(57)【要約】  本発明は、大腸癌の診断方法および予後の予測方法に関する。この方法では、ｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７（配列：TCCCTGGTGGTCTAGTGGTTAGGATTCGGCA（配列番号１））と、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ（配列：AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC（配列番号３））、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ（配列：UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC（配列番号４））、および、ｍｉＲ−１４２−５ｐ（配列：CAUAAAGUAGAAAGCACUACU（配列番号５））から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡとを組合せて、バイオマーカーとして使用する。結果として得られる方法は、体液を入力とする。したがって、この方法は、非侵襲的であり、疾患の最初期のステージであっても感度および特異度が高く、費用対効果も高い。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７（配列：TCCCTGGTGGTCTAGTGGTTAGGATTCGGCA（配列番号１））の発現レベルと、
下記から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの、体液サンプル中における発現レベルと、
ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ（配列：AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC（配列番号３））；
ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ（配列：UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC（配列番号４））；および、
ｍｉＲ−１４２−５ｐ（配列：CAUAAAGUAGAAAGCACUACU（配列番号５））；
を、体液サンプル中において決定する工程と、
（２）その次に、上記サンプル中におけるｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７および上記１つ以上のｍｉＲＮＡの発現レベルを、健常なヒトの体液中におけるｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７および上記１つ以上のｍｉＲＮＡの発現レベルと比較する工程と、
（３）上記サンプル中におけるｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７の発現レベルが健常なヒトの体液中におけるｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７の発現レベルよりも低く、かつ、上記サンプル中における上記１つ以上のｍｉＲＮＡの発現レベルが健常なヒトの体液中における上記ｍｉＲＮＡの発現レベルよりも高い場合に、上記サンプルにおいて大腸癌と診断する工程と、
を含むことを特徴とする、大腸癌の診断方法。
【請求項２】
ｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐおよびｍｉＲ−１４２−５ｐの全ての発現レベルを、体液サンプル中において決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記体液サンプル中における、下記ｐｉＲＮＡのうち１つ以上の発現レベルを決定する工程と、
上記発現レベルを、健常なヒトの体液中における同じｐｉＲＮＡの発現レベルと、それぞれ比較する工程と、
健常なヒトの体液中における同じｐｉＲＮＡの発現レベルと比較して、上記ｐｉＲＮＡの発現レベルが大腸癌に決定的な変化を示す場合に、サンプルにおいて大腸癌と診断する工程と、
をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【表１】
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【請求項４】
サンプル中における診断マーカーであるｐｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの１つ以上の発現レベルを、体液中における含有量が定常的な物質によって正規化する（好ましくは、ｍｉＲ−９３−５ｐ（配列：CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG（配列番号２））によって正規化する）、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
サンプル中における診断マーカーであるｐｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの１つ以上の発現レベルを、所定のカットオフ値と比較する工程を含み、
好ましくは、上記カットオフ値は、健常な統制群と大腸癌患者群とにおける発現レベル（任意構成で、正規化された発現レベル）に、統計解析を用いて得られる値である、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
サンプル中における診断マーカーであるｐｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの２つ以上の発現レベルを用いて、診断スコアを計算する工程と、
その次に、上記診断スコアを、所定のカットオフ値と比較する工程と、
を含み、
好ましくは、上記カットオフ値は、健常な統制群と大腸癌患者群とにおける発現レベル（任意構成で、正規化された発現レベル）に、統計解析を用いて得られる値である、
請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７の発現レベルを、体液サンプル中において決定する工程と、
その次に、ｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７の発現レベルを、基準発現レベルと比較する工程と、
を含む、患者の全生存予後の予測方法であって、
上記サンプル中におけるｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７の発現レベルが、上記基準発現レベルよりも高い場合には、良好な全生存予後が予測され、
上記サンプル中におけるｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７の発現レベルが、上記基準発現レベルよりも低い場合は、不良な全生存予後が予測され、
上記基準発現レベルは、全生存期間が良好な大腸癌患者群および全生存期間が不良な大腸癌患者群に由来するサンプルの統計解析から得られる、
ことを特徴とする方法。
【請求項８】
上記サンプル中におけるｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７の発現レベルは、体液中における発現レベルが定常的な物質（ｍｉＲ−９３−５ｐなど）を基準としている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
