(57)【要約】本開示は、微生物表現型の撹乱のための株ライブラリーを開発するためにｉｎ  ｖｉｖｏトランスポゾン変異誘発を利用する、ハイスループット（ＨＴＰ）微生物ゲノム操作を対象とする。ＨＴＰ微生物ゲノム操作プラットフォームは、改善された宿主表現型をもたらす遺伝子撹乱の高速かつ効率的な同定を可能にする微生物株ライブラリーを得るために、一式のＨＴＰツールセットを利用する。例えば、本明細書に記載のＨＴＰ微生物ゲノム操作プラットフォームは、ｉｎ  ｖｉｖｏトランスポゾン変異誘発を利用して宿主微生物のゲノムを撹乱し、これにより、宿主表現型を改善するために利用され得る多様な微生物株ライブラリーの創製が可能になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のハイスループット（ＨＴＰ）方法であって、
ａ．トランスポゾン変異誘発を使用して同じ微生物株バックグラウンドを有する最初の複数の微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々の微生物株を含む最初のＨＴＰ遺伝子設計トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーを創製するステップと；
ｂ．前記所望の表現型について前記最初のＨＴＰ遺伝子設計トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの個々の株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｃ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のＨＴＰ遺伝子設計トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーを創製するステップであって、前記遺伝的バリエーションは、前記先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｄ．前記所望の表現型について前記後続のＨＴＰ遺伝子設計トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｅ．微生物が前記所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｃ）〜ｄ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＨＴＰ遺伝子設計トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の株を含む新しいＨＴＰ遺伝子設計トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
を含む、ゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項２】
前記トランスポゾン変異誘発が、トランスポサーゼ酵素およびＤＮＡペイロード配列を提供することを含む、請求項１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項３】
前記トランスポサーゼ酵素およびＤＮＡペイロード配列が、トランスポサーゼ−ＤＮＡペイロード複合体を形成する、請求項２に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項４】
前記トランスポゾン変異誘発が、前記複数の微生物のゲノムへのトランスポゾンのランダム挿入をもたらす、請求項１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項５】
前記トランスポゾン変異誘発が、機能喪失型（ＬｏＦ）表現型を引き起こす、請求項１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項６】
前記トランスポゾン変異誘発が、機能獲得型（ＧｏＦ）表現型を引き起こす、請求項１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項７】
前記トランスポゾン変異誘発が、機能獲得型（ＧｏＦ）エレメントを含有するＤＮＡペイロード配列を前記ゲノムに挿入する、請求項１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項８】
前記機能獲得型エレメントが、プロモーター、可溶性タグエレメント、および対抗選択可能マーカーからなる群から選択される、請求項７に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項９】
前記トランスポゾン変異誘発が、機能喪失型（ＬｏＦ）エレメントを含有するＤＮＡペイロード複合体を挿入する、請求項１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項１０】
前記機能喪失型エレメントが、マーカーである、請求項９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項１１】
前記トランスポゾン変異誘発が、少なくとも２つのトランスポサーゼ−ＤＮＡペイロード複合体を用いて前記複数の微生物を形質転換することを含み、前記複合体のうちの１つが、機能獲得型（ＧｏＦ）エレメントを含有し、１つが、機能喪失型（ＬｏＦ）エレメントを含有する、請求項１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項１２】
前記トランスポゾン変異誘発が、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポゾン変異誘発システムを使用する、請求項１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項１３】
前記ゲノムが、トランスポゾン変異誘発、およびＳＮＰスワップ、プロモータースワップ、Ｓｔｏｐスワップ、配列最適化、またはこれらの任意の組合せの少なくとも１つを利用することによって撹乱される、請求項１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項１４】
前記微生物が、原核生物である、請求項１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項１５】
前記微生物が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓからなる群から選択される属に由来する、請求項１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項１６】
前記微生物が、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐｉｎｏｓａである、請求項１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項１７】
前記微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、請求項１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項１８】
前記微生物が、真核生物である、請求項１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項１９】
トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ）１つまたは複数の基準微生物株の微生物細胞の集団にトランスポゾンを導入するステップと、
ｂ）ランダムに組み込まれたトランスポゾンを含む少なくとも１つの微生物株を選択することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーを創製するステップであって、前記複数の個々の株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、１つまたは複数のランダムに組み込まれたトランスポゾンを含む、ステップと
を含む、方法。
【請求項２０】
ｃ）前記トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーから、前記基準微生物株の表現型性能と比較して、測定された表現型変数の性能の増大を呈する株を選択するステップ
をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記トランスポゾンが、前記基準微生物株のゲノムへの前記トランスポゾンのｉｎ  ｖｉｖｏ転位を可能にするトランスポゾンおよびトランスポサーゼタンパク質の複合体を使用して、前記基準微生物株に導入される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記トランスポサーゼタンパク質が、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポソームシステムに由来する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記トランスポゾンが、機能喪失型（ＬｏＦ）トランスポゾンまたは機能獲得型（ＧｏＦ）トランスポゾンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記機能喪失型トランスポゾンが、マーカーを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記マーカーが、対抗選択可能マーカーである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記機能獲得型トランスポゾンが、可溶性タグ、プロモーター、または対抗選択マーカーを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記微生物株が、原核生物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記微生物株が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓからなる群から選択される属に由来する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記微生物株が、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐｉｎｏｓａである、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記微生物株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
前記微生物株が、真核生物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法であって、
ａ．トランスポゾン変異誘発によって基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の株を含む最初のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーを創製するステップであって、前記複数の個々の株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、１つまたは複数のトランスポゾンを含む、ステップと；
ｂ．参照株に対する表現型性能改善について前記最初のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと；
ｃ．前記先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の株に存在する遺伝的バリエーションからのユニークな遺伝的バリエーションの組合せをそれぞれが含む後続の複数の微生物株を提供することによって、後続のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーを創製するステップと；
ｄ．前記参照微生物株に対する表現型性能改善について前記後続のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの個々の株をスクリーニングおよび選択することによって、追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと；
ｅ．株が、前記産生微生物株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｃ）〜ｄ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、新しいトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーが創製され、前記新しいライブラリー内の各微生物株が、先行するライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せである遺伝的バリエーションを含む、ステップと
を含む、ＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
【請求項３３】
前記後続のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーが、前記最初のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの部分的コンビナトリアルライブラリーである、請求項３２に記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
【請求項３４】
前記後続のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーが、前記最初のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、請求項３２に記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
【請求項３５】
前記後続のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーが、先行するトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの部分的コンビナトリアルライブラリーである、請求項３２に記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
【請求項３６】
前記後続のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーが、先行するトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、請求項３２に記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
【請求項３７】
後続のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの微生物株の表現型性能が、前記産生微生物株の表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１０％の増加を呈するまで、ステップｃ）〜ｄ）を繰り返す、請求項３２に記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
【請求項３８】
後続のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの微生物株の表現型性能が、前記産生微生物株の表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１倍の増加を呈するまで、ステップｃ）〜ｄ）を繰り返す、請求項３２に記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
【請求項３９】
ステップｅ）の改善された表現型性能が、目的の産物の体積生産性、目的の産物の比生産性、目的の産物の収率、目的の産物の力価、目的の産物の増大したまたはより効率的な産生からなる群から選択され、前記目的の産物が、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝産物、二次細胞外代謝産物、細胞内コンポーネント分子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３２に記載の産生株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
【請求項４０】
前記トランスポゾンが、機能喪失型（ＬｏＦ）トランスポゾンまたは機能獲得型（ＧｏＦ）トランスポゾンである、請求項３２に記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
【請求項４１】
前記機能喪失型トランスポゾンが、マーカーまたは対抗選択可能マーカーを含有する、請求項４０に記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
【請求項４２】
前記機能獲得型トランスポゾンが、プロモーター、可溶性タグ、または対抗選択可能マーカーを含有する、請求項４０に記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
【請求項４３】
前記産生微生物株が、原核生物である、請求項３２に記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
【請求項４４】
前記産生微生物株が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓからなる群から選択される属に由来する、請求項３２に記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
【請求項４５】
前記産生微生物株が、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐｉｎｏｓａである、請求項３２に記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
【請求項４６】
前記産生微生物株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、請求項３２に記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
【請求項４７】
前記産生微生物株が、真核生物である、請求項３２に記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
【請求項４８】
前記マーカーが、対抗選択可能マーカーである、請求項９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年６月６日に出願された米国仮出願第６２／５１５，９６５号の優先権の利益を主張し、その内容は、その全体において参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
分野
本開示は、微生物表現型の撹乱のための株ライブラリーを開発するためにｉｎ  ｖｉｖｏトランスポゾン変異誘発を利用する、ハイスループット（ＨＴＰ）微生物ゲノム操作方法を対象とする。
【０００３】
配列表に関する陳述
本願に添付された配列表は、紙コピーの代わりにテキストフォーマットで提供されており、参照により本明細書に組み込まれている。配列表を含有するテキストファイルの名称は、ＺＹＭＲ＿０１４＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、約１４ＫＢであり、２０１８年６月６日に作成されたものであり、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【背景技術】
【０００４】
背景
人間は、目的の産物を生成するのに千年間にわたって微生物細胞の生合成経路の力を利用してきており、その最古の例としては、アルコール、酢、チーズ、およびヨーグルトがある。これらの産物は、今日でも依然として大きな需要があり、また、微生物が産生可能な産物のレパートリーが増え続けている。遺伝子操作技術の出現により、科学者は、様々な生物体中に新規生合成経路を設計およびプログラムして、広い範囲の工業、医療用、および消費者向け製品を生産することが可能になった。実際に、微生物細胞培養が、低分子、抗生物質、ワクチン、殺虫剤、酵素、燃料、および工業用化学物質におよぶ産物を生産するのに現在使用されている。最新の工業用微生物によって産生される多数の産物を考慮すると、エンジニアが、所与の微生物が標的産物を産生することができる速度および効率を改善するのに極めて大きいプレッシャーの下にあることは驚くに当たらない。
【０００５】
様々な手法が、関与する微生物を「改良する」ことによって生物学に基づく工業プロセスの経済性を改善するのに使用されてきた。例えば、多くの工業では、微生物培養の親株が化学物質またはＵＶ放射線への曝露によって連続的に変異され、生産性、収率、および力価などの性能増大について引き続いてスクリーニングされる、微生物株改良プログラムを利用する。この変異誘発プロセスは、株が産物性能の適当な増大を実証するまで広範に繰り返される。次いで後続の「改善された」株は、商業生産で利用される。
【０００６】
しかしながら、伝統的な変異誘発プロセスによる改善された工業用微生物株の同定は、時間がかかり、非効率である。このプロセスは、まさにその特質から、計画性がなく、非効率、かつ遅いものである。
【０００７】
よって、有益な変異を発見および統合するプロセスを加速する、微生物を操作する新しい方法ついての当技術分野における必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
開示の概要
本開示は、当技術分野において現在実践されている遅く非効率な方法に対する劇的な改善を提供する微生物ゲノム操作のハイスループット（ＨＴＰ）方法を提供することにより、当技術分野におけるこの必要性に対処する。
【０００９】
ＨＴＰ微生物ゲノム操作プラットフォームは、改善された宿主表現型をもたらす遺伝子撹乱の高速かつ効率的な同定を可能にする微生物株ライブラリーを得るために、一式のＨＴＰツールセットを利用する。例えば、本明細書に記載のＨＴＰ微生物ゲノム操作プラットフォームは、ｉｎ  ｖｉｖｏトランスポゾン変異誘発を利用して宿主微生物のゲノムを撹乱し、これにより、宿主表現型を改善するために利用され得る多様な微生物株ライブラリーの創製が可能になる。
【００１０】
開示されるＨＴＰゲノム操作プラットフォームは、コンピューターで駆動され、分子生物学、自動化、および高度な機械学習プロトコールを統合する。この統合プラットフォームは、一式のＨＴＰ分子ツールセットを利用して、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを生み出す。これらのライブラリーは、とりわけ、科学的洞察および反復パターン認識から得られる。
【００１１】
上記のとおり、教示されるＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、微生物において試験するための特定のゲノム変更のライブラリーを提供することによって、ゲノム操作プロセスのドライバーとして機能する。特定のライブラリーまたはライブラリーの組合せを利用して操作された微生物は、結果として生じる成果、例えば、目的の産物の産生についてＨＴＰ様式で効率的にスクリーニングされる。ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを利用して微生物において試験するための特定のゲノム変更を明らかにし、次いでこれらの変更を内包する宿主微生物ゲノムを引き続いてスクリーニングするこのプロセスは、効率的な反復様式でインプリメントされる。一部の態様では、ゲノム操作キャンペーンの反復サイクルまたは「ラウンド」は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ超の反復／サイクル／ラウンドであり得る。
【００１２】
よって、一部の態様では、本開示は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００またはそれ超の「ラウンド」のＨＴＰ遺伝子操作（例えば、ＳＮＰスワップ、ＰＲＯスワップ、ＳＴＯＰスワップ、トランスポゾン変異誘発、またはこれらの組合せのラウンド）を行う方法を教示する。
【００１３】
一部の実施形態では、本開示は、各後続のＨＴＰ遺伝子操作ラウンドが先のラウンドの遺伝子操作で同定された遺伝的バリエーションに基づく線形手法を教示する。他の実施形態では、本開示は、各後続のＨＴＰ遺伝子操作ラウンドが先に行われた分析を含む任意の先のラウンドの遺伝子操作、および別個のＨＴＰ遺伝子操作ブランチで同定された遺伝的バリエーションに基づく非線形手法を教示する。
【００１４】
これらの反復サイクルからのデータは、大規模データ分析およびパターン認識を可能にし、それは統合プラットフォームによって利用され、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリー実装の後続のラウンドを通知する。したがって、教示されるプラットフォームで利用されるＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、大規模データパターン認識アルゴリズムから利益を得、各反復ラウンドの微生物操作によってより有益となる高度に動的なツールである。
【００１５】
一部の実施形態では、本開示の遺伝子設計ライブラリーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、９５０、９７５、１０００、またはそれ超の個々の遺伝子変化（例えば、少なくともＸの数のＰＲＯスワップライブラリーまたはトランスポゾン機能獲得ライブラリーにおけるプロモーター：遺伝子組合せの）を含む。
【００１６】
一部の実施形態では、本開示は、所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のハイスループット（ＨＴＰ）方法であって、ａ）トランスポゾン変異誘発を用いて同じ微生物株バックグラウンドを有する最初の複数の微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々の微生物株を含む最初のＨＴＰ遺伝子設計トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーを生み出すステップと；ｂ）所望の表現型について最初のＨＴＰ遺伝子設計トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；ｃ）それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のＨＴＰ遺伝子設計トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーを生み出すステップであって、該遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；ｄ）所望の表現型について後続のＨＴＰ遺伝子設計トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；ｅ）微生物が所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｃ）〜ｄ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＨＴＰ遺伝子設計トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを内包する個々の微生物株を含む新しいＨＴＰ遺伝子設計トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーが創製される、ステップとを含む、方法を教示する。
【００１７】
一部の実施形態では、本開示は、それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を作製する方法であって、組み合わされた遺伝的バリエーションのそれぞれが、最初のＨＴＰ遺伝子設計トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーまたは先行するステップのＨＴＰ遺伝子設計トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーに由来する、方法を教示する。
【００１８】
一部の実施形態では、後続の複数の微生物における遺伝的バリエーションの組合せは、最初のＨＴＰ遺伝子設計トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーまたは先行するステップのＨＴＰ遺伝子設計トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーにおける遺伝的バリエーションのすべての可能な組合せのサブセットを含むことになる。
【００１９】
一部の実施形態では、本開示は、後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが、最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーまたは先行するステップのＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーにおける遺伝的バリエーションに由来する部分コンビナトリアル微生物株ライブラリーであることを教示する。
【００２０】
例えば、先のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが遺伝的バリエーションＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤのみを有している場合、前記バリエーションの部分的コンビナトリアルは、それぞれがＡＢ、ＡＣ、またはＡＤの遺伝的バリエーションのユニークな組合せのいずれかを含む３種の微生物を含む後続のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーを含むことができる（変異が表される順序は重要でない）。先行するステップのＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーの遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーは、それぞれがＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＢＣ、ＢＤ、またはＣＤの遺伝的バリエーションのユニークな組合せのいずれかを含む６種の微生物を含むはずである。
【００２１】
一部の実施形態では、本開示の方法は、ランダム変異誘発、標的とした配列挿入、標的とした配列欠失、標的とした配列置き換え、トランスポゾン変異誘発、またはこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの方法を利用してゲノムを撹乱することを教示する。
【００２２】
現在開示した方法の一部の実施形態では、最初の複数の微生物は、工業生産株微生物に由来するユニークな遺伝的バリエーションを含む。
【００２３】
現在開示した方法の一部の実施形態では、最初の複数の微生物は、Ｓ１Ｇｅｎ１で表される工業生産株微生物、およびＳｎＧｅｎｎで表されるこれらに由来する任意の数の後続の微生物世代を含む。
【００２４】
一部の実施形態では、本開示は、所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のトランスポゾン変異誘発方法であって、ａ）トランスポサーゼ酵素およびＤＮＡペイロード配列を提供するステップを含む、方法を教示する。一部の実施形態では、トランスポサーゼ酵素およびＤＮＡペイロード配列は、トランスポサーゼ−ＤＮＡペイロード複合体を形成する。一部の実施形態では、トランスポゾン変異誘発は、複数の微生物のゲノムへのトランスポゾンのランダム挿入をもたらす。一部の実施形態では、トランスポサーゼは、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポゾンシステムに由来する。一部の実施形態では、ＤＮＡペイロード配列には、トランスポサーゼによって認識され得るモザイクエレメント（ＭＥ）が隣接する。ＤＮＡペイロードの具体的な配列は、標的ゲノムへのトランスポゾン挿入の機能喪失型または機能獲得型効果に対してバイアスをかけるように変えることができる。
【００２５】
一部の実施形態では、トランスポゾン変異誘発は、機能喪失型（ＬｏＦ）または機能獲得型（ＧｏＦ）の表現型を引き起こす。一部の実施形態では、ＤＮＡペイロードは、機能喪失型（ＬｏＦ）トランスポゾン、または機能獲得型（ＧｏＦ）トランスポゾンであり得る。一部の実施形態では、ＤＮＡペイロードは、選択マーカーを含む。一部の実施形態では、選択マーカーは、抗生物質耐性である。一部の実施形態では、ＤＮＡペイロードは、対抗選択マーカーを含む。一部の実施形態では、対抗選択マーカーは、選択可能マーカーを含有するＤＮＡペイロードのループアウトを促進するために使用され、これにより、マーカーの再利用、したがって操作のさらなるラウンドが可能になる。一部の実施形態では、ＧｏＦトランスポゾンは、ＧｏＦエレメントを含む。一部の実施形態では、ＧｏＦトランスポゾンは、プロモーター配列および／または可溶性タグ配列を含む。一部の実施形態では、ＧｏＦトランスポゾンは、抗生物質マーカーおよび強いプロモーターを含む。一部の実施形態では、方法は、ｂ）トランスポサーゼおよびＤＮＡペイロード配列を組み合わせて複合体を形成するステップと、ｃ）トランスポサーゼ−ＤＮＡペイロード複合体を微生物株に形質転換し、したがって微生物株のゲノムにおけるＤＮＡペイロード配列のランダム組込みをもたらすステップとをさらに含む。一部の実施形態では、ＤＮＡペイロードのランダム組込みを含む株は、最初のトランスポゾン変異誘発ライブラリーを形成する。
【００２６】
一部の実施形態では、方法は、ｄ）所望の表現型について最初のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ｅ）それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーを創製するステップであって、遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の微生物株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ｆ）所望の表現型について後続のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、ｇ）微生物が所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｅ）〜ｆ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の微生物株を含む新しいトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーが創製される、ステップをさらに含む。
【００２７】
一部の実施形態では、本開示は、（ａ）（１）１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す入力、および（２）対応する性能尺度を含む訓練セットで設定された（populated  with）予測モデルにアクセスするステップと；（ｂ）遺伝子変化を表す予測モデルに試験入力（test  input）を適用するステップであって、試験入力は、これらの遺伝子変化を組み入れる候補微生物株に対応する、ステップと；（ｃ）予測モデルに少なくとも部分的に基づいて候補微生物株の表現型性能を予測するステップと；（ｄ）これらの予測された性能に少なくとも部分的に基づいて候補微生物株の第１のサブセットを選択するステップと；（ｅ）候補微生物株の第１のサブセットの測定された表現型性能を得るステップと；（ｆ）これらの測定された表現型性能に少なくとも部分的に基づいて候補微生物株の第２のサブセットの選択物を得るステップと；（ｇ）（２）選択された候補微生物株の第２のサブセットの対応する測定された性能とともに（１）選択された候補微生物株の第２のサブセットに対応する入力を予測モデルの訓練セットに加えるステップと；（ｈ）少なくとも１つの候補微生物株の測定された表現型性能が性能測定基準を満たすまで、（ｂ）〜（ｇ）を繰り返すステップとによって候補微生物株の設計を反復して改善することを教示する。一部の場合では、予測モデルへの試験入力の第１の適用の間に、試験入力によって表される遺伝子変化が、１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を含み、試験入力の後続の適用の間に、試験入力によって表される遺伝子変化が、候補微生物株の先に選択された第２のサブセット内の候補微生物株に対する遺伝子変化を含む。
【００２８】
一部の実施形態では、第１のサブセットの選択は、上位性効果に基づき得る。これは、第１のサブセットの第１の選択の間に、１つまたは複数のバックグラウンド微生物株に対する遺伝子変化を表す複数のそれぞれの入力の適用に応じて、１つまたは複数のバックグラウンド微生物株の性能尺度間の相違点の程度を決定するステップと、少なくとも２つの候補微生物株内に組み入れられる遺伝子変化の適用に応じて、１つまたは複数のバックグラウンド微生物株の性能尺度の相違点の程度に少なくとも部分的に基づいて、少なくとも２つの候補微生物株を第１のサブセットに含めるために選択するステップとによって達成することができる。
【００２９】
一部の実施形態では、本開示は、候補微生物株の反復改良において上位性効果を適用する方法であって、少なくとも１つの微生物バックグラウンド株に行われた対応する遺伝子変化に応じて、測定された性能を表すデータを得るステップと；少なくとも２つの遺伝子変化の対応する応答性能尺度間の相違点の程度に少なくとも部分的に基づいて、少なくとも２つの遺伝子変化の選択物を得るステップであって、相違点の程度が、少なくとも２つの遺伝子変化が異なる生物学的経路を通じたこれらの対応する応答性能尺度に影響する程度に関連する、ステップと；選択された遺伝子変化を含む微生物バックグラウンド株に対する遺伝子変化を設計するステップとを含む、方法を教示する。一部の場合では、少なくとも２つの選択された遺伝子変化が設計される微生物バックグラウンド株は、測定された応答性能を表すデータが得られた少なくとも１つの微生物バックグラウンド株と同じである。
【００３０】
一部の実施形態では、本開示は、単一タイプの遺伝子微生物ライブラリーのみを利用するＨＴＰ株改良法を教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、トランスポゾン変異誘発ライブラリーのみを利用するＨＴＰ株改良法を教示する。
【００３１】
他の実施形態では、本開示は、２つまたはそれよりも多いタイプの遺伝子微生物ライブラリーを利用するＨＴＰ株改良法を教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、ＳＮＰスワップライブラリーおよびトランスポゾン変異誘発ライブラリーを組み合わせるＨＴＰ株改良法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＰＲＯスワップライブラリーおよびトランスポゾン変異誘発ライブラリーを組み合わせるＨＴＰ株改良法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＳＴＯＰスワップライブラリーおよびトランスポゾン変異誘発ライブラリーを組み合わせるＨＴＰ株改良法を教示する。さらに他の実施形態では、本開示のＨＴＰ株改良法は、１つまたは複数の伝統的な株改良法と組み合わせることができる。
【００３２】
一部の実施形態では、本開示のＨＴＰ株改良法は、改良された宿主細胞をもたらす。すなわち、本開示は、１つまたは複数の宿主細胞性質を改善する方法を教示する。一部の実施形態では、改善される宿主細胞性質は、宿主細胞によって産生される目的の産物の体積生産性、比生産性、収率、または力価からなる群から選択される。一部の実施形態では、改善される宿主細胞性質は、体積生産性である。一部の実施形態では、改善される宿主細胞性質は、比生産性である。一部の実施形態では、改善される宿主細胞性質は、収率である。
【００３３】
一部の実施形態では、本開示のＨＴＰ株改良法は、ＨＴＰ株改良法に供されない対照宿主細胞に対して１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、またはそれ超の少なくとも１つの宿主細胞性質の改善（例えば、この間の任意の範囲および部分範囲を組み入れての、目的の生体分子の収率または生産性のＸ％の改善）を呈する宿主細胞をもたらす。一部の実施形態では、本開示のＨＴＰ株改良法は、ＳＮＰスワップ、ＰＲＯスワップ、ＳＴＯＰスワップ、トランスポゾン変異誘発、およびこれらの組合せからなる群から選択される。
【００３４】
一部の実施形態では、本開示のトランスポゾン変異誘発方法は、トランスポゾン変異誘発方法に供されない対照宿主細胞に対して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、またはそれ超の少なくとも１つの宿主細胞性質の改善（例えば、この間の任意の範囲および部分範囲を組み入れての、目的の生体分子の収率または生産性のＸ％の改善）を呈する宿主細胞をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、多様性プール中のバリエーションを増加させるための本開示のＤＮＡ組換えの方法を示す。物理的または酵素的／化学的な手段により、ＤＮＡ切片、例えば、関連のある種からのゲノム領域を切断することができる。切断したＤＮＡ領域を融解し、再アニールさせ、その結果、オーバーラップする遺伝子領域が、ポリメラーゼ伸長反応を開始する。産物が１つまたは複数の出発配列に由来するエレメントを含むキメラＤＮＡに再アセンブルされるまで、後続の融解／伸長反応を実施する。
【００３６】
【図２】図２は、選択された配列の改変（例えば、スワップするための１００個のＳＮＰ）を用いて、新しい宿主生物を生成するための本開示の方法の概要を示す。手短に述べると、方法は以下を含む：（１）所望のＤＮＡ挿入断片を、設計し、アセンブリー反応において１つまたは複数の合成オリゴを組み合わせることによって生成する、（２）ＤＮＡ挿入断片を、形質転換プラスミド中にクローニングする、（３）完成したプラスミドを、所望の産生株中に移入させ、そのプラスミドが宿主株のゲノム中に組み込まれる、および、（４）選択マーカーおよび他の望まれないＤＮＡエレメントを、宿主株からループアウトする。ＤＮＡアセンブリーの各ステップは、追加の、品質管理（ＱＣ）のステップ、例えば、増幅およびシーケンシングのためにプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ細菌中にクローニングするステップも含むことができる。
【００３７】
【図３】図３は、本開示の形質転換プラスミドアセンブリー、および宿主生物中へのそのプラスミドの組込みを示す。挿入断片ＤＮＡ（insert  DNA）を、アセンブリー反応において１つまたは複数の合成オリゴを組み合わせることによって生成する。所望の配列を含有するＤＮＡ挿入断片に、ゲノムの標的領域に相同なＤＮＡの領域を隣接させる。これらの相同領域は、ゲノムの組込みを促進し、一旦組み込まれると、続くステップでベクター骨格のＤＮＡをループアウトするように設計されたダイレクトリピート領域を形成する。アセンブルされたプラスミドは、挿入断片ＤＮＡを含有し、必要に応じて、１つまたは複数の選択マーカーも含有する。
【００３８】
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｂは、本開示の実施形態のうちの１つのＤＮＡアセンブリー、形質転換および株スクリーニングのステップを示す。図４Ａは、ＤＮＡ断片を構築するためのステップ、前記ＤＮＡ断片をベクター中にクローニングするためのステップ、前記ベクターを宿主株中に形質転換するためのステップ、および選択配列を対抗選択によりループアウトするためのステップを示す。図４Ｂは、ハイスループット培養するためのステップ、スクリーニングするためのステップ、および選択された宿主株を評価するためのステップを示す。この図はまた、培養物タンク中の、選択された株の培養、スクリーニングおよび評価を行う任意選択のステップも示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｂは、本開示の実施形態のうちの１つのＤＮＡアセンブリー、形質転換および株スクリーニングのステップを示す。図４Ａは、ＤＮＡ断片を構築するためのステップ、前記ＤＮＡ断片をベクター中にクローニングするためのステップ、前記ベクターを宿主株中に形質転換するためのステップ、および選択配列を対抗選択によりループアウトするためのステップを示す。図４Ｂは、ハイスループット培養するためのステップ、スクリーニングするためのステップ、および選択された宿主株を評価するためのステップを示す。この図はまた、培養物タンク中の、選択された株の培養、スクリーニングおよび評価を行う任意選択のステップも示す。
【００３９】
【図５】図５は、本開示の自動化されたシステムの一実施形態を示す。本開示は、宿主生物のクローニング、形質転換、培養、スクリーニングおよび／またはシーケンシングが可能な多様なモジュールを有する自動化されたロボットシステムの使用を教示する。
【００４０】
【図６】図６は、第２のラウンドのＨＴＰ操作ＰＲＯスワッププログラムの結果を示す。ＰＲＯスワップの第１のラウンドの間に同定したプロモーター：：遺伝子の上位の組合せを、本開示の方法に従って分析して、宿主の性能に対して相加的またはコンビナトリアルに有益な効果を示す可能性があろう、前記変異の組合せを同定した。したがって、第２のラウンドのＰＲＯスワップ変異体は、多様なプロモーター：：遺伝子の変異の対の組合せを含んだ。結果として得られた第２のラウンドの変異体を、選択された生体分子の宿主細胞の収率の差についてスクリーニングした。有益な効果を示すことが予測されていた、変異の組合せの対が、円を用いて強調されている。
【００４１】
【図７】図７は、相関性の尺度を使用して計算した類似性マトリックスである。マトリックスにより、ＳＮＰバリアント間の機能類似性が描写される。低い機能類似性を有するＳＮＰの統合は、より高い機能類似性を有するＳＮＰの統合とは対照的に、株性能を改善する可能性がより高いことが期待される。
【００４２】
【図８】図８Ａ〜Ｂは、上位性マッピングの実験結果を示す。低い機能類似性を有するＳＮＰスワップとＰＲＯスワップとの組合せにより、改良された株性能が得られる。図８Ａは、すべてのＳＮＰ／ＰＲＯスワップの機能類似性によりクラスター化された樹状図を示す。図８Ｂは、産物の収率により測定した場合の、宿主株の、統合したＳＮＰの性能を示す。より大きなクラスターの距離が、宿主株の統合性能の改善と相関する。
【００４３】
【図９】図９Ａ〜Ｂは、多様性プール中の株バリアント間のＳＮＰの差を示す。図９Ａは、この実験の株の間の関係を示す。株Ａは、野生型の宿主株である。株Ｂは、中間の、操作された株である。株Ｃは、工業生産用の株である。図９Ｂは、各株において、ユニークなＳＮＰおよび共有されているＳＮＰの数を同定するグラフである。
【００４４】
【図１０】図１０は、検討中のインプットデータについての相対的な株性能の分布を示す。ゼロの相対的な性能は、操作された株がプレート中の基準株に等しく良好に機能したことを示す。本明細書に記載するプロセスは、ゼロを有意に上回って機能する可能性がある株を同定するように設計される。
【００４５】
【図１１】図１１は、プロモータースワップのプロセスにおいて利用される遺伝子標的の例を示す。
【００４６】
【図１２】図１２は、同定した遺伝子標的についてプロモータースワップのプロセスを実施するために利用されている例示的なプロモーターライブラリーを示す。ＰＲＯスワップ（すなわち、プロモータースワップ）のプロセスにおいて利用されるプロモーターは、Ｐ１〜Ｐ８であり、それらの配列および同一性は、表１に見出すことができる。
【００４７】
【図１３】図１３は、プロモータースワッピングの遺伝子の結果は、標的とされる特定の遺伝子に依存することを示す。
【００４８】
【図１４】図１４は、予測される株の設計の上位１００個についての変化の組成（composition  of  change）を示す。ｘ軸に、潜在的な遺伝子変化（ｄｓｓ変異はＳＮＰスワップであり、Ｐｃｇ変異はＰＲＯスワップである）のプールを列挙し、ｙ軸に、順位を示す。黒色のセルにより、候補の設計における特定の変化の存在を示し、一方、白色のセルにより、そうした変化の不在を示す。この特定の例では、上位１００個の設計はすべて、ｐｃｇ３１２１＿ｐｇｉ、ｐｃｇ１８６０＿ｐｙｃ、ｄｓｓ＿３３９およびｐｃｇ０００７＿３９＿ｌｙｓａの変化を含有する。加えて、上位の候補の設計は、ｄｓｓ＿０３４、ｄｓｓ＿００９の変化を含有する。
【００４９】
【図１５】図１５は、本開示の実施形態のうちの１つの、ＤＮＡアセンブリーおよび形質転換のステップを示す。フローチャートは、ＤＮＡ断片を構築するためのステップ、前記ＤＮＡ断片をベクター中にクローニングするためのステップ、前記ベクターを宿主株中に形質転換するためのステップ、および選択配列を対抗選択によりループアウトするためのステップを示す。
【００５０】
【図１６】図１６は、ハイスループット培養するためのステップ、スクリーニングするためのステップ、および選択された宿主株を評価するためのステップを示す。この図はまた、培養物タンク中の、選択された株の培養、スクリーニングおよび評価を行う任意選択のステップも示す。
【００５１】
【図１７】図１７は、本開示のプロモーターラダーに従って一連の調節性の発現を示す、例示的なプロモーターの発現プロファイルを示す。プロモーターＡの発現は、細菌培養の誘導期にピークに達し、一方、プロモーターＢおよびＣはそれぞれ、対数期および定常期にピークに達する。
【００５２】
【図１８】図１８は、本開示のプロモーターラダーに従って一連の調節性の発現を示す、例示的なプロモーターの発現プロファイルを示す。プロモーターＡの発現は、選択された基質を添加すると、即時にピークに達するが、基質の濃度が低下するにつれて、検出不能なレベルに急速に戻る。プロモーターＢの発現は、選択された基質を添加すると、即時にピークに達し、基質の対応する低下と一緒に、ゆっくり低下して、検出不能なレベルに戻る。プロモーターＣの発現は、選択された基質を添加すると、ピークに達し、培養全体を通して、基質が消散してしまった後でさえ、高度な発現状態を維持する。
