(57)【要約】  本発明は、循環器疾患、特に慢性心不全（ＨＦ）を治療する手段に関する。本発明の目的は、循環器疾患、特に慢性心不全を治療する新たな治療方法を、とりわけ、病理学的肥大のシグナル伝達を阻害または最小限に抑えると同時に、心筋収縮力をほとんど損なわずに保つ、より特異的な治療という観点で提供することである。このために、本発明は循環器疾患、特に慢性心不全を治療する手段であって、心筋細胞頂部上のβ1アドレナリン受容体の活性化によってｃＡＭＰを産生するβ1−ＡＲ／ｃＡＭＰ経路の構成要素を特異的に阻害する、またはその阻害を引き起こす手段を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
循環器疾患、特に慢性心不全、冠動脈疾患、または心不整脈を治療する手段であって、心筋細胞頂部上のβ1アドレナリン受容体の活性化によってｃＡＭＰを産生するβ1−ＡＲ／ｃＡＭＰ経路の構成要素を特異的に阻害する、またはその阻害を引き起こす手段。
【請求項２】
前記手段が、心筋細胞頂部上のβ1アドレナリン受容体を特異的に阻害するβ遮断薬である、請求項１に記載の手段。
【請求項３】
前記手段が、心筋細胞頂部上のβ1アドレナリン受容体と特異的に結合し、これを遮断する結合分子である、請求項１に記載の手段。
【請求項４】
前記結合分子が、心筋細胞頂部上のβ1アドレナリン受容体と特異的に結合し、これを遮断する抗体、好ましくはモノクローナル抗体、またはアプタマーである、請求項３に記載の手段。
【請求項５】
前記手段が、β1アドレナリン受容体を特異的に遮断するβ遮断薬または結合分子をその表面に固定化して輸送する、好ましくはこれに共有結合している、またはこれでコーティングされている担体であって、前記担体がＴ管への侵入が排除される大きさを有する、請求項１に記載の手段。
【請求項６】
前記手段が、１１ｎｍを超える直径を有し、β1アドレナリン受容体を特異的に遮断する、好ましくは心筋細胞頂部上のβ1アドレナリン受容体を特異的に遮断するβ遮断薬または結合分子をその表面に固定化して輸送する、好ましくはこれに共有結合している、またはこれでコーティングされているナノ粒子である、請求項５に記載の手段。
【請求項７】
前記手段が、細胞頂部に局在するように設計された、遺伝子的にコードされたβ1−ＡＲ／ｃＡＭＰ経路阻害剤である、請求項１に記載の手段。
【請求項８】
前記手段が、心筋細胞頂部上のβ1アドレナリン受容体を特異的に阻害するｐＨ依存性β遮断薬である、請求項１に記載の手段。
【請求項９】
請求項１〜８のうちいずれか一項に記載の手段を含む薬剤。
【請求項１０】
循環器疾患、好ましくは慢性心不全の治療に用いる、請求項９に記載の薬剤。
【請求項１１】
循環器疾患の治療的処置の方法であって、そうした治療を必要とする患者への、請求項１〜８のうちいずれか一項に記載の手段、または請求項９または１０に記載の薬剤の治療効果のある量の投与を含む方法。
【請求項１２】
前記循環器疾患が慢性心不全である、請求項１１に記載の治療的処置の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は循環器疾患、特に慢性心不全（ＨＦ）、冠動脈疾患、および心不整脈を治療する手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性心不全（ＨＦ）、冠動脈疾患、および高血圧などの循環器疾患は、全世界で主要な死亡原因となっており、世界的な医療負担も莫大である。例えば、ＥＵだけで２６００万人が慢性心不全に罹患しており、年間約３００億ユーロかかっている。最新の薬物治療をもってしても、心不全患者の５年生存率はわずか５０％ほどにとどまっている（非特許文献１、２）。現在の治療法は、ＨＦ病因に典型的な悪循環の大きな一因となっている交感神経系およびレニン・アンジオテンシン・アルドステロン系の過剰活性といった、重要な神経・ホルモン機構の遮断に主に狙いを定めている（非特許文献３）。心臓のβ1アドレナリン受容体（β1−ＡＲ）を選択的に阻害するβ遮断薬（βブロッカー）、アンギオテンシン変換酵素阻害薬またはアンギオテンシン受容体拮抗薬、アルドステロン受容体遮断薬といったいくつかの治療薬を併用することで、疾患の進行を大幅に遅らせることができる（非特許文献４）。喘息、重度の房室ブロック、および急性ＨＦといったいくつかの禁忌を有するほぼすべての患者で、β遮断薬を用いた治療が行われる。近年、イバブラジン（非特許文献５）およびネプリライシン阻害薬（非特許文献６）といった追加薬の登場により、死亡率をある程度低下させることができているものの、神経・ホルモン疾患機構の全体的な遮断に基づく従来の治療法は行き詰まってきているようだ。
【０００３】
β1−ＡＲが促進性Ｇタンパク質（Ｇｓ）と結合すると、アデニル酸シクラーゼが活性化され、セカンドメッセンジャーである環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）が産生される。心臓では、心筋細胞（ＣＭ）にあるβ1−ＡＲのカテコラミン刺激に応答して産生されたｃＡＭＰが、いくつかのカルシウム処理タンパク質および収縮タンパク質のｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）媒介リン酸化によって、興奮収縮連関を調節する。例えば、筋鞘のＬ型カルシウムチャネル（ＬＴＣＣ）のリン酸化はＣａ2+流入増加をもたらし、また筋形質のリアノジン受容体（ＲｙＲ）のリン酸化は筋小胞体（ＳＲ）からの収縮期のＣａ2+放出増加をもたらし、総じて陽性変力作用、すなわち心収縮力増加を担っている。ＳＲ  Ｃａ−ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ）阻害タンパク質であるホスホランバン（ＰＬＮ）のリン酸化はその抑制を緩和し、拡張期のＳＲへのＣａ2+再取り込みを促進して、弛緩を向上させる（弛緩促進作用）（非特許文献７）。これは心臓が身体的または精神的なストレスに対する収縮性増強の必要を満たすのに役立つ。しかしながら、ｃＡＭＰシグナル経路を長期間刺激すると、不適応心臓リモデリングに至る（非特許文献８）。これは、ＣＭ核で作用するＣＲＥＢおよびＨＤＡＣ５といった一部の転写調節因子をプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）がリン酸化することによって、またはホスファターゼであるカルシニューリンおよび転写因子ＮＦＡＴを刺激する可能性のあるイオンチャネル依存性Ｃａ2+上昇によって生じ、肥大遺伝子発現をもたらす（非特許文献９、１０、１１、１２）。
【０００４】
