(57)【要約】  本出願は、第１及び第２の抗原に結合する抗体分子であって、第１の抗原は、疾患抗原、例えば、腫瘍抗原であり、第２の抗原は、免疫細胞の表面上の腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）受容体抗原である抗体分子に関する。抗体分子は、好ましくは、ＣＤＲベース抗原結合部位及び抗体分子の定常ドメインの２つ以上の構造ループ中に局在し得る抗原結合部位を含む。抗体分子は、例えば、癌療法において適用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の抗原及び第２の抗原に結合する抗体分子であって、
（ｉ）前記第１の抗原についてのＣＤＲベース抗原結合部位；及び
（ｉｉ）前記抗体分子の定常ドメイン中に局在する前記第２の抗原についての抗原結合部位であって、前記定常ドメインの１つ以上の構造ループ中の１つ以上のアミノ酸改変を含む抗原結合部位
を含み、
前記第１及び第２の抗原の一方は、腫瘍抗原であり、他方は、免疫細胞の表面上の腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）受容体である、
抗体分子。
【請求項２】
前記腫瘍抗原の存在下で前記免疫細胞上の前記ＴＮＦＲＳＦ受容体を活性化させ得る、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項３】
前記ＴＮＦＲＳＦ受容体及び前記腫瘍抗原への前記抗体分子の結合が、前記免疫細胞上の前記ＴＮＦＲＳＦ受容体のクラスター化を引き起こす、請求項１又は２に記載の抗体分子。
【請求項４】
前記第１の抗原が、腫瘍抗原であり、前記第２の抗原が、免疫細胞の表面上のＴＮＦＲＳＦ受容体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項５】
前記第１の抗原が、免疫細胞の表面上のＴＮＦＲＳＦ受容体であり、前記第２の抗原が、腫瘍抗原である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項６】
前記免疫細胞上で発現される前記ＴＮＦＲＳＦ受容体が、活性化のために３つ以上の受容体のクラスター化を要求する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項７】
前記ＴＮＦＲＳＦ受容体が、ＣＤ２７、ＥＤＡ２Ｒ、ＥＤＡＲ、ＦＡＳ、ＬＴＢＲ、ＲＥＬＴ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ〜１０Ｄ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＴＮＦＲＳＦ２１及びＴＮＦＲＳＦ２５からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項８】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項９】
前記腫瘍抗原が、癌細胞上の細胞表面抗原である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１０】
前記腫瘍抗原が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である、請求項９に記載の抗体分子。
【請求項１１】
前記腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が、ＭＨＣ／ペプチド新抗原又は腫瘍微小環境抗原である、請求項１０に記載の抗体分子。
【請求項１２】
前記ＴＡＡが、ＨＥＲ２、ＦＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ２０、ＣＤ７３、ＰＳＭＡ、メソテリン、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＣＤ２００、αｖβ６、ＰＤＬ１、Ｂ７Ｈ３又はＥＧＦＲからなる群から選択される、請求項１０に記載の抗体分子。
【請求項１３】
前記腫瘍抗原が、可溶性多量体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１４】
可溶性多量体が、少なくとも二量体、例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）である、請求項１３に記載の抗体分子。
【請求項１５】
可溶性多量体が、少なくとも三量体である、請求項１４に記載の抗体分子。
【請求項１６】
全抗体である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１７】
ＩｇＧである、請求項１６に記載の抗体分子。
【請求項１８】
Ｆｃγ受容体に結合しない、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項１９】
１つ以上のＦｃγ受容体への前記抗体分子のＣＨ２ドメインの結合を低減させ、又は解消するように改変されている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項２０】
前記Ｆｃγ受容体が、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩからなる群から選択される、請求項１９に記載の抗体分子。
【請求項２１】
前記定常領域中の前記第２の抗原についての１つ以上の抗原結合部位を有する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項２２】
前記定常ドメインが、ＣＨ３、ＣＨ２、ＣＨ１及びＣＬからなる群から選択される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項２３】
前記定常ドメインが、ＣＨ３ドメイン又はＣＨ２ドメインである、請求項２２に記載の抗体分子。
【請求項２４】
前記定常ドメインが、ＣＨ３ドメインである、請求項２３に記載の抗体分子。
【請求項２５】
前記１つ以上の構造ループが、ＡＢ、ＣＤ及びＥＦループから選択される、請求項２３に記載の抗体分子。
【請求項２６】
前記アミノ酸改変が、アミノ酸置換、付加、又は欠失である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項２７】
前記第２の抗原についての前記抗原結合部位が、前記定常ドメインの２つ以上の構造ループ中の１つ以上のアミノ酸改変を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項２８】
前記第１の抗原についての前記ＣＤＲベース抗原結合部位が、３つのＶＨドメインＣＤＲ及び３つのＶＬドメインＣＤＲを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項２９】
前記ＣＤＲベース抗原結合部位が、免疫グロブリンＶＨドメイン及び免疫グロブリンＶＬドメインにより形成される、請求項２８に記載の抗体分子。
【請求項３０】
前記第１の抗原についての前記ＣＤＲベース抗原結合部位が、前記抗体分子の可変領域中に局在する、請求項２８又は２９に記載の抗体分子。
【請求項３１】
前記第１の抗原についての２つのＣＤＲベース抗原結合ドメインを有する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抗体分子をコードする核酸。
【請求項３３】
請求項３２に記載の核酸を含むベクター。
【請求項３４】
請求項３２に記載の核酸、又は請求項３３に記載のベクターを含む組換え宿主細胞。
【請求項３５】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抗体分子を産生する方法であって、前記抗体分子の産生のための条件下で請求項３４に記載の組換え宿主細胞を培養することを含む方法。
【請求項３６】
前記抗体分子を単離及び／又は精製することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抗体分子及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項３８】
医薬品としての使用のための、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項３９】
患者における癌を治療する方法における使用のための、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項４０】
患者における癌を治療する方法における使用のための医薬品の製造における、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抗体分子の使用。
【請求項４１】
患者における癌を治療する方法であって、治療有効量の請求項１〜３１のいずれか一項に記載の抗体分子を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項４２】
請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の使用のための抗体、使用又は治療方法であって、前記方法が、少なくとも１つの追加の治療剤を前記患者に投与することをさらに含む抗体、使用又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本発明は、第１及び第２の抗原に結合する抗体分子であって、第１の抗原は、疾患抗原、例えば、腫瘍抗原であり、第２の抗原は、免疫細胞の表面上の腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）受容体抗原である抗体分子に関する。抗体分子は、好ましくは、ＣＤＲベース抗原結合部位及び抗体分子の定常ドメインの２つ以上の構造ループ中に局在し得る抗原結合部位を含む。本発明の抗体分子は、例えば、癌療法において適用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
細胞シグナリングは、細菌から高等真核生物までの全ての生物の生活の根幹である。これには通常、可溶性又は表面発現リガンドと相互作用する細胞表面受容体が関与する。この相互作用は、受容体又はリガンドのいずれか又はその両方の変化をもたらし、次いでそれらの変化は、受容体細胞内ドメインと相互作用する細胞内タンパク質を介して変換される。リガンドの結合は受容体の立体構造変化を誘導し得、それが二量体又はオリゴマーへのそれらのまとまったクラスター化を引き起こす。次いで、このクラスター化効果は、複数の機序、例えば、受容体の細胞内ドメインのキナーゼ活性の誘導による、受容体及びそれらの細胞内シグナリングパートナー間の相互作用の促進／阻害による、又は受容体及び他の細胞表面受容体間の相互作用の促進／阻害による細胞内シグナリング経路の活性化をもたらす。このように活性化される多数の受容体ファミリー、例えば、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ、例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ））、シンデカン、ＥｐＨ受容体及び腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）受容体が存在する。
【０００３】
ＴＮＦＲＳＦ受容体は細胞表面において単量体として存在し、活性化のためにそれらのリガンドとの相互作用を介する三量体へのクラスター化を要求する。このクラスター化は、ＮＦｋＢ細胞内シグナリング経路の活性化をもたらす。この経路は、細胞内シグナリングタンパク質、例えば、ＴＲＡＦ２、３、及び５のリクルートメント、並びにＩＫＫα、ＩＫＫβ、ＩＫＫγ、ＰＩ３Ｋのｐ８５サブユニット、及びＡＫＴを含有するシグナリング複合体の形成により開始される。次いで、このシグナリング複合体はＩκＢαのリン酸化及び分解を誘導し、ＮＦ−κＢ１の活性化並びに核中へのｐ５０及びＲｅｌＡの流入をもたらす。これは、増殖及び生存シグナルをもたらす転写プログラムを活性化させる。ＴＮＦＲＳＦのメンバーとしては、Ｂ及びＴ細胞発生、生存、免疫活性化、並びに抗腫瘍免疫応答において重要な役割を有するいくつかの共刺激タンパク質が挙げられる。
【０００４】
Wajant(2015)Cell Death Differ.,22(1):1727-41は、ＴＮＦＲＳＦ受容体特異的抗体が、典型的には、アゴニスト活性を有さず、又は極めてわずかなアゴニスト活性を有するにすぎず、十分な受容体活性化を誘導するために外部架橋剤、例えば、プロテインＡ若しくはＧ若しくは二次抗体を使用する抗体−ＴＮＦＲＳＦ受容体複合体の二次架橋、又は細胞膜局在Ｆｃガンマ受容体への抗体の結合を要求することを報告している。
【０００５】
ＴＮＦＲＳＦ受容体及び癌細胞の両方を同時に標的化するポリペプチドを生成するためのいくつかの試みがなされてきた。例えば、Ｈｅｒ２特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）トラスツズマブに遺伝子的に融合している抗ＣＤ１３７アンチカリンタンパク質は、ヒト化マウスモデルにおいてＨＥＲ２が過剰発現される部位におけるリンパ球上のＣＤ１３７の腫瘍標的依存的活性化を提供するが、トラスツズマブ単独と比べて腫瘍成長阻害のいかなる改善も有さないことが報告されている（Hinner et al.,“Costimulatory T-cell engagement by PRS-343,a CD137(4-1BB)/HER2 bispecific,leads to tumour growth inhibition and TIL expansion in humanized mouse model”,poster presentation at the CRI-CIMT-AACR International Cancer Immunotherapy Conference:Translating Science into Survival;2016 Sept 25-28;New York,NY.,September 25-26,2016,New York,NY及びＰＣＴ公開の国際公開第２０１６／１７７８０２Ａ１号）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
本発明者らは、可変及び定常ドメイン中の両方の抗原結合部位を含む抗体分子が、疾患抗原、例えば、腫瘍抗原の存在下でコンディショナルでＴＮＦＲＳＦ受容体を活性化させ、例えば、腫瘍微小環境において疾患依存的に免疫細胞の活性化において高度に有効であることを認識した。これは、例えば、癌及び他の疾患の治療のための免疫療法において有用であり得る。
【０００７】
上記の背景セクションに記載のとおり、ＴＮＦＲＳＦリガンドのそのコグネイト受容体への初回ライゲーションは、受容体三量体化とそれに続く受容体クラスター化、腫瘍壊死因子受容体関連因子（ＴＲＡＦ）の活性化及び後続の強力な抗腫瘍Ｔ細胞活性の開始をもたらす一連のイベントを開始させる。活性化を効率的に達成するための治療剤のため、いくつかのＴＮＦＲＳＦタンパク質が三量体リガンドを模倣するように一緒に架橋されることが必要とされる。
【０００８】
本発明者らは、可変及び定常ドメイン中の抗原結合部位を含む抗体分子であって、一方の抗原結合部位は免疫細胞の表面上のＴＮＦＲＳＦ受容体に結合し、他方は腫瘍抗原に結合する抗体分子が、インビトロで腫瘍抗原に結合した場合にＴＮＦＲＳＦ受容体のクラスター化及びシグナリングを誘導し得たことを示した。ＴＮＦＲＳＦ受容体についての結合部位が抗体分子の可変ドメイン中に局在するか定常ドメイン中に局在するかにかかわらず、ＴＮＦＲＳＦ受容体のクラスター化及びシグナリングを達成することができた。換言すると、抗体分子内の２つの抗原結合部位の配向は重要でなく、但し、一方はＴＮＦＲＳＦ受容体に結合し、他方は腫瘍抗原に結合することを条件とする。
【０００９】
本発明者らは、上記詳述の２つの抗原結合部位を含む抗体分子が、抗体分子により結合される腫瘍抗原が可溶性多量体、例えば、二量体分子であった場合にＴＮＦＲＳＦ受容体のクラスター化及びシグナリングを誘導し得たことも示した。
【００１０】
本発明者らは、上記詳述の２つの抗原結合部位を含む抗体分子が、インビボで腫瘍成長を抑制し得たことをさらに示した。抗体分子の一方が本発明者らにより試験された二重特異的分子と同一の定常ドメインを含み、他方が同一の可変ドメイン結合部位を含む２つの抗体分子の組合せを使用した場合、腫瘍成長抑制は見られなかった。これは、ＴＮＦＲＳＦ受容体のクラスター化及びシグナリング並びにしたがって免疫細胞活性化及び対応する抗腫瘍効果を達成するために２つの結合部位が同一の分子中に存在しなければならないことを実証する。
【００１１】
上記のとおり、本発明者らにより同定された抗体分子の利点の１つは、それらが、疾患抗原、例えば、腫瘍抗原の存在下でコンディショナルでＴＮＦＲＳＦ受容体を活性化させ得ることである。具体的には、多価腫瘍抗原への抗体分子の結合が腫瘍抗原の部位における抗体分子のクラスター化を引き起こし、次いでそれが免疫細胞表面上のＴＮＦＲＳＦ受容体のクラスター化及び活性化をもたらすことが考えられる。結果として、抗体分子は、低減したオフターゲット効果を有する可能性が高い。それというのも、抗体分子は、たとえクラスター化を示すにしても、腫瘍微小環境の外側では低いクラスター化を示すためである。したがって、抗体分子のアゴニスト活性は、腫瘍抗原及びＴＮＦＲＳＦ受容体の両方が存在する環境に制限される。換言すると、アゴニスト活性は、コンディショナルである。さらに、多価腫瘍抗原の存在下での抗体のクラスター化は、抗体分子の第２の結合部位を介して結合するＴＮＦＲＳＦ受容体のクラスター化を補助すると考えられる。それというのも、抗体分子の両方の結合部位がそれらのそれぞれの標的に結合した場合に抗体分子のアゴニスト活性の増加が観察されたが、一方のみの結合部位が結合した場合には観察されなかったためである。
【００１２】
本発明者らにより同定された抗体分子は、それらの可変及び定常ドメイン中の両方で抗原結合部位を含む。抗体分子による腫瘍抗原及びＴＮＦＲＳＦ受容体の両方の結合は、腫瘍微小環境中でＴＮＦＲＳＦ受容体を発現する免疫細胞及び腫瘍抗原間の架橋を引き起こすと考えられる。
【００１３】
特に、本発明者らにより同定された抗体分子は、それらの可変ドメイン中の２つの抗原結合部位及びそれらの定常ドメイン中の２つの抗原結合部位を含む。したがって、両方の結合部位は、二価である。これは、多数の追加の利点を有する。例えば、両方の標的の二価結合は、腫瘍微小環境中でＴＮＦＲＳＦ受容体を発現する免疫細胞及び腫瘍抗原間の架橋をより安定的に作製し、それにより、免疫細胞が腫瘍微小環境中に局在化され、腫瘍上で作用し得る時間を延長することが予測される。例えば、定常ドメイン結合部位が腫瘍抗原に二価的に結合する場合、これは腫瘍抗原及び免疫細胞間の架橋を安定化し、抗体分子の可変ドメイン結合部位が免疫細胞表面上のＴＮＦＲＳＦ受容体に結合し、それをクラスター化することによりそれらの効果を発揮することが可能とすることが考えられる。同様に、定常ドメイン結合部位がＴＮＦＲＳＦ受容体に結合する場合、これも、腫瘍抗原及び免疫細胞間の架橋を安定化することが考えられ、驚くべきことに、免疫細胞表面上のＴＮＦＲＳＦ受容体のクラスター化及び活性化をもたらすことが示された。これは、Ｆａｂアームが移動し、それらの標的に結合することを可能とするヒンジ領域の抗体分子の公知のフレキシビリティと比較して抗体分子の定常ドメイン（特に２つのＣＨ３ドメイン）間のリジッドな構造及び小分子距離を考慮すると、驚くべきことである。定常ドメイン結合部位のタイトな形状に照らして、定常ドメイン結合部位が、最初は細胞膜上に近接して存在し得ないＴＮＦＲＳＦ受容体のクラスター化によりドライブされるアゴニズムを誘導し得ることは予測されなかった。しかしながら、本発明者らにより得られた本明細書に記載の結果は、そのような結合がインビトロ及びインビボの両方で可能であることを明らかに示す。さらに、本発明者らにより同定された抗体分子の両方の結合部位が二価であるという事実は、いずれかの結合部位が結合した場合にＴＮＦＲＳＦ受容体をクラスター化し、したがって、活性化させるように作用し得、抗体分子中の２つの結合部位の設計及び配向におけるフレキシビリティを可能とすることを意味する。
【００１４】
大多数の公知の二重特異的抗体はヘテロ二量体であり、それぞれのＦａｂアームを介して１つの標的抗原にのみ結合する。この一価相互作用は、抗原、例えば、ＴＮＦＲＳＦ受容体のクラスター化及びしたがってそのような受容体を発現する免疫細胞のアゴニズムを誘導するためには不十分であることが多い。
【００１５】
本発明者らにより同定された抗体分子のさらなる特徴は、腫瘍抗原及びＴＮＦＲＳＦ受容体についての２つの抗原結合部位が、両方とも、抗体構造自体内に含有されることである。特に、抗体分子は、その標的の両方に二価的に結合する分子をもたらすためのリンカー又は他の手段を介する抗体分子への他のタンパク質の融合を要求する。これは、多数の利点を有する。具体的には、本発明者らにより同定された抗体分子は、それらがいかなる追加の融合部分も含まないため、標準的抗体の産生について用いられるものと類似する方法を使用して産生することができる。構造は、改善された抗体安定性をもたらすことも予測される。それというのも、リンカーは経時的に分解し、不均一な抗体分子の集団をもたらし得るためである。融合している１つのみのタンパク質を有する集団のそれらの抗体は、ＴＮＦＲＳＦ受容体のコンディショナルアゴニズムを誘導し得ない。リンカーの開裂／分解は、患者への治療薬の投与前又は投与後に生じ得（例えば、酵素的開裂又は患者のインビボｐＨを介して）、それにより患者において循環しながらその有効性の低減をもたらす。本発明者らにより同定された抗体分子中ではリンカーが存在しないため、抗体分子は、投与前後の両方で同一数の結合部位を保持することが予測される。さらに、本発明者らにより同定された抗体分子の構造は、分子の免疫原性の観点からも好ましい。それというのも、融合タンパク質又はリンカー又はその両方の導入は、分子が患者に投与される場合に免疫原性を誘導し、治療薬の有効性の低減をもたらし得るためである。
