(57)【要約】  本発明は、0.1μM〜1,000μMの範囲の濃度の硫酸化オリゴ糖、及び式(I)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート:  PEG-R1-(BX)n        (I)（式中、Bは、リジン又はアルギニンであり、Xは、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン酸又はアスパラギン酸から選択され、nは、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及び20から選択される整数であり；R1は、存在しなくてもよく、又は5〜30アミノ酸を含むペプチドであり; PEGは、0.1μM〜1,000μMの範囲の濃度で含まれ;R1は、存在する場合は、0.1μM〜4,000μMの範囲の濃度で含まれ;(BX)nは、0.25μM〜1,000μMの範囲の濃度で含まれる）を含む、本質的にそれらからなる、又はそれらからなる、バイオマトリックス層を提供する。本発明は、さらに、バイオマトリックス層を組み立てるためのプロセスにも関する。【選択図】図１
2020524004.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のものを含む、本質的に以下のものからなる、又は以下のものからなる、バイオマトリックス層：
・  0.1μM〜1,000μMの範囲の濃度の負に荷電したポリマー(NCP)；及び
・  一般式(I)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート：
PEG-CW−スペーサー−R1−スペーサー−(BX)n        (I)；
（式中、
−  前記スペーサーは、存在しないか、又はジペプチド、トリペプチドもしくはテトラペプチドであり、ここで、前記ジペプチド、トリペプチドもしくはテトラペプチドは、グリシン、アミノプロパン酸、アミノ酪酸、アミノペンタン酸、アミノヘキサン酸、アミノヘプタン酸、アミノオクタン酸及び3-アミノアクリル酸、又はそれらの組み合わせからなり；
−  CWは、存在しないか、又はアミノ酸、システイン及びトリプトファンからなるジペプチドであり；
−  Bは、リジン又はアルギニンであり、Xは、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン酸、又はアスパラギン酸から選択され、nは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及び20から選択される整数であり；
−  R1は、生体機能的ペプチドを表し、存在しなくてもよく、又は5〜30個のアミノ酸を含むペプチドであり；
−  PEGは、0.1μM〜1,000μMの範囲の濃度で含まれており；
−  R1は、存在する場合、0.1μM〜4,000μMの範囲の濃度で含まれており；
−  (BX)nは、0.4μM〜4,000μMの範囲の濃度で含まれる。）。
【請求項２】
前記ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートが、式(Ia)のもの：
PEG-R1-(BX)n        (Ia)
（式中、B、X及びnは請求項1に定義されるとおりである。）
である、請求項1記載のバイオマトリックス層。
【請求項３】
前記ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートが、式(Ia)のもの：
PEG-(BX)n        (Ib)
（式中、B、X及びnは請求項1に定義されるとおりである。）
である、請求項1記載のバイオマトリックス層。
【請求項４】
前記式(I)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートが、PEG及びR1の間、及びR1及び(BX)nの間にリンカー配列をさらに含み、かつ、式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート：
PEG-CWGG-R1-GG-(BX)n        (II)
（式中、B、X、n及びR1は請求項1に定義されるとおりである。）
である、請求項1記載のバイオマトリックス層。
【請求項５】
前記式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートが、PEG及び(BX)nの間にさらなるリンカー配列を含み、かつ、式(IIa)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート：
PEG-CWGG-(BX)n        (IIa)
（式中、B、X、n及びR1は請求項1に定義されるとおりである。）
である、請求項1記載のバイオマトリックス層。
【請求項６】
前記ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートが、式(I)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート及び式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの混合物、又は式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート及び式(IIa)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの混合物であり、及び／又は前記混合物において、前記式(I)又は式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの比率が、0.1〜99.9 mol％の範囲である、請求項1〜5のいずれか1項記載のバイオマトリックス層。
【請求項７】
前記NCPが、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸、ポリスチレン硫酸（PSS）、硫酸化アルギン酸塩、硫酸化ヒアルロン酸、環状デキストラン硫酸、環状デキストランリン酸及びフィチン酸からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項記載のバイオマトリックス層。
【請求項８】
・  Bは、リジン又はアルギニンである；及び／又は
・  Xは、アラニン又はセリンである；及び／又は
・  (BX)nは、表1の配列番号1〜14を有するペプチドからなる群から選択されるペプチドである；及び／又は
・  R1は、表2の配列番号15〜353を有するペプチドからなる群から選択されるペプチドである、
請求項1〜7のいずれか1項記載のバイオマトリックス層。
【請求項９】
前記PEGが、場合によってはマレイミド官能化、カルボン酸官能化、アミノ官能化、アジド官能化、又はアルキン官能化されている、starPEG、好ましくは、4腕starPEG、より好ましくは、4 kD〜40 kDの範囲の分子量を有するものである、請求項1〜8のいずれか1項記載のバイオマトリックス層。
【請求項１０】
式(I)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート：NCP、又は式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート：NCPの比が、1：100及び100：1の間の範囲である、請求項1〜9のいずれか1項記載のバイオマトリックス層。
【請求項１１】
細胞、オルガノイド(例えば、間葉系球、神経幹細胞塊)、モルフォゲン、又は少なくとも一つの活性医薬成分をさらに含む、請求項1〜10のいずれか1項記載のバイオマトリックス層。
【請求項１２】
請求項1〜11のいずれか1項記載のバイオマトリックス層のビルディングブロックのコンビナトリアルライブラリーであって、以下のものを含む、以下のものから本質的になる、又は以下のものからなるPBSバッファー中の個別のストック溶液：
・  2.5μM〜7.5μMの、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、デキストラン硫酸、及びヒアルロン酸からなる群から選択される、NCP、
・  2.5μM〜7.5μMのPEG、好ましくは、4kD〜40kDの範囲の4腕star-PEG；
・  2.5μM〜7.5μMの配列番号1〜14を有するペプチドからなる群から選択される、(BX)nペプチド、及び
・  2.5μM〜7.5μMの配列番号15〜353を有するペプチドからなる群から選択される、R1ペプチド
を含む、前記ライブラリー。
【請求項１３】
請求項1〜11のいずれか1項記載の目的特異的なバイオマトリックス層を製造するためのキットであって、請求項12記載のバイオマトリックス層のビルディングブロックのストック溶液、及び本発明の目的特異的なバイオマトリックス層を製造するために前記ビルディングブロックを含むこれらのストック溶液を使用するための指示を含む、前記キット。
【請求項１４】
請求項1〜11のいずれか1項記載の、3nm〜40μMの範囲の厚さを有するバイオマトリックス層を製造する方法であって、以下のステップを含む前記方法：
i)      式(I)：
PEG-R1-(BX)n        (I)、
及び、場合によっては式(Ia)：
PEG-CWGG-R1-GG-(BX)n        (Ia)
のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートを調製するステップ
（式中、
−  Bは、リジン又はアルギニンであり、Xは、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン酸又はアスパラギン酸から選択され、nは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及び20から選択される整数であり；かつ
−  R1は、生体機能的ペプチドを表し、存在しなくてもよく、又は5〜30個のアミノ酸を含むペプチドである）；
ii)      前記ペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲート及びNCPを前記バッファーに最終濃度の100倍の濃度で溶解するステップ；
iii)      好適なバッファー溶液中に、ステップii)の溶液を希釈及び混合するステップ、ここで、式(I)又は式(II)のポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲート及び前記NCPは、各々0.1μM〜250μMの範囲の濃度で前記バッファー溶液に含有される；及び
iv)      ゲル化によってバイオマトリックス層を形成するステップ、
及び、場合により、前記ハイドロゲルが細胞又はオルガノイドを含む場合、以下の付加的なステップ：
v)       前記細胞又はオルガノイドを、上記のステップiv)により得られたバイオマトリックス層上に播種するステップ；及び
vi)      前記バイオマトリックス層及び前記播種された細胞又はオルガノイドをインキュベートし、該バイオマトリックス層への細胞付着を推進するステップ。
【請求項１５】
請求項1〜11のいずれか1項記載の、3nm〜40μMの範囲の厚さを有するバイオマトリックス層を製造する方法であって、第一のステップにおいて、生体機能的ペプチドR1を持たないバイオマトリックス層を調製し、第二のステップにおいて、生体機能的ペプチドを含むペプチドを添加することにより後修飾を実施し、ここで、前記添加されるペプチドが、R1-(BX)n、CW-R1-GG-(BX)n及びCWGG-R1-GG-(BX)n から選択され、かつ、B、X、n及びR1は請求項1に定義されるとおりである、前記方法。
【請求項１６】
前記バイオマトリックス層の厚さ、堅さ、多孔度及び細胞による表面カバー度が、調整可能である、請求項1〜11のいずれか1項記載のバイオマトリックス層、又は請求項14記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、0.1μM〜1,000μMの範囲の濃度の負に荷電したポリマー(NCP)及び0.1μM〜1,000μMの範囲の濃度のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートを含む、本質的にそれらからなる、又はそれらからなる、3nm〜40μmの範囲の厚さを有するバイオマトリックス層を提供する。本発明は、さらに、該バイオマトリックス層を組み立てるプロセスに関する。該バイオマトリックス層には、細胞及びオルガノイドを搭載することができる。バイオマトリックス層の、厚さ、堅さ及び多孔度のような、いくつかの特徴は、NCP及びペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートのタイプを選択することにより、及びバイオマトリックス層の調製中のそれらの濃度を調整することにより、調整され得る。本発明は、生体機能的ペプチドをさらに含んでいてもよい、負に荷電したポリマー(NCP)及びペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートのコンビナトリアルライブラリーを提供し、ここで、前記ライブラリーは、特異的細胞タイプの選択的培養、バイオメディカルデバイスのコーティングなどのためのバイオマトリックス層の表面の調整を可能にする。さらに、本発明は、該コンビナトリアルライブラリーの成分を含むキットを提供する。該バイオマトリックス層は、細胞外マトリックスを模倣しており、種々のバイオメディカル応用において使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
プラスチックフラスコ内での標準的な細胞培養は、天然の細胞外マトリックス(ECM)の複雑性を模倣する能力を持たない。特異的な細胞タイプの要求を満たすために、種々の化学的にコーティングされた表面が開発されてきた(Mei Y, Saha K, Bogatyrev SR, Yang J, Hook AL, Kalcioglu ZIらの文献、「ヒト多能性幹細胞のクローン成長のための生体材料のコンビナトリアル開発（Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells）」、Nat Mater 2010, 9(9): 768-778; Celiz AD, Smith JGW, Patel AK, Hook AL, Rajamohan D, George VTらの文献、「ヒト多能性幹細胞増殖及び多系列分化のための新規なポリマーの発見（Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation）」、Advanced Materials 2015, 27(27): 4006-4012)。生体材料の開発及びエンジニアリングには付加的な要件があり、例えば、細胞タイプ特異的3D環境及び天然ECMの機械的特性を再現することである。広く使用されているハイドロゲルのなかで、例えば、マトリゲル（Matrigel）は、ECMを模倣するバイオマトリックスとして使用されてきたが、特異的細胞タイプ及び組織の要求に容易に調整することはできない。ECM組成の変更は、損傷した肝臓組織の修復(Klaas M, Kangur T, Viil J, Maemets-Allas K, Minajeva A, Vadi Kらの文献、「細胞外マトリックス組成の変更は損傷した肝臓組織の修復を案内する（The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue）」、Scientific reports 2016, 6: 27398)、及び誘導された多能性幹細胞の増殖(Adnan N, Mie M, Haque A, Hossain S, Mashimo Y, Akaike Tらの文献、「誘導マウス多能性幹細胞の長期培養及び維持のための定義された生体模倣型マトリックスの構築（Construction of a defined biomimetic matrix for long-term culture and maintenance of mouse induced pluripotent stem cells）」、Bioconjugate Chemistry 2016)に影響することが示されている。特定の応用に適合させたバイオマトリックスを開発するために、化学合成を通じて(Ranga A, Gobaa S, Okawa Y, Mosiewicz K, Negro A, Lutolf MPの文献、「細胞運命のシステムレベル分析のための3Dニッシェマイクロアレイ（3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate）」、Nature Communications 2014, 5: 4324; Klim JR, Li L, Wrighton PJ, Piekarczyk MS, Kiessling LLの文献、「ヒト多能性幹細胞のための定義されたグリコサミノグリカン結合下層（A defined glycosaminoglycan-binding substratum for human pluripotent stem cells）」、Nat Methods 2010, 7(12): 989-994; Vegas AJ, Veiseh O, Doloff JC, Ma M, Tam HH, Bratlie Kらの文献、「コンビナトリアルハイドロゲルライブラリーは霊長類の外来反応を緩和する材料の同定を可能にする（Combinatorial hydrogel library enables identification of materials that mitigate the foreign body response in primates）」、Nat Biotech 2016, 34(3): 345-352)、又は種々のブタ組織由来のECMを使用して(Beachley VZ, Wolf MT, Sadtler K, Manda SS, Jacobs H, Blatchley MRらの文献、「細胞機能のハイスループットスクリーニング及びシステム分析のための組織マトリックスアレイ（Tissue matrix arrays for high-throughput screening and systems analysis of cell function）」、Nat Meth 2015, 12(12): 1197-1204)、インビトロの細胞培養応用及びインビボの生体適合性分析のためのコンビナトリアルライブラリーが生成されてきた。
【０００３】
ヘパリンを、ヘパリン結合ペプチドとコンジュゲート化された4腕ポリエチレングリコール(starPEG)と混合することによって形成される非共有結合性ハイドロゲルシステムは既に開発されている(Wieduwild R, Tsurkan MV, Chwalek K, Murawala P, Nowak M, Freudenberg Uらの文献、「非共有結合性ペプチド−ヘパリンハイドロゲルのための最小ペプチドモチーフ（Minimal Peptide Motif for Non-Covalent Peptide-Heparin Hydrogels）」、J Am Chem Soc 2013, 135(8): 2919-2922)）。このペプチドは、簡素な(BA)nモチーフ(式中、Bは塩基性残基Arg/Lysであり、AはAlaである)を有し、反復数nを増大するとより堅いハイドロゲルがもたらされる。バルクのハイドロゲル形成における(BA)n及びヘパリン間の相互作用は、ランダムコイルからα−ヘリックスへの転換と関連し、一方、ゲル化時間(瞬間〜数時間)はペプチド及び硫酸化オリゴ糖の選択に依存する(Wieduwild R, Krishnan S, Chwalek K, Boden A, Nowak M, Drechsel Dらの文献、「細胞培養のためのマイクロキャリアとしての非共有結合性ハイドロゲルビーズ（Noncovalent Hydrogel Beads as Microcarriers for Cell Culture）」、Angew Chem Int Ed 2015, 56(13): 1521-3773)。ペプチド及び硫酸化オリゴ糖(例えば、デキストラン硫酸、ヘパリン)構成成分を変えることを通じて、生体材料は、3D細胞培養及び薬物放出のような応用に適合させることができる(WO2014040591 A2)。この動的ネットワークは、注入性に不可欠な、ずり減粘及び自己修復特性を示した。マウスに注入されたハイドロゲルは、高い生体適合性を示し、有害な炎症応答を起こさなかった(Tondera, C.らの文献(2017)、「免疫担当ヌードマウスにおけるペプチド−オリゴ糖相互作用により架橋された注入可能なハイドロゲルシステムのインビボ試験（In Vivo Examination of an Injectable Hydrogel System Crosslinked by Peptide-Oligosaccharide Interaction in Immunocompetent Nude Mice）」、Adv. Funct. Mater. 27, 27, 1605189)。