細胞内で同時に発生する大量のさまざまな、またときに拮抗するｃＡＭＰ媒介作用は、細胞内シグナル伝達区画化により可能となっているという認識が近年高まってきている。この考えによれば、ｃＡＭＰは、局在する受容体、アンカータンパク質であるキナーゼ基質に結合したＰＫＡ、局所的ｃＡＭＰ分解に関与している酵素であるホスファターゼおよびホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）のプールを含む個別の細胞内マイクロドメインで作用する（非特許文献１３）。上述のカルシウム処理タンパク質（ＬＴＣＣ、ＲｙＲ、ＳＥＲＣＡ）のそれぞれが、個別に調節され、特定の機能転帰につながる独自のｃＡＭＰマイクロドメインを形成する（非特許文献１４、１５）。同様に、核ＰＫＡは、病理学的肥大に関係する別の局所を形成し（非特許文献１６）、一方、例えばＰＤＥ２によって制御される別のいくつかのマイクロドメインは、病理学的リモデリングから心臓を保護することが示されている（非特許文献１７）。加えて、近年、ＣＭに２種類のＬＴＣＣ群が特定された。１つはカベオラ膜ドメインに存在し、肥大促進作用と関連しており、もう１つは、カベオラ膜ドメイン以外で見られ、心筋収縮力の調節に関係している（非特許文献１８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｏｓｔｅｒｄ，Ａ．，Ｃｏｓｔ，Ｂ．，Ｈｏｅｓ，Ａ．Ｗ．，ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎｅ，Ｍ．Ｃ．，Ｄｅｃｋｅｒｓ，Ｊ．Ｗ．，Ｈｏｆｍａｎ，Ａ．，＆Ｇｒｏｂｂｅｅ，Ｄ．Ｅ．２００１．Ｔｈｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ  Ｓｔｕｄｙ．Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ，２２，１３１８−１３２７
【非特許文献２】Ｒｏｇｅｒ，Ｖ．Ｌ．２０１３．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ，１１３，６４６−６５９
【非特許文献３】Ｅｓｃｈｅｎｈａｇｅｎ，Ｔ．２００８．Ｂｅｔａ−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ−ａｄａｐｔ  ｏｒ  ｄｉｅ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ，１４，４８５−４８７
【非特許文献４】Ｐｏｎｉｋｏｗｓｋｉ，Ｐ．，Ｖｏｏｒｓ，Ａ．Ａ．，Ａｎｋｅｒ，Ｓ．Ｄ．，Ｂｕｅｎｏ，Ｈ．，Ｃｌｅｌａｎｄ，Ｊ．Ｇ．，Ｃｏａｔｓ，Ａ．Ｊ．，Ｆａｌｋ，Ｖ．，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｊｕａｎａｔｅｙ，Ｊ．Ｒ．，Ｈａｒｊｏｌａ，Ｖ．Ｐ．，Ｊａｎｋｏｗｓｋａ，Ｅ．Ａ．，Ｊｅｓｓｕｐ，Ｍ．，Ｌｉｎｄｅ，Ｃ．，Ｎｉｈｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐ．，Ｐａｒｉｓｓｉｓ，Ｊ．Ｔ．，Ｐｉｅｓｋｅ，Ｂ．，Ｒｉｌｅｙ，Ｊ．Ｐ．，Ｒｏｓａｎｏ，Ｇ．Ｍ．，Ｒｕｉｌｏｐｅ，Ｌ．Ｍ．，Ｒｕｓｃｈｉｔｚｋａ，Ｆ．，Ｒｕｔｔｅｎ，Ｆ．Ｈ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒ，Ｐ．，＆Ａｕｔｈｏｒｓ／Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ，Ｍ．２０１６．２０１６  ＥＳＣ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ：  Ｔｈｅ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ａｎｄ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  （ＥＳＣ）  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌｕｒｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  （ＨＦＡ）  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＳＣ．Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ，３７，２１２９−２２００
【非特許文献５】Ｓｗｅｄｂｅｒｇ，Ｋ．，Ｋｏｍａｊｄａ，Ｍ．，Ｂｏｈｍ，Ｍ．，Ｂｏｒｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｆｏｒｄ，Ｉ．，Ｄｕｂｏｓｔ−Ｂｒａｍａ，Ａ．，Ｌｅｒｅｂｏｕｒｓ，Ｇ．，Ｔａｖａｚｚｉ，Ｌ．，＆Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ，Ｓ．２０１０．Ｉｖａｂｒａｄｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ  （ＳＨＩＦＴ）：  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ，３７６，８７５−８８５
【非特許文献６】ＭｃＭｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｊ．，Ｐａｃｋｅｒ，Ｍ．，Ｄｅｓａｉ，Ａ．Ｓ．，Ｇｏｎｇ，Ｊ．，Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，Ｍ．Ｐ．，Ｒｉｚｋａｌａ，Ａ．Ｒ．，Ｒｏｕｌｅａｕ，Ｊ．Ｌ．，Ｓｈｉ，Ｖ．Ｃ．，Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｓ．Ｄ．，Ｓｗｅｄｂｅｒｇ，Ｋ．，Ｚｉｌｅ，Ｍ．Ｒ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ，Ｐ．−Ｈ．，＆Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ．２０１４．Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−ｎｅｐｒｉｌｙｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｖｅｒｓｕｓ  ｅｎａｌａｐｒｉｌ  ｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３７１，９９３−１００４
【非特許文献７】Ｂｅｒｓ，Ｄ．Ｍ．２００２．Ｃａｒｄｉａｃ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ−ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ，４１５，１９８−２０５
【非特許文献８】Ｌｏｈｓｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｓ．，＆Ｅｓｃｈｅｎｈａｇｅｎ，Ｔ．２００３．Ｗｈａｔ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ？  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ，９３，８９６−９０６
【非特許文献９】Ｄｅ  Ｗｉｎｄｔ，Ｌ．Ｊ．，Ｌｉｍ，Ｈ．Ｗ．，Ｂｕｅｎｏ，Ｏ．Ｆ．，Ｌｉａｎｇ，Ｑ．，Ｄｅｌｌｉｎｇ，Ｕ．，Ｂｒａｚ，Ｊ．Ｃ．，Ｇｌａｓｃｏｃｋ，Ｂ．Ｊ．，Ｋｉｍｂａｌｌ，Ｔ．Ｆ．，ｄｅｌ  Ｍｏｎｔｅ，Ｆ．，Ｈａｊｊａｒ，Ｒ．Ｊ．，＆Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎ，Ｊ．Ｄ．２００１．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，９８，３３２２−３３２７
