(57)【要約】  本発明は、変異鉄硫黄クラスタレギュレータ（ＩｓｃＲ）をコードする改変遺伝子及び、ビオチン、リポ酸又はチアミンのいずれかの生合成を増強するポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を特徴とする、鉄硫黄クラスタ輸送を改善することの可能な遺伝子改変された細菌細胞を提供する。本発明は更に、本発明の遺伝子改変された細菌を使用して、ビオチン、リポ酸又はチアミンのいずれかを製造する方法及び、ビオチン、リポ酸、又はチアミンの製造のための遺伝子改変された細菌細胞の使用を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビオチン又はリポ酸又はチアミンの生産を増強するための遺伝子改変された細菌であって、該細菌が、
ａ．変異ＩｓｃＲポリペプチドをコードする遺伝子改変された内在性ｉｓｃＲ遺伝子であって、該変異ＩｓｃＲポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４からなる群から選択される配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、該アミノ酸配列は、
ｉ．Ｘが配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４の対応するアミノ酸残基以外のアミノ酸である、Ｌ１５Ｘ、Ｃ９２Ｘ、Ｃ９８Ｘ、Ｃ１０４Ｘ及びＨ１０７Ｘ
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、遺伝子改変された内在性ｉｓｃＲ遺伝子と、
ｂ．少なくとも１つの導入遺伝子であって、
ｉｉ．ビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドと、
ｉｉｉ．リポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．８）を有するポリペプチドと、
ｉｖ．ＨＭＰ−Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するポリペプチドと、
ｖ．チロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するポリペプチドと、
からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、少なくとも１つの導入遺伝子と、
を備える、遺伝子改変された細菌。
【請求項２】
前記変異ＩｓｃＲポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸置換が、
ａ．ＸがＦ、Ｙ、Ｍ及びＷのいずれかであるＬ１５Ｘと、
ｂ．ＸがＹ、Ａ、Ｍ、Ｆ、ＷのいずれかであるＣ９２Ｘと、
ｃ．ＸがＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、ＷのいずれかであるＣ９８Ｘと、
ｄ．ＸがＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、ＷのいずれかであるＣ１０４Ｘと、
ｅ．ＸがＡ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、及びＬのいずれかであるＨ１０７Ｘと、
からなる群から選択される、請求項１に記載のビオチン又はリポ酸又はチアミンの生産を増強するための遺伝子改変された細菌。
【請求項３】
前記少なくとも１つの導入遺伝子が、ビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドをコードし、更に、
ａ．ＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）依存性メチルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．１．１．１９７）を有するポリペプチド、
ｂ．７−ケト−８−アミノペラルゴン酸（ＫＡＰＡ）シンターゼ活性（ＥＣ２．３．１．４７）を有するポリペプチド、
ｃ．７，８−ジアミノペラルゴン酸（ＤＡＰＡ）シンターゼ活性（ＥＣ：２．６．１．６２又はＥＣ：２．６．１．１０５）を有するポリペプチド、及び
ｄ．デチオビオチン（ＤＴＢ）シンテターゼ活性（ＥＣ６．３．３．３）を有するポリペプチド、
ｅ．ピメロイル−［アシルキャリアタンパク質］メチルエステルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．８５）を有するポリペプチド、及び
ｆ．６−カルボキシヘキサノエート−ＣｏＡリガーゼ活性（ＥＣ６．２．１．１４）を有するポリペプチド、
からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをコードする更なる導入遺伝子を含み、
前記細菌は、ビオチンの生産を増強するためのものである、
請求項１又は２に記載の遺伝子改変された細菌。
【請求項４】
前記少なくとも１つの導入遺伝子がリポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．８）を有するポリペプチドをコードし、更に、
ａ．オクタノイルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．３．１．１８１）を有するポリペプチドと、
ｂ．ピルビン酸デヒドロゲナーゼのジヒドロリポイルリジン残基アセチルトランスフェラーゼ成分（ＥＣ２．３．１．１２）を含むポリペプチドと、
ｃ．リポエートタンパク質リガーゼＡ活性（ＥＣ：６．３．１．２０）を有するポリペプチドと、
からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをコードする更なる導入遺伝子を含み、
前記細菌は、リポ酸の生産を増強するためのものである、
請求項１又は２に記載の遺伝子改変された細菌。
【請求項５】
前記少なくとも１つの導入遺伝子が、ＨＭＰ−Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するポリペプチド及び／又はチロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するポリペプチドをコードする１つの導入遺伝子をコードし、更に、
ａ．ＴｈｉＳアデニリルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．７．７．７３）を有するＴｈｉＦポリペプチドと、
ｂ．チアミンリン酸シンターゼ活性（ＥＣ２．５．１．３）を有するＴｈｉＥポリペプチドと、
ｃ．チアゾールシンターゼ活性（Ｅ．Ｃ．２．８．１．１０）を有するＴｈｉＧポリペプチドと、
ｄ．ホスホヒドロキシメチルピリミジンキナーゼ活性（ＥＣ２．７．４．７）を有するＴｈｉＤポリペプチドと、
ｅ．グリシンオキシダーゼ活性（ＥＣ１．４．３．１９）を有するＴｈｉＯポリペプチドと、
ｆ．硫黄担体タンパク質活性を有するＴｈｉＳポリペプチドと、
ｇ．ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ活性（２．７．１．５０）を有するＴｈｉＭポリペプチドと、
ｈ．チアミン一リン酸ホスファターゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．３．−）を有するポリペプチドと、
からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをコードする更なる導入遺伝子を含み、
前記細菌は、チアミンの生産を増強するためのものである、
請求項１又は２に記載の遺伝子改変された細菌。
【請求項６】
前記細菌が、
ａ．ＨＭＰ−Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するＴｈｉＣポリペプチドと、
ｂ．チロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するＴｈｉＨポリペプチド又はグリシンオキシダーゼ活性（ＥＣ１．４．３．１９）を有するＴｈｉＯポリペプチドと、
ｃ．ＴｈｉＳアデニリルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．７．７．７３）を有するＴｈｉＦポリペプチドと、
ｄ．チアミンリン酸シンターゼ活性（ＥＣ２．５．１．３）を有するＴｈｉＥポリペプチドと、
ｅ．チアゾールシンターゼ活性（Ｅ．Ｃ．２．８．１．１０）を有するＴｈｉＧポリペプチドと、
ｆ．ホスホヒドロキシメチルピリミジンキナーゼ活性（ＥＣ２．７．４．７）を有するＴｈｉＤポリペプチド、
ｇ．硫黄担体タンパク質活性を有するＴｈｉＳポリペプチドと、
ｈ．チアミン一リン酸ホスファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．−）活性を有するポリペプチドと、
をコードする更なる導入遺伝子を含む、請求項５に記載の遺伝子改変された細菌。
【請求項７】
前記少なくとも１つの導入遺伝子及び前記１以上の更なる導入遺伝子が構成的プロモータに作用可能に連結されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌。
【請求項８】
前記細菌が、エシェリキア属、バシラス属、ブレビバクテリウム属、バークホルデリア属、カンピロバクター属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属、セラチア属、ラクトバシラス属、ラクトコッカス属及びアシネトバクター属、シュードモナス属、及びアセトバクター属からなる群から選択される細菌の一種である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌。
【請求項９】
ａ．請求項１〜３、７、及び８のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌を増殖培地に導入して培養物を生成する工程であって、前記少なくとも１つの導入遺伝子が、ビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドをコードする工程と、
ｂ．前記培養物を培養する工程と、
ｃ．前記培養物によって生産されたビオチンを回収し、該回収されたビオチンを任意に精製する工程と、
を含む、ビオチンの製造方法。
【請求項１０】
ａ．請求項１、２、４、７、及び８のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌を増殖培地に導入して培養物を生成する工程であって、前記少なくとも１つの導入遺伝子が、リポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドをコードする工程と、
ｂ．前記培養物を培養する工程と、
ｃ．前記培養物によって生産されたリポ酸を回収し、該回収されたリポ酸を任意に精製する工程と、
を含む、リポ酸の製造方法。
【請求項１１】
ａ．請求項１、２、５〜８のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌を増殖培地に導入して培養物を生成する工程であって、前記少なくとも１つの導入遺伝子が、ＨＭＰ−Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するポリペプチド及び／又はチロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するポリペプチドをコードする工程と、
ｂ．前記培養物を培養する工程と、
ｃ．前記培養物によって生産されたチアミンを回収し、該回収されたチアミンを任意に精製する工程と、
を含む、チアミンの製造方法。
【請求項１２】
前記増殖培地が、グルコース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、アラビノース、キシロース、ラフィノース、マンノース、及びラクトース、又はそれらの任意の組み合わせから選択される炭素源を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のビオチン、リポ酸及びチアミンのいずれか１つの製造方法。
【請求項１３】
遺伝子改変された細菌におけるビオチン、リポ酸又はチアミンのいずれか１つの生産を増強するための変異ＩｓｃＲポリペプチドをコードする遺伝子改変された遺伝子の使用であって、該細菌が、
ｉ．ビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドと、
ｉｉ．リポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．８）を有するポリペプチドと、
ｉｉｉ．ＨＭＰ−Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するポリペプチドと、
ｉｖ．チロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するポリペプチドと、
からなる群から選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１つの導入遺伝子を備えて発現し、
前記遺伝子改変された細菌は、変異ＩｓｃＲポリペプチドをコードする内在性ｉｓｃＲ遺伝子であり、該変異ＩｓｃＲポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び１４と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、該アミノ酸配列は、Ｘが配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４の対応するアミノ酸残基以外のアミノ酸である、Ｌ１５Ｘ、Ｃ９２Ｘ、Ｃ９８Ｘ、Ｃ１０４Ｘ及びＨ１０７Ｘからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、使用。
【請求項１４】
請求項１３に記載の遺伝子改変された細菌におけるビオチン、リポ酸及びチアミンのいずれか１つの生産を増強するための変異ＩｓｃＲポリペプチドをコードする遺伝子改変された遺伝子の使用であって、該変異ＩｓｃＲポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸置換が、
ａ．ＸがＦ、Ｙ、Ｍ、及びＷのいずれか１つであるＬ１５Ｘと、
ｂ．ＸがＹ、Ａ、Ｍ、Ｆ、Ｗのいずれか１つであるＣ９２Ｘと、
ｃ．ＸがＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗのいずれか１つであるＣ９８Ｘと、
ｄ．ＸがＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗのいずれか１つであるＣ１０４Ｘと、
ｅ．ＸがＡ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、及びＬのいずれか１つであるＨ１０７Ｘと、
からなる群から選択される、使用。
【請求項１５】
ビオチン、リポ酸、又はチアミンのいずれか１つの生産を増強するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌の使用。
【請求項１６】
前記細菌が、
ａ．フラボドキシン／フェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼ（ＥＣ：１．１８．１．２及びＥＣ１．１９．１．１）をコードする遺伝子と、
ｂ．ピルビン酸フラボドキシン／フェレドキシンオキシレダクターゼ（ＥＣ１．２．７）をコードする遺伝子と、
ｃ．フラボドキシンをコードする遺伝子と、
ｄ．フェレドキシンをコードする遺伝子と、
ｅ．フラボドキシン及びフェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼをコードする遺伝子と、
からなる群から選択される１以上の遺伝子を更に含み、
該１以上の遺伝子は、前記細菌における該１以上の遺伝子の発現を増強することの可能な非ネイティブプロモータに作用可能に連結され、該１以上の遺伝子はネイティブ遺伝子又は導入遺伝子であり得る、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌。
【請求項１７】
ビオチン、リポ酸、又はチアミンのいずれか１つの生産を増強するための、請求項１６に記載の遺伝子改変された細菌の使用。
【請求項１８】
前記遺伝子改変された細菌が、
ａ．フラボドキシン／フェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼ（ＥＣ：１．１８．１．２及びＥＣ１．１９．１．１）をコードする遺伝子と、
ｂ．ピルビン酸フラボドキシン／フェレドキシンオキシレダクターゼ（ＥＣ１．２．７）をコードする遺伝子と、
ｃ．フラボドキシンをコードする遺伝子と、
ｄ．フェレドキシンをコードする遺伝子と、
ｅ．フラボドキシン及びフェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼをコードする遺伝子と、
からなる群から選択される１以上の遺伝子を更に含み、
該１以上の遺伝子は、前記細菌における該１以上の遺伝子の発現を増強することの可能な非ネイティブプロモータに作用可能に連結され、該１以上の遺伝子はネイティブ遺伝子又は導入遺伝子であり得る、
請求項９〜１２のいずれか１項に記載のビオチン、リポ酸、及びチアミンのいずれか１つの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異鉄硫黄クラスタレギュレータ（ＩｓｃＲ）をコードする改変された遺伝子、及びビオチン、リポ酸、又はチアミンのいずれかの生合成を増強するポリペプチドをコードする１以上の導入遺伝子を特徴とする、鉄硫黄クラスタ輸送を改善することの可能な遺伝子改変された細菌細胞に関する。本発明は更に、本発明の遺伝子改変された細菌を使用したビオチン、リポ酸、又はチアミンのいずれかの製造方法、及び遺伝子改変された細菌細胞のビオチン、リポ酸、又はチアミンの製造への使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ビオチン（ビタミンＢ７又はビタミンＨとしても知られている）及びチアミン（ビタミンＢ１としても知られている）は、人間が他の後生動物と同様にビオチン又はチアミンを生成できないため、人間にとって必須の食物ビタミンである。リポ酸（ＬＡ）は、硫黄を含むビタミン様の抗酸化物質であり、少量が細菌、植物、動物内で合成される。３つは全て栄養補助食品として広く使用されている。現在、これらのビタミン又はビタミン様化合物の製造は、化学合成に依存しているが、これには費用がかかる。これらの製造のための生合成法は、現在及び将来のニーズを満たすための新たなより費用効果の高い手段を提供する。
【０００３】
ビオチンは、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）等、特定のカルボキシル化反応を触媒する酵素の必須補因子である。全ての生命体内に存在するＡＣＣは、脂肪酸生合成の重要な基本単位であるマロニルＣｏＡを生成する。自然界では、ビオチンは脂肪酸生合成経路を含む線形経路によって合成される。大腸菌でのビオチン合成の初期基質はマロニルＡＣＰであり、これは脂肪酸合成の開始代謝物でもある。脂肪酸サイクルを開始する前に、マロニルＡＣＰはＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）依存性メチルトランスフェラーゼであるＢｉｏＣによってマスクされ、それによりマロニルＡＣＰメチルエステルが生成される。その後、２サイクル分の脂肪酸鎖伸長により、分子ピメロイルエステルＡＣＰが生成される。固有のエステラーゼであるＢｉｏＨによるピメロイルエステルＡＣＰのＯメチル基の加水分解により、この分子は脂肪酸伸長サイクルを終了することができる。
【０００４】