【００１６】
したがって、本発明の一態様は、第１の抗原及び第２の抗原に結合する抗体分子であって、
（ｉ）第１の抗原についての相補性決定領域（ＣＤＲ）ベース抗原結合部位；及び
（ｉｉ）抗体分子の定常ドメイン中に局在する第２の抗原についての抗原結合部位
を含み、前記抗原結合部位は、定常ドメインの１つ以上の構造ループ中の１つ以上のアミノ酸改変を含み；
第１及び第２の抗原の一方は、疾患抗原であり、他方は、免疫細胞の表面上の腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）受容体である抗体分子を提供する。
【００１７】
好ましくは、抗体分子は、全抗体、例えば、ＩｇＧであり得る。
【００１８】
本発明の他の態様は、本明細書に記載の抗体分子をコードする単離核酸、前記単離核酸を含む発現ベクター及び前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１９】
本発明の別の態様は、医薬品としての使用のための本明細書に記載の抗体分子を提供する。
【００２０】
本発明の他の態様は、癌を治療する方法における使用のための、本明細書に記載の抗体分子；癌の治療における使用のための医薬品の製造における、本明細書に記載の抗体分子の使用；及び癌を治療する方法であって、本明細書に記載の抗体分子をそれが必要とされる個体に投与することを含む方法を提供する。
【００２１】
他の態様及び実施形態は、以下に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
図面の簡単な説明
【図１】本発明の二価二重特異的抗体分子の提案される作用機序を示す。説明される抗体分子は、分子のいずれかの末端における抗原結合部位を含む。分子のある末端における抗原結合部位は腫瘍抗原に結合し得、逆の末端における抗原結合部位は免疫細胞上のＴＮＦＲＳＦ受容体に結合し得る。抗体分子の両方の末端がエンゲージされる場合、説明されるとおり、これは、近接する複数の受容体分子の架橋、並びに結果的に受容体のクラスター化及び活性化をもたらす。図１において、抗体分子のＦｃ末端はＴＮＦＲＳＦ受容体を標的化しており、Ｆａｂ末端は腫瘍抗原を標的化している。しかしながら、本明細書に実証されるとおり、Ｆａｂ末端がＴＮＦＲＳＦ受容体を標的化し、Ｆｃ末端が腫瘍抗原を標的化する逆の配向の抗体分子も、コンディショナルアゴニズムを誘導し得る。
【図２】種々の抗体分子の存在下でのｈＣＤ２０発現Ｄａｕｄｉ細胞を含有するＴ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。Ｆｃａｂ／Ｆａｂ標的（無／ＦＩＴＣ、無／ｈＣＤ２０、無／ｍＴＮＦＲＸ、ｍＴＮＦＲＸ／無、ｍＴＮＦＲＸ／ＦＩＴＣ及びｍＴＮＦＲＸ／ｈＣＤ２０）に従って標識された６つの異なる抗体分子を本アッセイにおいて増加濃度において使用した。ＴＮＦＲＸは、Ｔ細胞上で発現されるＴＮＦＲＳＦ受容体である。図面の凡例において規定されるとおりに架橋剤を使用した。これらは、フルオレセインイソチオシアネート−デキストラン（ＦＩＴＣｄｅｘ）及び抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（ａ−ｈＦｃ）であった。結果は、架橋剤の使用及びｈＣＤ２０結合により媒介される架橋の両方を介してｍＴＮＦＲＸ受容体が標的化され、抗ｍＴＮＦＲＸ抗体が架橋される場合、Ｔ細胞の活性化の増加が存在することを示す。ｍＴＮＦＲＸ／ｈＣＤ２０  ｍＡｂ２抗体分子は、いかなる架橋剤の不存在下でもＴ細胞を活性化させ得、ＥＣ５０は架橋剤の存在下で他の抗体分子と比較して有意に低かった。
【図３】種々の抗体分子の存在下でＥｐＣＡＭ及びＣＤ７３発現４Ｔ１細胞を含有するＴ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。Ｆｃａｂ／Ｆａｂ標的（無／ＦＩＴＣ、ｍＴＮＦＲＸ／ＦＩＴＣ、無／ｍＥｐＣＡＭ、ｍＴＮＦＲＸ／ｍＥｐＣＡＭ、無／ｍＣＤ７３、ｍＴＮＦＲＸ／ｍＣＤ７３及び無／ｍＴＮＦＲＸ）に従って標識された７つの異なる抗体分子を本アッセイにおいて増加濃度において使用した。図面の凡例に規定されるとおりＦＩＴＣｄｅｘ及びａ−ｈＦｃ架橋剤を使用した。２つのｍＡｂ２抗体分子（ｍＴＮＦＲＸ／ｍＥｐＣＡＭ及びｍＴＮＦＲＸ／ｍＣＤ７３）が、試験された抗体分子のうちＴ細胞の活性化についての最低ＥＣ５０値を有した。結果は、２つ以上のタイプの細胞表面受容体を使用して抗ＴＮＦＲＸ  Ｆｃａｂと対合させることができることを実証する。それというのも、ＣＤ７３はＧＰＩ結合細胞表面受容体であり、ＥｐＣＡＭは膜貫通糖タンパク質であるためである。
【図４】種々の抗体分子の存在下でのｈＥＧＦＲ発現ＣＴ２６細胞を含有するＴ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。Ｆｃａｂ／Ｆａｂ標的（無／ＦＩＴＣ、ｍＴＮＦＲＸ／ＦＩＴＣ、無／ｍＴＮＦＲＸ、ｈＥＧＦＲ／ＦＩＴＣ、ｈＥＧＦＲ／ｍＴＮＦＲＸ、無／ｈＥＧＦＲ及びｍＴＮＦＲＸ／ｈＥＧＦＲ）に従って標識された７つの異なる抗体分子を本アッセイにおいて増加濃度において使用した。図面の凡例に規定されるとおりＦＩＴＣｄｅｘ及びａ−ｈＦｃ架橋剤を使用した。結果は、ｍＡｂ２の両方の配向（ｈＥＧＦＲ／ｍＴＮＦＲＸ及びｍＴＮＦＲＸ／ｈＥＧＦＲ）が受容体クラスター化及びＴ細胞活性化を誘導し得ることを示す。
【図５】単一濃度（１０ｎＭ）の異なる抗体分子についてのＴ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。４つの異なる抗体分子を本アッセイにおいて使用した。これらの分子は、野生型Ｆｃａｂ（非改変ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有）；ｈＴＮＦＲＸ  ｍＡｂ（無／ｈＴＮＦＲＸ）；可溶性単量体（１ｍｅｒ）及びｈＴＮＦＲＸ（１ｍｅｒ／ｈＴＮＦＲＸ）の両方に結合するｍＡｂ２；並びに可溶性二量体（２ｍｅｒ）及びｈＴＮＦＲＸ（２ｍｅｒ／ｈＴＮＦＲＸ）の両方に結合するｍＡｂ２であった。結果は、抗原の単量体性質のため、可溶性二量体が２ｍｅｒ／ｈＴＮＦＲＸ  ｍＡｂ２の抗体架橋を誘導し得るが、可溶性単量体は１ｍｅｒ／ｈＴＮＦＲＸ  ｍＡｂ２の抗体架橋を誘導し得ないことを示す。これは、多量体可溶性因子が抗体架橋を誘導し得るが、単量体可溶性因子は誘導し得ないことを実証する。
【図６】種々の抗体分子の存在下でのＣＤ２０発現Ｄａｕｄｉ細胞を含有するＴ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。ＴＮＦＲＹは、Ｔ細胞上で発現されるＴＮＦＲＳＦ受容体である。Ｆｃａｂ／Ｆａｂ標的（ｍＴＮＦＲＹ／ｈＣＤ２０、無／ｍＴＮＦＲＹ、無／ｈＣＤ２０）に従って標識された３つの異なる抗体分子を本アッセイにおいて増加濃度において使用した。プロテインＬをｍＴＮＦＲＹモノクローナル抗体（無／ｍＴＮＦＲＹ）のための架橋剤として使用した。抗体分子をＣＤ２０発現Ｄａｕｄｉ細胞（ＣＤ２０＋細胞）の不存在下及び存在下で試験した。ＣＤ２０＋細胞の不存在下でのｍＴＮＦＲＹ抗体についての結果を図６Ａに示し、ＣＤ２０＋細胞の存在下での結果を図６Ｂに示す。結果は、ｍＡｂ２フォーマットを使用して第２のＴＮＦＲＳＦ受容体のアゴニズムを誘導することができること及びｍＴＮＦＲＸ／ｈＣＤ２０  ｍＡｂ２抗体分子がＴ細胞を活性化させ、ＥＣ５０はｍＴＮＦＲＸ標的化ｍＡｂ抗体分子と比較して有意に低いことを実証する。
【図７】種々の抗体分子の存在下でのヒトＥｐｈＡ２発現ＨＰＡＣ細胞を含有するＴ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。Ｆｃａｂ／Ｆａｂ標的（無／ＦＩＴＣ、無／ＥｐｈＡ２、無／ｍＴＮＦＲＸ、ｍＴＮＦＲＸ／ＦＩＴＣ、ｍＴＮＦＲＸ／ＦＩＴＣ＋無／ＥｐｈＡ２及びｍＴＮＦＲＸ／ＥｐｈＡ２）に従って標識された６つの異なる抗体分子又は組合せを本アッセイにおいて増加濃度において使用した。ＴＮＦＲＸは、Ｔ細胞上で発現されるＴＮＦＲＳＦ受容体である。７Ａ：結果は、ＥｐｈＡ２発現ＨＰＡＣ細胞の存在下でのｍＴＮＲＦＸ／ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ２抗体によるＴ細胞の活性化の増加が存在することを示す。この結果は、ｍＴＮＲＦＸ標的化抗体がＴ細胞の活性化を増加させるために架橋が要求されること及びｍＴＮＲＦＸ／ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ２抗体がＨＰＡＣ（ＥｐｈＡ２＋）細胞の存在下でまさに架橋することができる唯一の分子であり、いかなる追加の非生理学的架橋剤も要求しないことを実証する。７Ｂ：図面の識別例に示されるとおり架橋剤の存在下で６つの異なる抗体分子又は組合せを試験した。これらは、フルオレセインイソチオシアネート−デキストラン（ＦＩＴＣｄｅｘ）及び抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（ａ−ｈＦｃ）であった。結果は、ｍＴＮＦＲＸ受容体が標的化され、抗ｍＴＮＦＲＸ抗体が架橋される場合にＴ細胞の活性化の増加が存在することを示す。この結果は、ｍＴＮＲＦＸ標的化抗体がＴ細胞の活性化を増加させるために架橋が要求されることを実証する。
【図８】Ｂａｌｂ／ｃマウスコホートにおけるＣＴ２６同系モデルの腫瘍成長曲線を示す。Ｆｃａｂ／Ｆａｂ標的（無／ＦＩＴＣ、ｍＴＮＦＲＸ／無、ｍＴＮＲＦＸ／無＋無／ＥｐｈＡ２、ｍＴＮＦＲＸ／ＥｐｈＡ２）に従って標識された４つの異なる抗体分子又は組合せを、１ｍｇ／ｋｇにおいて腫瘍接種の１０、１２及び１４日後に投与した。平均腫瘍容積プラス又はマイナス平均値の標準誤差をプロットし、最終日の腫瘍容積を異なる群にわたり両側ｔ検定を使用して比較した。ｍＴＮＦＲＸ／ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ２抗体処理群は、対照抗体の無／ＦＩＴＣ処理群と比較して統計的に有意な腫瘍容積低減を示した。この結果は、ｍＴＮＲＦＸ／ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ２抗体が、ＥｐｈＡ２発現腫瘍に対してインビボでｍＴＮＦＲＸ／無及び無／ＥｐｈＡ２抗体の組合せよりも良好な抗腫瘍効力を有することを実証し、ｍＴＮＲＦＸ／ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ２により媒介されるｍＴＮＲＦＸ及びＥｐｈＡ２の二重特異的エンゲージメントによるｍＴＮＲＦＸのインビボ架橋が腫瘍成長の制御において有効であることを示す。
【図９】Ｂａｌｂ／ｃマウスコホートにおけるＣＴ２６．ｈＥＧＦＲ同系モデルの腫瘍成長曲線を示す。Ｆｃａｂ／Ｆａｂ標的（無／ＦＩＴＣ、無／ＥＧＦＲ、ｍＴＮＦＲＹ／無＋無／ｈＥＧＦＲ及びｍＴＮＦＲＹ／ｈＥＧＦＲ）に従って標識された４つの異なる抗体分子又は組合せを、１ｍｇ／ｋｇにおいて腫瘍接種の７、９及び１１日後に投与した。平均腫瘍容積プラス又はマイナス平均値の標準誤差をプロットし、最終日の腫瘍容積を異なる群にわたり両側ｔ検定を使用して比較した。ｍＴＮＦＲＹ／ｈＥＧＦＲ  ｍＡｂ２抗体処理群は、対照抗体の無／ＥＧＦＲ処理群と比較して統計的に有意な腫瘍容積低減を示した。この結果は、ｍＴＮＲＦＹ／ｈＥＧＦＲ  ｍＡｂ２抗体がＥＧＦＲ発現腫瘍に対してインビボでｍＴＮＦＲＸ／無及び無／ｈＥＧＦＲ抗体の組合せよりも良好な抗腫瘍効力を有することを実証し、ｍＴＮＲＦＹ／ｈＥＧＦＲ  ｍＡｂ２により媒介されるｍＴＮＲＦＹ及びｈＥＧＦＲの二重特異的エンゲージメントによるｍＴＮＲＦＹのインビボ架橋が腫瘍成長の制御において有効であることを示す。
【図１０】単一濃度（１０ｎＭ）の異なる抗体分子についてのＴ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。５つの異なる抗体分子を、図面の識別例に規定されるとおり異なる架橋剤との組合せで本アッセイにおいて使用した。これらは、フルオレセインイソチオシアネート−デキストラン（ＦＩＴＣｄｅｘ）、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（ａ−ｈＦｃ）、及びＶＥＧＦであり、１：１のモル比において使用した。これらの分子は、陰性対照抗体（無／ＦＩＴＣ）；ＶＥＧＦに結合するｍＡｂ（無／ＶＥＧＦ）；ｍＴＮＦＲＸ  ｍＡｂ（無／ｍＴＮＦＲＸ）；ＦＩＴＣ及びｍＴＮＦＲＸの両方に結合するｍＡｂ２（ｍＴＮＦＲＸ／ＦＩＴＣ）；並びにＶＥＧＦ及びｍＴＮＦＲＸの両方に結合するｍＡｂ２（ｍＴＮＦＲＸ／ＶＥＧＦ）であった。結果は、ｍＴＮＲＦＸ抗体が架橋される場合にのみＴ細胞の活性化を増加させ得ること及び二重特異的ｍＡｂ２抗体を抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体、又はＦａｂ標的（ｍＴＮＲＦＸ／ＦＩＴＣの場合にはＦＩＴＣｄｅｘ、及びｍＴＮＲＦＸ／ＶＥＧＦの場合にはＶＥＧＦ）のいずれかにより架橋することができることを示す。ｍＴＮＲＦＸ／ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２抗体は、おそらく活性化Ｔ細胞によるＶＥＧＦの産生に起因してより高いバックグラウンドのＴ細胞活性化を示した。これは、腫瘍微小環境中で増加レベルにおいて存在するＶＥＧＦ、可溶性因子がｍＴＮＲＦＸ／ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２抗体を架橋し、Ｔ細胞活性化を増加させ得ることを実証する。
【図１１】種々の抗体分子の存在下でのＴ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。Ｆｃａｂ／Ｆａｂ標的（無／ＦＩＴＣ、無／ＶＥＧＦ、ｍＴＮＦＲＸ／ＦＩＴＣ、ｍＴＮＦＲＸ／ＶＥＧＦ）に従って標識された４つの異なる抗体分子を本アッセイにおいて増加濃度において使用した。ＴＮＦＲＸは、Ｔ細胞上で発現されるＴＮＦＲＳＦ受容体である。図面の識別例に規定されるとおり架橋剤を使用した。これらは、フルオレセインイソチオシアネート−デキストラン（ＦＩＴＣｄｅｘ）、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体（ａ−ｈＦｃ）及びＶＥＧＦであった。結果は、ｍＴＮＦＲＸ受容体が標的化され、抗ｍＴＮＦＲＸ  ｍＡｂ２抗体がそれらのＦａｂ標的により架橋される場合にＴ細胞の活性化の増加が存在することを示す。この結果は、ＶＥＧＦがｍＴＮＲＦＸ／ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２抗体を架橋し得、効率（ＥＣ５０及び最大応答）が人工架橋剤（ＦＩＴＣｄｅｘ）と同等であることを実証する。
【図１２】Ｂａｌｂ／ｃマウスコホートにおけるＣＴ２６同系モデルの腫瘍成長曲線を示す。Ｆｃａｂ／Ｆａｂ標的（無／ＦＩＴＣ、無／ＶＥＧＦ、ｍＴＮＲＦＸ／無＋無／ＶＥＧＦ、ｍＴＮＦＲＸ／ＶＥＧＦ）に従って標識された４つの異なる抗体分子、又はそれらの組合せを１ｍｇ／ｋｇにおいて腫瘍接種の１０、１２及び１４日後に投与した。平均腫瘍容積プラス又はマイナス平均値の標準誤差をプロットし、最終日の腫瘍容積を異なる群にわたり両側ｔ検定を使用して比較した。ｍＴＮＦＲＸ／ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２抗体処理群は、対照抗体の無／ＦＩＴＣ処理群と比較して統計的に有意な腫瘍容積低減を示した。この結果は、ｍＴＮＲＦＸ／ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２抗体が、微小環境中で増加したＶＥＧＦ濃度を有することが記載された腫瘍に対してインビボでｍＴＮＦＲＸ／無及び無／ＶＥＧＦ抗体の組合せよりも良好な抗腫瘍効力を有することを実証し、ｍＴＮＲＦＸ／ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２により媒介されるｍＴＮＲＦＸ及びＶＥＧＦの二重特異的エンゲージメントによるｍＴＮＲＦＸのインビボ架橋が腫瘍成長の制御において有効であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
詳細な説明
本発明は、第１の抗原についての相補性決定領域（ＣＤＲ）ベース抗原結合部位及び抗体分子の定常ドメイン中の第２の抗原についての抗原結合部位を含む抗体分子に関する。第１及び第２の抗原の一方は、疾患抗原、好ましくは、腫瘍抗原であり、他方は、免疫細胞の表面上の腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）受容体である。
【００２４】
疾患抗原結合の存在下での免疫細胞表面上のＴＮＦＲＳＦ受容体への抗体分子の結合は、細胞内シグナリング経路を刺激し、免疫細胞を活性化させる、ＴＮＦＲＳＦ受容体のクラスターの形成を引き起こさない。
【００２５】
免疫細胞表面上のＴＮＦＲＳＦ受容体及び疾患抗原の両方への抗体分子の結合は、ＴＮＦＲＳＦ受容体の免疫細胞表面上のクラスターの形成を引き起こし、次いでそれが細胞内シグナリング経路を刺激し、免疫細胞を活性化させる。免疫細胞は疾患抗原の存在下でのみ活性化されるため、抗体分子は、疾患抗原の環境中で選択的に免疫細胞を活性化させるが、他箇所では活性化させないコンディショナルアゴニストである。例えば、疾患抗原は、腫瘍抗原であり得、抗体分子は、癌患者において腫瘍の微小環境中で選択的に免疫細胞を活性化させ得、他箇所では活性化させ得ない。
【００２６】
さらに、本明細書に記載の抗体分子は、他の機序、例えば、外部架橋剤による架橋、又はＦｃガンマ受容体相互作用を介する架橋に依存する抗体分子と比較して増加した免疫細胞活性化を呈する。ＴＮＦＲＳＦ受容体の活性化がより効率的であるため、免疫細胞活性化は、他の抗体分子に対して低濃度の本明細書に記載の抗体分子において達成することができる。したがって、本明細書に記載の抗体分子は、Ｆｃガンマ受容体相互作用及び／又は外部架橋剤、例えば、プロテインＡ若しくはＧ若しくは二次抗体の不存在下でＴＮＦＲＳＦ受容体のクラスター化を引き起こし得る。
【００２７】
したがって、本明細書に記載の抗体分子は、免疫細胞の疾患標的ドライブ活性化、特に免疫細胞の腫瘍標的ドライブ活性化を示し得る。腫瘍の環境中の免疫細胞の活性化は、免疫療法において、例えば、癌の治療に有用であり得る。
【００２８】
本明細書に記載の抗体分子は、ＣＤＲベース抗原結合部位及び定常領域抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを含み得る。好適な抗体分子は、免疫グロブリン及びその抗原結合断片を含む。
【００２９】
抗体分子は、天然又は部分的若しくは完全に合成により産生されたもの、例えば、組換え分子であり得る。
【００３０】
好ましい実施形態において、抗体分子は、全抗体である。例えば、抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ又はＩｇＭ、好ましくは、ＩｇＧ、又はアイソタイプサブクラスのいずれか、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４であり得る。例えば、抗体分子は、ｍＡｂ２（商標）二重特異的抗体であり得る。本明細書に言及されるｍＡｂ２二重特異的抗体は、その可変領域のそれぞれにおけるＣＤＲベース抗原結合部位及び定常領域、好ましくは、ＣＨ３ドメイン中の１つ以上の抗原結合部位を含むＩｇＧ免疫グロブリンである。
【００３１】
他の実施形態において、抗体分子は、第１の抗原についてのＣＤＲベース抗原結合部位及び第２の抗原についての定常ドメイン抗原結合部位を含む抗体断片であり得る。ＣＤＲ配列及びＣＨ３ドメインの両方を含む抗体断片の一例は、ＣＨ３ドメインに結合しているｓｃＦｖを含むミニボディである（Hu et al.(1996),Cancer Res., 56(13):3055-61）。したがって、文脈がそうでないことを要求しない限り、本明細書において使用される用語「抗体分子」は、「抗体分子又はその断片」と同等である。好ましい抗体断片は、２つ以上のＣＤＲベース抗原結合部位及び／又は定常ドメインを含み得、すなわち、それらは、多価であり得る。
【００３２】
抗体分子は、モノクローナル抗体分子であり得る。
【００３３】
抗体分子は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体分子であり得る。したがって、別のポリペプチドに融合している免疫グロブリン結合ドメイン、又は等価物を含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニング及び発現は、欧州特許出願第０１２０６９４号及び欧州特許出願第０１２５０２３号に記載されている。
【００３４】
本明細書に記載の抗体分子は、汚染物質を有さないという意味で単離されていてよく、例えば、抗体は、他のポリペプチド及び／又は血清構成成分に結合し得る。
【００３５】