【非特許文献１０】Ｈａ，Ｃ．Ｈ．，Ｋｉｍ，Ｊ．Ｙ．，Ｚｈａｏ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．，Ｊｈｕｎ，Ｂ．Ｓ．，Ｗｏｎｇ，Ｃ．，＆Ｊｉｎ，Ｚ．Ｇ．２０１０．ＰＫＡ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｓ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  ５  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｉｔｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｏｒｔ，ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１０７，１５４６７−１５４７２
【非特許文献１１】Ｍａｒｋｏｕ，Ｔ．，Ｈａｄｚｏｐｏｕｌｏｕ−Ｃｌａｄａｒａｓ，Ｍ．，＆Ｌａｚｏｕ，Ａ．２００４．Ｐｈｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＥＢ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＭＳＫ１  ａｎｄ  ＰＫＡ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ，３７，１００１−１０１１
【非特許文献１２】Ｗｅｅｋｓ，Ｋ．Ｌ．，＆Ａｖｋｉｒａｎ，Ｍ．２０１５．Ｒｏｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｃｌａｓｓ  ＩＩａ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ．Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，５９３，１７８５−１７９７
【非特許文献１３】Ｐｅｒｅｒａ，Ｒ．Ｋ．，＆Ｎｉｋｏｌａｅｖ，Ｖ．Ｏ．２０１３．Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＡＭＰ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  （Ｏｘｆ），２０７，６５０−６６２
【非特許文献１４】Ｆｒｏｅｓｅ，Ａ．，＆Ｎｉｋｏｌａｅｖ，Ｖ．Ｏ．２０１５．Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｃＡＭＰ  ｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｆｒｏｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，６，１７２
【非特許文献１５】Ｌｏｍｐｒｅ，Ａ．Ｍ．，Ｈａｊｊａｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｓ．Ｅ．，Ｋｒａｎｉａｓ，Ｅ．Ｇ．，Ｌｏｈｓｅ，Ｍ．Ｊ．，＆Ｍａｒｋｓ，Ａ．Ｒ．２０１０．Ｃａ２＋  ｃｙｃｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１２１，８２２−８３０
【非特許文献１６】Ｈａｊ  Ｓｌｉｍａｎｅ，Ｚ．，Ｂｅｄｉｏｕｎｅ，Ｉ．，Ｌｅｃｈｅｎｅ，Ｐ．，Ｖａｒｉｎ，Ａ．，Ｌｅｆｅｂｖｒｅ，Ｆ．，Ｍａｔｅｏ，Ｐ．，Ｄｏｍｅｒｇｕｅ−Ｄｕｐｏｎｔ，Ｖ．，Ｄｅｗｅｎｔｅｒ，Ｍ．，Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｗ．，Ｃｏｎｔｉ，Ｍ．，Ｅｌ−Ａｒｍｏｕｃｈｅ，Ａ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，Ｆｉｓｃｈｍｅｉｓｔｅｒ，Ｒ．，＆Ｖａｎｄｅｃａｓｔｅｅｌｅ，Ｇ．２０１４．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅｓ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ，１０２，９７−１０６
【非特許文献１７】Ｚｏｃｃａｒａｔｏ，Ａ．，Ｓｕｒｄｏ，Ｎ．Ｃ．，Ａｒｏｎｓｅｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｆｉｅｌｄｓ，Ｌ．Ａ．，Ｍａｎｃｕｓｏ，Ｌ．，Ｄｏｄｏｎｉ，Ｇ．，Ｓｔａｎｇｈｅｒｌｉｎ，Ａ．，Ｌｉｖｉｅ，Ｃ．，Ｊｉａｎｇ，Ｈ．，Ｓｉｎ，Ｙ．Ｙ．，Ｇｅｓｅｌｌｃｈｅｎ，Ｆ．，Ｔｅｒｒｉｎ，Ａ．，Ｂａｉｌｌｉｅ，Ｇ．Ｓ．，Ｎｉｃｋｌｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｇｒａｈａｍ，Ｄ．，Ｓｚａｂｏ−Ｆｒｅｓｎａｉｓ，Ｎ．，Ｋｒａｌｌ，Ｊ．，Ｖａｎｄｅｐｕｔ，Ｆ．，Ｍｏｖｓｅｓｉａｎ，Ｍ．，Ｆｕｒｌａｎ，Ｌ．，Ｃｏｒｓｅｔｔｉ，Ｖ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｇ．，Ｌｅｆｋｉｍｍｉａｔｉｓ，Ｋ．，Ｓｊａａｓｔａｄ，Ｉ．，＆Ｚａｃｃｏｌｏ，Ｍ．２０１５．Ｃａｒｄｉａｃ  Ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  Ｉｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ａ  Ｌｏｃａｌ  Ｐｏｏｌ  ｏｆ  ｃＡＭＰ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ  ２．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ，１１７，７０７−７１９
【非特許文献１８】Ｍａｋａｒｅｗｉｃｈ，Ｃ．Ａ．，Ｃｏｒｒｅｌｌ，Ｒ．Ｎ．，Ｇａｏ，Ｈ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，Ｙａｎｇ，Ｂ．，Ｂｅｒｒｅｔｔａ，Ｒ．Ｍ．，Ｒｉｚｚｏ，Ｖ．，Ｍｏｌｋｅｎｔｉｎ，Ｊ．Ｄ．，＆Ｈｏｕｓｅｒ，Ｓ．Ｒ．２０１２．Ａ  ｃａｖｅｏｌａｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｌ−ｔｙｐｅ  Ｃａ（２）＋  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｃａｒｄｉａｃ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ，１１０，６６９−６７４
【非特許文献１９】Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９０）、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６，８１８−８２２；  Ｇｏｐｉｎａｔｈ（２００７）、Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ３８７，１７１−１８２，ＷＯ  ９１／１９８１３