その後、中間体であるピメロイルエステルＡＣＰは、ビオチン特異的経路を介してビオチンに変換される（図１Ａ）。この経路では、ＢｉｏＦはピメロイルＡＣＰとアラニンとのＰＬＰ依存性脱炭酸アルドール縮合を触媒し、ＫＡＰＡ（８−アミノ−７−オキソノナン酸）を生成する。ＢｉｏＡ（及びＢｉｏＫ）は、ＫＡＰＡのＰＬＰ依存的なアミノ基転移を触媒して、ＤＡＰＡ（７，８−ジアミノペラルゴン酸）を生成する。ここで供与体はＳＡＭであり、副産物はＳ−アデノシル−オキソメチオニンである。ＢｉｏＤは、ＡＴＰ駆動のＤＡＰＡのカルボキシル化及び閉環を触媒して、デスチオビオチン（ＤＴＢ）内にチオファン環を形成する。ビオチン合成経路の最終ステップは、ＢｉｏＢ（ビオチンシンターゼ）による２つの炭化水素間に硫黄架橋を導入してビオチンを生成することを含むため、既知の最も複雑な反応の１つである。ＢｉｏＢはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ又はＡｄｏＭｅｔ）ラジカル酵素であり、二量体として検出され、活性部位に［２Ｆｅ−２Ｓ］２＋及び［４Ｆｅ−４Ｓ］２＋の２つの鉄硫黄クラスタを含む。ＤＴＢでチオファン環を形成するのに必要な硫黄原子は、ＢｉｏＢの［２Ｆｅ−２Ｓ］２＋クラスタから補充されると考えられている。結果として、ＤＴＢ合成で消費されるＢｉｏＢ二量体の鉄硫黄クラスタは、各触媒サイクル後に再生成されると考えられている。
【０００５】
リポ酸（ＬＡ）は、活性酸素種の強力な捕捉剤であるために重要な抗酸化剤であることに加えて、α−ケト酸デヒドロゲナーゼの補因子でもある。ＬＡは、脂肪酸代謝の中間体からデノボ合成される（図２）。大腸菌のＬＡ合成に関与する３つの酵素は、ＬｐｌＡ（リポエート−タンパク質リガーゼ）、ＬｉｐＢ（オクタノイルタンパク質ＡＣＰキャリアタンパク質：タンパク質トランスフェラーゼ）、及びＬｉｐＡ（リポ酸シンターゼ）である。ｌｐｌＡ遺伝子によってコードされるＬｐｌＡは、標的酵素のＥ２サブユニットの非リポイル化アポリポイルドメインへの外来性オクタン酸の結合をＡＴＰ依存的に触媒することができる。ｌｉｐＢ遺伝子によってコードされるＬｉｐＢは、ＡＣＰから標的酵素のＥ２サブユニットのアポリポイルドメインへのオクタノイル残基の転移を触媒することができる。ＡｃｅＦ遺伝子は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼのＥ２サブユニットのリポイルドメインをコードする。ｌｉｐＡ遺伝子によってコードされるＬｉｐＡは、２つのＣ−Ｓ結合の形成に関与している。ＬｉｐＡが駆動する反応には、その機能を果たすために鉄硫黄クラスタ（４Ｆｅ−４Ｓ）とＳＡＭ（ｍｅｔＫ遺伝子によって生成される）とが必要である。リポ酸は、主に細胞内において、様々な多酵素複合体のタンパク質結合リポアミド部分として存在する。
【０００６】
チアミン生合成の研究は、細菌、一部の原生動物、植物及び真菌で行われてきた。チアミンのチアゾール部分及びピリミジン部分は別々に合成される（図３）。ピリミジン部分である４−アミノ−５−ヒドロキシメチル−２−メチルピリミジンホスフェート（ＨＭＰ−Ｐ）は、デノボプリン生合成経路の中間体である５−アミノイミダゾールリボチド（ＡＩＲ）に由来する。グラム陰性菌では、ラジカルＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）依存性反応におけるＡＩＲからＨＭＰ−Ｐへの変換が、サブユニットあたり１個の［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスタを結合させるｔｈｉＣ遺伝子産物であるＨＭＰ−Ｐシンターゼによって触媒される。
【０００７】
次に、ＨＭＰ−Ｐは、チアゾールユニットと結合する前に、ＴｈｉＤキナーゼによってリン酸化されてＨＭＰ−ＰＰとなる。チアゾール部分である５−（２−ヒドロキシエチル）−４−メチルチアゾールホスフェート（ＨＥＴ−Ｐ）は、Ｌ−チロシン及び１−デオキシ−Ｄ−キシルロースホスフェート（ＤＸＰ）及びシステインに由来する。ここで、硫黄原子はＬ−システインに由来すると考えられる。ｔｈｉＨ遺伝子によってコードされるチロシンリアーゼは、サブユニットあたり１個の［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスタを結合させ、ラジカル媒介によるチロシンの２−イミノ酢酸及び４−クレゾールへの開裂を触媒する。チアゾール部分の合成には、少なくとも５つの遺伝子ｔｈｉＦ、ｔｈｉＳ、ｔｈｉＧ、ｔｈｉＨ及びｔｈｉＩの発現が必要である。
【０００８】
次に、ピリミジン部分及びチアゾール部分は、ｔｈｉＥによってコードされるチアミン−リン酸シンターゼ（ＥＣ２．５．１．３）の作用により結合されてＴＭＰを形成する。従って、ＴＭＰは全ての既知のチアミン生合成経路の最初の産物である。大腸菌及び他の腸内細菌科では、ＡＴＰの存在下で、ｔｈｉＬによってコードされるチアミンリン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．４．１６）により、ＴＭＰが補因子ＴＰＰへとリン酸化され得る。チアミン一リン酸ホスファターゼ（Ｅ．Ｃ３．１．３．−）を発現する導入遺伝子を含む細菌株は、ＴＭＰをチアミンに変換することによりチアミンの生産を増強することが可能である。
【０００９】
細菌を利用した細胞工場の使用は、ビオチン、リポ酸、チアミンの生合成製造のための一方法となり得る。バイオ製品の製造のための細胞工場としての組換え大腸菌の利点は、（ｉ）グルコース塩培地で最適な環境条件下で培養した場合の倍加時間が約２０分と、増殖速度が比類なく急速であること及び、（ｉｉ）大腸菌液体培養の理論的密度限界が、乾燥細胞重量約２００ｇ／ｌ又はおよそ１×１０１３生菌／ｍＬと推定され、高い細胞密度を容易に達成可能であるという事実により、広く認識されている。更に、大腸菌の遺伝子改変のための多くの分子ツール及びプロトコルが入手可能であり、また異種タンパク質の発現が容易な微生物であるという点はいずれも、所望のバイオ製品を高レベルで製造するために不可欠であろう。
【００１０】
大腸菌では、ビオチンオペロン構造は、対向する鎖（ｂｉｏＯ遺伝子座）の重複プロモータの制御下でｂｉｏＡとｂｉｏＢＦＣＤとに分割され、ｂｉｏＨは大腸菌染色体の他の場所にある。ビオチンオペロンの発現は、ビオチンオペロンのオペレータに結合するビオチン結合リプレッサ（ＢｉｒＡ）によって下方制御される。ＢｉｒＡはビオチンリガーゼとしても機能し、ビオチンを細胞のカルボキシラーゼへと移動させる。ＢｉｒＡ機能のビオチンリガーゼから転写リプレッサへの切り替えは、それぞれの細胞内ビオチン及びアポカルボキシラーゼプールによって調節される。大腸菌でのビオチンオペロン（ｂｉｏＡ及びｂｉｏＢＦＣＤ）の過剰発現は、増殖を阻害することが報告されている（Ｉｆｕｋｕ，Ｏら１９９５）。この阻害の原因はこれまで不明であり、これがビオチン合成の促進を妨げる障害となってきた。
【００１１】
一般に、例えば細菌を利用したテーラーメードの細胞工場（例：大腸菌）でのビオチン、リポ酸及びチアミンの製造を容易にするためには、これらの複雑な生合成経路のボトルネックを特定して、これらの経路がそれぞれの経路酵素の増殖及び生産のレベルを高める能力を制限する可能性のある様々な要因を克服することが必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
第１の実施形態によれば、本発明は、ビオチン、リポ酸、又はチアミンのいずれか１つの生産を増強するための遺伝子改変された細菌であって、
●変異ＩｓｃＲポリペプチドをコードする遺伝子改変された内在性ｉｓｃＲ遺伝子であって、変異ＩｓｃＲポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び１４と少なくとも８０％の配列同一性を有し、アミノ酸配列は、
○Ｘが配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び１４の対応するアミノ酸残基以外の任意のアミノ酸である、Ｌ１５Ｘ、Ｃ９２Ｘ、Ｃ９８Ｘ、Ｃ１０４Ｘ及びＨ１０７Ｘ
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、内在性ｉｓｃＲ遺伝子と、
○ビオチン生産を増強するためのビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドと、
○リポ酸生産を増強するためのリポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．８）を有するポリペプチドと、
○チアミン生産を増強するためのＨＭＰ−Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７を有するポリペプチド）と、
○チアミン生産を増強するためのチロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するポリペプチドと、
●から選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１つの導入遺伝子と、
を備える遺伝子改変された細菌を提供する。
【００１４】
好ましくは、変異ＩｓｃＲポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸置換は、
○ＸがＦ、Ｙ、Ｍ、及びＷのいずれか１つであるＬ１５Ｘ、
○ＸがＹ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｇ、Ｌ、Ｍ、Ｆ及びＷのいずれか１つであるＣ９２Ｘ、
○ＸがＡ、Ｖ、Ｉ、Ｇ、Ｌ、Ｆ及びＷのいずれか１つである９８Ｘ、
○ＸがＡ、Ｖ、Ｉ、Ｇ、Ｌ、Ｆ及びＷのいずれか１つであるＣ１０４Ｘ並びに、
○ＸがＡ、Ｙ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｖ、Ｉ、Ｇ及びＬのいずれか１つであるＨ１０７Ｘ
からなる群から選択される。
【００１５】
ビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドをコードする１つの導入遺伝子を含む、ビオチン生産を増強するための本発明による遺伝子改変された細菌は、
○ＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）依存性メチルトランスフェラーゼ活性（ＢｉｏＣ；ＥＣ２．１．１．１９７）を有するポリペプチド；
○７−ケト−８−アミノペラルゴン酸（ＫＡＰＡ）シンターゼ活性（ＢｉｏＦ；ＥＣ２．３．１．４７）を有するポリペプチド；
○７，８−ジアミノペラルゴン酸（ＤＡＰＡ）シンターゼ活性（ＢｉｏＡ；ＥＣ：２．６．１．６２）又はＬ−リジン：８−アミノ−７−オキソノナノエートアミノトランスフェラーゼ活性（ＢｉｏＫ：ＥＣ：２．６．１．１０５）を有するポリペプチド；
○デチオビオチン（ＤＴＢ）シンテターゼ活性（ＢｉｏＤ；ＥＣ６．３．３．３）を有するポリペプチド；及び
○ピメロイル−［アシルキャリアタンパク質］メチルエステルエステラーゼ活性（ＢｉｏＨ；ＥＣ３．１．１．８５）を有するポリペプチド又は６−カルボキシヘキサノエート−ＣｏＡリガーゼ活性（ＢｉｏＷ；ＥＣ６．２．１．１４）を有するポリペプチド；
からなる群から選択される１以上のポリペプチドをコードする更なる導入遺伝子を更に含んでもよい。
【００１６】
好ましくは、ビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドをコードする１つの導入遺伝子を含む、ビオチン生産を増強するための本発明による遺伝子改変された細菌は、ＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）依存性メチルトランスフェラーゼ活性（ＢｉｏＣ；ＥＣ２．１．１．１９７）を有するポリペプチド；７−ケト−８−アミノペラルゴン酸（ＫＡＰＡ）シンターゼ活性（ＢｉｏＦ；ＥＣ２．３．１．４７）を有するポリペプチド；及び７，８−ジアミノペラルゴン酸（ＤＡＰＡ）シンターゼ活性（ＢｉｏＡ；ＥＣ：２．６．１．６２）を有するポリペプチドをコードする更なる導入遺伝子を更に含む。
【００１７】
リポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．８）を有するポリペプチドをコードする１つの導入遺伝子を含む、リポ酸の生産を増強するための本発明による遺伝子改変された細菌は、
○オクタノイルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．３．１．１８１）を有するポリペプチドと、
○ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ２．３．１．１２）のジヒドロリポイルリジン残基アセチルトランスフェラーゼ部分を含むポリペプチドと、
○リポエートタンパク質リガーゼＡ（ＬｐｌＡ；ＥＣ：６．３．１．２０）を有するポリペプチドと、
からなる群から選択される１以上のポリペプチドをコードする更なる導入遺伝子を更に含んでもよい。
【００１８】
ＨＭＰ−Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するＴｈｉＣポリペプチドをコードする１つの導入遺伝子及び／又は、チロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するＴｈｉＨポリペプチドをコードする１つの導入遺伝子を含む、チアミンの生産を増強するための本発明による遺伝子改変された細菌は、
○ＴｈｉＳアデニリルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．７．７．７３）を有するＴｈｉＦポリペプチドと、
○チアミンリン酸シンターゼ活性（ＥＣ２．５．１．３）を有するＴｈｉＥポリペプチドと、
○チアゾールシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．１０）を有するＴｈｉＧポリペプチドと、
○ホスホヒドロキシメチルピリミジンキナーゼ活性（ＥＣ２．７．４．７）を有するＴｈｉＤポリペプチドと、
○硫黄担体タンパク質活性を有するＴｈｉＳポリペプチドと、
○チアミン一リン酸ホスファターゼ活性（ＥＣ３．１．３．−）を有するポリペプチドと、
○グリシンオキシダーゼ活性（ＥＣ１．４．３．１９）を有するＴｈｉＯポリペプチドと、
からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをコードする更なる導入遺伝子並びに、任意に、
○ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ活性（２．７．１．５０）を有するＴｈｉＭポリペプチド
をコードする導入遺伝子を更に含んでもよい。
【００１９】
好ましくは、遺伝子改変された細菌細胞は、ポリペプチド：ＴｈｉＣ（ｔｈｉＣ遺伝子によってコードされる）；ＴｈｉＤ（ｔｈｉＤ遺伝子によってコードされる）；ＴｈｉＥ（ｔｈｉＥ遺伝子によってコードされる）；ＴｈｉＦ（ｔｈｉＦ遺伝子によってコードされる）；硫黄担体タンパク質（ｔｈｉＳ遺伝子によってコードされる）；ＴｈｉＧ（ｔｈｉＧ遺伝子によってコードされる）；ＴＭＰホスファターゼ（ＴＭＰホスファターゼ遺伝子によってコードされる）；及びＴｈｉＨ（ｔｈｉＨ遺伝子によってコードされる）又はＴｈｉＯ（ｔｈｉＯ遺伝子によってコードされる）をコードする導入遺伝子を含む。この実施形態によれば、細胞は、（（ｔｈｉＭ遺伝子によってコードされる）酵素ＴｈｉＭをコードする導入遺伝子を更に含んでもよい。
【００２０】
好ましくは、本発明の遺伝子改変された細菌における少なくとも１つの導入遺伝子及び１つ以上の更なる導入遺伝子のそれぞれは、構成的プロモータに作用可能に連結されている（プロモータが、導入遺伝子を含むオペロンに作用可能に連結されていてもよい）。
【００２１】
本発明の遺伝子改変された細菌は、好ましくは、エシェリキア属、バシラス属、ブレビバクテリウム属、バークホルデリア属、カンピロバクター属、コリネバクテリウム属、セラチア属、ラクトバシラス属、ラクトコッカス属、アシネトバクター属、アセトバクター属、及びシュードモナス属からなる群から選択される属の種であり、より好ましくは、例えば大腸菌又はグルタミン酸生産菌等のエシェリキア属又はコリネバクテリウム属の種である。
【００２２】
第２の実施形態によれば、本発明は、
○ビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む本発明の遺伝子改変された細菌を増殖培地に導入して、培養物を作製する工程と、
○培養物を培養する工程と、
○培養物によって生産されたビオチンを回収し、回収されたビオチンを任意に精製する工程と、
を含むビオチン製造方法を提供する。
【００２３】
第３の実施形態によれば、本発明は、
○リポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．８）を有するポリペプチドをコードする１つの導入遺伝子を含む本発明の遺伝子改変された細菌を増殖培地に導入して、培養物を作製する工程と、
○培養物を培養する工程と、
○培養物によって生産されたリポ酸を回収し、回収されたリポ酸を任意に精製する工程と、
を含むリポ酸製造方法を提供する。
【００２４】
第４の実施形態によれば、本発明は、
○ＨＭＰ−Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するポリペプチドをコードする導入遺伝子及び／又はチロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む本発明の遺伝子改変された細菌を増殖培地に導入して、培養物を作製する工程と、
○培養物を培養する工程と、
○培養物によって生産されたチアミンを回収し、回収されたチアミンを任意に精製する工程と、
を含むチアミン製造方法を提供する。
【００２５】
好ましくは、ビオチン、リポ酸及びチアミンのいずれか１つを製造する方法で使用される増殖培地は、グルコース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、アラビノース、キシロース、ラフィノース、マンノース、ラクトース、又はそれらの任意の組み合わせから選択される炭素源を含む。
【００２６】
第４の実施形態によれば、本発明は、ビオチンシンターゼをコードする導入遺伝子を発現する細菌細胞におけるビオチン生産を増強するための、変異ｉｓｃＲポリペプチドをコードする遺伝子改変された遺伝子の使用であって、変異ｉｓｃＲポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４と少なくとも８０％の配列同一性を有し、アミノ酸配列は、Ｘが配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４の対応するアミノ酸残基以外の任意のアミノ酸であるＬ１５Ｘ、Ｃｙｓ９２Ｘ、Ｃｙｓ９８Ｘ、Ｃｙｓ１０４Ｘ及びＨｉｓ１０７Ｘからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する使用を提供する。
【００２７】
第４の実施形態によれば、本発明は、細菌におけるビオチン、リポ酸又はチアミンのいずれか１つの生産を増強するための変異ｉｓｃＲポリペプチドをコードする遺伝子改変された遺伝子の使用であって、細菌が、
・ビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドと、
・リポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．８）を有するポリペプチドと、
・ＨＭＰ−Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するポリペプチドと、チロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するポリペプチドと、
から選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１つの導入遺伝子を含み、かつ発現し、
遺伝子改変された遺伝子は、変異ＩｓｃＲポリペプチドをコードする内在性ｉｓｃＲ遺伝子であり、変異ＩｓｃＲポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４と少なくとも８０％の配列同一性を有し、
アミノ酸配列は、Ｘが配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４の対応するアミノ酸残基以外の任意のアミノ酸であるＬ１５Ｘ、Ｃｙｓ９２Ｘ、Ｃｙｓ９８Ｘ、Ｃｙｓ１０４Ｘ及びＨｉｓ１０７Ｘからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、使用を提供する。
【００２８】
第５の実施形態によれば、本発明は、ビオチン、リポ酸又はチアミンの生産を増強するための、本発明による遺伝子改変された細菌の使用を提供する。