抗体並びにそれらの構築方法及び使用は当分野において周知であり、例えば、Holliger & Hudson, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136(2005)に記載されている。モノクローナル及び他の抗体を取り、組換えＤＮＡ技術の技術を使用して元の抗体の特異性を保持する他の抗体又はキメラ分子を産生することが可能である。このような技術は、ＣＤＲ、可変領域、及び／又は第２の抗原結合部位を提供する定常ドメイン配列を異なる免疫グロブリン中に導入することを含み得る。ある免疫グロブリンのＣＤＲの別の免疫グロブリン中への導入は、例えば、欧州特許出願第１８４１８７号、英国特許第２１８８６３８Ａ号及び欧州特許出願第２３９４００号に記載されている。類似の技術を関連定常ドメイン配列に用いることができる。或いは、ハイブリドーマ又は抗体分子を産生する他の細胞は、産生される抗体の結合特異性を変更してもしなくてもよい遺伝子突然変異又は他の変化に供することができる。
【００３６】
本明細書に記載の抗体分子は、Ｆｃ受容体及び／又は補体への結合を低減させ、又は解消するように改変することができる。これは、抗体分子の抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）活性の低減において有用であり得る。例えば、抗体分子のＣＨ２ドメインは、１つ以上のＦｃγ受容体、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩ及び／又は補体へのＣＨ２ドメインの結合を低減させ、又は解消するための突然変異を含み得る。１つ以上のＦｃγ受容体及び補体へのＣＨ２ドメインの結合を低減させ、又は解消する突然変異は公知であり、それとしては、Bruhns, et al., Blood 113(16):3716-25(2009)及びXu et al., Cellular Immunology 200(1):16-26(2000)に記載の「ＬＡＬＡ突然変異」が挙げられる。したがって、抗体分子は、ＣＨ２ドメインを含み得、ＣＨ２ドメインは、ＣＨ２ドメインの１．３位及び１．２位におけるアラニン残基を含み、ナンバリングは、ＩＭＧＴナンバリングスキームに従う。
【００３７】
一部の実施形態において、本明細書に記載の抗体分子は、Ｆｃγ受容体結合部位を欠き得、Ｆｃγ受容体への結合を呈し得ず、又は実質的に呈し得ない。さらに、又は或いは、本明細書に記載の抗体分子は、Ｃ１ｑ結合部位を欠き得、Ｃ１ｑへの結合を呈し得ず、又は実質的に呈し得ない。Ｃ１ｑへの結合を解消するための突然変異は、当分野において公知である。
【００３８】
抗体分子は、抗体の１つ以上の特性、例えば、キネティクス、例えば、親和性、オン及びオフ速度並びに／又は他の生物物理学的特徴、例えば、機能的半減期を改善する１つ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入をさらに含み得る。
【００３９】
本明細書に記載の抗体分子は、疾患抗原、例えば、腫瘍抗原に結合する１つ以上の抗原結合部位、及びＴＮＦＲＳＦ受容体に結合する１つ以上の抗原結合部位を含む。この文脈における結合は、特異的結合を指し得る。用語「特異的」は、抗体分子がその特異的結合パートナー以外の分子へのいかなる有意な結合も示さない置換を指し得る。用語「特異的」は、抗体分子が多数の抗原により担持される特定のエピトープ、例えば、腫瘍抗原及びＴＮＦＲＳＦ受容体上のエピトープに特異的である場合にも適用可能であり、その場合、抗体分子は、エピトープを担持する種々の抗原に結合し得る。
【００４０】
本発明の抗体分子は、１つ以上の第１の抗原についてのＣＤＲベース抗原結合部位を含む。
【００４１】
ＣＤＲベース抗原結合部位は、抗体可変領域中の抗原結合部位である。６つのＣＤＲ；３つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）ＣＤＲ及び３つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ＣＤＲにより形成されるＣＤＲベース抗原結合部位。抗原の結合に対する異なるＣＤＲの寄与は、異なる抗原結合部位において変動し得る。所与の抗原、例えば、腫瘍抗原又はＴＮＦＲＳＦ受容体に対する抗体分子の調製、及びそのような抗体分子のＣＤＲ配列の決定は十分確立されており、多くの好適な技術が当分野において公知である。
【００４２】
ＣＤＲベース抗原結合部位は、ＴＮＦＲＳＦ受容体又は疾患抗原、例えば、腫瘍抗原に結合する抗体のＨＣＤＲ３を含み得る。ＨＣＤＲ３は、抗体分子の特異性の決定における役割を担うことが公知である（Segal et al.,(1974), PNAS, 71:4298-4302; Amit et al.,(1986), Science, 233:747-753;Chothia et al.,(1987),J. Mol. Biol.,196:901-917; Chothia et al.,(1989),Nature, 342:877-883; Caton et al.,(1990),J.Immunol.,144:1965-1968; Sharon et al.,(1990a), PNAS, 87:4814-4817; Sharon et al.,(1990b),J.Immunol.,144:4863-4869; Kabat et al.,(1991b),J. Immunol., 147:1709-1719）。ＣＤＲベース抗原結合部位は、ＴＮＦＲＳＦ受容体又は疾患抗原、例えば、腫瘍抗原に結合する抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及び／又はＬＣＤＲ３をさらに含み得る。
【００４３】
ＣＤＲの配列は、定型的技術を使用して任意の所与の抗体のＶＨ及びＶＬドメイン配列から容易に決定することができる。ＣＤＲ配列は、例えば、Kabat(Kabat, E.A et al(1991).Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit.,NIH Publication no. 91-3242. U.S. Department of Health and Human Services）又は国際ImMunoGeneTics情報システム（IMGT: Lefranc,M.-P. et al. Nucleic Acids Res.43, D413-22(2015)）に従って決定することができる。
【００４４】
抗原結合部位の３つのＶＨドメインＣＤＲは、免疫グロブリンＶＨドメイン内に局在し得、３つのＶＬドメインＣＤＲは、免疫グロブリンＶＬドメイン内に局在し得る。例えば、ＣＤＲベース抗原結合部位は、抗体可変領域中に局在し得る。
【００４５】
抗体分子は、１つ又は好ましくは、２つ以上、例えば、２つの第１の抗原についてのＣＤＲベース抗原結合部位を有し得る。したがって、抗体分子は、天然存在のＩｇＧ分子の場合と同様に、１つのＶＨ及び１つのＶＬドメインを含み得るが、好ましくは、２つのＶＨ及び２つのＶＬドメイン、すなわち、２つのＶＨ／ＶＬドメインペアを含む。
【００４６】
一部の好ましい実施形態において、抗体分子は、２つの可変領域を含むＩｇＧ分子であり得、それぞれの可変領域は、第１の抗原についてのＣＤＲベース抗原結合部位を含む。
【００４７】
本発明の抗体分子は、定常領域中に局在する第２の抗原についての抗原結合部位（すなわち、定常領域抗原結合部位）を含む。
【００４８】
第２の抗原についての抗原結合部位は、抗体分子の任意の定常領域中に局在し得る。例えば、第２の抗原についての抗原結合部位は、ＣＨ４、ＣＨ３、ＣＨ２、ＣＨ１又はＣＬドメインの１つ以上、好ましくは、ＣＨ３又はＣＨ２ドメイン、最も好ましくは、ＣＨ３ドメイン中に局在し得る。
【００４９】
抗原結合部位は、抗体分子の定常ドメインの１つ以上、例えば、１、２、３つ以上の構造ループから構成され得る。
【００５０】
抗体定常ドメインの構造ループとしては、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、及びＦＧ構造ループが挙げられる。抗原結合部位は、定常ドメインのＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦ、及びＦＧ構造ループの２つ以上、最も好ましくは、ＡＢ、ＣＤ及び／又はＥＦ構造ループを含み得る。
【００５１】
抗体定常ドメイン中の構造ループの位置は、当分野において周知である。例えば、ＣＨ３ドメインの構造ループは、ＣＨ３ドメインの残基７〜２１（ＡＢループ）、２５〜３９（ＢＣループ）、４１〜８１（ＣＤループ）、８３〜８５（ＤＥループ）、８９〜１０３（ＥＦループ）及び１０６〜１１７（ＦＧループ）において局在しており、残基は、ＩＭＧＴ（ImMunoGeneTics（商標））ナンバリングスキームに従ってナンバリングされる。他の定常ドメイン中の構造ループ位置の局在は、容易に決定することができる。
【００５２】
定常ドメインの構造ループは、第２の抗原についての抗原結合部位を形成するための１つ以上のアミノ酸改変を含み得る。１つ以上のアミノ酸改変としては、アミノ酸置換、付加、又は欠失を挙げることができる。標的抗原についての抗原結合部位を作出するための抗体定常ドメインの構造ループ領域中へのアミノ酸改変の導入は当分野において周知であり、例えば、Wozniak-Knopp G et al.(2010)Protein Eng Des.23(4):289-297；国際公開第２００６／０７２６２０号及び国際公開第２００９／１３２８７６号に記載されている。定常ドメイン結合部位の例は、以下に提供される。
【００５３】
好ましい実施形態において、本発明の抗体分子は、ＣＨ３ドメインの７〜２１、４１〜８１、及び／又は８９〜１０３位においてそれぞれ局在するＡＢ、ＣＤ及び／又はＥＦ構造ループ中の１つ以上のアミノ酸改変（置換、付加、及び／又は欠失）を含む。より好ましくは、本発明の抗体分子は、ＣＨ３ドメインの１１〜１８、４３〜７８及び／又は９２〜１０１位における１つ以上のアミノ酸改変（置換、付加、及び／又は欠失）を含む。最も好ましくは、本発明の抗体分子は、本明細書に記載の第１の抗原についての抗原結合部位を提供するためのＣＨ３ドメインの１２〜１８、４５．１〜７８、９２〜９４、及び／又は９７〜９８位における１つ以上のアミノ酸改変（置換、付加、及び／又は欠失）を含む。未改変ＣＨ３ドメインは、好ましくは、配列番号３に記載の配列を含み、又はそれからなる。残基ナンバリングは、ＩＭＧＴナンバリングスキームに従う。
【００５４】
抗体分子は、第２の抗原についての１、２、又は３つ以上の定常ドメイン抗原結合部位を含み得る。
【００５５】
第２の抗原についての定常ドメイン抗原結合部位を含有する抗体Ｆｃ領域は、Ｆｃａｂと称することができる。一部の実施形態において、本明細書に記載の抗体分子は、第１の抗原に結合する抗体を提供し、そのＦｃ領域を、第２の抗原に結合するＦｃａｂにより置き換えることにより産生することができる。本明細書に記載の抗体分子は、第１の抗原に結合する抗体を提供し、そのＣＨ３ドメインを、第２の抗原に結合するＣＨ３ドメインにより置き換えることにより、又はＣＨ３ドメインの断片を、第２の抗原に結合するＣＨ３ドメイン断片により置き換えることにより産生することもできる。
【００５６】
好ましい実施形態において、抗体は、第１の抗原及び第２の抗原に結合する抗体であって、
（ｉ）免疫グロブリンＶＨドメイン及び免疫グロブリンＶＬドメインにより形成される第１の抗原についてのＣＤＲベース抗原結合部位；並びに
（ｉｉ）抗体分子のＣＨ３ドメイン中に局在する第２の抗原についての抗原結合部位（前記抗原結合部位は、ＣＨ３ドメインの１つ以上の構造ループ中の１つ以上のアミノ酸改変を含む）
を含み、
第１及び第２の抗原の一方は、腫瘍抗原であり、他方は、免疫細胞の表面上のＴＮＦＲＳＦ受容体である抗体である。
【００５７】
さらに好ましい実施形態において、抗体は、第１の抗原及び第２の抗原に結合する抗体であって、
（ｉ）免疫グロブリンＶＨドメイン及び免疫グロブリンＶＬドメインによりそれぞれ形成される第１の抗原についての２つのＣＤＲベース抗原結合部位；及び
（ｉｉ）抗体分子の２つのＣＨ３ドメイン中に局在する第２の抗原についての２つの抗原結合部位（前記抗原結合部位は、ＣＨ３ドメインの１つ以上の構造ループ中の１つ以上のアミノ酸改変を含む）；
を含み、
第１及び第２の抗原の一方は、腫瘍抗原であり、他方は、免疫細胞の表面上のＴＮＦＲＳＦ受容体である抗体である。
【００５８】
いっそうさらに好ましい実施形態において、抗体は、第１の抗原及び第２の抗原に結合する完全免疫グロブリン分子、例えば、完全ＩｇＧ１分子であって、
（ｉ）免疫グロブリンＶＨドメイン及び免疫グロブリンＶＬドメインによりそれぞれ形成される第１の抗原についての２つのＣＤＲベース抗原結合部位；並びに
（ｉｉ）免疫グロブリン分子の２つのＣＨ３ドメイン中に局在する第２の抗原についての２つの抗原結合部位（前記抗原結合部位は、ＣＨ３ドメインの１つ以上の構造ループ中の１つ以上のアミノ酸改変を含む）
を含み、
第１及び第２の抗原の一方は、腫瘍抗原であり、他方は、免疫細胞の表面上のＴＮＦＲＳＦ受容体であり、
ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＬドメインをさらに含む完全免疫グロブリン分子である。
【００５９】
通常リンカーを介する抗体又はその断片への第２の抗原結合部分のコンジュゲーションを介して第２の抗原結合部位が提供される二重特異的分子は、当分野において公知である。このような分子は、リンカー開裂が第２の抗原結合部位の損失をもたらし得るという潜在的な欠点を有する。本発明に関して、２つの結合部位の一方の損失は、本発明の抗体分子を不活性にさせる。したがって、本発明の抗体分子は、好ましくは、例えば、抗体分子のＣ末端に、例えば、リンカー配列を介してコンジュゲートしている第２の抗原結合部分（例えば、アンチカリン、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、単一可変ドメイン（ｓＶＤ）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、又は抗原結合断片（Ｆａｂ））を含まない。本明細書に記載の抗体分子は、ＣＤＲベース抗原結合部位を介して第１の抗原に結合し、定常ドメイン抗原結合部位を介して第２の抗原に結合する。
【００６０】
一部の実施形態において、第１の抗原は、免疫細胞の表面上のＴＮＦＲＳＦ受容体であり得、第２の抗原は、疾患抗原、例えば、腫瘍抗原であり得る。
【００６１】
他の実施形態において、第１の抗原は、疾患抗原、例えば、腫瘍抗原であり得、第２の抗原は、ＴＮＦＲＳＦ受容体であり得る。
【００６２】
抗体分子は、５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、又は１ｎＭ未満の第１及び／又は第２の抗原についての解離定数を有し得る。例えば、抗原分子は、０．１〜５０ｎＭ、例えば、０．５〜１０ｎＭの第１及び／又は第２の抗原についての親和性を有し得る。抗体分子の結合キネティクス及び親和性（平衡解離定数、Ｋｄとして表現される）は、標準的技術、例えば、表面プラズモン共鳴を使用して、例えば、BIAcore分析を使用して決定することができる。
【００６３】
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）受容体は、腫瘍壊死因子スーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）の１つ以上のリガンドに結合する細胞外システインリッチドメインを含む膜結合サイトカイン受容体である。
【００６４】
ＴＮＦＲＳＦ受容体は、免疫細胞の表面上で局在し得る。ＴＮＦＲＳＦリガンドの結合時、ＴＮＦＲＳＦ受容体は、免疫細胞を活性化させる免疫細胞表面上のクラスターを形成する。例えば、リガンド結合ＴＮＦＲＳＦ受容体は、多量体、例えば、三量体、又は多量体のクラスターを形成し得る。リガンド結合ＴＮＦＲＳＦ受容体のクラスターの存在は、免疫細胞を活性化させる細胞内シグナリング経路を刺激する。
【００６５】
本明細書に記載の抗体分子は、細胞表面上のＴＮＦＲＳＦ受容体及び腫瘍抗原の両方にエンゲージすることにより、ＴＮＦＲＳＦ受容体がクラスター化し、免疫細胞を活性化させることを引き起こす。
【００６６】
ＴＮＦＲＳＦ受容体としては、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＥＤＡ２Ｒ、ＥＤＡＲ、ＦＡＳ、ＬＴＢＲ、ＲＥＬＴ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ−１０Ｄ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＴＮＦＲＳＦ２１及びＴＮＦＲＳＦ２５が挙げられる。
【００６７】
ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７：遺伝子ＩＤ  ９３９）は、ＮＰ＿００１２３３．１の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２４２．４の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＣＤ４０（ＴＮＦＲＳＦ５：遺伝子ＩＤ  ９５８）は、ＮＰ＿００１２４１．１の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２５０．５の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＥＤＡ２Ｒ（ＴＮＦＲＳＦ２７：遺伝子ＩＤ  ６０４０１）は、ＮＰ＿００１１８６６１６．１の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１１９９６８７．２の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＥＤＡＲ（遺伝子ＩＤ  １０９１３）は、ＮＰ＿０７１７３１．１の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０２２３３６，３の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＦＡＳ（ＴＮＦＲＳＦ６：遺伝子ＩＤ  ３５５）は、ＮＰ＿００００３４．１の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００００４３．５の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＬＴＢＲ（ＴＮＦＲＳＦ３：遺伝子ＩＤ  ４０５５）は、ＮＰ＿００１２５７９１６．１の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２７０９８７．１の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＲＥＬＴ（ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ：遺伝子ＩＤ  ８４９５７）は、ＮＰ＿１１６２６０．２の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０３２８７１．３の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（遺伝子ＩＤ  ７１３２）は、ＮＰ＿００１０５６．１の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１０６５．３の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（遺伝子ＩＤ  ７１３３）は、ＮＰ＿００１０５７．１の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１０６６．２の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ４（遺伝子ＩＤ  ７２９３）は、ＮＰ＿００３３１８の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３３２７）の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ（遺伝子ＩＤ  ８７７１）は、ＮＰ＿００３８１４．１の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８２３．３の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ８（遺伝子ＩＤ  ９４３）は、ＮＰ＿００１２３４．３の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２４３．４の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ９（遺伝子ＩＤ  ３６０４）は、ＮＰ＿００１５５２の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ００１５６１）の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（遺伝子ＩＤ  ８７９７）は、ＮＰ＿００３８３５．３の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８４４．３の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（遺伝子ＩＤ  ８７９５）は、ＮＰ＿００３８３３．４の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８４２．４の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（遺伝子ＩＤ  ８７９４）は、ＮＰ＿００３８３２．２の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８４１．