【００５３】
【図１９】図１９は、本開示のプロモーターラダーに従って一連の構成性の発現レベルを示す、例示的なプロモーターの発現プロファイルを示す。プロモーターＡは、最も低い発現を示し、それに続いて、プロモーターＢおよびＣがそれぞれ、発現レベルを増加させる。
【００５４】
【図２０】図２０は、株改良のための本開示のＬＩＭＳシステムの実施形態を図示する。
【００５５】
【図２１】図２１は、本開示のＬＩＭＳシステムの実施形態のクラウドコンピューティングの実装を図示する。
【００５６】
【図２２】図２２は、本開示の反復予測株設計ワークフローの実施形態を示す。
【００５７】
【図２３】図２３は、本開示の実施形態に従う、コンピューターシステムの実施形態を図示する。
【００５８】
【図２４】図２４は、本開示の実施形態に従って、微生物株を設計するための変異の選択における上位性効果の考慮事項を示すフローチャートである。
【００５９】
【図２５】図２５は、Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａにおけるトランスポゾン変異誘発のためのプラスミドの線形マップを示す。機能喪失型（ＬｏＦ）トランスポゾン、機能獲得型（ＧｏＦ）トランスポゾン、および機能獲得型（ＧｏＦ）再利用可能トランスポゾンが示されている。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
詳細な説明
定義
以下の用語は、当業者であればよく理解していると考えられるが、以下の定義を、本開示の主題の説明を容易にするために示す。
【００６１】
用語「ａ」または「ａｎ」は、そのエンティティの１つまたは複数を指し、すなわち、複数形の指示対象を指すことができる。したがって、用語「ａ」または「ａｎ」、「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」は、本明細書で互換的に使用される。さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による「要素」への言及は、文脈により唯一の要素が存在することが明確に要求されない限り、１つを超える要素が存在する可能性を除外しない。
【００６２】
本明細書で使用される場合、用語「細胞生物」、「微生物（microorganism）」、または「微生物（microbe）」は、広く解釈されるべきである。これらの用語は、互換的に使用され、これらに限定されないが、２つの原核生物ドメイン、細菌および古細菌、ならびにある特定の真核真菌および原生生物を含む。一部の実施形態では、本開示は、本開示内に存在するリスト／表および図面の「微生物（microorganism）」または「細胞生物」または「微生物（microbe）」に言及する。この特徴付けは、表および図面の同定された分類学的な属だけでなく、同定された分類学的な種、ならびに前記表または図面内の任意の生物体の様々な新規のおよび新しく同定または設計された株も参照することができる。同じ特徴付けが、実施例などの本明細書の他の部分におけるこれらの用語の記述にも当てはまる。
【００６３】
用語「原核生物」は、当技術分野で認識されており、核または他の細胞小器官を含有しない細胞を指す。原核生物は一般に、２つのドメイン、細菌および古細菌の１つに分類される。古細菌と細菌ドメインの生物体間の決定的な差異は、１６ＳリボソームＲＮＡ内のヌクレオチド塩基配列の基本的な差異に基づく。
【００６４】
用語「古細菌」は、Ｍｅｎｄｏｓｉｃｕｔｅｓ門の生物体のカテゴリー分類を指し、典型的には、珍しい環境内で見つかり、リボソームタンパク質の数および細胞壁におけるムラミン酸の欠如を含めたいくつかの判定基準によって原核生物の残りと区別される。ｓｓｒＲＮＡ分析に基づいて、古細菌は、２つの系統学的に別個の群：ＣｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａおよびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａからなる。これらの生理機能に基づいて、古細菌は、３つのタイプ：メタン生成菌（メタンを産生する原核生物）；高度好塩菌（非常に高濃度の塩（ＮａＣｌ）で生きる原核生物）；および高度（超）好熱菌（thermophilus）（非常に高温で生きる原核生物）へと整理することができる。古細菌を細菌と区別する統一的古細菌フィーチャ（すなわち、細胞壁内にムレインが無いこと、エステル連結膜脂質など）に加えて、これらの原核生物は、これらをその特定の生息環境に適応させるユニークな構造的または生化学的属性を呈する。Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａは、超好熱性硫黄依存性原核生物から主になり、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａは、メタン生成菌および高度好塩菌を含有する。
【００６５】
「細菌」または「真正細菌」は、原核生物体のドメインを指す。細菌は、以下の少なくとも１１の別個の群を含む：（１）２つの主要な亜門：（１）高Ｇ＋Ｃ群（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、その他）（２）低Ｇ＋Ｃ群（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ）が存在するグラム陽性（グラム＋）細菌；（２）Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、例えば、紅色光合成＋非光合成グラム陰性細菌（最も「一般的な」グラム陰性細菌を含む）；（３）ラン藻類、例えば、酸素発生型光合成生物；（４）スピロヘータおよび関連種；（５）Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ；（６）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ；（７）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ；（８）緑色硫黄細菌；（９）緑色非硫黄細菌（嫌気性光合成生物も）；（１０）放射線抵抗性ミクロコッカスおよび類縁体；（１１）ＴｈｅｒｍｏｔｏｇａおよびＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ。
【００６６】
「真核生物」は、細胞が、膜内に囲まれた核および他の小器官を含有する任意の生物体である。真核生物は、分類群ＥｕｋａｒｙａまたはＥｕｋａｒｙｏｔａに属する。真核細胞を原核細胞（上述の細菌および古細菌）から分離する決定的なフィーチャは、これらが膜結合型小器官、特に、遺伝物質を含有し、核包膜によって囲まれている核を有することである。
【００６７】
用語「遺伝的に改変された宿主細胞」、「組換え宿主細胞」、および「組換え株」は、本明細書で互換的に使用され、本開示のクローニングおよび形質転換方法によって遺伝的に改変された宿主細胞を指す。よって、この用語は、宿主細胞（例えば、細菌、酵母細胞、真菌細胞、ＣＨＯ、ヒト細胞など）であって、それが由来した天然に存在する生物体と比較して、それが変更された、改変された、または異なる遺伝子型および／または表現型（例えば、遺伝子改変が微生物のコーディング核酸配列に影響するとき）を呈するように遺伝的に変更、改変、または操作された、宿主細胞を含む。一部の実施形態では、この用語は、問題の特定の組換え宿主細胞だけでなく、このような宿主細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。
【００６８】
用語「野生型微生物」または「野生型宿主細胞」は、天然に存在する細胞、すなわち、遺伝的に改変されていない細胞を記述する。
【００６９】
用語「遺伝子操作された」は、宿主細胞のゲノムの任意のマニピュレーション（例えば、核酸の挿入、欠失、変異、または置き換えによる）を指すことができる。
【００７０】
用語「対照」または「対照宿主細胞」は、遺伝子改変または実験処置の効果を決定するための適切な比較宿主細胞（comparator  host  cell）を指す。一部の実施形態では、対照宿主細胞は、野生型細胞である。他の実施形態では、対照宿主細胞は、処置宿主細胞を差別化する遺伝子改変（複数可）を除いて、遺伝的に改変された宿主細胞と遺伝的に同一である。一部の実施形態では、本開示は、対照宿主細胞としての親株（例えば、株改良プログラムの基礎として使用されたＳ１株）の使用を教示する。他の実施形態では、宿主細胞は、処置宿主細胞において試験されている特異的プロモーターまたはＳＮＰを欠く遺伝的に同一の細胞であり得る。
【００７１】
本明細書で使用される場合、用語「対立遺伝子（複数可）」は、遺伝子の１つまたは複数の代替形態のいずれかを意味し、これらの対立遺伝子すべては、少なくとも１つの形質または特性と関係する。二倍体細胞では、所与の遺伝子の２つの対立遺伝子は、一対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占有する。
【００７２】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子座（locus）」（遺伝子座（loci）複数形）
は、例えば、遺伝子または遺伝子マーカーが見出される染色体上の具体的な１つもしくは複数の場所または部位を意味する。
【００７３】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝的に連結された」は、２種またはそれ超の形質であって、これらが交雑によって分離するのが困難であるように、繁殖中に高い割合で共遺伝される、形質を指す。
【００７４】
本明細書で使用される「組換え」または「組換え事象」は、染色体交差または独立組合せを指す。
【００７５】
本明細書で使用される場合、用語「表現型」は、個々の遺伝子構造（すなわち、遺伝子型）と環境との間の相互作用から生じる個々の細胞、細胞培養物、生物体、または生物体の群の観察可能な特性を指す。
【００７６】
本明細書で使用される場合、用語「キメラの」または「組換えの」は、核酸配列またはタンパク質配列を記述するとき、少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドもしくは２つの異種ポリペプチドを連結して単一の巨大分子にする、または少なくとも１つの天然の核酸もしくはタンパク質配列の１つもしくは複数のエレメントを再編成する核酸またはタンパク質配列を指す。例えば、用語「組換えの」は、例えば、化学合成による、または遺伝子操作技法による核酸の単離セグメントのマニピュレーションによる、配列の２つの別の方法で分離されたセグメントの人工の組合せを指すことができる。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「合成ヌクレオチド配列」または「合成ポリヌクレオチド配列」は、天然に存在することが知られていない、または天然に存在しないヌクレオチド配列である。一般に、このような合成ヌクレオチド配列は、任意の他の天然に存在するヌクレオチド配列と比較したとき、少なくとも１つのヌクレオチド差異を含む。
【００７８】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはこれらの類似体の、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は、分子の一次構造を指し、よって、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを含む。これは、修飾核酸、例えば、メチル化および／またはキャッピングされた核酸、修飾塩基、主鎖修飾を含有する核酸なども含む。用語「核酸」および「ヌクレオチド配列」は、互換的に使用される。
【００７９】
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」は、生物学的機能と関連したＤＮＡの任意のセグメントを指す。よって、遺伝子は、これらに限定されないが、コード配列および／またはこれらの発現に要求される調節配列を含む。遺伝子は、例えば、他のタンパク質の認識配列を形成する非発現ＤＮＡセグメントも含み得る。遺伝子は、目的の源からのクローニング、または公知のもしくは予測された配列情報からの合成を含めた、様々な源から得ることができ、所望のパラメータを有するように設計された配列を含み得る。
【００８０】
本明細書で使用される場合、用語「相同の」または「相同体」または「オルソログ」は、当技術分野で公知であり、共通の祖先またはファミリーメンバーを共有し、配列同一性の程度に基づいて決定される関連配列を指す。用語「相同性」、「相同の」、「実質的に同様の」、および「実質的に対応する」は、本明細書で互換的に使用される。これらは、核酸断片であって、１つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を媒介し、またはある特定の表現型を生じさせる核酸断片の能力に影響しない、核酸断片を指す。これらの用語は、本開示の核酸断片の修飾、例えば、最初の無修飾断片と比べて得られる核酸断片の機能的性質を実質的に変更しない１つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入も指す。したがって、当業者が十分に理解するように、本開示は、具体的な例示的な配列より多くを包含することが理解される。これらの用語は、１つの種、亜種、種類、栽培品種、または株内に見出される遺伝子と、別の種、亜種、種類、栽培品種、または株内の対応するまたは等価な遺伝子との間の関係を記述する。本開示の目的に関して、相同配列が比較される。「相同配列」または「相同体」または「オルソログ」は、機能的に関連していると見なされ、考えられ、または知られている。機能的関係は、これらに限定されないが、（ａ）配列同一性の程度および／または（ｂ）同じもしくは同様の生物学的機能を含めた、いくつかのやり方のいずれか１つにおいて示され得る。好ましくは、（ａ）および（ｂ）の両方が示される。相同性は、当技術分野で容易に利用可能なソフトウェアプログラム、Current  Protocols  in  Molecular  Biology（F.M.  Ausubelら編、１９８７年）補遺３０、セクション７．７１８、表７．７１に論じられたものなどを使用して決定することができる。いくつかの整列プログラムは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．）、ＡＬＩＧＮ  Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、およびＡｌｉｇｎＸ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）である。別の整列プログラムは、デフォルトパラメータを使用するＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）である。
【００８１】
本明細書で使用される場合、用語「内在性の」または「内在性遺伝子」は、天然に存在する遺伝子であって、それが宿主細胞ゲノム内に天然に見出される場所における天然に存在する遺伝子を指す。本開示との関連で、異種プロモーターを内在性遺伝子に作動可能に連結することは、既存の遺伝子であって、その遺伝子が天然に存在する場所における、既存の遺伝子の前に異種プロモーター配列を遺伝的に挿入することを意味する。本明細書に記載の内在性遺伝子は、本開示の方法のいずれかによって変異された天然に存在する遺伝子の対立遺伝子を含み得る。
【００８２】
本明細書で使用される場合、用語「外因性の」は、用語「異種の」と互換的に使用され、その生来の源（native  source）以外の何らかの源に由来する物質を指す。例えば、用語「外因性タンパク質」または「外因性遺伝子」は、非生来の源または場所由来であり、生物系に人工的に供給されたタンパク質または遺伝子を指す。
【００８３】
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド変化」は、当技術分野でよく理解されているように、例えば、ヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入を指す。例えば、変異は、サイレント置換、付加、または欠失を生じさせるが、コードされるタンパク質の性質もしくは活性、またはタンパク質が作製される方法を変更しない変更を含有する。
【００８４】
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質修飾」は、当技術分野でよく理解されているように、例えば、アミノ酸置換、アミノ酸修飾、欠失、および／または挿入を指す。
【００８５】
本明細書で使用される場合、用語、核酸またはポリペプチドの「少なくとも一部」または「断片」は、このような配列の最小限のサイズ特性を有する部分、または最大で全長分子の、および全長分子を含めた、全長分子の任意のより大きい断片を意味する。本開示のポリヌクレオチドの断片は、遺伝子調節エレメントの生物活性部分をコードすることができる。遺伝子調節エレメントの生物活性部分は、遺伝子調節エレメントを含む本開示のポリヌクレオチドの１つの部分を単離し、本明細書に記載の活性を評価することによって調製することができる。同様に、ポリペプチドの部分は、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸などであり得、最大で全長ポリペプチドまで伸び得る。使用される部分の長さは、特定の用途に依存する。ハイブリダイゼーションプローブとして有用な核酸の部分は、１２ヌクレオチドという短さであり得；一部の実施形態では、それは、２０ヌクレオチドである。エピトープとして有用なポリペプチドの部分は、４アミノ酸という短さであり得る。完全長ポリペプチドの機能を果たすポリペプチドの部分は一般に、４アミノ酸より長いはずである。
【００８６】
バリアントポリヌクレオチドは、ＤＮＡシャッフリングなどの変異誘発および組換え誘導（recombinogenic）手順に由来する配列も包含する。このようなＤＮＡシャッフリングのストラテジーは、当技術分野で公知である。例えば、Stemmer（１９９４年）、PNAS、９１巻：１０７４７〜１０７５１頁；Stemmer（１９９４年）、Nature、３７０巻：３８９〜３９１頁；Crameriら（１９９７年）、Nature  Biotech.、１５巻：４３６〜４３８
頁；Mooreら（１９９７年）、J.  Mol.  Biol.、２７２巻：３３６〜３４７頁；Zhangら（１９９７年）、PNAS、９４巻：４５０４〜４５０９頁；Crameriら（１９９８年）、Nature、３９１巻：２８８〜２９１頁；ならびに米国特許第５，６０５，７９３号および同第５，８３７，４５８号を参照。
【００８７】
本明細書に開示のポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅に関して、オリゴヌクレオチドプライマーを、目的の任意の生物体から抽出されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから対応するＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲ反応で使用するのに設計することができる。ＰＣＲプライマーを設計しＰＣＲクローニングするための方法は、当技術分野で一般に公知であり、Sambrookら（２００１年）、Molecular  Cloning:A  Laboratory  Manual（３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Plainview、New  York）に開示されている。Innisら編（１９９０年）、PCR  Protocols:  A  Guide  to  Methods  and  Applications（Academic  Press、New  York）；InnisおよびGelfand編（１９９５年）、PCR  Strategies（Academic  Press、New  York）；ならびにInnisおよびGelfand編（１９９９年）PCR  Methods  Manual（Academic  Press、New  York）も参照。ＰＣＲの公知の方法としては、これらに限定されないが、対プライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分ミスマッチプライマーなどを使用する方法が挙げられる。
【００８８】
本明細書で使用される用語「プライマー」は、増幅標的にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼを結合させ、それによって、プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下で、すなわち、ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼなどの重合のための作用物質の存在下で、かつ適当な温度およびｐＨで配置されたとき、ＤＮＡ合成の開始点として機能を果たすことができるオリゴヌクレオチドを指す。（増幅）プライマーは、好ましくは、増幅の効率を最大にするために一本鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合のための作用物質の存在下で伸長産物の合成をプライムするのに十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、プライマーの温度および組成（Ａ／Ｔ対Ｇ／Ｃ含有量）を含めた多くの因子に依存する。一対の双方向性プライマーは、ＰＣＲ増幅などのＤＮＡ増幅の技術分野で一般に使用されるように、１つの順方向プライマーおよび１つの逆方向プライマーからなる。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、コード配列または機能ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。一部の実施形態では、プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントは、エンハンサーと呼ばれることが多い。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーターの固有のエレメントまたはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであり得る。プロモーターは、その全体が生来の遺伝子に由来する場合があり、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成される場合があり、または合成ＤＮＡセグメントを含むことさえできる。異なるプロモーターは、異なる組織もしくは細胞型における、または発達の異なる段階における、または異なる環境条件に応じて遺伝子の発現を指示することができることが当業者によって理解されている。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は、完全に画定されていないので、あるバリエーションのＤＮＡ断片は、同一のプロモーター活性を有し得ることがさらに認識されている。
【００９０】
本明細書で使用される場合、語句「組換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、および「組換えＤＮＡコンストラクト」は、本明細書で互換的に使用される。組換えコンストラクトは、核酸断片の人工の組合せ、例えば、天然に一緒に見出されない調節配列およびコード配列を含む。例えば、キメラコンストラクトは、異なる源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ源に由来するが、天然に見出されるものと異なる様式で配列されている調節配列およびコード配列を含み得る。このようなコンストラクトは、それ自体で使用することができ、またはベクターと併せて使用することができる。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知であるように、宿主細胞を形質転換するのに使用される方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。当業者は、本開示の単離核酸断片のいずれかを含む宿主細胞を順調に形質転換、選択、および増殖させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝子エレメントをよく知っている。当業者は、異なる独立した形質転換事象は、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらし（Jonesら（１９８５年）、EMBO  J.、４巻：２４１１〜２４１８頁；De  Almeidaら（１９８９年）、Mol.  Gen.  Genetics、２１８巻：７８〜８６頁）、よって、所望の発現レベルおよびパターンをディスプレイする系（line）を得るために、複数の事象がスクリーニングされなければならないことも認識する。このようなスクリーニングは、とりわけ、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のイムノブロッティング分析、または表現型分析によってなしとげることができる。ベクターは、自発的に複製する、または宿主細胞の染色体内に組み込むことができるプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロ−ウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などであり得る。ベクターは、自律複製していない裸のＲＮＡポリヌクレオチド、裸のＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内のＤＮＡおよびＲＮＡの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリリシンコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチドコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソームコンジュゲートＤＮＡなどでもあり得る。本明細書で使用される場合、用語「発現」は、機能的最終産物、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質（前駆体または成熟）の産生を指す。
【００９１】
「作動可能に連結した」は、本文脈において、本開示によるプロモーターポリヌクレオチドのさらなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの、前記さらなるポリヌクレオチドの転写をもたらす連続した配置を意味する。
【００９２】
本明細書で使用される用語「目的の産物」または「生体分子」は、供給原料から微生物によって産生される任意の産物を指す。一部の場合では、目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコールなどであり得る。例えば、目的の産物または生体分子は、任意の一次または二次細胞外代謝産物であり得る。一次代謝産物は、とりわけ、エタノール、クエン酸、乳酸、グルタミン酸、グルタメート、リシン、トレオニン、トリプトファン、および他のアミノ酸、ビタミン、多糖などであり得る。二次代謝産物は、とりわけ、ペニシリンのような抗生物質化合物、またはシクロスポリンＡのような免疫抑制剤、ジベレリンのような植物ホルモン、ロバスタチンのようなスタチン薬、グリセオフルビンのような殺真菌薬などであり得る。目的の産物、または生体分子は、微生物によって産生される任意の細胞内コンポーネント、例えば、カタラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、グルコースイソメラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ラクターゼ、ストレプトキナーゼ、および多くのその他を含めた微生物酵素でもあり得る。細胞内コンポーネントとして、組換えタンパク質、例えば、インスリン、Ｂ型肝炎ワクチン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、ストレプトキナーゼなども挙げることができる。
【００９３】
用語「炭素源」は一般に、細胞増殖のための炭素の源として使用されるのに適した物質を指す。炭素源としては、これらに限定されないが、バイオマス加水分解物、デンプン、スクロース、セルロース、ヘミセルロース、キシロース、およびリグニン、ならびにこれらの基質のモノマーコンポーネントが挙げられる。炭素源は、これらに限定されないが、ポリマー、炭水化物、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチドなどを含めた様々な形態での様々な有機化合物を含み得る。これらとしては、例えば、様々な単糖、例えば、グルコース、デキストロース（Ｄ−グルコース）など、マルトース、オリゴ糖、多糖、飽和もしくは不飽和脂肪酸、スクシネート、ラクテート、アセテート、エタノールなど、またはこれらの混合物がある。光合成生物は、光合成の産物として炭素源をさらに産生することができる。一部の実施形態では、炭素源は、バイオマス加水分解物およびグルコースから選択され得る。
【００９４】
用語「供給原料」は、他の産物が作製され得る微生物または発酵プロセスに供給される原料または原料の混合物として定義される。例えば、バイオマスまたはバイオマスに由来する炭素化合物などの炭素源は、発酵プロセスにおいて目的の産物（例えば、低分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど）を産生する微生物の供給原料である。しかし、供給原料は、炭素源以外の栄養分を含有し得る。
【００９５】
用語「体積生産性」または「生産速度」は、単位時間当たり、媒体の体積当たりに形成される産物の量として定義される。体積生産性は、１時間当たり１リットル当たりのグラム（ｇ／Ｌ／ｈ）で報告することができる。
【００９６】
用語「比生産性」は、産物の形成の速度として定義される。比生産性は、１時間当たり細胞乾燥重量（ＣＤＷ）１グラム当たりの産物のグラム（ｇ／ｇ  ＣＤＷ／ｈ）での比生産性として本明細書でさらに定義される。所与の微生物のＯＤ６００に対するＣＤＷの関係を使用して、比生産性を、１時間当たり６００ｎｍにおける培養ブロスの光学密度（ＯＤ）当たり培養培地１リットル当たりの産物のグラム（ｇ／Ｌ／ｈ／ＯＤ）として表現することもできる。
【００９７】
用語「収率」は、原料の単位重量当たりに得られる産物の量として定義され、基質１ｇ当たりの産物のｇ（ｇ／ｇ）として表現することができる。収率は、理論的収率のパーセンテージとして表現することができる。「理論的収率」は、産物を作製するのに使用される代謝経路の化学量論比によって決まる所与の量の基質あたりに産生され得る産物の最大量として定義される。
【００９８】
用語「力価（titre）」または「力価（titer）」は、溶液の強度または溶液中の物質の濃度として定義される。例えば、発酵ブロス中の目的の産物（例えば、低分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど）の力価は、発酵ブロス１リットル当たりの溶液中の目的の産物のｇ（ｇ／Ｌ）として記述される。
【００９９】
用語「総力価」は、プロセスにおける初期体積またはプロセスにおける操作体積に対する、プロセスから取り出され、回収される溶液中の目的の産物、適用可能な場合、気相中の目的の産物、および任意の目的の産物を含むがこれらに限定されない、プロセスにおいて産生されるすべての目的の産物の和として定義される。
【０１００】
本明細書で使用される場合、用語「ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリー」または「ライブラリー」は、本開示による遺伝子撹乱のコレクションを指す。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、ｉ）データベースまたは他のコンピューターファイル中の配列情報のコレクション、ｉｉ）上述の一連の遺伝子エレメントをコードする遺伝子コンストラクトのコレクション、またはｉｉｉ）前記遺伝子エレメントを含む宿主細胞株として顕在化させ得る。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、個々のエレメントのコレクション（例えば、ＰＲＯスワップライブラリーのプロモーターのコレクション、ＳＴＯＰスワップライブラリーのターミネーターのコレクションまたはトランスポゾン変異誘発ライブラリー）を指すことができる。他の実施形態では、本開示のライブラリーは、遺伝子エレメントの組合せ、例えば、プロモーター：：遺伝子、遺伝子：ターミネーター、遺伝子欠失または撹乱、またはさらにはプロモーター：遺伝子：ターミネーターの組合せも指すことができる。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、宿主生物におけるライブラリーの各メンバーを適用する効果と関連したメタデータをさらに含む。例えば、本明細書で使用されるライブラリーは、特定の種における１つまたは複数の表現型に対するこれらの組合せの結果として生じる効果と一緒に、プロモーター：：遺伝子配列組合せのコレクションを含み、よって、将来のプロモータースワップにおいて前記組合せを使用することについて将来の予測値を改善することができる。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、用語「ＳＮＰ」は、核内低分子多形（複数可）を指す。一部の実施形態では、本開示のＳＮＰは、広く解釈されるべきであり、一塩基多型、配列挿入、欠失、反転、および他の配列置き換えを含む。本明細書で使用される場合、用語「非同義の」または「非同義ＳＮＰ」は、宿主細胞タンパク質におけるコード変化をもたらす変異を指す。
【０１０２】
ゲノム操作の「ハイスループット（ＨＴＰ）」方法は、自動化設備（例えば、液体ハンドラーまたはプレートハンドラーマシン）の少なくとも１つのピースを利用して、前記方法の少なくとも１つのステップを実行することができる。
【０１０３】
用語「トランスポゾン」は、ドナーポリヌクレオチド、例えばベクターから切除し、標的部位、例えば細胞のゲノムＤＮＡに組み込むことができるポリヌクレオチドを指す。トランスポゾンには、トランスポゾンの末端に位置するシス作用ヌクレオチド配列が隣接する核酸配列を含むポリヌクレオチドが含まれ得る。核酸配列には、少なくとも１つのシス作用ヌクレオチド配列が核酸配列の５’に位置し、少なくとも１つのシス作用ヌクレオチドが核酸配列の３’に位置する場合、シス作用ヌクレオチド配列が「隣接する」。シス作用ヌクレオチド配列が隣接する核酸配列は、本明細書において、「隣接配列」と呼ばれる場合がある。シス作用ヌクレオチド配列は、トランスポサーゼが結合するトランスポゾンの各末端における少なくとも１つの逆方向リピートを含む。「隣接配列」または「トランスポゾンペイロード」は、挿入変異誘発物質として作用する１つまたは複数の核酸配列を含み得る。挿入変異誘発物質とは、その挿入が、近くのコード領域または転位によって隣接配列が挿入されているコード領域によって発現される産物の発現のレベルまたは特質に影響する核酸配列である。発現される産物の特質が変更される場合、核酸は、「破壊性配列」と呼ばれる。発現のレベルが変更される場合、核酸は、「有効配列」と呼ばれる。本開示のトランスポゾンは、破壊性配列および／または有効配列であってよい１つまたは複数の挿入変異誘発物質を含み得る。
【０１０４】
本明細書で使用される用語「Ｐｒｏスワップ」は、最適な発現性質を有するプロモーターを選択して、全体的な宿主株表現型に対して有益な効果を生じさせる方法を指す。一部の実施形態では、これらの方法は、一連の発現強度または優れた調節性質を呈する、宿主細胞内の１つもしくは複数のプロモーターを同定し、かつ／または１つもしくは複数のプロモーターのバリアントを生成する方法を含む。これらの同定および／または生成されるプロモーターの特定の組合せを、プロモーターラダーとして一緒にグループ化することができる。
【０１０５】
本明細書で使用される用語「ＳＮＰスワップ」は、株全体にわたる個々の核内低分子多形ヌクレオチド変異（Ｓｍａｌｌ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）（すなわち、ＳＮＰ）の系統的な導入または除去を指す。一部の実施形態では、このプロセスを介して操作された結果として生じる微生物は、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを形成する。一部の実施形態では、ＳＮＰスワッピングでは、同定された有益な性能効果を有する標的ＳＮＰ「ビルディングブロック」の最適な組合せを用いて宿主生物体を再構築する。よって、一部の実施形態では、ＳＮＰスワッピングでは、反復プロセスにおいて１つずつ、または単一ステップにおける複数の変化としてのいずれかで、単一株バックグラウンド内に複数の有益な変異を統合することを伴う。複数の変化は、規定された変化の特定のセット、または変異の部分的にランダム化されたコンビナトリアルライブラリーのいずれかであり得る。他の実施形態では、ＳＮＰスワッピングでは、反復プロセスにおいて１つずつ、または単一ステップにおける複数の変化としてのいずれかで、株から有害と同定された複数の変異を除去することも伴う。複数の変化は、規定された変化の特定のセット、または変異の部分的にランダム化されたコンビナトリアルライブラリーのいずれかであり得る。一部の実施形態では、本開示のＳＮＰスワッピング方法は、有益なＳＮＰの付加ならびに有害なおよび／または中立の変異の除去の両方を含む。
【０１０６】
本明細書で使用される用語「ＳＴＯＰスワップ」は、細胞遺伝子転写の最適化によって宿主細胞生産性を（例えば、遺伝子ターミネーター配列のモジュレーションを介した転写のモジュレーションによって）改善する方法を指す。一部の実施形態では、本開示は、最適な発現性質を有する終結配列（「ターミネーター」）を選択して、全体的な宿主株生産性に対して有益な効果を生じさせる方法を教示する。一部の実施形態では、この方法は、一連の発現強度を呈する、宿主細胞内の１つもしくは複数のターミネーターを同定し、かつ／または１つもしくは複数のターミネーターのバリアント（例えば、ターミネーターラダー）を生成するステップを含む。これらの同定および／または生成されるターミネーターの特定の組合せを、ターミネーターラダーとして一緒にグループ化することができる。
【０１０７】
株改良の伝統的な方法
株改良の伝統的な手法は、２つのタイプの手法：指向株操作およびランダム変異誘発に広く分類され得る。
【０１０８】
株改良の指向操作方法は、特定の生物体の少数の遺伝子エレメントの計画された撹乱を伴う。これらの手法は、典型的には、特定の生合成プログラムまたは発生プログラムをモジュレートすることに着目し、前記経路に影響する遺伝因子および代謝因子の先の知識を利用する。その最も単純な実施形態では、指向操作は、特徴付けられた形質（例えば、遺伝子、プロモーター、または測定可能な表現型を生じさせることができる他の遺伝子エレメント）を、１つの生物体から同じまたは異なる種の別の生物体への移入を伴う。
【０１０９】
株操作のランダム手法は、性能改善を同定するように設計された広範なスクリーニングに加えて、親株のランダム変異誘発を伴う。これらのランダム変異を生じさせる手法には、紫外線への曝露、またはメタンスルホン酸エチルなどの変異誘発化学物質が含まれる。ランダムで概ね予測不可能であるが、株改良のこの伝統的手法は、より指向性の遺伝子マニピュレーションと比較していくつかの利点を有していた。第１に、多くの工業用生物体は、これらの遺伝子レパートリーおよび代謝レパートリーの観点からあまりよく特徴付けられておらず（かつあまりよく特徴付けられていないままであり）、代替の指向改善手法を不可能でなくとも困難にした。
【０１１０】
第２に、比較的よく特徴付けられたシステムにおいてでさえ、工業的性能改善をもたらす遺伝子型の変化は、予測するのが困難であり、時に、既知および未知の機能の多くの遺伝子における累積的変異を必要とする上位性表現型として現れるだけである。
【０１１１】
さらに、長年、所与の工業用生物体において指向ゲノム変異を引き起こすのに要求される遺伝的ツールは、利用可能でなく、または非常に遅く、かつ／もしくは使用するのが困難であった。
【０１１２】
しかし、伝統的な株改良プログラムの適用の拡大により、所与の株系統における獲得が次第に低減し、最終的にさらなる株効率の可能性が枯渇する。有益なランダム変異は、相対的に希有な事象であり、大きいスクリーニングプールおよび高い変異率を必要とする。これは必然的に、「改善された」株における多くの中立のかつ／または有害な（もしくは部分的に有害な）変異の不慮の蓄積をもたらし、それは、最終的に将来の効率向上に対して重荷となる。
【０１１３】
伝統的な累積的改善手法の別の制限事項は、任意の株測定基準に対する任意の特定の変異の効果について分かっている情報が皆無かそれに近いことである。これは基本的に、有益な変異を組み合わせ、統合し、または中立のもしくは有害な変異誘発の「荷物（baggage）」を除去する研究者の能力を制限する。
【０１１４】
変異誘発系統内の株間で変異をランダムに組み換える他の手法および技術が存在する。例えば、ＤＮＡシャッフリング、進化、または分子育種と時に呼ばれる反復的配列組換えのいくつかのフォーマットおよび例は、１９９４年２月１７日に出願された米国特許出願第０８／１９８，４３１号、１９９５年２月１７日に出願された第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１２６号、１９９５年４月１８日に出願された第０８／４２５，６８４号、１９９５年１０月３０日に出願された第０８／５３７，８７４号、１９９５年１１月３０日に出願された第０８／５６４，９５５号、１９９６年３月２５日に出願された第０８／６２１，８５９号、１９９６年３月２５日に出願された第０８／６２１，４３０号、１９９６年４月１８日に出願された第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５４８０号、１９９６年５月２０日に出願された第０８／６５０，４００号、１９９６年７月３日に出願された第０８／６７５，５０２号、１９９６年９月２７日に出願された第０８／７２１，８２４号、および１９９６年９月２７日に出願された第０８／７２２，６６０号；Stemmer、Science、２７０巻：１５１０頁（１９９５年）；Stemmerら、Gene、１６４巻：４９〜５３頁（１９９５年）；Stemmer、Bio/Technology、１３巻：５４９〜５５３頁（１９９５年）；Stemmer、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.、９１巻：１０７４７〜１０７５１頁（１９９４年）；Stemmer、Nature、３７０巻：３８９〜３９１頁（１９９４年）；Crameriら、Nature  Medicine、２巻（１号）：１〜３頁（１９９６年）；Crameriら、Nature  Biotechnology、１４巻：３１５〜３１９頁（１９９６年）に記載されている。これらのそれぞれは、すべての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１１５】
これらとしては、プロトプラスト融合、および変異された株全体にわたるゲノム組換えを促進する全ゲノムシャッフリングなどの技法が挙げられる。酵母および糸状菌などの一部の工業用微生物について、天然の接合サイクル（mating  cycle）もペアワイズゲノム組換えのために活用することができる。このように、有害な変異を、変異体を親株で「戻し交配する」ことによって除去し、有益な変異を統合することができる。さらに、２つの異なる株系統由来の有益な変異を潜在的に組み合わせることができ、それにより、単一の株系統をそのままで変異させることから入手可能であり得るものよりもさらなる改善可能性がもたらされる。しかし、これらの手法は、多くの制限を受けやすく、それらは、本開示の方法を使用して回避される。
【０１１６】
例えば、上述した伝統的な組換え手法は、遅く、変異をスワップするのに相対的に少数のランダム組換えクロスオーバー事象を利用し、したがって、任意の所与のサイクルまたは期間内に試みることができる組合せの数が限定される。さらに、先行技術における自然組換え事象は、本質的にランダムであるが、これらもゲノムの位置的バイアスを受けやすい。
【０１１７】
最も重要なことに、伝統的な手法はまた、個々の変異の影響についてわずかな情報しか提供せず、組み換えられた変異のランダムな分配に起因して、多くの特定の組合せを生成および評価することができない。
【０１１８】
伝統的な株改良プログラムに関連した上述の問題の多くを克服するために、本開示は、コンピューターで駆動され、分子生物学、自動化、データ分析、および機械学習プロトコールを統合するユニークなＨＴＰゲノム操作プラットフォームを示す。この統合プラットフォームは、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを構築するのに使用される一式のＨＴＰ分子ツールセットを利用する。これらの遺伝子設計ライブラリーは、以下で詳しく述べられる。
【０１１９】
教示されるＨＴＰプラットフォームおよびそのユニークな微生物遺伝子設計ライブラリーは、微生物株発生および進化のパラダイムを基本的にシフトする。例えば、工業用微生物株を開発する伝統的な変異誘発ベース方法は、最終的に、何年ものランダム変異誘発にわたって蓄積された重い変異誘発性ロードを背負った微生物に至る。
【０１２０】
この問題を解決する（すなわち、これらの微生物によって蓄積された遺伝的荷物を除去する）能力は、数十年にわたって微生物研究者が成し遂げられなかった。しかし、本明細書に開示のＨＴＰプラットフォームを利用すると、これらの工業用株を「再建する」ことができ、有害である遺伝子変異を同定および除去することができる。調和して、有益と同定される遺伝子変異を保持し、一部の場合では、改善することができる。結果として生じる微生物株は、これらの親株と比較して優れた表現型形質（例えば、目的の化合物の改善された産生）を実証する。
【０１２１】
さらに、本明細書に教示のＨＴＰプラットフォームは、微生物株性能に対して個々の変異が有する効果を同定し、特徴付け、定量することができる。この情報、すなわち、所与の遺伝子変化ｘが宿主細胞表現型ｙに対してどのような効果を有するか（例えば、目的の化合物または産物の産生）を生成することができ、次いで、以下で論じられる微生物ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーに記憶することができる。すなわち、各遺伝子順列についての配列情報および宿主細胞表現型に対するその効果が１つまたは複数のデータベースに記憶され、後続の分析（例えば、以下で論じられる上位性マッピング（epistasis  mapping））に利用可能である。本開示は、遺伝子挿入コンストラクトの形態で、または前記遺伝子順列を含有する１種または複数の宿主細胞生物体の形態で貴重な遺伝子順列を物理的に保存／記憶する方法も教示する（例えば、以下で論じられるライブラリーを参照）。
【０１２２】
これらのＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーをて洗練されたデータ分析および機械学習プロセスと統合された反復プロセスと結びつけると、宿主細胞を改善するための劇的に異なる方法が出現する。したがって、教示されるプラットフォームは、宿主細胞株を開発する先に論じられた伝統的な方法と基本的に異なる。教示されるＨＴＰプラットフォームは、先の方法に関連した欠点の多くを被らない。これらおよび他の利点は、以下で論じられる、ＨＴＰ分子ツールセットおよび得られる遺伝子設計ライブラリーを参照して明らかである。
【０１２３】
遺伝子設計＆微生物操作：一式のＨＴＰ分子ツールおよびＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを利用する株改良の系統的なコンビナトリアル手法
上述した通り、本開示は、株全体にわたる遺伝子変化の反復性系統的導入および除去によって微生物生物体を操作するための新規ＨＴＰプラットフォームおよび遺伝子設計ストラテジーを提供する。プラットフォームは、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーの創製を可能にし、所与の宿主株への遺伝子変更の効率的なインプリメンテーションを可能にする一式の分子ツールによって支持される。
【０１２４】
本開示のＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、特定の微生物株バックグラウンド内に導入され得る可能な遺伝子変更の源として機能を果たす。このように、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、所与の微生物株の初期のまたはさらなる操作に適用され得る遺伝的多様性の宝庫または遺伝子撹乱のコレクションである。宿主株へのインプリメンテーションのために遺伝子設計をプログラムするための技法は、本明細書にその全体が参照により組み込まれている「Microbial  Strain  Design  System  and  Methods  for  Improved  Large  Scale  Production  of  Engineered  Nucleotide  Sequences」という表題の、係属中の米国特許出願第１５／１４０，２９６号に記載されている。
【０１２５】
このプラットフォームで利用されるＨＴＰ分子ツールセットは、とりわけ、（１）プロモータースワップ（ＰＲＯスワップ）、（２）ＳＮＰスワップ、（３）開始／停止コドン交換、（４）ＳＴＯＰスワップ、および（５）配列最適化、および（６）トランスポゾン変異誘発、またはそれらの組み合わせを含み得る。本開示のＨＴＰ方法は、（７）上位性マッピングプロトコール、を含めたＨＴＰツールセットの統合／コンビナトリアル使用を指示するための方法も教示する。上述した通り、この一式の分子ツールは、単独または組合せのいずれかで、ＨＴＰ遺伝子設計宿主細胞ライブラリーの創製を可能にする。
【０１２６】