【００２９】
第６の実施形態によれば、本発明は、ビオチン、リポ酸又はチアミンのいずれか１つの生産を増強するための本発明による遺伝子改変された細菌であって、例えば、フラボドキシン／フェレドキシンレダクターゼ及びフラボドキシン還元システムのポリペプチド又はピルビン酸フラボドキシン／フェレドキシンオキシドレダクターゼシステムのポリペプチド等の、電子供与体ＮＡＤＰＨからＳＡＭラジカル鉄硫黄クラスタ酵素の［４Ｆｅ−４Ｓ］２＋クラスタへの増強された電子伝達を媒介することの可能なポリペプチドをコードする１以上の遺伝子を更に含む細菌を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】Ａ）細菌のビオチン経路の中間体及びビオチンの合成に至る各酵素段階、ＳＡＭ：Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、ＳＡＨ：Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン、ＣｏＡ：コエンザイムＡ、ＡＣＰ：アシルキャリアタンパク質、ＫＡＰＡ：７−ケト−８−アミノペラルゴン酸、ＡＭＴＯＤ：Ｓ−アデノシル−２−オキソ−４−チオメチルブチレート、ＤＡＰＡ：７，８−ジアミノペラルゴン酸、ＤＴＢ：デスチオビオチン、５’ＤＯＡ：５’−デオキシアデノシン並びに、Ｂ）ＩｓｃＲのｉｓｃオペロン構造、Ｆｅ−Ｓクラスタ形成における役割及び調節機構を示す図である。ｉｓｃオペロンは、遺伝子：ｉｓｃＳ（システイン脱スルフラーゼ）、ｉｓｃＵ（足場）、ｉｓｃＡ（Ａ型タンパク質）、ＨｓｃＢ（Ｄｎａｊ様コシャペロン）、ＨｓｃＡ（ＤｎａＫ様シャペロン）及びｆｄｘ（フェレドキシン）遺伝子の発現を制御するＩｓｃＲをコードするｉｓｃＲ遺伝子を含む。ＩｓｃＲは、遺伝子ｈｙａＡ、ｙｄｉＵ、ｅｒｐＡ及びｓｕｆＡを含む４０種類超の遺伝子も調節する。
【図２】細菌のリポ酸経路の中間体及び、リポイル化リポイルドメイン（リポ酸合成）に至る各酵素段階を示す図である。経路の主要な酵素には、ＬｉｐＡ（リポ酸シンターゼ）、ＬｉｐＢ（オクタノイルタンパク質ＡＣＰキャリアタンパク質：タンパク質トランスフェラーゼ）及び基質ＳＡＭ：Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンが含まれる。ＬｐｌＡは、リポエートタンパク質リガーゼＡ；ＥＣ：６．３．１．２０である。
【図３】細菌のチアミン経路の中間体並びに、チアミン（ＴＨＩ）；チアミン一リン酸（ＴＭＰ）及びチアミン二リン酸（ＴＰＰ）の合成に至る各酵素段階を示す図である。中間体の略語：５−アミノイミダゾールリボヌクレオチド（ＡＩＲ）、４−アミノ−２−メチル−５−（ホスホオキシメチル）ピリミジン（ＨＭＰ−Ｐ）、４−アミノ−２−メチル−５−（ジホスホメチル）ピリミジン（ＨＭＰ−ＰＰ）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）、デヒドログリシン（ＤＨＧ）、４−メチル−５−（２−ホスホオキシエチル）チアゾール（ＴＨＺ−Ｐ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、還元フェレドキシン（Ｆｄｘ  ｒｅｄ）、酸化フェレドキシン（Ｆｄｘ  ｏｘ）。
【図４】ＩＰＴＧ誘導性ｂｉｏＢ発現プラスミドを含む（大腸菌ＢＷ２５１１３）ΔｂｉｏＢ株（右パネル）及び、ＩＰＴＧ誘導性フレームシフトｂｉｏＢ（未熟停止コドン）発現プラスミドを含む参照（大腸菌ＢＷ２５１１３）株（左パネル）の経時的に測定された細胞密度（ＯＤ６００で測定）のグラフである。０．１ｇ／ＬのＤＴＢ、５０μｇ／ｍＬ、０ｍＭ（円形）のカナマイシン、０．０１ｍＭ（三角形）又は０．１ｍＭ（正方形）のＩＰＴＧを含む２００μＬのｍＭＯＰＳ中で増殖させた４つの生物株の複製について、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎを使用してＯＤ６２０を測定し、ＯＤ６００に変換した。それぞれの対数増殖速度の値を、隣接する枠内に示す。
【図５】（ビオチン定量方法で説明するように）２７５ｒｐｍの振盪で、３７℃で２０時間インキュベートした後に、４０μｇ／ｍｌのゼオシンとゼロ又は最大０．２４４μｇ／ｍＬまで増加する濃度のビオチンとを加えた１５０μＬのｍＭＯＰＳ培地中で増殖させたプラスミドｐＢＳ４５１を含む大腸菌ＢＳ１０１１の培養物の最終細胞密度（ＯＤ６００で測定）を示す散布図のグラフである。点線の灰色の縦線は、ビオチンバイオアッセイの最適なビオチン濃度範囲が０．０２４〜０．２４μｇ／Ｌであることを示している。
【図６】それぞれがＩＰＴＧ誘導性ｂｉｏＢ発現プラスミド（ｐＢＳ４１２）を含む４つの生物学的複製物における、アミノ酸変異を有する変異ＩｓｃＲを発現する３つの異なるｉｓｃＲ変異株（ＢＳ１３７７、Ｌ１５Ｆ）、（ＢＳ１３７５、Ｃ９２Ｙ）及び（ＢＳ１３５３、Ｈ１０７Ｙ）並びに大腸菌ＢＷ２５１１３  ΔｂｉｏＢ株（ＢＳ１０１１、参照）のビオチン生産（株については表１を参照）を示す棒グラフである。株を、０．１ｇ／ｌのＤＴＢと５０μｇ／ｍＬのカナマイシンとを含む４００μＬのｍＭＯＰＳ中で、２７５ｒｐｍの振盪で、３７℃で２４時間増殖させた。棒は、平均ビオチン生産値（高さ）及びＩＰＴＧ誘導レベル（灰色の陰影）を示し、黒い点は個々の複製培養物からのビオチン生産を示し、水平の点線は参照野生型株からの最大ビオチン生産を示す。ＩＰＴＧの不在下で培養した場合、どの株も検出可能なレベルのビオチンを生産しなかったことに留意すべきである。
【図７】変異ＩｓｃＲを発現するｉｓｃＲ変異株（ＢＳ１３５３、Ｈ１０７Ｙ）及び大腸菌ＢＷ２５１１３  ΔｂｉｏＢ株（ＢＳ１０１１、参照）の細胞密度とビオチン生産のグラフである。各株はＩＰＴＧ誘導性ｂｉｏＢ遺伝子発現プラスミド（ｐＢＳ４１２）を含む。データは、２５時間にわたって観察されたｉｓｃＲ  Ｈ１０７Ｙ変異株（濃い実線）及び参照株である大腸菌ＢＷ２５１１３  ΔｂｉｏＢ株（薄い灰色の点線）のそれぞれの３つの生物学的複製の平均測定ＯＤ６００並びに、ｉｓｃＲ  Ｈ１０７Ｙ変異株（濃い円形）及び参照株である大腸菌ＢＷ２５１１３  ΔｂｉｏＢ株（明るい灰色の円形）のそれぞれによるビオチン生産を表す。株を、２５０ｍＬのバッフル付きの振盪フラスコに入れた０．１ｇ／ｌのＤＴＢ、０．０１ｍＭ（Ａ）又は０．５ｍＭ（Ｂ）のＩＰＴＧ及び５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む５０ｍＬのｍＭＯＰＳ中で、３７℃、２７５ｒｐｍの振盪で増殖させた。増殖速度を黒い枠内に示す。
【図８】同定された変異株のｉｓｃＲ遺伝子におけるヌクレオチド及びアミノ酸配列変異の位置を示す、注釈が付けられたＩｓｃＲコード配列を示す図である。
【図９】Ｌ１５Ｆ及びＨ１０７Ｙ  ｉｓｃＲ変異が棒（野生型アミノ酸は灰色、変異アミノ酸は黒）として示される、ｈｙａ  ＤＮＡ結合部位（黒）に結合したＩｓｃＲ二量体（灰色）の結晶構造（ＰＤＢエントリ４ＨＦ１）を示す図及び変異した残基を強調する拡大画像である。
【図１０】ＩＰＴＧ誘導性ｂｉｏＢ発現プラスミドと、強力なリボソーム結合部位（ＲＢＳ）に作用可能に連結されたｉｓｃオペロン（ｉｓｃＳＵＡ−ｈｓｃＢＡ−ｆｄｘ、ｉｓｃＲ遺伝子を欠くネイティブ大腸菌ｉｓｃオペロン構造に対応する）又は大腸菌ｓｕｆオペロン（ｓｕｆＡＢＣＤＳＥ）及び中コピー数プラスミド（ｐ１５Ａ  ｏｒｉ）からのＴ５  ＬａｃＯ抑制プロモータを含むプラスミド又は対照プラスミドとを含む大腸菌株のビオチン生産を示す棒グラフである。対照プラスミドは、ｓｕｆオペロン又はｉｓｃオペロンの代わりにＧＦＰをコードするＩＰＴＧ誘導性遺伝子を含んだ。各株の生物学的トリプリケートを、低（０．０１ｍＭのＩＰＴＧ）及び高（０．１ｍＭのＩＰＴＧ）誘導下で、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを含み、基質として０．１ｇ／Ｌ（ＤＴＢ）を加えたｍＭＯＰＳで培養した。各株をディープウェルプレートで、３７℃、２７５ｒｐｍで２４時間増殖させた後、増殖ベースのバイオアッセイを使用してビオチン生産を評価した。棒は平均ビオチン生産値（高さ）及びＩＰＴＧ誘導レベル（灰色の陰影）を示し、黒い点は個々の複製からのビオチン生産を示し、十字はＯＤ６００として測定される各株のエンドポイント（最終）細胞密度を示す。０．０１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した場合、どの株も検出可能なレベルのビオチンを生成しなかったことに留意されたい。
【図１１】トリプリケートで実施された４つの異なるサンプルでのＢｉｏＢタンパク質発現レベルとビオチン生産との相関のグラフである。株はｐＢＳ４３０（ｂｉｏＢフレームシフトＩＰＴＧ誘導性プラスミド）を有するＢＳ１０１３（大腸菌ＢＷ２５１１３、バックグラウンド株）、ｐＢＳ４１２（ｂｉｏＢ  ＩＰＴＧ誘導性プラスミド）を含むＢＳ１０１１（ΔｂｉｏＢを含むＢＳ１０１３）、ｐＢＳ４１２を含むＢＳ１３５３（ｉｓｃＲ  Ｈ１０７Ｙ変異を含むＢＳ１０１１）である。０．１ｇ／ｌのＤＴＢ及びＩＰＴＧをグラフに示すように含むｍＭＯＰＳで菌株を増殖させた。
【図１２】ＩＰＴＧ誘導性ｂｉｏＢ発現プラスミド及び、ｉｓｃＲの以下のゲノム変異：野生型（ｉｓｃＲ  ＷＴ）、位置２２で停止コドンに変異したＥ２２＊グルタミン酸をコードするノックアウト変異（ｉｓｃＲ  ＫＯ）、位置９２でのシステインからチロシンへの置換をコードする変異（ｉｓｃＲ  Ｃ９２Ｙ）のいずれかを含む大腸菌ΔｂｉｏＢ株のビオチン生産を示す棒グラフである。棒は、所定のＩＰＴＧ誘導（灰色の陰影）レベルでの平均ビオチン生産値（高さ）を示し、点は個々の複製からのビオチン生産を示す。各株の生物学的トリプリケートを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むｍＭＯＰＳで、無誘導（０ｍＭのＩＰＴＧ）、低誘導（０．０１ｍＭのＩＰＴＧ）及び高誘導（０．１ｍＭのＩＰＴＧ）で、基質として０．１ｇ／ＬのＤＴＢを加えて培養した。各株をディープウェルプレートで、３７℃、２７５ｒｐｍで２４時間増殖させた後、増殖ベースのバイオアッセイを使用してビオチン生産を評価した。
【図１３】ビオチンオペロンプラスミドと、ｉｓｃＲの以下のゲノム変異：野生型（ｉｓｃＲ  ＷＴ）、変異ｉｓｃＲ  Ｈ１０７Ｙ（位置１０７でのヒスチジンからチロシンへの置換をコードする）又は位置９２でのシステインからチロシンへの置換をコードする変異（ｉｓｃＲ  Ｃ９２Ｙ）のいずれかを含む大腸菌ΔｂｉｏＡ  ΔｂｉｏＢＦＣＤ株によるビオチン生産を示す棒グラフである。各株の生物学的なクアドルプリケート（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅｓ）を、基質として０．１ｇ／Ｌのデスチオビオチン（ＤＴＢ）を含むか又は含まない１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含むｍＭＯＰＳ中で培養した。株をディープウェルプレートで、３７℃、２７５ｒｐｍで２４時間増殖させた後、増殖ベースのバイオアッセイを使用してビオチン生産を評価した。棒は平均ビオチン生産値（高さ）及びＤＴＢの有無（灰色の陰影）を示し、黒い点は個々の複製からのビオチン生産を示す。
【図１４】アミノ酸変異（ＢＳ１３７５、Ｃ９２Ｙ）及び（ＢＳ１３５３、Ｈ１０７Ｙ）を有する変異ＩｓｃＲを発現する２つの異なるｉｓｃＲ変異株及び対照株（ＢＳ１０１１、ＩｓｃＲ  ＷＴ）（株については表１を参照）の、それぞれがＩＰＴＧ誘導性ｌｉｐＡ（ｐＢＳ９９３、表４を参照）を発現するプラスミドを含む３つの生物学的複製のリポ酸生産（灰色の棒）及び２４時間生産後の最終（最終的な）ＯＤ６００（×印）を示す棒グラフである。株を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、０．１ｍＭのビオチン、０．６ｇ／ｌのオクタン酸及び０．０１ｍＭのＩＰＴＧを含む４００μＬのｍＭＯＰＳ中で、３７℃で２７５ｒｐｍの振盪で２４時間増殖させた。棒は平均リポ酸生産値（高さ）を示し、黒い点は個々の複製培養物からのリポ酸生産を示している。リポ酸の平均生産量が、最終ＯＤ６００が同じままであっても１．７９倍増加することが分かる。
【図１５】双方ともＩＰＴＧ誘導性ｌｉｐＡ発現プラスミド（ｐＢＳ１０３７）を含む、経時的に測定された参照株（大腸菌ＢＷ２５１１３）ΔｌｉｐＡ（ＷＴ、三角形）及び変異ｉｓｃＲ（Ｃ９２Ｙ）（Ｃ９２Ｙ、四角）を有するΔｌｉｐＡ株の細胞密度（ＯＤ６２０で測定）のグラフである。ＯＤ６２０を、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎを使用して、０．６ｇ／Ｌのオクタン酸、１００ｇ／ｍＬのアンピシリン及び、０〜０．０４ｍＭ（灰色の濃さが増加）のＩＰＴＧを含む２００μＬのｍＭＯＰＳ中で増殖させた６つの生物学的菌株の複製について測定した。それぞれの増殖速度（ＧＲ）を右側に示す。
【図１６】アミノ酸変異（ＢＳ２０１９、Ｃ９２Ｙ）及び（ＢＳ２０２０、Ｈ１０７Ｙ）を有する変異ＩｓｃＲを発現する２つの異なるｉｓｃＲ変異株及び大腸菌ＢＷ２５１１３  ΔｔｈｉＰ、ｔｈｉＬ＊株（ＢＳ７５０、参照）（株については表５を参照）の、それぞれがチアミン経路遺伝子全体ｔｈｉＣＥＦＳＧＨＭＤ（ｐＢＳ１４０）を発現するプラスミドを含む４つの生物学的複製のチアミン生産を示す棒グラフである。株を、２７５ｒｐｍの振盪で、３７℃で２４時間、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む４００μＬのｍＭＯＰ中で増殖させた。棒は、最終ＯＤ６００を修正したチオクロムアッセイ（チアミン、ＴＭＰ、ＴＰＰを含む）で測定した上清の平均チアミン生産値（高さ）を示し、黒い点は個々の複製培養物からのチアミン生産を示す。参照株（ＢＳ７５０）と比較して、変異株（ＢＳ２０１９及びＢＳ２０２０）ではＯＤ正規化力価が１．４３倍改善されていることが分かる。
【図１７】大腸菌ΔｂｉｏＡＢＦＣＤ  ｉｓｃＲ  Ｈ１０７Ｙ（位置１０７でのヒスチジンからチロシンへの置換をコードする）の、ＩＰＴＧ誘導性ＢｉｏＢ過剰発現プラスミドｐＢＳ６７９を単独で含む株（ＢＳ１９３７）、あるいは更にＦｌｄＡ−Ｆｐｒの構成的過剰発現を伴うｐＢＳ１１１２と共に含む株（ＢＳ２１８５）、又はＧＦＰの構成的過剰発現を伴うｐＢＳ１０５４と共に含む株（ＢＳ２７０７）によるビオチン生産を示す棒グラフである。各株を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、基質としての０．１ｇ／Ｌのデスチオビオチン（ＤＴＢ）、０、０．０１、０．０２５、０．０５、０．０７５又は０．１ｍＭのＩＰＴＧを含むｍＭＯＰＳ中で培養した。ＢＳ２１８５及びＢＳ２７０７の培地は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むこと以外は同じであった。株を、２７５ｒｐｍ、３７℃で２４時間、ディープウェルプレートで増殖させ、その後、増殖ベースのバイオアッセイを使用してビオチン生産を評価した。棒は、各菌株：ＢＳ１９３７（黒色の棒）；ＢＳ２１８５（灰色の棒）；及びＢＳ２７０７（市松模様の灰色の棒）によるビオチン生産値（高さ）を示す。
【図１８】ＩＰＴＧ誘導性ＢｉｏＢ過剰発現プラスミドｐＢＳ６７９を含む大腸菌ΔｂｉｏＡＢＦＣＤ  ｉｓｃＲ  Ｈ１０７Ｙ（位置１０７でのヒスチジンからチロシンへの置換をコードする）株によるビオチン生産を示す棒グラフである。ＢＳ２１８５は更に、ＦｌｄＡ−Ｆｐｒの構成的過剰発現を伴うｐＢＳ１１１２を含む。ＢＳ１９３７を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、基質としての０．１ｇ／Ｌのデスチオビオチン（ＤＴＢ）、０．０２５ｍＭのＩＰＴＧ誘導を含むｍＭＯＰＳ中で培養した。ＢＳ２１８５の培地は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを更に含む以外は同じであった。株を、２７５ｒｐｍ、３７℃で２４時間、ディープウェルプレートで増殖させ、その後、増殖ベースのバイオアッセイを使用してビオチン生産を評価した。暗い灰色の棒は平均ビオチン生産値（高さ）を示し（ＢＳ１９３７はｎ＝６及びＢＳ２１８５はｎ＝８）、明るい灰色の棒は最終ＯＤ６００を示す。黒い点は個々の複製からのビオチン生産及び最終ＯＤ６００を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
定義：
アミノ酸配列同一性：本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、実質的に等しい長さの２つのアミノ酸配列間の相同性の程度の定量的尺度を示す。比較する２つの配列は、ギャップを挿入するか、タンパク質配列の末端で切断を行うことにより、最適な適合を実現するためにアライメントを行う必要がある。配列同一性は、（（Ｎｒｅｆ−Ｎｄｉｆ）１００）／（Ｎｒｅｆ）として計算することが可能であり、ここで、Ｎｄｉｆはアライメントされた時の２つの配列の同一でない残基の総数であり、Ｎｒｅｆは片方の配列の残基の数である。配列同一性の計算は、例えばＢＬＡＳＴＰプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ．Ｒ及びＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８））（（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ）等のＢＬＡＳＴプログラムを使用して自動化することが好ましい。多重配列アライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷ配列アライメント法で実行され、デフォルトのパラメータはＴｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊら１９９４によって説明されており、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／で入手可能である。
【００３２】
好ましくは、ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基の置換、挿入、追加又は欠失の数は、その比較ポリペプチドと比較して制限されており、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以下の置換、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以下の挿入、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以下の追加、及び１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以下の欠失となっている。好ましくは、置換は保存的アミノ酸置換であり、グループ１：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン；グループ２：セリン、システイン、セレノシステイン、トレオニン、メチオニン；グループ３：プロリン；グループ４：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；グループ５：アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンのメンバー内の交換に限定されている。
【００３３】
アミノ酸略語：ロイシン（Ｌ）、システイン（Ｃ）及びヒスチジン（Ｈ）。
【００３４】
内在性遺伝子：起源が宿主細菌と相同な細菌細胞ゲノム内の遺伝子（即ち、宿主細菌のネイティブ遺伝子）。当技術分野で知られているツールを使用して内在性遺伝子を遺伝子改変することにより、遺伝子改変された内在性遺伝子が、それが由来する親内在性遺伝子によってコードされるポリペプチドとはアミノ酸配列が１つ以上の位置で異なる変異ポリペプチドをコードしてもよい。
【００３５】
ゲノム：細胞又は生物内に存在する遺伝物質。そのゲノムは、その細胞又は生物を構築及び維持するために必要な全ての情報を含み、また、細胞又は生物内に存在する染色体及びプラスミドの両方の遺伝物質を含む。
【００３６】
ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質。
【００３７】
