を用いてＮＬＣ粒子を得た。各エマルジョンは、前記マイクロフルイダイザーにおいて、４５℃、３０，０００ｐｓｉの条件で、５回ほど循環させて処理を行った。最終的なｐＨは６．５〜６．８となった。最終ＮＬＣ製剤を集めるために、得られたＮＬＣ粒子懸濁液を０．２μｍ除菌フィルター（例えば、０．２μｍポリエーテルスルホン膜シリンジ用フィルター）を用いて濾過し、これを２〜８℃で保存し、その後粒径の評価を行った。
【０４１１】
ＮＬＣ（複合体化されていないＮＬＣ）の安定性を評価するため、５℃で様々な時間貯蔵した後、動的光散乱（ＤＬＳ）を利用して、各製剤の平均流体力学的径（Ｚ平均）および多分散指数（ＰＤＩ）を測定した（表３）。
【表３】
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【０４１２】
図１Ａ〜図１Ｅは、異なる温度でインキュベートされた各製剤の、動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ、マルバーン・インスツルメント社）を利用して測定された、ｚ平均粒径の比較である。トリプリケートで製剤を水で１：１００希釈し、使い捨てポリスチレン製キュベットに入れて測定した（ＳＯＰパラメーター：材料の屈折率（ＲＩ）＝１．５９、分散剤のＲＩ（水）＝１．３３、温度（Ｔ）＝２５℃、粘度（水）＝０．８８７ｃＰ、測定角＝１７３°後方散乱、測定位置＝４．６５ｍｍ、自動減衰）。ゼータ電位の測定については、トリプリケートで製剤を１：１００希釈し、使い捨てＤＴＳ１０７０（マルバーン・インスツルメント社）折返しキャピラリーセルに添加した。以下のＳＯＰパラメーターを用いた：材料のＲＩ＝１．５９、分散剤のＲＩ（水）＝１．３３、粘度（水）＝０．８８７ｃＰ、Ｔ＝２５℃、自動減衰、および電圧選択。強度加重Ｚ平均粒径、各製剤のＰＤＩおよびゼータ電位の値、３つの測定値／レプリケート（合計９個の測定値）からの平均を表３に記載する。異なるＮ：Ｐ値での製剤化ＲＮＡ（ＮＬＣ＋ＲＮＡ複合体またはＣＮＥ＋ＲＮＡ複合体）の粒径は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ａｕｔｏ  Ｐｌａｔｅ  Ｓａｍｐｌｅｒ（ＡＰＳ、マルバーン・インスツルメント社）を用いて、３８４ウェルプレート構成のトリプリケートで測定した。異なるＮ：Ｐ値での製剤化ＲＮＡのゼータ電位は、製剤単独に対しての上記と同じ方法で、トリプリケートで測定した。ＮＬＣ結合能はゲル遅延度アッセイを用いて測定した。簡潔には、ＮＬＣおよびｒｖＲＮＡの複合体を様々なＮ：Ｐ値で作製し、１％アガロースゲル電気泳動にかけた。標準濃度を用いて、ゲル中を移動する未結合または過剰ｒｖＲＮＡを定量した。
【０４１３】
図１６Ｂは、製造時の、ＮＬＣ製剤およびＣＮＥ製剤の間の、動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて測定された粒径分布を比較している。長期のコロイド安定性は迅速な応答シナリオで貯蔵に適した製剤を開発する上での前提条件であったため、２５℃で保存された製剤の平均粒径をモニターした。ＮＬＣの粒径は少なくとも９か月間ほぼ変化せず（３％未満の変化）、それと比較してＣＮＥは３か月間の保存後に３０％、９か月間の保存後には３５０％の増加を生じた（図１６Ｃ）。疎水性ソルビタンエステル（Ｓｐａｎ）をはじめとする非イオン性界面活性剤、親水性エトキシ化ソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ）、および陽イオン性脂質のＤＯＴＡＰがコロイド安定性の保存に重要であり、それらは界面に存在するため、生物物理学的相互作用の調節において重要な役割を担っている。このことから、ｒｖＲＮＡ保護、タンパク質発現、および免疫原性の媒介における界面活性剤の役割の実験による解明を試みた。高圧マイクロフルイダイゼーション処理を利用して、物理化学的性質が異なるＮＬＣを合成した（方法を参照）。以前に公開された方法（Brito et al. Mol. Ther. 22(12):2118-29 (2014)参照）に従って社内（in-house）製造した例示的なＮＬＣ製剤およびＣＮＥ製剤の組成を、表２にまとめる。界面活性剤：油（Ｓ：Ｏ）モル比を増加させることで粒径が増加し（図３５）、これにより、ＤＬＳで測定した場合に４０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲のＺ平均粒径を有する単峰性のＮＬＣを生じさせることができた。ゼータ電位はＤＯＴＡＰの含量と相関関係にあり、０．４ｗ／ｖ％のＤＯＴＡＰを含んだ場合のおよそ＋１５ｍＶから、３．０ｗ／ｖ％のＤＯＴＡＰを含んだ場合の＋２８ｍＶに増加した。
【０４１４】
時間の関数としての粒径の発達は、コロイド安定性の情報を与える。５℃および２５℃でのインキュベーションは通例の保存条件をシミュレートしており（図１Ａおよび図１Ｂ）、３７℃は生理温度をシミュレートしており（図１Ｃ）、６０℃および８０℃は、コロイド安定性を促進して製剤間の差異化を促すために、製剤を高温ストレスに暴露している（図１Ｄおよび図１Ｅ）。当時入手可能な最新データによれば、ＮＬＣ製剤ＱＧ８０７は６０℃で少なくとも１か月間安定である。一方、陽イオン性ナノエマルジョン（ＣＮＥ）ＱＧ３８６の粒径は、６０℃でたった７日間インキュベートしただけで３倍超に増加した。６０℃における粒径データは、ＣＮＥとの比較で、ＮＬＣがコロイド安定性を有意に向上させたことを示している。図１Ｄを参照されたい。
実施例２：ＮＬＣ粒径および油：界面活性剤比の評価
【０４１５】
ＮＬＣは、液体の油および固体の脂質を含有する疎水性コアと、疎水性相（液体油および固体脂質、本明細書ではまとめて油と称する）を水相から分離する界面を構成する界面活性剤（乳化剤またはエマルジョン剤としても知られている）と、から構成される。界面活性剤はＮＬＣナノ粒子の表面上に存在するため、その含量によって利用可能な総表面積が決定される。一方、前記油は前記コア中に存在して、利用可能な総体積に主に寄与する。結果として、界面活性剤／油比が増加すると表面積（ＳＡ）／体積（Ｖ）比が増加し、すなわち、物質体積が固定されている場合、ＳＡ／Ｖ比の増加はＮＬＣ粒径の減少を意味する。後者は図２Ａ〜図２Ｂで実験的に示されており、同一の加工条件で、ただし異なる油／界面活性剤比で製造されたＮＬＣは油／界面活性剤の増加に従い粒径が増加した。粒径は油／界面活性剤と直線的な相関関係にあり（Ｒ２＝０．９７）；あるいは、粒径は界面活性剤／油比と逆相関している（Ｒ２＝０．９７）。
実施例３：Ｎ／Ｐ比の測定
【０４１６】
窒素：リン酸（Ｎ／Ｐ）比は、理論的には、ＲＮＡ−ＮＬＣ複合体の形成に利用できる陽イオン性窒素（正電荷）および陰イオン性リン酸基（負電荷）の化学量論モル比と表される。ＮＬＣに用いられる陽イオン性脂質ＤＯＴＡＰクロリド（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）は、四級トリメチルアンモニウム頭部基を含有し、ｐＨにかかわらず正電荷を持つ。それぞれのＤＯＴＡＰ分子が１個のトリメチルアンモニウム頭部基を持つため、窒素濃度（または正電荷量）はＤＯＴＡＰ濃度と本質的に等しい。一方、リボヌクレオチド一リン酸の平均分子量に対して正規化されたＲＮＡ濃度（３３９．５ｇ／ｍｏｌ）にほぼ比例して、ＲＮＡコピー中の各リボヌクレオチド一リン酸は１つのみからなる。すなわち、
【数１】
2020524143.tif 000029
式中、［ＤＯＴＡＰ］および［ＲＮＡ］は、それぞれＤＯＴＡＰのモル濃度およびＲＮＡのモル濃度である。
【０４１７】
さらに、理論Ｎ／Ｐの関数としての、ＮＬＣに結合したＲＮＡは、ゲル遅延度アッセイ（ＧＲＡ）を用いて特徴付けられる。２０μｇ／ｍＬのＲＮＡを無希釈の製剤または希釈した製剤と１：１（ｖ／ｖ）で混合した。製剤の希釈倍率は１／２〜１／１６００の範囲であった。開始ＤＯＴＡＰ濃度に応じて、Ｎ／Ｐ比は、０．１２（例えば、２０μｇ／ｍＬのＲＮＡと８００倍希釈したＱＧ８０７（０．４ｗ／ｖ％のＤＯＴＡＰ）とを複合体化させた場合）から、およそ７５０（２０μｇ／ｍＬのＲＮＡと無希釈のＱＧ９４２（３ｗ／ｖ％のＤＯＴＡＰ）とを複合体化させた場合）までの範囲をとった。ＲＮＡ−ＮＬＣ混合物を氷上で３０分間複合体形成させた後、１２０Ｖの１％アガロースゲル電気泳動に約１時間かけた。ＲＮＡバンドの光学的デンシトメトリー解析を実施して、Ｎ／Ｐの関数としての、ＮＬＣ製剤に結合したＲＮＡの相対量を求めた（図３Ａ）。ＱＧ８０７およびＱＧ９１１を除いて、ＮＬＣに結合したＲＮＡの割合（％）は、Ｎ／Ｐ値１未満での０％から、Ｎ／Ｐ値１超でのほぼ１００％に、急激に推移した正電荷と負電荷とが理論的には等モルであるＮ／Ｐ値１では、およそ５０％のＲＮＡがＮＬＣに結合している。このことは、ＲＮＡ−ＮＬＣ結合反応がＮ／Ｐ値１周辺で平衡状態となり、すなわち、この条件ではおよそ等量の結合ＲＮＡと未結合ＲＮＡとが存在することを示唆している。
【０４１８】
ＲＮＡ−ＮＬＣ間の結合と、送達および発現とがどのような相関関係にあるかを理解するために、ＳＥＡＰ発現レプリコンを用いたインビトロ実験を行った。ＳＥＡＰレプリコンを、ＱＧ８０７製剤、ＱＧ８４３製剤、ＱＧ９４２製剤、またはＱＧ９６３製剤と複合体形成させた。図３Ａに示されるのと同様に、各製剤のＮ／Ｐ比を変化させた。図３Ｂ〜図３Ｅの、特にＱＧ９４２、ＱＧ９６３、およびＱＧ８４３のＳＥＡＰデータは、ＲＮＡ−ＮＬＣ間結合曲線がほぼ同一であるのにもかかわらず、各製剤のピーク発現が異なることを示している。
【０４１９】
また、インビトロ実験を行い、種々の希釈度のＮＬＣｖ２を２０μｇ／ｍＬのＳＥＡＰ  ｒｖＲＮＡと複合体形成させて、一連のＮ：Ｐモル比を得た。これらのＲＮＡ／製剤複合体の物理的特性および生物学的特性を、インビトロＳＥＡＰ発現、粒径、ゼータ電位、およびＲＮＡ結合の測定により決定した（図２２Ａ〜図２２Ｄ）。ＲＮＡ結合が最大となり、ゼータ電位が一定の陽電位となり、粒径の増加が最少となることに相当する、最適なＳＥＡＰ発現レベルが得られる、Ｎ：Ｐ比が存在することを、結果は示している。同一製剤で、抗原発現と免疫原性に相関関係があることを考慮して（Pepini et al., J. Immunol. 1601877 (2017)参照）、ピークＳＥＡＰ発現に相当するＮ：Ｐ比（図２２の灰色で塗りつぶされた領域）では、同様の中和抗体価を期待できるという仮説を立てた。
【０４２０】
タンパク質発現、反応源性、および免疫原性の面から、インビボにおいてＮＬＣｖ２を特徴付けするため、５．８Ｌｏｇ１０  ＲＬＵ以上（１００、３７、１５、５．６）のインビトロＳＥＡＰ活性と相関しているものを含む、４〜５のＮ：Ｐ比と、仮定の最適ゾーンの外側のＮ：Ｐ比３を試験することにした。タンパク質発現の特徴付けのために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、各Ｎ：Ｐ比の、１０００ｎｇ用量、１００ｎｇ用量、および１０ｎｇ用量のＳＥＡＰ  ｒｖＲＮＡを筋肉内注射した。また、反応源性の特徴付けのため、各Ｎ：ＰでＮＬＣｖ２と複合体形成したｒｖＲＮＡを５０μｇ、モルモットに皮内経路で注射し、発赤直径を測定した。注射の２４時間後、マウスは採血して血清ＳＥＡＰ活性を測定し、モルモットは注射部位を測定した（図２２Ｅ〜図２２Ｈ）。免疫原性の特徴付けのため、ＺＩＫＶ  ｒｖＲＮＡを各Ｎ：ＰでＮＬＣｖ２と複合体形成させ、１０００ｎｇまたは１００ｎｇをマウスに筋肉内経路で送達した。その後、１４日後にマウスから採血し、中和抗体価を定量した（図２２Ｆおよび図２２Ｇ）。
【０４２１】
インビボでのＳＥＡＰ発現から始まり、最適なＮ：Ｐ比は用量に依存しており、最適Ｎ：Ｐは１０００ｎｇ用量では１５、１００ｎｇ用量では３７、１０ｎｇ用量では１００であった（図２２Ｅ）。予想通り、免疫原性は比較された２つの用量においてＳＥＡＰ発現と相関しているように思われた（図２２Ｆおよび図２２Ｇ）。１０００ｎｇ用量では、試験されたいずれのＮ：Ｐ比でも中和抗体価に有意差は検出されず、それらのＮ：Ｐ比でのＳＥＡＰ活性と同様であった（図２２Ｆ）。１００ｎｇ用量では、Ｎ：Ｐ比３７と１５との間での中和抗体価における有意差と、ＳＥＡＰ活性の有意ではないが僅かな差異とが認められたが、Ｎ：Ｐ比１５と５．６との間ではＳＥＡＰ活性と同様に有意な力価減少が生じた（図２２Ｇ）。反応源性に関しては、Ｎ：Ｐ比を３７から１５に１／２．５倍に減少させた場合、発赤直径の有意な減少が認められた（図２２Ｈ）。重要なこととして、これらのデータは、Ｎ：Ｐを３７から１５に１／２．５倍に減少させても、反応源性は有意に減少するが、とりわけ高用量ｒｖＲＮＡにおいて、抗原発現レベルとその後の免疫原性への影響は最小限となることを示唆している。実際に、Ｎ：Ｐ値１５および３７では、１０００ｎｇ用量と１００ｎｇ用量との間でＳＥＡＰ活性に有意差は無かったことから、用量節約効果が認められた（図２２Ｅ）。用量間のＳＥＡＰ活性の最も大きな差異は低Ｎ：Ｐ比において認められた（図２２Ｅ）。
