(57)【要約】本発明は、アグリカンに特異的に結合する免疫グロブリンに、ことさらには、ポリペプチド、かかるポリペプチドをコードする核酸に；かかるポリペプチドを調製するための方法に；予防、治療または診断目的のための、かかるポリペプチドを含む組成物および特に医薬組成物に関する。特に、本発明の免疫グロブリンは、アグリカンの活性を阻害する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アグリカンに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶ）。
【請求項２】
ヒトアグリカン［配列番号１２５］に特異的に結合する、請求項１に記載のＩＳＶ。
【請求項３】
イヌアグリカン（配列番号１２６）、ウシアグリカン（配列番号１２７）、ラットアグリカン（配列番号１２８）；ブタ（コア）アグリカン（配列番号１２９）；マウスアグリカン（配列番号１３０）、ウサギアグリカン（配列番号１３１）；カニクイザルアグリカン（配列番号１３２）および／またはアカゲザルアグリカン（配列番号１３３）に特異的に結合する、請求項１または２に記載のＩＳＶ。
【請求項４】
ニューロカン（配列番号１３４）および／またはブレビカン（配列番号１３５）に実質的に結合しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項５】
アグリカンへの結合について、ニューロカンおよび／またはブレビカンよりも１０倍より高い、１００倍より高い、好ましくは１０００倍より高い選択性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項６】
好ましくは、軟骨および／または半月板などの軟骨性組織に結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項７】
滑液（ＳＦ）中で３７℃で、１４日間、２１日間、１か月間、２か月間またはさらには３か月間などの、少なくとも７日間の安定性を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項８】
軟骨保持アッセイにおいて、少なくとも、３、４、５または６ＲＵなどの、少なくとも２ＲＵの軟骨保持を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項９】
少なくとも１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、またはさらにはそれを超えるなど、少なくとも５μｍ、軟骨中へと浸透する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項１０】
ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列から本質的になる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項１１】
４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＩＳＶであって、ここで；
−  ＣＤＲ１が、配列番号２４、２０、２１、２２、２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７および１０９からなる群より選択され；
−  ＣＤＲ２が、配列番号４２、３８、３９、４０、４１、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および１１０からなる群より選択され；ならびに
−  ＣＤＲ３が、配列番号６０、５６、５７、５８、５９、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４および１１１からなる群より選択される、
前記ＩＳＶ。
【請求項１２】
アグリカンのＧ１ドメインに結合する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項１３】
８より大きなｐＩを有する、請求項１２に記載のＩＳＶ。
【請求項１４】
２＊１０−２ｓ−１未満のＫｏｆｆを有する、請求項１２または１３に記載のＩＳＶ。
【請求項１５】
１＊１０−６Ｍ未満のＥＣ５０を有する、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項１６】
４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＩＳＶであって、ここで；
ｉ）ＣＤＲ１は、
ａ）配列番号２４、２０、もしくは２１；または
ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列と５、４、３、２もしくは１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列、ここで、
−  位置２において、Ｓは、Ｒ、Ｆ、ＩもしくはＴに変更されている；
−  位置３において、Ｔは、Ｉに変更されている；
−  位置５において、Ｉは、Ｓに変更されている；
−  位置６において、Ｉは、Ｓ、ＴもしくはＭに変更されている；
−  位置７において、Ｎは、ＹもしくはＲに変更されている；
−  位置８において、Ｖは、Ａ、Ｙ、ＴもしくはＧに変更されている；
−  位置９において、Ｖは、Ｍに変更されている；および／または
−  位置１０において、Ｒは、Ｇ、ＫもしくはＡに変更されている；
からなる群より選択される、
ならびに／あるいは
ｉｉ）ＣＤＲ２は、
ｃ）配列番号４２、３８、もしくは３９；または
ｄ）配列番号４２のアミノ酸配列と５、４、３、２もしくは１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列、ここで、
−  位置１において、Ｔは、ＡもしくはＧに変更されている；
−  ＳもしくはＮが位置３と位置４との間に挿入される（位置２ａ、表１．３Ｂ）；
−  位置３において、Ｓは、Ｒ、Ｗ、ＮもしくはＴに変更されている；
−  位置４において、Ｓは、ＴもしくはＧに変更されている；
−  位置５において、Ｇは、Ｓに変更されている；
−  位置６において、Ｇは、ＳもしくはＲに変更されている；
−  位置７において、Ｎは、Ｓ、ＴもしくはＲに変更されている；
−  位置８において、Ａは、Ｔに変更されている；および／または
−  位置９において、Ｎは、ＤもしくはＹに変更されている；
からなる群より選択される、
ならびに／あるいは
ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、
ｅ）配列番号６０、５６もしくは５７；または
ｆ）配列番号６０のアミノ酸配列と５、４、３、２もしくは１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列、ここで、
−  位置１において、Ｐは、Ｇ、Ｒ、ＤもしくはＥに変更されているか、または不在である；
−  位置２において、Ｔは、Ｒ、Ｌ、ＰもしくはＶに変更されているか、または不在である；
−  位置３において、Ｔは、Ｍ、ＳもしくはＲに変更されているか、または不在である；
−  位置４において、Ｈは、Ｄ、Ｙ、ＧもしくはＴに変更されている；
−  位置５において、Ｙは、Ｆ、Ｖ、ＴもしくはＧに変更されている；
−  位置６において、Ｇは、Ｌ、Ｄ、Ｓ、ＹもしくはＷに変更されている；
−  Ｒ、Ｔ、ＹもしくはＶが、位置６と位置７との間に挿入される（位置６ａ、表１．３Ｃ）；
−  位置７において、Ｇは、ＰもしくはＳに変更されている；
−  位置８において、Ｖは、Ｇ、Ｔ、Ｈ、Ｒ、ＬもしくはＹに変更されている；
−  位置９において、Ｙは、Ｒ、Ａ、Ｓ、ＤもしくはＧに変更されている；
−  位置１０において、Ｙは、Ｎ、Ｅ、Ｇ、ＷもしくはＳに変更されている；
−  Ｗが、位置１０と位置１１との間に挿入される（位置１０ａ、表１．３Ｃ）；
−  位置１１において、Ｇは、Ｓ、ＫもしくはＹに変更されている；
−  位置１２において、Ｐは、ＥもしくはＤに変更されているか、または不在である；および／または
−  位置１３において、Ｙは、Ｌに変更されているか、または不在である、
からなる群より選択される、前記ＩＳＶ。
【請求項１７】
−  ＣＤＲ１が、配列番号２４、２０、２１、２５、２７、２９、３１、３４、３５、３６、３７および１０９からなる群より選択され；
−  ＣＤＲ２が、配列番号４２、３８、３９、４３、４５、４７、４９、５０、５３、５４、５５および１１０からなる群より選択され；ならびに
−  ＣＤＲ３が、配列番号６０、５６、５７、６１、６３、６５、６７、７１、７２、７３、７４および１１１からなる群より選択される、
ＩＳＶの群より選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項１８】
−  ＣＤＲ１が、配列番号２４であり、ＣＤＲ２が、配列番号４２であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６０である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号２０であり、ＣＤＲ２が、配列番号３８であり、およびＣＤＲ３が、配列番号５６である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号２１であり、ＣＤＲ２が、配列番号３９であり、およびＣＤＲ３が、配列番号５７である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号２５であり、ＣＤＲ２が、配列番号４３であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６１である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号２７であり、ＣＤＲ２が、配列番号４５であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６３である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号２９であり、ＣＤＲ２が、配列番号４７であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６５である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号３１であり、ＣＤＲ２が、配列番号４９であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６７である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号３４であり、ＣＤＲ２が、配列番号５０であり、およびＣＤＲ３が、配列番号７１である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号３５であり、ＣＤＲ２が、配列番号５３であり、およびＣＤＲ３が、配列番号７２である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号３６であり、ＣＤＲ２が、配列番号５４であり、およびＣＤＲ３が、配列番号７３である；ならびに
−  ＣＤＲ１が、配列番号３７であり、ＣＤＲ２が、配列番号５５であり、およびＣＤＲ３が、配列番号７４である、
ＩＳＶの群より選択される、請求項１７に記載のＩＳＶ。
【請求項１９】
４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＩＳＶであって、ここで；
ｉ）ＣＤＲ１は、
ａ）配列番号２４および１０９；または
ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列と２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列、ここで、
−  位置７において、Ｎは、Ｓに変更されている；および／または
−  位置９において、Ｖは、Ｍに変更されている；
からなる群より選択される、
ならびに／あるいは
ｉｉ）ＣＤＲ２は、
ｃ）配列番号４２および１１０；または
ｄ）配列番号４２のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列、ここで、
−  位置１において、Ｔは、Ａに変更されている；
−  位置３において、Ｓは、Ｒに変更されている；
−  位置４において、Ｓは、Ｔに変更されている；
−  位置８において、Ａは、Ｔに変更されている；および／または
−  位置９において、Ｎは、Ｄに変更されている；
からなる群より選択される、
ならびに／あるいは
ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、
ｅ）配列番号６０および１１１；または
ｆ）配列番号６０のアミノ酸配列と２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、
−  位置４において、Ｈは、Ｒに変更されている；および／または
−  位置８において、Ｖは、Ｄに変更されている、
からなる群より選択される、前記ＩＳＶ。
【請求項２０】
−  ＣＤＲ１が、配列番号２４および１０９からなる群より選択され；
−  ＣＤＲ２が、配列番号４２および１１０からなる群より選択され；ならびに
−  ＣＤＲ３が、配列番号６０および１１１からなる群より選択される、
ＩＳＶの群より選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項２１】
エピトープビン１またはエピトープビン４に属する、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項２２】
４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項２１に記載のＩＳＶであって、ここで；
ｉ）ＣＤＲ１は、
ａ）配列番号３６；および
ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列と２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、
−  位置３において、Ｔは、Ｓに変更されている；
−  位置６において、Ｔは、Ｓに変更されている；
−  位置８において、Ｔは、Ａに変更されている；および／または
−  位置９において、Ｍは、Ｖに変更されている；
からなる群より選択される、
ならびに／あるいは
ｉｉ）ＣＤＲ２は、
ｃ）配列番号５４；および
ｄ）配列番号５４のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、
−  位置１において、Ａは、Ｉに変更されている；
−  位置４において、Ｗは、Ｒに変更されている；
−  位置７において、Ｇは、Ｒに変更されている；および／または
−  位置８において、Ｔは、Ｓに変更されている；
からなる群より選択される、
ならびに／あるいは
ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、
ｅ）配列番号７３；および
ｆ）配列番号７３のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、
−  位置１において、Ｒは、Ｇに変更されている；
−  位置２において、Ｐは、ＲもしくはＬに変更されている；
−  位置３において、Ｒは、ＬもしくはＳに変更されている；
−  位置５において、Ｙは、Ｒに変更されている；
−  位置６において、Ｙは、ＳもしくはＡに変更されている；
−  位置７において、Ｙは、Ｔに変更されているか、または不在である；
−  位置８において、Ｓは、Ｐに変更されている；
−  位置９において、Ｌは、ＨもしくはＲに変更されている；
−  位置１０において、Ｙは、ＰもしくはＡに変更されている；
−  位置１１において、Ｓは、ＡもしくはＹに変更されている；
−  位置１２において、Ｙは、Ｄに変更されている；
−  位置１３において、Ｄは、Ｆに変更されている；
−  位置１４において、Ｙは、Ｇに変更されているか、または不在である；および／または
−  位置１４の後、Ｓが挿入される、
からなる群より選択される、前記ＩＳＶ。
【請求項２３】
−  ＣＤＲ１が、配列番号２０、２９および３６からなる群より選択され；
−  ＣＤＲ２が、配列番号３８、４７および５４からなる群より選択され；ならびに
−  ＣＤＲ３が、配列番号５６、６５および７３からなる群より選択される、
ＩＳＶの群より選択される、請求項２２に記載のＩＳＶ。
【請求項２４】
ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列の、アグリカンのＧ１ドメインへの結合を交差ブロッキングする、請求項２２または２３に記載のＩＳＶ。
【請求項２５】
アグリカンのＧ１−ドメインのエピトープビン１に結合し、請求項２２または２３に記載のＩＳＶとアグリカンのＧ１ドメインへの結合について競合する、ＩＳＶ、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列。
【請求項２６】
４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、請求項２１に記載のＩＳＶであって、ここで；
ｉ）ＣＤＲ１は、
ａ）配列番号２４；および
ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列と２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、
−  位置２において、Ｓは、ＩもしくはＦに変更されている；
−  位置５において、Ｉは、Ｓに変更されている；
−  位置６において、Ｉは、ＳもしくはＭに変更されている；
−  位置７において、Ｎは、ＲもしくはＹに変更されている；
−  位置８において、Ｖは、ＡもしくはＹに変更されている；
−  位置９において、Ｖは、Ｍに変更されている；および／または
−  位置１０において、Ｒは、Ｋに変更されている；
からなる群より選択される、
ならびに／あるいは
ｉｉ）ＣＤＲ２は、
ｃ）配列番号４２；および
ｄ）配列番号４２のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、
−  位置１において、Tは、ＡもしくはＧに変更されている；
−  位置２と位置３との間にＮが挿入される（位置２ａ、表２．３Ｂ）；
−  位置７において、Ｎは、Ｒに変更されている；
−  位置８において、Ａは、Ｔに変更されている；および／または
−  位置９において、Ｎは、Ｄに変更されている；
からなる群より選択される、
ならびに／あるいは
ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、
ｅ）配列番号６０；および
ｆ）配列番号６０のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、
−  位置１において、Ｐは、不在である；
−  位置２において、Ｔは、Ｒに変更されているか、または不在である；
−  位置３において、Ｔは、Ｍに変更されているか、または不在である；
−  位置４において、Ｈは、ＤもしくはＹに変更されている；
−  位置５において、Ｙは、ＦもしくはＶに変更されている；
−  位置６において、Ｇは、ＬもしくはＤに変更されている；
−  位置８において、Ｖは、ＧもしくはＴに変更されている；
−  位置９において、Ｙは、Ｒに変更されている；
−  位置１０において、Ｙは、ＮもしくはＥに変更されている；
−  位置１１において、Ｇは、ＳもしくはＫに変更されている；
−  位置１２において、Ｐは、Ｅに変更されているか、または不在である；および／または
−  位置１３において、Ｙは、Ｌに変更されているか、または不在である、
からなる群より選択される、前記ＩＳＶ。
【請求項２７】
−  ＣＤＲ１が、配列番号２４、２５および２７からなる群より選択され；
−  ＣＤＲ２が、配列番号４２、４３および４５からなる群より選択され；ならびに
−  ＣＤＲ３が、配列番号６０、６１および６３からなる群より選択される、
ＩＳＶの群より選択される、請求項２６に記載のＩＳＶ。
【請求項２８】
ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列の、アグリカンのＧ１ドメインへの結合を交差ブロッキングする、請求項２６または２７に記載のＩＳＶ。
【請求項２９】
アグリカンのＧ１−ドメインのエピトープビン４に結合し、請求項２６または２７に記載のＩＳＶとアグリカンのＧ１ドメインへの結合について競合する、ＩＳＶ、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列。
【請求項３０】
配列番号５、１、２、６、８、１０、１２、１６、１７、１８および１９を有するＩＳＶ、ならびに配列番号５、１、２、６、８、１０、１２、１６、１７、１８および１９のいずれか１つと、９０％または９５％などの、８０％より高い配列同一性を有する、ＩＳＶからなる群より選択される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項３１】
アグリカンのＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメインに結合する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項３２】
８より大きなｐＩを有する、請求項３１に記載のＩＳＶ。
【請求項３３】
２＊１０−２ｓ−１未満のＫｏｆｆを有する、請求項３１または３２に記載のＩＳＶ。
【請求項３４】
１＊１０−６Ｍ未満のＥＣ５０を有する、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項３５】
請求項３１〜３４のいずれか一項に記載のＩＳＶであって、ここで；
ｉ）ＣＤＲ１は、
ａ）配列番号３２、３０および２３；ならびに
ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列と３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、
−  位置２において、Ｒは、Ｌに変更されている；
−  位置６において、Ｓは、Ｔに変更されている；および／または
−  位置８において、Ｔは、Ａに変更されている；
からなる群より選択される、
ならびに／あるいは
ｉｉ）ＣＤＲ２は、
ｃ）配列番号５０、４１、４８および５１；ならびに
ｄ）配列番号５０のアミノ酸配列と２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、
−  位置７において、Ｇは、ＳもしくはＲに変更されている；および／または
−  位置８において、Ｒは、Ｔに変更されている；
からなる群より選択される、
ならびに／あるいは
ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、
ｅ）配列番号６８、５９、６６および６９；ならびに
ｆ）配列番号６８のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、
−  位置４において、Ｒは、ＶもしくはＰに変更されている；
−  位置６において、Ａは、Ｙに変更されている；
−  位置７において、Ｓは、Ｔに変更されている；
−  位置８において、Ｓは、不在である；
−  位置９において、Ｎは、Ｐに変更されている；
−  位置１０において、Ｒは、ＴもしくはＬに変更されている；
−  位置１１において、Ｇは、Ｅに変更されている；および／または
−  位置１２において、Ｌは、ＴもしくはＶに変更されている、
からなる群より選択される、前記ＩＳＶ。
【請求項３６】
−  ＣＤＲ１が、配列番号３２、３０および２３からなる群より選択され；
−  ＣＤＲ２が、配列番号５０、４１、４８および５１からなる群より選択され；ならびに
−  ＣＤＲ３が、配列番号６８、５９、６６および６９からなる群より選択される、
ＩＳＶの群より選択される、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項３７】
−  ＣＤＲ１が、配列番号３２であり、ＣＤＲ２が、配列番号５０であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６８である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号３２であり、ＣＤＲ２が、配列番号５１であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６９である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号３０であり、ＣＤＲ２が、配列番号４８であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６６である；ならびに
−  ＣＤＲ１が、配列番号２３であり、ＣＤＲ２が、配列番号４１であり、およびＣＤＲ３が、配列番号５９である、
ＩＳＶの群より選択される、請求項３６に記載のＩＳＶ。
【請求項３８】
配列番号１３、４、１１および１４を有するＩＳＶ、ならびに配列番号１３、４、１１および１４のいずれか１つと、９０％または９５％などの、８０％より高い配列同一性を有する、ＩＳＶからなる群より選択される、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項３９】
ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列の、アグリカンのＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメインへの結合を交差ブロッキングする、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項４０】
アグリカンのＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメインに結合し、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載のＩＳＶとアグリカンのＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメインへの結合について競合する、ＩＳＶ、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列。
【請求項４１】
アグリカンのＧ２ドメインに結合する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項４２】
８より大きなｐＩを有する、請求項４１に記載のＩＳＶ。
【請求項４３】
２＊１０−２ｓ−１未満のＫｏｆｆを有する、請求項４１または４２に記載のＩＳＶ。
【請求項４４】
１＊１０−６Ｍ未満のＥＣ５０を有する、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項４５】
請求項４１〜４４のいずれか一項に記載のＩＳＶであって、ここで；
ｉ）ＣＤＲ１は、
ａ）配列番号２８；および
ｂ）配列番号２８のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、
−  位置１において、Ｇは、Ｒに変更されている；
−  位置２において、Ｐは、ＳもしくはＲに変更されている；
−  位置３において、Ｔは、Ｉに変更されている；
−  位置５において、Ｓは、Ｎに変更されている；
−  位置６において、Ｒは、Ｎ、ＭもしくはＳに変更されている；
−  位置７において、Ｙは、Ｒに変更されているか、または不在である；
−  位置８において、Ａは、Ｆに変更されているか、または不在である；および／または
−  位置１０において、Ｇは、Ｙに変更されている；
からなる群より選択される、
ならびに／あるいは
ｉｉ）ＣＤＲ２は、
ｃ）配列番号４６；および
ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、
−  位置１において、Ａは、ＳもしくはＹに変更されている；
−  位置４において、Ｗは、Ｌに変更されている；
−  位置５において、Ｓは、Ｎに変更されている；
−  位置６において、Ｓは、不在である；
−  位置７において、Ｇは、不在である；
−  位置８において、Ｇは、Ａに変更されている；
−  位置９において、Ｒは、Ｓ、ＤもしくはＴに変更されている；および／または
−  位置１１において、Ｙは、ＮもしくはＲに変更されている；
からなる群より選択される、
ならびに／あるいは
ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、
ｅ）配列番号６４；および
ｆ）配列番号６４のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、
−  位置１において、Ａは、ＲもしくはＦに変更されている；
−  位置２において、Ｒは、ＩもしくはＬに変更されている；
−  位置３において、Ｉは、ＨもしくはＱに変更されている；
−  位置４において、Ｐは、ＧもしくはＮに変更されている；
−  位置５において、Ｖは、Ｓに変更されている；
−  位置６において、Ｒは、Ｇ、ＮもしくはＦに変更されている；
−  位置７において、Ｔは、Ｒ、ＷもしくはＹに変更されている；
−  位置８において、Ｙは、ＲもしくはＳに変更されているか、または不在である；
−  位置９において、Ｔは、Ｓに変更されているか、または不在である；
−  位置１０において、Ｓは、Ｅ、Ｋに変更されているか、または不在である；
−  位置１１において、Ｅは、Ｎ、Ａに変更されているか、または不在である；
−  位置１２において、Ｗは、Ｄに変更されているか、または不在である；
−  位置１３において、Ｎは、Ｄに変更されているか、または不在である；
−  位置１４において、Ｙは、不在である；および／または
−  Ｄおよび／またはＮが、配列番号６４の位置１４の後に付加される、
からなる群より選択される、前記ＩＳＶ。
【請求項４６】
−  ＣＤＲ１が、配列番号２８、２２、２６および３３からなる群より選択され；
−  ＣＤＲ２が、配列番号４６、４０、４４および５２からなる群より選択され；ならびに
−  ＣＤＲ３が、配列番号６４、５８、６２および７０からなる群より選択される、
ＩＳＶの群より選択される、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項４７】
−  ＣＤＲ１が、配列番号２８であり、ＣＤＲ２が、配列番号４６であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６４である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号２２であり、ＣＤＲ２が、配列番号４０であり、およびＣＤＲ３が、配列番号５８である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号２６であり、ＣＤＲ２が、配列番号４４であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６２である；ならびに
−  ＣＤＲ１が、配列番号３３であり、ＣＤＲ２が、配列番号５２であり、およびＣＤＲ３が、配列番号７０である、
ＩＳＶの群より選択される、請求項４６に記載のＩＳＶ。
【請求項４８】
配列番号９、３、７および１５を有するＩＳＶ、ならびに配列番号９、３、７および１５のいずれか１つと、９０％または９５％などの、８０％より高い配列同一性を有する、ＩＳＶからなる群より選択される、請求項４１〜４７のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項４９】
ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列の、アグリカンのＧ２ドメインへの結合を交差ブロッキングする、請求項４１〜４８のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項５０】
アグリカンのＧ２−ドメインに結合し、アグリカンのＧ２ドメインへの結合について、請求項４１〜４８のいずれか一項に記載のＩＳＶと競合する、ＩＳＶドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列。
【請求項５１】
配列番号１〜１９および１１４〜１１８、ならびに配列番号１〜１９および１１４〜１１８のいずれか１つと、９０％または９５％などの、８０％より高い配列同一性を有する、ＩＳＶからなる群より選択される、請求項１〜５０のいずれか一項に記載のＩＳＶ。
【請求項５２】
請求項１〜５１のいずれか一項に記載の少なくとも１つのＩＳＶ、および場合によっては第２のＩＳＶ、場合によっては第３のＩＳＶ、および場合によっては第４のＩＳＶを含む、ポリペプチド。
【請求項５３】
請求項１〜５１のいずれか一項に記載の少なくとも２つのＩＳＶ、および場合によっては第３のＩＳＶ、および場合によっては第４のＩＳＶを含む、請求項５２に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
少なくとも２つのＩＳＶが、同じであっても異なっていてもよい、請求項５３に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
少なくとも２つのＩＳＶが、独立して、配列番号１〜１９および１１４〜１１８からなる群より選択される、請求項５４に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
少なくとも２つのＩＳＶが、配列番号５、６、８および１１４〜１１７からなる群より選択される、請求項５５に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
少なくとも２つのＩＳＶが、配列番号１３および１１８からなる群より選択される、請求項５５に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
少なくとも１つのさらなるＩＳＶを含む、請求項５２〜５７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
少なくとも１つのさらなるＩＳＶが、セリンプロテアーゼファミリーのメンバー、カテプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）／マトリキシンまたはA Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs（ＡＤＡＭＴＳ）、好ましくはＭＭＰ８、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＡＤＡＭＴＳ５（アグリカナーゼ−２）、ＡＤＡＭＴＳ４（アグリカナーゼ−１）および／またはＡＤＡＭＴＳ１１に結合する、請求項５８に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
少なくとも１つのさらなるＩＳＶが、活性を保持する、請求項５８または５９に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
少なくとも１つのさらなるＩＳＶが、セリンプロテアーゼファミリーのメンバー、カテプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）／マトリキシンまたはA Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs（ＡＤＡＭＴＳ）、好ましくはＭＭＰ８、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＡＤＡＭＴＳ５（アグリカナーゼ−２）、ＡＤＡＭＴＳ４（アグリカナーゼ−１）および／またはＡＤＡＭＴＳ１１の活性を阻害する、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載のポリペプチド
【請求項６２】
滑液（ＳＦ）中で３７℃で、１４日間、２１日間、１か月間、２か月間またはさらには３か月間などの、少なくとも７日間の安定性を有する、請求項５２〜６１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
軟骨保持アッセイにおいて、少なくとも、３、４、５または６ＲＵなどの、少なくとも２ＲＵの軟骨保持を有する、請求項５２〜６２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
少なくとも１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、またはさらにはそれを超えるなど、少なくとも５μｍ、軟骨中へと浸透する、請求項５２〜６３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
血清タンパク質結合部分または血清タンパク質をさらに含む、請求項５２〜６４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
血清タンパク質結合部分が、血清アルブミンに結合する、請求項６５に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
血清タンパク質結合部分が、血清アルブミンに結合するＩＳＶである、請求項６５または６６に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
血清アルブミンに結合するＩＳＶが、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、ＣＤＲ１は、ＳＦＧＭＳであり、ＣＤＲ２は、ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧであり、およびＣＤＲ３は、ＧＧＳＬＳＲである、請求項６７に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
血清アルブミンに結合するＩＳＶが、Ａｌｂ８、Ａｌｂ２３、Ａｌｂ１２９、Ａｌｂ１３２、Ａｌｂ１３５、Ａｌｂ１１、Ａｌｂ１１（Ｓ１１２Ｋ）−Ａ、Ａｌｂ８２、Ａｌｂ８２−Ａ、Ａｌｂ８２−ＡＡ、Ａｌｂ８２−ＡＡＡ、Ａｌｂ８２−Ｇ、Ａｌｂ８２−ＧＧ、Ａｌｂ８２−ＧＧＧを含む、請求項６８に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
血清タンパク質結合部分が、非抗体ベースのポリペプチドである、請求項６５または６６に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
ＰＥＧをさらに含む、請求項５２〜６４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
ＩＳＶが、互いに直接連結されているか、または、リンカーを介して連結されている、請求項５２〜７１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
第１のＩＳＶおよび／または第２のＩＳＶおよび／または場合によっては第３のＩＳＶおよび／または場合によっては第４のＩＳＶおよび／または場合によっては血清アルブミンに結合するＩＳＶが、リンカーを介して連結されている、請求項５２〜６９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
リンカーが、５ＧＳ、７ＧＳ、９ＧＳ、１０ＧＳ、１５ＧＳ、１８ＧＳ、２０ＧＳ、２５ＧＳ、３０ＧＳおよび３５ＧＳのリンカーからなる群より選択される、請求項７２または７３に記載のポリペプチド。
【請求項７５】
表Ｅ−１および表Ｅ−２においてそれぞれ示されるとおりの、標的に結合するＩＳＶおよび１つまたは２つのアグリカンに結合するＩＳＶを含む、ポリペプチドおよび／またはコンストラクトの群より選択される、請求項５２〜７４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７６】
請求項１〜５１のいずれか一項に記載のＩＳＶまたは請求項５２〜７５のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むかまたはこれから本質的になるコンストラクトであって、任意に１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、これらは、任意に１つ以上のペプチド性リンカーを介して連結されている、前記コンストラクト。
【請求項７７】
１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位が、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそのフラグメント、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小タンパク質またはペプチドからなる群より選択される、請求項７６に記載のコンストラクト。
【請求項７８】
請求項１〜５１のいずれか一項に記載のＩＳＶ、請求項５２〜７５のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項７６または７７に記載のコンストラクトをコードする、核酸。
【請求項７９】
請求項７８に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項８０】
請求項７８に記載の核酸、または請求項７９に記載の発現ベクターを含む、宿主または宿主細胞。
【請求項８１】
請求項１〜５１のいずれか一項に記載のＩＳＶ、または請求項５２〜７５のいずれか一項に記載のポリペプチドを生成するための方法であって、少なくとも以下のステップ：
ａ）好適な宿主細胞または宿主生物において、または別の好適な発現系において、請求項７８に記載の核酸を発現させること；任意に、それに続いて：
ｂ）請求項１〜５１のいずれか一項に記載のＩＳＶ、または請求項５２〜７５のいずれか一項に記載のポリペプチドを単離および／または精製すること、
を含む、前記方法。
【請求項８２】
請求項１〜５１のいずれか一項に記載の少なくとも１つのＩＳＶ、請求項５２〜７５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７６または７７に記載のコンストラクト、または請求項７８に記載の核酸を含む、組成物。
【請求項８３】
医薬組成物である、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８４】
少なくとも１つの薬学的に受入可能なキャリア、希釈剤または賦形剤および／またはアジュバントをさらに含み、および任意に、１つ以上のさらなる医薬活性ポリペプチドおよび／または化合物を含む、請求項８３に記載の組成物。
【請求項８５】
医薬としての使用のための、請求項８２〜８４のいずれか一項に記載の組成物、請求項１〜５１のいずれか一項に記載のＩＳＶ、請求項５２〜７５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７６または７７に記載のコンストラクト。
【請求項８６】
関節症および軟骨ジストロフィー、関節炎疾患、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風関節炎、乾癬性関節炎、外傷性の断裂または脱離、軟骨無形成症、肋軟骨炎、脊椎骨端骨幹端異形成症、椎間板ヘルニア、腰椎椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発軟骨炎などを予防または処置することにおける使用のための、請求項８５に記載の組成物、ＩＳＶ、ポリペプチド、またはコンストラクト。
【請求項８７】
関節症および軟骨ジストロフィー、関節炎疾患、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風関節炎、乾癬性関節炎、外傷性の断裂または脱離、軟骨無形成症、肋軟骨炎、脊椎骨端骨幹端異形成症、椎間板ヘルニア、腰椎椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発軟骨炎などを予防または処置するための方法であって、それを必要とする対象に、請求項８５に記載の少なくとも組成物、ＩＳＶ、ポリペプチド、または化合物またはコンストラクトのそれを必要とする人物にとっての薬学的活性量を投与することを含む、前記方法。
【請求項８８】
軟骨性組織からの化合物の流出を減少させるかおよび／または阻害するための方法であって、請求項５２〜７５のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチド、請求項７６または７７に記載のコンストラクト、または請求項８２〜８６のいずれか一項に記載の組成物の薬学的活性量を、それを必要とする人物に投与することを含む、前記方法。
【請求項８９】
ＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３活性を阻害および／またはブロッキングするための方法であって、請求項５２〜７５のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリペプチド、請求項７６または７７に記載のコンストラクト、または請求項８２〜８６のいずれか一項に記載の組成物の薬学的活性量を、それを必要とする人物に投与することを含む、前記方法。
【請求項９０】
関節症および軟骨ジストロフィー、関節炎疾患、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風関節炎、乾癬性関節炎、外傷性の断裂または脱離、軟骨無形成症、肋軟骨炎、脊椎骨端骨幹端異形成症、椎間板ヘルニア、腰椎椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発軟骨炎などを処置または予防するための医薬組成物の調製における、請求項１〜５１のいずれか一項に記載のＩＳＶ、請求項５２〜７５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７６または７７に記載のコンストラクト、または請求項８２〜８６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、アグリカンに結合する免疫グロブリンに関し、ことさらには、１つ以上のかかる免疫グロブリン（それぞれ本明細書において「本発明の免疫グロブリン（単数または複数）」、および「本発明のポリペプチド」ともまた称される）を含むかこれらから本質的になるポリペプチドに関する。本発明はまた、かかる免疫グロブリンまたはポリペプチドを含むコンストラクト、ならびにかかる免疫グロブリンまたはポリペプチドをコードする核酸（本明細書において「本発明の核酸（単数または複数）」ともまた称される）に関し；かかる免疫グロブリン、ポリペプチドおよびコンストラクトを調製するための方法に関し；かかる免疫グロブリンまたはポリペプチドを発現しているかまたはこれを発現することができる宿主細胞に関し；かかる免疫グロブリン、ポリペプチド、コンストラクト、核酸および／または宿主細胞を含む組成物、および特に医薬組成物に関し；ならびに特に予防および／または治療目的、例えば本明細書において記述される予防および／または治療目的のための、免疫グロブリン、ポリペプチド、コンストラクト、核酸、宿主細胞および／または組成物の使用に関する。本発明の他の側面、態様、利点および用途は、本明細書におけるさらなる記載から明らかとなるであろう。
【背景技術】
【０００２】
背景
変形性関節症は、全世界で最も一般的な身体障害の原因の一つである。３，０００万人の米国人がそれを罹患し、最も一般的な関節障害である。２０２５年までに、合衆国の人口の２０％超がそれを罹患すると予測されている。疾患は、全ての関節において起こり得、最も頻繁には膝、股関節（hip）、手指および脊椎において起こる。変形性関節症（ＯＡ）は、関節の症状、関節軟骨の欠損に由来する徴候、ならびに骨、腱および筋肉を含む隣接組織の変化の組み合わせにより特徴づけられる、多様な状態のグループとして定義することができる。ＯＡは、進行性の関節軟骨（骨を被覆する軟骨）のびらんにより特徴づけられる。最終的に、当該疾患は、関節軟骨の全体的な破壊、その下にある骨の硬化、骨棘形成などをもたらし、これらは全て、運動の喪失および疼痛をもたらす。疼痛は、ＯＡの最も顕著な症状であり、これは、ことに頻繁に、患者が医学的援助を求める理由である。
【０００３】
アグリカンは、関節軟骨における主要なプロテオグリカンである（Kiani et al. 2002 Cell Research 12:19-32）。この分子は、軟骨に過重負荷特性を与える含水ゲル構造を提供するので、関節軟骨の正しい機能において重要である。アグリカンは、軟骨細胞により発現される大きな多モジュール分子（２３１７アミノ酸）である。そのコアタンパク質は、３つの球状ドメイン（Ｇ１、Ｇ２およびＧ３）、ならびにグリコサミノグリカン鎖の付加のためのＧ２とＧ３との間の大きな伸展した領域からなる。この伸展した領域は、２つのドメインを含み、その１つはケラタン硫酸鎖（ＫＳドメイン）で、１つはコンドロイチン硫酸鎖（ＣＳドメイン）で置換されている。ＣＳドメインは、それに付加した１００〜１５０のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖を有する。アグリカンは、ヒアルロナンと大きな複合体を形成し、ここで、５０〜１００のアグリカン分子は、Ｇ１ドメインおよびリンクタンパク質を介して１つのヒアルロナン分子と相互作用する。水の取り込み（ＧＡＧ含有量に起因する）により、これらの複合体は、圧縮に耐える可逆的に変形可能なゲルを形成する。関節軟骨の構造、体液保持および機能は、アグリカンのマトリックス含有量、および完全なコアタンパク質に結合したコンドロイチン硫酸の量に関連している。
【０００４】