ｇｉ番号：（ｇｅｎｌｎｆｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）は、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋからのヌクレオチド配列、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ及び多くのその他からのタンパク質配列をはじめ、Ｅｎｔｒｅｚに処理される全ての配列にＮＣＢＩによって割り当てられる、データベースソースとは無関係の特定の配列を識別する一意の整数である。
【００３８】
Ｉｓｃ経路：鉄硫黄クラスタ経路；ｉｓｃＲ遺伝子を含むｉｓｃオペロンによってコードされる。
【００３９】
Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ：フィルタベースのマイクロプレート光度計。３４０〜８５０ｎｍ（６００〜６２０ｎｍを含む）の波長範囲で９６又は３８４ウェルプレートフォーマットからの吸光度を測定する。プレートは、５０℃までの選択された温度で、光度計内でインキュベートされる。光度計はＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製である。
【００４０】
ネイティブ遺伝子：宿主細胞と相同な細菌細胞ゲノムの内在性遺伝子。
【００４１】
非ネイティブプロモータ：本発明の遺伝子改変された細菌の文脈において、この細胞内の遺伝子又は導入遺伝子に作用可能に連結されたプロモータであり、このプロモータは、自然界で見つかる細菌細胞内のこの遺伝子又は導入遺伝子に作用可能に連結されたものではない。
【００４２】
ＯＤ：光学密度
【００４３】
導入遺伝子：遺伝子操作によって細菌のゲノムに導入された外来性遺伝子。本発明の文脈において、このゲノムは染色体遺伝子要素及びエピソーム遺伝子要素の双方を含む。
【００４４】
発明の詳細な説明
ビオチン、リポ酸、及びチアミンの合成のための生合成経路の共通の特徴は、複雑なラジカル媒介分子再配列を触媒するための１以上のＳＡＭ又はＡｄｏＭｅｔラジカル酵素を必要とすることである。ビオチンシンターゼ、リポ酸シンターゼ、ＨＭＰ−Ｐシンターゼ、及びチロシンリアーゼは、これらの経路におけるこれらの必須のステップを触媒することが知られているそれぞれの酵素である。ビオチンオペロンの過剰発現によって、又はＢｉｒＡリプレッサによるフィードバック調節の影響を受けにくい変異ビオチンオペロンを使用することによって、大腸菌のビオチン生合成を高めようとする以前の試みの失敗は、強い増殖阻害によるものであった（Ｉｆｕｋｕ，Ｏら１９９５）。観察された増殖阻害に関して、証拠に基づいた説明がないために、ビオチンシンターゼの過剰発現の毒性を説明しうる細胞因子を特定するには、代替的なアプローチが必要であった。
【００４５】
本発明により提供されるこの問題に対する解決策は、細菌細胞工場の細胞（例えば大腸菌）におけるビオチンシンターゼ、リポ酸シンターゼ、ＨＭＰ−Ｐシンターゼ、及びチロシンリアーゼの発現の増強に等しく適用可能であることが示されている。この問題を解決するために追求されたアプローチは、不完全なエラー修正ポリメラーゼによって生成されたバックグラウンド変異の蓄積により進化したゲノム多様性を持つ大腸菌細胞のライブラリを生成することであった。このようなライブラリの細胞を、ＩＰＴＧ誘導性ｂｉｏＢ遺伝子発現カセットを含むプラスミドで形質転換した。候補変異体は、変異細胞が由来する親大腸菌株においてＢｉｏＢ発現毒性を誘発するのに十分な濃度のＩＰＴＧの存在下で増殖することの可能なライブラリの細胞であった。
【００４６】
選択されたＢｉｏＢ発現変異株の増殖の遺伝的根拠を、全ゲノムシーケンシングによって確認した。驚くべきことに、３つの株が、多面発現性の転写因子（ＩｓｃＲ）［配列番号２］をコードするネイティブ鉄硫黄クラスタレギュレータ遺伝子（ｉｓｃＲ）に変異を有することが判明した。Ｆｅ−Ｓクラスタは多くのタンパク質及び必須酵素の補因子であり、ビオチン等のＳ含有化合物の合成に必要であるだけでなく、酸化還元又は鉄に関連するストレス状態のセンサとしても必要な多様な生化学的能力を付与する。
【００４７】
ＩｓｃＲは、Ｆｅ−Ｓクラスタホロタンパク質として、又はＦｅ−Ｓクラスタのないアポタンパク質として、２つの状態で存在する。ＩｓｃＲのＦｅ−Ｓクラスタのアセンブリは、ｉｓｃオペロンによってコードされるＩｓｃ経路によって触媒される。ｉｓｃオペロンは、まずレギュレータ（ＩｓｃＲ）をコードし、続いてシステイン脱スルフラーゼ（ＩｓｃＳ）、足場（ＩｓｃＵ）、Ａ型タンパク質（ＩｓｃＡ）、Ｄｎａｊ様コシャペロン（ＨｓｃＢ）、ＤｎａＫ様シャペロン（ＨｓｃＡ）及びフェレドキシン（Ｆｄｘ）をコードする。Ｉｓｃ経路は、ＩｓｃＲホロ酵素のアセンブリに不可欠であることに加えて、大腸菌におけるＦｅ−Ｓクラスタ生合成の主要な経路である（図１Ｂ）。
【００４８】
ＩｓｃＲの２つの形態の比率は、［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスタの細胞レベルによって決定され、鉄及び酸素のレベルを含むいくつかの要因の影響を受ける（Ｐｙ，Ｂ．＆Ｂａｒｒａｓ，２０１０）。鉄が豊富な条件下では、ＩｓｃＲは主にホロ酵素として存在し、その後、ｉｓｃオペロンの転写リプレッサとして働く。しかし、鉄が少ない条件下（低レベルの［２Ｆｅ−２Ｓ］クラスタ）では、ＩｓｃＲはそのアポタンパク質状態に戻り、ｉｓｃオペロンの転写を可能にする。ＩｓｃＲは、そのアポタンパク質状態ではｓｕｆＡＢＣＤＳＥオペロンの活性化因子として機能し、酸化ストレス下でＦｅ−Ｓクラスタ生合成を触媒する。
【００４９】
ＩｓｃＲは、大腸菌の２つのＦｅ−Ｓクラスタアセンブリシステムの発現を調節することに加えて、酸化ストレスメカニズム（例えばｓｏｄＡ）、特定の及び全体的なレギュレータ（例えばｙｑｊＩ及びｓｏｘＳ等）、アミノ酸生合成（例：ａｒｇＥ）及び未知の機能をもつ一連の遺伝子のさまざまな作用機序に関与する４０種類超の遺伝子を調節する。ＩｓｃＲの役割は、ＩｓｃＲ調節の状況が好気性条件と嫌気性条件との間で変化するという事実によって更に複雑になる（Ｍａｒｔｉｎ，ａｎｄ  Ｉｍｌａｙ，２０１２；Ｇｉｅｌら２００６）。
【００５０】
ＩｓｃＲの恒常性制御上の役割及び全体的な遺伝子調節における役割を考慮すると、その調節特性の変更の結果は予測不可能であり、細胞代謝に重大な影響を及ぼすであろう。更に、硫黄形成（ｓｕｆ）及びｉｓｃ経路の双方の発現が増強することによりＦｅ−Ｓクラスタの生合成が増加する細胞の状態は、蓄積されたＦｅ−Ｓクラスタがフェントン反応によって過酸化物ラジカルを生成するリスクを生む。
【００５１】
この観点から、３つの単離された個々の変異体が示すように、ＩｓｃＲが細胞のＢｉｏＢの活性と毒性に非常に重要であることは、全く予想外であった。更に、Ｆｅ−Ｓクラスタを合成し組み立てる能力を高めるｉｓｃオペロン又はｓｕｆオペロンの過剰発現は、ｂｉｏＢを過剰発現する細胞でのビオチン生産を増強することが見出されなかったため（例１、図１０を参照）、変異ＩｓｃＲタンパク質のビオチン生合成への影響は予想外であった。更に、ｉｓｃＲ遺伝子のノックアウトによる細胞のｉｓｃＲ調節の除去も、細胞内のビオチン生産を増強しなかった（例１、図１２を参照）。
【００５２】
変異細胞におけるＢｉｏＢ発現の毒性を排除したＩｓｃＲタンパク質の３つの異なる変異は、アミノ酸Ｌ１５［配列番号１６］、Ｃ９２［配列番号１８］及びＨ１０７［配列番号２０］の単一アミノ酸置換であった（図８）。３つの変異のうち２つはＩｓｃＲの残基に正確に対応しており、それぞれがＩｓｃＲホロタンパク質の形成に不可欠であることが知られている。ＩｓｃＲには、大腸菌に見られるように、異常なＦｅ−Ｓクラスタライゲーション機序があり、このため、Ｆｅ−Ｓクラスタライゲーションに不可欠な残基はＣ９２、Ｃ９８、Ｃ１０４及びＨ１０７である。この異常なライゲーションは、他のＦｅ−Ｓタンパク質と比較してＩｓｃＲのホロ酵素状態の安定性を低下させ、低Ｆｅ−Ｓ条件でのアポタンパク質状態への切り替えの原因となる（Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒら２０１２）。
【００５３】
理論に束縛されることを望まないが、これは、本発明の変異ｉｓｃＲ遺伝子を発現する細胞において、酵素（ビオチンシンターゼ、リポ酸シンターゼ、ＨＭＰ−Ｐシンターゼ、チロシンリアーゼ）を含む鉄−硫黄クラスタのアセンブリを促進しながら、これらを過剰発現している間であっても、Ｆｅ−Ｓクラスタ生合成の恒常性制御及び細胞増殖に必要な全体的な遺伝子調節が独自に保たれることを示唆している。
【００５４】
要約すると、本発明者らは、発現された変異ＩｓｃＲタンパク質がアポタンパク質の形でのみ存在するように、Ｆｅ−Ｓクラスタのライゲーションに必要な１以上のアミノ酸残基の欠如を特徴とする変異ＩｓｃＲタンパク質をコードする変異ｉｓｃＲ遺伝子を同定した。酵素を含む鉄硫黄クラスタの合成は、細菌におけるビオチン、リポ酸又はチアミンの生産を増強する取り組みの大きなボトルネックであることが示されている。この問題は、本発明によって提示されるように、アポタンパク質状態で存在する変異ＩｓｃＲタンパク質をコードする遺伝子を含む細胞工場におけるこれらの酵素の過剰発現によって容易に解決される。本発明の様々な実施形態を、以下により詳細に説明する。
【００５５】
Ｉ  ビオチン製造のための遺伝子改変された細菌細胞
本発明は、ビオチン生産レベルを増強することの可能な遺伝子改変された細菌細胞を提供する。細菌細胞は、野生型ＩｓｃＲの代わりに変異ＩｓｃＲを発現するように遺伝子改変され、ビオチンシンターゼ（ＥＣ２．８．１．６を有するビオチンシンターゼ）をコードする導入遺伝子を含む。場合により、遺伝子改変された細菌細胞は、ビオチン経路の更なるステップを触媒するポリペプチドをコードする１つ以上の更なる導入遺伝子を更に含んでもよい（図１Ａ）。ビオチン経路のステップを触媒するポリペプチドのレベルが増加すると、細菌細胞のビオチン経路の中間体と経路の最終生成物（ビオチン）との両方の合成が促進される。
【００５６】
遺伝子改変された細菌細胞によって発現される変異ＩｓｃＲポリペプチドは、ポリペプチド骨格（アポタンパク質）によって特徴付けられるＩｓｃＲポリペプチドファミリの野生型メンバーに由来する。ＩｓｃＲポリペプチドファミリの野生型メンバーのアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４のいずれか１つから選択される配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９８、１００％のアミノ酸配列同一性を有する。本発明による変異ＩｓｃＲポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸置換により、由来する対応する野生型ＩｓｃＲポリペプチドのアミノ酸配列と異なる。この置換は、Ｌ１５Ｘ、Ｃ９２Ｘ、Ｃ９８Ｘ、Ｃ１０４Ｘ、及びＨ１０７Ｘから選択され、置換アミノ酸であるＸは、変異型が由来する野生型ＩｓｃＲの対応する位置に見られるアミノ酸以外の任意のアミノ酸である。
【００５７】
別の一実施形態では、変異ＩｓｃＲのアミノ酸置換は、ＸはＬ以外の任意のアミノ酸であり、より好ましくは、Ｘはフェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、メチオニン（Ｍ）、及びトリプトファン（Ｗ）から選択されるＬ１５Ｘ；ＸはＣ以外の任意のアミノ酸であり、より好ましくは、Ｘはチロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、及びトリプトファン（Ｗ）から選択されるＣ９２Ｘ；ＸはＣ以外の任意のアミノ酸であり、より好ましくは、Ｘはアラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、及びトリプトファン（Ｗ）から選択されるＣ９８Ｘ；ＸはＣ以外の任意のアミノ酸、より好ましくは、Ｘはアラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、及びトリプトファン（Ｗ）から選択されるＣｙｓ１０４Ｘ；ＸはＨ以外の任意のアミノ酸であり、より好ましくは、Ｘはアラニン（Ａ）、チロシン（Ｙ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、及びロイシン（Ｌ）から選択されるＨｉｓ１０７Ｘのいずれかから選択される。例えば、変異ＩｓｃＲにおけるアミノ酸置換は、Ｌ１５Ｆ、Ｃ９２Ｙ、Ｃ９２Ａ、Ｃ９８Ａ、Ｃｙｓ１０４Ａ、Ｈ１０７Ｙ、及びＨ１０７Ａの中から選択され得る。
【００５８】
（野生型ＩｓｃＲの代わりに）本発明の遺伝子改変された細菌細胞により発現される変異ＩｓｃＲは、染色体上又は自己複製プラスミド上の細菌細胞のゲノム内に位置する遺伝子改変された遺伝子によりコードされる。染色体内の遺伝子改変されたｉｓｃＲ遺伝子は、ネイティブゲノム内の野生型ｉｓｃＲ遺伝子と同じゲノム内位置に位置していてもよい。本発明の遺伝子改変された細菌細胞のゲノムは、ネイティブな野生型ｉｓｃＲ遺伝子が欠失されているか、又は遺伝子改変されたｉｓｃＲ遺伝子によって直接置換されているために、ネイティブな野生型ｉｓｃＲ遺伝子を欠いている。遺伝子改変されたｉｓｃＲ遺伝子の発現を駆動するプロモータは、遺伝子改変されたｉｓｃＲ遺伝子が由来するか又は置き換えられた野生型ｉｓｃＲ遺伝子のネイティブプロモータであってもよい。あるいは、プロモータは、異種構成的プロモータ又は誘導性プロモータであってもよい。プロモータが異種構成的プロモータである場合、適切なプロモータにはａｐＦａｂファミリ［配列番号２３０−２３２］が含まれ、適切な誘導性プロモータには、ｐＢａｄ（アラビノース誘導性［配列番号２３３］及びＬａｃＩ［配列番号２３４］が含まれる。適切なターミネータには、［配列番号２３５−２３７］を含むａｐＦＡＢターミネータファミリのメンバーが含まれる。
【００５９】
本発明によるビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドは、デスチオビオチン（ＤＴＢ）のビオチンへの変換を触媒するビオチンシンターゼ活性を有するポリペプチドである。ビオチンシンターゼのこのファミリのメンバーは、幅広い属に属する細菌に見られる遺伝子によってコードされている。ビオチンシンターゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２２（起源：大腸菌）；配列番号２７（起源：候補名クロラキドバクテリウム・テルモピルムＢ）；配列番号２９（起源：ストレプトマイセス・ライディカス）；配列番号３１（起源：パラコッカス・デニトリフィカンス）；配列番号３３（起源：パラコッカス・デニトリフィカンス  ＰＤ１２２２）；配列番号３５（起源：アグロバクテリウム・ビティス）；配列番号３７（起源：ルエジェリア・ポメロイ）；配列番号３９（起源：アグロバクテリウム・ファブラム）；配列番号４１（起源：トコジラミのボルバキア内部共生体）；配列番号４３（起源：スフィンゴモナス・パウシモビリス）；配列番号４５（起源：アシディチオバシラス・フェリボランス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｉｖｏｒａｎｓ））；配列番号４７（起源：ガリオネラ・カスピフェリフォルマンス（Ｇａｌｌｉｏｎｅｌｌａ  ｃａｐｓｉｆｅｒｒｉｆｏｒｍａｎｓ））；配列番号４９（起源：ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ））；配列番号５１（起源：パラ百日咳菌）；配列番号５３（起源：プシリモナス属）；配列番号５５（起源：ケナルカエウム・シュンビオスム属）；配列番号５７（起源：アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス属）；配列番号５９（起源：ゲオバチルス・サーモグルコシダシウス）；配列番号６１（起源：枯草菌）；配列番号６３（起源：リシニバチルス・スフェリカス）；配列番号６５（起源：メチロコッカス・カプスラータス）；配列番号６７（起源：レクレルシア・アデカルボキシラータ）；配列番号６９（起源：クロモハロバクター・サレキシゲンス）；配列番号７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７（起源：シュードモナス属）のいずれか１つから選択された配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９８、１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００６０】
遺伝子改変された細菌細胞内の更なる導入遺伝子によってコードされ、その活性がビオチン経路の中間体と生成物との双方の合成を増強する役割を果たすポリペプチドは、次の通りである：
ａ）ＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）依存性メチルトランスフェラーゼ活性（ＢｉｏＣ；ＥＣ２．１．１．１９７）を有するポリペプチド；例えば、配列番号８９と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
ｂ）７−ケト−８−アミノペラルゴン酸（ＫＡＰＡ）シンターゼ活性（ＢｉｏＦ；ＥＣ２．３．１．４７）を有するポリペプチド；例えば、配列番号９１と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
ｃ）７，８−ジアミノペラルゴン酸（ＤＡＰＡ）シンターゼ活性（ＢｉｏＡ；ＥＣ：２．６．１．６２）を有するポリペプチド；例えば、配列番号９３と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；又は、例えば、配列番号９７と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド等のＬ−リジン：８−アミノ−７−オキソノナノエートアミノトランスフェラーゼ（ＢｉｏＫ；ＥＣ：２．６．１．１０５）；
ｄ）配列番号９５と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド等の、デスチオビオチン（ＤＴＢ）シンテターゼ活性（ＢｉｏＤ；Ｅ．Ｃ６．３．３．３）を有するポリペプチド；及び、任意に、
ｆ）配列番号９９と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド等の、ピメロイル−［アシル−キャリアタンパク質］メチルエステルエステラーゼ（ＢｉｏＨ；ＥＣ：３．１．１．８５）を有するポリペプチド；又は、
ｇ）６−カルボキシヘキサノエート−ＣｏＡリガーゼ活性（ＢｉｏＷ；ＥＣ６．２．１．１４）を有するポリペプチド；例えば、配列番号１０１と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【００６１】
ＢｉｏＢをコードする導入遺伝子は、ビオチン経路の更なるステップを触媒するポリペプチドをコードする１以上の更なる導入遺伝子と共に、遺伝子改変された細菌細胞のゲノム内に位置し、細菌細胞の染色体内又は自己複製プラスミド上に組み込まれている。ビオチン経路酵素（ＢｉｏＡＢＦＣＤ及びＨ又はＷ）内のＢｉｏＢ及び１以上の酵素をコードする導入遺伝子が、１以上のオペロン内のゲノムに存在してもよい。
【００６２】
ＢｉｏＢをコードする導入遺伝子及び１以上の更なる導入遺伝子の発現を駆動するプロモータは、好ましくは非ネイティブプロモータであり、異種構成的プロモータ又は誘導性プロモータであってもよい。プロモータが異種構成的プロモータである場合、適切なプロモータにはａｐＦａｂファミリ［配列番号２３０−２３２］が含まれ、適切な誘導性プロモータには、ｐＢａｄ（アラビノース誘導性［配列番号２３３］及びＬａｃＩ［配列番号２３４］が含まれる。適切なターミネータには、［配列番号２３５−２３７］を含むａｐＦＡＢターミネータファミリのメンバーが含まれる。選択されたプロモータ及びターミネータが、ＢｉｏＢのコード配列並びに、ＢｉｏＣ、ＢｉｏＤ、ＢｉｏＡ、ＢｉｏＦポリペプチドと、ＢｉｏＷ又はＢｉｏＨポリペプチドとのうちの１つ以上のコード配列のコード配列に作用可能に連結されていてもよいが、選択されたＢｉｏポリペプチドをコードする１つ以上のオペロンに作用可能に連結されていてもよい。
【００６３】
ＩＩ  本発明の遺伝子改変された細菌を使用してビオチンを製造及び検出する方法