【非特許文献２０】Ｐａｒｆｅｎｏｖ，Ａ．Ｓ．，Ｓａｌｎｉｋｏｖ，Ｖ．，Ｌｅｄｅｒｅｒ，Ｗ．Ｊ．，＆Ｌｕｋｙａｎｅｎｋｏ，Ｖ．２００６，Ａｑｕｅｏｕｓ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｓ  ａ  ｐａｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ，９０，１１０７−１１１９
【非特許文献２１】Ｍｉｒａｇｏｌｉ，Ｍ．，Ｎｏｖａｋ，Ｐ．，Ｒｕｅｎｒａｒｏｅｎｇｓａｋ，Ｐ．，Ｓｈｅｖｃｈｕｋ，Ａ．Ｉ．，Ｋｏｒｃｈｅｖ，Ｙ．Ｅ．，Ｌａｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｔｅｔｌｅｙ，Ｔ．Ｄ．，＆Ｇｏｒｅｌｉｋ，Ｊ．２０１３．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｔｉｓｓｕｅ：  ａ  ｎｅｗ  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉａｃ  ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ？  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  （Ｌｏｎｄ），８，７２５−７３７
【非特許文献２２】Ｎｏｖａｋ，Ｐ．，Ｓｈｅｖｃｈｕｋ，Ａ．，Ｒｕｅｎｒａｒｏｅｎｇｓａｋ，Ｐ．，Ｍｉｒａｇｏｌｉ，Ｍ．，Ｔｈｏｒｌｅｙ，Ａ．Ｊ．，Ｋｌｅｎｅｒｍａｎ，Ｄ．，Ｌａｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｔｅｔｌｅｙ，Ｔ．Ｄ．，Ｇｏｒｅｌｉｋ，Ｊ．，＆Ｋｏｒｃｈｅｖ，Ｙ．Ｅ．２０１４，Ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆａｓｔ  ｉｏｎ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ，１４，１２０２−１２０７
【非特許文献２３】Ｂｅｒｌｏｔ，Ｃ．Ｈ．２００２，Ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｌｐｈａ  ｓ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ａｆｆｅｃｔ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｇｓ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７７，２１０８０−２１０８５
【非特許文献２４】Ｌｅｆｋｉｍｍｉａｔｉｓ，Ｋ．，Ｍｏｙｅｒ，Ｍ．Ｐ．，Ｃｕｒｃｉ，Ｓ．，＆Ｈｏｆｅｒ，Ａ．Ｍ．（２００９）．”ｃＡＭＰ  ｓｐｏｎｇｅ”：  ａ  ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ｃｙｃｌｉｃ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ３‘，５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，４，ｅ７６４９
【非特許文献２５】Ｇａｒｃｉａｒｅｎａ  ＣＤ，Ｍａ  Ｙ，Ｓｗｉｅｔａｃｈ  Ｐ，Ｈｕｃ  Ｌ，Ｖａｕｇｈａｎ−Ｊｏｎｅｓ  ＲＤ．Ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ  ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎａ+／Ｈ+  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ａｎｄ  Ｎａ+−ＨＣＯ3-  ｃｏ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｓｐａｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ  ｉｎ  ｒａｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．２０１３；５９１（Ｐｔ  ９）：２２８７−２３０６．ｄｏｉ：１０．１１１３／ｊｐｈｙｓｉｏｌ．２０１２．２４９６６４
【非特許文献２６】Ｎｉｋｏｌａｅｖ，Ｖ．Ｏ．，Ｍｏｓｈｋｏｖ，Ａ．，Ｌｙｏｎ，Ａ．Ｒ．，Ｍｉｒａｇｏｌｉ，Ｍ．，Ｎｏｖａｋ，Ｐ．，Ｐａｕｒ，Ｈ．，Ｌｏｈｓｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｋｏｒｃｈｅｖ，Ｙ．Ｅ．，Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｓ．Ｅ．，＆Ｇｏｒｅｌｉｋ，Ｊ．２０１０．Ｂｅｔａ２−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｃＡＭＰ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２７，１６５３−１６５７
【非特許文献２７】Ｎｉｋｏｌａｅｖ，Ｖ．Ｏ．，Ｂｕｎｅｍａｎｎ，Ｍ．，Ｈｅｉｎ，Ｌ．，Ｈａｎｎａｗａｃｋｅｒ，Ａ．，＆Ｌｏｈｓｅ，Ｍ．Ｊ．２００４．Ｎｏｖｅｌ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｃＡＭＰ  ｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７９，３７２１５−３７２１８
【非特許文献２８】Ｎｉｋｏｌａｅｖ，Ｖ．Ｏ．，Ｂｕｅｎｅｍａｎｎ，Ｍ．，Ｓｃｈｍｉｔｔｅｃｋｅｒｔ，Ｅ．，Ｌｏｈｓｅ，Ｍ．Ｊ．，＆Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ，Ｓ．２００６．Ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｆａｒ−ｒｅａｃｈｉｎｇ  ｂｅｔａ１−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｂｕｔ  ｌｏｃａｌｌｙ  ｃｏｎｆｉｎｅｄ  ｂｅｔａ２−ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ，９９，１０８４−１０９１
【非特許文献２９】Ｃａｌｅｂｉｒｏ，Ｄ．，Ｎｉｋｏｌａｅｖ，Ｖ．Ｏ．，Ｇａｇｌｉａｎｉ，Ｍ．Ｃ．，ｄｅ  Ｆｉｌｉｐｐｉｓ，Ｔ．，Ｄｅｅｓ，Ｃ．，Ｔａｃｃｈｅｔｔｉ，Ｃ．，Ｐｅｒｓａｎｉ，Ｌ．，＆Ｌｏｈｓｅ，Ｍ．Ｊ．２００９．Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ｃＡＭＰ−ｓｉｇｎａｌｓ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ，７，ｅ１０００１７２
