(57)【要約】本開示は概して、ガンの処置のための組成物および方法に関する。いくらかの態様では、少なくとも一のエピジェネティック化合物および少なくとも一の化学療法剤の組合せを使用し、エピジェネティック療法による合成致死性の誘導（ISLET）のための方法をここに開示する。ここではまた、少なくとも一のエピジェネティック化合物と組み合わせるとき、ガン細胞の殺傷を誘導する化合物を識別するためのスクリーニング方法も開示する。ここにはさらに、ガンに対する化学療法剤の治療効果を強化するのに有効な量のエピジェネティック化合物がガンを有する対象に施されることを含む、ガンに対する化学療法剤の治療効果を強化する方法を開示する。
2020524262.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一のエピジェネティック化合物と組み合わせるとき、ガン細胞の殺傷を誘導する化合物を識別するにあたり、以下の：
ガン細胞をエピジェネティック化合物により処理することであり、そこでガン細胞は、薬剤のライブラリーで、少なくとも一の薬剤が標的遺伝子または遺伝子生産を抑制するものにより処理されていること；
エピジェネティック化合物による処理を生き延びなかった処理ガン細胞の標的遺伝子を識別すること；および
エピジェネティック化合物と組み合わせるとき、ガン細胞の殺傷を誘導する化合物が、エピジェネティック化合物による処理を生き延びなかった処理ガン細胞の標的遺伝子の抑制物質として識別されること
を含む、方法。
【請求項２】
エピジェネティック化合物は、DNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質、ヒストンデアセチラーゼ抑制物質、ヒストンメチルトランスフェラーゼ抑制物質、またはメチル化-DNA結合タンパク質抑制物質である、請求項1の方法。
【請求項３】
薬剤のライブラリーは、shRNAライブラリー、siRNAライブラリー、小分子ライブラリー、挿入変異ライブラリー、およびCRISPR-Cas sgRNAライブラリーからなる群より選ばれる、請求項1の方法。
【請求項４】
薬剤のライブラリーは、プールされたレンチウイルスshRNAライブラリーであるshRNAライブラリーである、請求項3の方法。
【請求項５】
ガンを処置するための方法であって、それを必要とする対象にDNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質およびメチル化-DNA結合タンパク質抑制物質から選ばれる少なくとも一のエピジェネティック化合物の効力量（effect amount）および少なくとも一の化学療法剤の有効な量を施すことを含む、方法。
【請求項６】
少なくとも一のDNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質はデシタビンである、請求項5に従う方法。
【請求項７】
少なくとも一のメチル化-DNA結合タンパク質抑制物質はKCC-08である、請求項5に従う方法。
【請求項８】
DNAメチルトランスフェラーゼはデシタビンであり、および少なくとも一の化学療法剤は以下の遺伝子：PLAS2G12A、EIF4A2、GNAZ、DCT、SULT1C4、HLX、ITK、AURKA、CHST3、MAP2K2、AADAT、CRAT、SULT4A1、PDE4D、THY1、PDE1B、BDH2、QPRT、STAT5A、PHF21A、MEF2C、IL17D、SEL1L、COMT、GLRX、AKR1C4、GNA12、B4GALT1、LEF1、XYLT1、GNAQ、GCA、AGXT2、DPM2、OGDHL、UGT2B10、PDE5A、GPSM1、LIG3、PDE4B、LCMT1、DHX58、GBGT1、DUSP9、DCI、B4GALT2、MTR、NT5C2、HSD3B2、ARL4D、GPT2、OAT、RFXAP、PDE11A、BCR、GNA11、PDE4C、DHRS3、FOXN1、PDE6G、G6PC2、RPIA、IDI1、ACSS1、FHIT、UGT1A3、FARS2、A4GALT、GATM、CHST1、AGPAT4、NT5M、MVK、UGT2B17、ARHGEF1、NEURL、QPCT、GNAI3、ATIC、PLA2G12A、DARS、AKRIC1、B4GALT5、FUT5、COX10、AKAP13、AGXT、GNMT、HOXB4、CAND1、CLC、TFAP2A、HMGN1、RAD9A、GNB3、ECGF1、ARPC3、ACVR1B、CKS1B、SLC1A2、UROS、CHST4、NT5E、PIGL、CIGALT1、PDE1A、ACP6、NOS1、RECQL4、NOS3、RNF2、LSS、ANP32A、RAG2、BCL2L2、CPE、CAPN9、PRKAR2A、EP300、FGFR2、ISYNA1、ARF3、IPMK、BCL11B、HMGCS1、GALNT14、GALNS、FAH、AK3L1、SULT1C2、GLP1R、AGPAT2、およびFOXP1の少なくとも一を抑制する化合物から選ばれる、請求項5に従う方法。
【請求項９】
少なくとも一の化学療法剤はオーロラキナーゼA抑制物質である、請求項5に従う方法。
【請求項１０】
オーロラキナーゼA抑制物質はアリセルチブである、請求項9に従う方法。
【請求項１１】
少なくとも一の化学療法剤はレチノイン酸受容体アゴニストである、請求項5に従う方法。
【請求項１２】
レチノイン酸受容体アゴニストはイソトレチノインである、請求項11に従う方法。
【請求項１３】
ガンは、前立腺ガン、卵巣ガン、肺ガン、結腸直腸ガン、中枢神経系ガン、および胸部ガンから選ばれる、請求項5に従う方法。
【請求項１４】
対象はヒトである、請求項5に従う方法。
【請求項１５】
少なくとも一のエピジェネティック化合物の施与および少なくとも一の化学療法剤の施与は連続的である、請求項5に従う方法。
【請求項１６】
少なくとも一のエピジェネティック化合物は少なくとも一の化学療法剤の施与の前に施される、請求項15に従う方法。
【請求項１７】
少なくとも一のエピジェネティック化合物の施与および少なくとも一の化学療法剤の施与は同時である、請求項5に従う方法。
【請求項１８】
ガンに対する化学療法剤の治療効果を強化するにあたり、ガンを有する対象にガンに対する化学療法剤の治療効果を強化するのに有効な量のエピジェネティック化合物を施すことを含む、方法。
【請求項１９】
対象に治療上有効な量の化学療法剤を施すことをさらに含む、請求項18の方法。
【請求項２０】
化学療法剤の治療上有効な量は、エピジェネティック化合物なしで施されるときに治療上有効ではない、請求項19の方法。
【請求項２１】
エピジェネティック化合物はDNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質またはメチル化-DNA結合タンパク質抑制物質である、請求項18の方法。
【請求項２２】
DNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質はデシタビンである、請求項21の方法。
【請求項２３】
メチル化-DNA結合タンパク質抑制物質はKCC-08である、請求項21の方法。
【請求項２４】
化学療法剤はオーロラキナーゼA抑制物質またはレチノイン酸受容体アゴニストである、請求項18の方法。
【請求項２５】
オーロラキナーゼA抑制物質はアリセルチブである、請求項24の方法。
【請求項２６】
レチノイン酸受容体アゴニストはイソトレチノインである、請求項24の方法。
【発明の詳細な説明】
【連邦政府による後援を受けた研究または開発に関する声明】
【０００１】
本発明は、the National Institute of Health/National Cancer Institute（米国国立衛生研究所/国立ガン研究所）により、授与番号R01CA113374、R03MH098712、およびP50CA058236の下で政府の支援を受けてなされた。政府はこの発明において一定の権利を有する。
本発明の分野
【０００２】
本開示は概して、ガンの処置のための併用療法、ならびにガンを処置するために組合せにおいて使用することができる化合物を識別するためのスクリーニング方法に関する。
バックグラウンド
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ガンは引き続き重大な健康問題であり、そして世界中の主要な死因である。ガンの遺伝学的基礎を理解する上で顕著な改善が行われ、および特定のガンの発生に関与する可能性がある特定の遺伝子にかなりの研究が焦点を当てている。ガン遺伝子は、過剰発現するとき、ガンをもたらす遺伝子であり、その一方で腫瘍サプレッサー遺伝子は、低発現するとき、ガンをもたらし得る遺伝子である。したがって、ガン遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子の両方を医学的にコントロールする能力には大きな価値がある。
【０００４】
最近、研究者は、ガンに関与するエピジェネティック（後成的とも言う）因子および両方のガン遺伝子と腫瘍サプレッサー遺伝子のコントロールのより一層良好な知識を得ることに興味を持っている。エピジェネティクス（後生学とも言う）には、細胞または有機体のDNA配列以外の要因によって生じる表現型が含まれる。DNAおよびヒストンでのエピジェネティックマーカーの変動は、腫瘍サプレッサー遺伝子のリプレッション（制止とも言う）およびガン遺伝子の活性化を媒介することができる。それゆえ、エピジェネティック酵素および/またはエピジェネティックマークの「ライティング（書き込み）」、「イレーシング（消去）」、および「リーディング（読み取り）」に関与する機構を抑制することによってのそのような変動の逆転は、魅力的なガン治療戦略である。
【０００５】
例えば、DNAメチル化は、メチル基がDNAの一定のシトシンに付加されるメチルトランスフェラーゼとして知られる酵素によって実行することができるDNAの化学的修飾である。このエピジェネティックなプロセスは、遺伝子型を変えない一方、それでも遺伝子発現調節において重要である。DNAメチルトランスフェラーゼは、DNA鎖へのメチル基の転移を触媒する。ガンにおいて、DNAメチルトランスフェラーゼはハイパーメチレーションを引き起こし得、そこではDNAが過剰にメチル化され、遺伝子が、例えば、腫瘍サプレッサー遺伝子およびDNA修復遺伝子を含めてサイレンスするように作用される。メチル化-DNA結合（MBD）タンパク質はまた、ガンの発達および進行中にDNAのハイパーメチレーションにも関与することができる。MBDタンパク質は「エピジェネティックリーダー（epigenetic readers）」として機能し、遺伝子リプレッションをプロモートするためにコ-レプレッサー複合体がリクルートされる。MBDタンパク質MBD2は、例えば、GSTP1プロモーターのCpGアイランドに結合し、それはそれがガン細胞において異常にメチル化されるときである。GSTP1プロモーターCpGアイランドのハイパーメチレーションおよび付随するGSTP1のエピジェネティックな遺伝子サイレンシングは、いくつかのガンの種類で、例えば、前立腺、胸部、および肝臓のガンを含め、頻繁に発生する。したがって、MBD媒介リプレッションを抑制することは、ガン研究において関心を集めている。
【０００６】
したがって、DNAメチル化は、エピジェネティックなガン研究の調査における重要なメカニズムであり得ると考えられる。一定のDNAメチルトランスフェラーゼインヒビターで、例えば、デシタビンなどのようなものは、化学療法の有効性を実証した。しかしながら、メチル化-DNA-結合タンパク質インヒビターおよびDNAメチルトランスフェラーゼインヒビター薬物で、例えば、デシタビンなどのようなものは、治療上有効な投薬量でのそれらの無効果または毒性のために、少なくとも部分的には臨床の場（clinical setting）での成功が限られている。
【０００７】
エピジェネティック化合物に加え、処置のために目下利用可能な広範な化学療法剤も存在する。しかしながら、化学療法剤には、いくつかの欠点があり得、健康な細胞に対する高い毒性レベルおよび有効性の様々なレベルが含まれる。
【０００８】
一つの既知の化学療法剤は、オーロラキナーゼＡインヒビターである。オーロラキナーゼは、有糸分裂プロセスで、中心体の成熟、染色体の整列、染色体の分離、および細胞質分裂を含めたもののために不可欠なタンパク質発現にリンクされた酵素である。オーロラキナーゼAの過剰発現は多くのヒト悪性腫瘍の際立った特色である。したがって、オーロラキナーゼAインヒビターはガン研究者にとって興味深いものである。しかしながら、デシタビンに似て、オーロラキナーゼAインヒビターで、アリセルチブなどのようなものは、インビボで適度な化学療法活性を示しただけであり、およびまたこの適度な活性を達成するために必要な用量での毒性のために部分的に制限を受ける。
【０００９】
別の既知の化学療法剤には、レチノイン酸受容体（RAR）アゴニストで、例えば、イソトレチノインなどのようなものが含まれる。レチノイン酸受容体は、標的遺伝子のレチノイン酸応答要素に結合することによって、体内でレチノイドの反応を媒介する。レチノイン酸または他のアゴニストの結合により、RARsはコアクチベータータンパク質をリクルートし、および標的遺伝子の転写を媒介することができる。レチノイドは他のシグナル伝達経路と相互作用し、および分化と抗増殖性シグナルをプロモートすることができ；レチノイドシグナル伝達経路のサプレッションは、ガンにおいて腫瘍発生と関連した。しかしながら、RARアゴニストで、例えば、イソトレチノインなどのようなものは、オーロラキナーゼAインヒビターのアリセルチブに似て、大部分のガンのタイプに対して、有望な化学療法活性をインビボで単一の薬剤として示していない。
【００１０】
それゆえ、改善された化学療法処置およびエピジェネティック療法によるガン細胞の合成致死性の誘導のための化合物を識別するための継続的な研究に対する分野において必要性が存在する。さらに、非悪性細胞に対して最小限か、またはまったくない細胞傷害性をもつ効果的な化学療法処置について必要性がある。
本発明の概略
【課題を解決するための手段】
【００１１】
ここに開示するのは、少なくとも一のエピジェネティック化合物と組み合わせるとき、ガン細胞の殺傷を誘導する化合物についてスクリーニングする方法であり、ガン細胞をエピジェネティック化合物により処理することを含み、そこでは少なくとも一の遺伝子または遺伝子生産の機能を失わせられる。例えば、一定の実施形態において、ガン細胞は、標的遺伝子または遺伝子生産を抑制すると考えられる薬剤のライブラリーで処理され得る。模範的な実施形態では、薬剤のライブラリーは、shRNAライブラリー、siRNAライブラリー、小分子ライブラリー、挿入変異ライブラリー、CRISPR/Cas sgRNAライブラリー、およびCRISPR/触媒的に不活性なdCas sgRNAライブラリーから選ばれ得る。
【００１２】
実施形態において、ここに開示するのは、少なくとも一のエピジェネティック化合物と組み合わせるとき、ガン細胞の殺傷を誘導する化合物をスクリーニングするための方法であり、それには、ガン細胞をエピジェネティック化合物により処理することで、そこでガン細胞は、例えば、shRNAライブラリーにより形質導入されており、そこでshRNAライブラリーは複数のshRNAsを含み、それらの各々は標的遺伝子について特異的であること、およびエピジェネティック化合物による処理を生き延びなかった形質導入されたガン細胞のshRNAsを識別すること、およびエピジェネティック化合物と組み合わせるときガン細胞の殺傷を誘導する化合物が、エピジェネティック化合物または標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの抑制物質による処理を生き延びなかった形質導入されたガン細胞のshRNAsの標的遺伝子の抑制物質として識別されることが含まれる。一定の実施形態では、エピジェネティック化合物は、DNA脱メチル化剤、ヒストンデアセチラーゼ抑制物質、ヒストンメチルトランスフェラーゼ抑制物質、およびメチル化-DNA結合タンパク質抑制物質から選定される。一定の実施形態では、エピジェネティック化合物はDNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質であり、および一定の実施形態では、エピジェネティック化合物はデシタビンである。他の実施形態では、エピジェネティック化合物はメチル化-DNA結合タンパク質抑制物質であり、および一定の実施形態では、エピジェネティック化合物はKCC-08である。一定の実施形態では、shRNAライブラリーはプールされたレンチウイルスshRNAライブラリーである。