４の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（遺伝子ＩＤ  ８７９３）は、ＮＰ＿００３８３１．２の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００３８４０．４の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る��ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（遺伝子ＩＤ  ８７９２）は、ＸＰ＿０１１５２４５４７．１の参照アミノ酸配列を有し、ＸＭ＿１１５２６２４５．２の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（遺伝子ＩＤ  ４９８２）は、ＮＰ＿００２５３７．３の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００２５４６．３の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ（遺伝子ＩＤ  ５１３３０）は、ＮＰ＿０５７７２３．１の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０１６６３９．２の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（遺伝子ＩＤ  ２３４９５）は、ＮＰ＿００３６５８４．１の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０１２４５２．２の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ（遺伝子ＩＤ  １１５６５０）は、ＮＰ＿４４３１７７．１の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０５２９４５．３の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１４（遺伝子ＩＤ  ８７６４）は、ＮＰ＿００１２８４５３４．１の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２９７６０５．１の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１７（遺伝子ＩＤ  ６０８）は、ＮＰ＿００１１８３．２の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１１９２．２の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１８（遺伝子ＩＤ  ８７８４）は、ＮＰ＿００４１９５．２の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００４１８６，１の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ１９（遺伝子ＩＤ  ５５５０４）は、ＮＰ＿００１１９１３８７．１の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１２０４４５８．１の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＮＦＲＳＦ２１（遺伝子ＩＤ  ２７２４２）は、ＮＰ＿０５５２６７．１の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０１４４５２．４の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＴＮＦＲＳＦ２５（ＤＲ３：遺伝子ＩＤ  ８７１８）は、リガンドＴＮＦＳＦ１５（ＴＬ１Ａ）に結合し、ＮＰ＿００１０３４７５３．１の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１０３９６６４．１の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００６８】
一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ受容体は、神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）でない。
【００６９】
一部の実施形態において、ＴＮＦＲＳＦ受容体は、ＣＤ４０でも、ＴＮＦＲＳＦ４でも、ＴＮＦＲＳＦ９でも、ＣＤ２７でも、ＧＩＴＲでもない。例えば、ＴＮＦＲＳＦ受容体は、ＣＤ２７、ＥＤＡ２Ｒ、ＥＤＡＲ、ＦＡＳ、ＬＴＢＲ、ＲＥＬＴ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ−１０Ｄ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１９、ＴＮＦＲＳＦ２１及びＴＮＦＲＳＦ２５からなる群から選択することができる。
【００７０】
ＴＮＦＲＳＦ受容体を表面上で発現する免疫細胞は、Ｔ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、ＮＫ細胞及び／又はＢ細胞、好ましくは、Ｔ細胞であり得る。
【００７１】
疾患抗原に近接する本明細書に記載の抗体分子による活性化後、活性化免疫細胞は、免疫応答、例えば、病原体又は癌細胞に対する免疫応答を開始させ、促進し、又はそれに関与し得る。癌細胞の認識及び根絶において免疫が担う役割の概要は、Chen and Mellman, Immunity 2013 39(1):1-10により提供されている。
【００７２】
疾患抗原は、個体中の疾患の部位において存在するが、他箇所に存在しない抗原である。疾患抗原としては、病原性抗原及び腫瘍抗原を挙げることができる。
【００７３】
病原性抗原としては、感染性疾患に関連するウイルス又は細菌からの抗原を挙げることができる。病原性抗原に近接する本明細書に記載の免疫細胞の活性化は、感染性疾患の治療において有用であり得る。
【００７４】
好ましくは、疾患抗原は、腫瘍抗原である。腫瘍抗原は、個体中の腫瘍の環境中に主に存在し、他箇所にユビキタスには存在しない抗原である。例えば、腫瘍抗原は、腫瘍細胞の表面上に存在し得、又は腫瘍微小環境の他の間質細胞上に、若しくは腫瘍に近接する生物体液中に存在し得る。したがって、腫瘍抗原は、個体中の腫瘍細胞の局在のマーカーである。
【００７５】
一部の実施形態において、腫瘍抗原は、癌細胞の表面上に局在する抗原であり得る。好ましくは、腫瘍抗原は、腫瘍細胞上で上方調節又は過剰発現される一方、それは、腫瘍の不存在下の同一組織からの対応する正常体細胞によっては豊富に発現されない。
【００７６】
一部の実施形態において、腫瘍抗原は、腫瘍の不存在下の対応する正常組織の間質細胞と比較して腫瘍微小環境の間質細胞上で上方調節又は過剰発現される。
【００７７】
好ましい腫瘍抗原は、細胞表面上に存在し、急速に内在化されない。
【００７８】
本発明の抗体分子による標的化に好適な腫瘍抗原は、当分野において公知の方法を使用して同定することができる。例えば、ＴＮＦＲＳＦ受容体及び腫瘍抗原を標的化する抗体分子は、ＴＮＦＲＳＦ受容体発現細胞を腫瘍抗原発現細胞と同時培養し、ＴＮＦＲＳＦ受容体発現細胞の活性化を例えば、ＥＬＩＳＡ、増幅アッセイ又は細胞毒性アッセイにより計測するアッセイにおいて使用することができる。
【００７９】
細胞表面腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又は腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）であり得る。
【００８０】
癌細胞により発現される腫瘍抗原としては、例えば、癌生殖系列（cancer-germ line）遺伝子によりコードされる癌精巣（ＣＴ）抗原、例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＧＡＧＥ−Ｉ、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＢＡＧＥ−Ｉ、ＲＡＧＥ−１、ＬＢ３３／ＭＵＭ−１、ＰＲＡＭＥ、ＮＡＧ、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１／ＣＴ７、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｉ、ＬＡＧＥ−Ｉ、ＳＳＸ−Ｉ、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−３、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−Ｉ及びＸＡＧＥ並びにそれらの免疫原性断片又はバリアント（Simpson et al. Nature Rev(2005)5,615-625, Gure et al., Clin Cancer Res(2005)11, 8055-8062; Velazquez et al., Cancer Immun(2007)7,11;Andrade et al., Cancer Immun(2008)8,2; Tinguely et al., Cancer Science(2008); Napoletano et al., Am J of Obstet Gyn(2008)198,99 e91-97）を挙げることができる。
【００８１】
他の細胞表面腫瘍抗原としては、例えば、ＡＦＰ、αｖβ３（ビトロネクチン受容体）、αｖβ６、ＣＡ１２５（ＭＵＣ１６）、ＣＤ４、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ８０、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＥｐＣＡＭ、ＧＤ３ガングリオシド、ＨＥＲ２、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＨＬＡ−ＤＲ、抗イディオタイプ癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、例えば、癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＴＡＧ−７２、葉酸結合タンパク質、Ａ３３、Ｇ２５０、フェリチン、糖脂質、例えば、ガングリオシド、炭水化物、例えば、ＣＡ−１２５、ＩＬ−２受容体、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＩＧＦ１Ｒ、Ｂ７Ｈ３、ＰＤＬ１、ＣＤ２００、ＥｐｈＡ２、及びメソテリン又はそれらのバリアントが挙げられる。これらの及び他の細胞表面腫瘍抗原は、Carter et al.,Endocr Relat Cancer 11(4):659-87(2004), Scott, A. M. and Renner, C.(2001). Tumour Antigens Recognized by Antibodies. eLS and Cheever et al., Clin Cancer Res(2009)15(17):5323-37に記載されている。
【００８２】
他の腫瘍抗原としては、「ストレスを受けた」癌細胞により用いられる非ＡＵＧ翻訳開始機序により生成されるアウトオブフレームペプチド−ＭＨＣ複合体が挙げられる（Malarkannan et al. Immunity 1999 Jun;10(6):681-90）。
【００８３】
他の腫瘍抗原としては、腫瘍細胞の、又は腫瘍微小環境の細胞の表面上のペプチド−ＭＨＣ複合体が挙げられ、ペプチド−ＭＨＣ複合体は、突然変異細胞内腫瘍抗原の腫瘍特異的新抗原ペプチド断片を含み、ペプチド新抗原は、１つ以上の腫瘍特異的突然変異を保有する（Gubin et al J Clin Invest.(2015)125(9):3413-21）。他の腫瘍抗原は、当分野において周知である（例えば、国際公開第００／２０５８１号；Cancer Vaccines and Immunotherapy(2000)Eds Stern, Beverley and Carroll, Cambridge University Press, Cambridge参照）。これらの腫瘍抗原の配列は公的データベースから容易に入手可能であるが、国際公開第１９９２／０２０３５６Ａ１号、国際公開第１９９４／００５３０４Ａ１号、国際公開第１９９４／０２３０３１Ａ１号、国際公開第１９９５／０２０９７４Ａ１号、国際公開第１９９５／０２３８７４Ａ１号及び国際公開第１９９６／０２６２１４Ａ１号にも見出される。
【００８４】
好ましい腫瘍抗原としては、ＨＥＲ２、ＦＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ２０、ＣＤ７３、ＰＳＭＡ、メソテリン、ＥｐｈＡ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＣＤ２００、αｖβ６、ＰＤＬ１、Ｂ７Ｈ３及びＥＧＦＲが挙げられる。
【００８５】
ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２；遺伝子ＩＤ  ２０６４）は、ＮＰ＿００１００５８６２．１の参照アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１００５８６２．２の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＦＡＰ（遺伝子ＩＤ  ２１９１）は、ＮＰ＿００１２７８７３６．１の参照アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１２９１８０７．１の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＥｐＣＡＭ（遺伝子ＩＤ  ４０７２）は、ＮＰ＿００２３４５．２の参照アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００２３５４．２の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＣＥＡＣＡＭ５（遺伝子ＩＤ  １０４８）は、ＮＰ＿００１２７８４１３．１の参照アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１２９１４８４．２の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＣＤ２０（ＭＳ４Ａ１；遺伝子ＩＤ  ９３１）は、ＮＰ＿０６８７６９．２の参照アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿０２１９５０．３の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ；遺伝子ＩＤ  ４９０７）は、ＮＰ＿００１１９１７４２．１の参照アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１２０４８１３．１の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１；遺伝子ＩＤ  ２３４６）は、ＮＰ＿００１０１４９８６．１の参照アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１０１４９８６．１の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。メソテリン（ＭＳＬＮ；遺伝子ＩＤ  １０２３２）は、ＮＰ＿００１１７０８２６．１の参照アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１１７７３５５．２の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＥｐｈＡ２（遺伝子ＩＤ  １９６９）は、ＮＰ＿００１３１６０１９．１の参照アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１３２９０９０．１の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＩＧＦ１Ｒ（遺伝子ＩＤ  ３４８０）は、ＮＰ＿０００８６６．１の参照アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿０００８７５．４の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＣＤ２００（遺伝子ＩＤ  ４３４５）は、ＮＰ＿００１００４１９６．２の参照アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１００４１９６．３の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。αｖβ６は、インテグリンサブユニットアルファＶ及びインテグリンサブユニットベータ６から構成されるヘテロ二量体である。インテグリンサブユニットアルファＶ（ＩＴＧＡＶ；遺伝子ＩＤ  ３６８５）は、ＮＰ＿００１１３８４７１．１の参照アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１１４４９９９．２の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。インテグリンサブユニットベータ６（ＩＴＧＢ６；遺伝子ＩＤ  ３６９４）は、ＮＰ＿０００８７９．２の参照アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿０００８８８．４の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＰＤＬ１（ＣＤ２７４；遺伝子ＩＤ  ２９１２６）は、ＮＰ＿００１２５４６３５．１の参照アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１２６７７０６．１の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６；遺伝子ＩＤ  ８０３８１）は、ＮＰ＿００１０１９９０７．１の参照アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１０２４７３６．１の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＥＧＦＲ（遺伝子ＩＤ  １９５６）は、ＮＰ＿００１３３３８２６．１の参照アミノ酸配列を有し得、ＮＭ＿００１３４６８９７．１の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００８６】
他の実施形態において、腫瘍抗原は、可溶性腫瘍抗原、例えば、癌細胞により産生され、又はそれに応答して産生される成長因子であり得る。可溶性因子は、腫瘍に近接する生物体液中で上方調節又は過剰発現され得る。可溶性腫瘍抗原は、多量体、例えば、二量体又は三量体であり得る。可溶性腫瘍抗原は、患者の体内の腫瘍部位において、又は腫瘍微小環境中で他箇所よりも高濃度で存在し得る。腫瘍微小環境及び関連可溶性腫瘍抗原は、Bhome et al., Front Cell Dev Biol. 2015 3:33により詳細に記載されている。
【００８７】
好適な可溶性腫瘍抗原としては、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ及びＳＤＦ１が挙げられる。
【００８８】
ＶＥＧＦ（ＶＥＧＦＡ；遺伝子ＩＤ  ７４２２）は、ＮＰ＿００１０２０５３７．２の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿００１０２５３６６．２の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＨＧＦ（遺伝子ＩＤ  ３０８２）は、ＮＰ＿０００５９２．３の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０００６０１．５の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。ＳＤＦ１（ＣＸＣＬ１２；遺伝子ＩＤ  ６３８７）は、ＮＰ＿０００６００．１の参照アミノ酸配列を有し、ＮＭ＿０００６０９．６の参照ヌクレオチド配列によりコードされ得る。
【００８９】
本発明の別の態様は、上記の抗体分子をコードする単離核酸を提供する。当業者は、当分野において周知の方法を使用するそのような核酸の調製を困難としない。単離核酸を使用して上記の抗体分子を例えば、細菌、酵母、昆虫又は哺乳動物宿主細胞中での発現により産生することができる。好ましい宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ又はＮＳ０細胞である。核酸は、一般に、発現のための組換えベクターの形態で提供される。
【００９０】
本発明の別の態様は、上記の核酸を含むベクターを提供する。
【００９１】
適切な調節配列、例として、プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子及び他の配列を適宜含有する好適なベクターを選択又は構築することができる。好ましくは、ベクターは、哺乳動物細胞中での核酸の発現をドライブするために適切な調節配列を含有する。ベクターは、例えば、細菌宿主、例えば、Ｅ．コリ（E.coli）中でのその選択、発現及び複製を可能とする複製起点、プロモーター領域及び選択マーカーのような配列も含み得る。
【００９２】
