(57)【要約】  その末期敗血症ならびに血小板減少症および低グリコーゲン血症などの微生物性炎症に関連する状態を含む、微生物性炎症を処置するための組成物および方法が開示される。一態様では、本明細書で開示される組成物および方法を使用すると、対象において感染組織、臓器、または系からの微生物のクリアランスを増強することも可能である。微生物性炎症に罹った対象において細胞中のストレス応答転写因子および代謝転写因子のレベルを低減するための組成物および方法も本明細書で開示される。
2020524144.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において微生物性炎症を処置する／阻害する／低減する方法であって、治療有効量の抗菌剤、および核内輸送モディファイヤー（ＮＴＭ）を含む組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記ＮＴＭを含む組成物が前記抗菌剤を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＮＴＭを含む組成物が前記抗菌剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物性炎症が、急性炎症、亜急性炎、慢性炎症、臓器特異的炎症、全身性炎症、または敗血症である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＮＴＭが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１６に示される配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物性炎症が、血液、脳、洞、上気道、または肺、心臓、骨髄、脾臓、肝臓、腎臓、尿路、膀胱、耳空洞、胃、腸、皮膚、目、歯、および／または歯肉に局在している、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物性炎症がウイルス感染により引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルス感染が、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、痘瘡ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、麻疹ウイルス、ポリオーマウイルス、ヒトパピローマウイルス、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、デングウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、レオウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ラッサ熱ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレー渓谷熱ウイルス、西ナイルウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルスＡ、ロタウイルスＢ、ロタウイルスＣ、シンドビスウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型、ハンタウイルス、風疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型、およびヒト免疫不全ウイルス２型からなる群から選択されるウイルスによる感染である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物性炎症が細菌感染により引き起こされ、前記細菌感染を引き起こす細菌が炭疽菌（Bacillus anthracis）ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌感染が、結核菌（Mycobaterium tuberculosis）、マイコバクテリウム・ボビス（Mycobaterium bovis）、マイコバクテリウム・ボビス  ＢＣＧ株（Mycobaterium bovis strain BCG）、ＢＣＧ亜株（BCG substrains）、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobaterium avium）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Mycobaterium intracellular）、マイコバクテリウム・アフリカヌム（Mycobaterium africanum）、マイコバクテリウム・カンサシ（Mycobaterium kansasii）、マイコバクテリウム・マリヌム（Mycobaterium marinum）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Mycobaterium ulcerans）、マイコバクテリウム・アビウム亜種パラ結核菌（Mycobaterium avium subspecies paratuberculosis）、ノカルジア・アステロイデス（Nocardia asteroides）、他のノカルジア種（Nocardia species）、在郷軍人病菌（Legionella pneumophila）、他のレジオネラ種（Legionella species）、アシネトバクター・バウマンニ（Acetinobacter baumanii）、チフス菌（Salmonella typhi）、サルモネラ菌（Salmonella enterica）、他のサルモネラ種（Salmonella species）、シゲラ・ボイディ（Shigella boydii）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、ソンネ菌（Shigella sonnei）、シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）、他のシゲラ種（Shigella species）、ペスト菌（Yersinia pestis）、ヘモリチカ菌（Pasteurella haemolytica）、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）、他のパスツレラ種（Pasteurella species）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、リステリア・イバノビイ（Listeria ivanovii）、ウシ流産菌（Brucella abortus）、他のブルセラ種（Brucella species）、コウドリア・ルミナンチウム（Cowdria ruminantium）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、ボルデテラ・アビウム（Bordetella avium）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）、ボルデテラ・トレマツム（Bordetella trematum）、ボルデテラ・ヒンジイ（Bordetella hinzii）、ボルデテラ・プテリ（Bordetella pteri）、ボルデテラ・パラペルツシス（Bordetella parapertussis）、ボルデテラ・アンソルピイ（Bordetella ansorpii）、他のボルデテラ種（Bordetella species）、鼻疽菌（Burkholderia mallei）、類鼻疽菌（Burkholderia psuedomallei）、セパシア菌（Burkholderia cepacian）、クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）、オウム病クラミジア（Chlamydia psittaci）、Ｑ熱コクシエラ（Coxiella burnetii）、リケッチア種（Rickettsial species）、エーリキア種（Ehrlichia species）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）、大腸菌（Escherichia coli）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、カンピロバクター種（Campylobacter species）、髄膜炎菌（Neiserria meningitidis）、淋菌（Neiserria gonorrhea）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、他のシュードモナス種（Pseudomonas species）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、軟性下疳菌（Haemophilus ducreyi）、他のヘモフィルス種（Hemophilus species）、破傷風菌（Clostridium tetani）、他のクロストリジウム種（Clostridium species）、エンテロコルチカ菌（Yersinia enterolitica）、および他のエルシニア種（Yersinia species）からなる群から選択される細菌による感染である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物性炎症が真菌感染により引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記真菌感染が、カンジタ・アルビカンス（Candida albicans）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplama capsulatum）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、ココシジオイデス・イミチス（Coccidiodes immitis）、南アメリカ分芽菌（Paracoccidiodes brasiliensis）、ブラストミセス・デルマチチジス（Blastomyces dermitidis）、ニューモシスシス・カリニ（Pneumocystis carinii）、ペニシリウム・マルネッフェイ（Penicillium marneffi）、およびアルテルナリア・アルテナータ（Alternaria alternata）からなる群から選択される真菌による感染である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記微生物性炎症が寄生虫感染により引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記寄生虫感染が、トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）、他のプラスモディウム種（Plasmodium species）、エントアメーバ・ヒストリチカ（Entamoeba histolytica）、ネグレリア・フォーレリ（Naegleria fowleri）、リノスポリジウム・セーベリ（Rhinosporidium seeberi）、ランブル鞭毛虫（Giardia lamblia）、ぎょう虫（Enterobius vermicularis）、エンテロビウス・グレゴリイ（Enterobius gregorii）、回虫（Ascaris lumbricoides）、ズビニ鉤虫（Ancylostoma duodenale）、アメリカ鉤虫（Necator americanus）、クリプトスポリジウム種（Cryptosporidium spp.）、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）、森林型熱帯リーシュマニア（Leishmania major）、他のリーシュマニア種（Leishmania species）、広節裂頭条虫（Diphyllobothrium latum）、小型条虫（Hymenolepis nana）、縮小条虫（Hymenolepis diminuta）、単包条虫（Echinococcus granulosus）、多包条虫（Echinococcus multilocularis）、フォーゲル包条虫（Echinococcus vogeli）、ヤマネコ条虫（Echinococcus oligarthrus）、肝吸虫（Clonorchis sinensis）;クロノルキス・ビベリニ（Clonorchis viverrini）、肝蛭（Fasciola hepatica）、巨大肝蛭（Fasciola gigantica）、槍形吸虫（Dicrocoelium dendriticum）、肥大吸虫（Fasciolopsis buski）、横川吸虫（Metagonimus yokogawai）、タイ肝吸虫（Opisthorchis viverrini）、ネコ肝吸虫（Opisthorchis felineus）、膣トリコモナス（Trichomonas vaginalis）、アカントアメーバ種（Acanthamoeba species）、インターカラーツム住血吸虫（Schistosoma intercalatum）、ビルハルツ住血吸虫（Schistosoma haematobium）、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）、他のシストソーマ種（Schistosoma species）、トリコビルハルツ住血吸虫（Trichobilharzia regenti）、旋毛虫（Trichinella spiralis）、旋毛虫ブリトビ（Trichinella britovi）、旋毛虫ネルソニ（Trichinella nelsoni）、旋毛虫ナティバ（Trichinella nativa）、およびエントアメーバ・ヒストリチカ（Entamoeba histolytica）からなる群から選択される寄生虫による感染である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
血液、脳、洞、上気道、または肺、心臓、骨髄、脾臓、肝臓、腎臓、尿生殖器官、膀胱、耳空洞、胃、腸、皮膚、目、歯、または歯肉において微生物負荷を低減する方法であって、ＮＴＭを含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項１６】
対象において血小板減少症に関連する微生物性炎症を処置する／阻害する／低減する方法であって、ＮＴＭを含む治療有効量の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項１７】
感染を有する対象の炎症部位の細胞において、ストレス応答転写因子（ＳＲＴＦ）のレベルを低減する方法であって、核内輸送モディファイヤー（ＮＴＭ）を含む治療有効量の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項１８】
前記ＮＴＭが配列番号２を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＳＲＴＦが、ＮＦ−κＢ、ＳＴＡＴ１α、またはＡＰ−１を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＮＦ−κＢが、ＮＦ−κＢ１、ＮＦ−κＢ  ＲｅｌＡまたはそれらの組合せである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）が、微生物性炎症に関与する細胞の核中で低減される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、顆粒球、単球、マクロファージ、樹状細胞、自然リンパ球系細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、内皮細胞または上皮細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
対象において抗菌剤の治療効果を増加させる方法であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１６に示される配列を含むＮＴＭを前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２４】
対象において微生物性炎症関連低グリコーゲン血症を低減する／阻害する／予防する方法であって、ＮＴＭを前記対象に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物性炎症を処置するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物性炎症（microbial inflammation）は、細菌、ウイルス、真菌または原生動物病原体に起因する全身性または限局性感染症（localized infection）の機序である。これらの感染症の一部の末期は、微小循環に可逆的または不可逆的損傷を与え多臓器不全（organ failure）の原因となる血管内または血管外感染症に応答した重症内皮機能損傷症候群（severe endothelial dysfunction syndrome）と定義される敗血症である。敗血症は現代の病院において予防し処置するべきもっとも困難な問題の１つを表す。重度の血管内または血管外感染症は、ついには、低血圧の根底にあり抗菌療法および対症療法を開始しているにもかかわらず逆転させるのが困難な重症微小血管内皮損傷（severe microvascular endothelial injury）となる。自然および適応免疫系により開始される防御を回避する微生物病原体は、特定の病原菌指向抗菌療法（pathogen-directed antimicrobial therapy）により完全には制御されず、この療法は遅延する場合が多い。微生物病原体の制御されない増殖中、特に血管外部位では、細菌はクオラムセンシングメカニズム（quorum sensing mechanism）を通じてそのゲノムを再プログラムし、微小血管損傷を強める複数の病原性因子を産生する。宿主の自然免疫応答は、免疫細胞ならびに非免疫内皮、線維芽細胞および上皮細胞に存在するパターン認識受容体、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体を通じて、細菌および真菌病原性因子ならびにウイルス核酸により開始され乱される。これらの受容体が生み出すシグナルは、核内因子カッパＢ（ＮＦ−κＢ）、アクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）、活性化されたＴ細胞の核内因子（ＮＦＡＴ）、およびｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  １アルファ（ＳＴＡＴ−１α）などのストレス応答転写因子（stress responsive transcription factor）（ＳＲＴＦ）の活性化を通じて、細胞の核へ中継される。これらの転写因子のそれぞれは、単独でまたは組み合わさって、炎症性促進性サイトカインおよびケモカイン、ならびにそれらの受容体、シグナルトランスジューサ（signal transducer）、および細胞接着分子をコードする複数の遺伝子の発現を引き起こすが、これはゲノム嵐と呼ばれる応答である。これらのゲノム再プログラミングの産物は、発熱、低血圧の原因となる微小血管内皮不安定性、急性呼吸促拍症候群（acute respiratory distress syndrome）の根底にある微小血管内皮損傷、播種性血管内凝固（disseminated intravascular）、および多臓器機能障害を媒介し、ついには昇圧剤（vasopressor）および補液蘇生（fluid resuscitation）が効かない潜在的致死性血管虚脱（potentially lethal vascular）をもたらすが、これは敗血症性ショックとして知られる状態である。このように、多数の微生物侵襲（microbial insult）に応答しての遺伝子調節ネットワークの再プログラミングは、微生物性炎症という基本過程を構成する宿主細胞核へのシグナル伝達に依存している。したがって、病原菌指向抗菌療法に加えて、シグナルカスケードの核内輸送を停止し、それによって肺、腎臓、心臓、脳、肝臓、皮膚等などの主要臓器にコラテラルダメージを与える宿主炎症応答の再プログラミングを阻害することが可能な新しい処置法および組成物が必要とされる。
【発明の概要】
【０００３】
微生物性炎症および／または敗血症（sepsis）もしくは敗血症（septicemia）として知られるその末期形態を処置することに関する方法および組成物が開示される。
【０００４】
一態様では、対象における微生物感染（例えば、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫感染など）に起因する微生物性炎症（例えば、急性炎症、亜急性炎、慢性炎症、臓器特異的炎症、全身性炎症、および／または敗血症など）を処置する／阻害する／低減する方法であって、治療有効量の抗菌剤、ならびに例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号７、配列番号８、配列番号９、および／または配列番号１６に示される配列を含むＮＴＭなどの１つまたは複数の核内輸送モディファイヤー（nuclear transport modifier）（ＮＴＭ）を含む組成物を対象に投与することを含む方法が本明細書で開示される。
【０００５】
対象において微生物性炎症（急性炎症、亜急性炎、慢性炎症、臓器特異的炎症、全身性炎症、および／または敗血症など）関連血小板減少症を処置する／阻害する／低減する方法であって、１つまたは複数のＮＴＭを含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む方法も本明細書で開示される。
【０００６】
一態様では、血液、脳、洞、上気道、または肺、心臓、骨髄、脾臓、肝臓、腎臓、尿路、膀胱、耳空洞、胃、腸、皮膚、目、歯または歯肉において微生物負荷量を低減する方法であって、１つまたは複数のＮＴＭを含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む方法が本明細書で開示される。
【０００７】
いずれかの先行する態様の方法であって、ＮＴＭを含む組成物が抗菌剤を含まない方法も本明細書で開示される。