ＯＡは、１）漸進的にドメインＧ３およびＧ２を放出し（軟骨の「収縮」をもたらす）、最終的にＧ１ドメインを放出する、アグリカンの分解、ならびに２）軟骨構造を不可逆的に破壊するコラーゲンの分解、により特徴づけられる。
【０００５】
変形性関節症をもたらすリスクファクターとして、加齢、肥満および関節傷害が同定されているが、ＯＡの原因は未知であり、現在、疾患の進行を停止させるかまたは関節を治癒させる薬理学的処置は存在しない。大きな関節については、疼痛のような潜在的な副作用を限定することを補助するために、薬物を関節中に注射することができる。治療の戦略は、第一に、疼痛を軽減すること、および関節の機能を改善することを目的とする。非オピオイド性抗ＮＧＦ疼痛処置であるファシヌマブは、第ＩＩ／ＩＩＩ相治験の間に、重要な疼痛スコアに改善をもたらすことが示されている。デュロキセチンは、変形性関節症に起因する慢性膝痛の処置について承認され、米国リウマチ学会（American College of Rheumatology）により条件付きで推奨されている。ラネリック酸ストロンチウムは、大きな多施設研究において、症候性の変形性膝関節症を有する患者において、関節腔の幅の減少の速度を著しく低下させるのみならず、プラセボと比較して疼痛スコアを改善することが見出された。しかし、この時点において、生物学的剤であるインターロイキン−１受容体アンタゴニストおよび抗腫瘍壊死因子抗体は、効果的であるとも、変形性関節症の経過を変化させるとも示されていない（Smelter Hochberg 2013 Current Opin. Rheumatol. 25:310）。したがって、多くのかかる治療は無効であるか、および／または副作用を伴う。究極的には、患者は、疼痛を制御することができない場合は、全膝または股関節の置換治療を受けることになる。
【０００６】
薬理学的治療は、パラセタモールの経口投与から始まり、これは、ＮＳＡＩＤＳまたはＣＯＸ−２阻害剤および弱いオピオイドと組み合わされる場合もある。薬物の経口投与の主な欠点は、目的の部位における限定されたバイオアベイラビリティ、ならびに、肝損傷、胃腸（ＧＩ）潰瘍、ＧＩ出血および便秘などの副作用のリスクである。
【０００７】
ＯＡは、限局的な性質を有するので、薬物の関節内投与は、処置を改善するための優れた機会を提供する。しかし、新たに開発された疾患修飾性変形性関節症薬（disease modifying osteoarthritis drug：DMOAD）のほとんどは、関節内に投与された場合であってすら、関節中では短い滞留時間を有する（Edwards 2011 Vet. J. 190:15-21；Larsen et al. 2008 J Pham Sci 97:4622-4654）。治療用タンパク質の関節内（ＩＡ）送達は、関節腔からのそれらの迅速なクリアランスおよび軟骨中での保持の不足により限定されてきた。関節における薬物の滑液での滞留時間は、しばしば、２４時間未満である。ＩＡ注射された薬物の大部分の迅速なクリアランスに起因して、有効濃度を維持するためには頻繁な注射が必要とされるであろう（Owen et al. 1994 Br. J. Clin Pharmacol. 38:349-355）。しかし、頻繁なＩＡ注射は、それらが引き起こし得る疼痛および不快が患者のコンプライアンスに負荷をかけること、ならびに関節の感染症を導くリスクに起因して、望ましくない。
【０００８】
Loffredoらは、ヘパリン結合ドメインとの融合による軟骨へのターゲティングされた送達が、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）のin vivoでの機能を延長させるために十分であるか否かを試験した。ヘパリンは、肥満細胞に存在する。しかし、ヘパリンの天然の役割は未知であるが、それは、抗血栓薬として広く用いられている（Loffredo et al. 2014 Arthritis Rheumatol. 66:1247-1255）。
さらなる軟骨アンカータンパク質（ＣＡＰ）の必要性は、なお存在している。
【発明の概要】
【０００９】
発明の要旨
本発明者らは、治療薬を、薬物を関節中に「アンカリング」して結果として薬物の保持を増大させるが、前記治療薬の有効性を損なわないはずである部分（本明細書においてまた「軟骨アンカータンパク質」または「ＣＡＰ」として示される）にカップリングすることにより、治療薬の有効性が著しく増大され得るという仮説を立てた。このアンカリングの概念は、毒性および副作用を減少させ、それにより可能な有用な薬物の数を広げることにより、薬物の有効性のみならず、患部の関節に対する操作上の特異性をも増大させる。本発明者らはさらに、アグリカン結合剤は、潜在的にアンカーとして機能し得るが、アグリカンは、重度にグリコシル化され、関節において軟骨が患う多様な障害において分解されるという仮説を立てた。さらに、薬物が臨床に入ることができる前に必要とされる多様な動物モデルにおけるコストおよび大規模な試験を考慮して、かかるアグリカン結合剤は、優先的に広い交差反応性を有するべきであり、例えば、アグリカン結合剤は、多様な種のアグリカンに結合すべきである。
【００１０】
多様な巧妙な免疫化、スクリーニングおよび特徴づけの方法を用いて、本発明者らは、関節における長期の保持および活性を可能にする優れた選択性、安定性および／または特異性の特徴を有する多数のアグリカン結合剤を同定することができた。
【００１１】
したがって、本発明は、アグリカンに特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶ）に関し、好ましくは前記ＩＳＶは、ヒトアグリカン（配列番号１２５）に特異的に結合し、および／またはここで、前記ＩＳＶは、イヌアグリカン（配列番号１２６）、ウシアグリカン（配列番号１２７）、ラットアグリカン（配列番号１２８）、ブタ（コア）アグリカン（配列番号１２９）、マウスアグリカン（配列番号１３０）、ウサギアグリカン（配列番号１３１）、カニクイザルアグリカン（配列番号１３２）および／またはアカゲザルアグリカン（配列番号１３３）に特異的に結合し、さらにより好ましくは、ここで、前記ＩＳＶは、ニューロカン（配列番号１３４）および／またはブレビカン（配列番号１３５）に実質的に結合しない。
【００１２】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなＩＳＶに関し、ここで、ＩＳＶは、アグリカンへの結合について、ニューロカンおよび／またはブレビカンよりも１０倍より高い、１００倍より高い、好ましくは１０００倍より高い選択性を有するか、および／または前記ＩＳＶは、好ましくは、軟骨および／または半月板などの軟骨性組織に結合するか、および／または前記ＩＳＶは、滑液（ＳＦ）中で３７℃で、１４日間、２１日間、１か月間、２か月間またはさらには３か月間などの、少なくとも７日間の安定性を有するか、および／または前記ＩＳＶは、軟骨保持アッセイにおいて、少なくとも、３、４、５または６ＲＵなどの、少なくとも２ＲＵの軟骨保持を有するか、および／または前記ＩＳＶは、少なくとも１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、またはさらにはそれを超えるなど、少なくとも５μｍ、軟骨中へと浸透するか、および／または前記ＩＳＶは、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列から本質的になる。
【００１３】
一側面において、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、本明細書において記載されるようなＩＳＶに関し、ここで；ＣＤＲ１は、配列番号２４、２０、２１、２２、２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７および１０９からなる群より選択され；ＣＤＲ２は、配列番号４２、３８、３９、４０、４１、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５および１１０からなる群より選択され；およびＣＤＲ３は、配列番号６０、５６、５７、５８、５９、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４および１１１からなる群より選択される。
【００１４】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなＩＳＶに関し、ここで、前記ＩＳＶは、アグリカンのＧ１ドメインに結合し、好ましくは前記ＩＳＶは、８より大きなｐＩを有し、および／または前記ＩＳＶは、２＊１０−２ｓ−１未満のＫｏｆｆを有するか、および／または、前記ＩＳＶは、１＊１０-６Ｍ未満のＥＣ５０を有する。
【００１５】
一側面において、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、本明細書において記載されるようなＩＳＶに関し、ここで；
ｉ）ＣＤＲ１は、以下からなる群より選択される：ａ）配列番号２４、２０、もしくは２１；またはｂ）配列番号２４のアミノ酸配列と５、４、３、２もしくは１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列、ここで、位置２において、Ｓは、Ｒ、Ｆ、ＩもしくはＴに変更されている；位置３において、Ｔは、Ｉに変更されている；位置５において、Ｉは、Ｓに変更されている；位置６において、Ｉは、Ｓ、ＴもしくはＭに変更されている；位置７において、Ｎは、ＹもしくはＲに変更されている；位置８において、Ｖは、Ａ、Ｙ、ＴもしくはＧに変更されている；位置９において、Ｖは、Ｍに変更されている；および／または、位置１０において、Ｒは、Ｇ、ＫもしくはＡに変更されている；ならびに／あるいは、
ｉｉ）ＣＤＲ２は、以下からなる群より選択される：ｃ）配列番号４２、３８、もしくは３９；またはｄ）配列番号４２のアミノ酸配列と５、４、３、２または１アミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列、ここで、位置１において、Ｔは、ＡもしくはＧに変更されている；ＳもしくはＮが位置３と位置４との間に挿入される（位置２ａ、表１．３Ｂ）；位置３において、Ｓは、Ｒ、Ｗ、ＮもしくはＴに変更されている；位置４において、Ｓは、ＴもしくはＧに変更されている；位置５において、Ｇは、Ｓに変更されている；位置６において、Ｇは、ＳもしくはＲに変更されている；位置７において、Ｎは、Ｓ、ＴもしくはＲに変更されている；位置８において、Ａは、Ｔに変更されている；および／または、位置９において、Ｎは、ＤもしくはＹに変更されている；ならびに／あるいは、
ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、以下からなる群より選択される：ｅ）配列番号６０、５６もしくは５７；またはｆ）配列番号６０のアミノ酸配列と５、４、３、２もしくは１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列、ここで、位置１において、Ｐは、Ｇ、Ｒ、ＤもしくはＥに変更されているか、または不在である；位置２において、Ｔは、Ｒ、Ｌ、ＰもしくはＶに変更されているか、または不在である；位置３において、Ｔは、Ｍ、ＳもしくはＲに変更されているか、または不在である；位置４において、Ｈは、Ｄ、Ｙ、ＧもしくはＴに変更されている；位置５において、Ｙは、Ｆ、Ｖ、ＴもしくはＧに変更されている；位置６において、Ｇは、Ｌ、Ｄ、Ｓ、ＹもしくはＷに変更されている；Ｒ、Ｔ、ＹもしくはＶが、位置６と位置７との間に挿入される（位置６ａ、表１．３Ｃ）；位置７において、Ｇは、ＰもしくはＳに変更されている；位置８において、Ｖは、Ｇ、Ｔ、Ｈ、Ｒ、ＬもしくはＹに変更されている；位置９において、Ｙは、Ｒ、Ａ、Ｓ、ＤもしくはＧに変更されている；位置１０において、Ｙは、Ｎ、Ｅ、Ｇ、ＷもしくはＳに変更されている；Ｗが、位置１０と位置１１との間に挿入される（位置１０ａ、表１．３Ｃ）；位置１１において、Ｇは、Ｓ、ＫもしくはＹに変更されている；位置１２において、Ｐは、ＥもしくはＤに変更されているか、または不在である；および／または、位置１３において、Ｙは、Ｌに変更されているか、または不在である。
【００１６】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなＩＳＶに関し、ここで、前記ＩＳＶは、ＣＤＲ１が、配列番号２４、２０、２１、２５、２７、２９、３１、３４、３５、３６、３７および１０９からなる群より選択され；ＣＤＲ２が、配列番号４２、３８、３９、４３、４５、４７、４９、５０、５３、５４、５５および１１０からなる群より選択され；およびＣＤＲ３が、配列番号６０、５６、５７、６１、６３、６５、６７、７１、７２、７３、７４および１１１からなる群より選択される、ＩＳＶの群より選択される。
【００１７】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなＩＳＶに関し、ここで、前記ＩＳＶは、
−  ＣＤＲ１が、配列番号２４であり、ＣＤＲ２が、配列番号４２であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６０である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号２０であり、ＣＤＲ２が、配列番号３８であり、およびＣＤＲ３が、配列番号５６である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号２１であり、ＣＤＲ２が、配列番号３９であり、およびＣＤＲ３が、配列番号５７である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号２５であり、ＣＤＲ２が、配列番号４３であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６１である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号２７であり、ＣＤＲ２が、配列番号４５であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６３である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号２９であり、ＣＤＲ２が、配列番号４７であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６５である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号３１であり、ＣＤＲ２が、配列番号４９であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６７である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号３４であり、ＣＤＲ２が、配列番号５０であり、およびＣＤＲ３が、配列番号７１である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号３５であり、ＣＤＲ２が、配列番号５３であり、およびＣＤＲ３が、配列番号７２である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号３６であり、ＣＤＲ２が、配列番号５４であり、およびＣＤＲ３が、配列番号７３である；ならびに
−  ＣＤＲ１が、配列番号３７であり、ＣＤＲ２が、配列番号５５であり、およびＣＤＲ３が、配列番号７４である、
ＩＳＶの群より選択される。
【００１８】
一側面において、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、本明細書において記載されるようなＩＳＶに関し、ここで；
ｉ）ＣＤＲ１は、以下からなる群より選択される：ａ）配列番号２４および１０９；またはｂ）配列番号２４のアミノ酸配列と２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、位置７において、Ｎは、Ｓに変更されている；および／または位置９において、Ｖは、Ｍに変更されている；ならびに／あるいは
ｉｉ）ＣＤＲ２は、以下からなる群より選択される：ｃ）配列番号４２および１１０；またはｄ）配列番号４２のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列、ここで、位置１において、Ｔは、Ａに変更されている；位置３において、Ｓは、Ｒに変更されている；位置４において、Ｓは、Ｔに変更されている；位置８において、Ａは、Ｔに変更されている；および／または、位置９において、Ｎは、Ｄに変更されている；ならびに／あるいは
ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、以下からなる群より選択される：ｅ）配列番号６０および１１１；またはｆ）配列番号６０のアミノ酸配列と２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、位置４において、Ｈは、Ｒに変更されている；および／または位置８において、Ｖは、Ｄに変更されている。
【００１９】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなＩＳＶに関し、ここで、前記ＩＳＶは、ＣＤＲ１が、配列番号２４および１０９からなる群より選択され；ＣＤＲ２が、配列番号４２および１１０からなる群より選択され；およびＣＤＲ３が、配列番号６０および１１１からなる群より選択される、ＩＳＶの群より選択される。
【００２０】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなＩＳＶに関し、ここで、前記ＩＳＶは、エピトープビン１またはエピトープビン４に属し、好ましくは前記ＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで；
ｉ）ＣＤＲ１は、以下からなる群より選択される：ａ）配列番号３６；およびｂ）配列番号３６のアミノ酸配列と２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、位置３において、Ｔは、Ｓに変更されている；位置６において、Ｔは、Ｓに変更されている；位置８において、Ｔは、Ａに変更されている；および／または位置９において、Ｍは、Ｖに変更されている；ならびに／あるいは
ｉｉ）ＣＤＲ２は、以下からなる群より選択される：ｃ）配列番号５４；およびｄ）配列番号５４のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、位置１において、Ａは、Ｉに変更されている；位置４において、Ｗは、Ｒに変更されている；位置７において、Ｇは、Ｒに変更されている；および／または位置８において、Ｔは、Ｓに変更されている；ならびに／あるいは
ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、以下からなる群より選択される：ｅ）配列番号７３；およびｆ）配列番号７３のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、位置１において、Ｒは、Ｇに変更されている；位置２において、Ｐは、ＲもしくはＬに変更されている；位置３において、Ｒは、ＬもしくはＳに変更されている；位置５において、Ｙは、Ｒに変更されている；位置６において、Ｙは、ＳもしくはＡに変更されている；位置７において、Ｙは、Ｔに変更されているか、または不在である；位置８において、Ｓは、Ｐに変更されている；位置９において、Ｌは、ＨもしくはＲに変更されている；位置１０において、Ｙは、ＰもしくはＡに変更されている；位置１１において、Ｓは、ＡもしくはＹに変更されている；位置１２において、Ｙは、Ｄに変更されている；位置１３において、Ｄは、Ｆに変更されている；位置１４において、Ｙは、Ｇに変更されているか、または不在である；および／または位置１４の後、Ｓが挿入される。
【００２１】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなＩＳＶに関し、ここで、前記ＩＳＶは、ＣＤＲ１が、配列番号２０、２９および３６からなる群より選択され；ＣＤＲ２が、配列番号３８、４７および５４からなる群より選択され；およびＣＤＲ３が、配列番号５６、６５および７３からなる群より選択される、ＩＳＶの群より選択される。
【００２２】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなＩＳＶに関し、ここで、前記ＩＳＶは、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列の、アグリカンのＧ１ドメインへの結合を交差ブロッキングする。
【００２３】
一側面において、本発明は、ＩＳＶ、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列であって、アグリカンのＧ１−ドメインのエピトープビン１に結合し、アグリカンのＧ１ドメインへの結合について本明細書において記載されるようなＩＳＶと競合するものに関する。
【００２４】
一側面において、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる、本明細書において記載されるようなＩＳＶに関し、ここで；ｉ）ＣＤＲ１は、以下からなる群より選択される：ａ）配列番号２４；およびｂ）配列番号２４のアミノ酸配列と２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、位置２において、Ｓは、ＩもしくはＦに変更されている；位置５において、Ｉは、Ｓに変更されている；位置６において、Ｉは、ＳもしくはＭに変更されている；位置７において、Ｎは、ＲもしくはＹに変更されている；位置８において、Ｖは、ＡもしくはＹに変更されている；位置９において、Ｖは、Ｍに変更されている；および／または、位置１０において、Ｒは、Ｋに変更されている；ならびに／あるいは、ｉｉ）ＣＤＲ２は、以下からなる群より選択される：ｃ）配列番号４２；およびｄ）配列番号４２のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列、ここで、位置１において、Ｔは、ＡもしくはＧに変更されている；位置２と位置３との間にＮが挿入される（位置２ａ、表２．３Ｂ）；位置７において、Ｎは、Ｒに変更されている；位置８において、Ａは、Ｔに変更されている；および／または、位置９において、Ｎは、Ｄに変更されている；ならびに／あるいは、ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、以下からなる群より選択される：ｅ）配列番号６０；およびｆ）配列番号６０のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、位置１において、Ｐは、不在である；位置２において、Ｔは、Ｒに変更されているか、または不在である；位置３において、Ｔは、Ｍに変更されているか、または不在である；位置４において、Ｈは、ＤもしくはＹに変更されている；位置５において、Ｙは、ＦもしくはＶに変更されている；位置６において、Ｇは、ＬもしくはＤに変更されている；位置８において、Ｖは、ＧもしくはＴに変更されている；位置９において、Ｙは、Ｒに変更されている；位置１０において、Ｙは、ＮもしくはＥに変更されている；位置１１において、Ｇは、ＳもしくはＫに変更されている；位置１２において、Ｐは、Ｅに変更されているか、または不在である；および／または、位置１３において、Ｙは、Ｌに変更されているか、または不在である；好ましくはＣＤＲ１は、配列番号２４、２５および２７からなる群より選択され；ＣＤＲ２は、配列番号４２、４３および４５からなる群より選択され；およびＣＤＲ３が、配列番号６０、６１および６３からなる群より選択され；さらにより好ましくは、ここで、前記ＩＳＶは、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列の、アグリカンのＧ１ドメインへの結合を交差ブロッキングする。
【００２５】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなＩＳＶ、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列であって、アグリカンのＧ１−ドメインのエピトープビン４に結合し、アグリカンのＧ１ドメインへの結合について本明細書において記載されるようなＩＳＶと競合するものに関する。
【００２６】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなＩＳＶに関し、ここで、前記ＩＳＶは、配列番号５、１、２、６、８、１０、１２、１６、１７、１８および１９を有するＩＳＶ、ならびに配列番号５、１、２、６、８、１０、１２、１６、１７、１８および１９のいずれか１つと、９０％または９５％などの、８０％より高い配列同一性を有する、ＩＳＶからなる群より選択される。
【００２７】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなＩＳＶに関し、ここで、前記ＩＳＶは、アグリカンのＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメインに結合し、好ましくはここで、前記ＩＳＶは、８より大きなｐＩを有し、および／または２＊１０−２ｓ−１未満のＫｏｆｆを有し、および／または１＊１０−６Ｍ未満のＥＣ５０を有する。
【００２８】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなＩＳＶに関し、ここで；ｉ）ＣＤＲ１は、以下からなる群より選択される：ａ）配列番号３２、３０および２３；ならびにｂ）配列番号３２のアミノ酸配列と３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、位置２において、Ｒは、Ｌに変更されている；位置６において、Ｓは、Ｔに変更されている；および／または、位置８において、Ｔは、Ａに変更されている；ならびに／あるいは、ｉｉ）ＣＤＲ２は、以下からなる群より選択される：ｃ）配列番号５０、４１、４８および５１；ならびにｄ）配列番号５０のアミノ酸配列と２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、位置７において、Ｇは、ＳもしくはＲに変更されている；および／または位置８において、Ｒは、Ｔに変更されている；および／またはｉｉｉ）ＣＤＲ３は、以下からなる群より選択される：ｅ）配列番号６８、５９、６６および６９；ならびにｆ）配列番号６８のアミノ酸配列と５、４、３、２または１アミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、位置４において、Ｒは、ＶもしくはＰに変更されている；位置６において、Ａは、Ｙに変更されている；位置７において、Ｓは、Ｔに変更されている；位置８において、Ｓは、不在である；位置９において、Ｎは、Ｐに変更されている；位置１０において、Ｒは、ＴもしくはＬに変更されている；位置１１において、Ｇは、Ｅに変更されている；および／または位置１２において、Ｌは、ＴもしくはＶに変更されている。好ましくは、ここで、前記ＩＳＶは、ＣＤＲ１が、配列番号３２、３０および２３からなる群より選択され；ＣＤＲ２が、配列番号５０、４１、４８および５１からなる群より選択され；およびＣＤＲ３が、配列番号６８、５９、６６および６９からなる群より選択される、ＩＳＶの群より選択され、さらにより好ましくは、ここで、前記ＩＳＶは、ＣＤＲ１が、配列番号３２であり、ＣＤＲ２が、配列番号５０であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６８であり；ＣＤＲ１が、配列番号３２であり、ＣＤＲ２が、配列番号５１であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６９である；ＣＤＲ１が、配列番号３０であり、ＣＤＲ２が、配列番号４８であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６６である；ならびにＣＤＲ１が、配列番号２３であり、ＣＤＲ２が、配列番号４１であり、およびＣＤＲ３が、配列番号５９である、ＩＳＶの群より選択される。
【００２９】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなＩＳＶに関し、ここで、前記ＩＳＶは、配列番号１３、４、１１および１４を有するＩＳＶ、ならびに配列番号１３、４、１１および１４のいずれか１つと、９０％または９５％などの、８０％より高い配列同一性を有する、ＩＳＶからなる群より選択される。
【００３０】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなＩＳＶに関し、ここで、前記ＩＳＶは、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列の、アグリカンのＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメインへの結合を交差ブロッキングする。一側面において、本発明は、ＩＳＶ、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列であって、アグリカンのＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメインに結合し、アグリカンのＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメインへの結合について本明細書において記載されるようなＩＳＶと競合する者に関する。
【００３１】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなＩＳＶに関し、ここで、前記ＩＳＶは、アグリカンのＧ２ドメインに結合し、好ましくはここで、前記ＩＳＶは、８より大きなｐＩを有し、および／または２＊１０−２ｓ−１未満のＫｏｆｆを有し、および／または１＊１０−６Ｍ未満のＥＣ５０を有する。
【００３２】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなＩＳＶに関し、ここで；ｉ）ＣＤＲ１は、以下からなる群より選択される：ａ）配列番号２８；およびｂ）配列番号２８のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、位置１において、Ｇは、Ｒに変更されている；位置２において、Ｐは、ＳもしくはＲに変更されている；位置３において、Ｔは、Ｉに変更されている；位置５において、Ｓは、Ｎに変更されている；位置６において、Ｒは、Ｎ、ＭもしくはＳに変更されている；位置７において、Ｙは、Ｒに変更されているか、または不在である；位置８において、Ａは、Ｆに変更されているか、または不在である；および／または、位置１０において、Ｇは、Ｙに変更されている；ならびに／あるいは、ｉｉ）ＣＤＲ２は、以下からなる群より選択される：ｃ）配列番号４６；およびｄ）配列番号４６のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、位置１において、Ａは、ＳもしくはＹに変更されている；位置４において、Ｗは、Ｌに変更されている；位置５において、Ｓは、Ｎに変更されている；位置６において、Ｓは、不在である；位置７において、Ｇは、不在である；位置８において、Ｇは、Ａに変更されている；位置９において、Ｒは、Ｓ、ＤもしくはＴに変更されている；および／または位置１１において、Ｙは、ＮもしくはＲに変更されている；ならびに／あるいは、ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、以下からなる群より選択される：ｅ）配列番号６４；およびｆ）配列番号６４のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、位置１において、Ａは、ＲもしくはＦに変更されている；位置２において、Ｒは、ＩもしくはＬに変更されている；位置３において、Ｉは、ＨもしくはＱに変更されている；位置４において、Ｐは、ＧもしくはＮに変更されている；位置５において、Ｖは、Ｓに変更されている；位置６において、Ｒは、Ｇ、ＮもしくはＦに変更されている；位置７において、Ｔは、Ｒ、ＷもしくはＹに変更されている；位置８において、Ｙは、ＲもしくはＳに変更されているか、または不在である；位置９において、Ｔは、Ｓに変更されているか、または不在である；位置１０において、Ｓは、Ｅ、Ｋに変更されているか、または不在である；位置１１において、Ｅは、Ｎ、Ａに変更されているか、または不在である；位置１２において、Ｗは、Ｄに変更されているか、または不在である；位置１３において、Ｎは、Ｄに変更されているか、または不在である；位置１４において、Ｙは、不在である；ならびに／あるいはＤおよび／またはＮが、配列番号６４の位置１４の後に付加され；好ましくはここで、前記ＩＳＶは、ＣＤＲ１が、配列番号２８、２２、２６および３３からなる群より選択され；ＣＤＲ２が、配列番号４６、４０、４４および５２からなる群より選択され；およびＣＤＲ３が、配列番号６４、５８、６２および７０からなる群より選択される、ＩＳＶの群より選択され、さらにより好ましくは、ここで、前記ＩＳＶは、ＣＤＲ１が、配列番号２８であり、ＣＤＲ２が、配列番号４６であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６４である；ＣＤＲ１が、配列番号２２であり、ＣＤＲ２が、配列番号４０であり、およびＣＤＲ３が、配列番号５８である；ＣＤＲ１が、配列番号２６であり、ＣＤＲ２が、配列番号４４であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６２である；ならびにＣＤＲ１が、配列番号３３であり、ＣＤＲ２が、配列番号５２であり、およびＣＤＲ３が、配列番号７０である、ＩＳＶの群より選択される。
【００３３】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなＩＳＶに関し、ここで、前記ＩＳＶは、配列番号９、３、７および１５を有するＩＳＶ、ならびに配列番号９、３、７および１５のいずれか１つと、９０％または９５％などの、８０％より高い配列同一性を有する、ＩＳＶからなる群より選択される。
【００３４】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなＩＳＶに関し、ここで、前記ＩＳＶは、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列の、アグリカンのＧ２ドメインへの結合を交差ブロッキングする。一側面において、本発明は、ＩＳＶ、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列であって、アグリカンのＧ２−ドメインに結合し、アグリカンのＧ２ドメインへの結合について本明細書において記載されるようなＩＳＶと競合するものに関する。
【００３５】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなＩＳＶに関し、ここで、前記ＩＳＶは、配列番号１〜１９および１１４〜１１８、ならびに配列番号１〜１９および１１４〜１１８のいずれか１つと、９０％または９５％などの、８０％より高い配列同一性を有する、ＩＳＶからなる群より選択される。
【００３６】
一側面において、本発明は、少なくとも１つの本明細書において記載されるようなＩＳＶを含むポリペプチドに関し、好ましくは前記は、少なくとも２つの本明細書において記載されるようなＩＳＶを含み、ここで、前記少なくとも２つのＩＳＶは、同じであっても異なっていてもよい。好ましくは、前記少なくとも２つのＩＳＶは、独立して、配列番号１〜１９および１１４〜１１８からなる群より選択され、より好ましくは、ここで、前記少なくとも２つのＩＳＶは、配列番号５、６、８および１１４〜１１７からなる群より選択され、またはここで、前記少なくとも２つのＩＳＶは、配列番号１３および１１８からなる群より選択される。
【００３７】
好ましくは、一側面において、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つのさらなるＩＳＶ、例えば治療用ＩＳＶを含む。好ましくは、前記少なくとも１つのさらなるＩＳＶは、セリンプロテアーゼファミリーのメンバー、カテプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）／マトリキシン（Matrixin）またはA Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs（ＡＤＡＭＴＳ）、好ましくはＭＭＰ８、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＡＤＡＭＴＳ５（アグリカナーゼ−２）、ＡＤＡＭＴＳ４（アグリカナーゼ−１）および／またはＡＤＡＭＴＳ１１に結合し；ここで、前記少なくとも１つのさらなるＩＳＶ、例えば治療用ＩＳＶは、好ましくは活性を保持する。さらにより好ましくは、前記少なくとも１つのさらなるＩＳＶ、例えば治療用ＩＳＶは、セリンプロテアーゼファミリーのメンバー、カテプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）／マトリキシンまたはA Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs（ＡＤＡＭＴＳ）、好ましくはＭＭＰ８、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＡＤＡＭＴＳ５（アグリカナーゼ−２）、ＡＤＡＭＴＳ４（アグリカナーゼ−１）および／またはＡＤＡＭＴＳ１１の活性を阻害する。
【００３８】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドに関し、ここで、前記ポリペプチドは、は、滑液（ＳＦ）中で３７℃で、１４日間、２１日間、１か月間、２か月間またはさらには３か月間などの、少なくとも７日間の安定性を有するか、および／または、軟骨保持アッセイにおいて、少なくとも、３、４、５または６ＲＵなどの、少なくとも２ＲＵの軟骨保持を有するか、および／または、少なくとも１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、またはさらにはそれを超えるなど、少なくとも５μｍ、軟骨中へと浸透する。
【００３９】
一側面において、本発明は、血清タンパク質結合部分または血清タンパク質をさらに含む、本明細書において記載されるようなポリペプチドに関し、好ましくは前記血清タンパク質結合部分は、血清アルブミンに結合する；さらにより好ましくは前記血清タンパク質結合部分は、血清アルブミンに結合するＩＳＶである；さらにより好ましくは、前記血清アルブミンに結合するＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、ＣＤＲ１は、ＳＦＧＭＳであり、ＣＤＲ２は、ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧであり、およびＣＤＲ３は、ＧＧＳＬＳＲである；さらにより好ましくは前記血清アルブミンに結合するＩＳＶは、Ａｌｂ８、Ａｌｂ２３、Ａｌｂ１２９、Ａｌｂ１３２、Ａｌｂ１３５、Ａｌｂ１１、Ａｌｂ１１（Ｓ１１２Ｋ）−Ａ、Ａｌｂ８２、Ａｌｂ８２−Ａ、Ａｌｂ８２−ＡＡ、Ａｌｂ８２−ＡＡＡ、Ａｌｂ８２−Ｇ、Ａｌｂ８２−ＧＧ、Ａｌｂ８２−ＧＧＧを含む（表Ｃを参照）。一側面において、本発明は、血清タンパク質結合部分または血清タンパク質をさらに含む、本明細書において記載されるようなポリペプチドに関し、ここで、前記血清タンパク質結合部分は、非抗体ベースのポリペプチドである。一側面において、本発明は、ＰＥＧをさらに含む、本明細書において記載されるようなポリペプチドに関する。
【００４０】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドに関し、ここで、前記ＩＳＶは、互いに直接連結されているか、または、リンカーを介して連結されている。一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドに関し、ここで、第１のＩＳＶおよび／または第２のＩＳＶおよび／または場合によっては第３のＩＳＶおよび／または場合によっては第４のＩＳＶおよび／または場合によっては前記血清アルブミンに結合するＩＳＶは、リンカーを介して連結されている；好ましくは前記リンカーは、５ＧＳ、７ＧＳ、９ＧＳ、１０ＧＳ、１５ＧＳ、１８ＧＳ、２０ＧＳ、２５ＧＳ、３０ＧＳおよび３５ＧＳのリンカーからなる群より選択される（表Ｄを参照）。
【００４１】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなポリペプチドに関し、ここで、前記ポリペプチドは、表Ｅ−１および表Ｅ−２においてそれぞれ示されるとおりの標的に結合するＩＳＶ、および示されるとおりの１つまたは２つのアグリカンに結合するＩＳＶを含む、ポリペプチドおよび／またはコンストラクトの群より選択される。
【００４２】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなＩＳＶ、または本明細書において記載されるようなポリペプチドを含むか、これから本質的になるコンストラクトに関し、これは、任意に１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、これらは、任意に１つ以上のペプチド性リンカーを介して連結されている；好ましくは前記１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそのフラグメント、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小タンパク質またはペプチドからなる群より選択される。
【００４３】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなＩＳＶ、本明細書において記載されるようなポリペプチド、または本明細書において記載されるようなコンストラクトをコードする、核酸に関する。
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるような核酸を含む、発現ベクターに関する。
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるような核酸、または本明細書において記載されるような発現ベクターを含む、宿主または宿主細胞に関する。
【００４４】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなＩＳＶまたは本明細書において記載されるようなポリペプチドを生成するための方法に関し、前記方法は、少なくとも以下のステップを含む：ａ）好適な宿主細胞または宿主生物において、または別の好適な発現系において、本明細書において記載されるような核酸を発現させること；任意に、それに続いて：ｂ）本明細書において記載されるようなＩＳＶ、または本明細書において記載されるようなポリペプチドを、単離および／または精製すること。
【００４５】
一側面において、本発明は、少なくとも１つの本明細書において記載されるようなＩＳＶ、本明細書において記載されるようなポリペプチド、本明細書において記載されるようなコンストラクト、または本明細書において記載されるような核酸を含む、組成物に関する；好ましくは前記組成物は、医薬組成物であり、これは、好ましくは、少なくとも１つの薬学的に受入可能なキャリア、希釈剤または賦形剤および／またはアジュバントをさらに含み、および任意に、１つ以上のさらなる医薬活性ポリペプチドおよび／または化合物を含む。
【００４６】
一側面において、本発明は、医薬としての使用のための、本明細書において記載されるような組成物、本明細書において記載されるようなＩＳＶ、本明細書において記載されるようなポリペプチド、または本明細書において記載されるようなコンストラクトに関する。好ましくは、本明細書において記載されるような組成物、ＩＳＶ、ポリペプチドまたはコンストラクトは、関節症および軟骨ジストロフィー、関節炎疾患、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風関節炎、乾癬性関節炎、外傷性の断裂または脱離、軟骨無形成症、肋軟骨炎、脊椎骨端骨幹端異形成（Spondyloepimetaphyseal dysplasia）、椎間板ヘルニア、腰椎椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発軟骨炎などを予防または処置することにおける使用のためのものである。
【００４７】
一側面において、本発明は、関節症および軟骨ジストロフィー、関節炎疾患、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風関節炎、乾癬性関節炎、外傷性の断裂または脱離、軟骨無形成症、肋軟骨炎、脊椎骨端骨幹端異形成症、椎間板ヘルニア、腰椎椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発軟骨炎などを予防または処置するための方法に関し、ここで、前記方法は、それを必要とする対象に、少なくとも本明細書において記載されるような組成物、ＩＳＶ、ポリペプチドまたはコンストラクトのそれを必要とする人物にとっての薬学的活性量を投与することを含む。
【００４８】
一側面において、本発明は、軟骨性組織からの化合物、ポリペプチドまたはコンストラクトの流出を減少させるかおよび／または阻害するための方法に関し、ここで前記方法は、本明細書において記載されるような少なくとも１つのポリペプチド、本明細書において記載されるような化合物またはコンストラクト、または本明細書において記載されるような組成物の薬学的活性量を、それを必要とする人物に投与することを含む。
【００４９】
一側面において、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ５活性および／またはＭＭＰ１３活性を阻害および／またはブロッキングするための方法に関し、ここで前記方法は、本明細書において記載されるような少なくとも１つのポリペプチド、本明細書において記載されるようなコンストラクト、または本明細書において記載されるような組成物の薬学的活性量を、それを必要とする人物に投与することを含む。
【００５０】
一側面において、本発明は、本明細書において記載されるようなＩＳＶ、本明細書において記載されるようなポリペプチド、本明細書において記載されるようなコンストラクト、または本明細書において記載されるような組成物の、関節症および軟骨ジストロフィー、関節炎疾患、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風関節炎、乾癬性関節炎、外傷性の断裂または脱離、軟骨無形成症、肋軟骨炎、脊椎骨端骨幹端異形成症、椎間板ヘルニア、腰椎椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発軟骨炎などを処置または予防するための医薬組成物の調製における使用に関する。
【００５１】
ポリペプチドおよび組成物の他の側面、利点、適用および用途は、本明細書におけるさらなる開示から明らかとなるであろう。いくつかの文書が、本明細書のテキスト全体にわたり引用される。本明細書において引用される文書（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造者の仕様書、説明書などを含む）の各々は、上記および下記のいずれにおいても、その全体において本明細書により参考として援用される。本明細書における何であれ、本発明が、先行発明によるかかる開示よりも日付が前であることを主張する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】１２５Ｉ標識ＡＬＢ２６−ＣＡＰコンストラクトの注射の２または４週間後のラット関節の切片のオートラジオグラフィー画像の例。注射の２週間後の結果および注射の４週間後の結果の両方について：左パネル：組織学的切片；右パネル：オートラジオグラフィー。
【００５３】
【図２】代表的なＭＡＲＧ画像。特異的ＭＡＲＧ染色は、画像上の黒い粒子として現れ、矢印により示される。
【００５４】
【図３】抗ＭＭＰ１３−ＣＡＰナノボディ（Ｃ０１０１００７５４）または抗ＡＤＡＭＴＳ５−ＣＡＰナノボディ（Ｃ０１０１００９５４）を用いたラットＭＭＴモデルにおけるナノボディによる軟骨分解の阻害。処置は、術後３日にＩＡ注射により開始した。術後４２日に病理組織学を行った。医学的および全体的な実質的な軟骨の変性幅ならびに軟骨変性の減少のパーセンテージを決定した。１群あたり２０個体の動物を用いた。
【００５５】
【図４】関節１つ（右膝）あたり４００μｇのナノボディの単一の関節内注射を受けた変形性関節症ラットおよび健常ラットにおける、ポリペプチドの第１の用量（ｈ）の後の時間に対する血清濃度（ｎｇ／ｍｌにおける平均濃度）。ドットは、健常動物における個々の濃度を表し；三角形は、ＯＡ動物における個々の濃度を表し；および線は、平均濃度を表す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
詳細な説明