ビオチンは、例に示すように、本発明の遺伝子改変された細菌細胞（例えば、遺伝子改変された大腸菌細胞）を使用して、増殖を介助するのに適し、かつビオチンの生合成に適した炭素源を含む培地に細胞を導入し、培養物によって生産されたビオチンを最終的に回収することにより、製造し取り出すことができる。
【００６４】
ビオチンシンターゼ（ＢｉｏＢ）をコードする導入遺伝子を含む本発明の遺伝子改変された細菌細胞は、供給された炭素源がデスチオビオチン（ＤＴＢ）を含む場合、ビオチンの生産レベルを高める。ＢｉｏＡ、ＢｉｏＦ、ＢｉｏＣ、ＢｉｏＤ及びＢｉｏＨ又はＢｉｏＷのそれぞれをコードする導入遺伝子を更に含む本発明の遺伝子改変された細菌細胞は、供給される炭素源がグルコース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、アラビノース、キシロース、ラフィノース、マンノース及びラクトースから選択される場合に、ビオチンを生産する（例１、図１３）。
【００６５】
本発明の遺伝子改変された細菌細胞により生産される細胞外ビオチンを定量化する方法は、例１．５に記載されている。本方法は、本発明の細胞の培養に由来する細胞外増殖培地を加えたビオチン欠乏増殖培地中におけるプラスミドｐＢＳ４５１を含むＢＳ１０１１のビオチン欠乏条件下での一晩培養物の増殖の測定に基づくバイオアッセイである。ビオチンバイオアッセイの検量線は、図５に示すように、既知の濃度範囲のビオチン標準液を加えたビオチン欠乏一晩培養物の増殖を測定することによって作成される。
【００６６】
ＩＩＩ  リポ酸製造のための遺伝子改変された細菌細胞
本発明は、リポ酸生産レベルを増強することの可能な遺伝子改変された細菌細胞を提供する。細菌細胞は、野生型ＩｓｃＲの代わりに、本発明に従って変異ＩｓｃＲを発現するように遺伝子改変されており（セクションＩを参照）、リポ酸シンターゼ（ＥＣ２．８．１．８）をコードする導入遺伝子を含む。ＬｉｐＡは、２つの硫黄結合の形成を促進することにより、共有結合したオクタノイルドメインからリポイルドメインへの変換を触媒する。必要に応じて、遺伝子改変された細菌細胞は、リポ酸合成経路の更なるステップを触媒するポリペプチド、より具体的にはコードされたポリペプチドＬｉｐＢ；例えばｌｉｐＢ遺伝子のＥＣ：２．３．１．１８１及び、コードされたポリペプチドＥ２；例えばａｃｅＦ遺伝子のＥＣ：２．３．１．１２等をコードする１以上の更なる導入遺伝子を更に含んでもよい（図２）。リポ酸経路のステップを触媒するこれらのポリペプチドのレベルの増加は、細菌細胞の経路の中間体と経路の最終産物との両方の合成を促進する。リポエートタンパク質リガーゼＡであるＬｐｌＡ；ＥＣ：６．３．１．２０をコードする更なる導入遺伝子は、オクタン酸を与えられた細胞におけるリポ酸の合成を、オクタノイル部分の活性化リポイルドメインへの転移を触媒することにより促進するのに役立つ。
【００６７】
リポ酸シンターゼは、幅広い属に属する広範な細菌及び真菌に見られる遺伝子によってコードされている。リポ酸シンターゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１０３（起源：大腸菌）；配列番号１０５（起源：枯草菌）；配列番号１０７（起源：出芽酵母）；配列番号１０９（起源：シュードモナス・プチダ）；配列番号１１１（起源：バクテロイデス・フラギリス）；及び配列番号１１３（起源：ストレプトマイセス・コエリカラー）のいずれか１つから選択された配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９８、１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００６８】
遺伝子改変された細菌細胞内の更なる導入遺伝子によってコードされ、その活性がリポ酸経路の中間体と生成物との両方の合成を強化する役割を果たすポリペプチドは以下の通りである：
ａ）（オクタノイル残基をＡＣＰから標的酵素活性のＥ２サブユニットのアポリポイルドメインに転移させるためのオクタノイルトランスフェラーゼ活性；ＬｉｐＢ；ＥＣ：２．３．１．１８１、配列番号１１５（起源：大腸菌）又は配列番号１１７（起源：フレクスナー赤痢菌）と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド等）；
ｂ）例えば、配列番号１１９（起源：大腸菌）又は配列番号１２１（起源：クレブシエラ・オキシトカ）又は配列番号２３９（ハイブリッド配列）と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド等の、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ２；ＥＣ：２．３．１．１２）のジヒドロリポイルリジン残基アセチルトランスフェラーゼ成分を含むポリペプチド。
ｃ）例えば、配列番号１２３（起源：大腸菌）又は配列番号１２５（起源：クレブシエラ・オキシトカ）と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド等の、リポエートタンパク質リガーゼＡ（ＬｐｌＡ；ＥＣ：６．３．１．２０）活性を有するポリペプチド。
【００６９】
リポ酸シンターゼをコードする導入遺伝子は、リポ酸経路の更なるステップを触媒するポリペプチドをコードする１以上の更なる導入遺伝子とともに、遺伝子改変された細菌細胞のゲノム内に位置し、細菌細胞の染色体中又は自己複製プラスミド上に組み込まれている。ＬｉｐＡをコードする導入遺伝子と、リポ酸経路酵素の酵素をコードする導入遺伝子（ＩｐＢ、ＩｐｌＡ及びＡｃｅＦ）の１以上とが、１以上のオペロン内のゲノムに存在していてもよい。
【００７０】
ＬｉｐＡをコードする導入遺伝子及び１以上の更なる導入遺伝子の発現を駆動するプロモータは、好ましくは非ネイティブプロモータであり、異種構成的プロモータ又は誘導性プロモータであってもよい。プロモータが異種構成的プロモータである場合、適切なプロモータにはａｐＦａｂファミリ［配列番号２３０−２３２］が含まれ、適切な誘導性プロモータには、ｐＢａｄ（アラビノース誘導性［配列番号２３３］及びＬａｃＩ［配列番号２３４］が含まれる。適切なターミネータには、［配列番号２３５−２３７］を含むａｐＦＡＢターミネータファミリのメンバーが含まれる。選択されたプロモータ及びターミネータは、個々の遺伝子調節又はオペロンの調節のために、それぞれの遺伝子に作用可能に連結され得る。
【００７１】
ＩＶ  本発明の遺伝子改変された細菌を使用してリポ酸を製造及び検出する方法
リポ酸は、例２及び図１４に示すように）、本発明の遺伝子改変された細菌細胞（例えば、遺伝子改変された大腸菌細胞）を使用して、細胞を適切な培地に導入し、細胞によって生産されたリポ酸を最終的に回収することにより、製造することができる。
【００７２】
リポ酸シンターゼ（ＬｉｐＡ）をコードする導入遺伝子を含む本発明の遺伝子改変された細菌細胞は、供給された炭素源がオクタン酸（ＯＡ）を含む場合にリポ酸を生産する。細胞は、適切な炭素源、例えばグルコース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、アラビノース、キシロース、ラフィノース、マンノース、及びラクトースの中から選択される供給源が供給されると、リポ酸を生産する。
【００７３】
本発明の遺伝子改変された細菌細胞により生産される細胞リポ酸を定量化する方法は、例２に記載されている。この方法は、本発明の細胞から抽出されたリポ酸を加えた最小培地でのリポ酸依存栄養要求性大腸菌株の増殖の測定に基づくバイオアッセイである。
【００７４】
Ｖ  チアミン製造のための遺伝子改変された細菌細胞
本発明は、チアミン生産レベルを増強することの可能な遺伝子改変された細菌細胞を提供する。細菌細胞は、本発明に従って、野生型ＩｓｃＲの代わりに変異ＩｓｃＲを発現するように遺伝子改変されており（セクションＩを参照）、ｔｈｉＣによってコードされる、ＨＭＰ−Ｐシンターゼ（ＥＣ４．１．９９．１７）とも呼ばれるホスホメチルピリミジンシンターゼ又は、ｔｈｉＨによってコードされる（２−イミノ酢酸シンターゼ（ＥＣ４．１．９９．１９）とも呼ばれるチロシンリアーゼをコードする導入遺伝子を含む。
【００７５】
遺伝子改変された細菌細胞は、チアミン合成経路の更なるステップを触媒するポリペプチドをコードする１つ以上の更なる導入遺伝子を更に含んでもよい（図３）。チアミン経路のステップを触媒するこれらのポリペプチドのレベルが増加すると、細菌細胞の経路の中間体と経路の最終生成物との両方の合成が促進される。例えば、細菌細胞は、以下をコードする１つ以上の導入遺伝子を更に含んでもよい：ＴｈｉＥチアミンリン酸シンターゼ（ＥＣ２．５．１．３）；（例えばｔｈｉＦ遺伝子によりコードされる）［ＴｈｉＳ］アデニリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．７．７３）；ＴｈｉＧチアゾールシンターゼ（Ｅ．Ｃ．２．８．１．１０）；ＴｈｉＳ硫黄キャリアタンパク質；ＴｈｉＤホスホヒドロキシメチルピリミジンキナーゼ（ＥＣ２．７．４．７）及びチアミン一リン酸ホスファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．−）；ＴｈｉＯグリシンオキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．１９）；及びＴｈｉＭヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ（２．７．１．５０）。
【００７６】
ＨＭＰ−Ｐシンターゼは、幅広い属に属する広範囲の細菌及び真菌に見られる。ＨＭＰ−Ｐシンターゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２０１（起源：大腸菌）；配列番号２０３（起源：シネココッカス・エロンガツス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ＿ｅｌｏｎｇａｔｕｓ））；配列番号２０５（起源：コリネバクテリウム・グルタミカム）；配列番号２０７（起源  候補名バウマニア・シカデリニコーラ（Ｂａｕｍａｎｎｉａ  ｃｉｃａｄｅｌｌｉｎｉｃｏｌａ））のいずれか１つから選択された配列と、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９８、１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００７７】
チロシンリアーゼは、２−イミノ酢酸シンターゼ（ＥＣ４．１．９９．１９）とも呼ばれる。ＨＭＰ−Ｐシンターゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２１７の配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９８、１００％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００７８】
遺伝子改変された細菌細胞の１以上の更なる導入遺伝子によってコードされ、その活性がチアミン経路の中間体と生成物との両方の合成を増強する役割を果たすポリペプチドは、次の通りである：
ａ）配列番号２１１と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド等の、［ＴｈｉＳ］アデニリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．７．７３）活性を有するポリペプチド；
ｂ）配列番号２０９と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド等の、チアミンリン酸シンターゼ（ＥＣ２．５．１．３）活性を有するポリペプチド；
ｃ）配列番号２１５と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド等の、チアゾールシンターゼ（Ｅ．Ｃ．２．８．１．１０）活性を有するポリペプチド；
ｄ）配列番号２２５と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド等の、ホスホヒドロキシメチルピリミジンキナーゼ（ＥＣ２．７．４．７）活性を有するポリペプチド；
ｅ）配列番号２１９、２２１及び２２３の中から選択される配列と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド等の、グリシンオキシダーゼ（ＥＣ１．４．３．１９）活性を有するポリペプチド；
ｆ）配列番号２１３と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド等の、ＴｈｉＳ硫黄キャリア活性を有するポリペプチド；
ｇ）配列番号１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９のいずれか１つから選択された配列と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド等の、チアミン一リン酸ホスファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．−）活性を有するポリペプチド；及び、
ｈ）配列番号２２７と８０、８５、９０、９５又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド等の、ＴｈｉＭヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ活性（２．７．１．５０）を有するポリペプチド。
【００７９】
好ましくは、遺伝子改変された細菌細胞は、（ｔｈｉＣ遺伝子によりコードされる）酵素ＴｈｉＣ；（ｔｈｉＤ遺伝子によってコードされる）ＴｈｉＤ；（ｔｈｉＥ遺伝子によってコードされる）ＴｈｉＥ；（ｔｈｉＦ遺伝子によってコードされる）ＴｈｉＦ；（この遺伝子によってコードされる）硫黄キャリアタンパク質；（ｔｈｉＧ遺伝子によってコードされる）ＴｈｉＧ；（ＴＭＰホスファターゼ遺伝子によってコードされる）ＴＭＰホスファターゼ；及び、（ｔｈｉＨ遺伝子によってコードされる）ＴｈｉＨと（ｔｈｉＯ遺伝子によってコードされる）ＴｈｉＯとのうちのいずれかをコードする導入遺伝子を含む。この実施形態によれば、細胞は、（（ｔｈｉＭ遺伝子によってコードされる）酵素ＴｈｉＭをコードする導入遺伝子を更に含んでもよい。
【００８０】
本発明の遺伝子改変された細菌におけるチアミン合成レベルは、チアミン−リン酸キナーゼをコードする内在性ｔｈｉＬ遺伝子の変異により更に増強され得る。変異ｔｈｉＬ遺伝子は、配列番号２２８のヌクレオチド配列を有し、親の野生型遺伝子と比較すると、Ｇ１３３Ｄ置換［配列番号２２９］を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド１３３〜１３５（ＧＧＴからＧＡＣ）に変異を有する。
【００８１】
ｔｈｉＣでコードされるＨＭＰ−Ｐシンターゼ（ＥＣ４．１．９９．１７）又は、ｔｈｉＨによってコードされるチロシンリアーゼ（ＥＣ４．１．９９．１９）をコードする導入遺伝子は、チアミン経路の更なるステップを触媒するポリペプチドをコードする１つ以上の更なる導入遺伝子とともに、遺伝子改変された細菌細胞のゲノム内に位置し、細菌細胞染色体中又は自己複製プラスミド上に組み込まれている。ｔｈｉＣ又はｔｈｉＨ導入遺伝子及びチアミン経路酵素の酵素をコードする導入遺伝子のうちの１以上が、１以上のオペロン内のゲノムに存在していてもよい。
【００８２】
ｔｈｉＣ又はｔｈｉＨ導入遺伝子及び１以上の更なる導入遺伝子の発現を駆動するプロモータは、好ましくは非ネイティブプロモータであり、異種構成的プロモータ又は誘導性プロモータであってもよい。プロモータが異種構成的プロモータである場合、適切なプロモータにはａｐＦａｂファミリ［配列番号２３０−２３２］が含まれ、適切な誘導性プロモータには、ｐＢａｄ（アラビノース誘導性［配列番号２３３］及びＬａｃＩ［配列番号２３４］が含まれる。適切なターミネータには、［配列番号２３５−２３７］を含むａｐＦＡＢターミネータファミリのメンバーが含まれる。選択されたプロモータ及びターミネータは、個々の遺伝子調節又はオペロンの調節のために、それぞれの遺伝子に作用可能に連結され得る。
【００８３】
ＶＩ  本発明の遺伝子改変された細菌を使用してチアミンを製造及び検出する方法
チアミン、チアミン一リン酸（ＴＭＰ）、及びチアミン二リン酸（ＴＰＰ）は、例３及び図１６に示すように、本発明の遺伝子改変された細菌細胞（例えば遺伝子改変された大腸菌細胞）を使用して、細胞を適切な培養培地に導入し、細胞によって生成されたチアミン、ＴＰＰ、及びＴＭＰを最終的に回収することにより、製造することができる。
【００８４】
ＨＭＰ−Ｐシンターゼをコードする導入遺伝子を含む本発明の遺伝子改変された細菌細胞は、供給される炭素源がグルコース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、アラビノース、キシロース、ラフィノース、マンノース及びラクトースから選択される場合に、チアミン、ＴＰＰ、及びＴＭＰを生産する。
【００８５】
本発明の遺伝子改変された細菌細胞により生産されたチアミンを定量する方法は、例３に記載されており、チアミン標準液と比較して、高圧液体クロマトグラフィーの使用が含まれ得る。
【００８６】
ＶＩＩ  ビオチン、リポ酸又はチアミンの製造のための遺伝子改変された細菌細胞の操作方法
本発明の細菌細胞におけるビオチン、リポ酸又はチアミンの合成に関連する酵素活性を有する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子をクローニング及び導入するのに適した組込み及び自己複製ベクターは市販されており、当業者に既知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  らＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照）。細菌細胞は、細胞内に異種ＤＮＡを導入することによって遺伝子操作される。本発明の細菌細胞におけるビオチン、リポ酸又はチアミン合成に関連する酵素活性を有する１以上のポリペプチドをコードする遺伝子の異種発現は、例１、２及び３にそれぞれ示されている。
【００８７】
本発明によるビオチン、リポ酸又はチアミン合成に関連する酵素活性を有する１以上のポリペプチドをコードする核酸分子を、自己複製ベクターによって宿主細胞に導入してもよいが、当該分野で標準的な方法及び技術を使用して宿主細胞ゲノム内に任意に組み込んでもよい。例えば、核酸分子を、化学的形質転換及びエレクトロポレーション、形質導入、粒子衝撃等を含む形質転換等の標準的なプロトコルによって導入してもよい。本発明の酵素をコードする核酸分子の発現を、核酸分子をゲノムに組み込むことによって達成してもよい。
【００８８】
本発明の細菌細胞におけるネイティブな内在性ｉｓｃＲ遺伝子の遺伝子改変は、適切な親細菌細胞に標準的な組み換え方法を適用し、内在性ｉｓｃＲ遺伝子を欠失（ノックアウト）して、セクションＩで定義される変異ＩｓｃＲポリペプチドをコードする導入遺伝子での挿入／置換を行うことにより実施可能である（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ＫＡ，ｅｔ  ａｌ．；２０００）。
【００８９】
ビオチン、リポ酸又はチアミンの製造のための本発明による遺伝子改変された細菌細胞は細菌であってもよく、適切な細菌の非網羅的なリストは次のとおりである：エシェリヒア、ブレビバクテリウム、バークホルデリア、カンピロバクター、コリネバクテリウム、シュードモナス、セラチア、ラクトバチルス、ラクトコッカス、アセトバクター、アシネトバクター、シュードモナス等からなる群から選択される属に属する種。
【００９０】
本発明の好ましい細菌種は、大腸菌、シュードモナス・プチダ、セラチア・マルセッセンス及びコリネバクテリウム・グルタミカムである。
【００９１】
ＶＩＩＩ  本発明の遺伝子改変された細菌細胞のビオチン生産能力は、電子伝達の増加により増強される。
酸化された［４Ｆｅ−４Ｓ］２＋クラスタを含むＳＡＭラジカル鉄硫黄クラスタ酵素、例えばＢｉｏＢ、ＴｈｉＣ及びＬｉｐＡは、［４Ｆｅ−４Ｓ］＋クラスタへの還元のために電子伝達を必要とする。還元された［４Ｆｅ−４Ｓ］＋クラスタのみが、触媒作用に必要なＳＡＭラジカルを生成することができる。電子供与体ＮＡＤＰＨから［４Ｆｅ−４Ｓ］２＋クラスタへの電子伝達は、フラボドキシン／フェレドキシンレダクターゼ（Ｆｐｒ）及びフラボドキシン（ＦｌｄＡ）還元システムにより、又はピルビン酸フラボドキシン／フェレドキシンオキシレダクターゼシステムにより媒介される。