【００１３】
ここにさらに開示するのは、ガンを処置するための方法であり、それが必要な対象に有効な量の少なくとも一のエピジェネティック化合物および有効な量の少なくとも一の化学療法剤を施すことを含む。一定の実施形態において、有効な量の少なくとも一のエピジェネティック化合物および有効な量の少なくとも一の化学療法剤は、ガン細胞の増殖を抑制するために相乗的に作用する。一定の実施形態において、ここに開示するのは、ガンを処置する方法であり、それが必要な対象に有効な量の少なくとも一のDNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質および有効な量の少なくとも一のオーロラキナーゼA抑制物質を施すことを含み、および他の実施形態において、ここに開示するのは、ガンを処置する方法であり、それが必要な対象に有効な量の少なくとも一のMBDタンパク質抑制物質および有効な量の少なくとも一のRARアゴニストを施すことを含む。一定の実施形態では、有効な量の少なくとも一のエピジェネティック化合物、例えば、DNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質またはMBDタンパク質抑制物質などのようなもの、および有効な量の少なくとも一の化学療法剤、例えば、オーロラキナーゼA抑制物質またはRARアゴニストなどのようなものは、ガン細胞の増殖を抑制するために相乗的に作用する。一定の実施形態では、少なくとも一のDNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質はデシタビンであり、および一定の実施形態では、少なくとも一のオーロラキナーゼA抑制物質はアリセルチブである。ここに開示する他の実施形態では、少なくとも一のMBDタンパク質抑制物質はKCC-08であり、および少なくとも一のRARアゴニストはイソトレチノインである。
【００１４】
一定の実施形態では、24時間の期間にわたる単回施与において施されるデシタビンの有効量は25mg/m2未満であり、および一定の実施形態では、24時間にわたる単回施与よりも多くにおいて施されるデシタビンの有効量は150mg/m2未満である。いくらかの態様では、サイクルにおいて施される少なくとも一のオーロラキナーゼA抑制物質の有効量は、約70mg未満から約1050mgまでに及ぶ。
【００１５】
一定の実施形態では、24時間の期間にわたる単回施与において施されるKCC-08の有効量は約5mg/kg未満であり、および一定の実施形態では、24時間の期間にわたる単回施与よりも多くにおいて施されるKCC-08の有効量は、約25mg/kg未満、例えば、約1mg/kg/日または約0.5mg/kg/日などのようなものである。いくらかの態様において、サイクルにおいて施される少なくとも一のRARアゴニストの有効量は、約30mg/kg/日未満から約60mg/kg/日未満までに及び、例えば、約30mg/kg/日などのようなものである。
【００１６】
ここに開示する一定の実施形態では、ガンは、前立腺ガン、卵巣ガン、肺ガン、結腸直腸ガン、中枢神経系ガン、および胸部ガンから選定される。一定の実施形態では、処置を必要とする対象はヒトである。
【００１７】
ここに開示する一定の実施形態では、少なくとも一のエピジェネティック化合物の施与および少なくとも一の化学療法剤の施与は連続的である。一定の実施形態では、少なくとも一のエピジェネティック化合物および少なくとも一の化学療法剤が連続的に施されるとき、少なくとも一のエピジェネティック化合物をまず施す。ここに開示する他の実施形態では、少なくとも一のエピジェネティック化合物の施与および少なくとも一の化学療法剤の施与は同時である。
【００１８】
またここに開示するのは、ガンに対する化学療法剤の治療効果を強化する方法（method of potentiating）であり、ガンを有する対象にガンに対する化学療法剤の治療効果を強化するのに有効な量においてエピジェネティック化合物を施すことを含む。一定の態様において、本方法は、治療上有効な量の化学療法剤を対象に施すことをさらに含み、および一定の態様において、化学療法剤の治療上有効な量は、エピジェネティック化合物を伴わないで施されるとき治療上有効ではない。ここに開示する方法の一定の実施形態では、エピジェネティック化合物はDNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質、例えば、デシタビンなどのようなものであり、およびここに開示する方法の一定の実施形態では、化学療法剤はオーロラキナーゼA抑制物質、例えば、アリセルチブなどのようなものである。ここに開示する方法の一定の実施形態では、エピジェネティック化合物はMBDタンパク質抑制物質、例えば、KCC-08などのようなものであり、およびここに開示する方法の一定の実施形態では、化学療法剤はRARアゴニスト、例えば、イソトレチノインなどのようなものである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】デシタビン処理対コントロール細胞の集団において変動したshRNAバーコードのウォーターフォールプロットであり、そこでx軸にて0.0を下回るバー[log2(デシタビン/コントロール)]はデシタビンに感作するshRNAsを指し示し、およびx軸にて0.0を上回るバーはデシタビンに耐性のshRNAsを指し示す。
【図１Ｂ】ビヒクルコントロールを伴いおよびデシタビンを伴うがAURKAを伴わないDU145細胞と比べた、AURKAを標的とするshRNAを100nMデシタビンと組み合わせて伴うDU145細胞を含む五つのサンプルを例示する棒グラフである。
【図２Ａ】デシタビンとアリセルチブの別々、ビヒクルコントロール、およびデシタビンとアリセルチブの一緒のものについて、DU145前立腺ガン細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【図２Ｂ】デシタビンとアリセルチブの別々、ビヒクルコントロール、およびデシタビンとアリセルチブの一緒のものについて、A549肺ガン細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【図２Ｃ】デシタビンとアリセルチブの別々、ビヒクルコントロール、およびデシタビンとアリセルチブの一緒のものについて、肝細胞の増殖曲線を示すグラフである。
【図３】18のガン細胞系に対するデシタビンおよびアリセルチブの併用処理について、Bliss（ブリス）相乗作用スコアを例示する棒グラフである。
【図４】例3のヌードマウスによって受け入れられたデシタビンおよびアリセルチブの施与のための処置スケジュールの実例を示す。
【図５Ａ】ビヒクルコントロール、デシタビン単独、高用量アリセルチブ単独、低用量アリセルチブ単独、高および低用量のアリセルチブの両方との同時のデシタビン、およびプライマーとしてのデシタビン次いで高および低用量のアリセルチブの両方を施したマウスからの腫瘍の容量における倍率変化を示すグラフである。
【図５Ｂ】ビヒクルコントロール、デシタビン単独、高用量アリセルチブ単独、低用量アリセルチブ単独、高および低用量のアリセルチブの両方との同時のデシタビン、およびプライマーとしてのデシタビン次いで高および低用量のアリセルチブの両方を施したマウスの日数における生存率レートを示すグラフである。
【図６】図６Ａは、ビヒクルコントロールの施与中の経時的なマウス体重における変化を示すグラフである。図６Ｂは、デシタビンの施与中の経時的なマウス体重における変化を示すグラフである。図６Ｃは、低用量（15mg/kg）のアリセルチブの施与中の経時的なマウス体重における変化を示すグラフである。図６Ｄは、高用量（25mg/kg）のアリセルチブの施与中の経時的なマウス体重における変化を示すグラフである。図６Ｅは、デシタビンおよび低用量（15mg/kg）のアリセルチブの組合せの施与中の経時的なマウス体重における変化を示すグラフである。図６Ｆは、デシタビンおよび高用量（25mg/kg）のアリセルチブの組合せの施与中の経時的なマウス体重における変化を示すグラフである。図６Ｇは、プライマーとしてのデシタビンおよび低用量（15mg/kg）のアリセルチブの組合せの施与中の経時的なマウス体重における変化を示すグラフである。図６Ｈは、プライマーとしてのデシタビンおよび高用量（25mg/kg）のアリセルチブの組合せの施与中の経時的なマウス体重における変化を示すグラフである。
【図７】図７Ａは、ビヒクルコントロール、デシタビン単独、高用量アリセルチブ単独、低用量アリセルチブ単独、高および低用量のアリセルチブの両方との同時のデシタビン、およびプライマーとしてのデシタビンそして次いで高および低用量の両方のアリセルチブによって続けられるものの施与後のマウス血小板（PLT）レベルを示す棒グラフである。図７Ｂは、ビヒクルコントロール、デシタビン単独、高用量アリセルチブ単独、低用量アリセルチブ単独、高および低用量のアリセルチブの両方との同時のデシタビン、およびプライマーとしてのデシタビンそして次いで高および低用量の両方のアリセルチブによって続けられるものの施与後のマウス好中球（NEUT）レベルを示す棒グラフである。図７Ｃは、ビヒクルコントロール、デシタビン単独、高用量アリセルチブ単独、低用量アリセルチブ単独、高および低用量のアリセルチブの両方との同時のデシタビン、およびプライマーとしてのデシタビンそして次いで高および低用量の両方のアリセルチブが続くものの施与後のマウスアルカリホスファターゼ（ALP）レベルを示す棒グラフである。図７Ｄは、ビークルコントロール、デシタビン単独、高用量アリセルチブ単独、低用量アリセルチブ単独、高および低用量のアリセルチブの両方との同時のデシタビン、およびプライマーとしてのデシタビンそして次いで高および低用量の両方のアリセルチブが続くものの施与後のマウスアスパラギン酸トランスアミナーゼ（AST）レベルを示す棒グラフである。図７Ｅは、ビヒクルコントロール、デシタビン単独、高用量アリセルチブ単独、低用量アリセルチブ単独、高および低用量のアリセルチブの両方との同時のデシタビン、およびプライマーとしてのデシタビンそして次いで高および低用量の両方のアリセルチブによって続けられるものの施与後のマウスアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）レベルを示す棒グラフである。
【図８】図８Ａは、ビヒクルコントロールの施与後のマウスにおける数日にわたる腫瘍容量における変化を示すグラフである。図８Ｂは、デシタビン（DAC）での前処置後のマウスにおける数日にわたる腫瘍容量における変化を示すグラフである。図８Ｃは、デシタビンの前処置なしでのアリセルチブ（MLN8237）の施与後のマウスにおける数日にわたる腫瘍容量における変化を示すグラフである。図８Ｄは、デシタビン（DAC）での前処置次いでアリセルチブ（MLN8237）の施与後の数日にわたる腫瘍容量における変化を示すグラフである。
【図９】デシタビンによる前処置および次いでアリセルチブを施与したマウスに対する、ビヒクルコントロールおよびアリセルチブを施与したマウスの生存率レートを示すグラフである。
【図１０】図１０Ａは、例5のビヒクルコントロールからのKI-67により染色したサンプル細胞のイメージである。図１０Ｂは、例5からのデシタビンにより前処置したKI-67により染色したサンプル細胞のイメージである。図１０Ｃは、デシタビンにより前処置せず、およびアリセルチブを施与した例5からのKI-67により染色したサンプル細胞のイメージである。図１０Ｄは、デシタビンにより前処置し、およびアリセルチブを施与した例5からのサンプル細胞のKI-67により染色したイメージである。図１０Ｅは、例5のビヒクルコントロールからのカスパーゼ3Aを使用して染色したサンプル細胞のイメージである。図１０Ｆは、例5からのデシタビンにより前処置したカスパーゼ3Aを使用して染色したサンプル細胞のイメージである。図１０Ｇは、デシタビンにより前処置せず、およびアリセルチブを施与した例5からのカスパーゼ3Aを使用して染色したサンプル細胞のイメージである。図１０Ｈは、デシタビンで前処置し、およびアリセルチブを施与した例5からのサンプル細胞のカスパーゼ3Aを使用して染色したイメージである。
【図１１】図１１Ａは、ビヒクルコントロール；100nMアリセルチブ単独；100nMデシタビン単独；および100nMのアリセルチブと組み合わせる100nMのデシタビンにより処理したDU145細胞組織サンプルにて実行したオーロラキナーゼＡについてのウエスタンブロット分析のイメージである。図１１Ｂは、ビヒクルコントロール；100nMアリセルチブ単独；100nMデシタビン単独；および100nMのアリセルチブと組み合わせる100nMのデシタビンにより処理したDU145細胞組織サンプルにて実行したDNAメチルトランスフェラーゼ3-ベータ（DNMT3B）についてのウエスタンブロット分析のイメージである。
【図１２】図１２Ａは、デシタビンまたはアリセルチブだけを含む細胞およびデシタビンとアリセルチブとの組合せを含む細胞と比べた、ビヒクルコントロールを含むDU145細胞における、LUMAアッセイによって測定されるメチル化割合を例示する棒グラフである。図１２Ｂは、デシタビンまたはアリセルチブだけを含む細胞およびデシタビンとアリセルチブとの組合せを含む細胞と比べた、ビヒクルコントロールを含むDU145細胞における、亜硫酸水素塩ゲノム配列決定後のサテライト2メチル化の割合を示す棒グラフである。
【図１３】図１３Ａは、ビヒクルコントロールまたはデシタビンまたはアリセルチブのいずれか単独による処理と比べて、デシタビンおよびアリセルチブの併用処理後のH3S10-ホスホ陽性細胞（H3S10-phospho positive cells）を示す棒グラフである。図１３Ｂは、ビヒクルコントロールまたはデシタビンまたはアリセルチブのいずれか単独による処理と比べて、デシタビンおよびアリセルチブの併用処理後の多核化細胞の割合を示す棒グラフである。図１３Ｃは、ビヒクルコントロールまたはデシタビンもしくはアリセルチブのいずれか単独による処理と比べて、デシタビンおよびアリセルチブの併用処理後の小核を有する細胞の割合を示す棒グラフである。
【図１４】デシタビン処理対コントロール細胞の集団における変動したshRNAバーコードのウォーターフォールプロットであり、デシタビンに感作されたshRNAsを有する149遺伝子は、それらがx軸にて0.0を下回ったときに識別される[log2(デシタビン/コントロール)]。
【図１５】ビヒクルコントロールまたは100nMデシタビンと組み合わせたCHST3を標的とするshRNA配列により処理したDU145細胞を例示する棒グラフであり、ビヒクルコントロールとの、および100nMデシタビンとの組合せでの非標的化shRNAs（shGFP）により処理したDU145細胞と比較した。
【図１６】CRATを標的とする二つの異なるshRNA配列により処理したDU145細胞を例示する棒グラフであり、それぞれビヒクルコントロールまたは100nMデシタビンと組み合わされ、ビヒクルコントロールとの、および100nMデシタビンとの組合せにおいて非標的化shRNAs（shGFP）により処理したDU145細胞と比較した。
【図１７】DCTを標的とする二つの異なるshRNA配列により処理したDU145細胞を例示する棒グラフであり、それぞれビヒクルコントロールまたは100nMデシタビンと組み合わされ、ビヒクルコントロールとの、および100nMデシタビンとの組合せにおいて非標的化shRNAs（shGFP）により処理したDU145細胞と比較した。
【図１８】ビヒクルコントロールまたは100nMデシタビンと組み合わせたFUT5を標的とするshRNA配列により処理したDU145細胞を例示する棒グラフであり、ビヒクルコントロールとの、および100nMデシタビンとの組合せにおいて非標的化shRNAs（shGFP）により処理したDU145細胞と比較した。
【図１９】GNAZを標的とする二つの異なるshRNA配列により処理したDU145細胞を例示する棒グラフであり、それぞれビヒクルコントロールまたは100nMデシタビンと組み合わされ、ビヒクルコントロールとの、および100nMデシタビンとの組合せにおいて非標的化shRNAs（shGFP）により処理したDU145細胞と比較した。
【図２０】ビヒクルコントロールまたは100nMデシタビンと組み合わせたHSD3B2を標的とするshRNA配列により処理したDU145細胞を例示する棒グラフであり、ビヒクルコントロールとの、および100nMデシタビンとの組合せにおいて非標的化shRNAs（shGFP）により処理したDU145細胞と比較した。