特に記載または定義がない限り、使用する全ての用語は、当分野におけるそれらの通常の意味を有し、それらは当業者にとり明らかである。参照として、例えば標準的なハンドブック、例えばSambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd. Ed.) Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）、F. Ausubelら（Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987）、Lewin（Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1985）、Oldら（Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering (2nd edition) University of California Press, Berkeley, CA, 1981）、Roittら（Immunology (6th. Ed.) Mosby/Elsevier, Edinburgh, 2001）、Roittら（Roitt's Essential Immunology (10th Ed.) Blackwell Publishing, UK, 2001）、およびJanewayら（Immunobiology (6th Ed.) Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York, 2005）、ならびに本明細書において引用される一般的な背景技術が挙げられる。
【００５７】
特に明記しない限り、具体的に詳細に記載しない全ての方法、ステップ、技術および操作は、当業者には明らかであるように、自体公知の方法で実施可能であり、実施された。参照として、例えば標準的なハンドブックおよび本明細書に記載の一般的背景技術、およびその中の引用参照文献、ならびに、例えば以下のレビュー：Presta (Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (5-6): 640-56, 2006)、Levin and Weiss (Mol. Biosyst. 2(1): 49-57, 2006)、Irving et al. (J. Immunol. Methods 248(1-2): 31-45, 2001)、Schmitz et al. (Placenta 21 Suppl. A: S106-12, 2000)、Gonzales et al. (Tumour Biol. 26(1): 31-43, 2005)が挙げられ、これらは、親和性成熟や、免疫グロブリンなどのタンパク質の特異性および他の所望の特性を改善するための他の技術などのタンパク質工学の技術を記載する。
【００５８】
本明細書で用いられる「配列」という用語（例えば「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」または「タンパク質配列」などの用語中）は、一般的に、文脈がより限定された解釈を必要としない限り、然るべきアミノ酸配列ならびにそれをコードする核酸またはヌクレオチド配列の両者を包含すると理解すべきである。
【００５９】
アミノ酸配列とは、文脈に依存して、単一のアミノ酸または２つ以上のアミノ酸の非分枝状配列を意味するものと解釈される。ヌクレオチド配列とは、３つ以上のヌクレオチドの非分枝状配列を意味するものと解釈される。
【００６０】
アミノ酸とは、天然に存在するタンパク質中に共通して見出されるＬ−アミノ酸である。アミノ酸残基は、標準的な３文字または１文字のアミノ酸コードに従って示されるであろう。例えば、ＷＯ  ０８／０２００７９の４８頁における表Ａ−２に参照がなされる。Ｄ−アミノ酸を含むアミノ酸配列は、この定義によっては包含されることを意図されない。翻訳後に修飾されるアミノ酸を含む任意のアミノ酸配列は、初めに、修飾された位置、例えばヒドロキシル化またはグリコシル化と共に、この表Ａ−２において示される記号を用いて翻訳されるアミノ酸配列として記載され得るが、これらの修飾は、アミノ酸配列においては明示的には示されない場合もある。連結、架橋およびエンドキャップ、非ペプチジル結合などで修飾された配列として表すことができる任意のペプチドまたはタンパク質は、この定義により包含される。
【００６１】
用語「タンパク質」、「ペプチド」、「タンパク質／ペプチド」、および「ポリペプチド」は、本開示全体にわたり交換可能に用いられ、各々は、本開示の目的のためには同じ意味を有する。各々の用語は、２つ以上のアミノ酸の直鎖からなる有機化合物を指す。化合物は、１０以上のアミノ酸；２５以上のアミノ酸；５０以上のアミノ酸；１００以上のアミノ酸、２００以上のアミノ酸、および３００以上ものアミノ酸を有していてもよい。当業者は、ポリペプチドをタンパク質から区別するアミノ酸の数の当該分野において認識されたカットオフ点は存在しないが、ポリペプチドは一般にタンパク質より少ないアミノ酸を含むこと；ポリペプチドは、化学合成または組み換え方法により作製することができること；およびタンパク質は、一般にin vitroまたはin vivoで組み換え方法により作製され、これは全て当該分野において公知のとおりであることを理解するであろう。
【００６２】
核酸またはアミノ酸配列は、例えば、それが得られた反応媒体または培養培地と比較し、通常、前記給源または培地中で会合する、別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分もしくは巨大分子、または少なくとも１つの混入物質、不純物もしくは微量成分などの少なくとも１つの他の成分からそれが分離されたとき、「（本質的に）単離された（形態）」と考えられる。特に少なくとも２倍に、特に少なくとも１０倍に、より具体的には少なくとも１００倍に、また最大で１０００倍以上に精製されたとき、核酸またはアミノ酸配列は「（本質的に）単離された」と考えられる。「（本質的に）単離された形態で」ある核酸またはアミノ酸は、好適なクロマトグラフィー技術、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動などの好適な技術を使用することにより決定したときに、好ましくは本質的に均質である。
【００６３】
あるヌクレオチド配列またはアミノ配列が、それぞれ、別のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を「含む」か、または「本質的に」別のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列「からなる」といわれるときは、それぞれ、後者のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、前者のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に組み込まれていることを意味しうるが、このことはより通常には、それぞれ、前者のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、その配列中に、それぞれ、後者の配列と同じヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有する、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基のストレッチを含むことを一般的に意味し、前者の配列が実際に生成されたまたは得られた方法とは無関係である（例えば、本明細書に記載されるいかなる好適な方法によるものであってもよい）。非限定的な例として、本発明のポリペプチドが、免疫グロブリン単一可変ドメイン（「ＩＳＶ」）を含むといわれるときは、前記免疫グロブリン単一可変ドメイン配列が、本発明のポリペプチドの配列中に組み込まれていることを意味しうるが、より通常には、本発明のポリペプチドが、その配列中にＩＳＶの配列を含むことを一般的に意味し、本発明の前記ポリペプチドが生成されたまたは得られた方法とは無関係である。また、核酸またはヌクレオチド配列が、別のヌクレオチド配列を含むといわれるときは、挙げられている前者の核酸またはヌクレオチド配列は、好ましくは、それが発現産物（例えばポリペプチド）として発現されるとき、後者のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列が前記発現産物の一部をなす（言い換えると、後者のヌクレオチド配列が、挙げられている前者のより大きな核酸またはヌクレオチド配列と同じ読み枠である）。また、本発明のコンストラクトがポリペプチドまたはＩＳＶを含むと言われる場合、これは、前記コンストラクトが、それぞれ少なくとも前記ポリペプチドまたはＩＳＶを包含することを意味し得るが、より通常には、このことは、前記コンストラクトが、前記ポリペプチドまたはＩＳＶに加えて、基、残基（例えば、アミノ酸残基）、部分および／または結合単位を包含することを意味し、これは、前記ポリペプチドまたはＩＳＶが、どのようにして前記基、残基（例えば、アミノ酸残基）、部分および／または結合単位に連結されているかには関係がなく、および前記コンストラクトがどのようにして生成されたかまたは得られたかにも関係がない。
【００６４】
「本質的に、〜からなる」とは、本発明の方法で使用するＩＳＶが、正確に本発明のＩＳＶと同じであるか、または、ＩＳＶのアミノ末端、カルボキシ末端、またはアミノ末端およびカルボキシ末端の両方に、１〜２０アミノ酸残基、例えば１〜１０アミノ酸残基、好ましくは１〜６アミノ酸残基、例えば１、２、３、４、５または６アミノ酸残基などの限定された数のアミノ酸残基を有する本発明のＩＳＶに対応する。
【００６５】
２つ以上のヌクレオチド配列を比較する場合、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列間の「配列同一性」のパーセンテージは、［第２のヌクレオチド配列の対応する部位のヌクレオチドと同一である第１のヌクレオチド配列中のヌクレオチドの数］を、［第１のヌクレオチド配列のヌクレオチドの総数］で除算し、［１００％］で乗算することにより算出することができ、第１のヌクレオチド配列と比較し、第２のヌクレオチド配列のヌクレオチドの欠失、挿入、置換または追加は、単一ヌクレオチド（位置）の相違と考えられる。代替的には、２つ以上のヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、例えばＮＣＢＩのＢｌａｓｔのｖ２．０などの配列アラインメント用の公知のコンピューターアルゴリズムを用いて、標準的な設定を用いて算出できる。配列同一性の程度を決定するための他の幾つかの技術、コンピューターアルゴリズムおよび設定は、例えばＷＯ  ０４／０３７９９９、ＥＰ  ０９６７２８４、ＥＰ  １０８５０８９、ＷＯ  ００／５５３１８、ＷＯ  ００／７８９７２、ＷＯ  ９８／４９１８５およびＧＢ  ２３５７７６８に記載されている。通常、２つのヌクレオチド配列間の「配列同一性」のパーセンテージを上記で概説した算出方法に従って決定する目的には、ヌクレオチド数の最も大きいヌクレオチド配列を「第１の」ヌクレオチド配列とし、別のヌクレオチド配列を「第２の」ヌクレオチド配列とする。
【００６６】
２つ以上のアミノ酸配列を比較する目的には、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列間の「配列同一性」（本明細書において「アミノ酸同一性」ともまた称される）のパーセンテージは、［第２のアミノ酸配列の対応する位置のアミノ酸残基と同一である第１のアミノ酸配列のアミノ酸残基の数］を、［第１のアミノ酸配列のアミノ酸残基の総数］で除算し、［１００％］で乗算することにより算出することができ、第１のアミノ酸配列と比較し、第２のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の欠失、挿入、置換または追加は、単一アミノ酸残基（位置）の相違として、すなわち、本明細書で定義される「アミノ酸相違」と考えられる。代替的には、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を、例えば、ヌクレオチド配列の配列同一性の程度の決定に関して上記したような公知のコンピューターアルゴリズムを用いて、同様に標準的な設定を用いて算出することができる。通常、２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」のパーセンテージを上記で概説した算出方法に従って決定する目的には、アミノ酸残基数の最も大きいアミノ酸配列を「第１の」アミノ酸配列とし、別のアミノ酸配列を「第２の」アミノ酸配列とする。
【００６７】
また、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を決定する際、当業者は、いわゆる「保存的」アミノ酸置換、すなわち、アミノ酸残基が類似する化学構造を有する他のアミノ酸残基により置換され、ポリペプチドの機能、活性または他の生物学的性質にほとんど、または本質的に影響しないアミノ酸置換と一般的に記載することができる置換を考慮し得る。かかる保存的アミノ酸置換は、例えばＷＯ  ０４／０３７９９９、ＧＢ  ３３５７６８、ＷＯ  ９８／４９１８５、ＷＯ  ００／４６３８３およびＷＯ  ０１／０９３００から当分野において周知であり、またかかる置換の（好ましい）タイプおよび／または組合せは、ＷＯ  ０４／０３７９９９、または例えばＷＯ  ９８／４９１８５、ならびにその中のさらなる引用参照文献の該当する教示を基礎として選択することができる。
【００６８】
かかる保存的置換は、好ましくは、以下のグループ（ａ）〜（ｅ）中の１つのアミノ酸が、同じグループ内の別のアミノ酸残基により置換される置換である。（ａ）小さい脂肪族、無極性または低極性残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；（ｂ）極性、負荷電残基およびそれらの（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｉｎ；（ｃ）極性、正荷電残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；（ｄ）大きい脂肪族、無極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌおよびシステイン；ならびに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。特に好適な保存的置換は、以下の通りである。ＡｌａからＧｌｙ、またはＳｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；ＡｓｎからＧｌｎ、またはＨｉｓ；ＡｓｐからＧｌｕ；ＣｙｓからＳｅｒ；ＧｌｎからＡｓｎ；ＧｌｕからＡｓｐ；ＧｌｙからＡｌａ、またはＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎ、またはＧｌｎ；ＩｌｅからＬｅｕ、またはＶａｌ；ＬｅｕからＩｌｅ、またはＶａｌ；ＬｙｓからＡｒｇ、Ｇｉｎ、またはＧｌｕ；ＭｅｔからＬｅｕ、Ｔｙｒ、またはＩｌｅ；ＰｈｅからＭｅの、Ｌｅｕ、またはＴｙｒ；ＳｅｒからＴｈｒ；ＴｈｒからＳｅｒ；ＴｒｐからＴｙｒ；ＴｙｒからＴｒｐ；および／またはＰｈｅからＶａｌ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕ。
【００６９】
また、本明細書に記載されるポリペプチドに適用されるいずれかのアミノ酸置換は、例えばSchulzらなどにより開発された、異なる種の相同タンパク質間のアミノ酸変化の頻度分析（Principles of Protein Structure", Springer-Verlag, 1978）、例えばChouおよびFasman により開発された構造形成ポテンシャル分析（Biochemistry 13: 211, 1974；Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978）、Eisenbergら（Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984）、KyteおよびDoolittle（J. Molec. Biol. 157: 105-132, 1981）またはGoldmanら（Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986）により開発されたタンパク質の疎水性パターン分析に基づいてもよく、これらの全内容を全て本明細書に参照により援用する。ナノボディの一次、二次および三次構造に関する情報は、本明細書の詳細な説明、および上で引用の一般的背景技術に記載されている。また、これに関して、ラマ由来のＶＨＨドメインの結晶構造が、例えばDesmyterら（Nature Structural Biology, 3: 803, 1996）、Spinelliら（Natural Structural Biology, 3: 752-757, 1996）またはDecanniereら（Structure, 7 (4): 361, 1999）に開示されている。従来公知のＶＨドメインにおいて、ＶＨ／ＶＬのインターフェースを形成する幾つかのアミノ酸残基およびそれらの位置における可能なラクダ化置換に関する詳しい情報が、上で引用の従来技術文献に存在する。
【００７０】
アミノ酸配列および核酸配列は、それらが全長において１００％の配列同一性（本明細書で定義される）を有する場合、「完全に同じ」であるものとする。
【００７１】
２つのアミノ酸配列を比較するとき、「アミノ酸（単数または複数）の相違」という用語は、第１の配列内のある位置において、第２の配列と比較し、単一アミノ酸残基が挿入、欠失または置換されていることを指し、すなわち、２つのアミノ酸配列が、１つ、２つもしくはそれ以上のかかるアミノ酸の相違を含みうることが理解される。ことさらには、本発明のアミノ酸配列および／またはポリペプチドにおいて、用語「アミノ酸の相違（単数または複数）」は、ｂ）、ｄ）またはｆ）において特定されるＣＤＲ配列の位置における、それぞれａ）、ｃ）またはｅ）のＣＤＲ配列と比較した、単一のアミノ酸残基の挿入、欠失または置換を指す；ｂ）、ｄ）およびｆ）のＣＤＲ配列は、それぞれａ）、ｃ）またはｅ）のＣＤＲ配列と比較して、１、２、３、４または最大５つのかかるアミノ酸の相違を含んでもよいことが理解されている。
【００７２】
「アミノ酸の相違（単数または複数）」は、１、２、３、４または最大５つの置換、欠失、挿入またはそれらのいかなる組み合わせであってもよいが、それは本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のポリペプチドの特性を改善するか、または少なくとも、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のポリペプチドの所望の特性、または所望の特性のバランスもしくは組合せを損なわないものである。この点、結果として得られる本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のポリペプチドは少なくとも、１、２、３、４または最大５つの置換、欠失または挿入を有さない、１つ以上のＣＤＲ配列を含むポリペプチドと比較し、親和性を表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）で測定した場合に、同じ、ほぼ同じ、またはより高い親和性で、アグリカンと結合すべきものである。
【００７３】
このことに関して、ｂ）、ｄ）および／またはｆ）によるＣＤＲのアミノ酸配列は、それ自体公知の親和性成熟の１つ以上の技術を用いる親和性成熟により、それぞれａ）、ｃ）および／またはｅ）によるアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列であってよい。
【００７４】
例えば、また本発明のポリペプチドの発現に用いる宿主生物に応じて、翻訳後修飾のための１つ以上の部位（例えば１つ以上のグリコシル化部位）を除去するように、かかる欠失および／または置換を設計でき、それは当業者の技量の範囲内である。
【００７５】
本明細書にて用いられている「ナノボディファミリー」、「ＶＨＨファミリー」または「ファミリー」とは、同一の長さを有する（すなわち、それらの配列中に同数のアミノ酸を有する）一群のナノボディおよび／またはＶＨＨ配列であって、（Ｋａｂａｔ番号づけに従い）位置８から位置１０６間のアミノ酸配列が８９％以上のアミノ酸配列同一性を有する配列を指す。
【００７６】
交換可能に用いられる用語「エピトープ」および「抗原決定基」は、免疫グロブリン、通常の抗体、ＩＳＶおよび／または本発明に係るポリペプチドなどの抗原結合性分子により、より具体的には前記分子の抗原結合部位により認識される、ポリペプチドまたはタンパク質などの大分子中の部分のことを指す。エピトープは、免疫グロブリンのための最小限の結合部位を定め、それにより免疫グロブリンの特異的な標的を表す。
エピトープを認識する抗原結合性分子（例えば本発明の免疫グロブリン、通常抗体、ＩＳＶおよび／またはポリペプチド）の部分は、「パラトープ」と呼ばれる。
【００７７】
特定のエピトープ、抗原、またはタンパク質（またはその少なくとも一部、断片もしくはエピトープ）と「結合する」ことができるか、「特異的に結合する」ことができるか、「親和性を有する」か、および／または「特異性を有する」アミノ酸配列（例えばＩＳＶ、抗体、本発明のポリペプチド、または一般に抗原に結合するタンパク質もしくはポリペプチドもしくはそれらのフラグメント）は、前記エピトープ、抗原またはタンパク質「に対する」または「を標的とする」と言われ、またはかかるエピトープ、抗原またはタンパク質に対する「結合」分子であるか、または「抗」エピトープ、「抗」抗原または「抗」タンパク質（例えば「抗」アグリカン）であると言われる。
【００７８】
親和性は、分子相互作用の強度または安定性を表す。親和性は、一般に、ＫＤまたは解離定数として示され、これは、モル／リットル（またはＭ）の単位を有する。親和性はまた、会合定数、ＫＡとして表すこともでき、これは、１／ＫＤに等しく、（モル／リットル）−１（またはＭ−１）の単位を有する。本明細書において、２つの分子の間の相互作用の安定性は、主に、それらの相互作用のＫＤ値により表されるであろう；関係ＫＡ＝１／ＫＤを考慮して、分子相互作用の強度をそのＫＤ値により特定することは、対応するＫＡ値を計算するためにも用いることができることは、当業者には明らかである。ＫＤ値は、分子相互作用の強度を、熱力学的な意味においてもまた特徴づける。なぜならば、それは、周知の関係ＤＧ＝ＲＴ．ｌｎ（ＫＤ）（同等にＤＧ＝−ＲＴ．ｌｎ（ＫＡ））による結合の自由エネルギー（ＤＧ）の変化に関係するからであり、ここで、Ｒは、気体定数に等しく、Ｔは、絶対温度に等しく、ｌｎは、自然対数を表す。
有意義（例えば特異的）であるとみなされる生物学的相互作用についてのＫＤは、典型的には、１０−１２Ｍ（０．００１ｎＭ）〜１０−５Ｍ（１００００ｎＭ）の範囲である。相互作用が強力であるほど、そのＫＤは弱い。
【００７９】
ＫＤはまた、ｋｏｆｆとして表される複合体の解離速度定数の、ｋｏｎとして表されるその会合の速度に対する比としても表すことができる（したがって、ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎおよびＫＡ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）。オフ速度ｋｏｆｆは、単位ｓ−１を有する（ここで、ｓは、秒のＳＩ単位表示法である）。オン速度ｋｏｎは、単位Ｍ−１ｓ−１を有する。オン速度は、１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１で変化し得、二分子相互作用についての拡散により限定される会合速度定数に近づく。オフ速度は、関係ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｏｆｆにより、所与の分子相互作用の半減期に関係する。オフ速度は、１０−６ｓ−１（複数の日にわたるｔ１／２を有する不可逆的な複合体に近い）〜１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）で変化し得る。
【００８０】
ＩＳＶＤなどの抗原結合タンパク質の抗原または抗原決定基への特異的結合は、それ自体公知の任意の好適な様式において決定することができ、これは、例えば、飽和結合アッセイおよび／または競合的結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）およびサンドウィッチ競合アッセイ、および当該分野においてそれ自体公知のこれらの様々なバリアント；ならびに本明細書において記述される他の技術を含む。
【００８１】
２つの分子の間の分子相互作用の親和性は、それ自体公知の様々な技術、例えば、周知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー技術（例えば、Ober et al. 2001, Intern. Immunology 13: 1551-1559を参照）を介して測定することができ、ここで、一方の分子をバイオセンサーチップ上に固定して、他方の分子を、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ、ひいてはＫＤ（またはＫＡ）値の測定を得られるフロー条件下において、固定された分子の上を通過させる。これは、例えば、周知のBIACORE（登録商標）装置（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden）を用いて行うことができる。Kinetic Exclusionアッセイ（KINEXA（登録商標））（Drake et al. 2004, Analytical Biochemistry 328: 35-43）は、結合パートナーの標識を行うことなく、溶液中の結合イベントを測定し、複合体の解離を動力学的に排除することに基づく。溶液中での親和性分析はまた、自動化生体分析および迅速な試料のターンアラウンドのためのプラットフォームを提供する（Fraley et al. 2013, Bioanalysis 5: 1765-74）GYROLAB（登録商標）イムノアッセイ系、たはＥＬＩＳＡを用いて行うことができる。
【００８２】
測定プロセスが何らかの形で、例えば一方の分子のバイオセンサー上でのコーティングに関連するアーチファクトにより、示唆される分子の固有の結合親和性に影響を及ぼす場合、測定されたＫＤが、見かけのＫＤに対応し得ることは、当業者には明らかであろう。また、一方の分子が、他方の分子に対する１つより多くの認識部位を含む場合見かけのＫＤが、測定され得る。かかる状況においては、測定された親和性は、２つの分子による相互作用のアビディティにより、影響を及ぼされ得る。特に、ＫＤの正確な測定は、非常に労働集約的であり得、したがって、しばしば、見かけのＫＤ値が、２つの分子の結合強度を評価するために決定される。全ての測定が一貫した方法において（例えばアッセイ条件を普遍に保って）なされる限り、見かけのＫＤ測定を、真のＫＤの近似として用いることができることに注意すべきであり、したがって、本文書において、ＫＤおよび見かけのＫＤは、等しい重要性または関連性をもって扱われるべきである。
【００８３】
「特異性」という用語は、特定の抗原結合性分子または抗原結合性タンパク質（例えば本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチド）分子が結合できる、様々なタイプの抗原または抗原決定基の数のことを指す。抗原結合性タンパク質の特異性は、例えば、ＷＯ  ０８／０２００７９号（本明細書において参考として援用される）の５３〜５６頁に記載されるように、親和性および／またはアビディティに基づいて決定することができ、また同文献は、（本発明のポリペプチドまたはＩＳＶＤなどの）抗原結合性分子と該当する抗原との間の結合を測定するための幾つかの好ましい技術を記載している。典型的には、抗原結合性タンパク質（例えば本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチド）は、１０−５〜１０−１２ｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは１０−７〜１０−１２ｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは１０−８〜１０−１２ｍｏｌ／Ｌの解離定数（ＫＤ）で（すなわち、１０５〜１０１２Ｌ／ｍｏｌ以上、好ましくは１０７〜１０１２Ｌ／ｍｏｌ以上、より好ましくは１０８〜１０１２Ｌ／ｍｏｌの会合定数（ＫＡ）により）それらの抗原と結合する。１０−４ｍｏｌ／Ｌ超のいかなるＫＤ値（または１０４Ｍ−１リットル／ｍｏｌより低いいかなるＫＡ値）は一般的に、非特異的結合を示すものとして考えられる。好ましくは、本発明の一価のＩＳＶＤは、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満（例えば１０〜５ｎＭの間、またはそれ以下）、例えば５００ｐＭ未満、例えば１０〜５ｐＭまたは５ｐＭ未満などの親和性で所望の抗原と結合する。ＷＯ  ０８／０２００７９号の５３〜５６頁のパラグラフｎ）についてもまた参照がなされる。
【００８４】
ＩＳＶおよび／またはポリペプチドが、第２の標的または抗原に結合する場合の親和性よりも、少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、および好ましくは少なくとも１０００倍、またはそれより良好な親和性（上記のとおりであり、ＫＤ値、ＫＡ値、Ｋｏｆｆ速度および／またはＫｏｎ速度として好適に表される）により第１の抗原に結合する場合に、当該ＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドは、別の（第２の）標的または抗原と比較して、（第１の）標的または抗原に「対して特異的である」と言われる。例えば、ＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドは、当該ＩＳＶおよび／またはポリペプチドが第２の標的または抗原に結合する場合のＫＤよりも、少なくとも１０倍低い、例えば少なくとも１００倍低い、および好ましくは少なくとも１０００倍低いか、またはさらに低いＫＤ値で、第１の標的または抗原に結合してもよい。好ましくは、ＩＳＶおよび／またはポリペプチドが、第２の標的または抗原と比較して第１の標的または抗原に「対して特異的である」場合、それは、（本明細書において定義されるとおり）前記第１の標的または抗原に対して向けられているが、前記第２の標的または抗原に対しては向けられていない。
【００８５】
抗原または抗原決定基に対する抗原結合タンパク質の特異的結合は、それ自体公知の任意の好適な様式において決定することができ、これは、例えば、飽和結合アッセイおよび／または競合的結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）および当該分野において公知のそれらの様々なバリアント；ならびに本明細書において記述される他の技術を含む。
【００８６】
親和性を評価するために用いることができる好ましいアプローチは、Friguet et al. 1985（J. Immunol. Methods 77: 305-19）の２ステップＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）の手法である。この方法は、溶液相での結合平衡の測定を確立し、プラスチックなどの支持体上の分子のうちの１つの吸着に関連して起こり得るアーチファクトを回避する。当業者には明らかであろうとおり、解離定数は、実際の解離定数であっても見かけの解離定数であってもよい。解離定数を決定するための方法は、当業者には明らかであり、例えば、ＷＯ  ０８／０２００７９の５３〜５６頁において記述される技術を含む。
【００８７】
最後に、多くの状況において、経験を積んだ科学者は、いくつかの参照分子と比較して結合親和性を決定することが好都合であると判断し得ることに、注意すべきである。例えば、分子ＡとＢとの間の結合強度を評価するために、例えば、Ｂに結合することが知られており、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）または他の形式における容易な検出のために（蛍光検出のためのフルオロフォア、光吸収検出のための発色団、ストレプトアビジン媒介性ＥＬＩＳＡ検出のためのビオチン）、フルオロフォアまたは発色団基またはビオチンなどの他の化学部分により好適に標識される、参照分子Ｃを用いる。典型的には、参照分子Ｃは、固定された濃度に保たれ、Ａの濃度は、所与の濃度またはＢの量に対して変化する。結果として、ＩＣ５０値は、Ａの不在下においてＣについて測定されるシグナルが半減するＡの濃度に対応して得られる。参照分子のＫＤであるＫＤｒｅｆならびに参照分子の総濃度ｃｒｅｆが既知であることを前提として、相互作用Ａ−Ｂについての見かけのＫＤは、以下の式：ＫＤ＝ＩＣ５０／（１＋ｃｒｅｆ／ＫＤｒｅｆ）から得ることができる。ｃｒｅｆ＜＜ＫＤｒｅｆである場合、ＫＤ≒ＩＣ５０であることに注意する。ＩＣ５０の測定が比較される結合剤に対して一貫した方法において（例えば固定されたｃｒｅｆを保って）行われることを前提として、分子相互作用の強度または安定性の相違は、ＩＣ５０を比較することにより評価することができ、この測定は、本文書全体にわたり、ＫＤと、または見かけのＫＤと等しいものとして判断される。
【００８８】
最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）はまた、生物学的または生化学的機能を阻害することにおける化合物の有効性、例えば薬理学的効果の測定であってもよい。この定量的測定は、所与の生物学的プロセス（またはプロセスの構成成分、すなわち、酵素、細胞、細胞受容体、走化性、退形成、転移、侵襲性など）を、半分まで阻害するために必要とされる、ポリペプチドまたはＩＳＶ（例えばナノボディ）の量を示す。言い換えれば、それは、ある物質の最大半量（５０％）阻害濃度（ＩＣ）（５０％ＩＣまたはＩＣ５０）である。本発明のポリペプチドまたはＩＳＶ（例えばナノボディ）などの所与のアンタゴニストについてのＩＣ５０値は、アゴニストの最大生物学的応答の半量を阻害するために必要とされる濃度を決定することにより、計算することができる。ある薬物のＫＤは、用量応答曲線を構築し、様々な濃度のアンタゴニスト（本発明のポリペプチドまたはＩＳＶ（例えばナノボディ）など）の効果（例えばアゴニスト活性を逆転させることにおける）を試験することにより、計算することができる。
【００８９】
最大半量有効濃度（ＥＣ５０）という用語は、特定された暴露時間の後で基線と最大値との間の半量の応答を誘導する化合物の濃度を指す。本発明に関して、それは、ポリペプチド、ＩＳＶ（例えばナノボディ）の効力の尺度として用いられる。計量的な用量応答曲線のＥＣ５０は、その最大効果の５０％が観察される化合物の濃度を表す。濃度は、好ましくは、モル濃度単位において表される。
【００９０】
生物学的系において、リガンド濃度の小さな変化は、典型的には、応答の迅速な変化と、その後のシグモイド関数をもたらす。リガンド濃度の増大に伴う応答の増大が緩慢になる屈曲点が、ＥＣ５０である。このことは、最良適合（best-fit）線の偏差により数学的に決定することができる。推定のためにグラフに依存することは、ほとんどの場合において好都合である。ＥＣ５０が例のセクションにおいて提供される場合、実験は、可能な限り正確なＫＤを反映するように設計した。言い換えると、ＥＣ５０値は、従って、ＫＤ値としてみなすことができる。用語「平均ＫＤ」は、少なくとも１回の実験、しかし好ましくは１より多く、例えば少なくとも２回の実験において得られる平均ＫＤ値に関する。用語「平均」とは、数学用語である「平均」（データの和を、データ中の項目の数により除算したもの）を指す。
【００９１】
それはまた、化合物のその阻害の尺度であるＩＣ５０（５０％阻害）に関する。競合結合アッセイおよび機能的アンタゴニストアッセイについて、ＩＣ５０は、用量応答曲線の最も一般的な要約的尺度である。アゴニスト／刺激因子アッセイについて、最も一般的な要約的尺度は、ＥＣ５０である。
【００９２】
阻害定数（Ｋｉ）は、阻害剤がどの程度強力であるかの指標である；それは、最大半量の阻害をもたらすために必要とされる濃度である。実験条件に依存して変化し得るＩＣ５０とは異なり、Ｋｉは、しばしば、薬物の阻害定数と称される。阻害定数Ｋｉは、Cheng-Prusoff等式：
【数１】
2020522515.tif 000002
を用いて計算することができ、ここで、［Ｌ］は、固定されたリガンドの濃度である。
【００９３】
ＩＳＶおよび／またはポリペプチドは、（上記のＫＤ値、ＫＡ値、Ｋｏｆｆ速度および／またはＫｏｎ速度として好適に表した場合に）ＩＳＶおよび／またはポリペプチドが第２の標的または抗原と結合する場合と比較し、少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍以上の親和性で、第１の抗原と結合するとき、別の（第２の）標的または抗原よりも第１の標的または抗原に「特異的である」ものとする。例えば、ＩＳＶおよび／またはポリペプチドは、前記ＩＳＶおよび／またはポリペプチドが第２の標的または抗原と結合する場合と比較し、少なくとも１０倍低いＫＤ値、例えば少なくとも１００倍低い、好ましくは少なくとも１０００倍低い、またはさらにはそれより低いＫＤ値で、第１の標的または抗原に結合しうる。好ましくは、ＩＳＶおよび／またはポリペプチドが、第２の標的または抗原と比較し第１の標的または抗原に「特異的である」というときは、それらが（本明細書で定義されるように）前記第１の標的または抗原に対するものであるが、前記第２の標的または抗原に対するものではないことをいう。
【００９４】
本明細書において交換可能に用いられる「（交差）ブロッキングする」、「（交差）ブロッキングされた」、「（交差）ブロッキング」、「競合的結合」、「（交差）競合する」および「（交差）競合すること」および「（交差）競合」の用語は、免疫グロブリン、抗体、ＩＳＶ、ポリペプチドまたは他の結合剤による、他の免疫グロブリン、抗体、ＩＳＶ、ポリペプチドまたは結合剤による所定の標的への結合を妨げる能力を意味する。免疫グロブリン、抗体、ＩＳＶ、ポリペプチドまたは他の結合剤が、別のものの標的への結合を妨げることを可能にする程度、すなわち、本発明における交差ブロッキングをしうるか否かは、例えば競合ＥＬＩＳＡにおいてファージ上にディスプレイされたＩＳＶＤに対して精製されたＩＳＶＤのスクリーニングを行うなどの、競合的結合アッセイを用いて決定でき、これは、当該分野において一般的である。特に好適な定量的交差ブロッキングアッセイとして、細胞上で発現されたアグリカンによる、ＥＬＩＳＡおよび蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）結合アッセイが挙げられる。ＦＡＣＳのセットアップにおいて、（低下した）チャネル蛍光により（交差）ブロッキングの程度を測定することができる。
【００９５】
標的に対して向けられた免疫グロブリン、抗体、ＩＳＶ、ポリペプチドまたは他の結合剤が、本明細書において定義されるように、（交差）ブロッキングするか否か、（交差）ブロッキングことができるか否か、競合的に結合するか否か、または（交差）競合的であるか否かを決定するための方法は、例えば、Xiao-Chi Jiaら（Journal of Immunological Methods 288: 91-98, 2004）、Miller ら（Journal of Immunological Methods 365: 118-125, 2011）において記載されるか、および／または本明細書において記載される方法である（例えば、例２．３を参照）。
【００９６】
アミノ酸配列は、２つの異なる抗原または抗原決定基（例えば、哺乳動物の異なる種からのアグリカンなど、例えば、ヒトアグリカン、イヌアグリカン、ウシアグリカン、ラットアグリカン、ブタアグリカン、マウスアグリカン、ウサギアグリカン、カニクイザルアグリカン、および／またはアカゲザルアグリカンなど）に対して、これらの異なる抗原または抗原決定基について（本明細書において定義されるとおり）特異的である場合に、「交差反応性」であると言われる。
【００９７】
本発明に関して、「調節すること（modulating）」または「調節する（to modulate）」とは、一般に、好適なin vitro、細胞、ex vivoまたはin vivoアッセイ（本明細書において記述されるものなど）を用いて測定した場合に、本発明のＩＳＶ、ポリペプチドまたはコンストラクトにより、セリンプロテアーゼファミリーのメンバー、カテプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）／マトリキシンまたはA Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs（ＡＤＡＭＴＳ）、好ましくはＭＭＰ８、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＡＤＡＭＴＳ５（アグリカナーゼ−２）、ＡＤＡＭＴＳ４（アグリカナーゼ−１）、ＡＤＡＭＴＳ１１および／または炎症促進性サイトカイン（例えば、インターロイキン−１αおよび−β、インターロイキン−６およびＴＮＦ−αなど）の活性を、低下させるかまたはこれを阻害することを意味する。特に、「調節すること」または「調節する」とは、好適なin vitro、細胞、ex vivoまたはin vivoアッセイ（本明細書において記述されるものなど）を用いて測定した場合に、前述のメンバーの活性を、同じアッセイにおける、本発明の免疫グロブリンまたはポリペプチドの存在を伴わないことを除いては同じ条件下における、前述のメンバーの活性と比較して、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、または少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または９０％、またはそれより多く低下させるかまたはこれを阻害することを意味していてもよい。
【００９８】
本発明に関して、「増強すること（enhancing）」または「増強する（to enhance）」とは、一般に、好適なin vitro、細胞、ex vivoまたはin vivoアッセイ（本明細書において記述されるものなど）を用いて測定した場合に、本発明のポリペプチドまたはコンストラクトの活性を増大するか、増強するか、またはこれを刺激することを意味する。特に、好適なin vitro、細胞、ex vivoまたはin vivoアッセイ（本明細書において記述されるものなど）を用いて測定した場合に、本発明のポリペプチドまたはコンストラクトの活性を、アグリカン結合剤（例えば本発明のアグリカンに結合するＩＳＶ）の存在を伴わないことを除いては同じ条件下における同じアッセイにおけるコンストラクトまたはポリペプチドの活性と比較して、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれより多く、例えば１００％などに、増大または増強することを意味する。
【００９９】
２つの化合物の「相乗効果」とは、２つの剤の組み合わせの効果が、それらの個々の効果の和よりも大きいものであり、好ましくは、対照の薬物および単一の薬物とは、統計学的に異なる。
【０１００】
本発明のＩＳＶまたはポリペプチドの「効力」という用語は、本明細書において用いられる場合、その特異的効果、例えば軟骨への浸透、アグリカンへの特異的結合、および／または軟骨保持などが生じるために必要とされる、本発明のＩＳＶまたはポリペプチドの量の関数である。それは、例のセクションにおいて用いられる場合、例えば当業者には公知の方法により、簡易に測定することができる。
【０１０１】
対照的に、本発明のＩＳＶまたはポリペプチドの「有効性」は、ＩＳＶまたはポリペプチドの濃度を飽和させた時点において、それ自体の効果の最大強度を測定する。有効性は、本発明のＩＳＶまたはポリペプチドから達成することができる最大応答を示す。それは、ＩＳＶまたはポリペプチドが所望される（治療的）効果、例えば、アグリカンへの結合またはアグリカンに対する保持、および／またはＡＤＡＭＴＳファミリーメンバーまたはＭＭＰファミリーメンバーの活性を阻害することなど、を提供する能力を指す。
【０１０２】
本発明のポリペチドまたはコンストラクトの「半減期」は、例えば天然のメカニズムによるコンストラクトまたはポリペチドの分解および／またはコンストラクトまたはポリペチドのクリアランスもしくは隔離により、コンストラクトまたはポリペチドの血清中濃度がインビボにおいて５０％減少するのに要する時間のことを指す。例えば、ＷＯ  ０８／０２００７９号の５７ページのパラグラフｏ）を参照。本発明のコンストラクトまたはポリペプチドのインビボ半減期は、薬物動態学的分析など、自体公知のいかなる方法で決定してもよい。好適な方法は当業者に明らかであると考えられ、例えば一般的には、ＷＯ  ０８／０２００７９の５７頁のパラグラフｏ）に記載の方法であってもよい。ＷＯ  ０８／０２００７９の５７頁のパラグラフｏ）に記載のように、半減期は、ｔ１／２−α、ｔ１／２−βおよび曲線下面積（ＡＵＣ）などのパラメータを使用して表すことができる。参照として、例えば標準的なハンドブック、例えばKennethら（Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists, John Wiley & Sons Inc., 1986）、ならびにM GibaldiおよびD Perron（"Pharmacokinetics", Marcel Dekker, 2nd Rev. Edition, 1982）が挙げられる。用語「半減期の増加」または「増加した半減期」とは、例えば、ＷＯ  ０８／０２００７９の５７頁のパラグラフｏ）にも記載されるとおり、ｔ１／２−βの増加を指すが、ｔ１／２−αおよび／またはＡＵＣ、またはその両方の増加を伴っても伴わなくともよい。
【０１０３】
特に明記しない限り、用語「免疫グロブリン」および「免疫グロブリン配列」は、本明細書において、重鎖抗体または従来の４鎖型抗体のいずれを指すものとして用いられるときでも、フルサイズの抗体、その個々の鎖、ならびにその全ての部分、ドメインまたは断片（限定されないが、抗原結合性ドメインまたは断片（例えばそれぞれＶＨＨドメインまたはＶＨ／ＶＬドメイン）を含む）を包含する一般的な用語として用いられる。
【０１０４】
本明細書で用いられる（ポリペプチドまたはタンパク質の）「ドメイン」なる用語は、残りのタンパク質とは独立に、その三次構造を保持する能力を有する、フォールディングされたタンパク質構造を意味する。一般的に、ドメインは、タンパク質の個別の機能特性を担い、多くの場合、タンパク質の残りの部分および／またはドメインの機能の損失なしに、他のタンパク質へ追加もしくは移動させることができ、またはそこから除去することができる。
【０１０５】
本明細書で用いられる「免疫グロブリンドメイン」という用語は、抗体鎖（例えば従来の４鎖型抗体の、または重鎖抗体の鎖など）の球状領域を、または、本質的に、かかる球状領域からなるポリペプチドを指す。免疫グロブリンドメインは、それらが抗体分子に特徴的な、約７つの逆平行β鎖が２つのβシートとして配列した２層サンドイッチからなり、任意に保存されたジスルフィド結合によって安定化された免疫グロブリンの折り畳み構造を保持していることを特徴とする。
【０１０６】
本明細書中で使用される用語「免疫グロブリン可変ドメイン」とは、当該技術分野および本明細書の下記において、「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」、および「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」とそれぞれ称される４つの「フレームワーク領域」から本質的になる、免疫グロブリンドメインを意味し、前記フレームワーク領域は、３つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」により中断され、それらは、当該技術分野および本明細書の下記において、「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」、および「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」とそれぞれ称される。このように、免疫グロブリン可変ドメインの一般構造または配列は、以下の通り示すことができる：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。抗原結合部位、特にＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を有することによって抗体に抗原に対する特異性を付与するのが、免疫グロブリン可変ドメイン（単数または複数）である。
【０１０７】
「単一可変ドメイン」と交換可能に用いられる「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（「ＩＳＶ」または「ＩＳＶＤ」）という用語は、抗原結合部位が単一の免疫グロブリンドメインに存在し、またそれにより形成される分子として定義される。これにより、ＩＳＶが、２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインが相互作用して抗原結合部位を形成する「従来型の」免疫グロブリンまたはそれらの断片とは別のものとなる。典型的には、従来型の免疫グロブリンでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が相互作用して抗原結合部位を形成する。この場合、ＶＨおよびＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）が、抗原結合部位に寄与しており、すなわち合計６つのＣＤＲが抗原結合部位の形成に関与している。
【０１０８】
上記の定義を考慮すると、従来の４鎖型抗体（当分野において公知の、例えば免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＤまたは免疫グロブリンＥ分子）の抗原結合性ドメイン、またはＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合されたＦｖまたはｓｃＦｖ断片などのＦｖ断片の抗原結合性ドメイン、またはかかる従来型の４鎖型抗体に由来するｄｉａｂｏｄｙ（いずれも公知）の抗原結合性ドメインは、通常、これらの場合、抗原の各エピトープへの結合が、通常、１つの（単一の）免疫グロブリンドメインのみでは起こらず、例えば軽鎖および重鎖可変ドメインによる一対の（会合している）免疫グロブリンドメインによって、すなわち免疫グロブリンドメインのＶＨ−ＶＬによって、はじめて各抗原のエピトープと共同で結合するため、ＩＳＶとは考えない。