実証されるように、教示されるＨＴＰ微生物操作プラットフォームとの関連で上述のＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを利用すると、有益な「原因となる」変異または遺伝子区画の同定および統合、ならびにまた、受動変異または有害な変異または遺伝子区画の同定および除去が可能になる。この新しい手法は、伝統的なランダム変異誘発または指向遺伝子操作（directed  genetic  engineering）によって達成することができなかった株性能の急速な改善を可能にする。遺伝的荷重を除去し、または遺伝的荷重を有さない株内に有益な変化を統合すると、さらなる改善を可能にし得る追加のランダム変異誘発の新しい、ロバストな出発点も提供される。
【０１２７】
一部の実施形態では、本開示は、オルソゴナルな有益な変化が、変異誘発株系統の様々な個別分岐にわたって同定されるので、これらを、より良好に働く株へと急速に統合することもできることを教示する。これらの変異はまた、変異誘発系統の一部でない株、例えば、指向遺伝子操作によって獲得される改良を有する株へと統合され得る。
【０１２８】
一部の実施形態では、本開示は、それが、発現および非発現遺伝子エレメントを含む複数の異なるゲノム領域にわたって変異のゲノムワイドコンビナトリアル効果を分析し、集められた情報（例えば、実験結果）を使用して株を増強させることが予期される変異組合せを予測するという点で公知の株改良手法と異なる。
【０１２９】
一部の実施形態では、本開示は、ｉ）開示される発明を介した改良に適用できる工業用微生物および他の宿主細胞、ｉｉ）下流分析のための多様性プールの生成、ｉｉｉ）大きいバリアントプールをハイスループットスクリーニングおよびシーケンシングするための方法およびハードウェア、ｉｖ）ゲノムワイド変異の相乗効果の機械学習コンピューター分析および予測のための方法およびハードウェア、ならびにｖ）ハイスループット株操作のための方法を教示する。
【０１３０】
以下の分子ツールおよびライブラリーは、例示的な微生物例の観点から論じられている。当業者は、本開示のＨＴＰ分子ツールは、真核細胞およびより高等の生命体を含めた任意の宿主細胞に適合することを認識する。
【０１３１】
微生物操作プラットフォームで利用される様々なＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーの創製を可能にする同定されたＨＴＰ分子ツールセットのそれぞれを、次に論じる。
【０１３２】
１．プロモータースワップ：プロモータースワップ微生物株ライブラリーを得るための分子ツール
一部の実施形態では、本開示は、全宿主株表現型に対する有益な効果（例えば、収率または生産性）を生じさせるのに最適な発現性質を有するプロモーターを選択する方法を教示する。
【０１３３】
例えば、一部の実施形態では、本開示は、一連の発現強度（例えば、以下に論じられるプロモーターラダー）、または優れた調節性質（例えば、選択された遺伝子のより厳格な調節制御）を呈する、宿主細胞内の１つもしくは複数のプロモーターを同定し、かつ／または１つもしくは複数のプロモーターのバリアントを生成する方法を教示する。これらの同定および／または生成されるプロモーターの特定の組合せを、以下でより詳細に説明されるプロモーターラダーとして一緒にグループ化することができる。
【０１３４】
次いで、問題のプロモーターラダーは、目的の所与の遺伝子と関連させられる。よって、プロモーターＰ１〜Ｐ８（一連の発現強度を呈するように同定および／または生成された８つのプロモーターを表す）を有し、プロモーターラダーを微生物中の目的の単一遺伝子と関連させる（すなわち、所与の標的遺伝子に作動可能に連結した所与のプロモーターで微生物を遺伝的に操作する）場合、８つのプロモーターの各組合せの効果を、操作された微生物が標的遺伝子と関連した特定のプロモーター（複数可）を除いて他の点では同一の遺伝的バックグラウンドを有することを考慮して、各コンビナトリアル取り組みの結果として生じる操作された株のそれぞれを特徴付けることによって確認することができる。
【０１３５】
このプロセスを介して操作された結果として生じる微生物は、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを形成する。
【０１３６】
ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、このプロセスを介して形成される実際の物理的な微生物株コレクションを指すことができ、各メンバー株は、他の点では同一の遺伝的バックグラウンドにおいて、特定の標的遺伝子に作動可能に連結した所与のプロモーターを代表し、前記ライブラリーは、「プロモータースワップ微生物株ライブラリー」と呼ばれる。
【０１３７】
さらに、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、遺伝子撹乱のコレクションを指すことができ、この場合、所与のプロモーターｘは、所与の遺伝子ｙに作動可能に連結しており、前記コレクションは、「プロモータースワップライブラリー」と呼ばれる。
【０１３８】
さらに、プロモーターＰ１〜Ｐ８を含む同じプロモーターラダーを利用して微生物を操作することができ、ここで、８つプロモーターのそれぞれは、１０の異なる遺伝子標的に作動可能に連結される。この手順の結果は、目的の標的遺伝子に作動可能に連結した特定のプロモーターを除いて、他の点では遺伝的に同一と仮定される８０の微生物である。これらの８０の微生物は、適切にスクリーニングし、特徴付け、別のＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを生じさせることができる。ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリー内の微生物株を特徴付けると、リレーショナルデータベース、オブジェクト指向データベース、または大規模分散ＮｏＳＱＬデータベースを含めた任意のデータ記憶コンストラクトに記憶することができる情報およびデータが生じる。このデータ／情報は、例えば、所与の遺伝子標的に作動可能に連結しているときの所与のプロモーター（例えば、Ｐ１〜Ｐ８）の効果であり得る。このデータ／情報は、プロモーターＰ１〜Ｐ８のうちの２つまたはそれ超を所与の遺伝子標的に作動可能に連結することから生じるより広いセットのコンビナトリアル効果でもあり得る。
【０１３９】
８のプロモーターおよび１０の標的遺伝子の上述の例は、単に例示的であり、その理由は、この概念は、一連の発現強度および任意の所与の数の標的遺伝子の呈示に基づいて一緒にグループ化された任意の所与の数のプロモーターを用いて適用することができるためである。当業者は、任意の遺伝子標的の前に２つまたはそれ超のプロモーターを作動可能に連結する能力も認識する。よって、一部の実施形態では、本開示は、プロモーターラダー由来の１、２、３、またはそれ超のプロモーターが１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結したプロモータースワップライブラリーを教示する。
【０１４０】
要約すると、様々なプロモーターを利用して生物体内の様々な遺伝子の発現を駆動することは、目的の形質を最適化する強力なツールである。本発明者らが開発したプロモータースワッピングの分子ツールは、少なくとも１つの条件下で少なくとも１つの遺伝子座の発現を変更することが実証されたプロモーター配列のラダーを使用する。次いでこのラダーは、ハイスループットゲノム操作を使用して生物体内の遺伝子の群に系統的に適用される。この群の遺伝子は、いくつかの方法のいずれか１つに基づいて目的の形質に影響を与える高い見込みを有すると決定される。これらは、目的の形質に対する公知の機能もしくは影響に基づく選択物、または先に決定された有益な遺伝的多様性に基づくアルゴリズム選択物を含み得る。一部の実施形態では、遺伝子の選択物は、所与の宿主内のすべての遺伝子を含み得る。他の実施形態では、遺伝子の選択物は、ランダムに選択された所与の宿主内のすべての遺伝子のサブセットであり得る。
【０１４１】
次いで、遺伝子に連結したプロモーター配列を含有する生物体の結果として生じるＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが、ハイスループットスクリーニングモデルにおいて性能について評価され、性能を増大させるプロモーター−遺伝子連鎖が決定され、情報がデータベースに記憶される。遺伝子撹乱（すなわち、所与の遺伝子ｙに作動可能に連結した所与のプロモーターｘ）のコレクションは、「プロモータースワップライブラリー」を形成し、これは、微生物操作処理で利用される潜在的な遺伝子変更の源として利用することができる。経時的に、より大きいセットの遺伝子撹乱は、より多様な宿主細胞バックグラウンドに対してインプリメントされるので、各ライブラリーは、実験的に確認されたデータのコーパスとしてより強力になり、それを使用して目的の任意のバックグラウンドに対する標的とした変化をより正確かつ予想通りに設計することができる。
【０１４２】
生物体内の遺伝子の転写レベルは、生物体挙動に影響するための重要な管理点である。転写は、翻訳（タンパク質発現）としっかりと共役し、このタンパク質は、生物体挙動を決定する量で発現される。細胞は、数千の異なるタイプのタンパク質を発現し、これらのタンパク質は、多数の複雑なやり方で相互作用して機能を生み出す。一連のタンパク質の発現レベルを系統的に変更することによって、機能は、複雑性のために、予測することが困難であるように変更され得る。一部の変更は、性能を増大させることができ、したがって、性能を評価するための機構と連関して、この技法は、機能が改善された生物体の生成を可能にする。
【０１４３】
低分子合成経路との関連で、酵素は、基質で始まり、目的の低分子で終わる、直鎖または分岐鎖中で該酵素の低分子基質および産物を介して相互作用する。これらの相互作用は、順次連結されるので、このシステムは、分散制御を呈し、１つの酵素の発現の増大は、別の酵素が律速となるまで経路フラックスを増大させることができるだけである。
【０１４４】
代謝制御分析（ＭＣＡ）は、実験データおよび第１原理から、どの１つまたは複数の酵素が律速であるかを決定するための方法である。しかし、ＭＣＡは、それが新しい律速な酵素を決定するのに各発現レベル変化後に広範な実験を必要とするので、限定されている。プロモータースワッピングは、この状況において有利であり、その理由は、プロモーターラダーを経路内の各酵素に適用することによって、律速の酵素が見出され、同じことを後続のラウンドで行って律速となる新しい酵素を見出すことができるためである。さらに、機能の読み取りは、目的の低分子のより良好な産生であるので、どの酵素が律速であるかを決定する実験は、産生を増大させる操作と同じであり、よって開発時間を短縮する。一部の実施形態では、本開示は、多ユニット酵素の個々のサブユニットをコードする遺伝子へのＰＲＯスワップの適用を教示する。さらに他の実施形態では、本開示は、個々の酵素、または生合成経路全体の調節を担う遺伝子にＰＲＯスワップ技法を適用する方法を教示する。
【０１４５】
一部の実施形態では、本開示のプロモータースワップツールを使用して、選択された遺伝子標的の最適の発現を同定することができる。一部の実施形態では、プロモータースワップの目標は、標的遺伝子の発現を増大させて代謝経路または遺伝経路における障壁を低減することであり得る。他の実施形態では、プロモータースワップの目標は、標的遺伝子の発現が要求されないとき、前記標的遺伝子の発現を低減して宿主細胞内の不要なエネルギー消費を回避することであり得る。
【０１４６】
転写、輸送、またはシグナル伝達のような他の細胞系という状況で、様々な合理的な方法を使用して、どのタンパク質が発現変化の標的であり、その変化が何であるべきかを経験的に試みて見出すことができる。これらの合理的な方法は、性能を改善するものを見出すのに試験されなければならない撹乱の数を低減するが、これらは、かなりのコストでそれを行う。遺伝子欠失スタディにより、その存在が特定の機能に極めて重要であるタンパク質が同定され、次いで重要な遺伝子を過剰発現させることができる。タンパク質相互作用の複雑性に起因して、これは、性能の増大において効果的でないことが多い。細胞におけるタンパク質レベルの関数として転写またはシグナル伝達挙動を第１原理から記述することを試みる異なるタイプのモデルが開発された。これらのモデルは、多くの場合、発現変化が異なる機能または改善された機能をもたらし得る標的を示唆する。これらのモデルの根底をなす仮定は、過度に単純化されており、パラメータは、測定するのが困難であり、したがって、これらが行う予測は、特に非モデル生物体について誤っていることが多い。遺伝子欠失およびモデル化の両方を用いると、ある特定の遺伝子にどのように影響するかを決定するのに要求される実験は、性能を改善する変化を起こすための後続の仕事と異なる。プロモータースワッピングは、これらの課題を回避し、その理由は、特定の撹乱の重要性を強調する構築された株も、すでに改良された株であるためである。
【０１４７】
よって、特定の実施形態では、プロモータースワッピングは、
【０１４８】
１．「ラダー」として作用する一連の「ｘ」プロモーターを選択するステップ。理想的にはこれらのプロモーターは、多重ゲノム遺伝子座全体にわたって高度に多様な発現をもたらすことが示されているが、唯一の要件は、これらが遺伝子発現を何らかのやり方で撹乱することである。
【０１４９】
２．標的にする一連の「ｎ」遺伝子を選択するステップ。このセットは、ゲノム内のあらゆるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、またはＯＲＦのサブセットであり得る。サブセットは、先に実証された有益な撹乱（先のプロモータースワップもしくは先のＳＮＰスワップ）との関連によって、先に生成された撹乱間の上位性相互作用に基づくアルゴリズム選択、標的にする有益なＯＲＦに関する仮説に基づく他の選択判定基準によって、またはランダム選択を介して、機能に関連したＯＲＦについてのアノテーションを使用して選択することができる。他の実施形態では、「ｎ」標的化遺伝子は、非コードＲＮＡを含めた非タンパク質コード遺伝子を含み得る。
【０１５０】
３．以下の遺伝子改変を迅速に、かつ一部の実施形態では、並行して実行するためのハイスループット株操作：生来のプロモーターが標的遺伝子ｎの前に存在し、その配列が公知であるとき、生来のプロモーターをラダー内のｘプロモーターのそれぞれで置き換える。生来のプロモーターが存在せず、またはその配列が未知であるとき、ラダー内のｘプロモーターのそれぞれを遺伝子ｎの前に挿入する（例えば、図１３を参照）。このように、株の「ライブラリー」（ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーとも呼ばれる）が構築され、ライブラリーの各メンバーは、他の点では同一の遺伝子状況（genetic  context）においてｎ標的に作動可能に連結したｘプロモーターの一事例である。先に記載したように、プロモーターの組合せを挿入し、ライブラリーが構築される組み合わせの可能性（combinatorial  possibility）の範囲を拡張することができる。
【０１５１】
４．  １つまたは複数の測定基準に対する株の性能が最適化されている性能を示す状況における株のライブラリーのハイスループットスクリーニング。
を含むマルチステッププロセスである。
【０１５２】
この基本プロセスを拡張して、とりわけ、（１）相互作用プロセスにおいて１つずつ、または単一ステップにおける複数の変化として、単一株バックグラウンド内に複数の有益な撹乱を統合することによって、株性能をさらに改善することができる。複数の撹乱は、確定した変化の特定のセット、または変化の部分的にランダム化されたコンビナトリアルライブラリーのいずれかであり得る。例えば、標的のセットが経路内のあらゆる遺伝子である場合、撹乱のライブラリーを株の先のライブラリーの改善された１つまたは複数のメンバー内に逐次再生すると、任意の所与の反復においてどの遺伝子が律速であるかにかかわらず経路内の各遺伝子の発現レベルを最適化することができ；（２）ライブラリーの個々のおよびコンビナトリアル生成の結果として生じる性能データを、そのデータを使用して各撹乱の相互作用に基づいて撹乱の最適のセットを予測するアルゴリズムに送り；（３）上記２つの手法の組合せをインプリメントする（図１２を参照）。
【０１５３】
上記に論じた分子ツールまたは技法は、プロモータースワッピングとして特徴付けられるが、プロモーターに限定されず、一連の標的の発現レベルを系統的に変更する他の配列変化を含み得る。一連の遺伝子の発現レベルを変更するための他の方法は、ａ）リボソーム結合部位（または真核生物内のコザック配列）のラダー；ｂ）各標的の開始コドンの他の開始コドンのそれぞれでの置き換え（すなわち、以下に論じられる開始／停止コドン交換）；ｃ）転写物の５’もしくは３’末端への、または任意の他の場所における配列を安定化し、または不安定にする様々なｍＲＮＡの結合、ｄ）タンパク質中の任意の場所における配列を安定化し、または不安定にする様々なタンパク質の結合を含み得る。
【０１５４】
手法は、工業用微生物を用いて本開示において例示されているが、所望の形質が遺伝子変異体の集団において同定され得る任意の生物体に適用可能である。例えば、これは、ＣＨＯ細胞、酵母、昆虫細胞、藻類、および植物などの多細胞生物の性能を改善するのに使用することができる。
【０１５５】
２．ＳＮＰスワップ：ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを得るための分子ツール
ある特定の実施形態では、ＳＮＰスワッピングは、微生物株の改良のランダム変異誘発手法ではなく、むしろ、株全体にわたる個々の核内低分子多形ヌクレオチド変異（Small  Nuclear  Polymorphism  nucleotide  mutation）（すなわち、ＳＮＰ）の系統的な導入または除去を伴う（それが名称「ＳＮＰスワッピング」の由来である）。
【０１５６】
このプロセスを介して操作される結果として生じる微生物は、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを形成する。
【０１５７】
ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、このプロセスを介して形成される実際の物理的な微生物株コレクションを指すことができ、各メンバー株は、他の点では同一の遺伝的バックグラウンドにおいて、所与のＳＮＰの存在または非存在を代表し、前記ライブラリーは、「ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリー」と呼ばれる。
【０１５８】
さらに、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、遺伝子撹乱のコレクションを指すことができ、この場合、所与のＳＮＰが存在し、または所与のＳＮＰが存在せず、前記コレクションは、「ＳＮＰスワップライブラリー」と呼ばれる。
【０１５９】
一部の実施形態では、ＳＮＰスワッピングでは、同定された有益な性能効果を有する標的ＳＮＰ「ビルディングブロック」の最適な組合せを用いて宿主生物を再構築する。よって、一部の実施形態では、ＳＮＰスワッピングでは、反復プロセスにおいて１つずつ、または単一ステップにおける複数の変化としてのいずれかで、単一株バックグラウンド内に複数の有益な変異を統合することを伴う。複数の変化は、確定した変化の特定のセット、または変異の部分的にランダム化されたコンビナトリアルライブラリーのいずれかであり得る。
【０１６０】
他の実施形態では、ＳＮＰスワッピングでは、反復プロセスにおいて１つずつ、または単一ステップにおける複数の変化としてのいずれかで、株から有害と同定された複数の変異の除去も関与する。複数の変化は、規定された変化の特定のセット、または変異の部分的にランダム化されたコンビナトリアルライブラリーのいずれかであり得る。一部の実施形態では、本開示のＳＮＰスワッピング方法は、有益なＳＮＰの付加ならびに有害なおよび／または中立の変異の除去の両方を含む。
【０１６１】
ＳＮＰスワッピングは、変異誘発および目的とする形質改善のための選択に供された株の系統における有益および有害な変異の両方を同定および活用する強力なツールである。ＳＮＰスワッピングは、ハイスループットゲノム操作技法を利用して、変異誘発系統における個々の変異の影響を系統的に決定する。ゲノム配列は、既知の性能改善を有する変異誘発系統の１つまたは複数の世代にわたる株について決定される。次いでハイスループットゲノム操作が系統的に使用されて、より早期の系統株における改良された株由来の変異を反復し、かつ／またはより後期の株内の変異をより早期の株配列に戻す。次いでこれらの株の性能が評価され、目的の改善された表現型に対する各個々の変異の寄与を決定することができる。上述した通り、このプロセスから生じる微生物株が分析され／特徴付けられ、宿主株全体にわたる微生物株改良を通知することができるＳＮＰスワップ遺伝子設計ライブラリーの基礎を形成する。
【０１６２】
有害な変異を除去すると、即時に性能を改善することができ、変異誘発荷重に供されていない株バックグラウンド内の有益な変異を統合すると、株性能を迅速かつ大いに改善することができる。ＳＮＰスワッピングプロセスを介して生成される様々な微生物株は、ＨＴＰ遺伝子設計ＳＮＰスワッピングライブラリーを形成し、それは、様々な付加／欠失／または統合されたＳＮＰを含むが、他の点では同一の遺伝的バックグラウンドを有する微生物株である。
【０１６３】
先に論じた通り、性能改善のためのランダム変異誘発および後続のスクリーニングは、工業用株改良のために一般に使用される技法であり、大規模製造に現在使用されている多くの株は、長年、時に数十年の期間にわたって反復してこのプロセスを使用して開発されてきた。ゲノム変異の生成のランダム手法、例えば、ＵＶ放射線またはメタンスルホン酸エチルなどの化学的変異誘発物質への曝露は、工業用株改良の好適な方法であった。その理由は、１）工業用生物体は、遺伝的または代謝的にあまりよく特徴付けられておらず、指向改善手法のための標的選択を困難または不可能にする場合があり、２）相対的に十分に特徴付けられたシステムにおいてでさえ、工業的性能改善をもたらす変化は、予測するのが困難であり、既知の機能を有さない遺伝子の撹乱を必要とする場合があり、３）所与の工業用生物体において指向ゲノム変異を作製するための遺伝的ツールは、利用可能でなく、または非常に遅く、かつ／もしくは使用するのが困難である場合があるためである。
【０１６４】
しかし、このプロセスの上述の利益にもかかわらず、いくつかの公知の不利点も存在する。有益な変異は、相対的に希有な事象であり、定まったスクリーニング能力を用いてこれらの変異を見出すために、変異率は、十分に高くなければならない。これにより、望まれない中立のおよび部分的に有害な変異が有益な変化とともに株内に組み入れられることが多い。経時的に、この「変異誘発荷重」が蓄積し、全体的なロバスト性、および増殖速度などの重要な形質が欠損した株を生じる。最終的に、「変異誘発荷重」は、ランダム変異誘発による性能のさらなる改善を得ることをますます困難または不可能にする。適当なツールを用いない場合、株系統の個別分岐および並列分岐に見出される有益な変異を統合することが不可能である。
【０１６５】
ＳＮＰスワッピングは、変異誘発系統内の株を比較するとき観察される一部またはすべての変異を系統的に反復し、または戻すことによってこれらの制限事項を克服する一手法である。このように、有益な（「原因となる」）変異を同定および統合することもでき、かつ／または有害な変異を同定および除去することもできる。これにより、さらなるランダム変異誘発または標的化遺伝子操作によって達成することができなかった株性能の迅速な改善が可能になる。
【０１６６】
遺伝的荷重を除去し、または有益な変化を遺伝的荷重が無い株内に統合すると、さらなる改善を可能にすることができる追加のランダム変異誘発の新しいロバストな出発点ももたらされる。
【０１６７】
さらに、オルソゴナルな有益な変化が、変異誘発株系統の様々な個別分岐にわたって同定されるので、これらを、より良好に働く株へと急速に統合することができる。これらの変異はまた、変異誘発系統の一部でない株、例えば、指向遺伝子操作によって獲得される改良を有する株へと統合され得る。
【０１６８】
変異誘発系統内の株間の変異をランダムに組み換える他の手法および技術が存在する。これらとしては、プロトプラスト融合、および変異された株全体にわたるゲノム組換えを促進する全ゲノムシャッフリングなどの技法が挙げられる。酵母および糸状菌などの一部の工業用微生物について、天然の接合サイクルもペアワイズゲノム組換えのために活用することができる。このように、有害な変異を、変異体を親株で「戻し交配する」ことによって除去し、有益な変異を統合することができる。指向変異による変化が所望される場合、本開示のＳＮＰスワッピング方法が使用され得る。
【０１６９】
例えば、これらの手法は、変異をスワップするのに相対的に少数のランダム組換えクロスオーバー事象を利用するので、株性能を最適化するのに組換えおよびスクリーニングの多くのサイクルを要し得る。さらに、天然の組換え事象は、本質的にランダムであるが、これらもゲノムの位置的偏りを受けやすく、一部の変異は、対処するのが困難であり得る。これらの手法はまた、追加のゲノムシーケンシングおよび分析を伴わない個々の変異の影響についてわずかな情報しか提供しない。ＳＮＰスワッピングは、これらの基本的な制限事項を克服し、その理由は、それがランダム手法ではなく、むしろ、株全体にわたる個々の変異の系統的な導入または除去であるためである。
【０１７０】
一部の実施形態では、本開示は、多様性プールの生物体の中に存在するＳＮＰ配列多様性を同定するための方法を教示する。多様性プールは、分析に利用される所与の数ｎの微生物であり得、前記微生物のゲノムは、「多様性プール」を代表する。
【０１７１】
特定の態様では、多様性プールは、特定の時点における「ベースライン」または「参照」遺伝子配列を有する元の親株（Ｓ１）（Ｓ１Ｇｅｎ１）、および次いで前記Ｓ１株に由来し／それから開発された、かつＳ１のベースラインゲノムに関して異なるゲノムを有する任意の数の後続の子孫株（Ｓ２−ｎ）（Ｓ２−ｎＧｅｎ２−ｎ）であり得る。
【０１７２】
例えば、一部の実施形態では、本開示は、多様性プール内の微生物ゲノムをシーケンシングして各株内に存在するＳＮＰを同定することを教示する。一実施形態では、多様性プールの株は、歴史的な微生物産生株である。よって、本開示の多様性プールは、例えば、工業用参照株、および伝統的な株改良プログラムを介して産生された１つまたは複数の変異工業用株を含み得る。
【０１７３】
一部の実施形態では、多様性プール内のＳＮＰは、「参照株」を参照して決定される。一部の実施形態では、参照株は、野生型株である。他の実施形態では、参照株は、任意の変異誘発に供される前の元の工業用株である。参照株は、専門家が定義することができ、元の野生型株または元の工業用株である必要はない。基準株は、前記参照株に由来し、またはそれから開発された後続の株が比較される「基準」、「参照」、または元の遺伝的バックグラウンドと見なされるものを単に代表する。
【０１７４】
多様性プール内のすべてのＳＮＰが同定されると、本開示は、ＳＮＰスワッピングの方法およびスクリーニング方法を教示して、個々にかつ／または群内でＳＮＰの効果（例えば、目的の表現型の創製）を描写する（すなわち、定量し、特徴付ける）。
【０１７５】
一部の実施形態では、本開示のＳＮＰスワッピング方法は、変異株（例えば、Ｓ２−ｎＧｅｎ２−ｎの中からの株）内で同定された１つまたは複数のＳＮＰを参照株（Ｓ１Ｇｅｎ１）または野生型株に導入する（「ウェーブアップ」）ステップを含む。
【０１７６】
他の実施形態では、本開示のＳＮＰスワッピング方法は、変異株（例えば、Ｓ２−ｎＧｅｎ２−ｎの中からの株）内で同定された１つまたは複数のＳＮＰを除去する（「ウェーブダウン」）ステップを含む。
【０１７７】
一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＮＰ変化（導入または除去のいずれか）を含むそれぞれの生成された株は、培養され、本開示の１つまたは複数の判定基準（例えば、目的の化学物質または産物の産生）下で分析される。分析された宿主株のそれぞれからのデータは、宿主株内に存在する特定のＳＮＰまたはＳＮＰの群と関連付けられ、または相関付けられ、将来使用するために記録される。よって、本開示は、任意の数の目的の微生物遺伝的または表現型形質に対する所与のＳＮＰの効果を同定することができる、大きい、高度にアノテートされたＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの創製を可能にする。これらのＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーに記憶された情報は、ＨＴＰゲノム操作プラットフォームの機械学習アルゴリズムに知らせ、プロセスの将来の反復を指示し、それは最終的に、高度に望ましい性質／形質を有する進化した微生物生物体をもたらす。
【０１７８】
３．開始／停止コドン交換：開始／停止コドン微生物株ライブラリーを得るための分子ツール
一部の実施形態では、本開示は、開始および停止コドンバリアントをスワップする方法を教示する。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび哺乳動物の典型的な停止コドンは、それぞれＴＡＡ（ＵＡＡ）およびＴＧＡ（ＵＧＡ）である。単子葉植物の典型的な停止コドンは、ＴＧＡ（ＵＧＡ）であり、一方、昆虫およびＥ．ｃｏｌｉは一般に、停止コドンとしてＴＡＡ（ＵＡＡ）を使用する（Dalphinら（１９９６年）、Nucl.  Acids  Res.、２４巻：２１６〜２１８頁）。他の実施形態では、本開示は、ＴＡＧ（ＵＡＧ）停止コドンの使用を教示する。
【０１７９】
本開示は、開始コドンをスワップすることを同様に教示する。一部の実施形態では、本開示は、ほとんどの生物体（特に真核生物）によって利用されているＡＴＧ（ＡＵＧ）開始コドンの使用を教示する。一部の実施形態では、本開示は、原核生物は、ＡＴＧ（ＡＵＧ）を最も多く使用し、その後にＧＴＧ（ＧＵＧ）およびＴＴＧ（ＵＵＧ）が続くことを教示する。
【０１８０】
他の実施形態では、本開示は、ＡＴＧ開始コドンをＴＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＡＴＧ開始コドンをＧＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＧＴＧ開始コドンをＡＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＧＴＧ開始コドンをＴＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＴＴＧ開始コドンをＡＴＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＴＴＧ開始コドンをＧＴＧで置き換えることを教示する。
【０１８１】
他の実施形態では、本開示は、ＴＡＡ停止コドンをＴＡＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＴＡＡ停止コドンをＴＧＡで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＡ停止コドンをＴＡＡで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＴＧＡ停止コドンをＴＡＧで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＴＡＧ停止コドンをＴＡＡで置き換えることを教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＴＡＧ停止コドンをＴＧＡで置き換えることを教示する。
【０１８２】
４．Ｓｔｏｐスワップ：最適化配列微生物株ライブラリーを得るための分子ツール
一部の実施形態では、本開示は、細胞遺伝子転写の最適化によって宿主細胞生産性を改善する方法を教示する。遺伝子転写は、転写開始（ＲＮＡｐ動員および転写複合体形成）、伸長（鎖合成／拡張）、ならびに転写終結（ＲＮＡｐ脱離および終結）を含めたいくつかの別個の生物学的現象の結果である。多くの関心が、遺伝子の転写モジュレーションによる（例えば、プロモーターを変更し、または調節転写因子を誘導することによる）遺伝子発現の制御に注がれているが、比較的少ない取り組みが遺伝子ターミネーター配列のモジュレーションを介した転写のモジュレーションに向けて行われている。
【０１８３】
転写が遺伝子発現レベルに影響を与える最も明白なやり方は、Ｐｏｌ  ＩＩ開始の速度によるものであり、これは、プロモーターまたはエンハンサー強度およびトランス活性化因子の組合せによってモジュレートすることができる（Kadonaga,  JT.、２００４年、「Regulation  of  RNA  polymerase  II  transcription  by  sequence-specific  DNA  binding  factors」、Cell.、２００４年１月２３日；１１６巻（２号）：２４７〜５７
頁）。真核生物では、伸長速度も、オルタナティブスプライシングに影響を与えることによって遺伝子発現パターンを決定する場合がある（Cramer  P.ら、１９９７年、「Functional  association  between  promoter  structure  and  transcript  alternative  splicing.」、Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.、１９９７年１０月１４日；９４巻（２１号）：１１４５６〜６０頁）。遺伝子上の終結の失敗は、プロモーターのＰｏｌ  ＩＩへのアクセシビリティを低減することによって下流遺伝子の発現を損なわせ得る（Greger  IH.ら、２０００年、「Balancing  transcriptional  interference  and  initiation  on  the  GAL7  promoter  of  Saccharomyces  cerevisiae.」、Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.、２０００年７月１８日；９７巻（１５号）：８４１５〜２０頁）。このプロセスは、転写干渉として公知であり、下等真核生物において特に関連しており、その理由は、これらが密集した遺伝子を有することが多いためである。
【０１８４】
終結配列も、配列が属する遺伝子の発現に影響し得る。例えば、スタディは、真核生物における非効率な転写終結は、スプライスされていないプレｍＲＮＡを蓄積させることを示す（West,  S.およびProudfoot,  N.J.、２００９年、「Transcriptional  Termination  Enhances  Protein  Expression  in  Human  Cells」、Mol  Cell.、２００９年２月１３日；３３巻（３〜９号）；３５４〜３６４頁を参照）。他のスタディも、３’末端プロセシングが非効率な終結によって遅延され得ることを示した（West,  Sら、２００８年、「Molecular  dissection  of  mammalian  RNA  polymerase  II  transcriptional  termination.」、Mol  Cell.、２００８年３月１４日；２９巻（５号）：６００〜１０頁）。転写終結も、合成の部位から転写物を放出することによってｍＲＮＡ安定性に影響し得る。
【０１８５】
真核生物における転写機構の終結
真核生物における転写終結は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに関連したタンパク質因子によって認識されるターミネーターシグナルを介して働く。一部の実施形態では、切断・ポリアデニル化特異性因子（ＣＰＳＦ）および切断刺激因子（ＣｓｔＦ）は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのカルボキシル末端ドメインからポリＡシグナルに移動する。一部の実施形態では、ＣＰＳＦ因子およびＣｓｔＦ因子はまた、終結部位に他のタンパク質を動員し、次いでこれは、転写物を切断し、転写複合体からｍＲＮＡを解放する。終結は、ｍＲＮＡ転写物のポリアデニル化も誘発する。バリデートされた真核生物終結因子の実例およびこれらの保存構造は、本文書の後の部分で論じられている。
【０１８６】
原核生物における転写の終結
原核生物では、Ｒｈｏ非依存性およびＲｈｏ依存性終結と呼ばれる２つの主要機構が転写終結を媒介する。Ｒｈｏ非依存性終結シグナルは、外因性転写終結因子を要求せず、その理由は、一連のウリジン（Ｕ）残基とともにこれらの配列から転写されるＲＮＡにおけるステムループ構造の形成が、転写複合体からのＲＮＡ鎖の放出を促進するためである。一方、Ｒｈｏ依存性終結は、ｍＲＮＡ上でＲｈｏと呼ばれる転写終結因子およびシス作用エレメントを必要とする。Ｒｈｏの最初の結合部位、Ｒｈｏ利用（ｒｕｔ）部位は、実際のターミネーター配列の上流の、高シチジン／低グアノシン含有量、および合成されているＲＮＡにおける相対的に小さい二次構造によって特徴付けられる伸長された（約７０ヌクレオチド、時に８０〜１００ヌクレオチド）一本鎖領域である。ポリメラーゼ休止部位と遭遇すると、終結が起こり、転写物がＲｈｏのヘリカーゼ活性によって放出される。
【０１８７】
ターミネータースワッピング（ＳＴＯＰスワップ）
一部の実施形態では、本開示は、最適な発現性質を有する終結配列（「ターミネーター」）を選択して、全体的な宿主株生産性に対して有益な効果を生じさせる方法を教示する。
【０１８８】
例えば、一部の実施形態では、本開示は、一連の発現強度を呈する、宿主細胞内の１つもしくは複数のターミネーターを同定し、かつ／または１つもしくは複数のターミネーターのバリアントを生成する（例えば、以下に論じられるターミネーターラダー）方法を教示する。これらの同定および／または生成されるターミネーターの特定の組合せを、以下でより詳細に説明されるターミネーターラダーとして一緒にグループ化することができる。
【０１８９】
次いで、問題のターミネーターラダーは、目的の所与の遺伝子と関連させられる。よって、ターミネーターＴ１〜Ｔ８（１つまたは複数のプロモーターと組み合わされるとき、一連の発現強度を呈するように同定および／または生成された８つのターミネーターを表す）を有し、ターミネーターラダーを宿主細胞内の目的の単一遺伝子と関連させる（すなわち、所与の標的遺伝子の３’末端に作動可能に連結した所与のターミネーターで宿主細胞を遺伝的に操作する）場合、ターミネーターの各組合せの効果を、操作された宿主細胞が標的遺伝子と関連した特定のプロモーター（複数可）を除いて他の点では同一の遺伝的バックグラウンドを有することを考慮して、各コンビナトリアル取り組みの結果として生じる操作された株のそれぞれを特徴付けることによって確認することができる。このプロセスを介して操作される結果として生じる宿主細胞は、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを形成する。
【０１９０】
ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、このプロセスを介して形成される実際の物理的な微生物株コレクションを指すことができ、各メンバー株は、他の点では同一の遺伝的バックグラウンドにおいて、特定の標的遺伝子に作動可能に連結した所与のターミネーターを代表し、前記ライブラリーは、「ターミネータースワップ微生物株ライブラリー」または「ＳＴＯＰスワップ微生物株ライブラリー」と呼ばれる。
【０１９１】
さらに、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、遺伝子撹乱のコレクションを指すことができ、この場合、所与のターミネーターｘは、所与の遺伝子ｙに作動可能に連結しており、前記コレクションは、「ターミネータースワップライブラリー」または「ＳＴＯＰスワップライブラリー」と呼ばれる。
【０１９２】
さらに、プロモーターＴ１〜Ｔ８を含む同じターミネーターラダーを利用して微生物を操作することができ、ここで、８つのターミネーターそれぞれは、１０の異なる遺伝子標的に作動可能に連結している。この手順の結果は、目的の標的遺伝子に作動可能に連結した特定のターミネーターを除いて、他の点では遺伝的に同一と仮定される８０の宿主細胞株である。これらの８０の宿主細胞株は、適切にスクリーニングし、特徴付け、別のＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを生じさせることができる。ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリー内の微生物株を特徴付けると、リレーショナルデータベース、オブジェクト指向データベース、または大規模分散ＮｏＳＱＬデータベースを限定することなく含めた任意のデータベースに記憶することができる情報およびデータが生じる。このデータ／情報は、例えば、所与の遺伝子標的に作動可能に連結しているときの所与のターミネーター（例えば、Ｔ１〜Ｔ８）の効果を含み得る。このデータ／情報は、プロモーターＴ１〜Ｔ８のうちの２つまたはそれ超を所与の遺伝子標的に作動可能に連結することから生じるより広いセットのコンビナトリアル効果でもあり得る。
【０１９３】
８のターミネーターおよび１０の標的遺伝子の上述の例は、単に例示的であり、その理由は、この概念は、一連の発現強度および任意の所与の数の標的遺伝子の呈示に基づいて一緒にグループ化された任意の所与の数のプロモーターを用いて適用することができるためである。
【０１９４】
要約すると、様々なターミネーターを利用して生物体内の様々な遺伝子の発現をモジュレートすることは、目的の形質を最適化する強力なツールである。本発明者らが開発したターミネータースワッピングの分子ツールは、少なくとも１つの条件下で少なくとも１つの遺伝子座の発現を変更することが実証されたターミネーター配列のラダーを使用する。次いでこのラダーは、ハイスループットゲノム操作を使用して生物体内の遺伝子の群に系統的に適用される。この群の遺伝子は、いくつかの方法のいずれか１つに基づいて目的の形質に影響を与える高い見込みを有すると決定される。これらは、公知の機能に基づく選択、または目的の形質に対する影響、または先に決定された有益な遺伝的多様性に基づくアルゴリズムによる選択を含み得る。
【０１９５】
次いで、遺伝子に連結したターミネーター配列を含有する生物体の結果として生じるＨＴＰ遺伝子設計微生物ライブラリーが、ハイスループットスクリーニングモデルにおいて性能について評価され、性能を増大させるプロモーター−遺伝子連鎖が決定され、情報がデータベースに記憶される。遺伝子撹乱（すなわち、所与の遺伝子ｙに連結した所与のターミネーターｘ）のコレクションは、「ターミネータースワップライブラリー」を形成し、これは、微生物操作処理で利用される潜在的な遺伝子変更の源として利用することができる。経時的に、より大きいセットの遺伝子撹乱は、より大きい多様性の微生物バックグラウンドに対してインプリメントされるので、各ライブラリーは、実験的に確認されたデータのコーパスとしてより強力になり、それを使用して目的の任意のバックグラウンドに対する標的とした変化をより正確かつ予想通りに設計することができる。すなわち、一部の実施形態では、本開示は、本発明の遺伝子設計ライブラリーのいずれかと関連したメタデータ内に埋もれた先の実験結果に基づく、宿主細胞内への１つまたは複数の遺伝子変化の導入を教示する。
【０１９６】
よって、特定の実施形態では、ターミネータースワッピングは、以下を含むマルチステッププロセスである。
【０１９７】
１．「ラダー」として作用する一連の「ｘ」ターミネーターを選択するステップ。理想的にはこれらのターミネーターは、多重ゲノム遺伝子座全体にわたって高度に多様な発現をもたらすことが示されているが、唯一の要件は、これらが遺伝子発現を何らかのやり方で撹乱することである。
【０１９８】
２．標的にする一連の「ｎ」遺伝子を選択するステップ。このセットは、ゲノム内のあらゆるＯＲＦ、またはＯＲＦのサブセットであり得る。サブセットは、先に実証された有益な撹乱（先のプロモータースワップ、ＳＴＯＰスワップもしくはＳＮＰスワップ）との関連によって、先に生成された撹乱間の上位性相互作用に基づくアルゴリズム選択、標的にする有益なＯＲＦに関する仮説に基づく他の選択判定基準によって、またはランダム選択を介して、機能に関連したＯＲＦについてのアノテーションを使用して選択することができる。他の実施形態では、「ｎ」標的化遺伝子は、非コードＲＮＡを含めた非タンパク質コード遺伝子を含み得る。
【０１９９】
３．以下の遺伝子改変を迅速に、かつ並行して実行するためのハイスループット株操作：生来のターミネーターが標的遺伝子ｎの３’末端に存在し、その配列が公知であるとき、生来のターミネーターをラダー内のｘターミネーターのそれぞれで置き換える。生来のターミネーターが存在せず、またはその配列が未知であるとき、ラダー内のｘターミネーターのそれぞれを遺伝子停止コドンの後に挿入する。
【０２００】
このように、株の「ライブラリー」（ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーとも呼ばれる）が構築され、ライブラリーの各メンバーは、他の点では同一の遺伝子状況においてｎ標的に連結したｘターミネーターの一事例である。先に記載したように、ターミネーターの組合せを挿入し、ライブラリーが構築される組み合わせの可能性の範囲を拡張することができる。
【０２０１】
４．  １つまたは複数の測定基準に対する株の性能が最適化されている性能を示す状況における株のライブラリーのハイスループットスクリーニング。
【０２０２】
この基本プロセスを拡張して、とりわけ、（１）相互作用プロセスにおいて１つずつ、または単一ステップにおける複数の変化としてのいずれかで、単一株バックグラウンド内に複数の有益な撹乱を統合することによって、株性能をさらに改善することができる。複数の撹乱は、確定した変化の特定のセット、または変化の部分的にランダム化されたコンビナトリアルライブラリーのいずれかであり得る。例えば、標的のセットが経路内のあらゆる遺伝子である場合、撹乱のライブラリーを株の先のライブラリーの改善された１つまたは複数のメンバー内に逐次再生すると、任意の所与の反復においてどの遺伝子が律速であるかにかかわらず経路内の各遺伝子の発現レベルを最適化することができ；（２）ライブラリーの個々のおよびコンビナトリアル生成の結果として生じる性能データを、そのデータを使用して各撹乱の相互作用に基づいて撹乱の最適のセットを予測するアルゴリズムに送り；（３）上記２つの手法の組合せをインプリメントする。
【０２０３】
手法は、工業用微生物を用いて本開示において例示されているが、所望の形質が遺伝子変異体の集団において同定され得る任意の生物体に適用可能である。例えば、これは、ＣＨＯ細胞、酵母、昆虫細胞、藻類、および植物などの多細胞生物の性能を改善するのに使用することができる。
【０２０４】
５．配列最適化：最適化配列微生物株ライブラリーを得るための分子ツール
一実施形態では、提供した開示の方法は、宿主生物が発現する１つまたは複数のコドン最適化遺伝子を含む。様々な宿主内での発現を改善するためにコドンを最適化するための方法は、当技術分野で公知であり、文献において記載されている（その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００７／０２９２９１８号を参照）。特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好適なコドンを含有する最適化されたコード配列（Murrayら、（１９８９年）、Nucl.  Acids  Res.、１７巻：４７７〜５０８頁も参照）を調製して、例えば、翻訳の速度を増大させ、または非最適配列から産生される転写物と比較して、より長い半減期などの望ましい性質を有する組換えＲＮＡ転写物を生成することができる。
【０２０５】
タンパク質発現は、転写、ｍＲＮＡプロセシング、ならびに翻訳の安定性および開始に影響するものを含めた多数の因子によって支配される。よって、最適化は、任意の特定の遺伝子のいくつかの配列フィーチャのいずれかに対処することができる。具体例として、希少コドン誘導翻訳休止は、タンパク質発現を低減し得る。希少コドン誘導翻訳休止は、宿主生物において稀に使用される目的のポリヌクレオチド中のコドンの存在が、利用可能なｔＲＮＡプールにおけるその不足に起因してタンパク質翻訳に対して負の効果を有し得ることを含む。
【０２０６】
代替の翻訳開始も、異種タンパク質発現を低減し得る。代替翻訳開始は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）として機能することができるモチーフを偶然に含有する合成ポリヌクレオチド配列を含み得る。これらの部位は、遺伝子内部部位から短縮タンパク質の翻訳を開始することができる。精製中に除去することが困難であり得る短縮タンパク質を産生する可能性を低減する一方法は、最適化ポリヌクレオチド配列から推定上の内部ＲＢＳ配列を排除するステップを含む。
【０２０７】
リピート誘導ポリメラーゼのスリッページは、異種タンパク質発現を低減し得る。リピート誘導ポリメラーゼのスリッページは、フレームシフト変異をもたらし得るＤＮＡポリメラーゼのスリッページまたはスタッタリングを引き起こすことが示されているヌクレオチド配列リピートを伴う。このようなリピートは、ＲＮＡポリメラーゼのスリッページも引き起こし得る。高いＧ＋Ｃ含有量偏りを有する生物体では、ＧまたはＣヌクレオチドリピートから構成されるより高い程度のリピートが存在し得る。したがって、ＲＮＡポリメラーゼのスリッページを誘導する可能性を低減する一方法は、ＧまたはＣヌクレオチドの長いリピートを変更するステップを含む。
【０２０８】
二次構造の干渉も異種タンパク質発現を低減し得る。二次構造は、ＲＢＳ配列または開始コドンを隔離することができ、タンパク質発現の低減と相関している。ステムループ構造も、転写休止および減衰に関与することができる。最適化ポリヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列のＲＢＳおよび遺伝子コード領域内に最小限の二次構造を含有して、転写および翻訳の改善を可能にすることができる。
【０２０９】
例えば、最適化プロセスは、宿主が発現する所望のアミノ酸配列を同定することによって始めることができる。アミノ酸配列から、候補ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ配列を設計することができる。合成ＤＮＡ配列の設計中に、コドン使用の頻度を、宿主発現生物体のコドン使用と比較することができ、希有な宿主コドンを合成配列から除去することができる。さらに、合成候補ＤＮＡ配列を、望ましくない酵素制限部位を除去し、任意の所望のシグナル配列、リンカー、または非翻訳領域を付加または除去するために修飾することができる。合成ＤＮＡ配列は、翻訳プロセスを妨害し得る二次構造、例えば、Ｇ／Ｃリピートおよびステムループ構造の存在について分析することができる。
