(57)【要約】  心不全（ＨＦ）を有する被験者は、血栓症を発症するリスクがより高い。したがって、本発明者らは、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）患者におけるトロンビン生成能を決定した。それらの前向き試験は、３４人の急性非代償性心不全患者及び３０人の心不全を有さない対照入院患者を含んでいた。対照と比較して、多血小板血漿を使用した内因性トロンビン生成能（ＥＴＰ）は、急性非代償性心不全患者において入院時により高く、入院期間中に増加したままであった。フォンヴィルブランド因子、第ＶＩＩＩ因子、及び内皮プロテインＣ受容体をはじめとする内皮機能障害の可溶性マーカーは、急性非代償性心不全患者において入院時にはより高かった。ＤＮＡ−ヒストン複合体の血漿中レベルは、対照と比較して、急性非代償性心不全患者において入院時に有意に上昇していた。より高い濃度のアネキシンＶ／組織因子（ＴＦ）陽性の内皮由来細胞外小胞もまた、対照と比較して、急性非代償性心不全患者において入院時に認められた。知見は、内因性トロンビン生成能と内皮機能障害の測定値を組み合わせた、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）患者におけるトロンビン生成能の決定法が、患者を層別化するのに、したがって、処置を方向付け、患者の経過観察をするのに、特に価値があることを実証する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）患者から得られた血液試料のトロンビン生成能を決定する工程、ｉｉ）内皮機能障害の少なくとも１つの可溶性バイオマーカーのレベルを決定する工程、ｉｉｉ）工程ｉ）で決定された能力及び工程ｉｉ）で決定されたレベルを、それらのそれぞれの所定の基準値と比較する工程、並びにｉｖ）トロンビン生成能及び内皮機能障害の可溶性マーカーのレベルの両方が、それらのそれぞれの所定の基準値よりも高い場合に、患者は凝固亢進状態を示すと結論付ける工程を含む、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）患者が凝固亢進状態を示しているかどうかを同定するための方法。
【請求項２】
血液試料が、多血小板血漿（ＰＲＰ）試料又は乏血小板血漿試料である、請求項１の方法。
【請求項３】
トロンビン生成能が、校正自動トロンボグラム（ＣＡＴ）アッセイによって決定される、請求項１の方法。
【請求項４】
患者から得られた血液試料中の内因性トロンビン生成能（ＥＴＰ）を決定する工程、及び前記の数値を所定の基準値と比較する工程を含む、請求項３の方法。
【請求項５】
活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）を血液試料に加え、トロンビン生成を５０％抑制するＡＰＣ濃度をこのようにして決定し、所定の基準値と比較する、請求項３の方法。
【請求項６】
フォンヴィルブランド因子、第ＶＩＩＩ因子、内皮プロテインＣ受容体、組織因子経路阻害剤、内皮由来細胞外小胞、及び患者から得られた血液試料中に循環しているＤＮＡ−ヒストン複合体からなる群より選択された内皮機能障害の少なくとも１つの可溶性マーカーのレベルを決定する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項７】
内皮組織因子＋及び／又はアネキシンＶ＋の細胞外小胞のレベルを決定する工程を含む、請求項６の方法。
【請求項８】
急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）患者に再入院のリスクがあるかどうかを決定するための、請求項１の方法の使用。
【請求項９】
患者が、抗凝固剤による処置に適格であるかどうかを決定するための、請求項１の方法の使用。
【請求項１０】
抗凝固剤が、第Ｘａ因子阻害剤、デオキシリボヌクレアーゼ、及びＰ−セレクチンアンタゴニストからなる群より選択される、請求項９の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）患者が凝固亢進状態を示すかどうかを同定するための方法に関する。
【０００２】
発明の背景：
神経ホルモンモジュレーターをはじめとする近年の治療法で観察される利点にも関わらず、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）で入院した患者の予後は依然として悪く、再入院率は６カ月後で約５０％であり１、１年後の死亡率は最大３０％である２。この非常に好ましくない予後は、血栓塞栓事象によって一部影響を受け、血栓塞栓事象は患者の最大３０％に起こり、しばしば死亡原因である３。これらの疫学的知見は、心不全（ＨＦ）患者における凝固亢進状態の原因となり得る複数の機序、例えば、可溶性凝血促進因子の増強、内皮機能障害、又は炎症などによって支持される４、５。それ故、血栓機序は、心不全における興味深い治療標的候補として出現し得る５、６。ワーファリンを用いた複数のビタミンＫ依存性凝固因子の非選択的枯渇よりもむしろ、新規な経口抗凝固剤を用いた標的化されたトロンビン生成の低減の方が有望であり得る。約５０００人の患者を含むこのような無作為試験ＣＯＭＭＡＮＤＥＲ−ＨＦが進行中であり、急性非代償性心不全からの退院直後に第Ｘａ因子阻害剤リバーロキサバンを用いた抗凝固療法を開始する６。このような研究を支援するために、急性非代償性心不全患者における過剰なトロンビン生成の生物学的評価、及び、選択された患者を含みかつ精巧な試験を使用した長期的な研究におけるトロンビン形成に至る機序のより良い理解が必要とされる。
【０００３】
内皮の損傷が、急性非代償性心不全の発病の原因となるというエビデンスが増えつつある。内皮は、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）経路によって支持されるその天然の抗凝固機能と、誘発される凝血促進活性との間のバランスを通して血管の恒常性を維持する際にその機能を発揮する。内皮表面においてトロンビンがトロンボモジュリン（ＴＭ）に結合すると、プロテインＣが活性化され、この反応は、プロテインＣが内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）に結合すると促進される。この内皮依存性活性化プロテインＣ経路の破壊が、マウスの急性非代償性心不全における心内膜血栓症を促進することが報告されている７。進行した内皮機能を反映する、高いレベルの内皮由来細胞外小胞（ｅＥＶ）は、心不全患者における心血管事象の独立した予測因子である８。これはまた、心不全における内皮の凝血促進特性も支持する。最後に、様々な疾患において放出される、好中球細胞外トラップは、内皮細胞の損傷を誘発し、組織因子経路阻害剤、プロテインＣ、及びトロンボモジュリンなどの内皮依存性抗凝固系をタンパク質分解する。
【０００４】
発明の要約：
本発明は、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）患者が凝固亢進状態を示すかどうかを同定するための方法に関する。特に、本発明は特許請求の範囲によって定義される。
【０００５】
発明の詳細な説明：
心不全（ＨＦ）を有する被験者は、血栓症を発症するリスクがより高い。したがって、本発明者らは、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）患者におけるトロンビン生成能を決定した。本発明者らの前向き試験は、３４人の急性非代償性心不全患者及び３０人の心不全を有さない対照入院患者を含んでいた。インビトロにおけるトロンビン生成、及び活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）によるトロンビンのダウンレギュレーションは、入院時、退院日、及び臨床的に少なくとも６週間安定した後に、校正自動トロンボグラムによってモニタリングされた。循環中の内皮由来細胞外小胞（ｅＥＶ）はフローサイトメトリーによって定量された。循環中のＤＮＡ−ヒストン複合体レベルはＥＬＩＳＡによって定量された。対照と比較して、多血小板血漿を使用した内皮トロンビン生成能（ＥＴＰ）は、急性非代償性心不全患者において入院時により高く、入院期間中は増加したままであった。臨床的に６週間安定した後、内因性トロンビン生成能の数値は、対照の数値まで低下した。トロンビン生成を５０％抑制する活性化プロテインＣ濃度は、退院後の期間と比較して、入院時にはより高かった。フォンヴィルブランド因子、第ＶＩＩＩ因子、及び内皮プロテインＣ受容体をはじめとする内皮機能障害の可溶性マーカーは、急性非代償性心不全患者において入院時により高かった。ＤＮＡ−ヒストン複合体の血漿中レベルは、対照と比較して、急性非代償性心不全患者において入院時に有意に上昇し、退院後の時点において有意に低下した。より高い濃度（５倍増加）のアネキシンＶ／組織因子（ＴＦ）陽性の内皮由来細胞外小胞もまた、対照と比較して、急性非代償性心不全患者において入院時に認められ、退院後の時点において有意に低下した。組織因子陽性の内皮由来細胞外小胞の濃度は、内因性トロンビン生成能と正に相関した。凝血促進性の内皮由来細胞外小胞及び第ＶＩＩＩ因子の上昇をもたらす進行した内皮機能障害は、トロンビン生成を増加させ、非代償性心不全の急性期における活性化プロテインＣ経路によるダウンレギュレーションを弱める。知見は、内因性トロンビン生成能と内皮機能障害の測定値を組み合わせた、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）患者におけるトロンビン生成能の決定法が、患者を層別化するのに、したがって、処置を方向付け、患者の経過観察をするのに、特に価値があることを実証する。