【０００４】
WO 2008/124165 A2は、ジペプチドモチーフをポリマー鎖にカップリングすることにより製造される、非共有結合性自己編成性ハイドロゲルを開示する。さらに、低分子量ヘパリン、及びstarPEGに結合したペプチドは公知である。ハイドロゲルは、ペプチド及びヘパリン間の非共有結合によって形成される。このペプチドは、HIP由来であり、配列(KA)4を含有する(Nori Yamaguchiらの文献:「多糖類-ポリ（エチレングリコール）星型コポリマーハイドロゲルのレオロジー特性（Rheological Characterization of Polysaccharide-Poly(ethylene glycol) Star Copolymer Hydrogels）」、BIOMACROMOLECULES, Vol. 6, No. 4, 28 May 2005(2005-05-28), 1931-1940頁; Nori Yamaguchiらの文献:「生理活性ハイドロゲルの製造のための足場としての多糖類ポリ（エチレングリコール）星型コポリマー（Polysaccharide poly(ethylene glycol) star copolymer as a scaffold for the production of bioactive hydrogels）」、BIOMACROMOLECULES, Vol. 6, No. 4, July 2005(2005-07), 1921-1930頁)。
【０００５】
一般に、ヘパリン結合ペプチドを有するstarPEGとヘパリン又は低分子量ヘパリンとのコンジュゲートからなるハイドロゲルの形成は、US 6 958 212 B1; Kyung Jae Jeongらの文献:「環境感受性ハイドロゲル内の共有結合性及び物理的相互作用の間の交錯（Interplay between Covalent and Physical Interactions within Environment Sensitive Hydrogels）」、BIOMACROMOLECULES, Vol. 10, No. 5, 23 March 2009(2009-03-23), 1090-1099頁; Mikhail V. Tらの文献:「制御された機械的特性を有する酵素的に分解可能なヘパリン−ポリエチレングリコールゲル（Enzymatically degradable heparin-polyethylene glycol gels with controlled mechanical properties）」、CHEMICAL COMMUNICATIONS, Vol. 46, No. 7, 16 December 2009(2009-12-16), 1141-1143頁; Mikhail V. Tsurkanらの文献:「二官能性ペプチドリンカーを備えたモジュラーStarPEG−ヘパリン−ゲル（Modular StarPEG-Heparin-Gels with Bifunctional Peptide Linkers）」、MACROMOLECULAR RAPID COMMUNICATIONS, Vol. 31, No. 17, 16 August 2010(2010-08-16), 1529-1533頁; Seal B. L.らの文献:「酵素感受性共有結合性架橋によって安定化された物理的マトリックス（Physical matrices stabilized by enzymatically sensitive covalent crosslinks）」、ACTA BIOMATERIALIA, Vol. 2, No. 3, 1 May 2006(2006-05-01), 241-251頁; Alison B. Prattらの文献:「インサイチュ組織工学のための合成細胞外マトリックス（Synthetic extracellular matrices for in situ tissue engineering）」、BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, Vol. 86, No. 1, 12 February 2004(2004-02-12), 27-36頁; Brandon I. Sealらの文献:「ペプチド及び多糖間の親和性相互作用に基づく物理的ポリマーマトリックス（Physical Polymer Matrices Based on Affinity Interactions between Peptides and Polysaccharides）」、BIOMACROMOLECULES, Vol. 4, No. 6, 1 November 2003(2003-11-01), 1572-1582頁; Freudenberg U.らの文献:「神経変性疾患の細胞置換療法を支援するスターPEGヘパリンハイドロゲルプラットフォーム（A star-PEG-heparin hydrogel platform to aid cell replacement therapies for neurodegenerative diseases）」、BIOMATERIALS, Vol. 30, No. 28, October 2009(2009-10), 5049-5060頁; Nie T.らの文献:「細胞応答を調節するためのヘパリン含有ハイドロゲルの製造（Production of heparin containing hydrogels for modulating cell responses）」、ACTA BIOMATERIALIA, Vol. 5, No. 3, March 2009(2009-03), 865-875頁; Benoitらの文献:「三次元ヒト間葉系幹細胞の骨形成分化に対するヘパリン官能化PEGハイドロゲルの効果（The effect of heparin-functionalized PEG hydrogels on three-dimensional human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation）」、BIOMATERIALS, Vol. 28, No. 1, 1 January 2007(2007-01-01), 66-77頁; Brandon L. Sealらの文献: 「環境感受性生体模倣ポリマーマトリックスの粘弾性挙動（Viscoelastic Behavior of Environmentally Sensitive Biomimetic Polymer Matrices）」、MACROMOLECULES, Vol. 39, No. 6, 23 February 2006(2006-02-23), 2268-2274頁)から、既に公知である。
【０００６】
しかし、上記で論じられている従来のヘパリン含有ハイドロゲルは、嵩高く、その調製に大量の、したがって高価な原材料を必要とし、かつ、適合させた細胞培養応用のための生体材料の開発を可能にする生体機能的ペプチドを含有させることが困難である。したがって、上記で論じられている従来の嵩高いハイドロゲルは、細胞外マトリックスを必ずしも常に正しく模倣するものではなく、したがって、バイオメディカル応用におけるそれらの用途に関して欠点を有する。
【０００７】
これに対し、バイオマトリックス層に基づくコンビナトリアルスクリーニングは、適合させた細胞培養応用のための生体材料を開発するための有望な戦略を提示する。異なる生化学的手がかりを取り込むライブラリーは探求されてきたが、細胞外マトリックスの適切な生化学的、物理的及び構造的特徴を同時に再現することがほとんどできていない。
【発明の概要】
【０００８】
（発明の簡単な説明）
従来のハイドロゲルの障害と不利益を克服するために、調整可能な3D構造及び形態学を有し、かつ、特異的細胞タイプの選択的な培養のための調整可能な表面を有するバイオマトリックス層、バイオメディカルデバイスなどのコーティングを提供することが、本発明の目的である。このバイオマトリックス層は、安定で、製造が容易で安価であり、かつ、このバイオマトリックス層の成分は、適合させた細胞培養応用のための生体材料を開発するためのコンビナトリアルスクリーニングを可能にするであろう。
【０００９】
この目的は、請求項1記載のバイオマトリックス層を提供することによって解決される。
【００１０】
本発明のバイオマトリックス層は、液液相分離(コアセルベーション)及びグリコサミノグリカン-ペプチド相互作用に基づく非共有結合性システムを表し、バイオマトリックスフィルムのライブラリーを生成することができる。グリコサミノグリカン、特に硫酸化グリコサミノグリカンは、式(I)のR1によって表される生体機能的ペプチドと一緒にされる。これらのビルディングブロックはコンビナトリアルに組み立てられ、得られる3Dバイオマトリックスの生化学的組成、機械的特性、及び形態学に影響を与える。
【００１１】
適合された生体材料のためのスクリーニングは、本発明のバイオマトリックス層を使用して実施することができる。特異的細胞株及び／又は細胞タイプの接着は、NCP、特にGAGのタイプと、生体機能的ペプチドの濃度とに依存し、細胞は増殖及び分化についてのポテンシャルを保持する。したがって、本発明は、細胞外マトリックスを正しく模倣し、したがってバイオメディカル応用における使用に関して有利なバイオマトリックス層を提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、コンビナトリアルライブラリーのビルディングブロックを含むキットであって、適合された生体材料のためのスクリーニングを可能にするキットを提供する。
【００１３】
簡素な段階的ピペッティングにより、異なる細胞の隔離された共培養のためのサンドイッチ構造の創造が可能になった。この非共有結合性システムは、したがって、単層又は多層化細胞培養モデルについて組織特異的細胞外マトリックス模倣物をスクリーニングするための理想的なツールである。
【００１４】
一つの実施態様において、本発明のバイオマトリックス層を調製するプロセスが提供される。
【００１５】
さらなる実施態様において、本発明は、バイオマトリックス層の3D構造及び形態学、特に厚さ、堅さ及び多孔度を調整する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
（図面の簡単な説明）
本発明の具体的な実施態様は、付随する図面への参照と共に、実施例において説明される。
【００１７】
【図１】図1は、異なる薄層形成方法についての模式図を示す。従来のハイドロゲルプロトコール：高濃度(mM)の構成成分を混合し、得られる混合物を細胞培養培地又はバッファー溶液中でピペッティングし、コヒーレントなハイドロゲルフィルムを形成する。バイオマトリックス層プロトコール：低濃度(μM)の構成成分を混合し、溶液中に液滴を生じ、それが次に重力によって底に沈んで、その組成に応じて多孔質又はコヒーレントなハイドロゲルフィルムを形成する。使用した略号：PEG：ポリ（エチレングリコール）、GAG：グリコサミノグリカン。
【００１８】
【図２】図2は、バイオマトリックス層形成を示す。A)バイオマトリックス組成の模式図。B)従来のハイドロゲルプロトコール：相分離は、PEG及びKA7を含む2.5 mM ローダミン標識ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート及び2.5 mM 14 kDa 溶液の新鮮な混合物をPBS中にピペッティングすることによって起こる。C〜D)バイオマトリックス層プロトコール：薄層は、PEG及びKA7溶液を含む50μMローダミン標識ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート及び50μM(C)又は10μM(D)の14 kDaヘパリンを等比で混合することによって形成された。E)PEG、RGDSP及びKA7を含む50μMペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートを50μM 14 kDaヘパリンと等比で混合し(各々最終濃度25μM)、37℃でインキュベートすることによるハイドロゲル薄層形成の経時変化。F)PEG、RGDSP及びKA7を含む50μMペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートを50μM 14 kDaヘパリンと等比で(各々最終濃度25μM)混合することによって調製したバイオマトリックス層の透過型電子顕微鏡(TEM)像。G) PEG、RGDSP及びKA7を含む5μMペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートを5μM 14 kDaヘパリンと等比で(各々最終濃度2.5μM)混合することによって調製したバイオマトリックス層のTEM像。
【００１９】
【図３】図3は、バイオマトリックス層の形態学及び機械特性の分析を示す。A)バイオマトリックス層の厚さは、その組成に依存する。層は、PEG及びKA7、又はPEG、RGDSP及びKA7を含む50μMペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートを、異なるモル比で50μMの異なるNCPと混合することによって形成した。標識のために、PEG-CWGG-KA7-Rhoを含有する10％ ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートを使用した。他のNCPについては、14 kDa ヘパリンと同じ重量／容量を使用した。B) AFMを使用したバイオマトリックス層のヤング率の測定。層は、1:1のPEG-ペプチド-コンジュゲート対NCP比で形成した。マトリゲルをコントロール及びリファレンスとして使用した。実験は、それぞれ３連で２日の異なる日に実施した。エラーバーは標準偏差を示す（n=6）。
【００２０】
【図４】図4は、バイオマトリックス層上への初代ヒト間葉系間質細胞(MSC)接着の分析結果を示す。層は、PEG及びKA7を含む50μMペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート(PEG、RGDSP及びKA7を含む異なるパーセンテージのペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートを有する)を、50μM 14 kDa ヘパリン、又は他のNCPについては同じ重量／容量と、等比で混合することによって形成した。コントロール表面は、フィブロネクチンでコーティングした。一晩のインキュベーションの後、細胞をファロイジンCF633(アクチン)及びDAPI(核)で染色し、蛍光像を取得して定量した。A)異なるバイオマトリックス層上及びフィブロネクチンコーティング上で培養したMSCの像(核は白、アクチンは灰色)。B)細胞カウント、及びC)細胞面積は、フィブロネクチンコーティングと比較して、異なるバイオマトリックス層上で培養したMSCについて分析した。１ウェル当たり1,250個のMSCを播種した。実験は、各々３連で異なる２日に実施した。スケールバーは100μmである。エラーバーは標準偏差を示す(n=6)。
【００２１】
【図５】図5は、バイオマトリックス層上への、A〜B)初代ヒト臍帯ベール内皮細胞(HUVEC)、及びC〜D)新生児ヒト皮膚線維芽細胞(HDFn)の接着の分析結果を示す。フィブロネクチンコーティングと比較した異なるバイオマトリックス層組成での細胞カウント及び被覆面積の定量を描く。層は、PEG及びKA7を含む50μMペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート(PEG、RGDSP及びKA7を含む異なるパーセンテージのペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートを有する)を、50μM 14 kDaヘパリン、又は他のNCPについては同じ重量／容量と、等比で混合することによって形成した。コントロール表面は、50μg/ml フィブロネクチンでコーティングした。一晩のインキュベーションの後、細胞をファロイジンCF633(アクチン)及びDAPI(核)で染色し、蛍光回転ディスク共焦点顕微鏡を使用して撮影し、定量した。１ウェル当たり2,500個のHDFn又はHUVECを播種した。実験は、各々３連で異なる２日に実施した。スケールバーは100μmである。エラーバーは標準偏差を示す(n=6)。
【００２２】
【図６】図6は、ラミニンコーティングと比較した、バイオマトリックス層上での初代マウスニューロン前駆細胞(NPC)接着及び増殖の分析結果を示す。A)層は、PEG、RGDSP及びKA7を含む50μMペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートを、50μMの異なるGAGと等比で混合することによって形成した。14 kDa ヘパリン、及びその他のNCPについては同重量を使用した。B)層は、PEG、RGDSP及びKA7を含む5μMペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートを5μMの異なるNCPと混合することによって形成した。14 kDaヘパリン、及び他のNCPについては同重量を使用した。A及びB)2,500個の細胞をフィルム上に播種し、2日間インキュベートした後、増殖についてはEdU、及び細胞数についてはHoechst33342を用いて染色した。すべての実験は、各々３連で２日の異なる日に実施した。エラーバーは標準偏差を示す(n=6)。
【００２３】
【図７】図7は、ラミニンコーティングと比較した、バイオマトリックス層上での初代マウスニューロン前駆細胞(NPC)分化の分析結果を示す。層は、PEG、RGDSP及びKA7を含む5μMペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートを5μMの異なるNCPと等比で混合することによって形成した。14 kDaヘパリン、及びその他のNCPについては同重量を使用した。A)異なるGAG及びラミニンを用いたバイオマトリックス層上での6日間の培養後のニューロン(Map2ab)及び星状細胞(GFAP)分化細胞の蛍光像。核は、Hoechst33342ブルーで染色した。B) ラミニンに対して正規化したMAP2ab陽性細胞の率の分析。C)ラミニンに対して正規化したGFAP陽性細胞の密度の分析。すべての実験は、各々３連で異なる２日に実施した。エラーバーは標準偏差を示す(n=6)。スケールバーは50μmである。アステリスクは、統計学的有意性、***: P≦0.01を示す。
【００２４】
【図８】図8は、異なる細胞タイプのレイヤー・バイ・レイヤー（layer-by-layer；交互）共培養の結果を示す。ボトム層は、PEG、RGDSP及びKA7を含む5μM ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートを0.7 mg/ml コンドロイチン硫酸Aと混合することによってPBS(pH 7.4)中で形成した。一晩のインキュベーションの後、5,000個のHDFnを播種し、一晩インキュベートした。第二のバイオマトリックス層として、新たに混合した、HDFn 細胞培養培地中の、PEG、RGDSP及びKA7を含む2.5 mM ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート及び3.5 mM 14kDa ヘパリン(合計5 μl)をトップにピペッティングした。2,500個のMSCを次にトップ層として播種した。細胞は、ファロイジンCF633(アクチン)で染色し、蛍光回転ディスク共焦点顕微鏡を使用して撮影した。A)レイヤー・バイ・レイヤー共培養形成の模式図。B)レイヤー・バイ・レイヤーアセンブリーのZスタック（Z-stack）及び側面観。C)トップ層上のMSCの最大投影。D)ボトム層上のHDFnの最大投影。スケールバーは1 mmである。
【００２５】
【図９】図9は、6種の異なるNCPをコンビナトリアルペプチドライブラリーの成分と一緒にすることによるバイオマトリックスキットのアセンブリーの例を示す。キットは、本発明のバイオマトリックス層の理想的な組成をスクリーニングするために使用することができる。
【００２６】
【図１０】図10は、NCPを添加した場合の、異なるNCPとのペプチド-PEGコンジュゲートのコアセルベーションを示す測定された光散乱を示す。
【００２７】