【０２１０】
６．トランスポゾン変異誘発多様性ライブラリー：トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーを得るための分子ツール
本トランスポゾン変異誘発ＨＴＰ分子ツールは、２つの問題を解決する：第１には、遺伝子型−表現型の関係に関する理解が不足している。よく研究されている生物体においてでさえもゲノム全体像の大部分は未だ十分に理解されていない。さらに、十分に理解されている遺伝子エレメントが、予期せぬ様式で相互作用する場合がある。第２には、成長の遅い生物体または遺伝的に扱いにくい生物体、特に大きなゲノムを有するものでは、可能性のあるすべての遺伝子標的に対して標的とした遺伝子撹乱を行うには莫大な時間および／またはコストがかかる。
【０２１１】
これらの問題を解決するために、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏトランスポゾン変異誘発を使用して宿主生物体の遺伝子エレメントを容易かつランダムにモジュレートする／撹乱する／操作するための方法を提供する。
【０２１２】
トランスポゾン変異誘発は、異なる遺伝子撹乱／変化（例えば、機能獲得型または機能喪失型）を宿すライブラリーを創製するために使用され、宿主の表現型をさらに改善するための新しい遺伝子標的を暗示し得る。
【０２１３】
理論によって束縛されることなく、一般に、トランスポゾンは、短い（典型的には５０ｂｐ未満の）トランスポゾン特異的末端ＤＮＡ配列を有することによって特徴付けられる。多くの場合、これらの末端配列は、同じかまたは密接に関連した配列の逆方向バージョンである。トランスポサーゼは、末端逆方向リピート配列に特異的に結合して、転位事象を触媒するトランスポサーゼ−ＤＮＡシナプス複合体を形成する。トランスポゾンは、任意の所望のＤＮＡ配列（例えば、任意のペイロード遺伝子、選択可能マーカー、プロモーター、プライマー結合部位、部位特異的組換え部位、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、レポーター遺伝子、ターミネーターなど）をさらに含み得る。
【０２１４】
本開示に記載されるある特定のツールは、微生物株における遺伝子の既存の多形に関するが、微生物株の性能を改善するのに有用であり得る新規の変異を創製しない。本開示は、ペイロードＤＮＡをゲノムにランダムに組み込んで、宿主株のフィーチャの改善をもたらすものについてさらにスクリーニングされ得る変異を創製し、全体的な宿主株表現型（例えば、収率または生産性）に対して有益な効果を引き起こす、トランスポゾン変異誘発システムを教示する。
【０２１５】
例えば、一部の実施形態では、本開示は、トランスポゾン変異誘発プロセスによって創製される、宿主細胞ゲノム内の変異／変更／挿入／欠失（すなわち遺伝子撹乱）を生成する方法を教示する。このプロセスにおいて生成される任意の特定のゲノム変更は、以下により詳細に説明するトランスポゾン変異誘発ライブラリー（トランスポゾン変異誘発多様性ライブラリーとも呼ばれる）として一緒にグループ化することができる。
【０２１６】
このプロセスを介して操作された結果として生じる微生物は、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを形成する。
【０２１７】
ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、このプロセスを介して形成される実際の物理的な微生物株コレクションを指すことができ、各メンバー株は、他の点では同一の遺伝的バックグラウンドにおいて、トランスポゾン変異誘発によって創製された所与の変異／変更／挿入／欠失（すなわち遺伝子撹乱）を代表し、株ライブラリーは、「トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリー」と呼ばれる。
【０２１８】
さらに、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、遺伝子撹乱のコレクションを指すことができ、この場合、所与の撹乱は、トランスポゾン変異誘発によって創製されており、コレクションは、「トランスポゾン変異誘発ライブラリー」と呼ばれる。
【０２１９】
トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーからの微生物は、ＨＴＰのさらなるラウンドに供することができる。トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーからの微生物は、適切にスクリーニングし、特徴付け、別のＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを生じさせることができる。ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリー内の微生物株を特徴付けると、リレーショナルデータベース、オブジェクト指向データベース、または大規模分散ＮｏＳＱＬデータベースを含めた任意のデータ記憶コンストラクトに記憶することができる情報およびデータが生じる。このデータ／情報は、例えば、宿主細胞の増殖または宿主細胞における分子の産生に対する遺伝子撹乱の効果であり得る。このデータ／情報は、２つまたはそれよりも多い遺伝子撹乱から生じるより広いセットのコンビナトリアル効果でもあり得る。
【０２２０】
トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーを周期性操作のさらなるラウンドに供して、所望の表現型（例えば、トリプトファン収率）をさらに改善することができる。操作のさらなるラウンドは、トランスポゾン変異誘発または本明細書に記載の他のライブラリータイプ、例えばＳＮＰスワップ、ＰＲＯスワップ、またはランダム変異誘発からなり得る。改良された株を、所望の表現型に対してスクリーニングして、性能が改善されたバリアントを同定することができ、また、改善された表現型を呈する他の株バリアントと統合して、明確に異なる有益な変異の相加効果によってさらに改良された株を産生することができる。
【０２２１】
当業者は、トランスポゾン変異誘発によって創製された遺伝子撹乱を任意の他の遺伝子撹乱と統合する能力を認識する。よって、一部の実施形態では、本開示は、トランスポゾン変異誘発によって創製された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、またはそれよりも多い遺伝子撹乱を有するトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーを教示する。
【０２２２】
要約すると、生物体内でトランスポゾン変異誘発によって創製された様々な変異／変更／挿入／欠失（遺伝子撹乱とも呼ばれる）を利用することは、目的の形質を最適化する強力なツールである。本発明者らによって開発された、ＨＴＰライブラリーを創製するためにトランスポゾン変異誘発を利用する分子ツールは、目的の形質に対して様々な効果を有する変異／変更／挿入／欠失のコレクションを使用する。次いでこのコレクションは、ハイスループットゲノム操作を使用して生物体内に系統的に適用される。この群の変異／変更／挿入／欠失は、いくつかの方法のいずれか１つに基づいて目的の形質に影響を与える高い見込みを有すると決定される。これらは、目的の形質に対する公知の機能もしくは影響に基づく選択物、または先に決定された有益な遺伝的多様性に基づくアルゴリズム選択物を含み得る。一部の実施形態では、変異／変更／挿入／欠失の選択物は、所与の宿主内のすべての遺伝子を含み得る。他の実施形態では、変異／変更／挿入／欠失の選択物は、ランダムに選択された所与の宿主内のすべての遺伝子のサブセットであり得る。他の実施形態では、変異／変更／挿入／欠失の選択物は、所与の分子の合成に関与するすべての遺伝子のサブセットであり得る。
【０２２３】
次いで、トランスポゾン変異誘発によって創製された遺伝子撹乱を含有する生物体の結果として生じるＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーが、ハイスループットスクリーニングモデルにおいて性能について評価され、性能を増大させる遺伝子撹乱が決定され、情報がデータベースに記憶される。遺伝子撹乱（例えば、変異／変更／挿入／欠失）のコレクションは、「トランスポゾン変異誘発ライブラリー」を形成し、これは、将来の微生物操作処理における潜在的な遺伝子変更の源として利用することができる。経時的に、より大きいセットの遺伝子撹乱は、より多様な宿主細胞バックグラウンドに対してインプリメントされるので、各ライブラリーは、実験的に確認されたデータのコーパスとしてより強力になり、それを使用して目的の任意のバックグラウンドに対する標的とした変化をより正確かつ予想通りに設計することができる。
【０２２４】
一部の実施形態では、本開示のトランスポゾン変異誘発ライブラリーを使用して、遺伝子標的の最適な発現を同定することができる。一部の実施形態では、目標は、標的遺伝子の活性を増大させて代謝経路または遺伝経路における障壁を低減することであり得る。他の実施形態では、目標は、標的遺伝子の発現が要求されないとき、標的遺伝子の活性を低減して宿主細胞内の不要なエネルギー消費を回避することであり得る。
【０２２５】
よって、特定の実施形態では、トランスポゾン変異誘発は、
【０２２６】
１．変異誘発のためのトランスポゾンシステムを選択し、システムを所与の微生物株に適用して、トランスポゾンによって引き起こされる変異（または任意の他の遺伝子撹乱だが、この梗概では単純性のために変異を使用する）を生成するステップ。理想的には、システムは、選択された微生物株のゲノムへのトランスポゾンのランダム組込みをもたらすことが示されている。このような組込みは、遺伝子発現を何らかのやり方で撹乱させる。
【０２２７】
２．トランスポゾンがそのゲノム内に組み込まれた株を迅速に選択するためのハイスループット株操作。このように、株の「ライブラリー」（ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリー、すなわちトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーとも呼ばれる）が構築され、ライブラリーの各メンバーは、他の点では同一の遺伝子状況においてトランスポゾン変異を含む株である。先に記載したように、変異の組合せを統合し、ライブラリーが構築される組合せの可能性の範囲を拡張することができる。
【０２２８】
３．  １つまたは複数の測定基準に対する株の性能が最適化されている性能を示す状況における株のライブラリーのハイスループットスクリーニング。
を含むマルチステッププロセスである。
【０２２９】
この基本プロセスを拡張して、とりわけ、（１）相互作用プロセスにおいて１つずつ、または単一ステップにおける複数の変化としてのいずれかで、単一株バックグラウンド内に複数の有益な撹乱（例えば、変異）を統合するステップであって、複数の撹乱（例えば、変異）は、変異によって改変された遺伝子機能にかかわらず、規定された変化の特定のセット、または変化の部分的にランダム化されたコンビナトリアルライブラリーのいずれかであり得る、ステップ、（２）ライブラリーの個々のおよびコンビナトリアル生成の結果として生じる性能データを、そのデータを使用して各撹乱の相互作用に基づいて撹乱の最適なセットを予測するアルゴリズムに送るステップ、および（３）上記２つの手法の組合せをインプリメントすることによって、株性能をさらに改善することができる。
【０２３０】
一部の実施形態では、トランスポゾンは、ＧＣリッチな領域における挿入を優先する。一部の実施形態では、トランスポゾンは、挿入部位においてＧＣ塩基を要求する。一部の実施形態では、トランスポゾンは、挿入部位においてＡＴリッチな領域を優先する。一部の実施形態では、トランスポゾンは、挿入部位においてＡＴ塩基を要求する。
【０２３１】
一部の実施形態では、トランスポゾンペイロードは、トランスポゾンが細胞内のコード領域内またはその付近に核酸配列を挿入するとき、そのコード領域によって発現される産物の特質を変更することができる非コードＤＮＡ配列を含む。細胞内に存在するコード領域によって発現される産物の特質を変更する任意のヌクレオチド配列を使用することができる。
【０２３２】
一部の実施形態では、トランスポゾンペイロードは、トランスポゾンを細胞内のコード領域付近に挿入するとき、そのコード領域の発現のレベルを変更することができる非コードＤＮＡ配列を含む。この有効配列は、コード領域の発現のレベルを増大または減少させ得る。細胞内に存在するコード領域の発現のレベルを変更する任意のヌクレオチド配列を使用することができる。
【０２３３】
一部の実施形態では、１つまたは複数の非コードまたはコードＤＮＡ配列としては、これらに限定されないが、プロモーター、ターミネーター配列、停止コドン、最適化されたコドン、スプライスアクセプター部位、スプライスドナー部位、サイレンサーエレメント、ＳＮＰ、可溶性タグ、バーコード、エンハンサー、マトリックス結合配列、転写結合部位、フレームシフト変異、選択可能マーカー、および対抗選択可能マーカーが挙げられる。
【０２３４】
一部の実施形態では、トランスポゾンペイロードは、選択可能マーカーを含む。本開示において使用され得る選択可能マーカーとしては、これらに限定されないが、薬物耐性マーカー（例えば、ハイグロマイシン、カナマイシン、ベータ−ラクタマーゼ耐性、ピューロマイシン、またはネオマイシン類似体Ｇ４１８）、検出可能マーカー（例えば、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、およびベータ−ガラクトシダーゼ）、ｍＦａｂＩ、クロラムフェニコール耐性、および栄養要求性マーカー（例えば、ＵＲＡ、ＬＹＳ、ｃｓｃＡ）が挙げられる。
【０２３５】
一部の実施形態では、トランスポゾンペイロードは、ＵＲＡ３／５−ＦＯＡ対抗選択システム、ｓａｃＢ、ｔｅｔＡＲ、ｒｐｓＬ、ｃｃｄＢ、ｐｈｅＳ、およびチミジンキナーゼを含むがこれらに限定されない対抗選択可能マーカーを含む。
【０２３６】
トランスポゾンペイロードは、多様な表現型応答を誘起するように変えることができる。例えば、機能喪失型（ＬｏＦ）ライブラリーにおいて、ペイロードは、成功したトランスポゾン組込みの事象の選択を可能にするマーカーを含み得る。別の例では、機能獲得型ライブラリーにおいて、ペイロードは、プロモーターまたは可溶性タグを含み得る。他の実施形態では、ペイロードは、選択可能マーカーを含有するペイロードの一部のループアウトを促進し、よって連続的なトランスポゾン変異誘発を可能にする、対抗選択可能マーカーを含み得る。
【０２３７】
一部の実施形態では、トランスポゾンは、高い転位頻度を有する。一部の実施形態では、トランスポゾンは、飽和変異誘発（例えば、ゲノム内のすべての遺伝子への少なくとも１回の挿入）を達成することが可能であるように、高い転位頻度を有する。
【０２３８】
本開示では、任意の適切なトランスポゾンシステムが使用され得る。一部の実施形態では、トランスポゾンは、カットアンドペーストトランスポゾンである。一部の実施形態では、トランスポゾンは、複製的トランスポゾンである。一部の実施形態では、トランスポゾンは、逆転写を伴うプロセスによって転位がなしとげられる、レトロエレメントである。一部の実施形態では、トランスポゾンおよびトランスポサーゼシステムは、Ｔｎ１、Ｔｎ２、Ｔｎ３、Ｔｎ４、Ｔｎ５、Ｔｎ６、Ｔｎ７、Ｔｎ１０、ｍａｒｉｎｅｒ、Ｈｉｍａｒ  １、Ｔｏｌ２、Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅ、Ｐエレメント、Ｐａｓｓｐｏｒｔ、Ｔｎ４００１、Ｔｙ１、Ｔｙ２、Ｔｙ３、Ｔｙ４、Ｔｙ５、合成トランスポゾン、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、ｐｉｇｇｙｂａｃｋ、またはこれらの誘導体を含むがこれらに限定されない群から選択される。一部の実施形態では、トランスポゾンシステムは、Ｔｎ５トランスポソームシステムである。
【０２３９】
一部の実施形態では、トランスポゾンは、２つまたはそれよりも多いトランスポゾンペイロードから構成された複合トランスポゾンである。一部の実施形態では、１つまたは複数のトランスポゾンペイロードがトランスポサーゼと複合体化する。一部の実施形態では、複合体化したトランスポゾンペイロードおよびトランスポサーゼは、ｉｎ  ｖｉｖｏ転位を可能にする。一部の実施形態では、複合体化したトランスポサーゼは、ポリペプチドである。一部の実施形態では、複合体化したトランスポサーゼは、トランスポサーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、複合体化したトランスポサーゼは、Ｔｎ５トランスポサーゼである。
【０２４０】
一部の実施形態では、トランスポゾンは、部位特異的組込みを媒介するポリヌクレオチドを含む。本開示において使用され得る部位特異的組込み配列としては、これらに限定されないが、ＬｏｘＰ（Ｃｒｅリコンビナーゼとの使用のため）およびＦＲＴ（ＦＬＰリコンビナーゼとの使用のため）が挙げられる。
【０２４１】
一部の実施形態では、トランスポゾンは、ゲノム内にランダムに挿入する。一部の実施形態では、トランスポゾンは、ゲノム内にランダムに挿入し、機能喪失型変異を引き起こす。一部の実施形態では、トランスポゾンは、遺伝子のプロモーター内に挿入する。一部の実施形態では、トランスポゾンは、オープンリーディングフレーム内にランダムに挿入し、破壊された遺伝子の転写または翻訳を防止する（例えば、機能喪失型変異）。一部の実施形態では、トランスポゾンは、遺伝子の上流調節エレメント内に挿入する。一部の実施形態では、トランスポゾンは、遺伝子に対して近位の部位にランダムに挿入し、遺伝子発現を増大させる（例えば、機能獲得型変異）。一部の実施形態では、トランスポゾンは、遺伝子のプロモーターまたは上流調節エレメント内に挿入し、機能獲得型変異を引き起こす。一部の実施形態では、トランスポゾンは、遺伝子のプロモーターまたは上流調節エレメント内に挿入し、機能喪失型変異を引き起こす。一部の実施形態では、トランスポゾンは、遺伝子内に挿入し、早期終結変異を引き起こす。一部の実施形態では、早期終結変異は、機能喪失型変異を引き起こす。
【０２４２】
一部の実施形態では、トランスポゾンは、挿入部位においてゲノムＤＮＡに組み込まれる。一部の実施形態では、トランスポゾンは、微生物生物によって安定に遺伝される。
【０２４３】
一部の実施形態では、トランスポゾンは、１つまたは複数のＤＮＡ配列（例えば、トランスポゾンペイロード）をゲノム内の挿入部位に挿入する。一部の実施形態では、トランスポゾンは、１つもしくは複数の破壊性配列および／または１つもしくは複数の有効配列、またはこれらの組合せを含む。
【０２４４】
一部の実施形態では、トランスポゾンは、ゲノムＤＮＡの一部の欠失をもたらす。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡの一部の欠失は、Ｃｒｅにより触媒されるＤＮＡの切除によってなしとげられる。
【０２４５】
トランスポゾンは、任意の適切なベクターを使用して細胞に送達されてよい。一部の実施形態では、ベクターは、少なくとも１個のトランスポゾン、少なくとも２個のトランスポゾン、少なくとも３個のトランスポゾン、少なくとも４個のトランスポゾン、少なくとも５個のトランスポゾン、少なくとも６個のトランスポゾン、少なくとも７個のトランスポゾン、少なくとも８個のトランスポゾン、少なくとも９個のトランスポゾン、少なくとも１０個のトランスポゾン、またはそれよりも多くを含み得る。
【０２４６】
一部の実施形態では、ベクターは、トランスポサーゼをコードするコード領域を含む。本明細書で使用される場合、用語「トランスポサーゼ」は、トランスポゾンの逆方向リピートまたはダイレクトリピートを結合し、ドナーポリヌクレオチド（例えば、ベクター）からのトランスポゾンの切除、およびその後の細胞のゲノムＤＮＡへのトランスポゾンの組込みを触媒するポリペプチドを指す。トランスポサーゼは、ポリペプチドとして存在し得る。代替として、トランスポサーゼは、トランスポサーゼをコードするコード配列を含むポリヌクレオチドとして存在してもよい。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはＤＮＡであり得る。トランスポサーゼをコードするポリヌクレオチドは、ベクター上にあっても、または染色体内に存在してもよい。トランスポサーゼが、トランスポサーゼをコードするコード配列として存在する場合、本開示の一部の態様では、コード配列は、トランスポゾンを含む同じポリヌクレオチド（例えば、ベクター）上に（すなわち、シスで）存在し得る。一部の実施形態では、トランスポサーゼコード配列は、第２のポリヌクレオチド（例えば、ベクター）上に、すなわち、トランスで存在し得る。
【０２４７】
本開示は、本明細書に開示のトランスポゾンおよびベクターを使用するための方法を提供する。ベクターは、当技術分野で公知の任意の適切な手段を使用して、標的細胞に形質転換し、評価し、クローニングしてよい。方法は、細胞を観察して、表現型が変化しているかどうかを決定するステップを含み得る。
【０２４８】
開示される方法は、細胞内に存在するトランスポゾンの位置をマッピングするステップを含み得る。一部の実施形態では、挿入のエリアは、配列分析によって同定され得る。配列分析は、ＰＣＲに基づく技法（例えば、インバースＰＣＲまたはリンカー媒介性ＰＣＲ技法）を含むがこれらに限定されない、当技術分野における任意の適切な手段によって行われ得る。一部の実施形態では、配列分析は、任意のプライマーとカップリングされたトランスポゾン特異的プライマー（Ｔｎプライマー）の使用により、トランスポゾンの境界のうちの１つをＰＣＲ増幅し、これをその後、トランスポゾン末端配列のすぐ近隣にある標的ＤＮＡを同定するためにシーケンシングすることを含む。一部の実施形態では、配列分析は、微生物ゲノム内の公知の配列に対するトランスポゾン特異的プライマーおよび設計されたプライマーの使用（例えば、「フットプリンティング」）を含む。一部の実施形態では、配列分析は、ハイブリダイゼーションによって同定され得るトランスポゾンに組み入れられたユニークな配列（例えば、特定の２０量体またはバーコード）をアッセイすることによって行われ得る。一部の実施形態では、配列分析は、マイクロアレイ分析を含む。一部の実施形態では、配列分析は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む。一部の実施形態では、トランスポゾン内の制限部位を切断することができる制限エンドヌクレアーゼを使用した配列分析。
【０２４９】
７．上位性マッピング  −  有益な遺伝子統合（genetic  consolidation）を可能にする予測的分析用ツール
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞内に有益な遺伝子変更を予測し、組み合わせるための上位性マッピング法（epistasis  mapping  method）を教示する。遺伝子変更は、上述のＨＴＰ分子ツールセット（例えば、プロモータースワップ、ＳＮＰスワップ、開始／停止コドン交換、配列最適化、トランスポゾン変異誘発）のいずれかによって生み出すことができ、これらの遺伝子変更の効果は、得られたＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの特徴付けから分かる。よって、本明細書で使用される場合、用語の上位性マッピングは、宿主性能の増大を生じさせる可能性のある遺伝子変更の組合せ（例えば、有益なＳＮＰもしくは有益なプロモーター／標的遺伝子の関連付け、またはトランスポゾン変異誘発キャンペーンからの有益な突然変異）を同定する方法を含む。
【０２５０】
諸実施形態では、本開示の上位性マッピング法は、２つの異なる機能群からの有益な変異の組合せは、同じ機能群からの変異の組合せと比較して、宿主性能を改善する可能性が高いというアイデアに基づく。例えば、Costanzo、The  Genetic  Landscape  of  a  Cell、Science、３２７巻、５９６４号、２０１０年１月２２日、４２５〜４３１頁を参照（その全体が本明細書に参照により組み込まれている）。
【０２５１】
同じ機能群からの変異は、同じ機構によって働く可能性が高く、よって、全体的な宿主性能に対して負または中立の上位性を呈する可能性が高い。対照的に、異なる機能群からの変異は、独立した機構によって働く可能性が高く、それは、宿主性能の改善、および一部の事例では相乗効果をもたらし得る。
【０２５２】
よって、一部の実施形態では、本開示は、ＳＮＰ変異を分析して、異なる機能群に属すると予測されるＳＮＰを同定する方法を教示する。一部の実施形態では、ＳＮＰ機能群類似度は、変異相互作用プロファイルの余弦類似度（相関係数と類似、図８Ａを参照）を計算することによって決定される。本開示は、変異類似度マトリックス（図７を参照）またはデンドログラム（図８Ａを参照）を介してＳＮＰを比較することも例示する。トランスポゾン変異誘発によってもたらされる遺伝子撹乱に同じ概念が適用され得る。
【０２５３】
よって、上位性マッピング手順は、１つまたは複数の遺伝的バックグラウンドにおいて適用される遺伝子変異の多様性を、１つまたは複数の遺伝的バックグラウンド内に前記変異を効率的かつ有効に統合する目的で、グループ化および／またはランク付けするための方法を提供する。
【０２５４】
諸態様では、統合は、標的生体分子を産生させるのに最適化された新規株を生み出す目的で実施される。教示した上位性マッピング手順によって、変異の機能分類を同定することが可能であり、このような機能分類は、望ましくない上位性効果を最小限にする統合ストラテジーを可能にする。
【０２５５】
先に説明した通り、工業発酵で使用するための微生物の最適化は、経済、社会、および自然界に関する広い暗示を含む重要で困難な問題である。伝統的に、微生物操作は、ランダム変異誘発の遅く不確かなプロセスによって実施されてきた。このような手法は、細胞の自然進化能力を活用して、人工的に課された選択圧に適応させる。このような手法はまた、有益な変異の珍しさ、基礎をなす適応度地形の荒削りさによって制限されており、より一般に、細胞生物学および分子生物学における現況技術を十分に利用しない。
【０２５６】
最新の手法は、機構レベルでの細胞機能の新しい理解および特定の表現型目標への標的化遺伝子マニピュレーションを実施する新しい分子生物学ツールを活用する。実際には、このような合理的手法は、生物学の根本的な複雑性によって混乱する。原因となる機構は、特に、それぞれに有益な効果が観察された２つまたはそれ超の変化を組み合わせようと試みる場合、理解が不十分である。時に、遺伝子変化のこのような統合は、正の結果（所望の表現型活性の増大によって測定される）を生じるが、正味の正の結果は、予期されたものより低くなり得、一部の場合では、予期されたものより高くなり得る。他の事例では、このような組合せは、正味の中立効果または正味の負の効果を生む。この現象は、上位性と呼ばれ、微生物操作（および一般に遺伝子操作）の基本的な課題の１つである。
【０２５７】
上述した通り、本ＨＴＰゲノム操作プラットフォームは、伝統的な微生物操作手法に関連した問題の多くを解決する。本ＨＴＰプラットフォームは、自動化技術を使用して、数百または数千の遺伝子変異を一度に実施する。特定の態様では、上述した合理的手法と異なり、開示したＨＴＰプラットフォームは、その全体が本明細書に参照により組み込まれている、Microbial  Strain  Design  System  And  Methods  For  Improved  Large-Scale  Production  Of  Engineered  Nucleotide  Sequencesという表題の米国出願第１５／１４０，２９６号に開示されている通り、数千の変異体の並列構築を可能にして、関連したゲノム空間の大きいサブセットをより有効に探索する。「あらゆること」を試すことによって、本ＨＴＰプラットフォームは、本発明者らの限られた生物学的理解によって誘導される困難を回避する。
【０２５８】
しかし同時に、本ＨＴＰプラットフォームは、ゲノム空間の組合せによる爆発的サイズ、および遺伝的相互作用の複雑性を考慮して生成されたデータセットを解明する計算手法の有効度によって基本的に制限されるという問題に直面する。所望の結果を生じる組合せの非ランダム選択を最大にするやり方で広大なコンビナトリアル空間のサブセットを探索する技法が必要とされる。
【０２５９】
いくぶん類似のＨＴＰ手法が、酵素最適化の場合において有効であると証明された。このニッチな問題において、目的のゲノム配列（１０００塩基の程度の）は、物理的構成が幾分複雑なタンパク質鎖をコードする。正確な構成は、その構成要素の原子成分間の集団電磁相互作用によって決定される。短いゲノム配列および物理的に制約された折り畳み問題のこの組合せは、貪欲最適化ストラテジーに具体的に役に立つ。すなわち、あらゆる残基において配列を個々に変異させ、結果として生じる変異体をシャッフルして、配列活性応答モデル化（Sequence  Activity  Response  modeling）に適合する分解能で局所的配列空間を有効にサンプリングすることが可能である。
【０２６０】
しかし、生体分子の完全ゲノム最適化に関して、このような残基中心の手法は、いくつかの重要な理由で不十分である。第１に、生体分子のゲノム最適化に伴う関連した配列空間の指数関数的増大のため。第２に、生体分子合成における調節、発現、および代謝相互作用の複雑性の追加のため。本発明者らは、教示される上位性マッピング手順を介してこれらの問題を解決した。
【０２６１】
変異のコレクション間の上位性相互作用を、前記変異を１つまたは複数の遺伝的バックグラウンド内により効率的かつ有効に統合する目的で、モデル化するための教示される方法は、当技術分野において革新的であり、高度に必要とされる。
【０２６２】
上位性マッピング手順を記述する場合、用語「より効率的な」および「より有効な」は、特定の表現型の目的に関して統合株の中での望ましくない上位性相互作用の回避を指す。
【０２６３】
プロセスを上記で一般に詳しく述べてきたので、より具体的なワークフロー例を次に記載する。
【０２６４】
第１に、Ｍ個の変異のライブラリーおよび１つまたは複数の遺伝的バックグラウンド（例えば、親菌株）から始める。ライブラリーの選択も遺伝的バックグラウンドの選択も、ここに記載した方法に特異的でない。しかし特定のインプリメンテーションでは、変異のライブラリーは、もっぱら、または組合せで：ＳＮＰスワップライブラリー、プロモータースワップライブラリー、トランスポゾン変異誘発ライブラリー、または本明細書に記載の任意の他の変異ライブラリー、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【０２６５】
一インプリメンテーションでは、単一の遺伝的バックグラウンドのみが提供される。この場合、別個の遺伝的バックグラウンド（微生物変異体）のコレクションが、この単一のバックグラウンドから最初に生成される。これは、変異の一次ライブラリー（またはそのあるサブセット）を所与のバックグラウンドに適用して、例えば、特定のＳＮＰのＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーまたは特定のプロモーターのＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを所与の遺伝的バックグラウンドに適用して、それに組み入れられている所与のＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーからの特定の遺伝子変更を除いて同一の遺伝的バックグラウンドを有する微生物変異体の集団（おそらく１００または１，０００）を生み出すことによって達成され得る。以下に詳述する通り、この実施形態は、コンビナトリアルライブラリーまたはペアワイズライブラリーをもたらし得る。
【０２６６】
別のインプリメンテーションでは、別個の公知の遺伝的バックグラウンドのコレクションを単に与えることができる。以下に詳述する通り、この実施形態は、コンビナトリアルライブラリーのサブセットをもたらし得る。
【０２６７】
特定のインプリメンテーションでは、遺伝的バックグラウンドの数およびこれらのバックグラウンド間の遺伝的多様性（変異の数または配列編集距離などで測定した）は、この方法の有効度を最大にするように決定される。
【０２６８】
遺伝的バックグラウンドは、天然の、生来の、もしくは野生型株、または変異された、操作された株であり得る。Ｎ個の別個のバックグラウンド株は、ベクトルｂで表すことができる。一例では、バックグラウンドｂは、Ｎ個の一次変異ｍ０＝（ｍ１、ｍ２、…  ｍＮ）を野生型バックグラウンド株ｂ０に適用して、Ｎ個の変異されたバックグラウンド株ｂ＝ｍ０ｂ０＝（ｍ１ｂ０、ｍ２ｂ０、…  ｍＮ  ｂ０）（式中、ｍｉｂ０は、変異ｍｉのバックグラウンド株ｂ０への適用を表す）を形成することによって形成される操作されたバックグラウンドを表すことができる。
【０２６９】
いずれの場合にも（すなわち、単一の提供された遺伝的バックグラウンドまたは遺伝的バックグラウンドのコレクション）、結果は、Ｎ個の遺伝的に別個のバックグラウンドのコレクションである。関連した表現型が各バックグラウンドについて測定される。
【０２７０】
第２に、Ｍ個の変異のコレクションｍ１内の各変異が、Ｎ個のバックグラウンド株ｂのコレクション内の各バックグラウンドに適用されて、Ｍ×Ｎ個の変異体のコレクションが形成される。Ｎ個のバックグラウンドが変異の一次セットｍ０（上述した）を適用することによってそれ自体得られたインプリメンテーションでは、変異体の結果として生じるセットは、時に、コンビナトリアルライブラリーまたはペアワイズライブラリーと呼ばれる。公知のバックグラウンドのコレクションが明示的に提供された別のインプリメンテーションでは、変異体の結果として生じるセットは、コンビナトリアルライブラリーのサブセットと呼ぶことができる。操作されたバックグラウンドベクトルの生成と同様に、諸実施形態では、入力インターフェース２０２は、変異ベクトルｍ１およびバックグラウンドベクトルｂ、ならびに外積などの指定されたオペレーションを受け取る。
【０２７１】
上記操作されたバックグラウンド例を続けて、Ｍ×Ｎコンビナトリアルライブラリーの形成は、ｍ１×ｍ０ｂ０、ｂ＝ｍ０ｂ０のＮ個のバックグラウンドに適用されたｍ１の外積によって形成された行列によって表すことができ、この場合、ｍ１中の各変異は、ｂ内の各バックグラウンド株に適用される。結果として生じるＭ×Ｎ行列の各ｉ番目の行は、バックグラウンドコレクションｂ内のすべての株へのｍ１内のｉ番目の変異の適用を表す。一実施形態では、ｍ１＝ｍ０であり、行列は、出発株ｂ０への同じ変異のペアワイズ適用を表す。その場合、行列は、その対角線回りで対称であり（Ｍ＝Ｎ）、対角線は、任意の分析において無視することができ、その理由は、それが同じ変異の２回の適用を表すためである。
【０２７２】
諸実施形態では、Ｍ×Ｎ行列の形成は、入力インターフェース２０２に化合物発現ｍ１×ｍ０ｂ０を入力することによって達成することができる。発現のコンポーネントベクトルは、直接入力することができ、これらの要素は、１つもしくは複数のＤＮＡ仕様を介して、またはインタープリター２０４によるインタープリテーション中にベクトルの検索を可能にするライブラリー２０６への呼出しとして明示的に指定される。「Microbial  Strain  Design  System  and  Methods  for  Improved  Large  Scale  Production  of  Engineered  Nucleotide  Sequences」という表題の米国特許出願第１５／１４０，２９６号に記載されている通り、インタープリター２０４、実行エンジン２０７、発注エンジン（order  placement  engine）２０８、およびファクトリー２１０を介して、ＬＩＭＳシステム２００は、入力された発現によって指定された微生物株を生成する。
【０２７３】
第３に、図２４のフローチャートを参照すると、分析装置２１４（図２０）は、Ｍ×Ｎコンビナトリアルライブラリー行列（４２０２）内の各変異体について表現型応答を測定する。したがって、応答のコレクションは、Ｍ×Ｎ応答行列Ｒと解釈することができる。Ｒの各要素は、ｒｉｊ＝ｙ（ｍｉ，ｍｊ）として表すことができ、式中、ｙは、変異ｍｉによって変異された、操作されたコレクションｂ内のバックグラウンド株ｂｊの応答（性能）を表す。単純性および実用性のために、本発明者らは、ペアワイズ変異を仮定し、この場合、ｍ１＝ｍ０である。今回の場合のように、変異のセットがペアワイズ変異ライブラリーを表す場合、結果として生じる行列は、遺伝子相互作用行列、またはより特定すれば、変異相互作用行列とも呼ばれる場合がある。
【０２７４】
当業者は、一部の実施形態では、上位性効果および予測的株設計に関するオペレーションは、ＬＩＭＳシステム２００の自動手段を通じて、例えば、分析装置２１４によって、または人によるインプリメンテーションによって、または自動化手段およびマニュアル手段の組合せを通じて完全に実施することができることを認識する。オペレーションが完全に自動化されていない場合、ＬＩＭＳシステム２００のエレメント、例えば、分析装置２１４は、例えば、その独自のオペレーション可能な能力を通じた結果を生成するのではなく、オペレーションを人が遂行した結果を受け取ることができる。本明細書の他の場所で記載されている通り、分析装置２１４などのＬＩＭＳシステム２００のコンポーネントは、１つまたは複数のコンピューターシステムによって完全または部分的にインプリメントすることができる。一部の実施形態では、特に、予測的株設計に関するオペレーションが自動化手段およびマニュアル手段の組合せによって実施される場合、分析装置２１４は、コンピューターハードウェア、ソフトウェア、もしくはファームウェア（またはこれらの組合せ）だけでなく、以下の表３に列挙されたもの、例えば、「性能を評価する」のカテゴリー下に列挙された装置などの人のオペレーターが運転する装置も含み得る。
【０２７５】
第４に、分析装置２１２は、応答行列を正規化する。正規化は、バイアスを除去し、かつ／またはこの方法に特異的な効果の関連した部分を単離する目的で測定された応答値を調整するマニュアルおよび／またはこの実施形態では、自動化プロセスからなる。図２４に関して、第１のステップ４２０２は、正規化された測定データを得ることを含み得る。一般に、予測的株設計および上位性マッピングを対象とする請求項において、用語「性能尺度」または「測定された性能」などは、未処理であっても、何らかの様式で処理された、例えば、正規化データであっても測定データを反映する測定基準を記述するのに使用され得る。特定のインプリメンテーションでは、正規化は、測定された応答値から先に測定されたバックグラウンド応答を減じることによって実施することができる。そのインプリメンテーションでは、結果として生じる応答要素は、ｒｉｊ＝ｙ（ｍｉ，ｍｊ）−ｙ（ｍｊ）として形成することができ、式中、ｙ（ｍｊ）は、一次変異ｍｊを親株ｂ０に適用することによって引き起こされた操作されたコレクションｂ内の操作されたバックグラウンド株ｂｊの応答である。正規化された応答行列の各行は、その対応する変異の応答プロファイルとして扱われることに留意されたい。すなわち、ｉ番目の行は、ｊ＝１〜Ｎについてすべてのバックグラウンド株ｂｊに適用された対応する変異ｍｉの相対的効果を記述する。
【０２７６】
ペアワイズ変異の例に関して、２つの変異の結果として生じる株の組み合わされた性能／応答は、個々に、変異のそれぞれに対する株の性能／応答より大きい、小さい、またはそれに等しい場合がある。この効果は、「上位性」として公知であり、一部の実施形態では、ｅｉｊ＝ｙ（ｍｉ，ｍｊ）−（ｙ（ｍｉ）＋ｙ（ｍｊ））として表すことができる。この数学的表現の変形は、可能であり、例えば、どのように個々の変化が生物学的に相互作用するかに依存し得る。上述したように、同じ機能群からの変異は、同じ機構によって働く可能性が高く、よって、全体的な宿主性能に対して負または中立の上位性を呈する可能性が高い。対照的に、異なる機能群からの変異は、独立した機構によって働く可能性が高く、それは、例えば、重複する変異効果を低減することによって宿主性能の改善をもたらし得る。よって、同じでない応答を生じる変異は、同様の応答を生じる変異より相加的な様式で組み合わさる可能性が高い。これは、次ステップにおける類似度の計算につながる。
【０２７７】
第５に、分析装置２１４は、応答の中の類似度、ペアワイズ変異例では、応答行列（４２０４）内のｉ番目の変異の効果とｊ番目（例えば、一次）変異の効果との間の類似度を測定する。Ｒのｉ番目の行は、Ｎ個のバックグラウンド株上のｉ番目の変異ｍｉの性能効果を表し、そのそれぞれは、それ自体上述した操作された変異の結果であり得ることを想起されたい。よって、ｉ番目の変異の効果とｊ番目の変異の効果との間の類似度は、ｉ番目の行とｊ番目の行との間の類似度ｓｉｊ、それぞれρｉおよびρｊによって表されて類似度行列Ｓを形成することができ、その一例は、図７に例示されている。類似度は、多くの公知の技法、例えば、相互相関または絶対余弦類似度、例えば、ｓｉｊ＝ａｂｓ（ｃｏｓ（ρｉ，ρｊ））を使用して測定され得る。
【０２７８】
余弦類似度のような測定基準の代替または補足として、応答プロファイルをクラスター化して類似度の程度を決定することができる。クラスタリングは、適当な距離尺度（例えば、Ｅｕｃｌｉｄｅａｎ、Ｈａｍｍｉｎｇなど）と併せて距離に基づくクラスタリングアルゴリズム（例えば、ｋ−平均、階層的凝縮型など）を使用することによって実施することができる。代替として、クラスタリングは、適当な類似度尺度（例えば、余弦、相関など）とともに類似度に基づくクラスタリングアルゴリズム（例えば、スペクトル、ミンカットなど）を使用して実施することができる。もちろん、任意の数の標準的な機能的なオペレーション（例えば、指数関数）を介して類似度尺度にマッピングすることができ、逆もまた同様である。一インプリメンテーションでは、階層的凝縮型クラスタリングを絶対余弦類似度と併せて使用することができる（図８Ａを参照）。
【０２７９】
クラスタリングの一例として、Ｃを変異ｍｉのｋ個の別個クラスターへのクラスタリングとする。Ｃを、ｃｉｊが、変異ｉがクラスターｊに属する程度、０から１の値であるクラスターメンバーシップ行列とする。そのとき、変異ｉとｊとの間のクラスターに基づく類似度は、Ｃｉ×Ｃｊ（Ｃのｉ番目の行とｊ番目の行とのドット積）によって与えられる。一般に、クラスターに基づく類似度行列は、ＣＣＴ（すなわち、Ｃ×Ｃ−転置行列）によって与えられる。ハードクラスタリング（変異が正確に１つのクラスターに属する）の場合では、２つの変異間の類似度は、これらが同じクラスターに属する場合、１であり、そうでない場合、０である。
【０２８０】
Costanzo、The  Genetic  Landscape  of  a  Cell、Science、３２７巻、５９６４号、２０１０年１月２２日、４２５〜４３１頁（その全体が本明細書に参照により組み込まれている）に記載されている通り、変異応答プロファイルのこのようなクラスタリングは、細胞の根本的な機能的な機構のおおよそのマッピングに関係する。すなわち、一緒にクラスター化する変異は、根本的な生物学的プロセスまたは代謝経路に関係付けられる傾向がある。このような変異は、「機能群」と本明細書で呼ばれる。この方法の重要な知見は、２つの変異が同じ生物学的プロセスまたは経路によって働く場合、観察される効果（特に観察される利益）は、重複し得ることである。反対に、２つの変異が遠位機構によって働く場合、有益な効果が重複する可能性は低い。
【０２８１】
第６に、上位性効果に基づいて、分析装置２１４は、図２４（４２０６）に示した通り、同じでない応答に至る変異の対を選択し、例えば、これらの余弦類似度測定基準は、類似度閾値未満に入り、またはこれらの応答は、十分に分離したクラスター内に入る（例えば、図７および図８Ａにおける）。これらの相違点に基づいて、選択された変異の対は、同様の対より良好にバックグラウンド株内に統合するはずである。
【０２８２】
十分に異なった応答に至る選択された変異の対に基づいて、ＬＩＭＳシステム（例えば、インタープリター２０４、実行エンジン２０７、発注依頼者（order  placer）２０８、およびファクトリー２１０のすべて、またはある組合せ）を使用して、これらの選択された変異を有する微生物株を設計することができる（４２０８）。諸実施形態では、本明細書で以下に、かつ他の場所で記載する通り、上位性効果を、予測モデルに組み入れる、またはそれと併せて使用して株選択を重み付けまたは選別することができる。
【０２８３】
ある好適な予測モデルを介してライブラリーからの変異のコレクションを特定のバックグラウンド内に統合することによって得られる仮定の株の性能（別名スコア）を推定することが可能であると仮定される。教示される方法で利用される代表的な予測モデルは、「ゲノムワイド遺伝子設計判定基準の効果のコンピューター分析および予測」というより大きいセクションに見出される「予測的株設計」という表題の以下のセクションに提供されている。
【０２８４】
線形回帰などの予測的株設計技法を使用する場合、分析装置２１４は、例えば、回帰結果を選別して十分に同じでない変異のみを保存することによって、低い類似度尺度を有する変異にモデルを制限することができる。代替として、予測モデルは、類似度行列を用いて重み付けることができる。例えば、一部の実施形態は、類似度行列を使用する重み付き最小二乗回帰を使用して、提案された変異の相互依存性を特徴付けることができる。一例として、重み付けは、回帰モデルに「カーネル」トリックを施すことによって実施することができる。（「カーネルトリック」が多くの機械学習モデル化手法に一般的である程度に、この再重み付けストラテジーは、線形回帰に制限されない）。
【０２８５】
このような方法は、当業者に公知である。諸実施形態では、カーネルは、要素１−ｗ＊ｓｉｊを有する行列であり、式中、１は、恒等行列の要素であり、ｗは、０から１の間の実数値である。ｗ＝０であるとき、これは、標準回帰モデルに変換される。実際には、ｗの値は、ペアワイズコンビナトリアルコンストラクトおよびこれらの付随効果ｙ（ｍｉ，ｍｊ）に対して評価されるとき、予測モデルの精度（ｒ２値または二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥ））に関係する。１つの単純なインプリメンテーションでは、ｗは、ｗ＝１−ｒ２と定義される。この場合、モデルが完全に予測的であるとき、ｗ＝１−ｒ２＝０であり、統合は、予測モデルだけに基づき、上位性マッピング手順は、役割を果たさない。一方、予測モデルがまったく予測的でない場合、ｗ＝１−ｒ２＝１であり、統合は、上位性マッピング手順だけに基づく。各反復中、精度を評価してモデル性能が改善しているかどうかを決定することができる。
【０２８６】
本明細書に記載の上位性マッピング手順は、どのモデルが分析装置２１４によって使用されているかに依存しないことが明らかであるはずである。このような予測モデルを考慮すると、コンビナトリアル統合（combinatorial  consolidation）を介して変異ライブラリーにアクセス可能なすべての仮定の株をスコア付けおよびランク付けすることが可能である。
【０２８７】
一部の実施形態では、上位性効果を説明するために、同じでない変異応答プロファイルを分析装置２１４が使用して、予測モデルからの各仮定の株に関連したスコアおよびランクを強化することができる。この手順は、同じでない応答プロファイルを有する候補株（例えば、多様なクラスターから引き出される株）を支持するための、スコアの再重み付けとして広く考えることができる。１つの単純なインプリメンテーションでは、株は、相違点閾値を満たさない、または同じクラスターから引き出された構成要素の変異（適当な重み付けを有する）の数によって低減されたそのスコアを有し得る。特定のインプリメンテーションでは、仮定の株の性能推定値は、仮定の株に関連した構成要素の変異（やはり適当な重み付けを有する）のすべての対に関連した類似度行列の項の和によって低減され得る。仮定の株は、これらの強化されたスコアを使用して再ランク付けすることができる。実際には、このような再重み付け算出は、最初のスコア推定値と併せて実施することができる。
【０２８８】
結果は、混乱させる上位性相互作用をより有効に回避するように強化されたスコアおよびランクを有する仮定の株のコレクションである。仮定の株をこの時構築することができ、またはこれらは、続いて分析または使用するために別の計算方法に送ることができる。
【０２８９】
当業者は、本明細書に記載の上位性マッピングおよび反復性予測的株設計は、ペアワイズ変異のみを使用することに限定されず、はるかに多くの変異をバックグラウンド株に同時に適用するように拡張することができることを認識する。別の実施形態では、追加の変異を、本明細書に記載の予測方法に従って選択された変異を使用して既に変異された株に順次適用することができる。別の実施形態では、上位性効果は、互いにわずかに異なるいくつかの株バックグラウンドに同じ遺伝子変異を適用し、改変された株バックグラウンドの中の正の応答プロファイルにおける任意の有意差に留意することによってインピュートされる。
【０２９０】
遺伝子設計に受け入れられる生物体
開示されるＨＴＰゲノム操作プラットフォームは、工業用微生物細胞培養物（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ａ．ｎｉｇｅｒおよびＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐｐ）で例示されるが、所望の形質を遺伝子変異体の集団内で同定することができる任意の宿主細胞生物体に適用可能である。
【０２９１】
よって、本明細書で使用される場合、用語「微生物」は、広く解釈されるべきである。これは、これらに限定されないが、２つの原核生物ドメイン、細菌および古細菌、ならびにある特定の真核真菌および原生生物を含む。しかし、ある特定の態様では、「高等」真核生物、例えば、昆虫、植物、および動物を本明細書に教示の方法において利用することができる。
【０２９２】
適当な宿主細胞としては、これらに限定されないが、細菌細胞、藻類細胞、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。一例示的な実施形態では、適当な宿主細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ  ｉｎ  Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓ．から入手可能なＳＨｕｆｆｌｅ（商標）コンピテントＥ．ｃｏｌｉ）が含まれる。
【０２９３】