上記体液は、血液、血清、血漿、尿および唾液から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡをバイオマーカーとして使用する、体液サンプルからの大腸癌の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸癌（ＣＲＣ）は全ての癌のうち９．７％を占め、世界で３番目に多い癌である。ＣＲＣは、癌に関連する死因としては４番目に多く、全ての癌による死因の１３％以上を占めており、先進国における悪性の死因の中では２番目に多い。早期に診断された患者の生存率は、顕著に良好である。ＣＲＣに対する生存率は、診断時における疾患のステージと密接に関連しており、診断が早ければ早いほど、生存の可能性が高くなる。例えば、疾患の進行の末期（ステージＩＶ）に診断された場合、５年生存率は２０％未満である。これに対して、初期（ステージＩ）に診断された場合は、５年生存率は９０％を超える。早期診断によって、しばしば、治癒的な外科的介入の可能性が生まれてくる。この外科的介入は、疾患が原発腫瘍および所属リンパ節に限定されている患者にのみ実行できる。
【０００３】
ほとんどの大腸癌は、緩やかに展開する。小型の良性大腸腺腫として始まった後、数十年かけて進行し、大きく形成異常性の高い病変となり、最終的には悪性となる。進行がこのように緩やかであるため、予防および介入の機会が複数存在する。早期診断により、治癒的処置のための最良の機会が得られる。それゆえ、早期の外科的治療が有効であるから、早期発見によりＣＲＣ患者は大いに利益を得るであろう。
【０００４】
しかし残念ながら、依然として、ほとんどのＣＲＣの症例は、既に進行したステージにおいて診断されている。このステージにおいては、治癒的な外科的処置は不可能であり、コストが高く望ましくない副作用があるにもかかわらず、化学療法が唯一の選択肢である。ＣＲＣの効果的な診断方法が存在しないので、大腸新生物の患者は、効果的な早期診断ＣＲＣ試験から最も利益を得るであろう。この試験とは、初期ステージのＣＲＣを発見でき、これによりは予防的介入を可能にするような試験である。
【０００５】
大腸癌のリスクは、５０歳以降に上昇し始める。その後もリスクは上昇を続け、１０年ごとに約２倍になる。リスクの上昇は、女性の方が遅い。７５歳以下の女性は、男性よりもＣＲＣの発生率が低い。
【０００６】
現時点で利用できる、最も一般的かつ迅速なＣＲＣの検出手順は、以下の通りである。
（i）便潜血試験（ＦＯＢＴ）：この試験は、「癌とは出血するものであり、それゆえ化学的アッセイまたは免疫学的アッセイによって便中から検出できる」「通常は、顕著な大きさの腫瘍は、大便中に血液が検出される前に存在しているはずである」という仮定に基づいている；
（ii）画像法（仮想結腸内視鏡検査など）；および、
（iii）肉眼的異常を同定する侵襲的方法（Ｓ状結腸内視鏡検査または結腸内視鏡検査など）。
【０００７】
ＦＯＢＴは、最も広範に使用されており、臨床的に有用なＣＲＣに関する試験である。ＦＯＢＴには、ヘモグロビン中のヘムのペルオキシダーゼ様活性に関する粗試験（グアヤック検査）、または、ヘモグロビンに対する特異的抗体に関する粗試験（糞便免疫化学試験；ＦＩＴ）が含まれる。しかし、このスクリーニング技術は、いくつかの短所に悩まされている。最大の短所は、感度が約５０％にとどまっており、腺腫に関しては感度が２０％しかないことである（腺腫が大きければ、１０例のうち１例は癌へと発展する）。このことは、「腺腫およびＣＲＣの全てが出血するわけではない」という事実に起因している。この試験はまた、あまり特異的ではない。というのも、便中に出現する血液は、非腫瘍状態（例えば、潰瘍性大腸炎、痔核、瘻孔など）にも関連しうるためである。したがって、結腸内視鏡検査も実施しなければならないが、これには次のような短所がある。
【０００８】
コンピュータ断層撮影コロノグラフィ（ＣＴＣ）、すなわち仮想結腸内視鏡検査は、結腸を画像化する最近の非侵襲的技術である。ＣＴＣに関しては、アッセイの性能特性が著しく異なっていることが報告されている（特異度：３９％〜９４％）。このことは、主として、患者の準備や、分析に使用するハードウェアおよびソフトウェアにおける、技術上の差異に起因している。ＣＴＣの他の制約としては、偽陽性の読取りが高い点、平坦な腺腫を検出できない点、ポリープを除去できない点、反復的かつ累積的な放射線照射、コストなどが挙げられる。
【０００９】
肉眼的異常を同定するための侵襲的方法としては、Ｓ状結腸内視鏡検査および結腸内視鏡検査が挙げられる。結腸内視鏡検査は、一般的には、ＣＲＣ、腺腫性ポリープまたは他の素因疾患（炎症性腸疾患など）の既往歴を有している、５０歳超の平均的個人および高リスク個人をスクリーニングするための好ましい方法である。結腸内視鏡検査は、依然として、ポリープおよびＣＲＣの有無に関する標準的な検査である。しかし、直径１ｃｍ超の病変の１５％までを見逃すことがある。結腸内視鏡検査に伴う合併症には、穿孔、出血、呼吸の低下、不整脈、感染などがある。１，０００人に約１人が穿孔を患い、１，０００人に３人が出血を経験する。この手順によって、１０，０００回の検査あたり１〜３人が死亡している。また、他の欠点のために、結腸内視鏡検査は、一般集団のためのルーティン的なＣＲＣスクリーニング法になれないかもしれない（訓練された要員の不足、患者の不快感、高コスト、結腸内視鏡検査に関するコンプライアンスの低さ（約２％）など）。大部分の散発性ＣＲＣは、良性腺腫から発展すると考えられており、そのうちのごく少数が悪性腫瘍にまで発展する。良性腺腫から悪性に発展する期間が５〜１０年であることを考慮すると、結腸内視鏡検査による一般集団を対象とした腺腫の検出は、患者に対して著しく過剰な治療を必要とし、費用がかかり、潜在的には有害である。結腸内視鏡検査は、ＦＯＢＴで陽性となった後の次の検査であるが、偽陽性率が６０％ある。それゆえ、不必要なリスクを課すこととなり、これは改善が必要である。
【００１０】
したがって、早期診断を（好ましくは、予後の予測も）可能とし、さらに、後には患者の進行および治療に対する応答の正確なモニタリングを可能とするバイオマーカーが、強く求められている。低侵襲性または非侵襲性の方法によって患者から得られるサンプル（血液サンプルなど）中に存在するバイオマーカーは、集団スクリーニングにおいて使用できるので好ましい。
【００１１】
現在、初期のＣＲＣを検出する血清学的スクリーニング検査または特異的診断試験は存在していない。最近では、大腸癌に対する感度が高く特異的な血液検査として、セプチンの９メチル化が報告されている（Warren et al (BMC Med 9 (2011) 133)）。商用化されている検査もあるが、この検査は労働集約的で高価であるため、ルーティン的なスクリーニングには用いられていない。
【００１２】
近年、いわゆるＣＲＣ特異的遺伝子が多数報告されている。これに該当する研究論文または特許出願の大多数は、結腸癌組織におけるＲＮＡ発現パターンと、異なる組織（隣接する正常組織または健常な結腸組織）におけるＲＮＡ発現パターンとの比較分析によって得られたデータに基づいている。このようなアプローチは、差異のあるｍＲＮＡを表示する技術として要約できる。しかし、ｍＲＮＡのレベルの差は、対応するタンパク質のレベルには必ずしも反映されない。少量のｍＲＮＡにコードされているタンパク質が、非常に多量に発見される場合がある。その一方で、多量のｍＲＮＡにコードされているタンパク質でも、発見することが全く困難な場合もある。ｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルとの間の相関の欠如は、ｍＲＮＡの安定性、翻訳の効率、タンパク質の安定性などの理由による。