【０００８】
一態様では、いずれかの先行する態様の方法であって、ＮＴＭを含む組成物が抗菌剤を確かに含む方法も本明細書で開示される。
【０００９】
感染症に罹った対象の炎症部位での細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞、自然リンパ球系細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ  Ｔ細胞、Ｔ細胞、内皮細胞、または上皮細胞など）においてストレス応答転写因子（ＳＲＴＦ）のレベルを低減する方法であって、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号７、配列番号８、配列番号９、および／または配列番号１６に示される配列を含むＮＴＭなどの１つまたは複数の核内輸送モディファイヤー（ＮＴＭ）を含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む方法も本明細書で開示される。
【００１０】
いずれかの先行する態様のＳＲＴＦのレベルを低減する方法であって、ＳＲＴＦがＮＦ−κＢ（ＮＦ−κＢはＮＦ−κＢ１、ＮＦ−κＢ  ＲｅｌＡまたはその組合せであるなど）、ＳＴＡＴ１α、および／またはＡＰ−１を含む方法も開示される。
【００１１】
ステロール調節エレメント結合タンパク質（Sterol Regulatory Element Binding Protein）（ＳＲＥＢＰ）のレベルを低減する方法であって、ＳＲＥＢＰがＳＲＥＢＰ１ａ、ＳＲＥＢＰ１ｃ、ＳＲＥＢＰ２を含む方法も開示される。
【００１２】
一態様では、対象において抗菌剤の治療効果を増加させる方法であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１６に示される配列を含むＮＴＭを対象に投与することを含む方法が本明細書で開示される。
【００１３】
添付図面は、本明細書に組み込まれその一部を構成するが、いくつかの実施形態を説明し、記述と一緒に開示された組成物および方法を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】核内輸送が微生物性炎症のゲノム調節における中心的なチェックポイントであることを示す模式図である。凡例：ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）；Ｃａ２＋（カルシウムイオン）；ＩＬ−１ＲおよびＩＬ−１８Ｒ（それぞれインターロイキン１および１８受容体）；ＩＦＮ−γ（インターフェロンガンマ）；ＩＦＮＧＲ（インターフェロンガンマ受容体）；ＳＦＫ（タンパク質チロシンキナーゼのＳｒｃファミリー）；ＭｙＤ８８（ミエロイド分化一次応答８８（Myeloid Differentiation Primary Response 88））；ＩＲＡＫ（インターロイキン−１受容体関連キナーゼ）；ＪＡＫ（ヤヌスキナーゼ）；Ｐ（リン酸基）；Ｕｂ（ユビキチン）；ＣａＭ（カルモジュリン）；ＴＲＡＦ６（ＴＮＦ受容体関連因子６）：ＩＫＫ（ＩカッパＢキナーゼ）；ＩκＢα（ＮＦ−κＢ阻害因子アルファ）；ＪＮＫ（ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ）；ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）；ＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核内因子）；ＡＰ−１（アクチベータータンパク質１）；ＮＦ−κＢ（核内因子カッパＢ）；ＮＰＣ（核膜孔複合体）；ＳＴＡＴ１（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  １）；Ｉｍｐα５（インポーチンアルファ５）；Ｉｍｐβ１（インポーチンベータ１）；ＴＮＦα（腫瘍壊死因子アルファ）；ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１７（それぞれインターロイキン１、６、１０および１７）；ＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質１）。
【図２】ＮＴＭでの処置を受けた感染マウスにおいてＳＲＴＦの核内輸送が低減され、正常な肝臓構造が保護されていることを示す図である。図２Ａは、ＮＴＭ（ｃＳＮ５０．１）またはビヒクルでの処置を受けた偽感染または盲腸スラリー（ＣＳ）感染マウスから感染１２時間後に収集した肝臓中のＮＦ−κＢｐ５０、ＮＦ−κＢｐ６５、ｐＹ７０１ホスホ−ＳＴＡＴ１α（ＭＷ９１）および−ＳＴＡＴ１β（ＭＷ８４）、ならびにＡＰ−１（ｃＦｏｓ）の核内含有量を示している。ドナー動物から新たに単離された腸内マイクロバイオームを含むＣＳは、多微生物性腹膜炎（polymicrobial peritonitis）および敗血症を引き起こすための腹腔内注射前に標準化された。それぞれのレーンは１つのマウス由来の核抽出物であり、それぞれの横列で示されるレーンは同じゲル由来である。示されている免疫ブロットは２つの独立した核抽出調製物を代表している。図２Ｂは、図２Ａに示される免疫ブロットの定量分析を示している。試料はすべて同じ免疫ブロット上のＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）に正規化された（データポイントは倍率変化の平均＋ＳＥＭとして表示されている、ｎ＝１０／群；ｔ検定により＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．０００１、ＮＳ＝有意ではない）。図２Ｃは、ＮＴＭ（ｃＳＮ５０．１）またはＰＡＳで染色されたビヒクルでの処置を受けた偽感染またはＣＳ感染マウスから感染１２時間後に収集した肝臓切片を示している。画像は５マウス／群を代表している。
【図３】細菌クリアランスがＮＴＭでの処置を受けた感染マウスにおいて改善されていることを示すグラフである。細菌コロニー形成単位（ＣＦＵ）は、ＮＴＭ（ｃＳＮ５０．１）またはビヒクルでの処置を受けた偽感染またはＣＳ感染マウスから感染１２時間後に収集され、標準条件下で培養された全血および臓器ホモジネートの段階希釈により決定された。バーは４〜５マウス／群からの平均値を表す（ｐ値はマン・ホイットニー検定により決定される）。
【図４】ＮＴＭが敗血症に対する血液および血管応答を調節することを示す図である。図４Ａは、ＣＳ感染前のおよびその感染後の２時間、６時間、１２時間、および２４時間での細胞数測定ビーズアレイ（cytometric bead array）により血漿中で測定されたサイトカイン／ケモカインを示している。メロペネムを用いた抗生物質療法は感染後１２時間で開始された（ｎ＝２０マウス／群；ｐ値は二元配置反復測定（two-way repeated measure）ＡＮＯＶＡにより計算される）。ＩＦＮ−γはＣＳ感染前におよびその感染後２時間、６時間および１２時間で血漿中ＥＬＩＳＡにより測定された（ビヒクル＋抗生物質、ｎ＝８；ｃＳＮ５０．１＋抗生物質、ｎ＝１３；ｐ値は二元配置反復測定ＡＮＯＶＡにより計算される）。図４Ｂは、ＮＴＭ（ｃＳＮ５０．１）またはビヒクルでの処置を受けた偽感染またはＣＳ感染マウスから感染１２時間後に収集された全血中の全ＷＢＣ、リンパ球、好中球、単球、および血小板を示している。バーは５マウス／群からの中央値を表す（ｐ値はマン・ホイットニー検定により決定される）。図４Ｃは、ＣＳ感染前におよびその感染後１２時間および２４時間で血漿中において測定された可溶性Ｅセレクチン、Ｌセレクチン、およびＰセレクチンを示す。メロペネムを用いた抗生物質療法は感染後１２時間で開始された（ｓＥセレクチンおよびｓＬセレクチンのｐ値は二元配置反復測定ＡＮＯＶＡにより計算された、ｓＰセレクチンのｐ値は２４時間でのみマン・ホイットニー検定により決定された、ｎ＝９／群）。図４Ｄは、ＮＴＭ（ｃＳＮ５０．１）またはビヒクルでの処置を受けた偽感染またはＣＳ感染マウスから感染１２時間後に収集された肝臓の肝実質中の好中球（矢印で示される）の代表的な画像（４００×拡大率）および定量化を示している。陽性茶色（ＤＡＢ−陽性）染色細胞のパーセンテージは、陽性細胞の全分析数を肝臓の切片中の全細胞数で除して計算された。バーは５マウス／群からの中央値を表す（ｐ値はマン・ホイットニー検定により決定される）。
【図５】図４Ｂに示され、感染またはＮＴＭ処置により変化することがない全血球数（ＣＢＣ）のパラメータを示すグラフである（Ｎ＝５マウス／群）。バーは５マウス／群からの平均値を表している。マン・ホイットニー検定により有意差は判定されなかった。
【図６】生存が、ＮＴＭ処置を抗生物質療法と組み合わせることにより増加することを示す図である。マウスにＣＳを感染させ、ビヒクルまたはＮＴＭ（ｃＳＮ５０．１）で処置し、両方がメロペネムを用いた抗生物質療法により補われた（ｎ＝２０マウス／群；ｐ値がログランク分析により計算されるカプラン・マイヤー生存プロット）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本化合物、組成物、物品、装置、および／または方法が開示され説明される前に、本化合物、組成物、物品、装置、および／もしくは方法は、別段の明記がない限り特定の合成方法もしく特定の組換えバイオテクノロジー方法に、または別段の明記がない限り、特定の試薬に限定されないこと、したがって、当然のことながら、変化してもよいことは理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定的であることを意図されていないことも理解されるべきである。
【００１６】
定義
明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つ（a）」、「１つ（an）」および「その（the）」は、文脈上別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「薬学的担体」への言及は、２つ以上のそのような担体および同類の物の混合物を含む。
【００１７】
範囲は、「約（about）」１つの特定の値から、および／または「約（about）」もう１つの特定の値までとして本明細書では表わすことが可能である。そのような範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値からおよび／または他の１つの特定の値までを含む。同様に、値が、先行詞「約（about）」を使用して近似値として表される場合、特定の値は別の実施形態を形成することは理解されるであろう。範囲のそれぞれのエンドポイントは、もう一方のエンドポイントとの関係で、およびもう一方のエンドポイントとは独立に、重要であることはさらに理解されるであろう。本明細書ではいくつかの値が開示されていること、およびそれぞれの値が、値それ自体に加えて「約（about）」その特定の値としても本明細書で開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」も開示される。当業者であれば適切に理解するように、値が開示される場合、その値「未満または等しい」、「その値より大きいまたは等しい」および値間の考えられる範囲も開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０未満または等しい」ならびに「１０よりも大きいまたは等しい」も開示される。出願全体を通じて、データはいくつかの異なるフォーマットで提供されること、およびこのデータはエンドポイントおよび開始ポイント、ならびにデータポイントのいかなる組合せの範囲でも表わすことも理解される。例えば、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント１５が開示される場合、１０および１５より大きい、１０および１５より大きいまたは等しい、１０および１５未満、１０および１５未満または等しい、および１０および１５に等しい値、ならびに１０と１５の間の値が開示されていると見なされるものと理解される。２つの特定の単位の間のそれぞれの単位も開示されるとも理解される。例えば、１０および１５が開示される場合、１１、１２、１３、および１４も開示される。
【００１８】
本明細書ではおよび続く特許請求の範囲では、以下の意味を持つと定義されることとするいくつかの用語に言及する。
【００１９】
「任意の」または「任意に」とは、それに続いて記載されるイベントまたは状況が生じても生じなくてもよいこと、その記載が前記イベントまたは状況が生じる場合および前記イベントまたは状況が生じない場合を含むことを意味する。
【００２０】
用語「患者」、「対象」および「個体」は本明細書では互換的に使用され、処置を受ける、診断されるおよび／またはそれから生体試料を得る動物（例えば、哺乳動物（ヒト、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌなど）、爬虫類、魚など）を意味する。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「結合する（bind）」、「結合する（binds）」、または「と相互作用する」とは、試料または生物中で１つの分子が特定の第２の分子を認識して接着するが、試料中の他の構造的に無関係な分子を実質的に認識しない、または接着しないことを意味する。一般に、第２の分子に「特異的に結合する」第１の分子は、その第２の分子に対して約１０８〜１０１２モル／リットルよりも大きな結合親和性を有し、共有結合および非共有結合（水素結合、疎水性、イオン性、およびファンデルワールス）が可能である正確に「１つになっている（hand-in-a-glove）」ドッキング相互作用を含む。
【００２２】
語句「核内輸送モディファイヤー」および「ＮＴＭ」は、転写因子の核内への進入を調節することができるペプチドを意味する。核内輸送モディファイヤーの例は、ヒト核内因子カッパＢ１核局在化配列由来のおよびヒト線維芽細胞成長因子４シグナル配列疎水性領域由来の２６〜２９アミノ酸ペプチドである。この語句は、語句「核内移行インヒビター」と互換的に使用される。
【００２３】
本明細書に記載されるＮＴＭでは、ＮＴＭ配列中のアミノ酸残基のいずれでも、その改変がペプチドの移行媒介機能に影響を及ぼさない限り突然変異させるおよび／または改変させる（すなわち、模倣物を形成する）ことが可能である。したがって、単語「ペプチド」は模倣物を含み、単語「アミノ酸」は改変されたアミノ酸、異常なアミノ酸、Ｄ型アミノ酸などを含む。
【００２４】
本明細書で使用される場合、語句「核内移行アダプター」および「核内輸送アダプター」は、通常４５ｋＤよりも大きなタンパク質（例えば、転写因子）の核への輸送を媒介することができる細胞成分を意味する。核内輸送アダプターの例は、カリオフェリンとしても知られるインポーチンである。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」は同意語として使用されて、長さまたは翻訳後修飾、例えば、グリコシル化もしくはリン酸化とは無関係に、アミノ酸の任意のペプチド結合鎖を意味する。
【００２６】
用語「遺伝子」は、特定のタンパク質、またはある特定の場合には、機能的もしくは構造的ＲＮＡ分子をコードする核酸分子を意味する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「核酸」または「核酸分子」は、ＲＮＡ（リボ核酸）およびＤＮＡ（デオキシリボ核酸）などの２つ以上のヌクレオチドの鎖を意味する。
【００２８】
用語「標識された」は、核酸、タンパク質、プローブまたは抗体に関しては、検出可能物質（検出可能薬剤）を核酸、タンパク質、プローブまたは抗体にカップリングする（すなわち、物理的にまたは化学的に連結する）ことによる核酸、タンパク質、プローブまたは抗体の直接標識化を包含することが意図されている。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「治療的」および「治療剤」は互換的に使用され、疾患または他の医学的状態を予防する、軽快させる、または処置することができる任意の分子、化学的実体、組成物、薬物、細胞、治療剤、化学療法剤、または生物学的製剤を包含することが意図されている。この用語は、低分子化合物、アンチセンス試薬、ｓｉＲＮＡ試薬、抗体、酵素、ペプチド有機または無機分子、細胞、天然または合成化合物および同類の物を含む。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「処置」は、疾患、疾患の症状もしくは疾患への素因を治癒する、治す、軽減する、緩和する、変更する、治療する、軽快させる、改善するまたは影響を及ぼす目的で、疾患、疾患の症状もしくは疾患への素因を有する、患者もしくは対象への治療剤の適用もしくは投与、または患者もしくは対象由来の単離された組織もしくは細胞株への治療剤の適用もしくは投与と定義される。
【００３１】
「減少」とは、症状、疾患、組成物、状態、または活性のより少ない量をもたらす任意の変化を指すことが可能である。物質は、その物質を用いた遺伝子産物の遺伝的生産量がその物質なしでの遺伝子産物の生産量と比べて少ない場合には、遺伝子の遺伝的生産量を減少させるとも理解される。その上、例えば、減少は、症状が以前観察されたよりも少なくなるような障害の症状の変化が可能である。減少は、状態、症状、活性、組成物の統計的に有意な量でのいかなる個々の、中央値の、または平均の減少でも可能である。したがって、減少は、その減少が統計的に有意である限り、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％減少が可能である。
【００３２】
「阻害する」、「阻害すること」、および「阻害」は、活性、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメータを減少させることを意味する。これは、活性、応答、状態、または疾患の完全な消失を含むことが可能であるがこれらに限定されない。これは、例えば、天然または対照レベルと比べた場合、活性、応答、状態、または疾患の１０％低減を含んでもよい。したがって、低減は、天然または対照レベルと比べた場合、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％またはその間の任意の量の低減が可能である。
【００３３】
「増加」とは、症状、疾患、組成物、状態、または活性のより大きな量をもたらす任意の変化を指すことが可能である。増加は、状態、症状、活性、組成物の統計的に有意な量でのいかなる個々の、中央値の、または平均の増加でも可能である。したがって、増加は、その増加が統計的に有意である限り、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％増加が可能である。
【００３４】
本出願全体を通じて、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物のその全体の開示は、これが関係する最先端の技術をさらに完全に説明するために、これにより参照によって本出願に組み込まれる。開示される参考文献は、参考文献に含まれその参照に頼っている文で考察される材料についても、参照により本明細書に個々におよび明確に組み込まれる。
【００３５】
開示される組成物を調製するために使用される成分ならびに本明細書に開示される方法内で使用される組成物それ自体が開示される。これらのおよび他の材料が本明細書で開示され、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、群などが開示される場合、これらの化合物のそれぞれ種々の個々のおよび集合的な組合せおよび並び替えの特定の参照が明確に開示されていない場合があるが、それぞれは具体的に想定されており本明細書に記載されていることは理解される。例えば、特定の核内輸送モディファイヤー（ＮＴＭ）が開示され考察され、ＮＴＭを含むいくつかの分子に加えることが可能であるいくつかの改変が考察される場合、特にそれとは反対に示されていなければ、ＮＴＭのありとあらゆる組合せおよび並び替えならびに可能な改変が具体的に想定される。したがって、分子Ａ、Ｂ、およびＣのクラスならびに分子Ｄ、Ｅ、およびＦのクラスが開示され、ならびに組合せ分子Ａ−Ｄの例が開示されるならば、たとえそれぞれが個々に列挙されていなくても、それぞれは個々におよび集合的に想定され、組合せＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ−Ｆが開示されると見なされる。同様に、これらのいかなるサブセットまたは組合せも開示される。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅのサブグループが開示されると見なされる。この発想は、開示された組成物を作成し使用する方法におけるステップを含むがこれに限定されない本出願のすべての態様に当てはまる。したがって、実施することが可能な種々の追加のステップが存在する場合、これらの追加のステップのそれぞれを開示された方法のいかなる特定の実施形態または実施形態の組合せでも実施することが可能であることは理解される。
【００３６】
Ｂ．使用方法
本明細書に記載される組成物、キット、細胞、および方法に類似するまたは等価である組成物、キット、細胞、および方法を本発明の実行または試験において使用することが可能であるが、適切な組成物、キット、細胞、および方法が下に記載されている。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、および特許は参照によりその全体が組み込まれる。例えば、米国特許出願第１４／３４９，９１８号明細書および米国特許第７，５５３，９２９号明細書は参照によりその全体が組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が統制する。下で考察される特定の実施形態は説明的なものにすぎず、限定的であることを意図されていない。
【００３７】
