(57)【要約】  ヒアルロン酸及びプロテアグリカン連結蛋白質１（ＨＡＰＬＮ１）を有効成分として含む軟骨再生用組成物に係わるものであり、ＨＡＰＬＮ１蛋白質は、軟骨形成促進及び関節軟骨再生能を有し、軟骨細胞のＴＧＦ−β受容体Ｉの発現レベルを上昇させ、軟骨形成能保有細胞の構成比を増大させ、軟骨組織の再生を誘導することができる。従って、該ＨＡＰＬＮ１蛋白質は、ＴＧＦ−βの信号伝逹を調節する新たな組成物であり、軟骨再生用薬学組成物、軟骨再生用健康食品組成物または軟骨再生用試薬組成物として有用に活用される。
2020531560.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸及びプロテアグリカン連結蛋白質１（ＨＡＰＬＮ１）を有効成分として含む軟骨再生用薬学組成物。
【請求項２】
前記ＨＡＰＬＮ１は、軟骨形成を促進し、関節軟骨を保護することを特徴とする請求項１に記載の軟骨再生用薬学組成物。
【請求項３】
前記ＨＡＰＬＮ１は、ＴＧＦ−β受容体Ｉの発現レベルを上昇させ、軟骨形成能保有細胞の構成比を増大させ、軟骨組織の再生を誘導することを特徴とする請求項１に記載の軟骨再生用薬学組成物。
【請求項４】
ヒアルロン酸及びプロテアグリカン連結蛋白質１（ＨＡＰＬＮ１）を有効成分として含む軟骨再生用健康食品組成物。
【請求項５】
ヒアルロン酸及びプロテアグリカン連結蛋白質１（ＨＡＰＬＮ１）を有効成分として含む軟骨再生用試薬組成物。
【請求項６】
ヒアルロン酸及びプロテアグリカン連結蛋白質１（ＨＡＰＬＮ１）を処理し、試験管内で軟骨組織を再生させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸及びプロテアグリカン連結蛋白質１（ＨＡＰＬＮ１：hyaluronan and proteoglycan link protein １）を有効成分として含む軟骨再生用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体において、骨と骨とが出合う蝶番部位は、ガラス質軟骨（hyaline cartilage）からなる関節軟骨（articular cartilage）が互いに当接し、耐圧力と引っ張り力とを行使し、各関節は、関節嚢（synovial capsule）が滑液（synovial fluid）を湛えており、関節運動による摩擦力を低減させる形態を有する。
【０００３】
関節軟骨は、成長板（growth plate）軟骨と共に、軟骨形態のうち、ガラス質軟骨に該当し、そのような軟骨組織の細胞外基質（ＥＣＭ：extracellular matrix）は、コラーゲンタイプII（typeII collagen）、アグリカン（aggrecan）、ヒアルロン酸（hyaluronan）、ＨＡＰＬＮ１（hyaluronan and proteoglycan link protein １）などが主な成分として、凝集体（aggregate）構造を有する。ここで、ヒアルロン酸鎖に、多数のアグリカンが結合するが、ＨＡＰＬＮ１は、それら二つの結合をさらに強く結束させることにより、凝集体を物理的化学的に安定化させる役割を行うと知られている。
【０００４】
膝関節において、軟骨の厚みは、約２ｍｍであり、外傷や疾病などにより、面積が１〜４ｍｍ２ほど損傷された場合には、自然治癒による再生が可能であるが、２０ｍｍ２程損傷された場合には、自力による再生は困難であり、一般的に、大きい苦痛を伴う。さらに、腫瘍、懐死のようなさまざまな原因により、関節軟骨を完全に失った場合には、関節機能を復元させるために、例えば、人工関節を当該個所に埋め込むというような措置が行われている。しかし、人工関節は、あくまでも関節機能と類似して人工的に構成されたものであり、生体においては、異物であるために、生体適合性維持が困難である。また、人工関節は、生体内における厳格な環境下において、複雑な動作が要求されるために、２０年以上維持させることは困難であり、その素材として、利用されている樹脂や金属などの劣化や、摩耗粉の発生などにより、機能低下が苦痛を引き起こす場合もあり、耐久性においても、十分であるとは言えない。従って、人工関節治療を代替するものとして、関節軟骨自体を再生する技術が要望されている。
【０００５】