Ｅ．ｃｏｌｉ種の適当な宿主株は、腸内毒素原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ）、腸管病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸管侵入性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＩＥＣ）、腸管出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）、尿路疾患性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）、ベロ毒素産生性Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１０４：Ｈ４、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１２１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１０４：Ｈ２１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＣ１０１を含む。
【０２９４】
一部の実施形態では、本開示は、Ｅ．  ｃｏｌｉ株ＮＣＴＣ  １２７５７、ＮＣＴＣ  １２７７９、ＮＣＴＣ  １２７９０、ＮＣＴＣ  １２７９６、ＮＣＴＣ  １２８１１、ＡＴＣＣ  １１２２９、ＡＴＣＣ  ２５９２２、ＡＴＣＣ  ８７３９、ＤＳＭ  ３００８３、ＢＣ  ５８４９、ＢＣ  ８２６５、ＢＣ  ８２６７、ＢＣ  ８２６８、ＢＣ  ８２７０、ＢＣ  ８２７１、ＢＣ  ８２７２、ＢＣ  ８２７３、ＢＣ  ８２７６、ＢＣ  ８２７７、ＢＣ  ８２７８、ＢＣ  ８２７９、ＢＣ  ８３１２、ＢＣ  ８３１７、ＢＣ  ８３１９、ＢＣ  ８３２０、ＢＣ  ８３２１、ＢＣ  ８３２２、ＢＣ  ８３２６、ＢＣ  ８３２７、ＢＣ  ８３３１、ＢＣ  ８３３５、ＢＣ  ８３３８、ＢＣ  ８３４１、ＢＣ  ８３４４、ＢＣ  ８３４５、ＢＣ  ８３４６、ＢＣ  ８３４７、ＢＣ  ８３４８、ＢＣ  ８８６３およびＢＣ  ８８６４のゲノム操作を教示する。
【０２９５】
一部の実施形態では、本開示は、ベロ細胞毒素産生性（ｖｅｒｏｃｙｔｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ）のＥ．  ｃｏｌｉ（ＶＴＥＣ）、例えば、株ＢＣ  ４７３４（Ｏ２６：Ｈ１１）、ＢＣ  ４７３５（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ４７３６  、ＢＣ  ４７３７（ｎ．ｄ．）、ＢＣ  ４７３８（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ  ４９４５（Ｏ２６：Ｈ−）、ＢＣ  ４９４６（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ  ４９４７（Ｏ１１１：Ｈ−）、ＢＣ  ４９４８（Ｏ１５７：Ｈ）、ＢＣ  ４９４９（Ｏ５）、ＢＣ  ５５７９（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ  ５５８０（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ  ５５８２（Ｏ３：Ｈ）、ＢＣ  ５６４３（Ｏ２：Ｈ５）、ＢＣ  ５６４４（Ｏ１２８）、ＢＣ  ５６４５（Ｏ５５：Ｈ−）、ＢＣ  ５６４６（Ｏ６９：Ｈ−）、ＢＣ  ５６４７（Ｏ１０１：Ｈ９）、ＢＣ  ５６４８（Ｏ１０３：Ｈ２）、ＢＣ  ５８５０（Ｏ２２：Ｈ８）、ＢＣ  ５８５１（Ｏ５５：Ｈ−）、ＢＣ  ５８５２（Ｏ４８：Ｈ２１）、ＢＣ  ５８５３（Ｏ２６：Ｈ１１）、ＢＣ  ５８５４（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ  ５８５５（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ５８５６（Ｏ２６：Ｈ−）、ＢＣ  ５８５７（Ｏ１０３：Ｈ２）、ＢＣ  ５８５８（Ｏ２６：Ｈ１１）、ＢＣ  ７８３２、ＢＣ  ７８３３（Ｏ生形態（ｒａｗ  ｆｏｒｍ）：Ｈ−）、ＢＣ  ７８３４（ＯＮＴ：Ｈ−）、ＢＣ  ７８３５（Ｏ１０３：Ｈ２）、ＢＣ  ７８３６（Ｏ５７：Ｈ−）、ＢＣ  ７８３７（ＯＮＴ：Ｈ−）、ＢＣ  ７８３８、ＢＣ  ７８３９（Ｏ１２８：Ｈ２）、ＢＣ  ７８４０（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ７８４１（Ｏ２３：Ｈ−）、ＢＣ  ７８４２（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ７８４３、ＢＣ  ７８４４（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ７８４５（Ｏ１０３：Ｈ２）、ＢＣ  ７８４６（Ｏ２６：Ｈ１１）、ＢＣ  ７８４７（Ｏ１４５：Ｈ−）、ＢＣ  ７８４８（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ７８４９（Ｏ１５６：Ｈ４７）、ＢＣ  ７８５０、ＢＣ  ７８５１（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ７８５２（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ７８５３（Ｏ５：Ｈ−）、ＢＣ  ７８５４（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ  ７８５５（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ  ７８５６（Ｏ２６：Ｈ−）、ＢＣ  ７８５７、ＢＣ  ７８５８、ＢＣ  ７８５９（ＯＮＴ：Ｈ−）、ＢＣ  ７８６０（Ｏ１２９：Ｈ−）、ＢＣ  ７８６１、ＢＣ  ７８６２（Ｏ１０３：Ｈ２）、ＢＣ  ７８６３、ＢＣ  ７８６４（Ｏ生形態：Ｈ−）、ＢＣ  ７８６５、ＢＣ  ７８６６（Ｏ２６：Ｈ−）、ＢＣ  ７８６７（Ｏ生形態：Ｈ−）、ＢＣ  ７８６８、ＢＣ  ７８６９（ＯＮＴ：Ｈ−）、ＢＣ  ７８７０（Ｏ１１３：Ｈ−）、ＢＣ  ７８７１（ＯＮＴ：Ｈ−）、ＢＣ  ７８７２（ＯＮＴ：Ｈ−）、ＢＣ  ７８７３、ＢＣ  ７８７４（Ｏ生形態：Ｈ−）、ＢＣ  ７８７５（Ｏ１５７：Ｈ−）、ＢＣ  ７８７６（Ｏ１１１：Ｈ−）、ＢＣ  ７８７７（Ｏ１４６：Ｈ２１）、ＢＣ  ７８７８（Ｏ１４５：Ｈ−）、ＢＣ  ７８７９（Ｏ２２：Ｈ８）、ＢＣ  ７８８０（Ｏ生形態：Ｈ−）、ＢＣ  ７８８１（Ｏ１４５：Ｈ−）、ＢＣ  ８２７５（Ｏ１５７：Ｈ７）、ＢＣ  ８３１８（Ｏ５５：Ｋ−：Ｈ−）、ＢＣ  ８３２５（Ｏ１５７：Ｈ７）、およびＢＣ  ８３３２（ＯＮＴ）、ＢＣ  ８３３３を教示する。
【０２９６】
一部の実施形態では、本開示は、腸管侵入性Ｅ．  ｃｏｌｉ（ＥＩＥＣ）、例えば、株ＢＣ  ８２４６（Ｏ１５２：Ｋ−：Ｈ−）、ＢＣ  ８２４７（Ｏ１２４：Ｋ（７２）：Ｈ３）、ＢＣ  ８２４８（Ｏ１２４）、ＢＣ  ８２４９（Ｏ１１２）、ＢＣ  ８２５０（Ｏ１３６：Ｋ（７８）：Ｈ−）、ＢＣ  ８２５１（Ｏ１２４：Ｈ−）、ＢＣ  ８２５２（Ｏ１４４：Ｋ−：Ｈ−）、ＢＣ  ８２５３（Ｏ１４３：Ｋ：Ｈ−）、ＢＣ  ８２５４（Ｏ１４３）、ＢＣ  ８２５５（Ｏ１１２）、ＢＣ  ８２５６（Ｏ２８ａ．ｅ）、ＢＣ  ８２５７（Ｏ１２４：Ｈ−）、ＢＣ  ８２５８（Ｏ１４３）、ＢＣ  ８２５９（Ｏ１６７：Ｋ−：Ｈ５）、ＢＣ  ８２６０（Ｏ１２８ａ．ｃ．：Ｈ３５）、ＢＣ  ８２６１（Ｏ１６４）、ＢＣ  ８２６２（Ｏ１６４：Ｋ−：Ｈ−）、ＢＣ  ８２６３（Ｏ１６４）、およびＢＣ  ８２６４（Ｏ１２４）を教示する。
【０２９７】
一部の実施形態では、本開示は、腸内毒素原性Ｅ．  ｃｏｌｉ（ＥＴＥＣ），ｓｕｃｈ  ａｓ  ｓｔｒａｉｎｓ  ＢＣ  ５５８１（Ｏ７８：Ｈ１１）、ＢＣ  ５５８３（Ｏ２：Ｋ１）、ＢＣ  ８２２１（Ｏ１１８）、ＢＣ  ８２２２（Ｏ１４８：Ｈ−）、ＢＣ  ８２２３（Ｏ１１１）、ＢＣ  ８２２４（Ｏ１１０：Ｈ−）、ＢＣ  ８２２５（Ｏ１４８）、ＢＣ  ８２２６（Ｏ１１８）、ＢＣ  ８２２７（Ｏ２５：Ｈ４２）、ＢＣ  ８２２９（Ｏ６）、ＢＣ  ８２３１（Ｏ１５３：Ｈ４５）、ＢＣ  ８２３２（Ｏ９）、ＢＣ  ８２３３（Ｏ１４８）、ＢＣ  ８２３４（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８２３５（Ｏ１１８）、ＢＣ  ８２３７（Ｏ１１１）、ＢＣ  ８２３８（Ｏ１１０：Ｈ１７）、ＢＣ  ８２４０（Ｏ１４８）、ＢＣ  ８２４１（Ｏ６Ｈ１６）、ＢＣ  ８２４３（Ｏ１５３）、ＢＣ  ８２４４（Ｏ１５：Ｈ−）、ＢＣ  ８２４５（Ｏ２０）、ＢＣ  ８２６９（Ｏ１２５ａ．ｃ：Ｈ−）、ＢＣ  ８３１３（Ｏ６：Ｈ６）、ＢＣ  ８３１５（Ｏ１５３：Ｈ−）、ＢＣ  ８３２９、ＢＣ  ８３３４（Ｏ１１８：Ｈ１２）、およびＢＣ  ８３３９を教示する。
【０２９８】
一部の実施形態では、本開示は、腸管病原性Ｅ．  ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、ｓｕｃｈ  ａｓ  ｓｔｒａｉｎｓ  ＢＣ  ７５６７（Ｏ８６）、ＢＣ  ７５６８（Ｏ１２８）、ＢＣ  ７５７１（Ｏ１１４）、ＢＣ  ７５７２（Ｏ１１９）、ＢＣ  ７５７３（Ｏ１２５）、ＢＣ  ７５７４（Ｏ１２４）、ＢＣ  ７５７６（Ｏ１２７ａ）、ＢＣ  ７５７７（Ｏ１２６）、ＢＣ  ７５７８（Ｏ１４２）、ＢＣ  ７５７９（Ｏ２６）、ＢＣ  ７５８０（ＯＫ２６）、ＢＣ  ７５８１（Ｏ１４２）、ＢＣ  ７５８２（Ｏ５５）、ＢＣ  ７５８３（Ｏ１５８）、ＢＣ  ７５８４（Ｏ−）、ＢＣ  ７５８５（Ｏ−）、ＢＣ  ７５８６（Ｏ−）、ＢＣ  ８３３０、ＢＣ  ８５５０（Ｏ２６）、ＢＣ  ８５５１（Ｏ５５）、ＢＣ  ８５５２（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５５３（Ｏ２６）、ＢＣ  ８５５４（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５５５（Ｏ８６）、ＢＣ  ８５５６（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５５７（ＯＫ２６）、ＢＣ  ８５５８（Ｏ５５）、ＢＣ  ８５６０（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５６１（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５６２（Ｏ１１４）、ＢＣ  ８５６３（Ｏ８６）、ＢＣ  ８５６４（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５６５（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５６６（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５６７（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５６８（Ｏ１１１）、ＢＣ  ８５６９（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５７０（Ｏ１１４）、ＢＣ  ８５７１（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５７２（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５７３（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５７４（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５７５（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５７６（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５７７（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５７８（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５８１（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５８３（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５８４（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５８５（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５８６（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５８８（Ｏ２６）、ＢＣ  ８５８９（Ｏ８６）、ＢＣ  ８５９０（Ｏ１２７）、ＢＣ  ８５９１（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８５９２（Ｏ１１４）、ＢＣ  ８５９３（Ｏ１１４）、ＢＣ  ８５９４（Ｏ１１４）、ＢＣ  ８５９５（Ｏ１２５）、ＢＣ  ８５９６（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８５９７（Ｏ２６）、ＢＣ  ８５９８（Ｏ２６）、ＢＣ  ８５９９（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８６０５（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８６０６（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８６０７（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８６０８（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８６０９（Ｏ５５）、ＢＣ  ８６１０（Ｏ１１４）、ＢＣ  ８６１５（Ｏ１５８）、ＢＣ  ８６１６（Ｏ１２８）、ＢＣ  ８６１７（Ｏ２６）、ＢＣ  ８６１８（Ｏ８６）、ＢＣ  ８６１９、ＢＣ  ８６２０、ＢＣ  ８６２１、ＢＣ  ８６２２、ＢＣ  ８６２３、ＢＣ  ８６２４（Ｏ１５８）、およびＢＣ  ８６２５（Ｏ１５８）を教示する。
【０２９９】
一部の実施形態では、本開示は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ、およびＳｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉを含むＳｈｉｇｅｌｌａ生物体の操作のための方法も教示する。
【０３００】
本開示の他の適当な宿主生物としては、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の微生物が挙げられる。一部の実施形態では、好適なＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ株／種としては、寄託基準株がＤＳＭ４４５４９であるＣ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、寄託基準株がＡＴＣＣ１３０３２であるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、および寄託基準株がＡＴＣＣ６８７１であるＣ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓが挙げられる。一部の実施形態では、本開示の好適な宿主は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
【０３０１】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の、特に、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ種の適当な宿主株は、特に、公知の野生型株：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１５８０６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ  ＡＴＣＣ１７９６５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ  ＡＴＣＣ１４０２０；ならびにこれらから調製されるＬ−アミノ酸産生変異体または株、例えば、Ｌ−リシン産生株：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７０９、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７０８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  １７１２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  ６４６３、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＦＥＲＭ−Ｐ  ６４６４、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＭ５８−１、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＧ５２−５、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＳＭ５７１４、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＤＳＭ１２８６６などである。
【０３０２】
用語「Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ」も、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍについて使用されている。Ｃ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ種のいくつかの代表は、例えば、株ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９など、先行技術においてＣ．ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓとも呼ばれている。
【０３０３】
一部の実施形態では、本開示の宿主細胞は、真核細胞である。適当な真核宿主細胞としては、これらに限定されないが、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、動物細胞、および植物細胞が挙げられる。適当な真菌宿主細胞としては、これらに限定されないが、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ、Ｆｕｎｇｉ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉが挙げられる。ある特定の好適な真菌宿主細胞には、酵母細胞および糸状菌細胞が含まれる。適当な糸状菌宿主細胞としては、例えば、ＥｕｍｙｃｏｔｉｎａおよびＯｏｍｙｃｏｔａ亜門の任意のフィラメント形が挙げられる。（例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Hawksworthら、In  Ainsworth  and  Bisby's  Dictionary  of  The  Fungi、８版、１９９５年、CAB  International、University  Press、Cambridge、UKを参照）。糸状菌は、キチン、セルロース、および他の複合多糖から構成される細胞壁を有する栄養菌糸体によって特徴付けられる。糸状菌宿主細胞は、酵母と形態学的に別個のものである。
【０３０４】
ある特定の例示的であるが限定されない実施形態では、糸状菌宿主細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ、またはこれらのテレオモルフもしくはアナモルフおよび同義語もしくは分類学的均等物の種の細胞であり得る。一実施形態では、糸状菌は、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｓｏｊａｅ、およびＡ．ｎｉｇｅｒ群のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｉからなる群から選択される。一実施形態では、糸状菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒである。
【０３０５】
別の実施形態では、真菌種の特定の変異体が、本明細書に提供される方法およびシステムのために使用される。一実施形態では、本明細書に提供されるハイスループットおよび／または自動化方法およびシステムに適した真菌種の特定の変異体が使用される。このような変異体の例は、プロトプラストが非常に良好な株（strains  that  protoplast  very  well）；主として、またはより好ましくは、単核を有するプロトプラストのみを産生する株；マイクロタイタープレート中で効率的に再生する株、より速く再生する株および／またはポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）分子を効率的に取り込む株、低粘度の培養物、例えば、培養において、単一クローンの単離を防止し、かつ／または培養物の粘性を上昇させるほどもつれていない菌糸を産生する細胞などを産生する株、ランダム組込みが低減された（例えば、障害のある非相同末端接合経路）株、またはこれらの組合せであり得る。
【０３０６】
さらに別の実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムにおいて使用するための特定の変異体株は、例えば、ウリジン要求性変異体株などの選択可能マーカー遺伝子を欠く株であり得る。これらの変異体株は、それぞれｐｙｒＧまたはｐｙｒＥ遺伝子によってコードされるオロチジン５ホスフェートデカルボキシラーゼ（ＯＭＰＤ）またはオロテートｐ−リボシルトランスフェラーゼ（ＯＰＲＴ）のいずれかを欠損している場合がある（T.  Goosenら、Curr  Genet.、１９８７年、１１巻：４９９〜５０３頁；J.  Begueretら、Gene.、１９８４年、３２巻：４８７〜９２頁）。
【０３０７】
一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムにおいて使用するための具体的な変異体株は、より短い菌糸およびより酵母様の外観によって特徴付けられる緻密な細胞形態を有する株である。
【０３０８】
適当な酵母宿主細胞としては、これらに限定されないが、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、およびＹａｒｒｏｗｉａが挙げられる。一部の実施形態では、酵母細胞は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｄａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、またはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。
【０３０９】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、藻類細胞、例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｃ．Ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）およびＰｈｏｒｍｉｄｉｕｍ（Ｐ．ｓｐ．ＡＴＣＣ２９４０９）である。
【０３１０】
他の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。適当な原核細胞としては、グラム陽性、グラム陰性、およびグラム不定細菌細胞が挙げられる。宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓの種であり得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである。
【０３１１】
一部の実施形態では、細菌宿主株は、工業用株である。多数の細菌工業用株が公知であり、本明細書に記載の方法および組成物において適している。
【０３１２】
一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ、Ａ．ｒｕｂｉ）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ（例えば、Ａ．ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａ．ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａ．ｇｌｏｂｆｏｒｍｉｓ、Ａ．ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ、Ａ．ｍｙｓｏｒｅｎｓ、Ａ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ａ．ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ、Ａ．ｐｒｏｔｏｐｈｏｎｎｉａｅ、Ａ．ｒｏｓｅｏｐａｒａｆｆｉｎｕｓ、Ａ．ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ、Ａ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｒｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｂ．ａｌｋａｏｐｈｉｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、およびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のものである。特定の実施形態では、宿主細胞は、これらに限定されないが、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、およびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを含めた工業用Ｂａｃｉｌｌｕｓ株である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ  Ｅ８８、Ｃ．ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｅ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｅｒｗｉｎｉａ種（例えば、Ｅ．ｕｒｅｄｏｖｏｒａ、Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅ．ａｎａｎａｓ、Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅ．ｐｕｎｃｔａｔａ、Ｅ．ｔｅｒｒｅｕｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｐａｎｔｏｅａ種（例えば、Ｐ．ｃｉｔｒｅａ、Ｐ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種（例えば、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｅｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｕｂｅｒｉｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種（例えば、Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ���である。一部の実施形態では、宿主細胞は、工業用Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｚ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、などである。
【０３１３】
本開示は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト（２９３、ＷＩ３８、ＰＥＲ．Ｃ６、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞を含む）、マウス（３Ｔ３、ＮＳ０、ＮＳ１、Ｓｐ２／０を含む）、ハムスター（ＣＨＯ、ＢＨＫ）、サル（ＣＯＳ、ＦＲｈＬ、Ｖｅｒｏ）、およびハイブリドーマ細胞株を含めて、様々な動物細胞型での使用にも適している。
【０３１４】
様々な実施形態では、原核生物株および真核生物株の両方を含めた本開示の実践において使用され得る株は、いくつかの培養株コレクション、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）から公的に容易にアクセス可能である。
【０３１５】
一部の実施形態では、本開示の方法は、多細胞生物にも適用可能である。例えば、プラットフォームは、作物の性能を改善するのに使用することができる。生物体は、複数の植物、例えば、Ｇｒａｍｉｎｅａｅ、Ｆｅｔｕｃｏｉｄｅａｅ、Ｐｏａｃｏｉｄｅａｅ、Ａｇｒｏｓｔｉｓ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｓｏｒｇｕｍ、Ｓｅｔａｒｉａ、Ｚｅａ、Ｏｒｙｚａ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ａｖｅｎａ、Ｈｏｒｄｅｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ、Ｐｏａ、Ｆｅｓｔｕｃａ、Ｓｔｅｎｏｔａｐｈｒｕｍ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｃｏｉｘ、Ｏｌｙｒｅａｅ、Ｐｈａｒｅａｅ、Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ、またはＬｅｇｕｍｉｎｏｓａｅを含み得る。例えば、植物は、トウモロコシ、イネ、ダイズ、綿、コムギ、ライムギ、カラスムギ、オオムギ、エンドウマメ、マメ、レンズマメ、ピーナッツ、ヤムビーン、ササゲ、ハッショウマメ、クローバー、アルファルファ、ルピナス、カラスノエンドウ、ハス、スイートクローバー、フジ、スイートピー、モロコシ、キビ、ヒマワリ、キャノーラなどであり得る。同様に、生物体は、複数の動物、例えば、非ヒト哺乳動物、魚、昆虫などを含み得る。
【０３１６】
遺伝子設計＆ＨＴＰ微生物操作プラットフォームにおいて利用するための遺伝的多様性プールの生成
一部の実施形態では、本開示の方法は、遺伝子設計として特徴付けられる。本明細書で使用される場合、用語の遺伝子設計は、新しい優れた宿主細胞を設計および生み出すために特定の遺伝子、遺伝子の部分、プロモーター、停止コドン、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または他のＤＮＡ配列の最適のバリアントを同定および選択することによる宿主生物のゲノムの再構築または変更を指す。
【０３１７】
一部の実施形態では、本開示の遺伝子設計法における第１のステップは、新しい宿主ゲノムを再構築することができる複数の配列バリエーションを有する最初の遺伝的多様性プール集団を得ることである。
【０３１８】
一部の実施形態では、本明細書に教示の遺伝子設計法における後続のステップは、上述のＨＴＰ分子ツールセット（例えば、ＳＮＰスワッピングまたはプロモータースワッピングまたはトランスポゾン変異誘発）の１つまたは複数を使用して、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを構築することであり、次いでこのライブラリーは、宿主細胞において試験するための特定のゲノム変更のライブラリーを提供することによってゲノム操作プロセスのドライバーとして機能する。
【０３１９】
既存の野生型株からの多様性プールの利用
一部の実施形態では、本開示は、所与の野生型集団の微生物の中に存在する配列多様性を同定するための方法を教示する。したがって、多様性プールは、分析に利用される所与の数ｎの野生型微生物であり得、前記微生物のゲノムは、「多様性プール」を代表する。
【０３２０】
一部の実施形態では、多様性プールは、前記野生型微生物の中で天然の遺伝的バリエーション中に存在する既存の多様性の結果であり得る。このバリエーションは、所与の宿主細胞の株バリアントから生じる場合があり、または完全に異なる種である微生物の結果である場合がある。遺伝的バリエーションは、天然に存在するか否かにかかわらず、株の遺伝子配列の任意の差異を含み得る。一部の実施形態では、遺伝的バリエーションは、とりわけ、ＳＮＰスワップ、ＰＲＯスワップ、開始／停止コドンスワップ、またはＳＴＯＰスワップを含み得る。
【０３２１】
既存の工業用株バリアントからの多様性プールの利用
本開示の他の実施形態では、多様性プールは、伝統的な株改良プロセスの間に創製された株バリアント（例えば、ランダム変異を介して生成され、長年にわたって収率改善のために選択された１種または複数の宿主生物株）である。よって、一部の実施形態では、多様性プールまたは宿主生物は、歴史的な産生株のコレクションを含み得る。
【０３２２】
特定の態様では、多様性プールは、特定の時点で「ベースライン」遺伝子配列を有する元の親微生物株（Ｓ１）（Ｓ１Ｇｅｎ１）、およびさらに、前記Ｓ１株に由来し、／それから開発された、かつＳ１のベースラインゲノムに関して異なるゲノムを有する任意の数の後続の子孫株（Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５など、Ｓ２−ｎに一般化可能）（Ｓ２−ｎＧｅｎ２−ｎ）であり得る。
【０３２３】
例えば、一部の実施形態では、本開示は、多様性プール内の微生物ゲノムをシーケンシングして各株に存在するＳＮＰを同定することを教示する。一実施形態では、多様性プールの株は、歴史的な微生物産生株である。よって、本開示の多様性プールは、例えば、工業用基準株、および伝統的な株改良プログラムを介して産生された１種または複数の変異工業用株を含み得る。
【０３２４】
多様性プール内のすべてのＳＮＰが同定されたら、本開示は、個々にかつ群において、ＳＮＰの効果（例えば、目的の表現型の創製）を描写する（すなわち、定量し、特徴付ける）ためのＳＮＰスワッピングの方法およびスクリーニング方法を教示する。よって、上述した通り、教示したプラットフォームにおける最初のステップは、複数の配列バリエーション、例えば、ＳＮＰを有する最初の遺伝的多様性プール集団を得ることであり得る。次いで、教示したプラットフォームにおける後続のステップは、上述のＨＴＰ分子ツールセット（例えば、ＳＮＰスワッピング）の１つまたは複数を使用して、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを構築することであり得、次いでこのライブラリーは、微生物において試験するための特定のゲノム変更のライブラリーを提供することによってゲノム操作プロセスのドライバーとして機能する。
【０３２５】
一部の実施形態では、本開示のＳＮＰスワッピング方法は、変異株（例えば、Ｓ２−ｎＧｅｎ２−ｎの中からの株）内で同定された１つまたは複数のＳＮＰを基準株（Ｓ１Ｇｅｎ１）または野生型株に導入するステップを含む。
【０３２６】
他の実施形態では、本開示のＳＮＰスワッピング方法は、変異株（例えば、Ｓ２−ｎＧｅｎ２−ｎの中からの株）内で同定された１つまたは複数のＳＮＰを除去するステップを含む。
【０３２７】
変異誘発を介した多様性プールの創製
一部の実施形態では、細胞の所与の多様性プール集団における目的の変異は、変異誘発化学物質または放射線を含めた、株を変異させる任意の手段によって人工的に生成することができる。用語「変異誘発させること」は、細胞核酸材料において１つまたは複数の遺伝子改変を誘導するための方法を指すのに本明細書で使用される。
【０３２８】
用語「遺伝子改変」は、ＤＮＡの任意の変更を指す。代表的な遺伝子改変は、ヌクレオチド挿入、欠失、置換、およびこれらの組合せを含み、単一塩基という小さいものまたは数万塩基という大きいものであり得る。よって、用語「遺伝子改変」は、染色体の領域を含むＤＮＡの位置または配向が変更されるヌクレオチド配列の反転および他の染色体再配列を包含する。染色体再配列は、染色体内再配列または染色体間再配列を含むことができる。
【０３２９】
一実施形態では、本主張の主題において使用される変異誘発方法は、実質的にランダムであり、その結果、遺伝子改変は、変異誘発される核酸材料内の任意の利用可能なヌクレオチド位置で行うことができる。別の言い方をすれば、一実施形態では、変異誘発させることは、特定のヌクレオチド配列における出現の優先または頻度の増加を示さない。
【０３３０】
本開示の方法は、これらに限定されないが、紫外光、Ｘ線照射、ガンマ照射、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソ尿素（ＥＮＵ）、メチルニトロソ尿素（methyinitrosourea）（ＭＮＵ）、プロカルバジン（ＰＲＣ）、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、アクリルアミドモノマー（ＡＡ）、クロラムブシル（ＣＨＬ）、メルファラン（ＭＬＰ）、シクロホスファミド（ＣＰＰ）、硫酸ジエチル（ＤＥＳ）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルホネート（ＭＭＳ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、マイトマイシン−Ｃ（ＭＭＣ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、３Ｈ２Ｏ、およびウレタン（ＵＲ）を含めた任意の変異誘発剤を使用することができる（例えば、Rinchik、１９９１年；Markerら、１９９７年；およびRussell、１９９０年を参照）。追加の変異誘発剤は、http://www.iephb.nw.ru/〜spirov/hazard/mutagen_lst.htmlに記載されているものを含めて当業者に周知である。
【０３３１】
用語「変異誘発させること」は、細胞機能を変更（例えば、標的化変異によって）またはモジュレートすることによって、変異誘発の速度、品質、または程度を増強する方法も包含する。例えば、細胞を変質させ、またはモジュレートすることによって、ＤＮＡ修復、変異誘発物質代謝、変異誘発物質感受性、ゲノム安定性、またはこれらの組合せが機能していない、または欠損しているようにすることができる。よって、通常ゲノム安定性を維持する遺伝子機能の破壊を使用して変異誘発を増強することができる。破壊の代表的な標的としては、これらに限定されないが、ＤＮＡリガーゼＩ（Bentleyら、２００２年）およびカゼインキナーゼＩ（米国特許第６，０６０，２９６号）が挙げられる。
【０３３２】
一部の実施形態では、本開示の切断酵素をコードする核酸を生成するために、部位特異的変異誘発（例えば、トランスフォーマー部位指向変異誘発キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの市販キットを使用するプライマー指向変異誘発）を使用して、核酸配列全体にわたって複数の変化をもたらす。
【０３３３】
１種または複数の変異誘発剤に曝露した際の遺伝子改変の頻度は、処置の用量および／または繰り返しを変更することによってモジュレートすることができ、特定の用途に合わせることができる。
【０３３４】
よって、一部の実施形態では、本明細書で使用される「変異誘発」は、エラープローンＰＣＲ変異誘発、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発、部位指向変異誘発、および本明細書に記載の技法のいずれかによる反復的配列組換えを含めて、変異を誘導するためのすべての当技術分野で公知の技法を含む。
【０３３５】
多様性を生成するための単一遺伝子座変異
一部の実施形態では、本開示は、ゲノムＤＮＡの選択された部分を導入し、欠失させ、または置き換えることによって細胞集団を変異させることを教示する。よって、一部の実施形態では、本開示は、特定の遺伝子座に変異を標的化するための方法を教示する。他の実施形態では、本開示は、標的ＤＮＡ領域を選択的に編集するための遺伝子編集技術、例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮＳ、またはＣＲＩＳＰＲの使用を教示する。
【０３３６】
他の実施形態では、本開示は、宿主生物の外で選択されたＤＮＡ領域を変異させ、次いで変異配列を宿主生物内に挿入して戻すことを教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、生来のプロモーターまたは合成プロモーターを変異させて、様々な発現性質を有する一連のプロモーターバリアント（以下のプロモーターラダーを参照）を生成することを教示する。他の実施形態では、本開示は、ＰｒｏＳＡＲなどの単一遺伝子最適化技法に適合する（本明細書に参照により組み込まれている、Foxら、２００７年、「Improving  catalytic  function  by  ProSAR-driven  enzyme  evolution.」、Nature  Biotechnology、２５巻（３号）、３３８〜３４３頁）。
【０３３７】
一部の実施形態では、ＤＮＡの選択された領域は、自然バリアントの遺伝子シャッフリング、または合成オリゴでのシャッフリング、プラスミド−プラスミド組換え、ウイルスプラスミド組換え、ウイルス−ウイルス組換えを介してｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成される。他の実施形態では、ゲノム領域は、エラープローンＰＣＲを介して生成される（例えば、図１を参照）。
【０３３８】
一部の実施形態では、選択された遺伝子領域内で変異を生成するステップは、「リアセンブリーＰＣＲ」によって実践される。簡単に言えば、オリゴヌクレオチドプライマー（オリゴ）が、目的の核酸配列のセグメントをＰＣＲ増幅するために合成され、その結果、オリゴヌクレオチドの配列は、２つのセグメントの接合部と重複する。重複領域は、典型的には、長さが約１０〜１００ヌクレオチドである。セグメントのそれぞれは、一連のこのようなプライマーで増幅される。次いでＰＣＲ産物は、アセンブリープロトコールに従って「リアセンブルされる」。簡単に説明すると、アセンブリープロトコールでは、ＰＣＲ産物は、例えば、ゲル電気泳動またはサイズ排除クロマトグラフィーによって最初に精製されてプライマーから離れる。精製産物は、一緒に混合され、追加のプライマーの非存在下で（「セルフプライミング」）、ポリメラーゼおよびデオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）および適切な緩衝塩の存在下で、約１〜１０サイクルの変性、リアニーリング、および伸長に供される。遺伝子に隣接するプライマーを用いた後続のＰＣＲが使用されて、完全にリアセンブルおよびシャッフルされた遺伝子の収量が拡大される。
【０３３９】
本開示の一部の実施形態では、上記に論じたものなどの変異ＤＮＡ領域は、変異体配列について富化され、その結果、複数の変異体スペクトル、すなわち、変異の可能な組合せが、より効率的にサンプリングされる。一部の実施形態では、変異配列は、アセンブリー反応の前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで親和性精製材料を増幅する好適なステップを用いて、ｍｕｔＳタンパク質親和性マトリックスを介して同定される（Wagnerら、Nucleic  Acids  Res.、２３巻（１９号）：３９４４〜３９４８頁（１９９５年）；Suら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.(U.S.A.)、８３巻：５０５７〜５０６１頁（１９８６年））。次いでこの増幅された材料は、本願の後の部分に記載されているアセンブリーまたはリアセンブリーＰＣＲ反応にかけられる。
【０３４０】
プロモーターラダー
プロモーターは、遺伝子が転写される速度を調節し、様々なやり方で転写に影響を与えることができる。構成的プロモーターは、例えば、内部または外部の細胞条件にかかわらず、定速でこれらの関連する遺伝子の転写を指示し、一方、調節可能プロモーターは、内部および／または外部の細胞条件、例えば、増殖速度、温度、具体的な環境化学物質に対する応答などに応じて遺伝子が転写される速度を増減する。プロモーターは、これらの正常な細胞コンテクストから単離することができ、操作されて、実質的に任意の遺伝子の発現を調節することができ、細胞増殖、産物収率、および／または目的の他の表現型の有効な改変を可能にする。
【０３４１】
一部の実施形態では、本開示は、下流の遺伝子設計法で使用するためのプロモーターラダーライブラリーを生成するための方法を教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、一連の発現強度または優れた調節性質を呈する、１つもしくは複数のプロモーターを同定し、かつ／または宿主細胞内で１つもしくは複数のプロモーターのバリアントを生成する方法を教示する。これらの同定および／または生成されたプロモーターの特定の組合せは、以下でより詳細に説明されるプロモーターラダーとして一緒にグループ化することができる。
【０３４２】
一部の実施形態では、本開示は、プロモーターラダーの使用を教示する。一部の実施形態では、本開示のプロモーターラダーは、連続した範囲の発現プロファイルを呈するプロモーターを含む。例えば、一部の実施形態では、プロモーターラダーは、刺激に応答して、または構成的発現を通じて一連の発現強度を呈する天然の、生来の、または野生型プロモーターを同定することによって創製される（例えば、図１２および図１７〜１９を参照）。これらの同定されたプロモーターは、プロモーターラダーとして一緒にグループ化することができる。
【０３４３】
他の実施形態では、本開示は、異なる条件にわたって一連の発現プロファイルを呈するプロモーターラダーの創製を教示する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、発現ピークが発酵の異なる段階全体にわたって広がったプロモーターのラダーを生み出すことを教示する（例えば、図１７を参照）。他の実施形態では、本開示は、特異的刺激に応答して異なる発現ピークダイナミクスを有するプロモーターのラダーを生み出すことを教示する（例えば、図１８を参照）。当業者は、本開示の調節プロモーターラダーは、任意の１つまたは複数の調節プロファイルの代表であり得ることを認識する。
【０３４４】
一部の実施形態では、本開示のプロモーターラダーは、応答の連続的な範囲にわたって予測可能な様式で遺伝子発現を撹乱するように設計される。一部の実施形態では、プロモーターラダーの連続的な特質は、株改良プログラムに追加の予測力を付与する。例えば、一部の実施形態では、選択された代謝経路のスワッピングプロモーターまたは終結配列は、非常に最適の発現比またはプロファイルを同定する宿主細胞性能曲線を生成することができ、標的とした遺伝子が特定の反応または遺伝的カスケードにとってもはや制限因子でない一方、不適切な環境下で不要な過剰発現または誤発現も回避する株を生成する。一部の実施形態では、プロモーターラダーは、所望のプロファイルを呈する天然の、生来の、または野生型プロモーターを同定することによって創製される。他の実施形態では、プロモーターラダーは、天然に存在するプロモーターを変異させて複数の変異プロモーター配列を得ることによって創製される。これらの変異プロモーターのそれぞれは、標的遺伝子発現に対する効果について試験される。一部の実施形態では、編集されたプロモーターは、様々な条件にわたって発現活性について試験され、その結果、各プロモーターバリアントの活性が記録され／特徴付けられ／アノテートされ、かつデータベース内に記憶される。結果として生じる編集されたプロモーターバリアントは、引き続いて組織化されて、これらの発現の強度に基づいて配列されたプロモーターラダーにされる（例えば、頂部付近に高度発現バリアントおよび底部付近に減弱された発現を有し、したがって、用語「ラダー」をもたらす）。
【０３４５】
一部の実施形態では、本開示は、同定された天然に存在するプロモーターおよび変異されたバリアントプロモーターの組合せであるプロモーターラダーを教示する。
【０３４６】
一部の実施形態では、本開示は、以下の判定基準：１）構成的プロモーターのラダーを表した；および２）短いＤＮＡ配列、理想的には１００塩基対未満によってコードされ得る、の両方を満たした天然の、生来の、または野生型プロモーターを同定する方法を教示する。一部の実施形態では、本開示の構成的プロモーターは、２つの選択された成長条件（典型的には、工業的な培養中に経験した条件の間で比較した）にわたって一定の遺伝子発現を呈する。一部の実施形態では、本開示のプロモーターは、約６０塩基対のコアプロモーターおよび長さが２６から４０塩基対の間の５’ＵＴＲからなる。
【０３４７】
一部の実施形態では、上述の同定した天然に存在するプロモーター配列の１つまたは複数が、遺伝子編集のために選択される。一部の実施形態では、天然のプロモーターは、上述した変異方法のいずれかを介して編集される。他の実施形態では、本開示のプロモーターは、所望の配列を有する新しいプロモーターバリアントを合成することによって編集される。
【０３４８】
２０１５年１２月７日に出願された米国特許出願第６２／２６４，２３２号の開示全体は、すべての目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０３４９】
本開示のプロモーターの非網羅的なリストを、以下の表１に提供する。プロモーター配列のそれぞれは、異種プロモーターまたは異種プロモーターポリヌクレオチドと呼ぶことができる。
【表１】
2020524494.tif 000002
【０３５０】