【０１０９】
これとは対照的に、ＩＳＶは、更なる免疫グロブリン可変ドメインとの組合せなしに抗原のエピトープと特異的に結合できる。ＩＳＶの結合部位は、単一のＶＨ／ＶＨＨまたはＶＬドメインにより形成される。ゆえに、ＩＳＶの抗原結合部位が、３つのＣＤＲのみにより形成される
【０１１０】
このように、単一可変ドメインは、それが単一の抗原結合単位（すなわち、単一の抗原結合性ドメインが他の可変ドメインと相互作用して機能的な抗原結合性単位を形成する必要がない、本質的に単一の可変ドメインからなる、機能的な抗原結合単位）を形成できる限り、軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）もしくは好適なその断片、または重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列またはＶＨＨ配列）もしくは好適なその断片、であってもよい。
【０１１１】
本発明の一態様において、ＩＳＶは、重鎖可変ドメイン配列（例えばＶＨ配列）であり、より具体的には、ＩＳＶは、従来の４鎖型抗体から誘導される重鎖可変ドメイン配列であるか、または重鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメイン配列であってもよい。
【０１１２】
例えば、ＩＳＶは、（単一）ドメイン抗体（もしくは（単一）ドメイン抗体としての使用に好適なアミノ酸）、（単一）ドメイン抗体としての使用に好適な免疫グロブリン、「ｄＡｂ」またはｓｄＡｂ、もしくはｄＡｂとしての使用に好適なアミノ酸、またはナノボディ（本明細書において定義され、ＶＨＨを含むがこれに限定されない）；ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、親和性成熟により得られたＶＨＨ配列、他の単一可変ドメイン、免疫グロブリン単一重鎖可変ドメイン、またはそれらのいかなる好適な断片、であってもよい。
【０１１３】
具体的には、ＩＳＶは、ナノボディ（Nanobody）（登録商標）（本明細書で定義される）またはその好適な断片であってもよい。なお、Nanobody（登録商標）およびNanobodies（登録商標）はAblynx N.V.社の登録商標である。ナノボディの一般的説明については、下のさらなる記載、また、例えば本明細書で引用するＷＯ  ０８／０２００７９（１６頁）に記載の従来技術をさらに参照してもよい。
【０１１４】
「ＶＨＨドメイン」（別名、ＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体断片およびＶＨＨ抗体）は、元々は「重鎖抗体」（すなわち「軽鎖欠損抗体」、Hamers-Casterman et al. Nature 363: 446-448, 1993）の抗原結合性免疫グロブリン（可変）ドメインとして記載されたものである。「ＶＨＨドメイン」という用語は、これらの可変ドメインを、従来の４鎖型抗体に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書において「ＶＨドメイン」または「ＶＨドメイン」と称される）から、および従来の４鎖型抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書において「ＶＬドメイン」または「ＶＬドメイン」と称される）から、区別するために選ばれたものである。ＶＨＨおよびナノボディの更なる説明に関する参照としては、例えば、Muyldermansのレビュー（Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001）、ならびに背景技術においても言及した以下の特許出願：Vrije Universiteit BrusselのＷＯ  ９４／０４６７８、ＷＯ  ９５／０４０７９およびＷＯ  ９６／３４１０３；UnileverのＷＯ  ９４／２５５９１、ＷＯ  ９９／３７６８１、ＷＯ  ００／４０９６８、ＷＯ  ００／４３５０７、ＷＯ  ００／６５０５７、ＷＯ  ０１／４０３１０、ＷＯ  ０１／４４３０１、ＥＰ  １１３４２３１およびＷＯ  ０２／４８１９３；Vlaams Instituut voor Biotechnologie（VIB）のＷＯ  ９７／４９８０５、ＷＯ  ０１／２１８１７、ＷＯ  ０３／０３５６９４、ＷＯ  ０３／０５４０１６およびＷＯ  ０３／０５５５２７；Algonomics N.VおよびAblynx N.V.のＷＯ  ０３／０５０５３１；カナダ国立研究会議（National Research Council of Canada）によるＷＯ  ０１／９０１９０；Institute of AntibodiesによるＷＯ  ０３／０２５０２０（＝ＥＰ  １４３３７９３）、ならびにAblynx N.V.によるＷＯ  ０４／０４１８６７、ＷＯ  ０４／０４１８６２、ＷＯ  ０４／０４１８６５、ＷＯ  ０４／０４１８６３、ＷＯ  ０４／０６２５５１、ＷＯ  ０５／０４４８５８、ＷＯ  ０６／４０１５３、ＷＯ  ０６／０７９３７２、ＷＯ  ０６／１２２７８６、ＷＯ  ０６／１２２７８７およびＷＯ  ０６／１２２８２５、およびAblynx N.V.によるさらなる公開特許出願が挙げられる。これらの出願に記載の更なる従来技術、特に国際公開第０６／０４０１５３号の４１〜４３頁に記載の参照文献リストを参照してもよく、当該リストおよび参照文献は、参照により本明細書に援用される。これらの参照文献に記載のように、ＩＳＶ、ナノボディ（特にＶＨＨ配列および部分的にヒト化したナノボディ）は、特に１つ以上のフレームワーク配列に存在する、１つ以上の「ホールマーク残基」の存在により特徴づけることができる。ＩＳＶ、ナノボディに関する更なる説明、具体的にはナノボディのヒト化および／またはラクダ化、ならびに他の修飾、部分または断片、誘導体または「ナノボディ融合体」、多価構築物（幾つかのリンカー配列に関する非限定的な例を包含する）、ならびに、ＩＳＶ、ナノボディの半減期を増加させる異なる修飾およびそれらの調製、については、例えばＷＯ  ０８／１０１９８５およびＷＯ  ０８／１４２１６４に記載されている。ナノボディの更なる一般的説明についての参照として、例えば本明細書において引用する、ＷＯ  ０８／０２００７９（１６頁）に記載の従来技術が挙げられる。
【０１１５】
「ドメイン抗体」（また、「Ｄａｂ」（単数または複数）、「ドメイン抗体」および「ｄＡｂ」としても公知、「ドメイン抗体」および「ｄＡｂ」の語は、GlaxoSmithKline社のグループの商標として使用されている）は、例えばＥＰ  ０３６８６８４、Ward et al.（Nature 341: 544-546, 1989）、Holt et al.（Tends in Biotechnology 21: 484-490, 2003）、およＷＯ  ０４／０６８８２０、ならびにＤｏｍａｎｔｉｓ社のＷＯ  ０６／０３０２２０、ＷＯ  ０６／００３３８８およびＷＯ  ０３／００２６０９および他の公開された特許出願に記載されている。ドメイン抗体は、本質的に、非ラクダ科の哺乳動物の、特にヒト４鎖型抗体のＶＨまたはＶＬドメインに対応する。単一の抗原結合性ドメインとして（すなわち、ＶＬまたはＶＨドメインの各々との対によってではなく）エピトープに結合させるためには、例えばヒトの単一ＶＨまたはＶＬドメイン配列のライブラリーを用いて、かかる抗原結合性に関する具体的な選抜を行う必要がある。ドメイン抗体は、ＶＨＨと同様、約１３〜約１６ｋＤａの分子量を有し、完全にヒト配列に由来する場合、例えばヒトの治療的使用のためのヒト化を必要としない。
【０１１６】
なお、哺乳類の起源でないため、本発明の文脈においては好ましさが低いが、単一可変ドメインを特定のサメの種由来のものとしてもよいことに留意すべきである（例えば、いわゆる「ＩｇＮＡＲドメイン」、ＷＯ０５／１８６２９を参照）。
【０１１７】
そのように、本発明の意味においては、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」または「単一可変ドメイン」という用語には、ヒト以外の給源の、好ましくはラクダ科の動物を給源とし、好ましくはラクダ科動物の重鎖抗体から誘導されるポリペプチドが含まれる。前述したように、それらはヒト化してもよい。さらに、当該用語は非ラクダ科動物（例えばマウスまたはヒト）を給源とし、それを、例えばDavies and Riechmann（FEBS 339: 285-290, 1994；Biotechnol. 13: 475-479, 1995；Prot. Eng. 9: 531-537, 1996）およびRiechmann and Muyldermans（J. Immunol. Methods 231 : 25-38, 1999）に記載のように「ラクダ化」した誘導ポリペプチドを含んでもよい。
【０１１８】
ＶＨＨドメインのアミノ酸残基は、Riechmann and Muyldermans（J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999）の図２に示すようなラクダ科動物由来のＶＨＨドメインへの適用と同様、Kabatら（"Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91）で示されるＶＨドメインに関する一般的な番号づけに従い付番される。ＶＨドメインのアミノ酸残基に番号づけするための代替法であって、ＶＨＨドメインにも同様に適用できる方法も当分野において公知である。しかしながら、本願の明細書、特許請求の範囲および図面では、特に明記しない限り、上記の通りＶＨＨドメインに適用されるKabat番号づけに従い行う。
【０１１９】
留意点としては、ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインに関して当分野で周知であるが、各ＣＤＲのアミノ酸残基の総数は変動しうるものであり、Kabat番号づけにより示されるアミノ酸残基の総数と対応しえないということである（すなわち、Kabat番号づけに従う１つ以上の位置が、実際の配列中に存在しないか、または、実際の配列が、Kabat番号づけから考えられる数より多くのアミノ酸残基を含む場合がありうる）。これは、一般的にはKabat番号づけが実際の配列中のアミノ酸残基の実際の番号づけに対応する場合も、また対応しない場合もあることを意味する。ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインのアミノ酸残基の総数は、通常１１０〜１２０の範囲、多くの場合１１２〜１１５の間の範囲である。しかしながら、より短いおよびより長い配列も、本明細書に記載される目的に適しうる点に留意すべきである。
【０１２０】
ＣＤＲ領域の決定は、様々な方法に従い実施できる。Kabatに従うＣＤＲの決定においては、ＶＨＨのＦＲ１が、位置１〜３０のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ１が、位置３１〜３５のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ２が、位置３６〜４９のアミノ酸を含み、ＶＨＨのＣＤＲ２が、位置５０〜６５のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ３が、位置６６〜９４のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ３が、位置９５〜１０２のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ４が、位置１０３〜１１３のアミノ酸残基を含む。
【０１２１】
しかしながら、本願においては、ＣＤＲ配列はKontermann and Dubel（Eds., Antibody Engineering, vol 2, Springer Verlag Heidelberg Berlin, Martin, Chapter 3, pp. 33-51, 2010）に従い決定されたものである。この方法によれば、ＦＲ１は位置１〜２５のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ１は位置２６〜３５のアミノ酸残基を含み、ＦＲ２は位置３６〜４９のアミノ酸を含み、ＣＤＲ２は位置５０〜５８のアミノ酸残基を含み、ＦＲ３は位置５９〜９４のアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ３は位置９５〜１０２のアミノ酸残基を含み、ＦＲ４は位置１０３〜１１３（Kabat番号づけに従う）のアミノ酸残基を含む。
【０１２２】
ドメイン抗体およびナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などのＩＳＶは、ヒト化することができる。具体的には、ナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などのヒト化された免疫グロブリン単一可変ドメインは、以前の段落で一般的に定義される免疫グロブリン単一可変ドメインであってもよいが、（本明細書で定義される）ヒト化置換であり、および／または、それに対応する少なくとも１つのアミノ酸残基（具体的には少なくとも１つのフレームワーク残基）が存在するものである。潜在的に有用なヒト化置換は、天然のＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を１つ以上の密接に関連するヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較し、その後、このように決定される１つ以上の潜在的に有用なヒト化置換（またはそれらの組み合わせ）を、本明細書に記載のいずれかの自体公知の方法に従い、前記ＶＨＨ配列中に導入し、得られるヒト化ＶＨＨ配列を、標的との親和性に関して、安定性に関して、発現の容易性およびレベルに関して、および／または、他の目的の特性に関して試験することにより、確認できる。このようにして、試行錯誤を減少させつつ、他の適切なヒト化置換（またはその好適な組合せ）を、本明細書の開示に基づき当業者が決定できる。また、前記に基づいて、免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）（のフレームワーク領域）を、部分的にヒト化でき、または完全にヒト化できる。
【０１２３】
１つ以上のＣＤＲのアミノ酸配列内に１つ以上の変異を導入することによって、ＩＳＶ、例えばドメイン抗体およびナノボディ（ＶＨＨドメインおよびヒト化されたＶＨＨドメインを含む）を親和性成熟させることもでき、かかる変異により、それぞれの親分子と比較し、得られる免疫グロブリン単一可変ドメインの各抗原に対する親和性が改善される。本発明の親和性成熟された免疫グロブリン単一可変ドメイン分子は、公知技術の方法により、例えば、Marks et al. （Biotechnology 10:779-783, 1992）、Barbas, et al.（Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813, 1994）、Shier et al.（Gene 169: 147-155, 1995）、Yelton et al.（Immunol. 155: 1994-2004, 1995）、Jackson et al.（J. Immunol. 154: 3310-9, 1995）、Hawkins et al.（J. Mol. Biol. 226: 889 896, 1992）、Johnson and Hawkins（Affinity maturation of antibodies using phage display, Oxford University Press, 1996）の記載に基づき調製できる。
【０１２４】
ＩＳＶ（例えばドメイン抗体またはナノボディ）を出発物質としてポリペプチドを設計／選抜および／または調製するプロセスは、本明細書において、前記ＩＳＶを「フォーマット化する」ともまた称され、ポリペプチドの一部を構成するＩＳＶは、「フォーマット化された」または「フォーマットされた形の」ポリペプチドであると言われる。ＩＳＶをフォーマット化できる方法の例、およびかかるフォーマットの例は、本明細書の開示に基づき当業者に自明であり、かかるフォーマット化されたＩＳＶは、本発明の更なる側面を構成する。
【０１２５】
例えば、限定されないが、１つ以上のＩＳＶを、ポリペプチドの調製用の「結合単位」、「結合ドメイン」または「ビルディングブロック」（これらの用語は交換可能に用いられる）として用いることができ、それらは任意に、（すなわち、アグリカン上の同一または他のエピトープに対する、および／またはアグリカン以外の１つ以上の他の抗原、タンパク質または標的に対する）結合単位として有用な１つ以上の更なるＩＳＶを含んでもよい。
【０１２６】
本発明は、アグリカンに対する特異性を有するか、および／またはアグリカンに結合する、アグリカン結合剤、例えばＩＳＶ（本明細書において「本発明のＩＳＶ」ともまた称される）および／またはポリペプチド（本明細書において「本発明のポリペプチド」ともまた称される）を提供する。
アグリカンはまた、アグリカン１、ＡＣＡＮ、ＡＧＣ１、ＡＧＣＡＮ、ＣＳＰＧＣＰ、ＭＳＫ１６、ＳＥＤＫ、軟骨特異的プロテオグリカンコアタンパク質（ＣＳＰＣＰ）またはコンドロイチン硫酸プロテオグリカン１（ＣＳＰＧ１）として知られる。アグリカンは、ヒトにおいては、染色体Ｃｈｒ１５：ｑ２６．１に位置するＡＣＡＮ遺伝子によりコードされる。
【０１２７】
アグリカンは、大きな多モジュール分子（２３１７アミノ酸）である。そのコアタンパク質は、３つの球状ドメイン（Ｇ１、Ｇ２およびＧ３）、ならびに、多数のＮ結合型オリゴ糖およびコンドロイチン硫酸鎖およびケラタン硫酸鎖が付加されるＧ２とＧ３との間の大きな伸展した領域からなる。アグリカンは、関節軟骨における主要なプロテオグリカンである。それは、軟骨に過重負荷特性を与えるヒアルロナンおよび連結タンパク質とのその相互作用を通して、含水ゲル構造を提供することにより、関節軟骨の正しい機能において重要な役割を果たす。Ｇ１ドメインは、ヒアルロナン酸および連結タンパク質と相互作用し、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）において安定な三元複合体を形成する。Ｇ２ドメインは、Ｇ１のタンデムリピートおよび連結タンパク質に相同であり、生成物のプロセッシングに関与する。Ｇ３は、コアタンパク質のカルボキシル末端を構成し、グリコサミノグリカン修飾および生成物の分泌を増強する。また、Ｇ３ドメインは、プロテオグリカン凝集物をＥＣＭタンパク質（フィビュリンおよびテネイシン）に連結する。アグリカンの分解は、Ｃ末端において開始されると考えられる。Ｇ３ドメインを有さないアグリカン分子の集団は、加齢と共に増加する。アグリカンは、ラミニン、フィブロネクチン、テネイシンおよびコラーゲンと相互作用するが、また、多様なA Disintegrin And Metalloprotease with Thrombo-spondin Motifs（ＡＤＡＭＴＳ）、例えばＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ５およびＡＤＡＭＴＳ１１、ならびにマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）例えばＭＭＰ８、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１９およびＭＭＰ２０の酵素的基質でもある。
【０１２８】
一側面において、本発明は、アグリカンに特異的に結合するＩＳＶおよびポリペプチドなどのアグリカン結合剤に関する。
本発明のアグリカン結合剤は、最終的に、ヒトにおける医薬としての使用のために意図される。したがって、一側面において、本発明は、ヒトアグリカン（配列番号１２５）に特異的に結合するアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよびポリペプチドに関する。
本発明者らは、高度に改善された種間交差反応性および精巧な選択性の特性を有するアグリカン結合剤を同定した。
【０１２９】
したがって、一側面において、本発明は、ＩＳＶまたはポリペプチドなどのアグリカン結合剤に関し、ここで、前記アグリカン結合剤は、ヒトアグリカン（Ｐ１６１１２；配列番号１２５）、イヌアグリカン（Ｑ２８３４３；配列番号１２６）、ウシアグリカン（Ｐ１３６０８；配列番号１２７）、ラットアグリカン（Ｐ０７８９７；配列番号１２８）；ブタアグリカン（コア；Ｑ２９０１１、配列番号１２９）；マウスアグリカン（Ｑ６１２８２；配列番号１３０）、ウサギアグリカン（Ｇ１Ｕ６７７−１；配列番号１３１）；カニクイザルアグリカン（ＸＰ＿００５５６０５１３．１；配列番号１３２）および／またはアカゲザルアグリカン（ＸＰ＿００２８０４９９０．１；配列番号１３３）に特異的に結合する（表Ｂを参照）。
【０１３０】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドが、先行技術の分子に対して、有利な特徴を有することを観察した；それらは、関節において安定であり、軟骨において長期間にわたり保持され、軟骨性組織に対して特異的であり、例えば、ニューロカン（Ｏ１４５９４、配列番号１３４）および／またはブレビカン（Ｑ９６ＧＷ７、配列番号１３５）（表Ｂを参照）には実質的に結合しない。
【０１３１】
したがって、一側面において、本発明は、ＩＳＶまたはポリペプチドなどのアグリカン結合剤に関し、ここで、前記アグリカン結合剤は、ニューロカン（Ｏ１４５９４、配列番号１３４）および／またはブレビカン（Ｑ９６ＧＷ７、配列番号１３５）に実質的に結合せず、好ましくはここで、前記アグリカンは、１０−５モル／リットルよりも高い、例えば１０−４モル／リットルのＫＤ値で、ニューロカンおよび／またはブレビカンに結合する。
【０１３２】
一側面において、本発明は、アグリカン結合剤アグリカンへの結合について、ニューロカンおよび／またはブレビカンよりも１０倍より高い、１００倍より高い、好ましくは１０００倍より高い選択性を有する、ＩＳＶなどのアグリカン結合剤に関する。
【０１３３】
好ましい本発明のアグリカン結合剤は、免疫グロブリン（例えば、重鎖抗体、従来の四鎖抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ分子など）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、例えばジスルフィド連結されたＦｖもしくはｓｃＦｖフラグメント、またはかかる従来の四鎖抗体から誘導されたダイアボディ、またはこれらの個々の鎖、ならびに全ての部分、ドメインまたはそのフラグメント（抗原結合ドメインまたはフラグメント、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインを含むが、これらに限定されない）、本発明の一価のポリペプチド、または他の結合剤）を含む。
【０１３４】
本発明のアグリカン結合剤は、唯一の例外を除き（表２．２を参照）、８を超えるｐＩを有することが観察された。理論により拘束されることなく、本発明者らは、アグリカンの高い正の電荷が、全部分の、すなわち、多重特異性ポリペプチドにおけるもののように別の構成要素にカップリングされた場合であっても、保持および軟骨浸透に影響を及ぼし得る、という仮説を立てた。したがって、本発明は、８より大きな、例えば８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０またはこれより大きな、例えば９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８または９．８ものｐＩを有する、アグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶ、ポリペプチドまたはコンストラクト、好ましくは本発明のＩＳＶに関する。
【０１３５】
本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドの、アグリカンへの結合は、当該分野において一般に公知の多様な結合アッセイにおいて測定することができる。典型的なアッセイとして（限定されることなく）、蛍光リガンド結合アッセイ、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、放射性リガンド結合アッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、プラズモン導波路共鳴（ＰＷＲ）、親和性に基づくバイオセンサーについてのＳＰＲイメージング、Whispering gallery型微小共振器（ＷＧＭ）、共鳴導波路格子（Resonant waveguide grating：ＲＷＧ）、Biolayer干渉バイオセンサー（Biolayer Interferometry Biosensor：ＢＩＢ）アッセイ、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、Ｘ線結晶解析、熱変性アッセイ（ＴＤＡ）、等温滴定カロリメトリー（ＩＴＣ）、ＥＬＩＳＡ、ならびに表面弾性波（Surface acoustic wave：ＳＡＷ）バイオセンサーおよびＲＷＧバイオセンサーアッセイなどのホールセルリガンド結合アッセイが挙げられる。本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドの、アグリカンへの結合を測定するための好ましいアッセイは、ＳＰＲ、例えば、例において記載されるようなＳＰＲなどであり、ここで、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドの、アグリカンへの結合を決定した。本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドの、アグリカンへの結合についてのいくつかの好ましいＫＤ値は、本明細書におけるさらなる説明および例から明らかとなるであろう。別の特に好ましいアッセイは、例において詳述されるようなＥＬＩＳＡである（例１．２および２．４を参照）。
【０１３６】
本発明のアグリカン結合剤のアグリカンへの結合はまた、好ましくはアグリカン標的の立体構造を保存す結合アッセイにおいて測定することができる。典型的なアッセイとして（限定されることなく）、アグリカンが細胞（例えばＣＨＯ細胞）表面上で暴露されるアッセイが挙げられる。
【０１３７】
本発明の態様において、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドは、前記アグリカンへの結合について、好ましくは表面プラズモン共鳴により測定される場合に、少なくとも約１０２Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０３Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０４Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０６Ｍ−１ｓ−１、１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０８Ｍ−１ｓ−１、少なくとも約１０９Ｍ−１ｓ−１、および少なくとも約１０１０Ｍ−１ｓ−１からなる群より選択される、オン速度定数（Ｋｏｎ）を有する。
【０１３８】
本発明の態様において、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドは、前記アグリカンへの結合について、好ましくは表面プラズモン共鳴により測定される場合に、約１０−３ｓ−１以下、約１０−４ｓ−１以下、約１０−５ｓ−１以下、約１０−６ｓ−１以下、約１０−７ｓ−１以下、約１０−８ｓ−１以下、約１０−９ｓ−１以下、および約１０−１０ｓ−１以下からなる群より選択される、オフ速度定数（Ｋｏｆｆ）を有する。
【０１３９】
本発明の態様において、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドは、１００ｎＭ〜１０ｐＭの平均ＫＤ値、例えば９０ｎＭ以下の平均ＫＤ値など、さらにより好ましくは８０ｎＭ以下、例えば７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５ｎＭ未満、またはさらにそれより低い、例えば４、３、２または１ｎＭ未満、例えば５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０ｐＭ未満、またはさらにそれより低い、例えば１０ｐＭ未満の平均ＫＤ値により、前記アグリカンに結合する。好ましくは、ＫＤは、例えばProteonにより決定されるように、ＳＰＲにより決定される。
本発明の免疫グロブリンおよび／またはポリペプチドのアグリカンへの結合についてのいくつかの好ましいEC50値は、本明細書におけるさらなる説明および例から明らかとなるであろう。
【０１４０】
ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて、好ましくはＧ１ドメインおよび／またはＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメインに結合する、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドは、ヒトアグリカンに結合することにおいて、１０−８Ｍ以下、より好ましくは１０−９Ｍ以下、またはさらには１０−１０Ｍ以下のＥＣ５０値を有していてもよい。例えば、かかるＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて、本発明の免疫グロブリンおよび／またはポリペプチドは、ヒトアグリカンに結合することにおいて、１０−１０Ｍ〜１０−８Ｍ、例えば１０−９Ｍ〜１０−８Ｍ、または１０−１０Ｍ〜１０−９ＭのＥＣ５０値を有していてもよい。
【０１４１】
かかるＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて、好ましくはＧ１ドメインおよび／またはＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメインに結合する、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドは、カニクイザル（cyno）アグリカンに結合することにおいて、１０−７Ｍ以下、好ましくは１０−８Ｍ以下、より好ましくは１０−９Ｍ以下、またはさらには１０−１０Ｍ以下のＥＣ５０値を有していてもよい。例えば、かかるＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて、本発明のポリペプチドは、cynoアグリカンに結合することにおいて、１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍ、例えば１０−１０Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−９Ｍ、のＥＣ５０値を有していてもよい。
【０１４２】
かかるＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて、好ましくはＧ１ドメインおよび／またはＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメインに結合する、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドは、ラットアグリカンに結合することにおいて、１０−６Ｍ以下、好ましくは１０−７Ｍ以下、好ましくは１０−８Ｍ以下、より好ましくは１０−９Ｍ以下、またはさらには１０−１０Ｍ以下のＥＣ５０値を有していてもよい。例えば、かかるＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて、本発明のポリペプチドは、ラットアグリカンに結合することにおいて、１０−１０Ｍ〜１０−６Ｍ、例えば１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−９ＭのＥＣ５０値を有していてもよい。
【０１４３】
かかるＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて、好ましくはＧ１ドメインおよび／またはＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメインに結合する、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドは、イヌアグリカンに結合することにおいて、１０−６Ｍ以下、好ましくは１０−７Ｍ以下、好ましくは１０−８Ｍ以下、より好ましくは１０−９Ｍ以下、またはさらには１０−１０Ｍ以下のＥＣ５０値を有していてもよい。例えば、かかるＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて、本発明のポリペプチドは、イヌアグリカンに結合することにおいて、１０−１０Ｍ〜１０−６Ｍ、例えば１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−９ＭのＥＣ５０値を有していてもよい。
【０１４４】
かかるＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて、好ましくはＧ１ドメインおよび／またはＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメインに結合する、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドは、ウシアグリカンに結合することにおいて、１０−６Ｍ以下、好ましくは１０−７Ｍ以下、好ましくは１０−８Ｍ以下、より好ましくは１０−９Ｍ以下、またはさらには１０−１０Ｍ以下のＥＣ５０値を有していてもよい。例えば、かかるＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて、本発明のポリペプチドは、ウシアグリカンに結合することにおいて、１０−１０Ｍ〜１０−６Ｍ、例えば１０−１０Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−９ＭのＥＣ５０値を有していてもよい。
【０１４５】
用語「軟骨性組織」とは、本明細書において用いられる場合、弾性軟骨、硝子軟骨および線維軟骨を含む軟骨を指し、これらは、細胞間隙に対する細胞（軟骨細胞）の比率、ならびにコラーゲンおよびプロテオグリカンの相対量により定義される。「関節軟骨」は、骨の関節の表面上で見出される軟骨であり、専ら硝子軟骨である。半月板は、完全に線維軟骨からなる。アグリカンは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）における主要なプロテオグリカンであり、全タンパク質含有量のうちの約５０％を占める（他の約５０％は、コラーゲンＩＩおよびいくつかの微量なタンパク質、例えば、コラーゲンＩＸなどである）。
【０１４６】
本発明のアグリカン結合剤は、滑膜、腱、および／または筋上膜などの非軟骨性組織に対して、軟骨および半月板などの関節における軟骨性組織に優先性を示した。したがって、本発明は、ＩＳＶまたはポリペプチドなどのアグリカン結合剤に関し、ここで、前記アグリカン結合剤は、好ましくは、非軟骨性組織と比較して、好ましくは少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、またはそれよりさらに多く、軟骨および／または半月板などの軟骨性組織に結合する。
【０１４７】
関節とは、２つ以上の骨が交わる領域であると理解される。ほとんどの関節は、可動性であり、骨が動くことを可能にする。関節は、軟骨、滑膜、靭帯、腱、滑液包および滑液からなる。いくつかの関節はまた、半月板を有する。
【０１４８】
例において示されるとおり、本発明のアグリカン結合剤は、多様な軟骨保持の特徴を有し、これが、特定の必要性に応じて関節における保持をカスタマイズすることを可能にする（例２．２を参照）。好ましくは、アグリカン結合剤は、関節内注射により期待され得る比較的短時間のアグリカン結合剤の軟骨への暴露の後で、軟骨において長期間にわたり保持される能力を有する。軟骨保持は、例のセクションにおいて記載されるように、ex vivoでの軟骨保持アッセイを介して測定することができる。保持の程度は、ウェスタンブロットの目視検査により、または濃度測定による定量を介して、測定することができる。保持の程度を決定するために用いられるスケールは、当該分野においてにより定義され得、例えば、０〜６ＲＵ（保持単位（Retention Unit））のスケールであり、ここで、このアッセイにおいて０は保持がないことであり、６は完全な保持である。必要な場合には、スケールは、各々のアグリカン結合剤にスコアが割り当てられている、例えば、完全な保持および保持なしが固定されている、本発明のアグリカン結合剤を用いて定量することができる。代替案においては、スケールは、本発明のアグリカン結合剤を介して割り当てられる多様な中間スコア、例えば、２つの１１４Ｆ０８＝６ＲＵ、およびダミーのアグリカン結合剤、例えばＡＬＢ２６−ＡＬＢ２６＝０ＲＵを含むアグリカン結合剤；または２つの１１４Ｆ０８＝６を含むアグリカン結合剤；６０８Ａ０５＝５を含むアグリカン結合剤；アグリカン結合剤６０４Ｇ０１＝４；２つの６０１Ｄ０２＝３を含むアグリカン結合剤；２つの６０６Ａ０７＝２を含むアグリカン結合剤；アグリカン結合剤１１２Ａ０１＝１；ならびにダミーのアグリカン結合剤、例えば、ＡＬＢ２６−ＡＬＢ２６＝０により設定することができる。（表２．２を参照）。したがって、本発明は、本発明によるＩＳＶおよび／またはポリペプチドなどのアグリカン結合剤に関し、ここで、前記アグリカン結合剤は、軟骨保持アッセイにおいて、少なくとも、３、４、５または６ＲＵなどの、少なくとも２ＲＵの軟骨保持を有する。
【０１４９】
本発明のアグリカン結合剤は、好ましくは安定であるべきである。第１の必要条件として、アグリカン結合剤の生物物理学的特性を、例３において詳述されるように試験し、ここで、これらのアグリカン結合剤が、高い融解温度、ならびに凝集および多量体化の徴候の不在により示されるように、有利な安定性の特徴を示したことが示された。次に、アグリカン結合剤は、滑液中での３７℃におけるインキュベーションにより、関節における長期にわたるそれらの活性について試験した（例６を参照）。コンストラクトのうちのいずれの分解も検出することはできなかった。このことは、in vivoでの状況を模倣する状態下において、コンストラクトが安定であったことを示している。
【０１５０】
一側面において、本発明は、アグリカン結合剤、例えばＩＳＶに関し、ここで、前記アグリカン結合剤は、滑液（ＳＦ）中で３７℃において、１４日間、２１日間、１か月間、２か月間またはさらには３か月間などの、少なくとも３日間、４日間、５日間、６日間、７日間の安定性を有する。
【０１５１】
本発明は、アグリカンへの結合に特に好適なアミノ酸残基のストレッチ（配列番号２０〜３７および１０９、配列番号３８〜５５および１１０、ならびに配列番号５６〜７４および１１１；表Ａ−２）を提供する。特に、本発明は、ヒトアグリカンに結合するアミノ酸残基のストレッチを提供し、ここで、前記ストレッチの前記アグリカンへの結合は、軟骨性組織の存在下において保持される（上記のとおり）。これらのアミノ酸残基のストレッチは、特にそれらが本発明のポリペプチドの抗原結合部位（の一部）を形成するように、本発明のコンストラクトまたはポリペプチドにおいて存在してもよく、および／または、これに組み込まれていてもよい。これらのアミノ酸残基のストレッチは、アグリカンに対して産生させた重鎖抗体のＣＤＲ配列またはＶＨＨ配列として作製した。これらのアミノ酸残基のストレッチは、本明細書において、「本発明のＣＤＲ配列（単数または複数）」（それぞれ、「本発明のＣＤＲ１配列（単数または複数）」、「本発明のＣＤＲ２配列（単数または複数）」および「本発明のＣＤＲ３配列（単数または複数）」）ともまた称される。
【０１５２】
しかしながら、本発明は、最も広義には、これらのアミノ酸残基のストレッチによって、本発明のポリペプチドが、所望される親和性および効力によりアグリカンと結合できる限り、これらのアミノ酸残基のストレッチが本発明のポリペプチドにおいて有する特定の構造的役割または機能に限定されない点に留意すべきである。このように、一般的に、本発明は最も広義には、特定の親和性、アビディティ、有効性および／または効力によりアグリカンと結合でき、本明細書に記載される１つ以上のＣＤＲ配列、特に二つ以上のかかるＣＤＲ配列の好適な組合せを、１つ以上の更なるアミノ酸配列を介して、全ポリペプチドがアグリカンと結合できる結合ドメインおよび／または結合単位を形成する態様で各々適切に連結された形で含む、ポリペプチド（本明細書において「本発明のポリペプチド（単数または複数）」ともまた称される）を提供する。しかしながら、本発明のポリペプチド中にかかるＣＤＲ配列が１つだけ存在する場合であっても、本発明のポリペプチドのアグリカンとの結合能力が十分に提供される点にも留意すべきであり、例えば再び参照として、ＷＯ  ０３／０５０５３１に記載のいわゆる「促進断片（Expedite fragments）」が挙げられる。
【０１５３】
具体的であるが非限定的な側面において、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドは、以下からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基のストレッチから本質的になるか、またはこれを含んでもよい：
ｉ）ＣＤＲ１配列：
ａ）配列番号２４、３２、２０、２１、２２、２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３４、３５、３６、３７および１０９；ならびに
ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列と４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列；
ならびに／または
ｉｉ）ＣＤＲ２配列：
ｃ）配列番号４２、５０、３８、３９、４０、４１、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５１、５２、５３、５４、５５および１１０；ならびに
ｄ）配列番号４２のアミノ酸配列と４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列；
ならびに／または
ｉｉｉ）ＣＤＲ３配列：
ｅ）配列番号６０、６８、５６、５７、５８、５９、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６９、７０、７１、７２、７３、７４および１１１；ならびに
ｆ）配列番号６０のアミノ酸配列と４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列、
好ましくは、ＩＳＶおよび／またはポリペプチドなどのアグリカン結合剤は、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含み、ここで、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、フレームワーク配列である。
【０１５４】
さらなる側面において、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のポリペプチドおよび／またはＩＳＶは、配列番号２０〜７４および１０９〜１１１からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基のストレッチを含んでもよい。
【０１５５】
特に、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のポリペプチドおよび／またはＩＳＶは、１つの結合部位を含むアグリカン結合剤であってよく、ここで、前記抗原結合部位は、上記のようなＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列（または任意の好適なそれらの組み合わせ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基のストレッチを含む。好ましい側面においては、しかし、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のポリペプチドおよび／またはＩＳＶは、本発明のＣＤＲ１配列、本発明のＣＤＲ２配列および／または本発明のＣＤＲ３配列からなる群より選択される１つより多くの、例えば２つ以上のアミノ酸残基のストレッチを含む。好ましくは、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のポリペプチドおよび／またはＩＳＶは、それぞれ、本発明のＣＤＲ１配列、本発明のＣＤＲ２配列および本発明のＣＤＲ３配列からなる群より選択される、３つのアミノ酸残基のストレッチを含む。本明細書において本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のポリペプチドおよび／またはＩＳＶのために好ましいものとして記述されるＣＤＲの組み合わせは、表Ａ−２において列記され、すなわち、好ましくは、前記表の単一の行に示されるＣＤＲの組み合わせである。
【０１５６】
上記のＣＤＲを有する代表的な本発明のポリペプチドを、表Ａ−１において示す（配列番号１〜１９および１１４〜１１８）。
【０１５７】
好ましい態様において、本発明は３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含む、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関し、ここで：
−  ＣＤＲ１は、配列番号２４、３２、２０、２１、２２、２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３４、３５、３６、３７および１０９からなる群より選択され；
−  ＣＤＲ２は、配列番号４２、５０、３８、３９、４０、４１、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５１、５２、５３、５４、５５および１１０からなる群より選択され；ならびに
−  ＣＤＲ３は、配列番号６０、６８、５６、５７、５８、５９、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６９、７０、７１、７２、７３、７４および１１１からなる群より選択され、
好ましくは、ＩＳＶおよび／またはポリペプチドなどのアグリカン結合剤は、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含み、ここで、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、フレームワーク配列である。
【０１５８】
好ましい態様において、本発明は、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含む、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関し、ここで：
−  ＣＤＲ１は、配列番号２４であり、ＣＤＲ２は、配列番号４２であり、およびＣＤＲ３は、配列番号６０である；
−  ＣＤＲ１は、配列番号３２であり、ＣＤＲ２は、配列番号５０であり、およびＣＤＲ３は、配列番号６８である；
−  ＣＤＲ１は、配列番号２０であり、ＣＤＲ２は、配列番号３８であり、およびＣＤＲ３は、配列番号５６である；
−  ＣＤＲ１は、配列番号２１であり、ＣＤＲ２は、配列番号３９であり、およびＣＤＲ３は、配列番号５７である；
−  ＣＤＲ１は、配列番号２２であり、ＣＤＲ２は、配列番号４０であり、およびＣＤＲ３は、配列番号５８である；
−  ＣＤＲ１は、配列番号２３であり、ＣＤＲ２は、配列番号４１であり、およびＣＤＲ３は、配列番号５９である；
−  ＣＤＲ１は、配列番号２５であり、ＣＤＲ２は、配列番号４３であり、およびＣＤＲ３は、配列番号６１である；
−  ＣＤＲ１は、配列番号２６であり、ＣＤＲ２は、配列番号４４であり、およびＣＤＲ３は、配列番号６２であり；
−  ＣＤＲ１は、配列番号２７であり、ＣＤＲ２は、配列番号４５であり、およびＣＤＲ３は、配列番号６３である；
−  ＣＤＲ１は、配列番号２８であり、ＣＤＲ２は、配列番号４６であり、およびＣＤＲ３は、配列番号６４である；
−  ＣＤＲ１は、配列番号２９であり、ＣＤＲ２は、配列番号４７であり、およびＣＤＲ３は、配列番号６５である；
−  ＣＤＲ１は、配列番号３０であり、ＣＤＲ２は、配列番号４８であり、およびＣＤＲ３は、配列番号６６であり；
−  ＣＤＲ１は、配列番号３１であり、ＣＤＲ２は、配列番号４９であり、およびＣＤＲ３は、配列番号６７である；
−  ＣＤＲ１は、配列番号３２であり、ＣＤＲ２は、配列番号５１であり、およびＣＤＲ３は、配列番号６９である；
−  ＣＤＲ１は、配列番号３３であり、ＣＤＲ２は、配列番号５２であり、およびＣＤＲ３は、配列番号７０であり；
−  ＣＤＲ１は、配列番号３４であり、ＣＤＲ２は、配列番号５０であり、およびＣＤＲ３は、配列番号７１である；
−  ＣＤＲ１は、配列番号３５であり、ＣＤＲ２は、配列番号５３であり、およびＣＤＲ３は、配列番号７２である；
−  ＣＤＲ１は、配列番号３６であり、ＣＤＲ２は、配列番号５４であり、およびＣＤＲ３は、配列番号７３であり；
−  ＣＤＲ１は、配列番号３７であり、ＣＤＲ２は、配列番号５５であり、およびＣＤＲ３は、配列番号７４であり；または