【００１３】
また、最新のアプローチでは、異なる組織間（または、健常組織と疾患組織との間）のタンパク質パターンの差異を探求することによって、ＣＲＣの診断に使える可能性がある候補マーカー分子を同定する。隣接する正常組織よりもＣＲＣ組織において多く存在すると思われる、７種類の核マトリクスタンパク質が同定されている（Bruenagel et al. (Cancer Research 62 (2002) 2437-2442)）。さらに、国際公開第２０１０／０６１９９６号は、複数のタンパク質バイオマーカーを開示しており、当該バイオマーカーのうちのいくつかは、ＣＲＣ患者の血清中で検出されうる。
【００１４】
大腸癌の分子マーカーとして知られている他の代表例には、以下がある。国際公開第２００５／０１５２２４号は、タンパク質ＲＬＡ−０（６０Ｓ酸性リボソームタンパク質Ｐ０）に対する抗体を使用して、大腸癌を診断する方法を開示している。国際公開第２００４／０７９３６８号は、ＨＳＰ９０が大腸癌において多く発現することを開示している。国際公開第２００４／０７１２６７号は、便サンプル中のＮＮＭＴ（ニコチンアミドＮ−メチルトランスフェラーゼ）を測定することによる、初期大腸癌の診断方法を開示している。国際公開第２００５／０１５２３４号は、ＳＡＨＨ（Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ）タンパク質が大腸癌の診断に利用できるを開示している。さらに、米国特許第７，５０１，２４３号は、結腸癌マーカーとしてＴＴＫ（チロシントレオニンキナーゼ）を開示している。
【００１５】
しかし、候補タンパク質マーカーは提案されてはいるものの、今日まで、それらの臨床的有用性／診断的有用性は実証されていない。理想的には、単一マーカーである新規な診断マーカーは、単独で（または、１つ以上の他のマーカーと組合せて使用される場合に）、現在使用されている診断方法と比較して、診断の感度および／または特異度が進歩しているはずである。現在では、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）またはＣＡ１９−９の検出に基づく診断血液試験が、ＣＲＣ分野における診断補助に利用できる。最初の血清癌胎児性抗原（ＣＥＡ）アッセイの開発（１９６５年）により、血液中でのスクリーニング検査の可能性について、かなりの期待がもたらされた。しかし、その後の研究が示したところによると、浸潤癌を有する個体におけるＣＥＡの感度は、３５％未満であった。また、ＣＥＡは初期形態を検出できず、ＣＥＡの特異度は不充分であった。これは、ＣＥＡの血清レベルは、いくつかの病理において増加するためである。より最近になって紹介されたＣＡ１９−９抗原の限界も、ＣＥＡの限界と同じようなものである。現在、これら２種類の分子は、治療後の観察に限定して使用されている。さらに、これらのバイオマーカーは、他の種類の癌によっても発現するし、良性病理においても発現する。以上に挙げた全てのことにもかかわらず、他の腫瘍マーカーとＣＥＡとを組合せることによって、特異度を失うことなく感度を増加させることができる。
【００１６】
昨今報告されたところによると、循環しているｍｉＲＮＡの特徴的なパネルによれば、患者の体液（とりわけ血清）から、結腸癌の非侵襲的な早期の検出および予後の予測が可能となる（Vychytilova-Faltejskova et al., Carcinogenesis, 2016, 941-950）。診断パネルには、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｍｉＲ−２７６ｃ−３ｐが含まれており、独立した検証によって、感度：８９％、特異度：８１％を示した。予後パネルには、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐおよびｍｉＲ−２７６ｃ−３ｐが含まれていた。しかしながら、この診断および予後パネルの一部のメンバーは、大腸癌以外の他の固形癌に関与していると記載されている。したがって、集団スクリーニングにおける特異度は、低くなる可能性がある。
【００１７】
総合すると、上述の診断アプローチは、大腸癌の初期ステージ（ＩおよびＩＩ）を検出する際の感度が低い。また、血液サンプルからＣＲＣを検出するための、信頼性をもって使用できる明確なバイオマーカーは、今日まで同定されていない。したがって、非侵襲的な様式で検査でき、ＣＲＣを早期に検出する特定のバイオマーカーの同定に対する臨床的な要望が存在している。
【００１８】
本発明の目的は、スクリーニング検査において使用でき、また疾患の初期ステージとも関連性がある、ＣＲＣの診断および予後の予測に好適な体液バイオマーカーを同定することによって、生存率を増加させることにある。望ましい検査には、以下の特徴のうち、可能な限り多くが含まれるであろう：平均並みのリスク、無症状の個体、高感度、非侵襲的、低リスク、費用効果が良い、大規模集団に容易に適用できる。
【発明の概要】
【００１９】
本発明は、新規に同定されたｐｉＲＮＡを提供し、これは大腸癌バイオマーカーとして有用である。ｐｉＲＮＡ（ＰＩＷＩ相互作用性ＲＮＡ）は、真核細胞において発現する、小型の非コードＲＮＡ分子である。ｐｉＲＮＡとｍｉＲＮＡとは、大きさが異なる点（前者が２６〜３１ヌクレオチド、後者が２１〜２４ヌクレオチド）、配列保存性が欠如している点、および複雑性が高い点において区別される。ｐｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡよりも特異的なマーカーであると見られる。
【００２０】
新規に同定されたｐｉＲＮＡは、以下の２つである。一つは、ｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７（配列：TCCCTGGTGGTCTAGTGGTTAGGATTCGGCA（配列番号１））（ｐｉＲ−５９３７、別名：ｐｉＲ−４３７７１）である。もう一つは、ｐｉＲ−２８８７６（配列：GTTTCCGTAGTGTAGTGGTCATCACGTTCGC（配列番号１５））である。これらのｐｉＲＮＡはいずれも、大腸癌バイオマーカーとして有用であり、癌患者においては下方制御されている。
【００２１】
さらに、上記のｐｉＲＮＡは、他のｐｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡと組合せたバイオマーカーとして使用される。循環しているｐｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの発現レベルが使用される。また、患者に由来する体液サンプルを使用して、診断方法および／または予後の予測方法を実施する。使用できる体液としては、特に、血液、血清、血漿、尿および唾液が挙げられる。
【００２２】
したがって、本発明の第１の態様では、大腸癌の診断方法が提供される。この方法は、
ｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７の発現レベルを、体液サンプルにおいて決定する工程と、
その次に、上記サンプルにおけるｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７の発現レベルを、健常なヒトの体液におけるｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７の発現レベルと比較する工程と、