ベクターは、適宜、プラスミド、ウイルス、例えば、ファージ、又はファージミドであり得る。さらなる詳細については、例えば、Molecular Cloning:a Laboratory Manual:3rd edition,Russell et al.,2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press参照。例えば、核酸構築物の調製、突然変異導入、シーケンシング、細胞中へのＤＮＡの導入及び遺伝子発現における核酸の操作のための多くの公知の技術及びプロトコルは、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds. John Wiley & Sons,1992に詳述されている。
【００９３】
本明細書に記載の核酸又はベクターは、宿主細胞中に導入することができる。
【００９４】
本発明の別の態様は、上記の抗体分子を含み、又はそれからなるポリペプチドを発現する核酸又はベクターを含む組換え細胞を提供する。
【００９５】
組換え抗体分子の産生に好適な一連の宿主細胞は、当分野において公知である。好適な宿主細胞としては、原核細胞、特に、細菌、例えば、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）及びラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）並びに真核細胞、例として、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ及びＣＨＯ由来細胞系（Ｌｅｃ細胞）、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３及びＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞、両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、昆虫細胞、例えば、トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）、Ｓｆ９及びＳｆ２１並びに酵母細胞、例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）を挙げることができる。
【００９６】
細胞中への核酸の導入のための技術は、当分野において十分確立されており、特定の状況に従って任意の好適な技術を用いることができる。真核細胞については、好適な技術としては、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介形質移入及びレトロウイルス又は他のウイルス、例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイル若しくはワクシニアを使用する形質導入を挙げることができる。細菌細胞については、好適な技術としては、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション及びバクテリオファージを使用する形質移入を挙げることができる。
【００９７】
マーカー遺伝子、例えば、抗生物質耐性又は感受性遺伝子を、当分野において周知のとおり、目的の核酸を含有するクローンの同定において使用することができる。
【００９８】
導入される核酸は細胞内の染色体外ベクター上に存在し得、又は核酸は、宿主細胞のゲノム中に組み込むことができる。組込みは、標準的技術に従ってゲノムによる組換えを促進する配列を核酸又はベクター内に含めることにより促進することができる。
【００９９】
方法は、抗体分子を単離及び／又は精製することをさらに含み得る。これは、当分野において公知の任意の簡便な方法を使用して達成することができる。組換え抗体分子の精製のための技術は当分野において周知であり、それとしては、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ又は例えば、プロテインＡ又若しくはプロテインＬを使用する親和性クロマトグラフィーが挙げられる。一部の実施形態において、精製は、上記のポリペプチド上の親和性タグを使用して実施することができる。
【０１００】
本発明の別の態様は、上記の抗体分子を産生する方法であって、上記の抗体分子をコードする核酸を宿主細胞中で発現させ、場合により、そうして産生された抗体分子を単離及び／又は精製することを含む方法を提供する。
【０１０１】
上記のとおり産生された抗体分子をさらに調査することができ、例えば、薬理学的特性及び／又は活性を決定することができる。タンパク質分析の方法及び手段は、当分野において周知である。
【０１０２】
本明細書に記載の抗体分子は、治療用途に有用であり得る。例えば、本明細書に記載の抗体分子は、癌の治療のために個体に投与することができる。
【０１０３】
抗体分子は単独で投与することができる一方、抗体分子は、通常、抗体分子の他に少なくとも１つの構成成分を含み得る医薬組成物の形態で投与される。方法は、医薬組成物に抗体分子を場合により、少なくとも１つの構成成分、例えば、下記の薬学的に許容可能な賦形剤又は他の物質と配合することを含み得る。
【０１０４】
本発明の別の態様は、上記の抗体分子及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【０１０５】
医薬組成物は、抗体分子の他に薬学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤又は当分野において周知の他の材料を含み得る。本明細書において使用される用語「薬学的に許容可能な」は、妥当な利益／リスク比に合致する、過度の毒性も、刺激も、アレルギー応答も、他の問題も、合併症もなしで対象（例えば、ヒト）の組織との接触における使用に好適な、正当な医学的判断の範囲内の化合物、材料、組成物、及び／又は剤形に関する。それぞれの担体、賦形剤などは、配合物の他の成分と適合性であるという意味でも「許容可能」でなければならない。担体又は他の材料の正確な性質は、注入、注射によるものであり得る投与の経路又は以下に考察される任意の他の好適な経路に依存する。
【０１０６】
非経口、例えば、注射による、例えば、皮下又は静脈内投与について、抗体分子を含む医薬組成物は、パイロジェンフリーであり、好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容可能な液剤の形態であり得る。当業者は、例えば、等張ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、乳酸化リンガー注射液を使用して好適な液剤を十分に調製し得る。保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／又は他の添加剤、例として、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸及びメチオニン；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３’−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン；単糖、二糖及び他の炭水化物、例として、グルコース、マンノース又はデキストリン；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成カウンターイオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN（商標）、PLURONICS（商標）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、必要により用いることができる。
【０１０７】
一部の実施形態において、抗体分子は、投与前の再構成のための凍結乾燥形態で提供することができる。例えば、凍結乾燥抗体分子は、個体への投与前に滅菌水中で再構成し、生理食塩水と混合することができる。
【０１０８】
本明細書に記載の抗体分子は、ヒト又は動物体の治療、例として、予防又は防止的治療の方法において使用することができる。治療の方法は、抗体分子をそれが必要とされる個体に投与することを含み得る。本発明の関連態様は、
（ｉ）医薬品としての使用のための上記の抗体分子、
（ｉｉ）患者における癌を治療する方法における使用のための、上記の抗体分子、
（ｉｉｉ）患者における癌を治療する方法における使用のための医薬品の製造における、上記の抗体分子の使用；及び
（ｉｖ）個体における癌を治療する方法であって、治療有効量の上記の抗体分子を個体に投与することを含む方法
を提供する。
【０１０９】
癌は、悪性癌細胞の異常増幅により特徴づけすることができ、それとしては、白血病、例えば、ＡＭＬ、ＣＭＬ、ＡＬＬ及びＣＬＬ、リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び多発性骨髄腫、並びに固形癌、例えば、肉腫、皮膚癌、黒色腫、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肝臓癌、頭頸部癌、食道癌、膵臓癌、腎臓癌、副腎癌、胃癌、精巣癌、胆嚢及び胆道の癌、甲状腺癌、胸腺癌、骨の癌、及び大脳腫瘍を挙げることができる。
【０１１０】
個体内の癌細胞は、個体中で正常体細胞から免疫学的に区別され得る（すなわち、癌性腫瘍は免疫原性であり得る）。例えば、癌細胞は、癌細胞により発現される１つ以上の抗原に対する個体における全身免疫応答を誘発し得る。免疫応答を誘発する抗原は腫瘍抗原であり得、又は正常細胞により共有され得る。
【０１１１】
上記の治療に好適な個体は、哺乳動物、例えば、げっ歯類（例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス）、ネズミ科（例えば、マウス）、イヌ科（例えば、イヌ）、ネコ科（例えば、ネコ）、ウマ科（例えば、ウマ）、霊長類、サル科（例えば、サル又は類人猿）、サル（例えば、マーモセット、ヒヒ）、類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー、オラウータン、テナガザル）、又はヒトであり得る。
【０１１２】
一部の好ましい実施態様において、個体は、ヒトである。他の好ましい実施態様において、非ヒト哺乳動物、特にヒトにおける治療効力を実証するためのモデルとして簡便に使用される哺乳動物（例えば、ネズミ科、霊長類、ブタ、イヌ科、又はウサギ動物）を用いることができる。
【０１１３】
一部の実施態様において、個体は、初回癌治療後に微小残存病変（ＭＲＤ）を有し得る。
【０１１４】
癌を有する個体は、当分野において公知の臨床基準に従って癌を診断するために十分な少なくとも１つの識別可能な徴候、症状、又は検査所見を呈し得る。このような臨床基準の例は、医学教本、例えば、Harrison’s Principles of Internal Medicine, 15th Ed., Fauci AS et al.,eds., McGraw-Hill,New York, 2001に見出すことができる。一部の例において、個体における癌の診断は、個体から得られた体液又は組織の試料中の特定の細胞タイプ（例えば、癌細胞）の同定を含み得る。
【０１１５】
治療は、一部の望ましい治療効果、例えば、病態の進行の阻害又は遅延が達成されるヒトか動物（例えば、獣医学的用途における）かを問わない任意の治療及び治療法であり得、それとしては、進行速度の低減、進行速度の停止、病態の改善、病態の治癒若しくは寛解（部分寛解か完全寛解かを問わない）、病態の１つ以上の症状及び／若しくは徴候の防止、改善、遅延、排除若しくは停止、又は治療の不存在下で予想される生存率を上回る対象若しくは患者の生存期間の延長が挙げられる。
【０１１６】
予防的措置としての治療（すなわち、予防）も含まれる。例えば、癌の発生又は再発が起こりやすく、又はそのリスクのある個体を本明細書に記載のとおり治療することができる。このような治療は、個体における癌の発生又は再発を防止又は遅延させ得る。
【０１１７】
特に、治療は、癌成長の阻害、例として、完全な癌の寛解、及び／又は癌転移の阻害を含み得る。癌成長は一般に、より発達した形態への癌内の変化を示す多数の指標のいずれか１つを指す。したがって、癌成長の阻害を計測するための指標としては、癌細胞の生存率の減少、腫瘍容積又は形態の減少（例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、超音波検査、又は他のイメージング法を使用して決定される）、腫瘍成長の遅延、腫瘍脈管構造の破壊、遅延型皮膚過敏反応テストの成績の改善、抗癌免疫細胞又は他の抗癌免疫応答の活性の増加、及び腫瘍特異的抗原のレベルの減少が挙げられる。個体における癌性腫瘍に対する免疫応答の活性化又は向上は、癌成長、特に対象に既に存在する癌の成長に抵抗する個体の能力を改善させ得、及び／又は個体における癌成長の傾向を減少させ得る。
【０１１８】
投与は、患者に対する利益を示すために十分である「治療有効量」におけるものであり得る。投与される実際量、並びに投与速度及びタイムコースは、治療されるものの性質及び重症度、治療される特定の患者、個々の患者の臨床病態、障害の原因、組成物の送達の部位、抗体分子のタイプ、投与の方法、投与のスケジューリング並びに医師に公知の他の因子に依存する。治療の処方、例えば、投与量の決定などは、一般の医師及び他の医師の責任の範囲内であり、治療される疾患の症状及び／又は進行の重症度に依存し得る。抗体分子の適切な用量は、当分野において周知である（Ledermann et al.(1991)Int. J. Cancer 47:659-664;及びBagshawe et al.(1991)Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4:915-922）。本明細書、又はPhysician’s Desk Reference(2003)に投与される抗体分子について適切と示される具体的な投与量を使用することができる。抗体分子の治療有効量又は好適な用量は、動物モデルにおけるインビトロ活性及びインビボ活性を比較することにより決定することができる。ヒトに対するマウス及び他の試験動物における有効投与量の外挿方法は、公知である。正確な用量は、治療すべき区域のサイズ及び局在、並びに抗体分子の正確な性質を含む、多数の因子に依存する。治療は、医師の裁量において毎日、週２回、週１回又は月１回の間隔において反復することができる。
【０１１９】
典型的な抗体用量は、全身適用について１００μｇ〜１ｇ、及び局所適用について１μｇ〜１ｍｇの範囲である。初回の高負荷用量とそれに続く１回以上の低用量を投与することができる。典型的には、抗体は、全抗体、例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４アイソタイプである。これは、成人患者の単一治療についての用量であり、それは小児及び幼児については比例調整し、分子量に比例して他の抗体フォーマットについても調整することができる。治療は、医師の裁量において毎日、週２回、週１回又は月１回の間隔において反復することができる。個体についての治療スケジュールは、抗体組成物の薬物動態及び薬力学的特性、投与経路並びに治療される病態の性質に依存的であり得る。
【０１２０】
治療は、定期的であり得、投与間の期間は、約２週間以上、例えば、約３週間以上、約４週間以上、約１ヵ月以上で１回、約５週間以上、又は約６週間以上であり得る。例えば、治療は、２〜４週間毎又は４〜８週間毎であり得る。好適な配合物及び投与経路は上記のものである。
【０１２１】
本方法は、少なくとも１つの追加の治療剤を患者に投与することをさらに含み得る。
【０１２２】
追加の治療剤としては、化学療法剤、抗腫瘍ワクチン、放射性核種、免疫治療剤、例えば、治療抗体分子若しくはその治療断片、サイトカイン、腫瘍崩壊ウイルス、ＣＡＲ−Ｔ細胞、又はホルモン療法用薬剤を挙げることができる。
【０１２３】
化学療法剤は、タキサン、細胞毒性抗生物質、チロシンキナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｂ＿ＲＡＦ酵素阻害剤、アルキル化剤、白金アナログ、ヌクレオシドアナログ、サリドマイド誘導体、抗新生物化学療法剤などからなる群から選択することができる。タキサンとしては、ドセタキセル、パクリタキセル及びナブパクリタキセルが挙げられ；細胞毒性抗生物質としては、アクチノマイシン、ブレオマイシン、アントラサイクリン、ドキソルビシン及びバルルビシンが挙げられ；チロシンキナーゼ阻害剤としては、エルロチニブ、ゲフィチニブ、アキシチニブ、ＰＬＸ３３９７、イマチニブ、コベミチニブ（cobemitinib）及びトラメチニブが挙げられ；ＰＡＲＰ阻害剤としては、ピラパリブ（piraparib）が挙げられ；Ｂ−Ｒａｆ酵素阻害剤としては、ベムラフェニブ及びダブラフェニブが挙げられ；アルキル化剤としては、ダカルバジン、シクロホスファミド、テモゾロミドが挙げられ；白金アナログとしては、カルボプラチン、シスプラチン及びオキサリプラチンが挙げられ；ヌクレオシドアナログとしては、ゲムシタビン及びアザシチジンが挙げられ；抗新生物薬としては、フルダラビンが挙げられる。本発明における使用に好適な他の化学療法剤としては、メトトレキセート、デファクチニブ、エンチノスタット、ペメトレキセド、カペシタビン、エリブリン、イリノテカン、フルオロウラシル、及びビンブラスチンが挙げられる。
【０１２４】
追加の治療剤としては、抗腫瘍ワクチンを挙げることができる。癌の治療のためのワクチン接種方針は診療所において実行されており、科学文献（例えば、Rosenberg, S. 2000 Development of Cancer Vaccines）において詳細に考察されてきた。これはとしては、主に、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を用いる又は用いないワクチン接種方法として自己又はアロジェニック癌細胞を使用することによりそれらの細胞により発現される種々の細胞マーカーに対して免疫系を応答させる方針が挙げられる。ＧＭ−ＣＳＦは抗原提示における強力な応答を誘発し、前記方針と用いた場合に特に十分に作用する。
【０１２５】
本発明の他の態様及び実施形態は、用語「含む」が用語「〜からなる」により置き換えられる上記の態様及び実施形態並びに用語「含む」が用語「本質的に〜からなる」により置き換えられる上記の態様及び実施形態を提供する。
【０１２６】
本出願は、文脈がそうでないことを要求しない限り、上記の態様及び上記の実施形態のいずれかと互いとの全ての組合せを開示することが理解すべきである。同様に、本出願は、文脈がそうでないことを要求しない限り、単独又は他の態様のいずれかとの一緒のいずれかの好ましい及び／又は任意選択の特徴の全ての組合せを開示する。
【０１２７】
上記実施形態の改変、さらなる実施形態及びその改変は、当業者に本開示の精読時に明らかであり、したがって、それらは本発明の範囲内である。
【０１２８】
本明細書に挙げられる全ての文献及び配列データベースエントリーは、全ての目的のために参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０１２９】
本明細書において使用される「及び／又は」は、他方を有し、又は有さない２つの規定の特徴又は構成成分のそれぞれの具体的開示と解釈すべきである。例えば、それぞれが本明細書に個々に記載されるかのように、「Ａ及び／又はＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ及び（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれの具体的開示と解釈すべきである。
【０１３０】
本発明のある態様及び実施形態は、目下、実施例により、及び上記の図面を参照して説明される。
【実施例】
【０１３１】
実験
実施例１
Ｆｃａｂ及びｍＡｂ２の調製
１．１  Ｆｃａｂ分子の選択
１．１．１  ｍＴＮＦＲＸ  Ｆｃａｂクローンのナイーブ選択
酵母細胞表面上でＦｃａｂクローンを発現するライブラリーを、ネズミ科ＩｇＧ  Ｆｃドメインに融合しているビオチン化組換えネズミ科ＴＮＦ受容体（ｍＴＮＦＲＸ）（ｍＴＮＦＲＸ−ｍＦｃ）とインキュベートし、ストレプトアビジンコートビーズを使用してＭＡＣＳによりソートした。次いで、５倍モル過剰のｍＦｃの存在下で減少濃度のビオチン化ｍＴＮＦＲＸ−ｍＦｃを使用して３回のＦＡＣＳ選択ラウンドを実施した。細胞を、ストレプトアビジン−アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（BD Bioscience、349024）又は抗ビオチン−ＡＰＣ（Miltenyi Biotec、130-090-856）により染色し、FACSAria（BD Bioscience）を使用してソートした。濃縮集団からの個々のクローンを抗原結合についてスクリーニングし、陽性バインダーをサブクローニングし、HEK  Expi293細胞中で可溶性Ｆｃａｂ（トランケートヒンジを含有）として発現させた（ExpiFectamine 293 Transfectionキット［ThermoFisher Scientific、A14524］を使用してExpi293F細胞［ThermoFisher Scientific、A14527］中に形質移入されるｐＴＴ５ベクター［National Research Council of Canada］中にＦｃａｂをクローニングした）。さらなる成熟のためのＦｃａｂを、細胞結合についてのスクリーニングにより同定した。
【０１３２】