【０４２２】
理論上のＲＮＡ／粒子比によりＲＮＡ−製剤複合体の物理的状態を予測できるかどうかを評価するために、固定量（１μｇ）のモデル１０ｋｂＲＮＡと様々な量で混合された、３種類の製剤、ＱＧ７５２、ＱＧ７６８、およびＱＧ３８６、の流体力学的径（ｚ平均；ｎｍ）を、比較した。流体力学的径は、全ての製剤において、製剤希釈度の増加に従って釣鐘曲線形に近いプロファイルを示し、すなわち、Ｎ／Ｐが減少（図４Ａ）するか、ＲＮＡ／粒子が増加（図４Ｂ）するか、あるいはＤＯＴＡＰ／ＲＮＡが減少（図４Ｃ）した。全製剤のＤＯＴＡＰの含量が同量（０．４ｗ／ｖ％）であるにもかかわらず、粒径のピーク（ＲＮＡと架橋結合したＮＬＣ粒子のクラスター化を示している可能性がある）は、異なるＮ／Ｐ比（図４Ａ）に、すなわち、ＱＧ７６８およびＱＧ３８６（４０倍製剤希釈または０．０１ｗ／ｖ％のＤＯＴＡＰ）では約３、ＱＧ７５２（１００倍製剤希釈または０．００４ｗ／ｖ％のＤＯＴＡＰ）では約１に、認められる。しかしこの相違は、開始粒径の差を考慮しＲＮＡ／粒子比の関数としてＺ平均をプロットする（図４Ｂ）ことで解消され、この場合、ピーク粒径は全製剤において１個のＮＬＣ粒子当たりおよそ１〜２コピーのＲＮＡのときに認められる。ＱＧ７５２は開始平均粒径（７５ｎｍ）がＱＧ３８６およびＱＧ７６８のいずれ（約１００ｎｍ）よりも小さいため、表面積／体積比がより高くなり、ＱＧ３８６およびＱＧ７６８と同様のＲＮＡ／粒子比を得るのにより多くの希釈（より低いＮ／Ｐ）が必要となる。通常、化学組成が一定に保たれる場合、粒径の減少は表面積／体積比を増加させ、結果として粒子濃度を増加させることとなる。この粒子濃度増加の原理は算術的には以下のようにまとめられる：製剤Ａおよび製剤Ｂが同じ化学組成および球形を共有しているが、異なる直径ｄＡおよび直径ｄＢをそれぞれ有し、ｄＡ＞ｄＢである場合、製剤Ｂは製剤Ａよりも（ｄＡ／ｄＢ）３倍大きな粒子濃度を有する。
【０４２３】
さらに、このＲＮＡ製剤粒径データは、ゲル遅延度アッセイ（ＧＲＡ）で測定される製剤のＲＮＡ結合能と相関している。ＧＲＡは、ある印加電圧下でゲルを分離した場合に、未結合すなわち遊離状態のＲＮＡの移動が、対照である非製剤化ＲＮＡすなわちＲＮＡ単独と一致するという原則に基づいており、すなわち、ＧＲＡでは、標準的なゲル電気泳動条件における、製剤のＲＮＡに対する結合能および固定化能が評価される。ＧＲＡでは、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）で染色される一体型のプレキャスト１．２％アガロースゲル中で泳動が行われる（Ｅ−ｇｅｌ（登録商標）、１．２％汎用アガロース、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社）。ＲＮＡをＮＬＣ製剤ＱＧ７６８と複合体形成させた場合、２．３よりも高い全てのＮ／Ｐ比で固定化を維持したが、これは図４Ａの上向きの領域（左から右）に相当し、この領域にはＱＧ７６８のＲＮＡ製剤粒径プロファイルの最大値が含まれる。Ｎ／Ｐ比が０．９を下回るにつれ未結合ＲＮＡの量は徐々に増加し、これは図２Ａの下向きの領域（左から右）に相当する。以上から、粒径は結合能と相関しており、最小の製剤用量を用いてのＲＮＡの複合体形成および送達の最適化法として利用できる。ＲＮＡ／粒子比が免疫原性にどのような影響を与えるかを調べるために、マウス（ｎ＝５／群）に、ＱＧ７６８と様々な比で複合体形成されたＺＩＫＶ  ｒｖＲＮＡを筋肉内注射し、１４日後にＺＩＫＶ中和抗体（ＰＲＮＴ８０力価）を測定した。
実施例４：ジカワクチン候補としてのＮＬＣ製剤の評価
【０４２４】
物理的安定性を示したＮＬＣ製剤のリード候補を、ＶＥＥＶ構造遺伝子がＺＩＫＶ  ＰｒＭ−Ｅカセットと置換されているベネズエラウマ脳炎ウイルスの１つの菌株（ＶＥＥＶ、ＴＣ８３菌株）由来の合成複製ウイルスＲＮＡ（ｒｖＲＮＡ）と、組み合わせた。ＲＮＡレプリコンシステムは異種プライム・ブースト戦略を促進するために開発された。製剤化されたｒｖＲＮＡを、従来の針を用いて筋肉内経路で投与した。いくつかのＮＬＣ製剤がインビボでロバストな免疫応答を増進した。
材料および方法
細胞培養
【０４２５】
ヒトスジシマカ（A. albopictus）という蚊に由来するＣ６／３６細胞（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、メリーランド州ロックヴィル）は、１０％（Ｖ／Ｖ）熱非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、および１％（ｖ／ｖ）トリプトースリン酸ブロス（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）を含有するダルベッコ最小必須培（ＤＭＥＭ）中、２９℃、５％ＣＯ２で維持した。ベロ細胞、ＢＨＫ−２１細胞、および２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）は、１０％（Ｖ／Ｖ）熱非働化ＦＢＳ、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、およびストレプトマイシン（sreptomycin）（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。また、全細胞株に対しマイコプラズマ汚染検査を行った。
プラスミド構築物
【０４２６】
ＳＰ６プロモーターの後ろに、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）と、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）菌株ＴＣ−８３の非構造遺伝子（図２１Ａ）と、ｐＳＰ６−ＶＥＥ−Ｒｅｐ−ＧＦＰと称されるＶＥＥＶサブゲノムプロモーターの制御下にある高感度ＧＦＰと、をコードするプラスミドを、Ｓｃｏｔｔ  Ｗｅａｖｅｒ博士から提供してもらった。分泌型ヒト胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードする対照としてのレポーターｒｖＲＮＡも設計した（図２１Ｂ）。
【０４２７】
次に、標準的なクローニング技術を用いて、ＳＰ６プロモーターをＴ７プロモーターと置換し、これをｐＴ７−ＶＥＥ−Ｒｅｐ−ＧＦＰと称した。フランス領ポリネシアのジカウイルス（ＺＩＫＶ）菌株であるＨ／ＰＦ／２０１３に由来するｐｒＭ遺伝子およびＥ遺伝子をコドン最適化したものをコードする断片を合成し、ｐＵＣ５７（ジェンスクリプト社）にクローニングした。Ｑ５変異導入キット（ニュー・イングランド・バイオラボ社（New England Biolabs））を用いて、コザック配列と、その後に、異型の日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）のシグナル配列（ｓｓ）を、または上流に同型のＺＩＫＶのシグナル配列（ｓｓ）を、以下のプライマーを用いて挿入した：ＪＥＶｓｓ−ＦＷＤ（ｇｃｔｇｇｃｃｔｃｃｃｔｇｇｃｔｇｔｇｇｔｃａｔｔｇｃｃｔｇｃｇｃｔｇｇａｇｃａＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＧ；配列番号１３）、およびＪＥＶｓｓ−ＲＥＶ（ｃａｃａｔｇａｔｔｇａｔｃｃｇｇｃａｃｔｃｃｔｃｔｔｇｃｃｃａｔｇｇｃｇｇｃｇｇｃＧＴＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＧＴＧ；配列番号１４）、またはＺＩＫＶｓｓ−ＦＷＤ（ｇｇａａｔｃｇｔｇｇｇｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇａｃｃａｃａｇｃａａｔｇｇｃａＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＡＧＡＧＧ；配列番号１５）、およびＺＩＫＶｓｓ−ＲＥＶ（ｃａｃｇｇａｔｇｔｇｔｃｔｇｃｔｃｃｔｃｔｃｃｇｃａｔｇｇｃｇｇｃｇｇｃＧＴＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＧＴＧ；配列番号１６）。次に、ＪＥＶｓｓまたはＺＩＫＶｓｓと、その後ろにＺＩＫＶのｐｒＭ遺伝子およびＥ遺伝子とをコードするこの複合断片を、プライマーとしてＺＩＫＶ−ｐｒＭ−Ｅ−ＦＷＤ（ＡＡＴＧＧＡＣＴＡＣｇａｃａｔａｇｔｃｇｃｃｇｃｃｇｃｃａｔｇ；配列番号１７）およびＺＩＫＶ−ｐｒＭ−Ｅ−ＲＥＶ（ＧＣＧＧＴＴＴＴＴＧＡＣＡｃｃｇｃｇｇＴＣＡＧＧＣＡＧＡＣＡＣＧＧＣＧ；配列番号１８）を用いてＰＣＲ増幅し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ酵素ミックス（クロンテック社）を用いてｐＴ７−ＶＥＥ−Ｒｅｐ−ＧＦＰのＰｆｌＦＩ部位とＳａｃＩＩ部位との間でクローニングし、ｐＴ７−ＶＥＥ−Ｒｅｐ−ＪＥＶｓｓ−ＺＩＫＶ−ｐｒＭ−ＥプラスミドまたはｐＴ７−ＶＥＥ−Ｒｅｐ−ＺＩＫＶｓｓ−ＺＩＫＶ−ｐｒＭ−Ｅプラスミドを得た。ｐＴ７−ＶＥＥ−Ｒｅｐ−ＳＥＡＰをＰＣＲ増幅で構築し、上記と同様にｐＴ７−ＶＥＥ−Ｒｅｐ−ＧＦＰのＰｆｌＦＩ部位とＳａｃＩＩ部位との間でクローニングした（図２１Ｂ）。サンガー法シーケンシングで全てのプラスミドの確認を行った。
ＲＮＡ生成
【０４２８】
Ｔｏｐ１０細胞（インビトロジェン社）における形質転換および増幅、並びにＭａｘｉ−ｐｒｅｐキット（キアゲン社）を用いた単離を行った後、プラスミドをＮｏｔＩ酵素（ニュー・イングランド・バイオラボ社）による制限酵素消化で直線化し、フェノール−クロロホルムを用いて精製した。Ｔ７  ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔキット（インビトロジェン社）を用いてＲＮＡをインビトロ転写した後、塩化リチウム沈殿し、Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｃａｐｐｉｎｇキット（ニュー・イングランド・バイオラボ社）によるキャップ形成を行った。次いで、キャップ形成された転写物を塩化リチウム沈殿し、ヌクレアーゼ非含有水に再懸濁して最終濃度１μｇ／μＬとし、アガロースゲル電気泳動による解析を行った。ＲＮＡは全て分注して−８０℃で保存した。
リボヌクレアーゼチャレンジアッセイ
【０４２９】
ＺＩＫＶ−ｒｖＲＮＡをＮＬＣｖ１およびＮＬＣｖ２と、Ｎ：Ｐ比がそれぞれ５０および１５となるように複合体形成させ、氷上に３０分間放置した。ＮＬＣｖ２複合体をヌクレアーゼ非含有水で希釈した後、１μｇのｒｖＲＮＡを２０μｇ／ｍＬで含有する複合体を５０ｎｇのＲＮａｓｅＡ（サーモサイエンティフィック社）で３０分間室温で処理し、その後、５μｇの組換えプロテイナーゼＫ（サーモサイエンティフィック社）とのインキュベーションを５５℃で１０分間行った。その後、等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）（インビトロジェン社）を用いてＲＮＡを抽出した。ボルテックス後、試料を１７，０００×ｇで１５分間遠心した。上清を回収し、グリオキサール添加色素（Glyoxal load dye）（インビトロジェン社）と１：１混合し、５０℃で１５分間加熱した。２００ｎｇに相当するＲＮＡを添加し、変性した１５０ｍＬの１％アガロースゲル上で、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｍａｘ  Ｇｌｙ泳動用緩衝液（インビトロジェン社）中、１２０Ｖで４５分間泳動した。ＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ  ＭＰイメージングシステム（バイオラド社）を用いてゲルをイメージングした。インタクトなｒｖＲＮＡバンドの強度を、リボヌクレアーゼおよびプロテアーゼＫによる処理を受けなかった複合体由来の、フェノール：クロロホルム：イソアミル抽出ＲＮＡと比較した。追加の対照として、２００ｎｇのｒｖＲＮＡ添加量で、リボヌクレアーゼおよびプロテアーゼＫによる処理を受けたｒｖＲＮＡ単独、およびその処理を受けなかったｒｖＲＮＡ単独が含まれた。
インビトロ実験用およびインビボ実験用の複合体化条件
【０４３０】
Ｎ：Ｐ最適化実験では、ＮＬＣｖ１またはＮＬＣｖ２を１０ｍＭクエン酸緩衝液で段階希釈し、ヌクレアーゼ非含有１０％スクロース溶液（生理食塩水などのイオン性薬剤を用いずに等張性を維持するため）で２０μｇ／ｍＬに希釈したｒｖＲＮＡと１：１で複合体形成させた。ｒｖＲＮＡを製剤に添加し、穏やかにピペッティングすることで、完全に混合させた。この複合体を氷上で３０分間インキュベートし、一連のＮ：Ｐモル比を得た。次に、これらの複合体を１０％スクロースでさらに希釈することで、目的の用量を得た。インビトロにおけるヒトＰＢＭＣ刺激用には、複合体化製剤は１：１２５希釈した。Ｎ：Ｐが５０のＮＬＣｖ１またはＣＮＥを用いるワクチン接種試験用には、ｒｖＲＮＡを１０％スクロースで４０μｇ／ｍＬに希釈して、製剤と１：１で複合体形成させた。Ｎ：Ｐが３７のＮＬＣｖ２を用いるモルモット試験用には、ｒｖＲＮＡを１０％スクロースで４００μｇ／ｍＬに希釈し、製剤と１：１で複合体形成させた。Ｎ：Ｐが１５のＮＬＣｖ２を用いるワクチン試験用には、ｒｖＲＮＡを１０％スクロースで１０００μｇ／ｍＬに希釈して、製剤と１：１で複合体形成させた。複合体はそのまま使用するか、目的の用量に１０％スクロースで希釈した。