【図１１】図11は、異なるR1ペプチドを含む、ヘパリンとのPEG-R1 コンジュゲートのコアセルベーションを示す測定された光散乱を示す。図の凡例の数字は、試験したPEG-R1 コンジュゲートに含まれる異なるR1ペプチドの配列番号を表す。PEG、R1及びKA7を含むペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート及びヘパリンの混合物を含有する溶液の光散乱能力は、PerkinElmer LS45 蛍光分光光度計で、500 nmで1200秒間、測定した。ヘパリンは、PEG、R1及びKA7を含むペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの溶液に、構成成分の各々について最終濃度5μMになるよう添加した。ベースラインは、PBSバッファー、又はPEG及びKA7を含む5μM ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート溶液を使用して当初観察し、三角でマークした。ヘパリン溶液は、定まったベースラインが観察された後、150秒で添加した。光の散乱は、瞬時に増大し、コアセルベーションの結果としての濁度を示した。すべての測定は、NCPについての代表としてのヘパリンと、試験したPEG、R1及びKA7を含むペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの相互作用を示す。
【００２８】
【図１２】図12は、10％FBS含有標準培地及び無血清培地中で増殖させた初代ヒト間葉系間質細胞(MSC)の分析の結果を示す。
【００２９】
【図１３】図13は、10％FBS含有標準培地及び無血清培地中で増殖させた初代ヒト間葉系間質細胞(MSC)の分析の結果を示す。(A) MSCは、3日間培養で保持した後、固定し、Hoechst 及びCellMaskGreenで染色した。表面は、PEG、RGDSP及びKA7を含む2.5μM ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート(配列番号17のR1ペプチドを含む)とR1配列なしの2.5μM PEG-CWGG-KA7、又はPEG、RGDSP及びKA7を含む2.5μM ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートとPEG、
【化１】
2020524004.tif 000003
及びKA7を含む2.5μM ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート(配列番号348のR1ペプチドを含む)、のいずれかを、5μM デキストラン硫酸(DS)と混合することによってコーティングし、バイオマトリックス層を形成した。プレーンのプラスチックを比較のために使用した。スケールバーは100μmである。培養の1日後及び3日後に固定した細胞の蛍光像から誘導した細胞カウントを、倍加時間(Td)を算出するために使用した。(B)血清含有培地中でプラスチックと比較した、バイオマトリックスコーティング上で培養したMSCについてのTd。(C)無血清培地中でプラスチックと比較した、バイオマトリックスコーティング上で培養したMSCについてのTd。データは、2回の独立した実験からの平均±SDを表す。値間の差は、t-テストで分析し、p-値を図に示す(n.s.は有意差なし)。
【００３０】
【図１４】図14は、培養の5継代後の、ヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)のフローサイトメトリーによる幹細胞性マーカー発現の分析の結果を示す。iPSCは、A〜C) PEG、
【化２】
2020524004.tif 000004
及びKA7を含む2.5μM ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート(配列番号241のR1ペプチドを含む)及びPEG、
【化３】
2020524004.tif 000005
及びKA7を含む2.5μM ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート(配列番号336のR1ペプチドを含む)との、5μM ヘパリンの混合物から構成されるバイオマトリックス層上で増殖させた。D〜F) 9 μg/mLマトリゲル（登録商標）溶液から調製されたコーティングを比較のために使用した。A)及びD)は、位相差像(10×)を表す。B、C、E、F)は、分析した幹細胞性マーカー、TRA1-60及びSSEA4、又はSox2及びOct4の蛍光シグナル強度のヒストグラム及び等高線図を表す。スケールバーは100μmである。
【００３１】
【図１５】図15は、5日間の培養後の、ヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)から由来する神経前駆細胞(NPC)の免疫細胞化学による幹細胞性マーカーの発現の分析の結果を示す。A) NPCは、2.5μM
【化４】
2020524004.tif 000006
及び2.5μM
【化５】
2020524004.tif 000007
との、5μM ヘパリンの混合物から構成されるバイオマトリックス層上で増殖させた。9 μg/mLマトリゲル（登録商標）溶液から調製されたコーティングを比較のために使用した。細胞は、4％ PFAで固定し、Hoechst33342で染色し、Sox1及びPax6を蛍光像として提示した。B)Pax6及びSox1陽性細胞の細胞数は、総細胞カウントに関して設定した。スケールバーは100μmである。
【００３２】
【図１６】図16は、抗Tuj1抗体での免疫細胞化学染色によって示される、ニューロンへの分化の10日後の、ヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)から由来する神経前駆細胞(NPC)の蛍光像を示す。NPCは、最初に、表2に与えられるペプチドライブラリーの単一又は2種の異なるペプチド配列を含む、PEG、R1及びKA7を含む5μM のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートとの、5μM デルマタン硫酸の混合物から構成されるバイオマトリックス層上で増殖させた。増殖の2日後、培地を、パターニング培地に6日間変更し、その後、成熟培地に4日間変更した。細胞は、4％ PFAで固定し、蛍光像によって提示されるように抗Tuj1抗体について染色した。示した5つの像は、ニューロンの伸長を促進した機能的なR1配列を表す。スケールバーは100μmである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、以下のものを含む、本質的に以下のものからなる、又は以下のものからなる、バイオマトリックス層を提供する：
・  0.1μM〜1,000μMの範囲の濃度の負に荷電したポリマー(NCP)；及び
・  式(I)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート:
PEG−CW−スペーサー−R1−スペーサー−(BX)n      (I);
【００３４】
（式中、
−  前記スペーサーは、存在しないか、又はジペプチド、トリペプチドもしくはテトラペプチドであり、ここで、前記ジペプチド、トリペプチドもしくはテトラペプチドは、グリシン、アミノプロパン酸、アミノ酪酸、アミノペンタン酸、アミノヘキサン酸、アミノヘプタン酸、アミノオクタン酸及び3-アミノアクリル酸、又はそれらの組み合わせからなり、前記スペーサーは、好ましくはジペプチドであり、最も好ましくはジペプチドGGであり；
−  CWは、存在しないか、又はアミノ酸、システイン及びトリプトファンからなるジペプチドであり；
−  Bは、リジン又はアルギニンであり、Xは、アラニン、セリン、スレオニン、チロシン、又はアスパラギン酸から選択され、nは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及び20から選択される整数であり；
−  R1は、生体機能的ペプチドを表し、存在しなくてもよく、又は5〜30個のアミノ酸を含むペプチドであり；
−  PEGは、0.1μM〜1,000μMの範囲の濃度で含まれており；
−  R1は、存在する場合、0.1μM〜4,000μMの範囲の濃度で含まれており；及び
−  (BX)nは、0.4μM〜4,000μMの範囲の濃度で含まれる。）。
【００３５】
本発明は、一つの実施態様において、以下のものを含む、本質的に以下のものからなる、又は以下のものからなる、バイオマトリックス層を提供する：
・  0.1μM〜1,000μMの範囲の濃度の負に荷電したポリマー(NCP);及び
・  式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート:
PEG-R1-(BX)n      (Ia)
【００３６】
（式中、
−  Bは、リジン又はアルギニンであり、Xは、アラニン、セリン、スレオニン、チロシン、又はアスパラギン酸から選択され、nは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及び20から選択される整数であり； 
−  R1は、生体機能的ペプチドを表し、存在しなくてもよく、又は5〜30個のアミノ酸を含むペプチドであり；
−  PEGは、0.1μM〜1,000μMの範囲の濃度で含まれており；
−  R1は、存在する場合、0.1μM〜4,000μMの範囲の濃度で含まれており；及び
−  (BX)nは、0.4μM〜4,000μMの範囲の濃度で含まれる。）。
【００３７】
一つの実施態様において、本発明は、以下のものを含む、本質的に以下のものからなる、又は以下のものからなる、バイオマトリックス層を提供する：
・  0.1μM〜250μMの範囲の濃度の負に荷電したポリマー(NCP);及び
・  式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート:
PEG-R1-(BX)n      (Ia)
【００３８】
（式中、
−  Bは、リジン又はアルギニンであり、Xは、アラニン、セリン、スレオニン、チロシン、又はアスパラギン酸から選択され、nは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及び20から選択される整数であり；
−  R1は、生体機能的ペプチドを表し、存在しなくてもよく、又は5〜30個のアミノ酸を含むペプチドであり；
−  PEGは、0.1μM〜250μMの範囲の濃度で含まれており;
−  R1は、存在する場合、0.1μM〜1,000μMの範囲の濃度で含まれており;及び
−  (BX)nは、0.4μM〜1,000μMの範囲の濃度で含まれる。）。
【００３９】
したがって、さらなる好ましい実施態様において、本発明は、以下のものを含む、本質的に以下のものからなる、又は以下のものからなる、バイオマトリックス層を提供する：
・  900μM〜1,000μMの範囲の濃度の負に荷電したポリマー(NCP);及び
・  式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート:
PEG-R1-(BX)n      (Ia)
【００４０】
（式中、
−  Bは、リジン又はアルギニンであり、Xは、アラニン、セリン、スレオニン、チロシン、又はアスパラギン酸から選択され、nは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及び20から選択される整数であり；
−  R1は、生体機能的ペプチドを表し、存在しなくてもよく、又は5〜30個のアミノ酸を含むペプチドであり；
−  PEGは、900μM〜1,000μMの範囲の濃度で含まれており;
−  R1は、存在する場合、3,500μM〜4,000μMの範囲の濃度で含まれており;及び
−  (BX)nは、3,500μM〜4,000μMの範囲の濃度で含まれる。）。
【００４１】
バイオマトリックス層の構成成分のこれらの濃度は、例えば、PBSバッファー中に2.5μM〜7.5μMの範囲、好ましくは5μMの構成成分を含む個別のストック溶液を使用して本発明のバイオマトリックス層を調製した場合に達成される。コアセルベーションは、本明細書におけるすべての実施態様について一般的に記載されるように起こり、本発明のバイオマトリックス層が形成され、ここで、これらの構成成分は、PBSバッファー上清と比較して上記の範囲に濃縮される。
【００４２】
本発明者らは、驚くべきことに、いまだ液体のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート及びNCPのビルディングブロックをバッファー又は細胞培養培地中にピペッティングする場合、液液相分離(コアセルベーション)が観察されることを見出した。さらに、この二つのバイオマトリックス構成成分を、50μM以下の濃度(混合前のNCP及びペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートのステム溶液における濃度)で、すなわち従来の嵩高いハイドロゲルを形成するために使用されるものよりもはるかに低い濃度で混合することによって、この液液相分離は、コアセルベート液滴の形成をもたらした。これらの液滴は、非共有結合性ゲル化を行い、ウェルプレートの底上に薄いフィルムを形成した。
【００４３】
本発明のバイオマトリックス層を形成するために、バイオマトリックス層の構造的骨格を形成するポリマーネットワークが必要とされる。
【００４４】
一般に、ポリマーネットワークは、任意のポリマーネットワークであってよい。好ましくは、ポリマーネットワークは、自己アセンブリーすることができる。自己アセンブリーすることができるポリマーネットワークは、容易に製造され、バイオマトリックスビルディングブロックの均一な分布を保証し、薄層ポリマーを形成するための付加的なステップを必要としない。
【００４５】
好ましい実施態様において、ポリマーネットワークはバイオマトリックスである。いくつかの実施態様において、バイオマトリックスは、ポリマー構成要素の各々が生じるバイオマトリックスに付与する特性の利点を得るために、２以上のポリマー構成要素を含んでいてもよい。
【００４６】
ポリマーネットワークを提供するためのバイオマトリックスの形成に好適なポリマーの非限定的な例としては、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリエチレングリコール、ポリ(アクリル酸)及びその誘導体；ポリ(エチレンオキサイド)及びそのコポリマー、ポリホスファゼン、シリコーン、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリウレタン及びその誘導体；又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００４７】
より好ましい実施態様において、本発明のバイオマトリックス層を形成するのに好適なポリマーは、ポリエチレングリコール(PEG)である。
【００４８】
PEGは、エチレンオキサイドモノマーから構成されるオリゴマー又はポリマーである。異なる応用は異なるポリマー鎖長を必要とするので、PEGは、エチレンオキサイドの重合によって調製され、300 g/mol〜10,000,000 g/molの分子量の広い範囲にわたって商業的に入手可能である。異なる分子量を有するPEGは異なる応用において用途を見出し、鎖長の効果のため異なる物理的特性（例えば粘度)を有する一方、それらの化学的特性はほとんど同一である。重合プロセスのために使用されるイニシエーターに応じて、異なる形態のPEGもまた入手可能であり、最も普遍的なイニシエーターは、単官能性メチルエーテルPEG、又はメトキシポリ（エチレングリコール）、略称mPEGである。より低分子量のPEGもまた、より純粋なオリゴマーとして入手可能であり、単分散、均一、又は離散と呼ばれる。
【００４９】
PEGはまた、異なる幾何学で入手可能である：
・  直鎖状PEG、ここでは、エチレンオキサイドモノマーが、分岐していないポリマー鎖に互いに結合している；
・  分枝状PEG、これは中央のコア基から放射状に伸びる3〜10本のPEG鎖を有する；
・  星状PEG、これは中央のコア基から放射状に伸びる10〜100本のPEG鎖を有する；及び
・  櫛状PEG、これは通常はポリマー骨格上に移植された複数のPEG鎖を有する。
【００５０】
PEGの名前にしばしば含まれる数字は、その平均分子量を示す(例えば、n＝9を有するPEGは、およそ400ダルトンの平均分子量を有するであろうし、PEG400と標識されるであろう)。ほとんどのPEGは、分子量の分布を有する分子を含有する(すなわち、それらは多分散である)。サイズ分布は、その重量平均分子量(Mw)及びその数平均分子量(Mn)によって統計学的に特徴づけることができ、その比は、多分散性指数(Mw/Mn)と呼ばれる。Mw及びMnは、質量分析法によって測定することができる。
【００５１】
PEGは、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、ベンゼン、及びジクロロメタンに可溶性であり、かつ、ジエチルエーテル及びヘキサンに不溶性である。
【００５２】
別の実施態様において、本発明のバイオマトリックス層は、直鎖状PEGを含む。直鎖状PEGを使用することは、直鎖状PEGはより安価であり、より狭い分子量分布を有するという利点を有する。さらに、二つのペプチドが結合した直鎖状PEG鎖を一つのみのペプチドを有するものから分離することは、4ペプチドを含む4腕starPEGをより修飾の程度が低い星状PEGの混合物から精製することと比較して、より容易であることができる。
【００５３】
しかし、本発明のバイオマトリックス層を調製するためにより好適なのは、starPEGを使用することである。好適には、前記starPEGは、4 kD〜40 kDの範囲、好ましくは4 kD〜30 kDの範囲、より好ましくは4 kD〜20 kDの範囲、最も好ましくは5 kD〜15 kDの範囲の分子量を有する。さらに最も好ましくは、前記starPEGは、4腕starPEGであり、それは最も好適には、10kDの分子量を有する。
【００５４】
本発明のさらなる実施態様において、本発明のバイオマトリックス層に含まれるPEGは、starPEG及び直鎖状PEGの混合物であってもよい。
【００５５】
直鎖状PEGが本発明のバイオマトリックス層に含まれる場合、それは、好適には、 1 kD〜100 kDの範囲、好ましくは2 kD〜80 kD、3 kD〜60 kD、4 kD〜40 kDの範囲、最も好ましくは5 kD〜20 kDの範囲の分子量を有する。さらに、最も好ましくは、本発明のバイオマトリックス層に含まれる直鎖状PEGは、5 kD、10 kD、15 kD及び20 kDから選択される分子量を有する。
【００５６】
前記混合物中のstarPEG：直鎖状PEGの比は、例えば1:1であってもよいが、製造すべきバイオマトリックス層の所望の特徴にしたがって、任意の比に調整することができる。
【００５７】
さらなる好ましい実施態様において、本発明のバイオマトリックス層を調製するために使用されるPEGは、官能化される。「官能化する」は、官能基又は部分の付着をもたらすようにして分子を修飾することを意味する。例えば、分子は、その分子を強力な求核剤又はコンジュゲート化された不飽和にする分子の導入によって官能化してもよい。好ましくは、分子、例えば、PEGは、官能化されて、チオール、アミン、アクリレート、アジド、アルキン、又はキノンになる。より好ましくは、本発明のバイオマトリックス層の調製における使用のために、PEGは、マレイミド官能化され、カルボン酸官能化され、アミノ官能化され、アジド官能化され、又はアルキン官能化される。このタイプの官能化は、PEGを式(I)のオリゴペプチドにコンジュゲート化するために必要とされる。したがって、最も好ましい実施態様において、starPEG、特に4腕PEG、及び／又は直鎖状PEGは、マレイミド、カルボン酸又はアミノ基で官能化される。
【００５８】
ポリマー-ペプチド-コンジュゲートの使用は、自己編成特性を呈するハイドロゲルの形成をもたらすことが示されていた(WO 2014040591 A2)。したがって、好ましい実施態様において、本発明のバイオマトリックス層は、オリゴペプチド及びポリエチレングリコール(PEG)のコンジュゲート、例えば、4腕starPEG及びオリゴペプチド、又は直鎖状PEG及びオリゴペプチドのコンジュゲートを含む。
【００５９】
好ましい実施態様において、本発明のバイオマトリックス層は、上記のとおりの式(I)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートのコンジュゲートを含む。
【００６０】
PEG-オリゴペプチドコンジュゲートは、好適には、直鎖状又は4腕starPEGにカップリングされている一つ、二つ又はそれ以上のオリゴペプチドを含む。
【００６１】
nは、好ましくは、5、6、7、8、9、10及び11から選択される整数である。より好ましくは、nは、5、6、7、8及び9から選択される整数である。最も好ましくは、nは、5及び7である。
【００６２】
好ましい実施態様において、Bは、リジンである。さらなる好ましい実施態様において、Bは、アルギニンである。
【００６３】
好ましい実施態様において、Xは、アラニン又はセリンである。最も好ましい実施態様において、Xは、アラニンである。さらなる最も好ましい実施態様において、Xは、セリンである。
【００６４】
本発明のペプチドにおいて、各アミノ酸残基は、以下の従来のリストにしたがって、アミノ酸の自明な名前に相当する1文字表記又は３文字表記によって表される。