例えば、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫などの微生物の感染に応答して、宿主免疫系は、サイトカイン、抗体の分泌、ならびに顆粒球、単球、マクロファージ、樹状細胞、自然リンパ球系細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ  Ｔ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびプラズマ細胞のエフェクター機序を含む、自然および適応免疫系という武器を用いることにより感染性微生物を除去しようと企てる。いかなる炎症でも、微生物病原性因子およびサイトカインに対する細胞応答により開始される炎症性シグナル伝達カスケードによりついにはストレス応答転写因子（ＳＲＴＦ）が核移行（nuclear translocation）し、炎症性遺伝子ネットワークを上方調節する。抑制されなければ、このゲノム再プログラミング（ゲノム嵐）は、内皮機能障害、多臓器不全ならびに先進国および発展途上国における１０の主要な死因の１つである微生物性炎症の最終的な末期を表す、敗血症性ショックとして知られ最終的に死に至るショックをもたらす。
【００３８】
感染中、毒性サイトカインの産生は、例えば、ＮＦ−κＢ、ＡＰ−１、ＮＦ−ＡＴ、ＳＴＡＴ−１などのＳＲＴＦによる厳密に調節された細胞内シグナル伝達に依存している。ＮＦ−κＢはパラダイムＳＲＴＦ（paradigmatic SRTF）であり微生物性炎症病態形成に役割を有し、ミエロイド、リンパ球、内皮細胞および外皮細胞のレベルで重大な役割を果たしている。しかし、ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ−１、およびＳＴＡＴ−１を含む他のＳＲＴＦも、標的組織の破壊の根底にある炎症およびアポトーシスのメディエーターをコードする数多くの標的遺伝子を活性化することにより関与してきた。さらに、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）１ａ、１ｃおよび２などの代謝転写因子は、ある特定の微生物病原体により活性化されることが可能である。核への炎症促進性免疫シグナル伝達のこれらの陽性エフェクターは自動刺激ループに関与しており、このループは微生物トリガーにより開始される炎症過程を増幅する。これらの機能を実行するため、活性化されたＳＲＴＦおよびＳＲＥＢＰは、自然および適応免疫刺激に応答している細胞の核に運ばれる。したがって、ＳＲＴＦおよびＳＲＥＢＰの制御されていない核移行は、微生物性炎症およびその末期、すなわち、敗血症の追加の特長を表す。
【００３９】
細胞生存因子をコードするハウスキーピング遺伝子を通常は調節する小さな転写因子（＜５０ｋＤ）は、細胞質から核に自由に通過する。これとは対照的に、ＳＲＴＦなどの５０ｋＤよりも大きな転写因子の核内輸送は、１つまたは複数の核局在化配列（ＮＬＳ）により先導される。これらの細胞内「ジップコード」は、微生物侵襲により免疫および非免疫細胞が刺激されるとＳＲＴＦ上に提示される。次に、ＮＬＳは、核内輸送アダプタータンパク質である、インポーチン／カリオフェリンアルファ（Ｉｍｐ  α）により認識される（図１参照）。ＳＲＴＦとインポーチンα複合体の刺激誘発形成はインポーチンベータ１（Ｉｍｐ  β１）も包含し、このインポーチンはカーゴの核への移行を可能にする核膜孔タンパク質により認識される。最近まで、核内輸送は、ＩκＢαと名付けられたＮＦ−κＢの分解抵抗性因子などの炎症促進性ＳＲＴＦの阻害因子をコードする遺伝子の強制発現を通じて標的にされてきた。しかし、ＮＦ−κＢは、感染に応答した核へのシグナル伝達を媒介する複数のＳＲＴＦの１つにすぎない。ＡＰ−１、ＳＴＡＴ１およびＮＦＡＴなどの他のＳＲＴＦも炎症応答中は核に輸送されるが、それらの核内輸送はＩκＢαにより妨げられず、反対に、ＡＰ−１経路は活性化される。核への複数の転写因子の移行を統合する重要なチェックポイントである核内輸送を標的にすることは、個々の転写因子のシグナル伝達経路を標的にするよりも効率的な戦略になり得る。この発想は、核内輸送モディファイヤー（ＮＴＭ）の設計および開発により証明された。
【００４０】
ＮＴＭは核内輸送シャトル、Ｉｍｐ  α５およびＩｍｐ  β１を標的にする。これらの核内輸送シャトルはＳＲＴＦを核に移行させシグナル伝達経路を制御し、このシグナル伝達経路はついにはゲノム再プログラミングをもたらす。最近の前臨床研究では、二重特異性を有する高度に可溶性の細胞透過性ＮＴＭ（ｃＳＮ５０．１）が使用された。このＮＴＭは、ＮＦ−κＢ１由来のＮＬＳを認識するＩｍｐ  α５と線維芽細胞成長因子４由来のシグナル配列疎水性領域（ＳＳＨＲ）を認識するＩｍｐ  β１の両方に結合するセグメントを有する。ＳＳＨＲは、ＡＴＰ−およびエンドサイトーシス非依存性機序を通じてペプチドおよびタンパク質の細胞内送達を可能にする膜移行モチーフ（membrane translocating motif）（ＭＴＭ）としての役目も果たす。このおよび他のＮＴＭは、細菌毒素により誘発される致命的なショックのモデルにおいて、ＳＲＴＦおよび代謝転写調節因子であるステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）の核移行を阻害し、それによって炎症応答、微小血管損傷、アポトーシスおよび出血性壊死ならびに代謝障害（metabolic derangement）を低減し、これに付随して生存が増加することが示されている。
【００４１】
本明細書に記載される核内移行を標的にする新規の形態の免疫療法は、所与の臓器の微生物感染組織および周辺領域の炎症駆動型破壊（inflammation-driven destruction）を停止することが可能である。微生物性炎症（例えば、急性炎症、亜急性炎症、慢性炎症、臓器特異的炎症、全身性炎症、および／または敗血症など）に関して、自然免疫の主要受容体である、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の刺激を通じて開始される炎症促進性シグナル伝達は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化する１つの機序である。ＴＬＲおよびサイトカイン受容体の下流に位置する共通の「チェックポイント」で核内輸送の阻害は、炎症性遺伝子の発現を全体的に抑制し、それによってゲノム嵐を静め多臓器損傷を防ぐ。多数の微生物侵襲に応答しての遺伝子調節ネットワークの再プログラミングは、微生物性炎症の基本的過程を構成する宿主細胞核へのシグナル伝達に依存している（描写については図１参照）。
【００４２】
したがって、一態様では、感染症に罹った対象における炎症部位での細胞核でストレス応答転写因子（ＳＲＴＦ）および代謝転写因子であるステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）のレベルを低減する方法であって、１つまたは複数の核内輸送モディファイヤー（ＮＴＭ）を含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む方法が本明細書で開示される。
【００４３】
細胞核においてＳＲＴＦおよび代謝転写因子であるステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）のレベルを低減することにより、開示されたＮＴＭは、ゲノム嵐（例えば、急性炎症、亜急性炎症、慢性炎症、臓器特異的炎症、全身性炎症、および／または敗血症など）ならびにその結果として内皮機能障害、多臓器不全、および敗血症に関連する最終的に致命的なショックを引き起こす微生物性炎症を低減する、阻害する、および／または予防することが可能であると理解され、本明細書では想定されている。したがって、微生物性炎症（例えば、急性炎症、亜急性炎症、慢性炎症、臓器特異的炎症、全身性炎症、および／または敗血症など）を処置する、阻害する、低減する、および／または予防する方法であって、ＮＴＭを含む組成物を１つまたは複数の抗菌剤と組み合わせて微生物性炎症に罹った対象に投与することを含む方法が本明細書に記載されている。
【００４４】
一態様では、細胞においてＳＲＴＦおよびＳＲＥＢＰ（例えば、ＳＲＥＢＰ１ａ、ＳＲＥＢＰ１ｃ、ＳＲＥＢＰ２など）のレベルを低減するために方法、微生物性炎症（例えば、急性炎症、亜急性炎症、慢性炎症、臓器特異的炎症、全身性炎症、および／または敗血症など）を処置する、阻害する、低減する、および／または予防する方法、ならびに宿主組織から微生物を取り除く方法は、１つまたは複数の核内輸送モディファイヤー（ＮＴＭ）を含む治療有効量の組成物を哺乳動物対象に投与することを含む。組成物の投与は、少なくとも１つのストレス応答転写因子調節遺伝子および／または少なくとも１つのステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）調節遺伝子の発現を減弱することにより微生物性炎症を減少させる。したがって、効果的な用量は、哺乳動物対象において、少なくとも１つのストレス応答転写因子（ＳＲＴＦ）のインポーチンアルファ媒介核移行を低減し、感染により引き起こされる炎症を低減するのに効果的な量である。同様に、効果的な用量は、哺乳動物対象において、少なくとも１つの代謝転写因子であるステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）のインポーチンベータ媒介核移行を低減し、感染により引き起こされる炎症を低減するのに効果的な量である。ＮＴＭはインポーチンアルファに、インポーチンベータに、またはインポーチンアルファとインポーチンベータの両方に結合してもよい。
【００４５】
ｃＳＮ５０．１ペプチドおよびその同類物により例証される核内輸送モディファイヤーの重要な態様は、感染部位および感染宿主細胞、ならびに他のミエロイド、リンパ系、および非リンパ系臓器に到達するそれらの能力である。このペプチドの細胞内送達の機序は解明されており、カポジＦＧＦ由来のシグナル配列疎水性領域（ＳＳＨＲ）に基づいている膜移行モチーフ（ＭＴＭ）により媒介される細胞膜を通過するエンドサイトーシス非依存性過程が報告されている（Veach et al. (2004) J Biol Chem 279: 11425-11431）。ＳＳＨＲの両親媒性ヘリックスベースの構造は、細胞膜への直接的挿入を促進し、傾斜型の膜横断配向は、膜統合性を乱すことなく、細胞膜のリン脂質二重層を通じて直接細胞の内部に核内輸送モディファイヤーを移行することを可能にする。この機序は、微生物性炎症に関与する複数の細胞型の細胞膜を通過するＳＳＨＲ先導カーゴの効率的な送達を説明する。
【００４６】
本明細書で開示されるＮＴＭは、ヒト線維芽細胞成長因子４のシグナル配列疎水性領域（ＳＳＨＲ）由来のモチーフに融合したＮＦκＢ１／ｐ５０サブユニットの核局在化配列（ＮＬＳ）領域（表１参照）に倣って作られる疎水性Ｎ５０モチーフで構成されるＮ５０含有ＮＴＭ（ＳＮ５０、ｃＳＮ５０、およびｃＳＮ５０．１）に由来している。ＳＳＨＲは、ＡＴＰ−およびエンドソーム非依存性機序によりペプチドに細胞膜を通過させ、Ｎ５０モチーフは刺激開始シグナル伝達中にインポーチンαに結合し、それによってＮＬＳ保有ＳＲＴＦのそのアダプタータンパク質へのドッキングを制限し活性化されたＳＲＴＦの核内移行を低減するように設計された。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
ＳＮ５０は、カポジ線維芽細胞成長因子（Ｋ−ＦＧＦ）のシグナル配列疎水性領域（ＳＳＨＲ）とＮＦκＢ１のｐ５０サブユニットの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を組み合わせる断片連結ペプチドである。ＳＮ５０のいかなる模倣物、誘導体、または相同体も、本明細書に開示される組成物、方法、およびキットに使用してもよい。ＳＮ５０の配列は、ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＶＱＲＫＲＱＫＬＭＰ（配列番号１）である。ＳＮ５０の生成および使用は米国特許第７，５５３，９２９号明細書に記載されている。
【００４９】
ｃＳＮ５０は、カポジ線維芽細胞成長因子シグナル配列の疎水性領域をｐ５０−ＮＦκＢ１の核局在化シグナル（ＮＬＳ）と組み合わせ、ＮＬＳのそれぞれの側にシステインを挿入して鎖内ジスルフィド結合を形成する断片設計環状ペプチドである。ｃＳＮ５０のアミノ酸配列は、ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＣＹＶＱＲＫＲＱＫＬＭＰＣ（配列番号１）である。ｃＳＮ５０を作成し使用する方法は、例えば、米国特許第７，５５３，９２９号明細書および米国特許第６，４９５，５１８号明細書に記載されている。これらの特許は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５０】
別の実施形態では、ｃＳＮ５０．１は細胞、組織、または臓器を免疫破壊から守るために投与してもよい。ｃＳＮ５０．１は、第１のシステインに隣接しているｃＳＮ５０の１８位のチロシンが取り除かれていること以外は、ｃＳＮ５０の配列を有する環状ペプチドである。ｃＳＮ５０．１のアミノ酸配列は、ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＣＶＱＲＫＲＱＫＬＭＰＣ（配列番号２）である。ｃＳＮ５０．１はｃＳＮ５０ペプチドの安定性を増加させるように設計され、すなわち、安定性を増加させるように、チロシンがｃＳＮ５０の配列から取り除かれていた。ｃＳＮ５０は、合成および精製方法に応じて２．０ｍｇ／ｍＬから４０ｍｇ／ｍＬの範囲に及ぶレベルで可溶性であり、ｃＳＮ５０．１は少なくとも１００ｍｇ／ｍｌのレベルで可溶性である。ｃＳＮ５０．１は、配列番号３、配列番号４および配列番号５にも包含される。ＮＴＭの追加の例は、カーゴがＮＦκＢ１以外の細胞内タンパク質由来の１つよりもむしろ２つのモジュールまたはカーゴとして組み込まれている断片設計および合成ペプチドを含む。そのような追加の例は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９の配列を含む。
【００５１】
したがって、微生物性炎症（例えば、急性炎症、亜急性炎症、慢性炎症、臓器特異的炎症、全身性炎症、および／または敗血症など）を処置する、阻害する、低減する、および／または予防する開示された方法において使用するための核内輸送モディファイヤー（ＮＴＭ）は、例えば、配列Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ（配列番号３）を有するＮＴＭでもよく、Ｘａａは任意のアミノ酸であるまたは存在しない。例えば、核内輸送モディファイヤーは、配列Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｃｙｓを有することが可能であり、Ｘａａは任意のアミノ酸であるまたは存在しない（配列番号４）。別の例として、核内輸送モディファイヤーは、配列Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ｘａａ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｃｙｓを有することが可能であり、Ｘａａは任意のアミノ酸であるまたは存在しない（配列番号５）。一実施形態では、核内輸送モディファイヤーは、配列番号２に示される配列を有するｃＳＮ５０．１である。ＮＴＭの別の例では、ＮＴＭは、配列Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａを有し、Ｘａａは任意のアミノ酸であるまたは存在しない（配列番号６）。さらに別の例では、ＮＴＭは、配列Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ（配列番号７）を有する。さらなる例では、ＮＴＭは、配列Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａ  Ｘａａを有し、Ｘａａは任意のアミノ酸であるまたは存在しない（配列番号８）。別の例では、ＮＴＭは、配列Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ（配列番号９）を有する。一態様では、対象において、微生物性炎症（例えば、急性炎症、亜急性炎症、慢性炎症、臓器特異的炎症、全身性炎症、および／または敗血症などの）を処置する、阻害する、低減する、および／または予防する方法であって、抗菌剤ならびに配列番号１に示される配列を有するＳＮ５０または配���番号２に示される配列を有するｃＳＮ５０．１、配列番号１６に示される配列を有するｃＳＮ５０．１ベータ、または配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、もしくは配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する本明細書で開示されるＮＴＭのいずれかを含むがこれらに限定されない１つまたは複数のＮＴＭを含む組成物を対象に投与することを含む方法が本明細書で開示される。一態様では、ＮＴＭは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＣＶＱＲＤＥＱＫＬＭＰＣ（配列番号１６）を含むｃＳＮ５０．１ベータが可能である。ｃＳＮ５０．１ベータは、２１位のリジンがアスパラギン酸で置き換えられており、２２位のアルギン残基がグルタミン酸で置き換えられていること以外は、ｃＳＮ５０．１の配列を有する環状ペプチドである。
【００５２】
上記のように、本明細書で開示される方法は、微生物性炎症（例えば、急性炎症、亜急性炎症、慢性炎症、臓器特異的炎症、全身性炎症、および／または敗血症など）を処置する、阻害する、低減する、および／または予防するのに使用することが可能である。一態様では、対象において、微生物性炎症（例えば、急性炎症、亜急性炎症、慢性炎症、臓器特異的炎症、全身性炎症、および／または敗血症など）を処置する、阻害する、低減する、および／または予防する方法であって、治療有効量の抗菌剤、および１つまたは複数のＮＴＭ（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１６など）を含む組成物を対象に投与することを含む方法が本明細書で開示される。
【００５３】
微生物性炎症（例えば、急性炎症、亜急性炎症、慢性炎症、臓器特異的炎症、全身性炎症、および／または敗血症など）の有害作用の１つは、微生物性炎症に罹った対象における血小板の喪失（すなわち、血小板減少症）の発生が可能であることが理解され本明細書では想定されている。炎症（例えば、急性炎症、亜急性炎症、慢性炎症、臓器特異的炎症、全身性炎症、および／または敗血症など）の結果として、多くの炎症促進性および抗炎症性サイトカインが放出されて微小血管内皮損傷を生じ、これが血小板の活性化および沈着を誘起し、それによって、血液中の血小板数の減少（血小板減少症）により明らかにされるその「消費」が生じる。この過程は凝血酵素であるトロンビンの生成を伴うが、プラスミノーゲン活性化因子も産生し、この因子がフィブリン分解酵素であるプラスミンの形成をもたらす。このようにして、フィブリノーゲンを枯渇させることが可能であり、播種性血管内凝固なしでまたはと共に血小板減少症として知られる過程である循環血小板が枯渇される間、制御されないトロンビン形成と出血の両方が起こる場合がある。成人の典型的な血小板数は１５０，０００〜４００，０００／μＬの間であるが、これらの数は微生物性炎症のせいでより少ない８０，０００／μＬになることがある。一態様では、微生物性炎症を呈する対象における微小血管内皮機能障害を処置することにより、血小板減少症は軽快することが理解されている。したがって、対象において炎症（例えば、急性炎症、亜急性炎症、慢性炎症、臓器特異的炎症、全身性炎症、および／または敗血症など）に関連する血小板減少症を処置する／阻害する／低減する方法であって、１つまたは複数のＮＴＭ（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１６など）を含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む方法が本明細書で開示される。血小板減少症を処置する、阻害する、または低減する開示された方法は、抗菌剤および／または抗炎症剤の追加をさらに含むことが可能であることが理解され、本明細書では想定されている。
【００５４】
核への炎症促進性シグナル伝達は、微生物性炎症中の肝臓における急速なグリコーゲン枯渇とも関連付けられてきたことも理解され本明細書では想定される。しかし、本明細書に示されるように、ＮＴＭ処置はグリコーゲン分解を予防する。したがって、一態様では、対象における炎症（例えば、急性炎症、亜急性炎症、慢性炎症、臓器特異的炎症、全身性炎症、および／または敗血症など）関連低グリコーゲン血症（hypoglycogenemia）を低減する／阻害する／予防する方法であって、ＮＴＭ（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１６などの）を対象に投与することを含む方法が本明細書で開示される。一態様では、炎症関連低グリコーゲン血症を低減する／阻害する／予防する方法は、抗菌剤の投与をさらに含むことが可能である。
【００５５】
「微生物性炎症」とは、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫などの微生物感染に起因する、発赤、膨潤、温度上昇、疼痛、および肺（および他の臓器）での微小血管内皮損傷の結果としての障害のある呼吸などの臓器機能の障害などの主徴に関連する身体状態のことである。感染性病原体（病原微生物）に対する自然および適応免疫応答は、顆粒球、単球、マクロファージ、樹状細胞、マスト細胞、自然リンパ球系細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫ  Ｔ細胞によるサイトカイン、ケモカイン、およびタンパク質分解酵素の産生の突発を含むことが可能である。微生物性炎症は特定の臓器に局在化することが可能である、または全身性であることが可能である。微生物性炎症は、急性から亜急性および慢性へと段階が進むことが可能であり、これに付随して組織破壊およびそれに続く線維症になる。野放しにしておけば、急性微生物性炎症は敗血症および敗血症ショックをもたらすことがあり、これは微生物性炎症の末期となる。
【００５６】
「微生物性炎症」とは、感染（「微生物侵襲」）により引き起こされる疾患の機序のことである。微生物性炎症は、自然免疫応答から、例えば、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫などの微生物に起因する感染症に発展する。したがって、微生物病原性因子により引き起こされる微生物損傷は、侵入微生物のクリアランスを妨げ臓器の損傷へさらに傷害を加える宿主産生炎症性メディエーターにより悪化する。微生物性炎症およびその末期である敗血症は、既知の（または未知の）病原性因子および微生物抗原により誘発されるいかなる微生物侵襲からも生じることが可能であると理解され、本明細書では想定されている。