ＺＩＫＶ  ＶＬＰの特徴付け
【０４３１】
ＺＩＫＶ−ｒｖＲＮＡをＮＬＣｖ１とＮ：Ｐ値５０で複合体形成させ、１００ｎｇを６ウェルプレート内のＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地中の２９３Ｔ細胞単層上で４時間インキュベートし、その後、完全培地と置換し、最後に２０時間インキュベートした。その後、上清を回収し、２０％スクロース溶液上に重ね、１００，０００×ｇ、２時間、１０℃の条件の超遠心（ＯＰＴＩＭＡ  ＭＡＸ−ＸＰ、ベックマン社、インディアナ州インディアナポリス）によりペレットを得た。次に、ペレットをＰＢＳで再懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによる解析にかけた。ＺＩＫＶタンパク質の検出と、その後のニトロセルロース膜への転写のために、抗ＺＩＫＶマウス免疫腹水（immune ascitic fluid）（ＷＲＣＥＶＡ、ＵＴＭＢ）は１：５０００希釈で使用し、二次試薬は１：４０００希釈で使用し、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（サザン・バイオテック社（Southern Biotech））を用いてタンパク質バンドを可視化した。透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）による評価では、上記の２９３Ｔ上清を１００，０００×ｇ、２時間、１０℃の条件の超遠心により２０％スクロース溶液を通して７０％スクロースクッション上にペレット化させた。中間相を回収し、１００ｋＤａ  Ａｍｉｃｏｎフィルター（ミリポア社、マサチューセッツ州ビルリカ）を通す濾過によりスクロースをＰＢＳと置換した。ＺＩＫＶ  ｐｒＭ／ＥをコードするｒｖＲＮＡが機能的でありＺＩＫＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）の分泌を誘導するかどうかを確認するため、１滴の無希釈濾液を３００メッシュのホーリーカーボングリッド上で乾燥させ、酢酸ウラニルで染色し、ウェスタンブロット（図２１Ｃ）および電子顕微鏡観察（図２１Ｄ）により、２００ｋＶ  ＦＥＩ  ＴＥＭで、ＺＩＫＶ  ＶＬＰの存在について調べた。
ＳＥＡＰアッセイ
【０４３２】
製剤化ｒｖＲＮＡからのタンパク質発現の特徴付けのため、ＳＥＡＰレポーターシステムを利用した。ＢＨＫ細胞を製剤化ＳＥＡＰ  ｒｖＲＮＡと２４時間インキュベートした後、上清を回収し、ＮｏｖａＢｒｉｇｈｔ（商標）Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ（商標）アッセイにより、製造業者の取扱説明書（サーモフィッシャー社）に従って、ＳＥＡＰ活性を測定した。図２３Ｄを参照されたい。
中和抗体価
【０４３３】
８０％プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ８０）をベロ細胞に対して前述の通りに行い（Beaty et al., Arboviruses, Diagnostic procedures for viral, rickettsial and chlamydial infections, Schmidt NJJ, Emmons RWW, Eds., Am. Public Health Assoc., Washington, DC, pp. 797-855 (1989)）、対照ウイルスとしてはＺＩＫＶ菌株ＦＳＳ１３０２５を用いた。簡潔に記載すると、ＺＩＫＶ  ＦＳＳ１３０２５のストックを約１×１０３プラーク形成単位／ミリリットル（ＰＦＵ／ｍＬ）に希釈し、その力価をベロ細胞に対するプラークアッセイにより確認した。試料を５６℃で３０分間熱非働化した後、１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで段階希釈した。全ての希釈試料を約２００ＰＦＵのＺＩＫＶの添加によりさらに２倍希釈し、混合し、３７℃で１時間インキュベートした後、６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）内の９０％コンフルエント単層ベロ細胞に導入し、３７℃で１時間インキュベートした。１％可欠アミノ酸、１％Ｌ−グルタミン、および１％ゲンタマイシンを含むＤＭＥＭ中１％アガロースをピペット操作により各ウェルに積層し、プレートを３７℃で３日間インキュベートした。その後、細胞１０％ホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレット染色後にプラークを可視化した。
【０４３４】
連続して行われる開発用の単一のＺＩＫＶ  ｒｖＲＮＡコンストラクトを選ぶために、中和抗体（ｎＡｂ）反応について、元のＺＩＫＶシグナル配列を有するＺＩＫＶ  ｐｒＭ／ＥをコードするｒｖＲＮＡと、ＪＥＶシグナル配列を有するＺＩＫＶ  ｐｒＭ／ＥをコードするｒｖＲＮＡと、を比較した。元のＺＩＫＶシグナル配列コンストラクトは１回投与後に１００％のセロコンバージョンを誘導し、２回投与後にはＪＥＶシグナル配列をコードするｒｖＲＮＡよりも有意に高い中和抗体価を誘導した（図３４Ａ〜Ｂ）。
ヒト末梢血単核球アッセイ
【０４３５】
ヒトドナーを含む試験は欧米治験審査委員会（Western Institutional Review Board）による承認を受けた。以前の記述の通りに、インフォームドコンセントを得た６人の健常ドナーから全血を採血し、ヘパリン処理し、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。Seubert et al., J Immunol. 180(8):5402-12 (2008)を参照されたい。１５０μＬ体積の無血清ＲＰＭＩ当たり１×１０６個の細胞をＵ字底ＴＣグレード９６ウェルプレートに播種し、この細胞に製剤／ｒｖＲＮＡ複合体を５０μＬの体積で添加し、３７℃でインキュベートした。２４時間後、プレートを１８００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を回収し、−２０℃で保存した。Ｍｉｐ−１β  ＥＬＩＳＡを以前の記述の通りに行った。Seubert et al., J Immunol. 180(8):5402-12 (2008)を参照されたい。
動物試験
【０４３６】
全ての動物試験は感染症研究所の施設内動物管理使用委員会（Infectious Disease Research Institute Institutional Animal Care and Use Committee）による承認を受けた。動物試験を実施した施設は国際実験動物管理公認協会（Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International）の認可を受けており、実験動物の管理と使用に関する指針（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）（国学術研究会議、２０１１年）に記載のガイドラインに従っている。標本サイズは全て、確実致死量（ＬＤ１００）チャレンジ投与後の、０．９９対０．０１の生存率（片側のフィッシャーの正確検定を用いてα＝０．０５）を想定した検出力解析に基づいて決定した。マウスは各群に無指定に盲検的に分配した。試験開始前に除外規準は設けなかった。
【０４３７】
モルモットにおける免疫原性および忍容性を評価するため、４００〜４５０ｇのハートレイ系モルモット（チャールスリバー社）に、筋肉内（IM）注射または皮内（ID）注射で、Ｎａｎｏｐａｓｓ  Ｍｉｃｒｏｎｊｅｔ６００針（ナノパス・テクノロジーズ社）を用いて、ＮＬＣとＺＩＫＶ  ｐｒＭ／ＥをコードするｒｖＲＮＡとを含有する１：１混合物を、後肢四頭筋に、総体積２５０μＬで、ワクチン接種した。２４時間後、皮内注射部位の発赤の直径を測定した。図に示される各時点で大腿静脈から採血し、低速遠心分離により血清を回収し、上記のようなＰＲＮＴ８０力価の測定まで−２０℃で保存した。
統計
【０４３８】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン７．０ｃ）およびＲＳｔｕｄｉｏ（バージョン０．９９．４９１）を用いて統計解析を行った。Ｑ−Ｑプロット解析およびボックスプロット解析による変換を行って、または行わずに、正規性および類似度に関して、データの分布および分散を評価した。テューキーの多重比較検定による１元配置分散分析および２元配置分散分析を用いた。
実施例５：全血アッセイ
【０４３９】
ヒト全血細胞を刺激してケモカインを放出させるＮＬＣ製剤の能力を評価するため、ヒト全血アッセイを実施した。８人の健常ドナーからヘパリン処理した全血を得た。表示の製剤（５％油でストック）を全血に添加した（最終的に０．４％油）。全血を３７℃−ＣＯ２で２４時間インキュベートした。血漿である上清を吸引し、βケモカインのＣＣＬ２およびＣＣＬ４、並びに好中球動員ケモカインのＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５およびＣＸＣＬ８についての評価を行った。全血の存在下でＱ３８６が不安定であることが判明し、データを取得できなかった。ヒト全血細胞は、他の試験製剤と比較して、ＱＧ７６８に応答してより高レベルのケモカインを放出した（図７Ａ〜図７Ｅ）。
実施例６：ＮＬＣ−ｒｖＲＮＡ複合体のインビトロ物理特性評価
【０４４０】
リボヌクレアーゼＡの存在下または非存在下でｒｖＲＮＡを種々の組成のＮＬＣと共にインキュベートし、変性アガロースゲル電気泳動を用いて抽出されたＲＮＡの完全性を評価した。ある特定の組成要件がＲＮＡ保護に必須であることが確認された。すなわち、Ｔｗｅｅｎ８０含量が相対的に多い（界面活性剤および陽イオン性脂質の総質量の７０％）ＮＬＣは、インビボにおいて、ｒｖＲＮＡをリボヌクレアーゼ分解から保護せず（図３６Ａ）、ｒｖＲＮＡを送達することができなかった（図３６Ｂ）。反対に、界面活性剤相のＴｗｅｅｎ８０画分が相対的に少ない（界面活性剤および陽イオン性脂質の総質量の３５％）ＮＬＣは、ｒｖＲＮＡを分解から保護した（図２Ｄ）。この結果を受けて、後の試験は、総界面活性剤画分の３５％未満のＴｗｅｅｎ８０を含有するＮＬＣ（以後、ＮＬＣｖ１と称する）を用いて行った。次に、インビトロにおけるトランスフェクションを最大にするため、窒素（Ｎ）：リン酸（Ｐ）モル比（Ｎ：Ｐ）によって測定される、複合体形成条件の最適化を試みた。ＣＮＥ製剤またはＮＬＣｖ１製剤を、一連のＮ：Ｐ値で、ＳＥＡＰをコードするｒｖＲＮＡと複合体形成させ、１００ｎｇの各ｒｖＲＮＡ複合体をＢＨＫ細胞と一晩インキュベートした。Ｎ：Ｐの関数としてのＳＥＡＰ発現について、ＮＬＣｖ１とＣＮＥとを比較した（図２Ｅ）。Ｎ：Ｐが増加するにつれてＳＥＡＰレベルの上昇が観察され、Ｎ：Ｐが５０未満の場合では、ＮＬＣｖ１よりもＣＮＥで有意に多い発現が見られた。しかし、ＣＮＥでのＳＥＡＰ発現はＮ：Ｐが約５０のときにピークとなり、Ｎ：Ｐが５０を超えると減少したが、これは、顕著な細胞剥離により明らかな細胞毒性によるものである可能性がある。興味深いことに、Ｎ：Ｐが５０のとき、ＮＬＣｖ１群におけるＳＥＡＰ発現はＣＮＥと同様であったが、その後も増加し続けた。以降のＮＬＣｖ１およびＣＮＥの比較試験では、インビトロにおいて同様のＳＥＡＰ発現レベルを示したＮ：Ｐ値５０を用いた。
実施例７：選抜された製剤のｒｖＲＮＡを送達しタンパク質発現を発生させる能力の評価
【０４４１】
データ未記載であるが、Ｔｗｅｅｎ濃度を下げることによりＱＧ７６７製剤およびＱＧ７６８製剤を改善できることが確認された。これらの製剤を用いた場合に確認された抗体価はむらがあり、数匹のマウスは非応答性であった。これらの製剤に含まれるＴｗｅｅｎを減少させると（ＱＧ８０７製剤、８０８製剤および９０６製剤に至るまで）、ＰＲＮＴ８０価が増加し、１００％のセロコンバージョンが生じた。
【０４４２】
ＮＬＣｖ１およびＮＬＣｖ２の特徴付けを行った研究では、５０超から１５への最適Ｎ：Ｐの減少が観察された（図２３Ｄ）。その減少に伴いＳ：Ｏモル比が０．１８から１．６８に増加し、これにより粒径が約１００ｎｍから約４０ｎｍに減少した（表２）。総油含量はＮＬＣｖ１とＮＬＣｖ２との間で僅かしか（約２０％）異なっていないため、理論上、球状の形態を想定した場合、およそ１／２．５倍の粒径の減少はおよそ１２倍のナノ粒子数の増加を意味する。ＮＬＣｖ２中のナノ粒子の粒径を小さくし、理論上、その粒子数を多くすることにより、表面結合型のｒｖＲＮＡコピーをより多くの細胞に分配することが可能となろう。