【非特許文献３０】Ｐｅｒｅｒａ，Ｒ．Ｋ．，Ｓｐｒｅｎｇｅｒ，Ｊ．Ｕ．，Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｈｕｂｓｃｈｅｒ，Ｄ．，Ｌｅｈｎａｒｔ，Ｓ．Ｅ．，Ａｂｅｓｓｅｒ，Ｍ．，Ｓｃｈｕｈ，Ｋ．，Ｅｌ−Ａｒｍｏｕｃｈｅ，Ａ．，＆Ｎｉｋｏｌａｅｖ，Ｖ．Ｏ．２０１５．Ｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎ  ｓｗｉｔｃｈ  ｏｆ  ｃＧＭＰ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ＡＮＰ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ａｄｒｅｎｏｃｅｐｔｏｒ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｃａｒｄｉａｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ．Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ，１１６，１３０４−１３１１
【非特許文献３１】Ｓｐｒｅｎｇｅｒ，Ｊ．Ｕ．，Ｐｅｒｅｒａ，Ｒ．Ｋ．，Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒ，Ｊ．Ｈ．，Ｌｅｈｎａｒｔ，Ｓ．Ｅ．，Ｍａｉｅｒ，Ｌ．Ｓ．，Ｈａｓｅｎｆｕｓｓ，Ｇ．，＆Ｎｉｋｏｌａｅｖ，Ｖ．Ｏ．２０１５．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｏｄｅｌ  ｗｉｔｈ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃＡＭＰ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ，６，６９６５
【非特許文献３２】Ｌｉｎ，Ｃ．Ａ．，Ｓｐｅｒｌｉｎｇ，Ｒ．Ａ．；  Ｌｉ，Ｊ．Ｋ．；  Ｙａｎｇ，Ｔ．Ｙ．；  Ｌｉ，Ｐ．Ｙ．；  Ｚａｎｅｌｌａ，Ｍ．；  Ｃｈａｎｇ，Ｗ．Ｈ．；  Ｐａｒａｋ，Ｗ．Ｊ．，Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｆｏｒ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃｏａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｓｍａｌｌ  ２００８，４，３３４−３４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、循環器疾患、特に慢性心不全を治療する新たな治療方法を、とりわけ、病理学的肥大のシグナル伝達を阻害または最小限に抑えると同時に、心筋収縮力をほとんど損なわずに保つ、より特異的なβ1−ＡＲ／ｃＡＭＰマイクロドメインに基づく治療という観点で提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このために、本発明は、循環器疾患、特に慢性心不全を治療する手段であって、心筋細胞頂部上のβ1アドレナリン受容体の活性化によってｃＡＭＰを産生するβ1−ＡＲ／ｃＡＭＰ経路の構成要素を特異的に阻害する、またはその阻害を引き起こす手段を提供する。
【０００８】
驚いたことに、心筋細胞（ＣＭ）のβ1−ＡＲ群には少なくとも２種類あることがわかっている。１つは膜頂部に位置し、肥大に関連したｃＡＭＰプールを強く刺激し、もう１つはＴ管に見られ、主にＣＭ収縮力の調節に関係している。現在行われているβ遮断薬を用いたβ1−ＡＲ／ｃＡＭＰシグナル伝達の全体的な阻害は、肥大促進シグナル伝達を抑制する（所望の作用）だけでなく、あまり容認できない収縮力の低下や、その他の心臓保護機構の阻害をもたらす。そのため本発明は、特定の細胞内マイクロドメインにおける疾患促進β1−ＡＲプール、またはこれらの疾患促進β1−ＡＲプールに関連するｃＡＭＰシグナル伝達を特異的に標的とすることによって、哺乳類、好ましくはヒトの循環器疾患、特に慢性心不全、冠動脈疾患、および心不整脈を治療する新しい手段を提供する。本発明は、より具体的には、マイナスの疾患促進作用、例えば肥大作用と関連するβ1−ＡＲの個別の機能的プールを選択的に阻害しながらも、心筋収縮力に対するプラスのβ1−ＡＲ作用をほとんど損なわずに保つことによって、標的を定めた心機能不全治療を実現する。したがって本発明は、マイクロドメイン特異的β1−ＡＲシグナル伝達機構を特異的に標的とする手段、例えば、病理に関連した個別の膜構造で作用する特異的なβ遮断薬、疾患促進マイクロドメインで受容体依存性Ｇｓタンパク質シグナル伝達を阻害する手段、または、局所の有害なセカンドメッセンジャー（ｃＡＭＰ）シグナルを遮断する手段を提供する。
【０００９】
「β1−ＡＲ」または「ベータ1−ＡＲ」という用語はベータ１アドレナリン受容体を指し、β1アドレナリン受容体、β1アドレナリン受容体、またはＡＤＲＢ１とも呼ばれる。β1−ＡＲは、Ｇｓヘテロ三量体Ｇタンパク質と関連するＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）であり、カテコラミンによるアデニル酸シクラーゼの活性化を媒介する。膜結合性で、主に心臓組織で発現する。β1−ＡＲの天然リガンドはエピネフリン（アドレナリン）およびノルエピネフリン（ノルアドレナリン）である。
【００１０】
本明細書で使用する「β1−ＡＲ／ｃＡＭＰ経路」または「β1−ＡＲ／ｃＡＭＰシグナル伝達」という用語は、リガンドとβ1−ＡＲの結合によるβ1−ＡＲの活性化、および活性化したβ1−ＡＲによって始動されるアデニル酸シクラーゼによるセカンドメッセンジャーｃＡＭＰのＧタンパク質媒介性形成を含む経路に関する。この経路の構成要素には、β1アドレナリン受容体、受容体と結合したＧｓタンパク質、およびＧｓタンパク質よって活性化されるアデニル酸シクラーゼ（アデニリルシクラーゼ、ＥＣ  ４．６．１．１）ＩＩＩを含む。
【００１１】
「頂部β1−ＡＲ／ｃＡＭＰ経路」または「頂部β１−ＡＲ／ｃＡＭＰシグナル伝達」という用語は、細胞頂部に位置するβ1−ＡＲの活性化によって誘発されるｃＡＭＰ産生を指すのに用いられることがあり、「Ｔ管β1−ＡＲ／ｃＡＭＰ経路」または「Ｔ管β1−ＡＲ／ｃＡＭＰシグナル伝達」という用語は、Ｔ管におけるβ1−ＡＲの活性化によって誘発されるｃＡＭＰ産生を指すのに用いられることがある。
【００１２】