また、最近の研究発表によれば、関節表面を穿孔し、骨形成因子（ＢＭＰ：bone morphogentic protein）が含有されたコラーゲンを、所望部位に配置することにより、関節軟骨の再生が報告されている。しかし、再生された関節軟骨は、隣接する既存の関節軟骨と連続して形成されず、完全な再生とは言えないのである。また、コラーゲンは、ＢＳＥ（bovine spongiform encephalopathy）、いわゆる、狂牛病のような問題から、生体適用を回避する傾向もある。従って、生体適用が認められる材料のみを利用し、軟骨を再生させる新規組成物の開発が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】大韓民国登録特許第１０−０６５４９０４号（２００６．１１．３０．登録）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、軟骨再生用薬学組成物を提供するところにある。
【０００８】
本発明の他の目的、は軟骨再生用健康食品組成物を提供するところにある。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、軟骨再生用試薬組成物を提供するところにある。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、試験管内で（in vitro）軟骨組織を再生させる方法を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明は、ヒアルロン酸及びプロテアグリカン連結蛋白質１（ＨＡＰＬＮ１：hyaluronan and proteoglycan link protein １）を有効成分として含む軟骨再生用薬学組成物、軟骨再生用健康食品組成物、または軟骨再生用試薬組成物を提供する。
【００１２】
また、本発明は、ヒアルロン酸及びプロテアグリカン連結蛋白質１（ＨＡＰＬＮ１）を処理し、試験管内で（in vitro）軟骨組織を再生させる方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ＨＡＰＬＮ１蛋白質は、軟骨形成促進能及び関節軟骨再生能を有し、軟骨細胞のＴＧＦ−β受容体Ｉの発現レベルを上昇させ、軟骨形成能保有細胞の構成比を上昇させ、軟骨組織の再生を誘導することができる。従って、本発明のＨＡＰＬＮ１蛋白質は、ＴＧＦ−βの信号伝逹を調節する新たな組成物であり、軟骨再生用薬学組成物、軟骨再生用健康食品組成物または軟骨再生用試薬組成物として、有用に活用される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】老化マウスの退化された成長板に対し、ＨＡＰＬＮ１蛋白質の反復腹腔投与による軟骨形成能を確認したものであり、（Ａ）は、組織内プロテアグリカンを、サフラニンＯ／ファーストグリーンＦＣＦ（Safranin Ｏ／Fast Green ＦＣＦ：ＳＯ／ＦＧ）染色法で確認したものであり、（Ｂ）は、軟骨形成能を保有した軟骨細胞の存在を、免疫組織化学法（immunohistochemistry）で確認したものである。
【図２】マウスの損傷された膝関節組織に対し、関節腔内に投与されたＨＡＰＬＮ１蛋白質の軟骨再生能、を免疫蛍光染色法（immunofluorescence）で確認したものである。
【図３】ヒト関節軟骨細胞に対するＨＡＰＬＮ１蛋白質の軟骨形成促進能を確認したものであり、（Ａ）は、軟骨特異遺伝子ＳＯＸ９、軟骨基質構成物であるアグリカン及びコラーゲンタイプＩＩの遺伝子発現量を、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction）を介して確認したものであり、（Ｂ）は、細胞外基質に蓄積されたプロテアグリカンを、サフラニンＯ／ファーストグリーンＦＣＦ染色法で確認したもである。
【図４】マウス関節軟骨細胞に対するＨＡＰＬＮ１蛋白質のＴＧＦ−β信号伝逹調節能を確認したものであり、（Ａ）は、ＨＡＰＬＮ１蛋白質のＴＧＦ−β受容体Ｉ調節能を、ウェスタンブロット（western blot）で確認したものであり、（Ｂ）及び（Ｃ）は、ＨＡＰＬＮ１蛋白質のＴＧＦ−β受容体Ｉ安定化、を重合酵素連鎖反応及びウェスタンブロットで確認したものであり、図４（Ｄ）は、ＨＡＰＬＮ１蛋白質による細胞表面ＴＧＦ−β受容体Ｉ提示能向上を、ウェスタンブロットで確認したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の発明者らは、老化マウス及び関節軟骨損傷マウスにおいて、ヒアルロン酸及びプロテアグリカン連結蛋白質１（ＨＡＰＬＮ１：hyaluronan and proteoglycan link protein １）蛋白質による軟骨形成促進能及び軟骨再生能を確認した。また、軟骨細胞でも、ＨＡＰＬＮ１蛋白質による軟骨形成促進能が有効であり、軟骨細胞のＴＧＦ−β受容体Ｉの提示量増加による信号伝逹調節効果を確認しながら、本発明を完成した。