を含み、
上記サンプルにおけるｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７の発現レベルが、健常なヒトの体液におけるｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７の発現レベルよりも低い場合に、サンプルにおいて大腸癌と診断する方法である。
【００２３】
マーカーとしてｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７を使用する、上記大腸癌の診断方法は、
下記から選択される１つ以上のｍｉＲＮＡの体液サンプルにおける発現レベルを決定する工程と、
ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ（配列：AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC（配列番号３））；
ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ（配列：UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC（配列番号４））；
ｍｉＲ−１４２−５ｐ（配列：CAUAAAGUAGAAAGCACUACU（配列番号５））；
発現レベルを、健常なヒトの体液中における同じｍｉＲＮＡの発現レベルと比較する工程と、をさらに含み、
上記サンプル中の上記ｍｉＲＮＡの発現レベルが、健常なヒトの体液中の上記ｍｉＲＮＡの発現レベルよりも高い場合に、サンプルにおいて大腸癌と診断する。
【００２４】
健常なヒトの体液における発現レベルは、大腸癌に罹患していない健常なボランティアから得られる体液サンプルにおける発現レベルを定めることによって得られる。望ましい場合は、公知の統計的手法によって発現の平均レベルを得てもよい。
【００２５】
発現レベルを比較するためには、サンプル中のｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７の含有量を、体液中の含有量が定常的である物質を基準として用いること（すなわち、正規化すること）が有効である。このような物質は、ｍｉＲ−９３−５ｐ（配列：CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG（配列番号２））であってもよい。
【００２６】
サンプル中における上記のｍｉＲＮＡの含有量を、体液中における含有量が定常的な物質（すなわち、正規化用のマーカー）を基準とすることもまた、有用である。好ましくは、正規化用のマーカーは、ｍｉＲ−９３−５ｐである。
【００２７】
一実施形態において、診断スコア（Ｄｘスコア）は、バイオマーカーの発現レベルから（または、好ましくは、正規化されたバイオマーカーの発現レベルから）計算できる。診断スコアの値は、その後、大腸癌に罹患している患者と大腸癌に罹患していない患者との分類に使用できる。
【００２８】
Ｄｘスコアがカットオフ値よりも高い場合、サンプルは陽性である（大腸癌と診断される）。Ｄｘスコアがカットオフ値よりも低い場合、サンプルは陰性である（大腸癌と診断されない）。カットオフ値は、公知の方法によって得られる。例えば、健常なボランティア群（統制群）および大腸癌患者群における、正規化された体液レベルの統計解析によって得られる。
【００２９】
Ｄｘスコアを使用することにより、この方法の感度は９６．２５％、特異度は９７．５０％にも到達しうる。
【００３０】
一実施形態においては、サンプル中におけるｈｓａ−ｍｉＲ−２３ａの正規化された血清レベルを、Ｘ（ｍｉＲ−２３ａ）＝２−（Ｃｔ．ｍｉＲ２３ａ-Ｃｔ．ｍｉＲ９３）で計算する。サンプル中におけるｈｓａ−ｍｉＲ−２７ａの正規化された血清レベルを、Ｘ（ｍｉＲ−２７ａ）＝２−（Ｃｔ．ｍｉＲ２７ａ-Ｃｔ．ｍｉＲ９３）で計算する。サンプル中におけるｈｓａ−ｍｉＲ−１４２−５ｐの正規化された血清レベルを、Ｘ（ｍｉＲ−１４２−５ｐ）＝２−（Ｃｔ．ｍｉＲ１４２−５ｐ-Ｃｔ．ｍｉＲ９３）で計算する。サンプル中におけるｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７の正規化された血清レベルを、Ｘ（ｐｉＲ−５９３７）＝２−（Ｃｔ．ｐｉＲ５９３７-Ｃｔ．ｍｉＲ９３）で計算する。
【００３１】
また、診断スコア（Ｄｘスコア）の計算には、以下の式が使用できる。
Ｄｘスコア＝−０．８８９５＋６２．９２６４８×Ｘ（ｍｉＲ−２３ａ）−８．０８９２８×Ｘ（ｍｉＲ−２７ａ）＋７３．１６７４５×Ｘ（ｍｉＲ−１４２−５ｐ）−１．６７５７×Ｘ（ｐｉＲ−５９３７）。
【００３２】
正規化されたバイオマーカーのレベルおよび診断スコア（Ｄｘスコア）を使用することができる。好ましくは、正規化用のマーカーはｍｉＲ−９３−５ｐである。正規化されたレベルまたはＤｘスコアが所定のカットオフ値よりも低い場合、サンプルは陽性である（大腸癌と診断される）。正規化されたレベルまたはＤｘスコアが所定のカットオフ値よりも高い場合、サンプルは陰性である（大腸癌と診断されない）。所定のカットオフ値および／またはＤｘスコアは、公知の方法によって得ることができ、決定することができる。例えば、健常なボランティア群（統制群）および大腸癌患者群における、正規化された体液レベルの統計解析によって得ることができ、決定することができる。
【００３３】
さらに、上記の大腸癌の診断方法は、
体液サンプル中における、下記ｐｉＲＮＡのうち１つ以上のｐｉＲＮＡの発現レベルを決定する工程と、
上記発現レベルを、健常なヒトの体液中の同じｐｉＲＮＡの発現レベルと、それぞれ比較する工程と、
健常なヒトの体液中における同じｐｉＲＮＡの発現レベルと比較して、上記ｐｉＲＮＡの発現レベルが大腸癌に決定的な変化を示す場合に、上記サンプルにおいて大腸癌と診断する工程と、
をさらに含んでもよい。
【００３４】
【表１】
2020527047.tif 000003
【００３５】
本発明で使用されるｍｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡは全て、体液中において含有量が定常的である同じ物質（ｍｉＲ−９３−５ｐなど）を基準とすることができる。
【００３６】
一実施形態において、診断スコア（Ｄｘスコア）は、バイオマーカーの発現レベルから（または、好ましくは、正規化されたバイオマーカーの発現レベルから）計算できる。診断スコアの値は、その後、大腸癌に罹患している患者と、大腸癌に罹患していない患者との分類に使用できる。
【００３７】
所定のカットオフ値および／またはＤｘスコアは、公知の方法によって得ることができ、決定することができる。例えば、健常なボランティア群（統制群）および大腸癌患者群における正規化された体液レベルの統計解析によって得ることができ、決定することができる。
【００３８】
本発明の診断方法によれば、たとえ最初期のステージ（臨床ステージＩおよび臨床ステージＩＩ）であったとしても、大腸癌の診断が可能となる。このことによって、患者の治療が成功する可能性が著しく増加する。この診断方法は、１つのｐｉＲＮＡのみを用いて実施できる。そして、その感度および特異度は、さらなるマーカーを追加することによって、より改善されうる。初期ステージのサンプルに関して達成された感度および特異度が示すところによると、この診断方法は、集団のスクリーニングにおける使用に非常に好適である。臨床現場で現在使用されている診断方法とは異なり、本発明の方法は非侵襲的であり、患者の快適さを増大させ、患者からサンプルを採取するための複雑な装置を必要としない。これらの利益によって、スクリーニングに参加する意思のある人が増加するであろう。また、大腸癌が早期に検出されるようになり、患者の回復および完治の可能性が大幅に向上するであろう。