【００９２】
更なる一実施形態では、ビオチン、リポ酸、又はチアミンを生産することの可能な本発明による遺伝子改変された細菌細胞は、フラボドキシン／フェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼをコードする遺伝子（ＥＣ：１．１８．１．２及びＥＣ１．１９．１．１）；ピルビン酸フラボドキシン／フェレドキシンオキシレダクターゼをコードする遺伝子（ＥＣ１．２．７）；フラボドキシンをコードする遺伝子；フェレドキシンをコードする遺伝子；フラボドキシン及びフェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼをコードする遺伝子からなる群から選択される１以上の遺伝子を更に含む。１以上の遺伝子のそれぞれに作用可能に連結されたプロモータは、細菌におけるこれらの１以上の遺伝子の発現を増強することができる。これらの１以上の遺伝子のそれぞれは、ネイティブ遺伝子であっても、導入遺伝子であってもよい。好ましくは、作用可能に連結されたプロモータは、この細菌におけるこれらの１以上の遺伝子の発現を、本発明の遺伝子改変された細菌が由来する親細菌におけるレベルよりも高いレベルまで増強する。好ましくは、本発明による遺伝子改変された細菌細胞は、フラボドキシン／フェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼ（ＥＣ：１．１８．１．２及びＥＣ１．１９．１．１）をコードする遺伝子及びフラボドキシンをコードする遺伝子あるいは、フラボドキシン及びフェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼの両方のコード配列を含む単一遺伝子を含む。加えて、この遺伝子改変された細菌細胞が、フェレドキシンをコードする遺伝子を更に含んでもよい。
【００９３】
本発明の遺伝子改変された細菌細胞における電子伝達経路の成分を発現する遺伝子の過剰発現は、（本発明のビオチン生産細胞についての例４に示すように）それらのＳＡＭラジカル鉄硫黄クラスタ酵素の細胞活性を増強する。
【００９４】
好ましくは、本発明の遺伝子改変された細菌細胞中のネイティブ遺伝子又は導入遺伝子によりコードされるポリペプチドは、フラボドキシン／フェレドキシンレダクターゼ活性（ＥＣ：１．１８．１．２及びＥＣ１．１９．１．１）を有する場合、配列番号２４１（起源：大腸菌由来のｆｐｒ遺伝子）；配列番号２４３（起源：枯草菌１６８由来のｙｕｍＣ遺伝子）；配列番号２４５（起源：シュードモナス・プチダＫＴ２４４０由来のｆｐｒ−Ｉ遺伝子）；配列番号２４７（起源：ストレプトマイセス・ベネズエラエ  ＡＴＣＣ  １０７１２由来のＳＶＥＮ＿０１１３遺伝子）；配列番号２４９（起源：コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＴＣＣ  １３０３２由来のＣｇｌ２３８４遺伝子）及び配列番号２５１（起源：スフィンゴバクテリウム属ＪＢ１７０由来のＳＪＮ  １５６１４．１遺伝子）のいずれか１つから選択された配列と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００９５】
好ましくは、本発明の遺伝子改変された細菌細胞中のネイティブ遺伝子又は導入遺伝子によってコードされるポリペプチドは、ピルビン酸フラボドキシン／フェレドキシンオキシレダクターゼ活性（ＥＣ１．２．７）を有する場合、配列番号２５３（起源：大腸菌Ｋ１２  ＭＧ１６５５由来のｙｄｂＫ遺伝子）；配列番号２５５（起源：ゲオバクター・スルフレデュセンス  ＡＭ−１由来のｐｏｒ遺伝子）；配列番号２５７（起源：ストレプトマイセス・プラテンシス  ＡＴＣＣ  ３３３３１由来のＳｆｌａ＿２５９２遺伝子；配列番号２５９（起源：プロピオニバクテリウム・フリューデンレイッヒイ  ＤＳＭ  ２０２７１由来のＲＭ２５＿０１８６遺伝子）；配列番号２６１（起源：シネコシスティス属  ＰＣＣ  ６８０３由来のｎｉｆＪ遺伝子）のいずれか１つから選択された配列と８０、８５、９０、９５、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００９６】
好ましくは、本発明の遺伝子改変された細菌細胞中のネイティブ遺伝子又は導入遺伝子によりコードされるポリペプチドは、フラボドキシンである場合、配列番号２６３（起源：大腸菌Ｋ１２  ＭＧ１６５５由来のｆｌｄＡ遺伝子）；配列番号２６５（起源：大腸菌Ｋ１２  ＭＧ１６５５由来のｆｌｄＢ遺伝子）；配列番号２６７（起源：枯草菌１６８由来のｙｋｕｎ遺伝子）；配列番号２６９（起源：シネコシスティス属  ＰＣＣ  ６８０３由来のｉｓｉＢ遺伝子；配列番号２７１（起源：ストレプトマイセス・ベネズエラエ  ＡＴＣＣ  １０７１２由来のｗｒｂＡ遺伝子）；配列番号２７３（起源：メタノコッカス・エオリカス・ナンカイ−３（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  Ｎａｎｋａｉ−３）由来のＰＲＫ０６２４２遺伝子）のいずれか１つから選択される配列と８０、８５、９０、９５又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００９７】
好ましくは、本発明の遺伝子改変された細菌細胞中のネイティブ遺伝子又は導入遺伝子によってコードされるポリペプチドは、フェレドキシンである場合、配列番号２７５（起源：大腸菌由来のｆｄｘ遺伝子）；配列番号２７７（起源：枯草菌１６８由来のｆｅｒ遺伝子）；配列番号２７９（起源：コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＴＣＣ  １３０３２由来のｆｄｘＢ遺伝子）；配列番号２８１（起源：シネコシスティス属  ＰＣＣ  ６８０３由来のｆｄｘ遺伝子）；配列番号２８３（起源：ストレプトマイセス・ベネズエラエ  ＡＴＣＣ  １０７１２由来のＳＶＥＮ＿７０３９遺伝子）；配列番号２８５（起源：メタノコッカス・エオリカス・ナンカイ−３（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ｎａｎｋａｉ−３）由来のｆｄｘ遺伝子）のいずれか１つから選択される配列と８０、８５、９０、９５又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００９８】
この細菌の電子伝達経路のポリペプチドをコードするネイティブ遺伝子又は導入遺伝子に作用可能に連結された場合に遺伝子発現を増強することの可能なプロモータは、好ましくは非ネイティブプロモータである。このプロモータは、構成的ａｐＦＡＢ３０９プロモータファミリ［配列番号２３０−２３２］のメンバーであってもよい。好ましくは、この非ネイティブプロモータは、このネイティブ遺伝子又は導入遺伝子に作用可能に連結された場合、この遺伝子改変された細菌におけるこのコードされたポリペプチドの発現を、それが由来する親細菌よりも高いレベルまで増強する。このネイティブ遺伝子又は導入遺伝子に作用可能に連結されることの可能な適切なターミネータには、ａｐＦＡＢ３７８ターミネータファミリ［配列番号２３５−２３７］が含まれる。
【実施例】
【００９９】
実施例１：ビオチン生産を増強することの可能な遺伝子改変された大腸菌株の同定及び特性評価
【０１００】
１  方法
１．１：例で使用した大腸菌の株を以下に示す。
【０１０１】
表１：株
【表１】
2020527359.tif 000003
【０１０２】
１．２：例で使用したプラスミドを以下に示す。
【０１０３】
表２：プラスミド
【表２】
2020527359.tif 000004
【０１０４】
１．３  培地と添加物：
各例で使用された増殖培地（ｍＭＯＰＳ）は、次の組成を有した：１．３２ｍＭのＫ２ＨＰ０４；２ｇ／ｌのＤ−グルコース；０．０４７６ｍｇ／ｌのパントテン酸カルシウム；０．０１３８ｍｇ／ｌのｐ−アミノ安息香酸；０．０１３８ｍｇ／ｌのｐ−ヒドロキシ安息香酸；０．０１５４ｍｇ／ｌの２，３−ジヒドロキシ安息香酸及び、１×改質ＭＯＰＳバッファ。
【０１０５】
１０×改質ＭＯＰＳは、０．４ＭのＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）；０．０４Ｍのトリシン；０．１ｍＭのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；９５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ；２．７６ｍＭのＫ２ＳＯ４；５μＭのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；５．２５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．５ＭのＮａＣｌ；及び５０００倍に希釈した微量栄養素ストック溶液を含む。
【０１０６】
微量栄養素ストック溶液：
【数１】
2020527359.tif 000005
【０１０７】
以下の抗生物質ストックを使用した：アンピシリン（ａｍｐ、１００ｍｇ／ｍＬ）、カナマイシン（ｋａｎ、５０ｍｇ／ｍＬ）、ゼオシン（ｚｅｏ、４０ｍｇ／ｍＬ）。指示に従って増殖培地に添加し、１０００倍希釈液を得た。
【０１０８】
１．４  大腸菌株ライブラリの作成：
進化したゲノム多様性を有する大腸菌ライブラリを、プラスミドｐＢＳ４１２を含む大腸菌株ＢＳ１０１１の細胞から、ｋａｎ（ＭＯＰＳ−ｋａｎ）を添加したｍＭＯＰＳ培地でこれらの細胞を一晩静置培養し、得られたｍＭＯＰＳ−ｋａｎ培養物の１００倍希釈液を調製し、一晩培養と希釈との連続工程を５回繰り返すことにより作成した。この手順により、不完全なエラー修正ポリメラーゼによって生成されたバックグラウンド変異の蓄積が可能になり、遺伝的多様性が生まれる。培養と希釈の各ラウンドの後、ＩＰＴＧを含むｍＭＯＰＳプレートに細胞培養のサンプルを播種し（下記参照）、ＢｉｏＢ発現の増強に耐える細胞の進化を検出した。次に、各ライブラリの細胞をＢｉｏＢ過剰発現プラスミドｐＢＳ４１２で形質転換した。
【０１０９】
１．５  変異株の選択
０、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１ｍＭのいずれかの濃度のＩＰＴＧを含むｍＭＯＰＳ（Φ＝９ｃｍ）を含む一連の１．５％寒天プレートに、ｐＢＳ４１２を含むＢＳ１０１１のｍＭＯＰＳ−ｋａｎのｏ／ｎ培養から得られた１０４、１０５、１０６、１０７個の細胞をそれぞれ播種することにより、選択アッセイを行った。次いで、プレートを３７℃で最大３６時間インキュベートし、間隔を置いて細胞増殖を評価した。これらの条件下で、０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いたｐＢＳ４１２からのＢｉｏＢ発現の誘導は、１０５個までの細胞の増殖を防止することが判明したが、１ｍＭのＩＰＴＧを用いた誘導は、単一のペトリ皿に播種した場合、少なくとも１０Λ７個の細胞の増殖を防止した。１０５個の細胞の細胞集団に対する１ｍＭのＩＰＴＧによる誘導を含む選択圧は、ＢｉｏＢ発現に対してより高いロバスト性を持つ株を特定するのに最適であることが判明した。従って、次のように実施された：
【０１１０】
１）セクション１．４に記載されているように、各ライブラリの約１０５個の細胞を各ｍＭＯＰＳ−ｋａｎ−１ｍＭのＩＰＴＧ寒天プレートに播種し、３７℃で最大２４時間インキュベートした。
２）単一コロニーをｍＭＯＰＳ−ｋａｎ液体培地で増殖させて前培養物を作成し、その後、０．００、０．０１、又は０．１ｍＭのＩＰＴＧのいずれかを添加したｍＭＯＰＳ−ｋａｎで実施したビオチンバイオアッセイ（以下のセクション１．６を参照）により、これらのビオチン生産を評価した。各前培養物の細胞を、２０％グリセロール中でグリセロールストックとして保存した。
３）ビオチン１．５ｍｇ／ｌ以上（細胞外ビオチンとして検出）を生産するコロニーをｍＭＯＰＳ−ｋａｎ寒天プレートに再度ストリークし、３７℃で最大２４時間インキュベートし、生物学的複製でのビオチン生産について再度バイオアッセイを行った（以下のセクション１．６で詳述）。
【０１１１】
４）選択したビオチン過剰生産株の細胞を以下のように評価した：
ａ）選択された株の細胞のゲノムにおける親株ＢＳ１０１１のゲノムと比較した遺伝子変異を特定するための全ゲノムシーケンシングを、選択された株の細胞から単離されたＤＮＡで次のように行った：選択された細胞を５−１０ｍＬのｍＭＯＰＳ−ｋａｎ内で増殖させ、次いで細胞を回収した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰｕｒｅｌｉｎｋゲノムＤＮＡ抽出キット（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｃａｔａｌｏｑ／ｐｒｏｄｕｃｔ／Ｋ１８２００１）を使用して、回収した細胞からゲノムＤＮＡを単離した。抽出されたＤＮＡの全ゲノムシーケンシングを行った。
ｂ）選択された株の細胞からこれらのｐＢＳ４１２プラスミドをキュアリングした。次に、ｐＢＳ４１２プラスミドをキュアリングした株の細胞を再度形質転換した。最後に、形質転換された株の細胞培養物のビオチン生産についてのバイオアッセイを再度行った。細胞からこれらのｐＢＳ４１２プラスミドをキュアリングする工程は、１ｍＭのＩＰＴＧを含み抗生物質を含まないＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）富栄養培地中で細胞を３７℃で一晩増殖させ、得られた培養物の細胞をＬＢ寒天プレート上にストリークし、３７℃で一晩インキュベートすることにより行った。寒天プレートからの単一コロニーを５０μｌのＬＢ培地で希釈し、５μｌを使用してＬＢ及びＬＢ−ａｍｐ寒天プレート上にスポットし、３７℃で一晩インキュベートした。ＬＢ−ａｍｐプレート上では増殖しなかったがＬＢプレート上では増殖したこれらの単一コロニーをＬＢプレート上に再度ストリークして単一コロニーを得、これらを再形質転換用のキュアリングされた株として使用した。
【０１１２】
形質転換株の細胞によるビオチン生産を生物学的複製で測定した（以下のセクション１．６で詳述）。簡単に説明すると、０．００、０．０１又は０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加したｍＭＯＰＳ−ｋａｎ中の生物学的複製について、ビオチン生産を再評価した。並行して、各形質転換株の細胞の増殖速度を、透明な通気性シールを使用して密封したマイクロタイタープレートに入れた２００μＬのｍＭＯＰＳ−ｋａｎ培地で、３７℃で２４時間、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＦＣで好気的増殖のための「高速振盪」を行って測定した。３０分ごとにＯＤ６２０を測定することにより、細胞増殖を監視した。
【０１１３】
１．６  ビオチン生産を定量化するためのバイオアッセイ
前培養物を、選択された単一細胞コロニーから９６ディープウェルプレートに入れた４００μＬのｍＭＯＰＳ−ｋａｎでそれぞれ作成し、２７５ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１６〜１８時間インキュベートした。０．１ｇ／Ｌのデスチオビオチン（ＤＴＢ）と、任意に最終濃度１ｍＭまでのＩＰＴＧとを含む、９６ディープウェルプレートに入れた４００μＬのｍＭＯＰＳ−ｋａｎに、初期ＯＤ６００を約０．０３とするのに十分な前培養物４μＬを接種することにより、生産培養物を作成した。次いで、培養物を２７５ｒｐｍで振盪しながら３７℃で２４時間増殖させた。培養物のＯＤ６００を測定した後、４０００Ｇで８分間遠心分離することにより、９６ディープウェルプレートの細胞をペレット化した。各培養上清からの上清を、超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）でビオチン濃度範囲が０．０５ｎＭ〜０．５０ｎＭとなるように希釈した。並行して、０．１ｎＭ（ビオチン０．０２４μｇ／Ｌ）〜１ｎＭ（ビオチン０．２４μｇ／Ｌ）の濃度範囲の５種類超のビオチン標準液をＭｉｌｌｉ−Ｑ水で調製した。次に、各希釈上清１５μＬと各ビオチン標準液とをマイクロタイタープレートのウェルに加えた。各ウェルは、プラスミドｐＢＳ４５１を含むＢＳ１０１１のビオチン欠乏一晩培養物１３５μＬを含んでいた。そして、一晩培養物を、ゼオシンを加えたｍＭＯＰＳで初期ＯＤ６２０が０．０１となるように希釈した。プレートを通気性のあるシールで密封し、２７５ｒｐｍで振盪しながら３７℃で２０時間インキュベートした後に、ＯＤ６００を測定した。このバイオアッセイで様々なビオチン標準液を使用して得られたビオチンバイオアッセイ検量線を、図５に示す。
【０１１４】
１．７  ゲノム変異の特定
全ての次世代シーケンシング（ＮＧＳ）データについて、選択された株の細胞のゲノムにおける親株のゲノムと比較した変異を、ＣＬＣゲノムワークベンチバージョン９．５．３（Ｑｉａｇｅｎ提供）を使用して、（単一又は少数の置換、欠失又は挿入はＶａｒｉａｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、より大きな挿入／欠失はＩｎＤｅｌｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｖａｒｉａｎｔｓにより）特定した。シーケンシング手順によって導入された誤ったヌクレオチドに起因するゲノム変異を区別するために、８５％のカットオフを使用して、特定の細菌株の細胞から単離されたＤＮＡ分子（ゲノム）群の８５％以上に変異が存在することを意味する「有意な変異」を定義した。
【０１１５】
シーケンシングによって配列が確認されたＫｅｉｏ  ΔｂｉｏＢ  ｓｃａｒ変異を考慮して、ＮＣＢＩからのゲノムアクセッション番号ＣＰ００９２７３を参照配列として使用した。
【０１１６】
１．８  ｉｓｃＲ変異のプロテオミクスの全体像の特性評価
０．０２５ｍＭのＩＰＴＧ誘導レベルでのＢＳ１０１３＋ｐＢＳ４３０、ＢＳ１０１１＋ｐＢＳ４１２及びＢＳ１３５３＋ｐＢＳ４１２並びに１ｍＭのＩＰＴＧ誘導でのＢＳ１３５３＋ｐＢＳ４１２のタンパク質含有量を、ＬＣ−ＭＳと効率的なタンパク質抽出とを組み合わせた最近開発されたアプローチによって求めた（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ，２０１５）。２．０％ＦＤＲのペプチド閾値に加えて、３つのペプチドを分析用に同定された最小数のペプチドとして選択した。タンパク質発現の著しい変化は、Ｓｃａｆｆｏｌｄ  Ｖｉｅｗｅｒ４．７．５を使用した複数のテストのＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正による分散分析（ＡＮＯＶＡ）に基づいて、０．５％の信頼区間で見受けられる。
【０１１７】
株を、ＯＤ６００が０．５に達するまで（対数期）、ｍＭＯＰＳ中でＩＰＴＧ誘導により約１０世代にわたって増殖させた。４℃で、最大速度で遠心分離することにより、１０８個の細胞を回収した。氷冷ＰＢＳバッファで１回洗浄した。ＰＢＳバッファを除去した後、４℃で、最大速度で遠心分離して再ペレット化し、液体窒素で急速凍結した。
【０１１８】
２．結果
２．１  ＢｉｏＢの過剰発現は毒性である
ネイティブなビオチンシンターゼ遺伝子（ｂｉｏＢ）を保持しているが、低コピープラスミド（複製開始点Ｓｃ１０１）に由来するＩＰＴＧ誘導性のフレームシフトされた大腸菌ｂｉｏＢ遺伝子（未熟な停止コドンによる非機能性ビオチンシンターゼをコードする）を発現する大腸菌は、ＩＰＴＧを含むか又は含まないｍＭＯＰＳ−ｋａｎ培地中で好気的に増殖可能である。このことは、大腸菌ＢＷ２５１１３、ＢｉｏＢフレームシフト変異体の対数増殖曲線を示す図４（左パネル）に示されている。対照的に、大腸菌ノックアウト株ΔｂｉｏＢでの機能性ビオチンシンターゼ遺伝子（ｂｉｏＢ）の過剰発現は、増殖に対して毒性であり、非常に顕著な誘導期の延長を引き起こす。このことは、低コピープラスミド（複製開始点Ｓｃ１０１）上のＩＰＴＧ誘導性Ｔ５プロモータに由来する大腸菌ｂｉｏＢ遺伝子を発現する大腸菌ノックアウト株ΔｂｉｏＢの増殖を示す図４（右パネル）に示されている。図４に示すように、ＩＰＴＧレベルの増加（灰色の暗さ）に応じたｂｉｏＢ発現の増加の誘導は、誘導期には大きく影響するが、増殖速度への影響はわずかである（黒枠）。
【０１１９】
２．２  ビオチン生産力価が増強されたｉｓｃＲ変異株の単離