【００１６】
本発明は、ヒアルロン酸及びプロテアグリカン連結蛋白質１（ＨＡＰＬＮ１）を有効成分として含む軟骨再生用薬学組成物を提供する。
【００１７】
望ましくは、前記ＨＡＰＬＮ１は、軟骨形成を促進し、関節軟骨を保護することができる。
【００１８】
望ましくは、前記ＨＡＰＬＮ１は、ＴＧＦ−β受容体Ｉの発現レベルを上昇させ、軟骨形成能保有細胞の構成比を上昇させ、軟骨組織の再生を誘導することができる。
【００１９】
本発明の組成物が薬学組成物である場合、投与のために、前述の有効成分以外に、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含んでもよい。前述の担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を有することができる。
【００２０】
本発明の薬学組成物は、それぞれ通常の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾールなどの経口型剤形にしたり、外用剤、坐剤または滅菌注射溶液の形態に剤形化したりして使用することができる。詳細には、剤形化する場合、通常使用する充填剤、重量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤のような希釈剤または賦形剤を使用しても調剤される。経口投与のための固形製剤としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などを含むが、それらに限定されるものではない。そのような固形製剤は、前記有効成分以外に、少なくとも１以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを混ぜても調剤される。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状物、リキッドパラフィン以外に、さまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを添加しても調剤される。非経口投与のための製剤は、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁液剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤を含む。非水性溶剤及び懸濁液剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性オイル、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用される。坐剤の基剤としては、Witepsol、Macrogol、Tween ６１、カカオバター、ラウリンバター、グリセロゼラチンなどが使用される。
【００２１】
本発明の薬学組成物の適する投与量は、患者の状態及び体重、疾病程度、薬物形態、時間によって異なるが、当業者によっても適切に選択されるが、前記組成物の一日投与量は、望ましくは、０．００１ｍｇ／ｋｇないし５０ｍｇ／ｋｇであり、必要により、一日１回ないし数回に分けて投与することができる。
【００２２】
また、本発明は、ヒアルロン酸及びプロテアグリカン連結蛋白質１（ＨＡＰＬＮ１）を有効成分として含む軟骨再生用健康食品組成物を提供する。
【００２３】
本発明の組成物が健康食品組成物である場合、さまざまな栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び充填剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含んでもよい。それ以外に、天然果物ジュース、合成果物ジュース、及び野菜飲料製造のための果肉を含んでもよい。そのような成分は、独立して、または組み合わせて使用することができる。また、健康食品組成物は、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、ガム類、アイスクリーム類、スープ、飲料水、茶、機能水、ドリンク剤、アルコール及びビタミン複合剤のうちいずれか１つの形態でもある。
【００２４】
また、前記健康食品組成物は、食品添加物を追加して含んでもよく、食品添加物としての適合いかんは、取り立てての規定がない限り、食品医薬安全処に承認された食品添加物公典の総則、及び一般試験法などにより、当該品目に係わる規格及び基準によって判定する。
【００２５】