−  ＣＤＲ１は、配列番号１０９であり、ＣＤＲ２は、配列番号１１０であり、およびＣＤＲ３は、配列番号１１１であり；
好ましくは、ＩＳＶおよび／またはポリペプチドなどのアグリカン結合剤は、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含み、ここで、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、フレームワーク配列である。
【０１５９】
好ましい態様において、本発明は、ＩＳＶなどのアグリカン結合剤に関し、ここで、配列番号１１７、５、１１８、１３、１１４〜１１６、１〜４、６〜１２および１４〜１９からなる群より選択される。
【０１６０】
本発明は、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドの、（またはそれを発現させるために用いられる本発明の核酸の）起源にも、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチド、または本発明の核酸が生成される（または生成された）か得られる（または得られた）かにも、限定されないことに、さらに留意すべきである。したがって、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドは、天然に存在するＩＳＶ（任意の好適な種からの）であっても、または合成または半合成のＩＳＶおよび／またはポリペプチドであってもよい。
【０１６１】
さらに、限定されないがヒト骨格または非免疫グロブリン骨格などの他の「骨格」に対して、前記の１つ以上のＣＤＲを「グラフトする」ことができることも、当業者に自明である。適切な骨格およびかかるＣＤＲグラフトの技術は当業者に自明であり、例えば米国特許第７，１８０，３７０号、国際公開第０１／２７１６０号、欧州特許出願公開第０６０５５２２号、欧州特許出願公開第０４６０１６７号、米国特許第７，０５４，２９７号、Nicaise et al.（Protein Science 13: 1882-1891, 2004）、Ewert et al.（Methods 34: 184-199, 2004）、Kettleborough et al.（Protein Eng. 4: 773-783, 1991）、O' Brien and Jones（Methods Mol. Biol. 207: 81-100, 2003）、Skerra（J. Mol. Recognit. 13: 167-187, 2000）およびSaerens et al.（J. Mol. Biol. 352: 597-607, 2005）、およびその中の更なる引例などにより公知技術である。例えば、マウスまたはラットのＣＤＲをヒトフレームワークおよび骨格上へグラフトする技術自体も公知であり、また同様に用いることにより、本発明の一価のポリペプチドについて本明細書において定義されるＣＤＲ配列の１つ以上と、１つ以上のヒトフレームワーク領域または配列と、を含むキメラタンパク質が提供される。アミノ酸配列を提示するための適切な骨格は当業者に自明であり、例えば、免疫グロブリン（すなわち本明細書で上記した免疫グロブリン配列以外の）に基づくかまたはそれに由来する結合骨格、プロテインＡドメイン（Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（商標）など）に由来するタンパク質骨格、テンダミスタット（tendamistat）、フィブロネクチン、リポカリン、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞レセプター、人工アンキリンリピート、アビマー（avimers）およびＰＤＺドメイン（Binz et al. Nat Biotech 23: 1257, 2005）、ならびに、限定されないがＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーなどの、ＤＮＡまたはＲＮＡに基づく結合部分（Ulrich et al. Com Chem. High Throughput Screen 9: 619-32, 2006）が挙げられる。
【０１６２】
本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドにおいて、ＣＤＲは、更なるアミノ酸配列に連結されてもよく、および／またはアミノ酸配列を介して各々連結されてもよく、その際、前記アミノ酸配列は、好ましくはフレームワーク配列であるか、またはフレームワーク配列として作用するアミノ酸配列であるか、または一緒にＣＤＲを提示するための骨格を形成する。
【０１６３】
好適な態様では、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドは、少なくとも２つのフレームワーク配列に連結される少なくとも３つのＣＤＲ配列を含み、その際、３つのＣＤＲ配列のうちの好ましくは少なくとも１つはＣＤＲ３配列であり、その他の２つのＣＤＲ配列はＣＤＲ１またはＣＤＲ２配列であり、好ましくは、１つがＣＤＲ１配列であり、１つがＣＤＲ２配列である。特に好適かつ非限定的な態様では、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチド、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を有し、その際、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関して本明細書で定義されるとおりであり、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、フレームワーク配列である。本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドにおいて、フレームワーク配列は、いかなる適切なフレームワーク配列であってもよく、適切なフレームワーク配列の例は、例えば標準的なハンドブックおよび本明細書の更なる開示および従来技術に基づき、当業者に明らかである。
【０１６４】
したがって、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドは、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含み、ここで；
（ｉ）ＣＤＲ１は、
（ａ）配列番号２４、３２、２０、２１、２２、２３、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３４、３５、３６、３７および１０９；ならびに
（ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列と、または配列番号２０〜２３、２５〜３７および１０９のいずれかと、４、３、２もしくは１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列；
からなる群より選択され、ならびに／あるいは、
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、
（ｃ）配列番号４２、５０、３８、３９、４０、４１、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５１、５２、５３、５４、５５および１１０；ならびに
（ｄ）配列番号４２のアミノ酸配列と、配列番号３８〜４１、４３〜５５および１１０のいずれかと、４、３、２もしくは１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列；
からなる群より選択され、ならびに／あるいは、
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、
（ｅ）配列番号６０、６８、５６、５７、５８、５９、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６９、７０、７１、７２、７３、７４および１１１；ならびに
（ｆ）配列番号６０のアミノ酸配列と、または配列番号５６〜５９、６１〜７４および１１１のいずれかと、４、３、２もしくは１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列；
からなる群より選択され、
好ましくは、ＩＳＶおよび／またはポリペプチドなどのアグリカン結合剤は、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含み、ここで、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、フレームワーク配列である。
【０１６５】
本発明のアグリカン結合剤は、アグリカンのＧ１領域、Ｇ１−ＩＧＤ−Ｇ２領域またはＧ２領域にマッピングすることができる。
したがって、本発明は、アグリカンのＧ２ドメインに結合する、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関する。例において記載されるとおり、本発明のこれらのアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドは、多様な好ましい特徴を有する。好ましくは、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチド、は、８より大きなｐＩを有するか、および／または２＊１０−２ｓ−１未満のＫｏｆｆを有するか、および／または１＊１０−６Ｍ未満のＥＣ５０を有する。
【０１６６】
本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドのＣＤＲの比較により、アグリカンのＧ２ドメインへの結合を保持しつつ、ＣＤＲにおいて許容可能な多数のアミノ変更が明らかとなった。参照として用いられた６０１Ｄ０２のＣＤＲに対する、全てのクローンのＣＤＲにおける配列可変性を、表１．５Ａ、１．５Ｂおよび１．５Ｃにおいて表す。
【０１６７】
一態様において、本発明は、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関し、ここで；
ｉ）ＣＤＲ１は、
ａ）配列番号２８、２２、２６および３３；ならびに
ｂ）配列番号２８のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、アミノ酸の相違（単数または複数）は、以下のとおり定義される：
−  位置１において、Ｇは、Ｒに変更されている；
−  位置２において、Ｐは、ＳもしくはＲに変更されている；
−  位置３において、Ｔは、Ｉに変更されている；
−  位置５において、Ｓは、Ｎに変更されている；
−  位置６において、Ｒは、Ｎ、ＭもしくはＳに変更されている；
−  位置７において、Ｙは、Ｒに変更されているか、または不在である；
−  位置８において、Ａは、Ｆに変更されているか、または不在である；および／または
−  位置１０において、Ｇは、Ｙに変更されている；
からなる群より選択され、ならびに／あるいは
ｉｉ）ＣＤＲ２は、
ｃ）配列番号４６、４０、４４および５２；ならびに
ｄ）配列番号４６のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、アミノ酸の相違（単数または複数）は、以下のとおり定義される：
−  位置１において、Ａは、ＳもしくはＹに変更されている；
−  位置４において、Ｗは、Ｌに変更されている；
−  位置５において、Ｓは、Ｎに変更されている；
−  位置６において、Ｓは、不在である；
−  位置７において、Ｇは、不在である；
−  位置８において、Ｇは、Ａに変更されている；
−  位置９において、Ｒは、Ｓ、ＤもしくはＴに変更されている；および／または
−  位置１１において、Ｙは、ＮもしくはＲに変更されている；
からなる群より選択され、ならびに／あるいは
ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、
ｅ）配列番号６４、５８、６２および７０；ならびに
ｆ）配列番号６４のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、アミノ酸の相違（単数または複数）は、以下のとおり定義される：
−  位置１において、Ａは、ＲもしくはＦに変更されている；
−  位置２において、Ｒは、ＩもしくはＬに変更されている；
−  位置３において、Ｉは、ＨもしくはＱに変更されている；
−  位置４において、Ｐは、ＧもしくはＮに変更されている；
−  位置５において、Ｖは、Ｓに変更されている；
−  位置６において、Ｒは、Ｇ、ＮもしくはＦに変更されている；
−  位置７において、Ｔは、Ｒ、ＷもしくはＹに変更されている；
−  位置８において、Ｙは、ＲもしくはＳに変更されているか、または不在である；
−  位置９において、Ｔは、Ｓに変更されているか、または不在である；
−  位置１０において、Ｓは、Ｅ、Ｋに変更されているか、または不在である；
−  位置１１において、Ｅは、Ｎ、Ａに変更されているか、または不在である；
−  位置１２において、Ｗは、Ｄに変更されているか、または不在である；
−  位置１３において、Ｎは、Ｄに変更されているか、または不在である；
−  位置１４において、Ｙは、不在である；および／または
−  ＤおよびＮが、配列番号６４の位置１４の後に付加される；
からなる群より選択され、
好ましくは、ＩＳＶおよび／またはポリペプチドなどのアグリカン結合剤は、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含み、ここで、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、フレームワーク配列である。
【０１６８】
一側面において、本発明は、
−  ＣＤＲ１は、配列番号２８、２２、２６および３３からなる群より選択され；
−  ＣＤＲ２は、配列番号４６、４０、４４および５２からなる群より選択され；ならびに
−  ＣＤＲ３は、配列番号６４、５８、６２および７０からなる群より選択される、
アグリカン結合剤の群より選択される、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関し、ここで、
好ましくは、ＩＳＶおよび／またはポリペプチドなどのアグリカン結合剤は、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含み、ここで、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、フレームワーク配列である。
【０１６９】
一側面において、本発明は、
−  ＣＤＲ１が、配列番号２８であり、ＣＤＲ２が、配列番号４６であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６４である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号２２であり、ＣＤＲ２が、配列番号４０であり、およびＣＤＲ３が、配列番号５８である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号２６であり、ＣＤＲ２が、配列番号４４であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６２である；ならびに
−  ＣＤＲ１が、配列番号３３であり、ＣＤＲ２が、配列番号５２であり、およびＣＤＲ３が、配列番号７０である；
アグリカン結合剤の群より選択される、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関し、
好ましくは、ＩＳＶおよび／またはポリペプチドなどのアグリカン結合剤は、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含み、ここで、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、フレームワーク配列である。
【０１７０】
一側面において、本発明は、配列番号９、３、７および１５、ならびに配列番号９、３、７および１５のいずれか１つと、９０％または９５％などの、８０％より高い配列同一性を有する、アグリカン結合剤からなる群より選択される、アグリカン結合剤の群から選択される、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関する。
【０１７１】
一側面において、本発明は、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列の、アグリカンのＧ２ドメインへの結合を交差ブロッキングする、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関する。
【０１７２】
一側面において、本発明は、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列であって、アグリカンのＧ２−ドメインに結合し、アグリカンのＧ２ドメインへの結合について、本発明のアグリカン結合剤、例えば好ましくは配列番号９、３、７および１５のいずれか１つにより表される本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドと競合するものに関する。
【０１７３】
本発明はまた、アグリカンのＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメインに結合する本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関する。例において記載されるとおり、本発明のこれらのアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドは、多様な好ましい特徴を有する。好ましくは、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドは、８より大きなｐＩを有するか、および／または２＊１０−２ｓ−１未満のＫｏｆｆを有するか、および／または１＊１０−６Ｍ未満のＥＣ５０を有する。
【０１７４】
本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドのＣＤＲの比較により、アグリカンのＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメインへの結合を保持しつつ、ＣＤＲにおいて許容し得るアミノ変更が明らかとなった。参照として用いられた６０４Ｆ０２のＣＤＲに対する全てのクローンのＣＤＲにおける配列の可変性を、表１．４Ａ、１．４Ｂおよび１．４Ｃにおいて表される。
【０１７５】
一側面において、本発明はまた、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関し、ここで；
ｉ）ＣＤＲ１は、
ａ）配列番号３２、３０および２３；ならびに
ｂ）配列番号３２のアミノ酸配列と３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、アミノ酸の相違（単数または複数）は、以下のとおり定義される：
−  位置２において、Ｒは、Ｌに変更されている；
−  位置６において、Ｓは、Ｔに変更されている；および／または
−  位置８において、Ｔは、Ａに変更されている；
からなる群より選択され、ならびに／あるいは
ｉｉ）ＣＤＲ２は、
ｃ）配列番号５０、４１、４８および５１；ならびに
ｄ）配列番号５０のアミノ酸配列と２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、アミノ酸の相違（単数または複数）は、以下のとおり定義される：
−  位置７において、Ｇは、ＳもしくはＲに変更されている；および／または
−  位置８において、Ｒは、Ｔに変更されている；
からなる群より選択され、ならびに／あるいは
ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、
ｅ）配列番号６８、５９、６６および６９；ならびに
ｆ）配列番号６８のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、アミノ酸の相違（単数または複数）は、以下のとおり定義される：
−  位置４において、Ｒは、ＶもしくはＰに変更されている；
−  位置６において、Ａは、Ｙに変更されている；
−  位置７において、Ｓは、Ｔに変更されている；
−  位置８において、Ｓは、不在である；
−  位置９において、Ｎは、Ｐに変更されている；
−  位置１０において、Ｒは、ＴもしくはＬに変更されている；
−  位置１１において、Ｇは、Ｅに変更されている；および／または
−  位置１２において、Ｌは、ＴもしくはＶに変更されている；
からなる群より選択され、
好ましくは、ＩＳＶおよび／またはポリペプチドなどのアグリカン結合剤は、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含み、ここで、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、フレームワーク配列である。
【０１７６】
一側面において、本発明は、
−  ＣＤＲ１は、配列番号３２、３０および２３からなる群より選択され；
−  ＣＤＲ２は、配列番号５０、４１、４８および５１からなる群より選択され；ならびに
−  ＣＤＲ３は、配列番号６８、５９、６６および６９からなる群より選択される、
本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関し、
好ましくは、ＩＳＶおよび／またはポリペプチドなどのアグリカン結合剤は、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含み、ここで、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、フレームワーク配列である。
【０１７７】
一側面において、本発明は、
−  ＣＤＲ１が、配列番号３２であり、ＣＤＲ２が、配列番号５０であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６８である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号３２であり、ＣＤＲ２が、配列番号５１であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６９である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号３０であり、ＣＤＲ２が、配列番号４８であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６６である；ならびに
−  ＣＤＲ１が、配列番号２３であり、ＣＤＲ２が、配列番号４１であり、およびＣＤＲ３が、配列番号５９である；
アグリカン結合剤の群より選択される、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関し、
好ましくは、ＩＳＶおよび／またはポリペプチドなどのアグリカン結合剤は、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含み、ここで、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、フレームワーク配列である。
【０１７８】
一側面において、本発明は、配列番号１１８、１３、４、１１および１４を有するアグリカン結合剤、ならびに配列番号１１８、１３、４、１１および１４のいずれか１つと、９０％または９５％などの、８０％より高い配列同一性を有する、アグリカン結合剤からなる群より選択される、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関する。
【０１７９】
一側面において、本発明は、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列の、アグリカンのＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメインへの結合を交差ブロッキングする、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関する。
【０１８０】
一側面において、本発明は、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列であって、アグリカンのＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメインに結合し、アグリカンのＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメインへの結合について、好ましくは配列番号１１８、１３、４、１１および１４のいずれか１つにより表される、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドと、競合するものに関する。
【０１８１】
特に好ましい態様において、本発明は、アグリカンのＧ１ドメインに結合する、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関する。例において記載されるとおり、本発明のこれらのアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチド、は、多様な好ましい特徴を有する。好ましくは、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドは、８より大きなｐＩを有するか、および／または２＊１０−２ｓ−１未満のＫｏｆｆを有するか、および／または１＊１０−６Ｍ未満のＥＣ５０を有する。
【０１８２】
本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドのＣＤＲの比較により、アグリカンのＧ１ドメインへの結合を保持しつつ、ＣＤＲにおいて許容可能な多数のアミノ変更が明らかとなった。参照として用いられた１１４Ｆ０８のＣＤＲに対する全てのクローンのＣＤＲにおける配列可変性を、表１．３Ａ、１．３Ｂおよび１．３Ｃにおいて表す。
【０１８３】
好ましい側面において、本発明は、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含む、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関し、ここで；
ｉ）ＣＤＲ１は、
ａ）配列番号２４、２０、２１、２５、２７、２９、３１、３４、３５、３６および３７；ならびに
ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列、ここで、アミノ酸の相違（単数または複数）は、以下のとおり定義される：
−  位置２において、Ｓは、Ｒ、Ｆ、ＩもしくはＴに変更されている；
−  位置３において、Ｔは、Ｉに変更されている；
−  位置５において、Ｉは、Ｓに変更されている；
−  位置６において、Ｉは、Ｓ、ＲもしくはＭに変更されている；
−  位置７において、Ｎは、ＹもしくはＲに変更されている；
−  位置８において、Ｖは、Ａ、Ｙ、ＴもしくはＧに変更されている；
−  位置９において、Ｖは、Ｍに変更されている；および／または
−  位置１０において、Ｒは、Ｇ、ＫもしくはＡに変更されている；
からなる群より選択され、ならびに／あるいは
ｉｉ）ＣＤＲ２は、
ｃ）配列番号４２、３８、３９、４３、４５、４７、４９、５０、５３、５４および５５；ならびに
ｄ）配列番号４２のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列、ここで、アミノ酸の相違（単数または複数）は、以下のとおり定義される：
−  位置１において、Ｔは、ＡもしくはＧに変更されている；
−  ＳもしくはＮが位置３と位置４との間に挿入される（位置２ａ、表１．３Ｂ）；
−  位置３において、Ｓは、Ｒ、Ｗ、ＮもしくはＴに変更されている；
−  位置４において、Ｓは、ＴもしくはＧに変更されている；
−  位置５において、Ｇは、Ｓに変更されている；
−  位置６において、Ｇは、ＳもしくはＲに変更されている；
−  位置７において、Ｎは、Ｓ、ＴもしくはＲに変更されている；
−  位置８において、Ａは、Ｔに変更されている；および／または
−  位置９において、Ｎは、ＤもしくはＹに変更されている；
からなる群より選択され、ならびに／あるいは
ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、
ｅ）配列番号６０、５６、５７、６１、６３、６５、６７、７１、７２、７３および７４；ならびに
ｆ）配列番号６０のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、アミノ酸の相違（単数または複数）は、以下のとおり定義される：
−  位置１において、Ｐは、Ｇ、Ｒ、ＤもしくはＥに変更されているか、または不在である；
−  位置２において、Ｔは、Ｒ、Ｌ、ＰもしくはＶに変更されているか、または不在である；
−  位置３において、Ｔは、Ｍ、ＳもしくはＲに変更されているか、または不在である；
−  位置４において、Ｈは、Ｄ、Ｙ、ＧもしくはＴに変更されている；
−  位置５において、Ｙは、Ｆ、Ｖ、ＴもしくはＧに変更されている；
−  位置６において、Ｇは、Ｌ、Ｄ、Ｓ、ＹもしくはＷに変更されている；
−  Ｒ、Ｔ、ＹもしくはＶが、位置６と位置７との間に挿入される（位置６ａ、表１．３Ｃ）；
−  位置７において、Ｇは、ＰもしくはＳに変更されている；
−  位置８において、Ｖは、Ｇ、Ｔ、Ｈ、Ｒ、ＬもしくはＹに変更されている；
−  位置９において、Ｙは、Ｒ、Ａ、Ｓ、ＤもしくはＧに変更されている；
−  位置１０において、Ｙは、Ｎ、Ｅ、Ｇ、ＷもしくはＳに変更されている；
−  Ｗが、位置１０と位置１１との間に挿入される（位置１０ａ、表１．３Ｃ）；
−  位置１１において、Ｇは、Ｓ、ＫもしくはＹに変更されている；
−  位置１２において、Ｐは、ＥもしくはＤに変更されているか、または不在である；および／または
−  位置１３において、Ｙは、Ｌに変更されているか、または不在である；
からなる群より選択され、
好ましくは、ＩＳＶおよび／またはポリペプチドなどのアグリカン結合剤は、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含み、ここで、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、フレームワーク配列である。
【０１８４】
好ましい側面において、本発明は、ＣＤＲ１が、配列番号２４、２０、２１、２５、２７、２９、３１、３４、３５、３６、３７および１０９からなる群より選択され；ＣＤＲ２が、配列番号４２、３８、３９、４３、４５、４７、４９、５０、５３、５４、５５および１１０からなる群より選択され；およびＣＤＲ３が、配列番号６０、５６、５７、６１、６３、６５、６７、７１、７２、７３、７４および１１１からなる群より選択される、アグリカン結合剤の群より選択される、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関する；好ましくは、アグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドは、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含み、ここで、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、フレームワーク配列である。
【０１８５】
好ましい側面において、本発明は、
−  ＣＤＲ１が、配列番号２４であり、ＣＤＲ２が、配列番号４２であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６０である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号２０であり、ＣＤＲ２が、配列番号３８であり、およびＣＤＲ３が、配列番号５６である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号２１であり、ＣＤＲ２が、配列番号３９であり、およびＣＤＲ３が、配列番号５７である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号２５であり、ＣＤＲ２が、配列番号４３であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６１である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号２７であり、ＣＤＲ２が、配列番号４５であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６３である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号２９であり、ＣＤＲ２が、配列番号４７であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６５である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号３１であり、ＣＤＲ２が、配列番号４９であり、およびＣＤＲ３が、配列番号６７である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号３４であり、ＣＤＲ２が、配列番号５０であり、およびＣＤＲ３が、配列番号７１である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号３５であり、ＣＤＲ２が、配列番号５３であり、およびＣＤＲ３が、配列番号７２である；
−  ＣＤＲ１が、配列番号３６であり、ＣＤＲ２が、配列番号５４であり、およびＣＤＲ３が、配列番号７３であり；
−  ＣＤＲ１が、配列番号３７であり、ＣＤＲ２が、配列番号５５であり、およびＣＤＲ３が、配列番号７４であり；ならびに
−  ＣＤＲ１が、配列番号１０９であり、ＣＤＲ２が、配列番号１１０であり、およびＣＤＲ３が、配列番号１１１である；
アグリカン結合剤の群より選択される、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関し、
好ましくは、ＩＳＶおよび／またはポリペプチドなどのアグリカン結合剤は、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含み、ここで、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、フレームワーク配列である。
【０１８６】
例のセクションにおいて、例示的なクローン１１４Ｆ０８が、特に好ましい特徴を有することが示されている。クローン１１４Ｆ０８は、クローン１１４Ａ０９（配列番号１１４）および１１４Ｂ０４（配列番号１１５）をさらに含む、ＣＤＲにおける類似性（これは、機能的特徴における類似性を反映する）に基づいてグループ化され（表Ａ−２ならびに表３．３Ａ、３．３Ｂおよび３．３Ｃを参照）、クローンのファミリーまたはセットを表す。したがって、別の特に好ましい側面において、本発明は、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含む、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関し、ここで；
ｉ）ＣＤＲ１は、以下からなる群より選択される：
ａ）配列番号２４および１０９；ならびに
ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列と２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、アミノ酸の相違（単数または複数）は、以下のとおり定義される：
−  位置７において、Ｎは、Ｓに変更されている；および／または
−  位置９において、Ｖは、Ｍに変更されている；
ならびに／あるいは
ｉｉ）ＣＤＲ２は、以下からなる群より選択される：
ｃ）配列番号４２および１１０；ならびに
ｄ）配列番号４２のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列、ここで、アミノ酸の相違（単数または複数）は、以下のとおり定義される：
−  位置１において、Ｔは、Ａに変更されている；
−  位置３において、Ｓは、Ｒに変更されている；
−  位置４において、Ｓは、Ｔに変更されている；
−  位置８において、Ａは、Ｔに変更されている；および／または
−  位置９において、Ｎは、Ｄに変更されている；
ならびに／あるいは
ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、以下からなる群より選択される：
ｅ）配列番号６０および１１１；ならびに
ｆ）配列番号６０のアミノ酸配列と２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、アミノ酸の相違（単数または複数）は、以下のとおり定義される：
−  位置４において、Ｈは、Ｒに変更されている；および／または
−  位置８において、Ｖは、Ｄに変更されている；
好ましくは、ＩＳＶおよび／またはポリペプチドなどのアグリカン結合剤は、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含み、ここで、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、フレームワーク配列である。
【０１８７】
一側面において、本発明は、
−  ＣＤＲ１が、配列番号２４および１０９からなる群より選択され；
−  ＣＤＲ２が、配列番号４２および１１０からなる群より選択され；ならびに
−  ＣＤＲ３が、配列番号６０および１１１からなる群より選択される、
アグリカン結合剤の群より選択される、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関し、
好ましくは、ＩＳＶおよび／またはポリペプチドなどのアグリカン結合剤は、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含み、ここで、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、フレームワーク配列である。
【０１８８】
さらに、例のセクションにおいて、アグリカンのＧ１領域に結合し、エピトープビン１またはエピトープビン４に属するアグリカン結合剤が、軟骨保持アッセイにおいて特に有効であることが示されている。一側面において、本発明は、エピトープビン１またはエピトープビン４に属する本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関する。
【０１８９】
エピトープビン１に属する本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドのＣＤＲの比較により、アグリカンのＧ１ドメインへの結合を保持しつつ、ＣＤＲにおいて許容することができる多数のアミノ変更が明らかとなった。参照として用いられた６０８Ａ０５のＣＤＲに対する全てのクローンのＣＤＲにおける配列可変性を、表２．３Ｄ、２．３Ｅおよび２．３Ｆにおいて表す。
【０１９０】
好ましい側面において、本発明は、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含む、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関し、ここで；
ｉ）ＣＤＲ１は、
ａ）配列番号３６、２０および２９；ならびに
ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列と２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、アミノ酸の相違（単数または複数）は、以下のとおり定義される：
−  位置３において、Ｔは、Ｓに変更されている；
−  位置６において、Ｔは、Ｓに変更されている；
−  位置８において、Ｔは、Ａに変更されている；および／または
−  位置９において、Ｍは、Ｖに変更されている；
からなる群より選択され、ならびに／あるいは
ｉｉ）ＣＤＲ２は、
ｃ）配列番号５４、３８および３７；ならびに
ｄ）配列番号５４のアミノ酸配列と２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、アミノ酸の相違（単数または複数）は、以下のとおり定義される：
−  位置１において、Ａは、Ｉに変更されている；
−  位置４において、Ｗは、Ｒに変更されている；
−  位置７において、Ｇは、Ｒに変更されている；および／または
−  位置８において、Ｔは、Ｓに変更されている；
からなる群より選択され、ならびに／あるいは
ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、
ｅ）配列番号７３、５６および６５；ならびに
ｆ）配列番号７３のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、アミノ酸の相違（単数または複数）は、以下のとおり定義される：
−  位置１において、Ｒは、Ｇに変更されている；
−  位置２において、Ｐは、ＲもしくはＬに変更されている；
−  位置３において、Ｒは、ＬもしくはＳに変更されている；
−  位置５において、Ｙは、Ｒに変更されている；
−  位置６において、Ｙは、ＳもしくはＡに変更されている；
−  位置７において、Ｙは、Ｔに変更されているか、または不在である；
−  位置８において、Ｓは、Ｐに変更されている；
−  位置９において、Ｌは、ＨもしくはＲに変更されている；
−  位置１０において、Ｙは、ＰもしくはＡに変更されている；
−  位置１１において、Ｓは、ＡもしくはＹに変更されている；
−  位置１２において、Ｙは、Ｄに変更されている；
−  位置１３において、Ｄは、Ｆに変更されている；
−  位置１４において、Ｙは、Ｇに変更されているか、または不在である；および／または
−  位置１４の後、Ｓが挿入される；
からなる群より選択され、
好ましくは、ＩＳＶおよび／またはポリペプチドなどのアグリカン結合剤は、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含み、ここで、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、フレームワーク配列である。
【０１９１】
一側面において、本発明は、
−  ＣＤＲ１が、配列番号２０、２９および３６からなる群より選択され；
−  ＣＤＲ２が、配列番号３８、４７および５４からなる群より選択され；ならびに
−  ＣＤＲ３が、配列番号５６、６５および７３からなる群より選択される；
アグリカン結合剤の群より選択される、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関し、
好ましくは、ＩＳＶおよび／またはポリペプチドなどのアグリカン結合剤は、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含み、ここで、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、フレームワーク配列である。
【０１９２】
一側面において、本発明は、エピトープビン１に属する本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドであって、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列の、アグリカンのＧ１ドメインへの結合を交差ブロッキングするものに関する。
【０１９３】
一側面において、本発明は、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列であって、アグリカンのＧ１−ドメインのエピトープビン１に結合し、アグリカンのＧ１ドメインへの結合について、本発明のアグリカン結合剤、例えばエピトープビン１に属する、好ましくは例えば配列番号１、１０および１８のいずれか１つにより表されるＩＳＶおよび／またはポリペプチドと競合するものに関する。
【０１９４】
エピトープビン４に属する本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドのＣＤＲの比較により、アグリカンのＧ１ドメインへの結合を保持しつつ、ＣＤＲにおいて許容することができる、多数のアミノ変更が明らかとなった。参照として用いられた１１４Ｆ０８のＣＤＲに対する全てのクローンのＣＤＲにおける配列の可変性を、表２．３Ａ、２．３Ｂおよび２．３Ｃにおいて表す。
【０１９５】
一側面において、本発明は、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含む、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関し、ここで；
ｉ）ＣＤＲ１は、
ａ）配列番号２４、２５および２７；ならびに
ｂ）配列番号２４のアミノ酸配列と２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、アミノ酸の相違（単数または複数）は、以下のとおり定義される：
−  位置２において、Ｓは、ＩもしくはＦに変更されている；
−  位置５において、Ｉは、Ｓに変更されている；
−  位置６において、Ｉは、ＳもしくはＭに変更されている；
−  位置７において、Ｎは、ＲもしくはＹに変更されている；
−  位置８において、Ｖは、ＡもしくはＹに変更されている；
−  位置９において、Ｖは、Ｍに変更されている；および／または
−  位置１０において、Ｒは、Ｋに変更されている；
からなる群より選択され、ならびに／あるいは
ｉｉ）ＣＤＲ２は、
ｃ）配列番号４２、４３および４５；ならびに
ｄ）配列番号４２のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列、ここで、アミノ酸の相違（単数または複数）は、以下のとおり定義される：
−  位置１において、Ｔは、ＡもしくはＧに変更されている；
−  位置２と位置３との間にＮが挿入される（位置２ａ、表２．３Ｂ）；
−  位置７において、Ｎは、Ｒに変更されている；
−  位置８において、Ａは、Ｔに変更されている；および／または
−  位置９において、Ｎは、Ｄに変更されている；
からなる群より選択され、ならびに／あるいは
ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、
ｅ）配列番号６０、６１および６３；ならびに
ｆ）配列番号６０のアミノ酸配列と５、４、３、２または１のアミノ酸（単数または複数）の相違を有するアミノ酸配列であって、ここで、アミノ酸の相違（単数または複数）は、以下のとおり定義される：
−  位置１において、Ｐは、不在である；
−  位置２において、Ｔは、Ｒに変更されているか、または不在である；
−  位置３において、Ｔは、Ｍに変更されているか、または不在である；
−  位置４において、Ｈは、ＤもしくはＹに変更されている；
−  位置５において、Ｙは、ＦもしくはＶに変更されている；
−  位置６において、Ｇは、ＬもしくはＤに変更されている；
−  位置８において、Ｖは、ＧもしくはＴに変更されている；
−  位置９において、Ｙは、Ｒに変更されている；
−  位置１０において、Ｙは、ＮもしくはＥに変更されている；
−  位置１１において、Ｇは、ＳもしくはＫに変更されている；
−  位置１２において、Ｐは、Ｅに変更されているか、または不在である；および／または
−  位置１３において、Ｙは、Ｌに変更されているか、または不在である；
からなる群より選択され、
好ましくは、ＩＳＶおよび／またはポリペプチドなどのアグリカン結合剤は、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含み、ここで、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、フレームワーク配列である。
【０１９６】
一側面において、本発明は、
−  ＣＤＲ１が、配列番号２４、２５および２７からなる群より選択され；
−  ＣＤＲ２が、配列番号４２、４３および４５からなる群より選択され；ならびに
−  ＣＤＲ３が、配列番号６０、６１および６３からなる群より選択される；
アグリカン結合剤の群より選択される、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関し、
好ましくは、ＩＳＶおよび／またはポリペプチドなどのアグリカン結合剤は、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含み、ここで、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、フレームワーク配列である。
【０１９７】
一側面において、本発明は、エピトープビン４に属する本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドであって、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列の、アグリカンのＧ１ドメインへの結合を交差ブロッキングするものに関する。
【０１９８】