【００６５】
【表１】
2020524004.tif 000008
【００６６】
(BX)nは、好ましくは、KA11、KA9、KA7、KA6、KA5、KS7、KS6、KS5、RA7、RA6、RA5、RS7、RS6、及びRS5から選択される。最も好ましくは、(BX)nは、以下のものから選択される：KA7、KA6、KA5、KS7、KS6及びKS5。それぞれのペプチド配列は、以下の表１に示されている。
【００６７】
表1：(BX)nの好ましいペプチド配列
【表２】
2020524004.tif 000009
【００６８】
本発明のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートは、本発明のさらなる実施態様において、生体機能的ペプチドR1を含む。この生体機能的ペプチドは、種々の機能を有する：好ましい態様において、生体機能的ペプチドは、バイオポリマーの提供をもたらす本発明のバイオマトリックス層への細胞の付着を改良するために使用される。本発明のなおさらなる態様において、生体機能的ペプチドは、インビボでのプロテアーゼ又は細胞によるこのようなバイオポリマーのタンパク分解を推進するために使用することができる。それは、さらに、可溶性シグナル伝達タンパク質、例えば成長因子などのシグナル伝達機能を、再現する。
【００６９】
本発明の好ましい実施態様において、R1は、5〜30個のアミノ酸を含有する。本発明のより好ましい実施態様において、R1は、5〜15個のアミノ酸を含有する。
【００７０】
本発明のバイオマトリックス層の一つの特別な特徴は、多様な生理活性ペプチドを、得られる生体材料構造中に取り込ませることができることである。例えば、生体機能的ペプチドは、組織を通って移動し組織をリモデリングする細胞によって使用される酵素の基質となるように(例えば、プラスミン、エラスターゼ、又はコラゲナーゼのようなマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)のための基質として)設計することができる。バイオマトリックス層の分解特徴は、生体機能的ペプチドの配列を変更することによって操作することができる。コラゲナーゼによって分解可能であるがプラスミンによって分解されない、又はプラスミンによって分解可能であるがコラゲナーゼによって分解されない、バイオマトリックス層ゲルを作製してもよい。そのうえ、バイオマトリックス層ゲルを、酵素反応のKmもしくはkcat、又はその両方が変更されるようにそのアミノ酸配列を単に変化させることによって、そのような酵素に応答してより速く又はより遅く分解するようにすることが可能である。したがって、細胞の通常のリモデリング特徴によってリモデリングされることができるという点で生体模倣型の生体材料を作製することができる。
【００７１】
付着部位
しかし、本発明にしたがって最も好ましいのは、細胞付着のための、R1によって表される生体機能的ペプチド、具体的には本発明のバイオマトリックス層中又は上への、細胞の表面の付着促進性受容体に結合するペプチドの取り込みである。フィブロネクチン由来のRGD(配列番号15)配列又は
【化６】
2020524004.tif 000010
配列のような、多様なこのような付着促進性ペプチドを取り込むことは平易である。RGDペプチド(配列番号15)は、細胞表面受容体インテグリンに対するフィブロネクチンの結合モチーフである。RGDS配列(配列番号16)は、当初、フィブロネクチンに対するラット腎臓線維芽細胞の接着を促進することが見出された。遊離RGDSペプチド(配列番号16)は、フィブロネクチンでコーティングされた基材に対する細胞の接着を阻害する。RGDS配列(配列番号16)はまた、感染性因子(トレポネーマの梅毒、マイコバクテリウムの結核)の標的でもある。
【化７】
2020524004.tif 000011
はまた、インタクトな赤血球のフィブリノーゲン誘導性凝集及び赤血球膜に対するフィブリノーゲンの特異的結合を遮断することができる。
【００７２】
さらなる好ましい実施態様において、生体機能的ペプチドR1の配列は、本明細書に添付する配列表に開示された配列番号15〜353の配列からなる群から選択される。これらの配列は、ECM及びシグナルペプチドを模倣するオリゴペプチド配列を含む。
【００７３】
より好ましくは、生体機能的ペプチドR1の配列は、本明細書に添付する配列表に開示された配列番号15、16、17、22、26、27、30、31、32、41、43、44、45、46、49、51、54、57、64、66、67、68、78、80、84、85、90、93、99、108、120、124、131、144、145、154、156、160、171、172、175、177、180、183、185、187、188、189、190、192、200、201、211、219、222、224、230、233、236、237、238、239、241、243、246、257、259、260、262、263、264、265、277、278、279、283、299、302、315、320、321、323、333、342、345及び348の配列からなる群から選択される。これらの配列は、付着及び成長因子ミメティックを含む。
【００７４】
最も好ましくは、生体機能的ペプチドR1の配列は、本明細書に添付する配列表に開示された配列番号17、30、32、46、49、57、63、67、77、93、130、145、155、159、187、218、233、237、240、242、245、259、264、276、282、319、320、341、345及び347の配列からなる群から選択される。これらの配列は、本発明のバイオマトリックス層における使用について特に興味の対象であるシグナルペプチドの配列及び付着ペプチドのコア配列を含む。
【００７５】
本発明の特に好ましい実施態様において、R1は、
【化８】
2020524004.tif 000012
である。
【００７６】
本発明の一つの実施態様において、生体機能的ペプチドR1は、存在しなくてもよく、式(Ib)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートであってもよい：
PEG-(BX)n          (Ib)
【００７７】
（式中、B、X及びnは、式(I)について定義したとおりである。）。
【００７８】
ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートが、式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート及び式(Ib)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの混合物であった場合に、本発明のバイオマトリックス層の製造に関して非常に良好な結果が達成された。したがって、最も好ましい実施態様において、本発明は、式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート及び式(Ib)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの混合物を含むバイオマトリックス層を提供する。この混合物において、位置R1に異なる生体機能的ペプチドを含有する、式(Ia)にしたがった３種までの異なるコンジュゲートを含有させることができる。
【００７９】
前記混合物中での前記式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの比率は、整調でき、前記混合物中での前記式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの比率のチューニングは、細胞ロード、すなわち、細胞でのバイオマトリックス層の表面カバー度を制御するために使用することができる。好適には、前記混合物中での式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの比率は、0〜100 mol％の範囲内であり、好適には、0.1〜99.9 mol％の範囲内である。0 mol％の前記式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの比率は、式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートが存在せず、式(Ib)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートのみが存在することを意味する。100 mol％の前記式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの比率は、式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートのみが存在し、式(Ib)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートが存在しないことを意味する。好ましい実施態様において、前記混合物中での式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの比率は、1〜99 mol％、又は10〜95 mol％、より好ましくは、10〜90 mol％、20〜70 mol％、又は25〜55 mol％の範囲内である。
【００８０】
より好ましい実施態様において、前記混合物中での式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの比率は、25 mol％である。例えば、MSCについて、ヘパリンをNCPとして使用した場合、25 mol％の式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートは、バイオマトリックスフィルム上の細胞数の顕著な増大をもたらした。ヘパリンハイドロゲルへの最良の付着及び展開は、100 mol％ starPEG-RGDSPを用いて達成された。表面カバー度は、式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの比率の増大に伴って次第に増大した。驚くべきことに、MSCについての最高の表面カバー度の一つは、NCPとしてコンドロイチン硫酸を含むバイオマトリックス層上で達成され、50 mol％の式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの比率が使用された(実施例を参照されたい)。したがって、さらなる最も好ましい実施態様において、式(Ib)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートとの混合物中での式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの比率は、50 mol％である。
【００８１】
好適には、生体機能的ペプチドR1は、短いペプチド配列によってPEG及び(BX)nビルディングブロックに連結されている。したがって、式(I)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートは、好ましくは、式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートである：
PEG-CWGG-R1-GG-(BX)n        (II)
【００８２】
（式中、B、X、n及びR1は、式(I)について定義したとおりである。）。
【００８３】
また、式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートにおいても、R1は存在しないことが可能である。したがって、式(I)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートは、好ましくは、式(IIa)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートである：
PEG-CWGG-(BX)n        (IIa)
【００８４】
（式中、B、X、n及びR1は、式(I)について定義したとおりである。）。
【００８５】
式(I)、(Ia)及び(Ib)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートについて記載したように、最も好ましい実施態様において、本発明は、式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート及び式(IIa)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの混合物を含むバイオマトリックス層を提供する。この混合物において、位置R1に異なる生体機能的ペプチドを含有する、式(II)にしたがった３種までの異なるコンジュゲートを含有させることができる。
【００８６】
好適には、前記混合物中での式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの比率は、0〜100 mol％、好適には0.1〜99.9 mol％の範囲内である。0 mol％の前記式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの比率は、式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートが存在せず、式(IIa)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートのみが存在することを意味する。100 mol％の前記式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの比率は、式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートのみが存在し、式(IIa)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートが存在しないことを意味する。好ましい実施態様において、前記混合物中での式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの比率は、1〜99 mol％、又は10〜95 mol％、より好ましくは、10〜90 mol％、20〜70 mol％、又は25〜55 mol％の範囲内である。最も好ましくは、前記混合物中での式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの比率は、25 mol％である。それより最も好ましくは、式(Ib)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートとの混合物中での式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの比率は、50 mol％である。
【００８７】
式(I)、(Ia)、(II)及び(IIa)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの製造は、例えば、それぞれのペプチドを、マレイミド官能化、カルボン酸官能化、又はアミノ官能化PEGと、コンジュゲート形成を許容する条件下で単に混合することによって行うことができる。例えば、リンカーペプチドのシステイン残基のチオール基は、マイケル型付加反応によってペプチドをマレイミド官能化PEGに連結するために使用することができる。あるいは、アミノ官能化PEGをアジドで修飾するために、得られるポリマーは、クリックケミストリーを通じてアルキン含有ペプチドのコンジュゲート化を可能にするであろう。
【００８８】
本発明の特に好ましい実施態様において、バイオマトリックス層は、上記で定義されたとおりのstarPEG-RGDSP-KA7及び10 kD starPEG-KA7、又はそれらの混合物から選択されるペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートを含み、ここで、starPEGは、分子量10 kDの4腕starPEGであり；又は、上記で定義されたとおりのstarPEG-CWGG-RGDSP-GG-KA7及び10 kD starPEG-CWGG-KA7、又はそれらの混合物から選択されるペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートを含み、ここで、starPEGは、分子量10 kDの4腕starPEGである。
【００８９】
本発明の具体的に好ましい実施態様に相当して、バイオマトリックス層は、付加的に、負に荷電したポリマー(NCP)を含み、これは天然のNCP又は合成NCPであることができる。この実施態様にしたがえば、オリゴ糖/オリゴペプチド/PEG-システムは、オリゴペプチド(CWGG-R1-GG-(BX)n及びCWGG-(BX)nのように、R1-(BX)nによって表される)が化学的にPEGにコンジュゲート化されるところに存在し、ゲル形成は、オリゴペプチド-PEG-コンジュゲート及びNCPを混合することを通じて実行される。非共有結合性巨大分子の自己編成化は、オリゴペプチド-PEG-コンジュゲート及びNCPの相互作用によっても誘導される。PEG及びNCPの選択は、生理活性タンパク質、例えば細胞及び成長因子などと相互作用するペプチドの流動性挙動、ゲル化条件、ゲル化速度、厚さ、堅さ、多孔度、ならびに調整可能な親和性を含む、様々なゲル特性をもたらすことができる。しかし、ゲル特性の可変性は、ペプチド配列モチーフR1-(BX)nの変化を通じても実現され、ここで、本発明のコンセプトにしたがって、相当するバイオマトリックス層は、主としてR1なしでも可能である。このようにして、オリゴペプチド配列の柔軟な設計は、広範な多様なゲル特性をもたらすことができ、上記のレオロジー特性、ゲル化条件、ゲル化速度、厚さ、堅さ、多孔度及びタンパク質結合特性をもたらすだけでなく、例えば、タンパク質分解的加水分解、又は他の酵素活性もしくは光衝撃感受性などの非酵素活性による生物学的分解などの特性をももたらす。
【００９０】
本発明のバイオマトリックス層に含まれるNCPは、典型的には、グリコサミノグリカン(GAG)、硫酸化又はリン酸化された直鎖状ポリマー、及び硫酸化又はリン酸化された環状ポリマーからなる群から選択される。負に荷電したオリゴ糖が好ましい。有利な実施態様によれば、前記負に荷電したオリゴ糖は、硫酸化又はリン酸化されたオリゴ糖であり、好ましくは、ヘパリン、デキストラン硫酸、α-硫酸シクロデキストリン、β-硫酸シクロデキストリン、γ-硫酸シクロデキストリン、α-リン酸シクロデキストリン、β-リン酸シクロデキストリン、γ-リン酸シクロデキストリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、及びケラタン硫酸を含むオリゴ糖の群から選択される。別の有利な実施態様によれば、前記NCPは、ポリスチレン硫酸（PSS）、硫酸化アルギン酸塩、硫酸化ヒアルロン酸、環状デキストラン硫酸、環状デキストランリン酸及びフィチン酸から選択される。
【００９１】
好ましい実施態様において、NCPは、ポリスチレン硫酸（PSS）、硫酸化アルギン酸塩、硫酸化ヒアルロン酸、環状デキストラン硫酸、環状デキストランリン酸及びフィチン酸からなる群から選択される。
【００９２】
より好ましくは、本発明のバイオマトリックス層は、硫酸化グリコサミノグリカン(GAG)であるNCPをさらに含む。GAGは、繰り返し二糖単位からなる長い非分岐多糖である。この繰り返し単位(ケラタンを除く)は、尿酸糖（グルクロン酸又はイズロン酸）又はガラクトースと共に、アミノ糖（N-アセチルグルコサミン又はN-アセチルガラクトサミン）からなる。GAGは、極性が高く、水を引き付ける。
【００９３】
GAGは、分子量、二糖構築、及び硫酸化に関して高度の不均一性を持っている。コア二糖構造に基づいて、GAGは、四つの群に分類される：ヘパリン/ヘパラン硫酸、及びコンドロイチン硫酸/デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、及びヒアルロン酸。
【００９４】
好ましい実施態様において、本発明のバイオマトリックス層は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、デキストラン硫酸、及びヒアルロン酸を含む、本質的にこれらからなる、又はこれらからなる、群から選択されるNCPを含む。
【００９５】
特に好ましい実施態様において、本発明のバイオマトリックス層は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、デキストラン硫酸、及びヒアルロン酸を含む、本質的にこれらからなる、又はこれらからなる、群から選択されるNCPを含む。
【００９６】
本発明の好ましい実施態様において、NCPは、ヘパリンである。ヘパリンは、ブタの腸又はウシの肺組織の粘膜に由来する。ヘパリンは、好ましくは、医薬品質のものである。
【００９７】