前記食品添加物公典に収載された品目としては、例えば、、ケトン類、グリシン、クエン酸カリウム、ニコチン酸、ケイ皮酸などの化学的合成品；柿色素、甘草抽出物、結晶セルロース、コーリャン色素、グアガムなどの天然添加物；Ｌ−グルタミン酸ナトリウム製剤、麺類添加アルカリ剤、保存料製剤、タール色素製剤などの混合製剤類；などを挙げることができる。
【００２６】
このとき、健康食品組成物を製造する過程において、食品に添加される本発明による組成物は、必要により、その含量を適切に加減することができる。
【００２７】
また、本発明は、ヒアルロン酸及びプロテアグリカン連結蛋白質１（ＨＡＰＬＮ１）を有効成分として含む軟骨再生用試薬組成物を提供する。
【００２８】
また、本発明は、ヒアルロン酸及びプロテアグリカン連結蛋白質１（ＨＡＰＬＮ１）を処理し、試験管内で（in vitro）軟骨組織を再生させる方法を提供する。
【００２９】
以下では、実施例を介して、本発明についてさらに詳細に説明する。それら実施例は、ただ、本発明についてさらに具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨により、本発明の範囲が、それら実施例によって制限されるものではないということは、当業界において当業者であるならば、自明であろう。
【実施例】
【００３０】
実施例１：生体内（in vivo）退化された軟骨組織におけるＨＡＰＬＮ１蛋白質による軟骨再生能分析
１−１．ＨＡＰＬＮ１蛋白質の反復腹腔投与による退化された成長板内軟骨形成促進
６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを若い（young）群に、２０ヵ月齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを老化（old）群に分類し、老化群には、ＨＡＰＬＮ１蛋白質を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：phosphate buffered saline）に希釈し、０．１ｍｇ／ｋｇの用量で、２週間毎日腹腔投与する一方、対照群は、ＰＢＳを同等な方法で腹腔投与した。
【００３１】
各群マウスの大腿骨及び膝関節の部位を取り、中性緩衝１０％ホルマリン（ＮＢＦ：neutral buffered １０％ formalin）で４８時間固定させ、連続して１０％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ：ethylenediaminetetraacetic acid）溶液で、７日間脱灰過程を遂行した。次に、各検体をパラフィン（paraffin）に包埋（embedding）し、パラフィンブロックを製造し、sagittal方向に５μｍ厚の組織切片スライドを製造した。組織学的評価のために、各組織切片スライドの軟骨組織は、サフラニンＯ／ファーストグリーンＦＣＦ（ＳＯ／ＦＧ）染色法を遂行して視覚化した。染色が完了した組織切片の観察は、Ｎｉ−Ｕ（Nikon）顕微鏡及びＤＳ−Ｒｉ１（Nikon）デジタルカメラを利用して撮影し、その結果を、図１（Ａ）に示した（縮尺バー＝１ｍｍ）。
【００３２】
図１（Ａ）から分かるように、若い対照群（young control）と比較したとき、老化対照群（old control）の成長板は退化し、軟骨組織跡だけ確認することができる一方、ＨＡＰＬＮ１蛋白質を反復的に腹腔投与され老化群（old ＨＡＰＬＮ１）においては、退化した成長板に軟骨が形成されたことを確認することができた（矢印先）。
【００３３】
１−２．ＨＡＰＬＮ１蛋白質の反復腹腔投与による軟骨形成能保有軟骨細胞の形成及び増加
前記実施例１−１から、ＨＡＰＬＮ１蛋白質の反復腹腔投与によって誘導された軟骨形成部位に、軟骨形成能を保有した細胞の存在いかんを確認するために、当該部位に対し、軟骨特異転写因子（cartilage-specific transcription factor）であるＳＯＸ９を、免疫組織化学法（ＩＨＣ：immunohistochemistry）を利用して染色した。染色が完了した組織切片の観察は、Ｎｉ−Ｕ（Nikon）顕微鏡及びＤＳ−Ｒｉ１（Nikon）デジタルカメラを利用して撮影し、その結果を図１（Ｂ）に示した（縮尺バー＝１ｍｍ）。
【００３４】
図１（Ｂ）から分かるように、若い対照群（young control）においては、ＳＯＸ９を発現する細胞を、軟骨組織内に全般的に保有している一方、老化対照群（old control）においては、ＳＯＸ９を発現する細胞を全く発見することができなかった。しかし、ＨＡＰＬＮ１蛋白質を反復的に腹腔投与された老化群（old ＨＡＰＬＮ１）の軟骨形成刺激部位において、ＳＯＸ９を発現する細胞が多数発見されることを確認することができた（矢印）。