【００５７】
「病原体」は、感染または疾患を引き起こす病原体、具体的には、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、または寄生虫である。
【００５８】
病原体はウイルスであり得ると理解されている。したがって、一実施形態では、病原体は、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、痘瘡ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、麻疹ウイルス、ポリオーマウイルス、ヒトパピローマウイルス、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、デングウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、レオウイルス、黄熱病ウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ラッサ熱ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレー渓谷熱ウイルス、西ナイルウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルスＡ、ロタウイルスＢ、ロタウイルスＣ、シンドビスウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型、ハンタウイルス、風疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型、およびヒト免疫不全ウイルス２型からなる群から選択することができる。
【００５９】
病原体が細菌である方法も開示される。病原体は、結核菌（Mycobaterium tuberculosis）、マイコバクテリウム・ボビス（Mycobaterium bovis）、マイコバクテリウム・ボビス  ＢＣＧ株（Mycobaterium bovis strain BCG）、ＢＣＧ亜株（BCG substrains）、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobaterium avium）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Mycobaterium intracellular）、マイコバクテリウム・アフリカヌム（Mycobaterium africanum）、マイコバクテリウム・カンサシ（Mycobaterium kansasii）、マイコバクテリウム・マリヌム（Mycobaterium marinum）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Mycobaterium ulcerans）、マイコバクテリウム・アビウム亜種パラ結核菌（Mycobaterium avium subspecies paratuberculosis）、ノカルジア・アステロイデス（Nocardia asteroides）、他のノカルジア種（Nocardia species）、在郷軍人病菌（Legionella pneumophila）、他のレジオネラ種（Legionella species）、アシネトバクター・バウマンニ（Acetinobacter baumanii）、チフス菌（Salmonella typhi）、サルモネラ菌（Salmonella enterica）、他のサルモネラ種（Salmonella species）、シゲラ・ボイディ（Shigella boydii）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、ソンネ菌（Shigella sonnei）、シゲラ・フレックスネリ（Shigella flexneri）、他のシゲラ種（Shigella species）、ペスト菌（Yersinia pestis）、ヘモリチカ菌（Pasteurella haemolytica）、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）、他のパスツレラ種（Pasteurella species）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、リステリア・イバノビイ（Listeria ivanovii）、ウシ流産菌（Brucella abortus）、他のブルセラ種（Brucella species）、コウドリア・ルミナンチウム（Cowdria ruminantium）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、ボルデテラ・アビウム（Bordetella avium）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）、ボルデテラ・トレマツム（Bordetella trematum）、ボルデテラ・ヒンジイ（Bordetella hinzii）、ボルデテラ・プテリ（Bordetella pteri）、ボルデテラ・パラペルツシス（Bordetella parapertussis）、ボルデテラ・アンソルピイ（Bordetella ansorpii）、他のボルデテラ種（Bordetella species）、鼻疽菌（Burkholderia mallei）、類鼻疽菌（Burkholderia psuedomallei）、セパシア菌（Burkholderia cepacian）、 クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）、オウム病クラミジア（Chlamydia psittaci）、Ｑ熱コクシエラ（Coxiella burnetii）、リケッチア種（Rickettsial species）、エーリキア種（Ehrlichia species）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）、大腸菌（Escherichia coli）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、カンピロバクター種（Campylobacter species）、髄膜炎菌（Neiserria meningitidis）、淋菌（Neiserria gonorrhea）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、他のシュードモナス種（Pseudomonas species）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、軟性下疳菌（Haemophilus ducreyi）、他のヘモフィルス種（Hemophilus species）、破傷風菌（Clostridium tetani）、他のクロストリジウム種（Clostridium species）、エンテロコルチカ菌（Yersinia enterolitica）、および他のエルシニア種（Yersinia species）、ならびにマイコプ��ズマ種（Mycoplasma species）からなる細菌の群から選択することができる。一態様では、細菌は炭疽菌（Bacillus anthracis）ではない。
【００６０】
病原体が、カンジタ・アルビカンス（Candida albicans）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplama capsulatum）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、ココシジオイデス・イミチス（Coccidiodes immitis）、南アメリカ分芽菌（Paracoccidiodes brasiliensis）、ブラストミセス・デルマチチジス（Blastomyces dermitidis）、ニューモシスシス・カリニ（Pneumocystis carinii）、ペニシリウム・マルネッフェイ（Penicillium marneffi）、およびアルテルナリア・アルテナータ（Alternaria alternata）からなる真菌の群から選択される真菌である方法も開示される。
【００６１】
病原体が、トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）、他のプラスモディウム種（Plasmodium species）、エントアメーバ・ヒストリチカ（Entamoeba histolytica）、ネグレリア・フォーレリ（Naegleria fowleri）、リノスポリジウム・セーベリ（Rhinosporidium seeberi）、ランブル鞭毛虫（Giardia lamblia）、ぎょう虫（Enterobius vermicularis）、エンテロビウス・グレゴリイ（Enterobius gregorii）、回虫（Ascaris lumbricoides）、ズビニ鉤虫（Ancylostoma duodenale）、アメリカ鉤虫（Necator americanus）、クリプトスポリジウム種（Cryptosporidium spp.）、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）、トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）、森林型熱帯リーシュマニア（Leishmania major）、他のリーシュマニア種（Leishmania species）、広節裂頭条虫（Diphyllobothrium latum）、小型条虫（Hymenolepis nana）、縮小条虫（Hymenolepis diminuta）、単包条虫（Echinococcus granulosus）、多包条虫（Echinococcus multilocularis）、フォーゲル包条虫（Echinococcus vogeli）、ヤマネコ条虫（Echinococcus oligarthrus）、肝吸虫（Clonorchis sinensis）;クロノルキス・ビベリニ（Clonorchis viverrini）、肝蛭（Fasciola hepatica）、巨大肝蛭（Fasciola gigantica）、槍形吸虫（Dicrocoelium dendriticum）、肥大吸虫（Fasciolopsis buski）、横川吸虫（Metagonimus yokogawai）、タイ肝吸虫（Opisthorchis viverrini）、ネコ肝吸虫（Opisthorchis felineus）、膣トリコモナス（Trichomonas vaginalis）、アカントアメーバ種（Acanthamoeba species）、インターカラーツム住血吸虫（Schistosoma intercalatum）、ビルハルツ住血吸虫（Schistosoma haematobium）、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）、他のシストソーマ種（Schistosoma species）、トリコビルハルツ住血吸虫（Trichobilharzia regenti）、旋毛虫（Trichinella spiralis）、旋毛虫ブリトビ（Trichinella britovi）、旋毛虫ネルソニ（Trichinella nelsoni）、旋毛虫ナティバ（Trichinella nativa）、およびエントアメーバ・ヒストリチカ（Entamoeba histolytica）からなる寄生生物の群から選択される寄生虫である方法も開示される。
【００６２】
処置を受けている微生物性炎症は、血液、脳、洞、上気道、または肺、心臓、骨髄、脾臓、肝臓、腎臓、尿生殖器官、膀胱、耳空洞、胃、腸、皮膚、目、歯、または歯肉を含むがこれらに限定されない、微生物感染が起こることが可能である対象のいかなる組織、臓器、または系でも可能であると理解され、本明細書では想定されている。したがって、一態様では、対象において微生物性炎症（例えば、急性炎症、亜急性炎症、慢性炎症、臓器特異的炎症、全身性炎症、および／または敗血症など）を処置する、阻害する、低減する、または予防する方法であって、抗菌剤および１つまたは複数のＮＴＭを含む組成物を対象に投与することを含み、微生物性炎症が血液、脳、洞、上気道、または肺、心臓、骨髄、脾臓、肝臓、腎臓、尿生殖器官、膀胱、耳空洞、胃、腸、皮膚、目、歯、または歯肉にある、方法が本明細書では開示される。
【００６３】
本明細書に示されるように、開示されているＮＴＭ（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１６など）は、抗菌剤が存在しなくても、直接に殺菌的でなくても、感染性微生物のクリアランスを増強することが可能である。このクリアランスは、宿主免疫系が、ＮＴＭがなければ、制御されない炎症（例えば、急性炎症、亜急性炎症、慢性炎症、臓器特異的炎症、全身性炎症、および／または敗血症など）が進行する、増加する、もしくは続くと考えられる感染性微生物を除去することができるように、またはウイルス、真菌、もしくは原生生物などの感染性病原体における病原性因子産生の低減により、炎症応答を制御するＮＴＭの能力の結果であり得る。したがって、一態様では、血液、脳、洞および／または肺を含む上気道、心臓、骨髄、脾臓、肝臓、腎臓、尿生殖器官、膀胱、耳空洞、胃、腸、皮膚、目、歯、または歯肉において病原微生物の負荷を低減する（すなわち、微生物を排除する）方法であって、１つまたは複数のＮＴＭを含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む方法が本明細書で開示される。一態様では、病原微生物の存在を低減する／阻害する（すなわち、微生物を排除する）方法は、ＮＴＭを含む組成物を対象に投与することを含むが、前記方法は抗菌剤の投与を含まない。一態様では、病原微生物の存在を低減する／阻害する（すなわち、微生物を排除する）方法は、抗菌剤の投与をさらに含むことが可能である。本明細書で使用される場合、クリアランスとは、組織、臓器、または系（例えば、血液、洞を含む上気道、および／または肺、脳、骨髄、脾臓、肝臓、腎臓、尿生殖器官、膀胱、耳空洞、胃、腸、皮膚、目、歯および歯肉など）などの感染部位での感染性微生物の数の低減のことである。感染性病原微生物の完全なまたは部分的な除去を含むクリアランスは、感染性微生物のより頑強ではない低減を含み得ることが理解されており、本明細書では想定されている。したがって、クリアランスは、感染性微生物の数の１０、２０、２５、３０、３３、４０、４５、５０、５５、６０、６６、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％の低減などを含むことが可能である。
【００６４】
微生物性炎症を処置する開示された方法で使用される開示された組成物の結果として観察された抗炎症効果は、ＮＴＭを有する組成物中でおよび／またはＮＴＭとは別個の組成物中で投与されるいかなる抗菌剤も存在しなくても治療効果を有することが可能であると理解され、本明細書では想定されている。したがって、一態様では、対象において微生物性炎症（例えば、急性炎症、亜急性炎症、慢性炎症、臓器特異的炎症、全身性炎症、および／または敗血症などの）を処置する、阻害する、低減する、および／または予防する方法であって、ＮＴＭ（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１６など）を含み、ＮＴＭ組成物の一部としても別個の投与としても抗菌剤を投与することを含まない方法が本明細書で開示される。
【００６５】
一態様では、抗菌剤の投与なしで炎症を低減し、微生物を宿主組織、臓器、または系から除去することができるにもかかわらず、開示されたＮＴＭ（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１６など）は殺菌的ではないことが理解され、本明細書では想定されている。したがって、ＮＴＭを含む組成物中の成分としてまたは別個の投与を介して、処置レジメンに抗菌剤を追加することが望ましい状況も存在することが可能である。したがって、対象において微生物性炎症（例えば、急性炎症、亜急性炎症、慢性炎症、臓器特異的炎症、全身性炎症、および／または敗血症などの）を処置する、阻害する、低減する、および／または予防する方法であって、抗菌剤および１つまたは複数のＮＴＭ（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１６など）を含む組成物を対象に投与することを含む方法が本明細書で開示される。ＮＴＭおよび抗菌剤は、同じ組成物の一部としてまたは別個に投与することができる。抗菌剤の例は、感染性微生物を直接攻撃するまたは宿主条件を変更して宿主系が微生物を寄せ付けないようにする抗生物質、抗体、低分子、および機能的な核酸（ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を含むがこれらに限定されない。
【００６６】
さらに、開示されたＮＴＭ（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１６など）は、宿主免疫系が感染性微生物と適切に戦うことができるように、抗菌剤の助けなしで、感染性微生物の数を低減し、炎症環境を変更することが可能なので、およびこれらの作用は抗菌剤の作用と相補的なので、抗菌剤の治療効果を増やす１つのやり方は、抗菌剤と一緒にＮＴＭ（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１６など）を投与することであると理解され、本明細書では想定されている。したがって、１つまたは複数のＮＴＭ（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１６など）を含む組成物を対象にさらに投与することにより、対象において抗菌剤の治療効果を増加させる方法が本明細書で開示される。抗菌剤の治療効果を増加させる開示された処置方法のいくつかの態様では、付随する抗菌剤はＮＴＭ含有組成物の成分である。別の態様では、抗菌剤はＮＴＭとは別個に投与される。抗菌剤の投与は、ＮＴＭ組成物の投与に先立って、と同時に、と協同して、またはこれに続いても可能である。
【００６７】
上記のように、抗菌剤は、感染性微生物を直接攻撃する、または宿主条件を変更して宿主系が微生物を寄せ付けないようにするいかなる抗生物質、抗体、低分子、および機能的な核酸（ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を含むことが可能である。そのような薬剤は、アバカビル、アシクロビル、アデホビル、アマンタジン、アンプレナビル、アンプリゲン、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、バラビル、シドホビル、コンビビル、ドルテグラビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エドクスジン、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、エコリエベル、ファムシクロビル、ホミビルセン、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホスホネット、ガンシクロビル、イバシタビン、イムノビル、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、ラミブジン、ロピナビル、ロビリド、マラビロク、モロキシジン、メチサゾン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネキサビル、ニタゾキサニド、ノービア、オセルタミビル、ペグインターフェロン  