【０００６】
したがって、本発明の第一の目的は、ｉ）患者から得られた血液試料のトロンビン生成能を決定する工程、ｉｉ）内皮機能障害の少なくとも１つの可溶性バイオマーカーのレベルを決定する工程、ｉｉｉ）工程ｉ）で決定された能力及び工程ｉｉ）で決定されたレベルを、それらのそれぞれの所定の基準値と比較する工程、並びにｉｖ）トロンビン生成能及び内皮機能障害の可溶性マーカーのレベルの両方が、それらのそれぞれの所定の基準値よりも高い場合に、患者は凝固亢進状態を示すと結論付ける工程を含む、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）患者が凝固亢進状態を示すかどうかを同定するための方法に関する。
【０００７】
本明細書において使用する「心不全」という用語は、生体の需要を満たすに十分な血流を心臓が供給できないことを示し、この病態は、医術において十分に説明されている。本明細書において使用する「急性心不全」という用語は、突然発症する心不全を示し、慢性心不全の既往があるか又は慢性心不全がなかった患者に突然発症し、症状が悪化し、入院が必要となるエピソードを指す。急性心不全に起因する合併症の一般的な症状としては、肺うっ血に起因する呼吸困難、又は心拍出量低下に起因する心原性ショック、易疲労性（運動耐容能低下）、末梢浮腫、全身浮腫（明白な全身性の浮腫）、夜間頻尿（頻繁な夜間の排尿）、徐脈、心ブロック、低血圧、眩暈、失神、糖尿病、乏尿、又は無尿、低カリウム血症、気管支痙攣、冷汗、及び喘息が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書において使用する「急性非代償性心不全」すなわち「ＡＤＨＦ（acute decompensated herat failure）」は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、心不全を患っている患者が、相対的に安定した期間の後に疾患の兆候及び症状の増加を経験する状態を指す（Allen and O'Connor, CMAJ 176(6):797-805, 2007）。
【０００８】
本明細書において使用する「凝固亢進状態」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、同年齢の対照被験者と比較して血液凝固（凝血）傾向が異常に増加している容態についての医学用語を指す。特に、凝固亢進状態は、患者の血栓症のリスクが高いことを示す。本明細書において使用する「血栓症」という用語は、循環系を通る血流を閉塞させる、血管内の血餅の形成を指す。したがって、「血栓症」という用語は、とりわけ、萎縮性血栓症、動脈血栓症、心臓血栓症、冠動脈血栓症、移行性血栓症、腸間膜血栓症、胎盤血栓症、増幅性血栓症、外傷性血栓症、及び静脈血栓症を含む。
【０００９】
「血液試料」という用語は、患者から得られた全血試料を意味する。例えば、患者からの血液は、標準的な静脈穿刺手順に従って、０．１０６Ｍのクエン酸ナトリウムを含有しているバキュテナー中に採取され得る。いくつかの実施態様では、血液試料は、多血小板血漿（ＰＲＰ）試料又は乏血小板血漿試料である。例えば、多血小板血漿（ＰＲＰ）は、次いで、１９０ｇで１０分間（室温）での遠心分離、その後のＰＲＰ層のピペット操作によって得ることができる。
【００１０】
本発明によると、トロンビン生成能は、当技術分野において周知である任意の方法によって決定される。例えば、Hemker及び共同研究者によって例えば開発された、校正自動トロンボグラム（ＣＡＴ）アッセイを使用して、血漿中のトロンビン生成が正確に測定される（Hemker HC, Giesen P, Al Dieri R, Regnault V, de Smedt E, Wagenvoord R, Lecompte T, Beguin S. Calibrated automated thrombin generation measurement in clotting plasma. Pathophysiol Haemost Thromb. 2003;33(1):4-15）。校正自動トロンボグラムは、蛍光発生基質の分離をモニタリングし、それを、凝固していない平行試料中の一定の既知のトロンビン活性と比較することによる、血小板を有する又は有さない凝固中の血漿（多血小板血漿／乏血小板血漿、ＰＲＰ／ＰＰＰ）中のトロンビン濃度を示す。典型的には、したがって、時間に対するトロンビン活性は、トロンボグラム（商標）（ＴＧ）曲線として提示され、これは微量のトロンビンを生じる初期相、その後の活性のバーストによって特徴付けられる。血液は、バーストの初っ端に血餅を形成し、血餅が形成された後にほぼ全てのトロンビンが形成される。したがって、トロンボグラム（商標）は、ラグタイム、増幅相、ピークまでの時間、及びトロンビンピーク、及び内因性トロンビン生成能を含む、様々な相を示す。本明細書において使用する「ラグタイム」という用語は、トロンビンバーストが開始するまでに要する時間（分）を示すことを意味する。本明細書において使用する「ピークまでの時間」（分）という用語は、反応開始から最大値に到達する瞬間までの時間を意味する。本明細書において使用する「トロンビンピーク」（nM）という用語は、試験試料に対するアッセイ中に達成された最大トロンビン活性を意味する。本明細書において使用する「ＥＴＰ（Endogenous Thrombin Potential）」すなわち「内因性トロンビン生成能」という用語は、曲線下面積（nM．分）に相当する、（ほぼ）ゼロのトロンビン活性が達成される瞬間までの曲線の時間積分を意味する（例えば、欧州特許第０４２０３３２−Ｂ１号、欧州特許第０８０２９８６−Ｂ１号、及びHemker et al. (1993) Thromb. Haemostasis 70: 617-624を参照）。したがって、内因性トロンビン生成能は、血漿中で作動している凝固促進力と抗凝固力との間のバランスを示し、好ましくは、患者のトロンビン生成能を決定するために計算される。内因性トロンビン生成能を決定するための以前から公知である評価法としては、Hemker et al. (1993) Thromb. Haemost 70: 617-624；及び国際公開公報第２００４／０１６８０７−Ａ１号に開示されている方法が挙げられ、典型的には実施例に記載の方法が挙げられる。したがって、いくつかの実施態様では、本発明の方法は、患者から得られた血液試料中の内因性トロンビン生成能を決定する工程、及び前記の数値を所定の基準値と比較する工程を含む。いくつかの実施態様では、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）を血液試料に加え、トロンビン生成を５０％抑制する活性化プロテインＣ濃度をこのように決定し、実施例に記載のような所定の基準値と比較する。
【００１１】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、フォンヴィルブランド因子、第ＶＩＩＩ因子、内皮プロテインＣ受容体、組織因子経路阻害剤、内皮由来細胞外小胞、及び患者由来の血液試料中に循環しているＤＮＡ−ヒストン複合体からなる群より選択された内皮機能障害の少なくとも１つの可溶性マーカーのレベルを決定する工程を含む。
【００１２】
本明細書において使用する「フォンヴィルブランド因子」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＮＣＢＩリファレンス配列ＮＰ＿０００５４３によって特徴付けられるヒトフォンヴィルブランド因子に由来する、血液試料中に存在する任意の可溶性ポリペプチドを指す。
【００１３】