【００３５】
実施例２：生体内損傷された軟骨組織におけるＨＡＰＬＮ１蛋白質による軟骨再生能分析
７週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、次のように３個群に分配した。正常対照群（Ｓｈａｍ control群）は、ＤＭＭ（destabilization of medial meniscus）施術に係わる模擬施術群（ｓｈａｍ operation）であり、施術後４週の間、既存の条件で飼育した。ビークル処置群（ＤＭＭ control群）は、ＤＭＭ施術後８週の間、既存の条件で飼育しながら、最後の４週の間は、週１回ＰＢＳを関節腔内投与した。ＨＡＰＬＮ１処置群（ＤＭＭ ＨＡＰＬＮ１群）は、ＤＭＭ施術後８週の間、既存の条件で飼育しながら、最後の４週の間は、週１回ＨＡＰＬＮ１蛋白質を、ＰＢＳに１μｇ／ｍＬ濃度に希釈して関節腔内投与した。
【００３６】
飼育終了時、施術及び処置が適用された膝組織を摘出し、ＮＢＦで４８時間固定させ、連続して１０％ ＥＤＴＡ溶液で７日間脱灰過程を遂行した。次に、各検体をパラフィンに包埋してパラフィンブロックを製造し、sagittal方向に５μｍ厚の組織切片スライドを製造した。免疫蛍光染色法（ＩＦ：immunofluorescence）を利用し、コラーゲンタイプＩＩ（Ｃｏｌ２：type ＩＩ collagen）を緑色蛍光に染色し、細胞核は、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を使用して青色蛍光に染色した。染色が完了した組織切片の観察は、Ｎｉ−Ｕ（Nikon）顕微鏡及びＤＳ−Ｒｉ１（Nikon）デジタルカメラを利用して撮影し、その結果を図２に示した（縮尺バー＝２００μｍ）。
【００３７】
図２から分かるように、正常対照群（Ｓｈａｍ control群）で発見されるコラーゲンタイプＩＩ発現細胞の数が、ビークル処置群（ＤＭＭ control群）で大きく減少している一方、ＨＡＰＬＮ１処置群（ＤＭＭ ＨＡＰＬＮ１群）において、コラーゲンタイプＩＩ発現細胞の数が大きく増加するということを確認することができた（矢印の先）。
【００３８】
実施例３：ＨＡＰＬＮ１蛋白質の試験管内軟骨形成促進能の分析
３−１．ＨＡＰＬＮ１蛋白質によるヒト関節軟骨細胞の軟骨形成能の上昇
ヒト関節軟骨細胞（ＨＡＣ：human articular chondrocyte）は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ、Gibco）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ：non-essentialaminoacid、Gibco）が含まれたDulbecco’s modified Eagle medium／Ｆ１２ １：１混合（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Gibco）培地内で、３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養された。
【００３９】
ＨＡＣの軟骨型性能を試すためのモデルとして、アルギン酸塩ビード（alginate bead）内に細胞を包埋する三次元培養システムを利用した。１．２５％アルギン酸塩（alginate）溶液に、ＨＡＣを均一に混合し、ビード当たり３０，０００個の細胞が含まれるようにした。それらは、前記成長培地に、５０μｇ／ｍＬ Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸（Ｌ−ascorbic acid ２−phosphate）、１％ ＩＴＳ（insulin-transferrin-selenium、Gibco）及び１０ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦ−β１を添加して培養し、ＨＡＰＬＮ１処理群は、５０ｎｇ／ｍＬ ＨＡＰＬＮ１を追加して添加した。培養は、３７℃、５％ ＣＯ２条件で、７日ないし２８日間持続させた。
【００４０】
培養終了時、アルギン酸塩ビードに包埋されたＨＡＣを回収するために、５５ｍＭ ＥＤＴＡ用液にアルギン酸塩を溶解させた後、５００ｘｇで３分間、遠心分離（centrifugation）した。遠心分離後に得られた細胞でもって、ＲＮＡ抽出及び重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、遺伝子発現様相を比較分析し、その具体的な過程は、次の通りである。
【００４１】