「心筋細胞頂部上のβ1アドレナリン受容体の活性化によってｃＡＭＰを産生するβ1−ＡＲ／ｃＡＭＰ経路の構成要素を特異的に阻害する、またはその阻害を引き起こす手段」という用語は、心筋細胞の細胞頂部（頂部β1−ＡＲ／ｃＡＭＰ経路）上のβ1アドレナリン受容体の活性化によってｃＡＭＰ形成に至るβ1−ＡＲ／ｃＡＭＰ経路の構成要素の少なくとも１つを、完全にではないにせよ、少なくとも大幅に阻害する、またはその阻害を引き起こす化合物、化合物の組成物、または遺伝子構築物に関する。それぞれのβ1−ＡＲを遮断する、すなわちリガンド結合によるβ1−ＡＲの活性化を妨げるβ遮断薬は、そうした手段の一例である。用語には、このような手段、例えばβ遮断薬を輸送する、これと共有結合している、またはこれでコーティングされている担体、例えばナノ粒子も含む。特に、本明細書における「特異的に阻害する」は、本発明の手段が存在する場合に、頂部β1−ＡＲ／ｃＡＭＰ経路によって産生されるｃＡＭＰの量が、阻害されていない経路と比較して、少なくとも５０％、好ましくは６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、また特に好ましくは少なくとも９５％減少し、Ｔ管β1−ＡＲ／ｃＡＭＰ経路によって産生されるｃＡＭＰの量が、同時に、手段が存在しない場合のレベルに対し、好ましくは実質的に未変化である、または６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは９５％以上のレベルにとどまっていることを意味する。本発明の手段に関連する「でコーティングされている」という用語は、本発明の手段、例えばβ遮断薬がコーティングからまったく、または少なくとも実質的に放出されないように固定化された形態で、本発明の手段を含む化合物または組成物の少なくとも１つの層が担体の表面にあることを意味する。
【００１３】
「β遮断薬」または「βブロッカー」という用語は、βアドレナリン受容体、例えばβ１アドレナリン受容体に結合し、これを遮断する化合物に関する。したがってこの用語は、βアドレナリン受容体の拮抗薬または逆作動薬を指す。β1−ＡＲに対して選択性のある既知のβ遮断薬の例に、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、エスモロール、メトプロロール、およびネビボロールがある。β1−ＡＲおよびβ2−ＡＲを遮断する非特異的なβ遮断薬の例に、プロプラノロール、ピンドロール、およびカルベジロールがある。
【００１４】
「循環器疾患」（ＣＶＤ）という用語は、例えば冠動脈疾患、心不整脈、および心不全（ＨＦ）などの心臓および血管の障害の分類に関し、「慢性心不全」または「うっ血性心不全」（ＣＨＦ）とも呼ばれる。
【００１５】
「Ｔ管」という用語は、骨格筋細胞および心筋細胞の中心に入り込んでいる筋鞘（筋細胞膜）の陥入部に関する。
【００１６】
「心筋細胞の細胞頂部」、「細胞頂部」、または「頂部」という用語は、陥入の部分でない、具体的にはＴ管の部分でない、心筋細胞の筋鞘の外部領域、すなわち心筋細胞膜の領域に関する。
【００１７】
「ＦＲＥＴ」（「フェルスター共鳴エネルギー移動」または「蛍光共鳴エネルギー移動」の略称）という用語は、非放射性の双極子−双極子相互作用による２個の発色団間のエネルギー移動、すなわちドナー発色団からアクセプター発色団へのエネルギー移動に関する。
【００１８】
「走査型イオン伝導顕微鏡」（ＳＩＣＭ）という用語は、ガラス製のナノピペット（例えば直径約３０〜５０ｎｍ、抵抗値約１００ＭΩ）を、生細胞の膜トポグラフィーを接触せずに正確に視覚化するため、ならびに単一のＴ管および細胞頂部といった明確に定められる膜構造物上の薬理学的リガンドに適用するための走査型プローブとして用いる非光学イメージング技術に関する。
【００１９】
第１の態様において、本発明は、循環器疾患、特に慢性心不全を治療する手段であって、心筋細胞頂部上のβ1アドレナリン受容体の活性化によってｃＡＭＰを産生するβ1−ＡＲ／ｃＡＭＰ経路の構成要素を特異的に阻害する、またはその阻害を引き起こす手段を提供する。
【００２０】
好ましい実施形態において、本発明の手段は心筋細胞頂部上のβ1アドレナリン受容体を特異的に遮断するβ遮断薬である。
【００２１】
さらに好ましい実施形態において、本発明の手段は、心筋細胞頂部上のβ1アドレナリン受容体と特異的に結合し、これを遮断する結合分子である。この結合分子は、例えば、心筋細胞頂部上のβ1アドレナリン受容体と特異的に結合し、これを遮断する抗体、好ましくはモノクローナル抗体、またはアプタマーであり得る。アプタマーは、標的分子、例えばβ1アドレナリン受容体のようなタンパク質と結合する特異性の高い抗体様の機能を有する短い合成一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドである。抗体と比べて、アプタマーは免疫原性が低く、特異性と親和性が高く、化学的に安定している。アプタマーは、例えば、ＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進展）と呼ばれる方法によって選択することができる（非特許文献１９）。
【００２２】
本発明の手段は、結合分子の複合体、例えば抗体の複合体、すなわち、同じ、または異なる結合分子、例えば抗体が複数存在する複合体であってもよい。好ましくは、この複合体はＴ管に入らないほど大きい。そのような複合体は、例えば５〜１０個の抗体からなり、頂部で作用するがＴ管には入らない。
【００２３】
さらに好ましい実施形態において、本発明の手段は、Ｔ管への侵入が排除される適切な大きさを有する担体、例えばナノ粒子であり、例えば１１ｎｍを超える直径を有する金またはプラスチックのナノ粒子であり、かつβ1アドレナリン受容体を特異的に遮断する、好ましくは心筋細胞頂部上のβ1アドレナリン受容体を特異的に遮断するβ遮断薬または結合分子でコーティングされている、これを輸送する、またはこれと共有結合している。ナノ粒子、例えばプラスチックまたは金のナノ粒子のような機能性担体は、とりわけ直径を考慮し、サイズが原因でＴ管に入らないように設計または選択することができるため、本発明の状況に特に適している。したがって、適切なサイズのナノ粒子は約２００ｎｍの大きさの開口部を通ってＴ管に入ることはないため、頂部の外膜に位置する受容体を特異的に遮断することが可能となる。適切なナノ粒子は、例えば、β遮断薬でコーティングされたシェルを有する金またはプラスチックのナノ粒子である。ナノ粒子の機能化には、プロプラノロールのような非選択的なβ遮断薬も使用できよう。１１ｎｍを超えるサイズの金ナノ粒子は、ＣＭのＴ管系に侵入できないため（非特許文献２０）、頂部に位置する受容体にのみ作用することが示されている。金ナノ粒子または非荷電合成ナノ粒子は、例えば正または負に荷電した合成のカルボキシル変性ポリスチレンラテックスナノ粒子と比較して、不活性度がはるかに高く、エンドサイトーシスの速度が遅いため有利である。正に帯電したカルボキシル変性ポリスチレンラテックスナノ粒子は細胞傷害性であり、ＣＭ膜の完全性を破壊することが示されている一方で、負に帯電したナノ粒子はその電荷によりナノポア形成と不整脈を誘発することがある（非特許文献２１）。ＣＭ膜に損傷を与えず、例えばβ1−ＡＲ選択的遮断薬と共有結合している、またはこれでコーティングされている（例えば約２００ｎｍの）カルボキシル変性粒子（非特許文献２２）など、他の種類の機能化ナノ粒子も使用できる。ナノ粒子は、抗体またはアプタマーのような結合分子を用いて機能化もし得る。
【００２４】
別法として、ドミナントネガティブなＧｓタンパク質（非特許文献２３）またはｃＡＭＰ「スポンジ」（非特許文献２４）など、細胞頂部に局在するよう設計された、遺伝子的にコードされたβ1−ＡＲ／ｃＡＭＰ経路阻害剤も使用できる。これらの手段は、細胞頂部に局在するβ1−ＡＲによるｃＡＭＰ産生を特異的に阻害する、またはこの経路によって生成される大量のｃＡＭＰを減らすことができる。