さらなる好ましい実施態様において、NCPは、ヘパラン硫酸である。
さらなる好ましい実施態様において、NCPは、コンドロイチン硫酸である。
さらなる好ましい実施態様において、NCPは、デルマタン硫酸である。
さらなる好ましい実施態様において、NCPは、ケラタン硫酸である。
さらなる好ましい実施態様において、NCPは、デキストラン硫酸である。
さらなる好ましい実施態様において、NCPは、ヒアルロン酸又は硫酸化ヒアルロン酸である。
さらなる好ましい実施態様において、NCPは、硫酸化アルギン酸塩である。
さらなる好ましい実施態様において、NCPは、環状デキストラン硫酸である。
さらなる好ましい実施態様において、NCPは、環状デキストランリン酸である。
さらなる好ましい実施態様において、NCPは、フィチン酸である。
【００９８】
ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、デキストラン硫酸、ポリスチレン硫酸（PSS）、硫酸化アルギン酸塩、硫酸化ヒアルロン酸、環状デキストラン硫酸、環状デキストランリン酸又はフィチン酸は、好適には、4 kD〜600 kDの範囲の分子量を有する。医薬品質の、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、デキストラン硫酸、又はヒアルロン酸の使用が好ましい。
【００９９】
本発明のバイオマトリックス層は、従来のハイドロゲルと構造的に異なり、0.1μM〜1,000μMの範囲の低濃度のビルディングブロックを含むストック溶液を使用して形成される。
【０１００】
したがって、PEGは、0.1μM〜250μMの範囲、好ましくは0.1μM〜125μM又は0.1μM〜75μMの範囲、より好ましくは0.1μM〜75μM又は0.1μM〜50μMの濃度でストック溶液に含まれる。最も好ましくは、PEGは、2.5μMの濃度、又は25μMの濃度、又は、それより最も好ましくは、1μM〜10μMの範囲で、ストック溶液に含まれる。好適なストック溶液は、5μM PEGを含む。
【０１０１】
R1は、存在する場合、0.1μM〜1000μMの範囲、好ましくは、0.1μM〜500μM又は0.1μM〜300μMの範囲、より好ましくは、0.1μM〜300μM又は0.1μM〜200μMの濃度でストック溶液に含まれる。最も好ましくは、R1は、10μMの濃度、又は100μMの濃度で含まれる。好適なストック溶液は、5μM R1を含む。
【０１０２】
(BX)nは、0.4μM〜1000μMの範囲、好ましくは、0.4μM〜750μM又は0.4μM〜500μMの範囲、より好ましくは、0.4μM〜250μM又は0.4μM〜100μMの濃度で、ストック溶液に含まれる。最も好ましくは、(BX)nは、10μM又は100μMの濃度で含まれる。好適なストック溶液は、5μM(BX)nを含む。
【０１０３】
NCPは、0.1μM〜250μMの範囲、好ましくは、0.1μM〜125μM又は0.1μM〜75μMの範囲、より好ましくは、0.1μM〜75μM又は0.1μM〜50μMの濃度で含まれる。最も好ましくは、NCPは、0.1μM〜25μMの範囲の濃度で含まれる。好適なストック溶液は、5μM NCPを含む。
【０１０４】
ストック溶液は、任意の好適なバッファー溶液中に調製することができる。ストック溶液を調製するために、本発明にしたがった好ましいものは、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)である。
【０１０５】
ペプチド-ポリエチレングリコール-コンジュゲート及びNCPは、1:100及び100:1の間の範囲、好ましくは、1:90及び90:1の間、1:80及び80:1の間、1:70及び70:1、又は1:60及び60:1、より好ましくは、1:50及び50:1、1:40及び40:1、1:30及び30:1、1:20及び20:1、又は1:10及び10:1、最も好ましくは、1:9及び9:1、1:8及び8:1、1:7及び7:1、1:6及び6:1、1:5及び5:1、1:4及び4:1、1:3及び3:1、1:2及び2:1の間の範囲、特に好ましいのは1: 1又は1:2及び2:1の間の、予め定義されたペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート: NCP比で本発明のバイオマトリックス層に存在する。
【０１０６】
ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート:NCPの比は、バイオマトリックス層の多孔度に影響することが見出された。バイオマトリックス層の多孔度を調整するために、ペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲート：NCPの比は、典型的には上述の範囲で変動し、ここで、NCPの比率が低いほど、バイオマトリックス層の多孔度は高い。多孔度の高い薄層フィルムは、バイオマトリックス層におけるNCPの比率を低下させることによって生成され得る。例えば、50μM NCP及び50μM ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートを混合することによって(混合物中で25μM NCP及び25μM ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートとなる)、コヒーレントフィルムとなり、NCP 濃度を10μMに低下させて、多孔度の高い構造をもたらした。
【０１０７】
ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート：NCP比の変更は、ゲル化速度をも変化させることができる。増大したゲル化速度は、バイオマトリックス層の増大した多孔度をもたらす。ゲル化速度はまた、位置R1への生体機能的ペプチドモチーフの包含によっても影響を受ける。ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート中のインテグリン結合モチーフ
【化９】
2020524004.tif 000013
のようなR1の包含/存在は、ゲル化率を低減し、したがって、多孔度の低いバイオマトリックス層をもたらす。多孔質構造の形成は、NCPのタイプを選択することによってさらに影響されることができる。例えば、ヘパリンを、ゲル化を加速するデキストラン硫酸で置き換えた場合、バイオマトリックス層の多孔度の高い構造が達成された。例えば、50μM デキストラン硫酸及び50μM star-PEG-KA7を混合することによって、多孔度の高いバイオマトリックス層フィルムがもたらされた。
【０１０８】
ゲル化率は、例えば、R1が存在する式(Ia)の化合物の比率が少なくとも10 ％である、式(Ib)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートとの式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートの混合物を使用することによって；及び／又は、式(II)の化合物の比率が少なくとも10 ％である、式(IIa)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートとの式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートの混合物を使用することによって、増大させることができる。
【０１０９】
ペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートのタイプを選択することによって、特異的な応用又は用途にバイオマトリックス層を調整することも可能である。細胞付着に不活性なバイオマトリックス層を製造することが望まれる場合、R1が存在しない、式(Ib)又は式(IIa)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートのみが、ハイドロゲルにおいて使用される。細胞に付着を提供すべきである場合、R1が存在する、式(I)又は式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートの少なくとも10％が混合されるべきである。ある種のバイオメディカル応用について、ペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートが、R1が存在する、式(I)又は式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートの100 ％までを構成するバイオマトリックス層を製造することも可能である。
【０１１０】
バイオマトリックス層フィルムの堅さは、例えば、NCPタイプ、ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート：NCP比、及び位置R1でのペプチド配列の伸長、及び／又は(BX)nのような、複数のパラメーターによって整調され得る。
【０１１１】
興味深いことに、NCP濃度は、R1が存在するペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートを使用した場合、ハイドロゲルフィルムの堅さに対して強力な効果を示した。例えば、ヘパリン濃度を増大させると、より堅いハイドロゲルが得られた。この効果は、R1が存在しないペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートを使用した場合、観察されなかった。
【０１１２】
5〜30個のアミノ酸からなるペプチドであると定義されているR1の伸長もまた、堅さに影響を与える。バイオマトリックス層の堅さが高いほど、R1に含有されるアミノ酸の数が低い。
【０１１３】
100：1及び1：100の間の範囲のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲート：NCPの比を変化させることもまた、堅さの調整をもたらす；ここで、硫酸化オリゴ糖の比率が高いほど、バイオマトリックス層の堅さが高い。堅さは、ゲル化率を増大又は低減させることによっても調整することができ、ここで、ゲル化率を低減させるとバイオマトリックス層の堅さがより強力になる。
【０１１４】
先に既に言及したように、より遅いゲル化は、上記のとおり、よりコンパクトなフィルム形成をもたらし、したがって、より堅いバイオマトリックス層が生じる。ヘパリンを、別のNCP、例えば、コンドロイチン硫酸A及びデルマタン硫酸で置き換えることは、ゲル化率を低減させ、それによって、バイオマトリックス層の堅さを増大させる。
【０１１５】
バイオマトリックス層の堅さは、ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの(BX)nペプチド中のアミノ酸 Xを、特に、この位置のアミノ酸の負電荷に関して、選択することによって、さらに調整してもよい；ここで、Xについて選択したアミノ酸の負電荷が高いほど、バイオマトリックス層の堅さはより強力になる。バイオマトリックス層の堅さは、ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート内のモチーフ(BX)nの反復物の数を選択することによって、さらに調整してもよい；ここで、nが大きいほど、バイオマトリックス層の堅さがより強力になる。
【０１１６】
薄層マトリックスの堅さは、(BX)nペプチド中のアミノ酸 Bを選択することによって、さらに調整してもよい。Bの位置にアルギニンを使用することは、より堅いバイオマトリックス層をもたらす。より柔らかいバイオマトリックス層が望まれる場合、Bは、好ましくはリジンである。
【０１１７】
ペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートのタイプを選択することによって、バイオマトリックス層の堅さを調整することも可能である。以下のタイプのペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートは、バイオマトリックス層の堅さを調整するためにハイドロゲル中で使用／取り込みすることができる：
・  R1が存在する、式(I)又は式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲート、
・  R1が存在する、式(Ia)又は式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲート、
・  式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートと式(Ib)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートとの混合物であって、R1が存在する、式(I)のコンジュゲートの比率は少なくとも10％である混合物、
・  式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートと式(IIa)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートとの混合物であって、前記混合物中の式(II)のコンジュゲートの比率は少なくとも10％である混合物；
・  R1が存在しない、式(Ib)又は式(IIa) のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲート、
ここで、R1の存在は、一般に堅さの低減をもたらす。
【０１１８】
本発明のさらなる実施態様において、0.1μM〜1,000μMの範囲、例えば0.1μM〜250μM、好ましくは、0.1μM〜125μM又は0.1μM〜75μMの範囲、より好ましくは、0.1μM〜75μM又は0.1μM〜50μMの濃度で、ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートを含むバイオマトリックス層は好ましい。最も好ましくは、PEGは、2.5μMの濃度又は25μMの濃度で含まれ、それより最も好ましくは、1μM〜10μMの範囲で含まれる。別の好ましい実施態様において、PEGは、900μM〜1,000μMの範囲で含まれる。
その多孔度及び堅さをその所望の機能、すなわち、ECMのタンパク質及びNCP部分の両方を模倣し、付着及び成長／分化する細胞のためのECMを提供することに適合させることができることは、本発明のバイオマトリックス層の大きな利点である。
【０１１９】
本発明のバイオマトリックス層は、特にその厚さにおいて従来のハイドロゲルと相違する。バイオマトリックス層の厚さは、典型的には3 nm〜40μmの範囲、好ましくは、3 nm〜1μM又は3 nm 〜500 nm、より好ましくは、3 nm〜100 nm、最も好ましくは、3 nm〜50 nm又は3nm〜10 nmであり；NCPのタイプを選択することによって、ペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲート及びNCPの濃度を選択することによって、及びペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲート:NCPの比を変えることによって、調整することができる。バイオマトリックス層の厚さは、コーティングすべき面積に適用する原材料の容量、例えば96ウェルプレートのウェルに適用する原材料の容量を制御することによって、さらに調整することができる。
【０１２０】
NCPのタイプに関しては、3 nm〜40μmの範囲の薄いハイドロゲルは、ヘパリンの代わりに、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、デキストラン硫酸、又はヒアルロン酸を使用することによって、得ることができる。
【０１２１】
バッファー溶液中のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲート及びNCPの濃度は、典型的には0.1及び250μMの間の範囲、最も好ましくは、PEGについては1〜10μMの範囲、及びNCPについては0.1〜25μMから選択される。ペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲート及びNCPの濃度が高いほど、得られるバイオマトリックス層の厚さが厚くなる。
【０１２２】
ステップiii)のバッファー溶液中のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲート：NCPの比は、典型的には1：100及び100：1の間の範囲、好ましくは、1:6及び6:1の間の範囲、最も好ましくは、1:2及び2:1の間の範囲で変化し、ここで、NCPの比率が低いほど、得られるバイオマトリックス層は薄くなる。
【０１２３】
本明細書において記載される組成を有する本発明のバイオマトリックス層は、いくつかの有利な特徴を有する。一つの態様において、このバイオマトリックス層は、脱イオン水、DMF、DMSO、エタノール、1M HCl及び1 M NaOHに対して高度に耐性である。
【０１２４】
本発明のバイオマトリックス層は、非常に良好な生体適合性を示し、定義された化学組成の利点を有する。本発明のバイオマトリックス層は、したがって、バイオ医薬において広く応用可能である。
【０１２５】
バイオマトリックス層の細胞ロード／表面カバー度を、調整すること、特に以下のことによって増大することができることは、本発明のバイオマトリックス層のさらなる利点である：
・  バイオマトリックス層を製造するために使用されるNCPのタイプを選択すること；及び／又は
・  式(I)、(Ia)又は式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートを使用すること；又は
・  式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートと式(Ib)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートとの混合物であって、R1が存在する式(I)の化合物の比率は少なくとも10 ％である混合物を使用すること、及び／又は
・  式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートと、式(IIa)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートとの混合物であって、R1が存在する式(II)の化合物の比率は少なくとも10 ％である混合物を使用すること；
ここで、細胞でのバイオマトリックス層の表面カバー度は、式(I)、(Ia)又は式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートの含量又は比率を増大させることによって、すなわち、生体機能的ペプチドR1の存在によって、増大する。
【０１２６】
ヘパリン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ならびにヒアルロン酸は、細胞によるバイオマトリックス層の増大した細胞ロード及び表面カバー度に寄与する。
【０１２７】
本発明のバイオマトリックス層が細胞を含む場合、この細胞は、典型的には 哺乳類細胞、昆虫細胞、細菌又は酵母細胞、好ましくは、哺乳類細胞、最も好ましくは、ヒト細胞又はヒト細胞株である。特に好ましい実施態様において、細胞は、ヒト幹細胞、より好ましくは、ヒト初代幹細胞、又は最も好ましくは、ヒト起源のiPS由来幹細胞である。バイオマトリックス層中に、又はその上に、含まれてもよい細胞の例は、ヒト線維芽細胞、間葉系間質細胞(MSC)、ニューロン前駆細胞(NPC)又はヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)である。
【０１２８】
本発明のさらなる大きな利点は、本発明のバイオマトリックス層のすべてのビルディングブロックが可変性であり、したがって、バイオマトリックス層の目的特異的な創造のためのライブラリーの基礎を形成することである。例えば、前記ライブラリーからビルディングブロックを選択することによって、バイオマトリックス層の表面への付着によって特異的細胞タイプ又は細胞株に結合することが可能なバイオマトリックス層を創造することが可能である。本発明のバイオマトリックス層は、細胞生存を促進し、細胞増殖を制御し、幹細胞性を保存し、及び特異的細胞系統への細胞分化をガイドするために、さらに好適である。
【０１２９】
したがって、さらなる、最も好ましい実施態様において、本発明は、以下のものを含む、本質的に以下のものからなる、又は以下のものからなる、バイオマトリックス層のビルディングブロックのコンビナトリアルライブラリーを提供する：
・  NCP、
・  PEG、
・  (BX)nペプチド、ここで、B、X及びnは本明細書において定義したとおりである、及び
・  R1ペプチド、ここで、R1は本明細書において定義したとおりである。
【０１３０】