【００３９】
本発明のＣＲＣ特異的バイオマーカーは、循環しているｐｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡである。すなわち、体液中におけるこれらのレベルが、ＣＲＣの診断および予後を示している。これらのバイオマーカーに基づく検査は、一般大衆に広く受け容れられる余地がある。なぜならば、侵襲性が最小限であり、従来のスクリーニング方法に頼る前に（または、従来のスクリーニング方法と組合せて）疾患に対する個人の感受性のモニタリングに使用できるからである。このことは、ＣＲＣのリスク、予防および治療を管理する上で、極めて有益である。
【００４０】
以上の観点から、小型の非コードＲＮＡ（マイクロＲＮＡおよびＰＩＷＩ相互作用性ＲＮＡ）の検出によって、非常に有望な診断アプローチを提供される。
【００４１】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子発現の重要な調節因子であり、多様なクラスの小型の内因性非コードＲＮＡが含まれている（長さ：１８〜２５ヌクレオチド）。マイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡ分解を促進させるたり、タンパク質翻訳を減衰させたりできる。バイオインフォマティクス研究によると、ｍｉＲＮＡは全てのヒト遺伝子のうちの５０％超を調節しており、それぞれのｍｉＲＮＡは数百もの遺伝子標的を制御できると推定されている。いくつかのｍｉＲＮＡは、細胞特異的、組織特異的および／または発生段階特異的に発現する。一方、他のｍｉＲＮＡは、遍在的に発現する。検証されたｍｉＲＮＡの数は、増加し続けている。ｗｅｂベースのデータベース「ｍｉＲＢａｓｅ」の最新バージョンでは、ヒトゲノム中の１８００超の前駆配列および２３４２超の成熟配列がアノテーションされている。ｍｉＲＮＡのゲノム位置に関するアノテーションによると、ｍｉＲＮＡの大部分は、遺伝子間の領域（アノテーションされている遺伝子または予想される遺伝子から１ｋｂ超離れている領域）に位置していることが示されている。このため、大部分のｍｉＲＮＡ遺伝子は、自律転写単位として転写されると仮定されている。
【００４２】
ｍｉＲＮＡは、多くの基本的な生物学的プロセスの主要調節因子として働くことがあり（胚発生、器官形成、細胞分化、増殖、アポトーシスなど）、幹細胞性や免疫などの主要な生物学的システムに影響を及ぼしている。
【００４３】
ｍＲＮＡと比較すると、マイクロＲＮＡは、より好ましいバイオマーカーである。ｍｉＲＮＡは半減期が長く、ＲＮＡ分解酵素への曝露、極端なｐＨ、長期保存、複数回の凍結融解サイクルなどの条件下における安定性が高いからである。
【００４４】
ＰＩＷＩ相互作用性ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）は、動物細胞において発現する小型の非コードＲＮＡ分子のうち、最大のクラスである。ｐｉＲＮＡは、ＰＩＷＩタンパク質との相互作用を介して、ＲＮＡ−タンパク質複合体を形成する。ｐｉＲＮＡとｍｉＲＮＡとでは、大きさが異なっており（前者が２６〜３１ｎｔであり、後者が２１〜２４ｎｔである）、また、配列保存性が欠如している点、および複雑性が増加している点においても異なっている。これらの小型ＲＮＡは、転写レベルおよび転写後レベルにおいて遺伝子発現を調節している。その他に、これらの小型ＲＮＡは、転移因子であるＬＩＮＥおよびＳＩＮＥのサイレンシングに優先的に関与しており、したがってゲノムの安定性に寄与している。さらに、ｐｉＲＮＡは、他の重要な生物学的プロセスにも関与している（配偶子形成、染色体の分離、幹細胞の自己再生など）。当初、ｐｉＲＮＡの発現は、生殖細胞系の細胞において記録された。しかし、ｐｉＲＮＡは全ての種類の組織に存在し、その発現は高度に組織特異的であることが判っている。さらに、腫瘍組織においては、ｐｉＲＮＡの発現の調節が失われていることが記録されている。それにもかかわらず、これらの分子の癌発生における正確な機能は知られていない。近年では、遊離循環しているｐｉＲＮＡが体液中に安定に存在することが報告されている。
【００４５】
本発明の第２の態様では、患者の全生存予後の予測方法が提供される。この方法は、
ｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７の発現レベルを、体液サンプル中において決定する工程と、
その次に、ｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７の発現レベルを、基準発現レベルと比較する工程と、を含み、
上記サンプル中におけるｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７の発現レベルが、上記基準発現レベルよりも高い場合には、良好な全生存予後が予測され、
上記サンプル中におけるｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７の発現レベルが、上記基準発現レベルよりも低い場合は、不良な全生存予後が予測される。
【００４６】
基準発現レベルは、良好な全生存期間（例えば、診断から少なくとも３年超）を有する大腸癌患者群に由来するサンプルと、不良な全生存期間（例えば、診断から３年未満）を有する大腸癌患者群に由来するサンプルとを統計解析することにより得られる。データの取得方法、評価方法および統計解析手法は、当業者に知られている。例えば、受信者動作特性解析（ＲＯＣ解析）を使用して、基準発現レベルを特定してもよい。
【００４７】
良好な全生存予後は、所定の年数以上（または、月数以上）の全生存の予後を意味する。例えば、診断から２０ヶ月以上、２４ヶ月以上、２６ヶ月以上、２６ヶ月以上または３年以上の全生存の予後を意味する。
【００４８】
不良な全生存予後は、所定の年数未満（または、月数未満）の全生存の予後を意味する。例えば、診断から２０ヶ月未満、２４ヶ月未満、２６ヶ月未満または３年未満の全生存の予後を意味する。
【００４９】
発現レベルを比較するために、サンプル中のｐｉＲＮＡ−ｈｓａ−５９３７の含有量は、体液中における含有量が定常的な物質（ｍｉＲ−９３−５ｐなど）を基準とすることが有用である。
【００５０】
［バイオマーカーの検出］
本発明のｐｉＲＮＡバイオマーカーおよびｍｉＲＮＡバイオマーカーの検出は、公知の方法によって実施してもよい（リアルタイムＰＣＲアッセイ、マイクロアレイアッセイ、組織化学アッセイ、免疫学的アッセイ、シーケンシングアッセイなど）。
【００５１】
ｍｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡは、いずれも、病院レベルの実験室医学部門で利用可能な、標準的なリアルタイムＲＴＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）技術によって検出できる。血清学的試験と比較したときの、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの主な利点は、感度、信頼性および特異度が高い点である。今日では、ＰＣＲを用いた個別のｍｉＲＮＡ／ｐｉＲＮＡアッセイにかかるコストは、充分に低い。そのため、スクリーニングプログラムにおいて、集団全体にわたる運用が可能である。市販のアッセイを利用して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってｍｉＲＮＡ／ｐｉＲＮＡを検出することができる（例えば、Thermo Fischer Scientific）。