【０４４３】
ｒｖＲＮＡを送達する能力について各種製剤組成をインビトロで評価するため、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードするレポーターｒｖＲＮＡを作製した。ＣＮＥ、ＱＧ８０７、ＱＧ８０８、ＱＧ９０６を用いて製剤化した、または、それぞれ陰性対照および陽性対照として１０％スクロースもしくはリポフェクタミン２０００を用いて製剤化した、１０ｎｇまたは１００ｎｇのＳＥＡＰコードｒｖＲＮＡを、２９３Ｔ細胞またはＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後に上清を回収し、ＳＥＡＰ活性についてアッセイした（図８Ａ〜図８Ｂ）。ＳＥＡＰ発現に対する細胞および用量による影響は様々な製剤で観察され、２９３Ｔ細胞はトランスフェクションを介したＳＥＡＰ発現に対してより抵抗性であった。ＢＨＫ細胞では、ＱＧ８０７、ＱＧ８０８、またはＱＧ９０６を用いて製剤化された１００ｎｇのｒｖＲＮＡはＣＮＥよりも高レベルのＳＥＡＰ発現をもたらしたが、一方、低用量のＲＮＡでは、ＣＮＥ製剤およびＱＧ９０６製剤が高いＳＥＡＰ発現をもたらした。ＳＥＡＰ活性は、ＮｏｖａＢｒｉｇｈｔ（商標）Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ（商標）アッセイにより、製造業者の取扱説明書（サーモフィッシャー社）に従って測定した。
【０４４４】
次に、ＣＮＥ製剤、ＱＧ８０７製剤、ＱＧ８０８製剤、または１０％スクロース製剤のＳＥＡＰコードｒｖＲＮＡを筋肉内注射し、注射後の様々な時点で各ＳＥＡＰ発現レベルをモック注射マウスと比較することにより、インビボにおけるタンパク質発現の動態を評価した（図９）。ＣＮＥ製剤、ＱＧ８０７製剤、およびＱＧ８０８製剤のＲＮＡは長期間に亘って非常に似た発現プロファイルを示し、注射の６日後のピークでは、１０％スクロース製剤のＲＮＡよりも３３〜３６倍より高いＳＥＡＰ活性を示した。２１日目までには、全ての群のＳＥＡＰ活性はバックグラウンドレベルに戻った。
【０４４５】
最後に、各濃度のｒｖＲＮＡと製剤とを１：１で複合体化することにより、ＱＧ８０７のＲＮＡ積載量を評価した。複合体形成反応の後、製剤化ＲＮＡを最終濃度２０μｇ／ｍＬまたは２μｇ／ｍＬに希釈し、最終用量がそれぞれ１μｇおよび０．１μｇとなるように各５０μＬを筋肉内経路でＣ５７ＢＬ／６マウスに注射した。注射の３日後および８日後に血清を採取し、ＳＥＡＰ活性を評価した（図１０）。１μｇ用量においては、試験された最低ＲＮＡ濃度（４０μｇ／ｍＬ）が最も高いレベルのＳＥＡＰ活性をもたらした。注射体積の制限により、この用量では、さらに低い濃度を試験できなかった。しかし、さらに低い濃度の影響は０．１μｇ用量で確認することができた。このデータから、最適な積載量は４０〜４μｇ／ｍＬのＲＮＡであると結論付けることができる。
実施例８：製剤は送達とは無関係に免疫原性を増強するよう改変できる
【０４４６】
製剤は送達とは無関係に免疫原性を増強するよう改変することができるが、そのような増強は固体脂質の存在に依存している。高パーセントの親水性界面活性剤を含有する各種ＮＬＣで刺激後の、インビトロにおける全血ケモカイン放出アッセイから得られたデータに基づいて、低パーセントの親水性界面活性剤組成を有する、ＮＬＣ中に存在する疎水性界面活性剤の差異が、インビボにおける免疫応答の調節における差異をもたらし得るという仮説を立てた。この仮説を確認するため、高い割合の親水性界面活性剤（２％ｔｗｅｅｎ８０）を含む１種のＮＬＣ、および低い割合の親水性界面活性剤（０．５％ｔｗｅｅｎ８０）を含む３種のＮＬＣ、および異なる種類の疎水性界面活性剤（Ｓｐａｎ８５、Ｓｐａｎ８０、およびＳｐａｎ６０）を、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードするＲＮＡまたはＺＩＫＶのｐｒＭ遺伝子およびＥ遺伝子をコードするＲＮＡと複合体形成させた。その結果、コロイド安定性に対して有害な作用は確認されなかった。１００ｎｇの単回筋肉内投与をＣ５７Ｂｌ／６マウスに行って、ＣＮＥ製剤化ＲＮＡまたは非製剤化ＲＮＡと比較した（図１１Ａ）。タンパク質発現は、注射の３日後に採取された血清に対するＳＥＡＰアッセイで測定したところ、低パーセントの親水性界面活性剤（０．５％ｔｗｅｅｎ８０）を含有するＮＬＣで製剤化されたＲＮＡにおいて２５倍を超える増強が生じたが、種々の疎水性界面活性剤を含有するＮＬＣで製剤化されたＲＮＡやＣＮＥ製剤化ＲＮＡの間では血清中の発現レベルに差異は無かった（図１１Ａ）。
【０４４７】
対照的に、中和抗体応答においては、各ＮＬＣ製剤化ＲＮＡの間で有意差が認められた（図１１Ｂ）。ＱＧ７６８（２％ｔｗｅｅｎ８０含有）で製剤化されたＲＮＡを接種したマウスで確認された中和抗体応答が小さいのは、抗原の発現レベルが小さいことが原因であると考えることができるが、ＣＮＥとＱＧ９０６、ＱＧ８０８、またはＱＧ８０７との間に認められた差異は抗原発現の差異が原因ではない可能性が高い。ＱＧ９０６、ＱＧ８０８、およびＱＧ８０７は、それぞれＳｐａｎ８０、Ｓｐａｎ８５、またはＳｐａｎ６０を含有しており、疎水性界面活性剤の組成にしか差異が無いため、確認された免疫原性の差異はこの成分が原因であると考えられる。ＣＮＥは油の組成においてＮＬＣと異なり、ＣＮＥはスクアレンのみから構成され、一方ＮＬＣはスクアレンおよび固体脂質のＤｙｎａｓａｎの両方から構成されるが、ＣＮＥが、ＣＮＥと同じ疎水性界面活性剤（Ｓｐａｎ８５）を含有するＱＧ８０８と有意差が無いことは興味深いことである。ＣＮＥおよびＱＧ８０８は油組成においてのみ異なっており、ＱＧ８０８が固体脂質であるＤｙｎａｓａｎを追加で有するため、製剤化ＲＮＡの免疫原性に対するＣＮＥ中のＳｐａｎ８５のＳｐａｎ６０との置換の影響を次に調べた。Ｓｐａｎ８５またはＳｐａｎ６０を含むＣＮＥを、ＺＩＫＶのｐｒＭ遺伝子およびＥ遺伝子をコードするＲＮＡと複合体形成させ、Ｓｐａｎ８５またはＳｐａｎ６０から構成されるＮＬＣで製剤化されたＲＮＡと比較し、１００ｎｇ単回筋肉内注射でＣ５７Ｂｌ／６マウスに投与した。接種の１４日後までに、中和抗体（ｎＡｂ）価の有意な増加が、Ｓｐａｎ８５がＳｐａｎ６０と置換されたＮＬＣ間でのみ確認され、これにより、固体油成分の重要性が示された（図１１Ｃ）。異なる製剤群の間でＳＥＡＰ発現レベルは同じであったため（図１１Ａ）、中和抗体価の差異は疎水性界面活性剤の種類の違いによるものと考えられた。ＣＮＥとＮＬＣｖ１との間でタンパク質発現レベルに経時的な変化がないことを確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６に１００ｎｇの製剤化型または非製剤化型のＳＥＡＰ  ｒｖＲＮＡを接種し、注射の３日後、７日後、１４日後、２１日後、および２８日後に採取した血清におけるＳＥＡＰ活性を測定したところ（図２５）、ＣＮＥ群とＮＬＣｖ１群との間で有意差は認められなかった。
実施例９：ＮＬＣ製剤化ＲＮＡは単回投与で免疫原性および有効性を与える
【０４４８】
上記のデータに基づいて、以降の全ての実験はＱＧ８０７（Ｓｐａｎ６０）を用いて行った。ＮＬＣ製剤化ＲＮＡの単回投与により誘導される免疫応答の有効性を調べるため、マウスに１μｇのＣＮＥ製剤化ＲＮＡまたはＮＬＣ製剤化ＲＮＡを接種し、免疫原性および有効性を、１０μｇまたは１μｇの非製剤化ＲＮＡと比較した。以前の実験で確認されたように、単回接種の１４日後に、ＣＮＥ製剤化ＲＮＡ群または単独ＲＮＡ群と比較して、ＮＬＣ製剤化群において有意により高度な中和抗体応答が見られた（図２Ａ）。しかし、以前の実験で確認されたように、０．１μｇ用量と比較して、１μｇ用量は全体の中和抗体価を減少させた（図１１Ｂ）。その後、追跡実験でこれらの所見を繰り返し得た。
【０４４９】
例えば、Ｃ５７ＢＬ／６に１μｇまたは０．１μｇのＮＬＣｖ１製剤化ｒｖＲＮＡ（疎水性界面活性剤としてＳｐａｎ６０を使用）を接種し、２つの別々の実験で１０倍高用量の非製剤化型との比較を行い、一方の実験ではプライミング後の中和抗体価を評価し、もう一方の実験では２８日目にブーストワクチン接種を行った。マウスから定期的に採血し、中和抗体価をＰＲＮＴ８０で評価した（図１８Ａ〜図１８Ｂ）。両方の実験で、１４日目に中和抗体価のピークが確認され、０．１μｇ製剤化型投与は１μｇ製剤化型投与よりも有意に高い中和抗体価を有した。しかし、単回投与後の８８日目および１５６日目までに、１４日目のピーク中和抗体価と比較して、１０μｇ非製剤化群と同様に、０．１μｇ製剤化群は中和抗体価の大幅な低下を示し、一方、１μｇ製剤化群は中和抗体価の有意な変化を示さなかった（図１８Ａ）。ブースト接種後においては、０．１μｇ製剤化群では２８日目に追加免疫されても１４日目、１２６日目、および２０９日目の間で中和抗体価の有意な減衰が認められたが、一方、１μｇ製剤化群は中和抗体価の有意な変化を示さなかった（図１８Ｂ）。
【０４５０】
追加免疫後の収縮期後Ｔ細胞応答を評価するため、各ワクチン製剤を受けた各マウス群の一部をブーストし、４６日後に脾臓を摘出し、脾細胞をＺＩＫＶのｐｒＭおよびＥのＣＤ８エピトープに対応するペプチドプールで刺激した（Muthumani et al., 2016; Elong Ngono et al., 2017）（図１２Ｂ〜図１２Ｆ）。活性化型ＣＤ４Ｔ細胞については有意差は認められなかったが（図１２Ｂ、１２Ｃ）、ＮＬＣ製剤化ＲＮＡは、ＣＮＥ製剤化ＲＮＡまたは非製剤化ＲＮＡと比較して、有意に高レベルのＩＦＮγ＋Ｔ細胞およびＣＤ１０７ａ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導した（図１２Ｄ、図１２Ｅ）。ＮＬＣ製剤化ＲＮＡは、ＣＮＥ製剤化ＲＮＡと比較して、有意に高レベルのＴＮＦ−α＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導しなかったが、これらの活性化型ＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルは非製剤化ＲＮＡ群よりも有意に高かった（図１２Ｆ）。ブーストを受けなかった残りのマウスには、単回接種の３０日後にチャレンジを行った。使用したチャレンジモデルは以前に記載されたものであり（Smith et al., 2017）、これらの免疫応答性マウスのＺＩＫＶ  Ｄａｋａｒ菌株４１５２５に対する感受性を増加させるための、チャレンジの１日前並びに１日後および４日後にインターフェロンα受容体（ＩＦＮＡＲ）を遮断するモノクローナル抗体の投与を含む。
【０４５１】
最適化されたワクチンプラットフォームの免疫原性および有効性を評価するため、反応性は最小限であるが免疫原性のＮ：Ｐ比でＮＬＣｖ２をｒｖＲＮＡと複合体形成させ、それを用いて、ＮＬＣｖ２とＮ：Ｐ値１５で複合体形成された１００ｎｇ、３０ｎｇ、１０ｎｇ、および３ｎｇをＣ５７ＢＬ／６マウスに筋肉内経路で接種し（ｎ＝１４／群）、同じＮ：Ｐ値（これらの組成物にとって最適ではない）の１００ｎｇのＮＬＣｖ１製剤化ｒｖＲＮＡ（ｎ＝１４）またはＣＮＥ製剤化ｒｖＲＮＡ（ｎ＝４）を接種したマウスに対し反応を比較した。最適なＮ：Ｐ値のＮＬＣｖ１とＣＮＥとを比較している別の試験を図２８にまとめている。対照として、非製剤化型の１００ｎｇ用量および１０ｎｇ用量を、モックワクチン接種により単独投与した（ｎ＝１４／群）。単回投与の２週間後、マウスから採血してＰＲＮＴ８０で中和抗体価を定量化し、１群当たり４匹のマウスを安楽死させて脾細胞を単離し、ＺＩＫＶ  ｐｒＭ／Ｅ（３４，５０）のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対応するペプチドプールで刺激し、Ｔ細胞応答をフローサイトメトリーで測定した（図２０Ａ〜図２０Ｂ）。
【０４５２】
１００ｎｇ用量、３０ｎｇ用量、および１０ｎｇ用量を受けたＮＬＣｖ２製剤化群においてのみ、１００％のセロコンバージョンが確認され、平均ＰＲＮＴ８０力価はそれぞれ１：６０４、１：３０２、および１：１１３であった。３ｎｇ用量群では２５％のセロコンバージョンが確認され、これは最適以下のＮ：Ｐ比で製剤化された１００ｎｇ  ＮＬＣＹ群と同様であった。ＣＮＥ製剤化群はＮ：Ｐ値１５のＮＬＣｖ１よりも有意に良好な結果となり、これはより低いＮ：Ｐ比でのインビトロにおけるＳＥＡＰ発現の増強（図３Ｃ）と相関しているが、同用量、同Ｎ：Ｐ値のＮＬＣｖ２製剤化群は中和抗体価を約１３倍に増加させた（平均ＰＲＮＴ８０は、１：６０４対１：４８、ｐ＜０．０００１）。
【０４５３】
ＣＤ８＋Ｔ細胞応答に関して、１００ｎｇおよび３０ｎｇのＮＬＣｖ２製剤化型の単回投与を受けたマウスにおいて、モックワクチン接種と比較して、かなりの割合のＢ２２０ｌｏＣＤ８＋ＩＦＮγ＋Ｔ細胞が確認された。これらの応答は、Ｎ：Ｐ値５０の１μｇのＮＬＣｖ１製剤化型の２回投与と比較して有意に減少しており（図２８Ｅ）、これにより、以前に示されたように、プライム・ブースト形式が細胞免疫反応を増強可能であることが確認された。Knudsen et al., J Virol. 88(21):12438-51 (2014)を参照されたい。