アルファ２ａ、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリン、ポドフィロトキシン、ラルテグラビル、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、ピラミジン、サキナビル、ソホスブビル、スタブジン、テラプレビル、テノホビル、テノホビルジソプロキシル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビクリビロック、ビダラビン、ビラミジン、ザルシタビン、ザナミビル、ジドブジン、クロファジミン；ダプソン；カプレオマイシン；サイクロセリン；エタンブトール（Ｂｓ）；エチオナミド；イソニアジド；ピラジナミド；リファンピシン；リファブチン；リファペンチン；ストレプトマイシン；アルスフェナミン；クロラムフェニコール（Ｂｓ）；ホスホマイシン；フシジン酸；メトロニダゾール；ムピロシン；プラテンシマイシン；キヌプリスチン／ダルポプリスチン；チアンフェニコール；チゲサイクリン（Ｂｓ）；チニダゾール；トリメトプリム（Ｂｓ）；例えば、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、メロペネム、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、スペクチノマイシン、ニタゾキサニド、メラルソプロール、エフロルニチン、メトロニダゾール、チニダゾール、メルテホシン、メベンダゾール、ピランテルパモエート、チアベンダゾール、ジエチルカルバマジン、イベルメクチン、ニクロサミド、プラジカンテル、アルベンダゾール、リファンピン、アンホテリシンＢ、フマギリン、カンジシジン、フィリピン、ハマイシン、ナタマイシン、ニスタチン、リモシジン、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ルリコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、アルバコナゾール、エフィナコナゾール、エポキシコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イントラコナゾール、ポサコナゾール、プロピコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾール、ボリコナゾール、アバフンギン、アニデュラフ���ンギン、カスポファンギン、ミカファンギン、オーロン、安息香酸、シクロピロクス、フルシトシン、グリセオフルビン、ハロプロジン、トルナフタート、ウンデシレン酸、クリスタルバイオレット、ペルーバルサム、オロトミド（Orotomide）、ミルテホシンなどのアミノグリコシド類；例えば、ゲルダナマイシン、リファキシミン、ハービマイシンなどのアンサマイシン類；例えば、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、およびメロペネムなどのカルバペネム類；例えば、セファドロキシル、セファゾリン、セフラジン、セファピリン、セファロチン、セファレキシン、セファクロル、セフォキシチン、セフォテタン、セファマンドール、セフメタゾール、セフォニシド、ロラカルベフ、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、モキサラクタム、セフトリアキソン、セフェピム、セフタロリンフォサミル、およびセフトビプロールなどのセファロスポリン類；例えば、テイコプラニン、バンコマイシン、テラバンシン、ダルババンシン、およびオリタバンシンなどの糖ペプチド；例えば、クリンダマイシンおよびリンコマイシンなどのリンコサミド類（Ｂｓ）；例えば、ダプトマイシンなどのリポペプチド；例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、テリスロマイシン、およびスピラマイシンなどのマクロライド類（Ｂｓ）；例えば、アズトレオナムなどのモノバクタム；例えば、フラゾリドンおよびニトロフラントインＢｓ）などのニトロフラン；例えば、リネゾリド、ポジゾリド、ラデゾリド、およびトレゾリドなどのオキサゾリジノン類（Ｂｓ）；例えば、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、ピペラシリン、テモシリン、およびチカルシリンなどのペニシリン類；例えば、バシトラシン、コリスチン、およびポリミキシンＢなどのポリペプチド；例えば、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ナジフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、グレパフロキサシン、スパルフロキサシン、およびテマフロキサシンなどのキノロン／フルオロキサシン；例えば、マフェニド、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファジアジン銀、スルファジメトキシン、スルファメチゾール、スルファメトキサゾール、スルファニルイミド（古風な）、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、トリメトプリムスルファメトキサゾール（コトリモキサゾール）（ＴＭＰ−ＳＭＸ）、およびスルホンアミドクリソイジン（古風な）などのスルホンアミド類（Ｂｓ）；例えば、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、およびテトラサイクリンなどのテトラサイクリン類（Ｂｓ）；例えば、アクトクスマブ、アチドルトクスマブ（Atidortoxumab）、ベルリマトクスマブ（Berlimatoxumab���、ベズロトクスマブ、コスフロビキシマブ（Cosfroviximab）、エドバコマブ、フェルビズマブ、フィリブマブ、フォラビルマブ、ラルカビキシマブ、モタビズマブ、ナビブマブ、パノバクマブ、パリビズマブ、ポルガビキシマブ、ＣＲ６２６１、ラフィビルマブ、パギバキシマブ、オビルトキサキシマブ、イバリズマブ、レガビルマブ、Ｒｍａｂ、セヴィルマブ、リババズマブペゴル、テフィバズマブ、スブラトクスマブ、およびツビルマブなどのモノクローナル抗体；およびチェックポイント阻害剤；ペンブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ピディリズマブ、ＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ−５１４、ＰＤＲ００１、セミプリマブ、およびイピリムマブを含むがこれらに限定されない。
【００６８】
一態様では、微生物性炎症（例えば、急性炎症、亜急性炎症、慢性炎症、臓器特異的炎症、全身性炎症、および／または敗血症など）を処置する開示された方法は、抗菌剤の効果に加えて、ＮＴＭが核内輸送シャトルを制御し、したがって、野放しの炎症応答を予防する結果であると理解され、本明細書では想定されている。したがって、感染症に罹っている対象の炎症部位の細胞において、ストレス応答転写因子（ＳＲＴＦ）（例えば、ＮＦ−κＢ（ＮＦ−κＢが、ＮＦ−κＢ１、ＮＦ−κＢ  ＲｅｌＡまたはそれらの組合せである場合を含む）、ＳＴＡＴ１α、および／またはＡＰ−１）ならびに／またはステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）１ａ、１ｃ、および２などの代謝転写因子のレベルを低減する方法であって、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１６などの１つまたは複数の核内輸送モディファイヤー（ＮＴＭ）を含む治療有効量の組成物を対象に投与することを含む方法が本明細書で開示される。一態様では、ＳＲＴＦが低減されつつある細胞はマクロファージ、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ  Ｔ細胞、Ｔ細胞、内皮細胞、または上皮細胞である。
【００６９】
１．医薬担体／医薬製品の送達
対象（例えば、ヒト対象）において微生物性炎症を処置するための本明細書に記載される組成物、例えば、医薬組成物は、微生物性炎症を処置する（前記微生物性炎症から生じる血小板減少症または低グリコーゲン血症を処置することを含む）および／または組織、臓器、もしくは系において病原性微生物の負荷を低減するのに十分な治療有効量の核内輸送モディファイヤー（ｃｓＮ５０、ｃＳＮ５０．１、ｃＳＮ５０．１ベータ、または配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および／もしくは配列番号９に示されるＮＴＭ）ならびに薬学的に許容される担体を含む。同様に、対象（例えば、ヒト対象）において微生物性炎症を処置するための本明細書に記載される組成物は、微生物性炎症を有する対象においてＳＲＴＦおよびＳＲＥＢＰの核内レベルを低減するのに十分な治療有効量の核内輸送モディファイヤー（ｃＳＮ５０、ｃＳＮ５０．１、ｃＳＮ５０．１ベータ、または配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および／もしくは配列番号９に示されるＮＴＭ）ならびに薬学的に許容される担体を含む。一部の態様では、組成物は抗菌剤をさらに含まない。
【００７０】
抗菌剤を添加せずに、組織において微生物病原性を阻害し、微生物クリアランスを実現する開示された組成物の能力にもかかわらず、抗菌剤の添加（組成物自体の中でまたは別個の投与として）が望ましい場合があることは理解され、本明細書では想定されている。したがって、対象において微生物性炎症を処置する、阻害する、低減する、または予防する方法であって、対象に抗菌剤を投与することを含む方法が本明細書で開示される。
【００７１】
上記のように、組成物は、薬学的に許容される担体中にインビボで投与することも可能である。「薬学的に許容される」とは、生物学的にも他の点でも望ましくない点がない物質のことであり、すなわち、この物質は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こさず、またはそれが含有される医薬組成物のその他の成分のいずれとも有害な様式で相互作用をせず、核酸またはベクターと一緒に対象に投与してもよい。当業者には周知であるように、担体は、当然のことながら、活性成分のいかなる分解も最小限に抑え、対象においていかなる有害な副作用も最小限に抑えるように選択される。
【００７２】
組成物は、経口的に、非経口的に（例えば、静脈内に）、筋肉内注射により、腹腔内注射により、経皮的に、体外的に、局所的鼻腔内投与もしくは吸入剤による投与を含む、局所的に、またはその他で投与してもよい。本明細書で使用される場合、「局所的鼻腔内投与」は、鼻孔の１つまたは両方を通じて鼻および鼻腔内中への組成物の送達を意味し、噴霧機構もしくは液滴機構により、または核酸もしくはベクターのエアロゾル化を通じての送達を含むことが可能である。吸入剤による組成物の投与は、噴霧もしくは液滴機構による送達を介する鼻または口を通じて可能である。送達は、挿管を介して呼吸器系のいかなる領域（例えば、肺）にでも直接可能である。必要とされる組成物の正確な量は、対象の種、年齢、体重および全身状態、処置を受けているアレルギー障害の重症度、使用される特定の核酸またはベクター、投与様式などに応じて対象により変動する。したがって、すべての組成物について正確な量を特定するのは可能ではない。しかし、適切な量は、本明細書で教示を与えられた日常実験のみを使用して当業者が決定することが可能である。
【００７３】
非経口使用のための組成物は、単位剤形で（例えば、単回用量アンプルで）または複数回用量を含有するおよび適切な保存剤を添加してもよいバイアルで提供してもよい（下記参照）。組成物は、液剤、懸濁剤、乳濁液剤、輸液装置、もしくは植込用の送達装置の形態でもよく、または組成物は、使用前に水もしくは別の適切なビヒクルで復元される乾燥粉末剤として提供してもよい。微生物性炎症を処置する活性剤は別として、組成物は、適切な非経口的に許容可能な担体および／または賦形剤を含んでいてもよい。活性治療剤は、徐放のためにマイクロスフェア剤、マイクロカプセル剤、ナノ粒子剤、リポソーム剤、またはその他に組み込んでもよい。さらに、組成物は、懸濁剤、可溶化剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、および／または分散剤を含んでいてもよい。
【００７４】
物質は液剤、懸濁剤（例えば、マイクロ粒子剤、リポソーム剤、または細胞に組み込まれている）に含まれていてもよい。これらは、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して標的としての特定の細胞型に向けてもよい。以下の参考文献は、特定のタンパク質を標的としての腫瘍組織に向けるこの技術の使用の例である（Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281, (1989); Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993); Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992); Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992); およびRoffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)）。また物質は、「ステルス」などのビヒクルおよび他の抗体コンジュゲートリポソーム（結腸癌への脂質媒介薬物ターゲティングを含む）、細胞特異的リガンドを通じたＤＮＡの受容体媒介ターゲティング、リンパ球依存性腫瘍ターゲティング（lymphocyte directed tumor targeting）、およびインビボでのマウス膠腫細胞の高度に特異的な治療レトロウイルスターゲティングにより送達されてもよい。以下の参考文献は、特定のタンパク質を標的としての腫瘍組織に向けるこの技術の使用の例である（Hughes et al., Cancer Research, 49:6214-6220, (1989); およびLitzinger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)）。
【００７５】
ａ）薬学的に許容される担体
抗体を含む組成物は薬学的に許容される担体と組み合わせて治療的に使用することが可能である。
【００７６】
適切な担体およびその処方は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995に記載されている。典型的には、適切な量の薬学的に許容される塩が製剤中で使用されて、製剤を等張性にする。薬学的に許容される担体の例は、生理食塩水、リンゲル液およびブドウ糖液を含むがこれらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは、約５〜約８であり、さらに好ましくは約７〜約７．５である。さらなる担体は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスなどの持続性調製物を含み、このマトリックスは、造形品、例えば、フィルム、リポソームまたはマイクロ粒子の形態である。ある特定の担体が、例えば、投与経路および投与されている組成物の濃度に応じて、より好ましい場合があることは当業者には明らかである。
【００７７】
医薬担体は当業者には公知である。これらの医薬担体は極めて典型的には、生理的ｐＨの減菌水、生理食塩水、および緩衝液などの溶液を含む、ヒトへの薬物の投与用の標準担体と考えられる。組成物は筋肉内にまたは皮下に投与することができる。他の化合物は、当業者が使用する標準的手順に従って投与される。
【００７８】
医薬組成物は、最適な分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤などを含んでいてもよい。医薬組成物は、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤などの１つまたは複数の活性成分を含んでいてもよい。
【００７９】
医薬組成物は、局所的処置が望ましいのかまたは全身的処置が望ましいのかに応じて、および処置される領域に応じて、いくつかの方式で投与してもよい。投与は、局所的に（眼科的に、膣に、直腸に、鼻腔内に、を含む）、経口的に、吸入により、または非経口的に、例えば、２区画注射器（two- compartment injector）を使用して静脈内点滴、皮下、腹腔内、または筋肉内注射によってもよい。開示された抗体は、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、体腔内に、または経皮的に投与することができる。
【００８０】
非経口投与のための調製物は、無菌水溶性または非水溶性液、懸濁液、および乳濁液を含む。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能有機エステルである。水溶性担体は、生理食塩水および緩衝溶媒を含む、水、アルコール／水溶液、乳濁液または懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム液、リンガーブドウ糖液、ブドウ糖と塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、または固定油を含む。静脈内ビヒクルは、流動および栄養補充液、電解質補充液（リンガーブドウ糖液に基づく補充液など）などを含む。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなどの、保存剤および他の添加剤が存在していてもよい。
【００８１】
マイクロスフェア剤および／またはマイクロカプセル剤の調製において使用するための材料は、例えば、ポリグラクチン、ポリ−（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタミン）、およびポリ（乳酸）などの生分解性／生体分解可能ポリマーである。徐放非経口製剤を処方する際に使用してもよい生体適合性担体は、炭水化物（例えば、デキストラン）、タンパク質（例えば、アルブミン）、リポタンパク質、または抗体である。植込錠において使用するための材料は、非生分解性（例えば、ポリジメチルシロキサン）または生分解性（例えば、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）もしくはポリ（オルトエステル）またはそれらの組合せ）が可能である。
【００８２】
経口使用のための製剤は活性成分（例えば、ｃＳＮ５０、ｃＳＮ５０．１、ｃＳＮ５０．１ベータ、または配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および／もしくは配列番号９に示されるＮＴＭ）を非毒性の薬学的に許容される賦形剤との混合物で含有する錠剤を含む。そのような製剤は当業者には公知である。賦形剤は、例えば、不活性希釈剤または充填剤（例えば、スクロース、ソルビトール、糖、マンニトール、微結晶セルロース、ジャガイモデンプンを含むデンプン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、またはリン酸ナトリウム）；顆粒化剤および崩壊剤（例えば、微結晶セルロースを含むセルロース誘導体、ジャガイモデンプンを含むデンプン、クロスカルメロースナトリウム、アルギン酸塩、またはアルギン酸）；結合剤（例えば、スクロース、グルコース、ソルビトール、アカシア、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、アルファ化デンプン、微結晶セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、またはポリエチレングリコール）；ならびに滑沢剤、滑剤、および付着防止剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、硬化植物油、またはタルク）でもよい。他の薬学的に許容される賦形剤は、着色料、香味料、可塑剤、湿潤剤、緩衝剤などであり得る。
【００８３】
錠剤はコーティングされていなくてもよく、または、任意選択で崩壊および消化管への吸収を遅延し、それによって長期間にわたり持続作用を提供するために、公知の技法によりコーティングされていてもよい。コーティングは、所定のパターンで活性薬物を放出するように適応させてもよく（例えば、放出制御製剤を実現するために）、またはコーティングは、胃を通過後まで活性薬物を放出しないように適応させてもよい（腸溶コーティング）。コーティングは、糖衣、フィルムコーティング（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリレートコポリマー、ポリエチレングリコールおよび／またはポリビニルピロリドンに基づく）、または腸溶コーティング（例えば、メタクリル酸コポリマー、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、ポリ酢酸ビニルフタレート、シェラック、および／またはエチルセルロースに基づく）でもよい。さらに、例えば、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートなどの時間遅延材（time delay material）を用いてもよい。
【００８４】
固形錠剤組成物は、組成物を望ましくない化学的変化（例えば、活性治療物質の放出に先立つ化学分解）から保護するように適応させたコーティングを含んでいてもよい。コーティングは、Swarbrick, J. and Boylan, J. C., supraに記載される様式に類似する様式で固形剤形上に適用してもよい。少なくとも２つの治療薬（例えば、ｃＳＮ５０、ｃＳＮ５０．１、または配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１６に示されるＮＴＭのいずれか、ならびに任意の抗菌剤）を錠剤中に一緒に混合してもよいし、または分割してもよい。一例では、第２の活性治療薬の実質的な部分が第１の活性治療薬の放出に先立って放出されるように、第１の活性治療薬は錠剤の内側に含まれ、第２の活性治療薬は外側にある。
【００８５】
経口使用のための製剤は、咀嚼錠として、または活性成分が不活性固形希釈剤（例えば、ジャガイモデンプン、ラクトース、微結晶セルロース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリン）と混合されている硬ゼラチンカップセル剤として、または活性成分が、水もしくは油媒体、例えば、ピーナッツオイル、液体パラフィン、もしくはオリーブオイルと混合されている柔ゼラチンカプセル剤として提供されてもよい。粉末剤および顆粒剤は、例えば、ミキサー、流動床装置または噴霧乾燥装置を使用する従来の様式で、錠剤およびカプセル剤下で上記の成分を使用して調製してもよい。本明細書に記載される組成物は、吸入および局所的適用のために製剤化することも可能である。任意選択で、抗菌剤をＮＴＭと組み合わせて投与してもよく、そのような方法は当業者には公知である（例えば、Gennaro, supra参照）。組合せは、相乗的であり有利であると予想される。
【００８６】
経口投与のための組成物は、粉末剤もしくは顆粒剤、水もしくは非水性媒体中の懸濁剤もしくは剤液、カプセル剤、サシェ剤、または錠剤を含む。増粘剤、香味料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が望ましい場合がある。
【００８７】
組成物の一部は、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸などの無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸などの有機酸との反応により、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、ならびにモノ−、ジ−、トリアルキルおよびアリルアミンならびに置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応により形成される薬学的に許容される酸−または塩基付加塩として潜在的に投与してもよい。
【００８８】
ｂ）治療的使用