このライブラリーは、好適には、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)中でのストック溶液の形態で提供される。より好ましくは、以下のものを含む、本質的にそれらからなる、又はそれらからなる、PBSバッファー中の前記ビルディングブロックの個別のストック溶液を含む、先行するいずれかの請求項のバイオマトリックス層のビルディングブロックのコンビナトリアルライブラリーが提供される：
・  2.5μM〜7.5μM、好ましくは5.0μMの、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、デキストラン硫酸、及びヒアルロン酸からなる群から選択されるNCP、
・  2.5μM〜7.5μM、好ましくは5.0μMの、PEG、好ましくは、4 kD〜40 kDの範囲の4腕star-PEG；
・  2.5μM〜7.5μM、好ましくは5.0μMの、配列番号1〜14を有するペプチドからなる群から選択される(BX)nペプチド、及び
・  2.5μM〜7.5μM、好ましくは5.0μMの、配列番号15〜353を有するペプチドからなる群から選択されるR1ペプチド。
【０１３１】
前記ストック溶液は、好適な量の個別のストック溶液を混合することによって本発明のバイオマトリックス層を容易に調製することができるという利点を有する。これに関する好適な量は、コアセルベーション及びマトリックス層形成が起こることを意味する。
【０１３２】
さらなる好ましい実施態様において、本発明は、PBS中の2.0μM〜7.5μMの以下のものを含むストック溶液を含む、目的特異的な本発明のバイオマトリックス層を製造するためのキットを提供する：
・  NCP、
・  PEG、
・  (BX)nペプチドのライブラリー、ここで、B、X及びnは本明細書において定義したとおりである、
・  R1ペプチドのライブラリー、ここで、R1は本明細書において定義したとおりである、及び
・  目的特異的な本発明のバイオマトリックス層を製造するために上述の剤を使用するための指示。
【０１３３】
上記のライブラリー及びキットに関して、NCPは、好ましくは、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸、ポリスチレン硫酸（PSS）、硫酸化アルギン酸塩、硫酸化ヒアルロン酸、環状デキストラン硫酸、環状デキストランリン酸及びフィチン酸から選択され、最も好ましくは、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸から選択される。
【０１３４】
PEGは、本明細書において定義したとおりの直鎖状PEG又はstarPEGであり、好ましくは、4kD及び40 kDの間、最も好ましくは10kDの分子量を有する4腕starPEGである。
【０１３５】
(BX)nペプチドのライブラリーは、好ましくは、配列番号1〜14のペプチドからなる。
R1ペプチドのライブラリーは、好ましくは、配列番号15〜353のペプチドからなる。好ましい実施態様において、R1ペプチドのライブラリーは、ペプチド
【化１０】
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を含まない。したがって、最も好ましい実施態様において、R1ペプチドのライブラリーは、配列番号15、16、18〜353のペプチドからなる。
【０１３６】
ライブラリー及びキットは、バイオマトリックス層の所望の目的又は用途に特に適合させた、本発明のバイオマトリックス層の理想的な組成についてスクリーニングするために使用することもできる。所望の目的又は用途は、例えば特異的細胞又は細胞株、例えばヒト細胞又はヒト細胞株、特定のヒト幹細胞、好ましくは、ヒト初代幹細胞、又は最も好ましくは、ヒト起源のiPS由来幹細胞の、付着のために特に好適なバイオマトリックス層を適合させる又は調製することである。例えば、ヒト線維芽細胞、間葉系間質細胞(MSC)、ニューロン前駆細胞(NPC)、又はヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)の付着のためのバイオマトリックス層の理想的な組成は、本発明のライブラリー又はキットを使用してスクリーニングすることができる。別の所望の目的又は用途は、バイオメディカルデバイスの生体適合性を改良するためのバイオメディカルデバイスのコーティングに特異的に好適なバイオマトリックス層を適合させる又は調製することである。
【０１３７】
このようなスクリーニングは、例えば、ハイスループットスクリーニングとして、HTSフォーマットで実施することができる。例えば、バイオマトリックス層の形成は、96又は384ウェルプレートのようなウェルプレートにおいて実行してもよく、ここで、各ウェルは、本発明のライブラリーから選択されたビルディングブロックの異なる混合物をローディングされることになる。
【０１３８】
本発明のさらなる実施態様において、バイオマトリックス層は、治療試薬のターゲティングされた放出のためのバイオマトリックス層を提供するために特に好適な3Dバイオマトリックス層を形成することが可能であり、ここで、相当する方法を介して、治療試薬は、前述のバイオマトリックス層内に閉じ込められているか又はカプセル化されていてもよい。利用される治療試薬の各々の群は、好ましくは、細胞、細胞球(例えば、間葉系球（mesensphere）、神経幹細胞塊)、又はオルガノイド、又はモルフォゲン、又は活性医薬成分を含む。
【０１３９】
本発明のバイオマトリックス層が、治療剤として細胞を含む場合、それらの細胞は上記で定義したとおりである。
【０１４０】
オルガノイドは、現実的な微小解剖学を示す、インビトロで三次元で製造される器官の小型化及び簡略化されたバージョンである。オルガノイドは、三次元培養においてそれらの自己更新能及び分化能により自己編成することができる、組織、胚性幹細胞又は誘導多能性幹細胞からの１個、又は数個の細胞から由来する。
【０１４１】
本発明の3Dバイオマトリックス層は、外来性物質の非存在下で複雑な細胞−細胞及び細胞−マトリックス相互作用の研究のための好都合なインビトロモデルを提供することができ、単層として細胞を成長させることに依拠する伝統的な細胞培養法では可能ではない、再生医療戦略の開発に利する可能性がある。異なるサイズの、間葉系幹細胞(MSC)スフェロイド、すなわち「間葉系球」は、本発明の3Dバイオマトリックス層において形成され、維持されることができる。間葉系球の3D培養は、細胞壊死又は分化の証拠を呈さないことが示されていたが、一方、分化培地中の間葉系球は、骨形成及び脂肪生成のコミットメントの組織学的マーカーに基づいて従来の2D培養法と同様の分化を呈した。そのうえ、組織培養プレート上にプレーティングされた場合、成長培地中の間葉系球内で培養されていた細胞は、付着単層で連続的に培養された細胞に典型的な形態学を回復し、多系統分化能についてのそれらの能力を保持した。実際、単層と比較した場合、回復されたMSCでは、より堅牢なマトリックスミネラル化及び脂質液胞含有量が明らかであり、3Dスフェロイドとして培養された細胞による分化の増強が示唆された。したがって、間葉系幹細胞のための3D培養システムは、従来の単層培養に付随する限界を回避し、多能性細胞の分化能を増強する可能性がある (Baraniak P.R., McDevitt T.C.、「懸濁液中での間葉系幹細胞スフェロイドの足場なしの培養は多系列ポテンシャルを保存する（Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheloids in suspension preserves multilineage potential）」、Cell Tissue Res. 2012 Mar; 347(3):701-11)。
【０１４２】
本発明の3Dバイオマトリックス層は、神経幹細胞塊を製造するために好都合な環境をさらに提供することができる。神経幹細胞塊は、神経幹細胞の遊離浮遊クラスターから構成される培養システムである。神経幹細胞塊は、インビトロで神経前駆細胞を探求する方法を提供する。推定上の神経幹細胞は、付着基材を欠くが上皮成長因子及び線維芽細胞成長因子のような必要な成長因子を含有する培地中に懸濁される。これは、神経幹細胞が特徴的な3Dクラスターへと形成されることを可能にする。神経幹細胞塊の典型的な用途は、神経幹細胞塊アッセイにおけるものである。
【０１４３】
モルフォゲンは、その不均一な分布が、発生生物学のコアプロセスの一つであり、組織内での種々の専門化細胞タイプの位置を確立する、形態形成又はパターン形成のプロセスにおける組織発生のパターンを支配する物質である。より具体的には、モルフォゲンは、細胞に直接作用して、その局所的濃度に応じて特異的細胞応答を生成する、シグナル伝達分子である。
【０１４４】
典型的には、モルフォゲンは、供給源細胞によって産生され、初期発生中の胚において周囲組織を通して拡散し、濃度勾配を作る。これらの勾配は、非専門化幹細胞の異なる細胞タイプへの分化のプロセスを駆動し、最終的に身体のすべての組織及び器官を形成する。形態形成のコントロールは、進化発生生物学における中心的な要素である。
【０１４５】
本発明のバイオマトリックス層における使用のために好適な哺乳類のモルフォゲンとしては、レチノイン酸、ソニックヘッジホッグ(SHH)、トランスフォーミング成長因子β(TGF-β)/骨形態形成タンパク(BMP)、及びWnt/β-カテニンが挙げられる。発生中に、ビタミンAの代謝産物であるレチノイン酸は、生物の後端の成長を刺激するために使用される。レチノイン酸は、転写因子として作用するレチノイン酸受容体に結合し、Hox遺伝子の発現を調節する。特に妊娠初期における、外因性レチノイドに対する胚の曝露は、先天性欠損をもたらす。TGF-βファミリーメンバーは、背腹軸パターン形成、及びいくつかの器官の形成に関与する。II型TGFβ受容体に対するTGF-βの結合は、I型受容体を動員し、後者がトランスリン酸化されることを引き起こす。I型受容体は、Smadタンパク質を活性化し、それが次に遺伝子転写を調節する転写因子として作用する。ソニックヘッジホッグ(Shh)は、発生中の胚における初期パターン形成に必須のモルフォゲンである。Shhは、Shhの非存在下でSmoothened受容体を阻害するPatched受容体に結合する。活性化されたSmoothenedは、次にGli1、Gli2、及びGli3を核内に移動させ、そこでそれらはPTCH1及びEngrailedのような標的遺伝子を活性化する。
【０１４６】
本発明のバイオマトリックス層が治療剤として活性医薬成分を含む場合、この活性医薬成分は、典型的には抗がん化合物、抗凝固化合物、抗炎症化合物、免疫抑制化合物、治療抗体、診断試薬、ホルモン、成長因子、サイトカイン、成長因子の阻害剤としての低分子、サイトカインの阻害剤としての低分子、成長因子のアプタマー阻害剤、及びサイトカインのアプタマー阻害剤から選択される。特に好ましい実施態様において、活性医薬成分は、ドキソルビシン、パクリタキセル、シクロスポリンA、タクロリムス、ラパマイシン、抗VEGF抗体、及び抗TNF-α抗体から選択される。
【０１４７】
本発明のバイオマトリックス層が治療剤としてモルフォゲンを含む場合、モルフォゲンは、典型的にはTNF-α、TGF-β、IFN-γ、FGF、VEGF、及びEGFから選択される。
【０１４８】
ハイドロゲルは、薬剤、特にタンパク質治療剤の送達のために特に有用である。ハイドロゲルは、生体適合性であり、タンパク質の変性を最小限にするためのタンパク質のために温和な環境を提供する。タンパク質は、ゲル内に物理的に閉じ込められるか、又は天然タンパク質及びNCP間の、もしくは共有結合的にカップリングされたタンパク質−(BX)nペプチド及びNCP間の、静電気的な相互作用によってゲルに結合される。タンパク質は、バイオマトリックスの分解によって放出されるか、又は静電気的な相互作用によって放出動態が与えられる。分解可能なR1は、ハイドロゲルを形成するPEGポリマー内に取り込ませることができ、ゲル内のセグメントの分解を介して、タンパク質は、ゲルが分解するにつれて放出されることになる。
【０１４９】
本発明は、さらに本発明のバイオマトリックス層を調製するプロセスに関する。
【０１５０】
第一の態様において、前記の、本発明のバイオマトリックス層の調製プロセスは、以下のステップを含む：
i)  式(Ia):
PEG-R1-(BX)n        (Ia)
【０１５１】
及び場合によっては式(II)：
PEG-CWGG-R1-GG-(BX)n        (II)
のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートを調製するステップ
【０１５２】
（式中、
−  Bは、リジン又はアルギニンであり、Xは、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン酸又はアスパラギン酸から選択され、nは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及び20から選択される整数であり；かつ
−  R1は存在しなくてもよく、又は5〜30個のアミノ酸を含むペプチドである。）
ii)    前記ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートをNCPと混合するステップ；
iii)    ステップii)の混合物を、好適なバッファー溶液又は培地に添加するステップであって、ここで、前記式(Ia)又は式(II)のポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートは、0.1μM〜250μMの範囲の濃度で前記バッファー溶液に含有されており、かつ、前記NCPは、0.1μM〜250μMの範囲の濃度で前記バッファー溶液に含有されている；及び
iv)    ゲル化によってバイオマトリックス層を形成するステップ、
及び、場合により、前記ハイドロゲルが細胞又はオルガノイドを含む場合、以下の付加的ステップ：
v)    前記細胞又はオルガノイドを、上記のステップiv)によって得られたバイオマトリックス層上に播種するステップ；及び
vi)    前記バイオマトリックス層及び前記播種された細胞又はオルガノイドをインキュベートし、バイオマトリックス層への細胞付着を推進するステップ。
【０１５３】
本発明のバイオマトリックス層について上記した利点及び有利な実施態様は、上記で言及されるように前記バイオマトリックス層を調製するプロセスにも同様に該当することは認識されるべきである。
【０１５４】
さらなる実施態様において、前記ペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートは、式(Ib)のコンジュゲートである：
PEG-(BX)n        (Ib)
【０１５５】
（式中、B、X及びnは、本明細書において定義したとおりである。）。
【０１５６】
さらなる実施態様において、前記コンジュゲートは、式(IIa)のコンジュゲートである：
PEG-CWGG-(BX)n        (IIa)
【０１５７】
（式中、B、X及びnは、本明細書において定義したとおりである。）。
【０１５８】
本発明のバイオマトリックス層について上記されるように、前記ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートは、本明細書において記載される好適な比率の、式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート及び式(Ib)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート、又は式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート及び式(IIa)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの混合物であることもできる。これらの混合物において、位置R1に異なる生体機能的ペプチドを含有する、式(I)、(Ia)、(II)又は(IIa)の3種までの異なるコンジュゲートをそれぞれ含有することができる。
【０１５９】
前記ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートをNCPと混合するステップii)、及びステップiii)の混合物を好適なバッファー溶液又は培地に添加するステップiii)は、非常にシンプルなプロセスであり、好ましくは、水性溶液、バッファー又は細胞培養培地中で実施される。好適なバッファーは、例えばPBS(リン酸緩衝生理食塩水)である。
【０１６０】
最も好ましい実施態様において、本発明は、以下のステップを含む、バイオマトリックス層を調製するプロセスを提供する：
i)      式(Ia):
PEG-R1-(BX)n        (Ia)、 
及び場合によっては式(II)
PEG-CWGG-R1-GG-(BX)n        (II)
のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートを調製するステップ
（式中、
−  PEGは、10 kDの4腕star-PEGであり；
−  (BX)nは、配列番号1〜14から選択されるペプチドであり、及び
−  R1は、存在しなくてもよく、又は配列番号15〜353から選択される生体機能的ペプチドである。）；
【０１６１】
ii)      前記ペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲート及びNCPを前記バッファー中に最終濃度の100xで溶解するステップ；
iii)      ステップii)の溶液を好適なバッファー溶液中に希釈及び混合するステップであって、ここで、式(Ia)又は式(II)のポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲート、及び前記NCPは、各々前記バッファー溶液に0.1μM〜250μMの範囲の濃度で含有される；及び
iv)      ゲル化によってバイオマトリックス層を形成するステップ、
及び場合により、前記ハイドロゲルが細胞又はオルガノイドを含む場合、以下の付加的なステップ：
v)      前記細胞又はオルガノイドを上記のステップiv)によって得られたバイオマトリックス層上に播種するステップ；及び
vi)      前記バイオマトリックス層及び前記播種された細胞又はオルガノイドをインキュベートし、バイオマトリックス層への細胞付着を推進するステップ。
【０１６２】
代替的な実施態様において、このプロセスは、最初のステップにおいて、生体機能的ペプチドR1を有さないマトリックスを調製し、第二のステップにおいて、生体機能的ペプチドを含むペプチドを添加することによって後修飾を実施し、ここで、前記添加されるペプチドはR1-(BX)n、CW-R1-GG-(BX)n及びCWGG-R1-GG-(BX)nから選択されるように変更することができる。得られるバイオマトリックス層は、本発明の元のプロセスで得られるバイオマトリックス層に匹敵する。
【０１６３】
バイオマトリックス層の形成、すなわち、ゲル化は、0℃〜50℃の範囲の温度で実施することができる。好ましくは、ゲル化は、10℃〜45℃、20℃〜40℃又は30℃〜35℃の範囲の温度で実施する。最も好ましくは、ゲル化は、室温〜37℃の範囲の温度で実施する。
【０１６４】
上記のように、厚さ、多孔度、堅さ及び細胞ロードのような、本発明のバイオマトリックス層のいくつかの特徴は、バイオマトリックス層を創造するための異なるビルディングブロックを選択することによって整調することができる。したがって、本発明は、本発明のバイオマトリックス層の厚さ、多孔度、堅さ及び細胞ロードを調整するプロセスをも提供する。
【０１６５】
一つの実施態様において、本発明は、以下のステップを含む、バイオマトリックス層の厚さを、好ましくは3 nm〜40μmの範囲に、調整するプロセスを提供する：
・  バイオマトリックス層を製造するために使用するNCPのタイプを選択するステップ；及び／又は
・  ペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲート：NCPの濃度を選択するステップ；及び／又は
・  ステップiii)のバッファー溶液中のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲート：NCPの比を1：1及び1：25の間に変えるステップ；ここで、NCPの比率が低いほど得られるバイオマトリックス層は薄くなる；及び／又は
・  コーティングすべき面積に適用する原材料の容量を制御するステップであって、ここで、より未加工の材料が特定の面積に適用されるほど、バイオマトリックス層の厚さは厚くなる。
【０１６６】
例えば、バイオマトリックス層の厚さは、バイオマトリックス層を調製するためにヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン硫酸、デルマタン硫酸、又はヒアルロン酸を使用することによって、低減させることができる。
【０１６７】