【００５２】
ＲＴ−ＰＣＴ法においては、最初に逆転写（ＲＴ）を利用して、標的ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する。次に、いくつかある従来のＰＣＲ法のうちの一つによって、ｃＤＮＡを増幅および定量する。しかし、これらの方法をｍｉＲＮＡ／ｐｉＲＮＡへと単純に転用することは、標的のサイズが短いために困難である。というのも、通常のＰＣＲ工程において使用されるプライマーの長さは、成熟ｍｉＲＮＡ／成熟ｐｉＲＮＡ自体と同じ長さなのでである。短鎖プライマーは、通常は有用でない。なぜならば、短鎖プライマーとｍｉＲＮＡ／ｐｉＲＮＡとの間の２本鎖は融解温度が低く、したがって信号バイアスが入り込む可能性があるためである。これらの問題を回避するために、本研究者らは、従来のプライマー（または、成熟ｍｉＲＮＡ／ｐｉＲＮＡ用の全く新規なプライマー）の酵素修飾に基づく、いくつかの創造的アプローチを開発した。現在のところ、ｍｉＲＮＡ／ｐｉＲＮＡの定量的ＰＣＲには、２つの主要な方法がある（ステム−ループＲＴに基づく方法、および、ポリデニル化(polydenylation)に基づく方法）。
【００５３】
［統計的手法］
受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）は、診断試験を評価するための、標準的な分析ツールである。バイオマーカーの診断精度は、最も一般的には、感度および特異度を計算することによって測られる。感度とは、真に疾患を有している患者のうち、「疾患を有している」と正しく分類された患者の割合である。同様に、特異度とは、真に疾患を有していない全ての患者のうち、「疾患を有していない」と正しく分類された患者の割合である。ほとんどの診断バイオマーカーの結果は、連続的なスケールによって提供される。そのため、試験の感度および特異度は、選択した特定の閾値に依存する。ＲＯＣ解析は、このような特定の閾値を同定するための統計的手法である。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、特異度の範囲全体にわたる、バイオマーカーの平均感度である。一般的に、ＡＵＣは、バイオマーカーの全体的な性能を表す要約統計量として使用される。予測に関与しないバイオマーカーのＡＵＣは、０．５である（この線は、上向きの対角線（偶然線）によって表される）。一方、疾患を完全に予測できるバイオマーカーのＡＵＣは、１である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】血清中におけるｐｉＲ−５９３７（Ａ、Ｂ）およびｐｉＲ−２８８７６（Ｃ、Ｄ）の、大腸癌における診断バイオマーカーとしての検証。Ａ、ＣはMann-Whitney検定であり、Ｂ、ＤはＲＯＣ解析である。
【図２】ｐｉＲ−５９３７の血清レベルは、大腸癌患者の全生存と強く相関している（ログ・ランク検定、Ｐ＜０．０００１）。
【図３】大腸癌患者（全ての臨床ステージ、ＴＮＭ：Ｉ〜ＩＶ）および健常なコントロールにおける、ｍｉＲＮＡレベルおよびｐｉＲＮＡレベル（***は、Ｐ＜０．０００１を表す）。
【図４】大腸癌患者（初期ステージ、ＴＮＭ：Ｉ〜ＩＩ）および健常なコントロールにおける、ｍｉＲＮＡレベルおよびｐｉＲＮＡレベル。
【図５】血清中のｍｉＲ−２３ａ−３ｐレベル、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐレベル、ｍｉＲ−１４２−５ｐレベルおよびｐｉＲ−５９３７レベルに基づく、Ｄｘスコア１の検証。全てのステージの大腸癌患者（Ａ、Ｃ）におけるものと、および初期ステージの大腸癌患者（Ｂ、Ｄ）におけるもの。
【図６】血清中のｍｉＲ−２３ａ−３ｐレベルおよびｐｉＲ−５９３７レベルに基づく、Ｄｘスコア２の検証。全てのステージの大腸癌患者（Ａ、Ｃ）におけるものと、および初期ステージの大腸癌患者（Ｂ、Ｄ）におけるもの。
【実施例】
【００５５】
〔患者および方法〕
［患者］
血清サンプルは、ｐｉＲＮＡプロファイリング研究に参加した、１４４例の大腸癌症例（ＴＮＭステージＩの患者：３６人、ＴＮＭステージＩＩの患者：３６人、ＴＮＭステージＩＩＩの患者：３６人、ＴＮＭステージＩＶの患者：３６人。男性：８２人、女性：６２人。平均年齢：６５歳）およびコントロール９６人（男性：４８人、女性：４８人；平均年齢６２歳）から収集した。候補ｐｉＲＮＡを、独立して検証するために、さらに８０例（ＴＮＭ臨床ステージＩの患者：１９人、ＴＮＭ臨床ステージＩＩの患者：２１人、ＴＮＭ臨床ステージＩＩＩの患者：２１人、ＴＮＭ臨床ステージＩＶの：患者１９人。男性：４４人、女性：３６人。平均年齢６５歳）およびコントロール８０人（男性：４７人、女性：３３人。平均年齢：６０歳）が参加した。また、疾患が初期ステージにある、さらに９０例の大腸癌症例（ＴＮＭステージ１の患者：４０人、ＴＮＭステージ２の患者：５０人。男性：５０人、女性：４０人。平均年齢：６１歳）およびコントロール１００人（男性：５２人、女性：４８人。平均年齢：５９歳）を利用して、同定されたｍｉＲＮＡ／ｐｉＲＮＡバイオマーカーおよびモデルを評価した。研究に登録された全ての被験者は、同じ民族的背景を有しており（ヨーロッパ系）、大腸癌患者は、ネオアジュバント治療を全く受けなかった。溶血はいくつかのｍｉＲＮＡの発現に影響を及ぼしうるので、溶血している血清サンプルは研究から除外した。全ての参加者（患者および健常なドナー）から書面によるインフォームドコンセントを得た。この研究は、Masaryk Memorial Cancer Instituteの地域倫理委員会によって承認された。
【００５６】
［ＲＮＡの抽出］
ＲＮＡ抽出の前に、全てのサンプルの溶血を確認した。この確認には、３点における（３８０ｎｍ、４１５ｎｍおよび４５０ｎｍ）Allen補正法によってヘモグロビン濃度を定量化する、Harboeの分光光度法を利用した。ヘモグロビン濃度が５ｍｇ・ｄＬ−１よりも低いサンプルのみを、研究において使用した。血清から、小型ＲＮＡを多く含んでいる全ＲＮＡを単離した。この単離にはQiagen miRNeasy Serum/Plasma Kit（Qiagen, GmbH, Hilden, Germany）を用い、製造者のプロトコルを改変したものに従った。簡潔に述べると、２５０μＬの血清を氷上で解凍し、４℃、１４０００×ｇにて５分間遠心分離して、細胞残渣を除去した。次に、２００μＬの上清を、１ｍＬのQIAzol Lysis Reagentで溶解させた。各サンプルに、１．２５μＬの0.8 μg・μl-1 MS2 RNA carrier（cat. no. 10165948001, Roche, Basel, Switzerland）を、１ｍＬのQIAzol溶液に添加した。抽出したＲＮＡを、２×２０μＬの予熱したElution Solutionで溶出させた。ライブラリを作製するために、ＲＮＡは常に、１２個のサンプルから別々に単離した（１２×２５０μＬ。結腸癌患者の場合、１２人の患者は全員同じステージであった）。相分離の後、１２個のサンプルの全てから上層の水相を集め、１．５容量の１００％エタノールと混合し、１個のRNeasy MinElute spin columnにピペットで移した。溶出には、１４μＬの予熱したElution Solutionを用いた。ＲＮＡの濃度および純度は、光学密度（Ａ２６０／２８０＞２．０；Ａ２６０／２３０＞１．８）を測定することによって、分光光度法で測定した。測定には、NanoDrop ND-1000分光光度計（Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA）を用いた。また、ＮＧＳ用にプールしておいたサンプルのＲＮＡ濃度および品質は、Qubit 2.0蛍光光度計（Thermo Fisher Scientific）およびAgilent 2100バイオアナライザ（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）を用いて測定した。サンプルは、−８０℃にて保存するか、またはさらなる処理に供した。