本明細書において使用する「第ＶＩＩＩ因子」すなわち「ＦＶＩＩＩ」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＮＣＢＩリファレンス配列ＡＡＡ５２４８４．１によって特徴付けられるヒト第ＶＩＩＩ因子に由来する血液試料中に存在する任意の可溶性ポリペプチドを指す。
【００１４】
本明細書において使用する「活性化プロテインＣ」すなわち「ＡＰＣ（activated protein C）」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＮＣＢＩリファレンス配列ＮＰ＿０００３０３によって特徴付けられるヒト活性化プロテインＣに由来する血液試料中に存在する任意の可溶性ポリペプチドを指す。
【００１５】
本明細書において使用する「内皮プロテインＣ受容体」すなわち「ＥＰＣＲ（endothelial protein C receptor）」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＮＣＢＩリファレンス配列ＮＰ＿００６３９５によって特徴付けられるヒトＥＰＣＲに由来する血液試料中に存在する任意の可溶性ポリペプチドを指す。
【００１６】
本明細書において使用する「組織因子経路阻害剤」すなわち「ＴＦＰＩ（tissue factor pathway inhibitor）」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＮＣＢＩリファレンス配列ＮＰ＿００１０２７４５２によって特徴付けられるヒト組織因子経路阻害剤に由来する血液試料中に存在する任意の可溶性ポリペプチドを指す。
【００１７】
可溶性マーカーのレベルを決定する標準的な方法は典型的には、患者から得られた血液試料を、該マーカーに特異的な結合対と接触させる工程を含む。いくつかの実施態様では、結合対は、特異的な可溶性マーカーに対して指向される、ポリクローナル又はモノクローナル、好ましくはモノクローナルであり得る抗体であり得る。本発明のポリクローナル抗体又はその断片は、公知の方法に従って、適切な抗原又はエピトープを、例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、及びとりわけマウスから選択された宿主動物に投与することによって発生させ得る。当技術分野において公知である様々なアジュバントを使用して、抗体の生成を増強させることができる。本発明の実施に有用な抗体はポリクローナルでもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、連続的な細胞株の培養によって抗体分子の生成をもたらす、任意の技術を使用して調製及び単離され得る。生成及び単離のための技術としては、ハイブリドーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術；及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、結合対はアプタマーであり得る。アプタマーは、分子認識に関して抗体の代替選択肢である分子のクラスである。アプタマーは、高い親和性及び特異性で任意のクラスの標的分子を実質的に認識する能力を有する、オリゴヌクレオチド配列又はオリゴペプチド配列である。このようなリガンドは、ランダム配列ライブラリーの指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）を通して単離されてもよい。いくつかの実施態様では、本発明の結合対を、検出可能な分子若しくは物質、例えば発色基質、蛍光分子、放射性分子、又は当技術分野において公知の任意の他の標識を用いて標識する。一般的にシグナルを（直接的又は間接的にのいずれかで）与える標識は当技術分野において公知である。本明細書において使用する、抗体又はアプタマーに関する「標識された」という用語は、検出可能な物質、例えば放射性物質、酵素（例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）又はフルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はフィコエリトリン（ＰＥ）又はヨードシアニン（Ｃｙ５）又はアロフィコシアニン）を、抗体又はアプタマーに結合（すなわち物理的に連結）させることによって抗体又はアプタマーを直接標識することだけでなく、検出可能な物質との反応性によってプローブ又は抗体を間接的に標識することも包含することを意図する。本発明の抗体又はアプタマーは、当技術分野において公知の任意の方法によって放射性分子を用いて標識され得る。例えば、放射性分子としては、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばＩ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、表面マーカーに対する抗体は、すでにフルオロフォア（例えばＦＩＴＣにコンジュゲート及び／又はフィコエリトリンにコンジュゲート又はアロフィコシアニン）にコンジュゲートされている。
【００１８】
前記のアッセイは、固相支持体への結合対（すなわち抗体又はアプタマー）の結合を含み得る。本発明の実施に使用することのできる固相支持体としては、基質、例えばニトロセルロース（例えば膜又はマイクロタイターウェルの形状）；ポリ塩化ビニル（例えばシート又はマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えばビーズ又はマイクロタイタープレート）；フッ化ポリビニリデン；ジアゾ化ペーパー；ナイロン膜；活性化ビーズ、磁気反応性ビーズなどが挙げられる。固相表面は好ましくはビーズである。細胞外小胞はほぼ０．１〜１μmの直径を有するので、本発明に使用するためのビーズは１μmより大きい直径を有するべきである。ビーズは、ガラス、プラスチック、ポリスチレン及びアクリルなどであるがこれらに限定されない、様々な材料から構成され得る。さらに、ビーズは好ましくは蛍光標識されている。いくつかの実施態様では、ＥＬＩＳＡ法（酵素結合免疫吸着アッセイ）が使用され、ここでのマイクロタイタープレートのウェルは、関心対象の該可溶性マーカーを認識する一組の抗体でコーティングされている。次いで、血液試料をコーティングされたウェルに加える。抗体−抗原複合体の形成を可能とするに十分なインキュベーション期間の後、プレート（群）を洗浄して非結合部分を除去し、検出可能なように標識された二次結合分子を加える。二次結合分子を、あらゆる捕捉された試料中マーカータンパク質と反応させ、プレートを洗浄し、二次結合分子の存在を、当技術分野において周知である方法を使用して検出する。
【００１９】
本明細書において使用する「細胞外小胞」すなわち「ＥＶ（extracellular vesicle）」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、アポトーシスを受けた細胞又は活性化された細胞から剥がれた形質膜小胞を示す。細胞外小胞のサイズの直径の範囲は０．１μmから１μmである。細胞外小胞の表面マーカーは、それらが起源とする細胞と同じである。本明細書において使用する「内皮由来細胞外小胞」という用語は、内皮細胞に由来する細胞外小胞を指す。特に内皮由来細胞外小胞は、組織因子（ＴＦ）及びアネキシンＶの発現によって特徴付けられる。したがって、いくつかの実施態様では、本発明の方法は、内皮組織因子＋及び／又はアネキシンＶ＋の細胞外小胞のレベルを決定する工程を含む。血液試料中の細胞外小胞のレベルを決定するための標準的な方法は、当技術分野において周知である。例えば、該方法は、患者から細胞外小胞の個体群を収集する工程、及び該細胞外小胞の特異的表面マーカーに対して指向される様々な結合対を使用する工程からなり得、ここでの細胞外小胞は、該結合対によって該表面マーカーに結合している。本発明によると、フローサイトメトリー法は、患者から得られた血液試料中の細胞外小胞のレベルを決定するための好ましい方法である。それ故、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、血液試料中の所望の細胞外小胞を分離することができる。別の実施態様では、磁気ビーズを使用して、細胞外小胞を単離することができる（磁気細胞分離装置）（ＭＡＣＳ））。例えば、特異的モノクローナル抗体で標識されたビーズを、細胞外小胞の正の選択のために使用し得る。他の方法としては、細胞外小胞ではない成分の枯渇よる細胞外小胞の単離を含み得る（負の選択）。例えば、細胞外小胞を４８８nmの波長の光で励起させ得、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリトリン、及びアロフィコシアニンの対数的な緑色及び赤色の蛍光を、５３０/３０nm、５８５/４２nm、及び６６０/２０nmのバンドバスフィルターをそれぞれ通して測定し得る。次いで、細胞外小胞の絶対数を、本発明の方法を実施するのに有用な特別なソフトウェアを通して計算し得る。したがって、具体的な実施態様では、本発明の方法は、上記のように血液試料を入手する工程；前記の調製された試料を容器に入れる工程；関心対象の細胞外小胞に特異的な表面マーカーに対する標識された抗体と、既知濃度の蛍光固相表面の両方を加える工程；調製された試料に対してＦＡＣＳ分析を実施して、その中の細胞外小胞の絶対数を計算する工程を含む。