【０４５４】
最後に、上記のように、残りの１０匹／群のマウスを単回投与の３０日後にチャレンジし、４日後に採血して、プラークアッセイで血液中のウイルスを定量した（図２０Ｃ）。疾患の兆候および体重減少についてマウスを毎日モニタリングした（図２０Ｄ〜図２０Ｅ）。チャレンジ前体重の２０％を超えて減量したマウス、または瀕死に見えたマウスは全て、表示の時点で安楽死させた（図２０Ｄ）。モックおよび非製剤化型１００ｎｇをワクチン接種したマウスは全て、高レベルのウイルス血症（２．６〜５．８ｌｏｇ１０  ＰＦＵ／ｍＬ）を発症したが、１０ｎｇ非製剤化群の１０匹中１匹のマウスは検出可能なウイルス血症（検出限界＝５０ＰＦＵ／ｍＬ）から保護された。ＮＬＣｖ２群では、１００ｎｇ用量、３０ｎｇ用量、および１０ｎｇ用量により検出可能なウイルス血症から１００％保護され、３ｎｇ用量では１０匹中６匹のマウスが保護された。１００ｎｇＮＬＣｖ１製剤化（最適以下のＮ：Ｐ）群では、１０匹中１匹のマウス（animal）がウイルス血症から保護されなかった。全てのＮＬＣｖ１群およびＮＬＣｖ２群が有意な体重減少および死亡から保護され、これにはＮＬＣｖ２製剤化型の３ｎｇ用量群も含まれる。非製剤化群は、チャレンジの１０日後のモックワクチン接種群における１００％の死亡と比較した場合に、それぞれ１００投与群および１０ｎｇ用量群において、チャレンジの３０日後までに、有意な体重減少を起こし、チャレンジから生存したのはたったの１０％および２０％であった。
【０４５５】
非製剤化ＲＮＡは両方の投与群で全てのマウスをウイルス血症から完全に保護することができなかったが、ＣＮＥ製剤化ＲＮＡおよびＮＬＣ製剤化ＲＮＡは共に、検出可能なウイルス血症（検出限界＝５０ＰＦＵ／ｍＬ）からの完全な保護を示した（図１２Ｇ）。生存率に関しては、全ての１μｇ用量群（非製剤化群、ＣＮＥ製剤化群、またはＮＬＣ製剤化群）が１００％のマウスを死亡から保護したが、１０μｇ非製剤化ＲＮＡをワクチン接種したマウスは８０％が生存し、それに対してモック接種群のマウスは１７％が生存した。
免疫応答性マウスにおける免疫原性
【０４５６】
免疫応答性マウスモデルにおけるタンパク質発現または免疫原性を評価するために、５匹／群の４週齢雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（チャールスリバー社）の後肢四頭筋に、総体積５０μＬのＲＮＡを含有する１：１混合物を、筋肉内（ＩＭ）製剤でワクチン接種した。様々な時点で、眼窩後（retro-orbital）経路を介して血液を採取し、低速遠心分離後に血清を回収し、上記のようなＰＲＮＴ８０力価の測定まで−２０℃で保存した。対照またはソルビタンモノエステル（例えば、Ｓｐａｎ）を含まない他の製剤を接種したマウスと比較した場合、単回筋肉内接種の後、製剤（／ＱＧ７６７および／ＱＧ７６８）を注射されたマウスが、接種の１４日後に、高力価のＺＩＫＶ中和抗体を示したことが、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ８０）による測定で分かった。
【０４５７】
実施例１０：積載量および送達を増強するためのＮＬＣのさらなる改変
【０４５８】
ＮＬＣの液体油成分であるスクアレンが、カスパーゼ依存性インフラマソーム活性化およびＩＬ１８依存性インフラマソーム活性化をはじめとする炎症経路を活性化することが、以前に示された（Desbien et al., 2015；未公開データ）。ウイルス複製はこれらのイベントにより負の影響を受けるため（Chen et al., 2015）、スクアレン含量を減少させつつ、ＮＬＣのＲＮＡ積載量を増強するためにＤＯＴＡＰ濃度を増加させることを試みた。インビボにおいてこれを試験するため、４種の追加の高ＲＮＡ積載量製剤、ＱＧ９２４、ＱＧ９２５、ＱＧ９４１、およびＱＧ９４２、を作製し、これら全てには、ＱＧ８０７のＤＯＴＡＰ濃度よりも高いが同一の高濃度のＤＯＴＡＰと、各製剤間で濃度を漸減させるスクアレンとを含有させた。次に、ＳＥＡＰを発現するレプリコンを４０μｇ／ｍＬでＱＧ８０７と複合体形成させ、１μｇ筋肉内投与後３日目に、１０倍より高いＲＮＡ濃度（４００μｇ／ｍＬ）で複合体形成され、同じく１μｇ筋肉内投与で送達されたＱＧ８０７、ＱＧ９２４、ＱＧ９２５、ＱＧ９４１、およびＱＧ９４２と、ＳＥＡＰ発現を比較した（図１３Ａ）。４０μｇ／ｍＬのＲＮＡと複合体形成されたＱＧ８０７と比較して、４００μｇ／ｍＬのＲＮＡと複合体形成されたＱＧ８０７は１μｇ用量を有効に送達することができなかったが、４０μｇ／ｍＬで複合体形成されたＱＧ８０７により送達された同じ投与群と比較して、４００μｇ／ｍＬのＲＮＡと複合体形成されたＱＧ９４２は１μｇ用量の後に同様のＳＥＡＰ発現レベルをもたらした。
【０４５９】
上記の実験では、ＮＬＣｖ１またはＣＮＥを４０μｇ／ｍＬ  ＲＮＡと１：１混合したが（Ｎ：Ｐ＝５０）、これは、１）５０μＬの注射量で１μｇのＲＮＡ投与が可能であり、且つ、２）インビトロ（図３Ｃ）およびインビボ（図２６）で最適のＳＥＡＰ発現をもたらした最低濃度であった。しかし、Ｎ：Ｐ値５０は製剤が相対的に大きく過剰であることを意味し、用量要求の増加に従って製剤関連の忍容性リスクを提起する。すなわち、エマルジョン化されたスクアレンおよびＤＯＴＡＰ（通常は陽イオン性脂質）は免疫賦活剤であり、含量が多いと炎症性・局所性の反応源性を誘導する可能性がある。Lv et al. J Control Release. 114(1):100-9 (2006); Desbien et al., Eur J Immunol. 45(2):407-17 (2015)を参照されたい。異常から、Ｎ：Ｐ値を大幅に低くして、高用量ＲＮＡを送達できるＮＬＣ製剤を設計および合成することを試みた。得られた製剤は、誘導体であるが物理化学的に異なる型のＮＬＣｖ１であり、以後はＮＬＣｖ２と称され、物理化学的性質は表２にまとめる。ＮＬＣｖ２より以前に、ＲＮＡ積載量を増加させるために高度濃縮型のＮＬＣｖ１を製造したが、いくつかは３０ｗ／ｖ％ものスクアレンおよび１．８ｗ／ｖ％ものＤｙｎａｓａｎ１１４を含有するが、Ｓ：Ｏ比は同じであった。Ｓ：Ｏ比が同じであることにより、ナノ粒子サイズと化学組成とを一定に保ったまま、ナノ粒子濃度の増加によりＲＮＡ積載量を増加できる。このアプローチにより多量のＲＮＡを積載することの実際的制限は克服されたが、過剰な製剤の使用は免れなかった。その結果、その後の型では、スクアレンおよびＤｙｎａｓａｎ１１４の含量をそれぞれ３．７５ｗ／ｖ％スクアレンおよび０．２４％Ｄｙｎａｓａｎ１１４まで低く減少させ、全体的な界面活性剤の組成（［ＤＯＴＡＰ］＋［Ｓｐａｎ６０］＋［Ｔｗｅｅｎ８０］）と比（［ＤＯＴＡＰ］：［Ｓｐａｎ６０］：［Ｔｗｅｅｎ８０］）を一定に保ったところ、ＮＬＣｖ１に対してのＮＬＣｖ２のＳ：Ｏ比が９倍（０．１８から１．６８）に効果的に増加した。興味深いことに、ＳＥＡＰ  ｒｖＲＮＡと複合体形成されたこれらの製剤のインビボにおけるスクリーニングを行ったところ、スクアレン濃度が減少するにつれてＳＥＡＰ発現が増加することが確認された（図２７）。この比較的高いＳ：Ｏ比により、ＤＬＳで測定した場合、ＮＬＣｖ２は約４０ｎｍの平均粒径を示し、ＮＬＣｖ１と比較して粒径がおよそ１／２倍であった（図２３Ａ）。ＮＬＣｖ１と同様に、ＮＬＣｖ２はｒｖＲＮＡをリボヌクレアーゼ分解から保護した（図２３Ｂ）。ＮＬＣｖ２の積載量の増加を確認するため、漸増濃度のｒｖＲＮＡをＮＬＣｖ１またはＮＬＣｖ２と複合体形成（１：１、体積比）させ、電気泳動ゲル遅延度アッセイ（図２３Ｃ）により未結合ＲＮＡを定量した。１００％のＲＮＡがＮＬＣｖ１に結合したのは１００μｇ／ｍＬに満たないｒｖＲＮＡ濃度（Ｎ：Ｐ＞２０）までであったが、ＮＬＣｖ２は最大で１０ｍｇ／ｍＬのｒｖＲＮＡ濃度まで１００％のＲＮＡ結合性を示した。
【０４６０】
スクアレン減少の細胞死に対する影響を調べるため、ＢＨＫ細胞を各高ＲＮＡ積載量製剤の１：２０希釈物と共に一晩、４時間インキュベートし、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色による細胞死の定量と、アネキシン染色による生細胞の定量とをフローサイトメトリーで行ったところ、アポトーシスは起こっていなかった（図１３Ｂ）。ＱＧ９４２処理細胞において最も多量の生細胞が確認されたが、このことは、他の全ての成分が各製剤間で同じであるが、スクアレンが最低濃度であることと相関している。
【０４６１】
インビトロにおいて最大のＳＥＡＰ発現をもたらすであろう最適Ｎ：Ｐを評価するため、上記のように、ＮＬＣｖ２をＳＥＡＰ−ｒｖＲＮＡと様々なＮ：Ｐ比で複合体形成させ、１００ｎｇ  ｒｖＲＮＡ用量をＢＨＫ細胞と共に一晩インキュベートした。ＮＬＣｖ１と比較して、ＮＬＣｖ２では最適Ｎ：Ｐの少なくとも約５倍の減少が認められ、ＮＬＣｖ１の場合の＞１００から、ＮＬＣｖ２の場合の１５〜３７に減少した（図２３Ｄ）。興味深いことに、ＮＬＣｖ２の場合の最大ＳＥＡＰ発現レベルがＮＬＣｖ１と比較して約２．５倍に増加した。結論として、ＣＮＥ（図３Ｃ）と比較して、ＮＬＣｖ２は約１／３のＮ：Ｐ値で最大ＳＥＡＰ発現をほぼ１０倍に増加させた。
【０４６２】
次に、ＱＧ９４２を、４００〜４５０ｇのハートレイ系モルモット（チャールスリバー社）を用いる免疫原性試験に移行させ、大型げっ歯類モデルにおいて抗ＺＩＫＶ中和抗体を誘導できるかどうかを確かめた。この試験では、ＱＧ９４２（ＮＬＣｖ２）に４００μｇ／ｍＬの濃度（１０倍高濃度）のＲＮＡを積載し、Ｎａｎｏｐａｓｓ  Ｍｉｃｒｏｎｊｅｔ６００針（ナノパス・テクノロジーズ社）を用いた筋肉内または皮内経路を介した５０μｇ用量、５μｇ用量、および０．５μｇ用量を、ＮＬＣとＺＩＫＶ  ｐｒＭ／ＥをコードするｒｖＲＮＡとを含有する１：１混合物を含む、４０μｇ／ｍＬのＲＮＡを積載するＱＧ８０７の、総体積２５０μＬでの、後肢四頭筋への５μｇ用量および０．５μｇ用量と、比較した。また、５０μｇの非製剤化ＲＮＡを対照として用いた。２４時間後、筋肉内／皮内注射部位の発赤の直径を測定した。図のレジェンドに示される各時点で大腿静脈から採血し、低速遠心分離により血清を回収し、上記のようなＰＲＮＴ８０力価の測定まで−２０℃で保存した。単回接種の１４日後までに、用量依存的な中和抗体応答が認められ、ＱＧ８０７では達成できなかった最高５０μｇ用量のＲＮＡを送達できたことが示された。さらに、２８日後にアッセイした場合、ＱＧ９４２またはＱＧ８０７で送達された５μｇ用量および０．５μｇ用量の間に有意差は認められなかったが、ＱＧ９４２に好ましい傾向が僅かに見られ、このことは、スクアレンが少ないほど有利になり得ることを示唆している可能性がある。用量反応性の傾向は確認されたが、筋肉内への５０μｇ、５μｇ、および０．５μｇの投与はそれぞれ１：７６１、１：４５２、および１：２２６という平均ＰＲＮＴ８０力価をもたらし、皮内投与はそれぞれ１：９０５、１：３８０、および１：２６９という平均ＰＲＮＴ８０力価をもたらし、投与間での有意差は無かった。図２３Ｅを参照されたい。興味深いことに、５μｇ  ｒｖＲＮＡ用量のＮＬＣｖ１製剤化群とＮＬＣｖ２製剤化群との間で有意差が認められ、ＮＬＣｖ２製剤化ｒｖＲＮＡは皮内投与経路または筋肉内投与経路でそれぞれ約４倍または約８倍より高い中和抗体価を誘導した。参考までに、これらのＮ：Ｐ比でのインビトロにおけるＳＥＡＰ発現は、ＮＬＣｖ１と比較して、ＮＬＣｖ２において約８．４倍増強された（図２３Ｄ）。タンパク質発現、反応源性、および免疫原性の面から、インビボにおいてＮＬＣｖ２を特徴付けするため、５．８Ｌｏｇ１０  ＲＬＵ以上（１００、３７、１５、５．６）のインビトロＳＥＡＰ活性と相関しているものを含む、４〜５のＮ：Ｐ比と、仮定の最適ゾーンの外側のＮ：Ｐ比３を試験することにした。タンパク質発現の特徴付けのために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、各Ｎ：Ｐ比の、１０００ｎｇ用量、１００ｎｇ用量、および１０ｎｇ用量のＳＥＡＰ  ｒｖＲＮＡを筋肉内注射した。また、反応源性の特徴付けのため、各Ｎ：ＰでＮＬＣｖ２と複合体形成したｒｖＲＮＡを５０μｇ、モルモットに皮内経路で注射し、発赤直径を測定した。注射の２４時間後、マウスは採血して血清ＳＥＡＰ活性を測定し、モルモットは注射部位を測定した（図２２Ｅ〜図２２Ｈ）。免疫原性の特徴付けのため、ＺＩＫＶ  ｒｖＲＮＡを各Ｎ：ＰでＮＬ��ｖ２と複合体形成させ、１０００ｎｇまたは１００ｎｇをマウスに筋肉内経路で送達した。その後、１４日後にマウスから採血し、中和抗体価を定量した（図２２Ｆ〜図２２Ｇ）。
【０４６３】