【図２１】IL17Dを標的とする二つの異なるshRNA配列により処理したDU145細胞を例示する棒グラフであり、それぞれビヒクルコントロールまたは100nMデシタビンと組み合わされ、ビヒクルコントロールとの、および100nMデシタビンとの組合せにおいて非標的化shRNAs（shGFP）により処理したDU145細胞と比較した。
【図２２】ITKを標的とする二つの異なるshRNA配列により処理したDU145細胞を例示する棒グラフであり、それぞれビヒクルコントロールまたは100nMデシタビンと組み合わされ、ビヒクルコントロールとの、および100nMデシタビンとの組合せの非標的化shRNAs（shGFP）により処理したDU145細胞と比較した。
【図２３】MAP2K2を標的とする二つの異なるshRNA配列により処理したDU145細胞を例示する棒グラフであり、それぞれビヒクルコントロールまたは100nMデシタビンと組み合わされ、ビヒクルコントロールとの、および100nMデシタビンとの組合せにおいて非標的化shRNAs（shGFP）により処理したDU145細胞と比較した。
【図２４】MEF2Cを標的とする二つの異なるshRNA配列により処理したDU145細胞を例示する棒グラフであり、それぞれビヒクルコントロールまたは100nMデシタビンと組み合わされ、ビヒクルコントロールとの、および100nMデシタビンとの組合せにおいて非標的化shRNAs（shGFP）により処理したDU145細胞と比較した。
【図２５】PDE1Bを標的とする二つの異なるshRNA配列により処理したDU145細胞を例示する棒グラフであり、それぞれビヒクルコントロールまたは100nMデシタビンと組み合わされ、ビヒクルコントロールとの、および100nMデシタビンとの組合せにおいて非標的化shRNAs（shGFP）により処置したDU145細胞と比較した。
【図２６】PDE4Bを標的とする四つの異なるshRNA配列により処理したDU145細胞を例示する棒グラフであり、それぞれビヒクルコントロールまたは100nMデシタビンと組み合わされ、ビヒクルコントロールとの、および100nMデシタビンとの組合せにおいて非標的化shRNAs（shGFP）により処理したDU145細胞と比較した。
【図２７】PDE4Cを標的とする四つの異なるshRNA配列により処理したDU145細胞を例示する棒グラフであり、それぞれビヒクルコントロールまたは100nMデシタビンと組み合わされ、ビヒクルコントロールとの、および100nMデシタビンとの組合せにおいて非標的化shRNAs（shGFP）により処理したDU145細胞と比較した。
【図２８】STAT5Aを標的とする二つの異なるshRNA配列により処理したDU145細胞を例示する棒グラフであり、それぞれビヒクルコントロールまたは100nMデシタビンと組み合わされ、ビヒクルコントロールとの、および100nMデシタビンとの組合せにおいて非標的化shRNAs（shGFP）により処理したDU145細胞と比較した。
【図２９】図２９Ａは、イソトレチノインの有無の両方でKCC-08により処理したPC-3細胞におけるレチノイドシグナル伝達の再活性化を示す棒グラフである。図２９Ｂは、イソトレチノインの有無の両方でKCC-08により処理したPC-3細胞におけるクローン原性生存率を示す棒グラフである。図２９Ｃは、例8において指し示す用量およびスケジュールで与えた、ビヒクルコントロール、KCC-08単独、イソトレチノイン単独、およびKCC-08とイソトレチノインの両方の組合せにより処置したヌードマウスにおけるPC-3異種移植片腫瘍成長を示すグラフである。
【図３０】22種の異なる化合物の投与前に与えたデシタビンにより処理したPC-3ガン細胞のBliss独立スコアを超える過剰を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の詳細な記載
ここに開示するのは、エピジェネティック療法による合成致死性の誘導（ISLET）について化合物をスクリーニングする方法である。これまで、新しい薬物の組合せは典型的に、それぞれいくらかの治療効果を有することが知られる二つの薬物をランダムに組み合わせ、および組合せの治療効果および毒性を評価することによって識別されてきた。他方で、ISLETスクリーニング法は、独特な薬物の組合せを識別することのための新しい、体系的なプラットフォームを提供する。典型的に、薬物の組合せには、エピジェネティック化合物および化学療法剤が含まれる。何ら理論に縛られることを意図しないが、エピジェネティック化合物への曝露は、典型的に、毒性がほとんどないかまったくない低投薬量で与えられ、ガン細胞を新しい脆弱性に曝すようにガン細胞を修飾し、それゆえガン細胞が新たに曝される脆弱性の一つを標的とする他の化学療法剤の影響を受け易くすると考えられる。このスクリーニングプラットフォームを使用すると、エピジェネティック化合物を伴わず非毒性用量で施与するとき、いくつかの化学療法剤はガン細胞に対する治療効果がほとんどないしまったくないと特定されたが、エピジェネティック化合物と組み合わせて施与するとき、驚くべきことに治療効果を示す。エピジェネティック化合物および/または化学療法剤以外の化合物も、ガンについての新しい、治療上の薬物の組合せを識別するために、このユニークな、スクリーニングプラットフォーム設計中にプラグすることができる。
【００２１】
一定の実施形態において、スクリーニング方法は、ガン細胞が少なくとも一の遺伝子または遺伝子生産（gene product）の機能を失うことになるように薬剤によりガン細胞を処理すること、例えば、薬剤のライブラリーからガン細胞を処置することであり、そこで少なくとも一の薬剤は標的遺伝子または遺伝子生産を抑制すること；次いで、ガン細胞を化合物、例えば、エピジェネティック化合物などのようなものにより処理すること；エピジェネティック化合物による処理を生き延びなかった処理ガン細胞の標的遺伝子を識別すること；およびエピジェネティック化合物と組み合わせるとき、ガン細胞の殺傷（killing）を誘発する化合物が、エピジェネティック化合物による処理を生き延びなかったガン細胞の標的遺伝子または遺伝子生産の抑制物質（インヒビターとも言う）として識別されることを含む。ここで使用するように、「遺伝子生産」という用語は、遺伝子の発現から生じる任意の物質、例えば、RNA、ポリペプチド、およびタンパク質などのようなものに言及する。
【００２２】
一定の実施形態において、スクリーニング方法は、ガン細胞をshRNAライブラリーにより形質導入すること、形質導入されたガン細胞を化合物、例えば、エピジェネティック化合物などのようなものにより処理すること、および化合物による処理を生き延びなかった形質導入されたガン細胞のshRNAsを識別することを含む。一定の実施形態では、エピジェネティック化合物は、DNA脱メチル化剤、ヒストンデアセチラーゼ抑制物質、ヒストンメチルトランスフェラーゼ抑制物質、またはMBDタンパク質抑制物質である。一定の実施形態では、化合物はDNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質であり、および一定の実施形態では、化合物はデシタビンである。一定の他の実施形態では、化合物は、MBDタンパク質抑制物質、例えば、KCC-08、KCC-03、およびKCC-07などのようなものである。一定の実施形態では、shRNAライブラリーはプールされたレンチウイルスshRNAライブラリーである。一定の実施形態では、本スクリーニング方法は、ガン細胞をCRIPSR-Cas9 sgRNAスクリーニングライブラリーにより形質導入すること、それは、例えば、Cas9エンドヌクレアーゼまたはdCas9触媒不活性変異体、CRISPR RNA（crRNA）、およびプールされたノックアウト細胞ライブラリーを作り出すためにトランス活性化RNA（tracrRNA）を含むことを含んでよいこと、形質導入されたガン細胞を化合物、例えば、エピジェネティック化合物などのようなものにより処理すること、化合物での処理を生き延びなかった形質導入されたガン細胞のsgRNAsを識別することを含む。crRNAおよびtracrRNAは、単一のガイドRNA（「sgRNA」）中に組み合わされてよい。
【００２３】
エピジェネティック療法は、遺伝子（群）（gene(s)）（（群）は複数もあり得ることを示すのに用いる）の核酸配列を変えることなく遺伝子発現に影響を与える薬物の使用に関する。ここで使用するように、「エピジェネティック化合物」は、遺伝子の核酸配列（遺伝子型）を変えることなく遺伝子の発現に影響を及ぼす化合物である。例えば、DNAメチルトランスフェラーゼは、グアニン残基が後に続くDNAの一定のシトシン残基をメチル化することによってDNAを化学的に修飾する働きをする。他の例として、MBDタンパク質抑制物質は、メチルCpG結合タンパク質のDNAへの結合を抑制するように作用し、それはその結果、クロマチン凝縮および不活性化の促進の減少を招く。エピジェネティック修飾の他の例には、ヒストン修飾およびマイクロRNA調整（microRNA regulations）が含まれる。これらのエピジェネティックなプロセスは、遺伝子型を変えないが、それでもなお遺伝子発現およびタンパク質調整において重要である。さらに、エピジェネティック化合物によって誘導される修飾は、典型的に、ガン細胞に非ガン細胞とは異なる影響を与える。例えば、ガンでは、DNAメチルトランスフェラーゼはハイパーメチレーション（高度メチル化とも言う）を引き起こし得、そこではDNAが過剰にメチル化され（over-methylated）、遺伝子をサイレンスにさせる（発現停止させるとも言う）働きをし、例えば、腫瘍サプレッサー（腫瘍抑圧とも言う）遺伝子およびDNA修復遺伝子などのようなものが含まれる。したがって、エピジェネティック化合物、例えば、DNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質などのようなものは、DNAメチルトランスフェラーゼの作用、それは、悪性細胞において活性なものであり、それを抑制することによって化学治療効果を発揮し得る。しかし、多くの既知のDNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質、例えば、デシタビンなどのようなものは、インビボで化学療法活性が低いか、または化学療法レベルでの非悪性細胞のそれらの毒性が耐えられるものでないかのいずれかであり、化学療法剤としてのそれらの使用が制限される。
【００２４】
ここで開示するように、ガン細胞において合成致死性を誘導するために、エピジェネティック化合物を他の化学療法剤と組み合わせ得ることを発見した。一定の実施形態では、エピジェネティック化合物と化学療法剤との組合せの治療効果は相乗的であり得、組合せの治療効果は、エピジェネティック化合物または化学療法剤のいずれか、または二つの和のいずれよりも、後に議論するように大きいことを意味する。エピジェネティック療法による合成致死性のこの誘導は驚くべきものであり、および予想外である。
【００２５】
ISLETは、化学療法剤のユニークな組合せを識別するための新しいスクリーニングプラットフォームを提供する。一定の実施形態において、ここに開示するのは、少なくとも一の薬剤が標的遺伝子または遺伝子生産（例えば、ポリペプチドなどのようなもの）を抑制する薬剤のライブラリーによりガン細胞を処理することを含む、ISLETについて化合物をスクリーニングするための方法である。例えば、一定の実施形態において、ここに開示するスクリーニング方法は、shRNAライブラリーによりガン細胞を形質導入すること、形質導入された細胞を化合物により処理すること、および化合物の処理を生き延びなかった細胞のshRNAsを識別することを含み得る。shRNAsはショートヘアピンRNAsであり、それは、ヘアピンターンを含む人工的に合成された小さなRNA分子であり、および本技術において既知である。Schlabach（シュラバッハ）M. R.ら、Cancer Proliferation Gene Discovery through Functional Genomics（機能ゲノミクスを通したガン増殖遺伝子発掘）、SCIENCE（サイエンス）、319、5863：620-4（2008）。shRNAsには、興味深い標的遺伝子のセクションに相補的な領域が含まれ、それによって、興味深い標的遺伝子について特異的なshRNAが作成される。そのようなものとして、shRNAは、興味深い特定の標的遺伝子の発現をダウンレギュレートまたはアップレギュレートするために使用し得る。
【００２６】
一定の実施形態では、ガン細胞はshRNAのレトロウイルスまたはレンチウイルスデリバリーを使ってshRNAにより形質導入される。一定の実施形態では、ガン細胞はレンチウイルスベクターを使ってshRNAにより形質導入される。一定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、標的遺伝子に特異的なshRNA；shRNAを識別するための手段、例えば、ユニークな識別性ヌクレオチド配列を有する核酸などのようなもの；抗生物質耐性遺伝子；および形質導入レベルを追跡するためのマーカー遺伝子、例えば、蛍光マーカー遺伝子などのようなものを含む。一定の実施形態では、標的遺伝子は、ガンにおいて役割を果たすことが知られているか、またはそうと考えられるタンパク質をコードする遺伝子である。
【００２７】
次いで、shRNA形質導入ガン細胞を収集し、および本技術において既知の手段によってDNAを分離し得る。一定の実施形態において、shRNAの識別のための手段、例えば、ユニークな識別性ヌクレオチド配列（またはshRNA「バーコード」）などのようなものは、核酸配列決定（例は、次世代配列決定）によって増幅および識別され得る。ユニークな識別ヌクレオチド配列、例えば、60ヌクレオチドの「バーコード」などのようなものは、例えば、Silva（シルバ）, J. M.ら、Second-Generation shRNA Libraries Covering the Mouse and Human Genomes（マウスおよびヒトゲノムをカバーする第二世代shRNAライブラリー）、NATURE GENETICS（ネイチャー・ジェネティクス）、37:11、1281-88（2005）およびWestbrook（ウェストブルック）, T. F.ら、A Genetic Screen for Candidate Tumor Suppressors Identifies REST（候補腫瘍サプレッサーについての遺伝子スクリーニングはRESTを明らかにする）、CELL（セル）、121：837-48（2005）において記載される。他のユニークな識別性ヌクレオチド配列には、例えば、ハーフヘアピンタグおよび全長ヘアピンタグ、例えば、Boettcher（ベッチェル）, M.およびHoheisel（ホーエアイゼル）, J. D.、Pooled RNAi Screens - Technical and Biological Aspects（プールしたRNAiスクリーニング-技術的および生物学的側面）、CURR GENOMICS（カレント・ジェノミクス）、11（3）：162-67（2010）において記載されるものなどのようなものが含まれる得る。PCR増幅とそれに続く相補プローブ配列を含むDNAマイクロアレイへのハイブリダイゼーションを使用することによって、ユニークな識別性ヌクレオチド配列が、特定のshRNAsの存在を識別し、および相対的頻度を定めるために使用し得る。ここに開示するスクリーニング方法において、処理ステップ後に識別されないshRNAsは、shRNAと組み合わせて使用されるとき、あり得るエピジェネティック化合物の処理を生き延びなかった細胞からのshRNAsを表す。
【００２８】
本開示の一定の実施形態では、shRNAsは特定のガン遺伝子を標的とし、およびそれらのガン遺伝子の発現を抑制する。一定の実施形態では、shRNAsは特定の腫瘍サプレッサー遺伝子を標的とし、およびそれらの腫瘍サプレッサー遺伝子の発現を増加させる。ここに開示するように、一定の実施形態において、ガン細胞がエピジェネティック化合物および特定の遺伝子を標的とするshRNAに曝されるとき、ガン細胞は生き延びない。したがって、そのようなshRNAsによって標的とされる特定の遺伝子の発現を直接的または間接的に減少または増加させる（またはポリペプチドの発現を減少または増加させることによって遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現を変動させる）薬剤は、エピジェネティック化合物による併用治療のためのISLET標的として選定され得る。
【００２９】