【００２０】
本明細書において使用する「ＤＮＡ−ヒストン複合体」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＤＮＡと、ヒストンをはじめとする核内タンパク質と、及びネトーシス（NETosis）と呼ばれる複雑な細胞死シグナル伝達経路の最中に好中球から放出される顆粒タンパク質との繊維状ネットワークを指す。したがって、いくつかの実施態様では、本発明の方法は、ＤＮＡ−ヒストン複合体の循環中レベルを決定する工程を含む。これらの複合体のレベルを決定するための標準的な方法はＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）法であり、ここでのマイクロタイタープレートのウェルは、ヒストンを認識する一組の抗体でコーティングされている。次いで、血液試料をコーティングされているウェルに加える。抗体−抗原複合体の形成を可能とするに十分なインキュベーション期間の後、プレート（群）を洗浄して非結合部分を除去し、検出可能なように標識された抗ＤＮＡ抗体を加える。抗ＤＮＡ抗体を、あらゆる捕捉された試料中マーカータンパク質と反応させ、プレートを洗浄し、抗ＤＮＡ抗体の存在を、当技術分野において周知である方法を使用して検出する。
【００２１】
典型的には、所定の基準値は、閾値又はカットオフ値である。典型的には、「閾値」又は「カットオフ値」は、実験で、経験的に、又は理論的に決定され得る。閾値はまた、当業者には認識されているであろうように、既存の実験条件及び／又は臨床条件に基づいて任意に選択されてもよい。例えば、適切に寄託された過去の患者の試料中のトロンビン生成能又は可溶性マーカーのレベルの後向き測定を、所定の基準値の確立に使用し得る。試験の関数及びベネフィット／リスクのバランス（偽陽性及び偽陰性の臨床結果）に従って、最適な感度及び特異度を得るように、閾値は決定されなければならない。典型的には、最適な感度及び特異度（及びまた閾値）は、実験データに基づいた受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して決定され得る。例えば、リファレンス群における発現レベルを定量した後、試験される予定の試料において決定されたレベルの統計学的処理のためのアルゴリズム分析を使用し、これにより、試料の分類について有意性を有する分類標準物質を得ることができる。ＲＯＣ曲線の正式名は、受信者動作特性曲線であり、これは、受信者操作特性曲線としても知られている。それは主に、生化学的臨床診断試験のために使用される。ＲＯＣ曲線は、真の陽性率（感度）及び偽の陽性率（１−特異度）の連続変数を反映する総合的な指標である。ＲＯＣ曲線は、画像合成法を用いて感度と特異度の間の関係を明らかとする。一連の様々なカットオフ値（閾値又は臨界値、すなわち、診断試験の正常な結果と異常な結果との間の境界値）が、一連の感度及び特異度の数値を計算するための連続変数として設定される。次いで、曲線を描くために、感度は縦軸座標として使用され、特異度は横軸座標として使用される。曲線下面積（ＡＵＣ）が高くなればなるほど、診断の正確度は高くなる。ＲＯＣ曲線上では、座標図のはるか左上に最も近い点は、高い感度と高い特異度の数値の両方を有する臨界点である。ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値は、１．０〜０．５である。ＡＵＣが０．５を上回る場合、ＡＵＣが１に近づくほど、診断結果はより良好となる。ＡＵＣが０．５〜０．７である場合、正確度は低い。ＡＵＣが０．７〜０．９である場合、正確度は中程度である。ＡＵＣが０．９より高い場合、正確度は極めて高い。このアルゴリズム法は、好ましくはコンピューターを用いて実施される。当技術分野における既存のソフトウェア又はシステムをＲＯＣ曲線の描写のために使用し得る：例えば、ＭｅｄＣａｌｃ９．２．０．１医学統計ソフトウェア、ＳＰＳＳ９．０、ＲＯＣＰＯＷＥＲ．ＳＡＳ、ＤＥＳＩＧＮＲＯＣ．ＦＯＲ、ＭＵＬＴＩＲＥＡＤＥＲ ＰＯＷＥＲ．ＳＡＳ、ＣＲＥＡＴＥ−ＲＯＣ．ＳＡＳ、ＧＢ ＳＴＡＴ ＶＩ０．０（ダイナミック・マイクロシステムズ社、シルバースプリング、メリーランド州、米国）など。いくつかの実施態様では、１つの任意定量値に対してだけでなく、一連の連続的な任意定量値に対しての、高い統計学的有意値（例えば低いＰ値）が得られる。したがって、いくつかの実施態様では、確定的な所定の基準値を使用する代わりに、一連の数値が与えられる。それ故、統計学的に有意な最小値（有意な最小閾値、例えば、最大閾値Ｐ値）は任意に設定され、工程ｇ）で計算された統計学的有意値がより高い（より有意である、例えばより低いＰ値）、一連の複数の任意の定量値が保持され、これにより、一連の定量値が与えられる。このような定量値の範囲は、上記のような「カットオフ」値を含む。例えば、「カットオフ」値のこの具体的な実施態様によると、患者の状態は、能力又はレベルを、同定されている数値の範囲と比較することによって決定され得る。いくつかの実施態様では、したがって、カットオフ値は、最も統計学的有意性が高い数値が見られる（例えば一般的に最小Ｐ値が見られる）定量値に例えば中心が置かれた一連の定量値からなる。例えば、１〜１０の仮定的な尺度で、理想のカットオフ値（最も高い統計学的有意性を有する数値）が５である場合、適切な（例示的な）範囲は４〜６であり得る。例えば、患者は、能力又はレベルを決定することによって得られた数値を比較することによって評価され得、ここでは５より大きな数値は、患者が凝固亢進状態を示すことを明らかとし、５未満の数値は患者が凝固亢進状態の特色を示さないことを明らかとする。いくつかの実施態様では、患者は、能力又はレベルを測定することによって得られた数値を比較し、尺度で数値を比較することによって評価され得、ここでは、４〜６の範囲を上回る数値は患者が凝固亢進状態を示すことを示し、４〜６の範囲を下回る数値は患者が凝固亢進状態を示さないことを示し、４〜６の範囲内に該当する数値は、患者が凝固亢進状態にあると結論付けるためにはさらなる研究が必要とされることを示す。
【００２２】
本発明の方法は、患者に再入院するリスクがあるかどうかを決定するのに特に適している。本明細書において使用する「再入院」という用語は、心不全のために入院したことがあり、かつ再度入院する患者を示す。この脈絡において、患者は、同じ疾患のために再度入院する。換言すれば、「再入院」という用語は心不全に因るさらなる入院を示す。
【００２３】
本発明の方法はまた、患者が、抗凝固剤による処置に適格であるかどうかを決定するのに特に適している。本明細書において使用する「抗凝固剤」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、血液凝固を予防又は抑制することのできる化合物を指す。様々な化合物が、凝固カスケードの１つ以上の酵素又は補助物質に影響を及ぼす抗凝固剤として記載されている。例えば、クマリンは、トロンビン及び第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び第Ｘ因子の活性のための補助物質として必要とされる活性型ビタミンＫを生物から枯渇させる、植物由来のビタミンＫアンタゴニストである。典型的なクマリンとしては、ワーファリン、アセノクマロール、フェンプロクモン、アトロメンチン、ブロディファクム、又はフェニンジオンが挙げられる。ヘパリンは高度に硫酸化されているグリコサミノグリカンであり、別のクラスの天然抗凝固剤に似ている。ヘパリンは、トロンビン及び凝固カスケードの他の酵素（第Ｘａ因子を含む）の活性を遮断するアンチトロンビンを活性化し、これにより、フィブリン塊の形成を抑制する。典型的には、低分子量のヘパリン（ＬＭＷＨ）又は未分画ヘパリン（ＵＦＨ）が、抗凝固療法におけるヘパリンとして使用される。また、ダナパロイド（オルガランとも呼ばれる）などのヘパリン類似物質も抗凝固療法において使用される。いくつかの実施態様では、抗凝固剤は、第Ｘａ因子阻害剤である。本明細書において使用する「第Ｘａ因子阻害剤」という用語は、第Ｘａ因子の機能を改変させる化合物の能力を指す。第Ｘａ因子阻害剤は、阻害剤と第Ｘａ因子との間に可逆的若しくは不可逆的な共有結合を形成することによって、又は非共有結合した複合体の形成を通して、第Ｘａ因子の活性を遮断又は低減させ得る。いくつかの実施態様では、第Ｘａ因子の阻害は、Wong et al, Journal of Thrombosis and Haemostasis 2008, 6(5), 820-829; Weitz et al, Thromb. Haemost. 2006, 96(3), 274-284; Turpie, A., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007, 27, 1238-1247; Turpie, A., European Heart Journal 2007, 29, 155-165; and Jiang, et al., Thrombosis and Haemostasis 2009, 101(4), 780-782に記載の方法を使用して評価され得る。第Ｘａ因子阻害剤の例としては、オタミキサバン、リバーロキサバン、フォンダパリヌクス、及びイドラパリヌクスが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２４】