組成物を投与するのに効果的な投与量およびスケジュールは、経験的に決めてもよく、そのような決定を下すことは当技術分野の範囲内である。組成物の投与のための投与量範囲は、障害の症状が影響を受ける所望の効果を生み出すほどの大きさの範囲である。投与量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などの有害な副作用を引き起こすほどの大きさであるべきではない。一般に、投与量は、患者の年齢、状態、性別および疾患の程度、投与経路、または他の薬物がレジメンに含まれているかどうかと共に変動し、当業者であればこれを決定することが可能である。投与量は、いかなる禁忌症（counterindication）の場合にも個々の医師が調整することが可能である。投与量は変動可能であり、１日または数日の間毎日１つまたは複数の用量投与で投与することが可能である。ガイダンスは、所与のクラスの医薬品の適切な投与量について文献に見出すことが可能である。例えば、抗体の適切な用量を選択する際のガイダンスは、抗体の治療的使用に関する文献、例えば、Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 and pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389に見出すことが可能である。単独で使用される抗体の典型的な１日投与量は、上記の要因に応じて、１日あたり約１μｇ／ｋｇ〜最大１００ｍｇ／ｋｇ体重またはそれよりも多い範囲に及んでもよい。
【００８９】
２．相同性／同一性
本明細書に開示された遺伝子またはタンパク質のいかなる既知の変異体および誘導体または生じる可能性のある変異体および誘導体を定義する１つのやり方は、特定の既知の配列に対する相同性の点から変異体および誘導体を定義することによると理解されている。例えば、配列番号２はＮＴＭの特定の配列を示している（ｃＳＮ５０．１）。具体的には、表明された配列に対して少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセントの相同性を有する本明細書で開示されたこれらのおよび他の遺伝子およびタンパク質の変異体が開示される。当業者であれば、２つのタンパク質または遺伝子などの核酸の相同性を判定する方法を容易に理解する。例えば、相同性は、相同性がその最も高いレベルであるように２つの配列を整列させた後で計算することが可能である。本明細書で使用される場合、配列相同性は配列同一性と互換的に使用される。
【００９０】
相同性を計算する別のやり方は、公表されているアルゴリズムにより実施可能である。比較のための配列の最適整列は、Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)の局地的相同性アルゴリズム（local homology algorithm）により、Needleman and Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970)の相同性アライメントアルゴリズム（homology alignment algorithm）により、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988)の類似検索法（search for similarity method）により、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理実行（GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）により、または精査により行ってもよい。
【００９１】
同じタイプの相同性は、例えば、Zuker, M. Science 244:48-52, 1989, Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989, Jaeger et al. Methods Enzymol. 183:281-306, 1989に開示されるアルゴリズムにより核酸について得ることが可能である。前記文献は、少なくとも核酸アライメントに関係する資料について参照により本明細書に組み込まれる。
【００９２】
３．ペプチド
ａ）タンパク質変異体
本明細書で考察されるように、ＮＴＭの多数の変異体が知られており、本明細書では想定されている。タンパク質変異体および誘導体は当業者にはよく理解されており、アミノ酸配列改変を含むことが可能である。例えば、アミノ酸配列改変は典型的には３つのクラス：置換的、挿入的または欠失的変異体のうちの１つまたは複数に入る。挿入は、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。挿入は通常、アミノまたはカルボキシル末端融合の挿入よりも小さな挿入になり、例えば、およそ１〜４残基である。細胞透過性融合タンパク質誘導体（cell-penetrating fusion protein derivative）は、インビトロでの交差架橋によりターゲティング配列の細胞内送達を与えるのに十分大きなポリペプチドを融合させることにより、または融合物をコードするＤＮＡで形質転換した組換え細胞培養により作成される。欠失は、タンパク質配列から１つまたは複数のアミノ酸残基を取り除くことを特徴とする。典型的には、タンパク質分子内のいずれか１つの部位で約２〜６以下の残基が欠失される。これらの変異体は通常、タンパク質をコードするＤＮＡにおいてヌクレオチドを部位特異的変異誘発し、それによって変異体をコードするＤＮＡを作成し、その後組換え細胞培養においてそのＤＮＡを発現させることにより調製される。既知の配列を有するＤＮＡ中の所定の部位で置換突然変異を作成するための技法、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＰＣＲ変異誘発は周知である。アミノ酸置換は典型的には単一残基の置換であるが、いくつかの異なる位置で同時に起こることが可能であり、挿入は通常、およそ約１〜１０アミノ酸残基であり、欠失は約１〜３０残基の範囲に及ぶ。欠失または挿入は好ましくは、隣接する対、すなわち、２残基の欠失または２残基の挿入で行われる。置換、欠失、挿入またはそれらの任意の組合せを組み合わせて、最終構築物に到達してもよい。突然変異は配列をリーディングフレームから逸脱させてはならず、好ましくは第２のｍＲＮＡ構造を作り出すおそれのある相補性領域を創り出さない。置換的変異体は、少なくとも１つの残基が取り除かれておりその場所に異なる残基が挿入されている変異体である。そのような置換は一般に、以下の表２および３に従って行われ、保存的置換と呼ばれる。
【００９３】
【表２】
2020524144.tif 000004
【００９４】
【表３】
2020524144.tif 000005
【００９５】
機能または免疫学的同一性の実質的な変化は、表３の置換ほど保存的ではない置換を選択する、すなわち、（ａ）例えば、シートもしくはらせん状構造として、置換の領域のポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位の分子の電荷もしくは疎水性または（ｃ）側鎖の大きさを維持することに対する残基の効果がより有意に異なる残基を選択することにより加えられる。タンパク質特性に最大の変化を生み出すと一般に予想される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリルもしくはスレオニルが疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルもしくはアラニルに（またはにより）置換される；（ｂ）システインもしくはプロリンが他の任意の残基に（またはにより）置換される；（ｃ）正電荷を持つ側鎖、例えば、リジル、アルギニル、もしくはヒスチジルを有する残基が負電荷を持つ残基、例えば、グルタミルもしくはアスパルチルに（またはにより）置換される；または（ｄ）大きな側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンは側鎖を持たない残基、例えば、グリシンに（またはにより）、この場合、（ｅ）硫酸化および／もしくはグリコシル化のために部位の数を増やすことにより置換される、置換である。
【００９６】
例えば、１つのアミノ酸残基を生物学的におよび／または化学的に類似する別のアミノ酸残基で置き換えることは保存的置換として当業者には公知である。例えば、保存的置換であれば、１つの疎水性残基を別の疎水性残基に変える、または１つの極性残基を別の極性残基に変えることになる。置換は、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組合せを含む。それぞれの明確に開示された配列のそのような保存的に置換された変動は、本明細書で提供される寄せ集めのポリペプチド内に含まれる。
【００９７】
置換的または欠失的変異誘発を用いて、Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化（ＳｅｒまたはＴｈｒ）のための部位を挿入することが可能である。システインまたは他の不安定な残基の欠失も望ましい場合がある。潜在的タンパク質分解部位、例えば、Ａｒｇの欠失または置換は、例えば、塩基性残基の１つを欠失するまたは１つの残基をグルタミニルもしくはヒスチジル残基により置換することにより達成される。
【００９８】
ある特定の翻訳後誘導体化は、発現されたポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は頻繁に翻訳後に、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミドされる。あるいは、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミドされる。他の翻訳後修飾は、プロリンおよびリジンの水酸化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のＯ−アミノ基のメチル化（T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco pp 79-86 [1983]）、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに一部の例では、Ｃ末端カルボキシルのアミド化を含む。
【００９９】
本明細書で開示されたタンパク質由来ペプチドの変異体および誘導体を定義する１つのやり方は、特定の既知の配列に対する相同性／同一性の点から変異体および誘導体を定義することによると理解されている。例えば、配列番号２はｃＳＮ５０．１の特定の配列を示している。具体的には、表明された配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％の配列同一性を有する本明細書に開示されるこれらのおよび他のタンパク質の変異体が開示される。当業者であれば、２つのタンパク質の相同性を判定する方法を容易に理解する。例えば、相同性は、相同性がその最も高いレベルであるように２つの配列を整列させた後で計算することが可能である。
【０１００】
相同性を計算する別のやり方は、公表されているアルゴリズムにより実施可能である。比較のための配列の最適整列は、Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)の局地的相同性アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970)の相同性アライメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988)の類似検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理実行（GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）により、または精査により行ってもよい。
【０１０１】
同じタイプの相同性は、例えば、Zuker, M. Science 244:48-52, 1989, Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989, Jaeger et al. Methods Enzymol. 183:281-306, 1989に開示されるアルゴリズムにより核酸について得ることが可能である。
【０１０２】
保存的突然変異および相同性の記載は、変異体が保存的突然変異である特定の配列に対して少なくとも７０％の相同性を有する実施形態などのいかなる組合せでも一緒に組み合わせることが可能であると理解されている。
【０１０３】
本明細書は種々のタンパク質およびタンパク質配列を考察しているので、それらのタンパク質配列をコードすることが可能な核酸も開示されていると理解される。これは、特定のタンパク質配列に関係するすべての縮重配列、すなわち、１つの特定のタンパク質配列をコードする配列を有するすべての核酸、ならびにタンパク質配列の開示された変異体および誘導体をコードする、縮重核酸を含む、すべての核酸を含むであろう。したがって、それぞれの特定の核酸配列が本明細書に略さずに書かれているわけではない場合があるが、ありとあらゆる配列は実際には、開示されたタンパク質配列を通して本明細書に開示され記載されることは理解されている。
【０１０４】
開示された組成物中に組み込むことが可能であるアミノ酸およびペプチド類似物が多数存在することは理解されている。例えば、多数のＤアミノ酸または異なる機能的置換成分を有するアミノ酸、次に表２および表３に示されるアミノ酸が存在する。
天然に存在するペプチドの逆立体異性体（opposite stereo isomer）、ならびにペプチド類似物の立体異性体が開示される。これらのアミノ酸は、ｔＲＮＡ分子に最適なアミノ酸を付与し、遺伝子構築物を操作し、例えば、アンバーコドンを利用して類似物アミノ酸を部位特異的なやり方でペプチド鎖中に挿入させることによりポリペプチド鎖中に容易に組み込むことが可能である。
【０１０５】
ペプチドに似ているが、天然のペプチド連結を経て接続されていない分子を作成することが可能である。例えば、アミノ酸またはアミノ酸類似物の連結は、ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−−ＣＨＨ２ＳＯ−（これらおよび他の連結はSpatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications (general review); Morley, Trends Pharm Sci (1980) pp. 463-468; Hudson, D. et al., Int J Pept Prot Res 14:177-185 (1979) (--CH2NH--, CH2CH2--); Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249 (1986) (--CH H2--S); Hann J. Chem. Soc Perkin Trans. I 307-314 (1982) (--CH--CH--, cis and trans); Almquist et al. J. Med. Chem. 23:1392-1398 (1980) (--COCH2--); Jennings-White et al. Tetrahedron Lett 23:2533 (1982) (--COCH2--); Szelke et al. European Appln, EP 45665 CA (1982): 97:39405 (1982) (--CH(OH)CH2--); Holladay et al. Tetrahedron. Lett 24:4401-4404 (1983) (--C(OH)CH2--);および Hruby Life Sci 31:189-199 (1982) (--CH2--S--)に見出すことが可能である）；これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。特定の好ましい非ペプチド連結は−ＣＨ２ＮＨ−である。ペプチド類似物は、ｂ−アラニン、ｇ−アミノ酪酸などの結合原子間に２つ以上の原子を有することが可能であることは理解されている。
【０１０６】
アミノ酸類似物およびペプチド類似物は、より経済的な生産、より大きな化学的安定性、増強された薬理学的特性（半減期、吸収、効力、有効性など）、変更された特異性（例えば、生物学的活性の広域スペクトル）、低減された抗原性などの増強されたまたは望ましい特性を有する場合が多い。
【０１０７】
Ｄ−アミノ酸を使用して、より安定したペプチドを生成することができる。なぜならば、Ｄアミノ酸はペプチダーゼなどにより認識されないからである。コンセンサス配列の１つまたは複数のアミノ酸の同じタイプのＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）での組織的置換を使用して、より安定したペプチドを生成することができる。システイン残基を使用して、２つ以上ペプチドを一緒に環化させるまたは結合させることができる。これはペプチドを特定のコンフォメーションに束縛するのに有益であり得る。シグナル配列疎水性領域の一括りにされたアルファらせん形配列を使用して、ＮＴＭにおいてその膜移行コンフォメーションを安定化することができる。
【実施例】
【０１０８】
以下の実施例は、当業者に、本明細書で請求される化合物、組成物、物品、装置および／または方法がどのようにして作成され評価されるかの完全な開示および説明を提供するために提示されており、単に例証的であることが意図されており、開示を限定することを意図されていない。数（例えば、量、温度など）に関しては正確さを確保するよう努力を重ねてきたが、いくつかの誤差および逸脱は説明されるべきである。別段の指示がない限り、部は重量部であり、温度は℃であるまたは周囲温度であり、圧力は大気またはほぼ大気である。
【０１０９】
[実施例１]
核内輸送シャトルを標的にすることにより多微生物性敗血症（polymicrobial sepsis）において生存、クリアランス、および血小板減少症が改善される
多微生物性敗血症の実験モデルにおいて、ｃＳＮ５０．１を用いた核内輸送アダプターＩｍｐα５およびＩｍｐβ１の同時ターゲティングによりＳＲＴＦの核内移行が減弱され、肝臓において代謝的に重要なグリコーゲン貯蔵が維持されたことが本明細書で報告される。ＮＴＭ処置により、血液、脾臓、および肺において細菌負荷が著しく低減され、血液中の炎症促進性サイトカインおよびケモカインが減弱され、血液中の正常な血小板数が維持され、微小血管損傷並びに肝臓の好中球浸潤の血漿マーカーが低減された。さらに、ＮＴＭと抗生物質療法を組み合わせると、死亡までの平均時間が著しく延長され、生存はほぼ２倍になった。
【０１１０】
ａ）結果
（１）ＮＴＭは肝細胞においてＳＲＴＦの核内輸送を減弱し、敗血症マウスの血液、脾臓、および肺において細菌負荷を低減する
グラム陰性菌は、単独でまたは他の微生物との組合せで、患者の３分の２で敗血症の原因となっているので、多微生物性敗血症の臨床的に関連するモデルが用いられた。この非外科的モデルでは、細菌豊富な腸内マイクロバイオームを用いて標準化チャレンジにより多微生物性腹膜炎が誘発される。新たに得られた腸内マイクロバイオームを、盲腸スラリー（ＣＳ）の形態で、腹腔内に注射し、それによって外科的創傷ならびに外科的腸管穿孔モデル（cecal ligation and puncture）に伴う腹膜腔中への盲腸内容物の制御されない溢流を回避した。最新で高度に可溶性の細胞透過性ＮＴＭペプチドであるｃＳＮ５０．１を用いてＳＲＴＦの核内移行を制御すると、微小血管損傷の敗血症関連メディエーターの産生を低減し、血液および主要臓器での細菌のクリアランスを改善し、抗菌療法の有効性を増加させ、それによって生存を改善することができるという仮説を検証した。
【０１１１】
敗血症に屈する患者は、末梢血単核球の核おいてキーとなるＳＲＴＦ、ＮＦ−κＢのレベルの著しい増加を示す。この臨床特質と一致して、見出されるＮＦ−κＢ１（ｐ５０）およびＮＦ−κＢ  ＲｅｌＡ（ｐ６５）だけでなく、他の細胞の中でも、肝実質細胞、マクロファージ、および微小血管内皮細胞を含む敗血症動物の肝細胞中のリン酸化ＳＴＡＴ１α（ＭＷ９１）、リン酸化ＳＴＡＴ１β（ＭＷ８４）およびＡＰ−１（ｃＦｏｓ）も核含有量が増加していた（図２Ａ）。ＮＴＭを用いた処置により、ＮＦ−κＢ１（ｐ５０）およびＮＦ−κＢ  ＲｅｌＡ（ｐ６５）、リン酸化ＳＴＡＴ１αおよびＡＰ−１（ｃＦｏｓ）の核含有量が著しく低減された（図２Ｂ）。ＳＴＡＴ１βはＮＴＭ処置では低減されなかった。ＳＴＡＴ１αとβ両方のチロシンリン酸化は炎症性サイトカインＩＦＮ−γにより誘発されるが、ＳＴＡＴ１βは転写的に不活性な切詰め型アイソフォームでありＳＴＡＴ１αのドミナントネガティブ阻害剤の機能を果たす。核への炎症促進性シグナル伝達は、敗血症中肝臓における急速なグリコーゲン枯渇にも関係付けられてきた。したがって、ＮＴＭ処置は感染マウスの肝臓においてグリコーゲン分解を予防し、これは過ヨウ素酸シッフ染色（ＰＡＳ）により実証された（図２Ｃ）。リポ多糖毒血症についての以前の研究では、ＮＴＭは肝臓からのグリコーゲン枯渇も予防した。
【０１１２】
効率的な微生物クリアランスは多微生物性敗血症からの生存に不可欠である。注目すべきことに、抗菌療法の非存在下では、ＮＴＭを用いて処置されたＣＳ感染マウスは、感染後１２時間までに血液および標的臓器（脾臓および肺）からの増強された細菌クリアランスを示した（図３）。ｃＳＮ５０．１ペプチドは試験された盲腸細菌の増殖をエクスビボでは阻害しなかったので、ＮＴＭの直接的な抗菌効果は排除することが可能である。細菌負荷の最も劇的な低減（約７００倍）が肺において認められ、脾臓および血液中の細菌も著しく低減された。偽感染動物における細菌の微々たる検出は、複数の腹腔内注射および繰り返される血液収集に帰すことが可能である。これらの結果は、核への炎症促進性シグナル伝達がＮＴＭ処置感染動物において低減している場合には、細菌クリアランスに関する血液由来および組織食細胞の機能が保存されている、または増強さえされていることを示している。
【０１１３】
（２）ＮＴＭは炎症性メディエーターおよび免疫シグナル伝達に対するその下流効果を減弱する