ここに開示するスクリーニング方法の一定の実施形態では、薬剤のライブラリーは、siRNAライブラリー、CRISPR（クリスパー）-Cas9 sgRNAライブラリー、挿入変異ライブラリー、またはshRNAライブラリーの代わりに本技術において通常の技量の者（当業者とも言う）に知られる他の小分子および/または核酸抑制物質分子ライブラリーを含み得る。例えば、一定の実施形態では、CRISPRシステムが使用され得る。典型的に、CRISPRシステムは、Cas9エンドヌクレアーゼ、CRISPR RNA（crRNA）、およびトランス活性化RNA（tracrRNA）が含まれ、およびプールされたノックアウトスクリーン用の形質導入細胞ライブラリーを作り出すために使用し得る。crRNAおよびtracrRNAは単一のガイドRNA（「sgRNA」）中に組み合わせられ得る。CRISPRはClustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）を表し、および遺伝子ノックアウトプールを作り出すために使用し得るゲノムエンジニアリングのためのシステムである。crRNAは、標的配列として使用され得るおよそ20のヌクレオチドのヌクレオチド配列、ならびにtracrRNAとハイブリダイズする他の核酸を含む。この標的化配列は、カスタマイズされたノックアウトプールを作り出すために、特定の遺伝子を抑圧または活性化するように変えられることができる。tracrRNAはcrRNAにハイブリダイズし、およびCas9エンドヌクレアーゼに結合して複合体を活性化し、標的配列内の特定の部位に二本鎖切断を作り出し、次いで開裂後に二本鎖切断を修復することが続く。Shalem（シェールム）ら、Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells（ヒト細胞でのゲノム-スケールのCRISPR-Cas9ノックアウトスクリーニング）、SCIENCE、343; 6166、84-87（2014）。このようにして、特定の遺伝子ノックアウトプールが作り出され得る。
【００３０】
ここでさらに開示するのは、ガンを処置するための方法であり、本方法には、処置を必要とする対象に有効な量の少なくとも一のエピジェネティック化合物、例えば、DNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質またはMBDタンパク質抑制物質、および有効な量の少なくとも一の化学療法剤を施すことが含まれる。一定の実施形態において、少なくとも一の化学療法剤は、RARアゴニスト（RAR作用物質とも言う）、キナーゼ抑制物質、例えば、オーロラキナーゼA（Aurora kinase A）抑制物質などのようなもの、Gタンパク質共役受容体抑制物質、グアニンヌクレオチド交換因子抑制物質、ホスファターゼ抑制物質、スルホトランスフェラーゼ抑制物質、アセチルトランスフェラーゼ抑制物質、ドパクロムトートメラーゼ抑制物質、フコシルトランスフェラーゼ抑制物質、ステロイドホルモン生合成抑制物質、サイトカイン抑制物質、ホスホジエステラーゼ抑制物質、JAK/Stat抑制物質、微小管剤（microtubule agents）、ヌクレオシド類似体、および抗生物質から選定される。一定の実施形態では、少なくとも一のエピジェネティック化合物および少なくとも一の化学療法剤は、低酸素経路、頂端接合（apical junction）経路、DNA修復経路、補体経路、解糖経路、凝固経路（coagulation pathways）、脂肪酸代謝経路、同種移植片拒絶経路、炎症反応経路、MTORC1シグナル伝達経路、酸化的リン酸化経路、およびペルオキシソーム経路から選定される少なくとも一の経路を標的とする。
【００３１】
一定の実施形態では、DNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質はデシタビンであり、および一定の実施形態では、オーロラキナーゼA抑制物質はアリセルチブである。ここに開示する他の実施形態では、MBDタンパク質抑制物質はKCC-08であり、および一定の実施形態では、RARアゴニストはイソトレチノインである。一定の態様において、ガンは、前立腺、卵巣、肺、結腸、中枢神経系、および胸部のガンから選ばれる。
【００３２】
ここで使用するように、動物において「ガン」は、ガンを引き起こす細胞に典型的な特徴、例えば、制御されない増殖、特殊な機能の喪失、不死、有意な転移能、抗-アポトーシス活性での著しい増加、急速な成長と増殖率、および一定の特徴的な形態および細胞性マーカーを有する細胞の存在に言及する。いくらかの状況において、ガン細胞は腫瘍の形態になることがあり、そのような細胞は、動物内に局所的に存在し、または独立した細胞、例えば、白血病性細胞として血流において循環する。ガンには、制限されないが、肺ガン、胸部ガン（breast cancer、乳ガンとも言う）、前立腺ガン、中枢神経系ガン、結腸直腸（colorectal、大腸とも言う）ガン、食道性ガン、胃ガン、白血病/リンパ腫、子宮ガン、皮膚ガン、内分泌性ガン、泌尿器ガン（urinary cancer）、膵臓ガン、消化器ガン（gastrointestinal cancer、胃腸ガンなどとも言う）、卵巣ガン、頸部ガン（cervical cancer、子宮頸ガンなどとも言う）、および腺腫が含まれることができる。一定の実施形態では、ガンは、前立腺ガン、卵巣ガン、肺ガン、結腸直腸ガン、および乳ガンから選ばれる。
【００３３】
ここで使用する「有効な量」という用語は、特定の障害、状態、または疾患を処置する、例えば、その徴候（symptoms）の一またはそれよりも多く（一以上とも言う）を改善、緩和、軽減、および/または遅延させるなどのようなもののために十分な化合物または組成物の量に言及する。ガンまたは他の望ましくない細胞増殖に関して、有効な量は、腫瘍の縮小および/または腫瘍の成長速度の低下（例えば、腫瘍の成長を抑圧するなどのようなもの）をさせるため、または他の望ましくない細胞増殖を防止または遅延させるのに十分な量を含む。いくらかのバリエーションでは、有効な量は、発生および/または再発を防止または遅延させるのに十分な量である。有効な量は、一回以上の施与で施すことができる。ガンの場合、化合物または組成物の有効な量は次のとおりであり得：（i）ガン細胞の数を減らし；（ii）腫瘍の大きさを小さくし；（iii）ある程度まで抑え、遅らせ、遅くし、およびいくらかの実施形態では、ガン細胞の末梢器官への浸潤を止め；（iv）腫瘍の転移を抑え（即ち、ある程度まで遅くし、およびいくらかの実施形態では止め）；（v）腫瘍の成長を抑え；（vi）腫瘍の発生および/または再発を防止または遅延し；および/または（vii）ガンに関連する一以上の徴候をある程度緩和する。
【００３４】
一定の実施形態では、エピジェネティック化合物は、ヒストンデアセチラーゼ抑制物質またはヒストンメチルトランスフェラーゼ抑制物質である。ヒストンデアセチラーゼ（ヒストン脱アセチル化酵素とも言う）抑制物質は、ヒストンデアセチラーゼ、それはヒストンでのアセチル基を除去する原因となる酵素であり、それを抑制し、DNAがヒストンの周囲をよりしっかりと包み込むのを可能にされる。ヒストンデアセチラーゼ抑制物質は、ヒストンのハイパーアセチル化を引き起こし、それによってそれは遺伝子発現に影響を及ぼす。模範的なヒストンデアセチラーゼ（抑制物質か？）には、クラスI、クラスII、クラスIII、およびクラスIVヒストンデアセチラーゼに作用するもの、例えば、ヒドロキシマート（hydroxymates）、環状テトラペプチド、デプシペプチド、ベンズアミド、ケトン、および脂肪酸化合物、例えば、フェニル酪酸およびバルプロ酸などのようなものが含まれる。言及され得るヒストンデアセチラーゼ抑制物質には、例えば、ロミデプシン（Istodax(R)（商標））（イストダックス）、ボリノスタット、およびエチノスタット（SNDX-275、MS-275）が含まれる。同様に、ヒストンメチルトランスフェラーゼ抑制物質も遺伝子発現に影響する。例えば、ヒストンのリジンまたはアルギニンのメチル化部位にてヒストンのメチル化を抑制することによって、ヒストンメチルトランスフェラーゼ抑制物質は遺伝子発現をサイレンスに、または場合によっては活性化するのに働く。模範的なヒストンメチルトランスフェラーゼ抑制物質には、ピノメトスタット（EPZ5676）、EPZ005687、GSK343、BIX01294、タゼメトスタット（EPZ-6438）、MI-503、MI-463、EPZ020411、MS049、UNC3866、CPI-1205、A-366、MI-136、GSK591、HLCL061塩酸塩、UNC1999、MM-102、SGC 0946、UNC0379、EPZ015666（GSK3235025）、PFI-2、UNC0631、SGC707、MS023、MI-3（メニン-MLL抑制物質）、BRD4770、MI-2（メニン-MLL抑制物質）、EI1、GSK503、EPZ004777、GSK126、CPI-360、CPI-169、AMI-1、およびOICR-9429が含まれる。
【００３５】
一定の実施形態では、ヒストンデアセチラーゼ抑制物質は、ヒストンデアセチラーゼをコードする遺伝子を標的とする核酸抑制物質分子である。一定の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ抑制物質は、ヒストンメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を標的とする核酸抑制物質分子である。本核酸抑制物質分子には、制限されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはRNA干渉分子、例えば、マイクロRNA、低分子干渉RNA（short interfering RNA）、またはpiwi-結合RNA（piwi-interacting RNA）などのようなものが含まれる。
【００３６】
一定の実施形態では、エピジェネティック化合物はMBDタンパク質抑制物質である。ここで用いるように、MBDタンパク質抑制物質は、メチル-CpG結合タンパク質の結合を抑制することができる化合物である。いくらかの実施形態では、MBDタンパク質抑制物質はMBD2タンパク質抑制物質である。特定の実施形態では、MBD2タンパク質抑制物質は、化合物KCC-08、KCC-03、およびKCC-07から選ばれ得る。KCC-08は、次の式（I）：
【化１】
2020524262.tif 000003
によって代表される。
【００３７】
KCC-03は以下の式（II）によって代表され、およびKCC-07は以下の式（III）によって代表される：
【化２】
2020524262.tif 000004
【００３８】
別の模範的なエピジェネティック化合物はDNA脱メチル化剤である。ここで用いるように、DNA脱メチル化剤は、DNAのメチル化を抑制することができる化合物である。いくらかの実施形態では、DNA脱メチル化剤は、DNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質である。DNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質は、メチル基のDNAへの転移を触媒する酵素を抑制する化合物である。特定の実施形態では、DNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質は、5-アザシチジン（アザシチジン、4-アミノ-1-β-D-リボフラノシル-s-トリアジン-2(1H)-オン、Vidaza(R)（ビダーザ））、デシタビン（5-アザ-2'-デオキシシチジン、Dacogen(R)（ダコゲン）、SGI-110（2'-デオキシ-5-アザシチジリルイル-(3'-5')-デオキシグアノシン）、RG108（N-フタリル-L-トリプトファン）、DZNep（SGI-1036、3-デアザンプラノシンA）、ゼブラリン（ピリミジン-2-オンベータ-リボフラノシド）、ジスルフィラム（DNMT1抑制物質）、プロカインアミド、およびASTX-727から選ばれ得る。
【００３９】
一定の実施形態では、DNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質は、DNAメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を標的とする核酸抑制物質分子である。本核酸抑制物質分子には、制限されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはRNA干渉分子、例えば、マイクロRNA、低分子干渉RNA、またはpiwi-結合RNAなどのようなものが含まれる。
【００４０】
ここには、エピジェネティック化合物と組み合わせて使用し得る化学療法剤も開示する。一定の実施形態において、化学療法剤は、ガン細胞の増殖を抑制するために相乗的である量においてエピジェネティック化合物と一緒に使用される。任意の既知の化学療法薬を使用し得る。一定の実施形態において、本化学療法剤は、核酸抑制物質分子、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのようなもの、またはRNA干渉分子、例えば、マイクロRNA、低分子干渉RNA、またはpiwi-結合RNAなどのようなものである。
【００４１】
ここで用いるように、RARアゴニストは、標的遺伝子発現を高めることができる模範的な化学療法剤である。レチノイン酸受容体は、遺伝子発現を抑制するためにコリプレッサータンパク質に結合することができる。RARアゴニストは、コリプレッサータンパク質の解離を引き起こし、および次にコアクチベータータンパク質の結合とリクルートメント（動員とも言う）を促進し、標的遺伝子のダウンストリーム（下流とも言う）発現がもたらされる。特定の実施態様において、RARアゴニストは、例えば、イソトレチノイン、アリトレチノイン、トレチノイン、ベキサロテン、タザロテン、MDI 301、R667、9-cis（シス）UAB30、アダパレン（Adapalene）、AC 261066、AC 55649、AM 580、AM 80、BMS 753、CD 1530、CD 2314、CD 437、Ch 55、TTNPB、BMS 453、EC 19、EC 23、およびフェンレチニドから選ばれ得る。
【００４２】
ここで用いるように、オーロラキナーゼ抑制物質は、有糸分裂を通して細胞のプログレッション（進行、増悪などとも言う）を抑制することができる別の模範的な化学療法化合物である。オーロラキナーゼ酵素は、細胞の有糸分裂において、機能の調節、例えば、中心体の成熟、染色体の整列、染色体の分離、および細胞質分裂などのようなものを含め、重要な役割を果たすことが知られる。ヒト細胞には、オーロラキナーゼA、オーロラキナーゼB、およびオーロラキナーゼCを含む酵素のオーロラキナーゼファミリーが含まれており、それらの各々が有糸分裂のプロセス中に異なる役割を果たす。オーロラキナーゼAは、例えば、一定のタイプのガンにおいて過剰発現する可能性があり得ることが発見された。したがって、オーロラキナーゼA抑制物質の研究は、その潜在的な化学療法特性について研究者にとって興味深いものである。特定の実施形態では、ここに開示するオーロラキナーゼA抑制物質は、アリセルチブ（MLN8237）、AMG-900、バラセルチブ、CYC116、ダンセルチブ（PHA-739358）MLN8054、VX-680（MK-0457、トザセルチブ）、およびTAS-119から選び得る。
【００４３】
一定の実施態様において、化学療法剤は、選ばれる化合物であり、それはガンに関連する、またはそうと考えられる遺伝子をそれが抑制するからである。ここに開示する一定の実施形態では、化学療法剤は、以下の遺伝子の少なくとも一つを抑制する化合物である：PLAS2G12A、EIF4A2、GNAZ、DCT、SULT1C4、HLX、ITK、AURKA、CHST3、MAP2K2、AADAT、CRAT、SULT4A1、PDE4D、THY1、PDE1B、BDH2、QPRT、STAT5A、PHF21A、MEF2C、IL17D、SEL1L、COMT、GLRX、AKR1C4、GNA12、B4GALT1、LEF1、XYLT1、GNAQ、GCA、AGXT2、DPM2、OGDHL、UGT2B10、PDE5A、GPSM1、LIG3、PDE4B、LCMT1、DHX58、GBGT1、DUSP9、DCI、B4GALT2、MTR、NT5C2、HSD3B2、ARL4D、GPT2、OAT、RFXAP、PDE11A、BCR、GNA11、PDE4C、DHRS3、FOXN1、PDE6G、G6PC2、RPI1、IDI1、ACSS1、FHIT、UGT1A3、FARS2、A4GALT、GATM、CHST1、AGPAT4、NT5M、MVK、UGT2B17、ARHGEF1、NEURL、QPCT、GNAI3、ATIC、PLA2G12A、DARS、AKRIC1、B4GALT5、FUT5、COX10、AKAP13、AGXT、GNMT、HOXB4、CAND1、CLC、TFAP2A、HMGN1、RAD9A、GNB3、ECGF1、ARPC3、ACVR1B、CKS1B、SLC1A2、UROS、CHST4、NT5E、PIGL、CIGALT1、PDE1A、ACP6、NOS1、RECQL4、NOS3、RNF2、LSS、ANP32A、RAG2、BCL2L2、CPE、CAPN9、PRKAR2A、EP300、FGFR2、ISYNA1、ARF3、IPMK、BCL11B、HMGCS1、GALNT14、GALNS、FAH、AK3L1、SULT1C2、GLP1R、AGPAT2、およびFOXP1。