ＴＲＩｚｏｌ（Thermo Scientific）溶液を利用し、製造社の指示事項により、ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡ０．１μｇから、oligo−ｄＴ２０プライマー（primer）と、SuperScript ＩＩＩ First-Strand Synthesis Supermix（Invitrogen）を利用し、first-strand ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡは、ｉＱ ＳＹＢＲ Green Supermix（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を利用し、各関心遺伝子に係わる２００ｎＭプライマーと共にＰＣＲを進めた。反応条件としては、最初５分間９５℃を維持させた後、９５℃で１０秒、６２℃で１５秒、７２℃で２０秒の３段階過程を４５回反復た。増幅信号は、ＣＦＸ Connect（Ｂｉｏ−ｒａｄ）でリアルタイム測定され、関心遺伝子の発現量は、それぞれのＧＡＰＤＨ発現量に対する相対値として算出される。その結果を図３（Ａ）にしめし、ＰＣＲに使用された各ヒト遺伝子に係わるプライマー配列は、次の通りである。
【００４２】
【表１】
2020531560.tif 000003
【００４３】
図３（Ａ）から分かるように、ＨＡＰＬＮ１蛋白質は、ＨＡＣをして、ＳＯＸ９遺伝子発現を増加させると共に、アグリカン（ＡＣＡＮ：aggrecan）及びコラーゲンタイプＩＩ（ＣＯＬ２Ａ１）の遺伝子発現を増加大させるということを確認することができた。
【００４４】
３−２．ＨＡＰＬＮ１蛋白質によるヒト関節軟骨細胞の細胞外基質内プロテアグリカン蓄積増加
前記実施例３−１から、ＨＡＰＬＮ１添加による軟骨基質の細胞外蓄積を評価するために、培養２８日目のアルギン酸塩ビードを、ＮＢＦで１５分間固定し、ＯＣＴ compound（Sakura）内で液体窒素によって凍結させた。そこから、厚み５μｍの凍結切片を得て、アセトン（acetone）固定後、サフラニンＯ／ファーストグリーンＦＣＦ染色で視覚化した。染色された組織切片の観察は、Ｎｉ−Ｕ（Nikon）顕微鏡及びＤＳ−Ｒｉ１（Nikon）デジタルカメラを利用して撮影し、その結果を図３（Ｂ）に示した（縮尺バー＝２５０μｍ）。
【００４５】
図３（Ｂ）から分かるように、ＨＡＰＬＮ１蛋白質が含まれた培地で培養されたＨＡＣのアルギン酸塩ビードにおいては、その対照群に比べ、サフラニンＯによって染色されたプロテアグリカンの蓄積が大きく増加したということを確認することができた。
【００４６】
実施例４：ＨＡＰＬＮ１蛋白質によるＴＧＦ−β信号伝逹調節能分析
４−１．ＨＡＰＬＮ１蛋白質によるマウス関節軟骨細胞のＴＧＦ−β受容体Ｉ（ＴβＲ１）の蛋白質量増加
５日齢のＩＣＲマウスの両足関節軟骨から、未成熟マウス関節軟骨細胞（ｉＭＡＣ：immature murine articular chondrocyte）を分離した。得られたｉＭＡＣは、１０％ ＦＢＳ（Gibco）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）、１％ ＮＥＡＡ（Gibco）が含まれたＤＭＥＭ／Ｆ１２（Gibco）培地内で、３７℃、５％ ＣＯ２条件で培養された。
【００４７】
プレート底に高密度に培養されたｉＭＡＣに、１００ｎｇ／ｍＬ ＨＡＰＬＮ１を３時間ないし７２時間処理した後で細胞を収集し、ＲＩＰＡ（radioimmunoprecipitation assay）緩衝液内で蛋白質を抽出した。その後、ウェスタンブロット（western blot）を行い、ＴＧＦ−β受容体Ｉ（ＴβＲ１）、ＡＬＫ１（activin receptor-like kinase １）、ＴＧＦ−β受容体ＩＩ（ＴβＲ２）及びＧａｐｄｈの蛋白質発現レベルを確認し、その結果を図４（Ａ）に示した。
【００４８】
図４（Ａ）から分かるように、ＨＡＰＬＮ１蛋白質により、ｉＭＡＣのＴＧＦ−β受容体Ｉ（ＴβＲ１）の蛋白質発現レベルが上昇することを確認することができた。一方、ＡＬＫ１（activin receptor-like kinase １）及びＴＧＦ−β受容体ＩＩ（ＴβＲ２）の発現レベルは、変動がないということを確認することができた。
【００４９】
４−２．ＨＡＰＬＮ１蛋白質によるマウス関節軟骨細胞のＴＧＦ−β受容体Ｉ（ＴβＲ１）の安定性上昇