一部の実施形態では、本開示のプロモーターは、上記表１由来のプロモーターと少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、または７５％の配列同一性を呈する。
【０３５１】
ターミネーターラダー
一部の実施形態では、本開示は、ＲＮＡコードエレメントの末端の３’位で１つまたは複数の転写終結配列を提供することによって、遺伝子操作された宿主株を改良する方法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、終結配列を付加すると、遺伝子操作された宿主内の選択された遺伝子のＲＮＡ転写の効率が改善されることを教示する。他の実施形態では、本開示は、終結配列を付加すると、遺伝子操作された宿主内の選択された遺伝子のＲＮＡ転写の効率が低減されることを教示する。よって、一部の実施形態では、本開示のターミネーターラダーは、一連の転写効率を呈する一連のターミネーター配列（例えば、１つの弱いターミネーター、１つの平均のターミネーター、および１つの強いプロモーター）を含む。
【０３５２】
転写終結配列は、転写で、オープンリーディングフレームをコードするヌクレオチド配列の下流に配置されたとき、オープンリーディングフレームの転写を終了させる任意のヌクレオチド配列であり得る。このような配列は、当技術分野で公知であり、原核生物、真核生物、またはファージ起源のものであり得る。ターミネーター配列の例としては、これらに限定されないが、ＰＴＨ−ターミネーター、ｐＥＴ−Ｔ７ターミネーター、Ｔ３−Ｔφターミネーター、ｐＢＲ３２２−Ｐ４ターミネーター、水疱性口内炎（vesicular  stomatitus）ウイルスターミネーター、ｒｒｎＢ−Ｔ１ターミネーター、ｒｒｎＣターミネーター、ＴＴａｄｃ転写ターミネーター、ならびに酵母認識終結配列、例えば、Ｍａｔα（α−因子）転写ターミネーター、生来のα−因子転写終結配列、ＡＤＲ１転写終結配列、ＡＤＨ２転写終結配列、およびＧＡＰＤ転写終結配列が挙げられる。転写ターミネーター配列の非網羅的なリストは、ｉＧＥＭレジストリにおいて見出すことができ、これは、http://partsregistry.org/Terminators/Catalogで利用可能である。
【０３５３】
一部の実施形態では、転写終結配列は、ポリメラーゼ特異的であっても非特異的であってもよいが、本実施形態において使用するために選択される転写ターミネーターは、選択されたプロモーターとの「機能的組合せ」を形成するべきであり、ターミネーター配列は、プロモーターで開始するＲＮＡポリメラーゼのタイプによって転写を終結することができるべきであることを意味する。例えば、一部の実施形態では、本開示は、真核生物ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩプロモーターおよび真核生物ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩターミネーター、Ｔ７プロモーターおよびＴ７ターミネーター、Ｔ３プロモーターおよびＴ３ターミネーター、酵母認識プロモーターおよび酵母認識終結配列などは一般に、機能的組合せを形成するはずであることを教示する。使用される転写終結配列の実体（identity）は、転写が所与のプロモーターから終結される効率に基づいて選択することもできる。例えば、異種転写ターミネーター配列は、ＲＮＡコードエレメントの転写的に下流に提供されて、所与のプロモーターから少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の終結効率を達成することができる。
【０３５４】
一部の実施形態では、操作された発現コンストラクトからのＲＮＡ転写の効率は、ＲＮＡコードエレメントの末端の３’位で２つまたはそれ超のヘアピンを含む二次構造を形成する核酸配列を提供することによって改善することができる。特定の理論によって束縛されることを望むことなく、二次構造は、転写伸長複合体を不安定化させ、ポリメラーゼをＤＮＡ鋳型から解離した状態にし、それによって、非機能的配列の非生産的転写を最小限にし、所望のＲＮＡの転写を増大させる。したがって、２つまたはそれ超の隣接するヘアピンを含む二次構造を形成する終結配列を提供することができる。一般に、ヘアピンは、それ自体で折り返してアームが一本鎖ループによって接続されている対を成したステム領域を形成することができるパリンドロームヌクレオチド配列によって形成することができる。一部の実施形態では、終結配列は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超の隣接するヘアピンを含む。一部の実施形態では、隣接するヘアピンは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の対を成していないヌクレオチドによって分離されている。一部の実施形態では、ヘアピンステムは、長さが４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ超の塩基対を含む。ある特定の実施形態では、ヘアピンステムは、長さが１２〜３０塩基対である。ある特定の実施形態では、終結配列は、約９〜２５塩基対を含むステム領域を有する２つまたはそれ超の中型のヘアピンを含む。一部の実施形態では、ヘアピンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドのループ形成領域を含む。一部の実施形態では、ループ形成領域は、４〜８ヌクレオチドを含む。特定の理論によって束縛されることを望むことなく、二次構造の安定性は、終結効率と相関し得る。ヘアピン安定性は、その長さ、それが含有するミスマッチまたはバルジの数、および対を成した領域の塩基組成によって決定される。グアニンとシトシンとの間の対合は、３つの水素結合を有し、２つしか有さないアデニン−チミン対合と比較してより安定である。ヘアピン形成パリンドロームヌクレオチド配列のＧ／Ｃ含有量は、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％またはそれ超であり得る。一部の実施形態では、ヘアピン形成パリンドロームヌクレオチド配列のＧ／Ｃ含有量は、少なくとも８０％である。一部の実施形態では、終結配列は、原核生物、真核生物、またはファージ起源の１つまたは複数の転写ターミネーター配列に由来する。一部の実施形態では、一連の４、５、６、７、８、９、１０またはそれ超のアデニン（Ａ）をコードするヌクレオチド配列が、終結配列の３’に提供される。
【０３５５】
一部の実施形態では、本開示は、一連のタンデム終結配列の使用を教示する。一部の実施形態では、一連の２、３、４、５、６、７、またはそれ超の第１の転写ターミネーター配列を、ｄｓＲＮＡコードエレメントの最終ヌクレオチドの３’に直接、またはｄｓＲＮＡコードエレメントの最終ヌクレオチドの３’に、少なくとも１〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜１，０００、もしくはそれ超のヌクレオチドの距離で配置することができる。タンデム転写ターミネーター配列間のヌクレオチドの数は、様々であり得、例えば、転写ターミネーター配列は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、またはそれ超のヌクレオチドによって分離され得る。一部の実施形態では、転写ターミネーター配列は、構造予測アルゴリズムによって決定されるこれらの予測された二次構造に基づいて選択することができる。構造予測プログラムは、当技術分野で周知であり、例えば、ＣＬＣ  Ｍａｉｎ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈを含む。
【０３５６】
当業者は、本開示の方法は、任意の終結配列に適合することを認識する。一部の実施形態では、本開示は、Pfeifer-Sancarら、２０１３年「Comprehensive  analysis  of  the  Corynebacterium  glutamicum  transcriptome  using  an  improved  RNAseq  technique」、Pfeifer-Sancarら、BMC  Genomics、２０１３年、１４巻：８８８頁）に開示されたアノテートされたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍターミネーターの使用を教示する。他の実施形態では、本開示は、http://partsregistry.org/Terminators/Catalogで利用可能であるｉＧＥＭレジストリにおいて見出される転写ターミネーター配列の使用を教示する。本開示の転写ターミネーター配列の非網羅的なリストを以下の表１．１に提供する。
【表１．１−１】
2020524494.tif 000003
【表１．１−２】
2020524494.tif 000004
【表１．１−３】
2020524494.tif 000005
【表１．１−４】
2020524494.tif 000006
【表１．１−５】
2020524494.tif 000007
【０３５７】
仮説主導型多様性プールおよびヒルクライミング
本開示のＨＴＰゲノム操作方法は、宿主細胞性能の有意な獲得を達成するのに先の遺伝的知識を必要としない。実際に、本開示は、ランダム変異誘発、および既存の宿主細胞バリアントの中での遺伝的多様性の同定（例えば、野生型宿主細胞と工業用バリアントとの間の比較など）を含めたいくつかの機能にとらわれない（functionally  agnostic）手法を介して多様性プールを生成する方法を教示する。
【０３５８】
しかし、一部の実施形態では、本開示は、下流のＨＴＰ操作に使用される遺伝的多様性変異を設計する仮説主導方法も教示する。すなわち、一部の実施形態では、本開示は、選択された変異の指向設計を教示する。一部の実施形態では、指向変異が、本開示の操作ライブラリー（例えば、ＳＮＰスワップ、ＰＲＯスワップ、またはＳＴＯＰスワップ）中に組み入れられる。
【０３５９】
一部の実施形態では、本開示は、遺伝子アノテーション、仮定された（もしくは確認された）遺伝子機能、またはゲノム内の場所に基づく指向変異の創製を教示する。本開示の多様性プールは、文献において宿主細胞の性能の増大に関連した特異的代謝経路または遺伝経路に関与すると仮定された遺伝子内の変異を含み得る。他の実施形態では、本開示の多様性プールは、宿主性能の改善に関連したオペロン内に存在する遺伝子への変異も含み得る。さらに他の実施形態では、本開示の多様性プールは、アルゴリズムが予測した機能または他の遺伝子アノテーションに基づく遺伝子への変異も含み得る。
【０３６０】
一部の実施形態では、本開示は、仮説主導型変異の標的に優先順位をつけるための「シェル」ベースの手法を教示する。標的優先順位付けのシェルメタファーは、少数の主要遺伝子のみが宿主細胞の性能の特定の態様（例えば、単一生体分子の産生）のほとんどを担うという仮説に基づく。これらの主要遺伝子は、シェルのコアに位置しており、その後、第２の層における二次効果遺伝子、第３のシェルにおける三次効果などが続く。例えば、一実施形態では、シェルのコアは、選択された代謝経路内の極めて重要な生合成酵素（例えば、クエン酸の産生）をコードする遺伝子を含み得る。第２のシェルに位置した遺伝子は、産物転換またはフィードバックシグナル伝達を担う生合成経路内の他の酵素をコードする遺伝子を含み得る。この例示的なメタファー下の第３の段の遺伝子は、生合成経路の発現のモジュレーションまたは宿主細胞内の全般的な炭素フラックスの調節を担う調節遺伝子を含みやすい。
【０３６１】
本開示は、あらゆる同定された変異からの性能獲得を最適化するための「ヒルクライム」法も教示する。一部の実施形態では、本開示は、ＨＴＰ多様性ライブラリー内のランダム、天然の、または仮説主導型変異が、宿主細胞性能に関連した遺伝子の同定をもたらすことができることを教示する。例えば、本方法は、遺伝子コード配列に、またはその付近に位置した１つまたは複数の有益なＳＮＰを同定することができる。この遺伝子は、宿主細胞性能に関連している場合があり、その同定は、生物体のコンビナトリアル遺伝子変異空間における性能「ヒル」の発見に類似し得る。
【０３６２】
一部の実施形態では、本開示は、ＳＮＰ変異において具現化された同定されたヒル周囲のコンビナトリアル空間を探索する方法を教示する。すなわち、一部の実施形態では、本開示は、その遺伝子ノード（すなわち、ヒルクライミング）から得られる性能獲得を最適化するための同定された遺伝子および関連した調節配列の撹乱を教示する。よって、本開示の方法によれば、遺伝子は、ランダム変異誘発から供給された多様性ライブラリー内で最初に同定することができるが、同じ遺伝子内の別の配列の指向変異によって株改良プログラムにおいて使用するために後に改善され得る。
【０３６３】
ヒルクライミングの概念は、単一遺伝子配列を囲繞するコンビナトリアル空間の探索を超えて拡張することもできる。一部の実施形態では、特定の遺伝子内の変異は、宿主細胞性能に対する特定の代謝経路または遺伝経路の重要性を明らかにすることができる。例えば、一部の実施形態では、単一ＲＮＡ分解遺伝子内の変異が有意な宿主性能獲得をもたらしたという発見を、宿主生物から追加の性能獲得を引き出すための手段として関連したＲＮＡ分解遺伝子を変異させるための基礎として使用することができる。当業者は、上記のバリアントが指向遺伝子設計へのシェルおよびヒルクライム手法を記述することを認識する。ハイスループットスクリーニング。
【０３６４】
細胞培養および発酵
本開示の細胞は、任意の所望の生合成反応または選択に適切に改変された慣例的な栄養培地中で培養することができる。一部の実施形態では、本開示は、プロモーターを活性化するための誘導培地中での培養を教示する。一部の実施形態では、本開示は、形質転換体（例えば、抗生物質）の選択剤、または阻害条件（例えば、高エタノール条件）下で増殖させるのに適した生物体の選択を含めた選択剤を含む培地を教示する。一部の実施形態では、本開示は、細胞増殖のために最適化された培地中の増殖細胞培養を教示する。他の実施形態では、本開示は、産物収率のために最適化された培地中の増殖細胞培養を教示する。一部の実施形態では、本開示は、細胞増殖を誘導することができ、最終産物産生に必要な前駆体（例えば、エタノール産生のための高レベルの糖）も含有する培地中の増殖培養を教示する。
【０３６５】
例えば、温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともに使用するのに適したものであり、当業者に明らかである。述べたように、多くの参考文献が、細菌、植物、動物（哺乳動物を含む）、および古細菌起源の細胞を含めた多くの細胞の培養および産生に利用可能である。例えば、Sambrook、Ausubel（すべて上記）、ならびにBerger、Guide  to  Molecular  Cloning  Techniques、Methods  in  Enzymology、１５２巻、Academic  Press,  Inc.、San  Diego、CA；ならびにFreshney（１９９４年）、Culture  of  Animal  Cells、a  Manual  of  Basic  Technique、３版、Wiley-Liss、New  York、およびそれに引用された参考文献；DoyleおよびGriffiths（１９９７年）、Mammalian  Cell  Culture:Essential  Techniques、John  Wiley  and  Sons、NY；Humason（１９７９年）、Animal  Tissue  Techniques、４版、W.H.  Freeman  and  Company；ならびにRicciardelleら、（１９８９年）、In  Vitro  Cell  Dev.  Biol.、２５巻：１０１６〜１０２４頁を参照。これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれている。植物細胞培養および再生について、Payneら（１９９２年）、Plant  Cell  and  Tissue  Culture  in  Liquid  Systems、John  Wiley  &  Sons,  Inc.、New  York、N.Y.；GamborgおよびPhillips（編）（１９９５年）、Plant  Cell,  Tissue  and  Organ  Culture;  Fundamental  Methods  Springer  Lab  Manual、Springer-Verlag（Berlin  Heidelberg  N.Y.）；Jones編（１９８４年）、Plant  Gene  Transfer  and  Expression  Protocols、Humana  Press、Totowa、N.J．、ならびにPlant  Molecular  Biology（１９９３年）、R.  R.  D.  Croy編、Bios  Scientific  Publishers、Oxford、U.K.  ISBN  0  12  198370  6。これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれている。一般に細胞培養培地は、AtlasおよびParks（編）、The  Handbook  of  Microbiological  Media（１９９３年）、CRC  Press、Boca  Raton、Fla.に示されており、これは、参照により本明細書に組み込まれている。細胞培養の追加の情報は、Sigma-Aldrich,  Inc（St  Louis、Mo.）からのLife  Science  Research  Cell  Culture  Catalogue（「Sigma-LSRCCC」）、および例えば、やはりSigma-Aldrich,  Inc（St  Louis、Mo.）からのThe  Plant  Culture  Catalogue  and  supplement（「Sigma-PCCS」）などの入手可能な市販の文献に見出され、これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれている。
【０３６６】
使用される培養培地は、適当な様式で、それぞれの株の要求を満たさなければならない。様々な微生物の培養培地の記載は、American  Society  for  Bacteriologyの「Manual  of  Methods  for  General  Bacteriology」（Washington  D.C.、USA、１９８１年）に存在する。
【０３６７】
本開示は、目的の産物を発酵調製するためのプロセスであって、ａ）適当な培地中で本開示による微生物を培養し、発酵ブロスをもたらすステップと；ｂ）ａ）の発酵ブロス中、かつ／または微生物の細胞内で目的の産物を濃縮するステップとを含む、プロセスをさらに提供する。
【０３６８】
一部の実施形態では、本開示は、生成される微生物を、所望の有機−化学化合物を産生させる目的で、例えば、ＷＯ０５／０２１７７２に記載されているように連続的に、あるいはバッチプロセス（バッチ培養）またはフェドバッチもしくは繰り返しフェドバッチプロセスで不連続に培養することができることを教示する。公知の培養方法についての全般的な特質の概要は、Chmiel（Bioprozesstechnik.  1:  Einfuehrung  in  die  Bioverfahrenstechnik（Gustav  Fischer  Verlag、Stuttgart、１９９１年））による教科書、またはStorhas（Bioreaktoren  and  periphere  Einrichtungen（Vieweg  Verlag、Braunschweig/Wiesbaden、１９９４年））による教科書において入手可能である。
【０３６９】
一部の実施形態では、本開示の細胞は、バッチまたは連続発酵条件下で増殖される。
【０３７０】
古典的なバッチ発酵は、クローズドシステムであり、培地の組成は、発酵の開始時に設定され、発酵中に人為的な変更に供されない。バッチシステムの変形は、フェドバッチ発酵であり、これは、本開示においても使用を見出す。この変形では、基質は、発酵が進行するにつれて徐々に添加される。フェドバッチシステムは、異化産物抑制が細胞の代謝を阻害する可能性がある、および培地中の基質の量が限定されていることが望ましい場合、有用である。バッチ発酵およびフェドバッチ発酵は、一般的であり、当技術分野で周知である。
【０３７１】
連続発酵は、目的の所望の生体分子産物を処理および回収するために、規定された発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、等量の馴化培地が同時に除去されるシステムである。一部の実施形態では、連続発酵は一般に、一定の高密度で培養物を維持し、この場合、細胞は、主に、対数期増殖にある。一部の実施形態では、連続発酵は一般に、静止または後期対数／静止期増殖で培養物を維持する。連続発酵システムは、定常状態増殖条件を維持しようと努める。
【０３７２】
連続発酵プロセスのための栄養分および成長因子をモジュレートするための方法、ならびに産物形成の速度を最大化するための技法は、工業微生物学の技術分野で周知である。
【０３７３】
例えば、本開示の培養のための炭素源の限定されないリストとしては、糖および炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、サトウダイコンまたはサトウキビ加工からのスクロース含有溶液、デンプン、デンプン加水分解物、およびセルロースなど；油脂、例えば、ダイズ油、ヒマワリ油、落花生油、およびココナツ脂肪など；脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、およびリノール酸など；アルコール、例えば、グリセロール、メタノール、およびエタノールなど；ならびに有機酸、例えば、酢酸または乳酸などが挙げられる。
【０３７４】
本開示の培養のための窒素源の限定されないリストとしては、有機窒素含有化合物、例えば、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、トウモロコシ浸出液、ダイズ粉、および尿素；または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、アンモニウムクロリド、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、および硝酸アンモニウムが挙げられる。窒素源は、個々に、または混合物として使用され得る。
【０３７５】
本開示の培養のための可能なリン源の限定されないリストとしては、リン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウム、または対応するナトリウム含有塩が挙げられる。
【０３７６】
培養培地は、例えば、金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、および鉄などの塩化物または硫酸塩、例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などの形態で塩をさらに含み得、これらは、増殖に必要である。
【０３７７】
最後に、アミノ酸などの必須の成長因子、例えば、ホモセリンおよびビタミン、例えば、チアミン、ビオチン、またはパントテン酸を、上述した物質に加えて使用することができる。
【０３７８】
一部の実施形態では、培養物のｐＨは、これらに限定されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、もしくはアンモニア水を含めた任意の酸もしくは塩基または緩衝塩；あるいは適当な様式でのリン酸または硫酸などの酸性化合物によって制御することができる。一部の実施形態では、ｐＨは一般に、６．０〜８．５、好ましくは６．５〜８の値に調整される。
【０３７９】
一部の実施形態では、本開示の培養物は、例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を含み得る。一部の実施形態では、本開示の培養物は、例えば、抗生物質などの適当な選択物質を添加することによって、培養物のプラスミドを安定化するように改変される。
【０３８０】
一部の実施形態では、培養は、好気性条件下で実行される。これらの条件を維持するために、酸素または酸素含有気体混合物、例えば、空気などが、培養物に導入される。過酸化水素を富化させた液体を使用することが同様に可能である。発酵は、適切な場合、高圧で、例えば、０．０３〜０．２ＭＰａの高圧で実行される。培養物の温度は、通常２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃、特に好ましくは３０℃〜３７℃である。バッチプロセスまたはフェドバッチプロセスでは、培養は、好ましくは、回収されるのに十分な目的の所望の産物（例えば、有機−化学化合物）の量が形成されるまで継続される。この目的は通常、１０時間〜１６０時間以内に達成することができる。連続プロセスでは、より長い培養時間が可能である。微生物の活動により、発酵培地中で、かつ／または前記微生物の細胞内で目的の産物が濃縮（蓄積）される。
【０３８１】
一部の実施形態では、培養は、嫌気性条件下で実行される。
【０３８２】
スクリーニング
一部の実施形態では、本開示は、ハイスループット初期スクリーニングを教示する。他の実施形態では、本開示は、性能データのロバストなタンクベースの検証も教示する（図４Ｂを参照）。
【０３８３】
一部の実施形態では、ハイスループットスクリーニングプロセスが、バイオリアクター内の株の性能を予測するのに設計される。先に記載した通り、培養条件は、生物体に適しており、バイオリアクター条件を反映しているように選択される。個々のコロニーが精選され、９６ウェルプレート中に移され、適当な量の時間にわたってインキュベートされる。細胞は、追加のシード培養のために新しい９６ウェルプレートに、または産生培養に引き続いて移される。培養物は、様々な長さの時間にわたってインキュベートされ、この場合、複数の測定を行うことができる。これらは、産物、バイオマス、またはバイオリアクター内の株の性能を予測する他の特性の測定を含み得る。ハイスループット培養結果は、バイオリアクター性能を予測するのに使用される。
【０３８４】
一部の実施形態では、タンクベースの性能検証が使用されて、ハイスループットスクリーニングによって単離された株の性能が確認される。発酵プロセス／条件は、クライアントサイトから得られる。候補株は、生産性または収率などの関連した株性能特性について、ベンチスケール発酵反応器（例えば、本開示の表３に開示した反応器）を使用してスクリーニングされる。
【０３８５】
産物回収および定量
目的の産物の産生についてスクリーニングするための方法は、当業者に公知であり、本明細書全体にわたって論じられている。このような方法は、本開示の株をスクリーニングするとき使用することができる。
【０３８６】
一部の実施形態では、本開示は、非分泌型細胞内産物を産生するように設計された株を改善する方法を教示する。例えば、本開示は、細胞内酵素、油、医薬品、または他の貴重な低分子もしくはペプチドを産生する細胞培養物のロバスト性、収率、効率、または全体的な望ましさを改善する方法を教示する。非分泌型細胞内産物の回収または単離は、本明細書に記載のものを含めて当技術分野で周知である溶解技法および回収技法によって達成することができる。
【０３８７】
例えば、一部の実施形態では、本開示の細胞は、遠心分離、濾過、沈殿、または他の方法によって回収することができる。次いで回収された細胞は、当業者に周知である凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊、もしくは細胞溶解剤の使用、または他の方法を含めた任意の好都合な方法によって破壊される。
【０３８８】
結果として生じる目的の産物、例えば、ポリペプチドは、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって回収／単離および必要に応じて精製することができる。例えば、産物ポリペプチドは、これらに限定されないが、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性相互作用、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、または沈降を含めた慣例的な手順によって栄養培地から単離することができる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、最終精製ステップで使用することができる。（例えば、ともに参照により本明細書に組み込まれている、Parryら、２００１年、Biochem.  J.、３５３巻：１１７頁、およびHongら、２００７年、Appl.  Microbiol.  Biotechnol．、７３巻：１３３１頁に記載の細胞内タンパク質の精製を参照）。
【０３８９】
上述した参考文献に加えて、様々な精製方法は、例えば、Sandana（１９９７年）、Bioseparation  of  Proteins、Academic  Press,  Inc.；Bollagら（１９９６年）、Protein  Methods、２版、Wiley-Liss、NY；Walker（１９９６年）、The  Protein  Protocols  Handbook、Humana  Press、NJ；HarrisおよびAngal（１９９０年）、Protein  Purification  Applications:  A  Practical  Approach、IRL  Press  at  Oxford、Oxford、England；HarrisおよびAngal  Protein  Purification  Methods:A  Practical  Approach、IRL  Press  at  Oxford、Oxford、England；Scopes（１９９３年）、Protein  Purification:  Principles  and  Practice、３版、Springer  Verlag、NY；JansonおよびRyden（１９９８年）、Protein  Purification:  Principles,  High  Resolution  Methods  and  Applications、２版、Wiley-VCH、NY；ならびにWalker（１９９８年）、Protein  Protocols  on  CD-ROM、Humana  Press、NJに示されたものを含めて、当技術分野で周知である。これらの文献のすべては、参照により本明細書に組み込まれている。
【０３９０】
一部の実施形態では、本開示は、分泌産物を産生させるように設計された株を改良する方法を教示する。例えば、本開示は、貴重な低分子またはペプチドを産生する細胞培養物のロバスト性、収率、効率、または全体的な望ましさを改善する方法を教示する。
【０３９１】
一部の実施形態では、免疫学的方法は、本開示の細胞によって産生される分泌型または非分泌型産物を検出および／または精製するのに使用することができる。一例示的手法では、従来の方法を使用して産物分子に対して（例えば、インスリンポリペプチドまたはその免疫原性断片に対して）産生される抗体は、ビーズ上に固定化され、エンドグルカナーゼが結合している条件下で細胞培養培地と混合され、沈降される。一部の実施形態では、本開示は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の使用を教示する。
【０３９２】
他の関連した実施形態では、米国特許第５，５９１，６４５号、米国特許第４，８５５，２４０号、米国特許第４，４３５，５０４号、米国特許第４，９８０，２９８号、およびSe-Hwan  Paekら、「Development  of  rapid  One-Step  Immunochromatographic  assay,  Methods」、２２巻、５３〜６０頁、２０００年）に開示された免疫クロマトグラフィーが使用される。これらの文献のそれぞれは、本明細書に参照により組み込まれている。一般的な免疫クロマトグラフィーは、２つの抗体を使用することによって検体を検出する。第１の抗体は、試験溶液中に、または試験溶液が滴下される、多孔質膜から作製されたおよそ矩形状をした試験片の末端の部分に存在する。この抗体は、ラテックス粒子または金コロイド粒子で標識される（この抗体は、以下で標識抗体と呼ばれる）。滴下された試験溶液が検出されるべき検体を含むとき、標識抗体は、検体を認識して検体と結合する。検体と標識抗体との複合体は、アブソーバーに向けて毛管現象によって流れ、このアブソーバーは、濾紙から作製され、標識抗体を含んだ末端と反対の末端に結合している。流れている間に、検体と標識抗体との複合体は、多孔質膜の中間に存在している第２の抗体（これは、以下でタッピング抗体（tapping  antibody）と呼ばれる）によって認識および捕捉され、この結果として、複合体は、可視シグナルとして多孔質膜上の検出部分に現れ、検出される。
【０３９３】
一部の実施形態では、本開示のスクリーニング方法は、測光検出技法（吸収、蛍光）に基づく。例えば、一部の実施形態では、検出は、抗体に結合したＧＦＰなどのフルオロフォア検出剤の存在に基づき得る。他の実施形態では、測光検出は、細胞培養からの所望の産物の蓄積に基づき得る。一部の実施形態では、産物は、培養物または前記培養物からの抽出物のＵＶを介して検出可能であり得る。
【０３９４】
当業者は、本開示の方法が、目的の任意の望ましい生体分子産物を産生する宿主細胞に適合することを認識する。以下の表２は、本開示の範囲内に含まれる産物カテゴリー、生体分子、および宿主細胞の限定されないリストを提示する。これらの例は、例示的な目的で提供されており、決して本開示の技術の適用性を限定するように意味していない。
【表２−１】
2020524494.tif 000008
【表２−２】
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【表２−３】
2020524494.tif 000010
【表２−４】
2020524494.tif 000011
【０３９５】
選択判定基準および目標
本開示の方法に適用される選択判定基準は、株改良プログラムの具体的な目標によって変動する。本開示は、任意のプログラム目標を満たすように適応させることができる。例えば、一部の実施形態では、プログラム目標は、差し迫った期限を伴わずに反応の単一バッチ収率を最大化することであり得る。他の実施形態では、プログラム目標は、生合成収率をリバランスして、特異的な産物を産生させ、または特定の比の産物を産生させることであり得る。他の実施形態では、プログラム目標は、産物の化学構造を改変すること、例えば、ポリマーの炭素鎖を長くすることであり得る。一部の実施形態では、プログラム目標は、性能特性、例えば、収率、力価、生産性、副生成物排除、プロセスエクスカーションに対する寛容性、最適な増殖温度、および増殖速度を改善することであり得る。一部の実施形態では、プログラム目標は、微生物によって産生される目的の産物の体積生産性、比生産性、収率、または力価によって測定した宿主性能の改善である。
【０３９６】
他の実施形態では、プログラム目標は、入力量当たりの最終産物収率（例えば、スクロース１ポンド当たりに産生されるエタノールの合計量）の観点から市販の株の合成効率を最適化することであり得る。他の実施形態では、プログラム目標は、例えば、バッチ完了率、または連続培養システムにおける歩留まり率の観点から測定した、合成速度を最適化することであり得る。他の実施形態では、プログラム目標は、特定のファージに対する株の耐性を増大させること、またはさもなければ培養条件下で株の活力／ロバスト性を増大させることであり得る。
【０３９７】
一部の実施形態では、株改良プロジェクトは、１つを超える目標を対象とする場合がある。一部の実施形態では、株プロジェクトの目標は、品質、信頼性、または全体的な収益性次第であり得る。一部の実施形態では、本開示は、上述した株性質の１つまたは複数を有する関連した選択された変異または変異の群の方法を教示する。
【０３９８】
当業者は、特定のプロジェクト目標を満たすように株選択判定基準をどのように合わせるかを認識する。例えば、反応が飽和しているときの株の単一バッチ最大収量の選択は、単一バッチ収量が高い株を同定するのに適切であり得る。一連の温度および条件にわたる収率の一貫性に基づく選択は、ロバスト性および信頼性が増大した株を同定するのに適切であり得る。
【０３９９】
一部の実施形態では、初期のハイスループットフェーズおよびタンクベースの検証の選択判定基準は、同一となる。他の実施形態では、タンクベースの選択は、追加のおよび／または異なる選択判定基準下で働き得る。例えば、一部の実施形態では、ハイスループット株選択は、単一バッチ反応完了収率に基づき得る一方、タンクベースの選択は、反応速度に対する収率に基づく選択を含むように拡張することができる。
【０４００】
シーケンシング
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の生物体の全ゲノムシーケンシングを教示する。他の実施形態では、本開示は、本開示の方法の品質対照としてのプラスミド、ＰＣＲ産物、および他のオリゴのシーケンシングも教示する。大および小プロジェクトのためのシーケンシング法は、当業者に周知である。
【０４０１】
一部の実施形態では、核酸をシーケンシングするための任意のハイスループット技法を、本開示の方法において使用することができる。一部の実施形態では、本開示は、全ゲノムシーケンシングを教示する。他の実施形態では、本開示は、遺伝的バリエーションを同定するためのアンプリコンシーケンシング、ウルトラディープシーケンシングを教示する。一部の実施形態では、本開示は、タグメンテーションを含めたライブラリー調製の新規方法も教示する（ＷＯ／２０１６／０７３６９０を参照）。ＤＮＡシーケンシング技法としては、標識ターミネーターまたはプライマー、およびスラブまたはキャピラリーにおけるゲル分離を使用する古典的ジデオキシシーケンシング反応（サンガー法）；可逆的に終止される標識ヌクレオチドを使用する合成によるシーケンシング、ピロシーケンシング；４５４シーケンシング；標識オリゴヌクレオチドプローブのライブラリーへの対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション；ライゲーションが後に続く標識クローンのライブラリーへの対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションを使用する合成によるシーケンシング；重合ステップ中の標識ヌクレオチドの組み入れのリアルタイムモニタリング；ポロニーシーケンシング；およびＳＯＬｉＤシーケンシングが挙げられる。
【０４０２】
本開示の一態様では、固体表面上の個々の分子を空間的に単離するステップであって、個々の分子が並行してシーケンシングされる、ステップを含むシーケンシングのハイスループット方法が使用される。このような固体表面として、非多孔性表面（Ｓｏｌｅｘａシーケンシング、例えば、Bentleyら、Nature、４５６巻：５３〜５９頁（２００８年）またはＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓシーケンシング、例えば、Drmanacら、Science、３２７巻：７８〜８１頁（２０１０年）などにおける）、ビーズ結合鋳型または粒子結合鋳型を含み得るウェルのアレイ（４５４、例えば、Marguliesら、Nature、４３７巻：３７６〜３８０頁（２００５年）、またはイオントレントシーケンシング、米国特許公開２０１０／０１３７１４３号もしくは同第２０１０／０３０４９８２号を用いてなど）、微細加工膜（ＳＭＲＴシーケンシング、例えば、Eidら、Science、３２３巻：１３３〜１３８頁（２００９年）を用いてなど）、またはビーズアレイ（ＳＯＬｉＤシーケンシングまたはポロニーシーケンシング、例えば、Kimら、Science、３１６巻：１４８１〜１４１４頁（２００７年）を用いるような）を挙げることができる。
【０４０３】
別の実施形態では、本開示の方法は、単離分子が固体表面上で空間的に単離される前または後のいずれかに単離分子を増幅するステップを含む。事前の増幅は、エマルジョンＰＣＲなどのエマルジョンに基づく増幅、またはローリングサークル増幅を含み得る。Ｓｏｌｅｘａに基づくシーケンシングも教示されており、この場合、Bentleyら（上記に引用した）に、かつ製造者の指示（例えば、ＴｒｕＳｅｑ（商標）試料調製キットおよびデータシート、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、２０１０年）に；かつさらに、参照により組み込まれている以下の参考文献：米国特許第６，０９０，５９２号；同第６，３００，０７０号；同第７，１１５，４００号；およびＥＰ０９７２０８１Ｂ１に記載されている通り、個々の鋳型分子が固体表面上で空間的に単離され、その後これらがブリッジＰＣＲによって並行して増幅されて別個のクローン集団またはクラスターを形成し、次いでシーケンシングされる。
【０４０４】
一実施形態では、固体表面上で配置および増幅された個々の分子は、１ｃｍ２当たり少なくとも１０５クラスターの密度で；または１ｃｍ２当たり少なくとも５×１０５の密度で；または１ｃｍ２当たり少なくとも１０６クラスターの密度でクラスターを形成する。一実施形態では、相対的に高い誤り率を有するシーケンシング化学反応が使用される。このような実施形態では、このような化学反応によって生じる平均品質スコアは、配列リード長の単調低下関数である。一実施形態では、このような低下は、配列リードの０．５パーセントが１〜７５位に少なくとも１つの誤差を有し；配列リードの１パーセントが７６〜１００位に少なくとも１つの誤差を有し；配列リードの２パーセントが１０１〜１２５位に少なくとも１つの誤差を有することに対応する。
【０４０５】
ゲノムワイド遺伝子設計判定基準の効果のコンピューター分析および予測
一部の実施形態では、本開示は、所与の宿主株内に組み入れている特定の遺伝子変更の効果を予測する方法を教示する。さらなる態様では、本開示は、所与の宿主株内に、前記宿主が特定の表現型形質または株パラメータを有するために組み入れるべきである提案された遺伝子変更を生成するための方法を提供する。所与の態様では、本開示は、新規宿主株を設計するのに利用することができる予測モデルを提供する。
【０４０６】
一部の実施形態では、本開示は、各ラウンドのスクリーニングの性能結果を分析する方法、およびその後のラウンドのスクリーニングで株性能を増強すると予測される新しく提案されたゲノムワイド配列修飾をおこすための方法を教示する。
【０４０７】
一部の実施形態では、本開示は、システムが、先のスクリーニング結果に基づいて宿主株に提案された配列修飾をおこすことを教示する。一部の実施形態では、本システムの推奨は、直前のスクリーニングからの結果に基づく。他の実施形態では、本システムの推奨は、先行するスクリーニングのうちの１つまたは複数の累積的結果に基づく。
【０４０８】
一部の実施形態では、本システムの推奨は、先に開発されたＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーに基づく。例えば、一部の実施形態では、本システムは、同じまたは異なる宿主生物において、先のスクリーニングからの結果を保存し、異なるプロジェクトにこれらの結果を適用するように設計される。
【０４０９】
他の実施形態では、本システムの推奨は、科学的洞察に基づく。例えば、一部の実施形態では、推奨は、遺伝子の公知の性質（アノテートされた遺伝子データベースおよび関連した文献などの源からの）、コドン最適化，転写スリップ、ｕＯＲＦ、または他の仮説主導型配列、および宿主最適化に基づく。
【０４１０】
一部の実施形態では、システムまたは予測モデルが推奨した宿主株への提案された配列修飾は、（１）プロモータースワップ、（２）ＳＮＰスワップ、（３）開始／停止コドン交換、（４）配列最適化、（５）Ｓｔｏｐスワップ、（６）トランスポゾン変異誘発、および（７）上位性マッピングを含む開示した分子ツールセットの１つまたは複数の利用によって実行される。
【０４１１】
本明細書に記載のＨＴＰ遺伝子操作プラットフォームは、任意の特定の微生物または表現型形質（例えば、特定の化合物の産生）に関してとらわれない。すなわち、本明細書に教示のプラットフォームおよび方法は、任意の宿主細胞とともに利用して、任意の所望の表現型形質を有するように前記宿主細胞を操作することができる。さらに、１つの新規宿主細胞を生み出すのに使用される所与のＨＴＰ遺伝子操作プロセスから学習した教訓を、教示された方法の間に行われる無数のプロセスパラメータの記憶、特徴付け、および分析の結果として、任意の数の他の宿主細胞に適用することができる。
【０４１２】
上位性マッピングセクションにおいて言及したように、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーからの変異のコレクションをある好適な予測モデルを介して特定のバックグラウンド内に統合することによって得られる仮定の株の性能（別名スコア）を推定することが可能である。このような予測モデルを考慮すると、コンビナトリアル統合を介して変異ラブラリーにアクセス可能なすべての仮定の株をスコア付けおよびランク付けすることが可能である。以下のセクションは、本ＨＴＰプラットフォームにおいて利用される特定のモデルを概説する。
【０４１３】
予測的株設計
遺伝子変化および株性能を記述し、株内の変化の組成に基づいて株性能を予測し、高い予測された性能を有する候補設計を推奨し、予測を選別して二次の考慮事項、例えば、既存の株に対する類似度、上位性、または予測における信頼度を最適化する方法を含む、予測的株設計の手法が本明細書に記載されている。
【０４１４】
株設計モデルへの入力
一実施形態では、例示を容易にする目的で、入力データは、２つのコンポーネント：（１）遺伝子変化のセットおよび（２）相対的株性能を含み得る。当業者は、このモデルは、オーバーフィッティングの対抗する考慮事項に留意しながら、容易に拡張して多種多様な入力を考慮することができることを認識する。遺伝子変化に加えて、調整され得る入力パラメータ（独立変数）の一部は、細胞型（属、種、株、系統発生的特徴付けなど）、および発酵が細胞を用いて行われている下でのプロセスパラメータ（例えば、環境条件、装置のハンドリング、修飾技法など）である。
【０４１５】
遺伝子変化のセットは、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーと呼ばれる遺伝子撹乱の先に論じたコレクションに由来し得る。相対的株性能は、任意の所与のパラメータまたは目的の表現型形質（例えば、目的の化合物、低分子、または産物の産生）に基づいて評価することができる。
【０４１６】
細胞型は、一般的なカテゴリー、例えば、原核生物システムおよび真核生物システム、属、種、株、組織培養物（分散細胞に対して）などにおいて指定され得る。調整され得るプロセスパラメータは、温度、圧力、反応器構成、および培地組成が挙げられる。反応器構成の例には、プロセスがバッチであっても連続であっても、反応器の体積、および連続である場合、体積流量などが含まれる。もしあれば、細胞が存在する、支持構造体を指定することもできる。培地組成の例としては、電解質の濃度、栄養分、老廃物、酸、ｐＨなどが挙げられる。
【０４１７】
予測的株設計モデルを生み出すのに次に使用される最初の線形回帰モデルにおいて利用される選択されたＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーからの遺伝子変化のセット
予測的株設計モデルを創製するために、同じ微生物種の株における遺伝子変化がまず選択される。各遺伝子変化の履歴も提供される（例えば、この株系統における最近の改変を示す「最後の変化」）。よって、この株の性能をその親の性能と比較することは、「最後の変化」の変異の性能に関するデータ点を表す。
【０４１８】
構築された株（built  strain）の性能評価
教示したモデルの目標は、株に導入される遺伝子変化の組成に基づいて株性能を予測することである。比較のための標準を構築するために、株性能をアッセイプレート１つ当たり、株１つ当たりの性能の中央値を最初に算出することによって一般的な参照株と比べて算出する。次いで、相対的性能を、同じプレート内の操作された株と一般的な参照株との間の平均性能の差異として計算する。プレート内の比較に算出を制限することにより、検討中の試料がすべて同じ実験条件を受けたことを保証する。
【０４１９】
図１０は、入力データについての相対的株性能の分布が検討中である例を示す。これは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍにおいて行われた。ゼロの相対的性能は、操作された株がプレート内基準または「参照」株と同等によく働いたことを示す。ゼロを有意に上回って働きやすい株を同定する予測モデルの能力が目的のものである。さらに、かつより一般的に、いくつかの判定基準によって任意の所与の株がその親より性能が優れているかどうかが、目的のものである。実際には、判定基準は、親レベルを超えるある閾値を満たす、または超える産物力価であり得るが、所望の方向で親からの統計的に有意な差異を有することも、代替としてまたは追加的に使用することができる。基準株または「参照」株の役割は、プレート内またはプレート間で比較を行うための付加された正規化因子として単に機能を果たすことである。
【０４２０】
留意すべき概念は、親株と参照株との間の差異のものである。親株は、現在のラウンドの変異誘発について使用したバックグラウンドである。参照株は、特にプレート間で比較を促進するためにあらゆるプレートで実行される対照株であり、典型的には、上記に言及した「基準株」である。しかし、基準株（例えば、全体的な性能をベンチマークするのに使用される野生型株または工業用株）は、所与のラウンドの株改良において変異誘発標的であるという意味において必ずしも「基準」である必要はないので、より記述的な用語は、「参照株」である。
【０４２１】
要約すると、基準／参照株は、一般に、構築された株の性能をベンチマークするのに使用され、一方、親株は、関連した遺伝的バックグラウンドにおける特異的な遺伝子変化の性能をベンチマークするのに使用される。
【０４２２】
線形回帰を用いた構築された株の性能のランク付け
開示したモデルの目標は、構築された株内に導入される遺伝子変化の組成の関数として相対的株性能を記述することによって構築された株の性能をランク付けることである。本開示全体にわたって論じられるように、様々なＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、操作された株内に導入される可能な遺伝子変化（例えば、遺伝子撹乱／変更）のレパートリーを提供する。線形回帰は、現在記載されている例示的な予測モデルの基礎である。