【００４４】
いくらかの実施態様において、エピジェネティック化合物または化学療法剤は、対象においてインビボで活性型に変換されるまで不活性であり得る。例えば、デシタビンの非活性バージョン、例えば、SGI-110（Astex(R)）（アステックス）などのようなものは、それらがインビボでデシタビンに変換され得るため、本開示の範囲内である。
【００４５】
いくらかの実施形態では、メチル化-DNA結合タンパク質抑制物質はKCC-08であり、および24時間の期間にわたる単回施与において施される投薬量は、約25mg/kg未満、例えば、約20mg/kg未満、約10mg/kg未満、約5mg/kg未満、または約2mg/kg未満、または約1mg/kgであり得る。一定の実施形態において、KCC-08は、複数の連続する日の経過にわたって施し、例えば、一日一回2-7日間施し、例えば、一日一回5日間などのようなものなどで施すことができる。KCC-08はまた、複数サイクル（例は、2、3、4、または4よりも多くのサイクル）において施すことができ、典型的には、各サイクルの間に0-6週間を有し、例えば、3週間のサイクルにわたってまたは4週間のサイクルにわたって5日ごとに施すなどのようなものであり得る。一定の実施形態においては、KCC-08は、4週間のサイクル中に5日ごとに約1mg/kg/日の量において施され得る。
【００４６】
いくらかの実施態様において、DNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質はデシタビンであり、および24時間の期間にわたり単回施与において施される投薬量は、約25mg/m2未満、例えば、約20mg/m2未満、約10mg/m2未満、約5mg/m2未満、または約3.5mg/m2未満などのようなものであり得る。一定の実施形態では、デシタビンが24時間の期間にわたって一回よりも多く施されるとき、24時間の期間にわたって施される投薬量は、150mg/m2未満、例えば、約125mg/m2未満、約100mg/m2未満、約40mg/m2未満、約35mg/m2未満、約30mg/m2未満、約25mg/m2未満、約20mg/m2未満、または約15mg/m2未満のようなものであり得る。一定の実施形態では、デシタビンは、複数の連続する日の経過にわたって施し、例えば、2-7日間一日一回施すなどのようなもの、例えば、5日間一日一回などのようなものであり得る。デシタビンはまた、複数のサイクル（例は、2、3、4、または4サイクルよりも多く）において施されてよく、典型的には、例えば、各サイクルの間に4-6週間を有し、例えば、4週間サイクルにわたり5日ごとに施されるようなものである。一定の実施形態では、デシタビンは、4週間のサイクル中に5日ごとに約20mg/m2の量において施され得る。一定の実施形態では、デシタビンは、4週間サイクル中に5日ごとに約5mg/m2以下の量において施されてもよく、および一定の他の実施形態では、デシタビンは4週間のサイクル中に5日ごとに約3.5mg/m2以下の量において施されてもよい。他の実施形態では、投薬量濃度は約1nMから約500nMまでに及んでよく、例えば、約10nMないし約250nM、または約100nMのようなものである。
【００４７】
いくらかの実施態様において、RARアゴニストはイソトレチノインであり、および投薬量濃度は、投薬量あたり約5mg/kgから約150mg/kgまでに及んでよく、例えば、投薬量あたり約90mg/kg、60mg/kg、約30mg/kg、約15mg/kg、および10mg/kgなどのようなものである。一定の実施形態では、RARアゴニストは、1日1回または2回施され得、例えば、1日2回施される15mg/kgまたは1日1回施される約30mg/kgなどのようなものである。一定の実施形態において、投薬量は、投薬量あたり約60mg/kg未満であり得る。一定の実施形態では、RARアゴニストがサイクルにおいて施されるとき、サイクルの全体の間に施される投薬量は、約30mg/kgから約300mg/kgまでに及び得、例えば、約90mg/kgないし約250mg/kg、または約150mg/kgなどのようなものである。一定の実施形態では、サイクルの全体の間に施される投薬量は約200mg/kg未満であり得る。
【００４８】
いくらかの実施形態では、オーロラキナーゼA抑制物質はアリセルチブであり、および投薬量濃度は約5nMから約150nMまでに及んでよく、例えば、約10nM、約50、または約100nMのようなものである。一定の実施形態において、投薬量濃度は、約10mg/kgから約30mg/kgまでに及んでよく、約15mg/kgまたは約25mg/kgなどのようなものである。一定の実施形態において、施される投薬量は、投薬量あたり約25mgから約75mgまでに及んでよく、例えば、投薬量あたり約10mg、30mg、約35mg、約40mg、および50mgなどのようなものである。一定の実施形態において、オーロラキナーゼA抑制物質は、1日1回または2回施され得、例えば、1日2回施される30mgまたは1日2回施される50mgなどのようなものである。一定の実施形態において、投薬量は、投薬量あたり約50mg未満であり得る。一定の実施形態では、オーロラキナーゼA抑制物質がサイクルにおいて施されるとき、サイクルの全体の間に施される投薬量は、約70mgから約1050mgまでに及んでよく、例えば、約350mgないし約700mg、約1050mg、または約700mgなどのようなものである。一定の実施形態では、サイクルの全体の間に施される投薬量は、約700mg未満であり得る。
【００４９】
一定の実施形態において、少なくとも一のエピジェネティック化合物、例えば、DNA脱メチル化剤またはメチル化-DNA結合タンパク質抑制物質などのようなものは、少なくとも一の化学療法剤、例えば、オーロラキナーゼA抑制物質またはRARアゴニストなどのようなものに対し連続的に施され得、および一定の実施形態では、それは少なくとも一の化学療法剤と同時に施され得る。ここで用いるように、「連続施与」という用語は、少なくとも一のエピジェネティック化合物および少なくとも一の化学療法剤が約1日より長い時間間隔（time separation）により施されることを意味する。一定の実施形態では、少なくとも一のエピジェネティック剤が連続して施されるとき、それは少なくとも一の化学療法剤の施与に先立ち、またはその後に施与されてもよく、および一定の実施形態では、施与は連続的および同時の双方であるように重複してよい（例は、少なくとも一のエピジェネティック化合物が最初にある時間の期間施され、次いで少なくとも一の化学療法剤が単独で施されるのが続き、次いで少なくとも一のエピジェネティック化合物および少なくとも一の化学療法剤の両方が同時に施されるのが続く）。いくらかの実施形態では、少なくとも一のエピジェネティック化合物は、数日の期間の間、例えば、約1日ないし約12日などのようなもの、または数週の期間の間、例えば、約1週間ないし約10週間などのようなもので施されるか、またはあるサイクル、例えば、28日のサイクルにおいて約5日毎ないし約7日毎などのようなものにおいて施され得る。
【００５０】
ここで用いるように、「同時施与」という用語は、化合物が約1日を超えない時間間隔、例えば、約12時間を超えない、約6時間を超えない、または約1時間を超えないなどのようなものにより施されることを意味する。同時施与の一定の実施形態では、化合物は、約15分を超えない（以内とも言う）の時間間隔で、例えば、約10分を超えない、約5分を超えない、または約1分を超えないなどのようなものにより施される。化合物が同時に施されるとき、それらは同じ組成物（例は、エピジェネティック化合物および化学療法剤の両方を含む薬剤組成物）または別々の組成物（例は、少なくとも一のエピジェネティック化合物が一の組成物において含まれ、および少なくとも一の化学療法剤は別の組成物において含まれる）において含まれ得る。
【００５１】
ここに開示する一定の実施形態では、少なくとも一のエピジェネティック化合物および少なくとも一の化学療法剤の施与は同時発生的であり、即ち、少なくとも一のエピジェネティック化合物および少なくとも一の化学療法剤の施与期間は互いに重複する。いくらかの実施形態では、少なくとも一のエピジェネティック化合物および少なくとも一の化学療法剤の施与は同時発生的ではない。例えば、いくらかの実施形態では、少なくとも一のエピジェネティック化合物の施与は、少なくとも一の化学療法剤が施される前に終結される。いくらかの実施形態では、少なくとも一の化学療法剤の施与は、少なくとも一のエピジェネティック化合物が施される前に終結される。一定の実施形態では、これらの二つの非同時発生的施与間の時間期間は、約1日から約8週間までに及ぶことができ、例えば、約2週間または約4週間などのようなものである。
【００５２】
ここに開示する方法による処置は、ガンからの完全な軽減または治癒、またはガンの一以上の徴候の部分的改善をもたらすことができ、および一時的または永続的であることができる。一定の実施形態では、ここに開示する方法において、有効な量の少なくとも一のエピジェネティック化合物および有効な量の少なくとも一の化学療法剤、例えば、デシタビンおよびオーロラキナーゼA抑制物質またはMBDタンパク質抑制物質およびRARアゴニストなどのようなものの施与は、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％減少をもたらし得る。対象における癌の少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約100％の対象におけるガンにおいて減少、および対象におけるガンにおいて100％の減少をもたらし得る（may result a in）。
【００５３】
いくらかの実施形態では、少なくとも一のエピジェネティック化合物、例えば、DNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質またはMBDタンパク質抑制物質などのようなもの、および少なくとも一の化学療法剤、例えば、オーロラキナーゼA抑制物質またはRARアゴニストなどのようなものの効果は相乗的である。ここで用いるように、用語「相乗作用」、「相乗的に」、およびそれらの派生語は、少なくとも一のエピジェネティック化合物および少なくとも一の化学療法剤の組合せの生物学的活性が、それぞれの薬剤が個別に施されるときの生物学的活性の和よりも高いことを指し示す。相乗作用は、それぞれの薬剤が同時に施されるとき、または薬剤の一方が他方の前に施される場合に発生し得る。いくらかの実施形態では、少なくとも一のエピジェネティック化合物および少なくとも一の化学療法剤は、ペイシェント（人間で言う場合の患者）に別々に施されるとき、最小腫瘍増殖抑制活性（minimal tumor growth inhibitory activity）を有し；しかし、少なくとも一のエピジェネティック化合物および少なくとも一の化学療法剤の同じ投薬量は、組み合わせてペイシェントに施されるとき、高い腫瘍増殖抑制活性を有し得る。少なくとも一のエピジェネティック化合物および少なくとも一の化学療法剤のこの相乗作用は驚くべきものであり、および予想外である。
【００５４】
相乗作用は、例えば、Bliss（ブリス）相乗作用法を含め、様々な方法によって測定することができる。Bliss, C.I.、The Toxicity of Poisons Applied Jointly（共に適用される毒物の毒性）、ANN. APPL. BIO.（アナールズ・オブ・アプライド・バイオ-サイエンシーズ）26：3 585-615（1939）参照。Bliss値は、実験的応答および算出したBliss独立値間の差として規定され得る。Bliss値は、組み合わせた二つの化合物の効果が単に相加的であるか、または相乗的であるかを指し示す。Bliss値のゼロは相加的と考えられ、そこで「相加的」という用語は、二つの化合物の組合せの結果が各化合物の和であり、および化合物類が相乗的と考えられないことを意味する。負のブリス値は拮抗作用を指し示し、そこで化合物の一方が他方の効果を抑制するように作用する。正のBliss値は相乗作用を指し示し、そこで二つの化合物の複合効果はそれらの和よりも大きくなる。正のBliss値が高いほど、二つの化合物の相乗作用が大きくなる。
【００５５】
ここに開示する一定の実施形態では、少なくとも一のエピジェネティック化合物および少なくとも一の化学療法剤は、ガン性細胞に対して約0より大きく、例えば、約0.1より大きく、約0.25より大きく、約0.4より大きく、約0.5より大きく、または約0.7より大きいなどのようなもののブリス相乗作用値を有する。
【００５６】
ここに開示する一実施形態では、少なくとも一のエピジェネティック化合物、例えば、DNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質などのようなもの、例えば、デシタビンなどのようなもの、および少なくとも一の化学療法剤、例えば、オーロラキナーゼA抑制物質などのようなもの、例えば、アリセルチブなどのようなものの相乗作用は、治療上有効な量を達成するためにエピジェネティック化合物および/または化学療法剤の施される用量が各薬剤を単独で施すときに通常必要とされるものよりも少なくてよいようなものである。一定の実施形態では、MBDタンパク質抑制物質、例えば、KCC-08などのようなものと、少なくとも一の化学療法剤、例えば、RARアゴニストなどのようなもの、例えば、イソトレチノインなどのようなものとの相乗作用は、治療上有効な量を達成するためにMBDタンパク質抑制物質および/または化学療法剤の施される用量が各薬剤を単独で施すときに通常必要とされるものよりも少なくてよいようなものである。それゆえ、いくらかの実施形態では、治療効果をあげるのに足らない量（subtherapeutic amount、治療量以下と言うこともある）の少なくとも一のエピジェネティック化合物および/または少なくとも一の化学療法剤を施し得る。「治療効果をあげるのに足らない量」または「治療効果をあげるのに足らないレベル」は、治療量より少ない量、すなわち、化合物が化学療法またはエピジェネティック目的について単独で施されるときに通常使用される量より少ない量に言及する。減少は、施与の量の減少および/または施与の頻度の減少の観点から反映され得る。
【００５７】
治療のための対象への施与は、例えば、経口、経鼻、経粘膜、眼内（ocularly）、直腸内、膣内、親として（parentally、parenterally非経口か？）で、筋肉内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内を含めたもの、直接脳室内（直接心室内とも言う）、静脈内、関節内、胸骨内、滑膜内、肝内、病巣内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射、大槽内（嚢内とも言う）に、局所に、粉体、軟膏、または点滴（点眼を含む）によるようなもので、頬側および舌下、経皮、吸入スプレーを通して、または本技術において既知の他のデリバリーモードを含めて含まれる任意の適切な投与経路によって行うことができる。
【００５８】