【００５７】
［小型ＲＮＡライブラリの構築およびシーケンシング］
全てのライブラリは、Illumina TruSeq Small RNA protocol（Illumina, San Diego, CA, USA）を使用して、製造者の説明書に従って調製した。簡潔に述べると、小型ＲＮＡを多く含んでいる全ＲＮＡを１μｇ以上使用して、一対のアダプタをｐｉＲＮＡの３’末端および５’末端に連結した。次に、固有のバーコードで標識した増幅プライマーを用いて、ＰＣＲにより１３サイクル増幅させた。次に、６％ネイティブ−ポリアクリルアミドゲル上で、サイズによる選抜を行った。次に、ｐｉＲＮＡの集合に対応している１４５〜１６０ｂｐのｃＤＮＡ断片を、ゲルから切り出し、溶出させ、エタノール沈澱によって沈澱させた。最終的に得られたｃＤＮＡペレットを風乾させ、ヌクレアーゼを含まない水８μＬ中で再懸濁した。調製したライブラリの濃度を、High Sensitivity DNA chipおよびAgilent 2100バイオアナライザ（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）を用いて測定した。各ライブラリを等モル量ずつ、ｃＤＮＡの最終濃度が２ｎＭとなるようにプールした。次に、サンプルをフローセル上でシーケンシングした。シーケンシングには、MiSeqシーケンサ（Illumina, San Diego, CA, USA）を使用し、５０ｂｐのsingle-end readでリードした。
【００５８】
［シーケンシングデータの処理および差異のあるｐｉＲＮＡの分析］
数基準のｍｉＲＮＡ発現データを、fastqファイルから、Chimira toolによって生成した。全ての配列からアダプタをトリミングし、ｐｉＲＢａｓｅ上にマッピングした。このとき、１配列当たり２個までのミスマッチを許容した。次に、R/Bioconductorパッケージを用いてさらに分析を行った。プールされている１７個超のサンプルにおいて、１００万回当たり１回未満しかリードされなかったｐｉＲＮＡを除外した。edgeRパッケージで正規化因子を加えることにより、リード回数を予め正規化した。さらに、LIMMAパッケージで、voom関数によってサンプル間での正規化を施した。正規化された発現レベルを決定した後、大腸癌患者と健常なコントロールとの間での発現に差異があるｐｉＲＮＡをスクリーニングした。スクリーニングには、線形モデルフィッティングおよびBayes approachを適用した。多重検定のために、得られたＰ値をBenjamini-Hochberg法で調整した。
【００５９】
［逆転写リアルタイムＰＣＲおよび定量リアルタイムＰＣＲ］
TaqMan MicroRNA Assayプロトコル（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）に従って、遺伝子特異的プライマーを用いて、全ＲＮＡから相補的ＤＮＡを合成した。逆転写酵素反応には、以下を使用した：１０ｎｇのＲＮＡサンプル、５０ｎＭのステム−ループＲＴプライマー（ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｐｉＲ−５９３７由来のもの；Applied Biosystems, Thermo Fisher, USA）、１×ＲＴ緩衝液、０．２５ｍＭずつのｄＮＴＰ、３．３３Ｕ・μＬ−１のMultiScribe逆転写酵素、および０．２５Ｕ・μＬ−１のＲＮＡ分解酵素阻害剤（全てTaqMan MicroRNA Reverse Transcription kitのもの；Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）。反応混合物（１０μＬ）を１６℃にて３０分間、４２℃にて３０分間、８５℃にて５分間インキュベートし、その後、４℃にて保持した（T100TM Thermal Cycler; Bio-Rad, Hercules, CA, USA）。QuantStudio 12K Flex Real-Time PCRシステム（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。２０μＬのＰＣＲ反応混合物には、以下が含まれていた：１．３３μＬのＲＴ産物、１×TaqMan (NoUmpErase UNG) Universal PCR Master Mix、１μＬのプライマー（ｍｉＲ−２３ａ−３ｐアッセイ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐアッセイ、ｍｉＲ−１４２−５ｐアッセイおよびｐｉＲ−５９３７アッセイのもの）、および、TaqMan MicroRNA Assay kit（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）のプローブミックス。９６ウェル光学プレート中において、９５℃にて１０分間インキュベートした。次に、９５℃にて１５秒間および６０℃にて１分間を、４０サイクルインキュベートして、反応させた。
【００６０】
［データの正規化および統計解析］
Ｃｔ値のデータは、QuantStudio 12K Flexソフトウェア（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）によって計算した。リアルタイムＰＣＲ反応は全て、３組ずつ行った。測定されたｍｉＲＮＡの平均発現レベルは全て、ｍｉＲ−９３−５ｐ（Assay No. 001090; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）によって正規化した後、２−ΔＣｔ方法によって分析した。標準的なgeNormおよびNormFinderアルゴリズムの組合せを通して、ｍｉＲ−９３−５ｐを内因性コントロールとして選択した（Vychytilova-Faltejskova et al, 2016を参照）。結腸癌患者の血清サンプル中における分析されたｍｉＲＮＡのレベルと、健常なドナーの血清サンプル中における分析されたｍｉＲＮＡのレベルとの間の統計的差異を、両側ノンパラメトリックMann-Whitney検定で評価した。手術前後の対になったサンプルを、対になったサンプル関して、両側ノンパラメトリックWilcoxon検定で分析した。Kaplan-Meier生存曲線およびログ・ランク検定の分析をって、ｐｉＲ−５９３７による予後予測能力を評価した。全ての計算には、GraphPad Prism version 5.00（GraphPad Software, La Jolla, CA, USA）およびR environment（R Development koa Team）を用いた。Ｐ値が０．０５未満であるときに、統計的に有意であるとみなした。
【００６１】
〔実施例１〕大腸癌患者および健常なドナーの体液中における、異なるレベルのＰＩＷＩ相互作用性ＲＮＡ