「野生型」Ｆｃａｂは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列を含む。これは、配列番号１及び配列番号２にそれぞれＬＡＬＡ突然変異の有無の両方で記載される。これらの実験について選択されたＦｃａｂクローンは、ＣＨ３ドメインのＡＢループ（残基７〜２１）、ＣＤループ（残基４１〜８１）及びＥＦループ（残基８９〜１０３）中の突然変異を含有した。全ての残基は、ＩＭＧＴナンバリングスキームに従ってナンバリングする。
【０１３３】
１．１．２  ＴＮＦＲＸ  Ｆｃａｂの親和性成熟
システインを除く等モル分布のアミノ酸を使用してＡＢループ中の７つの残基（残基１２〜１８）、ＣＤループ中の６つの残基（残基４５．１〜７８）及びＥＦループ中の５つの残基（９２〜９４及び９７〜９８）をランダム化することにより親和性成熟ライブラリーを構築した。
【０１３４】
親和性成熟ライブラリーをファージ中で生成し、ストレプトアビジンコート（ThermoFisher Scientific、11205D）及びニュートラビジンコート（ThermoFisher Scientific、14203及びA2666）Dynabeads間で交互にビオチン化ｍＴＮＦＲＸ−ｍＦｃに対して３回の選択ラウンドを実施した。５０ｎＭ〜１０ｎＭ及び１ｎＭの減少抗原濃度を使用して高親和性バインダーを同定した。第３ラウンドアウトプットをファージＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、上記のとおり陽性バインダーをサブクローニングし、発現させた。
【０１３５】
親和性成熟において同定された２６個のＣＤ及び３６個のＥＦループをシャッフルし、上記のとおりＨＥＫ  Expi293細胞中で可溶性Ｆｃａｂ（トランケートヒンジを含有）として発現させた。Ｆｃａｂを含有するＨＥＫ上清を、Dip and Read(商標)Streptavidin Biosensors（Pall ForteBio、18-5050）をOctet QKe System（Pall ForteBio）上で使用してビオチン化ｍＴＮＦＲＸ−ｍＦｃへの結合を計測することにより改善されたオフ速度について、及び細胞結合について、実施例１．３に記載のとおりスクリーニングした。
【０１３６】
１．１．３  ＴＮＦＲＹ  Ｆｃａｂクローンのナイーブ選択
酵母細胞表面上でＦｃａｂクローンを発現するライブラリーを、ネズミ科ＩｇＧ  Ｆｃドメインに融合しているビオチン化組換えネズミ科ＴＮＦ受容体（ｍＴＮＦＲＹ）（ｍＴＮＦＲＹ−ｍＦｃ）とインキュベートし、ストレプトアビジンコートビーズを使用してＭＡＣＳによりソートした。次いで、５倍モル過剰のｍＦｃの存在下で減少濃度のビオチン化ｍＴＮＦＲＹ−ｍＦｃを使用してＦＡＣＳ選択を実施した。細胞を、ストレプトアビジン−アロフィコシアニン（ＡＰＣ）（BD Bioscience、349024）又は抗ビオチン−ＡＰＣ（Miltenyi Biotec、130-090-856）により染色し、FACSAria（BD Bioscience）を使用してソートした。濃縮集団からの個々のクローンを抗原結合についてスクリーニングし、陽性バインダーをサブクローニングし、可溶性モックｍＡｂ２（ｍＴＮＦＲＹ／ＨｅｌＤ１．３）として発現させた。
【０１３７】
「野生型」Ｆｃａｂは、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列を含む。これは、配列番号１及び配列番号２にそれぞれＬＡＬＡ突然変異の有無の両方で記載される。これらの実験について選択されたＦｃａｂクローンは、ＣＨ３ドメインのＡＢループ（残基７〜２１）及びＥＦループ（残基８９〜１０３）内の突然変異を含有した。全ての残基は、ＩＭＧＴナンバリングスキームに従ってナンバリングする。
【０１３８】
以下の１．２に言及され、以下の実施例５及び７で同定されたｍＴＮＦＲＹ／ｈＣＤ２０及びｍＴＮＦＲＹ／ｈＥＧＦＲ  ｍＡｂ２抗体の構築における使用のために選択された抗ｍＴＮＦＲＹ  Ｆｃａｂクローンは、いかなる親和性成熟も受けなかったナイーブクローンであった。
【０１３９】
１．２  ｍＡｂ２の構築及び発現
抗マウスＴＮＦＲＸ  Ｆｃａｂ及び抗マウスＴＮＦＲＹ  Ｆｃａｂを同定し、種々のｍＡｂ２の調製における使用のために上記の１．１に記載の実験手順から選択してｍＡｂ２フォーマットにおけるそれらのＦｃａｂの特徴づけを可能とした。これらのｍＡｂ２は、選択された抗マウスＴＮＦＲＸ及び抗マウスＴＮＦＲＹ  Ｆｃａｂから調製し、抗体の可変領域を表１に詳述する。
【０１４０】
ｍＡｂ２に使用される命名体系は、Ｆｃａｂ／Ｆａｂであり、Ｆｃａｂは、Ｆｃ改変領域（Ｆｃａｂ）の結合標的を説明し、Ｆａｂは、ｍＡｂ２のＦａｂアームの結合標的を説明する。両方の場合、「ｍ」が標的名称の前に付く場合、これは標的のネズミ科バージョンへの結合を示し、「ｈ」が標的名称の前に付く場合、これは標的のヒトバージョンへの結合を示す。「ｍ」も「ｈ」も標的名称の前に付かない場合、これは、標的のネズミ科及びヒトバージョンの両方への結合を示す。Ｇ１をＦｃａｂに使用する場合、これは未変化ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域（ＷＴ）を示す。ＬＡＬＡ突然変異は、重鎖のＣＨ２ドメイン中に局在し、Ｆｃガンマ受容体結合の結合を低減させることが公知である（Bruhns,P.,et al.(2009)；及びXu,D.et al. (2000)）。ｍＡｂ２をＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞中で一過的発現により産生し、mAb Select SuReプロテインＡカラムを使用して精製した。
【０１４１】
ｍＴＮＦＲＸ−ｍＦｃについてのｍＴＮＦＲＸ／ｈＥＧＦＲの親和性は、Biacore T200を使用して決定した。５０００ＲＵのＥＧＦＲ−Ｆｃ（R&D Systems、344-ER）を、Series S CM5チップ（GE Healthcare、BR100530）上に固定化した。５ｎＭのｍＴＮＦＲＸ／ｈＥＧＦＲを１０μｌ／分において１分間インジェクトし、次いでｍＴＮＦＲＸ−ｍＦｃを種々の濃度において７０μｌ／分において３分間インジェクトし、緩衝液を１０分間インジェクトした。３０ｍＭのＮａＯＨを３０μｌ／分において１０秒間インジェクトすることより、チップを再生した。データを二重参照減算し（double reference subtracted）、BIAevaluation 3.2ソフトウェアを使用して分析して速度定数を計算した。
【０１４２】
ｍＴＮＦＲＹ／ＨｅｌＤ１．３のそのｍＴＮＦＲＹ標的についての親和性は、ｍＴＮＦＲＸ／ｈＥＧＦＲのそのｍＴＮＦＲＸ標的についての親和性を決定するために使用されたものと同様のBiacore法を使用して決定した。
【０１４３】
１．３  フローサイトメトリーにより決定された細胞上で発現されるマウスＴＮＦＲＸに対するＦｃａｂの結合親和性
レンチウイルス形質導入法を使用して、Lenti-X HTX Packaging System（Clontech、カタログ番号631249）を使用してマウスＴＮＦＲＸを過剰発現するＤＯ１１．１０細胞（National Jewish Health）を生成した。マウスＴＮＦＲＸ  ｃＤＮＡを含有するLenti-X発現ベクター（ｐＬＶＸ）（Clontech、カタログ番号631253）を、Lenti-X 293T Cell Line（Clontech、カタログ番号632180）中にLenti-X HTX Packaging Mixと同時形質移入してウイルスを生成した。Lenti-X HTX Packaging Systemにより産生されるレンチウイルスベクターを使用してＤＯ１１．１０細胞系を形質導入した。
【０１４４】
マウスＴＮＦＲＸを発現する細胞（マウスＴＮＦＲＸにより形質移入されたＤＯ１１．１０細胞系）に対する抗マウスＴＮＦＲＸ  Ｆｃａｂ及びｍＡｂ２の親和性を、フローサイトメトリーを使用して計測した。ｍＡｂ２及び対照ｍＡｂ希釈物（２×最終濃度）を１×ＤＰＢＳ（Gibco、14190-094）中で三つ組で調製した。ＤＯ１１．１０−ｍＴＮＦＲＸ細胞懸濁液をＰＢＳ＋２％のＢＳＡ（Sigma、A7906）中で調製し、４×１０−６個の細胞／ｍｌにおいてＶ字型９６ウェルプレート（Costar、3897）中で５０μｌ／ウェルで播種した。細胞を含有するウェルに５０μｌのｍＡｂ２又は対照ｍＡｂ（無／ｍＴＮＦＲＸ）希釈物を添加し（最終容量１００μｌ）、４℃において１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次いで、ＰＢＳ＋２％のＢＳＡ中で１：１０００希釈された１００μｌ／ウェルの二次抗体（抗ヒトＦｃ−４８８抗体、Jackson ImmunoResearch、109-546-098）を添加し、暗所で４℃において３０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＤＡＰＩ（Biotium、40043）を１ｍｇ／ｍｌにおいて含有する１００μｌのＰＢＳ中で再懸濁させた。Canto IIフローサイトメーター（BD Bioscience）を使用してプレートを読み取った。死細胞を排除し、ＦＩＴＣチャネルにおける蛍光（４８８ｎｍ／５３０／３０）を計測した。GraphPad Prism Softwareにおいて応答に対する対数（アゴニスト）を使用してデータをフィットさせた。
【０１４５】
実施例２
ｍＡｂ２架橋（ｍＴＮＦＲＸ−Ｘ配向）を介するコンディショナル受容体アゴニズム
活性化Ｔ細胞は、受容体ＴＮＦＲＸをそれらの細胞表面上で発現する。ＴＮＦＲＸのクラスター化は、ＴＮＦＲＸシグナリング及びさらなるＴ細胞活性化に不可欠であることが公知である。Ｔ細胞活性化アッセイを使用して以下に詳述される抗体分子の存在下でＴＮＦＲＸ受容体のクラスター化及びシグナリングを評価した。Ｔ細胞活性化はＩＬ−２の放出により決定した。
【０１４６】
２．１  Ｔ細胞の単離及び活性化
Ｔ細胞を単離するため、４〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Charles River）から脾臓を回収した。マウスを安楽死させ、脾臓を切除により単離した。７０μｍのセルストレーナー（Corning）を介して脾臓を５ｍｌのプラスチックシリンジの内側に押圧することにより脾細胞を単離した。セルストレーナーを１ｍｌのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（Gibco）により１０回洗浄し、溶出液を５０ｍｌのチューブ中で回収した。溶出液中に存在する赤血球を、１０ｍｌの赤血球溶解緩衝液（eBioscience）の添加を介して製造業者の説明書に従って溶解させた。ｐａｎＴ細胞単離キットＩＩ（Miltenyi Biotec Ltd）を製造業者の説明書に従って使用して溶出液中に存在する脾細胞からＴ細胞を単離した。
【０１４７】
Mouse T-Activator CD3/CD28 Dynabeads（Life technologies）を、ボルテックスに供することにより再懸濁させた。Ｔ細胞培地（１０％のＦＢＳ［Life Technologies]、1×ペニシリンストレプトマイシン［Life Technologies］、ピルビン酸ナトリウム［Gibco］、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ［Gibco］、２ｍＭのＬ−グルタミン［Gibco］及び５０μＭの２−メルカプトエタノール［Gibco］を有するＲＰＭＩ培地［Life Technologies］）によりビーズを２回洗浄した。
【０１４８】
Ｔ細胞培地中の１．０×１０６個の細胞／ｍｌの濃度における要求量のＴ細胞を、洗浄したMouse T-Activator CD3/CD28 Dynabeads（Life Technologies 11452D）により２：１の細胞とビーズとの比においてＴ−２５フラスコ（Sigma）中で刺激し、３７℃＋５％のＣＯ２において一晩インキュベートしてＴ細胞を活性化させた。
【０１４９】
２．２  ＣＤ２０発現Ｄａｕｄｉ細胞とのＴ細胞のインキュベーション
一晩のインキュベーション後、活性化Ｔ細胞をDynabeadsから洗浄し、２．０×１０６個の細胞／ｍｌの濃度においてＴ細胞培地中で再懸濁させた。９６ウェル平底プレートを、ＰＢＳ中で希釈された２．５μｇ／ｍｌの抗マウスＣＤ３抗体（Biolegend）との３７℃＋５％のＣＯ２における２時間のインキュベーションを介して抗マウスＣＤ３抗体によりコートし、次いでＰＢＳにより２回洗浄した。活性化Ｔ細胞を１．０×１０５個の細胞／ウェルにおいてプレートに添加した。細胞表面上でＣＤ２０を発現するＤａｕｄｉ細胞（ATCC、CCL-213）を、１０％のＦＢＳ（Life Technologies）及びピルビン酸ナトリウム（Gibco）を有するＲＰＭＩ培地（Life Technologies）中で維持した。Ｄａｕｄｉ細胞をＴ細胞培地中で１回洗浄し、必要により２．５×１０４個の細胞／ウェルにおいてプレートに添加した。
【０１５０】
２．３  ｍＡｂ２分子の架橋は、ｍＴＮＦＲＸ受容体クラスター化の有効な誘導をもたらす
Ｔ細胞活性化アッセイを使用して以下の表２に詳述される抗体分子の存在下でＴＮＦＲＸ受容体のクラスター化及びシグナリングを評価した。
【０１５１】
それぞれの試験抗体（詳細については表２参照）の２μＭの希釈物をＤＰＢＳ（Gibco）中で調製し、Ｔ細胞培地中でさらに１：１０希釈（３０μｌ＋２７０μｌ）して２００ｎＭの希釈物を得た。架橋剤（ａ−ｈＦｃ、Jackson Immunoresearch；又はＦＩＴＣｄｅｘ、Sigma）を必要により試験抗体と１：１のモル比においてウェルに添加した。
【０１５２】
９６ウェルプレートにおいて、抗体又は抗体／架橋抗体混合物の６つの５倍段階希釈物を調製した（６０μｌ＋２４０μｌのＴ細胞培地）。１００μｌの希釈抗体又は抗体／架橋抗体混合物をプレート上の活性化Ｔ細胞に添加した。
【０１５３】
Ｔ細胞を３７℃、５％のＣＯ２において７２時間インキュベートした。上清を回収し、マウスＩＬ−２ＥＬＩＳＡキット（eBioscience又はR&D systems）により製造業者の説明書に従ってアッセイした。Gen5 Software,BioTekによりプレートリーダーを使用して４５０ｎｍにおいてプレートを読み取った。６３０ｎｍの吸光度値を４５０ｎｍのものから減算した（補正）。サイトカイン濃度の計算のための標準曲線は、４パラメータロジスティック曲線フィット（Gen5 Software,BioTek）をベースとした。マウスＩＬ−２（ｍＩＬ−２）の濃度を抗体の対数濃度に対してプロットし、得られた曲線を、GraphPad Prismにおいて応答に対する対数（アゴニスト）の式を使用してフィットさせた。表３は、試験ｍＡｂ２及びｍＡｂの存在下でＴ細胞活性化アッセイにおいて観察されたＥＣ５０値及びＩＬ−２放出の最大応答を示す。図２は、Ｔ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。
【０１５４】
図２は、ＴＮＦＲＸ受容体が標的化され、抗ＴＮＦＲＸ抗体が架橋される場合にＴ細胞の活性化の増加が存在することを示す。Ｔ細胞活性化は、架橋剤（Ｄａｕｄｉ細胞、抗Ｆｃ抗体又はＦＩＴＣｄｅｘ）の不存在下で単一高濃度（１００ｎＭ）における抗体のいずれについても観察されなかった（データ示さず）。抗ＣＤ２０及び抗ＦＩＴＣ抗体は、予測されるとおり、架橋剤の存在下でＴ細胞活性化を誘導しない。抗ＴＮＦＲＸ受容体は、Ｄａｕｄｉ細胞の存在下で高濃度においていくらかのＴ細胞活性化を誘導する（無／ｍＴＮＦＲＸ）。この抗体は、抗Ｆｃ抗体により架橋させた場合（無／ｍＴＮＦＲＸ＋ａ−ｈＦｃ）、より高いレベルのＴ細胞活性化を誘導し、より低いＥＣ５０を有する（表３参照）。抗ＴＮＦＲＸ  Ｆｃａｂは、抗Ｆｃ抗体により架橋させた場合（ｍＴＮＦＲＸ／無＋ａ−ｈＦｃ）、Ｔ細胞を活性化させ、ＥＣ５０はＴＮＦＲＸ抗体（無／ｍＴＮＦＲＸ）と同等であるが、最大応答はそれよりも低い。同一の抗ＴＮＦＲＸ  Ｆｃａｂは、ｍＡｂ２中で抗ＦＩＴＣ  Ｆａｂと対合させた場合、ＦＩＴＣｄｅｘにより架橋させた場合にＴ細胞を活性化させ、ＥＣ５０及び最大応答はＴＮＦＲＸ抗体（ｍＴＮＦＲＸ／ＦＩＴＣ＋ＦＩＴＣｄｅｘ）と同等である。同一の抗ＴＮＦＲＸ  Ｆｃａｂは、ｍＡｂ２中で抗ＣＤ２０  Ｆａｂと対合させた場合、Ｄａｕｄｉ細胞の存在下でＴ細胞を活性化させ、ＥＣ５０はＴＮＦＲＸ抗体（ｍＴＮＦＲＸ／ｈＣＤ２０）よりも１００倍低く、最大応答はそれと同等である。
【０１５５】
このデータは、観察されたＴ細胞活性化が、Ｄａｕｄｉ細胞、抗ヒトＦｃ抗体を使用する、又は二重特異的抗体のＦａｂアームのエンゲージメントによる抗ＴＮＦＲＸ抗体の架橋時にのみ生じることを示す。ｍＴＮＦＲＸ／ｈＣＤ２０  ｍＡｂ２についてのＤａｕｄｉ細胞の不存在下でのＴ細胞活性化の欠落は、これらの分子が、Ｆａｂ標的の存在下でのみＴ細胞活性化を誘導するコンディショナルアゴニストであることを実証する。このコンディショナルアゴニズムは、ｍＴＮＦＲＸ／ｈＣＤ２０及びｍＴＮＦＲＸ／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２の両方において存在し、細胞表面受容体及び可溶性因子の両方を架橋のためのＦａｂ標的として使用することができることを実証する。
【０１５６】
ＴＮＦＲＸ抗体（無／ｍＴＮＦＲＸ）に対するＤａｕｄｉ細胞の架橋効果は、Ｆｃガンマ受容体相互作用を介して生じ、高い抗体濃度においてのみ低レベルのＴ細胞活性化をもたらす。対照的に、ｍＴＮＦＲＸ／ｈＣＤ２０  ｍＡｂ２は、ＦａｂアームがＤａｕｄｉ細胞の表面において発現されるＣＤ２０受容体によりエンゲージされる場合に極めて低い抗体濃度において高レベルのＴ細胞化を示す。これは、ｍＡｂ２フォーマットがアゴニスト受容体の架橋について、抗体架橋及び後続の受容体クラスター化についてＦｃガンマ受容体発現細胞及びＴＮＦＲＸ発現細胞の近接する存在に依存する抗体（ｍＡｂ）よりも優れていることを実証する。
【０１５７】
２．４：他の細胞表面受容体を使用してｍＡｂ２架橋を介するコンディショナル受容体アゴニズムを誘導することができる
Ｔ細胞活性化アッセイを使用して以下の表４に列記される抗体の存在下でＴＮＦＲＸ受容体のクラスター化及びシグナリングを評価した。
【０１５８】
実施例２．１に詳述されるとおりＴ細胞を単離し、活性化させた。一晩のインキュベーション後、活性化Ｔ細胞をDynabeadsから洗浄し、Ｔ細胞培地中で２．０×１０６個の細胞／ｍｌの濃度において再懸濁させた。９６ウェル平底プレートを、ＰＢＳ中で希釈された２．５μｇ／ｍｌの抗マウスＣＤ３抗体（Biolegend）との３７℃＋５％のＣＯ２における２時間のインキュベーションを介して抗マウスＣＤ３抗体によりコートし、次いでＰＢＳにより２回洗浄した。活性化Ｔ細胞をプレートに１．０×１０５個の細胞／ウェルにおいて添加した。細胞表面上でＥｐＣＡＭ及びＣＤ７３を発現する４Ｔ１細胞（ATCC、CRL-2539）を、１０％のＦＢＳ（Life Technologies）を有するＤＭＥＭ培地（Life Technologies）中で維持した。４Ｔ１細胞をＴ細胞培地中で１回洗浄し、必要によりプレートに２．５×１０４個の細胞／ウェルにおいて添加した。
【０１５９】
それぞれの試験抗体（詳細については表４参照）の２μＭ希釈物をＤＰＢＳ（Gibco）中で調製し、Ｔ細胞培地中でさらに１：１０希釈（３０μｌ＋２７０μｌ）して２００ｎＭの希釈物を得た。
【０１６０】
架橋剤（ａ−ｈＦｃ、Jackson Immunoresearch；又はＦＩＴＣｄｅｘ、Sigma）をウェルに必要により試験抗体と１：１のモル比で添加した。
【０１６１】
９６ウェルプレートにおいて、抗体又は抗体／架橋抗体混合物の６つの５倍段階希釈物を調製した（６０μｌ＋２４０μｌのＴ細胞培地）。１００μｌの希釈抗体又は抗体／架橋抗体混合物をプレート上の活性化Ｔ細胞に添加した。Ｔ細胞を３７℃、５％のＣＯ２において７２時間インキュベートした。上清を回収し、マウスＩＬ−２ＥＬＩＳＡキット（eBioscience又はR&D systems）により製造業者の説明書に従ってアッセイした。Gen5 Software,BioTekによりプレートリーダーを使用して４５０ｎｍにおいてプレートを読み取った。６３０ｎｍの吸光度値を４５０ｎｍのものから減算した（補正）。サイトカイン濃度の計算のための標準曲線は、４パラメータロジスティック曲線フィット（Gen5 Software,BioTek）をベースとした。マウスＩＬ−２（ｍＩＬ−２）の濃度を抗体の対数濃度に対してプロットし、得られた曲線を、GraphPad Prismにおいて応答に対する対数（アゴニスト）の式を使用してフィットさせた。表５は、試験ｍＡｂ２及びｍＡｂの存在下でＴ細胞活性化アッセイにおいて観察されたＥＣ５０値及びＩＬ−２放出の最大応答を示す。図３は、Ｔ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。
【０１６２】
図３は、ＴＮＦＲＸ受容体が標的化され、抗ＴＮＦＲＸ抗体が架橋される場合にＴ細胞の活性化の増加が存在することを示す。Ｔ細胞活性化は、架橋剤（４Ｔ１細胞、抗Ｆｃ抗体又はＦＩＴＣｄｅｘ）の不存在下で単一高濃度（１００ｎＭ）における抗体のいずれについても観察されなかった（データ示さず）。抗マウスＥｐＣＡＭ、抗マウスＣＤ７３及び抗ＦＩＴＣ抗体は、予測されるとおり、架橋剤の存在下でＴ細胞活性化を誘導しない。抗マウスＴＮＦＲＸ抗体は、抗Ｆｃ抗体により架橋させた場合（無／ｍＴＮＦＲＸ＋ａ−ｈＦｃ）にいくらかのＴ細胞活性化を誘導する（表５参照）。抗ＴＮＦＲＸ  Ｆｃａｂは、ｍＡｂ２中で抗ＦＩＴＣ  Ｆａｂと対合させた場合、ＦＩＴＣｄｅｘにより架橋させた場合（ｍＴＮＦＲＸ／ＦＩＴＣ＋ＦＩＴＣｄｅｘ）にＴ細胞を活性化させ、ＥＣ５０はＴＮＦＲＸ抗体（無／ｍＴＮＦＲＸ）よりも低く最大応答はそれよりも高い。同一の抗ＴＮＦＲＸ  Ｆｃａｂは、ｍＡｂ２中で抗マウスＥｐＣＡＭ  Ｆａｂ又は抗マウスＣＤ７３  Ｆａｂと対合させた場合、４Ｔ１細胞の存在下でＴ細胞を活性化させ、ＥＣ５０はＴＮＦＲＸ／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２（ｍＴＮＦＲＸ／ｍＥｐＣＡＭ又はｍＴＮＦＲＸ／ｍＣＤ７３）よりも低く、最大応答はそれと同等である。