インビボでのＳＥＡＰ発現をはじめとして、最適なＮ：Ｐ比は用量に依存しており、最適Ｎ：Ｐは１０００ｎｇ用量では１５、１００ｎｇ用量では３７、１０ｎｇ用量では１００であった（図２２Ｅ）。予想通り、免疫原性は比較された２つの用量においてＳＥＡＰ発現と相関しているように思われた（図２２Ｆ〜図２２Ｇ）。１０００ｎｇ用量では、試験されたいずれのＮ：Ｐ比でも中和抗体価に有意差は検出されず、それらのＮ：Ｐ比でのＳＥＡＰ活性と同様であった（図２２Ｆ）。１００ｎｇ用量では、Ｎ：Ｐ比３７と１５との間での中和抗体価における有意差と、ＳＥＡＰ活性の有意ではないが僅かな差異とが認められたが、Ｎ：Ｐ比１５と５．６との間ではＳＥＡＰ活性と同様に有意な力価減少が生じた（図２２Ｇ）。反応源性に関しては、Ｎ：Ｐ比を３７から１５に１／２．５倍に減少させた場合、発赤直径の有意な減少が認められた（図２２Ｈ）。重要なこととして、これらのデータは、Ｎ：Ｐを３７から１５に１／２．５倍に減少させても、反応源性は有意に減少するが、とりわけ高用量ｒｖＲＮＡにおいて、抗原発現レベルとその後の免疫原性への影響は最小限となることを示唆している。実際に、Ｎ：Ｐ値１５および３７では、１０００ｎｇ用量と１００ｎｇ用量との間でＳＥＡＰ活性に有意差は無かったことから、用量節約効果が認められた（図２２Ｅ）。用量間のＳＥＡＰ活性の最も大きな差異は低Ｎ：Ｐ比において認められた（図２２Ｅ）。
実施例１１：積載量およびＲＮＡ送達
【０４６４】
注射体積５０μＬ中１０μｇのＲＮＡ（２００μｇ／ｍＬ  ＲＮＡ濃度）を送達するため、ＱＧ８０７と比較して積載量を増加させたＮＬＣを作製した。図１４は、４００μｇ／ｍＬ  ＲＮＡをＱＧ８０７と１：１（ｖ／ｖ）で複合体形成（Ｎ／Ｐ値は約４．８）させても、単独または非製剤化ＲＮＡに対し、インビボにおけるＳＥＡＰ発現が有意に向上しなかったことを示している。一方、ＱＧ８０７は、４０μｇ／ｍＬ  ＲＮＡと１：１（ｖ／ｖ）で複合体形成（Ｎ／Ｐ値は約４８）させた場合に、１μｇまたは０．１μｇＲＮＡ（-１０μｇ用量）において、良好なＳＥＡＰ発現を示している。これは、１０μｇのＲＮＡを送達するためには、ＮＬＣの積載量を増加させる必要があることを示唆していた。
【０４６５】
積載量を増加させるため、総体積を一定に保ったまま平均ＮＬＣ粒径を減少させれば、理論上は、ＮＬＣ粒子の総数が増加し、ＲＮＡ結合部位の増加に繋がるはず、という仮説を立てた。これを受けて、ＱＧ８０７と比較的類似した組成を共有しているが、ただし、１０ｍＭクエン酸を製造時に添加し、３０，０００ｐｓｉで１０回循環（対して、ＱＧ８０７の場合は３０，０００ｐｓｉで５回循環）のマイクロフルイダイザー処理により平均粒径をより小さくした、ＱＧ９１１を製造した。ＱＧ９１１の最終Ｚ平均粒径は８７ｎｍであったが、この粒径はＱＧ８０７（Ｚ平均＝１０５ｎｍ）よりも約１７％小さい。
【０４６６】
粒径をさらに減少させるため、油／界面活性剤比をＱＧ９１１の半分にしたＱＧ９１２を製造した。界面活性剤の総量に対する油の量を減少させると、ＮＬＣ粒子の表面積（ＳＡ）対体積（Ｖ）比が増加し、すなわち粒径が減少する。この原則は、油／界面活性剤比が異なるＮＬＣをマイクロフルイダイザーにおいて３０，０００ｐｓｉで１０回循環させた、図２Ａ〜図２Ｂで実験的に確かめられる。ＱＧ９１２の油／界面活性剤比を下げることにより、Ｚ平均粒径を６３ｎｍに減少させることができた。
【０４６７】
インビトロのＳＥＡＰ発現データ（データ未記載）により、ＱＧ９１１およびＱＧ９１２の両方がＱＧ８０７よりも高いＲＮＡ積載量を促したことが示され、ＱＧ９１１およびＱＧ９１２の最適ＳＥＡＰ発現は、ＱＧ８０７の４０μｇ／ｍＬに対して、約１００μｇ／ｍＬ  ＲＮＡであった。１００μｇ／ｍＬ  ＲＮＡよりも多く積載するため、総ＮＬＣ濃度を増加させて、ＱＧ９２４（Ｚ平均＝１１０．６ｎｍ）およびＱＧ９２５（Ｚ平均＝５８．６ｎｍ）を製造した。ＱＧ９２４およびＱＧ９２５は共に、それぞれＱＧ９１１およびＱＧ９１２と同じ油／界面活性剤比を共有しているが、およそ７．４倍より濃縮されている。インビトロＳＥＡＰ発現により、ＮＬＣ濃度の７．４倍の増加が、ＲＮＡ積載量のさらなる増加をもたらしたことが示され（試験Ｎ１００６−２１４）、ＱＧ９２４の最適積載量は約２００μｇ／ｍＬとなり、ＱＧ９２５は約４００μｇ／ｍＬ以上となった。ＱＧ９２５はＱＧ９２４に対して半分のスクアレンとより小さな平均粒径を有するため、スクアレン含量の減少または粒径の減少またはそれらの組み合わせが高発現を促した、という仮説を立てた。この仮説のさらなる裏付けのために、それぞれ７．５ｗ／ｖ％スクアレン（油／界面活性剤＝１．２）および３．７５ｗ／ｖ％スクアレン（油／界面活性剤＝０．６）を含むＱＧ９４１およびＱＧ９４２を製造した。ＱＧ９２４、ＱＧ９２５、ＱＧ９４１およびＱＧ９４２を用いたインビボＳＥＡＰ発現実験で、１μｇ  ＲＮＡ用量において、油／界面活性剤の減少が、発現の増加と相関していることが示された。
実施例１２：各種ＳＰＡＮを用いた全血アッセイ
【表４】
2020524143.tif 000030
【０４６８】
各製剤を洗浄用（irrigation-grade）生理食塩水で１：１０希釈した。５０μＬ×１６の各希釈物を９６ウェルＵ字底組織グレード培養プレートに入れた。８人のドナーから採血した２００μＬのヘパリン処理全血を、各製剤にデュープリケートで添加した。３７℃−ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、血漿である上清を取り出し、ＩＬ−６、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）、ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）、およびＭｉｐ−１ｂ（ＣＣＬ４）を定量した。
【０４６９】
ｓｐａｎ６０（ソルビタンモノステアレート）を含有するＮＬＣ製剤ＱＧ８６３は、ＱＧ９８３（Ｓｐａｎ６５を含有するＮＬＣ）およびＱＧ９８７（Ｓｐａｎ６５を含有するＣＮＥ）を除く全ての群より有意に高いケモカイン値を誘導する（ｐ＜０．０００１；一元配置分散分析およびテューキーの多重比較検定）。Ｓｐａｎ６５はソルビタントリステアレートであり、Ｓｐａｎ６０のトリアシル化型である。これらの結果は、複数のケモカインの放出促進には、ＮＬＣ組成物において、完全飽和Ｃ１８アシル鎖（ステアリン酸基）を含有するソルビタンエステルが最も好ましく、特にモノアシル化型（Ｓｐａｎ６０）が好ましいこと示差している（図１５Ａ〜図１５Ｄ参照）。
実施例１３：単回接種の評価
【０４７０】
ＺＩＫＶ  ＰｒＭ−Ｅを発現するＶＥＥＶレプリコンＲＮＡをＱＧ８０７で製剤化し（１：１混合物、ＲＮＡ濃度４００ｎｇ／μＬ）、それを用いて、筋肉内経路でＣ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝５／群）を免疫した（５０μＬ  製剤化ＲＮＡ／注射／マウス）。表示の注射後時点で血清を回収し、ＰＲＮＴアッセイによりＺＩＫＶ中和力価を測定した。
【０４７１】
単回注射の後、ｒｖＲＮＡ単独（１０μｇまたは１μｇ用量）を接種した動物は、注射後１４日目にピーク力価を有し、それから力価は減少していき、８５日目には検出不可となった。対照的に、ＱＧ８０７製剤化ｒｖＲＮＡを接種した動物は、持続性の力価を有し、８５日目も測定可能であり、１μｇのｒｖＲＮＡを投与された動物の場合、１４日目に測定された力価に対して減少が見られなかった。２回のＲＮＡ注射を受けた動物においても同様のパターンが認められた。すなわち、ｒｖＲＮＡ単独（１０％スクロース中）を投与された動物は力価のブーストを示したが、４２日目にピークに達し、１２０日目までに検出不可なレベルにまで減少した。対照的に、ＱＧ８０７製剤化ｒｖＲＮＡを投与された動物は、４２日目に確認された力価に対して、持続性の力価を示した（図１８Ａ〜Ｂ）。
実施例１４：ＣＤ８  Ｔ細胞誘導
【０４７２】
マウスにＱＧ８０７製剤化ＶＥＥＶ−ＴＣ８３  ＺＩＫＶ  ＰｒＭ−Ｅ発現ＲＮＡワクチンを２回（０日目、２８日目）、筋肉内経路で接種した。ブーストの１４日後または４９日後、マウス（ｎ＝３／群）を安楽死させ、フローサイトメトリーを用いて脾細胞をＺＩＫＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞について染色した。ブーストの１４日後に、インターフェロンγ（ＩＦＮγ＋）またはＣＤ１０７ａを発現するＢ２２０ｌｏＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導が、ｒｖＲＮＡを注射した全ての動物で認められた。４９日目、ＱＧ８０７製剤化ＲＮＡを接種した動物は、ＲＮＡ単独接種と比較して、有意に高いＣＤ８＋Ｔ細胞レベルを有した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析、図１９Ａ〜図１９Ｂ）。
実施例１５：低用量ＲＮＡ保護
【０４７３】
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにＺＩＫＶ−ＰｒＭ−Ｅを発現する複製性（ｒｖＲＮＡ）を接種した。ＲＮＡは、ＱＧ９４２と組み合わせて、または１０％スクロースに含ませて、表示の用量で注射した。注射の２８日後、末梢血清をＺＩＫＶ中和抗体価についてアッセイし、脾細胞を再刺激後の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在についてアッセイした。製剤依存性の有意な力価増加を１００ｎｇ  ＲＮＡで確認することができた（一元配置分散分析）。すなわち、製剤化ＲＮＡは、同用量のＲＮＡ単独よりも有意に高い中和抗体価およびＣＤ８＋Ｔ細胞価を誘導した。モック接種対照動物に対しては、３０ｎｇのＲＮＡにおいても有意な増加を確認することができた。抗体の誘導は１０ｎｇでも認められたが、対照に対し有意ではなかった（図２０Ａ〜図２０Ｂ）。
実施例１６：抗体送達
【０４７４】
抗体のプロモーター下流配列を挿入することにより、レプリコン骨格の抗体送達用クローンを作製した。ＩｇＶＨおよびＩｇＶＬの可変領域および定常領域は、２Ａ配列または配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）で区切ることができる。抗体の重鎖および軽鎖を含有するキャッピングされたＲＮＡのトランスフェクションにより、機能的な結合抗体が得られた。ＲＮＡ用量／ウェルを１０μｇ〜１００μｇとして、これらの濃度を確認した。
【０４７５】
インビトロにおける抗体の検出後、マウスでの実験を行った。簡潔には、ＩｇＶＨ遺伝子およびＩｇＶＬ遺伝子がＩＲＥＳで区切られた抗体コンストラクトをＱＧ９４２とＮ：Ｐ比１５で複合体形成させた。用量５μｇまたは５０μｇを総体積１００μＬ（５０μＬ／脚）の筋肉内注射で注入した。注射の７日後に血清を回収し、定量的ＥＬＩＳＡを用いて抗原特異的抗体の定量を行った。５０μｇのＱＧ９４２製剤化ｒｖＲＮＡの注射は５μｇの単独ＲＮＡの注射よりも大きな抗体価をもたらした。
実施例１７：中和抗体およびＣＤ４＋Ｔ細胞誘導
【０４７６】
ヒト型結核菌（ｍｔｂ）Ｈ３７Ｒｖの低用量エアロゾルを与えられたマウスにおいて、原型のＮＬＣ製剤であるＱＧ８０７と組み合わせたＩＤ９１レプリコン（図２９）を、ＩＤ９１＋ＧＬＡ−ＳＥサブユニットワクチンと比較した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの各コホート（ｎ＝３／群）に、０．５μｇのＩＤ９１タンパク質および５μｇのＧＬＡ−ＳＥから構成されるワクチン、または１μｇのアルファウイルス骨格ＩＤ９１−ＲＮＡおよびＱＧ８０７から構成されるワクチンを、３週間間隔で２回（プライミング／ブースト）筋肉内に接種した。最後の接種の２週間後に脾細胞を単離し、インビトロにおいて、１枚の完全な９６ウェルプレートに対し、培地のみ、ＩＤ９１完全タンパク質、１０種の異なるＩＤ９１ペプチドがプールされたＩＤ９１重複ペプチドのうちの１種、またはＰ＋Ｉ（合計＝１６）を用いて、６時間の再刺激を行った。以下の表４を参照されたい。その後、ＩＣＳを実施した。
【表５】
2020524143.tif 000031
【０４７７】