【０４２３】
次いで、遺伝子変化および相対的性能に対するこれらの効果が、回帰に基づくモデル化のために入力される。株性能は、株内に含有される遺伝子変化の組成の関数として、一般的な基準株と比べてランク付けされる。
【０４２４】
構築された株を特徴付けるための線形回帰
線形回帰は、インプリメンテーションおよび解釈の容易さのために、記載されたＨＴＰゲノム操作プラットフォームにとって魅力的な方法である。結果として生じる回帰係数は、各遺伝子変化の存在に帰することができる相対的株性能の平均の増大または低下として解釈することができる。
【０４２５】
例えば、一部の実施形態では、本技法は、元のプロモーターを別のプロモーターに変化させると、任意の負の上位性相互作用の非存在下で、相対的株性能が平均でおよそ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多くのユニット改善され、よって潜在的に高度に望ましい変化であると結論付けることを可能にする（注意：入力は、無単位正規化値である）。
【０４２６】
したがって、教示した方法は、様々な教示したライブラリーからの自己のゲノム内に導入された様々な遺伝子撹乱を有する構築された株を記述し／特徴付け、ランク付けるための線形回帰モデルを使用する。
【０４２７】
予測的設計モデル化
構築した株からのデータを利用した上述した線形回帰モデルは、まだ構築されていない株についての性能予測を行うのに使用することができる。
【０４２８】
手順は、以下の通り要約することができる：遺伝子変化のすべての可能な構成をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで生成する、それに続き、回帰モデルを使用して相対的株性能を予測する、それに続き、性能による候補株設計を注文する。よって、未だ構築されていない株の性能を予測するための回帰モデルを利用することによって、本方法は、より少ない実験を同時に行いながらより高い性能の株の産生を可能にする。
【０４２９】
構成の生成
まだ構築されていない株の性能を予測するモデルを構築するとき、第１のステップは、設計候補の配列を生成することである。これは、株内の遺伝子変化の総数を固定し、次いで遺伝子変化のすべての可能な組合せを明確にすることによって行われる。例えば、潜在的な遺伝子変化／撹乱の総数を２９（例えば、２９の可能なＳＮＰ、もしくは２９の異なるプロモーター、または遺伝子撹乱のユニバースが２９である限り、これらの任意の組合せ）に設定し、次いで２９の潜在的な遺伝子変化のすべての可能な３メンバー組合せを設計する決定を下すことができ、３，６５４の候補株設計がもたらされる。
【０４３０】
上述の３，６５４候補株にコンテクストを提供するために、ｎ！／（（ｎ−ｒ）！＊ｒ！）を使用してｎの可能なメンバーからサイズｒの非重複グループの数を算出することができることを考慮されたい。ｒ＝３である場合、ｎ＝２９は、３，６５４を与える。よって、２９の潜在的な変化のすべての可能な３メンバー組合せを設計する場合、結果は、３，６５４候補株である。２９の潜在的な遺伝子変化は、図１４のｘ軸に存在する。
【０４３１】
新しい株設計の性能の予測
入力としてコンビナトリアル構成を用いて上で構築した線形回帰を使用して、次いで、各候補設計の予期される相対的性能を予測することができる。例えば、上位１００の予測された株設計についての変化の組成が、２次元マップにおいて要約され得る。このマップにおいて、ｘ軸は、潜在的な遺伝子変化（２９の可能な遺伝子変化）のプールを列挙し、ｙ軸は、ランク順序を示す。黒色のセルは、候補設計における特定の変化の存在を示すために使用することができ、一方、白色のセルは、その変化の非存在を示すために使用することができる。図１４を参照されたい。
【０４３２】
予測精度は、新しい知見がモデルを反復して保持および再フィットするにつれて経時的に増大するはずである。本発明者らによる研究からの結果は、予測モデルを反復して保持および改善することができる方法を例示する。モデル予測の品質は、予測値と観測値との間の関連性の強度を示す相関係数、または平均モデル誤差の尺度である二乗平均平方根誤差を含めたいくつかの方法によって評価することができる。モデル評価のための選択された測定基準を使用して、システムは、モデルが保持されるべきときの規則を定義することができる。
【０４３３】
上記モデルに対する２つの述べられていない仮定は、（１）上位性相互作用が存在しないこと、および（２）予測モデルを構築するために利用される遺伝子変化／撹乱はすべて、遺伝子変化の提案された組合せとして、同じバックグラウンドにおいて作製されたことを含む。
【０４３４】
二次フィーチャのフィルタリング
上記実例は、予測された宿主細胞性能に基づく線形回帰予測に着目した。一部の実施形態では、本線形回帰方法は、非生体分子因子、例えば、飽和バイオマス、耐性、または他の測定可能な宿主細胞フィーチャに適用することもできる。よって、本開示の方法は、構築するための候補に優先順位を付けるとき、予測された性能以外の他のフィーチャを考慮することも教示する。追加の関連したデータが存在すると仮定して、非線形項も、回帰モデルに含められる。
【０４３５】
既存の株との密接な関係
すでに構築されたものと同様である予測された株は、最上位の予測された候補でないにもかかわらず、時間およびコスト削減をもたらすことができる。
【０４３６】
変化の多様性
上述のモデルを構築するとき、遺伝子変化は、上位性相互作用の存在に起因して真に相加的となる（線形回帰によって仮定し、上記仮定として述べた通り）と確認することができない。したがって、遺伝子変化相違点の知識は、正の相加性の見込みを増大させるのに使用することができる。例えば、最上位にランク付けされた株由来の変化が同じ代謝経路上にあり、同様の性能特性を有すると分かると、その情報を使用して、変化の同じでない組成を有する別の最上位ランクの株を選択することができる。上位性マッピングに関して上記セクションに記載した通り、予測された最良の遺伝子変化を選別して十分に同じでない応答プロファイルを有する変異に選択を制限することができる。代替として、線形回帰は、予測に重み付けするために類似度行列を使用する重み付き最小二乗回帰であり得る。
【０４３７】
予測された性能の多様性
最後に、予測モデルを検証し、引き続いて改善するために、中程度のまたは不満足な予測された性能を有する株を設計するように選択することができる。
【０４３８】
反復株設計最適化
諸実施形態では、発注エンジン２０８は、最上位の候補変異を組み入れている微生物株を製造するために工場注文（factory  order）をファクトリー２１０に出す。フィードバック−ループ様式では、結果を分析装置２１４によって分析して、どの微生物が所望の表現型性質を呈するかを決定することができる（３１４）。分析フェーズ中に、修飾された株培養物が評価されて、これらの性能、すなわち、工業規模で産生される能力を含めて、これらの所望の表現型性質の発現が決定される。例えば、分析フェーズでは、とりわけ、プレートの画像データが使用されて、コロニー健康の指標として微生物コロニー増殖が測定される。分析装置２１４が使用されて、遺伝子変化が表現型性能と相関付けられ、結果として生じる遺伝子型−表現型相関データをライブラリー内に保存して（それは、ライブラリー２０６内に記憶され得る）、将来の微生物産生を知らせる。
【０４３９】
特に、十分に高い測定された性能を実際にはもたらす候補変化を、データベース中の行として加えることができる。このようにして、最良に働く変異が、教師付き機械学習様式で予測的株設計モデルに加えられる。
【０４４０】
ＬＩＭＳは、先のファクトリーランから発生した相関に基づいて、設計／構築／試験／分析サイクルを反復する。後続のサイクル中に、分析装置２１４は、単独で、または人のオペレーターと併せて、相関データを使用して遺伝子改変を微調整することによってより微細な粒度を有するより良好な表現型性能を達成して、入力インターフェース２０２に入力して戻すための基準株としての最良候補を選択することができる。このようにして、本開示の実施形態の実験室情報管理システム（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ）は、品質改善フィードバックループをインプリメントする。
【０４４１】
つまり、図２２のフロー図を参照して、反復予測的株設計ワークフローを以下の通り記述することができる。
・入出力変数、例えば、入力として遺伝子変化および出力として性能フィーチャの訓練セットを生成する（３３０２）。生成は、先の遺伝子変化およびこれらの遺伝子変化を組み入れている微生物株の対応する測定された性能に基づいて分析装置２１４によって実施することができる。
・訓練セットに基づいて初期モデル（例えば、線形回帰モデル）を開発する（３３０４）。これは、分析装置２１４によって実施することができる。
・設計候補株を生成する（３３０６）
・一実施形態では、分析装置２１４は、変化の組合せの形態でバックグラウンド株に行われる遺伝子変化の数を固定することができる。これらの変化を表すために、分析装置２１４は、インタープリター２０４に、変化のこれらの組合せを表す１つまたは複数のＤＮＡの仕様を提供することができる。（これらの遺伝子変化またはこれらの変化を組み入れる微生物株は、「試験入力」と呼ばれる場合がある）。インタープリター２０４は、１つまたは複数のＤＮＡの仕様を解釈し、エグゼキューションエンジン２０７は、ＤＮＡの仕様を実行してこれらの変化について個々の候補設計株を表す分解された出力を有するＤＮＡの仕様をポピュレートする。
・モデルに基づいて、分析装置２１４は、各候補設計株の予期される性能を予測する（３３０８）。
・分析装置２１４は、最高の予測された性能を有する限られた数の候補設計、例えば１００を選択する（３３１０）。
・上位性マッピングに関して本明細書の他の場所で記載したように、分析装置２１４は、例えば、上位性効果について上位の設計を選別し、または予測モデル内に、上位性を計算に入れることによって上位性などの二次効果について説明することができる。
・発注エンジン２０８によって作成された工場注文に基づいて選別された候補株を構築する（ファクトリー２１０で）（３３１２）。
・分析装置２１４は、選択された株の実際の性能を測定し、これらの優れた実際の性能に基づいて限られた数のこれらの選択された株を選択し（３３１４）、設計変化およびこれらの結果として生じる性能を予測モデルに加える（３３１６）。
・次いで分析装置２１４は、新しい設計候補株の生成に戻って反復し（３３０６）、停止条件が満たされるまで反復し続ける。停止条件は、例えば、性能測定基準、例えば、収率、増殖速度、または力価を満たす少なくとも１つの微生物株の測定された性能を含み得る。
【０４４２】
上記例では、株設計の反復最適化は、フィードバックおよび線形回帰を使用して機械学習をインプリメントする。一般に、機械学習は、限られた数の標識データの例を使用し、次いで未知のデータに対して同じタスクを実施して、情報タスク（分類または回帰など）の性能における性能判定基準、例えば、パラメータ、技法、または他のフィーチャの最適化として記述することができる。上記線形回帰の例のものなどの教師付き機械学習では、機械（例えば、演算デバイス）は、例えば、訓練データが呈するパターン、カテゴリー、統計的関係、または他の属性を同定することによって学習する。次いで学習の結果が使用されて、新しいデータが、同じパターン、カテゴリー、統計的関係、または他の属性を呈するかどうかが予測される。
【０４４３】
本開示の実施形態は、訓練データが入手可能であるとき、他の教師付き機械学習技法を使用することができる。訓練データの非存在下で、諸実施形態では、教師なし機械学習が使用される場合がある。代替として、諸実施形態では、少量の標識データおよび大量の未標識データを使用して、半教師付き機械学習が使用され得る。諸実施形態では、フィーチャ選択が使用されて最も関連したフィーチャのサブセットが選択されることによって機械学習モデルの性能が最適化される場合もある。選択される機械学習手法のタイプに応じて、線形回帰の代替として、またはそれに加えて、諸実施形態では、例えば、ロジスティック回帰、ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、デシジョンツリー、隠れマルコフモデル、ベイジアンネットワーク、グラムシュミット、強化ベースの学習、階層的クラスタリングを含めたクラスターに基づく学習、遺伝的アルゴリズム、および当技術分野で公知の任意の他の適当な学習機械が使用され得る。特に、諸実施形態では、ロジスティック回帰が使用されて分類自体とともに分類（例えば、異なる機能群への遺伝子の分類）の確率が提供され得る。例えば、Shevade、A  simple  and  efficient  algorithm  for  gene  selection  using  sparse  logistic  regression、Bioinformatics、１９巻、１７号、２００３年、２２４６〜２２５３頁、Lengら、Classification  using  functional  data  analysis  for  temporal  gene  expression  data、Bioinformatics、２２巻、１号、Oxford  University  Press（２００６年）、６８〜７６頁を参照。これらのすべては、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０４４４】
諸実施形態では、グラフィックスプロセシングユニット（ＧＰＵ）加速アーキテクチャが使用される場合があり、これは、特に、ディープニューラルネットワーク（ＤＮＮ）として公知の形態で、機械学習タスクの実施において評判が増大していることが見出されている。本開示の実施形態では、ＧＰＵに基づく機械学習、例えば、GPU-Based  Deep  Learning  Inference:  A  Performance  and  Power  Analysis、NVidia  Whitepaper、２０１５年１１月、Dahlら、Multi-task  Neural  Networks  for  QSAR  Predictions、コンピューターサイエンス学科、トロント大学、２０１４年６月（arXiv:1406.1231  [stat.ML]）に記載されているものが使用され得る。これらの文献のすべては、本明細書にその全体が参照により組み込まれている。本開示の実施形態に適用可能な機械学習技法は、他の参考文献の中でも、Libbrechtら、Machine  learning  applications  in  genetics  and  genomics、Nature  Reviews:  Genetics、１６巻、２０１５年６月、Kashyapら、Big  Data  Analytics  in  Bioinformatics:  A  Machine  Learning  Perspective、Journal  of  Latex  Class  Files、１３巻、９号、２０１４年９月、Prompramoteら、Machine  Learning  in  Bioinformatics、Bioinformatics  Technologiesの第５章、１１７〜１５３頁、Springer  Berlin  Heidelberg、２００５年にも見出すことができ、これらのすべては、本明細書にその全体が参照により組み込まれている。
【０４４５】
反復予測的株設計：例
以下は、上記に概説した反復予測的株設計ワークフローの例示的用途を提供するものである。
【０４４６】
訓練入力変数および出力変数の初期セットを調製した。このセットは、確定した遺伝子組成を有する１８６４のユニークな操作された株を含んでいた。各株は、５から１５の間の操作された変化を含有していた。合計３３６のユニークな遺伝子変化が該訓練に存在した。
【０４４７】
初期の予測コンピューターモデルを開発した。インプリメンテーションは、一般化線形モデル（４次多項式カーネルを用いたカーネルリッジ回帰）を使用した。インプリメンテーションは、２つの個別の表現型（収率および生産性）をモデル化する。これらの表現型を、以下に示す通り、加重和として組み合わせてランク付けのための単一スコアを得た。様々なモデルパラメータ、例えば、正則化係数を、指定された訓練データに対してｋ倍交差検証を介してチューニングした。
【０４４８】
インプリメンテーションは、上記上位性マッピングセクションに記載した相互作用効果のいずれの明確な分析も組み入れない。しかし、当業者が理解するはずであるように、インプリメントされる一般化線形モデルは、カーネルの２、３、および４次項を通じて暗黙的に相互作用効果を捕捉することができる。
【０４４９】
モデルを訓練セットに対して訓練する。訓練後、収率モデルの訓練データへの有意な品質フィッティングが実証され得る。
【０４５０】
次いで、候補株を生成する。この実施形態は、親株への新しい遺伝子変化の導入に関連した連続構築制約を含む。ここでは、候補は、所望の数の変化の関数として単に見なされない。代わりに、分析装置２１４は、出発点として、高性能測定基準を有すると分かっている先に設計された株（「シード株」）のコレクションを選択する。分析装置２１４は個々に、遺伝子変化をシード株のそれぞれに適用する。導入される遺伝子変化は、シード株内に既に存在するものを含まない。様々な技術的、生物学的、または他の理由で、ある特定の変異が明示的に要求されるか、または明示的に除外される。
【０４５１】
モデルに基づいて、分析装置２１４は、候補株設計の性能を予測した。分析装置２１４は、目的の２つの表現型（収率および生産性）に関する予測された性能に基づいて「最良」から「最悪」に候補をランク付ける。具体的には、分析装置２１４は、加重和を使用して候補株をスコア付けする：
【０４５２】
スコア＝０．８＊ｙｉｅｌｄ／ｍａｘ（ｙｉｅｌｄｓ）＋０．２＊ｐｒｏｄ／ｍａｘ（ｐｒｏｄｓ）、
式中、ｙｉｅｌｄは、候補株について予測された収率を表し、
ｍａｘ（ｙｉｅｌｄｓ）は、すべての候補株に対する最大収率を表し、
ｐｒｏｄは、候補株についての生産性を表し、
ｍａｘ（ｐｒｏｄｓ）は、すべての候補株に対する最大収率を表す。
【０４５３】
分析装置２１４は、能力の制約およびオペレーションの制約の両方を課すことによって候補のランク付けされたリストから推奨の最終セットを生成する。一部の実施形態では、能力限界は、所与の数、例えば４８のコンピューター生成候補設計株に設定することができる。
【０４５４】
訓練されたモデル（上述した）を使用して各候補株の予期される性能（収率および生産性についての）を予測することができる。分析装置２１４は、上記に与えたスコア付関数を使用して候補株をランク付けすることができる。次いで、能力およびオペレーションの制約を適用して４８の候補株の選別されたセットを得ることができる。次いで、選別された候補株を、発注エンジン２０８が作成した工場注文に基づいて構築する（ファクトリー２１０において）（３３１２）。注文は、候補株に対応するＤＮＡの仕様に基づき得る。
【０４５５】
実際には、ビルドプロセスは、予期された失敗率を有し、それによって株のランダムセットを構築しない。
【０４５６】
分析装置２１４を使用して選択された株の実際の収率および生産性性能を測定した。分析装置２１４は、３つの判定基準：モデル精度；株性能の改善；および人間の専門家が作成した設計との同等性（または改善）に基づいてモデルおよび推奨株を評価した。
【０４５７】
収率および生産性表現型を、推奨株について測定し、モデルが予測した値と比較することができる。
【０４５８】
次に、分析装置２１４は、推奨株のそれぞれの親株からのパーセンテージ性能変化を計算する。
【０４５９】
予測精度は、予測値と観測値との間の関連性の強度を示す相関係数、または平均モデル誤差の尺度である二乗平均平方根誤差を含めたいくつかの方法によって評価することができる。実験の多くのラウンドにわたって、モデル予測がずれる場合があり、新しい遺伝子変化を訓練入力に加えて予測精度を改善することができる。本例に関して、設計変化およびこれらの結果として生じる性能を予測モデルに加えた（３３１６）。
【０４６０】
サービスとしてのゲノム設計および操作
本開示の実施形態では、図２１のＬＩＭＳシステムソフトウェア３２１０を、図２１のクラウドコンピューティングシステム３２０２において実装して、複数のユーザーが本開示の実施形態によって微生物株を設計および構築するのを可能にすることができる。図２１は、本開示の実施形態によるクラウドコンピューティング環境３２０４を例示する。図２１に例示したものなどのクライアントコンピューター３２０６は、インターネットなどのネットワーク３２０８を介してＬＩＭＳシステムにアクセスする。諸実施形態では、ＬＩＭＳシステムアプリケーションソフトウェア３２１０は、クラウドコンピューティングシステム３２０２内に存在する。ＬＩＭＳシステムは、図２１に例示したタイプの１つまたは複数のプロセッサーを使用して１つまたは複数のコンピューターシステムを使用することができる。クラウドコンピューティングシステム自体は、ネットワーク３２０８を介してＬＩＭＳシステムアプリケーション３２１０をクライアントコンピューター３２０６にインターフェースをとるためのネットワークインターフェース３２１２を含む。ネットワークインターフェース３２１２は、アプリケーションプログラミングインターフェース（ＡＰＩ）を含むことによって、クライアントコンピューター３２０６におけるクライアントアプリケーションがＬＩＭＳシステムソフトウェア３２１０にアクセスするのを可能にすることができる。特に、ＡＰＩを通じて、クライアントコンピューター３２０６は、限定することなく、入力インターフェース２０２、インタープリター２０４、エグゼキューションエンジン２０７、発注エンジン２０８、ファクトリー２１０をランさせるソフトウェア、ならびに試験装置２１２および分析装置２１４を含めたＬＩＭＳシステム２００のコンポーネントにアクセスすることができる。サービス型ソフトウェア（ＳａａＳ）のソフトウェアモジュール３２１４は、クライアントコンピューター３２０６へのサービス型ＬＩＭＳシステムソフトウェア３２１０を提供する。クラウド管理モジュール３２１６は、クライアントコンピューター３２０６によるＬＩＭＳシステム３２１０へのアクセスを管理する。クラウド管理モジュール３２１６は、マルチテナントアプリケーションを使用するクラウドアーキテクチャ、当技術分野で公知の仮想化または他のアーキテクチャが、複数のユーザーにサービスすることを可能にし得る。
【０４６１】
ゲノム自動化
本開示の方法を自動化すると、同時に複数の試験株バリアントからの標的産物のハイスループット表現型スクリーニングおよび同定が可能になる。
【０４６２】
上述のゲノム操作予測モデルリングプラットフォームは、数百および数千の変異体株がハイスループット様式で構築される事実を前提としている。以下に記載のロボットシステムおよびコンピューターシステムは、このようなハイスループットプロセスを実行することができる構造機構である。
【０４６３】
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞生産性を改善し、または工業用株を再建する方法を教示する。このプロセスの一部として、本開示は、ＤＮＡをアセンブルし、新しい株を構築し、プレート中の培養物をスクリーニングし、タンク発酵のモデルにおける培養物をスクリーニングする方法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、新しい宿主株を創製および試験する上述の方法の１つまたは複数は、自動化ロボットによって助けられることを教示する。
【０４６４】
ＨＴＰロボットシステム
一部の実施形態では、本開示の自動化された方法は、ロボットシステムを含む。本明細書に概説したシステムは一般に、９６−または３８４−ウェルマイクロタイタープレートの使用を対象とするが、当業者が十分に理解するように、任意の数の異なるプレートまたは構成を使用することができる。さらに、本明細書に概説したステップのいずれか、またはすべてを自動化することができ、よって例えば、システムは、完全または部分的に自動化され得る。
【０４６５】
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、１つまたは複数の作業モジュールを含む。例えば、一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、ＤＮＡ合成モジュール、ベクタークローニングモジュール、株形質転換モジュール、スクリーニングモジュール、およびシーケンシングモジュールを含む（図５を参照）。
【０４６６】
当業者が十分に理解するとおり、自動化システムは、これらに限定されないが、液体ハンドラー；１つまたは複数のロボットアーム；マイクロプレートを適所配置するためのプレートハンドラー；プレートシーラー、プレートピアサー、非交差汚染プレート上のウェルの蓋を除去および交換するための自動化蓋ハンドラー；使い捨てチップを用いて試料分配するための使い捨てチップアセンブリー；試料分配のための洗浄可能なチップアセンブリー；９６ウェルローディングブロック；一体型サーマルサイクラー；冷却された試薬ラック；マイクロタイタープレートピペットポジション（必要に応じて冷却された）；プレートおよびチップのためのスタッキングタワー；磁気ビーズ処理ステーション；濾過システム；プレートシェーカー；バーコードリーダーおよびアプリケーター；ならびにコンピューターシステムを含めた多種多様なコンポーネントを含み得る。
【０４６７】
一部の実施形態では、本開示のロボットシステムは、ハイスループットピペット操作を可能にして遺伝子標的化および組換え用途のプロセスにおけるすべてのステップを実施する自動化液体および粒子ハンドリングを含む。これは、液体および粒子マニピュレーション、例えば、吸引、分注、混合、希釈、洗浄、正確な容量移送；ピペットチップの取戻しおよび廃棄；ならびに単一試料吸引からの複数の送達についての同一体積の繰り返しピペット操作などを含む。これらのマニピュレーションは、交差汚染のない液体、粒子、細胞、および生物体移送である。機器は、フィルター、膜、および／または娘プレートへのマイクロプレート試料の自動化複製、高密度移送、フルプレート連続希釈、ならびに大容量オペレーションを遂行する。
【０４６８】
一部の実施形態では、本開示の特注自動化液体ハンドリングシステムは、ＴＥＣＡＮ機械（例えば、特注ＴＥＣＡＮ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  Ｅｖｏ）である。
【０４６９】
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、マルチウェルプレート、ディープウェルプレート、スクウェアウェルプレート、試薬トラフ、試験管、ミニチューブ、マイクロチューブ、クライオバイアル、フィルター、マイクロアレイチップ、光ファイバー、ビーズ、アガロースゲルおよびアクリルアミドゲルのためのプラットフォームに適合し、他の固相マトリックスまたはプラットフォームは、アップグレード可能なモジュラーデッキ上に収容されている。一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、ソースおよび産出試料、試薬、試料および試薬希釈、アッセイプレート、試料および試薬リザーバー、ピペットチップ、ならびにアクティブチップ洗浄ステーションを配置するための多位置作業面のための少なくとも１つのモジュラーデッキを含有する。
【０４７０】
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、ハイスループット電気穿孔システムを含む。一部の実施形態では、ハイープット電気穿孔システムは、９６または３８４−ウェルプレート内で細胞を形質転換することができる。一部の実施形態では、ハイスループット電気穿孔システムとしては、ＶＷＲ（登録商標）ハイスループット電気穿孔システム、ＢＴＸ（商標）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＭＸｃｅｌｌ（商標）、または他のマルチウェル電気穿孔システムが挙げられる。
【０４７１】
一部の実施形態では、一体型サーマルサイクラーおよび／または温度調節器が、制御ブロックまたはプラットフォームなどの熱交換器の温度を安定化させるのに使用されて、０℃〜１００℃に試料をインキュベートする正確な温度制御をもたらす。
【０４７２】
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、液体、粒子、細胞、および多細胞生物をロボット制御でマニピュレートすることができる、単一もしくは複数の磁気プローブ、親和性プローブ、レプリケーター、またはピペッタを有する交換可能なマシンヘッド（単一またはマルチチャネル）に適合する。マルチウェルまたはマルチチューブ磁気分離器および濾過ステーションは、単一または複数の試料フォーマットにおいて液体、粒子、細胞、および生物体をマニピュレートする。
【０４７３】
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、カメラビジョンおよび／または分光計システムに適合する。よって、一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、進行中の細胞培養における色および吸収の変化を検出およびロギングすることができる。
【０４７４】
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、複数のハードウェアアドオンに柔軟であり、適応できることによって、システムが複数のアプリケーションを実行することを可能にするように設計される。ソフトウェアプログラムモジュールは、方法の創製、改変、および試行を可能にする。システムの診断モジュールは、セットアップ、機器整列、およびモータ動作を可能にする。特注のツール、実験機器、ならびに液体および粒子移送パターンは、異なるアプリケーションをプログラムおよび実施することを可能にする。データベースは、方法およびパラメータ記憶を可能にする。ロボットインターフェースおよびコンピューターインターフェースは、機器間の通信を可能にする。
【０４７５】
よって、一部の実施形態では、本開示は、図１５および１６に表したハイスループット株操作プラットフォームを教示する。
【０４７６】
当業者は、本開示のＨＴＰ操作方法を実行することができる様々なロボットプラットフォームを認識する。以下の表３は、図１５および１６に記載した本開示のＨＴＰ操作ステップの各ステップを実行することができる科学的装置の非排他的リストを提供する。
【表３−１】
2020524494.tif 000012
【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【０４７７】
コンピューターシステムハードウェア
図２３は、本開示の実施形態による非一時的コンピューター可読媒体（例えば、メモリー）内に記憶されたプログラムコードを実行するのに使用され得るコンピューターシステム８００の一例を例示する。コンピューターシステムは、入力／出力サブシステム８０２を含み、これは、アプリケーションに応じて人間のユーザーおよび／または他のコンピューターシステムとインターフェースで接続するのに使用することができる。Ｉ／Ｏサブシステム８０２は、例えば、キーボード、マウス、グラフィカルユーザーインターフェース、タッチスクリーン、または入力のための他のインターフェース、および例えば、ＬＥＤもしくは他のフラットスクリーンディスプレイ、あるいはアプリケーションプログラムインターフェース（ＡＰＩ）を含めた出力のための他のインターフェースを含み得る。ＬＩＭＳシステムのコンポーネントなどの本開示の実施形態の他のエレメントは、コンピューターシステム８００のもののようなコンピューターシステムで実装することができる。
【０４７８】
プログラムコードは、二次メモリー８１０もしくはメインメモリー８０８または両方内の永続記憶装置などの非一時的媒体内に記憶することができる。メインメモリー８０８として、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）などの揮発性メモリー、またはリードオンリーメモリー（ＲＯＭ）などの不揮発性メモリー、ならびに指示およびデータにより速くアクセスするための異なるレベルのキャッシュメモリーを挙げることができる。二次メモリーとして、永続記憶装置、例えば、ソリッドステートドライブ、ハードディスクドライブ、または光ディスクなどを挙げることができる。１つまたは複数のプロセッサー８０４は、１つまたは複数の非一時的媒体からのプログラムコードを読み込み、コードを実行してコンピューターシステムが本明細書の実施形態によって実施される方法をなしとげることを可能にする。当業者は、プロセッサー（複数可）は、ソースコードを取り込み、ソースコードを解釈またはコンパイルして、プロセッサー（複数可）８０４のハードウェアゲートレベルで理解可能であるマシンコードにすることができることを理解する。プロセッサー（複数可）８０４は、計算集約型タスクを扱うためのグラフィックスプロセシングユニット（ＧＰＵ）を含み得る。特に、機械学習では、１つまたは複数のＣＰＵ  ８０４は、大量のデータの処理を１つまたは複数のＧＰＵ  ８０４にオフロードすることができる。
【０４７９】
プロセッサー（複数可）８０４は、１つまたは複数の通信インターフェース８０７、例えば、ネットワークインターフェースカード、ＷｉＦｉトランシーバーなどを介して外部ネットワークと通信することができる。バス８０５は、Ｉ／Ｏサブシステム８０２、プロセッサー（複数可）８０４、周辺デバイス８０６、通信インターフェース８０７、メモリー８０８、および永続記憶装置８１０を通信可能にカップルする。本開示の実施形態は、この代表的なアーキテクチャに限定されない。代替の実施形態は、異なる配置およびタイプのコンポーネント、例えば、入出力コンポーネントおよびメモリーサブシステムのための別個のバスを使用することができる。
【０４８０】
当業者は、本開示の実施形態のエレメントの一部またはすべて、およびこれらの付随するオペレーションは、コンピューターシステム８００のもののような１つまたは複数のプロセッサーおよび１つまたは複数のメモリーシステムを含む１つまたは複数のコンピューターシステムによって完全または部分的にインプリメントされ得ることを理解する。特に、本明細書に記載のＬＩＭＳシステム２００ならびに任意のロボットおよび他の自動化システムまたはデバイスのエレメントは、コンピューター実装することができる。一部のエレメントおよび機能性は、ローカルにインプリメントすることができ、他のものは、例えば、異なるサーバーを通じたネットワークにわたって分散様式で、例えば、クライアント−サーバー様式でインプリメントすることができる。特に、図２１に示したように、サーバーサイドオペレーションを、サービス型ソフトウェア（ＳａａＳ）様式で複数のクライアントに利用可能にすることができる。
【０４８１】
本文脈における用語のコンポーネントは、ソフトウェア、ハードウェア、もしくはファームウェア（またはこれらの任意の組合せ）コンポーネントを広く指す。コンポーネントは、典型的には、指定された入力（複数可）を使用して有用なデータまたは他の出力を生成することができる機能コンポーネントである。コンポーネントは、自己充足型であってもよく、または自己充足型でなくてもよい。アプリケーションプログラム（「アプリケーション」とも呼ばれる）は、１つもしくは複数のコンポーネントを含み得、またはコンポーネントは、１つもしくは複数のアプリケーションプログラムを含むことができる。
【０４８２】
一部の実施形態は、他のモジュールまたはアプリケーションコンポーネントとともにコンポーネントの一部、すべてを含み、またはどれも含まない。なおさらに、様々な実施形態は、これらのコンポーネントの２つもしくはそれ超を単一モジュール内に組み入れ、かつ／またはこれらのコンポーネントの１つもしくは複数の機能性の一部を異なるコンポーネントと結びつけることができる。
【０４８３】
用語「メモリー」は、情報を記憶させるのに使用される任意のデバイスまたは機構であり得る。本開示の一部の実施形態によれば、メモリーは、これらに限定されないが、揮発性メモリー、不揮発性メモリー、およびダイナミックメモリーの任意のタイプを包含するように意図されている。例えば、メモリーは、ランダムアクセスメモリー、メモリー記憶デバイス、光学メモリーデバイス、磁気媒体、フロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、ハードドライブ、ＳＩＭＭ、ＳＤＲＡＭ、ＤＩＭＭ、ＲＤＲＡＭ、ＤＤＲ  ＲＡＭ、ＳＯＤＩＭＭＳ、消去可能プログラム可能リードオンリーメモリー（ＥＰＲＯＭ）、電気的消去可能プログラム可能リードオンリーメモリー（ＥＥＰＲＯＭ）、コンパクトディスク、ＤＶＤなどであり得る。一部の実施形態によれば、メモリーは、１つまたは複数のディスクドライブ、フラッシュドライブ、データベース、ローカルキャッシュメモリー、プロセッサーキャッシュメモリー、リレーショナルデータベース、フラットデータベース、サーバー、クラウドベースプラットフォームなどを含み得る。さらに、当業者は、情報を記憶するための多くの追加のデバイスおよび技法をメモリーとして使用することができることを十分に理解する。
【０４８４】
メモリーは、プロセッサー上の１つまたは複数のアプリケーションまたはモジュールをランさせるための指示を記憶させるのに使用され得る。例えば、メモリーは、一部の実施形態では、本願に開示のモジュールおよび／またはアプリケーションの１つまたは複数の機能性を実行するのに必要な指示のすべてまたは一部を収納するのに使用することができる。
【０４８５】
遺伝子設計予測に基づくＨＴＰ微生物株操作：例示的なワークフロー
一部の実施形態では、本開示は、本開示のコンピューター分析システムの推奨に基づく新しい宿主生物の指向操作を教示する。
【０４８６】
一部の実施形態では、本開示は、すべての遺伝子設計およびクローニング方法に適合する。すなわち、一部の実施形態では、本開示は、伝統的なクローニング技法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、制限酵素消化、ライゲーション、相同組換え、ＲＴ  ＰＣＲ、および当技術分野で一般に公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Sambrookら（２００１年）、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual（３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Plainview、New  York）に開示されているその他のものなどの使用を教示する。
【０４８７】
一部の実施形態では、クローン化された配列は、本明細書に教示のＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーのいずれか由来の可能なもの、例えば、プロモータースワップライブラリー由来のプロモーター、ＳＮＰスワップライブラリー由来のＳＮＰ、開始コドンもしくは停止コドン交換ライブラリー由来の開始コドンもしくは停止コドン、ＳＴＯＰスワップライブラリー由来のターミネーター、配列最適化ライブラリー由来の配列最適化、またはトランスポゾン変異誘発ライブラリー由来のトランスポゾンを含み得る。
【０４８８】
さらに、特定の構築物内に含まれるべき正確な配列組合せは、上位性マッピング機能によって知らされ得る。
【０４８９】
他の実施形態では、クローン化された配列は、合理的な設計（仮説主導型）に基づく配列および／または科学刊行物などの他のソースに基づく配列も含むことができる。
【０４９０】
一部の実施形態では、本開示は、ｉ）カスタムメイドＳＮＰ特異的ＤＮＡを生成するステップと、ｉｉ）ＳＮＰ特異的プラスミドをアセンブルするステップと、ｉｉｉ）ＳＮＰ特異的ＤＮＡで標的宿主細胞を形質転換するステップと、ｉｖ）任意の選択マーカーをループアウトさせるステップとを含む、指向操作の方法を教示する（図２を参照）。
【０４９１】
図４Ａは、ＤＮＡを取得およびアセンブルステップと、ベクターをアセンブルするステップと、宿主細胞を形質転換するステップと、選択マーカーを除去するステップとを含む、本開示の株操作法の一般的なワークフローを表す。
【０４９２】
特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドを構築する
一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞生物体のＤＮＡセグメントを挿入することおよび／または置き換えることおよび／または変更することおよび／または欠失させることを教示する。一部の態様では、本明細書に教示の方法は、宿主生物のゲノム内に組み入れる目的のオリゴヌクレオチド（すなわち、標的ＤＮＡセグメント）を構築することを伴う。一部の実施形態では、本開示の標的ＤＮＡセグメントは、公知の鋳型からのコピーもしくはカット、変異、またはＤＮＡ合成を含む、当技術分野で公知の任意の方法を介して得ることができる。一部の実施形態では、本開示は、標的ＤＮＡ配列を生成するための市販の遺伝子合成産物（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ（商標）、ＧｅｎｅＭａｋｅｒ（商標）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（商標）、Ａｎａｇｅｎ（商標）、Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ（商標）、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ（商標）、ＧｅＮＯｓｙｓ，Ｉｎｃ．、またはＱｉａｇｅｎ（商標））に適合する。
【０４９３】
一部の実施形態では、標的ＤＮＡセグメントは、宿主生物の選択されたＤＮＡ領域内にＳＮＰを組み入れる（例えば、有益なＳＮＰを付加する）ように設計されている。他の実施形態では、ＤＮＡセグメントは、宿主生物のＤＮＡからＳＮＰを除去する（例えば、有害なまたは中立のＳＮＰを除去する）ように設計されている。
【０４９４】
一部の実施形態では、本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の酵素合成または化学合成の方法のいずれかを使用して合成することができる。オリゴヌクレオチドは、固体支持体、例えば、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）、ポリスチレンビーズ、またはＣＰＧを含有し得る熱可塑性ポリマーから構成される膜上で合成することができる。オリゴヌクレオチドは、アレイ上で、マイクロフルイディクスを使用して並列のマイクロスケールで（Tianら、Mol.  BioSyst.、５巻、７１４〜７２２頁（２００９年））、または両方の組合せを提供する公知の技術で（Jacobsenら、米国特許出願第２０１１／０１７２１２７号を参照）合成することもできる。
【０４９５】
アレイ上の、またはマイクロフルイディクスによる合成は、より低い試薬使用を通じてコストを低減することによって、慣例的な固体支持体合成に対して利点を提供する。遺伝子合成に要求される規模は低く、したがって、アレイから、またはマイクロフルイディクスを通じて合成されるオリゴヌクレオチド産物の規模は、許容される。しかし、合成されるオリゴヌクレオチドは、固体支持体合成を使用するときより低い品質のものである（Tian、以下を参照；Staehlerら、米国特許出願第２０１０／０２１６６４８号も参照）。
【０４９６】
多数の進歩が、それが１９８０年代に最初に記載されて以来、伝統的な４ステップホスホラミダイト化学において達成されている（例えば、ペルオキシアニオンの脱保護を使用するSierzchalaら、J.  Am.  Chem.  Soc.、１２５巻、１３４２７〜１３４４１頁（２００３年）；代替の保護基についてHayakawaら、米国特許第６，０４０，４３９号；ユニバーサル支持体についてAzhayevら、Tetrahedron、５７巻、４９７７〜４９８６頁（２００１年）；大孔ＣＰＧの使用によるより長いオリゴヌクレオチドの改善された合成についてKozlovら、Nucleosides、Ｎucleotides,  and  Nucleic  Acids、２４巻（５〜７号）、１０３７〜１０４１頁（２００５年）；および改善された誘導体化についてDamhaら、NAR、１８巻、３８１３〜３８２１頁（１９９０年）を参照）。
【０４９７】
合成のタイプにかかわらず、次いで結果として生じるオリゴヌクレオチドは、より長いオリゴヌクレオチドのためのより小さいビルディングブロックを形成することができる。一部の実施形態では、より小さいオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知のプロトコール、例えば、ポリメラーゼ鎖アセンブリー（ＰＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および熱力学的にバランスの取れたインサイドアウト合成（thermodynamically  balanced  inside-out  synthesis）（ＴＢＩＯ）を使用して一緒に繋ぐことができる（Czarら、Trends  in  Biotechnology、２７巻、６３〜７１頁（２００９年）を参照）。ＰＣＡでは、所望のより長い産物の全長にまたがるオリゴヌクレオチドが、複数のサイクル（典型的には約５５サイクル）においてアニールおよび伸長されて完全長産物を最終的に達成する。ＬＣＲは、リガーゼ酵素を使用して２つのオリゴヌクレオチドを繋ぎ、これらはともにアニールされて第３のオリゴヌクレオチドになる。ＴＢＩＯ合成は、所望の産物の中心から開始し、遺伝子の５’末端における順方向鎖と、かつ遺伝子の３’末端における逆方向鎖と相同である重複オリゴヌクレオチドを使用することによって両方向で漸次伸長される。
【０４９８】
より大きい二本鎖ＤＮＡ断片を合成する別の方法は、トップストランドＰＣＲ（ＴＳＰ）によってより小さいオリゴヌクレオチドを組み合わせることである。本方法では、複数のオリゴヌクレオチドが所望の産物の全長にわたり、隣接するオリゴヌクレオチド（複数可）に対して重複領域を含有する。増幅は、ユニバーサル順方向プライマーおよび逆方向プライマーを用いて、かつ複数のサイクルの増幅を介して実施することができ、全長の二本鎖ＤＮＡ産物が形成される。次いでこの産物は、任意選択の誤差補正およびさらなる増幅を受けることができ、それにより、所望の二本鎖ＤＮＡ断片最終産物がもたらされる。
【０４９９】
ＴＳＰの一方法では、全長の所望の産物を形成するのに組み合わされるより小さいオリゴヌクレオチドのセットは、４０〜２００塩基の間の長さであり、互いに少なくとも約１５〜２０塩基重複する。実用的な目的のために、重複領域は、オリゴヌクレオチドの特異的アニーリングを保証するために最低でも十分長く、使用される反応温度でアニールするために十分高い融解温度（Ｔｍ）を有するべきである。重複は、所与のオリゴヌクレオチドが隣接するオリゴヌクレオチドによって完全に重複されるポイントまで伸長することができる。重複の量は、最終産物の品質に対していずれの効果も有さないようである。アセンブリー内の最初および最後のオリゴヌクレオチドビルディングブロックは、順方向および逆方向の増幅プライマーのための結合部位を含有するべきである。一実施形態では、最初および最後のオリゴヌクレオチドの末端側終端配列は、同じ相補性を有する配列を含有してユニバーサルプライマーの使用を可能にする。
【０５００】
特注プラスミドアセンブリング／クローニング
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物のゲノム内に所望の標的ＤＮＡ切片（例えば、特定のＳＮＰまたはトランスポゾンを含有する）を挿入することができるベクターを構築するための方法を教示する。一部の実施形態では、本開示は、標的ＤＮＡ、相同アーム、および少なくとも１つの選択マーカーを含むベクターをクローニングする方法を教示する（図３を参照）。
【０５０１】
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物内への形質転換に適した任意のベクターに適合する。一部の実施形態では、本開示は、宿主細胞に適合するシャトルベクターの使用を教示する。一実施形態では、本明細書に提供される方法において使用するためのシャトルベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉおよび／またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主細胞に適合するシャトルベクターである。本明細書に提供される方法において使用するためのシャトルベクターは、本明細書に記載の選択および／または対抗選択のためのマーカーを含み得る。マーカーは、当技術分野で公知のかつ／または本明細書に提供される任意のマーカーであり得る。シャトルベクターは、任意の調節配列（複数可）および／または当技術分野で公知の前記シャトルベクターのアセンブリーにおいて有用な配列をさらに含み得る。シャトルベクターは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなど本明細書に提供される宿主細胞内での繁殖に必要とされ得る任意の複製起点をさらに含むことができる。調節配列は、当技術分野で公知の、または本明細書に提供される任意の調節配列、例えば、宿主細胞の遺伝機構によって使用される、プロモーター、開始、停止、シグナル、分泌、および／または終結配列などであり得る。ある特定の事例では、標的ＤＮＡは、任意のリポジトリまたはカタログ製品から入手可能なベクター、コンストラクト、またはプラスミド、例えば、市販のベクター（例えば、ＤＮＡ２．０特注またはＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ベクターを参照）内に挿入することができる。ある特定の事例では、標的ＤＮＡは、任意のリポジトリまたはカタログ製品から入手可能なベクター、コンストラクト、またはプラスミド、例えば、市販のベクター（例えば、ＤＮＡ２．０特注またはＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ベクターを参照）内に挿入することができる。
【０５０２】