【０１６３】
このデータは、観察されたＴ細胞活性化が、抗ヒトＦｃ抗体を使用する、又は二重特異的抗体のＦａｂアームのエンゲージメントによる抗ＴＮＦＲＸ抗体の架橋時にのみ生じることを示す。マウスＥｐＣＡＭ及びマウスＣＤ７３の両方を発現する４Ｔ１細胞の存在下でｍＴＮＦＲＸ／ｍＥｐＣＡＭ及びｍＴＮＦＲＸ／ｍＣＤ７３  ｍＡｂ２を用いて観察されたＴ細胞活性化は、２つ以上のタイプの細胞表面受容体を使用して抗ＴＮＦＲＸ  Ｆｃａｂと対合させることができることを実証する。それというのも、ＣＤ７３はＧＰＩ結合細胞表面受容体であり、ＥｐＣＡＭは膜貫通糖タンパク質であるためである。
【０１６４】
実施例３
ｍＡｂ２架橋は、両方の配向で作用する
Ｔ細胞活性化アッセイを使用して以下の表６に列記される抗体の存在下でＴＮＦＲＸ受容体のクラスター化及びシグナリングを評価した。Ｔ細胞活性化はＩＬ−２の放出により決定した。
【０１６５】
３．１  ヒトＥＧＦＲを過剰発現する細胞系の産生
レンチウイルス形質導入法を使用して、Lenti-X HTX Packaging System（Clontech、カタログ番号631249）を使用してヒトＥＧＦＲを過剰発現するＣＴ２６細胞（ATCC、CRL-2638）を生成した。ヒトＥＧＦＲ  ｃＤＮＡを含有するLenti-X発現ベクター（ｐＬＶＸ）（Clontech、カタログ番号631253）を、Lenti-X293T Cell Line（Clontech、カタログ番号632180）中にLenti-X HTX Packaging Mixと同時形質移入してウイルスを生成した。Lenti-X HTX Packaging Systemにより産生されるレンチウイルスベクターを使用してＣＴ２６細胞系を形質導入した。
【０１６６】
３．２  Ｔ細胞活性化アッセイ
実施例２．１に記載のとおりＴ細胞を単離し、活性化させた。
【０１６７】
一晩のインキュベーション後、活性化Ｔ細胞をDynabeadsから洗浄し、Ｔ細胞培地中で２．０×１０６個の細胞／ｍｌの濃度において再懸濁させた。９６ウェル平底プレートを、ＰＢＳ中で希釈された２．５μｇ／ｍｌの抗マウスＣＤ３抗体（Biolegend）との３７℃＋５％のＣＯ２における２時間のインキュベーションを介して抗マウスＣＤ３抗体によりコートし、次いでＰＢＳにより２回洗浄した。活性化Ｔ細胞をプレートに１．０×１０５個の細胞／ウェルにおいて添加した。細胞表面上でｈＥＧＦＲを発現するように形質導入されたＣＴ２６細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ−２６３８）を、１０％のＦＢＳ（Life Technologies）を有するＤＭＥＭ培地（Life Technologies）中で維持した。ＣＴ２６．ｈＥＧＦＲ細胞をＴ細胞培地中で１回洗浄し、必要によりプレートに２．５×１０４個の細胞／ウェルにおいて添加した。
【０１６８】
それぞれの試験抗体（詳細については表６参照）の２μＭの希釈物をＤＰＢＳ（Gibco）中で調製し、Ｔ細胞培地中でさらに１：１０希釈（３０μｌ＋２７０μｌ）して２００ｎＭの希釈物を得た。架橋剤（ａ−ｈＦｃ、Jackson Immunoresearch；又はＦＩＴＣｄｅｘ、Sigma）を必要により試験抗体と１：１のモル比においてウェルに添加した。
【０１６９】
９６ウェルプレートにおいて、抗体又は抗体／架橋抗体混合物の６つの５倍段階希釈物を調製した（６０μｌ＋２４０μｌのＴ細胞培地）。１００μｌの希釈抗体又は抗体／架橋抗体混合物をプレート上の活性化Ｔ細胞に添加した。Ｔ細胞を３７℃、５％のＣＯ２において７２時間インキュベートした。上清を回収し、マウスＩＬ−２ＥＬＩＳＡキット（eBioscience又はR&D systems）により製造業者の説明書に従ってアッセイした。Gen5 Software,BioTekによりプレートリーダーを使用して４５０ｎｍにおいてプレートを読み取った。６３０ｎｍの吸光度値を４５０ｎｍのものから減算した（補正）。サイトカイン濃度の計算のための標準曲線は、４パラメータロジスティック曲線フィット（Gen5 Software,BioTek）をベースとした。マウスＩＬ−２（ｍＩＬ−２）の濃度を抗体の対数濃度に対してプロットし、得られた曲線を、GraphPad Prismにおいて応答に対する対数（アゴニスト）の式を使用してフィットさせた。
【０１７０】
３．３  Ｔ細胞活性化アッセイの結果
試験ｍＡｂ２及びｍＡｂの存在下でＴ細胞活性化アッセイにおいて観察されたＥＣ５０値及びＩＬ−２放出の最大応答を、表７に示す。図４は、Ｔ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。
【０１７１】
図４は、ＴＮＦＲＸ受容体が標的化され、抗ＴＮＦＲＸ抗体が架橋される場合にＴ細胞の活性化の増加が存在することを示す。Ｔ細胞活性化は、架橋剤（ＣＴ２６．ｈＥＧＦＲ細胞、抗Ｆｃ抗体又はＦＩＴＣｄｅｘ）の不存在下で単一高濃度（１００ｎＭ）における抗体のいずれについても観察されなかった（データ示さず）。抗ＥＧＦＲ（Ｇ１ＡＡ／Ｃｘ）ｍＡｂ及び抗ＥＧＦＲ（ＦＳ１−６７ＡＡ／４４２０）Ｆｃａｂ及び抗ＦＩＴＣ抗体（無／ｈＥＧＦＲ）は、予測されるとおり、架橋剤の存在下でＴ細胞活性化を誘導しない。抗ＴＮＦＲＸ抗体は、抗Ｆｃ抗体により架橋させた場合（無／ｍＴＮＦＲＸ＋ａ−ｈＦｃ）、Ｔ細胞活性化を誘導する（表７参照）。抗ＴＮＦＲＸ  Ｆｃａｂは、ｍＡｂ２中で抗ＦＩＴＣ  Ｆａｂと対合させた場合、ＦＩＴＣｄｅｘにより架橋した場合にＴ細胞を活性化させ、ＥＣ５０はＴＮＦＲＸ抗体（ｍＴＮＦＲＸ／ＦＩＴＣ＋ＦＩＴＣｄｅｘ）に対して低く、最大応答はそれに対して高い。同一の抗ＴＮＦＲＸ  Ｆｃａｂは、ｍＡｂ２中で抗ＥＧＦＲ  Ｆａｂと対合させた場合、ＣＴ２６．ｈＥＧＦＲ細胞の存在下でＴ細胞を活性化させ、ＥＣ５０はＴＮＦＲＸ／ＦＩＴＣ（ｍＴＮＦＲＸ／ｈＥＧＦＲ）に対して低いが、最大応答はそれに対して低い。ＴＮＦＲＸ抗体は、ｍＡｂ２中でＥＧＦＲ  Ｆｃａｂと対合させた場合、ＣＴ２６．ｈＥＧＦＲ細胞の存在下でＴ細胞を活性化させ、ＥＣ５０はＴＮＦＲＸ／ＦＩＴＣ（ｈＥＧＦＲ／ｍＴＮＦＲＸ）よりも低く、最大応答はそれと同等であった。
【０１７２】
このデータは、ｍＡｂ２の両方の配向が受容体クラスター化及びＴ細胞活性化を誘導し得ることを示しており、それは、ｍＡｂ２のＦｃａｂ及びＦａｂ部分の両方がＴＮＦＲＸ又はＴＡＡタイプの受容体のいずれかを標的化し得るためである。
【０１７３】
実施例４
可溶性因子によるｍＡｂ２架橋
Ｔ細胞活性化アッセイを使用して可溶性因子が以下の表８に列記される抗体の存在下でＴＮＦＲＸ受容体のクラスター化及びシグナリングを誘導し得るか否かを決定した。１ｍｅｒは可溶性単量体因子であり、２ｍｅｒは可溶性二量体因子である。
【０１７４】
実施例２．１に記載のとおりＴ細胞を単離し、活性化させた。
【０１７５】
一晩のインキュベーション後、活性化Ｔ細胞をDynabeadsから洗浄し、Ｔ細胞培地中で２．０×１０６個の細胞／ｍｌの濃度において再懸濁させた。９６ウェル平底プレートを、ＰＢＳ中で希釈された１μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ３抗体（BiotechneクローンUCHT1）との３７℃＋５％のＣＯ２における２時間のインキュベーションを介して抗ヒトＣＤ３抗体によりコートし、次いでＰＢＳにより２回洗浄した。活性化Ｔ細胞を１．０×１０５個の細胞／ウェルにおいてプレートに添加した。
【０１７６】
それぞれの試験抗体（詳細については表８参照）の２μＭの希釈物をＤＰＢＳ（Gibco）中で調製し、Ｔ細胞培地中でさらに１：１００希釈（３μｌ＋２９７μｌ）して２０ｎＭの希釈物を得た。架橋剤（ａ−ｈＦｃ、Jackson Immunoresearch；又はヒト２ｍｅｒ  Peprotech；又はヒト１ｍｅｒ）を抗ヒトＦｃ抗体及びヒト２ｍｅｒについては必要により試験抗体と１：１のモル比又は１ｍｅｒについては２：１のモル比でウェルに添加した。希釈抗体又は抗体／架橋抗体混合物（１００μｌ／ウェル）をプレート上の活性化Ｔ細胞に添加した。
【０１７７】
Ｔ細胞を３７℃、５％のＣＯ２において７２時間インキュベートした。上清を回収し、ヒトＩＬ−２  ＥＬＩＳＡキット（eBioscience）により製造業者の説明書に従ってアッセイした。Gen5 Software,BioTekによりプレートリーダーを使用して４５０ｎｍにおいてプレートを読み取った。６３０ｎｍの吸光度値を４５０ｎｍのものから減算した（補正）。サイトカイン濃度の計算のための標準曲線は、４パラメータロジスティック曲線フィット（Gen5 Software,BioTek）をベースとした。表９は、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて試験されたｍＡｂ２及びｍＡｂの存在に応答して産生されたヒトＩＬ−２レベルを示す。図５は、Ｔ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。
【０１７８】
図５は、ＴＮＦＲＸ受容体が標的化され、抗ＴＮＦＲＸ抗体が架橋される場合にＴ細胞の活性化の増加が存在することを示す。Ｔ細胞活性化は、架橋剤（抗Ｆｃ抗体、２ｍｅｒ又は１ｍｅｒ）の不存在下で単一高濃度（１０ｎＭ）における抗体のいずれについても観察されなかった。ＷＴ  Ｆｃａｂは、予測されるとおり、架橋剤の存在下でＴ細胞活性化を誘導しない。抗ＴＮＦＲＸ抗体は、抗ヒトＦｃ抗体により架橋させた場合（無／ｈＴＮＦＲＸ＋ａ−ｈＦｃ）にのみＴ細胞活性化を誘導する。同一の抗ヒトＴＮＦＲＸ  Ｆａｂは、ｍＡｂ２中でＦｃａｂ標的化１ｍｅｒと対合させた場合、抗Ｆｃ抗体により架橋させた場合（１ｍｅｒ／ｈＴＮＦＲＸ＋ａ−ｈＦｃ）にＴ細胞を活性化させるが、２ｍｅｒ又は１ｍｅｒのいずれかにより架橋させた場合（１ｍｅｒ／ｈＴＮＦＲＸ＋２ｍｅｒ及び１ｍｅｒ／ｈＴＮＦＲＸ＋１ｍｅｒには活性化させない。同一の抗ヒトＴＮＦＲＸ  Ｆａｂは、ｍＡｂ２中でＦｃａｂ標的化２ｍｅｒと対合させた場合、抗Ｆｃ抗体により架橋させた場合（２ｍｅｒ／ｈＴＮＦＲＸ＋ａ−ｈＦｃ）及びさらには２ｍｅｒにより架橋させた場合（２ｍｅｒ／ｈＴＮＦＲＸ＋２ｍｅｒ）にＴ細胞を活性化させるが、可溶性１ｍｅｒにより架橋させた場合（２ｍｅｒ／ｈＴＮＦＲＸ＋１ｍｅｒ）には活性化させない。
【０１７９】
このデータは、可溶性因子を使用してＦａｂアームを介してＴＮＦＲＸを、及びＦｃａｂを介して可溶性因子を標的化するｍＡｂ２の抗体架橋を誘導することができることを示す。この架橋は、Ｔ細胞上でＴＮＦＲＸ受容体をクラスター化することによりＴ細胞活性化をもたらす。１ｍｅｒの存在下で１ｍｅｒ／ＴＮＦＲＸ  ｍＡｂ２について観察された活性の欠落は、全ての可溶性因子がＴ細胞活性化に要求される抗体架橋効果を誘導し得るわけではないことを示唆する。２ｍｅｒが二量体であり、１ｍｅｒが単量体であるという事実は、少なくともｎ＝２（ｎは、可溶性因子のサブユニットの数を示す）の多量体可溶性因子の必要性を示す。
【０１８０】
実施例５
別のＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲＹ）のコンディショナル受容体アゴニズム
Ｔ細胞活性化アッセイを使用してｍＡｂ２フォーマットを使用してＴ細胞上で発現される異なるＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲＹ）を活性化させることができることを確認した。
【０１８１】
マウスＴＮＦＲＹを発現する細胞（マウスＴＮＦＲＹにより形質移入されたＤＯ１１．１０細胞系）を発現する細胞を、Ｔ細胞活性化実験において、ｈＣＤ２０発現Ｄａｕｄｉ細胞（ＣＤ２０＋細胞）の存在下又は不存在下で使用した。本実験において使用される抗体分子の詳細を表１０に示す。プロテインＬを架橋剤として使用し、ｍＴＮＦＲＹモノクローナル抗体（無／ｍＴＮＦＲＹ）とともに添加してｍＴＮＦＲＹ受容体活性化を刺激した。
【０１８２】
Ｔ細胞活性化はｍＩＬ−２サイトカイン放出をもたらし、それをＥＬＩＳＡにより定量した。図６Ａ及び図６Ｂは、種々の抗体分子の存在下でのＴ細胞活性化についての結果を示す。アッセイは、ｍＴＮＦＲＹ抗体（無／ｍＴＮＦＲＹ）について、ｈＣＤ２０発現細胞の不存在下（白四角、点線）及び存在下（黒四角、実線）の両方で実施し、それぞれ図６Ａ及び図６Ｂに説明する。ＥＣ５０結果を表１１に示す。ｈＣＤ２０発現Ｄａｕｄｉ細胞の不存在下で、ｍＴＮＦＲＹ／ｈＣＤ２０  ｍＡｂ２は最小のＴ細胞活性化（白丸、点線）をもたらす。同一のｍＴＮＦＲＹ／ｈＣＤ２０  ｍＡｂ２は、ｈＣＤ２０発現Ｄａｕｄｉ細胞の存在下（黒丸、実線）でＴ細胞を活性化させ、架橋剤（無／ｍＴＮＦＲＹ）の存在下でｍＴＮＦＲＹ抗体と比べて３０倍低いＥＣ５０をもたらす。ＣＤ２０＋細胞の添加は、ｍＴＮＦＲＹ抗体について類似レベルのＴ細胞活性化をもたらした（図６Ｂ）。
【０１８３】
本実験は、ｍＴＮＦＲＹ／ｈＣＤ２０  ｍＡｂ２が、ｈＣＤ２０発現細胞の存在下の場合にのみ高レベルのＴ細胞活性化を示すことを実証し、コンディショナルアゴニストとしてのｍＡｂ２フォーマットの好適性をさらに実証する。さらに、ｍＡｂ２は、低い抗体濃度において高レベルのＴ細胞活性化を示す一方、外部架橋剤の存在下でＴ細胞活性化をドライブするために高レベルのｍＴＮＦＲＹ抗体が要求される。これは、アゴニスト受容体の架橋におけるｍＡｂ２分子の優位性をさらに実証する。
【０１８４】
ｈＴＮＦＲＹ／ｈＣＤ２０  ｍＡｂ２、すなわち、ｍＴＮＦＲＹ／ｈＣＤ２０  ｍＡｂ２により結合されるネズミ科ＴＮＦＲＹ抗原とは対照的に、対応するヒトＴＮＦＲＹ抗原に結合するｍＡｂ２を、上記の実験設定を使用するＴ細胞活性化アッセイにおいても試験した。本アッセイを実施してｈＴＮＦＲＹ／ｈＣＤ２０  ｍＡｂ２が、ｈＣＤ２０発現Ｄａｕｄｉ細胞（ＣＤ２０＋細胞）の存在下又は不存在下で、ＴＮＦＲＹのヒトバージョンを発現するＴ細胞（ヒトＴＮＦＲＹにより形質移入されたＤＯ１１．１０細胞系）を活性化させ得るか否かを試験した。得られた結果は、上記のｍＴＮＦＲＹ／ｈＣＤ２０  ｍＡｂ２について得られた結果と同等であった。
【０１８５】
実施例６
他の細胞表面受容体を使用してインビトロ及びインビトロでｍＡｂ２架橋を介するコンディショナル受容体アゴニズムを誘導することができる
６．１．  他の細胞表面受容体を使用してインビトロでｍＡｂ２架橋を介するコンディショナル受容体アゴニズムを誘導することができる
Ｔ細胞活性化アッセイを使用して以下の表１２に列記される試験抗体の存在下でＴＮＦＲＸ受容体のクラスター化及びシグナリングを評価した。
【０１８６】
実施例２．１に詳述のとおりＴ細胞を単離し、活性化させた。一晩のインキュベーション後、活性化Ｔ細胞をDynabeadsから洗浄し、２．０×１０６個の細胞／ｍｌの濃度においてＴ細胞培地中で再懸濁させた。９６ウェル平底プレートを、ＰＢＳ中で希釈された２．５μｇ／ｍｌの抗マウスＣＤ３抗体（Biolegend）との３７℃＋５％のＣＯ２における２時間のインキュベーションを介して抗マウスＣＤ３抗体によりコートし、次いでＰＢＳにより２回洗浄した。活性化Ｔ細胞を１．０×１０５個の細胞／ウェルにおいてプレートに添加した。細胞表面上でヒトＥｐｈＡ２を発現するＨＰＡＣ細胞（ATCC、CRL2119（商標））を、１０％のＦＢＳ（Life Technologies）を有するＤＭＥＭ培地（Life Technologies）中で維持した。ＨＰＡＣ細胞をＴ細胞培地中で１回洗浄し、必要により２．５×１０４個の細胞／ウェルにおいてプレートに添加した。
【０１８７】
それぞれの試験抗体（詳細については表１２参照）の２μＭの希釈物をＤＰＢＳ（Gibco）中で調製し、Ｔ細胞培地中でさらに１：１０希釈（３０μｌ＋２７０μｌ）して２００ｎＭの希釈物を得た。
【０１８８】
架橋剤（ａ−ｈＦｃ、Jackson Immunoresearch；又はＦＩＴＣｄｅｘ、Sigma）を、必要により試験抗体と１：１のモル比でウェルに添加した。
【０１８９】
９６ウェルプレートにおいて、抗体又は抗体／架橋抗体混合物の６つの５倍段階希釈物を調製した（６０μｌ＋２４０μｌのＴ細胞培地）。１００μｌの希釈抗体又は抗体／架橋抗体混合物をプレート上の活性化Ｔ細胞に添加した。Ｔ細胞を３７℃、５％のＣＯ２において７２時間インキュベートした。上清を回収し、マウスＩＬ−２ＥＬＩＳＡキット（eBioscience又はR&D systems）により製造業者の説明書に従ってアッセイした。Gen5 Software,BioTekによりプレートリーダーを使用して４５０ｎｍにおいてプレートを読み取った。６３０ｎｍの吸光度値を４５０ｎｍのものから減算した（補正）。サイトカイン濃度の計算のための標準曲線は、４パラメータロジスティック曲線フィット（Gen5 Software,BioTek）をベースとした。マウスＩＬ−２（ｍＩＬ−２）の濃度を抗体の対数濃度に対してプロットし、得られた曲線を、GraphPad Prismにおいて応答に対する対数（アゴニスト）の式を使用してフィットさせた。表１３は、試験ｍＡｂ２及びｍＡｂの存在下でＴ細胞活性化アッセイにおいて観察されたＥＣ５０値及びＩＬ−２放出の最大応答を示す。図７Ａ及びＢは、Ｔ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。
【０１９０】
図７Ａは、ＥｐｈＡ２発現細胞（ＨＰＡＣ）の存在下でＴＮＦＲＸ受容体及びＥｐｈＡ２受容体を標的化する二重特異的抗体が存在する場合にＴ細胞の活性化の増加が存在するが、ＴＮＲＦＸ受容体を標的化する他の抗体が存在するが架橋されない場合には存在しないことを示す。これは、二重特異的抗体が２つの標的のＴＮＦＲＸ及びＥｐｈＡ２に結合することにより架橋されることを示す。図７Ｂは、ＴＮＦＲＸ受容体を標的化する任意の抗体が、非生理学的架橋剤（抗Ｆｃ抗体又はＦＩＴＣｄｅｘ）の存在下でＴ細胞を活性化させることを示す。抗ＥｐｈＡ２及び抗ＦＩＴＣ抗体は、予測されるとおり、架橋剤の存在下でＴ細胞活性化を誘導しない。抗マウスＴＮＦＲＸ抗体は、抗Ｆｃ抗体により架橋させた場合（無／ｍＴＮＦＲＸ＋ａ−ｈＦｃ）、いくらかのＴ細胞活性化を誘導する（表１３参照）。抗ＴＮＦＲＸ  Ｆｃａｂは、ｍＡｂ２中で抗ＦＩＴＣ  Ｆａｂと対合させた場合、ＦＩＴＣｄｅｘにより架橋させた場合（ｍＴＮＦＲＸ／ＦＩＴＣ＋ＦＩＴＣｄｅｘ）にＴ細胞を活性化させ、ＥＣ５０はＴＮＦＲＸ抗体（無／ｍＴＮＦＲＸ）よりも低く、最大応答はそれよりも高かった。同一の抗ＴＮＦＲＸ  Ｆｃａｂは、ｍＡｂ２中で抗ＥｐｈＡ２  Ｆａｂと対合させた場合（ｍＴＮＦＲＸ／ＥｐｈＡ２）、ＨＰＡＣ細胞の存在下でＴ細胞を活性化させ、ＥＣ５０はｍＴＮＦＲＸ／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２と比較して低く、最大応答はそれと同等であった。
【０１９１】
このデータは、観察されたＴ細胞活性化が、抗ヒトＦｃ抗体を使用する、又は二重特異的抗体のＦａｂアームのエンゲージメントによる抗ＴＮＦＲＸ抗体の架橋時にのみ生じることを示す。ＥｐｈＡ２を発現するＨＰＡＣ細胞の存在下でｍＴＮＦＲＸ／ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ２について観察されたＴ細胞活性化は、この受容体が、ＥｐｈＡ２及びｍＴＮＲＦＸに対する特異性を有するｍＡｂ２二重特異的抗体により標的化される場合にもｍＴＮＦＲＸ受容体の架橋を媒介し得ることを実証する。
【０１９２】
細胞表面腫瘍抗原ｈＰＳＭＡを発現する細胞の存在下又は不存在下でｍＴＮＦＲＸを発現するＴ細胞を活性化させる、ｍＡｂ２フォーマット中で抗ヒトＰＳＭＡ  Ｆａｂと対合させたｍＴＮＦＲＸ  Ｆｃａｂ（ｍＴＮＦＲＸ／ｈＰＳＭＡ）の能力を試験するためのＴ細胞活性化実験も実施し、上記のｍＴＮＦＲＸ／ｈＥｐＣＡＭ  ｍＡｂ２、並びに本明細書の他箇所に記載のｍＴＮＦＲＸ／ｈＣＤ２０、ｍＴＮＦＲＸ／ｍＣＤ７３、ｍＴＮＦＲＸ／ｈＥＧＦＲ、及びｍＴＮＦＲＸ／ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２対合についてのＴ細胞活性化アッセイから得られたものと同等の結果を生じさせた。
【０１９３】
類似のＴ細胞活性化アッセイを実施してネズミ科ＴＮＦＲＸではなくヒトＴＮＦＲＸにＦｃａｂが結合しているｍＡｂ２がＴ細胞活性化アッセイにおいてＴ細胞を活性化させ得るか否かも試験した。試験分子は、ｈＴＮＦＲＸ／ｍＥｐＣＡＭ、ｈＴＮＦＲＸ／ｈＥＧＦＲ、ｈＴＮＦＲＸ／ＥｐｈＡ２及びｈＴＮＦＲＸ／ｈＣＥＡＣＡＭ５  ｍＡｂ２であった。Ｔ細胞活性化アッセイにおいて使用されたＴ細胞はＴＮＦＲＸのヒトバージョンを発現し、ｍＡｂ２のＦａｂ部分により結合される関連細胞表面腫瘍抗原、すなわち、ｍＥｐＣＡＭ、ｈＥＧＦＲ、ＥｐｈＡ２又はｈＣＥＡＣＡＭ５をそれぞれを発現する細胞の存在下又は不存在下で試験した。結果は、本明細書に記載のｍＴＮＦＲＸ  Ｆｃａｂ、及びｈＣＤ２０、ｈＥｐＣＡＭ、ｍＣＤ７３、ｈＥＧＦＲ、ＥｐｈＡ２、ＶＥＧＦ又はｈＰＳＭＡに結合するＦａｂ部分を取り込むｍＡｂ２分子（すなわち、ｍＴＮＦＲＸ／ｈＣＤ２０、ｍＴＮＦＲＸ／ｈＥｐＣＡＭ、ｍＴＮＦＲＸ／ｍＣＤ７３、ｍＴＮＦＲＸ／ｈＥＧＦＲ、ｍＴＮＦＲＸ／ＥｐｈＡ２、ｍＴＮＦＲＸ／ＶＥＧＦ及びｍＴＮＦＲＸ／ｈＰＳＭＡ）を用いるＴ細胞活性化アッセイにおいて得られたものと同等であった。
【０１９４】
６．２  インビトロでコンディショナル受容体アゴニズムを示し得るｍＡｂ２は、インビボで腫瘍成長を抑制する