前記実施例４−１で示されたＨＡＰＬＮ１蛋白質によるＴＧＦ−β受容体Ｉ（ＴβＲ１）蛋白質レベル上昇が、安定性上昇による結果であるということを検証するために、同一実験条件下で、２４時間及び７２時間培養した細胞から、蛋白質レベルを比較した３種遺伝子の発現様相を比較分析すると共に、蛋白質生合成（de novo synthesis）を制限した環境において、ＨＡＰＬＮ１によるＴＧＦ−β受容体Ｉ（ＴβＲ１）蛋白質レベル上昇を検証した。
【００５０】
そのためのＲＮＡ抽出及びＰＣＲ過程は、次の通りである。
【００５１】
ＴＲＩｚｏｌ（Thermo Scientific）溶液を利用し、製造社の指示事項により、ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡ ０．１μｇから、oligo−ｄＴ２０プライマーとSuperScript ＩＩＩ First-Strand Synthesis Supermix（Invitrogen）とを利用し、first-strand ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡは、ｉＱ ＳＹＢＲ Green Supermix（Ｂｉｏ−ｒａｄ）を利用し、各関心遺伝子に係わる２００ｎＭプライマーと共にＰＣＲを進めた。反応条件としては、最初５分間９５℃を維持させた後、９５℃ １０秒、６１℃ １５秒、７２℃ ２０秒の３段階過程を４５回反復た。増幅信号は、ＣＦＸ Connect（Ｂｉｏ−ｒａｄ）でリアルタイム測定され、関心遺伝子の発現量は、それぞれのＧａｐｄｈ発現量に係わる相対値として算出された。その結果を、図４（Ｂ）に示し、ＰＣＲに使用された各マウス遺伝子に係わるプライマー配列は、次の通りである。
【００５２】
【表２】
2020531560.tif 000004
【００５３】
また、プレート底に高密度に培養されたｉＭＡＣに、１０μＭ、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）を処理して露出させる間、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）を処理する０．５時間前（ｐｒｅ）あるいは０．５時間後（ｐｏｓｔ）、から２００ｎｇ／ｍＬ ＨＡＰＬＮ１を処理した。シクロヘキシミド（ＣＨＸ）処理２４時間後、ＰＢＳでプレートを、細胞が付着した状態で洗浄し、細胞を収集し、ＲＩＰＡ緩衝液内で蛋白質を抽出した。抽出された溶解物（cell lysate）にウェスタンブロットを行い、ＴＧＦ−β受容体Ｉ（ＴβＲ１）、ＡＬＫ１（activin receptor-like kinase １）、ＴＧＦ−β受容体ＩＩ（ＴβＲ２）及びＧａｐｄｈの蛋白質発現レベルを確認し、その結果を図４（Ｃ）に示した。
【００５４】
図４（Ｂ）と図４（Ｃ）とから分かるように、ＨＡＰＬＮ１蛋白質により、ｉＭＡＣのＴＧＦ−β受容体Ｉ（ＴβＲ１）、ＡＬＫ１（activin receptor-like kinase １）、ＴＧＦ−β受容体ＩＩ（ＴβＲ２）のうちいずれも、その遺伝子発現が誘導あるいは抑制されないということを確認することができた。一方、ＨＡＰＬＮ１蛋白質により、ＴＧＦ−β受容体Ｉ（ＴβＲ１）は、、蛋白質発現レベルが変動していないＡＬＫ１（activin receptor-like kinase １）及びＴＧＦ−β受容体ＩＩ（ＴβＲ２）とは異なり、その発現レベルが上昇するということを確認することができた。それは、ＨＡＰＬＮ１蛋白質がＴＧＦ−β受容体Ｉ（ＴβＲ１）遺伝子に対する転写を誘導せず、その蛋白質の半減期を増大させたものであるということを示し、それは、ｉＭＡＣが保有したＴＧＦ−β受容体Ｉ（ＴβＲ１）蛋白質の安定性ガ上昇したということを示すのである。
【００５５】
４−３．ＨＡＰＬＮ１蛋白質によるマウス関節軟骨細胞のＴＧＦ−β受容体Ｉ（ＴβＲ１）の細胞表面積提示量増加
プレート底に高密度に培養されたｉＭＡＣに、１０μＭシクロヘキシミド（ＣＨＸ）を処理して露出させる間、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）を処理する０．５時間前（ｐｒｅ）あるいは０．５時間後（ｐｏｓｔ）から、２００ｎｇ／ｍＬ ＨＡＰＬＮ１を処理した。シクロヘキシミド（ＣＨＸ）処理２４時間後、ＰＢＳでプレートを、細胞が付着した状態で洗浄し、ＥＺ−Link Sulfo−ＮＨＳ−ＬＣ−Biotin（Thermo Scientific）を２時間反応させ、細胞表面蛋白質をビオチン（biotin）標識した。０．１Ｍ グリシン溶液で反応を終結させた後で細胞を収集し、ＮＰ−４０ lysis buffer（Bioworld）内で蛋白質を抽出した。抽出された溶解物において、ビオチン（biotin）抗体と磁性ビード（magnetic bead）とを利用した免疫沈降法を介して、ビオチン（biotin）が標識された細胞表面蛋白質だけ選択的に抽出し、そのように得られた分画物にウェスタンブロットを行い、ＴＧＦ−β受容体Ｉ（ＴβＲ１）、ＡＬＫ１（activin receptor-like kinase １）、ＴＧＦ−β受容体ＩＩ（ＴβＲ２）及びＧａｐｄｈの蛋白質発現レベルを確認し、その結果を図４（Ｄ）に示した。