ｒｖＲＮＡ型ＩＤ９１ワクチンを接種したマウスおよびタンパク質型ＩＤ９１ワクチンを接種したマウスは、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導した（図３０Ａ〜図３０Ｂ、図３１Ａ〜図３１Ｄ、および図３２Ａ〜図３２Ｄ）。ＩＤ９１タンパク質／ＧＬＡ−ＳＥアジュバントの接種かＩＤ９１  ｒｖＲＮＡの接種かに依存して、示差的な主要ＩＤ９１エピトープの認識によるロバストな抗原発現が示された（同上）。ＩＤ９１タンパク質／ＧＬＡ−ＳＥワクチンについては、ＣＤ４エピトープおよびＣＤ８エピトープの両方が同定された。ＩＤ９１タンパク質／ＧＬＡ−ＳＥを接種したＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ペプチドプール＃２、＃４、＃１０、＃１２、および＃１３は、良好な増殖性且つサイトカイン産生性のＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導した。一方、ＩＤ９１タンパク質／ＧＬＡ−ＳＥを接種したＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ペプチドプール＃３、＃４、＃１０、＃１１、および＃１２は、良好な増殖性且つサイトカイン産生性のＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導した。ＩＤ９１サブユニットのＲｖ３４７８はＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞の両方の主要エピトープを含有し得る。ＩＤ９１  ＲＮＡ＋ＱＧ８０７ワクチンは、ＣＤ４エピトープではなく、ＣＤ８エピトープを主に生じた。ＩＤ９１ＲＮＡ＋ＱＧ８０７を接種したＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ペプチドプール＃８、＃９、＃１０、＃１２、および＃１３は、良好な増殖性且つサイトカイン産生性のＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導した。ＩＤ９１サブユニットＲｖ１８８６がＣＤ８＋Ｔ細胞のほとんどの主要エピトープを含有している。
【０４７８】
表５は、８アミノ酸配列が重複している１５塩基長のＩＤ９１のエピトープマッピングを示している（それぞれ、配列番号１９〜１３３のエピトープ）。
【表６】
2020524143.tif 000032
【０４７９】
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスのコホート（ｎ＝４／群）に、生理食塩水、ＩＤ９１＋ＧＬＡ−ＳＥ、またはＩＤ９１−ＲＮＡワクチンを、筋肉内経路で１回接種し、３週間後、Ｔ細胞表現型の評価のために脾臓を摘出した。結果を、ＩＦＮｇ、ＩＬ−２、およびＴＮＦを発現する、ＣＤ４＋／ＣＤ４４＋Ｔ細胞の割合、またはＣＤ８＋Ｔ細胞の割合として表す（図３３Ａ）。２元配置分散分析を用いて統計的有意性（ｐ＜０．０５）を解析し、アステリスクで示した。１回の接種の後、ＩＤ９１＋ＧＬＡ−ＳＥ（タンパク質）ワクチンはＩＦＮα、ＴＮＦおよびＩＬ−２の誘導を特徴とするＴＨ１  ＣＤ４  Ｔ細胞応答を誘導し、一方、ＩＤ９１−ＲＮＡワクチンは顕著なＣＤ４＋  ＩＬ−２応答を誘導することができた。どちらのワクチンも、本実験における１回の接種後に有意なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を発生させなかった。
【０４８０】
Ｍｔｂ  Ｈ３７Ｒｖに対する効力もインビボにおいて示された。雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスのコホート（ｎ＝７／群）に、１μｇのＩＤ９１＋ＧＬＡ−ＳＥ、アルファウイルス骨格のＩＤ９１−ＲＮＡコンストラクト、または生理食塩水を、１回接種し、３週間後、Ｍｔｂ  Ｈ３７Ｒｖでチャレンジした。Ｍｔｂ  Ｈ３７Ｒｖチャレンジの３週間後に肺ホモジネートから細菌負荷（bacterial burden）を評価した（図３３Ｂ）。結果は、チャレンジの３週間後のマウスの肺内のＬｏｇ１０細菌数（コロニー形成単位；ＣＦＵ）として表す。生理食塩水と比較した場合の有意性（ｐ＜０．０５）を一元配置分散分析およびダネットの多重比較検定により解析し、アステリスクにより示した。ＩＤ９１＋ＧＬＡ−ＳＥワクチンおよびＩＤ９１−ＲＮＡワクチンの両方が、１回接種後に、Ｍｔｂ  Ｈ３７Ｒｖ感染に対して有効であることが、感染の３週間後の肺内細菌量の減少測定により分かった。
実施例１８：インビトロにおける核酸受容体のＮＬＣ製剤化リガンドによる刺激
【０４８１】
ウイルス遺伝物質を模倣するように操作された核酸作動薬は強力な自然免疫刺激物質であり、がんおよび感染症に対してＴＨ１型の適応免疫応答を駆動し得る。Temizoz et al., Curr Opin Pharmacol 41:104-113 (2018); Iurescia et al., Front Immunol 9:711 (2018); Reed et al., Nat Med 19(12):1597-608 (2013)を参照されたい。構造および場所に依存して、核酸作動薬はエンドソーム性（ＴＬＲ３、ＴＬＲ７／８、ＴＬＲ９）または細胞質性（ＲＬＲ、ＳＴＩＮＧ−Ｉ）のセンサーと結合し、インターフェロンおよび他の走化性サイトカインの産生を刺激する。また、ＴＬＲ３センサーおよびＲＩＧ−Ｉセンサーは、ＭＨＣ  Ｉタンパク質に対する抗原の交差提示を促し、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化し、成熟させて、抗原特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を形成させることが知られている。Jelinek et al., J Immunol 186(4):2422-9 (2011); Hochheiser et al., J Immunol 196(6):2439-43 (2016); Schmidt et al., Front Immunol 9:898 (2018)を参照されたい。ここでは、ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）で製剤化されたＴＬＲ３作動薬（ｄｓＲＮＡ）およびＲＩＧ−Ｉ作動薬（５’末端に三リン酸を有するｄｓＲＮＡ）が、作動薬単独と比較して、初代ヒトＰＢＭＣ由来樹状細胞、およびｍｏｎｏ−ｍａｃ−６（ＭＭ６）細胞株の両方において、インビトロにおけるケモカイン誘導を有意に増強することを示す。
【０４８２】
材料：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）：ＨＭＷは、ＴＬＲ３経路およびＲＩＧ−Ｉ／ＭＤＡ５経路を活性化できる合成ｄｓＲＮＡ類似体であるが、インビボジェン（Invivogen）から購入した。Ｒｉｂｏｘｘｏｌは、Ｒｉｂｏｘｘ社から購入した、５０ｂｐの合成ＴＬＲ３  ｄｓＲＮＡ作動薬である。ＳＥＶＤＩ（Sendai virus defective interfering）は、５’三リン酸末端基を有するｄｓＲＮＡ  ＲＩＧ−Ｉ作動薬であるが、以前に公開されたプロトコルに従って合成した。Martinez-Gil et al., J Virol 87(3):1290-300 (2013)。ＮＬＣ製剤は、コーデン・ファーマ（Corden Pharma）製のＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、サソール社（Sasol Limited）製のＤｙｎａｓａｎ（登録商標）１１４（トリミリスチン酸グリセリル）、並びにシグマ・アルドリッチ社製のスクアレン、Ｓｐａｎ（登録商標）６０（ソルビタンモノステアレート）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（エトキシ化ソルビタンモノオレート）、およびクエン酸ナトリウム二水和物を含む市販の試薬を用いて、ＩＤＲＩによって製造した。
【０４８３】
ＮＬＣ製造法：スクアレン、固体脂質のトリミリスチン酸グリセリル（Ｄｙｎａｓａｎ（登録商標）１１４）、非イオン性界面活性剤のソルビタンモノステアレート（Ｓｐａｎ（登録商標）６０）、および陽イオン性脂質のＤＯＴＡＰからなる油相を１００ｍＬビーカーに作製し、予熱した水バッチ（water batch）で６０℃に加熱した。１０ｍＭクエン酸ナトリウム二水和物および非イオン性界面活性剤のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０からなる水相を別の１００ｍＬビーカーに作製し、６０℃に平衡させた。固体成分を完全に溶解させた後、油相に水相を加えることにより油相と水相を合わせた。この二相混合物を高速実験室用乳化機（シルバーソン・マシンズ社）で均質化して、ミクロンサイズのＮＬＣ液滴を得た。この粗ＮＬＣ混合物を、Ｍ−１１０Ｐマイクロフルイダイザー（マイクロフルイディクス社）で、３０，０００ｐｓｉで個別に１０回循環させることで、さらなる処理を行った。最終粒径は、動的光散乱（ＤＬＳ）で測定したところ、４０〜５０ｎｍ（ｚ平均粒径）であり、多分散指数（ＰＤＩ）は０．１〜０．２であった。最後に、このマイクロフルイダイザーで処理した製剤を、０．２μｍポリエーテルスルホン膜シリンジフィルターで濾過し、２〜８℃で保存した。例示的なＮＬＣ製剤（ＱＧ９４２）の物理化学的性質を表６に示す。
【表７】
2020524143.tif 000033
【０４８４】
ＰＢＭＣ−ＤＣ刺激法：様々な窒素：リン酸（Ｎ：Ｐ）比でＲＮＡアジュバントをＮＬＣと混合し、氷上で３０分間インキュベートすることにより、静電的に結合した複合体を形成させた。播種した細胞を種々のＲＮＡ用量の複合物質で刺激して、用量反応曲線を得た。図３９Ａ〜図３９Ｅでは、６人のヒトドナーから得たＰＢＭＣ−ＤＣを、ＮＬＣ製剤化型（「ＱＧ９４２製剤化」）または単独（「非製剤化」）のｐｏｌｙＩＣ：ＨＭＷ、Ｒｉｂｏｘｘｏｌ、またはＳＥＶＤＩで刺激した。製剤のみの対照は「培地対照」と標識される。３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で２４時間のインキュベートした後、市販のＥＬＩＳＡキットを用いて、上清を自然免疫マーカーの濃度について定量した。２元配置分散分析およびシダックの多重比較検定により統計解析を行った。Ｐ値：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【０４８５】
ＭＭ６細胞における製剤スクリーニング：ＲｉｂｏｘｘｏｌおよびｐＩＣ：ＨＭＷを表７の例示的な陽イオン性製剤とＮ：Ｐ値１５で複合体形成させ、ＭＭ６細胞と一晩インキュベートした後、上清を回収し、ＩＦＮα／βを定量した（図４０）。ＮＬＣ製剤化Ｒｉｂｏｘｘｏｌで刺激されたＭＭ６細胞は非刺激対照に対して２０〜３０倍大きなＩＦＮα／β分泌を誘導した。ＮＬＣ製剤化ｒｉｂｏｘｘｏｌによるＩＦＮα／β誘導の詳細な解析は、ヒートマップ（図４１）にまとめる。
【表８】
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【０４８６】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）アジュバントはＮＬＣ（ＷＧ９４２）で製剤化することにより増強される。ＳＥＡＰをコードするレプリコンＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を、ｄｓＲＮＡと共製剤化した。試験されたｄｓＲＮＡには、Ｐｏｌｙ（ＩＣ）（インビボジェン製の合成の１．５〜１．８ｋｂのｄｓＲＮＡ類似体）、Ｒｉｂｏｘｘｏｌ（Ｒｉｂｏｘｘ製の５０ｂｐの合成のｄｓＲＮＡ  、ＳＥＶＤＩ（インビトロで転写されたおよそ５５０ｂｐのセンダイウイルス由来の欠損干渉ＲＮＡ）などのＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）のリガンド、または培地対照が含まれた。タンパク質発現に対するアジュバント刺激の影響を評価した（図３５Ａ〜図３５Ｅ、および図３６Ａ〜図３６Ｄ）。
【０４８７】
ｄｓＲＮＡアジュバントは、ＨＥＫ２９３細胞においてＳＥＡＰ発現をノックダウンすることが分かった。例えば、図３７（ＳＥＡＰ＋ＴＬＲ３リガンドをコードするベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）レプリコン（ＶＥＥｒｅｐ）＋ＮＬＣ）を参照されたい。さらに、低減型（reduced）１０％血清含有培地中でインビトロでトランスフェクトされたヒトＤＣにおけるＶＥＥｒｅｐの翻訳により、ＳＥＡＰおよびＩＰ−１０の発現増加が示された（図３８Ａ〜図３８Ｂ）。
実施例１９：免疫原性応答の増強
【０４８８】
ＮＬＣの使用とは別に、またはその使用に加えて、スクアレンを含むエマルジョンなどの安定な水中油型エマルジョンを用いた製剤により、ＴＬＲ３リガンドなどのアジュバントに対する免疫原生応答も増強され得る。以下の実験では、Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）によって補助された、免疫原性応答に対する製剤の影響を調べる。Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）（ポリＩＣＬＣ）は、カルボキシメチルセルロース、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸二本鎖ＲＮＡ、およびポリ−Ｌ−リジンの合成複合体である。
【０４８９】