一側面において、本発明は、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適な免疫グロブリン、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用のために好適な免疫グロブリン、ナノボディ、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列であって、アグリカンのＧ１−ドメインのエピトープビン４に結合し、アグリカンのＧ１ドメインへの結合について、エピトープビン４に属する本発明のアグリカン結合剤、例えば配列番号１１７、１１４、１１５、１１６、５、６および８のいずれか１つにより表されるＩＳＶおよび／またはポリペプチドなどと競合するものに関する。
【０１９９】
一側面において、本発明は、配列番号１１７、１１８、１１６、１１４、１１５、５、１３、１、２、６、８、１０、１２、１６、１７、１８、および１９により表されるアグリカン結合剤、ならびに配列番号１１７、１１８、１１６、１１４、１１５、５、１３、１、２、６、８、１０、１２、１６、１７、１８、および１９のいずれか１つと、９０％、または９５％、またさらにはそれより高いなどの、８０％より高いば配列同一性を有する、ＩＳＶからなる群より選択される、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関する。
【０２００】
１つの具体的かつ非限定的な側面では、本発明のアグリカン結合剤は、免疫グロブリンフォールドを含むアミノ酸残基のストレッチ、または適切な条件（生理的条件などの）下で、（すなわちフォールディングによって）免疫グロブリンフォールドを形成できるアグリカン結合剤であってもよい。参照として、特に、Halaby et al.（J. Protein Eng. 12: 563-71, 1999）によるレビューが挙げられる。好ましくは、適切に免疫グロブリンフォールドを形成するようにフォールディングされるとき、アミノ酸残基のストレッチは、アグリカンとの結合のための抗原結合部位を適切に形成することが可能である。したがって、好適な側面では、本発明のアグリカン結合剤は、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインなどの免疫グロブリンである。
【０２０１】
したがって、フレームワーク配列は好ましくは、免疫グロブリンフレームワーク配列（の好適な組合せ）、または免疫グロブリンフレームワーク配列から（例えば配列最適化（例えばヒト化またはラクダ化）によって）誘導されるフレームワーク配列である。例えば、フレームワーク配列は、軽鎖可変ドメイン（例えばＶＬ配列）などの免疫グロブリン単一可変ドメイン、および／または重鎖可変ドメイン（例えばＶＨ配列）から誘導されるフレームワーク配列であってもよい。特に好適な一側面では、フレームワーク配列は、ＶＨＨ配列から誘導されたフレームワーク配列（前記フレームワーク配列が任意に部分的に、または、完全にされてもよい）または、（本明細書で定義されるように）ラクダ化された従来型のＶＨ配列のいずれかである。
【０２０２】
フレームワーク配列は、好ましくは、本発明の一価のポリペプチドが、ドメイン抗体（またはドメイン抗体としての使用に適するアミノ酸配列）などのＩＳＶ、単一ドメイン抗体（または単一ドメイン抗体としての使用に適するアミノ酸）、「ｄＡｂ」（またはｄＡｂとしての使用に適するアミノ酸）、ナノボディ（登録商標）、ＶＨＨ配列、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列、または親和性成熟によって得られたＶＨＨ配列、であるようなものであってもよい。また、適切なフレームワーク配列は、例えば標準的なハンドブックおよび本明細書の更なる開示および従来技術に基づき、当業者に明らかである。
【０２０３】
本発明の別の特に好ましいクラスのＩＳＶは、天然に存在するＶＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、「ラクダ化」されている、すなわち、従来の四鎖抗体からの天然に存在するＶＨドメインのアミノ酸配列における１つ以上のアミノ酸残基を、重鎖抗体のＶＨＨドメインにおける対応する位置（単数または複数）において生じるアミノ酸残基の１つ以上により置き換えられている、アミノ酸配列を有するＩＳＶを含む。これは、当業者には明らかであろうそれ自体公知の様式において、例えば本明細書における記載に基づいて、行うことができる。かかる「ラクダ化」置換は、好ましくは、ＶＨ−ＶＬインターフェースを形成するか、および／もしくはこれにおいて存在するアミノ酸の位置において、ならびに／または、当業者に周知であり、例えばＷＯ  ９４／０４６７８およびDavies and Riechmann（1994および1996）において定義されている、いわゆるラクダ科ホールマーク残基において、挿入される。好ましくは、ラクダ化ＩＳＶを作製または設計するための出発材料または出発点として用いられるＶＨ配列は、好ましくは哺乳動物からのＶＨ配列、より好ましくはヒトのＶＨ配列、例えばＶＨ３配列である。しかし、かかる本発明のラクダ化ＩＳＶは、それ自体公知の任意の好適な様式において得ることができ、したがって、厳密には、天然に存在するＶＨドメインを出発材料として含むポリペプチドを用いて得られたポリペプチドに限定されないことに注意すべきである。
【０２０４】
例えば、再び本明細書においてさらに記載されるように、「ヒト化」および「ラクダ化」はいずれも、それぞれ天然に存在するＶＨＨドメインまたはＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列を提供し、次いで、前記ヌクレオチド配列中の１つ以上のコドンを、新たなヌクレオチド配列が、それぞれ「ヒト化された」または「ラクダ化された」本発明のＩＳＶをコードするように、それ自体公知の様式において変更することにより、行うことができる。この核酸を、次いで、所望される本発明のＩＳＶを提供するためにそれ自体公知の様式において発現させることができる。あるいは、それぞれ天然に存在するＶＨＨドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列に基づいて、それぞれ所望される本発明のヒト化またはラクダ化ＩＳＶのアミノ酸配列を設計して、次いで、それ自体公知のペプチド合成のための技術を用いて、de novoで合成することができる。また、それぞれ天然に存在するＶＨＨドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列に基づいて、それぞれ所望される本発明のヒト化またはラクダ化ＩＳＶをコードするヌクレオチド配列を設計して、次いで、それ自体公知の核酸合成のための技術を用いて、de novoで合成することができ、その後、そのようにして得られた核酸を、所望される本発明のＩＳＶを提供するために、それ自体公知の様式において発現させることができる。
【０２０５】
特に、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドにおいて存在するフレームワーク配列は、本発明のアグリカン結合剤がナノボディとなるように、例えばＷＯ  ０８／０２００７９（表Ａ−３〜Ａ−８）において定義されるような、ホールマーク残基の１つ以上を含んでもよい。かかるフレームワーク配列（の好適な組み合わせ）のいくつかの好ましいが非限定的な例は、本明細書におけるさらなる開示から明らかとなるであろう（例えば、表Ａ−２を参照）。一般に、ナノボディ（特に、ＶＨＨ配列および部分的にヒト化ナノボディ）は、特に、フレームワーク配列の１つ以上における１つ以上の「ホールマーク残基」の存在により特徴づけることができる（例えば、ＷＯ  ０８／０２００７９、６１頁２４行〜９８頁３行においてさらに記載されるとおりである）。本明細書において用いられる場合、任意の配列番号に関する「により表される」は、前記配列番号「を含むか、またはこれからなる」に等しく、好ましくは前記配列番号「からなる」に等しい。
【０２０６】
ことさらには、本発明は、（一般）構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＩＳＶを含むアグリカン結合剤を提供し、
ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４は、それぞれフレームワーク領域１〜４を指し、ここで、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３は、それぞれ相補性決定領域１〜３を指し、およびこれは：
ｉ）配列番号１１７、１１６、１１８、１１６、１１５、１１４および１〜１９のアミノ酸配列の少なくとも１つと、少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％のアミノ酸同一性を有し（表Ａ−２を参照）、ここで、アミノ酸同一性の程度を決定することを目的として、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は、無視される。このことに関して、また、配列番号１１７、１１８、１１６、１１５、１１４および１〜１９の免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク１配列（配列番号１１９、１２０および７５〜８４）、フレームワーク２配列（配列番号１２１および８５〜９３）、フレームワーク３配列（配列番号１２３、１２４、１２２、９４〜１０４および１１２−１１３）ならびにフレームワーク４配列（配列番号１０５〜１０８）を列記する表Ａ−２に対して参照がなされる；または
ｉｉ）表Ａ−２において表されるようなフレームワーク配列の組み合わせ；
ならびにここで；
ｉｉｉ）好ましくは、Kabat番号づけによる位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４および１０８におけるアミノ酸残基の１つ以上が、例えばＷＯ  ０８／０２００７９の表Ａ−３〜表Ａ−８において記述されるようなホールマーク残基から選択される。
【０２０７】
したがって、本発明は、ＩＳＶおよび／またはポリペプチドに関し、ここで、前記ＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および前記３つの相補性決定領域ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３から本質的になり、例えば、アグリカンに特異的に結合するＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および前記３つの相補性決定領域ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３からなり、治療用ＩＳＶ、例えば、セリンプロテアーゼファミリーのメンバー、カテプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）／マトリキシンまたはA Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs（ＡＤＡＭＴＳ）、好ましくはＭＭＰ８、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＡＤＡＭＴＳ５（アグリカナーゼ−２）、ＡＤＡＭＴＳ４（アグリカナーゼ−１）および／またはＡＤＡＭＴＳ１１に結合するＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および前記３つの相補性決定領域ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３からなり；血清アルブミンに結合するＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になる。
【０２０８】
本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドはまた、以下の同時係属中の全て表題「Improved immunoglobulin variable domains」の米国仮出願において記載される特定の変異／アミノ酸残基を含んでもよい：２０１４年５月１６日に出願されたＵＳ  ６１／９９４５５２；２０１４年６月１８日に出願されたＵＳ  ６１／０１４，０１５；２０１４年８月２１日に出願されたＵＳ  ６２／０４０，１６７；および２０１４年９月８日に出願されたＵＳ  ６２／０４７，５６０（全てAblynx N.V.に帰属する）。
【０２０９】
特に、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドは、以下を好適に含んでもよい：（ｉ）位置１１２におけるＫもしくはＱ；または（ｉｉ）位置１１におけるＶと組み合わせた位置１１０におけるＫもしくはＱ；または（ｉｉｉ）位置８９におけるＴ；または（ｉｖ）位置８９におけるＬと、位置１１０におけるＫもしくはＱ；または（ｖ）位置１１におけるＶと、位置８９におけるＬ；または（ｉ）〜（ｖ）の任意の好適な組み合わせ。
【０２１０】
前記の同時係属中の米国仮出願においてもまた記載されるとおり、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドが、上の（ｉ）〜（ｖ）のうちの１つによる変異（または好適なそれらの組み合わせ）を含む場合：
−  位置１１におけるアミノ酸残基は、好ましくは、Ｌ、ＶまたはＫ（および最も好ましくはＶ）から選択され；および
−  位置１４におけるアミノ酸残基は、好ましくは、ＡまたはＰから好適に選択され；および
−  位置４１におけるアミノ酸残基は、好ましくは、ＡまたはＰから好適に選択され；および
−  位置８９におけるアミノ酸残基は、好ましくは、Ｔ、ＶまたはＬから好適に選択され；および
−  位置１０８におけるアミノ酸残基は、好ましくは、ＱまたはＬから好適に選択され；および
−  位置１１０におけるアミノ酸残基は、好ましくは、Ｔ、ＫまたはＱから好適に選択され；および
−  位置１１２におけるアミノ酸残基は、好ましくは、Ｓ、ＫまたはＱから好適に選択される。
【０２１１】
前記の同時係属中の米国仮出願において記述されるとおり、前記の変異は、いわゆる「既存の抗体」の、本発明のＩＳＶ、ポリペプチドおよびコンストラクトへの結合を防止するかまたはこれを減少させることにおいて有効である。この目的のために、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドはまた、（任意に、前記変異と組み合わせて）Ｃ末端伸長部（Ｘ）ｎ（ここで、ｎは１〜１０、好ましくは１〜５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１）であり；ならびに各々のＸは、独立して選択される（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であって、好ましくは独立して、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）からなる群より選択される）を含んでもよく、これについて、再び前記米国仮出願ならびにＷＯ  １２／１７５７４１に参照がなされる。特に、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチドは、それがタンパク質、ポリペプチドまたは他の化合物またはそれを含むコンストラクトのＣ末端の終末を形成する場合、かかるＣ末端伸長部を含んでもよい（再び、前記米国仮出願ならびにＷＯ  １２／１７５７４１においてさらに記載されるとおりである。
【０２１２】
本発明のアグリカン結合剤は、任意の好適な様式において任意の好適なソースから誘導された免疫グロブリン、例えばＩＳＶであってよく、例えば、天然に存在するＶＨＨ配列（すなわち、ラクダ科の好適な種からの）、合成または半合成のアミノ酸配列であってよく、これは、これらに限定されないが、「ヒト化された」（本明細書において定義されるとおり）ナノボディまたはＶＨＨ配列、「ラクダ化された」（本明細書において定義されるとおり）免疫グロブリン配列（および特に、ラクダ化重鎖可変ドメイン配列）、ならびに親和性成熟（例えば、合成の、無作為な、または天然に存在する免疫グロブリン配列から出発して）、ＣＤＲ移植、ベニアリング（veneering）、異なる免疫グロブリン配列から誘導されるフラグメントを組み合わせること、重複するプライマーを用いるＰＣＲアセンブリーなどの技術、および当業者に周知の免疫グロブリン配列を操作するための類似の技術により得られたナノボディ；または本明細書においてさらに記載されるような前述のいずれかの任意の好適な組み合わせを含む。また、免疫グロブリンがＶＨＨ配列を含む場合、前記免疫グロブリンは、本明細書においてさらに記載されるように、１つ以上のさらなる（部分的にまたは完全に）ヒト化された本発明の免疫グロブリンを提供するために、好適にヒト化されていてもよい。同様に、免疫グロブリンが、合成または半合成の配列（部分的にヒト化された配列など）を含む場合、前記免疫グロブリンは、任意に、再び本明細書において記載されるように、１つ以上のさらなる（部分的にまたは完全に）ヒト化された本発明の免疫グロブリンを提供するために、さらに好適にヒト化されていてもよい。
【０２１３】
一側面において、本発明は、配列番号１１７、１１８、１１６、１１５、１１４および１〜１９からなる群より選択される、本発明のアグリカン結合剤、例えばＩＳＶを提供する。
【０２１４】
ＩＳＶは、ポリペプチドの調製のための「構成要素（building block）」として用いることができ、これは、任意に、アグリカン上の同じもしくは別のエピトープに対する、および／またはアグリカン以外の１つ以上の他の抗原、タンパク質もしくは標的に対する、１つ以上のさらなる「構成要素」、例えばＩＳＶ、例えば治療的な作用の機序を有する構成要素、例えば治療用ＩＳＶを含んでもよい。
【０２１５】
一般に、単一の構成要素、単一のＩＳＶまたは単一のナノボディを含むか、またはこれから本質的になるタンパク質またはポリペプチドまたはコンストラクトは、本明細書において、それぞれ、「一価の」タンパク質もしくはポリペプチドとして、または「一価のコンストラクト」と称されるであろう。２つ以上の構成要素または結合単位（例えばＩＳＶなど）を含むポリペプチドまたはコンストラクトは、本明細書において、「多価の」ポリペプチドまたはコンストラクトともまた称され、かかるポリペプチドまたはコンストラクト中に存在する構成要素／ＩＳＶは、本明細書において、「多価形式」におけるものともまた称されるであろう。例えば、「二価の」ポリペプチドは、２つのＩＳＶ、任意に、リンカーを介して連結されている配列を含んでもよく、一方、「三価の」ポリペプチドは、任意に２つのリンカー配列を介して連結された３つのＩＳＶを含んでもよく；一方、「四価の」ポリペプチドは、任意に３つのリンカー配列を介して連結された４つのＩＳＶを含んでもよい、など。
【０２１６】
多価のポリペプチドまたはコンストラクトにおいて、２つ以上のＩＳＶ、例えばナノボディは、同じであっても異なっていてもよく、同じ抗原または抗原決定基に対して（例えば同じ部分（単数または複数）もしくはエピトープ（単数または複数）に対して、または異なる部分もしくはエピトープに対して）向けられていてもよく、あるいは、異なる抗原または抗原決定基に対して向けられていてもよく；あるいは任意の好適なそれらの組み合わせであってもよい。少なくとも１つの構成要素が第１の抗原（すなわちアグリカン）に対して向けられており、少なくとも１つの構成要素が第２の抗原（すなわち、アグリカンとは異なるもの、例えば治療標的など）に対して向けられている、少なくとも２つの構成要素（例えばＩＳＶなど）を含むポリペプチドまたはコンストラクトは、それぞれ「多重特異性の」ポリペプチドまたは多重特異性コンストラクトともまた称され、かかるポリペプチドまたはコンストラクト中に存在する構成要素（例えばＩＳＶなど）は、本明細書において「多重特異的形式」にあるものともまた称されるであろう。したがって、例えば、「二重特異性の」本発明のポリペプチドは、第１の抗原（すなわちアグリカン）に対して向けられた少なくとも１つのＩＳＶ、および第２の抗原（すなわち、アグリカンとは異なるもの、例えば治療標的など）に対して向けられた少なくとも１つのさらなるＩＳＶを含むポリペプチドであり、一方、「三重特異性の」本発明のポリペプチドは、第１の抗原（すなわち、アグリカン）に対して向けられた少なくとも１つのＩＳＶ、第２の抗原（すなわち、アグリカンとは異なるもの、例えば治療標的など）に対して向けられた少なくとも１つのさらなるＩＳＶ、および第３の抗原（すなわち、アグリカンとも第２の抗原とも異なるもの）に対して向けられた少なくとも１つのさらなるＩＳＶを含むポリペプチドである；など。
【０２１７】
「マルチパラトープ型（multiparatopic）」のポリペプチドおよび「マルチパラトープ型」のコンストラクト、例えば、「バイパラトープ型（biparatopic）」のポリペプチドまたはコンストラクトおよび「トリパラトープ型（triparatopic）」のポリペプチドまたはコンストラクトなどは、各々が異なるパラトープを有する２つ以上の構成要素を含むか、またはこれらから本質的になる。
【０２１８】
したがって、アグリカンに結合する本発明のＩＳＶは、本質的に単離された形態（本明細書において定義されるとおり）であっても、またはそれらは、コンストラクトまたはポリペプチドの部分を形成してもよく、これは、アグリカンに結合する１つ以上のＩＳＶを含むか、またはこれらから本質的になってもよく、およびこれは、任意に、１つ以上のさらなるアミノ酸配列（全て、任意に、１つ以上の好適なリンカーを介して連結されている）をさらに含んでもよい。本発明は、アグリカンに結合する、少なくとも１つの本発明によるＩＳＶ、例えば１つ以上の本発明のＩＳＶ（またはその好適なフラグメント）を含むか、またはこれらから本質的になる、ポリペプチドまたはコンストラクトに関する。
【０２１９】
１つ以上の本発明のＩＳＶは、それぞれ一価、多価またはマルチパラトープ型の本発明のポリペプチドまたはコンストラクトを提供するために、かかるポリペプチドまたはコンストラクトにおいて結合単位または構成要素として用いることができ、全て本明細書において記載されるとおりである。本発明は、したがってまた、１つの本発明の一価のポリペプチドまたはＩＳＶを含むか、またはこれから本質的になる、一価のコンストラクトであるポリペプチドに関する。本発明は、したがってまた、それぞれ多価のポリペプチドまたは多価のコンストラクトである、ポリペプチドまたはコンストラクト、例えば、２つ以上の本発明のＩＳＶを含むか、またはこれらから本質的になる、二価または三価のポリペプチドまたはコンストラクトなどに関する（１つ以上のＶＨＨドメインを含む多価および多重特異性ポリペプチド、およびそれらの調製については、例えばまた、Conrathら（J. Biol. Chem. 276: 7346-7350, 2001）に、ならびに例えばＷＯ  ９６／３４１０３、ＷＯ  ９９／２３２２１およびＷＯ  ２０１０／１１５９９８に参照がなされる）。
【０２２０】
本発明はさらに、アグリカン、好ましくはヒトアグリカンに対して向けられた、少なくとも１つのＩＳＶ、例えば１つまたは２つのＩＳＶ（またはその好適なフラグメント）、および１つのさらなるＩＳＶを含むか、またはこれから（本質的に）なる、多価ポリペプチド（本明細書において「本発明の多価ポリペプチド（単数または複数）」ともまた称される）に関する。
【０２２１】
一側面において、その最も簡易な形態において、本発明の多価のポリペプチドまたはコンストラクトは、アグリカンに対して向けられた第１のＩＳＶ、例えばナノボディ、およびアグリカンに対して向けられた同一の第２のＩＳＶ、例えばナノボディを含む、二価の本発明のポリペプチドまたはコンストラクトであって、ここで、前記第１および前記第２のＩＳＶ、例えばナノボディは、任意に、リンカー配列（本明細書において定義されるとおり）を介して連結されていてもよい。別の形態において、本発明の多価のポリペプチドまたはコンストラクトは、アグリカンに対して向けられた第１のＩＳＶ、例えばナノボディ、アグリカンに対して向けられた同一の第２のＩＳＶ、例えばナノボディ、およびアグリカンとは異なる抗原、例えば治療標的などに対して向けられた第３のＩＳＶ、例えばナノボディを含む、本発明の三価のポリペプチドまたはコンストラクトであってよく、ここで、前記第１、第２、および第３のＩＳＶ、例えばナノボディは、任意に、１つ以上の、特に２つのリンカー配列を介して連結されていてもよい。
【０２２２】
別の側面において、本発明の多価のポリペプチドまたはコンストラクトは、アグリカンに対して向けられた第１のＩＳＶ、例えばナノボディ、および第２の抗原、例えば治療標的などに対して向けられた第２のＩＳＶ、例えばナノボディを含む、二重特異性の本発明のポリペプチドまたはコンストラクトであってもよく、ここで、前記第１および第２のＩＳＶ、例えばナノボディは、任意に、リンカー配列（本明細書において定義されるとおり）を介して連結されていてもよい；一方、本発明の多価のポリペプチドまたはコンストラクトはまた、アグリカンに対して向けられた第１のＩＳＶ、例えばナノボディ、第２の抗原、例えば治療標的などに対して向けられた第２のＩＳＶ、例えばナノボディ、および例えばまた治療標的などであるが前記第２の抗原とは異なる第３の抗原に対して向けられた第３のＩＳＶ、例えばナノボディを含む、三重特異性の本発明のポリペプチドまたはコンストラクトであってもよく、ここで、前記第１、第２、および第３のＩＳＶ、例えばナノボディは、任意に、１つ以上の、特に２つのリンカー配列を介して連結されていてもよい。
【０２２３】
好ましい側面において、本発明のポリペプチドまたはコンストラクトは、それぞれ、三価の二重特異性のポリペプチドまたはコンストラクトである。三価の二重特異性の本発明のポリペプチドまたはコンストラクトは、その最も簡易な形態において、アグリカンに対する２つの同一のＩＳＶ、例えばナノボディ、および例えば治療標的などの別の抗原に対して向けられた第３のＩＳＶ、例えばナノボディを含む、本発明の三価のポリペプチドまたはコンストラクト（本明細書において定義されるとおり）であってよく、ここで、前記第１、第２、および第３のＩＳＶ、例えばナノボディは、任意に、１つ以上の、特に２つのリンカー配列を介して連結されていてもよい。
【０２２４】
好ましい側面において、本発明のポリペプチドまたはコンストラクトは、それぞれ、三価の二重特異性のポリペプチドまたはコンストラクトである。三価の二重特異性の本発明のポリペプチドまたはコンストラクトは、アグリカンに対する２つのＩＳＶ、例えばナノボディ（ここで、アグリカンに対する前記ＩＳＶは、同じであっても異なっていてもよい）、および例えば治療標的などの別の抗原に対して向けられた第３のＩＳＶ、例えばナノボディを含む、本発明の三価のポリペプチドまたはコンストラクト（本明細書において定義されるとおり）であってよく、ここで、前記第１、第２および第３のＩＳＶ、例えばナノボディは、任意に、１つ以上の、および特に２つのリンカー配列を介して連結されてもよい。
本発明による特に好ましい三価の二重特異性のポリペプチドまたはコンストラクトは、本明細書において記載される例において、および表Ｅ−１およびＥ−２において示されるものである。
【０２２５】
別の側面において、本発明のポリペプチドは、二重特異性のポリペプチドまたはコンストラクトである。二重特異性の本発明のポリペプチドまたはコンストラクトは、その最も簡易な形態において、アグリカンに対するＩＳＶ、例えばナノボディを含む、二価の本発明のポリペプチドまたはコンストラクト（本明細書において定義されるとおり）、および例えば治療標的などの別の抗原に対して向けられた第２のＩＳＶ、例えばナノボディであってよく、ここで、前記第１および第２のＩＳＶ、例えばナノボディは、任意にリンカーを介して連結された配列であってもよい。
【０２２６】
好ましい側面において、本発明の多価のポリペプチドまたはコンストラクトは、アグリカンに対して向けられた２つ以上のＩＳＶを含むか、またはこれから本質的になる。一側面において、本発明は、本発明による少なくとも２つのアグリカンに結合するＩＳＶ、例えば２、３または４つのＩＳＶ（またはその好適なフラグメント）を含むか、またはこれから本質的になるポリペプチドまたはコンストラクトに関する。２つ以上のＩＳＶは、任意に、１つ以上のペプチド性リンカーを介して連結されていてもよい。
【０２２７】
本発明の多価のポリペプチドまたはコンストラクト中に存在する２つ以上のＩＳＶは、軽鎖可変ドメイン配列（例えばＶＬ配列）からなっても、重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列）からなってもよい；それらは、従来の４鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列からなっても、重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列からなってもよい。好ましい側面において、それらは、ドメイン抗体（またはドメイン抗体としての使用のために好適なアミノ酸）からなっても、単一ドメイン抗体（または単一ドメイン抗体としての使用のために好適なアミノ酸）からなっても、「ｄＡｂ」（またはｄＡｂとしての使用のために好適なアミノ酸）からなっても、ナノボディ（登録商標）（限定されないが、ＶＨＨを含む）からなっても、ヒト化ＶＨＨ配列からなっても、ラクダ化ＶＨ配列からなっても；または親和性成熟により得られたＶＨＨ配列からなる。２つ以上のＩＳＶは、部分的にまたは完全にヒト化されたナノボディまたは部分的にまたは完全にヒト化されたＶＨＨからなってもよい。
【０２２８】
本発明の一側面において、マルチパラトープ型（好ましくはバイパラトープ型またはトリパラトープ型）の本発明のポリペプチドまたはコンストラクトにおいて存在する第１のＩＳＶおよび第２のＩＳＶは、アグリカンへの結合について、互いに（交差）競合せず、したがって、異なるファミリーに属する。したがって、本発明は、２つ以上のＩＳＶを含むマルチパラトープ型(好ましくはバイパラトープ型)のポリペプチドまたはコンストラクトに関し、ここで、各々のＩＳＶは、異なるファミリーに属する。一側面において、このマルチパラトープ型（好ましくはバイパラトープ型）の本発明のポリペプチドまたはコンストラクトの第１のＩＳＶは、このマルチパラトープ型（好ましくはバイパラトープ型）の本発明のポリペプチドまたはコンストラクトの第２のＩＳＶのアグリカンへの結合を交差ブロッキングせず、および／または、第１のＩＳＶは、第２のＩＳＶによるアグリカンへの結合から交差ブロッキングされない。別の側面において、マルチパラトープ型(好ましくはバイパラトープ型）の本発明のポリペプチドまたはコンストラクトの第１のＩＳＶは、このマルチパラトープ型（好ましくはバイパラトープ型）の本発明のポリペプチドまたはコンストラクトの第２のＩＳＶのアグリカンへの結合を交差ブロッキングし、および／または第１のＩＳＶは、第２のＩＳＶによるアグリカンへの結合から交差ブロッキングされる。
【０２２９】
好ましい側面において、本発明のポリペプチドまたはコンストラクトは、２つ以上のＩＳＶを含むか、またはこれから本質的になり、これらのうちの少なくとも１つのＩＳＶは、アグリカンに対して向けられている。特に好ましい側面において、本発明のポリペプチドまたはコンストラクトは、３つ以上のＩＳＶを含むか、またはこれから本質的になり、これらのうちの少なくとも２つのＩＳＶは、アグリカンに対して向けられている。前記のアグリカンに対して向けられた少なくとも２つのＩＳＶは、同じであっても異なっていてもよく、アグリカンの同じエピトープ対して向けられていても、異なるエピトープに対して向けられていてもよく、同じエピトープビンに属していても、異なるエピトープビンに対して属していてもよく、および／またはアグリカンの同じドメインに結合しても異なるドメインに結合してもよいことは、理解されるであろう。
【０２３０】
好ましい側面において、本発明のポリペプチドまたはコンストラクトは、少なくとも２つのＩＳＶを含むか、またはこれから本質的になり、ここで、前記少なくとも２つのＩＳＶは、同じであっても異なっていてもよく、これらは、独立して、配列番号１１７、１１８、１１６、１１５および１〜１９からなる群より選択され、より好ましくは、前記少なくとも２つのＩＳＶは、配列番号１１７、５、６、８、１１４〜１１６からなる群より選択され、および／または前記少なくとも２つのＩＳＶは、配列番号１１８および１３からなる群より選択される。
【０２３１】
さらなる側面において、本発明は、アグリカンに対して向けられた２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインであって、配列番号１１７、１１８、１１４、１１５、１１６および１〜１９のいずれか１つにより結合されるような、同じエピトープ（単数または複数）に結合するものを含む、マルチパラトープ型（好ましくはバイパラトープ型）のポリペプチドまたはコンストラクトに関する。
【０２３２】
臨床用途のための分子の最終的な形式は、アグリカンに結合する１つまたは２つの構成要素、例えばＩＳＶ、および、治療的な作用の様式を有する１つ以上の構成要素、例えばＩＳＶ、およびおそらくはさらなる部分を含むことが、理解される。例のセクションにおいて、かかる形式が、アグリカン結合および保持の両方の特性、ならびに治療効果、例えば酵素および／または阻害機能を保持することが示される。治療的な作用の様式を有する１つ以上の構成要素、例えばＩＳＶは、アグリカンが関与する疾患、例えば関節炎疾患、変形性関節症、脊椎骨端骨幹端異形成、腰椎椎間板変性疾患、変形性関節疾患、関節リウマチ、離断性骨軟骨炎、アグリカン症（aggrecanopathies）、アグリカンが、他の、例えば治療的な、構成要素を、望ましい部位において（例えば関節においてなど）指揮するか、アンカリングするか、および／または保持するために用いられる疾患において、治療効果を有する任意の構成要素（「治療用構成要素」または「治療用ＩＳＶ」）であってよい。本発明は、したがって、１つ以上のさらなる構成要素、例えばさらなるＩＳＶが活性を保持する、本発明によるポリペプチドまたはコンストラクトに関する。
【０２３３】
本発明は、アグリカンに結合する少なくとも１つの本発明によるＩＳＶ、例えば１つ以上の本発明のＩＳＶ（またはその好適なフラグメント）、および少なくとも１つのさらなるＩＳＶ、特に治療用ＩＳＶを含むか、またはこれらから本質的になるポリペプチドまたはコンストラクトに関し、ここで、前記少なくとも１つのさらなるＩＳＶは、好ましくは治療標的に結合する、例えば、セリンプロテアーゼファミリーのメンバー、カテプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）／マトリキシンまたはA Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs（ＡＤＡＭＴＳ）、好ましくはＭＭＰ８、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＡＤＡＭＴＳ５（アグリカナーゼ−２）、ＡＤＡＭＴＳ４（アグリカナーゼ−１）および／またはＡＤＡＭＴＳ１１に結合する。
【０２３４】
一側面において、本発明は、アグリカンに結合する少なくとも１つのＩＳＶおよび治療効果を有する少なくとも１つのさらなるＩＳＶ、例えば治療用構成要素から本質的になるか、またはこれらを含む、本発明のポリペプチドまたはコンストラクトに関する。治療効果は、以下にさらに詳細に記載されるであろう疾患を寛解させるか、処置するか、または予防する、任意の所望される効果であってよい。好ましくは、さらなるＩＳＶ、例えば治療用ＩＳＶは、プロテアーゼ活性を阻害または減少させる、例えば、治療標的の、すなわち、セリンプロテアーゼファミリーのメンバー、カテプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）／マトリキシンまたはA Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs（ADAMTS）、好ましくはＭＭＰ８、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＡＤＡＭＴＳ５（アグリカナーゼ−２）、ＡＤＡＭＴＳ４（アグリカナーゼ−１）および／またはＡＤＡＭＴＳ１１の活性を、阻害または減少させる。活性を阻害または減少させることは、プロテアーゼまたはプロテイナーゼの活性部位に結合することにより、またはその構造を修飾することにより、当該プロテアーゼまたはプロテイナーゼの標的タンパク質の加水分解を妨げるかおよび／または低下させることにより、達成することができる。
【０２３５】
一側面において、本発明は、表Ｅ−１および表Ｅ−２のポリペプチドおよびコンストラクトから選択される本発明のポリペプチドまたはコンストラクトに関する。
一側面において、本発明は、滑液（ＳＦ）中で３７℃において、１４日間、２１日間、１か月間、２か月間またはさらには３か月間などの、少なくとも７日間の安定性を有する、本発明のＩＳＶ、ポリペプチドまたはコンストラクトに関する。
一側面において、本発明は、軟骨保持アッセイにおいて、少なくとも、３、４、５または６ＲＵなどの、少なくとも２ＲＵの軟骨保持を有する、本発明のＩＳＶ、ポリペプチドまたはコンストラクトに関する。
一側面において、本発明は、少なくとも１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、またはさらにはそれを超えるなど、少なくとも５μｍ、軟骨中へと浸透する、本発明のＩＳＶ、ポリペプチドまたはコンストラクトに関する。
【０２３６】
本発明のポリペプチド、コンストラクトまたはＩＳＶの安定性は、当業者に公知の慣用的なアッセイにより測定することができる。典型的なアッセイとして（限定されることなく）、例えば再び例のセクションにおいて（例６を参照）詳述されるように、前記ポリペプチド、コンストラクトまたはＩＳＶの活性を決定し、その後、所望される期間にわたり滑液中でインキュベートし、その後、活性を決定するアッセイが挙げられる。
【０２３７】
本発明の多価のポリペプチドまたはコンストラクトにおける治療的な構成要素の所望される活性は、当業者に公知の慣用的なアッセイにより測定することができる。典型的なアッセイとして、例のセクションにおいて（例８を参照）詳述されるように、ＧＡＧ放出がアッセイされるアッセイが挙げられる。
【０２３８】
相対的な親和性は、ポリペプチド中のＩＳＶＤの位置に依存し得る。本発明のポリペプチド中のＩＳＶＤの順序（配向）は、当業者の必要性に応じて選択することができる。個々のＩＳＶＤの順序、ならびにポリペプチドがリンカーを含むか否かは、設計上の選択の問題である。リンカーを有するかこれを有さないいくつかの配向は、他の配向と比較して 好ましい結合の特徴を提供する場合がある。例えば、本発明のポリペプチド中の第１のＩＳＶ（例えば、ＩＳＶ１）および第２のＩＳＶ（例えば、ＩＳＶ２）の順序は、以下であってもよい（Ｎ末端からＣ末端へ）：（ｉ）ＩＳＶ１（例えば、ナノボディ１）−［リンカー］−ＩＳＶ２（例えば、ナノボディ２）−［Ｃ末端伸長部］；または（ｉｉ）ＩＳＶ２（例えば、ナノボディ２）−［リンカー］−ＩＳＶ１（例えば、ナノボディ１）−［Ｃ末端伸長部］；（ここで、角括弧の間の部分、すなわちリンカー、およびＣ末端伸長部は、任意である）。全ての配向は、本発明により包含される。所望される結合の特徴を提供するＩＳＶの配向を含むポリペプチドは、例えば、例のセクションにおいて例示されるような慣用的なスクリーニングにより容易に同定することができる。好ましい順序は、Ｎ末端からＣ末端へ、以下のとおりである：治療用ＩＳＶ−［リンカー］−アグリカンに結合するＩＳＶ−［Ｃ末端伸長部］、ここで、角括弧の間の部分は、任意である。別の好ましい順序は、Ｎ末端からＣ末端へ、以下のとおりである：治療用ＩＳＶ−［リンカー］−アグリカンに結合するＩＳＶ−［リンカー］−アグリカンに結合するＩＳＶ−［Ｃ末端伸長部］、ここで、角括弧の間の部分は、任意である。
【０２３９】
本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のポリペプチドおよび／またはＩＳＶは、１つ以上の他の基、残基（例えばアミノ酸残基）、部分または結合単位を、さらに含んでも、含まなくともよい（これらのアグリカン結合剤、例えばポリペプチドおよび／またはＩＳＶ（さらなる基、残基、部分または結合単位を含むもの、またはこれを含まないもの）は、全て、「本発明の化合物（単数または複数）」、「本発明のコンストラクト（単数または複数）」および／または「本発明のポリペプチド（単数または複数）」と称される）。存在する場合、かかるさらなる基、残基、部分または結合単位は、ポリペプチドおよび／またはＩＳＶなどのアグリカン結合剤にさらなる機能性を提供するものであっても、そうでなくともよく、ポリペプチドおよび／またはＩＳＶのアグリカン結合剤の特性を修飾するものであっても、そうでなくともよい。
【０２４０】
例えば、かかる更なる基、残基、部分または結合単位は、１つ以上の更なるアミノ酸配列でもよく、そうすると、生じるポリペプチドは（融合）ポリペプチドとなる。好適かつ非限定的な側面では、前記１つ以上他の基、残基、部分または結合単位は、免疫グロブリンである。さらにより好ましくは、前記１つ以上他の基、残基、部分または結合単位は、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に適するアミノ酸、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に適するアミノ酸、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用に適するアミノ酸、ナノボディ（例えば例えばＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨまたはラクダ化ＶＨ配列）からなる群から選択されるＩＳＶである。
【０２４１】
上述の通り、更なる結合単位、例えば異なる抗原特異性を有するＩＳＶを連結して多重特異的なポリペプチドを形成することができる。２以上の特異性のＩＳＶを結合することによって、二重特異性、三重特異性等のポリペプチドまたはコンストラクトを形成しることができる。例えば、本発明のポリペプチドは、アグリカンに対する２つ以上のＩＳＶと、別の標的に対する少なくとも１つのＩＳＶとを含んでもよい。かかる構築物およびその修飾物はいずれも、（当業者に容易に想定できるように）、「本発明の化合物、本発明の構築物および／または本発明のポリペプチド」という本明細書で用いられる用語に包含される。
【０２４２】
上記の化合物、構築物および／またはポリペプチドにおいて、１つ、２つ、３つまたはそれ以上のＩＳＶ、および１つ以上の基、残基、部分または結合単位は各々、直接に、および／または１つ以上の適切なリンカーまたはスペーサを介して連結されてもよい。例えば、１つ以上の基、残基、部分または結合単位がアミノ酸配列であるとき、リンカーはアミノ酸配列でもよく、その結果、得られるポリペプチドは融合（タンパク質）または融合（ポリペプチド）となる。
【０２４３】
１つ以上の更なる基、残基、部分または結合単位は、いかなる適切なおよび／または目的のアミノ酸配列でもあってもよい。更なるアミノ酸配列は、本発明のポリペプチドの（生物学的）特性を変化させても、または変化させなくともよく、影響してもよく、また、本発明のポリペプチドに更なる官能性を付与しても、または付与しなくともよい。好ましくは、更なるアミノ酸配列は、それが本発明のポリペプチドに１つ以上の所望の特性または官能性を付与するものである。
【０２４４】
かかるアミノ酸配列の例は、当業者に明らかであり、一般的には、通常抗体およびその断片に基づくペプチド融合において用いられるあらゆるアミノ酸配列（限定されないが、ＳｃＦｖおよび単一ドメイン抗体を含む）を含んでもよい。参照としては、例えばHolliger and Hudson (Nature Biotechnology 23: 1126-1136, 2005)によるレビューが挙げられる。
【０２４５】
例えば、かかるアミノ酸配列は、本発明のポリペプチドそれ自体と比較し、半減期、溶解性または吸収を増加させ、免疫原性または毒性を減少させ、好ましくない副作用を排除または軽減し、および／または他の有利な特性を付与し、および／または、本発明の化合物、構築物またはポリペプチドの望ましくない特性を減少させるアミノ酸配列であってもよい。かかるアミノ酸配列の幾つかの非限定的な例は、血清タンパク質であり、例えばヒト血清アルブミン（例えばＷＯ  ００／２７４３５を参照）またはハプテン分子（例えば循環抗体により認識されるハプテン、例えばＷＯ  ９８／２２１４１を参照）である。
【０２４６】
本発明の特定の側面において、本発明のコンストラクトまたはポリペプチドは、当該部分を含まない対応する本発明のコンストラクトまたはポリペプチドと比較して、延長された半減期をもたらす部分を有していてもよい。本発明のかかるコンストラクトおよびポリペプチドのいくつかの好ましいが非限定的な例は、本明細書におけるさらなる開示に基づいて、当業者に明らかとなり、例えば、以下を含む：その半減期を延長するように（例えば、ペグ化により）化学修飾されている本発明のＩＳＶまたはポリペプチド；血清タンパク質（血清アルブミンなど）に結合するための少なくとも１つのさらなる結合部位を含む、本発明のアグリカン結合剤、例えば本発明のＩＳＶおよび／またはポリペプチド；または、本発明のアミノ酸配列の半減期を延長する少なくとも１つの部分（および特に少なくとも１つのアミノ酸配列）に連結されている、本発明の少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、本発明のポリペプチド。かかる半減期延長部分またはＩＳＶを含む、本発明のコンストラクト、例えば本発明のポリペプチドの例は、本明細書におけるさらなる開示に基づいて、当業者に明らかとなり；および、例えば、限定することなく以下を含む：１つ以上の本発明のＩＳＶが、１つ以上の血清タンパク質もしくはそのフラグメント（(ヒト)血清アルブミンもしくはその好適なフラグメントなど）に、または１つ以上の血清タンパク質に結合することができる結合単位（例えば、血清アルブミンなど（ヒト血清アルブミンなど）の血清タンパク質、ＩｇＧなどの血清免疫グロブリン、もしくはトランスフェリンに結合することができる、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用のために好適なＩＳＶ、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用のために好適なＩＳＶ、ｄＡｂｓ、ｄＡｂとしての使用のために好適なＩＳＶ、もしくはナノボディなど；さらなる記載および本明細書において記述される参考文献に対する参照がなされる）に、好適に連結されている、ポリペプチド；本発明のアミノ酸配列が、Ｆｃ部分（ヒトＦｃなど）または好適な部分またはそのフラグメントに連結されているポリペプチド；あるいは、１つ以上の本発明のＩＳＶが、１つ以上の血清タンパク質に結合することができる小タンパク質またはペプチド、例えばＷＯ  ９１／０１７４３、ＷＯ  ０１／４５７４６、ＷＯ  ０２／０７６４８９、ＷＯ２００８／０６８２８０、ＷＯ２００９／１２７６９１およびＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５１５５９において記載されるタンパク質およびペプチドなどに、好適に連結されているポリペプチド。
【０２４７】
一側面において、本発明は、本発明のコンストラクト、例えばポリペプチドを提供し、ここで、前記ポリペプチドは、血清タンパク質結合部分または血清タンパク質をさらに含む、
好ましくは、前記血清タンパク質結合部分は、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミンに結合する。
【０２４８】
一般に、延長された半減期を有する本発明のコンストラクトまたはポリペプチドは、好ましくは、対応する本発明のコンストラクトまたはポリペプチドそれ自体、すなわち延長された半減期をもたらす部分を含まないものの半減期よりも、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍、または２０倍を超えてより長い半減期を有する。例えば、半減期が延長された本発明のコンストラクトまたはポリペプチドは、例えば、ヒトにおいて、対応する本発明のコンストラクトまたはポリペプチドそれ自体、すなわち延長された半減期をもたらす部分を含まないものと比較して、１時間、好ましくは２時間より長く、より好ましくは６時間より長く、例えば１２時間より長く、またはさらには２４、４８もしくは７２時間より長く延長された半減期を有していてもよい。
【０２４９】
本発明の好ましいが非限定的な側面において、本発明のコンストラクト、例えば本発明のポリペプチドは、例えば、ヒトにおいては、対応する本発明のコンストラクトまたはポリペプチド自体、すなわち、延長された半減期をもたらす部分を伴わないものと比較して、１時間より長く、好ましくは２時間より長く、より好ましくは６時間より長く、例えば１２時間より長く、またはさらには２４、４８または７２時間より長く延長された、血清半減期を有する。
【０２５０】
本発明の別の好ましいが非限定的な側面において、かかる本発明のコンストラクト、例えば本発明のポリペプチドは、ヒトにおいて、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間またはそれより長い血清半減期を示す。例えば、本発明の化合物またはポリペプチドは、少なくとも５日間（約５〜１０日間など）、好ましくは少なくとも９日間（約９〜１４日間など）、より好ましくは少なくとも約１０日間（約１０〜１５日間など）、または少なくとも約１１日間（約１１〜１６日間など）、より好ましくは少なくとも約１２日間（約１２〜１８日間などまたはそれより長い）、または１４日間より長い（約１４〜１９日間など）半減期を有していてもよい。
【０２５１】