敗血症の初期高炎症期（hyperinflammatory phase）の間、炎症促進性サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−６、ならびにケモカイン単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２）の血漿レベルは劇的に増加する。同時に、ＩＩ型インターフェロン、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）は細胞媒介免疫応答を増強する。ＩＦＮ−γはマクロファージ機能の特異的活性化因子であり、細菌感染に対して宿主免疫防御において調節的役割を果たす。注目すべきことに、抗ＩＦＮ−γ抗体を投与すると、腹膜炎のラットモデルにおいて腹膜の細菌負荷が著しく減少した。ＩＦＮ−γ刺激ヒト肺微小血管内皮細胞においておよび急性呼吸促拍症候群（ＡＲＤＳ）により悪化するグラム陰性菌敗血症を抱えた患者から得られたすべての血管の内皮において、微小血管完全性の中心的存在である血管内皮（ＶＥ）カドヘリンの発現の低減が観察された。ＩＬ−１０などの抗炎症性サイトカインの産生も引き金となって炎症ホメオスタシス（inflammatory homeostasis）を修復する。増加したＩＬ−１０は、ＴＮＦ−α発現を抑制し過剰な免疫応答を相殺するフィードバック機構を提供するが、ＩＬ−１０の過剰産生は細菌クリアランスを低減する。ＩＬ−１０の過剰産生が継続すると、敗血症の後期段階を特徴付ける免疫抑制環境に寄与する。しかし、炎症メディエーターの過剰産生が優勢な場合、その結果は血管機能障害、多臓器不全および死亡である。ＳＲＴＦにより媒介される核シグナル伝達が減弱すると、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、およびＩＦＮ−γの血漿レベルの著しい抑制を伴い、一方、ＩＬ−６応答のパターンは依然として変化しなかった（図４Ａ）。累積的に、敗血症誘発炎症促進性応答は、ＩＬ−６の注目すべき例外はあるが、ＮＴＭにより抑制され、これはホメオスタシス調節を維持するのに寄与する。
【０１１４】
血液および臓器からの細菌クリアランスにおける食細胞の役割と一致して、ビヒクル処置とｃＳＮ５０．１処置動物の両方が、敗血症が開始された後１２時間で偽感染動物と比べて全循環白血球の著しい増加を表し、リンパ球、好中球および単球数がＮＴＭ（ｃＳＮ５０．１）を用いた処置により抑制されないことを示した（図４Ｂ）。際立ったことに、ＮＴＭは血小板数を維持し（図４Ｂ）、一方、ビヒクル処置マウスでは、血液中の血小板数の低下により明らかにされる血小板減少症が明白であった。重症の細菌感染のこの特質は、おそらく損傷をうけた微小血管表面による血小板絞扼（platelet entrapment）およびそれに続く血小板血栓の形成に起因する、転帰不良のマーカーである。急性血小板消費および微小血管機能障害は、ＳＲＴＦにより調節されその核内移行により制御されるゲノム再プログラミングの誘発に依存している。全血球数の他のパラメータは、感染によってもＮＴＭ処置によっても著しく変わることはなかった（図５）。
【０１１５】
セレクチンは、引き続く接着および遊出のための必要条件である、微小血管内皮に沿った好中球の係留および回転を調節することにより炎症において決定的な役割を果たしている。白血球遊走は、敗血症の間の多臓器炎症および機能障害をもたらす初期事象であると思われる。白血球のセレクチン媒介回転を妨げると、その血管外遊走および引き続く臓器機能障害が予防される。Ｌ−セレクチンは白血球上で構成的に発現されており、活性化に応答して血流に急速に放出される。Ｅ−セレクチンは内皮細胞では保存されず、むしろ、グラム陰性菌の主要病原性因子であるリポ多糖により、およびＴＮＦ−αなどのサイトカインにより惹起されるゲノム上方調節によってＥ−セレクチンが発現される。次に、Ｅ−セレクチンは血流中に放出される。Ｐ−セレクチンは活性化された血小板および内皮細胞により発現され、血小板−白血球および血小板−内皮細胞相互作用を媒介して血栓形成に寄与する。ＮＴＭは、抗生物質処置に加えて、血漿において可溶性Ｐ−セレクチンの発現を減弱し、可溶性Ｅ−セレクチンの上昇を妨げ、一方、内皮損傷のこれらのマーカーの血漿レベルは抗生物質処置だけでは上昇し続けた（図４Ｃ）。
【０１１６】
低減されたサイトカイン、ケモカインおよびセレクチン産生と一致して、ＮＴＭ処置は好中球による肝臓浸潤を阻害した（図４Ｄ）。好中球の肝実質中への遊走は、偽感染動物では観察されなかった。ビヒクルを用いた処置を受けた感染マウスでは、肝実質では好中球の数の増加が観察され、全身性炎症を示していた。これとは対照的に、ＮＴＭを用いて処置されたＣＳ感染マウスは、主に漿膜表面での好中球の凝集を呈し肝実質中の細胞は少数であり、これは、腸内マイクロバイオームの標準化された「盲腸スラリー」（ＣＳ）の形態での腹腔内注射に続く腹膜腔での炎症が局所的であることを示した。
【０１１７】
累積的に、感染マウスがＮＴＭ単独でまたは抗菌療法と組み合わせて用いて処置された場合、微小血管炎症のこれらのパラメータは著しく抑制され、この過程がＳＲＴＦの核内輸送に全面的に依存していることをさらに示した。
【０１１８】
（３）抗菌療法と組み合わせた核シグナル伝達調節は敗血症において生存を増加する
次に、多微生物性敗血症の急性期でのＮＴＭの有益な作用が敗血症での全体的な生存に対してプラスの効果をもたらすことが可能かどうかを問うた。この仮説を検証するため、多微生物性敗血症のモデルにおいてＮＴＭ処置を抗菌療法と組み合わせた。図６に示されるように、重症感染症を処置するのに一般に使用されている広域スペクトルβラクタム抗生物質であるメロペネムのみで処置した動物間の生存は４２時間での生存中央値で３０％であった。これとは対照的に、メロペネム処置をＮＴＭと組み合わせた場合、生存は５５％まで著しく増加し、死亡までの平均時間は８３時間まで伸びた（図６）。生存のこの増加は、手に負えない感染を抗菌療法単独では制御できない場合、ＮＴＭを用いて炎症促進性核シグナル伝達を標的にすると、敗血症において不可逆的な多臓器損傷が予防されることを示している。
【０１１９】
ｂ）考察
本研究は、臨床的に関連のある実験モデルにおける多微生物性敗血症の動態および結果を、微生物病原性因子および内在性メディエーターにより引き起こされるゲノム嵐の原因であるストレス応答性転写因子の核内輸送を標的にすることにより改善することが可能であることを実証している。核への敗血症誘発シグナル伝達は、多臓器不全に寄与する血液および脈管系応答の原因である。機構的には、ＮＴＭは、敗血症に関与しているいくつかの細胞型の細胞膜を透過し、細胞質から核へのそれぞれＳＲＴＦおよびＳＲＥＢＰの移行により媒介される核シグナル伝達の原因であるＩｍｐα５およびＩｍｐβ１を標的にする。ＮＴＭ、ｃＳＮ５０．１ペプチドによるＩｍｐα５およびＩｍｐβ１の選択的ターゲティングは、転写因子の両方の群により調節される種々の炎症促進性および代謝遺伝子の活性化を抑制するので、ＳＲＴＦおよびＳＲＥＢＰの核内輸送は治療介入のための魅力的な標的である。ＮＦ−κＢおよび他のＳＲＴＦ（ＡＰ−１およびＳＴＡＴ１）の核内移行を妨害することにより、ＮＴＭは、サイトカイン、ケモカイン、および細胞接着分子（セレクチン）の可溶性形態を含む炎症促進性メディエーターの発現を抑制した。注目すべきことに、抗菌療法の非存在下でのＮＴＭ処置は、腸内マイクロバイオームに由来する複数の微生物種のクリアランスを増強した。これは、細菌負荷の７００倍の低減が得られた肺では特に注目すべきであった。ＮＴＭ処置のそのような効果は、肺胞マクロファージの食細胞機能を損なうことが実証されているＩＬ−１０の初期抑制と関連する可能性がある。したがって、ＮＴＭ増強細菌クリアランスは、核内輸送を標的化するこの様式が、肺および他の臓器での貪食細胞の機能に、または血液殺菌力に有害ではないことを示している。注目すべきことに、肝細胞におけるＴｏｌｌ様受容体−４（ＴＬＲ４）の細胞型特異的遺伝子破壊は、抗生物質療法なしでの腸管穿孔モデルにより引き起こされる多微生物性敗血症のモデルにおいて、増強されたマクロファージ食作用、低下した細菌レベル、および改善された生存をもたらした。したがって、核内輸送のＮＴＭターゲティングは、細菌クリアランスの点でＴＬＲ４の遺伝子破壊に類似する転帰を達成する。
【０１２０】
ＴＬＲ４は、全身性炎症の最も活性の高い生物学的誘導因子として知られている病原性因子である、ＬＰＳのキャノニカル受容体である。大腸菌（Escherichia coli）および髄膜炎菌（Neisseria meningitides）により例証されるように、グラム陰性菌により発現されるＬＰＳは高度に多様であり、著しい構造的多様性および対応する生物活性を示す。単一の細菌種由来のＬＰＳにより誘発される全身性炎症の分析により、その特定のＬＰＳの作用機序に関して貴重な情報が提供される。しかし、本研究で使用されるモデルなどの多微生物性敗血症モデルは、腸内マイクロバイオーム（「盲腸スラリー」）の腹腔内注射に基づいているが、多様なＬＰＳ構造体を発現している多数のグラム陰性菌および追加の病原性因子ならびにグラム陽性菌および他の微生物を宿主に感染させる。したがって、この臨床的に関連するモデルは宿主の防御にとっての危険度を高め、新しくより効果的な対応策の試験にさらに大きな難題を課す。
【０１２１】
多微生物性敗血症のこの複雑な設定では、核内輸送チェックポイントのターゲティング（図１参照）は、概念上の利点を提供する。このチェックポイントは、細胞質から核への核内輸送シャトルにより認識され運ばれるＮＬＳを示すストレス応答転写因子の交通を制御する。６つのインポーチンαのファミリーは、哺乳動物細胞における核内輸送の中心的存在である。休止、非刺激細胞では、インポーチンαは、例えば、ＮＦ−κＢの阻害因子（ＩκＢα）による、または翻訳後修飾、例えば、ＮＦＡＴのリン酸化による、その遮蔽のせいでＳＲＴＦ中のＮＬＳモチーフを認識することができない（図１参照）。ＩκＢαの細胞活性化誘発分解および／または他の修飾（例えば、脱リン酸化）に続いて、ＮＬＳモチーフはＳＲＴＦ上に露出され、核移行のためにインポーチンαおよびβと複合体化することが可能になる。核内部に入った後は、遊離のＳＲＴＦはＤＮＡ中のそのコグネート部位に結合し、遺伝子転写を開始して、ゲノム全体での再プログラミングが生じる。したがって、免疫および非免疫細胞の休止から活性化状態への移行は、核への転写因子の核移行により制御される。この過程の間、ＳＲＴＦは、炎症性サイトカインおよびケモカイン、シグナルトランスジューサ（シクロオキシゲナーゼ、一酸化窒素合成酵素）、ならびに細胞接着分子をコードする過度の遺伝子を活性化する。これはゲノム嵐として知られている真に大規模な応答である。
【０１２２】
次に、サイトカインおよびケモカインの複数のシグナル伝達ネットワークは、ゲノム嵐の引き金となる微生物病原体により開始される微小血管損傷を悪化させることにより成人および新生児敗血症の機序に寄与する。注目すべきことに、ＮＴＭ単独で多微生物性成人敗血症の細菌クリアランスおよび血液学的指標を改善するが、併用の抗菌療法がなければ生存を改善するのに十分ではない。反対に、抗菌療法単独では、実験炭疽敗血症モデルにおいて死亡率を低減するには十分ではない。したがって、抗菌療法とＮＴＭによる遺伝子調節ネットワークの敗血症誘発調節不全の正常化を組み合わせると、気道および腹膜の感染経路に基づく２つの異なる実験敗血症モデルにおいて生存が著しく改善された。
【０１２３】
成人患者での臨床敗血症の大半の研究では、セレクチンのレベルの増加が敗血症の指標であり、レベルが高いほど一般に、疾患の重症度および死亡率が増加することを示している。しかし、一部の研究では、生存は、可溶性セレクチンのより高い血漿レベルと相関していた。患者での転帰が悪いほど可溶性接着分子のレベルが低くなるのは、崩壊したシェディングのせいであり、細胞表面で保持されている細胞表面接着分子のレベルが上昇していると仮定されている。しかし、それらの研究は、炎症性シグナル伝達が軽快している感染ではなく、激しい感染の文脈でｓＬ−およびｓＥ−セレクチンを評価していた。実際、セレクチンは、効果的な好中球動員には必要である。実験では、ＮＴＭ処置マウスでのｓＥ−およびｓＰ−セレクチンの可溶レベルが低いほど、異常なシェディングではなく、軽快した炎症性シグナル伝達のせいで内皮損傷が低減していることを示している。これは、ＮＴＭ処置動物のｓＬセレクチンのレベルが低くなっており肝臓への白血球の血管外漏出が減少していることによっても支持されている。さらに、ＮＴＭ処置動物では細菌クリアランスが増加しているので感染と闘うための血管外漏出が増加する必要性がなくなっている。したがって、結果は矛盾してはおらず、代わりに、核移行が阻害されていることに起因する炎症性シグナル伝達の低減により、セレクチンを流す細胞の活性化が妨げられていることを示す。このように、ＮＴＭによるいくつかのＳＲＴＦの複雑な調節により、そのいずれか１つに対する効果だけではなく、複数の炎症性シグナル伝達経路を通じたシグナル伝達が正常化される（図１参照）。
【０１２４】
多微生物性敗血症の機序における核内輸送シグナル伝達についての本研究は、血液および脈管系における炎症促進性と抗炎症性機序の複雑なバランスを修復する革新的アプローチを探索するための新たな手段を切り開き、それによりその末期敗血症を含む微生物性炎症により媒介される感染症からの首尾よい回復が可能になる。しかし、敗血症を回復させるのに効果を現す機序を調査するにはさらなる研究が必要である。炎症を調節し、リンパ球のアポトーシスを低減し、恒常性への復帰を促進するレゾルビンＤ１などの脂質メディエーターの発見は、敗血症研究において登場している多くのアプローチの１つである。注目すべきことに、レゾルビンＤ１は、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）１発現およびカスパーゼ３活性を低減することにより肝細胞のＥＲストレス誘発アポトーシスを阻害する。高脂血症のモデルにおいて最近実証されたように、本明細書で使用される二機能性ＮＴＭ  ｃＳＮ５０．１は、ＳＲＴＦの核内輸送を低減することに加えて、それぞれ脂質および炭水化物恒常性の原因である転写因子のＳＲＥＢＰおよび炭水化物応答領域結合タンパク質（ＣｈＲＥＰＢ）の核内輸送も調節する。したがって、ＳＲＥＢＰおよびＣｈＲＥＰＢのＮＴＭ調節発現および作用、ならびにエンドトキシン誘発カスパーゼ３／７活性の低減は、初期敗血症でのグリコーゲン分解の抑制および敗血症の後期免疫抑制段階での細胞保護効果についての潜在的機序を提供する。敗血症生存および死亡におけるメタボロミック、プロテオミックおよび臨床変数を特徴付ける研究は、生存者および非生存者における敗血症に対する宿主応答の頑強で再現性のある違いを示した。解糖、糖新生およびクエン酸回路は、市中感染敗血症の生存者と非生存者との間で顕著に異なっており、中鎖−および短鎖脂肪酸ならびに分岐鎖アミノ酸とのカルニチンエステルの蓄積は非生存者で特定された最も明白な生化学マーカーであった。総合すると、実験的研究により、核内輸送が多微生物性敗血症の致死的転帰に寄与する不可逆的微小血管損傷の発生におけるキーとなるステップと特定されている。本研究で実証されているように、炎症促進性転写因子の核内輸送、および別の場所に記述されている代謝トランス活性化因子を標的にすると、敗血症の根底にある微生物および代謝性炎症の開始および進行が減弱される。
【０１２５】
ｃ）材料および方法
（１）ペプチド合成および精製
高度に可溶性の細胞透過性ＮＴＭペプチドｃＳＮ５０．１は、別の場所に記載されている通りに合成し、精製し、フィルター殺菌した。
【０１２６】
（２）動物、感染および試料収集
生後８週間のメスのＣ５７Ｂ１／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をすべての実験で使用し処置群には無作為に割り当てた。生存および血液サイトカイン／ケモカイン分析では、すべてのマウスは体重１ｇあたり２ｍｇのＣＳを腹腔内注射した（５．５×１０８ＣＦＵ／ｋｇ）。ＣＳはWynn et alに記載される通りに実験ごとに新たに調製した。手短に言えば、健康な生後６週間のメスのマウスを供給業者から到着後２週間未満で安楽死させ、その盲腸を単離し、盲腸内容物（「腸内マイクロバイオーム」）を押し出し、秤量して、５％ブドウ糖に８０ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁した（標準化盲腸スラリー、ＣＳ）。ＮＴＭペプチドｃＳＮ５０．１は減菌水に溶解し、減菌生理食塩水に、０．４５％ｗ／ｖのＮａＣｌ中３．３ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈した。マウスには、ＣＳチャレンジ前３０分で、並びにチャレンジ後３０分、１．５時間、２．５時間、３．５時間、６時間、９時間、および１２時間で、０．２ｍｌの腹腔内注射によりＮＴＭ（ｃＳＮ５０．１ペプチド、０．６６ｍｇ／注射）、またはビヒクル（０．４５％ｗ／ｖのＮａＣｌ）を与えた。ＮＴＭ注射は５４時間まで６時間ごとに、その後、１２時間ごとに１６８時間目（ＣＳ７日後）の屠殺まで続いた。メロペネム（２５ｍｇ／ｋｇ皮下注射で投与される）を用いた抗生物質療法は、ＣＳ後１２時間で開始され、屠殺まで１２時間ごとに続いた。血液試料（約４０μＬ）は、ＣＳチャレンジ前に、チャレンジ後２時間、６時間、１２時間および２４時間で伏在静脈からＥＤＴＡ中に収集した。血漿は遠心分離により分離し、−８０℃で保存した。マウスは実験期間中ずっと生存について入念にモニターされた。
【０１２７】
血球集団、血液および臓器の細菌コロニー化ならびに肝臓核抽出物中のＳＲＴＦの分析では、ＣＳが調製され、１．８ｍｇ  ＣＳ／体重ｇの用量で上記の通りに投与された。対照マウスは、その体重に合わせた５％のブドウ糖単独の偽用量を与えられた。ＣＳ群は、上記の通りに調製されたｃＳＮ５０．１またはビヒクルの７腹腔内注射で処置された。マウスは、ＣＳ／偽注射の１２時間後にイソフルラン吸入により安楽死させた。全血は、後眼窩叢からＥＤＴＡ中に収集した。肺、脾臓および肝臓は収穫され、液体窒素に急速凍結し、−８０℃で保存し、または細菌数では、７０％エタノール中に手早く浸し、次に氷上で０．５ｍｌの無菌ＰＢＳ中に入れた。１つの肝葉を組織学的解析のために１０％ホルマリンに固定した。肝臓は、液体窒素またはホルマリンに移す前に無菌ＰＢＳで灌流した。血球集団は、バンダービルト大学のＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｓｈａｒｅｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅにおいて自動全血球計算により新たに収集された全血において決定された。
【０１２８】
（３）核抽出物調製および免疫ブロッティング
核抽出物は凍結肝臓から調製した。手短に言えば、肝臓切片をＮＰ−４０なしで氷上、ダンス型ハンドホモジナイザー（Dounce hand homogenizer）で破壊し、抽出物調製前に１分間４０００×ｇで核ペレット化した。それぞれの群（偽感染、ＣＳ感染＋ビヒクルおよびＣＳ感染＋ｃＳＮ５０．１）中５マウス由来の抽出物を、Ｌｉｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ上で、ポリクローナルヤギ抗ｃＦｏｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、モノクローナルマウス抗Ｙ７０１リン酸化ＳＴＡＴ１（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ならびにポリクローナルウサギ抗ＮＦ−κＢｐ５０および抗ＮＦ−κＢ  ｐ６５（Ａｂｃａｍ）を使用する定量的免疫ブロッティングによりＳＲＴＦの核内移行について分析した。マウスモノクローナル抗ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ、Ａｂｃａｍ）を使用して、正規化のための核ローディングコントロール（nuclear loading control）としてＴＢＰを測定した。
【０１２９】
（４）細菌培養物
全血（５０μｌ）は無菌ＰＢＳで１対１に希釈した。左肺および全脾臓を０．５ｍｌの無菌ＰＢＳ中でホモジナイズし、無菌ＰＢＳ中で段階希釈した。試料はトリプチックソイ寒天＋５％ヒツジ血液上に蒔いた。コロニーは３７℃での一晩インキュベーション後に計数し、結果は１ミリリットルの血液、または臓器ホモジネートあたりのＣＦＵで報告した。
【０１３０】
（５）サイトカイン／ケモカインアッセイ
細胞数測定ビーズアレイ（ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、マウス血漿中のＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１、ＴＮＦα、ならびに可溶性Ｅ−およびＬ−セレクチンを製造業者のプロトコールに従って測定し、バンダービルト大学のＦｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｃｏｒｅにおいて分析した。ＩＦＮ−γおよび可溶性Ｐ−セレクチンは、ＥＬＩＺＡ（それぞれ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によりマウス血漿中で測定した。
【０１３１】
（６）組織学的解析
顕微鏡分析のために収集された組織は一晩ホルマリン中で固定し、次にルーチン的に加工し、パラフィンに包埋して、５ミクロンで薄片を作り、荷電スライドに載せた。病理学評価のためのスライドは、バンダービルト大学のＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｓｈａｒｅｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅにおいて、ＰＡＳで染色される、または好中球について免疫染色された。好中球についての免疫組織化学は、２０分間Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ２溶液を使用して、Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  Ｍａｘ（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎｃ．Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）上で実施された。スライドは、１：２０００希釈で１時間抗好中球マーカー（カタログ番号ａｂ２５５７、Ａｂｅａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）と一緒にインキュベートし、次に１：２００希釈で１５分間ウサギ抗ラット二次（ＢＡ−４００１、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）中でインキュベートした。可視化のためにはＢｏｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｒｅｆｉｎｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎシステムを使用した。免疫染色スライドは、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ製の高スループットＬｅｉｃａ  ＳＣＮ４００スライドスキャナー自動デジタル画像システムを使用して、２０倍拡大率で０．５μｍ／ピクセルの解像度まで画像化した。色彩、彩度、強度、サイズ、ラウンドネス、および軸長についての上位および下位閾値は、核の青色ヘマトキシリン染色と茶色ＤＡＢ反応産物の両方について設定した。したがって、茶色（ＤＡＢ）陽性細胞は青色（ヘマトキシリンのみ）陰性細胞と区別することが可能である。陽性茶色（ＤＡＢ陽性）染色細胞のパーセンテージは、陽性細胞の全分析数を肝臓薄片中の全細胞数で除して計算された。全スライド画像化および免疫染色の定量化は、バンダービルト大学医療センターのＤｉｇｉｔａｌ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  Ｓｈａｒｅｄ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅで実施された。