さらなる実施態様において、本発明は、以下のステップによってバイオマトリックス層の多孔度を調整するプロセスを提供する： 
・  ステップiii)のバッファー溶液又は培地中のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲート：NCPの比を1：100及び100：1の間の範囲に変えるステップ；ここで、硫酸化オリゴ糖の比率が低いほど、バイオマトリックス層の多孔度は高くなる；及び／又は
・  ゲル化率を増大又は低減させるステップ、ここで、ゲル化率の増大は、バイオマトリックス層の増大した多孔度をもたらす。
【０１６８】
ゲル化率は、例えば、以下のステップによって増大させることができる：
・  硫酸化オリゴ糖のタイプ、例えば、デキストラン硫酸を選択するステップ；及び／又は
・  式(I)、(Ia)又は式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートを使用するステップ；又は
・  式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートと式(Ib)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートとの混合物を使用するステップであって、ここで、R1が存在する式(Ia)の化合物の比率は、0及び100％の間で変化し、ここで、細胞付着目的のためには、混合物中の式(Ia)の化合物の比率は、少なくとも10 ％である；及び／又は
・  式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートと式(IIa)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートとの混合物を使用するステップであって、ここで、式(IIa)の化合物の比率は、0及び100％の間で変化し、ここで、細胞付着目的のためには、混合物中の式(II)の化合物の比率は、少なくとも10％である。
【０１６９】
さらなる実施態様において、本発明は、以下のステップを含む、バイオマトリックス層の堅さを調整するプロセスを提供する：
・  バイオマトリックス層を製造するために使用する硫酸化オリゴ糖のタイプを選択するステップ；及び／又は
・  (BX)nペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート内の位置Xのアミノ酸を、特にその負電荷に関して選択するステップ；ここで、Xについて選択されたアミノ酸の負電荷が高いほど、バイオマトリックス層の堅さはより強力になる；及び／又は
・  ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート内のモチーフ(BX)nの反復物の数を選択するステップ；ここで、nが大きいほど、バイオマトリックス層の堅さはより強力になる；及び／又は
・  ステップiii)のバッファー溶液又は培地中のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲート：NCPの比を、100：1及び1：100間の範囲で変えるステップ；ここで、NCPの比率が高いほど、バイオマトリックス層の多孔度が高くなる；及び／又は
・  ゲル化率を増大又は低減させるステップ、ここで、ゲル化率の低減は、より強力なバイオマトリックス層の堅さをもたらす。
【０１７０】
さらなる実施態様において、本発明は、以下のステップを含む、バイオマトリックス層の堅さを調整するプロセスを提供する：
・  バイオマトリックス層を製造するためにコンドロイチン硫酸、又はデルマタン硫酸を使用するステップ、及び／又は
・  式(I)、(Ia)又は式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートを使用するステップ；又は
・  式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートと式(Ib)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートとの混合物を使用するステップ、ここで、R1が存在する式(Ia)の化合物の比率は、0及び100％の間で変化し、ここで、細胞付着目的のためには、式(Ia)の化合物の比率は少なくとも10％である、及び／又は
・  式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートと式(IIa)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートとの混合物を使用するステップ、ここで、R1が存在する式(II)の化合物の比率は、0及び100％の間で変化し、ここで、細胞付着目的のためには、式(II)の化合物の比率は少なくとも10％である。
【０１７１】
さらなる実施態様において、本発明は、以下のステップを含む、バイオマトリックス層の細胞ロード/表面カバー度を調整するプロセスを提供する：
・  バイオマトリックス層を製造するために使用する硫酸化オリゴ糖のタイプを選択するステップ；及び／又は
・  式(I)、(Ia)又は式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートを使用するステップ；又は
・  式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートと式(Ib)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートとの混合物を使用するステップであって、ここで、R1が存在する式(Ia)の化合物の比率は、0及び100％の間で変化し、ここで、細胞付着目的のためには、式(Ia)の化合物の比率は少なくとも10％である；及び／又は
・  式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートと式(IIa)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートとの混合物を使用するステップであって、ここで、R1が存在する式(II)の化合物の比率は、0及び100％の間で変化し、ここで、細胞付着目的のためには、式(II)の化合物の比率は少なくとも10％である、
ここで、バイオマトリックス層の細胞での表面カバー度は、式(Ia)又は式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートの含量又は比率を増大することによって増大する。
【０１７２】
バイオマトリックス層の細胞ロード/表面カバー度は、バイオマトリックス層を製造するためにヘパリン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、又はヒアルロン酸を使用することによって増大させることができる。
【０１７３】
さらなる態様において、本発明は、細胞又はオルガノイドを含むバイオマトリックス層を調製するプロセスを提供する。この場合、このプロセスは以下の付加的なステップをさらに含む：
v)  上記のステップiv)によって得られたバイオマトリックス層上に前記細胞又はオルガノイドを播種するステップ；及び
vi)  前記バイオマトリックス層及び前記播種された細胞又はオルガノイドをインキュベートし、バイオマトリックス層への細胞付着を推進するステップ。
【０１７４】
あるいは、細胞又はオルガノイドは、既に形成されているバイオマトリックス層に添加されないが、本発明のバイオマトリックス層の調製プロセスの間に既に添加されている。好適には、細胞は、ステップiii)の細胞培養培地のような培地に既に含有されている。
【０１７５】
さらなる態様において、本発明は、細胞又はオルガノイドを含むバイオマトリックス層を調製するプロセスを提供し、ここで、前記プロセスは、場合によっては以下のさらなるステップを含む：
vii)  前記細胞又はオルガノイド含有バイオマトリックス層を培養するステップ。
【０１７６】
前記細胞又はオルガノイド含有バイオマトリックス層の培養は、典型的には、成長及び発生を支持する、又は付着した又はカプセル化された細胞又はオルガノイドの生存性を維持する、培養培地中での液体培養で実施される。培養は、典型的には0℃〜50℃の範囲、好ましくは、10℃〜45℃、20℃〜40℃又は30℃〜35℃の範囲の温度で実施される。最も好ましくは、培養は、付着した又はカプセル化された細胞の生存性の維持及び/又は成長、及びさらなる発生のために最良である、室温〜37℃の範囲の温度で実施される。
【０１７７】
細胞をバイオマトリックス上に提供する場合、1〜106細胞/cm2、好ましくは、10〜106細胞/cm2、より好ましくは、102〜105細胞/cm2、最も好ましくは、103〜105細胞/cm2が、本発明のバイオマトリックス層上に播種される。
【０１７８】
細胞をバイオマトリックス中にカプセル化する場合、1〜1010細胞/mL、好ましくは、10〜109細胞/mL、より好ましくは、102〜108細胞/mL、最も好ましくは、103〜107細胞/mLが、細胞カプセル化のために使用される。
【０１７９】
細胞が成長し、本発明のバイオマトリックス層中又は上への播種のために提供される典型的な培養培地は、DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco)、好ましくは、10％FBS（ウシ胎児血清)を含有するDMEMである。
【０１８０】
さらなる実施態様において、本発明は、自己組み立てアプローチを使用する、段階的なピペッティングを通じて異なるタイプの細胞が物理的に隔離された、細胞を含有する多層バイオマトリックスを製造するプロセスを提供する。前記方法は、以下のステップを含む：
i)  第一のバイオマトリックス層フィルムを形成するステップ；
ii)  第一のバイオマトリックス層フィルム上に第一のタイプの細胞を播種するステップ；
iii)  第一の細胞層を形成するための播種された細胞のインキュベーションステップ；
iv)  第一の細胞層のトップ上に第二のバイオマトリックス層フィルムを形成するステップ；
v)  インキュベーションステップ、例えば、一晩；
vi)  第二のバイオマトリックス層フィルム上に第二のタイプの細胞を播種してサンドイッチ構造を形成するステップ；
vii)  サンドイッチ構造を、例えば、1日培養するステップ。
【０１８１】
液液相分離メカニズムは、第一及び第二のバイオマトリックス層フィルムのビルディングブロックの細胞培養培地中への直接の簡便なピペッティングを可能にする。サンドイッチ形成は、化学反応に関与せず、細胞に対して最小限の物理的ストレスしか与えない。本明細書の実施例において示すように、各細胞タイプは、その特徴的なフェノタイプを保持しながら増殖した。それにより、サンドイッチ細胞培養アッセイのためのバイオマトリックス層の成功した応用を実証することができた。別個の層への異なる細胞の隔離は、インビボでのそれらの生物学的機能を統合するために非常に重要である。簡便なピペッティング手順を使用するレイヤー・バイ・レイヤー法は、よりネイティブに近い共培養環境だけでなく、顕微鏡撮影にも適合した、種々のモデルの構築を可能にする。
【０１８２】
本発明のさらなる態様において、バイオマトリックス層を調製するプロセスが提供され、ここで、前記バイオマトリックス層は、モルフォゲン又は活性医薬成分を含む。モルフォゲン又は活性医薬成分の添加は、上記の方法のステップii)又はiii)において行ってもよい。
【０１８３】
前記活性医薬成分は、典型的には0.01μg/l〜2.0g/l;好ましくは、0.1μg/l〜1.5g/l、1.0μg/l〜1.0g/l又は10μg/l〜0.5g/lの範囲、より好ましくは、0.1mg/l〜0.1mg/lの範囲、最も好ましくは、1.0mg/l〜0.01g/lの範囲の最終濃度で、ステップiii)の混合物に含有される。
【０１８４】
本発明は、さらに、本発明のプロセスによって得られるバイオマトリックス層を提供する。本発明のバイオマトリックス層及びプロセスについて上述した利点及び有利な実施態様は、本発明のプロセスで得ることができるバイオマトリックス層にも等しく適用されることを認識すべきであり、それは上記を参照されたい。
【０１８５】
なおもさらなる態様において、本発明は、神経プロステーシス、バイオセンサー、神経移植、細胞培養、組織又は細胞貯蔵、薬物送達及びバイオメディカルデバイスのコーティングのような、バイオメディカル応用における本発明のバイオマトリックス層の用途を提供する。本発明の非共有結合性のバイオマトリックス層は、例えば単層及び多層細胞培養モデルのための組織特異的細胞外マトリックス模倣物をスクリーニングするための理想的なツールである。
【実施例】
【０１８６】
本発明を、16の図面及び19の実施例により、より詳細に説明する。
【０１８７】
実施例１：ペプチド合成
本明細書において言及されたすべてのペプチドは、自動固相ペプチド合成機(ResPep SL, Intavis, Cologne, Germany)において、2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3テトラメチルウロノイウムヘキサフルオロホスフェート活性化(HBTU活性化)された固相上で、標準化されたフルオレニルメトキシカルボニル化学(FMOC化学)を利用することによって製造される。良好なペプチド品質を得るために、各アミノ酸は、すべての非反応アミノ基は無水酢酸で保護して、5倍過剰と2回カップリングさせた。樹脂からペプチドを切断するために、樹脂を、トリフルオロ酢酸(TFA)トリイソプロピルシラン(TIS)/水/ジチオトレイトール(DTT)の、これらの構成成分が90(v/v):2.5(v/v):2.5(v/v):2.5(m/v)の比で存在する混合物で1時間半処理した。
【０１８８】
ペプチドは、2mg/mlトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン(TCEP)を含有する水中に溶解した。ペプチド精製は、分取C18カラム(AXIA(商標) 1001 A粒度10μm, 250×30mM, Phenomenex Torrance USA)を備えた分取HPLC-デバイス(Prostar(商標), Agilent Technologies, Santa Clara, USA)での逆相高圧液体クロマトグラフィー(UPLC)によって実行した。ペプチドは、溶剤Aが水中0.1％トリフルオロ酢酸(TFA)、及び溶剤Bがアセトニトリル中0.1％ TFA及び5％水である、5％〜100％溶剤Bの勾配を20ml/分で利用することによって、カラムから溶出させた。
【０１８９】
純度は、イソクラティック勾配及びエレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)(AQUITY(商標) TQ detector, Waters, Milford, Mass., USA)を利用して、分析C18カラム(AQUITY(商標) UPLC BEH C18, 粒度 1.7μm, 50×2.1 mM, Waters, Milford, Mass., USA)を備えた分析逆相超高圧液体クロマトグラフィー(UPLC Aquity(商標) with UV detector, Waters, Milford Mass., USA)によって確認した。ペプチドは、白い粉末に凍結乾燥し(CHRIST ALPHA(商標) 2-4LD plus+ vacuubrand RZ6)、さらに処理する前に1週間を超えない期間、乾燥条件下で4℃で保存した。
【０１９０】
実施例２：ペプチド-PEG-コンジュゲートの合成
バイオマトリックスアセンブリーにおいて利用したペプチド-starPEG コンジュゲートの合成は、10 kDa マレイミド官能化4腕ポリエチレングリコール(starPEG, JenKem Technology, Beijing, China)及びシステイン末端ペプチドの間のマイケル型付加反応を介して行った。両構成成分は、PBS(pH 7.4)中に溶解し、1:5(starPEG:ペプチド)のモル比で合計濃度80 mg/mlで混合した。反応混合物を、迅速にシールし、撹拌プレート上で、750 rpm、室温(24℃)で2時間、撹拌した。粗生成物を、8 kDa カットオフの透析チューブ(Spectrum Laboratories, Inc., Rancho Dominguez, CA, USA)中で、10 lの水に対して、定期的に水を交換して2日間透析して、未カップリングのペプチド及び塩を除去した。その後、生成物を、タンパク質分離用カラムである分析逆相C18カラム(Phenomenex, Torrance, CA, USA)及びイソクラティック勾配を使用して逆相UPLC(ACQUITY システム, Waters, Milford MA, USA)によって分析した。水中の透析された生成物を凍結乾燥した。
【０１９１】
実施例３：バイオマトリックス層の製造
ブタ腸粘膜由来のヘパリンナトリウム塩は、Millipore(MERCK KGaA(Darmstadt, Germany)から購入した。ウシ気管由来のコンドロイチン硫酸Aナトリウム塩、ロイコノストック属由来のデキストラン硫酸ナトリウム塩(5 kDa)、ウシ腎臓由来のヘパラン硫酸ナトリウム塩、及びブタ腸粘膜由来のデルマタン硫酸は、Sigma-Aldrich Co. LLC.(St. Louis, MO, USA)から購入した。ペプチド-starPEG コンジュゲート及びNCPは、PBS(pH 7.4)又は細胞培養培地に溶解し、ろ過した(0.22μM)。両構成成分を、次に、等容量で混合し、96ウェルプレートを使用して最終200μlに、及びμ-血管新生スライド(ibidi GmbH, Martinsried, Germany))を使用して60μlにした。薄層は、24℃又は37℃で、95％湿度及び5％ CO2で形成させた。
【０１９２】
実施例４：ゲル化時間分析
バイオマトリックス層は、μ-血管新生スライド中で調製した。構成成分を混合した直後、スライドを顕微鏡(Axio Observer Z1, Zeiss, Oberkochen, Germany)上に戴置された37℃のチャンバーに入れた。異なる時点で、バイオマトリックス層の形成の明視野写真を撮影した。
【０１９３】
実施例５： 3次元でのバイオマトリックス層構造の分析
バイオマトリックス層を、PBS又は完全細胞培養培地で3回洗浄し、薄層の構造を、回転ディスクユニットCSU-X1M 5000 デュアルカム(Yokagawa, Tokyo, Japan)を備えた蛍光回転ディスク共焦点顕微鏡(Axio Observer Z1(Zeiss, Oberkochen, Germany))を使用して分析した。画像分析は、ImageJ 1.48v23を使用して実施した。次に、強度プロフィールについてのFWHM(半値全幅)を算出し、プロット24の左肩及び右肩間のこれらのFWHMの距離を測定することによって、厚さを決定した。
【０１９４】
実施例６：原子間力顕微鏡(AFM)を使用した堅さ分析
これらのAFM研究のために、バイオマトリックス層を1.2 mlの容量で24ウェルプレート中に調製した。ゲルが形成されたら、実験前に上清を交換した。10μm及び20μmの直径を有する球状シリカ粒子を、先端なしの三角のパイレックス窒化物カンチレバー、長さ200μM及び力定数約0,08 N/mのPNP-TR-TL(NanoWorld AG, Neuchatel, Switzerland)に糊付けした。全ての力測定は、光学顕微鏡(AxioObserver Z1)に戴置されたNanowizard II(JPK Instruments AG, Berlin, Germany)を使用してPBS(pH 7.4)中で実施した。力曲線は、10x10μmのサンプル表面面積にわたって8x8のグリッドにマッピングした。インデントの深さは、ヤング率が一定の値に向かう傾向があり、下の基材が計算に影響しない、400〜500 nmに最適化された。値は、1サンプル当たり3つのグリッドを用いて異なる2日間で別個に調製し測定されたバイオマトリックス層から平均した。JPKSPMデータ処理ソフトウェア(JPK Instruments AG)を使用して、得られた力をヘルツモデルに当てはめて、球圧子を考慮したヤング率を算出した。測定のためのコントロールは、0.2％アガロースゲル及びマトリゲル25をプローブすることによって作製した。
【０１９５】
実施例７：一般的細胞培養