一部の実施形態では、本開示のアセンブリー／クローニング方法は、以下のアセンブリーストラテジー：ｉ）ＩＩ型慣習的クローニング、ｉｉ）ＩＩ  Ｓ型媒介または「ゴールデンゲート」クローニング（例えば、Engler,  C.、R.  Kandzia、およびS.  Marillonnet、２００８年、「A  one  pot,  one  step,  precision  cloning  method  with  high-throughput  capability」、PLos  One、３巻：ｅ３６４７頁；Kotera,  I.およびT.  Nagai、２００８年、「A  high-throughput  and  single-tube  recombination  of  crude  PCR  products  using  a  DNA  polymerase  inhibitor  and  type  IIS  restriction  enzyme」、J  Biotechnol、１３７巻：１〜７頁；Weber,  E.、R.  Gruetzner、S.  Werner、C.  Engler、およびS.  Marillonnet、２０１１年、Assembly  of  Designer  TAL  Effectors  by  Golden  Gate  Cloning、PloS  One、６巻：ｅ１９７２２頁を参照）、ｉｉｉ）ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）組換え、ｉｖ）ＴＯＰＯ（登録商標）クローニング、エキソヌクレアーゼ媒介アセンブリー（Aslanidisおよびde  Jong、１９９０年、「Ligation-independent  cloning  of  PCR  products  (LIC-PCR)」、Nucleic  Acids  Research、１８巻、２０号、６０６９頁）、ｖ）相同組換え、ｖｉ）非相同末端結合、ｖｉｉ）ギブソンアセンブリー（Gibsonら、２００９年、「Enzymatic  assembly  of  DNA  molecules  up  to  several  hundred  kilobases」、Nature  Methods、６巻、３４３〜３４５頁）、またはこれらの組合せの少なくとも１つを使用することができる。モジュラーＩＩＳ型ベースアセンブリーストラテジーは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／１５４１４７に開示されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれている。
【０５０３】
一部の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの選択マーカーを有するベクターをクローニングすることを教示する。選択圧下で原核細胞（例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ゼオシン、スペクチノマイシン／ストレプトマイシンに対する）、または真核細胞（例えば、ジェネテシン、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン）内の選択について抗生物質耐性機能をコードすることが多い様々な選択マーカー遺伝子が当技術分野で公知である。他のマーカーシステム、例えば、順調に形質導入された宿主細胞において発現されるＸ−ｇａｌまたは緑色もしくは赤色蛍光タンパク質などの蛍光レポーターの存在下で陽性クローンを選択するのに細菌において使用される周知のブルー／ホワイトスクリーニングシステムは、望まれるまたは望まれない細胞のスクリーニングおよび同定を可能にする。そのほとんどが原核生物系内でのみ機能的である選択マーカーの別のクラスは、産生細胞を死滅させる毒性遺伝子産物を発現する、「デス遺伝子（death  gene）」とも呼ばれることが多い対抗選択可能マーカー遺伝子に関する。このような遺伝子の例としては、ｓａｃＢ、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）、ｔｅｔＡＲ、ｐｈｅＳ、ｔｈｙＡ、ｇａｔａ−１、またはｃｃｄＢが挙げられ、その機能は、（Reyratら、１９９８年、「Counterselectable  Markers:  Untapped  Tools  for  Bacterial  Genetics  and  Pathogenesis」、Infect  Immun.、６６巻（９号）：４０１１〜４０１７頁）に記載されている。
【０５０４】
プロトプラスト形成法
一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムは、糸状菌細胞由来のプロトプラストの生成を使用する。プロトプラストを調製するための適当な手順は、例えば、ＥＰ２３８，０２３およびYeltonら（１９８４年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８１巻：１４７０〜１４７４頁）に記載されたものを含めて任意の当技術分野で公知のものであり得る。一実施形態では、プロトプラストは、１種または複数の溶菌酵素またはこれらの混合物を用いて糸状菌細胞の培養物を処理することによって生成される。溶菌酵素は、ベータ−グルカナーゼおよび／またはポリガラクツロナーゼであり得る。一実施形態では、プロトプラストを生成するための酵素混合物は、ＶｉｎｏＴａｓｔｅ濃縮物である。酵素処理の後、プロトプラストは、例えば、遠心分離などの当技術分野で公知の方法を使用して単離することができる。
【０５０５】
前培養および実際のプロトプラスト形成（protoplasting）ステップを変えて、プロトプラストの数および形質転換効率を最適化することができる。例えば、接種量の変動、接種方法、前培養培地、前培養時間、前培養温度、混合条件、洗浄緩衝液組成、希釈比、溶菌酵素処理中の緩衝液組成、使用される溶菌酵素のタイプおよび／または濃度、溶菌酵素とのインキュベーションの時間、プロトプラスト洗浄手順および／または緩衝液、実際の形質転換中のプロトプラストおよび／またはポリヌクレオチドおよび／または形質転換試薬の濃度、形質転換中の物理的パラメータ、最大で得られる形質転換体までの形質転換後の手順が存在し得る。
【０５０６】
プロトプラストは、浸透圧安定化緩衝液中に再懸濁させることができる。このような緩衝液の組成は、種、アプリケーション、および必要性に応じて変動し得る。しかし、典型的には、これらの緩衝液は、０．５から２Ｍの間のスクロース、シトレート、マンニトール、またはソルビトールのようないずれかの有機成分を含有する。より好ましくは、０．７５から１．５Ｍの間；１Ｍが最も好適である。さもなければ、これらの緩衝液は、０．１から１．５Ｍの濃度でＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌ、またはＭｇＣｌ２のような無機浸透圧安定化成分を含有する。好ましくは０．２から０．８Ｍの間；より好ましくは０．３から０．６Ｍの間、最も好ましくは０．４Ｍである。最も好適な安定化緩衝液は、ＳＴＣ（ソルビトール、０．８Ｍ；ＣａＣｌ２、２５ｍＭ；Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ；ｐＨ８．０）またはＫＣｌ−シトレート（ＫＣｌ、０．３〜０．６Ｍ；シトレート、０．２％（ｗ／ｖ））である。プロトプラストは、１×１０５から１×１０１０細胞／ｍｌの間の濃度で使用することができる。好ましくは、濃度は、１×１０６から１×１０９の間であり；より好ましくは、濃度は、１×１０７から５×１０８の間であり；最も好ましくは、濃度は、１×１０８細胞／ｍｌである。ＤＮＡは、０．０１から１０μｇの間；好ましくは０．１から５μｇの間、さらにより好ましくは０．２５から２μｇの間；最も好ましくは０．５から１μｇの間の濃度で使用される。トランスフェクションの効率を増大させるため、キャリアＤＮＡ（サケ精子ＤＮＡまたは非コードベクターＤＮＡのような）を形質転換混合物に添加することができる。
【０５０７】
一実施形態では、生成および後続の単離の後、プロトプラストは、１種または複数の凍結保護物質と混合される。凍結保護物質は、グリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリオール、糖、２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、メチルセルロース、Ｃ−連結凍結防止糖タンパク質（Ｃ−ＡＦＧＰ）、またはこれらの組合せであり得る。本明細書に提供される方法およびシステムにおいて凍結保護物質として使用するためのグリコールは、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール（ＰＥＧ）、グリセロール、またはこれらの組合せから選択することができる。本明細書に提供される方法およびシステムにおいて凍結保護物質として使用するためのポリオールは、プロパン−１，２−ジオール、プロパン−１，３−ジオール、１，１，１−トリス−（ヒドロキシメチル）エタン（ＴＨＭＥ）、および２−エチル−２−（ヒドロキシメチル）−プロパン−１，３−ジオール（ＥＨＭＰ）、またはこれらの組合せから選択することができる。本明細書に提供される方法およびシステムにおいて凍結保護物質として使用するための糖は、トレハロース、スクロース、グルコース、ラフィノース、デキストロース、またはこれらの組合せから選択することができる。一実施形態では、プロトプラストは、ＤＭＳＯと混合される。ＤＭＳＯは、少なくとも、多くて、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２．５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％ｗ／ｖまたはｖ／ｖ、それ未満、それ超、それに等しい、または約その値の最終濃度でプロトプラストと混合することができる。プロトプラスト／凍結保護物質（例えば、ＤＭＳＯ）混合物は、貯蔵前にマイクロタイタープレートに分配することができる。プロトプラスト／凍結保護物質（例えば、ＤＭＳＯ）混合物は、本明細書に提供される長期貯蔵（例えば、数時間、数日、数週間、数カ月、数年）にわたって、本明細書に提供される任意の温度、例えば、−２０℃または−８０℃などで貯蔵することができる。一実施形態では、追加の凍結保護物質（例えば、ＰＥＧ）が、プロトプラスト／ＤＭＳＯ混合物に添加される。さらに別の実施形態では、追加の凍結保護物質（例えば、ＰＥＧ）が、貯蔵前にプロトプラスト／ＤＭＳＯ混合物に添加される。ＰＥＧは、本明細書に提供される任意のＰＥＧであり得、本明細書に提供される任意の濃度（例えば、ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）で添加することができる。
【０５０８】
プロトプラスト形質転換方法
一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムは、本明細書に記載の糸状菌細胞に由来するプロトプラストへの核酸の移送を必要とする。別の実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムによって利用される形質転換は、本明細書に記載した通り、本質的にハイスループットであり、かつ／または部分的もしくは完全に自動化されている。本実施形態に付け加えて、形質転換は、本明細書に記載のコンストラクトまたは発現コンストラクトをマイクロタイタープレートのウェルに添加し、その後、本明細書に提供される方法によって生成されたプロトプラストをマイクロタイタープレートの各ウェルにアリコートすることによって実施される。プロトプラストの形質転換／トランスフェクションの適当な手順は、例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＮＬ９９／００６１８号、同ＰＣＴ／ＥＰ９９／２０２５１６号、FinkelsteinおよびBall（編）、Biotechnology  of  filamentous  fungi,  technology  and  products、Butterworth-Heinemann（１９９２年）、BennettおよびLasure（編）、More  Gene  Manipulations  in  fungi、Academic  Press（１９９１年）、Turner  ：Puhler（編）、Biotechnology、完全に改訂された第２版、VHC（１９９２年）protoplast  fusion  に記載されたもの、ならびにＥＰ６３５５７４Ｂに記載されたＣａ−ＰＥＧ媒介プロトプラスト形質転換を含めて、任意の当技術分野で公知のものであり得る。代替として、糸状菌宿主細胞またはこれらに由来するプロトプラストの形質転換は、電気穿孔、例えば、ChakrabortyおよびKapoor、Nucleic  Acids  Res.、１８巻：６７３７頁（１９９０年）によって記載された電気穿孔など、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介形質転換、例えば、Christiansenら、Curr.  Genet.、２９巻：１００〜１０２頁（１９９５年）；Durandら、Curr.  Genet.、３１巻：１５８〜１６１頁（１９９７年）；およびBarcellosら、Can.  J.  Microbiol.、４４巻：１１３７〜１１４１頁（１９９８年）に記載されたものなどのＤＮＡの微粒子導入、または細胞の「磁気微粒子銃（magneto-biolistic）」トランスフェクション、例えば、米国特許第５，５１６，６７０号および同第５，７５３，４７７号に記載されたものなどによっても実施することができる。一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムで使用される形質転換手順は、本明細書に提供されるハイスループットおよび／または自動化を受けやすいもの、例えば、ＰＥＧ媒介形質転換などである。
【０５０９】
本明細書に記載の方法を使用して生成されるプロトプラストの形質転換は、当技術分野で公知の任意の形質転換試薬を使用することによって促進することができる。適当な形質転換試薬は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）またはＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、ＴＲＡＮＳＰＡＳＳ（登録商標）Ｄ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製）、ＬＹＰＯＶＥＣ（登録商標）またはＬＩＰＯＧＥＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ製）から選択することができる。一実施形態では、ＰＥＧが最も好適な形質転換／トランスフェクション試薬である。ＰＥＧは、異なる分子量で入手可能であり、異なる濃度で使用することができる。好ましくは、ＰＥＧ４０００が、１０％から６０％の間、より好ましくは２０％から５０％の間、最も好ましくは３０％で使用される。一実施形態では、ＰＥＧは、本明細書に記載した通り、貯蔵前にプロトプラストに添加される。
【０５１０】
宿主細胞の形質転換
一部の実施形態では、本開示のベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃、またはＴｉ媒介遺伝子移入を含めた様々な技法のいずれかを使用して宿主細胞内に導入することができる（Christie,  P.J.およびGordon,  J.E.、２０１４年、「The  Agrobacterium  Ti  Plasmids」、Microbiol  SPectr.、２０１４年；２巻（６号）；１０．１１２８頁を参照）。特定の方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔が挙げられる（Davis,  L.、Dibner,  M.、Battey,  I.、１９８６年、「Basic  Methods  in  Molecular  Biology」）。形質転換の他の方法としては、例えば、酢酸リチウム形質転換および電気穿孔が挙げられる。例えば、Gietzら、Nucleic  Acids  Res.、２７巻：６９〜７４頁（１９９２年）；Itoら、J.  Bacterol.、１５３巻：１６３〜１６８頁（１９８３年）；ならびにBeckerおよびGuarente、Methods  in  Enzymology、１９４巻：１８２〜１８７頁（１９９１年）を参照。一部の実施形態では、形質転換宿主細胞は、組換え宿主株と呼ばれる。
【０５１１】
一部の実施形態では、本開示は、本開示の９６−ウェルプレートロボットプラットフォームおよび液体ハンドリング機械を使用する細胞のハイスループット形質転換を教示する。
【０５１２】
一部の実施形態では、本開示は、上述した１種または複数の選択マーカーを有する形質転換細胞をスクリーニングすることを教示する。このような一実施形態では、カナマイシン耐性マーカー（ＫａｎＲ）を含むベクターで形質転換された細胞を、有効量のカナマイシン抗生物質を含有する培地に蒔く。カナマイシンが入った培地上で目に見えるコロニー形成単位は、ベクターカセットをこれらのゲノム内に組み入れたと推定される。所望の配列の挿入は、関連した挿入部位のＰＣＲ、制限酵素分析、および／またはシーケンシングを介して確認することができる。
【０５１３】
選択された配列のループアウト
一部の実施形態では、本開示は、宿主生物からＤＮＡの選択された領域をループアウトする方法を教示する。ループアウト法は、Nakashimaら、２０１４年、「Bacterial  Cellular  Engineering  by  Genome  Editing  and  Gene  Silencing.」、Int.  J.  Mol.  Sci.、１５巻（２号）、２７７３〜２７９３頁に記載された通りのものであり得る。一部の実施形態では、本開示は、陽性形質転換体から選択マーカーをループアウトすることを教示する。ループアウト欠失技法は、当技術分野で公知であり、（Tearら、２０１４年、「Excision  of  Unstable  Artificial  Gene-Specific  inverted  Repeats  Mediates  Scar-Free  Gene  Deletions  in  Escherichia  coli.」、Appl.  Biochem.  Biotech.、１７５巻：１８５８〜１８６７頁）に記載されている。本明細書に提供される方法で使用されるループアウト法は、シングルクロスオーバー相同組換えまたはダブルクロスオーバー相同組換えを使用して実施することができる。一実施形態では、本明細書に記載の選択された領域のループアウトは、本明細書に記載のシングルクロスオーバー相同組換えを使用することを必然的に伴い得る。
【０５１４】
第１に、ループアウトベクター（loop  out  vector）が、宿主生物のゲノム内の選択された標的領域内に挿入される（例えば、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ、または他の遺伝子編集技法を介して）。一実施形態では、シングルクロスオーバー相同組換えが、図３に表したものなどの環状プラスミドまたはベクターをループインするために、環状プラスミドまたはベクターと宿主細胞ゲノムとの間に使用される。挿入されるベクターは、既存のまたは導入される近傍の宿主配列のダイレクトリピートである配列を用いて設計することができ、その結果、ダイレクトリピートがルーピングおよび欠失を予定しているＤＮＡの領域に隣接する。挿入されると、ループアウトプラスミドまたはベクターを含有する細胞を、選択領域の欠失について対抗選択することができる。
【０５１５】
当業者は、ループアウト手順の記載は、ゲノムから望まれない領域を欠失させるための一例示的方法を代表するにすぎないことを認識する。実際に、本開示の方法は、これらに限定されないが、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮＳ、ＦＯＫ、または他のエンドヌクレアーゼを介した遺伝子編集を含めて、ゲノム欠失の任意の方法に適合する。当業者は、相同組換え技法を介してゲノムの望まれない領域を置き換える能力も認識する。
【実施例】
【０５１６】
以下の実施例は、本開示の種々の実施形態を例証するために提供するのであって、それらには、いかなる場合であっても、本開示を制限する意図はない。特許請求の範囲により定義される、本開示の精神の範囲内に包含されるその変化および他の使用は、当業者により認識される。
【０５１７】
簡潔な目次を、下記に提供するが、これはもっぱら、読者を支援するためである。この目次により、本出願の実施例または開示の範囲を制限する意図は全くない。
【表４】
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【０５１８】
（実施例１）
ＨＴＰゲノム操作−Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａにおける株性能を改善するためのトランスポゾン変異誘発ライブラリーのインプリメンテーション
この実施例は、Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａにおけるｉｎ  ｖｉｖｏトランスポゾン変異誘発によって株ライブラリーを産生する方法について記載する。結果として生じるライブラリーをスクリーニングして、表現型（例えば、スピノシンなどの特定の化合物の力価）の改善を呈する株を同定することができる。
【０５１９】
株は、周期性操作のラウンドにおいて、または株性能に寄与する遺伝子型を解読するためにさらに使用され得る。ライブラリー内の株は、１つまたは複数の所望の化合物の産生が増大した改良された株の創製のために、異なる遺伝子撹乱を有する他の株との統合のためにも使用され得る。
【０５２０】
よって、本開示は、Ｓ．ｓｐｉｎｏｓａにおいてＥＺ−Ｔｎ５トランスポソームシステム（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏ）を使用してトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーを創製する方法について記載する。トランスポサーゼ酵素はまず、モザイクエレメント（ＭＥ）配列が隣接したＤＮＡペイロード配列と複合体化され、結果として生じるタンパク質−ＤＮＡ複合体が次いで細胞内に形質転換される。これは、生物体のゲノムＤＮＡへのＤＮＡペイロードのランダム組込みをもたらす。
【０５２１】
導入されるペイロードに応じて、機能喪失型（ＬｏＦ）ライブラリーまたは機能獲得型（ＧｏＦ）ライブラリーのいずれかが産生され得る。
【０５２２】
機能喪失型（ＬｏＦ）トランスポゾンライブラリー−ペイロードの配列は、多様な表現型応答を誘起するように変えることができる。機能喪失型（ＬｏＦ）ライブラリーの基礎事例において、このペイロードは、成功したトランスポゾン組込みの事象の選択を可能にするマーカーを含む。
【０５２３】
Ｔｎ５トランスポサーゼシステム（ＥＺ−Ｔｎ５；ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ（登録商標））を使用して、微生物においてｉｎ  ｖｉｖｏでランダム機能喪失型変異を作ることにより、トランスポゾン変異誘発ライブラリーを創製することができる。ＥＺ−Ｔｎ５トランスポサーゼシステムは安定であり、生きた微生物に電気穿孔によって導入することができる。細胞内に入ると、トランスポゾンシステムが宿主細胞内のＭｇ２＋によって活性化され、トランスポゾンが宿主のゲノムＤＮＡにランダムに挿入される。
【０５２４】
機能獲得型（ＧｏＦ）トランスポゾンライブラリー−ＧｏＦライブラリーを創製するには、遺伝子ペイロードのより複雑な具現形態が、例えば、プロモーターエレメントまたは可溶性タグ（この場合、機能獲得型可溶性タグトランスポゾンと呼ばれる）、および選択可能マーカーを含有するペイロードの一部のループアウトを促進し、よって連続的なトランスポゾン変異誘発を可能にする対抗選択可能マーカー（この場合、機能獲得型再利用可能トランスポゾンと呼ばれる）といったさらなるフィーチャを組み込むことにより、基礎事例に基づいて構築される。まとめると、これらのインプリメンテーションは、宿主表現型を改善する多様なライブラリーの創製を可能にする。
【０５２５】
本開示のトランスポゾンの限定されない例示的な構築物が図２５に示され、代表的な機能喪失型（ＬｏＦ）トランスポゾン、機能獲得型（ＧｏＦ）トランスポゾン、機能獲得型再利用可能トランスポゾン、および機能獲得型可溶性タグトランスポゾンの配列が、それぞれ、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０として提供される。
【０５２６】
これらのトランスポゾンをトランスポサーゼと複合体化し、細胞に形質転換することができる。結果として生じる細胞は、ランダムに組み込まれたＤＮＡペイロードを有し、よってトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーを形成する。ライブラリーを本明細書に記載のＨＴＰ手順に従ってさらにスクリーニングし、表現型の改善について評価することができる。トランスポゾンの組込みに起因して所望の表現型を有する株を、本開示に記載の任意の方法に従って、さらなる特徴付けおよびさらなる操作のために単離してもよい。
【０５２７】
例えば、ＬｏＦトランスポゾンライブラリーおよびＧｏＦトランスポゾンライブラリーを親株に対してスクリーニングすることができ、性能データ（スピノシンの力価）を分析することができる。これらのライブラリーにおいて創製された新しい株の一部は、親株と比較して改善された性能を有する。
【０５２８】
本明細書に記載の方法は、２つの主な問題を解決する。第１には、よく研究されている生物体においてでさえも、ゲノム全体像の大部分は未だ十分に理解されていない。また、十分に理解されている遺伝子エレメントが、予期せぬ様式で相互作用する場合があることも述べられている。これに対して、本開示は、表現型撹乱の誘起のための有効な遺伝子操作方法を提供する。第２には、成長の遅い生物体または遺伝的に扱いにくい生物体、特に大きなゲノムを有するものでは、可能性のあるすべての遺伝子標的に対して標的とした遺伝子撹乱を行うには莫大な時間またはコストがかかる場合がある。本開示は、株において所望の化合物を産生する性能の改善をもたらし得る、撹乱されたゲノムを有する株を創製するための有効な方法を提供する。よって、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏトランスポゾン変異誘発を使用して宿主生物体の遺伝子エレメントを容易かつランダムにモジュレートするための方法により、これらの問題に対処する。このようにして、異なる変異（機能獲得型および機能喪失型）を宿す株ライブラリーは、非常に急速に作製され得、宿主の表現型をさらに改善するための新しい遺伝子標的を暗示し得る。
【０５２９】
（実施例２）
ＨＴＰゲノム操作−Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおける株性能を改善するためのトランスポゾン変異誘発ライブラリーのインプリメンテーション
トランスポゾン変異誘発を行って、株を改良するためのＥ．ｃｏｌｉランダム株ライブラリーを生成することができる。これらの株ライブラリーを、トリプトファン収率などの所望の表現型に対してスクリーニングして、性能が改善された変異体を同定することができる。
【０５３０】
Ｅ．ｃｏｌｉ変異体ライブラリーは、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポゾンシステムを適用することによって生成され得る。手短に述べると、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポサーゼを、モザイクエレメント配列が隣接したペイロードＤＮＡと共にインキュベートして、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポサーゼをＤＮＡと複合体化し、トランスポソームを形成する。次いで、ＤＮＡ／タンパク質トランスポソーム複合体を電気穿孔によってＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポサーゼがペイロードＤＮＡのＥ．ｃｏｌｉゲノムへのランダム組込みを触媒することにより、株バリアントのランダムライブラリーを生じさせる。
【０５３１】
ペイロードＤＮＡの具体的な配列は、標的ゲノムへのトランスポゾン挿入の機能喪失型（ＬｏＦ）または機能獲得型（ＧｏＦ）のいずれかの効果に対してバイアスをかけるようにさらに変えることができる。機能喪失は、ＤＮＡペイロードに抗生物質選択マーカーを含めることによってなしとげられ得る。抗生物質マーカーは、生産的なトランスポゾン挿入のある細胞の選択を可能にする。ＤＮＡペイロードの挿入は、破壊された遺伝子の翻訳を防止するオープンリーディングフレームの破壊を含むがこれに限定されない様々な様式で、それが挿入されるＤＮＡの機能を破壊し得る。
【０５３２】
機能獲得は、ＤＮＡペイロードに抗生物質マーカーおよび強いプロモーターを含めることによってなしとげられ得る。抗生物質マーカーは、生産的なトランスポゾン挿入のある細胞の選択を可能にする。ＤＮＡペイロードの挿入は、強いプロモーターの作用によって、挿入部位に対して近位の遺伝子の発現を増大させ得る。
【０５３３】
機能喪失型または機能獲得型のいずれのＤＮＡペイロードも、マーカーの再利用、したがって操作のさらなるラウンドを可能にするために、選択マーカーに加えて対抗選択マーカーをさらに含有し得る。
【０５３４】
このトランスポゾン変異誘発によって生成された株バリアントのライブラリーは、所望の表現型に対してスクリーニングされ得る。株をハイスループットで培養および試験して、親株と比べて所望の表現型が改善された株を同定することができる。
【０５３５】
改良された株バリアントを周期性操作のさらなるラウンドに供して、所望の表現型（例えば、トリプトファン収率）をさらに改善することができる。操作のさらなるラウンドは、トランスポゾン変異誘発または本明細書に記載の他のライブラリータイプ、例えばＳＮＰスワップ、ＰＲＯスワップ、またはランダム変異誘発からなり得る。改良された株を、改善された表現型を呈する他の株バリアントと統合して、明確に異なる有益な変異の相加効果によってさらに改良された株を産生してもよい。
【０５３６】
これらのタイプの形質転換は、周期性操作におけるスクリーニングのための高品質のライブラリーの構築に関与するコストを削減する。トランスポゾン変異誘発をＥ．ｃｏｌｉに適用すると、数千のゲノムワイドの機能喪失型または機能獲得型の変異体を単一の反応で産生することが可能になる。代替的方法は、シングルクロスオーバー相同組換え（ＳＣＨＲ）によって株を操作するために、数千の割り当てられたプラスミドを苦労して構築することである。別の代替的方法は、ラムダレッドリコンビニアリング（ｌａｍｂｄａ  ｒｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ）によって株を操作するために、数千の割り当てられた線形断片を構築することである。これらの代替的方法はいずれも、意図されるペイロードＤＮＡを含有する各変異体に対してユニークなＤＮＡ断片の生成、および標的ゲノム上の特定の位置に対する組換えを指向する配列相同性を要求するため、高価である。反対に、トランスポゾン変異誘発は、単一のＤＮＡペイロードを使用し、多様性は、標的ゲノムへのランダム組込みによって生じる。
【０５３７】
本開示の番号を付けた実施形態
添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示は、以下の番号を付けた実施形態を示す。
トランスポゾン変異誘発ライブラリーを使用および創製する方法：
実施形態１．  所望の表現型を獲得するために微生物を進化させるゲノム操作のハイスループット（ＨＴＰ）方法であって、
ａ．トランスポゾン変異誘発を使用して同じ微生物株バックグラウンドを有する最初の複数の微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々の微生物株を含む最初のＨＴＰ遺伝子設計トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーを創製するステップと；
ｂ．前記所望の表現型について前記最初のＨＴＰ遺伝子設計トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの個々の株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｃ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数のものを提供することによって、後続のＨＴＰ遺伝子設計トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーを創製するステップであって、前記遺伝的バリエーションは、前記先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｄ．前記所望の表現型について前記後続のＨＴＰ遺伝子設計トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択するステップと；
ｅ．微生物が前記所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｃ）〜ｄ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＨＴＰ遺伝子設計トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの少なくとも２つの個々の株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々の株を含む新しいＨＴＰ遺伝子設計トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーが創製される、ステップと
を含む、ゲノム操作のＨＴＰ方法。
実施形態２．  前記トランスポゾン変異誘発が、トランスポサーゼ酵素およびＤＮＡペイロード配列を提供することを含む、実施形態１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
実施形態３．  前記トランスポサーゼ酵素およびＤＮＡペイロード配列が、トランスポサーゼ−ＤＮＡペイロード複合体を形成する、先行する実施形態のいずれかに記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
実施形態４．  前記トランスポゾン変異誘発が、前記複数の微生物のゲノムへのトランスポゾンのランダム挿入をもたらす、先行する実施形態のいずれかに記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
実施形態５．  前記トランスポゾン変異誘発が、機能喪失型（ＬｏＦ）表現型を引き起こす、先行する実施形態のいずれかに記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
実施形態６．  前記トランスポゾン変異誘発が、機能獲得型（ＧｏＦ）表現型を引き起こす、実施形態１から４までのいずれか１つに記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
実施形態７．  前記トランスポゾン変異誘発が、機能獲得型（ＧｏＦ）エレメントを含有するＤＮＡペイロード配列を前記ゲノムに挿入する、実施形態１から４までおよび６のいずれか１つに記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
実施形態８．  前記機能獲得型エレメントが、プロモーター、可溶性タグエレメント、および対抗選択可能マーカーからなる群から選択される、実施形態７に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
実施形態９．  前記トランスポゾン変異誘発が、機能喪失型（ＬｏＦ）エレメントを含有するＤＮＡペイロード複合体を挿入する、実施形態１から５までのいずれか１つに記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
実施形態１０．  前記機能喪失型エレメントが、マーカーである、実施形態９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
実施形態１１．  前記トランスポゾン変異誘発が、少なくとも２つのトランスポサーゼ−ＤＮＡペイロード複合体を用いて前記複数の微生物を形質転換することを含み、前記複合体のうちの１つが、機能獲得型（ＧｏＦ）エレメントを含有し、１つが、機能喪失型（ＬｏＦ）エレメントを含有する、先行する実施形態のいずれかに記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
実施形態１２．  前記トランスポゾン変異誘発が、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポゾン変異誘発システムを使用する、先行する実施形態のいずれかに記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
実施形態１３．  前記ゲノムが、トランスポゾン変異誘発、およびＳＮＰスワップ、プロモータースワップ、Ｓｔｏｐスワップ、配列最適化、またはこれらの任意の組合せの少なくとも１つを利用することによって撹乱される、先行する実施形態のいずれかに記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
実施形態１４．  トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ）１つまたは複数の基準微生物株の微生物細胞の集団にトランスポゾンを導入するステップと、
ｂ）ランダムに組み込まれたトランスポゾンを含む少なくとも１つの微生物株を選択することによって、複数の個々の微生物株を含む最初のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーを創製するステップであって、前記複数の個々の株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、１つまたは複数のランダムに組み込まれたトランスポゾンを含む、ステップと
を含む、方法。
実施形態１５．  ｃ）前記トランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーから、前記基準微生物株の表現型性能と比較して、測定された表現型変数の性能の増大を呈する株を選択するステップ
をさらに含む、実施形態１４に記載の方法。
実施形態１６．  前記トランスポゾンが、前記基準微生物株のゲノムへの前記トランスポゾンのｉｎ  ｖｉｖｏ転位を可能にするトランスポゾンおよびトランスポサーゼタンパク質の複合体を使用して、前記基準微生物株に導入される、実施形態１４から１５までのいずれかに記載の方法。
実施形態１７．  前記トランスポサーゼタンパク質が、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポソームシステムに由来する、実施形態１４から１６までのいずれかに記載の方法。
実施形態１８．  前記トランスポゾンが、機能喪失型（ＬｏＦ）トランスポゾンまたは機能獲得型（ＧｏＦ）トランスポゾンである、実施形態１４から１７までのいずれかに記載の方法。
実施形態１９．  前記機能喪失型トランスポゾンが、マーカーを含む、実施形態１８に記載の方法。
実施形態２０．  前記マーカーが、対抗選択可能マーカーである、実施形態１９に記載の方法。
実施形態２１．  前記機能獲得型トランスポゾンが、可溶性タグ、プロモーター、または対抗選択マーカーを含む、実施形態１８に記載の方法。
実施形態２２．  産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法であって、
ａ．トランスポゾン変異誘発によって基準微生物株のゲノムを操作することによって、複数の個々の株を含む最初のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーを創製するステップであって、前記複数の個々の株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、１つまたは複数のトランスポゾンを含む、ステップと；
ｂ．参照株に対する表現型性能改善について前記最初のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの個々の微生物株をスクリーニングおよび選択することによって、表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと；
ｃ．前記先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々の株に存在する遺伝的バリエーションからのユニークな遺伝的バリエーションの組合せをそれぞれが含む後続の複数の微生物株を提供することによって、後続のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーを創製するステップと；
ｄ．前記参照微生物株に対する表現型性能改善について前記後続のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの個々の株をスクリーニングおよび選択することによって、追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと；
ｅ．株が、前記産生微生物株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｃ）〜ｄ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、新しいトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーが創製され、前記新しいライブラリー内の各微生物株が、先行するライブラリーの少なくとも２つの個々の微生物株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せである遺伝的バリエーションを含む、ステップと
を含む、ＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
実施形態２３．  前記後続のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーが、前記最初のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの部分的コンビナトリアルライブラリーである、実施形態２２に記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
実施形態２４．  前記後続のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーが、前記最初のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、実施形態２２に記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
実施形態２５．  前記後続のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーが、先行するトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの部分的コンビナトリアルライブラリーである、実施形態２２または実施形態２３に記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
実施形態２６．  前記後続のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーが、先行するトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、実施形態２２または実施形態２４に記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
実施形態２７．  後続のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの微生物株の表現型性能が、前記産生微生物株の表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１０％の増加を呈するまで、ステップｃ）〜ｄ）を繰り返す、実施形態２２から２６までのいずれかに記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
実施形態２８．  後続のトランスポゾン変異誘発微生物株ライブラリーの微生物株の表現型性能が、前記産生微生物株の表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１倍の増加を呈するまで、ステップｃ）〜ｄ）を繰り返す、実施形態２２から２７までのいずれかに記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
実施形態２９．  ステップｅ）の改善された表現型性能が、目的の産物の体積生産性、目的の産物の比生産性、目的の産物の収率、目的の産物の力価、目的の産物の増大したまたはより効率的な産生からなる群から選択され、前記目的の産物が、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝産物、二次細胞外代謝産物、細胞内コンポーネント分子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、実施形態２２から２８までのいずれかに記載の産生株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
実施形態３０．  前記トランスポゾンが、機能喪失型（ＬｏＦ）トランスポゾンまたは機能獲得型（ＧｏＦ）トランスポゾンである、実施形態２２から２９までのいずれかに記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
実施形態３１．  前記機能喪失型トランスポゾンが、マーカーまたは対抗選択可能マーカーを含有する、実施形態３０に記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
実施形態３２．  前記機能獲得型トランスポゾンが、プロモーター、可溶性タグ、または対抗選択可能マーカーを含有する、実施形態３０に記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
実施形態３３．  前記産生微生物株が、原核生物である、実施形態９に記載の産生微生物株の表現型性能を改善するためのＨＴＰトランスポゾン変異誘発方法。
【０５３８】
番号を付けた実施形態における上述の方法は、原核生物において実施されても真核生物において実施されてもよい。例えば、方法は、以下の属：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、およびＺｙｍｏｍｏｎａｓの宿主細胞において実施され得る。
【表５】
2020524494.tif 000021
＊＊＊＊＊
【０５３９】
参照による組込み
本明細書に引用したすべての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願は、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている。しかし、本明細書に引用した任意の参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願の言及は、これらが有効な先行技術を構成するか、または世界のいずれかの国における共通の一般的知識の一部を形成するという承認または何らかの形式の示唆として解釈されず、かつそのように解釈されるべきでない。
【０５４０】
さらに、以下の特定の出願が参照により本明細書に組み込まれている：米国出願第１５／３９６，２３０号（米国公開第ＵＳ２０１７／０１５９０４５Ａ１号）；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５４６５（ＷＯ２０１７／１００３７７Ａ１）；米国出願第１５／１４０，２９６号（ＵＳ２０１７／０３１６３５３Ａ１）；ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２９７２５（ＷＯ２０１７／１８９７８４Ａ１）；ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５４６４（ＷＯ２０１７／１００３７６Ａ２）；米国仮出願第６２／４３１，４０９号；米国仮出願第６２／２６４，２３２号；および米国仮出願第６２／３６８，７８６号。
【図１】
2020524494.tif 000022
【図２】
2020524494.tif 000023
【図３】
2020524494.tif 000024
【図４Ａ】
2020524494.tif 000025
【図４Ｂ】
2020524494.tif 000026
【図５】
2020524494.tif 000027
【図６】
2020524494.tif 000028
【図７】
2020524494.tif 000029
【図８】
2020524494.tif 000030
【図９】
2020524494.tif 000031
【図１０】
2020524494.tif 000032
【図１１】
2020524494.tif 000033
【図１２】
2020524494.tif 000034
【図１３】
2020524494.tif 000035
【図１４】
2020524494.tif 000036
【図１５】
2020524494.tif 000037
【図１６】
2020524494.tif 000038
【図１７】
2020524494.tif 000039
【図１８】
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【図１９】
2020524494.tif 000041
【図２０】
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【図２１】
2020524494.tif 000043
【図２２】
2020524494.tif 000044
【図２３】
2020524494.tif 000045
【図２４】
2020524494.tif 000046
【図２５】
2020524494.tif 000047
【配列表】
2020524494000001.app
【国際調査報告】
2020524494.tif 000048
2020524494.tif 000049
2020524494.tif 000050
2020524494.tif 000051
2020524494.tif 000052