本発明者らによって得られた結果はまた、凝固亢進状態を示す患者が、治療有効量のデオキシリボヌクレアーゼを投与することからなる抗凝固療法に適格であり得ることを明らかとする。本発明において任意の適切なデオキシリボヌクレアーゼを使用してもよい。デオキシリボヌクレアーゼは最も好ましくは、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＥＣ３．１．２１．１）であるだろう。しかしながら、いくつかの実施態様では、それはデオキシリボヌクレアーゼＩＩ（ＥＣ３．１．２１．１）であってもよい。デオキシリボヌクレアーゼは多くの種に生じ、ＤＮＡを切断することのできる任意のデオキシリボヌクレアーゼを本発明に使用し得る。デオキシリボヌクレアーゼは、ウシ又はブタを起源としたものなどの動物源に由来していてもよい。それは、植物、真菌、又は微生物を起源としていてもよい。しかしながら、典型的にはかつ最も好ましくは、デオキシリボヌクレアーゼはヒトを起源としたものであり、好ましくは組換えヒトデオキシリボヌクレアーゼである。ドルナーゼ（商標）又はプルモザイム（商標）などの市販のデオキシリボヌクレアーゼ製剤を本発明の実施態様に使用してもよい。いくつかの実施態様では、デオキシリボヌクレアーゼはＤＮＡ加水分解活性を有し、例えばデオキシリボヌクレアーゼＩの場合には、それはＤＮＡを加水分解して５’−リン酸ヌクレオチドを与えることができ、デオキシリボヌクレアーゼＩＩの場合にはそれはＤＮＡを加水分解して３'リン酸ヌクレオチドを与えることができる。Labarce & Paiden, 1980, Anal. Biochem., 102:344-352において検出されたものなどの、例えばヘキスト染色を使用した蛍光ベースアッセイを使用して、ＤＮＡ加水分解についてアッセイすることができる。加水分解活性は、定性用ポリアクリルアミドゲル及びアガロースゲル電気泳動、濃色アッセイ（Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:349-362 (1950); Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:363-377 (1950)）、又はメチルグリーンアッセイ（Kurnick, Arch. Biochem. 29:41-53 (1950); Sinicropi, et al., Anal. Biochem. 222:351-358 (1994)）をはじめとする当技術分野において公知である様々な方法において評価され得る。高分子量形から低分子量形へのＤＮＡ分子の分解は、アガロースゲル電気泳動などの技術によって好ましくはモニタリングされ得る。酵素の非存在下における及び／又はデオキシリボヌクレアーゼ活性を有することが知られているタンパク質の存在下における対照実験が実施され得る。デオキシリボヌクレアーゼは、脱アミド化しがちであることが知られている。成熟ヒトデオキシリボヌクレアーゼＩのアスパラギン残基、特にアミノ酸７位及び７４位におけるアスパラギン残基が脱アミド化しがちである。このプロセスは、問題のアスパラギン残基を、アスパラギン酸残基又はイソアスパラギン酸残基へと変換する。脱アミド化は酵素の活性を低減させ、これは、成熟ヒトデオキシリボヌクレアーゼＩのアミノ酸７４位のアスパラギンにおける脱アミド化において特に該当する。脱アミド化形の酵素を除去してアミド化形のものを残す技術が利用可能であり、これらを使用して本発明において使用するためのデオキシリボヌクレアーゼを調製することができる。これらの技術は、ＤＮＡに依然として結合することのできるアミド化形の酵素を精製するための、ＤＮＡを使用したテンタクル型陽イオン交換（ＴＣＸ）又はアフィニティ精製を含み得る。本発明において使用するためのデオキシリボヌクレアーゼ製剤は典型的には、８５〜１００重量％（好ましくは９０〜１００重量％、より好ましくは９５〜１００重量％、さらにより好ましくは９９〜１００重量％）のアミド化された酵素、又は部分的にアミド化された酵素を含み得る。特に、これらの比率は、完全にアミド化された酵素の量を指し、すなわち天然にアミド化されている残基の全てが、アミド化されている。それらは典型的には、９５％超、好ましくは９９％超、さらにより好ましくは９９．９％超のアミド化形のデオキシリボヌクレアーゼを有するだろう。特に、これらの数値は、生成時の数値、又は、生成から１カ月後から１年後までの、好ましくは２カ月後から６カ月後までの、より好ましくは３カ月後から４カ月後までのそれらの数値を指す。それらは、製品の保存可能期間の任意の時点の間の数値を指し得る。天然の又は公知のデオキシリボヌクレアーゼの変異体を本発明において使用してもよい。したがって、デオキシリボヌクレアーゼという用語はこのような変異体も包含する。「変異体」という用語は、デオキシリボヌクレアーゼと同じ本質的な特徴又は基本的な生物学的機能を有するポリペプチドを指す。デオキシリボヌクレアーゼの本質的な特徴は、ホスホジエステラーゼ活性及びＤＮＡ加水分解能である。ＤＮＡ切断を測定するためのアッセイは本明細書において記載され、これらを使用して、変異体が加水分解活性を有するかどうかを決定することができる。デオキシリボヌクレアーゼの配列を、延長した半減期を有するように修飾してもよい。例えば、酵素の配列を変化させることにより、特定のプロテアーゼ、特に炎症細胞由来のプロテアーゼに対する認識配列を除去することができる。本発明において使用されるデオキシリボヌクレアーゼは、例えば、その生物学的半減期などのその特性を改変させるために化学的に修飾されていてもよい。これを達成するために、天然型又は変異型デオキシリボヌクレアーゼの標的化されたアミノ酸残基を、選択されたアミノ酸側鎖又はＮ末端残基若しくはＣ末端残基と反応することのできる有機誘導体化剤と反応させることによって、共有結合による修飾が導入されてもよい。適切な誘導体化剤及び方法は、当技術分野において周知である。特に誘導体化され得る残基としては、システイニル残基（最も一般的にはα−ハロアセテートとの反応による）、ヒスチジル残基（ｐＨ５．５〜７．０のジエチルピロカルボネートとの反応による）、リジニル残基及びアミノ末端残基（コハク酸又は他のカルボン酸無水物との反応による）、アルギニル残基（フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、及びニンヒドリンなどの試薬との反応による）が挙げられる。カルボキシル側鎖基（アスパルチル又はグルタミル）は、カルボジイミドとの反応により選択的に修飾されても、又は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル残基及びグルタミニル残基へと変換されてもよい。デオキシリボヌクレアーゼへのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はヒト血清アルブミンなどの薬剤の共有結合による付着は、該変異体のそれ���の免疫原性及び／又は毒性を低減させ得、並びに／あるいは、その半減期を延長させ得、したがって、本発明において使用され得る。本発明のいくつかの実施態様では、デオキシリボヌクレアーゼは、グリコサミノグリカンに直接コンジュゲートしていても、中間体分子を通して接続されていてもよい。
【００２５】