また、ここで開示するのは、有効な量の少なくとも一のエピジェネティック化合物、例えば、DNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質またはMBDタンパク質抑制物質などのようなもの、および有効な量の少なくとも一の化学療法剤、例えば、オーロラキナーゼA抑制物質またはRARアゴニストなどのようなものを含む、ガンを処置するための薬学的に許容可能な組成物であり、そこで少なくとも一のエピジェネティック化合物および少なくとも一の化学療法化合物は、ガン細胞の増殖を相乗的に抑制する。ここに開示する組合せを含む薬学的に許容可能な組成物は、任意の薬学的に許容可能な担体（キャリアとも言う）、例えば、非毒性の薬学的な有機または無機担体などのようなものと、薬学的に許容可能な組成物を提供するために混ぜ合わされてよい。典型的な薬学的に許容可能な担体には、例えば、マンニトール、尿素、デキストラン、乳糖、ジャガイモでんぷん、トウモロコシでんぷん、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアルキレングリコール、エチルセルロース、ポリ(ビニルピロリドン)、炭酸カルシウム、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、安息香酸ベンジル、炭酸ナトリウム、ゼラチン、炭酸カリウム、ケイ酸、および他の慣習的に採用される許容可能な担体が含まれる。薬学的剤形はまた、非毒性補助物質、例えば、乳化剤、保存剤、湿潤剤、およびその他同種類のものなどのようなものも含むことができる。
【００５９】
ここにさらに開示するのは、ガンの処置のためのキットであり、そこでキットは、有効な量の少なくとも一のエピジェネティック化合物、例えば、DNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質またはMBDタンパク質抑制物質などのようなもの、および有効な量の少なくとも一の化学療法剤、例えば、オーロラキナーゼA抑制物質またはRARアゴニストなどのようなものを含み、およびそこで少なくとも一のエピジェネティック剤および少なくとも一の化学療法剤は、ガン細胞の増殖を相乗的に抑制する。一定の実施形態では、キットにおいて少なくとも一のエピジェネティック化合物はデシタビンであってよく、および一定の実施形態では、キットにおいて少なくとも一の化学療法剤はアリセルチブであってよい。一定の実施形態においては、キットにおいて少なくとも一のエピジェネティック化合物はKCC-08であってよく、および一定の実施形態では、キットにおいて少なくとも一の化学療法剤はイソトレチノインであってよい。更なる実施形態では、キットは、化合物の投与または調剤について指示書を含み得る。
【００６０】
少なくとも一のエピジェネティック化合物および少なくとも一の化学療法剤の投薬頻度（dosing frequency）は、管理者の判断に基づいて、処置の過程にわたって調整され得る。別々に施されるとき、少なくとも一のエピジェネティック化合物および少なくとも一の化学療法剤は、異なる頻度および/または間隔で施され得る。少なくとも一のエピジェネティック化合物および少なくとも一の化学療法剤は、同じ投与経路または異なる投与経路を使用して施すことができる。
【００６１】
ここに開示する一定の実施形態において、少なくとも一のエピジェネティック化合物およびと少なくとも一の化学療法剤の組合せは、そこで組合せはガン細胞増殖を相乗的に抑制するのに有効であり、それは、非ガン性細胞増殖を相乗的に抑制せず、その効果は非ガン性細胞にて単に相加的であるか、または相加的未満であるようになる。一定の実施形態では、非ガン性細胞は初代肝細胞である。本開示の一定の実施形態では、DNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質、例えば、デシタビンなどのようなものと、オーロラキナーゼA抑制物質、例えば、アリセルチブなどのようなものとの組合せは、非ガン性細胞増殖を相乗的に抑制せず、その効果が非ガン性細胞にて単に相加的であるか、または相加的未満であるようになり、および一定の実施形態では、MBDタンパク質抑制物質、例えば、KCC-08などのようなものとRARアゴニスト、例えば、イソトレチノインなどのようなものの組合せは、非ガン性細胞増殖を相乗的に抑制せず、その効果は非ガン性細胞にて単に相加的であるか、または相加的未満であるようになる。ここに開示する一定の実施形態において、少なくとも一のエピジェネティック化合物および少なくとも一の化学療法剤は、非ガン性細胞での0または約0未満、例えば、約-0.05または約-0.10のブリス相乗作用値を有する。
【００６２】
ここに開示する一定の実施形態では、少なくとも一のエピジェネティック化合物、例えば、DNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質またはMBDタンパク質抑制物質などのようなものは遺伝性であり、それは初期のエピジェネティック化合物を除去した後でさえも少なくとも一の標的薬剤、例えば、オーロラキナーゼA抑制物質またはRARアゴニストなどのようなものを持続および感作するエピジェネティック記憶を誘導するようになる。これにより、望ましくない毒性をさらに最小限に抑えることができる逐次療法の可能性が考慮される。したがって、別の実施形態においては、ここに開示するのは、化学療法剤、例えば、オーロラキナーゼA抑制物質またはRARアゴニストなどのようなものに対して細胞を感作するための方法であり、本方法には、細胞が有効な量の化学療法剤と接触されるのに先立ち細胞を低用量の有効な量のエピジェネティック化合物と接触させることが含まれる。一定の実施形態において、エピジェネティック化合物の低用量は、約100nMのDNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質、例えば、デシタビンなどのようなものであり得る。一定の実施形態では、エピジェネティック化合物の低用量は、MBDタンパク質抑制物質、例えば、KCC-08などのようなものの約1mg/kg/日であり得る。一定の実施形態では、細胞が感作される化学療法剤は、オーロラキナーゼA抑制物質、例えば、アリセルチブなどのようなものであり、および一定の実施形態では、細胞が感作される化学療法剤はRARアゴニスト、例えば、イソトレチノインなどのようなものである。
【実施例】
【００６３】
例1-オーロラキナーゼAの識別
プールしたレンチウイルスshRNAネガティブ機能スクリーニングをDU145前立腺ガン細胞のサンプルにて行い、Schlabach M. R.ら、Cancer Proliferation Gene Discovery through Functional Genomics、SCIENCE、319、5863：620-4（2008）において先に記載した手順に適合させた。DU145前立腺ガン細胞はまず、プールしたレンチウイルスshRNAにより処理し、RNAライブラリーの形質導入がもたらされた。次いで、レンチウイルスにより形質導入したDU145細胞をデシタビンにより処理し、それは選定した数の形質導入細胞に対してだけ致死的である（即ち、shRNA「ドロップアウト」または「ヒット」）。したがって、ノックダウンのとき、コントロール処理細胞と比較して、DNAメチルトランスフェラーゼ抑制物質（DNMTi）デシタビンにより処理するときのDU145細胞において選択的に致死的であったターゲットが識別された。
【００６４】
DU145細胞のフラスコに、Cellecta(R)（セレクタ）（Decipher Collection（デサイファー・コレクション））からのゲノム-スケールのプールされたレンチウイルスshRNAライブラリー（genome-scale pooled lentiviral shRNA library）を形質導入した。プールでの各レンチウイルスは、27,000のshRNAの構築物（コンストラクトとも言う）、shRNA特異的バーコード、ピューロマイシン耐性遺伝子、および形質導入レベルを追跡するための蛍光マーカー遺伝子のそれぞれをエンコードした。5,000のヒト遺伝子のそれぞれは、プールにおいてレンチウイルスをコードする5ないし6のshRNAによってターゲットにされ、および形質導入された細胞の大部分だけが単一のレンチウイルス粒子を受け入れるのを確実にするために、低い感染多重度（multiplicity of infection、MOI、感染効率などとも言う）（およそ0.3のMOI）にて形質導入を行った。この低いMOIのもとで、各shRNAが集団において約100ないし約1000倍を表すように、十分なウイルスおよび細胞を形質導入した。
【００６５】
次いで、形質導入した細胞のライブラリーをデシタビン（100nMまたは500nM）またはビヒクルコントロールにより4日または7日間、すべて2ないし3回の反復実験において処理した。処理後、細胞を回収し、DNAを分離し、および50μgのゲノムDNAを使用して、生存細胞でのshRNA特異的バーコードを増幅した。次に、これらのバーコードを次世代シーケンシングによって識別し、および集団において個々のshRNAに対応する各バーコードの数をビヒクルおよびデシタビン処理細胞におけるそのshRNAの表示の尺度として使用した。「ヒット」は、ビヒクル処理細胞の集団と比較したデシタビン処理細胞の集団において「ドロップアウト」したそれらのshRNAsとして識別した。逆に、ビヒクル処理細胞の集団と比較してデシタビン処理細胞の集団において豊富化したshRNAsは、デシタビン処理に対する耐性を付与すると考えられた。図1Aは、デシタビン処理に対するコントロール細胞の集団におけるすべての大幅に変えられたshRNAバーコードのウォーターフォールプロットを示し、x軸での0.0を下回る（falling below）棒はデシタビンに感作したshRNAsを指し示し、およびx-軸での0.0を上回る（falling above）棒はデシタビンに対する耐性を付与したshRNAsを指し示す。
【００６６】
トップの感作性ヒット（top sensitizing hits）の中で、オーロラキナーゼA（AURKA）遺伝子をターゲットとするshRNAは、それが-1.13のlog2(DAC/veh)値を有し、それについて薬理学的薬剤が既に臨床開発下にあるトップヒットであった。図1Bは、AURKAの独立した検証をデシタビンと組み合わせたエピジェネティック治療による誘導合成致死性（Induced Synthetic Lethality with pigenetic Therapy）（ISLET）ターゲットとして示す。AURKAをターゲットとする5つの異なるshRNAsは100nMデシタビンと組み合わせて、それぞれAURKA shRNAs単独またはデシタビン単独と比較して、DU145ガン細胞の生存率を著しく低下させた。それゆえ、AURKAは、迅速な翻訳についてISLETターゲットとして選ばれた。図1Bに示すように、DU145細胞の全体的な生存率は、デシタビンを伴うがAURKAを伴わないビヒクルコントロールについて、shRNAをターゲットとするAURKAをデシタビンと一緒に有するDU145を含む5つのサンプルのいずれについてよりも顕著に高かった。
例2-ガン細胞でのDNMTiおよびAURKAの相乗的増殖抑制効果
【００６７】
オーロラキナーゼの薬理学的抑制物質をデシタビンと組み合わせてテストした。AURKA選択的（例は、アリセルチブおよびMLN8054）および非選択的（例は、AMG-900）オーロラキナーゼ抑制物質の両方は、DU-145細胞の相乗的増殖抑制を示し、および臨床開発間に最も遠い追加研究のために、アリセルチブを選んだ。アリセルチブおよびデシタビンは、インビトロの多様なガン細胞系において細胞の生存性、細胞増殖、およびクローン原性生存率（clonogenic survival）アッセイでの著しい相乗作用を示した。
【００６８】
DU145前立腺ガン細胞およびA549肺ガン細胞を、様々な濃度（0nM、10nM、50nM、および100nM）のアリセルチブ、更には様々な濃度のデシタビン（0nM、50nM、100nM、および250nM）で処理した。代表的なデータは、図2Aおよび2B、ならびに以下の表に示す。以下の表1は、様々な量のデシタビンと一緒に様々な量のアリセルチブによるDU145前立腺ガン細胞についての増殖抑制割合を示す。表1に示すように、100nMのアリセルチブおよび250nMのデシタビンは最大の増殖抑制率（0.93）を見せた。
【００６９】
【表１】
2020524262.tif 000005
【００７０】
以下の表2は、DU145前立腺ガン細胞における様々な量のアリセルチブと一緒の様々な量のデシタビンのBliss相乗作用値を示す。表2において示すように、最高のBliss相乗作用値（0.72）は、100nMのアリセルチブで100nMのデシタビンと組み合わせて観察した。各パネルでは、アラマー・ブルー細胞生存性（Alamar blue cell viability）アッセイにおいて各薬物の単独および組合せの用量反応を用いた。
【００７１】
【表２】
2020524262.tif 000006
【００７２】
同様に、表3は増殖抑制率を示し、および表4は、A549肺ガン細胞における様々な量のアリセルチブの様々な量のデシタビンと一緒のBliss相乗作用値を示す。表4に示すように、最高のBliss相乗作用値（0.68）は、100nMのアリセルチブの250nMのデシタビンとの組合せにおいて観察した。
【表３】
2020524262.tif 000007
【表４】
2020524262.tif 000008
【００７３】
各薬物単独では、テストした用量にて、DU-145およびA549ガン細胞系において細胞生存性に対する影響は最小限であったが、組み合わせた2つの薬物は細胞生存性の著しい低下を示した。正式な相乗作用分析は、Bliss独立スコアを使用して実行した（そこでゼロより大きい値は相加効果より大きいことを指し示す）。
【００７４】
最大の相乗作用を示す各薬剤の用量（即ち、DU145については100nMアリセルチブおよび100nMデシタビン、およびA549については100nMアリセルチブおよび250nMデシタビン）について、また増殖曲線を図2Aおよび2Bのグラフにおいて示す。図2Aのグラフは、薬剤単独（デシタビンおよびアリセルチブ別々）、ビヒクルコントロール、および薬剤の組合せ（デシタビンおよびアリセルチブ一緒）についてのDU145前立腺ガン細胞の増殖曲線である。図2Aに示すように、デシタビンおよびアリセルチブの組合せは一緒に相乗的に作用してDU145細胞の細胞ルチブ別々）、ビヒクルコントロール、および薬剤の組合せ（デシタビンおよびアリセルチブ一緒）についてのA549肺ガン細胞の増殖曲線である。図2Bに示すように、デシタビンおよびアリセルチブの組合せは一緒に相乗的に作用してA549肺ガン細胞の細胞増殖を抑制した。
【００７５】
興味深いことに、デシタビンおよびアリセルチブの組合せは複数のガン細胞系の増殖抑制について著しい相乗作用を示したが、その組合せは初代肝細胞の増殖を有意に変えることなく、正式な相乗作用分析は相加効果未満を示した。以下の表5において示すように、単独で作用するアリセルチブおよびデシタビンの両方は、初代肝細胞に対してある程度の増殖抑制をもつ。したがって、少なくとも相加効果が期待されるが；ただし、以下の表6において示すように、正式な相乗作用分析は、肝細胞に対するデシタビンおよびアリセルチブの併用効果が相加効果よりも小さいことを指し示した（即ち、負のBliss相乗作用値）。
【００７６】
【表５】
2020524262.tif 000009
【００７７】
【表６】
2020524262.tif 000010
【００７８】
図2Cのグラフは、薬剤単独（デシタビンおよびアリセルチブ別々）、ビヒクルコントロール、および薬剤の組合せ（デシタビンおよびアリセルチブ一緒）についての肝細胞セルの増殖曲線である。図2Cに示すように、デシタビンおよびアリセルチブの一緒の併用は経時的な細胞増殖に有意な影響を与えなかった。
【００７９】
デシタビンおよびアリセルチブの組合せの相乗作用分析は、一連の18のガン細胞系（前立腺9、卵巣1、肺1、結腸2、中枢神経系2、および乳ガン細胞系3）および2の非ガン細胞モデルにおいて評価した。最終的な累積Bliss相乗作用スコアは、0nM、10nM、50nM、および100nMのalsertib（alisertib（アリセルチブ）か？）と0nM、50nM、100nM、および250nMのデシタビンと一緒の16の組合せのそれぞれの相乗作用値の和に基づいて算出した。図3示すように、および以下の表7に挙げるように、評価したガン細胞系の大部分は、0.5を超える累積Bliss相乗作用スコア（即ち、テストしたすべての用量の組合せにわたるBliss相乗効果の和）を伴うデシタビンおよびアリセルチブの組合せによって相乗的に抑制された。
【００８０】
【表７】
2020524262.tif 000011
【００８１】
非ガン細胞モデル（肝細胞およびHEK293T細胞）の両方は、組合せによって相乗的に抑制されなかった。デシタビンおよびアリセルチブの組合せはLNCaPおよびT47D細胞において拮抗的であったが、この拮抗作用の機構的な精査（mechanistic dissection）が進行中である。それでもなお、これらのデータは、DNMTiおよびAURKAiによる併用療法が複数のガンの種類で幅広い治療上の利益を有し得ることを示唆する。さらに、テストした用量にわたるガン細胞における単一薬剤の非常に低い活性、および組合せにおける高度な増殖抑制は、ISLETパラダイムの予測と一致する。