【００２５】
さらに、本発明の手段は、Ｔ管と比較した細胞頂部のｐＨの違いにより、頂部のβ1−ＡＲに特異的に、または少なくとも優先的に作用するｐＨ依存性β遮断薬であり得る。Ｔ管と外側の膜（細胞頂部）におけるｐＨ調整イオン輸送体の発現が異なることにより、両方の場所で異なるｐＨ勾配が形成されることが示されている（非特許文献２５）。したがって、Ｔ管のｐＨで低活性を示す、または活性を示さないように設計されたβ遮断薬も、本発明の手段として想定される。「ｐＨ依存性β遮断薬」という用語は、遮断活性がｐＨに依存するβ遮断薬に関する。
【００２６】
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様の少なくとも１つの手段を含む薬剤に関する。この薬剤は、好ましくは適切な賦形剤およびアジュバントをさらに含む。そのような賦形剤およびアジュバントは、当業者に既知である。
【００２７】
さらに別の態様において、本発明は循環器疾患、特に慢性心不全の治療的処置の方法に関し、そうした治療を必要とする患者への、本発明の第１の態様に従った手段、または本発明の第２の態様に従った薬剤の治療効果のある量の投与を含む。
【００２８】
以下、例示のみを目的として、本発明をより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】Ｔ管、および頂部β1−ＡＲ（大きな黒丸）を有する筋鞘の頂部領域、およびＴ管のβ1−ＡＲ（大きな白丸）、およびＩＩ型プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ  ＩＩ）を有するＳＲ（筋小胞体）の一部、および４型ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ４）を示す心筋細胞（ＣＭ）の一部を簡略化した概略断面図である。
【図２Ａ】ｃＡＭＰ用ＦＲＥＴバイオセンサーを組み合わせた走査型イオン伝導顕微鏡（ＳＩＣＭ）の原理。この技術では、Ｔ管と細胞頂部といった異なるＣＭ膜構造におけるβ−ＡＲ群の局在化および正確な局所刺激のために、ナノピペット（サイズ約５０ｎｍ）を含むリガンドを使用する。
【図２Ｂ】ｃＡＭＰ用ＦＲＥＴバイオセンサーを組み合わせた走査型イオン伝導顕微鏡（ＳＩＣＭ）原理。受容体誘発性ｃＡＭＰシグナルは、細胞質ＦＲＥＴベースのバイオセンサーによって細胞内で検出される。
【図２Ｃ】ｃＡＭＰ用ＦＲＥＴバイオセンサーを組み合わせた走査型イオン伝導顕微鏡（ＳＩＣＭ）原理。この技術では、β1−ＡＲがＴ管と頂部の両方に位置すること、および両方の受容体プールが細胞質ｃＡＭＰ合成を同程度に活性化することが示された。ＩＳＯはβ−ＡＲ作動薬であるイソプロテレノール。ＩＣＩはβ2−ＡＲ遮断薬であるＩＣＩ  １１８，５５１で、ＳＩＣＭピペットを用いて印のある場所（白い矢印）に局所的に投与される。
【図３Ａ】ＳＩＣＭ／ＦＲＥＴから明らかとなった２つの異なるβ1−ＡＲ群。核局在化Ｅｐａｃ１−ＮＬＳセンサーを発現するラットの心室ＣＭは、頂部の受容体プールによって刺激された方が、Ｔ管によるものよりも強いβ1−ＡＲ／ｃＡＭＰ応答を示す。
【図３Ｂ】ＳＩＣＭ／ＦＲＥＴから明らかとなった２つの異なるβ1−ＡＲ群。核局在化Ｅｐａｃ１−ＮＬＳセンサーを発現するラットの心室ＣＭは、頂部の受容体プールによって刺激された方が、Ｔ管によるものよりも強いβ1−ＡＲ／ｃＡＭＰ応答を示す。
【図３Ｃ】ＳＩＣＭ／ＦＲＥＴから明らかとなった２つの異なるβ1−ＡＲ群。核局在化Ｅｐａｃ１−ＮＬＳセンサーを発現するラットの心室ＣＭは、頂部の受容体プールによって刺激された方が、Ｔ管によるものよりも強いβ1−ＡＲ／ｃＡＭＰ応答を示す。
【図３Ｄ】ＳＩＣＭ／ＦＲＥＴから明らかとなった２つの異なるβ1−ＡＲ群。核ＰＫＡ活性レポーターＡＫＡＲ３−ＮＬＳを発現している同じ細胞は、Ｔ管で刺激された受容体と比べて、頂部に位置するβ1−ＡＲによって誘導された方がはるかに強い核ＰＫＡ活性を示す。
【図３Ｅ】ＳＩＣＭ／ＦＲＥＴから明らかとなった２つの異なるβ1−ＡＲ群。核ＰＫＡ活性レポーターＡＫＡＲ３−ＮＬＳを発現している同じ細胞は、Ｔ管で刺激された受容体と比べて、頂部に位置するβ1−ＡＲによって誘導された方がはるかに強い核ＰＫＡ活性を示す。
【図３Ｆ】ＳＩＣＭ／ＦＲＥＴから明らかとなった２つの異なるβ1−ＡＲ群。核ＰＫＡ活性レポーターＡＫＡＲ３−ＮＬＳを発現している同じ細胞は、Ｔ管で刺激された受容体と比べて、頂部に位置するβ1−ＡＲによって誘導された方がはるかに強い核ＰＫＡ活性を示す。
【図４】Ｔ管または細胞頂部にβ1−ＡＲ刺激（ＩＳＯ＋ＩＣＩ）を与えた際に、カルシウムトランジェントの振幅として測定された心筋細胞の収縮力反応。カルシウムトランジェントはＴ管のβ1−ＡＲによってはるかに強く刺激され、この受容体プールが細胞収縮力の調節により強く関与していることを示唆している。
【図５Ａ】心筋梗塞の１６週間後の慢性心不全モデルのラットから単離した不全の心室心筋細胞における核ＰＫＡ活性の測定値。ＳＩＣＭ／ＦＲＥＴ測定は図３Ｄ〜Ｆで説明したように実施した。
【図５Ｂ】大動脈弁置換術を受けた肥大型心筋症の患者から単離した不全の心室心筋細胞における核ＰＫＡ活性の測定値。ＳＩＣＭ／ＦＲＥＴ測定は図３Ｄ〜Ｆで説明したように実施した。
【図６Ａ】アテノロールでコーティングしたナノ粒子（ＮＰ）の薬理学的特徴。アテノロールでコーティングした金ナノ粒子の概略図。
【図６Ｂ】アテノロールでコーティングしたナノ粒子（ＮＰ）の薬理学的特徴。β1−ＡＲおよびｃＡＭＰバイオセンサーＥｐａｃ１−ｃａｍｐｓを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞の実験データ。ＦＲＥＴベースのｃＡＭＰアッセイを使用することで、コーティングされていない対照（対照ＮＰ）ではなく、アテノロールコーティング（アテノロールＮＰ）が、ＩＳＯ誘導によるｃＡＭＰ増加を効果的に阻害することが示された。
【図６Ｃ】アテノロールでコーティングしたナノ粒子（ＮＰ）の薬理学的特徴。β1−ＡＲおよびｃＡＭＰバイオセンサーＥｐａｃ１−ｃａｍｐｓを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞の実験データ。ＦＲＥＴベースのｃＡＭＰアッセイを使用することで、コーティングされていない対照（対照ＮＰ）ではなく、アテノロールコーティング（アテノロールＮＰ）が、ＩＳＯ誘導によるｃＡＭＰ増加を効果的に阻害することが示された。
【図７Ａ】アテノロールでコーティングしたナノ粒子（アテノロールＮＰ）および対照ナノ粒子を用いて、新たに単離された成体ラットの心室心筋細胞（ＣＭ）で実施した心筋細胞肥大アッセイの実験データ。アテノロールＮＰは心筋細胞肥大を妨げることができるが、収縮力は阻害しない。
【図７Ｂ】アテノロールでコーティングしたナノ粒子（アテノロールＮＰ）および対照ナノ粒子を用いて、新たに単離された成体ラットの心室心筋細胞（ＣＭ）で実施した細胞収縮力アッセイの実験データ。アテノロールＮＰは心筋細胞肥大を妨げることができるが、収縮力は阻害しない。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