本発明の特に好ましいが非限定的な側面において、本発明は、アグリカンに結合する１つ以上の構成要素および場合によっては１つ以上の治療用構成要素の他に、本明細書において記載されるとおり、血清アルブミンに結合する少なくとも１つの構成要素、例えば血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）に結合するＩＳＶを含む、本発明のコンストラクト、例えば本発明のポリペプチドを提供し、ここで、前記血清アルブミンに結合するＩＳＶは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含むか、またはこれから本質的になり、ここで、ＣＤＲ１は、ＳＦＧＭＳであり、ＣＤＲ２は、ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧであり、およびＣＤＲ３は、ＧＧＳＬＳＲである。好ましくは、前記ヒト血清アルブミンに結合するＩＳＶは、Ａｌｂ８、Ａｌｂ２３、Ａｌｂ１２９、Ａｌｂ１３２、Ａｌｂ１３５、Ａｌｂ１１、Ａｌｂ１１（Ｓ１１２Ｋ）−Ａ、Ａｌｂ８２、Ａｌｂ８２−Ａ、Ａｌｂ８２−ＡＡ、Ａｌｂ８２−ＡＡＡ、Ａｌｂ８２−Ｇ、Ａｌｂ８２−ＧＧ、Ａｌｂ８２−ＧＧＧ、Ａｌｂ９２またはＡｌｂ２２３からなる群より選択される（表Ｃを参照）。
【０２５２】
一態様において、本発明は、血清タンパク質結合部分を含む本発明のコンストラクト、例えばポリペプチドに関し、ここで、前記血清タンパク質結合部分は、非抗体ベースのポリペプチドである。
【０２５３】
一側面において、本発明は、１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位を含む、本明細書において記載されるような化合物またはコンストラクトに関し、これらは、
好ましくは、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそのフラグメント、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小タンパク質またはペプチドからなる群より選択される。
【０２５４】
一態様において、本発明は、半減期の延長をもたらす部分を含む本発明のコンストラクト、例えばポリペプチドに関し、ここで、前記部分は、ＰＥＧである。したがって、本発明は、ＰＥＧを含む、本発明のコンストラクトまたはポリペプチドに関する。
【０２５５】
さらなるアミノ酸残基は、本発明のポリペプチドの他の（生物学的）特性を変化させるか、改変するか、または別段に影響を及ぼすものであっても、そうでなくともよく、本発明のポリペプチドにさらなる機能性を付加するものであっても、そうでなくともよい。例えば、かかるアミノ酸残基は：
ａ）Ｍｅｔ残基、例えば異種の宿主細胞または宿主生物における発現の結果として、Ｎ末端Ｍｅｔ残基を含んでもよく；
ｂ）合成の後で宿主細胞からのポリペプチドの分泌を指揮するシグナル配列またはリーダー配列を形成してもよい（（例えば、本発明のポリペプチドを発現させるために用いられる宿主細胞に依存して、本発明のポリペプチドのプレ形態、プロ形態またはプレプロ形態を提供するために）。好適な分泌型リーダーペプチドは、当業者には明らかであり、本明細書においてさらに記載されるものであってよい。通常は、かかるリーダー配列は、ポリペプチドのＮ末端に連結するが、本発明は、その最も広義において、それに限定されない；
ｃ）例えば前記配列または残基に対して向けられた親和性技術を用いて、「タグ」、例えば、ポリペプチドの精製を可能にするかまたはこれを促進するアミノ酸配列または残基を形成してもよい。その後、前記配列または残基を、取り除いて（例えば、化学的切断または酵素切断により）ポリペプチドを提供することができる（この目的のために、タグは、任意に、切断可能なリンカー配列を介してアミノ酸配列またはポリペプチド配列に連結されるか、または切断可能なモチーフを含んでもよい）。かかる残基のいくつかの好ましいが非限定的な例は、複数のヒスチジン残基、グルタチオン残基およびｍｙｃタグ（ＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡなど）である；
ｄ）官能化されているか、および／または官能基の付加のための部位として働き得る１つ以上のアミノ酸残基であってもよい。好適なアミノ酸残基および官能基は、は、当業者には明らかであり、これらに限定されないが、本明細書において記述される本発明のポリペプチドの誘導体のためのアミノ酸残基および官能基が挙げられる。
【０２５６】
本発明のコンストラクト、例えば本発明のポリペプチドにおいて、２つ以上の構成要素、例えばＩＳＶなど、および任意に１つ以上の他の基、薬物、剤、残基、部分または結合単位は、互いに直接連結されてもよく（例えばＷＯ  ９９／２３２２１において記載されるように）、および／または、互いに１つ以上の好適なスペーサーまたはリンカーを介して連結していてもよく、または任意のそれらの組み合わせであってもよい。多価かつ多重特異性のポリペプチドにおける使用のために好適なスペーサーまたはリンカーは、当業者には明らかであり、一般に、アミノ酸配列を連結するために当該分野において用いられる任意のリンカーまたはスペーサーであってよい。好ましくは、前記リンカーまたはスペーサーは、医薬用途のために意図されるコンストラクト、タンパク質またはポリペプチドを構築することにおける使用のために好適である。
【０２５７】
例えば、本発明のポリペプチドは、例えば、アグリカンに結合する１つの構成要素（ＩＳＶなど）、１つの治療用構成要素（ＩＳＶなど）、および（ヒト）血清アルブミンに結合する１つの構成要素（ＩＳＶなど）を含む、三価の、三重特異性ポリペプチドであってよく、ここで、前記第１、第２、および第３の構成要素（ＩＳＶなど）は、任意に、１つ以上の、特に２つのリンカー配列を介して連結されていてもよい。また、本発明は、アグリカンに結合する第１のＩＳＶおよび／または第２のＩＳＶおよび／または場合によっては第３のＩＳＶおよび／または場合によっては血清アルブミンに結合するＩＳＶを含む、本発明のコンストラクトまたはポリペプチドを提供し、ここで、前記第１のＩＳＶおよび／または前記第２のＩＳＶおよび／または場合によっては前記第３のＩＳＶおよび／または場合によっては前記血清アルブミンに結合するＩＳＶは、リンカーを介して連結されている。
【０２５８】
いくつかの特に好ましいスペーサーとして、抗体フラグメントまたは抗体ドメインを連結するために当該分野において用いられるスペーサーおよびリンカーが挙げられる。これらは、上で引用される一般的な背景技術において記述されるリンカー、ならびに例えばダイアボディまたはＳｃＦｖフラグメントを構築するために当該分野において用いられるリンカーを含む（このことに関しては、しかし、ダイアボディにおいて、およびＳｃＦｖフラグメントにおいては、用いられるリンカー配列は、関連するＶＨおよびＶＬドメインが完全な抗原結合部位を形成するために集合することを可能にする長さ、可撓性の程度、および他の特性を有するべきであるが、本発明のポリペプチドにおいて用いられるリンカーの長さまたは可撓性については、各々のＩＳＶ（例えばナノボディ）は、それ自体で完全な抗原結合部位を形成するので、特段の限定は存在しないことに注意すべきである）。
【０２５９】
例えば、リンカーは、好適なアミノ酸配列、および特に、１〜５０、好ましくは１〜３０、例えば１〜１０アミノ酸残基のアミノ酸配列であってよい。かかるアミノ酸配列のいくつかの好ましい例として、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカー、例えば（ｇｌｙｘｓｅｒｙ）ｚ型のもの、例えば（例えばＷＯ  ９９／４２０７７において記載されるような（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３または（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３、ならびに本明細書において記述されるAblynxによる出願において記載されるＧＳ３０、ＧＳ１５、ＧＳ９およびＧＳ７リンカー（例えばＷＯ  ０６／０４０１５３およびＷＯ  ０６／１２２８２５を参照）、ならびにヒンジ様領域、例えば天然に存在する重鎖抗体のヒンジ領域または類似の配列（例えばＷＯ  ９４／０４６７８において記載されるものなど）が挙げられる。好ましいリンカーを、表Ｄにおいて表す（配列番号１５４〜１７０）。
【０２６０】
他の好適なリンカーは、一般に、有機化合物またはポリマー、特に、医薬用途のためのタンパク質における使用のために好適なものを含む。例えば、ポリ（エチレングリコール）部分は、抗体ドメインを連結するために用いられてきた；例えばＷＯ  ０４／０８１０２６を参照。
【０２６１】
用いられるリンカー（単数または複数）の長さ、可撓性の程度、および／または他の特性（重要ではないが、通常は、ＳｃＦｖフラグメントにおいて用いられるリンカーについてのものとして）は、最終的な本発明のコンストラクト、例えば本発明のポリペプチドの特性（限定されないが、ケモカインに対する、または他の抗原の１つ以上に対する親和性、特異性またはアビディティを含む）に対して何らかの影響を有していてもよいことは、本発明の範囲内に包含される。本明細書における開示に基づいて、当業者は、任意にいくつかの限定された慣用的な実験の後で、本発明の特異的なコンストラクト、例えば本発明のポリペプチドにおける使用のために最適なリンカー（単数または複数）を決定することができるであろう。
【０２６２】
例えば、アグリカンおよび別の標的に対して向けられた構成要素、ＩＳＶまたはナノボディを含む本発明の多価ポリペプチドにおいて、リンカーの長さおよび可撓性は、好ましくは、それが、本発明の各々の構成要素（ＩＳＶなど）が、ポリペプチド中に存在してそのコグネートな標的（例えば、標的の各々の上の抗原決定基）に結合することを可能にするようなものである。やはり、本明細書における開示に基づいて、当業者は、任意にいくつかの限定された慣用的な実験の後で、本発明の特異的なコンストラクト、例えば本発明のポリペプチドにおける使用のために最適なリンカー（単数または複数）を決定することができるであろう。
【０２６３】
また、用いられるリンカー（単数または複数）が、１つ以上の他の有利な特性または機能を本発明のコンストラクト、例えば本発明のポリペプチドに付与すること、ならびに／または誘導体の形成のために、および／もしくは官能基の付加のために１つ以上の部位を提供することも、本発明の範囲内である（例えば、本発明のＩＳＶの誘導体については、本明細書において記載されるとおりである）。例えば、１つ以上の荷電したアミノ酸残基を含むリンカーは、改善された親水性の特性を提供することができ、一方、小さいエピトープまたはタグを形成するかまたはこれを含むリンカーは、検出、同定および／または精製の目的のために用いることができる。やはり、本明細書における開示に基づいて、当業者は、任意にいくつかの限定された慣用的な実験の後で、本発明の特異的なポリペプチドにおける使用のために最適なリンカーを決定することができるであろう。
【０２６４】
最後に、本発明のポリペプチドなどのコンストラクトにおいて２つ以上のリンカーが用いられる場合、これらのリンカーは、同じであっても異なっていてもよい。やはり、本明細書における開示に基づいて、当業者は、任意にいくつかの限定された慣用的な実験の後で、本発明の特異的なコンストラクトまたはポリペプチドにおける使用のために最適なリンカーを決定することができるであろう。
【０２６５】
通常は、発現および生成の容易性のためには、本発明のコンストラクト、例えば本発明のポリペプチドは、直鎖状ポリペプチドであろう。しかし、本発明は、最も広義には、それに限定されない。例えば、本発明のコンストラクト、例えば本発明のポリペプチドが、３つ以上の構成要素、ＩＳＶまたはナノボディを含む場合、３つ以上の「腕」を有するリンカーの使用によりそれらを連結することが可能であり、その各々の「腕」は、「星形」のコンストラクトを提供するように、構成要素、ＩＳＶまたはナノボディに連結する。また、通常はあまり好ましくないが、環状コンストラクトを使用することも可能である。
【０２６６】
したがって、本発明は、前記ＩＳＶが、互いに直接連結されているか、または、リンカーを介して連結されている、本発明のコンストラクト、例えば本発明のポリペプチドに関する。
したがって、本発明は、第１のＩＳＶおよび／または第２のＩＳＶおよび／または場合によっては血清アルブミンに結合するＩＳＶが、リンカーを介して連結されている、本発明のコンストラクト、例えば本発明のポリペプチドに関する。
【０２６７】
したがって、本発明は、前記リンカーが、５ＧＳ、７ＧＳ、９ＧＳ、１０ＧＳ、１５ＧＳ、１８ＧＳ、２０ＧＳ、２５ＧＳ、３０ＧＳ、３５ＧＳ、ｐｏｌｙ−Ａ、８ＧＳ、４０ＧＳ、Ｇ１ヒンジ、９ＧＳ−Ｇ１ヒンジ、ラマアッパーロングヒンジ領域（llama upper long hinge region）およびＧ３ヒンジのリンカーからなる群より選択される、本発明のコンストラクト、例えば本発明のポリペプチドに関する。
したがって、本発明は、前記ポリペプチドが、表Ｅ−１および表Ｅ−２のポリペプチドからなる群より選択される、本発明のコンストラクト、例えば本発明のポリペプチドに関する。
【０２６８】
タグまたは他の機能性部分（例えば毒素、標識、放射性化学物質など）をさらに含む、本発明のＩＳＶまたはポリペプチドを含む化合物、構築物および／またはポリペプチドも本発明に包含される。
【０２６９】
他の基、残基、部分または結合単位は、例えば、単独で生物学的におよび／または薬理的に活性を有するか、または活性を有さない化学基、残基、部分であってもよい。例えば、限定されないが、かかる基は、本発明の１つ以上のＩＳＶまたはポリペプチドに連結されることにより、本発明のポリペプチドの「誘導体」を形成しうる。
【０２７０】
したがって、本発明は最も広義には、本発明のポリペプチドの誘導体である化合物、構築物および／またはポリペプチドも包含する。かかる誘導体は一般的には、本発明のポリペプチド中の、および／または本発明のポリペプチドを形成するアミノ酸残基の１つ以上の修飾によって、具体的には化学的および／または生物学的（例えば酵素的）修飾によって得ることが可能である。
【０２７１】
かかる修飾の例、ならびに、かかる修飾および潜在的用途およびかかる修飾による利点を導入するために用いることができる態様、方法および技術により修飾できるポリペプチド配列中の（すなわちタンパク質骨格、または好ましくは側鎖上への）アミノ酸残基の例は、当業者に明らかである（Zangi et al., Nat Biotechnol 31(10):898-907, 2013を参照）。
【０２７２】
例えば、かかる修飾では、（例えば共有結合的な連結、または他のいずれかの好適な方法により）、本発明のポリペプチドの内部および表面への１つ以上の官能基、残基または、部分への、特に、１つ以上の（官能）基、残基または部分への導入を行ってもよく、それにより、本発明のポリペプチドに１つ以上の所望の特性または官能性が付与される。かかる官能基の例は、当業者に明らかである。
【０２７３】
例えば、かかる修飾では、（例えば共有結合的な連結、または他のいずれかの好適な方法により）、１つ以上の官能基の導入を行ってもよく、それにより、本発明のポリペプチドの半減期、溶解性および／または吸収性が増加し、本発明のポリペプチドの免疫原性および／または毒性が減少し、本発明のポリペプチドのいずれかの好ましくない副作用を排除または軽減し、および／または、他の有利な特性を付与し、および／または、本発明のポリペプチドの望ましくない特性を減少させ、または前記の２つ以上のいかなる組合せを生じさせる。かかる官能基、およびそれらを導入する技術の例は当業者に明らかであり、通常、前記で引用した一般的な先行文献に記載のいずれの官能基および技術、ならびに、医薬用タンパク質の修飾のための、特に、抗体または抗体断片（ＳｃＦｖおよび単一ドメイン抗体を含む）の修飾のための官能基および公知技術それ自体が含まれ、参照として、例えばRemington (Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1980)が挙げられる。かかる官能基は、例えば、本発明のポリペプチドに（例えば共有結合で）直接連結されてもよく、または任意に適切なリンカーまたはスペーサを介して連結されてもよく、これらはまた当業者に明らかである。
【０２７４】
一つの具体的な例は、本発明のポリペプチドを（例えばＰＥＧ化によって）化学修飾し、その半減期を増加させた、本発明の誘導体ペプチドである。これは、半減期を増加させておよび／または医薬用タンパク質の免疫原性を低下させるために最も広く用いられる技術の１つであり、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはその誘導体（例えばメトキシポリ（エチレングリコール）またはｍＰＥＧ）などの適切な薬理的に許容できるポリマーの付加を含む。一般的に、いかなる適切な形態のＰＥＧ化も使用可能であり、例えば抗体および抗体断片、例えば（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖなどの分野で用いられるＰＥＧ化を用いることができ、参照としては、例えばChapman (Nat. Biotechnol. 54: 531-545, 2002)、Veronese and Harris (Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 453-456, 2003)、Harris and Chess (Nat. Rev. Drug. Discov. 2: 214-221, 2003)および国際公開第０４／０６０９６５）が挙げられる。例えばNektar Therapeutics社（米国）から、タンパク質のＰＥＧ化用の各種試薬も市販されている。
【０２７５】
好ましくは、特にシステイン残基を介する部位特異的ＰＥＧ化が用いられる（例えばYang et al. (Protein Engineering 16: 761-770, 2003）を参照。例えば、この場合、本発明のポリペプチドに天然に存在するシステイン残基にＰＥＧを付加することが可能であり、本発明のポリペプチドを、ＰＥＧ付加用の１つ以上のシステイン残基が最適に導入されるよう修飾してもよく、または、ＰＥＧ付加のための１つ以上のシステイン残基を含むアミノ酸配列を、本発明のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に融合させてもよく、いずれも、当業者に公知のタンパク質工学的技術を直接使用できる。
【０２７６】
好ましくは、本発明のポリペプチドの場合、５０００以上の、例えば１０，０００以上および２００，０００未満の、例えば１００，０００未満、例えば２０，０００〜８０，０００の範囲の分子量のＰＥＧが用いられる。
【０２７７】
別の、通常はあまり好ましくない修飾は、通常は、本発明のポリペプチドを発現させるために用いられる宿主細胞に依存して、翻訳時および／または翻訳後修飾の一部としての、Ｎ連結またはＯ連結のグリコシル化を含む。
【０２７８】
本発明のマーカーポリペプチドの使用目的に応じて、さらにもう別の修飾として、１つ以上の検出可能マーカーまたは他のシグナル発生基もしくは部分を導入してもよい。適切な標識およびそれらを付加し、使用し、検出する技術は、当業者に明らかであり、例えば、限定されないが、蛍光マーカー（例えばフルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、およびフルオレサミンおよび蛍光金属、例えばランタノイド系列の１５２Ｅｕまたは他の金属など、リン光性標識、化学発光標識または生物発光標識（ルミナール、イソルミノール、セロマチック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、オキサレートエステル、ジオキセタンまたはＧＦＰおよびその類縁体）、放射性同位元素（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅおよび７５Ｓｅ）、金属、金属キレートもしくは金属カチオン（例えば９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、９７Ｒｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａなどの金属カチオン）、または特にインビボ、インビトロまたはin situでの診断およびイメージング用に適する他の金属もしくは金属カチオン（例えば１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒおよび５６Ｆｅ）、ならびにクロモフォアおよび酵素（例えばリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌のヌクレアーゼ、δ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母のアルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ビオチンアビジンペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコール糖−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエスチラーゼ）。他の適切な標識が、当業者に明らかであり、例えばＮＭＲまたはＥＳＲ分光法を使用して検出できる部分が挙げられる。
【０２７９】
本発明のかかるマーカーポリペプチドは、例えばインビトロ、インビボまたはインサイチュアッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡなどの公知のイムノアッセイおよび他の「サンドイッチアッセイ」など）、ならびに（具体的な標識の選択により）インビボの診断およびイメージング目的に使用することができる。
【０２８０】
当業者に明らかであるように、例えば上記で言及した金属または金属カチオンの１つをキレート化するために、キレート基を導入する他の修飾を行ってもよい。例えば、適切なキレート基として、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８１】
さらに別の修飾として、特定の結合対（例えばビオチン−（ストレプト）アビジン結合対）の一部分である官能基を導入してもよい。かかる官能基を用いることにより、結合対の残り半分を結合させた他のタンパク質、ポリペプチドまたは化学物質に、いわゆる結合対の形成によって、本発明のポリペプチドを結合させることができる。例えば、本発明のポリペプチドは、ビオチンとコンジュゲートさせ、アビジンまたはストレプトアビジンとコンジュゲートさせた他のタンパク質、ポリペプチド、化合物または担体と連結させることができる。例えば、本発明のかかるコンジュゲートポリペプチドは、例えば検出可能なシグナル発生剤をアビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートした診断システムにおいて、レポーターとして用いることができる。かかる結合対は、例えば本発明のポリペプチドを、医薬用途に適する担体などの担体に結合するために用いることもできる。例えば、Cao and Suresh (Journal of Drug Targeting 8: 257, 2000)に記載のリポソーム製剤を参照。またかかる結合対を用いて、治療的活性剤を本発明のポリペプチドに連結させてもよい。
【０２８２】
他の有望な化学的および酵素的修飾も当業者に明らかである。研究用途（例えば機能−活性の関係の試験）用に、かかる修飾を導入してもよい。参照としては、例えばLundblad and Bradshaw (Biotechnol. Appl. Biochem. 26: 143-151, 1997)が挙げられる。
【０２８３】
好ましくは、前記化合物、構築物、ポリペプチドおよび／または誘導体は、本明細書において定義される（すなわち本発明のポリペプチドのために定義される）親和性（最適には、ＫＤ値（実際のまたは見かけの）、ＫＡ値（実際のまたは見かけの）、Ｋｏｎ速度および／またはＫｏｆｆ速度、あるいは本明細書にさらに記載されるＩＣ５０値として測定され、および／または表される）によりアグリカンと結合する。
本発明のかかる化合物、構築物および／またはポリペプチド、およびその誘導体は、（本明細書で定義されるように）本質的に単離された形態であってもよい。
【０２８４】
一側面において、本発明は、本発明によるＩＳＶまたは本発明によるポリペプチドを含むか、またはこれから本質的になる、本発明のコンストラクトに関し、およびここで、１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含み、これらは、任意に１つ以上のペプチド性リンカーを介して連結されている。
【０２８５】
一側面において、本発明は、１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位が、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはそのフラグメント、血清タンパク質に結合することができる結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合することができる小タンパク質またはペプチドからなる群より選択される、本発明のコンストラクトに関する。
本発明はさらに、本明細書において記載される化合物、コンストラクト、ポリペプチド、核酸、宿主細胞、および組成物を調製するための方法に関する。
【０２８６】
本発明の多価ポリペプチドは、一般に、本発明の多価ポリペプチドを提供するために、少なくとも、ＩＳＶおよび／または本発明の一価のポリペプチドを、任意に１つ以上の好適なリンカーを介して、１つ以上のさらなるＩＳＶに好適に連結するステップを含む方法により、調製することができる。本発明のポリペプチドはまた、少なくとも、本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供し、前記核酸を好適な様式において発現させ、発現された本発明のポリペプチドを回収するステップを含む方法により、調製することができる。かかる方法は、それ自体公知の様式において行うことができ、これは、例えば本明細書においてさらに記載される方法および技術に基づいて、当業者には明らかであろう。
【０２８７】
本発明の多価ポリペプチドを調製するための方法は、少なくとも、２つ以上の本発明のＩＳＶと例えば１つ以上のリンカーとを好適な様式において一緒に連結するステップを含んでもよい。本発明のＩＳＶ（およびリンカー）は、当該分野において公知であり、本明細書においてさらに記載される任意の方法によりカップリングすることができる。好ましい技術は、多価のポリペプチドを発現する遺伝子のコンストラクトを調製するために、本発明のＩＳＶ（およびリンカー）をコードする核酸配列を連結することを含む。アミノ酸または核酸を連結するための技術は、当業者には明らかであり、再び、上述のSambrook et al.およびAusubel et al.などの標準的なハンドブック、ならびに以下の例への参照がなされる。
【０２８８】
したがって、本発明はまた、本発明の多価ポリペプチドを調製することにおける、本発明のＩＳＶの使用に関する。多価のポリペプチドを調製するための方法は、本発明のＩＳＶを、少なくとも１つのさらなる本発明のＩＳＶに、任意に１つ以上のリンカーを介して連結することを含むであろう。本発明のＩＳＶは、次いで、２（例えば二価のポリペプチドにおいて）、３（例えば三価のポリペプチドにおいて）、４（例えば四価のポリペプチドにおいて）、またはそれより多く（例えば多価のポリペプチドにおいて）の構成要素を含む、多価ポリペプチドを提供および／または調製することにおいて、結合ドメインまたは構成要素として用いられる。このことに関して、本発明のＩＳＶは、２、３、４またはそれより多くの構成要素を含む、多価、例えば二価、三価または四価の本発明のポリペプチドを提供および／または調製することにおいて、結合ドメインまたは結合単位として用いることができる。
【０２８９】
したがって、本発明はまた、多価のポリペプチドを調製することにおける、本発明のＩＳＶポリペプチド（本明細書において記載されるとおり）の使用に関する。多価のポリペプチドの調製のための方法は、本発明のＩＳＶを、少なくとも１つのさらなる本発明のＩＳＶ、任意に、１つ以上のリンカーを介して連結することを含むであろう。
【０２９０】
本発明のポリペプチドおよび核酸は、公知の方法をそのまま使用し調製することができ、それは本明細書における更なる記載から当業者に明らかである。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体の調製に関する公知の、具体的には、抗体断片（限定されないが（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖ断片が含まれる）の調製のためのいずれかの方法をそのまま使用し調製することができる。ポリペプチドおよび核酸を調製する幾つかの好適かつ非限定的な方法には、本明細書に記載される方法および技術が含まれる。
【０２９１】
本発明のポリペプチドを産生する方法は、次のステップを含みうる：
−適切な宿主細胞または宿主生物（本明細書において「本発明の宿主」ともまた称される）において、または本発明の前記ポリペプチドをコードする核酸（本明細書において「本発明の核酸」ともまた称される）の他の適切な発現系において、発現させるステップと、次に任意に：
−このようにして得られた本発明のポリペプチドを単離および／または生成するステップ。
具体的には、かかる方法は、以下のステップを含みうる：
−本発明の前記宿主が本発明の少なくとも１つのポリペプチドを発現および／または産生する条件下で、本発明の宿主を培養および／または維持するステップと、次に任意に、
−このようにして得られた本発明のポリペプチドを単離および／または精製するステップ。
したがって、本発明はまた、本発明のポリペプチド、ＩＳＶまたはコンストラクトをコードする核酸またはヌクレオチド配列（「本発明の核酸」ともまた称される）に関する。
【０２９２】
本発明の核酸は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの形態であってよい。本発明の一態様により、本発明の核酸は、本明細書において定義されるように、本質的に単離された形態である。本発明の核酸はまた、ベクター、例えば発現ベクター、例えばプラスミド、コスミドまたはＹＡＣなどにおいて存在しても、および／またはこれの一部であってもよく、これはやはり、本質的に単離された形態であってよい。したがって、本発明はまた、本発明の核酸またはヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【０２９３】
本発明の核酸は、本明細書に記載される本発明のポリペプチドに関する情報に基づいて、公知の方法をそのまま使用し調製または取得することができ、および／または、適切な天然の給源から単離することもできる。また、当業者に明らかなように、本発明の核酸を調製するために、幾つかのヌクレオチド配列、例えば、本発明のＩＳＶをコードする少なくとも２つの核酸、および例えば１つ以上のリンカーをコードする核酸は、好適な方法で連結されうる。本発明の核酸を生成させる技術は当業者に明らかで、例えば、限定されないが、自動化ＤＮＡ合成、部位特異的変異導入、２つ以上の天然のおよび／または合成された配列（またはその２つ以上の部分）を結合すること、不完全長の発現産物の発現をもたらす変異の導入、１つ以上の制限酵素部位の導入（例えば適切な制限酵素を用いて容易に切断でき、および／またはライゲーションできるカセットおよび／または領域の作製）、および／または１つ以上の「ミスマッチ」プライマーを使用したＰＣＲ反応による変異導入が挙げられる。これらの、および他の技術は当業者に明らかであり、参照としては、標準的なハンドブックである、Sambrook et al.およびAusubel et al.（前記）、ならびに下記の実施例が挙げられる。
【０２９４】
好ましいが非限定的な態様において、本発明の遺伝子コンストラクトは、以下を含む：
ａ）少なくとも１つの本発明の核酸；
ｂ）プロモーターなどの１つ以上の調節エレメント、および任意に好適なターミネーター
に作動的に連結され；ならびに任意にまた、
ｃ）それ自体公知の遺伝子コンストラクトの１つ以上のさらなるエレメント；
ここで、用語「調節エレメント」、「プロモーター」、「ターミネーター」および「作動的に連結される」は、当該分野におけるそれらの通常の意味を有する。
【０２９５】
本発明の遺伝子コンストラクトは、一般に、例えば上述のSambrookら、およびAusubelらなどの一般的なハンドブックにおいて記載される技術を用いて、本発明のヌクレオチド配列（単数または複数）を上記の１つ以上のさらなるエレメントに好適に連結することにより、提供することができる。
【０２９６】
本発明の核酸および／または本発明の遺伝子コンストラクトは、宿主細胞または宿主生物を形質転換するために、すなわち本発明のポリペプチドの発現および／または産生のために、用いることができる。好適な宿主または宿主細胞は、当業者には明らかであり、例えば、抗体および抗体フラグメント（（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖフラグメントを含むがこれらに限定されない）の発現および産生のための（これは、当業者には明らかであろう）、任意の好適な真菌、原核生物または真核生物の細胞または細胞株、または任意の好適な真菌、原核生物または（非ヒト）真核生物の生体、ならびにそれら自体公知のすべての他の宿主細胞または（非ヒト）宿主であってよい。また、本明細書において上で引用される一般的な背景技術に、ならびに、例えば、ＷＯ  ９４／２９４５７；ＷＯ  ９６／３４１０３；ＷＯ  ９９／４２０７７；Frenken et al. (Res Immunol. 149: 589-99, 1998）；Riechmann and Muyldermans (1999）、supra；van der Linden (J. Biotechnol. 80: 261-70, 2000）；Joosten et al. (Microb. Cell Fact. 2: 1, 2003）；Joosten et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 66: 384-92, 2005）；および本明細書において引用されるさらなる参考文献に対して、参照がなされる。さらに、本発明のポリペプチドはまた、細胞フリーの発現系において発現および／または産生させることができ、かかる系の好適な例は、当業者には明らかであろう。本発明の宿主または宿主細胞を形質転換させるための好適な技術は、当業者には明らかであり、意図される宿主細胞／宿主生物および用いられるべき遺伝子コンストラクトに依存し得る。再び、上述のハンドブックおよび特許出願に対して参照がなされる。形質転換された宿主細胞（これは、安定な細胞株の形態におけるものであってよい）または宿主生物（これは、安定な変異体の系統または系であってよい）は、本発明のさらなる側面を形成する。したがって、本発明は、本発明による核酸、または本発明による発現ベクターを含む宿主または宿主細胞に関する。好ましくは、これらの宿主細胞または宿主生物は、それらが、（例えば、好適な条件下において）本発明のポリペプチドを（および宿主生物の場合においては、その少なくとも１つの細胞、部分、組織または器官において）、発現するか、または（少なくとも）これを発現することができるようなものである。本発明はまた、本発明の宿主細胞または宿主生物のさらなる世代、後代および／または子孫を含み、これは、例えば、細胞分裂により、または有性もしくは無性生殖により得ることができる。
【０２９７】
本発明のポリペプチドの発現をもたらす／得るために、形質転換された宿主細胞、または形質転換された宿主生物は、一般に（所望される）本発明のポリペプチドが発現される／産生されるような条件下において、保たれるか、維持されるか、および／または培養されてもよい。好適な条件は、当業者には明らかであり、通常は、用いられる宿主細胞／宿主生物に、ならびに（適切な）本発明のヌクレオチド配列の発現を制御する調節エレメントに依存するであろう。再び、上で本発明の遺伝子コンストラクトの段落において記述されたハンドブックおよび特許出願に対して、参照がなされる。
【０２９８】
本発明のポリペプチドは、次いで、宿主細胞／宿主生物から、および／または前記の宿主細胞または宿主生物をその中で培養した培地から、それ自体公知のタンパク質の単離および／または精製の技術、例えば（分取）クロマトグラフィーおよび／または電気泳動技術、示差沈殿技術、親和性技術（例えば、本発明のポリペプチドに融合した特異的な切断可能なアミノ酸配列を用いて）、および／または分取免疫学的技術（すなわち、単離されるべきポリペプチドに対する抗体を用いて）を用いて、単離することができる。
【０２９９】
一側面において、本発明は、本発明によるコンストラクト、ポリペプチドまたはＩＳＶを生成するための方法に関し、該方法は、少なくとも以下のステップを含む：（ａ）好適な宿主細胞または宿主生物において、または別の好適な発現系において、本発明による核酸配列を発現させること；任意にそれに続いて、（ｂ）本発明によるコンストラクト、ポリペプチドまたはＩＳＶを単離および／または精製すること。
一側面において、本発明は、本発明によるコンストラクト、ポリペプチド、ＩＳＶまたは核酸を含む、組成物に関する。
【０３００】
一般に、医薬用途のために、本発明のコンストラクト、ポリペプチドおよび／またはＩＳＶＤは、少なくとも１つの本発明のコンストラクト、ポリペプチドおよび／またはＩＳＶＤ、ならびに少なくとも１つの薬学的に受入可能なキャリア、希釈剤または賦形剤および／またはアジュバント、ならびに任意に１つ以上の医薬活性ポリペプチドおよび／または化合物を含む、医薬調製物または組成物として処方することができる。非限定的な例により、かかる処方物は、経口投与のため、非経口投与（静脈内、筋肉内または皮下注射または静脈内輸注によるものなど）のために、局所投与（関節内投与など）のため、吸入による、皮膚貼付剤による、移植片による、坐剤などによる投与のために好適な形態におけるものであってよく、ここで、関節内投与が好ましい。投与の様式に依存して、固体、半固体または液体であってよいかかる好適な投与形態、ならびにその調製物における使用のための方法およびキャリアは、当業者には明らかであり、本明細書においてさらに記載される。かかる医薬調製物または組成物は、本明細書において一般に、「医薬組成物」と称されるであろう。
【０３０１】
したがって、さらなる側面において、本発明は、少なくとも少なくとも１つの本発明のコンストラクト、少なくとも１つの本発明のポリペプチド、少なくとも１つの本発明のＩＳＶ、または少なくとも１つの本発明の核酸、および少なくとも１つの好適なキャリア、希釈剤または賦形剤（すなわち、医薬用途のために好適なもの）、および任意に１つ以上のさらなる活性物質を含む、医薬組成物に関する。特定の側面において、本発明は、本発明によるコンストラクト、ポリペプチド、ＩＳＶまたは核酸、好ましくは表Ｅ−１または表Ｅ−２のうちの少なくとも１つ、および少なくとも１つの好適なキャリア、希釈剤または賦形剤（すなわち、医薬用途のために好適なもの）、および任意に１つ以上のさらなる活性物質を含む、医薬組成物に関する。
【０３０２】
一般に、本発明のコンストラクト、ポリペプチド、および／またはＩＳＶは、それ自体公知の任意の好適な様式において、処方および投与することができる。例えば、上で引用される一般的な背景技術に（ならびに特にＷＯ  ０４／０４１８６２、ＷＯ  ０４／０４１８６３、ＷＯ  ０４／０４１８６５、ＷＯ  ０４／０４１８６７およびＷＯ  ０８／０２００７９）、ならびに標準的なハンドブック、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences、第１８版、Mack Publishing Company, USA（1990）、Remington、the Science and Practice of Pharmacy、第２１版、Lippincott Williams and Wilkins（2005）；またはHandbook of Therapeutic Antibodies（S. Dubel編）、Wiley, Weinheim, 2007年（例えば２５２〜２５５頁を参照）に、参照がなされる。
【０３０３】
特定の側面において、本発明は、本発明によるコンストラクト、ポリペプチド、ＩＳＶまたは核酸を含み、少なくとも１つの薬学的に受入可能なキャリア、希釈剤または賦形剤および／またはアジュバントをさらに含み、および任意に、１つ以上のさらなる医薬活性ポリペプチドおよび／または化合物を含む、医薬組成物に関する。
【０３０４】
本発明のコンストラクト、ポリペプチド、および／またはＩＳＶは、従来の抗体および抗体フラグメント（ＳｃＦｖおよびダイアボディを含む）および他の医薬活性タンパク質のためのそれ自体公知の任意の様式において処方および投与することができる。これらを調製するためのかかる処方および方法は、当業者には明らかであり、例えば、非経口投与（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、腔内、動脈内または髄腔内投与）のために、または局所（例えば、関節内、経皮または皮内）投与のために好適な調製物を含む。
【０３０５】
非経口投与のための調製物は、例えば、輸注または注射のために好適な無菌の溶液、懸濁液、分散またはエマルジョンであってよい。かかる調製物のために好適なキャリアまたは希釈剤として、例えば、ＷＯ  ０８／０２００７９の１４３頁において記述されるものが挙げられる。通常は、水性の溶液または懸濁液が好ましいであろう。
【０３０６】
本発明のコンストラクト、ポリペプチド、および／またはＩＳＶはまた、遺伝子治療から知られる送達の方法を用いて投与することができる。例えば、その遺伝子治療薬送達方法について参考として援用される米国特許第５，３９９，３４６号を参照。遺伝子治療の送達の方法を用いて、本発明のコンストラクト、ポリペプチド、および／またはＩＳＶをコードする遺伝子を遺伝子導入した初代細胞に、特定の臓器、組織、移植片、腫瘍、関節または細胞を標的とする組織特異的プロモーターをさらに遺伝子導入してもよく、さらに、細胞内に局在した発現のためのシグナルおよび安定化配列を、遺伝子導入してもよい。
【０３０７】
本発明のコンストラクト、ポリペプチド、および／またはＩＳＶはまた、静脈内で、関節内で、または腹腔内で、輸注または注射により、投与してもよい。特段の例は、ＷＯ  ０８／０２００７９の１４４および１４５頁に、またはＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６２９７５（文書全体）において、さらに記載されるとおりである。
本発明のコンストラクト、ポリペプチド、および／またはＩＳＶの有用な投与量は、それらのin vitroでの活性と動物モデルにおけるin vivoでの活性とを比較することにより、決定することができる。マウス、および他の動物における有効な投与量の、ヒトへの推定のための方法は、当該分野において公知である；例えばＵＳ  ４，９３８，９４９を参照。
【０３０８】
処置における使用のために必要とされる本発明のコンストラクト、ポリペプチド、および／またはＩＳＶの量は、選択される特定のＩＳＶ、ポリペプチド、化合物および／またはコンストラクトによってのみ変化するのではなく、投与の経路、処置されている状態の性質、患者の年齢および状態によってもまた変化し、最終的には、主治医または臨床医の裁量によるであろう。また、本発明のコンストラクト、ポリペプチド、および／またはＩＳＶの投与量は、標的である細胞、腫瘍、関節、組織、移植片、または臓器に依存して変化する。
【０３０９】
所望される用量は、単一用量において適切な間隔において投与される分割された用量として、例えば、１日あたり２回、３回、４回またはそれより多くの部分用量（sub-dose）として、都合よく提示することができる。部分用量それ自体を、例えば多数の個別の緩やかに間隔を空けた投与に、さらに分割してもよい。好ましくは、用量は、１週間に１回、またはさらにそれより少ない頻度で、例えば２週間に１回、３週間に１回、１か月に１回、またはさらに２か月に１回、投与される。
【０３１０】
投与レジメンは、長期の処置を含んでもよい。「長期」とは、少なくとも２週間、および好ましくは数週間、数か月間、または数年間の期間を意味する。この投与の範囲において必要な修飾は、本明細書において提供される教示を前提として、慣用的な実験のみを用いて、当業者により決定され得る。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W.編、第４版）、Mack Publishing Co., Easton, PAを参照。投与量はまた、何らかの合併症のイベントがあった場合には、個々の医師により調整され得る。
【０３１１】
当該分野においては、関節において軟骨が罹患する障害、例えば変形性関節症などのための、より有効な治療が必要とされている。関節内投与された場合であっても、ほとんどの薬物の滞留時間は、罹患した軟骨を処置するためには不十分である。本発明者らは、治療薬を、薬物を関節中に「アンカリング」して結果として薬物の保持を増大させるが、前記治療薬の有効性を損なわないはずである部分（また、「軟骨アンカータンパク質」または「ＣＡＰ」としても示される）にカップリングすることにより、治療薬の有効性が著しく増大され得るという仮説を立てた。このアンカリングの概念は、毒性および副作用を減少させることにより、薬物の有効性のみならず、患部関節に対する操作上の特異性をも増大させ、それにより、有用な薬物候補の数を拡大する。本発明者らはさらに、アグリカン結合剤は、潜在的にアンカーとして機能し得るが、アグリカンは、重度にグリコシル化され、関節において軟骨が患う多様な障害において分解されるという仮説を立てた。さらに、薬物が臨床に入ることができる前に必要とされる多様な動物モデルにおけるコストおよび大規模な試験を考慮して、かかるアグリカン結合剤は、優先的に広い交差反応性を有するべきであり、例えば、アグリカン結合剤は、多様な種のアグリカンに結合すべきである。多様な巧妙な免疫化、スクリーニングおよび特徴づけの方法を用いて、本発明者らは、優れた選択性、安定性および特異性の特徴を有し、関節における長期の保持および活性を可能にする、多様なアグリカン結合剤を同定することができた。
【０３１２】
一側面において、本発明は、医薬としての使用のための、本発明による組成物、本発明によるＩＳＶ、本発明によるポリペプチド、および／または本発明によるコンストラクトに関する。
一側面において、本発明は、関節からの、組成物、ポリペプチドまたはコンストラクトの流出を減少させるかおよび／または阻害するための方法に関し、ここで、前記方法は、少なくとも１つの本発明によるポリペプチド、本発明によるコンストラクト、または本発明による組成物の薬学的活性量を、それを必要とする人物に投与することを含む。
【０３１３】
本発明において、用語「流出を減少させるかおよび／または阻害すること」とは、関節中から外側への、組成物、ポリペプチドまたはコンストラクトの外向き流を減少させるかおよび／または阻害することを意味する。好ましくは、流出は、本発明のアグリカン結合剤、例えばアグリカンに結合するＩＳＶ（単数または複数）の存在を伴わないことを除いて同じ条件下における、関節における前述の組成物、ポリペプチドまたはコンストラクトの流出と比較して、少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％、またはさらに例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、またはさらに１００％、低下させられるか、および／または阻害される。
【０３１４】
本発明のアグリカン結合剤は、軟骨に影響を及ぼす多様な疾患、例えば、関節症および軟骨ジストロフィー、関節炎疾患、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風関節炎、乾癬性関節炎、外傷性の断裂または脱離、軟骨無形成症、肋軟骨炎、脊椎骨端骨幹端異形成症、椎間板ヘルニア、腰椎椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発軟骨炎など（一般的に本明細書において「アグリカンに関連する疾患」として示される）において用いることができることが、理解される。
【０３１５】
一側面において、本発明は、アグリカンに関連する疾患、例えば、関節症および軟骨ジストロフィー、関節炎疾患、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風関節炎、乾癬性関節炎、外傷性の断裂または脱離、軟骨無形成症、肋軟骨炎、脊椎骨端骨幹端異形成症、椎間板ヘルニア、腰椎椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発軟骨炎などを予防または処置することにおける使用のための、本発明による組成物、ＩＳＶ、ポリペプチド、および／またはコンストラクトに関する。
【０３１６】
一側面において、本発明は、関節症および軟骨ジストロフィー、関節炎疾患、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風関節炎、乾癬性関節炎、外傷性の断裂または脱離、軟骨無形成症、肋軟骨炎、脊椎骨端骨幹端異形成症、椎間板ヘルニア、腰椎椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発軟骨炎などを予防または処置するための方法に関し、ここで、前記方法は、それを必要とする対象に、本発明による少なくとも組成物、ＩＳＶ、ポリペプチド、またはコンストラクトのそれを必要とする人物にとっての薬学的活性量を投与することを含む。
【０３１７】
一側面において、本発明は、関節症および軟骨ジストロフィー、関節炎疾患、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風関節炎、乾癬性関節炎、外傷性の断裂または脱離、軟骨無形成症、肋軟骨炎、脊椎骨端骨幹端異形成症、椎間板ヘルニア、腰椎椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発軟骨炎などを処置または予防するための医薬組成物の調製における、本発明によるＩＳＶ、ポリペプチド、組成物またはコンストラクトの使用に関する。
【０３１８】