【０１３２】
（７）統計
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを統計解析のために使用した。２４時間目での血球数、血液、肺ホモジネートおよび肝臓ホモジネート中の細菌数、好中球免疫染色、ｓＰ−セレクチンの血漿レベルならびに死亡までの平均時間は、ノンパラメトリックなマン・ホイットニーのＵ検定を使用して比較した。同じ動物から異なる時点で収集した血漿中のサイトカイン、ケモカイン、ｓＬ−セレクチンおよびｓＥセレクチンレベルは、サイダックポスト検定と一緒に反復測定二元配置ＡＮＯＶＡにより評価した。核抽出物中のＳＲＴＦはｔ−検定により解析した。生存データは、カプラン・マイヤー生存曲線としてプロットし、対数順位検定により解析した。データは平均±ＳＥＭとして提示し、＜０．０５のｐ値は有意であると見なした。
【０１３３】
ｄ）参考文献
Hawiger J, Veach RA, Zienkiewicz J (2015) New paradigms in sepsis: from prevention to protection of failing microcirculation. J Thromb Haemost 13: 1743-1756. 
Kumar A, Roberts D, Wood KE, Light B, Parrillo JE, Sharma S, et al. (2006) Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit Care Med 34: 1589-1596. 
Charalambous BM, Leung MH (2012) Pneumococcal sepsis and nasopharyngeal carriage. Curr Opin Pulm Med 18: 222-227. 
Schroeder M, Brooks BD, Brooks AE (2017) The Complex Relationship between Virulence and Antibiotic Resistance. Genes (Basel) 8. 
Kroger C, Kary SC, Schauer K, Cameron AD (2016) Genetic Regulation of Virulence and Antibiotic Resistance in Acinetobacter baumannii. Genes (Basel) 8. 
Opal SM (2010) New perspectives on immunomodulatory therapy for bacteraemia and sepsis. Int J Antimicrob Agents 36 Suppl 2: S70-73. 
Beutler B (2004) Innate immunity: an overview. Mol Immunol 40: 845-859. 
Hawiger J (2001) Innate immunity and inflammation: a transcriptional paradigm. Immunol Res 23: 99-109. 
Xiao W, Mindrinos MN, Seok J, Cuschieri J, Cuenca AG, Gao H, et al. (2011) A genomic storm in critically injured humans. J Exp Med 208: 2581-2590. 
DiGiandomenico A, Veach RA, Zienkiewicz J, Moore DJ, Wylezinski LS, Hutchens MA, et al. (2014) The "genomic storm" induced by bacterial endotoxin is calmed by a nuclear transport modifier that attenuates localized and systemic inflammation. PLoS One 9: e110183. 
Angus DC, van der Poll T (2013) Severe sepsis and septic shock. N Engl J Med 369: 2063. 
Hawiger J, Musser JM (2011) How to approach genome wars in sepsis? Crit Care 15: 1007. 
Talcott B, Moore MS (1999) Getting across the nuclear pore complex. Trends Cell Biol 9: 312-318. 
Weis K (2003) Regulating access to the genome. Nucleocytoplasmic transport throughout the cell cycle. Cell 112: 441-451. 
Bohrer H, Qiu F, Zimmermann T, Zhang Y, Jllmer T, Mannel D, et al. (1997) Role of NFkappaB in the mortality of sepsis. J Clin Invest 100: 972-985. 
Ye X, Ding J, Zhou X, Chen G, Liu SF (2008) Divergent roles of endothelial NF-kappaB in multiple organ injury and bacterial clearance in mouse models of sepsis. J Exp Med 205: 1303-1315. 
Liu G, Ye X, Miller EJ, Liu SF (2014) NF-kappaB-to-AP-1 switch: a mechanism regulating transition from endothelial barrier injury to repair in endotoxemic mice. Sci Rep 4: 5543. 
Zienkiewicz J, Armitage A, Hawiger J (2013) Targeting nuclear import shuttles, importins/karyopherins alpha by a peptide mimicking the NFkappaB1/p50 nuclear localization sequence. J Am Heart Assoc 2: e000386. 
Liu Y, Major AS, Zienkiewicz J, Gabriel CL, Veach RA, Moore DJ, et al. (2013) Nuclear transport modulation reduces hypercholesterolemia, atherosclerosis, and fatty liver. J Am Heart Assoc 2: e000093. 
Veach RA, Liu D, Yao S, Chen Y, Liu XY, Downs S, et al. (2004) Receptor/transporter-independent targeting of functional peptides across the plasma membrane. J Biol Chem 279: 11425-11431. 
Torgerson TR, Colosia AD, Donahue JP, Lin YZ, Hawiger J (1998) Regulation of NF-kappa B, AP-1, NFAT, and STAT1 nuclear import in T lymphocytes by noninvasive delivery of peptide carrying the nuclear localization sequence of NF-kappa B p50. J Immunol 161: 6084-6092. 
Liu D, Liu XY, Robinson D, Burnett C, Jackson C, Seele L, et al. (2004) Suppression of Staphylococcal Enterotoxin B-induced Toxicity by a Nuclear Import Inhibitor. J Biol Chem 279: 19239-19246. 
Liu D, Li C, Chen Y, Burnett C, Liu XY, Downs S, et al. (2004) Nuclear import of proinflammatory transcription factors is required for massive liver apoptosis induced by bacterial lipopolysaccharide. J Biol Chem 279: 48434-48442. 
Liu XY, Robinson D, Veach RA, Liu D, Timmons S, Collins RD, et al. (2000) Peptide-directed suppression of a pro-inflammatory cytokine response. J Biol Chem 275: 16774-16778. 
Vincent JL, Rello J, Marshall J, Silva E, Anzueto A, Martin CD, et al. (2009) International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA 302: 2323-2329. 
Wynn JL, Scumpia PO, Delano MJ, O'Malley KA, Ungaro R, Abouhamze A, et al. (2007) Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by generalized peritonitis. Shock 28: 675-683. 
Baran-Marszak F, Feuillard J, Najjar I, Le Clorennec C, Bechet JM, Dusanter-Fourt I, et al. (2004) Differential roles of STAT1alpha and STAT1beta in fludarabine-induced cell cycle arrest and apoptosis in human B cells. Blood 104: 2475-2483.
Wallington J, Ning J, Titheradge MA (2008) The control of hepatic glycogen metabolism in an in vitro model of sepsis. Mol Cell Biochem 308: 183-192. 
Frazier WJ, Wang X, Wancket LM, Li XA, Meng X, Nelin LD, et al. (2009) Increased inflammation, impaired bacterial clearance, and metabolic disruption after gram-negative sepsis in Mkp-1-deficient mice. J Immunol 183: 7411-7419. 
Qiu G, Wang C, Smith R, Harrison K, Yin K (2001) Role of IFN-gamma in bacterial containment in a model of intra-abdominal sepsis. Shock 16: 425-429. 
Herwig MC, Tsokos M, Hermanns MI, Kirkpatrick CJ, Mueller AM (2013) Vascular Endothelial Cadherin Expression in Lung Specimens of Patients with Sepsis-Induced Acute Respiratory Distress Syndrome and Endothelial Cell Cultures. Pathobiology 80: 245-251. 
Reddy RC, Chen GH, Newstead MW, Moore T, Zeng X, Tateda K, et al. (2001) Alveolar macrophage deactivation in murine septic peritonitis: role of interleukin 10. Infect Immun 69: 1394-1401. 
Hui P, Cook DJ, Lim W, Fraser GA, Arnold DM (2011) The frequency and clinical significance of thrombocytopenia complicating critical illness: a systematic review. Chest 139: 271-278. 
Steeber DA, Tang ML, Green NE, Zhang XQ, Sloane JE, Tedder TF (1999) Leukocyte entry into sites of inflammation requires overlapping interactions between the L-selectin and ICAM-1 pathways. J Immunol 163: 2176-2186. 
Lush CW, Cepinskas G, Sibbald WJ, Kvietys PR (2001) Endothelial E- and P-selectin expression in iNOS- deficient mice exposed to polymicrobial sepsis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 280: G291-297. 
Ley K, Bullard DC, Arbones ML, Bosse R, Vestweber D, Tedder TF, et al. (1995) Sequential contribution of L- and P-selectin to leukocyte rolling in vivo. J Exp Med 181: 669-675. 
Kishimoto TK, Jutila MA, Berg EL, Butcher EC (1989) Neutrophil Mac-1 and MEL-14 adhesion proteins inversely regulated by chemotactic factors. Science 245: 1238-1241. 
Leeuwenberg JF, Smeets EF, Neefjes JJ, Shaffer MA, Cinek T, Jeunhomme TM, et al. (1992) E-selectin and intercellular adhesion molecule-1 are released by activated human endothelial cells in vitro. Immunology 77: 543-549. 
Haraldsen G, Kvale D, Lien B, Farstad IN, Brandtzaeg P (1996) Cytokine-regulated expression of E-selectin, intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) in human microvascular endothelial cells. J Immunol 156: 2558-2565. 
Duerschmied D, Bode C, Ahrens I (2014) Immune functions of platelets. Thromb Haemost 112: 678-691. 
Veach RA, Zienkiewicz J, Collins RD, Hawiger J (2012) Lethality in a murine model of pulmonary anthrax is reduced by combining nuclear transport modifier with antimicrobial therapy. PLoS One 7: e30527. 
Deng M, Scott MJ, Loughran P, Gibson G, Sodhi C, Watkins S, et al. (2013) Lipopolysaccharide clearance, bacterial clearance, and systemic inflammatory responses are regulated by cell type-specific functions of TLR4 during sepsis. J Immunol 190: 5152-5160. 
Wolff SM (1973) Biological effects of bacterial endotoxins in man. J Infect Dis 128: Suppl:259-264. 
Davis CE, Arnold K (1974) Role of meningococcal endotoxin in meningococcal purpura. J Exp Med 140: 159-171. 
Wynn JL, Wilson CS, Hawiger J, Scumpia PO, Marshall AF, Liu JH, et al. (2016) Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proc Natl Acad Sci U S A 113: E2627-2635. 
Zonneveld R, Martinelli R, Shapiro NI, Kuijpers TW, Plotz FB, Carman CV (2014) Soluble adhesion molecules as markers for sepsis and the potential pathophysiological discrepancy in neonates, children and adults. Crit Care 18: 204. 
Ley K (2003) The role of selectins in inflammation and disease. Trends Mol Med 9: 263-268. 
Buckley CD, Gilroy DW, Serhan CN (2014) Proresolving lipid mediators and mechanisms in the resolution of acute inflammation. Immunity 40: 315-327. 
Jung TW, Hwang HJ, Hong HC, Choi HY, Yoo HJ, Baik SH, et al. (2014) Resolvin D1 reduces ER stress-induced apoptosis and triglyceride accumulation through JNK pathway in HepG2 cells. Mol Cell Endocrinol 391: 30-40. 
Langley RJ, Tsalik EL, van Velkinburgh JC, Glickman SW, Rice BJ, Wang C, et al. (2013) An integrated clinico-metabolomic model improves prediction of death in sepsis. Sci Transl Med 5: 195ra195. 28 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月14日(2020.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
ｃＳＮ５０は、カポジ線維芽細胞成長因子シグナル配列の疎水性領域をｐ５０−ＮＦκＢ１の核局在化シグナル（ＮＬＳ）と組み合わせ、ＮＬＳのそれぞれの側にシステインを挿入して鎖内ジスルフィド結合を形成する断片設計環状ペプチドである。ｃＳＮ５０のアミノ酸配列は、ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰＶＱＲＫＲＱＫＬＭＰ（配列番号１３）である。ｃＳＮ５０を作成し使用する方法は、例えば、米国特許第７，５５３，９２９号明細書および米国特許第６，４９５，５１８号明細書に記載されている。これらの特許は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【国際調査報告】
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