図１は、心筋細胞（ＣＭ）の一部を簡略化した概略断面図である。図１には、筋鞘８が陥入しているＴ管１、およびβ1−ＡＲ  ３（大きな黒丸）を有する筋鞘８の頂部領域２、およびＴ管のβ1−ＡＲ  ４（大きな白丸）、およびＩＩ型プロテインキナーゼＡ  ６（ＰＫＡ  ＩＩ）を有するＳＲ  ５（筋小胞体）の一部、および４型ホスホジエステラーゼ７（ＰＤＥ４）を示す。
【００３１】
機能性β−ＡＲの局在性を調べるために、走査型イオン伝導顕微鏡（ＳＩＣＭ）とＦＲＥＴベースの細胞内ｃＡＭＰ記録を組み合わせて（ＳＩＣＭ／ＦＲＥＴ）用いた（非特許文献２６）（図２）。この方法により、生きたＣＭの膜構造および関連するシグナル伝達のイメージングが、ナノメートルの正確さで可能となる。無傷の心筋細胞（ＣＭ）におけるｃＡＭＰのリアルタイム動態は、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づいた高感度バイオセンサーを用いて調べることができる。そのようなセンサーは、一対の蛍光タンパク質に融合した単一の環状ヌクレオチド結合ドメインを含み、ｃＡＭＰ結合時にそのコンフォメーションを変化させ（非特許文献２７）、ＦＲＥＴの減少をもたらす（図２Ｂ）。それらはトランスジェニック動物でＣＭ特異的（非特許文献２８）かつ遍在的に（非特許文献２９）発現せることができ、前例のない時空間解像度で生細胞のｃＡＭＰイメージングが可能となる。興味深いことに、Ｔ管または細胞頂部のβ1−ＡＲが局所的活性化した際にＳＩＣＭ／ＦＲＥＴ実験でそのような細胞質ｃＡＭＰバイオセンサーを用いると、これら２つの受容体プール間の細胞質β1−ＡＲ／ｃＡＭＰ反応に違いが認められなかった（図２Ｃ）。近年、ＬＴＣＣ、ＲｙＲ、およびＳＥＲＣＡなどの主要なカルシウムハンドリングタンパク質（非特許文献３０、３１）の近く、および核を標的としたｃＡＭＰバイオセンサーの局所版がいくつか開発されている。これにより、リアルタイムｃＡＭＰ動態のマイクロドメイン特異的イメージングが可能となった。こうした顕微鏡検査ツールと早期ＨＦのｉｎ  ｖｉｖｏマウスモデルを合わせて用いることで、この病気が、β1−ＡＲ刺激性の心筋収縮力に影響を及ぼすＴ管に関連する異なる膜ドメイン間でいくつかのＰＤＥの再分布をもたらしていることが明らかとなった（非特許文献３０）。また早期ＨＦは、β1−ＡＲとＳＥＲＣＡの直接的なマイクロドメインコミュニケーションに障害を引き起こし（非特許文献３１）、さらに収縮不全をもたらす。
【００３２】
少なくとも２つの異なるβ1−ＡＲ群があり、１つが膜頂部に位置し、肥大に関連したｃＡＭＰプールを強く刺激し、もう１つが主にＣＭ収縮力の調節に関連するＴ管にあるという仮説を検証するために、核標的ｃＡＭＰセンサーＥｐａｃ１−ＮＬＳおよび核標的ＰＫＡ活性レポーターＡＫＡＲ３−ＮＬＳ（非特許文献１６）を用い、ＳＩＣＭ／ＦＲＥＴ実験で、心筋細胞の頂部またはＴ管で局所的なβ1−ＡＲ刺激を行った。これらのセンサーを用いることで、頂部でβ1−ＡＲを刺激すると、Ｔ管で受容体を刺激するよりも、核内のｃＡＭＰ（図３Ａ〜Ｃ）およびＰＫＡ活性（図３Ｄ〜Ｆ）が上昇することが明確に示され、頂部に位置するβ1−ＡＲプールが病理学的ｃＡＭＰシグナル伝達と密接に関連していることが示唆された。それに対し、Ｔ管に局在するβ1−ＡＲの刺激では、細胞頂部の受容体刺激後に測定されるよりもはるかに強い収縮反応が生じた（図４）。
【００３３】
薬物治療候補という観点で適用できるようにするために、２つのβ1−ＡＲプールにかかわる上述の機序が、健康な細胞だけでなく、機能不全の心筋細胞でも有効でなければならない。図５は、機能不全のラット（図５Ａ）と機能不全のヒト（図５Ｂ）の心筋細胞を用いて、図３Ｄ〜Ｆで説明したように実施したＳＩＣＭ／ＦＲＥＴ実験を示す。いずれの症例でも、やはり頂部およびＴ管で刺激した受容体間に明確な差が認められる。これは、疾患によって、いくらかの脱感作（シグナル振幅の減少）は別として、本発明の手段が標的とする治療的に興味深いβ1−ＡＲ／ｃＡＭＰプールが変化しないことを示唆している。
【００３４】
図６および７は、β遮断薬でコーティングしたナノ粒子の実験データを示す。
【００３５】
β遮断薬でコーティングしたナノ粒子を調製するために、アテノロールと共有結合した両親媒性ポリマー、イソブチレン・無水マレイン酸共重合物を用いて１８ｎｍの金ナノ粒子をコーティングした。ポリマー骨格のアルキルアミン鎖は、金ナノ粒子と疎水性相互作用を示すアミノリガンドのドデシルアミンと無水マレイン酸との直接的なアミド化によって化学的に結合していた（非特許文献３２）。第２の反応ステップにおいて、アテノロールはアミノ基および直接アミド化を介してポリマーと共有結合していた（図６Ａ）。化学物質は、通常、無水マレイン酸／ドデシルアミン／アテノロールを２：１：０．５または２：１：２の割合で用いた。合成後、コーティングした粒子を洗浄し、大きさと安定性について特性化し、同時に、洗浄ステップでアテノロールの有無を試験した。
【００３６】
図６Ｂは、ＦＲＥＴベースのｃＡＭＰアッセイを用いて、安定的にβ1−ＡＲを発現するＨＥＫ２９３細胞におけるナノ粒子の薬理学的特徴を示す。βアドレナリン作動薬であるイソプロテレノール（ＩＳＯ、０．１ｎＭ）を添加することで、ＣＦＰ／ＹＦＰ比が上昇し、細胞内ｃＡＭＰの増加が示される。この上昇は、アテノロールでコーティングした３０ｎＭのナノ粒子による前処理（２０分）によって妨げられるが、コーティングしていない対照１８ｎｍ金ナノ粒子では効果がない。これらの実験のデータ解析結果を図６Ｃに示す。アテノロールでコーティングしたナノ粒子は、β1−ＡＲ依存性ｃＡＭＰ合成の遮断において、純粋なβ遮断薬アテノロール（３０ｎＭで使用）とほぼ同じくらい有効である。
【００３７】
β遮断薬でコーティングしたナノ粒子が肥大および細胞収縮力に及ぼす効果を評価するために、成体ラットの心室ＣＭを用いてさらに実験を行った（図７参照）。新たに単離した成体ラットの心室ＣＭを１日間培養し、コーティングしていない１８ｎｍの金ナノ粒子（対照ＮＰ）または共有結合したβ遮断薬アテノロールでコーティングした１８ｎｍ 金ナノ粒子（アテノロールＮＰ）（いずれも３０ｎＭ）と１時間プレインキュベートした。次いで、１０ｎＭイソプロテレノール（ＩＳＯ）と一緒に２４時間刺激し、肥大を誘発した。次いで、１群当たり細胞８０個について細胞表面積を測定した。実験から、アテノロールでコーティングしたナノ粒子が心筋細胞肥大を防ぐことが示された（図７Ａ）。
【００３８】
新たに単離した成体ラットの心室ＣＭを、アテノロール（１００ｎＭ）、アテノロールでコーティングしたナノ粒子、または対照ナノ粒子（いずれも３０ｎＭ）と２０分間インキュベートし、１０ｎＭイソプロテレノールでの刺激ありとなしについて、１Ｈｚのペーシング周波数で、エッジ検出法（ＩｏｎＯｐｔｉｘ）を用いて細胞収縮力を測定した。実験から、アテノロールでコーティングしたナノ粒子は、純粋なアテノロールと対照的に、細胞収縮力を低下させないことが示された（図７Ｂ）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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