例3-DNMTiおよびAURKAiの組合せはインビボでのガン増殖抑制を示した
【００８２】
DU145前立腺ガン細胞系のインビボ異種移植研究を使用して、7週間の期間にわたる2つの異なる処置時間スケジュールを使用する2つの用量レベルのアリセルチブ単独またはデシタビンとの組合せの処置の効果を調査した。まず、ヌードマウスにDU145細胞を接種し、それは10-12日間インキュベートして異種移植腫瘍を確立させた。接種したマウスは次に、最初の2週間で高用量および低用量のアリセルチブとデシタビンの両方により同時に処置するか、または最初のサイクルにおいて2週間デシタビン単独、次いでアリセルチブ単独を続けることによりプライム（予備刺激とも言う）した。処置時間のスケジュールと投薬量レベルを図4において示す。デシタビンの用量は0.75mg/kgで一定に保ち、および図4に示すように、低用量（15mg/kg）または高用量（25mg/kg）のアリセルチブと共に与えた。デシタビンおよびアリセルチブの用量の累積数は、両方のスケジュールにおいてすべての併用処置アーム（治療群とも言う）で同じであった。
【００８３】
これらの研究の結果を図5Aおよび5Bにおいて、および以下の表8および9において示し、初期腫瘍サイズからの腫瘍サイズでの倍率変化、即ち、与えられた時間での腫瘍サイズの初期の腫瘍サイズに対する比が指し示される。テストした用量にてデシタビンまたはアリセルチブ単独による単剤療法は、ビヒクルコントロールと比較して異種移植組織の成長または生存率を有意に変えなかった。
【００８４】
【表８】
2020524262.tif 000012
【００８５】
【表９】
2020524262.tif 000013
【００８６】
図5Aに示すように、すべてのビヒクルコントロール、デシタビン単独、高用量アリセルチブ、および低用量アリセルチブにより接種したマウスについて、腫瘍は有意な速度で成長し続けた。反対に、デシタビンを低用量および高用量アリセルチブの両方と同時に、および低用量および高用量アリセルチブの両方の投与前にプライミングしたデシタビンにより接種されたマウスでは、有意な腫瘍成長は、たとえあったとしてもわずかでしか観察されなかった。
【００８７】
DU145異種移植片の著しく高められた成長抑制がもたらされることに加え、デシタビンおよびアリセルチブの組合せはまた、アリセルチブ用量レベルおよびタイムスケジュールの両方でヌードマウスの生存率を高めた。図5Bに示すように、すべてのビヒクルコントロール、デシタビンだけ、高-および低-用量のアリセルチブだけを接種したマウスは、接種後40日未満の平均生存を有した。それとは反対に、デシタビンおよびアリセルチブの組合せにより両方のアリセルチブの投与レベルと時間スケジュールにて接種されたマウスは、実験の閾値を超えて達した平均生存時間を有した。
例4-デシタビンおよびアリセルチブの組合せのインビボ毒性プロファイル
【００８８】
処置したマウスの毒性プロファイルを観察し、および実験の過程にわたり動物の体重を量った。図6A-Hにおいて示すように、マウスの重量はすべての処置群において実験の時間経過を通して比較的安定したままであり、このレジメンが比較的忍容性が高いことが示唆された。
【００８９】
図7A-Eにおいて示すように、併用療法は、各薬物単独と比較して、任意の血液学的パラメーター、例えば、血小板減少および好中球減少などのようなものを悪化させるとは考えられなかった。血小板減少の場合、図7Aに示すように、本組合せはアリセルチブ単独と比較して保護的であると考えられた。
【００９０】
肝機能に関して、単剤アリセルチブ処置によりASTおよびALTの上昇が観察された。図7Dおよび7Eを参照。しかし、グラフが指し示すように、デシタビンおよびアリセルチブの組合せは、この点で再び保護的であると考えられた。全体として、これらの研究は、デシタビンおよびアリセルチブの組合せについて動物モデルにおける保護効果および相加的毒性の欠如を論証する。
例5-DNMTiはAURKAiに対する長期の感作を誘導することができる
【００９１】
ここでは、DNMTi（デシタビン）による処置がオーロラキナーゼAインヒビター（AURKAi）、例えば、アリセルチブなどのようなものに対して後に感作することができた持続的なエピジェネティック再プログラミングおよびエピジェネティック記憶を誘導するであろうかどうかを調べた。DU145細胞は、組織培養においてビヒクルコントロールまたは低用量デシタビン（100nM、上記の例において使用されたものと同様）により処理した。この低用量では、ほとんどの細胞が生き残り、および薬物なしで4日間回復可能にされた。
【００９２】
次いで、ビヒクルおよびデシタビンで前処理した細胞をヌードマウスに移植し、および異種移植片腫瘍を3週間確立させた。次いで、動物をビヒクルコントロールまたはアリセルチブ（MLN8237強制経口投与（oral gavage）によって15mg/kgにて）のいずれかにより毎日5週間処置した。したがって、4つのグループを確立した：（1）ビヒクルコントロールを受ける未処置DU145マウス；（2）アリセルチブを受ける未処置DU145マウス；（3）ビヒクルコントロールを受けるデシタビン前処置DU145マウス；および（4）アリセルチブを受けるデシタビン前処置DU145マウス。
【００９３】
図8Aは、ビヒクルコントロールを施与したグループの異種移植片成長を例示するスパイダープロット（クモ状プロットとも言う）である。異種移植片成長のスパイダープロットは、図8Bおよび8Cに示すように、デシタビン前処理単独またはアリセルチブ単独に比べて、図8Dに示すように、培養物でのデシタビン前処理およびインビボでのアリセルチブ（MLN8237）処置によるグループでは、異種移植片成長が著しく減少したことを明らかにした。このことは、図9に示すように、生存率の大幅な改善につながった。それゆえ、インビトロでのデシタビンによる前処理は、細胞が回復し、および異種移植腫瘍として確立するのが可能にされた後でさえも観察することができたAURKAiに対する長期の感作を数週間にわたって誘発すると考えられた。
【００９４】
次いで、デシタビン前処理実験からの残留異種移植腫瘍における増殖指数およびアポトーシスフラクションを調べた。ビヒクルコントロール、デシタビン前処理単独、アリセルチブ単独、およびアリセルチブと組み合わせたデシタビン前処理のそれぞれからのサンプル細胞をKI-67またはカスパーゼ3Aのいずれかにより染色した。図10A-Dにおいて示すように、KI-67染色において極めて大きな減少があった（減少した細胞増殖を示す）。さらに、図10E-Hに示すように、デシタビン前処理およびアリセルチブ処置グループでは、カスパーゼ3A染色において著しい増加（アポトーシスの増加を示す）があった。しかし、ビヒクルコントロール、デシタビン前処理単独、およびアリセルチブ処置単独のグループでは、KI-67およびカスパーゼ3A免疫組織化学（IHC）レベルにおいてほとんど変動はなかった。図10A-Hを参照。このことは、デシタビンによる前処理がAURKAiに対する長期感作を誘導することを示唆し、それは腫瘍細胞が低用量デシタビンにより初期に処置された後数週間でさえ動物においてAURKAiによる処置の際に増殖における極めて大きな減少およびアポトーシスにおける増加として現れた。
例6-DNMTiおよびAURKAiによるISLETの作用メカニズム
【００９５】
DNMTi（デシタビン）およびAURKAi（アリセルチブ）による誘導合成致死性の作用メカニズムの調査を開始するために、DU145細胞におけるDNAメチルトランスフェラーゼおよびオーロラキナーゼAタンパク質発現レベルに対する各インヒビターの効果を調べた。AURKAについてのウエスタンブロット分析は、ビヒクルコントロール；100nMアリセルチブ単独；100nMデシタビン単独；および100nMのアリセルチブと組み合わせた100nMのデシタビンにより処理したDU145細胞組織サンプルにおいて実行した。低用量でのデシタビン処理は、AURKAタンパク質レベルを大いに誘導することができたこと、およびアリセルチブとの併用でこれがさらに強化されることがわかった。図11Aを参照。
【００９６】
DNAメチルトランスフェラーゼ酵素には、DNMT1、DNMT3A、およびDNMT3Bを含む酵素のファミリーが包含される。デシタビンは、共有結合によるトラッピングおよび分解を介してDNMT1レベルを著しく低下させることが知られ；ただし、デシタビン単独ではDNMT3Bレベルを大いに低下させることはないと考えられる。この後のものの観察結果は、図11Bに示すように、DU-145細胞においての研究で確認した。この研究では、DNMT3Bについてのウエスタンブロット分析は、ビヒクルコントロール；100nMアリセルチブ単独；100nMデシタビン単独；および100nMのアリセルチブと組み合わせた100nMのデシタビンで処理したDU145細胞組織サンプルにて実行した。デシタビンはDNMT1レベルを著しく低下させた（データは示さない）が、DNMT3Bレベルを有意には変えなかった。アリセルチブ単独では、DNMT1またはDNMT3Aレベルに有意な影響は及ぼさなかった（データは示さない）が、図11Bに示すように、DNMT3Bレベルを著しく低下させた。このDNMT3Bの消耗（depletion）は、デシタビンおよびアリセルチブの併用処理においてさらに強められた。追加的な予備研究では、アリセルチブによるDNMT3Bの消耗が、DNMT3Bの産生の減少によるよりはむしろ、アリセルチブ処理による低下したタンパク質安定性およびDNMT3Bの高められたプロテアソーム分解によるかもしれないことが観察された。
【００９７】
これらのデータは、AURKAがDNMT3Bの安定化においてある種の役割を演じ得、さらに調査することができる仮説であることを示唆する。全体として、これらのデータは、AURKAおよびアリセルチブの予期しないアップレギュレーションを引き起こすAURKAiおよびDNMTiがデシタビンによるそれらのターゲット酵素の相互調節を導くことができ、DNAメチルトランスフェラーゼDNMT3Bの予期しないダウンレギュレーションにつながることを示唆する。
【００９８】
デシタビンおよびアリセルチブの組合せはDNMT1およびDNMT3Bの両方の著しい減少をもたらすため、組合せ処理は高められたDNA脱メチル化をもたらし得ると仮定される。ルミノメトリーメチル化アッセイ（Luminometric Methylation Assay）（LUMA）を使用して、ビヒクルコントロール；デシタビン；アリセルチブ；およびアリセルチブと組み合わせたデシタビンを含むDU145細胞についてのDNAメチル化を測定した。LUMAアッセイよって測定されるように、全体的なメチル化レベルは、デシタビンまたはアリセルチブ単独を含む細胞と比較して、DU145細胞において併用処理で著しく減少することが見出された。図12Aを参照。
【００９９】
図12Bにおいて示すように、反復要素の複数のクラスのバイサルファイト（亜硫酸水素塩とも言う）ゲノム配列決定（bisulfite genomic sequencing）は、動原体周辺配列（peri-centromeric sequences）、例えば、サテライト2配列（Satellite 2 sequences）などのようなものが、デシタビンおよびアリセルチブの併用処理においていずれかの薬物単独と比較して特に高い脱メチル化を見せることを示した。併用処理では、サテライト2メチル化（Satellite 2 methylation）の割合が10％未満に著しく減少し、ビヒクルコントロールまたはいずれかの薬物単独ではそれらのすべては30％を超えていたのと対照的である。ビヒクルコントロールについて、CpGサテライト2メチル化の割合は45.09％であったが、デシタビン単独でそれは33.33％であり、およびアリセルチブ単独では40.6％であった。しかし、デシタビンおよびアリセルチブの組合せにより、5.46％のサテライトIIメチル化がもたらされた。図12B参照。これらの知見は、デシタビンおよびアリセルチブの組合せによるDNMT1およびDNMT3Bの両方の消耗が、動原体周辺（pericentromeric）配列でのDNAメチル化を急激に減少させることができ得ることを示唆する。
【０１００】
動原体周辺領域でのDNAメチル化を含め、適切なエピジェネティックマークの確立および維持は、染色体凝縮、動原体ヘテロクロマチン化、および適切な動原体機能に関連し得る。AURKA活性は、有糸分裂中の適切な動原体構造および紡錘体の付着についても重要である。それゆえ、デシタビンおよびアリセルチブの組合せは、動原体周辺のDNAメチル化を変えること、および適切なAURKA活性を妨げることによって、どちらかの薬剤単独と比較して増加した分裂期細胞死（mitotic catastrophe）につながるであろうと仮定される。
【０１０１】
さらに、H3S10-リン酸化陽性細胞の蓄積を測定し、および図13Aに示すように、デシタビンおよびアリセルチブの併用処理は、ビヒクルコントロールまたはいずれかのデシタビンまたはアリセルチブ単独による処理と比較して、増加した有糸分裂停止をもたらした。同様に、図13Bに示すように、デシタビンおよびアリセルチブによる併用処理は、ビヒクルコントロール、デシタビン単独、またはアリセルチブ単独による処理を超えて多核化細胞の形成を増加させた。最後に、図13Cに示すように、デシタビンおよびアリセルチブの併用処理は、ビヒクルコントロール、デシタビン単独、またはアリセルチブ単独での処理を超えて小核を有する細胞のフラクションを増加させた。有糸分裂停止、多核化細胞、および小核を有する細胞はすべて、分裂期細胞死の指標である。総合すると、これらの初期の機構的研究は、DNMTiおよびAURKAiの組合せが動原体領域のエピジェネティック調節不全を通してガン細胞において分裂期細胞死を生成させることができるという概念にサポートを提供する。
例7-機能的ゲノムスクリーニングからのデシタビンのISLETヒットのさらなる識別
【０１０２】
上記の例1において記載し、およびSchlabach M. R.ら、Cancer Proliferation Gene Discovery through Functional Genomics、SCIENCE、319、5863：620-4（2008）に以前記載した手順から編集したプロセスに従い、プールしたレンチウイルスshRNAネガティブ機能スクリーニングをDU145前立腺ガン細胞のサンプルにて行った。DU145前立腺ガン細胞をプールしたレンチウイルスshRNAで最初に処理し、RNAライブラリーの形質導入がもたらされた。次いで、レンチウイルス形質導入したDU145細胞をデシタビンにより処理した。したがって、識別されたターゲットは、コントロール処理細胞と比較してデシタビンにより処理するとき、DU145細胞において選択的に致死性であった。
【０１０３】
DU145細胞のフラスコに、ゲノムス-ケールのプールしたレンチウイルスshRNAライブラリーを形質導入した。プールにおいて各レンチウイルスは、27,500のshRNA構築物、shRNA特異的バーコード、ピューロマイシン耐性遺伝子、および形質導入レベルを追跡する蛍光マーカー遺伝子のそれぞれをコードした。5,000のヒト遺伝子のそれぞれは、プールにおいてレンチウイルスをコードする5ないし6のshRNAによってターゲットにされ、および形質導入された大部分の細胞だけが単一のレンチウイルス粒子を受け入れるであろうことを確実にするために、低い感染多重度（およそ0.3のMOI）にて形質導入を行った。十分なウイルスおよび細胞は、この低いMOIの下で、各shRNAが母集団において約100ないし約1000倍を表すであろうように形質導入をした。
【０１０４】
次いで、形質導入した細胞のライブラリーをデシタビン（100nMまたは500nM）またはビヒクルコントロールにより4日または7日間、すべて2ないし3回の反復実験において処理した。処理後、細胞を収穫し、DNAを分離し、および50μgのゲノムDNAを使用して、生存細胞でのshRNA特異的バーコードを増幅した。次に、これらのバーコードを次世代シーケンシングによって識別し、および集団において個々のshRNAに対応する各バーコードの数を、ビヒクルおよびデシタビン処理細胞におけるそのshRNAの表示の尺度として使用した。「ヒット（Hits）」は、ビヒクル処理細胞の集団と比較したデシタビン処理細胞の集団において「ドロップアウトした（dropped out）」それらのshRNAsとして識別した。逆に、ビヒクル処理細胞の集団と比較してデシタビン処理細胞の集団において豊富化したshRNAsは、デシタビン処理に対する耐性を付与すると考えられた。
【０１０５】