アグリカンに結合することにより、本発明のアグリカン結合剤は、アグリカンを分解することにおいて、セリンプロテアーゼファミリーのメンバー、カテプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）／マトリキシンまたはA Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs（ＡＤＡＭＴＳ）、好ましくはＭＭＰ８、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＡＤＡＭＴＳ５（アグリカナーゼ−２）、ＡＤＡＭＴＳ４（アグリカナーゼ−１）および／またはＡＤＡＭＴＳ１１の活性を低下させるかまたは阻害し得ることが期待される。
【０３１９】
したがって、一側面において、本発明は、アグリカンを分解することにおいて、セリンプロテアーゼファミリーのメンバー、カテプシン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）／マトリキシンまたはA Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs（ＡＤＡＭＴＳ）、好ましくはＭＭＰ８、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＡＤＡＭＴＳ５（アグリカナーゼ−２）、ＡＤＡＭＴＳ４（アグリカナーゼ−１）および／またはＡＤＡＭＴＳ１１の活性を低下させるかまたは阻害する方法に関し、ここで、前記方法は、本発明による少なくともＩＳＶ、ポリペプチド、コンストラクトまたは組成物の薬学的活性量を、それを必要とする人物に投与することを含む。
【０３２０】
本発明の文脈において、「予防または処置」という用語は、疾患を予防および／または処置することが含まれるのみならず、また一般的に、疾患の発症を防止し、減速させ、または疾患の進行を逆転させ、疾患に関連する１つ以上の徴候の発症を防止または遅延させ、疾患に関連する１つ以上の徴候を低減および／または緩和し、それらに関連するいかなる疾患および／または徴候の重症度および／または期間を減少させ、および／または、それらに関連するいかなる疾患および／または徴候重症度の増加を防止し、疾患によって生じるいかなる生理的損傷も予防、低減または逆転させること、また通常では、処置を受ける患者に有益なあらゆる薬理学的行動が含まれる。
【０３２１】
処置を受ける対象は、いかなる温血動物でもあってもよいが、特に哺乳動物、具体的にはヒトである。当業者に明らかなように、処置を受ける対象は、具体的には、本明細書に記載の疾患、障害および症状に罹患するか、またはそのリスクを有する人物である。
【０３２２】
一般に、処置レジメンは、１つ以上の本発明のＩＳＶ、ポリペプチド、化合物および／またはコンストラクトの、またはこれを含む１つ以上の組成物の、１つ以上の薬学的に有効な量または用量における投与を含むであろう。投与されるべき具体的な量（単数または複数）または用量は、やはり上で引用される要因に基づいて、医師により決定され得る。
【０３２３】
一般に、処置されるべき特定の疾患、障害または状態、用いられるべき特定の本発明のＩＳＶ、ポリペプチド、化合物および／またはコンストラクトの効力、特定の投与の経路、および用いられる特定の医薬処方物または組成物に依存して、医師は、好適な日用量を決定することができるであろう。
【０３２４】
通常は、上の方法において、本発明のＩＳＶ、ポリペプチド、化合物および／またはコンストラクトは用いられるであろう。しかし、２つ以上のＩＳＶ、ポリペプチドおよび／または本発明のコンストラクトを、組み合わせにおいて用いることは、本発明の範囲内である。
【０３２５】
本発明のＩＳＶ、ポリペプチドおよび／またはコンストラクトは、１つ以上のさらなる薬学的に活性な化合物または原理と組み合わせて、すなわち、相乗効果をもたらしても、これをもたらさなくともよい組み合わせ処置レジメンとして、用いることができる。やはり、臨床医は、上で引用される要因およびその専門家としての判断に基づいて、かかるさらなる化合物または原理、ならびに好適な組み合わせ処置レジメンを選択することができるであろう。
【０３２６】
特に、本発明のＩＳＶ、ポリペプチドおよび／またはコンストラクトは、本明細書において引用される疾患、障害および状態の予防および／または処置のために用いられるか、またはこれらのために用いることができる、他の薬学的に活性な化合物または原理と組み合わせて用いることができ、その結果として相乗効果が得られても得られなくともよい。かかる化合物および原理、ならびにそれを投与するための経路、方法および医薬処方物または組成物の例は、臨床医には明らかであろう。
【０３２７】
２つ以上の物質または原理が組み合わされた処置レジメンの一部として用いられる場合、それらは、同じ投与の経路を介して投与されても、異なる投与の経路を介して投与されてもよく、本質的に同じ時点であっても、異なる時点において投与されてもよい（例えば、本質的に同時に、連続的に、または交互の体制により）。物質または原理が、同時に、同じ投与の経路を介して投与されるべきである場合、それらは、異なる医薬処方物または組成物、または組み合わされた医薬処方物または組成物の一部として、投与することができ、これは、当業者には明らかであろう。
【０３２８】
また、２つ以上の活性物質または原理が、組み合わされた処置レジメンの一部として用いられるべきである場合、物質または原理の各々を、化合物または原理が単独で用いられる場合と同じ量において、および同じレジメンに従って投与してもよく、かかる組み合わされた使用は、相乗効果をもたらし得るものであっても、そうでなくともよい。しかし、２つ以上の活性物質または原理の組み合わされた使用が相乗効果をもたらす場合、なお所望される治療的作用を達成しつつ、投与されるべき当該物質または原理のうちの一方、それより多くまたは全ての量を減少させることも可能であり得る。このことは、例えば、なお所望される薬学的効果または治療効果を得つつ、当該物質または原理のうちの１つまたはそれより多くをそれらの通常の量で使用した場合にそれらの使用に付随する任意の望ましくない副作用を、回避するか、制限するか、またはこれを軽減するために有用であり得る。
【０３２９】
本発明により使用される処置レジメンの有効性は、それ自体公知の任意の様式において、関与する疾患、障害または状態について、決定および／または追跡することができ、これは、臨床医には明らかであろう。臨床医はまた、適切である場合、および各症例ごとに、所望される治療効果を達成するために、望ましくない副作用を回避するか、制限するか、またはこれを軽減するために、および／または、一方での所望される治療効果を達成することと、他方での望ましくない副作用を回避するか、制限するか、またはこれを軽減することとの間の適切なバランスを達成するために、特定の処置レジメンを変更または改変することができるであろう。
【０３３０】
一般に、処置レジメンは、所望される治療効果が達成されるまで、および／または所望される治療効果が維持されるべきである限り、続けられるであろう。やはり、これは、臨床医により決定され得る。
【０３３１】
別の側面において、本発明は、少なくともアグリカンに関連する疾患の予防および／または処置のための；および／または本明細書において記述される処置の方法のうちの１つ以上における使用のための、医薬組成物の調製における、本発明のＩＳＶ、ポリペプチド、化合物および／またはコンストラクトの使用に関する。
本発明はまた、アグリカンを調節すること、例えばアグリカン分解を阻害することにより予防および／または処置することができる少なくとも１つの疾患または障害の予防および／または処置の処置のための医薬組成物の調製における、本発明のＩＳＶ、ポリペプチド、化合物および／またはコンストラクトの使用に関する。
【０３３２】
本発明はまた、本発明のＩＳＶ、ポリペプチド、化合物および／またはコンストラクトを患者に投与することにより予防および／または処置することができる少なくとも１つの疾患、障害または状態の予防および／または処置のための医薬組成物の調製における、本発明のＩＳＶ、ポリペプチド、化合物および／またはコンストラクトの使用に関する。
本発明はさらに、少なくとも１つのアグリカンに関連する疾患の予防および／または処置における使用のための、本発明のＩＳＶ、ポリペプチド、化合物および／またはコンストラクト、またはこれを含む医薬組成物に関する。
【０３３３】
処置されるべき対象は、任意の温血動物であってよいが、特に、哺乳動物、およびことさらにはヒトである。獣医学的適用において、処置されるべき対象は、商業目的のために育てられている、またはペットとして飼育されている任意の動物を含む。当業者には明らかであるように、処置されるべき対象は、特に、本明細書において記述される疾患、障害および／または状態を罹患しているか、またはそのリスクを有する人物であろう。
やはり、かかる医薬組成物において、１つ以上の本発明のＩＳＶ、ポリペプチド、化合物および／またはコンストラクト、またはこれをコードするヌクレオチド、および／またはこれを含む医薬組成物は、本明細書において記述されるもののような１つ以上の他の有効な原理と、好適に組み合わせてもよい。
【０３３４】
本発明はまた、in vitroで（例えばin vitroまたは細胞アッセイにおいて）またはin vivoで（例えば単細胞または多細胞生物において、および特に哺乳動物において、ことさらにはヒトにおいて、例えば本発明の疾患、障害または状態のリスクを有するかまたはこれを罹患するヒトにおいて）の使用のための、組成物（限定することなく、本明細書においてさらに記載されるような医薬組成物または調製物など）に関する。
処置についての言及は、別段に明示的に記述されない限り、確立した症状の処置、および予防的処置の両方を含むことが、理解されるべきである。
【０３３５】
配列は、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５に従って、説明の主要部において、および独立した配列表において、開示される。特定の番号により特定される配列番号は、説明の主要部において、および独立した配列表において、同じであるべきである。例として、配列番号１は、説明の主要部において、および独立した配列表の両方において、同じ配列を定義すべきである。説明の主要部における配列の定義と独立した配列表との間に矛盾が存在する場合（例えば、説明の主要部における配列番号１が、誤って、独立した配列表における配列番号２に対応する場合）、出願における、特に特定の態様の具体的な配列に対する参照は、出願の主要部における配列に対する参照として理解されるべきであり、独立した配列表に対する参照として理解されるべきではない。言い換えると、説明の主要部における配列の定義／命名と独立した配列表との間の矛盾は、独立した配列表を、説明、例、図面および請求の範囲を含む出願の主要部において開示される配列およびそれらの命名に補正することにより、解消されるべきである。
【０３３６】
本発明は、ここで、非限定的な好ましい側面、例および図面により、さらに記載されるであろう。
本願全体にわたり引用される参考文献の全ての全内容（学術文献、発行済み特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願を含む）は、特に、本明細書において上で言及される教示について、本明細書により参考として明示的に援用される。
【０３３７】
例
例１  アグリカンによるラマの免疫、重鎖のみの抗体フラグメントレパートリーのクローニング、およびファージの調製
本発明者らは、ＯＡの動物モデルの目的は、症状および疾患の進行を検出する機会を同定することができ、新たな治療を開発することができるように、関節の損傷のスケールおよび進行を制御可能に再現することであることに気づいた。理想的な動物モデルは、比較的低コストのものであり、再現可能な疾患の進行を、短時間の内に差異を検出するために十分に大きい効果の規模と共に提示するものである。モデルが、あまりに迅速に末期の変性へと進行する場合、ＯＡの病態生理学の代表である中間の時点を入手し得ない場合があり、この情報の不在下においては、潜在的な介入の微妙な効果は見逃される可能性がある。ＯＡが、機械的プロセスと生化学的プロセスとの相互作用の結果である末期の表現型であることを承知の上で、動物モデルは、制御された環境においてこれらの要因を研究することを可能にする（Teeple et al. 2013 AAPS J. 15: 438-446を参照）。
【０３３８】
動物モデルの最終的なゴールは、ヒト疾患を再現することである（Cohen-Solal et al. 2013 Bonekey Rep. 2: 422を参照）。ヒトＯＡにおけるプロフィールの不均一性を前提として、多くのモデルが必要とされる。それらは、自発的なものまたは誘導されるもののいずれかである。それらのほとんどは、ＯＡの発症に利する１つの要因、例えば加齢、機械的ストレス（手術）、化学的欠損（酵素）、または遺伝的要因におけるものに焦点を当てる。それらの全ては、重篤度、病変の局在および病因に関して異なる。しかし、発症中のＯＡの全ての側面に取り組む動物モデルは存在しない。
【０３３９】
したがって、様々な動物モデルにおいて、ならびに最終的にはヒト患者において有用であるために、ＣＡＰ結合剤は、好ましくは、広い交差反応性を有し、例えば、１つより多くの種のアグリカンに結合する。好ましくは、アグリカン結合剤は、ヒトアグリカン、ならびにイヌアグリカン、ウシアグリカン、ラットアグリカン、ブタアグリカン、マウスアグリカン、ウサギアグリカン、カニクイザルアグリカンおよび／またはアカゲザルアグリカンのうちの１つ以上に結合する。
【０３４０】
さらに、本発明者らは、アグリカンの分解が、Ｃ末端領域中で開始されるようであることに気づいた。Ｇ３ドメインを含まないアグリカン分子の集合は、加齢によっても増加する。関節炎に付随する軟骨の変性の主要な特徴は、Ｇ１ドメインとＧ２ドメインとの間の球間領域中でのタンパク質分解による切断に起因するアグリカンの減少である。したがって、好ましくは、アグリカン結合剤は、アグリカンのＮ末端領域、すなわち、ＣＳまたはＧ３ドメイン以外の領域、例えばＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２領域、またはＧ１−ドメイン、ＩＧＤ、またはＧ２ドメインに結合する。最も好ましくは、アグリカン結合剤は、軟骨細胞およびＥＣＭ中に存在し続けるＧ１ドメインに結合するであろう。
【０３４１】
１．１  免疫
５個体のラマを、組み換え（rec）ヒトアグリカンで免疫した（Ｇ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメイン、R&D Systems、＃1220-PG）（例１．２を参照）。抗原投与の後で血清試料を取得し、ヒト組み換えアグリカンＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２に対するＥＬＩＳＡにより、力価を決定した。全てのラマが、特異的な血清力価を示した。
【０３４２】
１．２  一次スクリーニング
ＰＢＬ（一次血液リンパ球（primary blood lymphocyte））からＲＮＡを抽出し、遺伝子フラグメントをコードするＩＳＶを増幅するためのＲＴ−ＰＣＲのための鋳型として用いた。これらのフラグメントを、ファージミドベクターpAX212中にクローニングし、Ｈｉｓ６タグおよびＦＬＡＧ３タグと融合させたＩＳＶを提示するファージ粒子の生成を可能にした。標準的なプロトコルに従って、ファージを調製し、保存した（Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual、第１版、Brian K. Kay, Jill Winter, John McCafferty, Academic Press, 1996を参照）。
【０３４３】
５つの免疫ライブラリーおよび２つの合成ＩＳＶライブラリーを用いて、ファージディスプレイ選択を行った。ライブラリーを、組み換えヒトおよび（ビオチン−）ラットアグリカンＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメイン、全長抽出されたウシアグリカンまたは完全なウシ軟骨の様々な組み合わせに対する、２回から３回の濃縮に供した。選択アウトプットからの個々のクローンを、ＥＬＩＳＡにおいてヒトＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメインに対する結合についてスクリーニングした（ＩＳＶを発現するE.coli細胞からのペリプラズム抽出物を用いて）。５４２のＥＬＩＳＡ陽性クローンの配列決定により、１４４のユニークなＩＳＶ配列を同定した。ＩＳＶを、種交差反応性について評価し、ＥＬＩＳＡにより個々のヒトＧ１、ＩＧＤおよびＧ２ドメインへの結合についてマッピングした。わずかなＩＳＶのみが、組み換えヒト、ラット、イヌおよびウシアグリカンＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２に対して類似の結合レベルを示した。限定された種交差反応性は、Ｇ１ドメイン結合剤について特に顕著であり、これについては、特にウシおよびイヌアグリカンへの結合が低かった。より種交差反応性が高いＧ１ドメイン結合性ＩＳＶを同定するために、ウシＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２、イヌＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２およびヒトＧ１ドメインに対するファージディスプレイ選択を行った。ＥＬＩＳＡにおいてヒト、カニクイザル、ラット、イヌおよびウシＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２への結合についてスクリーニングした１２４５のクローンのうち、わずか１５の新規の種交差反応性ＩＳＶを同定し、このうち９つを、Ｇ１−ドメインにマッピングすることができた。
【０３４４】
合計１９のユニークなクローンを、さらなる特徴づけのための「リードパネル」として選択した。このリードパネルについてのドメインマッピングおよび種交差反応性のデータの概要を、表１．２において提供する。
【表１】
2020522515.tif 000003
【０３４５】
１．３  Ｇ１結合剤
Ｇ１結合剤のＣＤＲにおける配列可変性を、クローン１１４Ｆ０８に対して決定した。クローン１１４Ｆ０８のＣＤＲのアミノ酸配列を、全ての他のクローン（Ｇ１結合剤）のＣＤＲを比較する参照として用い、以下の表１．３Ａ、１．３Ｂおよび１．３Ｃにおいて表す（ＣＤＲ１は、Kabat位置２６において開始し、ＣＤＲ２は、Kabat位置５０において開始し、およびＣＤＲ３は、Kabat位置９５において開始する）。
【表２−１】
2020522515.tif 000004
【表２−２】
2020522515.tif 000005
【表２−３】
2020522515.tif 000006
【０３４６】
１．４  Ｇ１−ＩＧＤ−Ｇ２結合剤
Ｇ１−ＩＧＤ−Ｇ２（ＧＩＧ）結合剤のＣＤＲにおける配列可変性を、クローン６０４Ｆ０２に対して決定した。クローン６０４Ｆ０２のＣＤＲのアミノ酸配列を、全ての他のクローン（ＧＩＧ結合剤）のＣＤＲを比較する参照として用い、以下の表１．４Ａ、１．４Ｂおよび１．４Ｃにおいて表す（ＣＤＲ１は、Kabat位置２６において開始し、ＣＤＲ２は、Kabat位置５０において開始し、およびＣＤＲ３は、Kabat位置９５において開始する）。
【表３−１】
2020522515.tif 000007
【表３−２】
2020522515.tif 000008
【表３−３】
2020522515.tif 000009
【０３４７】
１．５  Ｇ２結合剤
Ｇ２−結合剤のＣＤＲにおける配列可変性を、クローン６０１Ｄ０２に対して決定した。クローン６０１Ｄ０２のＣＤＲのアミノ酸配列を、全ての他のクローン（Ｇ２結合剤）のＣＤＲを比較する参照として用い、以下の表１．５Ａ、１．５Ｂおよび１．５Ｃにおいて示す（ＣＤＲ１は、Kabat位置２６において開始し、ＣＤＲ２は、Kabat位置５０において開始し、およびＣＤＲ３は、Kabat位置９５において開始する）。
【表４−１】
2020522515.tif 000010
【表４−２】
2020522515.tif 000011
【表４−３】
2020522515.tif 000012
【０３４８】
１．６  ＩＳＶの配列最適化
多様なＩＳＶを、配列最適化プロセスに供した。配列最適化は、親ＩＳＶ配列を変異させるプロセスである。このプロセスは、ＩＳＶのヒト化（ｉ）、翻訳後修飾（ｉｉ）、ならびに起こり得る既存の抗体のためのエピトープ（ｉｉｉ）をノックアウトすることを包含する。
（ｉ）ヒト化を目的として、親ＩＳＶ配列を、変異させて、ヒトＩＧＨＶ３−ＩＧＨＪ生殖系列コンセンサス配列に対してより同一性が高いＩＳＶ配列を得る。フレームワーク領域中の、ＩＳＶとヒトＩＧＨＶ３−ＩＧＨＪ生殖系列コンセンサスとの間で異なる特定のアミノ酸（いわゆるホールマーク残基を例外として）を、タンパク質の構造、活性および安定性は未変化に保つように、ヒトのカウンターパートへと変更する。一握りのホールマーク残基は、ＩＳＶの安定性、活性および親和性のために重要であることが知られており、したがって、変異させない。
（ｉｉ）ＣＤＲ中に存在する、および翻訳後修飾（ＰＴＭ）に対して感受性であるという実験的証左が存在するアミノ酸を、タンパク質の構造、活性および安定性は未変化に保ちつつ、ＰＴＭ部位が不活化されるように変更する。
（ｉｉｉ）タンパク質の構造、活性および安定性に影響を及ぼすことなく、ＩＳＶの配列を、任意の天然に存在する既存の抗体の結合を最少化して、処置創発的な免疫原性応答を惹起する可能性を減少させるために最適化する。
【０３４９】
配列を最適化した形式のＩＳＶの作製のために、ＩＳＶの構成成分を、全て標準的なプロトコルに従って、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）においてタグ付けされていないタンパク質として産生させ、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを介して精製し、その後、脱塩した。
多様な配列を最適化した形式のＩＳＶを、表Ａ−１およびＡ−２において示す。
【０３５０】
例２  リードパネル（精製ＩＳＶ）−アグリカンの特徴づけ
一次スクリーニング、ＥＬＩＳＡを介した結合の最初の評価、オフ速度および種交差反応性の決定の後で、リードパネルのＩＳＶを、さらなる特徴づけに供した。
【０３５１】
２．１  アグリカンリードパネルをＡＬＢ２６でフォーマットする（ｎ＝１９）
臨床用途のための分子の最終的な形式は、１つまたは２つのアグリカン結合ＩＳＶ（「アンカー」）、およびまた１つ、２つ、またはそれより多くの、治療的な作用の様式を有するＩＳＶまたは他の部分を含むことが見込まれる。したがって、１９の選択されたクローンを、一価または二価の形式においてＡＬＢ２６に融合させ（ＣＡＰ−ＡＬＢ２６またはＡＬＢ２６−ＣＡＰ−ＣＡＰ）、P. pastorisにおいて発現させた。ＡＬＢ２６は、異なる種からのアルブミンへの結合を完全に無効にする２つの変異をＣＤＲ１において有するＡＬＢ１１のバリアントである（アルブミン結合性ＩＳＶ）。アグリカン結合剤を含む最終的なポリペプチドの形式のサイズを模倣するために、ＡＬＢ２６への融合を行った。いかなる理論によっても拘束されることは望まないが、本発明者らは、ｐＩが、軟骨の浸透および保持に影響を及ぼし得るという仮説を立てた。陰性対照または「ダミー」として、二価のＡＬＢ２６（Ｃ０１０１００３０）を用いた。
【０３５２】
２．２  ex vivoでのウシ軟骨保持
軟骨保持を評価するための確立されたアッセイは存在しないので、本発明者らは、ウシ軟骨を用いて、信頼し得る、かつ再現可能なex vivo軟骨保持アッセイを開発した。
ウシの骨は、典型的には、地元の畜殺場から回収した。軟骨を、骨から切り落として約１ｍｍ厚の細片にし、さらに生検用カッターを用いて３ｍｍの直系を有する円板に切り抜いた。軟骨の円板を、フレッシュな軟骨から優先的に採取した。
【０３５３】
比較的短時間の軟骨へのナノボディの暴露（これは、関節内注射により期待され得る）の後で、ＩＳＶが、より長期間にわたり軟骨中に保持される能力を決定した。アッセイは、ex vivoで軟骨、典型的には３ｍｍのウシの円板（約１０ｍｇ湿重量）を、１０μｇ／ｍＬのナノボディ（１００μＬ）と共にＯＮでインキュベートすることと、その後、最大５日間にわたり洗浄すること（ＰＢＳ／０．１％のＢＳＡ／０．１％のＮａＮ３／１００ｍＭのＮａＣｌ）からなった。その後、結合した（保持された）ナノボディを、ＳＤＳ含有ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（ＬＤＳサンプルバッファー、Invitrogen）中で軟骨から放出させ、ウェスタンブロット（ＷＢ）により分析した。アッセイは、典型的には、ナノボディ試料１つあたり４枚の軟骨円板を用いて行った；２枚の円板は、ナノボディインキュベーションの直後（ｔ０）に分析し、結合したナノボディの初期量を決定した；２枚の円板は、洗浄後（ｔ１−５ｄａｙｓ）に分析した。保持の程度を、ｔ１−５ｄａｙｓおよびｔ０において検出されたナノボディの量の比として定義した。アッセイのスループットを増加させるために、この比の決定は、ウェスタンブロットの目視検査により行い、これは、０〜６のスコアを提供し、ここで、０は保持なしであり、６は完全な保持である。
【０３５４】
結果のまとめを、表２．２において示す。
【表５】
2020522515.tif 000013
【０３５５】
９つのコンストラクトが軟骨において非常に良好に保持された（スコア５〜６）ことを見出した。この「トップ９」は、組み換えＧ１、Ｇ２またはＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメインの全てに結合するアグリカン結合部分について、一価および二価の両方のコンストラクトを含んだ。このアッセイにおいて、１４のコンストラクトは、中程度の保持（＜５〜２のスコア）を示し、５つのコンストラクトは、検出可能であるが低い保持（＜２〜１のスコア）を示した。１つを除き全てのアグリカンコンストラクトが、８から９を超える範囲のｐＩ値を有したことは、注目すべきである。
【０３５６】
２．３  エピトープビニング
エピトープビニングのために、精製されたＡＬＢ２６融合ナノボディコンストラクトを、ＦＬＡＧタグに融合した同じセットナノボディに対して、競合ＥＬＩＳＡにおいて、スクリーニングした。
簡単に述べると、アッセイのセットアップは、以下のとおりである。モノクローナルファージＥＬＩＳＡを、ファージの半飽和希釈率で、１μｍの精製ナノボディ（または５μｇ／ｍＬのｍＡｂ）を用いて、またはこれを用いずに、インキュベートした。精製ナノボディ（またはｍＡｂ）の存在下における４５０ｎｍでの吸光度とこれの不在下における４５０ｎｍでの吸光度との間の比を、重複エピトープまたは非重複エピトープエピトープを認識するか否かを決定するために用いた。
【０３５７】
結果として生じたエピトープビンを、表２．２（上）において示す。エピトープビン２および３におけるコンストラクト（Ｇ１−ドメイン上のもの）は、ex vivoウシ軟骨保持アッセイにおいて、低い軟骨保持スコア（０〜１）を有した。しかし、ＥＬＩＳＡおよびウシ軟骨保持により測定されたウシアグリカンＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２に対する結合の間に、直接的な相関は存在しないようであった。いかなる理論にも拘束されないが、本発明者らは、これらのエピトープが、ネイティブな軟骨組織においては容易にはアクセス可能でない場合があるという仮説を立てた。
ビンに属するクローンのＣＤＲの配列可変性を、下および上に表す（すなわち、ビン８を、参照化合物として６０４Ｆ０２と共に；表１．４Ａ−Ｃ）。
【０３５８】
１１４Ｆ０８に対するエピトープビン４のＧ１結合剤の配列可変性を、以下の表２．３Ａ、２．３Ｂおよび２．３Ｃにおいて表す。クローン１１４Ｆ０８のＣＤＲのアミノ酸配列を、全ての他のクローン（エピトープビン４結合剤）のＣＤＲを比較する参照として用いた（ＣＤＲ１は、Kabat位置２６において開始し、ＣＤＲ２は、Kabat位置５０において開始し、およびＣＤＲ３は、Kabat位置９５において開始する）。
【表６−１】
2020522515.tif 000014
【表６−２】
2020522515.tif 000015
【表６−３】
2020522515.tif 000016
【０３５９】
６０８Ａ０５に対するエピトープビン１のＧ１結合剤の配列可変性を、以下の表２．３Ｄ、２．３Ｅおよび２．３Ｆにおいて表す。クローン６０８Ａ０５のＣＤＲのアミノ酸配列を、全ての他のクローン（エピトープビン１結合剤）のＣＤＲを比較する参照として用いた（ＣＤＲ１は、Kabat位置２６において開始し、ＣＤＲ２は、Kabat位置５０において開始し、およびＣＤＲ３は、Kabat位置９５において開始する）。
【表７−１】
2020522515.tif 000017
【表７−２】
2020522515.tif 000018
【表７−３】
2020522515.tif 000019
【０３６０】
２．４  結合の特徴−ＥＬＩＳＡおよびＳＰＲ
ex vivo ウシ軟骨保持およびエピトープビニングのデータに基づいて、様々なエピトープビンからのいくつかの例示的なコンストラクトを、さらなる特徴づけのために選択した。上記の理由のために、Ｇ２ドメインへの結合剤は、この段階におけるさらなる特徴づけから除外した。
【０３６１】
選択されたコンストラクトを、ヒト、カニクイザル、ラット、イヌおよびウシアグリカンからの組み換えＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２領域に対するＥＬＩＳＡにおいて特徴づけ、それらの種交差反応性を決定し、組み換えヒトニューロカンおよびブレビカンに対するＥＬＩＳＡにおいて特徴づけ、選択性を決定した。決定したＥＣ５０値を、表２．４Ａにおいて列記する。
【０３６２】
「一価の」アグリカン−ＡＬＢ２６形式に対して、オフ速度を決定するために、ＳＰＲ（ProteOn）実験を行った。アグリカン表面とのナノボディの相互作用が、不均一であることを見出した。不均一性は、再結合イベント、固定されたアグリカンの不均一な集団、および／または不均一なグルコシル化パターンに起因し得た。結果として、計算されたオフ速度は、単なる指標である。全体的に、解離動態は、ナノボディを含むアグリカンについて迅速であった（表２．４Ｂ）。
【表８−１】
2020522515.tif 000020
【表８−２】
2020522515.tif 000021
【０３６３】
例３  一価のリードコンストラクト−アグリカンの生物物理学的特徴づけ
全ての選択されたコンストラクトが、組み合わせにおけるものであってもそうでなくとも、多様な有利な特徴を示したことから、ＩＳＶ１１４Ｆ０８および６０４Ｆ０２およびそれらの対応するＡＬＢ２６−形式（Ｃ０１０１０００５４、−１１８および０９４）を、さらなる特徴づけのためのリードパネルを代表する例示的なコンストラクトとして用いた。
【０３６４】
３．１  E. coliおよびP. pastorisにおける一価の１１４Ｆ０８および６０４Ｆ０２の発現
生物物理学的特徴づけのために、一価のナノボディ１１４Ｆ０８および６０４Ｆ０２を、ＦＬＡＧ３−Ｈｉｓ６タグを用いて、E. coliおよび／またはP. pastorisにおいて発現させ、標準的なプロトコルに従って精製した（例えば、Maussang et al. 2013 J Biol Chem 288(41): 29562-72）。
【０３６５】
３．２  １１４Ｆ０８および６０４Ｆ０２のｐＩ、Ｔｍおよび分析的ＳＥＣ
Thermal shiftアッセイ（ＴＳＡ）のために、５μＬの精製された一価のナノボディ（８００μｇ／ｍｌ）を、５μＬの蛍光プローブSypro Orange（Invitrogen、S6551）（最終濃度１０×）と共に、１０μＬのバッファー（１００ｍＭのリン酸、１００ｍＭのホウ酸、１００ｍＭのクエン酸、１１５ｍＭのＮａＣｌ、３．５〜９の範囲の様々なｐＨにおいて緩衝化したもの）中で、インキュベートした。試料を、LightCycler 480II装置（Roche）において、４．４℃／ｓの速度で３７℃から９９℃まで加熱し、その後、それらを０．０３℃／ｓの速度で３７℃まで冷却した。熱により誘導されるアンフォールディングにより、タンパク質の疎水性のパッチを暴露し、これにSypro Orangeが結合して蛍光強度の増大をもたらす（Ｅｘ／Ｅｍ＝４６５／５８０ｎｍ）。蛍光強度曲線の第１の導関数の屈曲点は、融解温度（Ｔｍ）の尺度として働き、これは、本質的にEricssonら、2006年（Anals of Biochemistry, 357: 289-298）に従う。
【０３６６】
Biosep-SEC-3（Agilent）カラムと組み合わせたUltimate 3000装置（Dionex）において、１０ｍＭのリン酸、３００ｍＭのＡｒｇ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）を移動相として用いて、分析的分子ふるいクロマトグラフィー（分析的ＳＥＣ）実験を行った。８μｇのナノボディ試料（ｄ−ＰＢＳ中、０．５ｍｇ／ｍＬ）を注入した。
【０３６７】
２つのアグリカンＩＳＶの等電点は、比較的塩基性であった。配列を、表Ａ−１において示す。融解温度を、１１４Ｆ０８については６１．０℃、および６０４Ｆ０２については７０．０℃であるものと決定した。クローンのうちのいずれも、分析的ＳＥＣにより決定されるものとしては、凝集または多量体化の徴候を示さなかった。
したがって、正の機能的特性に次いで、ＩＳＶは、有利な生物物理学的特性を示す。
【０３６８】
３．３  １１４Ｆ０８ファミリーメンバー
１１４Ｆ０８のファミリーメンバーのＣＤＲにおける配列可変性を、以下の表３．３Ａ、３．３Ｂおよび３．３Ｃにおいて表す。クローン１１４Ｆ０８のＣＤＲのアミノ酸配列を、全ての他のクローン（１１４Ｆ０８ファミリーメンバー）のＣＤＲを比較する参照として用いた（ＣＤＲ１は、Kabat位置２６において開始し、ＣＤＲ２は、Kabat位置５０において開始し、およびＣＤＲ３は、Kabat位置９５において開始する）。
【表９−１】
2020522515.tif 000022
【表９−２】
2020522515.tif 000023
【表９−３】
2020522515.tif 000024
【０３６９】
例４  多様な種からの軟骨へのex vivoでの結合
例示的なＣＡＰ含有ポリペプチド（また本明細書において「ＣＡＰ含有コンストラクト」または「コンストラクト」としても命名される）は、組み換え／抽出されたヒトタンパク質に、およびウシex vivo軟骨保持アッセイにおいてはウシ軟骨に結合することが示された。これらの例示的なＣＡＰ含有コンストラクトがまた、他の種からの軟骨にも結合することを示すために、ウシ軟骨を用いた上記のような実験を、ヒト軟骨およびラット軟骨を用いて、本質的に繰り返した。
【０３７０】
４．１  ヒト軟骨へのex vivoでの結合
例示的なＣＡＰ含有コンストラクトがまたヒト軟骨にも結合することを確認するために、選択されたコンストラクトを、ex vivoでの軟骨結合アッセイにおいて、凍結ヒト軟骨片を用いて試験した。３０分間の洗浄の後で、ウェスタンブロットにより、結合を決定した。
結果を、表４．１においてまとめる。
【表１０】
2020522515.tif 000025
全てのコンストラクトが、ダミーコンストラクトよりも良好にヒト軟骨に結合したことを見出した。
【０３７１】
４．２  ex vivoでのラット軟骨への結合
ラットin vivoモデルにおけるコンストラクトの試験を容易にするために、ラット軟骨への結合を評価した。したがって、無傷の軟骨を有するラットからの大腿骨を用いて、アッセイをセットアップした。例示的なコンストラクトＣ０１０１０００５４、−１１８、および−０９４を、ラット軟骨と共に一晩インキュベートし、その後３０分間洗浄し、ウェスタンブロット分析により結合したコンストラクトの放出を追跡した。
【０３７２】
結果を、表４．２において示す。
全ての試験されたコンストラクトが、ラット軟骨に良好に結合したことを見出した。
【表１１】
2020522515.tif 000026
【０３７３】
例５  組織特異性
上で、本発明のコンストラクトがアグリカンに特異的に結合することが、in vitroおよびex vivoの両方において示された。加えて、これらのコンストラクトはまた、好ましくは、関節の軟骨に結合する一方で、関節中の他の組織には結合しないか、より少なく結合すべきである。
例示的なＣＡＰ含有コンストラクトの、滑膜、腱、筋上膜および半月板への結合を、ex vivo軟骨結合アッセイについてのものと同じセットアップを用いて評価した。コンストラクトとのＯＮインキュベーションの後の短時間の組織の洗浄（３０分間）の後で、コンストラクト放出およびウェスタンブロット分析を行った。
【０３７４】
結果を、表５においてまとめる。
結果は、ＣＡＰ結合剤が、関節において見出される他の組織よりも、半月板を含む軟骨性組織への優先的な結合を示すことを示す。
【表１２】
2020522515.tif 000027
【０３７５】
例６  ウシ滑液におけるナノボディ安定性
患者の利便性および安全を含む多様な理由のために、コンストラクトが滑膜中でより長い期間にわたり安定であり続けることが好ましい。
したがって、例示的なＡＬＢ２６融合ＣＡＰコンストラクトの滑液（ＳＦ）中での安定性を、非関節炎ウシＳＦ中でのコンストラクトの７日間までにわたる３７℃におけるインキュベーションにより評価した。
【０３７６】
結果を、表６においてまとめる。
【表１３】
2020522515.tif 000028
コンストラクトのいずれの分解も観察することができなかった。
【０３７７】
例７  ＩＬ−１α−刺激された外植片軟骨における保持
この時点において、ナノボディを含むＣＡＰの軟骨の結合および保持に取り組む全ての実験は、健常な（非関節炎の）ex vivoでの軟骨において行った。関節炎の軟骨は、分解したコラーゲンおよびアグリカンにより特徴づけられる。したがって、これらのタンパク質の分解が起こっている場合に、軟骨におけるアグリカン結合剤の結合および保持を評価することもまた、妥当である。このことを目的として、例示的なＡＬＢ２６融合ＣＡＰコンストラクトを、軟骨を、分解を誘導するように刺激した軟骨外植片アッセイにおいて試験した。
【０３７８】
簡単に述べると、ＩＬ−１αおよびオンコスタチンＭを用いて、またはこれらを用いずに培養し、その後５日間、培地を毎日交換しながら（洗浄）培養を続けたウシ軟骨外植片と共に、例示的なＣＡＰ含有コンストラクトを一晩（ＯＮ）インキュベートした。ＩＬ−１αおよびオンコスタチンＭは、主に、６日間の実験中にアグリカンの分解を誘導する。軟骨外植片を、ＷＢによるコンストラクトの結合および保持について分析した。２回の独立した実験を行った（Exp AおよびExp B）。
【０３７９】
ウェスタンブロットの結果を、表７．１において表す。
【表１４】
2020522515.tif 000029
【０３８０】
刺激された軟骨外植片中のコンストラクトを含むＣＡＰの保持の結果を、表７．２においてまとめる。
【表１５】
2020522515.tif 000030
【０３８１】
結果は、コンストラクトＣ０１０１００５４（「０５４」または「５４」）およびＣ０１０１００４５（「０４５」または「４５」）は、刺激された軟骨において、５日間の洗浄の後で、刺激されていない軟骨と比較して、減少した保持を有し、一方、コンストラクトＣ０１０１０１１８（「１１８」）およびＣ０１０１００９４（「０９４」または「９４」）は、刺激に対してほとんど感受性を示さなかったことを示す。
さらに、Ｇ２アグリカンドメイン（Ｃ０１０１００４５により例示されるもの）の結合は、他方のドメインへの結合よりも減少したようであり、これは、アグリカン分解がＣ末端から進行するという仮説と一致するであろう。
【０３８２】
例８  ＡＤＡＭＴＳ５−ＣＡＰ  ＧＡＧ放出アッセイ
軟骨アンカー部分であるＣＡＰの、軟骨組織におけるプロテアーゼ阻害性ナノボディの効力に対して生じ得る影響に取り組むために、例示的なＣＡＰコンストラクトを、ＡＤＡＭＴＳ５（ＡＴＳ５）をブロッキングするＩＳＶに融合させ、ＧＡＧ（グリコサミノグリカン（GlycosAminoGlycan））放出軟骨外植片アッセイにおいて試験した。
【０３８３】
コンストラクトをＧＡＧ放出軟骨外植片アッセイにおいて試験する前に、in vitroでの軟骨結合およびＡＤＡＭＴＳ５阻害特性を確認した。後者について、酵素ペプチドアッセイを行い、これは、in vitroで、ＡＤＡＭＴＳ５  ＩＳＶの酵素ブロッキング機能が、ＣＡＰ融合コンストラクトのいずれにおいても損なわれなかったことを示した。
【０３８４】
ＧＡＧ放出アッセイにおいて、ウシ軟骨外植片を、５日間にわたり、ＩＬ−１αおよびオンコスタチンＭ（ＡＤＡＭＴＳ５の誘導のため）およびある用量範囲のコンストラクトの存在下において培養し、その後、培養上清中の放出されたＧＡＧ含有量の定量を行った。
【０３８５】
試験されたコンストラクトおよびＧＡＧ放出アッセイの結果を、表８においてまとめる。
【表１６】
2020522515.tif 000031
結果は、アンカーアーム（anchoring arm）（ＣＡＰ−ＩＳＶコンストラクト）をＡＤＡＭＴＳ５阻害剤に負荷することは、なおＧＡＧ放出の効率的な阻害を可能にすることを示す。
【０３８６】
例９  ＣＡＰ−コンストラクトのin vivoでのバイオイメージング
例示的なアグリカンＣＡＰコンストラクトのin vitroおよびex vivoでの特徴づけと平行して、保持特性を確認するために、ＡＬＢ２６融合コンストラクトのうちのいくつかについて、in vivoでの生体分布を決定した。
【０３８７】
９．１  ＡＬＢ２６−ＣＡＰコンストラクトの生体分布研究
ナノボディを、１２５Ｉで標識した（１２５Ｉ−ＳＩＢのリジンカップリングを介して）。健常ラットの膝関節に、コンストラクトを注射した。注射の４週間後までの様々な時点において、関節のオートラジオグラフィー画像を作製した。これらの画像は、in vivoでのセッティングにおけるコンストラクトの保持および組織（軟骨）特異性を評価することを可能にする。
代表的な画像を、図１において示す。
【０３８８】
結果から、全てのコンストラクトが軟骨に対する特異的結合を示したことを結論付けることができる。注射の４週間後であっても、「一価の」および「二価の」アグリカン結合剤の両方について、はっきりとした染色が観察された。
【０３８９】
９．２  ＡＬＢ２６−ＣＡＰコンストラクトのＭＡＲＧ
上記の生体分布研究（例９．１）は、ＡＬＢ２６−ＣＡＰコンストラクトの軟骨における特異的保持を示した。しかし、画像の解像度は、軟骨中への浸透の深さの検討を可能にしなかった。イメージングの解像度を増大して、それにより軟骨中への浸透を評価することを可能にするために、ＭＡＲＧ（Micro-Auto-Radio-Graphy）を用いた。
【０３９０】
研究に用いられた例示的なコンストラクトを、表９．２Ａにおいて列記する。本研究のために、ナノボディを、３Ｈで標識し（３Ｈ−ＮＳＰのリジンカップリングを介して（Ｎ−スクシンイミジルプロピオン酸））、健常ラット関節および骨関節炎（前十字靱帯の切断を介して外科的に誘導した）ラット関節中に注射した；１群あたり８個体のラット。注射の７〜１４日間後、ラットを安楽死させ、注射された健常関節およびＯＡ誘導関節を、ＭＡＲＧのために処理した。
【０３９１】
代表的なＭＡＲＧ画像を、図２において示す。
【表１７】
2020522515.tif 000032
【０３９２】
アグリカン結合剤の全てが、一般に、健常な軟骨中への浸透を示した。コンストラクト６２６は、時折また、表面上のいくつかのより顕著な染色を示した。手術された膝においては、多様な程度の軟骨の染色および浸透が観察された：一価のコンストラクト０５４によっては、何らの染色も観察されなかった；一価のコンストラクト０９４によっては、染色は不在または軽度であったが、一方、二価のコンストラクト６２６は、浸透の深度は変動しつつも、いくらかより顕著な染色をもたらした（表９．２Ｂを参照）。
【表１８】
2020522515.tif 000033
【０３９３】
例１０  in vivoでのラットＭＭＴ  ＤＭＯＡＤは、統計学的に有意な効果を示した。
本発明のＣＡＰ結合剤のin vivoでの有効性をさらに示すために、ラットにおいて外科的に誘導した内側半月板断裂（ＭＭＴ）モデルを用いた。簡単に述べると、本発明のＣＡＰ結合剤を、抗ＭＭＰ１３  ＩＳＶ（「０７５４」もしくは「Ｃ０１０１００７５４」として命名される）または抗ＡＤＡＭＴＳ５  ＩＳＶ（「０９５４」もしくは「Ｃ０１０１００９５４」として命名される）にカップリングした。ラットに、一方の膝に手術を行い、ＯＡ様症状を誘導した。処置は、術後３日目にＩＡ注射により開始した。術後４２日に病理組織学を行った。探索性バイオマーカー分析のために、中間および最終の血清試料を取得した。医学的および全体的な実質的な軟骨の変性幅ならびに軟骨変性の減少のパーセンテージを決定した。１群あたり２０個体の動物を用いた。
ナノボディによる脛骨内側（medial tibia）における軟骨分解の阻害を、図３において示す。
【０３９４】
結果は、４２日後に、ＡＤＡＭＴＳ５−ＣＡＰコンストラクトおよびＭＭＰ１３−ＣＡＰコンストラクトにより、ビヒクルと比較して軟骨の幅が実質的に減少したことを示す。これらの結果は、ＣＡＰ部分は、（ａ）抗ＭＭＰ１３  ＩＳＶ（０７５４）または抗ＡＤＡＭＴＳ５  ＩＳＶ（０９５４）のいずれの活性に対しても負の影響を有しないこと；および（ｂ）関節においてより長時間にわたりこれらのコンストラクトの保持を可能にすることを示唆する。
【０３９５】
例１１  健常ラットおよび骨関節炎ラットにおけるＣＡＰ結合剤の保持は、in vivoで同様である。
健常なラットにおける軟骨保持研究において、本発明のポリペプチドは、関節内（Ｉ．Ａ．）注射の後１１２日間まで軟骨中で測定可能であったことが示された（データは示さず）。軟骨の組成は全身の循環における軟骨の結合および吸収に影響を有し得るので、本発明のポリペプチドの薬物動態学を、病気の変形性関節症ラットおよび健常なラットにおいてin vivoで比較し、その後、遅れずにポリペプチドの血清レベルを比較した。
【０３９６】
特に、ラットにおいて外科的に誘導した内側半月板断裂（ＭＭＴ）モデルを、いくつかの改変と共に例１０において記載されるように用いた。簡単に述べると、本発明のポリペプチドを、抗ＭＭＰ１３  ＩＳＶおよび抗ＡＤＡＭＴＳ５  ＩＳＶにカップリングして、ＭＭＰ１３−ＡＤＡＭＴＳ５−ＣＡＰ−ＣＡＰコンストラクト（「０９４９」または「Ｃ０１０１００９４９」ナノボディと命名される）を生じた。ラットに、一方の膝において手術を行い、ＯＡ様症状を誘導した（ＯＡ群）。各々の処置群（健常およびＯＡ）は、１５個体の動物からなり、第７日（健常）または術後７日（ＭＭＴ）において、４００μｇ／３０μｌのナノボディの単一のＩ．Ａ．注射を受けた。血清試料を、麻酔されたラットから、第０日において、第７日において（０ｈにおいて＝プレ用量試料）、第８日において（処置後２４ｈまでの異なる時点において）、第９日（処置の４８時間後）、ｄ１０（処置の３日後）、ｄ１４（処置の７日後）、ｄ２１（処置の１４日後）およびｄ４２（処置の３５日後）において回収した。回収した血清試料を、電気化学発光（electrochemoluminescence：ＥＣＬ）ベースの総合ＰＫアッセイ形式におけるポリペプチド濃度の決定、およびその後の非コンパートメント（non-compartmental）分析のために用いた。
健常ラットおよびＯＡラットの血清中のポリペプチドの保持を、図４において示す。
【０３９７】
結果は、健常なラットおよびＯＡラットにおけるポリペプチドの血清濃度において、何らの明らかな差異は観察され得ないことを示す。これらの結果は、軟骨分解は、本発明のポリペプチドの薬物動態学に対して、何らの影響を有しないことを示唆する。
【０３９８】
【表１９】
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【０３９９】
【表２０−１】
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【表２０−２】
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【０４００】
【表２１−１】
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【表２１−２】
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【表２１−３】
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【表２１−４】
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【表２１−５】
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【表２１−６】
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【表２１−７】
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【表２１−８】
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【表２１−９】
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【０４０１】
【表２２】
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【０４０２】
【表２３】
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【０４０３】
【表２４−１】
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【０４０４】
【表２４−２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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