ＣＴ２６同系腫瘍モデルを本実験において使用した。それというのも、ＣＴ２６細胞はネズミ科ＥｐｈＡ２を発現し、ＣＴ２６腫瘍から単離された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）はｍＴＮＦＲＸを発現するためである。ｍＴＮＦＲＸ／ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ２を、ＣＴ２６同系マウス腫瘍成長モデルにおいてインビボ活性について試験した。腫瘍成長を阻害するｍＡｂ２の能力を、ｍＴＮＲＦＸ／無  ｍＡｂ２、ｍＴＮＦＲｘ／無  ｍＡｂ２及び無／ＥｐｈＡ２  ｍＡｂの組合せ、並びに無／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ対照のものと比較した。それぞれ８〜１０週齢及び体重２０〜２５ｇのＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Charles River）を、試験開始前の１週間休息させた。全ての動物にマイクロチップを埋め込み、固有の識別子を与えた。それぞれのコホートは、１２匹のマウスを有した。ＣＴ２６結腸細胞癌系（ATCC、CRL-2638）を最初に拡張し、貯蔵し、次いでIDEXX BioresearchによりIMPACT Iプロトコルを使用して病原体についてプレスクリーニングし、病原体を有さないことが示された。ＣＴ２６細胞（約３〜５×１０６個）を−１５０℃の貯蔵所から解凍し、Ｔ１７５組織培養フラスコ中の１０％のＦＣＳ（Gibco、10270-106）を有する２０ｍｌのＤＭＥＭ（Gibco、61965-026）に添加した。イソフルラン（Abbott Laboratories）を使用してマウスを麻酔し、それぞれの動物は、左脇腹中に皮下注射された１×１０６個の細胞を受容した。腫瘍細胞接種後１０日目、マウスを健康状態及び腫瘍成長についてモニタリングし、ソートし、試験コホート中にランダム化した。この時点において腫瘍を有さなかったあらゆるマウスを試験から除外した。
【０１９５】
ｍＡｂ２分子及び対照抗体の全てをＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイリングにより注射の２４時間以内に分析し、不純物について確認した。抗体をＰＢＳ中で１ｍｇ／ｋｇの最終濃度において調製した。ｍＡｂ２分子及び対照抗体を、腫瘍接種後の１０、１２及び１４日目に腹腔内（ＩＰ）注射によりマウスに投与した。動物を麻酔下で週３回、盲検的に健康状態についてスクリーニングし、その間に腫瘍の正確な計測を行った。腫瘍容積計測は、測径器を用いて行って腫瘍の最長軸及び最短軸を決定した。以下の式を使用して腫瘍容積を計算した：
Ｌ×（Ｓ２）／２
（式中、Ｌ＝最長軸；Ｓ＝最短軸）
【０１９６】
腫瘍負荷が限界近くとみなされた２０日目に試験を中止し、全てのマウスを安楽死させた。結果を図８に示す。GraphPad Prismソフトウェアパッケージ内で両側スチューデントｔ検定を使用して最終腫瘍容積の統計的分析を実施した。
【０１９７】
腫瘍成長の抑制において、ｍＴＮＲＦＸ／ＥｐｈＡ２  ｍＡｂ２及び無／ＦＩＴＣ対照（正常成長）間に統計的に有意な差が実証された。このような統計的に有意な差は、無／ＦＩＴＣ対照群に対してｍＴＮＦＲＸ／無及び無／ＥｐｈＡ２の組合せ又はｍＴＮＦＲＸ／無のいずれについても観察されなかった。
【０１９８】
ＣＴ２６腫瘍モデルは、侵襲的で急速成長する腫瘍のモデルであり、本質的に腸転移を発症するマウスになりやすいモデルであり、結果として、極めて限定された治療ウインドウを有する。驚くべきことに、ｍＴＮＦＲＸ及びＥｐｈＡ２を標的化する抗体の組合せは、ＩｇＧ対照コホートと比較して腫瘍成長を有意に抑制しなかった。しかしながら、ｍＴＮＦＲＸ／ＥｐｈＡ２処理コホートは、ＩｇＧ対照と比較して成長の有意な抑制を明らかにした。この試験は、観察されたインビトロ結果と同様、腫瘍細胞中で発現されるＥｐｈＡ２及びＴＩＬ中で発現されるｍＴＮＲＦＸを標的化するｍＡｂ２二重特異的抗体によるｍＴＮＦＲＸの架橋が対照について観察されたものを上回るＴ細胞活性化及び後続の腫瘍成長制御をもたらすことを示す。
【０１９９】
実施例７
ｍＴＮＦＲＹ／ＥＧＦＲ  ｍＡｂ２のインビボ抗腫瘍活性
７．１  レトロウイルス形質導入によるヒトＥＧＦＲを過剰発現する細胞系の産生
レトロウイルス形質導入法を使用してMSCV Retroviral Expression System（Clontech、カタログ番号634401）を使用してヒトＥＧＦＲを過剰発現するＣＴ２６細胞（ATCC、CRL-2638）を生成した。ヒトＥＧＦＲ  ｃＤＮＡを含有するＭＳＣＶ発現ベクター（ｐＭＳＣＶ−ｈｙｇ）（Clontech、カタログ番号631461）を、RetroPack PT67細胞系（Clontech、カタログ番号631510）中に形質移入してウイルスを生成した。MSCV Retroviral Expression Systemにより産生されたレトロウイルスベクターを使用してＣＴ２６細胞系を形質導入した。
【０２００】
７．２  ｍＡｂ２のインビボ抗腫瘍活性
上記の７．１に記載のとおり、ヒトＥＧＦＲ発現レトロウイルスをＣＴ２６細胞中に形質導入することにより、ＣＴ２６．ｈＥＧＦＲ同系腫瘍モデルを産生した。これらの細胞をそれらのインビボ成長特性について試験し、野生型ＣＴ２６細胞と同等に成長することが示された。次いで、これらの細胞を使用してｍＴＮＦＲＹ／ｈＥＧＦＲ  ｍＡｂ２のインビボ抗腫瘍活性を試験した。腫瘍成長を阻害するｍＡｂ２の能力を、以下の対照：ｍＴＮＦＲＹ／無  ｍＡｂ２及び無／ｈＥＧＦＲ  ｍＡｂの組合せ；無／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ；並びに無／ｈＥＧＦＲ  ｍＡｂ単独のものと比較した。
【０２０１】
それぞれ８〜１０週齢及び体重２０〜２５ｇのＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Charles River）を、試験開始前の１週間休息させた。全ての動物にマイクロチップを埋め込み、固有の識別子を与えた。それぞれのコホートは、１２匹のマウスを有した。ＣＴ２６．ｈＥＧＦＲ細胞（約３〜５×１０６個）を−１５０℃の貯蔵所から解凍し、Ｔ１７５組織培養フラスコ中の１０％のＦＣＳ（Gibco、10270-106）及び１００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシン（Gibco、10687010）を有する２０ｍｌのＤＭＥＭ（Gibco、61965-026）に添加した。イソフルラン（Abbott Laboratories）を使用してマウスを麻酔し、それぞれの動物は、左脇腹中に皮下注射された１×１０６個の細胞を受容した。腫瘍細胞接種後７日目、マウスを、健康状態及び腫瘍成長についてモニタリングし、ソートし、試験コホート中にランダム化した。この時点において腫瘍を有さなかったあらゆるマウスを試験から除外した。
【０２０２】
ｍＡｂ２分子及び対照抗体の全てをＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイリングにより注射の２４時間以内に分析し、不純物について確認した。抗体をＰＢＳ中１ｍｇ／ｋｇの最終濃度において調製した。ｍＡｂ２分子及び対照抗体を、腫瘍接種後の７、９及び１１日目に腹腔内（ＩＰ）注射によりマウスに投与した。動物を麻酔下で週３回、盲検的に健康状態についてスクリーニングし、その間に腫瘍の正確な計測を行った。腫瘍容積計測は、測径器を用いて行って腫瘍の最長軸及び最短軸を決定した。以下の式を使用して腫瘍容積を計算した：
Ｌ×（Ｓ２）／２
（式中、Ｌ＝最長軸；Ｓ＝最短軸）
【０２０３】
腫瘍負荷が限界近くとみなされた２０日目に試験を中止し、全てのマウスを安楽死させた。結果を図９に示す。GraphPad Prismソフトウェアパッケージ内で両側スチューデントｔ検定を使用して最終腫瘍容積の統計的分析を実施した。
【０２０４】
ｍＴＮＲＦＹ／ｈＥＧＦＲ  ｍＡｂ２及び無／ｈＥＧＦＲ対照間で統計的に有意な差が実証されたが、他の群については実証されなかった。なぜ無／ＥＧＦＲ対照群が無／ＦＩＴＣ対照よりもわずかに早い腫瘍成長を示すかは不明確である。しかしながら、ｍＴＮＦＲＹ／ｈＥＧＦＲ  ｍＡｂ２がＣＴ２６．ｈＥＧＦＲ腫瘍モデルにおいて腫瘍成長の抑制を示すことは明確である。ｍＴＮＦＲＹ／無及び無／ｈＥＧＦＲ対照の組合せは、無／ｈＥＧＦＲ対照に対して統計的に有意な差を示さなかった。
【０２０５】
ＣＴ２６．ｈＥＧＦＲ腫瘍モデルは、インビボでＣＴ２６腫瘍モデルと同一の速度で成長し、それは侵襲的で急速成長する腫瘍のモデルであり、本質的に腸転移を発症するマウスになりやすいモデルであり、結果として、極めて限定された治療ウインドウを有する。驚くべきことに、ｍＴＮＦＲＹ及びｈＥＧＦＲを標的化する抗体の組合せは、ＩｇＧ対照コホートと比較して腫瘍成長を有意に抑制しなかった。しかしながら、ｍＴＮＦＲＹ／ｈＥＧＦＲ処理コホートは、無／ｈＥＧＦＲ対照と比較して成長の有意な抑制を明らかにした。
【０２０６】
実施例８
可溶性因子を使用してインビボ、及びインビトロでｍＡｂ２架橋を介するコンディショナル受容体アゴニズムを誘導することができる
８．１  可溶性因子を使用してインビトロでｍＡｂ２架橋を介するコンディショナル受容体アゴニズムを誘導することができる
本実施例において試験された抗体のセットがインビトロでＴＮＦＲＸ受容体のクラスター化及びシグナリングを誘導し得たか否かを決定するため、それらを上記の実施例４において試験された抗体について記載のとおり試験した。
【０２０７】
具体的には、Ｔ細胞活性化アッセイを使用して以下の表１４に列記される抗体の存在下でＴＮＦＲＸ受容体のクラスター化及びシグナリングを評価した。
【０２０８】
実施例２．１に詳述されるとおり、Ｔ細胞を単離し、活性化させた。
【０２０９】
一晩のインキュベーション後、活性化Ｔ細胞をDynabeadsから洗浄し、２．０×１０６個の細胞／ｍｌの濃度においてＴ細胞培地中で再懸濁させた。９６ウェル平底プレートを、ＰＢＳ中で希釈された２．５μｇ／ｍｌの抗マウスＣＤ３抗体（Biolegend）との３７℃＋５％のＣＯ２における２時間のインキュベーションを介して抗マウスＣＤ３抗体によりコートし、次いでＰＢＳにより２回洗浄した。活性化Ｔ細胞を１．０×１０５個の細胞／ウェルにおいてプレートに添加した。
【０２１０】
それぞれの試験抗体（詳細については表１５参照）の２μＭの希釈物をＤＰＢＳ（Gibco）中で調製し、Ｔ細胞培地中でさらに１：１０希釈（３０μｌ＋２７０μｌ）して２００ｎＭの希釈物を得た。
【０２１１】
架橋剤（ａ−ｈＦｃ、Jackson Immunoresearch；ＦＩＴＣｄｅｘ、Sigma；又はネズミ科ＶＥＧＦ  １６５、Peprotech）を、必要により試験抗体と１：１のモル比においてウェルに添加した。
【０２１２】
９６ウェルプレートにおいて、抗体又は抗体／架橋抗体混合物の６つの５倍段階希釈物を調製した（６０μｌ＋２４０μｌのＴ細胞培地）。１００μｌの希釈抗体又は抗体／架橋抗体混合物をプレート上の活性化Ｔ細胞に添加した。Ｔ細胞を３７℃、５％のＣＯ２において７２時間インキュベートした。上清を回収し、マウスＩＬ−２ＥＬＩＳＡキット（eBioscience又はR&D systems）により製造業者の説明書に従ってアッセイした。Gen5 Software, BioTekによりプレートリーダーを使用して４５０ｎｍにおいてプレートを読み取った。６３０ｎｍの吸光度値を４５０ｎｍのものから減算した（補正）。サイトカイン濃度の計算のための標準曲線は、４パラメータロジスティック曲線フィット（Gen5 Software, BioTek）をベースとした。表１５は、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて試験されたｍＡｂ２及びｍＡｂの存在に応答して産生されたヒトＩＬ−２レベルを示す。図１０は、Ｔ細胞活性化アッセイについてのＩＬ−２放出の代表的なプロットを示す。図１１において、マウスＩＬ−２（ｍＩＬ−２）の濃度を抗体の対数濃度に対してプロットし、得られた曲線を、GraphPad Prismにおいて応答に対する対数（アゴニスト）の式を使用してフィットさせた。表１６は、試験ｍＡｂ２及びｍＡｂの存在下でＴ細胞活性化アッセイにおいて観察されたＥＣ５０値及びＩＬ−２放出の最大応答を示す。
【０２１３】
図１０は、単一濃度（１０ｎＭ）における様々な架橋剤の存在下での様々な抗体の活性を示す。この図は、ｍＴＮＦＲＸ標的化抗体が架橋される場合にのみＴ細胞の活性化の増加が存在することを示す。対照抗体（無／ｍＴＮＦＲＸ及びｍＴＮＦＲＸ／ＦＩＴＣ）は、非生理学的架橋剤（抗ｈＦｃ、ＦＩＴＣｄｅｘ）により架橋させることができるが、ＶＥＧＦによっては架橋させることができない一方、ｍＴＮＦＲＸ／ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２は、腫瘍部位において過剰発現され得る生理学的可溶性因子に相当するＶＥＧＦにより架橋される。ｍＴＮＦＲＸ／ＶＥＧＦについて観察されたより高いバックグラウンドは、活性化Ｔ細胞により産生された残留ＶＥＧＦの結果である可能性が高い（J. Immunol. 2004 Apr 1;172(7):4618-23）。抗ＶＥＧＦ及び抗ＦＩＴＣ抗体は、予測されるとおり、架橋剤の存在下でＴ細胞活性化を誘導しない。ｍＴＮＦＲＸ／ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２の架橋活性を、抗体濃度をタイトレートすることにより対照ｍＴＮＦＲＸ／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ２と比較する場合、図１１に示されるとおり、２つのｍＡｂ２二重特異的抗体のＥＣ５０及び最大応答は同等である（表１６参照）。ｍＴＮＦＲＸ／ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２は高濃度（１０ｎＭ）においていくらかのバックグラウンド活性を有するが、これは低濃度（例えば、１ｎＭ）において減少する一方、１：１のＶＥＧＦ比で架橋しているｍＡｂ２の活性はそれらの低濃度において維持される。
【０２１４】
このデータは、観察されたＴ細胞活性化が抗ＴＮＦＲＸ抗体の架橋時にのみ生じることを示す。架橋は、２つ以上のｍＴＮＦＲＸ標的化抗体への二次抗体（ａ−ｈＦｃ）結合、例えば、無／ｍＴＮＦＲＸ＋ａ−ｈＦｃ及びこのようなＴＮＦＲＸのクラスター化の結果であり得る。これも、一端がＴＮＦＲＸを標的化し、他端が腫瘍部位において過剰発現され得る可溶性因子、例えば、ＶＥＧＦを標的化するｍＡｂ２二重特異的抗体の抗原結合末端の両方のエンゲージングの結果であり得る。
【０２１５】
８．２  インビトロでコンディショナル受容体アゴニズムを示し得るｍＡｂ２は、インビボで腫瘍成長を抑制する
ｍＴＮＦＲＸ／ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２を、ＣＴ２６同系マウス腫瘍成長モデルにおいてインビボ活性について試験した。
【０２１６】
ＣＴ２６同系腫瘍モデルを本実験において使用した。それというのも、ＣＴ２６腫瘍は増加濃度のＶＥＧＦを有し（Voron T,Colussi O, Marcheteau E, et al. VEGF-A modulates expression of inhibitory checkpoints on CD8+ T cells in tumors.The Journal of Experimental Medicine. 2015;212(2):139-148）、ＣＴ２６腫瘍から単離された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）はｍＴＮＦＲＸを発現することが記載されているためである。
【０２１７】
腫瘍成長を阻害するｍＴＮＦＲＸ／ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２の能力を、以下の対照：ｍＴＮＦＲＸ／無  ｍＡｂ２及び無／ＶＥＧＦ  ｍＡｂの組合せ；無／ＦＩＴＣ  ｍＡｂ；並びに無／ＶＥＧＦ  ｍＡｂ単独のものと比較した。
【０２１８】
それぞれ８〜１０週齢及び体重２０〜２５ｇのＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Charles River）を、試験開始前の１週間休息させた。全ての動物にマイクロチップを埋め込み、固有の識別子を与えた。それぞれのコホートは、１５匹のマウスを有した。ＣＴ２６結腸癌細胞系（ATCC、CRL-2638）を最初に拡張し、貯蔵し、次いでIDEXX BioresearchによりIMPACT Iプロトコルを使用して病原体についてプレスクリーニングし、病原体を有さないことが示された。ＣＴ２６細胞（約３〜５×１０６個）を−１５０℃の貯蔵所から解凍し、Ｔ１７５組織培養フラスコ中の１０％のＦＣＳ（Gibco、10270-106）を有する２０ｍｌのＤＭＥＭ（Gibco、61965-026）に添加した。イソフルラン（Abbott Laboratories）を使用してマウスを麻酔し、それぞれの動物は、左脇腹中に皮下注射された１×１０６個の細胞を受容した。腫瘍細胞接種後１０日目、マウスを健康状態及び腫瘍成長についてモニタリングし、ソートし、試験コホート中にランダム化した。この時点において腫瘍を有さなかったあらゆるマウスを試験から除外した。
【０２１９】
ｍＡｂ２分子及び対照抗体の全てをＳＥＣ−ＨＰＬＣプロファイリングにより注射の２４時間以内に分析し、不純物について確認した。抗体をＰＢＳ中で１ｍｇ／ｋｇの最終濃度において調製した。ｍＡｂ２分子及び対照抗体を、腫瘍接種後の１０、１２及び１４日目に腹腔内（ＩＰ）注射によりマウスに投与した。動物を麻酔下で週３回、盲検的に健康状態についてスクリーニングし、その間に腫瘍の正確な計測を行った。腫瘍容積計測は、測径器を用いて行って腫瘍の最長軸及び最短軸を決定した。以下の式を使用して腫瘍容積を計算した：
Ｌ×（Ｓ２）／２
（式中、Ｌ＝最長軸；Ｓ＝最短軸）
【０２２０】
腫瘍負荷が限界近くとみなされた２４日目に試験を中止し、全てのマウスを安楽死させた。結果を図１２に示す。GraphPad Prismソフトウェアパッケージ内で両側スチューデントｔ検定を使用して最終腫瘍容積の統計的分析を実施した。
【０２２１】
腫瘍成長の抑制において、ｍＴＮＲＦＸ／ＶＥＧＦ  ｍＡｂ２及び無／ＦＩＴＣ対照（正常成長）間に統計的に有意な差が実証された。このような統計的に有意な差は、無／ＦＩＴＣ対照に対してｍＴＮＦＲＸ／無及び無／ＶＥＧＦ対照の組合せ又は無／ＶＥＧＦ対照のいずれについても観察されなかった。
【０２２２】
ＣＴ２６腫瘍モデルは、侵襲的で急速成長する腫瘍のモデルであり、本質的に腸転移を発症するマウスになりやすいモデルであり、結果として、極めて限定された治療ウインドウを有する。驚くべきことに、ｍＴＮＦＲＸ及びＶＥＧＦを標的化する抗体の組合せは、ＩｇＧ対照コホートと比較して腫瘍成長を有意に抑制しなかった。しかしながら、ｍＴＮＦＲＸ／ＶＥＧＦ処理コホートは、ＩｇＧ対照と比較して成長の有意な抑制を明らかにした。この試験は、観察されるインビトロ結果と同様、腫瘍細胞中で過剰発現され、腫瘍微小環境内又はそこにおいて過剰発現されるＶＥＧＦ及びＴＩＬ中で発現されるｍＴＮＲＦＸを標的化するｍＡｂ２二重特異的抗体によるｍＴＮＦＲＸの架橋は、対照について観察されたものを上回るＴ細胞活性化及び後続の腫瘍成長制御をもたらすことを示す。
【０２２３】
【表１】
2020503860.tif 000002
【０２２４】
【表２】
2020503860.tif 000003
【０２２５】
【表３】
2020503860.tif 000004
【０２２６】
【表４】
2020503860.tif 000005
【０２２７】
【表５】
2020503860.tif 000006
【０２２８】
【表６】
2020503860.tif 000007
【０２２９】
【表７】
2020503860.tif 000008
【０２３０】
【表８】
2020503860.tif 000009
【０２３１】
【表９】
2020503860.tif 000010
【０２３２】
【表１０】
2020503860.tif 000011
【０２３３】
【表１１】
2020503860.tif 000012
【０２３４】
【表１２】
2020503860.tif 000013
【０２３５】
【表１３】
2020503860.tif 000014
【０２３６】
【表１４】
2020503860.tif 000015
【０２３７】
【表１５】
2020503860.tif 000016
【０２３８】
【表１６】
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【０２３９】
【表１７】
2020503860.tif 000018
【０２４０】
配列表
ＬＡＬＡ突然変異を有さない「野生型」Ｆｃａｂ  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号１）
【化１】
2020503860.tif 000019
【０２４１】
ＬＡＬＡ突然変異（下線）を含む「野生型」Ｆｃａｂ  ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）
【化２】
2020503860.tif 000020
【０２４２】
「野生型」Ｆｃａｂ  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列（配列番号３）
【化３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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