【００５６】
図４（Ｄ）から分かるように、ＨＡＰＬＮ１蛋白質により、ｉＭＡＣの細胞表面に提示されているＴＧＦ−β受容体Ｉ（ＴβＲ１）蛋白質の発現レベルが上昇していることを確認することができると共に、ＡＬＫ１（activin receptor-like kinase １）及びＴＧＦ−β受容体ＩＩ（ＴβＲ２）の発現、は変動がないということを確認することができた。
【００５７】
以下に、本発明によるＨＡＰＬＮ１を含む組成物の製剤例について説明するが、本発明は、それらを限定するものではなく、単に具体的に説明するものである。
【００５８】
＜処方例１＞薬学組成物の処方例
【００５９】
＜処方例１−１＞散剤の製造
ＨＡＰＬＮ１ ２０ｍｇ、乳糖１００ｍｇ及びタルク１０ｍｇを混合し、気密包に充填し、散剤を製造した。
【００６０】
＜処方例１−２＞錠剤の製造
ＨＡＰＬＮ１ ２０ｍｇ、とうもろこし澱粉１００ｍｇ、乳糖１００ｍｇ及びステアリン酸マグネシウム２ｍｇを混合した後、通常の錠剤の製造方法によって打錠して錠剤を製造した。
【００６１】
＜処方例１−３＞カプセル剤の製造
ＨＡＰＬＮ１ １０ｍｇ、とうもろこし澱粉１００ｍｇ、乳糖１００ｍｇ及びステアリン酸マグネシウム２ｍｇを混合した後、通常のカプセル剤製造方法によって前述の成分を混合し、ゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
【００６２】
＜処方例１−４＞注射剤の製造
ＨＡＰＬＮ１ １０ｍｇ、注射用滅菌蒸溜水適量及びｐＨ調節制適量を混合した後、筒状の注射剤の製造方法により、１アンプル当たり（２ｍｌ）前述の成分含量で製造した。
【００６３】
＜処方例１−５＞軟膏剤の製造
ＨＡＰＬＮ１ １０ｍｇ、ＰＥＧ−４０００ ２５０ｍｇ、ＰＥＧ−４００ ６５０ｍｇ、白色ワセリン１０ｍｇ、パラオキシ安息香酸メチル１．４４ｍｇ、パラオキシ安息香酸プロピル０．１８ｍｇ、及び残量の精製水を混合した後、通常の軟膏剤の製造方法によって軟膏剤を製造した。
【００６４】
＜処方例２＞健康補助食品
【００６５】
＜処方例２−１＞健康食品の製造
ＨＡＰＬＮ１ １ｍｇ、ビタミン混合物適量（ビタミンＡアセテート７０μｇ、ビタミンＥ １．０ｍｇ、ビタミンＢ１ ０．１３ｍｇ、ビタミンＢ２ ０．１５ｍｇ、ビタミンＢ６ ０．５ｍｇ、ビタミンＢ１２ ０．２μｇ、ビタミンＣ １０ｍｇ、ビオチン１０μｇ、ニコチン酸アミド１．７ｍｇ、葉酸５０μｇ、パントテン酸カルシウム０．５ｍｇ）及び無機質混合物適量（硫酸第１鉄１．７５ｍｇ、酸化亜鉛０．８２ｍｇ、炭酸マグネシウム２５．３ｍｇ、第１リン酸カリウム１５ｍｇ、第２リン酸カルシウム５５ｍｇ、クエン酸カリウム９０ｍｇ、炭酸カルシウム１００ｍｇ、塩化マグネシウム２４．８ｍｇ）を混合した後、顆粒を製造し、通常の方法によって健康食品を製造した。
【００６６】
＜処方例２−２＞健康飲料の製造
ＨＡＰＬＮ １１ｍｇ、クエン酸１０００ｍｇ、オリゴ糖１００ｇ、梅濃縮液２ｇ、タウリン１ｇ及び精製水を加え、、全体９００ｍｌになるようにし、通常の健康飲料製造方法により、前述の成分を混合した後、約１時間８５℃で撹拌加熱した後、作られた溶液を濾過し、滅菌された２Ｌ容器に集められて密封滅菌した後、冷蔵保管した。
【００６７】
以上、本発明の特定部分を詳細に記述したが、当業界の当業者において、そのような具体的な記述は、単に望ましい具現例であるのみ、それらに本発明の範囲が制限されるものではないという点は、明白である。従って、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲と、その等価物とによって定義されるものである。
【００６８】
本発明の範囲は、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味、範囲そしてその均等概念から導き出される全ての変更、または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものであると解釈されなければならないのである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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