初代ヒト間葉系間質細胞(MSC)、HUVEC及びHeLa細胞、及び神経膠芽腫U-251 MG細胞を使用した。各細胞タイプは、適切な培地中で成長させた:HDFn:2％低血清成長サプリメントを含む培地106;MSC:10％ FBSを含むDMEM GlutaMax 低グルコース(1 g/l)、NPC:2％ B27サプリメント、1％ GlutaMax及び1％ Pen/Strepを含む−増殖用には10 ng/ml EGF及びFGF2を含む、Neurobasal培地 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)(ここまでの培地はすべてThermo Fisher Scientific)、HUVEC:内皮細胞成長培地及び2％サプリメントミックス(PromoCell GmbH, Heidelberg, Germany)。NPCを除くすべての細胞タイプは、Greiner Bio-One International AG(Kremsmunster, Austria)のコーティングなしのT-25フラスコ中で成長させた。NPCは、ポリ-D-リジン/ラミニン(PDL: Sigma-Aldrich Co. LLC.;ラミニン: Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland)でコーティングした培養フラスコで成長させることによって増殖させた。NPCは、成体マウスの海馬内の歯状回（gentate gyrus）に由来する。
【０１９６】
実施例８：バイオマトリックス層上での細胞培養
KA7-starPEGとKA7-RGDSP-starPEGとを対応するモル比で混合することによって、異なるRGDSP濃度を達成した。一晩室温で保存する間にバイオマトリックス層を形成させた。μ-血管新生スライドに60μlの50mg/mlフィブロネクチン又は5μg/mlのラミニンを用いて作製したタンパク質コーティングを、コントロールとして使用した。形成されたバイオマトリックスの上清は除去し、細胞を、完全細胞培養培地中でバイオマトリックス層及びコントロール表面に添加した。完全細胞培養培地は、培養第一日に交換し、その後2日目ごとに交換した。
【０１９７】
実施例９：レイヤー・バイ・レイヤー共培養
バイオマトリックスの第一層は、5μM KA7-RGDSP-starPEG及び0.7mg/mlコンドロイチン硫酸A(50μM 14 kDaヘパリンと同じ重量／容量)を混合することによって調製した。HDFnの播種及び一晩インキュベーションの後、第二の薄層を形成させた。14 kDa ヘパリン及びKA7-RGDSP-starPEGコンジュゲートを、完全HDFn細胞培養培地に溶解し、0.22μm 遠心管フィルターを通してろ過した。これらの溶液を(ボルテックスによって)混合し、3.5mMの14kDa ヘパリン、及び2.5mMのKA7-RGDSP-starPEGコンジュゲートの最終濃度に到達した。第二層を形成させるために、5μlの混合物をHDFn層上の細胞培養培地中に注入した。もう一晩のインキュベーションステップ後に、MSCを添加して完全MSC細胞培養培地中でさらに培養した。
【０１９８】
実施例１０：幹細胞性マーカーについての海馬神経前駆細胞の染色
細胞を、4％ PFAを用いて10分間固定し、次に0.1％ Triton X-100を用いて10分間透過性にした後、10％ロバ血清を用いて1時間ブロッキングした。続いて、細胞を、1:500に希釈されたウサギ抗Sox2(MERCK KGaA, Darmstadt, Germany)及びマウス抗Nestin抗体(Becton, Dickinson and Company(BD), Franklin Lakes, NJ, USA)を用いて2時間インキュベートした。二次抗体、抗マウスAlexa Fluor 488及び抗ウサギ DyLight 549(Dianova GmbH, Hamburg, Germany)を1:500で1時間適用した。最後に、核を、Hoechst33342(1:4000)で染色した。サンプルは、回転ディスクユニットCSU-X1M 5000デュアルカム(Yokagawa)を備えた倒立共焦点顕微鏡Axio Observer Z1(Plan-Apochromat 10x/0.45 M27)(Zeiss)で撮影した。細胞サイズ及び数を測定するために、ImageJ 1.48vを使用した。
【０１９９】
実施例１１：海馬神経前駆細胞の分化アッセイ
EGFの休薬及びFGF2の段階的な低減により分化を導入した。最初に、細胞を、完全培地及び5 ng/ml FGF2を用いて2日間培養した。次に、細胞を、さらに4日間、成長因子なしで培養した後、4％ PFAで10分間固定した。細胞を、0.1％ Triton X-100を用いて10分間透過性にした後、10％ロバ血清を用いて1時間ブロッキングした。続いて、細胞を、1:500に希釈されたマウス抗Map2ab(Sigma-Aldrich Co. LLC.)及びウサギ抗GFAP(Agilent Technologies, Santa Clara, USA)を用いて2時間インキュベートした。二次抗体、抗マウス Alexa Fluor 488及び抗ウサギ DyLight 549を1:500で1時間適用した(Dianova GmbH)。最後に、核を、Hoechst33342(1:4000)で染色した。細胞は、倒立共焦点顕微鏡Axio Observer Z1(Plan-Apochromat 20x/0.8)(Zeiss)で撮影し、ImageJ細胞カウンタープラグインを用いて手動で分析した。
【０２００】
実施例１２：細胞展開についての免疫細胞化学
免疫染色に先立って、サンプルを、4％ PFAを用いて室温(24℃)で15分間固定し、 PBS(pH 7.4)中の0.25％ ウシ血清アルブミン、1％ Tergitol溶液及び0.1％ヘパリン中で1時間ブロッキングした。次に、ファロイジンをブロッキングバッファー中で1時間適用した。その後、PBS中の0.1μg/ml DAPIを5分間適用し、その後、バッファーで5分間3回洗浄した。サンプルを、回転ディスクユニットCSU-X1M 5000デュアルカム(Yokagawa)を備えた倒立共焦点顕微鏡Axio Observer Z1(Plan-Apochromat 10x/0.45 M27)(Zeiss)で撮影した。画像分析のために、ImageJ 1.48vを使用した。
【０２０１】
実施例１３：細胞増殖についての染色
細胞増殖は、Click-iT(登録商標) EdU Imagingキット(555 nm 励起)を製造業者の指示に従って(Thermo Fisher Scientific)使用して評価した。手短に述べると、細胞を、10μM EdUを用いて37℃で2時間インキュベートし、その後、4％ PFAでの固定及びPBS(pH 7.4)中の0.5％ Triton X-100での透過処理を行った。最後に、EdUを、Click-iT(登録商標)反応カクテルを用いて検出し、Hoechst 33342で対染色した。染色は、回転ディスクユニットCSU-X1M 5000デュアルカム(Yokagawa)を備えた倒立共焦点顕微鏡Axio Observer Z1(Plan-Apochromat 10x/0.45 M27)(Zeiss)を用いて可視化した。
【０２０２】
組織エンジニアは、異なる生物学的環境を模倣するために、種々の組成で実験するための汎用プラットフォームを必要とする。実際には、有望なアプローチには、しばしば、簡素な設計及び実現可能な方法が含まれる。さらに、潜在的なバイオメディカル応用は、安全なビルディングブロックの使用をも要求する。提示される汎用物理的バイオマトリックス層システムは、非特異的に静電気的に駆動された液液相分離(コアセルベーション)とその後の特異的ペプチド/NCP相互作用を通じたゲル化によって媒介される。この自己組み立てシステムは、たった一つのピペッティングステップによって3Dマトリックスを創造することを可能にする。そのうえ、複数の細胞層のようなより複雑な構造を容易に建設することができる。それもまた、安全なビルディングブロックを使用する：多くの硫酸化オリゴ糖はFDA承認済の化合物である一方、合成ペプチドと最も広範に使用されるバイオポリマーであるPEGとのコンジュゲート化も、生物学的汚染及び免疫原性の両方の潜在的リスクを最小化する。これにより、定義されたバイオマトリックス組成を調整し、動物抽出物由来の大きなタンパク質の従来の2D表面コーティングを補完するための、使いやすい3Dバイオマトリックスシステムが提供される。
【０２０３】
異なるNCPを、バイオマトリックス層中に取り込ませることができ、ECM由来のすべてのNCPをそれらのネイティブな形態での使用することが可能になる。ペプチド及びNCPの濃度を変えることは、化学組成、機械的特性及び形態学に影響を与える。したがって、NCP及びペプチド-starPEG コンジュゲートの異なるビルディングブロックを使用することによって、バイオマトリックスを、異なる細胞タイプの要件に適合するように調整することができる。MSC及びNPCのような初代細胞を培養するための定義された3Dマトリックスフィルムの最適組成が同定され、それらの付着、増殖及び分化のための環境が提供された。
【０２０４】
実施例１４：異なるNCP及び異なるR1ペプチドを有するペプチド-PEGコンジュゲートのコアセルベーションを示す光散乱測定
PEG-KA7及び個別のNCPを含有する溶液の光散乱能力を、PerkinElmer LS45蛍光分光光度計で、500nmで1800秒測定し、500個のデータポイントをサンプリングした。各NCPを、構成成分の各々について5μMの最終濃度になるようにPEG-KA7の溶液に添加した。ベースラインは、PBSバッファー及びPEG-KA7を使用して最初に観察し、三角でマークした。NCP溶液は、定まったベースラインが観察された後、180秒で添加した。光の散乱は、NCPの添加の時点で瞬時に増大し、コアセルベーションの結果としての濁度を示した(図10)。光散乱は、経時的に次第に低減し、コアセルベートの沈着を暗示した。この測定は、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、及びケラタン硫酸のグリコサミノグリカンについてのグリコサミノグリカン-ペプチド相互作用を示す。
【０２０５】
光散乱測定は、異なるR1ペプチドを含む、ヘパリンとのPEG-ペプチドコンジュゲートを用いても実施した(図11)。PEG-R1-KA7及びヘパリンの混合物を含有する溶液の光散乱能力は、PerkinElmer LS45蛍光分光光度計で、500nmで1200秒間、測定した。ヘパリンは、構成成分の各々について5μMの最終濃度になるようにPEG-R1-KA7の溶液に添加した。ベースラインは、PBSバッファー又は5μM PEG-KA7溶液を使用して最初に観察し、三角でマークした。ヘパリン溶液は、定まったベースラインが観察された後、150秒で添加した。光の散乱は、瞬時に増大し、コアセルベーションの結果としての濁度を示した。すべての測定は、NCPについて代表としてヘパリンを有する試験したPEG-R1-KA7コンジュゲートの相互作用を示す。
【０２０６】
実施例１５：ヘパラン硫酸及びKA7-RGDSP-starPEGを含むバイオマトリックス層での初代マウスニューロン前駆細胞(NPC)分化の分析
バイオマトリックス層を、5μMのヘパラン硫酸(ヘパラン)をPEG-RGSP-KA7と混合することによって形成させた。従来のPEGハイドロゲルコーティングは、二つの末端システインを含有するRGDSPペプチド及び4腕-starPEGを使用して、チオマレイミドマイケル型付加によって調製した(図12A)。位相差像は、分化プロトコールの第5日での神経前駆体の差次的成長を示す(図12B)。蛍光像は、両表面上の培養の6日後に、DNAの染色を通じた核(Hoechst)、ニューロン細胞(微小管関連タンパク質2ab(Map2ab))、及び星状細胞(グリア線維酸性タンパク質(GFAP))細胞をハイライトする。スケールバーは100μmである。画像分析の結果は、(図12C)細胞数、総細胞カウントに関しての、(図12D)MAP2ab陽性細胞の率及び(E)GFAP陽性細胞の率として示す。データは、独立した単離から由来する二つの初代細胞株と並行して3連で行った2回の独立した実験からの平均 ± SEMを表す。細胞数は、t-テストによるt（19）＝5.73の非常に有意なレベルでヘパランバイオマトリックスコーティングの方が高い。Map2ab陽性ニューロンの比率は増大した(t(19)＝2.74)のに対し、PEG-RGDSPゲルと比較してより少ないGFAP陽性星状細胞がヘパランバイオマトリックスで検出される(t(19)＝2.15)。
【０２０７】
実施例１６：10％ FBSを含有する標準培地及び無血清培地で増殖された初代ヒト間葉系間質細胞(MSC)の分析.
初代ヒト間葉系間質細胞(MSC)は、標準的な血清含有培地(10％ FBS、DMEM GlutaMax中, Invitrogen)中で3日間培養し、バイオマトリックス層又はプラスチックで成長させた場合で、細胞の倍加時間を、定義された無血清培地(StemPro, Invitrogen)と比較した。細胞の倍加時間は、以下の式に従って算出した：
Td =(tday3-tday1) x log(2)/log(Nday3/Nday1)
（式中、tは細胞カウントの時点を表し、Nはカウントされた細胞数を表す。）。
【０２０８】
バイオマトリックス層は、NCP デキストラン硫酸、及びPEG-ペプチドコンジュゲートの異なる混合物から作製した。一つのバイオマトリックス層は、
【化１１】
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をPEG-KA7と、1:1比で混合することによって作製した。2番目のバイオマトリックス層は、
【化１２】
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及び2.5μM
【化１３】
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を混合することによって作製した。MSCは、7,000細胞/cm2で播種した。第一のセットのサンプルは、4％ PFAを使用して培養24時間後(第1日)に固定した。第二のセットのサンプルは、培養約72時間後(第3日)に固定した。細胞は、Hoechst33342(1:4000、Invitrogen)及びCellMaskGreen(1:5000、Invitrogen)で染色した。画像を取得し、BioTek Lionheart FX 自動顕微鏡(10x対物)及びGen5ソフトウェア(バージョン3.03)を使用して細胞数について分析した。倍加時間の算出のために、第1日及び第3日の間の正確な間隔を利用した。
【０２０９】
結果(図13)は、血清含有培地を使用する場合、すべての表面で均一な細胞成長及び同様の倍加時間を示す。無血清培養条件において、プラスチック表面は、細胞コロニーの創出及び細胞が培養の3日以内に減少したことによる定量不能な倍加時間によって示されるように、MSCの成長に好適な環境を提供しなかった。結論として、提示されたペプチドの両混合物を用いるバイオマトリックス層は、無血清培地でのMSC増殖を可能にする定義された環境を提供する。
【０２１０】
実施例１７：５継代の培養後のヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)のフローサイトメトリーによる幹細胞性マーカー発現の分析
誘導多能性幹細胞(iPSC)、CRTD-1株を、5μM ヘパリンと2.5μM
【化１４】
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及び2.5μM
【化１５】
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との混合物から作製したバイオマトリックス層上に播種した。9μg/mLマトリゲル(登録商標)(Corning)溶液から調製したコーティングを比較のために使用した。mTeRS(STEMCELL technologies)を培養培地として使用した。70〜80％コンフルエントになった際、iPSCを、剥離のためにAccutase(Invitrogen)を使用することによって1:4〜1:20の分割比で新規表面上に分割した。TRA1-60、SSEA4、Sox2、及びOct4に対する一次抗体を含有するPSC 4-Marker 免疫細胞化学キット(Molecular probes, ThermoFisher)を使用して、LSR IIフローサイトメーター(BD)を使用するフローサイトメトリー分析のために、固定された細胞を染色した。抗体は、製造業者によって指示されるように1:100希釈で適用した。結果を図14に示す。
【０２１１】
実施例１８：培養5日後のヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)から由来する神経前駆細胞(NPC)の免疫細胞化学による幹細胞性マーカー発現の分析
ヒト誘導多能性幹細胞から由来する神経前駆細胞(NPC)を、標準増殖条件で培養した。増殖培地は、DMEM及びNeurobasal培地(Invitrogen)を1:1の比で混合し、1％ B27、0.05％ N2、2％グルタミン及び2％Pen/Strep(すべてInvitrogen)を添加することによって調製した。さらに、CHIR 99021(3μM 最終濃度、Axon MedChem)、アスコルビン酸(最終濃度200μM, SigmaAldrich)及びPumorphamine(最終濃度0.5μM, Santa Cruz)を添加した。培養5日後、細胞を、4％ PFAで固定し、Hoechst33342(1:4000、Invitrogen)、Sox1(1:300、R&D)及びPax6(1:300、Biolegend)で染色した。AF488及びCy3の蛍光標識を有する二次抗体は、Dianovaから購入し、1:500希釈で使用した。BioTek Lionheart FX自動顕微鏡(10x objective)を使用して画像を取得し、細胞カウント(Hoechstシグナル)、及びSox1及びPax6の蛍光シグナル強度についてGen5ソフトウェア(バージョン3.03)を用いて分析した。結果は、マトリゲルでコーティングした表面と比較してバイオマトリックス層上の有意に多数の、幹細胞性マーカーSox1及びPax6について陽性の細胞を示す。結果を図15に示す。
【０２１２】
実施例１９：抗Tuj1抗体での免疫細胞化学染色によって示される、ニューロンへの分化10日後の、ヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)から由来する神経前駆細胞(NPC)の蛍光像
NPCは、5μM デルマタン硫酸と、表2に掲載するペプチドライブラリーの単一又は異なる二つのペプチド配列を含む5μMのPEG-R1-KA7との混合物から作製されたバイオマトリックス層上で最初に増殖させた。増殖2日後、培地を6日間パターニング培地に変更し、その後4日間、成熟培地に変更した。細胞は、4％ PFAで固定し、蛍光像で提示されるように抗Tuj1抗体で染色した。5つの示される画像は、ニューロン伸長を促進した機能的 R1配列を提示する。スケールバーは100μmである。R1ペプチドライブラリーは、ヒト誘導多能性幹細胞から由来する、神経前駆細胞(NPC)のニューロン発生を促進する機能的ペプチド配列を同定するために使用した。すべてのバイオマトリックス表面は、5μMのヘパラン硫酸及び5μMのPEG-R1-KA7のストック溶液から調製した。
【０２１３】
最初に、NPCを、25,000細胞/cm2で播種し、増殖条件で培養した。増殖培地は、 CHIR 99021(最終濃度3μM、Axon MedChem)、アスコルビン酸(最終濃度200μM、SigmaAldrich)及びPumorphamine(最終濃度0.5μM、Santa Cruz)を基本培地(1:1の比のDMEM及びNeurobasal培地(Invitrogen)、1％ B27、0.05％ N2、2％グルタミン及び2％ Pen/Strep(すべてInvitrogen) に添加することによって調製した。増殖2日後、培地をパターニング培地(アスコルビン酸(最終濃度200μM)、Pumorphamine(最終濃度0.5μM)、GDNF(1 ng/mL, PeproTech)、及びBDNF(2ng/mL, PeproTech)を補充した基本培地)に交換し、さらに2日ごとに培地を交換した。6日後、培地を、成熟培地(アスコルビン酸(200μM)、TGF-β3(1ng/mL、PeproTech)、DBcAMP(100μM、Santa Cruz)、DAPT(5μM、Biomol)、GDNF(1ng/mL)、及びBDNF(2ng/mL)を補充した基本培地)に交換し、2日後に培地を交換した。細胞を4％ PFAで固定し、Hoechst33342(1:4000、Invitrogen)、マウス抗beta3チューブリン/Tuj1一次抗体(1:400、R and D Systems)及びAF488蛍光標識を有する抗マウス二次抗体(1:500、Dianova)で染色した。画像は、Gen5ソフトウェア(バージョン3.03)を有するBioTek Lionheart FX自動顕微鏡(10x対物)を使用して取得した。結果は、配列番号81、190、237、317を有するペプチド配列、及び17及び314の1:1比の混合物を含むバイオマトリックス層上でのニューロン細胞の発生を示す。結果を図16に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月2日(2020.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2020524004.tif 000037
2020524004.tif 000038