本発明者らによって得られた結果はまた、凝固亢進状態を示す患者が、Ｐ−セレクチンアンタゴニストの投与からなる抗凝固療法に適格であり得ることを明らかとする。該アンタゴニストは、実際に、患者の血流中に存在する内皮由来細胞外小胞によって媒介される有害な作用を予防するのに適切であり得る。本明細書において使用する「Ｐ−セレクチン」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、Hsu-Lin et al, J Biol Chem 259: 9121（1984）及びMc Ever et al, J Clin Invest 84:92 (1989)によって記載されているようなヒト血小板及び内皮細胞によって発現される１４０ｋＤａのタンパク質を指す。該用語はまた、ＣＤ６２Ｐ、ＧＭＰ−１４０、ＰＡＤＧＥＭ、及びＬＥＣＡＭ−３としても知られている。本明細書において使用する「Ｐ−セレクチンアンタゴニスト」という用語は、例えば、Ｐ−セレクチンとＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１との間の相互作用を阻害することによって、例えば、Ｐ−セレクチンを発現している内皮細胞及び活性化血小板と、ＰＳＧＬ−１を発現している白血球との相互作用を阻害することによって、Ｐ−セレクチンに拮抗することのできる任意の薬剤を含む。いくつかの実施態様では、Ｐ−セレクチンアンタゴニストは、Ｐ−セレクチンに対する抗体である。Ｐ−セレクチンに対する抗体は、例えば、米国特許第４，７８３，３９９号、国際公開公報第９３／０６８６３号、Geng et al (J. Biol. Chem., 266 (1991) 22313-22318)、国際公開公報第９３／２１９５６号、国際公開公報第２００５／１００４０２号、及び国際公開公報第２００８０６９９９９号から公知である。いくつかの実施態様では、本発明の抗Ｐ−セレクチン抗体はＳＥＧ１０１であり、これはクリザンリズマブとも命名されている。
【００２６】
本明細書において使用する「処置」又は「処置する」という用語は、予防的処置又は防止的処置、並びに、治癒的処置又は疾患修飾的処置（疾患に罹るリスクがあるか又は疾患に罹っていることが疑われる被験者、並びに、病気であるか又は疾患若しくは医学的容態を患っていると診断されている被験者の処置を含む）の両方を指し、これは臨床的再発の抑制も含む。障害又は再発している障害の１つ以上の症状を予防、治癒、その発症を遅延、その重症度を低減、又は寛解するために、あるいは、このような処置を行なわなかった時に予想される生存期間を超えて被験者の生存期間を延長するために、医学的障害を有するか又は最終的に障害に罹る可能性のある被験者に処置が投与され得る。「治療処方計画」によって、病気の処置のパターン、例えば療法中に使用される投薬パターンを意味する。治療処方計画は、誘導処方計画及び維持処方計画を含み得る。「誘導処方計画」又は「誘導期間」という語句は、疾患の初期処置に使用される治療処方計画（又は治療処方計画の一部）を指す。誘導処方計画の一般的目標は、処置処方計画の初期期間中に被験者に高いレベルの薬物を提供することである。誘導処方計画は、（部分的に又は全体に）「負荷処方計画」を使用し得、これは医師が維持処方計画中に使用するであろうよりも多くの用量の薬物を投与すること、医師が維持処方計画中に薬物を投与するであろうよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含み得る。「維持処方計画」又は「維持期間」という語句は、例えば、被験者が長期間（数か月又は数年間）にわたり寛解を保つために、病気の処置中に被験者の維持のために使用される、治療処方計画（又は治療処方計画の一部）を指す。維持処方計画は、連続的療法（例えば、定期的な間隔で、例えば週１回、月１回、年１回などに薬物を投与）又は断続的療法（例えば、間断的処置、断続的処置、再発時における処置、又は特定の予め決定された基準［例えば、疼痛、疾患の徴候など］）の到達時の処置を使用し得る。
【００２７】
本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例及び図面は、いずれにしても、本発明の範囲を限定するものと捉えられるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】急性非代償性心不全は、血漿中のトロンビン生成を増加させる。多血小板血漿中の代表的なトロンビン生成曲線。トロンビン生成は、０．５pMの組織因子によってトリガーされ、校正自動トロンボグラムアッセイを用いてモニタリングされた。
【図２】急性非代償性心不全は活性化プロテインＣの感受性を損なう。多血小板血漿中の活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）による内因性トロンビン生成能（ＥＴＰ）の抑制。
【図３】フォンヴィルブランド因子（ＶＷＦ）などの循環中の内皮活性化マーカーのレベルは、急性非代償性心不全患者において上昇している。
【図４】凝固促進性内皮由来細胞外小胞の濃度は、急性非代償性心不全患者において上昇している。細胞外小胞に関連した凝固促進活性は、アネキシンＶの結合によって検出されるリン脂質に依存した能力に依拠する。
【図５】ＤＮＡ−ヒストン複合体の血漿中レベルは、急性非代償性心不全患者において上昇している。
【００２９】
実施例：
実施例１：
材料及び方法
血液試料の収集
静脈血液試料を、１/１０容量の０．１０６Ｍのクエン酸ナトリウムを含有しているＭｏｎｏｖｅｔｔｅ（登録商標）（ザルスタット、ニュームブレヒト、ドイツ）シリンジ中に収集した。全ての分析は、血液収集後２時間以内に実施された。多血小板血漿（ＰＲＰ）を、２０℃で１９０ｇで１０分間の血液の遠心分離によって調製した。ＰＲＰを回収し、２０℃で１７５０ｇで残りの血液を１０分間遠心分離することによって得られた乏血小板血漿の添加により１５０Ｇ／Ｌに調整した。無血小板血漿（ＰＦＰ）は、４℃で１３０００ｇで３０分間遠心分離した乏血小板血漿から得られた。ＰＦＰを−８０℃で直ちに凍結し、必要時に３７℃で１５分間かけて解凍した。細胞外小胞の数を数えるために及び特徴付けのために、血液試料を２５００ｇで１５分間の２回の連続的な遠心分離にかけ、血小板を枯渇させた血漿（ＰＤＰ）を調製し、使用するまで−８０℃で保存した。
【００３０】
トロンビン生成アッセイ
校正自動トロンボグラム（ＣＡＴ）を、マイクロタイタープレートフルオロメーター（Fluoroskan Ascent、ThermoLalsystems社、ヘルシンキ、フィンランド）において３７℃で、専用ソフトウェアプログラム（ThrombinoscopeBV社、マーストリヒト、オランダ）を使用して実施した１０。凝固は、０．５pMの組換えヒト組織因子（ＴＦ）（イノビン（登録商標）、デイドベーリング社）を用いてトリガーされた。無血小板血漿中での測定のために、４μMの最終濃度のホスファチジル−コリン（ＰＣ）／セリン（ＰＳ）／エタノールアミン（ＰＥ）（ＰＣ／ＰＳ／ＰＥ、６０／２０／２０、モル％）の混合物を加えた。いくつかの最終濃度（６．７、１３．９、２５、及び６５nM）の社内製の活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）の非存在下又は存在下における多血小板血漿（ＰＲＰ）、及び、いくつかの最終濃度（０．８５、１．７、６．７、及び１３．９nM）の社内製の活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）の非存在下又は存在下における無血小板血漿（ＰＦＰ）を使用して、トロンビン生成曲線を３回ずつ記録した。トロンビン活性の総量（すなわち、内因性トロンビン生成能、ＥＴＰ）を、曲線下面積として評価した。内因性トロンビン生成能を５０％抑制したＡＰＣ濃度をＩＣ５０−ＡＰＣと定義した１１。
【００３１】
止血変数及び内皮マーカー
全ての測定は、乏血小板血漿中で実施された。可溶性トロンボモジュリン（ＴＭ）、可溶性内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）、遊離組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、フォンヴィルブランド因子（ＶＷＦ）、及び第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）をＥＬＩＳＡキット（Asserachrom、Diagnostica Stago（商標）、アニエール、フランス）によって測定した。
【００３２】
細胞由来細胞外小胞