進化したゲノム多様性を持つ大腸菌ライブラリ（セクション１．４及び１．５を参照）を、ｂｉｏＢ遺伝子発現に対する耐性が改善され、ビオチン生産が増加した株についてスクリーニングした。選択された株の全ゲノムシーケンシングにより、Ｌ１５Ｆ、Ｃ９２Ｙ、Ｈ１０７Ｙのいずれかのアミノ酸置換を持つｉｓｃＲポリペプチドをコードする鉄硫黄クラスタレギュレータ（ｉｓｃＲ）遺伝子を含む３つのユニークな変異体が同定された。コードされたレギュレータのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１６、１８及び２０である。セクション１．６（及び図５）で説明するように、バイオアッセイを使用してビオチン生産レベルを測定した。図６に、ｉｓｃＲ変異株及び大腸菌ＢＷ２５１１３  ΔｂｉｏＢ参照株のそれぞれのビオチン生産力価を、２つの異なるＩＰＴＧ濃度レベル（より濃い灰色でＩＰＴＧがより多い）の不在又は存在下で、ＤＴＢ０．１ｇ／ｌを加えたｍＭＯＰＳ中で増殖させた４つの生物学的複製（黒い点）について示す。参照株でのビオチン生産は、０．０１ｍＭを超えるＩＰＴＧレベルで阻害された。これは、参照株の増殖に対して毒性を有するＩＰＴＧレベルに対応する（図４を参照）。これに対し、ｉｓｃＲ変異株は、ＩＰＴＧレベル０．０１〜０．１ｍＭで増殖し、ビオチンを生産した。３つのｉｓｃＲ変異株は全て、ＩＰＴＧ濃度０．０１ｍＭで、参照株（点線）よりも約１．５倍多くのビオチンを生産した。ｉｓｃＲ変異株の生産は、ＩＰＴＧ濃度０．１ｍＭで、参照株の最高生産力価（ビオチン約１．５ｍｇ／ｌ）よりも最大２倍（ビオチン約３．２ｍｇ／ｌ）であった。
【０１２０】
２．３  ＩｓｃＲ  Ｈ１０７Ｙ変異株のビオチン生産及び増殖
ｉｓｃＲ（Ｈ１０７Ｙ）変異株の増殖プロファイル及びビオチン生産力価の特徴を、５０ｍＬのｍＭＯＰＳにＤＴＢ０．１ｇ／ｌを加えた、２つの異なるＩＰＴＧ誘導レベル（図７Ａで０．０１ｍＭ）及び０．５ｍＭ（図７Ｂ）での２５０ｍＬ振盪フラスコ実験で明らかにした。ＩＰＴＧレベルが低い場合（図７Ａ）、ＩｓｃＲ変異株（濃い灰色）と参照株（薄い灰色）とは増殖及びビオチン生産力価が類似しており、最終力価はビオチン約１．１ｍｇ／ｌであった。しかし、高ＩＰＴＧ誘導レベル（図７Ｂで０．５ｍＭ）では、参照株（明るい灰色）の増殖は大幅に抑制されたのに対し、ＩｓｃＲ変異株は低ＩＰＴＧ誘導レベルと同じ増殖プロファイルを保持した。更に、ＩｓｃＲ変異株のビオチン生産力価は約２倍に増加し、２５時間の増殖後、最大で約２．２ｍｇ／ｌとなった。
【０１２１】
２．４  ＩｓｃＲ変異の作用機序
図６に示すように、同定された３つのＩｓｃＲ変異株全てについて、ビオチン耐性を増強する表現型が明らかに示された。Ｃ９２変異（Ｃ９２Ｙ）がビオチン耐性を増強する能力は、ＩｓｃＲの［Ｆｅ−Ｓ］クラスタ結合特性におけるＣ９２の役割によるものであることが示唆されている。Ｃ９２Ｙ変異による［Ｆｅ−Ｓ］クラスタ結合特性の喪失は、ＩｓｃＲのＩｓｃオペロン抑制挙動を不活性化することが提示されている。同時に、Ｃ９２Ｙ変異ＩｓｃＲではＩｓｃＲのプロモータ機能は無傷のままであり、複数の細胞プロセスに不可欠な他の経路を活性化する機能を保持することが提示されている。Ｈ１０７も、ＩｓｃＲの［Ｆｅ−Ｓ］クラスタ結合特性を付与する同様の重要な役割を果たす。Ｈ１０７Ｙ変異も同様に、大腸菌のビオチン耐性を高めることが可能である。ＩｓｃＲのＬ１５Ｆも、鉄硫黄クラスタ結合を破壊することにより、鉄硫黄クラスタの枯渇を部分的に克服することが提示されている。図９は、ＤＮＡに結合したときのＩｓｃＲのＬ１５及びＨ１０７の位置（ｈｙａの結合部位、ＰＤＢエントリ４ＨＦ１）を示しており、Ｌ１５は各ＩｓｃＲサブユニットの内側に位置していることが分かる。フェニルアラニンは、ロイシンよりも著しく大きいアミノ酸であり、タンパク質の三次元の折りたたみを妨げる可能性がある。
【０１２２】
２．５  大腸菌株のみでのｉｓｃオペロン又はｓｕｆオペロンの過剰発現は、ビオチン生産の増強に十分ではない
大腸菌でのビオチン生産にｉｓｃオペロン（ｉｓｃＳＵＡ−ｈｓｃＢＡ−ｆｄｘ、ｉｓｃＲ遺伝子を欠いたネイティブな大腸菌オペロン構造に対応）又はｓｕｆオペロン（ネイティブな大腸菌オペロン構造に対応するｓｕｆＡＢＣＤＳＥ）の過剰発現が及ぼす直接的な影響を判断するため、各オペロンを、強力なＲＢＳ及びＩＰＴＧ誘導性Ｔ５プロモータの制御下に置かれた中程度のコピー数のプラスミド（ｐ１５Ａ  ｏｒｉ）にクローニングした。ｉｓｃオペロン又はｓｕｆオペロンの代わりにスーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質（ｓｆＧＦＰ）をコードする遺伝子を含むプラスミドを対照として使用した。ＩＰＴＧ誘導性ｂｉｏＢ発現プラスミドを含む大腸菌株の細胞に、それぞれのプラスミドを形質転換した：ＩＰＴＧ誘導性ｂｉｏＢ発現プラスミドに加えて、１）ＩＰＴＧ誘導性ｉｓｃオペロン、２）ＩＰＴＧ誘導性ｓｕｆオペロン、又は３）ＩＰＴＧ−誘導性ＧＦＰ（対照）のいずれかを含む生物学的トリプリケートコロニーを、アンピシリン１００μｇ／ｍＬ及びスペクチノマイシン５０μｇ／ｍＬを含む４００μＬのｍＭＯＰＳ中で低（０．０１ｍＭのＩＰＴＧ）誘導及び高（０．１ｍＭのＩＰＴＧ）誘導で培養した後、（セクション１．５に記載のように）ビオチン生産についてアッセイした。
【０１２３】
グラフ（図１０）から、全ての株でビオチンの生産がＩＰＴＧ誘導性であるが、検出可能なビオチン生産レベルに到達するのに必要なＩＰＴＧ濃度は、図６に示す参照及び変異ｉｓｃＲ株と比較すると、０．０１ｍＭのＩＰＴＧから０．１ｍＭのＩＰＴＧに増加していることが分かる。更に、図１０の両方のｓｆＧＦＰ株と比較した場合、ビオチン生産力価は、ｉｓｃオペロン又はｓｕｆオペロンの過剰発現によって有意に減少した。更に、ｉｓｃオペロンの過剰発現は、ｓｕｆオペロンの過剰発現よりも更にビオチン生産を抑制した。ｉｓｃＲに単一点変異を有する変異株で観察されるビオチン生産の増加（図６）と考え合わせると、これらの株におけるｉｓｃオペロンの抑制解除が、これらの株におけるビオチン生産の改善の唯一の／主な理由である可能性は低い。
【０１２４】
２．６  ＢｉｏＢタンパク質含有量はビオチン生産と相関する
野生型バックグラウンド株及び変異バックグラウンド株におけるＢｉｏＢの過剰発現の分子効果を調べるために、野生型バックグラウンド株：ｐＢＳ４３０を保持するＢＳ１０１３；ｂｉｏＢ生産プラスミド有する野生型ｉｓｃＲ株：ｐＢＳ４１２を保持するＢＳ１０１１；及び、ｂｉｏＢ生産プラスミドを有する変異ｉｓｃＲ株：ｐＢＳ４１２を保持するＢＳ１３５３のプロテオミクス測定を実施した。全ての株を、０．１ｇ／ＬのＤＴＢ及び０．０２５ｍＭのＩＰＴＧを含むｍＭＯＰＳ中で増殖させた。後者の株は、１ｍＭのＩＰＴＧ誘導で更に増殖させた。プロテオミクス分析のために対数期に細胞を採取し、残りの細胞培養物を合計２４時間インキュベートした後、他の文献に記載のバイオアッセイを使用してビオチン生産を測定した。
【０１２５】
グラフ（図１１）から、測定されたＢｉｏＢタンパク質レベルはビオチン生産と強く相関している（Ｒ２値０．９６）。この線形的な相関は、ＢｉｏＢ発現の促進がＩｓｃＲ変異細胞工場におけるビオチン生産の改善の鍵であることを示している。プロテオミクスデータのＡＮＯＶＡ分析により、更なる２９種類のタンパク質での発現の有意な増加（９５％信頼区間、ｐ値０．００１６６）が明らかとなった。これらの中には、ｉｓｃオペロン（ＩｓｃＡ及びＩｓｃＳ）並びにｓｕｆオペロン（ＳｕｆＢ及びＳｕｆＳ）のメンバーが含まれる。
【０１２６】
２．７  ｉｓｃＲノックアウト変異体ではビオチン生産は増強されない
ＭＡＧＥを使用して、ｉｓｃＲの位置２２のグルタミン酸をコードするコドン（Ｅ、ＧＡＡ）を停止コドン（＊、ＴＧＡ）へと変換することにより、ｉｓｃＲ遺伝子の翻訳ノックアウトをＢＷ２５１１３  ΔｂｉｏＢ株に導入した。コドンの変換の成否を、この領域のＰＣＲ増幅と、これに続くサンガーシーケンシングによって検証した。野生型ｉｓｃＲ、ｉｓｃＲノックアウト（Ｅ２２＊）及び変異型ｉｓｃＲ（Ｃ９２Ｙ）をコードする遺伝子を含む株を、ＩＰＴＧ誘導性ｂｉｏＢプラスミドｐＢＳ４１２で形質転換し、ＤＴＢ０．１ｇ／ｌ及びカナマイシン５０μｇ／ｌを加えたｍＭＯＰＳ中で、上記の３つの異なるＩＰＴＧ誘導レベル（０ｍＭ、０．０１ｍＭ及び０．１ｍＭ）で増殖させた生物学的複製（ｎ＝３）のビオチン生産をテストした。
【０１２７】
ＩＰＴＧ誘導によりｂｉｏＢ発現を誘導した場合、ｉｓｃＲノックアウト（ｉｓｃＲ  ＫＯ）株と野生型ｉｓｃＲ（ｉｓｃＲ  ＷＴ）株との間にビオチン生産の有意差は認められなかった。これは、ｉｓｃＲをノックアウトしてもビオチン生産が改善されないことを立証している。ＩｓｃＲ  Ｃ９２Ｙ置換をコードする変異ｉｓｃＲについて、ｉｓｃＲ  ＷＴ株及びｉｓｃＲ  ＫＯ株の両方と比較したビオチン生産の有意な改善が再び観察された。
【０１２８】
２．８  デノボビオチン生産は、本発明のｉｓｃＲ変異株で増強される
ｂｉｏＡ遺伝子及びビオチンオペロン全体（ΔｂｉｏＢ−ｂｉｏＤ）の両方が欠失され、ｉｓｃＲ  ＷＴ遺伝子、ｉｓｃＲ  Ｈ１０７Ｙ変異遺伝子又はｉｓｃＲ  Ｃ９２Ｙ変異遺伝子のいずれかを含むＢＷ２５１１３大腸菌株を、ネイティブ大腸菌ｂｉｏＡ及びビオチンオペロンを構成的に過剰発現するテトラサイクリン耐性プラスミドで形質転換した。ｂｉｏＯオペレータ部位に単一点変異が存在した（タイプ９変異、Ｉｆｕｋｕら１９９３）。これら３つの異なる株について、上記のようにテトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを含み、ＤＴＢ０．１ｇ／ｌを添加した場合及び添加しない場合のｍＭＯＰＳ（グルコース２ｇ／ｌ）での生物学的複製（ｎ＝４）のビオチン生産を評価した（図１３）。
【０１２９】
基質ＤＴＢを増殖培地に添加すると、３つの株全てでビオチン力価の有意な増加が観察され、ＤＴＢをビオチンに変換するｂｉｏＢ酵素反応自体が、これらの株でのビオチン生産のボトルネックではなくなったことを示している（図１３）。更に、ｉｓｃＲ  ＷＴ株と比較して、両方のｉｓｃＲ変異株でグルコースからのビオチンのデノボ生産の有意な増加が観察された。これらの結果を考慮すると、本発明の変異ｉｓｃＲ株は全て、直接前駆体であるＤＴＢから及びグルコースからの双方のビオチン生産の増強を介助すると推論することができる。
【０１３０】
実施例２：リポ酸生産を増強することの可能な遺伝子改変された大腸菌株の操作及び特性評価
この例で使用した大腸菌の株を以下に示す。
【０１３１】
表３：株
【表３】
2020527359.tif 000006
【０１３２】
この例で使用したプラスミドを以下に示す。
【０１３３】
表４：プラスミド
【表４】
2020527359.tif 000007
【０１３４】
プラスミドｐＢＳ１０３７上にクローニングされたＬｉｐＡ［配列番号１０３］をコードするＩＰＴＧ誘導性導入遺伝子を、ネイティブｉｓｃＲ遺伝子を含む大腸菌宿主株又は、例１に記載されるように、ネイティブｉｓｃＲ遺伝子がＣ９２Ｙ又はＨ１０７Ｙ置換を有するＩｓｃＲタンパク質をコードする変異ｉｓｃＲ遺伝子により置換された大腸菌宿主株に導入した；これら２つの株は更に、ｂｉｏＢ又はｌｉｐＡのノックアウトを含んだ。これらの株を、ビオチン０．１ｍＭ（ΔｂｉｏＢ株の場合）、ｌｉｐＡ発現の誘導のためのＩＰＴＧ及び基質としてのオクタン酸０．６ｇ／ｌを加えたｍＭＯＰＳ培地（セクション１．３に記載）中で、３７℃で２４時間培養した後、上清中の遊離リポ酸を測定した。ΔｌｉｐＡ株（ＢＳ１９１２及びＢＳ２１１４、表３）については、３７℃での２４時間の増殖の間、増殖を追跡した。
【０１３５】
記載された株の培養細胞によって生産されたリポ酸を、ｐＢＳ４５１を含むＢＳ１９１２を使用するセクション１．６に記載されたものと同様のバイオアッセイによって上清から測定した。リポ酸の定量のための増殖ベースのバイオアッセイを、リポ酸を合成できない栄養要求性大腸菌単一ΔｌｉｐＡ変異株（Ｈｅｒｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｇｕｅｓｔ，１９７５）（ｐＢＳ４５１を含むＢＳ１９１２）を使用して実施した。上清中の遊離リポ酸濃度を、リポ酸の唯一の供給源として生産株から回収されたリポ酸を加え、炭素源として５０ｎＮのコハク酸を含む最小培地でのリポ酸栄養要求性株の増殖を測定することによって求めた。リポ酸バイオアッセイの検量線を並行して実行し、既知の濃度範囲のリポ酸標準液を加えた最小培地で栄養要求性株を増殖させた。
【０１３６】
テストは、ＩｓｃＲタンパク質の変異型（Ｃ９２Ｙ又はＨ１０７Ｙ置換を有するＩｓｃＲタンパク質）をコードする遺伝子を含む大腸菌株でのｌｉｐＡ遺伝子の過剰発現が、ＩｓｃＲタンパク質の天然形態をコードする遺伝子を含む親大腸菌株におけるｌｉｐＡ遺伝子の過剰発現と比較して、リポ酸力価のより安定した生産と８０％の増加との両方をもたらすことを示している（図１４）。従って、ｉｓｃＲ  ＷＴ株（ｐＢＳ９９３を含むＢＳ１０１１）の生産力価の標準偏差は２．７３であるが、ｉｓｃＲ  Ｃ９２Ｙ（ｐＢＳ９９３を含むＢＳ１３７５）では１．４２、ｉｓｃＲ  Ｈ１０７Ｙ（ｐＢＳ９９３を含むＢＳ１３５３）では０．１１である（株については表１を参照）。個々の株の平均生産力価に基づき、変異株でのリポ酸生産は、ＷＴ株と比較して１．７９倍に改善されている（図１４を参照）。
【０１３７】
ＬｉｐＡの過剰発現は、ＷＴ  ｉｓｃＲ株（三角形、ｐＢＳ１０３７を含むＢＳ１９１２）及びｉｓｃＲ変異株（四角形、ｐＢＳ１０３７を含むＢＳ２１１４）の両方で、ＩＰＴＧによるＬｉｐＡの誘導の増加に応答して増殖速度を低下させる明確な傾向を示した（濃い灰色、図１５）。しかし、ＷＴ  ｉｓｃＲ株の増殖速度は、０．０１ｍＭ〜０．０３ｍＭでテストした全てのＩＰＴＧ誘導レベルで、変異ｉｓｃＲ株と比較してより大幅に低下した（図１５を参照）。
【０１３８】
実施例３：チアミン生産を増強することの可能な遺伝子改変された大腸菌株の操作及び特性評価
この例で使用した大腸菌の株を以下に示す。
【０１３９】
表５：株
【表５】
2020527359.tif 000008
【０１４０】
この例で使用したプラスミドを以下に示す。
【０１４１】
表６：プラスミド
【表６】
2020527359.tif 000009
【０１４２】
プラスミドｐＢＳ１４０上にクローニングされたチアミン経路遺伝子ｔｈｉＣＥＦＳＧＨＭＤを、（参照株として）ネイティブｉｓｃＲ遺伝子を含む大腸菌宿主株（ＢＳ７５０）と、例１に記載されているように、ネイティブｉｓｃＲ遺伝子が、それぞれＣ９２Ｙ又はＨ１０７Ｙ置換を有するＩｓｃＲタンパク質をコードする変異ｉｓｃＲ遺伝子によって置換されているこの参照株の誘導体（ＢＳ２０１９及びＢＳ２０２０）とに導入した。これらの株を、培養用のディーププレートの各ウェルで、３７℃で２４時間、ｍＭＯＰＳ培地（セクション１．３に記載）で培養した。
【０１４３】
上述の株の培養細胞によって生産された細胞外及び細胞内のチアミン、ＴＭＰ及びＴＰＰを、次のように回収及び抽出した：各培養液０．４ｍＬを、培養プレートに入れ、４０００×ｇで５分間遠心分離することにより、４℃で回収した。残りの全てのステップを氷上で実行した。細胞外ＴＰＰ、ＴＭＰ及びチアミンの分析のために、上清４０μＬを静かに除去した。残りの上清をデカントした後、培養プレートを裏返して残留培地を除去し、その後ボルテックスした。１００μＬの氷冷ＨＰＬＣグレードのメタノールを培養プレートの各ウェルに加えた。そして、細胞を再びボルテックスした。氷上で最低２０分間インキュベートした後、４０００×ｇで５分間の遠心分離により細胞片をペレット化した。上清を更なる分析のための細胞内抽出物として使用した。
【０１４４】
蛍光検出器を使用してＴＰＰ、ＴＭＰ及びチアミンを検出するために、各培養で生成されたチアミン化合物を、強い蛍光を発するチオクロムに誘導体化した。全てのステップを室温で実行した．体積４０μｌの細胞外及び細胞内抽出物を８０μｌの４Ｍ酢酸カリウムに加え、ピペッティングにより混合した。新たに調製したフェリシアン化カリウムを３．８ｍＭ含有する７ＭのＮａＯＨを４０μｌ添加し、混合した。新たに調製したＨ２Ｏ２を０．０６％含有する飽和ＫＨ２ＰＯ４を４０μｌ添加することにより、反応をクエンチさせた。６ＭのＨＣｌを４７μＬ添加することにより抽出物を中和し、次いでＨＰＬＣ又はＭｕｌｔｉｓｋａｎを使用した直接蛍光測定により分析した。誘導体化された全ての化合物を、分析された抽出物と並行してチオクロムに誘導体化された、新たに調製されたＴＰＰ、ＴＭＰ及びチアミン標準液の蛍光標準曲線を使用して定量化した。
【０１４５】
この試験は、変異形態のＩｓｃＲタンパク質（Ｃ９２Ｙ又はＨ１０７Ｙ置換を有するＩｓｃＲタンパク質）をコードする遺伝子を含む宿主大腸菌株（ＢＳ２０１９及びＢＳ２０２０）におけるｔｈｉＣ遺伝子及びｔｈｉＨ遺伝子とＴＭＰホスファターゼ遺伝子（Ａｔ５ｇ３２４７０）との組み合わせを含むチアミン経路遺伝子の過剰発現は、ネイティブな形態のＩｓｃＲタンパク質をコードする遺伝子を含む宿主大腸菌株（ＢＳ７５０）での過剰発現と比較して、チアミン、ＴＭＰ及びＴＰＰ、特にチアミンの生合成を増強することを示している。
【０１４６】
より具体的には、ｐＢＳ１４０を使用した場合には、ＷＴ  ｉｓｃＲを持つ株（ＢＳ７５０）とｉｓｃＲ変異をコードする株（ＢＳ２０２０、Ｈ１０７Ｙ又はＢＳ２０１９、Ｃ９２Ｙ）との間で、チアミン類（チアミン、ＴＭＰ及びＴＰＰ）のＯＤ正規化細胞外生産が１．４３倍増加することがテストで示された（図１６）。
【０１４７】
実施例４  ビオチンを生産可能な遺伝子改変された大腸菌株の生産性を高めるためのフラボドキシン／フェレドキシンレダクターゼ（Ｆｐｒ）及びフラボドキシン（ＦｌｄＡ）還元系の過剰発現
１  方法
１．１：例で使用した大腸菌の株を以下に示す。
【０１４８】
表７：株
【表７】
2020527359.tif 000010
【０１４９】
この例で使用したプラスミドを以下に示す。
【０１５０】
表８：プラスミド
【表８】
2020527359.tif 000011
【０１５１】
ＢｉｏＢをコードするＩＰＴＧ誘導性導入遺伝子を、プラスミドｐＢＳ６７９上にクローニングした。ＧＦＰをコードする構成的に調節された導入遺伝子を、プラスミドｐＢＳ１０５４上にクローニングした。そして、ＦｌｄＡ−Ｆｐｒをコードする合成オペロンを含む構成的に調節された導入遺伝子を、プラスミドｐＢＳ１１１２上にクローニングした。ｐＢＳ６７９を、例１に記載のように、Ｈ１０７Ｙ置換を有するＩｓｃＲタンパク質をコードする変異ｉｓｃＲ遺伝子によってネイティブｉｓｃＲ遺伝子が置換されており、更にｂｉｏＡＦＣＤ遺伝子のノックアウトを含む大腸菌宿主株（ＢＳ１６１５）に導入して、ＢＳ１９３７株を得た。次に、ＢＳ１９３７株をプラスミドｐＢＳ１０５４又はｐＢＳ１１１２のいずれかで更に形質転換し、それぞれＢＳ２７０７株（対照株）及びＢＳ２１８５株を得た。
【０１５２】
株を、適切な抗生物質及びＢｉｏＢ媒介触媒の基質としてのＤＴＢ０．１ｇ／Ｌを含み、  ＢｉｏＢ遺伝子の発現を誘導するためのＩＰＴＧ０、０．０１、０．０２５、０．０５、０．０７５又は０．１ｍＭを加えたｍＭＯＰＳ培地（例１．３に記載）で培養した。細胞をディープウェル培養プレートの各ウェルで、３７℃で２４時間インキュベートした。最終ＯＤを推定し、遠心分離によって上清を回収し、例１．６に記載のビオチンバイオアッセイによって上清からビオチンを定量した。
【０１５３】
株ＢＳ１９３７について、図１２及び図１７に示すように、遺伝子改変された内在性ｉｓｃＲ遺伝子を含む大腸菌細胞でのＢｉｏＢ遺伝子発現がＩＰＴＧの濃度の増加によって誘導されると、細胞はこれに対応したビオチン生産の漸進的な増加を示す。これらの遺伝子改変された細胞でのビオチン生産は、親株ＢＳ１９３７及び、ＦｌｄＡ−Ｆｐｒの代わりにＧＦＰをコードする導入遺伝子を発現する対照株と比較した場合に、ＦｌｄＡ−Ｆｐｒをコードする導入遺伝子（ＢＳ２１８５株）の同時発現により、更に増強される。
【０１５４】
ＩｓｃＲタンパク質の変異型（Ｈ１０７Ｙ置換を有するＩｓｃＲタンパク質）をコードする遺伝子と、ＢｉｏＢ遺伝子（ｐＢＳ６７９）及びＦｌｄＡ−Ｆｐｒ遺伝子（ｐＢＳ１１１２）の過剰発現のためのプラスミドとを含むＢＳ２１８５株のビオチン生産は、対照株ＢＳ１９３７（ＦｌｄＡ−Ｆｐｒ遺伝子の過剰発現なし）と比較して２．１２倍に増強された（図１８）。
【０１５５】
参照文献：
Datsenko KA, Wanner BL. (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. ;97(12): 6640-5.