プールした機能的ゲノムスクリーニングにおいてテストした27,000のshRNAsのうち、約1％の偽陽性率を有する有意なISLET「ヒット」と考えられる149を識別した。図14は、デシタビンを伴うもの、および伴わないものの両方のshRNAでの選択的殺傷の程度を示すウォーターフォールプロットであり、デシタビン処理を伴うカウント対コントロール処理を伴うカウントの比率のLog2変換としてプロットした。図1A、上記と同様に、値が負であるほど、shRNA単独と比較してshRNAとデシタビンの組合せの選択的殺傷のレベルが大きくなる。以下の表10は、149の識別した各々の潜在的なターゲット遺伝子を詳述する。
【０１０６】
【表１０−１】
2020524262.tif 000014
【表１０−２】
2020524262.tif 000015
【表１０−３】
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【表１０−４】
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【表１０−５】
2020524262.tif 000018
【０１０７】
表10において挙げたshRNA化合物のターゲットは、デシタビンと組み合わせるとき、ガン細胞において合成致死性を誘導した可能性があるインヒビターの開発のための潜在的なターゲットを表す。これらの潜在的なshRNAターゲットのうち、16はここで識別され、および図14において白いバーとして表す。16の潜在的なターゲットは、独立したターゲティングshRNAsによる更なる検証を受け、それらが生産的なISLETの組合せであることを確認した。識別した16のターゲットには、次の：GNAZ、2つのDCT shRNAs、ITK、AURKA、CHST3、MAP2K2、CRAT、PDE1B、STAT5A、MEF2C、IL17D、PDE48、HSD3B2、PDE4C、およびFUT5についてのshRNAsが含まれる。
【０１０８】
図15は、デシタビンと組み合わせてエピジェネティック療法による誘導合成致死性（Induced Synthetic Lethality with Epigenetic Therapy）（ISLET）ターゲットとしてのCHSTの独立した検証を示す。CHSTをターゲットとするshRNAは特に100nMデシタビンと組み合わせ、CHST shRNAs単独またはデシタビン単独に比べ著しく低下したDU145ガン細胞生存性を生じさせた。図15において示すように、DU145細胞の全体的な生存性は、デシタビンを伴うがCHSTをターゲットとするshRNAを伴わないビヒクルコントロールについて、CHSTをターゲットとするshRNAをデシタビンと一緒に伴うDU145を含むサンプルよりも顕著に高かった。
【０１０９】
図16は、CRATをターゲットとする2つの異なるshRNAsが100nMデシタビンと組み合わせて、それぞれCRAT shRNAs単独またはデシタビン単独に比べ著しく低下したDU145ガン細胞生存性を引き起こしたことを示す。図16において示すように、DU145細胞の全体的な生存性は、デシタビンを伴うがCRATをターゲットとするshRNAを伴わないビヒクルコントロールについて、CRATをターゲットとするshRNAをデシタビンと一緒に伴うDU145を含む2つのサンプルのいずれについてよりも顕著に高かった。
【０１１０】
図17は、DCTをターゲットとする2つの異なるshRNAsが100nMデシタビンと組み合わせて、それぞれDCT shRNAs単独またはデシタビン単独に比べ著しく低下したDU145ガン細胞生存性を引き起こしたことを示す。図17において示すように、DU145細胞の全体的な生存性は、デシタビンを伴うがDCTをターゲットとするshRNAを伴わないビヒクルコントロールについて、DCTをターゲットとするshRNAをデシタビンと一緒に伴うDU145を含む2つのサンプルのいずれについてよりも顕著に高かった。
【０１１１】
図18は、FUT5をターゲットとするshRNAが100nMデシタビンと組み合わせて、それぞれFUT5 shRNA単独またはデシタビン単独に比べ著しく低下したDU145ガン細胞生存性を引き起こしたことを示す。図18において示すように、DU145細胞の全体的な生存性は、デシタビンを伴うがFUT5をターゲットとするshRNAを伴わないビヒクルコントロールについて、FUT5をターゲットとするshRNAをデシタビンと一緒に伴うDU145を含むサンプルについてよりも顕著に高かった。
【０１１２】
図19は、GNAZをターゲットとする2つの異なるshRNAsが100nMデシタビンと組み合わせて、それぞれGNAZ shRNAs単独またはデシタビン単独に比べ著しく低下したDU145ガン細胞生存性を引き起こしたことを示す。図19において示すように、DU145細胞の全体的な生存性は、デシタビンを伴うがGNAZをターゲットとするshRNAを伴わないビヒクルコントロールについて、GNAZをターゲットとするshRNAをデシタビンと一緒に伴うDU145を含む2つのサンプルのいずれについてよりも顕著に高かった。
【０１１３】
図20は、HSD3B2をターゲットとするshRNAが100nMデシタビンと組み合わせて、それぞれHSD3B2 shRNA単独またはデシタビン単独に比べ著しく低下したDU145ガン細胞生存性を引き起こしたことを示す。図20において示すように、DU145細胞の全体的な生存性は、デシタビンを伴うがHSD3B2をターゲットとするshRNAを伴わないビヒクルコントロールについて、HSD3B2をターゲットとするshRNAをデシタビンと一緒に伴うDU145を含むサンプルについてよりも顕著に高かった。
【０１１４】
図21は、IL17Dをターゲットとする2つの異なるshRNAsが100nMデシタビンと組み合わせて、それぞれIL17D shRNAs単独またはデシタビン単独に比べ著しく低下したDU145ガン細胞生存性を引き起こしたことを示す。図21において示すように、DU145細胞の全体的な生存性は、デシタビンを伴うがIL17DをターゲットとするshRNAを伴わないビヒクルコントロールについて、IL17DをターゲットとするshRNAをデシタビンと一緒に伴うDU145を含む2つのサンプルのいずれについてよりも著顕著に高かった。
【０１１５】
図22は、ITKをターゲットとする2つの異なるshRNAsが100nMデシタビンと組み合わせて、それぞれITK shRNAs単独またはデシタビン単独に比べ著しく低下したDU145ガン細胞生存性を引き起こしたことを示す。図22において示すように、DU145細胞の全体的な生存性は、デシタビンを伴うがITKをターゲットとするshRNAを伴わないビヒクルコントロールについて、ITKをターゲットとするshRNAをデシタビンと一緒に伴うDU145を含む2つのサンプルのいずれについてよりも顕著に高かった。
【０１１６】
図23は、MAP2K2をターゲットとする2つの異なるshRNAsが100nMデシタビンと組み合わせて、それぞれMAP2K2 shRNAs単独またはデシタビン単独に比べ著しく低下したDU145ガン細胞生存性を引き起こしたことを示す。図23において示すように、DU145細胞の全体的な生存性は、デシタビンを伴うがMAP2K2をターゲットとするshRNAを伴わないビヒクルコントロールについて、MAP2K2をターゲットとするshRNAをデシタビンと一緒に伴うDU145を含む2つのサンプルのいずれについてよりも顕著に高かった。
【０１１７】
図24は、MEF2Cをターゲットとする2つの異なるshRNAsが100nMデシタビンと組み合わせて、それぞれMEF2C shRNAs単独またはデシタビン単独に比べ著しく低下したDU145ガン細胞生存性を引き起こしたことを示す。図24において示すように、DU145細胞の全体的な生存性は、デシタビンを伴うがMEF2CをターゲットとするshRNAを伴わないビヒクルコントロールについて、MEF2CをターゲットとするshRNAをデシタビンと一緒に伴うDU145を含む2つのサンプルのいずれについてよりも顕著に高かった。
【０１１８】
図25は、PDE1Bをターゲットとする2つの異なるshRNAsが100nMデシタビンと組み合わせて、それぞれPDE1B shRNAs単独またはデシタビン単独に比べ著しく低下したDU145ガン細胞生存性を引き起こしたことを示す。図25において示すように、DU145細胞の全体的な生存性は、デシタビンを伴うがPDE1BをターゲットとするshRNAを伴わないビヒクルコントロールについて、PDE1BをターゲットとするshRNAをデシタビンと一緒に伴うDU145を含む2つのサンプルのいずれについてよりも顕著に高かった。
【０１１９】
図26は、PDE4Bをターゲットとする4つの異なるshRNAsが100nMのデシタビンと組み合わせて、それぞれPDE4B shRNAs単独またはデシタビン単独に比べ著しく低下したDU145ガン細胞生存性を引き起こしたことを示す。図26において示すように、DU145細胞の全体的な生存性は、デシタビンを伴うがPDE4BをターゲットとするshRNAを伴わないビヒクルコントロールについて、PDE4BをターゲットとするshRNAをデシタビンと一緒に伴うDU145を含む4つのサンプルのいずれについてよりも顕著に高かった。
【０１２０】
図27は、PDE4Ｃをターゲットとする4つの異なるshRNAsが100nMデシタビンと組み合わせて、それぞれPDE4C shRNAs単独またはデシタビン単独に比べ著しく低下したDU145ガン細胞生存性を引き起こしたことを示す。図27において示すように、DU145細胞の全体的な生存性は、デシタビンを伴うがPDE4CをターゲットとするshRNAを伴わないビヒクルコントロールについて、PDE4CをターゲットとするshRNAをデシタビンと一緒に伴うDU145含む4つのサンプルのいずれについてよりも顕著に高かった。
【０１２１】
図28は、STAT5Aをターゲットとする2つの異なるshRNAsが100nMデシタビンと組み合わせて、それぞれSTAT5A shRNAs単独またはデシタビン単独に比べ著しく低下したDU145ガン細胞生存性を引き起こしたことを示す。図28において示すように、DU145細胞の全体的な生存性は、デシタビンを伴うがSTAT5AをターゲットとするshRNAを伴わないビヒクルコントロールについて、STAT5AをターゲットとするshRNAをデシタビンと一緒に伴うDU145を含む2つのサンプルのいずれについてよりも顕著に高かった。
例8-インビトロおよびインビボ腫瘍サプレッションを示すMBDタンパク質インヒビターおよびRARアゴニストの組合せ
レチノイン酸経路の活性化
【０１２２】
MBD2タンパク質インヒビターがレチノイン酸シグナル伝達経路活性化を誘発したかどうかを定めるために、レチノイン酸シグナル伝達（pRARE-ルシフェラーゼ）の存在に応答する異種レポータープラスミドによりトランスフェクトしたPC-3ヒト前立腺ガン細胞にKCC-08を投与し、およびそれらの細胞を用いて、レチノイン酸応答シグナル伝達経路の再活性化を評価した。ガン細胞を、イソトレチノイン（5μM）の有無の両方でビヒクルコントロールまたはKCC-08（10μM）により72時間処理し、および次いでルシフェラーゼレポーターの産生についてアッセイした。
【０１２３】
図29Aに示し、および以下の表11において詳述するように、ルシフェラーゼ活性は、KCC-08によって高められ、およびKCC-08と組み合わせるイソトレチノインによる刺激によりさらにもっと高められ、その結果KCC-08およびイソトレチノインの組合せがレチノイン酸シグナル伝達経路の活性化を相乗的に高めた。
【０１２４】
【表１１】
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【０１２５】
ガンのクローン原性生存率（clonogenic survival）についてアッセイするために、PC-3ガン細胞を6ウェルプレート中に5,000細胞/ウェルにて播種し、および夜通し付着させた。次に、細胞を、イソトレチノインの有無の両方で、ビヒクルコントロールまたはKCC-08により72時間処理し、リン酸緩衝化塩類溶液（phosphate-buffered saline）で3回洗浄し、および次いで元の完全増殖培地（complete growth medium）の場所に戻した。10日後、生き残った細胞によって築かれたコロニーはクリスタルバイオレット染色を使用して検出した。したがって、図29Bにおいて、および以下の表12において示すように、KCC-08およびイソトレチノインによるレチノイン酸シグナル伝達経路の回復により、72時間の曝露後のクローン原性生存率が減少することが決定され、12-27の独立した複製の平均が示された。
【表１２】
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【０１２６】
インビボ腫瘍サプレッション
ガン異種移植片成長サプレッションのために、100万のヒトPC-3前立腺ガン細胞をMatrigel（マトリゲル）において懸濁し、Jackson Laboratory（ジャクソン研究所）（Bar Harbor（バーハーバー）、ME（米国メイン州））によって提供されたMale（雄性）Fox1ヌードマウスの脇腹中に接種した。結果として生じる異種移植腫瘍が2週間後に測定可能になったとき、担ガン（tumor-bearing）マウスをKCC-08により処置し、塩類溶液中の腹腔内感染によって、週1について1mg/kgにて7日間の5日および次いで週2について0.5mg/kgで7日間の5日与えた。イソトレチノインは、週1および週2についてKCC-08と同じ7日間の5日に30mg/kgにて落花生油での強制経口投与により与えた。週3について、イソトレチノインは、7日間の5日に30mg/kgにて落花生油での強制経口投与により与え、およびKCC-08は与えなかった。腫瘍は3週間にわたって週3回測定し、および容量は式4/3*Π*幅*長さ*深さを使用することによって推定した。
【０１２７】
図29Cにおいて、および以下の表13において示すように、KCC-08およびイソトレチノインの組合せは、KCC-08の施与を停止した後にイソトレチノインが施与された場合でもインビボの腫瘍成長を相乗的に抑制した。
【表１３】
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【０１２８】
例9-デシタビンによるISLETヒットを識別するための化学ライブラリースクリーニング
デシタビンまたは化合物単独に比べガン細胞増殖を相乗的に抑制したライブラリーにおけるそれらの化合物を識別するために、化学ライブラリースクリーニング（Johns Hopkins Drug Library、JHDL）をDNMTインヒビターのデシタビンの有無により使用した。2段階のスクリーニングを実行した。最初の段階では、100nMデシタビンまたはビヒクルコントロールのいずれかに4日間曝露した後、3日間、5マイクロモルの単回投与においてJHDLライブラリーの3800化合物をPC-3前立腺ガン細胞に投与した。131の化合物を識別し、＞50％の増殖抑制が示された。
【０１２９】
第2段階では、識別した131の化合物の64を、各々の64の化合物単独（0-10μM）の全用量応答マトリクス（full dose response matrix）において、およびデシタビン（0-10μM）との組合せにおいて評価した。識別した化合物の各用量を3日間連続して加える前に、細胞を4日間連続してデシタビンの各用量に曝露した。すべての用量の組合せにわたってBliss Independenceスコアの和がゼロより大きい場合、化合物はデシタビンと組み合わせるとき、相乗的な増殖抑制を有することが確認された。図30は、識別した化合物の細胞に対するBliss Independenceスコア値を示す棒グラフである。次の22種類の化合物を識別した：コルヒチン、ストロファンチジン、ビノレルビン、NH125、ドセタキセル、ペリプロシマリン、トポテカン、クラドリビン、シタラビン、RO31-8220、ウアバイン、ゲムシタビン、PI828、ミコフェノール酸、GW843682、ブレオマイシン、アクラルビシン、ER27319、カルボプラチン、アニソマイシン、SB218078、およびバリノマイシン。
【０１３０】
この化学ライブラリースクリーニングアプローチは、キナーゼインヒビター、微小管剤、ヌクレオシド類似体、抗生物質、および他の薬剤を含め、複数のクラスの薬物を有意なISLETヒットとして識別した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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