蛍光抗体、ＣＤ４１−フィコエリトリン（ＣＤ４１−ＰＥ）、ＣＤ１４４−ＰＥ、ＣＤ１４−ＰＥ、及びアロフィコシアニン−ＥＰＣＲは、BD Pharmingen社（商標）から購入した。ＴＦに対する他の抗体、クローンＴＦ９−１０Ｈ１０、アロフィコシアニン−ＴＦは、Biotechne社（商標）製であり、アネキシンＶ（ＡｎｎＶ）−ＦＩＴＣはFischer Scientific（商標）製であった。マイクロパーティクルは、標準的な手順を使用して高感度フローサイトメトリーによって数えられた１２。血漿（２０μL）を、最適濃度の特異的抗体と１０μLのアネキシンＶ−ＦＩＴＣと共にインキュベートした。染色された試料をＧＡＬＬＩＯＳ機器（Beckman-Coulter社（商標）、マイアミ、フロリダ州、米国）で分析した。
【００３３】
結果
対照と比較して、多血小板血漿及び乏血小板血漿を使用した内因性トロンビン生成能（ＥＴＰ）は、急性非代償性心不全患者において入院時により高く、入院期間中は増加したままであった（図１）。
【００３４】
多血小板血漿中のトロンビン生成を５０％抑制する活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）濃度もまた、入院時においてより高かった（図２）。
【００３５】
フォンヴィルブランド因子（図３）、第ＶＩＩＩ因子、遊離組織因子経路阻害剤、及び可溶性形の内皮プロテインＣ受容体、及びトロンボモジュリンを含む、内皮機能障害の可溶性マーカーは、急性非代償性心不全患者において入院時により高かった。
【００３６】
対照と比較してより高い濃度のアネキシンＶ／組織因子（ＴＦ）陽性の内皮由来細胞外小胞が、急性非代償性心不全患者において入院時に認められた（図４）。
【００３７】
非常に複雑な好中球死滅シグナル伝達経路（ネトーシス）の間接的指標としての血漿中ＤＮＡ−ヒストン複合体レベルが、急性非代償性心不全患者において入院時に上昇している（図５）。
【００３８】
実施例２：
方法
患者及び対照
試験は、入院を必要とする異常な心機能に続発する心不全の症状及び兆候の急速な発症／進行として、欧州心臓病学会の指針に従って定義される急性非代償性心不全（全てニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）の心機能分類においてＩＩＩ度又はＩＶ度）のために循環器科に入院した３４人の治療継続患者の単一施設前向き試験であった。血液を入院時、退院時、臨床的に少なくとも６週間安定した後の退院後に収集した。血行動態の測定は、患者の臨床的評価の日常的な業務の一環であり、病院滞在中及び退院時の心不全療法は、治療医の自由裁量であった。外来診療所から募集された安定した慢性心不全（ＣＨＦ）を有する３０人の患者群も含めることにより、非代償性心不全の急性期との差異を識別した。試験は、病院滞在が複雑化させている原因となっている可能性を明瞭にするために、予定された医学的評価のために循環器科に紹介された、心室機能が保存され、心不全を起こしたことはなかったが、同じようなパターンの併存疾患、リスク因子（例えば高血圧、糖尿病、及び喫煙）、及びバックグラウンド薬物療法を有していた、３０人の対照入院患者（ＣＴ）を含んでいた。全ての試験群における除外基準は、凝固に影響を及ぼし得る因子であった：感染症及び炎症疾患、腫瘍、血清クレアチニン＞２００μmol/L、ステロイド薬の使用、急性冠動脈症候群、心房細動、及び抗凝固治療を必要とする全ての併存疾患。病院滞在中の除外基準は、補助装置又は心臓移植を必要とする憎悪心不全であった。全ての急性非代償性心不全患者は、静脈血栓塞栓症（ＶＴＥ）予防（１日１回４０００ＩＵのエノキサパリン）の投与を受けた。血液の収集を、入院時の静脈血栓塞栓症予防の前、及び退院日の最後のエノキサパリンの注射から３６時間後に実施した。対照入院患者及び慢性心不全患者には静脈血栓塞栓症の予防は全く投与されなかった。試験プロトコールは、地域倫理委員会（Comite de Protection des Personnes agreement 15/10/2014）によって認可された。全ての試験患者に書面による説明と同意が行なわれた。
【００３９】
血液試料の収集
静脈血液試料を、１/１０容量の０．１０６Ｍのクエン酸ナトリウムを含有しているＭｏｎｏｖｅｔｔｅ（登録商標）（ザルスタット、ニュームブレヒト、ドイツ）シリンジ中に収集した。全ての分析は、血液収集後２時間以内に実施された。多血小板血漿（ＰＲＰ）を、２０℃で１９０ｇで１０分間の血液の遠心分離によって調製した。ＰＲＰを回収し、２０℃で１７５０ｇで１０分間の残りの血液の遠心分離によって得られた乏血小板血漿の添加により、校正自動トロンボグラムのために１５０Ｇ／Ｌへと調整した。無血小板血漿（ＰＦＰ）は、４℃で１３０００ｇで３０分間遠心分離した乏血小板血漿から得られた。ＰＦＰを−８０℃で直ちに凍結し、必要時に３７℃で１５分間かけて解凍した。細胞外小胞の数を数えるために及び特徴付けのために、血液を２５００ｇで１５分間の２回の連続的な遠心分離にかけ、血小板を枯渇させた血漿（ＰＤＰ）を調製し、使用するまで−８０℃で保存した。
【００４０】
トロンビン生成アッセイ
校正自動トロンボグラムを、以前に報告されているように、専用ソフトウェアプログラム（ThrombinoscopeBV社、マーストリヒト、オランダ）を使用して３７℃で実施した。凝固は、０．５pMの組換えヒト組織因子（ＴＦ）（イノビン（登録商標）、デイドベーリング社）を用いてトリガーされた。無血小板血漿中での測定のために、４μMの最終濃度のホスファチジル−コリン／セリン／エタノールアミン（６０／２０／２０、モル％）の自家製混合物を加えた。いくつかの最終濃度（多血小板血漿では６．７、１３．９、２５、及び６５nM、無血小板血漿では０．８５、１．７、６．７及び１３．９nM）の社内製の活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）の非存在下又は存在下において、トロンビン生成曲線を３回ずつ記録した。トロンビン活性の総量（すなわち、内因性トロンビン生成能、ＥＴＰ）は、曲線下面積として評価された。内因性トロンビン生成能を５０％抑制したＡＰＣ濃度は、ＩＣ５０−ＡＰＣとして定義された。
【００４１】
止血変数及び内皮マーカーの定量
全ての測定は、ＰＤＰ中で実施された。可溶性トロンボモジュリン（ＴＭ）、可溶性内皮プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）、遊離組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、フォンヴィルブランド因子（ＶＷＦ）、及び第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）をＥＬＩＳＡキット（Asserachrom、Diagnostica Stago（商標）、アニエール、フランス）によって測定した。
【００４２】
内皮由来細胞外小胞の測定
蛍光抗体、ＣＤ１４４−フィコエリトリン（ＣＤ１４４−ＰＥ）、及びアロフィコシアニンＥＰＣＲはBD Pharmingen社から購入した。ＴＦに対する他の抗体、クローンＴＦ９−１０Ｈ１０、アロフィコシアニン−ＴＦはBiotechne社（商標）製であり、アネキシンＶ（ＡｎｎＶ）−ＦＩＴＣはFisher Scientific（商標）製であった。細胞外小胞は、標準的な手順を使用して高感度フローサイトメトリーによって数えられた：血漿（２０μL）を、最適濃度の特異的抗体と１０μLのＡｎｎＶ−ＦＩＴＣと共にインキュベートした。染色された試料をＧＡＬＬＩＯＳ機器（Beckman-Coulter社（商標）、マイアミ、フロリダ州、米国）で分析した。
【００４３】
血漿中ヌクレオソームレベルの決定
血小板を枯渇させた血漿（ＰＤＰ）中に循環しているヌクレオソームレベルを、ヌクレオソームのヒストン及びＤＮＡ成分に対して指向される一対の抗体を使用して、特別なＥＬＩＳＡによって測定した（Cell Death Detection-ELISA plus、Roche Diagnostics社、Sigma-Aldrich社）。製造業者は標準曲線を提供しなかったので、多量の内因性ヌクレオソームを含有している基準物質が使用され、ヌクレオソーム値は任意単位で報告された。
【００４４】
統計分析
カテゴリーデータは数字（％）として提示される；連続データは平均値±標準誤差（ＳＤ）として提示される。カテゴリー値の差分は、適宜、ピアソンのカイ二乗検定又はノンパラメトリックフィッシャーの正確確率検定を使用して実施された。連続変数を、ウィルコクソン検定を使用して比較した。全経過観察期間を通して急性非代償性心不全患者において研究された変数の変動は、フリードマン検定を使用することによって評価された。相関は、スピアマン相関係数を計算することによって評価された。αリスクは、全ての分析について５％に固定された。分析は、ＳＡＳ９．４（ＳＡＳ研究所、ケーリー、ノースカロライナ州、米国）を使用して実施された。
【００４５】
結果
基線における臨床的特徴