１４４人の大腸癌患者および９６人の健常なコントロールの血清サンプルから精製したＲＮＡの小型ＲＮＡを、MiSeqシーケンサ（Illumina）でシーケンシングした。合計２０個の小型ＲＮＡライブラリを作製してシーケンシングした（結腸癌患者に対して１２個のライブラリ、および、健常なコントロールに対して８個のライブラリ。各ライブラリには、１２人の患者／健常ドナーからのＲＮＡサンプルが含まれる）。平均すると、リードの９６％超について、Ｑスコアが３０超であった。それゆえ、得られたデータは高品質であると考えられた。シーケンシングされたサンプルは、平均して８，９２５，０００±２，１３９，５９７のリードを含んでおり、８，２１９，６６４±１，９５４，１７７のリードがフィルタを通過した。合計すると、大腸癌患者においては４７０のｐｉＲＮＡが、健常なドナーにおいては４５３のｐｉＲＮＡが、それぞれ検出可能であった（リード１００万回当たり５０コピー超）。このことから、健常なドナーと比較すると、大腸癌患者の血清サンプル中においては、３９個のｍｉＲＮＡが有意に異なるレベルであることが判った（１０個は上方制御、２９個は下方制御；表１；調整Ｐ値＜０．００５）。
【００６２】
【表２】
2020527047.tif 000004
2020527047.tif 000005
【００６３】
［患者およびコントロールの独立したコホートにおける、候補ｐｉＲＮＡの検証］
合計で、８０人の大腸癌患者および８０人の健常なドナーに由来する血清サンプルを、研究の検証フェーズに使用した。小型ＲＮＡのシーケンシングによって同定された、健常なコントロールと比較すると大腸癌患者の血清中におけるレベルが有意に低い３９個のｐｉＲＮＡのうち、ｐｉＲ−５９３７およびｐｉＲ−２８８７６を独立検証にとって最も有望なものとして選択した。これらのｐｉＲＮＡはいずれも、健常なドナーと比較すると、大腸癌患者の血清中において有意に減少することが示された。ｐｉＲ−５９３７は、Ｐ＜０．０００１、ＡＵＣ：０．９１６、感度：９２．５％、特異度：８２．５％であった。ｐｉＲ−２８８７６は、Ｐ＜０．０００１、ＡＵＣ：０．８９６、感度：９２．５％、特異度：７２．５％であった。さらに、血清中のｐｉＲ−５９３７レベルの高値は、このレベルの低値と比較して、良好な生存と有意に関連していた（Ｐ＜０．０００１、ＨＲ：０．０９、ＣＩ：０．０２〜０．０３６、図２）。このことは、ｐｉＲ−５９３７レベルによる予後予測効果を示している。
【００６４】
〔実施例２〕血清中のｐｉＲＮＡレベルおよびｍｉＲＮＡレベルの組合せに基づく、大腸癌診断モデル（Ｄｘスコア）の開発および検証
血清中のｐｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡレベルに基づく大腸癌診断モデル（Ｄｘスコア）を、（診断用の）ロジスティック回帰によって開発した。診断に関連するシグネチャーを生成するために、ｐｉＲ−５９３７、ｐｉＲ−２８８７６、および、Vychytilova-Faltejskova et al.の研究（２０１６年、背景技術欄に記載）において同定された上位４個のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３−ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐ）を、サンプルの訓練用データセットとして、双方向ステップワイズロジスティック回帰モデルに導入した。最終的なモデルは、Akaike情報基準を最大化するモデルとした。Ｄｘスコアをさらに分析するために、ＲＯＣ曲線（受信者動作特性曲線）を作成した。最大Youden指数を利用して、健常なドナーと結腸癌患者とを識別するための最適なカットオフ値を得た。次に、サンプルの各セットについてＲＯＣ曲線分析を行い、Ｄｘスコアの感度および特異度を計算した。得られたモデルおよびカットオフ値の検証を、疾患の初期ステージにあるサンプルの独立した検証用データセットで実行した。
【００６５】
このアプローチにより、２つの効果的な診断モデルが確立された。（i）４つのバイオマーカー（ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｐｉＲ−５９３７）の発現に基づく診断モデル（Ｄｘスコア１）。（ii）２つのバイオマーカー（ｍｉＲ−２３ａ−３ｐおよびｐｉＲ−５９３７）の発現に基づく診断モデル（Ｄｘスコア２）。いずれの診断モデルも、血清検体による大腸癌の診断において、非常に高い感度および特異度を特徴としていた。
【００６６】
Ｄｘスコアに含まれているｍｉＲＮＡ／ｐｉＲＮＡは全て、大腸癌患者および健常なドナーの血清中において、有意に異なるレベルを示した。いずれの検証コホートにおいても（第１コホート：全ＴＮＭステージ、第２コホート：初期ＴＮＭステージ）、患者の血清中では、ｍｉＲＮＡのレベルはより高く、ｐｉＲＮＡのレベルはより低かった（図３および４）。
【００６７】
分析能が最も良かったのは、４つのバイオマーカー（ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｐｉＲ−５９３７）（Ｄｘスコア１）に基づくモデルであった。この診断スコアは、以下の式により計算した。
Ｄｘスコア１＝−０．８８９５＋（６２．９２６４８×ｍｉＲ−２３ａ）−（８．０８９２８×ｍｉＲ−２７ａ）＋（７３．１６７４５×ｍｉＲ−１４２−５ｐ）−（１．６７５７×ｐｉＲ−５９３７）。
【００６８】
Ｄｘスコア１は、全てのＴＮＭステージにある患者コホートに対して、感度９９％、特異度９０％で大腸癌を同定できた（図５Ａ、Ｃ）。同じＤｘスコア１およびカットオフ値を、疾患の初期ＴＮＭステージにある患者の独立した検証コホートに対して適用したところ、感度は８４％、特異度は８３％であった（図５Ｂ、Ｄ）。この値は、現在使用されている大腸癌の診断アプローチを、顕著に上回っている（表２に要約した）。
【００６９】
【表３】
2020527047.tif 000006
【００７０】
２つのバイオマーカー（ｍｉＲ−２３ａ−３ｐおよびｐｉＲ−５９３７）（Ｄｘスコア２）に基づくモデルは、Ｄｘスコア１よりも僅かに低い分析能を示した。
この診断スコアは、以下の式により計算した。
Ｄｘスコア２＝−０．６４２４３＋（３９．９６７２３×ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ）−（１．６２８６１×ｐｉＲ−５９３７）。
【００７１】
Ｄｘスコア２は、全てのＴＮＭステージにある患者コホートに対して、感度９４％、特異度９０％で大腸癌を同定できた（図６Ａ、Ｃ）。同じＤｘスコア２およびカットオフ値を、疾患の初期ＴＮＭステージにある患者の独立した検証コホートに対して適用したところ、感度は８２％、特異度は７５％であった（図６Ｂ、Ｄ）。この値は、現在使用されている大腸癌の診断アプローチと比較した場合、依然として満足のいく性能である（表３に要約した）。
【００７２】
【表４】
2020527047.tif 000007
【図１】
2020527047.tif 000009
【図２】
2020527047.tif 000010
【図３】
2020527047.tif 000011
【図４】
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【図５】
2020527047.tif 000013
【図６】
2020527047.tif 000014
【配列表】
2020527047000001.app
【国際調査報告】
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2020527047.tif 000016