Fleischhacker, A. S. et a/. (2012) Characterization of the [2Fe-2S] cluster of Escherichia coli transcription factor IscR. Biochemistry 51 : 4453-4462.
Giel, J. L., Rodionov, D., Liu, M., Blattner, F. R. & Kiley, P. J. (2006) IscR-dependent gene expression links iron-sulphur cluster assembly to the control of 02-regulated genes in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 60, 1058- 1075.
Herbert AA, Guest JR. (1975) Lipoic acid content of Escherichia coli and other microorganisms. Arch Microbiol.; 106(3) :259-66. Epub 1975/12/31. pmid: 814874
Ifuku, O. et al. Sequencing analysis of mutation points in the biotin operon of biotin-overproducing Escherichia coli mutants. Biosci Biotechnol Biochem 57, 760-765 (1993).
Ifuku, O. et a/., (1995) "Molecular analysis of growth inhibition caused by overexpression of the biotin operon in Escherichia coli." Bioscience, biotechnology, and biochemistry 59(2): 184-189.
Martin, J. E. & Imlay, J. A. (2012) Replication during periods of iron starvation. 80, 319-334.
Py, B. & Barras, F. (2010) Building Fe-S proteins: bacterial strategies. Nat. Rev. Microbiol. 8, 436-446.
Schmitt, A, Kochanowski K., Vedelaar S., Ahrne E., Volkmer B., Callipo L., Knoops K., Bauer M., Aebersold R., & Heinemann M., (2015) The quantitative and condition-dependent Escherichia coli proteome. Nature Biotechnology 2015; doi: 10.1038
【図１】
2020527359.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2020527359.tif 000021
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2020527359.tif 000024
【図１４】
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【図１５】
2020527359.tif 000026
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月2日(2019.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変された細菌であって、該細菌が、ビオチン又はリポ酸又はチアミンの生産が増強され、且つ、
ａ．変異ＩｓｃＲポリペプチドをコードする遺伝子改変された内在性ｉｓｃＲ遺伝子であって、該変異ＩｓｃＲポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４からなる群から選択される配列と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、該アミノ酸配列は、
ｉ．Ｘが配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４の対応するアミノ酸残基以外のアミノ酸である、Ｌ１５Ｘ、Ｃ９２Ｘ、Ｃ９８Ｘ、Ｃ１０４Ｘ及びＨ１０７Ｘ
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、遺伝子改変された内在性ｉｓｃＲ遺伝子と、
ｂ．少なくとも１つの導入遺伝子であって、
ｉｉ．ビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドと、
ｉｉｉ．リポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．８）を有するポリペプチドと、
ｉｖ．ＨＭＰ−Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するポリペプチドと、
ｖ．チロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するポリペプチドと、
からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、少なくとも１つの導入遺伝子と、
を備える、遺伝子改変された細菌。
【請求項２】
前記変異ＩｓｃＲポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸置換が、
ａ．ＸがＦ、Ｙ、Ｍ及びＷのいずれかであるＬ１５Ｘと、
ｂ．ＸがＹ、Ａ、Ｍ、Ｆ、ＷのいずれかであるＣ９２Ｘと、
ｃ．ＸがＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、ＷのいずれかであるＣ９８Ｘと、
ｄ．ＸがＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、ＷのいずれかであるＣ１０４Ｘと、
ｅ．ＸがＡ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、及びＬのいずれかであるＨ１０７Ｘと、
からなる群から選択される、請求項１に記載のビオチン又はリポ酸又はチアミンの生産を増強するための遺伝子改変された細菌。
【請求項３】
前記少なくとも１つの導入遺伝子が、ビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドをコードし、更に、
ａ．ＳＡＭ（Ｓ−アデノシルメチオニン）依存性メチルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．１．１．１９７）を有するポリペプチド、
ｂ．７−ケト−８−アミノペラルゴン酸（ＫＡＰＡ）シンターゼ活性（ＥＣ２．３．１．４７）を有するポリペプチド、
ｃ．７，８−ジアミノペラルゴン酸（ＤＡＰＡ）シンターゼ活性（ＥＣ：２．６．１．６２又はＥＣ：２．６．１．１０５）を有するポリペプチド、
ｄ．デチオビオチン（ＤＴＢ）シンテターゼ活性（ＥＣ６．３．３．３）を有するポリペプチド、
ｅ．ピメロイル−［アシルキャリアタンパク質］メチルエステルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．８５）を有するポリペプチド、及び
ｆ．６−カルボキシヘキサノエート−ＣｏＡリガーゼ活性（ＥＣ６．２．１．１４）を有するポリペプチド、
からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをコードする更なる導入遺伝子を含み、
前記細菌は、ビオチンの生産を増強するためのものである、
請求項１又は２に記載の遺伝子改変された細菌。
【請求項４】
前記少なくとも１つの導入遺伝子がリポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．８）を有するポリペプチドをコードし、更に、
ａ．オクタノイルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．３．１．１８１）を有するポリペプチドと、
ｂ．ピルビン酸デヒドロゲナーゼのジヒドロリポイルリジン残基アセチルトランスフェラーゼ成分（ＥＣ２．３．１．１２）を含むポリペプチドと、
ｃ．リポエートタンパク質リガーゼＡ活性（ＥＣ：６．３．１．２０）を有するポリペプチドと、
からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをコードする更なる導入遺伝子を含み、
前記細菌は、リポ酸の生産を増強するためのものである、
請求項１又は２に記載の遺伝子改変された細菌。
【請求項５】
前記少なくとも１つの導入遺伝子が、ＨＭＰ−Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するポリペプチド及び／又はチロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するポリペプチドをコードする１つの導入遺伝子をコードし、更に、
ａ．ＴｈｉＳアデニリルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．７．７．７３）を有するＴｈｉＦポリペプチドと、
ｂ．チアミンリン酸シンターゼ活性（ＥＣ２．５．１．３）を有するＴｈｉＥポリペプチドと、
ｃ．チアゾールシンターゼ活性（Ｅ．Ｃ．２．８．１．１０）を有するＴｈｉＧポリペプチドと、
ｄ．ホスホヒドロキシメチルピリミジンキナーゼ活性（ＥＣ２．７．４．７）を有するＴｈｉＤポリペプチドと、
ｅ．グリシンオキシダーゼ活性（ＥＣ１．４．３．１９）を有するＴｈｉＯポリペプチドと、
ｆ．硫黄担体タンパク質活性を有するＴｈｉＳポリペプチドと、
ｇ．ヒドロキシエチルチアゾールキナーゼ活性（２．７．１．５０）を有するＴｈｉＭポリペプチドと、
ｈ．チアミン一リン酸ホスファターゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．３．−）を有するポリペプチドと、
からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドをコードする更なる導入遺伝子を含み、
前記細菌は、チアミンの生産を増強するためのものである、
請求項１又は２に記載の遺伝子改変された細菌。
【請求項６】
前記細菌が、
ａ．ＨＭＰ−Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するＴｈｉＣポリペプチドと、
ｂ．チロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するＴｈｉＨポリペプチド又はグリシンオキシダーゼ活性（ＥＣ１．４．３．１９）を有するＴｈｉＯポリペプチドと、
ｃ．ＴｈｉＳアデニリルトランスフェラーゼ活性（ＥＣ２．７．７．７３）を有するＴｈｉＦポリペプチドと、
ｄ．チアミンリン酸シンターゼ活性（ＥＣ２．５．１．３）を有するＴｈｉＥポリペプチドと、
ｅ．チアゾールシンターゼ活性（Ｅ．Ｃ．２．８．１．１０）を有するＴｈｉＧポリペプチドと、
ｆ．ホスホヒドロキシメチルピリミジンキナーゼ活性（ＥＣ２．７．４．７）を有するＴｈｉＤポリペプチド、
ｇ．硫黄担体タンパク質活性を有するＴｈｉＳポリペプチドと、
ｈ．チアミン一リン酸ホスファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．３．−）活性を有するポリペプチドと、
をコードする更なる導入遺伝子を含む、請求項５に記載の遺伝子改変された細菌。
【請求項７】
前記少なくとも１つの導入遺伝子及び前記１以上の更なる導入遺伝子が構成的プロモータに作用可能に連結されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌。
【請求項８】
前記細菌が、エシェリキア属、バシラス属、ブレビバクテリウム属、バークホルデリア属、カンピロバクター属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属、セラチア属、ラクトバシラス属、ラクトコッカス属及びアシネトバクター属、シュードモナス属、及びアセトバクター属からなる群から選択される細菌の一種である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌。
【請求項９】
ａ．請求項１〜３、７、及び８のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌を増殖培地に導入して培養物を生成する工程であって、前記少なくとも１つの導入遺伝子が、ビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドをコードする工程と、
ｂ．前記培養物を培養する工程と、
ｃ．前記培養物によって生産されたビオチンを回収し、該回収されたビオチンを任意に精製する工程と、
を含む、ビオチンの製造方法。
【請求項１０】
ａ．請求項１、２、４、７、及び８のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌を増殖培地に導入して培養物を生成する工程であって、前記少なくとも１つの導入遺伝子が、リポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドをコードする工程と、
ｂ．前記培養物を培養する工程と、
ｃ．前記培養物によって生産されたリポ酸を回収し、該回収されたリポ酸を任意に精製する工程と、
を含む、リポ酸の製造方法。
【請求項１１】
ａ．請求項１、２、５〜８のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌を増殖培地に導入して培養物を生成する工程であって、前記少なくとも１つの導入遺伝子が、ＨＭＰ−Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するポリペプチド及び／又はチロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するポリペプチドをコードする工程と、
ｂ．前記培養物を培養する工程と、
ｃ．前記培養物によって生産されたチアミンを回収し、該回収されたチアミンを任意に精製する工程と、
を含む、チアミンの製造方法。
【請求項１２】
前記増殖培地が、グルコース、マルトース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、アラビノース、キシロース、ラフィノース、マンノース、及びラクトース、又はそれらの任意の組み合わせから選択される炭素源を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のビオチン、リポ酸及びチアミンのいずれか１つの製造方法。
【請求項１３】
遺伝子改変された細菌におけるビオチン、リポ酸又はチアミンのいずれか１つの生産を増強するための変異ＩｓｃＲポリペプチドをコードする遺伝子改変された遺伝子の使用であって、該細菌が、
ｉ．ビオチンシンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．６）を有するポリペプチドと、
ｉｉ．リポ酸シンターゼ活性（ＥＣ２．８．１．８）を有するポリペプチドと、
ｉｉｉ．ＨＭＰ−Ｐシンターゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１７）を有するポリペプチドと、
ｉｖ．チロシンリアーゼ活性（ＥＣ４．１．９９．１９）を有するポリペプチドと、
からなる群から選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１つの導入遺伝子を備えて発現し、
前記遺伝子改変された細菌は、変異ＩｓｃＲポリペプチドをコードする内在性ｉｓｃＲ遺伝子であり、該変異ＩｓｃＲポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、及び１４と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有し、該アミノ酸配列は、Ｘが配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４の対応するアミノ酸残基以外のアミノ酸である、Ｌ１５Ｘ、Ｃ９２Ｘ、Ｃ９８Ｘ、Ｃ１０４Ｘ及びＨ１０７Ｘからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、使用。
【請求項１４】
請求項１３に記載の遺伝子改変された細菌におけるビオチン、リポ酸及びチアミンのいずれか１つの生産を増強するための変異ＩｓｃＲポリペプチドをコードする遺伝子改変された遺伝子の使用であって、該変異ＩｓｃＲポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸置換が、
ａ．ＸがＦ、Ｙ、Ｍ、及びＷのいずれか１つであるＬ１５Ｘと、
ｂ．ＸがＹ、Ａ、Ｍ、Ｆ、Ｗのいずれか１つであるＣ９２Ｘと、
ｃ．ＸがＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗのいずれか１つであるＣ９８Ｘと、
ｄ．ＸがＡ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗのいずれか１つであるＣ１０４Ｘと、
ｅ．ＸがＡ、Ｙ、Ｖ、Ｉ、及びＬのいずれか１つであるＨ１０７Ｘと、
からなる群から選択される、使用。
【請求項１５】
ビオチン、リポ酸、又はチアミンのいずれか１つの生産を増強するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌の使用。
【請求項１６】
前記細菌が、
ａ．フラボドキシン／フェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼ（ＥＣ：１．１８．１．２及びＥＣ１．１９．１．１）をコードする遺伝子と、
ｂ．ピルビン酸フラボドキシン／フェレドキシンオキシレダクターゼ（ＥＣ１．２．７）をコードする遺伝子と、
ｃ．フラボドキシンをコードする遺伝子と、
ｄ．フェレドキシンをコードする遺伝子と、
ｅ．フラボドキシン及びフェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼをコードする遺伝子と、
からなる群から選択される１以上の遺伝子を更に含み、
該１以上の遺伝子は、前記細菌における該１以上の遺伝子の発現を増強することの可能な非ネイティブプロモータに作用可能に連結され、該１以上の遺伝子はネイティブ遺伝子又は導入遺伝子であり得る、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の遺伝子改変された細菌。
【請求項１７】
ビオチン、リポ酸、又はチアミンのいずれか１つの生産を増強するための、請求項１６に記載の遺伝子改変された細菌の使用。
【請求項１８】
前記遺伝子改変された細菌が、
ａ．フラボドキシン／フェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼ（ＥＣ：１．１８．１．２及びＥＣ１．１９．１．１）をコードする遺伝子と、
ｂ．ピルビン酸フラボドキシン／フェレドキシンオキシレダクターゼ（ＥＣ１．２．７）をコードする遺伝子と、
ｃ．フラボドキシンをコードする遺伝子と、
ｄ．フェレドキシンをコードする遺伝子と、
ｅ．フラボドキシン及びフェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼをコードする遺伝子と、
からなる群から選択される１以上の遺伝子を更に含み、
該１以上の遺伝子は、前記細菌における該１以上の遺伝子の発現を増強することの可能な非ネイティブプロモータに作用可能に連結され、該１以上の遺伝子はネイティブ遺伝子又は導入遺伝子であり得る、
請求項９〜１２のいずれか１項に記載のビオチン、リポ酸、及びチアミンのいずれか１つの製造方法。
【国際調査報告】
2020527359.tif 000030
2020527359.tif 000031
2020527359.tif 000032