基線時の急性非代償性心不全群は、性別比、併存疾患、及びリスク因子に関して、心不全ではない心臓病患者（ＣＴ）群と類似していた（表１）。急性非代償性心不全は、低下した左心室駆出率、並びに増加した左心室拡張終期容積及び肺動脈圧を示した。血清中脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）のレベルは、対照においてよりも急性非代償性心不全患者における方がより高かった。急性非代償性心不全患者に使用されることがより多い利尿薬を除いて、活発な心臓血管薬物療法の使用において有意差は認められなかった。５人の急性非代償性心不全患者は、退院後３か月以内に死亡し、入手可能な臨床検査値による経過観察は行なわれなかった。対照の慢性心不全患者は、高血圧及び糖尿病（これらは急性非代償性心不全患者においてより頻繁であった）に関して急性非代償性心不全患者とは実質的に異なっていた。予想された通り、ＢＮＰ及びＣＲＰのレベルは、慢性心不全患者においてよりも急性非代償性心不全患者における方がより高かった。慢性心不全及び急性非代償性心不全患者は、対照と比較して、ＧＦＲ（６０mL/分未満）によって測定されたところ、同じような低下した腎機能を呈した。白血球数及び血小板数並びにフィブリノーゲンレベルは、全ての群において差はなかった。
【００４６】
インビトロにおけるトロンビン生成は、入院時に急性非代償性心不全患者において加速及び増加している。
【００４７】
入院時、血小板（同じ血小板数で調整された多血小板血漿）の存在下における内因性トロンビン生成能は対照と比較して急性非代償性心不全患者の方がより高く、一方、ラグタイム及びピークまでの時間は、際立っていたが、有意に短くはなかった（表２、データは示されていない）。血小板（無血小板血漿）の非存在下では、トロンビンピーク、内因性トロンビン生成能、及び速度は、対照と比較して急性非代償性心不全患者の方が増加し、ラグタイム及びピークまでの時間は短くなっていた（表２、データは示されていない）。対照と比較して、内因性トロンビン生成能は、慢性心不全患者において血小板の存在下においてのみ増加した。血小板の存在下において入院時には慢性心不全患者と急性非代償性心不全患者との間には内因性トロンビン生成能に有意差は全くなかったが、急性非代償性心不全患者の血小板の非存在下においては内因性トロンビン生成能はより高かった。内因性トロンビン生成能及び／又はトロンビンピークの増加は、退院日には維持されていたが、退院後の時点では失われていた（表２、データは示されていない）。
【００４８】
活性化プロテインＣの感受性は、急性非代償性心不全患者において入院時に損なわれている
活性化プロテインＣの存在下における内因性トロンビン生成能は、入院時に対照と比較して一貫してより高かった（データは示されていない）。活性化プロテインＣの非存在下における内因性トロンビン生成能の５０％阻害を与える活性化プロテインＣ濃度（ＩＣ５０−ＡＰＣ）は、血小板の存在下において、入院時に対照と比較して有意に増加した（表２）。血小板の非存在下におけるＩＣ５０−ＡＰＣは、対照と比較して急性非代償性心不全患者において増加する傾向があったが、統計学的有意性には達しなかった。血小板の存在下において入院時に、慢性心不全患者と対照又は急性非代償性心不全患者との間に差は全く認められなかったが、血小板の非存在下におけるＩＣ５０−ＡＰＣは、慢性心不全患者と比較して急性非代償性心不全患者において増加した。内因性トロンビン生成能（活性化プロテインＣの非存在下）及びＩＣ５０−ＡＰＣを、それらの算術積を使用して掛け合わせると、凝固促進表現型が、入院時において対照と比較してほぼ３倍の数値によって確認された（表２）。このパラメーターは、対照と比較して慢性心不全患者の多血小板血漿において増加する傾向があったが、統計学的有意性には達しなかった。慢性心不全患者と比較して、ＥＴＰ×ＩＣ５０−ＡＰＣ値は、入院時に急性非代償性心不全患者の血小板の非存在下において増加していた。ＡＰＣの存在下における内因性トロンビン生成能の数値は、入院時と比較して退院後の時点において下にシフトした（データは示されていない）。退院時、及び退院後の時点においてはさらにより、算術積のＥＴＰ×ＩＣ５０−ＡＰＣは減少した。
【００４９】
内皮活性化の可溶性マーカーは、心不全の急性非代償性期において上昇している
急性非代償性心不全患者は、対照と比べて入院時に、可溶性ＥＰＣＲ、可溶性ＴＭ、ＶＷＦ、遊離ＴＦＰＩ、及びＦＶＩＩＩのより高い血漿中レベルを示した（表２、データは示されていない）。ＦＶＩＩＩの増加は、同じような値のＦＶＩＩＩ/ＶＷＦ比によって明らかとなるように、ＶＷＦの増加と平行していた。これらの因子のレベルは、慢性心不全患者における血漿中レベルと比較して、急性非代償性心不全患者の方が入院時において有意により高かった。ＦＶＩＩＩ及びしたがってＦＶＩＩＩ/ＶＷＦ比のみが、対照と比較して慢性心不全患者において上昇していた。これらの因子の上昇は、退院日には維持されていたが、遊離ＴＦＰＩを除いて退院後の時点では失われていた。対照と比較して、ＡｎｎＶ＋内皮細胞外小胞、ＴＦ＋内皮細胞外小胞、及びＡｎｎＶ＋/ＴＦ＋内皮細胞外小胞の濃度は、急性非代償性心不全患者において入院時に有意により高かった（表２、データは示されていない）。慢性心不全患者におけるＴＦ＋内皮細胞外小胞の濃度は対照と比較して有意に増加していた。ＥＰＣＲ＋内皮細胞外小胞及びＡｎｎＶ＋/ＥＰＣＲ＋内皮細胞外小胞の濃度差は、急性非代償性心不全患者と対照又は慢性心不全患者との間に全く示されなかった（表２）。急性非代償性心不全患者におけるＡｎｎＶ＋内皮細胞外小胞及びＴＦ＋内皮細胞外小胞の濃度は、入院中の経過にわたり有意に減少し、入院時と比較して退院後の時点で減少した。
【００５０】
循環中のヌクレオソームは、入院時に急性非代償性心不全患者において上昇している
本発明者らは、退院後に経過観察された全ての患者を含む、急性非代償性心不全患者の部分集合における血漿中ヌクレオソームレベルを測定した。循環中のヌクレオソームは、対照及び慢性心不全患者と比較して、入院時に急性非代償性心不全患者において増加していた（データは示されていない）。退院日に、ヌクレオソームのレベルは上昇したが、一方、退院後の時点においては有意な下降が明らかであった。入院時のヌクレオソームレベルは、血小板の存在下におけるＩＣ５０−ＡＰＣ及びＥＴＰ×ＩＣ５０−ＡＰＣ（それぞれ、ｒ＝０．５９；ｐ＝０．０１３及びｒ＝０．６３；ｐ＝０．００６）、並びにＡｎｎＶ＋内皮細胞外小胞（ｒ＝０．７６；ｐ＝０．０００４）と有意に相関していた。
【００５１】
【表１】
2020524283.tif 000002
2020524283.tif 000003
【００５２】
結果は、平均値±標準偏差又は頻度（％）である。ＡＣＥは、アンギオテンシン変換酵素を示す；ＬＶＥＤＶ、左心室拡張終期容積；ＬＶＥＳＶ、左心室収縮終期容積；ＬＶＥＦ、左心室駆出分画率；ｓＰＡＰ、肺動脈圧；ＢＮＰ、脳性ナトリウム利尿ペプチド；ＧＦＲ、糸球体ろ過率；ＣＲＰ、Ｃ反応性タンパク質；ＡＳＡＴ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；ＡＬＡＴ、アラニンアミノトランスフェラーゼ。
【００５３】
【表２】
2020524283.tif 000004
【００５４】
数値は平均値±標準偏差である。ＥＴＰは、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）の非存在下における内因性トロンビン生成能を示す。ＩＣ５０−ＡＰＣ、ＥＴＰを５０％減少させるのに必要とされるＡＰＣ濃度；ＥＰＣＲ、内皮プロテインＣ受容体；ＴＭ、トロンボモジュリン；ＶＷＦ、フォンヴィルブランド因子；ＦＶＩＩＩ、第ＶＩＩＩ凝固因子；ＴＦＰＩ、組織因子経路阻害剤；ＥＶ、細胞外小胞；ＡｎｎＶ、アネキシンＶ；ＴＦ、組織因子。＊経過観察全期間におよぶ量的変数についてのフリードマン検定。
【００５５】
参考文献：
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の最新技術を記載する。これらの参考文献の開示は、ここに参照することにより本開示に組み込まれる。
【００５６】
【表３】
2020524283.tif 000005
2020524283.tif 000006
【図１】
2020524283.tif 000007
【図２】
2020524283.tif 000008
【図３】
2020524283.tif 000009
【図４】
2020524283.tif 000010
【図５】
2020524283.tif 000011
【国際調査報告】
2020524283.tif 000012
2020524283.tif 000013
2020524283.tif 000014