表８の製剤群当たり５匹のマウスを用いて、抗原特異的な抗体応答（エンドポイント力価として表される）および抗原特異的な脾臓細胞のリコール（抗原と４日間インキュベートした後にサイトカインＥＬＩＳＡを行うことにより判定）を発生させた。グルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）に関連した合成リピドＡ（ＳＬＡ）誘導体は、以前にColer et al., PloS one 6(1):e16333 (2011)に記載された。ＳＬＡを安定な水中油型エマルジョン（ＳＥ）と組み合わせて（Van Hoeven et al., PLoS One. 11(2): e0149610 (2016)を参照）、スクアレンを含有するＳＬＡ−ＳＥを形成させた。
【表９】
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【０４９０】
上記表８および下記表１０〜１３の安定なエマルジョン（ＳＥ）は、下記表９の例示的な製剤から構成され、以下の通りに作製した。ＳＥは、ジミリストイルホスファチジルコリンで乳化された代謝可能な油（スクアレン）およびポロキサマーからなる。エマルジョン滴は直径約１００ｎｍの単分散である。５×濃縮物を作製することで、接種直前のワクチン抗原との混合が可能となる。ＳＥを製造するため、油相および水相を別に作製した。油相については、０．７６ｇのジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）粉末を３．４ｇのスクアレンに添加した。ＤＭＰＣおよび油を含むビンを７０℃に加熱した超音波処理用水浴に入れ、ＤＭＰＣを油中に分散させた。水相については、リン酸一アンモニウム、リン酸二アンモニウム、ポロキサマー１８８、およびグリセロールを超純水に加え、超音波処理を行うことで、２７ｍＭリン酸アンモニウム緩衝液、２５ｍｇ／ｍＬグリセロール、および０．４ｍｇ／ｍＬポロキサマー１８８を含有するｐＨ６．２５の水相を作製した。次に、油（１０体積％）および水相（９０体積％）を合わせ、７，０００〜１０，０００ｒｐｍで１０分間の高剪断混合（３／４インチチューブラーミキシングアセンブリ―および角穴ハイシェアースクリーンミキシングヘッドを備えたシルバーソン社（Silverson）製Ｌ５Ｍ−Ａを使用）で処理して、粗エマルジョンを作製した。次に、この粗エマルジョンを３０，０００ｐｓｉで１６サイクルの高圧均質化（例えば、Ｍ−１１０Ｐ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（登録商標）処理装置を使用）で処理し、１０℃に設定した再循環冷却機で水冷した。最終製剤を、蠕動ポンプを介し一定流量で０．２μｍＰＶＤＦ膜に通して濾過し、バイアルに充填した。特徴付けには、ガスクロマトグラフィーによるスクアレンの定量化、ＨＰＬＣおよび荷電化粒子検出によるＤＭＰＣの定量化、動的光散乱による粒径の測定、ｐＨの測定、並びに、外観の評価が含まれた。全ての値が予想範囲内に含まれた。この製剤を注射用に１０％から２％に希釈した。
【表１０】
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【０４９１】
マウスに総体積０．１ｍＬの組み換えＬＥＩＳＨ−Ｆ２タンパク質＋アジュバント製剤を接種した。このマウスには注射間隔を３週間置いて皮下接種を２回行った。合計１μｇ／用量のタンパク質および１０μｇ／用量のＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）の注射を、尾の付け根に行った。接種後、血液を採取し、血清を作製し、抗原特異的抗体応答の分析を行って、接種により応答が誘導されたかどうかを判定した。接種を行ったマウスから得た血清を力価測定し、エンドポイント力価（未接種のマウスから得られた血清により決定された閾値よりも大きな最終吸光度（ＯＤ）値）を得た。特異的抗原に対する全ＩｇＧの、加えてＩｇＧ２アイソタイプおよびＩｇＧ１アイソタイプの、抗原特異的抗体応答の分析を行って、あらゆる免疫バイアスを明らかにした（ＩＦＮγがＩｇＧ２ａ／ｃ応答を刺激し、ＩＬ−４／５がＩｇＧ１応答を刺激することを考慮）（図４５）。
【０４９２】
最終接種の２１日後、動物を殺し脾臓を摘出した。単細胞懸濁液を作製し、２×１０５細胞／ウェルを１０ｍｇ／ｍＬの組換え抗原（ＬＥＩＳＨ−Ｆ２抗原）と共にインキュベートし、抗原特異的なリコール応答の評価を行った。４日後の培養上清中へのサイトカインの分泌を、サイトカインＥＬＩＳＡにより、製造業者の取扱説明書（ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社）に従って測定した。図４６Ａおよび図４７ＡのＩＬ−５を参照されたい。Ｔｈｅｌｐｅｒ１(Ｔｈ１)プロファイルはＩＦＮγ分泌を特徴とする（図４６Ｂおよび図４７Ｂ）。図４７ＣのＩＦＮγ＋ＴＮＦａ＋、図４７ＣのＣＤ１５４＋、および図４７ＥのグランザイムＢ＋も参照されたい。
【０４９３】
プライミング後、Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）単独と異なり、ＳＥまたはナノアラム（nanoalum）にＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）を含ませた混合製剤は抗原特異的抗体を誘導した。ブースト後、Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）／ＳＥは最も強い抗原特異的ＩｇＧ２ｃ応答をもたらした。さらに、ＳＥまたはナノアラムにＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）を含ませた混合製剤は抗原特異的なＩＦＮγリコール応答を誘導した。
【０４９４】
別の試験で、表１３の製剤群当たり７匹の雌マウスを用いて、抗原特異的な抗体応答（エンドポイント力価として表される）および抗原特異的な脾臓細胞のリコール（抗原と４日間インキュベートした後にサイトカインＥＬＩＳＡを行うことにより判定）を発生させたところ、同様の結果が示された（データ未記載）。
【表１１】
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【０４９５】
また、Ｃ７５ＢＬ／６マウス（５匹／群）に、総体積０．１ｍＬの、組み換えＬＥＩＳＨ−Ｆ３＋タンパク質とアジュバントとを組み合わせた製剤を接種した。マウスの首筋皮下への１回の１００μＬ注射により、表９の各種製剤の合計１ｍｇ／用量のタンパク質および５０、１０または２ｍｇ／用量のＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）を、接種した。
【表１２】
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【０４９６】
接種後、血液を採取し、血清を作製し、抗原特異的抗体応答の分析を行って、接種により応答が誘導されたかどうかを判定した。接種を行ったマウスから得た血清を力価測定し、エンドポイント力価（未接種のマウスから得られた血清により決定された閾値よりも大きな最終吸光度（ＯＤ）値）を得た。全ＩｇＧについて、ＬＥＩＳＨ−Ｆ３＋抗原に対する抗原特異的抗体応答を分析した（図４８〜図４９）。
【０４９７】
プライミング後、ＳＥまたはナノアラムにＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）を含ませた混合製剤は、Ａｇ  Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）単独よりも大きな抗原特異的抗体応答を誘導し、ＳＥにＨｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）を含ませた混合製剤は、Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）中ＡｇおよびＡｇ／Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）／ナノアラムを超えて、抗原特異的なＩＦＮｇリコール応答を増強した。また、この試験により、Ａｇ／Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）／ＳＥでのプライミングによりＣＤ８  Ｔ細胞を発生させることができること、用量節約が２５倍を超えると思われること、並びに、２μｇのＳＥ中Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）が５０μｇの非製剤化Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）よりも大きな応答を誘導すること、が示された（図４８〜図５１）。
【０４９８】
別の試験で、Ｃ７５ＢＬ／６マウスへの表１０の製剤の単回投与（プライミング）により、免疫原性応答に対する抗原ワクチン送達の影響を調べた。図５０を参照されたい。
【表１３】
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【０４９９】
別の試験で、Ｃ７５ＢＬ／６マウス（５匹／群、プライミング後の免疫応答用に５匹、ブースト後用に５匹）に表１１の製剤の１つを投与して、免疫原性応答に対する抗原ワクチン送達の影響を調べた。
【表１４】
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【０５００】
Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）のＳＥ製剤は抗原特異的なＩＦＮγ誘導において用量節約をもたらし、ＩＬ−５応答も抑制された（図５１〜図５２）。ＭＨＣクラスＩ制限ペプチド（Ｃ＋Ｂ）に対する応答は確認されなかった（図５２Ｂ）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２８−３】
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【図２８−４】
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【図２９】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図３９−３】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２−１】
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【図４２−２】
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【図４２−３】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５−１】
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【図４５−２】
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【図４６】
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【図４７−１】
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【図４７−２】
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【図４７−３】
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【図４８】
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【図４９−１】
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【図４９−２】
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【図５０−１】
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【図５０−２】
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【図５１】
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【図５２−１】
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【図５２−２】
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【図５２−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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